UNIVERSIDADE FEDER AL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra
e Pachylis aff pharaonis
(Heteroptera, Coreidae)
ITUZA CELESTE GARCIA RAMOS
RECIFE 2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e Pachylis
aff pharaonis (Heteroptera, Coreidae)
ITUZA CELESTE GARCIA RAMOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE
Orientador: Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes
Co-orientador: Profª. Drª. Rita de Cássia de Moura
RECIFE 2009
Ramos, Ituza Celeste Garcia Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis (Heteroptera, Coreidae) / Ituza Celeste Garcia Ramos. – Recife: O Autor, 2009.
88 folhas: il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Genética, 2009.
Inclui bibliografia.
1. Cariótipos 2. Heterocromatina constitutiva 3. Percevejos- análise cromossômica 4. Regiões organizadoras de nucléolos I Título.
595.754:575 CDU (2.ed.) UFPE 595.754. CDD (22.ed.) CCB – 2009- 053
Aos meus Pais, Regina e Waldir, e a Tarciano com todo meu amor e gratidão, dedico.
Agradecimentos
À Deus por permitir que, diante de tantas dificuldades, eu chegasse até aqui. Aos meus pais Regina e Waldir por terem criado oportunidades para que eu estudasse, por sempre me valorizarem e por mostrarem que não há limites para concretizarmos nossos sonhos. Aos meus avós Carlos (in memorian), Alayde, Severino e Angelina (in memorian) pelo orgulho que sentem por mim e por, embora distantes, sempre estarem presentes. Ao meu amor Tarciano por ter me apoiado nessa jornada e por fazer de mim uma mulher mais feliz. E a sua família, hoje também minha, pelo apoio e consideração que me tem. Aos meus sobrinhos Aquiles, Evelyn, Lívia, Lua e Yasmin por me alegrarem e me fazerem sentir uma pessoa querida. Aos meus primos e tios por sempre torcerem por mim e por ficarem felizes pelas minhas conquistas. A Gracy, Evandro, Cecília, Gleyce, Ana Paula e Samara por serem meus amigos apesar da minha ausência. Aos amigos biólogos Indra, Eric, Janilson, Catarina, Maria Gabriela, Bruno, Elise, Karla, Carolinne e Katiússia pela amizade e incentivo. Aos amigos de laboratório Jéfferson, Diogo, Jéssica, Danniele, Tyago, Merilane, Adriana, Marcela, Pollyanna, Sárah, Guilherme, Natália, Mirella, Cibelle, Amanda, Fernando, Felipe, Cristiane, Celso, Mônica, Ebenézer, Santelmo e Tatiana pela companhia e por toda ajuda durante a realização do mestrado. Aos meus colegas de turma Bethânia, Diego, Felipe, Gabriela, Geyner, Jéssica, Júlia, Marília, Nara, Petra, Rodrigo, Tatiana e Will pela atenção nos momentos difíceis e felizes que passamos. A minha orientadora Maria José de Souza Lopes por ter me aceito neste mestrado mesmo sem me conhecer, pela dedicação ao meu projeto e por ter ensinado-me a trabalhar com ética, perseverança e sempre em prol da ciência. A minha co-orientadora Rita de Cássia de Moura pela ajuda e atenção dadas a mim desde a graduação. A Cirlene pela amizade, colaboração neste trabalho e por todas as dúvidas tiradas. A Neide, Vilma, Marília e Martín pelas boas conversas e por me mostrar que é possível ser um bom pesquisador e professor ao mesmo tempo. A Neide por todo aprendizado no estágio de docência e pela força que sempre me deu. A Santelmo pela ajuda durante o estágio de docência. A Ebenézer pela disponibilização de artigos. E a ambos pela ajuda na utilização do fotomicroscópio. A Jéssica pelos “galhos que sempre quebrou”. A Francisca (Fran) pela ajuda e dedicação no laboratório. Ao professor Marcelo Guerra pela disponibilização do Laboratório para captura de imagens e a Ana Emília Silva pelo apoio na hibridização in situ fluorescente (FISH). Ao professor José Antônio Marin Fernandes da Universidade Federal do Pará pela identificação das espécies estudadas. Ao CNPq pelo apoio financeiro (projeto: 471485/2004-7).
Lista de abreviaturas
aff - Próximo
AgNO3 - Nitrato de prata AT - Adenina-timina
CMA3 - Cromomicina A3 + CMA3 - Cromomicina A3 positiva - CMA3 - Cromomicina A3 negativa DA - Distamicina A DAPI - 4’6-diamidino-2-fenilindol DAPI + - 4’6-diamidino-2-fenilindol positivo DAPI - - 4’6-diamidino-2-fenilindol negativo DNAr - DNA ribossômico et al - E colaboradores Fig - Figura FISH - Hibridização in situ fluorescente GC - Guanina- citosina HC - Heterocromatina constitutiva HF - Heterocromatina facultativa m - Cromossomo m/ mini cromossomo mg - Miligrama ml - Mililitro mm - Milímetro Nu - Nucléolo Pb - Pares de base RONs - Regiões organizadoras de nucléolos X - Cromossomo X Y - Cromossomo Y µm - Micrômetro µl - Microlitro 2SSC - Solução salina de citrato
Lista de Figuras
Fig. 1. Coloração convencional em cromossomos meióticos de Leptoglossus gonagra. a) 53 estágio difuso, b) diplóteno, c) diacinese, d) metáfase I, e) anáfase I, f) metáfase II e g) telófase II. As setas indicam os cromossomos m. Barra=5µm.
Fig. 2. Coloração convencional em cromossomos meióticos de Pachylis aff pharaonis. a) 54 estágio difuso, b) diplóteno, c) diacinese, d) metáfase I, e) anáfase I, f) anáfase II com X e g) anáfase II sem X. As setas indicam os cromossomos m. Barra=5µm.
Fig. 3. Padrão de bandeamento C (a,b) e duplas colorações CMA3/DA (c) e DAPI/DA (d) 55 em Leptoglossus gonagra. a) cariótipo, b) diacinese, (c) estágio difuso e (d) metáfase I. Em (c) as setas indicam os blocos CMA3 positivos nos cromossomos m e em (d) os cromossomos m sem marcações pelo DAPI. Barra=5µm.
Fig. 4. Padrão de bandeamento C (a,b) e tríplice coloração CMA3/DA/DAPI (c,d) em 56 Pachylis aff pharaonis. a) cariótipo, b-d) diplótenos. As setas indicam em (a) o bloco intersticial de HC, em (c,d) os cromossomos m sem marcações. Barra=5µm.
Fig. 5. Impregnação com AgNO3 (a,b) e FISH (c,d) com sonda de DNAr 45S em 57 Leptoglossus gonagra. (a) zigóteno, (b) diplóteno, (c) diacinese e (d) metáfase I. As setas em (a,b) indicam os cromossomos m com remanescente nucleolar e em (c,d) os sítios de DNAr. Barra=5µm.
Fig. 6. Impregnação com AgNO3 (a,b) e FISH (c,d) com sonda de DNAr 45S em Pachylis aff pharaonis. (a) leptóteno, (b) metáfase I, (c) diplóteno e (d) metáfase I. As 58 setas em (a,b) indicam o cromossomo com remanescente nucleolar semi-persistente e em (c,d) os sítios de DNAr. Barra=5µm.
Fig. 7. Exemplar macho de Pachylis aff pharaonis (a); casal de Leptoglossus gonagra em 78 cópula (b).
Lista de tabelas
Tabela 1. Espécies de Heteroptera analisadas por técnicas citogenéticas diferenciais. 43
Sumário
Introdução 12 Resumo 14 Abstract 16 1. Revisão da Literatura 18 1.1. Considerações gerais sobre Heteroptera 18 1.2. Cariótipo e comportamento meiótico em Heteroptera 22 1.2.1. Aspectos gerais 22 1.3. Caracterização de cromossomos holocêntricos e seu 26 comportamento meiótico 1.4. Heterocromatina constitutiva em Heteroptera 31 1.5. Regiões organizadoras de nucléolos em Heteroptera 38 2. Objetivos 51 2.1. Objetivo geral 51 2.2. Objetivos específicos 51 3. Materiais e Métodos 53 3.1. Materiais 53 3.2. Métodos 53 3.2.1. Preparações citológicas e coloração convencional 53 3.2.2. Bandeamento C 54 3.2.3. Coloração com fluorocromos 54 3.2.4. Impregnação com nitrato de prata 55 3.2.5. Hibridização in situ fluorescente (FISH) 55 3.3. Documentação fotográfica 56 4. Resultados 58 4.1. Coloração convencional 58 4.2. Bandeamento C e coloração com fluorocromos 59 4.3. Impregnação com nitrato de prata e FISH 59 5. Discussão 68 6. Conclusões 74 7. Referências Bibliográficas 76 8. Apêndice 87 8.1. Fotografias de exemplares das espécies estudadas neste trabalho 87
Introdução GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 12
Introdução
Heteroptera, corresponde a um grupo de insetos com algumas peculiaridades cromossômicas como a presença de cromossomos holocêntricos, estágio difuso, cromossomos “m” e meiose invertida restrita aos cromossomos sexuais. Essas características diferenciam esta subordem da maioria dos insetos estudados citogeneticamente. A família Coreidae (Coreoidea) é bastante numerosa e diversificada, possuindo uma grande variabilidade citogenética. Seus representantes em geral são caracterizados por possuírem um par de cromossomos m e sistema de determinação do sexo do tipo X0. Nesta família o número diplóide mais comum corresponde a 2n=21 (18A+2m+X0), sendo observadas variações de 2n=13 (10A+2m+X0) em Ceraleptus obtusus (Pseudophloeinae) até
2n=28 (24A+2m+X1X20) em Petillia calcar (Petascelidini). Dentro de sua ampla diversidade de espécies, Coreidae representa uma família ainda pouco estudada cromossomicamente. Particularmente, o uso de técnicas citogenéticas diferenciais como bandeamento C, para determinação da localização da heterocromatina constitutiva (HC), a impregnação com nitrato de prata e a hibridização in situ fluorescente (FISH), para identificação das regiões organizadoras de nucléolos (RONs), são pouco usadas neste grupo de insetos. Alguns dados cariotípicos descritos na literatura têm mostrado que em Coreidae a HC está localizada preferencialmente nas regiões terminais dos cromossomos na forma de pequenos blocos. Algumas exceções têm sido descritas em menor freqüência como blocos intersticiais e subterminais, bem como cromossomos totalmente ou quase totalmente heterocromáticos. As RONs também tem localização preferencial em regiões terminais, ocorrendo nos autossomos ou nos cromossomos sexuais. Neste trabalho, foram estudadas duas espécies da família Coreidae, Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis pertencentes a subfamília Coreinae através de diferentes técnicas convencionais e diferenciais de análise cromossômica.
Resumo GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 14
Resumo
Análise cromossômica de Leptoglossus gonagra (2n=21=18A+2m+X0) e Pachylis aff pharaonis (2n=15=12A+2m+X0) revelou cromossomos holocêntricos que decrescem gradualmente de tamanho. Nas duas espécies, o cromossomo X mostrou tamanho médio e os cromossomos m correspondem aos menores elementos do cariótipo. As duas espécies mostraram a heterocromatina constitutiva (HC) nas regiões terminais de todos os cromossomos. Adicionalmente, P. aff pharaonis mostrou um bloco intersticial de HC no
bivalente 2. A tríplice coloração CMA3/DA/DAPI revelou que nesta espécie todas as regiões
de HC, exceto dos cromossomos m são CMA3 positivas. Em L. gonagra, a dupla coloração
CMA3/DA revelou blocos CMA3 positivos restritos aos cromossomos m. Nas duas espécies, a coloração com DAPI foi neutra para todas as regiões cromossômicas e a impregnação com
AgNO3 revelou RONs ativas em apenas um bivalente autossômico. Em L. gonagra a RON está localizada na região terminal dos cromossomos m e em P. aff pharaonis está associada a região terminal do bivalente 2. A RON desta espécie evidenciou o fenômeno denominado nucléolo semi-persistente, permitindo a visualização do remanescente nucleolar até a metáfase I. Os resultados obtidos pela FISH nas duas espécies analisadas mostraram padrões similares
aqueles obtidos pela impregnação com AgNO3. Diferenças e similaridades cromossômicas encontradas nas espécies analisadas corroboram o status taxonômico das mesmas.
Palavras-chave: Cariótipos, heterocromatina constitutiva, percevejos, RONs.
Abstract GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 16
Abstract
Chromosomal analysis of Leptoglossus gonagra (2n=21=18A+2m+X0) and Pachylis aff pharaonis (2n=15=12A+2m+X0) revealed holocentric chromosomes that decrease gradually of size. In the two species, the X chromosome showed medium size and the m chromosomes corresponds to the smallest element of the karyotype. The two species showed the constitutive heterochromatin (CH) in the terminal regions of the all chromosomes. Additionally, P. aff pharaonis showed an interstitial CH block in the bivalent 2. The triple
staining CMA3/DA/DAPI revealed that in this species all of the regions of CH, except of the
m chromosomes are CMA3 positive. In L. gonagra, the double staining CMA3/DA revealed
blocks CMA3 positive restricted to the chromosomes m. In the two species, the staining with
DAPI was neutral for all of the chromosomal regions and the AgNO3 impregnation revealed active NORs in an autosomal bivalent. In L. gonagra the NOR is located in the terminal region of the chromosomes m and in P. aff pharaonis is associated in terminal region of the bivalent 2. The NOR of this species evidenced the phenomenon denominated semi-persistent nucleolus, allowing the visualization of the nucleolar remnants to the metaphase I. The results obtained by FISH in the two analyzed species showed similar patterns that obtained by
the AgNO3 impregnation. Differences and chromosomal similarities found in the analyzed species corroborate the taxonomic status of the same.
Key-words: Bugs, constitutive heterochromatin, karyotypes, NORs.
Revisão da literatura GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 18
1. Revisão da Literatura
1.1. Considerações gerais sobre Heteroptera
A ordem Hemiptera possui mais de 50.000 espécies distribuídas em aproximadamente
100 famílias e representa a maior e mais diversa ordem de insetos hemimetábolos (Gullan e
Cranston, 2000; Schaefer e Panizzi, 2000). Heteroptera, subordem de Hemiptera, tem seus
representantes chamados popularmente de percevejos e destaca-se por possuir várias espécies
adaptadas a diferentes tipos de habitats (Stonedahl e Dolling, 1991).
Heteroptera corresponde a um grupo monofilético bem estabelecido com cerca de
35.000 espécies distribuídas em todo o mundo, existindo tanto espécies cosmopolitas como
endêmicas. As ninfas de heterópteros se assemelham a adultos, entretanto diferem quanto as
asas e genitálias, que encontram-se em desenvolvimento. Neste grupo, as asas anteriores são
denominadas hemiélitros por possuírem uma parte proximal esclerificada e uma distal
membranosa, as quais são visíveis apenas a partir do quarto estágio ninfal (Gullan e Cranston,
2000; Schaefer e Panizzi, 2000). Outra característica diferencial de Heteroptera é a presença
de glândulas excretoras de mau odor localizadas no abdômen de ninfas e no tórax e abdômen
dos adultos. Estas excreções mostram diferentes funções, como atração durante o
acasalamento e localização no habitat, sendo a mais importante a defesa contra predadores
como as formigas (Schaefer e Panizzi, 2000).
Considerando o grupo mais primitivo com relação ao mais recente, com base em
dados morfológicos, a seqüência de ancestralidade das sete infraordens de Heteroptera é a
seguinte: Enicocephalomorpha, Dipsocoromorpha, Gerromorpha, Nepomorpha,
Leptodomorpha, Cimicomorpha e Pentatomorpha (Stonedahl e Dolling, 1991). Estes dados
concordam em grande parte com as relações filogenéticas estabelecidas anteriormente com
base em caracteres morfológicos (Kerzhner, 1967; Andersen, 1982; Froeschner, 1989). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 19
Contudo, certas características consideradas ancestrais, como membrana dos hemiélitros e
corium, podem representar sinapomorfias originadas recentemente na evolução do grupo
(Schuh e Slater, 1995; Gullan e Cranston, 2000). As infraordens Gerromorpha e Nepomorpha
concentram a maioria dos membros aquáticos e semi-aquáticos de Heteroptera, enquanto
quase todos os grupos remanescentes estão incluídos nas infraordens Cimicomorpha e
Pentatomorpha (Sorensen et al, 1995).
Entre os heterópteros existem espécies que são fitófagos especialistas, generalistas,
hematófagas e representantes de algumas de suas famílias são exclusivamente predadoras de
outros artrópodas (Schaefer e Panizzi, 2000). Muitas espécies de Heteroptera podem ser
daninhas ou benéficas devido a ampla variedade de seus hábitos alimentares, sendo
importantes do ponto de vista econômico (Fauvel, 1999). Entre os fitófagos, várias espécies
constituem pragas de plantas cultivadas e um número substancial de heterópteros são
predadores de insetos, por esta razão, agem como controladores biológicos, oferecendo
controle de nível moderado a alto em habitats naturais e cultivados (Grazia et al, 1999;
Schaefer e Panizzi, 2000).
Os heterópteros podem causar danos variados aos tecidos vegetais. Algumas espécies
injetam saliva tóxica na planta para ajudar no colapso dos tecidos celulares. A ação da saliva e
o dano mecânico causado pelos estiletes freqüentemente resultam em necrose dos tecidos da
planta, podendo ocasionar a morte da mesma quando existe infestação. Alguns grupos, como
Lygaeidae e Pentatomidae, alimentam-se extensivamente de sementes em desenvolvimento e
frutas, e freqüentemente matam ou impedem a germinação da planta (Stonedahl e Dolling,
1991).
A superfamília Coreoidea caracteriza-se principalmente por seus representantes
apresentarem um aspecto peculiar da membrana dos hemiélitros, com várias nervuras que
partem de uma nervura basal, curvada paralelamente ao bordo do corium (Schaefer, 1998). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 20
Esta superfamília compreende cerca de 2000 espécies, distribuídas em dez famílias: Alydidae,
Berytidae, Colobathristidae, Coreidae, Hyocephalidae, Lygaeidae, Malcidae, Pirrhocoridae,
Rhopalidae e Stenocephalidae (Stonedahl e Dolling, 1991).
As famílias de Heteroptera destacam-se por algumas características comuns a seus
representantes, as quais dão origem a denominações peculiares como: Pentatomidae
(percevejos que fedem), Coreidae (percevejos que esmagam), Lyagaeidae (percevejos de
semente), Reduviidae (percevejos assassinos), Cimicidae (percevejos de flores), Miridae
(percevejos de folhas), Notonectidae (nadadores de costas), Belostomatidae (percevejos
aquáticos gigantes), Corixidae (barqueiros aquáticos), Gerridae (patinadores de lagoa) e
Veliidae (pequenos andadores aquáticos) (Sorensen et al, 1995).
Coreidae é uma família cosmopolita de percevejos encontrados em todas as regiões
zoogeográficas do mundo. Abrange a maior parte dos representantes de Coreoidea,
concentrando as espécies de cores mais brilhantes e de maior porte. Destas, destaca-se
Pachylis pharaonis (Mictini) como o maior representante de Coreoidea encontrado no Brasil,
com cerca de 35mm de comprimento (Lima, 1940). Esta família compreende cerca de 252
gêneros e 1802 espécies no mundo, sendo mais diversa na Região Tropical e apresentando
para o novo mundo 136 gêneros e 838 espécies (Packauskas, 1994; Schuh e Slater, 1995). A
subfamília Coreinae, compreende várias tribos, das quais apenas oito delas têm representantes
no Brasil: Acanthocephalini, Mictini, Anisoscelini, Leptoscelini, Menenotini, Chariesterini,
Coreini e Discogasterini. Acanthocephalini e Mictini são as únicas que não possuem espécies
de interesse agrícola (Packauskas, 1994).
O gênero Leptoglossus (Anisoscelini) é um grande grupo complexo que concentra 49
espécies que se distribuem do Sul do Canadá passando pelos Estados Unidos, Antilhas,
América Central, até a América do Sul incluindo Chile e Argentina. Leptoglossus gonagra, é
a única espécie deste gênero que ocorre fora do Hemisfério Ocidental, tendo sido registrada GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 21
na África, Sudeste da Ásia, Ilhas Pacíficas e Austrália, sendo distribuída em todas as regiões
tropicais e subtropicais do mundo (Brailovsky e Barrera, 1998; Packauskas e Schaefer, 2001).
Baranowski e Slater (1986) admitiram como sinônimas Leptoglossus australis e Leptoglossus
gonagra. O adulto de L. gonagra tem sido descrito como um percevejo de coloração marrom
escura com listras alaranjadas na cabeça, com cerca de 20mm de comprimento (Gallo et al,
1988).
Entre os heterópteros várias espécies são transmissoras de doenças tanto em animais
como em plantas. Representantes do gênero Leptoglossus (Coreidae) ocorrem como pragas de
diversas culturas vegetais importantes no Brasil e em outros países. Entre estas, destacam-se
L. zonatus, L. stigma e L. gonagra, constituindo algumas das principais espécies prejudiciais
ao maracujazeiro (Passiflora spp.) e aceroleira (Malpighia glaba L.) (Caetano e Boiça Jr,
2000; Caetano et al, 2000; Micheloto et al, 2006). L. gonagra age sugando os talos e frutos,
ocasionando necrose secundária das estruturas da planta. Essa espécie apresenta diferentes
níveis de parasitismo nas diversas espécies de Passiflora spp, dependendo da resistência
destas ao seu ataque. Passiflora nitida é o hospedeiro representante do gênero mais resistente
a L. gonagra apresentando alto grau de antibiose e não permitindo que as ninfas se
desenvolvam. P. laurifolia, por sua vez, é a espécie mais susceptível, proporcionando menor
duração da fase ninfal, maiores pesos médios de ninfas e adultos e maior longevidade dos
adultos (Caetano e Boiça Jr, 2000).
Leptoglossus gonagra merece destaque entre as espécies do gênero por explorar uma
variedade de plantas hospedeiras. No Brasil é conhecido como percevejo do melão-de-São-
Caetano, podendo também atacar a abóbora, algodoeiro, araçazeiro, bucha, chuchu, pepino,
melancia, girassol, goiabeira, mamoneira, mangueira, maracujá, romã e citros (Baldin et al,
2002).
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 22
1.2. Cariótipo e comportamento meiótico em Heteroptera
1.2. Aspectos gerais
A subordem Heteroptera corresponde a um grupo de insetos com peculiaridades
cromossômicas que os diferenciam de outros grupos de organismos estudados
citogeneticamente. Entre essas características, destacam-se a presença de cromossomos
holocêntricos, a existência do estágio difuso durante a prófase I da meiose, a ocorrência dos
chamados cromossomos m e a presença de meiose invertida ou pós-reducional restrita aos
cromossomos sexuais. Esses padrões cromossômicos diferenciam esta subordem da grande
maioria dos insetos estudados (Ueshima, 1979).
O número diplóide, 2n=14 é o mais comum para Heteroptera e tem sido considerado
como cariótipo ancestral. Esse cariótipo é bastante conservado, estando representado em
algumas famílias como Pentatomidae (Antiteuchus mixtus, A. sepulcralis, A. macraspis,
Edessa meditabunda, E. rufomarginata), Coreidae (Clavigralla spinofemoralis) e Rhopalidae
(Stictopleurus punctatonervosus) (Muramoto, 1981; Rebagliati et al, 2003; Lanzone e Souza,
2006a). Apesar desta alta conservação cariotípica, são conhecidas variações que vão desde
2n=4 em Lethocerus sp. (Belostomatidae) até 2n=80 em algumas espécies do gênero Lopidea,
como em Lopidea incurva (Miridae) (Ueshima, 1979).
Um fenômeno especial que geralmente ocorre na prófase I da meiose de Heteroptera é
denominado estágio difuso. Neste estágio o DNA cromossômico descondensa totalmente e
estende-se pelo núcleo em forma de fibras fracamente coradas. Predominantemente este
estágio ocorre entre paquíteno e diplóteno. Na seqüência, os cromossomos sofrem
condensação e reaparecem como diplóteno avançado. Na maioria das espécies de Heteroptera
a descondensação cromossômica no estágio difuso envolve apenas os autossomos não GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 23
incluindo os cromossomos sexuais, este padrão foi observado em algumas espécies como
Leptoglossus impictus, Coreus marginatus (Coreidae), Eurydema pulchrum (Pentatomidae) e
Triatoma vitticeps (Reduviidae) (Nokkala, 1986; Bressa et al, 2005; Kaur et al, 2006).
Nas espécies que possuem cromossomos m foi observado que os mesmos podem
participar ou não da descondensação cromossômica. Em Cletus bipunctatus e Serinetha augur
(Coreidae) foi observada descondensação total dos cromossomos m e dos autossomos durante
o estágio difuso, permanecendo apenas o cromossomo X condensado (Kaur et al, 2006).
Algumas variações em relação ao estágio difuso foram descritas para Heteroptera. Em
Phthia picta e Acanonicus hahni (Coreidae) foi observada uma descondensação parcial dos
autossomos, nos quais foram detectadas regiões heteropicnóticas positivas espalhadas pelo
núcleo e o cromossomo X permaneceu condensado neste estágio (Papeschi e Mola, 1990 a,b;
Bressa et al, 2005). Spartocera batatas apresentou bivalentes autossômicos associados pelas
regiões heteropicnóticas positivas durante o paquíteno, e após o diplóteno as células entraram
em estágio difuso com o cromossomo X permanecendo condensado e os autossomos
totalmente descondensados, voltando a se condensar em diacinese (Franco et al, 2006).
Apesar de ser observado em quase todas as espécies de Heteroptera, o pentatomídeo Loxa
deducta representa uma das poucas espécies desta subordem com ausência de estágio difuso
(Ueshima, 1979; Rebagliati et al, 2001).
Heteroptera possui diversidade de sistemas cromossômicos de determinação do sexo:
XY, X0, Neo-XY e sistemas múltiplos como o Neo-XY1Y2. Sendo o sistema XY o mais
comum, por esta razão tem sido considerado como mecanismo ancestral para esta subordem
(Ueshima, 1979). Os mecanismos sexuais múltiplos ocorrem, principalmente nas famílias
Nepidae, Cimicidae e Reduviidae. Sistemas sexuais múltiplos nestes organismos
provavelmente tiveram origem a partir de sistemas simples por fragmentação do X ou do Y,
por não terem sido acompanhados por diminuição do número e tamanho dos autossomos GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 24
(Ueshima, 1979; Grozeva e Nokkala, 1996). Diferentes tipos de sistemas múltiplos têm sido
descritos para a subordem, como Xn0/XnXn, XnY/XnXn, XYn/XX e Neo-XY1Y2. Em Coreidae
predomina o sistema sexual XX/X0, entretanto, sistemas múltiplos de determinação sexual
tem sido observados nesta família como em Carlisis wahlbergi que possui X1X20. O sistema
sexual observado em Cimex adjuntos 2n=28 (23A+X1X2X3X4Y), teve origem provavelmente
a partir do sistema XY por ocorrência de fissões no cromossomo X (Ueshima, 1979).
O sistema sexual X0 foi provavelmente originado a partir do sistema XY por perda do
cromossomo Y (Nokkala e Nokkala, 1983). Contudo, apesar de ser um sistema derivado, está
amplamente distribuído em Heteroptera, principalmente nas famílias Coreidae e Lygaeidae
(Grozeva e Nokkala, 1996). Outro sistema derivado de determinação sexual é o Neo-XY
observado em Dysdercus albofasciatus (Pyrrhocoridae), originado provavelmente a partir do
sistema XX/X0. Inicialmente o cromossomo X ancestral foi inserido em um autossomo numa
posição subterminal, formando um Neo-X. Posteriormente, teria ocorrido uma inversão
envolvendo a maior parte do Neo-X, incluindo os segmentos do X e do autossomo ancestrais,
originando dois segmentos do X ancestral de diferentes tamanhos no novo Neo-X. O
autossomo homólogo do que sofreu a inserção e inversão seria então o Neo-Y. (Bressa et al,
1999).
Jacobs (2004) descreveu a evolução cariotípica do sistema Neo-XY1Y2 encontrado em
Dundocoris nodulicarinus. D. nodulicarinus septeni possui número diplóide 2n=7,Neo-
XY1Y2, com um par autossômico grande, um pequeno e três cromossomos sexuais. O sistema
cromossômico sexual dessa espécie foi possivelmente originado a partir de D. nodulicarinus
novenus (2n=9,Neo-XY1Y2) por meio de duas fusões. A primeira ocorrendo entre um
autossomo pequeno e o Y original (Y2) e a segunda entre o homólogo do autossomo
envolvido na fusão anterior e o Neo-X de D. nodulicarinus novenus. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 25
Coreidae representa uma família com ampla variabilidade citogenética. Em geral seus
representantes são caracterizados por possuírem um par de cromossomos m e sistema de
determinação sexual do tipo X0. Os números diplóides do macho variam de 2n=13
(10A+2m+X0), por exemplo em Serinetha augur até 2n=27 (24A+2m+X0) em algumas
espécies do gênero Holhymenia, como Holhymenia rubiginosa e H. clavigera. Entretanto, o
número diplóide mais comum é 2n=21 (18A+2m+X0) (Kaur et al, 2006; Bressa et al, 2008).
Comumente, em Heteroptera o número diplóide tem sido conservado em diferentes
gêneros, contudo, algumas variações são conhecidas entre representantes de um mesmo
gênero. Na família Notonectidae, o gênero Notonecta possui a maioria das espécies
apresentando número diplóide 2n=22 (20A+XY). Apesar desta conservação, em N. glauca
foram observados alguns indivíduos com 2n=24 (22A+XY). O par cromossômico adicional é
notavelmente menor que os outros pares autossômicos podendo ser considerados como
cromossomos m pelo tamanho diminuto. Por outro lado, o fato desses cromossomos
ocorrerem apenas em alguns espécimes sugere que eles podem ser cromossomos B (Angus et
al, 2004).
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 26
1.3. Caracterização de cromossomos holocêntricos e seu comportamento meiótico
Apesar da maioria dos eucariotas possuírem cromossomos monocêntricos, os quais
possuem centrômero localizado, uma grande variedade de grupos de organismos, desde
protistas até animais e vegetais, possuem cromossomos holocêntricos, os quais possuem
centrômero difuso ou atividade holocinética. Essa diferença em relação à localização do
centrômero acarreta divergências no comportamento meiótico desses cromossomos. Durante a
segregação, os microtúbulos ligam-se aos cromossomos monocêntricos pela região específica
onde o centrômero está localizado, movendo-se para o pólo durante a anáfase. Em contraste,
os microtúbulos ligam-se aos holocêntricos ao longo de toda sua extensão e movem-se ao
pólo paralelamente a placa metafásica durante a anáfase (Dernburg, 2001).
As fibras do fuso podem se ligar de duas formas diferentes aos cromossomos
holocêntricos, que pode ser ao longo de todo o cromossomo por meio de placas cinetocóricas
ou em numerosos, discretos e localizados cinetócoros. Este tipo de cromossomo possui muitas
denominações, para a Ordem Hemiptera (subordens: Homoptera e Heteroptera) podem ser
chamados de cromossomos com cinetócoros difusos, com atividade cinética difusa,
holocêntricos e holocinéticos (Mola e Papeschi, 2006).
Apesar do comportamento mitótico de cromossomos holocêntricos ser único em
termos de orientação e padrão de migração de cromátides, variações em seu comportamento
meiótico determinam a ocorrência de meiose dos tipos pré-reducional e pós-reducional. Em
anáfase o termo “divisão reducional” refere-se à divisão de cromossomos homólogos,
enquanto “divisão equacional” implica na separação de cromátides irmãs. Essas divisões são
identificadas de acordo com sua seqüência: em meiose pré-reducional, a divisão reducional
acontece na primeira divisão meiótica, com as cromátides irmãs permanecendo unidas até a
anáfase II e na pós-reducional ocorre o inverso, na anáfase I as cromátides dos cromossomos GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 27
homólogos segregam para pólos opostos da célula adiando a divisão reducional para meiose II
(Dernburg, 2001).
As formas de reconhecimento do cromossomo holocêntrico são: 1) a ausência de
constrição primária em metáfase mitótica; 2) migração de cromátides irmãs paralelamente ao
plano equatorial em anáfase mitótica; 3) persistência de fragmentos cromossômicos após
irradiação e 4) presença de discos cinetocóricos cobrindo grande superfície da cromátide em
mitose. Embora os dois primeiros critérios sejam aparentemente de simples observação, a
constatação dos mesmos tem sido dificultada quando os cromossomos são pequenos ou
puntiformes, como é o caso de muitos organismos com cromossomos holocêntricos (Mola e
Papeschi, 2006).
Em Heteroptera, os autossomos no início do ciclo meiótico possuem duas cromátides
irmãs em cada homólogo. Durante a meiose, os autossomos homólogos emparelham-se lado a
lado durante o zigóteno, permanecendo assim até começarem a se repelir no diplóteno
separando-se totalmente na anáfase I, caracterizando uma divisão reducional. Na anáfase II a
divisão do conteúdo genético ocorre semelhante à anáfase mitótica, onde as cromátides irmãs
migram para os pólos opostos da célula caracterizando uma divisão equacional (Ueshima,
1979; Papeschi et al, 2003; Mola e Papeschi, 2006).
A meiose invertida em Heteroptera está restrita aos cromossomos sexuais, inclusive
nas espécies que possuem cromossomos m. Na anáfase I, os cromossomos sexuais separam
suas cromátides irmãs de forma que elas migrem para os pólos opostos da célula,
caracterizando uma divisão equacional. Apenas na anáfase II, os cromossomos homólogos,
cada um com apenas uma cromátide, separam-se para pólos opostos caracterizando uma
divisão reducional nesta fase. Este fenômeno tem sido descrito como meiose invertida,
estando amplamente distribuída nesta subordem como observado em Nezara viridula
(Pentatomidae), Spartocera fusca (Coreidae), Triatoma infestans (Reduviidae), Tenagobia GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 28
(Fuscagobia) fuscata (Micronectidae) e Pateena elimata (Schizopteridae) (Grozeva e
Nokkala, 1996; Pérez et al, 1997; Dernburg, 2001; Papeschi et al, 2003; Cattani e Papeschi,
2004; Ituarte e Papeschi, 2004).
Apesar da divisão dos cromossomos sexuais ser bem definida como pós-reducional
para a maioria dos representantes de Heteroptera, tem sido verificado que em algumas
espécies, tais cromossomos mostram divisão pré-reducional, entre elas destacam-se Pachylis
gigas, P. lateralis, P. argentinus, Archimerus alternatus e A. calcarator (Coreidae), Anisops
fieberi, A. nivea e A. sardea (Notonectidae), Ectrychotes díspar (Reduviidae) e Dictyonota
tricornis (Tingidae) (Ueshima, 1979; Nokkala e Nokkala, 1984; Papeschi et al, 2003).
Os chamados cromossomo m foram inicialmente descritos na família Coreidae
correspondendo a um par de elementos diminutos com comportamento diferente quando
comparados tanto com autossomos como com cromossomos sexuais durante a meiose. Além
de Coreidae são conhecidas diferentes famílias que possuem espécies com este tipo de
cromossomos como Lygaeidae, Miridae, Reduviidae, Belostomatidae, Corixidae, Naucoridae,
Notonectidae, Pleidae, Saldidae, Colobathristidae, Largidae, Stenocephalidae, Hyocephalidae,
Schizopteridae, Dipsocoridae, Alydidae e Rhopalidae (Ueshima, 1979; Muramoto, 1981;
Grozeva e Nokkala, 1996). Apesar de terem sido descritos essencialmente por seu tamanho, é
o comportamento meiótico que define os cromossomos m (Ueshima, 1979; Mola e Papeschi,
2006).
Durante a prófase I da meiose os cromossomos m não pareiam nem formam quiasmas.
No final da diacinese ocorre aproximação para que no início da metáfase I associem-se
momentaneamente formando um pseudobivalente. Nesta fase, apresentam um comportamento
ligeiramente heteropicnótico negativo, permanecendo assim até o final da metáfase I. Na
anáfase I, movem-se precocemente para os pólos. Quando as metáfases I e II são formadas,
permanecem frequentemente no centro de um anel formado pelos autossomos com o GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 29
cromossomo “X” fazendo parte deste anel ou permanecendo fora dele. Este comportamento
foi descrito para várias espécies como Athaumastus haematicus, Leptoglossus impictus,
Phthia picta, Pachylis argentinus, Cletus bipunctatus e Serinetha augur (Coreidae) (Papeschi
et al, 2003; Bressa et al, 2005; Kaur et al, 2006).
Apesar dos cromossomos m apresentarem um comportamento bastante conservado nas
espécies que os possuem, são observadas variações relacionadas principalmente com o seu
tamanho, padrão de heteropicnose, distribuição e qualificação da HC e posicionamento em
relação aos outros cromossomos durante as metáfases I e II (Ueshima, 1979; Bressa et al,
2005; Kaur et al, 2006).
Algumas espécies, especialmente da família Pentatomidae, que não possuem
cromossomos m, apresentam uma conformação em anel formado pelos autossomos e/ou
cromossomos sexuais durante algumas fases da meiose. Na metáfase II de Eurydema
pulchrum, 2n=14 (12A+XY) (Pentatomidae), um autossomo permanece no centro de um anel
formado pelos demais cromossomos, enquanto que na telófase II são observados dois tipos de
pólos, um com seis autossomos e o X e o outro com seis autossomos e o Y. Em ambos os
casos, os autossomos formam uma conformação em círculo com o cromossomo sexual
localizado no centro do mesmo (Kaur et al, 2006). Bragada cruciferarum, 2n=14 (12A+XY)
(Pentatomidae), apresentou durante a metáfase II uma conformação em anel formado pelos
autossomos com os cromossomos sexuais localizados no centro, este comportamento foi
descrito em outras espécies como Nezara viridula, Triatoma platensis, Dysdercus chaquensis,
Coridius janus e Andrallus apinidens (Satapathy e Patnaik, 1991; Bressa et al, 2002; Pérez et
al, 2005; Kaur et al, 2006).
Dados da literatura têm revelado que algumas espécies de Coreidae não apresentam
cromossomos m como Carlisis wahlbergi e Acanonicus hahni (Papeschi e Mola, 1990a;
Fossey e Liebenberg, 1995). Por outro lado, Coreus marginatus (Coreidae) apresentou GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 30
cromossomos m quiasmáticos durante paquíteno, estes cromossomos formaram um bivalente
durante diplóteno e permaneceram no centro de um anel formado por autossomos durante a
metáfase I (Nokkala, 1986).
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 31
1.4. Heterocromatina constitutiva em Heteroptera
A heterocromatina consiste num estado altamente condensado da cromatina que ocorre
durante todo o ciclo celular, sendo distribuída em segmentos cromossômicos, ou
cromossomos inteiros representando uma significativa fração do genoma de eucariotas. Os
blocos heterocromáticos aparecem como cromocentros que podem agrupar-se formando uma
estrutura única ou podem permanecer separados formando cromocentros múltiplos. Esse
padrão depende de vários fatores entre os quais estão o tipo celular, o estado de
desenvolvimento do indivíduo e a espécie considerada (Sumner, 2003).
Brown (1966) classificou a heterocromatina em dois tipos, de acordo com o seu
comportamento no genoma. Heterocromatina facultativa (HF) correspondendo a
cromossomos inteiros que passam por um processo de condensação e são inativados em
tecidos somáticos, especialmente durante o desenvolvimento. Este tipo de heterocromatina
está relacionada com a inativação diferencial do cromossomo X em mamíferos, ou de todo o
complemento paterno em alguns homópteros, como conseqüência do balanceamento gênico
(Dillon, 2004). Por outro lado, a heterocromatina constitutiva (HC) é composta
predominantemente de grandes segmentos de DNA altamente repetitivo que são replicados
tardiamente durante a fase S, geralmente permanece condensada e inativa durante o ciclo
celular estando presente em regiões específicas nos cromossomos homólogos (Dernburg et al,
1996; Henikoff, 2000; Sumner, 2003).
Durante muito tempo a HC foi considerada sem função específica sendo tratada como
lixo ou parasita no genoma dos eucariotas superiores. Entretanto, embora a HC tenha uma
predominância de inatividade gênica, sabe-se que vários genes funcionais, essenciais ao
funcionamento celular, possuem localização nessas regiões e dependem da HC para sua
correta expressão (Dillon, 2004). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 32
A HC desempenha diversas funções durante o ciclo celular, como por exemplo, na
defesa do genoma e na regulação gênica durante a interfase, auxiliando também a
aproximação de cromosomos homólogos durante a meiose. Também participa na organização
dos microtúbulos dos fusos (HC centromérica), na estabilização das extremidades
cromossômicas (HC terminal), nas funções exercidas pelo centrômero no início da mitose e
na formação do mesmo. Além dessas funções, a HC também pode facilitar a evolução
cariotípica já que quebras e rearranjos cromossômicos ocorrem preferencialmente nestas
regiões (Karpen, 1994; Henikoff, 2000; Huisinga et al, 2006).
A heterocromatina parece representar um componente indispensável no genoma de
eucariotas. Neste sentido, tem sido considerado que uma quantidade mínima deste material
genômico pode ser necessária para o funcionamento celular normal, abaixo do qual as células
seriam inviáveis. Também existiria uma quantidade ótima que daria a populações de
diferentes espécies uma maior probabilidade de sobrevivência na presença de novos
ambientes. Tanto a quantidade mínima quanto a ótima podem variar de acordo com as
condições evolutivas das espécies consideradas (Dernburg et al, 1996; Henikoff, 2000).
Uma das técnicas mais amplamente utilizadas para a visualização da HC é o
bandeamento C (Sumner 1972). Esta técnica geralmente detecta regiões heterocromáticas que
possuem pelo menos 107 pb (Sumner, 2003). Entretanto, blocos menores geralmente são
invisíveis ao microscópio óptico através desta coloração diferencial. De um modo geral,
numerosos estudos realizados em uma ampla variedade de organismos através do
bandeamento C indicam regularidades nos padrões de distribuição da HC. Assim, a
heterocromatina possui uma distribuição definida nos conjuntos cromossômicos das espécies.
Os sítios preferenciais da HC em animais são as regiões pericentroméricas e em plantas as
regiões terminais e intersticiais, sendo os cromossomos sexuais de animais os que geralmente
apresentam as maiores variações na distribuição da HC (Henikoff, 2000). Contudo, é GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 33
importante considerar que nem sempre a HC é evidenciada pelo bandeamento C e que
algumas regiões de HC não são formadas integralmente por seqüências de DNA altamente
repetidas, e que nem todas as seqüências altamente repetitivas localizam-se em regiões
heterocromáticas (Sumner, 2003).
O padrão mais comum de distribuição da HC encontrado em cromossomos
holocêntricos de Heteroptera corresponde a pequenos blocos localizados principalmente nas
regiões terminais dos cromossomos (Camacho et al, 1985; Angus et al, 2004; Bressa et al,
2005; Franco et al, 2006; Lanzone e Souza, 2006b). Dentre as famílias de Heteroptera que
possuem representantes com HC localizada em regiões cromossômicas terminais podemos
destacar: Largidae (Largus rufipennis), Coreidae (Phthia picta) e Pentatomidae (Nezara
viridula) (Camacho et al, 1985; Bressa et al 2005; Lanzone e Souza, 2006b).
Localizações derivadas da HC em cariótipos de Heteroptera têm sido descritas
principalmente nos cromossomos sexuais, tais como blocos intersticiais, subterminais e
cromossomos quase totalmente heterocromáticos como observado no cromossomo Y de
Triatoma infestans (Pérez et al, 1997). No gênero Corixa, C. dentipes apresentou um bloco
intersticial no cromossomo X, enquanto C. affinis um bloco subterminal no cromossomo Y
(Waller e Angus, 2005).
Angus et al (2004) analisaram o padrão de bandeamento C de duas espécies do gênero
Notonecta (Notonectidae), as quais apresentaram variação na distribuição de HC. Notonecta
maculata apresentou um padrão distinto no cromossomo X, com duas bandas subterminais,
similares às observadas no par 2 de N. glauca. O par 1 de N. maculata mostrou-se
heterozigoto para um bloco heterocromático terminal, aparentemente separado do resto do
cromossomo por uma constrição.
Diferentes espécies de Belostomatidae tem sido analisadas em relação ao padrão de
distribuição da HC. Belostoma micantulum apresentou pequenos blocos de HC em dois pares GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 34
autossômicos, o cromossomo X possui um bloco de HC terminal e o Y é inteiramente
heterocromático. Belostoma oxyurum apresentou um bloco terminal no maior bivalente
autossômico. O segundo par autossômico, o menor par autossômico e o cromossomo X
apresentaram HC terminal, enquanto o cromossomo Y foi completamente heterocromático.
Belostoma elegans apresentou HC nas regiões terminais de todos os autossomos e do X,
enquanto o Y não apresentou HC (Papeschi, 1988; Papeschi,1995).
Alguns representantes da família Pentatomidae tiveram sua HC caracterizada
(Camacho et al, 1985; Rebagliati et al, 2003; Lanzone e Souza, 2006b). Nezara viridula
possui blocos de HC terminais em apenas uma extremidade cromossômica de todos os
autossomos. O cromossomo Y foi quase inteiramente heterocromático, enquanto o maior par
autossômico apresentou um bloco de HC fortemente marcado quando comparado com os
demais (Camacho et al, 1985). Antiteuchus mixtus, A. sepulcralis e A. macraspis mostraram
autossomos com HC restrita as regiões terminais, cromossomo X com um bloco diminuto de
HC e cromossomo Y quase totalmente heterocromático (Lanzone e Souza, 2006b).
Diferentes padrões de distribuição de HC foram descritos por Panzera et al (1995) em
três representantes da subfamília Triatominae (Reduviidae). Triatoma infestans possui blocos
de HC nos três maiores autossomos, localizados em ambas as extremidades dos pares 1 e 2 e
apenas em uma do par 3. O cromossomo X não possui HC e o Y foi totalmente
heterocromático. Triatoma platensis apresentou blocos de HC em um ou ambos terminais
cromossômicos envolvendo quatro pares autossômicos. O cromossomo Y foi inteiramente
heterocromático e o X possui apenas uma região com bloco de HC. O tamanho dos blocos de
HC nesta espécie são menores do que aqueles apresentados por T. infestans. Triatoma
delpontei apresentou todos os autossomos e o X com extensivas regiões de HC em um dos
terminais cromossômicos, enquanto o Y é totalmente heterocromático. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 35
Dentro de Triatominae, algumas variações no padrão de HC ocorrem até mesmo em
espécies do mesmo gênero, como observado no gênero Panstrongylus. Panstrongylus
megistus possui os cromossomos sexuais totalmente heterocromáticos, enquanto os
autossomos apresentam blocos intersticiais de HC. Panstrongylus herreri apresentou os
cromossomos sexuais totalmente heterocromáticos e blocos de HC nas regiões terminais dos
autossomos (Tartarotti e Azeredo-Oliveira, 1999). Rhodnius pallescens apresentou uma
distribuição de HC diferenciada, com dois cromossomos heterocromáticos em metáfases II,
que em algumas células são o cromossomo X e o Y e em outras correspondem ao X e a região
intersticial de um autossomo (Morielle-Souza e Azeredo-Oliveira, 2007).
Grozeva e Nokkala (2003) descreveram a distribuição da HC em seis espécies de
Nabidae. Os resultados revelaram diferenças na quantidade e localização da HC nestas
espécies. Somente em Nabis limbatus o padrão da HC permitiu a identificação de cada par
cromossômico do cariótipo. Nas outras espécies (N. brevis, N. ericetorum, N. pseudoferus, N.
rugosos e N. flavomarginatus) blocos de HC foram observados em apenas alguns autossomos
e no cromossomo X, com localização intersticial ou terminal. Por outro lado, quatro das seis
espécies analisadas (Nabis (Nabis) brevis, Nabis (Nabis) ericetorum, Nabis (Nabis)
pseudoferus pseudoferus, Nabis (Nabis) rugosus) apresentaram um cromosomo B. Em N.
rugosus esse cromossomo extra mostrou um bloco terminal de HC, enquanto que nas outras
espécies o cromossomo B foi eucromático.
A introdução de corantes fluorescentes, que apresentam especificidade para
determinadas seqüências de bases do DNA, mais especificamente a utilização da tríplice
coloração CMA3/DA/DAPI, descrita por Schweizer (1976) tem contribuído ao longo dessas
três décadas para um melhor conhecimento da qualificação da HC em diferentes grupos de
organismos. Nesta técnica dois corantes são mais utilizados, um deles com especificidade GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 36
para regiões ricas em AT: DAPI (4’6-diamidino-2-fenilindol) e o outro com especificidades
para GC: CMA3 (Cromomicina A3).
Rebagliati et al (2003) analisaram duas espécies de Pentatomidae em relação a riqueza
+ de pares de base da HC. Em Edessa meditabunda os blocos de HC terminais foram CMA3 e
DAPI+ nos bivalentes autossômicos e nos cromossomos sexuais. Contudo, um pequeno bloco
+ - CMA3 e DAPI foi detectado na região terminal do maior par autossômico. Esta região é
correspondente a RON nesta espécie. Similarmente, em E. rufomarginata, todos os
cromossomos marcaram positivamente com os corantes DAPI e CMA3.
A localização da HC de três espécies do gênero Antiteuchus (Pentatomidae) foi
descrita por Lanzone e Souza (2006b). Antiteuchus mixtus, A. sepulcralis e A. macraspis
apresentaram HC na região terminal dos autossomos, com o maior par autossômico
apresentando um grande bloco de HC. Um bloco diminuto foi observado no X e o
cromossomo Y foi completamente heterocromático. Entretanto, esses blocos diferiram em
tamanho sendo os maiores, observados em A. sepulcralis e A. macraspis. A tríplice coloração
+ nessas espécies mostrou apenas um bloco CMA3 observado na região terminal do maior par
autossômico correspondente as RONs, enquanto o DAPI corou homogeneamente todos os
cromossomos.
Morielle-Souza e Azeredo-Oliveira (2007) analisaram o padrão de composição de
bases da HC de alguns triatomineos. Panstrongylus megistus e Triatoma infestans não
+ apresentaram regiões CMA3 . Rhodnius pallescens mostrou os cromossomos sexuais com
+ blocos CMA3 , estes sítios correspondem a RON. Contudo, o corante DAPI não produziu
diferenciação cromossômica nestas espécies.
O uso de fluorocromos base específicos em Nabis (Aspilaspis) indicus revelou
pequenos blocos DAPI+ nas regiões terminais de todos os autossomos, e os cromossomos X e
+ + Y foram DAPI e CMA3 . Nabis (Aspilaspis) viridulus possui pequenos blocos intersticiais GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 37
+ CMA3 em todos os bivalentes autossômicos, e os cromossomos sexuais mostraram afinidade
pelo DAPI e CMA em algumas regiões de forma pontual. Himacerus (Aptus) mirmicoides
apresentou blocos intersticiais DAPI+ de diferentes tamanhos na maioria dos autossomos. Os
cromossomos sexuais apresentam-se marcados pelo DAPI e em alguns pontos pelo CMA3.
Em Prostemma guttula o cromossomo Y apresentou marcação CMA+ nas regiões terminais,
enquanto o cromossomo X apresentou um bloco CMA+ intersticial (Grozeva et al, 2004).
Bressa et al (2005) descreveram o padrão de distribuição da HC em três espécies de
Coreidae. Em Athaumastus haematicus não foram observados blocos de HC, Leptoglossus
impictus apresentou pequenos blocos na região terminal (em um ou ambos os telômeros) e
Phthia picta mostrou blocos terminais em todos os autossomos e nos cromossomos sexuais.
O uso de fluorocromos base específicos revelou que o cromossomo X dessas espécies foi
+ + DAPI e CMA3 durante a prófase meiótica. Todos os blocos dos autossomos observados pelo
bandeamento C são também DAPI+ e CMA-. Franco et al (2006) analisaram Spartocera
batatas (Coreidae) quanto ao padrão de distribuição de HC, observando blocos intersticiais
em todos os bivalentes e em alguns pares também foram observados pequenos blocos
terminais. Com relação à composição da HC nesta espécie, o corante DAPI revelou que todos
os blocos de HC são ricos em AT.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 38
1.5. Regiões organizadoras de nucléolos em Heteroptera
O nucléolo (Nu) representa uma estrutura nuclear altamente diferenciada tendo sido
identificada nos primórdios da história da citologia. Em 1931, Heitz reconheceu a sua
associação com as regiões cromossômicas identificadas como constrições secundárias que são
especialmente visíveis nas metáfases mitóticas de diferentes espécies. Essas regiões foram
denominadas organizadoras do nucléolo (RONs) por Mc Clintock em 1934 e estão
caracterizadas por um baixo grau de condensação do DNA e um alto conteúdo de proteínas
que respondem positivamente à impregnação com nitrato de prata (AgNO3), dependendo de
sua atividade na intérfase anterior. Nas regiões organizadoras de nucléolo estão localizados
genes ribossomais maiores, 18+28+5,8S os quais encontram-se agrupados em grande número
de cópias múltiplas organizadas em tandem (Lewin, 1993). Estes genes são muito
conservados como indica a capacidade das sondas de DNAr que se ligam a genomas de
organismos muito distintos filogeneticamente. Os genes 5S também formam parte dos
ribossomos e geralmente encontram-se separados em outros loci do genoma e são menos
conservados (Wolf, 1996).
O tamanho e a morfologia do Nu variam consideravelmente dependendo do tipo
celular, estado fisiológico da célula e da espécie considerada (Visintin e Amon, 2000). Ao
nível ultra estrutural tem sido identificados três componentes nucleolares básicos: 1-
Componente fibrilar denso, correspondente ao sítio de síntese do pré-RNA e constituído por
proteínas AgNO3 positivas. 2- Componente granular, formado por ribonucleoproteínas que
formam as partículas ribossomais que serão transportadas ao citoplasma. 3- Centro fibrilar,
encontrado na maioria dos metazoários, mas ausente em eucariotas. Este último componente
permanece em conexão com o cromossomo nas constrições secundárias durante a mitose
(Olson et al, 2000; Visitin e Amon, 2000). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 39
No ciclo celular, o Nu é formado na intérfase e desagregado durante as divisões. Seu
comportamento na mitose tem sido estudado numa ampla variedade de tipos celulares e
espécies. Na prófase, o nucléolo muda sua forma e gradualmente se reduz em componente
granular (Olson et al, 2000). Em metáfase e anáfase, os centros fibrilares permanecem
associados com os cromossomos portadores de RONs e são positivos para AgNO3. Na
telófase, o componente fibrilar reaparece em associação com o centro fibrilar. Rapidamente
forma-se de novo o componente granular na intérfase e o Nu reaparece. Na meiose, em geral
dois ciclos de desorganização e reorganização estão acoplados as duas divisões celulares
(Visitin e Amon, 2000) . Além disso, as variações no ciclo celular e o grau de condensação
atingido pelos cromossomos influenciam consideravelmente na visualização do material
nucleolar. Essa situação acentua-se nos grupos onde algumas fases são muito rápidas ou
ausentes (Suja e Rufas, 1987).
A técnica mais utilizada para identificar cromossomicamente o padrão de distribuição
e localização das RONs é a impregnação com nitrato de prata (AgNO3). Essa técnica permite
identificar as RONs que foram ativas na intérfase anterior (Goodpasture e Bloom, 1975;
Rufas et al, 1987). Outra técnica utilizada para a localização e distribuição das RONs é a
hibridização in situ fluorescente (FISH), a qual permite detectar as regiões cromossômicas
que possuem sítios de DNAr independente de sua atividade (Polak e Mcgee, 1990).
O número e distribuição das RONs nos cariótipos determinam o número de
cromossomos que fazem parte da organização nucleolar, assim como também, caracterizam
cromossomicamente diferentes espécies. Dados sobre o padrão e localização das RONs ainda
são escassos em representantes de Heteroptera. Em geral, neste grupo, a RON está localizada
principalmente em regiões cromossômicas terminais, podendo ser observada tanto em
autossomos como nos cromossomos sexuais (Papeschi, 1995). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 40
Tavares e Azeredo-Oliveira (1997) descreveram o padrão de atividade nucleolar em
intérfase e células meióticas de cinco espécies de triatomineos através da impregnação com
AgNO3. Vários remanescentes nucleolares foram observados em núcleos poliplóides e
folículos testiculares. Contudo, somente um remanescente nucleolar foi observado em núcleos
espermatogoniais das cinco espécies analisadas. Por outro lado, remanescentes nucleolares
marcados foram observados em algumas metáfases I de Triatoma brasilienses e T. sordida.
Morielle-Souza e Azeredo-Oliveira (2007) usaram impregnação com AgNO3 e FISH
para detecção de cromossomos portadores de RONs em três espécies de Triatominae. Em
Panstrongylus megistus duas RONs foram observadas, uma em autossomo e a outra no
cromossomo sexual. Rhodnius pallescens apresentou sítios de DNAr nos cromossomos
sexuais X e Y. Em Triatoma infestans foram observados sítios de DNAr em alguns
cromossomos tratados pela FISH. De acordo com Bardella et al (2008) o uso da impregnação
com AgNO3 em Triatoma melanosoma mostrou em diacinese avançada RONs em três pares
de autossomos e em um sexual. Remanescentes nucleolares também foram observados em
metáfases I e II e anáfases I e II, indicando o fenômeno de persistência nucleolar nesta
espécie.
A análise pela técnica de FISH em Triatoma platensis apresentou um sítio no
cromossomo X, enquanto em T. protacta foi observado marcação na região terminal de um
autossomo, e no maior bivalente autossômico em T. tibiamaculata (Severi-Aguiar e Azeredo-
Oliveira, 2005). Cromossomos meióticos de Triatoma vitticeps foram analisados pela
impregnação com AgNO3 e FISH revelando que o cromossomo X é portador de RONs
(Severi-Aguiar et al, 2006).
Rebagliati et al (2003) descreveram o padrão e distribuição de RONs em duas espécies
do gênero Edessa (Pentatomidae). Edessa meditabunda e E. rufomaginata apresentaram
RONs localizadas na região terminal de grandes autossomos. A localização da RON no GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 41
pentatomídeo Nezara viridula também foi observada na região terminal do maior par
autossômico, correspondente à constrição secundária visível na meiose. Pelo bandeamento C
foi possível detectar que o único bloco de HC localizado neste cromossomo coincide com a
RON. Nesta espécie, o Nu foi visualizado a partir de estágios iniciais da prófase (leptóteno-
zigóteno) até o diplóteno no qual sofre desintegração (Camacho et al, 1985). A localização de
RONs nas espécies Antiteuchus mixtus, A. sepulcralis e A. macraspis está restrita a região
terminal do maior par autosômico (Lanzone e Souza, 2006b).
Gonsález-García et al (1996) estudaram Graphosoma italicum em relação ao padrão
de distribuição de RONs. Nesta espécie a impregnação com AgNO3 e FISH mostraram uma
associação do Nu com cromossomos sexuais até a diacinese quando X e Y começam a se
separar. Resultados da FISH revelaram que nesta espécie ocorre apenas uma RON localizada
no cromossomo X. Esta região apresentou especificidade ao fluorocromo CMA3 o que indica
sua riqueza de pares de bases GC. Em Belostoma oxyurum o Nu também está associado aos
cromossomos sexuais, a desintegração ocorre precocemente no início da prófase I, sendo
visível somente até o final do estágio difuso (Papeschi, 1995).
Spartocera fusca (Coreidae) apresentou um único e grande nucléolo associado a um
bivalente autossômico desde o início da prófase meiótica até o diplóteno. Nesta espécie foi
observado o nucléolo semi-persistente na metáfase I. Em anáfase I foram observados dois
pequenos nucléolos segregando para pólos opostos. Por outro lado, o nucléolo decresce em
tamanho no decorrer da meiose, podendo ser facilmente observado até metáfase II (Cattani e
Papeschi, 2004). Padrão semelhante de localização de RON foi descrito para Acanonicus
hahni que apresentou uma RON associada a uma constrição secundária em um par
autossômico (Papeschi e Mola, 1990b).
Em Carlisis wahlbergi (Coreidae) as RONs estão localizadas em um dos maiores
pares de autossomos. Além disso, estas RONs estão em posição terminal e podem originar GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 42
nucléolos heteromórficos devido à ativação diferencial dos loci. Por outro lado, esses
nucléolos podem sofrer fusão permanecendo até a diacinese. Apesar da desintegração
nucleolar começar neste estágio, foi observado um nucléolo persistente até a metáfase II. Em
metáfase I e anáfase I foi observado um nucléolo que decresceu em tamanho no decorrer da
meiose. Adicionalmente, uma RON secundária foi localizada num par de autossomos médio
a qual foi ativa num pequeno número de células. Por outro lado nesta espécie as RONs são
negativas ao fluorocromo CMA3 (Fossey e Liebenberg, 1995). Na Tabela 1 estão
apresentados dados de diferentes espécies de Heteroptera analisadas através de técnicas
citogenéticas diferenciais.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 43
Tabela 1. Espécies de Heteroptera analisadas por técnicas citogenéticas diferenciais.
Família Cariótipo Bandeamento C Fluorescência Impregnação FISH Ref. espécie CMA3 DAPI com AgNO3 bibl.
Belostomatidae 2n=26+X1X2Y Bl. ter. de HC em todos aut. e Papeschi, 1988 Belostoma elegans o X, Y sem HC
B. micantulum 2n=24+XY Bl. de HC em dois aut., X com Papeschi, 1988 um bl. ter., Y het.
B. oxyurum 2n=6+XY A1 com HC em um ter., A2 e Uma RON ter. Papeschi, 1995 A3 e X com HC em ambos ter. no X e Y het.
Coreidae 2n=18+X0 Uma RON ter. Papeschi e Acanonicus hahni em um aut. Mola, 1990b
Athaumastus haematicus 2n=18+2m+X0 Ausência de HC Bressa et al, 2005
2n=18+XY Ausência de Uma RON ter. Fossey e Carlisis wahlbergi + bl. CMA3 em um aut. Liebenberg, 1995
Holhymenia rubiginosa 2n=24+2m+X0 Bl. int., ter. e subt. de Todas regiões Sítio ter. de Bressa et al, diferentes tamanhos em 4 à 9 de HC são DNAr em 2008 pares aut., X com um bl. subt. DAPI+ um aut. e m sem HC
2n=18+2m+X0 Bl. de HC em um ou ambos Todos bl. de Todos bl. de Bressa et al, Leptoglossus impictus - + ter. de todos crom. HC são CMA3 HC são DAPI 2005 GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 44
Pachylis argentinus 2n=12+2m+X0 Sítio int. de Papeschi et al, DNAr em 2003 um aut.
2n=18+2m+X0 Bl. ter. de HC em todos aut. e Todos bl. de Todos bl. de Bressa et al, Phthia picta - + no X HC são CMA3 HC são DAPI 2005
2n=20+2m+X Aut. e X com bl. int. e ter., m Todos os bl. de Todos os bl. de Franco et al, Spartocera batatas - + sem HC HC são CMA3 HC são DAPI 2006
S. fusca 2n=20+2m+X0 Uma RON em Sítio ter. de Cattani e um aut. DNAr em Papeschi, 2004 um aut.
Corixidae 2n=22+XY Bl. int. e ter. no A1, A2-A8 e X Waller e Angus, Corixa affinis com bl. ter., Y com bl. ter. e 2005 subt.
C. dentipes 2n=22+XY Bl. int. e ter. de HC no X, Y Waller e Angus, com 3 bl. de HC 2005
C. panzeri 2n=22+XY A1 e A2 com bl. subt., bl. em Waller e Angus, ambos ter. do X e do Y 2005
C. punctata 2n=22+XY A1-A4 com bl. ter. de HC, A5 Waller e Angus, het., X e Y com HC em um 2005 ter. e Y com um bl. de HC int.
Largidae 2n=12+X0 Bl. ter. de HC em todos aut. e Todos bl. de Todos bl. de Bressa et al, Largus rufipenins no X HC nos aut. HC nos aut. 2005 - + são CMA3 , X são DAPI , X com bl. com bl. DAPI- + CMA3 GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 45
Lygaeidae 2n=12+2m+XY Uma ou duas Souza et al, Nysius californicus RONs ativas 2007
Micronectidae - 2n=28+XY Um aut. sem HC, demais aut. Y CMA3 , Todos bl. de Ituarte e Tenagobia (Fuscagobia) com bl. int., ter. ou subt., bl. demais bl. de HC são DAPI+ Papeschi, 2004 fuscata ter. no X, Y heteroc. HC são + CMA3
Nabidae + + 2n=32+XY HC int. na maioria dos aut. Bl. CMA3 Bl. DAPI int. Uma RON Grozeva et al, Himacerus (Aptus) subt. no X e no na maioria dos associada aos 2004 mirmicoides Y, e ter. no Y aut. crom. sexuais
+ + Nabis (Aspilaspis) indicus 2n=33+XY HC ter. em todos aut., 3 Bl. CMA3 Bl. DAPI ter. Uma RON no X Grozeva et al, nos crom. nos aut., X e Y 2004 sexuais DAPI +
+ + N. (Aspilaspis) viridulus 2n=32+XY Bl. de HC int. nos aut. 3 Bl. CMA3 Bl. DAPI int. Uma RON Grozeva et al, nos crom. nos aut. associada aos 2004 sexuais crom. sexuais
N. (Nabis) brevis 2n=16+XY 3 aut. com um bl. int., 1 aut. e Grozeva e o X com um bl. int. e um ter., Nokkala, 2003 Y com um bl. ter
N. (Nabis) ericetorum 2n=16+XY Y com um bl. ter. Grozeva e Nokkala, 2003 GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 46
N. (Nabis) pseudoferus 2n=16+XY 1 aut. com um bl. int. de HC, Grozeva e Y com um bl. ter. Nokkala, 2003 pseudoferus
N. (Nabis) rugosus 2n=16+XY Y com um bl. ter. Grozeva e Nokkala, 2003
N. (Dolichonabis) limbatus 2n=16+XY A1, A3 e A4 com HC int. e nos Grozeva e dois ter., X, A2 e A5 com um Nokkala, 2003 bl. ter. e um int., A6-A8 e Y com um bl. int.
N. (Nabicula) 2n=16+XY Um bl. de HC int. no A1 e um Grozeva e bl. ter. no Y Nokkala, 2003. flavomarginatus
+ + Prostema guttula 2n=26+XY Y quase totalmente het. Bl. CMA3 int. Y DAPI Grozeva et al, no X e ter. no 2004 Y
Notonectidae 2n=22+XY A1-A3 e X com bl. de HC, Y Angus et al, Notonecta glauca het. 2004
N. maculata 2n=22+XY Dois bl. de HC no X, A1 com Angus et al, bl. ter. e Y het. 2004
N. obliqua 2n=22+XY A1 com bl. subt., A2-A4 e X Angus et al, com bl. ter., X com bl. int., Y 2004 het. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 47
N. viridis 2n=22+XY A1 e A2 com bl. em ambos Angus et al, ter., A10 e A11 são het. 2004
Pentatomidae 2n=14+XY Bl. ter. de HC em todos aut., Um bl. CMA + Um bl. DAPI- Uma RON ter. Lanzone e Antiteuchus mixtus 3 um bl. de HC no X e o Y het. ter. no A1 ter. no A1, no A1 Souza, 2006b demais regiões DAPI neutras
+ - A. sepulcralis 2n=14+XY Bl. ter. de HC em todos aut., Um bl. CMA3 Um bl. DAPI Uma RON ter. Lanzone e um bl. de HC no X e o Y het. ter. no A1 ter. no A1, no A1 Souza, 2006b demais regiões DAPI neutras
+ - A. macraspis 2n=14+XY Bl. ter. de HC em todos aut., Um bl. CMA3 Um bl. DAPI Uma RON ter. Lanzone e um bl. de HC no X, Y het. ter. no A1 ter. no A1, no A1 Souza, 2006b demais regiões DAPI neutras
+ - Edessa meditabunda 2n=12+XY Bl. CMA3 nos Bl. DAPI no Uma RON ter. Rebagliat et al, ter. dos aut. ter. do A1, bl. no A1 2003 DAPI+ nos ter. dos A2-A6
+ + E. rufomarginata 2n=12+XY Bl. CMA3 nos Bl. DAPI nos Rebagliat et al, ter. dos aut., X ter. dos aut. e 2003 + e Y CMA3 do X, Y DAPI neutro
Nezara viridula 2n=14+XY Bl. de HC em um ter. dos aut., Sítio int. de Camacho et al, bl. int. no A1, Y het. DNAr no 1985; Papeschi A1 et al, 2003 GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 48
Pyrrhocoridae 2n=10+neo-XY Dois crom. Bressa et al, Dysdercus albofasciatus DAPI+ 1999
Reduviidae 2n=18+X1X2Y Bl. ter. nos aut., X e Y het. Tartarotti e Pastrongylus herreri Azeredo- Oliveira, 1999
Bl. int. nos aut., X e Y het. Crom. sexuais Crom. sexuais Uma RON em Tartarotti e P. megistus - - CMA3 DAPI aut. e outra no X Azeredo- Oliveira, 1999; Morielle-Souza et al, 2007; Morielle-Souza e Azeredo- Oliveira, 2007;
+ Rhodnius pallescens 2n=20+XY Dois crom. Het. Bl. CMA3 nos Coloração Uma RON no Sítios de Morielle-Souza sexuais homogênea crom. sexual DNAr no X e Azeredo- com DAPI e no Y Oliveira, 2007; Morielle-Souza et al, 2007
Triatoma brasiliensis 2n=20+XY Uma RON Tavares e Azeredo- Oliveira, 1997
T. delpontei 2n=20+XY Todos aut. e X difásicos, y Uma RON Panzera et al, quase totalmente het. 1995 GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e ... 49
- T. infestans 2n=20+XY Um aut. het., um bl. ter. em Bl. CMA3 Coloração Uma RON Morielle-Souza um aut., um bl. int. em um aut. nos aut. e homogênea e Azeredo- e nos sexuais e um aut. com sexuais com DAPI Oliveira, 2007; bl. int. e ter. Morielle-Souza et al, 2007
T. lecticularia 2n=20+XY Uma RON Tavares e Azeredo- Oliveira, 1997
T. melanosoma 2n=20+XY Quatro RONs Bardella et al, 2008
T. platensis 2n=20+XY Bl. ter. em 4 aut., X difásico e Panzera et al, Y het. 1995
T. rubrovaria 2n=20+XY Uma RON Tavares e Azeredo- Oliveira, 1997
T. sordida 2n=20+XY Duas RONs Tavares e Azeredo- Oliveira, 1997
Rhopalidae 2n=10+2m+X0 Alguns bl. pontuais de HC nos Todos bl. de Todos bl. de Bressa et al, Jadera sanguinolenta - + crom. HC são CMA3 HC são DAPI 2005
A= par autossômico, bl.= bloco, crom.= cromossômico, ter.= terminal, int.= intersticial, subt.= subterminal, het.= heterocromático, HC= heterocromatina constitutiva, aut.= autossomo., Ref. bibl.= referências bibliográficas.
Objetivos GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 51
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Analisar citogeneticamente duas espécies da família Coreidae, Pachylis aff pharaonis e Leptoglossus gonagra.
2.2. Objetivos específicos
1. Descrever cariotipicamente as espécies Pachylis aff pharaonis e Leptoglossus gonagra.
2. Caracterizar a distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) e sua variabilidade através do bandeamento C.
3. Analisar a composição de bases da HC através do uso dos fluorocromos base
específicos CMA3 (Cromomicina A3) e DAPI (4’6-diamidino-2-fenilindol).
4. Verificar a distribuição e localização das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) nestas espécies usando a impregnação com AgNO3 e FISH com sonda de DNAr 45S de Arabidopsis thaliana.
Materiais e métodos GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 53
3. Materiais e Métodos
3.1. Materiais
Neste trabalho foram estudados os cromossomos meióticos e mitóticos de exemplares
machos de Pachylis aff pharaonis (Herbst, 1784) e de Leptoglossus gonagra (Fabricius,
1775). Os 19 indivíduos de P. aff pharaonis foram coletados em Igarassu
(7º5’3”S/34º54’23”W) e os 11 de L. gonagra foram coletados no Município de Goiana
(7º33’38”S/35º0’9”W), no Estado de Pernambuco, Brasil. As espécies analisadas foram
identificadas pelo Dr. José Antônio Marin Fernandes da Universidade Federal do Pará. O
material identificado foi depositado na coleção entomológica do Laboratório de Genética e
Citogenética Animal, Departamento de Genética/CCB/UFPE.
3.2. Métodos
3.2.1. Preparações citológicas e coloração convencional
Os exemplares machos de Pachylis aff pharaonis e Leptoglossus gonagra foram
anestesiados com éter e as gônadas foram retiradas, fixadas em etanol e ácido acético 3:1
(Carnoy) e acondicionadas em freezer. Para obtenção das preparações citológicas foi utilizada
a técnica clássica de esmagamento de folículos testiculares. Para a coloração convencional foi
utilizado o corante orceína lacto - acética a 2%. Para as técnicas diferenciais o esmagamento
foi realizado com adição de uma gota de ácido acético 45% e as lamínulas foram retiradas em GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 54
nitrogênio líquido. Antes da realização dessas técnicas as lâminas foram envelhecidas por
pelo menos três dias em estufa à 30°C.
3.2.2. Bandeamento C
O bandeamento C foi feito segundo Sumner (1972), com modificações. As lâminas
foram pré-tratadas com uma solução ácida (HCl 0,2N) por 30 minutos à temperatura
ambiente, seguida por solução básica (Ba(OH)2) por 60 a 80 segundos e solução salina (2x
SSC) por 45 minutos, ambas a 60°C. Depois de secas as lâminas foram coradas com Giemsa
diluído em tampão fosfato (pH 7,0) a 5% durante 5 minutos e lavadas com água destilada.
Depois de coradas as lâminas foram montadas com uma gota de Bálsamo do Canadá e
lamínula 24x24 mm.
3.2.3. Coloração com fluorocromos
A tríplice coloração CMA3/DA/DAPI foi realizada de acordo com o método de
Schweizer (1976) com modificações. Para Pachylis aff pharaonis as lâminas foram coradas
com Cromomicina A3 (CMA3) (0,5 mg/ml em tampão McIlvaine, pH 7,0) por uma hora,
contra-coradas com Distamicina A (DA) (0,1 mg/ml) por 40 minutos e coradas com DAPI
(0,5 mg/ml) por 20 minutos, após cada coloração as lâminas foram lavadas com água
destilada. Para Leptoglossus gonagra foi usada a dupla coloração CMA3/DA e DAPI/DA. As
lâminas foram coradas com CMA3 (0,5 mg/ml em tampão McIlvaine, pH 7,0) por 90 minutos
e contra-coradas com Distamicina A (DA) (0,1 ml/ml) por 60 minutos, após cada coloração as
lâminas foram lavadas com água destilada. Outras lâminas foram coradas com DAPI (0,5
mg/ml) durante 20 minutos e contra-coradas com Distamicina A (DA) (0,1 ml/ml) por 40 GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 55
minutos após cada coloração as lâminas foram lavadas em água destilada. Terminadas as
colorações, as lâminas foram montadas com uma gota de meio de montagem glicerol/tampão
Mcllvaine/MgCl2 e cobertas com lamínula 24x24 mm.
3.2.4. Impregnação com nitrato de prata
A impregnação com AgNO3 foi realizada segundo Rufas et al (1987). As lâminas
foram pré-tratadas com 2xSSC a 60°C por 10 minutos e submetidas a uma solução de AgNO3
(diluída em água formicada na concentração de 1g/ml) a 70°C durante 3 minutos. Em seguida
foram lavadas com água destilada, secas e montadas com uma gota de bálsamo do Canadá e
lamínula 24x24 mm.
3.2.5. Hibridização in situ Fluorescente (FISH)
O procedimento para FISH foi baseado em Moscone et al. (1996) com pequenas
modificações. Os sítios de DNAr 45S foram localizados usando a sonda R2, um fragmento de
6.5 kb da unidade repetitiva do DNAr 18S-5,8S-25S de Arabidopsis thaliana. A sonda foi
marcadas por nick translation (Invitrogen) com digoxigenina-11-dUTP (Roche). As lâminas
previamente preparadas e armazenadas no freezer, foram fixadas em Carnoy 3:1 por 15min,
desidratadas em etanol 70% e 100%, por 5 min cada e secas na estufa a 60 ºC por 30 min. Em
seguida foram pré-tratadas com RNAse a 37ºC por 1h, lavadas em 2xSSC, tratadas com
proteinase K por 20 min, fixadas em paraformaldeído por 10 min, desidratadas em etanol 70%
e 100% por 5 min cada e deixadas para secar por pelo menos 90 min. A mistura de
hibridização continha 50% de formamida (v/v), 5% de dextran sulfato (w/v), 2xSSC de 2-5
ng/µl de cada sonda. Cada lâmina recebeu 10 µl da mistura de hibridização e foi coberta com GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 56
uma lamínula. O conjunto lâmina-sonda-lamínula foi desnaturado a 75ºC por 5 min e
colocado para hibridizar a 37ºC por 18h. Os banhos pós-hibridização foram realizados em
2xSSC (2x vezes, 5 min cada) e 0,1x SSC (2x vezes, 5 min cada). A sonda foi detectada com
anti-digoxigenina conjugada com FITC produzido em ovelha (Roche) e o sinal amplificado
com anticorpo contra anticorpos de ovelha, produzido em coelho, conjugado com FITC
(Dako). Todas as preparações foram contra-coradas e montadas com 2µg/ml de DAPI em
Vectashield (Vector).
3.3. Documentação fotográfica
As fases da meiose submetidas a coloração convencional, bandeamento C e
impregnação com AgNO3 foram fotografadas em microscópio Leica WILB MPS52,
utilizando câmera Olympus D-535 ZOOM e impressas em papel INKJET PHOTO 240
profissional (FILIPAPER). Algumas células foram também fotografadas usando o filme
Kodak Imagelink, Asa 25 e as micrografias foram copiadas em papel Kodabrome II RC F3
(Kodak). As lâminas de FISH e coloração com fluorocromos foram analisadas em
fotomicroscópios de fluorescência Leica DMLB e DMRB, respectivamente, acoplados com
câmeras de vídeo Cohu. As imagens das melhores células da FISH e da coloração com
fluorocromos foram capturadas usando os programas QFISH e IM50 da Leica,
respectivamente. As pranchas foram montadas com o uso do programa Corel PHOTO-PAINT
12.
Resultados GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 58
4. Resultados
4.1. Coloração convencional
Leptoglossus gonagra com número diplóide 2n=21 (18A+2m+X0) e Pachylis aff
pharaonis com 2n=15 (12A+2m+X0) apresentaram cromossomos holocêntricos que
decrescem gradualmente de tamanho. Nas duas espécies, o cromossomo X é de tamanho
médio e o cromossomo m corresponde ao menor cromossomo (Fig. 1c,d,f; Fig. 2c,e). Durante
a prófase I da meiose, nas duas espécies analisadas, todos os estágios padrões foram
observados e adicionalmente foi detectado um estágio difuso entre o paquíteno e o diplóteno.
No estágio difuso os autossomos e os m apresentaram-se descondensados e o cromossomo
sexual univalente está condensado e heteropicnótico positivo (Fig. 1a; Fig. 2a). Ao final do
estágio difuso, os cromossomos voltam a se condensar, reaparecendo em diplóteno avançado
e o X é heteropicnótico positivo (Fig. 1b; Fig 2b). Durante a diacinese os bivalentes
autossômicos geralmente apresentaram quiasmas intersticiais ou terminais e os cromossomos
m mostraram-se separados (Fig. 1c; Fig. 2c). Na metáfase I, em ambas as espécies, os
cromossomos m se aproximaram formando um pseudobivalente heteropicnótico negativo que
se posicionou no centro de um anel de autossomos com o X, formado na maioria das células
observadas (Fig. 1d; Fig. 2d; Fig. 6d).
Em anáfase I de L. gonagra os autossomos e os cromossomos m sofrem divisão
reducional, enquanto o cromossomo X segrega equacionalmente (Fig. 1e). Durante a metáfase
II um novo anel é formado pelos autossomos com o cromossomo X e o m no centro (Fig. 1f).
Na anáfase II os autossomos e o m dividem-se equacionalmente e o cromossomo X sofre
divisão reducional. Durante telófase II os cromossomos m se posicionam no centro de um
círculo formado pelos outros cromossomos (Fig. 1g). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 59
Em Pachylis aff pharaonis, diferentemente de L. gonagra, na anáfase I todos os
cromossomos sofrem divisão reducional (Fig. 2e). Nesta espécie durante as anáfases II foram
observadas células com ou sem cromossomo X (Fig. 2f,g).
4.2. Bandeamento C e coloração com fluorocromos
Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis mostraram blocos de heterocromatina
constitutiva (HC) nas regiões terminais de todos os cromossomos (Fig. 3a,b; Fig. 4a,b).
Adicionalmente, P. aff pharaonis mostrou um bloco intersticial de HC no bivalente 2 (Fig.
4a). A dupla coloração CMA3/DA em L. gonagra revelou blocos CMA3 positivos restritos aos
cromossomos m (Fig. 3c). Em P. aff pharaonis a tríplice coloração CMA3/DA/DAPI revelou
que todas as regiões de HC, exceto dos cromossomos m são CMA3 positivas (Fig. 4c),
indicando riqueza de pares de base GC em quase todo o complemento cariotípico. Nas duas
espécies analisadas a coloração com DAPI mostrou-se neutra para todas as regiões
cromossômicas (Fig. 3d; Fig. 4d).
4.3. Impregnação com nitrato de prata e FISH
A impregnação com AgNO3 durante a prófase I da meiose revelou em Leptoglossus
gonagra a região organizadora de nucléolo (RON) associada aos cromossomos m (Fig. 5a,b).
Em Pachylis aff pharaonis a impregnação AgNO3 mostrou a RON associada a região
terminal do segundo par autossômico (Fig. 6b). Além disso, nesta espécie foi evidenciado o
fenômeno denominado nucléolo semi-persistente, permitindo a visualização do remanescente
nucleolar durante a prófase I até a metáfase I (Fig. 6a,b). A FISH permitiu identificar sítios de
DNAr 45S na região terminal dos cromossomos m de L. gonagra (Fig. 5c,d) e no segundo par GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 60
autossômico de Pachylis aff pharaonis (Fig. 6c,d). O padrão de marcação obtido pela FISH
nas duas espécies analisadas coincidiu com a marcação obtida pela impregnação com AgNO3
e com regiões de heterocromatina constitutiva positivas para CMA3.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 61
Fig. 1. Coloração convencional em cromossomos meióticos de
Leptoglossus gonagra. a) estágio difuso, b) diplóteno, c) diacinese, d) metáfase I, e) anáfase I, f) metáfase II e g) telófase
II. As setas indicam os cromossomos m. Barra=5µm.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 62
Fig. 2. Coloração convencional em cromossomos meióticos de Pachylis aff pharaonis. a) estágio difuso, b) diplóteno, c) diacinese, d) metáfase I, e) anáfase I, f) anáfase II com X e g) anáfase II sem X. As setas indicam os cromossomos m. Barra=5µm.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 63
Fig. 3. Padrão de bandeamento C (a,b) e duplas colorações CMA3/DA (c) e DAPI/DA (d) em Leptoglossus gonagra. a) cariótipo, b) diacinese, (c) estágio difuso e (d) metáfase I. Em (c) as setas indicam os blocos CMA3 positivos nos cromossomos m e em (d) os cromossomos m sem marcações pelo DAPI. Barra=5µm.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 64
Fig. 4. Padrão de bandeamento C (a,b) e tríplice coloração CMA3/DA/DAPI (c,d) em Pachylis aff pharaonis. a) cariótipo, b-d) diplótenos. As setas indicam em (a) o bloco intersticial de HC, em (c,d) os cromossomos m sem marcações. Barra=5µm.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 65
Fig. 5. Impregnação com AgNO3 (a,b) e FISH (c,d) com sonda de DNAr 45S em Leptoglossus gonagra. (a) zigóteno, (b) diplóteno, (c) diacinese e (d) metáfase I. As setas em (a,b) indicam os cromossomos m com remanescente nucleolar e em (c,d) os sítios de DNAr. Barra=5µm.
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 66
Fig. 6. Impregnação com AgNO (a,b) e FISH (c,d) com sonda de DNAr 45S em 3 Pachylis aff pharaonis. (a) leptóteno, (b) metáfase I, (c) diplóteno e (d) metáfase
I. As setas em (a,b) indicam o cromossomo com remanescente nucleolar semi-
persistente e em (c,d) os sítios de DNAr. Barra=5µm.
Discussão GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 68
5. Discussão
A presença de cromossomos holocêntricos na subordem Heteroptera está bem
estabelecida sendo registrada para todas as espécies descritas para esta subordem.
Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis também apresentaram cromossomos de
natureza holocêntrica. O complemento cariotípico dessas duas espécies foi caracterizado pela
presença de um par de cromossomos m. Esse tipo de cromossomo tem sido amplamente
descrito nesta subordem, particularmente na família Coreidae (Ueshima, 1979; Grozeva e
Nokkala, 1996; Kaur et al, 2006; Bressa et al, 2008). O comportamento desses cromossomos
é bastante conservado, entretanto, o seu tamanho, padrão de heteropicnose, distribuição e
qualificação da HC e posicionamento em relação aos outros cromossomos durante as
metáfases I e II são muito variáveis (Ueshima, 1979; Bressa et al, 2005, 2008; Kaur et al,
2006). Nas espécies aqui analisadas, os cromossomos m foram de tamanho pequeno, como
observado na maioria das espécies de Heteroptera. Entretanto, em algumas espécies, como
observado em Phthia picta (Coreidae), este cromossomo é de tamanho grande (Bressa et al,
2005).
As duas espécies analisadas apresentaram diferenças quanto ao número
cromossômico. Leptoglossus gonagra mostrou número diplóide modal para Coreidae 2n=21
(18A+2m+X0), cariótipo idêntico aos descritos para L. dilatiocollis, L. phyllopus, L. stigma e
L. impictus, (Ueshima, 1979; Bressa et al, 2005). O fato do número cromossômico 2n=21
(18A+2m+X0) estar presente em todas as espécies desse gênero estudadas citogeneticamente
até o momento, sugere uma conservação cariotípica e representam cerca de 10% de um total
de 49 espécies (Stonedahl e Dolling, 1991). Enquanto que Pachylis aff pharaonis apresentou
2n=15 (12A+2m+X0) correspondendo aos cariótipos descritos para P. argentinus, P. gigas e
P. lateralis (Ueshima, 1979; Papeschi et al, 2003). Os números cromossômicos apresentados GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 69
por L. gonagra de 2n=21 (18A+2m+X0) e P. aff pharaonis 2n=15 (12A+2m+X0) podem ter
derivado de 2n=14 (12A+XY) considerado ancestral para Heteroptera, possivelmente a partir
da perda do cromossomo Y e de sucessivas fissões de autossomos, o que explicaria o aumento
do número cromossômico e aparecimento de um par de cromossomos m.
Em geral, na meiose de Heteroptera a anáfase I é reducional para os autossomos e os
cromossomos m e equacional para os cromossomos sexuais. Por outro lado, na anáfase II
ocorre mudança em relação aos cromossomos sexuais, caracterizando meiose invertida restrita
a estes cromossomos. Leptoglossus gonagra mostrou meiose invertida para os cromossomos
sexuais, comportamento também descrito em L. impictus (Bressa et al, 2005). Em contraste,
Pachylis aff pharaonis apresentou ausência de meiose invertida de forma similar ao
observado em Pachylis argentinus (Papeschi et al, 2003).
Apesar do estágio difuso típico ser um fenômeno da meiose amplamente descrito em
heterópteros, sua duração e grau de descondensação cromossômica variam bastante entre as
espécies. Dentro desta variabilidade têm sido encontrados exemplos de grande
descondensação (Nokkala e Nokkala, 1984; Camacho et al, 1985; Nokkala, 1986; Rebagliati
et al, 1998) e de níveis parciais de descondensação (Papeschi e Mola, 1990b; Jacobs e
Liebenberg, 2001). Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis apresentaram estágio
difuso típico, o qual ocorre no início do paquíteno e apresenta ampla descondensação dos
autossomos e cromossomos m, enquanto os sexuais permanecem condensados. De acordo
com Grozeva e Nokkala (1996) a detecção de estágio difuso típico em Cryptostemma
pusillimun, pertencente à primitiva infraordem Dipsocoromorpha, sugere que este fenômeno
corresponde a uma condição ancestral entre os heterópteros.
Em Heteroptera, a distribuição de heterocromatina constitutiva (HC) revelada pelo
bandeamento C tem mostrado uma predominância de localização cromossômica terminal
(Panzera et al, 1992; Bressa et al, 2005). Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 70
apresentaram distribuição semelhante a esta em todos os cromossomos do complemento, com
um bloco intersticial adicional no par 2 de P. aff pharaonis. Em outras espécies têm sido
observados blocos de HC intersticiais em alguns cromossomos ou no complemento
cariotípico total (Grozeva et al, 2004; Franco et al, 2006). Leptoglossus impictus (Bressa et al,
2005) mostrou variação na distribuição de HC quando comparada com L. gonagra, com
alguns pares cromossômicos apresentando HC em apenas um dos terminais enquanto outros
pares apresentaram pequenos blocos em ambos terminais cromossômicos. Bressa et al (2008)
descreveram uma ampla localização da HC no coreídeo Holhymenia rubinosa. Esta espécie
mostrou blocos de HC terminais, subterminais e intersticiais localizados em vários
cromossomos, além de heteromorfismo da HC em vários bivalentes autossômicos, com
variação quanto ao número e tamanho dos blocos.
O uso de fluorocromos em Leptoglossus gonagra e Pachylis aff pharaonis permitiu
diferenciá-las quanto a riqueza de pares de bases da HC. Em P. aff pharaonis todas as
regiões cromossômicas terminais foram CMA3 positivas. A única exceção foi o cromossomo
m que se apresentou neutro para o CMA3. Em Leptoglossus gonagra, por sua vez, a marcação
CMA3 positiva foi restrita aos cromossomos m. A composição diferencial da HC destas
espécies com relação a riqueza de pares de base GC indica uma ampla heterogeneidade da
heterocromatina constitutiva intra e interespecificamente. Variações na qualificação da HC
tem sido observadas em outros heterópteros, como por exemplo em três espécies de Coreidae,
uma de Rhopalidae e uma de Largidae que possuem HC rica em AT (DAPI+), com exceção
do bloco terminal do cromossomo X de Largus rufipennis (Largidae) (Bressa et al, 2005).
Outras variações foram descritas em quatro espécies da família Nabidae, com blocos CMA3
positivos restritos aos cromossomos sexuais e correspondendo as RONs (Grozeva et al,
2004). Em Triatoma vitticeps (2n=20A+X1X2X3Y), os cromossomos X foram marcados pelo
+ + CMA3 e o Y mostrou bloco DAPI (Severi-Aguiar et al, 2006). GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 71
Os resultados obtidos com AgNO3, revelando RONs ativas nas duas espécies, foram
idênticos aqueles observados pela FISH que permitiu identificar os sítios de DNAr. Contudo,
para Leptoglossus gonagra a FISH foi fundamental para confirmar o padrão de RONs que
foram de difícil observação pela AgNO3 devido ao tamanho diminuto dos cromossomos m.
Pachylis aff pharaonis mostrou RONs na região terminal do segundo par autossômico. Esta
localização terminal de RONs também tem sido descrito em outras espécies de Heteroptera,
podendo envolver autossomos (Edessa meditabunda, Carlisis wahlbergi, Spartocera fusca)
e/ou cromossomos sexuais (Nezara viridula, Belostoma oxyurum) (Camacho et al, 1985;
Rebagliat et al, 2003; Cattani e Papeschi, 2004; Severi-Aguiar e Azeredo-Oliveira, 2005).
Pachylis aff pharaonis e Leptoglossus gonagra mostraram RONs CMA3 positivas
indicando riqueza de pares de bases GC nestas regiões. Dados da literatura tem revelado uma
correspondência entre blocos CMA3 positivos e as RONs em Heteroptera (Gonzáles-Garcia et
al, 1996; Papeschi et al, 2003; Rebagliati et al, 2003).
Em Leptoglossus gonagra tanto a impregnação AgNO3 como a FISH identificaram as
RONs nos cromossomos m, este resultado representa o primeiro caso de RON neste tipo de
cromossomo em Heteroptera. O fato do único sítio de DNAr 45S de Leptoglossus gonagra
estar localizado nos cromossomos m indica a importância da transmissão correta do conteúdo
genético destes cromossomos bem como a regulação da sua expressão. A presença de RONs
neste tipo de cromossomo pode ser resultante de diferentes tipos de rearranjos
cromossômicos, como translocação, fissão e fusão envolvidos na dispersão de seqüências de
sítios de DNAr e na própia origem de cromossomos m nesta espécie. Entretanto, dentre os
rearranjos citados, provavelmente a condição derivada de cromossomos m organizadores
nucleolares observadas em L. gonagra, deve-se a sucessivas fissões cromossômicas a partir de
um cariótipo ancestral. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 72
Em Leptoglossus gonagra o remanescente nucleolar foi visivel a partir do início da
prófase meiótica, persistindo até a diacinese. Este ciclo nucleolar é comum em Heteroptera e
tem sido descrito para várias espécies (Papeschi, 1995; Fossey e Liebenberg, 1995; Papeschi
et al, 2003; Lanzone e Souza, 2006b). Entretanto, algumas exceções tem sido descritas, como
na espécie Carlisis wahlberg, na qual foi observada a presença de remanescente nucleolar até
a diacinese com um ciclo de reativação na telófase I (Fossey e Liebenberg, 1995).
Em Pachylis aff pharaonis a atividade nucleolar foi iniciada no começo da prófase
meiótica e permaneceu até a metáfase I. Esta ativação prolongada do ciclo nucleolar tem sido
descrita como nucléolo semi-persistente. Em Spartocera fusca, alguns indivíduos analisados
apresentaram remanescentes nucleolares semi-persistentes desde o início da prófase meiótica
até a telófase II (Cattani e Papeschi, 2004). Dados da literatura tem sugerido que a semi-
persistência do nucléolo em conjunto com um longo estágio difuso, em diferentes espécies,
indicam que uma contínua atividade biossintética pode ser requerida durante a
espermiogênese (Fossey e Liebenberg, 1995).
Considerando o pequeno número de espécies analisadas até o momento nos gêneros
Leptoglossus (cinco) e Pachylis (quatro) bem como o registro inédito da ocorrência de
cromossomos m organizadores nucleolares, é imprescindível a realização de novos estudos
cariotípicos nestes gêneros. A ampliação e aprofundamento das análises citogenéticas
moleculares em representantes de Leptoglossus e Pachylis permitirão compreender a evolução
cromossômica e das seqüências de DNAs ribossomais em seus representantes.
Conclusões GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 74
6. Conclusões
1. Os cariótipos de Leptoglossus gonagra 2n=21(18A+2m+X0) e Pachylis aff
pharaonis 2n=15(12A+2m+X0) provavelmente se originaram a partir da perda do
cromossomo Y e de sucessivas fissões em um cariótipo ancestral
2n=14(12A+XY).
2. A presença de um pequeno par de cromossomos m é conservada nos gêneros
Pachylis e Leptoglossus assim como para a maioria das espécies de Coreidae.
3. Apesar de até o momento terem sido analisadas citologicamente apenas 10% das
espécies descritas para Leptoglossus, aparentemente o número cromossômico
2n=21 (18A+2m+X0) é conservado neste gênero.
4. O número diplóide 2n=15 (12A+2m+X0) e a meiose pré-reducional dos
cromossomos sexuais descritos para P. aff pharaonis também foram observados
em P. argentinus.
5. A heterocromatina constitutiva das espécies L. gonagra e P. aff pharaonis
apresentou heterogeneidade de composição de bases intra e interespecificamente.
6. A ocorrência de sítios de DNAr 45S nos cromossomos m de L. gonagra, sugere a
origem dos cromossomos m desta espécie a partir de fragmentos (autossômicos)
oriundos de sucessivas fissões em um cariótipo ancestral.
Referências bibliográficas GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 76
7. Referências Bibliográficas
Andersen NM (1982). The semiaquatic bugs (Hemiptera, Gerromorpha)- Phylogeny,
Adaptations, Biogeography and Classification. Entomonograph, Vol 3. (Klampenborg,
Denmark: Scandinavian Science Press Ltd.), 455p.
Angus RB, Kemeny CK and Wood L (2004). The C-banded karyotypes of the British
species of Notonecta L. (Heteroptera: Notonectidae). Hereditas 140:134-138.
Baldin ELL, Caetano AC e Lara FM (2002). Atração e desenvolvimento de Leptoglossus
gonagra (Fabr.) (Hemiptera: Coreidae) em cultivares de abóbora e moranga. Scientia
Agrícola vol.(59), nº 1, 191-196.
Baranowski RM and Slater JA (1986). Coreidae of Florida. Artropods of Florida and
Neighboring Land Áreas. Gainesville, Florida Vol. 12, 82p.
Bardella VB, Azeredo-Oliveira MTV and Tartarotti E (2008). Cytogenetic analysis in the
spermatogenesis of Triatoma melanosoma (Reduviidae: Heteroptera). Gen Mol Res 7
(2):326-335.
Brailovsky H and Barrera E (1998). A review of the Costa Rican species of Leptoglossus
Guérin, with descriptions of two new species (Hemiptera: Heteroptera: Coreidae:
Coreinae: Anisoscelini). Proc California Acad Science vol. 50, nº 6, pp. 167-184.
Bressa MJ, Papeschi AG, Mola LM and Larramendy ML (1999). Meiotic studies in
Dysdercus Guérin Méneville 1831 (Heteroptera: Pyrrhocoridae). I. Neo-XY in Dysdercus
albofasciatus Berg 1878, a new sex chromosome determining systems in Heteroptera.
Chrom Res 7:503-508.
Bressa MJ, Fumagali E, Ituarte S, Frassa MV and Larramendy ML (2002). Meiotic studies in
Dysdercus Guérin Méneville 1831 (Heteroptera: Pyrrhocoridae). II. Evidence on GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 77
variations of the diffuse stage between wild and laboratory-inbred populations of
Dysdercus chaquensis Freiberg, 1948. Hereditas 137:125-131.
Bressa MJ, Larramendy ML and Papeschi AG (2005). Heterochromatin characterization in
five species of Heteroptera. Genetica 124: 307-317.
Bressa MJ, Franco MJ, Toscani MA and Papeschi AG (2008). Heterocromatin
heteromorphism in Holhymenia rubinosa (Heteroptera: Coreidae). Eur, J. Entomol.
105:65-72.
Brow SW (1966). Heterochromatin. Science 151: 417-425.
Caetano AC e Boiça Jr AL (2000). Desenvolvimento de Leptoglossus gonagra Fabr.
(Heteroptera: Coreidae) em espécies de Maracujazeiro. An. Soc. Entomol. Brasil 29(2)
353-359.
Caetano AC, Boiça Jr AL e Ruggiero C (2000). Avaliação da ocorrência sazonal de
percevejos em cinco espécies de Maracujazeiro, utilizando diferentes métodos de
amostragem. Bragantia, Campinas, 59(1) 45-51.
Camacho JPM, Belda J and Cabrero J (1985). Meiotic behaviour of the holocentric
chromosomes of Nezara viridula (Insecta, Heteroptera) analysed by C-banding and silver
impregnation. Can. J. Genet. Cytol. 27:491-497.
Cattani MV and Papeschi AG (2004). Nucleolus organizing regions and semi-persistent
nucleolus during meiosis in Spartocera fusca (Thunberg) (Coreidae, Heteroptera).
Hereditas 140:105-111.
Dernburg AF (2001). Here, There, and Everywhere: Kinetochore function on holocentric
chromosomes. J. Cell Biol. 153 (6):33-38.
Dernburg AF, Sedat JW and Hawleyt S (1996). Direct evidence of a role for heterocromatin
in meiotic chromosome segregation. Cell 86:135-146.
Dillon N (2004). Heterocromatin structure an function. Biol Cell 96:631-637. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 78
Fauvel G (1999). Diversity of Heteroptera in agroecosystems: role of sustainability and
bioindication. Agric, Ecosy Envir 74:275-303.
Fossey A and Liebenberg H (1995). Meiosis and nucleolar structures in the stink bug Carlisis
wanhlbergi Stal (Coreidae: Heteroptera). Cytobios 81:7-15.
Franco MJ, Bressa MJ and Papeschi AG (2006). Karyotype and male meiosis in Spartocera
batatas and meiotic behaviour of multiple sex chromosome in Coreidae (Heteroptera).
Eur J Entomol 103:9-16.
Froeschner RC and Kormilev NA (1989). Phymatidae or Ambush bugs of the word: A
synonymic list with keys to species, except Lophoscutus and Phymata (Hemiptera).
Entomography 6:1-76.
Gallo D, Nakano O, Silveira Neto S, Carvalho RPL, Batista GC, Berti Filho E, Parra JRP,
Zucchi, RA , Alves SB e Vendramim JD (1988). Manual de entomologia agrícola. 2ed.
São Paulo: Ceres, 649p.
Goodpasture C and Bloom SE (1975). Visualization of nucleolar organizer regions in
mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma 53: 37-50.
Gonzáles-Garcia JM, Antônio C, Suja JA and Rufas JS (1996). Meiosis in holocentric
chromosomes: Kinetic activity is ramdoly restricted to the chromatid ends of sex
univalents in Graphosoma italicum (Heteroptera). Chrom Res 4:124-132.
Grazia J, de Fortes ND e Campos LA (1999). Biodiversidade do estado de São Paulo.
Invertebrados terrestres. Vol. 5: 102-112.
Grozeva S and Nokkala S (1996). Chromosomes and their meiotic behaviour in two families
of the primitive infraorder Dipsocoromorpha (Heteroptera). Hereditas 125:31-36.
Grozeva S and Nokkala S (2003). C-heterochromatin and extra (B) chromosome distribution
in six species of the Nabis (Heteroptera, Nabidae) with the modal male Karyotype 2n =
16 + XY. Folia biologica 51:1-2. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 79
Grozeva S, Kuznetsova VG and Nokkala S (2004). Patterns of chromosome banding in four
Nabidae species (Heteroptera, Cimicomorpha, Nabidae) with high chromosome number
karyotypes. Hereditas 140:99-104.
Gullan PJ and Cranston PS (2000). The insects: an out of entomology. Second edition, Ed.
Blackwell Science pp. 1-470.
Heitz E (1931) Die somatische heteropicnose bei Drosophila melanogaster und ibre
genetische. Bedeutung Z. Zellforsch 20:237-278.
Henikoff S (2000). Heterochromatin function in complex genomes. Bioch Bioph Acta
1470:01-08.
Huisinga KL, Brower-Toland B and Elgin SCR (2006). The contradictory definitions of
heterochromatin: transcription and silencing. Chromosoma 115:110-122.
Ituarte S and Papeschi AG (2004). Achiasmatic male meiosis in Tenagobia (Fuscagobia)
fuscata (Stal) (Heteroptera, Corixoidea, Micronactidae). Genetica 122:199-206.
Jacobs DH (2004). The evolution of a neo-XY1Y2 sex chromosomes system by autossome-
sex chromosome fusion in Dundocoris nodulicarinus Jacobs (Heteroptera: Aradidae:
Carventinae). Chrom Res 12:175-191.
Jacobs DH and Liebenberg (2001) Cytogenetics of Adamanotus uncotibialis Jacobs (Heteroptera: Aradidae). Caryologia 54(1):83-96. Karpen GH (1994). Position-effect variegation and the new biology of heterocromatin. Curr
Opin Gen Dev 4:281-291.
Kaur H, Chhabra S Suman V and Gupta M (2006). Chromosome and their meiotic behavior
in two families of the sub-order Heteroptera. Cytologia 71(2):111-118.
Kerzhner IM and Yachevskii TL (1967). Order Hemiptera (Heteroptera), in G. Ya. Bei-
Bienko (ed.), keys to the Insects of the European USSR. Vol. 1. Apterygota, Palaeoptera, GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 80
Hemimatabola (Leingrad: Zoological Institute, Academy of Sciences of the USSR), pp.
851-1118.
Lanzone C and Souza MJ (2006a). Chromosome complement and meiosis in three species of
the Neotropical bug genus Antiteuchus (Heteroptera, Pentatomidae, Discocephalinae).
Gen Mol Biol 29(1):49-55.
Lanzone C and Souza MJ (2006b). C-banding, fluorescent staining and NOR location in
holokinetic chromosomes of bugs of the Neotropical genus Antiteuchus (Heteroptera:
Pentatomidae: Discocephalinae). Eur J. Entomol 103:239-243.
Lewin B (1993). Genes IV. Oxford University Press, 2º ed. Pp. 1-1150.
Lima C (1940). Insetos do Brasil. 2º tomo, Hemípteros. Escola Nacional de Agronomia. Série
didática nº 3, cap. XXII, 352p.
Mc Clintock B (1934) The relation of a perticular chromosoma element to the development of
the nucleoli in Zea mays. Z. Zelljorsch mikroskop Anat. 19:191-237.
Michelotto MD, Silva RA e Busoli AC (2006). Percevejos (Hemiptera: Heteroptera)
coletados em aceroleira (Malpighia glabra L.) em Jaboticabal, SP. Arq. Inst. Biol. São
Paulo vol. 73, nº 1 123-125.
Mola LM and Papeschi AG (2006). Holokinetic chromosomes at a glance. Jour Bas Appl Gen
16(1/2):1-4.
Morielle-Souza A and Azeredo-Oliveira MTV (2007). Study of the nucleolar cycle and
ribossomal RNA distribution during meiosis in triatomines (Triatominae, Heteroptera).
Micron 39 (7) 1020-1026.
Moscone EA, Matzke MA, Matzke AJM (1996). The use of combinet FISH/GISH in
conjuntion with DAPI counterstaining to identify chromosomes containing transgene
inserts in amphidiploid tobacco. Chromosoma 1005: 231-236. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 81
Muramoto N (1981). A chromosome study of thirty Japanese Heteropterans (Heteroptera).
Genetica 49 (1):37-44.
Nokkala S (1986). The mechanisms behind the regular segregation of the m-chromosomes in
Coreus marginatus L. (Coreidae, Hemiptera). Hereditas 105:73-85.
Nokkala S and Nokkala C (1984). The occurrence of the X0 sex chromosome system in
Dictyonota tricornis (Schr.) (Tingidae, Hemiptera) and its significance for concepts of
sex chromosome systems evolution in Heteroptera. Hereditas 100:299-301.
Olson MOJ, Dundr M and Szebeni A (2000). The nucleolus: an old factory with unexpected
capabilities. Trends in Cell Biol. 10:189-196.
Packauskas RJ (1994). Key to the subfamilies and tribes of the new word Coreidae
(Hemiptera) with a checklist of published keys to genera and species. Proc. Entomol. Soc.
Wash. 96(1) 44-53.
Packauskas RJ and Schaefer CW (2001). Clarification of some taxonomic problems in
Anisoscelini and Leptoscelini (Hemiptera: Coreidae: Coreinae). Proc. Entomol. Soc.
Wash. 103(1) pp. 249-256.
Panzera F, Alvarez F, Sanchez-Rufas J, Pérez R, Suja JÁ, Scvortzoff E, Dujardin JP, Estramil
E and Salvatella R (1992). C-heterochromatin polymorphism in holocentric chromosomes
of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). Genome 35: 1068-1074.
Panzera F, Perez R, Panzera Y, Alvarez F, Scvortzoff E and Salvatella R (1995). Karyotype
evolution in holocentric chromosome of three related species of triatomines (Hemiptera-
Reduviidae). Chrom Res 3:143-150.
Papeschi AG (1988). C-banding and DNA content in three species of Belostoma
(Heteroptera) with large differences in chromosome size and number. Genetics 76:43-51. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 82
Papeschi AG (1995) Correspondence between C-banding and Ag-NOR in the sex
chromosomes of Belostoma oxyurum (Belostomatidae, Heteroptera). Cytologia 60:291-
295.
Papeschi AG and Mola LM (1990a). Meiotic studies in Acanonicus hahni (Stal) (Coreidae,
Heteroptera) I. Behaviour of univalents in desynaptic individuals. Genetica 80:31-38.
Papeschi AG and Mola LM (1990b). Meiotic studies in Acanonicus hahni (Stal) (Coreidae,
Heteroptera) II. Male chromosome behaviour in a spontaneous inversion mutant.
Genetica 81:59-66.
Papeschi AG, Mola LM, Bressa MJ, Greizerstein EJ, Lia V and Poggio L (2003). Behaviour
of ring bivalents in holokinetic systems: Alternative sites of spindle attachment in
Pachylis argentinus and Nezara viridula (Heteroptera). Chrom Res 11:725-733.
Pérez R, Panzera F, Page J, Suja JA and Rufas S (1997). Meiotic behaviour of holocentric
chromosomes: orientation and segregation of autosomes in Triatoma infestans
(Heteroptera). Chrom Res 5:47-56.
Pérez R, Hernández M, Quintero O, Scvorzoff E, Canale D, Méndez L, Cohanoff C, Martino
M and Panzera F (2005). Cytogenetic analysis of experimental hybrids in species of
Triatominae (Hemiptera-Reduviidae). Genetica 125:261-270.
Polak JM and Mcgee J (1990). In situ hybridization – principles and pratice. Oxford: Oxford
University 242p.
Rebagliati PJ, Papeschi AG, Mola LM, Pietrokovsky S, Gajate P, Bottazzi V and Wisnivesky-
Colli C (1998). Comparative meiotic studies in Triatoma sordida (Stal) and T. guasayana
Wygodzinsky and Abalos (Reduviidae, Heteroptera). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 93 (3):
309-315. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 83
Rebagliati PJ, Mola LM, Papeschi AG (2001). Karyotype and meiotic behaviour of the
holokinetic chromosomes of six Argentine species of Pentatomidae (Heteroptera).
Caryologia 54(4):339-347.
Rebagliati PJ, Papeschi AG and Mola LM (2003). Meiosis and fluorescent banding in Edessa
meditabunda and E. rufomarginata (Heteroptera: Pentatomidae: Edessinae). Eur Jour
Entomol 100:11-18.
Rufas JS, Giménez-Abian J, Suja JA and Garcia De La Vega C (1987). Chromosome
organization in meiosis revealed by light microscope analysis of silver-stained cores.
Genome 29: 706-712.
Satapathy SN and Patnaik SC (1991). Chromosomal studies in five species of Indian
Heteroptera (Plastapidae, Pentatomidae). Caryologia 44(1):55-62.
Schaefer CW (1998). Phylogeny, systematics, and pratical Entomology: The Heteroptera
(Hemiptera). An. Soc. Entomol. Brasil 27(4).
Schaefer CW e Panizzi AR (2000). Heteroptera of economic importance: a general view.
CRC Press LLC, pp. 1-8.
Schweizer D (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI.
Chromosoma 58:307-324.
Schuh RT and Slater JA (1995). True bugs of the word (Hemiptera: Heteroptera)
Classification and natural history. Comstock Publishing Associates, Cornell University
Press, London, pp 228-233.
Severi-Aguiar GDC and Azeredo-Oliveira MTV ( 2005). Localization of rDNA sites in
Holocentric chromosomes of three species of triatomines (Heteroptera, Triatominae). Gen
Mol Res 4 (4):704-709. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 84
Severi-Aguiar GDC, Lourenço LB, Bicudo HEMCand Azeredo-Oliveira MTV (2006).
Meiosis aspects and nucleolar ativity in Triatoma vitticeps (Triatominae, Heteroptera).
Genetica 126:141-151.
Sorensen JT, Campbell BC, Gill RJ and Steffen-.Campbell JD (1995). Non-monophyly of
Auchenorrhyncha (“Homoptera”), based upon 18S rDNA phylogeny: eco-evolutionary
and cladistic implications with pre-Heteropteroidea Hemiptera (S.I.) and a proposal for
new monophyletic suborders. Pan-Pacific Entomologist, 71 (1): 31-60.
Stonedahl GM and Dolling WR (1991). Heteroptera identification: a reference guide, with
special emphasis on economics groups. Jour Nat Hist 25, 1027-1066.
Suja JA and Rufas JS (1987). Nucleolar meiotic cycle in orthoptera. Cell. Biology Inter Rep
11(4):289-299.
Sumner AT (1972). A simple technique for demonstrating centrommeric heterochromatin.
Exp. Cell Res. 75:304-306.
Sumner AT (2003). Chomosomes: Organization and Function. Blackwell Science Ltd.,
UK. 287pp.
Tavares MG and Azeredo-Oliveira MTV (1997). Pattern of nucleolar activity during
spermiogenesis in triatomines (Heteroptera, Reduviidae) as analysed by silver staining.
Cytobios 89:93-103.
Tartarotti E and Azeredo-Oliveira MTV (1999) Heterocromatin patterns in triatomines of genus Panstrongylus. Cytobios 99:113-122. Ueshima N (1979). Animal Cytogenetics. Vol. 3. Insecta 6. Hemíptera II:
Heteroptera. Gebrüder Borntraeger, Berlin-Stuttgard, pp. 1-118.
Visintin R and Amon A (2000). The nucleolus: the magician’s hat for cell cycle tricks. Curr
Opin Cell Biol 12:372-377. GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 85
Waller MS and Angus RB (2005). A chromosomal investigation of the west European species
of Corixa Geoffroy (Heteroptera: Corixidae). Genetica 125:17-25.
Wolf KW (1996). The structure of condensed chromosomes in mitosis and meiosis of insects.
Int. Jour. Ins Morfol. Embryol. 25(1-2):37-62.
Apêndice GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 87
8. Apêndice
8.1. Fotografias de exemplares das espécies estudadas neste trabalho
Fig. 7. Exemplar macho de Pachylis aff pharaonis (a); casal de Leptoglossus gonagra em cópula (b).
GARCIA-RAMOS, IC. Caracterização citogenética de Leptoglossus gonagra e... 88