INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y

TECNOLOGÍA AVANZADA UNIDAD QUERÉTARO

ESTABLECIMIENTO DE UNA COLECCIÓN DE LEVADURAS CON ELEVADA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE LA FERMENTACIÓN DE MAÍZ MALTEADO

TESINA

Para obtener el grado de Especialidad en Tecnología Avanzada

PRESENTA

Nadia Jocelyn Talamantes Morales

Director de tesina

Dra. Regina Hernández Gama

Querétaro, Querétaro; Diciembre 2018.

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ÍNDICE Página

Índice I Índice de cuadros II Índice de figuras III Resumen IV Summary V

1. INTRODUCCIÓN 10 2. MARCO TEÓRICO 11 3. OBJETIVO GENERAL 12 Objetivos específicos 4. HIPÓTESIS 12 5. METODOLOGÍA 12 6. RESULTADOS 18 7. DISCUSIÓN 41 8. CONCLUSIONES 44 9. REFERENCIAS 46 10. PRODUCTOS 49

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ÍNDICE DE FIGURAS Número Figura Página

1 Morfología microscópica de las levaduras obtenidas después del 24 aislamiento en medio YPD.

2 Resultados de la cinética de fermentación para Saccharomyces 25 cerevisiae . 3 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 1. 26

4 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 2. 27

5 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 3. 28

6 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 4. 29

7 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 5. 30

8 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 6. 31

9 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 7. 32

10 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 8. 33

11 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 9. 34

12 Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 10. 35

13 Resultados de la producción de etanol de cada cultivo, durante las 36 cinéticas de fermentación. 14 Cultivos con mayor producción de etanol comparado con la cepa 37 comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky. 15 Cultivos con menor producción de etanol comparado con la cepa 38 comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky. 16 Electroforesis en gel de agarosa de la extracción de ADN. 39

17 Muestras de ADN aplificado a partir de una PCR. 40

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ÍNDICE DE TABLAS Número Tabla Página

1 Lista de ingredientes utilizados durante el proceso de elaboración 13 de bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz.

2 Lista de catalizadores utilizados durante el proceso de elaboración 13 de bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz.

3 Lista de frutos utilizados durante el proceso de elaboración de 13 bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz.

4 Lista de bebidas utilizados durante el proceso de elaboración de 14 bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz.

5 Oligonucleótidos. 18

6 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de ingredientes. 19

7 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de catalizadores. 19

8 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de bebidas 20 artesanales.

9 Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de la 21 fermentación de maíz malteado.

10 Colección de levaduras. 22

11 Resultados identificación taxonómica. 41

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RESUMEN En este proyecto se llevó a cabo una búsqueda de levaduras entre 33 muestras seleccionadas por su aportación durante procesos de elaboración de bebidas artesanales fermentadas a base de maíz. También se usaron muestras del producto de la fermentación de 3 variedades de maíz VC-152, FAC-M40 y VC-42 para la obtención de microorganismos. Cada muestra se inoculó en caldo extracto de maíz (2 g/L de extracto de maíz, 30 µl de amoxicilina, pH a 4.5). Una vez obtenido el crecimiento microbiano, se realizó tinción Gram para determinar los grupos microbianos presentes y se sembraron en YPD con varias resiembras hasta obtener un cultivo puro. Se obtuvo una colección de 10 cultivos de levaduras a las cuales se comparó su capacidad para producir etanol a través de cinéticas de fermentación de maíz. El maíz empleado en la fermentación se malteó lavando y germinando el maíz durante 4 días con hoja de plátano para conservar la humedad. Posteriormente se realizó una molienda y tratamiento térmico a ebullición constante por 3 h. Al extracto frío se añadieron enzimas alfa amilasa y beta glucosidasa. La cinética de fermentación se realizó durante 120 h y se tomaron muestras desde el tiempo 0 h y cada 24 h. Las muestras se separaron por HPLC para cuantificar el etanol, glucosa, maltosa y fructosa. Cada cultivo se identificó por técnicas moleculares para lo cual se realizó la extracción de ADN y se realizó una PCR con oligos ITS1 e ITS4. Se obtuvieron 10 cultivos de levaduras provenientes de maíz blanco 1VC-152, maíz blanco 2VC-152, maíz morado VC-42, , 1, tejuino 2, , guayaba y piña. Los productos se secuenciaron por el método de Sanger, seguido de un análisis en BLAST con la finalidad de establecer su identidad taxonómica. Al comparar los resultados respecto a una cepa comercial Sacchacomyces cerevisiae whisky, con 1.4 % de etanol a las 24 h. Se obtuvieron 6 de los 10 cultivos de la colección de levaduras que produjeron mayor cantidad de etanol que la cepa comercial de referencia, destacando entre ellas, consorcio 2 obtenida a partir de masa, con 2.7 % de etanol a las 24 h, Meyerozima caribbica 2 obtenida a partir de guayaba, con 4.7 % de etanol a las 72 h y Zygotorulaspora florentina obtenida a partir de tejuino 1, con 3.1 % de etanol a las 72 h. 8

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SUMMARY

In this project, a yeast search was presented among 33 samples for its contribution during the process of making traditional fermented beverages based on corn and samples of the fermentation product of 3 varieties of corn VC-152, FAC-M40 and VC- 42 are also presented for obtaining microorganisms. Each sample was inoculated into corn extract broth (2 g / L of corn extract, 30 μl of amoxicillin, pH to 4.5). Once the microbial growth was obtained, Gram stain was performed to determine the microbial groups present and planted in YPD with several reseeds until obtaining a pure culture. A collection of 10 yeast cultures was obtained to which their capacity to produce ethanol was compared through corn fermentation kinetics. The corn used in the fermentation was malted by washing and germinating the corn for 4 days with a banana leaf to conserve moisture. Subsequently, grinding and thermal treatment at constant boiling for 3 h. The enzymes alpha amylase and glucosidase were added to the cold extract. The fermentation kinetics was carried out for 120 h and samples were taken from time 0 h and every 24 h. The samples were separated by HPLC to quantify ethanol, glucose, maltose and fructose. Each culture was identified by molecular techniques for which DNA extraction was performed and a PCR was performed with oligos ITS1 and ITS4. We obtained 10 yeast cultures from white corn 1VC-152, white corn 2VC-152, VC-42, tepache, tejuino 1, tejuino 2, corn dough, guava and pineapple. The products were sequenced by the Sanger method, followed by a BLAST analysis in order to establish their taxonomic identity. When comparing the results with respect to a commercial strain Saccharomyces cerevisiae whiskey, with 1.4% ethanol at 24 h. Six of the 10 cultures of the yeast collection were obtained, producing more ethanol than the reference commercial strain, highlighting among them, consortium 2 obtained from the corn dough, with 2.7% ethanol at 24 h, Meyerozima caribbica 2 obtained from guava, with 4.7% ethanol at 72 h and Zygotorulaspora florentine obtained from tejuino 1, with 3.1% ethanol at 72 h.

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INTRODUCCIÓN La fermentación es un proceso bioquímico, que degrada una molécula orgánica para transformarla en otra más simple. Los procesos más importantes en la industria de alimentos y bebidas son la fermentación del ácido láctico y del alcohol (Mbajiuka et al. 2015). La fermentación alcohólica se lleva a cabo por hongos levaduriformes Sacaromycetos y en algunas ocasiones por no Sacaromycetos, siendo el principal producto de la fermentación el etanol, además algunos otros productos como aldehídos, ácidos y gases se acumulan generando características deseables o indeseables para el producto final. La fermentación alcohólica genera una cantidad mínima de energía, debido a que la mayor parte de la energía permanece en el producto final (Sossa Urrego et al. 2009). La levadura Saccharomyces cerevisiae se utiliza comúnmente para la producción de etanol y dióxido de carbono que se genera durante el proceso, tanto para las bebidas alcohólicas como para la industria alimentaria (Estela-Escalante et al. 2014; Mbajiuka et al. 2015). Por otra parte, las levaduras no Saccharomyces, es decir, levaduras de géneros taxonómicos distintos, son consideradas microorganismos de descomposición; sin embargo, se ha reportado que algunas especies de no Saccharomyces pueden colaborar a la calidad del vino. Por ello se ha practicado la fermentación mixta, la cual, como su nombre lo dice, consiste en mezclar en este caso Saccharomyces y no Saccharomyces, obteniendo una mejora en las características de la producción del vino (Berradre et al. 2012; Ciani et al. 2010). Hoy en día, existe una creciente instalación de empresas para la producción de bebidas alcohólicas artesanales principalmente cervezas y . En muchos procesos artesanales se emplean los mismos microorganismos asociados a las materias primas, lo que puede generar bajo rendimiento e incluso la generación de subproductos fermentativos indeseables. Las levaduras comerciales, actualmente no están adaptadas al maíz que es la materia prima que se desea fermentar en este proyecto; muchas de estas cepas se han seleccionado para la producción de vinos de mesa y cervezas hechas con malta de cebada. Algunas empresas productoras de etanol buscan obtener el mejor rendimiento en el proceso de fermentación y/o 10

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destilación, y al mismo tiempo tienen interés por establecer productos con características únicas. Por esta razón se propone el uso a futuro de dicha colección de levaduras fermentables, para el desarrollo u optimización de productos e incluso su comercialización. La fermentación alcohólica es un proceso que nace aproximadamente en los años 3000 a.C., en las civilizaciones de Egipto, China, India y Grecia, con la elaboración de bebidas alcohólicas como vino y cerveza a partir de frutos y cereales (Steinkraus 1995). Siendo ésta una forma de pago para los trabajadores, una bebida que consideraban más estéril que tomar agua por su proceso de tratamiento térmico para eliminar microorganismos. En México, años antes de la época prehispánica se acostumbraba tomar bebidas como el , chocolate, , tascalate, entre otros que procedían del maíz o del cacao, bebidas que generalmente no contenían alcohol. Después con la llegada de los españoles se comenzó a producir bebidas fermentadas, basadas principalmente en maíz y otros compuestos como piña, caña de azúcar, entre otros. Algunas de las bebidas fabricadas en base a la fermentación del maíz son: tejuino, originario de Colima y Sonora; tesquino, originario de ; tequino, originario de Aguascalientes; zende, originario del Estado de México; , originario de Chiapas; y guarapo, originario de Veracruz y Tabasco (Mendoza et al. 2017; Piló et al. 2018; Silva et al. 2017). Éstas dos últimas bebidas, la chicha y el guarapo, junto con el masato, también son bebidas que se toman actualmente en Colombia; comúnmente son apreciadas por lo refrescante (Bautista 2006; Vallejo et al. 2013). La fermentación del maíz en México comienza en la época prehispánica con los tarahumaras con la producción de tesgüino, siendo el maíz la base de la dieta de nuestros antepasados, actualmente México se encuentra en el 7º lugar como productor a nivel mundial; sin embargo, el 99 % del maíz que importamos proviene de Estados Unidos. Siendo ésto un tema de interés para mi proyecto, el utilizar el maíz mexicano como sustrato para la fermentación de bebidas alcohólicas. México tiene una gran variedad de maíces y es el principal productor de maíz blanco el cuál representa el 35 % de siembra agrícola, por otra parte también se tiene maíz amarillo que representa

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el 5 % de la producción nacional en México, maíz morado, entre muchos otros. Cada variedad de maíz tiene usos determinados, en México la mayor producción es para el maíz blanco con el 86,9 % el cuál está destinado la mayor parte para consumo humano nacional, por su alto contenido nutricional; seguido del maíz amarillo del cual la mayor parte es grano importado y se utiliza en la industria y para alimento animal; por otra parte, tenemos el maíz azul o morado que es utilizado para el consumo humano nacional y recientemente se ha aportado evidencia de su contribución a la nutrición por el aporte de antioxidantes (Sagarpa 2017). Es importante destacar que al interior del grupo de investigación se ha realizado la fermentación para la producción de whisky a partir de maltas con base maíz y se han encontrado áreas de oportunidad en el malteado y fermentación debido a la naturaleza del almidón de maíz (Espinoza 2018). De este modo se espera que la optimización del malteado y la exploración de nuevas cepas fermentativas puedan generar como resultado, mayor producción de etanol en la fermentación de maíz malteado. En este proyecto se buscaron principalmente microorganismos con alta producción de alcohol con base en maíz malteado.

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OBJETIVO GENERAL Obtener una colección de levaduras fermentadoras para la elaboración de bebidas alcohólicas, basadas en maíz malteado.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

o Establecer cultivos de levaduras a partir de muestras de bebidas fermentadas, ingredientes y catalizadores empleados en la fermentación de maíz. o Aislar levaduras. o Evaluar la producción de etanol de cada cultivo puro a partir de mostos de maíz malteado. o Identificar levaduras por técnicas moleculares.

HIPÓTESIS A partir de procesos de elaboración artesanal de bebidas alcohólicas con base maíz, es posible obtener microorganismos con elevada producción de etanol durante la fermentación de maíz malteado.

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METODOLOGÍA Se realizó una búsqueda bibliográfica para conocer el proceso fermentativo de maíz en la producción de bebidas artesanales. A partir de dicha revisión se establecieron cinco niveles de muestreo, ingredientes, catalizadores, frutos, bebidas artesanales y mosto de tres variedades de maíz. Se consideraron como ingredientes a los componentes principales de la formulación de bebidas a base de maíz. Los catalizadores además de agilizar en parte, el proceso de fermentación, también se caracterizan de ser los que aportan notas de aroma y sabor. Los frutos y bebidas en ocasiones son añadidos como agentes fermentadores o como inóculos en el proceso de fermentación.

Tabla 1. Lista de ingredientes utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas alcohólicas artesanales a base de maíz. Ingrediente Uso Referencia (Vallejo et al. 2013; Wacher et Piloncillo Preparación de chicha y tesgüino al., 2000) (Becerra 2014; Karimi, Emtiazi, Arroz Preparación de masato and Taherzadeh 2006) (Coll Cárdenas, Villat, Laporte, Miel de abeja Contiene levaduras Noia 2008) (Betancourt Botero, Bolívar Masa de maíz Elaboración de bebidas Escobar, and Toro 2013)

Tabla 2. Lista de catalizadores utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas alcohólicas artesanales base maíz. Catalizador Uso Referencia Clavo Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000) Canela Preparación de chicha (Vallejo et al. 2013) Flor de manzanilla Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000) Caña de azúcar Preparación de chicha, producción de alcohol (Rabelo et al. 2011) Frijolillo Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000) Flor de durazno Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)

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Hoja de madroño Preparación de tesgüino (Wacher et al. 2000)

Tabla 3. Lista de frutos utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas alcohólicas artesanales base maíz. Fruta Uso Referencia Piña Utilizado para chicha (Vallejo et al. 2013) Ciruela morada Fermentable (Dulf, Vodnar, and Socaciu 2016) Ciruela pasa Fermentable (Dulf, Vodnar, and Socaciu 2016) Fresa Fermentable (Hornedo-Ortega et al. 2016) Durazno néctar Fermentable (Hidayet Argun 2016) Guayaba Utilizado para chicha (Vallejo et al. 2013)

Tabla 4. Lista de bebidas utilizados durante el proceso de elaboración de bebidas alcohólicas artesanales base maíz. Bebida Uso Referencia Pozol Fermentable (Juvonen et al. 2015) Tascalate Fermentable Proyecto Tepache Fermentable (Nalini and Parthasarathi 2018) Tejuino Fermentable (Nava-Arenas 2009)

Todo el material con el que se procesaron las muestras se esterilizó por calor húmedo en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Cada muestra fue tomada en un tubo cónico de 50 ml estéril o en una bolsa de polipapel nueva para su transporte al laboratorio. Para la selección de las muestras se tomaron varios aspectos en cuenta; la muestra debía estar madura, en buen estado, fresca y en contacto con más muestras de la misma especie. Una vez colectadas, las muestras sólidas se lavaron con agua destilada, se trituraron en un mortero y se tomó 1g por triplicado, con el cual se inocularon matraces de 50 ml con 30 ml/L de caldo extracto de maíz (2g/L de extracto de maíz, 30 µl de amoxicilina, pH a 4.5) y se dejaron en incubación a 30°C hasta la aparición de crecimiento, durante

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24 h a 72 h. En el caso de las muestras líquidas se tomó 1 ml de muestra y se inoculó según lo antes descrito. Una vez obtenido el crecimiento en medio líquido se realizó una tinción de Gram de cada cultivo y se observó la morfología microscópica de cada cultivo. Cuando el cultivo tuvo presencia de levaduras se sembró por estría cruzada en agar dextrosa Sabouraud y las cajas de cultivo se incubaron durante 24 horas a 30°C, y nuevamente se realizó tinción de Gram para confirmar la morfología microscópica. Para los cultivos enriquecidos a partir de la fermentación de maíz, se pesaron 200g de granos de maíz, se realizaron tres lavados con agua potable y se dejaron en remojo durante 24 h a temperatura ambiente. Pasadas las 24 h se escurrieron los granos y se tomó la muestra de los granos sin germinación, el resto de los granos se colocaron en un recipiente plástico cubriéndolos con hoja de plátano por 4 días a temperatura ambiente, hasta conseguir la germinación de los granos. Al finalizar el tiempo se tomó la muestra del maíz germinado. Posterior a la germinación, el maíz se trituró finamente en un molino, se tamizó para eliminar cáscaras o residuos grandes y se pesaron 150 g de harina de maíz a los que se les añadieron 1500 ml de agua destilada. En este punto se dividieron en dos grupos los granos sin tratamiento térmico que se sometieron a fermentación durante tres días y los granos con tratamiento térmico. El tratamiento térmico consistió en llevar la mezcla de los granos en agua a ebullición durante 3 h. Al terminar se dejó enfriar y se fermentó a temperatura ambiente por 3 días. Se procesaron muestras de maíz blanco VC-152, morado VC-42 y amarillo FAC-M-40. Cada variedad de maíz se inoculó con los siguientes tratamientos: maíz germinado sin tratamiento térmico, maíz sin germinar sin tratamiento térmico, maíz germinado con tratamiento térmico y maíz germinado sin tratamiento térmico. De cada variable se tomó 1 g de muestra o 1 ml de suspensión fermentada a la cual se le realizó el mismo método de aislamiento de la forma antes descrita para las muestras de ingredientes, catalizadores y bebidas, haciendo seguimiento de los resultados por morfología microscópica con tinción de Gram.

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Una vez seleccionados los cultivos aislados de levaduras se procedió a realizar las cinéticas de fermentación. Para esto se llevó a cabo el proceso de malteado de maíz morado VC-42. El cual consistió en seleccionar los granos de maíz, se pesaron 200 g, se realizaron tres lavados con agua potable y se dejaron en remojo durante 24 h a temperatura ambiente. Pasadas las 24 h se escurrieron los granos y se colocaron en un recipiente plástico cubriéndolos con hoja de plátano por 4 días a temperatura ambiente, hasta conseguir la germinación de los granos. Al finalizar el tiempo, el maíz se trituró finamente en un molino, se tamizó para eliminar cáscaras o residuos grandes, se pesaron 150 g de harina de maíz a los que se les añadieron 1500 ml de agua destilada y se realizó un tratamiento térmico que consistió en llevar la mezcla de los granos en agua a ebullición durante 3 h. Al terminar se dejó enfriar y se fermentó a temperatura ambiente por 3 días en alícuotas de 50 ml en frascos serológicos sellados con tapones de acrilonitrilo y arillos de aluminio con agujas a las que se colocaron filtros de membrana de nylon de 0.22 µm de diámetro para permitir la liberación de dióxido de carbono, sin que se presentara contaminación. Para preparar los inóculos, se sembró cada cultivo en 150 ml de medio YPD y se incubaron a temperatura ambiente por 24 h, para posteriormente se añadidos en cada frasco. Al termino del tratamiento térmico del mosto de maíz y antes de la fermentación, se filtró el mosto y se añadieron 0.4g de a-amilasa pro Kg de maíz y 0.1g de glucosidasa por Kg de maíz, se homogenizó la mezcla del mosto con las enzimas y se colocaron 50mL en frascos de 125mL cada uno y se inocularon con 5mL del medio YPD con los diferentes cultivos. Se realizó cada ensayo por triplicado y se tomaron muestras cada 24 h hasta el tiempo final 120 h. Cada una de las muestras fueron filtradas y analizadas por HPLC para cuantificar la producción de etanol y el consumo de azúcares: maltosa, fructosa y glucosa. Los resultados del etanol y azúcares se cuantificaron con respecto a curvas de calibración con estándares de glucosa, fructosa, maltosa y etanol a 3, 2, 1, 0.5 y 0.25 %. Se utilizó una fase móvil con H2SO4 al 5 mM, el flujo utilizado durante la corrida fue de 0.35 ml/min con una presión máxima de 60 bares.

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Finalmente, las levaduras se identificaron por métodos moleculares para proporcionar mayor información sobre ellas. Para esto se realizó extracción de ADN a cada uno de los cultivos resultantes con el siguiente protocolo: 1. Se centrifugaron cultivos de 24 h de crecimiento en medio YPD a 10000 rpm durante 5 min, se decantó el sobrenadante y se suspendió la pastilla 0.2 ml de agua destilada. 2. Se añadieron 50 mg de la suspensión anterior en el tubo ZR Bashing Bead Lysis y se añadieron 0.750 ml de Bashing Bead Buffer al tubo. 3. Se centrifugó a 10000 xg por 1 min. 4. Se transfirieron 0.4 ml del sobrenadante a un Zymo – Spin IIIF Filter en un tubo de colección y se centrifugó a 8000 xg por 1 min. 5. Se añadieron 1.2 ml del Genomic Lysis Buffer al filtrado del tubo de colección del paso 3. 6. Se transfirieron 0.8 ml de la mezcla del paso 4 a un Zymo - Spin IIC Columns en un tubo de colección y se centrifugó a 10000 xg por 1 min. 7. Se decantó el sobrenadante del tubo y se repitió el paso 5. 8. Se añadieron 0.2 ml de DNA Pre – Wash Buffer al Zymo – Spin IIC Column y se centrifugó a 10000 xg por 1 min. 9. Se transfirió el Zymo – Spin IIC Column a un tubo eppendorf de 1.5ml, previamente esterilizado. Se añadieron 0.04 ml de DNA Elution Buffer. Se centrifugó a 10000xg por 1 min para eluir el DNA. Posteriormente se verificó la presencia del DNA extraído, mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se usó un marcador de peso molecular de 1 kb Plus DNA (Invitrogen). El ADN en el gel se sometió a separación a 80 V. El gel se tiñó por inmersión en una solución con SYBR Safe DNA Gel Stain 10 000X diluido apropiadamente en TAE 1X y se reveló con luz UV en un transiluminador UVP.

Una vez realizada la extracción de ADN de los cultivos, se realizó la amplificación por PCR de la región intergénica ribosomal con los oligos universales ITS1 e ITS4. En la Tabla 5 se muestran los oligonucleótidos que se utilizaron para la PCR.

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Tabla 5. Oligonucleótidos. Región Oligonucleótidos Referencia

5’TCCGTAGGTAACCTGCGG3’ (Morrissey et al. 2004) ITS1

5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’ ITS4 (Uruburu F 1999)

Se llevó a cabo una optimización de la temperatura para la amplificación con los oligos ITS1 e ITS4, por lo que se hizo una PCR de gradiente, partiendo de una temperatura de 55 ºC hasta 65 ºC. Al revelar los resultados por medio de una electroforesis se determinó la temperatura óptima de alineamiento de los oligos. Para la PCR se utilizaron 2 µl de ADN molde, 2U de ADN polimerasa, 2.5 µl de buffer con magnesio 10x, 2 µl de DNTP’s 10 mM, 2 µl de cada uno de los oligos 10 pM y se complementó con de agua estéril. En total fueron 11 muestras, de las cuales fueron 10 cepas y agua como control negativo. Se realizó una centrifugación corta para eliminar burbujas. Las condiciones para el termociclador fueron, calentamiento a 95°C durante 5 minutos, 30 ciclos de, 95ºC durante 1 min, 60ºC durante 1 min, 72ºC durante 1min y al finalizar los ciclos, una extensión final de 5 min en la misma temperatura de 72ºC. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa para determinar la amplificación de cada cepa. El producto de la PCR se secuenció por el método capilar mediante servicio externo con Macrogen Korea. Finalmente las secuencias obtenidas, se sometieron a una búsqueda con la herramienta BLAST (NCBI 2018), para encontrar los organismos de referencia con mayor identidad en sus secuencias.

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RESULTADOS Para este trabajo, se buscó aislar levaduras y reducir al máximo el crecimiento bacteriano, mediante el uso de un medio de cultivo de enriquecimiento que contenía 2 g/L de extracto de maíz y con pH de 4.5. Este medio favoreció el crecimiento de levaduras, además de la adición de amoxicilina, la cual inhibe la formación de la pared celular de las bacterias por lo que evita el crecimiento bacteriano. En la Tabla 6 se muestran los resultados obtenidos a partir de una tinción Gram en 9 muestras de ingredientes. Cabe destacar que, fue necesario realizar varias siembras de los cultivos, debido a la presencia de bacterias en todas las muestras.

Tabla 6. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de ingredientes.

Ingrediente Morfología microscópica

Piña Levaduras y cocos Gram +

Guayaba Levaduras y cocos Gram +

Papaya Cocos y bacilos Gram +

Ciruela morada Cocos Gram +

Ciruela pasa Cocos y bacilos Gram +

Cocos Gram + y bacilos Fresa Gram - Durazno (variedad Bacilos Gram + néctar) Masa de maíz Levaduras y cocos Gram + Arroz Cocos Gram +

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En la Tabla 7 se observan los resultados obtenidos a partir de una tinción Gram en 8 muestras de catalizadores, de las cuales únicamente se tuvo presencia de bacterias sin crecimiento de levaduras.

Tabla 7. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de catalizadores.

Nombre Resultados

Clavo Cocos Gram +

Canela Cocos Gram +

Cocos y bacilos Flor de manzanilla Gram +

Caña de azúcar Cocos Gram -

Frijolillo Cocos Gram +

Bacilos Gram + y Flor de durazno cocos Gram -

Hoja de madroño Cocos gram -

Bacilos y cocos Miel de abeja Gram +

En la Tabla 8 se muestras los resultados de morfología miscroscópica de 5 bebidas fermentadas de las cuales se tuvieron 2 bebidas con presencia de levaduras y 3 bebidas con bacterias; sin embargo, la presencia de bacterias también se observó en las bebidas de tejuino y tepache, como parte de un consorcio con las levaduras y que contribuyen a la fermentación proporcionando un toque ácido en algunas ocasiones a las bebidas.

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Tabla 8. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de bebidas artesanales.

Nombre Resultados

Pozol Cocos Gram +

Tascalate Cocos Gram +

Atole de maíz Cocos Gram -

Levaduras, Tejuino bacilos y cocos Gram + Levaduras y Tepache cocos Gram +

También se realizaron fermentaciones con 3 variedades de maíz, VC.152, FAC-M40 y VC-42 o bien, blanco, amarillo y morado. Para éste apartado se realizaron 4 tratamientos para cada tipo de maíz las cuales consistieron en germinar o no el maíz y aplicar un tratamiento térmico o no con una posterior fermentación. En la Tabla 9 se muestran los resultados de la tinción Gram realizada a 12 muestras, en donde se detectó la presencia de levaduras en el maíz germinado, las cuales se perdieron en las muestras con tratamiento térmico. Únicamente la fermentación con maíz germinado permitió el aislamiento de las levaduras.

Tabla 9. Tinción Gram de los cultivos enriquecidos a partir de la fermentación de maíz malteado. Tratado Maíz Germinado Resultado térmicamente Cocos Gram - X X Cocos Gram - Maíz blanco VC-152 X Cocos Gram + X Levaduras y cocos Gram + Cocos Gram - Maíz amarillo FAC-M-40 X X Cocos Gram +

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X Cocos Gram + X Levaduras y cocos Gram + Cocos Gram + X X Cocos Gram - Maíz morado VC-42 X Cocos Gram + X Levaduras y cocos Gram +

Finalmente, de un total de 33 muestras tomadas a partir de ingredientes, catalizadores, bebidas artesanales y fermentaciones base maíz, conseguimos una colección inicial de 12 levaduras, las cuales se muestran en la Tabla 10. Para llegar a este resultado se realizaron resiembras para aislar las levaduras, logrando aislar a partir de 8 muestras diferentes como el maíz blanco, amarillo y morado, tejuino, tepache, masa, guayaba y piña. En la tabla 10 se muestran dos cultivo para maíz blanco, tejuino, masa y guayaba, los cuales se numeran diferente sí hay diferencia en la morfología colonial y microscópica o con un subíndice si presentaron la misma morfología durante las resiembras en Agar Dextrosa Saboreaud.

Tabla 10. Colección de levaduras. Cultivo Muestra de origen 1 Maíz blanco 1 VC-152 germinado 2 Maíz blanco 2 VC-152 germinado

3 Maíz amarillo FAC-M-40 germinado

4 Maíz morado VC-42 germinado

5 Tepache

6 Tejuino 1

7 Tejuino 2

8 Masa 1

8a Masa 2

9 Guayaba 1 9a Guayaba 2 10 Piña

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A continuación, en la Figura 1 se muestran 10 imágenes de microscopía de tinción simple con safranina de diferentes levaduras. De la colección anterior, se observó una misma morfología en los cultivos obtenidos de las mismas muestras de masa y guayaba por lo que únicamente seleccionamos 10 levaduras para las siguientes investigaciones. En la Figura 1a se observa una morfología típica de levadura, ancha y alargada con algunas se observan levaduras en gemación, ésta levadura se aisló de la fermentación de maíz blanco germinado de la muestra 1. En la Figura 1b se observa una morfología circular, la cual corresponde a la muestra 2 de la fermentación de maíz blanco germinado. Continuando con la Figura 1c tiene una morfología ancha y ovalada la cual corresponde a la muestra obtenida de fermentación de maíz morado germinado, en la Figura 1d tenemos las levaduras provenientes de la fermentación de maíz amarillo germinado. La Figura 1e muestra el cultivo de levadura obtenido de piña; la Figura 1f, g, i, corresponde a las muestra de masa, guayaba y tejuino muestra 1, repectivamente, las cuales tienden a una morfología circular. En la Figura 1h se observan levaduras grandes y ovaladas, las cuales pertenecen a la muestra de tepache y finalmente en la Figura 1j se muestra una morfología tanto circular como alargada de levaduras, procedentes de tejuino muestra 2.

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a) b) c) d) e)

f) g) h) i) j)

Figura 1. Morfología microscópica de las levaduras obtenidas después del aislamiento en medio YPD. a) fermentación de maíz blanco muestra 1, b) fermentación de maíz blanco muestra 2, c) fermentación de maíz morado, d) fermentación de maíz amarillo, e) piña, f) masa, g) guayaba, h) tepache, i) tejuino muestra 1, j) tejuino muestra 2.

Posteriormente se realizaron las cinéticas de fermentación. Para ello se tomaron muestras por triplicado desde tiempo inicial (0 h) cada 24 h hasta completar 120 h. En la Figura 2 se muestran los resultados de la cinética de fermentación para el cultivo Saccharomyces cerevisiae whisky que funcionó para este estudio como un control positivo de fermentación y como una referencia para seleccionar cepas que produjeran mayor concentración de alcohol. Podemos observar que la levadura consume los azúcares y a su vez tiene una producción de etanol de 1.4%, lo que nos indica que es una levadura que actua desde las primeras 48 h de su fermentación, seguido de una liberación de glucosa a las 72 h.

Saccharomyces cerevisiae Whisky 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%)

Azúcares (%) Azúcares 4 Fructosa Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 2. Resultados de la cinética de fermentación para Saccharomyces cerevisiae Whisky.

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El cultivo 1 se obtuvo de la fermentación de maíz blanco VC-152 germinado. En la Figura 3 se muestra la cinética de este cultivo, donde se puede observar que la producción de etanol es elevada oscilando entre 2.55 % y 1.4 %, por otra parte la maltosa y la fructosa fueron consumidas por la levadura y la glucosa se liberó durante toda la cinética. Cabe mencionar que el tiempo 0 h en realidad pasaron hasta 90 min para su toma de muestra debido al proceso de homogenización, filtrado, adición de enzimas, el vaciado de alícuotas en cada frasco, la filtración y finalmente se procesó el tiempo cero para cada ensayo.

Cultivo 1 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%) 4 Fructosa

Azúcares (%) Azúcares Etanol 1 2

0 -1 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 3. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 1.

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El cultivo 2 se obtuvo, al igual que el cultivo 1, de la fermentación de maíz blanco VC- 152 germinado con una morfología distinta. En la Figura 4 se muestra la cinética de este cultivo, el cual muestra una producción de etanol elevada desde las primeras horas de la fermentación llegando a un punto máximo de 2.5 %, por otro lado la levadura mantuvo una liberación constante de glucosa al 2.0 % aproximadamente y la fructosa junto con la maltosa parecen ser consumidas por la levadura para la producción de etanol.

Cultivo 2

12 5

10 4

8 Glucosa 3 Maltosa 6 Fructosa 2 Etanol(%) Etanol Azúcares (%) Azúcares 4

1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 4. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 2.

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El cultivo 3 se obtuvo de la fermentación de maíz amarillo FAC-M-40 germinado. En la Figura 5 se observa que la levadura tiene una producción de etanol máxima de 0.34 % de las 24 h a las 48 h y un consumo total de maltosa y fructosa durante su producción de etanol. La levadura a partir de las 48 h comienza a liberar fructosa hasta llegar a un punto máximo a las 120 h de 6.6 % y en el caso de la glucosa se mantuvo una liberación constante, durante la cinética de fermentación al 2.0 % aproximadamente

Cultivo 3 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%) Fructosa Azúcares (%) Azúcares 4 Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 5. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 3.

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El cultivo 4 se obtuvo de la fermentación de maiz morado VC-42 germinado. La levadura del cultivo 4 no logró producir etanol como se muestra en la Figura 6, por otra parte la maltosa se mantuvo en trazas durante todo el proceso sin ser liberada como la fructosa a partir de las 96 h hasta llegar a un punto máximo a las 120 h de 4.6 %. La glucosa se mantuvo en concentraciones cercanas al 2.0% durante las 120 h al igual que el cultivo 3 y el cultivo 2. Cada microorganismo es totalmente distinto, no todos utilizan una misma ruta metabólica, podemos suponer que ésta levadura produjo ácido láctico en lugar de etanol o metabolizó los azúcares hasta CO2.

Cultivo 4 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%) 4 Fructosa

Azúcares (%) Azúcares Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 6. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 4.

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El cultivo 5 se obtuvo de una bebida artesanal llamada tepache. en la Figura 7 se muestra la cinética de fermentación de esta levadura, la cual tuvo una producción de etanol durante las primeras 24 h con un máximo de 0.96 %, a mismo tiempo que fue consumida la maltosa, por otra parte tenemos liberación de fructosa durante la cinética hasta un punto máximo a las 120 h de 3.0 % y una liberación constante de glucosa oscilando entre 0.59 % y 1.9 %.

Cultivo 5 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%) 4 Fructosa

Azúcares (%) Azúcares Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 7. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 5.

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El cultivo 6 se obtuvo de una bebida artesanal llamada tejuino y en este caso de la muestra 1 debido a la diferente morfología presentada entre las dos muestras de tejuino, se conservaron ambos cultivos (Figura 1). En la Figura 8 se muestra la cinética de fermentación de la levadura del cultivo 6. La levadura de este cultivo tuvo una buena producción de etanol un tanto tardía con respecto a la cepa S. Cerevisiae, debido a que obtuvo una producción del 3.1 % a las 72 h la producción de etanol, corresponde con el consumo de maltosa durante toda la cinética se mantuvo en trazas, comparado con la fructosa, la cual fue liberada desde el tiempo 0 hasta las 72 h donde se mantuvo constante al 7.0 %. Finalmente tenemos el comportamiento constante de la glucosa durante la cinética entre el 2.0 %

Cultivo 6 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa

2 Etanol (%) Fructosa Azúcares (%) Azúcares 4 Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 8. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 6.

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El cultivo 7 se obtuvo de una bebida artesanal llamada tejuino y en este caso es muestra 2 debido a la diferente morfología presentada en las imagenes de la Figura 1. En la Figura 9 se muestra la cinética de esta levadura, no tuvo producción de etanol, no liberó maltosa durante la cinética y se destaca su liberación de fructosa hasta llegar a un pico máximo de 10.3 % alas 72 h y después de a las 72 h a las 120 h se mantuvo en un 7.0%. Por último tenemos la glucosa que se mantuvo a liberación constante al 2.0% durante las 120 h.

Cultivo 7 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%) 4 Fructosa

Azúcares (%) Azúcares Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 9. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 7.

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El cultivo 8 se obtuvo de la una muestra de masa. En la Figura 10 se observa que la levadura tuvo una producción de etanol del 2.7 % a las 24 h, cayendo a las 72 h y llegando a un punto máximo a las 120 h con 3.0%, es necesario mencionar que el comportamiento de la producción de etanol corresponde con la liberación de maltosa a las 72 h donde la levadura lo ocupa como fuente para su producción final. Por otra parte la levadura liberó fructosa a las 48 h con 2.5 % y se observa nuevamente una liberación constante de glucosa al 2.0 % durante toda la cinética.

Cultivo 8 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa 2 Etanol (%) 4 Fructosa

Azúcares (%) Azúcares Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 10. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 8.

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El cultivo 9 se obtuvo de una muestra de guayaba. En la Figura 11 se observa que esta levadura tiene un buen comportamiento en la producción de etanol alcanzando un 4.7% a las 72 h de fermentación, correspondiendo al consumo de maltosa y por otra parte, la cinética sugiere que ese etanol se produce después del consumo de la fructosa acumulada durante las primeras 48 h de fermentación, nuevamente tenemos un comportamiento constante en la liberación de glucosa.

Cultivo 9 12 6

10 5

8 4

Glucosa 6 3 Maltosa Etanol (%) 4 2 Fructosa Etanol Azúcares (%) Azúcares 2 1

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 11. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 9. 35

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El cultivo 10 se obtuvo de una muestra de piña. En la Figura 12 se observa que la producción de etanol comienza desde las 0 h con un 3.0 % y se mantiene de las 24 h a las 120 h constante entre 0.3 % y 0.9 %, la maltosa permanece en trazas al ser consumida por la levadura. Lo que se destaca de la levadura es su acumulación de fructosa durante las primeras 72 h y por otra parte tenemos nuevamente la liberación constante de glucosa oscilando al 2.0 % durante la cinética.

Cultivo 10 12 5

10 4

8 3 Glucosa 6 Maltosa

2 Etanol (%) Fructosa 4 Azúcares (%) Azúcares Etanol 1 2

0 0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h)

Figura 12. Resultados de la cinética de fermentación empleando cultivo 10.

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En la Figura 13 se observan únicamente los resultados de etanol de las cinéticas de fermentación de los 10 cultivos comparados con la cepa comercial de referencia Saccharomyces cerevisiae Whisky, en color amarillo, la cual tuvo una producción de etanol de 1.4 % a las 24 h.

S. C erevisiae Cinética de fermentación Whisky Cultivo 1 5.0 Cultivo 2

Cultivo 3 4.0 Cultivo 4

3.0 Cultivo 5 Cultivo 6

2.0 Cultivo 7 Etanol (%) Cultivo 8 1.0 Cultivo 9

0.0 Cultivo 10 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h) Figura 13. Resultados de la producción de etanol de cada cultivo, durante las cinéticas de fermentación.

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En la Figura 14 se muestran los resultados de los 6 cultivos que tuvieron en algún punto de la cinética de fermentación una producción mayor a la cepa de referencia, Saccharomyces cerevisiae Whisky. Empezando por el cultivo 8 obtenido a partir de masa de maíz, con 2.7 % de etanol a las 24 h, cultivo 9 obtenido a partir de guayaba, con 4.7 % de etanol a las 72 h y cultivo 6 obtenido a partir de tejuino 1, con 3.1 % de etanol a las 72 h. El cultivo 1 obtenido a partir de maíz blanco 2VC-152, con 2.3 % de etanol a las 24 h, el cultivo 10 obtenida a partir de piña, con 3.0 % de etanol a las 0 h y el cultivo 2 obtenido a partir de maíz blanco 2VC-152, con 2.5 % de etanol a las 0 h.

Cinética de fermentación S. C erevisiae Whisky 4.5 Cultivo 1 4.0

3.5 Cultivo 2 3.0 Cultivo 6 2.5

2.0 Cultivo 8

Etanol (%) 1.5 Cultivo 9 1.0

0.5 Cultivo 10 0.0 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h) Figura 14. Cultivos con mayor producción de etanol comparado con la cepa comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky.

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En la Figura 15 se muestran los resultados de los 4 cultivos que tuvieron una producción menor a la cepa de referencia, Saccharomyces cerevisiae Whisky, durante la cinética de fermentación. Los cuales fueron, cultivo 3 proveniente de maíz amarillo FAC-M-40, cultivo 4 obtenido del maíz morado VC-42, cultivo 5 obtenido del tepache 1 y cultivo 7 obtenido del tejuino 2.

Cinética de fermentación 1.6 S. C erevisiae 1.4 Whisky

1.2 Cultivo 3 1.0

0.8 Cultivo 4 0.6 Etanol (%) 0.4 Cultivo 5 0.2

0.0 Cultivo 7 0 24 48 72 96 120 Tiempo (h) Figura 15. Cultivos con menor producción de etanol comparado con la cepa comercial de referencia, S. Cerevisiae Whisky.

Para realizar la identificación de los diferentes cultivos se eligieron técnicas moleculares. Para ello se realizó la extracción de ADN y se verificó su presencia y calidad mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2%. Destacando entre ellos el carril 11 que corresponde a la muestra de guayaba y el carril 12 que corresponde a piña.

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Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa de la extracción de ADN. 1) Marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen), 2) cultivo 1, 3) cultivo 2, 4) cultivo 3, 5) cultivo 4, 6) cultivo 5, 7) cultivo 6, 8) 2 3 cultivo 7, 9) cultivo 8, 10) cultivo 9, 11)6 cultivo 9a, 12) cultivo 10. 9

Una vez realizada la extracción de DNA de los 10 cultivos, se continuó con la amplificación por PCR con los oligos universales ITS1e ITS4 específicos para las levaduras. En el carril 1 tenemos el marcador de peso molecular, en el carril 2 tenemos el control negativo y del carril 3 al 13 los productos de amplificación a partir del ADN de los cultivos. Se puede apreciar en el carril 11 y 12 una similitud debido a que es la misma muestra del cultivo obtenido a partir de guayaba. 40

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Figura 15. Muestras de ADN aplificado a partir de una PCR. 1) marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen), 2) control negativo , 3) cultivo 1, 4) cultivo 2, 5) cultivo 3, 6) cultivo 4, 7) cultivo 5, 8) cultivo 6, 9) cultivo 7, 10) cultivo 8, 11) cultivo 9, 12) cultivo 9a, 13) cultivo 10.

Posterior a la amplificación por PCR, el producto se envió a secuenciación y se obtuvieron en total 8 secuencias con calidad apropiada, es decir, que pudieron ser secuenciadas para su posterior análisis taxonómico. Éstas secuencias se utilizaron para la comparación mediante el algoritmo BLAST (NCBI 2018) en las bases de datos NCBI. 2 secuencias correspondientes a los cultivos 3 y 8 no tuvieron suficiente calidad incluso después de resecuenciarlas, por lo que fueron nombradas como consorcio 1 y consorcio 2 al no ser cultivos puros. La mayoría de los cultivos pudieron identificarse a nivel de especie excepto el cultivo 10 que tiene una identidad muy baja con a secuencia más parecida.

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Tabla 11. Resultados Identificación taxonómica.

Cultivo Muestra de origen Cepa Identidad EValue 1 Maíz blanco Candida intermedia 100% 5e-143 1 VC-152 germinado y fermentado 2 Maíz blanco Meyerozima caribbica 1 99% 0.0 2 VC-152 germinado

y fermentado

3 Cultivo 4 / Maíz Consorcio 1 NA NA amarillo FAC-M-40 germinado y fermentado

4 Maíz morado Kluyveromyces 99% 0.0

VC-42 germinado y marxianus fermentado 5 Tepache Candida boidinii 99% 0.0

6 Tejuino 1 Zygotorulaspora 100% 0.0 florentina 7 Tejuino 2 Hanseniaspora uvarum 99% 0.0 8 Masa Consorcio 2 NA NA 9 Guayaba Meyerozima caribbica 2 100% 0.0 10 Piña Hanseniaspora sp. 90% 0.0

En la Tabla 11 se enumeran del 1-10 los cultivos finales que formaron parte de nuestra colección de levaduras, seguido de la muestra de donde se obtuvieron, la posición taxonómica, la identidad con respecto a la secuencia más cercana y los valores de e- value del BLAST, en el caso del cultivo 3 y 8 no aplica debido a que no se tenían los datos por parte de la secuenciación y no se pudieron correr en el programa.

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DISCUSIÓN

Una vez obtenida la identidad taxonómica de acuerdo a los resultados obtenidos en BLAST de cada cultivo, se realizó una búsqueda bibliográfica para tener conocimiento del potencial de cada cepa e indagar sobre su uso actual.

Comenzando con la cepa Candida intermedia obtenida de maíz blanco 1 VC-152, anteriormente ya se tenía el registro de Candida intermedia como levadura espontánea, encontrada durante la elaboración artesanal de vino de palma (Ríos. 2018). En otros estudios realizados en Portugal y Japón, se investigó el efecto por parte de Candida intermedia y Saccharomyces cerevisiae, ambas levaduras fermentadoras de xilosa y glucosa. Los autores evaluaron su rendimiento, usando como sustrato paja de trigo y se observó que en ocasiones la xilosa tomaba otra ruta metabólica y en lugar de producir etanol producía glicerol y xilitol (Fonseca et al. 2011; Tanino et al. 2012). En este estudio, Candida intermedia tuvo un comportamiento constante en la producción de etanol desde las 0 h como se muestra en la Figura 3; es probable que bajo nuestras condiciones de proceso se pueda aumentar el porcentaje alcohólico al realizar una fermentación en conjunto con Sacharomyces cerevisiae y Candida intermedia.

Meyerozima caribbica es una levadura que fue obtenida en dos muestras, maíz blanco 2 VC-152 y guayaba, además ha sido reportada como una cepa aislada de ecosistemas oleicos, de piña y mora. Produce enzimas β-glucosidadasa, peroxidasa y β-glucanasa (Luz Adriana Mambuscay M. et al. 2013); sin embargo, en este estudio la levadura fue aislada a partir de la fermentación de maíz blanco 1 germinado y guayaba. Por otra parte, M. caribbica es considerada una levadura fermentadora, que cataboliza L-arabinosa, D-glucosa y D-xilosa, el rendimiento de etanol que se obtuvo tomando como fuente de carbono la D-glucosa fue de 21.7g/L (Sukpipat et al. 2017). Es probable que, si nosotros aumentamos la producción de glucosa, la levadura lograría tener un incremento y una mayor estabilidad en la producción de etanol. En el caso específico del cultivo 2 se observó una producción de etanol al inicio y al final de la cinética como 43

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se muestra en la Figura 4 y en el cultivo 9 se logró un 4.5% a las 72 h como se muestra en la Figura 11. En otros estudios se utilizó M. caribbica como biocontrol en un mango ataulfo y esta levadura funcionó al igual que un fungicida, compitiendo por nutrientes como sacarosa y fructosa, controlando el crecimiento del patógeno Colletotrichum gloeosporioides, presente durante el proceso de putrefacción del mango (Bautista- Rosales et al. 2013).

En la India se utilizó Kluyveromyces marxianus para la producción de alcohol a partir del suero de queso, obteniendo que a las 72 h se consumía la lactosa, logrando un rendimiento alcohólico de 6.02 g/L, (BipashaDas et al. 2016). En otros estudios se utilizó K. marxianus para fermentación de etanol utilizando como biomasa la xilosa y obteniendo un rendimiento total de 6.02 g/L de etanol con bagazo de caña (Bourdichon et al. 2012; Dasgupta et al. 2017). En la Figura 6 podemos observar que K. marxianus, no logró producir etanol durante las 120 h.

Zygotorulaspora florentina fue evaluada en fermentaciones de cultivo mixto junto con Saccharomyces cerevisiae. La finalidad de ese estudio era analizar los resultados de aroma y sabor en vino (Lencioni et al. 2016). En otras investigaciones se han utilizado diferentes cepas de levaduras fermentadoras no convencionales, entre ellas Zygotorulaspora florentina, en conjunto con Saccharomyces cerevisiae, logrando mejoras en sabor de cerveza (Holt et al. 2018). En este trabajo, para Z. florentina se obtuvo un 3.0% de etanol a las 72 h, como se muestra en la Figura 8; sin embargo, de acuerdo a los resultados obtenidos por Lencioni et al. (2016) la aportación de esta levadura para mejorar el sabor de vinos, es importante, por lo que un cultivo mixto de Saccharomyces cerevisiae con Zygotorulaspora florentina, podría mejorar el aroma y sabor de la bebida de interés.

En China se analizó que la concentración de compuestos aromáticos podría incrementarse por medio de Hanseniaspora uvarum, mediante la actividad de enzimas como β-glucosidasa y la presencia de ácidos grasos; sin embargo, si se aumentaba la cantidad de levaduras se tenía un resultado contraproducente al elevar las 44

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concentraciones de ésteres, provocando un olor a esmalte de uñas en los vinos utilizados en ese proyecto (De Arruda Moura Pietrowski et al. 2012; Bourdichon et al. 2012; Chunxiao Wang and AlbertMasBraulio 2015; Kai Hu et al. 2018). H. uvarum puede aportar más al aroma y sabor. Se puede apreciar en la Figura 9 que H. uvarum no produce etanol, pero si alguna levadura de interés tiene por biomasa la fructosa, esta levadura le ayudaría como un cultivo mixto, debido a que la liberacion que tenemos por parte de nuestra cepa es alto y en algunos estudios hemos encontrado que realizan investigaciones con cultivos mixtos, para beneficiar la producción final del objetivo, en nuestro caso, etanol.

En estudios realizados en Brasil, se utilizó Candida boidinii en sustrato de xilosa obtenida a partir de una palma brasileña para la producción de biodiesel alcanzando 5g/L de etanol (Gonçalves et al. 2013). Los estudios encontrados para esta levadura, no consisten directamente en fermentación para uso alimentario, sino para la producción de bioetanol. La cepa identificada en este estudio fue aislada de una bebida tradicional, el tepache y como se muestra en la Figura 7, Candida boidinii, no logró producir etanol.

No se tiene certeza del contenido en el consorcio obtenido de la fermentación de maíz amarillo (Consorcio 1). Como se muestra en la Figura 5, el consorcio 1, no logró una producción de etanol durante las 120 h.

El consorcio 2 obtenido de una muestra de masa, podría colaborar con la parte de fermentación si se busca una generación de etanol en poco tiempo. En la Figura 10 podemos observar que el consorcio 2 a las 24 h y 120 h tiene una producción de etanol considerable; sin embargo, al ser un consorcio, probablemente puede tener diferentes tipos de levaduras, por lo que no se podría asegurar aroma y sabor aceptable.

CONCLUSIONES

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• A partir de 33 muestras, se obtuvo una colección de diez cultivos de levaduras, provenientes de la fermentación de maíz, bebidas artesanales y algunos ingredientes.

• Los cultivos seleccionados pertenecen a los siguientes géneros, Candida, Meyerozima, Kluyveromyces, Zygotorulaspora y Hanseniaspora.

• Las cepas Candida intermedia, Meyerozima caribbica 1, Zygotorulaspora florentina, consorcio 2, Meyerozima caribbica 2 y Hanseniaspora sp., fueron las que alcanzaron una producción de etanol mayor a la cepa de referencia, Sacchacomyces cerevisiae whisky.

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PRODUCTOS

Póster presentado en el 2nd Biotechnology World Symposium. San José del Cabo, B.C.S., México, octubre 2018. “Isolation and selection of ethanolic fermenting yeasts for the production of beverages”.

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