Contaminación por metales pesados en ciervo y jabalí de la zona minera de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia y sus efectos sobre el estrés oxidativo y la calidad seminal del ciervo
Memoria presentada por Manuel M. Reglero Álvarez para optar al grado de doctor por la Universidad de Castilla La Mancha
VºBº de los Directores
Dr. Rafael Mateo Soria Dr. Mark A. Taggart
Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos IREC (CSIC – UCLM – JCCM)
UNIVERSIDAD DE CASTILLA LA MANCHA DEPARTAMENTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA AGROFORESTAL Y GENÉTICA
ÍNDICE
ESTRUCTURA ...... 1
INTRODUCCIÓN ...... 3 1. Minería y contaminación ambiental por metales ...... 3 1.1. El distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia como caso de estudio ...... 4 2. Exposición por metales en ungulados silvestres ...... 7 2.1. Absorción, acumulación y efectos tóxicos...... 9 3. Metales, estrés oxidativo y reproducción ...... 18 3.1. El sistema reproductivo: diana de la toxicidad de los metales por estrés ...... 23 4. Contaminación por metales y seguridad alimentaria ...... 24 Referencias ...... 29 OBJETIVOS ...... 38
CAPÍTULO 1. Transfer of metals to plants and red deer in an old lead mining area in Spain ...... 39 RESUMEN ...... 40 ABSTRACT ...... 41 1. Introduction ...... 42 2. Materials and methods ...... 43 2.1. Study area ...... 43 2.2. Sampling ...... 44 2.3. Laboratory analysis ...... 45 2.4. Statistical analysis ...... 46 3. Results ...... 47 3.1. Metal levels and relationships in soil, sediment and water ...... 47 3.2. Metal levels and relationships in plants ...... 49 3.3. Metal levels and relationships in red deer tissues ...... 52 3.4. Relationship between metal concentrations in substrate, plants and deer tissues ...... 52 4. Discussion ...... 53 4.1. Metal levels in substrates and plants ...... 53 4.2. Metal levels in deer tissues ...... 56
5. Conclusions ...... 57 Acknowledgments ...... 58 References ...... 58
CAPÍTULO 2. Heavy metal exposure in large game from a lead mining area: Effects on oxidative stress and fatty acid composition in liver .... 62 RESUMEN ...... 63 ABSTRACT ...... 64 1. Introduction ...... 65 2. Materials and methods ...... 66 2.1. Study area ...... 66 2.2. Sampling ...... 67 2.3. Elemental analysis ...... 68 2.4. Analysis of oxidative stress biomarkers ...... 69 2.5. Fatty acid analysis ...... 70 2.6. Statistical analysis ...... 71 3. Results ...... 71 4. Discussion ...... 75 4.1. Interpreting metal levels in red deer and wild boar tissues ...... 77 4.2. Oxidative stress or GSH depletion? ...... 78 4.3. Changes in fatty acid composition ...... 79 5. Conclusions ...... 79 Acknowledgments ...... 80 References ...... 80
CAPÍTULO 3. Reduced sperm quality in relation to osxidative stress in red deer from a lead mining area ...... 84 RESUMEN ...... 85 ABSTRACT ...... 86 1. Introduction ...... 87 2. Materials and methods ...... 88 2.1. Study area ...... 88 2.2. Sampling ...... 88 2.3. Sperm quality measurements ...... 90 2.4. Analysis of oxidative stress biomarkers ...... 90 2.5. Elemental analysis ...... 90 2.6. Statistical analysis ...... 91
3. Results ...... 91 3.1. Differences between mining and control areas ...... 91 3.2. Relationships between element concentrations, sperm quality and oxidative stress biomarkers ...... 93 4. Discussion ...... 95 5. Conclusions ...... 98 Acknowledgments ...... 98 References ...... 98
CAPÍTULO 4. Should legislation regarding maximum Pb and Cd levels in human food also cover large game meat? ...... 102 RESUMEN ...... 103 ABSTRACT ...... 104 1. Introduction ...... 105 2. Materials and methods ...... 106 2.1. Study area ...... 106 2.2. Sampling ...... 106 2.3. Elemental analysis ...... 108 2.4. Statistical analysis ...... 108 3. Results ...... 109 4. Discussion ...... 110 4.1. Differences noted between mined and control areas, species, and age class ...... 112 4.2. Implications of data for human consumption ...... 113 Acknowledgments ...... 119 References ...... 119
DISCUSIÓN GENERAL ...... 124 Metales en suelos, sedimentos, aguas, y su trasferencia a plantas ...... 126 Niveles de metales en hígado y hueso de ciervo y jabalí ...... 129 Efectos sobre el estrés oxidativo y la composición de ácidos grasos a nivel hepático ..... 131 Reducción de la calidad espermática del ciervo y su relación con el estrés oxidativo ..... 133 Metales en carne de ciervo y jabalí: implicaciones de salud pública derivadas de su consumo ...... 135 Recomendaciones para reducir la exposición al Pb en el área de estudio ...... 138 Referencias ...... 140 CONCLUSIONES ...... 145
ESTRUCTURA
Los contenidos de esta tesis doctoral se han organizado siguiendo el esquema clásico establecido para la presentación de textos científicos. Comienza con una Introducción general , en la se aborda el contexto en el que han sido desarrollados los diferentes estudios de que consta la tesis. Expuesta la información básica introductoria, se definen los Objetivos que se plantearon con cada trabajo. A continuación se afrontan los cuatro Capítulos que constituyen el grueso de esta memoria. Se presentan tal y como fueron originariamente publicados en revistas científicas de prestigio internacional. El trabajo de tesis finaliza con una Discusión general , en la que se trata de ofrecer una visión global de los resultados obtenidos, y con las Conclusiones que se extraen de los hallazgos más destacados.
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INTRODUCCIÓN
1. MINERÍA Y CONTAMINACIÓN AMBIENTAL POR METALES
La minería se encuentra entre las actividades que generan un mayor impacto ambiental en todas sus fases de desarrollo, desde los procesos relacionados con la extracción de los metales y minerales hasta las actividades relacionadas con el tratamiento de las materias primas extraídas (Dybowska y col., 2006). De forma general, cualquier actividad minera conlleva la trasformación y/o destrucción de los espacios naturales circundantes, lo que está asociado irremediablemente a la pérdida de hábitats y al empobrecimiento o desaparición de las comunidades vegetales y animales que subsisten, no sólo en los terrenos directamente afectados sino también en las inmediaciones. Sin embargo, en el caso de la minería metálica (aquella centrada en la extracción y tratamiento de depósitos metalíferos) los impactos más nocivos se derivan de la introducción de elevadas concentraciones de metales en los ecosistemas (Higueras y col., 2012). La erosión eólica e hídrica de los residuos sólidos generados y almacenados en el medio ambiente (Csavina y col., 2012; Kostarelos y col., 2015), así como las emisiones de los hornos de fundición durante los periodos de actividad, conllevan la introducción de estos metales en las cadenas tróficas, lo que puede tener consecuencias para la conservación de los ecosistemas naturales y un riesgo de exposición para el hombre y la fauna, especialmente cuando metales altamente tóxicos como el plomo (Pb), el cadmio (Cd), y el arsénico (As) están involucrados (Li, 2006).
Para este tipo de minería, los problemas medioambientales asociados no desaparecen con el fin de las actividades de explotación o con el cierre de las concesiones. Si los residuos mineros que se generan durante los periodos de actividad no son adecuadamente tratados y eliminados, tienen la potencialidad de persistir largos periodos de tiempo, convirtiéndose en focos localizados de contaminación ambiental a largo plazo (Jacob y Otte, 2004). En la actualidad, las actividades relacionadas con la minería metálica se desarrollan bajo el amparo de un amplio compendio de normas y leyes que velan porque los impactos ambientales asociados a estas actividades sean lo más reducidos posible. Por ejemplo, las
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concesiones mineras son constantemente sometidas a inspecciones en las que se asegura el cumplimiento de la normativa en materia de emisiones contaminantes y generación y tratamiento de residuos sólidos, y el empleo de los medios tecnológicos más eficientes para reducir en la medida de lo posible la producción de emisiones contaminantes. Las obligaciones para con el medio ambiente que establece la ley perduran tras el cierre de las explotaciones, ya que las concesiones mineras están obligadas a implantar un proceso de restauración medioambiental sobre los terrenos afectados (Johnson y Hallberg, 2005). Dicho proceso suele ir acompañado de estudios de monitorización que aseguran que la contaminación está siendo adecuadamente eliminada gracias a las medidas de restauración o rehabilitación adoptadas, y que las poblaciones vegetales y animales que regresan a los terrenos restaurados no corren riesgos de exposición, limitando de este modo la entrada de la contaminación en los ecosistemas (Kabir y col., 2012).
Sin embargo, las minas y fundiciones que operaron con anterioridad a la segunda mitad del siglo XX lo hicieron mediante el uso de tecnologías y procesos ineficientes, y en ausencia de regulaciones medioambientales (Dybowska y col., 2006). Como consecuencia, los residuos sólidos y las emisiones que produjeron contenían altas concentraciones de metales, y tras el cese de las actividades, los residuos generados, acumulados en los terrenos adyacentes a las explotaciones, fueron abandonadas sin ser sometidos a un proceso de restauración, constituyendo hoy en día potenciales fuentes de contaminación que suponen riesgos para medio ambiente y el ser humano.
1.1. El distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia como caso de estudio
Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, caracterizado por la presencia de extensos montes mediterráneos, es un espacio natural protegido bajo la figura de Parque Natural (Ley 6/2011, de 10 de marzo) que, con una superficie de unas 226.000 hectáreas, se ubica al sur de la provincia de Ciudad Real (Castilla La Mancha) (Figura 1). Se encuentra vinculado a la unidad geográfica de Sierra Morena, caracterizada por la presencia de importantes yacimientos minerales muy ricos en galena argentífera y esfalerita. Por este motivo, toda esta región (Sierra Morena Sierra Madrona Valle de Alcudia) ha estado históricamente vinculada a la minería del Pb y del zinc (Zn) (aunque otros metales – como el cobre (Cu) – también fueron extraídos en menor representación), y ha sido localización de minas importantes a nivel mundial (Palero Fernández y Martín Izard, 2005; Higueras et al., 2012) (Figura 2). La minería en este antiguo distrito minero comenzó en el I Milenio a. C., y desde
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entonces su explotación ha estado sujeta a constantes altibajos motivados por cambios en la demanda en los metales que de estos yacimientos se podían extraer y por los avances en las tecnologías extractivas y de tratamiento de las materias primas (Hevia, 2003).
Fig. 1. Monte Mediterráneo característico de Sierra Madrona y Valle de Alcudia.
Fig. 2. Mapa de la provincia de Ciudad Real en la que se representa el antiguo distrito minero de Sierra Madrona y Valle de Alcudia, que ha servido como área de estudio de los trabajos que componen la tesis (adaptado de Rodríguez Estival y col., 2015).
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En el transcurso del siglo XIX se produce un gran resurgimiento en la explotación minera del Pb a nivel nacional, lo que motivó una repentina regeneración minera en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (Hevia, 2003). Es entonces cuando se ponen en funcionamiento nuevos yacimientos metálicos importantes y comienza una explotación intensiva de los terrenos mineros abiertos décadas y/o siglos posteriores, abandonados en su momento por la falta de medios tecnológicos adecuados que permitieran una explotación rentable. Durante la última década del siglo XIX y la primera del XX tuvo lugar el máximo apogeo de este distrito minero, que se convirtió en el principal productor de plomo de España (Hevia, 2003) (Figura 3). Pero a partir de 1910 comienza una nueva recesión de la minería del Pb a nivel nacional. Tras varias décadas de cambios contantes en los niveles de actividad, en el año 1988 se cierre el último complejo que quedaba en funcionamiento en la zona, y que se considera como la fecha oficial del abandono definitivo de la minería en el distrito minero del Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (Hevia, 2003).
Fig. 3. Minas de Horcajo a principios del siglo XX.
Como resultado de la extensa actividad minera desarrollada en el distrito minero del Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, un total de 484 viejas minas, escombreras y prospecciones mineras quedaron diseminadas por un territorio de 2.500 km 2. (Palero Fernández y Martín Izard, 2005) En España no existió una ley referente a la restauración de terrenos afectados por el desarrollo de actividades mineras hasta finales del siglo XX (Real Decreto 2994/1982, de 15 de octubre), lo que supuso que estos restos de antiguas actividades mineras fueran abandonados sin ser sometidos a un plan de restauración o rehabilitación (Figura 4). Los métodos de extracción y las tecnologías empleadas en el tratamiento de las materias primas eran ineficientes, por lo que los residuos generados durante décadas de intensa actividad podrían contener, aún en la actualidad, elevadas concentraciones de metales que, como el Pb, pueden representar una amenaza para el medio ambiente. Este hecho es de gran relevancia ecotoxicológica, ya que el territorio afectado por los residuos y restos mineros abandonados se encuentra en la actualidad
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dedicado a la explotación cinegética y ganadera (JCCM, 2010), por lo que las afecciones negativas derivadas de este problema medioambiental heredado no sólo podrían afectar al medio ambiente, sino también al ser humano a través del uso de la zona y de los productos (agrícolas, ganaderos, cinegéticos) que aquí se producen.
Figura 4. Castillete y escombrera en Mina de Horcajo (Almodóvar del Campo).
2. EXPOSICIÓN POR METALES EN UNGULADOS SILVESTRES
A medida que los residuos sólidos abandonados envejecen, los sulfuros de que están hechos la inmensa mayoría de yacimientos metalíferos se oxidan, generándose ácido sulfúrico, que acidifica las masas de agua de los alrededores. Estos procesos de oxidación y envejecimiento aumentan la solubilidad y biodisponibilidad de metales para las los seres vivos (Wilson y Pyatt, 2007). El lavado por el agua de lluvia supone la entrada de los metales contaminantes en ríos, arroyos y otros puntos de agua, así como en sus sedimentos, quedando potencialmente accesibles para plantas y animales. Algunas plantas son acumuladoras o hiperacumuladoras de ciertos metales, por lo que pueden ser utilizadas para descontaminar suelos mediante técnicas de fitoextracción (Sun y col., 2005). Sin embargo, la acumulación de altas concentraciones de metales por las plantas puede
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aumentar el riesgo de transferencia a la fauna herbívora y al ganado (Chaney, 1989; Madejón y col., 2002; Taggart y col., 2005). En el caso del Pb, por ejemplo, solo es acumulado de forma importante en la parte aérea de las plantas cuando éstas se encuentran en suelos altamente contaminados por este metal, que es fundamentalmente retenido en las raíces. En este caso, y en lo que a transferencia a los animales herbívoros se refiere, cobra mayor importancia como ruta de exposición para animales que incluyen en su dieta una proporción destacada de raíces y tubérculos (Schley y Roper, 2003).
La absorción de metales a través de las raíces (agua/suelos contaminados) no es la única vía por la que las plantas pueden acumular altas concentraciones de metales. El transporte de partículas finas contaminadas, procedentes de los residuos sólidos abandonados y movidas por el viento, puede significar un aporte importante a la presencia de metales en la parte aérea de las plantas que crecen en las áreas de influencia de la contaminación (Madejón y col., 2002; Wilson y Pyatt, 2007). Así, se podría decir que la ingestión de agua o plantas contaminadas (tanto partes aéreas como subterráneas), la inhalación directa de polvo contaminado, y la ingestión de suelo contaminado (tanto de forma intencionada – algo bastante frecuente en diversas especies de herbívoros – como inadvertida – mientras se alimentan) constituyen las principales vías por las que la fauna silvestre, especialmente los grandes herbívoros, se pueden ver expuestos a la contaminación minera (Beyer y col., 2007; Skerfving y Bergdahl, 2007; Ma, 2011).
Los ungulados silvestres son por tanto considerados buenos bioindicadores de la contaminación ambiental por metales (Wieczorek Dabrowska y col., 2013; Chiari y col., 2015). El ciervo ibérico ( Cervus elaphus ) y el jabalí ( Sus scrofa ) son las especies de ungulados silvestres más abundantes y de más amplia distribución en el área de estudio de los trabajos que componen la presente tesis doctoral (JCCM, 2010). Por otro lado, ambas son especies cinegéticas, lo que permite la recolección de muestras de diversos tejidos con relativa facilidad y en abundancia. Al ser su carne destinada al consumo humano, el estudio de niveles de contaminantes en sus tejidos permite evaluar la potencial transferencia de la contaminación al ser humano (Chiari y col., 2015). Además, las diferencias biológicas, ecológicas y fisiológicas que existen entre ambas especies son de gran interés ecotoxicológico para la realización de evaluaciones de riesgos medioambientales, ya que van a condicionar el potencial de exposición de cada especie a la contaminación y los riesgos sanitarios y de salud pública derivados. Por todo ello, y a efectos de cumplir los objetivos marcados, fueron seleccionadas como especies bioindicadoras idóneas (Figura 5).
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Los niveles de diversos metales y metaloides en tejidos de ambas especies han sido ampliamente estudiados en Europa con el objetivo principal de 1) evaluar la salud de los ecosistemas que habitan en lo que se refiere a la dispersión de la contaminación por metales que se deriva de diferentes actividades antropogénicas, principalmente asociadas a la minería, y de 2) evaluar la calidad de su carne como producto destinado al consumo por parte del hombre. En las Tablas 1 y 2 se ofrece una revisión de los niveles de diferentes metales y metaloides (aquellos en los que nos hemos centrado en los trabajos que componen la presente tesis) en hígado, riñón, hueso y músculo, ya que como veremos más adelante, estos tejidos son los más adecuados para evaluar la exposición ambiental de la fauna a estos elementos y la ocurrencia potencial de efectos tóxicos asociados con los niveles de exposición, así como para estimar el riesgo de transferencia a las cadenas tróficas (incluido el ser humano) a través de su consumo.
Fig. 5. Representación esquemática del potencial transporte de contaminantes en las cadenas tróficas que se puede originar como consecuencia de residuos mineros abandonados.
2.1. Absorción, acumulación y efectos tóxicos
Muchos metales y metaloides, como el cobre (Cu), en zinc (Zn) y el selenio (Se) son esenciales para diversas funciones biológicas dentro de ciertos rangos de concentración. Valores por debajo de esos rangos pueden ocasionar deficiencias, mientras que concentraciones por encima de los niveles adecuados pueden llegar a ser tóxicas, en ambos casos teniendo consecuencias adversas para la salud. Otros elementos, como los ya
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mencionados Pb, Cd y As no desempeñan ninguna función biológica, y son conocidos por su elevada toxicidad (Dudka y Miller, 1999). Las interacciones que se producen entre estos y otros elementos son sólo conocidas parcialmente (los elementos tóxicos pueden competir con los esenciales, interfiriendo en la función que éstos desempeñan en el organismo; y viceversa, algunos elementos esenciales pueden alterar la toxicidad de los metales tóxicos interfiriendo en su absorción, excreción, y metabolismo), pero su ocurrencia en los tejidos animales condiciona el carácter de las relaciones dosis efecto y dosis respuesta, influyendo en la identificación de niveles saludables y tóxicos (Nordberg y col., 2007).
Una vez que los metales y metaloides alcanzan el tracto gastrointestinal (asumiendo que la ingestión de agua, comida y suelo contaminados constituyen las principales vías de exposición a la contaminación minera para la fauna silvestre expuesta), una proporción de la cantidad ingerida es absorbida y pasa al torrente sanguíneo (Goyer y Clarkson, 2001; Beckett y col., 2007). Existen multitud de factores que influyen sobre la tasa de absorción de los diferentes elementos, tanto tóxicos como esenciales, pudiendo destacarse diversos factores relacionados con la forma química que se ingiere (Kendall y col. , 2001), el estado nutricional y las características de la dieta (Suttle, 2010) y la edad (Patrick, 2006; Apostoli y col., 2007). A través de la circulación sanguínea, los metales y metaloides son distribuidos a sus órganos y tejidos diana. El hígado y el riñón destacan entre los tejidos blandos en lo que se refiere a la acumulación, metabolismo (biotransformación y detoxificación) y excreción de la inmensa mayoría de los elementos. Para metales como el Pb, debemos añadir la importancia del tejido óseo como reservorio, ya que son los huesos los que más Pb acumulan (hasta un 90% de contenido corporal) y donde éste metal puede ser acumulado durante más tiempo (del orden de años o incluso décadas), hasta el punto de que los huesos pueden constituir una importante fuente interna de exposición a este metal tóxico (Rozman y Klaassen, 2001). En el caso de los metales tóxicos (o del exceso de elementos esenciales – concentraciones tóxicas), la mayoría va siendo progresivamente eliminado de la circulación sistémica por vía renal (orina) y gastrointestinal (heces), siendo el resto distribuido por los distintos sistemas fisiológicos, donde causan sus efectos tóxicos (Goyer y Clarkson, 2001). La mayoría de los metales y metaloides, como los estudiados en los diferentes trabajos de que consta la presente tesis doctoral (Pb, Cd, As, Cu, Se, Zn), se caracterizan por su persistencia y carácter acumulativo (Goyer y Clarkson, 2001; Hoffman y col., 2001). La US Agency for Toxic Substances and Disease Registry, en su lista de “contaminantes prioritarios”, ha incluido un total de 13 metales y metaloides, entre los que se encuentran el As (primero), el Pb (segundo), el Cd (séptimo), y otros de menor riesgo como el Se (posición 145) y el Zn (posición 75) (ATSRD, 2013).
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Tabla 1 a. Concentraciones ( g/g; peso fresco) de Pb, Cd, Cu, Zn y Se (medias (rangos), a no ser que se indique otra cosa) en hígado (H), riñón (R) y músculo (M) de ciervos ( Cervus elaphus ) en Europa. No se incluyen datos para As ya que las escasas referencias encontradas obtienen valores por debajo del límite de detección para este elemento.
Ciervo común (Cervus elaphus) Naturaleza País de zona Tejido (n) Cd Pb Cu Zn Se Referencia muestreada M (134) 0.01 2.04 Italia REF H (201) 0.07 0.42 Chiari y col., 2015 R (152) 1.02 0.24 M (20) 0.06 (0.01 0.13) 0.05 (0.003 0.39) 3.06 (1.78 6.11) 41.67 (24.17 80.56) 0.04 (0.01 0.10) Jarzyń'ska y Polonia REF H (20) 0.22 (0.07 0.59) 0.05 (0.02 0.14) 18.44 (3.75 39.06) 31.25 (20.63 46.88) 0.06 (0.02 0.13) Falandysz, 2011 † R (20) 2.55 (0.47 5.96) 0.06 (0.02 0.28) 4.47 (2.13 5.74) 27.66 (21.28 36.17) 0.85 (0.60 1.09) M (45) 0.04 (0.004 0.32) 0.18 (0.05 1.74) Croacia REF H (45) 0.16 (0.01 0.38) 0.09 (0.05 0.39) Bilandžić y col., 2009 R (45) 1.80 (0,11 3,91) 0.14 (0.05 1.10) M (48) 0.12 0.15 3.48 43.4 0.53 Croacia REF H (52) 0.18 0.095 14.7 30.0 0.24 Lazarus y col., 2008 R (297) 2.65 0.093 4.84 49.2 1.89 M (82) 0.10 (0.0 0.85) 0.22 (0.01 1.5) 3.3 (1.9 3.4) 39 (19 64) Polonia REF H (82) 0.19 (0.0 0.87) 0.26 (0.05 1.0) 16 (6.4 29) 31 (19 43) Falandysz y col., 2005 R (82) 2.2 (0.03 9.7) 0.31 (0.08 1.3) 5.2 (3.3 7.2) 30 (17 41)
Continuación de Tabla 1.
Naturaleza País de zona Tejido (n) Cd Pb Cu Zn Se Referencia muestreada M (22) 0.23 (0.01 1.32) 6.48 (0.15 104.9) 2.49 (1.19 5.34) 54.76 (17.80 109.12) Eslovaquia REF H (22) 0.26 (0.07 0.87) 1.9 (0.12 28.8) 13.34 (2.89 34.26) 26.24 (20.37 34.1) Gasparik y col., 2004 * R (22) 2.39 (0.32 5.76) 0.56 (0.10 1.30) 4.93 (3.54 8.05) 31.12 (20.9 126.09) H (36) 0.23 (0.08 0.96) 0.72 (0.05 10.41) CONT R (36) 2.39 (0.67 5.48) 0.36 (0.04 2.15) España Santiago y col., 1998 H (24) 0.19 (0.08 0.40) 0.34 (0.10 1.12) REF R (24) 1.9 (0.39 4.22) 0.27 (0.06 0.93) CONT H (28) 0.11 (0.02 0.58) 23.76 (3.31 76.13) 0.11 (0.06 0.21) Rodríguez Estival España y col., 2011b † REF H (26) 0.03 (0.01 0.16) 20.94 (5.60 68.19) 0.10 (0.06 0.19) CONT H (26) 0.13 (0.06 0.54) 12.83 (0.75 54.97) 0.11 (0.03 0.22) Rodríguez Estival España y col., 2013b † REF H (20) 0.04 (0.02 0.42) 14.43 (0.35 48.34) 0.12 (0.05 0.20)
Naturaleza de zona muestreada: REF (zona no afectada por ningún tipo de contaminación antropogénica); CONT (zona afectada por contaminación de origen industrial). † Valores calculado a partir del dato original en peso seco (factores de conversión: 4.7, 3.2 y 3.6 para riñón, hígado y músculo, respectivamente (Lazarus y col., 2008)). * Valor de mediana junto con el rango. a Otros estudios anteriores (1980 2003) ofrecen concentraciones para Pb y Cd en tejidos de ciervos de Alemania, Hungría, Austria, Noruega y Holanda. Estos datos no han sido incluidos en la tabla anterior porque las concentraciones detectadas en estos trabajos, coincidentes con los rangos aquí mostrados, son citadas y conveniente discutidas en las referencias ya proporcionadas en la tabla (Anke y col., 1980; Holm, 1988; Tataruch, 1993; Find’o y col., 1993; Wolkers y col., 1994; Falandysz, 1994; Arnhold y col., 1998; Kottferová y Koréneková, 1998, 2000; Frøslie y col., 2001; Tataruch y Kierdorf, 2003).
Tabla 2 a. Concentraciones ( g/g; peso fresco) de Pb, Cd, Cu, Zn y Se (medias (rangos), a no ser que se indique otra cosa) en hígado (H), riñón (R) y músculo (M) de jabalíes ( Sus scrofa ) en Europa. No se incluyen datos para As ya que las escasas referencias encontradas obtienen valores por debajo del límite de detección para este elemento.
Jabalí ( Sus scrofa ) Naturaleza País de zona Tejido (n) Cd Pb Cu Zn Se Reference muestreada M (1055) 0.02 2.20 Italia REF H (424) 0.67 0.52 Chiari y col., 2015 R (642) 3.72 0.39 M (34) 0.040 (0.008 0.140) 0.046 (0.002 0.092) CONT H (52) 5.57 (0.77 39.6) 0.90 (0.04 6.66) K (52) 49.5 (10 245.5) 1.19 (0.11 6.93) Polonia Durkalec y col., 2015 M (42) 0.004 (0.001 0.022) 0.027 (0.002 0.130) REF H (59) 0.19 (0.03 0.95) 0.08 (0.02 0.96) R (60) 2.11 (0.42 8.16) 0.09 (0.03 0.26) M (94) 0.08 (0.02 1.28) 1.11 (0.05 27.95) Croacia REF H (94) 0.35 (0.02 (1.57) 0.11 (0.05 0.90) Bilandžić y col., 2009 R (94) 4.94 (0.19 18.10) 0.08 (0.05 3.11) M (120) 0.16 1.61 13.48 Eslovaquia REF H (120) 0.55 3.41 28.20 Gasparik y col., 2012 R (120) 3.22 3.80 20.98 M (58) 0.08 (0.03 0.38) 0.13 (0.08 0.23) 12.20 (2.95 25.17) 53.21 (32.61 80.10) Italia REF H (59) 0.09 (0.008 0.38) 0.32 (0.18 0.56) 46.12 (5.51 117.54) 49.76 (27.78 83.16) Amici y col., 2012 R (59) 1.05 (0.02 3.08) 0.30 (0.09 0.44) 5.64 (1.64 13.29) 32.46 (12.92 48.30)
Continuación de Tabla 2.
Naturaleza País de zona Tejido (n) Cd Pb Cu Zn Se Reference muestreada H (21) 0.31 (0.10 0.73) 2.87 (0.12 43.06) CONT R (21) 1.52 (0.40 7.61) 0.68 (0.10 4.34) . España Santiago y col., 1998 H (8) 0.18 (0.07 0.38) 0.54 (0.11 2.68) REF R (8) 1.02 (0.40 1.74) 0.46 (0.16 1.76) CONT H (30) 0.25 (0.05 2.32) 5.94 (0.90 46.0) 0.34 (0.18 0.67) Rodríguez-Estival España REF H (30) 0.08 (0.01 0.52) 6.18 (0.92 46.16) 0.41 (0.14 0.86) y col., 2011b † CONT H (28) 0.21 (0.05 2.32) 2.46 (0.33 46.0) 0.44 (0.10 0.98) Rodríguez-Estival España REF H (19) 0.05 (0.003 0.99) 2.27 (0.37 11.03) 0.58 (0.23 1.11) y col., 2013b †
Naturaleza de zona muestreada: REF (zona no afectada por ningún tipo de contaminación antropogénica); CONT (zona afectada por contaminación de origen industrial). † Valores calculado a partir del dato original en peso seco (factores de conversión: 4.7, 3.2 y 3.6 para riñón, hígado y músculo, respectivamente (Lazarus y col., 2008)). a Otros estudios anteriores (1994 2003) ofrecen concentraciones para Pb y Cd en tejidos de ciervos de Alemania, Hungría, Austria, Noruega y Holanda. Estos datos no han sido incluidos en la tabla anterior porque las concentraciones detectadas en estos trabajos, coincidentes con los rangos aquí mostrados, son citadas y conveniente discutidas en las referencias ya proporcionadas en la tabla (Falandysz, 1994; Wolkers y col., 1994; Launer y col., 1996; Kottferová y Koréneková, 1998, 2000; Frøslie y col., 2001; Tataruch y Kierdorf, 2003).
Los metales tóxicos a cualquier grado de exposición, y los elementos esenciales cuando se encuentran a niveles que exceden los adecuados para el desempeño de sus funciones biológicas, destacan por provocar efectos tóxicos en multitud de sistemas fisiológicos, entre los que destacan los sistemas reproductivo e inmune en los vertebrados, por lo que tienen implicaciones sobre la resistencia a enfermedades y condicionan la supervivencia de las poblaciones expuestas. Algunos de estos metales tienen además propiedades mutagénicas y carcinogénicas (Bal y Kasprzak, 2002; Beyersmann y col., 2008; Bekki y col., 2013). Al igual que ocurría con el grado de absorción, la susceptibilidad a padecer los efectos tóxicos de la exposición a metales y metaloides depende de multitud de factores que condicionan el carácter de las relaciones dosis respuesta, entre los que destacan la composición de la dieta y el estatus nutricional y fisiológico, diversos aspectos intrínsecos como el sexo y la edad, y otros factores determinados genéticamente. Los efectos tóxicos que provocan de forma independiente se ven magnificados en escenarios de coexposición (Patra y col., 2011).
2.2.1. Metales pesados: plomo (Pb), cadmio (Cd) y arsénico (As)
Se trata de 3 de los elementos más tóxicos que se conocen, y ejercen su toxicidad tanto como consecuencia de exposiciones agudas (altas dosis durante cortos periodos de tiempo) como crónicas (bajas dosis durante largos periodos de tiempo). Si hablamos de contaminación ambiental derivada de actividades mineras y de exposición por parte de fauna silvestre, la mayor parte de los casos de exposición y efectos asociados son debidos a exposiciones de carácter crónico. Los 3 elementos tiene la capacidad de biomagnificarse en situaciones de exposiciones prolongadas, lo que facilita su introducción en las cadenas tróficas. Son considerados como disruptores endocrinos, y de esta capacidad para causar desórdenes en glándulas endocrinas y hormonas se derivan algunos de sus efectos más nocivos sobre la salud de los vertebrados (Rana, 2014), y especialmente en su sistema reproductivo (Balabanič y col., 2011). Los efectos tóxicos de estos metales pesados pueden manifestarse mediante alteraciones en multitud de sistemas fisiológicos (Flora, 2002), y el estrés oxidativo, que será abordado en profundidad más adelante, ha sido propuesto como el fenómeno desencadenante de la mayoría de ellos, ya sea de manera directa o indirecta (Patrick, 2006; Jomova y col., 2011; Ventura Lima y col., 2011; Jaishankar y col., 2014; Almeida Lopes y col., 2016).
En el caso del Pb, sus efectos tóxicos más notorios se han observado a nivel del sistema hematopoyético y cardiovascular (anemia, hipertensión) (Alissa y Ferns, 2011), el
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sistema reproductivo (infertilidad, esterilidad, abortos, malformaciones fetales y embrionarias) (Iavicoli y col., 2009), el sistema inmune (trastornos autoinmunes, inmunosupresión) (Mishra, 2009), el sistema nervioso (neuropatías periféricas y encefalopatías) (Patrick, 2006), el sistema óseo (alteraciones en la mineralización de los huesos y sus propiedades biomecánicas) (Flora, 2002), el sistema renal y hepático (metabolismo, anormalidades patológicas) (Mudipalli, 2007), y el digestivo (absorción de nutrientes y trastornos) (Davidson et al , 2007). Además, es un agente genotóxico (Jomova y Valko, 2011), y tiene la capacidad de alterar la absorción y metabolismo de diversos nutrientes esenciales, como el calcio (Ca), el hierro (Fe) y el zinc (Zn) (Davidson et al , 2007). Todos estos efectos adversos potenciales adquieren especial relevancia en humanos, ya que los niños son más propensos a padecerlas y a arrastrar sus consecuencias a lo largo de su vida (Patrick, 2006; Figura 6).
NIÑOS ADULTOS 150 Muerte →
100 ← Encefalopatía Encefalopatía→ ← Anemia Nefropatía → Anemia → ← Disminución de la longevidad Neuropatías periféricas Cólico → 50 ← Síntesis hemoglobina ↓ Infertilidad (hombre) Síntesis hemoglobina ↓ → 40 Nefropatía Presión sangínea sistólica ↑ ← Metabolismo vitamina D ↓ → 30 Agudeza auditiva ↓ ← Protoporfirina eritrocitaria ↑ (hombre ) Velocidad conducción nerviosa ↓ → 20 Protoporfirina eritrocitaria ↑ → ← Protoporfirina eritrocitaria ↑ (mujer) Toxicidad en el desarrollo → IQ ↓ 10 ← Hipertensión Audición ↓ → Plomo Crecimiento ↓ en sangre g/dl
Fig. 6. Efectos adversos asociados con la exposición al Pb en humanos.
El Cd se origina comúnmente como subproducto de la minería del Pb y del Zn, por lo que puede estar ampliamente distribuido en zonas afectadas por las actividades mineras asociadas, dando lugar a casos de coexposición con el Pb (Nordberg y col., 2007). Su toxicidad y los procesos a los que se asocia guardan similitudes con el Pb (Bernhoft, 2013). Destaca su capacidad para generar daños histopatológicos en los tejidos (especialmente los riñones, el hígado, los testículos y los huesos), alteraciones genéticas, y desórdenes en una amplia variedad de rutas y procesos metabólicos en multitud de sistemas (Patra y col., 2011). También compite con diversos elementos esenciales, especialmente el Zn (Moulis, 2010), ha sido asociado a efectos negativos en el sistema inmune, y tiene propiedades carcinogénicas (Bernhoft, 2013). En el sistema reproductivo, el Cd causas procesos de
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infertilidad, disfunciones sexuales, desarrollos anormales, y muertes prematuras, entre otros (Marettová y col., 2015).
Por su parte, el As ha sido clasificado como elemento peligroso sospechoso de provocar procesos carcinógenos principalmente en pulmones y piel (Fowler y col., 2007). Su toxicidad ha sido revelada en multitud de sistemas fisiológicos, aunque su órgano diana por excelencia, el riñón (y los procesos fisiológicos en que éste participa), resulta ser el más afectado (Sun y col., 2014). Las formas inorgánicas de este metaloide resultan ser mucho más tóxicas que las formas orgánicas (Ventura Lima y col., 2011), lo que incrementa el interés por el estudio de este metal en entornos afectados por la contaminación minera. Puede cruzar la barrera placentaria (es un elemento teratogénico), provocando diversas alteraciones durante el desarrollo embrionario y fetal, y está asociado a diversas enfermedades cardiovasculares (Jomova y col., 2011). Es capaz de sustituir a diversos elementos esenciales en los procesos celulares que éstos desempeñan para el correcto funcionamiento de las células (Fowler y col., 2007), y finalmente, ha sido asociado a alteraciones cromosómicas en los procesos de formación de células linfoides, afectando por lo tanto al sistema inmune (Basu y col., 2014). La neuropatía periférica ha sido detectada en diversos casos de exposición crónica a este metal, al igual que diversos desórdenes gastrointestinales y fallos hepáticos (Jomova y col., 2011).
2.2.2. Metales esenciales: cobre (Cu), zinc (Zn) y selenio (Se)
El Cu, como elemento esencial, se encuentra en pequeñas cantidades en prácticamente todos los tejidos y órganos, alcanzando niveles elevados en el hígado, que es órgano principal encargado de su homeostasis (Ellingsen y col., 2007). El Cu actúa como cofactor de múltiples enzimas, en las que desempeña funciones estructurales y catalíticas, estando estas enzimas implicadas en una amplia variedad de procesos biológicos necesarios para el crecimiento y el desarrollo, incluidas funciones antioxidantes (Gaetke y Chow, 2003). Se puede decir que el Cu, el Se y el Zn se encuentran funcionalmente interrelacionados, aunque las interacciones existentes entre ellos pueden conducir, en casos de exposición tóxica, a antagonismos. Por ejemplo, una alta ingestión de Zn estimula la formación de metalotioneínas, lo que previene la absorción de Cu a nivel del intestino, el hígado y el riñón (Gaetke y Chow, 2003). Los niveles de Cu presentes en el hígado varían ampliamente entre las especies, pero también entre las poblaciones dentro de una misma especie, ya que dependen estrechamente de los hábitos alimenticios y de las variaciones en la dieta (Ellingsen y col., 2007). De este modo, los niveles de Cu presentes en el cuerpo son
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regulados mediante reducciones en las tasas de absorción o incremento de las tasas de excreción (cuando es ingerido en exceso), siendo raros los casos de toxicidad aguda o crónica (Suttle, 2010). En casos de exposición tóxica, el Cu afecta principalmente al hígado, ya es que el principal reservorio de este metal. Su toxicidad se manifiesta a través del desarrollo de diversos desórdenes, como la cirrosis, necrosis hepática, la generación de daños en los túbulos renales, efectos en el cerebro y otros órganos (Ellingsen y col., 2007). También se ha asociado al desarrollo de alteraciones gastrointestinales que conducen a episodios de anorexia, y al ser un importante componente de proteínas neuronales, ha sido asociado a desórdenes neurodegenerativos (Gaetke y col., 2014). Finalmente, alteraciones en la homeostasis del Cu han sido relacionadas con efectos adversos sobre la función reproductiva. Entre los mecanismos propuestos para la aparición de estos efectos destaca la generación de radicales libres y de condiciones de estrés oxidativo. De hecho, una de las consecuencias mejor conocidas de la toxicidad del Cu es la peroxidación lipídica (Gaetke y Chow, 2003; Ellingsen y col., 2007; Gaetke y col., 2014).
El 90% del contenido corporal de zinc se encuentra almacenado en los músculos y los huesos, aunque otros órganos como el hígado y los riñones pueden albergar cantidades importantes, siendo fundamentales en su homeostasis (Plum y col., 2010). No son frecuentes los casos de intoxicación por Zn, ya que como ocurría con el Cu, se trata de un alimento que puede variar ampliamente entre especies y poblaciones en función de diversos factores. Por el contrario, las deficiencias de este micronutriente, que conducen a efectos muy similares a los observados en casos de intoxicación, son más frecuentes. El Zn interacciona con otros elementos, tanto esenciales como tóxicos, lo que puede dar lugar a casos en los que su homeostasis se es alterada, dando lugar a la aparición de efectos adversos para la salud (Plum y col., 2010). En casos de exposición ambiental al Zn, es relativamente frecuente la aparición de síntomas a nivel gastrointestinal. Una exposición al Zn durante largos periodos de tiempo conduce a deficiencias en la homeostasis del Cu, y en consecuencia a la aparición de anemia, lo que, como se ha comentado anteriormente, está relacionado con la competencia que existe entre ambos elementos en los eritrocitos (Plum y col., 2010). Una correcta homeostasis del Zn es esencial para el correcto funcionamiento del sistema inmune (Walker y Black, 2004) y de la función neuronal, siendo un elemento necesario para el correcto funcionamiento de los procesos que regulan la respuesta inmune de las células y la función y desarrollo cerebrales (Sandstead y Au, 2007). Por su papel como cofactor de enzimas antioxidantes, y por su capacidad para interaccionar con otros metales, el estrés oxidativo ha sido propuesto como un mecanismo relevante por el que tanto la deficiencia como el exceso de Zn podría desencadenar sus efectos dañinos para los organismos (Prasad, 2009).
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La actividad biológica del Se en vertebrados es mediada principalmente a través de las selenoproteinas, lo que incluye su contribución en el desempeño de funciones antioxidantes (Högberg y Alexander, 2007). Aparte de su función como parte activa del núcleo de estas proteínas, este micronutriente parece desempeñar otros tipos de funciones, por ejemplo, atenuando (a través de su interacción) la toxicidad de diversos metales tóxicos como el As y el Cd (Zwolak y Zaporowska, 2012). Se trata sin embargo de un elemento controvertido, ya que los rangos de concentraciones fisiológicas que definen deficiencias, esencialidad, y toxicidad son muy estrechos, llegando a ser un elemento tóxico a concentraciones escasamente superiores a las adecuadas para el desempeño de sus funciones biológicas (Högberg y Alexander, 2007) . Se trata de un elemento que es relativamente de fácil absorción a través del tracto gastrointestinal, y que tiene la capacidad de biomagnificarse a través de las cadenas tróficas ( Suttle, 2010) . La exposición crónica al Se ha sido asociada a diversas enfermedades y síndromes en humanos, y en animales, se ha asociado a disminuciones en índices de masa corporal, desórdenes hepáticos, alteraciones en el desarrollo embrionario, infertilidad y otras alteraciones reproductivas (Santolo, 2009; Benko y col., 2012). Es considerado además un elemento teratogénico. Elevadas concentraciones de Se en hígado, riñones ovarios y testículos han sido asociados con alteraciones patológicas (Hamilton y col., 2004; Högberg y Alexander, 2007). Finalmente, su toxicidad ha sido asociada a la generación de radicales libres y a la alteración del estado redox celular, por lo que se trata de un elemento que, en altas dosis de exposición, contribuye a la generación de estrés oxidativo (Hoffman, 2002; Zhang y col., 2013) .
3. METALES , ESTRÉS OXIDATIVO Y REPRODUCCIÓN
Como hemos visto, los metales y metaloides estudiados en la presente tesis doctoral y las anormalidades asociadas a su exposición y/o homeostasis fisiológicas están implicados, directamente y/o indirectamente, a la generación de condiciones de estrés oxidativo, lo que ha sido postulado (y demostrado) como una de las principales vías por las que provocan sus efectos tóxicos en los vertebrados (Jomova y Valko, 2011). El estrés oxidativo es causado por la sobreproducción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS y RNS, respectivamente, por sus siglas en inglés), y los metales contribuyen a ello de diferentes formas: 1) generando directamente ROS/RNS; 2) incrementando la susceptibilidad de las células al daño oxidativo mediante la alteración de los ácidos grasos de las membranas y comprometiendo la integridad de las membranas; 3) disminuyendo la capacidad del sistema de defensas antioxidantes (afectando a los niveles de antioxidantes o a los elementos esenciales de los que depende la actividad de enzimas antioxidantes); 4)
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estimulando la generación de radicales en la reacción de Fenton; y 5) afectando a los sistemas de reparación; 5) mediante la combinación de las formas anteriores (Costantini, 2008; Jomova y Valko, 2011; Birben y col., 2012).
Las ROS y RNS son subproductos naturales de los procesos metabólicos celulares, inestables y altamente reactivos, que tienen la capacidad de oxidar aminoácidos (proteínas), lípidos y ácidos nucleicos (DNA) cuando colisionan con estas moléculas, provocando la pérdida de sus funciones, la muerte celular, y en última instancia daños tisulares (Kohen y Nyska, 2002; Klauning y Kamendulis, 2004; Birben y col., 2012). La actividad de los antioxidantes endógenos (aquellos que producen las propias células) como el glutatión (GSH) y las enzimas glutatión peroxidasa (GPX) y superóxido dismutasa (SOD), y de los exógenos (nutricionales, deben ser adquiridos con la dieta) como las vitaminas A y E, como parte de un sistema antioxidante altamente regulado en el que las acciones de sus componentes están estrechamente interrelacionadas, son críticas para defender a las células y al organismo del daño oxidativo. De hecho, sus actividades y niveles en los tejidos son moduladas en respuesta a la presencia de ROS/RNS, e individualmente, los niveles/actividades de ciertos antioxidantes son regulados en función del estado de otros (Birben y col., 2012). En condiciones normales, los radicales libres son controlados por este sistema antioxidante. Sin embargo, la exposición a metales, especialmente a metales tóxicos como el Pb, alteran el equilibrio redox de las células, y el sistema natural antioxidante puede verse desbordado. En estos casos, los radicales libres que no han sido neutralizados o eliminados colisionan con las biomoléculas de las células, causando daños oxidativos, iniciando la cadena de consecuencias adversas para la salud. De este modo, el estrés oxidativo causado por una exposición ambiental a metales es considerado como un importante mecanismo en la aparición de desórdenes y trastornos en una amplia variedad de sistemas fisiológicos (Kohen y Nyska, 2002).
En los vertebrados, el hígado es un órgano fundamental en la homeostasis del sistema antioxidante, por lo que el estudio de biomarcadores de estrés oxidativo (peroxidación lipídica, niveles de antioxidantes endógenos y exógenos y actividad de enzimas antioxidantes) en este órgano es clave para evaluar el estado antioxidante global de un organismo. Esto es consecuencia de la importancia del hígado en el metabolismo y detoxificación de xenobióticos y sus metabolitos, como los radicales libres (Isaksson, 2010). Por ejemplo, la síntesis de GSH ocurre principalmente en el hígado, que es además el principal sitio de almacenamiento de antioxidantes nutricionales como las vitaminas A y E, y desde aquí, estos antioxidantes son distribuidos por todos los sistemas fisiológicos a través de la circulación sistémica. De este modo, desórdenes en el sistema antioxidante a nivel
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hepático como consecuencia de la exposición a la contaminación por metales pueden suponer alteraciones en otros tejidos y órganos (Birben y col., 2012).
La oxidación de los ácidos grasos de las membranas celulares (peroxidación lipídica) es probablemente el daño oxidativo más importante que conlleva la generación de condiciones de estrés, y por ello, es el biomarcador de efecto más comúnmente estudiado. De hecho, la determinación de subproductos generados en el proceso de peroxidación lipídica, como el malondialdehído (MDA), sirven como biomarcador para evaluar la generación de estrés oxidativo (Catalá, 2009). Se trata de un fenómeno que afecta principalmente a los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) de las membranas biológicas, mucho más susceptibles a la oxidación debido a la presencia de dobles enlaces (Birben y col., 2012), y que consiste en una serie de reacciones en cadena en las que un ácido graso, al oxidarse, se convierte a su vez en un radical (peróxido lipídico, LPO) capaz de oxidar a las moléculas vecinas. Se crean de este modo ciclos de peroxidación que pueden causar daños celulares importantes, ya que los PUFAs son fundamentales para el mantenimiento de las funciones de las membranas (Klauning y Kamendulis, 2004).
El GSH es el tiol no proteico más abundante en las células eucariotas animales (Lu, 2009), es el principal responsable de estado redox celular, y por lo tanto se convierte en uno de los más fiables biomarcadores de estrés oxidativo. En las células, el GSH está presente en dos formas: la reducida y la oxidada (GSSG), de modo que el ratio entre ambas refleja el estado redox. El GSSG es reciclado por enzimas como la GSH reductasa (GR), que lo devuelve a su forma reducida para que pueda seguir ejerciendo sus funciones (Ballatori y col., 2009). Los niveles en que el GSH se presenta en las células están controlados por una compleja red enzimática en la que participan, además de la GR, enzimas como la GPX (Cnubben y col. , 2001). Entre las muchas funciones clave que el GSH desempaña en las células destaca su papel como antioxidante (Lu, 2009), que es desempeñado 1) actuando de forma directa como molécula antioxidante (reaccionando directamente con los radicales libres), 2) haciendo de sustrato de la GPX, 3) sirviendo como fuente de cisteína (que también es un agente antioxidante), 4) regulando el trasporte y metabolismo (detoxificación) de los xenobióticos promotores de condiciones de estrés oxidativo, 5) previniendo la pérdida de tioles proteicos y otros antioxidantes como las vitaminas A y E, y 6) modulando las señales celulares que inducen la generación de antioxidantes en casos de necesidad (Ballatori y col., 2009; Cnubben y col., 2001).
La GPX y la SOD son consideradas como los antioxidantes enzimáticos más destacados del sistema antioxidante. La GPX cataliza la conversión del peróxido de
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hidrógeno (un subproducto del proceso de producción de radicales libres) en agua usando el GSH como sustrato (Cnubben et al., 2001). Se trata de una enzima selenodependiente (aunque también existen formas no dependientes del Se), ya que el Se es esencial como cofactor para su funcionamiento. Por su parte, la SOD capta el radical superóxido para dar lugar a la producción de oxígeno u peróxido de hidrógeno. Elementos esenciales como el Cu, y el Zn son necesarios en el núcleo activo de la enzima para que ésta puede desarrollar su función (Mruk y col., 2002).
Aunque en la presente tesis sólo se abordó el estudio de los antioxidantes endógenos mencionados anteriormente, los componentes nutricionales del sistema antioxidante son igualmente importantes en el estudio de efectos subletales relacionados con la aparición de desequilibrios en el estado redox en casos de exposición a metales tóxicos como el Pb (Rodríguez Estival, 2012). En investigaciones posteriores, desarrolladas en base a los trabajos que aquí se presentan (y que han sido tenidos en cuenta en la Discusión general), el estudio de estos antioxidantes ha aportado datos complementarios relevantes (Rodríguez Estival y col., 2011a, 2011b, 2013a, 2013b) que sustentan los resultados obtenidos. Entre los componentes exógenos del sistema antioxidante destacan las vitaminas A y E. En el caso de la vitamina A, es su forma libre, el retinol el que destaca por su papel como componente del sistema antioxidante de las células. El retinol se forma a partir de sus precursores, los β carotenos presentes en las plantas, para después de absorbido y transportado por el torrente sanguíneo hasta el hígado, donde es almacenado en forma de ésteres. La vitamia A participa además en la regulación del metabolismo de diversas biomoléculas y favorece la actividad de otros componentes del sistema antioxidante (Defo y col., 2014). Se trata además de una vitamina indispensable para los sistemas reproductivos e inmune y para el mantenimiento y desarrollo de diferentes tejidos durante el desarrollo embrionario. Por su parte, la vitamina E (tocoferol) es el principal antioxidante liposoluble que se encuentra en la naturaleza, y es conocido por su habilidad para neutralizar radicales libres y por su papel protector en las membranas biológicas frente al estrés oxidativo, contribuyendo al mantenimiento de su estructura mediante la formación de complejos con ciertos PUFAs, interrumpiendo la peroxidación lipídica (Traber y Atkinson, 2007). La vitamina E contribuye a modular la expresión de genes y los sistemas enzimáticos asociados a las membranas celulares, siendo en definitiva imprescindible para el correcto funcionamiento de los sistemas reproductivo, inmune y nervioso, entre otros (Kefer y col., 2009).
De los diferentes metales estudiados en la presente tesis doctoral, destaca el Pb por su importancia y representación en el problema de contaminación ambiental que suponen
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los restos mineros abandonados en Sierra Madrona y el Valle de Alcuia; y por su toxicidad, en la que la generación de condiciones de estrés oxidativo, incluso a niveles de exposición bajos, es especialmente relevante (Almeida Lopes y col., 2016). Existen múltiples rutas metabólicas por las que el Pb altera el equilibrio redox celular, y de hecho, el estrés oxidativo puede ser tanto una causa como una consecuencia de los efectos tóxicos provocados por el Pb (Gurer y Ercal, 2000). El Pb es conocido por sus efectos tóxicos sobre los componentes de las membranas celulares (especialmente los PUFAs), lo que conlleva un impacto sobre su estructura, integridad y funciones (Gurer y Ercal, 2000; Ahamed y Siddiqui, 2007) y a cambios en la composición de ácidos grasos, que incrementan su vulnerabilidad a la peroxidación lipídica, incrementando la susceptibilidad de las células a padecer más daños oxidativos. El efecto del Pb en el sistema hematológico, derivado de la inhibición de la enzima δ ALAD y de su efecto sobre enzimas relacionadas con la homeostasis de hierro Fe), constituye otra fuente de estrés. Además, el Pb induce la autooxidación de la oxihemoglobina, que constituye una fuente directa de radicales libres (Martínez Haro, 2010). El plomo puede perturbar el metabolismo y/o la función de diversos componentes del sistema antioxidante (Koivula y Eeva, 2010), disminuyendo su eficacia en la lucha contra el estrés oxidativo y comprometiendo su disponibilidad para el desempeño de sus muchas otras funciones, vitales para el correcto funcionamiento de los sistemas fisiológicos (Hsu y Guo, 2002; Almeida Lopes y col., 2016). Las respuestas observadas en la bibliografía científica en los biomarcadores de estrés (peroxidación lipídica, GSH, GPX, SOD) son muy variopintas, lo que obedece a la capacidad del sistema antioxidante para regularse y reaccionar positiva o negativamente, en función de diversos factores, a la amenaza oxidativa que supone la exposición al Pb con el fin de mantener un estado redox celular óptimo (Regoli y col., 2011).
El GSH ha sido identificado como uno de los biomarcadores más sensibles al Pb, ya sea por el efecto directo del metal pesado sobre esta molécula o sobre las enzimas (como la GR y la GPX) que participan en su regulación (Ahamed y Siddiqui, 2007). Esto puede ser debido, por un lado, a la gran afinidad de este metal pesado por los grupos funcionales sulfhidrilo (–SH), abundantes en el GSH. El Pb se une a estos grupos, inhabilitando al GSH para su función antioxidante, pero facilitando su expulsión del organismo a través de la bilis (Skerfving y Bergdahl, 2007). Por otro lado, el GSH reacciona con los radicales libres provocados por la presencia del Pb, oxidándose y convirtiéndose en GSSG, cuyos niveles pueden ser utilizados como un biomarcador de estrés oxidativo mediado por el plomo (Gurer Orhan y col., 2004). Ambas formas de acción conllevan la reducción de los niveles efectivos de GSH en determinadas circunstancias en que el sistema antioxidante, o la homeostasis del GSH, se ven saturadas. Enzimas como la GPX y la SOD dependen de
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varios metales esenciales (como el Se, el Cu, y el Zn) para conservar su estructura y desempeñar sus funciones antioxidantes, por lo que se convierten en dianas indirectas de la toxicidad del Pb, que puede interferir en la homeostasis de estos micronutrientes (Gurer y Ercal, 2000; Patrick, 2006). Finalmente, los antioxidantes exógenos como las vitaminas A (retinol) y E (tocoferol) participan de forma directa en la neutralización de radicales libres en casos de exposición al Pb. Por otro lado, el Pb puede provocar alteraciones en las rutas metabólicas que regulan los niveles tisulares de estos antioxidantes en los diferentes sistemas fisiológicos. En ambos casos, y al igual que ocurría con los antioxidantes endógenos, se han detectado respuestas positivas (incrementos en la movilización/uso que se traducen en un incrementos de su presencia en los tejidos para prevenir la aparición de daños oxidativos) y negativas (disminución de los niveles de vitaminas como consecuencia de una presión excesiva sobre el sistema antioxidante, que se ve desbordado ante la amenaza oxidativa) en función de los factores específicos que deben ser tenidos en cuenta en cada caso concreto (grado de exposición, susceptibilidad, estado nutricional, etc) (Jomova y Valko, 2011; Defo y col., 2014).
3.1. El sistema reproductivo: diana de la toxicidad de los metales por estrés
Entre los sistemas fisiológicos afectados por la exposición a metales, o por la generación de desórdenes en su homeostasis, destaca el sistema reproductivo, que es especialmente vulnerable a la generación de estrés oxidativo (Agarwal y col., 2012). Niveles bajos de ROS son necesarios para optimizar la maduración y función de las células reproductoras, tanto masculinas como femeninas. Por ejemplo, las reacciones acrosómicas, la motilidad, la capacitación espermática, y la fusión de la membrana espermática con la del ovocito son procesos especialmente dependientes de la presencia de ROS. Sin embargo, niveles elevados de radicales libres, provocados por la exposición a contaminantes oxidantes, causan estrés oxidativo e inician la producción de daños, lo que puede conducir a una disminución de la calidad espermática y en consecuencia a una pérdida de la capacidad reproductora (Fujii y col., 2003, 2005; Apostoli y col., 2007). Por otro lado, los espermatozoides anormales o no viables constituyen fuentes adicionales de radicales libres y estimulan los procesos de apoptosis, contribuyendo a alterar el desarrollo y maduración adecuados de los espermatozoides sanos (Vernet y col., 2004). En los ovarios, existe una compleja relación entre antioxidantes y radicales libres, y la homeostasis de esta relación es fundamental en la modulación de la ovulación. De todo ello se extrae que los desequilibrios
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en el estado redox son causa de serios desórdenes en la fundición reproductiva de ambos géneros (Agarwal y col., 2012).
La mayoría de las alteraciones provocadas por los metales tóxicos como el Pb en la reproducción tanto masculina como femenina se han asociado a desequilibrios en el estado redox de los órganos reproductores y/o células reproductoras, que conducen finalmente a disfunciones e infertilidad (Apostoli y col., 2007). De hecho, el mantenimiento de un estado antioxidante óptimo es fundamental para una correcta función reproductiva (Fujii y col., 2003, 2005; Kefer y col., 2009), de modo que alteraciones en los niveles/actividad de los principales componentes del sistema antioxidante ocasionados por la exposición a metales han sido relacionadas con diversas alteraciones en el sistema reproductivo (Sheweita y col., 2005; Defo y col., 2014). Los efectos tóxicos resultantes incluyen desórdenes en las funciones endocrina, testicular y ovárica, efectos adversos sobre la espermatogénesis (disminución del número de espermatozoides, pérdida de motilidad, anormalidades estructurales) y la oogénesis, infertilidad, y función prostática anormal, entre otros. Todos estos problemas, finalmente, se asocian a abortos, malformaciones, nacimientos prematuros y problemas de desarrollo (Thomas y Thomas, 2001). En el género masculino, el estrés oxidativo daña las membranas de los espermatozoides, disminuyendo su motilidad y viabilidad. De hecho, los espermatozoides son especialmente vulnerables a sufrir daños oxidativos debido a su alto contenido en PUFAs de sus membranas (Vernet y col., 2004; Saradha y Mathur, 2006). Por otro lado, metales como el Pb son considerados como disruptores endocrinos debido a su capacidad de provocar alteraciones a nivel hormonal, afectando a las hormonas tiroideas. Estas hormonas son reguladoras clave del desarrollo y función de los órganos reproductores, y alteraciones provocadas por los metales a este nivel han sido asociadas, a su vez, a cambios en parámetros de estrés oxidativo en los órganos reproductores, por lo que contribuyen, además, a la importancia del equilibrio redox para el correcto funcionamiento de la función reproductora (Apostoli y col., 2007). Finalmente, desequilibrios provocados por el Pb o el Cd en la homeostasis de micronutrientes necesarios para una correcta función reproductora (y un óptimo estado redox), como el Cu y/o el Zn, han sido asociados a efectos indirectos de su toxicidad sobre el sistema reproductivo (Castellanos y col., 2010).
4. CONTAMINACIÓN POR METALES Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
Como se ha comentado anteriormente, la gestión cinegética y la caza de ciervos y jabalíes es una de las actividades económicas más importantes en Sierra Madrona y el Valle
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de Alcudia en la actualidad (JCCM, 2010), cuya carne es destinada al consumo humano. Especialmente en regiones con una extensa tradición cinegética, como Castilla La Mancha, la carne que se obtiene de la caza de ciervos y jabalíes es de gran valor para el desarrollo económico de las comunidades locales. Por otro lado, es consumida con cierta regularidad, especialmente por los sectores de la población más ligados a los ámbitos rural y cinegético, aunque su uso se está haciendo progresivamente más extendido como consecuencia de su elevada calidad nutricional y de su imagen de “carne ecológica” (Ramazin y col., 2010; Sales y Kotrba, 2012; Strazdiņa y col., 2013). Por lo tanto, la presencia de metales como el Pb y el Cd en el músculo de estos animales puede ser evaluada desde una perspectiva de salud pública, ya que podría afectar a la idoneidad de su consumo por parte del hombre al implicar un riesgo de transferencia de la contaminación al ser humano.
En este sentido se deben considerar dos potenciales fuentes de contaminación. Por un lado, debemos tener en cuenta que la munición utilizada para la caza de estos animales está hecha de Pb. Las balas utilizadas en caza mayor presentan un núcleo de Pb y una punta blanda generalmente también de plomo. Este diseño permite que al impactar la bala sobre el animal ésta se deforme a medida que avanza por el interior de sus tejidos, aumentando varias veces su sección. Se consigue con ello que ceda gran parte de su energía cinética y le produzca al animal un choque hemodinámico y como consecuencia una muerte rápida. Sin embargo, estas balas expansivas hacen que se deposite gran cantidad de Pb a lo largo de la trayectoria del proyectil, y que en muchas ocasiones la fuerza del impacto haga que parte de la bala se desintegre en multitud de esquirlas minúsculas que pueden alojarse a bastante distancia del trayecto principal (Figura 7). Por este motivo, los tejidos próximos a la zona de impacto presentan niveles altísimos de contaminación por plomo (Hunt y col., 2006, 2009; Tsuji y col., 2009; Green and Pain, 2012; Lindboe y col., 2012; Meltzer y col., 2013). Dobrowolska y Melosik (2008), por ejemplo, encontraron niveles de 1.095,9 g/g y de 736 g/g (peso fresco) en tejidos próximos a la zona de impacto y salida respectivamente. La eliminación de la carne próxima al orificio de entrada y salida de la bala, alrededor de la trayectoria, y de los fragmentos visibles de Pb, aunque pueda reducir el riesgo de exposición a niveles elevados de Pb, no garantiza la inocuidad de la misma ya que se ha demostrado que multitud de fragmentos de Pb indetectables pueden alojarse a gran distancia de la trayectoria del proyectil al desintegrarse éste cuando impacta con huesos o estructuras sólidas del animal (Hunt y col., 2009). En el caso de las especies de caza menor, todo el trayecto de los perdigones de plomo a través de la carne está contaminado con plomo. En definitiva, resulta imposible eliminar por completo la contaminación de la carne por el Pb usado en las municiones (AESAN, 2012).
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Además, se ha observado que la manera de cocinar la carne de caza influye de forma importante sobre la bioaccesibilidad del Pb que contiene. En España, la carne de caza menor es frecuentemente cocinada en escabeche, utilizando vinagre como ingrediente principal. En el caso de la carne de caza mayor, ésta se cocina frecuentemente con vino. El cocinado con vinagre, y en menor medida con vino, aumenta significativamente la bioaccesibilidad del Pb metálico en comparación con otras recetas que no incluían estos ingredientes (Mateo y col., 2007; 2011). Esto puede suponer un mayor riesgo de exposición, especialmente en sectores de la población que basan su dieta en el consumo de carne procedente de animales de caza. Se ha estimado que con tres raciones semanales (unos 200 g) de perdices en escabeche se sobrepasaría la ingesta semanal tolerable de plomo según la Organización Mundial de la Saludos (OMS) (Mateo et al., 2011).
Fig. 7. Radiografías de gamos cazados en las que se aprecia la fragmentación de las balas de plomo (Autor: Oliver Krone).
Debido al uso de munición de Pb, varios estudios han cuestionado si la carne de caza es segura para su consumo por parte del hombre, especialmente ahora que nuestro conocimiento sobre la toxicidad de este metal pesado ha aumentado y que los umbrales de ingesta recomendados han disminuido (Guitart y col., 2002; Guitart y Thomas, 2005; Hunt y col., 2009; EFSA, 2010; Pain y col., 2010; Fachehoun y col., 2015). Diversos estudios demuestran que las personas que consumen con cierta frecuencia carne de caza presentan concentraciones de Pb en sangre significativamente superiores a las que no la consumen (Johansen y col., 2006; Meltzer y col., 2013, y referencias citadas) El Pb procedente de la munición es por lo tanto una fuente importante de contaminación para la carne de caza, y constituye un riesgo para la salud humana. De hecho, la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN) elaboró un informe en 2012 en el que recomendaba evitar
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el consumo de carne procedente de animales cazados con Pb a ciertos sectores sociales especialmente vulnerables, como niños y mujeres embarazadas (AESAN, 2012). Dichas recomendaciones coinciden con las emitidas por otros países en lo que al consumo de carne de caza se refiere ( Meltzer y col., 2013; Fachehoun y col., 2015). De todo esto se desprende que la única forma efectiva de evitar el riesgo de exposición al Pb para los consumidores de carne de caza consiste en utilizar munición alternativa que no contenga este metal tóxico (Mateo y col., 2014).
Por otro lado, la exposición crónica de los animales a la contaminación por metales (especialmente Pb y Cd) que persiste en zonas mineras puede conllevar la acumulación de niveles elevados en el tejido muscular de los animales expuestos (Payne y Livesey, 2010) (Figura 8). Diferentes estudios desarrollados recientemente en Europa se han centrado en el estudio de la presencia de metales tóxicos en la carne procedente de especies de caza mayor como consecuencia de su exposición ambiental a estos contaminantes. Las conclusiones obtenidas en este sentido son bastante variopintas. Los resultados de algunos de estos trabajos indican que la carne de ciervos y jabalíes puede contener niveles no seguros de metales tóxicos como el Pb como consecuencia de su exposición a estos metales en los ecosistemas que habitan, sin que tenga que existir necesariamente un problema de contaminación ambiental por estos metales (Amici y col., 2012; Danieli y col., 2012; Chiari y col., 2015). Es decir, sugieren que, de forma natural, los niveles de metales como el Pb en la carne de las especies de caza mayor acumula niveles de Pb más elevados que los animales criados en granjas, y usando los criterios de seguridad alimentaria considerados para la carne de ganado, los niveles encontrados en caza mayor exceden los límites establecidos. Por otro lado, otros estudios llegan a conclusiones opuestas, y sugieren que especies de caza mayor criadas en hábitats naturales libres de contaminación antropogénica no acumulan niveles de metales tóxicos en su carne que supongan un riesgo para la salud humana derivado de su consumo (Lazarus y col., 2008; Jarzyń'ska y Falandysz, 2011; Desideri y col., 2012). Al parecer, la idoneidad o no de la carne de caza mayor para su consumo por parte del hombre depende estrechamente de las condiciones específicas de las poblaciones cazadas, teniendo unas variabilidades inter e intra específica muy elevadas. Algunos trabajos han estudiado la presencia de metales tóxicos en la carne y/o vísceras de ungulados silvestres procedentes de zonas contaminadas como consecuencia de actividades industriales (Beyer y col., 2007; Wieczorek Dabrowska y col., 2013), y concluyen que la exposición de estos animales a altos niveles de contaminación por metales se traduce en la acumulación de niveles elevados en sus tejidos internos, más elevados que en el caso de animales que habitan zonas no contaminadas. Sin embargo, son muy escasos lo trabajos que han estudiado el incremento de riesgo para la salud pública
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que supone el consumo de la carne de poblaciones de ungulados criados en ambientes contaminados por metales tóxicos como el Pb y/o el Cd debido al desarrollo presente o pasado de actividades industriales (Durkalec y col., 2015, y referencias citadas).
Fig. 8. Ciervo ibérico campeando por una escombrera abandonada en Minas de Horcajo, una de las viejas concesiones mineras destinadas a la extracción y tratamiento de Pb más importantes de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (Autor: Rafael Mateo).
Paradójicamente, y a pesar de la importancia de la presencia del Pb en la carne de caza en lo que a la calidad de su carne y seguridad alimentaria se refiere, tanto debida al uso de munición de Pb como a la potencial exposición de los animales a altos niveles de contaminación ambiental en zonas concretas, en la Unión Europea no existe todavía una regulación específica que contemple criterios de seguridad alimentaria para este tipo de productos cárnicos. Aumentar nuestros conocimientos sobre las potenciales fuentes de la presencia del Pb en la carne de caza y su riesgo para la salud derivada del consumo de su carne son por lo tanto primordiales con el objetivo de proporcionar datos que fomenten avanzar en este sentido.
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OBJETIVOS
El objetivo general que se pretende cumplir con los trabajos que componen la presente tesis doctoral es el de evaluar si los residuos mineros abandonados en los espacios naturales abarcados hoy día por el antiguo distrito minero de Sierra Madrona y Valle de Alcudia constituyen un riesgo para el medio ambiente y la salud de la fauna silvestre expuesta, así como evaluar si existen riesgos asociados de salud pública. Para ello, este objetivo general se dividió en diversos objetivos específicos, que son abordados en los diferentes capítulos de que consta la tesis:
1. Estudiar la presencia de contaminación por metales en varios compartimentos del medio ambiente (suelos, plantas, agua, y sedimentos), y evaluar si una exposición a los niveles detectados puede suponer un riesgo para el medio ambiente y la salud.
2. Determinar el grado de exposición de la fauna silvestre a la contaminación por metales que persiste en las zonas afectadas por la presencia de residuos mineros, usando al ciervo ibérico (Cervus elaphus) y al jabalí (Sus scrofa) como especies bioindicadoras.
3. Evaluar la aparición de efectos subletales asociados a la exposición a la contaminación por metales en el ciervo, mediante el estudio de biomarcadores de estrés oxidativo y el perfil de ácidos grasos en el hígado.
4. Estudiar el potencial efecto de la contaminación por metales sobre la calidad reproductiva del ciervo, a través del análisis de diversos parámetros reproductivos y biomarcadores de estrés oxidativo en testículos y esperma.
5. Determinar, a través de análisis de metales en la carne (músculo) de ciervos y jabalíes abatidos en cacerías celebradas en fincas mineras, el potencial riesgo de salud pública que se deriva del consumo de la carne de las especies cinegéticas que se crían en estos terrenos contaminados.
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CAPÍTULO 1
Transfer of metals to plants and red deer in an old lead mining area in Spain
Reglero MM, Monsálve González L, Taggart MA, Mateo R. 2008. Transfer of metals to plants and red deer in an old lead mining área in Spain . Science of the Total Environment 406, 287 297.
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Transferencia de metales a plantas y al ciervo en una vieja zona minera de plomo en España
RESUMEN
La minería del plomo (Pb) en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, en el sur de España, comenzó en el I Milenio a. C. y continuó de forma intermitente hasta el final del siglo XX. El grado de contaminación por Pb, zinc (Zn), cadmio (Cd), cobre (Cu), arsénico (As) y selenio (Se) de suelos, agua y sedimentos, su transferencia a 13 especies de plantas, y al ciervo ( Cervus elaphus ) han sido estudiados. Las zonas mineras tuvieron mayores concentraciones en los sedimentos que las zonas control. Las concentraciones más elevadas se observaron para Pb (1481 g/g d.w.) y As (1880 g/g) en el sedimento de un arroyo procedente de una escombrera en Minas de Horcajo. Coherentemente, las plantas de las áreas mineras tuvieron niveles más elevados de Pb y As, y sus concentraciones estuvieron correlacionadas. Las mayores concentraciones de Pb estuvieron en las gramíneas (Pb: 97.5, As: 2.4 g/g d.w.) y las menores en las zarzas ( Rubus ulmifolius ). Las concentraciones medias más elevadas en hígado se encontraron en ciervos de la zona minera para Pb (0.805 g/g d.w.), Cd (0.554 g/g), Se (0.327 g/g) y As (0.061 g/g), aunque éstas estuvieron por debajo de los niveles asociados a envenenamientos clínicos.
Palabras clave : Cervus elaphus ; Caza mayor; Cadena trófica; Drenaje ácido; Tejidos vegetales.
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ABSTRACT
Lead mining in the Sierra Madrona mountains and the valley of Alcudia in Southern Spain began in the 1st millennium B.C., and the area was intermittently exploited up until the end of the 20th century. The degree of contamination by Pb, Zn, Cd, Cu, As and Se of soil, water and sediment, and the transfer to 13 species of plants, and then to red deer ( Cervus elaphus ) have been studied. Mined areas had higher concentrations in stream sediments than control areas. The highest concentrations were observed for Pb (1481 g g 1 d.w.) and As (1880 g g 1) in the sediment of a stream flowing beside the spoil dump at Mina de Horcajo. Plants from mining sites contained consistently higher levels of Pb and As, and their concentrations in plants were correlated. The highest concentrations of Pb were in Gramineae (Pb: 97.5, As: 2.4 g g 1 d.w.), and the lowest in elmleaf blackberry (Rubus ulmifolius ). The highest mean liver concentrations were found in red deer from the mining sites for Pb (0.805 g g 1 d. w.), Cd (0.554 g g 1), Se (0.327 g g 1), and As (0.061 g g 1), although these were well below the levels associated with clinical poisoning.
Keywords : Cervus elaphus ; Large game; Food chain; Acid drainage; Plant tissue.
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1. INTRODUCTION
Heavy metal contamination from mining and smelting activities has been studied worldwide in different environmental compartments, including water (Younger, 2001), soil (Álvarez et al., 2003) and biota (Brotheridge et al., 1998; Mateo et al., 2006; Wilson and Pyatt, 2007), and reviewed in several extensive reports (Dudka and Adriano, 1997; Johansen and Asmund, 2001; Johnson and Hallberg, 2005). As is the case in this study, several investigations have looked at the impact of Pb mines (Chukwuma, 1995; Pugh et al., 2002; Beyer et al., 2005; Deng et al., 2006; Li et al., 2006). Metal mining generates large volumes of crushed waste rock (spoil) and tailings with high concentrations of residual heavy metals. In former days such waste was left untreated after mines close, and then continues as a locally important long term, point source of environmental metal contamination (Jacob and Otte, 2004). As spoil weathers, metal sulphides become oxidised and sulphuric acid is generated which can cause acidification of nearby waterbodies. Likewise, this oxidation and weathering process commonly increases both the solubility and bioavailability of many metals for plants inhabiting such areas. Some plants are accumulators or even hyperaccumulators of metals and such species may be used to decontaminate soils by “phytoextraction” (Yanqun et al., 2004; Freitas et al., 2004a; Sun et al., 2005). However, the accumulation of toxic heavy metals in plants may increase the risk of transfer to herbivorous wild mammals, or to livestock and game animals (Chaney, 1989; Madejón et al., 2002; Taggart et al. 2005). Moreover, aerial borne contamination of vegetation by wind blown particulates may occur within the vicinity of the spoil dump. This may occur to a greater degree if the spoil is of a fine particle size (more readily entrained) and if it remains without vegetation and therefore physically unstable. Aerial borne particles deposited on above ground plant surfaces may pose an important route of exposure for herbivores, as may be the direct inhalation of metal rich dust (Ma, 1996). Further, Beyer et al. (2007) observed extremely high Pb exposure in deer due to the ingestion of polluted soils near a mine, because soil can constitute a significant dietary component for certain vertebrate species, including mammals.
Mining in the Sierra Madrona mountains and the valley of Alcudia in Southern Spain started at the beginning of the 1st millennium B.C. At the end of the 2nd century B.C., during the Roman expansion through the Iberian peninsula, there was an increase in the extraction and smelting of metals in this area, the focus being on the extraction of argentiferous galena. During the Middle Ages mining activities shifted towards the mercury deposits in Almadén (Valley of Alcudia), and then at the end of the 15th and during the 16th century, extraction of argentiferous galena re emerged. The 17th and 18th centuries were relatively inactive but
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extensive mining operations recommenced during the 19th 20th centuries as technical improvements to the extraction process made the area more viable again (Hevia, 2003). This province became the major Pb producing area in Spain during the second half of the 19th century, but from the 1930s onwards, production fell and in 1988 the last mine, San Quintín, closed. Around 484 old mines and prospects are located in an area spanning approximately 2500 km2, the majority of which targeted Pb–Zn veins. Other metals were also produced in the area though, i.e, Ag, Cu, Sb, Sn, W, As and Bi. Although many of the worked deposits were quite small in size, San Quintín (500,000 Mt of Pb), Minas de Horcajo (300,000 Mt of Pb), and Diógenes (200,000 Mt of Pb) were all important producers within Spain (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). The land affected by these mines has never been remediated.
Currently, the Sierra Madrona area is largely devoted to and occupied by hunting estates, where several hundred red deer (Cervus elaphus) are bagged every year, and are destined for human consumption. The key aim of our research was therefore to establish the degree of contamination in this mining area of the soil, sediment, water and plants, and to consider, using red deer tissues, the degree of food chain transfer of metals that may be occurring.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Study area
The Sierra Madrona and Alcudia Valley region is in the northern part of the Eastern Sierra Morena in the Province of Ciudad Real, Southern Spain (Figure 1). The elevation here ranges between 500 and 1,300 m. The climate is Mediterranean sub humid with marked seasons, and Mediterranean shrubland is dominant. The most important geological features in this area are a series of major Hercynian WNW–ESE trending anticlines and synclines. The lithostratigraphic sequence is composed of siliciclastic rocks with some interlayered volcanics and rare carbonate levels (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). The Montes de Ciudad Real region (where the control sites were located) has altitudes between 500 and 1000 m, has similar geomorphological, climatic and biogeographic characteristics to Sierra Madrona, and is considered to be part of the same natural macroregion (García Rayego, 1994). However, this area has not been widely mined historically and is not known to be rich in mineralised zones with high metal contents.
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Fig. 1. Study area in the Province of Ciudad Real. Two sampling sites (Minas de Horcajo and Navalmartina) are in the mining area, and two are the control sites (Torneros and Hornias Bajas).
Four sampling sites were selected within the region, two of them in the mining area of Sierra Madrona, and two in control areas in the Montes de Ciudad Real. One mine sampling site was at Minas de Horcajo La Garganta in Almodóvar del Campo. The soil and plants sampled at this site were from the vegetated hillside adjacent to the spoil dump for the mine, and the water and sediment were collected from a creek flowing between the vegetated hillside and the dump. The dump itself was not sampled because no vegetation occurred there. The second sampling site within the mined zone was at Navalmartina in Fuencaliente. Although this site has no mines within the hunting estate, it is around 10 km downstream of a Roman smelter located in the Valderreprisa pass (Hevia, 2003). As such, this site is perhaps intermediate between the first, actively mined area, and the 2 control areas. Sampling sites in the control areas were in the hunting estates of Torneros in Saceruela and Hornias Bajas in Piedrabuena. All these sampling sites were in the Province of Ciudad Real.
2.2. Sampling
Samples of 0 5 cm soil (100 g) were collected from each sampling site (n = 3 or 6 per site). Water (50 ml) and sediment (100 g) were collected from the nearest stream to the point of soil sampling when it was possible (n = 3 or 4 per site). The water was preserved with 1% nitric acid (Analytical grade, Panreac). The plants present at these points were sampled (50 g of leaves) if they were known to be components of the diet of red deer (Carranza, 2004). Three of the species sampled were collected at all four sampling sites: holm oak ( Quercus ilex ), gum rockrose ( Cistus ladanifer ), elmleaf blackberry ( Rubus ulmifolius ). Plus, various
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grasses (Gramineae) were also collected at all 4 sites. Grasses were sampled at early stages of growth and the species confirmed at the sampling site after total seed head development. The species analysed were bristly dogstail ( Cynosurus echinatus ), medusahead ( Taeniatherum caput-medusae ), Holcus sp., slender false brome (Brachypodium sylvaticum ), Bromus sp., tall oat grass ( Arrhenatherum album ) and big quaking grass ( Briza maxima ). Nine further species were sampled but were not present at all sampling sites, these were Algerian oak ( Quercus canariensis ), large grey willow ( Salix atrocinerea ), oneseed hawthorn ( Crataegus monogyna ), sageleaf rockrose ( Cistus salvifolius ), strawberry tree ( Arbutus unedo ), dog rose ( Rosa canina ), narrow leafed ash (Fraxinus angustifolia ), false olive ( Phillyrea angustifolia ) and Heather ( Erica sp.). In addition to leaves, acorns of Quercus ilex and flowers of Cistus ladanifer were also sampled.
Liver and bone (metacarpus) samples of 72 adult red deer (≥ 3 years old) were obtained from hunters during the autumn and winter of 2004 05 and 2005 06. The deer were from the hunting estates at La Garganta (surrounding Minas de Horcajo; n=13), Navalmartina (n=21), Hornias Bajas (n=18) and Torneros (n=20). Sex was recorded at the time of sampling and 45 males and 27 females were utilised.
2.3. Laboratory analysis
Soil samples were passed through a 0.5 mm stainless steel sieve to obtain a homogeneous sample and oven dried at 50 ºC to constant weight. Plant remains or small stones were removed from sediments prior to freeze drying (Christ Alpha 1 2, Braun Biotech). Dry sediment was sieved as for soils. Leaves were thoroughly cleaned with distilled water, dried at 50 ºC and homogenized using a cutting mill prior to digestion. Acorns, liver and bone were freeze dried.
Dry samples of liver, bone and leaves (0.5 g) were digested with 3 ml of HNO3 (69% Analytical Grade, Panreac), 1 ml of H2O2 (30% v/v Suprapur, Merck) and 4 ml of H2O (Milli Q grade) with a microwave oven (Ethos E, Milestone). The program for the digestion began at a potency of 750 W and ramped for 15 min up to 180 ºC, after which, samples were held for 10 minutes at 800 W and at a temperature of 180 ºC. Digested samples were diluted to a final volume of 50 ml with Milli Q H2O. The digestion of dry samples of soil and sediment (0.3 g) was also achieved with the microwave oven, but using 6 ml of HNO3, 2 ml of HF and 2 ml of HCl. Water samples (9 ml) were digested with 1 ml of HNO3 in the microwave oven and then diluted to a final volume of 10 ml.
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The analysis of As, Se, Cd and Pb was achieved using a graphite furnace atomic absorption spectroscopy system (AAnalyst 800, Perkin Elmer) equipped with an autosampler
(AS 800, Perkin Elmer), using 50 g NH 4H2PO 4 and 3 g Mg(NO 3)2 as matrix modifiers in each atomization for Pb and Cd, and 5 g Pd and 3 g Mg(NO 3)2 for As and Se. The analyses of Cu and Zn was achieved using a flame atomic absorption spectrometer system (AAnalyst 800 equipped with an autosampler AS 90 plus, Perkin Elmer). Solutions used for calibration were prepared from commercial stock standards with 1 g/l of each element (Panreac). The limits of detection (LODs, in g g 1 dry weight, back calculated to concentrations in samples) were, for As: 0.022, Se: 0.124, Cd: 0.004, Zn: 1.06, Cu: 1.48 and Pb: 0.065. Blanks were processed in each batch of digestions. A certified reference sample of bush branches and leaves (NCS DC 73349A, China National Analysis Center for Iron and Steel) was analyzed (n = 5) and the recovery (mean % recovery ± SE) was 105.9 ± 1.4% for Pb, 97.8 ± 1.0% for Zn, 97.5 ± 1.5% for Cu and 121 ± 2.2% for As. A sample spiked with 0.1 g g 1 Cd was analyzed (n = 6) and the recovery was 96.2 ± 2 %. A reference sample of bovine liver (BCR 185R, Community Bureau of Reference) was analyzed (n = 8) and the recovery was 94.4 ± 5.8% for Pb, 95.8 ± 0.7% for Zn, 100.4 ± 0.6% for Cu, 99.0 ± 4.0% for Cd, and 74.3 ± 2.2% for Se. A reference sample of bone ash (SRM 1400, National Institute of Standards and Technology, USA) with certified levels of Pb and Zn was analyzed (n = 12) and the recovery was 94.5 ± 1.8% for Pb and 92.6 ± 1.3% for Zn. All concentrations are given in dry weight (d.w.).
2.4. Statistical analysis
Data below the detection limit were assigned values of half of the respective LOD for each element. The concentrations of the elements were log transformed to attain or approach a normal distribution of the data. Differences in the concentrations of each element among the four plant species ( Quercus ilex , Cistus ladanifer , Rubus ulmifolius and Gramineae) sampled in all locations were studied with a general linear model (GLM), with the factors species and location as independent variables. Differences among species at each location or among locations for each species, including incidences where species were not sampled at every location, were studied with one way ANOVAs. The differences among locations in soil, water and sediment concentrations were also studied with one way ANOVA tests. Post hoc differences were established with Tukey tests. The relationship between the substrate (soil, sediment and water) concentration of the different elements and the plant concentrations from each sampling site was studied by linear correlations at a sampling point
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scale (n = 5 14). The differences among locations in concentrations of the different elements in red deer tissues were studied with a GLM, including sex as a factor. Linear correlations between the concentrations of the different elements were studied within each type of sample (soil, sediment, water, plants and deer tissues). Statistical significance was set at p < 0.05.
3. RESULTS
3.1. Metal levels and relationships in soil, sediment and water
The concentration of Pb was significantly higher in the sediment of the stream flowing through Minas de Horcajo that in the other sampling sites (p=0.008; Table 1; Figure 2). However, this difference was not significant for Pb in terms of water or soil. The concentrations of As in water, sediment and soil was higher in Minas de Horcajo than in the other sites (p<0.001), where mean levels in water exceeded 50 ng ml 1 and in sediment were over 1800 g g 1. Selenium in soil (not log transformed) was significantly higher in Minas de Horcajo than in the other areas (p=0.003). Zinc, Cu and Cd tended to be higher in sediment and soil from Minas de Horcajo and Navalmartina than in the other sites (all with p<0.02; Table 1). Cadmium was detectable in water from the mining area, but not in the control sites, while the opposite was true for Se.
Correlations among sediment concentrations of Zn, Cd and Cu were highly significant (all with r>0.9, p<0.001), but Pb was only correlated with Cd (r=0.77, p=0.12) and As (r=0.88, p<0.001). Concentrations of sediment Cd and As were significantly correlated (r=0.632, p=0.37). Correlations in soil were significant between Zn Cd, Zn Cu, Se Cu, Se As, As Cu, As Cd (all with r values between 0.55 and 0.74, p<0.05). Element concentrations were not correlated in water.
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Fig. 2. Pb concentrations (mean±SE) in stream sediments, plants and red deer tissues from mining and control areas. Those means sharing a capital letter did not differ among locations (Tukey test, p<0.05).
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3.2. Metal levels and relationships in plants
The concentrations of Pb were higher in the plants from Minas de Horcajo and Navalmartina, both in the mining area, than in the control sites (p<0.001; Table 2; Figure 2). There were significant differences among plant species, with the Gramineae from Minas de Horcajo having the highest concentration of Pb (p<0.001; Table 2; Figure 2). The concentration of Zn differed among species (p<0.001; Table 3), but only Rubus ulmifolius had a significantly lower concentration in Minas de Horcajo than in the control sites (Table 3). The concentration of Cu differed among areas (p=0.032) and species (p=0.017; Table 4). In particular, Cu levels were higher in Cistus ladanifer , Phillyrea angustifolia and Gramineae from the mining areas, than in the control sites. The concentration of Cd differed among locations (p=0.004) and species (p<0.001), in particular Quercus ilex from Minas de Horcajo had higher Cd levels than those from Hornias Bajas (Table 5). The concentration of As differed among locations (p<0.001) and species (p=0.001), being at its highest in the Gramineae from Minas de Horcajo (Table 6). The concentration of Se in plants did not differ among locations or species, with the exception of the acorn of Quercus ilex from Minas de Horcajo which had a higher level than in Torneros (Table 7).
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Several differences among species were consistently found at different locations. The lowest concentrations of Zn and Cu were observed in the acorns of Q. ilex (Tables 3 4) at all sites, and Pb in the mined area. The leaves of Cistus ladanifer had the highest concentrations of Cd (as did one sample of Cistus salvifolius ), whereas Phillyrea angustifolia and Fraxinus angustifolia had the lowest (Table 5).
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When results for all four areas were combined, a significant correlation was observed between Pb and As concentrations in the leaves of the four species sampled in all areas (r=0.699, p<0.001; Figure 3). However, Rubus ulmifolius showed lower levels of As with respect to Pb when compared to the other species. Other, less significant correlations were found between Pb and Cd (r=0.36, p=0.006), Cd and As (r=0.378, p=0.004) and Cd and Zn (r=0.31, p=0.019).
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Fig. 3. Relationship between As and Pb concentrations, expressed as logarithms, in plants collected in four sampling sites in the Province of Ciudad Real, Spain.
3.3. Metal levels and relationships in red deer tissues
Red deer from the mining area, especially from Navalmartina, had a higher concentration of Pb in liver (p<0.001; Table 8) than those from the control sites. The concentration of Se in liver and bone was also higher in deer from the mining area than in those from control sites (p≤0.001), as was the case for liver Cd and As (p<0.05). In contrast, bone Zn levels were lower in deer from the mining areas (p=0.001). Correlations among liver concentrations were positive for Zn Cd (r=0.635, p<0.001), Cu Cd (r=0.421, p<0.001), Se Cd (r=0.242, p<0.048) and Se As (r=0.301, p=0.013), and negative for Zn As (r= 0.26, p=0.033). Bone Pb concentrations were negatively correlated with As (r= 0.458, p=0.001) and Se (r= 0.417, p=0.002).
3.4. Relationship between metal concentrations in substrate, plants and deer tissues
A clear pattern was observed in the geometric means of the Pb concentrations found at the four sampling sites for sediment, plants and tissues of red deer (Figure 2). At the sampling point level, the Pb concentrations were correlated between sediment and Gramineae (r=0.858, p=0.013), but no other correlations were observed between the substrate (soil, sediment or water) and the other plant species. However, significant
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correlations were found for Pb levels between the four species of plants sampled at all the four locations (all with r>0.75). As for the other elements, significant correlations were observed for As between soil and Gramineae and Cistus ladanifer (r>0.74), for Se between soil and Gramineae (r=0.61), and for Cd and Zn between soil and Cistus ladanifer (r>0.69). Correlations between plant species were significant for Cd between Gramineae and Q. ilex (r=0.65), for Cu between Cistus ladanifer and Gramineae (r=0.83), for Zn between Rubus ulmifolius and Quercus ilex , for Se between Rubus ulmifolius and Gramineae (r=0.83) and for Cu and As between Cistus ladanifer and Gramineae (r>0.76).
4. DISCUSSION
The mining area of the Valle de Alcudia in the Sierra Madrona has been exploited intermittently for over 2100 years, since Roman occupation and up until the late 1900s (Hevia, 2003). The concentrations of several metals studied herein are currently significantly higher in stream sediments, plants and herbivores within this Pb mining area than in control sites located within the same province (Ciudad Real).
4.1. Metal levels in substrates and plants
The highest concentration of Pb was found in the streams flowing through the two mining sites. The concentrations of Pb in the sediment at Minas de Horcajo (1481 g g 1 d.w.) was comparable to that found in soil and sediment from other Pb mining areas (752 12139 g g 1; Chukwuma, 1995; Yanqun et al., 2004; Brown et al. 2005; Liu et al., 2005;
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Deng et al., 2006; Li et al., 2006; Conesa Alcaraz et al., 2007). The soil Pb concentration in Minas de Horcajo was much lower than this because the samples were collected from a vegetated hillside near the spoil dump, where the plants eaten by red deer were growing. The unvegetated soil from the spoil dump probably had much higher Pb concentrations, but this was not sampled. The sediment in the stream flowing through the mining area may give a better reflection of the overall metal pollution in the catchment.
Plants also reflected the difference between the mining and control areas, in terms of Pb concentrations, and Pb concentrations in plants were higher than in soils in Minas de Horcajo. This may be because there is often a significant amount of aerial deposition on plants of dust containing Pb around mines (Madejón et al., 2004; Hasselbach et al., 2005; Wilson and Pyatt, 2007). The significant correlation between Pb and As in plants (Fig. 3) may reflect this aerial deposition, since the uptake by and translocation into plants of these two elements is probably under quite differing control (Meharg et al., 1994; Huang and Cunningham, 1996). In terms of food chain transfer to herbivores, the presence of adsorbed metals to the surface of plants may be more important than the amounts absorbed by roots and translocated to the aerial parts of the plant (Madejón et al., 2002).
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The species that accumulated the most Pb were Gramineae, Quercus ilex and Cistus ladanifer . Gramineae from Minas de Horcajo had a concentration (97 g g 1) within the range for expected phytotoxicity (30 300 g g 1) according to Pugh et al. (2002), and at this level, grasses would also be potentially toxic to livestock (30 g g 1; Chaney, 1989). The levels observed in Gramineae are not dissimilar to the concentrations found in Cynodon dactilon and Sorghum halepense growing in soils affected by the Aznacóllar mine spill in Southern Spain (148 g g 1 d.w.; Madejón et al., 2002). The species with the lowest Pb concentration in Minas de Horcajo was Rubus ulmifolius (7.6 g g 1). Other studies have also found relatively low Pb concentrations in Rubus sp. growing in heavy metal polluted sites, i.e, 1.8 g g 1 in a study by Freitas et al. (2004b) and 22 g g 1 in work by Yoon et al. (2006). Finally, the concentrations of Pb in acorns of Quercus ilex or in the flowers of Cistus ladanifer were much lower than in their respective leaves. As a general rule, the translocation of toxic heavy metals from the roots to aerial plant parts, and especially to the reproductive structures of the plant, is restricted by various mechanisms (Chukwuma, 1995; Deng et al., 2006; An, 2006; Li et al., 2006).
The level of Cu in the soil from Minas de Horcajo (66 g g 1) is within the range of potential toxicity to plants (60 125 g g 1) according to Kabata Pendias and Pendias (1992), and is within the range of soil Cu levels observed in similar mining areas in NE Portugal (31 225 g g 1; Freitas et al., 2004b). Selenium levels in soil are normally around 0.2 g g 1 (Rosenfeld and Beath, 1964) but they can be highly geographically variable. Soils and sediments analysed here, when compared to our regionally relevant control area, are however elevated in Minas de Horcajo. Selenium levels in water are just 1 g l 1 which is an order of magnitude lower than that considered safe in drinking water for humans (WHO, 2006). The As levels in sediments at Minas de Horcajo (1880 g g 1) were over twice that of the most polluted sediment after the Aznalcóllar mine spill, and within the range of concentrations determined for the mine waste sludge associated with that disaster (Taggart et al., 2005). The water in the stream at Minas de Horcajo contains a mean of just over 50 g l 1, which is 5 times higher than the generally accepted drinking water standard for As for humans (WHO, 2006). Concentrations of As in plants were below phytotoxic levels (3 10 g g 1) and the maximum level tolerated by livestock (50 g g 1; Chaney, 1989). The detected Zn concentrations in plants were below the levels associated with phytotoxicity (500 1500 g g 1) and toxicity towards livestock (300 1000 g g 1; Chaney, 1989). The plant species with the highest Zn level in this study was Salix atrocinerea , and other Salix species have been shown to have elevated Zn levels in other mining areas (Pugh et al., 2002). Another species with high Zn levels in this study was Cistus ladanifer at the Minas de Horcajo site, and the levels were comparable to those found in mining areas in Portugal (Freitas et al., 2004a,
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2004b). Rosa canina from Minas de Horcajo was the only plant with Cu levels (27.2 g g 1) which can be associated with phytotoxicity (25 40 g g 1), and with levels above that tolerated by sheep (25 g g 1; Chaney, 1989). Phytotoxicity of Se in plants is highly variable but toxic effects are not considered to normally occur below 5 g/g in plant tissues (Reilly, 1996). Selenium levels in analysed plants were at least 10 times below this value. All the Cd concentrations found in plants in the present study are well below the level at which we would expect phytotoxicity (>5 700 g g 1), but in certain cases, i.e, for Cistus ladanifer in Minas de Horcajo (0.49 g g 1), the concentrations seen were close to the levels which would be of concern for livestock (>0.5 g g 1; Chaney, 1989).
4.2. Metal levels in deer tissues
The concentration of Pb in deer liver was higher in the mining sites than in the control sites. The mean concentrations of Pb in bone of deer showed a similar trend to the levels observed in sediments and plants (Fig. 2), but significant differences between locations were not noted. Liver tends to reflect short term acute exposure, while bone accumulates more than 90% of the total body burden of Pb over time, and therefore reflects long term exposure (Ma, 1996). Hence, the higher Pb level in liver (but not in bone) in red deer from the mining sites compared to the control sites, may indicate that there is a temporal aspect to the Pb exposure here. However, red deer from the mining area showed a liver concentration well below the liver concentration associated with clinical signs of Pb poisoning (30 g g 1 d.w. or 10 g g 1 w.w.; Ma, 1996; Frøslie et al., 2001). Frøslie et al. (2001) reviewed liver Pb levels in red deer from different parts of Europe and the mean values ranged from 0.03 to 2.5 g g 1 w.w. Several studies with cervids from sites polluted by mining and smelting activities have described higher tissue Pb concentrations than in the present study. Red deer from near a Cu Ni Fe ore smelter in Ontario, Canada, had liver and bone Pb levels around 1.47 and 6.78 g g 1 d.w., respectively (Parker and Hamr, 2001). Liver Pb concentrations in roe deer (Capreolus capreolus ) near a Pb smelter in Slovenia were also higher (0.71 g g 1 w.w.; Pokorny and Ribarič Lasnik, 2000) than those reported here. Red deer from the Province of Córdoba (Spain), on the southern side of Sierra Morena, had mean liver Pb concentrations of 0.57 g g 1 w.w., although some 4.3% of the deer had >2 g g 1 w.w. (Santiago et al., 1998). Much lower concentrations (0.030 0.045 g g 1 w.w.) have been observed in cattle from Northern Spain (Miranda et al., 2001).
The diet of red deer in Spain is based on grass between autumn and spring and on leaves of bushes and trees during the summer with some variation depending on the
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geographic area. In Sierra Morena, grasses represent 75% of the diet in spring and only 20% in summer. The species of bushes and trees more commonly consumed by red deer in Spain are Phyllirea angustifolia , Arbutus unedo , Quercus sp., Cistus sp., Erica sp., Olea europaea , Mirtus communis and Pistacia lentiscus (Carranza, 2004). In the present study, several of these species contained lower Pb levels than grasses (Gramineae) in the polluted site of Minas de Horcajo, and consequently some seasonal variations in the exposure to Pb in the deer may be expected. However, other sources of exposure to Pb should be evaluated in the future, because the Pb concentrations in liver and bone of the deer from Minas de Horcajo and Navalmartina were very similar despite the fact that the plants from the first site contained Pb levels more than one order of magnitude higher than they were in the second site. This may be because deer from the La Garganta hunting estate around Minas de Horcajo do not have full access to the most polluted areas, or, it may be that direct soil ingestion is a more important source of Pb exposure than plants are, as suggested by Beyer et al. (2007).
Levels of Cu and Zn in liver were no different in mined areas than in control sites. Liver Cu levels were within the range observed in roe and red deer (4 30 g g 1 w.w.) and well below the levels associated with Cu poisoning (>150 g g 1 w.w.; Frøslie et al., 2001). Selenium was higher at Minas de Horcajo that at the other 3 sites, whilst mean levels of Cd in liver were approximately twice as high in Minas de Horcajo than in one of the control sites. Liver As levels were comparable to those reported in European wild ungulates (0.02 g g 1 w.w.; Frøslie et al., 2001), and Cd liver levels were similar to those found in red deer from Sierra Morena (0.21 g g 1 w.w.; Santiago et al., 1998) and cattle from Spain and elsewhere (0.03 0.31 g g 1 w.w.; Miranda et al., 2001). The highest correlation between elements in red deer tissues was observed in the liver for Zn and Cd. Both elements can induce the cellular production of metallothionein, a low molecular weight metal binding protein, and consequently the correlation between them may be expected (Gamber and Scheuhammer, 1994; López Alonso et al., 2002).
5. CONCLUSIONS
The concentrations of Pb and other elements in the sediments, plants and red deer from mining areas, especially from Mina de Horcajo, were higher than in the control sites. The high concentration of Pb and As detected in the sediment of a stream flowing beside the spoil dump at Mina de Horcajo, and the elevated levels of As observed in water indicates the need for remedial action at the site. Phytostabilization of the dump would reduce the wind
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dispersion of metals and the volume of drainage to the stream. However, the possibility of an increased transfer to herbivores must be considered, especially if plants with the potential to accumulate are used. Some species of plants growing at Minas de Horcajo, like Gramineae and Rosa canina may exceed the levels of Pb and Cu associated with toxicity to livestock. On the contrary, Phillyrea angustifolia and Rubus ulmifolius had some of the lowest values for several metals. Similar scenarios to Mina de Horcajo are scattered throughout the historically mined area of the Sierra Madrona and the Valle de Alcudia, so further work should be done to identify autochthonous plant species that could be used in phytostabilization. Species combining both high tolerance and very low translocation would perhaps make suitable candidates.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank E. Arias, P. Talavera and D. Vidal for their help with sample collection, P. Camarero, S. Sánchez Maroto, for their help with laboratory work and W.N. Beyer for his comments on the manuscript. This project was funded by a grant from the Department of Education and Science of the Autonomous Government of Castilla La Mancha (PCC 05 004 2) and a grant from the University of Castilla La Mancha.
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CAPÍTULO 2
Heavy metal exposure in large game from a lead mining area: effects on oxidative stress and fatty acid composition in liver
Reglero MM, Taggart MA, Monsálve González L, Mateo R. 2009. Heavy metal exposure in large game from a lead mining area: effects on oxidative stress and fatty acid composition in liver . Environmental Pollution 157, 1388 1395.
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Exposición por metales pesados en caza mayor de una zona minera de plomo: efectos sobre el estrés oxidativo y la composición de ácidos grasos en el hígado
RESUMEN
La zona minera de plomo (Pb) en el Valle de Alcudia y Sierra Madrona (Sur de España) ha sido explotada intermitentemente durante unos 2100 años, desde tiempos de la ocupación Romana hasta finales del siglo XX. Hígado y hueso (metacarpo) de ciervos (n=168) y jabalíes (n=58) fueron analizados para Pb, Zn, Cu, Cd, As y Se. La peroxidación lipídica, el glutatión (GSH) total y oxidado, las enzimas superóxido dismutasa (SOD) y GSH peroxidasa (GPX), y la composición de ácidos grasos fueron estudiados en el hígado de los ciervos. Las concentraciones de Pb en hígado y hueso de ciervos y jabalíes fue más elevada en la zona minera que en la zona control, y más alta en el jabalí que en el ciervo, pero en ambos casos por debajo de los niveles asociados con signos clínicos de intoxicación por Pb. Los niveles hepáticos de Cu, Cd y Se fueron además más altos en ciervos de la zona minera. Los ciervos de la zona minera tuvieron un 39% menos de GSH en el hígado que los de la zona control. El porcentaje de ácido docosahexaenoico en el hígado de los ciervos de la zona minera fue un 16% más bajo en comparación con los ciervos de la zona control.
Palabras clave : Cervus elaphus ; Sus scrofa ; Metales pesados; Antioxidantes; Ácido docosahexaenoico.
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ABSTRACT
The Pb mining area of the Valley of Alcudia in the Sierra Madrona mountains (S. Spain) has been exploited intermittently for over 2100 years, since Roman occupation and up until the late 1900s. Red deer (n=168) and wild boar (n=58) liver and bone (metacarpus) were analyzed for Pb, Zn, Cu, Cd, As and Se. Lipid peroxidation, total and oxidized glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), GSH peroxidase (GPX) and fatty acid composition were studied in liver of red deer. The concentrations of Pb in liver and bone of red deer and wild boar were higher in the mining than in the control area, and higher in the wild boar than red deer, but well below the level associated with clinical signs of Pb poisoning. Liver levels of Cu, Cd and Se were also higher in red deer from the mining area. Red deer from the mining area had 39% less total GSH than in the control area. The percentage of docosahexaenoic acid in liver of red deer from the mining area was 16% lower than in the control area.
Keywords : Cervus elaphus ; Sus scrofa ; Heavy metals; Antioxidants; Docosahexaenoic acid
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1. INTRODUCTION
Mining in the Sierra Madrona mountains and the valley of Alcudia in the province of Ciudad Real, in Southern Spain, started at the beginning of the 1st millennium B.C. This province became the major Pb producing area in Spain during the second half of the 19th century, but from the 1930s onwards, production fell and in 1988 the last mine, San Quintín, was closed (Hevia, 2003). Around 484 old mines and prospects are located in an area spanning approximately 2 500 km 2, the majority of which targeted Pb–Zn veins. Other metals were also produced in the area though, i.e, Ag, Cu, Sb, Sn, W, As and Bi (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). The majority of the land affected by these mines has never been remediated.
Heavy metal mining and smelting produces contamination of air, water and soil, which can be transferred towards biota through the food chain. The accumulation of toxic heavy metals in some plants increases the risk of transfer to livestock and game animals (Chaney, 1989; Reglero et al., 2008). Moreover, exposure in wildlife will also occur via the ingestion of soil closely associated with food items (Ma et al., 1991; Beyer and Fries, 2003), or may be more direct, as animals may instinctively lick soil to attain essential elements (Beyer et al., 2007).
In a previous study, we observed significantly higher concentrations of Pb in sediments and plants of hunting estates within the Sierra Madrona mining area than in control sites, and this was also reflected in liver and bone Pb levels of red deer ( Cervus elaphus ) from the same estates (Reglero et al., 2008). A similar situation was observed in the Province of Cordoba on the southern side of the Sierra Madrona (known there as the Sierra Morena), where 4.3% of red deer and 13.8% of wild boar (Sus scrofa) had >2 g/g wet weight (w.w.) Pb in liver (Santiago et al., 1998). Moreover, bone Pb concentrations were higher in Iberian lynx (Lynx pardinus) from the Sierra Morena than in the Doñana National Park in SW Spain (2.052 vs. 0.136 g/g dry weight (d.w.); Millán et al., 2008).
Several studies have shown a relationship between elevated tissue Pb and oxidative stress biomarkers and fatty acid composition (Donaldson and Knowles, 1993, Gürer and Erçal, 2000, Hsu and Guo, 2002). Increased lipid peroxidation has been observed in livers of mallard ducklings (Anas platyrhynchos) and Canada goslings (Branta canadensis) exposed through diet to Pb contaminated sediment (Hoffman et al., 2000a, 2000b). Glutathione (GSH) levels in the liver of these bird species increased with the level of Pb exposure, but showed a negative relationship with liver Pb concentration within the group with the same level of Pb
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exposure (Mateo and Hoffman, 2001). The activity of GSH peroxidase (GPX) was significantly reduced in liver of juvenile mallards exposed to high doses of dietary Pb (Mateo et al., 2003b). Changes in fatty acid (FA) composition, especially an increase in arachidonic acid (AA: 20:4 n 6), has been described in several tissues of Pb exposed animal species (Knowles et al., 1998; Osterode and Ulberth, 2000); and this effect was not produced by other elements such as mercury, cadmium or selenium (Donaldson, 1985). Polyunsaturated FA´s (PUFA´s) such as AA are more susceptible to degradation by oxygen, heat and light, and their presence in tissues increases the susceptibility to lipid peroxidation (Lawton and Donaldson, 1991).
Currently, the Sierra Madrona area is largely devoted to and occupied by hunting estates, where several hundred red deer and wild boar are bagged every year, and are destined for human consumption. The key aim of our research was therefore to establish the degree of contamination in this mining area of red deer and wild boar by the analysis of liver and bone tissues, and to identify adverse effects of metal pollution on oxidative stress biomarkers and the fatty acid profile in liver of red deer.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Study area
The Sierra Madrona and Alcudia Valley region is in the northern part of the Eastern Sierra Morena in the Province of Ciudad Real (Figure 1). The elevation here ranges between 500 and 1300 m. The climate is Mediterranean sub humid with marked seasons, and Mediterranean shrubland is dominant. The most important geological features in this area are a series of major Hercynian WNW–ESE trending anticlines and synclines. The lithostratigraphic sequence is composed of siliciclastic rocks with some interlayered volcanics and rare carbonate levels (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). The Montes de Ciudad Real region (where the control sites were located) has altitudes between 500 and 1000 m, has similar geomorphological, climatic and biogeographic characteristics to Sierra Madrona, and is considered to be part of the same natural macroregion (García Rayego, 1994). However, this area has not been widely mined historically and is not known to be rich in mineralised zones with high metal contents. The mean concentration of Pb in sediments of streams from the mining areas studied here ranged from 44 to 1481 g/g dry weight, and in the control areas, was 10 to 16 g/g dry weight. Levels of Zn, Cu, Cd and As were also significantly higher in the mining areas (Reglero et al., 2008).
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2.2. Sampling
Nineteen hunting estates were selected within the region, ten of them in the mining area of Sierra Madrona, and nine in control areas in the Montes de Ciudad Real and eastern Sierra Morena. All these sampling sites were in the Province of Ciudad Real (Figure 1).
Fig. 1. Study area in the Province of Ciudad Real (S. Spain). The highest presence of Pb is found in the shaded area according to Palero Fernández and Martín Izard (2005). Some of the most relevant mines close to the sampling sites were Villagutiérrez (A), La Victoria (B), San Quintín (C), Santa Catalina (D), La Romanilla (E), Cabezarrubias del Puerto (F), Hinojosas de Calatrava (G), Mestanza (H), Las Minillas (I), El Horcajo (J), Fuencaliente (K), Diógenes (L), Los Pontones (M), Los Galayos (N) and Los Engarbes (O). The sampled hunting estates were El Rostro (1), Peñas Amarillas (2), Lagunillas (3), Torneros (4), Hornias Bajas (5), Los Manchones (6), Aeropuerto (7), Pozo del Borrico (8), Los Baldíos (9), El Girote (10), Zamorillas (11), El Burcio (12), La Gallega (13), La Garganta (14), Navalmartina (15), Umbría de Montoro (16), Tembladera (17), El Hoyo (18) and Navalcaballo (19).
Liver and bone (metacarpus) samples from 168 red deer and 58 wild boar were obtained from hunters during the autumn and winter of 2004 05 (74 red deer) and 2005 06 (94 red deer and 58 wild boar). Sampling took place after “monterias” (large driven hunts), which usually last three hours, at the end of which the animals are butchered. Samples were taken during this process and immediately cooled in a portable cooler. Within two hours, samples were transferred to a 80ºC freezer and stored until analysis (which was undertaken at the end of the hunting season, in late winter). Sex was recorded at the time of sampling,
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and 130 male and 38 female red deer were utilized with a similar sex ratio (male:female) in the samples from control (3.41) and mining (3.36) areas. Sex was determined in 30 of the wild boars sampled, 15 were male and 15 were female. Age of 52 red deer were precisely assessed from tooth sections (Klevezal’ and Kleinenberg, 1969) at the Quintos de Mora Laboratory of the Spanish Ministry of the Environment. Red deer were classified as juveniles (1 2 years old, n=4), subadults (>2 4 years old, n=38) and adults (>4 years old, n=10). There was a predominance of subadults in the control (68%) and mining areas (76%). Wild boar were aged using fur characteristics (Saenz de Buruaga et al., 1991), as juveniles (0.5 1 year old, n=17), subadults (>1 2 years old, n=14) and adults (>2 years old, n=27). As sampling was performed during the rapid processing of carcasses by professional butchers on the hunting estate, complete information on sex and age of all the animals utilized could not be obtained.
2.3. Elemental analysis
Liver and bone tissues were freeze dried (Christ Alpha 1 2, Braun Biotech) and dry samples (0.5 g) were digested with 3 ml of HNO 3 (69% Analytical Grade), 1 ml of H 2O2 (30% v/v Suprapur) and 4 ml of H 2O (Milli Q grade) with a microwave oven (Ethos E, Milestone) as defined previously (Reglero et al., 2008). Digested samples were diluted to a final volume of
50 ml with Milli Q H 2O.
The analysis of As, Se, Cd and Pb was achieved using a graphite furnace atomic absorption spectroscopy system (AAnalyst 800, Perkin Elmer) equipped with an autosampler
(AS 800, Perkin Elmer), using 50 g NH 4H2PO 4 and 3 g Mg(NO 3)2 as matrix modifiers in each atomization for Pb and Cd, and 5 g Pd and 3 g Mg(NO 3)2 for As and Se. The analyses of Cu and Zn were achieved using a flame atomic absorption spectrometer system (AAnalyst 800 equipped with an autosampler AS 90 plus, Perkin Elmer). Solutions used for calibration were prepared from commercial certified stock standards with 1 g/l of each element. The limits of detection (LODs, in g/g dry weight, back calculated to in tissue concentrations) were for Pb: 0.066, Cd: 0.004; Zn: 1.4, Cu: 3.0, As: 0.022 and Se: 0.127. Blanks were processed in each batch of digestions.
A reference sample of bovine liver (BCR 185R, Community Bureau of Reference) was analyzed (n = 8) and the recovery (mean±SE) was 94.4±5.8% for Pb, 95.8±0.7% for Zn, 100.4±0.6% for Cu, 99.0±4.0% for Cd, 114±11% for As (concentration close to LOD) and 74.3±2.2% for Se. A reference sample of bone ash (SRM 1400, National Institute of
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Standards and Technology) with certified levels of Pb and Zn was analyzed (n = 12) and the recovery was 94.5±1.8% for Pb and 92.6±1.3% for Zn. All concentrations are given in dry weight (d.w.).
2.4. Analysis of oxidative stress biomarkers
A balanced and representative number of red deer from the mining (n=41) and control areas (n=54) were studied for oxidative stress biomarkers in liver. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were measured as an estimate of lipid peroxidation using the method described by Aust (1985). Briefly, 0.5 g of liver was homogenized with 5 ml of ice cold 1.15% KCl in 0.01 M Na, K phosphate buffer (pH 7.4) with EDTA (0.02 M). An aliquot of the homogenate (2 ml) was then mixed with 1 ml of a freshly prepared solution containing 15% trichloroacetic acid, 0.375% thioarbituric acid, hydrochloric acid (0.25 N) and 1% butylated hydroxytoluene in deionized water. The tubes were capped and heated for 30 min at 85 °C in a heatblock (VWR). After this time the samples were cooled on ice to stop the reaction and were then centrifuged for 15 min at 2000 g (Meditronic BL; Selecta). The supernatant was transferred to plastic cuvettes and the absorbance measured at 535 nm in a spectrophotometer (Ultrospec 2100 Pr UV/Visible; Amersham Biosciences). Standard curves were generated for the assay using 1, 1, 3, 3 tetramethoxypropane.
Total GSH level (tGSH) in liver was determined in samples collected in 2005 by following the method described by Griffith (1980) with certain modifications. Briefly, 0.6 mL of the same homogenate used for TBARS assessment was vortexed with 0.6 mL of diluted tricholoroacetic acid (10% in H 20) three times, for 5 seconds each time, within a 15 min period. Next, the mixture was centrifuged at 3 500 g for 15 min at 4ºC and the supernatant was recovered. The following steps were carried out in an automated spectrophotometer (A25 Autoanalyzer; BioSystems) at 37 ºC. Three working solutions were made up in the same homogenizing buffer as follows: (I) 0.3 mM NADPH, (II) 6 mM DTNB, and (III) 50 IU of glutathione reductase/mL. Solution I and II were mixed at 7:1 volume respectively; 160 L of this new mixture was then automatically added to 40 L of sample (supernatant, see above) in a cuvette. After 15 seconds, 20 L of solution III was added and the absorbance at 405 nm was monitored after 30 and 60 seconds. The change in absorbance was used to determine the tGSH concentration by comparing the output with the results from a standard curve generated by serial dilution of GSH from 2 to 0.0625 mM. The oxidized GSH was measured by the same method, but after the incubation of 400 l of the supernatant with 8 l of 2 vinyl pyridine and 17 l of NaOH (6N) for 1 hour at room temperature. After centrifugation at 3500
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g for 15 min at room temperature, the supernatant was analyzed for the content of GSH using a calibration curve from 0.625 to 20 M of GSH.
The activities of GPX (EC 1.11.1.9) and superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) were recorded spectrophotometrically by micromethods using the Ransel and Ransod kits (Randox Laboratories) with an automated spectrophotometer (A25 Autoanalyzer; BioSystems). GPX and SOD were determined based on the methods described by Paglia and Valentine (1967) and Woolliams et al. (1983), respectively. For GPX, 100 l of liver homogenate were diluted with 200 l of Ransel diluting agent (Randox Laboratories). In the reaction cell at 37 ºC, 220 l of a reagent containing 4 mmol/l GSH, ≥0.5 U/l GSH reductase and 0.34 mmol/l NADPH (diluted in 0.05 mol/l phosphate buffer, pH 7.2, with 4.3 mmol/l ethylenediamine tetraacetic acid) were mixed with 5 l of diluted sample. Fifteen seconds later, 10 l of 0.18 mmol/l cumene hydroperoxide was added, and the absorbance read at 340 nm between 75 and 195 sec after sample addition. The enzyme activity was calculated by multiplying the increase in the absorbance per min by a factor of 8412. For SOD determination, 20 l of liver homogenate was diluted with 300 l of 0.01 mol/l phosphate buffer, pH 7. In the reaction cell at 37 ºC, 170 l of mixed substrate (containing 0.05 mmol/l xanthine and 0.025 mmol/l 2 (4 iodophenyl) 3 (4 nitrophenol) 5 phenyltetrazolium chloride) was mixed with 5 l of diluted sample, and 15 seconds later, 25 l of 80 U/l of xanthine oxidase was added. The mixed substrate was prepared in 40 mmol/l of N cyclohexyl 3 aminopropanesulfonic acid buffer, pH 10.2, with 0.94 mmol/l ethylenediamine tetraacetic acid. The absorbance was read at 505 nm between 45 and 225 sec after sample addition and the kinetics of the enzyme activity were calculated based on a calibration curve performed with SOD standards at concentrations ranging from 0.192 to 4.6 U/ml in 0.01 mol/l phosphate buffer, pH 7. A reference control of bovine blood with 317 U/ml was analyzed after a 1:200 dilution and the obtained concentration was 318 U/ml. Enzyme activities were expressed relative to mg of protein in the tissue homogenate determined by the method of Bradford (1976).
2.5. Fatty acid analysis
The FA composition was analyzed in the liver of red deer sampled in 2004 as described in a previous work to evaluate the effect of Pb on lipid metabolism (Mateo et al., 2003a). Liver tissue (0.3 g) was homogenized with 2.7 g of anhydrous sodium sulphate. After the addition of 10 l of a tridecanoic acid (13:0) solution (10 g/ l in methanol) as an internal standard, and 3 ml of H 2SO 4 (1N) in methanol, the headspace of the tubes was purged with
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pure N 2 to prevent oxidation, then the contents were vortexed and the tubes placed in an oven at 80 ºC for 6 hours then at 60 ºC for a further 12 hours, with occasional shaking. FA methyl esters (FAMEs) were extracted with 1.8 ml of n hexane after adding 3 ml of deionized water. FAMEs were analyzed by gas chromatography (GC; 6890N Network System, Agilent Technologies) coupled to an electronic impact mass spectrometry detector (EI MS; 5973 Network Mass Selective Detector). The capillary chromatographic column used was a BPX70 (SGE, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.25 m of film thickness, Cromlab). The injector (splitless mode) temperature was held at 270 ºC and the oven was maintained for 5 min at 100 ºC and then increased to 240 ºC at a ramp rate of 2.5 ºC/min. The carrier gas was helium at a flow of 1.2 ml/min. The source inlet of the mass spectrometer was held at 230 ºC and 70 V. The identification and quantification was achieved by comparison to retention times of FAME reference standards (FAMQ 005, AccuStandard) and the mass spectra. Results were expressed as % of individual FAMEs from the total amount.
2.6. Statistical analysis
Data below the detection limit were assigned values of half of the respective LOD for each element. The concentrations of the elements were log transformed to attain or approach a normal distribution of the data. Differences in tissue concentrations of the studied elements between control and mining areas or between species were done with Student t tests. Oxidative stress biomarkers and the percentage of each fatty acid in liver of red deer were also compared between areas with Student t tests. The effects of gender and age were studied with general linear models including these factors, and the area (mining or control areas) in the analyses. The relationships between liver and bone concentrations of the different elements were studied
3. RESULTS
Red deer from the mining areas had more Pb (p<0.001), Cd (p=0.023), Cu (p<0.001) and Se (p<0.001) in liver, and Pb (p=0.001) and Se (p=0.003) in bone than deer from control sites. However, bone Zn in deer from the control areas was higher (p=0.004). For wild boar, animals from the mining area had more Pb in liver (p<0.001) and bone (p<0.001) than those from the control sites. Again though, Cu (p=0.001) and Se (p=0.012) levels in liver from control areas was higher than in the mining areas in this species (Tables 1 and 2).
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Wild boar had more Pb in liver than red deer, and this was observed in the control (p=0.001) and mining sites (p<0.001). This interspecific difference was also observed in bone in both areas (both with p<0.001). Higher levels of Zn, As and Se were found in the liver of wild boar than in red deer from control and mining areas (all with p ≤ 0.001). However, liver Cu levels were higher in red deer than in wild boar in both areas (p ≤ 0.002) and the same was true for liver Cd but only in the mining areas (p=0.011; Table 1). Wild boar had more Zn in bone than deer in both areas (p<0.001 in each case), while this species also had more Se in bone in the control areas (p<0.001). Red deer from the mined areas showed a higher level of As in bone than wild boar (p<0.001; Table 2).
The total GSH and the oxidized GSH concentrations in liver of red deer were significantly lower in animals from the mining areas (Table 3), but these were not significantly related to log transformed liver Pb concentration in the analysis of covariance. However, the
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percentage of oxidized GSH was not affected and neither was lipid peroxidation as measured with TBARS, or the activity of SOD or GPX. None of the oxidative stress biomarkers were affected by age, but there were significantly higher values of TBARS, oxidized GSH, the percentage of oxidized GSH and GPX in males than females (all with p<0.001). Nevertheless, the differences in total GSH (p<0.001) and oxidized GSH (p=0.009) between control and mining areas were also significant when accounting for the effect of sex. A nominal number of significant differences were observed in the fatty acid composition in liver of red deer from control and mining areas. In particular, a lower percentage of docosahexaenoic acid (DHA: 22:6 n 3) and three other minor FAs (Table 4). There was a significant correlation between Pb concentration and the percentage of n 3 PUFA in liver of red deer (n=70, r=0.341, p=0.004; Figure 5), but there was not a significant difference between control and mining areas.
Fig. 2. Liver and bone Pb concentration (mean±SE) in red deer ( Cervus elaphus ) from hunting estates within the control and Pb mining areas in the Province of Ciudad Real (S. Spain).
Male red deer had more Cd (geometric means: 0.266 vs. 0.175 g/g d.w.; p=0.003) and Cu (54.6 vs. 29.7 g/g d.w.; p<0.001) in liver than females, and As levels were lower in males than females (0.039 vs. 0.063 g/g d.w.; p<0.001). Bone Pb was lower in males than females of red deer (0.994 vs. 2.086 g/g d.w.; p=0.006) and wild boar (5.267 vs. 8.399 g/g d.w.; p=0.048). The level of Cd in liver of red deer increased significantly with age (juveniles: 0.200, sub adults: 0.209, adults: 0.293 g/g d.w.; p=0.039) and this effect was more significant in wild boar (juveniles: 0.105, sub adults: 0.122, adults: 0.299 g/g d.w.; p=0.004).
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Lead concentrations in bone were nearly always higher than in liver (Figures 2 and 3), except in the Lagunillas area, where a red deer showed an extremely high Pb level in liver that could have originated from the bullet path. Significant correlations between liver and bone Pb concentrations were observed in red deer (n=161, r=0.420, p<0.001) and wild boar (n=51, r=0.716, p<0.001, Figure 4). In liver, Zn and Cd concentrations were correlated in red deer (r=0.44, p<0.001) and Zn and As were correlated in wild boar (r=0.573, p<0.001). Other correlations between elements and tissues were present but were less statistically significant.
Fig. 3. Liver and bone Pb concentration (mean±SE) in wild boar ( Sus scrofa ) from hunting estates within the control and Pb mining areas in the Province of Ciudad Real (S. Spain).
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Fig. 4. Relationship between liver and bone Pb concentrations in red deer ( Cervus elaphus ) and wild boar ( Sus scrofa ) from the Province of Ciudad Real (S. Spain).
Fig. 5. Relationship between liver Pb concentration and the percentage of n 3 poly unsaturated fatty acids (n 3 PUFA) in liver of red deer ( Cervus elaphus ) from the control and Pb mining areas of the Province of Ciudad Real (S. Spain).
4. DISCUSSION
The mining area of the Valle de Alcudia in the Sierra Madrona has been exploited intermittently for over 2100 years, since Roman occupation and up until the late 1900s (Hevia, 2003). The concentrations of several metals studied herein, especially Pb, are
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currently significantly higher in red deer and wild boar tissues within this Pb mining area than in control sites located within the same province of Ciudad Real. This elevated exposure may have effects on the health status of animals since red deer from the mining area had liver GSH levels around half that of the deer from the control sites. However, other biomarkers of oxidative stress were not affected by metal exposure and only limited changes were noted in the hepatic fatty acid profile.
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4.1. Interpreting metal levels in red deer and wild boar tissues
The concentration of liver Pb in the deer from the control sites falls within the range of background levels found in cattle, i.e, of around 0.16 g/g w.w., or approximately 0.5 g/g d.w. (if we assume d.w. of liver is 32%) (Frøslie et al., 2001). Red deer from the mining area showed a liver concentration above this background level, but well below the liver concentration associated with clinical signs of Pb poisoning (30 g/g d.w. or 10 g/g w.w.; Ma, 1996; Frøslie et al., 2001). Frøslie et al. (2001) reviewed liver Pb levels in red deer from different parts of Europe and the mean values ranged from 0.03 to 2.5 g/g w.w. Our mean values were within this range. Specific studies with cervids from sites polluted by mining and smelting activities have described higher tissue Pb concentrations than in the present study. For example, red deer from a Cu Ni Fe ore smelter in Ontario, Canada, had liver and bone Pb levels around 1.47 and 6.78 g/g d.w., respectively (Parker and Hamr, 2001). Liver Pb concentrations in roe deer near a Pb smelter in Slovenia were also higher (0.71 g/g w.w; Pokorny and Ribarič Lasnik, 2000) than those noted herein. Red deer from the Province of Córdoba (Spain), on the southern side of the Sierra Morena, had mean liver Pb concentrations of 0.57 g/g w.w., although some 4.3% of the deer had >2 g/g w.w. (Santiago et al., 1998).
Mean Pb concentration in liver of wild boar in Central Europe range from 0.03 g/g w.w. in Hungary to 0.67 g/g w.w. in Slovakia (Frøslie et al., 2001). The highest concentrations described in Europe are in wild boar from the Sierra Morena, which had mean levels of 2.6 g/g w.w. and a maximum value of 43.06 g/g w.w. (Santiago et al., 1998), again, higher than the levels detected in the present study.
Liver tends to reflect short term Pb exposure, while bone accumulates more than 90% of the total body burden of Pb over time, and therefore reflects long term exposure (Ma, 1996). In the areas studied here, the mean concentration of Pb in bone was higher than in liver. The only area which diverged from this trend was the Lagunillas estate, but this may have been as a result of contamination of the liver with ammunition fragments. High speed bullets usually fragment (at least partially) when hitting the targeted animal, and small pieces of lead can often contaminate the offal (Church et al., 2006). The correlation between liver and bone Pb concentrations in wild boar was more significant, (and the slope of the regression greater) than it was in red deer, which tends to suggest that there is a higher level of Pb deposition in bone in boar (Figure 4). Wild boar may have higher Pb concentrations in liver and bone when compared to red deer, because they commonly feed by rooting in the soil, and as such ingest significantly more soil, and eat more roots, bulbs, tubers, etc, which
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will tend to contain higher metal levels than above ground plant parts (Taggart et al., 2005). The increased accumulation of Pb in bone of females of both species (in comparison to males) has also been observed in numerous other wildlife species (Burger, 2007; Millán et al., 2008).
Levels of Cu in the liver of red deer were higher in the mining areas than in control sites, however, levels were within the range observed in roe and red deer in central and northern Europe (4 30 g/g w.w.) and well below the levels associated with Cu poisoning (>150 g/g w.w.; Frøslie et al., 2001). Liver Cu levels in wild boar were higher than the mean or median levels (3 7 g/g w.w.) reviewed by Frøslie et al. (2001). As occurs in other species of ruminants such as sheep, red deer also accumulated Cu in the liver, and this happened to a greater degree than in wild boar (Frøslie et al., 2001). Mean liver Zn levels in red deer from the mining and control areas were similar to the values observed in Cervidae from unpolluted sites (70 113 g/g d.w.). Further, they were below the mean value in white tailed deer (Odocoileus virginianus) living near a Zn smelter (178 368 g/g d.w.) which exhibited articular lesions compatible with Zn poisoning (Sileo and Beyer, 1985). Liver Se and Cd levels were higher in deer from the mining areas, and Cd levels were similar to those found in red deer from the Sierra Morena (0.21 g/g w.w.; Santiago et al., 1998), and within the range of means found in other European countries (0.03 0.46 g/g w.w.; Frøslie et al., 2001). The increase in Cd in liver with age has also been observed before in other species of wild mammals (Millán et al., 2008). Mean liver Cd levels found here in wild boar from mined areas were lower than most of the mean values detected in Europe (0.02 1.7 g/g w.w.; Frøslie et al., 2001), and those reported for the adjacent Sierra Morena area by Santiago et al. (1998; 0.28 g/g w.w.). Liver As levels in both species given here, were comparable to those reported in European wild ungulates (0.02 g/g w.w.; Frøslie et al., 2001).
4.2. Oxidative stress or GSH depletion?
The decrease in total GSH, and to a lesser extent, oxidized GSH, in red deer liver from the mining areas was not associated with changes in the redox balance of the tissue since the percentage of oxidized GSH and lipid peroxidation were not elevated, and the studied antioxidant enzymes, GPX and SOD, were similarly unaffected. The depleted GSH level in red deer from the mining area may correspond to the proposed role of GSH in the active excretion of Pb through bile (Klaassen and Shoeman, 1974). As observed with other metals (Keppler, 1999), Pb can bind to the thiol group of GSH (Christie and Costa, 1984; Donaldson and Knowles, 1993) and then be excreted. This role for GSH in the detoxification of Pb is
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supported by experimental evidence that less accumulation of Pb in tissues occurs when amino acid precursors of GSH and other thiols are supplied to some animals (Mylroie et al., 1977; Latta and Donaldson, 1986; Gürer et al., 1998; Erçal et al., 2000). However, other studies have described increases in GSH levels in tissues of mammalian and avian species exposed to Pb (Donaldson and Knowles, 1993; Hoffman et al., 2000a, 2000b; Mateo et al., 2003b), and it is known that enzyme γ glutamylcysteine synthetase, which is involved in GSH synthesis, can be induced by exposure to heavy metals and oxidative stress (Griffith, 1999). In turn, several studies have also described a decrease in GSH with Pb exposure (Dagget et al., 1998; Gürer et al., 1998; Hunaiti and Soud, 2000). Further, Mateo and Hoffman (2001) observed an inverse relationship between Pb and GSH levels in the liver of waterfowl exposed to certain levels of dietary Pb, but also, a higher GSH content in liver with increasing dietary Pb levels. This paradox may be explained by the balance between the induction of GSH synthesis by Pb exposure, and its use by the animal for biliary Pb excretion.
4.3. Changes in fatty acid composition
The most important change in fatty acid composition was the decrease in the percentage of DHA, an n 3 PUFA, in animals from mined areas. Following on from this, there was a significant negative correlation between liver Pb and the percentage of hepatic n 3 PUFA. The decrease in DHA may be related to the increased oxidation of this highly unsaturated FA, however, no increase in TBARS was observed in livers of red deer from the mining area. Lim et al. (2005a) also observed a decrease in the concentration in liver of DHA acid in 3 week old rats (control: 23.5 nmol/mg vs. Pb exposed: 14.7 nmol/mg) exposed to Pb through the milk of dams exposed to 0.2% Pb acetate in drinking water during lactation. Similarly, the concentration of n 3 PUFA decreased in the liver of rat pups exposed to Pb (34.7 vs. 18.2 nmol/mg; Lim et al., 2005a). In contrast, Lim et al. (2005b) observed a relative increase in DHA in the liver of those dams exposed to Pb (7.72% vs. 10.6%), but not in the tissue concentration. Further, we did not detect a significant increase in AA, which is the most frequently observed change in animals exposed to Pb (Donaldson and Leeming, 1984; Osterode and Ulberth, 2000; Mateo et al., 2003a).
5. CONCLUSIONS
The old Sierra Madrona Pb mines produce a significant amount of elevated Pb exposure towards large game species, and this is especially the case for wild boar. In red deer, a significant decrease (39%) in the hepatic level of GSH was observed in the mining
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area. The lower level of this cellular antioxidant may have implications for the redox balance of the liver tissue, however, no apparent consequences were observed in the peroxidation of lipids or the ratio of oxidized/reduced GSH. Nevertheless we observed a significant decrease (16%) in the percentage of DHA which has six double bonds and is more susceptible to oxidation than many other FAs. The liver Pb levels detected in wild boar and red deer from the mining area are well below those associated with clinical lead poisoning, but, the observed biochemical changes in deer highlight the importance of the study of other sublethal effects to assess the impact of pollution on wildlife.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank E. Arias, P. Talavera and D. Vidal for their help with sample collection, P. Camarero, S. Sánchez Maroto, for their help with laboratory work and W.N. Beyer for his comments on the manuscript. This project was funded by a grant from the Department of Education and Science of the Autonomous Government of Castilla La Mancha (PCC 05 004 2) and a grant from the University of Castilla La Mancha.
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CAPÍTULO 3
Reduced sperm quality in relation to oxidative stress in red deer from a lead mining area
Reglero MM, Taggart MA, Castellanos P, Mateo R. 2009. Reduced sperm quality in relation to oxidative stress in red deer from a lead mining area . Environmental Pollution 157, 2209 2215.
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Reducción de la calidad espermática en relación al estrés oxidativo en ciervos de una zona minera de plomo
RESUMEN
Aquí estudiamos los efectos de una elevada ingesta de metales pesados sobre la calidad espermática y los mecanismos antioxidantes en el esperma y los testículos de ciervos de una zona minera de Pb en España. Testículos, hígado y hueso de ciervos de zonas mineras (n=21) y controles (n=20) fueron obtenidos de cacerías y analizados para Pb, Zn, Cu, As y Se. Los testículos fueron pesados y medidos. La motilidad, integridad del acrosoma, y viabilidad y funcionalidad de la membrada fueron evaluados en espermatozoides del epidídimo. La peroxidación lipídica, el glutatión total y oxidado, la glutatión peroxidasa y la superóxido dismutasa fueron estudiados en los testículos y espermatozoides. Los ciervos de las zonas mineras tuvieron menos Cu en los testículos, testículos de mayor tamaño y peso, y espermatozoides de reducidas viabilidad de la membrana e integridad del acrosoma que los controles. Los efectos sobre la calidad espermática estuvieron asociados a una disminución de los niveles de Cu y a un aumento de los de Se en los testículos, y a los descensos en la actividad de las enzimas superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa en los testículos y espermatozoides.
Palabras clave : Reproducción masculina; Esterilidad; Antioxidantes; Metales pesados; Fauna silvestre.
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ABSTRACT
We studied the effects of elevated heavy metal uptake on the sperm quality and the antioxidant mechanisms of sperm and testis of red deer from a Pb mining area in Spain. Testis, liver and bone of red deer from mining (n=21) and control (n=20) areas were obtained from hunters and analyzed for Pb, Zn, Cu, Cd, As and Se. Testes were weighed and measured. Motility, acrosome integrity and viability and functionality of membrane were evaluated in epididymal spermatozoa. Lipid peroxidation, total and oxidized glutathione, glutathione peroxidase and superoxide dismutase were studied in testis and spermatozoa. Deer from mined areas showed less Cu in testis, a higher testis mass and size and reduced spermatozoa membrane viability and acrosome integrity. Effects on sperm quality were associated to decreased Cu and increased Se in testis, and to decreases in the activity of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in testis and spermatozoa.
Keywords : Male reproduction; Sterility; Antioxidants; Heavy metals, Wildlife
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1. INTRODUCTION
Heavy metal mining and smelting commonly contaminates air, water and soil compartments and this contamination is then transferred to biota through food chains. The accumulation of toxic heavy metals in some plants increases the risk of transfer to livestock and game animals (Chaney, 1989). Moreover, exposure of wildlife species to heavy metals can occur through the direct ingestion of soil associated with food items (Beyer and Fries, 2003) or as certain species instinctively lick soil to attain essential elements (Beyer et al., 2007).
In the province of Ciudad Real in southern Spain, the extraction of argentiferous galena started at the beginning of the 1st millennium B.C., and has continued intermittently ever since, with peaks of extraction and smelting activity occurring at the end of the 2nd century B.C., the end of the 15th and during the 16th century, and finally during the 19th 20th centuries (Hevia, 2003). This province became the major Pb producing area in Spain during the second half of the 19th century, but the last workings closed in 1988. Around 484 old mines and prospects are located in an area spanning approximately 2500 km 2, the majority of which targeted Pb–Zn veins. Other metals were also produced in the area though, i.e, Ag, Cu, Sb, Sn, W, As and Bi (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). The land affected by these mines has never been remediated, and heavy metal contamination has been reported in plants and animals sampled in the area (Reglero et al., 2008, 2009).
Although the Pb concentrations detected in liver of large game from mined areas in the Sierra Madrona were below the levels associated with clinical poisoning, red deer ( Cervus elaphus ) did have 39% less total glutathione (GSH) in liver, (than animals from control sites) indicating a measurable effect on oxidative stress due to metal exposure (Reglero et al., 2009). Heavy metal exposure induces oxidative stress in several tissues and in cells, including testis and spermatozoa (Stohs and Bagchi, 1996; Mateo et al., 2003; Doreswamy et al., 2004; Marchlewizc et al., 2004; Subramanian et al., 2006). Oxidative stress affects male fertility because it damages sperm membranes, decreasing both sperm motility and its ability to fuse with the oocyte (Tremellen, 2008). Spermatozoa are especially susceptible to oxidative stress due to the high level of polyunsaturated fatty acids (PUFA) in their membranes (Vernet et al., 2004). In ram (Ovis aries) spermatozoa, 45% of fatty acids are PUFAs (Castellanos et al., 2008). The generation of reactive oxygen species in sperm of Pb exposed mice has been linked to an increase in acrosome reacted spermatozoa (Hsu et al., 1998), suggesting that oxidative stress induced by Pb is implicated in premature capacitation.
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Despite knowledge regarding the adverse effects of Pb and other heavy metals on male reproductive function (Xu et al., 2003; Doreswamy et al., 2004; Marchlewizc et al., 2004; Subramanian et al., 2006), surprisingly few studies have been reported in wildlife (Blottner et al., 1999; Dauwe et al., 2004; Guillette et al., 2008). The key aim of our research was therefore to study the effect of elevated heavy metal uptake on the sperm quality and the antioxidant mechanisms of sperm and testis of red deer from mined areas in the Sierra Madrona, which are now largely devoted to, and occupied by, hunting estates.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Study area
The Sierra Madrona is in the northern part of the Eastern Sierra Morena in the Province of Ciudad Real, Southern Spain. The elevation here ranges between 500 and 1300 m. The climate is Mediterranean sub humid with marked seasons, and Mediterranean shrubland is dominant. During the sampling year (2005) Spain had the lowest annual rainfall since 1947, with only 279 mm in the Guadiana basin, where the study area is located (Spanish Meteorological Agency, http://www.aemet.es). The most important geological features in this area are a series of major Hercynian WNW–ESE trending anticlines and synclines. The lithostratigraphic sequence is composed of siliciclastic rocks with some interlayered volcanics and rare carbonate levels (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). The Montes de Ciudad Real region (where the control sites were located) has altitudes between 500 and 1000 m, has similar geomorphological, climatic and biogeographic characteristics to Sierra Madrona, and is considered to be part of the same natural macroregion (García Rayego, 1994). However, this area has not been widely mined historically and is not known to be rich in mineralised zones with high metal contents. The densities of red deer in managed hunting estates in the Sierra Madrona area (18.3 32.4 deer/100 ha) are within the range found in the Montes de Ciudad Real and Toledo area (11.3 90.1 deer/100 ha) (Vicente et al., 2007).
2.2. Sampling
Eight hunting estates were selected, six of them in mined areas within the Sierra Madrona, and two in control areas in the Montes de Ciudad Real. All sampling sites were in the Province of Ciudad Real (Figure 1). Testes of 44 adult red deer were obtained from
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hunters during the autumn of 2005 in the mining (n=21) and control (n=20) areas. Sampling took place after “monterias” (large driven hunts), which usually last 3 h, at the end of which the deer are butchered and samples were taken during this process. Testes were transported to the laboratory within 1 2 hours of being removed from carcasses, and processed immediately upon arrival at the laboratory. The length, diameter and weight of the right and left testes of each deer were recorded. Spermatozoa were recovered from the distal portion of the epididymis by cutting the caudae epididymides with a surgical blade and collecting oozing sperm mass as described by Soler et al. (2005), and placing it in 1 ml of phosphate saline buffer (pH 7.2; 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 0.1 g/l MgCl 2 6H 20, 0.1g/l CaCl 2, 1 g/l Na 2HPO 4, 0.15 g/l NaH 2PO 4, and 0.2 g/l KH 2PO 4) containing bovine serum albumin (at 5 g/l) and a final osmolality of 270 290 mOsmol/Kg. After spermatozoa collection, an inner portion of the parenchyma of the testis was frozen at 80ºC until analysis for oxidative stress biomarkers. Liver and bone sampling and processing for element analysis was previously described by Reglero et al. (2009).
Fig. 1. Study area in the province of Ciudad Real (S. Spain). The highest presence of Pb mines is found in the shaded area according to Palero Fernández and Martín Izard (2005). Some of the most relevant mines close to the sampling sites were Villagutiérrez (A), La Victoria (B), San Quintín (C), Santa Catalina (D), La Romanilla (E), Cabezarrubias del Puerto (F), Hinojosas de Calatrava (G), Mestanza (H), Las Minillas (I), El Horcajo (J), Fuencaliente (K), Diógenes (L), Los Pontones (M), Los Galayos (N) and Los Engarbes (O). The sampled hunting estates were Lagunillas (1), Hornias Bajas (2), Los Baldíos (3), El Girote (4), Zamorillas (5), El Burcio (6), La Garganta (7), Navalmartina (8).
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2.3. Sperm quality measurements
The individual motility, viability, and acrosome and plasma membrane integrities of spermatozoa were studied following the protocols described by Soler et al. (2005). Sperm concentration in the suspension was determined by microscopy in a Burker counting chamber. The % individual sperm motility was assessed in a small drop of sperm suspension held between a glass slide and a coverslip at 37 ºC under a phase contrast microscope (magnification x400).
2.4. Analysis of oxidative stress biomarkers
Lipid peroxidation estimated as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and reduced plus oxidized GSH (tGSH) were measured in homogenates of testis (0.5 g) or epididymal spermatozoa suspension (0.5 ml) following the methods described by Reglero et al. (2009). The activities of glutathione peroxidase (GPX; EC 1.11.1.9) and superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) of the supernatant of testis and spermatozoa homogenates were measured by micromethods using the Ransel and Ransod kits (Randox Laboratories). Enzyme activities were expressed relative to mg of protein in the supernatant of testis or spermatozoa homogenates (Reglero et al., 2009).
2.5. Elemental analysis
The concentration of Pb, Cd, Cu, Zn, As and Se were determined in testes by atomic absorption spectroscopy as described by Reglero et al. (2009). Pb and Se were also determined in spermatozoa suspensions (0.4 ml) after digestion in quartz tubes with 2 ml of
HNO 3 (65% Suprapur) for 12 h at room temperature. Then, 2 ml of H 2O2 (30% v/v Suprapur) were added to each tube which was gradually heated in a thermoblock up to 150ºC for 4 h.
Digested samples of spermatozoa were diluted to 5 ml with Milli Q H 2O prior Pb and Se analyses (Reglero et al., 2009). The limits of detection in testis (LODs, in g/g dry weight, back calculated to in tissue concentrations) were for Pb: 0.058, Cd: 0.003; Zn: 1.5, Cu: 3.7, As: 0.06 and Se: 0.046. The LODs in spermatozoa were 1.45 and 11.3 pg/106 cells for Pb and Se, respectively. A reference sample of bovine liver (BCR 185R, Community Bureau of Reference) was analyzed (n=8) and the recovery was 94.4±5.8% for Pb, 95.8±0.7% for Zn, 100.4±0.6% for Cu, 99.0±4.0% for Cd, 114±11% for As and 74.3±2.2% for Se. A reference sample of pig kidney (BCR 186) was also analyzed in duplicate and the recovery for Se was 82.6%.
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2.6. Statistical analysis
Data below the detection limit were assigned values of half of the respective LOD for each element. The concentrations of the elements were log transformed to attain or approach a normal distribution of the data. Differences in the concentration of the studied elements in testis and spermatozoa suspensions between control and mining areas were analysed with generalized linear models (GLM), taking into account the hunting estate as a nested factor within the area. Oxidative stress biomarkers and the parameters of sperm quality were also compared between areas with nested GLM as described before. The relationships between the testis and spermatozoa concentrations for the different elements analysed, the oxidative stress biomarkers and the parameters of sperm quality were studied with linear correlations, and also, when correlations were more significant, with analyses of covariance including the area (mined or control) as a factor, and the element concentration as a covariant. Liver and bone levels of elements were also compared between areas for the studied males to assess if the same differences observed by Reglero et al. (2009) were also observed in the present subsample of adult males. Statistical significance was set at p<0.05.
3. RESULTS
3.1. Differences between mining and control areas
The concentration of Pb in testis of red deer males was not significantly higher in the mining area than in the control sites (p=0.112; Table 1), but detectable levels were only observed in the mining area. Moreover, males from the mining area had lower levels of Cu in testis than males from the control sites (p<0.001; Table 1). No significant differences were noted for Cd, Zn, As or Se in testis between mining and control areas, but differences were found among hunting estates (Table 1). Lead and Se in the epididymal spermatozoa were not significantly higher in the deer from the mining area (Table 1). Liver Pb and Cu levels were significantly higher in males from the mining area than they were in control areas (mean (95%CI) in g/g d.w.; Pb: 0.60 (0.32 1.12) vs. 0.71 (0.03 0.16), p=0.001; Cu: 53 (38 74) vs. 29 (20 42), p=0.025). Other elements concentrations in liver and bone did not differ between areas.
The length, diameter and mass of testes of red deer from the mining area were 6%, 9% and 24% higher than in deer from the control areas (Table 2). However, the percentages of epididymal spermatozoa with acrosome and membrane integrity were 11% and 15% lower in
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the mining area (Table 2). Most of the studied parameters, especially acrosome integrity and membrane viability, also differed among estates (Table 2).
The level of tGSH was 15% higher in testis of red deer from the mining area than in the control area, and a significant difference also existed among hunting estates (Table 3). The activities of GPX and SOD were 16% and 14% lower in testis of red deer from the mining area than in the control area (Table 3). The activity of SOD in epididymal spermatozoa was also 42% lower in deer from the mining area (Table 3). GPX activity in spermatozoa showed the same trend observed in testis with a lower value in the mining area, although the difference was not significant (p=0.079, Table 3).
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3.2. Relationships between element concentrations, sperm quality and oxidative stress biomarkers
Concentrations in testis of Se were correlated positively with Zn (r=0.56, p<0.001). Cadmium was positively correlated with Pb (r=0.371, p=0.017) but negatively with Zn (r= 0.387, p=0.012). Other less significant correlations were observed in testis between As and Cu (r=0.33, p=0.035) and Zn and Pb (r= 0.317, p=0.044).
The concentration of Pb in spermatozoa was negatively correlated with Cu in testis (r= 0.334, p=0.035). No other significant relationships were noted between metals in testis and spermatozoa, likewise, no correlations were seen between levels of metals in spermatozoa. The activity of SOD in testis was positively correlated with Cu (r=0.472, p=0.002); and, spermatozoa membrane viability was positively correlated with SOD activity (r=0.490, p=0.020) and Cu levels (r=0.802, p<0.001) in testis (Figure 2). A significant correlation between testicular Cu level and acrosome integrity was also observed (r=0.664, p<0.001).
Fig. 2. Relationship between Cu levels in testis, spermatozoa membrane viability and SOD activity in testis. In the ANCOVA analysis, SOD activity in testis was positively affected by Cu (p=0.018) with no effect of area (i.e, mined or control; p=0.676) (left). Spermatozoa membrane viability was positively affected by Cu (p=0.001), with no effect of area (p=0.767) (center). The spermatozoa membrane viability was marginally affected by area (p=0.055), but not by the testicular SOD activity (p=0.411), although the correlation between spermatozoa membrane viability and SOD activity in testis was significant (r=0.490, p=0.020) (right).
The activity of GPX in testis was positively correlated with the membrane viability of spermatozoa (r=0.582, p=0.004), but interestingly, Se levels in testis were negatively correlated with GPX activity (r= 0.391, p=0.014) in testis and membrane viability of
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spermatozoa (r= 0.608, p=0.002; Figure 3). Testicular Se was also negatively correlated with acrosome integrity (r= 0.488, p=0.001) and spermatozoa membrane functionality (r= 0.372, p=0.023). GPX activity and Cu levels were correlated in testis (r=0.421, p=0.008).
Fig. 3. Relationships between Se levels in testis, spermatozoa membrane viability and GPX activity in testis. In the ANCOVA analysis, GPX activitywas negatively affected by Se (p=0.01), with area (i.e., mined or control) having an effect (p=0.037) (left). Spermatozoa membrane viability was negatively affected by Se (p=0.005), and an effect due to area was also noted (p=0.004) (center). The spermatozoa membrane viability was not significantly affected by area (p=0.099) or by the testicular SOD activity (p=0.131), although the correlation between spermatozoa membrane viability and GPX activity in testis was significant (r=0.582, p=0.004) (right).
The mass of the testis was negatively correlated with testicular Cu (r= 0.426, p=0.005) and Se (r=0.379, p=0.015), and similar correlations were found between the length of testis and these elements. In contrast, testicular Zn was positively correlated with length (r=0.470, p=0.002) and mass of testis (r=0.335, p=0.032).
TBARS in spermatozoa were negatively correlated with Zn (r= 0.319, p=0.042) and Se (r= 0.453, p=0.003) in testis. GSH in testis was associated with spermatozoa motility (r=0.393, p=0.012) and acrosome integrity (r=0.394, p=0.012). Arsenic in testis was correlated with testicular SOD activity (r=0.496, p=0.001) and GSH in spermatozoa (r=0.353, p=0.023). Lead in spermatozoa was negatively correlated with spermatozoa viability (r= 0.421, p=0.045).
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4. DISCUSSION
Red deer from the Sierra Madrona mining area showed higher Pb levels in liver and bone than in control sites (Reglero et al., 2008, 2009), and this difference was also reflected in a trend to increase in Pb in the testis. Moreover, several parameters and biomarkers pertinent to male reproduction such as testis mass and size, membrane viability and acrosome integrity of spermatozoa and antioxidant enzyme activities in testis and spermatozoa differed between the mining and the control areas. These differences were not, however, directly associated with Pb levels in testis and sperm, but instead showed significant relationships with Cu and Se in testis and with antioxidant enzymes, such as SOD and GPX, which are associated with, and have a requirement for, these elements. Lead levels >5 g/g d.w. in liver and >200 ng/ml in blood can be taken as chemical indicators of toxic exposure to Pb in mammals (Ma, 1996). This liver threshold was only exceeded in 5% of samples from red deer from the mined and control areas studied here. Adverse effects on male reproduction have been observed in humans and animals with >300 400 ng/ml of Pb in blood, and changes in spermatogenesis tend to be initiated at a concentration >2 g/g d.w. in testis, although important differences in Pb accumulation in testis may exist between species (Apostoli et al., 1998). The maximum testis Pb level in red deer from the mining area was 0.110 g/g d.w. The effects of mining pollution may had been exacerbated by the intense drought occurred in 2005.
Our results indicate that residual mining pollution in the hunting estates of the Sierra Madrona has affected Cu and Se homeostasis and distribution in tissues of red deer. For instance, red deer from the mining area showed higher Cu levels in liver (Reglero et al., 2009), but lower levels in testis than deer from the control sites. Moreover, levels of Se in liver from mined areas were higher than in control sites (Reglero et al., 2009), although this difference was not observed in testis or in liver of deer used in the present study. The mass of the testis was also higher in deer from mined areas, and this correlated positively with Se and Zn levels. Blottner et al. (1999) in a study on cadmium, also observed a higher mass of testis in roe deer ( Capreolus capreolus ) from a polluted area in Germany (when compared to control areas), and suggested this may be a feedback mechanism whereby more germinative epithelium tissue is generated to compensate for a decrease in the proliferation of spermatogenic cells.
Different forms of SOD are characterized by the transition metal found at their active sites. In eukaryotes, two forms of Cu/Zn SOD are found in the cytosol and in extracellular fluids, and Mn SOD is found in the mitochondria. In rat testis, in addition to cytosolic and
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mitochondrial SOD, Sertoli cells are capable of synthesizing and secreting extracellular Cu/Zn SOD (Mruk et al., 2002). During spermatozoa transit and storage in the epididymis, the cell undergoes a maturation process where the plasma membrane is modified, and this makes the spermatozoa highly vulnerable to oxidative damage (Vernet et al., 2004). In the epididymis, Cu/Zn SOD and the secreted form of this enzyme catalyse the dismutation of O2 to generate H2O2. High levels of GPX in the epididymis then convert H2O2 into H2O via the oxidation of GSH into GSSG (Vernet et al., 2004). In the red deer studied here, the SOD activity and the Cu concentration in testis show a positive relationship with spermatozoa membrane viability in the epididymis, which is as we would expect. Eghbali et al. (2008) also observed a positive correlation between Cu levels and SOD activity in seminal plasma of buffalo semen, and rats fed diets low in Cu have shown lower Cu/Zn SOD activity in testis and other tissues (Paynter et al., 1979). Interestingly, we have previously shown that Cu levels in soil, sediment, plant (Reglero et al., 2008) and deer liver (Reglero et al., 2009) are all higher in the mined areas than in the control areas utilised in this study. Hence, whilst elevated Cu exposure in red deer is demonstrated, testicular Cu is apparently depleted in mined areas when compared to control areas. It is known that high dietary levels of Mo can produce deficiencies in Cu (Johnson et al., 2007) and affect spermiogenesis (Van Niekerk and Van Niekerk, 1989). Since the hepatic Cu levels in deer from the mined areas were higher than those from the controls (Reglero et al., 2009), a Cu imbalance between tissues seems to be occurring in the deer from Sierra Madrona. Alternatively, a lower presence of SOD in testis may have reduced the incorporation of Cu in this tissue, but the evaluation of this hypothesis would need of the study of the expression of SOD in testis.
The other enzyme that could be significantly affected by mining pollution in deer testis and sperm is GPX. This is a selenoenzyme and Se levels are usually positively correlated with the activity of this enzyme when animals have low or normal Se dietary intakes (Lei et al., 1995; Kaushal and Bansal, 2007). In humans, the concentration of Se in seminal plasma is negatively correlated with oxidative damage of DNA in sperm and hence positively correlated with sperm quality (Xu et al., 2003). Nutritional studies have demonstrated the importance of Se for normal male reproduction function, and testis tend to have high concentrations of Se, especially in maturing animals when spermatogenesis begins (Behne et al., 1986). In rats, Lei et al. (1995) found the lowest activity of the classical intracellular form of GPX (GPX1), and the highest activity of the phospholipid hydroperoxide GPX (GPX4) in testis (as compared to other tissues). However, whilst Se status regulates GPX1, it does not specifically regulate GPX4 mRNA levels. Moreover, excess exposure to Se in male rats can actually decrease the GPX4 mRNA expression and reduce GPX activity in testis and liver (Gan et al., 2002). For the red deer studied here, liver Se levels were not different
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between the mining and the control areas, but we found evidence in previous studies to suggest that environmental exposure to elevated Se levels was occurring in this particular scenario (Reglero et al., 2008, 2009). Another explanation for the negative correlation we report here for Se against GPX activity and spermatozoa membrane viability may be related to Se speciation. Whilst we have determined total inorganic Se levels here, it is possible that the Se is actually in an organic form which renders it relatively unavailable for GPX synthesis in the testis. As expected, GPX activity was actually positively correlated with spermatozoa membrane viability. Understanding the speciation of Se in these tissues is important since it plays such a critical role in male reproduction. For example, Se covalently bound to proteins in forms like selenoprotein P (a major form found in plasma) would need to be broken down before the cell could utilize the element (Dumont et al., 2006).
The importance of the antioxidant system in testis to maintain healthy male reproductive function has been highlighted through studying natural processes like aging, or by observing exposure to toxic substances (Tremellen, 2008). Testosterone production by the Leydig cells decreases in aged rats and this is accompanied by a reduction in the activity of SOD and GPX and a decrease in glutathione levels (Luo et al., 2006). Where pollutants are concerned, several transition metals affect the antioxidant system of testis and sperm and hence the sperm quality. Monkeys exposed to chromium show decreased sperm counts and sperm forward motility, and this is accompanied by lower activities of SOD, catalase, and levels of GSH in sperm and seminal plasma in a dose and duration dependent manner (Subramanian et al., 2006). Mice exposed to nickel also exhibited a higher level of lipid peroxidation and DNA damage in testis (Doreswamy et al., 2004). Xu et al. (2003) found positive correlations between oxidative DNA damage in sperm and Cd in seminal plasma of humans, and negative correlations between these factors and the sperm concentration and viability. However, only a weak correlation was found between Pb in seminal plasma and oxidative DNA damage in sperm. Red deer from the Sierra Madrona mining area are exposed to a mixture of potentially toxic elements, and we have recorded elevated levels of Pb, Cd, Cu and Se in liver, Pb and Se in bone (Reglero et al., 2009), and Pb in testis. The interactions between heavy metals have also been investigated in vitro with salmon sperm. Copper showed a synergistic effect with Cr on oxidative DNA damage, whilst oxidation was diminished by the addition of Cd or Ni (Moriwaki et al., 2008). Moreover, the accumulation of certain essential elements can be affected by overexposure to others (essential or otherwise). A well known example relates to the accumulation of Se in tissues which is triggered by Hg exposure (Rooney, 2007). Although Hg levels in predators from Sierra Morena have been shown to be low (Millán et al., 2008), further work should be done on Hg levels in deer to study its possible interaction with Se and male reproductive function.
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5. CONCLUSIONS
The study of male sperm function in wildlife offers the opportunity to utilise a novel suite of biomarkers to evaluate exposure to environmental pollutants. In deer from the Sierra Madrona mining area we have observed a significant increase in the mass of the testis in comparison with control animals, and further work will be necessary to study the histopathological changes associated with this tissue proliferation. Moreover, epididymal spermatozoa membrane viability and acrosome integrity were significantly reduced in the deer from the mining area. However, these effects were not directly associated with observed increases in Pb concentrations in testis or spermatozoa, but were correlated with decreases in the activity of SOD and GPX in testis and spermatozoa. The effects of mining pollution on sperm quality of deer may be related to changes in Cu and Se homeostasis in tissues, since their levels in testis were associated with the observed reductions in SOD and GPX activities, respectively. In the case of Se, contrary to common findings in nutritional studies, levels were negatively associated with GPX activity and spermatozoa viability. Further work is now necessary to identify changes in the expression of these antioxidant enzymes, and to investigate the speciation of Se in order to determine its availability for GPX synthesis in testis.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank E. Arias, P. Talavera and D. Vidal for their help with sample collection, and J.J. Garde, P. Camarero, S. Sánchez Maroto, for their help with laboratory work. This project was funded by a grant from the Department of Education and Science of the Autonomous Government of Castilla La Mancha (PCC 05 004 2) and a grant from the University of Castilla La Mancha.
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CAPÍTULO 4
Should legislation regarding maximum Pb and Cd levels in human food also cover large game meat?
Taggart MA, Reglero MM, Camarero PR, Mateo R. 2011. Should legislation regarding maximum Pb and Cd levels in human food also cover large game meat? Environment International 37, 18 25.
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¿Debería la legislación respecto a niveles máximos de Pb y Cd en comida para consumo humano cubrir además la carne de caza mayor?
RESUMEN
La carne de caza puede estar contaminada por metales y metaloides si los animales residen en zonas contaminadas, o si la munición usada para cazar contamina la carne. El tejido muscular de ciervos y jabalíes abatidos en la provincia de Ciudad Real (España) en 2005 2006 fue analizado para As, Pb, Cu, Zn, Se y Cd. Las muestras se tomaron de fincas cinegéticas localizadas dentro y fuera de un área históricamente afectada por actividades mineras, de fundición y refinado de varios metales y metaloides. La carne destinada a consumo humano tuvo más Pb, As y Se (ciervo) y Pb (jabalí) cuando procedió de animales cazados en zonas mineras. La acumulación de Cd, Zn y As (ciervo) y Cd, Cu y Se (jabalí) se relacionó con la edad. La carne de dos jabalíes tuvo altos niveles de Pb, del orden de 352 y 2408 g/g d.w., lo que es probablemente debido a contaminación por la munición usada. Asimismo, el 19 84% de todas las muestras (dependiendo de la especie y la zona muestreada) tuvieron niveles de Pb >0.1 g/g w.w., el nivel máximo (MRL) permitido para la carne criada en granjas. Entre el 9 y el 43% de las muestras superaron además los límites establecidos para el Cd. Estos datos destacan una discrepancia entre lo que es considerado seguro para consumo humano en carne de animales criados en granja (pollo, ternera, cordero), respecto a lo que puede encontrarse en carne de caza. Se presenta una evaluación de riesgo que describe el número de comidas requeridas para exceder las máximas ingestas semanales tolerables (PTWIs) para Pb y Cd, y la contribución potencial del consumo de carne de caza mayor a estos criterios de ingesta.
Palabras clave : Caza mayor; Carne de venado; Jabalí; Minería metálica; Cadena trófica; Niveles máximos.
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ABSTRACT
Game meat may be contaminated with metals and metalloids if animals reside in anthropogenically polluted areas, or if ammunition used to kill the game contaminates the meat. Muscle tissue from red deer and wild boar shot in Ciudad Real province (Spain) in 2005 06 was analysed for As, Pb, Cu, Zn, Se and Cd. Samples were collected from hunting estates within and outside an area that has been historically used for mining, smelting and refining various metals and metalloids. Meat destined for human consumption, contained more Pb, As and Se (red deer) and Pb (boar) when harvested from animals that had resided in mined areas. Age related accumulation of Cd, Zn and As (in deer) and Cd, Cu and Se (in boar) was also observed. Two boar meat samples contained high Pb, at 352 and 2408 g/g d.w., and these were likely to have been contaminated by Pb ammunition. Likewise, 19 84% of all samples (depending on species and sampling area) had Pb levels > 0.1 g/g w.w., the EU maximum residue level (MRL) for farm reared meat. Between 9 and 43% of samples exceeded comparable Cd limits. Such data highlight a discrepancy between what is considered safe for human consumption in popular farmed meat (chicken, beef, lamb), and what in game may often exist. A risk assessment is presented which describes the number of meals required to exceed current tolerable weekly intakes (PTWIs) for Pb and Cd, and the potential contribution of large game consumption to such intake limit criteria.
Keywords : Large game hunting; Venison; Wild boar; Metal and metalloid mining; Food chain transfer; Maximum residue levels.
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1. INTRODUCTION
In Ciudad Real (south central Spain), large game hunting is popular and a major source of financial income. Approximately 40000 big game are shot each year (mainly red deer ( Cervus elaphus ) and wild boar ( Sus scrofa)) within Castilla la Mancha, the semi autonomous region in which Ciudad Real is the largest of five provinces. However, along Ciudad Real´s southern border there are also extensive areas that have been used historically for metal/metalloid mining, refining and smelting (Palero Fernández and Martín Izard, 2005). In Almadén, one of the world’s largest reserves of cinnabar (mercury) has been mined for >2000 years (Hernández et al., 1999). Likewise, within the Sierra Madrona Mountains and adjacent Alcudia valley (which marks the south west Ciudad Real border) 484 old mines lie across a 2500 km 2 area. Many mines targeted Pb Zn, but other metals and metalloids such as Cu, Sb, Sn, and As were also extracted. Mining began here in the 1st millennium B.C. and continued intermittently until 1988 when the last mine closed (Hevia, 2003). The majority of land affected by these operations has never been remediated, and elevated metal and metalloid levels have been reported in river water, sediments, soils, plants, and in game species living in this zone (Reglero et al., 2008). Further, in red deer, exposure may be initiating oxidative stress, altering tissue fatty acid profiles, and causing subtle toxic effects on (for example) sperm quality (Reglero et al., 2009a, 2009b; Castellanos et al., 2010).
At the same time, game meat may also pose a rather poorly regulated risk to human health. For example, Pb ammunition residues may remain in processed meat products and enter the human food chain. Several recent reports (Guitart et al., 2002; Guitart and Thomas, 2005; Johansen et al., 2006; Hunt et al., 2009; Pain et al., 2010) have questioned whether meat from animals shot with Pb ammunition is safe, as our knowledge has improved regarding Pb toxicity (Jedrychowski et al., 2009), as recommended intake thresholds have decreased (EFSA, 2010), and as work has shown how extensively Pb ammunition can become fragmented along/surrounding ammunition entry paths (Hunt et al., 2006, 2009; Tsuji et al., 2009). In addition to the risk posed by tiny Pb bullet/shot fragments in meat, the environment in which game is reared must also be considered. In areas where underlying geology is enriched in potentially toxic elements (Pb, Cd, Hg and As), or where anthropogenic pollution exists, a further additive risk may exist if pollutants are transferred through food chain pathways and become elevated in game which is then eaten by humans (as observed previously in livestock Farmer and Farmer, 2000; Sharpe and Livesy, 2005).
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The aim of this research was to investigate whether exposure to metals and metalloids in game in the Sierra Madrona Mountains/Alcudia valley area (Reglero et al., 2008) has also in turn, caused meat to contain levels of toxic elements that may (given current limits) pose a potential risk to human health, or the health of “at risk” groups such as children or hunters (who may consume higher than average amounts of such meat). We present data on Pb, Cd, Zn, Cu, As and Se in muscle tissue from hunted red deer and wild boar, and discuss results in light of current tolerable weekly metal and metalloid intakes (PTWIs) and maximum residue levels (MRLs) for reared/farmed meat. We also consider results in terms of location (whether game were shot within or outside mined areas), gender, age, and species, all of which may be relevant when assessing any risk posed. For example, perhaps consumption of meat from animals living in anthropogenically polluted areas increases risk, and/or hunting practices that preferentially select certain gender, age class, or species may affect exposure.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Study area
The Sierra Madrona Mountains and Alcudia Valley (which contains the mined zone) are in the northern part of the eastern Sierra Morena Mountains, and in the south western zone of Ciudad Real province (Figure 1). Elevation ranges from 500 1300 m, climate is Mediterranean sub humid with marked seasons, and Mediterranean shrubland dominates. The Montes de Ciudad Real region (where the control sites were located) has altitudes between 500 1000 m, similar geomorphological, climatic and biogeographic characteristics to Sierra Madrona, and is considered to be part of the same natural macroregion (García Rayego, 1994). However, this area has not been widely mined, and is not recognised to be rich in mineralised zones containing high metal and metalloid levels.
2.2. Sampling
Thirteen hunting estates were sampled, 7 in mined, 6 in control areas (Figure 1). Muscle tissue from the adductor muscle (medial part of leg) was taken from 88 red deer (51 from mined, 37 from control areas) and 42 wild boar (31 mined, 11 control). Care was taken to avoid tissue near to, or visibly damaged by bullet entry or fragmentation. Samples were all from hunter shot animals, and were collected between October 8th 2005 and February 19th 2006, after “monterias” (large driven hunts), at the end of which animals are butchered and
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subsequently enter the human food chain. Samples were cooled in a portable cooler, then transferred to a 20ºC laboratory freezer (within two hours) and stored until analysis.
Fig. 1. Map showing the study area within the province of Ciudad Real (Spain). The highest prevalence of Pb mines is found within the shaded area according to Palero Fernández and Martín Izard (2005). Some of the most relevant/largest mines, close to the sampling sites, were Villagutiérrez (A), La Victoria (B), San Quintín (C), Santa Catalina (D), La Romanilla (E), Cabezarrubias del Puerto (F), Hinojosas de Calatrava (G), Mestanza (H), Las Minillas (I), El Horcajo (J), Fuencaliente (K), Diógenes (L), Los Pontones (M) and Los Galayos (N). The hunting estates sampled were Peñas Amarillas (1), Lagunillas (2), Torneros (3), Hornias Bajas (4), Aeropuerto (5), Pozo del Borrico (6), Los Baldíos (7), El Girote (8), Zamorillas (9), El Burcio (10), La Garganta (11), Navalmartina (12), and El Hoyo (13).
Sex was recorded during sampling; 54 male and 34 female deer were sampled, as were 11 male and 9 female boar (sex was not recorded for all boar). The 88 deer were classed (by field observation) as juveniles (<2 years old, n=10), and subadults/adults (≥2 years old, n=78). Thirty six boar (of the 42 total) were aged using fur characteristics (Saenz de Buruaga et al., 1991), and classed as juveniles (0.5 1 year old, n=10), subadults (>1 2 years old, n=11) and adults (>2 years old, n=15).
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2.3. Elemental analysis
Muscle tissue was freeze dried (using a Christ Alpha 1 2, Braun Biotech system) and samples (0.5 g) were digested with 3 ml of HNO 3 (69% Analytical Grade), 1 ml of H 2O2 (30% v/v Suprapur) and 4 ml of H 2O (Milli Q grade) using a microwave oven system (Ethos E, Milestone) as described previously (Reglero et al., 2008). Digests were diluted to 50 ml final volume with Milli Q.
Arsenic, Se, Cd and Pb were analysed using a graphite furnace atomic absorption spectroscopy system (AAnalyst 800 equipped with AS 800 autosampler, Perkin Elmer), using
50 g of NH 4H2PO 4 and 3 g of Mg(NO 3)2 as matrix modifiers in each atomization for Pb and
Cd, and 5 g of Pd and 3 g of Mg(NO 3)2 for As and Se. Copper and Zn were analysed using a flame atomic absorption spectrometer system (AAnalyst 800 equipped with AS 90 plus autosampler, Perkin Elmer). Calibration solutions were prepared from commercial certified stock standard solutions containing 1 g/l of each element. Limits of detection (LODs, in g/g dry weight, back calculated to in tissue concentrations) and limits of quantification (LOQs; in parentheses) were, for Pb: 0.066 (0.220), Cd: 0.004 (0.013); Zn: 1.4 (4.7), Cu: 13.2 (44.0), As: 0.044 (0.147) and Se: 0.020 (0.067). Blanks were processed in each digestion batch.
Certified reference material (CRM; bovine liver, BCR 185R, Community Bureau of Reference) was analyzed (n=4) and the percentage recovery (mean ± relative standard deviation) was 93.9 ± 9.2% for Pb, 95.3 ± 1.5% for Zn, 100.4 ± 1.3% for Cu, 91.8 ± 1.1% for Cd, 105.1 ± 28% for As (certified As concentration was 2.4. Statistical analysis Data 108 Reglero et al., 2009b) were re analysed against muscle Pb using a linear regression to assess whether there had been muscle contamination with Pb ammunition (in which case, regression outliers may be obvious). 3. RESULTS Muscle Pb was higher in deer and boar from mined areas than in control areas (p<0.001 and 0.010 respectively; Table 1). Levels were very high in two boars from the mined zone (353 and 2408 g/g d.w. Pb). Excluding these outliers (probably Pb ammunition contaminated) muscle Pb remained higher in boars from the mined areas (p=0.011; mean, 95% CI and range: 1.756, 0.885 3.483, Correlations between muscle and liver Pb were significant for deer (r=0.532, p<0.001) and boar (r=0.730, p<0.001 (when excluding the two outliers)) from mined areas, but not in control areas. We also observed differences between muscle harvested in control and mined areas for Zn, As and Se in deer, and Cu in boar (Table 1). Arsenic and Se were higher in deer from mined areas (p<0.001 and 0.043 respectively), but Zn in deer and Cu in boar were lower (p=0.008 and <0.001, respectively). In GLMs for deer, area (mined or control; with estate as a nested factor), remained significant for Pb, Zn, As and Se (p=0.004, 0.006, 0.039, 109 and <0.001, respectively) and became significant for Cu (p<0.001; in comparison to t test results shown in Table 1). For boar, area remained significant for Pb (p<0.001), became significant for Cd (p<0.001) and Zn (p=0.001), but ceased to be significant for Cu. Fig. 2. Regression (with 95% confidence and prediction intervals) for Pb levels in the muscle and liver of red deers ( Cervus elaphus ; squares) and wild boars ( Sus scrofa ; circles) hunted in historically mined (black symbols) and control (white symbols) areas of the province of Ciudad Real in 2005–06. The two outlier muscle samples highlighted were assumed to have been contaminated by fragments from the Pb bullets used to kill these two wild boars. Several differences were noted between species from each area (Table 1). Here, boar from mined areas had higher muscle Pb and Se (p=0.001 and <0.001, respectively), but lower Cd and As (p=0.012 and 0.045) than deer; and boar from control areas had less Cd and Zn (p=0.002 and 0.011) but more Cu and Se (both at p<0.001) than deer. The GLMs indicated that sex was not significant in determining levels of all metals and metalloids in both species. However, age class was significant in deer for Cd, Zn, and As (p=0.004, 0.007, and 0.007, respectively) and in boar for Cd, Cu, and Se (p=0.005, 0.002 and <0.001). The nature of these differences is demonstrated in Figure 3. 4. DISCUSSION Briefly, results highlighted several key issues. Firstly, as noted in a number of studies (Cornatzer et al., 2009; Hunt et al., 2009), in two boar cases, muscle tissue was highly Pb contaminated, and this was almost certainly caused by ammunition impact fragmentation. In 110 addition, for several toxic metals and metalloids, meat from animals hunted in historically mined areas contained elevated levels in comparison to that from controls (Table 1). Finally, notable differences were observed between species and age classes, which may affect the likelihood of exposure and the risk posed to human consumers by such game. Fig. 3. Regression (with 95% confidence and Metal and metalloid levels in muscle tissue of red deer (Cervus elaphus ; left) and wild boar ( Sus scrofa ; right) hunted in historically mined and control areas of the province of Ciudad Real in 2005–06 with respect to animal age. Box plots show the median, 10th, 25th, 75th and 90th percentile. Points represent the 5th and 95th percentiles. Control data is not shown for deer since all animals were adults/subadults. On the y axes, JUV = juveniles, AD = adult, SUB = subadult, and n values are given in parentheses. 111 4.1. Differences noted between mined and control areas, species, and age class By area, deer from mined zones had elevated Pb, As and Se (but lower Zn), whilst boar had elevated Pb (but lower Cu). Previously, Reglero et al. (2008) indicated that in these mined zones, Pb and As contamination is most significant, i.e., maximum mean levels in river sediments were >1400 g/g and >1800 g/g respectively. Likewise, plants often had elevated Pb and As, levels of which were often correlated (Reglero et al., 2008). In contrast, Cu, Zn and Se are essential elements and hence tissue level and location (mined versus control) relationships may be expected to be less linear. Likewise, Reglero et al. (2008) showed that Zn and Cu in mined areas (whilst higher than in control zones) were not particularly high; maximum mean Zn was >70 g/g and >50 g/g, while Cu was >30 g/g and >60 g/g in river sediments and soils respectively. It is therefore unsurprising that elevated levels in animals from mined areas have not been clearly noted, and that in fact, we observe the reverse. This may suggest that, while Cu and Zn exposure/intake may still be slightly higher in mined areas, turnover and utilisation may also be greater. This could be linked to increased generation (which requires Zn/Cu) of protective metal binding metallothionein proteins, as triggered by increased exposure to toxic elements (Cd, Pb, As) and elevated oxidative stress. In mined areas, Pb and Se were higher in boar than deer, but Cd and As were lower; in control areas, boar had higher Cu and Se, but lower Cd and Zn. This pattern may relate to differing feeding habits. Red deer are herbivorous, browse (rather than graze) on elevated plant parts, and consume mainly tree foliage, shrubs and larger herbaceous species (Alvarez et al., 1991; Martinez, 2002). However, boar are more omnivorous, and although much of their diet is plant based, a significant seasonally variable amount of non plant (snails, terrestrial arthropods, eggs) matter will also be eaten (Giménez Anaya et al., 2008). Also, since boar commonly root within soil for sub surface items (tubers, rhizomes, bulbs), exposure to contaminated soil is likely to be higher (Taggart et al., 2009). These behavioural differences may explain why boar had higher Pb, Cu and Se than deer, irrespective of area. A similar trend was noted in liver for Pb, Zn, As and Se, but the reverse was noted for Cu and Cd (Reglero et al., 2009b). Cadmium here was consistently lower in boar than deer (as was Zn in controls), and Santiago et al. (1998) indicated (for animals from nearby Sierra Morena) that boar also had higher hepatic/renal Pb, but lower renal Cd than deer. Given that boar may be more exposed to mine polluted soil when feeding, in this case, it may be that deer are consuming more Cd 112 (and Zn) via specific food sources. Rockrose ( Cistus sp.; ladanifer and salvifolius ) and grey willow ( Salix atrocinerea ) were noted in Reglero et al. (2008) to have high Cd (and Zn) when compared to other plants in these areas, and the latter is certainly more likely to be eaten by deer, whilst Cistus sp. is known to be consumed by Spanish red deer (Carranza, 2004). Likewise, Salix sp. have been implicated previously in Cd related food chain toxicity in wildlife (Larison et al., 2000; Gamberg et al., 2005). Salix sp. is also known to accumulate Zn (Pugh et al., 2002), and this may be reflected here (in control areas). Further, Reglero et al. (2008) reported a fairly strong inter metal relationship between Zn and Cd in deer liver. In deer from mined areas Cd, Zn and As increased with age, while in control boars temporal increases in Cd, Cu and Se were noted (Figure 3). In elk muscle collected near the Sudbury metal smelting area (Ontario), Zn and Cd also increased from calf to adult (Parker and Hamr, 2001); and in Croatian red deer, Lazarus et al. (2008) observed accumulation in kidney and muscle. In wild red deer and boar from the Netherlands, Cd increased with age in liver and kidney, and tended to be higher in wild than in farmed individuals (Wolkers et al., 1994); while in 4 Canadian studies highlighted by Gamberg et al. (2005), moose kidney also showed age related Cd accumulation. For Cu, Se, As, and Zn, age related accumulation in muscle is not something consistently observed in previous studies, however, age dependent Cd accumulation in game/ungulate soft tissue (liver and kidney) is now well recognised (Wolkers et al., 1994; Parker and Hamr, 2001; Lazarus et al., 2008). Once ingested Cd has a long soft tissue half life (10 30 years) and accumulation is common, especially if animals are exposed to elevated Cd sources in diet over their lifetime (Lazarus et al., 2008). Fewer studies note Cd accumulation in muscle with age, but there is perhaps a lack of published data available regarding this tissue type. Indeed, Rudy (2009a, 2009b, 2010) suggests muscle accumulation may occur in several ungulate species. 4.2. Implications of data for human consumption In terms of meat contaminated with Pb ammunition, we noted that two boar samples contained 353 and 2408 g/g d.w Pb. In 2002, Haldimann et al. suggested in “Intake of lead from game meat – a risk to consumers’ health?”, that “frequent consumption of wild game meat has no significant effect on blood lead” and that “this type of food does not represent a relevant risk of exposure to Pb to the consumer’s health”. Since then, several studies have provided convincing evidence that this is unlikely to be true. It is now thought (EFSA, 2010) that there is probably no “safe” threshold PTWI for Pb intake in humans, since at very low exposures, significant adult nephrotoxicity may occur, and neurocognitive and 113 neurodevelopmental risks are posed to (in particular) the unborn fetus and young (<6 years) children (Jedrychowski et al., 2009; Kosnett, 2009; Jusko et al., 2008; Menke et al., 2006; Needleman, 2004). At the same time, Pb bullets are now known to fragment as they pass into/through game, and hundreds of tiny fragments may radiate into tissues up to distances of 45 cm from the bullet path (Cornatzer et al., 2009; Hunt et al., 2009). This means it is almost impossible to eliminate this source of food contamination, as long as Pb bullets remain in use. Packaged/processed large game meat can contain a significant amount of ammunition derived fragmented Pb (Cornatzer et al., 2009), and when such meat was fed to pigs (as a human model), mean pig blood Pb quadrupled to 2.29 g/dl (compared to 0.63 g/dl in controls) within two days of consumption (Hunt et al., 2009). Further, Iqbal et al. (2009) monitored 742 human subjects (from Dakota) and demonstrated that those who ate game had 0.3 g/dl higher blood Pb than those who did not. The levels noted here in boar meat contaminated by ammunition are also not dissimilar to data presented previously, i.e., Cornatzer et al. (2009) have shown using fluoroscopically guided biopsies of packaged ground venison, that Pb levels can reach 4200 55000 g/g d.w. (n=5); while Tsuji (2009) showed that white tailed deer muscle tissue contained up to 867 g/g w.w. (2948 d.w.), and caribou muscle had up to 5726 g/g w.w. (19468 d.w.). Although we only identified two boar samples to be ammunition contaminated (4.8% of boar), all animals sampled were almost certainly shot with copper jacketed Pb nosed bullets, and as such, a proportion of the processed meat derived from all these animals might reasonably be expected to contain localised concentrations of Pb contamination at or above the orders of magnitude mentioned. Despite increasing scientific concern regarding Pb ammunition contamination of game meat, there is currently no legislative MRL for Pb in game meat in the EU. In reared meat (i.e., farmed chicken, lamb, pork, beef) the current Pb MRL is 0.1 g/g w.w. (EC 466/2001), equivalent to ~0.34 g/g d.w. Game meat has perhaps historically been excluded from the legislative framework since it may be consumed by a limited proportion of the population in any given country, and likewise, it has not (in the past) been widely marketed outside specialist butchers/restaurants (i.e., in supermarkets). The first of these assumptions (and to an increasing degree, the second) is not, however, well supported by current information. Certain subsistence communities rely on shot game, some of which have been clearly shown to be exposed to ammunition Pb in meat in Canada (Hanning et al., 2003; Tsuji et al., 1996, 2008), Russia (Odland et al., 1999), and Greenland (Johansen et al., 2001). Likewise, in Alaska, Titus et al. (2009) estimate that 12% of the population (84000 people) is licensed to hunt game, and 60% of rural households harvest game, while 86% consume it. In the US 114 and Canada, hunted game meat is commonly donated/distributed to the poor, and Avery and Watson (2009) estimate that >6.2 million lbs of game meat may provide >25 million meals across the US year 1. Likewise, Watson and Avery (2009) estimate that in 2006, 6% of the US population (12.5 million people) >16 years of age hunted, as did 1.6 million children aged 6 15 years. Hunting expenditure was estimated at $23 billion (Iqbal et al., 2009). In Europe, “The Federation of Associations for Hunting and Conservation of the EU (FACE)” estimates there are >7.3 million hunters (FACE, 2009), i.e., about 1.5% of the total EU population. Large regional differences exist though, with proportions hunting by country ranging from 8.9% in Ireland (1:12 people) to 0.1% in the Netherlands (1:626). In Spain 1:44 or 2.3% hunt (almost 1 million individuals). Such figures indicate that large numbers of humans globally are potentially being exposed to Pb ammunition fragments via game meat, and hunters also provide large volumes of meat to other consumers (family, children, the poor, or those purchasing shot game). Figures regarding hunter numbers alone are therefore likely to underestimate exposure within the total population. Game is now being made increasingly available to the consumer via restaurants, supermarkets and high street butchers, and is often promoted as a healthy, “wild” alternative to otherwise often intensively farmed meat products. In addition to Pb ammunition contamination, we also show here that game residing in unremediated mined areas has higher muscle levels of several toxic metals and metalloids. In terms of assessing the risk posed to the consumer by the meat analysed, since specific MRLs do not exist within the EU for game, as a first approach we consider here those currently used for regulated farmed meat. The EU MRL for Cd in this case is 0.05 g/g w.w. (or 0.17 g/g d.w.) while for Pb it is 0.1 g/g w.w. (or 0.34 g/g d.w.; EC 466/2001). An equivalent MRL for As has not been set. EC 1881/2006 also gives an MRL for Pb in food to be eaten by children at 0.02 g/g w.w. (or 0.068 g/g d.w.). In addition to available MRLs, PTWIs have been defined by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA, 1999) for Pb at 25 g/kg b.w., for Cd at 7 g/kg b.w., and for As at 15 g/kg b.w.. Further, in 2009 and 2010, the European Food Safety Authority (EFSA) updated its PTWI recommendations in relation to Pb, Cd and As (EFSA, 2009a, 2009b, 2010). The EFSA recommended reducing the Cd PTWI to 2.5 g/kg b.w. (used here), and very importantly, for Pb and As, determined that existing PTWIs were no longer appropriate since evidence of adverse effects had now been reported at exposure levels well below these limits. Many would in fact consider there to be no “safe” threshold for either element. In terms of As, since we do not provide organic versus inorganic speciation data here, since only 23% of our data was actually >LOD, and since MRLs/PTWIs are lacking, the remainder of the discussion will focus simply on Pb and Cd. 115 In order to compare our results with available Cd and Pb MRLs and PTWIs, firstly, Figure 4 shows the percentage of samples of boar and deer from mined and control areas with muscle levels over these MRLs. In this case, a high percentage of muscle tissue destined for human consumption exceeded these limits. In general, the proportion of samples exceeding these limits was higher in animals from mined zones, but in the case of Cd in deer, there was actually little difference between the two areas (which may support the hypothesis that a plant, rather than a mine pollution based Cd source, is significant here). In terms of Pb, the proportion of samples exceeding the MRL was higher for boar than for deer, irrespective of area, whilst the reverse was true for Cd. Also, if we were to apply a Pb MRL proposed to protect children (0.068 g/g d.w.), 83.1% of all samples tested would exceed this MRL. It should also be noted, that whilst Pb ammunition residues may not be entirely bioavailable/accessible upon ingestion, biologically incorporated tissue (muscle) bound Pb is far more likely to be readily dissolved and absorbed during passage through the human digestive tract. In terms of PTWIs, Table 2 provides estimates regarding a variety of exposure scenarios. In this case, if Pb ammunition contaminated samples are included in the analysis, a 70 kg adult would only need to eat between 0.03 (equivalent to 4.5 g) and 1.7 meals (255 g) per week of this type of game meat to exceed the PTWI. Even assuming ammunition fragment Pb is less bioavailable, if just 10% is absorbed, only 0.3 meals (45 g) per week would be required. The presence of Pb ammunition fragments in such meat is therefore quite clearly incompatible with Pb consumption levels below the 25 g/kg b.w. PTWI. When ammunition contaminated meat is excluded from the analysis, the consumption of boar meat poses a greater risk than does that of deer, and the lowest risk is posed by deer and boar from the control areas. In terms of Cd, nominal consumption of this game (1 meal per week) would contribute <6% to the 2.5 g/kg b.w. PTWI in all scenarios. However, higher consumption rates (4 meals a week) may contribute significantly to the PTWI (up to 23%), and again the contribution is less if animals are sourced from uncontaminated areas, and in this case, boar pose a lower risk. Whilst Figure 4 and Table 2 provide important indications regarding meat quality and risks posed, it is very important that they are viewed in light of two other key factors. Firstly, these exposures are not isolated, i.e., consumers are constantly exposed to various additional sources of Cd and Pb via other lifestyle/environmental factors. In actuality, this “background” exposure may be very significant in the EU since, for example, Nasreddine and Parent Massin (2002) suggest dietary intake from regulated foodstuffs in Europe for Pb may be such that (depending on country) consumers already ingest 17 – 131% of the Pb PTWI, 116 and 17 – 50% of the old 7 g/kg b.w. Cd PTWI. Using the new 2.5 g/kg b.w. Cd PTWI this existing exposure would be 48 – 140%. Secondly, and this is critical, the EFSA no longer consider the 25 g/kg b.w. PTWI for Pb to be appropriate, hence Table 2 is inherently highly conservative. Even if the old PTWI were to fall by just 50% to 12.5 g/kg b.w., consumers eating Pb ammunition free boar meat would only need to eat 3 4 meals per week to exceed the PTWI. Fig. 4. Lead and Cd levels in muscle tissue of red deer ( Cervus elaphus ) and wild boar (Sus scrofa ) hunted in historically mined and control areas of the province of Ciudad Real in 2005–06. The control lines (at 0.34 g/g d.w. for Pb and 0.17 g/g d.w. for Cd) show the current statutory EU maximum residue level (MRL; from EC 466/2001) for Pb and Cd in poultry and other non game (farmed) meat to be consumed by humans. Percentages given show the proportion of meat samples containing levels in excess of the respective MRL. To conclude, this study, amongst others (Mateo et al., 2007; Pain et al., 2010) highlights a significant discrepancy that currently exists between what is considered safe for human consumption in popular farmed meat such as chicken, beef, lamb and pork, and what in game, may actually exist. A lack of EU legislation regarding MRLs in game meat may thus 117 leave consumers at risk from the effects of potentially highly toxic elements such as Pb, Cd, As and Hg. Further, since data regarding muscle tissue levels in wild large game species is actually fairly scarce, a lack of information is available within Europe and beyond to allow a thorough risk assessment of this issue. Given the quantity of game meat that is clearly being consumed worldwide, this represents a lack of data which should be addressed. Perhaps the highest priority for legislators at the moment is undoubtedly Pb in this context, since in many ways this is recognised as the easiest contaminant/issue to deal with. Highly elevated Pb levels in game meat could easily be reduced and addressed with suitable legislation banning the use of Pb based ammunition in game hunting, primarily in order to protect the human consumer. There are now many adequate lead free ammunition alternatives available, but a lack of legislative action is currently preventing the uptake/use of these which may have significant human health implications; besides the now well documented implications of continued use of Pb ammunition on wildlife/the environment (Mateo, 2009). Food safety legislation in the EU and beyond should act to protect the welfare of all citizens, whether they be hunters, their families/friends, pregnant women, children or subsistence communities, no matter what proportion of the population these groups represent. The scale of this issue is such that it should not be underestimated on the basis of 118 hunting being a minority activity, or because game may be a relatively rarely consumed food item for a large proportion of the population. EU regulations regarding food safety are founded on the principle of keeping contaminants (such as Pb) “at the lowest possible levels” such that “no foodstuffs containing an unacceptable amount of residual substances may be marketed” (EEC 315/93). This seems starkly at odds with the continued use of Pb based ammunition to kill animals that then enter the human food chain. In this particular study we have also highlighted a case where anthropogenic pollution (from mining) has also resulted in game meat having elevated metal and metalloid levels, and this may be a situation that is not uncommon globally, but unfortunately, because there are very few studies of this nature which focus on muscle tissue (rather than liver or kidney), the scale of this particular contamination pathway is currently difficult to assess. In this case, in the Sierra Madrona Mountains/Alcudia valley, further action should be taken to effectively restrict access to mined areas for game animals whose meat could enter the human food chain, and where feasible, contaminated areas should be remediated appropriately. Further monitoring is needed to assess the scale of this issue within Spain and further afield, as is more research regarding specific trace metal and metalloid exposure pathways for common game species. ACKNOWLEDGMENTS We would like to thank Lidia Monsalve González for her help with the laboratory work, the hunting estate owners for allowing us to take samples after the hunts, and the butchers for their assistance during sampling. This project was funded by a grant from the Department of Education and Science of the Autonomous Government of Castilla La Mancha (PCI 08 0096) and a grant from the University of Castilla La Mancha, Spain. REFERENCES Alvarez, G., Martinez, T., Martinez, E., 1991. 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Los procesos y tecnologías empleadas eran ineficientes, y como consecuencia, los residuos resultantes (tanto sólidos como en forma de emisiones provenientes de las fundiciones) contenían aún altas concentraciones de metales, lo que sin duda debió causar una amplia dispersión de la contaminación por las áreas circundantes durante los periodos de intensa actividad (Hevia, 2003; Salomons, 2005). El cierre de la última concesión minera que quedaba en funcionamiento en 1988 supuso el fin de una progresiva recesión de la minería en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia que había comenzado 50 años antes, y el abandono definitivo de la actividad en este distrito (Hevia, 2003). Sin embargo, la ausencia de legislación ambiental en materia de restauración de minas hasta ese momento hizo que no se repararan los daños causados en el medio ambiente, ni que se realizaran actuaciones que previnieran potenciales daños futuros. Bajo el desconocimiento y falta de previsión de que los residuos generados durante siglos de actividad aún podían contener y liberar importantes cantidades de metales en el medio ambiente, las concesiones mineras de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, tras su cierre, fueron abandonadas sin ser sometidas a ningún proceso de recuperación. Como consecuencia, un total de 484 viejas minas abandonadas, con sus focos de contaminación (escombreras, escorias, y drenajes ácidos), están repartidas en la actualidad por un territorio cuya extensión alcanza los 2.500 km 2 (Palero Fernández y Martín Izard, 2005). El agua de lluvia y el viento continúan siendo potenciales medios de dispersión de la contaminación que parte de estos focos para entrar en los ecosistemas Mediterráneos que ahora ocupan la 124 zona, en la que actividades como la caza, la cría de ganado en régimen extensivo, la agricultura y la protección de espacios naturales han pasado a ser las actividades económicas más importantes (PORN, 2010). De este modo, la presencia de minas y escombreras, que constituyen potenciales focos de contaminación local por metales a largo plazo, se convierte en un potencial riesgo para la salud de los animales (tanto silvestres como domésticos) que habitan la zona, y en un riesgo de salud pública derivado del consumo de la carne que aquí se produce. Los trabajos que componen la presente tesis doctoral son el resultado de un proyecto de investigación cuyo objetivo general consistió en evaluar si los residuos mineros abandonados en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia constituyen hoy en día un riesgo para el medio ambiente, la fauna silvestre que habita los ecosistemas potencialmente afectados, y para la salud pública. Dos especies de ungulados silvestres, el ciervo ibérico ( Cervus elaphus ) y el jabalí ( Sus scrofa ), fueron seleccionadas por sus características biológicas y ecológicas como especies bioindicadoras de la contaminación por metales. El primero de los trabajos llevados a cabo se centró en estudiar la presencia de metales contaminantes en diferentes compartimentos del medio ambiente (suelos, sedimentos, corrientes de agua) y las plantas que circundan las minas y escombreras abandonadas. Estos análisis se complementaron con el estudio del contenido de estos metales en dos tejidos (hígado y hueso) de ciervos muestreados en las zonas potencialmente afectadas por estos focos contaminantes, con el objeto de estudiar su potencial grado de exposición y de transferencia a través de la cadena trófica (Capítulo 1). Este trabajo asentó las bases para el desarrollo del segundo, en el que se profundizó en el estudio del hígado y el hueso como tejidos idóneos para evaluar el grado de exposición de los ungulados silvestres a la contaminación por metales, especialmente Pb y Cd. En este caso, el jabalí se sumó como especie objeto de estudio, algo que resulta de gran interés debido a las diferencias fisiológicas y ecológicas que caracterizan a ambas especies y que podrían condicionar el nivel en que se ven expuestas a la contaminación. En este trabajo se realizó además una primera aproximación al estudio de los potenciales efectos tóxicos subletales que podría conllevar la exposición a la contaminación para el ciervo, a través del estudio de diversos biomarcadores de estrés oxidativo y del perfil de ácidos grasos en el hígado (Capítulo 2). Los resultados observados pusieron de manifiesto la necesidad de profundizar en el estudio de los efectos adversos que la exposición a la contaminación por metales (especialmente el Pb) podría tener sobre mecanismos fisiológicos concretos. Por su 125 sensibilidad al efecto nocivo de los metales tóxicos, el aparato reproductivo de los ciervos fue seleccionado como objeto de estudio. Así, en el Capítulo 3 de la presente tesis estudiamos el contenido en metales en testículos y espermatozoides del epidídimo de ciervos y su relación con diversos parámetros relacionados con la calidad reproductiva y biomarcadores de estrés oxidativo como variables de efecto. Finalmente, dada la importancia de la caza como actividad económica en las zonas comprendidas por el antiguo distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, era de gran de importancia abordar el riesgo que la transferencia de metales contaminantes a través de la cadena trófica podría tener desde un punto de vista de salud pública, ya que la carne (y en menor medida las vísceras) de los ciervos y jabalíes que se cazan en la zona es destinada al consumo humano. Para ello, muestras de músculo de ciervos y jabalíes fueron analizadas para evaluar su contenido en metales, y los resultados obtenidos fueron enfrentados a los límites máximos establecidos por la legislación europea para la presencia de metales contaminantes en carne de abasto. Los trabajos de esta tesis fueron la primera iniciativa científica destinada a conocer la potencial problemática ambiental que existe entorno a los residuos mineros abandonados en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia con el fin de evaluar la necesidad de su restauración. Además, constituyen la primera aproximación al estudio de la salud animal y la seguridad alimentaria entorno al consumo de carne de caza procedente de zonas afectadas por la contaminación minera en España. De hecho, estos trabajos han servido de base para el desarrollo de investigaciones posteriores que han confirmado los resultados que aquí se presentan, y han puesto de manifiesto las necesidades reveladas (Rodríguez Estival, 2012). METALES EN SUELOS , SEDIMENTOS , AGUAS , Y SU TRASFERENCIA A PLANTAS La erosión eólica e hídrica de las minas, escombreras y escorias abandonadas en antiguos distritos mineros son importantes actores de la dispersión de los metales contaminantes y de su introducción en los ecosistemas circundantes (Kostarelos y col., 2015). Así, la determinación de los niveles de contaminación por metales en suelos, sedimentos, y cursos de agua en los espacios naturales próximos a residuos mineros constituye un primer paso necesario en toda evaluación de riesgos medioambientales, ya que la presencia de altos niveles (niveles tóxicos) en estos compartimentos del ecosistema es clave para su presencia en niveles superiores (plantas y animales) (Bolan y col., 2013). 126 Como cabía esperar, se detectaron diversas diferencias significativas entre las zonas mineras y las controles respecto a las concentraciones de varios metales en los diferentes medios abióticos analizados. Incluso entre las dos zonas mineras estudias se detectaron diferencias importantes, debido a su distinta tipología. No hay que olvidar que en Minas de Horcajo las muestras se tomaron en las proximidades de una vieja escombrera, mientras que en Navalmartina (la otra finca estudiada dentro de la en zona minera) no se encontraron restos de escombreras o escorias, sino que la zona muestreada se ubicaba a unos 10 km de una antigua fundición, pudiendo ser considerada como una localización intermedia (desde el punto de vista ecotoxicológico) entre una zona contaminada y una zona control (Capítulo 1). En los suelos, los niveles de arsénico (As) fueron como media 14 veces superiores en Minas de Horcajo que en el resto de los puntos de muestreo (Capítulo 1), siendo los valores observados comparables a los detectados en investigaciones posteriores (30,7 – 36,1 g/g; Higueras y col., 2012). Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas respecto a los niveles de Pb presente en los suelos. Esto es debido probablemente a que las muestras se tomaron de la ladera localizada enfrente de la escombrera, con el objetivo de poder muestrear vegetación potencialmente consumida por los herbívoros de la zona y que no estaba presente en puntos más próximos a la escombrera. Estudios posteriores han observado concentraciones comprendidas entre los 15.000 y los 28.000 g/g en suelos muestreados directamente en las escombreras abandonadas de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia. Incluso en suelos circundantes, destinados al pasto de herbívoros silvestres y domésticos, se han observado niveles medios de hasta 1.500 g/g (Rodríguez y col., 2009; Higueras y col., 2012). Los valores detectados en los sedimentos manifestaron más fielmente la presencia de una contaminación asociada a las antiguas actividades mineras que se desarrollaron en las zonas estudiadas (Capítulo 1). En este sustrato, los niveles de Pb y As fueron, como media, 64 y 627 veces más elevados en los suelos de Minas de Horcajo que en el resto de los puntos de muestreo. En el caso del Pb, los niveles observados están dentro del rango de los obtenidos posteriormente por otros autores en el estudio de sedimentos próximos a concesiones mineras abandonadas en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (303 – 26.900 g/g; Higueras y col., 2012). Por otro lado, los valores observados para el As son superiores a los detectados en estudios posteriores para este metal tóxico, en los que los resultados obtenidos han resultado ser altamente variables (14,6 – 223,1 g/g; Higueras y col., 2012). De hecho, los valores de As en los sedimentos de Minas de Horcajo están dentro del rango de valores los observados en los sedimentos más contaminados tras el vertido de Aznalcóllar (Taggart y col., 2005). Finalmente, en el caso del agua, las principales 127 diferencias fueron observadas para los niveles de As, que fueron 15 veces superiores en Minas de Horcajo que en el resto de los puntos estudiados, alcanzando niveles que superan ampliamente los estándares de salud establecidos para el agua destinada a consumo humano (WHO, 2006). Rodríguez Estival y col. (2014), en un estudio reciente llevado a cabo en una finca ganadera de Sierra Madrona y Valle de Alcudia con presencia de residuos mineros abandonados, hallaron niveles de Pb en puntos de agua para el ganado entre los 12,9 y los 43,8 g/l, con un nivel de medio (26,6 g/l) que superaba el criterio de salud pública para el agua potable. Los resultados anteriores ponen claramente de manifiesto que los residuos mineros abandonados en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia aún contienen altos niveles de metales tóxicos, y como tales representan una fuente importante de contaminación para los ecosistemas circundantes (Directiva 86/278/EEC). Ruiz y col. (2009) observaron que la biodisponibilidad del Pb y otros metales presentes en estos suelos es especialmente elevada en aquellos en los que la fracción de partícula predominante es más fina, con valores comprendidos entre el 31 y el 46% en el caso del Pb. Esto es de gran relevancia desde el punto de vista ecotoxicológico, ya que la fracción biodisponible es la que potencialmente puede ser absorbida por las plantas y pasar a las cadenas tróficas. En este sentido, se encontraron niveles de metales muy diversos entre especies vegetales estudiadas en función de la zona, siendo en general más altos en las zonas mineras, muy especialmente en Minas de Horcajo, que en las controles. En algunos casos, las concentraciones de metales halladas en las plantas fueron incluso superiores a las de los suelos sobre las que se asentaban. Esta circunstancia se explica por las partículas de polvo contaminadas que, tras ser arrastradas por el viento, son adsorbidas por la superficie de las hojas, pudiendo constituir en términos de trasferencia a los herbívoros una fuente más importante que la propia absorción por las raíces e incorporación a las partes aéreas de las plantas (Madejón y col., 2002). De entre todas las especies muestreadas, han sido las gramíneas (las preferidas por los herbívoros como alimento) las que acumularon mayores concentraciones de Pb, alcanzando niveles de hasta 97 g/g (Capítulo 1). Estos niveles están dentro del rango de fitotoxicidad (30 300 g/g; Pugh y col., 2002) y son considerados como potencialmente tóxicos para el ganado (>30 g/g; Chaney, 1989). Por otro lado, se trata de valores comparables a los observados en plantas crecidas en suelos afectados por el vertido de Aznalcóllar (148 g/g; Madejón y col., 2002). Estos resultados son comparables a los observados por Rodríguez Estival y col. (2014) en el estudio citado anteriormente, en un pool de plantas (fundamentalmente gramíneas, con menor proporción de Brassicaceae , 128 Fabaceae y Malvaceae ) (2,3 – 182,7 g/g). Los niveles alcanzados para Rosa canina (41.3 g/g) y los valores más altos encontrados en encinas (35.9 g/g) en Minas de Horcajo (ambas especies son consumidas habitualmente por los ciervos y otros animales herbívoros) también superaron los niveles potencialmente tóxicos para la alimentación del ganado. Otros metales, como el Cu y el Cd, también alcanzaron en algunos casos concentraciones en las plantas que podrían resultar tóxicos para el ganado (Chaney, 1989) (Capítulo 1). NIVELES DE METALES EN HÍGADO Y HUESO DE CIERVO Y JABALÍ Los ungulados silvestres están potencialmente expuestos a la contaminación por metales cuando se alimentan en el entorno de residuos mineros abandonados. La ingestión de suelo (tanto de forma inadvertida como intencionada), agua, y/o vegetación contaminados constituyen las principales fuentes de exposición a este tipo de contaminación, motivo por el que estos ungulados silvestres son buenas especies bioindicadoras de la contaminación ambiental por metales pesados y metaloides (Beyer y col., 2007). Una vez absorbido, el plomo pasa al torrente sanguíneo, y de ahí es distribuido a los órganos y tejidos diana, entre los que destacan en hígado y los huesos (Goyer y Clarkson, 2001). En las zonas mineras estudiadas en el Capítulo 1, las concentraciones de Pb observadas en el hígado de los ciervos fueron 2,8 veces superiores a las observadas en los animales de las zonas control. La acumulación de Pb en los huesos siguió una tendencia similar a la observada en el hígado, en los sedimentos y en las plantas, pero en este tejido no se llegaron a detectar diferencias significativas (aunque fueron notorias). Por un lado, esto sugiere una exposición temporal de los animales a la contaminación, ya que el hígado tiende a reflejar una exposición aguda mientras que el hueso refleja principalmente una exposición crónica (Goyer y Clarkson, 2001). Por otro lado, muestra claramente que la presencia de Pb en los tejidos internos de los ciervos de la zona minera es debida a una exposición ambiental. Sin embargo, en el Capítulo 2 detectamos resultados similares respecto a la acumulación de Pb para el hígado (los ciervos de la zona minera registraron niveles de Pb en hígado 4 veces superiores a los observados en los controles), y además, las diferencias fueron significativas para los niveles de Pb encontrados en los huesos. En este caso, los ciervos del área minera registraron niveles de Pb en hueso 1,7 superiores a los observados en los animales del área control. La acumulación de Pb en ambos tejidos 129 estuvo positivamente relacionada, lo que sugiere que los animales están resultando expuestos de forma crónica a una fuente de plomo (Goyer y Clarkson, 2001). Los niveles hallados en hígado de los ciervos de las zonas afectadas por los residuos mineros abandonados (nivel medio obtenido de ambos estudios: 0,67 g/g) están por encima de los valores basales reconocidos para ungulados no expuestos a la contaminación (<0.5 g/g; Frøslie y col., 2001), aunque están lejos de la concentración mínima de Pb en hígado asociada a una exposición tóxica (>5 g/g dw; Ma, 2011) (Capítulos 1 y 2). A excepción de alguna diferencia puntual entre fincas concretas, no se observaron diferencias toxicológicamente relevantes entre zonas para el resto de los metales estudiados (Cd, Cu, Se, Zn), estando en todos los casos los niveles registrados dentro de los rangos considerados como normales (Frøslie y col. 2001) (Capítulos 1 y 2). Por ejemplo, en el ciervo se observó cierta diversidad respecto al contenido hepático de Cu, pero dicha variabilidad puede ser debida a su condición de rumiantes, estando en todos los casos muy lejos de los niveles asociados con intoxicación. En el caso de los huesos, se ha observado un nivel medio de 2,38 g/g de Pb en los ciervos muestreados en las zonas afectadas por la minería, frente a los 0,98 g/g detectados en los huesos de los ciervos procedentes de la zona control (Capítulos 1 y 2). A pesar de que esta diferencia denota claramente que los ciervos de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia están expuestos crónicamente a la contaminación por Pb que persiste en la zona (los ciervos de la zona minera presentan niveles 3 veces superiores), en ningún caso se superaron (atendiendo a valores medios) las concentraciones basales establecidas para este metal en el tejido óseo en ganado (<7 g/g; Suttle, 2010). El jabalí presentó mayores niveles de Pb en ambos tejidos (hígado y hueso) que el ciervo, lo que puede estar relacionado con las diferencias existentes entre ambas especies respecto a sus hábitos alimenticios: el jabalí ingiere mucha mayor proporción de tubérculos y raíces (que contienen mayores niveles de Pb que las partes aéreas) y al mismo tiempo una importante cantidad de suelo, lo que conlleva una mayor exposición a metales en diversas formas químicas (Taggart y col., 2005). En el hígado, los jabalíes de la zona minera presentaron niveles de Pb 5 veces superiores a los observados en los jabalíes control, y el valor medio registrado superó ampliamente el nivel basal establecido en la literatura científica para este metal en el hígado (<0.5 g/g; Frøslie y col., 2001). Prácticamente la misma diferencia fue observada entre los jabalíes de la zona minera y la control para el contenido de Pb en el tejido óseo, y en este caso, el nivel medio detectado superó el basal establecido para el contenido de Pb en el hueso (<7 g/g; Suttle, 2010). En esta especie, la regresión entre la concentración de Pb en hígado y hueso mostró una mayor pendiente, lo 130 que sugiere que la deposición de Pb en hueso de jabalí es mayor que en el caso del ciervo (Capítulo 2). Estos resultados coinciden con los obtenidos en otros trabajos de investigación posteriores centrados en el estudio de la exposición de ciervos y jabalíes a la contaminación por Pb en el antiguo distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (Rodríguez Estival y col., 2011b, 2013a, 2013b). Estos autores detectaron niveles medios de Pb en hígado de ciervos comprendidos entre los 0,35 y los 0,46 g/g, llegando algunos animales a superar considerablemente el nivel basal citado anteriormente. Para los huesos muestran valores inferiores a los observados en la presente tesis (0,46 – 0,77 g/g), aunque están dentro del mismo rango, y en todos los casos fueron superiores a los registrados en los ciervos de las zonas control. En el caso del jabalí, los niveles de Pb en hígado observados en los animales de la zona minera estuvieron entre los 0,67 y los 0,81 g/g, que superaron por 3 los niveles medios observados en los jabalíes muestreados en las zonas control. Por su parte, en el hueso de los animales de la zona minera detectaron niveles medios de Pb comprendidos entre los 3,86 y los 7,36 g/g, muy por encima de los 1,23 g/g que como media observaron en los jabalíes de las zonas control estudiadas. Se pone de manifiesto por lo tanto que los ungulados silvestres que habitan las áreas afectadas por los residuos mineros abandonados en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia están expuestos de forma crónica a la contaminación metalífera que aún persiste en la zona. A raíz de los resultados obtenidos en trabajos posteriores, parece tratarse de una situación mantenida en el tiempo, lo que manifiesta claramente el carácter persistente de esta problemática ambiental. De los metales estudiados, el Pb marca claramente las diferencias entre los ungulados silvestres procedentes de las áreas mineras de aquellos procedentes de las controles, alcanzando, especialmente en algunos casos concretos, niveles potencialmente tóxicos en los tejidos estudiados, por lo que es considerado el principal responsable de los potenciales efectos adversos derivados de la exposición a los residuos mineros en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia. EFECTOS SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO Y LA COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS A NIVEL HEPÁTICO El Pb es capaz de causar efectos negativos en multitud de sistemas fisiológicos a niveles de exposición relativamente bajos a través de la inducción de condiciones de estrés oxidativo (Jomova y Valko, 2011). De hecho, el estrés oxidativo es uno de los principales 131 mecanismos moleculares por los que el Pb y otros metales pesados ejercen su toxicidad, teniendo efectos negativos a concentraciones muy inferiores a las asociadas con signos clínicos (Sharma y col., 2014). De este modo, los biomarcadores de estrés oxidativo se convierten en herramientas adecuadas para evaluar la ocurrencia de efectos subletales debidos a exposiciones crónicas a la contaminación por metales (Jomova y Valko, 2011). A pesar de que los niveles de Pb detectados en el hígado de los ciervos muestreados en la zona minera en el marco de esta tesis son del orden de 60 veces inferiores a los asociados con síntomas clínicos de envenenamiento en herbívoros, las variables de efecto estudiadas en este sentido han proporcionado algunos resultados relevantes (Capítulo 2). Hemos observado una reducción de los niveles de GSH, principal antioxidante celular endógeno, del 39% en los ciervos de la zona minera en comparación con los controles. Dado que no observamos alteraciones en el resto de los biomarcadores analizados a nivel hepático (ni cambios en el porcentaje de GSH oxidado, ni procesos de peroxidación lipídica, ni alteraciones en la actividad de las enzimas antioxidantes GPX y SOD), esta disminución fue asociada al papel que desempeña el GSH en la detoxificación del Pb (Flora y col., 2013). Sin embargo, estudios posteriores han proporcionado nuevos datos que sugieren la existencia de alteraciones en el estado redox de las células como consecuencia de la exposición de los ciervos al Pb. Rodríguez Estival y col. (2011b) observaron una reducción del 44% en los niveles hepáticos de GSH en los ciervos de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia en comparación con los procedentes de zonas control, la cual estuvo directamente relacionada con los niveles de Pb en hígado. Este resultado estuvo acompañado por un incremento en la actividad de la SOD y un incremento de la peroxidación lipídica. Todos estos resultados fueron asociados a la alteración del balance redox que ocasiona la exposición a un metal tóxico como el Pb. Además, en este y otro trabajo previo (Rodríguez Estival y col., 2011a,b) se observó que los antioxidantes endógenos no eran los únicos afectados por la exposición al Pb, sino que la homeostasis de antioxidantes nutricionales como las vitaminas A y E se veía igualmente comprometida en los ciervos expuestos a la contaminación. La aparente disparidad entre nuestros resultados y los realizados por Rodríguez Estival y col. podría estar asociada a diferencias puntuales en las poblaciones (fincas) de animales muestreadas respecto a estado nutricional, grado de exposición a la contaminación, edad, sexo, y otros factores. Debe tenerse en cuenta que la maquinaria antioxidante está cuidadosamente regulada para responder a las necesidades fisiológicas de un organismo, lo que incluye respuestas adaptativas específicas ante una amenaza como la exposición un metal tóxico (y oxidante) como el Pb (Regoli y col., 2011). 132 Por otro lado, el estudio del perfil hepático de ácidos grasos, importante por la susceptibilidad de estas moléculas a la peroxidación de lípidos, mostró una disminución del 16% en los niveles del ácido docosahexanóico en los ciervos de las zonas mineras respecto a los controles que se relacionó con la exposición a la contaminación por Pb (Capítulo 2). La disminución de los niveles de este ácido graso poliinsaturado podría estar relacionada con un aumento de su oxidación. Sin embargo no se observó un aumento en la peroxidación de lípidos (TBARS). Por lo tanto, otros mecanismos bioquímicos podrían estar ocurriendo en respuesta a la exposición al Pb y provocando los cambios observados en el perfil de ácidos grasos. Por ejemplo, algunos estudios han observado que los cambios producidos en el perfil de ácidos grasos en casos de exposición a metales podrían estar relacionados con perturbaciones ocasionadas en el proceso de desaturación de estas moléculas (Shingfield y col., 2008). REDUCCIÓN DE LA CALIDAD ESPERMÁTICA DEL CIERVO Y SU RELACIÓN CON EL ESTRÉS OXIDATIVO La exposición crónica al Pb ha sido asociada con una amplia variedad de disrupciones en el sistema reproductivo a diferentes niveles, desde efectos sobre los niveles de testosterona y la calidad reproductiva hasta efectos en los desarrollos embrionario y fetal (Iavicoli y col., 2009). Muchos de estos efectos han sido observados a niveles de exposición por debajo de los considerados en la literatura como tóxicos, y ha sido demostrado que el estrés oxidativo puede ser un actor principal en el origen de muchas de estas alteraciones. De hecho, un sistema antioxidante en óptimas condiciones es esencial para el mantenimiento de la función reproductiva (Fujii y col., 2003). En el Capítulo 3 de la presente tesis doctoral observamos que los ciervos de las zonas contaminadas presentaron niveles de Pb más elevados en los testículos que los procedentes de zonas no contaminadas, en concordancia con lo que habíamos observado en los Capitulos 1 y 2 en tejidos en el hígado y el hueso. Además, observamos que los ciervos de las zonas mineras presentaban testículos más grandes, una reducida viabilidad de la membrana de los espermatozoides y una disminuida integridad del acrosoma. Todos estos cambios, en los ciervos expuestos a la contaminación, estuvieron acompañados de la inhibición parcial de las enzimas antioxidantes SOD y GPX tanto en los testículos como en los espermatozoides, y de un incremento en los niveles de GSH a nivel testicular. Sin embargo, y a pesar de que estas alteraciones han sido documentadas en casos de exposición tóxica al Pb, en nuestro estudio no observamos que tuvieran una relación directa con la exposición a este metal pesado. El valor máximo de Pb observado en los testículos fue de 0.11 g/g, muy lejos de los valores 133 asociados con cambios en la espermatogénesis en la literatura científica (>2 g/g) (Apostoli y col., 1998). Sin embargo, y a la luz de las correlaciones observadas entre los diferentes parámetros, estos efectos podrían asociarse a variaciones provocadas en los niveles de Cu, Se, y/o Zn, lo que sería un indicio de que la contaminación presente en la zona ha supuesto, indirectamente, un cambio en la homeostasis, distribución, y/o funciones (utilización) de estos minerales en los tejidos de los ciervos, lo que a su vez ha ocasionado trastornos en las rutas metabólicas que dependen de éstos (Capítulo 3). En un estudio posterior, Castellanos y col. (2010) observaron un desequilibrio en los niveles de Cu en los testículos de ciervos de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia similar al observado en el presente trabajo, y sugieren que la exposición de los ciervos a metales tóxicos como el Pb y el Cd puede implicar alteraciones (interacciones) en la regulación de los niveles de Cu en los testículos, que serían en última instancia los causantes de los cambios fisiológicos observados en el sistema reproductivo. En el estudio de Castellanos y col. (2010), esta alteración en la regulación del Cu (negativamente relacionado con el Pb) estuvo relacionada con alteraciones en el perfil de ácidos grasos de los testículos. En todo caso, estos resultados difieren de los obtenidos por Castellanos y col. (2015), también en ciervos del antiguo distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia. En este caso, observaron que los ciervos de las zonas mineras presentaron niveles de Pb más elevados en el parénquima de los testículos, en el epidídimo y en los espermatozoides que los ciervos de zonas controles. Estos resultados estuvieron acompañados de una reducida integridad del acrosoma, una incrementada actividad de la GPX, y un mayor grado de fragmentación del ADN en el esperma de los ciervos expuestos a la contaminación. Por otro lado, y al igual que ocurría en el hígado, se deben considerar los complejos mecanismos de regulación que controlan el sistema antioxidante, también en los órganos reproductivos, y que diversos factores (tanto intrínsecos como extrínsecos) pueden condicionar la variabilidad de las respuestas observadas en estos casos. En este sentido, Rodríguez Estival y col., (2011a) detectaron diversas alteraciones en la homeostasis de las vitaminas A y E en los testículos de los mismos ciervos considerados en el presente trabajo que podrían estar relacionadas directa o indirectamente con los resultados aquí observados. 134 METALES EN CARNE DE CIERVO Y JABALÍ : IMPLICACIONES DE SALUD PÚBLICA DERIVADAS DE SU CONSUMO En la actualidad, la mayor parte del antiguo distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia se encuentra destinado a la gestión cinegética y a la caza de los ungulados silvestres que allí habitan, entre los que destacan en ciervo y el jabalí (PORN, 2010), cuya carne es destinada al consumo humano. En este sentido se deben considerar dos circunstancias importantes. Por un lado, debemos tener en cuenta que la munición utilizada para la caza de estos animales contiene Pb, que al impactar en el cuerpo del animal puede fragmentarse en multitud de esquirlas que contaminan la carne en un radio variable alrededor de la zona de impacto (Hunt y col., 2009; Green and Pain, 2012). Por otro lado, la exposición crónica de los animales a la contaminación por metales (especialmente Pb y Cd) que persiste en la zona puede conllevar la acumulación de niveles elevados en el tejido muscular (Payne y Livesey, 2010). La carne de caza forma parte de nuestra dieta, especialmente en ciertas regiones que, como Castilla La Mancha, tienen una extensa tradición cinegética. Por lo tanto, la presencia de metales como el Pb y el Cd en el músculo de estos animales (ya sea debida a la fragmentación de la munición o a una acumulación debida a una exposición a la contaminación ambiental) puede ser interpretada desde una perspectiva de salud pública, ya que podría afectar a la idoneidad de su consumo por parte del hombre al implicar un riesgo de transferencia de la contaminación al ser humano. Para ello, y dado que en la Unión Europea no existe todavía una regulación específica que contemple criterios de seguridad alimentaria para la carne de caza, debemos hacer uso de la normativa que regula la seguridad sanitaria de la carne de ganado destinada a consumo humano. Según dicha normativa (RC 629/2008), el nivel máximo de Pb permitido para la carne (tejido muscular) y a la fabricación de productos derivados destinados a consumo humano es de 0,1 g/g en peso fresco (que equivale a 0,34 g/g en peso seco). En el caso del Cd, este nivel máximo establecido es de 0,05 g/g en peso fresco (equivalente a 0,17 g/g en peso seco). En términos de carne contaminada como consecuencia de la fragmentación de la munición de Pb, en nuestro estudio (Capítulo 4) identificamos claramente 2 jabalíes (de los 48 muestreados) que claramente presentaban niveles de Pb en músculo excesivamente elevados en comparación con el resto (353 y 2.408 g/g), lo que fue sin duda fue debido a la fragmentación de la munición utilizada para abatirlos. Se trata de un tipo de contaminación de la carne prácticamente imposible de eliminar o evitar por completo en tanto que se continúe usando munición de Pb para el ejercicio de la caza (Green and Pain, 2012). Otros estudios han mostrado valores similares de contenido de Pb en carne de caza mayor 135 abatida con munición de Pb (p. ej. Cornatzer y col., 2009; Tsuji y col., 2009). Aunque en nuestro caso el porcentaje de animales cuya carne se puedo identificar como afectada por este tipo de contaminación fue relativamente bajo (un 4,8% de los jabalíes muestreados), el resto de los animales muestreados fueron cazados de la misma manera, por lo que es esperable que la carne procesada del total de los animales cazados contenga localizaciones puntuales donde la carne muestre niveles de Pb extremadamente altos. Debe tenerse en cuenta que las muestras de ambos jabalíes (al igual que las del resto de los animales muestreados para este trabajo) se tomaron del músculo aductor con el fin de asegurarse de estar alejados de la zona de impacto de la bala. Obviamente, la carne de caza con niveles de Pb como los observados en estos dos animales no debería ser destinada a ningún tipo de uso por su alta toxicidad. De hecho, aun asumiendo que el Pb procedente de la munición se absorbiese tan solo un 10% durante la digestión, un adulto de 70 Kg de peso superaría la ingesta semanal tolerable de metales y metaloides (25 g/kg peso vivo; EFSA, 2010) con solo 45 g de carne, por lo que la carne contaminada con munición es totalmente inaceptable para el consumo humano. En lo que se refiere a la exposición de ciervos y jabalíes a la contaminación ambiental por metales en el Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, nuestro estudio muestra algunos datos de gran relevancia en lo que a salud pública se refiere (Capítulo 4). Tanto los ciervos como los jabalíes de las zonas mineras presentaron niveles de Pb en músculo entre 4 y 8 veces más elevados, respectivamente, que los animales de las zonas control, y el 57% de los músculos de ciervo y el 84% de los músculos de jabalí analizados tuvieron niveles de Pb que superaron el nivel máximo autorizado en la legislación europea para carne de ganado destinada a consumo humano (0,34 g/g). La carne de los ciervos y jabalíes de las zonas afectadas por la contaminación metálica también presentó niveles de Cd que superaron el estándar establecido por la normativa en un 43 y un 19% de los casos, respectivamente (0,17 g/g). La relación positiva encontrada en ambas especies entre los niveles de Pb en músculo y los de hígado indica que es la contaminación ambiental a este metal pesado la principal responsable de estos resultados. Si tomamos como referencia el límite máximo aceptable de Pb en carne destinada al consumo de niños (0.068 g/g), deberíamos decir que un 83.1% de los animales muestreados en este trabajo tuvieron niveles de Pb en carne que la hace no apta para su consumo. Si nos atenemos a la misma ingesta semanal tolerable de metales y metaloides anteriormente mencionada, un adulto de 70 kg superaría estos límites ingiriendo entre 4,5 y 255 g de carne a la semana. En el caso del Cd, una comida de esta carne a la semana contribuiría a menos del 6% de la ingesta semanal tolerable (2,5 g/kg peso vivo) considerando todos los escenarios. Sin embargo, un incremento en el ratio de ingesta (4 comidas a la semana) puede incrementar esta 136 contribución hasta el 23%. En definitiva, para ambas especies, el consumo de carne procedente de las zonas control (no afectadas por la contaminación minera) representa un riesgo menor de exposición a estos metales derivado de su consumo (Sevillano Morales, 2013). Los valores de los animales muestreados en las zonas control estuvieron dentro del rango observado por otros estudios (p. ej. Jarzyń'ska y Falandysz, 2011; Amici y col., 2012; Danieli y col., 2012). Estudios desarrollados posteriormente con las principales especies ganaderas que se crían en las fincas de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, a raíz de los estudios que componen esta tesis, han mostrado que el problema de la transferencia de la contaminación por Pb no se limita a los herbívoros silvestres, sino que también los domésticos (vacas y ovejas) están expuestos a altos niveles de contaminación (Rodríguez Estival y col., 2012), lo que se traduce en la acumulación de este metal en tejidos como el hígado, donde alcanza niveles superiores a los considerados como seguros por la legislación vigente (Pareja Carrera y col., 2014). Por otro lado, se encontraron algunas diferencias entre ciervos y jabalíes respecto al contenido de metales y metaloides en tejido muscular, tanto en las zonas afectadas por la contaminación con en las controles, por lo que podrían deberse a los distintos patrones de alimentación que presentan ambas especies (como ya se ha comentado en el Capítulo 2) (Sevillano Morales, 2013). Los ciervos comen más cantidad de hierba y hojas y los jabalíes más cantidad de raíces y bulbos, que además de contener valores más elevados de metales que las partes aéreas, su consumo implica una ingesta superior de suelo de forma inadvertida. Por otro lado, y como se constató en el Capítulo 1, ciertas plantas tales como las jaras ( Cistus ladanifer y C. salvifolius ) y el sauce ( Salix atrocinerea ), muy demandadas por los ciervos en su alimentación en ecosistemas Mediterráneos, resultaron tener valores más elevados de Cd y Zn que otras especies vegetales, lo que también podría contribuir a explicar los diferentes patrones observados entre ambas especies respecto a la acumulación de elementos en el tejido muscular. En lo que a seguridad alimentaria se refiere, podríamos decir que la carne de jabalí representa un riesgo de exposición a metales como el Pb y el Cd menor que la carne de ciervo. Finalmente, la edad parece ser un factor que también debe ser considerado a la hora de evaluar la seguridad alimentaria de la carne de caza. En nuestro estudio, un incremento de edad se ha relacionado con un mayores niveles de Cd, Zn y As en ciervos de zonas mineras, y de Cd, Cu y Se en los jabalíes de la zona control. En el caso del tejido muscular, diversos trabajos desarrollado con ungulados indican una acumulación progresiva de diversos metales y metaloides con la edad (p. ej. Rudy, 2009). En lo que a este factor de refiere, y considerando las implicaciones para la salud pública, nuestros resultados sugieren que la carne de los animales adultos podría 137 representar un mayor riesgo de exposición a los metales y metaloides que la de los animales más jóvenes. En su conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral ponen de manifiesto el elevado riesgo que conlleva para el medio ambiente la contaminación por metales, muy especialmente por Pb, que todavía persiste en el antiguo distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia. No obstante, los trabajos que la componen no deja de ser una superficial aproximación que debería completarse (como se ha venido haciendo en años posteriores) con más investigaciones que esclarezcan las consecuencias potenciales que podrían derivarse de esta problemática, con el fin de poder establecer unas medidas correctoras eficientes de deberían acometerse. A pesar de ello, esta tesis pone de manifiesto diversas necesidades primordiales. Por un lado, la de abordar la erradicación del problema de la contaminación en esas zonas. Por otro, la de establecer unos límites legales máximos a nivel europeo de residuos por metales en carne de caza. Y por último, la de buscar alternativas eficaces a la munición de Pb. RECOMENDACIONES PARA REDUCIR LA EXPOSICIÓN AL PB EN EL ÁREA DE ESTUDIO Si abordamos la necesidad de erradicar el problema de la contaminación minera en Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, tanto por cuestiones medioambientales como de salud pública, las primeras medidas de actuación que deberían ser abordadas consistirían en eliminar los residuos mineros que se reparten por este espacio natural y en restaurar los terrenos afectados. Eliminar los residuos mineros consistiría precisamente en eso: localizar los principales focos contaminantes (grandes escombreras, minas, y edificios mineros en ruinas) y retirarlos para proceder a su tratamiento y eliminación adecuados. Sin embargo, esta medida de actuación no eliminaría la contaminación asociada por completo, por lo que debería ir acompañada de la restauración de los terrenos que durante decenas o siglos han soportado estos residuos y su zona de influencia más inmediata. En este sentido, ya existen algunas investigaciones que han ahondado en la adecuación de diferentes estrategias para la restauración de los terrenos mineros que se reparten por Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (Sánchez Sánchez, 2012). A pesar de la aparente facilidad que representa la solución a este problema, y de la delantera que se lleva en materia de investigaciones cuyos resultados facilitarían la adopción de las formas de proceder más adecuadas y eficientes, estas tareas no están exentas de dificultades, especialmente por las particularidad socioeconómicas que las 138 afectan. Por un lado, resulta necesario el inicio de campañas de información a través de las cuales se ponga el problema (y sus consecuencias) en conocimiento de todos los agentes sociales más estrechamente vinculados a este territorio (ganaderos, cazadores, agricultores, propietarios de fincas, etc.). Por otro lado, es de vital importancia el apoyo (institucional y económico) e implicación de los órganos administrativos competentes de la gestión socioeconómica de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia (Junta de Comunidades, Diputación Provincial, mancomunicades, etc.). Hasta que no exista un firme compromiso social e institucional para la erradicación de este problema ambiental, sólo se puede recomendar, a los propietarios/gestores de las fincas afectadas, que adopten las medidas necesarias para limitar al máximo el acceso de los animales (tano silvestres como domésticos) a los principales focos contaminantes (escombreras, puntos de agua próximos, vegetación en sus zonas de influencia) (Rodríguez Estival y col., 2014). Algo que tampoco resulta sencillo. Sólo evitando la exposición de los animales a la contaminación se puede eliminar (o al menos reducir) el riesgo que dicha exposición representa para la salud de las poblaciones potencialmente afectadas y para el consumo de su carne por parte del hombre. Precisamente, las necesidades expuestas en los párrafos anteriores son especialmente relevantes si tenemos en cuenta que este problema de contaminación ambiental podría tener serias implicaciones para la salud pública derivadas de la carne (de caza y ganadera) que allí se cría, y con ello, para las familias que viven de estas actividades. En el caso concreto de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia, no se puede olvidar la importancia económica que tienen la caza y la comercialización de la carne de caza. Esto pone de manifiesto, en primer lugar, la necesidad de abordar el tema desde un punto de vista legislativo. Si no existe una normativa que, a nivel europeo, regule la presencia de metales tóxicos en la carne de caza que se destina a consumo humano, resulta estéril intentar avanzar en otros sentidos. Sería recomendable la constitución de un comité de expertos que, a nivel europeo, evalúe toda la información existente, y que en función de las conclusiones obtenidas recomiende unos niveles de residuos máximos para la presencia de metales pesados tanto en la carne como en las vísceras de animales silvestres de interés cinegético (Morales y col., 2011; Jarzyń'ska y Falandysz, 2011; Desideri y col., 2012). Finalmente, debemos recomendar que las balas (si hablamos de caza mayor) fabricadas con Pb sean sustituidas por otras fabricadas con materiales diferentes, menos tóxicos o incluso inocuos desde un punto de vista toxicológico (como el Cu, el acero o el tungsteno), aunque ello suponga todavía abrir un intenso debate en España. Algunos países, como Alemania y Estados Unidos, ya han dado la polémica por zanjada y aceptan 139 los resultados de todos los trabajos realizados a nivel internacional que dejan patente la urgente necesidad de proceder en este sentido. Así, en estos y otros países ya en 2011 se empezó a cazar con balas de Cu, un metal que apenas se fragmenta (lo que reduce el riesgo de que esquirlas metálicas se esparzan por la carne del animal abatido tras el impacto de la bala) y que no es tan tóxico como el Pb. La necesidad de que en España también se empiece a caminar en este sentido se hizo especialmente obvia en 2012, cuando un informe de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN) recomendaba que “ los niños menores de seis años, mujeres embarazadas y mujeres que planeen quedarse embarazadas no deberían consumir carne procedente de animales cazados con munición de Pb”, alegando precisamente como razón la contaminación que se produce de la carne por el uso de este metal pesado en la munición, y la imposibilidad de eliminarla por completo (AESAN, 2012). El desarrollo de estudios epidemiológicos que evalúen la exposición de los consumidores de carne de caza a metales tóxicos en relación al uso de munición de Pb podría ser decisivo en un país como España a la hora de buscar el apoyo de los sectores sociales más escépticos en lo que a la prohibición de este tipo de munición se refiere (Meltzer y col., 2013). 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Los niveles de este metal pesado en ambos tejidos estuvieron significativamente correlacionados, indicando una exposición crónica a la contaminación ambiental. Los niveles hallados en el hígado de los animales de la zona minera superan (como media) los valores reconocidos como basales para ungulados no expuestos a la contaminación, aunque están lejos de los niveles mínimos asociados a una toxicidad clínica. 4. Esta exposición a la contaminación conllevó la aparición de efectos subletales en el hígado de los ciervos, reflejados por alteraciones en la homeostasis del glutatión, principal antioxidante endógeno, y en el perfil de ácidos grasos. Estos resultados, junto con los datos obtenidos en investigaciones posteriores, sugieren que la exposición al Pb causa alteraciones importantes en la homeostasis del sistema antioxidante a nivel hepático en los ciervos expuestos a la contaminación. 5. Alteraciones en diversos parámetros relacionados con la calidad reproductiva y en biomarcadores de estrés oxidativo en los ciervos expuestos a la contaminación, tanto en los testículos como en los espermatozoides del epidídimo, ponen de manifiesto la presencia de efectos subletales en el sistema reproductivo. Dichos efectos pueden 145 estar indirectamente relacionados con desequilibrios en la homeostasis de elementos esenciales debido a la exposición a la contaminación por metales en la zona minera. 6. Los ciervos y los jabalíes de las zonas mineras presentaron niveles de Pb y Cd en músculo mucho más elevados que los animales de las zonas control, superando en un porcentaje considerable de los casos el nivel máximo autorizado por la legislación europea para carne de ganado destinada a consumo humano. 7. Factores como la especie y la edad deben ser considerados cuando se evalúa el riesgo para la salud pública que el consumo de la carne de ciervos y jabalíes tiene en cuando a su contenido en metales tóxicos. Nuestros resultados muestran que la carne de jabalí representa un riesgo de exposición a metales como el Pb y el Cd mayor que la carne de ciervo. Por otro lado, la carne de los animales adultos podría representar un mayor riesgo de exposición a los metales y metaloides que la de los animales más jóvenes. 8. En su conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral ponen de manifiesto el elevado riesgo que conlleva para el medio ambiente y la salud pública la contaminación por metales, muy especialmente por Pb, que todavía persiste en el antiguo distrito minero de Sierra Madrona y el Valle de Alcudia. 146 147