THÈSE
Pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR de médecine et de pharmacie Ecologie et biologie des interactions - EBI (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges) Secteur de recherche : Physiologie, Biologie des organismes, populations et Interactions
Présentée par : Damien Costa
Analyse de l'écologie microbienne des conduites d'eau d'unités de soins dentaires
Directeur(s) de Thèse : Christine Imbert, Julien Verdon
Soutenue le 10 décembre 2015 devant le jury
Jury :
Président Loïc Favennec Professeur et praticien hospitalier, Université de Rouen
Rapporteur Thierry Jouenne Directeur de recherche CNRS, PBS, Université de Rouen
Rapporteur Hélène Chardin Professeur et praticien hospitalier, Université Descartes, Paris
Membre Christine Imbert Professeur, EBI, Université de Poitiers
Membre Julien Verdon Maître de conférences, EBI, Université de Poitiers
Membre Jérôme Labanowski Chargé de recherche CNRS, IC2MP, Université de Poitiers
Pour citer cette thèse : Damien Costa. Analyse de l'écologie microbienne des conduites d'eau d'unités de soins dentaires [En ligne]. Thèse Physiologie, Biologie des organismes, populations et Interactions. Poitiers : Université de Poitiers, 2015. Disponible sur Internet
(Faculté Médecine et Pharmacie) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Gay Lussac
Secteur de Recherche : Physiologie, Biologie des organismes, populations et Interactions
Présentée par : Damien COSTA
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ANALYSE DE L’ECOLOGIE MICROBIENNE DES CONDUITES D’EAU D’UNITES DE SOINS DENTAIRES
************************ Directrice de Thèse : Christine IMBERT Co-directeur de Thèse : Julien VERDON
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Soutenue le 10 décembre 2015 devant la Commission d’Examen
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JURY Rapporteurs : Mme CHARDIN Hélène MCU-PH, Université Paris Descartes M. JOUENNE Thierry Professeur, Université de Rouen
Examinateurs : M. LABANOWSKI Jérôme CR-CNRS, Université de Poitiers M. FAVENNEC Loic PU-PH, Université de Rouen M. VERDON Julien MCF, Université de Poitiers Mme IMBERT Christine PU, Université de Poitiers Remerciements
Je tiens tout particulièrement à remercier le Pr Christine Imbert, ma directrice de thèse, pour sa gentillesse, sa patience, la qualité de ses enseignements, son amitié, sa grande disponibilité, son écoute, ses conseils, la qualité de son encadrement tout au long de cette aventure de doctorant et d’interne IPR.
J’aimerai également remercier le Dr Julien VERDON, mon co-directeur de thèse, pour son amitié, sa gentillesse, ses relectures et ses remarques pertinentes concernant ce manuscrit de thèse et les articles parus ou en cours de soumission.
Je remercie également Hélène CHARDIN, Thierry JOUENNE, LoÏc FAVENNEC et jérôme LABANOWSKI, les autres membres de mon jury de thèse, pour avoir accepté de lire et d’évaluer mon travail et pour certains, de se déplacer jusqu’à Poitiers pour cela.
Je remercie Didier Bouchon, directeur du laboratoire Écologie et Biologie des Interactions (EBI) pour m’avoir permis de réaliser ma thèse d’université au sein de son laboratoire.
Plus particulièrement, je tiens à remercier Yann Héchard et Jean-Marc Berjeaud successivement responsables de l’équipe Microbiologie de l’Eau (MDE) pour leur accueil au sein de l’équipe, la gestion qu’ils en font et je tiens également à remercier l’ensemble de l’équipe MDE pour leurs amitiés, les soirées jeux de carte, bref, les bons moments passés ensemble.
Un grand merci à Anne Mercier pour son investissement, son amitié, son aide très précieuse dans les travaux de ma thèse, ses remarques et conseils toujours pertinents.
Merci à Jérôme LESOBRE pour son amitié, son implication et son savoir-faire précieux.
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Merci également à Kévin Gravouil, pour son amitié, son investissement, son efficacité et ses compétences bioinformatiques qui furent précieuses au cours de ces travaux de thèse.
Je tiens à remercier le Pr Guylène PAGE pour la qualité de ses enseignements, sa gentillesse, son amitié, sa disponibilité, sa pédagogie et pour m’avoir accompagné dans mes « premiers pas » de chercheur et m’avoir transmis la passion de la recherche.
Merci à toute l’équipe opérationnelle d’Hygiène (EOH) du CHU de Poitiers : le Dr Olivier Castel (le chef !), le Dr Sarah Thévenot, le Dr Anne Bousseau, Jeanne, Flo, Nicole, Christiane, les techniciennes, Catherine Laland et Chantal Leger pour leurs amitiés, leurs gentillesses, leurs conseils et la qualité de la formation professionnelle prodiguée pendant ces quelques années.
Merci à Christophe et à Alain pour leurs amitiés et leur aide logistique quotidienne et indispensable.
Je remercie l’ensemble de l’équipe du Laboratoire de Parasitologie et Mycologie du CHU de Poitiers et en particulier le Pr Marie-Hélène Rodier pour son amitié, ses conseils, son accueil chaleureux pendant de nombreux semestres en tant qu’interne IPR au sein de son service.
Merci à mes précédents maîtres de stages qui m’ont accompagné au cours de mon cursus de Pharmacien : les Dr Louis Julienne et Françoise brousse.
Merci à Raymond Pontcharraud (alias « Pompon ») pour m’avoir accompagné aux côtés de Guylène PAGE, dans mes « premiers pas » de chercheur, pour son amitié et sa joie de vivre.
Merci à Mlle Marie-Paule Jouannetaud et à Mr François Seguin, successivement doyens de la section Pharmacie de l’université de Médecine- Pharmacie de Poitiers pour leurs amitiés et leurs conseils.
Merci au Dr Antoine Dupuis pour son amitié et son rôle dans l’encadrement, l’orientation des Internes IPR au CHU de Poitiers.
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Merci à Nathalie Quellard et à Béatrice Fernandez pour les observations en microscopie électronique, à Joanne Bertaux pour son amitié et son aide pour l’ensemble de la technique de FISH.
Un grand merci à mon frère Mickaël COSTA et ma maman Marie-Thérèse COSTA pour leur soutien, leur aide et leurs encouragements. Je remercie également ma tante Marie Bernadette et ses enfants Jérôme et Jean-Christophe pour leur soutien.
Et enfin, je remercie l’ensemble des mes amis (co-doctorants, co-internes, de lycée, de fac, de collège) : Pierre alias « bibi » qui m’a fait l’honneur d’être membre de mon jury de thèse d’exercice, Nathalie, Thomas, Maxime, Fred, Nico, Sarah, Angel, Marie, Marion, Vanessa, Chloé, Vincent, Emilie, Elodie, Kévin (alias « Professeur Brunet »), Alida et « Loulou », Thibault, Mathieu, Caro, Steeve et tous les autres… pour tous les bons moments passés ensemble depuis plusieurs années déjà pour certains ou un peu moins pour d’autres.
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Liste des tableaux (hors articles)
Tableau I : Critères microbiologiques d'une eau potable ...... 26 Tableau II : Liste des principaux produits de désinfection des LUSD proposés par les fournisseurs d'USD en France ...... 35 Tableau III : Prévalence des infections nosocomiales par microorganisme ...... 55 Tableau IV : Gènes impliqués dans la formation d’un biofilm de C. albicans ...... 58 Tableau V : Programme utilisé pour la qPCR 16S ...... 73 Tableau VI : Programme utilisé pour la qPCR 18S fongique ...... 74 Tableau VII : Programme utilisé pour la PCR C. albicans ...... 75 Tableau VIII : Programme utilisé pour la qPCR C. albicans...... 76 Tableau IX : Programme utilisé pour la PCR Amibes ...... 77 Tableau X : Programme utilisé pour la qPCR Amibes ...... 78 Tableau XI : Programme utilisé pour la qPCR Legionella pneumophila ...... 79 Tableau XII : Programme utilisé pour la qPCR Legionella spp...... 79 Tableau XIII : Programme utilisé pour la qPCR Pseudomonas aeruginosa ...... 80 Tableau XIV : Programme PCR de préparation des échantillons au pyroséquençage bactérien ...... 81 Tableau XV : Récapitulatif des amorces utilisées pour la PCR multiplexes ...... 81 Tableau XVI : Programme PCR de préparation des échantillons pour le pyroséquençage fongique .. 85 Tableau XVII : Préparation du milieu PYNFH complémenté...... 87 Tableau XVIII : Recette de la salive artificielle ...... 88 Tableau XIX : Données recueillies concernant les USD privées ...... 99 Tableau XX : Données recueillies concernant les USD dépendantes du CHU de Poitiers ...... 100 Tableau XXI : Résultats de la qPCR Amibienne ...... 105 Tableau XXII : Résultats de la qPCR Legionella spp...... 106 Tableau XXIII : Résultats de la qPCR P. aeruginosa ...... 108 Tableau XXIV : Données UFC et qPCR 16S (bactérienne) et 18S (fongique) de l’unité supplémentaire ...... 166 Tableau XXV : Données des indices de diversité issus des pyroséquençages bactérien et fongique de l'unité supplémentaire ...... 166
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Liste des figures (hors articles)
Figure 1 : Photo d'une USD du CHU de Poitiers ...... 19 Figure 2 : Fauteuil de barbier ...... 20 Figure 3 : Représentation du fauteuil de J. Snell ...... 21 Figure 4 : Exemples d'instruments statiques utilisés en odontologie ...... 22 Figure 5 : Représentation d’une pièce-à-mains et d’un contre-angle ...... 22 Figure 6 : Représentation d'une turbine ...... 23 Figure 7 : Représentation des PIR d’une USD ...... 23 Figure 8 : Schématisation du circuit d'eau alimentant les PIR ...... 24 Figure 9 : Modes de contamination microbiologique des circuits d’alimentation en eau des PIR ...... 26 Figure 10 : Mécanismes de résistance d'un biofilm fongique de C. albicans ...... 29 Figure 11: Détails de la formation d'un biofilm à l’intérieur d’une tubulure ...... 31 Figure 12 : Photo en Microscopie Électronique à Balayage d'un biofilm à P. aeruginosa ...... 43 Figure 13 : Etapes de la formation d'un biofilm de P. aeruginosa ...... 46 Figure 14 : Résumé des voies de signalisation impliquées dans la formation, le développement et la dispersion d’un biofilm de P. aeruginosa ...... 47 Figure 15 : Représentation des systèmes de QS chez P. aeruginosa ...... 48 Figure 16 : Voie de signalisation et régulation du c-di-GMP ...... 50 Figure 17 : Différentes formes de Candida albicans ...... 54 Figure 18 : Exemples de candidoses cutanéo-muqueuses ...... 56 Figure 19 : Image en MEB de l’architecture d'un biofilm à C. albicans ...... 57 Figure 20 : Action des gènes de C. albicans impliqués dans la formation d'un biofilm ...... 59 Figure 21 : Types d'interactions bacterio-fongique existantes ...... 62 Figure 22 : Mécanismes moléculaires d'interactions entre P. aeruginosa et C. albicans ...... 63 Figure 23 : Observations en microscopie optique d'un trophozoïte et d'un kyste de Vermamoeba vermiformis...... 65 Figure 24 : Observations en Microscopie électronique à transmission (MET) de la phagocytose de L. pneumophila par V. vermiformis et de sa réplication à l'intérieur de l'amibe ...... 66 Figure 25 : Images par microscopie électronique à transmission d’interactions entre V. vermiformis et Candida sp...... 68 Figure 26 : Points de prélèvement des USD investiguées ...... 70 Figure 27 : Photographie du CBR en fonctionnement ...... 90 Figure 28 : Chronologie de l’étude de l’effet préventif du calbenium© sur la formation du biofilm polymicrobien ...... 94 Figure 29 : Exemple d’un gel de migration de produits de PCR 18S C. albicans ...... 102 Figure 30 : Exemple d’un gel de migration de produits PCR 18S amibienne obtenu...... 104 Figure 31 : Comparaison des données issues des qPCR 18S amibienne et 16S Legionella spp...... 107 Figure 32 : Représentation cytoscape de la composition bactérienne des USD ...... 134 Figure 33 : Représentations cytoscape des conditions d'IW, d'OWS et d'OWA de l’ensemble des 21 prélèvements d’USD ...... 135 Figure 34 : Représentation en heatmap de l’abondance relative des communautés bactériennes des conditions IW, OWS, et OWA de l’unité supplémentaire ...... 168 Figure 35 : Représentation en heatmap de l’abondance relative des communautés fongiques des conditions IW, OWS, et OWA de l’unité supplémentaire ...... 169 Figure 36 : Photographies en MEB du biofilm polymicrobien développé sur coupons de PVC ...... 173
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Figure 37 : Influence des matériaux sur la formation d'un biofilm polymicrobien en condition dynamique ...... 174 Figure 38 : Influence des matériaux sur la biomasse de P. aeruginosa développée dans le biofilm polymicrobien ...... 174 Figure 39 : Influence des matériaux sur la biomasse de C. albicans développée dans le biofilm polymicrobien ...... 175 Figure 40 : Pourcentage de survie de P. aeruginosa au sein du biofilm mixte avec C. albicans en présence ou en absence de V. vermiformis après exposition à différents désinfectants pendant 15 min ...... 197 Figure 41 : Pourcentage de survie de C. albicans au sein du biofilm mixte avec P. aeruginosa en présence ou en absence de V. vermiformis après exposition à différents désinfectants pendant 15 min ...... 198 Figure 42 : Evaluation de l'efficacité du calbenium©, de l'oxygenal 6© et du sterispray© sur V. vermiformis dans l’eau filtrée en condition planctonique ...... 199 Figure 43 : Activité du calbenium© sur V. vermiformis en suspension en eau filtrée + 5% de salive artificielle avec et sans co-incubation avec P. aeruginosa et C. albicans ...... 200
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Abréviations
°C : Degré Celsius µL : Microlitres µm : Micromètres A : Adénine ADA : American dental association ADN : Acide désoxyribonucléique ADNdb : ADN double brins ADNr : ADN ribosomal AES : Accident d’exposition au sang AFNOR : Association française de normalisation AHL : Acyl homoserines lactones ARB : Amoeba resistant bacteria ARNr : ARN ribosomal C : Cytosine CDC : Centers for disease control c-di-GMP : Di-guanosine monophosphate cyclique CFU : Colony forming unit. (Unité formant colonie) CHU : Centre hospitalo-universitaire DGC : Diguanylate cyclase dNTP : Désoxyribonucléotides triphosphate E : Efficacité EDTA : Acide éthylène diamine trétracétique G : Guanine GMP : Guanosine monophosphate H : Heure HBV : Virus de l’hépatite B HCl : Acide chlorydrique HCV : Virus de l’hépatite C HIV : Virus de l’immunodéficience humaine HSV : Herpes simplex virus IAS : Infections associées aux soins IW : Incoming water (Amont d’unité) LPS : Lipopolysaccharides LUSD : Lignes d’eaux des unités de soins dentaires M : Molaire MEC : Matrice extracellulaire
MgCl2 : Chlorure de magnésium MIDs : Multiplexe IDentifiers (Identifiants multiplexes) mL : Millilitres mm : Millimètres mM : Millimolaires NaCl : Chlorure de sodium NCBI : National center for biotechnology information ND : Non détectable 8 | P a g e
NF : Norme Française ng : Nanogrammes ORL : Oto-Rhino-Laryngologie OTUs : Operational taxonomic units (Unités taxonomiques opérationnelles) OWA : Output water after activity (Eau de sortie d’unité après activité) OWS : Output water after stagnation (Eau de sortie d’unité après stagnation) Pa : Pseudomonas aeruginosa PAMP : Pattern Associated Molecular Pattern PCA : Plate count agar PCoA : Analyse en composante principale PCR : Polymerase chain reaction PDE : Phosphodiesterase pH : Potentiel hydrogène PIR : Portes instruments rotatifs Ppm : Partie par million PQS : Pseudomonas quinolone signal PTP : Pico titer plate PVC : Polychlorure de vinyle qPCR : PCR quantitative QS : Quorum sensing s : Secondes SDS : Sodium dodecyl sulfate sRNA : Small ARN T : Thymine TLR : Toll-Like Receptor U : Unités UFC : Unité formant colonies UG : Unité génomique USD : Unité de soins dentaires v/v : Volume/volume VBNC : Viable mais non cultivable
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Table des matières
Remerciements ...... 2 Liste des tableaux (hors articles) ...... 5 Liste des figures (hors articles) ...... 6 Abréviations ...... 8 Table des matières ...... 10 Introduction ...... 14 Synthèse bibliographique ...... 18 Partie I : contexte des USD ...... 19
1. Définition et histoire des USD ...... 19 2. Instrumentation utilisée en odontologie ...... 21 3. Le circuit d’alimentation en eau des PIR ...... 24 4. Alimentation hydrique et sources potentielles de contamination microbienne ...... 24 5. Qualité microbiologique de l’eau des USD ...... 26 6. La problématique du biofilm ...... 27 7. Stratégies de décontamination du circuit d’eau des USD ...... 32 8. Le risque infectieux et les USD ...... 38 Partie II : Microorganismes présents dans les LUSD ...... 41
1. Pseudomonas aeruginosa ...... 42 1.1. Généralités ...... 42 1.2. Pathogénicité ...... 43 1.3. Facteurs de virulence ...... 44 1.4. Biofilm de P. aeruginosa ...... 45 1.4.1. Le Quorum Sensing chez P. aeruginosa ...... 47 1.4.2. La voie de signalisation du c-di-GMP (Di-guanosine monophosphate cyclique) ...... 49 1.4.3. Les sRNAs ...... 51 1.5. Implication clinique de P. aeruginosa associé à des biofilms ...... 51 1.6. Résistance aux antibiotiques et aux traitements chimiques de l’eau ...... 52 2. Candida albicans...... 53 2.1. Généralités ...... 53
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2.2. Pathogénicité ...... 54 2.3. Biofilm à C. albicans ...... 56 2.4. Résistance aux antifongiques et aux désinfectants ...... 60 2.5. Implication clinique de C. albicans dans les biofilms ...... 61 2.6. Interactions microbiennes ...... 61 2.6.1. Interactions entre C. albicans et P. aeruginosa ...... 62 3. Vermamoeba vermiformis ...... 64 3.1. Généralités ...... 64 3.2. Nutrition ...... 65 3.3. Pathogénicité ...... 66 3.4. Résistance aux traitements ...... 67 3.5. Interactions entre V. vermiformis et P. aeruginosa ou C. albicans ...... 68 Matériel et méthodes ...... 69 Partie I Etude de la diversité microbienne des USD ...... 70
1. Caractéristiques des USD étudiées ...... 70 2. Stratégie d’échantillonnage ...... 70 3. Etude de la flore bactérienne totale cultivable ...... 71 4. Extraction d’ADN et quantification ...... 72 5. qPCR 16S bactérienne ...... 72 6. qPCR 18S fongique ...... 73 7. PCR C. albicans ...... 74 8. qPCR C. albicans ...... 75 9. PCR Amibes ...... 76 10. qPCR amibienne ...... 77 11. qPCR L. pneumophila ...... 78 12. qPCR Legionella spp...... 79 13. qPCR P. aeruginosa ...... 80 14. Pyroséquençage du gène de l’ARNr 16S ...... 80 15. Pyroséquençage du gène de l’ARNr 18S ...... 84 Partie II Modélisation dynamique d’un biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD ..... 86
1. Souches microbiennes ...... 86 2. Culture et entretien des souches ...... 86 2.1. Candida albicans ...... 86 11 | P a g e
2.2. Pseudomonas aeruginosa...... 86 2.3. Vermamoeba vermiformis ...... 87 3. Milieux d’expérimentation ...... 88 4. Préparation des suspensions microbiennes ...... 88 4.1. Suspension de C. albicans...... 88 4.2. Suspension de P. aeruginosa ...... 89 4.3. Suspension de V. vermiformis ...... 89 5. Mise au point du modèle dynamique ...... 89 6. Étude de l’influence des matériaux sur la formation du biofilm ...... 91 7. Entretien des coupons ...... 92 8. Évaluation de l’effet de traitements désinfectants sur le biofilm polymicrobien ...... 92 8.1. Les désinfectants testés ...... 92 8.2. Étude de l’efficacité des produits sur un biofilm déjà formé : approche curative ...... 92 8.3. Étude de l’effet préventif du calbenium© sur la formation du biofilm polymicrobien : approche prophylactique ...... 93 8.4. Analyse de l’épaisseur du biofilm par imagerie à fluorescence ...... 94 9. Microscopie Electronique à Balayage (MEB) ...... 95 10. Étude de l’activité des désinfectants sur V. vermiformis en suspension ...... 96 11. Analyses statistiques ...... 97 Résultats et Discussion ...... 98 Partie I Étude de la diversité microbienne des USD ...... 99
1. Caractéristiques des USD étudiées ...... 99 2. Recherche ciblée de microorganismes ...... 101 2.1. Recherche de C. albicans ...... 101 2.1.1. PCR C. albicans ...... 101 2.1.2. qPCR C. albicans ...... 102 2.2. Recherche d’amibes libres...... 103 2.2.1. PCR amibienne...... 103 2.2.2. qPCR amibienne ...... 104 2.3. Résultats des qPCR bactériennes ...... 105 2.3.1. qPCR Legionella spp...... 105 2.3.2. qPCR Legionella pneumophila ...... 106 2.3.3. qPCR Pseudomonas aeruginosa ...... 107
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3. Analyse par pyroséquençage de la diversité bactérienne des LUSD ...... 108 3.1. Article : Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in dental unit waterlines ...... 111 3.2. Résultats complémentaires publiés ...... 120 3.2.1. Table S1 : caractéristiques physico-chimiques de l’eau municipale de Poitiers ...... 120 3.2.2. Table S2 : paramètres bioinformatiques du pyroséquençage ...... 121 3.2.3. Table S3 : caractère pathogène des espèces bactériennes détectées ...... 122 3.2.4. Table S4 : liste exhaustive des genres bactériens détectés ...... 123 3.2.5. Table S5 : résultats de la qPCR Legionella spp...... 132 3.3. Résultats complémentaires non encore publiés ...... 133 4. Densité et diversité des communautés bactériennes et fongiques des LUSD soumises à des produits désinfectants ...... 136 4.1. Article en cours de soumission : Bacterial and fungal communities density and diversity in dental unit waterlines (DUWL) subjected to disinfectants ...... 138 4.2. Données complémentaires ...... 166 Partie II Modélisation dynamique d’un biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD ... 171
1. Principales caractéristiques du modèle ...... 171 2. Influence des matériaux sur le développement du biofilm ...... 173 3. Efficacité des désinfectants sur un biofilm polymicrobien ...... 177 3.1. Efficacy of dental unit waterlines disinfectants on a polymicrobial biofilm (article actuellement soumis) ...... 177 3.2. Expériences complémentaires ...... 195 3.2.1. Évaluation de l’influence de la présence de V. vermiformis dans un biofilm polymicrobien sur l’activité des désinfectants de LUSD ...... 195 3.2.2. Activité des désinfectants des LUSD sur V. vermiformis en condition planctonique . 199 Conclusion et perspectives ...... 203 Bibliographie...... 209
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Introduction
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Lors de la réalisation des soins dentaires, les patients ainsi que l’équipe soignante (dentiste, assistant(e) dentaire…) sont exposés à l’eau circulant dans les unités de soins dentaires (USD) soit par le biais de projections soit par inhalation des aérosols générés lors de l’utilisation des pièces rotatives. Or, la contamination microbienne des Lignes d’eaux des Unités de Soins Dentaires (LUSD) est bien connue puisque les premières publications sur le sujet datent des années 1960. Les microorganismes retrouvés dans les LUSD sont multiples : bactéries, virus, champignons et amibes libres cohabitent et interagissent entre eux. Ces microorganismes sont retrouvés dans les LUSD à la fois sous forme planctonique et sous forme sessile (biofilm). Les biofilms facilitent les interactions microbiennes et favorisent la persistance microbienne au sein des LUSD, notamment en limitant la sensibilité des microorganismes aux agents désinfectants. Les conditions au sein des LUSD sont favorables à la présence de microorganismes qui pourront, lors de la réalisation des soins, entrer en contact avec les patients et les soignants et potentiellement engendrer des infections. Ce travail de thèse s’inscrit donc dans un contexte de compréhension et de prévention des infections associées aux soins (IAS), avec un intérêt particulier porté au risque infectieux potentiellement associé aux réseaux d’eau des USD.
Peu d’IAS clairement liées aux USD ont été rapportées dans la littérature à ce jour. Ceci peut s’expliquer soit parce que les populations microbiennes présentes dans les LUSD exposent finalement peu les patients à un risque infectieux, soit parce que trop peu d’investigations sont entreprises dans ce contexte et que le lien avec les soins dentaires est insuffisamment recherché en cas d’infection, notamment de la sphère ORL ou respiratoire. En effet, il est assez peu intuitif de suspecter une « banale » visite chez le chirurgien-dentiste comme pouvant être la cause d’une infection. Ceci s’expliquant, par exemple, par des délais d’apparition des signes cliniques parfois longs après l’exposition infectante ou encore par une symptomatologie trop aspécifique laissant penser à d’autres causes infectantes que la visite chez le dentiste. De plus, l’origine certaine d’une infection ayant pour source les LUSD ne pourrait être établie que par la mise en évidence d’empreintes génétiques identiques entre la souche isolée chez un patient (ou chez un soignant) et la souche retrouvée dans les LUSD. De plus, ceci nécessiterait la mise en œuvre 15 | P a g e
de techniques moléculaires, rarement, voire jamais, réalisées en routine pour établir le diagnostic d’infections courantes.
À ce jour, les études disponibles concernant la contamination microbienne des LUSD ont évalué quantitativement et qualitativement les populations cultivables présentes en utilisant principalement des méthodes de microbiologie conventionnelle basées sur le dénombrement de microorganismes sur gélose. Or, ces approches ne permettent qu’une estimation partielle de la diversité microbienne réelle des LUSD puisque de nombreuses espèces microbiennes sont viables mais non cultivables et que les microorganismes présents dans un même environnement ont des contraintes de croissance différentes.
Deux objectifs principaux ont été définis au cours de ma thèse :
Le premier objectif consistait à décrire et à évaluer le plus précisément possible la communauté microbienne présente dans les LUSD. Pour ce faire, des techniques conventionnelles d’ensemencement sur géloses nutritives ont été complétées par des techniques de biologie moléculaire telles que la PCR et la qPCR mais également par une approche plus innovante par pyroséquençage. Le pyroséquençage est une technique de séquençage haut débit permettant le séquençage de plusieurs échantillons d’ADN simultanément. Son intérêt ici consiste à obtenir une exhaustivité dans la détection des communautés microbiennes (bactérienne et fongique) des échantillons. La diversité microbienne a été étudiée en évaluant les variations de la communauté microbienne survenant au sein de l’USD selon le trajet de l’eau entre le point d’alimentation et celui de sortie de l’USD. L’influence des traitements chimiques par des désinfectants ou physiques par des purges a également été investiguée. Cette première partie a été réalisée en partenariat avec des chirurgiens-dentistes mettant leurs USD ponctuellement à notre disposition, et visait à améliorer l’appréhension du risque infectieux associé aux soins dentaires.
Le deuxième objectif principal de ce travail de thèse consistait à modéliser la formation d’un biofilm polymicrobien dans des conditions mimant celles des LUSD 16 | P a g e
afin d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements désinfectants proposés par les fournisseurs d’USD sur ce biofilm. En effet, les tests préalables à la commercialisation des désinfectants utilisés pour l’entretien des LUSD ne sont pas toujours clairement définis, et ne sont pas toujours pertinents au regard du choix des microorganismes (amibes libres non testées), des conditions de croissance microbienne (mode biofilm peu étudié), etc... Le biofilm développé dans le modèle mis au point était constitué de trois espèces microbiennes classiquement retrouvées dans les LUSD, à savoir : Pseudomonas aeruginosa (bactérie), Candida albicans (champignon levuriforme) et Vermamoeba vermiformis (protiste). P. aeruginosa a été choisi puisque c’est une bactérie fréquemment retrouvée dans tous types de réseaux d’eau, parce qu’elle est bien connue pour sa capacité à développer des biofilms et qu’elle est parfois responsable d’infections nosocomiales d’origine hydrique. C. albicans est une levure commensale mais aussi un pathogène opportuniste de l’Homme fréquemment retrouvé au niveau de la cavité buccale. Sa présence dans les LUSD peut s’expliquer par rétro-contamination à partir du fluide buccal des patients par défaillance ou absence de valve anti-reflux sur les porte-instruments rotatifs. Enfin, V. vermiformis est une amibe libre fréquemment retrouvée dans les milieux aquatiques et pouvant interagir avec les bactéries et même leur servir d’hôte comme pour Legionella pneumophila par exemple. Les fournisseurs d’USD préconisent de plus en plus la mise en œuvre d’un traitement chimique circulant au sein de leur fauteuil, soit de façon continue, soit par intermittence. Nous avons développé des conditions permettant d’évaluer l’efficacité curative et prophylactique du calbenium©, de l’oxygenal 6© et du sterispray©, trois produits clés du marché Français des désinfectants des LUSD, sur notre modèle dynamique de biofilm polymicrobien.
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Synthèse bibliographique
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Partie I : contexte des USD
1. Définition et histoire des USD
L’USD est un terme général qui désigne le fauteuil dentaire dans sa globalité (Figure 1). L’USD regroupe la plupart des appareils nécessaires à la réalisation des soins d’odontologie comme les seringues multifonctions, les turbines, les contre- angles, les pièces à mains, les circuits d’eau et d’air qui alimentent ces instruments, etc...
Figure 1 Photo d'une USD du CHU de Poitiers
Jusqu’au XVIIIe siècle, le concept même de l’USD n’existait pas car les dentistes n’utilisaient pas de fauteuil spécifique destiné à leur art. Le fauteuil de barbier (Figure 2) est considéré comme la racine commune à l’émergence des fauteuils destinés à la coiffure et à l’odontologie. 19 | P a g e
Figure 2 Fauteuil de barbier (musée de la British Dental Association, Londres) http://www.biusante.parisdescartes.fr/sfhad/cab/texte03.htm
C’est dans les années 1790 que Josiah Flagg, un chirurgien-dentiste américain, a développé le premier fauteuil destiné exclusivement à la pratique des soins dentaires (1). De nombreuses améliorations ont ensuite été apportées au fauteuil. Le premier fauteuil inclinable (Figure 3) a été inventé par James Snell, un chirurgien-dentiste Londonien, en 1832, afin de faciliter l’accès à la cavité buccale des patients.
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Figure 3 Représentation du fauteuil de J. Snell http://www.biusante.parisdescartes.fr/sfhad/cab/texte03.htm
Dans les années 1860, James Beall Morrison inventa le fauteuil dentaire totalement ajustable ainsi que les premiers instruments commandés par pédale (1). Puis, au début du XXe siècle sont apparus les premiers fauteuils alimentés en eau et en électricité pour évoluer vers les USD d’aujourd’hui.
2. Instrumentation utilisée en odontologie
L’instrumentation statique et l’instrumentation dynamique sont les 2 catégories d’instrumentation utilisées en odontologie.
L’instrumentation statique n’a pas besoin d’une source énergétique pour son utilisation. Quelques exemples d’instruments statiques sont présentés sur la Figure 4. Ces instruments ne nécessitant pas d’approvisionnement en eau pour leur fonctionnement, ils ne sont pas exposés à un risque de contamination microbienne d’origine hydrique en cours d’utilisation et par conséquent, ces instruments n’ont pas fait l’objet d’une attention particulière au cours de cette thèse.
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Figure 4 Exemples d'instruments statiques utilisés en odontologie (2)
À l’inverse, l’instrumentation dynamique est constituée d’instruments munis d’un moteur nécessitant un apport énergétique pour fonctionner. Concrètement, cette instrumentation dynamique est regroupée sous l’appellation « porte-instruments rotatifs (PIR) » qui se divise en 2 catégories selon l’alimentation électrique ou pneumatique (par air comprimé) du moteur :
- Les contre-angles/pièces-à-mains : la pièce rotative possède un moteur à alimentation électrique munie d’une gaine électrique, d’un tuyau d’air et d’un tuyau d’eau. La seule différence entre les contre-angles et les pièces-à-mains tient dans l’angle de la partie terminale de l’instrument (Figure 5) : l’angle est ouvert pour les contre-angles et la pièce est rectiligne pour les pièces-à- mains.
A B
Figure 5 Représentation d’une pièce-à-mains (A) et d’un contre-angle (B) http://www.google.fr/imgres?imgurl=https%3A%2F%2Fwww.athenadental.fr
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- Les turbines (Figure 6) : la pièce rotative possède un moteur à alimentation pneumatique. La vitesse de rotation engendrée est très élevée (jusqu’à 400 000 tours par minute) nécessitant un spray de refroidissement pour éviter toute nécrose tissulaire.
Figure 6 Représentation d'une turbine http://www.google.fr/imgres?imgurl=http%3A%2F%2Fimg.medicalexpo.fr
Les PIR (Figure 7) sont alimentés en eau via l’USD et sont, de ce fait, potentiellement exposés à une contamination microbienne.
Portes Instruments Rotatifs (PIR)
Figure 7 : Représentation des PIR d’une USD http://www.topdentaire.com/recherche.php?motscles=amm
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3. Le circuit d’alimentation en eau des PIR
Dans une USD, l’eau est nécessaire pour la réalisation de nombreux soins : elle est apportée par le circuit d’alimentation des PIR schématisé sur la Figure 8. L’eau circule dans l’ensemble de l’USD et permet le refroidissement des moteurs des PIR mais aussi l’approvisionnement du crachoir et du système de remplissage du gobelet. Afin d’acheminer l’eau au travers Figure 8 : Schématisation du circuit d'eau alimentant de l’USD, des matériaux flexibles sont les PIR (brochure commerciale KaVo) nécessaires et constituent les LUSD. Il s’agit principalement du polyuréthane, du PVC et du polyéthylène (1, 3).
Les aérosols générés lors de l’usage des PIR exposent à la fois les patients et le personnel du cabinet dentaire à un risque infectieux dans le cas où des microorganismes pathogènes sont présents dans l’eau d’alimentation des PIR. De plus, ces microorganismes peuvent rester en suspension dans l’air pendant plusieurs heures et du fait des cycles successifs de patients au quotidien, l’exposition du personnel dentaire est finalement continue (1).
4. Alimentation hydrique et sources potentielles de contamination microbienne
Le plus souvent, l’USD est directement branchée sur le réseau d’eau potable. Il est plus rare d’avoir des unités comportant un réservoir d’eau indépendant destiné à approvisionner les différents instruments. Les hôpitaux ou les cliniques dentaires dotées de nombreuses USD ont plutôt tendance à utiliser des réservoirs de stockage d’eau, or ceci nécessite une attention particulière vis-à-vis du risque de contamination manuportée lors du remplissage du réservoir. De plus, si l’entretien des réservoirs est insuffisant ou inadapté, des biofilms peuvent se former sur les 24 | P a g e
surfaces internes des réservoirs augmentant ainsi le risque de contamination microbiologique de l’eau (4-6).
Comme décrit précédemment, l’eau d’alimentation des PIR permet également l’approvisionnement du système de remplissage du gobelet et du crachoir. Il s’agit donc d’un circuit comptant de nombreuses ramifications (Figure 8) et autant d’opportunités de former des « bras morts », offrant dès lors de multiples sites potentiels favorables à la prolifération des microorganismes présents dans l’eau.
Par conséquent, il a été montré que l’eau en sortie d’USD était communément contaminée par une forte densité en microorganismes avec une charge bactérienne pouvant atteindre 104 à 106 Unités Formant Colonies (UFC) par mL, principalement des bactéries d’origine hydrique comme Pseudomonas aeruginosa ou Legionella sp. (7-9) Parfois, des pathogènes opportunistes d’origine humaine comme Staphylococcus aureus ou encore Candida albicans sont également retrouvés dans ces LUSD (6, 10).
La présence de microorganismes buccaux dans l’eau en sortie des USD est liée à des phénomènes de ré-aspiration des sécrétions biologiques des patients au niveau des PIR et peut être diminuée par la mise en place et l’entretien régulier de valves anti-reflux à leurs niveaux (11). Cependant une enquête italienne réalisée sur 54 USD de plusieurs fournisseurs différents a rapporté une inefficacité de ces dispositifs anti-reflux dans 74% des cas (12). La cause évoquée serait liée à l’usure des valves car toutes les USD investiguées avaient fonctionné pendant au moins 6 mois avant la réalisation de l’étude. Cette enquête a été discutée, puis défendue par ses auteurs mais la fréquente détection de microorganismes d’origine buccale et de traces de sang dans les eaux de sortie des USD tend à confirmer la réalité de ces dysfonctionnements (1, 13, 14).
Les microorganismes présents dans les LUSD, du fait de leur contact inévitable avec les matériaux constitutifs des tubulures de ces réseaux d’eau, peuvent former des biofilms et dès lors compliquer les stratégies de désinfection. De
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plus, ces biofilms participent à la contamination de l’eau de sortie des USD par relargage périodique des microorganismes qui les composent (1, 6).
En résumé, les 3 principales sources de contamination de l’eau d’alimentation des PIR sont : la contamination via le réseau d’eau municipal (ou l’eau du réservoir), la formation de biofilm dans les tubulures de l’USD et la ré-aspiration de la salive et/ou du sang des patients (Figure 9).
Figure 9 : Modes de contamination microbiologique des circuits d’alimentation en eau des PIR
5. Qualité microbiologique de l’eau des USD
L’eau d’entrée des USD doit, au minimum, répondre aux critères de potabilité de l’eau (15). Les critères microbiologiques d’une eau potable en France sont rappelés dans le Tableau I. Dans les établissements de santé, un indicateur de qualité supplémentaire est utilisé : le niveau cible de P. aeruginosa qui doit être inférieur à 1 UFC/ 100 mL.
Tableau I Critères microbiologiques d'une eau potable (15)
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Il n’y a pas, à l’heure actuelle, de texte réglementaire concernant l’eau sortant des USD. Cependant si l’eau d’entrée de l’USD doit répondre aux critères de potabilité de l’eau, il semblerait logique que l’eau de sortie d’USD réponde également à ces critères. Toutefois, comme le montre le Tableau I, les critères microbiologiques de l’eau en France (et également en Europe) ne précisent pas clairement de seuil pour la flore aérobie revivifiable, or il s’agit des bactéries les plus souvent détectées dans les eaux des USD (1). Il existe en revanche des recommandations émises par l’American Dental Association (ADA) et les Centers for Disease Control (CDC) qui préconisent un seuil maximum de 500 UFC/ mL d’eau en sortie des USD.
6. La problématique du biofilm
Les biofilms constituent le mode de vie privilégié des microorganismes dans la nature (16, 17). Un biofilm est une communauté microbienne structurée constituée de cellules adhérées entre elles et/ou de façon irréversible à un substrat et imbriquées dans une matrice extracellulaire (MEC) ayant été sécrétée par les cellules microbiennes (16, 18). La composition de la MEC varie selon les microorganismes constitutifs du biofilm mais elle est essentiellement composée d’eau, de polysaccharides, d’ADN extracellulaire, de protéines, d’acides nucléiques et de lipides (19, 20).
Quatre étapes sont décrites pour caractériser la formation d’un biofilm : l’attachement réversible à un substrat, l’attachement irréversible à ce même substrat, la maturation et la dispersion du biofilm. Tout d’abord, les microorganismes adhèrent de façon réversible à un substrat. Ce phénomène fait intervenir plusieurs facteurs dont les conditions environnementales du milieu (pH, température, force ionique, vitesse d’écoulement du milieu) mais aussi la rugosité de la surface ou encore l’hydrophobicité et la mobilité des microorganismes. La balance entre forces attractives et répulsives doit donc être en faveur des forces attractives (21, 22). Ensuite vient l’étape d’adhérence irréversible au substrat faisant intervenir des interactions de type ligands/récepteurs. Ce mécanisme implique notamment des adhésines de surface présentes par exemple sur des flagelles, ou encore sur des pili de type IV (23). Puis, vient l’étape de maturation du biofilm pendant laquelle les microorganismes se multiplient sur la surface colonisée et sécrètent une MEC 27 | P a g e
aboutissant à l’organisation tridimensionelle du biofilm (24, 25). Des canaux se développent au sein de la MEC permettant l’approvisionnement en oxygène et en nuriments des microorganismes (26). Enfin, vient l’étape de dispersion du biofilm. Certains des microorganismes se détachent du biofilm, en amas ou à l’état de cellules isolées, et peuvent alors se disperser vers d’autres sites. La dispersion d’un biofilm est un processus complexe metttant en jeu plusieurs conditions parmi lesquelles on retrouve une carrence en oxygène, en nutriments, de fortes concentrations en toxines ou en déchêts métaboliques ou encore une concentration élevée soudaine en nutriments (25, 27, 28). Cette dispersion microbienne peut augmenter d’un facteur 100 la charge bactérienne moyenne initiale du milieu ; de l’eau par exemple (11).
L’environnement tridimensionnel d’un biofilm est hétérogène car soumis à des gradients physico-chimiques. En effet, l’architecture d’un biofilm résulte en une meilleure oxygénation et en un meilleur accès aux nutriments pour les microoganismes retrouvés en périphérie du biofilm plutôt que pour ceux retrouvés en son centre où les conditions sont plus proches de l’anaérobiose. Il en résulte, au sein d’un biofilm, des microenvironnements variés permettant la cohabitation entre plusieurs espèces microbiennes aux propriétés métaboliques différentes (29, 30). Ainsi, au sein d’un biofilm, plusieurs espèces aux exigences nutritionnelles et métaboliques différentes peuvent cohabiter permettant un métabolisme de groupe et certaines substances toxiques pour des microorganismes peuvent éventuellement être métabolisées par d’autres espèces microbiennes constitutives du biofilm (31).
Une fois le biofilm implanté, son élimination constitue un problème majeur. En effet, les biofilms sont connus pour leur capacité accrue de résistance aux agents antimicrobiens comparativement à la sensibilité à l’état planctonique des cellules qui les constituent (32, 33). Plusieurs mécanismes de résistance sont impliqués. La Figure 10 résume ces mécanismes pour un biofilm fongique mais il en va de même pour un biofilm bactérien.
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Figure 10 Mécanismes de résistance d'un biofilm fongique de C. albicans. Les flèches représentent les différents facteurs impliqués dans la résistance aux antifongiques au sein du biofilm incluant la densité cellulaire, le stress environnemental, les persisters (cellules persistantes), la MEC, les pompes d’efflux, la surexpression des cibles et la physiologie du biofilm. Les facteurs les plus influents sur la capacité de résistance sont représentés au centre du schéma (17)
L’organisation en biofilm entraîne une modification phénotypique et génotypique des cellules microbiennes. La proximité cellulaire au sein d’un biofilm favorise grandement les transferts génétiques horizontaux par l’intermédiaire des plasmides de conjuguaison ou encore via l’ADN extracellulaire. Ainsi, au sein d’un biofilm les interactions microbiennes sont nombreuses (échanges génétiques, métaboliques, de molécules de signalisation) et influencent la croissance, la virulence et la survie des microorganismes constitutifs de cette communauté (34, 35).
De plus, l’organisation des microorganismes en biofilm leur assure une protection physique face aux différents traitements. Certaines études récentes s’intéressent aux propriétés physiques des biofilms par modélisation mathématique et rapportent une forte visco-élasticité des biofilms (36-38). Cette visco-élasticité 29 | P a g e
permet notamment de résister aux forces de cisaillement et de revenir rapidement en position initiale après exposition à un flux d’air (36). L’élasticité intervient dans la résistance de courte durée aux forces de cisaillement tandis que la viscosité intervient dans la résistance au long terme à ces mêmes forces de cisaillement (39). Récemment, Tierra et al. ont modélisé mathématiquement le comportement d’un biofilm en réponse à l’exposition à un écoulement de liquide (37). Le modèle prédit que la résistance du biofilm à un écoulement liquide est largement influencée par les propriétés visco-élastiques de la MEC. Plus la viscosité de la MEC est faible, plus la dispersion du biofilm sous l’effet de l’écoulement du liquide s’en trouve facilitée. Plus les propriétés élastiques de la MEC sont importantes, plus les forces de cisaillement nécessaires au détachement du biofilm doivent être importantes. Donc, plus la visco- élasticité de la MEC est faible, plus le biofilm se dispersera facilement. La MEC protège donc physiquement les microorganismes au sein du biofilm. Elle agit également comme barrière à la pénétration des agents chimiques et empêche la reconnaisance des antigènes microbiens par le système immunitaire. La composition de la MEC intervient dans ces processus de protection des microorganismes aux agents anti-infectieux. Par exemple, il a été démontré que la MEC des biofilms de C. albicans était riche en beta-1,3-glucane qui agierait comme agent séquestrant de certains antifongiques tels que les azolés ou les échinocandines (40, 41).
D’autres facteurs interviennent de concert dans la résistance des mircoorganismes organisés en biofilm aux agents chimiques comme les interactions multi-espèces ou encore l’état physiologique des microorganismes (42). Les interactions inter-espèces au sein d’un biofilm polymicrobien peuvent aboutir dans certains cas à une tolérance supérieure des microorganismes aux agents désinfectants. Par exemple, l’association Bacillus cereus et Pseudomonas fluorescens engendre une tolérance accrue de ces microorganismes au glutaraldéhyde et au dioxyde de chlore comparativement à leurs tolérances respectives en biofilm mono-espèce (43, 44). Encore, l’oganisation en biofilm multi- espèces de Listeria monocytogenes et de Lactobacillus plantarum aboutit à une tolérance accrue de L. monocytogenes à l’acide péracétique et au chlorure de benzalkonium (45).
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De plus, au sein d’un biofilm, un niveau élevé de cellules persistantes est retrouvé (46). Les cellules persistantes sont définies comme des variants phénotypiques dormants qui se forment aléatoirement au sein d’une population microbienne et étant hautement tolérants aux antibiotiques (47). Ce sont donc des cellules au métabolisme ralenti leur assurant une certaine tolérance aux agents chimiques. Le réensemencement de cellules persistantes provenant d’un biofilm est capable d’engendrer la formation d’un nouveau biofilm constitué d’une nouvelle sous-population de cellules persistantes suggérant qu’il s’agit bien de variations phénotypiques et non génétiques (17). Certaines approches récentes de mort induite par l’utilisation de métabolites semblent efficaces sur ces cellules persistantes comme par exemple l’association mannitol-tobramycine sur les biofilms à P. aeruginosa (48).
Les LUSD sont fréquemment colonisées par des biofilms (8, 9, 49, 50). Il a d’ailleurs été démontré qu’un biofilm commençait à se développer dans les LUSD dès les premières heures suivant l’installation et l’approvisionnement en eau de l’USD (51, 52). Plusieurs caractéristiques des USD sont favorables à la formation d’un biofilm : la stagnation de l’eau (12 heures/jour au moins), l’écoulement laminaire, le rapport surface/volume (6/1) des tubulures, la dureté de l’eau, la nature des matériaux composant les tubulures (PVC, polyuréthane…) (11, 50)… (Figure 11).
Figure 11 Détails de la formation d'un biofilm à l’intérieur d’une tubulure (10). Des macromolécules venant de la phase aqueuse sont adsorbées sur les parois de la tubulure, et 31 | P a g e
forment un dépôt (A), ce qui permet aux microorganismes de se fixer à la surface de façon irréversible (B). Les divisions successives des cellules adhérées (C), ainsi que le recrutement de nouvelles cellules planctoniques venant de l’eau, conduisent à la maturation du biofilm (D)
Même si parfois les traitements antimicrobiens utilisés sont capables de désorganiser, de réduire en partie un biofilm mature, l’élimination totale d’un biofilm nécessiterait bien souvent le remplacement des surfaces colonisées, ce qui dans le contexte dentaire signifierait un remplacement pur et simple de l’USD.
7. Stratégies de décontamination du circuit d’eau des USD
Si la contamination microbienne des LUSD est aujourd’hui bien documentée (1, 8, 9, 50, 53-55), il n’y a pas, à l’heure actuelle, de méthode standardisée pour lutter contre cette contamination, ni d’obligation d’application de l’une ou l’autre des méthodes disponibles. Il ne s’agit en effet que de recommandations d’usage (15). D’ailleurs une enquête réalisée dans l’Est de l’Angleterre a montré que 9% des cabinets dentaires n’appliquaient aucune mesure de contrôle de la contamination microbienne des LUSD (56). Au cours d’une enquête réalisée par questionnaire auprès des chirurgiens dentistes du département de la Vienne (France) et dans le cadre de l’obtention du diplôme d’état de docteur en Pharmacie, il est apparu que 68% (n=57) des praticiens interrogés avaient conscience du risque de développement d’un biofilm au sein des LUSD et que seulement 28% d’entre eux avaient conscience du risque infectieux associé à la contamination microbiologique de ces LUSD (57).
Parmi les méthodes physiques de décontamination, sont retrouvées :
- la purge des tubulures : il est préconisé de purger quotidiennement pendant 5 minutes chaque PIR avant sa première utilisation et de les purger pendant 20 à 30 secondes entre chaque patient (15, 58). Certaines études ont montré que les purges permettaient de réduire légèrement le niveau de contamination microbienne en sortie d’USD. En effet, elles ne permettraient d’éliminer qu’une partie des microorganismes planctoniques et seraient inefficaces sur les biofilms (5, 59, 60). 32 | P a g e
- La filtration à seuil de coupure de 0,22 µm à utiliser sur l’eau qui alimente l’USD et/ou le plus près possible du PIR. C’est un procédé efficace mais sans effet sur les biofilms déjà développés dans les LUSD : cette filtration permet donc d’assurer un niveau de contamination microbienne satisfaisant de l’eau de sortie des USD. Les filtres nécessitent néanmoins un entretien et un remplacement régulier (quotidien (61) ou hebdomadaire (62)) à cause du colmatage. Il est à noter que la taille des pores ne suffit pas à assurer une élimination des toxines bactériennes (15).
- L’asséchement des LUSD a également été proposé pendant les périodes d’inactivité prolongée (nuit, week-end, vacances). Malheureusement, après remise en eau, la contamination microbienne n’était pas significativement diminuée par rapport à une USD n’ayant pas été asséchée. Ce manque d’efficacité s’expliquerait par le fait que les exopolysaccharides des biofilms sont très hydratés et facilitent donc la survie des microorganismes sans apport d’eau extérieur (63).
- L’approvisionnement des USD par des eaux dont la qualité microbiologique est contrôlée a été étudié. Là encore, la qualité microbiologique de l’eau en sortie d’USD ne s’en est pas retrouvée significativement améliorée. La présence d’un biofilm dans les LUSD, contaminant en continu l’eau de sortie des USD, en serait l’explication (5, 64, 65).
- L’utilisation de valves anti-reflux a été proposée pour limiter la contamination microbienne d’origine humaine. Comme mentionné précédemment, une maintenance suivie et des tests d’efficacité réguliers de ces valves sont préconisés pour éviter les dysfonctionnements, cependant, la périodicité n’est pas concrètement explicitée (12, 15).
En résumé, ces méthodes physiques sont certainement efficaces pour diminuer de manière transitoire le nombre de microorganismes en suspension dans l’eau mais leurs effets sont nettement limités par la présence de biofilm au sein des LUSD.
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Pour les méthodes chimiques :
Un traitement régulier des LUSD est recommandé ; en effet, les traitements chimiques sont susceptibles d’agir sur les biofilms déjà formés, contrairement aux méthodes physiques.
Deux types de traitements chimiques doivent être distingués :
- Le traitement continu de l’USD : il s’agit de la circulation en permanence au sein des LUSD d’une solution désinfectante à faible concentration. Le but ici est de limiter la contamination microbienne et la formation de biofilm dans les LUSD par un traitement qui débute dès l’installation d’un nouveau fauteuil. - Le traitement choc qui consiste à faire circuler pendant un cycle d’environ 45 minutes la solution désinfectante une à deux fois par semaine. Ici, on vient s’attaquer au biofilm déjà formé.
Parmi les produits chimiques proposés par les fournisseurs pour traiter les LUSD, on retrouve fréquemment des produits à base de peroxyde d’hydrogène
(H2O2), de dioxyde de chlore, d’hypochlorite de sodium, de chlorexhidine, d’acide péracétique et d’acide citrique (1). Ces désinfectants agissent sur les microorganismes par perturbation de l’intégrité membranaire ou oxydation. Ces produits ont une efficacité variable, en particulier sur les biofilms, cependant, la plupart d’entre eux ont été testés uniquement sur des modèles de laboratoire et non pas en conditions réelles d’utilisation. Le choix entre ces différents produits est souvent dépendant du fournisseur de l’USD qui préconise bien sûr le produit commercialisé par son entreprise. Le Tableau II récapitule les principaux produits de désinfection des LUSD disponibles sur le marché Français.
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Tableau II Liste des principaux produits de désinfection des LUSD proposés par les fournisseurs d'USD en France
Fournisseur Produit désinfectant Protocole AIREL/QUETIN Calbenium© (ammonium quaternaire, En continu (2%) MIGLIONICO EDTA, tosylchloramide sodique, allantoïne, aspartame, arôme de menthe et sorbitol) METASYS GREEN&CLEAN WK© (solution à 2% En continu + choc si
d’H2O2) besoin A-DEC ICX© (percarbonate de sodium + nitrate En continu (1 pastille d’argent + agents de surface par bouteille) cationiques) © KAVO Oxygenal 6 (H2O2 6% + ions Argent) En continu (0,02% en
H2O2) + choc hebdomadaire © CASTELLINI Peroxy Ag+ (H2O2 3% + ions Argent) En continu (0,06% en
STERN WEBER H2O2) + choc en fin de ANTHOS journée ou après une période de stagnation
© PLANMECA PlanClear (H2O2) En continu (0,02%) © XO XO water clean (H2O2) En continu (0,02%)
Certains des produits désinfectants disponibles sur le marché Français et dont l’utilisation est couramment préconisée par les fournisseurs d’USD ont été étudiés au cours de cette thèse. Il s’agit de l’oxygenal 6©, du calbenium© et du sterispray©. La majorité des désinfectants disponibles sur le marché Français sont à base de peroxyde d’hydrogène (H2O2). La littérature scientifique rapportant quelques études sur l’oxygenal 6© (66, 67), ce produit a été choisi dans notre étude comme représentant des produits à base de peroxyde d’hydrogène et nous permet de nous référencer à la bibliographie. Le calbenium© a été choisi de par sa présence sur le marché Français et de par sa composition différente de celle de l’oxygenal 6©. Le sterispray© a également été choisi dans ce travail et pourtant il n’apparait pas dans le 35 | P a g e
Tableau II. En fait, certains fournisseurs d’USD du marché Français ne disposent pas de leur propre produit de désinfection des LUSD et préconisent donc des produits commercialisés par d’autres entreprises (pas forcément spécialisées dans les USD) comme c’est le cas pour le sterispray©. L’ICX© n’a pas été testé dans l’étude car il s’agit d’un produit de désinfection des LUSD utilisé dans le cas où l’approvisionnement en eau de l’USD se fait par un réservoir. En effet, dans les travaux réalisés au cours de cette thèse, l’ensemble des USD étudiées étaient approvisionnées en eau via le réseau d’eau municipal.
L’oxygenal 6© est un produit proposé par la société KaVo Dental qui possède un marché dans 18 pays à travers le monde, principalement en Europe mais aussi aux USA, au Brésil ou encore au Japon. L’oxygenal 6© est un mélange d’eau oxygénée (H2O2) à 6% v/v et d’ions argent. Son utilisation est recommandée en traitement continu des LUSD à une concentration de 0,02% v/v en H2O2 (soit environ 0,3% de la solution d’oxygenal 6©). Son utilisation en traitement choc est également recommandée de façon hebdomadaire à une concentration 10 fois plus élevée (donc 3% en oxygenal 6©) pendant un cycle de 45 minutes. L’oxygenal 6© est décrit dans la littérature comme l’un des produits les plus actifs sur les microorganismes (1, 66). Le © © dentosept , lui aussi à base d’H2O2 et d’ions argents ou encore l’ecasol , une solution à pH neutre d’acide hypochloreux, sont également décrits parmi les plus actifs mais ils ne sont pas disponibles sur le marché Français.
Le sterispray© est proposé par la société Gammasonic qui possède un marché exclusivement national. Il s’agit d’un mélange complexe à base de chlorure de benzalkonium, d’EDTA, de chloramine, d’aspartame, de sorbitol, d’arômes et d’huile essentielle de thym. Cependant les proportions respectives de chacun des composants ne sont pas communiquées par le fabricant. Son utilisation est recommandée en traitement continu des LUSD à une concentration de 1% v/v.
Le calbenium© quant à lui est un produit proposé par la société Quetin/Airel dont la composition est très proche de celle du stérispray© : ammonium quaternaire, EDTA, tosylchloramide sodique, allantoïne, aspartam, arôme de menthe et sorbitol. Là aussi, les proportions respectives de chacun des composants ne sont pas communiquées par le fabricant. Ce produit est principalement vendu en France
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(70%) par la société Quetin/Airel mais également dans d’autres pays européens, au Moyen-Orient et en Corée. Son utilisation est recommandée en traitement continu des LUSD à une concentration de 2% v/v. En pratique, la dilution du calbenium© est assurée par un système appelé IGN Mag système, également fourni par la société Quetin/Airel, qui est raccordé à l’USD et qui assure en plus l’ionisation de la solution de calbenium© au moment de son injection.
Ces trois types de désinfectants sont vendus comme répondant à certaines normes de bactéricidie, fongicidie, virucidie… comme par exemple la norme AFNOR NF T 72-150 (norme de bactéricidie en suspension en eau stérile de spectre 4 ou 5, c’est-à-dire, testée sur : P. aeruginosa/Escherichia coli/Staphylococcus aureus/Enterococcus hirae/ +/- Mycobacterium smegmatis). Cependant, mis à part pour l’oxygenal 6©, aucune publication internationale ne rapporte de résultats scientifiques évaluant leur efficacité dans le contexte des USD, en particulier sur les biofilms.
Enfin, l’utilisation combinée des systèmes de désinfection physique et chimique pourrait limiter au maximum la contamination microbienne en sortie des USD. O’Donnell et al. ont décrit en 2009 un système de traitement centralisé mis en œuvre pour la première fois à l’hôpital universitaire en odontologie de Dublin (Dublin Dental University Hospital) pour l’approvisionnement simultané des nombreuses USD de la structure (68). Ce système repose sur deux modules : le premier consiste en un pré-traitement par filtration de l’eau qui servira d’alimentation aux USD ; le second consiste en un traitement continu de cette eau filtrée par l’ecasol©. Selon les auteurs, ce système entièrement automatisé garantirait une qualité microbiologique satisfaisante des LUSD avec une contamination bactérienne moyenne de 18 UFC/mL obtenue dans l’eau de sortie des USD, ceci ayant été corrélé à une absence de biofilm dans les LUSD par microscopie électronique sur une période de suivi de 2 ans.
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8. Le risque infectieux et les USD
Plusieurs voies d’exposition aux microorganismes peuvent être identifiées dans un cabinet dentaire. La transmission microbienne peut se faire par contact direct avec l’eau du réseau ou les liquides biologiques (sang, salive, sécrétions respiratoires….). Elle peut également se faire de manière indirecte par manuportage, exposition à des surfaces et/ou à des instruments contaminés. Enfin, cette transmission peut également se faire par exposition aux aérosols d’eau ou de liquides biologiques générés lors des soins (inhalation des gouttelettes ou contamination des plaies par projections) (7, 15, 58, 69-71). Ainsi, les infections sont transmissibles, de patient à patient ou de patient à l’équipe médicale et inversement.
Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes spécifiquement intéressés au risque infectieux lié à l’exposition à l’eau de sortie des USD. Il est vrai que si la contamination microbiologique de ces eaux est bien connue, les infections avérées directement reliées à cette voie d’exposition sont quant à elles plutôt rares, ce qui soulève la question de la nécessité de mettre en œuvre des moyens efficaces pour contrôler cette contamination microbienne (72). Cependant, la plupart des patients qui consultent un chirurgien-dentiste ne sont pas particulièrement suivis quant au développement d’une éventuelle infection post-consultation. En effet, avec les nombreuses et courantes voies d’exposition aux microorganismes, il n’est pas évident ne serait-ce que d’envisager la consultation dentaire comme l’origine éventuelle d’une infection. De plus, la consultation de son médecin traitant pour des signes infectieux n’est pas systématique et une étude prospective épidémiologique reposant sur le suivi des infections développées chez des patients exposés à des LUSD connues comme fortement contaminées par des microorganismes parait peu envisageable d’un point vue éthique. Tout ceci contribue certainement à une sous- estimation du risque infectieux réel associé aux soins dentaires.
Cependant, quelques exemples d’infections microbiennes liées ou très fortement suspectées d’être liées aux LUSD ont été rapportés dans la littérature. En 1983, Wallace et al. ont rapporté, en faisant la revue des infections dues à des Mycobactéries atypiques, deux cas de lymphadénites cervicales survenues chez des patients après la réalisation de soins dentaires (73). Cependant, aucune recherche 38 | P a g e
étiologique poussée n’ayant été entreprise, l’origine d’une contamination via les LUSD n’a pas été démontrée. En 1987, Martin et al. relatent la survenue de deux cas d’abcès dentaires à P. aeruginosa chez des patients atteints de cancer (74). Ces deux patients avaient été traités dans le même cabinet dentaire. Les LUSD de ce cabinet s’étant avérées être contaminées par des souches de P. aeruginosa du même sérotype que celles isolées chez les patients. Cependant, du fait des limitations techniques de l’époque, les investigations n’ont pas pu prouver avec certitude que les LUSD étaient la source de l’infection à P. aeruginosa. En 1995, Atlas et al. rapportent un cas mortel de légionellose à Legionella dumoffi chez un chirurgien-dentiste dont l’origine fortement présumée s’avérait être la contamination des LUSD (75). Des analyses PCR ont révélé la présence de L. dumoffi en forte proportions dans les LUSD mais également, en beaucoup plus faibles proportions, dans la douche du domicile du dentiste. En l’absence de culture des souches incriminées, l’origine certaine de la contamination n’a pas pu être déterminée. En 2007, Barbeau et al., ont relaté une action en justice menée par un patient ayant développé une kératite amibienne sévère (76). Le patient a témoigné avoir reçu une projection d’eau dans l’œil droit lors des soins dentaires. Il s’agissait d’un patient porteur de lentilles de contact et les LUSD se sont effectivement révélées être contaminées par des amibes libres. Cependant, l’action en justice n’a pas condamné le chirurgien-dentiste car il a été estimé qu’étant donné que le patient rinçait ses lentilles de contact à l’eau du robinet, la contamination avait tout aussi bien pu venir de là. En 2012, Ricci et al. ont rapporté un cas mortel de légionellose à L. pneumophila chez une femme de 82 ans ayant cette fois-ci été corrélé avec certitude à la contamination des LUSD du cabinet dentaire où était suivie la patiente (77). La patiente n’avait pas été exposée à d’autres sources potentielles de contamination à Legionella sp. pendant la durée d’incubation de la maladie. Les investigations des réseaux d’eaux de l’habitation de la patiente ont révélé l’absence de Legionella sp. contrairement à celles des LUSD qui ont révélé la présence de L. pneumophila. L’analyse de biologie moléculaire (par polymorphisme de longueur des fragments amplifiés et par sequence-based typing) couplée au typage phénotypique a montré que la souche clinique de la patiente et la souche environnementale isolée des LUSD étaient identiques.
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Certaines études ont également montré, de façon indirecte, l’exposition des chirurgiens dentistes aux microorganismes via les LUSD. Par exemple, en 1985, Fotos et al., ont montré chez des équipes soignantes de plus de deux ans d’ancienneté que 23 % et 19% respectivement des sujets de l’étude avaient des IgG et des IgM anti-Legionella dans leur sérum contre 8% (pour les IgG) dans la population générale (78).
Enfin, certaines études ont montré la présence en quantité importante d’endotoxines dans les LUSD et dans les aérosols générés lors de l’utilisation des PIR (7, 79, 80). Or l’inhalation d’endotoxines a été corrélée avec l’exacerbation des réactions inflammatoires des voies aériennes et à la sévérité des crises d’asthme (81). D’ailleurs, Pankhurst et al. en 2005 ont observé une corrélation entre l’apparition de la maladie asthmatique chez des chirurgiens dentistes et le moment où ils ont commencé à exercer leur métier, c'est-à-dire à utiliser l’USD en routine (82).
Le risque infectieux lié aux USD est donc bien prouvé même si de prime abord il semble rare. Cependant, comme évoqué précédemment, de nombreux facteurs interviennent dans l’évaluation de ce risque et pourraient être responsables d’une sous-estimation de ce dernier.
La plupart des investigations microbiologiques menées sur les LUSD sont basées sur des approches de microbiologie conventionnelle, par ensemencement sur géloses. Cependant, ce type d’approche a une sensibilité limitée et ne détecte pas les microorganismes viables non cultivables ; elle ne peut ainsi estimer qu’environ 5% de la population bactérienne totale présente dans un échantillon (7).
Une partie des travaux réalisés au cours de cette thèse avaient donc pour objectif de compléter les études cultures-dépendantes par des analyses de biologie moléculaire sur des prélèvements d’eaux d’USD. Ceci a été réalisé dans le but d’avoir une meilleure connaissance de la composition bactérienne des LUSD tout au long de l’USD ce qui pourrait contribuer à une évaluation mieux documentée du risque infectieux associé.
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Partie II : Microorganismes présents dans les LUSD
Les LUSD sont contaminées par une large diversité de microorganismes regroupant bactéries, champignons microscopiques, virus et protistes (1, 4, 7). Ces microorganismes sont apportés dans les LUSD soit par l’eau alimentant les USD, les espèces microbiennes ont alors une origine environnementale ; soit par ré-aspiration du fluide buccal des patients et dans ce cas l’origine des microorganismes est humaine.
Globalement, la majorité des microorganismes présents dans les LUSD sont des bactéries d’origine environnementale, principalement des Gram négatives aérobies ou aéro-anaérobies facultatives hétérotrophes. La plupart de ces bactéries d’origine environnementale n’ont pas été décrites dans la littérature scientifique en tant que pathogène pour l’Homme comme Bacillus subtilis, Aeromonas sp., Flavobacterium sp., Lactobacillus sp., etc… Cependant, certaines d’entre elles sont à l’inverse bien connues pour leurs pouvoirs pathogènes comme P. aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, L. pneumophila, ou encore Mycobacterium abscessus…(1, 4, 9, 83).
Parmi les microorganismes d’origine humaine retrouvés dans les LUSD figurent les bactéries de la cavité buccale et en particulier les bactéries du genre Streptococcus qui abritent également des espèces pathogènes opportunistes : S. sanguinis, S. mutans, S. salivarius… Sont également retrouvées dans les LUSD d’autres bactéries d’origine humaine comme les bactéries du genre Staphylococcus (Staphyloccocus aureus, S. epidermidis…) (1, 9).
Concernant les champignons retrouvés dans les LUSD, les genres principalement observés sont Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Candida et Exophiala. Certains pathogènes ou pathogènes opportunistes y sont aussi retrouvés comme A. fumigatus, C. albicans, etc…(9, 10). 41 | P a g e
Concernant les amibes libres, les genres amibiens ayant le plus souvent été observés dans les LUSD sont Vermamoeba, Vanella et Vahlkampfia (9). Ces genres amibiens peuvent servir de niches à des espèces bactériennes capables de résister à la phagocytose amibienne comme L. pneumophila.
Les paragraphes suivants portent plus précisément sur les 3 espèces microbiennes étudiées au cours de ces travaux de thèse : P. aeruginosa ; C. albicans et V. vermiformis. Pour notre étude, ces 3 espèces microbiennes ont été choisies comme support au développement d’un biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD car leur présence a déjà été mise en évidence dans les LUSD (9, 10, 12, 55, 84). De plus, P. aeruginosa et C. albicans sont des espèces connues pour leur capacité à développer des biofilms et notamment à coexister au sein d’un biofilm (85- 88). Par ailleurs, l’espèce V. vermiformis à déjà été décrite comme pouvant modifier la sensibilité de certains microorganismes aux agents désinfectants comme C. albicans (89).
1. Pseudomonas aeruginosa
1.1. Généralités
P. aeruginosa appartient au phylum des Proteobacteria, à la classe des Gammaproteobacteria et au genre Pseudomonas. Il s’agit d’un bacille à Gram négatif, aérobie strict, mobile grâce à un flagelle polaire, ubiquitaire des sols, des végétaux et des milieux aqueux (Figure 12). C’est également une bactérie commensale de l’Homme, en particulier au niveau de la flore digestive et parfois au niveau cutané.
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Figure 12 Photo en Microscopie Électronique à Balayage d'un biofilm à P. aeruginosa. La morphologie de P. aeruginosa y est bien visible (Laboratoire EBI, équipe MDE)
1.2. Pathogénicité
P. aeruginosa est un pathogène opportuniste pour l’Homme, impliqué à la fois dans les infections communautaires et nosocomiales. Il serait à l’origine de plus de 2 millions d’infections nosocomiales chaque année dans le monde (90). D’après les résultats de la dernière enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales en France, P. aeruginosa est le 3ème germe le plus fréquemment responsable d’infections nosocomiales avec 977 cas recensés en 2012 (91). Toutefois la principale source de contamination reste endogène, P. aeruginosa étant détecté chez environ 50% des patients hospitalisés (92, 93).
Certains facteurs peuvent favoriser la survenue de l’infection chez l’Homme :
- Des défenses immunitaires affaiblies : patients cancéreux, sous immunosuppresseurs, personnes âgées, patients greffés… - Les patients atteints de mucoviscidose - Une antibiothérapie digestive à large spectre - Les grands brûlés par rupture des barrières naturelles
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- La mise en place de matériel invasif comme des sondes vésicales, des sondes d’intubation, des cathéters… qui pourront servir de support à la bactérie pour la formation d’un biofilm.
Différents types d’infections peuvent survenir chez l’Homme en fonction de l’exposition à ces facteurs de risque et des voies d’entrée de la bactérie. Parmi les infections à P. aeruginosa, les plus fréquemment décrites sont les infections pulmonaires, les infections des tissus mous, du tractus urinaire, du pied diabétique, les bactériémies, les otites et les kératites (94). Malheureusement, le taux de mortalité associé est élevé : les pneumopathies nosocomiales à P. aeruginosa sont fatales dans 50 à 70 % des cas et les septicémies dans 30 à 50% (93). Ceci peut s’expliquer par le fait que les populations touchées à l’hôpital sont déjà, le plus souvent, des populations fragiles mais aussi parce que P. aeruginosa est dotée d’une forte capacité de résistance aux antibiotiques (33, 92, 95, 96).
1.3. Facteurs de virulence
P. aeruginosa synthétise de nombreux facteurs de virulence impliqués à la fois dans la colonisation de l’hôte et dans les différentes étapes du processus d’infection.
Parmi les facteurs de virulence de P. aeruginosa sont retrouvés le flagelle, les pili, le lipopolysaccharide (LPS), les exotoxines (A, S, T, U et Y), certaines enzymes sécrétées (élastases, phospholipase C), les sidérophores (la pyoverdine et la pyochéline) et les phénazines (pyocyanine). Le flagelle intervient dans la mobilité cellulaire, dans l’adhérence cellulaire (via des adhésines flagellaires), dans les premières étapes de la formation du biofilm et dans la réponse inflammatoire via des interactions PAMP (Pattern Associated Molecular Pattern) / TLR (Toll-Like Receptor) induisant la synthèse de cytokines pro- inflammatoires (97-99). Les pili et notamment les pili de type IV sont impliqués dans l’adhérence aux cellules épithéliales par l’intermédiaire d’adhésines (100, 101). Le LPS est un composant de la paroi bactérienne qui entraîne une stimulation excessive de la réponse inflammatoire de l’hôte pouvant engendrer un choc septiqe parfois
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mortel (102). Les exotoxines (exotoxines S, T, U, Y et A) sont impliquées dans la destruction tissulaire, la résistance à la phagocytose et la dissémination bactérienne par destruction des filaments d’actine, induction de l’apopotose ou encore inhibition de la synthèse protéique (103-105). Certaines enzymes sécrétées par P. aeruginosa sont également des facteurs de virulence de cette bactérie comme la phospholipase C ou les élastases (PsE, LasB, LasA) qui interviennent dans la dégradation des phospholipides, de l’élastine, du collagène, de la fibrine ou encore des Immunoglobulines G et A et qui perturbent donc l’organisation cellulaire et les réponses immunitaires de l’hôte (106, 107). Les sidérophores sont des chélateurs du Fer (sous sa forme Fe3+). Le Fer s’avère indispensable au métabolisme bactérien. La pyoverdine intervient, en plus de son rôle de chélateur de Fer, dans la régulation de l’expression de gènes codant pour d’autres facteurs de virulence de P. aeruginosa comme l’exotoxine A (108). La pyochéline intervient également dans la chélation du Fer (avec une affinité moindre pour le fer que la pyoverdine (109)) mais aussi, dans la production de radicaux hydroxyles cytotoxiques (107). La pyocyanine est la principale phénazine produite par P. aeruginosa et elle s’avère toxique pour les cellules eucaryotes et procaryotes via la génération d’espèces oxygénées réactives (107, 110). La pyocyanine est également un pigment bactérien responsable de la coloration verdâtre des cultures de P. aeruginosa (111).
1.4. Biofilm de P. aeruginosa
P. aeruginosa a la capacité de former des biofilms constitués de microcolonies enchevêtrées dans des exopolysaccharides qui se structurent en forme de champignons séparés par des canaux permettant la circulation des nutriments (16). La formation d’un biofilm par P. aeruginosa est schématisée sur la Figure 13.
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Figure 13 Etapes de la formation d'un biofilm de P. aeruginosa. Étapes (stages) I à V : adhérence réversible de P. aeruginosa sur une surface ; adhérence irréversible de P. aeruginosa à la surface ; prolifération des cellules ; maturation du biofilm ; dispersion du biofilm (112)
En ce qui concerne les biofilms de P. aeruginosa, la composition de la MEC s’avère riche en exopolysaccharides et en ADN extracellulaire. P. aeruginosa produit au moins 3 exopolysaccharides intervenant dans la structure et la stabilité du biofilm : l’alginate, le Pel et le Psl. Les souches mucoïdes et non mucoïdes de P. aeruginosa diffèrent notamment par la proportion exprimée de ces exopolysaccharides. Chez les souches mucoïdes, l’alginate est prédominant dans la MEC contrairement aux souches non mucoïdes pour lesquelles les exopolysaccharides majoritaires sont Psl et Pel. L’alginate contriburait à la stabilité du biofilm ainsi qu’à la rétention d’eau et de nutriments dans le biofilm tandis que Psl/Pel seraient particulièrement impliqués dans les premières étapes de la formation du biofilm (112).
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Les étapes de formation et de dispersion d’un biofilm de P. aeruginosa sont régulées par 3 principaux systèmes, le Quorum Sensing (QS), la voie de signalisation impliquant le Di-guanosine monophosphate cyclique (c-di-GMP) et les petits ARNs (sRNAs pour small RNAs) comme résumé sur la Figure 14 (113).
Figure 14 Résumé des voies de signalisation impliquées dans la formation, le développement et la dispersion d’un biofilm de P. aeruginosa (113)
1.4.1. Le Quorum Sensing chez P. aeruginosa
Le QS est une forme de communication intercellulaire impliquant la production, la sécrétion et la détection par les bactéries de signaux constitués de
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petites molécules appelées «auto-inducteurs» et étant, en général, des homosérines lactones pour les bactéries Gram négatives. Le QS permet aux bactéries d’adapter leur comportement par régulation de l’expression de certains gènes en réponse à la concentration en molécules signales (113). Les gènes sous l’influence du QS peuvent représenter jusqu’à 10% d’un génome bactérien (114).
Concernant P. aeruginoa, il existe au moins 3 systèmes de QS, 2 basés sur des acyl homosérines lactones (AHL) : les systèmes las et rhl et un autre système impliquant une quinolone (Pseudomonas Quinolone Signal, PQS). Le système las comprend le gène lasR codant la protéine régulatrice LasR et le gène lasI codant une enzyme LasI (auto-inducteur synthase) nécessaire à la synthèse d’un type d’AHL : la N-(3-oxododecanoyl)-L-homosérine lactone (3-oxo- C12-HSL). Le deuxième système rhl fonctionne selon le même schéma et comprend le gène rhlR, codant la protéine régulatrice RhlR et le gène rhlI, codant une enzyme auto-inducteur synthase RhlI nécessaire à la synthèse d’un second type d’AHL : la N- butyryl-L-homosérine lactone (C4-AHL). La 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone (PQS) est une autre molécule de signalisation transportée par des vésicules membranaires via la protéine régulatrice PqsR. Les gènes activés par ces systèmes interviennent dans la synthèse d’élastase, de lectines, de rhamnolipides, de pyocyanine, de chitinase et de pyoverdine comme schématisé dans la Figure 15.
elastase exotoxin A
Figure 15 Représentation des systèmes de QS chez P. aeruginosa. OMVs : outer membrane vesicles (modifié d’après (113)) 48 | P a g e
Le QS intervient notamment dans les dernières étapes du développement du biofilm de P. aeruginosa, en particulier via la synthèse des rhamnolipides qui semblent jouer un rôle important dans le maintien de la structure des canaux. Au sein de l’architecture en champignons du biofilm, ces canaux sont nécessaires à la distribution de l’oxygène et des nutriments aux microorganismes. Les rhamnolipides de part leur propriété de biosurfactants vont faciliter le détachement du biofilm et donc sa dispersion (113, 115).
1.4.2. La voie de signalisation du c-di-GMP (Di-guanosine monophosphate cyclique)
Il s’agit de l’une des voies de signalisation les plus complexes découvertes chez les bactéries (113). Dans les cellules bactériennes, le c-di-GMP est généré à partir de 2 guanosines triphosphates par les diguanylates cyclases et il est dégradé en 2 guanosine monophosphate (GMP) par des phospodiesterases spécifiques. 2 GTP c-di-GMP 2 GMP Diguanylates Phospodiesterases cyclases
C’est une voie très complexe impliquant de nombreux récepteurs et effecteurs cellulaires comme présenté sur la Figure 16. Pour P. aeruginosa, 3 récepteurs au c- di-GMP ont été identifiés (WspA, YfiB et RocS1) ainsi que 5 diguanylates cyclases (WspR, YfiN, SadC, RoeA et SiaD) ; 5 phosphodiesterases (BifA, DipA, RocR, MucR et NbdA) et 4 effecteurs (Alg44, FleQ, PelD et FimX) (113, 116). Les phosphodiesterases seraient impliquées dans la dispersion du biofilm en réponse à de faibles concentrations en oxygène sans que le mécanisme d’activation précis ne soit élucidé à l’heure actuelle. L’effecteur Alg 44 intervient dans la synthèse d’alginate, composant important de la MEC des souches mucoides (113, 117). De façon plus générale, le c-di-GMP jouerait un rôle crucial dans la transition entre la forme planctonique et la forme sessile. Parmi les facteurs impliqués dans le développement des biofilms à P. aeruginosa et sous l’influence de la voie du c-di- GMP figurent la synthèse d’exopolysaccharides et d’adhésines, la sécrétion d’ADN extracellulaire ainsi que le contrôle de la mort cellulaire et de la mobilité. De fortes
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concentrations en c-di-GMP induisent la synthèse d’adhésines et de MEC tout en inhibant la mobilité bactérienne, favorisant donc la formation du biofilm. À l’inverse, de faibles concentrations en c-di-GMP entraînent une baisse de la production d’adhésines, d’exopolysaccharides et favorisent la mobilité bactérienne facilitant donc la dispersion du biofilm. Bien sûr, toutes ces voies sont reliées entre elles et des interconnections entre le QS et la voie du c-di-GMP ont été observées (113).
Figure 16 Voie de signalisation et régulation du c-di-GMP (118) De nombreux récepteurs aux c-di-GMP ont été reliés à des processus physiologiques allant de la synthèse de polysaccharides à la régulation de l’expression de gènes impliqués par exemple dans la mobilité bactérienne. La voie du c-di-GMP joue un rôle important dans la régulation de la dispersion du biofilm. Les récepteurs au c-di-GMP sont retrouvés au niveau de protéines régulatrices chez de nombreux microorganismes. Parmi ces protéines régulatrices sont retrouvées chez P. aeruginosa, Alg44 qui contrôle positivement la synthèse d’alginate ou encore PilZ qui régule négativement la mobilité bactérienne. De plus, la voie du c-di-GMP inhibe le facteur de transcription FleQ de P. aeruginosa qui est impliqué dans l’activation de la synthèse du flagelle et réprime la production de l’exopolysaccharides Pel. Pel est également régulé par la pectate lyase E (PelE) qui contient un domaine récepteur au c-di-GMP, le domaine 50 | P a g e
PelD. Les taux intracellulaires de c-di-GMP sont sous le contrôle antagoniste des diguanylates cyclases (DGCs) et des phosphodiesterases (PDEs) qui sont souvent associées aux domaines senseurs amino-terminaux comme le PER-ARNT-SIM (PAS) qui intervient dans la détection des ligands gazeux et les domaines BLUF (Blue Light Using Flavin) qui interviennent dans la détection de lumière. Les PDEs ou les DGCs sont stimulées pas différents signaux comme les taux d’oxygène (O2), de monoxyde d’azote (NO), de nutriments… En retour, le c-di-GMP intervient dans la coordination de facteurs de transcription aboutissant soit à une favorisation de la formation de biofilm (dans le cas de fortes concentrations en c-di-GMP) soit à la dispersion du biofilm (dans le cas de faibles concentrations en c-di-GMP).
1.4.3. Les sRNAs
De petites molécules d’ARN non codantes (les sRNAs) ont été décrites comme participant à la régulation post-transcriptionnelle de certains gènes chez P. aeruginosa (113, 119). L’exemple le plus connu concernant les mécanismes impliqués dans le développement de biofilm de P. aeruginosa est celui de rsmY et rsmZ. Dans cette voie, le principal récepteur est GacS qui, après activation, phosphoryle GacA qui, en retour, active la transcription de rsmY et rsmZ qui vont réduire l’activité des protéines effectrices RsmA et RsmN. Ceci entraîne une régulation négative de la synthèse du polysaccharide Psl. Il a été démontré qu’une expression accrue de rsmY et rsmZ résulterait en une amélioration de l’adhérence initiale des bactéries à une surface abiotique mais, à l’inverse, le développement ultérieur du biofilm est freiné par de hautes concentrations de ces sRNAs (120). Ces sRNAs interviendraient également dans l’amélioration de la mobilité des cellules (121). Là encore des interactions avec le QS ont été observées (113).
1.5. Implication clinique de P. aeruginosa associé à des biofilms
Les biofilms de P. aeruginosa ont régulièrement été incriminés dans les infections pulmonaires de patients atteints de mucoviscidose ou de bronchopneumopathie chronique obstructive, dans les infections de plaies chroniques et de plaies des grands brûlés (122).
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Les biofilms cliniques incluant P. aeruginosa peuvent être mono-espèce, en particulier au niveau des plaies chroniques des patients diabétiques (123), mais également multi-espèces, associant alors des espèces telles que C. albicans, ou Aspergillus fumigatus par exemple, notamment chez les patients atteints de mucoviscidose (124-126). On retrouve également des biofilms polymicrobiens impliquant P. aeruginosa associé à S. aureus ou à Acinetobacter baumannii dans le cas des plaies chroniques ou chez les grands brûlés (122, 127). La grande aptitude de P. aeruginosa à développer des biofilms est également impliquée dans la survenue d’infections du site opératoire, notamment lorsque des matériaux sont implantés comme les prothèses de hanches par exemple (128).
Les biofilms de P. aeruginosa sont également omniprésents dans les canalisations d’eau ; on les retrouve par exemple au niveau des douches, des éviers, dans les fontaines réfrigérantes, dans les USD, etc… Ces biofilms peuvent là aussi être à l’origine d’infections chez les sujets les plus vulnérables exposés à l’eau contaminée voire même causer des épidémies nosocomiales d’origine environnementale (129-132).
1.6. Résistance aux antibiotiques et aux traitements chimiques de l’eau
Les infections humaines à P. aeruginosa sont généralement difficiles à traiter du fait des nombreuses résistances naturelles et/ou acquises aux antibiotiques (96, 133).
Parmi les mécanismes de résistance naturelle de P. aeruginosa sont retrouvés : la faible perméabilité de la membrane externe, l’expression constitutive de pompes d’efflux membranaires et l’expression inductible d’une β-lactamase (céphalosporinase AmpC) (134). Les transferts horizontaux, les modifications membranaires et les mutations sont impliqués dans les résistances acquises (94). Ces phénomènes induisent une résistance systématique à certains antibiotiques : les pénicillines G, A et M, les céphalosporines de 1ère et 2ème génération, le cotrimoxazole, les macrolides, les phénicolés, les cyclines, les quinolones de 1ère génération et la kanamycine sont inefficaces contre P. aeruginosa. Par conséquent, une symptomatologie évocatrice et l’isolement clinique d’une souche de P. 52 | P a g e
aeruginosa nécessitent obligatoirement la réalisation d’un antibiogramme pour adapter les traitements au cas par cas. Néanmoins, tous ces mécanismes peuvent se cumuler et aboutir dans certains cas à des impasses thérapeutiques.
Par ailleurs, parmi les produits communément utilisés dans le traitement chimique des réseaux d’eau potable sont retrouvés : le chlore, les chloramines, l’ozone et l’iode (135). Les essais en laboratoire n’ont pas montré de résistance particulière de P. aeruginosa vis-à-vis de ces traitements (135-137). Cependant, il a été montré qu’un traitement pendant une semaine à une concentration en chlore de 10 à 15 ppm d’un biofilm mono-espèce de P. aeruginosa ne suffisait pas à éliminer totalement ce biofilm (138). Sous forme de biofilm, P. aeruginosa serait doté d’une meilleure tolérance aux désinfectants du fait de la difficulté des produits à atteindre les couches profondes du biofilm (135).
2. Candida albicans
2.1. Généralités
Candida albicans est une levure du genre Candida, de la classe des Saccharomycètes et du phylum des Ascomycètes. Il s’agit d’un champignon microscopique eucaryote commensal de l’Homme principalement retrouvé au niveau des muqueuses comme la cavité buccale, le tractus gastro-intestinal, le tractus uro- génital mais aussi au niveau de la peau (139).
C. albicans peut exister sous 2 formes principales : la blastospore et l’hyphe. La blastospore, communément appelée forme « levure », est ovoïde et unicellulaire. L’hyphe est une forme filamenteuse et pluricellulaire pouvant être septée (cloisonnée) ou non. Cependant, une forme intermédiaire existe : on parle de pseudomycélium (ou pseudohyphe) (Figure 17).
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Figure 17 Différentes formes de Candida albicans http://www.atsu.edu/faculty/chamberlain/website/lects/fungi.htm
Les blastospores sont impliquées dans la dissémination du microorganisme via la circulation sanguine tandis que les hyphes sont impliqués dans l’invasion et la pénétration tissulaire. Ainsi, les blastospores semblent initier l’infection, tandis que les hyphes sont impliqués dans sa propagation et dans l’atteinte des organes. La transition morphologique est une réponse à différentes conditions du milieu comme le pH, la température ou la présence de nutriments (140).
2.2. Pathogénicité
Les levures du genre Candida sont responsables d’infections opportunistes dénommées candidoses. L’incidence des infections fongiques est en constante augmentation, notamment en milieu hospitalier. Les résultats de la dernière enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales en France classent C. albicans au 9ème rang des germes responsables d’infections nosocomiales (Tableau III) (91).
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Tableau III Prévalence des infections nosocomiales par microorganisme (91)
Les candidoses sont des infections fréquentes et peuvent être superficielles ou profondes. Les candidoses superficielles sont des atteintes cutanéo-muqueuses comme les candidoses oropharyngées, digestives, génitales, les intertrigos ou les onychomycoses…(Figure 18). Les candidoses profondes vont toucher les organes profonds tels que la rate ou le foie. Candida peut également disséminer dans l’organisme et engendrer des septicémies alors appelées candidémies. On parle de candidose systémique lorsque Candida a été isolé dans plusieurs sites non contigus, impliquant une dissémination sanguine du champignon (141).
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Figure 18 Exemples de candidoses cutanéo-muqueuses (141)
Indépendamment de leur sévérité, les candidoses ont des causes très variées (endo- ou exogènes) comme par exemple un statut immunitaire affaibli (patients atteints du VIH, d’hémopathies malignes, sous immunosuppresseurs…), ou encore des facteurs locaux favorables comme la transpiration, la macération, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre ou la pose de dispositifs invasifs, etc… (141, 142).
C. albicans est la principale espèce du genre Candida impliquée en pathologie humaine et elle est impliquée dans plus de 50% des candidémies pour lesquelles la mortalité associée varie entre 40 et 60% (141). En 2015, Alp et al. ont publié une enquête rétrospective des 10 dernières années dans un centre hospitalo- universitaire Turc. Les candidémies sont apparues à la 5ème place de l’ensemble des hémocultures positives entre janvier 2001 et décembre 2010 pour l’ensemble des patients du CHU sans précision sur l’origine nosocomiale ou communautaire de l’infection. Parmi les candidémies, C. albicans était responsable de 58,3% d’entre elles (143).
2.3. Biofilm à C. albicans
Tout comme P. aeruginosa, C. albicans est une espèce microbienne capable d’adhérer facilement aux surfaces, qu’elles soient organiques ou synthétiques, et par conséquent, C. albicans est fréquemment retrouvé sous forme de biofilm (144).
La formation d’un biofilm de C. albicans suit les principales étapes de développement d’un biofilm précédemment citées (Synthèse bibliographique : Partie I, section 6, page 27) avec néanmoins une spécificité due à son polymorphisme.
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L’adhérence initiale à une surface se fait par les blastospores. Rapidement, les blastospores vont se diviser formant alors une couche basale à la surface du support. Puis, dans les 12 à 30 heures suivant l’adhérence, les formes hyphes commencent à apparaître formant une seconde couche au sein du biofilm et de façon concomittente la MEC commence à être sécrétée. Puis, vient l’étape de maturation où le biofilm grossit et la MEC s’épaissit et englobe le réseau fongique constitué de blastospores, d’hyphes et de pseudo-hyphes. Au niveau de la couche la plus superficielle du biofilm, les hyphes sont toujours présents mais parfois des blastospores y sont attachées (Figure 19). Enfin, au-delà de 72 heures après l’adhérence initiale, vient la phase de dispersion du biofilm fongique, des blastospores sont disséminées dans l’environnement (145, 146).
Figure 19 Image en MEB de l’architecture d'un biofilm à C. albicans
De nombreux gènes sont impliqués dans la formation de biofilm de C. albicans. Les différentes fonctions de ces gènes sont récapitulées dans le Tableau IV et leurs rôles dans le développement de ce biofilm sont schématisés dans la Figure 20.
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Table IV Gènes impliqués dans la formation d’un biofilm de C. albicans
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Figure 20 Action des gènes de C. albicans impliqués dans la formation d'un biofilm (146). Les flèches représentent des relations positives. Les « T » représentent des relations négatives. Un « + » indique que le gène/signal en amont stimule l’expression de la cible en aval. Un « - » indique que le gène/signal en amont inhibe l’expression de la cible en aval. Les pointillés indiquent une répression par un mécanisme indirect
Deux molécules de QS sont principalement impliquées dans le développement et la dispersion du biofilm de C. albicans : le farnesol et le tyrosol (147-149). Le farnesol inhibe la formation d’hyphes et la formation du biofilm dans ses premières étapes d’adhérence. Le farnesol s’accumule dans le surnageant des biofilms matures favorisant le développement des blastospores et ainsi la dispersion du biofilm. Le tyrosol a une action opposée à celle du farnesol et favorise donc la filamentation. L’activité du tyrosol est supérieure à celle du farnesol dans les premières heures de formation du biofilm puis la situation s’inverse après 24 heures, de façon à favoriser respectivement la formation puis la dispersion du biofilm (150). D’autres petites molécules sont détectables dans le surnageant du biofilm mature comme l’alcool phényléthylique, le dodécanol ou le nérolidol. Elles seraient également impliquées dans l’inhibition de la filamentation et donc favoriseraient la dispersion du biofilm (146). 59 | P a g e
2.4. Résistance aux antifongiques et aux désinfectants
Une étude menée par l’InVs entre 2008 et 2012 en France ne rapporte pas d’émergence particulière de souches résistantes de C. albicans aux traitements usuels (azolés et echinocandines) : la prévalence des souches résistantes reste très faible (<1%) (151). Cependant, sous forme de biofilm, C. albicans est jusqu’à 2000 fois plus résistant aux antifongiques que lorsqu‘il se trouve sous forme planctonique (142). Cette résistance serait due, en plus de la protection physique apportée par le biofilm, aux modifications phénotypiques des cellules car même après dispersion du biofilm, ces cellules gardent une forte capacité de résistance (152). De plus, des mutants produisant un biofilm avec une MEC très fine conserveraient une forte résistance aux antifongiques (153). Une surexpression des pompes d’efflux, des changements de la composition en ergostérols et en glucanes de la membrane fongique interviendraient également dans les mécanismes de résistance des cellules fongiques au sein du biofilm (154-156). Concernant la résistance spécifique de C. albicans aux produits de désinfection couramment utilisés pour le traitement des réseaux d’eau potable, très peu de données sont disponibles. Il a été montré qu’en suspension dans l’eau, la concentration en chlore généralement présente dans l’eau potable (0,2 ppm) était suffisante pour une inactivation complète de C. albicans en 1 à 3 heures (157). Cependant, en eau potable supplémentée avec 2% de salive et à 20°C, seules de fortes concentrations en chlore (62-118 ppm) sont efficaces en 15 minutes pour éliminer C. albicans en condition biofilm. Le peroxyde d’hydrogène est quant à lui inefficace pour éliminer C. albicans, que ce soit en condition sessile ou planctonique, dans l’eau potable supplémentée de 2% de salive et à 20°C (89). La sensibilité de C. albicans aux traitements de désinfection de l’eau semble donc influencée par les conditions environnementales et l’organisation en biofilm.
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2.5. Implication clinique de C. albicans dans les biofilms
Les biofilms impliquant Candida spp. (mono ou pluri-espèces) sont fréquemment associés à des infections ayant pour point de départ les dispositifs médicaux implantés comme par exemple les cathéters veineux ou les sondes urinaires (158). D’ailleurs, C. albicans a été décrit comme l’espèce fongique la plus communément associée aux infections liées aux biofilms (159).
C. albicans a été décrit en modèle de laboratoire comme possédant la plus grande capacité d’adhérence aux cellules épithéliales de la cavité orale comparativement aux autres espèces du genre Candida (159).
C. albicans peut être impliqué dans des biofilms mono- ou polymicrobiens. Par exemple, les biofilms mono-espèce de C. albicans sont fréquemment rapportés dans la littérature dans le cadre de septicémies associées à la présence d’un cathéter (160-162). Parmi des exemples de biofilms mixtes bactério-fongique impliquant C. albicans, peuvent être cités, la plaque dentaire (163) ou les prothèses vocales où C. albicans peut être principalement associé à des bactéries des genres Streptococcus ou Lactobacillus (164) ou encore le cas des patients atteints de mucoviscidose où C. albicans peut interagir avec P. aeruginosa (122, 124).
2.6. Interactions microbiennes
De part son caractère commensal chez l’Homme, C. albicans est l’espèce fongique la plus communément impliquée dans les interactions mixtes bactério- fongiques (165). La Figure 21 schématise ces différents modes d’interactions : interactions physiques directes, interactions chimiques, utilisation croisée de métabolites, modifications du milieu environnant (pH…) ou encore interactions via le système immunitaire. De façon plus spécifique, nous nous intéresserons ici aux interactions entre C. albicans et P. aeruginosa, car ces 2 microorganismes ont été choisis comme modèle d’étude dans nos travaux.
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Figure 21 Types d'interactions bacterio-fongique existantes (165)
2.6.1. Interactions entre C. albicans et P. aeruginosa
La Figure 22 résume les interactions observées entre P. aeruginosa et C. albicans.
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Figure 22 Mécanismes moléculaires d'interactions entre P. aeruginosa et C. albicans (165)
P. aeruginosa a été décrit comme capable d’adhérer et même de développer des biofilms à la surface des hyphes de C. albicans, aboutissant à la mort de la cellule fongique. Les mécanismes impliqués font intervenir d’une part la phospolipase C de P. aeruginosa qui est capable de dégrader la phosphatidylcholine (un phospholipide abondant chez les eucaryotes) et d’autre part la production de phénazines par P. aeruginosa génèrant un stress oxydatif pour la cellule fongique.
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De plus, P. aeruginosa, par sa production et sécrétion de la 3-oxo-C12-HSL, inhibe la filamentation de C. albicans par l’intermédiaire de la voie RasI-AMPcyclique-protéine kinase A, un mécanisme d’action similaire à celui du farnesol. À l’inverse, le farnesol (sécrété par C. albicans) inhibe les processus de QS de P. aeruginosa : il existe donc un équilibre entre P. aeruginosa et C. albicans assurant la cohabitation de ces 2 microorganismes dans un même environnement. D’autres facteurs sécrétés par C. albicans et non encore clairement identifiés interviennent sur la production de certains facteurs de virulence par P. aeruginosa (comme les phénazines) ou altèrent la mobilité de P. aeruginosa (129, 165).
3. Vermamoeba vermiformis
3.1. Généralités
V. vermiformis est une espèce d’amibe libre. Les amibes libres se nourrissent par phagocytose d’autres microorganismes. Ce sont des protozoaires (eucaryotes unicellulaires) communément retrouvés dans l’eau et les sols (166). On les distingue des amibes parasitaires (Entamoeba histolytica, Entamoeba coli…) qui ont besoin d’un hôte pour survivre.
On les classe en différents genres dont les plus fréquemment rencontrés sont Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia, Vahlkampfia et Hartmanella. L’espèce la plus couramment retrouvée dans l’environnement est V. vermiformis, anciennement dénommée Hartmanella vermiformis. En effet, en 2011, une reclassification de l’espèce H. vermiformis a été proposée sous l’appellation de V. vermiformis car elle différait beaucoup des autres espèces du genre Hartmanella (167).
Les amibes libres se présentent sous deux formes distinctes : le trophozoïte et le kyste (Figure 23).
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Figure 23 Observations en microscopie optique d'un trophozoïte (1) et d'un kyste (4) de Vermamoeba vermiformis. Cv : vacuole (168)
Le trophozoïte est la forme végétative de l’amibe. Sous cette forme, l’amibe est métaboliquement active. Le kyste est la forme de résistance de l’amibe. Lorsque les conditions du milieu sont défavorables à la survie amibienne (carrence en nutriments, température trop élevée ou trop faible, pH inapproprié…), les amibes s’enkystent. Les amibes enkystées ont une forme généralement arrondie et le kyste se compose de deux parois : l’endo et l’ecto-kyste (168-170). L’enkystement est un phénomène réversible.
3.2. Nutrition
Les amibes libres se nourrissent sous leur forme trophozoïte par phagocytose d’autres micro-organismes tels que des bactéries, des champignons ou certaines algues…(171-173). Les déplacements des amibes sont facilités sur des surfaces plutôt qu’en suspension et par conséquent les amibes sont régulièrement retrouvées à la surface des biofilms où elles se nourrissent (174). Cependant, certaines bactéries sont capables de résister à la phagocytose amibienne voire même de proliférer dans les amibes. Ces bactéries résistantes à la phagocytose amibienne sont regroupées sous le terme d’ARB pour Amoeba Resistant Bacteria (170) et l’exemple le plus décrit est L. pneumophila (Figure 24) qui après s’être multiplié dans les amibes va lyser la cellule amibienne et être disséminé dans l’environnement (175).
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Figure 24 Observations en Microscopie électronique à transmission (MET) de la phagocytose de L. pneumophila par V. vermiformis (A-D) et de sa réplication à l'intérieur de l'amibe (E-F) (176)
3.3. Pathogénicité
Certaines espèces amibiennes sont responsables d’infections graves, fréquemment mortelles comme les encéphalites amibiennes granulomateuses à Acanthamoeba castellanii (177, 178) ou, plus rares encore, les méningoencéphalites amibiennes primitives à Naegleria fowleri (179, 180). Les amibes libres du genre Acanthamoeba peuvent également causer des kératites qui sont souvent difficiles à traiter et peuvent aboutir à la perte de l’œil. Toutes les personnes peuvent être atteintes, peu importe leur statut immunitaire, le principal facteur de risque étant le port de lentilles de contact et surtout le fait de les laver à l’eau du robinet (qui peut être contaminée par des amibes libres) (180, 181). 66 | P a g e
V. vermiformis n’a pas été à l’heure actuelle décrite comme une espèce responsable d’infection chez l’Homme bien qu’elle ait été isolée dans le liquide cérébrospinal d’un patient décédé de méningoencéphalite (182). L’amibe n’a cependant pas été considérée comme origine de l’infection. En 2014, une étude a montré la présence d’amibes du genre Hartmanella sur des lentilles de contact sans aller jusqu’à l’identification d’espèce (183), et du fait de la forte prévalence de V. vermiformis dans l’eau, sa colonisation éventuelle des lentilles de contact semble plausible et laisse planer le doute sur sa capacité à engendrer des kératites. Par contre, plusieurs études relatent des interactions entre V. vermiformis et L. pneumophila (184-187) laissant penser que V. vermiformis pourrait servir de niche à cette bactérie et par conséquent être vecteur de légionellose.
3.4. Résistance aux traitements
D’une façon générale, les amibes libres sont résistantes aux traitements de désinfection, qu’ils soient physiques ou chimiques, en particulier du fait de leur aptitude à former des kystes.
L’efficacité des traitements sur les amibes libres varie en fonction des genres amibiens. La plupart des études disponibles sur la sensibilité aux traitements de désinfection des amibes libres dans l’eau concernent le genre Acanthamoeba (188- 193). Néanmoins, quelques données sont disponibles concernant V. vermiformis. Par exemple, Kutcha et al. en 1993 ont rapporté qu’une incubation de 30 minutes à 60°C était efficace pour éliminer la totalité des trophozoïtes et des kystes de V. vermiformis (175). Critchley et Bentham en 2009 ont mis en évidence que des expositions à des concentrations en chlore de 1 et 5 mg/L pendant 8 h étaient les conditions minimales d’inactivation respectives pour les trophozoïtes et les kystes de V. vermiformis (191). En 2015, Fouque et al. ont rapporté différentes conditions permettant l’inactivation totale des kystes de V. vermiformis dans l’eau : incubation de 10 minutes à une concentration de 15 mg/L de chlore ; exposition à une température de 60°C pendant 30 minutes ; exposition pendant 30 minutes à une concentration équivalente à 0,5 g/L en H2O2 à partir d’une solution mélangeant acide péracétique et H2O2 et l’exposition à une protéase, la subtilisine, à 0,625 U/mL pendant 24 heures (194). 67 | P a g e
3.5. Interactions entre V. vermiformis et P. aeruginosa ou C. albicans
Quelques études ont rapporté que P. aeruginosa était capable tout comme L. pneumophila de résister à la phagocytose amibienne, notamment concernant V. vermiformis, faisant de l’amibe un vecteur potentiel de la bactérie (170, 195). En ce qui concerne C. albicans, des études réalisées au sein de notre laboratoire ont montré que la survie de C. albicans dans l’eau était favorisée en présence de V. vermiformis (196). Par ailleurs, des images en microscopie électronique à transmission ont permis de mettre en évidence l’internalisation possible des levures dans l’amibe (Figure 25).
Figure 25 Images par microscopie électronique à transmission d’interactions entre V. vermiformis et Candida sp. : co-culture entre V. vermiformis et C. albicans (A et B), entre V. vermiformis et C. glabrata (C et D) et V. vermiformis et C. parapsilosis (E et F) (196)
De plus, la présence de V. vermiformis influerait sur la sensibilité de C. albicans aux traitements chimiques. En effet, en présence de l’amibe, C. albicans est moins sensible à l’oxygenal 6© (89).
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Matériel et méthodes
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Partie I Étude de la diversité microbienne des USD
1. Caractéristiques des USD étudiées
Sept USD ont été investiguées au cours de ce travail : trois installées dans des cabinets dentaires privés et quatre sous la responsabilité du CHU de Poitiers. Les sept USD sont situées dans la ville de Poitiers ou dans un rayon de 15 km autour.
Des informations ont été recueillies en dialoguant avec les équipes dentaires concernées (dentistes et assistants dentaires). Les thèmes abordés ont été : le modèle de l’USD (marque, fournisseur), son âge, l’utilisation d’éventuels traitements de l’eau en entrée et au sein de l’USD (filtre, adoucisseur, produits chimiques…), la réalisation de purges et la stérilisation des PIR entre chaque patient. Les professionnels ayant participé à l’étude nous ont très bien accueilli et ils étaient très intéressés vis-à-vis des résultats que nous nous sommes engagés à valoriser et à publier de façon anonyme.
2. Stratégie d’échantillonnage
La Figure 26 décrit les trois points d’eau prélevés pour chaque USD :
Aval :
Amont (IW) Après stagnation (OWS)
Après activité (OWA)
Figure 26 : Points de prélèvement des USD investiguées 70 | P a g e
Ont ainsi été prélevés :
un point en amont d’USD : il s’agissait du robinet d’eau le plus proche possible de l’unité et situé sur le réseau avant le passage dans l’unité. Ce point constitue un témoin de la qualité de l’eau en entrant dans l’unité car, malheureusement, le prélèvement au raccordement même de l’unité était impossible. Ce point est abrégé « IW » pour « Incoming Water ».
2 points en aval d’USD correspondant à des prélèvements de l’eau de sortie de l’un des PIR. La turbine a été investiguée à chaque fois par souci d’homogénéité. Le point en aval après stagnation, c’est-à-dire après une période d’inactivité prolongée, à savoir le lundi matin, après la période de stagnation du week-end (48 heures) et avant la première utilisation de l’USD, a été prélevé. Il s’agit d’un témoin de la qualité résiduelle de l’eau de sortie de l’USD. Ce point est abrégé « OWS » pour « Output Water after Stagnation ». Et enfin, le point en aval après activité, soit juste après le traitement du dernier patient quotidien, a également été prélevé : il s’agit d’un témoin de la qualité de l’eau de sortie d’USD entre 2 patients. Cet horaire a été choisi pour limiter la gêne occasionnée par nos interventions. Ce point est abrégé « OWA » dans les résultats pour « Output Water after Activity ».
Un litre a été prélevé à chaque fois. Chacun des prélèvements a été réalisé en double à au moins une semaine d’intervalle. Les prélèvements ont été réalisés en condition d’asepsie (gants, masque chirurgical) à l’aide de flacons stériles contenant du thiosulfate de sodium pour neutraliser les éventuels résidus de désinfectants.
3. Etude de la flore bactérienne totale cultivable
Un volume de 50 µL de chaque prélèvement a été ensemencé en duplicata sur milieu gélosé R2A (197) en utilisant un ensemenceur spirale (WASP 2 spiral plater ; Biomerieux, Craponne, France). Le dénombrement des UFC a été réalisé après 7 jours d’incubation à 28°C en condition aérobie.
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4. Extraction d’ADN et quantification
Des volumes de 100 à 500 mL de chaque prélèvement ont été filtrés sur membrane en polycarbonate à seuil de coupure de 0,22 µm (47 mm de diamètre, Fisher, Ilkirch, France), en utilisant une rampe de filtration en inox préalablement stérilisée par flambage à l’alcool.
L’ADN a ensuite été extrait à partir de ces filtres. Chaque membrane a été découpée avec un scalpel et des pinces stériles et les morceaux découpés ont été déposés dans un tube contenant des billes en verre (MP Biomedicals, Fisher Scientific, Villebon-sur-Yvette, France) puis stockés à -20°C. Un mL de tampon d’extraction (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 100 mM pH 8,0, NaCl 20 mM et 2% de SDS) a été ajouté par tube. Les tubes ont été vortexés puis soumis à agitation mécanique pendant 20 secondes (FastPrep Instrument, MP Biomedicals) avant d’être incubés à 70°C pendant 15 minutes. Après 15 minutes de centrifugation à 10 000 g, les surnageants ont été récupérés, mis en contact avec de l’acétate de potassium 3M pH 5,5 (volume 1/10) et incubés 10 minutes dans la glace avant centrifugation à 14 000 g pendant 10 minutes également. Les acides nucléiques ont été précipités par ajout d’un volume d’isopropanol glacé et ont été lavés avec de l’éthanol 70%.
Les aliquots d’ADN extrait ont été quantifiés par utilisation du SYBR Green (Invitrogen, Fisher Scientific, France) sur le LightCycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Allemagne). Une courbe standard de fragments d’ADN digérés par l’enzyme de restriction Hind III (Promega, Madison, USA) a été utilisée suivant la méthode décrite par Leggate et al. (198). Tous les échantillons d’ADN ont été conservés à -20°C jusqu’à utilisation.
5. qPCR 16S bactérienne
Une qPCR 16S a été réalisée sur nos échantillons en utilisant la technique de détection au SYBR Green sur le LightCycler 480. Les amorces 341F (5’-CCTACG GGAGGCAGCAG-3’) et 515R (5’-ATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’) ont été utilisées (199). 72 | P a g e
Le milieu réactionnel (volume final : 10 µL) contenait, pour chaque échantillon à analyser, une concentration finale à 0,5 µM de chaque amorce (soit 0,5 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM), 2 µL de LightCycler FastStart DNA MasterPLUS Sybr Green I mix (Roche Applied Science, France), 5 μL d’eau et 2 μL d’ADN à analyser. Le programme de qPCR utilisé est représenté dans le Tableau V.
Tableau V Programme utilisé pour la qPCR 16S
Cycle Répétition Étape Température Temps Annotation 1 1 1 95°C 10 min Activation 2 35 1 95°C 10 s Dénaturation 2 60°C 10 s Hybridation 3 72°C 15 s Acquisition des données (real time) /Quantification 3 1 1 95°C 0 s Dénaturation
2 65°C 15 s Hybridation augmentation de la température de 0,1°C 3 95°C 0 s Collecte des données de la courbe de dissociation (melting curve)
La souche PA 14 de Pseudomonas aeruginosa a été utilisée pour obtenir la courbe d’étalonnage.
6. qPCR 18S fongique
Pour une recherche globale de micromycètes dans nos échantillons, une qPCR 18S fongique a été réalisée en utilisant les amorces FF390 (5’-CGATAACGA ACGAGACCT-3’) et FR1 (5’-AKCCATTCAATCGGTAKT-3’) (200).
Le milieu réactionnel (volume final : 10 µL) contenait, pour chaque échantillon à analyser, une concentration finale à 0,5 µM de chaque amorce (soit 0,5 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM), 2 µL de LightCycler FastStart DNA MasterPLUS Sybr Green I mix (Roche Applied Science, France), 5 μL d’eau et 2 μL 73 | P a g e
d’ADN à analyser. Les caractéristiques du programme utilisé sont présentées dans le Tableau VI.
Tableau VI Programme utilisé pour la qPCR 18S fongique
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 95°C 10 min 2 40 1 95°C 15 s 2 50°C 30 s 3 70°C 60 s 3 1 1 95°C 0 s 2 70°C 15 s 3 95°C 0 s
La souche de C. albicans ATCC 3153 a été utilisée pour préparer la courbe d’étalonnage.
7. PCR C. albicans
Pour la recherche de C. albicans dans les échantillons, une PCR a été réalisée en utilisant les amorces INT1-F (5’-AAGTATTTGGGAGAAGGGAAAGGG-3’) et INT2-R (5’-AAAATGGGCATTAAGGAAAAGAGC-3’) (201).
Le mélange réactionnel (volume final de 25 µL par tube) était composé de
11,9 µL d’eau, 5 µL de tampon PCR 5X, 1,5 µL de MgCl2, 0,4 µL de dNTP (concentration initiale de 10 mM pour chaque dNTP), 0,5 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM (soit une concentration finale de 0,2 µM pour chacune d’elle), 0,2 µL d’ADN polymerase concentrée initialement à 5 U/µL et 5 µL d’ADN à tester concentré initialement entre 1 et 5 ng/µL.
Le programme PCR décrit dans le Tableau VII a été effectué sur un Thermocycler (Eppendorf, USA).
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Tableau VII Programme utilisé pour la PCR C. albicans
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 95°C 2 min 2 45 1 95°C 1 min 2 55°C 30 s 3 72°C 1 min 3 1 1 72°C 10 min
La souche de C. albicans ATCC 3153 a été utilisée comme témoin.
8. qPCR C. albicans
Toujours pour la recherche de C. albicans dans les échantillons, une qPCR a également été réalisée en utilisant le même couple d’amorce que précédemment (INT1-F et INT2-R). Le mélange réactionnel contenait pour un volume final de 10 µL, par tube, 4,2
µL d’eau, 2 µL de SYBR Green I Master Mix 5X, 0,8 µL de MgCl2, 0,5 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM (soit une concentration finale de 0,5 µM pour chacune d’elle) et 2 µL d’ADN à tester concentré initialement entre 1 et 5 ng/µL.
Le programme de qPCR s’est déroulé sur le LightCycler 480 comme décrit dans le Tableau VIII.
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Tableau VIII Programme utilisé pour la qPCR C. albicans
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 95°C 10 min 2 45 1 95°C 10 s 2 55°C 10 s 3 72°C 15 s 3 1 1 95°C 0 s 2 50°C 15 s 3 95°C 0 s
La souche de C. albicans ATCC 3153 a également été utilisée comme témoin.
9. PCR Amibes
Pour la recherche d’amibes libres dans nos échantillons, une PCR amibes a été réalisée en utilisant les amorces Ami6F1 (5’-CCAGCTCCAATAGCGTATATT-3’) et Ami9R (5’-GTTGAGTCGAATTAAGCCGC-3’) (202).
Le mélange réactionnel (volume final : 25 µL par tube) contenait : 12 µL d’eau,
5 µL de tampon PCR 5X (MgCl2 inclus), 0,4 µL de dNTP (concentration initiale de 10 mM de chaque dNTP), 1,25 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM (soit une concentration finale de 0,2 µM pour chacune d’elle), 0,1µL de GoTaq concentrée initialement à 5 U/µL et 5 µL d’ADN à tester concentré initialement entre 1 et 5 ng/µL.
Le programme PCR a été réalisé sur le Thermocycler Eppendorf selon les modalités du Tableau IX.
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Tableau IX Programme utilisé pour la PCR Amibes
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 95°C 2 min 2 40 1 95°C 30 s 2 55°C 30 s 3 72°C 1 min 3 1 1 72°C 10 min
Pour les témoins positifs, les souches d’amibes V. vermiformis ATCC 50802 et A. castellanii ATCC 30234 ont été utilisées.
10. qPCR amibienne
Pour compléter la recherche d’amibes libres dans les échantillons, une qPCR amibienne a été réalisée en utilisant les amorces Amo 1400F (5’-ATGCCGACCARS GATYMGGAG-3’), Amo 1540R (5’-CAAGSTGCYMGGGGAGTCAT-3’), Vahl 560F (5’-AGGTAGTGACAAGMYRTAGYGACT-3’) et Vahl 730R (5’-GGGCGTTTTAAC TACARCAGTATTA-3’) (203).
Le mélange réactionnel contenait, pour un volume final de 10 µL, par tube 4 µL d’eau, 2 µL de SYBR Green I Master Mix 5X, 0,5 µL de chaque amorce concentrée à 10 µM (soit une concentration finale pour chaque amorce à 0,5 µM) et 2 µL d’ADN à tester (là aussi initialement concentré à 0,5 ng/µL). Le programme PCR utilisé est décrit dans le Tableau X.
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Tableau X Programme utilisé pour la qPCR Amibes
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 94°C 10 min 2 45 1 95°C 10 s 2 62°C 10 s 3 72°C 10 s 3 1 1 95°C 0 s 2 65°C 15 s 3 98°C 0 s
Pour la gamme standard, les souches de V. vermiformis ATCC 50802 et d’A. castellanii ATCC 30234 ont été utilisées.
11. qPCR L. pneumophila
Les amorces mip-F (5’-GCATTGGTGCCGATTTGG- 3’) et mip-R (5’-GCT TTGCCATCAAATCTTTCTGAA-3’) ont été utilisées pour la recherche spécifique de L. pneumophila par qPCR.
Le milieu réactionnel (volume final de 10 µL) contenait pour chaque échantillon à analyser une concentration finale à 0,5 µM de chaque amorce (mip-F et mip-R) (soit 0,5 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM), 2 µL de SYBR Green I Master mix 5X (Roche Applied Science, France), 5 μL d’eau et 2 μL d’ADN à analyser (concentré initialement à 0,5 ng/µL). La réaction a été réalisée selon la méthode décrite par Joly et al. (204) et selon le protocole résumé dans le Tableau XI.
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Tableau XI Programme utilisé pour la qPCR Legionella pneumophila
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 95°C 10 min 2 45 1 95°C 10 s 2 60°C 10 s 3 72°C 10 s 3 1 1 95°C 0 s 2 65°C 15 s 3 95°C 0 s
Une gamme de concentrations génomiques a été élaborée en utilisant une souche de L. pneumophila Lens pour obtenir la courbe standard.
12. qPCR Legionella spp.
Pour la recherche de l’ensemble des espèces de Legionella dans les prélèvements, la composition du mélange réactionnel de la qPCR était identique à la précédente mais en utilisant, cette fois-ci, les amorces annotées Leg 140F (5’- AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’) et Leg 140R (5’-AACCACCTACGCACCCTTTA- 3’) (selon Dutil et al. (205)). Le programme PCR utilisé est décrit dans le Tableau XII.
Tableau XII Programme utilisé pour la qPCR Legionella spp.
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 95°C 10 min 2 45 1 95°C 10 s 2 58°C 10 s 3 72°C 15 s 3 1 1 95°C 0 s 2 65°C 15 s 3 95°C 0 s
La souche L. pneumophila Lens a été utilisée pour obtenir la courbe standard.
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13. qPCR P. aeruginosa
Une qPCR a été réalisée pour rechercher la présence de P. aeruginosa dans les échantillons. Pour cela, les amorces PaerF (5’-TGCTGGTGGCACAGGACAT-3’) et PaerR (5’-TTGTTGGTGCAGTTCCTCATTG-3’) ont été utilisées (206).
Le mélange réactionnel contenait, pour un volume final de 10 µL, par tube 5 µL d’eau, 2 µL de SYBR Green I Master Mix 5X, 0,5 µL de chaque amorce concentrée à 10 µM (soit une concentration finale pour chaque amorce à 0,5 µM) et 2 µL d’ADN à tester (là aussi initialement concentré à 0,5 ng/µL). Le programme PCR utilisé est décrit dans le Tableau XIII.
Tableau XIII Programme utilisé pour la qPCR Pseudomonas aeruginosa
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 94°C 10 min 2 45 1 95°C 10 s 2 62°C 10 s 3 72°C 10 s 3 1 1 94°C 0 s 2 65°C 15 s 3 95°C 0 s
La souche ATCC 9027 de P. aeruginosa a été utilisée pour réaliser la gamme standard.
14. Pyroséquençage du gène de l’ARNr 16S
Pour chaque échantillon à analyser, un fragment de gène codant l’ARNr 16S, d’environ 586 bases, a été amplifié par PCR en utilisant les amorces 341F (précédemment décrite) et 926R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3’). Le mélange réactionnel contenait, pour un volume final de 50 µL, par tube 28,5 µL d’eau, 10 µL de tampon Phusion PCR 5X (soit une concentration finale à 1X), 1 µL de chaque dNTP (concentration initiale de 10 mM, soit une concentration finale de 200 µM pour 80 | P a g e
chacun des dNTP), 2,5 µL de chaque amorce concentrée initialement à 10 µM (soit une concentration finale de 0,5 µM pour chacune d’elle), 0,5 µL de Phusion Hot Start II high-fidelity DNA polymerase (Fisher Thermo Scientific) initialement concentrée à 2 U/µL (soit une concentration finale de 1 U = 0,02 U/µL) et 5 µL d’ADN à tester concentré initialement entre 1 et 5 ng/µL. Le programme PCR utilisé est résumé dans le Tableau XIV.
Tableau XIV Programme PCR de préparation des échantillons au pyroséquençage bactérien
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 98°C 1 min 2 35 1 95°C 30 s 2 50°C 30 s 3 72°C 1 min 3 1 1 72°C 5 min
Les triplicats des produits PCR ainsi obtenus ont été poolés, purifiés en utilisant le kit de nettoyage PCR selon les instructions du fabricant (Macherey-Nagel, Hoerdt, France) et quantifiés selon la technique SYBR Green précédemment décrite.
Ensuite, les produits PCR purifiés ont été amplifiés par PCR multiplexes. Il s’agissait d’une PCR de 9 cycles conduite dans des conditions similaires à celles décrites précédemment mais en présence des identifiants multiplexes (MIDs), de la clé et de l’adaptateur nécessaires au pyroséquençage (voir Tableau XV).
Tableau XV Récapitulatif des amorces utilisées pour la PCR multiplexes
Séquences nucléotidiques 926 R CCGTCAATTCMTTTRAGT Adaptateur CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC Clé TCAG MID 1 TCATAGACAG
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MID 2 TATCACTACG MID 3 CTGTACGTAG MID 4 AGTCTCTAGA MID 5 AGATACACAG MID 6 ACTCTAGTCT MID 7 AGTCAGTGTA MID 8 CTACGTCTGT MID 9 CGACTACGAG MID 10 TAGCACACTA MID 11 TACGAGTACA MID 12 TGCTACTGAG MID 13 CACGATAGCG MID 14 TATATCGACA MID 15 TGTACTACAT MID 16 AGAGCGCGAG MID 17 CGTAGATCGA MID 18 TGATGACGCG MID 19 TCTCTCGAGA MID 20 TAGTGTAGCG MID 21 TCACGACGTA
Les produits issus de la PCR multiplexes ont ensuite été purifiés et quantifiés à l’aide du kit Quant-iT©PicoGreen dsDNA (Life Technologies, Thermo Fisher). Puis, les échantillons ont subi une étape de PCR en émulsion et ils ont été séquencés à l’aide du Séquenceur 454 Junior GS (Roche Applied Science). Le jeu de séquences obtenu a été analysé selon le pipeline GnS-PIPE (version 1.1.11) d’après Terrat et al. (207). Brièvement, les séquences ont été regroupées selon les différents MIDs choisis initialement. Les données présentant des ambiguïtés, des erreurs dans les séquences attendues des amorces, des longueurs de séquences inférieures à 300 paires de bases, etc… ont été éliminées. Les séquences rigoureusement identiques ont été regroupées et les séquences ayant passées les filtres de qualité ont été assignées en Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTUs) et affiliées
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taxonomiquement selon la banque de données Silva r114 (208). Une OTU correspond à une espèce bactérienne sur le plan taxonomique.
Selon les besoins des représentations graphiques et pour essayer de pondérer les variations dues aux échantillonnages, les 21 prélèvements ont été regroupés selon les 3 conditions d’eaux étudiées nommées IW, OWS et OWA comme précédemment expliqué dans le paragraphe « stratégies d’échantillonage ». Ainsi, pour chaque catégorie d’eau étudiée (IW, OWS ou OWA), les résultats des prélèvements des 7 USD ont été regroupés.
De plus, un échantillonnage aléatoire des séquences obtenues a été réalisé pour chacun des 21 prélèvements en choisissant comme seuil de séquences à analyser, le nombre le plus faible de séquences obtenues parmi l’ensemble du jeu de données. Ainsi, nous avons éliminé des biais de sur-représentation de certaines OTUs du fait d’un nombre simplement plus important de données obtenues pour un échantillon donné comparativement aux autres.
Les représentations en « Boxplots » ont été obtenues en utilisant le logiciel « R » package (R Development Core Team, version 2004) et le diagramme de Venn a été obtenu en utilisant le programme « BioVenn » (209).
Afin d’évaluer le risque infectieux réel pour l’Homme inhérent à l’exposition à l’eau des USD étudiées, la présence d’espèces bactériennes potentiellement pathogènes et de pathogènes avérés a été recherchée dans les prélèvements. Cependant, même avec le jeu de données obtenu par pyroséquençage, l’identification jusqu’à l’espèce est délicate. Nous avons donc comparé nos données avec celles du NCBI (National Center for Biotechnology Information). L’affiliation d’espèce proposée dans l’article paru chez Water Research a été réalisée uniquement dans le cas où les séquences affichaient un pourcentage d’identité d’au moins 97,5% et une « E-value » très faible (≤10-4) ; la E-value correspond à la probabilité d’avoir un alignement obtenu purement par hasard. Seulement les OTUs estimées comme représentant au moins 0,1% de proportion relative dans l’une des 3 conditions testées (IW, OWS ou OWA) ont été confrontées à cette banque de données NCBI. 83 | P a g e
En ce qui concerne le caractère pathogène opportuniste ou non des espèces bactériennes ainsi identifiées, nous nous sommes basés sur l’existence de cas d’infections humaines préalablement rapportées dans la base de données « PubMed ».
15. Pyroséquençage du gène de l’ARNr 18S
En complément du pyroséquençage bactérien, et toujours dans le but de disposer d’un inventaire le plus exhaustif possible de la communauté microbienne des LUSD, un pyroséquençage fongique a été réalisé. Par contre, pour des raisons économiques, les 21 conditions n’ont pas pu être soumises au pyroséquençage fongique. Ainsi, les quatre USD ayant la plus forte population fongique représentée (d’après les résultats de la qPCR 18S) ont été sélectionnées et pour chacune d’elles, les 3 conditions d’eau prélevée (IW, OWS et OWA) ont été analysées, soit un total de 12 échantillons analysés par pyroséquençage.
Le principe a été exactement le même que pour le pyroséquençage bactérien sauf bien sûr concernant le choix des amorces. Pour l’analyse fongique, les amorces FR1 (5′-ANCCATTCAATCGGTANT-3′) et FF390 (5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′) ont été sélectionnées d’après les travaux de Prevost-boure et al. 2011 (200). Le programme PCR est présenté dans le Tableau XVI.
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Tableau XVI Programme PCR de préparation des échantillons pour le pyroséquençage fongique (207)
Cycle Répétition Étape Température Temps 1 1 1 94°C 3 min 2 35 1 94°C 1 min 2 52°C 1 min 3 72°C 1 min 3 1 1 72°C 5 min
La suite de la technique de pyroséquençage et l’analyse des données ont été réalisées de manière identique à celles du pyroséquençage bactérien décrit ci- dessus.
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Partie II Modélisati biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD on dynamique d’un
1. Souches microbiennes
Trois souches ont été utilisées : la souche ATCC 3153 de C. albicans, la souche ATCC 50802 de V. vermiformis et la souche ATCC 9027 de P. aeruginosa. Concernant P. aeruginosa, la souche ATCC 9027 a été choisie après s’être assuré qu’il n’y avait pas d’antagonisme avec celle de C. albicans.
2. Culture et entretien des souches
2.1. Candida albicans
La souche de C. albicans a été entretenue à partir de cryotubes de conservation (-80°C) (Fisher Thermo Scientific, France) par repiquage (incubation 48h à 37°C) sur gélose Sabouraud GC (milieu Sabouraud additionné en Gentamicine 0,04 g/L et en Chloramphénicol 0,5 g/L) (Sigma-aldrich, St-Louis, USA). Les antibiotiques évitent la contamination bactérienne de la gélose. Avant chaque expérimentation, la souche a été repiquée sur gélose Sabouraud GC et incubée 48h à 37°C.
2.2. Pseudomonas aeruginosa
La souche de P. aeruginosa a également été entretenue à partir de cryotubes de conservation (-80°C) par repiquage sur gélose BHI (Brain Heart Infusion ou bouillon cœur-cervelle) (Sigma-aldrich, St-Louis, USA). Avant chaque expérimentation, la souche a été repiquée sur gélose BHI et incubée pendant 24h à 37°C.
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2.3. Vermamoeba vermiformis
La souche de V. vermiformis a été cultivée et entretenue en milieu liquide PYNFH complémenté (Tableau XVII). La souche amibienne a été repiquée une fois toutes les deux semaines en flasques de culture de 25 cm² (Sarsted, USA) dans le milieu PYNFH complémenté et incubée à température ambiante. Cinq jours avant chaque expérimentation, la souche amibienne a été repiquée à température ambiante dans une nouvelle flasque pour laisser le temps à l’amibe d’atteindre une concentration suffisante. Afin de conserver les souches d’amibes libres à plus long terme, une cryoconservation est réalisée (adaptation du protocole ATCC), dans du DMSO (Diméthylsulfoxyde) à 7,5% final. Les cryotubes sont conservés à -80°C.
Tableau XVII Préparation du milieu PYNFH complémenté
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3. Milieux d’expérimentation
Afin d’être le plus proche possible des conditions des LUSD, les expérimentations ont toutes eu lieu dans de l’eau du réseau filtrée sur une membrane à seuil de coupure de 0,22 µm (Fisher Scientific Stéricup) additionnée ou non (selon les besoins de l’expérimentation) de salive artificielle (5% v/v). La composition de la salive artificielle est donnée dans le Tableau XVIII.
Tableau XVIII Recette de la salive artificielle d'après Devine et al. (210)
Pour 1 Litre Proteose peptone 10 g Tryptone 5 g Extrait de levure 5 g KCl 2,5 g Sucrose 2 g Arginine 210 mg Urée 60 mg Hémine 50 mg Ménadione 10 mg Mucine gastrique de porc 2,5 g
4. Préparation des suspensions microbiennes
4.1. Suspension de C. albicans
Les concentrations en levures souhaitées pour chaque expérimentation ont été obtenues en dispersant quelques colonies de C. albicans dans de l’eau filtrée. Les dénombrements ont tous été réalisés avec une cellule de Kova® (Hycor biomedical inc., California, USA) par microscopie optique.
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4.2. Suspension de P. aeruginosa
Les concentrations souhaitées en bactéries pour chaque expérimentation ont été obtenues par mise en suspension dans 2 mL d’eau filtrée des bactéries par grattage des colonies préalablement obtenues à la surface des géloses BHI à l’aide d’un grattoir de cellules (Costar, Corning incorporated, NY, USA).
Les densités optiques des suspensions obtenues ont été lues au densitomètre cellulaire (cell densisty meter WPA CO 8000, Biochrom, Cambridge, Angleterre) puis des dilutions ont été réalisées en eau filtrée afin d’obtenir les concentrations cellulaires souhaitées. Une unité de DO à 0,1 (longueur d’onde de 600 nm) correspond à une concentration d’environ 1010 UFC de P. aeruginosa/mL.
4.3. Suspension de V. vermiformis
Pour chaque expérience, les amibes ont été récupérées à partir des flasques de culture à l’aide d’un grattoir de cellules (Costar, Corning incorporated, NY, USA). Les amibes ont ensuite été centrifugées à 300 g (Thermo scientific, Heraeus Multifuge X3, Villebon sur Yvette, France) pendant 7 minutes, puis lavées dans de l’eau filtrée. Enfin, elles ont été remises en suspension en eau filtrée de façon à obtenir les concentrations nécessaires pour chaque expérimentation. Les dénombrements ont été réalisés par microscopie optique en utilisant des cellules de Kova®.
5. Mise au point du modèle dynamique
Afin de réaliser des biofilms polymicrobiens dans le contexte des LUSD, un CDC Biofim Reactor (CBR) a été utilisé comme support au développement des biofilms en conditions dynamiques. Le CBR (Figure 27) est formé d’un bécher d’environ 1 L, disposant d’un système d’agitation par barreau aimanté et de plusieurs entrées prévues pour des suspensions d’alimentation. Le CBR peut contenir jusqu’à 24 coupons répartis sur 8 portoirs. Les coupons servent de support à la formation de 89 | P a g e
biofilms. Ces coupons peuvent être de différentes matières mais leur dimension doit être de 3 mm d’épaisseur pour un diamètre de 12,7 mm afin de pouvoir être parfaitement imbriqués dans les portoirs du CBR. Le CBR et les coupons sont commercialisés par la société BioSurface Technologies (Bozeman, MT, USA).
Portoirs CBR
Coupons
Pompe péristaltique Agitateur magnétique
Suspension d’alimentation
Figure 27 Photographie du CBR en fonctionnement
Afin de mimer au mieux les conditions des LUSD, le CBR a été alimenté sous agitation magnétique par une suspension microbienne à un débit de 90 mL/min selon une répétition de cycles de 30 min alternant 12 min de circulation de la suspension microbienne dans le réacteur avec 18 min de stagnation d’eau. Ce choix de cycle a été réalisé afin de mimer les périodes de fonctionnement d’une USD lors des consultations chez le dentiste. Les cycles de 30 minutes se sont alors succédés chaque jour de fonctionnement du modèle sur des plages horaires allant de 9h00 à 12h00 et de 14h00 à 17h00. Chaque jour de la semaine, la suspension microbienne était renouvelée. Pendant les week-ends, les cycles de fonctionnement du CBR ont été interrompus de façon à mimer la stagnation d’eau du week-end des LUSD.
Afin d’obtenir le développement d’un biofilm polymicrobien, la suspension d’alimentation du CBR était composée, dès le 1er jour de fonctionnement du modèle, d’eau filtrée additionnée en P. aeruginosa à une concentration de 103 UFC/mL, en C. albicans à 104 UFC/mL, en salive artificielle (5% v/v) et additionnée ou non de V. 90 | P a g e
vermiformis à 104 cellules/mL selon les besoins des expérimentations. En effet, des expériences ont été réalisées en parallèle avec et sans V. vermiformis afin d’étudier l’influence des amibes sur la sensibilité des microorganismes aux agents désinfectants. Chacune des expérimentations a été réalisée au moins deux fois à des périodes différentes et toujours à température ambiante. Entre chaque expérimentation, l’ensemble CBR-tuyaux d’alimentation a été stérilisé par autoclavage (sans les coupons ; leur entretien sera décrit ci-dessous).
6. Étude de l’influence des matériaux sur la formation du biofilm
Afin d’étudier l’influence de différents matériaux sur la formation du biofilm polymicrobien, des coupons en PVC, en polyuréthane, en teflon, en polyéthylène et en silicone (BioSurface Technologies, Bozeman, MT, USA) ont été utilisés comme support. Pour cette expérimentation, la suspension alimentant le CBR ne contenait pas d’amibes. La cinétique de fomation du biofilm a été suivie sur une période d’un mois. Pour cela, aux différents temps investigués, les coupons ont été retirés du CBR, puis vortexés dans 2 mL d’eau filtrée afin d’en détacher le biofilm. Les suspensions microbiennes ainsi obtenues ont été diluées avec de l’eau filtrée avant d’être ensemencées sur géloses BHI (pour dénombrement des bactéries) et Sabouraud GC (pour dénombrement des levures). Les UFC ont été dénombrées après 48 h d’incubation à 37°C.
Au bout d’un mois de développement des biofilms, le CBR a été alimenté uniquement avec de l’eau filtrée afin de mimer l’action de purges sur le biofilm. L’effet sur le biofilm a été évalué après 1 et 3 journées de purges. Les ensemencements et dénombrements ont été réalisés de la même manière que décrit précédemment.
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7. Entretien des coupons
Après chaque expérimentation, afin de les stériliser, les coupons ont été récupérés, immergés dans un bain d’éthanol à 70% pendant une nuit puis soniqués pendant 15 min dans un bain de surfanios© (ANIOS, Lille, France) à une amplitude de sonication de 50% (modèle 75038, bioblock scientific, Illkirch, France). Les coupons ont ensuite été rincés avec de l’eau stérile, séchés et stockés en sachet plastique jusqu’à la prochaine utilisation.
8. Évaluation de l’effet de traitements désinfectants sur le biofilm polymicrobien
8.1. Les désinfectants testés
Trois produits désinfectants vendus par des fournisseurs d’USD ont été testés : l’oxygenal 6© (Kavo, Biberach, Allemagne), le sterispray© (Gammasonic, Billom, France) et le calbenium© (Airel, Champigny-sur-Marne, France).
8.2. Étude de l’efficacité des produits sur un biofilm déjà formé : approche curative
Après une semaine de fonctionnement du modèle dynamique comme décrit précédemment (paragraphe 5 ; page 90), et en présence des trois espèces microbiennes, les coupons ont été retirés du CBR et placés en microplaques de 24 puits (Costar, Corning incorporated, NY, USA). Une fois introduits dans la microplaque 24 puits, les coupons ont été traités à température ambiante, pendant 15 min, avec chacun des 3 produits désinfectants étudiés. La gamme de concentrations pour chacun de ces produits était de 0 (condition contrôle) à 10 % v/v, les dilutions ayant été réalisées avec de l’eau filtrée. Une fois les 15 min écoulées, les coupons ont été transférés dans des tubes Falcon de 50 mL (VWR, USA) contenant 2 mL d’eau filtrée et un excès de thiosulfate de sodium de façon à neutraliser l’éventuel excédent de produit désinfectant. Le tube a ensuite été vortexé
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pendant 2 min de façon à décrocher le biofilm de la surface des coupons. La suspension microbienne ainsi obtenue a été diluée en série avec de l’eau filtrée avant d’être ensemencée à la fois sur gélose BHI et sur gélose Sabouraud GC. Les UFC ont été dénombrées sur chacune des géloses après 48h d’incubation à 37°C. Les antibiotiques présents sur le milieu Sabouraud GC empêchent P. aeruginosa de croître, permettant ainsi le dénombrement spécifique de C. albicans. Des UFC de P. aeruginosa et de C. albicans ont parfois été observées sur le milieu BHI mais l’aspect des colonies étant très différent entre ces deux microorganismes, aucune confusion ne peut être faite. Concernant V. vermiformis, l’analyse de la viabilité a été réalisée par dénombrements des amibes sur cellule de Kova après dilution volume à volume de la suspension amibienne avec du bleu de Trypan à 0,4% (Merck, Darmstadt, Allemagne). Le bleu de Trypan est un colorant vital colorant les cellules mortes en bleu et ne colorant pas les cellules vivantes qui restent ainsi incolores.
8.3. Étude de l’effet préventif du calbenium© sur la formation du biofilm polymicrobien : approche prophylactique
Afin d’évaluer l’efficacité du calbenium© à prévenir la formation du biofilm polymicrobien, un système IGN Mag (Airel, Champigny-sur-Marne, France) a été raccordé au modèle dynamique décrit précédemment dès le 1er jour de fonctionnement du CBR. L’IGN mag a assuré l’approvisionnement en continu à 2% (v/v) en calbenium© dans le CBR ainsi que l’ionisation de cette solution. L’ensemble du modèle a fonctionné comme précédemment décrit (paragraphe 5 ; page 90) mis à part l’addition de calbenium© à 2% dans la suspension microbienne alimentant le CBR. Une condition contrôle a été réalisée en alimentant l’IGN Mag exclusivement en eau filtrée. La cinétique de développement du biofilm polymicrobien a été suivie durant une semaine de fonctionnement du CBR selon les mêmes méthodes de détachement du biofilm, d’ensemencement et de dénombrement que celles décrites précédemment (paragraphe 8.2 page 93). Après la stagnation du week-end, l’effet du traitement (ou de la purge en eau pour la condition contrôle) sur le biofilm polymicrobien a été évalué après le tout premier cycle de fonctionnement du modèle
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(le 1er cycle de 30 min) de la journée mais également à la fin de la journée, après le dernier cycle de fonctionnement du modèle. Ces conditions ont pour but d’évaluer l’impact d’un seul et de plusieurs cycles de circulation du traitement (ou uniquement d’eau dans le cas de la condition contrôle) sur le biofilm. La Figure 28 résume la chronologie de cette étude.
CBR-IGN Mag : cinétique du biofilm
Ensemencements : - avant remise en Stagnation route du modèle Lundi au Ensemencement Aucun Lundi du week- - après le 1er cycle vendredi quotidien ensemencement suivant end de la journée - après le dernier cycle de la journée
© Figure 28 Chronologie de l’étude de l’effet préventif du calbenium sur la formation du biofilm polymicrobien
8.4. Analyse de l’épaisseur du biofilm par imagerie à fluorescence
Après une semaine de fonctionnement du modèle CBR couplé au système IGN Mag versus CBR seul (soumis au traitement prophylactique versus condition contrôle), les coupons ont été retirés du CBR afin d’étudier l’architecture du biofilm formé par microscopie à fluorescence.
L’épaisseur du biofilm relative à la présence de P. aeruginosa a été comparée entre les coupons n’ayant subi aucun traitement (condition contrôle, CBR seul) ; les coupons ayant été traités pendant 15 min à une concentration de 2% en Calbenium© (CBR seul puis traitement de 15 minutes) ; et les coupons ayant subi le traitement préventif à 2% en Calbenium© dès le premier jour de fonctionnement du modèle (CBR-IGN Mag). Pour cela, le kit PNA FISH (Peptide nucleic acid Fluorescence in situ hybridization) KT007© (AdvanDX, Vedbaek, Danemark) a été utilisé. Il s’agit d’un kit de marquage spécifique d’Escherichia coli et de P. aeruginosa.
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La fixation du biofilm présent sur les coupons a été réalisée pendant une nuit d’incubation à température ambiante en utilisant la solution de fixation du kit déposée à la surface des coupons, puis la fixation a été finalisée par une étape supplémentaire d’incubation à 80°C pendant 20 min dans un thermocycleur à lames (Biometra, Göttingen, Allemagne). Le reste de la procédure de marquage fluorescent a été réalisée suivant les instructions du fournisseur du kit. Les observations ont été réalisées avec un microscope à fluorescence Axio Observer A1 (Zeiss, France) équipé d’un apotome, d’un objectif à plan apochromatique 20X/0,8 et d’un filtre spécifique pour le marquage de P. aeruginosa (Filtre Zeiss, set 43). Sur chaque coupon, 5 emplacements de 0,15 mm² ont été analysés avec une projection en Z d’intervalle 1,2 µm (déterminé par le logiciel Zen, Zeiss, France). À cause de la surface striée des coupons, une analyse globale de l’épaisseur du biofilm sur l’ensemble des images recueillies n’est pas réalisable. Par conséquent, ces analyses ont été réalisées, en triplicat, en mesurant l’épaisseur du biofilm sur 5 fenêtres de 2,5 x 10-3 mm² (où les aires des coupons étaient planes) pour chacun des 5 emplacements de 0,15 mm².
9. Microscopie Electronique à Balayage (MEB)
Afin d’observer la structure des biofilms polymicrobiens à la surface des coupons dans les conditions d’études (contrôle, traitement curatif ou préventif) des observations en MEB ont également été réalisées.
Pour cela, une étape préliminaire de fixation a été nécessaire : les coupons ont été recouverts d’une solution de glutaraldéhyde à 2,5% pendant au moins 1 h à température ambiante puis lavés dans du tampon phosphate et rincés à l’eau distillée.
Les coupons ont ensuite été déshydratés par bains successifs avec des concentrations croissantes en acétone : - 2 fois 1 min dans un bain à 50% acétone - 50% eau distillée (v/v) - 2 fois 5 min dans un bain à 70% acétone - 30% eau distillée (v/v) 95 | P a g e
- 2 fois 15 min dans un bain à 90% acétone - 10% eau distillée (v/v) - 1 fois 15 min dans un bain à 100% acétone
Les coupons ont alors été soumis à dessiccation par la méthode en point critique : les cellules adhérées aux coupons ont été déshydratées en remplaçant l’acétone par du CO2 à l’état gazeux. Ce processus nécessite plusieurs étapes. En effet, l’acétone a été progressivement remplacé par du CO2 liquide. Une fois l’acétone totalement éliminé, la température a été augmentée jusqu’au point critique
(31°C, 73 bars) ; ce point correspond à la transition de phase du CO2. Le point critique a ensuite été dépassé et la température augmentée jusqu’à 42°C afin que le
CO2 présent dans la chambre de dessiccation soit uniquement dans son état gazeux : les cellules sont ainsi déshydratées. Finalement, le gaz a été éliminé lentement de la chambre de dessiccation afin de conserver intactes les structures cellulaires sous vide : la pression a pour cela été descendue progressivement jusqu’à 0, en gardant une température constante.
Avant l’observation, une dernière étape a été nécessaire : la métallisation. Celle-ci a pour but de rendre les échantillons conducteurs aux électrons et donc observables en MEB. Pour cela, les coupons ont été installés sur des petits plots métalliques à l’aide d’adhésif conducteur et de colle argentée. Ces montages ont ensuite été disposés dans un métalliseur (BalTec) afin de recouvrir les coupons d’une fine couche d’or par bombardement d’électrons en atmosphère d’argon sous vide. Une fois séchés, les coupons ont été observés (Jeol JSM 840A, Japan).
10. Étude de l’activité des désinfectants sur V. vermiformis en suspension
Les activités du calbenium©, du sterispray© et de l’oxygenal 6© sur V. vermiformis ont été évaluées en condition planctonique.
Pour cela, des suspensions de V. vermiformis à une concentration de 2 x 106 cellules/mL en eau filtrée à 22°C ont été réalisées. Puis, les suspensions amibiennes préparées ont été mises en contact pendant 15 minutes avec les différents
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désinfectants selon une gamme de concentration allant de 0 (condition témoin) à 5% v/v. Après les 15 minutes de contact, du thiosulfate de sodium a été ajouté en excès dans chacune des suspensions afin de stopper l’action du désinfectant. Puis, la viabilité des amibes a été évaluée par coloration vitale au bleu de Trypan en cellule de Kova comme décrit précédemment (paragraphe 8.2, page 93).
Pour tester l’influence de la présence de P. aeruginosa et de C. albicans sur la sensibilité de V. vermiformis aux traitements désinfecants en condition planctonique, P. aeruginosa et/ou C. albicans ont été mis en co-cultures avec V. vermiformis (2 x 106 cellules/mL) (Multiplicity of infection de 1) en eau filtrée à 22°C pendant 18 h avant d’effectuer les tests de viabilité de V. vermiformis selon la gamme de concentration décrite ci-dessus.
Pour tester l’influence de la salive, des tests identiques ont été réalisés en ajoutant 5% de salive artificielle aux différentes suspensions, co-cultures ou non.
11. Analyses statistiques
L’ensemble des tests statistiques a été réalisé à partir du site de traitement en ligne des données Biostatgv (http://marne.u707.jussieu.fr/biostatgv/). Des analyses par tests de Mann et Whithney ou Kruskal et Wallis ont été réalisées suivant les besoins.
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Résultats et Discussion
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Partie I Étude de la diversité microbienne des USD
1. Caractéristiques des USD étudiées
Les équipes dentaires interrogées dans le cadre de ces travaux ont été très réceptives à la problématique, très coopératives, très intéressées et en attente des résultats. Par soucis de lisibilité, les informations recueillies sont présentées individuellement (Tableaux XIX et XX) en fonction de l’origine publique ou privée des cabinets dentaires. Tableau XIX Données recueillies concernant les USD privées
Cabinets privés Unité 1 Unité 2 Unité 3
Unité de 7 ans, Unité de 12 ans, Date de mise en service Unité de 7 ans, © KAVO Primus PLANMECA de l’unité/modèle QUETIN PE 8 © © 1058 Prostyle Compact
Eau d’entrée : Filtre (n’ayant traitement /adoucisseur/ Aucun traitement Adoucisseur jamais été changé) filtre antimicrobien
Traitement continu à l’oxygenal 6© (0,02 % en H O Procédés chimiques de Traitement continu 2 2 Traitement continu soit 0,3 % v/v) + traitements /Produits/ au calbenium© (2 % au calbenium© (2 % choc Concentrations v/v) v/v) hebdomadaire de 45 min à 0,2 % en
H2O2 (3 % v/v)
Stérilisation après Stérilisation unique Stérilisation unique Stérilisation des PIR chaque patient quotidienne quotidienne
Deux Unique, quotidiennes : Purges quotidienne : le soir Aucune matin et soir pendant 5 min pendant 5 min
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Tableau XX Données recueillies concernant les USD dépendantes du CHU de Poitiers
Cabinets publics Unité 4 Unité 5 Unité 6 Unité 7
Date de mise en Unité de 12 Unité de 2 ans, Unité de 3 ans, Unité de 8 service de l’unité, ans, KAVO KAVO Primus KAVO Primus ans, KAVO modèle Systematica© 1058© 1058© Systematica©
Eau d’entrée : Aucun Aucun traitement/adoucisseur/ Aucun traitement Aucun traitement traitement traitement filtre antimicrobien
Traitement Traitement continu à continu à Traitement l’oxygenal 6© l’oxygenal 6© continu à Procédés chimiques de (0,02 % en H2O2 (0,02 % en H2O2 l’oxygenal 6© Aucun traitements/Produits/ soit 0,3% v/v) + soit 0,3% v/v) + (0,02 % en traitement Concentrations choc choc H O soit 2 2 hebdomadaire de hebdomadaire de 0,3 % v/v) 45 min à 0,2 % 45 min à 0,2 %
en H2O2 (3 % v/v) en H2O2 (3% v/v)
Stérilisation Stérilisation Stérilisation après Stérilisation après Stérilisation des PIR après chaque après chaque chaque patient chaque patient patient patient
Purges Aucune Aucune Aucune Aucune
L’ensemble des points investigués dans ces tableaux est susceptible d’interférer sur la qualité microbiologique des LUSD. D’après les informations recueillies, une hétérogénéité certaine a été observée entre les USD, témoignant finalement de la singularité de chaque cas. Ainsi, nous avons observé, par exemple, une stérilisation des PIR après chaque patient pour la totalité des USD publiques étudiées contrairement aux USD privées. Ceci peut s’expliquer par un accès plus aisé à la stérilisation des instruments dans un établissement hospitalier plutôt que dans un cabinet de ville. À l’inverse, le personnel des USD publiques ne réalise aucune purge des instruments contrairement à certains des professionnels du privé. Des différences ont également été observées concernant les procédures de traitements physique ou chimique, à la fois de l’eau venant alimenter les USD et de l’eau circulant au sein des USD. L’âge des USD varie également. Ainsi des 100 | P a g e
différences entre USD ont pu être observées entre un ou plusieurs des critères retenus, rendant ainsi les analyses quantitatives complexes mais cette variabilité reflète néanmoins la réalité du terrain.
2. Recherche ciblée de microorganismes
Au préalable des études par pyroséquençage, des analyses par PCR et qPCR ont été réalisées de façon à cibler la recherche de certaines espèces microbiennes dans les LUSD prélevées. Ont particulièrement été recherchés C. albicans, P. aeruginosa, Legionella spp., L. pneumophila, ainsi que V. vermiformis et A. castellanii. Ces microorganismes ont été ciblés car, d’après les données bibliographiques (6, 8, 10, 51, 53-55, 67, 77, 211-216), ils sont communément retrouvés dans les LUSD. De plus, nous souhaitions vérifier leur présence dans les échantillons prélevés afin de les utiliser ensuite comme modèle d’étude mimant des conditions proches de celles réellement retrouvées dans les cabinets dentaires. Et enfin, puisque certaines de ces espèces sont des pathogènes opportunistes pour l’Homme, il semblait intéressant de rechercher leur présence afin de mieux apprécier le risque infectieux associé. Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous.
2.1. Recherche de C. albicans
2.1.1. PCR C. albicans
Après migration sur gel d’agarose des produits de PCR 18S obtenus, aucune bande similaire à celle du témoin positif (taille attendue de 310 pb) n’a été observée sur le gel comme le montre la Figure 29, et ce, pour l’ensemble des prélèvements d’USD. Cette expérience n’a pas permis de mettre en évidence la présence d’ADN de C. albicans dans les prélèvements. La sensibilité de la qPCR étant supérieure à celle de la PCR et la qPCR permettant d’avoir une quantification de l’espèce recherchée, une recherche complémentaire de C. albicans par qPCR a été ralisée dans les échantillons.
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Marqueur de taille
1500 pb 1000 pb
500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb
Figure 29 Exemple d’un gel de migration de produits de PCR 18S C. albicans
2.1.2. qPCR C. albicans
Aucun des échantillons testés ne s’est révélé colonisé par C. albicans. A la fin de la qPCR, le seuil de fluorescence signant la détection des espèces recherchées n’a été atteint que pour les points de gamme du témoin C. albicans. Par conséquent, tout comme pour la PCR C. albicans, les résultats de la qPCR C. albicans n’ont pas permis de mettre en évidence la présence de cette espèce fongique dans les échantillons.
Peu de données sont disponibles dans la littérature sur la contamination fongique des USD comparativement à la contamination bactérienne. Néanmoins, le genre Candida et l’espèce C. albicans figurent parmi les contaminants fongiques classiquement retrouvés dans les LUSD (10, 217). Puisque C. albicans est une espèce commensale de l’Homme et qu’elle est notamment retrouvée au niveau buccal, nous nous attendions à en détecter dans les échantillons en sortie d’USD. Le caractère aléatoire des contaminations microbiennes des LUSD ainsi que celui de la composition de la flore buccale des patients peut expliquer l’absence de détection de C. albicans dans nos conditions : un nombre plus important d’USD échantillonnées
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aurait peut-être permis sa détection. De plus, il a été démontré que dans l’eau du réseau C. albicans ne survit pas plus de 192 heures (8 jours) (218). Ainsi, si la potentielle contamination des LUSD investiguées par C. albicans remontait à plus d’une semaine au moment de l’échantillonnage, il semblerait logique de ne pas en avoir détecté. Par ailleurs, C. albicans pourrait persister dans les LUSD au sein de biofilms. Cependant, nous n’avons pas directement prélevé de biofilm dans le cadre de ces travaux pour des raisons pratiques et techniques. En effet, cela aurait nécessité l’excision de portions de tubulures d’USD ce qui n’est pas réalisable en conditions d’utilisation des USD. Le relarguage périodique et inconstant des microorganismes à partir du biofilm dans les LUSD pourrait donc également expliquer le fait que nous n’avons pas détecté de levure C. albicans dans les prélèvements au moment des échantillonnages.
2.2. Recherche d’amibes libres
2.2.1. PCR amibienne
La présence d’amibes libres dans les prélèvements d’eaux d’USD a été observée dans 14 des 21 échantillons testés (Figure 30), ce qui représente 67% de prélèvements positifs. Parmi les prélèvements, respectivement 4/7 ; 4/7 et 6/7 étaient positifs à la présence d’amibes pour les conditions d’amont d’USD (IW : Incoming Water) ; de sortie d’USD après période de stagnation prolongée (OWS : Output Water after Stagnation) et de sortie d’USD en fin de journée d’activité (OWA : Output Water after Activity). Les espèces d’amibes libres Vermamoeba vermiformis et Acanthamoeba castellanii (taille du fragment amplifié attendu : 618 et 853 pb respectivement) étaient toutes deux présentes dans les échantillons étudiés mais V. vermiformis semblait plus fréquemment présente que A. castellanii. Ces 2 espèces amibiennes ont été ciblées car elles font partie des espèces d’amibes libres les plus communément retrouvées dans l’environnement hydrique (219). De plus, une qPCR amibienne a été réalisée afin d’évaluer quantitativement la colonisation amibienne totale des échantillons.
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Figure 30 Exemple d’un gel de migration de produits PCR 18S amibienne obtenu
2.2.2. qPCR amibienne
Les résultats quantitatifs obtenus sont présentés dans le Tableau XXI. Par qPCR la présence d’amibes libres a été détectée dans 18 des 21 échantillons. En condition IW (Incoming Water), les quantités d’amibes détectées variaient de « ND » à 0,70 x 10² copies de 18S amibien/mL d’eau filtrée, en condition OWS (Output Water Stagnation), elles variaient de 0,02 à 1,66 x 10² copies de 18S amibien/mL d’eau filtrée et en condition OWA (Output Water Activity), elles variaient de « ND » à 2,16 x 10² copies de 18S amibien/mL d’eau filtrée. Aucune différence significative (p>0.05) n’a été obtenue entre chacune des 3 conditions étudiées (IW, OWS et OWA).
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Tableau XXI Résultats de la qPCR Amibienne
x10² copies de 18S amibien/mL d’eau filtrée IW OWS OWA Unit 1 0,07 1,66 (±0,25) ND Unit 2 0,21 (±0,05) 0,06 (±0,02) 0,008 (±0,006) Unit 3 0,06 0,69 2,16 (±0,82) Unit 4 0,70 (±0,09) 0,32 (±0,15) 1,36 (±0,13) Unit 5 ND 0,02 (±0,02) 0,02 (±0,01) Unit 6 ND 0,04 (±0,01) 0,006 (±0,004) Unit 7 0,02 (±0,01) 0,41 (±0,10) 0,03 (±0,02)
ND : Non Détectable IW : Incoming Water ; OWS : Output water Stagnation ; OWA : Output Water Activity
Les amibes libres sont ubiquitaires des milieux aquatiques (219) et par conséquent fréquemment retrouvées dans les réseaux d’eau potable (220). Ainsi, nous nous attendions à observer la présence d’amibes libres dans les LUSD étudiées puisque les conditions leurs sont à priori favorables (9, 211). D’après les résultats, l’espèce V. vermiformis est régulièrement retrouvée dans les prélèvements des LUSD. De façon intéressante selon l’étude de Ji et al. (219), V. vermiformis serait l’une des espèces amibiennes les plus susceptibles de coexister avec les légionnelles. Ainsi, du fait d’un cas mortel de légionellose déjà rapporté dans la littérature due à l’exposition d’une patiente à des LUSD contaminée par L. pneumophila (77) et de par la capacité connue des légionelles à résister à la phagocytose amibienne (194, 203, 221), il paraissait intéressant de rechercher la présence de légionelles dans les échantillons.
2.3. Résultats des qPCR bactériennes
2.3.1. qPCR Legionella spp.
Les résultats obtenus pour la quantification de l’ensemble des espèces de légionelles retrouvées dans les prélèvements d’USD sont présentés dans le Tableau XXII. La quantitié de Legionella spp. détectée dans les échantillons variait de « ND »
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à 1,03 x 103 copies de 16S/mL d’eau filtrée. De plus, la présence de Legionella spp. a été détectée dans 13 des 21 conditions étudiées, principalement en conditions OWS et OWA. Une différence significative (p<0.05) a été observée entre la condition IW et chacune des conditions OW (OWS et OWA). Par contre, il n’y avait pas de différence significative (p>0.05) entre les conditions OWS et OWA. La présence de Légionelles apparait donc plus importante en sortie plutôt qu’en amont d’USD.
Tableau XXII Résultats de la qPCR Legionella spp.
Nombre de copies de 16S Legionella spp./mL eau filtrée IW OWS OWA Unit 1 ND 4,56 (±0,47) x10² ND Unit 2 0,41 (±0,16) x101 0,91 (±0,64) x101 3,36 (±1,71) x101 Unit 3 ND 2,04 (±0,57) x10² 1,03 (±0,16) x103 Unit 4 1,14 (±0,07) x10² 1,51 (±0,22) x10² 1,10 (±0,11) x10² Unit 5 ND 0,21 (±0,15) x101 0,16 (±0,07) x101 Unit 6 ND ND ND Unit 7 ND 7,48 (±7,2) x101 0,15 (±0,03) x101
ND : Non Détectable ; IW : Incoming Water ; OWS : Output Water Stagnation ; OWA : Output Water Activity.
2.3.2. qPCR Legionella pneumophila
En complément de la qPCR Legionella spp., une recherche spécifique de L. pneumophila a été réalisée par qPCR. Tous les échantillons testés sont négatifs pour la présence de L. pneumophila. On peut donc en conclure à une absence de L. pneumophila dans les USD testées.
Sur l’un des prélèvements (condition OWS de l’unité 4), des colonies de Legionella sp. ont été identifiées. Après envoi de la souche au Centre National de Référence des légionelles de Lyon pour identification, il s’agissait de l’espèce L. anisa. L. anisa fait partie des espèces de légionelles pouvant être pathogènes pour l’Homme (222, 223).
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De façon intéressante, en comparant les données obtenues entre les qPCR 18S amibienne et 16S Legionella spp., il semblerait y avoir une corrélation entre la présence de ces 2 microorganismes dans les LUSD. En effet, comme représenté sur la Figure 31, lorsque de fortes concentrations en amibes sont observées dans les échantillons, les concentrations observées en légionelles sont également importantes. Il semble donc y avoir une présence concomitante de ces 2 genres microbiens, probablement liée à la capacité des légionelles à survivre à la phagocytose amibienne (221), d’où la nécessité de disposer de traitements efficaces sur les amibes libres pour diminuer le risque infectieux associé aux LUSD.
Figure 31 Comparaison des données issues des qPCR 18S amibienne et 16S Legionella spp.
2.3.3. qPCR Pseudomonas aeruginosa
Les résultats obtenus pour la quantification de P. aeruginosa dans les prélèvements d’USD sont présentés dans le Tableau XXIII.
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Tableau XXIII Résultats de la qPCR P. aeruginosa
UG de P. aeruginosa/mL d’eau filtrée IW OWS OWA Unit 1 ND 2,45 x101 ND Unit 2 ND ND ND Unit 3 ND 7,62 (±0,16) x104 2,75 (±0,07) x104 Unit 4 ND ND ND Unit 5 ND ND ND Unit 6 ND 1,55 x101 8,55 Unit 7 ND ND ND
ND : Non Détectable. UG : Unité Génmique ; IW : Incoming Water ; OWS : Output Water Stagnation ; OWA : Output Water Activity.
Les résultats ont montré que la présence de P. aeruginosa est inconstante au sein des USD étudiées et qu’elle peut atteindre des proportions importantes (104 UG/mL) dans ces réseaux d’eau. L’hypothèse envisagée est la présence inconstante de P. aeruginosa au sein des biofilms développés dans les LUSD. Là encore, l’hétérogénéité des résultats et donc la singularité des communautés bactériennes de chaque USD est mise en avant.
3. Analyse par pyroséquençage de la diversité bactérienne des LUSD
L’objectif consistait à évaluer de manière quantitative et exhaustive la population bactérienne retrouvée dans les LUSD depuis l’approvisionnement en eau des USD (la condition IW), jusqu’à la sortie de l’USD (les conditions OWS et OWA). Ce travail a fait l’objet d’un article récemment publié dans Water Research (224). Cet article se trouve à la suite de cette introduction. Les résultats de cette étude ont montré une grande diversité et densité bactérienne en sortie d’USD. La composition de la communauté bactérienne évolue tout au long du trajet de l’eau dans l’USD. La stagnation d’eau sur une période prolongée apparaît critique sur la modification de la composition bactérienne suggérant l’influence du biofilm développé dans les LUSD.
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La composition du microbiome commun aux LUSD a été décrite. La présence en proportions non négligeables de genres bactériens d’intérêt en santé humaine a été observée, comme Pseudomonas, Legionella, ou encore des genres considérés comme incluant des pathogènes émergents tels que Mycobacterium, Propionibacterium… Ainsi, ces travaux apportent à la communauté scientifique une meilleure connaissance des populations bactériennes retrouvées dans les LUSD ainsi que la mise en évidence de certaines espèces pathogènes opportunistes pour l’Homme (en proportions importantes). Ces résultats vont contribuer à une meilleure appréhension du risque infectieux associé aux USD.
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Article 1
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3.1. Article : Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in dental unit waterlines
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3.2. Résultats complémentaires publiés
Les données présentées ici correspondent aux résultats complémentaires (« supplemental data ») associés à l’article paru dans Water Research présenté ci- dessus.
3.2.1. Table S1 : caractéristiques physico-chimiques de l’eau municipale de Poitiers
Ce premier tableau détaille les paramètres physico-chimiques du réseau d’eau municipal de Poitiers au moment de la réalisation des prélèvements.
Table S1: Physico-chemical characteristics of the municipal water system of Poitiers (France), corresponding to the incoming water (IW). Data were collected from the Regional Health Agency of Poitou-Charentes website at each DUW sampling date (http://www.ars.poitou-charentes.sante.fr/Derniers-resultats-de-qualite.117124.0.html).
Incoming water (IW)
Parameter Value
Ammonium (NH4) < 0.01 mg/L
Total aluminium < 30 µg/L
Free chlorine 0.26 (±0.11) mg/L
Total chlorine 0.35 (±0.13) mg/L
Conductivity (25°C) 563.00 (±5.94) µS/cm
Nitrate (NO3) 45.00 (±2.68) mg/L
Water temperature (°C) 14.00 (±3.45)
Turbidity (NFU) 0.18 (±0.13)
pH 7.70 (±0.07)
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3.2.2. Table S2 : paramètres bioinformatiques du pyroséquençage
Ce second tableau détaille les paramètres bioinformatiques utilisés pour l’analyse des données issues du pyroséquençage.
Supplementary material 2:
Table S2: Bioinformatic parameters and databases used in the analysis of pyrosequencing results.
Step Description Parameter Preprocessing Minimum length threshold 300 Number of ambiguities tolerated 0 Detection of proximal primer sequence Complete and perfect Detection of distal primer sequence Complete and perfect Random selection Same high-quality reads for each sample Yes Clustering Chosen level of similarity (%) 95 Ignoring differences in homopolymer lengths Yes Filtering Chosen clustering similarity threshold 95 Used taxonomic database SILVA (r114) Chosen taxonomic level Phylum Taxonomy Used taxonomic database SILVA (r114) Method or tool of comparison USEARCH Similarity or confidence threshold (%) 80 Analysis Chosen level of similarity (%) 95 Ignoring differences in homopolymer lengths Yes Computation of a UNIFRAC distance matrix Yes
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3.2.3. Table S3 : caractère pathogène des espèces bactériennes détectées
Ce tableau rapporte les références retrouvées dans la littérature scientifique permettant de classer certaines des espèces bactériennes détectées dans les prélèvements d’eau des USD comme pathogènes opportunistes pour l’Homme.
Table S3: Potential human pathogenic bacteria identified in DUW. Only references related to human described infections published in the Pubmed database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) over the last decade are presented.
Species References over the last 10 years Acinetobacter lwoffi (225, 226) Bacillus cereus (227-231) Corynebacterium accolens (232, 233) Dolosigranulum pigrum (234, 235) Micrococcus luteus (236, 237) Mycobacterium abscessus/chelonae (238-243)
Mycobacterium gordonae (244-250) Neisseria perflava No recent publication Novosphingobium aromaticivorans (251, 252) Propionibacterium acnes (253-257) Propionibacterium granulosum (258, 259) Pseudomonas aeruginosa (95, 130, 132, 135, 228, 260-267) Pseudomonas peli No recent publication Shewanella algae (268-274) Stenotrophomonas maltophilia (67, 275-283) Streptococcus mitis (284-289) Streptococcus oralis (284)
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3.2.4. Table S4 : liste exhaustive des genres bactériens détectés
Ce tableau volumineux détaille de manière exhaustive l’ensemble des genres bactériens détectés dans les prélèvements d’USD en fonction des 3 points d’investigation (IW, OWS et OWA) et précise respectivement le nombre de séquences détectées correspondantes.
Table S4: List of all the genera detected in the three water groups by 454 pyrosequencing.
IW OWS OWA PHYLUM CLASS GENUS (count) (count) (count) Acidobacteria Bryobacter Bryobacter 0 1 0 Holophagae Holophaga 23 63 5 Solibacteres Candidatus Solibacter 0 6 0 Acidimicrobidae Iamia 0 1 1 Actinobacteridae Actinomyces 6 3 0 Corynebacterium 139 56 27 Geodermatophilus 0 4 2 Micrococcus 3 0 6 Mycobacterium 1075 1228 4780 Nocardia 11 0 0 Nocardioides 4 1 0 Propionibacterium 3841 1092 621 Rothia 32 28 9 Streptomyces 0 1 0 Tsukamurella 0 2 0 Actinoallomurus 28 2 1 Actinomycetospora 0 0 4 Aeromicrobium 0 1 0 Aestuariimicrobium 3 0 0 Agromyces 0 1 0 Alpinimonas 1 0 0 Arthrobacter 13 5 36 Brevibacterium 3 1 0 Candidatus Rhodoluna 0 0 3 Clavibacter 6 0 0 Curtobacterium 14 0 1 Dietzia 125 54 19 Friedmanniella 7 0 0 Frigoribacterium 4 0 4 Frondihabitans 18 0 0 Gordonia 4 3 10 Kribbella 6 0 0
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Leucobacter 0 0 5 Microbacterium 22 3 2 Microlunatus 5 3 0 Modestobacter 1 8 1 Plantibacter 1 3 0 Rhodococcus 18 0 2 Thermobispora 1 0 1 Rubrobacteridae Gaiella 0 4 1 Armatimonadetes Chthonomonadetes Chthonomonas 0 25 32 Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroides 22 2 11 Porphyromonas 6 0 2 Prevotella 98 13 16 Anaerophaga 76 19 28 Barnesiella 250 878 699 Dysgonomonas 9 0 0 Paludibacter 0 0 2 Proteiniphilum 11 0 0 Cytophagia Arcicella 1 0 11 Candidatus Amoebophilus 0 6 0 Cytophaga 0 0 2 Dyadobacter 0 11 173 Emticicia 1 0 1 Flexibacter 58 116 131 Hymenobacter 2 2 3 Leadbetterella 1 0 0 Runella 2 1 1 Sporocytophaga 3 1 0 Flavobacteriia Chryseobacterium 23 11 1 Wautersiella 0 0 2 Cloacibacterium 20 2 1 Flavobacterium 83 9 14 Fluviicola 0 0 12 Owenweeksia 0 27 2 Sphingobacteriia Chitinophaga 1 0 0 Ferruginibacter 8 67 3 Flavihumibacter 1 0 0 Lacibacter 2 29 9 Lewinella 2 0 0 Niastella 0 1 0 Parasegetibacter 0 0 47 Pedobacter 11 0 1 Sediminibacterium 31 183 146 Solitalea 0 1 0 Sphingobacterium 4 0 2 Terrimonas 7 0 3
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Chlamydiae Chlamydiales Chlamydia 10 13 4 Neochlamydia 1 8 0 Candidatus Metachlamydia 0 0 2 Candidatus Rhabdochlamydia 60 564 90 Chlorobi Chlorobia Chlorobium 2 2 5 Chlorochromatium Chlorochromatium Chlorochromatium 457 14 71 Chloroflexi Caldilineae Caldilinea 0 3 0 Cyanobacteria Nostocales Nostoc 0 1 0 Deinococcus- Thermus Deinococci Deinococcus 0 0 1 Euryarchaeota Methanobacteria Methanobrevibacter 0 0 1 Fibrobacteres Fibrobacterales Fibrobacter 1 0 0 Firmicutes Bacilli Aerococcus 33 2 3 Alloiococcus 0 1 0 Bacillus 620 179 117 Enterococcus 8 5 1 Gemella 14 0 8 Granulicatella 14 14 0 Staphylococcus 275 59 109 Streptococcus 290 80 41 Aeribacillus 0 1 0 Alicyclobacillus 0 1 0 Aneurinibacillus 0 0 1 Anoxybacillus 0 3 1 Brevibacillus 7 9 3 Brochothrix 12 0 1 Cohnella 0 0 1 Dolosigranulum 70 1 9 Exiguobacterium 0 1 0 Geobacillus 5 0 1 Jeotgalicoccus 0 1 0 Lactobacillus 19 6 3 Lactococcus 2 0 0 Oceanobacillus 0 2 0 Paenibacillus 21 21 21 Planifilum 7 0 1 Planococcus 1 1 2 Planomicrobium 1 0 1 Thermoactinomyces 15 0 2 Thermoflavimicrobium 0 1 0 Tumebacillus 0 1 1 Viridibacillus 1 0 0 Clostridia Clostridium 219 243 101 Acetivibrio 0 0 1
125 | P a g e
Acetobacterium 33 0 1 Alkaliphilus 15 46 3 Anaerococcus 36 11 14 Anaerofilum 1 0 2 Anaerostipes 33 0 6 Blautia 6 1 0 Butyricicoccus 121 7 15 Christensenella 0 4 6 Coprococcus 0 0 1 Coprothermobacter 15 0 1 Dehalobacter 0 5 0 Desulfitobacterium 1 0 1 Desulfosporosinus 36 101 368 Eubacterium 9 0 1 Finegoldia 1 3 1 Gelria 0 11 4 Geosporobacter 14 0 0 Halarsenatibacter 2 2 2 Halocella 3 0 0 Johnsonella 0 7 3 Lachnospira 1 0 0 Lutispora 6 11 5 Moryella 0 0 1 Oribacterium 1 1 0 Oscillibacter 12 0 6 Papillibacter 0 0 1 Pelospora 0 8 7 Peptoniphilus 13 6 4 Pseudobutyrivibrio 8 0 0 Roseburia 0 0 21 Ruminococcus 0 0 3 Sedimentibacter 0 0 2 Subdoligranulum 1 0 0 Syntrophaceticus 3 2 0 Syntrophomonas 0 133 1 Thermincola 0 3 0 Erysipelotrichia Erysipelothrix 4 3 0 Negativicutes Veillonella 35 29 4 Anaerosinus 13 0 0 Anaerospora 0 7 0 Pelosinus 0 3 0 Pelosinus 0 2 1 Thermolithobacteria Thermolithobacter 0 6 9 Gemmatimonadetes Gemmatimonadales Gemmatimonas 14 29 17 Nitrospirae Nitrospirales Leptospirillum 0 1 1 126 | P a g e
Nitrospira 4 20 5 Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaera 8 66 35 Planctomycetia Blastopirellula 0 1 0 Candidatus Scalindua 3 0 0 Gemmata 26 34 16 Pirellula 20 4 4 Planctomyces 6 32 7 Rhodopirellula 0 1 1 Singulisphaera 0 1 9 Zavarzinella 4 0 1 Proteobacteria Alphaproteobacteria Brevundimonas 15 19 9 Rhodoplanes 11 7 1 Rickettsia 12 20 4 Roseomonas 1 3 0 Sphingomonas 949 2366 986 Afipia 43 45 147 Altererythrobacter 3 3 0 Azospirillum 1 0 0 Belnapia 0 2 0 Blastomonas 269 482 749 Bosea 41 72 21 Bradyrhizobium 313 174 139 Candidatus Captivus 1 9 3 Candidatus Neoehrlichia 0 1 0 Caulobacter 48 16 58 Cohaesibacter 1 0 0 Defluviicoccus 19 36 28 Devosia 2 0 1 Dongia 17 57 378 Erythrobacter 86 101 36 Filomicrobium 0 1 1 Haematobacter 0 0 1 Hirschia 0 0 1 Holospora 27 148 150 Hyphomicrobium 83 173 154 Inquilinus 3 0 0 Kaistobacter 1 0 0 Loktanella 0 1 0 Maricaulis 1 3 1 Meganema 0 1 0 Methylobacterium 418 95 26 Methylovirgula 7 0 0 Nitrobacter 0 0 1 Novispirillum 0 2 0 Novosphingobium 650 237 75
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Ochrobactrum 12 1 0 Paracoccus 23 24 17 Parvibaculum 5 5 0 Parvularcula 15 514 61 Pedomicrobium 6 20 0 Pelagibius 1 20 1 Phenylobacterium 68 162 46 Phyllobacterium 0 0 2 Porphyrobacter 36 618 389 Rhizobium 22 20 6 Rhodobacter 20 14 8 Rhodobium 2 0 0 Rhodopila 0 1 0 Rhodospirillum 3 0 0 Rhodovulum 3 1 0 Roseovarius 6 0 0 Rubellimicrobium 0 6 0 Rubribacterium 0 1 0 Sandarakinorhabdus 0 1 0 Skermanella 0 5 0 Sneathiella 1 0 0 Sphingobium 628 2019 1986 Sphingopyxis 1353 315 418 Thioclava 10 11 1 Tistlia 0 1 0 Wolbachia 14 0 0 Woodsholea 0 0 1 Zymomonas 4 6 1 Betaproteobacteria Alcaligenes 1 0 0 Burkholderia 0 16 24 Neisseria 76 19 12 Achromobacter 9 26 33 Acidovorax 12 725 55 Actimicrobium 0 1 0 Aquabacterium 152 160 96 Azoarcus 1 2 1 Azospira 8 22 7 Caenimonas 0 0 11 Candidatus Nitrotoga 0 0 1 Comamonas 4 9 7 Curvibacter 76 6 5 Dechloromonas 0 20 1 Delftia 0 2 1 Denitratisoma 1 0 1 Derxia 11 1 21
128 | P a g e
Diaphorobacter 3 0 0 Gallionella 0 75 13 Herbaspirillum 2 0 1 Hydrogenophaga 317 2 19 Ideonella 1 2 22 Inhella 1 0 2 Janthinobacterium 18 44 11 Leptothrix 1 2 0 Limnobacter 0 0 3 Limnohabitans 21 11 1 Massilia 55 13 17 Methylibium 0 6 1 Methylophilus 9 0 0 Methylotenera 10 0 2 Methyloversatilis 32 48 5 Mitsuaria 4 0 0 Paucibacter 27 1 7 Paucimonas 3 1 0 Pelomonas 4 1 11 Piscinibacter 14 0 2 Polaromonas 1 7 3 Polynucleobacter 16 0 4 Pseudorhodoferax 35 3 5 Ralstonia 8 19 14 Rhizobacter 172 136 59 Rhodoferax 0 2 2 Roseateles 2 0 0 Sideroxydans 0 5 2 Simonsiella 1 0 0 Simplicispira 1 2 0 Sphaerotilus 9 0 2 Sterolibacterium 1 80 16 Sulfuritalea 0 1 5 Telluria 1 2 0 Tepidicella 1 0 0 Tepidimonas 9 0 8 Thauera 5 4 1 Thiobacillus 0 5 0 Undibacterium 450 83 211 Variovorax 53 34 17 Xylophilus 1 0 1 Zoogloea 1 0 0 Deltaproteobacteria Geothermobacter 0 1 1 Anaeromyxobacter 0 10 1 Archangium 0 0 1
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Bdellovibrio 1 31 2 Candidatus Entotheonella 1 1 0 Candidatus Magnetoglobus 1 14 8 Cystobacter 0 2 2 Desulfobacterium 0 0 1 Desulfobulbus 0 1 0 Desulfocapsa 0 4 4 Desulforhopalus 1 0 0 Desulfovibrio 1 0 0 Desulfurivibrio 10 13 1 Desulfuromonas 0 36 1 Geoalkalibacter 0 0 2 Geobacter 2 91 11 Haliangium 0 3 2 Nannocystis 0 8 0 Pelobacter 0 13 3 Smithella 1 0 0 Sorangium 4 0 0 Vampirovibrio 34 14 0 Epsilonproteobacteria Sulfurimonas 0 1 0 Sulfurospirillum 6 0 3 Sulfurovum 0 4 0 Gammaproteobacteria Acinetobacter 138 86 214 Aeromonas 2 0 3 Coxiella 106 36 21 Cronobacter 0 3 0 Enterobacter 13 1 0 Haemophilus 110 13 21 Halomonas 4213 832 3955 Legionella 140 1501 177 Pantoea 1 0 14 Pseudomonas 904 517 453 Salmonella 4 0 0 Shewanella 1873 418 1938 Shigella 1 0 0 Stenotrophomonas 8 2079 691 Acidiferrobacter 0 11 2 Aggregatibacter 2 0 0 Alkanibacter 2 0 0 Alkanindiges 7 0 2 Aquicella 2 8 12 Arenimonas 19 0 1 Beggiatoa 1 8 2 Cellvibrio 3 0 0 Chromohalobacter 0 1 0
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Citrobacter 0 0 10 Cycloclasticus 0 1 0 Diplorickettsia 4 3 0 Dokdonella 0 0 3 Enhydrobacter 226 277 177 Gallibacterium 1 0 0 Granulosicoccus 3 13 1 Hydrocarboniphaga 11 0 0 Luteibacter 0 2 2 Lysobacter 0 6 0 Marichromatium 0 9 0 Marinobacter 0 4 0 Marinospirillum 0 1 0 Methylobacter 0 1 0 Methylohalomonas 83 167 99 Methylomicrobium 1 0 0 Methylosoma 0 2 0 Microbulbifer 10 1 1 Moritella 11 6 0 Nevskia 32 63 0 Nitrosococcus 33 30 38 Perlucidibaca 11 5 7 Photobacterium 2 0 0 Piscirickettsia 2 2 0 Proteus 6 0 0 Pseudospirillum 1 0 0 Pseudoxanthomonas 61 0 0 Psychrobacter 0 0 8 Raoultella 0 5 0 Rheinheimera 3 0 2 Rhodanobacter 0 3 0 Rickettsiella 0 3 17 Rugamonas 3 0 1 Salinisphaera 1 32 10 Steroidobacter 0 0 13 Thermomonas 1 7 2 Thioalkalispira 56 1486 507 Thioalkalivibrio 1 0 0 Thiohalobacter 2 6 2 Thiohalocapsa 0 1 1 Thiohalomonas 0 0 1 Thiomicrospira 0 6 8 Thiorhodospira 0 1 0 Xanthomonas 3 16 4 Spirochaetes Spirochaetales Leptospira 1 4 2 131 | P a g e
Verrucomicrobia Opitutae Opitutus 0 20 11 Verrucomicrobiae Pedosphaera 3 11 9 Prosthecobacter 7 2 4 Bacteria Bacteria Unclassified 100 1157 1135 Bacteria Bacteria Unknown 891 459 586
3.2.5. Table S5 : résultats de la qPCR Legionella spp.
Enfin, ce dernier tableau détaille les résultats de la qPCR Legionella spp. (qui ont d’ailleurs déjà été rapportés plus haut dans cette thèse, sous une autre forme, dans la section 2.3.1 page 106).
Table S5: Variation of log 16S rDNA Legionella spp. copies/L of water (estimated by qPCR) from the seven dental units according to the water groups: IW, OWS and OWA.
Legionella spp qPCR was set up using the primers Lspp 140F and Lspp 140R that amplified a 140-bp fragment, as described by Dutil et al. (2007). Standard curve was obtained with serial dilutions of a standard sample containing a 1500 pb fragment of the 16S rRNA gene from L. pneumophila Lens amplified using a 27F-1492R primers set (199), at concentrations ranging from 102 to 106 gene copies/μl.
Dental Units (N=7)
Log 16S rDNA Legionella spp. IW OWS OWA /L of water n % n % n %
≤ 4 6 85.7 3 42.9 4 57.1
4-5 - - 1 14.3 1 14.3
5-6 1 14.3 3 42.9 1 14.3
>6 - - - - 1 14.3
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3.3. Résultats complémentaires non encore publiés
Différentes approches ont été réalisées en terme d’analyses et de représentations graphiques des données obtenues à l’issue du pyroséquençage. Les Figures 32 et 33 montrent une représentation des données du pyroséquençage plus imagée que celle présentée dans l’article paru dans Water Research. Sur la Figure 32 sont représentées chacune des 21 conditions de l’étude (IW, OWS et OWA des 7 USD). De surcroit, cette représentation fait apparaitre les inter-relations entre les conditions IW, OWS et OWA. En effet, chaque point (ou nœud) de couleur correspond à l’une des 7 répétitions des conditions IW (jaune), OWS (rouge) et OWA (bleu) respectivement. Chaque point blanc désigne une OTU (Operational Taxonomic Unit ou Unité Taxonomique opérationelle) ; rappelons que chaque OTU correspond à une espèce bactérienne d’un point de vue taxonomique. Les différents liens correspondent à la répartition des différentes OTUs présentes dans chacune des conditions étudiées. Plus les nœuds sont proches les uns des autres, plus la composition bactérienne globale des conditions associées est proche. Cette représentation témoigne de la grande complexité de l’organisation bactérienne des USD. La proximité des points d’IW, contrairement à la répartition plus éparse des conditions d’OW (OWS et OWA), suggère une composition de la communauté bactérienne proche entre les conditions IW contrairement aux conditions d’OW. Cependant, l’un des points jaunes représentant les conditions IW est très éloigné des autres points jaunes suggérant une communuauté bactérienne très éloignée de celles des autres conditions IW. Là encore, cela témoigne de la singularité de la communauté bactérienne en sortie de chaque USD.
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Figure 32 Représentation cytoscape de la composition bactérienne des USD. IW (jaune) ; OWS (rouge) ; OWA (bleu)
La Figure 33 permet de préciser la représentation cytoscape de la Figure 32 selon les trois conditions d’eau étudiées (IW, OWS et OWA). En effet, cette Figure 33 nous permet d’apprécier la similarité entre les sept populations bactériennes respectives de chacune des conditions étudiées (IW, OWS et OWA) en observant la distance entre chaque nœud mais aussi les OTUs spécifiques ou communes à chaque condition étudiée (représentées respectivement par les branches orientées vers l’extérieur ou vers le centre sur ce type de représentation). Là aussi, les populations bactériennes de la condition d’IW semblent proches les unes des autres sauf pour l’une des USD étudiée. A l’inverse, les conditions d’OW (OWA et OWS) semblent avoir des populations bactériennes plus diversifiées les unes des autres. Ce type de représentation permet d’apprécier rapidement la similitude ou l’hétérogénéité des compositions bactériennes entre des conditions de prélèvements
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similaires. De plus, il est possible de sélectionner (sur le logiciel ayant permis cette représentation graphique) chacune des OTUs représentées sur ces graphiques et donc de savoir à quelle espèce bactérienne elle correspond.
IW OWS
OWA Figure 33 Représentations cytoscape des conditions d'IW,
d'OWS et d'OWA de l’ensemble des 21 prélèvements d’USD
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4. Densité et diversité des communautés bactériennes et fongiques des LUSD soumises à des produits désinfectants
L’objectif de cette étude était d’évaluer l’impact des traitements désinfectants (oxygenal 6© et calbenium©) sur les communautés bactériennes et fongiques des LUSD en conditions réelles d’utilisation, sur des USD âgées de 8 à 12 ans. Comme pour la précédente étude, la composition de la communauté microbienne a été suivie depuis l’amont de l’USD (IW) jusqu’à la sortie de l’USD, après la période de stagnation prolongée du week-end (OWS) ou en fin de journée d’activité (OWA). Les données ont été obtenues par approche de microbiologie conventionnelle (dénombrement d’UFC), qPCR mais aussi par pyroséquençage bactérien et fongique. L’ensemble des résultats a montré une incapacité à atteindre la qualité microbiologique de l’eau recommandée par l’ADA en sortie d’USD, alors même que les USD étudiées étaient traitées chimiquement pendant la période des prélèvements. L’efficacité des traitements est apparue variable d’une USD à une autre. La contamination microbienne de l’eau de sortie des USD s’est avérée dépendante de multiples paramètres comme la stagnation d’eau, les rétro- contaminations ou encore la qualité microbiologique de l’eau alimentant les USD. L’influence de la stagnation d’eau a été critique sur la composition et la concentration microbienne en sortie d’USD, même si, un traitement choc avant la stagnation du weekend est apparu bénéfique pour limiter cette contamination. Les biofilms semblent donc largement influencer la composition microbienne en sortie d’USD. Là encore, des genres d’intérêt en santé humaine sont présents en quantité importante en sortie d’USD comme par exemple Propionibacterium, Legionella, Stenotrophomonas, Candida… Une persistance des espèces décrites comme résistantes aux traitements a également été observée, suggérant l’importance de modifier les conditions d’utilisation ou d’alterner les traitements chimiques afin d’en optimiser l’efficacité sur le long terme et donc de limiter le risque infectieux associé aux USD.
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Article 2
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4.1. Article en cours de soumission : Bacterial and fungal communities density and diversity in dental unit waterlines (DUWL) subjected to disinfectants
Bacterial and fungal communities density and diversity in dental unit waterlines
(DUWL) subjected to disinfectants
Damien Costa1,2*, Anne Mercier1,3, Kevin Gravouil3, Jérôme Lesobre4, Julien Verdon1,
Christine Imbert1,5
a. Equipe Microbiologie de l’Eau, Ecologie et Biologie des Interactions, Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7267, Université de Poitiers, Poitiers, France b. Service de Bactériologie et d’Hygiène hospitalière, CHU de Poitiers, Poitiers, France c. Laboratoire coopératif ThanaplastSP-Carbios Bioplastics, Ecologie et Biologie des Interactions, Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7267, Université de Poitiers, Poitiers, France d. Université Blaise Pascal, UMR CNRS 6023, Laboratoire Microorganismes : Génome et Environnement, 24 avenue des Landais, Aubière, France e. Faculté de Médecine et de Pharmacie de Poitiers, Poitiers, France
*corresponding author, Equipe Microbiologie de l’Eau, Ecologie et Biologie des Interactions, Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7267, Université de Poitiers, UFR SFA, Pôle Biologie Santé, 1 rue Georges Bonnet, bât B37, 86073 Poitiers, cedex 9, France E-mail address: [email protected], phone: +33 (2); fax:+33(2) 38 64 40 22
ABSTRACT
Chemical disinfectants are advocated to reduce the microbial contamination in dental unit waterlines (DUWL). However, until now their efficacy has been poorly examined in real conditions after long-term treatments. In this study, the microbial community from three
DUWL treated with Calbenium© or Oxygenal 6© was investigated during routine dental practice. Water was collected from the tap water supplying units to the output exposure point of the turbine handpiece following a stagnation or an activity period. For the first time in this context, both bacterial and fungal diversities were investigated using 454 high-throughput 138 | P a g e
pyrosequencing. Results showed that the microbial contamination remained relevant in the output water from all studied DUWL. Water stagnation, DU maintenance practices and quality of water supplying DU were critical to the microbial contamination of DUWL. The occurrence of potentially pathogenic bacteria and fungi in spite of routine chemical treatments, suggest different susceptibilities of microbial genera to treatment and a potential associated infectious risk. Results also suggest that a disinfectant shock before a prolonged stagnation period was effective to limit the microbial proliferation inside DUWL.
Consequently, it may be displayed as recommendation of reliably improving the quality of
DUWL output water. Necessity to proceed to regular water quality control of DUWL was also highlighted.
Keywords: dental unit waterlines (DUWL), water contamination, disinfection, Oxygenal 6©,
Calbenium©, microbial diversity, pyrosequencing,
Introduction
Dental unit water lines (DUWL) provide an environment conducive to microbial attachment and biofilm formation (9, 10, 83, 290). DUWL are predominantly colonized by environmental microorganisms including bacteria, fungi and protozoa. However, some microorganisms commonly found in the oral cavity, such as oral streptococci, or on skin, such as
Staphylococcus aureus, have also been identified in DUWL (14, 224, 291, 292). This suggests various origins from microbial contamination: microorganisms can be provided by the water supplying the dental chair unit, or through the suck-back of biological fluids from oral cavity of patients resulting of a malfunction of antiretraction devices; finally, the continuous biofilm detachment or fragmentation also participates in this contamination (5, 6, 215, 293).
Consequently, many studies are focused on microbial contamination of DUWL (9, 49, 53, 55, 139 | P a g e
292). However, infections associated with this contamination are rarely reported (74, 77) maybe because of the difficulty to prove the DUWL exposure as the origin of the infection or the usually limited clinical significance that do not result in case reports. Thus, infections related to contaminated dental output water may be more frequent than the number of corresponding case-reports. In fact, both patients and dental staff are regularly exposed to this infectious risk due to inhalation of aerosol produced during dental cares. Additionally Dental
Unit Water (DUW) may be ingested or may contaminate surgical wounds. Moreover, the quality of DUW is of importance since vulnerable patients (elderly, diabetics, immune- compromised patients...) are increasingly frequent. The assessment of risks related to DUW is taken into account in guidelines from governmental agencies such as the American Dental
Association (ADA) and/or the Center for Disease Control and Prevention (CDC), and the current recommendation is that the dental output water as water delivered to Dental Unit (DU) be kept at or below existing standards for potable drinking water, i.e. with aerobic heterotrophic microbial density inferior to 500 CFU per mL (colony forming units per milliliter; American Dental Association, (1, 294). Nevertheless, in France as in most
European countries, no standard defines the microbial quality of the dental output water delivered to patients.
Common approaches recommended to reduce microbial contamination in DUWL output water include non-chemical methods such as the use of microbial filters and/or anti-retraction valves, the achievement of regular flushing of DUWL or the sterilization of handpieces (6, 15,
295, 296). In addition, an efficient way to reduce microbial contamination and control biofilms in DUWL is the use of chemical treatments, especially based on hydrogen peroxide and silver ions, chlorine dioxide, chlorhexidine, peracetic acid or citric acid (66, 67). These agents can be used intermittently (e.g. daily or once to twice weekly) or continuously in
DUWL supply water (6). A number of studies evaluated the efficacy of chemical agents to 140 | P a g e
control the microbiological water quality inside DUWL on laboratory models, few ones were performed in real practise conditions after long-term exposure. The aim of this study was to investigate the bacterial and fungal communities in DUWL treated with a disinfectant in real conditions, in actual daily working dental units and according to the flow from the water supply (incoming water) to the outer exposure point (output water). This study focused on
DUWL subjected to Calbenium© or Oxygenal 6©, two disinfectants commonly used by French dentists, for which no or a limited number of studies were reported (66, 67, 297).
Currently, a disinfectant efficacy is evaluated based on its properties to reduce the microbial contamination using a plate count approach (American Dental Association, 2012). Here, microbial abundance was estimated by quantitative PCR. Moreover, a concurrent characterization of both bacterial and fungal community composition was performed using a
454 high-throughput pyrosequencing approach. These data should help to reduce the risk of exposure of both patients and dental staff to infections and to define European standards for
DUWL output water.
Results and discussion
The bacterial and fungal communities in DUWL treated with Calbenium© or Oxygenal© disinfectants were investigated during routine dental practice and accordingly to the flow from the water supply (Incoming Water: IW) to the outer exposure point (Output Water after
Stagnation period: OWS and Output Water after Activity period: OWA). The IW analysis reflected the microbiological quality of the water supplying dental units. As the stagnation of water promotes the growth and the proliferation of biofilm within DUWL (55), the OWS can be considered as an indicator of the microorganisms present in the biofilm in the absence of feasibility to collect DUWL tubing. Contaminating microorganisms in both OW samples
(OWS and OWA) may originate from IW or from the retraction of oral fluids in DUWL. 141 | P a g e
Contrary to the OWS, the OWA was exposed all day long to a chemically treated water flow and consequently was considered as an indicator of the treatment efficiency. A total of 18 conditions were submitted to pyrosequencing runs. 16S and 18S analyses were performed on the 3 studied DU (3 water conditions for each studied DU). We chose 8 to 12 year old DU in order to investigate the long term activity of chemical agents on DUWL. One DU (the Unit 3) was treated with Oxygenal 6© whose disinfectant activity has been already described on
DUWL (66, 67) allowing some comparison with available data. To our knowledge, no data exist as regards to Calbenium© activity against the microbial community encountered inside
DUWL. However Calbenium© is used in some European countries (mainly in France) to control the microbial contamination of DUWL. Consequently, we studied 2 DU treated by
Calbenium© to evaluate its activity in real practise conditions. In addition, dental units were also chosen to make possible the investigation of softener influence (Unit 1) and shock treatment influence (Unit 3) on the microbial contamination of DUWL.
Bacterial and fungal abundances in DUWL: influence of disinfectant
Occurrence of bacterial and fungal communities was estimated by qPCR based on the 16S rRNA and 18S rRNA genes, respectively. Results sustained colonization by both bacteria and fungi in the three DUWL, with levels varying according to the DU and to water flow inside the DU (Table 1a and 1b).
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Based on the number of rRNA gene copy per 100 mL of water, fungi would be less prevalent and significantly less abundant than bacteria in sampled DUWL. Interestingly, 18S rRNA gene fragments from Amoebae spp. were also recovered from our samples by qPCR (SM1,
Table S1) based on the protocol from (203). Results showed the colonisation of DUWL by a wide range of microorganisms despites processes of flushing and disinfecting treatment in our working DU. However, due to their encystment ability, free living amoebae (FLA) may protect some microorganisms from environmental stress, as described for Legionella pneumophila which is known to resist to amoebic phagocytosis (221). Consequently, control the FLA contamination in DUWL may contribute to limit the infectious risk associated to
DUWL exposure. Higher 16S and 18S rRNA gene copy number per 100 mL of water was quantified in both OWS compared to IW (p < 0.05) in the studied DU, with the exception of the bacterial colonization in OWS of the Unit 3 (Table 1a and 1b). This highlights the critical influence of the stagnation period that significantly increases microbial abundance inside 143 | P a g e
DUWL, as previously reported (53, 216, 224). Moreover, the number of rRNA gene copy per
100 mL of water recovered in OWA remained higher than in the IW (p < 0.05) in all studied
DU. Surprisingly, the IW of the Unit 3 showed a discrepancy in the number of 16S rRNA gene copy per 100 mL of water, significantly higher (p < 0.05) than the ones from the two others DU. After biological analyses and new in situ investigations (new CFU counts were performed on an upstream part of the water pipe supplying the DU), this bacterial contamination could be attributed to a local degradation of the water distribution pipe, confirming interest of regular water quality control of DUWL. All molecular results were consistent with the plate counts that reflected only the aerobic and aero-tolerant culturable fraction of the DUW microbial communities. Whereas two DU showed less than 500 CFU per ml of IW (Table 2), none of the disinfectant-treated DUWL reached the microbial water quality level recommended by the CDC and the ADA for OW (294).
Altogether, these two combined approaches showed that the microbial colonization of DUWL changed accordingly to the water circulation within the DU and that stagnation was a significant contributory factor in the contamination of output water.
Remarkably, for the Unit 1 and Unit 3, subjected to Calbenium© and Oxygenal 6© disinfectants respectively, the number of bacterial and fungal rRNA gene copy per 100 mL of water were higher in OWA than in OWS (p < 0.05) whereas in the Unit 2, also treated with
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Calbenium©, a significant decrease was observed between OWS and OWA (p < 0.05). These inconsistent results suggest that a range of factors inherent to each DU may limit or interfere with the activity of the disinfectant, providing an additional supply of microorganisms in
DUWL such as suck-back of oral fluids and deterioration of the microbial quality of the supplying water (1, 6, 298).
Until now, to our knowledge, none comprehensive evaluation of the efficacy of Calbenium© in DUWL under routine dental practices was done. However, (297) showed that an Oxygenal
6© treatment on a laboratory DUW biofilm model resulted in a loss of 100% of biofilm viable counts and in a reduction of 99.2% of biofilm coverage of dental tubing. Biofilm viable counts were performed after scraping surfaces used for the biofilm development. However,
Oxygenal 6© activity tests were performed on young biofilms (14 days) and the contact time was 16 hours (overnight) which can explain the very high observed efficacy (297). In general dental practices, (66) have demonstrated the efficacy of Oxygenal 6© application in a continuous mode over 6 other disinfectants to maintain a water quality level consistent with the ADA guidelines in 91% of the treated DUWL studied (Schel et al., 2006). However, no information about the characteristics of the DUWL studied were provided, such as the DU origin and age. Thus, the present study reinforce current interests in evaluating the efficacy of treatments under routine dental practices after long-term application of disinfectant, such as
Calbenium© and Oxygenal 6© since they are commonly used by French dentists.
Bacterial and fungal genus richness, diversity and evenness indices in DUWL: influence of disinfectant
Pyrosequencing was used to characterize both bacterial and fungal communities according to the water route inside DUWL treated with a disinfectant. A total sum of 37010 (with a mean length of 385 bases) and 28 619 reads (with a mean length of 316 pb) for bacteria and fungi 145 | P a g e
respectively, were obtained from the 9 samples (IW, OWS and OWA for each studied DU) after 454 pyrosequencing quality filtering. After bio-informatic filters and a homogenization step, 252 and 81 representative bacterial and fungi genera members respectively, were assigned at a cut-off of 95% sequence similarity, indicating a high microbial diversity in the
DUWL. The complexity of the bacterial and fungal communities in the three water groups from the three DUWL was investigated based on richness (number of genus-level OTUs),
Shannon and Evenness indices at a 95% sequence similarity cut-off (Table 3a and 3b).
Bacterial community analyses showed that in both Calbenium©-treated Units 1 and 2, while the OWS displayed a higher bacterial richness than the IW, decreases of the number of bacterial genera (Unit 1: 29.4% and Unit 2: 36.0%) and Shannon index were observed in the
OWA conditions, with values close to those observed in the IW. The different bacterial indices suggested the efficacy of Calbenium© disinfectant to minimising the bacterial diversity in DUWL. While a constant decrease of the Shannon and Evenness indices was observed
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from the IW to OWA for the Unit 1, Evenness index remained stable in Unit 2, suggesting a distinct influence of Calbenium© on the bacterial community of these both DU, in favor of few but highly dominant bacterial species in the Unit 1. Considering bacterial biomass and diversity metrics, a similarity was showed in IW from the Unit 1 equipped with a water softener (Table 4) and from the Unit 2. This observation is in agreement with the work of
(299) suggesting that water softener would not be a constant source of microbial contamination of DUWL.
Remarkably, for the Oxygenal©-treated Unit 3, the observed bacterial richness in the IW was the highest observed among the three DU and yet a 58.2% decrease of the bacterial genera was observed in OWS compared to IW. Nevertheless, with 200 bacterial genera and a
Shannon index at 3.56, the OWA reverted to values closed to the ones observed in the IW. In addition, the Evenness index decreased of 25.3% between IW and OWS, following by a value in OWA close to the one observed in IW, suggesting a discrepancy in the repartition of species abundance in OWS. This result suggested that Oxygenal 6© used as a shock cycle for
45 min before the weekend, was effective to control the negative influence of water stagnation on the bacterial diversity in DUWL. It also highlighted the impact of a contaminated supplying water on the OWA water microbial quality and, in this context, only a subsequent limited efficacy of Oxygenal 6© to reduce the bacterial load in OW.
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In contrast to previous observations on DUWL bacterial diversity, the fungal community analyses showed different results in both Calbenium©-treated Units 1 and 2. A reduction of the fungal genus number was observed in OWS compared to IW only in the Unit 2, suggesting a lower fungal diversity in the output water only for this Unit. In the Unit 1, a 2- fold increase of the number of fungal genera was observed in OWA compared to OWS. Here, in contrast to the bacterial investigations, Evenness and Shannon evolution patterns suggested a dominance of few fungal species in both OW (mainly in OWA) from the Unit 2 compared to the Unit 1. Thus, indices suggested a variable efficacy of Calbenium© disinfectant to minimising or limiting bacterial and fungal community diversities inside DUWL.
Remarkably, for the Oxygenal 6©-treated Unit 3, a similar evolution pattern was observed for both bacterial and fungal diversity indices, highlighting interest of shock treatment before a long water stagnation period and influence of the microbial quality of the water supplying this
DUWL.
Through these three distinct case studies, our results confirmed that microbial richness and diversity may be strongly linked to technical, maintenance and practice characteristics of each
DU but also dependant on the microbial quality of the water supplying the DU. Inconsistent results observed from the indices of both bacterial and fungal community diversity clearly suggest that the long-term disinfection efficacy should be optimized to reduce both density and diversity of the microbial communities in DUWL.
Bacterial and fungal communities composition in DUWL: influence of disinfectant
Bacterial and fungal genera representing at least 1% of the total abundance of one of the three studied water groups were considered in each condition (Fig. 1 and 2). Proteobacteria (73.6 ±
10.3%) and Actinobacteria (10.2 ± 10.8%) were the dominant phyla in the studied DUWL, with levels varying according to the DU and to water flow inside the DU (SM2, Table S1).
Members of Firmicutes, Bacteroidetes and Chlamydia were also found in minority according 148 | P a g e
to the relatively low calculated percentages. At the class level, Gamma- (40.3 ± 22.9%),
Alpha- (23.8 ± 17.3%), Beta-Proteobacteria (8.5 ± 10.1%) and Actinobacteridae (7.5 ± 9.9%) were the most represented (SM2, Table S2). Ascomycota (34.9 ±31.9%) and Basidiomycota
(34.2 ± 28.9%) were dominant at fungal phyla level and Saccharomycetes (22.8 ± 25.2%),
Tremellomycetes (16.3 ± 22.6%), Dothideomycetes (6.4 ±10.4%) and Sordariomycetes (5.3 ±
6.5%) at the class level, also in varying proportions according to the DU and to water flow inside the DU (SM2, Tables S3 and S4).
In the Unit 1, subjected to continuous Calbenium© treatment, Halomonas (27% of the total sequences), Shewanella (13%), Propionibacterium (12%) and Sphingomonas (12%) were the dominant bacterial genera detected in IW (Fig. 1). Interestingly, Stenotrophomonas was the sole dominant genus in both OW, representing 42% and 76% of the total bacterial sequences in OWS and OWA, respectively (Fig. 1). Concerning the fungal contamination, Mortierella
(13%), Saccharomyces (13%), and Galactomyces (8%) were dominant in IW (Fig. 2).
Interestingly, the detection of the genus Candida, also dominant in IW (31 % of the total sequences), varied according to the water flow inside DUWL. Indeed, it represents 12 % of the total sequences in OWS and decreases to 5% in OWA. Phoma (20%) and Flammulina
(28%) were also dominant in OWS and OWA, respectively. Nevertheless, unknown fungi represented 16% and 37% of the total sequences and unclassified fungi, 34% and 20% of the total sequences in OWS and OWA, respectively (Fig. 2).
In the Unit 2, also subjected to continuous Calbenium© treatment, Halomonas (30%),
Propionibacterium (18%) and Shewanella (14%) were always the three dominant bacterial genera detected in IW, as observed in the Unit 1 (Fig. 1). Interestingly, these genera were also highly detected in OWS (Halomonas 23%, Propionibacterium 20% and Shewanella 14% of the total sequences) whereas Parvularcula (14%), Barnesiella (14%), Sphingomonas (10%) and Sphingobium (9%) were dominant in OWS. Regarding the fungal contamination, 149 | P a g e
Mortierella (26%) and Malassezia (6%) genera were dominant in IW, Mrakia (50%) and
Sporobolomyces (18%) in OWS and, Pseudallescheria (10%) and Cladosporium (6%) in
OWA (Fig. 2). Interestingly, contrary to previous observation concerning the Unit 1, Candida genus represented 14% of the total sequences in IW of the Unit 2 and its prevalence increases according to the water flow inside DUWL, representing 27 % of the total sequence in OWS and reaching 77 % in OWA.
Regarding the Unit 3 subjected to both continuous and intermittent Oxygenal 6© treatments, the IW was dominated by Pseudomonas (12% of the total sequences), Chlorobacterium
(11%), Sphingomonas (7%) and Sphingobium (7%) genera (Fig. 1). This observation evidenced that, in this DU, the bacterial community composition of the IW differed from that detected in the two other studied DU. Interestingly, while 36% of the total sequences detected in OWS were affiliated to Legionella, this genus was not dominant in OWA. Both OW were dominated by Sphingomonas, representing 22% and 17% of the total sequences in OWS and
OWA, respectively, and Sphingobium genera (14% and 17%). Regarding the fungal contamination, the majority of the sequences were affiliated to unknown fungi (47%), Mrakia
(22%) and Candida (8%) in IW, to environmental fungi (88%) in OWS, and to Mrakia (54%), environmental fungi (11%) and Candida (3%) in OWA (Fig. 2).
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For the first time, a 454 high-throughput pyrosequencing was used to concurrently investigate both bacterial and fungal communities in DUWL. Results showed that large and diverse bacterial and fungal communities were associated from the water supply to the outer exposure point of the three DUs. Whereas the bacterial community analysis was in agreement with previous results on DUWL (224), this study also showed that the number of fungal genera identified in DUWL was higher than that obtained from the previous spread-plated, staining and biochemical test studies (4, 10, 54). Despites flushing and disinfectant applications, more than 80 distinct fungal genera could colonize the studied DUWL, mainly belonging to
Ascomycota and Basidiomycota phyla. The result showed that the class Saccharomycetes was dominant in the core fungal microbiome of DUWL. Nevertheless, the occurrence of yeasts and filamentous fungi were previously reported in DUWL using culture-based approach (4,
10, 54). Interestingly, our study showed the occurrence of Candida genera in the three studied
DUWL whereas, until recently, this genus has been recovered only occasionally from DUWL
(4, 10). The infectious risk associated with Candida albicans is well documented whereas the other members of the Candida species were also suspected in increasing number of infections
(10). Curiously, Aspergillus and Penicillium, previously described as prevalent in drinking water and DUWL, were not detected in our DUWL (4, 10, 300-302)
Our results highlight the critical influence of the water stagnation on the microbial contamination and probably the associated influence of the biofilm developed inside DUWL.
Indeed, especially in the OWS condition, diverse bacterial and fungal communities were observed in each sampled DU with nevertheless, even if the observed microbial communities were rather close among the IW conditions (especially in IW from Units 1 and 2), suggesting the development of specific biofilm inside each DU and, consequently the singularity of each studied case. Moreover, results highlighted that the OWA condition was influenced by the microbial community from both IW and OWS and consequently, the own biofilm of each DU. 153 | P a g e
In addition, the occurrence of potentially pathogenic bacterial and fungal genera such as
Stenotrophomonas, Propionibacterium, Legionella, Halomonas, Pseudomonas, Shewanella,
Candida, Cladosporium and Fusarium in DUWL subjected to dinsinfectant reinforced the interest to regular control the microbiological water quality in dental outlput water. The studied continuous disinfecting protocols seemed partially effective to reduce microbial density and diversity in DUWL after long-term application, however, their activity was insufficient to reach the microbial quality CFU threshold defined by the ADA and the CDC in output waters (American Dental Association, 2012). Results suggested also distinct and variable disinfectant activity on the bacterial and fungal communities inhabiting DUWL.
Interestingly, a shock treatment before a long water stagnation period may limit the microbial colonization of DUWL, expected an acceptable quality of the water supplying the DUWL.
Also, the lack of efficacy of disinfecting treatments in DUWL may be explained by a short exposure time and frequency, an inadequate disinfectant and concentration, a malfunction of devices, a lack of compliance to disinfectant protocols (1, 214, 303). The exopolysaccharide polymers excreted from microorganisms attached to the internal tubing may also form a protective matrix to chemical water treatment as well as the biofilm structure which may limit microorganisms exposure to disinfectants (6, 16, 17). Interestingly, results from O’Donnell and colleagues showed that the lesser efficacy of some disinfectants based on hydrogen peroxide may result from the selection of disinfectant-tolerant species and especially, from the production by microorganisms of enzymes such as catalase that degrade the active agent
(O’Donnell et al., 2007). Interestingly, in the Unit 3 treated with hydrogen peroxide (active agent of Oxygenal 6©), the prevalence of two catalase positive bacterial genera (e.g.
Sphingomonas and Sphingobium) was higher in OW than in IW suggesting a selection of these species after exposure to disinfectant. Zhang and colleagues have also previously observed a high level of Sphingomonas sp. in drinking water biofilms with 0.6 to 1.0 mg/L of 154 | P a g e
chlorine residual (Zhang et al., 2012). Altogether, the results may suggest that different disinfection strategies are needed to improve the microbial quality of the DUWL output water.
In conclusion, the present study indicates that each DUWL develop an heterogeneous and complex ecological system with bacterial and fungal assemblages in populations, influenced by the conjunction of a range of factors. Through these three distinct case studies, the results clearly demonstrated that the infectious risk of exposure for both patients and dental staff remained relevant even though DUWL disinfectant application associated to flushing process.
Despites the limited number of studied DU, the results are sufficiently significant to claim and support the definition of European standards for DUWL output water, regular microbial water quality investigations of DUWL during routine general dental practice, and the compliance with existing preventive recommendations in offices.
Experimental procedures
Dental units and disinfectants
The three DU studied (named Unit 1 to 3) were in operation in Poitiers (France). As presented in the Table 4, the 8-12 year-old DU were chosen with similar features to limit the influence on the microbial community to other parameters than disinfectant application. All the DUWL were supplied from the municipal water system of Poitiers, France (SM3, Table S1) and subjected to flushing at the start of each day to reduce microbial accumulation subsequently to overnight stagnation. Additionally, DUWL of Units 1 and 2 were continuously treated with
2% of Calbenium© (Airel-Quetin, Champigny-sur-Marne, France) and DUWL of the Unit 3 were continuously treated with 0.3% of Oxygenal 6© (KaVo, Biberach, Germany).
Importantly, for the unit 3, an additional treatment was implemented each week (on Friday) 155 | P a g e
before the long water stagnation period consequently to the inactivity of the weekend. The procedure consisted of a cycle of 45 min with Oxygenal 6© at 3% (v/v) circulated inside
DUWL. Calbenium© is a complex mixture based on ethylene diamine tetreacetic acid
(EDTA), benzalkonium chloride, sodium tosylchloramide, allantoin, aspartam, sorbitol and spearmint or lemon aroma, whereas Oxygenal 6© is composed of hydrogen peroxide and silver ions.
Water sampling
Dental Unit Water (DUW) samples (1 L) were collected at two different time periods in routine dental practices from (i) tap water upstream from the unit (here named Incoming
Water or IW), (ii) turbine handpiece output water after a 48 h-stagnation period (after the weekend), on Monday morning and before the beginning of the working day (named Output
Water after Stagnation or OWS) and (iii) turbine handpiece output water immediately after dental care of the last patient of the sampling day (named Output Water after Activity or
OWA). In order to neutralize the residual disinfectant, water samples were stored in sterile bottles with 3 mL of sodium thiosulfate (18 g L-1) at 4°C for no longer than 24 h before analysis. During sampling, care measures were taken to ensure that the microorganisms did not originate from the sampler.
Total aerobic and aero-tolerant cultivable microbial biomass in DUW
Each DUW sample was analysed by direct plate-spread in duplicate using a WASP 2 spiral plater (Biomerieux) on R2A (Difco), medium specifically recommended in standard methods for heterotrophic plate counts of treated potable water (197). The number of CFU was counted
7 days after plate incubation under aerobic conditions at 28°C, as recommended by the manufacturer. 156 | P a g e
Total water DNA extraction
DNA was directly extracted from the DUWL samples filtered over a sterile 0.22 µm polycarbonate membrane (Sartorius), as described by Costa and colleagues (Costa et al.,
2015). DNA extraction from water guaranteed DNA and RNA free filtered on polycarbonate membrane in the same conditions as for DUW samples were performed as negative control.
DNA concentrations of crude extracts were quantified in duplicate using SYBR Green I dye
(Invitrogen) and a standard curve of HindIII-digested λ DNA fragments (Promega) on a
LightCycler 480 Instrument (Roche Applied Science). Aliquots of 0.05 ng µL-1 diluted DNA were stored at -20°C ready for molecular applications.
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
Quantitative PCR was carried out using the LightCycler FastStart DNA MasterPLUS Sybr
Green I mix (Roche Applied Science) in a LightCycler 480 Instrument (Roche Applied
Science). All qPCR reactions were performed in duplicate for each DUW sample using the epMotion® 5070 pipetting robot (Eppendorf). The 10 μL reaction mixture contained 0.5 μM of each primer, 1X of LightCycler FastStart DNA MasterPLUS Sybr Green I mix (Roche
-1 Applied Science, France), 5 μL of H2O, and 2 μL of a 0.05 ng µL DNA-diluted template.
The copy number of bacterial 16S rRNA gene was quantified using the 341F - 515R primer set (199) as described by Costa and colleagues (Costa et al., 2015). The FF390 - FR1 primer set was used to access the copy number of fungal 18S rRNA gene according the amplification protocol previously described by (200). A standard curve was generated by performing serial dilutions of a known amount of a standard sample containing a fragment of the 18S rRNA gene of Candida albicans ATCC 3153 at concentrations ranging from 102 to 106 gene copies
μL-1. No-template control was run for each quantitative PCR assay. 157 | P a g e
Bacterial and fungal rRNA gene quantities were adjusted to account for the filtered volume of water for each respective sample and then analyzed using Mann-Whitney tests.
Pyrosequencing of 16S and 18S rRNA gene sequences
Bacterial and fungal diversities were determined for each DUW sample by 454 pyrosequencing of ribosomal genes. Duplicate extracted DNA from each DUWL sample were pooled according to the water group prior to pyrosequencing. Each sample was prepared from the same DNA input quantity in order to normalize the libraries and achieve even representation of each library in the pyrosequencing results. The V3-V5 region of the bacterial 16S rRNA genes was amplified using primers 341F and 926R (199) as described in
Costa and colleagues (Costa et al., 2015). The fungal 18S rRNA genes was amplified using primers FF390 and FR1 as described by (207). PCR products for each sample were purified using the PCR clean-up Kit according to the manufacturer’s instructions (Macherey-Nagel) and quantified using SYBR Green I dye (Invitrogen). Purified PCR products were then specifically tagged in a second PCR of 7 cycles, conducted under similar amplification conditions, using primers containing pyrosequencing adaptors and ten base pair multiplex identifiers barcode added to one primer at 5’ position to specifically identify each sample.
Finally, bacterial and fungal PCR products were purified and quantified using the Quant-iT™
PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Life Technologies). Size and purity of amplicons were checked using the MultiNA bioanalyzer (Shimadzu). Equimolar PCR products (1x109 molecules µL-1) were pooled for a single sequencing reaction run for each community (i.e. bacteria and fungi). The Lib-L kit (Roche Applied Science) was used for emPCR and unidirectional sequencing of the amplicon library. The two pyrosequencing runs were carried out in a GS Junior 454 Sequencer (Roche Applied Science) following manufacturer's recommendations. 158 | P a g e
Bioinformatic analysis of 16S and 18S rRNA gene sequences
Pyrosequencing data were analyzed using the GnS-PIPE (version 1.1.11) pipeline described by (207), based on the parameters detailed in SM4 (SM4, Table S1). Briefly, raw reads were sorted according to identifier sequences. All reads with mismatches in the primer sequence, ambiguities in the sequence, or sequences inferior to a minimal length were discarded.
Rigorous dereplication (i.e. clustering of strictly identical sequences) was performed using a
PERL program. The retained dereplicated reads were then aligned using INFERNAL alignment (304) and clustered into operational taxonomic units (OTU) as described by Terrat and colleagues (Terrat et al., 2015). All the retained high-quality reads were taxonomically assigned according to the Silva r114 reference database (208). Operational taxonomic units
(OTUs) were clustered at 95% sequence similarity to obtain reliable representation of bacterial and fungal communities through taxonomic classification. During the analysis, all singletons corresponding to reads detected only once and not clustered (that might be artefacts such as PCR chimeras and large sequencing errors produced by the PCR and the pyrosequencing) were checked on the basis of the quality of their taxonomic assignments
(Terrat et al., 2015). In order to avoid biased community comparisons, the samples reads were reduced by random selection closed to the lowest datasets. The retained high-quality reads were used for taxonomy-independent analyses including estimation of diversity indices and taxonomy-based analyses using similarity approaches against Silva r114 reference databases and post-processed using R package (R Development Core Team, 2004). Heatmaps were built up from the relative abundance values of the most dominant bacterial and fungal genera across the samples (relative abundance > 1%) using the gplots R package.
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Nucleotide sequence accession numbers
The raw datasets are available on the EBI database system in the Sequence-Read Archive
(SRA), under study accession numbers PRJEB11059 (http://www.ebi.ac.uk/ena).
Acknowledgments
Authors sincerely thank the scientific supports provided by S. Terrat and colleagues from the
GenoSol platform (INRA, Dijon, France, www2.dijon.inra.fr/plateforme_genosol/) for the development of the 454 pyrosequencing.
References
American Dental Association, 2012. Statement on dental unit waterlines. Available from http://www.ada.org/en/member-center/oral-health-topics/dental-unit-waterlines. [accessed May 2014]. Arvand, M. and Hack, A. (2013) Microbial contamination of dental unit waterlines in dental practices in Hesse, Germany: A cross-sectional study. Eur J Microbiol Immunol (Bp) 3(1), 49-52. Association, A.D. (2012) Statement on dental unit waterlines, http://www.ada.org/en/member- center/oral-health-topics/dental-unit-waterlines. Baker, G.C., Smith, J.J. and Cowan, D.A. (2003) Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J Microbiol Methods 55(3), 541-555. Chemidlin Prévost-Bouré, N., Christen, R., Dequiedt, S., Mougel, C., Lelièvre, M., Jolivet, C., Shahbazkia, H.R., Guillou, L., Arrouays, D. and Ranjard, L. (2011) Validation and application of a PCR primer set to quantify fungal communities in the soil environment by real-time quantitative PCR. PLoS One 6(9), e24166. Cole, J.R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R.J., Kulam-Syed-Mohideen, A.S., McGarrell, D.M., Marsh, T., Garrity, G.M. and Tiedje, J.M. (2009) The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res 37(Database issue), D141-145. Coleman, D.C., O'Donnell, M.J., Shore, A.C. and Russell, R.J. (2009) Biofilm problems in dental unit water systems and its practical control. J Appl Microbiol 106(5), 1424-1437. Coleman, D.C., O’Donnell, M.J., Miller, A.S., Boyle M.A. (2014) Minimising microbial contamination in dental unit water systems and microbial control in dental hospitals., pp. 166-207. Costa, D., Mercier, A., Gravouil, K., Lesobre, J., Delafont, V., Bousseau, A., Verdon, J. and Imbert, C. (2015) Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in dental unit waterlines. Water Res 81, 223- 231. Costerton, J.W., Stewart, P.S. and Greenberg, E.P. (1999) Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284(5418), 1318-1322. Dallolio, L., Scuderi, A., Rini, M.S., Valente, S., Farruggia, P., Sabattini, M.A., Pasquinelli, G., Acacci, A., Roncarati, G. and Leoni, E. (2014) Effect of different disinfection protocols on microbial and biofilm contamination of dental unit waterlines in community dental practices. Int J Environ Res Public Health 11(2), 2064-2076.
160 | P a g e
Greub, G. and Raoult, D. (2004) Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev 17(2), 413-433. Hambsch, B., Sacré, C. and Wagner, I. (2004) Heterotrophic plate count and consumer's health under special consideration of water softeners. Int J Food Microbiol 92(3), 365-373. Kadaifciler, D.G., Ökten, S. and Sen, B. (2013) Mycological contamination in dental unit waterlines in Istanbul, Turkey. Braz J Microbiol 44(3), 977-981. Kumar, S., Atray, D., Paiwal, D., Balasubramanyam, G., Duraiswamy, P. and Kulkarni, S. (2010) Dental unit waterlines: source of contamination and cross-infection. J Hosp Infect 74(2), 99-111. Le Calvez, T., Trouilhé, M.C., Humeau, P., Moletta-Denat, M., Frère, J. and Héchard, Y. (2012) Detection of free-living amoebae by using multiplex quantitative PCR. Mol Cell Probes 26(3), 116- 120. Martin, M.V. (1987) The significance of the bacterial contamination of dental unit water systems. Br Dent J 163(5), 152-154. Mesquita-Rocha, S., Godoy-Martinez, P.C., Gonçalves, S.S., Urrutia, M.D., Carlesse, F., Seber, A., Silva, M.A., Petrilli, A.S. and Colombo, A.L. (2013) The water supply system as a potential source of fungal infection in paediatric haematopoietic stem cell units. BMC Infect Dis 13, 289. Montebugnoli, L., Dolci, G., Spratt, D.A. and Puttaiah, R. (2005) Failure of anti-retraction valves and the procedure for between patient flushing: a rationale for chemical control of dental unit waterline contamination. Am J Dent 18(4), 270-274. O'Donnell, M.J., Boyle, M.A., Russell, R.J. and Coleman, D.C. (2011) Management of dental unit waterline biofilms in the 21st century. Future Microbiol 6(10), 1209-1226. O'Donnell, M.J., Shore, A.C., Russell, R.J. and Coleman, D.C. (2007) Optimisation of the long-term efficacy of dental chair waterline disinfection by the identification and rectification of factors associated with waterline disinfection failure. J Dent 35(5), 438-451. Oliveira, B.R., Crespo, M.T., San Romão, M.V., Benoliel, M.J., Samson, R.A. and Pereira, V.J. (2013) New insights concerning the occurrence of fungi in water sources and their potential pathogenicity. Water Res 47(16), 6338-6347. Pankhurst, C.L. (2003) Risk assessment of dental unit waterline contamination. Prim Dent Care 10(1), 5-10. Petti, S., Moroni, C., Messano, G.A. and Polimeni, A. (2013) Detection of oral streptococci in dental unit water lines after therapy with air turbine handpiece: biological fluid retraction more frequent than expected. Future Microbiol 8(3), 413-421. Petti, S. and Tarsitani, G. (2006) Detection and quantification of dental unit water line contamination by oral streptococci. Infect Control Hosp Epidemiol 27(5), 504-509. Porteous, N.B., Bizra, E., Cothron, A. and Yeh, C.K. (2014) A survey of infection control teaching in U.S. dental schools. J Dent Educ 78(2), 187-194. Puttaiah, R., Svoboda, K.K., Lin, S.M., Montebugnoli, L., Dolci, G., Spratt, D. and Siebert, J. (2012) Evaluation of an automated dental unit water system's contamination control protocol. J Contemp Dent Pract 13(1), 1-10. Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., Gerken, J., Schweer, T., Yarza, P., Peplies, J. and Glöckner, F.O. (2013) The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Res 41(Database issue), D590-596. Ramage, G., Rajendran, R., Sherry, L. and Williams, C. (2012) Fungal biofilm resistance. Int J Microbiol 2012, 528521. Reasoner, D.J. and Geldreich, E.E. (1985) A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol 49(1), 1-7. Ricci, M.L., Fontana, S., Pinci, F., Fiumana, E., Pedna, M.F., Farolfi, P., Sabattini, M.A. and Scaturro, M. (2012) Pneumonia associated with a dental unit waterline. Lancet 379(9816), 684.
161 | P a g e
Sammon, N.B., Harrower, K.M., Fabbro, L.D. and Reed, R.H. (2010) Incidence and distribution of microfungi in a treated municipal water supply system in sub-tropical Australia. Int J Environ Res Public Health 7(4), 1597-1611. Santiago, J.I., Huntington, M.K., Johnston, A.M., Quinn, R.S. and Williams, J.F. (1994) Microbial contamination of dental unit waterlines: short- and long-term effects of flushing. Gen Dent 42(6), 528-535. Santé, D.G.D.L. (juin 2006) Guide de prévention des infections liées aux soins réalisés en chirurgie dentaire et stomatologie., Ministère de la santé et des solidarités, Direction générale de la santé, Conseil supérieur d'hygiène publique de France, Deuxième édition. Schel, A.J., Marsh, P.D., Bradshaw, D.J., Finney, M., Fulford, M.R., Frandsen, E., Østergaard, E., ten Cate, J.M., Moorer, W.R., Mavridou, A., Kamma, J.J., Mandilara, G., Stösser, L., Kneist, S., Araujo, R., Contreras, N., Goroncy-Bermes, P., O'Mullane, D., Burke, F., O'Reilly, P., Hourigan, G., O'Sullivan, M., Holman, R. and Walker, J.T. (2006) Comparison of the efficacies of disinfectants to control microbial contamination in dental unit water systems in general dental practices across the European Union. Appl Environ Microbiol 72(2), 1380-1387. Smith, G. and Smith, A. (2014) Microbial contamination of used dental handpieces. Am J Infect Control 42(9), 1019-1021. Szymańska, J. (2005a) Evaluation of mycological contamination of dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med 12(1), 153-155. Szymańska, J. (2005b) Microbiological risk factors in dentistry. Current status of knowledge. Ann Agric Environ Med 12(2), 157-163. Szymańska, J. (2006) Bacterial decontamination of DUWL biofilm using Oxygenal 6. Ann Agric Environ Med 13(1), 163-167. Szymańska, J., Sitkowska, J. and Dutkiewicz, J. (2008) Microbial contamination of dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med 15(2), 173-179. Terrat, S., Plassart, P., Bourgeois, E., Ferreira, S., Dequiedt, S., Adele-Dit-De-Renseville, N., Lemanceau, P., Bispo, A., Chabbi, A., Maron, P.A. and Ranjard, L. (2014) Meta-barcoded evaluation of the ISO standard 11063 DNA extraction procedure to characterize soil bacterial and fungal community diversity and composition. Microb Biotechnol. Walker, J.T., Bradshaw, D.J., Bennett, A.M., Fulford, M.R., Martin, M.V. and Marsh, P.D. (2000) Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol 66(8), 3363-3367. Walker, J.T., Bradshaw, D.J., Finney, M., Fulford, M.R., Frandsen, E., ØStergaard, E., Ten Cate, J.M., Moorer, W.R., Schel, A.J., Mavridou, A., Kamma, J.J., Mandilara, G., Stösser, L., Kneist, S., Araujo, R., Contreras, N., Goroncy-Bermes, P., O'Mullane, D., Burke, F., Forde, A., O'Sullivan, M. and Marsh, P.D. (2004) Microbiological evaluation of dental unit water systems in general dental practice in Europe. Eur J Oral Sci 112(5), 412-418. Walker, J.T., Bradshaw, D.J., Fulford, M.R. and Marsh, P.D. (2003) Microbiological evaluation of a range of disinfectant products to control mixed-species biofilm contamination in a laboratory model of a dental unit water system. Appl Environ Microbiol 69(6), 3327-3332. Walker, J.T. and Marsh, P.D. (2007) Microbial biofilm formation in DUWS and their control using disinfectants. J Dent 35(9), 721-730. Wirthlin, M.R., Marshall, G.W. and Rowland, R.W. (2003) Formation and decontamination of biofilms in dental unit waterlines. J Periodontol 74(11), 1595-1609.
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4.2. Données complémentaires
L’approche méthodologique précédémment décrite (dans le paragraphe 4 page 136 correspondant à la méthodologie de l’article) a été appliquée à une USD ayant la particularité de ne posséder aucun traitement chimique circulant dans ses LUSD (unité 7 du Tableau XX). Dans la mesure où il n’y avait pas de traitement chimique, et que les praticiens ont déclaré ne réaliser aucune purge en routine (comme indiqué dans le Tableau XX), seule la circulation de l’eau dans les LUSD lors des soins peut être considérée comme un traitement physique susceptible de modifier le niveau de contamination microbienne en sortie de l’USD. L’ensemble des résultats obtenus pour cette USD sont présentés dans les Tableaux XXIV et XXV.
Tableau XXIV Données UFC, qPCR 16S (bactérienne) et 18S (fongique) de l’unité supplémentaire. *significatif par rapport à l’IW (Mann-Whitney, p < 0.05) #significatif par rapport à l’OWS (Mann-Whitney, p < 0.05)
Tableau XXV Données des indices de diversité issus des pyroséquençages bactérien et fongique de l'unité supplémentaire
Les données obtenues ont révélé une contamination microbienne importante, à la fois bactérienne et fongique, en sortie d’USD. En comparant les conditions OWS et OWA dans cette USD qui n’était pas traitée, nous avons pu évaluer l’influence spécifique de la circulation d’eau liée à l’activité quotidienne des soins sur la contamination microbienne des LUSD. A l’exception des résultats obtenus par qPCR
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16S, aucune différence significative n’a été observée entre les conditions OWS et OWA de cette USD. Concernant les indices de diversité de la population bactérienne, nous n’avons pas observé de réelle baisse de diversité bactérienne entre les conditions OWS et OWA. De plus, les valeurs proches des indices de Shannon et d’Evenness observées entre les conditions OWS et OWA témoignaient d’une répartition de la communauté bactérienne proche entre ces 2 conditions (OWS et OWA). Cependant, pour les données fongiques, une baisse de la diversité a été observée entre les conditions OWS et OWA. Ainsi, l’effet mécanique de la circulation d’eau dans les LUSD dû à l’activité quotidienne des soins ne semble pas efficace pour réduire la diversité bactérienne en sortie d’USD mais semble efficace pour réduire la diversité fongique.
Les compositions des communautés bactérienne et fongique de cette USD sont présentées respectivement sur les Figures 34 et 35. En comparant les profils en Heatmaps obtenus pour les 3 conditions d’étude (IW, OWS et OWA), il est apparu que les communautés de sortie d’USD (OWS et OWA) apparaissent semblables entre elles et très différentes de l’amont de l’USD, suggérant là encore la forte influence du biofilm développé dans les LUSD.
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Figure 34 Représentation en heatmap de l’abondance relative des communautés bactériennes des conditions IW, OWS, et OWA de l’unité supplémentaire. Seuls les genres ayant une abondance relative d’au moins 1% sur l’ensemble des séquences obtenues sont représentés
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Figure 35 Représentation en heatmap de l’abondance relative des communautés fongiques des conditions IW, OWS, et OWA de l’unité supplémentaire. Seuls les genres ayant une abondance relative d’au moins 1% sur l’ensemble des séquences obtenues sont représentés
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En résumé, cette première partie des résultats a montré que les LUSD étaient colonisées par une large densité et diversité microbienne.
De nombreux paramètres semblent influencer cette contamination microbienne en sortie des USD, comme l’âge des USD, les procédures mises en place pour l’entretien et la désinfection du matériel de soins et des LUSD, aboutissant finalement à une singularité de chaque cas étudié. De plus, il a été démontré qu’une période de stagnation d’eau prolongée influence de manière critique la contamination microbienne en sortie des USD.
Parmi les microorganismes ainsi mis en évidence en sortie d’USD et en proportions non négligeable figurent certaines espèces pathogènes ou pathogènes opportunistes pour l’Homme.
Il a été observé que l’action mécanique seule de la circulation d’eau dans l’USD liée à son usage quotidien ne permet pas de diminuer la contamination microbienne des LUSD. Il a également été observé que des USD âgées de 8 à 12 ans dont les LUSD étaient traitées par des désinfectants, ne répondaient pas à la qualité microbiologique de l’eau attendue en sortie d’USD, et donc aux recommendations de l’ADA ou des CDC.
La présence de certaines espèces (Sphingomonas, Sphingobium) dotées de mécanisme de résistance à l’oxygenal 6© (expression d’une catalase) a d’ailleurs été observée en sortie d’USD et contribue à expliquer la contamination microbienne excessive des LUSD.
Néanmoins, il semble que l’utilisation de produits désinfectants en traitements chocs soit efficace pour limiter l’influence critique de la période de stagnaton d’eau prolongée du week-end sur la contamination microbienne en sortie d’USD.
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Partie II M biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD odélisation dynamique d’un
Au cours de ce travail, un modèle permettant le développement d’un biofilm polymicrobien dans des conditions mimant celles des LUSD a été mis au point.
1. Principales caractéristiques du modèle
Puisque les LUSD sont soumises à une contamination par des microorganismes d’origines variées (environnementale et humaine), il a été choisi d’alimenter le modèle avec une suspension polymicrobienne composée de P. aeruginosa, C. albicans et V. vermiformis. P. aeruginosa a été choisi comme représentant d’une contamination bactérienne d’origine environnementale car, comme vu dans la partie II de la synthèse bibliographique, il est fréquemment isolé dans les réseaux d’eau et développe facilement des biofilms. C. albicans a été selectionné comme microorganisme d’origine humaine pouvant contaminer les LUSD par ré-aspiration du fluide buccal des patients. De plus, il est lui aussi capable de former facilement des biofilms et notamment des biofilms mixtes avec P. aeruginosa. D’autre part, dans la logique de contamination des LUSD par ces fluides buccaux, de la salive artificielle (5% v/v) a été ajoutée à la suspension polymicrobienne alimentant le modèle. Enfin, V. vermiformis a été choisi comme second représentant d’une contamination d’origine environnementale, d’une part parce que les amibes libres sont ubiquitaires des environnements aquatiques et d’autre part parce qu’il pourrait y avoir des interactions intéressantes entre cette espèce amibienne et C. albicans, d’après des travaux préalables réalisées au sein de notre laboratoire de recherche (89). L’étude a été réalisée avec une eau à température ambiante car la température moyenne des LUSD a été décrite comme étant de 23°C (215).
Les biofilms ont été formés sur des coupons au sein d’un réacteur CDC. Ce réacteur a été choisi afin de disposer d’un modèle capable d’être approvisionné dans
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des conditions de flux dynamique et de manière intermittente. De plus, le réacteur CDC présente l’avantage de permettre la formation simultanée d’un biofilm sur 24 coupons (8 portoirs pouvant accueillir au maximum 3 coupons chacun) et les biofilms formés dans un réacteur CDC ont la particularité de couvrir simultanément les 2 faces des coupons. Pour assurer une répartition la plus homogène possible des microorganismes à la surface des coupons, un barreau aimanté a permis l’agitation en continu de la suspension d’alimentation du réacteur pendant les périodes de fonctionnement du modèle.
Le choix des différents matériaux testés (PVC, teflon, polyuréthane…) pour la formation du biofilm polymicrobien s’est fait après dialogue avec les fournisseurs d’USD pour ne tester que les matériaux les plus fréquemment utilisés dans la conception des LUSD. Par la suite, seuls les coupons en PVC ont été choisis pour les tests d’activité des différents désinfectants car d’après les informations recueillies auprés des fournisseurs, le PVC serait le matériau le plus communément présent dans les LUSD.
Afin de mimer le flux d’eau circulant dans les LUSD au cours de l’activité de soins, le modèle devait être alimenté avec un flux intermittant de suspension microbienne. Pour cela, une pompe péristaltique a été utilisée permettant de programmer les phases d’alimentation du réacteur sur les périodes de 9 heures à midi puis de 14 heures à 17 heures, tous les jours, afin de se rapprocher des conditions d’activité quotidienne d’un chirurgien dentiste. Bien sûr, un praticien n’utilise pas son USD pendant toute la durée d’une consultation ; pour mimer cela, la pompe a été programmée de façon à alterner des cycles de 12 min de fonctionnement et de 18 min d’inactivité pour une durée fictive de consultation moyenne de 30 min. Le débit de la pompe a été établi pour correspondre au débit moyen retrouvé dans les LUSD (environ 90 mL/min (83)).
Une fois le modèle validé par des techniques d’ensemencements, d’observation des amibes sur cellule de kova et d’observation du biofilm polymicrobien en MEB (Figure 36), ce modèle a été utilisé pour réaliser les différentes études décrites ci-après.
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A B
C D
Figure 36 Photographies en MEB du biofilm polymicrobien développé sur coupons de PVC. A et B : Photos générales du biofilm polymicrobien ; C : zoom sur une cellule de V. vermiformis ; D : zoom sur des cellules de C. albicans
2. Influence des matériaux sur le développement du biofilm
Afin d’évaluer l’influence des matériaux sur le développement d’un biofilm polymicrobien dans les conditions du réacteur CDC mimant les LUSD, des coupons en PVC, polyuréthane, teflon, polyéthylène et silicone ont été utilisés comme substrat. Pour cette étude, le biofilm polymicrobien contenait uniquement P. aeruginosa et C. albicans. La cinétique de développement du biofilm polymicrobien a été suivie sur une période d’un mois. Puis, au bout d’un mois, afin d’évaluer l’action des purges sur le biofilm polymicrobien développé, le réacteur CDC a été alimenté pendant 3 jours en circuit ouvert et uniquement en eau filtrée (donc dépourvue de tout microorganisme). Les résultats obtenus concernant d’une part la biomasse totale du biofilm polymicrobien et d’autre part chacune des espèces microbiennes constituant ce biofilm, sont présentés sur les Figures 37 à 39.
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Figure 37 Influence des matériaux sur la formation d'un biofilm polymicrobien en condition dynamique. J5 à J30 : après 5 à 30 jours de fonctionnement du modèle. T24h et T72h CO : après 24 et 72 heures de fonctionnement du modèle en circuit ouvert alimenté exclusivement en eau filtrée
Figure 38 Influence des matériaux sur la biomasse de P. aeruginosa développée dans le biofilm polymicrobien. J5 à J30 : après 5 à 30 jours de fonctionnement du modèle. T24h et T72h CO : après 24 et 72 heures de fonctionnement du modèle en circuit ouvert alimenté exclusivement en eau filtrée.
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* * * * * * *
Figure 39 Influence des matériaux sur la biomasse de C. albicans développée dans le biofilm polymicrobien. J5 à J30 : après 5 à 30 jours de fonctionnement du modèle. T24h et T72h CO : après 24 et 72 heures de fonctionnement du modèle en circuit ouvert alimenté exclusivement en eau. Recherche d’une différence entre les différents matériaux pour chaque temps d’étude : *p<0,05 (Kruskal-Wallis)
Concernant la biomasse totale, le biofilm se développe progressivement tout au long de l’expérimentation et aucune différence significative n’apparait entre les différents matériaux au cours des 30 premiers jours de fonctionnement du modèle (Figure 37). Ce profil est également retrouvé lorsqu’on s’intéresse spécifiquement à la biomasse de P. aeruginosa dévelopée au sein du biofilm polymicrobien (Figure 38). Concernant C. albicans, une augmentation significative (de 1 à plus de 2,5 Log d’UFC/mm²) et très précoce (dès J5) du nombre de levures présentes au sein du biofilm polymicrobien est observée pour les biofilms formés sur polyuréthane comparativement aux biofilms formés sur les autres matériaux (PVC, téflon, polyéthylène et silicone). Le nombre de levures présentes au sein des biofilms polymicrobiens n’augmente plus à partir de J12. Cependant, après un mois, une différence significative est observée entre les biofilms développés d’une part sur silicone ou polyéthylène, et d’autre part sur PVC, polyuréthane ou teflon (Figure 39). Le silicone et le polyéthylène apparaissent donc moins favorables que les 3 autres
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matériaux au développement de C. albicans dans les biofilms complexes dans les conditions d’étude.
En 1994, Hawser et al. ont démontré que les biofilms de C. albicans étaient significativement plus développés sur disques de PVC que sur disques de polyuréthane ou de silicone (305). Il s’agissait d’une étude en condition statique avec une période d’adhérence initiale d’une heure à 37°C dans du PBS. En 2011, Estivill et al. ont observé un développement significativement plus important de biofilm de C. albicans sur teflon que sur polyuréthane et PVC, sans différence significative entre le PVC et le polyuréthane (306). Cependant, leurs résultats apparaissent souche-dépendant. De plus, les conditions étaient, là aussi, très différentes du modèle décrit dans la thèse. En effet les auteurs ont travaillé sur des biofilms mono-espèce préparés en condition statique et sur une période d’adhérence initiale de 90 minutes à 35°C dans du PBS stérile. Ainsi, les conditions expérimentales des études décrites dans la littérature étant éloignées de celles utilisées dans la thèse, il est difficile de comparer les résultats obtenus pour C. albicans. Ensemble, ces résultats montrent l’influence à la fois du matériau substrat mais aussi de l’espèce microbienne étudiée et de l’ensemble des conditions expérimentales (âge du biofilm, présence d’un flux, température) sur le développement du biofilm. Dans le modèle dynamique mimant les conditions des LUSD, il semblerait que les matériaux n’influencent pas la biomasse totale développée par les biofilms polymicrobiens sur une période d’un mois (p > 0,1). Cependant, la composition de la communauté microbienne de ces biofilms polymicrobiens semble modifiée par certains matériaux. Après étude de la cinétique de formation des biofilms mixtes pendant 30 jours, le modèle CDC a été alimenté exclusivement en eau filtrée et dans des conditions de circuit ouvert afin d’évaluer l’influence de la réalisation de purges sur ces biofilms. Ainsi, après une journée de fonctionnement du modèle en circuit ouvert, soit entre J30 (juste avant la purge) et T24h CO (après 24h de purge), une baisse comprise entre 0,3 et 1,6 log d’UFC/mm² a été observée quelque soit le matériau utilisé (que ce soit sur la biomasse totale ou sur chacune des espèces formant le biofilm). Puis, entre T24h CO et T72h CO, aucune diminution supplémentaire de la biomasse
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globale ou spécifique des biofilms n’a été observée. Ainsi, conformément aux données de la littérature, et aux résultats décrits dans la Partie I de ce travail, les purges seules, c'est-à-dire non associées à un traitement chimique, n’entraînent qu’une réduction limitée du biofilm déjà formé (1, 303, 307).
3. Efficacité des désinfectants sur un biofilm polymicrobien
L’objectif de ce travail était d’évaluer l’effet de trois désinfectants couramment utilisés pour l’entretien des USD - l’oxygenal 6©, le sterispray© et le calbenium© - sur un biofilm polymicrobien (P. aeruginosa + C. albicans + V. vermiformis). V. vermiformis a été intégrée au sein du biofilm polymicrobien car certains travaux préalables à cette thèse suggèrent une modification de la sensibilité de C. albicans aux désinfectants en présence de cette espèce d’amibe libre. L’aptidude de ces désinfectants à éliminer un biofilm déjà formé ainsi que leur capacité à prévenir la formation d’un biofilm ont été étudiées. Ces travaux font l’objet d’un article actuellement soumis pour publication.
3.1. Efficacy of dental unit waterlines disinfectants on a polymicrobial biofilm (article actuellement soumis)
Les résultats obtenus au cours de cette étude ont montré une efficacité variable en fonction des désinfectants testés. Les concentrations d’usage préconisées par les fournisseurs ne se sont pas toujours révélées être les plus appropriées. Le calbenium© semble être particulièrement efficace, que ce soit sur un biofilm polymicrobien déjà installé ou pour limiter sa formation. Cependant, aucun des traitements testés ne s’est avéré efficace contre V. vermiformis que ce soit sur le biofilm polymicrobien déjà installé ou en prévention de sa formation suggèrant l’intérêt d’inclure des amibes libres dans les tests d’efficacité des produits de désinfection des LUSD.
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Article 3
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EFFICACY OF DENTAL UNIT WATERLINES DISINFECTANTS ON A
POLYMICROBIAL BIOFILM
Damien Costaa,b*, Marion Girardota,c , Joanne Bertauxd, Julien Verdona, Christine Imberta,c f. Equipe Microbiologie de l’Eau, Ecologie et Biologie des Interactions, Centre National de
la Recherche Scientifique UMR 7267, Université de Poitiers, Poitiers, France g. Service de Bactériologie et d’Hygiène hospitalière, CHU de Poitiers, Poitiers, France h. Faculté de Médecine et de Pharmacie de Poitiers, Poitiers, France i. Equipe Ecologie Evolution Symbiose, Ecologie et Biologie des Interactions, Centre
National de la Recherche Scientifique UMR 7267, Université de Poitiers, Poitiers, France
*corresponding author, Equipe Microbiologie de l’Eau, Ecologie et Biologie des Interactions,
Centre National de la Recherche Scientifique UMR 7267, Université de Poitiers, UFR SFA,
Pôle Biologie Santé, 1 rue Georges Bonnet, bât B37, 86073 Poitiers, cedex 9, France E-mail adress: [email protected], phone: +33 (2) 49 44 21 58; fax:+33(2) 38 64 40 22
ABSTRACT
Due to their high surface-volume ratio, their laminar flow, frequent stagnation periods Dental
Unit Waterlines (DUWL) promote microorganisms attachment and biofilm development resulting in the continuous contamination of the outlet water from dental units; this contamination may be responsible for a potential infectious risk due to the exposure of patients and medical staff to droplet inhalation or splashed water. In this study, the anti- biofilm activity of three disinfectants recommended by dental units manufacturers:
Calbenium©, Oxygenal 6© and Sterispray© was evaluated. A dynamic model mimicking
DUWL conditions was developed and allowed the formation of polymicrobial biofilms 179 | P a g e
containing both bacteria (Pseudomonas aeruginosa), fungi (Candida albicans) and Free
Living Amoeba (FLA: Vermamoeba vermiformis). The ability of disinfectants to reduce the biofilm formation or to eradicate an already formed biofilm was evaluated. Results showed the various effects of the tested disinfectants according to their composition, concentration and the targeted species. Vermamoeba vermiformis was resistant to disinfectants, regardless of the tested concentrations (0.1 to 10% v/v) and the concentrations recommended by manufacturers were not the most appropriate. Results also showed that Calbenium© was the most effective disinfectant to reduce already formed biofilms; its maximum efficiency was observed from 0.5% on both P. aeruginosa and C. albicans compared to 2 and 3% respectively for Sterispray©. The maximum efficiency of Oxygenal© was observed from 3% on P. aeruginosa but Oxygenal© was unable to totally eliminate C. albicans in the tested conditions, contrary to other disinfectants. Calbenium© was able to efficiently prevent the biofilm formation even if it displayed no prophylactic activity against V. vermiformis. Overall, the FLA survival may contribute to maintain other species. Finally the tested disinfectants were partially active against sessile microorganisms and more suitable concentrations could be used to increase their efficacy. Their use in a prophylactic rather than curative way should be recommended.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Vermamoeba vermiformis, disinfection, Oxygenal 6, Calbenium, Sterispray model.
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1. Introduction
The microbial contamination of dental unit waterlines (DUWL) is currently well described (6, 8, 50, 53, 83, 215). Bacteria, fungi, viruses and free living amoebae (FLA) can be detected in the output DUWL, thus exposing both patients and dental health care personnel to a potential associated infectious risk (9, 10, 84, 211). This microbial diversity encountered in DUWL can originate from three different ways of contamination; the supplying water of dental units (DU) may be contaminated by environmental germs such as Gram negative bacteria like Pseudomonas aeruginosa. In addition, the retrograde aspiration of oral fluids may induce the colonization of DUWL by human oral microflora and finally, the biofilm development inside DUWL due to the overall features of DU pipes (laminar flow, water stagnation, high ratio surface/volume…) constitutes a primary reservoir for continuous microbial contamination of the output DUWL (295). Consequently, the biofilm appears as a main target to limit microbial contamination levels of DUWL. Indeed, the bacterial load in output DUWL would frequently range between 102 and 106 CFU/mL, often exceeding guidelines from the American Dental Association who recommend a limit of 500 CFU/mL to meet with standards for drinking water (294). Chemical treatments may contribute to reduce the biofilm development inside DUWL. Three of the treatments frequently distributed by DU suppliers were retained in this study: Oxygenal 6©, Calbenium© and Sterispray©. According to respective manufacturer recommendations, Calbenium© should circulate continuously in
DUWL at a concentration of 2% (v/v), Sterispray© at 1% (v/v) and Oxygenal 6© at 0.02% of
H2O2 (corresponding to 0.3% v/v of the entire product); in addition after a long water
© stagnation period, Oxygenal 6 should be used at a concentration of 0.2% of H2O2 during a 45 min cycle. The purpose of this study was to evaluate the efficacy of each of these chemical treatments as regards their activity against polymicrobial biofilms developed in DUWL
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conditions. We studied both their efficacy to prevent biofilm formation and their ability to eradicate a pre-formed biofilm. Investigations were carried out on a polymicrobial biofilm composed of P. aeruginosa, Candida albicans and Vermamoeba vermiformis. These microorganisms were chosen as representative species from both environmental and human origins whose presence in DUWL has been frequently reported (9, 10, 84, 224). We included
V. vermiformis in this model since a previous study highlighted a modification in disinfectant susceptibility of Candida spp. due to the FLA presence (89), suggesting its potential influence on polymicrobial biofilms as well.
2. Material and methods
2.1 Strains used for the study
Strains used in this study were P. aeruginosa ATCC 9027, C. albicans ATCC 3153 and V. vermiformis ATCC 50802. Pseudomonas aeruginosa was cultivated on Brain Heart
Infusion (BHI) agar, C. albicans on Sabouraud Glucose Chloramphenicol (GC) agar and V. vermiformis in PYNFH media.
2.2 Polymicrobial biofilm formation
A CDC Biofilm Reactor (CBR) System was used to develop biofilms in dynamic conditions. The CBR contained 24 PVC sterile coupons (12.7-mm diameter, 3-mm depth, supplied by BioSurface Technologies, Bozeman, MT). In order to mimic the functioning of a dental unit, the CBR was fed with a microbial suspension at a flow rate of 90 mL/min for a 30 min cycle consisting of 12 min of continuous-flow phase followed by 18 min of water stagnation. This 30 min cycle was repeated twice by hour from 9.00 to 12.00 am and 2.00 to
5.00 pm. Each flow cycle mimicked the dental care of a patient. During weekends, the CBR 182 | P a g e
was under batch phase without any feeding. During activity periods (Monday to Friday), the feeding suspension was renewed each day. In order to establish polymicrobial biofilms, the feeding suspension was composed of P. aeruginosa (103 cells/mL), V. vermiformis (104 cells
/mL), C. albicans (104 cells /mL) and 5% (v/v) artificial saliva whose composition was described by (210, 308). All experiments were performed twice in separate periods at room temperature.
2.3 Studied Disinfectants
Three disinfectants commonly used by French dentists to treat their DUWL were retained: Oxygenal 6© (Kavo, Biberach, Germany), Calbenium© (Airel, Champigny-sur-
© © Marne, France) and Sterispray (Gammasonic, Billom, France). Oxygenal 6 contains H2O2
(6%) and silver ions. Calbenium© is a complex cocktail composed of ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), ammonium IV, sodium tosylchloramide, allantoin, aspartam, sorbitol and aroma. Sterispray© contains benzalkonium chloride, EDTA, chloramine, aspartam, sorbitol, aroma and thyme essential oil. However, details on the respective concentrations of each component were not given by manufacturers.
2.4 Evaluation of disinfectant anti-biofilm activity
2.4.1 Activity of periodic treatment with disinfectants: a curative approach
After running for one week as described above (section 2.2), coupons coated with biofilms were removed from the CBR, placed into 24-wells plates (Costar, Corning incorporated, NY, USA) and incubated for 15 min at room temperature with disinfectant used at a concentration ranging between 0 (control condition) and 10% (v/v). Each coupon was then transferred to a 50 mL tube and vortexed during 2 min in 2 mL of sterile water containing an excess of sodium thiosulfate in order to neutralize tested disinfectants residual. 183 | P a g e
The obtained microbial suspensions with microorganisms detached from coupons were then serially diluted and plated on BHI and Sabouraud GC (Sigma-aldrich, St-Louis, USA) agar plates. CFU were counted after 48h of incubation at 37°C. Vermamoeba vermiformis were counted using kova cells (Hycor biomedical inc., California, USA) after viable coloration with 0.4% trypan blue 1:1 (v/v) (Merck, Darmstadt, Germany).
2.4.2 Activity of continuous treatment with Calbenium©: a prophylactic approach
An IGN Mag system (Airel society, Champigny-sur-Marne, France) was connected to the CBR system since the first working day in order to evaluate the influence of a Calbenium© continuous treatment on the formation of polymicrobial biofilms. This IGN Mag system provided a continuous supply of Calbenium© (concentration 2% v/v) inside the CBR system.
IGN Mag systems are usually installed on dental chair units marketed by the Airel society in order to control the microbial development into DUWL. This system was chosen to be closer to real conditions of DUWL.
The one week overall cycle was that decribed above (section 2.2) except that
Calbenium© was added continuously (2% v/v) to the feeding suspension; no treatment was added for the control condition. CFU analyses were performed daily from the day following the start of the CBR/IGN Mag system (called D1 for Day 1 after the system launching). After the weekend of water stagnation, CFU analysis was performed thrice on the same day: i) first, before restarting the working cycle of our CBR/IGN Mag system (noted “D7 stag” for Day 7 and stagnation condition); ii) second, immediately after the first 30 min working cycle of the day (called “D7 stag + 1st cycle” ) and finally, iii) at the end of the day, so after 12 running cycles (called “D7 end of the day”). CFU counts were performed as previously described
(section 2.4.1).
184 | P a g e
2.5 Sterilization of coupons
At the end of experiments, coupons were removed and immersed in a bath of 70 % ethanol during one night before being sonicated 15 min, 50% amplitude (bioblock scientific,
Illkirch, France) in a bath of surfanios© (ANIOS, Lille, France). Coupons were then rinsed with sterile water, dried and stored until the next use.
2.6 Fluorescence imaging
After model running for one week as described in the section 2.2, coupons with polymicrobial biofilms were removed from the CBR and the architecture of obtained biofilms was investigated by fluorescence imaging; biofilm thickness related to P. aeruginosa on coupons periodically or continuously treated by Calbenium© and in control untreated ones were compared. A PNA FISH kit specific for Escherichia coli and P. aeruginosa was used
(KT007, AdvanDX, Vedbaek, Denmark). Experiments were performed in triplicates for each condition. Fixation was performed overnight at room temperature using the provided fixation solution and was finalized 20 min at 80°C (thermocycler blade T1, Biometra).The remaining fluorescence labelling procedure was made according to manufacturer's recommendations.
Microscopic observations were made using an Axio Observer A1 (Zeiss, France) coupled with an Apotome and equipped with a 20X/0.8 plan Apochromatic objective and a filter specific for P. aeruginosa labelling (Zeiss filter set 43). Images were analysed with the Zen software (Zeiss). On each coupon, five locations of 0.15 mm² were analyzed with a Z scan with a 1.2 µm interval (thickness of a focal plane as determined by the software). Due to the striated surface of coupons, measuring maximum biofilm thickness was not possible on entire images; consequently we performed analyses using five 2.5x10-3 mm² windows in planar areas in each image.
185 | P a g e
2.7 Statistical analysis
Pairwise comparisons between each studied condition were performed using Mann and Whitney tests.
3. Results
3.1 Activity of disinfectants against polymicrobial biofilms
3.1.1 Periodic treatment to eradicate preformed biofilms
The disinfectant efficacy was investigated by treating preformed polymicrobial biofilms for 15 min and enumerating culturable cells collected by vortexing the coupons coated with biofilm.
Regardless of the tested concentration, none of the studied disinfectants was able to totally eradicate P. aeruginosa cells (Fig. 1A). Oxygenal 6©, Sterispray© or Calbenium© decreased the bacterial concentration up to about 2.5 log of culturable cells compared to control (p<0.01). In addition, compared to control, significant P. aeruginosa concentration decreases were observed from 0.1% with Calbenium© and from 1% with both Sterispray© and
Oxygenal©. The strongest effects against P. aeruginosa were observed using Calbenium©,
Sterispray© and Oxygenal 6© from 0.5%, 2% and 3% (v/v) respectively.
Regarding the effect on C. albicans, significant decreases were also observed compared to control for Calbenium© at 0.1% and for both Sterispray© and Oxygenal© at 1%.
Calbenium© and Sterispray© totally eradicated C. albicans cells after a 15 min treatment using concentrations of at least 0.5% and 3% respectively (Fig. 1B). However, Oxygenal 6© was unable to totally eradicate yeasts.
186 | P a g e
Regarding V. vermiformis, no difference was observed between control and treated conditions, whatever the tested concentration and the studied disinfectant (p>0.05) (Fig. 1C).
Fig. 1: Activity of disinfectants against already formed polymicrobial biofilm after 15 min of exposure time. *p< 0.01 compared to control. 1A : activity on P. aeruginosa; 1B: activity on C. albicans and 1C: activity on V. Vermiformis.
3.1.2 Continuous treatment with Calbenium© to prevent biofilm formation
187 | P a g e
The continuous treatment with 2% Calbenium© (v/v) both delayed and limited P. aeruginosa growth within polymicrobial biofilms (concentrations ranging between 0.4 and
1.2 Log CFU / mm2) compared to the untreated condition (between 1.2 and 3.5 Log CFU / mm2) (Fig. 2A). However Calbenium© (2% v/v) did not totally prevent biofilm formation as bacteria were collected from biofilms as soon as the third day of CBR regular activity.
Despite a treatment during four day (day 1 to day 4), a successive 2 day-water stagnation period favoured the growth of P. aeruginosa in biofilms (comparing “D4” to “D7 stag” results for the treated condition: p=0.036, Figure 2A). A single flow cycle (continuous-flow for 12 min) using Calbenium at 2% (v/v) was not enough to totally eradicate P. aeruginosa (about
0.7 Log CFU / mm2 at “D7 stag + 1st cycle”, Figure 2A). However no culturable bacterial cell was isolated after 12 successive flow cycles (“D7 end of the day”, Figure 2A). In absence of treatment (control condition), the 2-days water stagnation period promoted P. aeruginosa growth in the biofilm (“D4” compared to “D7 stag”; p=0.037) but, this time, without
Calbenium©, the 12 successive cycles performed on the day following the stagnation period
(“D7 end of the day” condition) were clearly not sufficient to eliminate P. aeruginosa cells in biofilms.
Regarding C. albicans (Fig. 2B), no yeasts were isolated on coupons throughout the
Calbenium© continuous treatment, regardless of the conditions (regular activity or after stagnation period) whereas yeast concentrations ranged between 1.2 and 2.7 Log CFU / mm2 in biofilms removed from untreated control coupons. CBR regular activity favoured C. albicans growth in biofilms in absence of treatment as the yeast concentrations gradually increased during the 4-day period of activity (p<0.01). Stagnation contributed to the persistence of fungal cells in biofilms but did not promote their multiplication (results at D4 compared to those at D7 stag: p<0.01). Finally, in the case of untreated control coupons, the
188 | P a g e
12 successive cycles did not significantly reduce the concentration of culturable C. albicans cells (results at D7 stag +1st cycle compared to those at D7 end of the day: p=0.06).
Conversely, regarding V. vermiformis, no significant difference was observed throughout the experiment, by comparing treatment and control conditions: p values ranged between 0.07 and 0.18 (Fig. 2C). Amoebae concentrations were similar through the experiment, ranging between 1.5 and 2.6 Log CFU / mm2. Vermamoeba vermiformis concentrations increased until D4 and then seemed uninfluenced by both water stagnation and flush cycles.
Fig. 2: Preventive anti-biofilm activity of a continuous treatment of Calbenium© (2% v/v). D7 Stag: sampling was made after a week-end of water stagnation. D7 stag + 1st cycle: sampling was made after the first flow cycle consecutive to the condition « D7 stag ». D7 end of the day: sampling was made at the end of the corresponding running day. *p< 0.01 compared to control. 2A : activity against on P. aeruginosa; 2B: activity on C. albicans and 2C: activity on V. Vermiformis.
189 | P a g e
3.1.3 Effect of Calbenium© treatment on the biofilm thickness related to P. aeruginosa
The mean values for the biofilm thickness related to P. aeruginosa presence in polymicrobial biofilms were: 5.20, 5.36 and 1.56 µm for the control, the periodic (2% v/v, 15 min of time exposure) and the continuous preventive treatment to Calbenium© (2% v/v) respectively. A significant difference (p<0.01) was observed between results obtained for a preventive continuous treatment and those for the two other conditions (Figure 3).
Fig. 3: Imaging of Pseudomonas aeruginosa biofilm on the polymicrobial biofilms developed on striated PVC coupons. A: control; B: Calbenium© periodic treatment; C: Calbenium© continuous treatment. Left pannels: PNA FISH labelled P. aeruginosa biofilm distribution in one focal plane. Right pannels: three-dimensionnal rendering of the biofilm thickness (transparency projections across 10 µm depth).
190 | P a g e
4. Discussion
One of the goals of this work was to develop a polymicrobial biofilm model that would mimic DUWL. The flow cycle features were chosen to mimic the daily activity encountered inside DUWL. The three studied microorganisms forming these biofilms belonged to bacterial, fungal and protist groups and were representative of both environmental and human ways of contamination related to DUWL. Pseudomonas aeruginosa is frequently observed in
DUWL and is widely known to develop biofilms. Candida albicans is frequently isolated from human oral cavities and was chosen as representative of fungi. Vermamoeba vermiformis was included in our model due to its ubiquity in aquatic environments, its ability to interact with some bacteria such as Legionella spp., and importantly, to modify the susceptibility of C. albicans to disinfectants such as Oxygenal 6© (89).
In this study, complex biofilms were produced including prokaryote and eukaryote species and the activity of the studied disinfectants was investigated by focusing on their specific effect on each studied species. Generally, results showed a variable efficiency on mature mixed biofilm cells depending on the microbial species, the tested disinfectant and its concentration. Gradual effects were observed on P. aeruginosa cells according to the range of concentrations of the tested disinfectants used periodically, without inducing the total eradication of an already developed biofilm. Actually, the highest activity was obtained against C. albicans suggesting a higher susceptibility of this fungal species to disinfectants when compared the studied bacteria and protist. Regarding V. vermiformis growing in biofilms, no difference was observed after treatment compared to untreated controls whatever the tested conditions, suggesting the uselessness of the studied disinfectants against this FLA species. These results also agree with those previously obtained regarding the activity of
Oxygenal 6© against Candida mixed with V. vermiformis (89) and may be at least partially 191 | P a g e
explained by the ability of FLA to form cysts which resist to stress (194). The disinfectant efficacy may be improved by increasing the exposure time to treatments; however this would be certainly conflicting with the time available for DUWL maintenance. Overall, regarding the periodic treatment, Calbenium© showed the highest anti-biofilm activity against both C. albicans and P. aeruginosa, and its optimal activity was obtained from a concentration of
0.5% (v/v). Sterispray© appeared highly effective against both C. albicans and P. aeruginosa from 3% (v/v); finally the maximum activity of Oxygenal 6© against P. aeruginosa in biofilms was obtained from 3% (v/v) but it never reached to totally eradicate C. albicans in the tested range of concentrations. Some studies dealing with the efficacy of Oxygenal 6© reported that Oxygenal 6© is one of the most effective agents to meet with the CDC guidelines
(6, 66). However, to our knowledge, there is no available data in the literature concerning the efficacy of Calbenium© and Sterispray©, which explains the interest of our study to provide some comparative data. Our results showed that Calbenium© would reach its maximum of efficiency at the concentration recommended by the manufacturer (2%) and even before
(≥0.5%). Oxygenal 6© maximum activity was only observed using a higher concentration
(3%) than the one recommended by the manufacturer for continuous treatment (0.3% v/v).
Finally, the maximum efficacy of Sterispray© was reached also using a concentration higher than the one recommended by the manufacturer (3% instead of 1%).
As Calbenium© was the most effective treatment against pre-formed biofilms, its efficacy was then studied according to a continuous treatment in order to evaluate its interest to prevent biofilm formation. In order to be close to real conditions, an IGN Mag system was used for this prophylactic strategy. Based on both CFU counts and biofilm thickness measures related to the localization of P. aeruginosa in the polymicrobial biofilm, Calbenium© used as a continuous treatment was successfully able to limit biofilm development. We focused on P. aeruginosa as an indicator of the polymicrobial biofilm thickness due to its ubiquitous 192 | P a g e
presence in polymicrobial biofilms, as shown by scanning electron microscopy (SEM) images obtained during preliminary studies (data not shown). Continuous treatments would be effective to prevent biofilm development inside DUWL. In the case of experiments made under a continuous treatment, results obtained for control conditions clearly showed that, after a long water stagnation period, water flushes performed in the absence of a concomitant chemical treatment were unable to totally eradicate microbial cells detached from biofilms.
Finally, we successfully designed a dynamic model mimicking the DUWL conditions and enabling the development of a polymicrobial biofilm as encountered in real conditions of dental unit pipes; the influence of some disinfectants used by dentists in their DU was evaluated on each microbial species constituting this polymicrobial biofilm including bacteria, fungi and FLA. Generally our results showed the limited or incomplete activity of disinfectants against these important species. Overall, this highlights the need to better document the real activity of disinfectants used routinely for DU maintenance.
Conclusion
For the first time, efficacy of DUWL disinfectants was evaluated on a polymicrobial
biofilm model mimicking DUWL conditions and including bacteria, fungi and FLA.
For the first time, activities of Sterispray© and Calbenium© were studied.
Calbenium© was shown to be the most efficient on a pre-formed polymicrobial biofilm,
even at a concentration lower than those recommended by the manufacturer.
Unfortunately none of the studied treatments used periodically was able to fully eradicate
bacteria within the developed biofilms.
The efficacy of disinfectants was higher on fungal than on bacterial tested species.
Regarding Calbenium©, its use in a preventive way limits the biofilm formation. 193 | P a g e
Extended water flushing periods performed in the absence of disinfectant treatment were
poorly effective to prevent biofilm growth or to eliminate already formed biofilms.
Finally, no efficacy was obtained on FLA regardless of the studied conditions highlighting
the interest to include them in this type of studies and to control their development inside
DUWL to avoid direct or indirect human associated pathogenicity related to their presence.
Acknowledgments
We sincerely thank the Kavo, Gammasonic and Airel societies and more particularly Thierry
Rouleau, general manager, for providing the IGN Mag System. We also sincerely thank Dale
A. Shelton for kindly providing us the PNA FISH kit KT007, AdvanDX. All authors certified that this work was free of conflict of interest.
References
Arvand, M. and Hack, A., 2013. Microbial contamination of dental unit waterlines in dental practices in Hesse, Germany: A cross-sectional study. Eur J Microbiol Immunol (Bp) 3(1), 49-52. American Dental Association, 2012. Statement on dental unit waterlines. Available from: http://www.ada.org/1856.aspx [accessed August 2014]. Barbeau, J. and Buhler, T., 2001. Biofilms augment the number of free-living amoebae in dental unit waterlines. Res Microbiol 152(8), 753-760. Barbot, V., Costa, D., Deborde, M. and Imbert, C., 2014. Efficacy of dental unit disinfectants against Candida spp. and Hartmannella vermiformis. Pathog Dis 70(3):289-96. Barbot, V., Robert, A., Rodier, M.H. and Imbert, C., 2012. Update on infectious risks associated with dental unit waterlines. FEMS Immunol Med Microbiol 65(2), 196-204. Costa, D., Mercier, A., Gravouil, K., Lesobre, J., Delafont, V., Bousseau, A., Verdon, J. and Imbert, C., 2015. Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in dental unit waterlines. Water Res 81, 223-231. Dallolio, L., Scuderi, A., Rini, M.S., Valente, S., Farruggia, P., Sabattini, M.A., Pasquinelli, G., Acacci, A., Roncarati, G. and Leoni, E., 2014. Effect of different disinfection protocols on microbial and biofilm contamination of dental unit waterlines in community dental practices. Int J Environ Res Public Health 11(2), 2064-2076. Devine, D.A., Percival, R.S., Wood, D.J., Tuthill, T.J., Kite, P., Killington, R.A. and Marsh, P.D., 2007. Inhibition of biofilms associated with dentures and toothbrushes by tetrasodium EDTA. J Appl Microbiol 103(6), 2516-2524. Fouque, E., Héchard, Y., Hartemann, P., Humeau, P. and Trouilhé, M.C., 2015. Sensitivity of Vermamoeba (Hartmannella) vermiformis cysts to conventional disinfectants and protease. J Water Health 13(2), 302-310.
194 | P a g e
O'Donnell, M.J., Boyle, M.A., Russell, R.J. and Coleman, D.C., 2011. Management of dental unit waterline biofilms in the 21st century. Future Microbiol 6(10), 1209-1226. Pankhurst, C.L., 2003. Risk assessment of dental unit waterline contamination. Prim Dent Care 10(1), 5-10. Schel, A.J., Marsh, P.D., Bradshaw, D.J., Finney, M., Fulford, M.R., Frandsen, E., Østergaard, E., ten Cate, J.M., Moorer, W.R., Mavridou, A., Kamma, J.J., Mandilara, G., Stösser, L., Kneist, S., Araujo, R., Contreras, N., Goroncy-Bermes, P., O'Mullane, D., Burke, F., O'Reilly, P., Hourigan, G., O'Sullivan, M., Holman, R. and Walker, J.T., 2006. Comparison of the efficacies of disinfectants to control microbial contamination in dental unit water systems in general dental practices across the European Union. Appl Environ Microbiol 72(2), 1380-1387. Sissons, C.H., Cutress, T.W., Hoffman, M.P. and Wakefield, J.S., 1991. A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH, and mineralization. J Dent Res 70(11), 1409-1416. Szymanska, J., 2003. Biofilm and dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med 10(2), 151-157. Szymańska, J., 2005. Evaluation of mycological contamination of dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med 12(1), 153-155. Szymańska, J., Sitkowska, J. and Dutkiewicz, J., 2008. Microbial contamination of dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med 15(2), 173-179. Trabelsi, H., Sellami, A., Dendena, F., Sellami, H., Cheikh-Rouhou, F., Makni, F., Ben, D.S. and Ayadi, A., 2010. Free-living Amoebae (FLA): morphological and molecular identification of Acanthamoeba in dental unit water. Parasite 17(1), 67-70. Walker, J.T., Bradshaw, D.J., Bennett, A.M., Fulford, M.R., Martin, M.V. and Marsh, P.D., 2000. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol 66(8), 3363-3367.
3.2. Expériences complémentaires
3.2.1. Évaluation de l’influence de la présence de V. vermiformis dans un biofilm polymicrobien sur l’activité des désinfectants de LUSD
En complément des résultats figurant dans l’article ci-dessus, des expériences similaires ont été réalisées en absence de V. vermiformis. Ces travaux avaient pour objectif d’évaluer l’influence de la présence ou non de V. vermiformis sur l’activité des désinfectants sur le biofilm déjà formé. Le but était de vérifier si des interactions entre V. vermiformis et les 2 autres espèces du biofilm (P. aeruginosa et C. albicans) pouvaient influencer l’activité des désinfectants. Les résultats sont présentés sur les Figures 40 et 41 concernant l’activité au sein du biofilm mixte contre P. aeruginosa et C. albicans, respectivement.
195 | P a g e
À une exception près, aucune différence significative n’a été observée entre les conditions avec et sans V. vermiformis. En effet, en absence de V. vermiformis, C. albicans survit au sein du biofilm polymicrobien à une concentration en calbenium© allant jusqu’à 1% tandis qu’en présence de V. vermiformis, C. albicans survit à une concentration en calbenium© inférieure ou égale à 0,3% (Figure 40 A). Ainsi, la présence de V. vermiformis semble potentialiser l’activité du calbenium© sur C. albicans en biofilm polymicrobien.
Cependant, les valeurs très élevées de certains écarts-type rendent l’interprétation des résultats délicate. Malheureusement, même en répétant les essais, de grandes variabilités ont toujours été observées. D’ailleurs, même pour les conditions témoins, les écart-types obtenus sont élevés. Plusieurs hypothèses peuvent être évoquées. Un caractère aléatoire du taux de recouvrement des surfaces des coupons par le biofilm pourrait expliquer en partie les écarts-types importants. Le développement plus ou moins important de la MEC des biofilms, une composition différente de la MEC, la présence plus ou moins importante de cellules persistantes, les transferts génétiques au sein du biofilm polymicrobien ou encore la compétition entre P. aeruginosa et C. albicans pouvant être en faveur de l’une ou l’autre de ces espèces sont toutes des hypothèses susceptibles de contribuer à ces variations observées d’écart-types.
196 | P a g e
A 140% 120% 100% 80% 60% SansSans V. V.vermiformis vermiformis 40% AvecAvec V. V.vermiformis vermiformis
Pourcentagede survie 20% 0% calbenium©
Concentrations B 140% 120% 100% 80% 60% SansSans V. V.vermiformis vermiformis 40% AvecAvec V. V.vermiformis vermiformis Pourcentagede survie 20% 0% sterispray© C Concentrations 140%
120%
100%
80%
60% SansSans V. V.vermiformis vermiformis 40% AvecAvec V. V.vermiformis vermiformis Pourcentagede survie 20%
0% oxygenal©
Concentrations
Figure 40 Pourcentage de survie de P. aeruginosa au sein du biofilm mixte avec C. albicans en présence ou en absence de V. vermiformis après exposition à différents désinfectants pendant 15 min. A : calbenium B : sterispray C : oxygenal 197 | P a g e
A 140% 120%
100%
80%
60% SansSans V. V.vermiformis vermiformis 40% * AvecAvec V. V.vermiformis vermiformis Pourcentagede survie 20%
0%
calbenium© B Concentrations 140%
120%
100%
80%
60% SansSans V. vermiformisV. vermiformis 40% AvecAvec V. vermiformisV. vermiformis Pourcentagede survie 20%
0% sterispray©
Concentrations C 140% 120% 100% 80% 60% SansSans V. V.vermiformis vermiformis 40% AvecAvec V. V.vermiformis vermiformis Pourcentagede survie 20% 0%
oxygenal© Concentrations
Figure 41 Pourcentage de survie de C. albicans au sein du biofilm mixte avec P. aeruginosa en présence ou en absence de V. vermiformis après exposition à différents désinfectants pendant 15 min. A : calbenium B : sterispray C : oxygenal. * p<0,05 (Mann-Whitney) 198 | P a g e
3.2.2. Activité des désinfectants des LUSD sur V. vermiformis en condition planctonique
Devant la faible efficacité observée des désinfectants testés sur V. vermiformis en condition de biofilm polymicrobien (partie 3.1), une étude complémentaire de l’efficacité de ces désinfectants a été réalisée sur cette espèce amibienne en condition planctonique avec et sans la présence concomittente de P. aeruginosa et C. albicans. L’objectif était d’évaluer si la résistance observée de V. vermiformis aux désinfectants (partie 3.1) était liée aux conditions expérimentales ou si cette résistance se retrouvait quelques soient les conditions d’étude.
La Figure 42 représente le pourcentage de viabilité de V. vermiformis, en suspension seule en eau filtrée, en fonction d’une gamme de concentrations des différents désinfectants de LUSD testés (calbenium©, oxygenal 6© et sterispray©). L’efficacité obtenue est variable selon les traitements. En effet, l’oxygenal 6© est inefficace pour tuer V. vermiformis dans les conditions testées contrairement au calbenium© et au sterispray©. L’efficacité maximale (proche des 100% d’élimination aux écart-types près) a été obtenue pour une concentration supérieure ou égale à 0,5%, que ce soit pour le calbenium© ou le sterispray© (Figure 42).
Figure 42 Evaluation de l'efficacité du calbenium©, de l'oxygenal 6© et du sterispray© sur V. vermiformis dans l’eau filtrée en condition planctonique
199 | P a g e
Afin d’évaluer l’influence de la présence en condition planctonique de P. aeruginosa et/ou C. albicans sur l’efficacité du calbenium© vis-à-vis de V. vermiformis, des tests ont été réalisés. Ces tests ont été effectués en suspensions en eau filtrée additionnéee ou non de 5% de salive artificielle. Seuls les résultats obtenus avec le mélange eau filtrée + 5% de salive artificielle sont présentés sur la Figure 43, les résultats obtenus en eau filtrée seule étant similaires. Aucune influence particulière n’a été constatée : le calbenium© reste efficace pour tuer V. vermiformis même en suspension polymicrobienne (Figure 43). L’activité du sterispray© et de l’oxygenal 6© sur V. vermiformis en suspension polymicrobienne, selon le même principe, n’a pas encore été étudiée et le sera prochainement.
Figure 43 Activité du calbenium© sur V. vermiformis en suspension en eau filtrée + 5% de salive artificielle avec et sans co-incubation avec P. aeruginosa et C. albicans
Ainsi, contrairement aux résultats obtenus en biofilm polymicrobien (partie 3.1), en suspension, le calbenium© et le sterispray© sont efficaces contre V. vermiformis, en conditions mono comme polymicrobiennes. Cette espèce d’amibes libres apparait donc résistante naturellement à l’oxygenal 6© dans les conditions d’étude. L’oxygenal 6© agissant par oxydation contrairement au calbenium© et au sterispray© qui agissent par perturbation de l’intégrité membranaire, V. vermiformis semble peu sensible au stress oxydatif engendré par l’H2O2. En condition biofilm, la résistance amibienne aux désinfectants testés semble accrue, d’où l’intérêt de tester ces produits en condition biofilm avant commercialisation. La répartition des amibes
200 | P a g e
au sein du biofilm, ainsi que la consommation des désinfectants par l’ensemble des constituants du biofilm pourraient expliquer cette perte d’efficacité.
Au cours de cette seconde partie, un modèle mimant les conditions des LUSD a été mis au point afin de tester l’influence de différents matériaux (PVC, silicone, polyéthylène, teflon et polyuréthane), ainsi que l’activité de différents désinfectants (oxygenal 6©, calbenium©, sterispray©) sur la formation et le développement d’un biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD.
Les résultats ont montré que la biomasse totale du biofilm polymicrobien développée à la surface des coupons du réacteur n’était pas influencée par la nature des matériaux. Cependant, une différence dans la répartition des espèces microbiennes au sein du biofilm polymicrobien a été observée. Le développement de C. albicans au sein du biofilm polymicrobien semble limité sur des coupons en silicone ou en polyéthylène.
Une efficacité variable des désinfectants testés a été observée sur le biofilm polymicrobien développé dans les conditions mimant celles des LUSD. Le calbenium© est apparu être le plus efficace pour réduire un biofilm déjà formé dès la concentration 0,5% alors même que la concentration d’utilisation du calbenium© recommandée par son fabricant est de 2%. Le maximum d’activité du sterispray© a été observé pour une concentration légèrement supérieure à celle recommandée par son fabricant (2 vs 1% respectivement) tandis que l’oxygenal 6© s’est révélé moins efficace que les 2 autres produits et ceci même pour une concentration très supérieure à celle recommandée par son fabricant (10 vs 0,3% respectivement).
Les résultats ont également montré que le calbenium© était efficace en traitement prophylactique pour limiter la formation d’un biofilm polymicrobien dans le contexte des LUSD à la concentration d’usage recommandée par son fabricant (2%).
Si le calbenium© et le sterispray© se sont avérés efficaces contre V. vermiformis en suspension, aucun des désinfectants testés n’est apparu efficace sur V. vermiformis dans notre modèle mimant les LUSD et donc en condition de biofilm polymicrobien. Or, certaines amibes libres comme V. vermiformis peuvent abriter des bactéries à potentiel pathogène pour l’Homme comme L. pneumophila, d’où l’intérêt
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d’éliminer les amibes libres pour réduire le risque infectieux associé à l’exposition aux LUSD.
La plupart des produits vendus à l’heure actuelle comme désinfectants des LUSD le sont car ils répondent à des normes de bactéricidie ou de fongicidie qui ne paraissent finalement pas adaptées à la situation dans laquelle devront agir ces produits. En effet, nous avons vu que les LUSD étaient contaminées par des biofilms polymicrobiens. Or les normes auxquelles répondent les désinfectants des LUSD comme la NF EN 1040 sont le reflet de tests réalisés en suspension et qui par conséquent, ne sont pas adaptées au contexte d’utilisation de ces produits. Ainsi, il paraitrait judicieux de faire évoluer ces normes vers des tests réalisés en condition biofilm, impliquant plusieurs microorganismes différents et notamment des microorganismes communément retrouvés dans les LUSD (Pseudomonas, Propionibacterium, Mycobacteirum, Candida, Amibes libres…).
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Conclusion et perspectives
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Au cours de ces travaux de thèse, 2 axes complémentaires ont donc été développés concernant à la fois l’étude de la diversité microbienne réellement observée dans les LUSD et l’étude de l’activité de plusieurs traitements désinfectants, à la fois en conditions réelles d’utilisation sur des USD âgées de 8 à 12 ans, mais aussi en modèle de laboratoire sur un biofilm polymicrobien regroupant des représentants d’intérêt des catégories de microorganismes retrouvés dans les LUSD.
En effet, les LUSD se sont révélées être une niche favorable pour le développement et la persistance de microorganismes où bactéries, champignons microscopiques et amibes libres cohabitent. L’ensemble de ces microorganismes ont été détectés au cours de ces travaux et pour la première fois dans le domaine, une analyse exhaustive de la communauté bactérienne et fongique a été réalisée.
Concernant la communauté bactérienne, les phylums les plus représentés ont été les Proteo- ou les Actinobacteria. Les genres bactériens les plus représentés ont été Halomonas, Shewanella, Pseudomonas, Legionella, Stenotrophomonas, Propionibacteirum, Mycobacterium et Sphingobium. Les proportions observées variaient en fonction de la catégorie d’eau échantillonée (IW, OWS et OWA) mais aboutissent à une exposition en sortie d’USD à certains genres abritant des pathogènes opportunistes pour l’Homme comme Stenotrophomonas, Pseudomonas ou Mycobaterium… D’ailleurs certaines espèces pathogènes ont été détectées en proportions non négligeables dans les LUSD investiguées : S. maltophilia, P. aeruginosa, P. acnes ou encore M. abscessus/chelonae.
Concernant la communauté fongique, les principaux phylums fongiques représentés étaient les Asco- et Basidiomycètes. Et finalement, les LUSD investiguées se sont avérées principalement contaminées par des champignons d’origine environnementale ainsi que par des champignons du genre Candida, abritant lui aussi certaines espèces pathogènes opportunistes pour l’Homme ; toutefois, la présence de la principale espèce impliquée en pathologie humaine, C. albicans, n’a pas été observée dans les échantillons.
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Afin de compléter ces approches descriptives, un pyroséquençage amibien des échantillons a été envisagé mais il n’a pas pu être réalisé au cours de cette thèse. Il semblerait cependant pertinent de le réaliser par la suite afin de compléter la description de la communauté microbienne présente dans les LUSD et pourquoi pas de la mettre en relation avec les espèces bactériennes capables de résister à la phagocytose amibienne, comme par exemple les Légionelles. Ainsi, cela permettrait de justifier l’incorporation de certaines espèces d’amibes libres d’intérêt dans les normes utilisées pour évaluer l’activité antimicrobienne des désinfectants des LUSD. De plus, le fait d’être efficace sur ces amibes libres pourrait permettre une réduction de la présence d’espèces ARB à potentiel pathogène pour l’Homme dans les LUSD.
Des modifications de la densité et de la composition de la communauté microbienne ont été observées entre l’eau alimentant les USD et l’eau en sortie d’USD. Il y a donc, lors de la circulation de l’eau au sein d’une USD, une modification de la flore microbienne. La mise en évidence de la singularité de la communauté microbienne de l’eau de sortie de chaque USD indique que chaque cas est unique et que différents paramètres semblent intervenir ou interférer avec la composition de cette communauté microbienne. L’influence critique de la stagnation prolongée d’eau sur la composition et la densité microbienne a d’ailleurs été mise en évidence. D’autres paramètres interviennent probablement sur cette contamination microbiologique des LUSD comme par exemple, l’âge des USD, l’observance des recommendations ministérielles relatives à la réalisation des purges, la stérilisation des PIR, les différents produits de désinfection utilisés et leurs modalités d’utilisation. Au cours de cette thèse, ces derniers points ont été pointés du doigt. Il serait intéressant d’évaluer lesquels de ces paramètres influencent le plus cette contamination microbienne des LUSD. Cependant, ces paramètres sont nombreux et en conditions réelles d’utilisation, on note que généralement, plusieurs d’entre eux diffèrent simultanément entre deux USD. Il est donc par conséquent peu envisageable « d’isoler » chacun de ces paramètres ce qui rend malheureusement ce projet d’étude utopique. L’étude du développement de biofilms polymicrobiens sur différents matériaux dans le contexte des LUSD suggère une influence des matériaux sur les espèces composant le biofilm. Il pourrait être intéressant de compléter ces résultats en testant 205 | P a g e
l’influence des matériaux sur d’autres microorganismes désormais décrits comme couramment présents dans les LUSD grâce à nos travaux sur la diversité microbienne comme par exemple les mycobactéries. L’intérêt de matériaux sur lesquels auraient été préalablement greffés des susbtances antimicrobiennes pourrait également être étudié. Cependant, le développement et l’installation de ce type de matériaux dans le contexte des LUSD paraissent coûteux et probablement dysproportionnés par rapport au risque infectieux décrit et par rapport à des moyens plus simples de contrôle de la contamination microbienne des LUSD.
L’activité des différents traitements de désinfection des LUSD testés s’est avérée variable sur les microorganismes constitutifs d’un biofilm polymicrobien selon l’approche par modèlisation au laboratoire. De façon intéressante, le calbenium© et le sterispray© sont apparus plus efficaces que l’oxygenal©, lui-même étant décrit dans la littérature comme l’un des désinfectants les plus efficaces dans ce contexte. Cependant, aucun de ces 3 produits n’a fait preuve d’efficacité contre V. vermiformis en condition de biofilm polymicrobien contrairement aux tests réalisés en suspension. Ceci suggère l’intérêt de faire évoluer les normes utilisées comme référence pour l’activité microbicide de ces produits vers des tests en biofilms polymicrobiens. De plus, nous n’avons testé ces désinfectants que sur une souche de chaque espèce microbienne. Des études complémentaires pourraient être envisagées sur d’autres souches afin de confirmer les tendances observées. Par ailleurs, chaque désinfectant a été testé en utilisant une gamme de concentrations incluant les concentrations préconisées par les fournisseurs d’USD. Or, les résultats montrent que les concentrations préconisées par les fournisseurs ne sont pas toujours les plus actives contre les microorganismes inclus dans un biofilm polymicrobien. En effet, les concentrations les plus appropriées semblent être 0,5 et 3% respectivement pour le calbenium© et le sterispray©. Par contre, l’efficacité observée de l’oxygenal 6© n’est apparue que très limitée dans la gamme de concentration testée dépassant pourtant la concentration d’usage recommandée par son fournisseur (0,3%). De plus, l’intérêt d’initier les traitements désinfectants, en prophylaxie, dès l’installation d’un nouveau fauteuil a été démontré au cours des expériences de modélisation.
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Les études en conditions réelles de l’efficacité des traitements de désinfection sur des USD âgées de 8 à 12 ans ont montré l’incapacité de ces traitements chimiques à atteindre les seuils de contamination microbienne recommandés par l’ADA et les CDC en sortie d’USD. Ceci suggére potentiellement une adaptation de la communauté microbienne aux produits de désinfection utilisés et donc probablement le développement de résistances ou encore une incapacité des désinfectants à agir sur les biofilms développés dans les LUSD ou à atteindre les couches profondes de ces biofilms. Ces travaux ont néanmoins démontré l’intérêt de réaliser des traitements chocs avant la période de stagnation prolongée du week-end pour limiter l’effet néfaste de celle-ci, ainsi que l’intérêt de s’assurer d’une qualité microbiologique satisfaisante de l’eau alimentant les USD.
Afin d’évaluer les phénomènes de résistance, une étude par modélisation en laboratoire pourrait être envisagée sur le long terme (plusieurs mois) en utilisant un biofilm polymicrobien et en suivant l’évolution de la composition des communautés microbiennes constituant le biofilm au cours du temps. Il pourrait également être intéressant de faire une étude sur le long terme en conditions réelles en proposant à plusieurs praticiens de changer régulièrement de solution de désinfection dont les principes actifs n’auraient pas les mêmes mécanismes d’actions afin d’évaluer la sélection ou le développement consécutif d’espèces résistantes. Sur le même principe, il pourrait être proposé aux praticiens de réaliser des chocs hebdomadaires avec un désinfectant différent de celui utilisé pour le traitement continu des LUSD (au mécanisme d’action différent).
De plus, afin de compléter ces travaux, une étude de l’activité de ces désinfectants pourrait être envisagée sur les autres espèces microbiennes retrouvées comme majoritaire dans les USD comme les Propionibactéries ou encore les Mycobactéries qui sont connues comme des pathogènes émergents à l’heure actuelle.
En résumé, les LUSD sont contaminées par une diversité microbienne importante exposant les patients et les soignants, parfois en forte proportions, à une eau en sortie d’USD chargée en microorganismes dont certains peuvent être des 207 | P a g e
pathogènes opportunistes de l’Homme. Cela suggère l’intérêt de veiller à maintenir une qualité microbiologique satisfaisante de l’eau sortant des USD d’autant plus que les populations exposées sont de plus en plus souvent des sujets déjà fragilisés sur le plan immunitaire. Pour atteindre cet objectif, une combinaison de plusieurs actions semble judicieuse : s’assurer d’une bonne qualité microbiologique de l’eau dès le départ, par exemple par l’utilisation de filtres sur l’eau alimentant les USD et surtout par l’entretien régulier de ces filtres; traiter chimiquement en continu les LUSD et ceci dès l’installation d’une nouvelle USD ; et également réaliser des traitements chocs des LUSD avant les périodes de stagnation prolongée. Il paraîtrait également judicieux d’alterner des traitements chimiques présentant un mécanisme d’action différent afin de limiter les phénomènes de résistance. Enfin, il parait essentiel de sensibiliser les chirurgiens dentistes à ces risques et donc aux recommendations concernant la réalisation de purge et la stérilisation des PIR.
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Bibliographie
1. Coleman DC, O’Donnell, M.J., Miller, A.S., Boyle M.A. Minimising microbial contamination in dental unit water systems and microbial control in dental hospitals. In : Walker, JH (Eds), Decontamination in Hospitals and Healthcare Woodhead Publishing Limited University of Leeds, UK2014. p. 166-207. 2. Richaud-Morel B BE, Arlin LR, Perrin C, Faoro B. Prévention des infections associées aux soins en chirurgie dentaire dans les établissements de santé. 2011. 3. Yabune T, Imazato S, Ebisu S. Inhibitory effect of PVDF tubes on biofilm formation in dental unit waterlines. Dent Mater. 2005;21(8):780-6. 4. Walker JT, Bradshaw DJ, Finney M, Fulford MR, Frandsen E, ØStergaard E, et al. Microbiological evaluation of dental unit water systems in general dental practice in Europe. Eur J Oral Sci. 2004;112(5):412-8. 5. Coleman DC, O'Donnell MJ, Shore AC, Russell RJ. Biofilm problems in dental unit water systems and its practical control. J Appl Microbiol. 2009;106(5):1424-37. 6. O'Donnell MJ, Boyle MA, Russell RJ, Coleman DC. Management of dental unit waterline biofilms in the 21st century. Future Microbiol. 2011;6(10):1209-26. 7. Pankhurst CL, Coulter WA. Do contaminated dental unit waterlines pose a risk of infection? J Dent. 2007;35(9):712-20. 8. Szymanska J. Biofilm and dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med. 2003;10(2):151-7. 9. Szymańska J, Sitkowska J, Dutkiewicz J. Microbial contamination of dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med. 2008;15(2):173-9. 10. Szymańska J. Evaluation of mycological contamination of dental unit waterlines. Ann Agric Environ Med. 2005;12(1):153-5. 11. Ganguly S, Mitchell AP. Mucosal biofilms of Candida albicans. Curr Opin Microbiol. 2011;14(4):380-5. 12. Berlutti F, Testarelli L, Vaia F, De Luca M, Dolci G. Efficacy of anti-retraction devices in preventing bacterial contamination of dental unit water lines. J Dent. 2003;31(2):105-10. 13. Tuttlebee CM, O'Donnell MJ, Keane CT, Russell RJ, Sullivan DJ, Falkiner F, et al. Effective control of dental chair unit waterline biofilm and marked reduction of bacterial contamination of output water using two peroxide-based disinfectants. J Hosp Infect. 2002;52(3):192-205. 14. Petti S, Tarsitani G. Detection and quantification of dental unit water line contamination by oral streptococci. Infect Control Hosp Epidemiol. 2006;27(5):504-9. 15. Santé DGDL. Guide de prévention des infections liées aux soins réalisés en chirurgie dentaire et stomatologie. Ministère de la santé et des solidarités, Direction générale de la santé, Conseil supérieur d'hygiène publique de France, Deuxième édition.juin 2006. 16. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999;284(5418):1318-22. 17. Ramage G, Rajendran R, Sherry L, Williams C. Fungal biofilm resistance. Int J Microbiol. 2012;2012:528521. 18. Giaouris E, Heir E, Desvaux M, Hébraud M, Møretrø T, Langsrud S, et al. Intra- and inter- species interactions within biofilms of important foodborne bacterial pathogens. Front Microbiol. 2015;6:841. 19. Zarnowski R, Westler WM, Lacmbouh GA, Marita JM, Bothe JR, Bernhardt J, et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 2014;5(4):e01333-14. 20. Sutherland I. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology. 2001;147(Pt 1):3-9.
209 | P a g e
21. Pratt LA, Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol Microbiol. 1998;30(2):285-93. 22. Danese PN, Pratt LA, Kolter R. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture. J Bacteriol. 2000;182(12):3593-6. 23. Farfan MJ, Cantero L, Vergara A, Vidal R, Torres AG. The long polar fimbriae of STEC O157:H7 induce expression of pro-inflammatory markers by intestinal epithelial cells. Vet Immunol Immunopathol. 2013;152(1-2):126-31. 24. Ma L, Conover M, Lu H, Parsek MR, Bayles K, Wozniak DJ. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathog. 2009;5(3):e1000354. 25. Vogeleer P, Tremblay YD, Mafu AA, Jacques M, Harel J. Life on the outside: role of biofilms in environmental persistence of Shiga-toxin producing Escherichia coli. Front Microbiol. 2014;5:317. 26. Filloux A, Vallet I. [Biofilm: set-up and organization of a bacterial community]. Med Sci (Paris). 2003;19(1):77-83. 27. Martínez LC, Vadyvaloo V. Mechanisms of post-transcriptional gene regulation in bacterial biofilms. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:38. 28. Flemming HC, Wingender J. Relevance of microbial extracellular polymeric substances (EPSs)- -Part II: Technical aspects. Water Sci Technol. 2001;43(6):9-16. 29. Costerton JW, Lewandowski Z, DeBeer D, Caldwell D, Korber D, James G. Biofilms, the customized microniche. J Bacteriol. 1994;176(8):2137-42. 30. Wingender J, Flemming HC. Biofilms in drinking water and their role as reservoir for pathogens. Int J Hyg Environ Health. 2011;214(6):417-23. 31. Terada A, Hibiya K, Nagai J, Tsuneda S, Hirata A. Nitrogen removal characteristics and biofilm analysis of a membrane-aerated biofilm reactor applicable to high-strength nitrogenous wastewater treatment. J Biosci Bioeng. 2003;95(2):170-8. 32. Ramage G, Vande Walle K, Wickes BL, López-Ribot JL. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 2001;45(9):2475-9. 33. Tré-Hardy M, Vanderbist F, Traore H, Devleeschouwer MJ. In vitro activity of antibiotic combinations against Pseudomonas aeruginosa biofilm and planktonic cultures. Int J Antimicrob Agents. 2008;31(4):329-36. 34. Madsen JS, Burmølle M, Hansen LH, Sørensen SJ. The interconnection between biofilm formation and horizontal gene transfer. FEMS Immunol Med Microbiol. 2012;65(2):183-95. 35. Peters BM, Jabra-Rizk MA, O'May GA, Costerton JW, Shirtliff ME. Polymicrobial interactions: impact on pathogenesis and human disease. Clin Microbiol Rev. 2012;25(1):193-213. 36. Rmaile A, Carugo D, Capretto L, Wharton JA, Thurner PJ, Aspiras M, et al. An experimental and computational study of the hydrodynamics of high-velocity water microdrops for interproximal tooth cleaning. J Mech Behav Biomed Mater. 2015;46:148-57. 37. Tierra G, Pavissich JP, Nerenberg R, Xu Z, Alber MS. Multicomponent model of deformation and detachment of a biofilm under fluid flow. J R Soc Interface. 2015;12(106). 38. Peterson BW, He Y, Ren Y, Zerdoum A, Libera MR, Sharma PK, et al. Viscoelasticity of biofilms and their recalcitrance to mechanical and chemical challenges. FEMS Microbiol Rev. 2015;39(2):234- 45. 39. Rupp CJ, Fux CA, Stoodley P. Viscoelasticity of Staphylococcus aureus biofilms in response to fluid shear allows resistance to detachment and facilitates rolling migration. Appl Environ Microbiol. 2005;71(4):2175-8. 40. Nett JE, Sanchez H, Cain MT, Andes DR. Genetic basis of Candida biofilm resistance due to drug-sequestering matrix glucan. J Infect Dis. 2010;202(1):171-5. 41. Al-Fattani MA, Douglas LJ. Biofilm matrix of Candida albicans and Candida tropicalis: chemical composition and role in drug resistance. J Med Microbiol. 2006;55(Pt 8):999-1008.
210 | P a g e
42. Sanchez-Vizuete P, Orgaz B, Aymerich S, Le Coq D, Briandet R. Pathogens protection against the action of disinfectants in multispecies biofilms. Front Microbiol. 2015;6:705. 43. Lindsay D, Brözel VS, Mostert JF, von Holy A. Differential efficacy of a chlorine dioxide- containing sanitizer against single species and binary biofilms of a dairy-associated Bacillus cereus and a Pseudomonas fluorescens isolate. J Appl Microbiol. 2002;92(2):352-61. 44. Simões M, Simões LC, Vieira MJ. Species association increases biofilm resistance to chemical and mechanical treatments. Water Res. 2009;43(1):229-37. 45. van der Veen S, Abee T. Generation of variants in Listeria monocytogenes continuous-flow biofilms is dependent on radical-induced DNA damage and RecA-mediated repair. PLoS One. 2011;6(12):e28590. 46. Lewis K. Persister cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry (Mosc). 2005;70(2):267-74. 47. Lewis K. Persister cells. Annu Rev Microbiol. 2010;64:357-72. 48. Barraud N, Buson A, Jarolimek W, Rice SA. Mannitol enhances antibiotic sensitivity of persister bacteria in Pseudomonas aeruginosa biofilms. PLoS One. 2013;8(12):e84220. 49. Szymańska J. Microbiological risk factors in dentistry. Current status of knowledge. Ann Agric Environ Med. 2005;12(2):157-63. 50. Barbot V, Robert A, Rodier MH, Imbert C. Update on infectious risks associated with dental unit waterlines. FEMS Immunol Med Microbiol. 2012;65(2):196-204. 51. Barbeau J, Tanguay R, Faucher E, Avezard C, Trudel L, Côté L, et al. Multiparametric analysis of waterline contamination in dental units. Appl Environ Microbiol. 1996;62(11):3954-9. 52. Williams HN, Johnson A, Kelley JI, Baer ML, King TS, Mitchell B, et al. Bacterial contamination of the water supply in newly installed dental units. Quintessence Int. 1995;26(5):331-7. 53. Arvand M, Hack A. Microbial contamination of dental unit waterlines in dental practices in Hesse, Germany: A cross-sectional study. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2013;3(1):49-52. 54. Kadaifciler DG, Ökten S, Sen B. Mycological contamination in dental unit waterlines in Istanbul, Turkey. Braz J Microbiol. 2013;44(3):977-81. 55. Kumar S, Atray D, Paiwal D, Balasubramanyam G, Duraiswamy P, Kulkarni S. Dental unit waterlines: source of contamination and cross-infection. J Hosp Infect. 2010;74(2):99-111. 56. Chate RA. An audit improves the quality of water within the dental unit water lines of general dental practices across the East of England. Br Dent J. 2010;209(7):E11. 57. Robert A, Bousseau A, Costa D, Barbot V, Imbert C. Are dentists enough aware of infectious risk associated with dental unit waterlines ? Bull Group Int Rech Sci Stomatol Odontol. 2013;52(1):e29-34. 58. Comité technique nationale des infections nosocomiales et des infections liées aux soins. Risque infectieux et soins dentaires. 2006. 59. Rice EW, Rich WK, Johnson CH, Lye DJ. The role of flushing dental water lines for the removal of microbial contaminants. Public Health Rep. 2006;121(3):270-4. 60. Cobb CM, Martel CR, McKnight SA, Pasley-Mowry C, Ferguson BL, Williams K. How does time- dependent dental unit waterline flushing affect planktonic bacteria levels? J Dent Educ. 2002;66(4):549-55. 61. Murdoch-Kinch CA, Andrews NL, Atwan S, Jude R, Gleason MJ, Molinari JA. Comparison of dental water quality management procedures. J Am Dent Assoc. 1997;128(9):1235-43. 62. Pankhurst CL, Philpott-Howard JN, Hewitt JH, Casewell MW. The efficacy of chlorination and filtration in the control and eradication of Legionella from dental chair water systems. J Hosp Infect. 1990;16(1):9-18. 63. Fiehn NE, Larsen T. The effect of drying dental unit waterline biofilms on the bacterial load of dental unit water. Int Dent J. 2002;52(4):251-4. 64. Depaola LG, Mangan D, Mills SE, Costerton W, Barbeau J, Shearer B, et al. A review of the science regarding dental unit waterlines. J Am Dent Assoc. 2002;133(9):1199-206; quiz 260.
211 | P a g e
65. Kettering JD, Stephens JA, Muñoz-Viveros CA, Naylor WP. Reducing bacterial counts in dental unit waterlines: tap water versus distilled water. J Contemp Dent Pract. 2002;3(3):1-9. 66. Schel AJ, Marsh PD, Bradshaw DJ, Finney M, Fulford MR, Frandsen E, et al. Comparison of the efficacies of disinfectants to control microbial contamination in dental unit water systems in general dental practices across the European Union. Appl Environ Microbiol. 2006;72(2):1380-7. 67. Szymańska J. Bacterial decontamination of DUWL biofilm using Oxygenal 6. Ann Agric Environ Med. 2006;13(1):163-7. 68. O'Donnell MJ, Boyle M, Swan J, Russell RJ, Coleman DC. A centralised, automated dental hospital water quality and biofilm management system using neutral Ecasol maintains dental unit waterline output at better than potable quality: a 2-year longitudinal study. J Dent. 2009;37(10):748- 62. 69. Bagga BS, Murphy RA, Anderson AW, Punwani I. Contamination of dental unit cooling water with oral microorganisms and its prevention. J Am Dent Assoc. 1984;109(5):712-6. 70. Scully C, Greenspan JS. Human immunodeficiency virus (HIV) transmission in dentistry. J Dent Res. 2006;85(9):794-800. 71. InVS. Analyse du risque infectieux lié à la non stérilisation entre chaque patient des PIR en chirurgie dentaire. 2009. 72. Hancocks S. A risky business. Br Dent J. 2010;209(10):483. 73. Wallace RJ, Swenson JM, Silcox VA, Good RC, Tschen JA, Stone MS. Spectrum of disease due to rapidly growing mycobacteria. Rev Infect Dis. 1983;5(4):657-79. 74. Martin MV. The significance of the bacterial contamination of dental unit water systems. Br Dent J. 1987;163(5):152-4. 75. Atlas RM, Williams JF, Huntington MK. Legionella contamination of dental-unit waters. Appl Environ Microbiol. 1995;61(4):1208-13. 76. Barbeau J. Lawsuit against a dentist related to serious ocular infection possibly linked to water from a dental handpiece. J Can Dent Assoc. 2007;73(7):618-22. 77. Ricci ML, Fontana S, Pinci F, Fiumana E, Pedna MF, Farolfi P, et al. Pneumonia associated with a dental unit waterline. Lancet. 2012;379(9816):684. 78. Fotos PG, Westfall HN, Snyder IS, Miller RW, Mutchler BM. Prevalence of Legionella-specific IgG and IgM antibody in a dental clinic population. J Dent Res. 1985;64(12):1382-5. 79. Putnins EE, Di Giovanni D, Bhullar AS. Dental unit waterline contamination and its possible implications during periodontal surgery. J Periodontol. 2001;72(3):393-400. 80. Singh TS, Bello B, Mabe OD, Renton K, Jeebhay MF. Workplace determinants of endotoxin exposure in dental healthcare facilities in South Africa. Ann Occup Hyg. 2010;54(3):299-308. 81. Michel O, Kips J, Duchateau J, Vertongen F, Robert L, Collet H, et al. Severity of asthma is related to endotoxin in house dust. Am J Respir Crit Care Med. 1996;154(6 Pt 1):1641-6. 82. Pankhurst CL, Coulter W, Philpott-Howard JN, Surman-Lee S, Warburton F, Challacombe S. Evaluation of the potential risk of occupational asthma in dentists exposed to contaminated dental unit waterlines. Prim Dent Care. 2005;12(2):53-9. 83. Walker JT, Bradshaw DJ, Bennett AM, Fulford MR, Martin MV, Marsh PD. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol. 2000;66(8):3363-7. 84. Trabelsi H, Sellami A, Dendena F, Sellami H, Cheikh-Rouhou F, Makni F, et al. Free-living Amoebae (FLA): morphological and molecular identification of Acanthamoeba in dental unit water. Parasite. 2010;17(1):67-70. 85. Hogan DA, Kolter R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 2002;296(5576):2229-32. 86. Holcombe LJ, McAlester G, Munro CA, Enjalbert B, Brown AJ, Gow NA, et al. Pseudomonas aeruginosa secreted factors impair biofilm development in Candida albicans. Microbiology. 2010;156(Pt 5):1476-86.
212 | P a g e
87. Méar JB, Kipnis E, Faure E, Dessein R, Schurtz G, Faure K, et al. Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interactions: more than an opportunistic criminal association? Med Mal Infect. 2013;43(4):146-51. 88. Xu L, Wang F, Shen Y, Hou H, Liu W, Liu C, et al. Pseudomonas aeruginosa inhibits the growth of pathogenic fungi: In vitro and in vivo studies. Exp Ther Med. 2014;7(6):1516-20. 89. Barbot V, Costa D, Deborde M, Imbert C. Efficacy of dental unit disinfectants against Candida spp. and Hartmannella vermiformis. Pathog Dis. 2014. 90. Cross A, Allen JR, Burke J, Ducel G, Harris A, John J, et al. Nosocomial infections due to Pseudomonas aeruginosa: review of recent trends. Rev Infect Dis. 1983;5 Suppl 5:S837-45. 91. Enquête Nationale De Prévalence. Ministère de la santé, InVS, ARLIN, CCLIN; 2012. 92. Engler K, Mühlemann K, Garzoni C, Pfahler H, Geiser T, von Garnier C. Colonisation with Pseudomonas aeruginosa and antibiotic resistance patterns in COPD patients. Swiss Med Wkly. 2012;142:w13509. 93. C.Cattoen. Epidémiologies des infections à Pseudomonas. http://www.infectio- lille.com/diaporamas/DUAC/pyo-DUAC09-Cattoen.pdf2009. [accessed january 2015] 94. Gellatly SL, Hancock RE. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 2013;67(3):159-73. 95. McCarthy K. Pseudomonas aeruginosa: evolution of antimicrobial resistance and implications for therapy. Semin Respir Crit Care Med. 2015;36(1):44-55. 96. Moazami Goudarzi S, Eftekhar F. Multidrug resistance and integron carriage in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Tehran, Iran. Turk J Med Sci. 2015;45(4):789-93. 97. Haiko J, Westerlund-Wikström B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2013;2(4):1242-67. 98. Kearns DB. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 2010;8(9):634-44. 99. O'Toole GA, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 1998;30(2):295-304. 100. Giraud C, Bernard C, Ruer S, De Bentzmann S. Biological 'glue' and 'Velcro': molecular tools for adhesion and biofilm formation in the hairy and gluey bug Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 2010;2(3):343-58. 101. Giraud C, Bernard CS, Calderon V, Yang L, Filloux A, Molin S, et al. The PprA-PprB two- component system activates CupE, the first non-archetypal Pseudomonas aeruginosa chaperone- usher pathway system assembling fimbriae. Environ Microbiol. 2011;13(3):666-83. 102. Lynn WA, Golenbock DT. Lipopolysaccharide antagonists. Immunol Today. 1992;13(7):271-6. 103. Ramachandran G. Gram-positive and gram-negative bacterial toxins in sepsis: a brief review. Virulence. 2014;5(1):213-8. 104. Veesenmeyer JL, Hauser AR, Lisboa T, Rello J. Pseudomonas aeruginosa virulence and therapy: evolving translational strategies. Crit Care Med. 2009;37(5):1777-86. 105. Kipnis E, Sawa T, Wiener-Kronish J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Med Mal Infect. 2006;36(2):78-91. 106. Shirtliff ME, Mader JT, Camper AK. Molecular interactions in biofilms. Chem Biol. 2002;9(8):859-71. 107. S. Bricha KO, S. Oulkheir, N. E. EL Haloui, B. Attarassi. Virulence factors and epidemiology related to Pseudomonas aeruginosa. Revue Tunisienne d’Infectiologie. 2009. 108. Visca P, Imperi F, Lamont IL. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends Microbiol. 2007;15(1):22-30. 109. Gasser V, Guillon L, Cunrath O, Schalk IJ. Cellular organization of siderophore biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa: Evidence for siderosomes. J Inorg Biochem. 2015;148:27-34. 110. Britigan BE, Roeder TL, Rasmussen GT, Shasby DM, McCormick ML, Cox CD. Interaction of the Pseudomonas aeruginosa secretory products pyocyanin and pyochelin generates hydroxyl radical
213 | P a g e
and causes synergistic damage to endothelial cells. Implications for Pseudomonas-associated tissue injury. J Clin Invest. 1992;90(6):2187-96. 111. Mentel M, Ahuja EG, Mavrodi DV, Breinbauer R, Thomashow LS, Blankenfeldt W. Of two make one: the biosynthesis of phenazines. Chembiochem. 2009;10(14):2295-304. 112. Rasamiravaka T, Labtani Q, Duez P, El Jaziri M. The formation of biofilms by Pseudomonas aeruginosa: a review of the natural and synthetic compounds interfering with control mechanisms. Biomed Res Int. 2015;2015:759348. 113. Wolska KI, Grudniak AM, Rudnicka Z, Markowska K. Genetic control of bacterial biofilms. J Appl Genet. 2015. 114. Wagner VE, Bushnell D, Passador L, Brooks AI, Iglewski BH. Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing regulons: effects of growth phase and environment. J Bacteriol. 2003;185(7):2080-95. 115. Boles BR, Thoendel M, Singh PK. Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol Microbiol. 2005;57(5):1210-23. 116. Hengge R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nat Rev Microbiol. 2009;7(4):263-73. 117. Merighi M, Lee VT, Hyodo M, Hayakawa Y, Lory S. The second messenger bis-(3'-5')-cyclic- GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 2007;65(4):876-95. 118. McDougald D, Rice SA, Barraud N, Steinberg PD, Kjelleberg S. Should we stay or should we go: mechanisms and ecological consequences for biofilm dispersal. Nat Rev Microbiol. 2012;10(1):39- 50. 119. Ventre I, Goodman AL, Vallet-Gely I, Vasseur P, Soscia C, Molin S, et al. Multiple sensors control reciprocal expression of Pseudomonas aeruginosa regulatory RNA and virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(1):171-6. 120. Chambers JR, Sauer K. Small RNAs and their role in biofilm formation. Trends Microbiol. 2013;21(1):39-49. 121. Irie Y, Starkey M, Edwards AN, Wozniak DJ, Romeo T, Parsek MR. Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix polysaccharide Psl is regulated transcriptionally by RpoS and post-transcriptionally by RsmA. Mol Microbiol. 2010;78(1):158-72. 122. Mulcahy LR, Isabella VM, Lewis K. Pseudomonas aeruginosa biofilms in disease. Microb Ecol. 2014;68(1):1-12. 123. Fazli M, Bjarnsholt T, Kirketerp-Møller K, Jørgensen B, Andersen AS, Krogfelt KA, et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. J Clin Microbiol. 2009;47(12):4084-9. 124. Bousbia S, Raoult D, La Scola B. Pneumonia pathogen detection and microbial interactions in polymicrobial episodes. Future Microbiol. 2013;8(5):633-60. 125. Millar FA, Simmonds NJ, Hodson ME. Trends in pathogens colonising the respiratory tract of adult patients with cystic fibrosis, 1985-2005. J Cyst Fibros. 2009;8(6):386-91. 126. Moore JE, Shaw A, Millar BC, Downey DG, Murphy PG, Elborn JS. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung: does microflora type influence microbial loading? Br J Biomed Sci. 2005;62(4):175-8. 127. Barsoumian AE, Mende K, Sanchez CJ, Beckius ML, Wenke JC, Murray CK, et al. Clinical infectious outcomes associated with biofilm-related bacterial infections: a retrospective chart review. BMC Infect Dis. 2015;15:223. 128. Gristina AG, Costerton JW. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J Bone Joint Surg Am. 1985;67(2):264-73. 129. Peleg AY, Hooper DC. Hospital-acquired infections due to gram-negative bacteria. N Engl J Med. 2010;362(19):1804-13.
214 | P a g e
130. Breathnach AS, Cubbon MD, Karunaharan RN, Pope CF, Planche TD. Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa outbreaks in two hospitals: association with contaminated hospital waste- water systems. J Hosp Infect. 2012;82(1):19-24. 131. Falkinham JO, Pruden A, Edwards M. Opportunistic Premise Plumbing Pathogens: Increasingly Important Pathogens in Drinking Water. Pathogens. 2015;4(2):373-86. 132. Loveday HP, Wilson JA, Kerr K, Pitchers R, Walker JT, Browne J. Association between healthcare water systems and Pseudomonas aeruginosa infections: a rapid systematic review. J Hosp Infect. 2014;86(1):7-15. 133. Koehnke A, Friedrich RE. Review: Antibiotic discovery in the age of structural biology - a comprehensive overview with special reference to development of drugs for the treatment of Pseudomonas aeruginosa infection. In Vivo. 2015;29(2):161-7. 134. Strateva T, Yordanov D. Pseudomonas aeruginosa - a phenomenon of bacterial resistance. J Med Microbiol. 2009;58(Pt 9):1133-48. 135. Mena KD, Gerba CP. Risk assessment of Pseudomonas aeruginosa in water. Rev Environ Contam Toxicol. 2009;201:71-115. 136. Pyle BH, McFeters GA. Iodine sensitivity of bacteria isolated from iodinated water systems. Can J Microbiol. 1989;35(4):520-3. 137. Aspinall ST, Graham R. Two sources of contamination of a hydrotherapy pool by environmental organisms. J Hosp Infect. 1989;14(4):285-92. 138. Vess RW, Anderson RL, Carr JH, Bond WW, Favero MS. The colonization of solid PVC surfaces and the acquisition of resistance to germicides by water micro-organisms. J Appl Bacteriol. 1993;74(2):215-21. 139. Ghannoum MA, Jurevic RJ, Mukherjee PK, Cui F, Sikaroodi M, Naqvi A, et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathog. 2010;6(1):e1000713. 140. Cannon RD, Holmes AR, Mason AB, Monk BC. Oral Candida: clearance, colonization, or candidiasis? J Dent Res. 1995;74(5):1152-61. 141. Association Française des Enseignants de Parasitologie et Mycologie (ANOFEL). Candidoses. 2014. http://campus.cerimes.fr/parasitologie/enseignement/candidoses/site/html/cours.pdf. [accessed March 2015]. 142. Douglas LJ. Candida biofilms and their role in infection. Trends Microbiol. 2003;11(1):30-6. 143. Alp S, Arikan-Akdagli S, Gulmez D, Ascioglu S, Uzun O, Akova M. Epidemiology of candidaemia in a tertiary care university hospital: 10-year experience with 381 candidaemia episodes between 2001 and 2010. Mycoses. 2015;58(8):498-505. 144. Modrzewska B, Kurnatowski P. Adherence of Candida sp. to host tissues and cells as one of its pathogenicity features. Ann Parasitol. 2015;61(1):3-9. 145. Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK, Hoyer LL, McCormick T, Ghannoum MA. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J Bacteriol. 2001;183(18):5385-94. 146. Finkel JS, Mitchell AP. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nat Rev Microbiol. 2011;9(2):109-18. 147. Alem MA, Oteef MD, Flowers TH, Douglas LJ. Production of tyrosol by Candida albicans biofilms and its role in quorum sensing and biofilm development. Eukaryot Cell. 2006;5(10):1770-9. 148. Martins M, Henriques M, Azeredo J, Rocha SM, Coimbra MA, Oliveira R. Morphogenesis control in Candida albicans and Candida dubliniensis through signaling molecules produced by planktonic and biofilm cells. Eukaryot Cell. 2007;6(12):2429-36. 149. Ghosh S, Kebaara BW, Atkin AL, Nickerson KW. Regulation of aromatic alcohol production in Candida albicans. Appl Environ Microbiol. 2008;74(23):7211-8. 150. Ramage G, Saville SP, Wickes BL, López-Ribot JL. Inhibition of Candida albicans biofilm formation by farnesol, a quorum-sensing molecule. Appl Environ Microbiol. 2002;68(11):5459-63.
215 | P a g e
151. InVS. www.invs.sante.fr/content/download/23142/.../fiche_Candida_web.pdf2013 [accessed january 2015] 152. Baillie GS, Douglas LJ. Effect of growth rate on resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents. Antimicrob Agents Chemother. 1998;42(8):1900-5. 153. Ramage G, VandeWalle K, López-Ribot JL, Wickes BL. The filamentation pathway controlled by the Efg1 regulator protein is required for normal biofilm formation and development in Candida albicans. FEMS Microbiol Lett. 2002;214(1):95-100. 154. Niimi M. Characterization of the multi-drug efflux systems of pathogenic fungi using functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi. 2010;51(2):79- 86. 155. Mukherjee PK, Chandra J, Kuhn DM, Ghannoum MA. Mechanism of fluconazole resistance in Candida albicans biofilms: phase-specific role of efflux pumps and membrane sterols. Infect Immun. 2003;71(8):4333-40. 156. LaFleur MD, Kumamoto CA, Lewis K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50(11):3839-46. 157. Sisti M, Brandi G, De Santi M, Rinaldi L, Schiavano GF. Disinfection efficacy of chlorine and peracetic acid alone or in combination against Aspergillus spp. and Candida albicans in drinking water. J Water Health. 2012;10(1):11-9. 158. Cauda R. Candidaemia in patients with an inserted medical device. Drugs. 2009;69 Suppl 1:33-8. 159. Ramage G, Mowat E, Jones B, Williams C, Lopez-Ribot J. Our current understanding of fungal biofilms. Crit Rev Microbiol. 2009;35(4):340-55. 160. Akbari F, Kjellerup BV. Elimination of Bloodstream Infections Associated with Candida albicans Biofilm in Intravascular Catheters. Pathogens. 2015;4(3):457-69. 161. Martinez LR, Mihu MR, Tar M, Cordero RJ, Han G, Friedman AJ, et al. Demonstration of antibiofilm and antifungal efficacy of chitosan against candidal biofilms, using an in vivo central venous catheter model. J Infect Dis. 2010;201(9):1436-40. 162. Walraven CJ, Lee SA. Antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 2013;57(1):1-8. 163. Rautemaa R, Ramage G. Oral candidosis--clinical challenges of a biofilm disease. Crit Rev Microbiol. 2011;37(4):328-36. 164. Talpaert MJ, Balfour A, Stevens S, Baker M, Muhlschlegel FA, Gourlay CW. Candida biofilm formation on voice prostheses. J Med Microbiol. 2015;64(Pt 3):199-208. 165. Peleg AY, Hogan DA, Mylonakis E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat Rev Microbiol. 2010;8(5):340-9. 166. Thomas V, McDonnell G, Denyer SP, Maillard JY. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 2010;34(3):231-59. 167. Smirnov AV, Chao E, Nassonova ES, Cavalier-Smith T. A revised classification of naked lobose amoebae (Amoebozoa: lobosa). Protist. 2011;162(4):545-70. 168. Smirnov AVM, R. New data on the cyst structure of Hartmannella vermiformis. 1999. p. Page, 1967 (Lobosea, Gymnamoebia). Protistology, 1(2): 82-85. . 169. Thomas V, Loret JF, Jousset M, Greub G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ Microbiol. 2008;10(10):2728-45. 170. Greub G, La Scola B, Raoult D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerg Infect Dis. 2004;10(3):470-7. 171. Weekers PH, Bodelier PL, Wijen JP, Vogels GD. Effects of Grazing by the Free-Living Soil Amoebae Acanthamoeba castellanii, Acanthamoeba polyphaga, and Hartmannella vermiformis on Various Bacteria. Appl Environ Microbiol. 1993;59(7):2317-9. 172. Hoffmann R, Michel R. Distribution of free-living amoebae (FLA) during preparation and supply of drinking water. Int J Hyg Environ Health. 2001;203(3):215-9.
216 | P a g e
173. Delafont V, Mougari F, Cambau E, Joyeux M, Bouchon D, Héchard Y, et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environ Sci Technol. 2014;48(20):11872-82. 174. Pickup ZL, Pickup R, Parry JD. A comparison of the growth and starvation responses of Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis in the presence of suspended and attached Escherichia coli K12. FEMS Microbiol Ecol. 2007;59(3):556-63. 175. Kuchta JM, Navratil JS, Shepherd ME, Wadowsky RM, Dowling JN, States SJ, et al. Impact of Chlorine and Heat on the Survival of Hartmannella vermiformis and Subsequent Growth of Legionella pneumophila. Appl Environ Microbiol. 1993;59(12):4096-100. 176. Greub G, Raoult D. Morphology of Legionella pneumophila according to their location within Hartmanella vermiformis. Res Microbiol. 2003;154(9):619-21. 177. Martinez AJ, Janitschke K. Acanthamoeba, an opportunistic microorganism: a review. Infection. 1985;13(6):251-6. 178. Marciano-Cabral F, Cabral G. Acanthamoeba spp. as agents of disease in humans. Clin Microbiol Rev. 2003;16(2):273-307. 179. Wang A, Kay R, Poon WS, Ng HK. Successful treatment of amoebic meningoencephalitis in a Chinese living in Hong Kong. Clin Neurol Neurosurg. 1993;95(3):249-52. 180. Schuster FL, Visvesvara GS. Free-living amoebae as opportunistic and non-opportunistic pathogens of humans and animals. Int J Parasitol. 2004;34(9):1001-27. 181. Beattie TK, Seal DV, Tomlinson A, McFadyen AK, Grimason AM. Determination of amoebicidal activities of multipurpose contact lens solutions by using a most probable number enumeration technique. J Clin Microbiol. 2003;41(7):2992-3000. 182. Centeno M, Rivera F, Cerva L, Tsutsumi V, Gallegos E, Calderón A, et al. Hartmannella vermiformis isolated from the cerebrospinal fluid of a young male patient with meningoencephalitis and bronchopneumonia. Arch Med Res. 1996;27(4):579-86. 183. Niyyati M, Rahimi F, Lasejerdi Z, Rezaeian M. Potentially pathogenic free-living amoebae in contact lenses of the asymptomatic contact lens wearers. Iran J Parasitol. 2014;9(1):14-9. 184. Fields BS, Fields SR, Loy JN, White EH, Steffens WL, Shotts EB. Attachment and entry of Legionella pneumophila in Hartmannella vermiformis. J Infect Dis. 1993;167(5):1146-50. 185. Tyson JY, Vargas P, Cianciotto NP. The novel Legionella pneumophila type II secretion substrate NttC contributes to infection of amoebae Hartmannella vermiformis and Willaertia magna. Microbiology. 2014;160(Pt 12):2732-44. 186. Buse HY, Donohue MJ, Ashbolt NJ. Hartmannella vermiformis inhibition of Legionella pneumophila cultivability. Microb Ecol. 2013;66(3):715-26. 187. Donlan RM, Forster T, Murga R, Brown E, Lucas C, Carpenter J, et al. Legionella pneumophila associated with the protozoan Hartmannella vermiformis in a model multi-species biofilm has reduced susceptibility to disinfectants. Biofouling. 2005;21(1):1-7. 188. Turner NA, Russell AD, Furr JR, Lloyd D. Resistance, biguanide sorption and biguanide- induced pentose leakage during encystment of Acanthamoeba castellanii. J Appl Microbiol. 2004;96(6):1287-95. 189. Lloyd D, Turner NA, Khunkitti W, Hann AC, Furr JR, Russell AD. Encystation in Acanthamoeba castellanii: development of biocide resistance. J Eukaryot Microbiol. 2001;48(1):11-6. 190. Turner NA, Russell AD, Furr JR, Lloyd D. Acanthamoeba spp., antimicrobial agents and contact lenses. Sci Prog. 1999;82 ( Pt 1):1-8. 191. Critchley M, Bentham R. The efficacy of biocides and other chemical additives in cooling water systems in the control of amoebae. J Appl Microbiol. 2009;106(3):784-9. 192. Storey MV, Långmark J, Ashbolt NJ, Stenström TA. The fate of legionellae within distribution pipe biofilms: measurement of their persistence, inactivation and detachment. Water Sci Technol. 2004;49(11-12):269-75.
217 | P a g e
193. Storey MV, Winiecka-Krusnell J, Ashbolt NJ, Stenström TA. The efficacy of heat and chlorine treatment against thermotolerant Acanthamoebae and Legionellae. Scand J Infect Dis. 2004;36(9):656-62. 194. Fouque E, Héchard Y, Hartemann P, Humeau P, Trouilhé MC. Sensitivity of Vermamoeba (Hartmannella) vermiformis cysts to conventional disinfectants and protease. J Water Health. 2015;13(2):302-10. 195. Cateau E, Imbert C, Rodier MH. Hartmanella vermiformis can be permissive for Pseudomonas aeruginosa. Lett Appl Microbiol. 2008;47(5):475-7. 196. Vanessa B, Virginie M, Nathalie Q, Marie-Hélène R, Christine I. Hartmannella vermiformis can promote proliferation of Candida spp. in tap-water. Water Res. 2012;46(17):5707-14. 197. Reasoner DJ, Geldreich EE. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol. 1985;49(1):1-7. 198. Leggate J, Allain R, Isaac L, Blais BW. Microplate fluorescence assay for the quantification of double stranded DNA using SYBR Green I dye. Biotechnol Lett. 2006;28(19):1587-94. 199. Baker GC, Smith JJ, Cowan DA. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J Microbiol Methods. 2003;55(3):541-55. 200. Chemidlin Prévost-Bouré N, Christen R, Dequiedt S, Mougel C, Lelièvre M, Jolivet C, et al. Validation and application of a PCR primer set to quantify fungal communities in the soil environment by real-time quantitative PCR. PLoS One. 2011;6(9):e24166. 201. Baquero C, Montero M, Sentandreu R, Valentín E. Identification of Candida albicans by polymerase chain reaction amplification of CaYST1 gene intron fragment. Rev Iberoam Micol. 2002;19(2):80-3. 202. Thomas V, Herrera-Rimann K, Blanc DS, Greub G. Biodiversity of amoebae and amoeba- resisting bacteria in a hospital water network. Appl Environ Microbiol. 2006;72(4):2428-38. 203. Le Calvez T, Trouilhé MC, Humeau P, Moletta-Denat M, Frère J, Héchard Y. Detection of free- living amoebae by using multiplex quantitative PCR. Mol Cell Probes. 2012;26(3):116-20. 204. Joly P, Falconnet PA, André J, Weill N, Reyrolle M, Vandenesch F, et al. Quantitative real-time Legionella PCR for environmental water samples: data interpretation. Appl Environ Microbiol. 2006;72(4):2801-8. 205. Dutil S, Veillette M, Mériaux A, Lazure L, Barbeau J, Duchaine C. Aerosolization of mycobacteria and legionellae during dental treatment: low exposure despite dental unit contamination. Environ Microbiol. 2007;9(11):2836-43. 206. Shannon KE, Lee DY, Trevors JT, Beaudette LA. Application of real-time quantitative PCR for the detection of selected bacterial pathogens during municipal wastewater treatment. Sci Total Environ. 2007;382(1):121-9. 207. Terrat S, Plassart P, Bourgeois E, Ferreira S, Dequiedt S, Adele-Dit-De-Renseville N, et al. Meta-barcoded evaluation of the ISO standard 11063 DNA extraction procedure to characterize soil bacterial and fungal community diversity and composition. Microb Biotechnol. 2014. 208. Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Res. 2013;41(Database issue):D590-6. 209. Hulsen T, de Vlieg J, Alkema W. BioVenn - a web application for the comparison and visualization of biological lists using area-proportional Venn diagrams. BMC Genomics. 2008;9:488. 210. Devine DA, Percival RS, Wood DJ, Tuthill TJ, Kite P, Killington RA, et al. Inhibition of biofilms associated with dentures and toothbrushes by tetrasodium EDTA. J Appl Microbiol. 2007;103(6):2516-24. 211. Barbeau J, Buhler T. Biofilms augment the number of free-living amoebae in dental unit waterlines. Res Microbiol. 2001;152(8):753-60.
218 | P a g e
212. Leoni E, Dallolio L, Stagni F, Sanna T, D'Alessandro G, Piana G. Impact of a risk management plan on Legionella contamination of dental unit water. Int J Environ Res Public Health. 2015;12(3):2344-58. 213. Lisboa GM, Lisboa YR, Pinheiro TM, Stegun RC, da Silva-Filho EA. Microbial diversity in dental unit waterlines. Acta Odontol Latinoam. 2014;27(3):110-4. 214. O'Donnell MJ, Shore AC, Russell RJ, Coleman DC. Optimisation of the long-term efficacy of dental chair waterline disinfection by the identification and rectification of factors associated with waterline disinfection failure. J Dent. 2007;35(5):438-51. 215. Pankhurst CL. Risk assessment of dental unit waterline contamination. Prim Dent Care. 2003;10(1):5-10. 216. Santiago JI, Huntington MK, Johnston AM, Quinn RS, Williams JF. Microbial contamination of dental unit waterlines: short- and long-term effects of flushing. Gen Dent. 1994;42(6):528-35. 217. Szymańska J. Antifungal efficacy of hydrogen peroxide in dental unit waterline disinfection. Ann Agric Environ Med. 2006;13(2):313-7. 218. Barbot V, Migeot V, Rodier MH, Deborde M, Imbert C. Saliva promotes survival and even proliferation of Candida species in tap water. FEMS Microbiol Lett. 2011;324(1):17-20. 219. Ji WT, Hsu BM, Chang TY, Hsu TK, Kao PM, Huang KH, et al. Surveillance and evaluation of the infection risk of free-living amoebae and Legionella in different aquatic environments. Sci Total Environ. 2014;499:212-9. 220. Delafont V, Brouke A, Bouchon D, Moulin L, Héchard Y. Microbiome of free-living amoebae isolated from drinking water. Water Res. 2013;47(19):6958-65. 221. Greub G, Raoult D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev. 2004;17(2):413-33. 222. McNally C, Hackman B, Fields BS, Plouffe JF. Potential importance of Legionella species as etiologies in community acquired pneumonia (CAP). Diagn Microbiol Infect Dis. 2000;38(2):79-82. 223. Thacker WL, Benson RF, Hawes L, Mayberry WR, Brenner DJ. Characterization of a Legionella anisa strain isolated from a patient with pneumonia. J Clin Microbiol. 1990;28(1):122-3. 224. Costa D, Mercier A, Gravouil K, Lesobre J, Delafont V, Bousseau A, et al. Pyrosequencing analysis of bacterial diversity in dental unit waterlines. Water Res. 2015;81:223-31. 225. Starakis I, Blikas A, Siagris D, Marangos M, Karatza C, Bassaris H. Prosthetic valve endocarditis caused by Acinetobacter lwoffi: a case report and review. Cardiol Rev. 2006;14(1):45-9. 226. Seifert H, Strate A, Schulze A, Pulverer G. Vascular catheter-related bloodstream infection due to Acinetobacter johnsonii (formerly Acinetobacter calcoaceticus var. lwoffi): report of 13 cases. Clin Infect Dis. 1993;17(4):632-6. 227. Pitt TL, McClure J, Parker MD, Amézquita A, McClure PJ. Bacillus cereus in personal care products: risk to consumers. Int J Cosmet Sci. 2015;37(2):165-74. 228. Zhang J, Li Y, Lu X, Wang X, Zang H, Wang T, et al. Distinguishing the dominant species of pathogen in maxillary sinusitis by sequencing DNA dataset analysis. Gene. 2015;561(2):256-60. 229. Decousser JW, Ramarao N, Duport C, Dorval M, Bourgeois-Nicolaos N, Guinebretière MH, et al. Bacillus cereus and severe intestinal infections in preterm neonates: Putative role of pooled breast milk. Am J Infect Control. 2013;41(10):918-21. 230. Miyata J, Tasaka S, Miyazaki M, Yoshida S, Naoki K, Sayama K, et al. Bacillus cereus necrotizing pneumonia in a patient with nephrotic syndrome. Intern Med. 2013;52(1):101-4. 231. Rosenbaum A, Papaliodis D, Alley M, Lisella J, Flaherty M. Bacillus cereus fasciitis: a unique pathogen and clinically challenging sequela of inoculation. Am J Orthop (Belle Mead NJ). 2013;42(1):37-9. 232. Wong JS, Seaward LM, Ho CP, Anderson TP, Lau EO, Amodeo MR, et al. Corynebacterium accolens-associated pelvic osteomyelitis. J Clin Microbiol. 2010;48(2):654-5. 233. Ang LM, Brown H. Corynebacterium accolens isolated from breast abscess: possible association with granulomatous mastitis. J Clin Microbiol. 2007;45(5):1666-8.
219 | P a g e
234. Haas W, Gearinger LS, Hesje CK, Sanfilippo CM, Morris TW. Microbiological etiology and susceptibility of bacterial conjunctivitis isolates from clinical trials with ophthalmic, twice-daily besifloxacin. Adv Ther. 2012;29(5):442-55. 235. Lécuyer H, Audibert J, Bobigny A, Eckert C, Jannière-Nartey C, Buu-Hoï A, et al. Dolosigranulum pigrum causing nosocomial pneumonia and septicemia. J Clin Microbiol. 2007;45(10):3474-5. 236. Zhang Y, Lu Z. Peroxiredoxin 1 protects the pea aphid Acyrthosiphon pisum from oxidative stress induced by Micrococcus luteus infection. J Invertebr Pathol. 2015;127:115-21. 237. Dürst UN, Bruder E, Egloff L, Wüst J, Schneider J, Hirzel HO. [Micrococcus luteus: a rare pathogen of valve prosthesis endocarditis]. Z Kardiol. 1991;80(4):294-8. 238. Iroh Tam PY, Kline S, Ward G, Ferrieri P. Non-tuberculous mycobacterial infection in hospitalized children: a case series. Epidemiol Infect. 2015:1-9. 239. Solyar A, Lee AS, Przybyszewski B, Lanza DC. Atypical mycobacterium detection in refractory chronic rhinosinusitis. Otolaryngol Head Neck Surg. 2012;146(6):1012-6. 240. Simmon KE, Brown-Elliott BA, Ridge PG, Durtschi JD, Mann LB, Slechta ES, et al. Mycobacterium chelonae-abscessus complex associated with sinopulmonary disease, Northeastern USA. Emerg Infect Dis. 2011;17(9):1692-700. 241. Al-Benwan K, Ahmad S, Mokaddas E, Johny M, Kapoor MM. Diagnosis of endocarditis caused by Mycobacterium abscessus. Ann Saudi Med. 2010;30(5):408-11. 242. Petrini B. Mycobacterium abscessus: an emerging rapid-growing potential pathogen. APMIS. 2006;114(5):319-28. 243. Hu Q, Li L, Zhuang Y. [Identification of postoperative M. chelonae infection outbreak by polymerase chain reaction of 16s-23s ribosomal DNA spacer sequence]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 1999;22(11):648-51. 244. Nakazawa A, Hagiwara E, Ikeda S, Oda T, Komatsu S, Ogura T. [A case of pulmonary Mycobacterium gordonae infection diagnosed by gastric juice culture and successfully treated with multidrug chemotherapy]. Kekkaku. 2012;87(11):727-31. 245. Foti C, Sforza V, Rizzo C, De Pascale G, Bonamonte D, Conserva A, et al. Cutaneous manifestations of Mycobacterium gordonae infection described for the first time in Italy: a case report. Cases J. 2009;2:6828. 246. den Broeder AA, Vervoort G, van Assen S, Verduyn Lunel F, de Lange WC, de Sévaux RG. Disseminated Mycobacterium gordonae infection in a renal transplant recipient. Transpl Infect Dis. 2003;5(3):151-5. 247. Barber TW, Craven DE, Farber HW. Mycobacterium gordonae: a possible opportunistic respiratory tract pathogen in patients with advanced human immunodeficiency virus, type 1 infection. Chest. 1991;100(3):716-20. 248. London RD, Damsker B, Neibart EP, Knorr B, Bottone EJ. Mycobacterium gordonae: an unusual peritoneal pathogen in a patient undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis. Am J Med. 1988;85(5):703-4. 249. Kurnik PB, Padmanabh U, Bonatsos C, Cynamon MH. Mycobacterium gordonae as a human hepato-peritoneal pathogen, with a review of the literature. Am J Med Sci. 1983;285(1):45-8. 250. Lohr DC, Goeken JA, Doty DB, Donta ST. Mycobacterium gordonae infection of a prosthetic aortic valve. JAMA. 1978;239(15):1528-30. 251. Bogdanos DP, Vergani D. Bacteria and primary biliary cirrhosis. Clin Rev Allergy Immunol. 2009;36(1):30-9. 252. Kaplan MM. Novosphingobium aromaticivorans: a potential initiator of primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol. 2004;99(11):2147-9. 253. Achermann Y, Goldstein EJ, Coenye T, Shirtliff ME. Propionibacterium acnes: from commensal to opportunistic biofilm-associated implant pathogen. Clin Microbiol Rev. 2014;27(3):419-40.
220 | P a g e
254. Aubin GG, Portillo ME, Trampuz A, Corvec S. Propionibacterium acnes, an emerging pathogen: from acne to implant-infections, from phylotype to resistance. Med Mal Infect. 2014;44(6):241-50. 255. Grosso MJ, Frangiamore SJ, Ricchetti ET, Bauer TW, Iannotti JP. Sensitivity of frozen section histology for identifying Propionibacterium acnes infections in revision shoulder arthroplasty. J Bone Joint Surg Am. 2014;96(6):442-7. 256. McDowell A, Nagy I, Magyari M, Barnard E, Patrick S. The opportunistic pathogen Propionibacterium acnes: insights into typing, human disease, clonal diversification and CAMP factor evolution. PLoS One. 2013;8(9):e70897. 257. Portillo ME, Corvec S, Borens O, Trampuz A. Propionibacterium acnes: an underestimated pathogen in implant-associated infections. Biomed Res Int. 2013;2013:804391. 258. Mak TN, Schmid M, Brzuszkiewicz E, Zeng G, Meyer R, Sfanos KS, et al. Comparative genomics reveals distinct host-interacting traits of three major human-associated propionibacteria. BMC Genomics. 2013;14:640. 259. Jahns AC, Eilers H, Ganceviciene R, Alexeyev OA. Propionibacterium species and follicular keratinocyte activation in acneic and normal skin. Br J Dermatol. 2015;172(4):981-7. 260. Seng P, Bayle S, Alliez A, Romain F, Casanova D, Stein A. The microbial epidemiology of breast implant infections in a regional referral center for plastic and reconstructive surgery in the south of France. Int J Infect Dis. 2015. 261. Azzopardi EA, Azzopardi E, Camilleri L, Villapalos J, Boyce DE, Dziewulski P, et al. Gram negative wound infection in hospitalised adult burn patients--systematic review and metanalysis-. PLoS One. 2014;9(4):e95042. 262. Mahenthiralingam E. Emerging cystic fibrosis pathogens and the microbiome. Paediatr Respir Rev. 2014;15 Suppl 1:13-5. 263. Markou P, Apidianakis Y. Pathogenesis of intestinal Pseudomonas aeruginosa infection in patients with cancer. Front Cell Infect Microbiol. 2014;3:115. 264. Roser DJ, van den Akker B, Boase S, Haas CN, Ashbolt NJ, Rice SA. Pseudomonas aeruginosa dose response and bathing water infection. Epidemiol Infect. 2014;142(3):449-62. 265. Tümmler B, Wiehlmann L, Klockgether J, Cramer N. Advances in understanding Pseudomonas. F1000Prime Rep. 2014;6:9. 266. Naze F, Jouen E, Randriamahazo RT, Simac C, Laurent P, Blériot A, et al. Pseudomonas aeruginosa outbreak linked to mineral water bottles in a neonatal intensive care unit: fast typing by use of high-resolution melting analysis of a variable-number tandem-repeat locus. J Clin Microbiol. 2010;48(9):3146-52. 267. Eckmanns T, Oppert M, Martin M, Amorosa R, Zuschneid I, Frei U, et al. An outbreak of hospital-acquired Pseudomonas aeruginosa infection caused by contaminated bottled water in intensive care units. Clin Microbiol Infect. 2008;14(5):454-8. 268. Dey S, Bhattacharya D, Roy S, Nadgir SD, Patil A, Kholkute SD. Shewanella algae in acute gastroenteritis. Indian J Med Microbiol. 2015;33(1):172-5. 269. Srinivas J, Pillai M, Vinod V, Dinesh RK. Skin and Soft Tissue Infections due to Shewanella algae - An Emerging Pathogen. J Clin Diagn Res. 2015;9(2):DC16-20. 270. Liu PY, Shi ZY, Shyu CL, Wu ZY, Lai KL, Chang CY, et al. Cobra bite wound infection caused by Shewanella algae. Int J Infect Dis. 2014;20:11-2. 271. Goyal R, Kaur N, Thakur R. Human soft tissue infection by the emerging pathogen Shewanella algae. J Infect Dev Ctries. 2011;5(4):310-2. 272. Nath R, Saikia L, Choudhury G, Das PP. Isolation of Shewanella algae from rectal swabs of patients with bloody diarrhoea. Indian J Med Microbiol. 2011;29(4):422-5. 273. Tan CK, Lai CC, Kuar WK, Hsueh PR. Purulent pericarditis with greenish pericardial effusion caused by Shewanella algae. J Clin Microbiol. 2008;46(8):2817-9.
221 | P a g e
274. Liu MC, Gau SJ, Wu HC. Acute exudative tonsillitis caused by Shewanella algae in a healthy child. Scand J Infect Dis. 2006;38(11-12):1104-5. 275. De Mauri A, Torreggiani M, Chiarinotti D, Andreoni S, Molinari G, De Leo M. Stenotrophomonas maltophilia: an emerging pathogen in dialysis units. J Med Microbiol. 2014;63(Pt 11):1407-10. 276. Brooke JS. Stenotrophomonas maltophilia: an emerging global opportunistic pathogen. Clin Microbiol Rev. 2012;25(1):2-41. 277. Garazi M, Singer C, Tai J, Ginocchio CC. Bloodstream infections caused by Stenotrophomonas maltophilia: a seven-year review. J Hosp Infect. 2012;81(2):114-8. 278. Azzopardi EA, Azzopardi SM, Boyce DE, Dickson WA. Emerging gram-negative infections in burn wounds. J Burn Care Res. 2011;32(5):570-6. 279. Viswanathan R, Singh AK, Ghosh C, Basu S. Stenotrophomonas maltophilia causing early onset neonatal sepsis. Indian Pediatr. 2011;48(5):397-9. 280. Nyc O, Matejková J. Stenotrophomonas maltophilia: Significant contemporary hospital pathogen - review. Folia Microbiol (Praha). 2010;55(3):286-94. 281. Tsai WP, Chen CL, Ko WC, Pan SC. Stenotrophomonas maltophilia bacteremia in burn patients. Burns. 2006;32(2):155-8. 282. Dalamaga M, Karmaniolas K, Chavelas C, Liatis S, Matekovits H, Migdalis I. Stenotrophomonas maltophilia: a serious and rare complication in patients suffering from burns. Burns. 2003;29(7):711- 3. 283. Sanyal SC, Mokaddas EM. The increase in carbapenem use and emergence of Stenotrophomonas maltophilia as an important nosocomial pathogen. J Chemother. 1999;11(1):28- 33. 284. Shelburne SA, Sahasrabhojane P, Saldana M, Yao H, Su X, Horstmann N, et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerg Infect Dis. 2014;20(5):762-71. 285. Bingol UA, Ulucay C, Ozler T. An Unusual Cause of Flexor Tenosynovitis: Streptococcus mitis. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(12):e263. 286. Mitchell J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Mol Oral Microbiol. 2011;26(2):89-98. 287. Arning M, Gehrt A, Aul C, Runde V, Hadding U, Schneider W. Septicemia due to Streptococcus mitis in neutropenic patients with acute leukemia. Blut. 1990;61(6):364-8. 288. Classen DC, Burke JP, Ford CD, Evershed S, Aloia MR, Wilfahrt JK, et al. Streptococcus mitis sepsis in bone marrow transplant patients receiving oral antimicrobial prophylaxis. Am J Med. 1990;89(4):441-6. 289. Catto BA, Jacobs MR, Shlaes DM. Streptococcus mitis. A cause of serious infection in adults. Arch Intern Med. 1987;147(5):885-8. 290. Puttaiah R, Svoboda KK, Lin SM, Montebugnoli L, Dolci G, Spratt D, et al. Evaluation of an automated dental unit water system's contamination control protocol. J Contemp Dent Pract. 2012;13(1):1-10. 291. Porteous NB, Bizra E, Cothron A, Yeh CK. A survey of infection control teaching in U.S. dental schools. J Dent Educ. 2014;78(2):187-94. 292. Petti S, Moroni C, Messano GA, Polimeni A. Detection of oral streptococci in dental unit water lines after therapy with air turbine handpiece: biological fluid retraction more frequent than expected. Future Microbiol. 2013;8(3):413-21. 293. Wirthlin MR, Marshall GW, Rowland RW. Formation and decontamination of biofilms in dental unit waterlines. J Periodontol. 2003;74(11):1595-609. 294. Association AD. Statement on dental unit waterlines http://www.ada.org/en/member- center/oral-health-topics/dental-unit-waterlines2012 [accessed on may 2015].
222 | P a g e
295. Dallolio L, Scuderi A, Rini MS, Valente S, Farruggia P, Sabattini MA, et al. Effect of different disinfection protocols on microbial and biofilm contamination of dental unit waterlines in community dental practices. Int J Environ Res Public Health. 2014;11(2):2064-76. 296. Smith G, Smith A. Microbial contamination of used dental handpieces. Am J Infect Control. 2014;42(9):1019-21. 297. Walker JT, Bradshaw DJ, Fulford MR, Marsh PD. Microbiological evaluation of a range of disinfectant products to control mixed-species biofilm contamination in a laboratory model of a dental unit water system. Appl Environ Microbiol. 2003;69(6):3327-32. 298. Walker JT, Marsh PD. Microbial biofilm formation in DUWS and their control using disinfectants. J Dent. 2007;35(9):721-30. 299. Hambsch B, Sacré C, Wagner I. Heterotrophic plate count and consumer's health under special consideration of water softeners. Int J Food Microbiol. 2004;92(3):365-73. 300. Mesquita-Rocha S, Godoy-Martinez PC, Gonçalves SS, Urrutia MD, Carlesse F, Seber A, et al. The water supply system as a potential source of fungal infection in paediatric haematopoietic stem cell units. BMC Infect Dis. 2013;13:289. 301. Oliveira BR, Crespo MT, San Romão MV, Benoliel MJ, Samson RA, Pereira VJ. New insights concerning the occurrence of fungi in water sources and their potential pathogenicity. Water Res. 2013;47(16):6338-47. 302. Sammon NB, Harrower KM, Fabbro LD, Reed RH. Incidence and distribution of microfungi in a treated municipal water supply system in sub-tropical Australia. Int J Environ Res Public Health. 2010;7(4):1597-611. 303. Montebugnoli L, Dolci G, Spratt DA, Puttaiah R. Failure of anti-retraction valves and the procedure for between patient flushing: a rationale for chemical control of dental unit waterline contamination. Am J Dent. 2005;18(4):270-4. 304. Cole JR, Wang Q, Cardenas E, Fish J, Chai B, Farris RJ, et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 2009;37(Database issue):D141-5. 305. Hawser SP, Douglas LJ. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 1994;62(3):915-21. 306. Estivill D, Arias A, Torres-Lana A, Carrillo-Muñoz AJ, Arévalo MP. Biofilm formation by five species of Candida on three clinical materials. J Microbiol Methods. 2011;86(2):238-42. 307. Watanabe E, Agostinho AM, Matsumoto W, Ito I. Dental unit water: bacterial decontamination of old and new dental units by flushing water. Int J Dent Hyg. 2008;6(1):56-62. 308. Sissons CH, Cutress TW, Hoffman MP, Wakefield JS. A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH, and mineralization. J Dent Res. 1991;70(11):1409-16.
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RESUME
Au cours des soins dentaires une production d’aérosols est engendrée lors de l’utilisation des pièces-à-mains. Par inhalation de ces aérosols ou projections d’eau, les patients et le personnel soignant peuvent être exposés à un risque infectieux selon la qualité microbiologique des lignes d’eau des unités de soins dentaires (LUSD).
D’une part, la composition microbienne des LUSD a été étudiée. Pour cela, sept unités de soins dentaires (USD) ont été investiguées. Pour chaque USD, trois conditions d’eaux ont été analysées : l’eau alimentant les USD, l’eau en sortie d’USD après la stagnation d’eau du week-end et l’eau en sortie d’USD après une journée d’activité.
D’autre part, une modélisation in vitro a été élaborée afin d’évaluer l’efficacité de différents traitements chimiques recommandés par les fournisseurs d’USD sur un biofilm polymicrobien.
La population microbienne varie selon chaque USD et évolue au cours du trajet de l’eau au sein des USD. La contamination microbienne en sortie d’USD apparaît plus importante qu’en entrée d’USD. Parmi les genres microbiens présents en forte proportion dans les différentes conditions étudiées figurent: Candida, Halomonas, Propionibacterium, Mycobacterium, Stenotrophomonas, Pseudomonas, Legionella… Les traitements chimiques proposés par les fournisseurs d’USD présentent une efficacité variable. Le plus efficace parmi ceux testés semble être le calbenium©.
De part la présence de genres microbiens potentiellement pathogènes pour l’homme et parfois en proportions importantes, un contrôle efficace de la qualité microbiologique de l’eau sortant des USD semble essentiel afin de limiter la survenue d’infections associées aux soins.
MOTS CLÉS : Eau ; Unité dentaire ; Bactéries ; Champignon ; Amibes ; Pyroséquençage ; Infection
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