VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS Agnė Piliponytė

VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS BIOLOGIJOS KATEDRA

Agnė Piliponytė

PATOGENINIŲ GRYBŲ LEPTOSPHAERIA SPP.GENETINĖ ĮVAIROVĖ LIETUVOJE

Magistro baigiamasis darbas

Molekulinės biologijos ir biotechnologijos studijų programa, valstybinis kodas 62401B107

biologijos studijų kryptis

Vadovas dr. Gintaras Brazauskas

Apginta prof. Gintautas Kamuntavičius

Kaunas, 2010

TURINYS

Turinys...... 2 Santrauka lietuvių kalba...... 3 Santrauka anglų kalba...... 4 ĮVADAS...... 5 1.LITERATŪROS APŢVALGA...... 7 1.1 Fomozės epidemiologija ir ţalingumas...... 7 1.1.1 Leptosphaeria spp. šeimininkų įvairovė...... 10 1.1.2 Leptosphaeria maculans ir Leptosphaeria biglobosa rūšių palyginimas...... 10 1.1.3 Leptosphaeria spp. įvairovė ir paplitimas pasaulyje...... 13 1.2 Molekulinių metodų taikymas Leptosphaeria spp. tyrimuose...... 16 2. MEDŢIAGA IR METODIKA...... 21 2.1 Ţieminių rapsų stiebų ėminių surinkimo vietos...... 21 2.2 Leptosphaeria spp. auginimo sąlygos...... 22 2.3 DNR išskyrimas mikro – metodu...... 22 2.4 L. maculans ir L. biglobosa rūšių atpaţinimas...... 23 2.5 L. maculans poravimosi tipų nustatymas...... 24 2.6 AFLP metodika...... 25 2.7 Duomenų analizė...... 28 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...... 29 3.1 Leptosphaeria spp. rūšių paplitimas rapsų pasėliuose Lietuvoje...... 29 3.2 L. maculans poravimosi tipų pasiskirstymas...... 32 3.3 L. maculans genetinės įvairovės Lietuvoje vertinimas AFLP metodu...... 35 IŠVADOS...... 38 LITERATŪROS SĄRAŠAS...... 39 DUOMENŲ APROBAVIMAS...... 46 PRIEDAI...... 48

2 SANTRAUKA

Fomozė rapsų pasėliuose iki 2001 metų nebuvo labai išplitusi Lietuvoje, tačiau pastaraisiais metais ši liga padaro daug ţalos, ypač ţieminiuose rapsuose. Todėl buvo pradėti pirmieji tyrimai, siekiant išsiaiškinti Lepthosphaeria maculans rūšių komplekso populiacijos struktūrą. 386 pavyzdţiai surinkti įvairiuose Lietuvos regionuose 2006, 2007, 2009 metais, nuo ţieminių rapsų apatinės ir viršutinės stiebo dalies. Rūšiai specifinė PGR analizė, parodė, kad iš surinktų 2006-2007 metais izoliatų visi priklausė L. maculans rūšiai, o 2009 metų izoliatuose aptiktos abi rūšys L. maculans ir L. biglobosa. L. maculans poravimosi tipai pasiskirsė beveik lygiai MAT1-1 turėjo 155 izoliatai, o MAT1-2 tipas aptiktas 162 izoliatuose. Abiejų tipų pasiskirstymas rodo, kad yra paplitęs lytinio dauginimosi būdas. Naudojant AFLP ţymenis nustatyta, kad tarp L. maculans izoliatų vyrauja didelė genetinė įvairovė tiek populiacijų viduje, tiek tarp populiacijų. Tokią didelę genetinę įvairovę padeda sukurti lytinis dauginimosi tipas.

3 SUMMARY

Since 2001 phoma stem canker has became a very serious problem in winter oilseed rape in Lithuania. The current study presents the first evaluation of the fungus Leptosphaeria maculans species complex population structure in Lithuania. 386 samples of winter oilseed rape stubble with phoma stem canker symptoms on the crown and upper were collected from different regions in 2006, 2007, 2009 harvest years. Species-specific PCR analysis revealed the presence of only L. maculans isolates in 2006 and 2007 collections while both species - L. maculans and L. biglobosa were detected among the isolates from 2009. The mating types of L. maculans were distributed equally with 155 isolates of MAT1-1 type and 162 isolates of MAT1-2 type. The presence and distribution of both mating types indicate the prevalence of sexual reproduction. High degree of genetic variation among L. maculans isolates as detected with AFLP markers further confirms the high degree of sexual outcrossing.

4 ĮVADAS

Rapsai pastaruoju metu, auginami kaip aliejiniai augalai, pasaulyje yra treti po sojų ir medvilnės. Svarbiausi rapsų auginimo kontinentai yra Azija (51,0% visų rapsų plotų), Europa (28,7%), Šiaures Amerika (17,4%) (FAO QBS, 1999). Rapsų sėklos yra labai svarbi maistinio aliejaus ţaliava pasaulyje. Taip pat šio aliejinio augalo sėklos plačiai naudojamos biokurui, išspaudos – pašarui gyvuliams. Tačiau didelė rapsų sėklų derliaus dalis prarandama dėl įvairių grybinių ligų, tarp jų vienos svarbiausių – fomozės. Fomozė – labai ţalinga rapsų grybinė liga, plačiai išplitusi visose šalyse, kur tik auginami šie augalai (West ir kiti, 2001; Fitt ir kiti., 2006). Fomozę sukelia grybo Leptosphaeria rūšių kompeksas, iš kurių svarbiausia ir ţalingiausia rūšis yra Leptosphaeria maculans, sukelianti sausąjį stiebo puvinį šaknies kaklelio srityje, dėl ko rapsų stiebai lūţta ir augalai bręsta anksčiau laiko, pasėliai išgula, o Leptosphaeria biglobosa gali sukelti fomozės poţymius ant lapų ir stiebų aukščiau šaknies kaklelio (Balesdent ir kiti, 1992; Brun ir kiti, 1997; Fitt ir kiti, 2006). Šios dvi grybo Leptosphaeria rūšys priklauso aukšliagrybių (Ascomycota) skyriui, lokuloaskomicetų (Loculoascomycetes) klasei. Fomozę sukelia grybas Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & de Not. (anamorfa Phoma lingam (Tode:Fr) Desm.), vėliau buvo nustatyta, kad rapsus paţeidţia 2 skirtingo virulentiškumo grybų rūšys – Leptosphaeria maculans ir L. biglobosa (Shoemaker ir Brun, 2001). Grybai Leptosphaeria maculans (anamorfa Phoma lingam) ir Leptosphaeria biglobosa yra morfologiškai panašios, bet genetiškai skirtingos askomicetų rūšys (Howlett ir kiti, 2001). Anglijoje ant rapsų šios abi rūšys gyvuoja kartu (Brassica napus ssp. oleifera) (West ir kiti, 2002b). Leptosphaeria maculans yra svarbus bastutinių šeimos, ypač Brassica genties, augalų patogenas, sukeliantis fomozės stiebo sausąjį puvinį stiebo apatinėje dalyje (stem base canker), paplitęs visoje Europoje, Anglijoje, taip pat Kanadoje ir Australijoje (Fitt ir kiti, 1997; West ir kiti, 2001a). Grybas L. biglobosa yra maţiau ţalingas, nes sukelia fomozės dėmes aukščiau ant stiebo (West ir kiti, 2001a). Iš pradţių šie grybai laikyti viena rūšimi, vėliau buvo sąlyginai išskirtos dvi grupės, agresyvi ir neagresyvi, Tox+ ir Tox0 (Rouxel ir kiti, 1994), arba A grupė ir B grupė (Johnson ir Lewis, 1994; Williams ir Fitt, 1999; West ir kiti, 2001a). Šis skirstymas buvo paremtas morfologiniais skirtumais, molekulinėm ir biocheminėm charakteristikom ir taip pat skirtingais sukeliamais simptomais ant rapsų lapų ir stiebų (Johnson ir Lewis, 1994). 2001 metais šios dvi grupės buvo aprašytos ir pavadintos skirtingom rūšim – Leptosphaeria maculans (A grupė) ir Leptosphaeria biglobosa (B grupė) (Schoemaker ir Brun, 2001). Kaip ir dauguma askomicetų Leptosphaeria grybas yra haploidas ir gali savo genetinę informaciją perduoti lytinio ir nelytinio dauginimosi metu arba abiem būdais. Lytinis dauginimasis labai reikšmingas patogeninių grybų gyvenime, nes dėl lytinio dauginimosi didėja jų genotipinė įvairovė ir

5 tai leidţia jiems prisitaikyti prie kintačių aplinkos sąlygų (Rau ir kiti, 2005; Bull, 1994). Beveik visi grybai turi trumpą generacijos laiką ir platų geografinį pasiskirstymą. Grybus lengva gauti dideliais kiekiais, jais lengva eksperimentiškai manipuliuoti, be etinių ar kitokių suvarţymų. Šios charakteristikos leidţia su grybais eksperimentuoti kaip su organizmais, kuriais galima patvirtinti pagrindines hipotezes populiacijų ir evoliucijos biologijoje (Bull, 1994). Agresyvūs ir neagresyvūs izoliatai (arba L. maculans ir L. biglobsoa rūšys) nevienodai išplitę, yra didelė geografinė variacija ir kai kuriuose regionuose agresyvūs izoliatai visai nepaplitę (Humpherson- Jones, 1986; Salisbury ir kiti, 1995; Ballinger ir Salisbury, 1996), todėl kai kuriuose regionuose atsirado galimybė sumaţinti fungicidų naudojimą, ypač ten, kur nepaplitę izoliatai, sukeliantys fomozės sausąjį puvinį šaknies kaklelio srityje. Santykis tarp L. maculans ir L. biglobosa rūšių keičiasi iš regiono į regioną su vienos ar kitos rūšies dominavimu, kai kuriose regionuose vienodai yra paplitę abiejų grybo rūšių izoliatai (Hall ir kiti, 1993; Zhou ir kiti,1999). Lietuvoje fomozė taip pat išplitusi ir ţalinga ţieminiuose rapsuose, tačiau iki šiol kokios Leptosphaeria rūšys ją sukelia nebuvo tyrinėjama. Molekuliniai metodai leidţia atskirti Leptosphaeria maculans ir Leptosphaeria biglobosa rūšis, taip pat suteikia galimybę nustatyti Leptosphaeria maculans izoliatų poravimosi tipus, bei įvertiniti šių rūšių polimorfiškumą.

Tyrimo objektas: Leptosphaeria maculans ir Leptosphaeria biglobosa. Darbo tikslas: nustatyti patogeninių grybų Leptosphaeria spp. genetinę įvairovę Lietuvoje. Darbo uţdaviniai: 1. identifikuoti Leptosphaeria spp. rūšinę sudėtį Lietuvoje; 2. nustatyti Leptosphaeria maculans izoliatų poravimosi tipus; 3. Ištirti Leptosphaeria spp. įvairovę Lietuvoje AFLP ţymenų metodu;

6 1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1 Fomozės epidemiologija ir ţalingumas Viena iš labiausiai paplitusių ir ţalingiausių ţieminių ir vasarinių rapsų grybinių ligų daugelyje šalių, kur tik auginami rapsai, yra fomozė, kurią sukelia grybas Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & de Not. (anamorfa Phoma lingam (Tode)Desm.). Fomozė sukelia sausąjį puvinį, įvairias ţaizdas ant rapsų stiebo, ypač stiebo apatinėje dalyje, ties šaknies kakleliu, kurios išryškėja tik rapsų vegetacijos pabaigoje. Uţsikrečiama ţymiai anksčiau, daugelyje šalių skirtingu metu, priklausomai nuo vietos klimatinių sąlygų, auginamų rapsų rūšių bei veislių, auginimo technologijų ir kitų veiksnių (Brazauskienė ir kiti, 2007). Grybas produkuoja askosporas, piknosporas ir micelį (Punithalingam, Holliday, 1972), kiekviena iš šių struktūrų gali būti kaip pirminė infekcija. Piknosporos gali funkcionuoti ir kaip antrinis infekcijos šaltinis (1 pav.). Pirminis uţkrėtimas gali kilti nuo rapsų derliaus liekanų, rapsų sėklų, kitų augalų, kitų augalų liekanų. Antrinis uţsikrėtimas vyksta nuo jau uţkrėstų rapsų augalų (Hall, 1992).

1 paveikslas. L. maculans plitimo būdai. Rodyklės rodo uţkrato judėjimo kryptį (Hall, 1992).

Pagrindinis pirminio uţsikrėtimo šaltinis - pasėlių liekanos. Pseudoteciai, askosporos, piknidijos, piknosporos ir micelis gali išsilaikyti pasėlių liekanose kol šios išlieka nesuirę, tai gali būti metai, dveji arba daugiau nei penkeri (Alabouvette, Brunin, 1970). Pirminis uţkrėtimo šaltinis, pasirodo gali būti neveiksmingas ir po dviejų metų, jei jis yra ne ant šeimininko pasėlių. Fomoze gali uţsikrėsti sveiki rapsų pasėliai, jei jie yra pasėti jau uţsikrėtusiame lauke arba pasėti netoli esančių uţkrėstų laukų, tikriausiai todėl prasideda naujai pasėtų augalų uţsikrėtimas (Bocor ir kiti, 1975).

7 Tačiau yra ir nuomonių, kad L. maculans dirvoje neišgyvena daugiau nei kelis mėnesius (Gabrielson, 1983). Yra keletas faktorių, kurie įtakoja ligos daţnumą ir sunkumą, pirmiausiai tai augalo amţius, jautriausi yra jauni ţieminių rapsų lapai rudenį, nuo jų vėliau liga latentiškai plinta į šaknies kaklelį. Kitas faktorius meteorologinės sąlygos, fomozei palankiausia plisti kai yra šiltas oras. Aptikta, kad paţeidimai ant lapų pasirodo greičiausiai kai yra 14 – 16°C, tačiau askosporos gali uţkrėsti augalus ir rudenį ţemesnėse temperatūrose. Didelė drėgmė yra svarbi infekcijai ir maţiau svarbi ligos vystimuisi, tai buvo nustatyta per sausros sezonus. Drėgmės poveikis infekcijai nėra iki galo suprastas. Dar vienas faktorius yra dauginimosi būdas, lytinės askosporos yra pirminis ir pagrindinis infekcijos šaltinis, antrinė infekcija vyksta nelytinėmis sporomis - piknosporomis. Askosporos iš lytinių vaisiakūnių pseudotecių pasklinda nuo sumedėjusių ligotų augalų liekanų (daţniausiai tai yra praėjusių metų sumedėję rapsų stiebai) (Hall, 1992). Taigi, fomoze ţieminių rapsų augalai paprastai uţsikrečia rudenį, nuo ligotų augalų liekanų oru plintančiomis askosporomis (lytinėmis sporomis) (2 pav.) ir tai laikoma pagrindiniu šios ligos sukėlėjo infekcijos šaltiniu. Be to, infekcija gali kilti ir nuo uţsikrėtusių sėklų, nuo ligotų rapsų augalų liekanų tiesioginio kontakto metu bei lietaus nuplautomis piknosporomis (nelytinėmis sporomis), tačiau šie ligos plitimo būdai yra maţai reikšmingi.

2 paveikslas. L. maculans mikroskopinė morfologija: (b) pseudoteciai, (d) askosporos (Thurwachter ir kiti, 1999). Kiti bastutinių šeimos augalai, piktţolės taip pat yra potencialūs infekcijos šaltiniai (Thurwachter ir kiti, 1999). Nuo 1970 metų Australijoje kasmet buvo prarandama apie 5 procentus derliaus, tačiau 2003 metais kai kuriuose regionuose derliaus nuostoliai išaugo virš 90 procentų. Europoje ir Kanadoje, taip pat netenkama dalies rapsų sėklų derliaus dėl šios ligos, bet jie ne tokie dideli kaip Australijoje (Howlett, 2004).

8 Fomozę sukeliantis grybas savo gyvenimo cikle turi lytinę ir nelytinę stadijas (3 pav.). Lytinėje stadijoje grybas vadinamas Leptosphaeria maculans, nelytinėje – Phoma lingam. Lytinė grybo P. lingam stadija pirmiausiai atrasta N. Zelandijoje ir patvirtinta, kaip L. maculans. Šis patogenas paţeidţia rapsų skilčialapius, lapus, stiebus, šaknis bei ankštaras ir sukelia paţeidimus (Gabrielson, 1983).

3 paveikslas. L. maculans gyvenimo ciklas ant Brassica napus (Howlett, 2001).

Esant tinkamai temperatūrai, ir aukštai santykinei oro drėgmei formuojasi lytinė stadija – vaisiakūniai pseudoteciai, iš kurių ore pasklinda lytinės sporos – askosporos. Askosporos vėjo pagalba plinta didesniais atstumais ir uţkrečia rapsus laukuose iki kelių km nuo infekcijos šaltinio. Askosporos, patekusios ant rapsų lapų, dygsta ir grybas patenka į augalo audinius per augalo ţioteles ar ţaizdas (Williams, 1992). Grybo nelytinė stadija ir nelytinės sporos – piknosporos (konidijos), manoma, plinta su vandens purslais nedideliais atstumais ir gali uţkrėsti gretimus augalus. Grybo askosporų plitimo periodas labai skiriasi įvairiuose regionuose, bet paprastai sutampa su laikotarpiu, kai pasirodo jauni rapsų augalai, kurie šiam patogenui yra jautriausi. Pavyzdţiui, Australijoje askosporos iš grybo pseudotecių pasklinda ore geguţės mėnesį, tuo metu pasirodo ir jauni rapsų daigai (Bokor ir kiti, 1975). Kanadoje, Ontario valstijoje, askosporos išbarstomos nuo rugsėjo iki lapkričio – tuo metu dygsta naujai pasėti ţieminiai rapsai (Rempel, Hall, 1993). Vakarų Kanadoje, atvirkščiai, askosporos plinta nuo augalų liekanų nuo geguţės iki rugpjūčio ir uţkrečia vasarinius rapsus. Vakarų Europoje fomozės sukėlėjo askosporos nuo ankstesnių metų ţieminių rapsų augalų 9 liekanų pasklinda ore nuo vėlyvo rugsėjo ir plinta per visą rudens ir ţiemos periodą, tačiau didţiausia askosporų koncentracija ore, kiekvieną sezoną, gali būti skirtingu laiku (Thurwachter ir kiti, 1999). Rytų Europoje, kaip rodo negausūs tyrimai, fomozės sukėlėjo askosporos pasklinda ore rugsėjo– lapkričio mėnesiais, tačiau daugiausia askosporų ore aptinkama pavasarį, po šaltos ţiemos. Švedijoje retai buvo aptinkami fomozės sukėlėjo pseudoteciai su askosporomis, tačiau 1999 m. rudenį ir 2000 m. pavasarį jie buvo nustatyti keliose vietose, pietinėje Švedijos dalyje (Kuusk ir kiti, 2002). 1.1.1 Leptosphaeria spp. šeimininkų įvairovė. Pastebėta, kad nekryţmaţiedţiai augalai, tokie kaip pupelės (Phaseolus sp.), apyniai (Humulus sp.), daugiametis patvenis (Swertia perennis L.), dirvoninis kietis (Artemisia campestris) gali būti L. maculans šeimininkais (Müller, 1953; Müller ir Tomasevic, 1957; Saccardo, 1883; Tulasne ir Tulasne, 1863). L. maculans šeimininkais gali būti kultūriniai bastutiniai augalai (Brassicas) tokie kaip Brassica napus, B. rapa, B. juncea, B. oleracea. Neseniai nustatyta, kad baltaţiedis vairenis (Arabidopsis thaliana) yra taip pat potencialus L. maculans šeimininkas (Rouxel ir Balesdent, 2005). Pastebima, kad L. maculans ribos pasaulyje plečiasi, bei pakeičia maţiau ţalingą L. biglobosa rūšį. Daugumoje šalių šios dvi rūšys dalijasi ta pačia šeimininkų grupe. L. maculans rūšis gali infekuoti įvairius kryţmaţiedţių taksonus laukuose ir pavienius iš gausių kryţmaţiedţių rūšių, tokius kaip ridikas (Raphanus sativus), baltoji garstyčia (Sinapis alba), sėjamoji graţgarstė (Eruca sativa). Laboratorijos sąlygomis kai kurie izoliatai gali uţkrėsti kitas kryţmaţiedţių rūšis tokias kaip abisininė balţa (Crambe abyssinica) (Bonham ir kiti, 2004). 1.1.2 Leptosphaeria maculans ir Leptosphaeria biglobosa rūšių palyginimas Grybas Leptosphaeria maculans turi keletą izoliatų, kurie daugiau ar maţiau tarpusavyje susiję ir turi kai kurių morfologinių panašumų. Tačiau dvi rūšis daţniausiai sunku atskirti naudojant įprastus morfologinius kriterijus, tiksliai atskirti galima panaudojant molekulinius įrankius (Rouxel ir kiti, 2004). Paprastai izoliatai yra skirstomi į 2 grupes, A ir B, arba agresyvus ir neagresyvus, arba Tox+ ir Tox ° (dabar skiriamos L. maculans ir L. biglobosa rūšys), priklausomai nuo jų gebėjimo sukelti fomozės stiebo sausąjį puvinį ant rapsų augalų arba produkuoti fitotoksiną sirodesminą PL. B grupės izoliatai (arba L. biglobosa rūšis) be sirodesmino PL gamybos, gali taip pat sukelti lapo paţeidimus ir stiebo šerdies uţkrėtimą (Balesdent ir kiti, 1992). A grupės izoliatai (arba L. maculans rūšis) gali būti klasifikuojami į tris patogeniškas grupes PG2, PG3 ir PG4, remiantis skirtingomis reakcijomis ant B. napus veislių Westar, Quinta ir Glacier sėklaskilčių (Koch ir kiti, 1991; Mengistu ir kiti, 1991). B grupės izoliatai nesukelia infekcijos naudojant šį testą, todėl klasifikuojami kaip PG1. Per paskutinius 10 metų, keletas molekulinių metodų buvo taikomi klasifikuoti L. maculans. Priimtiniausia

10 klasifikacija vis dar yra A ir B grupės, akivaizdu tai, kad dvi populiacijos atstovauja skirtingoms rūšims (Kuusk ir kiti, 2002). A grupės izoliatai sukelia stiebo apatinės dalies sausąjį puvinį, dėl ko rapsų stiebai lūţta ir augalai bręsta anksčiau laiko, pasėliai išgula. B grupės izoliatai gali sukelti fomozės poţymius ant lapų ir stiebų aukščiau šaknies kaklelio. Vėliau buvo nustatyta, kad skirtingo virulentiškumo izoliatai priskirtini skirtingoms rūšims – Leptosphaeria maculans (A grupės izoliatai) ir L. biglobosa (B grupės izoliatai) (Shoemaker ir Brun, 2001). Leptosphaeria maculans ir Leptosphaeria biglobosa daţnai randamos kartu infekuotų augalų audinyje, tačiau šių rūšių sukeliamų ligų sunkumas, ekspresija yra skirtinga. Pagrindinis simptomas sukeliamas L. maculans ant rapsų lapų yra dideli blyškiai rudi, blyškiai pilki, pilkšvai ţali paţeidimai. Tuo tarpu Leptosphaeria biglobosa sukelia tik maţus tamsius paţeidimus, kuriuos galima sumaišyti su Alternaria sukeliamais panašiais simptomais ant lapų. Vėlesnėse stadijose, po sisteminės kolonizacijos, augalo audinyje, L. maculans izoliatai sukelia ţalingą sausąjį puvinį šaknies kaklelio srityje. Tuo tarpu L. biglobosa izoliatai sukelia blyškiai rudus paţeidimus su tamsiais krašteliais viršutinėje stiebo dalyje. Galiausiai L. maculans izoliatai parodė labai specializuotą genas – genas sąveiką su visais Brassica šeimininkais (B. napus, B. rapa, B. oleracea, ir B. juncea, kitais) (Balesdent ir kiti, 2004). Skirtingai nuo kitų šeimininko – grybo sistemų, kurių pagrindiniai atsparumo ir virulentiškumo genai buvo apibūdinti (Joosten ir de Wit, 1999), genetinė sąveika tarp Brassica spp. ir L. maculans yra labai sudėtinga. L. maculans virulentiškumo genai buvo apibūdinti, tačiau nei vienas iš jų nebuvo klonuotas. Patogenai, kurie sudaro didţiausią riziką įveikti atsparumo genus yra tie, kurių dauginimosi būdai yra kompleksiški, su maţiausiai vienu lytiniu ciklu per augimo sezoną ir nelytiniu dauginimuisi per epidemijos laikotarpį, bei aukštu potencialu genotipo srautui (McDonald ir Lind, 2002). L. maculans tinka kai kurie iš šių kriterijų. Ţinios apie L. maculans rūšies, paplitusios po visą pasaulį, struktūrą turi svarbią reikšmę, kai yra renkamasi kokius atsparumo (R) genus naudoti. Galimybė perduoti pirminį atsparumą iš vieno regiono kitam ir /arba rizikos galimybė platinti naujas rūšis iš vienos vietos į kitą. Tik neseniai, keliose šalyse, detaliai pradėta tyrinėti šio patogeno populiacijos virulentiškumo modelis. Be to, nei viename iš tyrinėjimų, nebuvo palyginta rūšies struktūra tarp skirtingų šalių ar kontinentų (Rouxel, Balesdent, 2005). Genetiniai ir fizikiniai L. maculans genolapiai galėtų būti rėmai funkcinėms ir genetinėms genomikos studijoms (Howlett ir kiti, 2001). Tokia specializuota sąveika niekada nebuvo nustatyta L. biglobosa izoliatuose, kurie taip pat gali sukelti simptomus ant visų bastutinių augalų rūšių. Galbūt dėl to, kad L .biglobosa nebuvo tyrinėjama detaliai, nes daugelyje šalių L. biglobosa ţalingumas rapsams nėra didelis (Gall ir kiti,1995). 11 Būdingi simptomai sukeliami Leptosphaeria maculans yra lengvai identifikuojami ant lapų, yra daug sunkiau atpaţinti specifinius Leptosphaeria biglobosa poţymius (4 pav.).

4 paveikslas. Fomozės dėmės ant rapsų lapų, kurias sukelia A grupės (A) ir B grupės (B) Leptosphaeria maculans izoliatai (West ir kiti, 2001).

Abi rūšys gali išgyventi ant uţartų rapsų liekanų, bet L. biglobosa išgyvena ilgiau ant neuţartų liekanų nei ant uţartų. Tokiomis pačiomis sąlygomis L. maculans aksosporos išgyvena ilgiau nei L. biglobosa. Abiejų rūšių pseudotecių subrendimo greitis panašus 15 – 20°C, tačiau L. biglobosa pseudoteciai bręsta daug lėčiau nei L. maculans esant < 10°C (West, 2001). Du skirtingi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) gauti pavyzdţiai siejami su skirtingu patogeniškumu ir pigmento gamyba, yra lengvas būdas remiantis šiais duomenimis klasifikuoti izoliatus į A ir B grupes. B grupės izoliatai yra labiau kompleksiški nei A grupės izoliatai. B grupės izoliatai buvo suskirstyti į tris pogrupius NA1 NA2 ir NA3 (E. Koch ir kiti, 1991). Skirtumai tarp šių grupių ir pogrupių yra paremti izofermentų ir tirpių baltymų tyrimais, analizuojant ribosominės DNR regionus įtraukiant 18S, 5.8S bei ITS, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) analizėmis. Jautriausia iš šių technikų yra AFLP analizės metodas (Purwantara ir kiti, 2000). In vitro sąlygomis, buvo nustatytas morfologinis pseudotecių skirtumas, nesugebėjimas kryţmintis tarp A ir B grupių izoliatų, kryţminimasis vyko tarp priešingų poravimosi tipų A ir A arba B ir B, tai rodo, kad dvi grupės yra skirtingos rūšys ir jos pavadintos L. maculans ir L. biglobosa. Dvi rūšys tarpusavyje taip pat skiriasi dygimu, augimu, pigmento difuzija, biocheminiais bruoţais, molekuline struktūra ir patogeniškumu. Tyrinėjimai paremti sekomis iš transkribuojamų ribosominės DNR regionų pasikartojimų, leido nustatyti ryšį tarp septynių rūšies atstovų kompleksų. L. maculans genomo dydis siekia 34 Mb su 16 chromosomų (Howlett, 1997; Cozijnsen ir kiti, 2000). Kai kurios chromosomos nebūdingos B tipui (Leclair ir kiti, 1996). Remiantis literatūros šaltiniais, vienas papildomas skirtumas tarp L. maculans ir L. biglobosa yra geografinis paplitimas. Abi rūšys yra plačiai išsibarstę po visą pasaulį, manoma, kad L. maculans 12 plečiasi tose vietose, kur L. biglobosa dominavo tokiose valstybėse kaip Lenkija ir Centrinė Kanada (Fitt ir kiti, 2006; Gall ir kiti, 1995). 1.1.4 Leptosphaeria spp. įvairovė ir paplitimas pasaulyje Leptosphaeria maculans A ir B tipai gali infekuoti tą patį augalą-šeimininką ir turėti panašiai atrodančias sporas, bet skirtingai atrodo kultūroje, skirtingos jos yra genetiškai, taip pat skirtinga medţiagų apykaita, skirtingus sukelia paţeidimo poţymius ant lapo ir stiebo. Santykis tarp A ir B grupių keičiasi iš regiono į regioną su vienos ar kitos grupės dominavimu, kai kuriuose regionuose vienodai yra paplitę abiejų grupių izoliatai (5 pav.) (Hall ir kiti, 1993; Zhou ir kiti,1999).

5 paveikslas. Leptosphaeria maculans (Lm) ir Leptosphaeria biglobosa (Lb) paplitimas pasaulyje (Fitt ir kiti, 2006). Europoje L. maculans rūšis paplitusi daugumoje vakarinių šalių, kuriose auginami ţieminiai rapsai, tokiose kaip Vokietija, Prancūzija ir Anglija. Labai gimininga rūšis, L. biglobosa, pasitaiko visoje Europoje, Šiaurės Amerikoje ir dalyje Kinijos, tačiau ji yra maţiau ţalinga nei L. maculans. Patogenai gali plisti į naujas vietas per sėklų judėjimą, nors tai vyksta retai (Wang ir kiti, 2003). Iki 1970 metų vidurio fomozė Kanadoje buvo sukeliama tik L. biglobosa. Neseniai L. maculans aptikta pirmą kartą Meksikoje ir Brazilijoje (Moreno-Rico ir kiti, 2001). Daugelį metų fomozę sukelenčių patogenų populiacijoje Europos vakarų šalyse buvo dominuojanti L. maculans, nors yra maţi sezoniniai ir regioniniai skirtumai, kurie įtakoja L. biglobosa ir L. maculans santykį grybo populiacijų struktūroje. Lenkijoje iki 1990 metų vidurio fomozę sukeldavo tik L. biglobosa (Jêdryczka ir kiti, 1994). Ištyrus patogeno populiacijos struktūrą, paaiškėjo, kad vakariniuose Lenkijos regionuose rapsai buvo infekuoti L. maculans. Rytinėse Lenkijos dalyse buvo randama tik L. biglobosa. Santykinis pasikeitimas tarp dviejų rūšių pastebimas Čekijos Respublikoje (Jêdryczka ir kiti, 2002a), Vengrijoje (Szlavik ir kiti, 2003). Iki dabar, literatūroje aptinkama, kad vienintelė šalis rytų Europoje yra Rusija, kurioje aptinkami

13 tik L. biglobosa izoliatai (Jêdryczka ir kiti, 2002b; Gasich ir kiti, 2003). L. maculans plinta Šiaurės Amerikoje, kurioje anksčiau L. maculans nebuvo. Aišku, kad agresyvus patogenas, L. maculans yra vis labiau plinta centrinėje ir rytinėje Europoje. Ribų plėtimosi rytų kryptimi prieţastys gali būti uţkrėstų sėklų gabenimas iš vakarų į centrinę ir rytinę Europą (West ir kiti, 2005). Dvi zonos Europoje, kuriose yra stipri fomozės epidemija, bet skirtingos patogeno populiacijos ir klimatas yra Anglija ir Lenkija. L. maculans ir L. biglobosa aptinkamos Anglijoje, tačiau L. maculans yra dominuojanti ir sukelia stiebo pagrindo vėţį. O Lenkijoje dominuoja L. biglobosa rūšis, kuri sukelia paţeidimus aukščiau ant stiebo (Huang ir kiti, 2005). Fomozė buvo reta liga Švedijoje, sunkių ligos protrūkių niekada nebuvo. Manoma, kad tik B grupės izoliatai, kurie yra maţai agresyvūs, buvo paplitę Švedijoje. Pranešimai apie būdingus stiebo vėţio simptomus ţieminiuose rapsuose buvo gauti iš pietinės Švedijos 1999 rudenį, tada iškilo klausimas ar ne L. maculans A grupės izoliatai (L. maculans rūšis) sukėlė ligą (Kuusk ir kiti, 2002). Fomozė 1998 ir 1999 metais mūsų šalies sąlygomis brendimo tarpsnio pabaigoje buvo išplitusi atitinkamai ant 30,0 ir 37,9 proc. ţieminių rapsų stiebų, tačiau ligos intensyvumas buvo nedidelis (Brazauskienė, Petraitienė, 2004). Pastaraisiais metais ţymiai padidėjus rapsų plotams Lietuvoje bei šiltėjant klimatui, ši liga pradėjo sparčiai plisti. 2004–2005 metų duomenimis, fomozė įvairiuose ţieminių rapsų pasėliuose paţeidė atitinkamai 83,2 – 99,0 proc. ir 75,5 – 100 proc. stiebų (Brazauskienė ir kiti, 2007). Iki 2003 metų Lietuvoje, kaip ir kaimyninėse šalyse Lenkijoje bei Švedijoje, (Jedryczka ir kiti, 1999; Kuusk ir kiti, 2002), fomozė nebuvo labai išplitusi ir ţalinga, todėl buvo manoma, kad šiose šalyse išplitę tiktai B grupės, arba neagresyvūs izoliatai. Tačiau pastaraisiais metais Švedijoje ir Lenkijoje atlikti Leptosphaeria spp. populiacijos struktūros tyrimai molekuliniais metodais parodė, kad yra išplitę tiek B, tiek A grupės izoliatai ir kad A grupės izoliatų kiekis grybo populiacijoje didėja. Lietuvoje taip pat vis daţniau nustatoma, kad ţieminių rapsų pasėliuose prieš derliaus nuėmimą daugelis fomozės paţeistų augalų būna su tipingais simptomais šaknies kaklelio srityje (kurį sukelia agresyvūs izoliatai), todėl tikėtina, kad grybo Leptosphaeria spp. populiacijos struktūra Lietuvoje yra taip pat pasikeitusi. Iki šiol molekuliniais metodais tai nebuvo tirta, todėl duomenų apie Lietuvoje paplitusio fomozės sukėlėjo, grybo Leptosphaeria spp. populiacijos struktūrą, nėra. L. maculans populiacijos struktūra yra svarbus faktorius veikiantis epidemijos sunkumą skirtingose šalyse. Tyrimo rezultatai rodo, kad Australijoje, kur fomozės epidemija būna labai sunki, yra paplitę tik A grupės grybo L. maculans izoliatai. Purwantara ir kiti (2000) nustatė, kad Australijoje paplitę grybo izoliatai yra labiau agresyvūs nei tie, kurie yra iš kitų kraštų. Buvo nustatyta, kad Vakarų Kanadoje fomozė sukeliama B grupės izoliatų ir fomozės poţymiai ant stiebų išryškėja tik brendimo tarpsnyje. Vėliau epidemijos sunkumo padidėjimas Kanadoje buvo siejamas su didėjančiu A grupės izoliatų 14 santykiu L. maculans populiacijos struktūroje. Epidemija daţniau būna sunkesnė vakarų Europoje, kur A grupė daţniausiai yra dominantinė, nei rytinėje Europoje kurioje dominuoja B grupės izoliatai. Atliekant eksperimentus Europoje patogeniškumas rapsams buvo skirtingas tarp A ir B grupių izoliatų (Johnson ir Lewis, 1994). Ant jautrių fomozei augalų, B grupės izoliatai sukėlė šviesiai rudas dėmes ant stiebų, o A izoliatai pirmiausiai sukelia tipingas dėmes ant lapų – abu grybai pirmiausia paţeidţia lapus, po to išsivysto dėmės ant stiebų ar šaknies kaklelio srityje, o vėliau per lapkočius grybas patenka į šaknies kaklelį ir galiausiai ankštarų brendimo tarpsniu išsivysto sausasis fomozės puvinys (arba vėţys) šaknies kaklelio srityje.Taigi, A grupės izoliatai yra paprastai siejami su sausuoju puviniu rapsų stiebo apačioje (šaknies kaklelio srityje), o B grupės izoliatai labiau paţeidţia stiebus įvairiame aukštyje virš šaknies kaklelio. Kur Leptosphaeria maculans populiacijose yra susimaišę A ir B grupės izoliatai, skirtingų izoliatų santykis populiacijose priklauso nuo sudėtingos sąveikos tarp patogeno, šeimininko, klimato ir agronominių faktorių. Įvairiose šalyse didelis skirtumas gali būti patogeno populiacijos struktūroje. Atlikti tyrimai Prancūzijoje rodo, kad 95% iš surinktų izoliatų pietinėse srityse buvo A grupės, o iš rytinių vietų 62% B grupės, kitose srityse apytikriai A ir B grupių izoliatai pasiskirstė vienodomis dalimis, nėra aišku ar šis santykis skiriasi keičiantis metų laikams. A ir B izoliatų paplitimas Prancūzijoje atrodo, gali priklausyti nuo bandinių surinkimo laiko. Augimo sezono metu A tipas dominuoja rudenį, bet jo dominavimas sumaţėja prieš derliaus nuėmimą (Penaud ir kiti,1999). Anglijoje tyrimai parodė, kad yra ne tik didelis srities kitimas populiacijos struktūroje, bet ir santykis B grupės izoliatų buvo didesnis 1980 metais nei yra dabar, nors ankstesni tyrimai priklausė nuo pavyzdţių paėmimo vėlai rudenį, kada ten paprastai būna daugiau B grupės sukeltų paţeidimų.Ryšys tarp klimatinių veiksnių tokių kaip temperatūra ir krituliai bei skirtumai tarp kontinentų epidemiologijoje nulemia fomozės sukeltos epidemijos sunkumą. Su skirtingais faktoriais yra susijęs ligos uţkrato gyvybingumas, pseudotecių brendimas, aksosporų išbarstymo laikas, infekcijos gausumas, augalo-šeimininko atsparumas. Klimatiniai faktoriai lemia pseudotecių išsilaikymą ant rapsų stiebų liekanų, nes stiebų degradacija yra veikiama drėgmės ir dirvoţemio temperatūros. Išgyvenamumui palankios drėgnos vasaros ir šaltos ţiemos. Stiebų liekanos išlieka infekcijos šaltiniu iki 4 metų vakarų Australijoje, keletą metų - vakarų Kanadoje, kai yra drėgnos ir karštos vasaros ir labai šaltos ţiemos. Švelnus drėgnas klimatas Anglijoje prisideda prie spartaus augalų liekanų irimo, kurios daţniausiai suyra per 2 metus (Barbetti ir Khangura, 1997). Reikia apdairumo interpretuojant tyrimo duomenis, nes gali skirtis naudojami metodai taip pat atliekami skirtingi tyrimai su pavyzdţiais, kurie daţnai paimti skirtingu laiku ir skirtingais metų laikų sezonais. Seniau buvo bandoma atskirti A ir B grupes pagal jų gaminamus pigmentus. Dabar atskirti A 15 ir B grupes naudojami molekuliniai metodai, tokie kaip PGR (polimerazinė grandininė reakcija) ar imunologiniai tyrimai (Sosnowski ir kiti, 1999). Siekiant sustabdyti fomozės epidemijos plitimą, buvo pagerintos šios ligos valdymo strategijos (fungicidų naudojimas, sėjomaina, raţienos sunaikinimas), sukuriamos rapsų veislės su didesniu atsparumu ligai. Tačiau didėjantys uţkrėstų fomoze rapsų pasėlių plotai daugelyje šalių, rodo vis didėjančią šios ligos epidemijos grėsmę (Howlett ir kiti, 2001).

1.2 Molekulinių metodų taikymas Leptosphaeria spp. tyrimuose Tyrinėjant filogenetinius ir taksonominius ryšius yra reikalaujama lanksčios ir patikimos ţymenų sistemos galinčios aptikti didelį polimorfiškumą. Dėl efektyvumo ir galimybės automatizuoti procesą PGR paremtu metodu AFLP patrauklus šiems tyrimams (Donini ir kiti, 1997) Populiacijų genetikos tyrimuose naudojami genetiniai ţymenys turi būti patikimi ir polimorfiški. Per pastaruosius dvidešimt metų molekulinių ţymenų technologijos suteikė nepaprastai gausų skaičių ţymenų, kurie leidţia greitai atskirti beveik visus grybų populiacijoje genetinių pakitimų lygius (Bull, 1994). AFLP yra dominantiniai genetiniai ţymenys, kurie turi keletą privalumų prieš kitus ţymenis tokius kaip RFLP, RAPD. AFLP metodika buvo panaudojama aptikti ir išanalizuoti polimorfizmui tarp L. maculans izoliatų (6 pav.). AFLP taip pat naudojamas populiacijų tyrimams (Pongam ir kiti, 1998).

6 paveikslas. L. maculans izoliatų AFLP ţymenys ( Pongam ir kiti, 1999).

AFLP yra naudojamas L. maculans dauginimosi tyrimuose. L. maculans turi vieną dauginimosi tipo (MAT) lokusą su dviem kintamom formom. Formas koduoja bendri baltymai su DNR rišimosi domenais. Lytinė reprodukcija L. maculans labai svarbi vystymosi cikle sukuriant genetinę įvairovę.

16 Aptikta 70 savitų genotipų (panaudojant AFLP) tarp 84 L. maculans izoliatų surinktų nuo rapsų Australijoje, tai atspindi daţną lytinį kryţminimasi. Genetinė įvairovė šiuose grybuose yra naudinga bandant suprasti dauginimosi procesus (Cozijnsen, Howlett, 2003). Įvertinti genetinę įvairovę viduje, ir giminingumą tarp Australijos, Europos ir Šiaurinės Amerikos L. maculans rūšies komplekso populiacijų, buvo naudojama AFLP ir kariotipavimo anlizės. Tarp tyrinėtų 100 izoliatų dauguma jų buvo polimorfiški ir tik du izoliatai turėjo identiškas AFLP struktūras. Remiantis AFLP profiliais, izoliatai buvo padalinti į penkis tipus. AFLP1 talpino visus Australijos 66 A grupės izoliatus (Purwantara ir kiti, 2000) išskyrus du neagresyvius izoliatus. AFLP 2 talpino 21 B grupės izoliatus iš Europos ir Šiaurinės Amerikos. AFLP 3 sudaryta iš 5 B grupės izoliatų, kurie buvo iš Kanados, trys iš jų priskirti NA2. AFLP 4 talpino du neagresyvius izoliatus iš Australijos. Kiti tipai nebuvo analizuojami dėl jų maţo pavyzdţių kiekio. AFLP analizė 66 A grupės (AFLP1) izoliatų su dviem sekų kombinacijomis davė 74 fragmentus, 50 (68 %) buvo polimorfiški. Naudojant UPGMA klasterinę analizę šie fragmentai neparodė aiškaus atitinkamų grupių atsiskyrimo pagal geografinę kilmę.Tarp daugumos sugrupuotų izoliatų panašumas buvo didesnis nei 72 procentai. Atlikus klasterinę UPGMA analizę, nustatyta, kad Australijos ir Europos populiacijos yra skirtingose, bet gretimose grupėse, tuo tarpu Šiaurinės Amerikos populiacija dalinai sutampa su abiem populiacijom. Iš visų trijų genetinės įvairoves indeksų įvertinimų maţiausias yra Šiaurės Amerikos izoliatų lyginant su Australijos ir Europos izoliatais. Panaudojus didelį skaičių izoliatų nustatyta, kad Australijos ir Europos populiacijos skirais viena nuo kitos taip pat ir nuo Šiaurės Amerikos (Purwantara ir kiti 2000). Geografinis atskyrimas atitinka du kitus L. maculans tyrinėjimus. Pongam, Osborn ir Williams (1999) analizavo 49 A grupės izoliatus AFLP ţymenimis ir parodė, kad izoliatai iš Šiaurės Dakotos (25 izoliatai), Manitobos (4 izoliatai), Dţordţijos (5) ir Jungtinės karalystės (1) formavo vieną grieţtą klasterinę grupę, izoliatai iš Ontarijo (4), Australijos (2), Prancūzijos (2), Vokietijos (3) ir Jungtinės karalystės (3) formuoja kitą grupę didesne įvairove. Autoriai manė, kad L. maculans buvo įvesta Šiaurės Dakotos valstijoje iš vakarinės Kanados ir populiacijos turi išlikti santykinai nepakitę per paskutinį dešimtmetį. Tuo tarpu išsiaiškinti genetinę L. maculans įvairovę Australijoje buvo pasirinkta taip pat AFLP analizė. Jai atlikti buvo naudojamos dvi pradmenų kombinacijos, kurios parodė didelį polimorfiškumą tarp izoliatų. Tie patys izoliatai AFLP analize buvo pakartoti du kartus. AFLP profiliai, buvo analizuojami vizualiai, nedidelio intensyvumo fragmentai buvo neanalizuojami. Visi fragmentai kurių dydis svyravo nuo 0,15 kb iki 1 kb buvo įtraukti į analizę. Fragmentai buvo monomorfiniai arba polimorfiniai. Fragmentai galėjo būti nepriklausomi ir vienodo dydţio, ir galbūt turėti identiškas sekas. AFLP izoliatų profiliai buvo sumuojami, arba fragmentas yra arba nėra ir duomenys suvesti į binarinę 17 formą. Ši forma buvo panaudojama sukonstruoti panašumo matricai tarp visų izoliatų porų remiantis panašumo koeficientu. Konstruojant panašumo matrica buvo remiamasi UPGMA (unweighted pair group with arithmetic means) ir NMDS. Populiacijos pasidalinimo laipsnis tarp izoliatų buvo nustatytas naudojant molekulinės variacijos analizę (AMOVA), kuriuose buvo keli hierarchijos lygiai: diferenciacija tarp vietų, paţeidimai lape ir izoliatai lape. AFLP analizei buvo naudojami 90 L. maculans izoliatų. Dvi AFLP pradmenų kombinacijos davė iš viso 92 ţymenis iš jų 82 - polimorfiniai. Polimorfinių ţymenų skaičius buvo aukštas, dauguma fragmentų buvo arba ypač gausūs arba labai reti, tik 11% fragmentų (10/92) sudarė populiacijos pasikartojamumą tarp 16% ir 85%. Klasterinėje AFLP analizėje dauguma izoliatų sudarė vieną pagrindinę grupę ir tik keli izoliatai nebuvo sugrupuoti. Aštuoni izoliatai suformavo ryškesnes grupes. Taip pat pasitelkiant NMDS išsibarstymo lauką, kuris duoda tri dimensinį genetinio pakitimo vaizdą erdvėje. Kad NDS išsibarstymo laukas patikimai vaizdavo sąryšius tarp izoliatų, rodo gautas reikšės dydis 0,109. AMOVA parodė, kad 60% genetinis kintamumas buvo aiškinamas skirtumu tarp atskitų izoliatų paţeidimuose ir 32% genetinių pakitimų tarp paţeidimų ant lapų. Tik 7% genetinių pakitimų pasiskirsė tarp lapų vietovėse ar tarp vietovių. Tyrimai L. maculans izoliatų iš Kanados naudojant RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ţymenis atskirti 93 izoliatus surinktus nuo dviejų skirtingų laukų esančius vienas nuo kito apie 20 kilometrų (Mahuku ir kiti, 1997).Gauti izoliatai buvo iš askosporų ir piknosporų, jie parodė, kad 45,5% genetinės variacijos galėjo būti dėl skirtingų laukų. Didelės proporcijos šio skirtumo tarp laukų galėjo būti dėl askosporų, tai yra specifiška kiekvienam laukui (Barrins ir kiti, 2002). Kitą tyrimą taip pat Australijoje atliko Hayden ir jos komanda (2005), jie tyrė L. maculans populiacijos genetinę struktūrą rapsų laukuose. Šiam tyrimui buvo panaudota 8 ţymenys įtraukiant ir minisatelitinį ţymenį (MinLm1) (Attard ir kiti, 2001) išanalizuoti genetinę įvairovę 159 izoliatuose. Genetinė struktūra buvo tiriama molekulinės variacijos hierarchine analize (AMOVA). Gauti rezultatai 67 procentai variacijos pasiskirstė tarp paţeidimų raţienoje ir 33 procentai tarp paţeidimų sodinukuose.

Bendras FST daigų populiacijai buvo aukštas FST =0,328. Genetinė difereciacija buvo nustatyta tarp pavyzdţių iš skirtingų sporų tipų, askosporų ir konidijų, pagal keturis polimorfiškus lokusus. Fišerio testas aptiko reikšmingus skirtumus (P <0,05) pasikartojančiuose aleliuose tarp subpopuliacijų visuose keturiuose polimorfiškuose lokusuose. FST apskaičiuotas pagal θ buvo labai ţemas visiems lokusams. Aukšta genotipinė įvairovė charakterizuoja atsitiktinai besidauginančią populiaciją. Nuosekliai visi izoliatai, askosporų ir konidijų pavyzdţiai, turi vienodą poravimosi tipų pasiskirstymą. Atsitiktinis poravimasis nebuvo netikėtas askosporų pavyzdţiams, kurie yra pagrindinis pirminis uţsikrėtimo šaltinis ant daigų. 18 AFLP ţymenų analizė bus naudinga, aptinkant patogeninių grybų populiacijos dauginimąsi vegetaciniu būdu, galima bus nustatyti ar liga paplito lytinėmis ar nelytinėmis sporomis. Lenkija yra viena iš pagrindinių šalių auginanti rapsus centrinėje Europos dalyje. Fomozės poţymiai aptinkami visuose auginamų rapsų regionuose, todėl augintojai buvo skatinami į savo auginimo planus įtraukti ligos rezistentiškumą. Todėl reikia tyrinėti fomozės sukėlėjo L. maculans populiacijas Lenkijoje. Apibūdinti L. maculans izoliatus surinktus nuo uţkrėstų rapsų augalų Lenkijoje.Tam buvo pasirinktas PGR (polimerazinę grandininę reakcija) metodas, kuris paremtas genominės DNR ţymenimis, kurie padės identifikuoti L. maculans rūšių kopleksų komponentus. Pasirinkta generuoti genominius ţymenis PGR metodu, naudojant sekas gautas iš pasikartojančių DNR sekų elementų. Pradmenys gauti iš REP (repetitive extragenic palindromic) sekų (Gilson ir kiti, 1984) ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) (Hulton ir kiti, 1991), pastoviųjų pasikartojančių bakterinių DNR elemetų „BOX‟ ir LMR1, 5.3 kb pasikartojantis elementas specifinis L. maculans Tox+ grupei (Taylor ir Borgmann, 1994). Nevienodas efektyvumas ir patikimumas rep- PGR buvo įvertintas naudojant pasaulinio standarto izoliatus iš IBCN (International Blackleg of Crucifers Network) (Rouxel ir Seguin-Swartz, 1995) ir galiausiai apibūdinti izoliatai iš Europos. Po to rep-PGR buvo naudojamas apibūdinti 90 izoliatų iš Lenkijos. Lenkijos 90 izoliatų apibūdinti naudojant ERIC ir rep-PGR. Iš 90 izoliatų 84 izoliatai (93.3%) buvo klasifikuoti į Tox° NA1 grupę ir tik 6 izoliatai buvo Tox+ (6.7%). Visi izoliatai, identifikuoti kaip Tox+, buvo iš pasėlių augančių vakarinėje Lenkijos dalyje. Šiame regione, ţiemos yra šiltesnės nei rytinėje Lenkijos dalyje. Tox+ izoliatai Raw 4 ir Ph Bial buvo izoliuoti 1992 ir 1993, atitinkamai šiaurės vakarų Lenkijoje. Baltijos jūros įtaka šiam regionui apibūdinama kaip, švelnesnė ţiema, nedideliu temperatūrų svyravimu. Tox+ izoliatai Ph L5 (išskirtas 1991) ir PL 47 (išskirtas1995) atkeliavo iš centrinės vakarų Lenkijos, PL 56 ir PL 69 (išskirti 1995) iš pietvakarinės Lenkijos dalies. Visi kiti izoliatai buvo priskirti Tox° NA1 grupei, kurie surinkti iš intesyviai auginamų rapsų regionų vakarinėje, centrinėje ir rytinėje Lenkijos dalyje. Rep-PGR generuoja DNR ţymenis, amplifikuojant sekas tarp atsitiktinai išsibarsčiusių pasikartojančių sekų genome (George ir kiti, 1998). Rep-PGR metodas buvo skirtas rūšims ar kilmės atskyrimui tarp prokariotų. Neseniai rep-PGR ţymenys buvo panaudoti apibūdinti Aspergillus (van Belkum ir kiti, 1993), Fusarium (Edel ir kiti, 1995) Verticillium (Arora ir kiti, 1996). Dabartiniuose tyrimuose REP, ERIC ir BOXA pradmenys generuoja specifinius ţymenis visiems L. maculans rūšių komplekso nariams. Patvirtinta, kad ERIC-, REP ir BOX sekos dabar yra panaudojamos grybų genomams, ir gali būti naudingos izoliatų apibūdinimui. Analizuojama Lenkijos Tox° izoliatų populiacija parodė gausų paplitimą, ir neatrodo suderinama su sunkia ţala priskiriama L. maculans ant B. napus Lenkijoje (Frencel ir kiti, 1991), kyla klausimas ar 19 tikrai Tox° yra silpnai patogeniška, kaip daţniausiai apibūdinama literatūroje (Williams ir Fitt, 1999). Šie rezultatai patvirtina ankstesnių tyrimų rezultatus kad, abu Tox+ ir Tox° izoliatai yra ţinomi ir aptinkami Lenkijoje, jie sukelia lapų paţeidimus lauko sąlygomis, taip pat dviejų grupių izoliatų paţeidimai gali būti šiek tiek skirtingi (Ansan-Melayah ir kiti, 1997). Keturi Lenkijos izoliatai Tox° NA1 buvo labiau agresyvūs nei du Prancūzijos izoliatai Tox° NA1 ar kontroliniai izoliatai iš NA1 ir NA3 pogrupių sėklaskilčių uţkrėtimo eksperimentų (Gall ir kiti, 1995). 24 paplitę po pasaulį silpnai patogeniški izoliatai galėjo sukelti stiebo paţeidimus (Sippel ir Hall, 1995). Devynių Tox° ir vieno Tox+ Lenkijos izoliatų patogeniškumas buvo palygintas su dviem Pracūzijos izoliatais, naudojant tris skirtingus uţkrėtimo būdus (sėklaskiltės uţkrėtimas, stiebo uţkrėtimas, dirvoţemio uţkrėtimas) ant B. napus. Agresyvumo skirtumai nustatyti tarp skirtingų Lenkijos Tox° izoliatų (Jedryczka ir kiti, 1994). Vienas Lenkijos Tox° izoliatas buvo labiau agresyvus nei Prancūzijos ir Lenkijos Tox+ izoliatai. Visi šie faktai rodo, kad Tox° izoliatų vaidmuo fomozės ligoje ant rapsų turi būti toliau tyrinėjami. Dominuojanti Tox° Lenkijoje, priešingai nei dominuojanti Tox+ Vakarų Europoje, suteikia specifinę ir unikalią galimybę palyginti poveikį Tox° ir Tox+ rapsams (Jêdryczka ir kiti,1999). Keletas metodų buvo plėtojami identifikuoti L. maculans virulentiškumo tipus. Įtraukiant kultūros ir patogeniškumo charakteristikas, izofermentus, monokloninius antikūnius, RFLP, RAPD, elektroforetinį kariotipavimą ir viruleškumo tipui specifines DNR ţymes (McGee ir Petrie, 1978). Neseniai remiantis specifinės diagnostikos testais, paremtais nukleotidinėmis sekomis iš ribosominės DNR transkribuotų plotų regionų, buvo numatyta tiksliai įvertinti L. maculans virulentiškumo tipus (Mahuku ir kiti,1995; Taylor,1993; Xue ir kiti,1992) ir sudaryti galimybę sparčiai aptikti silpnai virulentišką (L. biglobosa) ir labai virulentišką (L. maculans) tipus. Ypatingai naudingas aptikti ir diferencijuoti augalų patogenus tokius, kurie yra artimai susijusios rūšys, naudojant PGR (Henson ir French, 1993). Remiantis PGR reakcija pietiniame Ontaryje, naudojant specifinius oligonukleotidinius pradmenis, nustatyti L. maculans virulentiškumo tipai, dviejuose komercinių aliejinių rapsų laukuose.Gauti rezultatai parodė, kad abu virulentiškumo tipai paplitę abiejuose laukuose, bet dominuoja labiau virulentiškas tipas. Panašus dominavimas labiau virulentiško tipo aptiktas ir Australijoje (Plummer ir kiti, 1994). Labiau virulentiškas tipas kolonizuoja lapus, stiebus, ankštaras ir sėklas, tuo tarpu silpnai virulentiškas tipas aptinkamas tik ant lapų ir sėklų, tai patvirtina ankstesnius pranešimus Ontaryje, kad tik labiau virulentiškas tipas aptinkamas ant stiebų ir ankštarų (Hall ir kiti,1993) ir abu tipai aptinkami ant sėklų (Chigogora ir Hall, 1995). Ko-infekcija leidţia skirtingiem virulentiškumo tipams sąveikauti fiziologiškai. Nėra ţinoma ar silpniau virulentiškas tipas įsikuria rapsų lapuose prieš infekuojant rapsą labiau virulentiškam tipui, ar šie tipai tuo pačiu metu infekuoja rapsą, ar pirma infekuoja augalą labiau virulentiškas tipas,o po to silpnai virulentiškas (Mahuku ir kiti,1996). 20 2. MEDŢIAGA IR METODIKA

2.1 Ţieminių rapsų stiebų ėminių surinkimo vietos

Izoliatų grupių Nr. Vietovė (rajonas) Stiebo paţeidimo Tirta izoliatų vieta* 2006 metų derliaus ţieminų rapsų stiebų ėminiai 06-01 Kėdainių, Akademija A 9 06-02 Kėdainių, Akademija A 11 06-03 Kėdainių, Akademija V 11 06-06 Kėdainių, Sviliai A 11 06-07 Kėdainių, Sviliai V 6 06-08 Raseinių, Nemakščiai A 10 06-09 Radviliškis, Pociūnėliai V 14 06-10 Radviliškis, Pociūnėliai A 30 06-11 Radviliškio, Pociūnėliai A 5 Iš viso izoliatų iš 2006 metų ėminių 107 2007 metų derliaus ţieminų rapsų stiebų ėminiai 07-16 Kėdainių, Dotnuva V 11 07-19 Kėdainių, Dotnuva A 8 07-21 Kėdainių, Dotnuva A 11 07-22 Kėdainių,Dotnuva V 12 07-23 Kėdainių, Dotnuva A 11 07-25 Kėdainių, Dotnuva A 14 07-26 Kėdainių,Dotnuva V 12 07-27 Kėdainių, Dotnuva A 9 07-28 Kėdainių, Dotnuva V 14 07-38 Jonavos, Gureliai V 32 07-40 Ukmergės,Tulpiakiemis V 4 Iš viso izoliatų iš 2007 metų ėminių 138 2009 metų derliaus ţieminių rapsų stiebų ėminiai VA 09 /1-42 Varėna, Perloja A 42 KED 09/ 1-36 Kėdainių,Akademijos A 36 SL 09/ 1a-37a Pakruojo,Pasvalio A 37 SL 09/ 1v-26v Pakruojo,Pasvalio V 26 LAT 09/ 1-5 Latvija,Peterlauki A 5 LAT 09/1vp-41vp** Latvija,Peterlauki V 41 Iš viso izoliatų iš 2009 metų ėminių 187 Iš viso izoliatų išskirta 432

* A -stiebo apačia (šaknies kaklelis), V – viršutinė stiebo dalis, 5 cm aukščiau šaknies kaklelio ** izoliatai išskirti iš pavienių piknosporų

1 lentelė. Grybo Leptosphaeria rūšių surinkimo vietos 2006 – 2009 metais.

21 Tyrimai atlikti 2008-2009 metais Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filiale Ţemdirbystės institute, Genetikos ir fiziologijos laboratorijoje.

2.2 Leptosphaeria spp. auginimo sąlygos

Leptosphaeria spp. izoliatų grynos kultūros buvo gautos iš LAMMC filialo Ţemdirbystės instituto Augalų patologijos ir apsaugos skyriaus. Grybo izoliatai išskirti iš pavienių askosporų. Leptosphaeria spp. izoliatų kolonijos, kurios augo ant bulvių dekstrozės agaro, buvo persėtos į V8 terpę (2 lentelė), joje buvo auginama 4 paras purtyklėje esant 20ºC temperatūrai ir maišoma 100 aps/min. 2 lentelė. V8 terpės sudėtis.

Medţiaga Kiekis Pastabos Darţovių sultys 100 ml CaCO3, 1,5 g Vanduo iki 500 ml Antibiotikas (chloramphenincol 50 500µ įpilama prieš naudojimą mg/ml)

2.3 DNR išskyrimas mikro- metodu

Genominė DNR išskirta iš Leptosphaeria spp. grybų mikro - metodu. Pasiruošiamas ekstrakcijos buferis (3 lentelė), TE buferis (4 lentelė). 3 lentelė. Ekstrakcijos buferio sudėtis.

Medţiaga Kiekis Koncentracija tirpale Pastabos Sorbitolis 2,55 g 140 mM 1M Tris – HCl pH 8,0 22 ml 220 mM 0,5M EDTA pH 8,0 4,4 ml 22 mM NaCl 4,67 g 800 mM CTAB 0,8 g 0,8 % Sarkozinas 1,0 g 1,0 % Vanduo iki 100 ml Tirpinti vandens vonelėje 55º C Merkaptoetanolis 0,2 ml 0,2 % Pridėti tik prieš naudojant

Chloroformas – izoamilo alkoholis (24:1): chloroformo 48 ml + izoamilo alkoholio 2 ml.

4 lentelė. TE buferio sudėtis.

Medţiaga Kiekis 1M Tris – HCl pH 8,0 1 ml 0,5M EDTA pH 8,0 0,2 ml Vanduo iki10 ml

Darbo eiga: 1. 0,2 g grybų ėminys sutrinamas 5 ml mėgintuvėlyje uţpylus 300µl ekstrahuojančio buferio. 2. Sutrinta masė perkeliama į 2 ml mėgintuvėlį ir uţpilama 700 µl ekstrahuojančio buferio bei 400µl chloroformo – izoamilo alkoholio (24:1) mišinio. 3. Sumaišoma purtyklėje ir inkubuojama vandens vonelėje 55º C 10 min. Kas 2 min. sumaišoma purtyklėje. 4. Centrifuguojama 5 min. 12000 rpm. 5. Supernatantas perkeliamas į naują 2 ml mėgintuvėlį. Uţpilamas lygus tūris chloroformo ir sumaišoma purtyklėje. 6. Centrifuguojama 5 min. 12000 rpm. 7. Supernatantas perkeliamas į naują 2 ml mėgintuvėlį. Pridedama 5 µl ribonukleazės A (10µg µl- 1). Palaikoma 15 min. 37 º C. 8. Uţpilama 1,2 tūrio izopropanolio. 9. Švelniai pavartant sumaišoma. 10. Centrifuguojama 10 min. 12000 rpm. 11. Supernatantas nupilamas. 12. Ant nuosėdų uţpilama 1 ml 70 % etanolio ir papurtoma, kad nuosėdos atšoktų nuo sienelių. 13. Centrifuguojama 5 min. 12000 rpm. nupilamas etanolis. 14. Pakartojami 12 – 13 punktai. 15. Nuosėdos pradţiovinamos 16. Ištirpinamos nuosėdos uţpylus 50 µl TE buferio.

2.4 L. maculans ir L. biglobosa rūšių atpaţinimas

Rūšių identifikaivimui buvo naudojama PGR analizė su rūšims specifiniais pradmenims (6 lentelė). 5 lentelė. 1 mėginiui PGR reakcijos mišinio komponentai ir koncentracijos.

Medţiaga Kiekis Koncentracija DNR 1.00 μl 50ng/μl PCR buffer 1.00 μl 10x DreamTaq buffer dNTPs 0.2 μl 10 mM L mac F 1.00 μl 10μM L big F 1.00 μl 10μM L mac R 2.00 μl 10μM Taq-Pol 0.05 μl 5U/μl H O 3.75 μl 2 Viso : 10 μl

PGR ciklas:

95 ºC – 2 min; (95ºC – 15 sek, 70 ºC – 30 sek, 72 ºC – 1 min) x 30 ciklai; 72 ºC – 10 min.

6 lentelė. Rūšių atpaţinimui naudotų pradmenų nukleotidų sekos. Pradmens Nukleotidų seka pavadinimas L. mac F 5„-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3„ L. big F 5„-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3„ L. mac R 5„-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3„

Gauti produktai patikrinami leidţiant elektroforezę 1.5 % agarozės gelyje. Elektroforezė vykdoma apie 1.5 – 2 valandas, esant 50 – 70 V įtampai. Baigus elektroforezę gelis, patalpinamas į fotografavimo kamerą (Mini Bis PRO), kur apšviečiamas ultravioletiniais spinduliais. Gelyje matomi fragmentai ties 331 bp (L. maculans) arba 444 bp (L. biglobosa). Šiame darbe naudotas molekulinės masės ţymeklis Gene Ruler ™ DNA Ladder MIX (Fermentas, Lietuva). 2.5 L. maculans poravimosi tipų nustatymas L. maculans poravimosi tipų nustatymui buvo naudojama PGR analizė su specifiniais pradmenims (8 lentelė). 7 letelė. 1 mėginiui PGR reakcijos mišinio komponentai ir koncentracijos Medţiaga Kiekis Koncentracija DNR 1.00 μl 50ng/μl PCR buffer 1.00 μl 10x DreamTaq buffer dNTPs 0.2 μl 10 mM L mac MAT 1- 1 1.00 μl 10μM L mac MAT 1- 2 1.00 μl 10μM L mac MAT 1 2.00 μl 10μM Taq-Pol 0.05 μl 5U/μl H O 3.75 μl 2 Viso : 10 μl

PGR ciklas: 94 ºC – 2 min; (94ºC – 30 sek, 60 ºC – 30 sek, 72 ºC – 1 min) x 35 ciklai; 72 ºC – 10 min.

24 8 lentelė. Poravimosi tipų nustatymui naudotų pradmenų nukleotidų sekos.

Pradmens Nukleotidų seka pavadinimas MAT 1-1 5„-CTCCATGCAATGTACTTGG-3„ MAT 1-2 5„-AGCCGGAGGTGAAGTTGAAGC-3„ MAT 1 5„-TGGCGAATTAAGGGATTGCTG-3„

2.6 AFLP metodika AFLP analizę sudarė keletas etapų – DNR sukarpymas TaqI ir AseI (VspI) restriktazėmis, adapterių ligavimas, preamplifikacija, selektyvi amplifikacija ir AFLP fragmentų forezė. 1. Mišinio paruošimas 1.1. Sumaišomi šie restrikcijos komponentai: 10.00 μl DNR (50ng/μl) 1.00 μl Enzimas (1) – Fast Digest TaqI (10U/μl) 4.00 μl Fast Digest buffer (10 x) 25.00 μl H O 2 ------40.00 μl Inkubuojama 10 min 65°C temperatūroje tinkamoje Enzimui (1) amplifikatoriuje (Mastercycler gradient – eppendorf). 1.2. Į pirmą pasigamintą mišinį pridedami šie komponentai: 1.00 μl Fast Digest buffer (10 x) 1.00 μl Enzimas (2) – Fast Digest AseI (VspI) (10U/μl) 8.00 μl H O (add 10 μl / tube) 2 ------50.00 μl Mišinys inkubuojamas 37°C 35 min amplifikatoriuje (Mastercycler gradient – eppendorf).

25 1.3. Inkaro (adapterio) paruošimas: paimama 25 μg viršutinės grandinės OLIGO (61) ir 22 μg apatinės grandinės OLIGO (62) (1 μg/μl konc.) ir padidinamas kiekis iki 100 μl praskiedţiant H O. Gaunama 2 50 pM konc. TaqI inkaro. Oligo61(T-top)/Oligo62 (T-bottom) 5‟-GACGATGAGTCCTGAC TACTCAGGACTGGC- 5‟ Paimama 2.6 μg viršutinės grandinės OLIGO (41) ir 2.0 μg apatinės grandinės OLIGO (42) (1μg/μl konc.) ir padidinamas kiekis iki 100 μl praskiedţiant H O. Gaunama 5 pM konc. AseI inkaro. 2 Oligo41(A-top)/Oligo42 (A-bottom) 5‟-CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGAT- 5‟ Sumaišomi Oligo41(A-top)/Oligo42 (A-bottom) ir Oligo61(T-top)/Oligo62 (T-bottom) adapteriai laikomi 5 min. 95°C vandens vonelėje, lėtai atšaldoma (2 h.) norint gauti kuo geresnį grandinių sukibimą. Mišinį galima laikyti -20°C. 1.4. Inkarų prijungimo (ligazės) mišinys : 1.00 μl inkaras (Adapter T) (50 pM: TaqI) 1.00 μl inkaras (Adapter A) (5 pM: AseI) 1.00 μl 10 mM ATP 0.50 μl Fast Digest buffer (10 x) 1.00 μl T DNA ligase (1U/μl) 4 0.50 μl H O (add 5 μl / tube) 2 ------55.00 μl inkubuojama 2 h 37°C amplifikatoriuje (Mastercycler gradient – eppendorf).. Ligazės produktai naudojami pre – amplifikacijos mišinyje. 2. Pre-amplificijos mišinys 10.00 μl 10 x praskiestas ligavimo produktas (20 μl pradinio mišinio ir 180 μl H O) 2 1.00 μl Pradmuo 1 (oligo43/A00, 100 ng/μl stock) 1.00 μl Pradmuo 2 (oligo63/T00, 100 ng/μl stock) 5.00 μl PCR buffer (10x DreamTaq buffer) 1.25 μl dNTPs (10 mM) 0.25 μl Taq-Pol (DreamTaq 5U/μl) 31.50 μl H O 2 ------50.00 μl

26 Mėginai amplifikuoti pagal programą: [94°C, 30 sek; 55°C, 30 sek; 72°C, 60 sek] x 25 ciklai PGR produktai patikrinami atlikus elekroforezę 1,5% agarozės gelyje. Duomenys agarozės gelyje turi būti matomi kaip dėmės tarp 50 – 700 bp ( 7 pav.II), neturėtų matytis dėmių virš 2 kb ir produkto liekanų aplink šulinėlius (7 pav. I).

7 paveikslas. Pre amplifikacijos produktai agarozės gelyje. Praskiedţiama medţiagos koncentraciją iki 1ng/μl (daţniausiai skiedţiama 20 - 50 x ). 3. Selectyvi amplifikacija su selektyviais pradmenimis ( 9 lentelė). 7.5 μl 20x paskiestas pre-amplifikacijos mišinys (10 μl produkto ir 190 μl H O) 2 0.75 μl Pradmuo 1 (AseI +2, 50 ng/μl) 0.45 μl Pradmuo 2 (TaqI (+2), 50 ng/μl) 1.5 μl PCR buffer (DreamTaq buffer 10x) 0.30 μl dNTPs (10 mM) 0.06 μl Taq-Pol (DreamTaq 5U/μl)) 4.44μl H O 2 ------15.00 μl Mėginai amplifikuoti pagal programą: Nusileidimo profilis: (94ºC, 30 sek; 65 – 56ºC (sumaţinant 0.7ºC kiekviename cikle), 30 sek; 72ºC, 60 sek) x 12 Baigiama su : (94ºC, 30 sek; 56ºC, 30 sek; 72ºC, 60 sek) x 24

27 9 lentelė. Selektyviai amplifikacijai naudoti pradmenų deriniai

Pradmens pavadinimas Nukleotidų seka FAM+ AG 5‟- Fam- GACTGCGTACCTAATAG- 3‟ T+AA 5‟ – GATGAGTCCTGACCGAAA - 3‟

Pradmens pavadinimas Nukleotidų seka FAM+ AC 5‟- Fam- GACTGCGTACCTAATAC- 3‟ T+A 5‟-GATGAGTCCTGACCGAA - 3‟

Selektyvios amplifikacijos gauti produktai buvo leidţiami pro kapiliarinę elektroforezę, buvo įnešama 0,125 μl 500 LIZ dydţio standartas (Applied Biosystems), 9,25 μl formamido ir 1 μl selektyvios PGR amplifikacijos produkto. Pavyzdţiai analizuoti su ABI 3130 genetiniu analizatorium (Applied Biosystems). 2.7 Duomenų analizė Gauti produktai, atlikus rūšims specifinę ir poravimosi tipams specifinę PGR, vertinti vizualiai. AFLP analizėje visi fragmentai buvo vertinami kaip “1” (fragmentas yra), arba “0” (fragmento nėra) 50 -500 bp ribose ir įtraukti į dvejetainę matricą naudojant programinę įrangą GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems). Manoma, kad fragmentai gali būti nepriklausomi ir tie fragmentai, kurie turi identiškus dydţius, gali turėti ir identiškas sekas. Todėl panašumo matrica tarp visų izoliatų porų buvo sukonstruota remiantis Dice panašumo koeficientu (Nei ir Li, 1979). Dendrogramos gautos naudojant klasterinę analizę, naudojant UPGMA algoritmą. Šie duomenys analizuoti NTSYSpc2.2 programine įranga (Rohlf, 1993). Visi variantai buvo suskaidyti į kovariantų komponentus (tarp populiacijų ir tarp izoliatų populiacijoje) pagal AMOVA su Arlequin 3,1 programine įranga (Excoffier ir kiti, 2006).

28 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Leptosphaeria spp. rūšių paplitimas rapsų pasėliuose Lietuvoje. Genominė DNR buvo išskirta iš 432 Leptosphaeria spp. izoliatų, uţaugintų in vitro iš 2006-2007 bei 2009 metais surinktų rapsų stiebų ėminių Kėdainių, Radviliškio, Raseinių, Jonavos, Ukmergės, Varėnos, Pakruojo, Pasvalio rajonuose bei vieno Latvijos Peterlauki rajono. Iš 2006 metų derliaus ţieminių rapsų stiebų ėminių buvo išskirti 107 Leptosphaeria spp. izoliatai, iš 2007 metų stiebų ėminių – 138 grybo izoliatai, o iš 2009 metais surinktų ţieminių rapsų stiebų ėminių – 141 grybo izoliatas iš Lietuvos ir 46 izoliatai iš Latvijos. Izoliatai buvo išskirti nuo įvairių rapsų veislių, bei stiebo paţeidimo vietų (stiebo apatinėje arba viršutinėje dalyje). Atlikus rūšims specifinę PGR analizę nustatyta, kad visi 245 izoliatai išskirti iš 2006 ir 2007 metų ėminių priklauso Leptosphaeria maculans (senso stricto) rūšiai (8 pav.).

8 paveikslas. Leptosphaeria rūšių nustatymas 2006-2007 metų izoliatams. Matosi 331 bp dydţio L. maculans DNR fragmentai. 2006 – 2007 metų 144 izoliatai buvo išskirti iš apatinės stiebo dalies paţeidimų ir 129 izoliatai iš viršutinės stiebo dalies, tikintis aptikti abi Leptosphaeria rūšis. Šie nauji ir šiek tiek netikėti rezultatai, kuomet 2006 ir 2007 metais identifikuota tik viena – L. maculans rūšis (1 priedas), galima paaiškinti ypatingai greitu šios rūšies plitimu Lietuvoje, o taip pat palankiomis meteorologinėmis sąlygomis šiam patogenui vystytis 2006-2007 metais. Gali būti, kad Leptosphaeria biglobosa pseudoteciams temperatūra tais metais buvo per ţema brendimui. Kaip jau buvo minėta literatūros apţvalgoje, abi rūšys gali išgyventi ant uţartų rapsų liekanų, bet Leptosphaeria biglobosa išgyvena ilgiau ant neuţartų liekanų nei ant uţartų. Tokiomis pačiomis sąlygomis Leptosphaeria maculans aksosporos išgyvena ilgiau nei Leptosphaeria biglobosa. Abiejų rūšių pseudotecių subrendimo greitis panašus 15 – 20°C,

29 tačiau Leptosphaeria biglobosa pseudoteciai bręsta daug lėčiau nei Leptosphaeria maculans esant < 10°C (J. S. West, 2001). Tuo tarpu izoliatai, išskirti iš 2009 metais surinktų ţieminių rapsų stiebų ėminių iš įvairių Lietuvos vietų, skyrėsi savo rūšine sudėtimi (10 lentelė). 10 lentelė. 2009 metų izoliatų pasiskirstymas pagal grybo Leptosphaeria rūšis.

Izoliatų grupių nr. Vietovė Stiebo apačia - Grybo Leptosphaeria rūšis viršus L. maculans L. biglobosa Viso VA 09 /1-42 Varėna, Perloja A - 42 42 KED 09/ 1-36 Kėdainiai, Akademija A 35 - 35 ŠL 09/ 1a-37a Pakruojis ir Pasvalys A 24 12 36 ŠL 09/ 1v-26v Pakruojis ir Pasvalys V 24 2 26 LAT 09/ 1-5 Latvija, Peterlauki raj. A 5 - 5 LAT 09/ 1vp* -41vp* Latvija, Peterlauki raj. V 37 3 40 Viso: 125 59 184

Pietų Lietuvoje Varėnos rajone nusatyta tik L. biglobosa rūšis, tuo tarpu Vidurio Lietuvoje (Kėdainių rajone) visi izoliatai priklausė L. maculans rūšiai. Šiaurės, Lietuvoje Pakruojo ir Pasvalio vietovėse, buvo aptiktos abi rūšys (1 priedas). Šiose dviejose vietovėse ant rapsų stiebo apatinės dalies aptikta 24 L. maculans ir du kartus maţiau (12) L. biglobosa rūšiai priklausančių izoliatų, o stiebo viršutinėje dalyje nustatyta, kad 2 izoliatai priklauso L. biglobosa ir 24 L. maculans rūšiai. Taigi šiose Šiaurės Lietuvos vietovėse, kad ir aptinkamos abi rūšys tačiau dominuojanti rūšis išlieka L. maculans. Rezultatai rodo, kad 2009 metai buvo palankūs abiejų grybo Leptosphaeria rūšių plitimui(9 paveikslas), tačiau Varėnos regione, kur aptikta tik L. biglobosa skirtingai nei Kėdainių regione kur aptikta tik L. maculans galėjo skirtis mikroklimatinės sąlygos. Latvijoje fomozė, taip pat kaip ir visame pasaulyje, yra viena pagrindinų rapsų ligų, 2006 metais derėjimo metu aptikta rapsų uţsikrėtusių šia liga nuo 12 iki 72 %, o 2007 metais nuo 49 iki 86 % (Balodis ir kiti, 2008). Latvija, pirmoji Baltijos regione aptiko abi Leptosphaeria rūšis, pagal skirtingus simptomus ant lapų, bei skirtingą morfologiją (Adamovičs ir kiti, 2009). Ištyrus Leptosphaeria spp. izoliatus, išskirtus iš 2009 metais Latvijoje surinktų ţieminių rapsų stiebų ėminių, aptiktos abi rūšys, tačiau L. biglobosa izoliatai aptikti tik trys iš 45 izoliatų. Gali būti, kad Latvijoje dominuojanti rūšis taip pat yra L. maculans, tačiau norint įsitikinti reikėtų ištirti daugiau izoliatų iš įvairių Latvijos vietovių.

9 paveikslas. Leptosphaeria rūšių nustatymas 2009 metų izoliatams.Matosi 331 bp dydţio L. maculans ir 444 bp dydţio L. biglobosa DNR fragmentai.

Ištyrus 386 Leptosphaeria spp. izoliatus, išskirtus iš 2006, 2007 ir 2009 derliaus metais surinktų Lietuvoje fomozės paţeistų ţieminių rapsų stiebų ėminių, aptiktos L. maculans ir L. biglobosa rūšys tiek stiebo apačioje tiek viršutinėje stiebo dalyje, o L. maculans rūšis nustatyta kaip ryškiai dominuojanti rūšis. Šie duomenys rodo, kad yra didelė rizika fomozės epidemijai Lietuvoje. Santykinis pasikeitimas tarp dviejų rūšių pastebimas Čekijos Respublikoje (Jêdryczka ir kiti., 2002a), Vengrijoje (Szlavik ir kiti, 2003) ir Austrijoje. Skelbiama, kad pastaraisiais metais fomozės sukėlėjo populiacijos struktūra ir Lenkijoje kinta agresyvėjimo linkme (Karolewski ir kiti, 2002). Lietuvoje ši tendencija taip pat pastebima.

31 3.2 Leptosphaeria maculans poravimosi tipų pasiskirstymas.

Kaip ir kiti lokuloaskomicetai, L. maculans turi vieną poravimosi tipo (MAT) lokusą su dvejomis alternatyviomis formomis (10 pav.), kurios turi būti skirtingos, kad vyktų poravimasis tarp izoliatų. Šis lytinio dauginimosi būdas yra labai svarbi ligos vystymosi ciklo dalis, lemianti naujų genetinių formų atsiradimą bei askosporų suformavimą. Pagal poravimosi tipą 2006 – 2007 metų izoliatai pasidalino į dvi beveik lygias dalis – 114 izoliatų buvo MAT1-1 tipo ir 127 izoliatai – MAT1-2 tipo (11 lentelė). 11 lentelė. 2006-2007 metų izoliatų pasiskirstymas pagal Leptosphaeria maculans poravimosi tipus. Izoliatų Vietovė Stiebo Tirta Izoliatų poravimosi tipai grupių Nr. paţeidimo izoliatų vieta 2006 metų derliaus stiebų ėminiai MAT1-1 MAT1-2 Abu 06-01 Kėdainių, Akademija A 10 3 6 1 06-02 Kėdainių, Akademija A 11 7 4 0 06-03 Kėdainių, Akademija V 11 4 7 0 06-06 Kėdainių, Sviliai A 11 3 8 0 06-07 Kėdainių, Sviliai V 6 3 3 0 06-08 Raseinių, Nemakščiai A 10 4 6 0 06-09 Radviliškis, Pociūnėliai V 14 6 8 0 06-10 Radviliškis, Pociūnėliai A 30 17 13 0 06-11 Radviliškio, Pociūnėliai A 5 2 3 0 Iš viso ištirta 2006 metų ėminių 107 49 58 1 2007 metų derliaus stiebų ėminiai 07-16 Kėdainių, Dotnuva V 11 5 6 0 07-19 Kėdainių, Dotnuva A 8 3 5 0 07-21 Kėdainių, Dotnuva A 11 7 4 0 07-22 Kėdainių,Dotnuva V 12 5 7 0 07-23 Kėdainių, Dotnuva A 11 4 5 2 07-25 Kėdainių, Dotnuva A 14 9 5 0 07-26 Kėdainių,Dotnuva V 12 7 5 0 07-27 Kėdainių, Dotnuva A 9 3 5 1 07-28 Kėdainių, Dotnuva V 14 4 9 1 07-38 Jonavos, Gureliai V 32 16 16 0 07-40 Ukmergės,Tulpiakiemis V 4 2 2 0 Iš viso ištirta 2007 metų ėminių 138 65 69 4 Iš viso ištirta izoliatų 246 114 127 5

Kaip matome vienuoliktoje lentelėje dalis izoliatų grupių pasiţymėjo netolygiu pasiskirstymu tarp poravimosi tipų (izoliatų grupės Nr. 06-06, 06-02, 07-25), tačiau šių grupių dydis (11-14 izoliatų) nėra pakankamas, kad galima būtų teigti apie vieno poravimosi tipo dominavimą. Penkiems izoliatams nustatyti abu poravimosi tipai. Šie izoliatai nenaudoti tolimesnėje AFLP analizėje dėl galimo izoliatų mišinio.

10 paveikslas. Leptosphaeria maculans poravimosi tipų nustatymas 2009 metų izoliatams. Matosi 443 bp dydţio MAT1-2 ir 686 bp dydţio MAT1-1 DNR fragmentai. 2009 metais Varėnos vietovės izoliatai nebuvo įtraukti, nes visi izoliatai priklausė L. biglobosa rūšiai (10 lentelė). Lietuvos KED 09/ 1-36, ŠL 09/ 1a-37a, ŠL 09/ 1v-26v grupių izoliatai pasiskirtė beveik tolygiai. 41 izoliatas turėjo MAT1 -1 tipą, o MAT1-2 turėjo 35 izoliatai, taip pat nustatyti 5 izoliatai kurie turėjo abu poravimosi tipus (12 lentelė). 12 lentelė. 2009 metų izoliatų pasiskirstymas pagal Leptosphaeria maculans poravimosi tipus.

Izoliatų grupių nr. Vietovė Stiebo Tirta Poravimosi tipai apačia – izoliatų viršus MAT1-1 MAT1-2 Abu KED 09/ 1-36 Kėdainiai, Akademija A 33 16 13 4 ŠL 09/ 1a-37a Pakruojis ir Pasvalys A 24 14 10 0 ŠL 09/ 1v-26v Pakruojis ir Pasvalys V 24 11 12 1 LAT 09/ 1-5 Latvija, Peterlauki raj. A 5 4 1 0 LAT 09/ 1vp* -41vp* Latvija, Peterlauki raj. V 34 34 0 0 Iš viso ištirta 2009 metų ėminių: 120 79 36 5 * izoliatai išskirti iš pavienių piknosporų

Nors ir pavyko nustatyti 5 izoliatams (3 priedas) , kad jie priklauso Leptosphaeria maculans rūšiai, tačiau nepavyko nustatyti kokius poravimosi tipus jie turi. Taigi, abu poravimosi tipai aptikti visose Lietuvos populiacijose tiek 2006-2007, tiek 2009 metais, taip pat stiebo apatinėje ir viršutinėje dalyje (2 priedas). Nėra ţenklaus pasiskirstymo tarp poravimosi tipų, tarkim kaip Prancūzijoje atlikus PGR analizę 401 izoliatui, aptikti abu poravimosi tipai, kurie pasiskirstė santykiu 1:1 (Gout ir kiti, 2006). Australijoje iš surinktų 152 izoliatų aptikti abu poravimosi

33 tipai, 86 priklausė MAT 1-1 ir 66 MAT1-2 (57:43%) (Hayden ir kiti 2005), tuo tarpu sudėjus Lietuvos 2006- 2007 ir 2009 metų izoliatus gaunasi, kad MAT1-1 tipą turėjo 155 izoliatai, o MAT 1-2 turėjo 162 izoliatai (49:51%). Įdomūs rezultatai gauti ištyrus Latvijos grupės izoliatus, visi izoliatai, išskyrus vieną (10 paveikslas) turėjo MAT1-1 poravimosi tipą ir šis tipas vyrauja viršutinėje stiebo dalyje. Latvijos LAT 09/ 1vp* - 41vp* izoliatai, išskirti iš piknosporų, o Lietuvos izoliatai bei Latvijos 5 izoliatai išskirti iš askosporų, gal tai ir turėjo įtakos, kad būtent aptiktas tik vienas poravimosi tipas. Tačiau Hayden ir kiti 2005 metais atlikę tyrimus nustatė, kad nėra poravimosi tipams reikšmingo santykinio skirtumo ar izoliatas kilęs iš askosporos ar konidijos (piknosporos). Apibendrinus gautus rezultatus matome, kad Lietuvoje paplitę abu L. maculans poravimosi tipai MAT 1-1 ir MAT1-2, o tai, savo ruoţtu, sudaro prielaidas didelei genetinei šio patogeno variacijai bei adaptyvumui susikurti.

34 3.3 L. maculans genetinės įvairovės Lietuvoje vertinimas AFLP metodu. Ţinios apie Leptosphaeria maculans genetinės variacijos svarbą ir pasiskirstymą populiacijoje, ir tarp populiacijų, gali padėti numatyti patogeno evoliucinį potencialą įveikti pagrindinius genus ir kiekybinį atsparumą (MacDonald ir Linde, 2002). Siekiant įvertinti Leptosphaeria maculans izoliatų genetinę įvairovę Lietuvoje, tyrimams buvo pasirinktas AFLP ţymenų metodas. AFLP ţymenys pasiţymi tarprūšiniu universalumu, ţymenų gausa bei geru atsikartojamumu. Tiriamąją populiaciją sudarė 83 L. maculans izoliatų, kurie buvo išskirti iš ţieminių rapsų stiebų, surinktų Kėdainių, Jonavos bei Radviliškio rajonuose 2006 ir 2007 m (13 lentelė). Papildomai įtraukti 4 L. biglobosa izoliatai, kurie buvo išskirti iš 2008 metų derliaus ţieminių rapsų stiebų, surinktų Kėdainių rajone, šie izoliatai sudarė tarprūšinę kontrolę. AFLP ţymenų metodui buvo panaudotos dvi pradmenų poros. 13 lentelė. L. maculans ir L. biglobosa populiacijų izoliatų skaičius ir AFLP haplotipai, poravimosi tipų pasiskirstymas ir populiacijai specifinis FST indeksas.

Populiacijai Izoliatų AFLP haplotipų MAT1-1/ Grybo rūšis Vietovė, metai specifinis F skaičius skaičius MAT1-2a ST indeksasa L. maculans Kėdainiai, 2006 24 24 8/16 0.201 L. maculans Jonava, 2007 30 30 16/14 0.211 L. maculans Radviliškis, 29 29 16/13 0.208 2006 L. biglobosa Kėdainiai, 2008 4 4 - - Viso: 87 87 40/43 0.207 a Poravimosi tipai ir populiacijai specifinis FST indeksas nustatytas tik L. maculans rūšiai Atlikus AFLP gauti rezultatai parodė, kad amplifikuotų fragmentų skaičius svyravo nuo 40 iki 82, L. maculans fragmentų vidurkis vienam izoliatui buvo 66,5. Keturi pasirinkti L. biglobosa izoliatai turėjo nuo 34 iki 48 fragmentų (vidurkis 43,3). AFLP pradmenų poros su pradmeniu T-A (vienas selektyvus nukleotidas) amplifikavo vidutiniškai 52,1 L. maculans fragmentus ir 32,8 L. biglobosa fragmentus, tuo tarpu pradmuo T-AA, kuris turėjo du selektyvius nukleotidus 3„ gale, davė vidutiniškai tik 14,4 ir 10,5 fragmentus. AFLP rezultatai parodė aiškų skirtumą tarp L. maculans ir L. biglobosa izoliatų, tik 20 alelių iš 156 (12,8%) buvo bendri. Be to buvo nustatytas aukštas vidurūšinis polimorfizmas su neidentiškais AFLP profiliais L. maculans ir L. biglobosa grupėse. Trylika monomorfinių alelių identifikuota tarp L. maculans ioliatų, tuo tarpu 29 monomorfiniai aleliai buvo nustatyti tarp keturių L. biglobosa izoliatų. 87 izoliatai buvo sugrupuoti pagal DICE koeficientą naudojant UPGMA. Kaip matosi dendrogramoje atsiskiria dvi grupės, vienai grupei priklauso L. maculans izoliatai, kitai grupei L. biglobosa (11pav.).

11 paveikslas. Dendrograma sudaryta su UPGMA algoritmu remiantis DICE panašumo koeficientu. L. maculans: K-Kėdainiai;J –Jonava; R- Radviliškis ir L. biglobosa paţymėta kaip B.

Dauguma sugrupuotų L. maculans izoliatų panašumas yra daugiau nei 65 %. Vidurūšinis grupavimas nebuvo toks akivaizdus, nors kai kurios grupės pagal surinkimo kilmę atsiskyrė. Kėdainių populiacijos izoliatai formavo atskirą grupę su tam tikromis išimtimis (įsiterpę 5 izoliatai priklausantys Radviliškio grupei ir 1 izoliatas Jonavos), dauguma izoliatų iš Radviliškio ir Jonavos

36 susimaišę tarpusavyje ir sudarė kitą grupę. Diţiausias genetinis giminingumas nustatytas tarp dviejų Jonavos populiacijos izoliatų 07-38-28 ir 07-38-29 (Dice koeficietnas 0,97). Analizuojant genetinę variaciją su AMOVA nustatyta ţenklių genetinių skirtumų (P < 0,0001) genetinių pakitimų tarp populiacijų (14 lentelė). 14 lentelė. Molekulinės variacijos analizė (AMOVA) trims Leptosphaeria maculans populiacijoms Lietuvoje.

Variacijos Variacijos Procentinė D. F. Kvadrarų suma Tikimybėa šaltinis komponentai variacija Tarp 2 196.54 3.132 20.7 <0.0001 populiacijų Populiacijos 80 960.13 12.001 79.3 - viduje aTikimybė didelei reikšmei gauti, nustatyta atlikus 1023 permutacijas.

Dauguma pakitimų identifikuota tarp izoliatų populiacijos viduje (79,3%). Populiacijai specifinis fiksacijos indeksas buvo panašus visose trijose populiacijose, tai rodo, kad šios populiacijos patiria panašaus dydţio evoliucinį spaudimą, vidurkis FST = 0,207 (13 lentelė). Taigi, AFLP ţymenų pagalba buvo nustatyta didelė genetinė variacija, kur visi 83 L. maculans ir 4 L. biglobosa izoliatai identifikuoti kaip skirtingi genotipai. Tokia didelė genetinė įvairovė gali būti paaiškinama lytinio dauginimosi ciklo metu sukuriama variacija bei tokios variacijos išlaikymu dėl pernelyg maţo atrankos spaudimo. Nepaistant fakto, kad atstumas tarp labiausiai nutolusių populiacijų surinkimo vietų Radviliškio ir Jonavos buvo apie 60 kilometrų, ţymus skirtumas (P < 0,0001) genetinės variacijos tarp populiacijų gautas su 20,7 % visos variacijos, priskirta populiacijos lygiui pagal AMOVA rezultatus. Didesnė diferenciacija L. maculans rūšyje nustatyta Kanadoje tik 55 % iš bendros variacijos priskirta diferenciacijai laukų populiacijų viduje (Mahuku ir kiti, 1997). Neseniai atlikti tyrimai Australijoje (Barrins ir kiti, 2002) ir Prancūzijoje (Gout ir kiti, 2006) parodė aukštesnę vidupopuliacinę įvairovę, kur bendras genetinis kintamumas pasiskirstė maţoje erdvinėje skalėje, nepaistant to, kad atstumai nuo vietų buvo daugiau nei 500 kilometrų. Aukštesnį diferenciacijos lygį šiame tyrime galėjo sukelti izoliatų surinkimas nuo skirtingų rapsų veislių stiebų ir didesnio įvertintų lokusų skaičiaus

37 IŠVADOS

 Panaudojus rūšims specifinius pradmenis PGR analizės metodu nustatyta, kad ant Lietuvoje auginamų rapsų paplitusios abi Leptosphaeria rūšys: Leptosphaeria maculans ir Leptosphaeria biglobosa. Taip pat nustatyta, kad šių rūšių santykis Lietuvoje yra kintantis 2006 ir 2007 metais aptikta tik Leptosphaeria maculans, o 2009 metais abi rūšys. Tačiau kaip ir daugelyje šalių dominuojanti rūšis bhuvo nustatyta Leptosphaeria maculans.  Tyrimo metu nustatyta, kad Leptosphaeria maculans surinkti izoliatai priklauso abiem poravimosi tipams ir jų pasiskirstymas yra tolygus. Šis pasiskirstymas rodo vyraujantį Leptosphaeria maculans lytinio dauginimosi ciklą.  AFLP ţymenys parodė, kad tarp L. maculans izoliatų vyrauja didelė genetinė įvairovė tiek populiacijų viduje, tiek tarp populiacijų. Tokią didelę genetinę įvairovę padeda sukurti lytinis dauginimosi tipas. AFLP ţymenų analizė leidţia aiškiai atskirti L. maculans ir L. biglobosa rūšis.

38 LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Adamovičs A., Kārkliņš A., Āboliņš M., Alsiņa I., Bankina B., Grīslis Z., Lapiņš D., Osītis U., Ruţa A.,Turka I., Ţukauska I. 2009, Research activities of the latest devades in the faculty of agriculture. Proceedings international scientific conference „ Latvia university of agriculture – 70“, Jelgava 2009, 9 psl.978-9984-48-007-7; 2. Alabouvette C., Brunin B., 1970. Recherches sur la maladie du colza due a Leptosphaeria maculans. Role des restes de culture dan la conservation et la dissemination du parasite. Ann. Phytopathol. 2: 463-475; 3. Ansan-Melayah D, Rouxel T, Bertrandy J, Letarnec B, Mendes- Pereira E and BalesdentMH, 1997. Field efficiency of Brassica napus specific resistance correlates with Leptosphaeria maculans population structure. Eur J Plant Pathol 103: 835–841; 4. Arora DK, Hirsch PR and Kerry BR (1996) PCR-based molecular discrimination of Verticillium chlamydosporium isolates Mycol Res 100: 801–809; 5. Attard A., Gourgues M, Gout L, Schmit J, Roux J, Narcy JP Balesdent MH, Rouxel T (2001) Molecular characterisation and polymorphism of MinLm1, and minisatellite from the phytopathogenic ascomycete Leptosphaeria maculans. Curr Genet 40:54–64; 6. Balesdent, M. H., Attard, A., Kuhn, M. L., and Rouxel, T. 2002. New avirulence genes in the phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans. Phytopathology 92:1122-1133; 7. Balesdent, M.-H., C. Gall, P. Robin, T. Rouxel 1992 Intraspecific variation in soluble mycelial protein and esterase patterns of Leptosphaeria maculans French isolates. Mycol. Res. 96, 677– 684; 8. Ballinger, D.J. and Salisbury, P.A. (1996). Seedling and adult plant evaluation of race variability in Leptospheria maculans on Brassica species in Australia. Australian Journal of Experimental Agriculture, 36, 485-488; 9. Balodis O., Bankina B., Gaile Z., 2008. Fungicide use efficiency for disease control in winter rape. Zemdirbyste – Agriculture, vol. 95, No.3, p 13 – 18; 10. Barrins J. M., Purwantara A., Ades P. K., Salinsbury P. A., Howlett B. J., 2002. Genetic diversity of isolates of Leptosphaeria maculans from canola (Brassica napus) pandock in Australia. Australas Plant Path 31: 129-135; 11. Bocor A., Barbetti J.,Brown G., MacNish C., Wood P., 1975. Blacleg of rapeseed. J. Agric. West. Aust. 16: 7-10; 12. Bonham S., Staal J., Thomma B., Wang, M.L. and Dixelius, C. 2004 Characterization of an Arabidopsis–Leptosphaeria maculans pathosystem: resistance partially requires camalexin

39 biosynthesis and is independent of salicylic acid, ethylene and jasmonic acid signalling. Plant J. 37, 9–20; 13. Brazauskienė I., Petraitienė E, 2004, Disease incidence and severity of phoma stem canker (Phoma lingam) on winter oilseed rape (Brassica napus L.) in Lithuania as affected by different prochloraz and tebuconazole application times // Z. PflKrankh. PflSchutz. – 2004,vol. 111, p. 439–450; 14. Brazauskienė I., Petraitienė E., Povilionienė E., 2007 Peculiarities of phoma lingam epidemiology and occurrence on winter and spring oilseed rape (Brassica napus var.oleifera) in Lithuania // proceedings 12th internat. Rapeseed congress, Wuhan, China. – 2007, part 4, p. 220–223; 15. Bull, J.J. 1994. Perspective: virulence. Evolution 48:1423–1437; 16. Burdon, J.J. & Silk, J. 1997. Sources and patterns of diversity in plant-pathogenic fungi. Phytopathology 87(7): 664-669; 17. Chigogora J. L. and Hall R., 1995.Relationship among measures of blackleg in winter oilseed rape and infection of harvested seed by Leptosphaeria maculans. Canadian Journal of Plant Pathology 17: 25-30; 18. Cozijnsen, A.J., Popa, K.M., Rolls, B.D., Purwantara, A. and Howlett, B.J.,2000. Genome analysis of the plant pathogenic fungus Leptosphaeria maculans . Molecular Plant Pahtology 1: 293 – 302; 19. Cozijnsen J., Howlett J.,2003. Characterisation of the mating – type locus of the plat pathogenic ascomycete Leptosphaeria maculans. Curr Genet 43: 351- 357; 20. Donini P., Elias M.L, Bougourd S.M., Koebmer R.M.D., 1997,AFLP fingerprinting reveals pattern differences between template DNA extracted from different plant organs. Genome, Vol 40; 21. Excoffier L., Laval G., Schneider S. 2006. Arlequi ver 3.1. An Integrated Software Package for Population Genetics. Geneva, Switzerland, University of Geneva, Genetics and Biometry Laboratory; 22. FAO Quarterly Bulletin of Statistics FAO,1999, Roma .vol 12, 22 - 35 p; 23. Fitt BDL, Gladders P, Turner JA, Sutherland KG, Welhalm SJ, Davies JML., 1997. Prospects for developing a forecasting scheme to optimise use of fungicides for disease control on winter oilseed rape in the UK . Aspect Appl Biol 48: 135 – 142; 24. Fitt, B. D. L., Brun, H., Barbetti, M. J., and Rimmer, S. R. 2006. Worldwide importance of phoma stem canker (Leptosphaeria maculans and L. biglobosa) on oilseed rape (Brassica napus). European Journal of Plant Pathology. 114:3- 15; 40 25. Frencel I.,Lewartowska E. and Jedryczka M., 1991. The spectrum and severity of fungal diseases in field infections of winter oilseed rape in Poland. A review of the 1980‟s. IOBC/WPRS Bull. 14: 137–140; 26. Gabrielson R. L., 1983, Blackleg disease of cucifers caused by Leptosphaeria maculans (Phoma lingam) and its control. Seed Sci. Technol. 11: 749 – 780; 27. Gall, C., Balesdent, M. H., Desthieux, I., Robin, P., and Rouxel, T. 1995. Polymorphism of Tox0 Leptosphaeria maculans isolates as revealed by soluble protein and isozyme electrophoresis. Mycol. Res. 99:221-229; 28. Gasich E L; Levitin M M; Nikonorenkov W A; Portenko L G; Jêdryczka M; Lewartowska E (2003). Gribnyje boliezni jarowogo rapsa w Rossji i ich wriedonosnost'. Wiestnik Zaszczity Rastjenij (Plant Protection News, St. Petersburg-Pushkin) 2, 54-57; 29. George M.L.C., Nelson R.J., Zeigler R.S. and Leung H.,1998. Rapid population analysis of Magnaporthe grisea by using rep-PCR and endogenous repetitive DNA sequences. Phytopathology 88: 223–229; 30. Gilson E., Clement J.M., Brutlag D. and Hofnung M.,1984. A family of dispersed repetitive extragenic palindromic DNA sequences in E. coli. EMBO J 3: 1417–1421; 31. Grudzienė D., Venskutonis R.O., Šileika G., 2001, Lietuvoje auginamų rapsų veislių sėklų ir aliejaus cheminė sudėtis bei eksraktų antioksidacinės savybės. Maisto chemija ir technologija : Mokslo darbai. LMI, KTU T. 35. P. 16-26; 32. Gout L., Eckert M., Rouxel T., Balesdent M. H., 2006. Genetic variability and distribution of mating type alleles in field populations of Leptosphaeria maculans from France. Appl Environ Microb 72: 185-191; 33. Hayden H.L., Howlett B. J., 2005. Genetic structure of population of the fungus Leptosphaeria maculans in a disease nursery of Brassica napus in Australia. Curr Genet 48: 142-149; 34. Hall R., 1992. Epidemiology of blackleg of oilseed rape. Canadian journal of plant pathology 14: 46-55; 35. Hall R, Peters RD, Assabgui RA, 1993. Occurrence and impact of blackleg of oilseed rape in Ontario. Canadian Journal of Plant Pathology 15: 305-313; 36. Henson J. M. And French R.,1993. The polymerase chain rection and plant disease diagnosis. Annual Review of Phytopathology 31: 81-109; 37. Howlett, B.J. ,1997. Genome analysis of the fungal plant pathogen, Leptosphaeria maculans using pulsed field gel electrophoresis. Electrophoresis 18: 1544 – 7; 38. Howlett B.J., Idnurm A., Pedras M.S. 2001. Leptosphaeria maculans, the causal agent of

blackleg disease of brassicas. Fungal Genetics and Biology 33 : 1-14; 41 39. Howlett, B.J., 2004. Current knowledge of the Brassica napus–Leptosphaeria maculans interaction : a review. Can. J. Plant Pathol. 24, 245–252; 40. Huang Yong-Ju, Fitt Bruce D.L., Jedryczka Malgorzata, Dakowska Sylwia,. West, Peter Gladders Jonathan S., Steed1 Julie M. and Li1 Zi-Qin 2005, Patterns of ascospore release in relation to phoma stem canker epidemiology in England (Leptosphaeria maculans) and Poland (Leptosphaeria biglobosa), European Journal of Plant Pathology (2005) 111: 263–277; 41. Hulton C.S.J., Higgins C.F. and Sharp P.M., 1991. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria. Mol Microbiol 5: 825–834; 42. Humpherson – Jones F. M., 1986, The occurrence of virulent phatotypes of Leptosphaeria maculans in brassica seed crops in England. Plant Pathology 35: 224-231; 43. Jêdryczka M.,Lewartowska E,Frencel I.,1994. Properties of Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. isolates from Poland. I. pathogenicity characterisation. Phytopathologia Polonica 7 (XIX), 71- 79; 44. Jedryczka M, Fitt BDL, Kachlicki P, Lewartowska E, Balesdent MH, Rouxel T.1999 Comparison between Polish and United Kingdom populations of Leptosphaeria maculans, cause of stem canker of winter oilseed rape. J Plant Dis Protect 106:608-617; 45. Jêdryczka M; Plachka E; Kuchtova P; Lewartowska E; Odstrcilová L (2002a). Zmiany wpopulacji grzyba Leptosphaeria maculans w Republice Czeskiej w latach 1999–2001 [Changes in the population of the fungus Leptosphaeria maculans in the Czech Republic in the years 1999–2001]. XXIV Konferencja Naukowa „Roœliny Oleiste”, Poznañ 16-17.04.2002. Streszczenia/Abstracts, p. 49; 46. Jêdryczka M, Nikonorenkov V A; Levitin M; Gasich E; Lewartowska E; Portenko L(2002b). Spectrum and severity of fungal diseases on spring oilseed rape in Russia. IOBC/wprs Bulletin 25 (2), 13-20; 47. Johnson RD, Lewis BG. (1994) Variation in host range, systemic infection and epidemiology of Leptosphaeria maculans. Plant Pathol 43: 269 - 277; 48. Karolewski Z, Kosiada T, Hylak-Nowosad B, Nowacka K. (2002) Changes in population of Leptosphaeria maculans in Poland. Phytopathologia Polonica 25:27-34; 49. Koch, E., K. Song, T. C. Osborn, P. H. Williams (1991): Relationship between pathogenicity and phylogeny based on restriction fragment length polymorphism in Leptosphaeria maculans. Mol. Plant-Microbe Interact. 4, 341–349;

42 50. Kuusk A.-K , Happstadius I. , Zhou L. , Steventon L. A., Giese H. and Dixelius C. , 2002,

Presence of Leptosphaeria maculans Group A and Group B Isolates in Sweden, Journal of Phytopathology ,Volume 150, Issue 6, Pages 349-356; 51. Leclair, S., Ansan-Melayah, D., Rouxel, T. and Balesdent, M. 1996. Meiotic behaviour of the minichromosome in the phytopathogenic ascomycete Leptosphaeria maculans. Current Genetics 30: 541 – 548; 52. Mahuku G. S., Goodwin P.H., Hall R. 1995, A competitive polynerase chain reaction to quantify DNA of Leptosphaeria maculans during blackleg development in oilseed rape. Molecular Plant- Microbe Interactions 8: 761-767; 53. Mahuku G.S., Goodwin P.H., Hall R., Hsiang T.,1997, Variability in the highly virulent type of Leptosphaeria maculans within and beween oilseed rape fields. Can J Bot 75: 1485-1492; 54. McDonald B.A, Linde C., 2002. Pathogen population genetics, evolutionary potential, and durable resistance. Annu Rev Phytopathol 40:349–379; 55. McGee D. C. and Petrie G. A., 1978. Variability of Leptosphaeria maculans in relation to blackleg of oilseed rape. Phytopathology 68: 625-630; 56. Mengistu, A., S. R. Rimmer, E. Koch, P. H. Williams, 1991. Pathogenicity grouping of isolates of Leptosphaeria maculans on Brassica napus cultivars and their disease reaction profiles on rapid-cycling brassicas. Plant Dis. 75, 1279–1282; 57. Moreno-Rico O; Frias-Trevino A G; Luna-Ruiz J J; Manzano-Flores D E; Romero-Cova S; Seguin-Swartz G (2001). Characterization and pathogenicity of isolates of Leptosphaeria maculans from Aguascalientes and Zacatecas, Mexico. Canadian Journal of Plant Pathology 23, 270-278; 58. Müller E., 1953, Kultuversuche Mit Ascomyceten. I. Sydowia, 7, 325–334; 59. Müller E. and Tomasevic M., 1957 Kultuversuche mit einigen Arten der Gattung Leptosphaeria Ces. et Not. Phytopathol Z. 29, 287–294; 60. Nei M., Li W. H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1979, 76, p. 5269-5273; 61. Penaud A., Jain L., Poisson B., Balesdent M., Pérès A., 1999. Structure of populations

Leptosphaeria maculans in France. Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress, 1999. Canberra, Australia. http://www.regional.org.aug/papers/index.htm ; 62. Punithalingam E. and Holliday P., 1972, Leptosphaeria maculans. CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria. No. 331;

43 63. Pongam P.,Osborn T.C., Williams P.H.,1998, Genetic analysis and identification of amplified fragment length polymorphism markers linked to the alm1 avirulence gene of Leptosphaeria

maculans. Phytopatology; 64. Pongam P., Osborn T.C. and Williams P.H. 1999, Assessment of genetic variation among Leptosphaeria maculans isolates using pathogenicity data and AFLP analysis. Plant Disease 83:

149 – 154; 65. Purwantara A., Barrins M. J., Cozijnsen J. A., Ades K. P and Howle J. B., 2000, Genetic diversity of isolates of the Lepthosphaeria maculans spieces complex from Astralia, Europe and North America using AFLP analysis. Mycol. Res. 104 (7) 772-781; 66. Rau D., Maier F., Papa R., Brown A et all., 2005. Isolation and characterization of the mating- type locus of the barley pathogen Pyrenophora teres and frequencies of mating-type idiomorphs

within and among fungal populations collected from barley landraces. NRC Research Press Web site: http://genome.nrc.ca on ; 67. Rohlf F. J., 1993. NTSYS-pc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.0. Setauket, NY, Exeter Software, Applied Biostatistics Inc; 68. Rouxel T, Gall C and Balesdent MH (1994) Du polymorphisme au complexe d‟espèces: combien d‟agents pathogènes sont impliqués dans la nécrose du collet du colza? Agronomie 14: 413–432; 69. Rouxel, T., Mendes-Pereira, E., Brun, H., and Balesdent, M. H. 2004. Species complex of fungal phytopathogens: Leptosphaeria maculans-L. biglobosa case study. Pages 33-75 in: Plant Genome: Biodiversity and Evolution, vol. 2, Pt. A: Lower groups. A. K. Sharma and A. Sharma, eds. Science Publisher, Enfield, NH; 70. Rouxel and Balesdent, 2005, The stem canker (blackleg) fungus, Leptosphaeria maculans,

enters the genomic era, MOLECULAR PLANT PATHOLOGY 6 ( 3 ) , 225–241; 71. Saccardo, P.A. (1883) Sylloge Fungorum, II. Padua; 72. Salisbury, P.A., Ballinger, D.J., Wratten, N., Plummer, K.M. and Howlett, B.J. (1995). Blackleg disease on oilseed Brassica in Australia: a review. Australian Journal of Experimental Agriculture, 35, 665-672; 73. Shoemake R.A., Brun H 2001. The teleomorph of the weakly aggressive segregate of Leptosphaeria maculans .Canadian Journal of Botany 79, 412–419; 74. Sippel D.W. and Hall R.,1995.Glucose phosphate isomerase polymorphism distinguish weakly virulent from highly virulent strains of Leptosphaeria maculans. Can J Plant Pathol 17: 1–94; 75. Szlávik S Z; Jêdryczka M; Kiss I; Lewartowska E; Nagy G 2003. Population structure and pathogenicity grouping of L. maculans isolates from Hungary. Blackleg News, 3-4; 44 76. Taylor J. L., 1993. A sample, sensitive and rapid method for detecting seed contaminated with the highly virulent Leptosphaeria maculans. Applied and Environmental Microbiology 59: 3681-3685; 77. Tulasne, L.R. and Tulasne, C. (1863) Selecta Fungorum Carpologia, 2. Paris: La Presse Impériale; 78. van Belkum A, Quint WGV, de Pauw BE, Melchers WJG and Meis JF, 1993. Typing of Aspergillus species and Aspergillus fumigatus isolates by interrepeat polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 31: 2502–2505; 79. Wang G; West J S; Jêdryczka M 2003. Characterisation of Leptosphaeria maculans /Phoma lingam isolates from the seeds of winter oilseed rape. 2nd International SeedHealth Conference "Healthy seed for healthy crop". 16-18.09.2003, Poznañ. Abstracts,pp. 75-76; 80. West J.S., Kharbanda P.D., Barbetti M.J., Fitt B.D.L. 2001. Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) on oilseed rape in Australia, Canada and Europe // Plant Pathology., 50, p. 10-27; 81. West J. S, Balesdent M. H. Rouxel T, Narcy JP, Huang YJ, Roux J, Steed JM, Fitt BDL, Schmit J, 2002 a, Colonisation of winter oilseed rape tissues by A/Tox+ and B/Tox0 Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) in France and England. Plant Pathol 51:311-321; 82. West JS, Jedryczka M, Leech PK, Dakowska S, Huang YJ, Roux J, Steed JM, Fitt BDL. (2002b) Biology of Leptosphaeria maculans ascospore release in England and Poland. WPRS Bull 25 (2):21-29; 83. West J S, Fitt B. D. L., Jêdryczka M., Karolewski Z.,2005. Evidence for the eastward spread of the aggressive oilseed rape pathogen Leptosphaeria maculans in Europe. Proceedings BCPC Symposium 81 (Introduction and Spread of Invasive Species), 293-294; 84. Williams RH and Fitt BDL (1999) Differentiating A and B groups of Leptosphaeria maculans, causal agent of stem canker (Blackleg) of oilseed rape. Plant Pathol 48: 161–175; 85. Xue B. G., Goodwin P. H and Annis S.L., 1992, Pathotype identification of Leptosphaeria maculans with PCR and oligonucleotide primers from ribosomal internal transcribed spacer sequences.Physiological and Molecular Plant Pathology 41: 179-188; 86. Zhou Y, Fitt BDL, Welham SJ, Gladders P, Sansford CE, West JS, 1999. Effects of severity and timing of stem canker (Leptosphaeria maculans) symptoms on yield of winter oilseed rape (Brassica napus) in the UK. European Journal of Plant Pathology 105, 715±28;

45 DUOMENŲ APROBAVIMAS

Semaškienė R., Brazauskienė I., Gaurilčikienė I., Supronienė S., Statkevičiūtė G., Brazauskas G., Ramanauskienė J., Piliponytė A., Dabkevičius Z. Population analysis of economically important fungi of arable crops in Lithuania // Proceedings of international scientific conference „Good practices in sustainable agriculture“, Sofia, 12-13 November, 2009, p. 270-280

PADĖKA

Nuoširdţiai dėkoju savo darbo vadovui dr. Gintarui Brazauskui, uţ suteiktą galimybę atlikti šį tyrimą LŢI genetikos ir fiziologijos laboratorijoje, ţinias ir visokeriopą pagalbą ruošiant magistrinį baigiamajį darbą, taip pat esu dėkinga visam genetikos ir fiziologijos laboratorijos kolektyvui uţ sudarytą jaukią darbo atmosferą. Esu labai dėkinga dr. Irenai Brazauskienei ir LŢI augalų patologijos ir apsaugos skyriui uţ tiriamosios medţiagos surinkimą ir auginimą. Uţ galimybę atlikti kapiliarinę elektroforezę, dėkoju LSDI sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriui. Asmeniškai noriu padėkoti doktorantei Graţinai Statkevičiūtei, uţ nuoširdţią pagalbą, patarimus ir palaikymą atliekant šį darbą.

47 PRIEDAI 1 priedas Leptosphaeria rūšių nustatymas 2006-2007 metai

2009 metai

51 2 priedas L. maculans poravimosi tipai 2006-2007

54 2009 metai.

55 3 Priedas Bendra rezultatų lentelė. Izoliato nr. Rūšis Poravimosi tipas 06-01 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT 1-2 3 L. maculans MAT 1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT 1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-2 06-02 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT 1-1 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT 1-1 8 L. maculans MAT 1-1 9 L. maculans MAT 1-1 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT1-2 06-03 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT 1-1 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT1-2 06-06 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT 1-1

56 10 L. maculans MAT1-2 11 L. maculans MAT1-2 06-07 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT 1-1 06-08 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT 1-1 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-2 06-09 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT 1-1 4 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT 1-1 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT 1-2 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT 1-1 12 L. maculans MAT 1-1 13 L. maculans MAT1-2 14 L. maculans MAT 1-1 06-10 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT 1-1 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT 1-1 7 L. maculans MAT 1-1 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT 1-1 12 L. maculans MAT 1-1

57 13 L. maculans MAT 1-1 14 L. maculans MAT1-2 15 L. maculans MAT1-2 16 L. maculans MAT 1-1 17 L. maculans MAT1-2 18 L. maculans MAT1-2 19 L. maculans MAT 1-1 20 L. maculans MAT 1-1 21 L. maculans MAT1-2 22 L. maculans MAT 1-1 23 L. maculans MAT1-2 24 L. maculans MAT 1-1 25 L. maculans MAT 1-1 26 L. maculans MAT 1-1 27 L. maculans MAT 1-1 28 L. maculans MAT 1-1 29 L. maculans MAT 1-1 30 L. maculans MAT1-2 06-11 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT 1-1 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT1-2 07-16 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT 1-1 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT 1-1 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT 1-1 12 L. maculans MAT1-2 07-19 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT 1-1 4 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT 1-1 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT 1-1 07-21 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT 1-1

58 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT 1-1 7 L. maculans MAT 1-1 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-2 11 L. maculans MAT 1-1 07-22 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT 1-1 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT1-2 13 L. maculans MAT 1-1 07-23 1 L. maculans MAT 1-1/ MAT 1-2 2 L. maculans MAT 1-1/ MAT 1-2 3 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT 1-1 10 L. maculans MAT1-2 12 L. maculans MAT 1-1 13 L. maculans MAT 1-1 07-25 1 L. maculans MAT1-1 2 L. maculans MAT1-1 4 L. maculans MAT1-1 5 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-1 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-2 11 L. maculans MAT1-2 12 L. maculans MAT1-1 13 L. maculans MAT1-1 14 L. maculans MAT1-2 15 L. maculans MAT1-1 16 L. maculans MAT1-1

59 17 L. maculans MAT1-1 07-26 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT 1-1 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT 1-1 8 L. maculans MAT 1-1 9 L. maculans MAT 1-1 10 L. maculans MAT 1-1 11 L. maculans MAT 1-1 12 L. maculans MAT1-2 07-27 1 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT 1-1/ MAT 1-2 4 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT 1-1 10 L. maculans MAT 1-1 07-28 1 L. maculans MAT 1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT 1-1 4 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT 1-1 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-2 11 L. maculans MAT1-2 12 L. maculans MAT 1-1/ MAT 1-2 13 L. maculans MAT1-2 14 L. maculans MAT1-2 07-38 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1 5 L. maculans MAT 1-1 6 L. maculans MAT1-2 7 L. maculans MAT 1-1 8 L. maculans MAT 1-1

60 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-2 11 L. maculans MAT1-2 12 L. maculans MAT1-2 13 L. maculans MAT 1-1 14 L. maculans MAT 1-1 15 L. maculans MAT1-1 16 L. maculans MAT1-2 17 L. maculans MAT 1-1 18 L. maculans MAT 1-1 19 L. maculans MAT1-2 20 L. maculans MAT 1-1 21 L. maculans MAT1-2 22 L. maculans MAT1-2 23 L. maculans MAT 1-1 24 L. maculans MAT 1-1 25 L. maculans MAT 1-1 26 L. maculans MAT1-2 27 L. maculans MAT1-2 28 L. maculans MAT1-2 29 L. maculans MAT1-2 30 L. maculans MAT 1-1 31 L. maculans MAT 1-1 32 L. maculans MAT 1-1 07-40 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT 1-1 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT 1-1

2009 metai Izoliato nr. Rūšis Poravimosi tipas VA 09 1 L. biglobosa 2 L. biglobosa 3 L. biglobosa 4 L. biglobosa 5 L. biglobosa 6 L. biglobosa 7 L. biglobosa 8 L. biglobosa 9 L. biglobosa 10 L. biglobosa 11 L. biglobosa 12 L. biglobosa 13 L. biglobosa 14 L. biglobosa 15 L. biglobosa 61 16 L. biglobosa 17 L. biglobosa 18 L. biglobosa 19 L. biglobosa 20 L. biglobosa 21 L. biglobosa 22 L. biglobosa 23 L. biglobosa 24 L. biglobosa 25 L. biglobosa 26 L. biglobosa 27 L. biglobosa 28 L. biglobosa 29 L. biglobosa 30 L. biglobosa 31 L. biglobosa 32 L. biglobosa 33 L. biglobosa 34 L. biglobosa 35 L. biglobosa 36 L. biglobosa 37 L. biglobosa 38 L. biglobosa 39 L. biglobosa 40 L. biglobosa 41 L. biglobosa 42 L. biglobosa KED 09 1 L. maculans MAT1-1 2 L. maculans MAT1-1/ MAT1-2 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT1-1 5 L. maculans MAT1-1 6 L. maculans MAT1-1/ MAT1-2 7 L. maculans MAT1-2 8 L. maculans MAT1-1 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-2 11 L. maculans MAT1-1 12 L. maculans MAT1-2 13 L. maculans MAT1-2 14 L. maculans MAT1-1 15 L. maculans MAT1-1 16 L. maculans - 17 L. maculans MAT1-1 19 L. maculans MAT1-1 20 L. maculans MAT1-2 21 L. maculans MAT1-2

62 22 L. maculans MAT1-1 23 L. maculans MAT1-1 24 L. maculans MAT1-1/ MAT1-2 25 L. maculans MAT1-1/ MAT1-2 26 L. maculans MAT1-1 27 L. maculans MAT1-2 28 L. maculans MAT1-1 29 L. maculans MAT1-2 30 L. maculans MAT1-1 31 L. maculans MAT1-2 32 L. maculans MAT1-2 33 L. maculans - 34 L. maculans MAT1-1 35 L. maculans MAT1-2 36 L. maculans MAT1-1 ŠL 09 (apačia) 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT1-1 3 L. biglobosa 4 L. maculans MAT1-1 5 L. maculans MAT1-1 6 L. maculans MAT1-1 7 L. maculans MAT1-1 8 L. maculans MAT1-2 9 L. maculans MAT1-1 10 L. maculans MAT1-1 11 L. maculans MAT1-2 12 L. biglobosa 13 L. biglobosa 14 L. biglobosa 15 L. biglobosa 17 L. maculans MAT1-1 18 L. maculans MAT1-1 19 L. maculans MAT1-2 20 L. maculans MAT1-2 21 L. maculans MAT1-2 22 L. biglobosa 23 L. maculans MAT1-2 24 L. maculans MAT1-2 25 L. maculans MAT1-2 26 L. maculans MAT1-2 27 L. maculans MAT1-1 28 L. maculans MAT1-1 29 L. maculans MAT1-1 30 L. maculans MAT1-1 31 L. maculans MAT1-1 32 L. biglobosa 33 L. biglobosa

63 34 L. biglobosa 35 L. biglobosa 36 L. biglobosa 37 L. biglobosa ŠL 09 (viršus) 1 L. maculans MAT1-2 2 L. maculans MAT1-1 3 L. maculans MAT1-2 4 L. maculans MAT1-2 5 L. maculans MAT1-2 6 L. maculans MAT1-1 7 L. maculans MAT1-1 8 L. maculans MAT1-1 9 L. maculans MAT1-2 10 L. maculans MAT1-1 11 L. maculans MAT1-1 12 L. biglobosa 13 L. maculans MAT1-2 14 L. maculans MAT1-1/ MAT1-2 15 L. maculans MAT1-1 16 L. maculans MAT1-1 17 L. maculans MAT1-2 18 L. biglobosa 19 L. maculans MAT1-2 20 L. maculans MAT1-2 21 L. maculans MAT1-2 22 L. maculans MAT1-1 23 L. maculans MAT1-1 24 L. maculans MAT1-2 25 L. maculans MAT1-1 26 L. maculans MAT1-2 LAT 09 1 L. maculans MAT1-1 2 L. maculans MAT1-2 3 L. maculans MAT1-1 4 L. maculans MAT1-1 5 L. maculans MAT1-1 LAT 09 (vp) 1 L. maculans MAT1-1 2 L. maculans MAT1-1 3 L. maculans MAT1-1 4 L. maculans MAT1-1 5 L. maculans MAT1-1 6 L. maculans MAT1-1 7 L. maculans MAT1-1 8 L. maculans MAT1-1 9 L. maculans MAT1-1 10 L. maculans MAT1-1

64 11 L. maculans MAT1-1 12 L. maculans MAT1-1 13 L. maculans MAT1-1 14 L. maculans MAT1-1 15 L. maculans MAT1-1 16 L. maculans MAT1-1 17 L. maculans MAT1-1 18 L. maculans MAT1-1 19 L. maculans MAT1-1 20 L. maculans MAT1-1 21 L. maculans MAT1-1 22 L. maculans MAT1-1 23 L. maculans MAT1-1 24 L. maculans - 25 L. maculans MAT1-1 26 L. maculans MAT1-1 27 L. maculans MAT1-1 28 L. maculans MAT1-1 29 L. maculans MAT1-1 30 L. maculans MAT1-1 31 L. maculans MAT1-1 32 L. maculans MAT1-1 33 L. maculans - 34 L. maculans MAT1-1 35 L. maculans - 37 L. biglobosa 38 L. biglobosa 39 L. maculans MAT1-1 40 L. maculans MAT1-1 41 L. biglobosa