Thèse Etude De L'activité Antimicrobienne Et Antioxydante

كليـــــــت عــــــــلوم الطبيـــــــــعت والحــــــــــياة Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie (SNV)

N°………………/………/2019

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE APPLIQUEE

Thèse Présentée par

Anis BERTELLA

Pour l’obtention du diplôme de

Filière: Sciences Biologiques Spécialité: Microbiologie Appliquée

Thème Etude de l’activité antimicrobienne et antioxydante des huiles essentielles d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii Soutenue publiquement le 13/11/2019

Devant le Jury Président Kihal Mebrouk Pr . Université Oran 1 Examinateurs Abbouni Bouziane Pr. Université de Sidi Bel Abbès Setti Benali Pr. Université de Chlef Benmechernene Zineb Pr. Université Oran 1 Hamini Kadar Nisserine MCA Université Oran1 Directeur de thèse Benlahcen Kheira Pr. Université Oran 1

Année universitaire 2019/2020 Remerciements

Mes vifs remerciements vont au Pr KIHAL Mebrouk, Directeur du laboratoire de Microbiologie Appliquée pour m’avoir accepté dans son laboratoire de recherche et pour m’avoir fait l’honneur de présider ce jury.

J’exprime mes remerciements et mes sincères gratitudes au Pr BENLAHCEN Kheira pour ses orientations et ses aides durant l’élaboration de ce travail.

Je tiens à remercier tout spécialement: Pr SETTI Benali Pr ABBOUNI Bouziane Pr BENMECHERNENE Zineb Mme HAMINI KADAR Nisserine Pour m’avoir honoré en acceptant d’examiner ce travail.

Mes vifs remerciements vont également Au Professeur Artur M.S. SILVA et au Professeur Diana C. G. A. PINTO du groupe de recherche QOPNA Université d’Aveiro, Portugal.

Au Professeur Cristina NERIN, Au Docteur Magdalena WRONA du groupe de recherche GUIA,Université de Saragosse, Espagne.

Au Professeur HADJADJ-AOUL Seghir, pour avoir identifié les espèces végétales qui ont fait l’objet de notre étude.

Mes sincères remerciements vont également au Docteur ZOUAGUI Souad responsable du Laboratoire de bactériologie au CHU d’Oran.

Je remercie vivement Mme GOURI-DJAABOUB Serra du Département de Biologie, Université Tahri Mohamed de Béchar. Mes sincères remerciements sont adressés aux ingénieurs des laboratoires de recherche à l’université d’Oran 1 qui m’ont beaucoup aidé durant l’élaboration de ce travail.

J’adresse mes remerciements à tous mes amis et mes collègues à l’université d’Oran 1. Enfin, à toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de ce travail qu’elles veuillent bien accepter l’expression de ma gratitude.

Dédicaces

A tous ceux qui me sont chers. ملخص

حًثم يقبويت انؼًبداث انحُىَت يشكهت سئُغُت نهظحت انعًىيُت ـٍ انًغخشفُبث حىل انعبنى ، ؿػ إنً رنك خطىسة انؼًبـبث انؽزائُت االططُبعُت انًغخعًهت ـٍ األؼزَت وانخٍ هذـهب حفع هزِ األؽعًت ويُع األكغذة. جًُع هزِ انًعبَُش كبَج وساء انحبجت انعبجهت نهعىايم انؼًبدة نهًُكشوببث ويؼبداث األكغذة انطبُعُت. انهذؾ يٍ هزا انعًم هى حغهؾُ انؼىء عهً انخأثُش انؼًبد نهًُكشوببث و انخبطُت انؼًبدة نألكغذة نهضَىث األعبعُت انًغخخهظت يٍ َببحبث Artemisia herba-alba ، Artemisia campestris و Rosmarinus tournefortii ببإلػبـت إنً حشكُبهب انكًُُبئٍ و انغًُت انحبدة.

يثم يشدود انضَج األعبعٍ انًغخخشج عٍ ؽشَق انخقطُش انًبئٍ نـ Artemisia herba-alba أعهً َغبت بًعذل ٪0,65 وقذ عًح ححهُم انضَج األعبعٍ بخقُُت انكشويبحىؼشاـُب انؽبصَت انًخظهت بًطُبؾ انكخهت )CPG-MS( بخحذَذ 41 يشكببً كًُُبئُب ً، حُث كبٌ انكبـىس هى انعُظش انغبئذ ـٍ انضَىث األعبعُت نـ Artemisia herba-alba و Rosmarinus tournefortii بُغبت )50,47٪( و)45,89٪( و يشكب germacrene D )20,91 ٪( ـٍ صَج Artemisia campestris. كشؿ انُشبؽ انؼًبد نهبكخُشَب عٍ ـبعهُت انضَج األعبعٍ نـ Artemisia herba-alba عهً بكخُشَب Klebsiella oxytoca و Acinetobacter baumannii يٍ خالل ؽشَقت انخًبط انًببشش واالَخشبس ببألقشاص حُث بهػ قطش يُطقت انخثبؾُ 31,3 يهى، كزنك يٍ خالل حقُُت Microatmosphère حُث بهػ قطش انخثبؾُ 48 يهى عهً عالنت Acinetobacter baumannii . حى حغجُم قًُخٍُ يهًخٍُ نهخشكُض انًثبؾ األدًَ وانخشكُض األدًَ انقبحم نهبكخُشَب حًثهج ـٍ 5 و 10 يهؽى/يم عهً عالالث Staphylococcus aureus. كًب حى انقؼبء انكهٍ عهً انخالَب انبكخُشَت ـٍ ؼؼىٌ 24 عبعت ورنك ببنُغبت نكم انغالالث انًذسوعت. ًَخهك انضَج األعبعٍ نــ Artemisia harba-alba َشبؽ يؼبد نهفطشَبث جذ يهى، حًثم أعبعب يٍ خالل قطش انخثبؾُ عهً عالنت Aspergillus niger انزٌ بهػ 7 ,53 يهى. وجذ انخشكُضاألدًَ انًثبCMI( ؾ( وانخشكُض األدًَ انقبحم نهفطشَبث )CMF( جذ يخخهؿ يٍ عالنت إنً أخشي، حُث حى حغجُم قًُت انخشكُضاألدًَ انًثبCMI( ؾ( نــ Aspergillus niger 2,5 يُكشونخش/يم بًُُب انخشكُض األدًَ انقبحم نهفطشَبث )CMF( كبٌ < 20 يُكشونخش، أظهشانضَج األعبعٍ نــ Rosamrinus tournefortii َغب حشكُضأدًَ يثبCMI( ؾ( وحشكُض أدًَ قبحم نهفطشَبث )CMF( جذ يهًت حُث كبَج 2,5 و 5 يُكشونخشعهً عالنت Penicillium sp. َظهش انُشبؽ انؼًبد نألكغذة بىاعطت ؽشَقت DPPH وؽشَقت يىنذ انجزوس انحشة ـٍ انًىقع ، انقىة انًهًت نضَج نــ

Artemisia harba-alba ،يٍ خالل قًُت IC50 حًثهث ـٍ 41,73 يهػ/غ وخفغ انُغبت انًئىَت نعًهُت حثبُج جزس انهُذسكغُم إنً 29,62٪. أيب ـًُب َخض ؽشَقت ORAC ـخشجع اـؼم قًُت ORAC نضَج Rosamrinus tournefortii حُث كبَج 337,49 يُكشويىل/غ.

يكٍ انخحهُم HS-SPME-CPG-O-SM يٍ ححذَذ انعذَذ يٍ انًشكببث انًفخبحُت نهشائحت، ورنك ػًٍ كم يٍ انضَىث األعبعُت انًذسوعت. إػبـت إنً إجشاء اخخببس انغًُت انحبدة حُث نىحظج أعشاع انخُفظ انغشَع و عذو انحشكت بجشعت

يقذاسهب 500 يجى/ كجى، ـٍ حٍُ كبَج انجشعت انًخىعطت انقبحهت ) DL50) 615 يجى/كػ.

الكلمات المفتاحية: صَج أعبعٍ ، كبـىس ، َشبؽ يؼبد نهًُكشوببث ، َشبؽ يؼبد نألكغذة ، عًُت .

Résumé

La résistance aux antibiotiques est actuellement un problème majeur de santé publique qui se pose au niveau des hôpitaux à travers le monde, un autre souci et celui des risques accrus des additifs alimentaires synthétiques ajoutés aux aliments dont l’objectif est de conserver ces denrées alimentaires et empêcher les réactions d’oxydation. Tous ces paramètres sont derrière le besoin urgent en agents antimicrobiens et antioxydants naturels. L’objectif de ce présent travail est de mettre en évidence l’effet antimicrobien et antioxydant des huiles essentielles extraites des espèces d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii, ainsi que leur composition chimique, profil aromatique et leur toxicité aiguë. Le rendement de l’huile essentielle extraite par hydrodistillation le plus important revient à AHA avec un taux de 0,65 %. L’analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) a permet l’identification de 41 composés chimiques au total. Les composés majeurs des huiles essentielles d’AHA, RT et AC sont le camphre (50,47 %), (45,89 %) et le germacrène D (20,91 %) respectivement. L’activité antibactérienne révèle le potentiel effet de l’huile d’AHA, par technique de diffusion sur disque notamment sur les souches de Klebsiella oxytoca, Acinetobacter baumannii et Staphylococcus aureus, avec des diamètres de la zone d’inhibition allant jusqu'à 31,3 mm, de même par méthode de microatmosphère avec des diamètres allant à 48 mm sur la souche d’Acinetobacter baumannii. Une faible CMI et CMB de 5 et 10 mg/mL sur les souches de Staphylococcus aureus. Une élimination des cellules bactériennes totale est atteinte après 24 h. Une importante activité antifongique de l’huile d’AHA, est traduite principalement par un diamètre d’inhibition de 53,7 mm sur Aspergillus niger. Les concentrations minimale inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF) sont variables; l’HE d’AHA a inhibé la souche d’Aspergillus niger à une concentration de 2,5 μL/mL, mais la concentration minimale fongicide était >20 μL/mL. L’huile essentielle de RT a présenté une CMI et CMF importante sur Penicillium sp. Qui étaient 2,5 et 5 μL/mL respectivement. L’activité antioxydante par méthode de DPPH et par générateur de radicaux libre in situ, montre le pouvoir important de l’huile d’AHA, traduit par une IC50 de 41,73 mg/g et un pourcentage d’hydroxylation à 29,62 %. Quant à la méthode ORAC, c’est l’huile essentielle de RT qui a présenté le plus haut pouvoir antioxydant avec une valeur de 337,49 µmol/g. L’analyse HS-SPME-CPG-O-SM a permis d’identifier plusieurs odorants clés dans nos huiles essentielles étudiées. De plus que l’épreuve de toxicité aiguë a montré qu’un comportement anormal de l’isolement dans un coin et de respiration rapide des animaux traités est observé avec une dose de 500 mg/kg, alors que la dose létale médiane (DL50) est de 615 mg/kg.

Mots clés: Huile essentielle, camphre, activité antimicrobienne, activité antioxydante, toxicité. Abstract

Antibiotic resistance is currently a major public health problem in hospitals around the world, another concern is the increased risk of synthetic food additives added to foods in order to conserve them and prevent oxidation reactions. All these parameters are behind the urgent need for natural antimicrobial agents and antioxidants. The objective of this work is to highlight the antimicrobial and antioxidant effect of the essential oils extracted from the species of Artemisia herba-alba, Artemisia campestris and Rosmarinus tournefortii, as well as their chemical composition, aromatic profile and the acute toxicity.

The most important yield of the EO extracted by hydrodistillation returns to AHA with a rate of 0.65%. GC-MS analysis allowed the identification of a total of 41 chemical compounds. The major compound of the essential oils of AHA, RT and AC are camphor (50.47%), (45.89%) and germacrene D (20.91%) respectively. The antibacterial activity reveals the potential effect of AHA EO, by disc diffusion technique especially on Klebsiella oxytoca, Acinetobacter baumannii and Staphylococcus aureus strains, with diameters of the inhibition zone reaching 31.3 mm, likewise by microatmosphere method with diameters going to 48 mm on the Acinetobacter baumannii strain. A low MIC and MBC of 5 and 10 mg/mL was noticed on Staphylococcus aureus strains. Total bacterial cell removal is reached after 24 hours. A significant antifungal activity of AHA EO, is mainly translated by a 53.7 mm inhibition zone diameter on Aspergillus niger. The minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum fungicidal concentrations (MFC) are variable, the EO of AHA inhibited the Aspergillus niger strain at a concentration of 2.5 μL/mL, but the minimal fungicidal concentration was > 20 μL/mL. The essential oil of RT showed a significant MIC and MFC on Penicillium sp. which were 2.5 and 5 μL/mL respectively.

The antioxidant activity by DPPH method and by free radical generator in situ, shows the important power of the oil of AHA, translated by an IC50 of 41.73 mg/g and a reduced percentage of hydroxylation to 29.62 %. For the ORAC method, it is the essential oil of RT which has the highest antioxidant capacity with an ORAC value of 337.49 μmol /g.

The analysis HS-SPME-GC-O-MS has allowed the identification of several key odorants present in the essential oil AHA, AC and RT, in addition of the acute toxicity test showed that abnormal behavior of corner sitting and rapid respiration of treated animals was observed at a dose of 500 mg/kg, while the median lethal dose (LD50) was 615 mg/kg.

Key words: Essential oil, camphor, antimicrobial activity, antioxidant activity, toxicity. Sommaire Liste des tableaux Liste des figures Symboles et abréviations Introduction ...... 1 Chapitre I: Revue bibliographique 1. Monographie des plantes étudiées ...... 3 1.1. Genre Artemisia L...... 3 1.1.1. Artemisia herba-alba Asso...... 3 1.1.1.1. Présentation ...... 3 1.1.1.2. Noms vernaculaires ...... 3 1.1.1.3. Description botanique ...... 3 1.1.1.4. Systématique ...... 4 1.1.1.5. Habitat et distribution ...... 4 1.1.1.6. Usages ...... 5 1.1.1.7. Huile essentielle d’Artemisia herba alba ...... 5 1.1.2. Artemisia campestris L...... 9 1.1.2.1. Présentation ...... 9 1.1.2.2. Noms vernaculaires ...... 9 1.1.2.3. Description botanique ...... 9 1.1.2.4. Systématique ...... 10 1.1.2.5. Distribution et habitat ...... 11 1.1.2.6. Usages ...... 11 1.1.2.7. Huile essentielle d’Artemisia campestris ...... 11 1.2. Rosmarinus tournefortii de Noé...... 14 1.2.1. Genre Rosmarinus L...... 14 1.2.2. Présentation ...... 14 1.2.3. Noms vernaculaires ...... 15 1.2.4. Description botanique ...... 15 1.2.5. Systématique ...... 16 1.2.6. Distribution et habitat ...... 16 1.2.7. Usages ...... 17 1.2.8. Huile essentielle de Rosmarinus tournefortii ...... 17 2. Les huiles essentielles ...... 18 2.1. Définition ...... 18 2.2. Caractéristiques et propriétés physicochimiques ...... 18 2.3. Historique ...... 19 2.4. Localisation et rôle dans la plante ...... 20 2.5. Activités biologiques ...... 20 2.5.1. Activité antimicrobienne ...... 21 2.5.1.1 Activité antibactérienne ...... 21 2.5.1.2. Activité antifongique ...... 22 2.5.1.3. Activité antivirale ...... 23 2.5.1.4. Activité anti-protozoaire ...... 23 2.5.2. Activité antioxydante ...... 24 2.5.3. Activité insecticide ...... 25 2.5.4. Activité anticancéreuse ...... 25 2.5.5. Activité anti-inflamatoire ...... 26 2.6. Utilisation ...... 27 2.6.1. Produits pharmaceutiques ...... 27 2.6.2. Cosmétique et parfumerie ...... 27 2.6.3. Aliments et boissons ...... 27 2.6.4. Médecine populaire ...... 28 2.6.5. Autres usages ...... 28 2.7. Méthodes d’extraction ...... 28 2.7.1. Hydrodistillation ...... 29 2.7.2. Entrainement à la vapeur d’eau ...... 29 2.7.3. Extraction par micro-ondes ...... 30 2.7.4. L’expression à froid ...... 30

2.7.5. Extraction par CO2 ...... 30 2.8. Composition chimique ...... 31 2.8.1. Terpènes ...... 32 2.8.1.1. Les monoterpènes ...... 32 2.8.1.2. Les sesquiterpènes ...... 32 2.8.1.3. Les diterpènes ...... 32 2.8.1.4. Les norterpènes ...... 33 2.8.2. Phénylpropanoïdes ...... 33 2.8.3. Composés soufrés et azotés ...... 34 2.9. Toxicité des huiles essentielles ...... 34 2.10. Situation économique des huiles essentielles ...... 36 Chapitre II: Matériel et méthodes 1. Préparation du matériel végétal ...... 38 2. Extraction des huiles essentielles ...... 41 3. Détermination du rendement en huile essentielle ...... 41 4. Analyse de la composition chimique CPG-SM ...... 41 5. Etude de l’activité antibactérienne ...... 43 5.1. Souches bactériennes ...... 43 5.2. Méthode de diffusion par disque...... 43 5.3. Méthode de microatmosphère ...... 44 5.4. Détermination de la CMI et la CMB...... 44 5.5. Mesure de la décroissance bactérienne (Time-kill assay) ...... 45 6. Etude de l’activité antifongique ...... 46 6.1. Méthode de diffusion par disque...... 46 6.2. Détermination de la CMI et de la CMF ...... 46 7. Etude de l’activité anti-oxydante ...... 47 7.1. Mesure du piégeage du radical DPPH ...... 47 7.2. La méthode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)...... 47 7.3. Activité anti radicalaire dans un générateur de radicaux ...... 48 8. Olfactométrie ...... 50 8.1. Choix de la fibre SPME ...... 50 8.2. Analyse HS-SPME-CPG-O/SM ...... 51 8.3. Détermination de l’OAV (Odor Activity Value) ...... 52 8.4. Calcul de la limite de détection (LOD) ...... 53 9. Etude de la toxicité aigüe ...... 54 9.1. Les animaux d’expérience ...... 54 9.2. Protocol expérimental ...... 55 9.2.1. L’échantillonnage ...... 55 9.2.2. Choix de la population d’étude ...... 56 9.2.3. Préparation des doses d’huile essentielle...... 57

9.3. Détermination de dose létale médiane (DL50) ...... 57 9.4. Tests d’Irwin simplifiés ...... 58 9.5. Evolution pondérale… ...... 59 Chapitre III: Résultats et interprétations 1. Rendement ...... 60 2. Composition chimique ...... 60 3. Activité antibactérienne ...... 64 3.1. Méthode de diffusion par disque...... 64 3.2. Méthode de microatmosphère ...... 66 3.3. Détermination de la CMI de et la CMB ...... 67 3.4. Mesure de la décroissance bactérienne (Time-kill assay) ...... 68 4. Activité antifongique ...... 69 4.1. Méthode de diffusion par disque...... 69 4.2. Détermination de la CMI de et la CMF ...... 71 5. Activité anti-oxydante ...... 71 5.1. Piégeage du radical libre DPPH ...... 71 5.2. Méthode ORAC ...... 72 5.3. Activité anti radicalaire dans un générateur de radicaux hydroxyles ...... 73 6. Olfactométrie ...... 74 6.1. Analyse HS-SPME-CPG-O/SM ...... 74 6.2. Mesure de l’OAV ...... 80 6.3. Analyse sensorielle ...... 82 7. Toxicité aigüe et comportement ...... 85

7.1. Dose létale médiane (DL50) ...... 85 7.2. Description des comportements et test d’Irwin simplifié ...... 85 7.3. Evolution pondérale ...... 89 Discussion ...... 91 Conclusion et perspectives ...... 103 Références bibliographiques ...... 105 Annexes ...... 130

Liste des tableaux

Tableau I: Systématique d'Artemisia herba alba Asso...... 4 Tableau II: Composés majoritaires retrouvés dans les chémotypes d’HE d’AHA...... 7 Tableau III: Systématique d'Artemisia capmestris L...... 10 Tableau IV: Composés majoritaires trouvés dans les chémotypes d’HE d’AC...... 13 Tableau V: Systématique de Rosmarinus tournefortii de Noé...... 16 Tableau VI : Composés majoritaires retrouvés dans les chémotypes d’HE de RT ...... 18 Tableau VII: L’échelle de Hodge et Sterner ...... 58 Tableau VIII: Rendement des huiles essentielles ...... 60 Tableau IX: Composition chimique des huiles essentielles ...... 61 Tableau X: Diamètre de la zone d’inhibition ...... 65 Tableau XI : Diamètres des zones d’inhibition par méthode de microatmosphère ...... 67 Tableau XII: Concentration minimales inhibitrices (CMI) et bactéricides (CMB) ...... 68 Tableau XIII: Diamètres des zones d’inhibition des souches fongiques ...... 70 Tableau XIV: Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF) ...... 71

Tableau XV: Valeurs des IC 50 des huiles essentielles ...... 72 Tableau XVI: Valeurs ORAC des huiles essentielles ...... 72 Tableau XVII: Valeurs du pourcentage d’hydroxylation ...... 73 Tableau XVIII: Composés odorants retrouvés dans les HEs identifiés par CPG-O-SM ...... 75 Tableau XIX: Composés odorants identifiés par les panélistes ...... 78 Tableau XX: Composés dépourvus d’odeur ou présents en quantités inférieures à leurs seuils olfactifs ...... 81 Tableau XXI: Comportement et taux de mortalité des souris après injection de l’HE d’AHA...... 85 Tableau XXII: Résultats des tests d’Irwin simplifiés ...... 87

Liste des figures

Figure 1: Aspects morphologiques de l’espèce Artemisia herba-alba Asso...... 4 Figure 2: Aspects morphologiques de l’espèce Artemisia campestris L...... 10 Figure 3: Aspects morphologiques de l’espèce Rosmarinus tourneforti de Noé...... 16 Figure 4: Zone d’échantillonnage ...... 39 Figure 5: Préparation du matériel végétal ...... 40 Figure 6: Extraction de l’huile essentielle par hydro distillation ...... 41 Figure 7: Mesure de la décroissance bactérienne...... 45 Figure 8: Schéma du dispositif de génération de radicaux libres In situ (Pezo et al., 2008)... 49 Figure 9: Dispositif de génération de radicaux libres In situ...... 49 Figure 10: Schéma récapitulatif de l’analyse HS-SPME-CPG-O-SM ...... 52 Figure 11: Population de 9 souris dans leur habitat… ...... 54 Figure 12: Schéma récapitulatif de l’obtention de la population d’étude ...... 55 Figure 13: Population de souris provenant de différentes générations à différents âges ...... 56 Figure 14: Différentes étapes de l’injection intrapéritonéale ...... 57 Figure 15: Chromatogrammes des huiles essentielles analysées CPG-SM ...... 63 Figure 16: Zones d’inhibition par méthode de diffusion par disque ...... 64 Figure 17: Zones d’inhibition par méthode de microatmosphère ...... 66 Figure 18: Cinétique de décroissance bactérienne ...... 69 Figure 19: Zones d’inhibition des souches fongiques ...... 70

Figure 20: Valeurs des IC 50 des huiles essentielles...... 72 Figure 21: Représentation des valeurs ORAC des huiles essentielles ...... 73 Figure 22: Pourcentage d’hydroxylation ...... 74 Figure 23: Profil sensoriel des huiles essentielles d’AHA, AC et RT ...... 83 Figure 24: Valeurs OAV des classes d’odeurs caractéristiques des HEs d’AHA, AC et RT..84 Figure 25: Différents comportements de souris après traitement par HE d’AHA ...... 88 Figure 26: Évolution pondérale des souris traitées par l’HE d’AHA ...... 90 Symboles et abréviations

%: pourcent [C]: concentration °C: degré Celsius AC: Artemisia capmestris AChE: L'acétylcholinestérase AHA: Artemisia herba-alba ATCC: American Type Culture Collection BChE : La butylcholinestérase C: Carbone CLHP: Chromatographie Liquide à Haute Performance cm: centimètre CMB: Concentration Minimale Bactéricide CMF: Concentration Minimale Fongicide CMI: Concentration Minimale Inhibitrice CPG: Chromatographie en Phase Gazeuse DHB: Acide 2,5-dihydroxybenzoïque

DL50: Dose létale médiane DMSO: Diméthylsulfoxide DPPH: 2,2 diphényl-1-picrylhydrasyl E: Est EO: Essential Oil Eq: Equivalent eV: électronvolt FID: Flame Ionization Detector GABA: l’Acide γ-Aminobutyrique gET/g: gramme équivalent Trolox par gramme h: heure H: Hydrogène HE: Huile Essentielle HEs: Huiles Essentielles HS: Head Space HSV: Herpes Simplex Virus

IC50: Concentration inhibitrice 50 IndR: Indice de rétention J.C: Jésus christ kg: kilogramme L: litre m: masse mg: milligramme ml: millilitre mm: millimètre MUS $: Million de dollar N: Nord nd: Non détecté NIST: National Institute of Standards and Technology nm: nanomètre O: Olfactométrie OAV: Odor Activity Value ORAC: Oxygen Radical Absorbance Capacity p: poids PGE2 : Prostagalndine E2 pH: potentiel d’hydrogène PSA: Potato succhrose Agar PSB: Potato Suchrose Broth RFA: Relative Flavor Activity RT: Rosmarinus tournefortii SIDA: Syndrome d’Immuno-Déficience Acquise SM: Spectrométrie de Masse SPME: Solid Phase Micro Extraction t: temps tR : temps de Rétention UFC: Unité Formant Colonie v: volume VIH: Virus de I’immunodéficience Humaine α: alpha β: béta γ: gamma δ: delta

Introduction

Au cours des dernières décennies, les infections associées aux soins de santé, également connues sous le nom d'infections nosocomiales, sont devenus des problèmes mondiaux responsables du taux élevé de morbidité et de mortalité dans les hôpitaux (Benbelaïd et al., 2016). La principale cause de ces infections réfractaires est la multi- résistance des micro-organismes pathogènes aux antibiotiques utilisés (Rosenthal et al., 2012), qui résulte de l'utilisation abusive et inappropriée de ces bactéricides (Sbayou et al., 2014). D’une part, face à ce grave problème, la recherche d'antimicrobiens alternatifs doit être poursuivie ainsi que toutes les stratégies possibles doivent être explorées (Clardy et Walsh, 2004). D’autre part, de nombreux produits chimiques synthétiques ont été utilisés comme agents de conservation dans les aliments pour contrôler la détérioration naturelle et prévenir la croissance des micro-organismes pathogènes, ainsi utilisés comme agents antioxydants (Shaaban et al., 2012). Sachant que, l'utilisation de ces conservateurs synthétiques dans les denrées alimentaires est soumise à des restrictions (Bendif et al., 2018), les préoccupations des consommateurs se sont concentrées sur la toxicité des produits chimiques de synthèse (Shaaban et al., 2012). En effet, les aspects de sécurité des antioxydants chimiques sont discutés, car plusieurs effets carcinogènes et tératogènes ainsi qu'une toxicité résiduelle ont été documentés (Moreira et al., 2005). En conséquence, les scientifiques sont actuellement à la recherche de nouveaux antibiotiques et additifs alimentaires naturels, parmi les solutions disponibles, les métabolites secondaires des plantes sont des sources prometteuses et riches en de nouveaux antimicrobiens efficaces, sans effets secondaires (Benbelaïd et al., 2013); contrairement à la plupart des antibiotiques actuellement utilisés, un exemple de ces métabolites est les huiles essentielles et les extraits de plantes qui seraient une nouvelle source d'alternatives naturelles (Rahman et al., 2011); de plus elles sont connues par leurs propriétés anticancéreuses, antinociceptives, antidiabétiques, antivirales, antibactériennes et antioxydantes (Luciardi et al., 2016). Les huiles essentielles sont généralement connues comme composés non phytotoxiques ayant une activité potentielle contre les microorganismes, sauf lorsqu'elles sont utilisées de manière inappropriée où elles peuvent en conséquence avoir un effet nocif même sur la santé humaine (Mizanur-Rahman et al., 2013).

Introduction

Toutes ces constatations nous ont donné l’idée d’étudier l’activité antimicrobienne, anti-oxydante et la composition chimique des huiles essentielles de quelques plantes sauvages poussant en Algérie, dans la wilaya de Batna, à savoir: Artemisia herba-alba Asso., Artemisia campestris L. et de Rosmarinus tournefortii de Noé. Plusieurs recherches ont été menées sur les activités biologiques (Mighri et al., 2010b; Abu- Darwish et al., 2015) et la composition chimique des huiles essentielles de nos espèces sélectionnées (Dob et Benabdelkader, 2006 ; Dahmani-Hamzaoui et Baaliouamer, 2010; Delimi et al., 2017), mais l’étude de leur toxicité ainsi que le profil aromatique reste très limitée. De ce fait, nous avons voulu étudier la toxicité des huiles essentielles trouvées plus performantes en termes d’activité biologique dans le but d’une éventuelle utilisation dans les domaines médical et alimentaire. Ce présent travail de recherche s’articule sur trois chapitres: D’abord le chapitre I est consacré à une revue bibliographique récente, et aux données nouvelles sur notre sujet de recherche, ensuite le chapitre II détaille le matériel utilisé et les méthodes d’étude des différents paramètres abordés. Le chapitre III donne tous les résultats obtenus après étude de l’activité antimicrobienne, anti-oxydante, la composition chimique, l’olfactométrie et la toxicité aigüe, ainsi que leurs interprétations suivis d’une discussion, d’une conclusion et des perspectives.

Chapitre I: Revue bibliographique

CHAPITRE I Revue bibliographique

CHAPITRE I

Revue bibliographique

1. Monographie des plantes étudiées

1.1. Genre Artemisia L. Le genre Artemisia L. regroupe plusieurs petites herbes et arbustes (Abad et al., 2012), il comprend un grand nombre d’espèces, de 200 à 400 selon les auteurs, retrouvé dans toute la moitié nord du monde (Salido et al., 2004), il appartient à la famille des Astéracées, l’une des plus grandes familles qui englobe environ 1000 genre et plus de 20000 espèces (Abad et al., 2012), parmi ces genres les plus importants sont Artemisia, Santolina, Centaurea, Chrysanthemum...etc (Dob et Benabdelkader, 2006). En Algérie, environ onze espèces d’Artemisia peuvent être trouvées (Quezel et Santa, 1962; Boukhalkhal et al., 2018). Selon Tutin et al. (1976), le genre peut être divisé en deux sections, Artemisia et Dracunculus. Historiquement, ce genre est connu pour sa richesse en composés biologiquement actifs, les recherches phytochimiques ont prouvé que ce genre contient principalement les monoterpènes et sesquiterpène (Tang et al., 2000; Houari et Ferchichi, 2009; Akrout et al., 2010).

1.1.1. Artemisia herba-alba Asso.

1.1.1.1. Présentation Artemisia herba-alba Asso. est une plante caractérisée par son arôme pénétrant, agréable et fort, tandis que le goût est extrêmement amer (Fleisher et al., 2002), la période de floraison est généralement entre mai et juin jusqu’en octobre dans certaines régions (Vernin et al., 1995). Cette espèce a une croissance végétative en automne (grandes feuilles) puis à la fin de l'hiver jusqu'au printemps (petites feuilles) (Mohamed et al., 2010).

1.1.1.2. Noms vernaculaires L’espèce Artemisia herba-alba Asso, synonyme A. inculta Del. (Hudaib et Aburjai, 2006), est connue sous le nom arabe "Chih", en français armoise blanche et en anglais "desert wormwood" (Segal et al., 1987).

1.1.1.3. Description botanique Artemisia herba-alba Asso est une plante dressée, suffrutescente à tiges nombreuses, tomenteuses, de 30-50 cm de hauteur. Les feuilles sont courtes,

CHAPITRE I Revue bibliographique généralement pubescentes argentées. Capitules sessiles ou subsessiles, généralement 2-5 fleurs toutes hermaphrodites et groupées en grappes, à capitules très petites (3/1,5mm) et ovoïdes. Bractées externes de l'involucre orbiculaires, opaques et pubescentes; les intérieures oblongues, brillantes et glanduleuses (Quezel et Santa, 1962; Khebri, 2009; Messai, 2011).

Photo. Bertella A.; Oct 2015; Bouilef, Batna, Est Algérie

Figure 1: Aspects morphologiques de l’espèce Artemisia herba-alba Asso.

1.1.1.4. Systématique Le Tableau I suivant illustre la classification de l’Artemisia herba-alba Asso. selon Quezel et Santa (1962) et Dupont (2004).

Tableau I: Systématique d'Artemisia herba alba Asso. Embranchement Phanérogames ou Spermaphytes Sous-embranchement Angiospermes Classe Eudicots Sous classe Asteridées Ordre Asterales Famille Astéracées Genre Artemisia Espèce Artemisia herba alba Asso.

1.1.1.5. Habitat et distribution L’Artemisia herba alba Asso. est un arbuste largement répondu dans les zones semi-arides à arides autour du bassin méditerranéen (Quezel et Santa, 1962; Nabli,

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1989), les steppes de la région irano-turanienne, de la péninsule ibérique, l’Afrique du nord (Algérie, Maroc et Tunisie) et le Moyen-Orient. En Algérie, elle est abondante dans les larges steppes des hauts plateaux et le désert du Sahara (Quezel et Santa, 1962; Djebaïli, 1984).

1.1.1.6. Usages L’espèce L’Artemisia herba alba Asso. a été utilisée en médecine traditionnelle pour traiter les rhumes, soulager le diabète, la toux, les troubles intestinaux, traiter les blessures chez l’homme et les bétails (Yashphe et al., 1979; Bailey et Danin, 1981), les diarrhées, névralgie, bronchite et l’hypertension (Tahraoui et al., 2007). Les infusions d’Artemisia herba alba Asso. ont été utilisées comme agents antibactérien, analgésique et hémostatique (Mohamed et al., 2010; Tilaoui et al., 2011). Al-Khalil (1995), a mentionné dans ses travaux de recherche que l’infusion de l’armoise blanche est utilisée en Jordanie comme un hypoglycémiant afin de soulager le diabète et aussi comme sédatif. Des recherches in vitro ont prouvé plusieurs activités de l’extrait aqueux de l’armoise blanche, Sallal et Alkofahi (1996), ont trouvé que cet extrait inhibe l’action hémolytique des venins de serpents et de scorpions, Amr (1995), a prouvé une importante activité antioxydante de l’extrait d’Artemisia herba alba.

1.1.1.7. Huiles essentielles d’Artemisia herba alba L’huile essentielle d’Artemisia herba-alba a été jugée responsable de son utilisation thérapeutique comme désinfectant, anthelminthique et antispasmodique (Mohamed et al., 2010). De plus, traditionnellement; cette plante est connue pour ses huiles essentielles qui ont un effet purgatif très prononcé et joue un rôle majeur dans le contrôle des vers intestinaux (Idris et al., 1982), le soulagement du diabète, traitement de bronchite et d'autres maladies telles que la jaunisse (Marrif et al., 1995), ainsi qu’elles sont largement utilisées en industrie pharmaceutique et cosmétique (Salah et Jäger, 2005; Kadri et al., 2011), à noter qu’une grande partie de cette huile provienne de Marrakech au Maroc (Vernin et al., 1995). Les travaux de recherche sur l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba ont permis de découvrir plusieurs chémotypes à travers le monde. Dans l’est algérien précisément, un chémotype à camphre est retrouvé à BouSaâda (49,3 %) (Dahmani- Hamzaoui et Baaliouamer 2010) à Souk Ahrass (34,34 %) (Delimi et al., 2017), et à

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M’sila (19,4%) (Dob et Benabdelkader, 2006). Un autre chémotype contenant la chrysanthénone (16,2 %) a été enregistré à Oum El Bouaghi (Rekkab et al., 2016) . En Tunisie les chémotypes à α et β-thujone sont les plus retrouvés, notamment à Tabarka (β-thujone ; 23,29 %) (Selmi et al., 2016), à Gafsa (α-thujone ; 8,73 %) (Zouari et al., 2010), à Médenine (β-thujone 33,7 %), (α-thujone 21,2 %) (Mighri et al., 2009), à Kirchaou β-thujone (58,4 %), α-thujone (44,4%) et α-thujone (17,4%) (Mighri et al., 2010a) et à Matmata α-thujone (43,85 %) (Akrout, 2004), à Samaaliat (α-thujone ; 79,9 %), à Msaken (α-thujone ; 49,5 %) (Boukrich et al., 2010), d’autres chémtypes aussi sont présents en Tunisie, comme celui à Pinocarvone (38 %) (Neffati et al., 2008), et à 1,8 cinéole (19,59 %) retrouvé à Ariana (Bachrouch et al., 2015), à EL Kef (Chrysanthénone; 64,8 %), (Camphre; 49,7 %), à Kirchaou (trans-sabinyl acetate ; 43,8 %), (Davanone; 20.7 %) (Boukrich et al., 2010). Au Maroc, différents chémotypes sont reconnus dans plusieurs régions, à Taroudant (α-thujone ; 59,07 %) (Sbayou et al., 2014), à Errachidia (Verbénol ; 21,83 %) (Tilaoui et al., 2011), à Oujda (Chrysanthénone ; 30,6%), à Tahanout (Chrysanthénone ; 47,0 %) (Fadli et al., 2016), à Guercif deux chémotypes sont enregistrés en fonction de la période de collecte, un premier à Chrysanthénone pour la plante collectée aux mois d’Avril et de Juin avec des taux de 47,71 et 48,45 % respectivement, et un autre à camphre (45,03 %) pour celle recueillie en mois de Septembre (Ghanmi et al., 2010), à Machraa (Chrysanthénone ; 52,5 %), (Camphre ; 31,9 %), à Laayoun (Chrysanthénone ; 35,3 %), (Camphre ; 43,3 %), à Tafouralt (Chrysanthénone ; 42,5 %), (Camphre ; 46,2 %), à Sidi Chefi (Chrysanthénone ; 30,6 %), (Camphre ; 43 %), à Bentayet (Camphre ; 43 et 39,6 %), à Midar (Camphre ; 45,6 et 42,8 %) à Boudnib (α-thujone ; 73,8 et 44,2 %) et à Guelmina (α-thujone 54,4 et 65,3 %) (Paolini et al., 2010). En Jordanie, un chémotye à β-thujone (25.1 %), α-thujone (22.9 %) et 1,8-cinéole (20,1 %) a été retrouvé à Buseirah (Abu-Darwish et al., 2015), à Amman un autre à α- thujone (16,2 %) (Hudaib et Aburjai, 2006). En Espagne, les chémotypes retrouvés sont aussi nombreux, à Jaén (Davanone ; 18,1 %) (Salido et al., 2001), (1,8-cinéole ; 19,0%), (1,8-cinéole ; 41,8%), (p-Cymène; 20.6 %) (Chrysanthénone ; 36,4 %), (cis-Chrysanthénol ; 27,8 %) et (cis-Chrysanthényl acétate ; 18,4 %) (Salido et al., 2004) à Aranjuez, (Camphre ;15,0 %) (Feuerstein et al., 1988).

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Plusieurs activités biologiques de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba, ont été prouvées par de nombreuses recherches, telle l’activité antibactérienne (Ghanmi et al., 2010; Zouari et al., 2010; Sbayou et al., 2014), Antifongique (Ghanmi et al., 2010; Mighri et al., 2010b; Abu-Darwish et al., 2015; Mehani et al., 2016), antioxydante (Zouari et al., 2010, Rafiq et al., 2016) et anti-inflammatoire (Mighri et al., 2010b; Abu-Darwish et al., 2015; Qnais et al., 2016), d’autres activités comme les activités antileishmanienne, anthelminthiques et antispasmodiques de l'huile essentielle d’Artemisia herba-alba de divers chémotypes ont été rapportées (Yashphie et al., 1987; Hatimi et al., 2001). Une autre activité aussi importante est celle anticancéreuse, Tilaoui et al. (2011) ont rapporté une importante activité contre les cellules de leucémie lymphoïde aiguë. D’autres travaux ont montré l’activité de l’huile d’Artemisia herba- alba sur la lignée cellulaire murine de mastocytome (P815, ATCC: TIB64) et les lignées cellulaires de carcinome du rein (Tilaoui et al., 2015). Qnais et al. (2016) ont montré une activité antinociceptive et anti-inflammatoire en inhibant la production de l’acide nitrique et de la prostagalndine E2 (PGE2). Bachrouch et al. (2015) ont enregistré une activité insecticide de l’huile sur plusieurs insectes de conservations de grains. Dans une autre étude menée par Delimi et al. (2017) l’huile a affecté la reproduction des insectes et montré une activité répulsive sur les adultes d’Ephestia kuehniella. L’huile essentielle d’Artemisia herba-alba avait même la capacité de restaurer l’activité des antibiotiques sur certaines bactérie résistantes par blocage du système d’efflux membranaire (Fadli et al., 2016). Ouachikh et al. (2009) ont prouvé dans leur étude un effet anti corrosif de l’huile essentielle d’Artemisia herba alba appliquée sur le métal. Selmi et al, (2016) ont rapporté que l’huile essentielle d’Artemisia herba alba exerce des effets protecteurs grâce à son activité antioxydante potentielle, en augmentant les taux de l'acétylcholinestérase (AChE), la butylcholinestérase (BChE), l’activité des enzymes antioxydantes et le taux de testostérone.

Tableau II : Composés majoritaires retrouvés dans les chémotypes d’HE d’AHA

Pays/Régions Composés majoritaires Références Algérie - BouSaâda - Camphre (49,3 %) (Dahmani-Hamzaoui et Baaliouamer, 2010) - Souk Ahrass - Camphre (34,34 %) (Delimi et al., 2017) - M’sila - Camphre (19,4%) (Dob et Benabdelkader, 2006)

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- Oum El Bouaghi - Chrysanthénone (16,2 %) (Rekkab et al., 2016) Tunisie - Tabarka - β-thujone (23,29 %) (Selmi et al., 2016) - Gafsa - α-thujone (8,73 %) (Zouari et al., 2010) - Médenine - β-thujone (33,7 %) (Mighri et al., 2009) - α-thujone (21,2 %) - Kirchaou - β-thujone (58,4 %) (Mighri et al., 2010a) - α-thujone (44,4%) - α-thujone (17,4%) - Matmata - α-thujone (43,85 %) (Akrout, 2004) - Samaaliat - α-thujone (79,9 %) (Boukrich et al., 2010) - Msaken - α-thujone (49,5 %) - Ariana - 1,8 cinéole (19,59 %), Chrysanthénone (64,8 (Bachrouch et al., 2015) - EL Kef %) - Camphre (49,7 %) - Kirchaou - trans-sabinyl acetate (43,8 %) (Boukrich et al., 2010) - Davanone (20,7 %) Maroc - Taroudant - α-thujone (59,07 %) (Sbayou et al., 2014) - Errachidia - Verbénol (21,83 %) (Tilaoui et al., 2011) - Oujda - Chrysanthénone (30,6%) (Fadli et al., 2016) - Tahanout - Chrysanthénone (47,0 %) (Fadli et al., 2016) - Guercif Plante collectée au - Chrysanthénone (47,71 %) (Ghanmi et al., 2010) mois d’Avril Juin - Chrysanthénone (48,45 %) Septembre - Camphre (45,03 %) - Machraa - Chrysanthénone (52,5 %) (Paolini et al., 2010) - Camphre (31,9 %) - Laayoun - Chrysanthénone (35,3 %) - Camphre (43,3 %) -Tafouralt - Chrysanthénone (42,5 %) - Camphre (46,2 %) - Sidi Chefi - Chrysanthénone (30,6 %) ; Camphre (43 %) - Bentayet - Camphre (43 et 39,6 %) - Midar - Camphre (45,6 et 42,8 %) - Boudnib - α-thujone (73,8 et 44,2 %) - Guelmina - α-thujone (54,4 et 65,3 %) Jordanie - Buseirah β-thujone (25,1 %) ; α-thujone (22,9 %) (Abu-Darwish et al., 2015)

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1,8-cinéole (20,1 %) Amman α-thujone (16,2 %) (Hudaib et Aburjai, 2006) Espagne - Jaén - Davanone (18,1 %) (Salido et al., 2004) - 1,8-cinéole (19,0 %) - 1,8-cinéole (41,8 %) - p-Cymène (20,6 %) ; Chrysanthénone (36,4 %) - cis-Chrysanthénol (27,8 %) - Aranjuez - cis-Chrysanthényl acétate (18,4 %) (Feuerstein et al., 1988) - Camphre (15,0 %)

1.1.2. Artemisia campestris L.

1.1.2.1. Présentation L’Artemisia campestris est un arbuste permanent à peine aromatique (Chalchat et al., 2003). D'après Tutin et al. (1976) c’est une espèce polymorphe et qui peut se trouver avec six sous-espèces distinguées par des données morphologiques et caryologiques, ses sous espèces sont : Artemisia campestris ssp. campestris L., ssp. glutinosa (Gay ex Besser) Batt., ssp. maritima Arcangeli, ssp. borealis (Pallas) Hall et Clements. (Dib et al., 2017a).

1.1.2.2. Noms vernaculaires En Algérie, Artemisia campestris est connue souvent sous le nom "Dgouft" (Dob et al., 2005), est aussi "Alala", "Tedjok" (Quezel et Santa, 1962). Son nom en Anglais est "field wormwood" (Juteau et al., 2002).

1.1.2.3. Description botanique L’Artemisia campestris L. est un sous-arbrisseau vivace, pouvant atteindre 30-150 cm de hauteur, avec des tiges ramifiées et ascendantes formant une panicule; elles sont habituellement brunes à rouges et glabres, et d’une forme lignifiée dans la partie inférieure et pubescente au sommet (Quézel and Santa, 1962; Chalchat et al., 2003). Les feuilles sont vertes, soyeuses quand elles sont jeunes, souvent glabrescentes à maturité; les feuilles basales sont 2-3 pinnatiséquées, pétiolées ou même auriculées, les supérieures sont les plus simples (Quézel and Santa, 1962; Chalchat et al., 2003). La plante a une inflorescence composée: la capitule ovoïde et hétérogame, contenant 8 à 12 fleurs, organisées sur un réceptacle convexe et glabre, et entouré de bractées

CHAPITRE I Revue bibliographique involucrales glabres organisées en plusieurs rangs. Les fleurs du rayon sont femelles, pistillées et fertiles, tandis que les fleurs du disque sont stériles et fonctionnellement mâles avec des ovaires avortés réduits (Ouyahya, 1990; Quézel and Santa, 1962). Les fleurs mâles sont tubulaires, jaunâtres, dépourvues de calice, avec 5 pétales fusionnées et 5 étamines fusionnées, avec la présence de sacs sécrétoires sur les lobes de la corolle des fleurs en disque (Minami et al., 2010). Le fruit est un akène ovoïde dépourvu de pappus (Kreitschitz et Vallès, 2007).

Photo. Bertella A.; Oct 2015; Bouilef, Batna, Est Algérie

Figure 2: Aspects morphologiques de l’espèce Artemisia campestris L.

1.1.2.4. Systématique D'après Quezel et Santa, (1962); Dupont (2004), la classification d’Artemisia campestris L. dans la systématique est la suivante:

Tableau III: Systématique d'Artemisia capmestris L. Embranchement Phanérogames ou Spermaphytes Sous-embranchement Angiospermes Classe Eudicots Sous classe Asteridées Ordre Asterales Famille Astéracées Genre Artemisia Espèce Artemisia capmestris L.

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1.1.2.5. Habitat et Distribution Géographiquement, Artemisia campestris L. prédomine dans les régions arides des pays d'Afrique du Nord (Noumi et al., 2010) comme le Maroc (Fakchich et Elachouri, 2014), l'Algérie (Rebbas et Bounar, 2014), la Tunisie (Kawada et al., 2012; Saadaoui et al., 2014) et la Libye (El-Mokasabi, 2014). Elle pousse dans les prairies sèches et riches en bases dans une grande partie de l'Europe centrale et méridionale (Pirini Chrisoula et al., 2014); elle est considérée comme une plante rudérale, dans les terres sèches et perturbées du sud de l'Espagne (Salinas et Guirado, 2002). Elle accompagne la végétation dominante des prairies xérophiles en République tchèque (Novák et Konvička, 2006) et pousse sur des sols graveleux près des rivières Tammaro et Calore en Italie (Guarino et al., 2008), tandis qu'au Japon, elle pousse à l'état sauvage le long des côtes des îles Ryukyu (Minami et al., 2010). Elle représente l'espèce indigène interdite qui persiste dans les sites de référence des dunes restaurées dans le Grand Lac en Amérique du Nord (Emery et Rudgers, 2010).

1.1.2.6. Usages Artemisia campestris L. possède de nombreuses propriétés pharmacologiques qui couvrent un large éventail d’utilisations notamment en tant qu'antioxydant, antifongique, insecticide, antibactérien, antimutagène, antitumoral, anthelminthique, antihypertenseur (Dib et al., 2017a), antivenin, anti-inflammatoire et antirhumatismale (Akrout et al., 2001). Dans la médecine populaire arabe, Artemisia campestris L. a été utilisé aussi comme fébrifuge, vermifuge, anticancéreux, contre les troubles digestifs, l'ulcère gastrique et les douleurs menstruelles (Dob et al., 2005; Djeridane et al., 2007). L’infusion, la macération et la décoction des feuilles et des fleurs d'Artemisia campestris L. étaient souvent les modes de préparation pour l'administration orale (Sefi et al., 2010).

1.1.2.7. Huile essentielle d’Artemisia campestris En Algérie, plusieurs chémotypes ont été rapportés dans des travaux précédents sur l’Artemisia campestris, à BouSaâda Dob et al. (2005) ont trouvé un chémotype à (Z,E)-Farnésol (10,3 %) et Cédrol (5,4 %), tandis que Belhattab et al. (2011) ont rapporté un chémotype à α-pinène (18,4 %). De leur part, Bakchiche et al. (2013), Bakchiche et al. (2014) ont indiqué la présence d’un chémotype de l’huile essentielle d’Artemisia campestris à Djbel Amour composé principalement de β-pinène (26,6 %) et (25,6 %).

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En Tunisie, les chémotypes enregistrés étaient seulement ceux à α-pinène (41,1 %) à Ben Guerdane (Neffati et al., 2008) et d’autres à β-pinène dans la région de Beni- Khedache (β-pinène; 34,2 %) (Akrout et al., 2011) et (β-pinène; 41,8 %), Akrout et al. (2010) ont trouvé un chémotype à β-pinène dans les régions de Ben Guerdane, Benikhdache, Djerba et Tataouine avec des taux allant de 24,2 à 27,9 %. Au Maroc, deux chémotypes sont retrouvés dans la région de Figuig, un premier contenant le Spathulénol (13,13 %) et le β-pinène (11,92 %) (Dib et al., 2017c)et un autre caractérisé par le Spathulénol avec un taux de 10,19 % (Dib et al., 2017b). En France un chémotype à γ-Terpinène (46,5 %) a été retrouvé à Camargue (Juteau et al., 2002). Au Portugal, l’huile extraite de la plante collectée dans la ville d’Aveiro, contient principalement le β-pinène (17,8 %) (Silvestre et al., 1999). En Serbie, précisément à Voïvodine, un chémotype à spathulénol (9,2 %) et β- pinène (9,1 %) est retrouvé (Chalchat et al., 2003). En Italie, les chémotypes qui marquent les régions d’Alexandrie, Ravenne et Rovigo contiennent tous le 1,2-dihydro acénaphthylène avec des quantités allant de 30,5 à 77,3 %, sauf un seul qui contenait 1 ,2-dihydro acénaphthylène (30 %) et β-pinène (30,5 %) (Bellomaria et al., 2001), alors qu’à Piémont, un chémotype à 1,8 cinéole (19,2 %) et spathulénol (18,7 %) est retrouvé (Mucciarelli et al., 1995). En Lituanie, un chémotype à germacrène D, est retrouvé dans plusieurs régions avec un taux variant de 9,8 à 31, 2 %, d’autres chémotypes sont aussi présents, contenant le spathulénol (9,7 %) et L’humulène epoxide II (11,1 %) (Judzentiene et Budiene 2014). A Azarbaïjan, une huile extraite à partir des fleurs, feuilles et racines était majoritairement composée de α-pinène avec des taux allant de 23,9, 23,3 et 29,2 % respectivement (Kazemi et al., 2009) En république de Bachkirie un chémotype à α-Pinène (41 %) est présent (Khalilov et al., 2001). Lis et Kowal (2015), ont rapporté à Lodz en Pologne un chémotype contenant le Germacréne D (24,2 %). Quant aux activités biologiques, l’huile essentielle d’Artemisia campestris a montré des effets antibactériens sur plusieurs souches et un effet antiradicalaire (Akrout et al., 2010; Akrout et al., 2011). Une autre étude menée par Neffati et al. (2008), a prouvé une activité antimutagénique sur la souche de Salmenella typhymurirm. Akrout et al. (2011) ont aussi montré que l’huile d’Artemisia campestris inhibe la croissance des cellules d’adénocarcinome colorectal HT-29.

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Tableau IV: Composés majoritaires trouvés dans les chémotypes d’HE d’AC

Pays/Régions Composés majoritaires Références Algérie - Bou Saâda - (Z,E)-Farnésol (10,3 %) (Dob et al., 2005) - Cédrol (5,4 %) - α-pinène (18,4 %) (Belhattab et al., 2011) - Djbel Amour - β-pinène (26,6 %) (Bakhchiche et al., 2013) - Oum El Bouaghi - β-pinène (25,6 %) (Bakhchiche et al., 2014)

Tunisie - Ben Guerdane - α-pinène (41,1 %) (Neffati et al., 2008) - Beni-Khedache - β-pinène (34,2 %) (Akrout et al., 2011) - β-pinène (41,8 %) - Ben Guerdane, - β-pinène avec des taux allant de 24,2 à (Akrout et al., 2010) Benikhdache, 27,9 %. - Djerba - Tataouine Maroc - Figuig - Spathulénol (13,13 %) et β-pinène (Dib et al., 2017c) (11,92 %) - Spathulénol (10,19 %) (Dib et al., 2017b).

France - Camargue - Terpinène (46,5 %) (Juteau et al., 2002) Portugal - Aveiro - β-pinène (17,8 %) (Silvestre et al., 1999). Serbie - Voïvodine -spathulénol (9,2 %) et β- pinène (9,1 %). (Chalchat et al., 2003).

Italie - 1,2-dihydro acénaphthylène avec des (Bellomaria et al., 2001) - Alexandrie, Ravenne et quantités allant de 30,5 à 77,3 %, sauf un Rovigo seul qui contenait 1 ,2-dihydro acénaphthylène (30 %) et β-pinène (30,5 %) - Piémont - 1,8 cinéole (19,2 %) et spathulénol (Mucciarelli et al., 1995). (18,7 %).

Lituanie - Germacrène D avec un taux variant de (Judzentiene et Budiene 2014).

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9,8 à 31, 2 % - Spathulénol (9,7 %) et L’humulène epoxide II (11,1 %) Azarbaïjan une huile extraite à partir des (Kazemi et al., 2009) fleurs, feuilles et racines était majoritairement composée de α-pinène avec des taux allant de 23,9, 23,3 et 29,2 % respectivement République de Bachkirie - α-Pinène (41 %) (Khalilov et al., 2001).

Pologne - Lodz - Germacréne D (24,2 %) (Lis et Kowal, 2015)

1.2. Rosmarinus tournefortii

1.2.1. Genre Rosmarinus L.

La famille des Lamiacées est composée d'herbes, de buissons et occasionnellement d'arbres à distribution cosmopolite, dont environ 300 genres et 7500 espèces (Bendeddouche et al., 2011). Le genre Rosmarinus L. se compose de trois espèces d'arbustes aromatiques originaires de la région méditerranéenne (Quezel et Santa, 1962; Bendeddouche et al., 2011), qui sont Rosmarinus officinalis, ainsi que deux espèces endémiques, à savoir Rosmarinus tomentosus Hub.-Mor. et Maire, et Rosmarinus eriocalyx Jord. & Fourr. (Harley et al., 2004). Précédemment connu sous le nom de Rosmarinus tournefortii (Noë ex Jord. et Fourr.) Jahand. et Maire, et décrit comme exclusivement endémique en Algérie (Quezel et Santa, 1962; Benbelaid et al., 2016). L'espèce la plus connue est le romarin commun (Rosmarnus officinalis L.), a été largement cultivée depuis l'antiquité en tant que plante herbacée et de jardin. L'introduction la plus récente à la culture est celle de Rosmarnus eriocalyx Jord & Fourr., Originaire du sud de l'Espagne et de l'Afrique du Nord (Bendeddouche et al., 2011).

1.2.2. Présentation Rosmarinus eriocalyx Jord. et Fourr. L'espèce, précédemment connue sous le nom de Rosmrinus tournefortii (Noë ex Jord. et Fourr.) Jahand. & Maire, est représentée par des arbustes à feuilles persistantes aromatiques endémiques en Afrique du Nord notamment, l’Algérie, le Maroc, la Libye (Bendif et al., 2017; Bendif et al., 2018). En

CHAPITRE I Revue bibliographique revanche, Bendeddouche et al., (2011) ont confirmé que Rosmarinus Tournefortii a les meme caractéristiques que l’éspèce de l’afrique du nord.

Rosmarinus eriocalyx a été reconnu pour la première fois sous le nom de Rosmarinus officinalis var. tournefortii Noé. Le nom et la combinaison de Noé ont été validement publiés par Murbeck (1898) et au niveau de l'espèce par Maire (1934). L'épithète tournefortii, qui honore le grand botaniste français Joseph Pitton de Tournefort (1656-1708), a été largement utilisée dans de nombreuses plantes (Upson, 2006). Cependant, c'est Jordan & Fourreau (1866) qui a publié le premier nom spécifique valide pour ce taxon, Rosmarinus eriocalyx (Bendeddouche et al., 2011).

1.2.3. Noms vernaculaires Le genre Rosmarinus L. est connu sous le nom vernaculaire arabe "Iklil el djebel" (Bendif et al., 2017), en anglais sous le nom "Rosemary" (Benbelaïd et al., 2016) et en français c’est le Romarin, alors qu’en Algérie, il est connu sous plusieurs appellations telles "Klil", "Hassalhan", "lazir" (Quezel et Santa, 1996), et même des noms berbères comme "Azur", "Iazir, Ouzbir", "Aklel", "Touzala" et "Touzzal" (Arnold et al., 1997).

1.2.4. Description botanique Rosmarinus tournefortii de Noé. est un arbuste très odorant à feuilles persistantes aromatique, et diffère de Rosmarinus officinalis L. par ses feuilles plus petites, seulement 5-15 mm de long et moins de 2 mm de large, densément poilu. L'inflorescence et le calice ont de doubles poils glandulaires, l'un court, l'autre étant constitué de longs poils glandulaires au sommet (Quézel et Santa, 1962, Naghibi et al., 2005). Une autre différence par rapport à Rosmarinus officinalis L. est sa croissance prostrée et sa faible hauteur (souvent inférieure à 25 cm et ne dépassant jamais 1 m de hauteur) (Fadel et al., 2011).

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Photo. Bertella A.; Oct 2015; Bouilef, Batna, Est Algérie

Figure 3: Aspects morphologiques de l’espèce Rosmarinus tourneforti de Noé

1.2.5. Systématique La systématique de Rosmarinus tournefortii de Noé est décrite par Quezel et Santa, (1962) dans le Tableau V qui suit:

Tableau V: systématique de Rosmarinus tournefortii de Noé. Règne Végétal Embranchement Spermaphytes Classe Dicotylédones Ordre Lamiales (Labiales) Famille Lamiaceae Genre Rosmarinus Espèce Rosmarinus tournefortii de Noé.

1.2.6. Distribution et habitat Rosmarinus tournefortii est une plante endémique de l'Afrique du Nord, présente en Algérie, au Maroc et en Libye (Bendif et al., 2018). Elle est aussi retrouvée au sud de l’Espagne (Tucker et DeBaggio, 2000). En Algérie, il est rare, poussant sur des sols et des prairies rocheuses dans les régions montagneuses de l'Oranais, de l’Algerois et de l'est de l'Algérie (Quézel et Santa, 1962; Arnold et al., 1997; Benbelaïd et al., 2016).

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1.2.7. Usages Dans la médecine traditionnelle, le décocté de feuilles de romarin et de parties aériennes a été prescrit pour traiter l'hypotension et les douleurs abdominales, alors que la poudre de plante a été utilisée pour traiter la diarrhée. L'infusion de feuilles est utilisée comme agent tonique, antitussif, carminatif, antiasthmatique, fébrifuge et antiparalytique (Arnold et al., 1997). En Algérie, Rosmarinus tournefortii est une plante médicinale réputée, largement utilisée par les populations locales dans le traitement de plusieurs pathologies, dont certaines maladies infectieuses (Benbelaïd et al., 2016).

1.2.8. Huile essentielle de Rosmarinus tournefortii Seules quelques études ont été réalisées sur Rosmarinus tournefortii et concernent principalement sa fraction volatile (Soriano Cano et al., 1993; Arnold et al., 1997; Dahmane et al., 2010; Neffar et Benabderahmane, 2013; Tahri et al., 2014; Benbelaïd et al., 2016; Bendif et al., 2017). Les études sur la composition chimique de l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii, ont conduit à la découverte de plusieurs chémotypes, en Algérie, le chémotype à camphre est le plus retrouvé, à Tlemcen (35,50 %) (Benbelaïd et al., 2014), à Sidi Bel-abbès (Daya) 37,6 % (Bendeddouche et al., 2011), à Sétif (Djbel Boutaleb) 41,2, 39,9 et 29,7 % pour l’huile extraite à partir des racines, feuilles et fleurs respectivement (Bendif et al., 2017), dans la même région plusieurs chémotypes à camphre aussi sont enregistrés, avec des taux allant de 32,3 à 37,0 % (Arnold et al., 1997), à Tiaret (Sidi Bakhti) 16,9 % (Bendif et al. , 2018). Au Maroc, un chémotype à 1,8-Cineole (54,8 %) est reconnu (Elamrani et al., 2003). L’huile essentielle a montré certaines activités biologiques, telle l’activité antimicrobienne (Benbelaïd et al., 2016). Bendif et al. (2017) ont trouvé que l’huile de Rosmarinus tournefortii est active sur Candidia albicans, Bendeddouche et al., (2011) ont rapporté une importante activité antibactérienne aussi sur Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli. (Bendif et al., (2017) décrivent une notable activité antioxydante.

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Tableau VI : Composés majoritaires retrouvés dans les chémotypes d’HE de RT

Pays/Régions Composés majoritaires Références Algérie - Tlemcen - camphre (35,50 %) (Benbelaid et al., 2014) - Sidi Bel-abbès (Daya) - camphre (37,6 %) (Bendeddouche et al., 2011) - Sétif (Djbel Boutaleb) (Bendif et al., 2017) - camphre à 41,2, 39,9 et 29,7 % pour l’huile extraite à partir des racines, feuilles et fleurs respectivement. - Sétif - Dans la même région plusieurs chémotypes à camphre aussi sont enregistrés, avec des taux allant de 32,3 à 37,0 % (Arnold et al., 1997), - Tiaret (Sidi Bakhti) - camphre (16,9 %) (Bendif et al., 2018). Maroc - 1,8-Cineole (54,8 %) (Elamrani et al., 2003).

2. Les huiles essentielles

2.1. Définition Il existe plusieurs expressions pour définir les huiles essentielles, appelées aussi "essence" ou "huile volatile" (Chouitah, 2012), ce sont des mélanges naturels complexes de métabolites secondaires volatils, lipophiles et souvent liquides, extraites à partir de plantes par entrainement à la vapeur ou hydro-distillation et par expression à froid (Laib, 2011; Guinoiseau et al., 2015), elles sont isolées à partir de feuilles, de graines, de bourgeons, de fleurs, de brindilles, d’herbes, d’écorces, de bois, de racines ou de fruits (Burt, 2004), elles sont caractérisées par une odeur accentuée (Sbayou et al., 2014) et renferment les principes odorants volatils contenus dans les végétaux (Chouitah, 2012). Les huiles essentielles présentent plusieurs activités biologiques telles que: l’activité antioxydante, anti-tumorale, anti inflammatoire, anti génotoxique, antibactérienne et antifongique (Sbayou et al., 2014; Guinoiseau et al., 2015).

2.2. Caractéristiques et propriétés physicochimiques Les huiles essentielles sont des composés naturels, volatils et complexes des plantes, de nature huileuse ou grasse (Carson et Hammer, 2011), et souvent d’une odeur forte et caractéristique (Burt, 2004; Bakkali et al., 2008). Elles présentent une faible solubilité dans l’eau, mais solubles dans les graisses, alcools, solvants organiques et

CHAPITRE I Revue bibliographique autres substances hydrophobes et sont généralement liquides à température ambiante (Carson et Hammer, 2011), limpide et exceptionnellement colorées (Andrade et al., 2014).

2.3. Historique L’utilisation des plantes aromatiques et médicinales est liée à l’évolution des anciennes civilisations humaines à travers le monde entier. Tout d’abord, les hydrolats (eaux aromatiques) faisaient l’objet d’un usage en Inde il y a 7000 ans (Garneau, 2005). Quatre mille ans avant J.C, les égyptiens ont utilisé les huiles comme parfum dans les momifications des corps (Chouitah, 2012). Plus tard en Chine, l’Empereur Chen Nong (2800 avant J.C.) médecin érudit, regroupait ces connaissances relatives aux plantes médicinales dans un traité, le Pen Ts’ao, qui regroupe plus de 1000 plantes médicinales utiles (Lardy et Haberkorn, 2007). La méthode de distillation a été utilisée pour la première fois à l’est (Inde, Egypte et Perse) pour produire les huiles essentielles il y a plus de 2000 ans de cela (Burt, 2004), ainsi que l’ère byzantine de la civilisation qui était accompagnée de la mise en exploitation des bases de distillation (Fekih, 2015). Ensuite c’est Gerber (721-815) qui décrivit pour la première fois la technique de distillation (Hellal, 2011) et depuis, la civilisation arabe vers le 9ème siècle donna une importante progression à l’art de distillation (Bauer et al., 2001), ainsi qu’à la commercialisation des huiles essentielles (Fekih, 2015). Ensuite, le procédé d’entrainement à la vapeur d’eau apparut vers l’an mille par Avicenne, médecin et scientifique Persan. Durant le 13ème siècle, les huiles essentielles sont devenues préparées par les pharmaciens et leurs effets pharmacologiques ont été décrits dans les pharmacopées (Bauer et al., 2001), mais leur utilisation n’a pas été largement répandue en Europe qu’avec le 16ème siècle (Burt, 2004). Au 17éme siècle, Hermann Boerhave décrivit les huiles essentielles d’un point de vue chimique (Hellal, 2011). Les premières expériences sur les propriétés bactéricides des vapeurs des huiles essentielles, ont été réalisées par De la Croix en 1881 (Boyle, 1955). Cependant, à la fin du 19ème et au début du 20ème siècles que l’utilisation des huiles essentielles dans les médicaments, devient progressivement la seconde utilité après leur usage en tant que parfum et aromes (Burt, 2004), et plus spécialement en 1928 le terme aromathérapie vit le jour par le chimiste français René-Maurice Gatte fosse qui l’utilisa pour décrire les propriétés thérapeutiques des huiles essentielles (Hellal, 2011). En 1964, le français Jean Valunet a réussi à traiter des patients en médecine et en psychiatrie (Fekih, 2015).

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2.4. Localisation et rôle dans la plante Les huiles essentielles sont souvent décrites comme des métabolites secondaires des plantes (Bakkali et al., 2008), qui sont traditionnellement connues pour être des métabolites non indispensables à la croissance et le développement des végétaux, voir même des composés sans fonction notable (Croteau et al., 2000). Elles ne sont pas universellement synthétisées chez toutes les plantes, contrairement aux métabolites primaires qui sont produites chez tous les végétaux, et possèdent généralement un rôle essentiel et font part des métabolismes de respiration et de photosynthèse (Theis et Lerdau, 2003). Cette justification reste naïve, car les fonctions de ces métabolites secondaires n’ont jamais été investiguées, et ce manque plutôt de connaissances ne signifie pas l’absence d’un rôle ou d’une fonction des huiles essentielles (Pichersky et al., 2006). Récemment, un intérêt accru aux métabolites secondaires a permet de découvrir que ces composés jouent un rôle de défense chez les plantes (McCaskill et Croteau, 1998; Gang et al., 2002; Gershenzon et Dudareva, 2007), notamment pour permettre à ces dernières de s’échapper des risques de microorganismes et insectes (Andrade et al., 2014), en jouant le rôle d’un antibactérien, antifongique, antiviral, insecticide et parfois même protéger contre les herbivores par réduction de leur appétit envers certaines plantes (Bakkali et al., 2008). Les huiles essentielles sont rencontrées pratiquement que chez les plantes supérieures (Chouitah, 2012), et sont élaborées dans des cellules glandulaires spécialisées et couvertes d’une cuticule (Laib, 2011). Elles peuvent être synthétisées dans plusieurs organes de plantes telles: bourgeon, feuilles, fleurs, tiges, brindilles, graines, fruits, racines, bois ou écorce (Bakkali et al., 2008), et sont stockées dans des cellules sécrétrices spécialisées, des cavités, des canaux d’huile et des résines, des cellules épidermiques ou des trichomes glandulaires (poils glandulaires) (Carson et Hammer, 2011).

2.5. Activités biologiques En dépit de leurs antécédents d'être considérés comme des métabolites secondaires non essentiels des plantes, il est devenu clair que les huiles essentielles et leurs composants ont des fonctions biologiques spécifiques (Pichersky et al., 2006; Gershenzon et Dudareva, 2007; Vickers et al., 2009). Parmi ces activités biologiques, les huiles essentielles ont montré plusieurs capacités thérapeutiques et médicinales tels que l’activité antimicrobienne (Lima, 1992; Elgayyar et al., 2001), anti-inflammatoire

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(Vazquez et al., 1996; Park et al., 1998), anticarcinogène (Aruna et Sivaramakrishnan, 1996), analgésique, antioxydante, antithrombotique (Carson et Hammer, 2011) et insecticide (Konstantopoulou et al., 1992; Karpouhtsis et al., 1998).

2.5.1. Activité antimicrobienne L’activité antimicrobienne inclue l’activité sur les bactéries, champignons, virus et protozoaires (Jirovetz et al., 2006), elle est généralement liée aux composés majoritaires que contient l’huile essentielle, comme les monoterpènes, sesquiterpènes et les composés non terpéniques tels les Phénylpropanoïdes ainsi que les composés soufrés qui sont souvent des composés antimicrobiens (Carson et Hammer, 2011).

2.5.1.1. Activité antibactérienne Les huiles essentielles sont connues pour avoir un effet antibactérien (Deans et Ritchie, 1987; Carson et al., 1995; Mourey et Canillac, 2002), et ceci sur les deux groupes de bactéries gram-positif et gram-négatif, qui ont démontrées une importante sensibilité in vitro (Carson et Hammer, 2011). Les méthodes utilisées pour évaluer cette activité sont souvent des techniques de diffusion, dilution ou de bio autographie (Rios et al., 1988). La technique de diffusion est souvent celle des disques ou de puits, tandis que les techniques de dilution en milieu liquide ou solide servent à déterminer les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides (Kalemba et Kunicka, 2003; Burt, 2004; Lahlou, 2004; Holley et Patel, 2005; Wilkinson, 2006). Plusieurs études ont montré cette activité antibactérienne contre un large spectre de souches bactériennes, telles que Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteria, Bacillus cereus et Staphylococcus aureus (Hulin et al., 1998). Une étude expérimentale menée par Rahman et al. (2016) a montré que l’huile essentielle de Premna integrifolia possède une activité antibactérienne contre un ensemble de souches pathogènes et cella peut être due à la présence de mono- et sesquiterpènes oxygénés. D’autres huiles essentielles ont aussi présenté un effet antibactérien sur les enthéropathogènes zoonotiques y compris Salmonella spp., Escherichia coli O157 :H7, Campylobacter jejunii et Clostridium perfringens. A noter aussi que les mélanges de différentes huiles essentielles ont exercé un important effet antibactérien notamment sur Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli O157:H7 et Listeria monocytogenes (Gutierrez et al., 2008). Un autre travail a prouvé que treize huiles essentielles parmi seize testées ont inhibé la croissance d’Helicobactor pylori qui est associée aux gastrites et augmente le

CHAPITRE I Revue bibliographique risque d’apparition des ulcères peptiques (Kelly, 1998). Parmi les composants des huiles essentielles qui présentent un effet anti Helicobactor pylori, ce sont surtout le carvacrol, l’isoeugénol, le nérol, le citral et le sabinène (O’Gara et al., 2000), les composés majeurs de l’huile essentielle de thym et d’origan, qui sont le thymol et le carvacrol ont montré une activité inhibitrice sur les bactéries pathogènes telles Eschericihia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis et Salmonella typhimurium (Burt, 2004), ainsi que l’eugénol, le terpenen-4-ol et le carvacrol trouvés aussi actifs contre la croissance de quatre souches d’ Escherichia coli O157:H7 et de Listeria monocytogenes (Santoyo et al., 2006). Dans une étude menée par Bharti et al. (2012), plusieurs huiles essentielles sont avérées actives sur un ensemble de bactéries et principalement l’huile essentielle de Thymus vulgaris et Melaleuca alternifoli, qui ont inhibé la croissance de plusieurs souches, principalement de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumonia.

2.5.1.2. Activité antifongique Les huiles essentielles et leurs composants présentent également une activité contre les champignons, activité qui est de mieux en mieux décrite. Un large éventail de pathogènes fongiques humains, animaux et agricoles ont montrés une importante sensibilité aux huiles essentielles in vitro, ce qui accroît l'intérêt pour leur application thérapeutique ou industrielle. Parmi les pathogènes humains et animaux ciblés, les levures du genre Candida et les dermatophytes comme Epidermophyton, Microsporum et Trichophyton qui ont attiré le plus grand intérêt (Hammer et al., 1996; Hammer et al., 1999; Yu et al., 2004; Preuss et al., 2005). Aussi un effet antifongique important contre les champignons responsables de la détérioration des aliments a été démontré notamment sur plusieurs espèces d’Aspergillus, Microsproum, Mucor, Penicillium, Eurotium, Debaryomyces, Pichia, Zygosaccharomyces et Candida (Cosentino et al., 2003; Holley et al., 2005). Parmi les composants des huiles essentielles responsables de l’activité antifongique, c’est le carvacrol et le thymol qui ont prouvé une action sur des espèces fongiques responsables de l’altération des aliments telles qu’Aspergillus niger, Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus (Razzaghi-Abyaneh et al., 2009).

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2.5.1.3. Activité antivirale Pendant de nombreuses années, les données sur l’activité antivirale des huiles essentielles et leurs constituants étaient très modestes par rapport aux autres activités biologiques, telle que l’activité antibactérienne et antifongique, et ceci est bien prouvé par le peu de publication sur ce sujet. Plus récemment, plusieurs publications ont décrit l’activité antivirale in vitro d’une large gamme d’huiles essentielles. La plupart de ces études a été conduit sur les virus de la grippe et de l’herpès simplex (HSV 1 et 2) (Carson et Hammer, 2011), les huiles essentielles ont été même utilisées pour traiter le virus de l’herpès simplex (HSV type 1 et 2), qui provoque certaines des infections virales les plus courantes chez les humains. Un exemple était celui de l'huile essentielle de Melissa officinalis L., qui contient le citral et le citronellal, et qui a inhibé la réplication du HSV-2 (Allahverdiyev et al., 2004). Les huiles essentielles d’Artemisia glabella (Seidakhmetova et al., 2002), Cynanchum stauntonii (Zai-Chang et al., 2005), Houttuynia cordata (Hayashi et al., 1995), Oenanthe crocata (Bonsignore et al., 2004), Origanum acutidens (Sökmen et al., 2004), Salvia limbata et Salvia sclarea (Öğütçü et al., 2008) et le cinnamaldehyde (Hayashi et al., 2007) ont été testé sur le virus de la grippe. Un nombre appréciable des huiles ont montré une activité antivirale puissante mais il n'y a malheureusement pas d'étude sur l’activité antivirale des huiles essentielles contre les principaux virus de notre époque, tels que le VIH et l'hépatite C (Edris, 2007).

2.5.1.4. Activité anti protozoaire Plusieurs huiles essentielles ont été jusqu'à présent testées sur les protozoaires, certaines d’entre elles ont prouvé une activité anti protozoaire remarquable (Anthony et al., 2005). Leishmania spp. sont les agents responsables de la leishmaniose, ces espèces ont montré une sensibilité aux huiles essentielles notamment celle de Ocimum gratissimum (Ueda-Nakamura et al., 2006), l'huile de Thymus vulgaris (Mikus et al., 2000) et même certains composants telles la limonène, le nérolidol (Arruda et al., 2005), le linalol (Rosa et al., 2003) et le terpinen-4-ol (Mikus et al., 2000). Aussi Leishmania amazonensis s'est révélée sensible à l'huile essentielle de Croton cajucara riche en linalol et à l'huile de Chenopodium ambrosioides (Carson et Hammer, 2011). L'huile de citronnelle (Cymbopoagan citratus) a montré une activité antitrypanosomienne in vitro contre Crithidia deanei (Pedroso et al., 2006), de même que l'huile d’Ocimum gratissimum contre Herpetomonas samuelpessoai (Holetz et al.,

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2003). Bien que les deux organismes d'essai soient considérés comme non pathogènes chez les vertébrés, ils se sont avérés être des modèles utiles d'infections trypanosomiennes importantes chez les humains. Trypanosoma cruzi était inhibé par l'huile de citronnelle et le citral (Santoro et al., 2007a), Origanum vulgare et Thymus vulgaris, le thymol (Santoro et al., 2006), Achillea millefolium, Syzygium aromaticum et Ocimum basilicum, ainsi que l'eugénol et le linalol (Santoro et al., 2007b) Un autre travail in vivo comprend l'évaluation des huiles de Cymbopoagan citratus et Ocimum gratissimum dans un modèle murin d'infection à Plasmodium berghei dans lequel les deux huiles ont significativement supprimé la parasitémie (Tchoumbougnang et al., 2005). Dans une autre étude chez la souris, les voies d'administration intrapéritonéale et orale de l'huile de Chenopodium ambrosioides ont empêché le développement des lésions et retardé l'évolution de l'infection par Leishmania amazonensis par rapport aux souris non traitées (Monzote et al., 2007).

2.5.2. Activité antioxydante L’activité antioxydante et l’un des sujets les plus abordés dans la recherche sur les huiles essentielles ; suite aux dommages engendrés par les réactions d’oxydation sur l’ensemble des substances biologiques, et qui par conséquent, peut provoquer plusieurs maladies telles que : le cancer, maladie du foie, l’Alzheimer, les arthrites, l’inflammation, le diabète, la maladie de Parkinson, l’athérosclérose et le SIDA (Shaaban et al., 2012). Depuis, Il a été largement rapporté que les huiles essentielles extraites à partir de plantes naturelles, présentent des propriétés antioxydantes et antiradicalaire (Lou et al., 2017). Un exemple est celui de l’huile essentielle de Bidens pilosa Linn, qui a montré une importante activité anti-oxydante (Deba et al., 2008). l’activité antioxydante in vivo a été aussi mise en évidence par une étude sur l’huile essentielle d’Origan, qui donnée aux lapins en régime excessif, à favoriser la retardation de l’oxydation des lipides (Deba et al., 2008). Concernant les composés responsables de cette activité, ce sont souvent les terpènes et terpénoides y compris: α-terpinène, β-terpinène, and β-terpinolène présents chez Melaleuca alternifolia, 1,8-cinéole dans Mentha aquatic L., Mentha longifolia L., et Mentha piperita L., menthone et isomenthone dans Mentha longifolia et Mentha piperita, thymol, eugenol, et linalool dans le cumin, cannelle et gingembre (El-massry et El-Ghorab, 2006), et il semble être une tendance générale que les huiles essentielles qui contiennent des hydrocarbures monoterpéniques, des monoterpènes et/ou des

CHAPITRE I Revue bibliographique sesquiterpènes oxygénés ont des propriétés antioxydantes plus importantes (Deba et al., 2008). Toutes ces études suggèrent que les huiles essentielles, sont une source importante d’antioxydants naturels, et peuvent être utilisées en étant une alternative aux antioxydants synthétiques, afin de prévenir plusieurs maladies dégénératives (Yanishlieva-Maslarova, 2001).

2.5.3. Activité insecticide Les huiles essentielles sont connues pour leur activité insecticide (Burt, 2004) et elles ont montrés une toxicité sur les insectes nuisibles aux grains. Les principaux constituants des huiles essentielles comme les monoterpènes, sont également intéressants pour les marchés industriels en raison de leurs activités biologiques puissantes en plus de leur toxicité pour les insectes (Lee et al., 2001). Un exemple et celui de l’huile essentielle de romarin et de Zanthoxylum monophyllum qui ont montré une importante activité insecticide contre le Charançon du riz (Lee et al., 2001; Prieto et al., 2011). Les huiles essentielles qui sont des insecticides naturels présentent plusieurs avantages par rapport aux insecticides synthétiques à cause de leur biodégradation rapide et la réduction des risques de l'environnement (El-Idrissi et al., 2014).

2.5.4. Activité anticancéreuse Les huiles essentielles, en tant qu'antioxydants naturels, ont montré une activité efficace contre la prolifération des cellules cancéreuse dans de nombreuses études et supposées avoir des activités anticancéreuses potentielles pour la prévention et les stratégies thérapeutiques (Morshedloo et al., 2017). Plusieurs études ont prouvé l’action des huiles essentielles et leurs composés sur la croissance des cellules tumorale in vitro. L’huile essentielle d’Elsholtzia ciliata a montré une activité antiproliférative in vitro contre les cellules du cancer de pancréas et de sein (Pudziuvelyte et al., 2017), Casaeria sylvestris et Zanthoxylum rhoifolium ont été testées sur les cellules cancéreuses de cancer du col de l'utérus, du côlon et du poumon (Silva et al., 2007; Silva et al., 2008), Comptonia peregrina aussi contre les cellules de cancer du côlon et des poumons (Sylvestre et al., 2007), Curcuma wenyujin contre les cellules cancéreuses hépatiques (Kilani et al., 2008), Cyperus rotundus contre une lignée de cellules leucémiques (Kilani et al., 2008), Eugenia zuchowskiae contre les lignées cellulaires cancéreuses du sein et du mélanome (Cole et al., 2007), Juniperus excelsa contre les lignées cellulaires du sein, du colon, de l'épiderme, du poumon et de la prostate (Topçu et al., 2005), Photinia serrulata contre les lignées cellulaires du

CHAPITRE I Revue bibliographique cancer du col de l'utérus, du poumon et du foie (Hou et al., 2007), Salvia libanotica contre les lignées cellulaires du cancer du côlon (Itani et al., 2008), Schefflera heptaphylla contre les lignées cellulaires cancéreuses du sein, du foie et du mélanome (Li et al., 2009), Schinus molle contre le cancer du sein et les lignées cellulaires leucémiques (Díaz et al., 2008), Tetraclinis articulata contre les lignées cellulaires cancéreuses humaines du mélanome, du sein et de l'ovaire (Carson et Hammer, 2011), Thymus broussonettii contre les lignées cellulaires cancéreuses ovariennes (Ait M’Barek et al., 2007) et Photinia serrula contre les cellules de cancer cervical, hépatiques et lignées cellulaires du cancer du poumon (Hou et al., 2007). De nombreux isoprénoïdes présents dans les huiles essentielles inhibent la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses in vitro, notamment le carvacrol, le citral, le p-cymène, le farnésol, le géraniol, le d-limonène, le nérolidol, l'alcool périllylique, le pinène, le terpinéol, le thymol, le verbénone et la α et la α-ionone (Elson et al., 1999; Tatman et Mo 2002; Joo et Jetten 2009). En dehors de leurs effets directs sur la prolifération des cellules, des huiles essentielles et de leurs composants peuvent également exercer des effets anticancéreux grâce à leurs propriétés antimutagènes, antiangiogéniques, anti-inflammatoire (Issa et al., 2006; Tabanca et al., 2007).

2.5.5. Activité anti-inflammatoire L'utilisation traditionnelle des huiles essentielles comme agents anti- inflammatoires suggère qu'elles possèdent une puissante activité anti-inflammatoire (Vogler et Ernst, 1999), et par conséquent, ces dernières ont la propriété de combattre les inflammations (Moro Buronzo, 2008), qui sont souvent associées à certaines maladies y compris l’hypertension, le cancer, l’accident vasculaire cérébral (Schmid- Scheonbein, 2006). Cette activité est due principalement aux aldéhydes qu’en contiennent ces huiles (Moro Buronzo, 2008). Il a été même prouvé que l’inhalation des vapeurs des huiles essentielles a un effet anti-inflammatoire et réduit l’asthme (Inouye et al., 2001). L’Aloe vera et l’un des meilleurs plantes connues par leur activité anti- inflammatoire (Vogler et Ernst, 1999). L'huile essentielle d'Aloe vera présentait la plus grande activité inhibitrice de la lipoxygénase (96%), suivie de l'huile de thym (86%) et de l'huile de bergamote (85%) à une concentration de 0,5 μg/mL. L'huile de camomille a montré une légère activité inhibitrice de la lipoxygénase à 0,5 μg/mL mais a montré une forte activité induisant la lipoxygénase à 5 μg/mL (Wei et Shibamoto, 2010),

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L'huile essentielle de racine de réglisse a également montré une forte activité anti- inflammatoire dans un test anti-inflammatoire de dépistage de l'inhibiteur de la lipoxygénénase (Tanaka et Shibamoto, 2008).

2.6. Utilisation Pendant l’ère moderne, les huiles essentielles et certains de leurs composants connus par leurs propriétés antiseptiques (bactéricide, fongicide et virucide) et médicales ainsi que leur odeur (Abad et al., 2012), ont été utilisés dans plusieurs produits tels que : les produits cosmétiques, détergents et produits de nettoyage, agriculture, produits agroalimentaires et en industrie pharmaceutique (Bakkali et al., 2008).

2.6.1. Produits pharmaceutiques Conjuguée à leur utilisation historique en thérapie, les activités biologiques démontrées par les huiles essentielles et leurs composants ont naturellement suscité un grand intérêt pour leur utilisation en tant que médicaments. Par conséquent, les huiles essentielles sont des ingrédients de médicaments vendus pour un large éventail d'applications thérapeutiques (Forte et Raman, 2000; Ghosh et al., 2006). Les huiles essentielles sont des ingrédients actifs ou des excipients dans de nombreux médicaments en vente libre. Par exemple, l'huile d'eucalyptus se trouve dans plus de 100 produits en vente libre (Beerling et al.,, 2002), destinés principalement au traitement ou à la prise en charge des symptômes des infections des voies respiratoires supérieures (Carson et Hammer, 2011). Un autre exemple et celui de l’ajout des huiles essentielles en tant que composant de pâte d’obturation canalaire en médecine dentaire et aussi comme ingrédient des antiseptiques (Burt, 2004).

2.6.2. Cosmétique et parfumerie Les huiles essentielles et leurs composés sont utilisés en cosmétique, dans l’industrie de la parfumerie de de la savonnerie notamment comme substance aromatisante et parfumante (Bakkali et al., 2008; El Haib, 2011).

2.6.3. Aliments et boissons Les huiles essentielles et leurs constituants sont largement utilisés dans de nombreux aliments et boissons, principalement comme agents aromatisants (Margetts, 2005; Taylor, 2005) et conservateurs (Bakkali et al., 2008), elles sont présentes dans le

CHAPITRE I Revue bibliographique processus de fabrication de nombreux produits finis comme les gâteaux, biscuits, soupes, sauces, chewing gum, chocolats, bonbons (Bakkali et al., 2008). Les huiles essentielles d'écorces d'agrumes sont parmi les plus importantes, notamment les huiles d'orange, de citron, de mandarine et de pamplemousse (Ahmad et Rehman, 2006; Schawb et al., 2008). Les huiles de menthe poivrée, de menthe, d'eucalyptus et de citronnelle sont d'autres huiles de premier plan en termes de volume (schawb et al., 2008). Parmi les constituants individuels, l'un des plus importants pour l'industrie des arômes est le menthol (Serra et al., 2015). Reste à noter que l’ajout des huiles essentielles aux aliments peut être limité à cause de leur effet sur les propriétés organoleptiques de l'aliment, leur concentration nécessaire pour conserver l’aliment et l'interaction avec d'autres ingrédients dans le produit (Holley et Patel, 2005).

2.6.4. Médecine populaire Les huiles essentielles sont aussi utilisées comme agents antimicrobiens en médecine populaire (Bellakhdar, 1997), et en aromathérapie et pratiques paramédicales (Shaaban et al., 2012). Elles sont appliquées comme remède antimicrobien, analgésique, sédatif, anti-inflammatoire, spasmolytique et anesthésique (Abad et al., 2012).

2.6.5. Autres usages Centaines huiles essentielles ont été même utilisées pour leur effet répulsif et insecticide (Burt, 2004). On les utilise aussi dans la fabrication des adhésifs (colle, scotch …) et celle de la nourriture pour animaux et dans l’industrie automobile (El Haib, 2011).

2.7. Méthodes d’extraction Les huiles essentielles sont obtenues à partir de plusieurs parties de plantes aromatiques, y compris les feuilles, fleurs, fruits, graines, bourgeons, rhizomes, racines et écorces (Shaaban et al., 2012). Il existe plusieurs méthodes d’extraction des huiles essentielles, telle l’hydrodistillation et la distillation à basse ou à haute pression, extraction par solvants, expression à froid, fermentation ou enfleurage, et d’autres techniques qui peuvent impliquer l’utilisation du dioxyde de carbone liquide ou des micro-ondes (Bakkali et al., 2008; Carson et Hammer, 2011; Shaaban et al., 2012). En plus du fait que, la composition chimique de l’huile essentielle en quantité et en qualité est en relation directe avec les conditions climatiques, la composition du sol, l’organe distillé et le cycle végétative de la plante (Bakkali et al., 2008). Il est important à 28

CHAPITRE I Revue bibliographique signaler que la composition chimique des huiles essentielles extraites, diffère en termes du nombre de molécules et leur stéréochimie, en fonction de la technique d’extraction utilisée (Masotti et al., 2003; Angioni et al., 2006), celle-ci intervient aussi d’une façon déterminante dans le rendement (Benjilali, 2005). La méthode d’extraction peut être aussi choisie en fonction de l’utilisation prévue de l’huile essentielle (Bakkali et al., 2008).

2.7.1. Hydrodistillation L'hydrodistillation est une méthode traditionnelle d'extraction des huiles essentielles, c’est l’une des méthodes les plus anciennes et les plus faciles (Meyer- Warnod B., 1984). En principe, elle correspond à une distillation hétérogène. Cette méthode consiste à immerger le matériel végétal dans un bain-marie; le mélange est ensuite chauffé à ébullition, à la pression atmosphérique, sous l’action de la chaleur, les molécules odorantes contenues dans les cellules végétales sont libérées sous la forme d'un mélange azéotropique, bien que la plupart des composants aient des points d'ébullition supérieurs à 100 °C, ils sont mécaniquement entraînés par la vapeur d'eau. Le refroidissement par condensation conduit à la séparation du mélange eau et huile essentielle par décantation (Rassem et al., 2016). Le système "Clevenger" préconisé par la Pharmacopée Européenne permet le recyclage de la phase aqueuse du distillat à travers un système de cohobage. Ainsi, l'eau et les molécules volatiles (Huile essentielle) sont séparées par leurs différences de densité. La durée de l’hydrodistillation est généralement comprise entre trois et six heures selon le matériel végétal. Ce paramètre peut affecter le rendement de l’huile essentielle et sa composition chimique (Dick et Starmans, 1996). L’hydrodistillation est une méthode d'extraction efficace et à haut rendement pour les herbes et les épices dans lesquelles les huiles essentielles sont difficiles à isoler et particulièrement riches en matières non hydrosolubles et thermiquement stables (Roohinejad et al., 2018).

2.7.2. Entrainement à la vapeur d’eau Contrairement à l’hydro distillation, le matériel végétal est soumis à la vapeur directe, produite dans le distillateur, ou par la vapeur indirecte produite à l’extérieur et transmise vers ce dernier, tout sous pression (<0,1 bar), cette vapeur va extraire les composés volatils par action osmotique (Lahlou, 2004). Les méthodes d’hydrodistillation et d’entrainement à la vapeur d’eau restent les deux méthodes

CHAPITRE I Revue bibliographique dominantes en production commerciale des huiles essentielles (Carson et Hammer, 2011).

2.7.3. Extraction par micro-ondes Cette technique a été aussi développée et rapportée par plusieurs auteurs, en tant que méthode d’extraction des huiles essentielles avec un rendement très important, et un temps d’extraction réduit par rapport aux techniques traditionnelles. Le principe de la méthode est basé sur le fait d’appliquer des microondes, dont l’objectif est d’exciter les molécules d’eau présentes dans la plante, tout en provoquant la rupture des cellules végétales et la libération des huiles essentielles piégées dans l’espace des tissus extracellulaires (Lahlou, 2004).

2.7.4. L’expression à froid La méthode d’expression à froid est l'une des meilleures méthodes pour extraire les huiles essentielles, elle signifie théoriquement que l'huile est pressée à basse pression et à basse température. Ce processus garantit que l'huile résultante est pure à 100% et conserve toutes les propriétés de la plante, vue que c’est une technique d'extraction mécanique où la chaleur est réduite et minimisée tout au long du processus (Rassem et al., 2016). La méthode d’expression à froid est principalement réservée aux agrumes (Citrus), afin d’extraire les huiles essentielles contenues dans ses écorces (Lahlou, 2004) et aussi utilisée pour extraire les huiles essentielles de certaines plantes (Arnould- Taylor, 1981).

2.7.5. Extraction par CO2 Une autre technique plus complexe peut être utilisée, c’est l’extraction par fluide supercritique (Buchbauer, 2000), c’est un processus de séparation d'un composant (l'extractant) d'un autre (la matrice) en utilisant des fluides supercritiques comme solvant d'extraction. En pratique, plus de 90% de l'extraction analytique par fluide supercritique est effectuée avec du dioxyde de carbone (CO2) pour plusieurs raisons pratiques (Rassem et al., 2016). Cette extraction se fait à une pression critique relativement basse (74 bars) et une température (32°C), le CO2 est relativement non toxique, ininflammable, non corrosif, disponible en grande pureté et facilement éliminé de l'extrait (Rozzi et al., 2002). Le produit résultant est souvent d’un bon profil organoleptique, mais cette technique reste toujours à cout élevé (Burt, 2004).

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2.8. Composition chimique Les huiles essentielles ne sont pas des simples composés ou mixtures de quelques composants (Carson et Hammer, 2011), il s’agit d’un mélange qui pouvant contenir plus de 60 composants (Senatore, 1996; Russo et al., 1998). Ces composés retrouvés dans les huiles essentielles sont d’une variété de classes chimiques, principalement les terpènes, mais elles peuvent contenir aussi les phénylpropanoïdes et autres composés différents (Carson et Hammer, 2011), Ces composés sont tous des hydrocarbures et leurs dérivés oxygénés, qui peuvent aussi renfermer l’azote ou le soufre, et ils ont généralement un faible poids moléculaire et peu soluble dans l’eau (Weidenhamer et al., 1993; Griffin et al., 1999). La composition chimique des huiles essentielles est souvent caractérisée par deux ou trois composés majeurs qui constituent de 20 à 70 %, alors que les autres composants sont présents à l’état de trace (Bakkali et al., 2008) et elle peut différer d’une partie de la plante à une autre, un exemple et celui de la composition de l’huile essentielle des grains de coriandre qui été différente de celle extraite à partir des feuilles (Burt, 2004), ainsi que pour avoir une composition chimique constante des huiles essentielle, elles doivent être extraites dans les mêmes conditions et à partir du même organe de la plante qui s’est développé sur le même sol, sous les mêmes conditions climatiques et récoltées dans la même saison (Bakkali et al., 2008) Le groupe de terpène des huiles essentielles est souvent représenté par les monoterpènes, sesquiterpènes et même les diterpènes (Dorman et Deans, 2000), ainsi que leurs dérivés oxygénés tels que les alcools, aldéhydes, esters, phénols et cétones. (Rahman et al., 2016; Pudziuvelyte et al., 2017). Ces composés sont responsables de l’odeur et des activités biologiques des huiles essentielles (Soković et al., 2007).

2.8.1. Terpènes Les terpènes, connus aussi sous le nom isoprène ou terpénoïdes et isoterpénoïdes lorsqu’ils contiennent de l’oxygène. C’est le plus grand groupe de composés naturels, avec plus de 30000 structures connues (Dubey et al., 2003; Theis et Lerdau, 2003). Ils sont formés d’une combinaison de plusieurs unités isoprène (C5), et forment plusieurs classes en fonction de leur structure et fonction chimique. Les principaux terpènes sont les monoterpènes (C10), mais les hémiterpènes (C5), diterpène (C20), triterpène (C30) et tétraterpène (C40) peuvent aussi exister (Bakkali et al., 2008).

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2.8.1.1. Les monoterpènes Les monoterpènes sont formés de deux unités isoprènes (Carson et Hammer, 2011), ce sont les molécules les plus représentatives des huiles essentielles en constituant 90 %, approximativement 1500 monoterpénoïds ont été décrits (Breitmaier, 2006), ils permettent de générer une variété de structure qui consiste de plusieurs fonctions telles que les carbures (myrcène, terpinène et camphène…etc.), alcools (geraniol, menthol, et bornéol … etc.), aldéhyde (geranial, néral et citronéllal.. etc.) cétones (tégetone, menthone et camphre …etc.), esters (linalil acétate, menthyl et isobornyl acéate..etc.), éthers (1,8-cinéole, et menthofurane…etc.), peroxydes (ascaridole…etc.) et phénols (thymol et carvacrol…etc.) (Bakkali et al., 2008).

2.8.1.2. Les sesquiterpènes Les sesquiterpènes forment le deuxième groupe le plus fréquent dans les huiles essentielles, après les monoterpènes. Ils sont formés à partir de la combinaison de trois unités d'isoprène, en leur donnant la formule moléculaire C15H24. Ils constituent un groupe structurellement divers, tous issus du farnésyl pyrophosphate par divers processus de cyclisation souvent suivis de réarrangements squelettiques (Croteau et al., 2000). Ils sont les plus structurellement diversifiés parmi les terpénoïdes présents dans les huiles essentielles, avec plus de 120 types squelettiques différents. Les sesquiterpènes peuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques (Carson et Hammer, 2011). Les principaux sesquiterènes des huiles essentielles sont : le cadinène, germacrone et curcumène (Bakkali et al., 2008).

2.8.1.3. Les diterpènes La plupart des diterpènes dans les huiles essentielles sont formés par les combinaisons tête-à-queue de quatre unités d'isoprène suivies d'un réarrangement et/ou de substitutions. Ils sont des composants très communs et importants des résines végétales (Langenheim, 2003), mais se retrouvent également en petites quantités dans de nombreuses huiles essentielles. Ils ont la formule moléculaire générale C20H32 et sont donc beaucoup plus lourds que leurs équivalents mono- et sesquiterpénoïdes. Leur masse moléculaire plus élevée par rapport aux mono- et sesquiterpènes signifie qu'une plus grande quantité d'énergie doit être libérée des parties de la plante par distillation à la vapeur. Leur récupération et la concentration obtenue à partir d'huiles essentielles augmentent avec l'augmentation des temps de distillation à la vapeur (Carson et Hammer, 2011).

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2.8.1.4. Les norterpènes Les caroténoïdes (C40) sont une classe de terpènes supérieurs basée sur huit unités d'isoprène et sont importants chez les plantes pour plusieurs raisons, notamment leur rôle dans la photosynthèse (Hirschberg, 2001). Ils ne se produisent pas dans les huiles essentielles. Cependant, ils sont pertinents pour les huiles car, lorsque leur épine dorsale de carbone est clivée, généralement par oxydation, ils produisent une gamme de plus petits composés appelés apocaroténoïdes (Auldridge et al., 2006; Kloer et al., 2006). Le groupe d'apocaroténoïdes le plus répandu survient lorsque les caroténoïdes sont clivés à la position 9-10, produisant des produits C13 appelés norterpénoïdes ou norisoprénoïdes. Ce sont des composants mineurs importants de certaines huiles essentielles, contribuant particulièrement à l'arôme et à la saveur (Auldridge et al., 2006; Rodríguez-Bustamante et Sánchez, 2007). Les exemples incluent α-ionone, l'arôme violet ressemblant naturellement à Boronia megastigma (Plummer et al., 1996; Ghisalberti, 1998) et β-damascone de Rosa damascena (Babu et al., 2002).

2.8.2. phénylpropanoïdes Seulement environ 50 phénylpropanoïdes ont été décrits. Les phénylpropanoïdes se retrouvent moins souvent dans les huiles essentielles et moins souvent que les terpénoïdes (Sangwan et al,. 2001; Clifford, 2000; Bakkali et al., 2008). Cependant, certaines des huiles contenant des phénylpropanoïdes en contiennent des proportions significatives, comme l'eugénol dans l'huile de clou de girofle, présente 70 à 90 % de l'huile (Carson et Hammer, 2011), ou le chémotype riche en méthyleugénol de l'huile essentielle de racine d’Anemopsis californica. Les familles de plantes dans lesquelles les phénylpropanoïdes sont plus fréquentes sont les Apiaceae (Umbelliferae), les Lamiaceae, les Myrtaceae (Chaieb et al., 2010), les Piperaceae (Martins et al., 1998) et les Rutaceae (Ghisalberti, 1998). Les phénylpropanoïdes importants comprennent les acides hydroxycinnamiques, l'anéthole, le chavicol, l'eugénol et leurs dérivés méthylés, l’estragol (méthyl chavicol) et le méthyleugénol, ainsi que le cinnamaldéhyde largement distribué. La myristine et le dillapiole sont deux autres phénylpropanoïdes qui se trouvent couramment dans les huiles essentielles lorsque les phénylpropanoïdes sont présents (Martins et al., 1998; Clifford, 2000; De Morais et al., 2007).

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2.8.3. Composés soufrés et azotés Plus rarement, quelques composés présents dans les huiles essentielles contiennent une ou plusieurs molécules de soufre ou d'azote. La présence de soufre en particulier confère une odeur souvent forte et caractéristique (Boelens, 1996; Goeke, 2002). Les composés contenant du soufre et de l'azote se présentent principalement sous la forme d'aglycones ou de glucosinolates, ou de leurs produits de dégradation, qui comprennent les isothiocyanates. Les glucosinolates, connus historiquement sous le nom de glucosides d'huile de moutarde, sont des composés contenant du soufre ou de l'azote formés à partir de glucose et d'un des huit acides aminés (Halkier et Gershenzon, 2006). La famille des Brassicacées, avec plus de 350 genres et 3000 espèces, est une source importante de glucosinolates et d'isothiocyanates (Fahey et al., 2001). Cela inclut les légumes crucifères, tels que le brocoli, le chou-fleur, les choux de Bruxelles et divers choux (Carson et Hammer, 2011).

2.9. Toxicité des huiles essentielles Les huiles essentielles sont généralement connues comme produits sans danger, mais ces derniers restent des substances naturelles puissantes (Bouguerra, 2012). Vu leur composition chimique complexe, les huiles essentielles sont à utiliser avec précautions et prudence, car elles peuvent engendrer de grave dégâts de santé lors d’une utilisation aléatoire et inappropriée (Benzeggouta, 2005). Les effets secondaires des huiles essentielles varient en fonction de leur nature chimique (Traoré, 2006), certaines sont toxiques par voie cutanée en raison de leur pouvoir irritant (huiles riches en thymol ou en carvacrol), allergène (huiles riches en cinnamaldéhyde) (Smith et al., 2000) ou phototoxique (huiles de citrus contenant des furocoumarines) (Naganuma et al., 1985). D'autres huiles essentielles ont un effet neurotoxique, notamment celles riches en cétones comme l'α-thujone (Franchomme et al, 1990). Certaines huiles essentielles sont avérées même cytotoxiques, sur des cellules d’hamster chinois (Pibiri, 2006). De même, il a été trouvé que la toxicité des huiles essentielles varie en fonction de la phase dans laquelle elles sont appliquées, l’huile de thym est plus toxique par contact en phase liquide que lors de son application en phase gazeuse, et l’inverse pour le cas de l’huile essentielle de lavande (Inouye, 2003). En générale, les huiles essentielles présentent une toxicité aiguë faible ou très faible par voie orale, pour la plupart des huiles essentielles couramment utilisées telles que les huiles essentielles d’anis, eucalyptus, girofle, etc. la DL 50 se situe entre 2 et 5 g/kg, ou

CHAPITRE I Revue bibliographique plus souvent supérieur à 5g/kg. En revanche certaines huiles ont une DL50 inférieure à 1g/kg, comme l’huile essentielle de boldo (Peumus boldus) qui est de 0,13 g/kg (Opdyke et Letizia; 1983), l’huile de Chénopode vermifuge (Chenopodium ambrosioides) qui a présenté une DL50 de 0,25 g/kg et l’huile de moutarde (0,34 g/kg) (Bruneton, 1999; Benzeggouta, 2005). L’administration des huiles essentielles à des doses toxiques se manifeste en premier lieu par un phénomène de stress, plusieurs définitions sont données au mot stress (Calvez, 2010) mais en biologie la plupart de ces descriptions sont semblables est aboutissent à définir le stress comme étant l’ensemble des réactions de réponses physiologiques d’un organisme (homme ou animal), mises en place pour assurer le maintien de l’équilibre menacé appelé aussi l’homéostasie (Favard, 2018; Calvez, 2010), tout en impliquant des réponses neuronales, réponses du système neuroendocrinien, et d’autre réponses métaboliques et comportementales (Favard, 2018). Selon leur nature, les stresseurs sont de 2 types, physiques et psychologiques (Calvez, 2010). Le stress est connu par son rôle bénéfique s’il est présent à court terme, en outre s’il persiste à long terme ses conséquences peuvent être très lourdes. (Calvez, 2010). À court terme, il s’agit d’une réaction adaptive qui se manifeste par un ensemble de changements de comportements qui ont pour but de permettre une acclimatation pouvant offrir à l’individu une chance de survie tout en mettant en œuvre ses capacités morales et physiques (Favard, 2018). La réaction qui suit la détection de l’agent stressant évolue et elle est fonction de la durée d’agissement de ce dernier, ceci selon le syndrome général d’adaptation (Favard, 2018), qui comporte trois principales phases: la phase d’alarme qui se traduit par la mobilisation des réserves énergétiques pour garantir certaines fonctionnalités biologiques (Favard, 2018), comme la sécrétion d’hormones telles que l’adrénaline élaborée par la glande médullo-surrénale, dont les conséquences sont une augmentation du rythme cardiaque, tension artérielle et hyperthermie (INRS, 2018). Cette phase peut durer au plus tard vingt-quatre heures (Pacaud, 2006). Juste après cette période et si la situation persiste, une phase de résistance s’installe ; elle est caractérisée par la sécrétion de nouvelles hormones dont les glucocorticoïdes, qui vont augmenter le taux de sucre dans le sang tout en permettant un bon apport énergétique nécessaire pour répondre à la situation stressante (INRS, 2018). La dernière phase est celle d’épuisement, les capacités de l’organisme sont débordées et le corps est envahi de glucocorticoïdes, et 35

CHAPITRE I Revue bibliographique que si la situation de stress n’est pas dépassée ces derniers peuvent être nuisibles (INRS, 2018). 2.10. Situation économique des huiles essentielles Dans cette dernière période, le marché des huiles essentielles est en évolution remarquable, et les principaux producteurs de ce secteur sont toujours en recherche continue de nouvelles molécules et essences afin d’enrichir leur production (Bessah et Benyoussef, 2015). Près de 3000 huiles essentielles sont connues, alors que seulement 300 sont d’une grande importance commerciale (Bégin et Gérinn, 2000). Les quantités des huiles essentielles produites varient considérablement d’une espèce à l’autre, certaines huiles sont produites à raison de 35 000 tonnes par an, alors que pour certaines espèces elle est limitée à quelques kilogrammes (Bouguerra, 2012) En 2008, le Brésil et l’Inde ont dominé la production des huiles essentielles avec des taux de 28,6 % et 25,6 % respectivement, ensuite les Etats-Unis, la Chine et l’Argentine participent avec des productions respectives de 16,8 %, 9,0 % et 4,9 % (Bessah et Benyoussef, 2015). Les principaux pays leaders en production des huiles essentielle sont répartis dans le monde entier, en Europe la production se concentre dans les pays méditerranéens tels que: Italie, Espagne, Portugal, France, Croatie, Albanie et Grèce, qui produisent tous des huiles essentielles à l’échelle industrielle. Sans manquer les pays de l’Europe de l’est comme la Bulgarie, la Roumanie, la Hongrie et l'Ukraine et aussi l'immense Fédération de Russie étendu sur l’Asie du nord. Le continent asiatique aussi et puissant par son climat diversifié et semble d’être le pole le plus important de la production des huiles essentielles représenté par la Chine et l'Inde qui jouent un rôle majeur suivies de l'Indonésie, le Sri Lanka et le Vietnam. Le continent américain est aussi présent, avec la richesse végétale des Etats-Unis, Canada et Mexique. Les principaux pays producteurs d’huile essentielle en Afrique sont le Maroc, la Tunisie, l'Egypte, l'Algérie et la Côte d'Ivoire alors que certains autres pays qui contribuent faiblement (Bousbia, 2011) Les prix des huiles essentielles varient de 1,80 $ US/kg pour l'huile d'orange à 120 000,00 $ US/kg pour l'huile d'iris (Bousbia, 2011). Les chiffres représentant le taux global d’importation sont très importants, et ont atteint les 2 milliards de dollar en 2005, et les Etats-Unis d’Amérique était premiers avec une valeur de 391 MUS$, suivie de la France (199 MUS$), le Royaume-Uni (175 MUS$), le Japon (152 MUS$), l’Allemagne (117 MUS$), la Suisse (103 MUS$), l’Irlande (75 MUS$), la Chine (65 MUS$), le Singapour (61 MUS$) et enfin l’Espagne (61 MUS$) (Başer et Buchbauer, 2009). 36

CHAPITRE I Revue bibliographique

En Algérie et selon les statistiques, la production des huiles essentielles reste faible et les échanges commerciaux sont nettement dominés par les importations. En 2002 la valorisation des plantes médicinales et aromatiques pour la production des huiles essentielles ont abouti à l’exportation de 1137 kg d’huiles essentielles d’une valeur de 31255 US$. Puis de 2003 à 2005, une baisse des exportations a marqué cette filière, et les quantités exportées étaient de 68,5 à 100 kg, puis une reprise de la cadence des exportations a été notée en 2006 avec 2823 kg et d’une valeur de 7644 US$. Le pic des exportations est enregistré en 2008 avec un volume de 22690 kg et une valeur commerciale de 998261 US$ (Bessah et Benyoussef, 2015).

Chapitre II: Matériel et méthodes

CHAPITRE II Matériel et méthodes

L’ensemble des manipulations ont été réalisées dans trois laboratoires de recherche, l’extraction de l’huile essentielle, les expérimentations de l’étude de l’activité antimicrobienne et la toxicité aigüe ont été conduites au sein du Laboratoire de Microbiologie Appliquée (LMA), à l’université d’Oran 1. L’analyse de la composition chimique des huiles essentielles par CPG-SM a été effectuée dans le laboratoire de l’unité de recherche QOPNA, à l’université d’Aveiro au Portugal. Alors que l’activité antioxydante et le test d’olfactométrie (HS-SPME-CPG-O-SM) ont été réalisés au Laboratoire de Chimie Analytique (LCA) à l’université de Saragosse en Espagne.

1. Préparation du matériel végétal La partie aérienne des trois plantes: Artemisia herba-alba Asso., Artemisia campestris L. et Rosmarinus tournefortii de Noé, a été récoltée en pleine floraison pendant la période d’Octobre-Novembre 2015 dans la région de Bouilef à Batna à l’est de l’Algérie (Figure 4) (Coordonnées: Latitude 35° 35' 55.707 N", Longitude 6° 12' 53.942 E" et Altitude 988 mètres). L’identification des espèces a été réalisée au sein du Laboratoire Ecologie (LE) par le Professeur: Hadjadj-Aoul S., du Département de Biologie, à l’université d’Oran 1 Ahmed Ben Bella et des spécimens ont été déposés dans l’herbier du même Département. Des codes voucher ont été attribués pour les trois espèces A.herba-alba (02888), A. campestris (02894), et R. tournefortii (02315). Ces plantes sélectionnées (Figure 5) ont été séchées à l’ombre et à l’air libre pendant 20 jours, ensuite elles ont été broyées.

CHAPITRE II Matériel et méthodes

Fesdis, Bouilef) Fesdis, C B A

A : Zoom sur la zone d’échantillonnage (commune de (commune d’échantillonnage zone la sur Zoom : : Carte: la de wilaya de Batna : Carte: d’Algérie

ALGERIE

;

Figure

B N Zone d’échantillonnage

W. BATNAW.

Fesdis

CHAPITRE II Matériel et méthodes

AC: AC: Noé RT: AHA:

AHA AC RT

de de tournefortii Rosmarinus campestris Artemisia

Artemisia herba Artemisia Collecte

- alba L. Asso. Asso.

Séchage

Figure 5: PréparationmatérielFigure 5: du végétal Broy

age

Extraction

CHAPITRE II Matériel et méthodes

2. Extraction des huiles essentielles Des échantillons de 200 g chacun ont été soumis à l’hydrodistillation dans un appareil de type Clevenger modifié pendant 3 h (Figure 6(A)). L’huile essentielle a été récupérée par décantation (Figure 6(B)) et desséchée avec du sulfate de sodium

(Na2SO4), puis conservée dans des flacons opaques et hermétiques à 4°C (Figure 6(C)).

Huile essentielle

Hydrolat

(B). Séparation de l’huile essentielle par décantation

Huile essentielle conservée dans un flacon opaque et hermétique à 4°C

(A). Appareil de Clevenger modifié (Montage d’hydrodistillation) (C). Conservation de l’huile essentielle

Figure 6: Extraction de l’huile essentielle par hydro distillation

3. Détermination du rendement en huile essentielle Le rendement en huile essentielle est défini comme étant le rapport de la masse de l’huile essentielle et la masse du matériel végétal utilisé pendant l’extraction, il est calculé selon la formule suivante (Bouguerra, 2012):

= 퐌퐇퐄 푹푯푬 퐗 ퟏퟎퟎ 퐌퐏퐒 RHE: Rendement en huile essentielle (%); MHE: Masse de l’huile essentielle obtenue (g); MPS: Masse de la plante sèche traitée (g).

4. Analyse de la composition chimique par CPG-SM Les composés volatils isolés ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) en utilisant un chromatographe Shimadzu (GC/MS-QP2010) avec une colonne capillaire DB-5 en silice fondue (la

CHAPITRE II Matériel et méthodes même que celle utilisée dans l'analyse CPG/FID. La température du four a été programmée à 50°C pendant 3 minutes, puis augmentée à raison de 2°C/min pour atteindre 250°C, puis maintenue à ce même degré pendant 10 minutes. La température de l’injecteur était de 250°C alors que celle du détecteur était de 280°C (rapport de division: 1/100). L’Hélium (99,995% de pureté) était le gaz vecteur avec un débit de 1,2 mL/min. Les conditions du spectromètre de masse étaient d’une tension d'ionisation de 70 eV et d’une température de la source d'ions de 150°C, tandis que les spectres de masse par ionisation électronique ont été acquis dans la plage de masse 50-550 m/z.

À partir du chromatogramme des ions totaux, les pics ont été identifiés par comparaison de leurs spectres de masse avec la bibliothèque de spectres de masse de l'équipement utilisé dans notre expérimentation (NIST 14 et Wiley Registry ™ Mass Spectral Data), et par comparaison des temps de rétention et des données de spectre de masse avec les composés étalons injectés dans les mêmes conditions chromatographiques et aussi en comparant leur indice de rétention obtenus à partir des temps de rétention d'un mélange d’étalons de n-alcanes.

Pour la quantification des constituants majeurs, l'étalon interne a été appliqué et la quantité de métabolites a été obtenue à partir des courbes d'étalonnage tracées pour des composés standards purs. Tous les échantillons injectés et les solutions étalons contiennent une quantité fixe d'étalon interne (tétracosane). Une courbe d'étalonnage a été obtenu par injection de cinq à sept concentrations connues de chaque type: (-) - trans-caryophyllène (y = 12.625x-1,6698; R2 = 0,9959); α-terpinéol (y = 9,7387x- 1,8045; r2 = 0,9976); (+) - guaiol (y = 11,623x-0,9992, r2 = 0,9968); l'acétate de géranyle (y = 13,282x-0,1886; r2 = 0,9982); β-pinène (y = 8,0257x-0,4166; r2 = 0,9993); carvacrol (y = 8.9673x + 0,061; r2 = 0,9985), où y correspond au rapport de la zone de pic de l'étalon / surface du pic de l'étalon interne et x correspond à la masse de l’étalon. Les valeurs des coefficients de corrélation ont confirmé la linéarité des diagrammes d'étalonnage. Les concentrations des étalons ont été choisies afin de garantir la quantification de chaque composé dans les échantillons par interpolation de la courbe d'étalonnage. Les résultats ont été exprimés en mg de composé par mg d'huile essentielle, en moyenne plus ou moins l’écart-type des trois analyses indépendantes.

CHAPITRE II Matériel et méthodes

5. Etude de l’activité antibactérienne

5.1. Souches bactériennes Les souches bactériennes choisies pour cette étude sont des bactéries pathogènes, souvent responsable de maladies et infections nosocomiales dont plusieurs sont résistantes aux antibiotiques, voir même multi-résistantes. Certaines de ces bactéries aussi peuvent être impliquées dans la contamination et l’altération des denrées alimentaires. L’activité antibactérienne a été étudiée contre 21 souches bactériennes Gram + et

Gram -, dont; 6 souches ATCC : Staphylococcus aureus ATCC 25923 (SASM A1),

Staphylococcus aureus ATCC 43300 (SARM A1), Bacillus cereus ATCC 11778 (BC

A1), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (PA A1), Escherichia coli ATCC 25922

(EC A1) and Klebsiella pneumoniae ATCC 70603 (KP A1) et 15 souches cliniques dont certaines sont résistantes aux antibiotiques ; 3 souches de Staphylococcus aureus resistant à la Methicilline (SARM B1, SARM B2 and SARM B3), 5 souches productrices de bétalactamase à spectre étendu ; 2 Escherichia coli (ECB1 BLSE and ECB2 BLSE), 2

Klebsiella pneunomoniae (KPB1 BLSE and KPB2 BLSE) and Proteus mirabilis (PMB1

BLSE), 7 souches de bactéries sensibles: Staphylococcus epidermidis (SEpi B1),

Staphylococcus haemolyticus (SH B1), 2 Acinetobacter baumannii (AB B1 and AB B2),

Proteus mirabilis (PMB2), Salmonella enteritidis (SEnt B1) et Klebsiella oxytoca (KO

B1). Ces souches nous ont été fournies par le service de bactériologie du laboratoire central, au centre hospitalo-universitaire d’Oran.

5.2. Méthode de diffusion par disque L’activité antibactérienne a été étudiée par la technique de diffusion par disque, selon la méthode décrite par Sfeir et al., (2013), avec quelques modifications. 1 mL d’une suspension (Ajustée a une densité bactérienne de 1.107 UFC/mL) a été étalé sur une boite de pétri contenant la gélose Mueller-Hinton (Annexe 1), puis l’excédent a été éliminé par aspiration. Un disque de papier filtre (6 mm de diamètre) a été déposé aseptiquement au centre de la boite, sur lequel 6 µL d’huile essentielle ont été ajoutés. Les boites ont été laissées pendant 15 min à température ambiante (un seul disc utilisé par boite), puis incubées à 37°C pendant 24h. Les zones d’inhibition ont été mesurées en millimètre. La streptomycine (10 µg/disque) a été utilisée comme témoin positif. Les expériences ont été conduites en triples et la moyenne a été calculée.

CHAPITRE II Matériel et méthodes

Selon le diamètre d’inhibition, les souches ont été classées en se basant sur leur sensibilité aux huiles essentielles comme suit: résistante pour un diamètre inférieur à 8 mm, moyennement sensible pour un diamètre compris entre 8-14 mm, sensible pour un diamètre de 14 à 20 mm et hautement sensible pour un diamètre supérieur à 20 mm (Sfeir et al., 2013).

5.3. Méthode de microatmosphère La diffusion des composés volatils actifs de l’huile essentielle a été évaluée par la méthode de microatmosphère décrite par Raho-Ghalem et Benali (2008). Après étalement de 100 µL de suspension bactérienne (1.107 UFC/mL) sur boite de gélose Mueller-Hinton (Annexe 1), un disque de papier filtre stérilisé de 25 mm a été déposé au centre du couvercle de la boite puis 50 µL de l’huile essentielle ont été placé sur ce disque. Les boites ont été ensuite sellées à l’aide du parafilm et incubées à 37°C pendant 24 h. Après incubation, les diamètres des zones d’inhibition pour trois répétitions ont été mesurés.

5.4. Détermination de la CMI et de la CMB La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée par la méthode décrite par Mizanur-Rahman et al. (2013), l’huile essentielle a été diluée dans du diméthylsulfoxide (DMSO) à 40 % (v/v) et ajoutée au bouillon Mueller-Hinton pour avoir une série de concentrations finales de 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 et 0,67 mg/mL. Un témoin négatif de DMSO et bouillon Mueller-Hinton (Annexe 1) a été préparé, la concentration finale du DMSO ne doit pas excéder 1%. Ensuite, une culture jeune (1.107UFC/mL) a été préparée dans de l’eau physiologique et une aliquote de 100 µL a été ajoutée dans chaque tube. Après 24h d’incubation à 37°C, la CMI a été déduite à partir de la première concentration présentant une absence de croissance bactérienne. Pour déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB), un volume de 10 µl de chaque tube n’ayant pas présenté de cultures bactériennes a été étalé sur gélose Mueller-Hinton selon la méthode décrite par Sf ei r et al. (2013). La CMB représente la plus faible concentration qui ne donne aucune croissance après 24h d’incubation à 37°C (Mizanur Rahman et al., 2013). La CMI et CMB ont été exprimées en mg/mL et chaque expérience a été répétée trois fois successivement. Le rapport CMB/CMI a été utilisé pour classifier les substances antibactériennes en fonction de leur activité bactéricide (CMB/CMI inférieur à 4) ou bactériostatique (CMB/CMI supérieur à 4) (Sbayou et al., 2014).

CHAPITRE II Matériel et méthodes

5.5. Mesure de la décroissance bactérienne (Time-kill assay) La mesure de la décroissance bactérienne au cours du temps a été étudiée selon la méthode décrite par Guinoiseau et al. (2015). Une culture jeune de chaque souche a été ajustée à une densité de 0,5 McFarland (1. 107 UFC/mL) puis diluée à 1/20, 1 mL de cet inoculum a été transféré dans 9 mL de bouillon Mueller-Hinton additionné de Tween 80 (0,01 % v/v), avec une concentration en huile essentielle correspondant à la CMI. La suspension finale contient approximativement 5. 105 UFC/mL a été incubée à 37°C pendant 24h sous agitation (Figure 7). Une aliquote de 100 µL est prélevée en duplicata à 0, 2, 4, 6, 8 et 24h, diluée et ensemencée sur gélose Mueller-Hinton (Annexe 1) et un dénombrement a été effectué après incubation à 37°C pendant 24h.

Flacons contenant le milieu de Témoin culture + l’inoculum + HE

Incubateur Agitateurs

Figure 7 : Mesure de la décroissance bactérienne HE : Huile essentielle

6. Etude de l’activité antifongique L’activité antifongique des huiles essentielles a été testée sur cinq souches de moisissures: Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, Penicillium sp. Le choix des souches fongiques était basé sur leurs implications dans la contamination, l’altération des denrées alimentaires, de certains produits végétaux -lors du stockage- de transport et de leur pathogénicité pour certaines espèces végétales ainsi que leur pouvoir de production de mycotoxines.

CHAPITRE II Matériel et méthodes

Une partie des souches fongiques faisant l’objet de cette étude provient de la collection du laboratoire de Microbiologie Appliquée (LMA), alors que d’autres nous ont été fournies par le Laboratoire de Microbiologie et Sécurité Sanitaire des Aliments (LMSSA) de l’université de Béchar.

6.1. Méthode de diffusion par disque L’activité antifongique des huiles essentielles a été étudiée par la technique de diffusion sur disque (Viljoen et al., 2003), une suspension sporale de 1.106 spore/mL a été préparée et ajustée convenablement. Un volume de 1 mL de cette préparation est ajouté au milieu de culture à l’extrait de malt en surfusion (MEA) (Annexe 1) ensuite bien homogénéisé. Ce milieu a été coulé dans des boites de pétri et laissé pour solidification. Des disques de papier filtre (6 mm de diamètre) ont été déposés au centre de chaque boite et imbibé d’huile essentielle à raison de 8 µL/disque. Toutes les expériences ont été réalisées en triplicata, après incubation de 7 jours à 25°C ; la moyenne du diamètre de la zone d’inhibition autour du disque et l’écart type ont été calculés pour chaque test.

6.2. Détermination de la CMI et de la CMF La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée par la méthode de dosage par dilution en tube décrite par Saxena et al. (2012) avec quelques modifications, une dilution en série de l'huile essentielle a été préparée dans du DMSO (1% v/v) pour obtenir des concentrations finales de 2,5, 5, 10 et 20 μL/mL. Un volume de 1 mL de chaque concentration a été ajouté à des tubes contenant 1 mL de PSB et 1 mL d'une suspension sporale de 1.106 spore/ml puis incubé à 25°C pendant 7 jours. Le test a été répété trois fois. La valeur de la CMI a été estimée comme étant la plus faible concentration qui ne présentait aucune croissance visible à l’œil nu par rapport au tube témoin. Pour déterminer la concentration minimale fongicide (CMF), des fractions de (100 μL) ont été prélevées en double à partir des tubes présentant une absence de croissance et transférées dans des boîtes de Pétri (55 mm) contenant déjà le PSA comme milieu de culture (Annexe 1). Après incubation pendant 5 jours à 25°C, on déduit la CMF à partir des premières boites qui ne présentent aucune croissance fongique.

7. Etude de l’activité antioxydante Trois méthodes ont été appliquées pour évaluer le pouvoir antioxydant des huiles essentielles, la première consiste à la mesure de la capacité de l’huile essentielle à réduire le radical chimique DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) par transfert d’un

CHAPITRE II Matériel et méthodes hydrogène, la deuxième technique est le test ORAC et finalement par mesure de la capacité antioxydante dans un générateur de radicaux libres In situ.

7.1. Mesure du piégeage du radical DPPH L'activité antioxydante des huiles essentielles a été évaluée en premier temps par la méthode du piégeage du radical 2,2-diphényl-2-picryl-hydrazyle (DPPH), décrite par Akrami et al. (2015) avec quelques modifications, la technique se déroule en préparant 5 concentrations différentes d’huile essentielle dans du méthanol (25, 12,5, 10, 5 et 2,5 %). La réaction a été conduite en ajoutant 100 µL de chacune de ces dilutions à 3,5 mL d'une solution de DPPH à 30 µg/g (m/m) dans du méthanol. Une solution témoin à blanc (DPPH dans du méthanol sans huile essentielle) a été également préparée. Tous les échantillons ont été laissés pendant 30 minutes dans l'obscurité. Après ce temps, l'absorbance des échantillons à 515 nm a été mesurée en utilisant le spectrophotomètre UV-VIS (Jenway 7315, Royaume Uni). De plus, une courbe d’étalonnage pour vérifier la concentration de DPPH a été effectuée ; à cet effet, des solutions étalons de DPPH à des concentrations comprises entre 4 et 64 μg/g (m/m) ont été préparées quotidiennement dans du méthanol. La capacité antioxydante des échantillons a été exprimée en pourcentage d'inhibition du DPPH (I%) et elle a été calculée selon la formule suivante :

I% = [(A0-A) / A0] x 100

A0 : valeur d'absorbance du blanc (DPPH dans le méthanol) ; A: valeurs d'absorbance de l'échantillon d’huile essentielle (DPPH avec huile essentielle).

La courbe des valeurs représentant le pourcentage d'inhibition après 30 minutes en fonction de la concentration d’huile essentielle a été tracée, et une régression linéaire a

été appliquée pour obtenir la valeur IC50. Cette valeur est inversement proportionnelle à l'activité antioxydante.

7.2. La méthode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) Le pouvoir antioxydant des huiles essentielles a été aussi évalué par la mesure de la capacité d'absorption des radicaux libres oxygénés (ORAC). La capacité des huiles essentielles à piéger les radicaux péroxyles, générés par la décomposition spontanée de l’AAPH (2,20-azobis (2-amidinopropane) dihydrochlorure), a été estimée selon la méthode développée et adaptée par Bentayeb et al. (2009), qui permis une réaction de 47

CHAPITRE II Matériel et méthodes réduction d’une heure de temps entre l'AAPH et la fluorescéine. Le système chromatographique de séparation Alliance 2795 (Waters, Milford, MA, USA) couplé à un détecteur de fluorescence à balayage 474 (Waters, Milford, MA, USA) a été utilisé pour mesurer la décroissance de la fluorescence. À cette fin, 100 µL d'échantillon ou du tampon phosphate (blanc) ou standard (Trolox) ont été ajoutés à 800 µL de solution de fluorescéine (2,3 ppm). Ensuite la réaction a été initiée par l'addition de 600 µL du réactif AAPH (34,4 mg/g). Finalement, 20 µL du mélange réactionnel ont été injectés chaque minute en utilisant un débit d'eau de 0,5 mL/min. La température de mesure a été fixée à 40°C dans un auto-échantillonneur thermostaté du système chromatographique. Les valeurs ORAC sont généralement exprimées en µmol d’équivalents (EQ) Trolox par gramme de composé étudié.

7.3. Activité anti radicalaire dans un générateur de radicaux hydroxyles La capacité anti-oxydante des huiles essentielles a été mesurée en utilisant un générateur de radicaux hydroxyles en phase gazeuse, selon la technique et le dispositif développés par Pezo et al. (2008) L’assemblage détaillé est montré dans la Figure 8. L'air comprimé a été fourni par un compresseur (Cecatto Bluair Brendola, Italie). L'aérosol a été généré au moyen du dispositif complet (régulateur de débit et nébuliseur), et pour améliorer la précision du flux d’alimentation en peroxyde d’hydrogène, une pompe péristaltique Bio-Rad (Hercules, CA, USA) et placée à l’entrée du tube capillaire, réglée à 0,8 mL/min. Le débit d'air total a été fixé à 3,76 L/min. Le photoréacteur utilisé pour générer OH• à partir de H2O2 (0,29 mol/L) consistait en un tube de quartz cylindrique, entouré de huit lampes UV fluorescentes (Philips Eindhoven, Pays-Bas), placées axialement. Les pièges à antioxydants (Huiles essentielles) consistaient en huit pipettes Pasteur, contenant de la laine de verre (0,1 g) dont les huiles essentielles ont été ajoutées à raison de 0,04 g/pipette. Toutes les connexions ont été réalisées avec des raccords instantanés HR LF3000 polymériques pour air comprimé (Legris Rennes, France). Finalement, Cinquante millilitres de solution de salicylate, piégeant les radicaux OH• -5 (Salicylate de sodium à 1,25.10 mol/L dans l’acide orthophosphorique 85% (H3PO4) à 250 µmol/L, pH ajusté à 4,5 à l’aide de la solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) à 0,1 mol/L) étaient contenus dans huit flacons en verre, d'une capacité de 100 mL chacun.

CHAPITRE II Matériel et méthodes

Tubes contenant l’huile essentielle Sortie d’air -1 470 mL min

Flacons de solution salicylate

Photoréacteur (Tubes quartz + Lampes)

Nébuliseur H2O2 Aérosol (≈ 2%)

Auxiliaire + Nébulisation d’air -1 3,7 L min

Drain H2O2 H2O2 débit -1 (≈98%) 0,80 mL min

Figure 8: Schéma du dispositif de génération de radicaux libres In situ (d’après Pezo et al., 2008)

Photoréacteur Tubes contenant l’huile essentielle (Tubes quartz + Lampes)

Flacons de solution salicylate

Pompe Peroxyde d’hydrogène Nébuliseur péristaltique (H2O2))

Figure 9: Dispositif de génération de radicaux libres In situ

CHAPITRE II Matériel et méthodes

Ensuite, une analyse chromatographique de l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (2,5- DHB) et de l'acide salicylique restant a été effectuée sur un système CLHP (Waters série 2795 Milford, MA, USA) couplé à un détecteur de fluorescence (Waters 474) fonctionnant aux longueurs d'onde optimales pour les deux composés (λex = 324 nm,

λem = 448 nm).). La séparation a été réalisée sur une colonne à phase inversée (Waters XTerra MS C18). La phase mobile était un tampon d'acétate aqueux (35 mmol/L, pH 5,9), méthanol, 90:10 (v/v) ; en mode isocratique (1,5 mL/min). Le volume d'injection était de 20 µL. Un détecteur à barrette de photodiodes Waters PDA 2996 couplé en série avant que le détecteur de fluorescence ne soit utilisé pour surveiller les éventuels composés non fluorescents.

8. Olfactométrie

Afin de mettre en évidence, quantifier et identifier les composés odorants des huiles essentielles d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii, nous avons fait appel au couplage chromatographie en phase gazeuse/olfactométrie (GC/O), dont l’extraction a été réalisée par la technique de microextraction en phase solide (SPME). La GC/O est une technique chromatographique basée sur l’implication du nez humain en plus d’un détecteur physique qui est généralement un spectromètre de masse (Fernanadez et al., 2009) Pour évaluer la contribution de chaque composé odorant à l’odeur générale des huiles essentielles, deux méthodes sont généralement utilisées, qui sont la mesure de l’OAV (Odor Activity Value) et la technique de RFA (Relative Flavor activity) (Dharmawan et al., 2009). Dans ce travail et pour évaluer ce caractère, nous avons utilisé la méthode qui a pour principe de mesurer l’OAV. 8.1. Choix de la fibre SPME Pour sélectionner la fibre appropriée à nos échantillons d’HE; quatre fibres de polarité et d'épaisseur différentes ont été testées, à savoir: - Fibre de Divinylbenzène /carboxène /polydiméthylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) 50/30 μm (Grise). - Fibre de carboxène /polydiméthylsiloxane (CAR/PDMS) de 75 μm (Noire). - Fibre de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 100 μm (Rouge). - Fibre de polyacrylate (PA) de 85 μm (blanche). Cette étape de sélection des fibres a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse-olfactométrie couplée à la spectrométrie de masse (CPG-O-SM). Les composés

CHAPITRE II Matériel et méthodes volatils des huiles essentielles sont extraits par la technique de microextraction en phase solide (SPME), dont le mode d’extraction choisi est celui dans son espace de tête. L’adsorption a été réalisée pendant 15 min à 50°C. Une fois l’extraction est terminée, la fibre est passée dans l’injecteur du chromatographe, et la désorption s’effectue à une température de 250°C pendant 2 min en mode splitless (vanne de split fermée). Les conditions chromatographiques choisies sont les même décrites ci-dessous. À noter que toutes les fibres testées et utilisées ont été conditionnées avant leur première mise en fonctionnement selon les conditions du fabricant (Annexe 2).

8.2. L’analyse HS-SPME-CPG-O/SM Les analyses HS-SPME-CPG-O-SM ont été effectuées avec une fibre de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 100 μm (Rouge) précédemment sélectionnée. L’extraction des composés volatils a été effectuée en mode de son espace de tête, en plaçant 20 μL d’HE dans un flacon à vis de 20 mL et dans lequel la fibre SMPE est introduite. L’adsorption a eu lieu dans les mêmes conditions de sélection de la fibre (température de 50 °C pendant 15 minutes), en utilisant l’agitateur d’un chromatographe série Agilent 6890. L'analyse des composés volatils a été réalisée avec le système CPG Agilent série 7820A, couplé à un détecteur de masse série 5977B-MDS. L'injection a été réalisée manuellement et le mode de division de flux a été adopté. Alors que la désorption est faite pendant 2 minutes à 250°C. La séparation chromatographique a été effectuée sur une colonne BP-20 (30 x 0,25 x 0,25 um) fournie par la société science analytique SGE (Madrid, Espagne). La température initiale a été réglée à 40 ° C (5 min), puis élevée de 40 à 216 °C à raison de 7 °C/min puis augmentée à nouveau à 300°C avec une cadence de 30°C/min cette température finale a été maintenue pendant 2 min. L'hélium a été utilisé comme gaz vecteur à un débit de 2,02 mL/min. L'ionisation a été réalisée par impact électronique, le piège de température était de 220°C; L’acquisition a été réalisée en mode SCAN (45- 350 m/z).

L’identification des composés volatils a été réalisée par comparaison de leur spectre de masse avec ceux présents dans la banque de données NIST et par mesure de leur temps de rétention, après injection d’une série de n-alcane (C6-C28). Alors que la semi-quantification a été faite par injection d’un étalon externe et traçage de sa courbe d’étalonnage.

CHAPITRE II Matériel et méthodes

Un test sensoriel a été réalisé par un panel formé de 6 membres, à la sortie du port de détection olfactive (cône nasal), les effluents sont reniflés par 6 panélistes et les informations telles que le temps de rétention du composé et son odeur ont été notés. En parallèle, l’intensité sur une échelle allant de 1 à 3: (1 était très faible, odeur difficilement reconnaissable et 3 était très forte, note intense) a été attribuée à chaque composé senti. Par conséquent ces données rapportées sur une fiche (Annexe 3) ont permis d’obtenir d’une manière synchrone un olfactogramme. Chaque échantillon est flairé trois fois par chacun des panélistes.

Olfactogramme C

15 min à Chromatogramme 250°C

Figure 10 : Schéma récapitulatif de l’analyse HS-SPME-CPG-O-SM

A : Extraction de l’échantillon dans son espace de tête ; B : Analyse par CPG-O-SM ; C : Résultats traduits par l’olfactogramme et le chromatogramme (Fernandez et al., 2009 ; D : Port olfactométrique (Fernandez et al., 2009).

8.3. Détermination de l’OAV (Odor Activity Value) L’OAV est définie en étant le rapport entre la concentration en odorant dans un échantillon et son seuil olfactif (Lorjaroenphon, 2012). Ce dernier est définie comme la plus faible concentration en composé odorant permettant à 50 % d’un jury chargé de

CHAPITRE II Matériel et méthodes sentir l’échantillon de détecter son odeur (EPA, 1992). Dans la présente étude, les valeurs OAV ont été calculées à l'aide de l'équation suivante décrite par (Lubinska- Szczygeł et al., 2018):

퐂퐂퐎 C CO : Concentration du composé (μg/g) ; 퐎퐀퐕 OT ; Seuil olfactif (μg/g); 퐎퐓 Les seuils de détection olfactive utilisés pour le calcul de l’OAV sont indiqués dans différents rapports et travaux de recherche.

Après l’obtention des valeurs OAV, un profil aromatique a été élaboré à partir des odorants clés, tout en regroupant le nombre de composés appartenant à la même classe d’odeur pour estimer l’odeur globale de nos HE d’une part. De plus, la somme des valeurs OAV des éléments odoriférants faisant partie de la même classe d’odeur a été calculée pour juger l’odeur abondante par rapport à cette somme d’une autre part. L’ensemble des valeurs de seuil olfactif utilisé ont été retrouvées dans la bibliographie ainsi que les classes d’odeur des composés rapportées sont celles retrouvées dans les bases de données en ligne (thegoodscentscompany.com, flavornet.org).

8.4. Calcul de la limite de détection (LOD) Dans le cas de composés aromatiques déterminés par olfactométrie, là où il n'y a pas de pic caractéristique, une limite de détection (LOD) de chaque analyte est appliquée pour déterminer son OAV. La LOD a été déterminée en utilisant la méthode du signal sur bruit selon la formule suivante :

LOD = 3. [X] S / N

[X]: concentration de l'analyte; S/N : signal/bruit ; valeur établie à l'aide du chromatogramme de faibles concentrations d'analytes.

Pour avoir un pic caractéristique de chaque analyte, un volume de 20 μL du mélange de standard a été analysé par HS-SPME-CPG-SM dans les mêmes conditions précédemment utilisés pour nos échantillons. Dans le cas d'absence d'étalon de certains composés, des standards ayant une structure similaire ont été utilisés. Alors que dans l’absence de ces derniers, le pic central du chromatogramme (linalool) est appliqué pour quantifier nos composés. Toutes les données des standards utilisés sont présentées dans les tableaux de L’annexe 4. 53

CHAPITRE II Matériel et méthodes

9. Etude de la toxicité aigüe L’huile essentielle d’Artemisia herba-alba a été choisie parmi les autres huiles essentielles extraites d’Artemisia campestris et de Rosmarinus tournefortii, pour faire l’objet de cette étude toxicologique, ce choix est justifié par le pouvoir antimicrobien et antioxydant prouvé par cette substance. Dans la présente étude, la toxicité aigüe de l'huile essentielle a été étudiée par la détermination de la dose létale médiane (DL50), ainsi que l'évaluation du comportement après l’administration des différentes doses, et aussi par l’estimation de l’évolution du poids corporel.

9.1. Les animaux d’expérience Pour étudier la toxicité de l’huile essentielle, les animaux utilisés ont été mis dans l’animalerie du département de biologie en zone protégée, bien éclairée et à l’abri de tout bruit violent, et à température ambiante. Ces souris de souche NMR-I sont placées dans des cages durant toute la période de l’étude. Les cages rectangulaires représentant leur habitat sont en PVC blanc, d’une dimension de 50x25 cm et 25 cm de hauteur. Une couche de litière est étalée sur le fond de la cage et cette dernière est dotée d’une mangeoire contenant de la nourriture sous forme de croquettes que les animaux reçoivent à volonté. Le couvercle de la cage consiste en une grille en inox fixée rigoureusement pour éviter que l’animal ne s’échappe. Sur cette même grille, un biberon d’eau est fixé incliné pour permettre à l’animal de s’alimenter (Figure11).

Mangeoire remplie de croquettes

Litière

Figure 11: Population de 9 souris dans leur habitat

CHAPITRE II Matériel et méthodes

9.2. Protocol expérimental

9.2.1. L’échantillonnage Une population initiale de 9 souris de souche NMR-I a été utilisée pour la reproduction des sujets à expérimenter, comme l’illustre la Figure 12. Trois couples formés d’un mâle et de deux femelles chacun ont été choisis pour un accouplement, afin de donner une première génération (F1). Comme résultat, la population obtenue est composé de 36 souris de sexe différent. Ensuite, à partir de cette première génération, 3 autres groupes formés cette fois-ci d’un mâle et trois femelles chacun, ont été accouplés et qui a leur tour ont formé une progéniture comportant 54 souris tout sexe confondu (F2). Finalement, un groupe d’un mâle et deux femelles ont fait l’objet d’une reproduction, en donnant une 3ème descendance regroupant 15 souris, entre mâles et femelles (F3), un total de 114 animal est recensé en fin de cette opération.

9 souris (mâles et femelles) pour la reproduction d’une génération initiale

3 mâles 6 femelles

36 souris tout sexe confondu (F1)

3 mâles 9 femelles

54 souris tout sexe confondu (F2)

1 mâle 2 femelles

15 souris tout sexe confondu (F3)

114 souris tout sexe confondu (F1+F2+F3)

Figure 12 : Schéma récapitulatif de l’obtention de la population d’étude

CHAPITRE II Matériel et méthodes

9.2.2. Choix de la population d’étude Sur 114 animaux obtenus après 3 générations, nous en avons sélectionné 100 individus. Leur poids allait de 14 à 35 g tous sexes confondus. Le lot des 100 souris a été partagé en 10 groupes de 10 souris chacun et des lettres alphabétiques ont été attribuées à ces groupements (T, A, B, C, D, E, F, G, H et I), qui vont subir l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba à différentes doses par injection intrapéritonéale, dont le but d’estimer la dose létal médiane DL50.

A B

Mère 8 souriceaux Mère 9 souriceaux

C D D

4 souriceaux Papier pour créer une Mère 10 souriceaux atmosphère ambiante

E F

4 souriceaux Papier pour créer une 4 souriceaux Papier pour créer une atmosphère ambiante atmosphère ambiante

Figure 13: Population de souris provenant de différentes générations à différents âges A, B : Mère et ses souriceaux âgés d’1 jour C : Souriceaux âgés de 4 jours D : Mère et ses souriceaux âgés d’1 semaine E, F : Souriceaux âgés de 10 jours

CHAPITRE II Matériel et méthodes

9.2.3. Préparation des doses d’huile essentielle En se basant sur la technique décrite par Hilan et al. (2009), une série de dose de 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 et 85 mg/mL a été préparée, par dilution de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba dans du Tween 80 (1 % v/v).

9.3. Détermination de dose létale médiane (DL50) L’eau et la nourriture sont retirées 12 heures avant la pesée et ces souris ont été acclimatées dans le laboratoire au moins trente minutes avant leur manipulation. Chacune des souris a été utilisée une fois dans cette expérience. Comme le montre la Figure 14, le site d’injection représente le quadrant abdominal inférieur droit de l’animal en regard de la cuisse ; cette zone a été désinfectée à l’aide d’un coton stérilisé et de l’alcool chirurgicale. L’injection est administrée en utilisant une aiguille 26 G 3/8 0,45 x 102, avec un angle de 15 à 20°.

Souris

Seringue

A B

Souris A : Zone intrapéritonéale désinfectée ; B : Repérage du quadrant abdominal inférieur droit ; C : Seringue introduite en position inclinée à un Seringue angle de 15 à 20°.

Figure 14 : Différentes étapes de l’injection intrapéritonéale

L'huile essentielle a été administrée par injection intrapéritonéale à chaque groupe de souris à l’ordre de 0,01 mL / g de poids corporel, un groupe a servi de témoin et a été injecté par Tween 80 (1 % v/v). Les souris ont été ensuite surveillées pendant 24 h et les symptômes de la toxicité ont été notés. Le taux de mortalité a été enregistré ainsi que le comportement des souris et ceci pendant les 22 jours qui suivent le traitement. A la 57

CHAPITRE II Matériel et méthodes fin de l’expérience le nombre de souris décédées a été relevé pour calculer la dose létale médiane selon la méthode arithmétique de Karber, rapportée par Ahmed et Azmat

(2014). La valeur de la DL50 est exprimée en mg d’HE par Kg de poids corporel.

DL50 = DL100 –Σ (a × b)/n

n= le nombre total de souris formant un groupe ; a= la différence entre deux doses successives de la substance administrée ; b= le nombre moyen de souris décédées noté pour deux doses successives ; DL100= dose létale provoquant la mort de la population testée dans un groupe.

L’échelle de Hodge et Sterner (Tableau VII) a été utilisé pour estimer le degré de nocivité de l’huile essentielle, en se référant aux six classes de toxicité décrites et ceci par comparaison de son DL 50 obtenue (Hodge et Sterner, 2005).

Tableau VII: L’échelle de Hodge et Sterner

Classe de toxicité DL 50 par voie orale (mg/kg) Terme utilisé 1 1 ou moins Extrêmement Toxique

2 1-50 Hautement Toxique

3 50-500 Modérément Toxique

4 500-5000 Etroitement Toxique

5 5000-15000 Pratiquement Non-toxique

6 15.000 ou plus Relativement inoffensif

9.4. Tests d’Irwin simplifiés

Pour mieux décrire les effets sur les comportements provoqués par une certaine substance toxique, il existe une méthode connue par les tests d’Irwin simplifiés citée par Benlahcen (2008) qui comporte une étape d’observation et une étape de manipulation de l’animal. Dans cette étude, et pour évaluer l’effet des différentes doses de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba sur les souris sujettes, seule la phase d’observation à l’œil nu des comportements physiques a été adoptée. Ces derniers sont spécialement: la posture corporelle, l’activité locomotrice, le réflexe de redressement, les sursauts spontanés, les cris et les rythmes cardiaque et respiratoire.

Pour chaque individu, une fiche de description (Annexe 5) des différents comportements est établie, où le score normal de chaque critère est indiqué sur une

CHAPITRE II Matériel et méthodes colonne CN (comportement normal), comportement anormal (CA) et le comportement anormal intense (CA*).

9.5. Evolution pondérale

Après injection des différentes doses d’HE et en plus du suivi du comportement des souris qui ont fait l’objet de cette étude durant 22 jours, le poids corporel a été pris à plusieurs intervalles de temps exprimés en jours, à savoir j, j+5, j+10, j+15, j+20 et j+22, dans le but d’estimer l’impact de l’HE d’AHA sur l’évolution pondérale des individus traitées. Les résultats exprimés en moyenne de trois pesées sont rapportés (Annexe 8).

Chapitre III: Résultats et interprétations

CHAPITRE III Résultats et interprétations

1. Rendement L’huile essentielle a été extraite à partir des trois plantes séchées à l’air libre, et ceci par hydro-distillation dans un appareil de type Clevenger modifié. Nous avons obtenu une huile de couleur jaune pâle et odeur accentuée pour Artemisia herba-alba et Rosmarinus tournefortii, alors que Artemisia campestris a donné une huile de couleur jaunâtre plus foncée et faiblement odorante. Le rendement en huile essentielle après hydro-distillation des trois plantes était largement variable, l’ensemble des valeurs de rendement sont regroupées dans le tableau 5, le rendement le plus important a été enregistré pour l’huile d’Artemisia herba alba, avec une quantité de 0,64% (m/m), suivi de Rosmarinus tournefortii avec un rendement de 0,36 % (m/m), alors que l’Artemisia campestris représente un faible rendement en huile essentielle de 0,29 % (m/m).

Tableau VIII: Rendement des huiles essentielles

Artemisia herba alba Artemisia campestris Rosmarinus tournefortii Rendement en % 0,6405 ± 0,13 0,2949 ± 0,09 0,3647 ± 0,04

2. Composition chimique L'huile essentielle obtenue par hydrodistillation de la partie aérienne d’Artemisia herba-alba, Artemsia campestris et Rosmarinus tournefortii, a été analysée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM). Les résultats obtenus montrent l’identification de 41 composés différents au total pour les trois plantes à partir des chromatogrammes obtenus (Figure 15), les composés identifiés sont listé dans le Tableau IX en fonction de leur temps de rétention dans une colonne capillaire DB-5 fusionnée, représentant environ 98,3, 99,9 et 98.9 % de la composition totale des huiles d’Artemisia herba-alba, Artemsia campestris et Rosmarinus tournefortii respectivement. L'huile essentielle d’Artemisia herba-alba est principalement constituée de monoterpènes oxygénés (92,6%) suivis des hydrocarbures monoterpéniques (3,2%), le composé le plus abondant étant le camphre représentant 50,47% de la quantité totale soit 0,5102 mg/mg d'huile essentielle. Les autres constituants majeurs détectés sont l'α- thuyone (12,71%, 0,1153 mg), la β-thuyone (9,97%, 0,0986 mg), l'eucalyptol (8,2%, 0,0913 mg) et le chrysanthénone (8,19% 0,0911 mg).

CHAPITRE III Résultats et interprétations

L’huile essentielle d’Artemisia campestris est constituée principalement d’hydrocarbures sesquiterpéniques, composés aromatiques monocycliques et hydrocarbures mono-terpéniques avec des taux de 34,2, 30,55 et 23,73 % respectivement. Le composé majoritairement présent était le germacrène D (20,91 %, 0,2101 mg), le 1,2,3,4,5,6,7,8-Octahydro-1-méthyl-anthracène est aussi présent avec un taux de 17,21 % (0,1003 mg), suivis du 1,2,3,4,4a,9,10,10a-(trans-4a,10a)-Octahydro-9 oxophénanthrène (12,13% ; 0,707 mg). Les composés abondants dans l’huile de Rosmarinus tournefortii, étaient essentiellement les monoterpénes oxygénés (54,61 %) et les hydrocarbures monoterpéniques (26,6 %). Le camphre était majoritairement abondant avec un taux représentant 45,89 % (0,7244 mg), les autres composés majeurs présents sont le camphéne (3,24 % ; 0,0313 mg), α-pinène (8,13 % ; 0,0293 mg) et α-bisabolol (6,33 % ; 0,0143 mg).

Tableau IX: Composition chimique des huiles essentielles

Indice de Composition en % tR rétention Composés* Groupes [1] [2] AHA AC RT IndR IndR 8,535 948 948 α-Pinène a < 0,4 3,98 ± 0,23 8,13 ± 0,41 9,324 950 953 Camphène a 2,42 ± 0,16 < 0,4 9,24 ± 0,43 10,536 898 897 Sabinène a nd < 0,4 < 0,4 10,755 943 943 β-Pinène a < 0,4 2,91 ± 0,26 2,41 ± 0,10 11,496 958 958 β-Myrcène a < 0,4 3,21 ± 0,59 0,45 ± 0,04 13,011 1051 1052 α-Terpinène a < 0,4 < 0,4 0,49 ± 0,01 13,505 1040 1042 o-Cymène a < 0,4 1,62 ± 0,08 1,42 ± 0,06 13,747 1018 1018 Limonène a nd 2,09 ± 0,25 3,18 ± 0,07 13,862 1059 1059 Eucalyptol b 8,19 ± 0,31 nd 5,58 ± 0,15 14,280 976 976 (E)-β-Ocimène a nd 5,92 ± 0,09 nd 14,908 955 958 (E)-α-Ocimène a nd 1,36 ± 0,01 nd 15,572 998 998 γ-Terpinène a < 0,4 2,64 ± 0,04 0,87 ± 0,02 4-Méthyl-3-(1- 17,268 1022 1023 méthyléthylidène) a nd -1-cyclohexene < 0,4 0,41 ± 0,02 18,243 1107 1106 Filifolone a 1,46 ± 0,06 nd nd 18,673 1110 1110 α-Thuyone b 12,71± 0,12 nd nd 19,428 1115 1115 β-Thuyone b 9,97 ± 0,09 nd nd 19,674 1120 1119 Chrysanthénone b 8,19 ± 0,19 nd nd 21,310 1122 1121 Camphre b 50,47 ± 0,47 < 0,4 45,89 ± 0,16 22,364 1113 1114 Pinocarvone b 2,32 ± 0,03 < 0,4 nd

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Suite Tableau IX Indice de Composition en % tR rétention Composés* Groupes [1] [2] IndR IndR AHA AC RT 23,633 1137 1137 4-Terpinéol b 0,78 ± 0,01 < 0,4 2,27 ± 0,12 24,642 1141 1143 α-Terpinéol b nd nd 0,87 ± 0,08 cis-3- 27,444 1291 1290 f nd < 0,4 nd Hexénylvalérate 36,221 1221 1221 α-Copaène c < 0,4 1,02 ± 0,07 0,87 ± 0,02 36,664 1337 1339 β-Bourbonène c nd < 0,4 nd 2-Phényl-1,3- 37,527 1345 1347 e nd 1,21 ± 0,18 nd cyclohexadiene 38,908 1494 1494 β-Caryophyllène c nd 2,05 ± 0,06 3,99 ± 0,19 40,071 1386 1386 Alloaromadendrène c nd < 0,4 nd 41,146 1579 1579 Humulène c nd < 0,4 0,60 ± 0,03 41,365 1438 1440 β-Farnésène c nd 1,94 ± 0,03 < 0,4 42,495 1434 1435 γ-Muurolène c nd 1,01 ± 0,07 1,74 ± 0,05 42,761 1515 1515 Germacrène D c 0,62 ± 0,02 20,91 ± 0,61 < 0,4 42,994 1524 1524 α-Curcumène c nd 3,77 ± 0,14 < 0,4 43,230 1468 1469 β-Sélinène c nd 1,42 ± 0,05 nd 43,662 1603 1603 Germacrène B c nd 3,94 ± 0,10 < 0,4 45,148 1470 1469 δ-Cadinène c nd 1,91 ± 0,14 3,14 ± 0,23 48,556 1537 1536 Spathulénol d 0,94 ± 0,04 6,04 ± 0,09 nd Oxide de 48,625 1506 1507 d 0,60 ± 0,08 nd 1,11 ± 0,05 caryophyllène 50,426 1586 1586 Geranylisovalérate f nd 1,70 ± 0,16 nd 54,770 1622 1625 α-Bisabolol d nd nd 6,33 ± 0,49 1,2,3,4,5,6,7,8- 61,795 1714 1714 Octahydro-1- e nd 17,21 ± 0,90 nd méthyl-anthracène 1,2,3,4,4a,9,10,10a- (trans-4a,10a)- 64,834 1720 1720 e nd 12,13 ± 0,64 nd Octahydro-9 oxophénanthrène Hydrocarbures a monoterpéniques monoterpènes b oxygénés hydrocarbures c sesquiterpéniques sesquiterpènes d oxygénés Hydrocarbure aromatique e monocyclique Autres f *Les composés ont été identifiés par: i) comparaison avec l’étalon pure; ii) comparaison avec l’étalon silylé; iii) comparaison avec la bibliothèque des spectres CPG-SM NIST14.lib et WILEY229.LIB; iv) comparaison avec les spectres de la bibliographie; v) interprétation du spectre de fragmentation MS; nd– [1] [2] Non détecté; IndR –Indice de rétention avec C5-C35n-alkanes; IndR –NIST14.lib indice de rétention.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Abondance

Temps (min) A

Abondance

B Temps (min)

Abondance

C Temps (min)

Figure 15 : Chromatogrammes des huiles essentielles analysées par CPG-SM

A: HE d’AHA; B: HE d’AC; C: HE de RT.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

3. Activité antibactérienne 3.1. Méthode de diffusion par disque La technique de diffusion sur disque a été utilisée pour l’ensemble des 21 souches bactériennes, ce test préliminaire nous a permet de mettre en évidence le pouvoir antibactérien des trois huiles essentielles. Les résultats résumés dans le Tableau X, révèlent une importante activité antibactérienne de l’huile essentielle d’Artemisia herba- alba sur la plupart des souches bactériennes testées. Les diamètres de la zone d’inhibition les plus élevés ont été remarqués sur Klebsiella oxytoca KO B1,

Acinetobacter baumannii AB B1, Staphylococcus aureus SARMB1 et Staphylococcus aureus SARMB3 avec des valeurs de 31,3, 30,7, 28,3 et 28 mm. Une action antibactérienne modérée a été observée sur le reste des souches à l’exception de l’espèce Pseudomonas aeruginosa PA A1 qui a montré une certaine résistance avec une zone d’inhibition inférieur à 8 mm.

Klebsiella oxytoca Staphylococcus aureus Acinetobacter baumannii KO B1 SARM B1 AB B1

Zone d’inhibition

Disque imbibé d’HE

Croissance bactérienne

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa SARM B3 PA A1

Figure 16 : Zones d’inhibition par méthode de diffusion par disque

CHAPITRE III Résultats et interprétations

L’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii a montré un pouvoir antibactérien plus faible que cette précédente, seules les souches de Bacillus cereus BC A1 et Klebsiella oxytoca KO B1 qui ont été sensible avec des diamètres d’inhibition de 19,7 et 19,3 mm. L’activité antibactérienne sur le reste des espèces bactériennes était médiocre avec des zones d’inhibition allant de 8,3 à 15,3 mm. Alors que les souches de Pseudomonas aeruginosa PA A1, Escherichia coli EC A1 et Staphylococcus aureus SARM A1 était toutes résistantes.

Tableau X: Diamètre des zones d’inhibition

Diamètre de la zone d’inhibition (mm) Bactéries Artemisia Artemisia Rosmarinus Streptomycine herba-alba campestris tournefortii 10 µg/disque + Gram Staphylococcus aureus SA A1 16,3 ± 0,5 10,7 ± 0,6 12 ± 1 14,3 ± 0,5 Staphylococcus aureus SARM A1 21,3 ± 0,5 10,7 ± 1,2 <8 ± 0.0 15,3 ± 0,5 Staphylococcus aureus SARM B1 28,3 ± 0,5 9,7 ± 1,2 12 ± 0,0 16 ± 1 Staphylococcus aureus SARM B2 26,3 ± 0,5 9,7 ± 0,6 11 ± 0,0 15,6 ± 0,5 Staphylococcus aureus SARM B3 28 ± 1 10,3 ± 0,6 13,7 ± 2,5 14,3 ± 0,5 Staphylococcus epidermidis SEpi B1 10,7 ± 0,5 10,7 ± 0,6 9,3 ± 0,6 16,6 ± 0,5 Staphylococcus haemolyticus SH B1 17,7 ± 0,5 11,7 ± 0,6 10,3 ± 0,6 11,3 ± 0,5 Bacillus cereus BC A1 24 ± 1 15,7 ± 0,6 19,7 ± 0,6 25 ± 1 Gram - Pseudomonas aeruginosa PA A1 <8 ± 0,0 11,3 ± 0,6 <8 ± 0.0 21,6 ± 0,5 Escherichia coli EC A1 11 ± 1 11,3 ± 0,6 <8 ± 0.0 15 ± 1 Klebsiella pneunomoniae KP A1 13 ± 1 9,3 ± 0,6 10,3 ± 0,6 18 ± 1 Escherichia coli EC B1 BLSE 10,3 ± 0,5 <8 ± 0.0 11,3 ± 1,3 R Escherichia coli EC B2 BLSE 11,3 ± 0,5 <8 ± 0.0 8,3 ± 1,2 7 ± 0,0 Klebsiella pneumoniae KP B1 BLSE 11 ± 1 10,3 ± 0,6 12,3 ± 1,2 8 ± 0,0 Klebsiella pneumoniae KP B2 BLSE 11,7 ± 0,5 <8 ± 0.0 11,7 ± 2,1 R Acinetobacter baumannii AB B1 30,7 ± 1,5 <8 ± 0.0 15,3 ± 0,6 13,6 ± 0,5 Acinetobacter baumannii AB B2 27,3 ± 0,5 <8 ± 0.0 13,7 ± 0,6 10 ± 1 Proteus mirabilis PM B1 BLSE 17 ± 1 <8 ± 0.0 12,3 ± 1,2 R Proteus mirabilis PM B2 17,7 ± 1,1 <8 ± 0.0 11,3 ± 0,6 8 ± 1 Salmonella enteritidis SEnt B1 21,7 ± 0,5 <8 ± 0.0 15 ± 0,0 13 ± 1 Klebsiella oxytoca KO B1 31,3 ± 0,5 9,3 ± 0,6 19,3 ± 0,6 16 ± 1 Valeurs représentées en moyenne des trois répétitions ± l’écart type. R: résistante.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Quant à l’huile d’Artemisia campestris, seule la souche de Bacillus cereus BC A1 qui a été inhibé avec un diamètre d’inhibition de 15,3 mm. Sur le reste des souches, la plupart des zones d’inhibition enregistrées étaient de 9,3 à 11,7 mm, alors que souches plusieurs aussi ont été résistantes avec un diamètre inférieur à 8 mm.

3.2. Méthode de microatmosphère La technique de micro-atmosphère a été appliquée pour mettre en évidence l’activité antibactérienne de la fraction volatile des huiles essentielles, les souches testées dans cette méthode étaient celles présentant une importante sensibilité dans la technique de diffusion par disque, traduite par un diamètre de la zone d’inhibition supérieur à 15 mm. Nos résultats regroupés dans le Tableau XI montrent qu’une importante activité antibactérienne revient à l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba principalement, sur l’ensemble des souches testées et notamment pour les souches Acinetobacter baumannii

AB B1 et Acinetobacter baumannii AB B2 traduite par des diamètres de zone d’inhibition considérables allant jusqu'à 48 mm (Figure 17). L’huile d’Artemisia campestris a maintenu son effet antibactérien modéré sur la souche Bacillus cereus BC A1, avec un diamètre de 19,7 mm.

Zone d’inhibition

Croissance bactérienne

Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii AB B1 AB B2

Zone d’inhibition

Croissance bactérienne

Bacillus cereus BC A1 Klebsiella oxytoca KO B1

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Figure 17: Zones d’inhibition par méthode de microatmosphère

Tableau XI: Diamètres des zones d’inhibition par méthode de microatmosphère

Bactérie Diamètre de la zone d’inhibition (mm) Artemisia Artemisia Rosmarinus

herba-alba campestris tournefortii + Gram Staphylococcus aureus SA A1 - - - Staphylococcus aureus SARM A1 41 ± 1 - - Staphylococcus aureus SARM B1 40,3 ± 0,5 - - Staphylococcus aureus SARM B2 40 ± 1 - - Staphylococcus aureus SARM B3 39 ± 1 - - Staphylococcus haemolyticus SH B1 - - - Bacillus cereus BC A1 44,3 ± 0,5 19,7 ± 1,5 19,3 ± 1,5 Gram - Acinetobacter baumannii AB B1 48 ± 1 - 19,2 ± 2 Acinetobacter baumannii AB B2 47,6 ± 0,5 - - Proteus mirabilis PM B1 BLSE - - - Proteus mirabilis PM B2 - - - Salmonella enteritidis SEnt B1 26,6 ± 0,5 - 16,9 ± 2,5 Klebsiella oxytoca KO B1 22,6 ± 0,5 - 15,5 ± 2.3 Valeurs représentées en moyenne des trois répétitions ± l’écart type. Le symbole - : souche non étudiée.

L’huile de Rosmarinus tournefortii a présenté une activité modérée avec notamment un diamètre de la zone d’nihibition de 19,2 et 19,3 mm sur les souches d’Acinetobacter baumannii AB B1 et Bacillus cereus BC A1.

3.3. Détermination de la CMI et de la CMB Les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides ont été déterminées par la méthode de dilution en milieu liquide, pour les souches qui ont présenté une importante sensibilité, les valeurs sont listées dans le Tableau XII. En présence de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba, l’ensemble des souches bactériennes ont été inhibées à une concentration de 10 mg/mL, alors que la concentration minimale bactéricide s’avère plus élevée et atteint 20 mg/mL bien que les plus faibles concentrations minimales inhibitrices et bactéricides de 5 mg/mL et 10 mg/mL respectivement ont été observées uniquement pour les souches Staphylococcus aureus

SARMA1, Staphylococcus aureus SARMB1 et Bacillus cereus BCA1. Quant aux huiles essentielles d’Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii, les valeurs de concentration minimale inhibitrice et bactéricide semblent être plus élevées, en atteignant les 20 et 80 mg/mL respectivement, voir même une CMI

CHAPITRE III Résultats et interprétations supérieure à 80 mg/mL pour le cas de de l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii contre la souche Staphylococcus aureus SARMB3.

Tableau XII : Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et bactéricides (CMB)

Artemisia herba- Artemisia Rosmarinus alba campestris tournefortii Bactérie MIC MBC MIC MBC MIC MBC (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) + Gram

Staphylococcus aureus SASMA1 5 10 - - - -

Staphylococcus aureus SARMB1 5 10 - - - -

Staphylococcus aureus SARMB2 10 20 - - - -

Staphylococcus aureus SARMB3 10 20 - - >80 -

Bacillus cereus BCA1 5 10 20 80 5 80 Gram(-)

Acinetobacter baumannii ABB1 10 20 - - 5 80

Acinetobacter baumannii ABB2 10 20 - - 5 80

Proteus mirabilis PMB1 BLSE 10 20 - - - -

Proteus mirabilis PMB2 10 20 - - - -

Salmonella enteritidis SEntB1 10 20 - - 10 40

Klebsiella oxytoca KOB1 10 20 - - 20 40 Le symbole - : Non étudiée.

3.4. Mesure de la décroissance bactérienne (Time-kill assay) Dans le but d’évaluer la rapidité de l’action antibactérienne de l’huile essentielle sur une population bactérienne, et afin de mieux se rapprocher du contexte de l’usage clinique de ces substances, nous avons choisis la technique de décroissance bactérienne. Les bactéries témoin ont présenté une courbe de croissance classique, caractérisée par une phase exponentielle qui commence au début de la troisième heure pour la plupart des souches bactériennes. D’après notre courbe de décroissance bactérienne des souches présentant une importante sensibilité à l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba (Figure 18), nous constatons qu’avec une concentration correspondant à la CMI; une réduction remarquable de la population bactérienne dès les premières heures d’incubation à l’exception des souches de Staphylococcus aureus SARMA1 Acinetobacter baumannii

ABB2 qui marquent une diminution lente. Une élimination totale est atteinte après 24 h, et ceci pour l’ensemble des souches traitées.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Figure 18: Cinétique de décroissance bactérienne A : courbe de croissance des bactéries (Témoin); B : courbe de décroissance bactérienne en présence de l’huile essentielle d’AHA.

4. Activité antifongique Le pouvoir antifongique des huiles essentielles d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii, a été étudié par la technique de diffusion par disque et par la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale fongicide (CMF).

4.1. Méthode de diffusion par disque A partir des résultats obtenus (Tableau XIII), l’activité antifongique des huiles essentielles semble variable, l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba montre un potentiel antifongique remarquable notamment sur l’espèce Aspergillus niger par un diamètre de la zone d’inhibition de 53,7 mm, suivi de Penicillium sp. par une zone d’inhibition de 32,7 mm. Par comparaison des huiles essentielles d’Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii avec la précédente, ces dernières ont montré une activité antifongique beaucoup moins importante, avec des zones d’inhibition ne dépassant pas 35 mm, les 69

CHAPITRE III Résultats et interprétations diamètres de la zone d’inhibition les plus notables étaient ceux de l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii sur Penicillium sp. (35 mm) et de l’huile d’Artemisia campestris sur Aspergillus niger (20,7 mm) et Penicillium sp. (17,7 mm).

Aspergillus niger - AHA Aspergillus fumigatus - AHA Fusarium oxysporum - AHA

Zone d’inhibition

Disque imbibé d’HE

Croissance fongique

Aspergillus terreus - RT Aspergillus niger- AC Aspergillus terreus - AHA

Figure 19: Zones d’inhibition des souches fongiques

Tableau XIII: Diamètres des zones d’inhibition des souches fongiques

Diamètre de la zone d’inhibition (mm) Souche fongique Artemisia Rosmarinus Artemisia herba-alba campestris tournefortii Aspergillus niger 53,7 ± 1,5 20,7 ± 0,6 7,3 ± 0,6 Aspergillus fumigatus 30,7 ± 0,6 15,3 ± 1,5 8,3 ± 0,6 Aspergillus terreus 12,3 ± 0,6 7,3 ± 0,6 11,7 ± 1,2 Fusarium oxysporum 19,0 ± 2,0 7,0 ± 0,0 11,7 ± 0,6 Penicillium sp. 32,7 ± 1,5 17,7 ± 1,2 35,0 ± 1,0 Valeurs représentée en moyenne des trois répétitions ± l’écart type.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

4.2. Détermination de la (CMI) et de la (CMF) Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF) ont été déterminées seulement pour les souches fongiques montrant une importante sensibilité aux huiles essentielles, traduite par des diamètres de la zone d’inhibition supérieurs à 12 mm. Nos résultats rapportés dans le Tableau XIV montrent que la majorité des concentrations minimales inhibitrices et fongicides enregistrées étaient entre 2,5 et 20 µL/mL, sauf pour certaines souches là ou ces valeurs étaient >20 µL/mL, l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba est capable d’inhiber la croissance d’Aspergillus niger à une concentration de 2,5 µL/mL, mais la concentration minimale fongicide était supérieure à 20 µL/mL. Une concentration de 10 µL/mL était suffisante pour inhiber et tuer les souches d’Aspergillus fumigatus et de Penicillium sp. L’huile d’Artemisia campestris a montré une activité antifongique modérée avec des concentrations minimales inhibitrices et fongicides de 10 et 20 µL/mL. Quant à l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii, un résultat important est obtenu sur Penicillium sp. par des concentrations minimales inhibitrices et fongicides de 2,5 et 5 µL/mL respectivement.

Tableau XIV: Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF) Rosmarinus Artemisia herba-alba Artemisia campestris tournefortii Souches fongiques CMI CMF CMI CMF CMI CMF (µL/mL) (µL/mL) (µl/mL) (µl/mL) (µL/mL) (µL/mL) Aspergillus niger 2,5 >20 10 10 - - Aspergillus fumigatus 10 10 - - - - Aspergillus terreus 5 20 - - - - Fusarium oxysporum >20 >20 - - - - Penicillium sp. 10 10 10 20 2,5 5 Le symbole - : Non étudiée.

5. Activité anti-oxydante 5.1. Piégeage du radical libre DPPH D’après les résultats obtenus, nous avons calculé graphiquement les valeurs des concentrations inhibitrices 50 (IC50) en utilisant la courbe linéaire des pourcentages d’inhibition en fonction des différentes concentrations de l’huile essentielle (Annexe 6). Les valeurs représentées sur la Figure 20 et le Tableau XV, montrent que l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba exerce une importante activité antioxydante traduite par une IC50 de 41,73 mg/g. Une activité médiocre a été observée pour l’huile d’Artemisia campestris, avec une IC50 de 53,44 mg/g. Dernièrement l’huile essentielle

CHAPITRE III Résultats et interprétations de Rosmarinus tournefortii est dotée d’un faible pouvoir antioxydant estimé par une

IC50 très élevée de 108,31 mg/g.

Tableau XV: Valeurs des IC 50 des huiles essentielles

Huile essentielle IC 50 (mg/g) Artemisia herba-alba 41,73 ± 4,14 Artemisia campestris 53,44 ± 6,37 Rosmarinus tournefortii 108.31 ± 8,01 Valeurs représentées en moyenne des trois répétitions ± l’écart type.

140

120

100

80 Artemisia herba-alba Artemisia campestris 60 Rosmarinus tournefortii IC IC 50 (mg/g) 40

0 Huile essentielle

Figure 20: Valeurs des IC 50 des huiles essentielles

5.2. Méthode ORAC Le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) nous a permis d’estimer le potentiel antioxydant des huiles essentielles, il est basé sur leur capacité à piéger les radicaux libres, Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XVI et la Figure 21, nous observons clairement que l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii, possède un potentiel antioxydant notable parmi les trois huiles essentielles étudiées avec une valeur de 337,49 µmol Trolox/g HE.

Tableau XVI: Valeurs ORAC des huiles essentielles Huile essentielle Eq trolox en µmol/g HE Artemisia herba-alba 309,08 ± 7,19 Artemisia campestris 158,10± 4,69 Rosmarinus tournefortii 337,49 ± 9,87 Valeurs représentées en moyenne des trois répétitions ± l’écart type.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

350

340

330 Artemisia herba-alba 320 Artemisia campestris Rosmarinus tournefortii 310 EqTrolox en µmol/g en EqTrolox

300

290 Huile essentielle

Figure 21: Représentation des valeurs ORAC des huiles essentielles

5.3. Activité anti radicalaire dans un générateur de radicaux hydroxyles en phase gazeuse Les concentrations de l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque obtenues en utilisant la courbe d’étalonnage du DHB (Annexe 7), nous ont permis de calculer le pourcentage d’hydroxylation du témoin à blanc et en présence de l’huile essentielle (Figure 22), d’après le graphique, l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba a montré une importante activité antioxydante avec un pourcentage d’hydroxylation réduit à 29,62 %, tandis que l’huile d’Artemisia campestris était de moindre activité avec un taux d’hydroxylation de 50,99 %. Alors que l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii n’a présenté qu’une légère activité avec un pourcentage d’hydroxylation atteignant 81,58 %.

Tableau XVII: Valeurs du pourcentage d’hydroxylation Huile essentielle Pourcentage d’hydroxylation (%) Témoin 100 Artemisia herba-alba 29,62 Artemisia campestris 50,99 Rosmarinus tournefortii 81,58 Valeurs représentées en moyenne des trois répétitions ± l’écart type.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

120%

100%

80% Témoin Artemisia herba-alba 60% Artemisia campestris

40% Rosmarinus tournefortii

Pourcentage d'hydroxylation d'hydroxylation Pourcentage 20%

Figure 22: Pourcentage d’hydroxylation

6. Olfactométrie

6.1. Analyse HS-SPME-CPG-O-SM

L’odeur d’une huile essentielle est la résultante des senteurs des différents composants présents, et afin d’identifier et quantifier les principaux composés odorants de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et de Rosmarinus tournefortii, nous avons procédé à un couplage de chromatographie en phase gazeuse/olfactométrie (CPG-O-SM). Les résultats de l’analyse HS-SPME-CPG-O-SM ont permis d’identifier plusieurs composés odorants présents dans nos huiles essentielles, dont certains sont détectés par le spectromètre de masse, qui ont été identifiés par comparaison de leurs spectres de masse avec ceux présents dans la bibliothèques des données, ces composés sont soit présents à des quantités infimes inférieures à leurs seuils olfactifs ou n’ont pas d’odeur caractéristique (Tableau XX). D’autres composants en plus de cette méthode d’identification, ils sont confirmés après reconnaissance de leurs odeurs par les panélistes (Tableau XVIII). Le reste des composés regroupés dans le Tableau XIX sont présents en faibles quantités ce qui a fait de leur détection par le spectromètre de masse impossible, cependant nous avons pu les identifier en comparant leur indice de rétention et l’odeur révélée par l’ensemble des panélistes avec ceux disponibles dans la bibliographie.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Les résultats montrent qu’un total de 37, 45 et 48 composants ont été détectés par le spectromètre de masse, dont 22, 28 et 32 composés odorants d’entre eux ont été confirmés en plus de la comparaison de leurs spectres de masse avec ceux disponibles dans la bibliothèque de données de l’équipement, par les données rapportées par les panélistes concernant l’odeur perçue et son intensité (Tableau XVIII), alors que le reste des éléments qui n’ont pas d’odeur caractéristique ou sont présents en quantités inférieures à leur seuil olfactif sont aux nombres de 15, 17 et 16 composés listés dans le Tableau XX, ceci pour les huiles essentielles d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et de Rosmarinus tournefortii respectivement. Alors que 24, 13 et 24 composés odorants ont été reconnus par les panélistes et n’ont pas été détectés par le détecteur physique, puis confirmés par leurs indices de rétention calculés selon les temps de rétention notés par ces derniers, et ceci respectivement dans les huiles essentielles d’AHA, , d’AC et de RT (Tableau XIX).

Tableau XVIII : composés odorants retrouvés dans les HEs identifiés par CPG-O-SM

AHA Seuils [C] N° tR (min) Composés olfactifs OAV Classes d’odeur* (μg/g) (μg/g) 1 11,635 α-pinène 0,19 A 20,23 106,47 Boisée, Epicée 2 12,159 Camphène 0,15 B 57,19 381,27 Camphrée 3 13,002 β-myrcène 1,5. 10- 3 D 3,97 2646,67 Balsamique, Epicée 4 12,787 β-pinène 1,5 C 16,3 10,87 Boisée, Epicée 5 14,341 Eucalyptol 1,3. 10- 3 D 135,34 104107,69 Mentholée, douce 6 14,868 α-thuyone - 19,44 - Herbacée, boisée 7 17,833 Camphre 4,6 A 374,81 81,48 Camphrée 8 18,13 Terpinen-4-ol 1,2 C 22,8 19 Épicée 9 18,177 α-thujenal - 10,09 - Grasse, herbacée Épicée, mentholée, 10 18,625 Verbénone 6,8.10- 6 E 10,66 1567647,06 camphrée 11 18,841 Bornyl formate - 10,54 - Herbacée 12 19,167 D-carvone 0,067 A 13,91 207,61 Épicée 13 20,646 Chrysanthénone - 40,22 - Grasse 14 21,238 Eugénol 6. 10- 3 D 11,38 1896,67 Épicée, douce 15 22,458 4-vinylguaiacol 0,04 F 210,34 5258,5 Épicée 16 23,049 Humulène 0,39 C 9,09 23,31 Boisée 17 23,165 Alloaromadendrène - 7,87 - Boisé 18 23,563 Germacrène D - 45,35 - Boisé, épicée 19 23,773 Allo-ocimène - 10,55 - Douce, florale

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Suite Tableau XIX Herbacée, boisée, 20 24,001 γ-muurolène - 7,54 - épicée Épicée, médicinale, 21 24,141 δ-cadinène 0,1 G 11,46 114,6 boisée Oxide de Herbacée, épicée, 22 24,658 0,41 C 3,89 9,49 caryophyllène douce AC Seuils [C] N° tR (min) Composés olfactifs OAV Classes d’odeur* (μg/g) (μg/g) 1 11,635 α-pinène 0,19 A 95,32 501,68 Boisée, épicée 2 12,119 Camphène 0,15 B 4,6 30,67 Camphrée 3 13,041 β-pinène 1,5 C 64,52 43,01 Boisée, épicée 4 13,411 β-myrcène 1,5. 10- 3 D 52,69 35126,67 Balsamique, épicée Hespéridée, 5 14,657 D-limonène 0,2 A 32,80 164 mentholée Fruitée, douce, 6 14,330 O-cymène - 107,62 - hespéridée 7 14,911 β-ocimène 0,034 H 31,17 916,76 Hespéridée 8 15,202 γ-Terpinène 1 D 52,27 52,27 Chimique, épicée 9 15,327 Citral 0,1 A 1,41 14,1 Fruitée 10 15,663 Terpinolène 0,41 C 5,01 122,19 Boisée 11 16,016 Thuyone - 11,38 - Mentholée 12 16,813 (-)-trans-pinocarveol - 7,10 - Boisée, balsamique 13 19,932 Camphre 4,6 A 4,31 0,94 Camphrée 14 17,064 (E)-2-decenal 0,017 A 1,73 101,76 Grasse 15 17,542 Terpinen-4-ol 1,2 C 3,16 2,63 Epicée 16 17,796 α-terpineol 5 C 2,59 0,518 Grasse, mentholée Douce, épicée et 17 18,118 Cis-verbénone - - 1,81 camphrée Cis-3-hexenyl-alpha- 18 18,525 - 8,55 - Douce et herbacée méthylbutyrate 19 19,666 Bornyl acétate 1,38 D 2,41 1,75 Boisée, herbacée 20 20,936 α-cubebène - 7,44 - Herbacée, grasse 21 21,080 Eugénol 6. 10- 3 D 19,39 3231,67 Épicée, douce 22 21,561 Copaène - 40,37 - Boisée, épicée 23 22,400 β-Caryophyllène 0,064 J 0,064 103,02 Boisée, épicée 24 22,716 Aromandendrène - 18,78 - Boisée 25 22,953 Humulène 0,16 D 15,27 95,44 Boisée

G Épicée, médicinale, 26 24,249 δ-Cadinène 0,1 13 130 boisée 27 24,536 Germacrène D - 21.03 - Boisée, épicée

28 24,676 Nérolidol 0,015 K 5,32 354,66 Florale

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Suite tableau XX RT Seuils [C] N° tR (min) Composés olfactifs OAV Classes d’odeur* (μg/g) (μg/g) 1 11,635 α-pinène 0,19 A 138,45 728,68 Boisée 2 12,349 Camphène 0,15 B 29 193,33 Camphrée 3 13,225 β-pinène 1,5 C 120,38 80,25 Boisée 4 13,350 β-Myrcène 0,67 A 29,19 43,57 Balsamique, épicée 5 13,619 α-thujène - 12,86 - Boisée, herbacée 6 14,657 D-limonène 0,2 A 276,55 1382,75 Hespéridée, mentholée 7 14,790 Eucalyptol 13.10- 4 D 18,64 14338,46 Mentholée, douce 8 15,033 γ-Terpinène 0,26 D 36,17 139,11 Chimique, boisée, fruitée 9 15,173 (+)-3-carène 0,044 T 30,63 696,13 Douce 10 15,640 α-Terpinène 0,085 Q 18,11 213,06 Fruitée Boisée, hespéridée et 11 15,773 (E)-β-terpinolène - 6,02 - chimique 12 15,990 α-phellandrène 0,16 B 6,94 43,37 Épicée, mentholée 13 16,636 Thuyone - 2,55 - Boisée, herbacée 14 17,725 Camphre 4,6 A 398,07 86,54 Boisée, balsamique 15 18,177 Bornéol 0,08 R 26,98 337,25 Camphrée 16 18,199 terpinen-4-ol 1,2 C 41,02 34,18 Epicée, boisée 17 18,440 α-terpinéol 5 C 40,87 8,17 Grasse, épicée, mentholée Épicée, mentholée, 18 18,618 Verbénone 6,8.10-6 E 1,85 272058,82 camphrée 19 18,740 β-cyclocitral 5. 10- 3 S 1,83 366 Mentholée 20 19,282 Pipéritone - 3,26 - Mentholée 21 20,997 α-cubebène - 7,63 - Herbacée, grasse 2-ethyl-3- 22 21,357 - 15,24 - Végétale, épicée methoxypyrazine 23 21,863 Alloaromadendrene - 3,31 - Boisée 24 22,426 β-caryophyllène 6,4. 10- 3 J 43,86 6853,12 Boisée, épicée 25 22,656 Aromandrène - 6,77 - Boisée 26 22,749 cis-β-farnesène - 6,15 - Hespéridée, herbacée 27 23,447 β-selinène - 6,36 - Herbacée 28 23,930 γ-cadinène - 18,83 - Boisée 29 23,736 β-bisabolène - 14,14 - Balsamique 30 24,278 α-cadinène - 4,65 - Boisée Oxide de 31 25,078 0,41 C 6,6 16,1 Herbacée, douce, épicée caryophyllène 32 26,528 α-bisabolol - 8,04 - Épicée, florale A: (Dharmawan et al., 2009); B: (Usami et al., 2013); C: (Tamura et al., 2001); D : (Pino et Mesa, 2006); E: (Kaneko et al., 2017); F: (Yuan et al., 2016); G: (Célis et al., 2012); H: (Han et al., 2017); J: (Zheng et al., 2012); K: (Gulati et Joshi, 2015); Q: (Nakamura et Miyazawa, 2013); S: (Buttery al., 1990); T: (Boonbumrung et al., 2001). *: (thegoodscentscompany.com, flavornet.org).

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Tableau XIX : Composés odorants identifiés par les panélistes

AHA Seuils tR LOD N° Composés olfactifs OAV Classes d’odeur* (min) (μg/g) (μg/g) 1 6,20 Epoxylinalool 6. 10- 3 H 0,047 0,006 Florale 2 8,91 Isopropyl butanoate 6,2. 10- 3 I 0,046 0,0062 Fruitée 3 9,51 O-xylène 0,38 I 0,35 0,38 Herbacée 4 12,04 Octadiénone - 0,047 - Herbacée 5 13,16 Non identifié - - - - 6 13,96 Non identifié - - - - 3,3,6-trimethyl-1,5- 7 15,12 - 0,025 - Herbacée heptadien-4-ol 8 15,50 3-nonenal - 0,36 - Grasse Méthylcyclopentapyr- 9 16,17 - 0,086 - Maillard azine 10 17,52 Linalyl formate - 0,047 - Hespéridée, herbacée 11 18,12 Cumin aldéhyde 0,4 D 0,049 0,4 Acide, épicée 12 18,79 Non identifié - - - - 13 19,34 Alcool cuminique - 0,049 - Boisée, herbacée 14 19,45 Non identifié - - - - 15 19,53 Méthyl quinoxaline - 0,48 - Maillard, Fruitée 16 20,51 Non identifié - - - - 17 21,22 β-elemène - 0,046 - Herbacée 18 21,43 Ethyl decanoate - 0,047 - Fruitée 19 22,11 Non identifié - 0,046 - - 20 22,28 Linalyl butyrate - 0,047 - Fruitée, douce 21 22,54 Isogéraniol - 0,13 - Florale 22 25,51 Non identifié - - - - 23 25,55 Oxo-β-ionone 7. 10- 3 D 0,046 6,57 - 24 25,91 7-heptadécéne - 0,023 - Boisée AC Seuils tR LOD N° Composés olfactifs OAV Classes d’odeur* (min) (μg/g) (μg/g) 1 7,02 Ethyl isobutyrate - 0,047 - Douce, chimique 2 12,84 5-methylfurfural 2 L 0,98 0,49 Douce, maillard 3 14,50 Non identifié - - - - 4 15,78 Non identifié - - - - 4-mercapto-4-methyl- 5 15,89 1,5. 10- 6 M 0,025 1666,66 Florale 2-pentanol 6 16,15 (E)-rose oxide 5. 10- 4 N 0,046 92 Florale 7 16,88 (E)-2-nonénal 1,7. 10- 4 L 0,36 2117,66 Végétale, herbacée

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Suite Tableau XX 8 17,03 Ethylbenzaldéhyde - 0,17 - Douce 9 17,64 (E,Z)-2,4-nonadiénal - 0,1 - Épicée 10 18,08 Octanoate d’éthyle 0,015 P 0,047 3,13 Fruitée, grasse 11 18,94 D-carvone 0,067 A 0,032 0,48 Épicée 12 20,64 Dihydrocarvyl acetate - 0,032 - Camphrée, médicinale 13 25,25 Tridecanol - 0,025 - Chimique RT Seuils tR LOD N° Composés olfactifs OAV Classes d’odeur* (min) (μg/g) (μg/g) 1 8,8 Méthylbutanone - 0,047 - Camphrée 2 12,43 Octanone - 0,047 - Chimique 3 13,53 2,4-heptadiénal - 0,047 - Grasse 4 13,79 (E)-β-ocimène 0,034 C 0,047 1,38 Douce, herbacée 5 14,31 β-phellandrène - 0,047 - Épicée 6 14,84 2,4-heptadienal - 0,047 - Maillard 7 16,17 périllen - 0,046 - Boisée 8 17,01 L-menthol - 0,11 - Camphrée 9 17,27 Non identifié - - - - 10 17.72 Epoxy-p-menthène - 0,11 - Mentholée 11 17,95 (E)-carveol - 0,032 - Épicée Camphrée, médicinale, 12 18,06 Isobornyl formate - 0,047 - boisée 13 18,25 Octanoate d’éthyle - 0,047 - Grasse, fruitée, épicée 14 18,35 Isobutyric acid - 0,1 - Grasse, acide 15 19,19 Géranial 0,032 D 0,13 4,06 Hespéridée 16 19,79 Non identifié - - - - 17 20,89 2-undécenal - 0,36 - Douce 18 21,01 Eugénol 0,006 D 0,9 150 Épicée, douce 19 22,55 Butyl octanoate - 0,047 - Fruitée 20 22,80 Méthyl eugénol - 0,19 - Boisée, douce 21 22,99 Citronéllyl isobutyrate - 0,047 - Fruitée, Florale 22 23,29 α-farnésène - 0,047 - Boisée, douce 23 23,36 Méthyl laurate - 0,047 - Grasse 24 24,12 Isopropyl benzoate - 0,17 - Douce, fruitée C: (Tamura et al., 2001); D : (Pino et Mesa, 2006); H: (Han et al., 2017); I: (Nagata, 2003); L: (Mayr et al., 2015); M: (Kishimoto et al., 2006); N: (Duan et al., 2014); P: (Niu et al., 2019). - : valeur non disponible. *: (thegoodscentscompany.com, flavornet.org).

CHAPITRE III Résultats et interprétations

6.2. Mesure de l’OAV Dans le but de chercher les composés participant à l’odeur de l’huile essentielle, l’OAV a été calculée comme étant le rapport de la concentration du composé volatil dans l’échantillon et son seuil olfactif (Lubinska-Szczygeł et al., 2018). D’après les résultats des OAV obtenues pour les composés odorants (Tableau XVIII), nous constatons des valeurs très variables entre les huiles essentielles des différentes espèces étudiées et même au sein de chaque plante. Nos résultats montrent que dans l’huile essentielle d’AHA, les odorants qui possèdent des valeurs d’OAV les plus importantes sont: le verbénone (OAV= 1567647,06), l’eucalyptol (OAV= 104107,69), le 4-vinylguaiacol (OAV=5258,5), le β- myrcène (OAV=2646,67), l’eugénol (OAV=1896,67) et le camphène (OAV= 381,27). Alors que les composés ayant les plus faibles OAV sont: β-pinène (OAV=10,87) et l’oxide de caryophyllène (OAV= 9,49). Tandis que l’huile d’AC est caractérisée par la présence des principaux odorants marqués par des valeurs OAV très importantes qui sont: le β-myrcène (OAV=35126,67), l’eugénol (OAV=3231,67), le β-ocimène (OAV=916,76), α-pinène (OAV=501,68) et Nérolidol (OAV=354,66). Par contre, les éléments présentant les plus faibles valeurs OAV étaient le camphre (OAV= 0,94), et le α-terpinéol (OAV=0,518). Les composés qui ont montrés des valeurs d’OAV les plus élevées dans l’huile essentielle de RT sont principalement : le verbénone (OAV=272058,82), l’Eucalyptol (OAV=14338,46), β-caryophyllène (OAV=6853,12), d-limonène (OAV= 1382,75), α- pinène (OAV= 728,68) et (+)-3-carène (OAV=696,13). Quant aux composés révélant les valeurs d’OAV les plus infimes sont: l’oxide de caryophyllène (OAV=16,1) et le α- terpinéol (OAV=8,17). Les composants présents en faibles quantités et qui ne sont pas quantifiables sont présentés dans le Tableau XX, leurs valeurs OAV sont calculées par rapport à leurs LOD. Par conséquent, tous ces composés sont présents à des quantités inférieures aux LOD et donc les valeurs de l’OAV de nos échantillons sont moins élevées, ça n’empêche pas que les odeurs de ces éléments ont été perçues par certains panélistes. Par manque de données bibliographiques indiquant le seuil olfactif des composés odorants, le calcul de la valeur OAV reste impossible pour certains composés présents dans nos échantillons d’HE.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Tableau XX: Composés dépourvus d’odeur ou présents en quantités inférieures à leurs seuils olfactifs

AHA N° tR (min) Composés [C] (μg/g) 1 10,888 Santolina triène 8,01 2 13,203 Mesitylène 25,51 3 13,479 Dimer alpha-phellandrène 13,70 4 14,333 O-cymène 9,67 5 15.798 Filifolone 1019 6 17,189 β-thuyone 295,07 7 17,972 Pinocarvone 16,12 8 19,053 Ocimenone 18,51 9 19,404 Cis-chrysanthénol acétate 16,48 10 19,544 Trans-verbenyl isovalerate 16,35 11 19,795 Isopiperitenone 29,31 12 20,314 α-copaène 8,64 13 20,999 Cadina-3,5-diene 11,87 14 21,59 α-cubebène 35,70 15 25,128 Spathulénol 14,41 AC N° tR (min) Composés [C] (μg/g) 1 12,614 Non identifié 3,79 2 16,228 Cosmène 6,56 3 16,304 3-ethyl-o-xylene 7,32 4 16,521 Alloocimène 16,10 5 17,229 Pinovarvone 2,29 6 18,525 Cis-3-hexynyl valérate 4,96 7 20,739 isoterpinolene 7,63 8 21,561 α-copaène 40,37 9 22,110 cyperène 10,89 10 22,716 Alloaromandrène 18,78 11 22,763 Isoledène 13,98 12 23,743 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl-benzene 71,81 13 23,861 β-selinène 25,36 14 23,954 β-farnésene 17,24 15 24,116 γ-murrolène 20,70 16 25,160 Spathulénol 14,25 17 25,562 Non identifié 6,47 RT N° tR (min) Composés [C] (μg/g) 1 11,226 Cyclène 7,37 2 12,349 (+)-4-carène 233,66 3 13,720 Psi-limonène 9,91 4 14,904 O-cymène 34,02 5 15,941 Cyclofenchène 29,71 81

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Suite tableau XXI 6 15,565 2-carène 20,74 7 16,120 Bornylène 16,12 8 18,475 (-)-myrténol 6,29 9 19,892 1,7,7-trimethyl-bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester acetic acid 41,06 10 21,410 Ylangène 14,02 11 21,550 α-copaène 37,27 12 22,509 (+)-calarène 14,03 13 22,918 Z,Z,Z-1,5,9,9-tetramethyl-1,4,7,-cycloundecatriene 13,50 14 23,302 α-amorphène 44,21 15 24,102 4-diene cadina-1(6) 50,12 16 24,210 Cubenène 5,63

6.3. Analyse sensorielle D’après l’analyse sensorielle de nos huiles essentielles, l’ensemble des résultats notés par les panélistes ont démontré que les composés odorants présents dans nos échantillons possèdent plusieurs odeurs apparentant à différentes classes qui sont précisément : l’odeur douce, boisée, camphrée, épicée, florale, fruitée, chimique, médicinale, acide, grasse, mentholée, végétale, herbacée et hespéridée. À signaler que seuls les odorants clés qui ont été pris en considération pour élaborer le profil sensoriel (OAV ≥ 1). Comme l’illustre la Figure 23, notre HE d’AHA semble être marquée par une odeur épicée, qui se traduit par la présence de plusieurs composés possédant cette odeur qui sont au nombre de 10. Quant à l’HE d’AC, nos résultats montrent que l’odeur de cette dernière est dominée par une senteur épicée, reflétée par 9 composés odorants possédant ce caractère, une odeur boisée est aussi présente vu les 7 composés qu’en présentent. Alors que l’HE de RT présente une fragrance épicée, ceci tenant compte des 7 composés ayant cette senteur, les odeurs boisée et mentholée sont aussi abondantes et principalement démontrées par la présence de 6 éléments odoriférants formant chaque classe. Alors que tenant compte de la somme des valeurs OAV des composés odorants, et comme l’illustre la Figure 24, les valeurs les plus importantes sont enregistrées pour les classes d’odeurs mentholée (1671754,75), épicée (1577709,33) et camphrée (1568109,81) pour l’HE d'AHA, épicée (39192,76) et balsamique (35126,67) dans l’HE d’AC et finalement les senteurs mentholée (288197,57), boisée (279057,33) et camphrée (272587,4) qui caractérisent notre HE de RT.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Figure 23 : Profil sensoriel des huiles essentielles d’AHA, AC et RT

CHAPITRE III Résultats et interprétations

Ceci permet d’observer qu’il y’a plus de composés ayant une odeur épicée dans l’HE d’AHA mais les composés possédant une plus grande valeur OAV ensemble sont pourvus d’une senteur mentholée, quant à l’HE d’AC, nous constatons la présence de plus de composés ayant une odeur boisée du même que cette classe est marquée par la plus grande somme OAV. Alors que l’HE de RT est marquée par l’abondance des odorants clés ayant une odeur épicée mais la somme OAV de la classe des éléments dont la senteur est mentholée se trouve la plus élevée.

Figure 24 : Valeurs OAV des classes d’odeurs caractéristiques des HEs d’AHA, AC et RT 84

CHAPITRE III Résultats et interprétations

7. Toxicité aigüe et comportement

7.1. Dose létale médiane (DL50) Le test de toxicité aigüe est utilisé pour déterminer la gamme de doses en évaluant l'index thérapeutique de l'extrait de plante (Ahmed et Azmat, 2014). La dose létale médiane a été estimée en utilisant différentes doses d’HE allant de 45 à 85 mg/mL. Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau XXI. L’huile essentielle a montré une

DL100 de 850 mg/kg, et la mort des animaux testés a été atteinte après les 30 premières minutes de l'expérience. Le comportement anormal de l’isolement dans un coin et de respiration rapide des animaux traités a été observé pour une dose de 500 mg/kg. Les doses administrées ont donné une valeur DL50 de 615 mg/kg.

Tableau XXI: Comportement et taux de mortalité des souris après injection de l’HE d’AHA Dose Taux de Principaux symptômes (mg/mL) mortalité Témoin 0 (0%) Comportement normal 45 0 (0%) Comportement normal Isolement, tachypnée, tachycardie et mort après 45 min et 50 1 (10%) rétablissement total des souris survivantes. Isolement, tachypnée, tachycardie et mort après 39 ±3 min et 55 4 (40%) rétablissement total des souris survivantes. Isolement, tachypnée, tachycardie, déséquilibre, inconscience et 60 5 (50%) mort après 41 ±5 min et rétablissement total des souris survivantes. Tachypnée, tachycardie, déséquilibre, inconscience et mort après 65 7 (70%) 34±3 min et rétablissement total des souris survivantes. Tachypnée, légère hypoactivité, inconscience et mort après 31±8 70 8 (80%) min et rétablissement total des souris survivantes. Tachypnée, hypoactivité, inconscience et mort après 30 ±4 min et 75 9 (90%) rétablissement total de la souris survivante. Exophtalmie, tachypnée, hypoactivité, inconscience et mort après 29 80 9 (90%) ±9 min et rétablissement total de la souris survivante. 85 10 (100%) Exophtalmie, tachypnée, hypoactivité et mort après 30 ± 6 min.

7.2. Description des comportements et test d’Irwin simplifié Après injection de l’huile essentielle, plusieurs comportements physiques ont été observés sur les souris sujettes, ces comportements se sont traduits principalement par des perturbations de l’activité locomotrice et un rythme cardiaque anormal. L’ensemble des mouvements et des attitudes sont détaillés ci-dessous pour chaque dose étudiée. - Groupe A (45 mg/mL) Concernant ce groupe recevant la plus faible dose d’huile essentielle, aucun comportement anormal visible n’a été observé, mis à part un stress juste après l’injection et la remise des souris dans la cage.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

- Groupe B (50 mg/mL) Sur ce groupe de souris, majoritairement des symptômes de tachycardie, tachypnée et d’isolement dans un seul coin du compartiment sont éminents mais qui disparaissent après quelques minutes de l’injection et soulagement de l’ensemble des souris à l’exception d’un seul individu mort après 45 min. - Groupe C (55 mg/mL) Les attitudes remarquées sont notamment une légère hypoactivité, tachycardie et tachypnée. Les souris se rapprochent des parois de la cage, un réflexe d’agrippement et affaissement du train arrière (elle pousse difficilement ses membres inférieurs). Ensuite, des mouvements rotatoires répétés dans un seul coin de la cage. Reprise d’une activité normale de la plupart des souris survivantes et mort de 4 individus après 39 ±3 min. - Groupe D (60 mg/mL) Les souris de ce groupe ont manifestés des signes de tachypnée, rythme cardiaque anormal et déséquilibre dans la posture corporelle, ainsi qu’une inconscience et isolement dans l’encoignure de la cage. Finalement, la mort de la moitié de la population est survenue après 41 ±5 min et rétablissement total des souris survivantes. - Groupe E (65 mg/mL) Un stress et une hyperactivité ont été observés juste après l’injection, suivis rapidement d’une hypoactivité, tachycardie et spasmes. Ensuite les souris se déplacent en se rapprochant des parois de la cage en aller-retour tout en manifestant un réflexe d’agrippement. Des mouvements de léchage répétés sont souvent présents avec un déséquilibre et posture anormale et finalement une inconscience jusqu’à la mort de 7 individus après 34±3 min et rétablissement total des souris survivantes. - Groupe F (70 mg/mL) Tachypnée, légère hypoactivité, inconscience, mort après 31±8 min et rétablissement total des souris survivantes. - Groupe G (75 mg.ml-1) Une activité locomotrice normale parfois marquée par des signes d’hypoactivité en faisant le tour de la cage et en touchant les parois, avec tentative d’agrippement, démarche chancelante à travers la cage, et mouvement de déplacement en rotation (tracer un cercle de ≈15 cm) et puis rotation sur place. Des sursauts et des pas en vacillant toujours restent présents, ensuite une tachycardie persistante se manifeste suivie de tremblements et changement de position en allongeant sur le côté droit avec grelottement, puis sur côté gauche. Reprise d’un mouvement avec affaissement du train 86

CHAPITRE III Résultats et interprétations arrière. Finalement la souris termine par s’allonger sur son côté gauche et faire le geste de léchage et inconscience jusqu’à la mort. - Groupe H (80 mg/mL) Les comportements remarqués sur les souris de ce groupe, étaient les mêmes que ceux notés pour le groupe précèdent, en plus d’une tachypnée qui se voit clairement lors de l’hypoactivité des souris, finalement une exophtalmie est visiblement remarquée. - Groupe I (85 mg/mL) Juste après l’injection de la substance, une activité modérée est remarquable tout en titubant, après quelques secondes un réflexe d’agrippement sur les parois de la cage et constaté, puis il est suivi directement d’une tachycardie et d’une hypoactivité marquée parfois par quelques sursauts. Une reprise de l’hypoactivité avec des petits pas pour arriver à s’isoler dans le coin de la cage. Finalement, on a observé une exophtalmie, des tremblements, des rotations en s’allongeant sur l’un des côtés et puis sur l’autre avec une tachycardie et tachypnée très prononcée et même inconscience jusqu'à la mort de ces souris.

Tableau XXII : Résultats des tests d’Irwin simplifiés

Groupes d’animaux émoin T (75 mg/mL) (75 mg/mL) (80 (45 mg/mL) (45 mg/mL) (55 mg/mL) (60 (50 mg/mL) (50 (70 mg/mL) (70 (85 mg/mL) (85

I F B mg/mL) (65 E A C D G H

Observation CN CN CN CN CA CA CA CA* CA* CA* Posture corporelle +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ + + + Activité locomotrice +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ + + Comportement anormal - - - - + ++ ++ +++ +++ +++ (Déséquilibre) Exophtalmie ------+ + Tremblement - - - - ++ ++ +++ +++ +++ +++ Sursaut spontané +- +- +- +- +- +- +- + + + Tachycardie - - + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ Tachypnée - - + + +++ +++ +++ +++ +++ +++ Réflexe de redressement +++ +++ +++ ++ +- +- - - - - L’isolement dans le coin - - +- +- +- ++ ++ ++ ++ +++ Cris ------+- +- T: Témoin; CN: Comportement normal; CA: Comportement anormal; CA*: Comportement anormal intense. 87

CHAPITRE III Résultats et interprétations

A B

C D

E F

G H

Figure 25 : Différents comportements de souris après traitement par HE d’AHA

A : Affaissement du train arrière ; B, C : Réflexe d’agrippement vu de haut; D : Réflexe d’agrippement vu de côté ; E, F : État de stress et isolement ; G : État comateux et H : mort après 30 min de traitement (Dose de 85 mg/mL).

CHAPITRE III Résultats et interprétations

7.3. Evolution pondérale L’évaluation du poids corporel a été effectuée pendant les 22 jours qui ont suivi l’administration de l’huile essentielle. Comparés au groupe témoin vivant dans les mêmes conditions expérimentales, les résultats listés dans l’Annexe 8 et illustrés par la Figure 26 montrent que le poids corporel des souris recevant des doses de 45 et 50 mg/mL reste en évolution croissante constamment tout au long de cette période d’étude. Ainsi, le groupe d’individus traités à raison de 55 mg/mL ont montré une phase stationnaire du poids durant les dix premiers jours avant de reprendre une croissance normale pendant le reste de la période d’expérimentation. En revanche, les animaux prenant les concentrations de 60, 65, 70 et 75 mg/mL ont été marqués par une certaine stabilité de leur poids durant plus de 15 jours suivant l’injection, à l’exception de la souris E10 qui a repris sa croissance par une évolution corporelle dès le dixième jour. Quant à la seule souris survivante du groupe administrant une dose de 80 mg/mL, un léger développement corporel noté après plus de 15 jours par rapport à ses précédentes. Les souris recevant la dose la plus élevée de 85 mg/mL ont subi la mort le même jour de l’injection.

CHAPITRE III Résultats et interprétations

T1 50 Témoin 50 45 mg/mL A1 T2 A2 40 40

A3 T3 30 30 A4 A5 T4 20 20 A6 Poids (g) Poids T5 (g) Poids A7 10 10 A8 T6 A9 0 0 A10 0 5 10 15 20 25 30 T7 0 5 10 15 20 25 30 Temps (jours) Temps (jours)

50 mg/mL 55 mg/mL 40 B1 40 35 B2 35 C2

30 B3 30 C4 25 B4 25 20 B5 20 C6 15 B6 15 Poids (g) Poids (g) Poids 10 B8 10 C8 5 B9 5 C10 0 B10 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Temps (jours) Temps (jours)

40 60 mg/mL 40 65 mg/mL 35 D1 35

30 30 25 D2 25 E2 20 D3 20 E7 15 15 Poids (g) Poids (g) Poids 10 D4 10 E10 5 5 0 D8 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Temps (jours) Temps (jours)

40 70 mg/mL 40 75 mg/mL 35 35

30 30 25 F6 25 20 20 G5 15 F10 15 Poids (g) Poids 10 (g) Poids 10 5 5 0 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Temps (jours) Temps (jours)

40 80 mg/mL 35

30 25 20 H1 15 Poids (g) 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (jours)

Figure 26: Évolution pondérale des souris traitées par l’HE d’AHA

Discussion

Rendement Nous rappelons que le rendement en huile essentielle d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii était de 0,6405, 0,2949 et 0,3647 % respectivement. Le rendement en huile d’Artemisia herba-alba pour notre cas était moyen par rapport à celui trouvé précédemment par certains auteurs, ce rendement est étroitement proche de celui trouvé par Dahmani-Hamzaoui et Baaliouamer (2010) qui était de 0,62 % et celui trouvé aussi par Akrout (2004) qui était de 0,65%. La valeur de rendement la plus faible retrouvée était de 0,1 % (Feuerstein et al., 1988; Fleisher et al., 2002; Dob et Benabdelkader, 2006), alors que les rendements le plus importants sont de 3 % trouvé pour la plante collectée dans la région de Boussaira au sud de la Jordanie (Abu-Darwish et al., 2015) et de 4,9 % pour la plante collectée dans la région d’El Kef en Tunisie (Boukrich et al., 2010). Notre rendement en huile essentielle d’Artemisia campestris est légèrement proche de celui enregistré par Silvestre et al. (1999) et par Chalchat et al. (2003), qui sont de 0,2 %. Un faible rendement de 0,1 % a été observé par Dob et al. (2005) alors que le rendement le plus important revient à la plante collectée dans la région de Camargue à Marseille à l’ouest de la France, qui donnait 1,1 % d’huile essentielle. Peu sont les travaux sur l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii, et en comparant le rendement en huile essentielle, notre valeur enregistrée est moins importante que celle mentionnée par Bendif et al. (2017) qui était de 0,02, 0,73 et 0,89 % pour l’huile extraite à partir des tiges, feuilles et fleurs. Notre rendement aussi est très faible par rapport à celui rapporté par Bendif et al. (2018) mais ceci est obtenu après extraction par CO2 supercritique qui était de 3,7 %. Le rendement en huile essentielle des plantes est souvent minime, il est généralement de 1 % ou moins (Langenheim, 1994; Carson et Hammer, 2011). La différence de rendement est tout à fait normale car ce dernier il varie en fonction de plusieurs paramètres notamment le climat, la nutrition de la plante, le stress (Croteau, 1986) et la période de collecte (Akrout et al., 2003).

Composition chimique En référence au camphre (50,5%, 0,5102 mg), notre chémotype de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba est similaire à celui rapporté par Dahmani-Hamzaoui et Baaliouamer (2010), avec un pourcentage de camphre de 49,3%, trouvé chez A.

Discussion herba-alba collectée dans la région de Boussaada (Algérie). Cependant, Belhattab et al. (2014) ont rapporté un pourcentage de camphre allant de 17,3 à 33 % pour la plante récoltée dans les régions de Bougaa, Boussaada, Boutaleb et Benifouda pas très loin de la région de Bouilef. Un fait intéressant est que le camphre est le principal composé de l’huile essentielle des plantes récoltées à M'sila (19,4%, Dob et Benabdelkader, 2006), à Benifounda (33,1%, Belhattab et al., 2014), à Boussaada (49,3%, Dahmani -Hamzaoui et Baaliouamer, 2010) et à Bouilef, rapporté ici. Dans d’autres régions, le principal composé signalé est l'α-thuyone (de 23,5 à 28,1%, Belhattab et al., 2014), composé également présent dans notre A. herba-alba de Bouilef mais en plus faible pourcentage (12,7%). Le β-thuyone aussi qui est l’un des composés majeur de notre huile, n’était présent en quantité significative que chez les plantes récoltées à M'sila (15,0%; Dob et Benabdelkader, 2006) et à Bougaa (7,8%; Belhattab et al., 2014) en Algérie mais abondant (58,4 %) dans l’huile essentielle extraite de la plante de la région de Kirchaou au sud de la Tunisie . Le chrysanthénone caractérise A. herba-alba présente sans le Sahara d’Algérie avec un taux de 40,9 % (Boutemak et al., 2009), mais présent seulement à raison de 8,2 % dans notre huile essentielle. Enfin, la quantité d’eucalyptol rapportée ici, est similaire à celle trouvée dans la plante recueillie à Boussaada, Benifouda et Bougaa en Algérie avec un pourcentage de 9,8, 8,6 et 8,2 respectivement (Belhattab et al., 2014), ce même composé a spécifié l’huile de la plante collectée dans la région de Néguev en Iran avec une quantité de 26,6 % (Fleisher et al., 2002). L’huile d’Artemisia campestris dans notre cas d’étude est caractérisée par le Germacrène D (21,91 %), ce composé n’est pas beaucoup retrouvé dans l’huile de cette espèce, il a été rapporté dans l’huile essentielle de la plante collectée dans la province de Voïvodine en Serbie avec un pourcentage de 3,3 % (Chalchat et al., 2003), aussi il a été présent dans le chémotype de la plante présente a Camargue dans la région de Marseille en France avec des quantités allant de 0,2 à 0,7 % (Juteau et al., 2002) et détecté à l’état de trace dans l’huile essentielle d’Artemisia campestris retrouvée à Djelfa en Algérie (Dob et al., 2005). Le composé (E)-β-Ocimène est observé en quantité plus faible dans plusieurs plantes de différentes régions, principalement dans la région d’Aveiro au Portugal avec un pourcentage de 2,9 % (Silvestre et al., 1999), aussi dans l’HE extraite de la plante présente à Camargue avec des quantités allant de 1,2 à 1,7 % (Juteau et al., 2002) et même dans la plante retrouvée en Serbie avec un taux de 0,6 % (Chalchat et

Discussion al., 2003). Le reste des composés majeurs n’ont pas été du tout retrouvés précédemment. La composition de notre huile essentielle de Rosmarinus tournefortii est très proche de celle rapportée par (Bendif et al., 2017), pour l’huile extraite de la plante collectée dans la région de Boutaleb à Sétif, avec un taux de camphre allant de 29,7 à 41,2 %, de α-pinène qui varie de 7,8 à 17,8 %, de camphène 10 à 15,6 % et d’eucalyptol 3,5 à 10,2 %, alors que la taux de α-bisabolol était beaucoup plus faible que dans notre huile, qui était limité à un taux variant de 0,2 à 0,8 %. Un autre chémotype de la plante collectée à Sidi Bakhti dans la région de Tiaret, dont l’huile a été extraite par CO2 supercritique était composé de grande quantité de camphre (16,9) % mais marquée par la présence de certains autres composés avec des pourcentages importants comme le n- untriacontane (5,4 %), α-tocophérol (4,7 %) et ß-amyrin (17,7 %) (Bendif et al., 2018). Les résultats rapportés ici joints aux précédents soulignent l'influence de l'origine de la plante dans la composition chimique de son huile essentielle, un fait déjà constaté dans le sud de la Tunisie et spécialement avec l’huile essentielle d’AHA (Mohsen et Ali, 2009), du même pour l’huile de RT collectée dans différentes régions (Bendif et al., 2017; Bendif et al., 2018).

Activité antibactérienne Les résultats de l’activité antibactérienne de l’huile d’Artemisia harba-alba présentés ici sont similaires à une étude antérieure réalisée par Zouari et al. (2010) sur cette même espèce contre Escherichia coli dont le diamètre de la zone d’inhibition est de (11,3 mm), Bacillus cereus (23 mm) et Pseudomonas aeruginosa PAA1 (0 mm), et également les résultats rapportés par Mighri et al. (2010b) contre Staphylococcus aureus SASMA1 (17,7 mm). Pseudomonas aeruginosa était également résistante à l'huile essentielle d’Artemisia herba-alba (Zouari et al., 2010; Sbayou et al., 2014), ce qui peut être dû à la résistance intrinsèque à l'antimicrobien et aux antibiotiques présenté par Pseudomonas aeruginosa, qui est liée à la nature de son membrane externe (Mann et al., 2000). Cependant, les résultats les plus encourageants sont ceux des cas de Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii et Klebsiella oxytoca. Notre huile essentielle d’Artemisia campestris était de moindre activité antibactérienne mais celle-ci reste plus performante que l’HE étudiée par Khebri (2011), là où les diamètres de la zone d’inhibition étaient inférieurs à 6 mm sur Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae.

Discussion

Le pouvoir antibactérien de l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii dans notre étude est différent de celui trouvé dans des travaux précédents, l’huile essentielle était moins active sur Bacillus cereus et Staphylococcus aureus en comparant les diamètres de la zone d’inhibition avec ceux trouvés par Benbelaïd et al. (2016) qui étaient de de 32 mm sur et 40 mm, alors qu’elle a montré une activité plus importante sur Salmonella enteritidis qui est inhibé avec un diamètre de 9 mm (Benbelaïd et al., 2016). L’activité sur la souche Pseudomonas aeruginosa était nulle ce qui est pareil pour les résultats rapportés par Benbelaïd et al. (2016) et Bendeddouche et al. (2011).

L’activité des composés volatils de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba sur la souche Klebsiella oxytoca et moins importante que celle exercée en contact directe, cette différence peut être due au fait que la technique de diffusion sur disque est une méthode directe qui dépend de la diffusibilité et de la solubilité de l’huile essentielle, contrairement à la méthode de microatmosphère qui dépend de la volatilité des composés de l’huile essentielle (Dobre et al., 2010). Il a été déjà prouvé que l’activité antimicrobienne des composés volatils résulte de l’action de la vapeur directe sur les microorganismes et l’effet indirect à travers le milieu qui absorbe la vapeur (Moleyar et Narasimham, 1986). De même cette action est beaucoup plus efficace, quand les microorganismes sont exposés à une forte concentration pendant une courte période de temps (Inouye et al., 2001). Il a été montré aussi que les huiles contenant de l'alcool, une cétone, un ester, de l'oxyde et de l'hydrocarbure en tant que constituants majeurs présentaient une activité dominante de vapeur volatile, tandis que les huiles contenant un groupe aldéhyde présentaient une activité beaucoup plus importante par diffusion (Inouye et al., 2006), ceci et en concordance avec nos résultats précédemment décris.

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et bactéricides (CMB) de l’huile essentielle d’Artemisia herba alba sont plus élevées que celles trouvées auparavant, Sbayou et al. (2014) ont obtenu une CMI et CMB de 1,25 μL/mL sur E. coli. Les résultats de Mighri et al. (2010b) sur les souches S. aureus avec une CMI de 0,62 et CMB de 5 mg/mL, et aussi sur B. cereus où la CMI était de 0,62 mg/mL et une CMB de 2,5 mg/mL. En revanche notre huile essentielle possède un effet bactéricide vu son rapport de CMB/CMI de 2 qui restera inférieur à 4. Cette activité peut être due principalement aux taux de monoterpènes oxygénés et hydrocarbures sesquiterpéniques (Rahman et al., 2016), et spécialement le pourcentage élevé de camphre présent. Ces

Discussion résultats sont en concordance avec les travaux précédents qui attribuent l’activité antibactérienne à la présence d’une bonne quantité camphre (Mighri et al., 2010a). Cependant il est possible que les composés mineurs augmentent le pouvoir antibactérien en jouant un éventuel rôle de synergie (Rahman et al., 2016). En comparant nos résultats à ceux trouvés par Benbelaïd et al. (2016), l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii a inhibé S. enteritidis par une concentration minimale plus faible qui était de 10 mg/mL, alors que sur d’autres souches ces concentrations sont plus élevées, elles sont de 1,25 mg/mL sur B. cereus, 0,63 mg/mL sur S. aureus.

À rappeler qu’une activité bactéricide totale de l’huile essentielle d’Artemisia herba alba a été atteinte après 24 h d’incubation, cette activité est proche de celle trouvée par Clemente et al. (2016) pour l’huile essentielle de moutarde qui présentait un effet létal sur E. coli après 23h. Le travail mené par May et al. (2000) a montré que l’huile essentielle de l’arbre du thé élimine S. aureus résistant à la méthicilline dans 6 h de temps. Alors que les résultats obtenus par Guinoiseau et al. (2015) ont montré une activité bactéricide de la fraction alcoolique de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus sur une souche de S. aureus dans seulement 1 heure. Ces résultats indiquent la présence de différents mécanismes d’action des huiles essentielles sur les cellules bactériennes (Burt, 2004). Le pouvoir antibactérien des huiles essentielles peut être attribué à leurs composants majoritaires, tels que les alcools terpéniques qui sont solubles dans les milieux aqueux et donc très puissants sur les cellules microbiennes (Fillippi et al., 2006) et ils sont connus par leur effet bactéricide beaucoup plus que bactériostatique (Hogg et al., 2005).

Activité antifongique Parmi les huiles essentielles étudiées, l’huile d’Artemisia herba-alba possède l’activité antifongique la plus importante. Une activité importante est traduite par un diamétre de la zone d’nhibition de 53,7 mm sur la souche d’Aspergillus niger, contrairemnt aux résultats trouvé par Vijloen et al. (2003), là où cette souche a montré une rsisitance a l’huile essentielle d’Osmitopsis asteriscoides. La zone d’inhibition retrouvée sur la souche de Fusarium oxysporum est un peu plus importante que celle trouvées pour les huiles essentielles d’Aegle marmelos, Cymbopogon winterianus et Cistus oranitum qui sont de 17, 15 et 16 mm respectivement (Pattnaik et al., 1997).

Discussion

Les résultats retrouvés sur la souche d’Aspergillus fumigatus sont proches de ceux retrouvés pour Aegle marmelos et Cymbopogon martini avec des zones d’inhibition de 30 mm. Nos résultats retrouvés sur Aspergillus fumigatus et Fusarium oxysporum sont d’une grande importance par rapport à ceux retrouvés pour l’huile d’Ageratum conyzoides, où ces deux souches fongiques étaient résistantes (Pattnaik et al., 1997). Les résultats enregistrés pour l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba et Rosmarinus tournefortii sur la souche de Penicillium sp. sont très encourageants. Plusieurs composants détectés dans les HEs d’Artemisia herba-alba et Rosmarinus tournefortii ont été rapportés comme agents antifongiques efficaces, tels que le 1,8-cinéole (Bel Hadj Salah-Fatnassi et al, 2017), α-terpinéol, terpinen-4-ol, α- pinène, β-pinène (Dorman et Deans, 2000). Il a été démontré dans la littérature que l'activité inhibitrice d'une huile essentielle résulte d'une interaction complexe entre ses différents constituants, susceptible de produire des effets additionnels, synergiques ou antagonistes, même à des faibles concentrations (Zakarya et al., 1993 ;Xianfei et al., 2007), à savoir le 1,8-cinéole associé au camphre, qui a montré des effets antimicrobiens très importants (Viljoen et al., 2003).

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF) de l’huile essentielle d’AHA trouvées sont plus élevées que celles rapportées par Abu-Darwish et al. (2015) qui étaient une CMI de 1,25 mg/mL sur Aspergillus niger et une CMI et CMF de 2,5 et 5 mg/mL sur Aspergillus fumigatus. Contrairement au modèle observé avec les bactéries, où les concentrations minimales inhibitrices et bactéricides des huiles sont souvent les mêmes ou seulement une ou deux dilutions en série différentes (Hammer et al., 1996; Hammer et al., 1999; Yu et al., 2004; Preuss et al., 2005) ; les concentrations d'huile nécessaires pour tuer les champignons sont souvent plus élevées que celles requises pour inhiber simplement leur croissance (Hammer et al., 2003).

Activité anti-oxydante

L’IC50 est inversement liée à la capacité antioxydante des huiles essentielles, car elle exprime la quantité d’antioxydants requise pour diminuer la concentration du radical libre à 50%. Plus la valeur d’IC50 est basse, plus l’activité antioxydante des extraits est importante (Laib et Barkat, 2011).

La valeur de la concentration inhibitrice 50 (IC50) trouvée pour l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba semble être plus élevée que celle trouvée dans certains travaux

Discussion précédents, Rafiq et al. (2016) ont rapporté une IC 50 de 2,33 %. Alors que l’huile essentielle d’Artemisia campestris représente une IC 50 plus basse que celle enregistrée par Akrout et al., (2011) qui est de 94,5 mg/ml. Quant à l’huile essentielle de

Rosmarinus tournefortii, une valeur d’IC50 largement supérieure à celle trouvée par Bendif et al., (2017) qui était de 4,04 mg/ml. La capacité des huiles essentielles à piéger le radical DPPH peut être due au fort pourcentage de composés oxygénés (mono et sesquiterpène) tels que le camphre, 1,8 cineole, linalool et autres qui sont connus par leur activité antioxydante (Selmi et al., 2016). En plus de la composition chimique différente (Selmi et al., 2016), la comparaison des résultats reste non fiable à raison des différents paramètres adoptés lors de l’analyse et les protocoles modifiés qui utilisent différentes concentrations de DPPH, différents solvants (méthanol, éthanol…) et aussi différents temps de réaction (15, 30 et 60 min) (Boukhalkhal et al., 2018).

La méthode ORAC est basée sur la réaction de transfert d’un atome d’hydrogène (Bendif et al. 2017), l’huile essentielle de Rosmarinus tourenfortii semble être efficace en tant qu’antioxydant à rupture de chaine, vu la valeur IC50 de 1,35 gET/g enregistrée, cette valeur est beaucoup plus importante que celle rapportée par Bendif et al. (2017) qui était de 0,14 à 0,17 gET/g d’huile essentielle. Elle aussi remarquable que la valeur ORAC de plusieurs huiles extraites à partir de thym, thym rouge, romarin, verveine citronnelle, basilic et aneth qui varient de 0,1 à 1,24 gET/g d’huile essentielle, mais reste moins importante des valeurs retrouvées pour les huiles d’origan, de clou de girofle et de cannelle qui atteignent 2,62 gET/g (Bentayeb et al., 2014). Les valeurs enregistrées pour Artemisia herba-alba et Artemisia campestris sont de moindre importance que celle retrouvées avec Rosmarinus tournefortii, mais elles restent plus élevées que les valeurs enregistrées pour plusieurs espèces de Juniperus qui ne dépasserait pas 0,027 gET/g d’huile essentielle (Zheljazkov et al., 2018). Les résultats peuvent être justifiés par la présence en quantités importantes de l’eucalyptol et de l’α-pinène dans les huiles de Rosmarinus tournefortii et d’Artemisia herba-alba, qui sont des capteurs de radicaux pyroxyles dérivés de l’APPH, souvent retrouvés dans les réactions d’oxydation des lipides (Bendif et al., 2017).

En comparant nos résultats avec ceux rapportés par Pezo et al. (2008), le pouvoir antioxydant de notre HE d’Artemisia herba-alba est moins important que celui exercé

Discussion par les huiles essentielles de cannelle, origan et de clou de girofle, alors que son activité est beaucoup plus importante que celle des huiles essentielles de romarin, gingembre, verveine citronnelle et de la propolis, qui ont présenté des pourcentages d’hydroxylation de 37,03, 60,37, 61,11 et 40,47 % respectivement. Notre HE d’Artemisia campestris est trouvée moins active que la plupart des huiles essentielles, sauf celles du gingembre et de la citronnelle. Quant à l’huile essentielle de Rosmarinus tournefortii, son pouvoir antioxydant est trop faible par rapport aux résultats précédemment retrouvés par Pezo et al. (2008). La différence de l’activité de l’huile essentielle d’une méthode à l’autre peut être due aux différents mécanismes, tels que la prévention de l’initiation, décomposition du peroxyde, prévention de l'abstraction continue de l'hydrogène, piégeage des radicaux libres, la capacité de réduction et liaison de catalyseurs à ions de transition. Il est donc important d'utiliser plusieurs méthodes d'analyse et différents substrats pour évaluer l'efficacité des antioxydants (Boukhalkhal et al., 2018).

Analyse HS-SPME-CPG-O-SM La combinaison de la chromatographie en phase gazeuse-olfactométrie avec la spectromètrie de masse (CPG-O-SM) permet l'identification des substances odorantes par le biais de la perception sensorielle humaine. En séparant les composants individuels des mélanges odorants et en combinant la perception du nez humain à la spectrométrie de masse simultanée, tout en rendant possible l’'identification des odorants dans des mélanges très complexes (Brattoli et al., 2013), tels que les huiles essentielles et les matrices alimentaires (Rusdi et al., 2016). L’analyse CPG-O-SM de nos échantillons d’huile essentielle d’AHA, AC et RT a conduit à l’identification de 61, 58 et 72 composés respectivement. En termes de nombre d’éléments odorants, nos résultats trouvés pour l’HE de RT sont proches de ceux trouvés par Rusdi et al. (2016), qui ont détecté plus de 70 composés dans l’HE de Polygonum minus. Par contre, le nombre de composés retrouvés dans nos HE est moins important que celui rapporté par Miyazawa et al. (2015) pour l’huile essentielle extraite de Magnolia obovata. Par le biais de l’olfactométrie (CPG-O), et en plus de l’identification ordinaire basée sur la comparaison des spectres de masse, nous avons identifié un nombre de 22, 28 et 32 composés odorants parmi les éléments détectés qui ont été ensuite confirmés par leurs odeurs perçues par les panélistes, ceci pour les HE d’AHA, AC et RT

Discussion respectivement. Ces résultats obtenus nous mènent à les comparer quantitativement à ceux d’autres auteurs du fait que leurs travaux réalisés sur plusieurs espèces, ils ont trouvé que le Magnolia obovata, contenait 24 composés odoriférants parmi ceux présents dans l’HE de cette plante (Miyazawa et al., 2015). Quant à Rusdi et al. (2016), ils ont identifié seulement 18 odorants présents dans l’huile essentielle de Polygonum minus. De leur part, Usami et al. (2013) ont détecté 13 et 12 composants attribuant une odeur à l’éspèce Chrysanthemum japonense dans les fleurs et les feuilles respectivement. Alors que dans la fraction volatile d’Ampelosis brevipedunculata étudiée par Nakamura and Miyazawa (2013), un total de 39 composants actifs possédant une odeur ont été identifiés dans ses branches et feuilles, dont 30 éléments proviennent des feuilles principalement. Cependant, l’OAV est un paramètre très important qui permet d’identifier les odorants clés présents dans l’huile essentielle ainsi que leur contribution pour conférer une odeur à cette substance. À noter que les composés montrant une valeur d’OAV supérieure à 1 sont considérés comme des odorants clés (Niu et al., 2019). Ainsi, il a été souvent défini que les odorants marqués par les plus fortes OAV sont connus pour contribuer le plus à la note globale du mélange (Grosch, 2001). Par conséquent, il serait bien de savoir que les odorants qui possèdent les valeurs d’OAV les plus importantes dans notre HE d’AHA sont le verbénone (OAV= 1567647,06), l’eucalyptol (OAV= 104107,69), le 4-vinylguaiacol (OAV=5258,5), le β- myrcène (OAV=2646,67), l’eugénol (OAV=1896,67) et le camphène (OAV= 381,27). Par contre, le β-pinène (OAV=10,87) et l’oxide de caryophyllène (OAV= 9,49) sont les composés présentant les plus faibles valeurs d’OAV. Tous ces composés se retrouvent parmi 14 odorants clés caractérisant l’HE d’AHA. Tandis que, nos résultats ont montré que l’huile d’AC est caractérisée par la présence des principaux odorants clés marqués par des valeurs OAV très importantes qui sont : le β-myrcène (OAV=35126,67), l’eugénol (OAV=3231,67), le β-ocimène (OAV=916,76), α-pinène (OAV=501,68) et Nérolidol (OAV=354,66), ces odorants clés sont présents entre autres éléments ce qui fait un total de 18 odoriférants clés, en revanche, les éléments présentant les plus faibles valeurs OAV étaient le camphre (OAV= 0,94), et le α-terpinéol (OAV=0,518) qui ne sont pas considérés comme éléments clés de l’odeur de l’HE d’AC et leur omission ne provoque pas de changement sur la note olfactive globale.

Discussion

Comme l’indiquent nos résultats, les valeurs d’OAV les plus élevées dans l’huile essentielle de RT reviennent aux principaux odorats clés qui sont le verbénone (OAV=272058,82), l’eucalyptol (OAV=14338,46), β-caryophyllène (OAV=6853,12), d-limonène (OAV= 1382,75), α-pinène (OAV= 728,68) et (+)-3-carène (OAV=696,13), ces composés se trouvent dans une liste de 18 odorants clés. Dans nos HE d’AHA et de RT l’eucalyptol est un odorant très actif vu sa valeur d’OAV, en comparaison avec les résultats de Kilic et al. (2004) ce composé est trouvé parmi les odorants clés les plus abondants dans les feuilles de Laurus nobilis L. Le β-myrcène qui est l’odorant le plus abondant dans notre HE d’AC, il a été trouvé par Dharmawan et al. (2009) dans l’HE des écorces de mandarine (Citrus nobilis) et fait partie des odorants clés de cette espèce avec une valeur d’OAV de 29310. Le β-caryophylène qui a été trouvé comme odorants clé dans notre HE d’AC et de RT, a été aussi trouvé par Miyazawa et al. (2015) dans l’HE de Magnolia obovata, mais avec une OAV de 787 qui est beaucoup plus élevée que celle trouvée dans notre HE de RT, par contre très faible par rapport à la valeur observée dans notre HE d’AC. Le β-pinène est un autre odoriférant clé très important puisqu’il a été trouvé dans nos trois HEs étudiées, cet élément a marqué l’huile essentielle de Citrus nobilis avec une valeur OAV de 18560 trouvée par Dharmawan et al. (2009). L’huile essentielle d’AHA est caractérisée par une odeur épicée, cet attribut est dû à la présence de plusieurs odorants clés ayant une odeur épicée et qui sont au nombre de 10 composés tels que: le verbénone, l’eugénol, le 4-vinylguaiacol, le β-Caryophyllène, δ-Cadinène, terpinen-4-ol, β-myrcène, β-pinène, α-pinène et l’oxide de caryophyllène, dont certains possèdent des valeurs OAV notables, à savoir le verbénone (OAV=1567647,06). Alors que tenant compte de la somme des OAV des composants ayant la même odeur, le caractère dominant de celui de senteur mentholée, bien que l’odeur épicée est aussi abondante. À noter aussi que l’aldéhyde cuminique présent dans notre HE d’AHA en quantité inférieure à sa limite de détection (LOD=0,4 μg/g), peut être à l’origine de cette odeur épicée vu que son OAV relative à sa LOD est de 8,16 ; en plus, les travaux réalisés par Ravi et al. (2013) ont prouvé que l’aldéhyde cuminique est responsable en grande partie de l’odeur épicée de l’huile de cumin (Cuminum cyminum L.). Une odeur boisée épicée marque notre HE d’AC, ce caractère est justifié par la présence de 9 composés possédant une senteur d’épice, suivie d’une odeur boisé marquée par la présence de 7 élément ayant ce caractère, voir même que certains d’entre 100

Discussion eux renferment ces deux caractères simultanément dont l’α-pinène, β-pinène, β- Caryophyllène et le δ-Cadinène. Dans une étude menée par Usami et al. (2013) sur l’espèce Chrysanthemum japonense, le β-Caryophyllène se trouve en deuxième position avec le camphre comme des composants contribuant à l’odeur épicée de la phase volatile de cette plante. Cependant, notre HE de RT est caractérisée par une odeur boisée, vu l’abondance de composants dont des effluves de bois en caractérisent, les senteurs épicée et mentholée de l’HE de RT sont aussi prouvées par l’existence d’odorants clés dont ces effluves dominent, notamment par le fait que certains possèdent des valeurs OAV très importantes tels que le Verbénone (mentholée, OAV=272058,82), l’eucalyptol (mentholée, OAV=14338,46) et le β-caryophyllène (épicée, OAV= 6853,12).

Toxicité aigüe et comportement

Nous rappelons que la dose létale médiane (DL50) de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba est de 615 mg/kg, en se basant sur l’échelle de Hodge et Sterner (2005) l’huile essentielle est légèrement toxique avec sa dose létale médiane qui se situe entre 500 et 5000 mg/kg. Dans notre étude, l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba était plus toxique en comparaison avec les résultats trouvés par Qnais et al. (2016) pour l’huile essentielle extraite de la même espèce collectée en Jordanie, là où la dose létale médiane qui était supérieure à 4000 mg/kg, Ainsi que Hilan et al. (2009) ont trouvé que l’huile essentielle de Prangos asperula est moins toxique avec une DL 50 de 1040 μL/kg. Tandis que Shalaby et al. (2011) ont observé une plus faible concentration de 470 mg/kg pour l’huile essentielle de Mentha longifolia L, ce qui signifie que cette dernière est plus toxique que notre huile essentielle d’Artemisia herba-alba.

Les comportements observés sur les souris dans notre présente étude sont principalement, l’hypoactivité, déséquilibre, tachypnée, tachycardie, l’isolement, les spasmes et les tremblements. Ces mêmes symptômes à l’exception des contractions musculaires ont été rapportés par Hilan et al. (2009) dans leur recherche lors de l’injection de l’huile essentielle de Prangos asperula à des souris. Ainsi, plusieurs de ces comportements ajoutés à une somnolence et à une convulsion ont été notées par Ahmed et Azmat (2014) dans leur travail lors de l’injection de l’extrait méthanolique de l’espèce Berberis vulgarisa à des souris. D’après INRS (2018), les comportements de l’augmentation du rythme cardiaque et respiratoire sont des symptômes qui traduisent

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Discussion un stress dans sa phase d’alarme, ces mêmes comportements ont été observés sur les souris recevant notre huile essentielle d’AHA, donc ils justifient que cette substance peut être considérée comme un agent stressant. Les comportements liés à une diminution de la mobilité peuvent laisser préjuger que cette huile présente un effet sédatif (Ondele et al., 2015). Alors que, pour savoir l’origine de cette toxicité de l’HE d’AHA, il serait bien de revenir à sa composition chimique et examiner les composants possédant un pouvoir toxique. D’après la composition qualitative de notre HE, la présence de l’eucalyptol et des thuyones semble être majoritairement à l’origine de cette toxicité, vu que l’eucalyptol présent à raison de 8,19 %, il a été reconnu le composé toxique de l’HE d’eucalyptus et a forte dose il est hépatotoxique et néphrotoxique (Xu et al., 2014). Quant à l'α-thuyone (12,71%, 0,1153 mg) et la β-thuyone (9,97%, 0,0986 mg), ce sont des terpènes parfois néfastes surtout connus par leur effet nocif dans l’absinthe, et qui sont présents dans plusieurs huiles essentielles, Ils bloquent les récepteurs à l’acide γ-aminobutyrique (GABA) et peuvent ainsi être à l’origine de convulsions (Höld et al., 2001). Les troubles de l’évolution pondérale remarqués pendant les jours qui suivent l’administration des HEs peuvent être provoqués par à une anorexie, qui a été aussi notablement observée, ce symptôme est cité par Bancharel (2016) comme étant un résultat d’une ingestion des HEs. Un autre paramètre pouvant être à l’origine de cette perte de poids est le stress, car Cal vez (2010) a trouvé que l’ exposition à une situation stressante provoque une modification de la prise alimentaire chez l’ homme même que chez l ’ ani mal , ce qui confirme l’ impact de notre HE sur l’ évolution pondérale. Malgré que Yashphe et al. (1979), Bailey et Danin (1981) et Tahraoui et al. (2007) ont rapporté que l’espèce Artemisia herba-alba Asso. a été utilisée en médecine traditionnelle pour traiter les rhumes, soulager le diabète, la toux, les troubles intestinaux, traiter les blessures chez l’homme et les bétails, les diarrhées, névralgie, bronchite et l’hypertension, il n’en sort pas moins que l’huile essentielle de cette même plante peut être toxique selon la dose administrée, d’où nos résultats le confirment.

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Conclusion et perspectives

Conclusion

À la lumière de nos résultats Les plantes aromatiques et médicinales sont d’une grande importance, surtout avec les vertus thérapeutiques et les activités biologiques que présentent et qui sont connues depuis l’antiquité, ces dernières continuent à faire l’objet de plusieurs recherches scientifiques à travers le monde. Ce présent travail a été consacré à l’étude des activités antimicrobiennes et antioxydantes ainsi que la composition chimique, le profil aromatique et la toxicité des huiles essentielle de trois plantes dont certaines sont connues pour leur importance en médecine traditionnelle. Les résultats obtenus sont d’une grande importance, le rendement des huiles essentielles était variable, c’est Artemisia herba-alba qui a donné un rendement important de 0,64 % ± 0,13. La composition chimique des huiles essentielles a donné 41 composés chimiques au total, les HEs d’Artemisia herba-alba et de Rosmarinus tournefortii sont majoritairement composées de camphre, quant à l’huile d’Artemisia campestris, le germacrène D était le composé le plus abondant. L’activité antibactérienne de nos HEs varie d’une espèce à l’autre et aussi selon les souches testées, une activité puissante revient à l’HE d’AHA, notamment sur les souches de Klebsiella oxytoca, Acinetobacter baumannii et Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline avec des diamètres de la zone d’inhibition allant jusqu'à 31,3 mm. L’HE de RT était de moindre activité antibactérienne avec les diamètres les importants de 19,3 et 19,7 mm sur Klebsiella oxytoca et Bacillus cereus respectivement. Alors qu’une faible activité antibactérienne a été remarquée pour l’HE d’AC par des diamètres ne dépassant pas les 15,7 mm. Une activité remarquable des composés volatils de l’huile essentielle d’AHA par méthode de microatmosphère, notamment sur la souche d’Acinetobacter baumanni avec un diamètre de la zone d’inhibition de 47,6 mm. L’HE d’AHA a montré une activité bactéricide avec un ratio CMB/CMI de 2, tandis que celle d’AC s’est présentée bactériostatique avec un ratio CMB/CMI de 4. Alors que l’huile de Rosmarinus tournefortii est d’un effet bactéricide que sur la souche de Klebsiella oxytoca. Une élimination totale des bactéries par l’HE d’AHA est atteinte après 24 h, ceci pour l’ensemble des souches traitées. L’activité antifongique sur cinq souches de moisissures a révélé que l’HE d’AHA est active sur l’ensemble des souches est notamment sur la souche d’Aspergillus niger. L’HE de RT est retrouvée active principalement sur Penicillium sp., alors que l’HE

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Conclusion d’AC n’a présenté qu’une légère activité antifongique sur Aspergillus niger. Les concentrations minimale inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF) sont variables, l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba a inhibé la souche d’Aspergillus niger à une concentration de 2,5 μl/ml, mais la concentration minimale fongicide était >20 μl/ml. L’huile essentielle de Rosmarnus tournefortii a présenté une CMI et CMF importante sur Penicillium sp. Qui étaient 2,5 et 5 μl/ml respectivement. L’activité antioxydante des huiles essentielles est trouvée très variable entre les

HEs et pour chaque méthode. La méthode DPPH montre une importante IC50 de 41,73 mg/g de l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba. Une valeur ORAC remarquable de 337,49 µmol/g HE caractérise l’huile essentielle de Rosmarnus tournefortii. L’activité anti radicalaire dans un générateur de radicaux hydroxyles en phase gazeuse a montré que l’huile essentielle d’Artemisia herba-alba est dotée d’une importante activité antioxydante avec un pourcentage d’hydroxylation réduit à 29,62 %. L’analyse HS- SPME-CPG-O-SM a abouti à l’identification de plusieurs odorants clés participant à la note globale des HEs. Plusieurs odeurs peuvent être attribuées à nos échantillons et ceci tenant compte du nombre des odorants clés et leurs valeurs OAV. Bien que l’AHA a pu être utilisé à des fins thérapeutiques, ça n’empêche que leur HEs peuvent être très toxiques voir mortelles, si elles sont prises ou administrées par injection, comme le confirme notre étude de toxicité qui a montrée des comportements anormaux de tachypnée, tachycardie et l’isolement dans un coin des animaux traités, observés avec une dose de 500 mg/kg, en plus d’une dose létale médiane de 615 mg/kg. En conclusion, l’HE d’AHA est jugée d’une grande importance vu leurs activités biologiques et sa légère toxicité, ces résultats encourageants de cette étude nous motivent à mener des expérimentations plus approfondies sur l’activité antimicrobienne notamment in vivo, ainsi que la toxicité par des méthodes histologiques selon différents modes d’administration (orale, cutanée…), pour confirmer l’innocuité de cette substance afin de pouvoir estimer son éventuelle applicabilité dans le domaine médical. Tenant compte de l’activité antioxydante de ces HEs et leurs profils aromatiques, il serait envisageable de mener des essais d’incorporation de ces substances dans certains matériaux plastiques pour créer un emballage actif, ainsi que suivre son potentiel de conservation et estimer son degré de sécurité tout en évaluant les migrations globale et spécifique de certains composés vers l’aliment conditionné.

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Annexes

Annexe 1: Composition des milieux de culture

Potato Sucrose Broth (PSB) Pomme de terre 200 g Sucrose 20 g Eau distillée 1 L pH final 5,6 ± 0.1

Potato Sucrose Agar (PSA) Pomme de terre 200 g Sucrose 20 g Eau distillée 1 l Agar 20 g Eau distillée 1 L pH final 5,6 ± 0.1

Bouillon Mueller Hinton Peptone 17,5 g Extrait de viande 2 g Amidon 1,5 g Eau distillée 1 L pH final à 25°C : 7,3 ± 0,1

Gélose Mueller Hinton Peptone 17,5 g Extrait de viande 2 g Amidon 1,5 g Agar 17 g Eau distillée 1 L pH final à 25°C : 7,3 ± 0,1

Milieu à l’extrait de malt Extrait de malt 17,5 g peptone 2 g Agar 15 g Eau distillée 1 L pH final 5,4 ± 0,2

130

Annexes

Annexe 2: Fiche technique de la fibre SMPE (Supelco, Bellefonte, États-Unis)

131

Annexes

Annexe 3: Fiche de description de l’odeur des composés perçus

Analyse : ………………………………………………………………………...... Date : ……………………………………………………………………………………... Nom du panéliste :…………………...…………………………………………………... Temps Intensité (1 à 3) Odeur

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Annexes

Annexe 4 : Liste des étalons utilisés pour calculer la limite de détection (LOD)

AHA tR N° Composés Étalons (min) 1 6,20 Epoxylinalool linalool 2 8,91 Isopropyl butanoate 1-phényl-2-butanone 3 9,51 O-xylène O-xylène 4 12,04 Octadiénone linalool 5 13.16 Non identifié - 6 13,96 Non identifié - 7 15,12 3,3,6-triméthyl-1,5-heptadien-4-ol décanol 8 15,50 3-nonénal nonanal 9 16,17 Méthylcyclopentapyrazine diethylméthyl pyrazine 10 17,92 Linalyl formate linalool 11 18,12 Aldéhyde cuminique aldéhyde cuminique 12 18,79 Non identifié - 13 19,34 Alcool cuminique aldéhyde cuminique 14 19,45 Non identifié - 15 19,53 Méthyl quinoxaline coumarine 16 20,51 Non identifié - 17 21,22 β-elemène 1-phényl-2-butanone 18 21,43 Ethyl décanoate linalool 19 22,11 Non identifié 1-phényl-2-butanone 20 22,28 Linalyl butyrate linalool 21 22,54 Isogéraniol géraniol 22 25,51 Non identifié - 23 25,55 Oxo-β-ionone 1-phényl-2-butanone 24 25,91 7-heptadécéne pentadécène AC tR N° Composés Étalons (min) 1 7,02 Éthyl isobutyrate linalool 2 12,84 5-methylfurfural 5-méthylfurfural 3 14,50 Non identifié linalool 4 15,78 Non identifié benzoate de méthyl 5 15,89 4-mercapto-4-méthyl-2-pentanol décanol 6 16,15 (E)-rose oxide 1-phényl-2-butanone 7 16,88 (E)-2-nonenal nonanal 8 17,03 Éhylbenzaldéhyde benzaldéhyde 9 17,64 (E,Z)-2,4-nonadiénal (E,Z)-2,4-nonadiénal 10 18,08 Octanoate d’éthyl linalool 133

Annexes

11 18,94 D-carvone carvacrol 12 20,64 Dihydrocarvyl acétate carvacrol 13 25,25 Tridécanol décanol RT tR N° Composés Étalons (min) 1 8,8 Méthylbutanone linalool 2 12,43 Octanone linalool 3 13,53 2,4-heptadiénal linalool 4 13,79 (E)-β-ocimène linalool 5 14,31 β-phellandrène linalool 6 14,84 2,4-heptadiénal linalool 7 16,17 Périllen 1-phényl-2-butanone 8 17,01 L-menthol l-menthol 9 17,27 Non identifié - 10 17.72 Epoxy-p-menthène mentol 11 17,95 (E)-carvéol carvacrol 12 18,06 Isobornyl formate linalool 13 18,25 Octanoate d’éthyle linalool 14 18,35 L’Acide isobutyric acide valérique 15 19,19 Géranial géraniol 16 19,79 Non identifié - 17 20,89 2-undécenal nonénal 18 21,01 Eugénol eugénol 19 22,55 Octanoate de butyl linalool 20 22,80 Méthyl eugénol méthyl eugénol 21 22,99 Citronellyl isobutyrate linalool 22 23,29 α-farnésène linalool 23 23,36 Laurate de méthyl linalool 24 24.12 Benzoate d’isopropyl benzaldéhyde

134

Annexes

Annexe 5 : Fiche descriptive du comportement (Test d’Irwin)

Groupe d’animaux A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10

Observation Posture corporelle Activité locomotrice Comportement anormal

(Déséquilibre) Exophtalmie Tremblement Sursaut spontané Tachycardie Tachypnée Réflexe de redressement L’isolement dans le coin Cris

Annexe 6: Courbes des pourcentages d’inhibition en fonction des différentes concentrations d’huiles essentielles

Artemisia herba-alba

80,00 70,00 y = 0,8265x + 15,509 60,00 R² = 0,966 50,00 40,00 Artemisia herba-alba 30,00 20,00 Linéaire (Artemisia herba-alba) 10,00 Pourcentage d'inhibition % d'inhibition Pourcentage 0,00 0 20 40 60 80 Concentration d'HE en mg/g

135

Annexes

Artemsia campestris

90 80 y = 0,2409x + 37,125 70 R² = 0,9693 60 50 Artemsia campestris 40 30 Linéaire (Artemsia 20 campestris) 10 Pourcentage d'inhibition % d'inhibition Pourcentage 0 0 50 100 150 200 Concnetration d'HE

Rosmarinus tournefortii 80 70 y = 0,315x + 15,88 60 R² = 0,981 50 40 Rosmarinus tournefortii 30 20 Linéaire (Rosmarinus tournefortii) 10 Pourcentage d'inhibition % d'inhibition Pourcentage 0 0 50 100 150 200 Concentration d'HE en mg/g

136

Annexes

Annexe 7: Courbe d’étalonnage de l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque, concentration du DHB quantifié en présence des huiles essentielles

Coube d'étalonnage de l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) 4000000 y = 6E+06x + 8152,8 3500000 R² = 0,9999 3000000 2500000 Courbe d'étalonnage de 2000000 l'acide 2,5- dihydroxybenzoique 1500000 Linéaire (Courbe

Surface pic du Surface 1000000 d'étalonnage de l'acide 2,5- 500000 dihydroxybenzoique) 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Concentartion du DHB en µg/g

Figure A: Courbe d’étalonnage de l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque

0,9 0,8 0,7 Témoin 0,6 Artemisia herb-alba 0,5 0,4 Artemisia campestris 0,3 Rosmarinus tournefortii 0,2 Concentration du DHB en µg/g en DHB du Concentration 0,1 0

Figure B: Concentration du 2,5-DHB quantifié en présence des huiles essentielles

137

Annexes

Annexe 8 : Tableau des résultats de l’évolution pondérale

Groupes d’animaux/Doses Poids (g) Souris/sexe (mg/mL) J J+5 J+10 J+15 J+20 J+22 Témoins T1/mâle 14,2 16,1 19,5 23,1 25,9 26,6 T2/mâle 17,7 19,1 22,3 24,9 27,8 28,3 T3/mâle 26,8 28,3 29,8 32,7 34,1 34,9 T4/femelle 19,8 20,7 23,1 25,4 28,2 29 T5/mâle 33,3 34,8 36,4 38,2 39,4 39,9 T6/mâle 35 36,1 37,8 38,9 40,6 41,1 T7/mâle 29,8 31,3 33,4 35,3 36,9 38,8 T8/mâle 34,7 35,8 37,5 38,9 39,7 40,2 T9//femelle 24,9 26,3 28,7 31,1 34,4 34,7 T10/femelle 18,1 20,1 22,5 24,7 27,3 28,1 A/45 (mg/mL) A1/mâle 16,3 18,2 21,1 23,8 26,5 27 A2/femelle 24 26,4 28,5 31,2 34,3 34,9 A3/mâle 27,3 28,3 29,8 32,7 34,1 34,9 A4/femelle 14,9 17,1 19,9 23,2 26,1 26,9 A5/femelle 19,1 21,9 23,4 25,6 28,2 29 A6/mâle 32,7 34,9 36,1 38,3 39,7 39,9 A7/mâle 31,9 33,1 34,7 36,1 37,9 38,2 A8/femelle 19,9 21,7 23,1 25,4 28,2 29 A9/femelle 24,9 26,3 27,9 29,3 31,9 32,1 A10/femelle 18,1 20,9 22,7 24,9 26,4 26,8 B/50 (mg/mL) B1/femelle 15,4 17 19,8 23,1 26,2 26,7 B2/mâle 23,7 25,3 27,1 29,1 31,3 31,4 B3/femelle 17,9 19,2 21,1 23,5 25,6 26 B4/femelle 22,1 24,6 26 27,9 29,3 29,5 B5/mâle 28 29,9 30,9 32,8 34,3 34,6 B6/femelle 18,7 20,4 22,4 23,9 25,7 26 B7/mâle 29,9 Mort de la souris B8/femelle 19,3 20,9 22,3 23,9 25,3 25,7 B9/mâle 32,8 33,9 35,1 36,2 37,1 37,3 B10/femelle 23,7 25,2 27,4 29,9 31,3 31,9 C/55 (mg/mL) C1//femelle 22,9 Mort de la souris C2/femelle 16,1 16,2 16,1 17,9 19,4 19,7 C3/mâle 33,4 Mort de la souris C4/femelle 24,8 24,8 24,9 25,8 27,1 27,3 C5/femelle 25,2 Mort de la souris C6/femelle 25,3 25,9 26,1 27 28,6 28,9 C7/mâle 26,9 26,9 27,1 28,2 29,8 30,4 C8/femelle 19,4 19,5 19,5 20,6 21,7 21,9 C9/mâle 30,8 Mort de la souris C10/mâle 31,4 31,5 31,4 32,9 34,4 34,7 D/60 (mg/mL) D1/femelle 17,9 17,9 18 18,2 19,9 20 D2/femelle 26,8 26,8 26,9 27,3 27,9 28,4 D3/femelle 25,7 27,6 27,7 27,8 28,4 28,6 D4/femelle 15,8 15,9 16,1 16,1 16,9 17,5 D5/femelle 18,8 D6/femelle 17,7 Mort des souris D7/femelle 22,9 D8/mâle 34,5 34,5 34,5 35,1 36,9 37,3 D9/mâle 31,8 Mort de la souris 138

Annexes

D10/mâle 28,7 Mort des souris E/65 (mg/mL) E1/femelle 14,9 E2/femelle 19,2 19,6 19,5 20,2 22,8 23,2 E3/femelle 18,6 E4/femelle 24,8 Mort des souris E5/mâle 29,9 E6/mâle 34,7 E7/femelle 23,8 23,9 23,6 24,9 27,4 27,9 E8/femelle 19,5 Mort des souris E9/femelle 22,9 E10/mâle 30,1 30,4 30,3 32,5 34,9 35,5 F/70 (mg/mL) F1/femelle 27,8 F2/mâle 34,4 F3/femelle 16,3 Mort des souris F4/mâle 29,1 F5/femelle 19,8 F6/femelle 24,9 24,9 24,6 24,8 26,6 28,8 F7/femelle 22,1 F8/mâle 32,1 Mort des souris F9/femelle 25,5 F10/femelle 26,9 26,9 26,7 27,3 29,1 30,3 G/75 (mg/mL) G1/femelle 14,1 G2/mâle 33,8 Mort des souris G3/mâle 28,7 G4/femelle 19,2 G5/femelle 19,7 19,8 20,1 20,3 22,6 24,1 G6/mâle 32,9 G7/femelle 26,7 G8/femelle 28,5 Mort des souris G9/femelle 23,9 G10/femelle 17,8 H/80 (mg/mL) H1/mâle 27 27,1 27,2 27,2 27,9 28 H2/femelle 24,6 H3/femelle 15,9 H4/mâle 34,9 H5/femelle 14,2 H6/mâle 29,3 Mort des souris H7/femelle 17,7 H8/mâle 32,3 H9/femelle 25,7 H10/femelle 23,4 I/85 (mg/mL) I1/mâle 28,8 I2/mâle 34,7 I3/mâle 28,1 I4/femelle 19,6 I5/femelle 26,6 Mort des souris I6/femelle 18,7 I7/femelle 24,5 I8/femelle 25,5 I9/femelle 26,7 I10/femelle 15,5

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Industrial Crops & Products 116 (2018) 137–143

Contents lists available at ScienceDirect

Industrial Crops & Products

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Artemisia herba-alba Asso. essential oil antibacterial activity and acute T toxicity ⁎ Anis Bertellaa, , Kheira Benlahcena, Sidaoui Abouamamaa, Diana C.G.A. Pintob, Karim Maamara, ⁎ Mebrouk Kihala, Artur M.S. Silvab, a Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biology, Faculty of Life and Natural Sciences, University of Oran 1 Ahmed BenBella, 31100, Algeria b Department of Chemistry & Organic Chemistry, Natural Products and Food Stuﬀs (QOPNA), University of Aveiro, Campus de Santiago, 3810-193 Aveiro, Portugal

ARTICLE INFO ABSTRACT

Keywords: Artemisia herba-alba Asso., known as the desert wormwood, is a medicinal plant and its essential oil is used in Artemisia herba-alba Asso. Algerian herbal medicine. In the present study the in vitro antibacterial activity against 21 bacterial strains and Essential oil chemical composition of Artemisia herba-alba essential oil were investigated. The acute toxicity by determination Antibacterial activity of the median lethal dose was also studied. The results of gas chromatography/mass spectrometry analysis of the Median lethal dose essential oil gave 19 compounds accounting for 98.7% and the major constituent was camphor with an amount Camphor of 50.7%. A significant antibacterial effect was observed with important zones of inhibition against Klebsiella oxytoca (31.3 mm) by disc diffusion method and against Acinetobacter baumannnii (47.6 mm) by micro- atmoshphere method. The minimum inhibitory concentration and the minimum bactericidal concentration − − values were ranging from 5 to 10 mg mL 1 and 10–20 mg mL 1, respectively. Moreover, their ratio exhibited by the essential oil was 2. The bactericidal end point was achieved after 24 h of exposure to the essential oil, for all − the bacteria assayed. The oil was slightly toxic with a median lethal dose of 615 mg kg 1. The results of this study suggest that the essential oil of Artemisia herba-alba can be a source of natural antibacterial agents with potential pharmacological applications.

1. Introduction Mediterranean region spreading into middle east, north-western Hi- malayas and India (Vernin et al., 1995). In Algeria, A. herba-alba is Infection diseases caused by the bacterial species are becoming a abundant in the arid areas, steppes and Sahara (Dahmani-Hamzaoui serious therapeutic problem (Soković et al., 2007), notably with the and Baaliouamer, 2010). The essential oil of A. herba-alba (known as increase of drug resistant pathogens (Prabuseenivasan et al., 2006) that armoise oil) is historically known in traditional and herbal medicine. appear by the broadly and inappropriate use of antibiotics (Sbayou Numerous scientists have showed various biological and pharmacolo- et al., 2014). This bacterial resistance developed versus the current gical effects in the oil, especially antimicrobial (bacteria and fungi) antibiotics and the demands for natural compound exhibiting anti- (Hudaib and Aburjai, 2006). microbial activity have motivated the researchers to investigate the Essential oils are generally known as non-phytotoxic compounds efficiency of new antimicrobial agents, such as essential oils and ex- with potential activity against microorganisms, except when they are tracts from plants (Alim et al., 2009; Rahman et al., 2011). Hence es- inappropriately used and consequently can lead to harmful effect on sential oils and plant extracts are promising new sources of natural human health (Mizanur-Rahman et al., 2013). alternatives to drugs (Rahman et al., 2011), this is relative to their To the best of our knowledge, there are no available reports on the anticancer, antinociceptive, antidiabetic, antiviral, antibacterial and toxicological effects of Artemisia herba-alba essential oil growth in antioxidant properties (Luciardi et al., 2016). Algeria, and the antibacterial effect by gaseous contact. Thus, the aim of Artemisia herba-alba Asso. (syn: A. inculta Del.), known as the desert the present study is to investigate the chemical composition and the wormwood (Sheeh in arabic), is a medicinal and aromatic dwarf shrub antibacterial activity of Artemisia herba-alba essential oil, and its acute belonging to the genus Artemisia, Asteraceae family and Anthemideae toxicity by the determination of the median lethal dose (LD50). tribe (Hudaib and Aburjai, 2006; Dahmani-Hamzaoui and Baaliouamer, 2010; Tilaoui et al., 2011), that grows wild in arid areas of the

⁎ Corresponding authors. E-mail addresses: [email protected] (A. Bertella), [email protected] (A.M.S. Silva). https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.02.064 Received 22 October 2017; Received in revised form 20 February 2018; Accepted 20 February 2018 Available online 27 February 2018 0926-6690/ © 2018 Elsevier B.V. All rights reserved. A. Bertella et al. Industrial Crops & Products 116 (2018) 137–143

− 2. Materials and methods 1.2 mL min 1. The mass spectrometer conditions were as follow: ionization voltage 70 eV; ion source temperature 150 °C; electron ionization 2.1. Plant material mass spectra were acquired over the mass range 50–550 m/z. From total ion chromatogram the peaks were identified by com- Aerial parts of A. herba-alba Asso. were collected at the flowering paring their mass spectra with the equipment mass spectral library stage in October-November 2015from a population located at Bouilef in (NIST 14 Mass Spectral and Wiley Registry™ of Mass Spectral Data), by Batna province, east of Algeria (GPS Coordinates: Latitude 35° 35ʹ comparing the retention times and mass spectra data with standard 55.707 Nʺ, Longitude 6° 12ʹ 53.942 Eʺ and Altitude 988 m). The species compounds, injected in the same chromatographic conditions and by was identified by Professor Hadjadj-Aoul Seghir and stored as a voucher comparison of their retention index, relative to a standard mixture of n- specimen (02888) in the plant Herbarium of the department of Biology, alkanes. University of Oran 1 Ahmed BenBella, Algeria. For quantification purposes of the major constituents, the internal standard method was applied and the amount of metabolites present was 2.2. Standards and reagents achieved from the calibration curves obtained by pure standard compounds. All the injected samples and standards solutions contain a fixed Dichloromethane p.a. was supplied by Panreac, while tetracosane quantity of internal standard (tetracosane). A calibration curve was ob-

(99%) and n-paraffin mixtures (C5-C8,C7-C10,C10-C16,C18-C24,C24-C36, tained by injection of five to seven known concentrations of each standard: 2 C25-C35) were supplied by Supelco Inc. Carvacrol (99%), geranyl (−)-trans-caryophyllene (y = −1.67 + 12.62x; r = 1.00); α-terpineol acetate (98%), α-terpineol (98%), geraniol (98%), cineol (99%), (R)- (y = −1.80 + 9.74x; r2 = 1.00); (+)-guaiol (y = −1.00 + 11.62x; limonene (97%), (S)-limonene (96%), β-pinene (99%), α-pinene r2 = 1.00); geranyl acetate (y = −0.19 + 13.28x; r2 =1.00); β-pinene (> 85%), (−)-camphen (85%) and eucalyptol (99%) were supplied by (y = −0.42 + 8.02x; r2 = 1.00); carvacrol (y = 0.06 + 8.97x; r2 = 1.00), Sigma-Aldrich, while (+)-aromadendrene (> 97%), (−)-alloar- where y corresponds to the standard peak area/internal standard peak area omadendrene (> 98%), (+)-guaiol (> 98%), (+)-calarene (> 99%), ratio and x corresponds to the standard mass. Values of correlation coeffi- (−)-globulol (99%), (+)-β-cedrene (97%), (−)-α-cedrene (99%), cients confirmed linearity of the calibration plots. The concentrations of the (−)-trans-caryophyllene (99%), (−)-α-copaene (96%), (−)-α-cube- standards were chosen in order to guarantee the quantification of each bene (> 98%), (−)-α-gurjunene (> 97%), (+)-γ-gurjunene (> 98%) compound in the samples by intrapolation in the calibration curve. Results and sodium sulfate were purchased from Fluka. Streptomycin (10μg) were expressed as mean ± standard deviation of three independent assays. was purchased from BIO-RAD.Mueller-Hinton Agar and Mueller-Hinton Thepercentageofeachgroupedcompoundsandofthetotalidentified Broth were purchased fromHiMedia and OXOID, respectively. Finally, compounds error presented were obtained by propagation of uncertainty. dimethylsulfoxide was purchased from BIOCHEM Chemopharma. 2.6. Antibacterial activity 2.3. Bacterial strains 2.6.1. Disc diffusion assay The antibacterial activity was studied against 21 bacterial species; 6 Antibacterial activity was tested by disc diffusion method as de- from the American Type Culture Collection: Staphylococcus aureus ATCC scribed by Sfeir et al. (2013), with some modifications. One mL of a

25923 (MSSAA1), Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSAA1), Bacillus bacterial suspension (adjusted to a bacterial density of 7 −1 cereus ATCC 11778 (BCA1), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1.0 × 10 UFC mL ) is seeded in the Petri dishes containing Mueller- (PAA1), Escherichia coli ATCC 25922 (ECA1) and Klebsiella pneumoniae Hinton agar (MHA), then the excess is removed by aspiration. A sterile ATCC 70603 (KPA1), 15 strains isolated from in-patients; 3 strains of paper disc (6 mm diameter) was aseptically placed on the inoculated Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSAB1, MRSAB2 and plates on which 6 μL of pure essential oil were added. Then, plates were MRSAB3), 5 strains of extended spectrum β-lactamase producing bac- kept for 15 min at room temperature (only one disc was tested per teria: 2 Escherichia coli (ESBL ECB1 and ESBL ECB2), 2 Klebsiella pneu- plate). After 24 h of incubation at 37 °C, the inhibition zones were nomoniae (ESBL KPB1 and ESBL KPB2) and Proteus mirabilis (ESBL PMB1), measured in mm. Streptomycin 10 μg/disc was used as a positive con- 7 strains of sensitive bacteria: Staphylococcus epidermidis (SEpiB1), trol. All experiments were done in triplicate. Staphylococcus haemolyticus (SHB1), 2 Acinetobacter baumannii (ABB1 and Referring to the inhibition zone diameter, the sensitivity of bacterial ABB2), Proteus mirabilis (PMB2), Salmonella enteritidis (SEntB1) and strains to the essential oil was classified as follow: not sensitive for a Klebsiella oxytoca (KOB1). diameter smaller than 8 mm, moderately sensitive (+) for a diameter ranging from 8 to 14 mm, sensitive(++) for a 14–20 mm diameter, and 2.4. Essential oil isolation very sensitive (+++) for a diameter larger than 20 mm (Sfeir et al., 2013). Samples of dried (in the dark, at room temperature and inert at- mosphere for 20 days) and ground aerial parts (200 g each sample) of A. 2.6.2. Microatmosphere test herba-alba were hydrodistilled for 3 h in a Clevenger-type apparatus to The diffusion of active volatile components of essential oil was as- obtain the essential oil. Each sample was extracted twice. Essential oil sessed by the microatmosphere method, which was done as described was dried over anhydrous sodium sulfate (Na2SO4) and stored in sealed by Raho-Ghalem and Mohamed (2008). vials protected from light at 4 °C until analysis. After spreading 100 μL of a bacterial suspension − (1.0 × 107 UFC mL 1) in Petri dishes of 85 mm diameter containing 2.5. Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis and 20 mL of MHA, a sterilized filter paper disc of 25 mm was placed in the quantification centre of the Petri dish lidand soaked with 50 μL of pure essential oil. The plates were then sealed with parafilm tape and incubated at 37 °C The isolated volatile compounds were analysed by GC/MS, using a for 24 h. Then the diameter of the inhibition zone was measured for Shimadzu GC/MS-QP2010 ultra chromatographer. The fused DB-5 ca- three repetitions. pillary column (the same as that used in the GC/FID analysis). The oven temperature was programmed at 50 °C for 3 min, then 2 °C/min to 2.6.3. Determination of MIC and MBC 250 °C, and then left at 250 °C for 10 min. The injection port tempera- Minimum inhibitory concentration (MIC) was determined using the ture was 250 °C and that of the detector was 280 °C (split ratio: 1/100). method described by Mizanur-Rahman et al. (2013), with the following He (99.995% purity) was the carrier gas with a flow rate of modifications: essential oil was diluted in DMSO (40% v/v) that is

138 A. Bertella et al. Industrial Crops & Products 116 (2018) 137–143 added to Mueller-Hinton broth (MHB) to obtain concentrations ranging 2.8. Statistical analysis − − from 80 to 0.67 mg mL 1 (80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.67 mg mL 1), and negative control, consisting of MHB with DMSO (40%, v/v), was Statistical analysis was carried out using Graph Pad Prism 5. Data prepared, the final concentration of DMSO in the assay did not exceed obtained was analysed through unpaired Student’s test or ANOVA 1%. Then an overnight culture of each strain were adjusted in spec- combined with Tukey’s test. P values of less than 5% (p< 0.05), were trophotometer with sterile physiological solution to give a final density considered to be significant. − of 0.5 McFarland (1.0 × 107 UFC mL 1) and 100 μL aliquots from this suspension is added to each tube. After 24 h of incubation at 37 °C, MIC 3. Results and discussion was determined as the lowest concentration of the essential oil in- hibiting visible bacterial growth. 3.1. Chemical composition of the A. herba-alba essential oil To determine the minimum bactericidal concentration (MBC), an aliquot of 10 μL from each tube presented no visible growth were The yellowish essential oil obtained by hydrodistillation of the spread on MHA dishes (Sfeir et al., 2013). The MBC was the lowest aerial part from A. herba-alba yielded 0.6% (v/w). The analysis of the concentration that gives no culture on the agar plates after 24 h at 37 °C oil by GC–MS gave 19 different compounds representing 98.3% of the (Mizanur-Rahman et al., 2013). MIC and MBC are expressed in mg total composition. The components are listed in Table 1, according to − mL 1 and each assay was repeated thrice. The ratio MBC/MIC is used their retention time in the fused DB-5 capillary column. The essential to classify antimicrobials in accordance to their bactericidal activity oil was mainly constituted of oxygenated monoterpenes (92.6%) fol- (MBC/MIC lower than 4) or bacteriostatic (higher than 4) (Sbayou lowed by monoterpene hydrocarbons (3.2%), the most abundant com- et al., 2014). pound found was camphor representing 50.5% of the total amount and − 0.5102 mg mg 1 of essential oil (Table 1). Other major constituent detected are α-thujone (12.7%; 0.1153 mg), b-thujone (10.0%; 2.6.4. Time-kill assay 0.0986 mg), eucalyptol (8.2%; 0.0913 mg), chrysanthenone (8.2%; The time kill procedures were done according to the method de- 0.0911 mg). The remaining components were present in trace amounts scribed by Guinoiseau et al. (2015). An overnight culture of each strain that could not be quantified our with amounts lower than 0.09 mg. fi were adjusted in spectrophotometer to give a nal density of 0.5 Referring to the camphor, this chemotype amount (50.5%; 0.5102 mg) 7 −1 McFarland (1.0 × 10 UFC mL ) then diluted to 1/20. 1 mL of this was similar to that reported by Dahmani-Hamzaoui and Baaliouamer, inoculum was transferred into 9 mL of MHB-Tween 80 (0.01% v/v) (2010), with a percentage of camphor of 49.3%, found in A. herba-alba fi with a concentration of essential oil corresponding to the MIC, the nal growth wild in Boussaada region (Algeria). However, Belhattab et al. 5 −1 suspensions contain approximately 5.0 × 10 UFC mL were in- (2014) reported a percentage of 17.3% for the plant collected in the μ cubated at 37 °C for 24 h under agitation. Aliquots (100 L) are taken in same region. An interesting fact is that the camphor percentage varies duplicate each two hours, and serially 10-fold diluted, plated onto MHA (17.3–33.1%) with the region from where the A. herba-alba was col- in order to count viable cells after incubation at 37° C for 24 h. The limit lected (Dob and Benabdelkader, 2006; Belhattab et al., 2014). Being the fi 2 of quanti cation by this method is 10 CFU. major compound in the essential oil of the plants collected in M’sila (19.4%; Dob and Benabdelkader, 2006), in Benifounda (33.1%; Belhattab et al., 2014), in Boussaada (49.3%; accordingly to Dahmani- 2.7. Acute toxicity (Lethal dose 50) Hamzaoui and Baaliouamer, 2010 report) and in Bouilef, herein reported. In the other regions the major compound reported is α-thujone 2.7.1. Animals (from 23.5 to 28.1%; Belhattab et al., 2014), compound that is also A population of 100 NMR-I mice (25–40 g) of either sex was divided found in A. herba-alba from Bouilef but in lower percentage. Other in- into 10 groups (10 mice each) and used in this study. The mice were teresting compounds are chrysanthenone, also found in A. herba-alba fasted for 12 h before weighing and all animals were used only once in from other regions [from 3.2 to 19.0% (Dob and Benabdelkader, 2006; this experiment. Dahmani-Hamzaoui and Baaliouamer, 2010; Belhattab et al., 2014)], and eucalyptol, found in much less percentage [from traces (Dob and 2.7.2. Preparation of different doses of essential oil Benabdelkader, 2006) to 13.4% (Dahmani-Hamzaoui and Baaliouamer, − Doses in serial of 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 and 85 mg mL 1were 2010)]. The amount, herein reported, for these compounds is similar to prepared by diluting essential oil in Tween 80 (1% v/v) as reported by the one found in the plant collected in Boussaada for chrysanthenone Hilan et al. (2009). (Belhattab et al., 2014) and the ones found in plants collected from Benifouda, Bougaa, and Boussaada for eucalyptol (Belhattab et al., 2014). Finally, β-thujone is highlighted due to the fact that in the 2.7.3. Determination of the median lethal dose (LD50) Bouilef A. herba-alba essential oil is one of the major compounds Essential oil was administrated by intraperitoneal injection to each (Table 1) and its amount is only significant in the plants collected in −1 group in a proportion of 0.01 mL g of mice body weight, one group M’sila (15.0%; Dob and Benabdelkader, 2006) and in Bougaa (7.8%; served as vehicle control received Tween 80 (1% v/v). The animals Belhattab et al., 2014). were placed under observation for 24 h and symptoms of toxicity were The results herein reported joined with previous ones emphasise the noted. The mortality rate was checked for each group during the next influence of the plant origin in the chemical composition of its essential 22 days. By the end of the experiment period, dead animals were oil, fact that was already found in southern Tunisia A. herba-alba es- counted to calculate the LD50 using the arithmetic method of Karber sential oil (Mohse and Ali, 2009). reported by Ahmed and Azmat (2014). −Σ 3.2. Antibacterial activity LD50 =LD100 (a × b)/n n = entire number of animals in a group. a = the difference between 3.2.1. Disc diffusion assay two successive doses of administered substance. b = the mean number The antibacterial activity of A. herba-alba essential oil was pre- of dead animals noted for two successive doses. LD100 = Lethal dose liminary tested by disc diffusion method against 21 bacterial strains. As provoke the death of all test animals (100%). showed in Table 2, the essential oil have a variable antibacterial ac- Hodge and Sterner (2005)scale was used to evaluate the toxicity of tivity against most bacteria assayed, an important effect was noticed the essential oil after comparing the LD50. against S. aureus MRSAB2, A. baumannii ABB2, S. aureus MRSAB3, S.

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Table 1 Chemical composition of Artemisia herba-alba essential oil.

Rt Retention indexes Identiﬁed Compoundsx Class % Amounty

[1] [2] Rind Rind

8.535 948 948 α-Pinene a < 0.4 tr 9.324 950 953 Camphene a 2.42 ± 0.16 0.0086 ± 0.0006 10.755 943 943 β-Pinene a < 0.4 tr 11.496 958 958 β-Myrcene a < 0.4 tr 13.011 1051 1052 α-Terpinene a < 0.4 tr 13.505 1040 1042 p-Cymene a < 0.4 tr 13.862 1059 1059 Eucalyptol b 8.19 ± 0.31 0.0911 ± 0.0014 15.572 998 998 γ-Terpinene a < 0.4 tr 18.243 1107 1106 Filifolone a 1.46 ± 0.06 tr 18.673 1110 1110 α-Thujone b 12.71 ± 0.12 0.1153 ± 0.0022 19.428 1115 1115 b-Thujone b 9.97 ± 0.09 0.0986 ± 0.0024 19.674 1120 1119 Chrysanthenone b 8.19 ± 0.19 0.0913 ± 0.0014 21.310 1122 1121 Camphor b 50.47 ± 0.47 0.5102 ± 0.0021 22.364 1113 1114 Pinocarvone b 2.32 ± 0.03 0.0305 ± 0.0014 23.633 1137 1137 4-Terpineol b 0.78 ± 0.01 tr 36.221 1221 1221 α-Copaene c < 0.4 tr 42.761 1515 1515 Germacrene D c 0.62 ± 0.02 tr 48.556 1537 1536 Spathulenol d 0.94 ± 0.04 tr 48.625 1506 1507 Caryophyllene oxide d 0.60 ± 0.08 tr 88.195 ––Internal standard (tetracosane) –– Monoterpene hydrocarbons a 3.18 ± 0.30 Oxygenated monoterpenes b 92.63 ± 0.61 Sesquiterpene hydrocarbons c 0.95 ± 0.03 Oxygenated sesquiterpene d 1.54 ± 0.09 Total identified compounds – 98.30 ± 0.69 x Compounds were identified by: i) comparison with pure standards; ii) comparison with the GC–MS spectral libraries NIST14.lib and WILEY229·LIB; iii) comparison with spectra found in the literature; iv) interpretation of pattern fragmentation MS spectrum. [1]Rind – Retention index against C5-C35 n-alkanes; [2]Rind – NIST14.lib retention index. ymg of compound/mg of essential oil. tr – traces. Data were analysed through unpaired Student’s test or ANOVA combined with Tukey’s test. P values of less than 5% (p < 0.05), were considered to be significant.

aureus MRSAB1, A. baumannii ABB1 and K. oxytoca KOB1which were very contact assay that depends mainly on the diﬀusibility and solubility, sensitive with an inhibition diameter of 26.3, 27.3, 28, 28.3, 30.6 and contrarily to the microatmosphere method that depends upon the vo-

31.3 mm respectively. Furthermore, S. aureus MRSAA1 and B. cereus latility of essential oil compounds (Dobre et al., 2010). BCA1 were tightly less sensitive with an inhibition zone of 21.3 and 24 mm. In addition, S. aureus MSSAA1, P. mirabilis ESBLPMB1, P. mirabilis 3.2.3. Determination of MIC and MBC PMB2 and S. haemolyticus SHB1were sensitive with an inhibition zone Referring to the large inhibition zones observed with disc diffusion ranging from 16.3 to 17.6 mm. On the other hand, the other strains method, the MIC and MBC were determined for 11 very sensitive bac- were moderately sensitive to the essential oil with an inhibition zone terial strains that showed a diameter of inhibition above 20 mm and the below 14 mm while P. aeruginosa PAA1 was highly resistant. The results results are reported in Table 4. The lowest MIC and MBC were 5 and herein presented were similar to a previous study using A. herba-alba −1 10 μLmL are noticed against S. aureus MRSAA1, S. aureus MRSAB1, done by Zouari et al. (2010) against E. coli (11.3 mm) and B. cereus and B. cereusBCA1. All other bacteria have a higher MIC and MBC with − (23 mm) and P. aeruginosa PAA1 (0 mm), also that carried by Mighri 10 and 20 mg mL 1. Those concentrations are upper than the doses et al. (2010) against S. aureus SASMA1 (17.7 mm). P. aeruginosa was also found for A. herba-alba essential oil by Sbayou et al. (2014), against − resistant to A. herba-alba essential oil (Zouari et al., 2010; Sbayou et al., E.coli (MIC and MBC 1.25 μLmL 1) and the result of Mighri et al. − 2014) this can be due to the intrinsic resistance to the antimicrobial and (2010) against S. aureus (MIC 0.62, MBC 5 mg mL 1) and B. cereus (MIC − antibiotics presented by P. aeruginosa, which is related to its outer 0.62, MBC 2.5 mg mL 1). In fact, our essential oil showed a significant membrane nature (Mann et al., 2000). Moreover, the antibacterial ac- bactericidal activity as specified by the ratio MBC/MIC of 2 that is < 4. tivities of A. herba-alba essential oil were in some cases very similar to This activity could be related to the amounts of oxygenated mono-and streptomycin and in others lower (Table 2). However, the results that sesquiterpene hydrocarbons (Rahman et al., 2011) and especially to the must be highlighted are the cases of Escherichia coli ESBL ECB1, Kleb- high percentage of camphor present in the oil. These results are in siella pneumoniae ESBL KPB2, and Proteus mirabilis ESBLPMB1, bacteria agreement with the previous findings that attribute the potential anti- that are resistant to Streptomycin (Table 2). bacterial of A. herba-alba essential oil to the presence of an important quantity of camphor (Mighri et al., 2010). However, it is possible that 3.2.2. Microatmosphere test the minor compounds give rise to the antibacterial activity by synergic The antibacterial activity by gaseous contact of the essential oil was interactions (Rahman et al., 2011). tested for the strains found very sensitive in the previous experiment. As showed in Table 3, the essential oil exhibited an important activity 3.2.4. Time-kill assay against all the strains tested and especially against A. baumannii ABB1, The time kill procedure was used to evaluate the kinetic of the A. baumanniii ABB2 and B. cereus BCA1, with a diameter of inhibition of bactericidal activity of the essential oil, being the results summarized in 48, 47.6 and 44.3 mm, respectively (Fig. 1). The less sensitive bacteria the time kill curves (Fig. 2A). The bactericidal end point was achieved to the volatile compounds of A. herba-alba essential oil was K. oxytoca after 24 h of exposure to the essential oil for all bacterial strains tested.

KOB1 with an inhibition zone of 22.6 mm (Fig. 1). This difference in the This activity was nearly closer to that reported by Clemente et al. activity could be relating to the fact that disc diffusion assay is a direct (2016) for mustard essential oil, which present a lethal effect after 23 h

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Table 2 Antibacterial activity of Artemisia herba-alba essential oil.

Bacteria Diameter of the inhibition zone (mm ± SD)

A. herba-alba essential oil (6 μL/disc)x Streptomycin (10 μg/disc)

Gram(+)

Staphylococcus aureus MSSAA1 16.3 ± 0.5 14.3 ± 0.5

Staphylococcus aureus MRSAA1 21.3 ± 0.5 15.3 ± 0.5

Staphylococcus aureus MRSAB1 28.3 ± 0.5 16 ± 1

Staphylococcus aureus MRSAB2 26.3 ± 0.5 15.6 ± 0.5

Staphylococcus aureus MRSAB3 28 ± 1 14.3 ± 0.5

Staphylococcus epidermidis SEpiB1 10.6 ± 0.5 16.6 ± 0.5

Staphylococcus haemolyticus SHB1 17.6 ± 0.5 11.3 ± 0.5

Bacillus cereus BCA1 24 ± 1 25 ± 1 Gram(−)

Pseudomonas aeruginosa PAA1 < 8 ± 0.0 21.6 ± 0.5

Escherichia coli ECA1 11 ± 1 15 ± 1

Klebsiella pneunomoniae KPA1 13 ± 1 18 ± 1

Escherichia coli ESBL ECB1 10.3 ± 0.5 R

Escherichia coli ESBL ECB2 11.3 ± 0.5 7 ± 0.0

Klebsiella pneumoniae ESBL KPB1 11 ± 1 8 ± 0.0

Klebsiella pneumoniae ESBL KPB2 11.6 ± 0.5 R

Acinetobacter baumannii ABB1 30.6 ± 1.5 13.6 ± 0.5

Acinetobacter baumannii ABB2 27.3 ± 0.5 10 ± 1

Proteus mirabilis ESBLPMB1 17 ± 1 R

Proteus mirabilis PMB2 17.6 ± 1.1 8 ± 1

Salmonella enteritidis SEntB1 21.6 ± 0.5 13 ± 1

Klebsiella oxytoca KOB1 31.3 ± 0.5 16 ± 1

Values represent averages ± standard deviations for triplicate experiments. xThis amount of pure essential oil is analogous to 10 μg. R: resistant. Data were analysed through unpaired Student’s test or ANOVA combined with Tukey’s test. P values of less than 5% (p < 0.05), were considered to be signiﬁcant.

Table 3 Table 4 Antibacterial activity by microatmosphere method. MIC and MBC values of Artemisa herba-alba essential oil.

− − Bacteria Diameter of the inhibition zone (mm ± SD) Bacteria MIC (mg mL 1) MBC (mg mL 1)

Gram(+) Gram(+)

Staphylococcus aureus MRSAA1 41 ± 1 Staphylococcus aureus MRSAA1 510

Staphylococcus aureus MRSAB1 40.3 ± 0.5 Staphylococcus aureus MRSAB1 510

Staphylococcus aureus MRSAB2 40 ± 1 Staphylococcus aureus MRSAB2 10 20

Staphylococcus aureus MRSAB3 39 ± 1 Staphylococcus aureus MRSAB3 10 20

Bacillus cereus BCA1 44.3 ± 0.5 Bacillus cereus BCA1 510 Gram(−) Gram(−)

Acinetobacter baumannii ABB1 48 ± 1 Acinetobacter baumannii ABB1 10 20

Acinetobacter baumannii ABB2 47.6 ± 0.5 Acinetobacter baumannii ABB2 10 20

Salmonella enteritidis SEntB1 26.6 ± 0.5 Proteus mirabilis ESBL PMB1 10 20

Klebsiella oxytoca KOB1 22.6 ± 0.5 Proteus mirabilis PMB2 10 20

Salmonella enteritidis SEntB1 10 20 Values represent averages ± standard deviations for triplicate experiments. Klebsiella oxytoca KOB1 10 20 Data were analysed through unpaired Student’s test or ANOVA combined with Tukey’s test. P values of less than 5% (p < 0.05), were considered to be signiﬁcant. MIC – Minimum Inhibitory Concentration. MBC – Minimum Bactericidal Concentration. ’ ’ of incubation for E.coli. The work done by May et al. (2000) showed Data were analysed through unpaired Student s test or ANOVA combined with Tukey s test. that tea tree essential oil eliminated MRSA within 6 h. Whereas in the P values of less than 5% (p < 0.05), were considered to be signiﬁcant. results found by Guinoiseau et al. (2015), a complete bactericidal activity of the alcohol fraction of Cistus ladaniferus essential oil against S.

Fig. 1. Inhibition zones by microatmosphere method.

141 A. Bertella et al. Industrial Crops & Products 116 (2018) 137–143

Fig. 2. Time-kill curves of treated bacteria with Artemisia herba-alba essential oil.

MRSAA1 – Staphylococcus aureus; MRSAB1 – Staphylococcus aureus; MRSAB2 –Staphylococcus aureus; MRSAB3 – Staphylococcus aureus; ABB1 – Acinetobacter baumannii;ABB2 – Acinetobacter baumannii;KOB1 – Klebsiella oxytoca;BCA1 – Bacillus cereus; SEntB1 – Salmonella enteritidis

Table 5 Toxicological study of Artemisia herba-alba essential oil on mice.

− Dose (mg kg 1) Mortality rate Symptoms

Control 0 (0%) nd 450 0 (0%) nd 500 1 (10%) Corner sitting, rapid breathing, death after 45 min and total recovery of the survived mice. 550 4 (40%) Corner sitting, rapid breathing, death after 39 ± 3 min and total recovery of the survived mice. 600 5 (50%) Corner sitting, rapid breathing, imbalance, unconsciousness, death after 41 ± 5 min and total recovery of the survived mice. 650 7 (70%) Rapid breathing, imbalance, unconsciousness, death after 34 ± 3 min and total recovery of the survived mice. 700 8 (80%) Rapid breathing, hypoactivity, unconsciousness, death after 31 ± 8 min and total recovery of the survived mice. 750 9 (90%) Rapid breathing, hypoactivity, unconsciousness, death after 30 ± 4 min and total recovery of the survived mice. 800 9 (90%) Rapid breathing, hypoactivity, unconsciousness, death after 29 ± 9 min and total recovery of the survived mice. 850 10 (100%) Rapid breathing, hypoactivity and death after 30 ± 6 min. nd – non detected; Data were analysed through unpaired Student’s test or ANOVA combined with Tukey’s test. P values of less than 5% (p<0.05), were considered to be signiﬁcant.

aureus was noticed after only 1 h. Those variations might indicate a essential oil was slightly toxic with its LD50 comprises between 500 and − diﬀerent mechanism of action of those essential oils on bacterial cells 5000 mg kg 1. (Burt, 2004). In our study, A. herba-alba essential oil was less toxic comparing to the result found by Qnais et al. (2016) for A. herba-alba essential oil −1 growth in Jordan that presents a LD50 higher than 4000 mg kg . Also 3.3. Acute toxicity (LD50) in the previous studies (Hilan et al., 2009) reported the toxicity of

Prangos asperula essential oil that presented a low toxicity with a LD50 −1 The test of acute toxicity (LD50) is used to determine the range of of 1040 μLkg , while Shalaby et al. (2011) estimated a smaller LD50 − doses and evaluating the therapeutic index of plant extract (Ahmed and value of 470 mg kg 1 for Mentha longifolia L. which mean those es- Azmat, 2014). In the current study, the acute toxicity of A. herba-alba sential oils are more toxic than our A. herba-alba essential oil. essential oil was investigated by the determination of the median lethal dose (LD50) and the assessment of the behaviour after administration on mice, the results are summarized in Table 5. The essential oil showed a 4. Conclusion −1 LD100 of 850 mg kg , and the death of tested animals was achieved after the ﬁrst 30 min of experiment. The abnormal behaviour as corner The results obtained in this study showed an important antibacterial sitting and rapid breathing of the treated animals were observed with a activity of A. herba-alba essential oil and conﬁrm previous results. The −1 dose of 500 mg kg .The administrated doses gave a LD50 value of chemical composition herein reported is also consistent with earlier − 615 mg kg 1. Based on Hodge and Sterner (2005) scale, A. herba-alba works but also draw attention to the fact that the region of grow can

142 A. Bertella et al. Industrial Crops & Products 116 (2018) 137–143 influence the essential oil chemical composition. The volatile com- and Safety. http://www.ccohs.ca/oshanswers/chemicals/id50. html, Consulted on: pounds of the essential oil proved a high activity by gaseous contact 03/06/2017. Hudaib, M.M., Aburjai, T.A., 2006. Composition of the essential oil from Artemisia herba- against the bacteria assayed. Toxicologically, the oil seems to have a alba grown in Jordan. J. Essent. Oil Res. 18, 301–304. safe level according to the median lethal dose (LD50), however further Luciardi, M.C., Blázquez, M.A., Cartagena, E., Bardón, A., Arena, M.E., 2016. Mandarin in vivo studies and clinical assays are needed to confirm the safety and essential oils inhibit quorum sensing and virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. Food Sci. Technol. 68, 373–380. possible applications of Artemisia herba-alba essential oil as antibacterial Mann, C.M., Cox, S.D., Markham, J.L., 2000. 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143 Résumé

L’objectif de ce présent travail est de mettre en évidence l’effet antimicrobien et antioxydant des huiles essentielles extraites des espèces d’Artemisia herba-alba, Artemisia campestris et Rosmarinus tournefortii, ainsi que leur composition chimique, profil aromatique et leur toxicité aigüe. Le rendement de l’huile essentielle extraite par hydrodistillation le plus important revient à AHA avec un taux de 0,65 %. Les composés majeurs des huiles essentielles d’AHA, RT et AC sont le camphre (50,47 %), (45,89 %) et le germacrène D (20,91 %) respectivement. L’activité antibactérienne révèle le potentiel effet de l’huile d’AHA, par technique de diffusion sur disque notamment sur les souches de Klebsiella oxytoca, Acinetobacter baumannii et Staphylococcus aureus, avec des diamètres de la zone d’inhibition allant jusqu'à 31,3 mm, de même par méthode de microatmosphère avec des diamètres allant à 48 mm sur la souche d’Acinetobacter baumannii. Une élimination totale des cellules bactériennes est atteinte après 24 h. Ensuite, une importante activité antifongique de l’huile d’AHA est traduite principalement par un diamètre d’inhibition de 53,7 mm sur Aspergillus niger. L’activité antioxydante par méthode de DPPH et par générateur de radicaux libre in situ, a montré le pouvoir important de l’huile d’AHA. L’analyse HS-SPME-CPG-O-SM a permis d’identifier plusieurs odorants clés. De plus que l’épreuve de toxicité aigue a donné une dose létale médiane (DL50) est de 615 mg/kg.

Mots clés:

Huile essentielle; Camphre; HS-SPME-CPG-O-SM; Klebsiella oxytoca; Acinetobacter baumanniin; DPPH; activité antimicrobienne; Hydroxylation; Activité antioxydante; Toxicité.