BlOOXIDACE ARSENOPYRITU U BAKTERIE FERROOXIDANS Bakalářská práce Martin Gajdošík

Vedoucí práce: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc. Brno 2016 Bibliografický záznam

Autor: Martin Gajdošík Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Biooxidace arsenopyritu u bakterie Acidithiobacillus Název práce: ferrooxidans.

Studijní program: Biochemie

Studijní obor: Biochemie

Vedoucí práce: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc.

Akademický rok: 2015/2016

Počet stran: 57

Klíčová slova: biooxidace arsenopyritu; Acidithiobacillus ferrooxidans; kapalinová chromatografie; hmotnostní spektrometrie Bibliographic Entry

Author Martin Gajdošík Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Arsenopyrite biooxidation by Acidithiobacillus Title of Thesis: ferrooxidans.

Degree programme: Biochemistry

Field of Study: Biochemistry

Supervisor: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc.

Academic Year: 2015/2016

Number of Pages: 57 Keywords: arsenopyrite biooxidation; Acidithiobacillus ferrooxidans; liquid chromatography; mass spectrometry Abstrakt

Tato bakalářská práce shrnuje poznatky o rozpouštění sulfidických rud s důrazem na biooxidaci arsenopyritu. Zároveň se věnuje metabolismu a toleranci k arsenu u bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans a separačním metodám, které se využívají pro stanovení sloučenin arsenu a síry s důrazem na kapalinovou chromatografii a hmotnostní spektrometrii. V experimentální části byla optimalizována metoda pro stanovení arsenitanu a arseničnanu ESI-MS detekcí. Tato metoda byla následně společně sjiž optimalizovanou metodou IPC-MS využita pro stanovení sloučenin arsenu a síry v průběhu bakteriální a chemické oxidace arsenopyritu.

Abstract

This thesis summarizes knowledge about the dissolution of sulphide ore with an emphasis on arsenopyrite biooxidation. It is also focused on Acidithiobacillus ferrooxidans and its metabolism and tolerance to arsenic and separation methods used for the determination of arsenic and sulfur compounds with an emphasis on liquid chromatography and mass spectrometry. An ESI-MS method has been optimized for analysis of arsenite and arsenate in the experimental part. This method together with the already optimized method IPC-MS was subsequently used for the determination of arsenic and sulfur compounds created during bacterial and chemical arsenopyrite oxidation. MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

Akademický rok: 2015/2016

Ústav: Ústav biochemie

Student: Martin Gajdošík

Program: Biochemie

Obor: Biochemie

Ředitel Ústavu biochemie PřF MU Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu MU určuje bakalářskou práci s tématem:

Téma práce: Biooxidace arsenopyritu u bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans

Téma práce anglicky: Arsenopyrite biooxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans

Oficiální zadání: Teoretickou částí bakalářské práce bude provedení literární rešerše, jejíž náplní bude shrnutí poznatků o biooxidaci sulfi- dických rud s důrazem na biooxidaci arsenopyritu. V praktické části pak bude student sledovat změny koncentrací sirných látek v průběhu kultivace bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans na arsenopyritu.

Jazyk závěrečné práce: čeština

Vedoucí práce: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc.

Datum zadání práce: 24. 9. 2015

V Brně dne: 20.1.2016

Souhlasím se zadáním (podpis, datum):

doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc. student vedoucí práce zástupce ředitele Ústavu biochemie pro pedagogické záležitosti Poděkování

Na tomto místě bych chtěl poděkovat doc. RNDr. Oldřichu Janiczkovi, CSc. za odborné vedení, Mgr. Jiřímu Kučerovi, Ph.D. a doc. Ing. Martinu Mandloví, CSc. za věcné rady, Hedvice Řičankové za pomoc při práci v laboratoři a Mgr. Lucii Simoníkové za stanovení celkového arsenu. Dále děkuji celé své rodině a přítelkyni za trpělivost a podporu během celého bakalářského studia. Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 11. května 2016 Martin Gajdošík Obsah

Seznam použitých zkratek 10 Úvod 11 Teoretická část 12 1. Loužení sulfidových minerálů 12 1.1. Mechanismus chemické oxidace 12 1.2. Biooxidace 13 1.3. Biooxidace arsenopyritu 14 2. Acidithiobacillus ferrooxidans 15 2.1. Obecná charakteristika 15 2.2. Oxidace železa 16 2.3. Aerobní oxidace síry a redukovaných sirných sloučenin 17 2.4. Tolerance k arsenu 19 3. Kapalinová chromatografie 21 4. Hmotnostní spektrometrie 25 4.1. Iontové zdroj e 25 4.2. Hmotnostní analyzátory 27 4.3. Spojení kapalinové chromatografie s MS detekcí 28 5. Stanovení sirných látek 29 6. Stanovení arsenu a j eho forem 30 Cíl práce 31 Experimentální část 32 7. Materiál a metody 32 7.1. Chemikálie 32 7.2. Přístroje 32 7.3. Vliv napětí fragmentom na fragmentaci látek 32 7.4. Kalibrace 32 7.5. Bakteriální kmen a jeho kultivace 33 7.6. Sledování biooxidace arsenopyritu 34 8. Výsledky a diskuze 36 8.1. Vliv napětí fragmentom na fragmentaci látek 36 8.2. Kalibrace 37 8.3. Biooxidace arsenopyritu 39

8 Souhrn 52 Použitá literatura 53

9 Seznam použitých zkratek

AAS atomová absorpční spektrometrie ACN acetonitril AES atomová emisní spektrometrie AFS atomová fluorescenční spektrometrie AMD kyselá drenážní voda Cl chemická ionizace El elektronová ionizace EPS extracelulární polymerní látky ESI elektrosprej FAB ionizace urychlenými atomy FD desorpce polem FI ionizace polem HDR heterodi sulfidreduktáza HG metoda generování hydridů HiPIP železo-sirný protein s vysokým redoxním potenciálem ICP indukčně vázaná plazma IEC iontově výměnná chromatografie IPC iontově párová chromatografie LD desorpce laserem MALDI ionizace laserem za účasti matrice NP-LC kapalinová chromatografie s normálními fázemi PD desorpce plazmou RP-LC kapalinová chromatografie s reverzními fázemi S IMS hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů SQR sulfid: chinon- oxi doreduktáza TBA tributylamin TeTH tetrathi onanhy drol áza TOF průletový analyzátor TQR thi osí ran: chinon- oxi doreduktáza

10 Úvod

Bakterie A. ferrooxidans je prvním objeveným a nejlépe prostudovaným mikroorganismem, který je schopen katalyzovat rozpouštění sulfidických rud. Tato vlastnost vychází ze schopnosti oxidovat síru, redukované sirné sloučeniny a hlavně železnaté ionty, které pak chemicky napadají povrch minerálu. Nekontrolovaná aktivita této a metabolický podobných bakterií má za následek okyselování okolního prostředí, mobilizaci těžkých kovů a biokorozi, při níž jsou znehodnocovány stavební materiály. Poznatky z výzkumu těchto bakterií mohou být využity k ekologicky šetrnějším způsobům zpracování rud, získání kovů z odpadových materiálů, desulfurizaci uhlí a redukci environmentálni ho znečištění. Výhodou biotěžby je možnost extrakce kovů z chudých rud nebo z nezužitkovaného materiálu, u kterých by byl tradiční způsob těžby ekonomicky nevýhodný. Cílený kov může být převeden do rozpustné formy (bioloužení) nebo zůstává v pevné fázi (biooxidace). Technologické varianty tohoto procesu se pak liší rychlostí, se kterou roste i cena potřebného vybavení a nároky na provoz. V nejjednodušším případě dochází k pouhému zavlažování hald a odvádění matečného roztoku. Nej složitější je pak loužení v bioreaktorech, které se kvůli finanční náročnosti využívá pouze pro biooxidaci zlatých rud arsenopyritu a pyritu. V případě biooxidace asenopyritu se do roztoku uvolňují rozpustné anorganické formy arsenu, které mohou proniknout do buňky a negativně ovlivnit její metabolickou aktivitu. Bakterie A. ferrooxidans je schopná v cytoplazmě redukovat arseničnan a skrz cytoplazmatickou membránu aktivně vylučovat arsenitan. Tímto mechanismem tak omezuje toxické působení těchto sloučenin na své životní funkce. Navíc na úrovni roztoku může být arseničnan i arsenitan imobilizován produkty jejího energetického metabolismu.

11 Teoretická část

1. Loužení sulfidových minerálů

1.1. Mechanismus chemické oxidace

Hlavním oxidantem sulfidových minerálů je v neutrálním aerobním prostředí molekulární kyslík. Železité ionty, které vznikají spontánní oxidací železnatých iontů uvolňovaných během oxidativního rozpouštění minerálu pyritu, arsenopyritu a chalkopyritu, mohou reagovat s vodou za vzniku nerozpustného hydroxidu železitého. Při pH menším než 2,5 je tato hydrolýza omezena a Fe3+, které j sou ve srovnání s O2 silněj šími oxidanty těchto minerálů, tak mohou dramaticky zvýšit rychlost jejich rozpouštění. V kyselém prostředí je však chemická oxidace železa extrémně pomalá [1], Mechanismus chemické oxidace kovových sulfidů vyplývá ze způsobu zániku vazby mezi sírou a kovem. V případě pyritu, molybdenitu a tungstenitu jsou valenční pásma tvořené pouze orbitaly kovových atomů a nepodílejí se na vazbě mezi kovem a sírou. U ostatních minerálů se na stavbě valenčního pásma podílejí také orbitaly síry. Tato odlišnost se odráží v rozdílné chemické reaktivitě těchto minerálů, a tak musely být navrženy dva mechanismy loužení. V případě FeS2, M0S2 a WS2 se předpokládá thiosíranový mechanismus. Vazba mezi sírou a kovem je štěpena pouze působením oxidačních činidel po oxidaci disulfidické skupiny a prvním detegovatelným meziproduktem je thiosíran. Ten je následně oxidován na tetrathionan, který je degradován na elementární síru, sulfit, pentathionan a trithionan. Tyto sloučeniny j sou nakonec oxidovány na sulfát, který tvoří až 90% všech oxidačních produktů.

Fe3+ + Fe3" ,2- SOi- + H + * s2o| • sno^6

Obrázek 1: Thiosíranový mechanismus.

V případě ostatních minerálů se předpokládá polysulfidový mechanismus. Vazba mezi kovem a sírou je zde štěpena kromě oxidačních činidel také protony, přičemž k jejímu zániku dochází před oxidací sulfidické síry. Tyto minerály jsou tedy do určité

12 míry rozpustné v kyselinách. Po navázání dvou protonů na sulfidickou síru vzniká sulfan, ze kterého v přítomnosti Fe3+ vzniká radikál FhS*"1". Po disociaci může z tohoto radikálu dimerizací vznikat disulfidový aniont a z něj po oxidaci a elongaci polysulfidy (FbSn). V kyselém prostředí se nakonec z polysulfidů uvolňují kruhy elementární síry, nejčastěji S$, které jsou odolné vůči chemické oxidaci. V abiotickém prostředí se tak elementární síra hromadí v roztoku nebo může tvořit vrstvu na povrchu minerálu a tím negativně ovlivnit rychlost rozpouštění. Bočními reakcemi mohou vznikat také malá množství síranu, thiosíranu a polythionanů [2-4].

Obrázek 2: Polysulfidový mechanismus.

1.2. Biooxidace

V aerobním kyselém prostředí mohou určité druhy bakterií katalyzovat oxidaci Fe2+ a tím urychlit rozpouštění sulfidických minerálů. Bakterie oxidující síru pak zajišťují transformaci intermediálních sirných sloučenin na kyselinu sírovou [4]. Ve starší literatuře jsou popisovány dva možné mechanismy bioloužení sulfidických minerálů. Podle nich může být rozpouštění katalyzováno buď na povrch přisedlými bakteriemi („přímý" mechanismus) nebo planktonickými bakteriemi, které generují Fe3+ a až ty pak při kontaktu s minerálem způsobují jeho oxidaci („nepřímý" mechanismus). Nyní je již známo, že Fe3+ hrají roli v obou případech a pro popis bioloužení jsou dnes používány termíny kontaktní a nekontaktní [1], Kontakt mezi minerálem a buňkou zajišťují extracelulární polymerní látky (EPS) na povrchu bakterie. Složení EPS vrstvy je druhově specifické a i v rámci druhu se může měnit v závislosti na typu substrátu. EPS pak slouží jako reakční prostor, který obsahuje zvýšenou koncentraci Fe3+ v komplexu s kyselinou glukuronovou. Bylo prokázáno, že se A. ferrooxidans přednostně váže na místa minerálu, kde se nachází viditelné povrchové vady a místa s nízkým stupněm krystalizace. Adhezi zprostředkovávají primárně elektrostatické interakce mezi záporně nabitým povrchem minerálu a kladně nabitou EPS.

13 Sekundárně pak hydrostatické interakce a kovalentní vazby. Po přichycení jednotlivých buněk se na povrchu minerálu vytváří biofilm [4].

1.3. Biooxidace arsenopyritu

Arsenopyrit (FeAsS) je nej rozšířenější minerál v zemské kůře, který obsahuje arsen. Jedná se sulfidový minerál, který může nést stopy zlata. Kvůli této vlastnosti bývá často těžen a zpracováván, přičemž se při extrakci zlata využívá tvorby rozpustného komplexu zlata s kyanidem. Okolní arsenopyrit však snižuj e účinnost kyanizace tím, že fyzicky brání kontaktu kyanidu se zlatem. K rozrušení sulfidové matrice se využívají procesy pražení, tlaková oxidace a biooxidace [5]. Biooxidace arsenopyritu vede k produkci kyseliny sírové, arsenité [As(III)] a arseničné [As(V)] [6]. V závislosti na podmínkách mohou být vznikající formy arsenu imobilizovány nově vznikajícími Fe3+ [7]. Za laboratorních podmínek s roztoky o definovaném složení bylo potvrzeno, že bakterie A. ferrooxidans způsobuje precipitaci arsenu. Nicméně ne ve formě As(V), jak předpokládala řada autorů, nýbrž jako As(III). Ve stejné studii bylo prokázáno, že bakterie A. ferrooxidans není schopna oxidovat As(III). K oxidaci může nicméně docházet v přítomnosti Fe2+ a O2 Fentonovou reakcí. As(V) pak může precipitovat ve formě FeAsCk Autor také předpokládá, že tato bakterie inkorporuje As(III) do své EPS vrstvy, kde Fe3+ hrají roli nukleačních zárodků [8].

Oxidace Fe2+ vede k tvorbě železitých oxyhydroxidů tooeleitu, jarositu, schwertmannitu, ferrihydritu, goethitu nebo lepidokrokitu, které mají schopnost inkorporovat a adsorbovat As(III) nebo As(V). Tvorba jednotlivých minerálů a účinnost vychytávání závisí na podmínkách okolního prostředí [9]. Pochopení imobilizace arsenu těmito minerály tak může vést k navrhnutí účinného procesu pro odstranění arsenu z přírodních zdrojů, popřípadě k zvýšení efektivity biooxidace arsenopyritu.

14 2. Acidithiobacillus ferrooxidans

2.1. Obecná charakteristika

Rod Acidithiobacillus (dříve ) patří do kmenu Proteobakteria a zahrnuje gramnegativní tyčinkovité bakterie Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, , Acidithiobacillus albertensis a Acidithiobacillus ferrivorans, které získávají energii oxidací anorganický simých látek. Tento rod byl dlouhou dobu řazen do třídy . Nedávná multiproteinová fylogenetická analýza však prokázala, že rod Acidithiobacillus nenáleží ani do jedné třídy proteobakterií, a tak musela být vytvořena zcela nová třída [10, 11]. Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans byla poprvé izolována v roce 1947 z kyselé drenážní vody (AMD) uhelného dolu. Jedná se o gramnegativní, pohyblivou, nesporulující bakterii o průměru 0,5-0,8 [im a délce 0,9-1,5 [im se zaoblenými okraji. Jako všechny gramnegativní bakterie má i A. ferrooxidans vnější buněčnou stěnu, která je navíc obalená slizovitým obalem [12]. A. ferrooxidans je mezofilní (teplotní optimum 20-35 °C) a acidofilní (pH optimum 1,8-2,0) bakterie, která díky schopnosti adaptace může žít i mimo tato optima. Vykazuje navíc pozoruhodnou schopnost tolerance k velkému množství rozpustných kovových iontů. Z hlediska výživy se jedná o obligátně chemolitoautotrofní bakterii, která je schopna získávat energii pro svůj růst oxidací redukovaných forem síry, železnatých iontů, vodíku a kyseliny mravenčí. Bakterie preferuje aerobní prostředí, avšak je schopná růst i v nepřítomnosti kyslíku, přičemž využívá Fe3+ ionty jako akceptory elektronů. Bakterie se vyskytuje celosvětově, převážně pak v simých pramenech, kyselých důlních vodách nebo v odpadech po zpracování rud. Po mnoho let byla považována za nej důležitější mikroorganismus v procesu biotěžby, který probíhá při teplotách 40 °C a méně. Dnes je již známo, že růst této bakterie není upřednostněn v prostředí, kde je koncentrace Fe3+ mnohonásobně vyšší než Fe2+. Tyto podmínky se vyskytují například v kontinuálně pracujících míchaných tancích, kde jsou dominantními bakteriemi Leptospirillum, At. Caldus popřípadě A. thiooxidans. A. ferrooxidans může být dominantní bakterií v zavlažovacích systémech, zvláště pak při vyšších koncentracích Fe2+ iontů v loužicím roztoku [13].

15 2.2. Oxidace železa

Oxidace Fe2+ je v aerobním neutrálním prostředí velice rychlá. Železo oxidující bakterie jsou tak limitovány na prostředí s nízkou nebo nulovou hladinou kyslíku, popřípadě na prostředí silně kyselé, kde je abiotická oxidace železa výrazně pomalejší, a kde lze využít Fe2+ pro bioenergetické procesy [14]. Bakteriální oxidace Fe2+, v níž je kyslík akceptorem elektronů, probíhá podle rovnice 1 [15].

2+ + 3+ Fe + 1/2 02 + 2H -> 2 Fe + H20 (rovnice 1)

Bakterie A. ferrooxidans čelí při růstu na Fe2+ zásadním bioenergetickým problémům. Najeden mol zoxidovaných Fe2+ se uvolní pouze jeden mol elektronů a rozdíl redoxních potenciálů mezi párem Fe2+/Fe3+ (770 mV při pH 2) a O2/H2O (1120 mV při pH 2) je velice nízký. Navíc pro fixaci CO2 a jiné anabolické procesy potřebuje bakterie redukované koenzymy NAD(P)H, jejichž tvorba je kvůli nízkému redoxní potenciálu páru NAD(P)+/NAD(P)H (-320 mV při pH 6,5) termodynamicky nevýhodná. Pro vytvoření relativně malého množství biomasy tak musí být zoxidováno mnoho Fe2+. Oxidací uvolněná energie slouží ktranslokaci protonů, které pronikají do cytoplasmy z okolního prostředí. Tato translokace společně s konzumací protonů při redukci kyslíku na vodu pomáhá udržovat protonový gradient mezi cytoplasmou a periplasmatickým prostorem, který může být využit pro tvorbu ATP, rotaci bičíku, transport skrz membránu nebo pro redukci NAD+, při které musí být elektrony pocházející z oxidace Fe2+ přeneseny proti směru gradientu redoxního potenciálu [14, 16]. Dýchací řetězec, tedy dráhu ve směru gradientu redoxního potenciálu („downhill" dráhu) kóduje u bakterie A. ferrooxidans operon rus. Dráhu proti směru gradientu redoxního potenciálu („uphill" dráhu) kóduje operon petl. Oxidace Fe2+ začíná ve vnější membráně na cytochromu C2 (Cyc2), ze kterého jdou elektrony dále na protein rusticyanin, který se nachází v periplasmatickém prostoru. Právě na úrovni rusticyaninu dochází k přerozdělení toku elektronů ke konečným akceptorům O2 nebo NAD+. Předpokládá se, že rusticyanin funguje jako elektronová zásobárna, která udržuj e Cyc2 v oxidované formě. Z rusticyaninu mohou být elektrony dále předány „downhill" drahou přes cytochrom C4 (Cycl) až na transmembránovou aa3 oxidázu, která redukuje O2 na H2O nebo „uphill" drahou přes cytochrom C4 (CycAl) na bci komplex. Z tohoto komplexu jsou elektrony

16 přeneseny pomocí ubichinonu na transmembránový enzym NADH dehydrogenázu, kde dochází k redukci NAD+ na NADH [17].

2FeJ- 2Fe>- [OUT PH2

H*

CycAl

NADH Ľhu^F oo, termina :omplex WL oxidase complex j • ADP • Pi

NAD* * H- NADH H' 2H- • l/202 , H,0

[ IN PH6.5

y -0.32 V 0.11 V 0.78 V 1.12 V

NAD-/NADH Ubiquinone ox/rcd Fť'/Fe1- XOj/H,0 II ^ I Uphill |Downhill

Obrázek 3: Schéma elektronového transportního řetězce, který je zapojen do oxidace železa [17].

2.3. Aerobní oxidace síry a redukovaných sirných sloučenin

Kromě Fe2+ může A. ferrooxidans získávat elektrony i z redukovaných forem síry, přičemž konečným produktem oxidace je kyselina sírová. Tato oxidační dráha je však vzhledem k množství oxidačních stupňů a forem anorganické síry mnohem složitější [18]. Elementární síra se přirozeně vyskytuje ve formě osmiatomových kruhů, tvořících kosočtverečné krystaly. Ty jsou velmi málo rozpustné ve vodě a nemohou samovolně pronikat do nitra buňky. Činností A. ferrooxidans vznikají hydrofilní sirné globule, které se skládají z hydrofobního jádra tvořeného elementární sírou (převážně Ss), které obklopují dlouhé řetězce polythionanů [19]. Bakterie je schopna z těchto globuli extrahovat Ss vylučováním povrchově aktivních látek [20]. OMP protein zanořený ve vnější membráně pak na thiolovou skupinu váže extrahovanou síru a transportuje ji přes vnější membránu do periplasmy, kde dochází k aktivační reakci. Bakterie A. ferrooxidans

17 využívá pro aktivaci nukleofilní atak molekul glutathionu (GSH) na Ss kruh za vzniku

GS9H. Glutathion-polysulfidy (GSnH, n > 2) jsou nestabilní a rychle se rozkládají na elementární síru a své níží homology (rovnice 2) [21].

S8 + GSH -> (GS9H) -> GSnH + (9 - n)/858 (rovnice 2)

Sulfurdioxygenázy kódované sox a sor geny nebyly zatím u bakterie A. ferrooxidans nalezeny. Vzhledem k deregulaci hdr operonu při růstu bakterie na elementární síře se předpokládá, že je GSSH oxidován v cytoplazmě enzymovým komplexem heterodisulfidreduktázou (HDR). Tento komplex katalyzuje u methanogeních archeí štěpení disulfidické vazby X-S-S-X. Je tedy možné, že v případě A. ferrooxidans pracuje HDR v obráceném směru, kdy využívá protonový gradient k oxidaci GSSH na sulfit. Nicméně vzhledem k tomu, že tento komplex hraje roli v dvouelektronové redukci, neměl byt být schopen katalyzovat čtyřelektronovou oxidaci S° a to ani v případě, že skutečně pracuje v obráceném směru [22, 23]. Dalším krokem je oxidace sulfitu na sulfát. Enzym sulfitdehydrogenáza katalyzující tuto reakci byl nalezen v cytosolu bakterie A. ferrooxidans [24]. Geny kódující známé sulfitdehydrogenázy, však zatím nebyly v jejím genomu nalezeny [22]. Dalšími enzymy zapojenými do oxidace sirných sloučenin jsou periplasmaticky orientované enzymy tetrathionanhydroláza (TetH), thiosíranxhinon-oxidoreduktáza (TQR) a sulfidxhinon-oxidoreduktáza (SQR) a v cytoplasmě se nacházející rhodanáza. TetH katalyzuje rozklad tetrathionanu a pentathionanu na elementární síru, thiosíran a sulfát [25]. Předpokládá se, že v průběhu této enzymatické reakce vzniká jako reaktivní intermediát sulfan-monosulfonová kyselina (HS2SO3), která vysvětluje vznik síry a vyšších polythionanů [20]. TQR katalyzuje oxidaci thiosíranu na tetrathionan a SQR oxidaci sulfidu na elementární síru. Elektrony získané oxidací sirných sloučenin jsou přeneseny přes chinonový pool přímo na terminálni oxidázy bd a bo3 nebo nepřímo přes bci komplex na terminálni oxidázu aa3. Komplex bci předává elektrony na terminálni oxidázu skrze cytochrom c (CycA2) nebo HiPIP. Elektrony mohou být přeneseny také na NADH komplex I, kde dochází k tvorbě redukčních ekvivalentů [22].

18 Extra cellutar cnvironment F*1* F*" W Fe'*

Obrázek 4: Model anaerobní oxidace elementární síry spojené s Fe redukcí [23].

2.4. Tolerance k arsenu

Arsen je toxický prvek, který negativně ovlivňuje rychlost růstu bakterie A. ferrooxidans a při vyšších koncentracích může způsobit až její smrt. Koncentrace rozpuštěného arsenu, která začíná být pro bakterii toxická, se díky schopnosti adaptace může výrazně lišit. Udává se, že As(III) je pro bakterii třikrát více toxický než As(V). Nicméně z výsledků studie [26] se zdá, že povaha toxicity je rozdílná. As(III) způsobuje zpomalení rychlosti bakteriální oxidace, zatímco As(V) také lag fázi. As(III) tak nemusí být nutně třikrát toxičtější než As(V).

As(V) může v buňce nahradit fosfát a tím narušuje fosforylaci, syntézu ATP, primární aktivní transport, glykolýzu, pentózový cyklus atd. Toxičtější, rozpustnější a mobilnější As(III) má silnou afinitu k sulfohydrylovým skupinám. Díky tomu je schopen narušit strukturu a aktivitu proteinů, receptoru a transkripčních faktorů. Kromě toho reaguje As(III) také s dithiolovou skupinou, která se nachází v aktivním místě mnoha enzymů a koenzymů. As(III) tak narušuje intracelulární redoxní homeostázu, syntézu a opravu deoxyribonukleotidů, skládání proteinů, metabolismus síry a detoxifikaci xenobiotik. Z důvodu vysoké toxicity není specifický přenašeč pro sloučeniny arsenu v buňkách obsažen. As(III) a As(V) pronikají vnější membránou nespecifickými poriny a cytoplazmatickou membránou díky specifickým přenašečům molekul chemických

19 analogů. Díky své podobnosti s fosfátem vniká As(V) do cytoplazmy fosfátovým transportním systémem. Při pH nižším než 9,3 existuje As(III) jako glycerolu strukturně podobný As(OH)3. Hlavní branou vstupu je tak glycerolový transportér [27]. Ars operon nalezený v chromozomu bakterie A. ferrooxidans má vzhledem k běžně se vyskytujícím ars operonům atypické uspořádání. Skládá se ze dvou divergentních elementů arsRC and arsBH, které se transkribují nezávisle na sobě. ArsC je detoxifikační As(V) reduktáza, patřící do skupiny nízkomolekulárních tyrosin fosfatáz. ArsB je membránově lokalizovaná pumpa, která využívá membránový potenciál k vylučování As(III) ven z buňky. ArsR je protein, který na sebe váže intracelulární As(III) a v jeho nepřítomnosti funguj e j ako represor. V případě bakterie A. ferrooxidans neobsahuje ArsR domnělé vazebné místo pro As(III) a je tedy zajímavé, že i přesto funguje ArsR jako represor obou elementů. Role ArsH proteinu v mechanismu resistence k arsenu zatím není známa. Bioinformatická klasifikace prokázala, že protein ArsH patří do rodiny NADPH-dependentních FMN reduktáz. Tento protein má s jedinou výjimkou alespoň 50x větší aktivitu, než dosud měřené bakteriální Fe3+ reduktázy. Ukázalo se, že je ArsH vyžadován pro resistenci u bakterie Y. enterocolitica. Zádi je tomu také tak u A. ferrooxidans není známo [27-30].

20 3. Kapalinová chromatografie

Chromatografické metody patří do skupiny separačních metod, které jsou založeny na rozdílené distribuci dělených látek ve směsi mezi dvě nemísitelné fáze: mobilní a stacionární [31]. Analyt je rozpuštěn v mobilní fázi, která může být kapalinou (kapalinová chromatografie), plynem (plynová chromatografie) a prochází stacionární fází, která může být umístěna v koloně (sloupcová chromatografie) nebo na pevném povrchu (planární chromatografie). V případě eluční kolonové chromatografie dochází při dělení látek k opakovanému ustalování rovnováhy dělených látek mezi mobilní a stacionární fází, přičemž látky s vyšší afinitou k sorbentu setrvávají ve stacionární fázi delší dobu, čímž narůstá jejich retence. V ideálním případě dochází k rozdělení vzorku na jednotlivé složky, které jsou po eluci z kolony analyzovány vhodným detektorem. Závislost intenzity signálu detektoru na elučním čase nebo elučním objemu se nazývá chromatogram. Ten se skládá z píků gaussovského tvaru, které reprezentují rozdělené frakce. Separace a eluce jednotlivých složek je tedy ovlivněna jak povahou stacionární fáze, tak povahou fáze mobilní. Eluce může probíhat buď s mobilní fází o konstantním složení (isokratická eluce) a nebo s mobilní fází o zvyšující se eluční síle (gradientova eluce), která se uplatňuje, pokud mají složky směsi výrazně odlišné fyzikálně chemické vlastnosti [32]. Základní charakteristickou veličinou pro každou dělenou látku je retenční čas ÍR nebo retenční objem VR. Retenční čas je doba, která uplyne od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křivky (vrcholu píku). Retenční objem je pak objem mobilní fáze, která proteče kolonou za tuto dobu. Mrtvý retenční čas ÍM (mrtvý retenční objem VM) je retenční čas (objem) složky, která není na koloně zadržována a pohybuje se stejnou rychlostí jako mobilní fáze. Všechny dělené látky stráví v mobilní fázi naprosto stejný čas a liší se pouze dobou, kterou stráví ve fázi stacionární. Doba, kterou dělené látky stráví v mobilní fází, se nazývá redukovaný retenční čas Í'R (rovnice 3).

t'R = tR — tM (rovnice 3)

Dalšími charakteristikami veličinami jsou pak šířka píku při základně w, výška píku h popřípadě šířka píku v polovině výšky píku Wh.

21 b —

nástřik

Obrázek 5: Schéma chromatogramu a jeho základních charakteristík.

Z retenčních časů a šířek píků pak můžeme určit míru kvality separace dvou sousedních píků, kterou vyjadřuje veličina rozlišení, R (rovnice 4) [31].

2 A tR R = (rovnice 4)

W-L + W2

Kapalinová chromatografie (LC) je nej univerzálnější m a nejvíce používaným typem eluční chromatografie. Separace na prvních kolonách (1-5 cm šířka, 5-50 cm délka, velikost částic v koloně 150-200 [im) byla velice zdlouhavá. Aplikace vakua nebo tlaku pro urychlení separace se však ukázaly jako neúčinné, protože zvýšený průtok mobilní fáze snižuje účinnost chromatografické kolony. Východiskem bylo snížení velikosti částic v koloně. Malé částice však kladou mobilní fázi velký odpor a tak musela být vyvinuta technologie, která umožní aplikaci velmi vysokého tlaku: vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) [33]. Zařízení HPLC se skládá z šesti hlavních částí. První z nich je zařízení pro uchovávání a úpravu mobilní fáze. Tato část se skládá ze zásobníků mobilní fáze, odplyňovače a směšovače (v případě gradientově eluce). Další části zajišťují transport mobilní fáze (čerpadlo a tlumič nárazových pulsů), dávkování vzorku (autosampler, vysokotlaký dávkovací ventil), separaci látek (kolona), detekci látek (detektor) a záznam dat (počítač, software) [31, 33].

22 LC může být na základě rozdílného separačního mechanismu rozdělena na, adsorbční, rozdělovači, afinitní, chirální, iontově výměnnou a gelové permeační chromatografii [32]. Obrázek 6 popisuje nejvhodnější využití jednotlivých technik v závislosti na velikosti a polaritě analyzované látky.

Increasing polarity

I Water-insoluble ^ Water-soluble ^ Nonpolar Ionic Nonionic polar

Obrázek 6: Aplikace kapalinové chromatografie [33].

Nej používanější variantou LC je rozdělovači chromatografie, v níž je dělení založeno na intramolekulárních interakcích, které jsou zprostředkované Van der Walsovými silami. Na základě polarity použitých fází pak můžeme tento typ chromatografie rozdělit na normálně a reverzně fázovou chromatografii [31, 32]. Nejčastěji využívaná reverzně fázová kapalinová chromatografie (RP-LC) využívá polární mobilní a nepolární stacionární fázi. Obvykle se jedná o směs vodné složky s polárními organickými rozpouštědly (alkoholy, acetonitril, tetrahydrofuran) a dlouhé uhlíkaté řetězce (Cl8, C8) navázané na povrch silikagelu. Povrch sorbentu je schopen reagovat s nepolárními molekulami analytu pouze slabými disperzními silami. Silnější polární interakce mezi analytem a mobilní fází tak následně usnadňují eluci. Retence klesá se zvyšující se polaritou separované látky a roste s klesající polaritou mobilní fáze nebo se zvyšující se délkou alkylu na stacionární fázi. Silně polární látky a látky iontové povahy

23 jsou zadržovány velmi slabě nebo vůbec a eluují v mrtvém objemu. Retenci těchto látek lze zvýšit potlačením jejich disociace (změnou pH) nebo přídavkem soli či činidla, které tvoří s analytem iontový pár. Iontově párová chromatografie (IPC) je založena na tvorbě iontových asociátů mezi dělenou látkou iontové povahy a opačně nabitým iontem, jehož molekula má relativně velký nepolární podíl. Vzniklý iontový pár je neutrální a může být zadržován na reverzních fázích. Důležitým faktorem je nastavení optimálního pH, při kterém budou všechny tímto způsobem analyzované látky disociovány. Pro anionty se jako protiionty používají kvartérní amoniové soli (pH 7-8) a pro kationty alkylsulfonové kyseliny (pH 3-4). V případě dnes již téměř nevyužívané kapalinové chromatografie s normálními fázemi (NP-LC) se pro separaci látek používá polární stacionární fáze a mobilní fáze s nižší polaritou. Většinou jde o čistý silikagel nebo silikagel s polární chemicky vázanou fází a binární směs dvou rozpouštědel s rozdílnou polaritou např. hexan a propanol. Retenční mechanismus je založen na soutěži mezi dělenou látkou a mobilní fází o lokalizovaná adsorbční centra na povrchu stacionární fáze. Retence roste s rostoucí polaritou separované látky a klesá s vyšším podílem polárnější složky v mobilní fázi. Iontově výměnná chromatografie (IEC) je založena na iontových interakcích mezi stacionární fází (iontoměničem) a opačně nabitými ionty v okolním roztoku. Iontoměničem je makromolekulami matrice s kovalentně navázanou iontovou funkční skupinou. Pro separaci kationtů se využívají katexy s kyselými funkčními skupinami (sulfonová nebo karboxylová kyselina). Pro separaci aniontů pak anexy s bazickými funkčními skupinami (aminy). Mobilní fází jsou vodné roztoky pufrů, přičemž k eluci dochází nejčastěji změnou iontové síly [31, 34].

24 4. Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie (MS)jemikroanalytickámetoda, která produkuje, separuje a deteguje ionty v plynné fázi. Každý hmotnostní spektrometr obsahuje iontový zdroj, kde dochází k tvorbě plynných iontů, analyzátoru, který separuje ionty na základě poměru hmotnosti a náboje (m/z) a detektoru, který měří četnost jednotlivých iontů (abundance). Pro správnou funkčnost analyzátoru, detektoru ale i některých iontových zdrojů je zapotřebí nízký tlak, při kterém nedochází k srážkám molekul plynu, které by j inak bránily přesné detekci. Důležitou komponentou je tak i systém pump [35]. Hmotnostní spektrum, závislost intenzity signálu na m/z, obsahuje píky jednotlivých iontů, které vznikly ionizací analytu. Vyjádření hmotnostního spektra může být absolutní nebo relativní. V absolutním vyjádření představuje intenzita píku skutečnou sílu signálu pro daný iont. V případě relativního vyjádření je intenzita jednotlivých píků udávána v procentech intenzity základního píku, tedy píku s nej vyšší intenzitou [36].

4.1. Iontové zdroje

MS využívá celou řadu ionizačních technik. Iontové zdroje produkují ionty nejčastěji ionizací neutrální molekuly v plynné fázi nebo převedením nabitých částic z kondenzované formy do plynné fáze [37]. Iontové zdroje rozdělujeme podle množství dodané energie na měkké a tvrdé. Měkké zdroje využívají nízkou ionizační energii a vytváří nefragmentované molekulové ionty, které jsou vhodné pro analýzu velkých křehkých molekul. Naopak tvrdé zdroje využívají nadbytek ionizační energie a způsobují fragmentaci analytu. Mohou však poskytnout velice přesná kvantitativní data [35]. Ionizace elektrosprejem (ESI) je společně s MALDI nej používanějším iontovým zdrojem. Jde o měkkou ionizační techniku, která probíhá za atmosférického tlaku a je tedy vhodná pro spojení s LC nebo kapilární elektroforézou. Umožňuje analýzu proteinů, polymerů, ale i malých polárních látek. Vzorek prochází za atmosférického tlaku spolu s rozpouštědlem tenkou kovovou kapilárou s malým průtokem, přičemž na něj působí silné elektrické pole mezi kapilárou a proti elektrodou. Toto pole indukuje akumulaci náboje ve špičce kapiláry. Pokud je elektrostatická atrakce kapaliny s proti elektrodou vyšší než povrchové napětí kapaliny dochází ke změně tvaru kapky na konci kapiláry na tzv. Taylorův kužel, z něhož se uvolňují malé nabité kapičky. Kapičky dále putují

25 prostorem, který je zahříván inertním plynem nebo zahřívanou kapilárou, přičemž se z nich odpařuje rozpouštědlo. Tímto procesem dochází v kapičkách ke zvýšení hustoty náboje, přičemž po dosažení Rayleightova limitu, dochází k rozpadu na menší kapičky, ze kterých se nakonec uvolňují samostatné plynné ionty analytu [35-38].

Analytc molecule Solvent Coulomb Naked charged evaporation fission analyle Spraying no/vle i + +

+ +

Charged parent Charged progeny droplet i Charged droplet at droplets Taylor cone the Rayleigh limit

Power supply 1 +ve AA/WV-

Obrázek 7: Schéma ionizace elektrosprejem [39].

V případě elektronové ionizace (El) jsou molekuly plynného analytu ionizovány urychlenými elektrony, které jsou emitovány ze žhaveného vlákna. Měkčí technika chemické ionizace (Cl) využívá podobnou konstrukci jako El, s tím rozdílem, že se neionizuje přímo analyt, ale reaktivní plyn a až ten pak chemicky reaguje s molekulami analytu, přičemž jim předává náboj. Ionizace polem (FI) využívá silné elektrické pole k produkci iontů z molekul plynu a je jednou z nej měkčích metod pro tvorbu iontů z organických látek. U všech výše uvedených ionizačních technik je potřeba dodat analyt v plynné fázi. K tomu se obvykle využívá přímá sonda, která může být zahřívána nebo eluent z plynové chromatografie. Desorpce polem (FD) byla první technikou, která kombinovala desorpci a ionizaci analytu. Desorpční ionizace může být vyvolána také plasmou (PD), urychlenými atomy (FAB), ionty (SIMS) nebo laserem (LD, MALDI). Tyto techniky umožňují analýzu vzorků bez předchozí evaporace a jsou tak aplikovatelné i pro netěkavé analyty. Laserová desorpce (LD) využívá ozařování vrstvy pevné látky (vzorku) krátkým laserovým pulsem o vhodné vlnové délce, při kterém dochází k přenosu energie, následné evaporaci a ionizaci. Přímé ozáření však způsobuje fragmentaci. Tento problém byl vyřešen díky rozpuštění analytu v roztoku malých organických molekul v tzv. matrici, která silně absorbuje při vlnové délce laseru a pomocí níž se ionizační energie přenáší na

26 molekuly analytu. Ionizace laserem za účasti matrice (MALDI) je tak účinný zdroj intaktních plynných iontů z velkých, netěkavých a tepelně labilních sloučenin [35-38]. V případě indukčně vázané plazmy (ICP) je plynný nebo zmizený analyt unášen nejčastěji argonem skrz plazmu, kde dochází k jeho atomizaci a ionizaci. ICP byla poprvé spojena s atomovou emisní spektrometrií (AES) a ve spojení s hmotnostní spektrometrií je dnes nej populárnější metodou pro analýzu anorganických látek [37].

4.2. Hmotnostní analyzátory

Podobně jako u iontových zdrojů, existuje i celá řada hmotnostních analyzátorů. Průletový analyzátor (Time-of-Flight [TOF]) separuje ionty na základě rozdílné doby potřebné pro jejich průlet od iontového zdroje k detektoru. Na rozdíl od skenovacích analyzátorů tak umožňuje současné stanovení všech iontů. Tento analyzátor bývá nejčastěji spojován s MALDI, kde může být laserový puls brán jako startovací signál pro začátek měření času. Plynné ionty jsou urychleny elektrickým polem a vstupují do průletové trubice. Při vstupu mají všechny ionty stejnou kinetickou energii, ale různou rychlost, která je nepřímo úměrná hodnotě m/z. V případě využití ESI jako iontového zdroj e vstupuj i ionty do TOF analyzátoru kolmo k průletové trubici. Zde j sou pozastaveny a až následné urychlení elektrickým polem funguje jako startovací signál. Kvadrupólový hmotnostní filtr se skládá se z čtyř tyčovitých elektrod, na které je přivedena kombinace střídavého a stejnosměrného proudu. Na základě velikosti stejnosměrného napětí a amplitudy střídavého napětí v daném okamžiku se pak urychlené ionty o určitém poměru m/z pohybují po přímočaré trajektorii k detektoru, zatímco ionty s jinou hodnotou m/z j sou vychýleny a zachyceny na elektrodách. Naproti tomu sektorový magnetický analyzátor zakřivuje dráhu letu všech iontů, přičemž poloměr výsledné trajektorie závisí na intenzitě magnetického pole, poměru m/z a rychlosti iontu. Na základě velikosti intenzity magnetického pole pak ionty o určité hodnotě m/z procházejí štěrbinou k detektoru, zatímco ostatní ionty jsou zachyceny. Analyzátory typu pastí (kvadrupólová iontová past, orbitrap, a iontový cyklotron) využívají oscilační elektrické pole k zachycení iontů uvnitř pastí. Jejich rozdělení se pak uskutečňuje na základě rozdílné rezonanční frekvence [35].

27 4.3. Spojení kapalinové chromatografie s MS detekcí

Hmotnostní spektrometrie je v současné době nej publikovanější metodou pro detekci látek na výstupu z LC. Výhodou hmotnostní spektrometrie oproti stále ještě používaným UV/VIS nebo fluorescenčním detektorům je její univerzálnost a citlivost. Kromě údajů z chromatogramu navíc poskytuje spektrální údaje o identitě látky [31]. Oproti spojení s plynovou chromatografií je spojení LC s MS technicky náročnější. Analyzovaná látka je na výstupu z LC unášena nadbytkem mobilní fáze při atmosférickém tlaku. Musí být tedy zajištěn přechod z atmosférického tlaku do vakua, které je nezbytné pro hmotnostní analyzátory a odstranění mobilní fáze. Byly vyvinuty různá technická řešení tohoto spojení využívající El nebo Cl. Ty však nebyly příliš vhodné, protože docházelo ke ztrátě citlivosti a rozsáhlé fragmentaci. Nej používanější mi variantami jsou dnes ionizační techniky, které využívají fragmentaci za atmosférického tlaku, především pak ESI. Jediným omezením je pak použití těkavých elektrolytů jako přísad do mobilní fáze. ESI je měkkou ionizační technikou a umožňuje tak určení MR i u vysokomolekulárních látek. Na druhou stranu malé množství fragmentovaných iontů může znesnadnit odvození struktury. Tento problém lze vyřešit použitím tandemové hmotnostní spektrometrie [40].

28 5. Stanovení sírnych látek

Metody stanovení anorganických sírnych látek jsou zásadní pro správné pochopení mnohých environmentálni ch procesu. Jejich analýza je však vhledem k množství, podobnosti a reaktivitě velice složitá. Sirné látky mohou v roztoku vzájemně reagovat, popřípadě se rozkládat a oxidovat. Skladování i samotná analytická technika tak může ovlivnit složení směsi a vést k chybným výsledkům. Příkladem může být rychlá oxidace siřičitanu na síran, které lze zabránit použitím formaldehydu. Mnoho analytických metod bylo vyvinuto a použito pro stanovení sírnych sloučenin. Nej vhodnějšími metodami pro stanovení většího množství sírnych látek ve směsích jsou kapalinová chromatografie a kapilární elektroforéza. Možné je využít také analýzu na mokré cestě, UV-vis spektrofotometru, polarografii, voltametrii, IR a Ramanovu spektroskopii. Ani jedna z těchto metod však neposkytuje dostatečnou citlivost nebo možnost stanovení více analytů najednou. Pro separaci většiny záporně nabitých sírnych sloučenin jsou úspěšně využívány hlavně metody IEC a iontové interakční chromatografie v kombinaci s různými detektory. Výběr jednotlivých technik pak závisí na povaze konkrétního analytu. Například kvůli extrémně vysokým retenčním časům na IEC se pro stanovení vyšších polythionanů využívá hlavně IPC [41]. Pro stanovení sírnych sloučenin se také využívají derivatizační činidla, která zvyšují citlivost detekce. Například pro stanovení thiosíranu, siřičitanu a sulfidu se může využít monobrombiman (MBB) a vzniklé fluoreskující deriváty pak mohou být separovány na RP-LC [42]. Touto metodou mohou být detegovány také polysulfidy, nicméně jejich kvantifikace není možná [43]. V některých případech nejsou používané techniky dostatečně selektivní a citlivé. Využití ICP-MS spojené s předchozí separační technikou umožňuje dobré rozlišení oxidačních stavů a různých víceatomových sloučenin jakými jsou sloučeniny arsenu. V případě rozlišování sírnych sloučenin však tato metoda není zcela účinná. Metoda ESI-MS byla úspěšně využita pro přímé stanovení sírnych sloučenin. Pro analýzu komplexních vzorkuje však žádoucí využit předchozích separační ch metod [44].

29 6. Stanovení arsenu a jeho forem

Celá řada instrumentálních metod byla vyvinuta pro stanovení celkového arsenu. Pro pochopení biogeochemie, toxicity a metabolických drah, ve kterých je zapojen musely být vyvinuty metody pro stanovení jeho rozličných chemických forem. Nej populárnější analytické metody používané pro speciační analýzu jsou založeny na separaci s prvkově specifickou detekcí. Pro detekci celkového arsenu a anorganických i organických As specií se využívá hlavně UV spektrometrie, atomová absorpční spektrometrie (AAS), s indukčně vázaným plazmatem spojené metody atomové emisní spektrometrie (IPC-AES) a hmotnostní spektrometrie (IPC-MS), elektrochemické metody polarografie a voltametrie, atomová fluorescenční spektrometrie (AFS) atd. Pro separaci se využívají metody plynové chromatografie, kapilární elektroforézy, ale hlavně aplikace HPLC jako je IPC a IEC [45]. ICP metody využívají plazmu, která svou vysokou teplotou atomizuje a ionizuje všechny formy arsenu a odezva specií tak nekolísá jako u tradičních AAS metod. ICP- AES je vzhledem k své nízké citlivosti méně používanou technikou. Naopak ICP-MS je nej používanější analytickou technikou používanou pro detekci arsenu. Umožňuje multielementární a multiizotopovou analýzu, poskytuje vysokou citlivost a široký lineární rozsah. Spojení ICP-MS s HPLC nabízí vysokou selektivitu, citlivost a možnost analyzovat množství As specií [46]. Jejich identifikace je však založena pouze na porovnávání retenčních časů se standardy a při nedostatečné separaci může vést k chybným výsledkům. ESI-MS může poskytnout strukturní informace o složitějších organických speciích, čehož může být využito při identifikaci a přesnější speciační analýze [47]. Další často používanou technikou je derivatizační metoda generování hydridů (HG). Ta je založena na tvorbě plynných hydridů ze sloučenin arsenu. Nejčastěji reakcí s tetrahydroboritaném sodným. Metoda se vyznačuje vysokou citlivostí a dochází během ní k odstranění doprovodného materiálu ze vzorku. Spojením HG s MS, AAS, AFS nebo AES tak umožňuje stanovení stopového množství arsenu. Možná je také předchozí separace a tím citlivější stanovení As specií. Nicméně ne všechny sloučeniny arsenu tvoří plynné hydridy a často je tak nutné použít dekompoziční techniky [48].

30 Cíl práce

Cílem teoretické části bylo shrnutí poznatků o biooxidaci sulfidických rud s důrazem na biooxidaci arsenopyritu. Dále jsme se zabývali metabolismem a tolerancí k arsenu u bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans a separačním metodám, které se využívají pro stanovení sloučenin arsenu a síry s důrazem na kapalinovou chromatografii a hmotnostní spektrometrii. Cílem experimentální části bylo sledovat změny koncentrací sloučenin arsenu a síry v průběhu bakteriální a chemické oxidace arsenopyritu

31 Experimentální část

7. Materiál a metody

7.1. Chemikálie

Byly použity chemikálie pro analytické účely o čistotě p.a. Pro přípravu mobilních fází pak chemikálie s čistotou pro LC-MS. Pro všechny použité roztoky byla využívána ultračistá voda deionizovaná systémem Milli-Q Academie (Merck Millipore).

7.2. Přístroje

Měření byly prováděny hmotnostním spektrometrem Agilent 6224 Accurate-Mass TOF LC/MS (Agilent Technologies) s ionizací Duál ESI, spektrofotometrem Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech), pH bylo měřeno radiometrem PHM220 Lab pH Meter (Radiometer Analytical) se skleněnou elektrodou a redoxní potenciál radiometrem PHM 93 Reference pH Meter (Radiometer Copenhagen) se skleněnou ORP elektrodou Inlab Redox (Mettler Toledo). Pro analýzu dat z hmotnostní spektrometrie byl používán software MassHunter Workstation (Agilent Technologies) Dále bylo využíváno základního laboratorního vybavení jako je elektromagnetická míchačka, centrifugy, laboratorní a analytické váhy nebo flowboxy.

7.3. Vliv napětí fragmentom na fragmentaci látek

Byly připraveny standardní roztoky NaAsCh a Na2HAs04 • 7H20 o koncentraci 1 mmol ľ1 v 0,1% kyseliny octové. Pomocí autosampleru a vysokotlakého dávkovacího ventilu HPLC bylo dávkováno 10 ul vzorku do protékající mobilní fáze (0,1% kyselina octová, 0,5 ml min"1). Vzorky byly postupně analyzovány na hmotnostním spektrometru v negativním módu při různých hodnotách napětí fragmentoru (60 až 200 V).

7.4. Kalibrace

Byly připraveny standardní roztoky a NaAsCh a Na2HAs04 • 7H20 o koncentraci od

5 do 200 umol ľ1. Byl dávkován 1 ul vzorku do protékající mobilní fáze (0,1% kyselina

32 octová, 0,5 ml min"1). Vzorky byly analyzovány hmotnostním spektrometrem v negativním módu při napětí fragmentoru 120 V. Meze detekce a stanovitelnosti byly počítány z hodnot kalibrační přímky podle následujících rovnic[49].

t(P, v)(sa + xsb) Mez detekce X,. = —: —— (rovnice 5) y J b + t(P, v)sb

Mez stanovitelnosti 3,33 • Xu (rovnice 6)

Kde t(P, v) je kritická hladina studentova rozdělení t pro jednostranný test s hladinou

významnosti P a počtem stupňů volnosti v = (n — 2), sa směrodatná odchylka průsečíku

regresní přímky s osou y, sb směrodatná odchylka směrnice regresní přímky, x aritmetický průměr hodnot x a b směrnice regresní přímky.

7.5. Bakteriální kmen a jeho kultivace

Bakteriální kmen Acidithiobacillus ferrooxidans, CCM 4253 byl kultivován v 9K médiu. Jeho složení na 11 media je následovné.

Složka Ai: 600 ml H20 0,1 g KC1

0,5 g MgSC-4 7H20

3,0 g (NH4)2S04

Složka A2: 100 ml H20 0,5 g K2HPO4

Složka B: 300 ml H20(pH 1,3)

44,2 g FeSC-4 7H20

Složka C: 2 ml H20

14,2 mg Ca(N03)2 • 4H20

Výsledné pH složky B bylo upraveno kyselinou sírovou na 1,3. Všechny složky byly sterilizovaný varem a vychlazeny na laboratorní teplotu. Složka Ai byla smíchána se složkou A2 a vzniklá směs nalita do složky B. Nakonec byla za stálého míchání po kapkách přidána složka C.

33 Do devíti litrů 9K média byl inokulován 1 litr bakteriální suspenze A. ferrooxidans a pH kultury bylo upraveno na 1,76. Takto připravená kultura byla kultivována 2 dny na elektromagnetické míchačce při 28°C za soustavného provzdušňování fritou. Aby nedocházelo ke srážení vznikajících železitých iontů, bylo pH po 4 a 24 hodinách upraveno pod hodnotu 1,60. Koncentrace buněk na konci kultivace byla 2,24 • 108 buněk ml"1. Tato hodnota byla určena turbidimetricky měřením absorbance při 450 nm.

7.6. Sledování biooxidace arsenopyritu

Před kultivací musel být arsenopyrit očištěn od všech nečistot. Pro odstranění zoxidované povrchové vrstvy byl třikrát promyt střídavě horkou HC1 (6 mol ľ1) a deionizovanou vodou. Pro odstranění jemných částic vázaných elektrostaticky na jeho povrchu pak dvakrát sonifikován s ethanolem. Nakonec byl vysušen na vzduchu při laboratorní teplotě. Do jedenácti kultivačních baněk byl navážen takto připravený arsenopyrit a přidána sterilní voda okyselená kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,02. Arsenopyrit byl sterilizován varem a následně ještě jeden den promýván na rotační třepačce při 28°C. Promytý arsenopyrit byl dekantován a ještě jednou promyt 50 ml kyselé vody. Buněčná kultura kultivovaná v 9K médiu byla centrifugována 10 minut při 9600 x g a teplotě 4°C. Pelet byl rozsuspendován v 1 ml kyselé vody a centrifugován 10 minut při 12100 x g a laboratorní teplotě. Takto byly buňky promyty ještě dvakrát. K připravenému arsenopyritu bylo do každé z jedenácti baněk přidáno 100 ml kyselé vody pH 2,02 a do devíti z nich 1 ml rozsuspendované bakteriální kultury. Byly připraveny tři sady vzorků. Baňky 1-3 obsahovaly 0,7 g arsenopyritu a řádově 108 buněk ml"1. Baňky 4-6 0,3 g arsenopyritu a 109 buněk ml"1. Baňky 7-9 0,7 g arsenopyritu a 109 buněk ml"1. Baňky 10 a 11 byly abiotické s 0,7 g a 0,3 g arsenopyritu. Počáteční pH bylo upraveno na 1,8 kromě vzorků 3, 6, 9, kde bylo pH nastaveno na 2,0. Baňky byly umístěny do kultivační místnosti na rotační třepačku, kde byly buňky kultivovány při 28°C. U baněk 2, 5 a 8 bylo navíc na začátku kultivace udržováno pH kyselinou chlorovodíkovou kolem hodnoty 1,8. Po různých časových intervalech byly odebírány vzorky pro měření pH a redoxního potenciálu a vzorky pro stanovení koncentrace Fe2+, Fe3+ a pro měření na MS a ICP-AES, které byly ihned centrifugovány 10 minut při 12100 x g. Supernatant byl přenesen do nové mikrozkumavky a zamražen v hlubokomrazícím boxu.

34 Stanovení koncentrace F e a Fe Koncentrace Fe3+ byla stanovena spektrofotometrií v UV oblasti měření absorbance při 300 nm [50]. Koncentrace Fe2+ pak měřením absorbance při 510 nm s využitím fenantrolinové metody [51].

Stanovení síranu, thiosíranu, polythionanů, arsenitanu, arseničnanu a celkového arsenu Koncentrace síranu, arsenitanu a arseničnanu ve vzorcích byly stanovovány hmotnostní spektrometrií bez předchozí separace na chromatografické koloně. Stokrát zředěné vzorky byly dávkovány do mobilní fáze tvořené 0,1% kyselinou octovou o průtoku 0,5 ml min"1, přičemž objem nástřiku byl 1-10 ul. Vzorky byly měřeny v negativním módu při napětí fragmentoru 120 V. Koncentrace polythionanů byly sledovány pomocí IPC s MS detekcí. Tato metoda byla optimalizována v diplomové zabývající se biooxidací pyritu [52]. Bylo dávkováno 1-10 ul do mobilní fáze, kterou tvořil 30% acetonitril (ACN) v 0,1% kyselině octové s přídavkem 10 mmol ľ1 tributylaminu (TBA) jako iontově párového činidla. Separace probíhala na koloně Hypersil ODS s částicemi o velikosti 5 um. Vzorky byly měřeny v negativním módu při napětí fragmentoru 120 V. Celkový rozpuštěný arsen byl měřen metodou ICP-AES.

35 8. Výsledky a diskuze

8.1. Vliv napětí fragmentom na fragmentaci látek

I přesto, že je ESI měkkým iontovým zdrojem, může docházet v průběhu ionizace k fragmentaci analyzovaných látek. Ve výsledném hmotnostním spektru se pak vyskytují jak molekulové ionty, tak i jeho fragmenty. Následující grafy (obrázky 8 a 9) zobrazují závislost četnosti jednotlivých iontů na napětí fragmentoru.

o X

0 c +-» 01 >u c i_ >

100 120 140 160 Napětí fragmentoru [V]

Obrázek 8: Fragmentace arseničnanu. Průměrná četnost fragmentů H2AsC>4 (- •)a

AsOj ( M ) vznikajících při fragmentaci Na2HAs04 • 7H20.

Arseničnan byl při nižších hodnotách fragmentoru detegován ve formě H2As04 (m/z = 140,9171). Se zvyšujícím se napětím, docházelo k odštěpení vody a detekci fragmentu AsOj (m/z = 122,9065). Kromě toho byly v malém množství detegovány

fragmenty AsOj (m/z = 106,9121) a H3As04 • CH3C00~(m/z = 200,9380).

36 60 80 100 120 140 160 180 200 Napětí fragmentom [V]

Obrázek 9: Fragmentace arsenitanu. Průměrná četnost fragmentů HAs02 • CH3C00

( • ) a As02 ( M ) vznikajících při fragmentaci NaAsCh.

Arsenitan byl detegován ve formě As02 (m/z = 106,9121) a při nižších hodnotách

napětí fragmentom jako HAs02 • CH3C00~ (m/z = 166,9326). V malém množství byl

nalezen také H2As04 (m/z = 140,9171). U arseničnanu i arsenitanu byly při nízkých hodnotách napětí detegovány ionty odvozené od kyseliny octové, která tvořila mobilní fázi. U obou byly také nalezeny ionty s valencí j inou než v původním vzorku. Tato skutečnost ukazuj e na možnou konverzi mezi sloučeninami arsenu i za abiotických podmínek. Ke stanovení arsenitanu a arseničnanu by bylo ideální využít napětí fragmentom 180 V. Nicméně vzhledem k možnosti stanovit větší množství látek v jednom běhu bylo pro další měření zvoleno napětí 120 V, při kterém jsou všechny ionty detegovány v dostatečném množství a které bylo využito pro stanovení sirných látek [52].

8.2. Kalibrace

Následující grafy (obrázky 10 a 11) zobrazují kalibrační závislosti pro stanovení

arsenitanu a arseničnanu MS detekcí. Sledovány byly četnosti molekulových iontů As02

pro arsenitan a H2AsC>4 pro arseničnan. V tabulce 1 jsou uvedeny meze detekce a stanovitelnosti vypočtené z kalibračních dat.

37 20 O y = 11775X-2684,2 X R2 = 0,9988

15 l/l 0 4-» 01 >u 10 >

25 50 75 100 125 150 Koncentrace [pimol ľ1]

Obrázek 10: Kalibrační závislost pro stanovení arseničnanu. V grafu je uvedena rovnice kalibrační přímky a hodnota spolehlivosti.

15 O y= 13686X+54115 X R2 = 0,9996...--'''

10 0 c 4-* >0o1

c

25 50 75 100 Koncentrace [|imol I"1]

Obrázek 11: Kalibrační závislost pro stanovení arsenitanu. V grafu je uvedena rovnice kalibrační přímky a hodnota spolehlivosti.

38 Tabulka 1: Meze detekce a stanovitelnosti vypočtené z kalibračních dat (P=0,05).

H2As04 AsOj

Mez detekce [umol ľ1] 5,15 5,89

Mez stanovitelnosti [umol ľ1] 17,16 19,62

Kalibrační závislost pro stanovení arseničnanu je lineární v rozsahu 5-150 umol ľ . Při vyšších hodnotách dochází k saturaci detektoru, který pak neposkytuje lineární odezvu. Pro stanovení vyšších koncentrací je tak zapotřebí ředění. Kalibrační závislost pro stanovení arsenitanu je lineární pouze v rozsahu 12,5-100 umol ľ1. Při hodnotách nad 200 umol ľ1 docházelo k saturaci detektoru. Vytvoření kalibrační závislosti v rozsahu 12,5-200 umol ľ1 však nebylo možné. U koncentrací nad 100 umol ľ1 docházelo k blíže nespecifikovanému jevu, kdy byl při opakovaném měření stejného vzorku sledován nárůst četnosti fragmentu AsO^. Kalibrační závislosti pro stanovení síranu, thiosíranu, tetrathionanu a pentathionanu byly převzaty z předchozích prací [52, 53].

8.3. Biooxidace arsenopyritu

Bakteriální oxidace probíhá obvykle v prostředí H2S04. V bakalářské práci [53] bylo prokázáno, že bakteriální oxidace pyritu probíhá i v prostředí HC1, které je vhodné pro sledování sirných meziproduktů. Ukázalo se, že je toto prostředí vhodné i pro biooxidaci arsenopyritu.

Životaschopnost A. ferrooxidans lze nepřímo sledovat měřením koncentrace Fe3+, Fe2+a redoxním potenciálem, který je dán hlavně poměrem Fe3+/Fe2+. První kultivace A. ferrooxidans na arsenopyritu proběhla úspěšně (podmínky a výsledky nejsou uvedeny). Docházelo však ke vzniku sraženiny, která bránila přesnému vyhodnocení. Aby k tomuto jevu nedocházelo, upravili jsme v následujících experimentech počáteční pH pod 1,8. Ani po několika pokusech, při kterých byly následně upravovány i další parametry, se nám však nepodařilo zajistit růst bakterie. V závěrečném experimentu j sme použili tři sady vzorků, které se lišily množstvím buněk a arsenopyritu.

39 Zároveň se každý vzorek v sadě lišil počátečním pH nebo jeho úpravou v průběhu kultivace (tabulka 2).

Tabulka 2: Různé podmínky kultivace A. ferrooxidans na arsenopyritu v závěrečném experimentu.

Vzorek pH Úprava pH Objem Množství buněk Množství arsenopyritu

1 1,8 ne 100 ml 108 ml"1 7 g ľ1 2 1,8 ano 100 ml 108 mľ1 7 g ľ1 3 2,0 ne 100 ml 108 mľ1 7 g ľ1 4 1,8 ne 100 ml 109 mľ1 3 g ľ1 5 1,8 ano 100 ml 109 mľ1 3 g ľ1 6 2,0 ne 100 ml 109 mľ1 3 g ľ1 7 1,8 ne 100 ml 109 mľ1 7 g ľ1 8 1,8 ano 100 ml 109 mľ1 7 g ľ1 9 2,0 ne 100 ml 109 mľ1 7 g ľ1 10 1,8 ne 100 ml Abioticky 7 g ľ1 11 1,8 ne 100 ml Abioticky 3 g ľ1

Po prvních 4. hodinách vykazovaly všechny biotické vzorky biologickou aktivitu. Ta však byla do 50. hodin téměř u všech vzorků zastavena nebo silně inhibována. Pravděpodobně kvůli vyplavování toxických forem arsenu. Následující graf (obrázek 12) zobrazuje v čase se měnící koncentraci železitých iontů u vzorků 7-9. Vzorky se lišily pouze počátečním pH popřípadě jeho úpravou v průběhu kultivace.

40 12

10

E 8 E + m V 6 OJ u ro i_ +-» c 4 CD u c: O

iV*±»* „ + 1 • • é 400 450 500 550 0 50 100 150 200 250 300 350 Doba kultivace [hod]

Obrázek 12: Závislost koncentrace Fe3+ na době kultivace u vzorků 7(A), 8(#)a 9(B)

Z grafu je patrné, že se nejméně inhibované buňky nacházely ve vzorku 9 s počátečním pH 2,0. Aktivita buněk ve vzorcích 7 a 8 (počáteční pH 1,8) byla silně inhibována již v počátečních fázích. Nejrychleji docházelo k inhibici ve vzorku 8, kde byla reakční směs z důvodu zvyšujícího se pH v počátečních fázích kultivace okyselována. Stejný vliv pH na inhibici byl sledován i u zbylých dvou sad. Pozorování lze vysvětlit imobilizací toxických sloučenin arsenu, ke které dochází při vyšším pH. Po 50. hodinách byl aktivní růst bakterie pozorován pouze u vzorků 6 a 9. V menší míře pak také u vzorku 4, kde byl toxický účinek sloučenin arsenu díky menšímu množství vstupního arsenopyritu nižší. U všech těchto biologicky aktivních vzorků docházelo v průběhu kultivace k tvorbě žluté sraženiny. Barva abiotických a biologicky neaktivních vzorků zůstala beze změny (obrázek 13). Výsledky ukazují, že tvorba sraženiny podporuje zachování biologické aktivity ve vzorku.

41 Obrázek 13: Vzorky 9, 6 a 10 na konci kultivace.

Pro další analýzy byl vybrán biologický vzorek 9 a abioticky vzorek 10 se stejnou koncentrací arsenopyritu. Následují grafy (obrázky 14-22) zobrazují změny pH, redoxního potenciálu a koncentrací sledovaných iontů během bakteriální a chemické oxidace arsenopyritu.

2,6

2,4

2,2

?.s-.

1,8 • 1

1,6

1,4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 14: Hodnoty pH během bakteriální ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

42 Při biologické i chemické oxidaci arsenopyritu docházelo v počátečních fázích k nárůstu pH. Důvodem byla pravděpodobně konzumace protonů při oxidaci železa nebo v postulovaném polysulfidovém mechanismu. K maximální hodnotám pH docházelo u všech vzorků po 12. hodinách. Poté začalo díky oxidaci sirných meziproduktů na kyselinu sírovou pH klesat. V případě biologických vzorků byly tyto změny výraznější než u abiotických.

12

10

O E 8

u_ 6 OJ u

OJ u O ví

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 15: Koncentrace Fe2+ během bakteriální ( • ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

43 12

10

O E 8 E

u_ 6 OJ u

5 4 u o

II # • 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 16: Koncentrace Fe3+ během bakteriální ( • ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

600

550

£ 500

'u

B 450 O Q. "E x ° 400

350

300 1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 17: Hodnoty redoxního potenciálu během bakteriálni ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

44 Během bakteriální oxidace docházelo k uvolňování Fe , které byly zpočátku díky množství aktivních buněk ve vzorku, téměř kvantitativně oxidovány na Fe3+. Po 12. hodinách se rychlý nárůst koncentrace Fe3+ zastavil a do 40. hodiny koncentrace mírně klesala. Maximální koncentrace Fe3+ 11,4 mmol ľ1 bylo dosaženo po 125. hodinách. Následně tato koncentrace opět klesla a po zbytek kultivace se držela přibližně na stejné hodnotě. Po 164. hodinách docházelo k nárůstu Fe2+, který byl nejspíše způsoben snižující se biologickou aktivitou ve vzorku. Na počátku se redoxní potenciál držel na hodnotách kolem 575 mV a po 164. hodinách začal klesat až k hodnotě 476 mV na konci kultivace. Vzhledem k poklesům a následnému zastavení nárůstu koncentrace Fe3+ i přes pokračující biooxidaci, lze přepokládat že se Fe3+ podílejí na tvorbě sraženiny. Existuje také možnost, že se biooxidace po 200. hodinách zastavila. V případě neaktivních biologických vzorků však koncentrace Fe3+ po ztrátě biologické aktivity klesla až k nule. Z tohoto důvodu si nárůst Fe2+ vysvětlujeme sníženou biologickou aktivitou, nebo nadbytkem stále vznikajících Fe2+, jejichž koncentrace je vyšší než kapacita A. ferrooxidans oxidovat je.

V případě chemické oxidace dochází k vyplavování Fe2+, které jsou oxidovány na Fe3+pouze v malém množství. Po 75. hodinách se vyplavování Fe2+ zastavilo na hodnotě 11,0 mmol ľ1. Pokles viditelný po 175 hodině je vzhledem k absenci viditelné sraženiny ve vzorku způsoben pravděpodobně chybou měření. Podle tohoto výsledku lze říci, že se chemická oxidace po 75. hodinách zastavila. Redoxní potenciál na začátku kultivace klesl a po celou dobu se držel kolem hodnoty 380 mV.

45 30

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 18: Koncentrace síranu během bakteriální ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

• • 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 19: Koncentrace arsenitanu během bakteriální ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

46 ro c >u 'c 3 CD

OJ

ro 1 i_ +-» c cu u O 1 v;

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Doba kultivace [hod]

Obrázek 20: Koncentrace arseničnanu během bakteriální ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

25

O 20 E zi. =3

£ 15 O

ro

B 10 cu u ro c cu u oc v;

50 100 150 200 250 300 Doba kultivace [hod]

Obrázek 21: Koncentrace tetrathionanu během bakteriální ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

47 • • 1— 100 150 200 250 300 Doba kultivace [hod]

Obrázek 22: Koncentrace pentathionanu během bakteriální ( ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

V případě biologického vzorku došlo na začátku kultivace k nárůstu koncentrace síranu s maximem 29,5 mmol ľ1 po 125 hodinách. Následně tato hodnota klesla zhruba na polovinu. Arsen byl v biologickém vzorku detegován výhradně jako As(III). Jeho koncentrace na začátku kultivace prudce stoupla (maximum 5,7 mmol ľ1) a po 50. hodinách začala klesat až k hodnotám pod 2 mmol ľ1. Výsledky tedy naznačují, že se tvorby sraženiny účastní společně s Fe3+ také síran a As(III). Koncentrace síranu začala klesat v okamžiku, kdy byla z roztoku odstraněna většina As(III). Je tedy možné, že inkorporace síranu nebo As(III) do sraženiny závisí na poměru mezi těmito sloučeninami. Pro přesnější vyhodnocení by však bylo zapotřebí znát chemickou formu vznikající sraženiny v jednotlivých dobách kultivace. Co se týče dalších sirných látek, nebyl ve vzorcích detegován thiosíran ani trithionan a je tedy zajímavé, že byly nalezeny nízké koncentrace tetrathionanu, pentathionanu a hexathionanu. Všechny polythionany byly bakteriálně rozloženy asi po 200. hodinách kultivace. V případě chemické oxidace docházelo k pomalej Šímu, ale konstantnímu nárůstu síranu. Po 250. hodinách došlo k zastavení nárůstu koncentrace As(V) na hodnotě 5,5 mmol ľ1. Po 125. hodinách byly navíc detegovány nízké koncentrace As(III). Podle výsledků v předchozí části došlo k zastavení rozpouštění arsenopyritu již po 75. hodinách.

48 Nicméně do 250. hodiny je detegován nárůst As(V) a nárůst síranu probíhá nepřetržitě. Během chemické oxidace sirných sloučenin by tak mohl vznikat pool intermediátů, který je postupně oxidován až na síran. Vzhledem k chemické netečnosti však hlavním intermediátem pravděpodobně nebude postulovaná elementární síra. Při rozpouštění FeAsS by se v ideální případě měly uvolňovat sloučeniny železa, síry a arsenu v poměru 1:1:1. Koncentrace sledovaných forem arsenu však nedosáhla stejných hodnot jako v případě síranu a celkového rozpuštěného železa. Tyto výsledky tedy naznačují, že k zastavení rozpouštění arsenopyritu by mohlo docházet v důsledku tvorby inertní vrstvy tvořené arsenem. Stejně jako u biologického vzorku nebyl detegován thiosíran ani trithionan. Koncentrace polythionanů byly oproti biologické oxidaci po celou dobu na nižších hodnotách, přičemž nedocházelo k jejich rozkladu. Tvorba i degradace polythionanů tedy úzce souvisí se sirným metabolismem bakterie. Následující grafy (obrázky 23 a 24) zobrazují změny koncentraci celkového rozpuštěného arsenu (ICP-AES) a sumy As(III) + As(V) (ESI-MS) během bakteriální a chemické oxidace arsenopyritu.

14

12

10 OÍJ l/l L_ ro

O 8 ><-OuJ +J , >i/3> 6 Q. IM O u ro i_ +-» CD 2 u O ví 50 100 150 200 Doba kultivace [hod]

Obrázek 23: Koncentrace celkového rozpuštěného arsenu během bakteriální ( )a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

49 O 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Doba kultivace [hod]

Obrázek 24: Suma koncentrací As(III) + As(V) během bakteriální ( • ) a chemické ( • ) oxidace arsenopyritu.

Při porovnání námi zjištěné sumy As(III) + As(V) a celkové koncentrace rozpuštěného arsenu, je patrné, že je koncentrace celkového rozpuštěného arsenu větší než suma námi sledovaných sloučenin arsenu. Toto pozorování by mohlo naznačovat, že se arsen vyskytuje ve vzorku v dalších formách. Metoda ICP-AES by mohla při využití správného algoritmu poskytnout data o koncentraci celkové arsenu, který se nachází ve sraženině. Jak již bylo řečeno, v aktivních biologických vzorcích byl detegován rozpustný arsen výlučně jako As(III). V případě abiotických vzorků pak jako As(V). Důvodů může existovat celá řada. Nejjednodušším vysvětlením by bylo, že se činností bakterie z arsenopyritu uvolňuje pouze As(III) a v její nepřítomnosti nebo neaktivitě As(V). Jiným vysvětlením by mohlo být, že se se z arsenopyritu uvolňuje vždy As(V), přičemž v biologickém vzorku dochází činností detoxifikační As(V) reduktázy, k přeměně na As(III). Uvolňování nebo přeměna těchto sloučenin však může být ovlivněna dalšími chemickými reakcemi. Například As(III) může být v přítomnosti vysoké koncentrace Fe2+ oxidován Fentonovou reakcí na As(V). Jiná chemická reakce může probíhat, pokud při oxidaci arsenopyritu vzniká postulovaný sulfid, který nebyl v této bakalářské práci stanovován. Reakcí sulfidu s As(V) může docházet k redukci na As(III), přičemž

50 v průběhu redukčního mechanismu vznikají také thioarseničnany, dithioarseničnany, thioarsenitany, dithioarsenitany, elementární síra a další As-S specie [54]. Tyto sloučeniny arsenu by v našem případě mohly vysvětlit rozdíl mezi sumou koncentrací As(III) + As(V) a koncentrací celkového arsenu. Sloučeniny však v hmotnostním spektru nebyly detegovány. Koncentrace síranu, Fe2+ i Fe3+ dosahují na konci chemické oxidace vyšších hodnot než v případě pyritu [52]. Společně s absencí thiosíranu v případě arsenopyritu toto pozorování naznačuje, že je mechanismus rozpouštění těchto dvou minerálů odlišný. Pozorování vzniku síranu během chemické oxidace arsenopyritu, jehož koncentrace je srovnatelná s koncentrací uvolněného železa však nenaznačuje, že by mechanismus rozpouštění arsenopyritu probíhal s v současné době uznávaným polysulfidovým mechanismem. Závěrem nutno dodat, že pochopení mechanismu, jakým je arsenopyrit rozpouštěn, je pouhým sledováním vznikajících látek vzhledem ke komplexnosti systému takřka nemožné. Zvláště pak, pokud neznáme koncentrace všech vznikajících látek. Dalším vlivem, který znesnadňuje přesné vyhodnocení je navíc tvorba sraženiny, jejíž vznik podporuje zachování biologické aktivity A. ferrooxidans při růstu na arsenopyritu.

51 Souhrn

Byla optimalizována metoda ESI-TOF MS pro stanovení arsenitanu a arseničnanu. Tato metoda byla společně s metodou IPC-MS a ICP-AES využita pro stanovení arsenitanu arseničnanu, celkového arsenu a sirných látek v průběhu biooxidace arsenopyritu bakterií Acidithiobacillus ferrooxidans. Zároveň byla za stejných podmínek sledována i chemická oxidace arsenopyritu. Byl pozorován negativní vliv sloučenin arsenu na bakterii a vliv počátečního pH na srážení železa s arsenem a síranem. Bylo prokázáno, že se v průběhu biooxidace vyskytuje v roztoku arsenitan a naopak v průběhu chemické oxidace arseničnan. V případě chemické oxidace byl pozorován kontinuální nárůst síranu, který společně se srovnatelnou koncentrací celkového rozpuštěného železa nepotvrzuje v literatuře všeobecně uznávaný polysulfidový mechanismus.

52 Použitá literatura

1. Barton LL, Mandl M, Loy A. 2010. Geomicrobiology: Molecular and Environmental Perspective. 1st ed. Netherlands: Springer.

2. Sand W. 1999. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. Applied and Environmental Microbiology 65:319-321.

3. Sand W, Gehrke T, Jozsa P-G, Schippers A. 2001. (Bio)chemistry of bacterial leaching—direct vs. indirect bioleaching. Hydrometallurgy 59:159-175.

4. Vera M, Schippers A, Sand W. 2013. Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation—part A. Applied Microbiology and Biotechnology 97:7529-7541.

5. Tuovinen OH, Bhatti TM, Bigham JM, Hallberg KB, Garcia Jr. O, Lindstrom EB. 1994. Oxidative dissolution of arsenopyrite by mesophilic and moderately thermophilic acidophiles. Applied and Environmental Microbiology 60:3268-3274.

6. Collinet M, Morin D. 1990. Characterization of arsenopyrite oxidizing Thiobacillus: tolerance to arsenite, arsenate, ferrous and ferric iron. Antonie van Leeuwenhoek 57:237-244.

7. Mandl M, Matulová P, Dočekalová H. 1992. Migration of arsenic(III) during bacterial oxidation of arsenopyrite in chalcopyrite concentrate by Thiobacillus ferrooxidans. Applied Microbiology and Biotechnology 38:429 - 431.

8. Duquesne K, Lebrun S, Casiot C, Bruneel O, Personné JC, Leblanc M, Elbaz- Poulichet F, Bonnefoy G. 2003. Immobilization of arsenite and ferric iron by Acidithiobacillus ferrooxidans and its relevance to acid mine drainage. Applied And Environmental Microbiology 69:6165-73.

9. Morin G, Juillot F, Corinne C, Bruneel O, Personné J-C, Elbaz-Poulichet F, Leblanc M, Ildefonse P, Calas G. 2003. Bacterial Formation of Tooeleite and Mixed Arsenic(III) or Arsenic(V)—Iron(III) Gels in the Carnoulěs Acid Mine Drainage, France. A XANEs, XRD, and SEM Study. Environmental Science 37:1705-1712.

53 10. Kelly DP, Wood AP. 2000. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov and gen. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 50:511-516.

11. Williams KP, Kelly DP. 2013. Proposal for a new class within the phylum , Acidithiobacillia classis nov., with the type order Acidithiobacillales, and emended description of the class Gammaproteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 63:2901 - 2906.

12. Fečko P, Kušnierová M, Cablík V, Pečtová I. 2004. Environmentálni biotechnologie. 1st ed. VSB -TU Ostrava: Ediční středisko VSB - TUO.

13. Rawlings DE. 2002. Heavy metal mining using microbes. Annual Review of Microbiology 56:65-91

14. Bird LJ, Bonnefoy V, Newman DK. 2011. Bioenergetic challenges of microbial iron metabolisms. Trends in Microbiology 19:330-340

15. Meruane G, Vargas T. 2003. Bacterial oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5-7.0. Hydrometallurgy 71:149-158.

16. Rawlings DE. 2005. Characteristics and adaptability of iron- and sulfur-oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates. Microbial Cell Factories 4:13.

17. Bonnefoy V, Holmes DS. 2012. Genomic insights into microbial iron oxidation and iron uptake strategies in extremely acidic environments. Environmental Microbiology 14:1597-1611.

18. UríkM, LitteraP, MikušováP. 2013. Mikrobiálna oxidácia sulfidov. Chemické listy 107:292-297.

19. Steudel R, Holdt G, Göbel T. 1988. Solubilization of Elemental Sulfur in Water by Cationic and Anionic Surfactants. Angewandte Chemie International Edition 27:1358-1359.

20. Steudel R, Holdt G, Göbel T, Hazeu W. 1987. Chromatographic Separation of Higher Polythionates SnO. Angewandte Chemie International Edition 26:151-153.

54 21. Rohwerder T, Sand W. 2003. The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphilium spp. Microbiology-SGM 149:1699-1709.

22. Quatrini R, Appia-Ayme C, Denis Y, Jedlicki E, Holmes DS, Bonnefoy V. 2009. Extending the models for iron and sulfur oxidation in the extreme Acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans. BMC Genomics 10:394.

23. Kučera J, Pakostova E, Lochman J, Janiczek O, Mandl M. 2016. Are there multiple mechanisms of anaerobic sulfur oxidation with ferric iron in Acidithiobacillus ferrooxidans^ Research in Microbiology. doi:10.1016/j.resmic.2016.02.004 (v tisku).

24. Žeravčíková B. 2002. Enzym sulfitdehydrogenasa u bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU, Brno.

25. Jong GAH, Hazeu W, Bos P, Kuenen JG. 1997. Polythionate degradation by tetrathionate hydrolase of Thiobacillus ferrooxidans. Microbiology-SGM 143:499-504.

26. Breed AW, Glatz A, Hansford GS, Harrison STL. 1996. The effect of As(III) and As(V) on the batch bioleaching of a pyrite-arsenopyrite concentrate. Minerals Engineering 9:1235-1252.

27. Slyemi D, Bonnefoy V. 2011. How prokaryotes deal with arsenic. Environmental Microbiology Reports 4:571-586.

28. Butcher BG, Deane SM. 2000. The Chromosomal Arsenic Resistance Genes of Thiobacillus ferrooxidans Have an Unusual Arrangement. Applied 66:1826-1833.

29. Mo HY, Chen Q, Du J, Tang L, Qin F, Miao B, Wu XL, Zeng J. 2011. Ferric Reductase Activity of the ArsH Protein from Acidithiobacillus ferrooxidans. Journal of microbiology and biotechnology 21:464-469.

30. Butcher BG, Rawlings DE. 2002. The divergent chromosomal ars operon of Acidithiobacillus ferrooxidans is regulated by an atypical ArsR protein. Microbiology-SGM 148:3983-3992.

31. Nováková L, Douša M. 2013. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Hradec Králové (Klatovy): Lucie Nováková (Michal Douša).

55 32. Mermet J-M, Otto M, Valcárcel Cases M. 2004. Analytical chemistry: a modern approach to analytical science. 2nd ed. Weinheim: Wiley-VCH.

33. Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. 2004. Fundamentals of analytical chemistry. 8th ed. Belmont, CA: Thomson-Brooks/Cole.

34. Harvey D. 2000. Modern analytical chemistry. 1st ed. Boston: McGraw-Hill.

35. Ekman R, Silberring J, Westman-Brinkmalm A, Kraj A. 2009. Mass spectrometry: instrumentation, interpretation, and applications. 1st ed. Hoboken, N.J.: John Wiley & Sons.

36. Gross JH. 2011. Mass spectrometry: a textbook. 2nd ed. Berlin: Springer.

37. Hoffmann E, Stroobant V. 2007. Mass spectrometry: principles and applications. 3rd ed. Chichester: John Wiley & Sons.

38. Watson JT, Sparkman OD. 2007. Introduction to mass spectrometry: instrumentation, applications and strategies for data interpretation. 4th ed. Hoboken, N.J.: John Wiley & Sons.

39. http://america.pink/electrospray-ionization_1404975.html

40. Holčapek P, Jandera P. 1998. Spojení kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Chemické listy 92:278-286.

41. O'Reilly JW, Dicinoski GW, Shaw MJ, Haddad PR. 2001. Chromatographic and electrophoretic separation of inorganic sulfur and sulfur-oxygen species. Analytica Chimica Acta 432:165-192.

42. Gru C, Legoff H, Narcon S, Sarradin P-M, Caprais J-C, Lallier FH. Determination of reduced sulfur compounds by high-performance liquid chromatography in hydrothermal seawater and body fluids from . The Analyst 123:1289-1293.

43. Rethmeier J, Rabenstein A, Langer M, Fischer U. 1997. Detection of traces of oxidized and reduced sulfur compounds in small samples by combination of different high-performance liquid chromatography methods. Journal of Chromatography A 760:295-302.

56 44. Stewart II, Barnett DA, Horlick G. 1996. Investigations into sulfur speciation by electrospray mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry 11:877-886.

45. Burguera M, Burguera JL. 1997. Analytical methodology for speciation of arsenic in environmental and biological samples. Talanta 44:1581-1604.

46. Hung DQ, Nekrassova O, Compton RG. 2004. Analytical methods for inorganic arsenic in water: a review. Talanta 64:269-277.

47. Ninh TD, Nagashima Y, Shiomi K. 2006. Quantification of seven arsenic compounds in seafood products by liquid chromatography/electrospray ionization- single quadrupole mass spectrometry (LC/ESI-MS). Food Additives and Contaminants 23:1299-1307.

48. Gong Z, Lu X, Ma M, Watt C, Le C. 2002. Arsenic speciation analysis. Talanta 58:77-96.

49. Doerffel K. 1966. Statistik in der analytischen Chemie. Zeitschrift für Chemie 6:479.

50. Mandl M, Nováková O. 1993. An ultraviolet spectrophotometric method for the determination of oxidation of iron sulphide minerals by . Biotechnology Techniques 7:573-574.

51. Tamura H, Goto K, Yotsuyanagi T, Nagayama M. 1974. Spectrophotometric determination of iron(II) with 1,10-phenanthroline in the presence of large amounts of iron(III). Talanta 21:314-318.

52. Strajtová S. 2015. Využití hmotnostní spektrometrie při stanovení anorganických sirných látek u bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU, Brno.

53. Strajtová S. 2015. Metody separace anorganických sirných látek. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU, Brno.

54. Rochette EA, Bostick BC, Li G, Fendorf S. 2000. Kinetics of Arsenate Reduction by Dissolved Sulfide. Environmental Science & Technology 34:4714-4720.

57