Universidade Federal De Goiás Programa De Pós-Graduação Em Ciências Farmacêuticas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MATHEUS GABRIEL DE OLIVEIRA

Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-DAD para quantificação da hibalactona isolada das partes subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L. (Araliaceae) e otimização da sua extração por ultrassom

Goiânia 2018

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1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese

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Nome completo do autor: Matheus Gabriel de Oliveira

Título do trabalho: Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-DAD para quantificação da hibalactona isolada das plantas subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L. (Araliaceae) e otimização da sua extração por ultrassom.

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Assinatura do(a) orientador(a)² Data: 07/06/2019

Versão atualizada em setembro de 2017. MATHEUS GABRIEL DE OLIVEIRA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula Coorientador: Prof. Dr. Vinicius Barreto da Silva

Goiânia 2018

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.

Gabriel de Oliveira, Matheus Desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-DAD para quantificação da hibalactona isolada das partes subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L. (Araliaceae) e otimização da sua extração por ultrassom [manuscrito] / Matheus Gabriel de Oliveira. - 2018. XCV, 95 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula; coorientador Dr. Vinicius Barreto da Silva. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Faculdade Farmácia (FF), Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Goiânia, 2018. Bibliografia. Anexos. Inclui siglas, fotografias, abreviaturas, símbolos, gráfico, tabelas, lista de figuras, lista de tabelas.

1. Acariçoba. 2. Lignana. 3. CLAE. 4. Sonicação. 5. Box- Behnken. I. Realino de Paula, José, orient. II. Título.

CDU 615.1

Dedico este trabalho aos meus pais e aos meus amigos, os quais sempre me incentivaram a dar o meu melhor.

ii AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me permitido chegar até aqui.

Aos meus pais, Maria de Fátima Gabriel Oliveira e Délio Souza de Oliveira, por sempre me apoiarem e acreditarem em mim.

Ao meu orientador, Prof. Dr. José Realino de Paula, pela confiança na realização deste trabalho, pela amizade, além de me servir como exemplo de pessoa solidária e justa.

Ao meu coorientador, Prof. Dr. Vinicius Barreto da Silva, por ser meu professor e amigo de longa data e por sempre estar disposto a me instruir nos trabalhos científicos.

Ao LPPN por me receber de maneira carinhosa, em especial aos amigos Aline Neves, Andressa Tuane, Danillo Luiz, Leandro Leal, Lídia Vitoriano, Liliane Sousa, Paulo Almeida, Priscila Dias e Waléria Ramos.

Ao Prof. Dr. Leonardo Luiz Borges e à Profa. Dra. Suzana Ferreira Alves pelas valiosas contribuições nas análises estatísticas e cromatográficas deste trabalho.

Ao LabRMN IQ-UFG, que tornou possível a identificação do composto químico isolado neste trabalho.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

iii SUMÁRIO

Ítem Assunto Página

1 INTRODUÇÃO 11

1.1 Introdução geral 11

1.2 Família Araliaceae Juss. e o gênero Hydrocotyle L. 12

1.3 Hydrocotyle umbellata L. 15

1.4 Hibalactona 17

1.5 Otimização de métodos extrativos 21

2 OBJETIVO 23

2.1 Objetivo Geral 23

2.2 Objetivos Específicos 23

3 MÉTODOS 24

3.1 Obtenção do material vegetal 24

3.2 Obtenção do extrato etanólico bruto 24

3.3 Fracionamento do extrato etanólico bruto 25

3.4 Cromatografia em coluna (CC) da fração diclorometano e 25 isolamento da hibalactona

3.5 Análises espectrométricas 26

3.6 Desenvolvimento e validação do método de quantificação da 27 hibalactona por CLAE

3.6.1 Conformidade do Sistema (‘‘System Suitability’’) 28

3.6.2 Validação do método analítico 28

3.6.2.1 Seletividade 28

3.6.2.2 Linearidade e intervalo 29

3.6.2.3 Limite de detecção e quantificação 29

3.6.2.4 Precisão (Repetibilidade e Precisão intermediária) 30

3.6.2.5 Exatidão 30

iv 3.6.2.6 Robustez 30

3.7 Planejamento experimental da extração da hibalactona por 31 ultrassom

4 PUBLICAÇÃO 34

5 CONCLUSÕES 76

6 REFERÊNCIAS 77

7 ANEXO 88

v FIGURAS, QUADROS E TABELAS

Título Página

Figura 1. Hydrocotyle umbellata L. (acariçoba). A) Aspecto geral da folha 15 e inflorescência. B) Partes subterrâneas (raíz e rizoma).

Figura 2. Distribuição geográfica da ocorrência de Hydrocotyle umbellata 16 L..

Figura 3. Biossíntese da hibalactona. 20

Figura 4. Extração por ultrassom. A) Destruição das microbolhas que 21 transportam o material vegetal por efeito do ultrassom. B) Liberação das substâncias transportadas para o meio externo.

Figura 5. Fracionamento da fração diclorometano de H. umbellata L. 26

Quadro 1. Atividades biológicas e compostos isolados das espécies de 14 Hydrocotyle L. encontradas no Brasil.

Quadro 2. Espécies vegetais fontes de hibalactona. 18

Quadro 3. Condições cromatográficas testadas para o desenvolvimento 27 do método analítico CLAE para quantificação da hibalactona.

Tabela 1. Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações. 28

Tabela 2. Fatores codificados e seus níveis empregados no primeiro 31 Planejamento fatorial Box-Behnken.

Tabela 3. Fatores codificados e seus níveis empregados no segundo 31 Planejamento fatorial Box-Behnken.

Tabela 4. Matriz experimental do segundo Planejamento fatorial Box- 32 Behnken para a avaliação da influência dos fatores de extração por ultrassom da hibalactona.

vi SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

Símbolo, sigla Significado ou abreviatura

ANOVA Análise de variância

CC Cromatografia em Coluna

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CV Coeficiente de variação

DAD Detector de arranjo de diodos

E-HU Extrato etanólico de Hydrocotyle umbellata L.

FDA Food and Drug Administration

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

HUD Fração diclorometano do extrato etanólico de Hydrocotyle umbellata L.

LD Limite de detecção

LQ Limite de quantificação

MSR Metodologia de superfície de resposta

NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NAD+ Nicotinamide Adenine Dinucleotide

RE Resolução (ANVISA)

vii Rf Retention factor

RMN Ressonância Magnética Nuclear

UPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry

UV Ultravioleta

viii RESUMO

Hydrocotyle umbellata L., conhecida popularmente como "acariçoba", é uma erva da família Araliaceae nativa do continente Americano. Em estudos recentes, as atividades antinociceptiva, anti-inflamatória e ansiolítica da acariçoba foram atribuídas a presença da lignana hibalactona nas partes subterrâneas da planta. Contudo, há uma escassez de estudos relacionados ao seu processo de extração e métodos analíticos para sua quantificação. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método analítico para quantificação da hibalactona nas partes subterrâneas de H. umbellata por CLAE-DAD e aplicar técnicas de planejamento fatorial para otimizar a extração desse composto por ultrassom. O método de quantificação por CLAE foi desenvolvido em um cromatógrafo Waters® e2695 com fase estacionária C18 Zorbax (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), fase móvel constituída de acetonitrila: metanol: água (10:65:25), vazão de 0,8 mL/min e comprimento de onda de 290 nm. O método proposto foi validado conforme regulamentação da RDC n° 899/2003 da ANVISA. A extração por ultrassom foi investigada utilizando Planejamento Box-Behnken associado a metodologia de superfície de resposta (MSR), para avaliação dos fatores: proporção sólido-líquido, graduação alcoólica e temperatura. O método de CLAE demonstrou seletividade, linearidade, repetibilidade, exatidão e robustez para a quantificação da hibalactona. As condições ótimas encontradas para extração da hibalactona foram: proporção sólido-líquido de 1:5 g/mL, graduação alcoólica de 70% (v/v) e temperatura de 65 °C. Os valores experimentais apresentaram boa concordância com os valores preditos, demonstrando a adequabilidade do modelo de MSR obtido na otimização da extração da hibalactona de H. umbellata. Através deste estudo foi possível desenvolver e validar método de CLAE para quantificação da hibalactona nas partes subterrâneas de H. umbellata e determinar suas condições ótimas de extração pela técnica de ultrassom para a amostra estudada, contribuindo, portanto, para o controle de qualidade e padronização de produtos derivados da espécie.

Palavras-Chave: acariçoba; lignana; CLAE; sonicação; box-behnken; metodologia de superfície de resposta.

ix ABSTRACT

Hydrocotyle umbellata L., also known as "acariçoba", is an herb of the Araliaceae family native to the American continent. Recently, the antinociceptive, anti-inflammatory and anxiolytic-like effects of the specie were attributed to the lignan hibalactone found in the subterraneous parts of the plant. However, there is a lack of studies regarding its extraction process and analytical methods for its determination.This work aimed to develop and validate an HPLC-PDA analytical method for the determination of hibalactone in H. umbellata subterraneous parts and to apply experimental design techniques to optimize its ultrasound-assisted extraction (UAE). HPLC analysis were performed on a Waters® e2695 with PDA detector in a reversed-phase chromatography using acetonitrile/methanol/water (10:65:25), flow of 0.8 mL/min, detection at 290 nm and C18 column (250 mm x 4.6 mm, 5 μm). The primary validation parameters were determined according to Brazilian legislation. The optimization of the hibalactone UAE was performed using Box-Behnken desing and Response surface methodology (RSM) to investigate the influence of the following parameters: solid-to-liquid ratio, ethanolic strength and extraction temperature.The HPLC method proved to be selective, linear, precise, accurate and robust, being useful for the analysis of hibalactone in H. umbellata subterraneous parts extracts. The optimal UAE condition was obtained with solid-to-liquid ratio of 1:5 g/mL, ethanolic strength of 70% (v/v) and temperature of 65 °C. The experimental values of hibalactone content under optimal UAE conditions were in good agreement with the RSM predicted values. In this study, it was possible to develop and validate HPLC analytical method for the determination of hibalactone in H. umbellata subterraneous parts and to determine its optimal UAE conditions for application in quality control and standardization of raw materials of the specie.

Keywords: acariçoba; lignan; HPLC; sonication; box-behnken; response surface methodology.

x 1 INTRODUÇÃO

1.1. Introdução Geral

A utilização de plantas no tratamento de doenças é um método terapêutico natural que está presente de forma marcante na cultura popular (RODRIGUES; CARVALHO, 2001), fato que tem levado a um avanço na implantação de políticas que buscam viabilizar a utilização racional, segura e eficaz de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2006a; 2006b). A partir de uma perspectiva histórica, o tratamento de doenças e a produção de medicamentos foram iniciados com o uso de plantas medicinais (SCHULZ; HANSEL; TYLER, 2002). Nesse sentido, uma análise das fontes de novos fármacos lançados no mercado entre 1981 e 2014, realizada por Newman e Cragg (2016), apontou que 51% dos medicamentos são derivados ou inspirados em produtos naturais. A expansão da demanda por medicamentos à base de plantas vem crescendo mundialmente, onde o mercado farmacêutico mundial de fitoterápicos movimenta atualmente cerca de 20 bilhões de dólares. No Brasil, esse mercado gera um faturamento de cerca de 160 milhões de dólares anuais, constituindo um mercado promissor principalmente pelo reconhecimento de sua biodiversidade (BUFAINO, 2013; FEBRAFAR, 2016). Nos últimos anos, esforços multidisciplinares têm proporcionado um acréscimo no número de pesquisas relacionadas à elucidação das propriedades terapêuticas das plantas, baseado no estudo de seus constituintes ativos (DIAS; URBAN; ROESSNER, 2012). A investigação dos fitoconstituintes contribui não somente para validar o uso etnomedicinal de espécies consagradas, como também isolar substâncias que possam servir, inclusive, como marcadores para controle de qualidade (CUNHA; ROQUE, 2005). Com o objetivo de obter produtos com alto valor agregado, torna-se necessário estabelecer um rigoroso controle da qualidade em todas as fases de desenvolvimento, desde o cultivo, processamento do insumo vegetal, até o produto final, pois somente desta forma é possível garantir composição constante e propriedades terapêuticas que possam ser reprodutíveis (AHMAD; KHAN; CAMEOTRA, 2014). Nesse contexto, o desenvolvimento de métodos analíticos apropriados é essencial para que o controle de qualidade possa garantir a segurança, eficácia e qualidade de

11 produtos vegetais padronizados. Consequentemente, antes de um método ser implementado na rotina, ele deve primeiramente ser validado para demonstrar que é adequado para a finalidade pretendida (ROZET et al., 2007). De acordo com dados da ANVISA (BRASIL, 2014), a causa mais frequente de indeferimento de registros de fitoterápicos são problemas relacionados com a validação de métodos analíticos, sendo esta etapa, portanto, crítica no desenvolvimento destes produtos. Por outro lado, a adequabilidade dos métodos analíticos aplicados na análise de extratos vegetais depende do processo de extração utilizado (OONA, 2009). Recentemente, os avanços na área de planejamento e otimização de experimentos proporcionaram uma ferramenta importante para conduzir experimentos de maneira mais eficaz (ZHANG; HE; HU, 2011; AZWANIDA, 2015). Considerando que diversos fatores são capazes de influenciar a extração dos fitoconstituintes, a utilização de técnicas estatísticas capazes de analisar os fatores simultaneamente tem sido cada vez mais requerida a fim de se obter produtos com consistência em termos de composição química, contribuindo, também, para o estabelecimento de parâmetros no controle de qualidade (AZWANIDA, 2015).

1.2. Família Araliaceae Juss. e o gênero Hydrocotyle L.

No contexto das plantas medicinais, a família Araliaceae representa uma fonte promissora na descoberta de novos fármacos. Essa família é constituída por 43 gêneros e 1.450 espécies amplamente distribuídas em regiões tropicais e temperadas. As espécies geralmente são compostas por arbustos ou árvores, podendo também apresentar-se como ervas, lianas e epífitas (JUDD et al., 2009). Possui espécies utilizadas popularmente e na fitoterapia, incluindo o ginseng (Panax ginseng C.A. Mey.), hera (Hedera helix L.) e centela (Centella asiatica L.) (ALVES, 2013). No Brasil, ocorrem cinco gêneros (Aralia L., Hedera L., Hydrocotyle L., Oreopanax Decne. & Planch. e Schefflera J.R.Forst. & G.Forst.) e 93 espécies (SOUZA; LORENZI, 2012). As Araliaceae foram alvo de estudos recentes de filogenia e o gênero Hydrocotyle L., anteriormente pertencente à família Apiaceae, foi incluído na família Araliaceae, baseando-se nas características morfológicas e anatômicas (APG IV, 2016). As espécies do gênero Hydrocotyle L. possuem como características principais habitat aquático ou semiaquático, incluindo ervas de caule prostrado ou subterrâneo com nós radicantes, folhas frequentemente simples e estipuladas e umbelas simples com pequenas flores bissexuais (STEVENS et al., 2001; JUDD et al., 2009).

12 A morfologia das espécies de Hydrocotyle L. exibe variação interespecífica e intraespecífica (NICOLAS; PLUNKETT, 2009), com destaque para a variação das folhas e a inflorescência (MATHIAS; CONSTANCE, 1951). Dessa forma, a delimitação das espécies tem sido baseada principalmente na morfologia foliar e no tipo de inflorescência, o que tem sido enfatizado na descrição de novas espécies (KONSTANTINOVA; YEMBATUROVA, 2010). Das espécies do gênero, 17 encontram-se distribuídas no Brasil (FIASCHI, 2015) e estudos científicos têm se concentrado em H. umbellata L., H. bonariensis Lam., H. leucocephala Cham. & Schltdl, H. ranunculoides L. f. e H. verticillata Thunb. Dentre as principais atividades relatadas, destacam-se a fitorremediação (CHYAN et al., 2015), atividade antioxidante (MAULIDIANI et al., 2014; AJANI et al., 2017) e atividade depressora do sistema nervoso central (ROCHA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2017b). Em relação ao perfil fitoquímico, os principais compostos isolados pertencem a classe dos flavonoides, triterpenos, esteroides e óleos essenciais (Quadro 1). Por outro lado, são escassos estudos científicos para as demais espécies de Hydrocotyle L. encontradas no Brasil, as quais, visto o potencial terapêutico das espécies citadas anteriormente, também podem representar fontes terapêuticas potenciais, como: H. acuminata Urb., H. alpestris Gardner, H. barbarossa Cham. & Schltdl., H. bowlesioides Mathias & Constance, H. bradei Rossberg, H. callicephala (Cham.) Urb., H. exigua (Urb.) Malme, H. hirta R.Br. ex A. Rich., H. itatiaiensis Brade, H. langsdorffii DC., H. leucocephala Cham. & Schltdl., H. pusilla A. Rich., H. quinqueloba Ruiz & Pav., H. ranunculoides L. f., H. ulei H. Wolff, H. umbellata L. e H. verticillata Thunb (FIASCHI, 2015).

13 Quadro 1. Atividades biológicas e compostos isolados das espécies de Hydrocotyle L. encontradas no Brasil. Espécie Atividades biológicas Compostos isolados Referência H. bonariensis Antioxidante, Quercetina; Bonarienosídeo A ao D; Saniculosídeo-R1; AJANI et al., 2009; SILVA et al., Anticolinesterásica, Tetrahidropalmatina; (-)-(S)-xilopinina; 2-O-α-fructofuranosídeo de 2009; MASOUMIAN et al., 2011; Anticatarata. etila; (+)-limoneno; γ-muuroleno; Rutinosídeo-quercetina; O- TABOPDA et al., 2012; BARBOSA et pentosil-hexosídeo-quercetina; 3-O-glucosídeo-quercetina; 3-O- al., 2013; MAULIDIANI et al., 2014; glucosídeo-7-O-ramnosídeo-canferol; Ranuncosídeo I, II, IV, V; 3- COASACA et al., 2015; HUONG; O-β-D-glicopiranosídeo-β-sitosterol. KHOANH; VU, 2016; AJANI et al., 2017.

H. leucocephala Fitorremediação. 3,8,9,10-tetraol-4,6-diino-1-heptadeceno; 3,9,10-triol-4,6-diino-8- MA et al., 2003; RAMOS et al., 2006. acetil-1-heptadeceno; 3,8,10-triol-4,6-diino-9-acetil-1-heptadeceno; 4-hidroxi-4-(1-hidroxi-1-metil-etil)-ciclohex-2-eno-1-ona; Leucoceramidas A ao G; Leucocerebrosídeos A ao F; (-)- hinoquinina; Espinasterol; Desidrovomifoliol; 3-hidroxi-5α,6α-epoxi- 7-megastigmen-9-ona; 3-O-α-L-arabinopiranosídeo-canferol; 3-O-α- L-arabinopiranosídeo-quercetina; 3-O-β-D-galactopiranosídeo- quercetina; 3-O-β-D-galactopiranosídeo-canferol.

H. ranunculoides Fitorremediação. Ranuncosídeo I ao VII; 3-oxo-15α,16α,21β,22α,28-pentahidroxi-12- DELLA-GRECA et al., 1994a, b; oleanen-3-ona; 3-oxo-15α,16α,21β,22α,28-pentahidroxi-12- CORSARO et al., 1995; BASILICO et oleanen-3-ona; 3β,15α,16α,21β,22α,28-hexahidroxi-12-oleanen-3- al., 2017. ona; 3β,16α,21β,22α,28-pentahidroxi-12-oleanen-3-ona; ácido 17,22-seco-3-oxo-22,23-dihidroxi-Δ12,16-oleanólico; ácido 3-oxo-23- hidroxi-Δ12-oleanólico.

H. umbellata Ansiolítica; Sedativa; Quercetina; 3-O-galactosídeo-quercetina; 3-O-(β-D- ADAMS et al., 1989; SANTANA, Analgésica; Anti-inflamatória; glicopiranosídeo) oleanolato de metila; Estigmasterol; 7,25- 2001; SOOKNAH; WILKIE, 2004; Antioxidante; Anti-úlcera estigmastidien-3-ol; 3-O-β-D-glicopiranosídeo estigmasterol; CHAVASIRI et al., 2005; ROJAS et Fitoremediação. Umbelatosídeo A ao D; Germacreno D; β-sesquifelandreno; β- al., 2009; SOSA et al., 2011; ROCHA bisaboleno; Cariofileno; Hibalactona. et al., 2011; FLORENTINO, 2013; OLIVEIRA et al., 2017a; OLIVEIRA et al., 2017b.

H. verticillata Fitoremediação. CHYAN et al., 2015. ¯¯¯¯¯¯¯¯

14 1.3. Hydrocotyle umbellata L.

H. umbellata, conhecida popularmente como "acariçoba" ou "erva-do-capitão", é uma erva perene, herbácea, prostrada e de habitat semiaquático. Apresenta folhas pecioladas, peltadas, glabras e com nervuras radiadas. As flores são brancas e dispostas em umbelas. Os caules são subterrâneos, do tipo estolho, de coloração amarelo-acastanhado, com sulcos e arestas longitudinais e frequentemente retorcidos. Em cada nó emerge uma folha ou uma folha e uma inflorescência, além de numerosas raízes adventícias (SANTANA et al., 2001; LORENZI; MATOS, 2002) (Figura 1).

Figura 1. Hydrocotyle umbellata L. (acariçoba). A) Aspecto geral da folha e inflorescência. B) Folhas e partes subterrâneas (raíz e rizoma). Fonte: Próprio autor.

A acariçoba é uma planta nativa do continente Americano (Figura 2) e encontrada em todo o território brasileiro (FIASCHI, 2015). É utilizada popularmente para o tratamento de úlceras na pele, eczema, dermatite, psoríase, erisipela, reumatismo e outros processos inflamatórios (LORENZI; MATOS, 2002). Além disso, possui grande interesse na medicina Ayurveda (Indiana) devido ao seu potencial ansiolítico e efeito estimulante da memória (REIS et al., 1992).

15 Figura 2. Distribuição geográfica da ocorrência de Hydrocotyle umbellata L. Fonte: Tropicos (2017).

Estudos científicos têm demonstrado atividade antioxidante, antiulcerogênica, antinociceptiva, anti-inflamatória, ansiolítica e sedativa do extrato etanólico das partes subterrâneas da planta (SANTANA, 2001; ROCHA et al., 2011; FLORENTINO et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2017a; OLIVEIRA et al., 2017b). Os ensaios de toxicidade aguda sugerem que as folhas de H. umbellata são pouco tóxicas, quando administradas por via oral, visto que, em uma dosagem de 5,0 g/kg do extrato etanólico não foi verificada morte em ratos Wister (SANTANA et al., 2001). Em relação ao perfil fitoquímico da espécie, estudos revelam a presença dos flavonoides quercetina e quercetina-3-O-galactosídeo (ADAMS et al., 1989); dos esteroides estigmasterol, estigmasta-7,25-dien-3-ol e estigmasteril-3-O-β-D-glucopiranosídeo (CHAVASIRI et al., 2005); dos triterpenos metil-oleanolato 3-O-β-D-glucopiranosídeo (CHAVASIRI et al., 2005) e umbelatosídeos A ao D (SOSA et al., 2011); dos sesquiterpenos germacreno D, β-sesquifelandreno, β-bisaboleno, cariofileno (ROJAS et al., 2009); e da lignana hibalactona (OLIVEIRA et al., 2017b).

16 1.4. Hibalactona

Recentemente, as atividades antinociceptiva, anti-inflamatória e ansiolítica de H. umbellata foram atribuídas à presença da hibalactona nas partes subterrâneas da planta (OLIVEIRA et al., 2017b). Hibalactona, também conhecida como ‘‘savinin’’, é uma lignana da classe das dibenzilbutirolactonas encontrada principalmente em espécies da família Araliaceae, Cupressaceae e Rutaceae (Quadro 2). A biossíntese da hibalactona inicia-se a partir da desaminação da fenilalanina e o acoplamento oxidativo de duas unidades de álcool coniferílico, seguido de reações enzimáticas de oxidação e redução com NADPH e NAD+ como cofatores (Figura 3). Embora alguns métodos tenham sido relatados para a síntese da hibalactona (GOLAKOTI et al., 2016; LLOYD; TAYLOR; UNSWORTH, 2016), desafios na síntese de lignanas ainda existem, como o baixo rendimento global, pureza enantiomérica insatisfatória e auxiliares quirais de custo elevado (ROYO, 2008). Além das atividades da hibalactona relacionadas a H. umbellata (OLIVEIRA et al., 2017b), diversas atividades biológicas têm sido descritas para essa lignana, incluindo: atividade antitumoral (CHANG et al., 2000; MANSOOR et al., 2013), anti-estrogênica (LEE et al., 2005), antimicrobiana (BASTOS; ALBUQUERQUE; SILVA, 1999; WEN et al., 2007), larvicida (MATSUBA, 1972), antioxidante (OLIVEIRA et al., 2017a), anti-inflamatória (BAN et al., 2002), anti-colinesterásica (JUNG et al., 2015) e neuroprotetora (YOON et al., 2008). Apesar do potencial terapêutico da hibalactona, há uma escassez de métodos analíticos para sua análise em extratos vegetais. Em amostra biológica, SONG et al. (2012), desenvolveram e validaram método por UPLC-MS/MS para estudo farmacocinético de quatro lignanas, incluindo hibalactona, em plasmas de rato após administração do extrato de Acanthopanax sessiliflorus (Rupr. & Maxim.) Seem. (Araliaceae). Por outro lado, a técnica de CLAE tem sido descrita como o método analítico mais utilizado para análise quantitativa e qualitativa de lignanas em extratos vegetais, principalmente devido a acessibilidade e baixo custo do método (CALVO-FLORES et al., 2015). Assim, o desenvolvimento e validação de método por CLAE para a hibalactona pode contribuir para o controle de qualidade de extratos padronizados nesse marcador obtidos a partir de H. umbellata.

17 Quadro 2. Espécies vegetais fontes de hibalactona. Espécie Parte(s) da planta Referência Acanthopanax chiisanensis Raízes LEE et al., 2005 Nakai (Araliaceae) Acanthopanax gracilistylus Raízes YANG; XUE, 2014 W.W. Sm. (Araliaceae) Acanthopanax senticosus Raízes YANG; XUE, 2014 (Rupr. ex Maxim.) Harms (Araliaceae) Acanthopanax sessiliflorus Raízes ELYAKOVA et al., 1966; (Rupr. & Maxim.) Seem. KAI et al, 2012; SONG et (Araliaceae) al., 2012; YANG; XUE,2014; Amyris pinnata Kunth Folhas BADAWI et al., 1981; (Rutaceae) CUCA-SUAREZ et al., 2015 Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. Raízes LIM et al., 2009 (Apiaceae) Aristolochia indica L. Raízes CHE et al., 1984 (Aristolochiaceae) Artemisia chamaemelifolia Vill. Partes aéreas MARCO et al., 1996 (Asteraceae) Biota orientalis (L.) Endl. Folhas YOON et al., 2008 (Cupressaceae) Calocedrus formosana (Florin) Madeira, Raízes SATYANARAYAN et al., Florin (Cupressaceae) 1985; FANG; LIU; CHENG, 1990, Chamaecyparis formosensis Madeira HSIEH et al., 2007; CHEN Matsum. (Cupressaceae) et al., 2008 Chamaecyparis obtusa (Siebold Folhas, Raízes, MATSUBARA et al., 1972; & Zucc.) Endl. (Cupressaceae) Sementes OZAKI; HASEGAWA; HIROSE, 1983; TAKAKU et al., 2001; WEN et al., 2007; JEONG et al., 2014 Fagara heitzii Aubrév. & Pellegr. Caule MBAZE et al., 2009 (Rutaceae) Hydrocotyle umbellata L. Partes OLIVEIRA et al., 2017b (Araliaceae) subterrâneas Hypoestes purpurea (L.) R. Br. Partes aéreas SHEN et al., 2004 (Acanthaceae) Hyptis capitate Jacq. Partes aéreas ALMTORP; HAZELL; (Lamiaceae) TORSSELL, 1991 Juniperus chinensis L. Folhas, Madeira FANG; LEE; CHENG, 1992; (Cupressaceae) JUNG et al., 2015; KUO et al., 2016 Juniperus communis L. Madeira BREDENBERG; (Cupressaceae) RUNEBERG, 1961 Juniperus conferta Parl. Madeira DOI; SHIBUYA, 1972 (Cupressaceae) Juniperus formosana Hayata Casca KUO; YU, 1996 (Cupressaceae) Juniperus rigida Siebold & Zucc. Caule e Folhas WOO et al., 2011 (Cupressaceae)

18 Quadro 2. Continuação. Juniperus sabina L. Folhas FELICIANO et al., 1990 (Cupressaceae) Juniperus thurifera L. Folhas, Madeira BREDENBERG; (Cupressaceae) RUNEBERG, 1961 FELICIANO et al., 1987; FELICIANO et al., 1989; Justicia neesii Ramamoorthy Não informado RAJASEKHAR; (Acanthaceae) SUBBARAJU, 1998. Micranthemum umbrosum (J.F. Raízes PARKER et al., 2006 Gmel.) S.F. Blake (Linderniaceae) Pterocarpus santalinus Blanco Raízes CHO et al., 2001 (Fabaceae) Taiwania cryptomerioides Folhas, Madeira, LIN et al., 1999; CHANG et Hayata (Cupressaceae) Raízes al., 2000, CHYU; KUO, 2007 Taxus baccata L. (Taxaceae) Folhas DAS et al., 1998 Virola elongata (Benth.) Warb. Frutos KATO; YOSHIDA; (Myristicaceae) GOTTLIEB, 1990 Zanthoxylum capense (Thunb.) Raízes LUO et al., 2013; Harv. (Rutaceae) MANSOOR et al., 2013 Zanthoxylum caudatum Alston Caule NISSANKA et al., 2001 (Rutaceae) Zanthoxylum heitzii (Aubrév. & Caule NGOUELA; TSAMO; Pellegr.) P.G. Waterman CONNOLLY, 1994 (Rutaceae) Zanthoxylum naranjillo Griseb. Folhas BASTOS et al., 1996; (Rutaceae) BASTOS et al., 1999 Zanthoxylum nitidum (Roxb.) Caule YANG et al., 2009 DC. (Rutaceae) Zanthoxylum setulosum P. Partes aéreas MORA et al., 2011 Wilson (Rutaceae) Zanthoxylum tessmannii (Engl.) Raízes AYOFOR et al., 1984 J.F. Ayafor. (Rutaceae)

19 Figura 3. Biossíntese da hibalactona. As estruturas foram desenhadas através do programa ACD/ChemSketch v. 12.01. Fonte: adaptado de Dewick (2009).

20 1.5. Otimização de métodos extrativos

Os métodos clássicos de extração, isto é, aqueles geralmente citados ou incluídos nas farmacopeias, como a maceração, percolação e o refluxo, são geralmente utilizados na extração da hibalactona (LIM et al., 2009; JUNG et al., 2015; CUCA-SUAREZ; DELLA- MONACHE; COY-BARRERA, 2015). Contudo, a fim de tornar os processos extrativos mais rápidos, usar menor quantidades de solventes e aumentar a eficiência de extração, diversos métodos foram desenvolvidos nas últimas décadas, dentre os quais, destaca-se a extração por ultrassom (CHEMAT et al., 2017). O princípio de extração por ultrassom consiste na geração de ondas mecânicas que criam uma variação na pressão do solvente, gerando calor e formação de microbolhas que colapsam (cavitação), promovendo uma fragmentação da célula vegetal e consequente liberação dos fitoconstituintes (CHEMAT et al., 2017) (Figura 4). A extração por ultrassom tem sido recentemente empregada para extração da hibalactona (YOON et al., 2008; JEONG et al., 2014).

Figura 4. Extração por ultrassom. A) Destruição das microbolhas que transportam o material vegetal por efeito do ultrassom. B) Liberação das substâncias transportadas para o meio externo. Fonte: adaptado de Lindseth et al. (2013).

Por outro lado, são diversos os fatores capazes de influenciar os processos extrativos, tais como, a divisão do material vegetal, a natureza do solvente, a temperatura e o tempo de extração (SASIDHARAN et al., 2011). Tais fatores podem interferir de forma positiva ou negativa no rendimento da extração, sendo portanto, indispensável que a definição e padronização dos mesmos sejam feitos de forma planejada (SOUSA et al., 2014). Dentre os planejamentos experimentais baseados em princípios estatísticos, destaca-se o desenho de Box-Behnken (BOX; HUNTER; HUNTER, 1978), o qual possibilita a realização de ensaios com fatores, isto é, variáveis independentes, em três diferentes valores ou níveis. Além disso, é possível interpretar e otimizar os resultados para a resposta

21 de interesse, isto é, variável dependente, através de metodologia de superfície de resposta (MSR) (FERREIRA et al., 2007). A MSR é uma estratégia baseada em modelos matemáticos empíricos que permite identificar os fatores que influenciam significativamente na resposta e encontrar os valores operacionais ótimos, como também avaliar possíveis interações entre os fatores. Além disso, as superfícies geradas permitem relacionar graficamente a resposta obtida e os fatores estudados que a afetam a partir do campo experimental previamente delimitado (BEZERRA et al., 2008). ZHANG et al. (2014) otimizaram a extração por ultrassom em escala-piloto da lignana shisandrina B das sementes de Schisandra chinensis (Turcz.) Baill (Schisandraceae). A análise de superfície de resposta identificou que os fatores graduação alcoólica (95 %), temperatura (60 °C) e tempo (70 min) influenciaram significativamente na extração da lignana, possibilitando também verificar que a otimização reduziu o custo do processo extrativo. Dessa forma, o planejamento e a otimização de experimentos têm permitido o aumento da eficiência da extração, bem como redução no número de experimentos, o que contribui para a redução da geração de resíduos e ainda no custo final do processo (CUNICO et al., 2008).

22 2 OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Propor um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para quantificar o marcador hibalactona isolado das partes subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L. (Araliaceae) e otimizar a extração desse composto pelo método de ultrassom.

2.2. Objetivos Específicos

 Obter o extrato etanólico das partes subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L. e realizar sua partição líquido-líquido;

 Obter a hibalactona a partir da fração diclorometano do extrato etanólico;

 Desenvolver e validar método analítico para quantificação da hibalactona nas partes subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L. por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;

 Utilizar o Planejamento Box-Behnken associado a metodologia de superfície de resposta para otimizar a extração por ultrassom da hibalactona presente nas partes subterrâneas de Hydrocotyle umbellata L.

23 3 MÉTODOS

3.1. Obtenção do material vegetal

Para a realização do estudo foi utilizada a espécie H. umbellata cultivada no Horto de Plantas Medicinais da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás (UFG) (16° 40’ 33’’ S; 49° 14’ 39’’ W; 768 m), identificada pelo Prof. Dr. Heleno Dias Ferreira, do Departamento de Biologia Geral/ICB–UFG. A exsicata do material botânico foi depositada no Herbário da Universidade Federal de Goiás-UFG sob o número de registro 22394.

O período de coleta das partes subterrâneas foi de dezembro de 2013 a janeiro de 2014. As partes subterrâneas foram coletadas, lavadas com água corrente, dessecadas em estufa com circulação forçada de ar a 40 ºC e trituradas em moinho de facas (modelo Tipo WILLYE), e o material vegetal obtido na forma de pó foi acondicionado ao abrigo de luz e umidade.

3.2. Obtenção do extrato etanólico bruto

O extrato etanólico foi obtido por processo de maceração dinâmica, partindo-se de 400 g do material vegetal e empregando etanol 96 °G.L. como solvente extrator. A proporção droga:solvente utilizada correspondeu a uma parte do material pulverizado para cinco partes de etanol. Após um período de 4 horas em maceração sob agitação mecânica (Agitador Fisatom-715), realizou-se a filtração e o extrato obtido foi concentrado em evaporador rotativo, modelo MA-120 (TECNAL®), a uma temperatura de 40 °C. A fim de aumentar a eficiência da extração, o resíduo vegetal foi submetido a mais duas extrações de maneira análoga à primeira, obtendo-se assim o extrato etanólico bruto das partes subterrâneas de H. umbellata, sendo denominado E-HU, mantido sob refrigeração e ao abrigo da luz (adaptado de OLIVEIRA et al., 2017b).

24 3.3. Fracionamento do extrato etanólico bruto

Para obtenção das frações, 30 g do extrato (E-HU) foram dissolvidos em 200 mL de metanol/água (7:3). A solução obtida foi submetida a partições líquido/líquido com solventes de polaridades crescentes (hexano, diclorometano e acetato de etila), conforme descrito por Ferri (1996). Para essa partição a amostra solubilizada em metanol/água foi transferida para um funil de separação. Adicionou-se 100 mL de hexano, agitou-se e após a separação das fases, a fase hexânica foi recolhida em um recipiente limpo e seco. Realizou-se mais duas extrações subsequentes com 100 mL de hexano. Repetiu-se o mesmo procedimento para diclorometano e acetato de etila. Os solventes de cada fração foram evaporados em rotaevaporador e cada fração foi dessecada até peso constante. A fração aquosa resultante no final do processo do fracionamento foi liofilizada. Ao final do processo, obteve-se 4 frações do extrato: fração hexânica, fração diclorometano, fração acetato de etila e fração aquosa.

3.4. Cromatografia em Coluna (CC) da fração diclorometano e isolamento da hibalactona

O procedimento para isolamento da hibalactona a partir da fração diclorometano seguiu metodologia adaptada de Oliveira et al. (2017b). A fração diclorometano (HUD, 1,5 g) foi fracionada em coluna cromatográfica (4 x 18,5 cm) de sílica gel 60G 0,05-0,2 mm (Vetec, Brasil) na proporção 1:40 e eluída em 100 mL de fases móveis compostas por hexano-acetato de etila (95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80), diclorometano-acetato de etila (50:50, 20:80 e 100%), metanol-acetato de etila (1:1) e metanol 100%. Foram coletadas alíquotas de 10 mL, resultando em 53 frações. Após evaporação dos solventes as frações foram monitoradas por Cromatografia em Camada ® Delgada (CCD) em cromatoplacas de sílica gel F254 (Cromatoplates Alugram , Germany) de 4 x 10 cm e espessura de 0,25 cm. As frações foram dissolvidas com 3 gotas de diclorometano e aplicadas nas cromatoplacas, sendo eluídas em fases móveis constituídas por misturas de hexano e acetato de etila (9:1, 8:2, 7:3), diclorometano e acetato de etila (1:1 e 4:6) e hexano, acetato de etila e metanol (10:10:1) e reveladas em vapores de iodo e observadas em luz UV a 254/365 nm. Para avaliação da presença da hibalactona foi empregado como padrão a substância anteriormente isolada no Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais (LPPN) pelo Prof. Dr. Thiago Levi Silva Oliveira (OLIVEIRA et al.,

25 2017b). O cálculo do fator de retenção (Rf) foi realizado dividindo-se a distância percorrida pela banda pela distância percorrida pela fase móvel.

Com base nas análises de Rf das bandas observadas em luz UV a 254/365 nm, as frações HUD1.4 e HUD1.5 foram reunidas e novamente fracionadas em coluna cromatográfica (1,5 x 14,5 cm). Para a eluição foram utilizados 20 mL das fases móveis utilizadas no primeiro fracionamento. Foram coletadas alíquotas de 5 mL, resultando em 15 frações. A fração que apresentou perfil cromatográfico do padrão de hibalactona (fração HUD1.4, 5-4) foi submetida a recristalização em metanol, resultando na formação de um cristal branco (25 mg) que foi posteriormente analisado por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). O procedimento experimental desenvolvido para o isolamento da hibalactona a partir da fração diclorometano de H. umbellata é representado na Figura 5.

Figura 5. Fracionamento da fração diclorometano de H. umbellata L.

3.5. Análises espectrométricas

O composto isolado foi caracterizado pelos espectros de RMN 1H e mapas de contorno HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) e HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), obtidos em espectrômetro Brüker modelo Avance III – 500 1 13 operando a 500 MHz ( H) e 125 MHz ( C), com o uso de clorofórmio deuterado (CDCl3). Tetrametilsilano (TMS) foi utilizado como padrão de referência interno para os deslocamentos químicos (δ, ppm). Para o processamento e análise dos espectros de RMN de 1H e mapas de contorno HSQC e HMBC foi utilizado o programa TopSpin®.

26 3.6. Desenvolvimento e validação do método de quantificação da hibalactona por CLAE

As análises foram realizadas utilizando um Sistema Cromatográfico da marca Waters® modelo HPLC Alliance® com módulo de separação e2695, detector de arranjo de diodo (DAD) 2998 e sistema de processamento de dados Empower 2.0. As separações cromatográficas foram conduzidas em coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 de fase reversa (250 mm x 4,6 mm, 5 μm). A fase móvel empregada foi uma mistura de acetonitrila grau HPLC, metanol grau HPLC e água ultrapura (Mili-Q®) na proporção 10:65:25, respectivamente, com modo de eluição isocrático e vazão de 0,8 mL/min por 20 min, e detecção a 290 nm. O volume de injeção foi de 10 μL. As análises foram realizadas a temperatura ambiente (25 °C). A fase móvel foi previamente filtrada em membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm (Millex®) e desgaseificada usando banho de ultrassom (USC 1800A, 40 kHz, Uniques). O Quadro 3 resume as condições cromatográficas que foram testadas para a escolha do método a partir de variações em condições anteriormente descritas na literatura para identificação da hibalactona (SCHMIDT et al., 2006).

Quadro 3. Condições cromatográficas testadas para o desenvolvimento do método analítico CLAE para quantificação da hibalactona. N° Composição da fase Proporção da fase Vazão móvel móvel 1 Acetonitrila:Metanol 20:80 0,5 mL/min 2 Acetonitrila:Metanol 50:50 0,5 mL/min

3 Metanol:Água 70:30 0,5 mL/min

4 Acetonitrila:Metanol:Água 20:65:15 0,5 mL/min

5 Acetonitrila:Metanol:Água 15:65:20 0,5 mL/min

6 Acetonitrila:Metanol:Água 10:65:25 0,5 mL/min

7 Acetonitrila:Metanol:Água 10:65:25 1 mL/min

8 Acetonitrila:Metanol:Água 10:65:25 0,8 mL/min

27 3.6.1 Conformidade do Sistema (‘‘System Suitability’’)

Antes da execução da validação, o sistema cromatográfico utilizado para a análise foi avaliado para verificar a sua capacidade de fornecer resultados reprodutíveis. Esta avaliação foi alcançada com experimentos de conformidade do System Suitability, que pode ser definida como um conjunto de testes para garantir que o equipamento utilizado está apto a gerar resultados de exatidão e precisão aceitáveis. Os parâmetros medidos e seus limites recomendados, estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações. Parâmetro Recomendação Fator de retenção (k) O pico deve estar bem separado de outros picos e do pico correspondente ao tempo de

retenção de um composto não retido (tm), k > 2 Repetitividade (RSD) RSD < 1% para n > 5

Resolução (Rs) Rs > 2 entre o pico de interesse e o interferente potencial mais próximo (impureza, produto de

degradação ou outras substâncias) Fator de cauda (TF) TF ≤ 2 Número de pratos teóricos da coluna (N) Em geral deve ser > 2000 para CLAE Fonte: (FDA, 2001) e (RIBANI et al., 2004).

3.6.2 Validação do método analítico

A validação foi realizada de acordo com o preconizado pela RE n° 899/2003 para Categoria I referente aos testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas (BRASIL, 2003).

3.6.2.1 Seletividade

A seletividade do método foi avaliada através da identificação da hibalactona na amostra por comparação entre os tempos de retenção e espectro de absorção ultravioleta (190 a 400 nm) dos picos obtidos na amostra e no padrão de referência (hibalactona isolada). Os cromatogramas e os espectros de absorção do diluente metanol grau HPLC foram também avaliados para verificação de possíveis picos interferentes do mesmo nas análises.

28 3.6.2.2 Linearidade e intervalo

Para a construção da curva-padrão foram preparadas sete soluções de concentração de hibalactona: 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL e 200 μg/mL em metanol grau HPLC. As soluções padrão foram filtradas em membrana de 0,45 μm Millex® e injetadas, em triplicata, no cromatógrafo. As médias das áreas de cada concentração dos marcadores foram plotadas no eixo das ordenadas e as concentrações correspondentes nas abscissas. A equação da reta foi obtida pelo método dos mínimos quadrados, de acordo com a equação 1:

Equação 1: 푦 = 푎 + 푏푥

Onde: a= Inclinação da reta em relação ao eixo; b= Interseção da reta com o eixo y.

A curva foi plotada no programa Microsoft Excel 2013. Os resultados dos testes foram tratados com o auxílio do software Statistica 7, realizando-se os testes de significância da regressão, por análise de variância (ANOVA), e de normalidade dos resíduos pelo método de Anderson-Darling. Todos estes foram calculados com intervalo de confiança de 95%.

3.6.2.3 Limite de detecção e quantificação

Os limites de detecção e de quantificação foram calculados com as equações 2 e 3, respectivamente:

3 Equação 2: 퐿퐷 = 퐷푃푎 푥 퐼퐶

10 Equação 3: 퐿푄 = 퐷푃푎 푥 퐼퐶

Onde:

DPa= Desvio padrão do intercepto com o eixo Y da curva de calibração; IC= Inclinação da curva de calibração.

29 3.6.2.4 Precisão (Repetibilidade e Precisão intermediária)

Para a avaliação da precisão, a repetibilidade (precisão intracorrida) e a precisão intermediária (precisão intercorridas) foram determinadas. A precisão foi avaliada pela determinação da concentração de três pontos da curva analítica: nível baixo (37 μg/mL), nível médio (80 μg/mL) e nível alto (110 μg/mL) ao nível de repetibilidade. As soluções foram filtradas em membrana de 0,45 μm Millex® e injetadas, em triplicata, no cromatógrafo. A precisão intermediária foi executada por um analista diferente e em dia diferente, com o preparo das amostras respeitando as condições anteriores. Por meio do coeficiente de variação (CV), calculado através do programa Microsoft Excel 2013, foi possível estabelecer esses parâmetros.

3.6.2.5 Exatidão

A exatidão foi verificada adicionando-se quantidades conhecidas (concentração equivalente a 42,668 μg/mL) do padrão de hibalactona às soluções da amostra em três níveis de concentrações diferentes, conforme item 3.6.2.4. O valor da exatidão, em porcentagem, foi obtido pela relação entre a concentração do padrão adicionado na amostra e a concentração do padrão antes da adição, conforme equação 4:

Equação 4: [(퐴푚표푠푡푟푎 + 푝푎푑푟ã표 ℎ𝑖푏푎푙푎푐푡표푛푎) − (푃푎푑푟ã표 ℎ𝑖푏푎푙푎푐푡표푛푎)] 퐸푥푎푡𝑖푑ã표 = 100 푥 [푃푎푑푟ã표 ℎ𝑖푏푎푙푎푐푡표푛푎]

3.6.2.6 Robustez

A robustez foi avaliada variando-se a composição de (ACN:MeOH:H2O) na fase móvel de (10:65:25) para (5:70:25) e (10:60:30), a temperatura de 25 °C foi alterada para 26 e 27°C e a coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) foi alterada para a coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 mm x 150 mm, 5 μm). Calculou-se o CV entre as áreas dos picos de hibalactona em cada alteração em relação à área do método original.

30 3.7. Planejamento experimental da extração da hibalactona por ultrassom

O processo de otimização da extração da hibalactona foi realizado em banho de ultrassom (USC 1800A, 40 kHz, Uniques) e conduzido por dois planejamentos Box- Behnken (BOX; HUNTER; HUNTER, 1978). No primeiro planejamento, os fatores proporção sólido-líquido, graduação alcoólica, temperatura e tempo tiveram seus efeitos avaliados em três níveis de acordo estudos relatados para otimização de lignanas (ZHANG et al., 2007; ZHAO et al., 2012; GUO et al., 2015) (Tabela 2).

Tabela 2. Fatores codificados e seus níveis empregados no primeiro Planejamento fatorial Box-Behnken.

Fatores Níveis

-1 0 +1

Proporção sólido-líquido (g/mL) 1:30 1:20 1:10 Graduação alcoólica (%, v/v) 65 80 95 Temperatura (°C) 25 50 55 Tempo (min) 15 30 45

Os fatores e níveis que demonstraram influência na extração da hibalactona foram em seguida otimizados em um segundo Planejamento fatorial Box-Behnken (Tabela 3). A matriz de Planejamento fatorial com os fatores e níveis analisados, consistiu na combinação de 17 experimentos incluindo 5 pontos centrais (Tabela 4).

Tabela 3. Fatores codificados e seus níveis empregados no segundo Planejamento fatorial Box-Behnken.

Fatores Níveis

-1 0 +1

Proporção sólido-líquido (g/mL) 1:10 1:7,5 1:5 Graduação alcoólica (%, v/v) 50 60 70 Temperatura (°C) 45 55 65

31 Tabela 4. Matriz experimental do segundo Planejamento fatorial Box-Behnken para a avaliação da influência dos fatores de extração por ultrassom da hibalactona.

Experimento Proporção Graduação Temperatura sólido- alcoólica líquido 1 -1 -1 0

2 -1 +1 0

3 +1 -1 0

4 +1 +1 0

5 0 -1 -1

6 0 +1 -1

7 0 -1 +1

8 0 +1 +1

9 0 0 -1

10 +1 0 -1

11 -1 0 +1

12 +1 0 +1

13 0 0 0

14 0 0 0

15 0 0 0

16 0 0 0

17 0 0 0

Os resultados experimentais obtidos em ambos os Planejamentos Box-Behnken foram analisados por ANOVA e regressão linear utilizando a MSR e empregando o software Statistica 7. O modelo polinomial quadrático de resposta encontrado consistiu em uma equação polinomial linear, dada pela equação 5. Ao final do processo, a condição ótima de extração da hibalactona foi testada em triplicata por meio de experimento comprobatório.

32 Equação 5: 푘 푘

푦 = 훽0 + ∑ 훽푖푋푖 + ∑ 훽푖푖푋²푖 + ∑ ∑ 훽푖푗 푋푖푋푗 푖=1 푖=1

Onde: y = variável dependente (resposta predita);

β0 = constante do modelo; xi = conjunto de variáveis independentes; xj = coeficientes dos fatores de interação;

βi = coeficientes lineares;

βii = coeficientes quadráticos;

βij = coeficientes de interação.

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