UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca

Marina Escoque Lodovicho

Ribeirão Preto 2015

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Toxicologia

Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Toxicologia no dia 06/11/2015. A versão original encontra-se disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP.

Orientada: Marina Escoque Lodovicho Orientadora: Profa. Dra. Suely Vilela

Ribeirão Preto 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Lodovicho, Marina Escoque

Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca. Ribeirão Preto, 2015.

103p. : il. ; 30 cm

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP - Área de concentração: Toxicologia.

Orientadora: Vilela, Suely

1. Bothrops jararaca, 2. BJ-CRP, 3. CRISP, 4.Caracterização bioquímica, 5. Potencial inflamatório, 6. Sistema complemento

FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome do aluno: Marina Escoque Lodovicho Título do trabalho: Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do Título de Mestre em Ciências.

Área de Concentração: Toxicologia

Orientadora: Profa. Dra. Suely Vilela

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. ______

Instituição:______Assinatura: ______

Prof. Dr. ______

Instituição:______Assinatura: ______

Prof. Dr. ______

Instituição:______Assinatura: ______

Dedicatória

À Deus por sempre guiar meus passos.

À meus pais Antônio Carlos e Ângela, à meu irmão Pablo pelo amor, incentivo e dedicação. Amo vocês!

Agradecimentos

Agradeço à Profa. Dra. Suely Vilela por estes dois anos de orientação, ensinamentos, paciência, recursos oferecidos no laboratório e pela confiança depositada em mim.

Aos companheiros de laboratório, Tássia, Rafhaella, Marco Aurélio, Tiago, Carol, Danilo e Anna pela amizade e todos os bons momentos vividos.

À Pós doutoranda Tássia por toda a ajuda em experimentos, conselhos, companheirismo e amizade.

À Pós doutoranda Carol pela ajuda com as correções na qualificação e na dissertação, ajuda nos experimentos, muita paciência comigo e várias explicações.

Aos técnicos do laboratório, Luiz, Sante, Adélia e Franco pela amizade, ajudas técnicas e dedicação.

Aos professores que abriram a porta de seus laboratórios e me permitiram a realização de ensaios. À Profa. Dra. Luciana Simon Pereira Crotte à Profa. Dra. Lúcia Helena Faccioli o meu muito obrigada.

À colaboração da Prof. Dra. Eliane Candiane Arantes e a Dra. Karla de Castro Figueiredo Bordon pela realização de análises em seus laboratórios.

À Dra. Manuela Perto Pucca que realizou ensaios com minha toxina no Laboratório de Toxicologia da Universidade Católica de Leuven, na Bélgica, sob coordenação do professor Dr. Jan Tytgat.

À Agência CAPES pela concessão da bolsa de estudo e à FAPESP pelo financiamento da pesquisa Proc. N. 2011/23236-4.

À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, à Universidade de São Paulo e todos seus funcionários pelo acolhimento e estrutura oferecida.

A todos que de alguma maneira colaboraram com a realização desse trabalho!

“Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma oportunidade invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da beleza do reino do espírito, para seu próprio prazer pessoal e para proveito da comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer.”

Albert Einstein i

RESUMO

LODOVICHO, M. E. Isolamento, caracterização bioquímica e avaliação do potencial inflamatório de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) da peçonha de Bothrops jararaca. 2015. 103f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.

Envenenamentos por serpentes do gênero Bothrops provocam reações sistêmicas e locais como coagulopatias, hemorragias, reação inflamatória, dor e mionecrose. Proteínas secretadas ricas em cisteínas (CRISPs) estão presentes nas peçonhas de serpentes e estão amplamente distribuídas entre mamíferos, répteis e anfíbios. Estão envolvidas em algumas reações biológicas, porém muitas funções ainda são desconhecidas. O presente trabalho objetivou o isolamento, a caracterização bioquímica/estrutural, enzimática e funcional, a avaliação do potencial inflamatório e avaliação da atividade sobre o sistema complemento de uma CRISP isolada da peçonha de Bothrops jararaca. A CRISP denominada BJ-CRP, foi isolada da peçonha de Bothrops jararaca através da combinação de três etapas cromatográficas: exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca aniônica em coluna Source 15Q e cromatografia de fase reversa em coluna C18. O grau de homogeneidade foi determinado e confirmado por eletroforese SDS-PAGE, que mostrou uma banda única de 25,19 kDa, e por MALDI-TOF/TOF que apresentou a massa molecular de 24,6 kDa. A sequência N-terminal e a análise dos peptídeos trípticos por MALDI TOF/TOF demonstrou a presença de 100 resíduos de aminoácidos, os quais apresentaram até 96% de similaridade com sequências de outras CRISPs já descritas, porém de outros gêneros e espécies de serpentes, pois ainda não há CRISPs isoladas do gênero Bothrops. A BJ-CRP não possui atividade proteolítica sobre a azocaseína, o fibrinogênio e a fibrina. Também não apresentou atividade coagulante e hemorrágica, e não demonstrou atividade quando testada na concentração de 1µM em 13 diferentes canais para potássio dependentes de voltagem. Por outro lado, esta toxina foi capaz de induzir um processo inflamatório agudo (tempos de 1 e 4 horas), observado pelo recrutamento de neutrófilos e aumento da citocina pró-inflamatória IL-6 na cavidade peritoneal de camundongos. Ensaios realizados com a BJ-CRP e a peçonha de Bothrops jararaca mostraram modulação na atividade hemolítica promovida pela via clássica do sistema complemento. A BJ-CRP também promoveu ação direta sobre alguns componentes isolados do sistema complemento, como C3 e C4, conforme avaliado por SDS-PAGE e Western blot. O presente trabalho descreve a purificação da BJ-CRP, a primeira CRISP isolada da peçonha da serpente do gênero Bothrops. Os resultados obtidos são promissores e abrem perspectivas para o melhor entendimento desta classe de proteínas, e para a compreensão do mecanismo de ação desta classe de toxinas na resposta inflamatória induzida pelo envenenamento botrópico.

Palavras Chave: CRISP, BJ-CRP, Bothrops jararaca, caracterização bioquímica, potencial inflamatório, sistema complemento. ii

ABSTRACT

Lodovicho, M. E. Isolation, biochemical characterization and evaluation of the inflammatory potential of acysteine rich secretory protein (CRISP) from Bothrops jararaca. 2015. 103f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.

Envenomation by snakes from Bothrops genus is characterized by systemic and local effects such as coagulopathies, bleeding disorders, inflammation, pain and myonecrosis.The cysteine rich secretory proteins (CRISPs) are present in snake venoms and are widely distributed mammals, reptiles and amphibians. They are involved in certain biological activities, however many of their functions are still unknown. The aim of the present study was to isolate a CRISP from Bothrops jararaca and to biochemically/functionally characterize it by evaluating its involvement on inflammatory responses and on the complement system. The CRISP named BJ-CRP was isolated from Bothrops jararaca crude venom through the combination of three chromatographic steps: molecular exclusion on Sephacryl S-200 column, anion exchange chromatography on Source 15Q and reverse phase chromatography using C18 column. A high purity degree was obtained as confirmed by SDS- PAGE, showing a single band of 25.19 kDa, and by MALDI-TOF/MS showing a molecular mass of 24.6 kDa. The N-terminal sequence and analysis of tryptic peptides by MALDI TOF/ MS resulted in the determination of 100 amino acid residues, which had up to 96% similarity to sequences from other snake venom CRISPs that were previously described, but from other genus and snake species. The BJ-CRP did not have proteolytic activity on azocasein, fibrinogen or fibrin. It did not show coagulant or hemorrhagic activity, and also did not show activity on 13 different voltage dependent potassium channels when tested at a concentration of 1µM. Moreover, this toxin was able to induce an acute inflammatory response (1 and 4 hours after injection), observed by the recruitment of neutrophils and increase of interleukin-6 into the peritoneal cavity of mice. BJ-CRP and B. jararaca crude venom were capable of modulating the hemolytic activity promoted by the classical pathway of the complement system, and BJ-CRP also showed direct action on some complement system components, such as C3 and C4 as evaluated by SDS-PAGE and Western blot. The present work describes the purification of BJ-CRP, the first CRISP isolated from a Bothrops snake venom. The results obtained showed to be promising and open up prospects in order to better understand the involvement of this class of toxins in the inflammatory response induced by Bothrops envenomation.

Keywords: CRISP, BJ-CRP, Bothrops jararaca, inflammatory potential, complement system. iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Foto da espécie Bothrops jararaca e distribuição da espécie Bothrops jararca no Brasil ...... 6

Figura 2. Vias de ativição do sistema complemento ...... 20

Figura 3. Isolamento e preparação dos oócitos de Xenopus laevis ...... 40

Figura 4. Oócitos de Xenopus laevis demonstrando o desenvolvimento dos estágios de I a VI ...... 41

Figura 5. Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200 ...... 44

Figura 6. Cromatografia de troca aniônica da fração F ...... 45

Figura 7. Cromatografia de fase-reversa em coluna C18 da fração Q3 ...... 46

Figura 8. Determinação da massa molecular da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS) a 12% ...... 48

Figura 9. Determinação da massa molecular da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca por espectometria de massas...... 48

Figura 10. Focalização isoelétrica da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca em gel de poliacrilamida a 7% ...... 49

Figura 11. Comparação entre as sequências parciais de aminoácidos da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca ...... 50

Figura 12. Atividade fibrinogenolítica da BJ-CRP em eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS) a 10% ...... 51 iv

Figura 13. Atividade fibrinolítica da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca...... 52

Figura 14. Avaliação da atividade hemorrágica ...... 53

Figura 15. Recrutamento de células após a administração da BJ-CRP em diferentes concentrações...... 55

Figura 16. Recrutamento de células após a administração da BJ-CRP em diferentes intervalos de tempos ...... 56

Figura 17. Dosagem da citocina IL-6 no lavado peritoneal ...... 57

Figura 18. Gráficos representativos da cinética da lise das hemácias através do sistema complemento por meio do qual o valor do t½ é calculado ...... 58

Figura 19. Efeito da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca sobre a atividade hemolítica da via clássica do sistema complemento humano...... 59

Figura 20. Análise de componentes específicos do sistema complemento por Western blot .... 60

Figura 21. Avaliação por eletroforese em gel de poliacrilamida dos componentes do sistema complemento isolados ...... 61

Figura 22. Análise eletrofisiológica da BJ-CRP em 13 diferentes canais para potássio dependentes de voltagem (Kvs) ...... 62

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Diferentes classes de toxinas encontradas na peçonha de Bothrops jararaca ...... 8

Tabela 2. CRISPs isoladas de peçonhas de serpentes ...... 13

Tabela 3. Análise da recuperação proteica da BJ-CRP ...... 47

Tabela 4. Resíduos obtidos na determinação da estrutura primária da BJ-CRP ...... 49

Tabela 5. Avaliação da atividade coagulante da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca ...... 54

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AEG - Glicoproteína epididimal ácida BCA - Ácido bicinconínico BPP - do inglês “bradykinin-potentiating peptide” ou peptídeo potenciador de bradicinina (PPB) BSA - Albumina de soro bovino C4BP - Fator C4 Binding protein CAP - Cysteine Rich Secretory Protein (CRISP), Antigen 5 (Ag5) and Pathogenesis-Related (PR1) Proteins cDNA - Ácido desoxirribonucleico complementar CD59 – Protectina CETA - Centro de extração de toxinas animais CEUA - Comitê de Ética no Uso de Animais CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência CNG - Canal dependente de nucleotídeo cíclico CR1 - do inglês “complement receptor 1” ou receptor de complemento tipo 1 CRD - Domínio rico em cisteína CRISP - Do inglês “cysteine rich secretory protein” ou proteína secretada rica em cisteína cPLA2- Fosfolipase A2 dependente de cálcio DAF - do inglês“decay accelerating factor” ou fator acelerador de degradação DALYs - Disability Adjusted Life Years DAB - 3,3‟– Diaminobenzidina EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético FH - Fator H FI - Fator I HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência ICR - Região reguladora de canais iônicos Ig – Imunoglobulina IL - Interleucina LAAO - L-aminoácido oxidase LCP - Lavado da cavidade peritonial MAC - Complexo de ataque à membrana MALDI-TOF - Ionização e dessorção a laser assistida por matriz com ionizador por tempo de voo MASPs - Serinoproteases circulantes associadas à MBL MCP - Do inglês “membrane co-factor protein” ou proteína cofator de membrana MBL - Lectina tipo-C ligante de manose vii

MS - Espectrometria de massas NK - Células Assassinas Naturais (Natural Killers-NK) OMS - Organização Mundial de Saúde PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilaminda PAF - Fator de ativação plaquetária PAMPs - Padrões Moleculares Associados a Patógenos PBS - Salina tamponada com fosfato PDF - Produto de degradação do fibrinogênio/fibrina pI - Ponto isoelétrico PSA - Persulfato de amônio PITC - Fenilisotiocianato

PLA2- Fosfolipase A2 PTH-aa - Feniltiohidantoína-aminoácido PVDF - Fluoreto de polivinilideno RNA - Ácido ribonucleico SC - Sistema complemento SD - Desvio padrão SDS - Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio SHN - Soro humano normal svVEGF- do inglês “snake venom vascular endothelium growth factor” ou fator de crescimento vascular endotelial de peçonha de serpente T½ - Tempo necessário (em segundos) para ocorrer a lise de 50% das hemáciaspresentes no meio reacional TBS - Salina tamponada com TRIS TEA-Ca-Mg - Tampão Trietanolamina-Ca2+-Mg2+ TEMED – Tetrametiletilenodiamina TC - Tempo de coagulação sanguínea TCA - Tempo de coagulação ativado TFA - Ácido trifluoroacético TNF – α - Fator de necrose tumoral α TP - Tempo de protrombina TPPA - Tempo de protrombina parcial ativada VA - Via alternativa do sistema complemento VC - Via clássica do sistema complemento VHC - Vírus da hepatite C VL - Via das lectinas do sistema complemento

SUMÁRIO

RESUMO ...... i ABSTRACT ...... ii LISTA DE FIGURAS ...... iii LISTA DE TABELAS ...... v LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...... vi

1. INTRODUÇÃO ...... 2 1.1. Ofidismo ...... 2 1.2. Serpentes ...... 3 1.3. O gênero Bothrops ...... 4 1.4. Bothrops jararaca ...... 6 1.5. Proteína secretada rica em cisteína (CRISP) de peçonha de serpentes ...... 9 1.6. O processo inflamatório e peçonhas de serpentes ...... 15 1.7. O sistema complemento e peçonhas de serpentes ...... 18 1.8. Canais iônicos e toxinas animais ...... 21

2. OBJETIVOS ...... 25 2.1. Objetivos gerais ...... 25 2.2. Objetivos específicos: ...... 25

3. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 27 3.1. Materiais ...... 27 3.1.1. Peçonha ...... 27 3.1.2. Animais ...... 27 3.1.3. Plasma humano ...... 27 3.1.4. Soro humano ...... 27 3.1.5. Outros reagentes ...... 28 3.2. Métodos ...... 28 3.2.1. Obtenção da CRISP da peçonha de Bothrops jararaca ...... 28 3.2.1.1. Exclusão molecular em Sephacryl S-200 ...... 28 3.2.1.2. Cromatografia de troca iônica ...... 29 3.2.1.3. Cromatografia de fase-reversa em coluna C18...... 29

3.2.2. Eletroforese em gel de poliacrilamina contendo dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE) ...... 29 3.2.3. Determinação da concentração proteica ...... 30 3.3. Caracterização bioquímica ...... 31 3.3.1. Determinação da massa molecular ...... 31 3.3.1.1. Determinação por espectometria de massas (MALDI-TOF/TOF) ...... 31 3.3.1.2. Determinação por SDS-PAGE ...... 31 3.3.1.3. Focalização isoelétrica (pI) ...... 32 3.4. Caracterização estrutural ...... 33 3.4.1. Determinação do N-terminal (Degradação de Edman) ...... 33 3.4.2. Sequenciamento por MALDI-TOF/TOF ...... 33 3.4.3. Alinhamento múltiplo ...... 34 3.5. Caracterização enzimática ...... 34 3.5.1. Atividade proteolítica sobre a azocaseína ...... 34 3.5.2. Atividade proteolítica sobre o fibrinogênio ...... 34 3.5.3. Atividade proteolítica sobre a fibrina ...... 35 3.6. Caracterização funcional ...... 35 3.6.1. Atividade hemorrágica ...... 35 3.6.2. Atividade coagulante ...... 35 3.6.3. Avaliação do potencial inflamatório ...... 36 3.6.3.1. Dosagem indireta de óxido nítrico (NO) pela reação de Griess ...... 36 3.6.3.2. Quantificação de proteínas ...... 37 3.6.3.3. Quantificação de citocinas através de ELISA ...... 37 3.6.4 Sistema Complemento ...... 37 3.6.4.1. Efeito das toxinas sobre o sistema complemento (SC) ...... 37 3.6.4.2. Ensaios de atividade hemolítica por método cinético ...... 38 3.6.4.3. Avaliação de componentes específicos por Western blot ...... 38 3.6.4.4. Avaliação de componentes isolados por eletroforese em gel de poliacrilamida ...... 39 3.6.5. Atividade sobre canais para potássio ...... 40 3.6.5.1. Medidas eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus laevis (Técnica de voltage- clamp com dois microeletrodos)...... 40 3.7. Análise dos resultados ...... 41

4. RESULTADOS ...... 43 4.1. Isolamento da proteína secretada rica em cisteína de Bothrops jararaca ...... 43 4.2. Determinação da massa molecular ...... 47

4.3. Focalização isoelétrica (pI) ...... 49 4.4. Determinação da estrutura primária ...... 49 4.4.1. Alinhamento múltiplo ...... 50 4.5. Atividade proteolítica sobre a azocaseína ...... 51 4.6. Atividade proteolítica sobre o fibrinogênio ...... 51 4.7. Atividade proteolítica sobre a fibrina ...... 52 4.8. Atividade hemorrágica ...... 52 4.9. Atividade coagulante ...... 54 4.10. Avaliação do potencial inflamatório ...... 54 4.10.1. Dosagem de citocinas, proteínas e NO ...... 57 4.11. Sistema Complemento ...... 57 4.11.1. Ensaios de atividade hemolítica por método cinético ...... 57 4.11.2. Avaliação de componentes específicos por Western blot ...... 59 4.11.3. Avaliação de componentes isolados por eletroforese em gel de poliacrilaminada ...... 60 4.12. Atividade sobre canais para potássio ...... 62 4.12.1. Medidas eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus laevis (Técnica de voltage- clamp com dois microeletrodos)...... 62

5. DISCUSSÃO ...... 64

6. CONCLUSÕES ...... 75

7. REFERÊNCIAS ...... 77

ANEXOS ...... 102

Introdução Introdução 2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Ofidismo Acidentes ofídicos afetam milhões de pessoas anualmente, sendo que no Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, no período de 2000 a 2013 foram notificados 360.506 acidentes e 1.487 óbitos. A maior incidência de casos concentra-se nas regiões Norte e Sudeste ultrapassando o número de 90.000 casos, porém o maior número de óbitos está registrado nas regiões Norte e Nordeste, ficando em torno de 500 óbitos no período mencionado (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Esse contraste pode ocorrer devido às diferenças de acesso ao tratamento em cada localidade, pois encontramos os mesmos gêneros distribuídos em todo o território nacional e, sendo o gênero o meio pelo qual se baseia o tratamento. Em 2009 a Organização Mundial de Saúde (OMS) acrescentou o envenenamento por serpentes à lista de doenças tropicais negligenciadas, pois assim como a malária, a tuberculose, a dengue e algumas doenças parasitárias, o risco de um acidente com serpentes está sempre presente, sendo que a mortalidade associada a acidentes peçonhentos é muito maior quando comparada a outras doenças tropicais negligenciadas (WILLIAMS et al., 2010). Em uma análise de âmbito mundial, sabe-se que o maior número de acidentes por serpentes encontra-se no Sul e no Sudeste da Ásia e na África subsaariana (CHIPPAUX, 1998; KASTURIRATNE et al., 2008). O DALYs (Disability Adjusted Life Years) é um indicador conhecido mundialmente que avalia a carga de uma doença. Na avaliação do envenenamento por serpentes, constatou-se um impacto elevado, pois a maioria dos acometidos são crianças ou jovens trabalhadores agrícolas que devido ao envenenamento evoluem com sequelas permanentes, sejam elas físicas e/ou psicológicas (HARRISON et al., 2009). Estimativas sobre a incidência, a morbidade e a mortalidade por acidentes ofídicos são baseadas muitas vezes em dados hospitalares que não retratam o verdadeiro impacto deste agravo, pois muitas pessoas acometidas não procuram atendimento adequado e utilizam-se de tratamentos tradicionais (WHO, 2010). O animal causador do acidente sempre deve ser identificado, pois ajudará no reconhecimento de espécies de importância médica em nível regional, auxiliando na indicação mais precisa do antiveneno a ser administrado. O tratamento para acidentes ofídicos consiste na infusão endovenosa de soro específico que depende do gênero da serpente, e quando há falta de soros específicos, o tratamento pode ser realizado por meio das associações de outros soros, porém este pode não ser capaz de neutralizar de maneira eficiente a ação da peçonha

Introdução 3

(BRASIL, 1998). A terapia com antiveneno baseia-se na neutralização das ações tóxicas dos diversos componentes da peçonha, reduzindo os efeitos sistêmicos causados pelo envenenamento (CARDOSO et al., 1993; JORGE; RIBEIRO, 1997). As toxinas presentes nas peçonhas de serpentes podem induzir uma série de efeitos fisiológicos no indivíduo acometido, como distúrbios neurotóxicos, cardiotóxicos, miotóxicos hemorrágicos, hemostáticos, coagulantes, ações nefrotóxicas e hepatotóxicas, que combinados podem levar a digestão/morte da presa ou vítima (CHIPPAUX; WILLIAMS, 1991; CALKOSINSKI et al., 2010). Os efeitos clínicos observados no envenenamento humano causado por peçonha de serpentes podem ser agrupados em categorias de acordo com a sua significância clínica: (1) paralisia flácida; (2) miólise sistêmica; (3) coagulopatia e hemorragia; (4) falhas e danos renais; (5) cardiotoxicidade e, (6) danos teciduais no local da picada (WHITE, 2004). Cada um desses efeitos pode causar diversos efeitos secundários, contribuindo potencialmente para danos locais do envenenamento e mortalidade (WHITE, 2005).

1.2. Serpentes As serpentes constituem um grupo de répteis que apresentam um longo corpo flexível, cabeça recoberta de escamas ou placas; olhos redondos, com pupila vertical ou circular; uma narina de cada lado da cabeça; boca com grande extensibilidade e fosseta loreal, um orgão termorreceptor posicionado entre os olhos e a narina (FRANCO, 2003). Serpentes peçonhentas apresentam pupilas em fenda; presas anteriores com orifício central ou sulco; fosseta loreal, sendo a cabeça destacada do corpo. A maioria possuem hábitos noturnos e são vagarosas (PINHO; PERREIRA, 2001). O Brasil apresenta uma fauna rica em serpentes, as quais estão atualmente divididas em 10 famílias: Anomalepididae (6 espécies), Leptotyphlopidae (14), Typhlopidae (6), Aniliidae (1), Tropidophiidae (1), Boidae (12), Colubridae (34), Dipsadidae (237), Elapidae (27) e Viperidae (28) (BERNARDE, 2011), contudo apenas as famílias Viperidae e Elapidae são consideradas peçonhentas, sendo os gêneros Bothrops, Crotalus e Lachesis pertencentes à família Viperidae e o gênero Micrurus pertencente à família Elapidae (MELGAREJO, 2003). Costa e Bérnils (2012) discutiram alguns argumentos contrários à nomenclatura de gêneros e famílias sumarizada por Bernarde (2011). Dos argumentos utilizados contra a nomenclatura, estão o fato da futura necessidade da republicação de materiais educativos e banco de dados, uma possível confusão de assimilação dessas alterações pelos profissionais

Introdução 4 não familiarizados com a taxonomia e os erros já existentes quanto ao uso de nomes populares para as serpentes brasileiras. A classificação das serpentes sofreu modificações nos últimos anos, devido à descoberta de novas espécies e novas informações taxonômicas (WHO, 2010; CARRASCO et al., 2012). Fernwick e colaboradores (2009) propuseram uma nova classificação para as serpentes do gênero Bothrops da família Viperidae. Esta foi dividida em cinco gêneros: Bothriopsis, Bothrocophias, Bothropoiodes, Bothrops e Rhinocerophis baseada em informações taxonômicas, dados moleculares e morfológicos, porém esta nova classificação ainda não está bem aceita na comunidade científica. A árvore filogenética de Fernwick e colaboradores (2009) é semelhante à de outros autores, como Parkinson e colaboradores (2002) e Wüster e colaboradores (2005), os quais concordam que Bothrocophias é um gênero válido, entretanto os autores também possuem opiniões divergentes. Parkinson e colaboradores (2009) preferem não realizar mudanças que afetem a nomenclatura e argumentam que são necessários maiores estudos. Já Wüster e colaboradores (2005) optaram por invalidar o gênero Bothriopsis. Serpentes da família Viperidae apresentam um complexo sistema de produção e estocagem da peçonha devido ao maior grau de especialização no aparelho venenífero (PINHO; PERREIRA, 2001). Nos acidentes ofídicos, a peçonha é injetada na vítima via seus dentes afiados e causa danos de forma grave. As serpentes usam a peçonha para imobilizar e matar suas presas, sendo o mecanismo de defesa de menor importância quando consideramos a composição do veneno (KARLSSON, 1979). As peçonhas de serpentes são constituídas por uma mistura de componentes biológicos que compreendem enzimas hidrolíticas, proteínas não enzimáticas, moléculas orgânicas e inorgânicas (AIRD, 2002). As toxinas presentes na peçonha de serpentes são resultados da duplicação de genes de proteínas ou peptídeos tipicamente usados em outras regiões do corpo e que são expressos na glândula de veneno (FRY, 2005). Os componentes da peçonha variam de acordo com a localização geográfica da serpente, as estações do ano, também em relação a espécie e a idade da serpente (CHIPPAUX; WILLIAMS, 1991; SHASHIDHARAMURTHY et al., 2002).

1.3. O gênero Bothrops O gênero Bothrops compreende diversas espécies, como: Bothrops jararaca (jararaca), Bothrops jararacussu (jararacussu), Bothrops alternatus (urutu-cruzeiro), Bothrops

Introdução 5 neuwiedi (jararaca-pintada), e Bothrops moojeni (caiçara) (MELGAREJO, 2003), e estão amplamente distribuídas por todo o território nacional (BRASIL, 2001). Peçonhas de serpentes do gênero Bothrops possuem ação proteolítica, coagulante e hemorrágica. A atividade proteolítica é derivada de frações heterogêneas da peçonha, como proteases, hialuronidases e fosfolipases, que atuam promovendo alterações no local da picada e proximidades, caracterizando uma atividade inflamatória aguda com a presença de edema, bolhas e necrose. A ação coagulante é caracterizada por distúrbios na coagulação através da ativação de fatores como protrombina e Fator X. O consumo de fatores de coagulação e a geração de produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina podem ocasionar a incoagulabilidade sanguínea. Na peçonha de filhotes, a atividade coagulante é predominante, assim, manifestações locais podem não existir ou serem discretas. A atividade hemorrágica ocorre devido às hemorraginas presentes na peçonha que provocam lesões na membrana basal dos capilares (FRANÇA; MÁLAQUE, 2003; FUNASA, 2001). O envenenamento botrópico causa inflamação, equimose, bolhas e necrose na região da picada. Sistemicamente ocorrem alterações na coagulação sanguínea e sangramento (RIBEIRO; JORGE,1997). Além do quadro clínico citado, podem ocorrer complicações locais, como necrose do local afetado e formação de abscesso; complicações sistêmicas, como choque e insuficiência renal aguda (IRA) (BRASIL, 2001). Os acidentes botrópicos são clinicamente classificados como leve, moderado ou severo, de acordo com as manifestações clínicas apresentadas. A classificação baseia-se no tamanho do edema local, no tempo de coagulação que se apresenta normal ou alterado, e na presença/ausência e grau de hemorragia apresentada (CARDOSO et al., 2009). O gênero Bothrops é responsável pela maioria dos acidentes ofídicos por serpentes peçonhentas no país. Apesar do gênero Crotalus apresentar maior porcentagem de letalidade, a maior porcentagem de morbidade fica atribuída ao gênero Bothrops (PINHO; PERREIRA, 2001; BERNARDE, 2011). A detecção sistêmica do envenenamento por Bothrops pode ser feita pelo ensaio imunoenzimático ELISA (THEAKSTONet al., 1992), e também pelos testes de tempo de coagulação sanguínea (TC), tempo de protrombina (TP), tempo de protrombina parcial ativada (TPPA), tempo de coagulação ativado (TCA) e aumento dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina (PDF) devido aos distúrbios relacionados com os fatores de coagulação ocasionados por esses acidentes (TAKAHIRA, 1999). O hemograma completo do paciente pode ajudar a detectar variações provenientes do envenenamento e avaliar a eficácia do tratamento. A dose de antiveneno administrada é baseada de acordo com a severidade dos sinais e sintomas apresentados pelo paciente (FRANÇA; MÁLAQUE, 2003), no entanto, o

Introdução 6 tratamento não é 100% eficaz no controle das manifestações locais, mas se mostra eficaz no controle de sintomas sistêmicos (GONÇALVES; MARIANO, 2000). Em casos de hemorragias locais ou sistêmicas a administração do antiveneno estabelece os níveis normais de plaquetas (SANTORO et al., 2008). O soro utilizado no tratamento botrópico é constituído pela mistura da peçonha de 5 espécies do gênero Bothrops: B. jararaca (50%), B. alternatus (12,5%), B. moojeni (12,5%), B. neuwiedi (12,5%) e B. jararacussu (12,5%), produzido a partir da imunização em cavalos (CARDOSO; YAMAGUCHI; SILVA, 2003).

1.4. Bothrops jararaca A serpente Bothrops jararaca é popularmente conhecida como jararaca e pertence à família Viperidae. Possui coloração variada, desde tons castanhos claros a preto, com manchas em forma de “v” invertido ao longo do corpo. Possuem tamanho médio de aproximadamente 1 metro. São vivíperas, alimentam-se de pequenos roedores e possuem hábitos noturnos. É característica das regiões sul e sudeste do Brasil, sendo responsável pela maioria dos casos de acidentes ofídicos (FRANÇA, MÁLAQUE, 2009) (Fig.1A). É encontrada em algumas localidades das regiões Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil (Fig.1B). Apresentam dentição do tipo solenóglifo, como qualquer serpente da família Viperidae, sendo capazes de injetar a peçonha armazenada em duas glândulas localizadas na parte posterior da mandíbula (JACKSON, 2007; VONK et al., 2008).

Figura 1. Foto da espécie Bothrops jararaca e distribuição da espécie Bothrops jararaca no Brasil. (A) Bothrops jararaca. Fonte: http://www.cobrasbrasileiras.com.br/viperidae.html; (B) Distribuição da espécie Bothrops jararca no Brasil. Fonte: BRASIL, 2001.

Introdução 7

A peçonha de Bothrops jararaca é constituída por diversos componentes, sendo que mais de 80% do peso seco é constituído pela fração proteica (ESCALANTE et al., 2003). A fração não proteica é representada por carboidratos, lipídeos, metais, aminas biogênicas, nucleotídeos e aminoácidos livres (FRANÇA; MÁLAQUE, 2009). A peçonha da serpente de B. jararaca pode provocar lesões no local da picada, tais como sangramento local, dor, aparecimento de bolhas e edema. Complicações também podem ocorrer levando a necrose do local. Os sinais sistêmicos incluem sangramentos, incoagulabilidade sanguínea e plaquetopenia (SANTORO et al., 2008). O indivíduo acometido também pode apresentar quadros de vômitos, sudorese, hipotensão arterial, insuficiência renal e choque (SANTORO et al., 2008; FRANÇA, MÁLAQUE, 2003; CARDOSO et al., 1993). Os primeiros estudos sobre a composição da peçonha de B. jararaca datam de 1949, quando pesquisadores observaram que ao incubar o plasma com a peçonha de B. jararaca, ocorria a geração de um fator hipotensor e espasmogênico para a musculatura lisa, o qual foi denominado bradicinina (ROCHA e SILVA; BERLADO; ANDRADE, 1949). A partir disso, várias toxinas foram identificadas na peçonha de B. jararaca e divididas em diferentes classes. Na tabela 1 podemos destacar algumas toxinas de diferentes classes presente na peçonha de B. jararaca.

Introdução 8

Tabela 1. Diferentes classes de toxinas encontradas na peçonha de Bothrops jararaca.

Classes Classificação Proteína Referência

BJ-PLA2 Serrano et al.,1999, 1 Fosfolipase A2 BJ-PLA2-I Araújo, 2014 KN-BJ1 e KN-BJ2 Serrano et al.,1998

2 Serinoprotease Bothrombina Nishida et al., 1994 TL-BJ Serrano et al., 2000

3 Lectina like Bothrojaracina cadeia A Zingali et al.,1993

4 Lectina do tipo C Proteína de ligação ao fator IX/X Mizuno et al.,1997

5 Lectina α-GPIb-BP Fujimura et al.,1995 Jararagina Maruyama et al., 1992a

6 Metaloprotease Bothrojaractivase Berger et al., 2008 Jararafibrase I Maruyama et al., 1992a

7 Nucleotidase NPP-BJ Santoro et al., 2009

Cada uma das famílias de proteínas presentes nas peçonhas do gênero Bothrops possuem características específicas. As metaloproteases, por exemplo, possuem participação nas atividades hemorrágica, fibrinogenolítica e colagenolítica (MARUYAMA et al., 1992b). As serinoproteases são capazes de agir na agregação plaquetária, coagulação sanguínea e na fibrinólise (SANO-MARTINS, SANTORO, 2003). O grupo das fosfolipases A2 presentes no gênero Bothrops desencadeiam uma reação inflamatória intensa com liberação de mediadores inflamatórios (OLIVEIRA, 2009) e também possuem atividade miotóxica (TEIXEIRA et al., 2003). Lectinas tipo-C estão relacionadas às atividades pró-coagulante e anticoagulante, também podem ser agonistas e antagonistas da ativação plaquetária (MORITA, 2004). Embora a peçonha de Bothrops jararaca seja alvo de vários estudos, a composição da peçonha ainda é pouco estudada. Estudos mostraram que o veneno de filhotes apresenta uma atividade coagulante sobre o plasma 12 vezes maior do que a observada em serpentes adultas dessa espécie (FURTADO et al., 1991). Menezes e colaboradores (2006) avaliaram de forma individual o proteoma da peçonha de 18 espécimes de Bothrops jararaca, de uma única ninhada, utilizando técnicas de eletroforese e avaliação da atividade proteolítica, demonstrando assim que a peçonha de fêmeas possui um perfil eletroforético mais

Introdução 9 homogêneo e uma maior atividade proteolítica sobre a caseína, quando comparada com a peçonha dos machos. Zelanis (2011) em uma análise proteômica demonstrou que a porcentagem de toxinas na peçonha de Bothrops jararaca possui variações dependentes do sexo e da idade das serpentes. Metaloproteases por exemplo, estão presentes na porcentagem de 53,2% nos filhotes, 29,9% nas serpentes adultas, 25,4% em adultos machos e 33,1% em fêmeas adultas; já as serinoproteases estão presentes na porcentagem de 3,3% nos filhotes, 8,1% nos adultos, sendo 8,6% nos adultos machos e 7,7% em fêmeas adultas. Em relação às CRISPs que serão abordadas posteriormente, foi demonstrado que as maiores porcentagens são encontradas nos filhotes (2,7%) e nas fêmeas adultas (1,5%) (ZELANIS, 2011). Uma análise transcriptômica da glândula da serpente Bothrops jararaca demonstrou 1,6% de CRISPs; 53,1% de metaloproteases; 28,5% de serinoproteases; 0,5% de LAAOs;

8,3% de lectina tipo-C; 0,7% de PLA2; 0,9% de inibidor de PLA2;6,2% de precursor de peptídeo potenciador de bradicinina (PPB) e 0,2% de svVEGF (fator de crescimento vascular endotelial de peçonha de serpentes) do total de transcritos (CIDADE et al., 2006). Toxinas presentes em peçonhas de serpentes já foram descritas como agentes terapêuticos. No caso da serpente Bothrops jararaca, um peptídeo potenciador de bradicinina foi descoberto através do estudo do envenenamento desta serpente, dando origem ao fármaco captopril utilizado para tratar a hipertensão (CUSHMAN, ONDETTI, 1991). Porém devido a escassez da peçonha e suas variações de composição, a alternativa foi sintetizar uma substância com a mesma fórmula da toxina para a produção do medicamento em massa. Peçonhas de serpentes são ricas em compostos bioativos, os quais podem ser estudados e posteriormente contribuírem para o desenvolvimento de novos fármacos, entretanto a ação conjunta das toxinas que compõem a peçonha de animais pode exercer intoxicação e afetar o sistema fisiológico de um indivíduo, não sendo adequada para o uso terapêutico (KOH; ARMUGAN; JEYASEELAN, 2006). A maioria das toxinas já descritas, isoladas da peçonha de Bothrops jararaca pertencem às classes das fosfolipases, metaloproteases e serinoproteases, sendo que até o presente momento não há dados na literatura referentes ao isolamento de uma CRISP da peçonha de Bothrops jararaca.

1.5. Proteína secretada rica em cisteína (CRISP) de peçonha de serpentes As CRISPs são proteínas amplamente distribuídas entre mamíferos, répteis e anfíbios. Apresentam massa molecular entre 20 e 30 kDa e uma sequência homóloga de aminoácidos contendo 16 resíduos de cisteína conservados que formam 8 pontes dissulfeto, sendo que dez

Introdução 10 desses resíduos de cisteína estão localizados na sua porção C-terminal (YAMAZAKI, MORITA, 2004; GUO et al., 2005). O nome CRISP é devido ao conjunto de resíduos de cisteína que residem na sua porção C-terminal, formando um domínio compacto (EBERSPAECHER et al., 1995). Com base em algumas estruturas tridimensionais já estudadas, as CRISPs apresentam dois domínios: o domínio N-terminal e o domínio C-terminal rico em cisteína (CRD) (GIBBS, O‟ BRYAN, 2007). O domínio N-terminal faz parte da superfamília de proteínas CAP (CRISPs, Antigen 5, Pathogenesis Related (PR-1) Proteins) e está envolvido na formação de uma estrutura em forma de fenda formando um sítio ativo que contém três pontes dissulfeto intramoleculares (HENRIKSEN et al, 2001; SHIKAMOTO et al., 2005), no entanto a função deste domínio ainda não está bem definida. Sabe-se que algumas CAPs estão relacionadas com agentes antifúngicos em plantas (NIDERMAN et al., 1995) e significantes alergenos em humanos (KING et al., 1978; LU et al., 1993). Já o domínio CRD contém duas sub-regiões, uma região dobrável composta por duas pontes dissulfeto cruzadas que formam um elo com o domínio CAP, e a região reguladora de canais iônicos (ICR) (GUO et al.,2005; SHIKAMOTO et al., 2005; GIBBS et al., 2006), a qual parece ser essencial para a atividade de bloqueio de canais dessas proteínas (WANG et al., 2005, 2006; ZHOU et al., 2008; SHIKAMOTO et al., 2005; GUO et al., 2005; GIBBS et al., 2006). A região N-terminal é mais conservada quando comparada com outras regiões da CRISP (OSIPOV et al., 2005). São proteínas de natureza básica, com exceção de uma CRISP (CRVP-25h-A) isolada da peçonha de Naja haje (OSIPOVet al., 2005), a qual apresenta caráter ácido. As CRISPs encontradas nos mamíferos estão distribuídas em 4 classes baseando-se na similaridade da sequência dos aminoácidos (CRISP 1; CRISP 2; CRISP 3 e CRISP 4 (KRATZSCHMAR et al., 1996; JALKANEM et al., 2005), porém autores como Sunagar e colaboradores (2014) descreveram somente três tipos, pelo fato da CRISP 4 ter sido descrita somente em ratos. A CRISP foi identificada pela primeira vez em epidídimo de mamíferos e recebeu o nome de glicoproteína epididimal ácida (AEG), também conhecida como CRISP 1 (KIERSZENBAUM et al., 1981), podendo ser encontrada também nos testículos, sendo sua função sugerida como maturação do esperma (KASAHARA et al., 1989) e inibição da fusão dos gametas (ELLERMAN et al., 2002). Estudos demonstraram que a CRISP 1 quando incubada com gametas de camundongos, ratos e humanos, seja ela nativa ou recombinante, é capaz de se ligar na superfície do ovo impedindo a fusão dos gametas (COHEN et al., 2000b, 2001; ELLERMAN et al., 2002), porém a CRISP 1 não afeta a ligação dos gametas, sugere-se que ela possui ação

Introdução 11 em eventos subsequentes que levam à fusão (COHEN, ELLERMAN, CUASNICU, 2000a, COHEN et al., 2001). Em experimentos com a epididymal sperm protein DE isolada por Cameo e Blaquier (1976) semelhante às outras CRISPs 1, foi demonstrado que as pontes dissulfeto são necessárias para a atividade biológica da proteína, pois quando a proteína foi reduzida e alquilada para evitar a restauração das pontes dissulfeto, observou-se a diminuição da capacidade da proteína de inibir a fusão dos gametas (ELLERMAN et al., 2002). Estudos mais recentes também demonstraram que a CRISP 1 de humanos pode ser futuramente considerada um método imunocontraceptivo, pois a imunização com a proteína em primatas produziu um elevado título de anticorpos, os quais demonstraram capacidade de entrar no trato reprodutivo masculino e também de se ligar às células in vivo, podendo assim interferir no processo de fertilização (ELLERMAN et al., 2010). A CRISP 2, também conhecida como TPX-1 e testis-specific protein 1 (KASAHARA et al., 1989) é expressada somente nos testículos, produzida e secretada a partir de células espermatogências nos vários estágios de diferenciação, a qual pode estar envolvida com a interação entre células espermatogênicas e células de Sertoli, pois observou-se uma redução de 50% na interação dessas células na presença de um anticorpo anti- TPX-1 (MAEDA, 1998), sendo esta interação necessária para que as células espermatogências se diferenciem, uma vez que as células de Sertoli proporcionam todas as condições necessárias para que ocorra a diferenciação de células durante a espermatogênese (FRANÇA, RUSSELL, 1998). Em uma análise de estrutura-função foi observado que resíduos de aminoácido da porção N- terminal dessa proteína eram suficientes para a atividade de adesão celular, enquanto a região rica em resíduos de cisteína da porção C-terminal eram dispensáveis (MAEDA, NISHIDA, NAKANISHI, 1991). A CRISP 3 (specific granule protein of 28 kDa; SGP 28) (KJELDSEN et al., 1996) indica uma possível relação com a defesa inata do hospedeiro, pois sua distribuição inclui: glândulas salivares (HAENDLER et al., 1993), grânulos de neutrófilos humanos (KJELDSEN et al., 1996), epidídimo, ovário, timo e cólon (KRATZSCHMAR et al., 1996), também pelo fato de sua expressão estar aumentada no câncer de próstata (KOSARI et al., 2002) e na pancreatite crônica (LIAO et al., 2003), no entanto seu papel na fisiopatologia dessas doenças ainda não foi confirmado. Recentemente, a CRISP 3 foi descrita por apresentar uma possível relação com o vírus da hepatite C (VHC), onde constataram que esta proteína inibe a fase inicial da infecção, ou seja, a entrada do vírus na célula hospedeira. Porém o mecanismo pelo qual ocorre essa inibição ainda não foi definido. Acredita-se que ela pode se ligar ao envelope do vírus impedindo assim sua fixação à receptores da célula hospedeira, ou pode se ligar a

Introdução 12 superfície da célula hospedeira interferindo com o processo de endocitose do vírus (LEE et al., 2014). A CRISP 4 isolada de ratos é expressada exclusivamente no epitélio do epidídimo de uma forma andrógeno dependente que começa na puberdade juntamente com a maturação do esperma. Possui alta similaridade com a CRISP-1 de humanos, podendo estar envolvida nos mesmos processos, porém a comparação dos padrões de expressão das CRISPs entre ratos e humanos torna-se complicado, uma vez que a estrutura dos epidídimos de cada um são diferentes (JALKANEN et al., 2005). A primeira CRISP identificada em répteis foi a Helothermine (HLX), isolada da saliva do lagarto mexicano Heloderma horridum horridum (MOCHCA-MORALES, MARTIN, POSSANI, 1990) responsável por modular canais iônicos, como canais de cálcio e potássio dependentes de voltagem, e receptores rianodina (MORRISSETTE et al., 1995; NOBILE et al., 1994 e 1996). Em relação às serpentes, Yamazaki e colaboradores (2003), isolaram CRISPs de diferentes espécies de serpentes, demonstrando assim que esta proteína possui grande distribuição entre as serpentes das famílias Viperidae e Elapidae de diferentes continentes. Na tabela 2 estão representadas algumas CRISPs isoladas de peçonha de serpentes.

Introdução 13

Tabela 2. CRISPs isoladas de peçonhas de serpentes.

Proteína isolada Espécie Referência Ophanin Ophiophagus hannah Yamazaki et al., 2003 catrin-1/ catrin-2 Crotalus atrox Yamazaki et al., 2003 Triflin Trimeresurus flavoviridis Yamazaki et al., 2002b Piscivorin Agkistrodon p. piscivorus Yamazaki et al., 2003 NA-CRVP1/NA-CRVP2 Naja atra Jin et al., 2003 Tigrin Rhabdophis t. tigrinus Yamazaki et al., 2002b Ablomin Agkistrodon blomhoffi Yamazaki et al., 2002b Latisemin Laticauda semifasciata Yamazaki et al., 2002b pseudechetoxin (PsTx) Pseudechis australis Brown et al., 1999 pseudecin (Pdc) Pseudechis porphyriacus Yamazaki et al., 2002a Stecrisp Trimeresurus stejnegeri Tu et al., 2004 TJ-CRVP Trimeresurus jerdonii Jin et al., 2003 CRVP-25h-A Naja haje Osipov et al., 2005 CRVP-23K Naja kaouthia Osipov et al., 2005 CRVP-24K Naja kaouthia Osipov at el., 2005 Inflamin Aipysurus eydouxii Barnwal e Kini, 2013 Natrin Naja atra Wang et al., 2010

Peçonhas de serpentes já demonstraram um potencial como novos agentes para o combate de doenças negligenciadas. Podemos citar a peçonha da serpente Bothrops moojeni, que demonstrou ser capaz de matar as promastigotas, mas não as amastigotas da leishmaniose in vitro devido a ação do peróxido de hidrogênio da L-aminoácido oxidase (LAAO) (TEMPONE et al., 2001) e a peçonha de Bothrops jararaca que demonstrou potencial para inibição do crescimento dos parasitas de Trypanosoma cruzi e de Leishmania major possivelmente relacionado com o comprometimento mitocondrial (GONÇALVES et al., 2002). Adade e colaboradores (2014) testaram a CRISP crovirin isolada da peçonha da serpente Crotalus viridis viridis quanto a sua atividade nos parasitas de Leishmania amazonensis, Trypanosoma cruzie Trypanosoma brucei rhodesiense, e constataram a atividade leishmanicida e tripanomicida principalmente contra as formas intracelulares, podendo então futuramente ser usada para o tratamento da Leishmaniose e da doença de Chagas, uma vez que ela também apresenta baixa toxicidade para as células hospedeiras. Lecht e colaboradores (2015) demonstraram que a CRISP denominada ES-CRISP, isolada da

Introdução 14 peçonha de Echis carinatus sochureki é capaz de inibir a angiogênese por meio da interação direta com células endoteliais, inibindo alguns fatores reguladores deste processo, podendo contribuir para a compreensão de mecanismos envolvidos na progressão da angiogênese. Em relação a outras possíveis atividades biológicas das CRISPs de serpentes, podemos citar a CRISP patagonin isolada da peçonha de Philodryas patagonienses, a qual demonstrou atividade miotóxica, pois quando injetada em ratos via intramuscular causou danos ao músculo gastrocnêmio, uma atividade ainda não descrita para as CRISPs. Quando administrada uma dose mais elevada, observaram fibras musculares necrosadas com desorganização do material miofibrilar juntamente com edema e uma reação inflamatória, devido à presença de um infiltrado polimorfonuclear, porém não foi observado hemorragia. A injeção de patagonin também não causou danos nos tecidos do cérebro, cerebelo, coração, fígado, baço e pulmão (PEICHOTO et al., 2009). Estudos sugerem que a maioria das CRISPs com funções já descritas estão envolvidas com o bloqueio de canais iônicos. Por exemplo, a helothermine (HLX) de Heloderma horridum horridum bloqueia canais para cálcio (NOBILE et al., 1996) e potássio dependentes de voltagem (NOBILE et al., 1994) e, receptores rianodina (MORRISSETTE et al., 1995). As CRISPs ablomim (Agkistrodon blomhoffi), latisemin (Laticauda semifasciata) e triflin (Trimeresurus flavoviridis) estão relacionadas ao bloqueio de canais para cálcio tipo-L, já tigrin (Rhabdophis t. Tigrinus) não demonstrou essa atividade. Opanin (Ophiophagus hannah), catrin-2 (Crotalus atrox) e piscivorin (Agkistrodon p. piscivorus) possuem uma baixa, mas significante inibição da contração das células do músculo liso devido às altas concentrações de potássio (YAMAZAKI et al., 2002b, 2003). Em relação aos canais CNG (canais dependente de nucleotídeos cíclicos), as CRISPs PsTx (Pseudechetoxin) de Pseudechis australise e Pseudecin (Pdc) de Pseudechis porphyriacus podem atuar como bloqueadoras, enquanto triflin (Trimeresurus flavoviridis), latisemin (Laticauda semifasciata), piscivorin (Agkistrodon piscivorus piscivorus) e tigrin (Rhabdophis t. tigrinus) não bloqueiam esse canal (BROWN et al., 1999; YAMAZAKI et al., 2002a; YAMAZAKI et al., 2003; ZAGOTTA, SIEGELBAUM, 1996). A comparação entre PsTx e Pdc demonstrou que elas se diferem em apenas sete resíduos de aminoácidos e bloqueiam o canal CNG com afinidades diferentes (YAMAZAKI et al., 2002a), o que sugere a existência de uma região específica nessas proteínas que pode ser crítica para a inibição do canal. Estudos demonstraram que algumas toxinas que inibem canais apresentam o resíduo Glu 186. Quando essas toxinas apresentam o resíduo Phe 189

Introdução 15 além do Glu 186 elas são consideradas fortes bloqueadoras, porém outros estudos ainda são necessários para confirmar tal suspeita (YAMAZAKI et al., 2003). Estudos com a toxina PsTx demonstraram que ela inibe o fluxo de corrente através dos canais CNG, funcionando como um bloqueador de alta afinidade pelo poro do canal (BROWN et al. (1999); (2003). Yamazaki e colaboradores (2002b) demonstraram que a CRISP ablomin é capaz de bloquear canais para potássio devido à inibição do potencial elétrico, bem como a contração, promovida pela interação de proteínas com receptores. O presente trabalho traz contribuições para o conhecimento mais aprofundado dessa família de proteínas amplamente distribuída, mas pouco caracterizada, e ainda destacar funções como indução do processo inflamatório e modulação do sistema complemento.

1.6. O processo inflamatório e peçonhas de serpentes A inflamação constitui um processo homeostático desencadeado pelo organismo com o objetivo de reduzir a lesão, isolar ou destruir o agente agressor após uma lesão tecidual ou infecção local (LEVY, 1996). Desencadeado o processo inflamatório, ocorre a ativação de mecanismos de reparo necessários para garantir o restabelecimento das funções normais do organismo (ROCHA e SILVA, 1978). A resposta inflamatória aguda pode ser dividida em imunidade inata, não imunológica, englobando os eventos que ocorrem localmente no interior dos tecidos, como os eventos vasculares e celulares; e a imunidade adquirida que contribui com a defesa do organismo por meio da produção de anticorpos, células T auxiliares e linfócitos T citotóxicos (TLASKALOVA-HOGENOVA et al., 2005). A imunidade inata é a primeira linha de defesa do organismo contra agentes infecciosos e suas principais células efetoras são os macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células NK (natural killers), proteínas do sistema complemento e citocinas (CRUVINEL et al., 2010). Macrófagos e neutrófilos possuem receptores responsáveis pelo reconhecimento de moléculas como lipopolissacarídeos, resíduos de manose e ácidos teicóicos, conhecidos como PAMPS (Padrões Moleculares Associados a Patógenos) que estão presentes na superfície dos microorganismos, ativando assim a resposta imune inata e conduzindo a fagocitose dos microorganismos (CRUVINEL et al., 2010; MEDZHITOV, JANEWAY, 1997). Esses receptores também podem ser encontrados nas células dendríticas, as quais são responsáveis pela captura e apresentação de antígenos para os linfócitos, já as células NK reconhecem e lisam células infectadas e também são responsáveis pelo recrutamento de macrófagos e neutrófilos (CRUVINEL et al., 2010).

Introdução 16

As alterações decorrentes do processo inflamatório são reguladas pela liberação imediata e sequencial de mediadores inflamatórios, os quais são produzidos principalmente por células inflamatórias (SHARMA, BUCHANAN, 1994). Os mediadores são responsáveis por promoverem os sinais característicos da resposta inflamatória: dor, calor, rubor e tumor, que podem vir acompanhados ou não de perda de função do tecido ou órgão afetado (ROCHA e SILVA, 1978). Os mediadores inflamatórios são classificados em: aminas vasoativas (histamina e serotonina), neuropeptídeos, mediadores derivados de lipídios (eicosanoides, leucotrienos e prostaglandinas), óxido nítrico, citocinas e quimiocinas, cascata de proteínas plasmáticas (fatores do complemento) e fator de ativação plaquetária (PAF) (KING, 2007). Em relação à sua liberação, são classificados como intermediários e finais. Mediadores intermediários são liberados no ínicio e durante o processo inflamatório, incluem as citocinas TNF-α e IL-1, a quimiocina IL-8 (CUNHA et al., 2008), fatores do complemento C3a e C5a (JANG et al., 2010), e bradicinina (FERREIRA et al., 1965; TONUSSI, FERREIRA, 1997), sendo responsáveis pela liberação de outros mediadores, sejam eles intermediários e/ou finais. Os mediadores finais são representados pelas prostaglandinas e eicosanoides, responsáveis pela dor (FERREIRA, 1973), tais como: histamina, serotonina, fator de agregação plaquetária (CEVIKBAS, STEINHOFF, IKOMA, 2010) e leucotrienos (CUNHA et al., 2003). As citocinas constituem um grupo de proteínas solúveis de curta atividade, são glicoproteínas e peptídeos produzidos por várias células imunes e células vasculares, que através de uma baixa concentração são capazes de ativar receptores específicos e modular as funções de células e tecidos. Diferentes tipos de células podem secretar algumas citocinas, e uma citocina específica também pode agir em vários tipos de células e desencadear várias atividades biológicas dependendo do tipo de célula, tempo e contexto (HIRANO, 1999). As citocinas podem ser divididas em pró inflamatórias, como é o caso da IL-6, IL-1 e TNF- α, as quais se caracterizam como uma potente defesa contra patógenos exógenos; e as citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10 que são importantes para a regulação do processo inflamatório e manutenção da homeostasia do organismo (HOWARD et al., 1993). Concomitantemente com os eventos celulares, ocorrem os eventos vasculares que compreendem a vasodilatação e o aumento da permeabilidade da vênula com consequente exsudação plasmática, promovendo um aumento local da concentração de mediadores de origem plasmática (ROCHA e SILVA, 1978). Inicialmente ocorre uma vasoconstrição, seguida de uma vasodilatação favorecendo o aumento do fluxo sanguíneo no local e promovendo sinais como calor e vermelhidão local. Mudanças estruturais na parede do vaso levam ao aumento da permeabilidade vascular e ao extravasamento de proteínas, evento pelo

Introdução 17 qual forma o edema (KOWAL-VERN et al., 1997; RANKIN, 2004; ROITT, BROSTOFF, MALE, 1999). Ocorre o aumento da viscosidade do sangue e a redução do fluxo sanguíneo, fazendo com que os leucócitos circulantes no interior do vaso migrem para a periferia, dando início ao processo de migração leucocitária (CONTRAN, KUMAR, COLLINS, 1999). Como dito anteriormente, a vasodilatação decorrente da inflamação faz com que o fluxo sanguíneo diminua, assim as células circulantes colidem mais frequentemente com as células endoteliais ativadas que expressam moléculas de superfície capazes de se ligarem aos leucócitos. Estes são então atraídos para a periferia do vaso e entram em contato com o endotélio (CRUVINEL et al., 2010) e, posteriormente participam da fagocitose e destruição de agentes patogênicos, levando à resolução do processo inflamatório (BROCHE, TELLADO, 2001). A migração dos leucócitos circulantes para o local da inflamação é dependente de moléculas endoteliais e mediadores quimiotáticos (SPRINGER, 1994; WEBER, 2003). Por outro lado, a resposta imune adquirida é estimulada pela exposição a certos agentes, aumentando a capacidade de defesa após cada exposição sucessiva e sempre “lembrando” do agente que o organismo entrou em contato (LAROSA, ORANGE, 2008). A imunidade adaptativa se divide em humoral, na qual anticorpos são secretados pelos linfócitos B, reconhecendo antígenos e os neutralizando, impedindo que infectem outras células, porém este tipo de imunidade atua somente contra patógenos extracelulares e toxinas, e a imunidade adquirida, a qual é mediada por linfócitos T que atuam contra patógenos intracelulares, osquais sobrevivem e se proliferam dentro dos fagócitos, não podendo, portanto, serem alcançados por anticorpos (MESQUITA et al., 2010). Peçonhas de algumas serpentes estão relacionadas com o processo inflamatório. As serpentes do gênero Bothrops apresentam diversos componentes na sua peçonha, que contribuem para os efeitos hemorrágicos e coagulantes (NEIVA et al., 2009; DE

ALVARENGA et al., 2011). As fosfolipases A2 (PLA2) presentes na peçonha são capazes de desencadear alguns efeitos inflamatórios como: aumento da permeabilidade microvascular, recrutamento de leucócitos nos tecidos, nocicepção e liberação de mediadores inflamatórios (TEIXEIRA et al., 2003). As metaloproteases são responsáveis pelos efeitos de origem inflamatória, mediada por metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos) no edema induzido pelo envenenamento (TEIXEIRA et al., 2005). Zychar e colaboradores (2010) demonstraram que metaloproteases, fosfolipases e serinoproteases presentes na peçonha de serpentes possuem participação na resposta inflamatória, sendo que a maior ação se deve às metaloproteases, que contribuem para os efeitos inflamatórios locais e

Introdução 18

nociceptivos. As fosfolipases A2 apresentaram um efeito menor, limitado a nocicepção, já as serinoproteases não contribuíram significativamente para a resposta inflamatória, mas seu papel não deve ser descartado. Em relação às CRISPs, Barnwal e Kini (2013) identificaram a CRISP inflamin a partir da biblioteca de cDNA da glândula da serpente Aipysurus eydouxii. Inflamin foi injetada na cavidade peritoneal de camundongos e demonstrou a ativação de cPLA2 (fosfolipase A2 dependente de cálcio) conduzindo a biossíntese de prostanóides e a indução de edema quando injetada na pata de camundongos. Wang e colaboradores (2010) isolaram a CRISP natrin da peçonha da serpente Naja atra, a qual demonstou atuação na regulação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais, participando assim do processo inflamatório. Contudo, ainda pouco se sabe sobre a participação das CRISPs no processo inflamatório causado pelo envenenamento por serpentes. Como há outros componentes na peçonha que também participam deste processo, suas funções precisam ser estudadas isoladamente.

1.7. O sistema complemento e peçonhas de serpentes O sistema complemento (SC) consiste em um conjunto de mais de 30 proteínas que interagem com outras moléculas do sistema imune de uma maneira altamente regulada para gerar componentes ativos com funções de promover a inflamação e destruir microorganismos invasores (WAGNER; FRANK, 2010; WALPORT, 2001). Suas proteínas são sintetizadas principalmente nos hepatócitos e nos monócitos (BURGER, 1988; COLE, COLTEN, 1988), já proteínas reguladoras ligadas à membrana são sintetizadas nas células que são expressas (CAMPBELL, 1988). A ativação do SC leva à formação de produtos de clivagem, como as anafilatoxinas C3a e C5a, que são importantes na iniciação da resposta inflamatória contra microorganismos invasores e na quimiotaxia dos leucócitos (HAAS, STRIJP, 2007). Além das anafilatoxinas, a ativação do sistema complemento também leva à formação do MAC (membrane attack complex), através da ligação de C5b a C6 e posteriormente a ligação com as últimas proteínas do SC (SIM, 1992). A ativação do sistema complemento pode ocorrer por três vias distintas dependendo do estímulo, são elas: via clássica (VC), via alternativa (VA) e via das lectinas (VL) (WAGNER; FRANK, 2010) (Fig. 2). Na via clássica (VC) um antígeno e um anticorpo específico (IgM ou IgG) se interagem formando um imunocomplexo que é reconhecido pelo componente C1. A ativação da via das lectinas (VL) ocorre pela ligação de uma lectina tipo-C ligante de manose (MBL, mannose-binding lectin) a glicoproteínas ou polissacarídeos

Introdução 19 encontrados na superfície de microorganismos. A ligação de MBL a serinoproteases circulantes associadas (MASP) forma um complexo que leva à clivagem dos componentes C4 e C2, resultando na geração de uma C3 convertase similar à da VC. A via alternativa (VA) é iniciada por hidrólise espontânea do componente circulante C3, independente do reconhecimento de patógenos por anticorpos. A ligação de proteínas específicas da VA levam a ativação de C3 que irá interagir com polissacarídeos e proteínas de superfície de células alteradas ou microorganismos para gerar o MAC (WAGNER; FRANK, 2010). As três vias tornam-se iguais e segue-se uma via comum quando o complexo C3 convertase é formado. Assim, ocorre a clivagem de mais moléculas de C3 e a formação do complexo C5 convertase que é capaz de clivar moléculas de C5 dando origem aos fragmentos C5a e C5b. Enquanto o fragmento C5a é uma importante anafilatoxina, o C5b se liga às últimas proteínas do SC (C6, C7, C8 e C9), resultando na formação do complexo de ataque à membrana (MAC) (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2011). As proteínas C6, C7, C8 e C9 não possuem atividade enzimática, apenas fazem parte da estrutura de formação do MAC, que se deposita na superfície das células, onde forma poros permitindo a livre passagem de água e íons, resultando no aumento do volume osmótico e a consequentemente ruptura das células (CARROLL; SIM, 2011). O sistema complemento é caracterizado como uma cascata enzimática capaz de gerar complexos que estão envolvidos com a anafilaxia, quimiotaxia, opsonização, remoção de imunocomplexos e a modulação da resposta imune (WALPORT, 2001). É fundamental que haja uma regulação precisa desse sistema a fim de evitar o consumo exagerado de proteínas do complemento e a ocorrência de danos às células hospedeiras, portanto paralelo à ativação do SC ocorre também o processo de regulação. A regulação pode ocorrer por meio de fatores plasmáticos, como o fator C4b Binding Protein (C4BP) que atua na via clássica e na via das lectinas; o Fator H (FH) que atua na via alternativa, os quais impedem a continuidade das três vias, pois aceleram o decaimento das C3 convertases e atuam como co-fatores do Fator I (FI) na clivagem dos fragmentos C3b e C4b (BLOM et al., 2002; MORGAN, HARRIS, 1999; RODRÍGUEZ DE CÓRDOBA et al., 2004), e também por meio de reguladores presentes na membrana das células, como o complement receptor 1 (CR1), o membrane co-factor protein (MCP), que atuam como co- fatores do Fator 1 na clivagem dos fragmentos C3b e C4b; o decay accelerating factor (DAF), responsável pelo decaimento de C3 e C5 convertase e a protectina (CD59) que inibe a incorporação do C9 ao complexo que posteriormente formaria o MAC (KIM; SONG, 2006).

Introdução 20

Figura 2. Vias de ativação do sistema complemento (WAGNER; FRANK, 2010).

Alguns compostos das peçonhas de animais são capazes de modular o sistema complemento, seja pela clivagem direta de um componente específico ou pela formação de complexos capazes de ativar a cascata do complemento (DIAS DA SILVA et al., 1995), porém essa atividade ainda é pouco estudada. A literatura nos mostra alguns exemplos de toxinas ou peçonhas que possuem atividades sobre o sistema complemento. A serinoprotease flavoxobin, isolada da peçonha da serpente Trimeresurus flavoviridis demonstrou ser capaz de ativar o sistema complemento, atráves da clivagem da molécula de C3 em dois fragmentos (YAMAMOTO et al., 2002). A glicoproteína oxiagin da peçonha de Naja oxiana demonstrou através de ensaios, que inibe a lise de eritrócitos e a formação da C3 convertase, pois impede a interação de C2 com C4b (SHOIBONOV et al., 2005). Já a peçonha de Crotalus atrox

Introdução 21 demonstrou ser capaz de gerar anafilatoxinas C3a a partir do componente C3 e C5a a partir dos componentes C5 (MAN, MINTA, 1977). Pidde-Queiroz e colaboradores (2013) demonstraram que a metaloprotease P-I de Bothrops pirajai ativa preferencialmente a via clássica do sistema complemento pela clivagem direta dos componentes C3, C4 e C5, gerando fragmentos biologicamente ativos. Na literatura não encontramos estudos de CRISPs relacionadas com o sistema complemento, sendo assim é de grande importância o seu isolamento e a caracterização funcional, bem como os estudos sobre o processo inflamatório e sobre a modulação do sistema complemento.

1.8. Canais iônicos e toxinas animais Os canais iônicos são formados por glicoproteínas de membrana que permitem a passagem seletiva de íons através de um poro. Esses canais respondem a estímulos elétricos, químicos, mecânicos, alterações da concentração de ligantes (neurotransmissores, peptídeos e hormônios) e mudanças de voltagem (HILLE, 1992). Canais iônicos sensíveis à voltagem são responsáveis pela geração e propagação de sinais elétricos em neurônios e outras células excitáveis; mudam sua conformação (abertos, fechados ou inativos) em função do potencial de membrana. Assim, ocorre a despolarização ou repolarização da membrana devido à passagem de correntes iônicas para dentro ou para fora das células (CATTERALL, 1984). Os canais para cálcio (Ca+) dependentes de voltagem estão presentes no sistema nervoso, endócrino e cardiovascular. Atuam regulando processos intracelulares, como: neurotransmissão e expressão gênica, liberação de hormônios e contração da musculatura cardíaca por meio do influxo do íon cálcio em resposta a despolarização da membrana (McDONOUGH, 2007). São canais formados por uma subunidade α1 tetramérica, responsável pela formação do poro do canal e por várias subunidades reguladoras que são responsáveis pelas propriedades eletrofisiológicas e cinéticas do canal (BELEBONI et al., 2004, ESCOUBAS, DIOCHOT, CORZO, 2000). Os canais para sódio (Na+) dependentes de voltagem são responsáveis pela geração e propagação do potencial de ação. São encontrados na maioria das células excitáveis (BELEBONI et al., 2004). São constituídos por proteínas transmembrana compostas de uma subunidade α e pelo menos 3 subunidades β. A subunidade α é o local onde existem sítios receptores para os agentes farmacológicos que agem nesse tipo de canal. As subunidades β são responsáveis pela dependência de voltagem e pela cinética de abertura do canal (CESTÈLE, CATTERALL, 2000).

Introdução 22

Os canais para potássio (K+) são proteínas que permitem o movimento de íons K+ através da membrana plasmática (JAN, JAN, 1992). Quatro tipos distintos de canais de K+ são identificados no músculo liso arterial, entre eles: canais para potássio sensíveis ao cálcio

(Kca), canais para potássio dependentes de voltagem (Kv), canais de potássio de retificação interna (Kir) e os canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP). Canais para potássio dependentes de voltagem (Kv) são importantes em alguns processos fisiológicos, como: ativação de linfócitos, liberação de neurotransmissores e excitabilidade celular (GUTMAN et al., 2005), são capazes de regular o potencial de membrana do músculo liso em resposta à estímulos despolarizantes, promovendo a repolarização do potencial de ação nas células excitáveis (NELSON, QUAYLE, 1995). Os canais para potássio são formados por mais de 40 tipos diferentes de canais, e classificados de acordo com sua homologia na sequência de aminoácidos em pelo menos 12 subfamílias (Kv1-Kv12) (GUTMAN et al., 2005). A subfamília Kv1 (Shaker) e seus subtipos (Kv1.1-Kv1.8) são os mais estudados, e encontrados no cérebro, coração, rim, pâncreas, pulmão, sistema nervoso periférico, retina, linfócitos, osteoclastos e células hematopoiéticas. A subfamília Shaw (Kv3.1-Kv3.4) pode ser encontrada principlamente no cérebro e interage com toxinas de anêmonas do mar. A subfamília Kv7 (Kv7.1-Kv7.5) é encontrada no coração, músculo esquelético e sistema nervoso central. Já a subfamília hERG (Eag) (Kv10, Kv11, Kv12) é pouco estudada, e encontrada principlamente no sistema nervoso central (MOUHAT et al., 2008). As toxinas animais possuem alta especificidade por certos subtipos de canais iônicos ou receptores de membrana. Como existem poucas drogas com ação específica sobre canais iônicos, esse mecanismo de ação das toxinas animais serve como ferramenta para elucidar o papel fisiológico ou patologias relacionadas aos canais iônicos e receptores de membrana (HARVEY et al., 1998). Existem dois mecanismos nos quais as toxinas animais atuam nos canais iônicos dependentes de voltagem. A toxina pode se ligar em alguma região do canal provocando mudanças conformacionais que alteram a abertura, fechamento e inativação do canal (WANG, STRICHARTZ, 1983), ou a toxina pode se ligar na porção extracelular do canal, causando obstrução do poro condutor e impedindo o fluxo de íons (GARCIA et al., 1991). A peçonha de aranhas do gênero Lasiodora já foi descrita com ações farmacológicas, como o bloqueio do canal para cálcio (Ca2+) do tipo-L e alteração da cinética e voltagem de canais para sódio (Na+) (KUSHMERICK et al., 2001). Alguns exemplos de toxinas de aranhas ativas em canais para sódio (Na+), são as μ-agatoxinas (μ-Aga I a μ-Aga VI), isoladas

Introdução 23 da peçonha da espécie Agelenopsis aperta (SKINNER et al., 1989). A toxina Argiotoxina 636 (Argiope sp.), que é capaz de inibir canais para potássio dependentes de ligantes e dependentes de voltagem (LEE, JOHN, WEISS, 1999). E a toxina denominada stromatoxina (ScTx1) isolada da peçonha da aranha caranguejeira africana Stromatopelma calceata (ESCOUBAS et al., 2002), que é um potente inibidor de canais para potássio dos subtipos Kv4.2 e Kv2.2. Toxinas presentes na peçonha do escorpião Tityus serrulatus também já foram descritas pela capacidade de atuar em canais para potássio (K+), como: Ts6, Ts7, Ts8, Ts9 e Ts15 (COLOGNA et al., 2001, MARCUSSI et al., 2011). As toxinas IpTxA e IpTxi (Pandinus imperator) isoladas por Valdivia e Possani (1998), e a toxina maurocalcina (Mca) do escorpião Maurus palmatus, isolada por Fajloun e colaboradores (2000) são exemplos de toxinas específicas para canais de cálcio (Ca+), elas ativam o receptor de rianodina (Ryr), um canal de liberação de cálcio intracelular. As toxinas escorpiônicas que atuam em canais para sódio (Na+) são divididas em dois grupos de acordo com seus efeitos farmacológicos, as toxinas α que agem diminuindo ou bloqueando o mecanismo de inativação desses canais, e as toxinas β que afetam a ativação do canal (JOVER, COURAUD, ROCHAT, 1980; COURAUD et al., 1982; CATTERALL , 1986). Em relação às serpentes, a toxina crotamina isolada da peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus, demonstrou atividade sobre canais de sódio (Na+) dependentes de voltagem (CHEYMOL, 1978a, 1978b; CHANG, TSENG, 1978). Ainda na peçonha de Crotalus durissus terrificus, a toxina isolada crotoxina demonstrou ser capaz de modular a corrente em canais de cálcio do tipo-L (ZHANG et al., 2010). Em relação às CRISPs, a toxina Natrin purificada da peçonha de Naja atra é conhecida por bloquear canais para potássio do subtipo Kv1.3 (WANG et al., 2006) e também canais para potássio ativados por cálcio (BKCa) (WANG et al., 2005). Yamazaki e colaboradores (2003) testaram a atividade de algumas CRISPs (ophanin, piscivorin, catrin-1 e catrin-2) sobre a contração da artéria caudal de ratos, e observaram que as CRISPs ophanin, piscivorin e catrin-2 demonstraram uma inibição dos canais para potássio em diferentes graus.

Objetivos

Objetivos 25

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos gerais O presente trabalho tem por objetivo o isolamento, a caracterização bioquímica, estrutural, enzimática e funcional, a avaliação do potencial inflamatório e a ação sobre o sistema complemento de uma proteína secretada rica em cisteína (CRISP) isolada da peçonha de Bothrops jararaca.

2.2. Objetivos específicos:

 Purificação de uma CRISP da peçonha de Bothrops jararaca pela associação de métodos cromatográficos.  Caracterização bioquímica/estrutural através da determinação da massa molecular, do ponto isoelétrico e da estrutura primária parcial da CRISP.  Caracterização enzimática através da determinação da atividade proteolítica sobre os substratos: azocaseína, fibrinogênio e fibrina.  Caracterização funcional através da determinação das atividades hemorrágica, coagulante e sobre canais iônicos.  Avaliação do potencial inflamatório.  Avaliação da atividade sobre o sistema complemento.

Materiais e Métodos

Materiais e Métodos 27

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Peçonha A peçonha de Bothrops jararaca foi doada pelo Instituto Butantan, obtida e processada no Laboratório de Herpetologia, da Divisão de Desenvolvimento Científico.

3.1.2. Animais Para a avaliação da atividade hemorrágica e do potencial inflamatório da CRISP, foram utilizados camundongos machos da linhagem Swiss e C57BL/6, respectivamente. Ambos os animais pesando de 20 a 25g, adquiridos do Biotério Central do campus de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo. Todos os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura (24C) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 h) com livre acesso à ração e água. Nos dias dos experimentos, os animais foram levados para a sala de experimentação por aproximadamente 1h antes de iniciar quaisquer tratamentos. A utilização e manutenção dos animais nos protocolos experimentais foram realizadas adotando as normas do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Campus de Ribeirão Preto - USP (Processo n° 2014.1.226.53.5).

3.1.3. Plasma humano O plasma humano utilizado nos experimentos de coagulação foi obtido a partir do sangue de 10 voluntários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, sadios na faixa etária de 20 a 40 anos, de ambos os sexos e que não receberam medicação durante dez dias anteriores aos experimentos. O sangue dos doadores foi colhido por punção venosa utilizando-se citrato de sódio 3,8% (9:1, v/v) como anticoagulante e, em seguida foi centrifugado a 5.000 xg por 10 minutos. O sobrenadante obtidofoi congelado a - 80ºC até a realização dos experimentos.

3.1.4. Soro humano O soro humano normal (SHN) utilizado nos ensaios sobre o sistema complemento foi obtido do sangue coletado de 10 voluntários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, sadios na faixa etária de 20 a 40 anos, de ambos os sexos e que não receberam medicação anti-inflamatória durante dez dias anteriores aos experimentos. O sangue dos

Materiais e Métodos 28 doadores foi colhido por punção venosa e deixado coagular em temperatura ambiente por 1 h, separando o soro do coágulo por centrifugação a 5.000 xg por 10 minutos a 4°C. O soro foi reunido em pools, separado em alíquotas e congelado a -80°C até a realização dos experimentos. O presente projeto está de acordo com os termos da Resolução nº 466/12, de 12 de dezembro de 2012 do Conselho Nacional de Saúde, do Ministério da Saúde e demais resoluções complementares à mesma e foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da FCFRP-USP (Processo n° 29889014.9.0000.5403).

3.1.5. Outros reagentes Os reagentes utilizados foram todos de grau analítico. Os demais materiais e equipamentos estão descritos na metodologia.

3.2. Métodos

3.2.1. Obtenção da CRISP da peçonha de Bothrops jararaca A CRISP foi isolada através da combinação de diferentes passos cromatográficos, iniciando pela exclusão molecular em Sephacryl S-200, seguida por cromatografia de troca aniônica, utilizando a coluna Source 15 Q em sistema ÄKTA™ purifier (GE Healthcare) e cromatografia de fase-reversa utilizando a coluna C18 em sistema HPLC. Todas as frações cromatográficas obtidas foram avaliadas quanto à composição proteica por eletroforese SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970) conforme descrito no item 3.2.2.

3.2.1.1. Exclusão molecular em Sephacryl S-200 A peçonha bruta de Bothrops jararaca (200 mg) foi suspensa em 2 mL de tampão bicarbonato de amônio (Ambic) 50 mM pH 8,0, centrifugada a 12.000 xg por 10 minutos em centrífuga EBA 12 (Hettich) e o sobrenadante límpido aplicado na coluna contendo resina de exclusão molecular Sephacryl S-200 (127 x 3,5 cm) previamente equilibrada à temperatura ambiente e eluída com o mesmo tampão. Foram coletados 3 mL/tubo em um fluxo de 15 mL/hora. A absorbância de todas as frações foi monitorada em 280 nm em espetrofotômetro Beckman DU-640. As frações foram reunidas, liofilizadas e armazenadas em freezer -20°C.

Materiais e Métodos 29

3.2.1.2. Cromatografia de troca iônica A fração liofilizada e identificada como pool F (50mg) obtida no processo de exclusão molecular (item 3.2.1.1) foi suspensa em 2 mL de tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,0 e centrifugada a 25.000 xg em centrífuga 5804 R (Eppendorf). O sobrenadante límpido foi aplicado à coluna de troca aniônica Source 15 Q (11,5x 2,6 cm), previamente equilibrada à temperatura ambiente com os tampões Tris-HCl 20 mM pH 8,0 (A) e Tris-HCl 20 mM pH 8,0 + NaCl 1M (B) em sistema ÄKTA™ purifier (GE Healthcare). A eluição das frações foi feita com tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0 (A) com gradiente linear de 0 a 1M de NaCl (B) em um fluxo de 60 mL/hora e coletadas frações de 3 mL/tubo. A absorbância de todas as frações foi monitorada em 280 nm. As frações foram reunidas, liofilizadas e armazenadas em freezer - 20°C.

3.2.1.3. Cromatografia de fase-reversa em coluna C18 A fração Q3 (25 µg) obtida da cromatografia de troca iônica (item 3.2.1.2) foi submetida à cromatografia de fase reversa em coluna C18 (Shimadzu®) utilizando sistema HPLC (Shimadzu®). A fração Q3 foi suspensa em solução de ácido trifluoracético (TFA) 0,1% (Solvente A), centrifugada a 12.000 xg por 10 minutos em centrífuga EBA (Hettich) e o sobrenadante aplicado no sistema HPLC utilizando o loop de 500 µL. A coluna foi previamente equilibrada com solução de ácido trifluoracético (TFA) 0,1% (Solvente A) e a eluição foi realizada no fluxo de 1 mL/min com gradiente de concentração linear de solvente contendo acetonitrila 50% e TFA 0,1% (Solvente B): 100% de solvente A (10 minutos), 0- 100% de solvente B (60 min) e 100% de solvente B (10 minutos).

3.2.2. Eletroforese em gel de poliacrilamina contendo dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE) As frações cromatográficas obtidas e a CRISP isolada foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamina de resolução de 12% (m/v) em condições desnaturantes, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS), de acordo com a técnica descrita por Laemmli (1970). Para o ensaio de atividade fibrinogenolítica foi utilizado gel de poliacrilamida na resolução de 10% (m/v). Para a avaliação dos componentes isolados do sistema complemento foram utilizados géis de poliacriliamida nas resoluções de 8% (m/v) e 10% (m/v). No sistema eletroforético os géis foram polimerizados em uma placa de vidro de tamanho 10,5 x 10,0 cm acoplada a uma cuba vertical contendo o tampão de corrida Tris- Glicina pH 8,3 (Tris Base- 25 mM; Glicina- 192 mM; SDS 0,1%) conectada a uma fonte de

Materiais e Métodos 30 energia (Electrophoresis Power Supply – EPS 601- GE Healthcare). Foram preparados dois géis de poliacrilaminda sendo um para separação, na resolução de 12% (m/v) contendo bis- acrilamida: acrilamida (1: 19 m/m) preparado em Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 e SDS a 10% e o gel de empilhamento, na resoluçãode 5% em acrilamida, que foi preparado em Tris-HCl 1 M pH 6,8 e SDS a 10%. As amostras foram acrescidas com 5 µL de tampão de amostra contendo Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8; Glicerol 10%; SDS 2% e azul de bromofenol 0,001% na ausência ou na presença do agente redutor β- mercaptoetanol 5%. Amostras com β- mercaptoetanol foram submetidas à fervura a 100 ºC por 4 minutos antes de serem aplicadas no gel. As amostras contendo tampão desnaturante em um volume final de 15 µL foram aplicados nos poços do gel para a corrida em 110 V e 10 mA por aproximadamente 2,5 horas. O gel foi corado em azul de coomassie G-250 a 0,1% (p/v) dissolvido em água: metanol: ácido acético (40:50:10, v/v) por 30 minutos e descorado com várias trocas sucessivas de ácido acético glacial a 7% (v/v). Como padrão de massa molecular foi utilizado Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific) de massa 14,4 a 116 kDa, com os padrões beta-galoctosidase (116 kDa), soro albumina bovina (66,2 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa), lactato-desidrogenase (35,0 kDa), REase Bsp98I (25,0 kDa), beta-lactoglobulina (18,4 kDa) e lisozima (14,4 kDa).

3.2.3.Determinação da concentração proteica A quantificação de proteínas foi realizada pela medida da absorbância a 205/280 nm baseada no método de Scopes (1974). A dosagem foi feita em amostras diluídas até a absorbância a 280 nm ficar na faixa de 0,2 a 0,8 nm. Em seguida, foi avaliada a absorbância a 205 nm na mesma faixa. Os valores de absorbância a 205 nm foram extrapolados de acordo com a diluição realizada e o cálculo foi feito através da equação:

[proteína] mg/mL= A205/[27,0 + 120 (A280/ A205)]

Onde: A205= Leitura da absorbância a 205 nm A280= Leitura da absorbância a 280 nm

A concentração proteica da recuperação foi determinada baseando-se no método do àcido bicinconínico (BCA) (SMITH et al., 1985) conforme descrito no protocolo do Kit utilizado, Pierce BA Protein Assay Kit. O ensaio é baseado na mudança de cor do meio, onde a absorbância medida a 562 nm é proporcional a concentração de proteína presente na amostra. Para a determinação da

Materiais e Métodos 31 quantidade proteica foi utilizada uma curva padrão da proteína albumina em diferentes concentrações.

3.3. Caracterização bioquímica

3.3.1. Determinação da massa molecular A massa molecular da CRISP isolada foi determinada tanto por migração eletroforética em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970) quanto por espectrometria de massas com ionização de matriz assistida por laser, com analisador por tempo de voo (MALDI-TOF MS).

3.3.1.1. Determinação por espectometria de massas (MALDI-TOF/TOF) As análises foram realizadas em espectrômetro de massas tipo duplo TOF com fonte MALDI (MALDI-TOF/TOF), modelo AXIMA Performance, Shimadzu Biotech, Manchester, UK) e os espectros de massa foram adquiridos no modo linear positivo, após calibragem do aparelho com padrões de proteína incluindo BSA, insulina, citocromo c, ribonuclease, apomioglobina e aldolase. As amostras foram diluídas em 50 µL de água Milli-Q e misturadas na proporção de 1:1 com a matriz composta de ácido sinapínico (10 mg/mL) em acetonitrila 50% e TFA 0,1%, e aplicadas na placa do MALDI. A faixa de massas moleculares avaliada foi de 3.000-100.000 m/z. Estas análises foram realizadas no Centro de Química de Proteínas doHemocentro de Ribeirão Preto em colaboração com o Prof. Dr. José César Rosa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.

3.3.1.2. Determinação por SDS-PAGE A estimativa da massa molecular em eletroforese SDS-PAGE, foi feita pela interpolação de uma curva logarítmica linear da massa molecular relativa das proteínas do padrão versus a distância de migração no gel. Como padrão de massa molecular foi utilizado Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific), de massa 14,4 a 116 kDa, com os padrões beta-galoctosidase (116 kDa), soro albumina bovina (66,2 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa), lactato-desidrogenase (35,0 kDa), REase Bsp98I (25,0 kDa), beta-lactoglobulina (18,4 kDa) e lisozima (14,4 kDa).

Materiais e Métodos 32

3.3.1.3. Focalização isoelétrica (pI) A focalização isoelétrica da CRISP foi realizada segundo método descrito por Vesterbeg (1972), com pequenas modificações. O gel foi preparado a 7% (m/v) em poliacrilamida (bis-acrilamida: acrilamida 0,8:30) contendo 10% (m/v) de sacarose, 1% (v/v) de anfólito pH 3,0-10,0 (Pharmacia Biotech), 0,17% (v/v) de Temed (Tetrametiletilenodiamina) e 0,075% (m/v) de persulfalto de amônio (PSA). A solução a ser polimerizada foi adicionada a um sistema constituído por uma placa fina de vidro de 18 x 11 cm com espessura de 0,14 cm, montada em duas placas grossas do mesmo tamanho fixadas por meio de pinças metálicas. Após a polimerização do gel, as placas grossas foram retiradas e a placa fina foi utilizada como suporte para o gel, que foi então colocado em uma placa de porcelana refrigerada (umedecida com glicerol) ligada a um banho na temperatura de 10 °C (sitema MultiphorTMII, GE Healthcare). Duas tiras de papel (Pharmacia Biotech) foram utilizadas para conectar o gel e os eletrodos de platina, sendo o cátodo embebido em uma solução de NaOH 1M e o ânodo em ácido fosfórico 1M. Os eletrodos de platina foram centralizados sobre as tiras de papel e o sistema foi então fechado. A fonte de alta voltagem (modelo Electrophoresis Power Supply EPS 3501 XL, GE Healthcare) foi ajustada para valores de 2000 V, 20 mA, 500 V.h para a realização de uma pré-focalização por 30 minutos. Em seguida, 10 µL da CRISP foram aplicados no centro do gel com a utilização de um pente e a focalização prosseguiu por aproximadamente 4 horas a 2000 V, 20 mA e 3000 V.h. Padrões de focalização isoelétrica (ficocianina pI 4,45; 4,65 e 4,75; β lactoglobulina B pI 5,1; anidrase carbônica bovina pI 6; anidrase carbônica humana pI 6,4; mioglobulina equina pI 6,8 e 7,0; hemoglobina A pI 7,1; hemoglobina C pI 7,5; lentil lectina pI 7,8; 8,0 e 8,2 e citocromo C pI 9,6 - IEF Standards, faixa de pI 4,45-9,6, Bio-Rad) foram corridos em paralelo à amostra nas mesmas condições. Após a focalização isoelétrica desprezou-se 0,5 cm das laterais do gel e tiras de 1,0 x 0,5 cm foram seccionadas do mesmo, sendo colocadas em tubos de ensaio 0,5 mL de água Milli-Q para leitura do pH após 12 horas em repouso. Estas tiras foram cortadas das laterais do gel intercaladamente, de forma a obter valores de pH para cada 0,5 cm do gel. Desta forma foi possível construir uma curva de pH versus a distância de migração no gel para o cálculo do pI da amostra. O gel foi fixado em solução de ácido tricloroacético a 20% (m/v) por 30 minutos e, após sucessivas lavagens com água Milli-Q, foi corado com azul de coomassie G-250 0,1% (m/v) dissolvido em água Milli-Q: metanol: ácido acético (40:50:10, v/v) e descorado em solução de ácido acético 10% e metanol 5%.

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3.4. Caracterização estrutural

3.4.1. Determinação do N-terminal (Degradação de Edman) A sequência N-terminal da proteína foi obtida pelo sequenciamento proteico através do método de degradação de Edman (EDMAN; BEGG, 1967), que consiste em três etapas: acoplamento, clivagem e conversão. Após os procedimentos de purificação, a proteína solúvel (20 pmol/ciclo de análise) foi aplicada diretamente em uma membrana de fibra de vidro (Wako, Japão). O Sequenciador Automático de Proteínas da marca Shimadzu (Sistema PPSQ-33A) procedeu à análise da sequência da proteína. O aminoácido derivado da reação com o PITC (fenilisotiocianato) foi convertido a PTH-aa (feniltiohidantoína-aminoácido), que foi então separado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando coluna de fase reversa e gradiente isocrático. A quantificação e identificação dos resíduos foram realizadas através da comparação com os tempos de retenção do padrão de aminoácidos (25 pmol) aplicado antes do sequenciamento da amostra. Cada resíduo particular foi identificado baseando-se no aumento significativo de concentração em relação ao ciclo anterior seguido por uma diminuição do sinal durante os ciclos subsequentes. O ensaio foi realizado no “Laboratório de Toxinas Animais” da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FCFRP-USP), sob coordenação da Profa. Dra. Eliane Candiani Arantes e análise da Dra. Karla de Castro Figueiredo Bordon.

3.4.2. Sequenciamento por MALDI-TOF/TOF A CRISP (10µg) foi submetida à digestão enzimática com as enzimas tripsina e endoproteinase Glu-C (V8 protease) de acordo com instruções do fabricante Promega®, e em seguida, foi ressuspendida em matriz contendo ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/mL) e aplicada manualmente na placa de MALDI Opti-TOF 384 (ABSciex), que foi então deixada em temperatura ambiente para cristalização completa da matriz. A amostra foi analisada utilizando um espectrômetro de massas MALDI-TOF/TOF (Applied Biosystems 4800-Plus). Os resultados gerados por MS foram comparados às sequências depositadas no banco de dados NCBI e Swiss-Prot utilizando os sites BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e MASCOT (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html) na tentativa de identificar sequências homólogas de proteínas para fins comparativos.

Materiais e Métodos 34

3.4.3. Alinhamento múltiplo O sequenciamento N-terminal e os fragmentos obtidos por espectrometria de massas da CRISP de Bothrops jararaca foram comparados com outras sequências de CRISPs, depositadas no banco de dados Protein Data Bank, por alinhamento múltiplo utilizando o programa ClustalX versão 2.0.11. (http://www.clustal.org/).

3.5. Caracterização enzimática

3.5.1. Atividade proteolítica sobre a azocaseína A atividade proteolítica foi testada utilizando a azocaseína como substrato segundo protocolo descrito por Bernardes e colaboradores (2008). Diferentes quantidades da enzima (30 e 60 µg) foram adicionadas a 1mL da solução de azocaseína (1 mg/mL) Tris-HCl 50 mM+ CaCl2 5 mM pH 7,6 e incubadas a 37 °C por 60 minutos. Em seguida foram adicionados 500 µL de ácido tricloroacético (TCA) 5% (m/v) para precipitar a azocaseína não degradada. Após 20 minutos as soluções foram centrifugadas e a absorbância do filtrado medido em 366 nm. Uma unidade de atividade foi definida como um aumento de 0,01 unidades de absorbância a 366 nm, expressando os resultados como atividade específica (U/mg).

3.5.2. Atividade proteolítica sobre o fibrinogênio Esta atividade foi determinada segundo a técnica descrita por Edgar e Prentice (1973), com algumas modificações de acordo com Bernardes e colaboradores (2008). A proteína (5 µg) foi incubadapor 1 hora a 37 ºC com a solução de fibrinogênio (2mg/mL). A reação foi interrompida com a adição de 6 µL de tampão Tris-HCl 0,05 M pH 6,5, contendo glicerol 10% (v/v), β-mercaptoetanol 10% (v/v), SDS 2% (v/v) e azul de bromofenol 0,05% (m/v), seguida por fervura a 100 °C por 4 minutos. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE a 10% como descrito no item3.2.2. O teste de inibição da atividade proteolítica foi realizado através da pré-incubação de 5 µL de EDTA (5 mM) com a CRISP separadamente por 30 minutos à 37 ºC, e em seguida incubada com a solução de fibrinogênio por 1 hora a 37 ºC. Ao término da incubação foi adicionado tampão desnaturante à amostra, sendo esta submetida à fervura por 4 min e aplicada no gel de eletroforese na presença de SDS.

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3.5.3. Atividade proteolítica sobre a fibrina O ensaio de atividade fibrinolítica foi realizado de acordo com método previamente descrito (LEITÃO; POLIZELLO; ROTHSCHILD, 2000), incubando-se diferentes quantidades (5, 10 e 20 µg) da CRISP em placas de Petri contendo fibrina. Foi preparada uma solução de fibrinogênio 0,3% (vol. final de 10 mL) e solução de agarose 0,95% sob aquecimento até a formação de um colóide transparente (vol. final = 10 mL), sendo que ambas as soluções foram preparadas em tampão barbital 50 mM, pH 4,6 contendo CaCl2 1,66 mM, MgCl2 0,68 mM, NaCl 94 mM e azida sódica 0,02%. Após o resfriamento da solução de agarose (± 40 ºC) foi adicionada a solução de fibrinogênio (fibrinogênio:agarose; 1:1; v/v). A mistura (fibrinogênio-agarose) foi coagulada com 100 µL de uma solução contendo trombina bovina (1 µg/µL), e a solução foi então vertida em placas de Petri para a coagulação. As placas contendo o coágulo foram mantidas a 4 ºC e após 30 min., com auxílio de uma ponteira, pequenas cavidades (5 mm de diâmetro) foram feitas sobre o coágulo de fibrina para a aplicação das amostras nas concentrações desejadas, em volume final de 30 µL, seguindo-se com incubação por 24 h à 37 ºC. A atividade fibrinolítica foi avaliada visualmente e quantificada em cm de acordo com os halos de lises produzidos, comparando- se com um controle positivo (peçonha bruta de Bothrops jararaca) e um controle negativo (PBS).

3.6. Caracterização funcional

3.6.1. Atividade hemorrágica A atividade hemorrágica foi realizada pelo método descrito por Nikai e colaboradores (1984). Os animais foram divididos em 3 grupos (n=2), 1 grupo controle negativo (50µL de PBS); 1 grupo controle positivo (10µg da peçonha/ 50µL de PBS) e 1 grupo teste que recebeu amostras contendo 15g da CRISP em 50L de PBS. As amostras foram injetadas intradermicamente no dorso de camundongos Swiss machos de 20 a 25g. Após 3h os animais foram eutanasiados, as peles removidas e foi observada a presença ou ausência de hemorragia.

3.6.2. Atividade coagulante A avaliação da atividade coagulante foi desenvolvida conforme metodologia descrita por Selistre; Giglio; Homsi-Brandeburgo (1990). Para avaliação da atividade coagulante 200µL de plasma citratado, obtido a partir de indivíduos saudáveis (item 3.1.1) foram misturados com 10 µL de PBS (controle negativo);

Materiais e Métodos 36

10 µg da CRISPe incubados a 37ºC. O tempo de coagulação (TC) foi cronometrado em segundos. Como controle positivo foi utilizado plasma (200L), com adição de 10g da peçonha bruta de B. jararaca.

3.6.3. Avaliação do potencial inflamatório Em grupos de 5 camundongos C57BL/6 machos, foram injetados via intraperitoneal, 300 µL da toxina CRISP em diferentes doses (2,0; 5,0 e 10,0 µg/animal) diluídas em PBS estéril. O grupo controle recebeu 300 µL de PBS estéril. Após 4 horas os animais foram submetidos à eutanásia pela instilação de CO2. Para a análise das células inflamatórias, a cavidade peritoneal foi lavada com 3 mL de PBS gelado. O lavado peritoneal foi coletado com auxílio de seringa e agulha estéril e transferido para tubos plásticos de 15 mL, centrifugados (Mega Fuge 16R, Thermo) a 200 xg por 10 min e em seguida mantidos em banho de gelo. O sobrenadante límpido foi estocado a -20°C para a dosagem de citocinas, e o pellet ressuspendido em 500 µL de PBS estéril gelado para a contagem de células totais e diferenciais. As células peritoneais totais (leucócitos) foram contadas em Câmara de Neubauer diluídas em solução de Turk (1/20). A contagem diferencial dos leucócitos em neutrófilos e células mononucleares foi feita com amostras de células do lavado peritoneal (100 µL), que foram concentradas em lâminas de microscópio utilizando citocentrífuga (Cytospin 3, Shandon Souther Products Ltd., UK), coradas com corante de Romanowsky e analisadas em microscópio óptico (Bioval), magnificação 400X. Foram contadas 100 células por lâmina e os resultados expressos pelas porcentagens médias de cada tipo observado (MENALDO et al., 2013; ZOCCAL et al., 2013).

3.6.3.1. Dosagem indireta de óxido nítrico (NO) pela reação de Griess

O óxido nítrico (NO) produzido pelas células se decompõe em nitritos (NO2) e nitratos

(NO3) que ficam presentes no sobrenadante do lavado peritoneal. A dosagem de NO2 foi feita pelo método de ensaio colorimétrico baseado na reação de Greiss (GREEN et al., 1981). Cem microlitros dos sobrenadantes do lavado peritoneal foram incubados com o mesmo volume do reagente de Greiss (mistura de 1:1 de uma solução de NEED 0,1% em

água destilada com uma solução de sulfanilamida 1% em H3PO4 5%) a temperatura ambiente.

A concentração de NO2 foi determinada usando um curva de 1 a 200 µM NaNO2. Os dados foram apresentados como µM/mL de NO2.

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3.6.3.2. Quantificação de proteínas Para se avaliar o extravasamento de proteínas, o lavado da cavidade peritoneal (LCP) foi centrifugado a 200 xg por 10 min, em centrífuga Mega Fuge 16R (Thermo) e o sobrenadante recolhido para a determinação da concentração proteica pelo método de Bradford, empregando o kit comercial (Pierce, Rockford, USA), conforme especificações do fabricante (ZOCCAL et al., 2013).

3.6.3.3. Quantificação de citocinas através de ELISA As citocinas (IL-6, TNF-α e IL-10) foram quantificadas nos sobrenadantes obtidos da centrifugaçãodo lavado da cavidade peritoneal (LCP) (item 3.6.3) através do ensaio imuno- enzimático (ELISA). Foram utilizados anticorpos específicos (purificados e biotinilados) e proteínas recombinantes, de acordo com instruções do fabricante (R & D Systems, MN, e PharMingen, San Diego, CA). A leitura da densidade óptica foi feita em 490 nm e a concentração de citocinas foi calculada a partir da curva padrão, construída com diferentes concentrações de cada citocina avaliada. Para a citocina IL-6 a concentração máxima da curva foi de 1.000 pg/mL e para as citocinas TNF-α e IL-10 a concentração máxima foi de 2.000 pg/mL. Os resultados foram expressos em pg/mL de proteína (ZOCCAL et al., 2013).

3.6.4. Sistema Complemento

3.6.4.1. Efeito das toxinas sobre o sistema complemento (SC) Os ensaios in vitro foram realizados para determinar os efeitos das toxinas sobre o sistema complemento por meio da atividade hemolítica promovida pelo soro humano normal (SHN) pré-incubado por 1 h a 37°C com diferentes concentrações da CRISP (6,25; 12,5; 25; 50; 100 µg/mL) ou da peçonha bruta de B. jararaca (25; 50; 100; 150; 200 µg/mL). Alíquotas de sangue de carneiro foram centrifugadas (Baby 206, Fanem) a 500 xg por 10 minutos, e o sedimento de hemácias obtido, foi então lavado com tampão trietanolamina (tampão TEA-Ca2+-Mg2+), pH 7,4 e gelatina 0,1%, preparando uma suspensão de hemácias a 5% contendo aproximadamente 1,2 x 109 células/mL. Em seguida, esta suspensão foi sensibilizada com hemolisina (anticorpo de coelho anti-hemácias de carneiro), obtido de acordo com Almeida e Fife (1976) na titulação de 1:800, para sensibilização máxima. A formação de um complexo antígeno-anticorpo (hemácias e hemolisa) é responsável pela ativação da via clássica do sistema complemento. A suspensão de hemácias sensibilizadas foi

Materiais e Métodos 38 mantida a 4°C por 15 minutos e a absorbância em 700 nm foi ajustada para 0,7-0,8 em espectrofotômetro (SpectraMax Plus, Molecular Devices).

3.6.4.2. Ensaios de atividade hemolítica por método cinético A atividade hemolítica foi determinada pela medida do tempo (em segundos) necessário para ocorrer lise de 50% das hemácias presentes no meio reacional (t½). Antes dos ensaios sobre o complemento, a CRISP de B. jararaca e a peçonha bruta foram investigadas quanto à capacidade de induzir hemólise direta, incubando-as com hemácias de carneiro na ausência de SHN. Os ensaios para a VC/VL foram realizados em microplacas de 96 poços, com os controles positivos sendo constituídos de 193 µL de tampão TEA-Ca2+ -Mg2+ + 7 µL de SHN (item 4.6.4.1), completando um volume final de 200 µL. Diluições seriadas da toxina em diferentes concentrações (6,25 a 100 µg/mL) e da peçonha (25 a 200 µg/mL) foram preparadas em tampão TEA-Ca2+-Mg2+, e em seguida 193 µL de cada diluição foram aplicados na microplaca, juntamente com 7 µL de SHN para perfazer um volume final de 200 µL. As placas foram mantidas a 37°C por uma hora, e após este período de incubação, foram adicionados 40 µL/poço de hemácias de carneiro sensibilizadas. As misturas reacionais foram homogeneizadas e a leitura das absorbâncias em 700 nm foi realizada imediatamente em microleitor (SpectraMax Plus, Molecular Devices).

3.6.4.3. Avaliação de componentes específicos por Western blot Para avaliar a atividade da CRISP sobre componentes específicos do sistema complemento (C3, C4 e Fator B), o SHN foi pré-incubado com diferentes concentrações (50, 100, 150 e 200 µg/mL) da toxina isolada ou da peçonha bruta de B. jararaca por 1 h a 37°C. A reação foi interrompida com a adição de EDTA 10 mM. Como controle positivo foi utilizado Zymosan (2 mg/mL). As amostras foram diluídas na proporção de 1:20 (C4 e Fator B) ou 1:60 (C3) em PBS, congeladas e armazenadas até a realização do Western blot. Para a realização do imunoblotting, 10 µL de cada amostra desnaturada com tampão contendo β-mercaptoetanol foram separados em géis de poliacrilamida 8% (C3 e Fator B) ou 10% (C4), conforme descrito no item 3.2.2. Nestes ensaios, foi utilizado o padrão de massa molecular Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Standards (Bio-Rad, #161-0375), composto por dez proteínas com massas moleculares entre 10 e 250 kDa. Após a corrida eletroforética, as amostras foram transferidas dos géis para membranas de PVDF (fluoreto de polivinilideno) por 2 h a 110V e 300 mA, utilizando tampão de

Materiais e Métodos 39 transferência contendo tris-hidroximetil aminometano 0,3%, glicina 1,44% e metanol 20%, pH 8,3. Decorrido este período, as membranas foram coradas com corante Ponceau S 0,1% em ácido acético para visualizar a transferência. Em seguida, as membranas foram lavadas com tampão de bloqueio contendo 5% de BSA em TBS (salina tamponada com Tris) por 2 h. Após este período, as membranas foram incubadas overnight em temperatura ambiente, sob agitação, com um dos seguintes anticorpos (marca Binding Site) diluídos 1:2000 em tampão de bloqueio: anticorpo policlonal de ovelha anti-C3, anticorpo policlonal de ovelha anti-C4 e anticorpo policlonal de ovelha anti-Fator B. Após a incubação, as membranas foram lavadas sob agitação por três vezes de 15 minutos cada com tampão de lavagem TBS contendo Tween 20, e incubadas com anticorpo secundário (conjugado peroxidase anti-ovelha IgG, marca Binding Site) diluído 1:3000 em tampão de bloqueio por 1 h. Após o tempo de incubação, as membranas foram novamente lavadas com tampão de lavagem, como descrito anteriormente. As membranas foram então reveladas por reação com o substrato de peroxidase DAB (3,3‟- Diaminobenzidine), conforme recomendações do fabricante (Sigmafast™).

3.6.4.4. Avaliação de componentes isolados por eletroforese em gel de poliacrilamida Para avaliar a atividade da CRISP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca sobre os componentes isolados do sistema complemento (C1, C3, C4 e Fator B) (Binding Site), 3 µg de cada um dos componentes foram incubados com diferentes concentrações das amostras (50 e 100 µg/mL) por 1 hora a 37ºC. Como controle negativo foi utilizado 3 µg do substrato. Para obter o volume final de 20 µL, foi adicionado PBS a cada uma das amostras. A reação foi interrompida pela adição de 3 µL de tampão desnaturante contendo β-mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas a 100ºC por 5 minutos e 20µL foram aplicados no gel de poliacrilamida a 10% para a corrida eletroforética conforme descrito no item 3.3.2. Como padrão de massa molecular foi utilizado Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific), de massa 14,4 a 116 kDa, com os padrões beta-galoctosidase (116 kDa), soro albumina bovina (66,2 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa), lactato-desidrogenase (35,0 kDa), REase Bsp98I (25,0 kDa), beta-lactoglobulina (18,4 kDa) e lisozima (14,4 kDa). O gel foi corado em azul de coomassie G-250 a 0,1% (p/v) dissolvido em água: metanol: ácido acético (40:50:10, v/v) por 30 minutos e descorado com várias trocas sucessivas de ácido acético glacial a 7% (v/v).

Materiais e Métodos 40

3.6.5. Atividade sobre canais para potássio

3.6.5.1. Medidas eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus laevis (Técnica de voltage- clamp com dois microeletrodos) Oócitos de Xenopus laevis foram isolados através de ovariotectomia parcial (Figs. 3A e 3B). Os animais foram anestesiados com tricaína 1 g/L. Após a retirada dos oócitos, os mesmos foram defoliculados por tratamento com solução de colagenase 2,5 mg/mL em solução ND96- livre de cálcio em pH 7,5 por 2 horas, 15-16 °C. Após o período de tratamento, os oócitos dos estágios V e VI da maturação foram selecionados para posterior injeção do cDNA (Figs. 3C e 3D).

Figura 3. Isolamento e preparação dos oócitos de Xenopus laevis. (A) Exemplar do Xenopus laevis. (B) Ovariotectomia parcial para retirada dos oócitos. (C) Seleção dos oócitos. (D) Injeção do cDNA dos canais de interesse nos oócitos. Fotos gentilmente cedidas pelo Laboratório de Toxicologia da Universidade Católica de Leuven.

Os oócitos nos estágios V e VI são identificados pelo tamanho e possuem cerca de 1- 1,3 mm (Fig.4). Os cDNA para canais para potássio foram sintetizados a partir dos plasmídeos linearizados utilizando kit de transcrição (T7 ou SP6 mMESSAGE mMACHINE, Ambion, USA). Os oócitos traduzem o cDNA injetado nas suas respectivas proteínas (canais para potássio), que são expressas na membrana celular dos mesmos, podendo então ser utilizados para os ensaios eletrofisiológicos.

Materiais e Métodos 41

Figura 4. Oócitos de Xenopus laevis demonstrando o desenvolvimento dos estágios de I a VI (ALLEN et al., 2007).

As medidas eletrofisiológicas foram conduzidas utilizando a técnica voltage-clamp com dois microeletrodos. Os registros foram realizados à temperatura ambiente (18-22°C) utilizando um amplificador Gene Clamp 500 (Axon Instruments, USA) controlados por um sistema de aquisição de dados Clampex10 (AxonInstruments, USA). As micropipetas foram confeccionadas a partir de capilares de vidro (borosilicato WPI 1B120-6) estiradas utilizando um estirador manual WPI. A resistência foi de 0,6 a 1,5 MΩ para os dois eletrodos. As correntes dos oócitos foram registradas 1-7 dias após a injeção do cDNA para os canais para potássio. Para os ensaios foi utilizada 1 µM da toxina. Os ensaios eletrofisiológicos utilizando a técnica de voltage-clamp com dois microeletrodos foram desenvolvidos pela Dra. Manuela Berto Pucca no Laboratório de Toxicologia da Universidade Católica de Leuven, Bélgica, coordenado pelo professor Dr. Jan Tytgat.

3.7. Análise dos resultados Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos pelas médias dos valores e desvios padrões (SD). A significância estatística dos resultados foi avaliada utilizando teste t de Student ou análise de variância (ANOVA “one-way”) seguida de teste de Tukey, considerando os valores de p < 0,05 como significativos por meio do software Graph Pad Prism 5.

Resultados

Resultados 43

4. RESULTADOS

4.1. Isolamento da proteína secretada rica em cisteína de Bothrops jararaca O isolamento da toxina BJ-CRP da peçonha de Bothrops jararaca foi realizado em três etapas cromatográficas (Figs. 5, 6 e 7). A Fig. 5A mostra o perfil cromatográfico obtido na exclusão molecular em Sephacryl S-200 da peçonha bruta de Bothrops jararaca, a qual foi desdobrada em 15 frações cromatográficas: A1; A2; B; C; D; E; F; F1; F2; G; G1; H; H1; H2 e I (Fig. 5A). A eletroforese SDS-PAGE das referidas frações selecionadas (F, F1 e F2) é mostrada na Fig.5B. A Fig. 6A mostra o perfil cromatográfico da fração F na etapa de troca aniônica em coluna Source 15 Q utilizando o sistema ÄKTA™ purifier (GE Healthcare), a qual resultou em 5 frações cromatográficas: Q1, Q2, Q3, Q4 e Q5. Foi realizada a eletroforese SDS-PAGE das frações (Fig. 6B), sendo então selecionada a fração Q3. A Fig. 7A mostra o perfil cromatográfico da fração Q3 obtida na cromatografia de fase-reversa em coluna C18, a qual corresponde à amostra de interesse, denominada BJ-CRP, uma CRISP, proteína secretada rica em cisteína isolada da peçonha de B. jararaca. O grau de pureza da BJ-CRP foi avaliado por eletroforese SDS-PAGE, a qual apresentou banda única (Fig. 7B).

Resultados 44

Figura 5. Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200. (A) Fracionamento da peçonha bruta de Bothrops jararaca em coluna contendo resina Sephacryl S-200 (127 x 3,5 cm), previamente equilibrada com tampão bicarbonato de amônio (AMBIC) 0,05M pH 8,0. Amostra: 200 mg de peçonha foi suspendida em 2,0 mL de Ambic 0,05 M, pH 8,0. A eluição foi realizada com o mesmo em tampão em um fluxo de 15 mL/hora, sendo coletados 3mL/tubo. A peçonha bruta foi desdobrada em 15 frações: A1; A2; B; C; D; E; F; F1; F2; G; G1; H; H1e I. (B) Eletroforese em gel de poliacrilamina em condições desnaturantes (SDS) a 12%. Linha1: Fração F; Linha 2: Fração F1, Linha 3: Fração F2.

Resultados 45

Figura 6. Cromatografia de troca aniônica da fração F. (A) Coluna Source 15Q (11,5 x 2,6 cm), previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0 (A) e Tris-HCl 20 mM + NaCl 1M pH 8,0 (B), em sistema ÄKTA™ purifier (GE Healthcare). Amostra: 50 mg da fração F (item 3.2.1.1) dissolvida em 2 mL do tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0. A eluição foi realizada em tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0 (tampão A) e com um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl (tampão B) no fluxo de 60 mL/hora, sendo coletado 3 mL/tubo. A fração F foi desdobrada em 5 novas frações: Q1; Q2; Q3; Q4 e Q5. (B) Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS) a 12%. Linha1: Fração Q1; Linha 2: Fração Q2; Linha 3: Fração Q3; Linha 4: Fração Q4; Linha 5: Fração Q5.

Resultados 46

Figura 7. Cromatografia de fase-reversa em coluna C18 da fração Q3. (A) Acoluna C18 foi previamente equilibrada com ácido trifluoracético (TFA) 0,1% (Solvente A) no sistema HPLC. Amostra: 25 µg da fração Q3 (item 3.2.1.2) dissolvida em 500 µL do Solvente A. A eluição foi realizada no fluxo de 1 mL/min com gradiente de concentração linear de solvente contendo acetonitrila 50% e TFA 0,1% (Solvente B): 100% de solvente A (10 minutos), 0-100% de solvente B (60 min) e 100% de solvente B (10 minutos). (B) Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS) a 12%. Linha 1: BJ-CRP na presença de β-mercaptoetanol; Linha 2:BJ-CRP na ausência de β-mercaptoetanol.

Resultados 47

A tabela 3 mostra o rendimento da BJ-CRP de acordo com os procedimentos de purificação utilizados no presente trabalho.

Tabela 3. Análise da recuperação proteica da BJ-CRP.

Etapa de purificação Proteína total (mg)a Rendimento (%) Peçonha Bruta b 404,13 100 Sephacryl S-200 (Fração F) 34,4 8,51 Source 15Q (Fração Q3) 2,53 0,63 CRISP (BJ-CRP) 0,36 0,09

a- As concentrações das proteinas foram obtidas pelo método de dosagem BCA (item 3.2.3). b- O valor de proteína total da peçonha bruta é referente ao aplicado em 2,5 procedimentos cromatográficos diferentes.

4.2. Determinação da massa molecular A massa molecular foi inicialmente determinada por eletroforese SDS-PAGE utilizando 10 µg da proteína na presença e na ausência do agente redutor β-mercaptoetanol (Fig.8A). A massa molecular estimada por meio da interpolação de uma curva logarítmica linear da massa molecular relativa das proteínas do padrão versus a distância de migração no gel (Fig. 8 B) foi de 25,19 kDa em condições redutoras. A massa molecular da BJ-CRP também foi determinada por MALDI-TOF/MS em modo linear, que mostrou a massa de 24,6 kDa (Fig.9).

Resultados 48

Figura 8. Determinação da massa molecular da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS) a 12%.(A) Linha 1: BJ-CRP na presença do agente redutor β-mercaptoetanol; Linha 2: BJ-CRP na ausência do agente redutor β-mercaptoetanol. (B) Curva logarítmica linear da massa molecular relativa das proteínas do padrão versus a distância de migração no gel pela qual foi calculada a massa molecular da BJ-CRP.

Figura 9. Determinação da massa molecular da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca por espectometria de massas. As análises foram feitas em espectrômetro de massas tipo duplo TOF com fonte MALDI (MALDI-TOF/TOF). Os espectros de massas foram adquiridos de modo linear positivo.

Resultados 49

4.3. Focalização isoelétrica (pI) A focalização isoelétrica permitiu estabelecer que a BJ-CRP é uma proteína de caráter ácido, sendo seu pI aproximado de 6,0 (Fig. 10), conforme determinado pela curva de pH versus a distância de migração no gel (resultados não mostrados).

Figura 10. Focalização isoelétrica da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca em gel de poliacrilamida a 7%. O pI foi calculado pela curva de pH versus a distância de migração no gel, como descrito no item 3.3.1.3. Linha 1: BJ-CRP; Linha 2: Padrão de focalização isoelétrica (IEF Standards, faixa de pI 4,45 - 9,6, Bio-Rad) que correram em paralelo à amostra nas mesmas condições.

4.4. Determinação da estrutura primária A estrutura primária parcial da BJ-CRP foi determinada pelos métodos de degradação de Edman e por espectometria de massas (MALDI-TOF/TOF), totalizando 100 resíduos de aminoácidos (Tabela 4). Primeiramente pela degradação de Edman (item 3.4.1.) obtivemos 55 resíduos de aminoácidos da BJ-CRP. Posteriormente a BJ-CRP foi clivada com as enzimas tripsina e endoproteinase Glu-C (V8 protease) (item 3.4.2.), onde através da clivagem com a enzima tripsina obtivemos 4 peptídeos trípticos, os quais foram analisados por MALDI-TOF/TOF.

Tabela 4. Resíduos obtidos na determinação da estrututra primária da BJ-CRP.

Peptídeos trípticos Resíduos da região amino-terminal

KPEIQNEIVDLHNSLR SVDFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRKSVNPTASNMLKMEWYPEA SVNPTASNMLK AANAERWAYR YGIGADPPNAVTGHYTQIVWYKSGPP CGDCPSACDNGLCTNPCTK

Resultados 50

4.4.1. Alinhamento múltiplo A sequência obtida pelos métodos de Degradação de Edman e MALDI-TOF/TOF foi comparada com outras sequências depositadas no banco de dados utilizando o programa Clustal 2.1 multiple sequence alignment (Fig. 11).

Identidade (%)

BJ-CRP ------SVDFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRKSVNPTASNMLKMEW Ch-CRPIa ------SVDFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEW 96 Og-CRPa MIAFIVLPILAAVLQQSSGSVDFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEW 95 Bs-CRP MIAFIVLPILAAVLQQSSGSVDFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEW 95 Dr-CRPK MIAFIVLPILAAVLQQSSGSVDFDSESPRRPEIQNEIVDLHNSLRRSVTPTASNMLKMEW 90 Dr-CRPB ------SVDFDSESPRKPEIQNEIVEFHNSLRRSVNPTASNMLKMEW 89 **********:********::*****:**.***********

BJ-CRP YPEAAANAERWAYR------Ch-CRPIa YPEAAANAERWAYRCIESHSPRDSRVLEGIKCGENIYMSPVPIKWTEIIHGWHGENKNFK Og-CRPa YPEAAANAERWAYGCIEEHSPRDSRVIEGIKCGENIYMSTNPRKWTEIIHAWHDEYKDFK Bs-CRP YPEAAANAERWAYGCIEEHSPRDSRVIEGIKCGENIYMSTNPRKWTEIIHAWHDEYKDFK Dr-CRPK YPEAAANAERWAFRCILNHSPYNSRVIGGIKCGENIYMSPYPMKWTAIIHEWHKEKKDFV Dr-CRPB YPEAAANAERWAFRCILDHSPYNSRVIGGIKCGENIYMSSNPIKWIEIIRKWHDEKKNFI ************:

BJ-CRP YGIGADPPNAVTGHYTQIVWYK------Ch-CRPIa YGIGAEPSNAVTGHFTQIVWYKSYRVGCAAAYCPSSKYSYFYVCQYCPAGNIRGKTATPY Og-CRPa YGIGADPSNAVIGHYTQIVWYKSYRIGCAAAYCPSLEYSYFYVCQYCPVGNIIGKTATPY Bs-CRP YGIGADPSNAVIGHYTQIVWYKSYRIGCAAAYCPSLEYSYFYVCQYCPAGNIIGKTATPY Dr-CRPK YGQGASPANAVVGHYTQIVWYKSYRSGCAAAYCPSSEYNYFYVCQYCPAGNIIGKIATPY Dr-CRPB YGKGANPSNAVVGHYTQVVWYKSYRIGCAAAYCPSSAYKYFYVCQYCPAGNIVGRTATPY ** **.*.*** **:**:****

BJ-CRP -SGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTK------Ch-CRPIa KSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTKEDKYSNCKSLVQQAGCQDKQMQSDCSAICFCQNKII Og-CRPa TSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTEENMFTNCDSMVQKRSCQDNYIKSKCPASCFCQNKII Bs-CRP TSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTEENMFTNCDSMIQKRSCQDNYIKSKCPASCFCQNKII Dr-CRPK TSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCSHHDEFTNCKDLVKQG-CHSNYLKTKCPASCFCHNEII Dr-CRPB KSGQPCGDCPSACDNGLCTNPCRREDVFTNCIDMAKGRSCQDNYMKLNCPAACFCRNEIK ** ****************** .

Figura 11. Comparação entre as sequências parciais de aminoácidos da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca. O alinhamento múltiplo das sequências foi feito utilizando o programa Clustal 2.1 multiple sequence alignment. (*) regiões totalmente conservadas; (:) variação/troca conservativa de um aminoácido; (.) variação/troca não conservativa de um aminoácido. Em amarelo estão destacados os resíduos de cisteína. Em ítalico estão destacados os peptídeos sinal. Em azul estão destacados os peptídeos obtidos por espectometria de massas. As sequências de aminoácidos da CRISP foram alinhadas com: Ch-CRPIa de Crotalus horridus (gi:190195313); Og- CRPa de Trimeresurus gracilis (gi:190195325); Bs-CRP de Bothriechis schlegelii(gi:190195305); Dr- CRPK de Daboia russellii (gi:190195321) e Dr-CRPB de Daboia russellii(gi:190195323).

Resultados 51

4.5. Atividade proteolítica sobre a azocaseína Para verificar uma possível atividade proteolítica da BJ-CRP sobre o substrato azocaseína, a amostra foi incubada com o substrato por 1 hora a 37°C. A proteína não apresentou atividade proteolítica sobre a azocaseína.

4.6. Atividade proteolítica sobre o fibrinogênio A BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca não demonstrou atividade proteolítica sobre o fibrinogênio bovino, visto que a proteína não degradou nenhuma das cadeias. Podemos verificar na Fig.12 que as cadeias Aα, Bβ e Yγ permaneceram inalteradas, diferentemente da BJ-CRP, a peçonha bruta foi capaz de degradar as cadeia Aα e parcialmente a cadeia Bβ do fibrinogênio.

Figura 12. Atividade fibrinogenolítica da BJ-CRP em eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS) a 10%. Determinação da atividade fibrinogenolítica da BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca. Linha 1: Controle negativo (Fibrinogênio - 8µg): bandas Aα, Bβ e Yγ); Linha 2: Fibrinogênio - 8µg + BJ-CRP - 5µg; Linha 3: Fibrinogênio - 8µg + BJ-CRP - 5µg + Inibidor (EDTA); Linha 4: Controle positivo (Fibrinogênio - 8 µg + peçonha bruta - 5 µg); Linha 5: BJ-CRP - 5µg.

Resultados 52

4.7. Atividade proteolítica sobre a fibrina Os resultados da atividade fibrinolítica mostraram que a BJ-CRP não possui capacidade de degradar a fibrina no tempo de 18 horas. Diferente da CRISP, a peçonha bruta de Bothrops jararaca (controle positivo) degradou a fibrina, fato observado pela formação de um halo transparente ao redor de onde foi aplicada a amostra (Fig. 13).

Figura 13. Atividade fibrinolítica da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca. Poços 1, 2 e 3: BJ-CRP nas doses de 5, 10 e 20 µg. Poços 4, 5 e 6: PBS (controle negativo); Poço 7: peçonha bruta de Bothrops jararaca (controle positivo).

4.8. Atividade hemorrágica Não foi observada hemorragia na pele dos camundongos que receberam injeção intradérmica da toxina (Fig.14A). Também não se observou hemorragia no controle negativo (PBS) (Fig.14B). O grupo de camundongos que recebeu a peçonha de Bothrops jararaca apresentou hemorragia (Fig. 14C).

Resultados 53

Figura 14. Avaliação da atividade hemorrágica. (A) BJ-CRP. (B) controle negativo (PBS). (C) peçonha de Bothrops jararaca. As amostras foram injetadas intradermicamente no dorso de camundongos as doses de 15 µg e 10 µg da BJ-CRP e da peçonha bruta, respectivamente. O grupo pertencente ao controle negativo recebeu 50 µL de PBS. Após 3 horas os animais foram eutanasiados e suas peles removidas para a análise.

Resultados 54

4.9. Atividade coagulante A BJ-CRP demonstrou não possuir atividade coagulante quando incubada com plasma. Foi avaliado até o tempo de 16 minutos não havendo coagulação. O controle positivo, 10 µg de peçonha de Bothrops jararaca, coagulou no tempo médio de 28 segundos. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Tabela 5. Avaliação da atividade coagulante da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca. Tempo (s)* Tempo (s)* Tempo (s)* Média Peçonha bruta B. jararaca 31 s 29 s 24 s 28 s BJ-CRP Não coagulou Não coagulou Não coagulou - PBS (Controle negativo) Não coagulou Não coagulou Não coagulou -

*Tempo avaliado em segundos

4.10. Avaliação do potencial inflamatório Inicialmente, quando testadas as doses de 2, 5 e 10 µg/animal, observamos um aumento significativo (p<0,05) na contagem de células totais (leucócitos) em relação ao controle negativo (PBS), quando utilizamos a dose de 10µg/animal (Fig. 15A). Quando realizada a contagem diferencial de células, ou seja, a contagem de neutrófilos e células mononucleares, observou-se um aumento do número de neutrófilos em todas as doses testadas quando comparado ao controle negativo (Fig. 15B), sem alterações significativas no número de células mononucleares em todas as doses testadas em relação ao controle negativo (Fig. 15C) no lavado peritoneal de camundongos.

Resultados 55

Figura 15. Recrutamento de células após a administração da BJ-CRP em diferentes doses. (A) Recrutamento de leucócitos; (B) neutrófilos; (C) células mononucleares nas doses de 2, 5 e 10 µg/animal (n= 5 camundongos por grupo), verificados após 4 horas de tratamento. No controle negativo foi injetado PBS. (*) Variações significativas em relação ao controle negativo (p<0,05). Os resultados foram expressos pelas médias dos valores e desvio padrão (SD).

Com base nesses resultados, foi escolhida a dose intermediária de 5 µg/animal para a próxima etapa do experimento, onde realizamos o tratamento dos animais com a BJ-CRP em diferentes intervalos de tempo (1,4 e 24 h). Após injeção intraperitoneal da toxina nos camundongos, o número de células totais (leucócitos) (Fig.16A), com predominância de neutrófilos (Fig.16B) recrutados para a cavidade peritoneal foi significativamente maior (p<0,05) quando comparado ao controle negativo (PBS), após 1 e 4 horas de tratamento. Observamos a diminuição dessas células no

Resultados 56 tempo de 24h de tratamento, sugerindo então uma possível inflamação aguda. O número de células mononucleares (Fig.16C) não foi significativamente diferente (p<0,05) em relação ao controle negativo em nenhum dos tempos testados.

Figura 16. Recrutamento de células após a administração da BJ-CRP em diferentes intervalos de tempos. (A) Recrutamento de leucócitos e (B) neutrófilos no lavado peritoneal de camundongos induzidos pela BJ-CRP (5µg) após 1e 4 horas de tratamento (n= 5 camundongos por grupo) significativamente diferente (p<0,05) do controle negativo (PBS). A contagem de células mononucleares (C) não foi significativamente diferente (p<0,05) em relação ao controle negativo em todos os tempos avaliados. (*) Variações significativas em relação ao controle negativo (p<0,05). Os resultados foram expressos pelas médias dos valores e desvio padrão (SD).

Resultados 57

4.10.1. Dosagem de citocinas, proteínas e NO As dosagens foram todas realizadas nos tempos de 1, 4 e 24 horas de tratamento, utilizando a dose de 5 µg/animal da toxina. Na avaliação do exsudato inflamatório observamos que a dosagem da citocina IL-6 foi significativamente diferente (p<0,05) do controle negativo (PBS) (Fig. 17). As dosagens de IL-10, TNF-α, NO e proteínas, não mostraram nenhum valor significativamente diferente do controle negativo (resultados não mostrados).

Figura17. Dosagem da citocina IL-6 no lavado peritoneal. O lavado peritoneal obtido no tempo de 1 hora após a injeção da toxina foi centrifugado para a dosagem da citocina IL-6 através do ensaio imunoenzimático ELISA. (*) Variações significativas em relação ao controle negativo (p<0,05). Os resultados foram expressos pelas médias dos valores e desvio padrão (SD). BJ-CRP = CRISP 5 µg/animal.

4.11. Sistema Complemento

4.11.1. Ensaios de atividade hemolítica por método cinético Os testes sobre a atividade hemolítica foram realizados após verificar que a BJ-CRP e a peçonha bruta de Bothrops jararaca não induzem hemólise direta quando incubadas com sangue de carneiro na ausência de soro humano normal (SHN), que é a fonte dos componentes do sistema complemento (Fig.18A). Quando incubamos o soro com as hemácias verificamos conforme demonstrado na Fig.18B, a ocorrência de hemólise relacionada aos componentes do sistema complemento presentes no SHN. A incubação das

Resultados 58 toxinas com o soro e as hemácias (Fig.18C) sugere uma modulação do sistema complemento pelas toxinas, ou seja, observamos diferenças do valor médio de t½ do SHN após seu tratamento com as toxinas, comparando-o com o valor médio de t½ do SHN não tratado.

Figura 18. Gráficos representativos da cinética da lise das hemácias através do sistema complemento, por meio do qual o valor do t½ é calculado. (A) Controle 1: BJ-CRP/ peçonha bruta de B. jararaca e hemácias. (B) Controle 2: soro e hemácias. (C) Ensaio: toxina (BJ-CRP/ peçonha bruta de B. jararaca), soro e hemácias. O t/½ (s) mostra o tempo em segundos necessário para que ocorra a lise de 50% das hemácias pelo sistema complemento.

Quando testadas diferentes concentrações das amostras, observamos que somente as concentrações de 50 e 100 µg/mL da BJ-CRP foram significativamente diferentes (p<0,05) do controle (Fig.19A), enquanto que no ensaio realizado com a peçonha de Bothrops jararaca somente a concentração de 200 µg/mL foi significativamente diferente (p<0,05) do controle (Fig.19B).

Resultados 59

Figura 19. Efeito da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca sobre a atividade hemolítica da via clássica do sistema complemento humano. (A) BJ-CRP (B) Peçonha bruta. O controle representa o SHN incubado apenas com o tampão. t½ (s) mostra o tempo em segundos necessário para que ocorra a lise de 50% das hemácias pelo sistema complemento. (*) Variações significativas em relação ao controle negativo (p<0,05). Os resultados foram expressos pelas médias dos valores e desvio padrão (SD).

4.11.2. Avaliação de componentes específicos por Western blot Avaliamos a ação da BJ-CRP (50, 100, 150 e 200 µg/mL) por Western blot utilizando anticorpos específicos para os componentes C3 (Fig.20A), C4 (Fig.20B) e fator B (Fig.20C). Os resultados demonstraram que ocorreu modulação dos componentes do sistema complemento. Podemos visualizar a formação de fragmentos de ativação com massa entre 37 e 50 kDa para o componente C3, formação de fragmentos com massas entre 15 e 20 kDa para o componente C4, e fragmentos com massa entre 25 e 37 kDa para o componente Fator B. Esses fragmentos são correspondentes à possíveis produtos de clivagem de cada um desses componentes, fato deduzido pela comparação de massas moleculares.

Resultados 60

Figura 20. Análise de componentes específicos do sistema complemento por Western blot. (A) Análise da proteína C3 (cadeia α = 110 kDa; cadeia β = 75 kDa) e seus fragmentos. (B) Análise da proteína C4 (cadeia α = 97 kDa; cadeia β = 75 kDa; cadeia γ = 33 kDa) e seus fragmentos. (C) Análise da proteína Fator B (cadeia única= 93 kDa) e seus fragmentos. Padrão de massa molecular: Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Standards (Bio-Rad, #161-0375), massas moleculares entre 10 e 250 kDa; Linha 1: Controle negativo (SHN + PBS); Linha 2: Controle positivo (Zymosan + SHN + PBS); Linha 3: SHN + BJ-CRP - 50 µg/mL; Linha 4: SHN + BJ-CRP - 100 µg/mL; Linha 5: SHN + BJ-CRP - 150 µg/mL; Linha 6: SHN + BJ-CRP- 200 µg/mL.

4.11.3. Avaliação de componentes isolados por eletroforese em gel de poliacrilaminada A avaliação dos componentes isolados por eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada para compreender como ocorre a modulação das toxinas sobre os componentes do sistema complemento. Observamos que a BJ-CRP possui ação direta sobre os componentes

Resultados 61

C3 (fragmentos entre 35 e 45 kDa) (Fig.21A) e C4 (fragmentos em torno de 45 kDa) (Fig.21C) nas concentrações de 50 e 100 µg/mL. Já a peçonha bruta de Bothrops jararaca demonstrou ação direta sobre os componentes C3 (fragmentos abaixo de 14 kDa) (Fig.21A), C1 inibidor (consumo da cadeia do componente) (Fig.21B), C4 (fragmentos abaixo de 14 kDa e consumo da cadeia do componente) (Fig.21C) e Fator B (fragmentos em torno de 35 kDa) (Fig.21D) nas concentrações de 50 e 100 µg/mL.

Figura 21. Avaliação por eletroforese em gel de poliacrilamida dos componentes do sistema complemento isolados. (A) Componente C3 (cadeia α = 110 kDa; cadeia β = 75 kDa). (B) Componente C1 inibidor (cadeia única= 83 kDa). (C) Componente C4 (cadeia α = 97 kDa; cadeia β = 75 kDa; cadeia γ = 33 kDa). (D) Componente Fator B (cadeia única= 93 kDa). Linha 1: (3 µg do componente + BJ-CRP- 50 µg/mL + PBS); Linha 2: (3µg do componente + BJ-CRP - 100 µg/mL + PBS); Linha 3: (3µg do componente + peçonha- 50 µg/mL + PBS); Linha 4: (3µg do componente + peçonha- 100 µg/mL + PBS); Linha 5: (Controle BJ-CRP- 50µg/mL + PBS); Linha 6: (Controle peçonha- 50 µg/mL + PBS); Linha 7: Controle negativo (3µg do componente + PBS).

Resultados 62

4.12. Atividade sobre canais para potássio

4.12.1. Medidas eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus laevis (Técnica de voltage- clamp com dois microeletrodos) A Fig. 22 mostra o efeito da BJ-CRP isolada da serpente Bothrops jararaca em canais para potássio dependentes de voltagem (Kv). Foi realizado um extenso screening (13 diferentes Kvs), demonstrando que a BJ-CRP não é capaz de modular nenhum dos diferentes canais para potássio na concentração testada (1µM). Adicionalmente, foram realizados ensaios utilizando uma maior concentração da BJ-CRP no canal Kv1.3 (2 µM). No entanto, nenhum efeito foi observado.

Figura 22. Análise eletrofisiológica da BJ-CRP em 13 diferentes canais para potássio dependentes de voltagem (Kvs). Traços representativos na presença (*) ou ausência de 1 µM de BJ- CRP.

Discussão

Discussão 64

5. DISCUSSÃO

O presente trabalho descreve o processo de purificação e a caracterização bioquímica, estrutural, enzimática e funcional da primeira CRISP, denominada de BJ-CRP, da peçonha de Bothrops jararaca. O processo de purificação consiste em três etapas cromatográficas consecutivas: exclusão molecular em Sephacryl S-200 (Fig.5A), cromatografia de troca iônica em Source 15Q (Fig.6A) e fase reversa em HPLC utilizando a coluna C18 (Fig.7A). Na primeira etapa do isolamento, verificamos que as frações F, F1 e F2 apresentaram proteínas com massa molecular na faixa de 20 a 30 kDa, sendo estas então escolhidas para dar continuidade ao processo. Após análise das referidas frações em cromatografia de troca aniônica, a fração F foi escolhida pelo fato de apresentar melhor reprodutibilidade e rendimento. Das cinco frações obtidas na cromatografia de troca aniônica, escolhemos a fração posteriormente denominada Q3 pelo fato de apresentar maior grau de pureza. A última etapa cromatográfica em coluna C18 (Fig.7A) foi realizada tanto como processo de isolamento, como para verificação do grau de pureza da BJ-CRP. Os cálculos de rendimento para esse processo de isolamento indicam uma baixa quantidade de proteína, em torno de 0,09% (Tabela 3), sendo então repetido diversas vezes com o objetivo de se obter amostra para a realização da caracterização funcional e estrutural da proteína, que foi concentrada, desalinizada, liofilizada e armazenada em freezer - 20 °C até o momento da realização dos experimentos. Estes dados são compatíveis com os dados da análise proteômica realizada por Zelanis (2011), que demonstrou que em serpentes adultas, a maior porcentagem encontrada de CRISPs é de 1,5%. Na literatura, encontramos diferentes etapas cromatográficas utilizadas no processo de isolamento das CRISPs. Em 2002, Yamazaki e colaboradores isolaram as CRISPs triflin (Trimeresurus flavoviridis) por SP- Sepharose, Superdex 75 e Blue Sepharose; tigrin (Rhabdophis tigrinus tigrinus) em duas etapas cromatográficas, Q-Sepharose e Superdex 200; ablomin (Agkistrodon blomhoffi) foi isolada em Superdex 75, Q-Sepharose e SP-Sepharose; e latisemin (Laticauda semifasciata) nas etapas de Superdex 75, SP-Sepharose, Mono-S e heparin- Sepharose. Jin e colaboradores (2003) isolaram duas CRISPs da peçonha da serpente Naja atra. A primeira etapa foi realizada em SP-Sephadex G-25, a fração contendo a CRISP NA-CRVP1 foi isolada posteriormente em coluna C18 em sistema HPLC, e a fração contendo a CRISP NA-CRVP2 foi isolada posteriormente em Resource S. Outros exemplos de CRISPs são as catrin-1 e catrin-2 da peçonha de Crotalus atrox, isoladas pela combinação de etapas cromatográficas em Superdex 75, Q-Sepharose e SP- Sepharose; ophanin da peçonha de

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Ophiophagus hannah, isolada somente em duas etapas, Superdex 75 e Mono-Q; piscivorinde Agkistrodon piscivorus piscivorus, isolada em Superdex 75, SP-Sepharose e heparin- Sepharose CL-6B (YAMAZAKI et al., 2003). As CRISPs CRVP-23K e CRVP-24K de Naja Kaouthia, e CRVP-25hA de Naja haje foram isoladas inicialmente por cromatografia de gel filtração em Sephadex G50, seguida por cromatografia de troca catiônica em HPLC, sendo que após esta etapa as CRISPs CRVP-23K e CRVP-24K foram isoladas em cromatografia de fase reversa em coluna C18, e a CRISP CRVP-25hA em coluna de troca aniônica em HPLC devido ao seu cárater ácido (OSIPOV et al., 2005). A CRISP PsTx (Pseudechis australis) foi purificada por cromatografia de troca catiônica em sistema HPLC utilizando a coluna C5 e por cromatografia de fase reversa em C4 (BROWN et al., 1999). Stecrisp de Trimeresurus stejnegeri foi purificada em três etapas cromatográficas, coluna Q-Sepharose, SP-Sepharose e outra cromatografia em coluna Q-Sepharose (TU et al., 2004). A CRISP TJ-CRVP foi isolada em três passos cromatográficos, utilizando as colunas CM Sephadex, Sephadex G-100 e cromatografia de fase reversa em coluna C8. A CRISP pseudecin foi isolada através de duas etapas cromatográficas, utilizando as colunas Superdex 75 e SP-Sepharose. A CRISP natrin foi purificada em três etapas cromatográficas, Sephadex C25, DEAE-Sepharose e CM- Sepharose. Portanto o processo padronizado no presente trabalho está dentro do encontrado na literatura, pois foram utilizados 3 passos cromatográficos, os quais também foram utilizados para a purificação de outras CRISPS. Observa-se a grande prevalência de uso da cromatografia de fase reversa em HPLC. A análise proteômica da peçonha de B. jararaca realizada por Zelanis (2011), demonstrou que as maiores porcentagens de CRISP foram encontradas em filhotes (2,7%) e fêmeas adultas (1,5%). Entretanto, apesar destes relatos ainda não foi isolada nenhuma CRISP da peçonha de B. jararaca, o que reforça a importância e a contribuição do isolamento da CRISP, do presente trabalho para os estudos da composição da peçonha desta espécie e gênero. A BJ-CRP apresentou massa molecular de 25,19 kDa por eletroforese em gel de poliacrilamina em condições redutoras (Fig. 8), e massa de 24,6 kDa determinada por espectometria de massas (Fig.9), massa próximas à de outras CRISPs já isoladas, como latisemin (L. semifasciata) com massa de 24,2 kDa (YAMAZAKI et al., 2002b) e triflin (T. Flavoviridis) com massa de 24,7 kDa (YAMAZAKI et al., 2002b). A maioria das CRISPs descritas é de natureza básica, entretanto a BJ-CRP isolada apresenta natureza ácida, com pI aproximado de 6,0 (Fig.10). Assim como a BJ-CRP, a

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CRISP denominada CRVP-25h-A isolada da peçonha de Naja haje por Osipov e colaboradores (2005) também apresenta caráter ácido. No presente trabalho foi determinada parte da sequência primária da BJ-CRP através dos métodos de degradação de Edman (55 resíduos) e por espectometria de massas (4 peptídeos trípticos) (Tabela 4), totalizando 100 resíduos de aminoácidos. Os resíduos obtidos da BJ-CRP foram comparados com outras sequências depositadas no banco de dados NCBI (Fig. 11), os quais apresentaram similaridade de até 96% com outras sequências de diferentes espécies de serpentes, como: Crotalus horridus (gi:190195313); Trimeresurus gracilis (gi:190195325); Bothriechis schlegelii (gi:190195305) e Daboia russellii (gi:190195323), mas nenhuma pertencente ao gênero Bothrops. Peichoto e colaboradores (2009) obtiveram 14 resíduos de aminoácidos da CRISP patagonin, a qual demonstrou grande similaridade com a sequência N-terminal de outras CRISPs como, ophanin, tigrin, trifin e ablomin. As CRISPs são proteínas que apresentam em torno de 200 resíduos de aminoácidos em sua sequência. As CRISPs pseudechetoxin (PsTx) e pseudecin (Pdc), possuem 221 (YAMAZAKI, MORITA, 2004; OSIPOV et al., 2005) e 210 resíduos respectivamente (OSIPOV et al., 2005). Stecrisp e natrin possuem 221 resíduos de aminoácidos em suas sequências (TU et al., 2004). As CRISPs Latisemin e Triflin isoladas por Yamazaki e colaboradores (2002) apresentam 217 e 221 resíduos, respectivamente. Fox e colaboradores (2006) também descreveram sequências parciais isoladas da peçonha bruta de Bothrops jararaca que apresentam similaridade com sequências parciais da CRISP Stecrisp (Trimeresurus stejnegeri) isolada por Tu e colaboradores (2004) e Triflin (Trimeresurus flavoviridis) isolada por Yamazaki e colaboradores (2002). Cidade e colaboradores (2006) obtiveram 1,6% de CRISPs em relação ao total de transcritos em uma análise transcriptômica da glândula da serpente Bothrops jararaca. Em relação a outras espécies do gênero Bothrops, Neiva e colaboradores (2009) obtiveram 0,2% de CRISP do total de transcritos da serpente Bothrops atrox. Kashima e colaboradores (2004) obtiveram 1% de CRISP em relação ao total de transcritos da serpente Bothrops jararacussu e Junqueira de Azevedo e Ho (2002) obtiveram 0,6% de CRISP em relação ao total de transcritos da serpente Bothrops insularis. Analisamos a sequência obtida da BJ-CRP comparando-a com a análise transcriptômica da glândula da serpente Bothrops jararaca realizada por Cidade e colaboradores (2006) utilizando os programas ClustalX (http://www.clustal.org/) e Expasy (http://www.expasy.org), porém dentre os transcritos de CRISPs obtidos no estudo, não identificamos a sequência da BJ-CRP.

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A BJ-CRP isolada da peçonha de Bothrops jararaca não apresentou atividade nos ensaios proteolíticos realizados sobre a azocaseína, o fibrinogênio bovino (Fig.12) e a fibrina (Fig.13). Entretanto, na peçonha de Bothrops jararaca podemos encontrar algumas enzimas capazes de degradar as cadeias do fibrinogênio, como as serinoprotease jararassin-1, que age preferencialmente sobre a cadeia Bβ (VIEIRA et al., 2004) e KN-BJ, que degrada somente a cadeia Aα (SERRANO et al., 1998). Do gênero Bothrops, a metaloprotease não hemorrágica neuwiedase (Bothrops neuwiedi) age tanto na cadeia Aα como na cadeia Bβ do fibrinogênio (RODRIGUES et al., 2000). Em 2009, Peichoto e colaboradores também obtiveram resultados negativos para as atividades proteolíticas realizadas sobre a azocaseína e o fibrinogênio da CRISP Patagonin, isolada da peçonha da serpente Philodryas patagoniensis. A BJ-CRP não apresentou atividade hemorrágica (Fig.14A) e coagulante sobre o plasma (Tabela 5) independentemente das concentrações utilizadas, assim como a CRISP de Philodryas patagoniensis também não apresentou indução de hemorragia (PEICHOTO et al., 2009). Diferentemente da CRISP isolada, quando utilizamos a peçonha bruta de Bothrops jararaca no ensaio observamos a indução de hemorragia (Fig.14C), fato que pode estar relacionado com outros componentes presentes na peçonha que já foram descritos por interferir com a hemostasia, seja atuando na cascata de coagulação sanguínea ou sobre componenentes da matriz extracelular e do epitélio vascular (THEAKSTON, KAMIGUTI, 2002; SERRANO, MAROUN, 2005; MOURA-DA-SILVA, BUTERA, TANJONI, 2007) como algumas metaloproteases. As CRISPs TJ-CRVP (Trimeresurus jerdonii), NA-CRVP1 e NA-CRVP2 (Naja atra) foram isoladas por Jin e colaboradores (2003) e testadas quanto a suas atividades enzimáticas e biológicas. Tanto as atividades enzimáticas de proteólise, arginina esterase, fosfolipase, L-amino ácido oxidase e acetilcolinesterase, como as atividades biológicas de miotoxicidade, letalidade, coagulante, anticoagulante, hemorrágica, agregação plaquetária e atividade de inibição da agregação plaquetária mostraram resultados negativos. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a BJ-CRP de Bothrops jararaca participa do processo inflamatório. Após sua injeção na cavidade peritoneal de camundongos, observamos um aumento na contagem de células totais (leucócitos) (Fig. 15A) e neutrófilos (Fig.15B) em relação ao controle negativo (PBS), quando utilizamos a dose de 10 µg/animal. Nos estágios iniciais da inflamação aguda, os neutrófilos são as células predominantes. Os leucócitos (células totais) circulantes migram seletivamente e em número significativo para o tecido inflamado no decorrer do processo. Já as células mononucleares são observadas mais tardiamente no processo inflamatório, assim como também estão presentes nos

Discussão 68 processos crônicos (BROCHE, TELLADO, 2001). Por esta razão, para avaliar o potencial inflamatório desta toxina em diferentes tempos de tratamento (1, 4 e 24 h) selecionamos a dose de 5 µg/animal da BJ-CRP baseando-se na contagem de neutrófilos. Verificamos que a BJ-CRP é capaz de induzir uma resposta inflamatória quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos na dose de 5µg/animal nos tempos de 1 e 4 horas, pois foi observado o recrutamento de leucócitos (Fig.16A) com predomínio de neutrófilos (Fig.16B) para o local da injeção, indicando portanto uma possível inflamação aguda. Peçonhas de serpentes do gênero Bothrops já foram relatadas por sua capacidade de induzir a migração de leucócitos nos locais em que foram aplicadas, como é o caso das peçonhas de B. asper (GUTIÉRREZ, CHAVES, CERDA, 1986), B. erythromelas, B. alternatus (FLORES, ZAPPELLINI, PRADO-FRANCESCHI, 1993), B. jararaca (ZYCHAR et al., 2010) e B. atrox (MOREIRA et al., 2012). Em relação ao potencial inflamatório induzido pela peçonha da serpente Bothrops jararaca, Carneiro e colaboradores (2002) demonstraram que esta peçonha causa alterações locais e sistêmicas, caracterizadas por uma inflamação aguda com recrutamento de leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios, quando esta foi injetada na cavidade peritonial de camundongos. Zamuner e Teixeira (2002) demonstraram que a peçonha é capaz de induzir a expressão de moléculas de adesão de leucócitos promovendo então o fluxo de neutrófilos para o local da inflamação. Petricevich e colaboradores (2000) demonstraram o aumento dos níveis de citocinas e óxido nítrico quando injetadas as peçonhas de Bothrops jararaca e Bothrops asper em camundongos. Dentre as enzimas presentes na peçonha de Bothrops jararaca, a metaloprotease Jararhagina-C (MOURA-DA-SILVA et al., 2003) demonstrou ser capaz de induzir o recrutamento de leucócitos e o aumento da concentração de citocinas IL-6, IL-1β e TNF-α, com níveis máximos de 2 a 4 horas após o tratamento (CLISSA et al., 2006). Natrin, a CRISP isolada da peçonha da serpente Naja atra, demonstrou possuir um importante papel no processo inflamatório, atuando na regulação da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais (WANG et al., 2010). Após a injeção intraperitoneal da BJ-CRP, também foi observada a produção da citocina IL-6 no lavado peritoneal dos camundongos, a qual foi significativamente diferente do grupo controle no tempo de 1 hora após o tratamento (Fig.17), sendo assim nossos resultados condizem com a literatura, uma vez que a citocina IL-6 está relacionada com a iniciação e manutenção da inflamação (FIELDING et al., 2008), aumentando seus níveis logo no início desse processo.

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A citocina IL-6 é uma citocina pró-inflamatória produzida por várias células, como: linfócitos B e T, monócitos, fibroblastos, células endoteliais e células tumorais (ATAIE- KACHOIE, POURGHOLAMI, MORRIS, 2013), sendo responsável pela migração dos neutrófilos para os tecidos, ativando sua maturação, regula moléculas de adesão das células endoteliais envolvidas na adesão de leucócitos ao endotélio, participa de processos fisiológicos como resposta imune, mecanismos de defesa e hematopoiese (SUWA et al., 2002; TEIXEIRA, CURY, MOREIRA, 2009; KISHIMOTO, 2006). Esta citocina também apresenta um efeito regulatório, pois age como um feedback negativo, inibindo a produção de TNF-α, o que limita a resposta inflamatória aguda (GADIENT, PATTERSON, 1999). A produção de citocinas já foi descrita em vítimas de acidentes botrópicos e crotálicos, e em alguns modelos experimentais (BARRAVIEIRA et al., 1995; LOMONTE, TARKOWSKI, HANSON, 1993; PETRICEVICH et al., 2000), porém a participação das citocinas no processo inflamatório ocasionado por esses acidentes ainda não está bem esclarecida, não se sabe se os mediadores contribuem para as manifestações do envenenamento ou se somente refletem o grau de danos nos tecidos (STONE et al., 2013). Já foram relatadas elevadas concentrações das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-8 e TNF-α no plasma de indivíduos que sofreram envenenamento por serpentes (CROCKER et al., 2010; ACIKALIN, GOKEL, 2011; AVILA-AGUERO et al., 2001). Em relação aos modelos experimentais, estudos utilizando camundongos tratados com peçonhas de diferentes espécies de serpentes demonstraram o aumento da citocina IL-6, do óxido nítrico (NO), IL-5, IL-4, IL-10 e TNF-α, além de prostaglandinas e leucotrienos (MOREIRA et al., 2007, 2012; HERNANDEZ CRUZ et al., 2008; GALVÃO NASCIMENTO et al., 2010). Em relação à citocina TNF-α, não observamos alterações significativas na sua dosagem no lavado peritoneal dos camundongos em nenhum dos tempos de tratamento. O TNF-α também é uma citocina pró-inflamatória com importante papel na resposta imune de infecções e do câncer, e na regulação do processo inflamatório (ADERKA, 1996). É produzida por macrófagos e monócitos ativados, entre suas atividades estão a indução da degranulação de neutrófilos, a diferenciação de macrófagos, liberação de leucotrienos e estimulação da migração leucocitária para o local da lesão (VASSALLI, 1992; ULLOA, TRACEY, 2005). Estudos já demonstraram que indivíduos picados por serpentes da espécie Bothrops jararaca tiveram a produção de TNF-α no local da picada, porém o soro desses indivíduos mostraram resultados negativos para esta citocina (BARRAVIEIRA et al., 1995; CARNEIRO et al., 2002).

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A citocina IL-10 também não foi detectada no lavado peritoneal dos camundongos. IL-10 é uma citocina anti-inflamatória, que quando produzida por macrófagos e neutrófilos faz com que diminua a produção de citocinas pró-inflamatórias (OBERHOLZER, OBERHOLZER, MOLDAWER, 2002; RANGEL-SANTOS et al., 2004). Portanto, podemos sugerir que seria necessário realizar a dosagem de IL-10 em um maior tempo de tratamento, devido a produção mais tardia. Não obtivemos resultados significativos nas dosagens de NO e proteínas, os quais podem estar relacionados com outros componentes presentes na peçonha de Bothrops jararaca. O NO (óxido nítrico) é produzido pela conversão da L-arginina em L-citrulina mediada pela enzima óxido nítrico sintetase (NOS), a qual apresenta duas isoformas com relevância no processo inflamatório, são elas: NOS endotelial (eNOS) que é dependente de Ca2+ e produz pequenas quantidades de NO, e a NO induzível (iNOS) que geralmente não é detectada no tecido vascular livre de injúria, mas é expressa por leucócitos em resposta a estímulos inflamatórios e citocinas. A iNOS produz uma grande quantidade de NO e não é dependente de Ca2+ (SPRAGUE, KHALIL, 2009). O NO é caracterizado como um potente vasodilator, está relacionado com o processo inflamatório devido a sua capacidade de aumentar a permeabilidade vascular e a formação do edema através de mudanças no fluxo sanguíneo local (SALVEMINI et al., 1996). Petricevich e colaboradores (2000) demonstraram que as peçonhas de Bothrops jararaca e Bothrops asper quando injetadas via intraperitoneal em camundongos elevaram as concentrações de NO, por mecanismos ainda desconhecidos. A compreensão da resposta inflamatória nos acidentes ofídicos pode nos levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas para auxiliar na recuperação dos pacientes acometidos (ÁVILA-AGUERO et al., 2001). O sistema complemento consiste em um conjunto de proteínas séricas que está diretamente relacionado com o processo inflamatório, atuando como mediador químico deste. O sistema complemento auxilia no estabelecimento, evolução e resolução do processo inflamatório. Portanto, uma vez que verificamos a atividade da BJ-CRP no processo inflamatório, é de grande importância a realização de ensaios sobre o sistema complemento, pois estes dois processo são dependentes e ocorrem concomitantemente. Os resultados obtidos nesse trabalho também demonstraram que tanto a BJ-CRP isolada, como a peçonha bruta de Bothrops jararaca são capazes de modular o sistema complemento. Visto que a BJ-CRP e a peçonha bruta de Bothrops jararaca não induziram hemólise direta (Fig.18A), realizamos um ensaio somente com hemácias e soro para observar a

Discussão 71 ocorrência de hemólise, relacionada aos componentes do soro em um determinado tempo (t½). (Fig.18B). Após verificar que o soro foi capaz de promover hemólise, adicionamos as amostras de toxinas ou peçonha bruta ao meio, onde observamos novamente uma hemólise, porém com diferenças do valor de t½ (Fig.18C) em relação ao ensaio anterior, sugerindo que a BJ-CRP e a peçonha bruta de Bothrops jararaca são capazes de modular os componentes do sistema complemento, interferindo assim na hemólise. O t½ se refere ao tempo em segundos gasto pelo SC para lisar 50% das hemácias do meio. Quando uma substância atua sobre as proteínas que compõem as diferentes vias de ativação do SC, o valor de t½ vai estar aumentado, ou seja, haverá o consumo dos componentes durante o tratamento do SHN e a lise das hemácias ocorre de forma mais lenta. Assim, através desse ensaio, verificamos se o complemento sofre modulação, por meio do aumento ou diminuição do tempo de lise das hemácias adicionadas ao meio reacional. Realizamos ensaios testando diferentes concentrações da BJ-CRP e da peçonha bruta de Bothrops jararaca no sistema complemento. No ensaio hemolítico realizado com a BJ- CRP (Fig. 19A) somente as concentrações de 50 e 100 µg/mL induziram modulação significativa do sistema complemento, já no ensaio realizado com a peçonha de Bothrops jararaca (Fig. 19B), somente a concentração de 200 µg/mL foi capaz de induzir modulação significativa do sistema complemento. Somente pela metodologia utilizada não é possível afirmar que os efeitos observados dessas toxinas se devem a ativação ou a inibição dos componentes, ou até mesmo à possíveis bloqueios nas vias de ativação ou nas proteínas regulatórias do SC. Portanto, além de verificar a atividade das toxinas em diferentes concentrações sobre a atividade hemolítica da via clássica do SC, realizamos também ensaios com os componentes do SC isolados. Através da literatura (ABBAS, LICHTMAN, PILLAI, 2011) sabemos que o componente C3 do SC é formado pelas cadeias α e β, com massas moleculares de 110 e 75 kDa, respectivamente. Após a incubação do componente C3 com a BJ-CRP ou com a peçonha bruta, houve a formação de fragmentos de massas em torno de 37 a 50 kDa (Fig.20A), indicando modulação desse componente. O componente C4 possui as cadeias α (97 kDa), β (75 kDa) e γ (33 kDa). Sugerimos que este componente também sofreu modulação pela BJ- CRP e pela peçonha bruta, fato observado pela visualização de fragmentos entre 15 e 20 kDa (Fig.20B). Da mesma forma, no ensaio com o componente Fator B (93 kDa), observamos fragmentos de massas entre 25 e 37 kDa, os quais podemos sugerir que são correspondentes à modulação do componente Fator B (Fig.20C).

Discussão 72

Com o intuito de verificar se a peçonha bruta de B. jararaca e/ou a BJ-CRP atuam diretamente sobre os componentes do SC, realizamos outro ensaio utilizando componentes isolados do SC e SDS-PAGE, por meio do qual confirmamos que a peçonha bruta e a BJ-CRP são capazes de atuar diretamente sobre alguns componentes. Observamos a formação de fragmentos entre 35 e 45 kDa (Fig.21A), os quais indicam que a BJ-CRP possui uma ação direta sobre o componente C3. Também observamos a formação de fragmentos abaixo de 14 kDa (Fig.21A), indicando que a peçonha bruta também possui uma ação direta sobre o componente C3. Em relação ao componente C1 inibidor, observamos a diminuição da sua cadeia (Fig.21B), principalmente quando utilizamos a maior concentração da peçonha, indicando então que a peçonha de B. jararaca possui uma ação direta sobre esse componente. A BJ-CRP e a peçonha bruta de B. jararaca também demonstraram uma ação direta sobre o componente C4. Observamos a formação de fragmentos próximos a 45 kDa (Fig.21C), indicando uma ação direta da BJ-CRP e, observamos a presença de fragmentos abaixo de 14 kDa e consumo da cadeia α do componente C4, principalmente na maior concentração da peçonha bruta (Fig.21C), indicando que esta também apresenta uma ação direta sobre o componente C4. Em relação ao componente Fator B, observamos a formação de fragmentos próximos a 35 kDa (Fig.21D), por meio do qual sugerimos que a peçonha bruta possui ação direta sobre o componente Fator B. Especificamente em relação ao gênero Bothrops, Pidde-Queiroz e colaboradores (2010) avaliaram a ação de peçonhas de 19 espécies de serpentes do gênero Bothrops sobre o complemento, demonstrando que 11 inibiram completamente a via alternativa, 16 reduziram a atividade da via das lectinas, enquanto todas foram capazes de ativar completamente a via clássica. Ayres (2010) demonstrou que as peçonhas de Bothrops jararacussu e Bothrops pirajaisão capazes de ativar o sistema complemento através da modulação na atividade hemolítica das vias clássica/lectinas e via alternativa. Neste mesmo estudo, também foi demonstrado que as peçonhas induziram a liberação de fatores quimiotáticos C3a e C5a capazes de promoverem o recrutamento de neutrófilos. Menaldo e colaboradores (2013) avaliaram a ação de duas serinoproteases isoladas da peçonha de Bothrops pirajai que foram capazes de induzir modulação da via clássica e via alternativa em diferentes níveis, porém a modulação da via alternativa foi menos pronunciada. Em 2000, Farsky e colaboradores investigaram a ação da peçonha de Bothrops asper e da metaloproteases isolada BaP1 na ativação do sistema complemento e demonstraram que tanto a peçonha bruta, como a toxina

Discussão 73 foram capazes de ativar o sistema complemento levando a formação do componente C5a, que está envolvido na quimiotaxia de neutrófilos durante o envenenamento. Visto que a BJ-CRP é capaz de induzir um processo inflamatório, nosso trabalho demonstrou que os resultados obtidos nos ensaios do sistema complemento, como clivagem e ativação de proteínas foram coerentes, uma vez que esses dois precessos são dependentes e ocorrem concomitantemente. A BJ-CRP foi testada em alguns subtipos de canais iônicos para potássio, porém não demonstrou atividade sobre esses canais. Os traços observados (Fig. 22) representam a corrente de potássio específica de cada subtipo de canal e, como a BJ-CRP não demonstrou atividade em nenhum dos subtipos de canais para potássio na concentração de 1µM, o traço da corrente do canal para potássio e o traço da corrente correspondente à ação da BJ-CRP se sobrepõem. Entretanto, não é possível discutir essa atividade, uma vez que seria necessário testes em outros tipos de canais e uma análise mais detalhada da sequência e da estrutura da BJ-CRP a fim de esclarecer se existe uma região específica na toxina que é capaz de modular algum tipo de canal iônico. Realizamos esse ensaio porque a literatura demonstra que algumas CRISPs possuem atividade em canais para potássio. Especificamente para os canais de potássio dependentes de voltagem, a toxina natrin purificada da peçonha de Naja atra demonstrou ser capaz de bloquear canais para potássio do subtipo Kv1.3, com as concentrações na faixa de 1-200 nM (WANG et al., 2006). Yamazaki e colaboradores (2003) demonstraram que as CRISPs piscivorin, catrin-2 e ophanin agem sobre canais para potássio na concentração de 1 µM e em diferentes graus. Acredita-se que essa diferença de intensidade seja devido aos diferentes resíduos de aminoácidos presentes na estrutura de cada uma das proteínas. A análise comparativa entre as estruturas das CRISPs sugere que a região entre os resíduos 184 a 189 pode ser crítica para a inibição da atividade do canal. Dessa forma, torna-se de grande importância o isolamento, a caracterização bioquímica, estrutural, enzimática e funcional das CRISPs, visando melhor entender o papel destas proteínas na composição da peçonha e no envenenamento botrópico. Visto que a BJ- CRP apresentou atividade funcional, como indução do processo inflamatório e ativação de alguns componentes do sistema complemento, esta toxina deve ser mais estudada e utilizada como ferramenta para entender os mecanismos desses processos.

Conclusões

Conclusões 75

6. CONCLUSÕES

O presente trabalho traz contribuição inédita para o conhecimento da composição da peçonha de B. jararaca e também para o entedimento do seu mecanismo de ação. Descreve pela primeira vez o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural, enzimática e funcional de uma CRISP na espécie B. jararaca, denominada BJ-CRP e traz avanços quanto à contribuição da CRISP no processo inflamatório e no sistema complemento. A BJ-CRP possui as seguintes características: é uma proteína de caráter ácido, com pI próximo de 6,0 e massa molecular de 24,6 kDa. Sua sequência parcial de aminoácidos (100 resíduos) mostrou similaridade com outras CRISPs já isoladas de peçonhas de serpentes, porém até o momento nenhuma CRISP do gênero Bothrops foi isolada. Essa toxina não demonstrou atividade proteolítica sobre os substratos azocaseína, fibrinogênio e fibrina. Também não foi capaz de induzir atividade hemorrágica e coagulante, atividades características do envenenamento botrópico, sugerindo que essas atividades pertencem a outros componentes presentes na peçonha de Bothrops jararaca.

Os estudos sobre canais de potássio dependentes de voltagem (Kv), demonstraram que a BJ-CRP não possui ação sobre os subtipos de canais para potássio avaliados, pois não houve alterações nas correntes dos canais quando a BJ-CRP foi testada. Como as CRISPs são proteínas conhecidas por modular canais iônicos, a BJ-CRP deve ser mais estudada quanto à sua atividade em outros tipos de canais. A BJ-CRP demonstrou atividade inflamatória quando administrada na cavidade peritoneal de camundongos, induzindo o recrutamento de células para o local da administração da toxina nos tempos de 1 e 4 horas após o tratamento, bem como a produção da citocina pró-inflamatória IL-6 no tempo de 1 hora, o que nos permite sugerir que essa toxina possui participação na inflamação induzida pela peçonha de Bothrops jararaca. A BJ-CRP também foi capaz de modular a via clássica do sistema complemento através do aumento do tempo de hemólise observado na presença da toxina. Esse resultado foi confirmado quando verificamos sua atividade sobre alguns componentes isolados. A BJ-CRP foi capaz de ativar os componenetes C3 e C4 do sistema complemento, por meio da produção de fragmentos nos ensaios de Western blot e eletroforese em gel de poliacrilamina, entretanto, experimentos complementares deverão ser realizados para determinar se esta toxina induz ativação ou inibição dos componentes avaliados. Visto que há poucos relatos sobre as CRISPs na literatura e especialmente, no gênero Bothrops, os resultados obtidos trazem contribuição expressiva para o conhecimento desta classe de proteína, no entanto, novos estudos são necessários para esclarecer suas características bioquímicas e estruturais.

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Anexos

Anexo 102

ANEXO

Anexo 103