Interactions Entre Les Éosinophiles Et Les Cellules Épithéliales Bronchiques : Importance Dans L'asthme Et Sa Sévérité

Interactions entre les éosinophiles et les cellules épithéliales bronchiques : importance dans l'asthme et sa sévérité

Thèse

Marie-Chantal Larose

Doctorat en microbiologie-immunologie Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

Interactions entre les éosinophiles et les cellules épithéliales bronchiques : importance dans l’asthme et sa sévérité

Thèse

Marie-Chantal Larose

Sous la direction de :

Michel Laviolette, directeur de recherche Nicolas Flamand, codirecteur de recherche

Résumé

L’asthme est une maladie des bronches qui affecte environ 300 millions de personnes mondialement. L’asthme sévère représente 10% de cette population et certains de ces asthmatiques ont des symptômes incontrôlés et une éosinophilie pulmonaire persistante malgré la prise quotidienne de fortes doses de corticostéroïdes. Un nombre élevé d’éosinophiles dans les voies aériennes est associé avec des symptômes incontrôlés, des exacerbations fréquentes et la sévérité de l’asthme. L’identification des facteurs responsables de cette éosinophilie est donc primordiale. Par conséquent, le but général de ma thèse était de comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité. Le recrutement des éosinophiles du sang vers la lumière bronchique nécessite, entre autres, la participation de chimioattractants, de l’interleukine-5 et de molécules d’adhésion. Les éotaxines, CCL11, CCL24 et CCL26, sont des chimioattractants puissants et sélectifs pour l’éosinophile puisqu’elles se lient principalement sur le récepteur CCR3 présent sur l’éosinophile. Notre premier objectif était de comparer l’effet des différentes éotaxines sur la migration des éosinophiles d’asthmatiques et de sujets sains. Par la suite, nous avons focalisé nos études sur l’importance de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Étant donné que la CCL26 n’est pas exprimée chez les rongeurs, les études portant sur la CCL26 sont limitées comparativement à celles sur la CCL11 et la CCL24. À cet égard, notre deuxième objectif était d’évaluer le rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité et de caractériser l’effet de l’IL-13 sur la production de la CCL26 par les cellules épithéliales bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Ensuite, le troisième objectif était d’investiguer les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les cellules épithéliales bronchiques. Le quatrième objectif a permis d’évaluer l’importance de l’IL-5 dans le recrutement des éosinophiles, en étudiant l’effet de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles induite par des médiateurs lipidiques, tels que l’acide 5-oxo-éicosatétraénoïque, la prostaglandine D2 et le 2- arachidonoyl-glycérol. Finalement, pour le cinquième objectif, nous avons évalué l’importance de la périostine, une protéine impliquée dans l’adhésion des éosinophiles, dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme. Pour conclure, les résultats obtenus dans cette thèse favoriseront l’identification de possibles cibles thérapeutiques pour diminuer l’éosinophilie pulmonaire persistante observée chez les asthmatiques sévères.

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Table des matières

Résumé ...... iii Table des matières ...... iv Liste des tableaux ...... vii Liste des figures ...... viii Abréviations ...... ix Remerciements ...... xiii Avant-propos ...... xv CHAPITRE I : Introduction ...... 1 1.0 : L’ASTHME ...... 1 1.1 Les différents phénotypes et sévérités ...... 1 1.2 L’inflammation allergique...... 2 1.3 L’inflammation chronique...... 3 2.0 : LES ÉOSINOPHILES ...... 4 2.1 La morphologie et la structure des éosinophiles ...... 4 2.2 La migration des éosinophiles de la moelle osseuse vers la muqueuse bronchique . 9 2.3 Le rôle de l’éosinophile dans l’asthme ...... 9 2.4 Le rôle de l’interleukine-5 chez les éosinophiles ...... 10 3.0 : LES CHIMIOATTRACTANTS ...... 10 3.1 Les chimiokines...... 11 3.2 Les médiateurs lipidiques ...... 16 4.0 : INTERLEUKINE-13 (IL-13) ...... 19 4.1 Les récepteurs et la signalisation cellulaire de l’IL-13 ...... 20 5.0 : LES CELLULES ÉPITHÉLIALES BRONCHIQUES (CÉB) ...... 23 5.1 Effet de l’IL-13 sur les CÉB ...... 25 5.2 Les CÉB, l’IL-13 et la CCL26 ...... 26 CHAPITRE II : Problématique et objectifs de recherche ...... 28 CHAPITRE III ...... 30 CCL26/Eotaxin-3 is more potent to induce the migration of eosinophils of asthmatics than CCL11/eotaxin-1 and CCL24/eotaxin-2 ...... 30 3.1 Résumé ...... 31 3.2 Abstract ...... 32 3.3 Introduction ...... 33 3.4 Materials and Methods ...... 33 3.5 Results ...... 36 3.6 Discussion ...... 41 3.7 Conclusion ...... 45 3.8 List of Abbreviations ...... 45 3.9 Acknowledgments ...... 45 3.10 Figures ...... 46 CHAPITRE IV ...... 51 Correlation between CCL26 production by human bronchial epithelial cells and airway eosinophils: involvement in severe eosinophilic asthma ...... 51 4.1 Résumé ...... 52 4.2 Abstract ...... 53

4.3 Introduction ...... 54 4.4 Materials and Methods ...... 55 4.5 Results ...... 58 4.6 Discussion ...... 61 4.7 Conclusion ...... 63 4.8 List of abbreviations ...... 64 4.9 Acknowledgments ...... 64 4.10 Tables and Figures ...... 65 CHAPITRE V ...... 73 STAT6 activation involved in CCL26 greater production by bronchial epithelial cells from subjects with severe eosinophilic asthma ...... 73 5.1 Résumé ...... 74 5.2 Abstract ...... 75 5.3 Introduction ...... 76 5.4 Materials and methods ...... 77 5.6 Discussion ...... 82 5.7 Conclusion ...... 84 5.8 List of abbreviations ...... 84 5.9 Acknowledgements ...... 84 5.10 Tables and figures ...... 86 CHAPITRE VI ...... 93 Mechanisms of human eosinophil migration induced by the combination of IL-5 and the endocannabinoid 2-arachidonoyl-glycerol ...... 93 6.1 Résumé ...... 94 6.2 Abstract ...... 95 6.3 Introduction ...... 96 6.4 Materials and methods ...... 96 6.5 Results ...... 98 6.6 Discussion ...... 99 6.7 Conclusion ...... 100 6.8 List of abbreviations ...... 101 6.9 Tables and figures ...... 102 CHAPITRE VII ...... 106 Sputum but not blood periostin levels correlate with sputum eosinophil counts in asthma...... 106 7.1 Résumé ...... 107 7.2 Abstract ...... 108 7.3 Introduction ...... 109 7.4 Materials and methods ...... 109 7.5 Results ...... 111 7.6 Discussion ...... 113 7.7 Conclusion ...... 117 7.8 List of Abbreviations ...... 117 7.9 Acknowledgements ...... 117 7.10 Tables and figures ...... 118 v

Chapitre VIII : Perspectives et conclusions ...... 127 Bibliographie ...... 156

Liste des tableaux

Tableau I. Liste non exhaustive des protéines et médiateurs présents dans les granules des éosinophiles.

Tableau II. Liste non exhaustive des médiateurs sécrétés par l’éosinophile.

Tableau III. Liste non exhaustive des récepteurs présents sur l’éosinophile.

Tableau IV. Liste des récepteurs des chimiokines et de leurs agonistes.

Tableau V. Liste des chimioattractants in vitro de l’éosinophile, de leurs récepteurs et de leur efficacité chez l’humain et les rongeurs.

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Liste des figures

Figure I. Inflammation bronchique chez les asthmatiques.

Figure II. La signalisation de l’IL-13 induite par sa liaison avec son récepteur.

Figure III. Expression de CX3CR1 chez les éosinophiles et l’effet de son ligand sur la migration des éosinophiles.

Figure IV. Expression des récepteurs des chimiokines chez les éosinophiles frais humains.

Figure V. Effet de l’IL-5 sur l’expression des récepteurs CCR et CXCR chez les éosinophiles.

Figure VI. Expression du récepteur CB2 chez les leucocytes humains.

Figure VII. Production de la CCL26 chez des CÉB d’un asthmatique sévère non éosinophilique stimulées à l’IL-13.

Figure VIII. Expression de la 15-LO chez les CÉB.

Figure IX. Effet du HECO1 sur la production des métabolites de la 15-LO par les éosinophiles.

Figure X. Effet de la 15-LO sur la production des protéines induite par l’IL-13 chez les CÉB.

Figure XI. Effet des médiateurs de la 15-LO sur l’expression de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les Calu-3.

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Abréviations

11-HETE : acide 11-hydroxyéicosatétraénoïque 12-HETE : acide 12-hydroxyéicosatétraénoïque 13-HODE : acide 13-hydroxyoctadécadiénoïque 15-HEDE : acide 15-hydroxyéicosadiénoïque 15-HETE : acide 15-hydroxyéicosatétraénoïque 15-HETrE : acide 15-hydroxyéicosatriénoïque 15-LO : 15-lipoxygénase-1 2-AG : 2-arachidonoyl-glycérol 5-oxo-ETE : acide 5-oxo-éicosatétraénoïque AA : acide arachidonique AEA : anandamide APRIL : a proliferation-inducing ligand AMAC : alternative macrophage activation-associated CC chemokine AREG : amphiregulin

BLT1 : leukotriene B4 receptor 1

BLT2 : leukotriene B4 receptor 2 BRAK : breast- and kidney-expressed chemokine C5a : complement component 5a CÉB : cellules épithéliales bronchiques CIS : cytokine-induced STAT inhibitor CTACK : cutaneous T-cell-attracting chemokine CysLTs : cystéinyl-leucotriènes DAMPs : damage-associated molecular patterns DC-CK1 : dendritic cell-specific CC chemokine

DP2 : prostaglandin D2 receptor 2 DTT : dithiothreitol Duox : dual oxidases ECP : eosinophilic cationic protein EDN : eosinophil-derived neurotoxin EGF : epidermal growth factors

EGFRs : epidermal growth factors receptors ELC : EBI1-ligand chemokine ENA : epithelial neutrophil-activating peptide EPO : eosinophil peroxidase

EXC4 : eoxin C4 FAAH : fatty acid amide hydrolase FGF : fibroblast growth factor fMLP : N-formylmethionine-leucyl-phenylalanine FPR : formyl peptide receptor FPRL1 : formyl peptide receptor-like 1 FPRL2 : formyl peptide receptor-like 2 GCP : granulocyte chemotactic protein G-CSF : granulocyte colony-stimulating factor GM-CSF : granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSFR : GM-CSF receptor GRO : growth-regulated protein HB-EGF : Heparin-binding EGF-like growth factor HCC : hemofiltrate CC chemokine HPLC : high performance liquid chromatography HRB : hyperréactivité bronchique ICAM : intercellular adhesion molecule Ig : immunoglobines IGF : insulin-like growth factor IL : interleukine ILC : IL-11 R-alpha-locus chemokine IL-3Rα : IL-3 receptor alpha IL-4Rα : IL-4 receptor alpha IL-5Rα : IL-5 receptor alpha IL-13Rα1 : IL-13 receptor alpha 1 INF : interféron INFγR : INFγ receptor

IP : interferon gamma-induced protein I-TAC : interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant JAK : Janus kinases LARC : liver and activation-regulated chemokine LBA : lavage bronchoalvéolaire LC-MS/MS : chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse LDL : lipoprotéines de basse densité LEC : liver-expressed chemokine LFA : lymphocyte function-associated antigen LT : leucotriène MADCAM : mucosal vascular addressin cell adhesion molecule MAG : monoacylglycérol MBP : major basic protein MCP : monocyte chemotatic protein MDC : macrophage-derived chemokine MEC : mucosa-associated epithelial chemokine MGSA : melanoma growth stimulating activity MIP : macrophage inflammatory protein Mlig : monokine induced by INF-γ MMP : matrix metalloproteinase MPIF : myeloid progenitor inhibitory factor NADPH : nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NAP : neutrophil-activating peptide NDGA : nordihydroguaiaretic acid NGF : nerve growth factor NO : nitric oxide OXE : oxoeicosanoid receptor PAF : platelet-activating factor PAMPs : pathogen-associated molecular patterns PARC : pulmonary and activation-regulated chemokine PDGF : platelet-derived growth factor

PF : platelet factor PG: prostaglandine PIRB : paired immunoglobulin-like receptor B PRRs : pattern recognition receptors PTP : protein tyrosine phosphatases RANTES : regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted SCF : stem cell factor SCM : single cysteine motif SDF : stromal cell-derived factor siRNA : small interfering RNA SLC : secondary lymphoid-tissue chemokine SOCS : suppressor of cytokine signalling STAT6 : signal transducer and activator of transcription 6 STCP : stimulated T cell chemotactic protein TARC: thymus and activation-regulated chemokine TECK : thymus-expressed chemokine TGF : transforming growth factor TLR : toll-like receptor TNF : tumor necrosis factor TNFβR : TNF-beta receptor

TH2 : T-helper 2 cell TDCF : tumor derived chemotactic factor TSLP: thymic stromal lymphopoietin TX : thromboxane TYK : tyrosine kinase VCAM : vascular cell adhesion molecule VEGF : vascular endothelial growth factor VLA : very late antigen γc : la chaine commune des récepteurs de cytokines γ

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Remerciements

Les études graduées sont une grande aventure qui nécessite de la passion, de la persévérance et, le plus important, des personnes qui vous entourent et soutiennent. J’ai eu la chance de partager cette aventure avec des personnes formidables que je ne remercierai jamais assez.

Tout d’abord, je tiens à remercier mon comité de thèse, Dre Marie-Renée Blanchet, Dre Jamila Chakir, Dr Francis Davoine, Dr Michel Laviolette et Dr Nicolas Flamand, pour avoir accepté d’évaluer et de corriger ma thèse.

Marc-Antoine Loranger, tu m’as toujours supporté et encouragé dans mes choix de carrière et de vie. Je te remercie d’avoir accepté mon train de vie chargé et pour ton écoute lors des moments joyeux et difficiles. Tu as été mon rayon de soleil pendant mes études graduées. Je veux également remercier Archie pour sa compagnie lors de l’écriture de ma thèse.

Mes parents, Jean-Pierre Larose et Lise St-Cyr, ont été mes modèles pendant toute mon enfance et le seront pour le reste de ma vie. Je chérirai pour toujours votre appui et vos encouragements dans mes activités académiques et sportives.

Je remercie mes amis pour toutes ces soirées de détente et de rigolade qui m’ont permis de me relaxer et de me changer les idées. J’ai passé des moments formidables avec vous que je n’oublierais jamais. Camille Leclerc, je te remercie spécialement pour m’avoir supporté comme colocataire pendant mon pré-doctorat.

Véronique Provost et Cyril Martin, je vous remercie de m’avoir guidé, aidé et de m’avoir partagé votre expérience ainsi que votre apport technique. Véro, tu as été un mentor compréhensif et à l’écoute, me permettant d’apprendre beaucoup et efficacement, et de me sentir supporté. Sophie Plante, je te remercie pour ton aide et pour tout le temps passé ensemble dans la salle de culture. De plus, je dois dire un gros merci à Anne-Sophie qui m’a enduré pendant la fin de mon doctorat. Tu m’as permis de finir mon doctorat dans la joie et la bonne humeur.

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Je veux également remercier les co-auteurs des papiers inclus dans cette thèse. Votre aide et expérience ont été essentielles pour la réalisation de celle-ci.

Finalement, mes directeurs de recherche, Dr Michel Laviolette et Dr Nicolas Flamand, vous serez des modèles pour ma carrière future. Je vous remercie pour le temps que vous m’avez consacré et vos commentaires pertinents et avisés qui m’ont permis de m’améliorer et de me perfectionner. Sans vous, je n’aurai pas réussi à faire des études graduées d’une telle qualité et aussi complètes.

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Avant-propos

Je suis co-première auteure avec Dr Véronique Provost de l’article CCL26/Eotaxin-3 is more potent to induce the migration of eosinophils of asthmatics than CCL11/eotaxin-1 and CCL24/eotaxin-2, publié au Journal of Leucocyte Biology en août 2013 (Provost et al. J Leukoc Biol. 2013 Aug; 94(2):213-22.).

Je suis co-première auteure avec Caroline Turcotte de l’article Mechanisms of human eosinophil migration induced by the combination of IL-5 and the endocannabinoid 2- arachidonoyl-glycerol, publié au Journal of Allergy and Clinical Immunology en mai 2014 (Larose et al. J Allergy Clin Immunol. 2014 May;133(5):1480-2.).

Je suis première auteure de l’article Correlation between CCL26 production by human bronchial epithelial cells and airway eosinophils: involvement in severe eosinophilic asthma, publié au Journal of Allergy and Clinical Immunology en octobre 2015 (Larose et al. J Allergy Clin Immunol. 2015 Oct;136(4): 904-13.).

Je suis première auteure de l’article Sputum but not blood periostin levels correlate with sputum eosinophil counts in asthma, soumis au European Respiratory Journal.

Je suis première auteure de l’article Methylation level and STAT6 activation involved in CCL26 greater production by bronchial epithelial cells from subjects with severe eosinophilic asthma qui sera prochainement soumis.

CHAPITRE I : Introduction

1.0 : L’ASTHME L’asthme est un problème majeur de santé qui affecte environ 300 millions de personnes mondialement (1). En Amérique du Nord, la prévalence est très élevée, soit d’environ 10%, et elle augmente chaque année, ce qui engendre des coûts très importants à l’état (2,2 milliards de dollars en 2010 au Canada) (2;3). L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies respiratoires qui implique de nombreuses cellules inflammatoires, immunes et résidentes de la muqueuse bronchique, ainsi que leurs médiateurs, les cytokines, les chimiokines, les facteurs de croissance et les médiateurs lipidiques (4;5). Cette maladie peut causer des serrements à la poitrine, une respiration sifflante, de la toux et de l’essoufflement (4). Ces symptômes sont causés par un rétrécissement des voies respiratoires dû à l’inflammation, au remodelage de la muqueuse bronchique et à l’hyperréactivité bronchique (HRB), qui se caractérise par une réponse exagérée des muscles lisses bronchiques lors de l’inhalation d’un allergène ou d’un stimulus (4;6). Les médicaments principalement utilisés dans le traitement de l’asthme sont les agonistes β2-adrénergiques et les corticostéroïdes. D’une part, les agonistes β2-adrénergiques sont des bronchodilatateurs utilisés pour relaxer les muscles lisses bronchiques et diminuer les symptômes dus au bronchospasme. D’autre part, les corticostéroïdes sont des anti-inflammatoires employés pour prévenir les exacerbations ainsi que pour contrôler et soulager les symptômes de l’asthme causés par l’inflammation (4;7). Récemment, deux médicaments biologiques ont été approuvés, l’omalizumab, constitué d’anticorps dirigés contre l’immunoglobuline E (IgE), et le mepolizumab, constitué d’anticorps dirigés contre l’interleukine (IL)-5. Ils réduisent les exacerbations et l’inflammation permettant une diminution de la dose de corticostéroïdes administrée quotidiennement chez les sujets asthmatiques sévères allergiques (omalizumab) ou éosinophiliques (mepolizumab) présentant des symptômes incontrôlés malgré la prise de fortes doses de corticostéroïdes (8-12).

1.1 Les différents phénotypes et sévérités L’asthme est une maladie hétérogène qui comprend plusieurs phénotypes et différents niveaux de sévérité. Le phénotype le plus répandu chez les asthmatiques est celui de type

TH2 (T-helper 2 cell) (13;14). Ce phénotype se caractérise par la présence d’éosinophiles et

de lymphocytes TH2, de cellules inflammatoires, et de cytokines TH2 telles que l’IL-4, l’IL- 5 et l’IL-13 (13;15). D’autre part, la sévérité de l’asthme est classifiée légère, modérée ou sévère en fonction du niveau d’obstruction bronchique et de la dose de corticostéroïdes utilisée quotidiennement (16). Chez les asthmatiques sévères, des sujets éosinophiliques et non éosinophiliques sont également observés. Présentement, ces phénotypes sont définis par le pourcentage d’éosinophiles dans les expectorations induites (16;17). Généralement, lorsque les asthmatiques sévères ont 3% et plus d’éosinophiles dans leurs expectorations induites, ils sont définis comme étant éosinophiliques. Le pourcentage d’éosinophiles dans les expectorations induites est la mesure la plus reproductible et efficace disponible. Cependant, la technique pour obtenir des expectorations induites est coûteuse, laborieuse et non disponible dans plusieurs hôpitaux ou cliniques. Donc, la découverte de biomarqueurs valables et mesurables dans le sang favoriserait une classification plus simple des sujets par phénotype. Cette classification est un élément clé lors du choix du traitement à prévaloir chez les sujets avec un asthme sévère, puisque certains médicaments sont inefficaces chez certains phénotypes. En effet, certains asthmatiques sévères sont incontrôlés, symptômes persistants et inflammation soutenue, malgré la prise de fortes doses de corticostéroïdes (13).

1.2 L’inflammation allergique L’inflammation est une caractéristique importante de l’asthme qui a un grand rôle à jouer dans l’HRB et le remodelage des voies respiratoires (6;18). Le développement de l’inflammation allergique débute avec l’exposition des voies respiratoires à un aéro- allergène, tel que les poils d’animaux, les acariens, le pollen et les moisissures (19). En premier lieu, il se produit une sensibilisation des poumons à l’allergène. L’allergène traverse l’épithélium soit grâce à son activité protéolytique intrinsèque ou soit en étant capté par des cellules dendritiques (19). Les cellules dendritiques activées par les allergènes migrent vers les ganglions lymphatiques à proximité pour activer les lymphocytes T CD4+ naïfs (19). Lorsque des cellules inflammatoires, telles que les basophiles, les éosinophiles, les mastocytes, les lymphocytes natural killer T, les lymphocytes TH2 et les cellules lymphoïdes innées 2, produisent de l’IL-4 dans le site d’activation, les lymphocytes T CD4+ se différencient en lymphocytes TH2 (19-21). Ces lymphocytes sécrèteront de l’IL-4 et de l’IL- 13 et se lieront aux lymphocytes B grâce aux molécules de co-stimulation CD28 et au ligand

CD40, ce qui induira la production d’IgE par les lymphocytes B (19). Ces IgE spécifiques migrent vers les bronches pour se lier aux récepteurs de hautes affinités d’IgE des mastocytes. La liaison des IgE spécifiques aux mastocytes prédisposera les mastocytes à réagir immédiatement lors des prochaines expositions (19). Lors d’une deuxième exposition à l’allergène, une inflammation bronchique se produit immédiatement suivant l’exposition à l’allergène (19). Les allergènes qui traversent l’épithélium se lient aux récepteurs d’IgE spécifiques présents à la surface des mastocytes (19). Ces mastocytes activés sécrètent des granules, des médiateurs lipidiques et des cytokines provoquant la réaction immédiate. Cette réaction se caractérise par une bronchoconstriction, une vasodilatation, une augmentation de la perméabilité vasculaire et de la production de mucus (19). Dans certains cas, les mastocytes activés, les lymphocytes TH2 et, possiblement, les cellules lymphoïdes innées 2 synthétisent des cytokines, des chimiokines et des facteurs de croissance, conduisant au recrutement de cellules inflammatoires telles que les éosinophiles, les basophiles, les lymphocytes T et les monocytes (19;21). Ce phénomène induira une réaction tardive qui provoquera une deuxième phase de bronchoconstriction (19). La Figure I est une représentation de l’inflammation bronchique chez les asthmatiques.

1.3 L’inflammation chronique Lors d’expositions répétées des voies respiratoires à un allergène, une inflammation chronique se développe (18;19). Cette inflammation contribue au développement de l’asthme, à l’hyperréactivité bronchique et au remodelage bronchique (18). En effet, elle se caractérise par des dommages continus aux cellules épithéliales bronchiques et par l’induction d’un remodelage bronchique (19). Ce remodelage provoque plusieurs changements dans la structure du tissu bronchique dont une fibrose sous-épithéliale due à une production excessive des protéines de la matrice extracellulaire par les fibroblastes, la métaplasie des glandes à mucus qui est associée avec une augmentation de la production du mucus, l’hypertrophie et l’hyperplasie des muscles lisses et une augmentation de l’angiogenèse (19).

Figure I. Inflammation bronchique chez les asthmatiques.

Sally E Wenzel. 2012, Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches.

Sally E Wenzel. 2012, Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. (22)

2.0 : LES ÉOSINOPHILES L’éosinophile est une cellule inflammatoire centrale dans l’asthme et sa sévérité (23). En effet, le nombre d’éosinophiles dans le sang et dans les voies aériennes corrèle avec la sévérité de la maladie, les symptômes et le nombre d’exacerbations (18;24-27). Ils représentent de 1 à 3% des leucocytes circulatoires chez les individus sains et environ 5% des leucocytes chez les asthmatiques (23). Ils sont également présents dans différentes pathologies telles que la rhinosinusite chronique, l’œsophagite à éosinophiles, la rhinite, la dermatite et certains cancers (syndrome hyperéosinophilique, maladie de Hodgkin) (28-30).

2.1 La morphologie et la structure des éosinophiles La morphologie de cette cellule se caractérise par un diamètre de 8 µm, par un noyau bilobé et par la présence de nombreux granules (23;31;32). Les principaux granules retrouvés dans l’éosinophile sont les granules spécifiques, aussi nommées secondaires, et, en moins grande quantité, les granules primaires, les eosinophil sombrero vesicles, les petites granules et les corps lipidiques (Tableau I) (33). Les granules spécifiques sont constituées des major basic

protein (MBP), eosinophil-derived neurotoxin (EDN), eosinophilic cationic protein (ECP) et eosinophil peroxidase (EPO), en plus de plusieurs cytokines, chimiokines, enzymes et facteurs de croissance (34). De nombreuses études ont également démontré la présence de récepteurs dans les granules secondaires, soit des récepteurs de chimiokines (CCR3), de cytokines (IL-4Rα), de cystéine-leucotriènes (CysLTs) et de P2Y12 (34). De plus, les éosinophiles produisent rapidement des médiateurs lipidiques (CysLTs, thromboxane (TX), prostaglandine (PG) D2, acide 15-hydroxyéicosatétraénoïque (15-HETE), facteur d'activation plaquettaire (PAF)) (35;36), et synthétisent de nombreux autres médiateurs lorsqu’ils sont activés (Tableau II). Finalement, l’éosinophile exprime une grande variété de récepteurs qui lui permet d’interagir avec son environnement (Tableau III) (35).

Tableau I. Liste non exhaustive des protéines et médiateurs présents dans les granules des éosinophiles. Granules Granules Petites granules Corps lipidiques spécifiques primaires

Protéines Cristaux de Phosphatases Cyclooxygénase, cationiques Charcot-Leyden acides, 5-LO, MBP, ECP, EDN, Arylsulfatase B, 15-LO, EPO Catalase, LTC4 synthase, Cytochrome b558, EPO, Enzymes Élastase, Estérase Phosphatases acides, ECP Collagénases, Arylsulfatase B, Histaminase, Phospholipase D, Catalase, Estérases non spécifiques, Lyzozyme, Élastase, Énoyl-CoA hydratase, 3- Kétoacyl-CoA thiolase, β- glucuronidase

Chimiokines CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CXCL1, CXCL10, CXCL12

Cytokines IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-10, IL- 12, IL-13, IFN-γ, TNF, GM-CSF, TGFα, TGFβ

Facteurs de croissance SCF, NGF, PDGF, VEGF, EGF, APRIL

Références : (35;36)

Tableau II. Liste non exhaustive des médiateurs sécrétés par l’éosinophile.

Médiateurs

Chimiokines CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL10, CCL11, CCL17, CCL22, CXCL1, CXCL5, IL-8, CXCL9, CXCL10, CXCL11

Cytokines IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-16, IL-17, IFN- γ, TNF-α, GM-CSF

Lipides CysLTs, PAF, TXA2, PGD2, PGE2

Facteurs de croissance SCF, TGF-α, HB-EGF-LBP, NGF, PDGF

Facteurs fibrogéniques IL-11, TGF-β, NGF, SCF, PDGF, EGF, VEGF, HB-EGF, MMP9, MMP17 Références : (23;35;37)

Tableau III. Liste non exhaustive des récepteurs présents sur l’éosinophile. Récepteurs Ligands Chimiokines CCR1 CCL3, CCL5 CCR2 CCL2 CCR3 CCL2,-5,-11,-24,-26 CCR6 CCL20 CXCR1, CXCR2 IL-8 Cytokines IL-3Rα, βc IL-3 IL-5Rα, βc IL-5 GM-CSFRα, βc GM-CSF IFNGR IFN-γ TNFβR TNF-β IL-4Rα, IL-13Rα1 IL-4, IL-13

Médiateurs lipidiques CysLT1, CysLT2 CysLTs PAF PAF FPR fMLP OXE 5-oxo-ETE

CB2 2-AG

BLT1, BLT2 LTB4

DP2 PGD2 Molécules d’adhésions LFA-1 ICAM-1,-2,-3 VLA4 VCAM-1, fibronectine CD62L MADCAM-1, CD34 CD162 sélectines P αdβ2 VCAM α4β7 MADCAM-1, VCAM, fibronectine Molécules de signalisation TLR PAMPs MHCII récepteur des lymphocytes T CD80, CD86 CD28 Références : (23;35;37-49)

2.2 La migration des éosinophiles de la moelle osseuse vers la muqueuse bronchique Le recrutement des éosinophiles vers la muqueuse bronchique est un processus complexe mettant en jeux plusieurs cellules et molécules. Le développement de l’éosinophile débute dans la moelle osseuse où l’éosinophile dérive d’une cellule de la moelle osseuse CD34+, une molécule importante dans le recrutement des éosinophiles vers les voies aériennes (31;50). En effet, une diminution du nombre d’éosinophiles dans les LBA est observée chez des souris déficientes en CD34 comparativement aux souris contrôles (51). Ensuite, l’éosinopoïèse est induite principalement par l’IL-5, un médiateur essentiel à la différenciation, la maturation et la prolifération des précurseurs des éosinophiles. Par la suite, des cytokines, chimiokines et molécules d’adhésion, spécialement l’IL-5 et les éotaxines, initient la migration des éosinophiles de la moelle osseuse vers le sang (23;52;53). Dans le sang, les éosinophiles se lient faiblement à la paroi des vaisseaux sanguins grâce aux sélectines, créant un roulement des cellules (54;55). Lorsque les éosinophiles se lient à un chimioattractant, ceux-ci se fixent à la paroi vasculaire, puis adhèrent à celle-ci grâce aux intégrines, aux molécules d’adhésion des cellules vasculaires (VCAM) et aux molécules d’adhésion intercellulaires (ICAM) (31;56). Ce phénomène entraine la transmigration des éosinophiles entre les cellules endothéliales vers la matrice extracellulaire du tissu bronchique (31;57). Cette opération est facilitée par le réarrangement du cytosquelette des éosinophiles et par la digestion de la membrane extracellulaire produite par des protéases sécrétées par les éosinophiles, les métalloprotéases matricielles (MMPs) et le système plasminogène-plasmine (31;57).

2.3 Le rôle de l’éosinophile dans l’asthme Suite au recrutement des éosinophiles dans la muqueuse bronchique et à leur activation, ceux- ci libèrent des granules avec des protéines toxiques, des médiateurs lipidiques et des espèces réactives de l’oxygène pour se défendre contre l’invasion de particules indésirables (31). La libération des granules se fait soit par exocytose (fusion d’une ou des granule(s) avec la membrane cellulaire), par à la pièce (sécrétion sélective de granules dans de petites vésicules) ou par cytolyse (rupture de la membrane cellulaire) (31). D’une part, ces granules endommagent notamment les nerfs et les CÉB (58;59). D’autre part, les médiateurs lipidiques induisent de la bronchoconstriction et l’hypersécrétion de mucus, et les espèces réactives de l’oxygène endommagent les cellules résidentes de la muqueuse bronchique (31).

2.4 Le rôle de l’interleukine-5 chez les éosinophiles L’IL-5 est une cytokine centrale dans l’inflammation éosinophilique (60;61). Tel que mentionné précédemment, elle favorise la prolifération, la maturation et la différentiation des éosinophiles (31). De plus, elle inhibe leur apoptose, augmentant leur survie dans le tissu bronchique (57). À cet égard, des traitements ciblant l’IL-5, le mépolizumab et le reslizumab, diminuent le nombre d’éosinophiles dans le sang et dans les expectorations induites, et réduit le taux d’exacerbation chez les asthmatiques sévères éosinophiliques (8;10-12;62;63). Des effets similaires ont été observés avec le benralizumab, un traitement ciblant le récepteur de l’IL-5, toutefois ces effets sont prolongés, plus rapides et efficaces (64).

L’IL-5 favorise également la migration des éosinophiles en amplifiant la réponse de ceux-ci à certains chimioattractants (60;61). La CCL5 (65;66), CCL11 (67), CCL26 (53), CCL26,

PAF (68;69), LTB4 (69), fMLP (69) et PGD2 (70) induisent une migration plus importante des éosinophiles lorsque ceux-ci sont en présence d’IL-5. Cet effet amplificateur de l’IL-5 serait causé par l’interaction entre la signalisation induite par son récepteur et les récepteurs des chimioattractants. L’IL-5 se lie à un récepteur constitué de deux sous-unités, IL-5Rα et la chaine commune β qui se lie également à l’IL-3 et au GM-CSF. La liaison de l’IL-5 avec son récepteur active plusieurs facteurs de signalisation, dont les protéines tyrosines kinases Lyn, Syk et Fyn, Janus kinases (JAK)2 et signal transducers and activators of transcription (STAT)5. Les protéines tyrosines kinases, spécialement Lyn, et JAK2 induisent l’activation de facteurs signalétiques Rho GTPases, qui favorisent le changement morphologique et la chimiokinésie de l’éosinophile. De plus, STAT5 peut faciliter la migration des éosinophiles en augmentant l’expression de molécules d’adhésion (71).

3.0 : LES CHIMIOATTRACTANTS Les chimioattractants sont particulièrement importants pour induire la migration cellulaire. Dans un contexte inflammatoire, ils induisent une migration dirigée des leucocytes vers le site inflammatoire à l’aide d’un gradient. Plusieurs chimiokines et médiateurs lipidiques induisent la migration des éosinophiles.

3.1 Les chimiokines Les chimiokines sont de petites protéines ayant plusieurs rôles lors d’une réaction inflammatoire, mais étant principalement reconnues pour leur pouvoir chimiotactique (72). Elles font partie de la grande famille des cytokines et elles sont regroupées en quatre sous- familles : les chimiokines C, CC, CXC et CX3C, classification basée sur la position des cystéines conservées aux extrémités N-terminales (72;73). À cet égard, le tableau IV répertorie les récepteurs connus des chimiokines et leurs agonistes par sous-famille. Dans l’homéostasie tissulaire, les chimiokines induisent le mouvement de cellules, dont les leucocytes, les fibroblastes, les cellules épithéliales et endothéliales, vers des tissus spécifiques (72;73). Lors d’une réaction inflammatoire pulmonaire, elles induisent la migration de cellules inflammatoires, telles que les éosinophiles et les neutrophiles, vers la muqueuse bronchique (71;73-75). Plusieurs chimiokines participent au recrutement de l’éosinophile humain avec des puissances chimiotactiques variées in vitro. Les éotaxines et CCL5 (RANTES) sont des chimioattractants reconnus et puissants de l’éosinophile humain (53;53;76;77;77-79). Cependant, les éotaxines se démarquent des autres chimioattractants, puisqu’elles sont sélectives pour l’éosinophile. CCL7 (MCP-3), CCL8 (MCP-2) et CCL13 (MCP-4) sont caractérisés comme étant de faibles chimioattractants de l’éosinophile humain (53;77;78;80-86). CXCL12 (SDF) semble également être un chimioattractant, mais d’autres études seront nécessaires pour le confirmer (87;88). D’autre part, le rôle de CCL3 comme chimioattractant de l’éosinophile humain n’est pas encore confirmé (76;84), puisque certaines études n’ont pas observé de migration des éosinophiles induite par CCL3 (78;81).

Tableau IV. Liste des récepteurs des chimiokines et de leurs agonistes.

Chimiokines Noms communs Récepteurs Chimiokines CC CCL1 I-309 CCR8 CCL2 MCP-1/TDCF CCR1, CCR2 CCL3 MCP-1α/LD78α CCR1, CCR3, CCR5 CCL4 MCP-1β CCR1, CCR5 CCL5 RANTES CCR1, CCR3, CCR5 CCL7 MCP-3 CCR1, CCR2, CCR3, CCR5 CCL8 MCP-2 CCR1, CCR2, CCR3, CCR5

CCL11 Éotaxine-1 CCR3, CCR5 CCL13 MCP-4 CCR1, CCR2, CCR3, CCR5 CCL14 HCC-1 CCR1, CCR5 CCL15 HHC-2 CCR1, CCR3 CCL16 HCC-4/LEC CCR1, CCR2, CCR3, CCR5 CCL17 TARC CCR4 CCL18 DC-CK1/PARC/AMAC-1 CCL19 MIP-3β/ELC/Exodus-3 CCR7 CCL20 MIP-3α/LARC/Exodus-1 CCR6 CCL21 6Ckine/SLC/Exodus-2 CCR7 CCL22 MDC/STCP-1 CCR4 CCL23 MPIF-1/CKβ8 CCR1 CCL24 MPIF-2/Eotaxin-2 CCR3 CCL25 TECK CCR9 CCL26 Éotaxine-3 CCR3, CX3CR1 CCL27 CTACK/ILC CCR10 CCL28 MEC CCR3, CCR10 Chimiokines C XCL1 Lymphotactin/SCM-1α XCR1 XCL2 SCM-1β XCR1 Chimiokines CX3C CX3CL1 Fractalkine/CX3CL1 CX3CR1 Chimiokines CXC CXCL1 GRO-α, MGSA-α CXCR2 CXCL2 GRO-α, MGSA-α CXCR2 CXCL3 GRO-γ, MGSA-γ CXCR2 CXCL4 PF-4 CXCR3 CXCL5 ENA-78 CXCR2 CXCL6 GCP-2 CXCR1, CXCR2 CXCL7 NAP-2 CXCR1, CXCR2 CXCL8 IL-8 CXCR1, CXCR2 CXCL9 Mig CXCR3 CXCL10 IP-10 CXCR3 CXCL11 I-TAC CXCR3, CXCR7 CXCL12 SDF-1α/β CXCR4, CXCR7 CXCL13 SDF-1α/β CXCR5 CXCL14 BRAK/bolekine CXCL16 CXCR6 Références : (89)

3.1.1 Les éotaxines Les éotaxines font partie de la famille des CC chimiokines (56). On retrouve trois éotaxines : CCL11 (éotaxine-1), CCL24 (éotaxine-2) et CCL26 (éotaxine-3) (90-92). Au niveau

structural, elles diffèrent de 70 % dans leurs séquences nucléotidiques et se retrouvent sur des chromosomes différents (93). Elles sont principalement produites par les CÉB, mais aussi par les éosinophiles, les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les lymphocytes et les fibroblastes (94;95). Les éotaxines sont hautement sélectives pour l’éosinophile grâce à leur liaison avec le récepteur CCR3, principalement présent sur l’éosinophile, leur permettant de créer un mouvement dirigé des éosinophiles selon un gradient (91). CCR3 est un récepteur à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (23;31;96). On le retrouve en très grande quantité sur l’éosinophile et en plus faible quantité sur le basophile, et le lymphocyte TH2 (97;98). D’autre part, des évidences suggèrent que les éotaxines se lient chacune de façon différente au récepteur CCR3, résultant à des affinités différentes (99;100). CCR3 est aussi un récepteur pour CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (MCP-2) et CCL13 (MCP-4) (101-103). Contrairement aux éotaxines, ces chimiokines peuvent activer d’autres récepteurs présents sur d’autres types cellulaires, démontrant qu’elles sont non sélectives pour l’éosinophile (104).

3.1.1.1 La CCL11 La CCL11 est la première éotaxine à être découverte en 1993, suivie par la CCL24 en 1997 et, finalement, la CCL26 en 1999 (92;100;105;106). Rapidement, les éotaxines ont été associées à différentes maladies éosinophiliques, dont l’asthme. En effet, les niveaux de CCL11 sont plus élevés dans les lavages bronchoalvéolaires (LBA), les expectorations induites, la muqueuse bronchique et le sang de sujets asthmatiques comparativement à des sujets sains (107-120). De plus, Dent et al ont démontré que les niveaux de CCL11 dans les expectorations induites sont plus élevés chez les sujets asthmatiques sévères ou modérés que chez les asthmatiques légers ou les sujets sains (121). Plusieurs évidences indiquent également une association entre les niveaux de CCL11 et le nombre d’exacerbations ou le nombre d’éosinophiles dans les LBA, les expectorations induites, les biopsies bronchiques et l’épithélium (107;110;111;115;122). Cependant, une étude a démontré que l’inhalation de la CCL11 chez des sujets asthmatiques n’induit pas le recrutement d’éosinophiles dans les voies aériennes, suggérant un impact limité de la CCL11 comme chimioattractant de l’éosinophile dans l’asthme (123). Chez les modèles murins, des souris Balb/c déficientes en CCL11 ont un recrutement inférieur des éosinophiles vers les voies aériennes suite à une stimulation allergénique comparativement aux souris contrôles. Par contre, des souris

C57/B6 déficientes en CCL11 ont un recrutement des éosinophiles similaires que les souris contrôles, illustrant que le rôle de la CCL11 dans le recrutement des éosinophiles dans les souris est dépendant de leur espèce (124).

3.1.1.2 La CCL24 Les niveaux de CCL24 augmentent dans la muqueuse bronchique et les expectorations induites de sujets asthmatiques (125;126). De plus, Coleman et al ont démontré que la CCL24 est associée avec la sévérité de l’asthme et le faible contrôle de la maladie (127). En effet, les sujets asthmatiques sévères éosinophiliques non contrôlés avaient des niveaux plus élevés de CCL24 dans l’épithélium que les sujets sains et ces niveaux étaient inversement associés avec le volume expiratoire maximale en une seconde (VEMS). Tout comme la CCL11, la CCL24 est également associée avec le nombre d’exacerbations et le nombre d’éosinophiles dans la muqueuse bronchique et l’épithélium (127;128). Dans des modèles murins, des souris déficientes en CCL24 ont une réduction du nombre d’éosinophiles dans le LBA, suite à une stimulation avec l’IL-13, et dans la muqueuse bronchique, suite à une stimulation à l’ovalbumine, comparativement aux souris contrôles. Pope et al se sont également intéressé à l’importance du récepteur CCR3 comparativement à la CCL11 et la CCL24 dans le recrutement des éosinophiles. Cette étude a démontré que, suite à une stimulation à l’ovalbumine, des souris déficientes en CCL24 et CCL11 ont une diminution similaire des éosinophiles dans le LBA et la muqueuse bronchique que des souris déficientes en CCR3 (129;130). Ces résultats illustrent que, chez la souris, le récepteur CCR3 nécessite la liaison de CCL11 et de CCL24 pour induire ces fonctions.

3.1.1.3 La CCL26 La CCL26, comparativement à la CCL11 et la CCL24, n’est pas exprimée par les rongeurs, puisque ceux-ci possèdent seulement un pseudogène de la CCL26 (131). L’utilisation de matériels humains est donc nécessaire afin d’étudier les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles, spécialement dans l’asthme d’autant plus que les rongeurs ne développent pas la maladie spontanément (132). À cet égard, la CCL26 semble se démarquer des deux autres éotaxines par son implication dans plusieurs physiopathologies éosinophiliques chez l’homme. En effet, les niveaux de CCL26 dans le sang augmentent chez les patients souffrant de dermatite atopique, d’œsophagite à éosinophiles, du syndrome de

Churg-Strauss, de folliculite éosinophilique, de vascularite à petits vaisseaux, du syndrome hyperéosinophilique et de maladies rhumatoïdes (133-138). De plus, Landi et al ont démontré que la CCL26 est le marqueur systémique le plus sensible afin d’identifier les patients atteints de cholangite sclérosante primitive, d’une cirrhose biliaire primitive ou d’une hépatite autoimmune (139). Dans les polypes nasaux, la quantité de cellules positives en CCL26 est plus élevée chez les sujets avec une rhinosinusite chronique éosinophilique que chez les sujets avec une rhinosinusite chronique non éosinophilique (29). Les niveaux de CCL26 sont également plus élevés dans les biopsies d’œsophage de patients avec une œsophagite à éosinophiles que ceux avec une maladie de reflux gastro-œsophagien (30). Dans l’asthme, les niveaux de CCL26 sont augmentés dans la muqueuse bronchique ou dans les LBA, spécialement à la suite d’une réaction allergique (140-142). Toutes ces études suggèrent une relation étroite entre la CCL26 et les éosinophiles. À cet égard, seulement Coleman et al se sont intéressés à évaluer cette relation dans l’asthme et sa sévérité et rapportent que l’expression en ARNm de la CCL26 dans l’épithélium est augmentée avec la sévérité de l’asthme et corrèle avec le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites (127).

3.1.1.4 Distinction entre les éotaxines Même si les trois éotaxines sont des chimioattractants sélectifs de l’éosinophile et qu’elles sont associées à l’asthme, plusieurs études suggèrent qu’elles agiraient distinctement l’une de l’autre et ce sur différents aspects. Tout d’abord, l’expression des éotaxines est régulée différemment à la suite d’une réaction allergique. Les niveaux de CCL11 corrèlent avec le nombre d’éosinophiles 6 heures à la suite d’une réaction allergique induite sous-cutanée alors que, pour la CCL24, cette corrélation est observée après 24 heures (143). Une autre étude a démontré que, chez les sujets asthmatiques, seuls les niveaux de CCL26 sont augmentés 24 heures après la réaction allergique dans les biopsies bronchiques. Ces études suggèrent une régulation temporelle distincte de chaque éotaxine (142). Par ailleurs, il a aussi été démontré que les gènes de la CCL11, de la CCL24 et de la CCL26 sont induits différemment. Les gènes de la CCL11 et de la CCL24 sont majoritairement induits par les cytokines TH1, mais le gène de la CCL26 seulement par les cytokines TH2 (144-148). Étant donné que les cytokines TH1 et TH2 sont très présentes dans la réponse initiale de l’inflammation et que, dans la réponse tardive, les cytokines TH2 sont prédominantes, ces résultats suggèrent une implication de la CCL11 et de la CCL24 lors de la réaction initiale et une implication de la CCL26 lors de la

réponse tardive. De plus, les éotaxines semblent être exprimées différemment selon le type de tissus ou de cellules : la CCL11 par la muqueuse et l’épithélium bronchique, la CCL24 par les macrophages alvéolaires et les CÉB et la CCL26 par les CÉB (111;127;140;149). Ces résultats supportent que la CCL11 favoriserait davantage la migration des éosinophiles vers la muqueuse bronchique alors que la CCL24 et la CCL26 favoriserait leur migration vers la lumière bronchique (149). Pour conclure, l’ensemble de ces études nous démontre que les éotaxines ont des rôles distincts, mais coopératifs dans la migration et l’activation des éosinophiles.

3.2 Les médiateurs lipidiques

Les médiateurs lipidiques ont de nombreux rôles physiologiques et pathophysiologiques dans l’inflammation, l’immunité et l’homéostasie (150). Ces médiateurs proviennent des phospholipides membranaires ou des lipides ingérés durant la diète. Dans un contexte inflammatoire, les médiateurs lipidiques peuvent avoir un rôle pro-inflammatoire, anti- inflammatoire ou régulateur (151). L’acide arachidonique (AA), métabolisé à partir des phospholipides membranaires grâce aux phospholipases A2, est une source importante de médiateurs lipidiques, tels que les leucotriènes (LT) et les prostaglandines (PG) (152). Ces métabolites ont des rôles importants dans l’asthme, dont la bronchoconstriction, la vasodilatation, l’augmentation de la production de mucus et de la perméabilité vasculaire

(153-156). De plus, le LTD4 amplifie la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les CÉB (157). Ces métabolites sont également des facteurs chimiotactiques de l’éosinophile. In vitro, la PGD2, le LTB4 et les CysLTs (LTC4, LTE4 et LTD4) sont de faibles chimioattractants de l’éosinophile humain (42;70;79;158-165). Cependant, les évidences quant au rôle du LTE4 et du LTC4 comme chimioattractant sont limitées. L’acide 5-oxo-éicosatétraénoique (5-oxo- ETE) est le chimioattractant le plus puissant de l’éosinophile humain (70;166;167). Le PAF, métabolisé à partir des phospholipides membranaires, est également un chimioattractant important (163;166;168;169). Métabolisé à partir de phospholipides membranaires, les endocannabinoïdes, soit le 2-arachidonoyl-glycérol (2-AG) ou l’anandamide (AEA) sont également des sources de médiateurs lipidiques. Le 2-AG et l’AEA activent principalement les récepteurs CB1 et CB2, et sont hydrolysés en acide arachidonique (AA) grâce à l’enzyme

monoacylglycérol (MAG) lipase et l’hydrolase des amides d'acides gras (FAAH), respectivement (151). L’éosinophile exprime le récepteur CB2 et l’enzyme MAG lipase, permettant au 2-AG et à l’AEA d’activer l’éosinophile ou d’être hydrolysés par celui-ci. A cet égard, le 2-AG induit une faible migration des éosinophiles humains (49;170). D’autres enzymes sont également impliquées dans le métabolisme de l’AA, des endocannabinoïdes et de leurs métabolites, telles que les cyclooxygénases et les lipoxygénases (LO) (151). Le tableau V représente la liste des chimioattractants in vitro de l’éosinophile et de leurs récepteurs connus.

Table V. Liste des chimioattractants in vitro de l’éosinophile, de leurs récepteurs et de leur efficacité chez l’humain et les rongeurs.

Chimioattractants de Humain Rongeurs l’éosinophile Récepteurs Efficacité Récepteurs Efficacité CCR3 CCR3 CCL11/ éotaxine-1 ++ ++ (171-174) (53;70;77;79) (175;176) (177-181) CCR3 CCR3 CCL24/ éotaxine-2 ++ + (171;172;174) (53;77) (175;176) (176;182) CCR3 CCR3 CCL26/ éotaxine-3 +++ - (171;172;183) (184;185) (175;176) (176;182) CCR1/3 CCR1/3/5 CCL5/ RANTES ++ - (171-173;186) (53;76-78) (175;176) (176;187;188) PAFR PAFR PAF ++ + (189;190) (164;166;168) (191) (179;192-195) C5aR C5aR C5a ++ ++ (196-198) (76;78;163) (199;200) (188;201) CB 2-AG 2 + n/a n/a (48;49) (170) OXE 5-oxo-ETE +++ - (45-47) (70;166;202) (203) BLT1/2 + BLT1/2 + LTB4 (38-40) (79;163;164) (38;40;204-206) (178;192-195) DP2 + DP2 + PGD2 (41-44) (42;70) (44;207-209) (43;210) FPR, FPRL1/2 fMLP + n/a + (211-213) (78;163;164) (201;214) CCR1/3 CCR1/3 CCL3/ MIP-1α +/- +/- (96;171-173;186) (76;78;84;215) (175;176) (176;182;216) CCR1/2/3 CCR1/2/3 CCL7/ MCP-3 + n/a (171-173;217) (77;78) (175;176) CCR1/2/3 CCR1/2/3 CCL8/ MCP-2 + n/a (171-173;217) (78) (175;176) CCR1/2/3 CCR1/2/3 CCL13/ MCP-4 + n/a (171-173;217) (53) (175;176) CXCL12/ SDF CXCR4 + CXCR4 n/a

(87;218) (87) (176)

CysLTR1/2 + CysLTR1/2 - LTD4 (219;220) (159-161;221) (222;223) (178) - : aucune migration, +/- : faible ou aucune migration, + : migration entre 10-30%, ++ : migration entre 30-50%, +++ : migration au-dessus de 50%, n/a : non disponible 4.0 : INTERLEUKINE-13 (IL-13)

L’IL-13 est une cytokine de type TH2 fortement associée à la physiopathologie de l’asthme. En effet, les niveaux d’IL-13 dans la muqueuse bronchique sont plus élevés chez les asthmatiques que chez les sujets sains (224;225) et, dans les expectorations induites, corrèlent avec l’asthme et sa sévérité (26;226;227). Plusieurs études ont également rapporté que des polymorphismes du gène de l’IL-13 peuvent contribuer au développement de la physiopathologie de l’asthme (228-232). Présentement en phase clinique, des traitements ciblant l’IL-13 ou son récepteur révèlent des résultats prometteurs chez les asthmatiques sévères incontrôlés avec une éosinophilie persistante. En effet, le lebrikizumab, un anti-IL- 13, diminue la fréquence des exacerbations et augmente le VEMS chez ces patients, spécialement ceux avec des niveaux élevés de périostine dans le sérum (233-235). Un autre anti-IL-13, le tralokinumab, augmente le VEMS, mais n’a aucun effet sur la fréquence des exacerbations (236;237). Finalement, le dupilumab, un inhibiteur du récepteur IL-4Rα, a des effets similaires au lebrikizumab (238;239). De plus, l’IL-13 est importante dans plusieurs autres maladies inflammatoires telles que la rhinite, la dermatite allergique et la sinusite chronique (228).

L’IL-13 partage plusieurs fonctions inflammatoires avec la cytokine IL-4. Leurs sécrétions par les lymphocytes T de type TH2 favorisent le développement, le recrutement et l’activation des mastocytes et des éosinophiles ainsi que la production de mucus, la prolifération des fibroblastes et des muscles lisses dans la muqueuse bronchique (8;19;228;240;241). Ils induisent également l’expression de nombreuses chimiokines telles que CCL2, CCL3, CCL7, CCL8, CCL11, CCL12, CCL17, CCL24 et CCL26 (228). L’IL-13 et l’IL-4 sont considérées comme étant des cytokines redondantes à cause du partage de leurs sous-unités de récepteurs. Malgré cette redondance, plusieurs études effectuées dans des modèles murins ont permis de démontrer des différences importantes entre ces deux cytokines. En effet, dans un contexte d’infection parasitaire, les souris déficientes en IL-13 n’ont aucune clairance des parasites et

produisent des IgE, mais les souris déficientes en IL-4 éliminent les parasites sans production d’IgE (242-244). D’autres études ont démontré que l’IL-4 est essentiel à la production d’IgE et à l’activation des mastocytes et que l’IL-13 est essentiel à la production de mucus et à la clairance des parasites. (245;246). Ces résultats révèlent que, d’une part, l’IL-4 est important pour l’activation des mastocytes et que, d’autre part, l’IL-13 est important pour la production de mucus et la clairance des vers. De plus, dans des modèles murins d’asthme, l’IL-13 est nécessaire et suffisant pour induire la réponse inflammatoire créée par les lymphocytes T de type TH2 et l’HRB dans les poumons (247;248). Par contre, l’IL-4 n’est pas nécessaire pour induire les symptômes de l’asthme, suggérant que l’IL-13 seul pourrait induire ces symptômes (228;248;249). À cet égard, l’administration d’un agent bloquant l’IL-13 dans les poumons de souris inhibe la production de mucus et l’HRB induite par l’ovalbumine (247). Par ailleurs, l’administration d’un anticorps ciblant l’IL-4 n’a aucun effet s’il est administré après la réaction allergique, mais prévient le développement de l’asthme si celui- ci est administré avant la réaction allergique (250). Pour conclure, ces études effectuées chez la souris supportent que l’IL-4 semble avoir un rôle prédominant lors de la sensibilisation à un allergène alors que l’IL-13 semble être davantage impliqué lors de l’inflammation chronique chez les asthmatiques (228;251).

4.1 Les récepteurs et la signalisation cellulaire de l’IL-13 Tel que mentionné ci-dessus, l’IL-13 et l’IL-4 ont des propriétés similaires causées par le partage de leurs sous-unités de récepteurs (228). Ces sous-unités sont la chaine commune des récepteurs de cytokine γ (γc), IL-4Rα, IL-13Rα1 et IL-13Rα2. L’IL-13 et l’IL-4 peuvent se lier aux récepteurs constitués d’une sous-unité IL-4Rα et d’une sous-unité IL-13Rα1 (251). Ce récepteur est présent sur les cellules hématopoïétiques, les lymphocytes B, les monocytes/macrophages, les cellules dendritiques, les éosinophiles, les basophiles, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les CÉB (228). Seul l’IL-4 peut se lier aux récepteurs constitués d’une sous-unité γc et d’une sous-unité IL-4Rα, et seul l’IL-13 peut se lier à la sous-unité IL-13Rα2 avec une forte affinité et à la sous-unité

IL-13Rα1 avec une faible affinité (252). La sous-unité IL-13Rα2 sert à moduler négativement la réponse de l’IL-13, puisqu’elle ne possède aucun élément pour activer la cellule (decoy receptor) (228). IL-13Rα2 est présente dans plusieurs organes tels que le cerveau, le foie, le thymus, et sur les cellules musculaires lisses et les CÉB dans le poumon (252). Les autres

sous-unités ont un rôle activateur puisqu’elles induisent l’activation de JAK : la sous-unité

γc active JAK3, la sous-unité IL-4Rα active JAK1 et la sous-unité IL-13Rα1 active JAK2 et la tyrosine kinase 2 (TYK2) (252). Lorsque les JAK sont activées, elles phosphorylent les résidus tyrosines spécifiques présents sur les sous-unités des récepteurs, permettant la liaison du facteur de transcription STAT6 sur le récepteur (252). Par la suite, JAK1 présent sur la sous-unité IL-4Rα induit la phosphorylation du facteur de transcription STAT6 (228). Cette phosphorylation induit la dimérisation de STAT6, une étape essentielle à la présence de STAT6 dans le noyau (252;253). Une fois que STAT6 activé est présent dans le noyau, il se lie au promoteur de certains gènes afin d’induire leur transcription, tels que la CCL26 (252;254;255). L’activation de STAT6 est hautement régulée et peut être inhibée par des phosphatases ou des protéines inhibitrices telles que les suppressor of cytokine signaling protein (SOCS) (256). La famille des SOCS comprend 8 protéines : cytokine-induced STAT inhibitor (CIS) et SOCS1-SOCS7 (257). SOCS1 et SOCS3 sont connues pour être impliquées dans l’inhibition de STAT6. SOCS1 se lie directement aux JAKs phosphorylées et SOCS3 se lie aux récepteurs de l’IL-13 (256;257). La Figure II représente la signalisation induite par la liaison de l’IL-13 à son récepteur.

L’importance de STAT6 dans l’inflammation asthmatique a été évaluée à plusieurs reprises (253). Par exemple, une étude a démontré que des souris déficientes en STAT6 ne développaient pas d’HRB ni de production de mucus induite par l’IL-13 et que la reconstitution de STAT6 dans les CÉB était suffisante pour renverser ce phénomène (258). En effet, STAT6 est particulièrement important pour induire les fonctions de l’IL-13, telles que la production de chimiokines, la contraction des muscles lisses et la production de mucus par les CÉB (259-261). De plus, les niveaux de STAT6 augmentent dans l’asthme, suggérant un rôle particulier de STAT6 dans l’inflammation bronchique chez les asthmatiques (253;262).

Figure II. La signalisation de l’IL-13 induite par sa liaison avec son récepteur.

Modifié de Shuai et al. 2003. Nat Rev Immunol. 3(11):900-11. (257)

5.0 : LES CELLULES ÉPITHÉLIALES BRONCHIQUES (CÉB) Chez l’homme, le poumon est l’organe qui possède la plus grande surface interagissant continuellement avec l’environnement extérieur (263). L’épithélium bronchique est la première barrière physique, chimique et immunologique face à l’environnement inhalé (264). Chez les sujets sains, l’épithélium bronchique est recouvert de mucus et contient des cellules ciliées en forme de colonnes, des cellules à mucus et des cellules Clara qui sécrètent du surfactant (265). Les cellules sont collées les unes aux autres ou à la matrice extracellulaire grâce à des molécules de jonctions et d’adhésions, aux desmosomes et aux hémidesmosomes, permettant à l’épithélium d’effectuer son rôle de barrière (264;265). Ces cellules recouvertes de mucus maintiennent l’homéostasie dans le poumon et protègent la muqueuse bronchique des réactions allergiques, bactériennes ou virales (266). La présence d’antioxydants favorise

le maintien de l’intégrité de l’épithélium et la résistance face aux dommages. Lors de dommage à l’épithélium, une réparation intrinsèque de celui-ci est activée par la sécrétion de ligands des récepteurs epidermal growth factor (EGFRs), conduisant à la migration, à la différentiation et à la prolifération des cellules.

Chez les asthmatiques, la structure normale de l’épithélium bronchique est altérée (264;266;267). Les cellules ciliées en forme de colonne sont physiquement endommagées, la prolifération des cellules basales et des cellules à Clara est altérée, les jonctions serrées de l’épithélium sont sévèrement perturbées, et une hyperplasie et une hypertrophie des cellules à mucus sont observées. De plus, la présence d’antioxydants est diminuée et l’expression des EGFRs et de molécules de stress et de dommage, tel que la protéine heat shock protein 70 et les enzymes caspases, sont augmentées, suggérant l’augmentation de l’apoptose et de la régénération des CÉB. L’expression de ces molécules corrèle avec la sévérité de l’asthme et peut expliquer en partie la réparation erronée de l’épithélium. Dans l’asthme sévère, l’épithélium est également caractérisé par une prolifération excessive des cellules basales.

Lors de l’activation des poumons par des allergènes ou des molécules présentes dans la pollution ou la fumée de cigarette, les CÉB contribuent à la régulation de l’inflammation pulmonaire grâce à la sécrétion de nombreux médiateurs (Tableau VI) (267). En effet, les CÉB expriment plusieurs pattern recognition receptors (PPRs) qui répondent à la liaison de pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), présent dans les microbes, ou à la liaison de damage-associated molecular patterns (DAMPs), sécrétés suite au dommage tissulaire (265). Les CÉB sont également impliquées dans l’induction des exacerbations. L’infection virale des voies aérienne contribue entre 40 et 80% des exacerbations chez les asthmatiques. Les virus infectent les CÉB par leur liaison avec les récepteurs ICAM-1 et des lipoprotéines à basse densité (LDL).

Tableau VI. Liste non exhaustive des médiateurs sécrétés par les CÉB lors d’une réaction inflammatoire Médiateurs Cytokines IL-1, IL-6, IL-11, IL-13, IL-15, IL-16, IL- 33, TSLP, IFN, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, TARC

Facteurs de croissance TGF-β, EGF, HB-EGF, AREG, FGFs, PDGFs, IGFs, neurotrophins, VEGFs

Chimiokines CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL24, CCL26, CCL13, CCL20, CCL28, CXCL8, CX3CL1

Médiateurs lipidiques AA, 15-LO, 15-HETE, CysLTs

Médiateurs peptidiques Endothéline-1, -3

Reactive oxygen/nitrogen species Duox-1 et -2, NO, peroxyde d’hydrogène

Enzymes Lipoxygénases, cytochrome P450, xanthine oxydase, NADPH oxydase Référence : (264;266;268)

5.1 Effet de l’IL-13 sur les CÉB L’épithélium est une cible importante de l’IL-13 lors d’une réaction inflammatoire, ce qui s’explique en partie par la présence des quatre sous-unités des récepteurs de l’IL-4 et l’IL-13 (266). La liaison de l’IL-13 aux CÉB contribue à de nombreux phénomènes inflammatoires, tels que le remodelage bronchique, la surproduction de mucus et le recrutement de cellules inflammatoires (95;264). Tous ces phénomènes sont produits grâce à la capacité de l’IL-13 à induire l’expression de gènes inflammatoires chez les CÉB. En effet, l’IL-13 contribue au remodelage bronchique en induisant l’expression de TGF-β, de la mucine 5b et de la protéine CLCA1 des cellules caliciformes chez les CÉB (269-271). De plus, l’IL-13 favorise la production de chimiokines par les CÉB, une étape majeure dans le recrutement de cellules inflammatoires vers le poumon (228;241;272). Par exemple, la production de la CCL26 par

les CÉB nécessite la présence de l’IL-13 ou de l’IL-4 (140;148;228;273;274). L’IL-13 induit également l’expression de la 15-lipoxygénase (LO) par les CÉB, une enzyme métabolisant des médiateurs lipidiques impliquée dans l’inflammation, spécialement chez les asthmatiques (275;276). En effet, Chu et al ont démontré que les niveaux de 15-LO et de 15-HETE, un de ses métabolites, augmentent avec la sévérité de l’asthme dans l’épithélium et dans les LBA, respectivement (275). Étant donné que les niveaux d’IL-13 corrèlent avec l’asthme et sa sévérité, les médiateurs induits par l’IL-13 chez les CÉB pourraient avoir un rôle clé dans l’asthme et sa sévérité.

5.2 Les CÉB, l’IL-13 et la CCL26 L’IL-13 induit fortement l’expression et la production de la CCL26 par les CÉB. À cet égard, Coleman et al ont illustré une relation importante entre la CCL26 présente dans l’épithélium et l’asthme sévère éosinophilique (127). Les auteurs ont comparé les niveaux des éotaxines dans l’épithélium et dans les LBA de différents groupes de sujets : des sujets sains, asthmatiques légers, asthmatiques modérés et asthmatiques sévères. Tout d’abord, ils ont démontré que la CCL11 est exprimée très faiblement dans l’épithélium et que son expression est similaire entre les différents groupes de sujets (147). D’autre part, l’expression de la CCL24 et de la CCL26 étaient élevées et augmentaient dans l’épithélium d’asthmatiques sévères éosinophiliques. De plus, ces niveaux d’expression corrélaient avec le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites, le nombre d’exacerbations et le faible contrôle des symptômes. Par contre, les auteurs ont démontré que les niveaux protéiques de CCL24 dans les LBA diminuent avec la sévérité de l’asthme. Ceux-ci n’ont pas réussi à quantifier les niveaux de CCL26 dans les LBA. Étant donné que les niveaux de CCL24 dans les LBA diminuent dans l’asthme sévère, l’implication de la CCL24 dans l’éosinophilie pulmonaire présente dans les voies aériennes des sujets asthmatiques sévères éosinophiliques semble limitée. Des expériences supplémentaires seront nécessaires afin de confirmer les résultats obtenus en ARNm au niveau protéique et afin de mieux définir l’implication de la CCL26 dans l’asthme sévère.

De plus, il sera important de définir les mécanismes impliqués dans l’augmentation de l’expression de la CCL26 dans l’épithélium de sujets asthmatiques sévères. Évidemment, les

protéines présentes dans le chemin signalétique induit par l’IL-13 sont des cibles potentielles, soient STAT6, SOCS1, SOCS3 ou les sous-unités des récepteurs. La diminution de l’expression de la CCL26 par l’inhibition de STAT6 chez des cellules épithéliales a été bien décrite dans la littérature, soit en utilisant des inhibiteurs de STAT6, un small interfering RNA (siRNA) de STAT6 ou des mutations dans le site de liaison de STAT6 du gène de la CCL26 (254;255;277;278). SOCS1 et SOCS3 semblent également impliquées dans l’expression de la CCL26, puisque l’augmentation des niveaux de SOCS1 ou de SOCS3 diminue l’expression de la CCL26 chez des HEK293, des cellules humaines de reins provenant d’un embryon (279). D’autres protéines pourraient aussi être impliquées dans ce phénomène. En effet, des études ont reporté que l’inhibition des canaux à protons ou de la 15-LO induisaient une diminution de la production de la CCL26 par les cellules épithéliales (276;280;281). Une autre avenue prometteuse est l’implication des mécanismes épigénétiques dans l’expression de la CCL26, tels que la méthylation et l’acétylation des histones. La méthylation de l’ADN au promoteur est associée à une diminution de l’expression du gène, puisque celle-ci bloque la liaison des facteurs de transcription (282). D’autre part, l’acétylation des histones favorise l’expression des gènes, puisqu’elle induit le déroulement de l’ADN (282). À cet égard, Lim et al ont démontré que la diminution des niveaux de méthylation était en lien avec l’expression de la CCL26 chez les cellules épithéliales de l’oesophage de sujets souffrant d’une oesophagite à éosinophiles comparativement à ceux de sujets sains (283). De plus, l’acétylation du gène de la CCL26 a été associée avec l’expression de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les cellules épithéliales de l’oesophage (284). Ces résultats supportent le rôle de la méthylation et de l’acétylation dans l’expression de la CCL26 dans les maladies éosinophiliques. L’ensemble de ces études suggère qu’une régulation positive ou négative de ces facteurs pourrait conduire à l’augmentation de l’expression de la CCL26 dans l’épithélium de sujets asthmatiques sévères.

CHAPITRE II : Problématique et objectifs de recherche

Le recrutement des éosinophiles est une caractéristique centrale de l’asthme et sa sévérité. Effectivement, le nombre élevé d’éosinophiles présents dans les voies aériennes est associé avec la sévérité et les symptômes de la maladie. À cet égard, le but général de cette thèse est de comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques qui diminueront l’éosinophilie bronchique observée dans l’asthme sévère.

Plusieurs études se sont préalablement intéressées aux chimioattractants impliqués dans le recrutement des éosinophiles, soit chez les éosinophiles provenant de sujets sains ou soit de modèles murins (table VI). On retrouve également plusieurs articles évaluant les niveaux de ces chimioattractants dans les poumons d’asthmatiques comparativement à ceux de sujets sains. Les chimioattractants CCL5 (125;224;285-290), CCL11 (107-117;119), CCL24 (125-

127), CCL13 (109;114;125;291), CCL26 (127;140), CXCL12 (292) et PGD2 (293-295) ont des niveaux plus élevés chez les asthmatiques, alors que CCL5 (285;286;296), CCL11(107- 110;116;122), CCL24(127), CCL13 (109;297), CCL26 (127) (140) et CXCL12 (292) corrèlent avec le nombre d’éosinophiles dans la muqueuse bronchique ou les voies aériennes. Cependant, peu d’études ont évalué les chimioattractants qui seraient spécifiquement impliqués dans le recrutement des éosinophiles d’asthmatiques en comparant avec ceux provenant de sujets sains. Notre équipe a préalablement démontré que la CCL11 induit une migration plus importante des éosinophiles d’asthmatiques que de sujets sains (67;166). D’autre part, les études portant sur la CCL26 sont limitées comparativement à celles sur la CCL11 ou la CCL24, puisque la CCL26 n’est pas présente chez la souris. Étant donné que les éotaxines sont des chimioattractants sélectifs pour l’éosinophile, qu’ils sont associés à l’asthme et que l’implication de la CCL26 dans l’asthme est mal définie, le premier sous- objectif de mon projet de doctorat était de comparer l’importance des éotaxines dans le recrutement des éosinophiles de sujets asthmatiques comparativement ceux de sujets sains (Chapitre III) (99;100). Par la suite, le deuxième objectif était d’évaluer la biosynthèse de la CCL26 par les CÉB et d’identifier l’importance de cette biosynthèse dans l’asthme et sévérité (Chapitre IV). En effet, les CÉB sont de grandes productrices de CCL26 en présence d’IL- 13. Même si plusieurs évidences démontrent l’importance de la CCL26 dans les maladies

éosinophiliques, seulement une étude a évalué son importance dans la sévérité de l’asthme en démontrant que les niveaux d’ARNm de la CCL26 sont supérieurs dans l’épithélium de sujets asthmatiques sévères éosinophiliques que de sujets asthmatiques légers ou de sujets sains (127). Le troisième objectif était de comprendre les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les CÉB (Chapitre V). Nous avons étudié les facteurs impliqués dans la signalisation de l’IL-13, soient STAT6, SOCS1, SOCS3 et les sous-unités des récepteurs. Nous avons également évalué l’implication des niveaux de méthylation dans le promoteur de la CCL26 sur l’expression de celle-ci.

L’IL-5 est également un élément clé dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme. En effet, il potentialise l’éosinophile et ses niveaux augmentent chez les asthmatiques comparativement aux sujets sains. De plus, des traitements ciblant l’IL-5 ou son récepteur réduisent le taux des exacerbations et le nombre d’éosinophiles dans le sang ou les expectorations induites chez les asthmatiques sévères éosinophiliques (8;10-12;62-64).

Finalement, la CCL5 (65;66), CCL11 (67), CCL26 (53), CCL26, PAF (68;69), LTB4 (69), fMLP (69) et PGD2 (70) induisent une migration plus importante des éosinophiles lorsque ceux-ci sont en présence d’IL-5. Par conséquent, notre quatrième objectif était d’investiguer l’impact de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles induite par le 2-AG, étant donné que l’importance du 2-AG sur la migration des éosinophiles était peu définie (Chapitre VI).

Un autre élément essentiel au recrutement des éosinophiles est l’implication des intégrines. Les intégrines permettent la liaison des éosinophiles aux cellules endothéliales, conduisant à la transmigration de ceux-ci. Certaine molécule, telle que la périostine, facilite et augmente la liaison des éosinophiles aux intégrines. À cet effet, des souris déficientes en périostine ont un recrutement inférieur des éosinophiles vers les LBA que les souris contrôles. De plus, un nombre grandissant d’étude ont identifié une association entre l’asthme et la périostine (298- 303). À cet égard, le cinquième objectif de ma thèse était d’identifier l’importance de la périostine dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme (Chapitre VII).

CHAPITRE III

CCL26/Eotaxin-3 is more potent to induce the migration of eosinophils of asthmatics than CCL11/eotaxin-1 and CCL24/eotaxin-2

Véronique Provost*§, Marie-Chantal Larose*§, Anick Langlois*, Marek Rola-Pleszczynski†, Nicolas Flamand*‡, et Michel Laviolette*‡.

*Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada, †Unité d’immunologie, Faculté de médecine, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada. § Ces auteurs ont contribué équitablement à ce projet. ‡ Ces auteurs ont contribué équitablement à ce projet.

Avant-propos Étant donné que les éotaxines sont des chimioattractants sélectifs pour l’éosinophile, qu’ils sont associés à l’asthme et que l’implication de la CCL26 dans l’asthme est mal définie, ce chapitre élucidera l’impact des éotaxines, CCL11, CCL24 et CCL26, sur la migration des éosinophiles d’asthmatiques comparativement à ceux de sujets sains et déterminera l’implication du récepteur CCR3 dans ce processus. Je suis co-première auteure avec Véronique Provost sur cet article. J'ai participé, en collaboration avec Véronique Provost, à l'élaboration des protocoles de recherche, effectué les manipulations, analysé les données, interprété les résultats et participé à la rédaction du manuscrit. Véronique Provost a également contribué à la conception de l’étude. François Chouinard a participé à l'élaboration des protocoles de recherche, à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit. Anick Langlois, Dr Marek Rola-Pleszczynski, Dr Nicolas Flamand et Dr Michel Laviolette ont participé à la conception de l'étude, à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit. L’article présenté dans ce chapitre a été publié au Journal of Leucocyte Biology en août 2013 (Provost et al. J Leukoc Biol. 2013 Aug; 94(2):213-22.)

3.1 Résumé Le recrutement des éosinophiles vers les voies aériennes est une caractéristique cruciale de l’asthme. Les chimiokines CCL11, CCL24 et CCL26 sont des chimioattractants reconnus de l’éosinophile impliqués dans ce recrutement en activant principalement le récepteur CCR3. Dans le modèle murin, l’inhibition de la CCR3 prévient le développement de l’asthme. Cependant, chez l’humain, cette inhibition diminue seulement de 40% le recrutement des éosinophiles. Étant donné que la CCL26 n’est pas exprimée chez les rongeurs, nous avons évalué l’impact des différentes éotaxines sur la migration des éosinophiles de sujets sains et asthmatiques et l’implication de la CCR3 dans ce phénomène. Nos résultats démontrent que, même si la migration des éosinophiles de sujets sains induite par les trois éotaxines est similaire, la migration des éosinophiles de sujets asthmatiques est plus importante lorsqu’induite par la CCL11 et encore plus par la CCL26 comparativement à celle induite par la CCL24. Les trois éotaxines induisent une migration des éosinophiles après 6 heures, mais seule la CCL26 induit une deuxième phase de migration à partir de 12 heures. Puisque les antagonistes de CCR3 SB 328437 et SB 297006 inhibent la migration des éosinophiles induite par le 5-oxo-eicosatetraenoate et que l’antagoniste UCB 35625 inhibe la migration induite par la CXCL12, l’anticorps 7b11 ciblant CCR3 a été utilisé pour inhiber CCR3. L’anticorps inhibe complètement la migration des éosinophiles de sujets sains induite par les trois éotaxines. Chez les éosinophiles d’asthmatiques, la migration avec CCL24 a été complètement inhibée, mais la deuxième phase de migration induite par la CCL26 n’a pas été inhibée par l’anticorps de CCR3. Pour conclure, la migration des éosinophiles d’asthmatiques induite par la CCL26 est plus efficace que celle induite par la CCL11 ou la CCL24 et la présence d’un autre récepteur que le CCR3 semble être impliquée dans ce phénomène. Ces résultats suggèrent que la CCL26 a un rôle unique dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme.

3.2 Abstract CCL11, CCL24 and CCL26 are chemokines involved in the recruitment of eosinophils into tissues. According to the current understanding, eotaxins mainly activate CCR3. While the genomic or pharmacological inhibition of CCR3 prevents the development of experimental asthma in rodents, it only impairs the recruitment of eosinophils by ~40% in humans. Since humans express CCL26 but not rodents, we investigated the impact of CCL11, CCL24, and CCL26 on human eosinophils recruitment ex vivo and evaluated the involvement of CCR3 in this process. The migration of eosinophils of healthy volunteers was similar for the three eotaxins. Eosinophils of mild asthmatics had a greater response to CCL11 and a much greater response to CCL26. Whereas all eotaxins induced the migration of eosinophil of asthmatics from 0 to 6 hours, CCL26 triggered a second phase of migration between 12 and 18 hours. Given the CCR3 antagonists SB 328437 and SB 297006 inhibited the 5-oxo- eicosatetraenoate-induced migration of eosinophils and that the CCR3 antagonist UCB 35625 was not specific for CCR3 (it inhibited the CXCR4-dependent, CXCL12-induced migration), CCR3 blockade was performed with the CCR3 mAb 7b11. This antibody completely blocked the effect of the three eotaxins on eosinophils of healthy subjects and the effect of CCL24 on asthmatics’ eosinophils. Interestingly, CCR3 blockade did not affect the second migration phase induced by CCL26 on eosinophils of asthmatics. In conclusion, CCL26 is a more effective chemoattractant than CCL11 and CCL24 for eosinophils of asthmatics. The mechanism of this greater efficiency is not yet defined. However, these results suggest that CCL26 may play a unique and important role in the recruitment of eosinophils in persistent asthma.

3.3 Introduction Eosinophils play a significant role in asthma pathogenesis (33;304-306). During asthma exacerbations, a significant number of eosinophils infiltrate both the bronchial mucosa and lumen of asthmatics (304;305;307). This recruitment of eosinophils occurs in response to chemoattractants (308;309). The CC chemokines eotaxin-1/CCL11, eotaxin-2/CCL24 and eotaxin-3/CCL26 are potent chemoattractant for eosinophils (310-316). They are mainly produced by epithelial and endothelial cells (317-320) and mainly activate the G-protein- coupled receptor CCR3 (321-323) which is highly expressed on eosinophils.

Lung-derived eotaxins can induce eosinophil mobilization from the bone marrow to the bronchial mucosa and locally stimulate the release of reactive oxygen species and cationic proteins, resulting in the typical epithelial cell damage observed in asthma (324-327). Interestingly, the genomic or pharmacological inhibition of CCR3 abrogates experimental asthma in rodents while diminishing eosinophil recruitment by ~40% in humans (328-331). This unexpected difference might be attributed to species differences in chemokine expression. In this respect, while CCL11 and CCL24 are expressed in both rodents and humans, CCL26 is expressed in humans but not in rodents (332). Moreover, CCL26 is heavily produced by human lung epithelial cells (317;318;320), hinting it might have an important role in eosinophil recruitment in this organ. This suggests important and distinctive roles of eotaxins in the recruitment and activation of eosinophils observed in asthma pathogenesis.

Although eotaxins mainly activate the same chemokine receptor (CCR3), comparative data regarding their potency and efficacy at stimulating human eosinophil functions are lacking. In this study, we compared the effect of CCL11, CCL24 and CCL26 on human eosinophil migration and found that CCL26 promotes a migration pattern different than those obtained with CCL11 and CCL24 in asthmatics but not in healthy volunteers.

3.4 Materials and Methods Reagents. Human recombinant interleukin (IL)-5, CCL24, CCL26 and CXCL12 were purchased from Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ, USA); 5-KETE from Cayman Chemical

(Ann Arbor, MI, USA); mAb against CCR3 (clone 61828), rat IgG2a isotype control (clone 54447) and human recombinant CCL11 from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA); anti- human CD16 antibodies from Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA); SB 328437, SB 297006, UCB 35625 and AMD3100 from Tocris Bioscience (Ellisville, Missouri, USA); Dextran T-500 from Sigma-Aldrich Canada Ltd. (Oakville, ON, Canada); lymphocyte separation medium, Hank’s balanced salt solution, RPMI 1640 medium and foetal bovine serum (FBS) from Wisent Inc. (St-Bruno, QC, Canada), and Biocoat MatrigelTM Invasion Chambers (24-well plates, 8 µm pores) from BD Bioscience (Mississauga, ON, Canada).

Evaluation of volunteers. Approval from the local ethics committee was obtained and non smoking mild allergic asthmatic and healthy subjects signed an informed consent form for the study. They did not experience any respiratory tract infection for at least one month prior to the study. Asthmatic subjects had a positive reaction to at least one allergen on prick tests and had a history of asthma for at least 6 months as defined by the American Thoracic Society criteria (333). They were only using β2 agonists on demand as therapy and had a provocative concentration of methacholine inducing a 20% fall in forced expiratory volume in one second

≤8 mg/ml (tidal breathing method) (PC20). Healthy volunteers had no history of allergy or asthma and a PC20 value >16 mg/ml. Thirty volunteers with mild asthma and eight healthy volunteers were recruited to perform the experiments.

Isolation of human eosinophils. Blood eosinophils were purified as previously described (334;335). In brief, venous blood (150 ml from mild asthmatics and 450 ml from healthy subjects) was centrifuged to remove the platelet-rich plasma and erythrocytes were removed by Dextran-mediated sedimentation. Granulocytes then were separated from mononuclear cells by centrifugation on a discontinuous gradient using a lymphocyte separation medium. The remaining erythrocytes were removed from the granulocytes by hypotonic lysis with sterile water. Eosinophils were purified from the granulocytes by negative selection using CD16 Microbeads and a magnetic cell sorter. Cell recovery ranged from 70,000 to 200,000 and 13,000 to 44,000 eosinophils per ml of blood of asthmatic subjects and healthy subjects, respectively. The purity and viability of the resulting eosinophil preparations were always greater than 98.5%, as assessed by Diff-Quik staining and trypan blue exclusion respectively.

In order to preserve eosinophil viability over time, all experiments described below were performed in presence of IL-5 (336-339).

Migration assays and CCR3 blocking treatment. Migration of eosinophils through a reconstituted basement membrane was evaluated in 24-well Biocoat MatrigelTM Invasion Chambers as previously described (334;335). In brief, pre-warmed eosinophil suspensions (37ºC, 106 cells/ml in RPMI medium containing 10% FBS) were incubated for 15 min with IL-5 (10 ng/ml) and placed in the upper chamber of the migration apparatus. Eosinophils were allowed to migrate for up to 18 hours. CCL11, CCL24, CCL26 or 5-KETE was added in the lower chamber of the migration apparatus at the indicated concentrations (see figure legends). At the end of the assays, cells in both the upper and the lower chambers were harvested, washed twice with cold (4°C) RPMI medium, counted using the handheld automated cell counter Sceptor 2.0 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), and labelled with trypan blue for cell viability testing on a hemacytometer. Approximately 98% of initial eosinophils added to chambers were harvested. For each condition, net migration was calculated as follow: 100 × (chemoattractant-stimulated cells in lower chamber – vehicle-stimulated cells in lower chamber)/total cells. Chemoattractant-stimulated cells represent those recovered in lower chambers of the migration apparatus; vehicle-stimulated cells represent the number cells recovered in the lower chambers that had migrated in absence of chemoattractant; total cells represent the number of eosinophils placed in the upper chamber at the beginning of each assay.

In some experiments, eosinophils were incubated with a CCR3 mAb (or its control mAb), the CCR3 antagonists SB 328437, SB 297006, UCB 35625, or the CXCR4 antagonist AMD3100 simultaneously with IL-5. The mAb or antagonists were also added in the lower chamber of the migration apparatus before the addition of eotaxins or 5-KETE. 5-KETE was always used at 1 µM while CXCL12 was used at 100 nM.

Assays were performed to distinguish eosinophil directional movement (chemotaxis) from non-directional movement (chemokinesis). In these assays, CCL26 (100 nM) was added either in the upper chamber, in both upper and lower chambers or in the lower chamber of

the migration apparatus. Eosinophils were recovered as described above after 18 hours of incubation.

Analysis of eotaxins half-life. For the assessment of eotaxins half life, pre-warmed eosinophil suspensions (37ºC, 0.5 × 106 cells/ml in RPMI medium containing 10% FBS) were incubated for 15 min with IL-5 (10 ng/ml). Eosinophil suspensions (5 ml) were incubated with 500 ng/ml (~55 nM) of CCL11, CCL24 or CCL26 for 0, 4.5, 9 and 18 hours. Incubations were stopped by harvesting one ml of the cell suspensions which was mixed with one ml of ice-cold incubation buffer. Supernatants were immediately spun to remove cell debris, aliquoted and kept at -80°C until the analysis of each eotaxin by ELISA according to the manufacturer’s instructions. Eotaxins were quantified individually with specific ELISA kits without cross-reactivity between eotaxins as mentioned in data sheets. For each time of incubation, eotaxin levels were expressed as a percent of initial eotaxin levels (T = 0).

Statistical analyses. Data obtained from dose-response and time-course experiments were analyzed with the Tukey-Kramer’s method. The results were considered significant if p values were <0.05. The data were analyzed using the statistical package program SAS version 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

3.5 Results CCL26 induces a greater migration of eosinophils of asthmatics than CCL11 and CCL24. We first established which concentration of eotaxins led to an optimal migration of eosinophils. IL-5-treated eosinophils of asthmatics were placed in the upper chamber of the Biocoat MatrigelTM Invasion Chambers, increasing concentrations of eotaxins were added in the bottom wells, and migration assays were performed for 18 hours. As shown in Fig. 1A, the migration of eosinophils induced by CCL11 and CCL24 was maximal at 10 nM while that induced CCL26 was maximal at 100 nM. The mean maximal migrations obtained with CCL11, CCL24, and CCL26 were 40%, 27%, and 59% respectively (Fig. 1A). These results indicate that CCL11 and CCL24 are more potent than CCL26, but that CCL26 is more effective to induce the migration of eosinophils of asthmatics. Because the migration of

eosinophils was assessed at different time points (up to 18 hours) and in order to prevent eosinophil apoptosis, all migration assays were performed in presence of IL-5 (338;339). Given IL-5 is chemokinetic for eosinophils (340), we next confirmed that the eotaxin-induced eosinophil migrations were the consequence of chemotaxis rather than chemokinesis. Other experiments were performed in which CCL26 was added in the lower chamber, in the upper chamber, or in both chambers of the migration apparatus. Under these experimental conditions, eosinophil migration was only observed when CCL26 was added to the lower chamber of the migration apparatus, demonstrating that the observed migrations were the consequence of chemotaxis rather than chemokinesis (Fig. 1B). All eotaxins used in our studies were produced in E. Coli and are available at R&D Systems; CCL24 and CCL26 are also available from PeproTech. We did not observe any difference between CCL24 and CCL26 from the two companies.

The CCL26-induced migration of eosinophils of asthmatics is biphasic. We next evaluated the kinetic responses of eosinophils of asthmatics to eotaxins. The migrations induced by CCL11 (Fig. 2A) and CCL24 (Fig. 2B) were rapid and reached their maxima at 6 hours. The impact of CCL26 was different (Fig. 2C): it induced the migration of eosinophils within 6 hours, then the migration plateaued until 12 hours (comparison between 6 and 12 hours, p = 0.98) and further increased up to 18 hours (comparison between 12 and 18 hours, p = 0.04). The CCL26-induced migration did not increase after 18 hours (data not shown). This biphasic pattern suggests that, in contrast to CCL11 and CCL24, CCL26 differently activates eosinophils of mild asthmatics.

These results prompted us to test whether CCL26 had a longer half-life than CCL11 and CCL24, thereby explaining the second phase of migration (from 12 to 18 hours). Eosinophils were consequently incubated with vehicle, CCL11, CCL24, or CCL26 for up to 18 hours then eotaxins were quantified by ELISA. Figure 2D shows that 85% of eotaxins were still present after 18 hours and that no difference between the levels of eotaxins was observed. This indicates that eotaxins were very stable under our experimental conditions and that the greater migration observed with CCL26 cannot be the consequence of a differential half-life compared to CCL11 and CCL24. In this respect, eotaxins that were incubated with

eosinophils overnight induced similar migration rates than fresh eotaxins (data not shown). Eotaxins were also measured in the supernatants of eosinophils incubated in absence of eotaxin (vehicle). No CCL11, CCL24 or CCL26 were detected suggesting that eosinophils from asthmatics did not produce significant levels of eotaxins under these conditions (data not shown).

CCR3 blockade partially inhibits CCL26-induced the asthmatics’ eosinophil migration in contrast to those induced by CCL11 and CCL24. Given the importance of CCR3 in mediating the effects of eotaxins (321-323), we next assessed whether its blockade would specifically prevent the migrations induced by CCL11, CCL24, and CCL26. We initially addressed the specificity of the CCR3 antagonists SB 328437 (341) and SB 297006 (341) by performing dose response experiments in which the migration of eosinophils of asthmatics was induced with the CCR3 ligand CCL24 or with the OXE receptor ligand 5-KETE (342). Both SB 328437 (Fig. 3A) and SB 297006 (Fig. 3B) inhibited the 5-KETE- and the CCL24-induced migration of eosinophils. Although the inhibitory effect of SB 328437 and SB 297006 on the CCL24-induced eosinophil migration occurred at a lower concentration than that observed for 5-KETE, we felt the IC50s were too close to utilise SB 328437 or SB 297006 as specific CCR3 antagonists.

We next addressed the specificity of the dual CCR1/CCR3 antagonist UCB 35625 (343). UCB 35625 inhibited the CCL24-induced but not the 5-KETE-induced migration of eosinophils (Fig. 3C), suggesting that UCB 35625 could be a more suitable antagonist than SB 328437 or SB 297006. At the time of its chemical synthesis, UCB 35625 specificity was tested for CCR1 and CCR3 (343). Given human eosinophils are now recognized to expressing CXCR4 and responding to CXCL12 (344-346), we tested if UCB 35625 would modulate performed migration assays with CXCL12, a chemotactic factor for eosinophils. Results are expressed in % of control (chemokine alone) since 100 nM CXCL12 induced a net migration of eosinophils of ~35% compared to ~45% for CCL24. Noteworthy, 10 µM UCB 35625 inhibited both the CCL24- and CXCL12-induced migrations, indicating that this antagonist binds to receptor(s) other than CCR3, such as CXCR4 (Fig. 3D). In contrast, the CXCR4 antagonist AMD3100 inhibited the CXCL12-induced but not CCL24-induced

eosinophil migration. All together, these results show that UCB 35625 is not specific for CCR3 and consequently not suitable for studies investigating a specific CCR3 blockade.

We therefore performed additional experiments with the blocking CCR3 mAb clone 61828 previously known as 7b11 (347). As depicted in Fig. 3E, this mAb inhibited the migration of asthmatics’ eosinophils induced by CCL24 in a dose-dependent fashion with ~95% inhibition at 3 µg/ml. The 5-KETE-induced migration of eosinophils was not altered by this blocking antibody. Consequently, all the experiments involving the CCR3 mAb were performed using a working concentration of 10 µg/ml.

We next addressed the involvement of CCR3 in eotaxin-induced migration of asthmatic eosinophils (Fig. 3F). CCR3 blockade completely inhibited the eosinophil migration induced by CCL24, while inhibiting the CCL11-induced migration by more than 90%. In contrast, ~30% of the eosinophil migration induced by CCL26 persisted in presence of the blocking mAb. These results indicate that the migration of eosinophils from mild asthmatics induced by CCL11 and CCL24 is mostly or completely mediated by CCR3 activation. Importantly, these results also indicate that a significant portion of the CCL26-induced migration of eosinophils from mild asthmatics we observed is independent of CCR3 activation.

Importantly, neither the antagonists nor the antibodies used in this study affected eosinophil viability, which was always greater than 97% at the end of all our experiments.

CCL26 and CCL11 induce greater migration rates of asthmatics’ eosinophils compared to healthy volunteers’ eosinophils. We previously documented that CCL11 is more potent at inducing the migration of eosinophils from subjects with mild asthma compared to eosinophils from healthy subjects (334). Consequently, we assessed whether CCL24 and CCL26 could also promote greater migration rates of eosinophils of asthmatics compared to cells of healthy subjects. In contrast to our data with asthmatics’ eosinophils, all eotaxins induced similar migration rates of healthy subjects’ eosinophils (24, 29 and 16% for CCL11, CCL24, and CCL26 respectively;

p=0.41 between eotaxins; Fig. 4). Eosinophil migrations induced by CCL11 and CCL26 were higher with asthmatics’ eosinophils compared to healthy subjects’ eosinophils (CCL11: 40% vs. 25%, p=0.03, CCL26: 60% vs. 16%, p=0.0001) and this response was greater with CCL26 compared to CCL11 (p=0.01). Importantly, CCL24 induced similar eosinophil migrations from the two groups of subjects (p=0.36).

CCR3 blockade does not inhibit the late phase of the biphasic asthmatics’ eosinophil migration induced by CCL26. Since CCL26 induced a biphasic migration pattern and that a significant proportion of the CCL26-induced migration of asthmatics’ eosinophils was not inhibited by CCR3 blockade, we further investigated the involvement of CCR3 for the migration of asthmatics’ eosinophils by performing kinetic experiments in presence of the blocking CCR3 mAb. Asthmatics’ eosinophil migrations induced by CCL24 were completely inhibited by the blocking CCR3 mAb at 9 hours and did not further increase thereafter, indicating that CCR3 was the main receptor activated by this chemokine (Fig. 5B). In contrast, the migrations induced by CCL11 (Fig. 5A) and CCL26 (Fig. 5C) were not completely inhibited at 9 hours. Interestingly, the migration induced by CCL26 further increased between 9 and 18 hours, an observation similar to the one presented in Fig. 2C. These results indicate that mild asthmatics’ eosinophil migrations induced by CCL11 and CCL26 observed up to 9 hours were mostly but not completely dependent of CCR3. Importantly, the late migration phase of asthmatics’ eosinophils observed in presence of the same 100 nM CCL26 was not inhibited by the blocking CCR3 mAb, strongly suggesting that this late migration phase was CCR3- independent.

CCR3 blockade completely inhibits the eotaxins-induced migrations of eosinophils from healthy volunteers. We also investigated the involvement of CCR3 in the migration of eosinophils from healthy volunteers by performing CCR3 blockade experiments. Due to the low cell recovery in these subjects, we only performed migration assays at 18 hours in combination with the CCR3 blocking antibody (Fig. 5). Migrations of eosinophils from healthy volunteers induced by the same concentrations of eotaxins used to stimulate asthmatic eosinophils (Fig. 5A-C) were

completely inhibited by the blocking CCR3 mAb 18 hours, indicating that CCR3 is the major if not the only receptor activated by eotaxins in normal eosinophils. These results further demonstrate significant differences in activation of eosinophils of asthmatics compared to cells of healthy subjects.

3.6 Discussion Eosinophil recruitment is an important step in the pathogenesis of allergic diseases and asthma. Several eosinophil chemoattractants involved in this process have been identified but their physiological roles remain incompletely defined. CCL11, CCL24, and CCL26 are recognized chemokines for eosinophils (310;311;313-316). To our knowledge, this is the first study that compared the effects of these three chemokines on the recruitment of human eosinophils obtained from mild asthmatics and healthy volunteers. Our data confirmed they are potent inducers of eosinophil migration. They also showed that CCL26 was more efficacious than CCL11 and CCL24 to promote the chemotaxis of eosinophils of subjects with mild asthma while their effect on eosinophils of healthy subjects was similar. Importantly and in contrast to CCL11 and CCL24, the greater efficacy of CCL26 was associated with a biphasic chemotactic response of eosinophils of subjects with mild asthma involving a unique late response between 12 and 18 hours that was not inhibited by CCR3 blockade. These data suggest that, in asthma, CCL26 promotes eosinophil migration in a distinctive manner compared to CCL11 and CCL24 and likely has a unique role in the recruitment and activation of eosinophils in this disease. Although the cellular and molecular mechanisms underlying this effect of CCL26 are not completely defined yet, our data suggest this is mediated through signalling pathways unrelated to CCR3 activation.

Our data indicate that the potency of eotaxins to induce human eosinophil migration through a reconstituted basement membrane was CCL11 = CCL24 > CCL26, in agreement with other reports using desensitization experiments and competitive binding studies (311;314- 316;348). Moreover, the observed efficacy of eotaxins was CCL26 > CCL11 ≥ CCL24 for eosinophils of subjects with mild asthma and CCL11 = CCL24 = CCL26 for eosinophils of healthy volunteers (Fig. 1A and 4). Additionally, this study confirms our initial report that eosinophils from asthmatics have a greater response to CCL11 than those from healthy

volunteers (334). CCL26 also induced a greater migration of asthmatics’ eosinophils compared to cells of healthy subjects and the asthmatics’ eosinophil response was higher with CCL26 compared to CCL11 (Fig. 1 and 4). Importantly, all eotaxins had a similar half life (Fig. 2D), indicating the differences observed between eotaxins with asthmatics’ eosinophils are not the consequence of a differential eotaxin clearance.

Our initial attempt to prevent CCR3 activation with pharmacological agents was unsuccessful because CCR3 antagonists SB 328437 and SB 297006 (Fig. 3A and B) and the dual CCR1/CCR3 antagonist UCB 35625 (Fig. 3 C-D) lacked the desired specificity to rule out the specific involvement of CCR3 in our experimental model. Fortunately, the blocking CCR3 mAb proved to be more specific and did not alter the 5-KETE-induced eosinophil migration. For this reason, it was utilized throughout the study. The persistent CCL26- induced migration of eosinophils of subjects with mild asthma during CCR3 blockade is puzzling. This cannot be attributed to a more sustained presence of CCL26 since all eotaxins had a similar half life (Fig. 2D). This cannot be attributed to rapid clearance of the blocking antibody given it still inhibited the effects of CCL11 and CCL24 (Fig. 4 and 5) and totally blocked the effect of the same concentration of CCL26 on eosinophils from healthy subjects (Fig. 5). It suggests that another receptor, apart from CCR3, mediates the effects of CCL26 during the late phase of the migration. This is supported by an earlier study from Cuvelier et al. who documented a CCR3-independent pathway for the migration of human eosinophils through IL-4-treated human umbilical veins endothelial cells (349). As of today, the binding profile of CCL26 to chemokine receptors remains somewhat undefined. CCL26 binds to CCR3 (315;316) and CX3CR1 (350). However, our eosinophil preparations did not migrate in presence of the main CX3CR1 ligand fractalkine (data not shown) nor were we able to detect any significant CX3CR1 expression on eosinophils by flow cytometry (data not shown) indicating that the involvement of CX3CR1 in the CCL26-induced eosinophil migration we observed is very unlikely. Additionally, CCL26 was reported to act as antagonist on CCR1, CCR2, and CCR5, promoting the repulsion of human monocytes (351;352). These receptors are expressed by human eosinophils and could potentially participate to the migration of asthmatics’ eosinophils induced by CCL26 (33;353). Importantly, CCL11 is a CCR5 agonist (354;355) and the weak CCR3-independent migration

observed in Fig. 5A (less than 10%) could be related to CCR5 activation. However, if CCR5 is activated both CCL11 and CCL26, the different migration pattern between CCL11 and CCL26 in the late phase of migration (after 9 hours) suggests that CCR5 is unlikely the receptor involved at later time points. Finally, we cannot exclude that CCL26 activates additional signalling pathways at the beginning of the migration assays (T = 0). However, since CCR3 blockade is performed 15 min before the addition of CCL26, this effect of CCL26 would also depend on receptor(s) other than CCR3.

The results presented here were performed at different time points, ranging from 1 to 18 hours. In order to insure that the viability of our eosinophil preparations was greater than 97% at all time points, all experiments were done in presence of human recombinant IL-5 (324). Interestingly, it was previously reported that IL-5 participated in the expression of chemokine receptors (CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CXCR2 and CXCR4) on eosinophils (356;357). It is therefore possible that IL-5 induces the expression of another receptor activated by CCL26 that is not present on freshly isolated asthmatics’ eosinophils. Such an effect would explain why the CCL26-induced migration of asthmatics’ eosinophils is biphasic, as opposed to CCL11 and CCL24. This raises the possibility that IL-5 induces the expression of a chemokine receptor activated by CCL26, but not CCL11 or CCL24, on eosinophils from asthmatics but not those from healthy subjects.

We previously compared CCR3 expression levels on eosinophil from healthy and asthmatics subjects using cytofluorometic analysis (334). Eosinophil CCR3 expressions were similar between these groups, in percentage of positive cells and as in percent change in fluorescence. These data suggest that the differential response of eosinophil to CCL11 and CCL26 between healthy and asthmatic subjects (Fig. 4) would not be attributable to CCR3 expression. Moreover, Kawashima et al have postulated that eosinophils from asthmatics have an increased affinity of CCR3 for CCL11 compared to healthy subjects (358). However, at that time, CCL26 was not recognized as a CCR3 ligand and was not studied in comparison to CCL11. Also, our results show that CCR3 is the only receptor involved in eotaxin-induced migration with eosinophil from healthy subjects (Fig. 5), in contrast to asthmatics,

strengthening our assumption of another receptor(s) involved in asthmatic eosinophil migration induced by CCL26.

This study was performed with human blood eosinophils because CCL26 is expressed in humans but not in rodents, in contrast to CCL11 and CCL24 that are expressed in both rodents and humans (332). Previous studies have reported dissimilar eosinophil activation and distinct responses to chemotactic agents between humans and rodents (356;359-365). Consequently, experimental procedures regarding eosinophil activation by eotaxins should consider these species differences. Another important benefit to study eosinophil activation in humans is the possibility to compare blood eosinophils from asthmatics and healthy subjects. However, due to a lower eosinophil recovery with healthy subjects compared to asthmatics, few conditions per experimental protocol could be performed with these cells. Despite this limitation, reproducibility between data in each protocol with healthy subjects allowed to obtain valuable results (Fig. 4 and 5).

Overall, the data presented herein support the hypothesis that CCR3 in not the only receptor mediating the biological effects of CCL26 and suggest that additional receptor(s) are expressed on eosinophils of asthmatics. This is indeed supported by several facts: 1) the migration of eosinophils induced by CCL24 was similar in both groups of subjects; 2) the migration of asthmatics’ eosinophils to CCL24 was completely blocked by the anti-CCR3 mAb; 3) the migration of eosinophil of healthy volunteers induced by 10 nM CCL11 and 100 nM CCL26 were completely blocked by the blocking CCR3 mAb, and 4) the late phase of the migration of asthmatics’ eosinophils induced by 100 nM CCL26 was not inhibited by the blocking CCR3 mAb.

The greater efficiency of CCL26 to induce migration of eosinophils of asthmatic subjects, notably due to its biphasic effect, may play an important role in asthma physiopathology, in contrast to rodent models of asthma in which CCL26 is not expressed (332). CCR3 blockade did not completely prevent the accumulation of eosinophils in the sputum of individuals challenged with allergens (331;366;367). This is of particular interest, may be very important in the pathogenesis of asthma, and could have an important clinical impact since CCL26 is

the main eotaxin found in the bronchial mucosa of asthmatic individuals following allergen challenge (368).

3.7 Conclusion In conclusion, we showed that eotaxins differentially activate mild asthmatics’ eosinophils ex vivo. These results combined with other studies that reported a differential cellular production of eotaxins (317;319) underscore that the functions of eotaxins are different and suggest a non-redundant role of eotaxins in the recruitment and activation eosinophils in vivo. The cellular and molecular mechanisms implicated in the regulation of asthmatics’ eosinophil functions by CCL26 fosters further investigations in the hope of better defining key pathways involved in the recruitment and activation of eosinophils to the airways in asthma.

3.8 List of Abbreviations BSA: bovine serum albumin, FBS: foetal bovine serum, IL: interleukin; mAb: monoclonal antibody, 5-oxo-ETE: 5-oxo-6, 8,11,14-eicosatetraenoic acid.

3.9 Acknowledgments The authors thank Luce Trépanier and Claudine Ferland for recruiting and evaluating the subjects, Francine Deschesnes, Johanne Lepage, Joanne Milot, Élaine Plourde and Hélène Villeneuve for blood sampling and Serge Simard for performing statistical analyses. This work was supported by a grant to ML from the Canadian Institutes of Health Research, a doctoral studentships to VP from the Respiratory Health Network of the Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ), a master studentships to MCL from Wilbrod Bhérer and Joseph Demers Foundation of Université Laval and a Scholarship to NF from the FRSQ.

3.10 Figures

FIGURE 1. Effect of eotaxins on the migration of asthmatics’ eosinophils. Pre-warmed asthmatics’ eosinophil suspensions were incubated with 10 ng/ml IL-5 for 15 min then placed in the upper chamber of the migration apparatus. A. Increasing concentrations of CCL11, CCL24 or CCL26 were placed in the lower chamber of the migration apparatus and migrations were performed during 18 hours. The data represent the mean (± SEM) of seven independent experiments, each performed in duplicates, a > b > c, p ≤ 0.01. B. Migration of eosinophils in response to 100 nM CCL26 added in the upper chamber, the lower or both. Migrations were performed during 18 hours. The data represent the mean (± SEM) of four independent experiments, each performed in duplicates.

FIGURE 2. Kinetics of eotaxin-induced eosinophil migration (A-C) and eotaxins half life (D) Pre-warmed asthmatics’ eosinophil suspensions were incubated with 10 ng/ml IL-5 for 15 min then placed in the upper chamber of the migration apparatus. Kinetic responses were performed by adding 10 nM CCL11 (A), 10 nM CCL24 (B), or 100 nM CCL26 (C) in the lower chamber of the migration apparatus. The data represent the mean (± SEM) of five (CCL11 and CCL24) or seven (CCL26) independent experiments, each performed in duplicates. D. Pre-warmed eosinophil suspensions were pre-incubated with 10 ng/ml IL-5 for 15 min then incubated with 500 ng/ml eotaxins. Eotaxins were quantified by ELISA in eosinophil supernatants after 4.5, 9 and 18 hours of incubation. Eotaxin levels are expressed as the percentage of the initial eotaxin levels (T=0). The data represent the mean (± SEM) of four independent experiments, each performed in duplicates.

FIGURE 3. Involvement of CCR3 in the migration of asthmatics’ eosinophils induced by eotaxins. Pre-warmed asthmatics’ eosinophil suspensions were incubated with 10 ng/ml IL-5 for 15 min then placed in the upper chamber of the migration apparatus. A. The CCR3 antagonist SB 328437, SB 297006 (B), UCB 35625 (C), the CXCR4 antagonist AMD3100 (D) or the blocking CCR3 mAb (E) was added to both the eosinophil suspension and the lower chambers 10 min before the addition of either 10 nM CCL24, 100 nM CXCL12 or 1 µM 5-KETE to the lower chamber of the migration apparatus. F. The blocking CCR3 mAb or its control isotype both at 10 µg/ml were added to the eosinophil suspensions and the lower chamber 10 min before the addition of 10 nM CCL11, 10 nM CCL24 or 100 nM CCL26. All migrations were performed during 18 hours. The data represent the mean (± SEM) of four independent experiments, each performed in duplicates.

FIGURE 4. Comparison of eotaxin-induced migrations of eosinophils of healthy and asthmatic subjects. Pre-warmed eosinophil suspensions were incubated with 10 ng/ml IL-5 for 15 min then placed in the upper chamber of the migration apparatus. Migration were started by adding 10 nM CCL11, 10 nM CCL24 or 100 nM CCL26 to the lower chamber of the migration apparatus and performed during 18 hours. The data represent the mean (± SEM) of four (healthy) and seven (asthmatics) independent experiments, all performed in duplicates.

FIGURE 5. Impact of CCR3 blockade on migrations of eosinophils of healthy and asthmatic subjects. Pre-warmed eosinophil suspensions were incubated with 10 ng/ml IL-5 for 15 min then placed in the upper chamber of the migration apparatus. Migration of eosinophil of asthmatic (●) and healthy volunteers (○) were performed for the indicated times with (A) 10 nM CCL11, (B) 10 nM CCL24 or (C) 100 nM CCL26 in presence of 10 µg/ml of the blocking CCR3 mAb or its control isotype. Antibodies were added to the eosinophil suspensions and the lower chamber 10 min before the addition of eotaxins. Migrations were performed during 18 hours. The data represent the mean (± SEM) of four (healthy) and four (asthmatics) independent experiments, all performed in duplicates.

CHAPITRE IV

Correlation between CCL26 production by human bronchial epithelial cells and airway eosinophils: involvement in severe eosinophilic asthma

Marie-Chantal Larose, Jamila Chakir, Anne-Sophie Archambault, Philippe Joubert, Véronique Provost, Michel Laviolette§, et Nicolas Flamand§.

Du centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC G1V 4G5, Canada. § Ces auteurs ont contribué équitablement à ce projet.

Avant-propos Puisque les résultats du précédent chapitre ont identifié l’importance de la CCL26 dans la migration des éosinophiles d’asthmatiques, ce chapitre évaluera le rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Il déterminera l’effet de l’IL-13 sur la capacité biosynthétique des CÉB à produire de la CCL26 ainsi que la relation de cette production avec l’asthme et sa sévérité. De plus, la quantité de CCL26 sera comparée dans des biopsies bronchiques et des expectorations induites de sujets avec différentes sévérités d’asthme. Je suis la première auteure sur cet article. J'ai participé à la conception de l’étude, à l'élaboration des protocoles de recherche, effectué les manipulations, analysé les données, interprété les résultats et participé à la rédaction du manuscrit. Dr Jamila Chakir, Anne-Sophie Archambault et Dr Philippe Joubert ont contribué en effectuant des manipulations, en analysant des données et en interprétant des résultats. Véronique Provost, Dr Nicolas Flamand et Dr Michel Laviolette ont participé à la conception de l'étude, à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit.

L’article présenté dans ce chapitre a été publié dans le Journal of Allergy and Clinical Immunology en octobre 2015 (Larose et al. J Allergy Clin Immunol. 2015 Oct;136(4): 904- 13.).

4.1 Résumé INTRODUCTION. L’éosinophilie pulmonaire corrèle avec les symptômes et la sévérité de l’asthme. Les cellules épithéliales bronchiques (CÉB) sont des productrices importantes de CC chimiokines, telles que la CCL26 qui recrute et active les éosinophiles d’asthmatiques. Nous postulons que la production de la CCL26 par les CÉB pourrait être impliquée dans la persistance de l’éosinophilie pulmonaire observée chez les asthmatiques sévères malgré un traitement avec des corticostéroïdes inhalés. MÉTHODES. Des CÉB et des coupes histologiques provenant de biopsies bronchiques et des expectorations induites ont été obtenues de sujets avec différentes sévérités d'asthme. L’ARNm des chimiokines humaines a été quantifié par qPCR chez des CÉB stimulées ou non avec de l'IL-13. L’expression protéique de la CCL26 a été mesurée par ELISA dans les surnageants des CÉB et dans les expectorations induites. Sur les coupes histologiques, le niveau de la CCL26 et le nombre d’éosinophiles ont été évalués par immunohistochimie. RÉSULTATS. Parmi toutes les CC chimiokines humaines, seul l'ARNm de la CCL26 est fortement augmenté chez les CÉB stimulées avec l'IL-13. L’expression génique et protéique de la CCL26 augmente avec le temps et chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques comparativement à celle d’asthmatiques légers et de sujets sains. Les analyses immunohistochimiques sur les biopsies bronchiques démontrent un niveau similaire de CCL26 chez les sujets avec différentes sévérités d’asthme et aucune corrélation entre les niveaux de CCL26 et le nombre d’éosinophiles. Par contre, dans les expectorations induites, les niveaux de CCL26 corrèlent avec le nombre d’éosinophiles chez les asthmatiques, illustrant le rôle de la CCL26 dans le recrutement des éosinophiles vers la lumière bronchique. CONCLUSION. Nos résultats démontrent une relation entre la CCL26 produite par les CÉB, les éosinophiles dans les expectorations induites et la sévérité de l’asthme. Ils supportent également l’implication de la CCL26 dans l’éosinophilie pulmonaire persistante observée dans l’asthme sévère et illustrent que la CCL26 serait une cible thérapeutique potentielle afin de traiter cette éosinophilie.

4.2 Abstract BACKGROUND. High pulmonary eosinophil counts are associated with asthma symptoms and severity. Bronchial epithelial cells (BEC) produce CC chemokines notably CCL26 (eotaxin-3) that recruits and activates eosinophils from asthmatics. This suggests that CCL26 production by BEC may be involved in persistent eosinophilia in severe asthma despite a treatment with high corticosteroid doses. OBJECTIVE. To determine if CCL26 correlates with eosinophilia and asthma severity. METHODS. Human CC chemokines’ expression was assessed by qPCR or qPCR array in vehicle- or IL-13-treated-BEC. CCL26 was quantitated by ELISA. Immunohistochemistry analyses of CCL26 and major basic protein were done on bronchial biopsies. RESULTS. IL-13 selectively induced CCL26 expression by BEC. This increase was time-dependent and more prominent in BEC from severe eosinophilic asthmatics. CCL26 levels measured in the supernatants of IL-13-stimulated BEC also increased with asthma severity: severe eosinophilic asthmatics > mild asthmatics  healthy subjects. Immunohistochemistry analyses of bronchial biopsies confirmed the increased levels of CCL26 in the epithelium of mild and severe eosinophilic asthmatics. Tissue eosinophil counts did not correlate with CCL26 staining. However, sputum CCL26 levels significantly correlated with sputum eosinophils (p < 0.0001), suggesting that CCL26 participates in the movement of eosinophils from the tissues to the airway lumen. CONCLUSIONS. These results show a relation between CCL26 production by IL-13- stimulated BEC, sputum eosinophil counts and asthma severity. They also suggest a role for CCL26 in the sustained inflammation observed in severe eosinophilic asthma and reveals CCL26 as a potential target for treating eosinophilic asthmatics that are refractory to classic therapies.

4.3 Introduction The recruitment of eosinophils to the airways is a recognized feature of asthma and increases with disease intensity and severity (369-374). In most asthmatics, corticosteroids decrease eosinophil numbers and control asthma symptoms. However, a subset of patients with severe asthma has persistent elevated counts of sputum eosinophils and remains symptomatic despite being treated with high-dose of corticosteroids (375;376). This stresses the need to decipher the mechanisms of eosinophil recruitment to the airways in order to develop novel pharmaceutical tools that would effectively block this recruitment.

Bronchial and inflammatory cells can release eosinophil chemotactic factors, notably CC chemokines (109;377;378). Among them, CCL11 (eotaxin-1), CCL24 (eotaxin-2) and CCL26 (eotaxin-3) chiefly recruit and activate eosinophils (92;96;100;102;105;106;174;379- 383). While they induce a similar migration rate of freshly isolated eosinophils from healthy donors, their effects on mild asthmatic eosinophils differ, CCL26 being more effective than CCL11 and CCL24 (167). Increased levels of CCL26 are found in eosinophilic diseases such as atopic dermatitis, chronic rhinosinusitis, eosinophilic esophagitis and Churg-Strauss vasculitis, suggesting a primordial role for CCL26 in the pathogenesis of eosinophilic diseases (384-390). Increased CCL24 and CCL26 mRNA levels were recently documented in airway epithelial brushings of asthmatics (391). This was associated to lower lung functions, increased sputum eosinophil counts, and asthma exacerbation events. Given that interleukin (IL)-13 induces the production of CCL26 by bronchial epithelial cells (392) and that IL-13 levels in the bronchial mucosa and sputum of asthmatics with asthma severity are increased (393), we postulated that IL-13 was promoting the release of eotaxins by human bronchial epithelial cells (BEC).

Consequently, we investigated the impact of IL-13 on CC chemokine expression by bronchial epithelial cells obtained from healthy subject and from mild and severe eosinophilic asthmatics. We also assessed if the levels of CCL26 were increased in the bronchial tissue and the airway lumen of asthmatics.

4.4 Materials and Methods

Reagents. Human recombinant IL-13 was purchased from Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ, USA); pAb CCL26, human CCL26/Eotaxin-3 DuoSet ELISA kit, human CCL26/eotaxin-3 Quantikine ELISA Kit, anti-goat HRP-AEC staining kit and Antigen Retrieval Reagent- Basic from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA); DMEM/F12 medium and foetal bovine serum (FBS) from Wisent Inc. (St-Bruno, QC, Canada); anti-human eosinophil major basic protein (MBP) clone BMK-13 from Meridien Life Science (Memphis, TN, USA); RLT Plus, RNeasy Plus MiniKit, Human CCL26 QuantiTect Primers, RT2 First Strand Kit, RT2 Profiler qPCR Multiplex Array Kit, RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix, RT2 Profiler PCR array 386 wells plates and Human RRN18S QuantiTech primer assay from Qiagen (Mississauga, ON, Canada); qScript cDNA Synthesis Kit and BR-SYBR Green SuperMix from Quanta Biosciences (Gaithersburg, MD, USA); Mayer’s haematoxylin and the Giemsa Stain Kit (Jenner-Wright), Artisan™ were from Dako Canada (Burlington, ON, Canada) and aqueous based permanent CC/Mount medium from Sigma-Aldrich Canada (Oakville, ON, Canada); and anti-mouse EnVision + System-HRP (AEC) kit from Dako (Burlington, ON, Canada).

Clinical criteria for subjects’ selection. Never-smoking asthmatic and healthy subjects without recent airway infection (8 weeks) were recruited for bronchial biopsies. Asthmatic subjects had a history of asthma for at least 6 months and were classified using the ATS criteria (333). Mild asthmatics only used β2 agonists on demand as therapy and had a normal

FEV1. Moderate asthmatics were taking a low to moderate dose of inhaled corticosteroids (≤ 500 µg of fluticasone proprionate or the equivalent). Severe eosinophilic asthmatics required a high dose of inhaled corticosteroids ( 1000 µg of fluticasone proprionate or the equivalent in combination with a long-acting β2 agonist) and demonstrated a high (> 5%, severe eosinophilic) or a low (≤ 2%, severe non-eosinophilic) induced sputum eosinophil count, sputum neutrophil count being  64%. Healthy volunteers had no history of allergy, asthma, or any other inflammatory disease, and had a PC20 value > 16 mg/ml. Approval from the local ethics committee was obtained and all volunteers signed an informed consent form. Human primary BEC lines culture and stimulation. BEC lines from healthy subjects, mild or severe eosinophilic asthmatics were obtained as described earlier (394;395). BEC were

cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Cells were grown in 12-well plates (3 × 105 cells/well) until they reached 80% confluence. Cells then were stimulated with vehicle or increasing concentrations of IL-13 in DMEM-F12 medium supplemented with 1% fetal bovine serum and incubated for up to 24 hours. Incubations were stopped by harvesting the culture media and by processing the cells for mRNA extraction. Culture media were immediately spun to remove cell debris and the resulting supernatants were kept at -80°C until chemokine quantitation by ELISA. qPCR analyses. Following mRNA extraction with the RNeasy Plus MiniKit, RNA was quantified by ultraviolet with the Synergy H1 Hybrid Multi-Mode microplate reader (BioTek, Winooski, VT). For the analysis of CCL26 mRNA by qPCR, total RNA was converted into cDNA using the qScript cDNA Synthesis Kit on the DNA engine PTC-200 (MJ Research, Watertown, NY). Amplification was performed with the CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON) using the BR-SYBR Green SuperMix and human CCL26 QuantiTect Primers (NM_006072). For CC chemokines mRNA analysis, cDNA synthesis was performed using the RT2 First Strand Kit and qPCR reactions were performed with the 7900HT Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Burlington, ON) using a custom made RT2 Profiler qPCR Multiplex Array Kit and the RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix. The RT2 Profiler PCR array 386 wells plates were filled by epMotion 5075 LH system (Eppendorf, Hamburg, Germany). External control mix for the efficiency of reverse transcriptase, the amplification reactions and the detection of genomic DNA contamination were also included. PCR amplifications were then performed using the following protocol: a denaturation step at 95˚C for 5 min followed by 40 cycles (1-min denaturation at 95˚C, 30-sec annealing at 60˚C, and 1-min elongation at 72˚C). Data acquisition and analyses were performed with the SDS software (version 2.3). Gene expression was calculated using the relative quantification normalized to the 18S rRNA (human RRN18S QuantiTech primer assay, NM_X03205) as reference gene with the 2-∆∆CT method related to the Pfaffl method (396-398). Negative controls were also performed as described above in absence of cDNA templates.

Bronchial biopsy processing and immunohistochemistry. Bronchial biopsies of healthy and asthmatic subjects were taken from the IUCPQ Tissue Bank, site of the Respiratory Health Network Tissue Bank of the Fonds de la recherche du Québec-Santé. All biopsies were processed using the same standardized methodology. For CCL26 staining, tissues were fixed in 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin and cut into 4 µm sections using a microtome (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL). Tissue slides then were deparaffinized with xylene, followed by numerous washes using decreasing concentrations of ethanol. Immunostaining of biopsy sections was done using the anti-goat HRP-AEC staining kit and the Antigen Retrieval Reagent-Basic according to the manufacturer’s instructions. For MBP staining, biopsies were embedded in OCT compound (Tissue-Tek O.C.T. compound, Sakura), frozen (-80˚C), then cut into 6 µm sections and kept frozen (-80˚C) until analysis. Tissue slides were fixed and permeabilized with acetone/methanol and rehydrated in PBS. Immunostaining of biopsy sections was done using the anti-mouse EnVision + System-HRP (AEC) staining kit according to the manufacturer’s instructions. Tissue slides were incubated with the primary antibodies (CCL26 or MBP), counterstained with Mayer’s haematoxylin and mounted with the aqueous based permanent CC/Mount medium. CCL26 and MBP stainings were pictured with the digital slide scanner Nanozoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Middlesex, NJ). Chemokine staining intensity on each biopsy was blindly scored by two of the authors (JC and PJ) for bronchial epithelium, where a 0 score corresponds to no staining, 1 to focal staining with < 10% of positive cells, 2 to moderate staining with 10-75% of positive cells and 3 to strong staining with > 75% of positive cells. Eosinophil numbering was determined as the number of MBP positive cells per mm2 of bronchial tissue, excluding mucus glands or by using the Giemsa Stain Kit (Jenner-Wright), Artisan™. Measures of the total bronchial tissue surface were achieved with the Image ProPlus Software.

Quantitation of chemokines in induced sputum. Sputum samples were obtained with the collaboration of Dr Louis-Philippe Boulet who supervises the induced sputum lab of our institution. Samples were processed (within 2 hours) as described previously (399;400). In brief, mucus plugs were isolated from saliva then treated with a volume (in ml) of dithiothreitol representing four times the mucus weight (in g). An equal volume of Dulbecco’s phosphate buffered saline then was added to the all samples before their filtration

using a 0.45 µm nylon filter. The resulting supernatants were collected for chemokine quantitation. Cell pellets were assessed for cell viability and differential counts using trypan blue exclusion and Diff-Quik staining, respectively. In order to limit chemokine processing by proteases such as mast cell tryptase, aprotinin (10 µg/ml) was added to all samples.

Statistical analyses. Data are expressed as mean  SEM and were analysed using one-way or two-way ANOVA with a blocking factor according to the protocols. Log-transformation was investigated to stabilize variances. The normality assumption was verified with the Shapiro-Wilk tests after a Cholesky factorization. The Brown and Forsythe's variation of Levene's test statistic was used to verify the homogeneity of variances. Relationships between variables were expressed using the Pearson’s correlation coefficient. The results were considered significant with p-values  0.05. Analyses were performed using the statistical packages SAS, v9.4 and R, v3.0 (SAS Institute).

4.5 Results

IL-13 selectively increases the expression of CCL26 by human primary bronchial epithelial cells IL-13 stimulates the production of CCL26 by epithelial cells (140;148;392;401;402). In this regard, we tested if IL-13 would induce the expression of CCL26 and other CC chemokines by human primary BEC obtained from healthy controls, and mild and severe asthmatics. Clinical characteristics of these subjects are presented in table 1. Untreated cells from healthy controls and from mild or severe eosinophilic asthmatics mainly expressed CCL20 >>> CCL28  CCL25  CCL22  CCL2 (figure 1A). Smaller and similar mRNA levels were also found for CCL4, CCL5, CCL17, CCL24, CCL26, and CCL27 (figure 1B). The mRNAs of other CC chemokines, including CCL11, were not detected. There was no difference between the 3 groups of volunteers, except for CCL20 (MIP-3α) for which an increased mRNA level was observed for severe eosinophilic asthmatics compared to healthy controls and/or mild asthmatics (p < 0.0001). No difference was observed between CCL20 levels of BEC from healthy controls vs. mild asthmatics. When cells were treated with 30 ng/ml of IL-13 during 24 hours, CCL26 mRNA levels were increased by up to four orders of magnitude (figure 2). This increased CCL26 mRNA expression was higher in cells from severe eosinophilic

asthmatics compared to those from either healthy controls or mild asthmatics (p < 0.01). Noteworthy, CCL26 was the only CC chemokine whose mRNA expression was significantly increased upon stimulation with IL-13 (p < 0.0001 compared to baseline).

Kinetic and concentration responses of IL-13-mediated CCL26 production by BEC. We next performed kinetic and concentration-response experiments in which we analyzed the effect of IL-13 on CCL26 expression and production. The treatment of BEC with 30 ng/ml of IL-13 induced a time-dependent expression of the CCL26 mRNA in all groups. CCL26 mRNA levels were detected after 4 hours of stimulation and increased up to 24 hours. In agreement with the qPCR array data presented in figure 2, IL-13 induced an increase in CCL26 mRNA that was significantly higher in BEC from severe eosinophilic asthmatics compared to those from healthy individual or mild asthmatics (p < 0.01; figure 3A). CCL26 was also released in the cell culture supernatants in a time-dependent fashion and increased up to 24 hours after the addition of IL-13 (figure 3B). At this time point, CCL26 protein levels in the culture supernatants were significantly higher in the severe eosinophilic asthmatics group compared to the healthy control and mild asthmatic groups (figure 3B, p ≤ 0.03) in agreement with the observed increased expression of CCL26 mRNA (figure 3A). Noteworthy, we could not detect any CCL26 in the supernatants of untreated cells. Since no difference was found between cell lines from healthy controls and mild asthmatics, we performed concentration-response experiments using two cell lines from both groups. These experiments show that IL-13 stimulated the expression of CCL26 by BEC in a concentration dependent manner (figure 3C).

CCL26 expression is increased in the bronchial epithelium of asthmatics. We next assessed if CCL26 levels were increased in the bronchial epithelium of asthmatics by performing immunohistochemistry analyses on bronchial biopsies obtained from healthy controls, mild asthmatics, and severe eosinophilic asthmatics. The clinical characteristics of these subjects are presented in table 2. Typical CCL26 staining data are shown for each group in figure 4. A weak epithelial expression of CCL26 was found in bronchial epithelium of healthy controls. This expression significantly increased in mild and severe eosinophilic asthmatics (asthmatic vs. healthy subjects: p = 0.027, figure 4D). However, CCL26 staining

was not different between the epithelium of mild and severe eosinophil asthmatics (figure 4E). These results indicate that the increased CCL26 expression in the bronchial epithelium of asthmatics could explain, in part, the recruitment of eosinophils into bronchial mucosa observed in this disease. However, they contrast with the CCL26 production observed in IL- 13-stimulated primary BEC where higher CCL26 levels were found in severe eosinophilic asthmatics (figure 3).

Increased eosinophil numbers in bronchial biopsies of mild asthmatics but not severe eosinophilic asthmatics. We next determined the number of eosinophils by MPB staining in bronchial biopsies of the same donors (table 2). In contrast to CCL26, the number of eosinophils in the bronchial mucosa was different between the asthmatic groups (figure 5). The healthy controls had low eosinophil counts and the mild asthmatics had significantly greater eosinophils in the submucosa. The severe eosinophilic asthmatic group had low eosinophil counts comparable to those observed in healthy controls. This was surprising given that these severe eosinophilic asthmatics had a high eosinophil counts in their induced sputum (table 2). Noteworthy, essentially similar results were obtained by enumerating eosinophils with the Giemsa Stain Kit (Jenner-Wright), Artisan™ in which human eosinophils are bright pink (not shown).

CCL26 protein level correlates with eosinophil number in the airway lumen. Given that BEC from severe asthmatics release more CCL26 than those of healthy volunteers and mild asthmatics in vitro (figure 3), that the CCL26 staining in bronchial epithelium was not associated with an increased eosinophil number in bronchial mucosa (figures 4 and 5) and that low eosinophil counts were obtained in bronchial mucosa from severe eosinophilic asthmatics (figure 5), we postulated that BEC released CCL26 in the airway lumen rather than in the submucosa and that eosinophil counts of the induced sputum would correlate with sputum CCL26 levels. In this respect, we measured the levels of CCL26 in the induced sputum of healthy controls and asthmatics from different severities that had different eosinophil counts in their sputum. The clinical characteristics of these individuals are presented in table 3. We found a significant correlation between sputum CCL26 and sputum eosinophils and an inverse correlation between sputum CCL26 and sputum neutrophils

(figure 6), strongly supporting a crucial role of CCL26 in the recruitment of eosinophils into the airway lumen. Noteworthy, high CCL26 levels were mainly found in the sputum samples of severe eosinophilic asthmatics (figure 6A).

4.6 Discussion The current pharmacological treatment of asthma includes the daily use of inhaled corticosteroids to dampen airway inflammation. The dose of corticosteroids is adjusted to control asthma symptoms and increases with disease severity. Sputum eosinophil counts are very useful to adjust the dose of corticosteroids required to decrease airway eosinophilia and asthma symptoms (24-27). However, some severe asthmatics remain symptomatic despite high doses of inhaled and/or oral corticosteroids and many of these individuals present a persistent elevated eosinophil count in their induced sputum (11;403). To study the severe asthma phenotype of BEC in term of chemokine expression, we selected severe asthmatics with persistent asthma symptoms and eosinophilic airway inflammation as defined by a high eosinophil cell count in induced sputum (tables 1, 2 and 3). This particular severe asthma phenotype represents a good opportunity to better clarify the mechanisms sustaining eosinophil recruitment into the airways.

Using primary BEC lines, we demonstrate that among all CC chemokines, BEC predominantly express CCL26 in response to IL-13 (figure 2); that the induced CCL26 expression and release by IL-13-stimulated cells were significantly more important with cells of subjects with severe eosinophilic asthma (figure 3); that CCL26 staining is more prominent in bronchial epithelium of asthmatics compared to healthy controls (figure 4); that the number of eosinophils in airway mucosa of subjects with severe eosinophilic asthma is lower than that observed in mild asthma (figure 5); that CCL26 levels correlate with eosinophil counts in our sputum samples (figure 6); and that increased sputum CCL26 levels are mainly found in severe eosinophilic asthmatics (figure 6). These results underscore the importance of BEC release of CCL26 in the airway recruitment of eosinophils and the pathogenesis of eosinophilic asthma and its severity. Moreover, they suggest that, in subjects with severe eosinophilic asthma, a great proportion of the recruited eosinophils to airway mucosa are

further attracted to the airway lumen likely on the effect of CCL26, thereby decreasing the number of eosinophils observed in the mucosa.

To our knowledge, this is the first study that evaluated the expression of all CC chemokines by primary BEC in asthma. While a limited number of CC chemokines was expressed by unstimulated BEC, their treatment with IL-13 led to an important and selective up-regulation of CCL26 expression, by up to four orders of magnitude (figures 2 and 3). This increase of CCL26 expression is in line with two recent studies. The first one showed that human epithelial cells from eosinophilic esophagitis robustly responded to IL-13 with an increase of CCL26 expression by ~four orders of magnitude (404). The second study showed that epithelial brushings from asthmatics had increased expression of CCL24 and CCL26 mRNAs (405). Moreover, our observations further support the primordial role of CCL26 in the pathogenesis of eosinophilic diseases, adding severe eosinophilic asthma to atopic dermatitis, chronic rhinosinusitis, eosinophilic esophagitis and Churg-Strauss vasculitis (384-390).

IL-13 levels are increased in bronchoalveolar lavage fluids, bronchial biopsies, and sputum of asthmatics, notably severe asthmatics (406-410). IL-13 is involved in several aspects of airway inflammation and remodelling such as mucus production, IgE synthesis, recruitment of eosinophils, proliferation of bronchial fibroblasts and smooth muscle cells(411). Promising preclinical data from experimental models of asthma led to the development of various humanized anti IL-13 monoclonal antibodies (412;413). Among them, lebrikizumab elicited an improvement of lung function in patients with uncontrolled asthma characterized by high level of TH2 responses such as circulating IgE and blood eosinophils (414). Our data suggest that IL-13 may promote eosinophil recruitment and asthma severity by stimulating BEC to release CCL26 in the airways.

Some cellular mechanisms may explain the observed increased expression of CCL26 in BEC of severe eosinophilic asthmatics. Airway epithelial cells express all IL-13 receptor subunits (IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-4Rα and the γ-chain)(404). It is possible that BEC express more receptors at their surface or that the downstream signaling triggered by their activation is enhanced. It is well established that the activation of IL-13 receptors involves numerous

kinases, notably JAK1, JAK2, JAK3 and Tyk2. They rapidly phosphorylate the specific transcription factor signal transducer and activator of transcription (STAT)-6 that then translocates to the nucleus and initiates transcription. The activation of STAT6 can be downregulated by the suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins, in particular SOCS1 and SOCS3 (279;415-418). Thus it is possible that in BEC from severe eosinophilic asthmatics, the JAK-STAT6 pathway is enhanced either because of an imbalance between JAK and SOCS proteins or that there is an increase in STAT6 expression. Moreover, a decreased methylation of the CCL26 gene could also be involved in the increased CCL26 release we observed. In this respect, Lim et al. demonstrated that increased CCL26 mRNA levels in subjects with eosinophilic esophagitis were linked to a lower methylation of CCL26 gene compared to healthy subjects (283). Further experiments are necessary to define if those cellular mechanisms or a combination of these processes are involved.

Corticosteroids activate anti-inflammatory genes that encode for cytokines, chemokines, adhesion molecules, inflammatory enzymes and receptors, and suppress inflammatory genes (419). However, severe eosinophilic asthmatics do not respond to corticosteroid therapy and several molecular mechanisms leading to the corticosteroid resistance may be involved in severe asthma including: glucocorticoid receptor (GR) dysfunction including altered GR binding affinity or overexpression of the pro-inflammatory β subunit, an increased proinflammatory transcription factors, an abnormal histone acetylation and de-acetylation leading to the repression of anti-inflammatory gene activation, and a genetic susceptibility (419). Additional experiments exploring these hypotheses will be an important step to increase our understanding of chemokine expression in asthma and its severity.

4.7 Conclusion In conclusion, we showed that CCL26 is the only CC chemokine to be highly expressed by BEC upon treatment with IL-13. Importantly, BEC from severe eosinophilic asthmatics released more CCL26 and a significant correlation was found between CCL26 levels and eosinophil numbers in the induced sputum, supporting a major role of CCL26 for eosinophil recruitment in asthma. The mechanism sustaining the increased sputum CCL26 levels observed in severe eosinophilic asthmatics needs to be defined. These data suggest that

sputum CCL26 could be a biomarker to identify specific asthmatic phenotype in which IL- 13 is a key player and could a valuable target for the treatment of severe eosinophilic asthma. This report underscores the necessity to study the role of chemokines in the recruitment of eosinophils in humans, and emphasize the importance to better understand the mechanisms of eosinophil recruitment in asthma in order to offer a more effective therapy to asthmatics, in particular those suffering from severe asthma.

4.8 List of abbreviations mAb: antibody; BEC: bronchial epithelial cells; IL: interleukin; mAb: monoclonal antibody; pAb: polyclonal antibody

4.9 Acknowledgments

The authors thank Luce Trépanier and Claudine Ferland for recruiting and evaluating the subjects, Sophie Plante for BEC subculture, Serge Simard for performing statistical analyses, Mylène Bertrand for the processing of induced sputum samples, and Sabrina Biardel from the Respiratory Health Network Tissue Bank for her assistance with biopsies and immunohistochemistry. This work was supported by a grant to ML and NF from the Fondation de l’IUCPQ and the J-D-Bégin Research Chair. MCL was supported by scholarships from La fondation Wilbrod-Bhérer et Joseph-Demers de l’Université Laval, la direction de la recherche universitaire de l’IUCPQ and the CIHR - Quebec Respiratory Health Training Program. NF was supported by a salary award from the Fonds de la recherche du Québec-Santé.

4.10 Tables and Figures

Table 1: Clinical characteristics of subjects who provided the primary BEC lines. FEV FVC SEX ATOPY 1 SPUTUM Subjects AGE (% of (% of (M/F) (yes/no) EOS (%) predicted) predicted) Healthy 29.8 98.8 4/5 0/9 NA NA controls ± 3.4 ± 4.8 Mild 23.6 94.9 7/2 9/0 NA NA asthmatics ± 1.4 ± 5.9 Severe 62 57 73 34.2 eosinophilic 2/3 4/1 ± 1.1 ± 6.6 ± 6.8 ± 16.5 asthmatics

Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, FVC: forced vital capacity, EOS: eosinophil

Table 2: Clinical characteristics of subjects who provided bronchial biopsies for CCL26 immunostaining and eosinophil (MPB+ cell) counts.

FEV1 FVC SEX ATOPY SPUTUM Subjects AGE (% of (% of (M/F) (yes/no) EOS (%) predicted) predicted) Healthy 24.8 100.4 104.9 5/3 0/8 NA controls ± 1.9 ± 3.37 ± 5.2 Mild 26 90.4 98.7 3/5 7/1 NA asthmatics ± 3.6 ± 3.9 ± 4.1 Severe 54.9 64.9 78.8 26.5 eosinophilic 6/4 7/3 ± 2.8 ± 4.1 ± 4.0 ± 7.8 asthmatics

Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, FVC: forced vital capacity, EOS: eosinophil

Table 3: Clinical characteristics of subjects who provided induced sputum supernatants and cells.

FEV1 FVC SEX ATOPY SPUTUM Subjects AGE (% of (% of (M/F) (yes/no) EOS (%) predicted) predicted) Healthy 62.1 96 102 0.8 3/4 2/1 controls ± 5.7 ± 4.6 ± 4.6 ± 0.4 Moderate 50.1 80.4 91.6 2.4 7/4 7/2 asthmatics ± 5.0 ± 4.1 ± 2.6 ± 1.0 Severe non 47.3 66.5 87.2 0.7 eosinophilic 8/5 11/0 ± 3.8 ± 3.2 ± 4.0 ± 0.2 asthmatics Severe 52.7 67.1 89.5 29.5 eosinophilic 3/8 8/2 ± 5.0 ± 6 ± 4.2 ± 6.7 asthmatics

Mean ± SEM, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, FVC: forced vital capacity, EOS: eosinophil

FIGURE 1. Relative expression of CC chemokines by human BEC. Panels A and B represent the ratio between mRNAs of CC chemokines and 18S rRNA control. Panel B is a zoom of panel A. mRNAs were quantified by qPCR array as described in Methods. Results are the mean (± SEM) of 3 independent experiments performed in duplicate (*: p<0.0001, severe asthmatics vs. healthy controls and mild asthmatics). Two-way ANOVA with a Tukey’s multiple comparisons test were performed to obtain p values.

FIGURE 2. Effect of IL-13 on CC chemokine expression by human BEC. Cells were treated with vehicle or IL-13 for 24 hours. mRNAs were extracted and CC chemokine expression quantified using a qPCR array as described in Methods. Results represent the mean (± SEM) of 3 independent experiments performed in duplicate. Two-way ANOVA with a Tukey’s multiple comparisons test were performed to obtain p values. * p < 0.01 compared to healthy controls and mild asthmatics.

FIGURE 3. Kinetic and concentration responses of IL-13 on CCL26 expression and release by primary bronchial epithelial cells. A,B) Cells were treated with 30 ng/ml IL-13 for up to 24 hours. C) Cells were treated with increasing concentrations of IL-13 during 8 hours. A,C) CCL26 and 18S rRNA was quantified by qPCR as described in Methods. B) CCL26 protein in culture supernatants was analyzed by ELISA. A,B) Two-way ANOVA with a Tukey’s multiple comparisons test were performed (*: p<0.01 vs healthy controls and mild asthmatics).

FIGURE 4. CCL26 protein expression by bronchial epithelium and submucosa. Representative images (200X magnification) of CCL26 staining (red) from a healthy control (A), a mild asthmatic (B), and a severe eosinophilic asthmatic (C). D) Computed scores of CCL26 staining intensity in bronchial epithelium of asthmatics were compared to those of healthy controls (E,F) Computed scores of CCL26 staining intensity in bronchial epithelium and bronchial submucosa for healthy controls, mild and severe eosinophilic asthmatics. Unpaired t test were performed to obtain p values.

FIGURE 5. Eosinophil counts in the bronchial mucosa in health and asthma. Representative images (200X magnification) of MBP staining (red) from a healthy control (A), a mild asthmatic (B), and a severe eosinophilic asthmatic (C). D) Computed analyses of eosinophil counts in bronchial biopsies of healthy controls, mild and severe eosinophil asthmatics. P values were obtained using a one-way ANOVA combined with a Tukey’s multiple comparisons test.

FIGURE 6. Correlation between CCL26 level and eosinophil number in sputum of healthy and asthmatic subjects. Induced sputum from healthy controls, moderate asthmatics, severe non-eosinophilic asthmatics and severe eosinophilic asthmatics were isolated and processed as described in Methods. CCL26 levels as well as eosinophil (A) and neutrophil (B) numbers were obtained as described in methods. (C) Legends for panels 6A and 6B. For the analysis of the correlation, a Spearman’s rank correlation test was performed.

CHAPITRE V

STAT6 activation involved in CCL26 greater production by bronchial epithelial cells from subjects with severe eosinophilic asthma

Marie-Chantal Larose1, Anne-Sophie Archambault1, Véronique Provost1, Miriam Larouche2, Catherine Laprise2, Jamila Chakir1, Michel Laviolette1 et Nicolas Flamand1.

1Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC G1V 4G5, Canada ; 2Université du Québec à Chicoutimi, Département des sciences fondamentales, Saguenay, QC G7H 2B1, Canada.

Avant-propos Puisque le chapitre IV a démontré une surproduction de la CCL26 chez CÉB de sujets asthmatiques sévères éosinophiliques et que la CCL26 est associé à l’éosinophilie bronchique, il était nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 chez les CÉB de sujets asthmatiques sévères éosinophiliques. À cet égard, ce chapitre étudiera ces mécanismes. Je suis la première auteure dans cet article. J'ai participé à la conception de l’étude et à l'élaboration des protocoles de recherche, effectué les manipulations, analysé les données, interprété les résultats et participé à la rédaction du manuscrit. Anne-Sophie Archambault et Miriam Larouche ont contribué en effectuant des manipulations, en analysant des données et en interprétant des résultats. Véronique Provost, Dr Catherine Laprise et Dr Jamila Chakir ont participé à l’interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit. Dr Nicolas Flamand et Dr Michel Laviolette ont participé à la conception de l'étude, à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit.

L’article présenté dans ce chapitre sera prochainement soumis.

5.1 Résumé

INTRODUCTION. L’asthme est une maladie inflammatoire caractérisée par une éosinophilie bronchique corrélant avec la sévérité de la maladie. Nous avons récemment démontré que le chimioattractant CCL26, spécifique pour l’éosinophile, corrèle avec l’éosinophilie pulmonaire et que cette chimiokine est principalement produite par les cellules épithéliales bronchiques (CÉB) en présence d’interleukine (IL)-13. Cette production est accentuée dans l’asthme sévère éosinophilique et corrèle avec le nombre d’éosinophiles retrouvé dans les expectorations induites. Nous postulons que la voie de signalisation de l’IL- 13 et/ou la méthylation du gène de la CCL26 sont impliquées dans la surproduction de la CCL26 observée chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques. MÉTHODES. Des CÉB isolées de biopsies bronchiques et des biopsies bronchiques ont été obtenues de sujets sains et asthmatiques (légers ou sévères éosinophiliques). Les CÉB ont été stimulées avec de l’IL-13 et/ou les inhibiteurs (ou véhicule) pendant différents temps. L’ARNm (qPCR) de CCL26 et la protéine (ELISA) de CCL26, STAT6 et phospho(p)-STAT6 ont été mesurés dans les CÉB. SOCS1 et SOCS3 ont été évaluées par immunohistochimie sur les biopsies bronchiques. Les niveaux de méthylation ont été quantifiés par pyroséquençage. RÉSULTATS. L’inhibition de STAT6 diminue l’expression de la CCL26 induite par l’IL- 13 chez les CÉB. Le ratio phospho-STAT6/STAT6, indicatif de son activation, est plus élevé chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques comparativement aux sujets sains et aux asthmatiques légers. Un marquage important de SOCS3 et faible de SOCS1 a été observé dans les CÉB de biopsies bronchiques. Les niveaux de méthylation du promoteur du gène de la CCL26 sont similaires chez les CÉB de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. CONCLUSION. Nos résultats dévoilent que la production de la CCL26 par les CÉB de sujets asthmatiques sévères éosinophiliques est régulée par une augmentation de l’activation de STAT6.

5.2 Abstract

RATIONALE. High pulmonary eosinophil counts correlate with asthma severity and symptoms. We recently showed that sputum CCL26 levels, a selective eosinophil chemoattractant, correlate with sputum eosinophil counts. We also found that the production of CCL26 induced by IL-13 in bronchial epithelial cells (BECs) is significantly enhanced in BECs from severe eosinophilic asthmatics. We thus investigated the impact of signaling events mediated by IL-13 and CCL26 gene methylation on CCL26 overexpression observed in BECs from severe eosinophilic asthmatics. METHODS. BECs were incubated with IL-13 for up to 48 hours and, if necessary, pre-incubated with the STAT6 inhibitor AS1517499 for 1 hour. CCL26 expression, production and methylation levels were quantitated by qPCR, ELISA, and pyrosequencing, respectively. STAT6 and phosphorylated(p) STAT6 were evaluated by ELISA. Immunohistochemistry analyses of SOCS1 and SOCS3 were done on bronchial biopsies. RESULTS. The inhibition of STAT6 decreases CCL26 expression and production from IL-13-stimulated BECs. In that regard, the pSTAT6/STAT6 ratios were increased in IL-13-stimulated BECs from severe eosinophilic asthmatics, compared to those from healthy subjects and mild asthmatics. Strong staining of SOCS3 and weak staining of SOCS1 were observed in BECs from bronchial biopsies. In contrast, methylation levels of CCL26 promotor gene were similar in BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics. CONCLUSIONS. Our results showed the involvement of STAT6 in the enhanced CCL26 expression induced by IL-13 in BECs from severe eosinophilic asthmatics.

5.3 Introduction

Eosinophil recruitment to the airways is a well-recognized feature of asthma given its association with disease severity and symptoms (24-27). Eosinophil numbers and asthma symptoms usually decrease with corticosteroids treatment. However, some patients with severe asthma have persistent elevated counts of sputum eosinophils and remain symptomatic despite being treated with high dose of corticosteroids (16). We recently showed that airway CCL26 correlates with this severe pulmonary eosinophilia (420). Of note, we demonstrated that CCL26 is the only CC chemokine highly expressed by bronchial epithelial cells (BECs) upon treatment with interleukin (IL)-13. BECs from subjects with severe uncontrolled eosinophilic asthma released more CCL26 than cells from healthy subjects or subjects with mild asthma. These results support that targeting CCL26 might help treating eosinophilic asthmatics that are refractory to classic therapies. This stresses the need to decipher the mechanisms involved in CCL26 production by BECs from subjects with severe uncontrolled eosinophilic asthma in order to develop novel pharmaceutical tools that would inhibit CCL26 production and, consequently, the persistent pulmonary eosinophilia.

Given that CCL26 production by BECs is induced by IL-13, the signaling factors of IL-13 pathway are probably involved in this phenomenon. IL-13 binding to IL-13Rα1 and IL-4Rα receptor units activates numerous kinases, such as Janus Kinase 1 (JAK1) that rapidly phosphorylate the specific transcription factor signal transducer and activator of transcription (STAT)-6 (421). Then, STAT6 translocates to the nucleus and initiates gene transcription. The activation of STAT6 can be downregulated by the suppressors of cytokine signaling (SOCS)1 and SOCS3 proteins (422). Thus, we postulate that, in BECs from severe eosinophilic asthmatics, the IL-13 pathway is enhanced because of an imbalance between the activation of STAT6 and SOCS protein levels resulting in an increased STAT6 phosphorylation. Moreover, given that Lim et al. demonstrated that a lower methylation level in the CCL26 gene was linked to CCL26 mRNA expression in subjects with eosinophilic esophagitis (283), a decreased methylation level in CCL26 promoter could also be involved in the increased CCL26 production by BECs of severe eosinophilic asthmatics.

Consequently, we investigated 1) the expression and the functional responses of the different signaling effectors linked to the IL-13 signaling and 2) the importance of methylation in CCL26 expression in BECs from healthy subjects, mild asthmatics, and severe eosinophilic asthmatics.

5.4 Materials and methods

Reagents. Human recombinant IL-13 was purchased from Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ, USA); human CCL26/Eotaxin-3 DuoSet ELISA kit, Human/mouse Phospho-STAT6 (Y641) Cell-Based ELISA, Human/mouse STAT6 Cell-Based ELISA from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA); DMEM/F12 medium and foetal bovine serum (FBS) from Wisent Inc. (St-Bruno, QC, Canada); RLT Plus Lysis Buffer, Human CCL26 QuantiTect Primers, Human RRN18S QuantiTech primer assay, QIAamp DNA mini kit, EpiTech Bisulfite Kit, Pyromark PCR Kit and Pyromark Gold Q24 Reagents from Qiagen (Mississauga, ON, Canada); qScript cDNA Synthesis Kit from Quanta Biosciences (Gaithersburg, MD, USA); SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix from Biorad Laboratories (Mississauga, ON, Canada); EZ-10 DNAaway RNA Miniprep Kit from Bio Basic Canada Inc. (Markham, ON, Canada); the STAT6 inhibitor AS1517499 from Axon Medchem (Reston, VA, USA); dimethyl sulfoxide (DMSO), Mount Medium from Thermo Fisher Scientific (Ottawa, Ontario, Canada); polyclonal SOCS1 antibody (H-93) from Santa-Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA), polyclonal SOCS3 antibody (ab16030) and EXPOSE Rabbit specific HRP-AEC detection IHC kit from Abcam (Cambridge, MA, USA), Hematoxylin from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada).

Clinical criteria for subjects’ selection. Never-smoking asthmatics and healthy subjects without recent airway infection (8 weeks) were recruited for bronchial biopsies. Healthy volunteers had no history of allergy, asthma, or any other inflammatory disease, and had a

PC20 value > 16 mg/ml. Asthmatic subjects had a history of asthma for at least 6 months and were classified using the ATS criteria (423). Mild asthmatics only used β2 agonists on demand as therapy and had a normal FEV1. Severe eosinophilic asthmatics required a high dose of inhaled corticosteroids ( 1000 µg of fluticasone proprionate or the equivalent in combination with a long-acting β2 agonist) and demonstrated a high (> 5%) induced sputum

eosinophil count, sputum neutrophil count being  64%. Approval from the local ethics committee was obtained and all volunteers signed an informed consent form.

Human primary BEC lines culture and stimulation. BEC lines from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics were obtained as described earlier (424-426). BECs were cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Cells were grown in 12-well plates (3 × 105 cells/well) until they reached 80% confluence. Cells then were stimulated with vehicle or 30 ng/ml of IL-13 in DMEM-F12 medium supplemented with 1% fetal bovine serum and incubated for up to 24 hours. In order to evaluate the impact of STAT6 inhibition, BECs were pre-incubated 1 hour with increasing concentration of the STAT6 inhibitor AS1517499, or dimethyl sulfoxide (DMSO) and then incubated with 30 ng/ml of IL-13 or vehicle for 24 hours. Incubations were stopped by harvesting the culture media and by processing the cells for mRNA or DNA extraction. Culture media were immediately spun to remove cell debris and the resulting supernatants were kept at -80°C until CCL26 quantitation by ELISA.

Analysis of CCL26 expression by qPCR. Following mRNA extraction with the EZ-10 DNAaway RNA Miniprep Kit, RNA was quantified by ultraviolet with the Synergy H1 Hybrid Multi-Mode microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA). For the analysis of CCL26 mRNA by qPCR, total RNA was converted into cDNA using the qScript cDNA Synthesis Kit on the DNA engine PTC-200 (MJ Research, Watertown, NY, USA). Amplification was performed with the CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) using the SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix and human CCL26 QuantiTect Primers (NM_006072). Gene expression was calculated using the relative quantification normalized to the 18S rRNA (human RRN18S QuantiTech primer assay, NM_X03205) as a reference gene with the 2-∆∆CT method related to the Pfaffl method (396-398). Negative controls were also performed as described above in absence of cDNA templates.

Bronchial biopsy processing and immunohistochemistry. Bronchial biopsies of healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics were taken from the IUCPQ

Tissue Bank, site of the Respiratory Health Network Tissue Bank of the Fonds de la recherche du Québec-Santé. All biopsies were processed using the same standardized methodology. Tissues were fixed in 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin and cut into 4 µm sections using a microtome (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL, USA). Tissue slides then were deparaffinized with xylene, followed by numerous washes using decreasing concentrations of ethanol. Immunostaining of biopsy sections was done using the EXPOSE Rabbit specific HRP-AEC detection kit and the Antigen Retrieval Reagent-Basic according to the manufacturer’s instructions. Tissue slides were incubated with the primary antibodies (SOCS1 or SOCS3), counterstained with Mayer’s haematoxylin and mounted medium. SOCS1 and SOCS3 staining were pictured with the digital slide scanner Nanozoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Middlesex, NJ). SOCS1 and SOCS3 staining intensity on each biopsy was blindly scored by two of the authors (JC and PJ) for bronchial epithelium, where a 0 score corresponds to no staining, 1 to focal staining with < 10% of positive cells, 2 to moderate staining with 10-75% of positive cells and 3 to strong staining with > 75% of positive cells.

Methylation level of CCL26 gene by pyrosequencing DNA extracted from BECs was quantitated by ultraviolet with the Synergy H1 Hybrid Multi- Mode microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA). Then, 650 ng of DNA had bisulfite treatment using EpiTech Bisulfite Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Based on previous epigenetic analyses (283), methylation level of 4 CpG in CCL26 promoter (Fig. 6A) was measured using bis-pyrosequencing (Pyromark PCR Kit and Pyromark Gold Q24 Reagents, Qiagen, Mississauga, ON, Canada). PCR primers were designed using PyroMark Assay Design software (v2.0.1.15).

Statistical analyses. Data are expressed as mean  SEM and were analysed using one-way or two-way ANOVA with a blocking factor according to the protocols. The normality assumption was verified with the Shapiro-Wilk tests after a Cholesky factorization. The Brown and Forsythe's variation of Levene's test statistic was used to verify the homogeneity of variances. The results were considered significant with p-values  0.05. Analyses were performed using the statistical packages SAS, v9.4 and R, v3.0 (SAS Institute).

5.5 Results Involvement of STAT6 in CCL26 expression and production by BECs in severe eosinophilic asthma We first evaluated the importance of STAT6 in CCL26 expression and production by BECs. Cells were pre-incubated 1 hour with different concentrations of the inhibitor of STAT6, AS1517499, then treated 24 hours with IL-13. Our results indicate that the STAT6 inhibitor induces a concentration-dependent decrease of CCL26 expression (Fig. 1A,B). Secondly, we compared the level of STAT6 activation between BECs from healthy subjects and subjects with mild asthma or severe eosinophilic asthma. BECs were treated for different times with 30 ng/ml of IL-13 over 48 hours. STAT6 and pSTAT6 were quantitated by ELISA and the activation levels of STAT6 was calculated with the ratio between pSTAT6 and STAT6. We found that STAT6 activation was higher in BECs from severe eosinophilic asthmatics than cells from mild asthmatics (p < 0.05) and healthy subjects (p < 0.001) during the peak of STAT6 activation, which was between 5 and 30 minutes of incubation with IL-13 (Fig. 2A). The level of STAT6 was comparable in BECs of healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics during the incubation (Fig. 2B).

Staining of SOCS1 and SOCS3 in bronchial epithelium Given that SOCS1 and SOCS3 are inhibitory proteins of STAT6 (422), we investigated if they were involved in the greater STAT6 activation observed in BECs from severe eosinophilic asthmatics. Thus, we evaluated the protein levels of SOCS1 and SOCS3 in epithelium from bronchial biopsies of healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics (Table 2). SOCS3 levels tended to be lower in epithelium of severe eosinophilic asthmatics than those of healthy subjects or mild asthmatics, but it was not statistically significant. SOCS1 levels were similar between our group of subjects (Fig. 3). We also tested if IL-13 receptors were associated with the higher STAT6 activation. IL-4Rα or IL-13Rα1 mRNA expression were assessed in untreated BECs and in BECs treated with IL-13 for 24 hours. We found no difference in IL-4Rα or IL-13Rα1 mRNA expression between BECs of healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics, whether BECs were treated or not with IL-13 (Fig. 4).

STAT6 and IL-13 are essential for CCL26 expression and production throughout the incubation time We previously demonstrated that IL-13 induces a sustained time-dependant CCL26 expression and production over 24 hours in BECs (420). Given these results, we were intrigued by the rapid decrease of STAT6 activation in BECs after only 1 hour of incubation with IL-13 (Fig. 2). Consequently, we tested if STAT6 and IL-13 were essential for CCL26 expression and production throughout the 24 hours of incubation. In order to evaluate their involvement throughout the incubation time, we incubated BECs with 30 ng/ml of IL-13 for 24 hours and, for some conditions, we changed the media to remove the IL-13, or we added the STAT6 inhibitor at different times. IL-13 withdrawal demonstrated that the continuous presence of IL-13 is essential for CCL26 expression and production throughout the incubation time (Fig. 5B). Indeed, even if IL-13 was removed after 16 hours of incubation, we obtained about 75 percent of total CCL26 expression We found similar results with the inhibition of STAT6, demonstrating that STAT6 is also essential for CCL26 expression and production throughout the incubation time (Fig. 5C).

Similar levels of methylation in CCL26 promoter gene in BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics Since a lower methylation level of CCL26 gene could support an increased CCL26 production, we tested whether the level of methylation in CCL26 promoter gene could modulate CCL26 expression in BECs in asthma. Based on Lim et al (283), we evaluated the methylation level of 4 CpG near the STAT6 binding sites in the CCL26 promoter (Fig. 6A). ADN extracted from BECs incubated with 30 ng/ml of IL-13 for 24 hours were treated with bisulfite and analysed by pyrosequencing. Our results demonstrated that the methylation levels of the 4 CpG were similar in BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics (Fig. 6B). Moreover, the levels of methylation between BECs unstimulated and stimulated with IL-13 were comparable (Fig. 6C).

5.6 Discussion

Given that IL-13-treated-BECs from severe eosinophilic asthmatics produced greater amount of CCL26 than cells from mild asthmatics or healthy subjects (420), we investigated the mechanisms that could support this increase of CCL26 production. Our results demonstrate that 1) CCL26 production and expression induced by IL-13 in BECs are STAT6-dependent, 2) STAT6 activation is greater in BECs from severe eosinophilic asthmatics, 3) SOCS3 levels tended to be lower in epithelium of subjects with severe eosinophilic asthma, 4) methylation levels of CCL26 promotor gene are similar in BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics.

Involvement of STAT6 in CCL26 production and expression is well established. Blanchard et al demonstrated that STAT6 bind to CCL26 promoter when induced by IL-13 and that mutations in STAT6 binding sites decrease CCL26 production by human intestinal epithelial cells lines (277). Others confirmed these results by using a STAT6 siRNA, the STAT6 inhibitor, AS1517499, or STAT6 phosphorylation inhibitor in epithelial cells (254;255;278). In order to confirme these results in our BECs isolated from bronchial biopsies, we used the STAT6 inhibitor AS1517499. As expected, STAT6 inhibition decreased significantly CCL26 expression and production in BECs (Fig. 1). We also evaluated if STAT6 is essential for CCL26 expression and production throughout the incubation time, given that STAT6 activation decreased after only 1 hour of incubation wih IL-13 in BECs. Our results demonstrated that STAT6 is essential for CCL26 production and expression throughout the incubation, illustrating that CCL26 production induced by IL-13 is STAT6-dependent in BECs (Fig. 5). Other molecular factors could have been involved in CCL26 expression and production in BECs. Park et al demonstrated that proton pump inhibitors decrease CCL26 secretion by esophageal epithelial cells (280) and Zhao et al illustrated that the inhibition of 15-Lipoxygenase (LO), a enzyme of lipid mediators, by a 15-LO siRNA decreases CCL26 production induced by IL-13 in BECs (276), supporting a role of proton pumps and 15-LO in CCL26 production in epithelial cells.

To our knowledge, this is the first demonstration of an increase in STAT6 activation in BECs from severe eosinophilic asthmatics (Fig. 2,3). These results support a key role of STAT6 in

asthma severity. Previously, only STAT6 expression were evaluated in asthma (257). In bronchial epithelium, Walford et al found that STAT6 levels are higher in asthmatics compared to healthy subjects (253) and Mullings et al demonstrated that STAT6 levels increase in severe asthmatics compared to mild asthmatics or healthy subjects (262). Given that we obtained similar levels of STAT6 in BECs of our three group of subjects, our results differ from these studies, possibly because we did in-vitro experiments instead of in-vivo. The involvement of SOCS1 and SOCS3 in asthma is less clear. Gielen et al reported that SOCS1, but not SOCS3, increases in BECs and in bronchial biopsies of subjects with asthma compared to healthy subjects (427). On the other hand, Doran et al found that mRNA SOCS1 expression, but not SOCS3, decreases in bronchial biopsies from severe asthmatics compared to mild asthmatics (428) and Fukuyama demonstrated that mRNA SOCS1 expression is similar between healthy subjects and asthmatics in smooth muscle cells (429). Even if those studies did not find a relation between SOCS3 and asthma, SOCS3 increased with asthma and its severity in eosinophils and lymphocytes (256;430;431). The discrepancies observed between each study could be explained by the different cell types or tissues used, suggesting that SOCS1 and SOCS3 expression are highly regulated and cell-type dependent. In our study, we obtained no statistically significant difference of SOCS1 and SOCS3 levels in epithelium of healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics, but SOCS3 levels tended to be lower in epithelium of severe eosinophilic asthmatics (Fig. 3). This weak decrease of SOCS3 levels could partially explained the increase of STAT6 observed in BECs of severe eosinophilic asthmatics.

Thereafter, we were interested to evaluate the epigenetic mechanisms, especially methylation, involved in CCL26 overexpression observed in severe eosinophilic asthma as observed by Lim et al. in esophageal epithelial cells of subjects with eosinophilic esophagitis (284). Of note, the level of methylation of a gene promoter inversely correlates with gene expression, given that DNA methylation usually blocks the binding of transcription factors (282). Thus, we evaluated the methylation levels of four CpG near the STAT6 binding sites in the CCL26 promoter in BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics (Fig. 6A). In contrast to Lim et al, the methylation levels of the four CpG were similar in BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic

asthmatics (Fig. 6B). Also, the levels of methylation were comparable between unstimulated BECs and IL-13-stimulated-BECs (Fig. 6C). Those results demonstrate that methylation levels near the STAT6 binding sites are not involved in the overexpression of CCL26 in BECs from severe eosinophilic asthmatics. Given that our results differ from Lim et al, those data also suggest that the regulation of CCL26 expression change among cell types and/or pathologies. We can not exclude that other sites of methylation in the CCL26 promoter might have different levels of methylation between BECs of our three groups of subjects. Other epigenetic mechanisms could also be involved in this phenomenon, such as histone acetylation. Indeed, Lim et al reported that IL-13 increases histone acetylation at the CCL26 promoter gene and that CREB-binding protein (CBP), a histone acetyltransferase, increases CCL26 promoter activity (284). Unlike methylation level, histone acetylation correlates with gene expression (282).

5.7 Conclusion

In conclusion, our study demonstrates that STAT6 activation, but not methylation, is involved in the enhanced CCL26 production by BECs from severe eosinophilic asthmatics. The weak decrease of SOCS3 observed in bronchial epithelium of severe eosinophilic asthmatics suggest that SOCS3 could be involved in the modulation of STAT6 activation in BECs. Given that CCL26 is associated with persistent pulmonary eosinophilia in severe asthma (420), these results support that modulating these molecules could have valuable utility for the treatment of severe asthma.

5.8 List of abbreviations

BECs: bronchial epithelial cells; IL: interleukin; STAT: signal transducer and activator of transcription, SOCS: suppressor of cytokine signaling, CBP: CREB-binding protein, 15-LO: 15-lipoxygenase, JAK: Janus Kinase

5.9 Acknowledgements

The authors thank Sophie Plante for BEC subculture, Serge Simard for performing statistical analyses and Sabrina Biardel from the Respiratory Health Network Tissue Bank for her

assistance with biopsies and immunohistochemistry. This work was supported by a grant to ML and NF from the J-D-Bégin Research Chair. MCL was supported by scholarships from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and the CIHR - Quebec Respiratory Health Training Program. ML, JC and NF are members of the inflammation group of the RSR.

5.10 Tables and figures

Table 1: Clinical characteristics of subjects who provided the primary BEC lines.

FEV1 SEX ATOPY SPUTUM Subjects AGE (% of (M/F) (yes/no) EOS (%) predicted) Healthy 30.6 100.4 5/4 0/9 NA controls ± 3.2 ± 4.4 Mild 21.5 91.4 2/7 9/0 NA asthmatics ± 1.4 ± 2.3 Severe 62.2 61.8 38.2 eosinophilic 3/2 4/1 ± 1.2 ± 4.7 ± 13.4 asthmatics Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, EOS: eosinophils

Table 2: Clinical characteristics of subjects who provided bronchial biopsies for SOCS1 and SOCS3 immunostainings.

FEV1 SEX ATOPY SPUTUM Subjects AGE (% of (M/F) (yes/no) EOS (%) predicted) Healthy 26.1 103.9 5/5 0/10 NA controls ± 3.3 ± 2.2 Mild 26.8 89 5/5 9/1 NA asthmatics ± 3.2 ± 3.6 Severe 56.6 66.4 26.6 eosinophilic 7/3 7/3 ± 2.8 ± 4.3 ± 7.8 asthmatics Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, EOS: eosinophil

FIGURE 1. STAT6 inhibition decreases dose-dependently CCL26 expression and production in BECs. BECs from healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics were isolated from bronchial biopsies. Cells were pre-incubated 1 hour with AS1517499 and, then treated with 30 ng/ml of IL-13 for 4 and 24 hours. CCL26 expression (A) and production (B) was evaluated by qPCR and ELISA, respectively, as described in Methods (**: p<0.001, ***: p<0.0001, AS1517499 vs. DMSO). Two-way ANOVA with a Tukey’s multiple comparisons test were performed to obtain p values

FIGURE 2. Greater STAT6 activation in BECs from severe eosinophilic asthmatics than mild asthmatics and healthy controls. BECs were treated with 30ng/ml of IL-13 for up to 24 hours. STAT6 and pSTAT6 was quantitated by ELISA as described in Methods (*: p<0.05, severe asthmatics vs. healthy controls and mild asthmatics **: p<0.001, severe asthmatics vs. healthy controls). Two-way ANOVA with a Tukey’s multiple comparisons test were performed to obtain p values.

FIGURE 3. Staining of SOCS1 and SOCS3 in bronchial epithelium of healthy controls, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics. Computed scores of SOCS1 (A) and SOCS3 (B) staining intensity in bronchial epithelium of asthmatics and healthy controls. Representative images (400X magnification) of SOCS1 and SOCS3 staining (red) of bronchial biopsies from healthy controls, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics (C).

FIGURE 4. Similar level of mRNA IL-13 receptors in BECs of healthy subjects and asthmatics. BECs were freshly harvested or treated with 30 ng/ml of IL-13 for 24 hours (n=3). IL-4Rα (A) and IL-13Rα1(B) mRNA were quantified by qPCR as described in Methods.

FIGURE 5. Involvement of STAT6 and IL-13 in CCL26 expression and production throughout time in BECs. BECs were treated 24 hours with 30 ng/ml of IL-13 and for some conditions the media was changed (B), or STAT6 inhibitor, AS1517499, was added (C) to the media at different time during the incubation time (Experimental schema in A). % of control is based on the value of CCL26 when BECs are treated only with IL-13 for 24 hours. CCL26 expression and production was evaluated by qPCR and ELISA, respectively, as described in Methods.

FIGURE 6. Similar methylation levels in CCL26 promoter gene between BECs of healthy subjects, mild asthmatics and severe eosinophilic asthmatics. BECs were treated with (B, C) 30 ng/ml of IL-13 or (C) vehicle for 24 hours. The methylation level of the selected CpG (A) was quantified by pyrosequencing, as described in Methods. P values were obtained by two-way ANOVA.

CHAPITRE VI

Mechanisms of human eosinophil migration induced by the combination of IL-5 and the endocannabinoid 2-arachidonoyl- glycerol

Marie-Chantal Larose, Caroline Turcotte, François Chouinard, Claudine Ferland, Cyril Martin, Véronique Provost, Michel Laviolette§, et Nicolas Flamand§.

Avant-Propos Vu l’importance de l’IL-5 dans le recrutement des éosinophiles et dans l’asthme, ce chapitre démontrera l’importance de l’IL-5 pour la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et expliquera les mécanismes impliqués dans ce phénomène. Dans cette lettre à l’éditeur, je suis co-première auteure avec Caroline Turcotte et nous avons participé à l'élaboration des protocoles de recherche, effectué les manipulations, analysé les données et interprété des résultats. François Chouinard, Claudine Ferland, Cyril Martin et Véronique Provost ont contribué en effectuant des manipulations, en analysant des données et en interprétant des résultats. Dr Michel Laviolette a participé à la l’interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit. Dr Nicolas Flamand a participé à la conception de l'étude, à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit.

L’article présenté dans ce chapitre a été publié dans le Journal of Allergy and Clinical Immunology en mai 2014 (Larose et al. J Allergy Clin Immunol. 2014 May;133(5):1480-2.)

6.1 Résumé Le recrutement des éosinophiles dans les maladies éosinophiliques est un processus mal défini. Par contre, l’implication des chimiokines et des médiateurs lipidiques est bien reconnue. Les médiateurs lipidiques 5-oxo-ETE (KETE), PAF et prostaglandine (PG) D2 ont été caractérisés comme étant des chimioattractants de l’éosinophile. De plus, PAF et 5-KETE sont impliqués dans le recrutement des éosinophiles chez les asthmatiques. D’autres médiateurs lipidiques sont moins bien caractérisés comme étant des chimioattractants de l’éosinophile tels que le 2-arachidonoyl-glycérol (AG). Pour cette raison, nous avons étudié le rôle du 2-AG dans la migration des éosinophiles et les mécanismes qui sont impliqués dans cette migration. Nos résultats démontrent que l’IL-3, IL-5 et GM-CSF augmentent fortement la migration des éosinophiles induite par le 2-AG. Cette augmentation est inhibée en présence d’un inhibiteur de Src-like kinase et est absente lorsque la migration est induite par le 5-

KETE ou la PGD2. En présence d’IL-5, la migration des éosinophiles induite par le 2-AG est similaire à celle de la CCL11 après 4 heures d’incubation, mais inférieure à celle induite par le 5-KETE. Étonnamment, cette migration est supérieure à celle d’autres agonistes du récepteur CB2 ou à l’acide arachidonique (AA), mais des antagonistes de CB2 inhibent significativement cette migration, suggérant qu’un autre mécanisme serait impliqué. Étant donné que la monoacylglycérol (MAG) lipase est une enzyme responsable de l’hydrolyse du 2-AG en AA et qu’elle est exprimée dans l’éosinophile, nous avons évalué son impact sur la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5. L’inhibition de la MAG lipase chez les éosinophiles diminue partiellement la migration induite par le 2-AG et l’IL-5, suggérant une implication de l’AA dans celle-ci. Une migration similaire des éosinophiles observée soit avec le 2-AG ou soit avec un agoniste de CB2 et de l’AA supporte notre hypothèse. Des inhibiteurs de 15-lipoxygénase (LO) diminuent également la migration des éosinophiles induite par le 2-AG. Ces résultats démontrent que l’IL-5 augmente fortement la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et que cette migration nécessite la participation de kinases LYN, de CB2, d’AA et de la 15-LO. L’implication de l’IL-5 dans cette migration supporte un rôle du 2-AG dans le recrutement des éosinophiles dans les maladies éosinophiliques telles que l’asthme.

6.2 Abstract Eosinophil recruitment to the tissues in eosinophilic diseases is a process not completely defined. On the other hand, chemokines and lipid mediators’ involvement is well recognized.

Lipid mediators 5-oxo-ETE (KETE), PAF and prostaglandin (PG) D2 are characterized as eosinophil chemoattractant. Additionally, PAF and 5-KETE are involved in eosinophil recruitment in asthma. Other lipid mediators are not well characterized as eosinophil chemoattractant, such as 2-arachidonoyl-glycerol (AG). In this respect, we evaluated the role of 2-AG in eosinophil migration and the mechanisms involved in this migration. Our results demonstrated that IL-3, IL-5 and GM-CSF robustly increase the 2-AG-induced eosinophil migration. This increase was inhibited by a Src-like kinase inhibitor and was absent when 5- KETE or PGD2 induced the migration. In presence of IL-5, 2-AG-induced eosinophil migration was similar to CCL11-induced migration after 4 hours of incubation, but was weaker than the migration induced by 5-KETE. Surprisingly, this migration was more efficient than those induced by other CB2 agonists or arachidonic acid (AA), but CB2 antagonists inhibited significantly this migration, suggesting that other mechanisms are involved. Given that monoacylglycerol (MAG) lipase, which hydrolyzes 2-AG into AA, is expressed in eosinophils, we evaluated its impact on IL-5-treated-eosinophil migration induced by 2-AG. MAG lipase inhibition decreased partially this migration, suggesting an involvement of AA. Similar level of migration induced by 2-AG or CB2 agonist with AA confirmed our hypothesis. 15-lipoxygenase (LO) inhibitors decreased also 2-AG-induced eosinophil migration. In conclusion, our results demonstrated that IL-5 increases substantially 2-AG-induced eosinophil migration and that this migration requires Lyn kinases, CB2, AA and 15-LO participation. The involvement of IL-5 in this migration supports a role of 2-AG in eosinophil recruitment in eosinophilic diseases such as asthma.

6.3 Introduction How eosinophils migrate to the tissues in eosinophilic diseases is not completely defined but is recognized to involve chemokines and/or bioactive lipids, noteworthy prostaglandin D2 and 5-oxo-eicosatetraenoate (5-KETE). In mice, eosinophils might play an important role in adipose tissue maintenance (432). The chemoattractants recruiting eosinophils to the latter are unknown, but IL-5 might be involved (432;433) The endocannabinoid 2-arachidonoyl- glycerol (2-AG), found in the adipose tissue, activates eosinophils (49); is recognized to activate the cannabinoid receptors CB1 and CB2; and can regulate leukocytes’ functions through its metabolites (48). Herein, we investigated the mechanisms of the 2-AG–induced migration of human eosinophils. Methods are provided in this article’s Online Repository at www.jacionline.org.

6.4 Materials and methods Materials 15(S)-hydroxyl-eicosatetraenoate (HETE), 1-AG, 2-AG, 2-AG ether, 5-KETE, AA, AEA,

CP 55,940, cysteinyl-leukotrienes enzyme immunoassay kit, EXC4, EXC4 EIA kit, His- tagged human MAG lipase, JZL-184, L-759,633, lipoxin A4, methyl-arachidonyl- fluorophosphonate, NDGA, PAF, PD 146176, PD 98059, and pyrrophenone were purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, Mich). AM-630, SR144528, indomethacin, PP2, and PP3 were purchased from Tocris Bioscience (Ellisville, Mo). A23187 and dimethyl sulfoxide were obtained from Sigma-Aldrich (St Louis, Mo). The magnetic bead–conjugated anti- CD16 mAbs for the magnetic cell sorting were purchased from Miltenyi Biotec (Auburn, Calif). HBSS, FBS, and RPMI 1640 were obtained from Wisent Laboratories (St-Bruno, Quebec, Canada). The ECL detection kit was purchased from GE Healthcare (Mississauga, Ontario, Canada). The 5-LO inhibitor L 739,010 and the 5-LO–activating protein antagonist MK-0591 were kindly provided by Dr Denis Riendeau from Merck Frosst (Kirkland, Quebec, Canada). All cytokines and chemokines were purchased from Peprotech (Dollard des Ormeaux, Quebec, Canada). 15(S)-HETE-glycerol (G) was synthesized by Cayman Chemical and represents a mixture of 15(S)-HETE-sn1-G (81.6%) and 15(S)-HETE-sn2-G (14.6%).

Volunteers and isolation of eosinophils The study was approved by the Ethic Committee of the Centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec. All volunteers signed an informed consent form for the study. Human eosinophils were purified from the venous blood of rhinitic volunteers as described earlier (48). The purity of the resulting eosinophil suspensions was always 98.5% or more and the viability was 98% or more, as assessed by Diff Quik staining and trypan blue exclusion, respectively.

Migration assay Migration assays were performed with 3 mm pore inserts (BD Bioscience, Mississauga, Ontario, Canada) as recommended by the manufacturer. In brief, 700 mL of prewarmed (37°C) RPMI containing 10% FBS, the agonist of interest, was put in the lower chambers. Then, 200 mL of prewarmed eosinophil suspensions (37°C, 2.5 X 106 cells/mL) in RPMI containing 10% FBS was added in the upper chamber of the migration apparatus. Eosinophils were allowed to migrate for 2 hours at 37°C unless stated otherwise (see Figures). The upper chambers were then removed, and migrated cells in the lower chambers were enumerated by using the Scepter 2 automated cell counter (EMD Millipore, Billerica, Mass). In experiments in which enzyme inhibitors or receptor antagonists were used, compounds were added to both the eosinophil suspensions and the lower chamber 5 minutes before the migration assay. Experiments were performed in the presence of 10 ng/mL of IL-5, which was added to eosinophils 10 minutes before the beginning of the migration assays (unless stated otherwise). Net migrations were calculated as follows: (stimulus-induced migrated cells – unstimulated cells)/total cells used in the assay. When a cytokine was present, net migration was calculated as follows: (cytokine-treated stimulus-induced migrated cells) – (cytokine- treated cells). The eosinophil migration observed in the presence of 10 ng/ml of IL-5 alone typically represented approximately 10% of all cells.

Cell stimulations and analyses of cysteinyl-leukotrienes and EXC4 biosynthesis Prewarmed (37°C), freshly isolated human eosinophil suspensions (106 cells/mL) in HBSS containing 1 mM of CaCl2 were stimulated with vehicle (dimethyl sulfoxide) 1-AG, 2-AG, AEA, AA, A23187 alone or in combination with 1 mM of PAF for 15 minutes. Incubations

were stopped by the addition of 1 volume of cold (48°C) incubation buffer, then rapidly centrifuged (48°C; 700g). Supernatants were harvested for the analysis of lipid mediator biosynthesis by ELISA according to the manufacturer’s instructions.

Statistical analyses Statistical analyses were done using mixed-effects ANOVA, followed by the Tukey a posteriori test and were considered significant when P values were <.05.

6.5 Results IL-3, IL-5, and GM-CSF but not IL-13 or IFN-g robustly increased the 2-AG–induced eosinophil migration from ~3% to ~40% (Fig 1, A). IL-3, IL-5, and GM-CSF receptors share a common βγ subunit that activates within seconds the Src-like lyn kinase (434). Consistent with this, the effect of IL-5 was dependent on concentration, immediate, and blocked by the Src-like inhibitor PP2 but not its negative control PP3 (see Fig E1, A-D, in this article’s Online Repository at www.jacionline.org). Importantly, IL-5 potentiated the effect of 2-AG but not those of 5-KETE and prostaglandin D2 (Fig 1, B). All the following migration experiments were performed in the presence of 10 ng/mL IL-5 because 2-AG alone did not induce significant eosinophil chemotaxis. 2-AG induced a migration rate comparable to that induced by CCL11 (eotaxin-1), higher than that induced by arachidonic acid (AA), but lower than that induced by 5-KETE in IL-5–treated eosinophils (Fig 1, C). In contrast, the CB1/CB2 receptor agonist CP 55,940 and the selective CB2 receptor agonist L-759,633 induced minimal eosinophil migrations; AA mimicked 2-AG only at 30 mM (Fig 1,D). When tested at a similar concentration, the 2-AG position isomer 1-AG was as potent as 2-AG whereas the effects of the endocannabinoid (and CB2 agonist) arachidonylethanolamide (AEA) and of 2-AG ether (nonhydrolyzable 2-AG) were minimal (Fig 1, E). Human eosinophils express the CB2 receptor (48;49) and both CB2 receptor antagonists tested in this study inhibited the effects of 2-AG but not those of 5-KETE (Fig 1, F). The contrasting effects of CB2 agonists and antagonists suggested that additional mechanisms, apart from CB2 receptor activation, were involved in the effects of 2-AG. Human eosinophils express the monoacyl-glycerol (MAG) lipase, which hydrolyzes 2-AG into AA (see Fig E2, A, in this article’s Online Repository at www.jacionline.org). Consistent with this, 2-AG and AA, alone or in

combination with platelet-activating factor (PAF), induced similar cysteinyl-leukotrienes and eoxin C4 (EXC4) biosynthesis (Fig 2, A and B). Concentration-response experiments in PAF- stimulated eosinophils unraveled an optimal 2-AG concentration of 1 mM (Fig E2, B). Noteworthy, the PAF-/2-AG-induced eicosanoid biosynthesis was blocked by the MAG lipase inhibitors methyl-arachidonoyl-fluorophosphonate and JZL-184 with IC50 values of ~3 and ~30 nM, respectively (Fig 2, C). Consequently, we assessed whether 2-AG hydrolysis inhibition affected eosinophil migration. MAG lipase inhibition partially blocked (~40%) the 2-AG–induced eosinophil migration (Fig 2, D) while having no effect on the 5-KETE– induced migration (Fig E2, C). The inability of other CB2 agonists to mimic 2-AG (Fig 1,

D), and the inhibitory effect of CB2 receptor antagonists (Fig 1, F) and JZL-184 (Fig 2, D), suggested that both CB2 receptor activation and AA were involved in the regulation of eosinophil migration by 2-AG. In this respect, the combination of the CB1/CB2 receptor agonist CP 55,940 and AA led to migration rates similar to those of 2-AG (Fig 2, E). We next assessed whether eicosanoids biosynthetic enzymes were involved in the effects of 2- AG. While 5-lipoxygenase or cyclooxygenase inhibitors did not affect eosinophil migration, the lipoxygenase inhibitor nordihydroguaiaretic acid (NDGA) and the 15-lipoxygenase inhibitor PD146176 significantly decreased the 2-AG– but not the 5-KETE–induced eosinophil migration (Fig 2, F, and Fig E2, D). Altogether these results indicate that the 15- lipoxygenase pathway is very likely involved in the regulation of eosinophil migration induced by 2-AG. However, we could not recapitulate the effect of 2-AG with 15(S)- hydroxyleicosatetraenoate, lipoxin A4, EXC4, or 15-(S)-hydroxyl-eicosatetraenoate-sn1- glycerol, alone or combined with CP 55,940 (not shown).

6.6 Discussion We provide herein evidence that (1) 2-AG alone induces minimal eosinophil chemotaxis; (2) the 2-AG–induced migration is blocked by CB2 receptor antagonists; (3) the 2-AG–induced eosinophil migration is enhanced by IL-5 in a Lyn-dependent manner; (4) 2-AG, but not AEA, is metabolized into eicosanoids by eosinophils; (5) the migration of eosinophils induced by 2-AG is sensitive to the MAG lipase inhibitor JZL-184; and (6) 15-lipoxygenase inhibitors block the effect of 2-AG on eosinophil migration. Noteworthy, the 2-AG–induced migration of eosinophils occurred at 2-AG concentrations that can be found in vivo (48). 2-

AG was shown to induce a modest (~10%) and CB2-dependent eosinophil migration in the presence of NDGA and in the absence of cytokine (49). Our data demonstrate that 2-AG alone induces minimal chemotaxis (~3%; Fig 1, A) but underscore that the 2-AG–induced eosinophil migration is complex and involves many mechanisms, notably cytokines, 2-AG hydrolysis, and 15-lipoxygenase metabolites. The inefficacy of natural (AEA) and synthetic

CB2 receptor agonists to mimic the effect of 2-AG indicates that the CB2 receptor is required but not sufficient for the 2-AG–induced migration of eosinophils. Given the involvement of

MAG lipase and 15-lipoxygenase in the 2-AG–induced migration, it is possible that CB2 engagement on eosinophils activates these enzymes by yet to be documented mechanisms. IL-3, IL-5, and GM-CSF profoundly enhanced the 2-AG–induced eosinophil migration, and this was unique among the tested lipids (Fig 1, A and B). The Lyn inhibitor PP2 inhibited the effect of IL-5, which is in line with its rapid phosphorylation/activation in IL-5–treated eosinophils (435). Feltenmark et al (436) showed that IL-5 was the best stimulus for EXC4 biosynthesis during short incubation periods, indicating that IL-5 quickly regulates 15- lipoxygenase. Given that the 15-lipoxygenase inhibitors NDGA and PD146176 decreased the 2-AG–induced migration, it is possible that Lyn directly/indirectly regulates 15- lipoxygenase activity by phosphorylation. Forsell et al (437) and Brunnstrom et al (438) recently documented the production of novel 2-AG–derived 15-lipoxygenase metabolites. Thus, the 15-lipoxygenase–derived lipidome of human eosinophils is likely more complex than initially thought. The use of a mixture of 2-AG– and AA-derived 15-lipoxygenase metabolites from eosinophils might have been a better strategy to recapitulate the effect of 2-AG on the migration of eosinophils than testing individual 15-lipoxygenase metabolites. In this regard, we are planning to analyze the 2-AG– and AA-derived lipidomes of eosinophils linked to 15-lipoxygenase and perform migration assays using this lipidome. Finally, we cannot exclude that the inhibitors we used in this study might inhibit off targets.

6.7 Conclusion In conclusion, this study confirms that the endocannabinoid 2-AG, in combination with IL- 5, has the ability to activate and modulate eosinophil functional responses and, consequently, to play a significant role in the regulation of inflammatory processes such as asthma and possibly obesity.

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6.8 List of abbreviations 5-KETE: 5-oxo-eicosatetraenoate; 2-AG: 2-arachidonoyl-glycerol; 15-HETE: 15(S)- hydroxyl-eicosatetraenoate; AEA: arachidonylethanolamide; EX: eoxin; PAF: platelet- activating factor; IL: interleukine; AA: arachidonic acid; MAG: monoacyl-glycerol; MAFP: methyl-arachidonoyl-fluorophosphonate; NDGA: nordihydroguaiaretic acid; INF: interferon; DMSO: Dimethyl sulfoxide

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6.9 Tables and figures

FIGURE 1. Impact of IL-5 and the CB2 receptor on the 2-AG–induced eosinophil migration. A-F, IL-5 (or cytokine)-treated eosinophils migrated for 2 hours unless stated otherwise. Eosinophils were treated or not with IL-5 and then lipid-induced migration was performed (Fig 1, B). Migration of IL-5–treated eosinophils was performed during the indicated times (Fig 1, C). Migration of IL-5–treated eosinophils in response to different agonists (Fig 1, D and E). IL-5–treated eosinophils were incubated for 10 minutes with SR144528 or AM630 and then lipid-induced migration was performed (Fig 1, F).

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FIGURE 2. Metabolism of 2-AG by eosinophils and its role during migration. A and B, Eosinophils were stimulated with 1 mM of 2-AG, AA, or AEA, alone or in combination with PAF. C, Eosinophils were stimulated for 15 minutes with 1 mM of PAF and 2-AG in the presence or absence of the indicated inhibitors. D and F, Migration of IL-5–treated eosinophils in response to 3 mM 2-AG in the presence of different inhibitors. E, Migration of IL-5–treated eosinophils in response to the indicated agonists. *P < .001. DMSO, Dimethyl sulfoxide.

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FIGURE E1. Impact of IL-5 and its signaling on the 2-AG–induced eosinophil migration. A, Eosinophils were treated for 10 minutes with IL-5 and then migration was performed for 2 hours. B, Eosinophils were treated with IL-5 for the indicated times and then migration was induced by 2-AG for 2 hours. C, Eosinophils were treated for 10 minutes with IL-5 (10 ng/mL) and then migration was induced with 2-AG or 5-KETE for 2 hours. PP2 or PP3 was added 10 minutes before the migration. D, Chemical structures of PP2 and PP3. *P < .0001.

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FIG E2. Involvement of metabolism for the 2-AG–mediated eosinophil migration. A, Immunoblot of MAG lipase with cell lysates from neutrophils, Jurkat T cells, eosinophils, or human recombinant His-tagged MAG lipase. B, PAF-stimulated eosinophils were incubated in the presence of the indicated concentration of 2-AG for 15 minutes. Cysteinyl-leukotriene biosynthesis was then assessed as described in Methods. C, Migration of IL-5–treated eosinophils in response to 1 mM of 5-KETE in the presence of the group IVA phospholipase A2 pyrrophenone or the MAG lipase inhibitor JZL-184. D, Migration of IL-5–treated eosinophils in response to 1 mM of 5-KETE in the presence of compounds that inhibit the 15-lipoxygenase.

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CHAPITRE VII

Sputum but not blood periostin levels correlate with sputum eosinophil counts in asthma.

Marie-Chantal Larose, Anne-Sophie Archambault, Véronique Provost, Julie S Lefebvre, Jamila Chakir, Louis-Philippe Boulet, Michel Laviolette, et Nicolas Flamand.

Du centre de recherche de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, QC G1V 4G5, Canada.

Avant-propos Nous avons étudié le rôle de la périostine dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme, puisque la périostine est associé à l’asthme et augmente l’adhésion des éosinophiles. Ce chapitre évaluera si la périostine est associée à l’asthme et sa sévérité, et si elle est un bon biomarqueur de l’éosinophilie pulmonaire. Je suis la première auteure dans cet article. J'ai participé à la conception de l’étude, à l'élaboration des protocoles de recherche, effectué les manipulations, analysé les données, interprété les résultats et participé à la rédaction du manuscrit. Anne-Sophie Archambault a contribué en effectuant des manipulations, en analysant des données et en interprétant des résultats. Véronique Provost et Dr Louis-Philippe Boulet ont participé à l’interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit. Julie Lefebvre et Dr Jamila Chakir ont participé à la conception de l’étude. Dr Nicolas Flamand et Dr Michel Laviolette ont participé à la conception de l'étude, à l'interprétation des résultats et à la rédaction du manuscrit.

L’article présenté dans ce chapitre a été soumis au European Respiratory Journal.

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7.1 Résumé OBJECTIFS : Les biomarqueurs disponibles afin d’identifier les phénotypes et la sévérité de l’asthme sont peu nombreux et peu efficaces. Étant donné que le rôle de la périostine comme biomarqueur systémique dans l’asthme est controversé, nous avons évalué, dans le sang et les expectorations induites, si les niveaux de périostine corrèlent avec le nombre d’éosinophiles et s’il existe une association avec l’asthme et sa sévérité. MÉTHODES : Les expectorations induites et les plasmas ont été obtenus de sujets sains et asthmatiques (légers, modérés, sévères non éosinophiliques et sévères éosinophiliques). Les cellules épithéliales bronchiques (CÉB) ont été isolées de biopsies bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. La périostine et la CCL26 ont été quantifiées par ELISA. RÉSULTATS : Dans les expectorations induites, les niveaux de périostine, de CCL26 et le nombre d’éosinophiles corrèlent. De plus, en présence d’IL-13, les CÉB de sujets asthmatiques sévères éosinophiliques sécrètent davantage de périostine que ceux de sujets sains et d’asthmatiques légers. Par contre, les niveaux de périostine dans les plasmas sont similaires entre les sujets sains et asthmatiques, et ces niveaux corrèlent faiblement avec le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites. Dans l’asthme sévère éosinophilique, cette corrélation a été significative. Le nombre d’éosinophiles dans le sang ne corrèle pas avec les niveaux de périostine dans le sang, mais corrèle légèrement avec le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites. CONCLUSIONS : Nos résultats démontrent que, même si les niveaux de périostine et le nombre d’éosinophiles corrèlent dans la lumière bronchique, les niveaux de périostine dans le sang ne pourraient pas prédire la présence d’inflammation éosinophilique bronchique ni la sévérité de l’asthme.

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7.2 Abstract OBJECTIVE: Since the role of periostin to identify eosinophilic asthma is still debated, we evaluated whether blood and sputum periostin levels link to sputum eosinophil counts. METHODS AND MEASUREMENTS: Blood and induced sputum samples were obtained from healthy and asthmatic (mild, moderate, severe non-eosinophilic, severe eosinophilic) subjects, and blood samples from atopic dermatitis subjects. Human bronchial epithelial cells (BECs) obtained from healthy subjects and mild or severe eosinophilic asthmatics were treated with IL-13. Periostin and CCL26 levels were quantitated by ELISA. MAIN RESULTS: In sputum, eosinophil counts, CCL26 and periostin levels significantly correlated. Plasma periostin levels were similar in healthy and asthmatic subjects. In asthmatics, they correlated with sputum eosinophil counts in severe eosinophilic asthma, but weakly in the whole group. Of note, BECs of severe eosinophilic asthmatics released greater amounts of periostin than those of mild asthmatics and healthy subjects. Blood eosinophil counts did not correlate with plasma periostin levels and showed a slightly better correlation with sputum eosinophil counts. CONCLUSIONS: Except for severe eosinophilic asthma, plasma periostin levels weakly correlated with sputum eosinophil counts and could not predict the degree of bronchial eosinophilic inflammation. Both sputum periostin and CCL26 levels showed better correlation with sputum eosinophil counts.

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7.3 Introduction Asthma severity, symptoms and exacerbations are frequently associated with airway eosinophilia (24-27). Induced sputum eosinophil counts have been used to adjust corticosteroid doses and to document persisting lung eosinophilia in symptomatic asthmatics on inhaled corticosteroids (16). Since sputum collecting techniques and analyses are laborious and available to a limited number of health care facilities, there is the need to find easily measurable biomarkers that could repetitively document asthma phenotypes and severities.

Serum periostin levels have been shown to correlate with the clinical response to lebrikizumab (301). Accordingly, several groups have investigated the putative involvement of serum periostin as a blood biomarker for asthma severity or for the presence of airway eosinophilic inflammation. However, no general consensus has been achieved yet. While some studies reported that serum periostin levels were increased in asthmatics (439-441), other studies reported similar serum periostin levels in asthmatics and healthy controls (300;442-444). The severity of asthma and its treatment varied from a study to the other (Table 1), likely explaining part of the observed discrepancies. Some studies showed that blood periostin levels correlate to some extent with sputum eosinophil counts (299;441;442;445), suggesting that this parameter could be used as a biomarker of eosinophilic asthma. Consequently, we investigated if sputum periostin levels link to sputum eosinophil counts and if blood periostin levels correlate with asthma severity and⁄or sputum eosinophils counts using blood, sputum and bronchial samples of healthy controls and subjects with asthma of various severities.

7.4 Materials and methods Reagents. Human recombinant IL-13 was purchased from Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ, USA) and DMEM/F12 medium and foetal bovine serum (FBS) from Wisent Inc. (St-Bruno, QC, Canada). Human periostin DuoSet ELISA kit and human CCL26 DuoSet ELISA kit from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) were used to measure these proteins in the samples described below.

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Clinical criteria for subjects’ selection. Healthy volunteers had no history of allergy, asthma, or any other inflammatory disease, and had a PC20 value > 16 mg/ml. Subjects with atopic dermatitis had a history of eczema or/and hives; they had medical history, allergy skin prick tests, physical examination, blood sampling and a normal methacholine provocative test for the IUCPQ tissue bank. Asthmatic subjects were evaluated at the IUCPQ Asthma Clinic; they had a history of asthma for at least 6 months and were classified using the ATS criteria

(423). Mild asthmatics only used β2 agonists on demand as therapy and had a normal FEV1. Moderate asthmatics were taking a low to moderate dose of inhaled corticosteroids (≤ 500 µg of fluticasone propionate or the equivalent). Severe eosinophilic asthmatics required a high dose of inhaled corticosteroids ( 1000 µg of fluticasone propionate or the equivalent in association with a long-acting β2 agonist) and demonstrated a high (> 5%, severe uncontrolled eosinophilic) or a low (≤ 3%, severe controlled non-eosinophilic) induced sputum eosinophil count, with a sputum neutrophil count  64%. Approval from the local ethics committee was obtained for this study and all volunteers signed an informed consent form. Measurement of blood biomarkers. Unless otherwise indicated, platelet-depleted plasma samples obtained from heparin-containing blood collection tubes were kept at -80°C until periostin quantitation by ELISA. Blood eosinophil counts and serum IgE levels were measured using standard assays in the clinical laboratories of our institution.

Human primary BEC lines culture and stimulation. Bronchial epithelial cells (BECs) were isolated from healthy subjects, mild or severe eosinophilic uncontrolled asthmatics as described earlier (424-426). Briefly, BECs were cultured in DMEM-F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. When cells reached 80% of confluence, they were stimulated with vehicle or 30 ng/ml of IL-13 in DMEM-F12 medium supplemented with 1% fetal bovine serum and incubated for up to 24 hours. Incubations were stopped by harvesting the culture media, which were immediately spun to remove cell debris. The resulting supernatants were kept at -80°C until periostin and CCL26 quantitation by ELISA.

Processing of induced sputum. Induced sputum samples were obtained as previously described (399;400). Briefly, mucus plugs were isolated from saliva and placed in a volume

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(in ml) of dithiothreitol representing four times the mucus weight (in g), and an equal volume of Dulbecco’s phosphate buffered saline. The resulting supernatants were collected using a 0.45 µm nylon filter for protein quantitation. Cell pellets were assessed for cell viability and differential counts using trypan blue exclusion and Diff-Quik staining, respectively. In order to limit protein processing by proteases such as mast cell tryptase, aprotinin (10 µg/ml) (from Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canada) was added to all samples. The resulting supernatants were kept at -80°C until periostin and CCL26 quantitation by ELISA.

Statistical analyses. Data are expressed as mean  SEM and were analysed using one-way or two-way ANOVA, with a blocking factor according to the protocols, or Student’s t-test. The normality assumption was verified with the Shapiro-Wilk tests after a Cholesky factorization. The Brown and Forsythe's variation of Levene's test statistic was used to verify the homogeneity of variances. Relationships between variables were expressed using the Pearson correlation coefficient. The receiver operating characteristic (ROC) curves analysis were based on >3% of sputum eosinophils for eosinophilic asthma. The results were considered significant with p-values  0.05. Analyses were performed using the statistical packages SAS, v9.4 and R, v3.0 (SAS Institute).

7.5 Results IL-13 induced the release of periostin by BECs and this was more marked in severe eosinophilic asthma. We previously showed that IL-13 stimulate the BEC release of the eosinophil chemoattractant CCL26 and that this release is greater in BECs of severe eosinophilic asthmatics than cells of healthy subjects or mild asthmatics (425). We thus tested if IL-13 have the same impact on periostin release. The clinical characteristics of the subjects from whom BECs were isolated are presented in Table 2. IL-13 stimulated a time-dependent production of periostin by BECs over 24 hours (Fig. 1A). The periostin release was greater in BECs of severe eosinophilic asthmatics than those of healthy subjects (p = 0.0015) and mild asthmatics (p = 0.018), similarly to what we previously observed for CCL26 (425). Of note, there was a significant correlation between CCL26 and periostin production by IL-13- stimulated BECs (R2 = 0.67, p < 0.0001) (Fig. 1B).

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Periostin levels and eosinophil counts correlate in sputum samples of healthy and asthmatic subjects. We next assessed periostin levels and eosinophil counts in sputum samples from healthy and asthmatic subjects. Clinical characteristics of these subjects are presented in Table 3. Sputum periostin levels correlated with sputum eosinophil counts (R2 = 0.47, p < 0.0001) and sputum CCL26 levels (R2 = 0.35, p = 0.0002) (Fig. 2A,B). We also confirmed the correlation we previously documented (425) between CCL26 levels and eosinophil counts (R2 = 0.49, p < 0.0001) in the sputum samples this present study (Fig. 2C).

Blood periostin levels do not differ between healthy and asthmatic subjects. We then evaluated if blood periostin levels increase with asthma severity. We first tested if the blood collected in tubes without (serum) or with anticoagulants (plasma) would yield similar periostin levels and found that serum periostin levels were similar to plasma periostin levels, regardless of the used anticoagulant-treated tube (Fig. 3A). Moreover, we quantitated comparable amounts of periostin in serum and plasma samples when recombinant periostin was added to samples before the assay, further validating the accuracy of the detection assay (Fig. 3A). For the remaining experiments, blood samples were obtained using heparin-treated tubes. We next measured plasma periostin levels of healthy subjects and subjects with mild, moderate, severe controlled non-eosinophilic or severe uncontrolled eosinophilic asthma. Clinical characteristics of these subjects are presented in Table 4. Although there was a trend for lower plasma periostin levels in moderate and severe asthmatics, this did not reach statistical significance (Fig. 3B). When we compared healthy subjects with all asthmatics (n=61), we also found no statistically significant difference, even if plasma periostin levels tended to be lower in the asthmatic group (Fig. 3C). However, subjects without corticosteroids treatment (healthy subjects and mild asthmatics) had greater levels of plasma periostin than subjects with corticosteroids treatment (moderate and severe asthmatics) (p = 0.0052), indicating that corticosteroid use was possibly decreasing blood periostin levels (Fig. 3D). Given that some earlier studies documented increased plasma periostin levels in asthmatics (Table 1) and that we observed not such trend, we also evaluated blood periostin levels in patients suffering from atopic dermatitis (n=15), a condition associated with

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elevated blood periostin levels (446). These subjects had greater blood periostin levels than those of healthy subjects (Fig. 3E; p = 0.0001).

Plasma periostin levels correlate with sputum eosinophil counts in subjects with severe eosinophilic asthma. We finally verified if there is a correlation between plasma periostin levels and sputum eosinophil counts in subjects of Table 4 and found that they very slightly correlate when mild, moderate and severe asthmatics were analyzed together (Fig. 4A; R2 = 0.12, p = 0.023). A stronger correlation was found when the analysis was limited to severe eosinophilic asthmatics (Fig. 4B; R2 = 0.56, p = 0.0021). Blood eosinophils correlated better than plasma periostin levels with sputum eosinophil counts when all asthmatics were included (Fig. 4C; R2 = 0.34, p = 0.0001). By generating ROC curves, we evaluated the efficacy of plasma periostin levels and blood eosinophil counts to predict the presence of > 3% eosinophils in induced sputum. For plasma periostin levels, the values obtained were 0.479 for the area under the curve (AUC), 19.3 for the cut off value with the best sensitivity and sensibility, 65.2% for the sensitivity and 40.0% for the specificity (Fig. 4D). For blood eosinophil counts, the values obtained were 0.682 for the AUC, 0.137 for the cut off value, 85.7% for the sensitivity and 50.0% for the specificity. Additionally, plasma periostin levels did not correlate with serum IgE (R2 = 0.037, p = 0.11) nor blood eosinophil counts (R2 = 0.037, p = 0.083) when healthy subjects, and subjects with mild, moderate, and severe asthma were combined (Fig. E1).

7.6 Discussion This study shows that sputum periostin levels significantly correlated with sputum eosinophil counts (Fig. 2A) whereas plasma periostin levels were similar in asthmatic and healthy controls no matter the asthma severity (Fig. 3B,C) and weakly correlated with sputum eosinophil counts (Fig. 4A). Interestingly, plasma periostin levels correlated more significantly with sputum eosinophil counts in subjects with severe eosinophilic asthma. Given that these subjects have persistent high sputum eosinophil counts despite high doses of inhaled corticosteroids (Fig. 4B) and an increased release of periostin and CCL26 by IL- 13-activated BECs (Fig. 1A), these results suggest that plasma periostin levels partially

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depend on its release in the bronchial mucosa. The higher levels of plasma periostin observed in subjects without inhaled corticosteroids treatment (healthy subjects and mild asthmatics) compared to subjects with inhaled corticosteroids treatment (moderate and severe asthmatics) (Fig. 3D) further support the hypothesis that plasma periostin levels depend in part on its bronchial release. Those results indicate that plasma periostin levels is not a good biomarker to predict the degree of bronchial eosinophilic inflammation, except in subjects known to present severe asthma with persisting airway eosinophilia.

To our knowledge, this is the first study that evaluated periostin release by primary BECs from healthy subjects, subjects with mild asthma and subjects with severe eosinophilic asthma (Fig. 1). Only mRNA expression of periostin was previously evaluated in epithelial brushings from healthy and asthmatic subjects (447). In agreement with our results, Woodruff et al (447) demonstrated that mRNA periostin expression is greater in epithelial brushings from subjects with asthma than those from healthy subjects, and that IL-13 increases this expression. IL-13 is a key cytokine to induce BECs periostin (448) and CCL26, a selective chemoattractant of eosinophils, releases (167;425). Additionally, IL-13 levels are increased in bronchoalveolar lavage fluids, bronchial biopsies and sputum of asthmatics, notably severe asthmatics (227;449;450). In this regard, the treatment with lebrikizumab, a monoclonal antibody specifically binding IL-13, improves lung function and reduces asthma exacerbations in patients with uncontrolled asthma characterized by high level of TH2 responses (301;302) and subjects with high pre-treatment level of serum periostin had a better improvement than subjects with low pre-treatment level of serum periostin (301). Those data suggest that high levels of blood periostin are associated with the increased IL-13-induced BECs release of periostin observed in severe eosinophilic asthma. Moreover, IL-13 is also able to induce periostin release in lung fibroblasts and human microvascular endothelial cells, illustrating the importance of IL-13 in periostin production (451). Our results, combined with those from these above studies, confirm that IL-13 and periostin are closely related in asthma, and that BECs have a significant role in this relation because of their capacity to produce high levels of periostin in presence of IL-13, especially cells of severe eosinophilic asthmatics. Given that periostin seems to be associated with airway remodelling, tissue

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regeneration and airway hyperresponsiveness, the marked production of periostin by BECs suggest that it might be involved in the development of asthma and its severity.

The correlation between sputum periostin levels and sputum eosinophil counts (Fig. 2A) further supports the involvement of periostin in eosinophilic asthma. This is in agreement with Bobolea et al (298) and Simpson et al (299) who showed that sputum periostin levels were higher in subjects with severe eosinophilic asthma compared to subjects with severe non-eosinophilic asthma. Altogether, those studies may support the involvement of periostin in eosinophil migration toward the lungs observed in asthma. Periostin is an extracellular matrix protein that can bind several integrins, such as αVβ1 and αVβ3 (210). Periostin can bind the integrin αMβ2 on eosinophils increasing their adhesion (452). Blanchard et al (453) also demonstrated that periostin increased eosinophil adhesion and, interestingly, bronchoalveolar lavage fluids of periostin-null mice showed a significant decrease of eosinophil number. Periostin and CCL26 increase concomitantly with asthma severity (420) suggesting that they cooperate to increase the recruitment of eosinophils by promoting eosinophil adhesion and migration respectively. Further experiments should be conducted to better characterize the impact of periostin on human eosinophil cellular functions, such as transmigration, activation and degranulation.

The absence of difference of periostin plasma levels between asthmatic and healthy subjects (Fig. 3B,C) and the poor correlation between plasma periostin levels and sputum eosinophil counts (Fig. 4A) suggest that blood periostin does not clearly discriminate asthmatics from healthy subjects, nor asthma of different severities as previously observed (300;442-444). Our results also demonstrate that blood eosinophil counts could be a better predictor of eosinophilic airway inflammation compared to blood periostin (Fig. 4D,E) as previously reported by Simpson et al (299). Interestingly, plasma periostin levels correlated to sputum eosinophil counts of severe eosinophilic asthmatics (Fig. 4B), as documented by others (299;441;445), supporting blood periostin level as a biomarker for airway eosinophilia in that specific group. On the other hand, other studies reported that asthmatics have higher serum periostin levels than healthy subjects (439-441), or found no correlation between serum periostin levels and sputum eosinophil counts (454;455). Given the discrepancies with those

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studies, we evaluated plasma periostin levels in subjects with atopic dermatitis, a condition recognized for its increased blood periostin levels (446), in order to evaluate the validity of our periostin measures. As previously reported, we found increased plasma periostin levels in subjects with atopic dermatitis compared to healthy subjects, supporting the validity of our results (Fig. 3E). Finally, the groups of subjects included in our study present a wide age difference between phenotypes (Table 4). To confirm that this is not interfering with our results, we evaluated whether there was a correlation between plasma periostin levels and age of asthmatics, and found no such correlation (Fig. E2, r2 = 0.009, p = 0.39). Caswell- Smith et al (456) data support our results by demonstrating no association between serum periostin and age or sex in 480 patients.

The reported blood periostin levels vary between studies. In this regard, the severity and phenotype of asthmatic groups differs between articles (Table 1) and our data suggest a possible impact of corticosteroids intake resulting in lower blood periostin levels (Fig. 3D), in agreement with Hoshino et al (441). Secondly, we performed our analysis with the periostin ELISA kit from R&D Systems, which used the canonical sequence of periostin to generate their antibody (Asn22-Gln836). This test was also employed by others (441), but we did not obtain similar results. For example, Hoshino et al (441) found higher serum periostin levels in healthy subjects than corticosteroid-naive asthmatics. Of note, Wagener et al (454) compared two ELISA kits, the periostin ELISA kit from R&D Systems and the Elecsys Periostin ELISA kit from Roche Diagnostics, and found similar results with each other. Those data suggest that blood periostin level differences or similarities observed between different groups of subjects are more dependent on subject inflammatory phenotype or treatment than on the ELISA kit used.

Unlike previous studies, we used plasma instead of serum samples. In order to compare our results with results from published studies, we quantified periostin levels in different blood collecting tubes (Fig. 3A). Our results demonstrated that periostin levels are similar in serum samples and plasma samples regardless of the anti-coagulant used. Additionally, we added known amount of recombinant periostin to our serum and plasma samples to ensure the

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validity and the accuracy of our method. However, in sputum samples, we cannot exclude a possible matrix effect of sputum when quantifying periostin.

7.7 Conclusion In conclusion, plasma periostin levels were similar in healthy subjects and asthmatic subjects regardless of asthma severity and showed a weak correlation with sputum eosinophil counts, suggesting they are not a valuable biomarker to predict asthma severity or the degree of bronchial eosinophilic inflammation and, therefore, have a limited clinical value. One exception might be severe eosinophilic asthma, in which we confirmed a significant correlation between plasma periostin levels and sputum eosinophil counts and that then could be used to monitor the anti-inflammatory treatment.

7.8 List of Abbreviations BECs: Bronchial epithelial cells; IL: Interleukin; AUC: area under the curve

7.9 Acknowledgements The authors thank Sophie Plante for BECs subculture, Serge Simard for performing statistical analyses, Mylène Bertrand for the processing of induced sputum samples, and Sabrina Biardel from the Respiratory Health Network Tissue Bank for her assistance with plasma and sputum samples. This work was supported by a grant to ML and NF from the J-D-Bégin Research Chair. MCL was supported by scholarships from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and the CIHR - Quebec Respiratory Health Training Program. ML, JC and NF are members of the inflammation regroupment of the RSR.

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7.10 Tables and figures

Table 1: Reports of blood periostin levels in asthma.

Authors Studied groups Blood periostin levels Reference

Corren et al. UA 6

Jia et al. SE, SnE SE > SnE 7

Kanemitsu et al. H, MO to S MO to S > H 8

Matsusaka et al. H, MI to MO, MO to S MO to S MI to MO > H 9

Hoshino et al. H, MI MI > H 10

H  A Thomson et al. H, MI, MO, S 11 MI MO  S

Johansson et al. H, MI to MO, S H  MI to MO  S 12

Han et al. H, A, COPD H A  COPD 13

Gorska et al. H, MI to MO, COPD H  MI to MO  COPD 14

Simpson et al. MO to SE, MO to SnE MO to SE > MO to SnE 15

H: healthy control, A: asthma, MI: mild asthma, MO: moderate asthma, S: severe asthma, SE: severe eosinophilic asthma, SnE: severe non-eosinophilic asthma, UA: uncontrolled asthma, COPD: chronic obstructive pulmonary disease

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Table 2: Clinical characteristics of subjects who provided the primary BEC lines.

FEV1 Sex Atopy Sputum EOS Subjects Age (% of (M/F) (yes/no) (%) predicted) Healthy 25.2 101.6 2/3 0/5 NA controls ± 1.6 ± 5.7 Mild 23.6 98.7 1/6 7/0 NA asthmatics ± 1.5 ± 6.2 Severe 63.2 59.2 36.5 eosinophilic 4/2 4/1 ± 1.4 ± 4.7 ± 11.1 asthmatics Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, EOS: eosinophil

Table 3: Clinical characteristics of subjects who provided induced sputum.

FEV1 FVC Sex Atopy Sputum Subjects Age (% of (% of (M/F) (yes/no) EOS (%) predicted) predicted) Healthy 33.0 89.7 85.0 2.4 1/2 2/0 controls ± 8.3 ± 11.9 ± 11.3 ± 2.0 Moderate 60.2 79.7 92.9 54.0 8/2 8/2 asthmatics ± 3.5 ± 5.7 ± 5.8 ± 8.3 Severe non 51.2 71.8 86.1 1.39 eosinophilic 4/5 6/2 ± 4.5 ± 6.1 ± 5.7 ± 0.5 asthmatics Severe 63.3 65.3 83.1 24.1 eosinophilic 6/6 7/4 ± 2.6 ± 5.7 ± 5.6 ± 5.4 asthmatics Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, FVC: forced vital capacity, EOS: eosinophil

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Table 4: Clinical characteristics of subjects who provided plasma samples.

FEV1 FVC Sputum Blood Blood Sex Atopy Subjects Age (% of (% of EOS* EOS IgE (M/F) (yes/no) predicted) predicted) (%) (x109/L) (IU/ml) Healthy 31.1 101.9 108.4 0.09 10.6 9/11 0/20 NA controls ± 3.3 ± 3.0 ± 3.9 ± 0.01 ± 1.2 Atopic 33.2 105.1 109.3 0.15 104.5 4/10 0/14 NA dermatitis ± 3.4 ± 3.6 ± 3.9 ± 0.03 ± 56.1 Mild 31.6 97.8 110.2 5.6 0.25 380.7 8/13 19/1 asthmatics ± 2.4 ± 2.7 ± 3.6 ± 2.1 ± 0.03 ± 133.2 Moderate 45.4 84.8 100.8 6.7 0.32 179.3 9/11 18/2 asthmatics ± 2.5 ± 3.6 ± 3.6 ± 4.5 ± 0.06 ± 46.4 Severe non 53.3 65.8 82.0 0.6 0.17 193.2 eosinophilic 11/9 14/6 ± 2.6 ± 5.6 ± 5.0 ± 0.2 ± 0.04 ± 100.4 asthmatics Severe 52.6 65.4 85.1 31.7 0.46 730.3 eosinophilic 10/10 15/5 ± 3.4 ± 4.3 ± 4.5 ± 6.7 ± 0.07 ± 220.8 asthmatics Mean ± SEM, NA: not available, M: male, F: female, FEV1: forced expiratory volume in 1 second, FVC: forced vital capacity, EOS: eosinophil, IgE: immunoglobulin E, IU: international Units, *Sputum samples were obtained for 7 to 15 subjects in each asthmatic group.

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FIGURE 1. Periostin production by BECs of severe eosinophilic asthmatics, mild asthmatics and healthy subjects. Periostin (A) and CCL26 (B) were quantitated by ELISA in the supernatants of BECs from healthy controls and asthmatics that were treated with IL- 13 (30 ng/ml) for the indicated times. A Pearson correlation test was performed and P values were obtained by two-way ANOVA/Tukey multiple comparisons test.

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FIGURE 2. Correlation of sputum periostin levels with sputum eosinophil counts and sputum CCL26 levels. Periostin and CCL26 were quantitated by ELISA in induced sputum from healthy controls and asthmatics as described in the Methods section. A Pearson correlation test was performed (n=34).

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FIGURE 3. Blood periostin healthy controls, asthmatics and atopic dermatitis subjects. Periostin levels were quantitated by ELISA in blood samples of healthy controls (B-E), subjects with asthma (A, n=3; B-D; legend in B) and subjects with atopic dermatitis (E). P values were obtained by one-way ANOVA or Student’s t-test.

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FIGURE 4. Correlation between plasma periostin levels and blood eosinophil counts with sputum eosinophil counts. Correlation between sputum eosinophil counts and plasma periostin levels (A, all subjects n=43 and B, severe eosinophilic asthmatics) or blood eosinophil counts (C; n=37) from subjects with asthma were analysed by Pearson correlation tests. ROC curves (D) were performed to predict eosinophilic asthma (> 3% of sputum eosinophils).

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FIGURE E1. Correlation between plasma periostin levels with blood eosinophils and IgE levels. Periostin levels were quantitated by ELISA in plasma samples of healthy controls and subjects with asthma. Correlation between plasma periostin levels and blood eosinophil (n=82) or IgE level (n=68) was perform by Pearson correlation tests.

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FIGURE E2. Correlation between plasma periostin levels and the age of asthmatics. Periostin levels were quantitated by ELISA in plasma samples of subjects with asthma. A Pearson correlation test was performed (n=82).

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Chapitre VIII : Perspectives et conclusions

L’éosinophilie bronchique corrèle avec les symptômes et la sévérité de l’asthme. Généralement, l’utilisation des corticostéroïdes chez les asthmatiques permet généralement de diminuer cette éosinophilie. Cependant, certains asthmatiques sévères ont une éosinophilie persistante malgré la prise de forte dose de corticostéroïdes et les mécanismes responsables de cette éosinophilie restent encore à définir. Mon projet de doctorat avait pour but de comprendre les mécanismes impliqués dans cette éosinophilie persistante et d’identifier de possibles cibles thérapeutiques afin de diminuer celle-ci. Globalement, nous avons démontré que la CCL26 est impliquée dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme, spécialement chez les asthmatiques sévères éosinophiliques, que le 2-AG pourrait être un chimioattractant de l’éosinophile dans l’asthme et que la périostine ne serait pas un bon biomarqueur systémique pour identifier la sévérité de l’asthme ou l’éosinophilie pulmonaire, même si elle semble être impliquée dans l’asthme et sa sévérité.

Chapitre III : migration des éosinophiles induite par les éotaxines Notre premier objectif était d’évaluer l’implication de la CCL26 dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité. Dans ce chapitre, nos résultats illustrent le rôle important de la CCL26 dans le recrutement d’éosinophiles de sujets asthmatiques. Tout d’abord, ce chapitre démontre que la CCL26 induit une transmigration des éosinophiles d’asthmatiques plus importante et biphasique comparativement à celle induite par la CCL11 ou la CCL24. De plus, la CCL26 induit une transmigration plus importante des éosinophiles d’asthmatiques que ceux de sujets sains, résultat faiblement observé avec la CCL11 et non observé avec la CCL24. Les différences observées entre les trois éotaxines ne sont pas causées par la dégradation de celles-ci. En effet, la quantité de chaque éotaxine est demeurée similaire pendant 18 heures d’incubation avec des éosinophiles. Par contre, cette expérience n’exclut pas un possible clivage des éotaxines qui permettrait tout de même à ceux-ci de se lier à l’anticorps de l’ELISA. Un clivage de la CCL26 pourrait changer sa fonction chimiotactique et ainsi expliquer les résultats observés. Nous aurions pu évaluer la capacité chimiotactique de chaque éotaxine en utilisant les éotaxines préincubées pendant 18 heures. Par la suite, puisque des évidences suggèrent que chaque éotaxine se lie différemment au récepteur CCR3 (99;100), l’importance de ce récepteur a été évaluée lors de la transmigration

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des éosinophiles d’asthmatiques induite par les éotaxines et lors de la transmigration biphasique induite par la CCL26. Chez les éosinophiles de sujets sains, la transmigration induite par les trois éotaxines était totalement inhibée par l’anticorps ciblant CCR3. Chez les éosinophiles d’asthmatiques, l’anticorps inhibait totalement la transmigration induite par la CCL24, mais partiellement celle induite par la CCL11 et la CCL26. L’anticorps inhibait totalement la transmigration induite par la CCL26 entre 0 et 9 heures d’incubation, mais pas la deuxième phase de transmigration entre 9 et 18 heures. Ces résultats suggèrent que, chez les éosinophiles d’asthmatiques, la CCL26 pourrait se lier à un autre récepteur que CCR3 afin d’induire la transmigration des éosinophiles ou qu’il y a un changement de conformation du récepteur CCR3 favorisant la liaison de la CCL26. Suite à cette étude, nous avons investiguer si la CCL26 pouvait se lier à un autre récepteur que le CCR3 sur les éosinophiles. Étant donné que la CCL26 est un ligand du récepteur

CX3CR1 (457), nous avons évalué l’expression de CX3CR1 chez les éosinophiles humains.

Une très faible expression en ARNm ou protéique de CX3CR1 chez les éosinophiles a été obtenue (Figure III). Même si l’expression de CX3CR1 est plus élevée chez les éosinophiles d’asthmatiques que de sujets sains, le ligand de CX3CR1 induisait aucune migration des

éosinophiles d’asthmatiques, suggérant que le récepteur CX3CR1 n’est pas impliqué dans la migration induite par la CCL26. Afin de confirmer notre hypothèse, nous devrions évaluer l’effet d’un antagoniste ou d’un anticorps ciblant CX3CR1, seul ou en combinaison avec l’anticorps ciblant CCR3, sur la migration des éosinophiles induite par les éotaxines. D’autre part, la CCL26 se lie également aux récepteurs CCR1, CCR2 et CCR5 comme antagoniste (351;352). Afin de confirmer l’expression de ces récepteurs et d’autres récepteurs potentiels, nous avons évalué l’expression des récepteurs des chimiokines chez les éosinophiles de sujets sains et de sujets asthmatiques. Les récepteurs CCR1, CCR3 et CXCR4 sont fortement exprimés chez l’éosinophile, et CCR2 et CCR5 sont faiblement exprimés (Figure IV). Puisque l’effet de l’anticorps ciblant CCR3 a été partiel seulement lors de la transmigration des éosinophiles d’asthmatiques, une de nos hypothèses était que le récepteur recherché serait surexprimé chez les éosinophiles d’asthmatiques comparativement à ceux de sujets sains. Cependant, aucune modulation significative de l’expression des récepteurs n’a été obtenue entre les éosinophiles de sujets sains et d’asthmatiques. Une autre hypothèse était que, puisque nos cellules sont en présence d’IL-5 pendant la transmigration, il est possible que

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l’expression du récepteur responsable de la deuxième phase de la transmigration soit induite par l’IL-5. Des récepteurs sont modulés par l’IL-5, soit CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CXCR2 et CXCR4 (356;357). Pour cette raison, nous avons également évalué l’effet de l’IL-5 sur l’expression des récepteurs des chimiokines chez les éosinophiles. L’expression des récepteurs CCR2, CCR8, XCR1 et CXCR5 augmentaient en présence d’IL-5 chez les éosinophiles d’asthmatiques (Figure V). Étant donné que ces résultats représentent seulement l’ARNm, il sera important de confirmer l’expression protéique de ces récepteurs. Par la suite, puisque le récepteur CCR2 lie la CCL26 et que son expression augmente en présence de l’IL- 5, nous pourrions évaluer si CCR2 est impliqué dans la migration des éosinophiles induite par la CCL26 en utilisant un anticorps ou un antagoniste de CCR2. Même si la CCL26 est un antagoniste du récepteur CCR2, il est possible qu’un changement de conformation du CCR2 pendant la transmigration favorise l’activation du récepteur par la CCL26. D’autre part, le changement de conformation du récepteur CCR3 est une autre hypothèse de l’inhibition incomplète de la migration des éosinophiles induite par la CCL26 par l’anticorps ciblant le CCR3. Les récepteurs à sept domaines transmembranaires sont reconnus pour être dynamiques et avoir différentes conformations. Dans nos expériences in vitro, il est probable qu’un changement de conformation survienne au courant de la migration permettant la liaison de la CCL26, mais pas celle de la CCL24 et faiblement celle de la CCL11, sur le récepteur CCR3 même en présence de l’anticorps. Ce changement de conformation pourrait être induit par la présence d’IL-5.

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Figure III. Expression de CX3CR1 chez les éosinophiles et l’effet de son ligand sur la migration des éosinophiles. Les leucocytes ont été isolés de sang de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. A,B) Afin d’effectuer la cytométrie en flux, ils ont été incubés avec les anticorps Pacific Blue-anti-CD16 (BioLegend) et APC-anti-CCR3 (BioLegend). Les leucocytes ont été séparés par grosseur (FSC) et granularité (SSC). Les granulocytes ont été isolés et les éosinophiles ont été sélectionnés par LOW HIGH CD16 and CCR3 . B) Par la suite, les niveaux de CX3CR1 ont été mesurés chez les

éosinophiles (EOS). C) L’expression en ARNm de CX3CR1 a été évalué par qPCR chez des éosinophiles. D) Les éosinophiles d’asthmatiques (n=3) ont été pré-incubés pendant 5 minutes avec 10 ng/ml d’IL-5 et ils ont été déposés dans des inserts de 3 µM. 10 nM de

CCL11 et différentes concentrations de CX3CL1 ont été ajoutées dans les puits (Chambre de Boyden modifiée). La migration des éosinophiles a été effectuée pendant 18 heures. Les résultats représentent la moyenne (± SEM) d’expériences indépendantes (en duplicata).

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Figure IV. Expression des récepteurs des chimiokines chez les éosinophiles frais humains. Les éosinophiles ont été isolés du sang de 3 sujets sains, 3 asthmatiques légers et de 3 asthmatiques sévères éosinophiliques. L’ARNm a été extrait des éosinophiles par Trizol. L’expression des récepteurs a été évalué par multiplex qPCR avec le customs RT2 Profiler qPCR Multiplex Array Kit (Qiagen). Le panel B représente un agrandissement du panel A. Les résultats représentent la moyenne (± SEM) de 3 expériences indépendantes (en duplicata).

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Figure V. Effet de l’IL-5 sur l’expression des récepteurs CCR et CXCR chez les éosinophiles. Les éosinophiles ont été isolés du sang de sujets sains, d’asthmatiques légers et d’asthmatiques sévères éosinophiliques. Les cellules ont été incubées pendant 18 heures avec 10 ng/ml d’IL-5. L’ARNm a été extrait des éosinophiles par Trizol. L’expression des récepteurs CCR (A) et CXCR (B) a été évalué par multiplex qPCR avec le customs RT2 Profiler qPCR Multiplex Array Kit (Qiagen). Les résultats représentent la moyenne (± SEM) d’expériences indépendantes (en duplicata).

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Chapitre IV : rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité Puisque nous avons démontré dans le précédent chapitre que la CCL26 était important pour la migration des éosinophiles d’asthmatique, nous avons étudié l’importance de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Dans ce chapitre, nous avons démontré que la CCL26 est associée avec l’éosinophilie pulmonaire dans l’asthme sévère éosinophilique. Tout d’abord, parmi toutes les CC chimiokines, seul l’ARNm de la CCL26 est fortement induit par l’IL-13 chez les CÉB et son expression est plus élevée chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques comparativement à ceux de sujets sains et d’asthmatiques légers. Dans la muqueuse bronchique, les niveaux de CCL26 sont similaires entre les différents groupes de sujets et aucune association n’a été mesurée entre les niveaux de CCL26 et le nombre d’éosinophiles. En effet, le nombre d’éosinophiles est plus important dans les biopsies bronchiques de sujets asthmatiques légers que de sujets sains et d’asthmatiques sévères éosinophiliques. Au premier abord, ces résultats m’ont surpris, puisque la corrélation entre le nombre d’éosinophiles et la sévérité de l’asthme est reconnue et souvent citée. Suite à une revue de la littérature, cette corrélation n’est pas aussi définie que je le croyais. En effet, le nombre d’éosinophiles dans les biopsies bronchiques est plus élevé chez les asthmatiques légers que les sujets sains (125;141;449;458-460). Dans l’asthme sévère, Duncan et al ont démontré qu’il y avait une corrélation entre le nombre d’éosinophiles dans les biopsies bronchiques et la sévérité de l’asthme (24). Par contre, Benayoun et al ont démontré que le nombre d’éosinophiles était plus élevé dans les biopsies bronchiques chez les asthmatiques légers que les asthmatiques sévères (461) et Lemiere et al ont démontré qu’il y avait un nombre similaire d’éosinophiles entre les asthmatiques modérés et les asthmatiques sévères (25). Ces études supportent nos résultats et suggèrent que, dans les biopsies bronchiques, le nombre d’éosinophiles augmente dans l’asthme, mais n’est pas associé à la sévérité de l’asthme. D’autre part, nos résultats ont démontré qu’il y a une diminution du nombre d’éosinophiles dans les biopsies bronchiques entre les asthmatiques légers et les asthmatiques sévères éosinophiliques. Cette diminution pourrait être causée par la prise de corticostéroïdes chez les asthmatiques sévères et/ou une migration des éosinophiles vers la lumière bronchique. Puisque les sujets asthmatiques sévères éosinophiliques ont un pourcentage d’éosinophiles de 5% et plus dans leur expectoration induite, la deuxième hypothèse semblait plausible. À cet égard, nous avons évalué s’il y avait une corrélation entre les niveaux de

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CCL26, la sévérité de l’asthme et le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites des sujets asthmatiques. Nos résultats ont démontré une forte corrélation entre les niveaux de CCL26 et le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites ainsi qu’une association avec la sévérité de l’asthme. Ces résultats suggèrent que la CCL26 est impliquée dans l’éosinophilie pulmonaire chez les asthmatiques sévères éosinophiliques en induisant une migration dirigée des éosinophiles vers la lumière bronchique. Étant donné que la CCL26 est associée avec le nombre d’éosinophiles et la sévérité de l’asthme dans les expectorations induites, mais pas dans les biopsies bronchiques, ces résultats suggèrent également que la CCL26 est libérée de façon apicale par les CÉB afin de créer le gradient chimiotactique de la CCL26 vers la lumière bronchique. Des expériences supplémentaires seront nécessaires afin de confirmer cette hypothèse en utilisant des CÉB cultivées en interface air-liquide (ALI). Ces dernières nous permettraient d’évaluer la production apicale et la production basale de la CCL26 par les CÉB et de comparer cette production entre les CÉB de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Nous devrions également évaluer si la surproduction de la CCL26 chez les CÉB est associée à l’éosinophilie, en comparant la production et l’expression de la CCL26 chez des CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques et non éosinophiliques. Des résultats préliminaires provenant de CÉB d’un asthmatique sévère non éosinophilique suggèrent que la surproduction de la CCL26 est spécifique aux asthmatiques sévères éosinophiliques (Figure VII). De plus, il serait important de comprendre les mécanismes impliqués dans la surproduction de la CCL26 par les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques pour identifier des cibles thérapeutiques afin de diminuer cette production et l’éosinophilie pulmonaire. Les mécanismes ont été étudiés dans le Chapitre VII.

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Figure VII. Production de la CCL26 chez des CÉB d’un asthmatique sévère non éosinophilique stimulées à l’IL-13. Des CÉB isolées de biopsies bronchiques ont été obtenues d’asthmatiques sévères éosinophiliques et d’un asthmatique sévère non éosinophilique. Les CÉB ont été incubées pendant 24 heures avec 30 ng/ml d’IL-13. L’expression de la CCL26 en ARNm (A) et en protéines (B) ont été évaluées par qPCR et ELISA, respectivement. Les résultats représentent une expérience ou la moyenne (± SEM) de 5 expériences indépendantes (en duplicata).

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Chapitre V : mécanismes de la surproduction de la CCL26 dans l’asthme sévère. Suite à l’étude précédente démontrant le rôle de la CCL26 dans l’éosinophilie bronchique, il était primordial de comprendre les mécanismes impliqués dans la surproduction de la CCL26 chez les CÉB dans l’asthme sévère. Dans ce chapitre, nous avons démontré que le facteur de transcription STAT6 est impliqué dans la surproduction de la CCL26 chez les CÉB de sujets asthmatiques sévères éosinophiliques. Tout d’abord, la production et l’expression de la CCL26 diminuaient en fonction de la concentration en présence de l’inhibiteur de STAT6, AS1517499. L’utilisation d’un inhibiteur pour évaluer l’implication de STAT6 est une limite de l’étude. Une méthode plus sensible et spécifique aurait été d’utiliser un siRNA de STAT6. Par contre, cette méthode est plus coûteuse et laborieuse avec des CÉB humaines. Nos résultats sont tout de même similaires à plusieurs études qui ont préalablement démontré l’implication de STAT6 dans l’expression et la production de la CCL26 chez des cellules épithéliales en utilisant des inhibiteurs de STAT6, un siRNA de STAT6 ou en effectuant une mutation sur le site de liaison de STAT6. Ensuite, nous avons démontré que les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques avaient des niveaux d’activation de STAT6 plus élevés entre 5 et 30 minutes d’incubation avec l’IL-13 que ceux de sujets sains et d’asthmatiques légers. Ces résultats suggèrent que la surproduction de la CCL26 chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques est, du moins en partie, causée par une activation de STAT6 plus importante. Pour cette expérience, nous avons utilisé un ELISA au lieu d’effectuer des immunobuvardages, puisque cette technique nous permettait d’obtenir des résultats quantitatifs et de comparer tous nos résultats lors d’une seule expérience. Cependant, il n’est pas possible de confirmer que la quantité de protéines est similaire entre chaque condition, malgré la quantification des protéines par Bradford. En effet, puisque la quantification par Bradford n’est pas une technique assez sensible, les échantillons de protéines de CÉB ont des niveaux différents de β-actine lorsqu’évalués par immunobuvardage. Par ailleurs, nous observons que la quantité de STAT6 totale chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques a une tendance à être inférieure à celles d’asthmatiques légers et de sujets sains. Puisque nous avons utilisé un ELISA, nous ne pouvons pas confirmer si cette tendance est causée par une quantité de protéines totales inférieures chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques ou par des niveaux de

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STAT6 total inférieurs. Une confirmation de ces résultats par immunobuvardage permettrait de répondre à cette interrogation. Étant donné que SOCS1 et SOCS3 sont des protéines inhibitrices de l’activation de STAT6, nous voulions déterminer si elles étaient impliquées dans l’augmentation de l’activation de STAT6 observée chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques. Par immunohistochimie, nous avons comparé les niveaux de SOCS1 et de SOCS3 dans l’épithélium de biopsies bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Nos résultats ont démontré que les niveaux de SOCS1 et de SOCS3 sont similaires entre les différents groupes de sujets. Cependant, on observe une légère diminution des niveaux de SOCS3 dans l’épithélium d’asthmatiques sévères éosinophiliques, qui pourrait expliquer partiellement l’augmentation de l’activation de STAT6 chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques. Le faible nombre de sujets par groupes pourrait expliquer que cette diminution n’est pas statistiquement significative. Il serait préférable de confirmer ces résultats en quantifiant les niveaux de SOCS1 et de SOCS3 dans les CÉB. À cet effet, nous avons essayé d’évaluer les niveaux de SOCS1 et SOCS3 dans les CÉB par immunobuvardage, mais les trois anticorps testés pour SOCS1 ou pour SOCS3 étaient soit non spécifiques ou soit inefficaces. Finalement, nous avons évalué les niveaux de méthylation dans le promoteur du gène de la CCL26 chez les CÉB de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Les niveaux de méthylation de quatre CpG à proximité des sites de liaison de STAT6 ont été quantifiés par pyroséquençage dans de l’ADN traité avec du bisulfite. Ces expériences ont été effectuées en collaboration avec l’équipe du Dr Laprise qui possède l’expertise pour utiliser un pyroséquenseur et pour analyser les résultats. Nos résultats démontrent que les niveaux de méthylation sont similaires chez les CÉB de sujets sains, d’asthmatiques légers et d’asthmatiques sévères éosinophiliques. Ces résultats diffèrent de ceux de Lim et al qui démontrent que les niveaux de méthylation d’un des CpG sont inférieurs chez les cellules épithéliales de l’œsophage de sujets avec une œsophagite à éosinophiles comparativement à ceux de sujets sains et que ces niveaux sont inversement associés avec l’expression de la CCL26 (283). L’ensemble de ces résultats suggère que la régulation de l’expression de la CCL26 diffère dépendamment du type cellulaire et/ou de la physiopathologie.

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En perspective, d’autres molécules que celles impliquées dans le chemin signalétique de l’IL- 13 pourrait être impliquées dans la production de la CCL26 par les CÉB. À cet égard, nous nous sommes intéressés à l’implication de la 15-LO dans cette production, résultats discutés dans la section Travaux en cours, ici-bas.

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Chapitre VI : migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5 Ensuite, nous avons étudié l’impact de l’IL-5 sur le recrutement des éosinophiles induit par le 2-AG, étant donné l’importance de l’IL-5 dans l’asthme et de la caractérisation peu définie du 2-AG comme chimioattractant des éosinophiles. Dans ce chapitre, nous avons démontré que l’IL-5 augmente fortement la migration des éosinophiles induite par le 2-AG. En effet, la migration des éosinophiles induite par le 2-AG seul est presque inexistante (3% de migration nette). Mais en présence d’IL-5, d’IL-3 ou de GM-CSF, elle augmente d’environ 10 fois (30 à 40% de migration nette). Puisque l’IL-13 et l’INF-y n’avaient pas d’effet sur la migration induite par le 2-AG et que l’IL-5, l’IL-3 et GM-CSF partagent la sous-unité de récepteur communβγ, nous avons évalué l’implication de la kinase LYN, activée par ce récepteur. En utilisant un inhibiteur de Src-like lyn, PP2, nous avons démontré l’importance de cette kinase dans la migration induite par le 2-AG et l’IL-5. Le récepteur commun βγ peut également activer la kinase JAK2, suggérant que JAK2 pourrait être impliquée dans cette migration (462). L’utilisation d’inhibiteurs de JAK2 tels que CEP33779, AZD1480 ou cucurbitacin 1 lors de la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5 permettrait d’évaluer cette implication. Ensuite, nous avons démontré que la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-

5 nécessite la participation du récepteur CB2 en utilisant des antagonistes de CB2. Par contre, des agonistes de CB2 induisent une faible migration des éosinophiles, suggérant que l’activation du récepteur CB2 n’est pas suffisante pour expliquer l’ampleur de la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5. Nous avons postulé que le métabolisme du 2- AG serait nécessaire à cette migration, puisque celui-ci est souvent impliqué dans les activités fonctionnelles du 2-AG. En effet, l’inhibiteur de MAG lipase, JZL-184, a partiellement inhibé cette migration, démontrant l’implication du métabolisme du 2-AG en AA dans celle- ci. L’utilisation d’un seul inhibiteur de la MAG lipase est une limite de cette expérience, mais JZL-184 est le seul inhibiteur sélectif connu de la MAG lipase. Par la suite, nous avons confirmé l’implication du récepteur CB2 et du métabolisme du 2-AG dans la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5. En présence d’IL-5, la migration des éosinophiles induite par un agoniste de CB2 ou l’AA était inférieure à celle induite par le 2-AG, mais la migration induite par un agoniste de CB2 en combinaison avec l’AA était similaire.

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Finalement, nous avons démontré que les inhibiteurs de la 15-LO diminuent la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5. Cependant, les métabolites de la 15-LO que nous avons testés, 15-HETE, 15-HETE-glycérol, lipoxin A4 et eoxin C4 (EXC4), n’ont pas induit de migration des éosinophiles en présence d’IL-5 et ils n’ont pas augmenté la migration induite par un agoniste de CB2. Il est possible que d’autres métabolites de la 15-LO soient impliqués dans la migration induite par le 2-AG ou qu’il existe un effet synergique des métabolites ce qui expliquerait l’absence de migration lorsqu’ils sont testés individuellement. Une autre hypothèse est que l’effet de la 15-LO soit intracellulaire. Par exemple, elle pourrait favoriser l’activation de la kinase LYN ou celle de la MAG lipase. Cette hypothèse pourrait être évaluée en identifiant l’impact d’inhibiteurs de la 15-LO sur la migration des éosinophiles induite par le 2-AG et l’IL-5 lorsque les éosinophiles sont en présence des métabolites de la 15-LO.

En perspective, suite à cette étude, nous avons évalué l’expression du récepteur CB2 chez les leucocytes par qPCR. Nos résultats ont démontré que l’expression de CB2 est largement plus élevée chez les éosinophiles que les autres leucocytes (Figure VI), suggérant que le 2-AG a un effet prédominant sur l’éosinophile. Ce résultat confirme l’importance d’évaluer l’impact du 2-AG sur les réponses fonctionnelles de l’éosinophile. Nous avons démontré l’impact du 2-AG sur la migration et la biosynthèse de CysLTs des éosinophiles, mais pas sur la transmigration, la biosynthèse d’autres médiateurs lipidiques et la dégranulation des éosinophiles. À cet égard, nous devrions évaluer l’effet du 2-AG et de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles lorsque ceux-ci sont dans des inserts recouverts d’une membrane basale de Matrigel ou de cellules endothéliales. Nous devrions également stimuler les éosinophiles avec du 2-AG et de l’IL-5 afin de quantifier la production de médiateurs lipidiques par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS), de ROS par réduction du cytochrome C et de granules secondaires par ELISA. De plus, nous pourrions définir l’implication de l’IL-5 et du 2-AG dans l’asthme, spécialement chez les sujets obèses. En effet, les niveaux de 2-AG augmentent chez les sujets obèses comparativement aux sujets contrôles (463). Nous pourrions comparer les niveaux de 2-AG dans les biopsies bronchiques, les expectorations induites ou les LBA chez des sujets sains, asthmatiques sans obésité et asthmatiques avec obésité. De plus, nous devrions évaluer s’il y

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a une association entre les niveaux de 2-AG, d’IL-5 et le nombre d’éosinophiles dans ces tissus ou liquides biologiques.

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Figure VI. Expression du récepteur CB2 chez les leucocytes humains. Les leucocytes ont

été isolés du sang de sujets sains, allergiques ou asthmatiques. L’expression du CB2 a été évaluée par qPCR chez les éosinophiles (Eos), les neutrophiles (Neu), les lymphocytes (Lympho), les monocytes (Mono) et les macrophages alvéolaires (Macro). Les résultats représentent la moyenne (± SEM) d’expériences indépendantes (en duplicata).

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Chapitre VI : rôle de la périostine comme biomarqueur systémique dans l’asthme Notre dernier objectif avait pour but d’identifier le rôle de la périostine, protéine impliquée dans l’adhésion des éosinophiles, dans l’éosinophilie bronchique observée dans l’asthme. Les travaux présentés dans ce chapitre démontrent que, même si la périostine est associée au nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites, elle n’est pas un bon biomarqueur systémique pour identifier la sévérité de l’asthme ou l’éosinophilie bronchique. Tout d’abord, l’IL-13 induit fortement la production de la périostine par les CÉB et cette production est plus importante chez les asthmatiques sévères éosinophiliques que chez les asthmatiques légers et les sujets sains. De plus, la sécrétion de périostine par les CÉB corrèle avec celle de la CCL26. Dans les expectorations induites, les niveaux de périostine corrèlent avec le nombre d’éosinophiles et les niveaux de CCL26. Ces résultats démontrent une forte relation entre l’IL-13, la périostine et la CCL26, suggérant que la périostine a un rôle dans l’asthme et sa sévérité. La relation entre l’IL-13 et la périostine a préalablement été identifiée dans la littérature. En effet, l’IL-13 induit également la production de la périostine chez les fibroblastes et les cellules endothéliales microvasculaires (451). De plus, le lebrikizumab, un traitement anti-IL-13, est plus efficace chez les sujets avec des niveaux élevés de périostine dans le sérum que chez les sujets avec des niveaux faibles de périostine dans le sérum (301). Puisque les niveaux d’IL-13 augmentent dans l’asthme sévère, ces résultats renforcent la possibilité d’un rôle de la périostine dans l’asthme et sa sévérité. Ce rôle pourrait être en lien avec le recrutement des éosinophiles. En effet, la périostine augmente l’adhésion des éosinophiles aux cellules endothéliales par sa liaison avec des intégrines (452). De plus, des souris déficientes en périostine ont un nombre inférieur d’éosinophiles dans les LBA comparativement aux souris contrôles (453). Puisque nous avons observé une association entre la périostine et la CCL26, ces résultats suggèrent que la périostine et la CCL26 auraient un rôle coopératif dans la migration des éosinophiles en augmentant l’adhésion des éosinophiles et leur migration, respectivement. D’autres expériences seraient également nécessaires afin d’évaluer l’impact de la périostine sur d’autres réponses fonctionnelles de l’éosinophile, telles que la dégranulation et la transmigration. D’autre part, dans les plasmas, les niveaux de périostine étaient similaires chez les sujets sains et les asthmatiques, peu importe la sévérité de l’asthme. Lorsque nous avons comparé les sujets traités avec des corticostéroïdes (asthmatiques modérés et sévères) avec les sujets

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non traités avec des corticostéroïdes (sujets sains et asthmatiques légers), les niveaux de périostine étaient plus faibles chez les sujets traités avec des corticostéroïdes, suggérant que la prise de corticostéroïdes diminue la périostine sanguine. Ces résultats étaient en accord avec des études préalablement publiées (300;442-444). Cependant, d’autres études ont obtenu des niveaux supérieurs de périostine dans le sang d’asthmatiques que de sujets sains (439-441). Puisque nos résultats diffèrent de ceux-ci, nous avons évalué les niveaux de périostine dans les plasmas de sujets avec une dermatite atopique, sujets connus pour avoir des niveaux élevés de périostine dans le sang. Tel que préalablement décrit, les sujets avec une dermatite atopique avaient des niveaux supérieurs de périostine dans leur plasma que les sujets sains, supportant la validité de nos résultats. Par la suite, nous avons évalué si la périostine dans le sang pourrait être un bon biomarqueur de l’éosinophilie bronchique. Nous avons obtenu une faible corrélation entre les niveaux de périostine dans les plasmas et le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites chez les asthmatiques, résultats similaires à d’autres études (299;441;445). Lorsque seuls les sujets asthmatiques sévères éosinophiliques sont inclus dans l’analyse, cette corrélation augmente fortement. Aucune corrélation n’a été obtenue entre les niveaux de périostine et le nombre d’éosinophiles ou les niveaux d’IgE dans le sang. De plus, le nombre d’éosinophiles dans le sang avait une meilleure corrélation avec le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites que les niveaux de périostine, tel que préalablement publié par Simpson et al (299). Par contre, d’autres études n’ont pas obtenu de corrélation entre les niveaux de périostine dans le sang et le nombre d’éosinophiles dans les expectorations induites (454;455). Nos résultats suggèrent que la périostine ne serait pas un bon biomarqueur systémique pour évaluer la sévérité de l’asthme ou l’éosinophilie bronchique, à l’exception des sujets asthmatiques sévères éosinophiliques qui sont déjà caractérisés comme ayant une éosinophilie bronchique. Plusieurs études ont obtenu des résultats différents à l’égard de la périostine dans le sang. Ces différences peuvent s’expliquer par soit le phénotype ou la sévérité d’asthme des sujets ou l’ELISA utilisé. En effet, la sévérité ou le phénotype des sujets asthmatiques varie beaucoup d’une étude à l’autre. De plus, notre étude a démontré un possible impact des corticostéroïdes sur les niveaux de périostine dans le sang, supportant l’importance de la sévérité de l’asthme lors de la quantification de la périostine sanguine. D’autre part, ces

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études ont utilisé différents ELISA de la périostine, soit commercial ou soit fait maison. La spécificité et l’efficacité de ces ELISA pour identifier la périostine n’ont pas toujours été évaluées par ces études. Afin d’évaluer ces paramètres avec l’ELISA utilisé dans cette étude, nous avons ajouté de la périostine recombinante à des échantillons de sérum ou de plasma et, ensuite, évaluer si l’on quantifiait précisément la périostine ajoutée. Nos résultats ont démontré que l’ELISA quantifiait spécifiquement et efficacement les niveaux de périostine ajoutés dans les échantillons de sérum ou de plasma. Quelques limitations sont présentes dans notre étude. Tout d’abord, le nombre de patients par phénotype est limité, soit environ 20 patients par phénotype pour les plasmas. Dans les autres études discutées plus tôt, on retrouve entre 12 et 225 patients par phénotype. De plus, nous n’avons pas investigué la possibilité d’un effet matrice des surnageants d’expectorations induites sur la quantification de la périostine. Cependant, je suis confiante que, s’il y a un effet matrice, il est grandement diminué par l’utilisation de dithiothreitol (DTT) lors de l’isolation des surnageants d’expectorations induites et des dilutions effectuées lors des ELISA. En perspective, puisque, présentement, il y a un très grand intérêt pour l’identification de biomarqueurs dans l’asthme et que Dr Flamand est récemment responsable d’un LC-MS/MS quantifiant plus de 200 lipides, il serait intéressant d’évaluer si un ou plusieurs de ces lipides pourraient être des biomarqueurs systémiques pour identifier les phénotypes et la sévérité de l’asthme. Une autre avenue intéressante serait d’utiliser des échantillons d’urine au lieu du sang pour quantifier ces lipides. En effet, plusieurs études ont démontré que les niveaux de

LTE4 augmentaient dans les urines d’asthmatiques, spécialement d’asthmatiques sensibles à l’aspirine (464).

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Travaux en cours : Implication de la 15-LO dans l’expression de la CCL26 chez les CÉB Lorsque nous avons étudié les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 par les CÉB, nous nous sommes intéressés à d’autres molécules que celles impliquées dans la signalisation de l’IL-13, telles que la 15-LO. En effet, Chu et al ont démontré que les niveaux de 15-LO dans l’épithélium et de 15-HETE dans les LBA augmentent dans l’asthme sévère (275) et Zhao et al ont démontré que l’inhibition de la 15-LO chez des CÉB diminue significativement l’expression de la CCL26 induite par l’IL-13 (276;281). Tout d’abord, nous avons évalué l’expression de la 15-LO chez les CÉB (Figure VIII). Tout comme la CCL26, l’expression génique et protéique de la 15-LO est induite par l’IL-13 et elle est plus élevée chez les CÉB d’asthmatiques sévères éosinophiliques que chez les sujets sains et asthmatiques légers.

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Figure VIII. Expression de la 15-LO chez les CÉB. Des CÉB isolées de biopsies bronchiques ont été obtenues de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Les CÉB ont été incubées pendant 8 heures (A) ou 24 heures (B,C) avec 30 ng/ml d’IL-13 ou véhicule (V). L’expression en ARNm (A) et en protéine (B,C) ont été évaluées par qPCR et immunobuvardage, respectivement (en C, BNE = CÉB d’un sujet sain, BAE = CÉB d’un asthmatique léger, BSAE = CÉB d’un asthmatique sévère éosinophilique et EOS = éosinophiles). Les résultats représentent la moyenne (± SEM) de 3 à 6 expériences indépendantes (en duplicata). Two-way ANOVA avec un Tukey’s multiple comparisons test ont été effectués afin d’obtenir les valeurs de P.

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Afin d’évaluer l’effet de la 15-LO sur l’expression de la CCL26, nous avons utilisé un inhibiteur de la 15-LO, HECO1, gracieusement offert par le Dr Hans-Erik Claesson de Karolinska Institute (Stockholm, Suède). Des éosinophiles, qui expriment fortement la 15- LO, ont été préincubés avec HECO1 ou DMSO avant une incubation avec de l’AEA ou du 2-AG. La stimulation avec l’AEA et le 2-AG induit la synthèse de 15-HETE-EA et de 15- HETE, respectivement, par les éosinophiles. L’analyse des métabolites de la 15-LO par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) démontre que l’HECO1 inhibe la production de 15-HETE-EA et de 15-HETE (Figure IX, A). Ensuite, nous avons évalué l’effet d’HECO1 sur la production intrinsèque de médiateurs lipidiques grâce à l’analyse par LC-MS/MS en stimulant les éosinophiles avec de l’ionophore de calcium A23187. HECO1 diminue significativement la production des métabolites de la 15-LO, soit le 15-HETE, le 13-HODE, le 15-HEPE et le 15-HETrE, mais également la production de 12- HETE (Figure IX, B). Puisque la 15-LO métabolise de faible quantité de 12-HETE (465;466), il est possible que la 12-HETE inhibée provienne de la 15-LO. Afin de confirmer la spécificité de l’inhibiteur, nous devrions évaluer l’expression de la 12-LO chez les éosinophiles et identifier l’impact d’un inhibiteur de la 12-LO sur la production de 12-HETE chez les éosinophiles. De plus, il sera important de confirmer que les résultats obtenus chez les éosinophiles sont similaires chez les CÉB. Nous avons également évalué l’efficacité d’inhibiteurs commerciaux de la 15-LO, soient le PD146176, un inhibiteur spécifique de la 15-LO et le nordihydroguaiaretic acid (NDGA), un inhibiteur de la 15-LO et de la 12-LO. NDGA inhibe significativement la production des métabolites de la 15-LO, mais le PD146176 n’a aucun effet. Il semble que le lot de PD146176 que nous avons utilisé est inefficace.

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Figure IX. Effet du HECO1 sur la production des métabolites de la 15-LO par les éosinophiles. Des éosinophiles ont été isolés du sang de sujets allergiques ou asthmatiques. Les éosinophiles incubés à 37°C ont été prétraités avec différentes concentrations de HECO1 pendant 5 minutes et, ensuite, 3µM de 2-AG, AEA (A) ou A23187 (B) a été ajouté pendant 15 minutes. Les réactions ont été arrêtées en ajoutant une solution froide contenant des standards internes. Les éosinophiles ont été conservés toute la nuit à -20°C afin de dénaturer les protéines. Les échantillons ont été extraits pour l’analyse en HPLC (A) ou en LC-MS/MS (B). Les résultats représentent la moyenne (± SEM) de 4 à 5 expériences indépendantes (en duplicata). Two-way ANOVA avec un Tukey’s multiple comparisons test ont été effectués afin d’obtenir les valeurs de P (***: p<0.0001, HECO1 vs. DMSO).

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Par la suite, nous avons évalué l’effet de l’inhibiteur de la 15-LO sur l’expression de la CCL26 chez les CÉB, en utilisant des CÉB préincubées avec HECO1 ou DMSO et stimulées pendant 24 heures avec de l’IL-13. Nos résultats démontrent que HECO1 inhibe en fonction de la concentration l’expression et la production de la CCL26 (Figure X, A), en concordance avec Zhao et al (276;281). Ces données suggèrent que la 15-LO est impliquée dans la production de la CCL26 par les CÉB. Ensuite, nous avons évalué si la 15-LO était impliquée dans la production d’autres protéines induites par l’IL-13, soient la périostine et CXCL1. La CXCL8, non induite par l’IL-13 et produite constitutivement par les CÉB, a été utilisé comme contrôle. HECO1 inhibe en fonction de la concentration la production de la périostine induite par l’IL-13 chez les CÉB, similairement à celle de la CCL26 (Figure X, B). La CXCL1 est inhibée significativement avec 10-5M d’HECO1 et la CXCL8 n’est pas inhibée par l’inhibiteur. Ces résultats suggèrent que la 15-LO est impliqué dans la production des protéines induites par l’IL-13 chez les CÉB. Il est nécessaire de confirmer ces résultats avec un autre inhibiteur spécifique de la 15-LO ou en utilisant un siRNA de la 15-LO. Nous pourrions également déterminer l’implication de la 15-LO en effectuant une transfection de la 15-LO dans une lignée cellulaire de CÉB. Les Calu-3 sont des cellules épithéliales bronchiques immortalisées qui n’exprime pas la 15-LO, ce qui en ferait un bon modèle pour évaluer les effets de la 15-LO ou de ses métabolites (467;468).

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Figure X. Effet de la 15-LO sur la production des protéines induite par l’IL-13 chez les CÉB. Des CÉB isolées de biopsies bronchiques ont été obtenues de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Les CÉB ont été incubées pendant 24 heures avec 30 ng/ml d’IL-13. L’expression en ARNm de la CCL26 (A) et en protéines de la CCL26 (A,B), la CXCL8, la périostine et la CXCL1 (B) ont été évaluées par qPCR et ELISA, respectivement. Les résultats représentent la moyenne (± SEM) de 9 à 11 expériences indépendantes (en duplicata). Two-way ANOVA avec un Tukey’s multiple comparisons test ont été effectués afin d’obtenir les valeurs de P (*: p<0.01, **: p<0.001, ***: p<0.0001, HECO1 vs. DMSO).

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L’effet de la 15-LO sur la production de protéines induites par l’IL-13 peut provenir de l’enzyme elle-même ou des métabolites produits par celle-ci. Afin d’investiguer cette question, nous avons évalué si l’ajout de métabolites de la 15-LO augmentait l’expression de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les Calu-3, qui n’expriment pas de 15-LO. Les Calu-3 ont été incubées pendant 24 heures avec de l’IL-13. Du DMSO, du 15-HETE ou du 15-HETE en combinaison avec du EXC4 ont été ajoutés à 0, 6 et 18 heures pendant l’incubation avec l’IL-

13. L’ajout du 15-HETE+EXC4, mais pas du 15-HETE seul, augmente l’expression de la CCL26 chez les Calu-3 (Figure XI), suggérant que l’effet de la 15-LO est causé, du moins en partie, par ses métabolites dans les CÉB. D’autres expériences sont nécessaires afin de confirmer que les métabolites de la 15-LO sont totalement ou partiellement responsables des effets de la 15-LO chez les CÉB. Premièrement, il faut évaluer d’autres métabolites que la

15-HETE et l’EXC4. De plus, nous pourrions évaluer l’expression de la CCL26 lorsque les CÉB sont préincubées avec un inhibiteur de 15-LO, puis incubées avec de l’IL-13 et des métabolites de la 15-LO. Si l’ajout d’un métabolite de la 15-LO inverse les effets de l’inhibiteur, ces résultats indiqueraient que ce métabolite est responsable des effets de la 15- LO. Par la suite, il sera important de comprendre comment la 15-LO ou ses métabolites sont impliqués dans l’expression des protéines induites par l’IL-13. Une hypothèse est que la 15- LO ou ses métabolites sont impliqués dans le chemin signalétique induit par l’IL-13. Ceux- ci pourraient favoriser l’activation des JAK, l’activation de STAT6 ou inhiber la liaison ou l’activation des protéines inhibitrices telles que les SOCS ou les protein tyrosine phosphatases (PTP). Blazevic et al ont démontré que, chez le rat, l’inhibition de l’enzyme 12/15-LO induit une diminution de l’activation de STAT3 chez les cellules vasculaires de muscles lisses (469). De plus, Conrad et al ont illustré que la 12/15-LO inhibe l’activation des PTP en favorisant leur oxydation chez des fibroblastes de souris (470). Ces études supportent l’implication de la 15-LO ou de ses métabolites dans le chemin signalétique induit par l’IL-13. Finalement, lorsque l’on compare les symptômes de l’asthme expérimental chez des souris déficientes en 12/15-LO ou en IL-13, ces symptômes sont particulièrement similaires. Andersson et al ont démontré que les souris déficientes en 12/15-LO ont une diminution des cytokines TH2, des leucocytes dans les LBA, des éosinophiles dans la muqueuse bronchique, de l’hypertrophie de l’épithélium et de la production de mucus (471).

Les souris déficientes en IL-13 ont une réduction des cytokines TH2, des éosinophiles dans

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les LBA, de la production de mucus et de l’HRB (247;472;473). Ces résultats renforcent la relation étroite entre l’IL-13 et la 15-LO et suggèrent que la 15-LO pourrait être impliquée dans plusieurs fonctions de l’IL-13, notamment le recrutement des éosinophiles, l’HRB, la bronchoconstriction et le remodelage bronchique.

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Figure XI. Effet des médiateurs de la 15-LO sur l’expression de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les Calu-3. La lignée cellulaire de cellules épithéliales bronchiques Calu-3 a été incubée pendant 24 heures avec 30 ng/ml d’IL-13. Du DMSO ou 100µM de 15-HETE ou

100µM de 15-HETE + 100µM d’EXC4 ont été ajoutés au temps 0, 6 et 18 heures. L’expression en ARNm de la CCL26 a été évaluée par qPCR. Les résultats représentent la moyenne (± SEM) d’une expérience en duplicata.

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En conclusion Ces travaux ont mis en évidence le rôle primordial de la production de la CCL26 par les CÉB dans le recrutement des éosinophiles chez les sujets avec un asthme sévère éosinophilique. Ils ont révélé la complexité de la modulation de cette production, notamment par l’amplification de la réponse induite par l’IL-13 et l’implication de la 15-LO et de ces métabolites. Ces travaux ont également démontré la capacité des endocannabinoïdes à initier la migration des éosinophiles. Globalement, ils ont amélioré notre compréhension de la physiopathologie de l’asthme, plus spécifiquement de l’asthme sévère éosinophilique. Ils soulignent plusieurs interrogations et suggèrent plusieurs nouvelles expériences afin d’éventuellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques efficaces à cette maladie de plus en plus fréquente dans notre société.

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