INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
“Estudio de la actividad farmacológica de Chenopodium sp. y Barkleyanthus Salicifolius”
TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO FARMACÉUTICO
PRESENTA:
AASITH ARELLANO CASTRO
DIRECTOR A: DRA. YOLANDA DE LAS
MERCEDES GÓMEZ Y GÓMEZ.
MÉXICO, D. F., SEPTIEMBRE DE 2014
Dedicatoria
A mis padres Laura y Álvaro:
Gracias por estar a mi lado, cada uno a su modo pero siempre incondicionales. A veces las palabras no son suficientes pero quiero que sepan que sin ustedes no habría logrado todo esto, gracias por su amor, por su tiempo, por sus consejos y regaños, gracias por cada momento compartido y por todo lo aprendido, los amo.
A Morris que esté con el Señor:
Gracias mi fiel amigo, por todas las noches que te desvelaste a mi lado, por asomar tu carita y alegrarme cuando nada podía hacerlo, por iluminar la habitación con tu sola presencia y por estar siempre conmigo. ¡Lo logramos una vez más coração¡ Agradecimientos
A Mis hermanos Nantan y Jespah: Por su cariño y por todo el apoyo que siempre me han brindado. Por tantas experiencias compartidas y por cada anécdota que podemos recordar con alegría, los amo.
A mi abuelo Álvaro: ¡Por todo!
A mis amigos: A todos y cada uno de ellos por su cariño y apoyo, por su compañía y por tantas cosas vividas a lo largo del camino, los quiero.
De manera muy especial a la Dra. Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez: Por todo el apoyo que me brindó, por los conocimientos que compartió conmigo, por su compañía, sus anécdotas y sus consejos. De corazón ¡gracias!
Al M. en C. José Antonio Mondragón Herrera: Por su colaboración en este trabajo y por todo su apoyo y tiempo.
A la Q. F. B. María Esther Bautista Ramírez: Por los conocimientos compartidos y por su apoyo.
A la Q. F. I. Silvia Mariscal Tovar: Por su colaboración y apoyo.
A todos aquellos roedores que sin quererlo dieron su vida para la realización de este trabajo
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ÍNDICE DE CONTENIDO
ÍNDICE GENERAL………...………………………………………………………………. i ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………………………….. iv ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………… vi ABREVIATURAS………………………………………………………………………….... viii
ÍNDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN…………………………………...………………………………... 1 2. FUNDAMENTO TEÓRICO…………………………..……………………………... 4 2.1 Chenopodium sp………………………………………………………………... 4 2.2 Barkleyanthus Salicifolius………….….……………………………………….. 5
2.3 Metabolitos secundarios en plantas...………….…………………………….… 6 2.3.1 Fenoles...……………….…………………………………………………... 7 2.3.2 Flavonoides….………..………….………………………………………… 8 2.3.3 Terpenos………………….....……………………………………………… 12 2.3.4 Compuestos nitrogenados…….…………………………………………. 12 2.3.5 Otros compuestos………………………………………………………... 13 2.5 Actividad antioxidante……………………..………………………………….. 14 2.6 Actividad antimicrobiana……………………………………………………… 15 2.7 Actividad antiinflamatoria.………………………………….……………………. 17 2.7.1 Proceso inflamatorio, mecanismo general.….………….……………….. 18 2.7.2 Resolución del proceso inflamatorio...….………………………………... 20 2.7.3 Otros frenos a la inflamación……………………...……………………... 20 2.7.4 Control farmacológico de la inflamación…………..…………………….. 21
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2.8 Actividad cicatrizante………………………………………………………….. 21 2.8.1 Proceso de cicatrización…………………………………………………... 22 3. FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA METODOLOGÍA……………………….…...... 26 3.1 Extracción por sonicación……………………...………………..………………. 26 3.2 Cuantificación de fenoles………………………………………………………… 26 3.3 Cuantificación de flavonoides………………………….………………………… 27 3.4 Identificación por electroforesis capilar………....……………………………… 27 3.4.1 Proceso electroforético………………………..……………………………… 27 3.4.2 Electroforesis capilar………………………………………………………….. 28 3.4.3 Electroforesis capilar micelar………………………………………………… 29 3.5 Determinación de la capacidad antioxidante………………..………………….. 29 3.5.1 Método Ácido 2, 2' Azinobis-3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico (ABTS)…… 30 3.6 Determinación de la capacidad antimicrobiana. Método disco-placa……….. 31 3.7 Determinación de la actividad antiinflamatoria. Modelo de indicción de edema auricular con aceite de crotón…………………………………………... 3 1 3.8 Evaluación del efecto cicatrizante………………………………………………. 32 3.8.1 Gel de carbopol……………………………………………………………… 32 3.8.2 Generalidades de histología………………………………………………. 33 4. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………….…. 34 5. OBJETIVOS………….……………………………………………………………….. 35 6. METODOLOGÍA……………………………………………………………………... 36 6.1 Materiales y reactivos……………………………………………………………. 36 6.2 Métodos…………………………………………………………………………… 37 6.2.1 Pruebas cualitativas………………………………………………………….. 38 6.2.2 Pruebas cuantitativas………………………………………………………... 44 6.2.3 Método analítico……………………………………………………………… 46 6.2.4 Determinación de la capacidad antioxidante……………………………… 46 6.2.5 Determinación de la capacidad antimicrobiana…………………………… 47 6.2.6 Evaluación de la capacidad antiinflamatoria de Chenopodium sp………. 48 6.2.7 Evaluación del efecto cicatrizante de Chenopodium sp………………….. 49 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………….. 52 7.1 Pruebas cualitativas (preliminar fitoquímico)…………………………………… 52
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7.2 Pruebas cuantitativas……………………………………………………………. 59 7.2.1 Cuantificación de fenoles totales…………………………………………….. 59 7.2.2 Cuantificación de flavonoides totales……………………………………….. 61 7.2.3 Cuantificación de esteroides…………………………………………………. 63 7.2.4 Cuantificación de taninos……………………………………………………. 65 7.3 Método analítico (Identificación de flavonoides por electroforesis capilar)… 67 7.4 Determinación de la capacidad antioxidante…………………………………… 72 7.5 Determinación de la actividad antimicrobiana………………………………… 74 7.6 Evaluación de la actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp…………….. 79 7.6.1 Determinación del porcentaje de actividad antiinflamatoria (% inhibición y % inflamación)…………………….………………………………………. 80 7.7 Actividad cicatrizante de Chenopodium sp…………………………………… 82 7.7.1 Actividad cicatrizante en animales sanos (normoglucémicos)……………. 82 7.7.2 Actividad cicatrizante en animales diabéticos tipo II……………………….. 89 8. RESUMEN DE RESULTADOS……….……………………………………………… 97 9. CONCLUSIONES……………………………………………………………………... 99 10. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO…………………………………………………… 100 11. REFERENCIAS……………………………………………………………………….. 101 11.1 Referencias electrónicas………………………………………………………. 115 12. ANEXOS.………………………………………………………………………………. 116 ANEXO 1. Caracterización de las plantas de estudio………………….…………. 116 ANEXO 2. Cálculos…………………………………………….…………………….. 120 ANEXO 3. Preparación de reactivos y soluciones………………………………… 125 ANEXO 4. Preparación de laminillas para histología……………………………… 127
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Evaluación de la actividad farmacológica de extractos de origen natural… 3 Tabla 2. Estructura básica de los grupos de flavonoides…………………….………… 11 Tabla 3. Clasificación de antioxidantes según su tipo…………….……………………. 15 Tabla 4. Clasificación etiológica de diabetes mellitus…………………………..………. 24 Tabla 5. Rendimiento de los extractos de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp………………………………………………………………………………….. 44 Tabla 6. Pruebas fitoquímicas para saponinas, fenoles, esteroides y alcaloides en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp ……………………………….. 48 Tabla 7. Pruebas para flavonoides y taninos en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp………………………………………………………………… 54 Tabla 8. Pruebas de glicósidos cianogénicos y azúcares reductores en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp………………………………… 56 Tabla 9. Pruebas de quinonas y cumarinas Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp………………………………………………………………… 57 Tabla 10. Pruebas de glicósidos cardiacos y sesquiterpenlactonas en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp………………………………... 58 Tabla 11. Cuantificación de fenoles totales en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. con ácido gálico……………………………………………. 60 Tabla 12. Cuantificación de flavonoides totales en miligramos equivalentes a rutina en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp……………………...... 62 Tabla 13. Cuantificación de esteroides en miligramos equivalentes a colesterol por g de muestra de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp……………… 64 Tabla 14. Cuantificación de taninos en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp con ácido tánico……………………………………………………………….. 66 Tabla 15. Flavonoides identificados en los extractos cetónicos de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp…………………………………………………... 71 Tabla 16. Capacidad antioxidante TAEC obtenida con el radical ABTS……………….. 72 Tabla 17. Curva estándar de Cefalosporina C…………………………………………..... 74
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Tabla 18 Curva estándar de Ketoconazol………………………………………..……….. 75 Tabla 19. Concentración inhibitoria en equivalentes a µg de Cefalosporina C y equivalentes a miligramos equivalentes de Ketoconazol……………………. 77 Tabla 20. Rendimiento de los extractos de Chenopodium sp. y dosis administrada…. 80 Tabla 21. Peso de las orejas de ratón de los diferentes grupos estudiados………...… 80 Tabla 22. Actividad antiiflamatoria de Chenopodium sp. (%inhibición y % inflamación)……………………………………………………………………. 81 Tabla 23. Comparación visual de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp. en ratas normoglucémicas……………………………………………………….. 84 Tabla 24. Actividad cicatrizante (%) de las heridas cerradas en ratas normoglucémicas……………..………………………………………………… 85 Tabla 25. Comparación histológica de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp. en ratas normoglucémicas…………………………………………………….. 88 Tabla 26. Comparación visual de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp. en ratas diabéticas…………………………………………………………………. 91 Tabla 27. Actividad cicatrizante (%) de las heridas cerradas en ratas diabéticas………………………………………………………………...……… 92 Tabla 28. Comparación histológica de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp. en ratas diabéticos……...…………...………………………………………. 94
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Chenopodium murale L “Hediondilla”………………………………….….…... 4 Figura 2. Barkleyanthus salicifolius “Jarilla”…………..………………………………..... 5 Figura 3. Estructura química del fenol………………………………………………….... 7 Figura 4. Estructura base de los flavonoides……………………………………….…... 8 Figura 5. Componentes local y sistémico del proceso inflamatorio…………………… 19 Figura 6. Reacción del reactivo Folin-Ciocalteu...………………………………….…… 26
Figura 7. Reacción de flavonoles con AlCL3……….……………………………...…..... 27 Figura 8. Proceso de separación electroforética…………………………………….…. 28 Figura 9. Reacción de formación del Radical ABTS.……………..………………….… 30 Figura 10. Curva tipo de ácido gálico para la cuantificación de fenoles totales…..….. 59 Figura 11. Curva tipo de rutina para la cuantificación de flavonoides totales…..….... 62 Figura 12. Curva estándar de colesterol para la cuantificación de esteroides…...….... 64 Figura 13. Curva patrón de ácido tánico para la cuantificación de taninos………….... 65 Figura 14. Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides…..…….. 67 Figura 15. (a) Electroferograma del extracto cetónico de tallo de Barkleyanthus salicifolius, (b) Electroferograma de la mezcla de los estándares…………. 68 Figura 16. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la hoja de Barkleyanthus salicifolius con estándares agregados, (b) Electroferograma del extracto cetónico de hoja de B. salicifolius, (c) Electroferograma de la mezcla de estándares………………………………………………………………………. 68 Figura 17. (a) Electroferograma del extracto cetónico del tallo de Chenopodium sp. con estándares adicionados, (b) Electroferograma del extracto cetónico de tallo de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares………………………………………………………………………. 69 Figura 18. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la hoja de Chenopodium sp. con estándar agregado, (b) Electroferograma del extracto cetónico de hoja de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares….. 69
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Figura 19. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la flor de Chenopodium sp. con estándar adicionado, (b) Electroferograma del extracto cetónico de flor de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares……………………………………………………………………….. 70 Figura 20. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la raíz de Chenopodium sp. con estándares añadidos, (b) Electroferograma del extracto cetónico de raíz de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares……………………………………………………………………….. 70 Figura 21. Curva patrón de Trolox utilizando el radical ABTS…………………………. 72 Figura 22. Curva estándar de Cefalosporina C………………………………………….. 75 Figura 23. Curva estándar de Ketoconazol………………………………………..……. 76
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ABREVIATURAS
ABTS Ácido 2, 2' Azinobis-3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico
ADA Asociación Americana de Diabetes (por sus siglas en inglés)
ADN o DNA Ácido Desoxirribonucleico
°C Grados centígrados
CIEF Electroforesis Isoeléctrica
CINVESTAV Centro de Investigación y Estudios Avanzados
CITP Isotacoforesis
CGE Electroforesis Capilar en Gel cm Centímetro
CMC Concentración Micelar Crítica
CMI Concentración Mínima Inhibitoria
CoA Coenzima A
CZE Electroforesis Capilar de Zona dL Decilitro
DM Diabetes Mellitus
DMG Diabetes Mellitus Gestacional
EC Electroforesis Capilar
EGF Factores de Crecimiento Epidermial
ENCB Escuela Nacional de Ciencia Biológicas eq. Equivalente
Facs. Factores
FRAP Poder Antioxidante de Reducción Férrica g Gramo
G- CSF Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos
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GM-CSF Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos-Macrófagos h Hora
HPLC Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia
IFN Interferón
IL Interleucina
IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social
IPN Instituto Politécnico Nacional
IR Infrarrojo
Kg Kilogramo
Kv Kilovoltio
L Leucocito (para la figura 5)
L Litro
LT Leucotrieno
M Molar
MØ Macrófago
MEKC Electroforesis Capilar Micelar
µg Microgramo
µL Microlitro
µm Micrómetro o micra mg Miligramo mL Mililitro mm Milímetro mM Milimol o Milimolar
MPO Mielomaperoxidasa
MS Metabolito Secundario
N Normal nm Nanómetro
OMS Organización Mundial de la Salud
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ORAC Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno
PAF Factor Activador de Plaquetas
PBS Buffer fosfato Salino
PG Prostaglandina
PGE Prostaglandina E pH Potencial Hidrógeno
PMN Neutrófilos Polimorfonucleares psi Libra-fuerza por pulgada cuadrada
RNA Ácido ribonucleico
RMN Resonancia Magnética Nuclear s Segundo sp. Especie
SDF Factor Derivado del Estroma
SDS Dodecil Sulfato de Sodio
SOD Superóxido dismutasa
SSA Secretaria de Salud y Asistencia
STZ Estreptozocina
TEAC Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox
TGF Factor del Crecimiento Transformador
TNF Factor de Necrosis Tumoral
TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
TRAP Parámetro Antioxidante Total de Atrapamiento de Radicales
Trolox 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2- ácido carboxílico
UV Ultra violeta
VEGF Factor de Crecimiento Endotelio Vascular
Vis Visible
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1. INTRODUCCIÓN
Desde la antigüedad, alrededor del mundo uno de los tratamientos más empleados para la prevención y cura de enfermedades ha sido la herbolaria, que consiste en utilizar plantas preparadas de distintas maneras (ungüentos, infusiones, cataplasmas, decocciones, elixires, tinturas, vaporizaciones, emplastos, entre otros) con el fin de contrarrestar las dolencias o malestares de la población. Generalmente las plantas utilizadas son nativas de la región donde se ocupan y el conocimiento de sus propiedades ya sean benéficas o dañinas se ha obtenido con base en métodos empíricos como la observación, por ejemplo, si cierta hierba era comida por los animales significaba que no había riesgos al ingerirla, por el contrario si la evitaban existía la posibilidad de que fuera venenosa o provocara algún daño al contacto, tal es el caso de la ortiga (Valencia Ortiz, 1995; Waizel Bucay, 2011).
Conforme se fueron conociendo las diferentes propiedades de cada especie vegetal comenzó la búsqueda de las dosis adecuadas para cada padecimiento lo cual se logró mediante ensayos a prueba y error. Al pasar el tiempo se ha mostrado mayor interés en conocer las funciones medicinales de las plantas así como las dosis adecuadas para tratar las diferentes enfermedades ya que, como es sabido se ha descubierto la presencia de sustancias activas de suma importancia en las diferentes estructuras de cada especie vegetal (Waizel Bucay, 2011).
En la época actual y de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que el 80% de la población mundial aún confía en las preparaciones con base en plantas medicinales para encontrar alivio a sus problemas primarios de salud. Hoy es común encontrar en las ciudades de todo el mundo productos chinos, alemanes, japoneses, indios, coreanos, brasileños, españoles, franceses, suizos, rusos, etc. elaborados con plantas medicinales y que son vendidos para
1 2014 atender padecimientos que los epidemiólogos teóricos del siglo XX denominaban para lograr la atención primaria de la salud (Waizel Bucay, 2011).
Los países desarrollados están regresando al uso de sistemas de medicina tradicional que implican el uso de productos herbolarios y remedios. De acuerdo con una reciente investigación, alrededor de 1400 preparaciones herbolarias son ampliamente usadas en los estados miembros de la Unión Europea, ellas son de empleo popular y significativas en relación con la atención básica de la salud en Bélgica, Francia, Alemania y Holanda. En China se están buscando los ingredientes activos de la gran riqueza en aproximadamente 5000 plantas medicinales que se han empleado rutinariamente desde la antigüedad. Por estas razones desde hace décadas se han realizados estudios en una amplia variedad de especies vegetales con el fin de estudiar a fondo sus efectos o poder determinar cuáles son las sustancias activas y en que estructuras se encuentran (Waizel Bucay, 2011), algunos ejemplos de estos trabajos de investigación fitoquímica se observan en la Tabla 1.
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Tabla 1. Evaluación de la actividad farmacológica de extractos de origen natural.
Planta Parte Principio activo Uso Referencia utilizada aislado Hipolipemiante Antihipertensivo Bozin et al., Allium sativus L. Bulbos Compuestos Antimicrobiano 2008; fenólicos Antifúngico Rassoul et Antioxidante al., 2006 antiinflamatorio Alcaloide, Antidiabético Bauhinia variegata L. Hojas flavonoides, Antiviral Martínez et esteroides y Antibacteriano al., 2011 taninos Antiinflamatoria Fenoles, Antihistamínica flavonoides, Cicatrizante Cabrera Bryophyllum pinnata Hojas taninos, Analgésica Rodríguez et abundantes Antibacteriana al., 2011 ácidos y Antifúngica minerales Antiespasmódico Hojas, tallos, Tratamiento contra cáscara de Quinonas y erupciones cutáneas Morales León Cassia uniflora Mill los frutos, cumarinas Analgésico et al., 2011 semillas y Antiinflamatorio raíces Antiartrítico
Flavonoides, Antiinflamatorio Crescentia cujete L. Toda la esteroides y Antialérgico Espitia Baena planta triterpenos Antibiotico et al., 2011
Cicatrizante Esteroles, Depurativa saponinas, Antiinflamatoria Rodríguez de Rumex lunaria L. Hojas flavonoides, Emoliente Vera et al., antraquinonas Astringente 2007 Alivia picaduras de insectos
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2. FUNDAMENTO TEÓRICO
2.1 Chenopodium sp.
Conocida comúnmente como “hediondilla, quelite de puerco, pie de ganso, quinua negra, yuyo negro, quelite de perro, hierba del perro” fue caracterizada (ver Anexo 1) por Abigail A. Santiago Sánchez bióloga egresada de ENCB y se determinó que se trata de Chenopodium murale L. Es una hierba anual de raíz fibrosa, de consistencia leñosa, presenta un tallo herbáceo cilíndrico de posición erguida. Mide de 20 a 50 cm de alto, por lo general el tallo ramificado de forma simpódica y filotaxia alterna con los peciolos sobre las hojas. El tipo de hojas va desde pecioladas hasta ovaladas y rombicovaladas de 2 a 3.5 cm de largo todas de borde entero con ápices apiculados y base cuneada presentando una nervación pinnatipartida. Inflorescencia simpétala de simetría radial, estambres libres en grupos de 5. Posición del ovario: súpero con el perianto cubriéndolo de manera incompleta con borde atenuado. Posición de las flores tipo racimo. En medicina tradicional se utiliza como antiinflamatorio y cicatrizante (Rzedowski et al., 2005).
Distribución en México
Se ha registrado en Aguascalientes, Baja California Norte, Baja California Sur, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Estado de México, Michoacán, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luís Potosí, Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz (Villaseñor y Espinosa, 1998).
Figura 1. Chenopodium murale L. “Hediondilla”
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2.2 Barkleyanthus salicifolius (Kunth) H.E. Robins. & Brett.
Esta especie conocida como “Jarilla, azomiate amarillo, azumiate, chilca” y a veces listada como Senecio salignus también fue identificada (ver Anexo 1) por Abigail A. Santiago Sánchez bióloga egresada de ENCB, presentando las siguientes características: hierba perenne bastante ramificada con tallo glabro erecto de 1 a 2 m de alto, estriado y con médula visible en corte transversal ramificándose de manera tomentulosa. Presenta hojas en los peciolos de 0.5 a 3 cm de largo, lanceoladas y laminares de borde entero, atenuadas en la base y con ápice apiculado. La nervadura central muy arcada, las nervaduras paralelas a la central casi imperceptibles aunque estas se unen en la base. Flores compuestas, linguadas y del disco, estas paniculadas-corimbosas, compactas y amplias de color amarillo a blanco presentan simetría radial. Algunos usos medicinales de la jarilla son: antimicótico, remedio contra fiebres intermitentes y reumatismo (Rzedowski et al., 2005).
Distribución altitudinal en México
En el Valle de México de los 2250 a los 3650 m (Rzedowski y Rzedowski, 2001).
Figura 2. Barkleyanthus salicifolius “Jarilla”
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2.3 Metabolitos secundarios en plantas
El metabolismo es el conjunto de reacciones químicas que realizan las células de los seres vivos para sintetizar sustancias complejas y transformarlas en otras más simples o para degradar las complejas y obtener las simples. Las plantas, organismos autótrofos, además del metabolismo primario presentan un metabolismo secundario que les permite producir y acumular compuestos de naturaleza química diversa (Ávalos-García y Pérez-Urria Carril, 2009).
Las plantas producen una gran cantidad y diversidad de compuestos orgánicos que no parecen tener una función en el crecimiento y desarrollo. Estas sustancias se conocen con el nombre de metabolitos secundarios (MS), productos secundarios o productos naturales. Los metabolitos secundarios no tienen función reconocida o directa en los procesos de fotosíntesis, respiración, transporte de solutos, síntesis de proteínas, aislamiento de nutrientes, diferenciación o formación de carbohidratos, proteínas o lípidos. Durante muchos años, el significado adaptativo de muchos metabolitos secundarios era desconocido. Se creía que estos compuestos eran sencillamente productos finales del metabolismo sin función o metabolitos de desecho. Recientemente, se descubrió que muchos metabolitos secundarios tienen importantes funciones en las plantas (Taiz y Zeiger, 2006) tales como:
Protegen a las plantas de ingestión por herbívoros y de la infección por patógenos microbianos.
Sirven como atrayentes de polinizadores de semilla y como agente en la competencia planta-planta.
El reconocimiento de propiedades biológicas de muchos metabolitos secundarios ha alentado el desarrollo de nuevas drogas, antibióticos, insecticidas y herbicidas. Además, la creciente apreciación de los altamente diversos efectos biológicos de
6 2014 los metabolitos secundarios ha llevado a reevaluar los diferentes roles que poseen en las plantas, especialmente en el contexto de las interacciones ecológicas. Los metabolitos secundarios vegetales pueden dividirse en tres grandes grupos químicamente diferentes con base en sus orígenes biosintéticos: terpenos, fenoles y compuestos que contienen nitrógeno y glicósidos (Wink, 2003; Avalos-García y Pérez-Urria Carril, 2009).
Estos metabolitos secundarios, se distribuyen diferencialmente entre grupos taxonómicos, presentan propiedades biológicas, muchos desempeñan funciones ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes, entre otros (Avalos-García y Pérez-Urria Carril, 2009).
2.3.1 Fenoles
Las plantas sintetizan una gran variedad de productos secundarios que contienen un grupo fenol. Estas sustancias reciben el nombre de compuestos fenólicos, polifenoles o fenilpropanoides y derivan todas ellas del fenol, un anillo aromático con un grupo hidroxilo (Figura 3).
Figura 3. Estructura química del fenol
Estos compuestos fenólicos de las plantas forman un grupo químicamente heterogéneo de unos 10,000 compuestos, algunos son solubles solo en solventes orgánicos, otros son ácidos carboxílicos y glicósidos solubles en agua, mientras que otros son polímeros muy insolubles. Desde el punto de vista de la estructura
7 2014 química, son un grupo muy diverso que comprende desde moléculas sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros complejos como los taninos y la lignina.
En el grupo también se encuentran pigmentos flavonoides. De acuerdo con su diversidad química, los fenoles tienen funciones muy diversas en las plantas. Muchos tienen papeles en la defensa de las plantas contra herbívoros o patógenos. Otros participan en el soporte mecánico en la atracción de polinizadores y dispersantes de frutos, en la absorción de la radiación ultravioleta dañina o en la reducción del crecimiento de las plantas competidoras próximas (Wink, 2003; Ávalos-García y Pérez-Urria Carril, 2009).
2.3.2 Flavonoides
Los flavonoides son un gran grupo de sustancias vegetales que fueron descubiertas por el premio Nobel en Bioquímica Dr. Albert Szent- Györgyi, quien les denominó como "vitamina P". El Dr. Szent- Györgyi descubrió que los flavonoides favorecen la función de la vitamina C, mejorando su absorción y protegiéndola de la oxidación. Los flavonoides comprenden varias clases de sustancias naturales, entre las cuales están muchas de las que les confieren colores: amarillo, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y frutos, especialmente (Martínez, 2005).
Su esqueleto carbonado contiene 15 carbonos ordenados en dos anillos aromáticos unidos por un puente de tres carbonos (Figura 4) (Martínez, 2005).
Figura 4. Estructura base de los flavonoides (Martínez, 2005).
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En la ruta de biosíntesis de flavonoides la primera etapa consiste en la condensación de 3 moléculas de malonil-CoA con una molécula de p-cumaril-CoA. Esta reacción está catalizada por calcona sintasa y da lugar a naringerina calcona, precursor de los flavonoles y antocianinas. La misma condensación catalizada por la estilbeno sintasa conduce a la formación estilbenos implicados en mecanismos de defensa de plantas frente a patógenos (Ávalos García y Pérez-Urria Carril, 2009).
Los flavonoides retiran oxígeno reactivo especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos, peróxidos lipídicos o hidroperóxidos; debido a que en su estructura química puede existir un número variable de grupos hidroxilo- fenólicos lo que les confiere una gran capacidad antioxidante (Pérez Trueba, 2003).
Además de las propiedades antioxidantes de los flavonoides, también se ha demostrado otras actividades farmacológicas, tales como (Gómez Sánchez, 2012):
Propiedades anticancerígenas: muchos han demostrado ser tremendamente eficaces en el tratamiento del cáncer. Se sabe que muchos inhiben el crecimiento de las células cancerosas. Se ha probado contra el cáncer de hígado.
Propiedades cardiotónicas: tienen un efecto tónico sobre el corazón, potenciando el músculo cardíaco y mejorando la circulación. Atribuidas fundamentalmente al flavonoide quercetina aunque aparece en menor intensidad en otros como la genisteína y la luteolina. Se ha estudiado que los flavonoides reducen el riesgo de enfermedades cardíacas.
Fragilidad capilar: mejoran la resistencia de los capilares y favorecen el que éstos no se rompan, por lo que resultan adecuados para prevenir el
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sangrado. Los flavonoides con mejores resultados en este campo son la hesperidina, la rutina y la quercetina.
Propiedades antitrombóticas: la capacidad de estos componentes para impedir la formación de trombos en los vasos sanguíneos posibilita una mejor circulación y una prevención de muchas enfermedades cardiovasculares.
Disminución del colesterol: poseen la capacidad de disminuir la concentración de colesterol y de triglicéridos.
Protección del hígado: algunos flavonoides han demostrado disminuir la probabilidad de enfermedades hepáticas. Fue probado en laboratorio que la silimarina protege y regenera el hígado durante la hepatitis. Junto con la apigenina y la quercetina, son muy útiles para eliminar ciertas dolencias digestivas relacionadas con el hígado, como la sensación de plenitud o los vómitos.
Protección del estómago: ciertos flavonoides, como la quercetina, la rutina y el kaemferol, tienen propiedades antiulcéricas al proteger la mucosa gástrica.
Antiinflamatorios y analgésicos: la hesperidina por sus propiedades antiinflamatorias y analgésicas, se ha utilizado para el tratamiento de ciertas enfermedades como la artritis. Los taninos tienen propiedades astringentes, vasoconstrictoras y antiinflamatorias, pudiéndose utilizar en el tratamiento de las hemorroides (Gómez Sánchez, 2012).
Los flavonoides se clasifican en función del grado de oxidación del puente de tres carbonos, siendo los principales antocianinas (pigmentos), flavonas, flavonoles e isoflavonas (Tabla 2).
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Tabla 2. Estructura básica de los grupos de flavonoides (Mercado Sánchez, 2010).
Grupo Estructura Grupo Estructura
Antocianidinas Dihidroflavonoles
Auronas Flavonas
Biflavonoides Flavonoles
Chalconas Flavandioles
Dihidrochalconas Isoflavonoides
Flavanonas Protocianidinas
Flavanol _ _
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2.3.3 Terpenos
Los terpenos, o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios (más de 40.000 moléculas diferentes). Son biosintetizados a partir de la acetil CoA o de intermediarios glicolíticos. Suelen ser insolubles en agua y derivan todos ellos de la unión de unidades de isopreno (5 átomos de C). De esta forma, los terpenos se clasifican por el número de unidades de isopreno (C5) que contienen: los terpenos de 10 C contienen dos unidades C5 y se llaman monoterpenos; los de 15 C tienen tres unidades de isopreno y se denominan sesquiterpenos, y los de 20 C tienen cuatro unidades C5 y son los diterpenos. Los triterpenos tienen 30 C, los tetraterpenos tienen 40 C y se habla de politerpenos cuando contienen más de 8 unidades de isopreno (Ávalos García y Pérez-Urria Carril, 2009).
La ruta biosintética de estos compuestos da lugar tanto a metabolitos primarios como secundarios de gran importancia para el crecimiento y supervivencia de las plantas. Entre los metabolitos primarios se encuentran hormonas (giberelinas, ácido abscísico y citoquininas), carotenoides, clorofilas y plastoquinonas (fotosíntesis), ubiquinonas (respiración) y esteroles (de gran importancia en las estructura de membranas). A la vista de esta variedad de compuestos, es evidente que muchos terpenos tienen un importante valor fisiológico y comercial (Ávalos García y Pérez-Urria Carril, 2009).
2.3.4 Compuestos nitrogenados
Los alcaloides son una gran familia de más de 15.000 metabolitos secundarios que tienen en común tres características: son solubles en agua, contienen al menos un átomo de nitrógeno en la molécula y exhiben actividad biológica. La mayoría son heterocíclicos aunque algunos son compuestos nitrogenados alifáticos (no cíclicos) como la mescalina o la colchicina, por ejemplo. Se encuentran en el 20% aproximadamente de las plantas vasculares, la mayoría
12 2014 dicotiledóneas herbáceas. En humanos, los alcaloides generan respuestas fisiológicas y psicológicas la mayoría de ellas consecuencia de su interacción con neurotransmisores. A dosis altas, casi todos los alcaloides son muy tóxicos. Sin embargo, a dosis bajas tienen un alto valor terapéutico como relajantes musculares, tranquilizantes, antitusivos o analgésicos. Se sintetizan normalmente a partir de lisina, tirosina y triptófano, aunque algunos como la nicotina y compuestos relacionados derivan de la ornitina (Ávalos García y Pérez-Urria Carril, 2009).
2.3.5 Otros compuestos
Los MS de las plantas también se pueden dividir en más categorías menos generales, clasificados según su vía biosintética y estructura química, además de los terpenoides y los alcaloides encontramos:
Betalaínas. Las betalaínas son pigmentos rojos y amarillos que están presentes solamente en los Caryophyllales excepto Caryophyllaceae y Molluginaceae; en contraste de la mayoría de las otras plantas, cuyos pigmentos son antocianinas (que son flavonoides). Al igual que los demás pigmentos, cumplen funciones de atracción de polinizadores y dispersores, probablemente tienen funciones adicionales como absorción de luz ultravioleta y protección contra herbívoros (Clement et al., 1994).
Glucosinolatos. De ellos se derivan los aceites de mostaza, al ser hidrolizados por las enzimas myrosinasas (Rodman, 1981). Evolutivamente se originaron dos veces, por lo que se encuentran en dos líneas de plantas no emparentadas filogenéticamente: todos los Brassicales por un lado y en Drypetes (Rodman, et al., 1998).
Glicósidos. Los glicósidos son metabolitos vegetales de gran importancia. Su nombre hace referencia al enlace glicosídico que se forma cuando una molécula de azúcar se condensa con otra que contiene un grupo hidroxilo. Existen tres grupos de glicósidos de particular interés: saponinas, glicósidos cardiacos y
13 2014 glicósidos cianogénicos. Una cuarta familia, los glucosinolatos, se incluyen en este grupo debido a su estructura similar a los glicósidos.
Poliacetilenos. Grupo grande de metabolitos no nitrogenados, formados por la unión de unidades de acetato por la vía de los ácidos grasos. Se encuentran en algunos grupos emparentados de familias de astéridas.
Antocianinas y otros flavonoides. Son compuestos fenólicos, hidrosolubles, presentes en las vacuolas celulares de las plantas, que se sintetizan a partir de fenilalanina y malonil-CoA. Todos los flavonoides comparten la vía biosintética central, pero los productos finales son muy variados entre especies de plantas. Se encuentran en todas las embriofitas. Tienen funciones de protección contra la luz ultravioleta, defensa ante el herbivorismo, pigmentación, entre otros. Los flavonoides más conocidos son las antocianinas, pigmentos de las flores de muchas plantas. Hay tanta variabilidad entre especies (se han enumerado alrededor de 9.000 flavonoides y se siguen contando) que son útiles para diferenciar entre especies de plantas (Williams y Grayer, 2004).
2.5 Actividad antioxidante
Los antioxidantes son compuestos que a baja concentración respecto a un sustrato o molécula, retrasan o previenen su oxidación. La función principal es neutralizar a los radicales libres. Al chocar con un radical libre, el antioxidante cede un electrón, se oxida y se transforma en un radical libre débil no tóxico (Almeida, 2012).
No todos los antioxidantes actúan de la misma manera, los llamados enzimáticos catalizan o aceleran reacciones químicas que utilizan sustratos que reaccionan con el radical libre. Los antioxidantes se clasifican en endógenos (que se encuentran en el organismo y son sintetizados por sus células), exógenos y cofactores (ingresan a través de la dieta) como se muestra en la Tabla 3 (Mayor Oxilia, 2010; Mercado Sánchez, 2010).
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Tabla 3. Clasificación de antioxidantes según su tipo.
Endógenos Exógenos Cofactores Glutatión Vitamina E Cobre Coenzima Q Vitamina C Zinc Ácido tióctico Betacaroteno Manganeso Enzimas: Flavonoides Hierro Superóxido dismutasa (SOD) Catalasa Glutatión peroxidasa Licopenos Selenio
La capacidad antioxidante de una mezcla no viene dada solo por la suma de las capacidades antioxidantes de cada uno de sus componentes; también depende del microambiente en que se encuentre el compuesto (Robards, et al., 1999).
Existen diversos compuestos cromógenos utilizados para determinar la capacidad antioxidante de compuestos fenólicos siendo uno de los más utilizados debido a su estabilidad el radical ácido 2, 2' Azinobis-3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico (ABTS).
2.6 Actividad antimicrobiana
Los antimicrobianos constituyen la base fundamental del tratamiento de las enfermedades infecciosas, uno de los problemas más frecuentes y causante de la mayor morbimortalidad en cualquier especialidad médica. Se puede decir que existe una batalla constante entre nuestro organismo y los microorganismos invasores que nos rodean, nuestra primera barrera defensiva es la integridad de la piel y las mucosas, la otra respuesta defensiva es la reacción inmunológica que crea mecanismos de defensa guardando esta información en la memoria de los glóbulos blancos para actuar con mayor efectividad en el siguiente ataque, sin embargo, este mecanismo no es siempre posible y efectivo, por lo que se hace
15 2014 necesario el ayudar a nuestros mecanismos de defensa con otras armas que ayudan a destruir al microorganismo invasor, en general estos se llaman antibióticos, término que aunque muy utilizado en la actualidad no es preciso, ya que antibiótico significa antivida, por lo tanto la destrucción del huésped y el invasor, por este motivo es más apropiado denominarlos antimicrobianos, ya que actúan contra cualquier tipo de microbios como son: bacterias, hongos y virus.
Existen diferentes mecanismos para destruir microorganismos, como someterlos a condiciones ambientales donde se hace difícil el sobrevivir como: la desecación, ebullición, rayos ultravioleta, ultrasonido, etc. este mecanismo es llamado de esterilización, al igual que otras substancias antimicrobianas como los antisépticos no pueden ser aplicados sobre el ser humano que ha sido infectado, se hace necesario introducir otras substancias químicas (naturales, sintéticas, semisintéticas) que lleguen a los diferentes compartimientos orgánicos y destruyan al germen a través de mecanismos de acción especiales, sin alterar en forma importante nuestras células, evitando la toxicidad y efectos colaterales, debiendo destruir preferentemente a varios gérmenes a la vez y evitar que se defiendan creando mecanismos de resistencia (Zabala Canedo, 2011).
Existen cuatro mecanismos de acción antimicrobiana y son (Valls, 2008):
Coagulación de proteínas: las proteínas de las células, muchas de las cuales son enzimas, existen en un estado coloidal, si las propiedades son enérgicamente alteradas por un agente antibacteriano se coagularán y no serán funcionales.
Destrucción de la membrana o de la pared celular: las sustancias que pueden alterar las propiedades físicas o químicas de la membrana impiden su funcionamiento normal, matando o inhibiendo a la célula. La pared celular actúa como una estructura de sujeción protegiendo a la célula de la lisis osmótica. Los agentes que destruyen la pared (Lisozima) o impiden su síntesis normal (penicilina) traen consigo la lisis celular.
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Remoción de grupos sulfhidrilos libres: las enzimas que contienen cisteína tienen cadenas laterales que terminan en grupos sulfhidrilo. Esas enzimas no pueden funcionar a menos que los grupos sulfhidrilo permanezcan libres y reducidos. Los agentes oxidantes, por lo tanto, interfieren con el metabolismo ligando grupos sulfhidrilo vecinos para dar uniones disulfuro:
+ 2
푅 − 푆퐻 퐻푆 − 푅 − 퐻 → 푅 − 푆 − 푆 − 푅 Muchos metales como el ion mercúrico también interfieren por combinación con los sulfhidrilos:
푅 − 푆퐻 퐶푙 푅 − 푆 + + 2
퐻푔 퐻푔 퐶푙 푅 − 푆퐻 퐶푙 푅 − 푆 Existen en la célula muchas enzimas que contienen grupos sulfhidrilo, por consiguiente los agentes oxidantes y los metales pesados causan un daño considerable.
Antagonismo químico: la interferencia de un agente químico en la reacción normal entre una enzima específica y su sustrato se conoce como "antagonismo químico". Al unirse con la parte activa de la enzima impide la unión de ésta con el sustrato (Valls, 2008).
2.7 Actividad antiinflamatoria
Diversos estudios muestran que hay un amplio grupo de especies vegetales que tienen efecto antiinflamatorio tal es el caso de: Allophylus comimia L. (Oliva Hernández et al., 2013); Piper auritum (Vega Montalvo y Lagarto Parra, 1999); Aloe vera L. (León Sarabia et al., 1999); Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia, Curatella americana y Physalis peruviana (González Guevara et al., 2011).
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Al ser de origen natural suelen tener menos repercusiones para el organismo, sin embargo, aún no se ha logrado equiparar la potencia de los compuestos sintéticos debido al bajo contenido de metabolitos secundario presentes en las plantas que confieren dicha actividad.
2.7.1 Proceso inflamatorio, mecanismo general
La inflamación puede iniciarse por estímulos infecciosos, físicos, químicos o traumáticos. A pesar de la heterogeneidad de los estímulos, los diferentes mecanismos del proceso pueden ser estudiados sistemáticamente. El proceso tiene tres fases: iniciación, consolidación y resolución.
La primera fase se origina por la acción de células como los polimorfonucleares neutrófilos (PMN), basófilos y eosinófilos y de los factores producidos por ellas. Además participan las plaquetas. La segunda fase ocurre gracias a la participación de macrófagos y de linfocitos. La fase de resolución se cumple por la interacción entre macrófagos y fibroblastos y busca reparar los daños producidos por la agresión (Rojas Montoya, 2004).
Una vez iniciado el proceso con aflujo de PMN, macrófagos y linfocitos tiene lugar un balance homeostático entre el reclutamiento de estas células, división in situ, migración y muerte. Por lo general la inflamación aguda termina en resolución por apoptosis de las células que participan, por fagocitosis y lisis del microorganismo responsable, cuando el proceso inflamatorio es de origen infeccioso. Si el Agente no es eliminado o fallan los mecanismos homeostáticos, el proceso se hace crónico y se acompaña de daño tisular. En este caso hay una superproducción de un factor derivado del estroma celular, conocido como SDF-1, producido por los fibroblastos, que retiene in situ las células inflamatorias. El fibroblasto produce además Interferón-beta (IFN-β) que es antiapoptótico y prolonga su sobrevivencia (Rojas Montoya, 2004).
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El proceso inflamatorio tiene un componente local y otro sistémico (Figura 5). En el primero participan los sistemas del complemento, de coagulación y de cininas así como metabolitos del ácido araquidónico y varias citocinas, con lo cual se genera vasodilatación local, trasudación de líquidos, formación de edema, aumento de la temperatura local y aflujo de las células de las sangre hacia el tejido afectado.
La respuesta sistémica por su parte se caracteriza por fiebre, leucocitosis, cambios en las concentraciones de metales pesados e incremento en una serie de proteínas especiales producidas por el hígado que se conocen como proteínas de la fase aguda de la inflamación. Simultáneamente se producen cambios endócrinos como aumento en la producción de cortisol, glucagón, catecolaminas y hormonas tiroideas, incremento de la gluconeogénesis y del catabolismo proteico con un balance nitrogenado negativo (Rojas Montoya, 2004).
Figura 5. Componentes local y sistémico del proceso inflamatorio. En la respuesta local participan eicosanoides, PGs, LT, TNF, IL-1, IL-2 y factores de los sistemas del complemento. En la respuesta sistémica participan IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, TNF, INF y factores formadores de colonias (Rojas Montoya, 2004).
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2.7.2 Resolución del proceso inflamatorio
Tanto el sistema del complemento como el de coagulación tienen enzimas reguladoras que evitan que su activación se prolongue más de lo necesario. El proceso inflamatorio es por lo general limitado y termina por resolverse. La desaparición de las células que ya no sean requeridas en el proceso ocurre por apoptosis (Rojas Montoya, 2004).
Cuando el agente no logra ser eliminado o hay alguna alteración que conduzca a una reacción autoinmune, se genera el proceso crónico en el cual intervienen el fibroblasto y factor derivado del estroma, SDF-1 que evita la apoptosis de los linfocitos y asegura su permanencia en el lugar de la agresión prolongando el proceso inflamatorio (Rojas Montoya, 2004).
Al eosinófilo se le asignaban funciones antiinflamatorias muy importantes. Hoy se tiene como una célula más proinflamatoria que antiinflamatoria pero con algunas funciones reguladoras. El eosinófilo es una de las pocas fuentes de fosfolipasa D, que inactiva el “factor activador de las plaquetas”. Posee histaminasa que desactiva la histamina (Rojas Montoya, 2004).
2.7.3 Otros frenos a la inflamación
Citoquina antagonista del receptor para la IL-1. Frena la acción de la IL-1 por lo cual actúa como antiinflamatorio.
Factor del crecimiento transformador beta, TGFβ. Es antiinflamatorio porque frena la hematopoyesis, reduce la producción de las citoquinas proinflamatorias e inhibe la adherencia de leucocitos al endotelio vascular (Rojas Montoya, 2004).
Reparación de tejido. Cuando cesa el proceso inflamatorio se inicia la reparación y/o cicatrización de los tejidos. Los macrófagos cumplen el papel inicial de
20 2014 desbridamiento y remoción de materiales externos y restos celulares (Rojas Montoya, 2004).
Los fibroblastos y las células epiteliales y endoteliales, estimuladas por citosinas como “factores de crecimiento epidermial” (EGF) y factor de crecimiento endotelio vascular (VEGF), inician la cicatrización con neoformación vascular, proceso conocido como angiogénesis (Rojas Montoya, 2004).
Fibronectina. Esta glucoproteína sirve como un factor de adherencia de varios microorganismos a los fagocitos. Además, cumple una importante función en la resolución del proceso inflamatorio, promoviendo la formación de la matriz tisular para la regeneración y/o cicatrización de los tejidos. Su acción se refuerza en presencia de heparina (Rojas Montoya, 2004).
2.7.4 Control farmacológico de la inflamación
La inhibición en la síntesis de los eicosanoides ofrece hacia el futuro perspectivas prometedoras. Por ejemplo, los esteroides inducen la síntesis de una proteína, la “macrocortina”, que inhibe parcialmente la fosfolipasa. En esta forma la producción de los eicosanoides disminuye apreciablemente, tanto la vía de la ciclo-oxigenasa como de la lipo-oxigenasa. La aspirina y los antiinflamatorios no esteroideos, por su parte, inhiben la ciclo-oxigenasa y su acción antiinflamatoria se debe a la disminución en la producción de prostaglandinas (PGs). Este efecto es en ocasiones tan importante, que la indometacina aplicada tópicamente en la piel, puede inhibir muchas de las manifestaciones iniciales de enrojecimiento producidas por la luz solar (Rojas Montoya, 2004).
2.8 Actividad Cicatrizante
Actualmente se han realizado diversos estudios en plantas que presentan propiedades cicatrizantes, algunas de ellas son: Bryophyllum pinnata (Domínguez Suárez et al., 2001); Rumex Lunaria L. (Rodríguez de Vera et al., 2007); Dorstenia
21 2014 drakena L. (Méndez Martínez et al., 2008); Zeyheria tuberculosa (De Albuquerque Sarmento et. al., 2014), esto con el fin de aprovechar los recursos naturales presentes en diversas regiones del mundo, donde los recursos económicos no permiten que toda población de cierta zona pueda adquirir medicamentos para lesiones en la piel, pues la mayoría de ellos tiene costos elevados como las pomadas contra quemaduras, irritación de la piel, etc.
2.8.1 Proceso de cicatrización
Cuando se produce una herida, se desencadena una serie de fenómenos biológicos destinados a reparar la lesión, que en conjunto se denominan “proceso de cicatrización”. En el mejor de los casos, el proceso finaliza con la reparación completa de la lesión, sin secuelas funcionales ni estéticas. Cuando las condiciones no son tan favorables y se debe sustituir el tejido perdido, el organismo sustituye el defecto mediante una cicatriz. La formación de la cicatriz comprende cuatro fases:
Fase inflamatoria. Inmediatamente después del traumatismo se produce la rotura de vasos sanguíneos y la salida de elementos hemáticos, que dan origen al hematoma y posteriormente al coágulo. Al mismo tiempo se inicia una reacción inflamatoria con vasodilatación para eliminar la llegada a la zona lesionada de elementos celulares responsables de la reparación, como los leucocitos, macrófagos y neutrófilos. La acción de estos elementos celulares puede verse dificultada en presencia de fármacos antiinflamatorios, inmunodepresores, vasoconstrictores o anticoagulantes (Alonso Peña, 2007).
Fase de eliminación o lisis. Es una fase de limpieza de la zona que llevan a cabo los monocitos, macrófagos y mastocitos, mediante la liberación de enzimas y la fagocitosis de los tejidos muertos. La acción de estos elementos celulares se ve dificultada en presencia de corticoides, antibióticos, inmunodepresores o antisépticos citotóxicos (Alonso Peña, 2007).
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Fase de síntesis o fase proliferativa. Los monocitos actúan como precursores de los fibroblastos, que son los encargados de la síntesis de colágeno y fibras elásticas. Finalmente, las células epiteliales proliferan para conseguir el cierre de la herida. En esta fase se produce la creación de nuevas células del endotelio vascular que formaran nuevos vasos sanguíneos, proceso denominado “neoangiogénesis”, así como la cobertura de toda la lesión con epidermis, proceso que recibe el nombre de “epitelización”. Esta fase puede verse dificultada por el empleo de antibióticos, corticoides, inmunodepresores o antisépticos, así como por una técnica de cura de la herida. No es conveniente emplear curas secas, apósitos adherentes que desprendan la zona de reepitelización, vendajes compresivos o una técnica traumática que lesione de nuevo capilares sanguíneos. La deficiente vascularización de la zona, que no permite el correcto aporte de oxígeno a los tejidos, y un estado nutricional deficiente son otros condicionantes que pueden retrasar la curación de la herida (Alonso Peña, 2007).
Fase de maduración. El proceso de cicatrización no concluye con la epitelización de la herida, sino que se prolonga durante 6-12 meses más con la fase de maduración. En esta fase se reorganizan las fibras de colágeno desestructuradas y se reduce el número de capilares formados. En condiciones normales se consigue que la cicatriz sea pálida y reduzca su consistencia y volumen. En condiciones patológicas, la cicatriz permanecerá largo tiempo roja (excesiva actividad vascular), dura y elevada (excesivas fibras de colágeno desorganizadas). Es en esta fase cuando las medidas encaminadas a la prevención de las cicatrices de mala calidad son más eficaces. Cuanto antes se inicien las medidas preventivas, mejores resultados funcionales y estéticos se obtendrán. Una cicatriz adecuada es aquella que tiene un color, un relieve, una sensibilidad y una textura normales, sea cual fuere la causa que la motivó, resultado que cabe esperar en un plazo de 6 a 12 mese tras la lesión (Alonso Peña, 2007).
Algunas enfermedades afectan el proceso de cicatrización, tal es el caso de la diabetes, enfermedad crónica degenerativa, sin cura, que sólo se controla y su prevalencia va en aumento (Kalofoutis, et al., 2007).
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En México el número de casos de diabetes en menores de 40 años se ha duplicado en los últimos diez años, de acuerdo con la secretaria de salud. Este problema de salud, junto con el sobrepeso y la obesidad es la principal causa de muerte en nuestro país (OMS; SSA; IMSS, 2011).
De acuerdo con el comité de expertos de la Asociación Americana de Diabetes (ADA), la diabetes mellitus (DM) se clasifica en cuatro grupos principales (Tabla 4). Aunque no se indican en la tabla, cabe señalar que en el tercer grupo, denominado “otros tipos específicos” existen varios subtipos de diabetes, tales como la diabetes mitocondrial, lipoatrófica, fibrocalculosa, etc., cada uno de los cuales está genéticamente determinado (Velho y Froguel, 1997; Sánchez-Michel y González-Gálvez, 1997; Committee Report, 1997).
Tabla 4. Clasificación etiológica de diabetes mellitus (Vázquez Procopio, 2012).
DIABETES TIPO 1
A. Asociada al sistema inmune B. Idiopática
DIABETES TIPO 2
OTROS TIPOS ESPECIFICOS DE DIABETES
A. Defectos genéticos relacionados con la función de la células β B. Defectos genéticos en la acción de la insulina C. Enfermedades del páncreas exocrino D. Endocrinopatías E. Química o farmacológicamente inducida F. Infecciones G. Formas poco comunes de diabetes asociada al sistema inmune H. Otros síndromes genéticos algunas veces asociados con diabetes
DIABETES MELLITUS GESTACIONAL (DMG)
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Los síntomas generales que presentan los enfermos de diabetes son: altos niveles de glucosa, altos niveles de presión, triglicéridos elevados, entre otros. Una de las patologías más frecuente es un deficiente proceso de cicatrización ya que la hiperglucemia es detonador de los desórdenes bioquímicos que dan lugar a las complicaciones sistémicas. El proceso inflamatorio en una parte esencial de la cicatrización de las heridas agudas, y se sabe que su alteración constituye una de las causas principales de la cronificación de las heridas (Moffatt et al., 2008). Contrario a lo que ocurre durante la cicatrización normal, la eliminación apoptótica fisiológica de las células inflamatorias se detiene, lo que provoca un anormal estancamiento de la fase inflamatoria en las heridas diabéticas. En estas, además existe una sobre-expresión de citocinas pro-inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (del inglés, TNF-a) y la interleucina-1b (IL-1b), lo que trae consigo consecuencias deletéreas de impacto local y remoto. La red etiopatogénica de citocinas inflamatorias, proteasas locales, especies reactivas al nitrógeno y al oxígeno, propician un ambiente citotóxico y pro-degradativo en el lecho de la herida, que perjudica la granulación y re-epitelización. La glicosilación no enzimática de proteínas persiste como un ingrediente patogénico activo en el deterioro del proceso de cicatrización. La acumulación anormal de productos glicosilados interfiere con la replicación del ADN, el anclaje, la migración y la proliferación celular. La diabetes afecta la liberación, el reclutamiento y la diferenciación de las células madre derivadas de médula ósea, lo que limita la disponibilidad de estas células para reparar el tejido. La re-epitelización también se altera debido a la activación y/o diferenciación incompleta de los queratinocitos, lo cual obstruye su migración. Se necesitan de forma urgente abordajes farmacológicos novedosos y revolucionarios para reducir las diversas complicaciones de la diabetes, tales como la temida amputación de miembros inferiores (Berlanga-Acosta, 2010).
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3. FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA METODOLOGÍA
3.1 Extracción por sonicación
La sonicación consiste en la aplicación de ultrasonidos, dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se puede destruir las estructuras subcelulares, este tipo de energía se utiliza para la extracción de algunos compuestos fenólicos de plantas pues mejoran el rendimiento (Hromádkova y Ebringerová, 2003), ya que al romper las paredes celulares se incrementar la transferencia de masa y favorecer la actividad de las enzimas.
3.2 Cuantificación de fenoles
El método espectrofotométrico desarrollado por Folin y Ciocalteu, 1927, para la determinación de fenoles totales, se fundamenta en su carácter reductor y es el más empleado. El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico (Figura 6). La transferencia de electrones a pH básico reduce los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos cromógenos de color azul intenso, de tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23), presentando un máximo de absorción a una longitud de 765 nm, siendo proporcional este color al número de grupos hidroxilo de la molécula. En la realización de la prueba es necesario hacer una curva tipo, utilizando como estándar algún compuesto fenólico; para finalmente poder expresar los resultados como gramos de muestra equivalentes a gramos del estándar (Spanos y Wrolstad, 1990).
Figura 6. Reacción del reactivo Folin-Ciocalteu (Mercado Sánchez, 2010).
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3.3 Cuantificación de flavonoides
Existen diferentes métodos para la cuantificación de flavonoides, los cuales pueden ser cromatográficos o espectrofotométricos. Las flavonas y flavonoles, forman complejos coloridos estables con el AlCl3 (Figura 7), presentando un máximo de absorbancia a 510 nm, por lo que pueden analizarse mediante espectrofotometría UV/Vis (Julián Loaeza, 2009).
Para poder cuantificar los flavonoides en una muestra, debe de realizarse por anticipado una curva tipo utilizando algún estándar, para así poder expresar el resultado de la muestra como gramos de muestra equivalentes a gramos del estándar (Mercado Sánchez, 2010).
Figura 7. Reacción de flavonoles con AlCl3 (Mercado Sánchez, 2010).
3.4 Identificación por electroforesis capilar
3.4.1 Proceso electroforético
Es el fenómeno que ocurre cuando las especies cargadas (iones) de un sistema se mueven y se separan bajo la influencia de un campo eléctrico en función de su
27 2014 distinta velocidad de migración la cual depende de la carga y el tamaño de la partícula. Las partes básicas de dicho sistemas son: un par de electrodos, una fuente de poder y un medio conductor (Figura 8) (Castillo Rodríguez et al., 2005).
Figura 8. Proceso de separación electroforética (Castillo Rodríguez et al., 2005).
3.4.2 Electroforesis capilar
La electroforesis realizada en tubos capilares ha aumentado el interés en esta técnica desde el punto de vista analítico, mejorando realmente la movilidad clásica de electroforesis, ampliando increíblemente el campo de aplicación de esta técnica (Castillo Rodríguez et al., 2005).
Sus principales ventajas son: alta resolución, alta eficiencia de separación, corto tiempo de análisis, pequeñas cantidades de muestra y bajo consumo de disolventes orgánicos así como la separación de un sin número de compuestos y una gama de mecanismos que proporcionan una separación selectiva (Castillo Rodríguez et al., 2005).
En la electroforesis capilar se pueden distinguir varios tipos de separación: • Electroforesis Capilar de Zona (CZE) • Electroforesis Capilar Micelar (MEKC) • Electroforesis Capilar en Gel (CGE) • Electroforesis Isoeléctrica (CIEF) • Isotacoforesis (CITP)
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Todos estos tipos de separación se pueden realizar usando el mismo equipo lo cual hace que la electroforesis capilar sea una técnica analítica muy versátil. En CZE la separación ésta basada en las diferencias de movilidades efectivas, en el tamaño de la molécula, en CIEF las diferencias en el punto isoeléctrico y CIPT en diferencias de movilidad efectiva (Mercado Sánchez, 2010).
3.4.3 Electroforesis capilar micelar
La electroforesis capilar micelar (MEKC) es un método de separación altamente eficiente utilizado para el análisis de pequeñas moléculas neutras, compuestos cargados con idénticas movilidades o mezclas de compuestos con carga o sin carga. El mecanismo de separación en MEKC se basa en las diferencias en equilibrios de distribución entre una fase acuosa y una fase pseudo-estacionaria micelar. Estas fases se mueven con diferentes velocidades debido a una combinación de electroforesis y electroósmosis (Mercado Sánchez, 2010).
En la electroforesis capilar micelar se adiciona un surfactante al sistema electrolito a una concentración alrededor de la concentración micelar critica (CMC). Los surfactantes pueden ser aniónicos o catiónicos, uno de los surfactantes más utilizados es el dodecil sulfato de sodio (SDS), es un surfactante tipo aniónico que permite la formación de micelas con carga negativa, lo que les confiere una movilidad electroforética hacia el electrodo positivo. Cuando se introduce una muestra en el sistema los componentes se distribuyen entre la fase acuosa y el interior hidrófobo de las micelas. La distribución de los analitos y los equilibrios que resultan dependen de la polaridad de los analitos. Con los analitos polares se favorece la permanencia en la disolución acuosa mientras que los compuestos no polares prefieren el medio constituido por la cadena hidrofóbica de las micelas (Mercado Sánchez, 2010).
3.5 Determinación de la capacidad antioxidante
Existen diversos métodos para evaluar la actividad antioxidante (captación de radicales libres) ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias más aplicadas en
29 2014 las medidas in vitro de la capacidad antioxidante total de un compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radical; la pérdida de color ocurre de forma proporcional con la concentración. No obstante, las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro nos dan tan sólo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. Uno de los métodos más aplicados es ABTS ya que presenta una excelente estabilidad en ciertas condiciones (Kuskoski, 2005).
3.5.1 Método Ácido 2, 2' Azinobis-3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico (ABTS)
El radical ABTS•+ se obtiene por la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,42 mM, concentración final) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h (ver Figura 9). Este reactivo se mantiene estable por 2 a 3 días si se guarda en la oscuridad. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia de 0,70 (±0,02) a 734 nm y 25ºC. La absorbancia se mide cada 30 s después de la adición de 1.0 ml de la solución ABTS•+ a 100 μL de muestra, homogenizada durante 30 s en forma continua durante 6 minutos. La disminución de la coloración es expresada como el porcentaje de inhibición de ABTS, la cual es comparada con una curva estándar del antioxidante sintético de referencia, Trolox (20-200μmol/L). Los resultados se expresan como mmol o μmol de Trolox equivalente por gramo de muestra fresca (Chuquimia et al., 2008).
Figura 9. Reacción de formación del radical ABTS (Mercado Sánchez, 2010).
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3.6 Determinación de la capacidad antimicrobiana. Método disco-placa
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiogramas, cuyo principal objetivo es evaluar la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos. El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana (Picazo, 2000).
Actualmente no existe un método universal que reproduzca las condiciones en las que se encuentra un microorganismo produciendo una infección y, por lo tanto, la situación ideal en la que deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad, sin embargo, uno de los métodos más utilizados y aceptados para el estudio de la sensibilidad es el método del antibiograma disco-placa el cual consiste en depositar en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución (Picazo, 2000).
3.7 Determinación de la actividad antiinflamatoria. Modelo de inducción de edema auricular con aceite de croton
El aceite de croton se obtiene de la especie Croton tiglium L y posee propiedades irritantes, proinflamatorias y promotora de tumores. Estas propiedades se deben a
31 2014 que contiene una mezcla de ésteres del forbol de la cual la sustancia más potente es el 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA). La aplicación del TPA desencadena todos los eventos propios del proceso inflamatorio: vasodilatación y eritema entre 1-2 h, extravasación y edema entre 3-4 h, llegando al máximo a las 6-8 h. A las 12-14 h el edema desaparece, pero la vasodilatación y el eritema pueden persistir entre 24-48 h.
A nivel histológico, se produce agregación plaquetaria a las 2 h, agregación y adherencia de PMNs (neutrófilos y eosinófilos) a las 4-6 h, migración a la dermis y desgranulación de mastocitos a partir de las 6 h. Entre 6-24 h se observa la acumulación y migración de leucocitos al compartimiento subcorneal epitelial, particularmente alrededor de los folículos, que degenera en la formación de abscesos subcorneales a las 48-72 h. A partir de 24 h aparece incremento de la mitosis en la membrana basal epidérmica, lo que conlleva hiperplasia y engrosamiento epidérmico aparente a las 48-96 h. Se ha comprobado que en este modelo se produce infiltración de neutrófilos mediante el análisis de actividad de Mielomaperoxidasa (MPO) en el sitio de inflamación, se produce también un incremento de la concentración de prostaglandina E2 (PGE2) y Leucotrieno B4 (LTB4) (Fernández Urquiza y Torres Fuentes, 2004; Raederstorff et al., 1996).
3.8 Evaluación del efecto cicatrizante.
3.8.1 Gel de carbopol.
El gel de carbopol 940, es un hidrogel monofásico constituido por macromoléculas dispersas en una fase líquida. Sus características lubricantes son adecuadas para su aplicación en piel seca o seborreica, ya que al secarse forma una película trasparente no oclusiva, elástica y de alta adherencia, que no obtura los poros cutáneos. El gel de carbopol 940 tiene propiedades de bioadhesión por esto es utilizado como transportes para distribuir y liberar medicamentos de aplicación tópica (Guillermo Navarro, 2002).
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La literatura reporta que la solución acuosa de carbopol 940 no tiene actividad antimicrobiana o efecto inhibitorio del crecimiento celular. También ha sido reportado que el gel de carbopol 940 no tiene efecto en el desarrollo normal del proceso de cicatrización (Guillermo Navarro, 2002).
3.8.2 Generalidades de histología animal.
Para estudiar la evolución de las cicatrices experimentales, se realizan cortes histológicos; un corte se prepara cortando una porción delgada de un fragmento pequeño de tejido fijado, que después se tiñe, se monta en un medio con índice de refracción adecuado, sobre un portaobjetos y finalmente se cubre con un cubreobjetos (Guillermo Navarro, 2002).
La tinción empleada más a menudo en histología es la de hematoxilina eosina, técnica a la que se hace referencia frecuentemente como H y E. La hematoxilina es una base que brinda un tinte azuloso preferencialmente a los componentes ácidos de la célula; como la mayor parte de los componentes ácidos son DNA y RNA, el núcleo y ciertas regiones del citoplasma se tiñen de color azul oscuro; estos se denominan componentes basófilos. La eosina en un ácido que imparte una coloración sonrosada a los componentes básicos de la célula; como muchos constituyentes citoplasmáticos tienen pH básico, las regiones del citoplasma se tiñen de color rosado; se dice que estos elementos son acidófilos (Guillermo Navarro, 2002).
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4. JUSTIFICACIÓN
En México, actualmente, sigue utilizándose la herbolaria en la vida cotidiana como tratamiento o cura para diversas enfermedades, por ejemplo, un té de bugambilia o de gordolobo para contrarrestar la tos o un té de manzanilla o hierbabuena para el dolor estomacal, sin embargo, para muchos de estos remedios aún no se conocen todas sus propiedades ni se sabe cuáles son las sustancias activas que contiene, como estás interactúan en el organismo así como los efectos adversos que pueden ocasionar. Por ello es importante investigar que metabolitos secundarios son los que le confieren dichas propiedades. Así mismo es conveniente determinar la concentración de dichas sustancias en cada estructura de las plantas a fin de saber cuál de ellas nos proporcionará mejores resultados al utilizarlos con fines terapéuticos o preventivos.
En este trabajo está dedicado al estudio de dos especies vegetales (Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.) utilizadas en la medicina tradicional de nuestro país como cicatrizante, antiinflamatorio y antifúngico.
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5. OBJETIVOS
General:
• Evaluar la actividad farmacológica de Barkleyanthus salicifolius y Chemopodium sp.
Específicos:
• Determinar los metabolitos secundarios presentes en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
• Cuantificar los metabolitos secundarios identificados en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
• Identificar a través de electroforesis capilar los flavonoides presentes en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
• Determinar la capacidad antioxidante de Barkleyanthus salicifolius y Chemopodium sp.
• Probar la actividad antimicrobiana de Barkleyanthus salicifolius y Chemopodium sp.
• Determinar la actividad antiiflamatoria de Chemopodium sp.
• Estudiar la propiedad cicatrizante de Chemopodium sp. a nivel visual e histológico.
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6. METODOLOGÍA
6.1 Materiales y reactivos.
Equipos. Equipo de Electroforesis Capilar Beckman Coulter P/ACE MDQ,
Espectrofotómetro GBC UV/Vis, Estufa “BG” E50, Sonicador Autoscience AS3120B, Balanza analítica Ohaus AP310S, Micrótomo Leica RM2245, Incubadora BOEKEL Modelo 132000, Microscopio compuesto LABOMED listed 7GA9.
Reactivos.
Acetona (C3H6O), ácido acético (CH3-COOH (C2H4O2)), ácido bórico
(H3BO3), ácido clorhídrico concentrado (HCl), ácido nítrico (HNO3), ácido
sulfúrico concentrado (H2SO4), agua destilada (H2O), amoníaco (NH3),
anhídrido acético ((CH3CO)2O), carbonato de calcio (CaCO3), carbonato de
sodio (Na2CO3) anhidro, citrato sódico (NaH2(C3H5O(COO)3)), clorhidrato de hidroxilamina (NH2OH.HCL), cloroformo (CHCl3), cloruro de aluminio
(AlCl3), cloruro férrico (FeCl3), cloruro de sodio (NaCl), dodecil sulfato de
sodio (SDS), etanol (C2H6O), éter de petróleo ((CH3)3COCH3), ferrocianuro
de potasio (K3(Fe(CN)6)), fosfato disódico (Na2HPO4), grenetina, hidróxido
de amonio (NH4OH), hexano (C6H14), hidróxido de potasio (KOH), hidróxido
de sodio (NaOH), magnesio metálico (Mg°), metanol (CH4O), molibdato de
amonio ((NH4)6Mo7O24•4H2O), nitrato de bismuto pentahidratado
(Bi(NO3)3•5H2O), nitrito de sodio (NaNO2), nitroprusiato de sodio (Na2
(Fe(CN)5NO)), para-dimetilaminobenzaldehido (C9H11NO), peróxido de
hidrógeno (H2O2), persulfato de potasio (K2S2O8), piridina (C5H5N), sulfato
de cúprico (CuSO4), sulfato de cúprico pentahidratado (CuSO4•5H2O) y
tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6•4H2O) (Marca “J.T.Baker” o “Reasol”) y silano (Marca “Sigma”). Reactivo de Baljet, reactivo de Benedict, reactivo de Dragendorff, reactivo de Erlich, soluciones de Fehling A y B, reactivo de Folin-Ciocalteua (Marca Hycel), reactivo de gelatina, reactivo de
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Grignard, reactivo de Lieberman, reactivo de Mayer y reactivo de Sonneschain (Anexo 3).
Estándares. Ácido caféico, ácido gálico, aceite de croton, Cefalosporina C, colesterol, estreptozocina (STZ) y Radical 2,2-Azinobis-3-Etilbenzotiazolin-6-Acido Sulfónico (ABTS) (Marca “Sigma”), ácido tánico (Marca “Reasol”), Ketoconazol (Lab. “Bruluart”), Trolox (Marca “Aldrich”), apigenina, catequina, epigalocatequina, kaemferol, luteolina, miricetina, naringenina, quercetina y rutina. (Marca “Fluka”).
Cepas. Bacillus cereus (11778, ENCB), Bacillus subtilis (6633 ATCC, ENCB), Candida albicans (ATCC 10231, CINVESTAV-IPN) Escherichia coli (ATCC 10536, CINVESTAV-IPN) y Staphylococcus aureus (ATCC 6538, CINVESTAV-IPN).
Material biológico. Tallos y hojas de jarilla (Barkleyanthus salicifolius) y tallos, hojas, flores y raíces de hediondilla (Chenopodium sp.) (Anexo 1).
6.2 Métodos.
Preparación de las muestras. Una vez adquiridos los ejemplares de Chenopodium sp. (hediondilla) y Barkleyanthus salicifolius (jarilla) cada planta se separó por estructuras (tallos, hojas, flor y raíz según cada caso), se secaron en una estufa a una temperatura aproximada a 40°C durante 24 h y se molió para su procesamiento.
Preparación de los extractos.
Preliminar fitoquímico. Se pesaron 0.5 g de muestra y se adicionaron 10 mL de éter de petróleo y 10 mL de una mezcla
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metanol - agua 9:1. La suspensión se sonicó durante 10 minutos, se filtró y se utilizó un embudo de separación para obtener dos fases: polar (metanol - agua) y no polar (éter de petróleo) (Galindo, et al., 1989).
Determinación de actividad antioxidante, pruebas antimicrobianas y cuantificación de metabolitos secundarios. A 2 g de muestra se le adicionaron 30 mL de acetona al 70 %, se sonicó durante 20 minutos y se filtró (Choy et al., 2007).
Identificación de flavonoides. Se pesaron 2 g de cada muestra, se agregaron 30 mL de acetona al 70 %, se sonicó por 20 minutos, se filtró y se realizó la extracción (Sun et al., 2008).
Prueba antiinflamatoria. Se pesaron 5 g de hediondilla, (completa, molida y seca) en tres vasos de precipitados, se adicionaron 40 mL de hexano, acetona y metanol respectivamente, cada mezcla se sonicó por 20 minutos, se filtró y evaporó (Young et al., 1989 y Payá et al., 1993 modificado).
Prueba cicatrizante. Se pesaron 5 g de muestra, se adicionaron 40 mL de acetona al 70 %, se sonicó por 20 minutos, se filtró y evaporó.
6.2.1 Pruebas cualitativas
Preliminar fitoquímico
Las siguientes pruebas fueron realizadas para el extracto de cada una de las muestras por analizar.
Saponinas. A 1 mL del extracto metanólico se añadieron 9 mL de agua destilada y se filtró la solución. Se tomó 1 mL del filtrado en un
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Altura menor a 5mm = prueba negativa. Altura 5-9 mm = contenido bajo. Altura de 10-14 mm = contenido moderado. Altura mayor a 15 mm = contenido alto.
Fenoles. En 5 tubos de ensaye se colocaron, en cada uno, 5 gotas de la fracción metanólica del extracto más tres gotas de agua destilada (obteniendo un color amarillo). Uno de los tubos sirvió como testigo, en el resto de ellos se agregaron 1, 2, 3 y 4 gotas de cloruro férrico respectivamente. La caracterización de fenoles se hizo de acuerdo a la coloración (Galindo et al., 1989):
Ninguna reacción (no hay cambio de color: prueba negativa). Cambio de color a azul obscuro: fenoles o taninos pirogálicos (hidrosolubles). Cambio de color a verde obscuro: fenoles o taninos de tipo catecol (flavonoides o taninos concentrados).
Esteroides (Prueba de Lieberman – Buchard). Se colocó 1 mL de extracto no polar en un tubo y se adicionaron de 3 a 4 gotas de cloroformo. Se evaporó y se añadieron unas gotas de anhidro acético y una gota de ácido sulfúrico concentrado. Los cambios de coloración indicaron (Galindo et al., 1989):
Azul o verde = esteroides. Rojo, rosado o violeta = triterpenos. Amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados.
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Alcaloides
Reacción de Dragendorff. A 3 mL de la fracción polar se añadieron 4 gotas de amoníaco, se evaporó casi a sequedad y se adicionaron 3 gotas de ácido acético y una gota de agua destilada, la solución se concentró a baño maría. Se agregaron unas gotas de esta solución en un papel filtro y se cubrió con reactivo de Dragendorff. Un cambio de color naranja a rojo o rosado indicó la presencia de alcaloides (Galindo et al., 1989).
Reacción de Sonneschain. A una porción del extracto polar se adicionaron 2 mL de ácido clorhídrico al 10 %, se calentó a ebullición por cinco minutos, se enfrió y filtró. Al filtrado se añadió una gota del reactivo de Sonneschain. Un precipitado blanco o naranja indica una prueba positiva.
Reacción de Mayer. Se evaporó una porción del extracto, se agregaron de dos a tres gotas de ácido clorhídrico concentrado y una gota de reactivo de Mayer. Una coloración de amarilla a naranja o rojo ladrillo indica prueba positiva.
Flavonoides. 0.5 mL de la fracción polar se disolvieron con 2 mL de etanol absoluto, se repartieron en 3 tubos, uno de ellos sirvió como testigo para las siguientes pruebas:
Reacción de Shinoda. Se adicionaron 2 gotas de ácido clorhídrico concentrado, la obtención de una coloración roja indicó la presencia de auronas o chalconas, en caso de no haber un cambio se agregó un trozo de magnesio metálico, la
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formación de una coloración naranja o roja indicó presencia de flavonas; si fue roja flavonoles y si fue magenta flavonas.
Reacción con hidróxido de sodio. Se añadieron 3 gotas de hidróxido de sodio al 10 %, si se formó un coloración de amarillo a rojo, indicó el contenido de xantonas y flavonas; de café a naranja flavonoles; de púrpura a rojizo chalconas y azul antocianinas.
Taninos. A 1 mL del extracto polar se adicionaron 2 mL de agua destilada y 3 gotas de cloruro de sodio al 2 %, se calentaron por un minuto, se enfrió y filtró. El filtrado se dividió en cuatro tubos y uno de ellos sirvió como testigo para las siguientes pruebas:
Reacción con gelatina. Se adicionaron 2 gotas del reactivo de gelatina. La formación de una precipitado blanco indicó el contenido de taninos.
Reacción de cloruro férrico. Se añadió una gota de cloruro férrico al 1 %, la formación de coloraciones de azul a negro indicaron la presencia de derivados de ácido gálico y coloraciones verdes derivados de catecol.
Reacción con ferrocianuro. Se adicionó una gota de ferrocianuro de potasio al 1 %. La formación de un color azul indicó la presencia de compuestos fenólicos.
Glicósidos cianogénicos. Se adicionó 1 mL de ácido clorhídrico al 10 % y 1 mL de cloroformo a 0.5 mL de extracto polar. Se colocó una tira de papel filtro impregnada con reactivo de Grignard en la boca del tubo y se calentó a baño maría. La formación de una mancha rosa a roja indicó prueba positiva.
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Azúcares reductores. Se tomaron 2 mL del extracto polar y se ajustó el pH a 11 (con hidróxido de sodio al 10 % en caso en ser necesario), se dividió el extracto en dos tubos para las siguientes pruebas:
Reacción de Fehling. Se adicionaron 0.5 mL de solución de Fehling A, 0.5 mL de solución de Fehling B y 1 mL de agua destilada.
Reacción de Benedict. Se añadieron 0.5 mL de reactivo de Benedict y 1 mL de agua destilada.
Se preparó un testigo para cada tubo, sin extracto. Se calentaron los cuatro tubos por 15 minutos en baño maría. Se identificó la presencia de azúcares reductores cuando en los tubos que contenían el extracto se formó un precipitado de color naranja o rojo.
Quinonas. En tres tubos se colocó 1 mL de la fracción polar respectivamente y se concentró para realizar los siguientes ensayos:
Reacción con hidróxido de amonio. Se adicionó una gota de hidróxido de amonio concentrado a una de las porciones del extracto. Se consideró positiva la prueba para antraquinonas cuando apareció una coloración roja en los dos primeros minutos.
Reacción con ácido sulfúrico. Se añadió una gota de ácido sulfúrico concentrado a otra fracción del extracto. La formación de una coloración roja indicó el contenido de antraquinonas.
Reacción de Börntraguer. Se diluyó el extracto en 3 mL de agua destilada, se filtró y se añadieron 3 mL de hidróxido de
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potasio al 5 %, se calentó durante tres minutos, se enfrió y se realizó una extracción con 3 mL de cloroformo. Se eliminó la fase acuosa y a la fracción clorofórmica se agregaron 2 mL de hidróxido de potasio al 5 %. Un color rojo indicó la presencia de benzoquinonas; si fue un color amarillo verdoso se añadió una gota de peróxido de hidrógeno al 6 %. Si la coloración cambia a rojo, se consideró positiva para derivados de antronas.
Cumarinas
Reacción de Erlich. Se colocaron 0.5 mL del extracto polar en un tubo de ensaye, se concentró y se adicionaron 2 gotas de reactivo de Erlich y una gota de ácido clorhídrico concentrado. La coloración naranja, indicó presencia de cumarinas.
Reacción con hidróxido de amonio. Se concentró otra porción del extracto y se añadieron 0.5 mL de etanol y dos gotas de hidróxido de amonio concentrado. Se consideró positiva la prueba si se presentó una fluorescencia azul- violeta.
Glicósidos cardiacos. Se concentraron 2 mL del extracto polar a un tercio del volumen original y se dividió en tres porciones para las siguientes pruebas:
Reacción de Legal. Se evaporó el disolvente y se adicionaron 2 gotas de piridina, se agregó una gota de nitroprusiato de sodio al 5 % y cuatro gotas de hidróxido de potasio 2 N, una coloración roja poco estable indicó la presencia de glicósidos cardiacos.
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Reacción de Baljet. Se añadieron tres gotas del reactivo de Baljet. Una coloración de naranja a rojo obscuro indicó presencia de glicósidos cardiacos.
Sesquiterpenlactonas
Reacción con hidroximato férrico. Se colocó una porción del extracto en un tubo y se adicionaron dos gotas de clorhidrato de hidroxilamina 2 N y una gota de hidróxido de potasio 2 N en metanol. Se calentó la mezcla durante dos minutos, se enfrió y se llevó a pH de 1 con ácido clorhídrico 0.5 N y se adicionó una gota de cloruro de potasio 1 %. Una coloración roja, violeta o rosa indicó una prueba positiva para este metabolito.
6.2.2 Pruebas cuantitativas
Las concentraciones de los extractos utilizados para esta etapa del trabajo se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Rendimiento de los extractos de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura utilizada para el extracto Concentración del extracto (mg/mL) Barkleyanthus salicifolius tallo 3.79 Barkleyanthus salicifolius hoja 4.36 Chenopodium sp. tallo 3.49 Chenopodium sp. hoja 3.46 Chenopodium sp. flor 1.78 Chenopodium sp. raíz 3.21
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Cuantificación de fenoles totales. Se elaboró una curva tipo de ácido caféico utilizando concentraciones de 0.002, 0.004, 0.006, 0.008, 0.010, 0.12, 0.014 y 0.016 mg/mL. Para el ensayo se diluyeron los extractos y se tomaron 100 µL para completarse a 500 µL con agua destilada. Se agregaron 250 µL del reactivo de Folin- Ciocalteau 1N, se sonicó por 5 minutos, se adicionaron 1250 µL de carbonato de sodio al 20 %, se dejó reposar 20 minutos y se determinó la absorbancia a 760 nm. La prueba se realizó por duplicado (Liu et al., 2002).
Cuantificación de flavonoides totales. Se elaboró una curva tipo usando como estándar el flavonoide rutina utilizando concentraciones de 10, 20, 30, 40, 50, 75, y 100 µg/mL. Para el ensayo, primero se realizó la dilución pertinente para cada extracto. Se tomó 2 mL de cada dilución y se colocó en tubos de ensaye respectivamente, se añadió 30 µL de nitrito de sodio 5 % y se dejó reaccionar durante cinco minutos. Se agregó 20 µL de cloruro de aluminio al 10 %, se mezcló y reposó por cinco minutos nuevamente. Se adicionó 200 µL de carbonato de sodio 1 M y 250 µL de agua destilada, se centrifugó y realizó lectura de absorbancia a 510 nm. El ensayo se realizó por triplicado (Liu et al., 2002).
Cuantificación de esteroides. Se elaboró una curva patrón de colesterol utilizando concentraciones de 0.0033, 0.00675, 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1 y 0.2 mg/mL. Para el ensayo se diluyeron los extractos, se tomó 1 mL y se le adicionaron 1.5 mL de cloroformo y 0.5 mL de reactivo de Lieberman se reposó por 20 minutos y se leyó la absorbancia de las muestras a 560 nm (Galindo et al., 1989, modificado).
Cuantificación de taninos. Se elaboró una curva tipo de ácido tánico utilizando concentraciones de 2, 4, 6, 8, y 10 µg/mL. Para el ensayo se realizó la dilución de los extractos cetónicos, de estos se tomaron 100 µL, se agregó agua destilada para llevar a un volumen de 500 µL, se
45 2014 adicionaron 250 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu y 1250 µL de solución de carbonato de sodio al 20 %. Se agitaron los tubos con vortex, se reposaron por 40 minutos y se determinó la absorbancia a 725 nm (Makkar Harinder, 2000).
6.2.3 Método analítico
Identificación de flavonoides por electroforesis capilar. La determinación de flavonoides se realizó con un equipo Beckman Coulter P/ACE MDQ, cuyo detector presenta un arreglo de diodos, utilizando un capilar de sílica fundida de 60 cm de longitud con un diámetro interno de 75 micras. Las muestras fueron inyectadas a una presión de 0.5 psi por 5 segundos, el voltaje empleado para la separación fue de 15 Kv, las muestras se detectaron a 214 nm y el tiempo de corrimiento de las muestras fue de 20 minutos. Se utilizó una solución amortiguadora de boratos 40 mM con un pH de 9, a la cual se adicionó dodecil sulfato de sodio (SDS) 40 mM. Las muestras fueron filtradas (previamente a su corrimiento) con una membrana de 45 µm (en caso de ser necesario se diluyeron con agua miliQ), se colocaron en viales para electroforesis capilar y se llevo a cabo su corrimiento para la obtención de los electroferogramas. Se utilizaron nueve estándares de flavonoides (rutina, quercetina, miricetina, apigenina, kaemferol, naringenina, epigalocatequina, catequina y luteolina) de cada uno se preparó 1 mg/mL de agua miliQ y se corrieron bajo las condiciones antes descritas (Sun et al., 2008).
6.2.4 Determinación de la capacidad antioxidante. Se preparó una solución con el reactivo 2,2´azinobis-(3-etilbenzotiazolin 6-ácido sulfónico) “ABTS” a 7 mM diluido con agua destilada, se mezcló 1:1 con una solución de persulfato de potasio a 2.45 mM, se dejó reposar 16 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente se diluyó con alcohol hasta obtener una absorbancia de 0.7+ 0.01 a una longitud de onda de 754 nm. Se elaboró una curva tipo con el antioxidante de referencia (6-hidroxi-2,
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5, 7, 8 tetrametilcromo-2 ácido carbónico 97 %) “Trolox” utilizando concentraciones de 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1 y 1.25 mM. Para el ensayo se mezcló 980 µL del radical ABTS+ y 20 µL de la muestra y se midió su absorbancia (Choy et al., 2007).
6.2.5 Determinación de la capacidad antimicrobiana
Preparación de los medios de cultivo e inóculos.
Matraces inóculo. Se prepararon 5 matraces con 50 mL de caldo nutritivo, se esterilizaron y se inoculó cada matraz con 50 µL de una suspensión de E.coli, S.aureus, S.typhi, B.cereus y C.albicans respectivamente. Se incubó por 24 h a 37 °C.
Medio para antibióticos 1. Se pesaron 5.185 g del medio para antibióticos 1 (Bioxon) y se disolvieron en 170 mL de agua destilada.
Medio para antibióticos 2. Se pesaron 4.335 g del medio para antibióticos 2 (Bioxon) y se disolvieron el 170 mL de agua destilada.
Una vez disueltos y homogéneos los medios 1 y 2 para antibióticos se procedió a su esterilización y se realizó un vaciado en placa, se vertieron 10 mL de medio 2 como base y se solidificó, mientras, se inocularon los matraces de medio 1 con 50 µL de inóculo (un microorganismo por cada matraz). Se vaciaron 10 mL del medio inoculado en cada una de las cajas que contenían medio 2 solidificado.
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Preparación de los sensidiscos. Se cortaron discos de papel filtro con un diámetro de 6 mm. Se esterilizaron y se impregnaron con 100 µL de extracto concentrado a 45 °C. Las concentraciones de los extractos fueron de: 1.67 mg/mL y 1.49 mg/mL para el tallo y la hoja de B. salicifolius y 0.43 mg/mL, 0.84 mg/mL, 0.33 mg/mL y 0.28 mg/mL para el tallo, la hoja, la flor y la raíz de Chenopodium sp. respectivamente.
Ya listo el material se colocó un sensidisco de cada extracto por placa de cada microorganismo. Se incubaron las placas durante 24 h a 37 °C. Se midió los halos de inhibición obtenidos. Para poder obtener las equivalencias en µg se realizaron dos curvas estándar: la primera utilizando como antibiótico Cefalosporina C con concentraciones de 63 µg/mL, 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 1000 µg/mL, 2000 µg/mL, 4000 µg/mL y 8000 µg/mL; la segunda utilizando como antifúngico Ketoconazol con concentraciones de 1.25 µg/mL, 2.5 µg/mL, 5 µg/mL y 10 µg/mL.
6.2.6 Determinación de la actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp.
Preparación de los extractos. Se pesaron 5 g de muestra (planta completa, seca y triturada) y se colocaron en tres tubos diferentes a los cuales se les añadieron 40 mL de acetona, hexano y metanol respectivamente. Se sonicó cada suspensión durante 20 minutos, se realizó un filtrado grueso y se evaporó cada filtrado a sequedad.
Prueba en roedores. Se utilizaron seis lotes de cinco ratones adultos (uno por cada extracto más un control positivo, uno negativo y uno para el fármaco de referencia). Se administraron 100 µL del extracto resuspendido en agua potable a cada ratón. Una hora después se aplicaron 50 µL de aceite de croton al 5% en etanol en
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la oreja izquierda. Para el control positivo únicamente se administró aceite de croton y al control negativo no se le administró ninguna sustancia. Transcurridas tres horas se sacrificó a los roedores, se cortaron y perforaron las orejas inflamadas y se pesaron individualmente (Young, 1989 y Payá, 1993 modificado). Las concentraciones de los extractos fueron de: 24.99 mg/mL, 30.48 mg/mL y 5.23 mg/mL utilizando como solventes hexano, acetona y metanol respectivamente.
6.2.7 Evaluación del efecto cicatrizante de Chenopodium sp.
Preparación del gel cicatrizante. Se utilizaron como excipientes carbopol, trietanolamina, glicerina y agua destilada, como principios activos se emplearon los extractos concentrados de Chenopodium sp. Se disolvió el carbopol en el agua destilada hasta obtener una fase homogénea, se agregaron la trietanolamina y la glicerina. Una vez formado el gel se tomaron porciones de aproximadamente 6 g, con las que se resuspendió cada extracto.
Formulación del gel:
Agua destilada……………………….. 72.3 mL Alcohol desnaturalizado…………….. 8.3 mL Carbopol………………………………. 2.5 g Glicerina………………………………. 5 mL Trietanolamina……………………….. 13.3 mL
Las concentraciones de principio activo por g de gel, en los geles de Chenopodium sp. fueron: 1.016 mg/g para la flor, 0.4 mg/g para la hoja, 0.5 mg/g para la raíz, 2.01 mg/g para el tallo y 42.2 mg/g para la planta completa.
49 2014
Prueba en roedores sanos. Se utilizaron 4 lotes de tres ratas hembra wistar blancas (un lote por cada gel: tallo, hoja, flor y raíz). A todos los individuos se les rasuró el lomo y se hizo una incisión de aproximadamente 1.5 cm de largo a cada lado. A todos se les aplicó el gel correspondiente en la incisión del lado izquierdo. El lado derecho sirvió como control negativo. La aplicación del gel se realizó diariamente durante un periodo de nueve días.
Prueba en roedores diabéticos. Se indujo diabetes mellitus tipo 2 mediante una inyección intraperitoneal de estreptozocina (STZ) (65 mg/kg/0.5 mL de citrato de sodio pH= 4.5) para alcanzar una concentración de glucosa en el plasma de 125 mg/dL o mayor (Olazo Marinero, 2010). A los 15 días se realizó la medición de glucosa en sangre, los animales con los niveles de glucosa mayor a 150 mg/dL fueron seleccionados para el experimento.
A todos los individuos se les rasuró el lomo y se hizo una incisión de forma circular de aproximadamente 1.0 cm de diámetro en el lomo de las rata diabéticas, al grupo control negativo (ratas diabéticas sin tratamiento).
Para ambas pruebas se utilizó un lote como control positivo al cual se aplicó una pomada para quemaduras (Furacin: Nitrofurazona 2 mg/g) en las heridas de las ratas.
Comprobación histológica. Una vez obtenidos, los tejidos epidérmicos de las heridas, fueron colocados en paraformaldehido al 4 % en solución buffer de fosfatos PBS (Anexo 3) durante una noche. A continuación se pusieron en etanol a diferentes diluciones desde 30 hasta 60 % permaneciendo una hora en cada solución, posteriormente se colocaron en etanol al 70 % por 24 h. Transcurrido
50 2014 este período se volvieron a realizar pases de una hora en soluciones de etanol al 80, 90, 100 y 100 %. A continuación los tejidos se sumergieron en Alcohol-xilol 50:50 durante 60 minutos, seguido de xilol puro por 1 h. Después fueron colocados en parafina a 60 °C 24 h de nueva cuenta se colocaron en parafina limpia por 1 h y por último se realizó la inclusión en los moldes para proceder a realizar los cortes histológicos.
Se enfrió los bloques de parafina que contiene las muestras de tejido, después se realizó los cortes de 4 micras en micrótomo a los cuales se colocó a flotación en un baño maría a 42 °C, se recuperó los cortes con laminillas preparadas (ver Anexo 4). Para el análisis histológico se desparafinaron los tejidos en una estufa a temperatura entre 65 – 70 °C, luego se les sumergió 2 veces en xilol puro durante 5 minutos, dos veces en etanol absoluto durante dos minutos, se secó al aire y se adicionó hematoxilina, se enjuagó y adicionó eosina, se lavó con agua, se colocó en PBS por 30 s, en agua destilada por un minuto y por último se realizó el montaje de las laminillas y se observaron en un microscopio de luz.
51 2014
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 Pruebas cualitativas
Preliminar fitoquímico
En esta etapa se utilizaron pruebas rápidas, sencillas y selectivas para la determinación de los metabolitos secundarios presentes en cada una de las estructuras de las plantas en estudio. Al analizar los resultados obtenidos en el tamizaje realizado a las distintas partes de las plantas, se comprobó la diversidad de los metabolitos secundarios presentes en cada una de las muestras, los cuales son de gran interés fitoquímico y farmacológico.
Saponinas, fenoles, esteroides y alcaloides
En la Tabla 6 se presentan los resultados para las primeras cuatro pruebas realizadas a las muestras durante el preliminar fitoquímico.
Tabla 6. Pruebas fitoquímicas para saponinas, fenoles, esteroides y alcaloides en Chenopodium sp. y Barkleyanthus salicifolius.
Planta y Saponinas Fenoles Esteroides Alcaloides estructura Presencia Reacción Reacción de Reacción de Reacción de Reacción de espuma con FeCl3 Lieberman- Dragendorff Sonneschain de Mayer Buchard Barkleyanthus (-) (+) (+) (-) (-) (+) salicifolius tallo Barkleyanthus (-) (+) (+) (-) (-) (+) salicifolius hoja Chenopodium (-) (+) (-) (-) (-) (+) sp. tallo Chenopodium (-) (+) (+) (-) (-) (+) sp. hoja Chenopodium (-) (+) (+) (-) (-) (+) sp. flor Chenopodium (-) (+) (+) (-) (-) (+) sp. raíz
Los resultados representan una n=2; (-) metabolito no presente; (+) metabolito presente
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En la Tabla 6 se observa que el contenido de saponinas en las muestras es nulo. Estos resultados discrepan con estudios realizados recientemente (Abbas et al., 2012 y Saleem et al., 2014) los cuales mencionan la presencia de saponinas en Chenopodium murale (se utilizó el mismo método que en el presente trabajo para la determinación). Así mismo (Gioanetto et al., 2010; Russo et al., 2011; IICA, 2005 y Sikarwar et al., 2013) reportan el contenido de este metabolito secundario en especies del género Chenopodiaceae tales como Chenopodium album y Chenopodium ambrosioides.
En cuanto a Barkleyanthus salicifolius (Gioanetto et al., 2010) reporta ausencia de dicho metabolito acorde con lo reportado por (Ndom et al., 1983) en cuyo estudio mencionan que las especies pertenecientes a la familia Asteraceae = Compositae no contienen saponinas. Las diferencias dadas entre resultados se deben a que la producción y composición de metabolitos secundarios en las plantas no depende exclusivamente de los mecanismos de biosíntesis, la variabilidad puede ser atribuida a factores genéticos, abióticos como luz, temperatura, disponibilidad de agua, nutrientes, etc. y bióticos ocasionados por la interacción con animales, plantas y microorganismos (Torres-Martínez et al., 2013) así como a variaciones de altitud y clima (Melgarejo et al., 2013).
Para fenoles se observa pruebas positivas en los seis extractos analizados siendo los resultados esperados con base a los trabajos realizados por (Gioanetto et al., 2010 y Russo et al., 2011) en el caso de Chenopodium sp. los cuales mencionan el contenido de compuestos fenólicos en el género Chenopodiaceae y (Amat, 1983) para Barkleyanthus salicifolius que hace alusión a dichos metabolitos en toda la familia Compositae.
Así mismo, con excepción del tallo de Chenopodium sp. todas las estructuras contienen esteroides. La presencia de estos metabolitos secundarios se comprueba con lo reportado en un estudio desarrollado previamente (Huacuja González, 1995) en plantas del genero Senecio al cual pertenece Barkleyanthus salicifolius. La familia Chenopodiaceae se caracteriza por contener diferentes
53 2014 grupos de metabolitos secundarios entre los que destacan los esteroides (Russo et al., 2011). Para el caso particular de Chenopodium murale (Ahmad et al., 2003 y Abbas et al., 2012) reportan el contenido de éste metabolito.
De las tres pruebas realizadas para alcaloides solo la de Mayer fue positiva para todos los extractos. La aparición de dichos metabolitos concuerdan con la información obtenida por (Waizel-Bucay y Martínez-Rico, 2011 y Huacuja- González et al., 1995) quienes mencionan el contenido de alcaloides en el género Senecio y (Gioanetto et al., 2010) reporta la presencia de estos metabolitos en Senecio salignus sinonimia de Barkleyanthus salicifolius. Para Chenopodium sp. los resultados también son acordes con los estudios de (Russo et al., 2011; Gioanetto et al., 2010 y Agrawal et al., 2014) los cuales hablan sobre el hallazgo de alcaloides en especies de la familia Chenopodiaceae tales como Chenopodium album y Chenopodium ambrosioides. Por su parte (Abbas et al., 2012; utilizando la prueba de Mayer) encontraron alcaloides en Chenopodium murale.
Flavonoides y taninos
La Taba 7 muestra los resultados obtenidos del preliminar fitoquímico para flavonoides y taninos.
Tabla 7. Pruebas para flavonoides y taninos en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura Flavonoides Taninos Reacción de Reacción Reacción Reacción Reacción con Shinoda NaOH 10% con gelatina con FeCL3 K4[Fe(CN)6] Barkleyanthus (+) (+) (-) (+) (-) salicifolius tallo Barkleyanthus (+) (+) (-) (+) (-) salicifolius hoja Chenopodium sp. tallo (+) (+) (-) (+) (-) Chenopodium sp. hoja (-) (+) (-) (+) (-) Chenopodium sp. flor (+) (+) (-) (+) (-) Chenopodium sp. raíz (-) (-) (-) (+) (-)
Los datos representan una n=2; (-) metabolito no presente; (+) metabolito presente
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En la Tabla 7 se observa la presencia de flavonoides en el tallo y la hoja de Barkleyanthus salicifolius información que era de esperarse ya que (Amat et al., 1983) descubrió la existencia de flavonoides en la familia Compositae mientras que (Ndom et al., 2007 y Huacuja-González et al., 1995) hablan de dichos compuestos específicamente en el género Senecio, tal es el caso de Senecio vulgaris L. (Gioanetto et al., 2010). Otro autor (Russo et al., 2011) ha estudiado a las Chenopodiaceae reportando a los flavonoides como uno de los grupos de metabolitos secundarios característicos de la especies pertenecientes a esta familia. Lo cual es coherente con los resultados obtenidos en el presente trabajo para Chenopodium sp. ya que hubo pruebas positivas para el tallo, hoja y flor de la planta comprobando así lo reportado por (Ahmad et al., 2003; Abbas et al., 2012 y Saleem et al., 2014) para Chenopodium murale. Algunas otras especies del mismo género con contenido de dichos metabolitos son Chenopodium graveolens (González Elizondo et al., 2004) y Chenopodium album (Gioanetto et al., 2010; Russo et al., 2011 y Agrawal et al., 2014).
Las reacciones para taninos muestran que dichos metabolitos se encuentran presentes en las hojas y el tallo de Barkleyanthus salicifolius y en el tallo, hojas, flores y raíz de Chenopodium sp., estos resultados concuerdan con los trabajos realizados por (Huacuja-González, 1995) para B. salicifolius mencionando que el género Senecio es una fuente importante de ácido tánico y (Abbas et al., 2012) para Chenopodium sp. quienes reportan el contenido de taninos en Chenopodium murale.
Glicósidos cianogénicos y azúcares reductores
En la Tabla 8 se presentan los resultados para glicósidos cianogénicos y azúcares reductores pruebas realizadas durante el preliminar fitoquímico.
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Tabla 8. Pruebas de glicósidos cianogénicos y azúcares reductores en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Glicósidos cianogénicos Azúcares reductores Planta y estructura Reacción de Grignard Reacción de Fehling Reacción de Benedict Barkleyanthus salicifolius tallo (-) (-) (-) Barkleyanthus salicifolius hoja (-) (-) (-) Chenopodium sp. tallo (-) (-) (-) Chenopodium sp. hoja (-) (-) (-) Chenopodium sp. flor (-) (-) (-) Chenopodium sp. raíz (-) (-) (-)
Los resultados representan una n=2; (-) ausencia de metabolito; (+) presencia de metabolito
En la Tabla 8 se muestra ausencia total tanto de glicósidos cianogénicos como de azúcares reductores en ambas plantas. Estos resultados son iguales a los obtenidos en diversos estudios realizados a la familia Compositae (Amat, 1983) dentro de la cual se encuentra el género Senecio (Ndom et al., 2007; Waizel- Bucay y Martínez-Rico, 2011 y Huacuja-González, 1995) al cual pertenece Barkleyanthus salicifolius donde también se reporta ausencia de ambos metabolitos (Gioanetto et al., 2010). En el caso de Chenopodium sp. la información arrojada por las pruebas es validada por trabajos realizados en la familia Chenopodiaceae, (Russo et al., 2011) indica que no hay presencia de glicósidos cianogénicos ni azúcares reductores en ella. Estos resultados son reafirmados por estudios en los cuales se ha experimentado directamente con Chenopodium murale (Mohamed et al., 2013; Ahmad et al., 2003 y Saleem et al., 2014). La única discrepancia en cuanto a los resultados obtenidos en el presente trabajo la reporta (Abbas et al., 2012) pues obtuvo presencia de glicósidos en C. murale. Estas diferencias pueden ser atribuidas a las diferentes condiciones climatológicas y geográficas bajo las cuales se desarrollaron los ejemplares utilizados para cada estudio, así como a los métodos de cultivo y cosecha de los mismos (Enríquez Flores et al., 2008; Torres-Martínez et al., 2013 y Melgarejo et al., 2013).
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Quinonas y cumarinas
La Tabla 9 muestra los resultados obtenido para quinonas y cumarinas en la pruebas fitoquímicas preliminares.
Tabla 9. Pruebas de quinonas y cumarinas en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura Quinonas Cumarinas Reacción con Reacción Reacción de Reacción Reacción con (NH)4 OH con H2SO4 Börntraguer de Erlich (NH)4 OH Barkleyanthus salicifolius (-) (+) (-) (-) (-) tallo Barkleyanthus salicifolius (+) (-) (-) (-) (-) hoja Chenopodium sp. tallo (-) (-) (-) (-) (-) Chenopodium sp. hoja (-) (+) (-) (-) (-) Chenopodium sp. flor (-) (-) (-) (-) (-) Chenopodium sp. raíz (-) (-) (-) (-) (-)
Los datos representan una n=2; (+) metabolito presente; (-) metabolito ausente
La Tabla 9 muestra que, de las reacciones para quinonas la de (NH)4OH dio positiva únicamente en la hoja de Barkleyanthus salicifolius. La reacción con
H2SO4 sólo fue positiva para las hojas tanto de Chenopodium sp. como de B. salicifolius. La reacción de Börntraguer fue negativa para todas las muestras. Distintos autores (Gioanetto et al., 2010; Amat et al., 1983; Ndom et al., 2007; Torres-Martínez et al., 2013 y Waizel-Bucay y Martínez-Rico, 2011) mencionan que para Barkleyanthus salicifolius no se ha reportado contenido de quinonas y para Chenopodium sp. (Ahmad et al., 2003; Agrawal, 2014 y Saleem et al., 2014) no mencionan la presencia de dichos metabolitos en esta especie. Las diferencia en los resultados para dichas plantas pueden deberse a que los ejemplares provienen de zonas geográficas con distintas condiciones climatológicas y disponibilidad de agua, diferentes tipos de suelo, etc. (Enríquez Flores et al., 2008; Torres-Martínez et al., 2013 y Melgarejo et al., 2013) o al uso de una método distinto para la determinación de dichas sustancias.
57 2014
Conforme a los estudios realizados por (Gioanetto et al., 2010; Amat et al., 1983; Ndom et al., 2007; Torres-Martínez et al., 2013 y Waizel-Bucay y Martínez-Rico, 2011) se tiene el conocimiento que el género Senecio no presenta contenido de cumarinas por lo tanto los resultados obtenidos en el presente trabajo para B. salicifolius corroboran esta información al ser negativas las dos pruebas para dicho metabolito. Para el caso Chenopodium sp. podemos ver que ambas pruebas fueron negativas al igual que lo reporta (Agrawal, 2014), sin embargo, (Ahmad et al., 2003) obtuvo presencia de cumarinas en el tamizaje de Chenopodium murale mostrando una vez más que la producción de metabolitos secundarios varia ante las distintas condiciones climatológicas y geográficas, así como por los métodos de cultivo y recolección.
Glicósidos cardiacos y sesquiterpenlactonas
En la Tabla 10 se presentan los resultados de las pruebas de glicósidos cardiacos y sesquiterpenlactonas.
Tabla 10. Pruebas de glicósidos cardiacos y sesquiterpenlactonas en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura Glicósidos cardiacos Sesquiterpenlactonas Reacción de Reacción de Reacción con hidroximato Legal Baljet férrico Barkleyanthus salicifolius tallo (+) (+) (+) Barkleyanthus salicifolius hoja (-) (-) (-) Chenopodium sp. tallo (+) (-) (+) Chenopodium sp. hoja (-) (-) (+) Chenopodium sp. flor (+) (-) (-) Chenopodium sp. raíz (-) (+) (-)
Los resultados representan una n=2; (+) presencia de metabolito; (-) metabolito no presente
De las reacciones para glicósidos cardiacos (Tabla 10) se observa que la reacción de Legal fue negativa para la hoja de B. salicifolius y la hoja y raíz de Chenopodium sp. La reacción de Baljet fue positiva para el tallo de Barkleyanthus
58 2014 salicifolius y para la raíz de Chenopodium sp. (Sikarwar et al., 2013) también obtuvo una prueba positiva para glicósidos en Chenopodium murale. Por otro lado, no se reportan resultados positivos ante estos metabolitos para Barkleyanthus salicifolius.
La reacción con hidroximato férrico para sesquiterpenlactonas fue positiva para el tallo de B. salicifolius y para el tallo y la hoja de Chenopodium sp. (Tabla 10). Estos resultados concuerdan con los reportados por (Amat et al., 1983; Ndom et al., 2007 y Huacuja-González, 1995) para Senecio, género al cual pertenece B. salicifolius, sin embargo, para Chenopodium sp. ninguno de los trabajos consultados reporta contenido de sesquiterpenlactonas en Chenopodium murale pero si en Chenopodium graveolens (González Elizondo et al., 2004).
7.2 Pruebas cuantitativas
7.2.1 Cuantificación de fenoles totales
Para la cuantificación de fenoles totales se obtuvo una curva tipo utilizando ácido gálico como patrón obteniendo una R2 de 0.9987 (Figura 10).
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 y = 57.187x + 0.0108 0.3 R² = 0.9987
nm 760 Absorbancia 0.2 0.1 0 0 0.005 0.01 0.015 0.02 Concentración de ácido gálico mg/ml
Figura 10. Curva tipo de ácido gálico para la cuantificación de fenoles totales
59 2014
En la Tabla 11 se muestran los datos que se obtuvieron mediante cálculos (Anexo 2) para la cuantificación de fenoles totales expresados en mg equivalentes a ácido gálico por g de muestra.
Tabla 11. Cuantificación de fenoles totales en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. con ácido gálico.
Planta y estructura Absorbancia Concentración[mg Dilución Concentración real Concentración de 760 nm ácido gálico / mL] [mL] [mg ácido gálico / mL] fenoles totales [mg eq. de ácido gálico / g de muestra] Barkleyanthus 0.382±0.018 0.006±0.0003 1:40 0.26±0.012 3.9±0.192 salicifolius tallo Barkleyanthus 0.486±0.016 0.0083±0.0002 1:40 0.332±0.011 4.98±0.178 salicifolius hoja Chenopodium sp. tallo 0.268±0.007 0.0045±0.0001 1:10 0.045±0.001 0.675±0.020
Chenopodium sp. hoja 0.344±0.007 0.0058±0.0001 1:10 0.058±0.001 0.87±0.020
Chenopodium sp. flor 0.137±0.0 0.0022±0.0 1:10 0.022±0.0 0.33±0.0 Chenopodium sp. raíz 0.140±0.0007 0.0023±0.00001 1:10 0.023±0.0001 0.345±0.001
Los resultados representan promedio ± DS de una n=2; DS= desviación estándar
Para éste método de cuantificación la concentración más alta de fenoles totales se presenta en la hoja de Barkleyanthus salicifolius (4.98±0.178) mientras que en la flor de Chenopodium sp. se encuentra la concentración más baja (0.33±0.0) de estos metabolitos.
Algunos autores han realizado la cuantificación de fenoles totales a partir de ácido gálico en especies pertenecientes a los mismo géneros de las plantas estudiadas en este trabajo, tal es el caso de Chenopodium quinoa, Chenopodium pallidicaule (Repo de Carrasco y Encina Zelada, 2008), Chenopodium murale (Mohamed et al., 2013; Ibarra-Alvarado et al., 2010) y Senecio patagonicus (González et al., 2013), Senecio parasiticus (Téllez Flores, 2006) recordando que Senecio salignus es sinónimo de Barkleyanthus salicifolius. De los trabajos mencionados se tienen reportados los siguientes resultados respecto a la cuantificación de fenoles totales:
60 2014
Chenopodium quinoa en sus distintas variedades andinas desde 35.29±0.07 hasta 139.94±1.80 mg eq. de ácido gálico por 100 g de muestras; Chenopodium pallidicaule también en sus distintas variedades andinas desde 67.46 ±0.70 hasta 85.71±0.47 mg eq. de ácido gálico por 100 g de muestras (Repo de Carrasco y Encina Zelada, 2008), Chenopodium murale extracto acuoso 74.9±0.23 mg eq. de ácido gálico por g de muestra y extracto AgNPs (nanopartículas de plata) 80.83±0.15 mg eq. de ácido gálico por g de muestra (Mohamed et al., 2013) y 30.6±0.9 mg eq. de ácido gálico por g de extracto seco (Ibarra-Alvarado et al., 2010), Senecio patagonicus 75.18±4.61 mg eq. de ácido gálico por g de extracto (González et al., 2013), Senecio parasiticus 427.23±23.18 mg eq. de ácido gálico por g de muestra seca (Téllez Flores, 2006). En comparación con algunos de estos datos, los obtenidos en el presente trabajo son muy bajos tomando en cuenta que la mayor concentración la presenta la hoja de B. salicifolius con 4.98±0.178 mg eq. de ácido gálico por g de muestra seca mientras que la concentración más baja es de la flor de Chenopodium sp. con 0.33±0.0 mg eq. de ácido gálico por g de muestra, tales diferencias entre los resultados de cada trabaja pueden deberse a las variaciones en el método de Folin- Ciocalteau para la determinación de compuestos fenólicos totales y/o a las condiciones climatológicas y geográficas en las que se desarrollo cada planta estudiada.
7.2.2 Cuantificación de flavonoides totales
Para la cuantificación de flavonoides totales en las muestras, se realizó una curva tipo de calibración (Figura 11) utilizando como estándar el flavonoide rutina, de la cual se obtuvo una R2 de 0.9832 que es aceptable. A partir de ésta curva, se realizaron los cálculos (Anexo 2) para determinar las concentraciones que se observa en la Tabla 12, los resultados se expresan como mg equivalentes a rutina por g de muestra.
61 2014
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
nm 510 Absorbancia y = 0.0042x - 0.0038 0 R² = 0.9832 0 20 40 60 80 100 Concentración rutina (µg/ml)
Figura 11. Curva tipo de rutina para la cuantificación de flavonoides totales
Tabla 12. Cuantificación de flavonoides totales en miligramos equivalentes a rutina en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura Absorbancia Concentración Dilución Concentración real [µg Concentración de 510 nm [µg rutina / [mL] rutina / mL] flavonoides totales mL] [mg eq. de rutina / g de muestra] Barkleyanthus 0.3393±0.020 81.65±4.887 1:10 816.9±48.872 12.253±0.733 salicifolius tallo Barkleyanthus 0.1863±0.011 45.26±2.633 1:100 4562.98±263.343 67.904±3.950 salicifolius hoja Chenopodium sp. tallo 0.0533±0.004 13.60±1.073 1:10 136±10.736 2.04±0.161 Chenopodium sp. hoja 0.121±0.004 29.71±1.037 1:10 297.1±10.378 4.456±0.155 Chenopodium sp. flor 0.079±0.002 19.71±0.629 1:10 197.1±6.299 2.956±0.094 Chenopodium sp. raíz 0.0373±0.003 9.79±0.727 1:10 97.9±7.273 1.469±0.109
Los resultados representan promedio ± DS de una n=3; DS= desviación estándar
Se observa que la mayor concentración de flavonoides se presenta en la hoja de Barkleyanthus salicifolius con una concentración de 67.904±3.950 mg eq. de rutina/ g de muestra. La menor concentración de dicho metabolito se encuentra en la raíz de Chenopodium sp. siendo de 1.469±0.109 mg eq. de rutina/ g de muestra (Tabla 12). Cabe mencionar que en las pruebas fitoquímicas la raíz de Chenopodium sp. resultó negativa a las pruebas para flavonoides, lo cual indica
62 2014 que pudo haber presencia de alguna sustancia interferente en la cuantificación de dichos metabolitos para el caso de esta muestra puesto que se hubo lectura de absorbancia. Siendo entonces el tallo de la misma planta quien presenta la menor concentración de flavonoides con 2.04±0.161 mg.
Para el caso del género Chenopodium se reporta las siguientes concentraciones de flavonoides totales: 12.77 ±0.07 y 14.1± 0.12 mg eq. de catequina/g de muestra en el extracto acuoso y el extracto AgNPs (nanopartículas de plata) de Chenopodium murale respectivamente (Mohamed et al., 2013) y 15.8 ± 0.1mg eq. de catequina/g de extracto seco de Chenopodium murale (Ibarra-Alvarado et al., 2010). Para el género Senecio (Farizano et al., 2008) reporta una concentración de 3.56±0.16 mg eq. de quercetina/g de muestra en Senecio argophylloides G. y (Tundis et al., 2012) obtuvo una concentración de 11.8 mg eq. de quercetina/g de planta para Senecio stabianus.
Con base en la información anterior podemos ver que las concentraciones en Chenopodium sp. son bajas en comparación con las concentraciones reportadas para Chenopodium murale, mientras que el contenido de flavonoides totales en S. argophylloides G. y S. stabianus resulta bajo en comparación con el contenido de estos metabolitos en Senecio salignus = Barkleyanthus salicifolius, haciéndose notar que para cada estudio se utilizó un estándar diferente, en el presente trabajo se utilizó rutina, para Chenopodium murale se usó catequina y en las dos especies de Senecio se ocupó quercetina. Quizá esta sea la razón por la cual existan dadas diferencias entres los resultados de cada trabajo.
7.2.3 Cuantificación de esteroides
Para la cuantificación de esteroides en B. salicifolius y Chenopodium sp. se realizó una curva estándar de colesterol de la cual se obtuvo una R2 de 0.9997 (Figura 12).
63 2014
Con base en los cálculos realizados en el Anexo 2 se obtuvieron los datos mostrados en la Tabla 13 los cuales expresan la concentración de esteroides en mg equivalentes a colesterol por g de muestra.
0.3
0.25
0.2
0.15 y = 1.35x + 0.007 0.1 R² = 0.9997
nm 560 Absorbancia 0.05
0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Concentración de colesterol mg/mL
Figura 12. Curva estándar de colesterol para la cuantificación de esteroides
Tabla 13. Cuantificación de esteroides en miligramos equivalentes a colesterol por g de muestra de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura Absorbancia Concentración Dilución Concentración real Concentración de 560 nm [mg colesterol [mL] [mg colesterol / mL] esteroides [mg eq. de / mL] colesterol / g de muestra] Barkleyanthus salicifolius 0.0202±0.002 0.144±0.002 1:50 7.2±0.104 108±1.571 tallo Barkleyanthus salicifolius 0.263±0.0 0.189±0.0 1:160 30.24±0.0 453.6±0.0 hoja Chenopodium sp. tallo 0.106±0.001 0.073±0.001 1:30 2.19±0.031 32.85±0.471 Chenopodium sp. hoja 0.238±0.007 0.171±0.005 1:70 11.97±0.366 179.55±5.499 Chenopodium sp. flor 0.0785±0.0007 0.053±0.0005 1:30 1.59±0.015 23.85±0.235 Chenopodium sp. raíz 0.087±0.002 0.059±0.002 1:30 1.77±0.062 26.55±0.942
Los resultados representan promedio ± DS de una n=2; DS= desviación estándar
64 2014
Se observa que las concentraciones más altas de esteroides se encuentran en las hojas de ambas especies siendo de 453.6±0.0 mg para B. salicifolius y de 179.55±5.499 mg para Chenopodium sp.
En el caso del tallo de Chenopodium sp. puede observarse que con base en los resultados obtenidos durante el preliminar fitoquímico (Reacción de Lieberman- Buchard) hubo interferencia de alguna sustancia en la cuantificación de esteroides ya que se detecto la presencia de estos metabolitos aún cuando la prueba de Lieberman fue negativa.
7.2.4 Cuantificación de taninos
Se realizó una curva patrón utilizando como estándar ácido tánico (Figura 13) en la cual se obtuvo un valor de R2 de 0.9774. Basándose en los cálculos del Anexo 2 se obtuvieron los datos de las concentraciones de mg equivalentes a ácido tánico contenidas en los extractos utilizados (Tabla 14).
0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 y = 0.0422x - 0.0032 0.15 R² = 0.9774 0.1
nm 725 Absorbancia 0.05 0 -0.05 0 2 4 6 8 10 12 Concentraciónde ácido tánico µg/ml
Figura 13. Curva patrón de ácido tánico para la cuantificación de taninos
65 2014
Tabla 14. Cuantificación de taninos en Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. con ácido tánico.
Planta y estructura Absorbancia Concentración Dilución Concentración real Concentración de taninos 725 nm [µg ácido tánico / [mL] [µg ácido tánico / [mg eq. de ácido tánico / mL] mL] g de muestra]
Barkleyanthus salicifolius 0.339±0.002 8.109±0.050 1:40 324.36±2.010 4.865±0.030 tallo Barkleyanthus salicifolius 0.375±0.004 8.962±0.117 1:40 358.48±4.691 5.377±0.070 hoja Chenopodium sp. tallo 0.28±0.005 6.711±0.134 1:10 67.11±1.340 1.007±0.020 Chenopodium sp. hoja 0.334±0.004 7.991±0.100 1:10 79.91±1.005 1.199±0.015
Chenopodium sp. flor 0.12±0.0007 2.919±0.016 1:10 29.19±0.167 0.438±0.002
Chenopodium sp. raíz 0.134±0.002 3.251±0.050 1:10 32.51±0.502 0.488±0.007
Los resultados representan promedio ± DS de una n=2; DS = desviación estándar
En la Tabla 14 se muestran las concentraciones de taninos presentes en los diferentes extractos de Chenopodium sp. y B. salicifolius. Se observa que la concentración más baja se encuentra en la flor de Chenopodium sp. (0.438±0.002 mg) mientras que la más alta está en la hoja de B. salicifolius (5.377±0.070 mg).
66 2014
7.3 Método analítico
Identificación de flavonoides por electroforesis capilar
El electroferograma obtenido a partir de la solución con los estándares de flavonoides se observa en la Figura 14, éste se utilizó para comparar con los electroferogramas obtenidos de los extractos de las muestras. El orden de aparición de los picos, fue de Rutina en el minuto 7.8+0.2, Catequina en el minuto 8.7+0.2, Quercetina en el minuto 9.5+0.3, Naringenina en el minuto 10.2+0.2, Miricetina en el minuto 10.9+0.2, Luteolina en el minuto 11.2+0.2, Epigalocatequina en el minuto 11.6+0.2, Kaemferol en el minuto 15.4+0.2 y Apigenina en el minuto 16+0.1.
Figura 14. Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides
Posteriormente se traslapó el electroferograma de la mezcla de los estándares con los electroferogramas de cada muestra. En el electroferograma del extracto del tallo de Barkleyanthus salicifolius se logró identificar los compuestos Catequina, Quercetina y Luteolina como se observa en la Figura 15.
67 2014
Figura 15. (a) Electroferograma del extracto cetónico de tallo de Barkleyanthus salicifolius, (b) Electroferograma de la mezcla de estándares
Para el electroferograma del extracto de hoja de B. salicifolius se identificaron los compuestos Catequina, Quercetina, Luteolina y Epigalocatequina como se muestra en la Figura 16.
Figura 16. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la hoja de Barkleyanthus salicifolius con estándares agregados, (b) Electroferograma del extracto cetónico de hoja de B. salicifolius, (c) Electroferograma de la mezcla de estándares
68 2014
En el electroferograma del extracto del tallo de Chenopodium sp. se identificaron cuatro flavonoides: Rutina, Catequina, Quercetina y Naringenina, como se observa en la Figura 17.
Figura 17. (a) Electroferograma del extracto cetónico del tallo de Chenopodium sp. con estándares adicionados, (b) Electroferograma del extracto cetónico de tallo de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares
Para el electroferograma del extracto de la hoja de Chenopodium sp. se identificó el compuesto Catequina como se muestra en la Figura 18.
Figura 18. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la hoja de Chenopodium sp. con estándar agregado, (b) Electroferograma del extracto cetónico de hoja de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares
69 2014
En el electroferograma del extracto de la flor de Chenopodium sp. se identificó un sólo flavonoide Catequina como se observa en la Figura 19.
Figura 19. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la flor de Chenopodium sp. con estándar adicionado, (b) Electroferograma del extracto cetónico de flor de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares
Finalmente en el electroferograma del extracto de la raíz de Chenopodium sp. se identificaron los compuestos Miricetina y Epigalocatequina como se observa en la Figura 20.
Figura 20. (a) Electroferograma del extracto cetónico de la raíz de Chenopodium sp. con estándares añadidos, (b) Electroferograma del extracto cetónico de raíz de Chenopodium sp., (c) Electroferograma de la mezcla de estándares
70 2014
En resumen los compuestos identificados en los extractos cetónicos de las muestras se observan en la Tabla 15. Destacando que la Catequina fue el compuesto encontrado con mayor frecuencia.
Tabla 15. Flavonoides identificados en los extractos cetónicos de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp.
Planta y estructura Flavonoides
Barkleyanthus salicifolius tallo Catequina, Quercetina y Luteolina Barkleyanthus salicifolius hoja Catequina, Quercetina, Luteolina y Epigalocatequina Chenopodium sp. tallo Rutina, Catequina, Quercetina y Naringenina Chenopodium sp. hoja Catequina Chenopodium sp. flor Catequina Chenopodium sp. raíz Miricetina y Epigalocatequina
Algunos autores (Saleem et al., 2014; Ibarra-Alvarado et al., 2010 y Gawlik-Dziki et al., 2013) reportan la presencia de los flavonoides Quercetina y Kaemferol en Chenopodium murale detectados mediante el uso de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC por sus siglas en ingles) a diferencia del presente trabajo en el que se utilizó Electroforesis Capilar (EC). Las diferencias entre los resultados pueden deberse a las distintas zonas de recolección de los ejemplares usados para dichos estudios, así como a la época del año en la cual se recolectaron, el estrés al cual fueron sometidas las plantas durante su crecimiento, etc.
En otro estudio (García-Quitana et al., 1977) se reporta la presencia de Quercetina en tres especies del género Senecio (S. cymosus, S. otites y S. yegua) y Kaemferol en cuatro especies del mismo género (S. cymosus, S. otites, S. fistulosus y S. yegua). Sabiendo que Senecio salignus es sinónimo de Barkleyanthus salicifolius podemos decir que con base en lo mencionado por García- Quintana la Quercetina es característica del género Senecio ya que al igual que en el trabajo de dicho autor en el presente se detecto éste flavonoide en ambas estructuras de B. salicifolius.
71 2014
7.4 Determinación de la capacidad antioxidante
Utilizando el radical ABTS, se realizó una curva patrón para la determinación de la capacidad antioxidante en Chenopodium sp. y Barkleyanthus salicifolius. Se usó Trolox como estándar para poder expresar los datos como equivalentes de dicha sustancia (TEAC). En la curva, que se muestra en la Figura 21, se obtuvo una R2 de 0.9856 que es aceptable.
100 90 80 70
60 50 40 y = 67.896x + 9.6459 30 R² = 0.9856 % inhibición 20 10 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Concentración Trolox (mM)
Figura 21. Curva patrón de Trolox utilizando el radical ABTS
Después se realizaron los cálculos (Anexo 2) se obtuvieron los datos mostrados en la Tabla 16. Cabe destacar que la hoja de B. salicifolius presenta la concentración más alta (1006 µM).
Tabla 16. Capacidad antioxidante TEAC obtenida con el radical ABTS.
Planta y estructura Capacidad antioxidante TEAC [µM equivalentes de Trolox] Barkleyanthus salicifolius tallo 96 Barkleyanthus salicifolius hoja 1006 Chenopodium sp. tallo 13
Chenopodium sp. hoja ND
Chenopodium sp. flor ND
Chenopodium sp. raíz ND
Los datos representa una n=1; ND= No Detectable
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En la Tabla 16 se observa que para la hoja, la flor y la raíz de Chenopodium sp. no se detecto actividad antioxidante. Esto pudo deberse a que se diluyeron demasiado los extractos por lo cual hubo poca o nula inhibición del radical ABTS.
Ibarra-Alvarado et al. en 2010 realizaron un estudio de la capacidad antioxidante de Chenopodium murale y determinaron una concentración de 868.9 µmol de Trolox/ g extracto. Comparando su resultado con el obtenido en este trabajo (13 µmol) podemos ver que hay una diferencia bastantes considerable la cual puede deberse a la diferencia en cuanto a la composición química de ambos ejemplares estudiados.
En 2005, Domínguez et al. determinaron que Barkleyanthus salicifolius presenta una concentración de 1797.7±168.4 µmol equivalentes a Trolox/ g en el extracto metanólico de las hojas de dicha planta resultado similar al presentado en la Tabla 16 para la misma estructura (1006 µmol).
Se ha comprobado que para una misma muestra la actividad antioxidante varía notablemente al utilizar distintos métodos e incluso utilizando el mismo si las condiciones no son iguales para ambos estudios (Pérez Jiménez, 2007).
Pérez Jiménez en 2007 realizó un estudio para una solución de catequina: ácido gálico 1M:1M en diferentes disolventes. Respecto a los resultados obtenidos para la mezcla en un mismo disolvente en los métodos FRAP, ABTS y ORAC, todos expresados en equivalentes Trolox, estos difieren bastante entre sí. Esto se debe a que, aunque estos tres métodos usen como estándar el mismo compuesto, están basados en reacciones muy diferentes. También ha sido comentado, que al medir por FRAP, TRAP y ABTS la capacidad antioxidante, se observa que, en ciertos grupos de alimentos, el orden relativo de capacidad antioxidante varía considerablemente entre un análisis y otro. Por tanto, al comparar valores de capacidad antioxidante para distintas muestras, se tendría que tomar siempre el mismo método y aplicarlo en las condiciones lo más parecidas posible, ya que en
73 2014 la bibliografía existen amplias variantes para in mismo método, que pueden influir significativamente en los resultados.
7.5 Determinación de la actividad antimicrobiana
Para esta etapa del trabajo se realizaron dos curvas patrón utilizando como estándares un antibiótico (Cefalosporina C) para la inhibición de bacterias y un antimicótico (Ketoconazol) para la inhibición de hongos con el fin de poder determinar los microgramos equivalentes a los fármacos presentes en los extractos estudiados.
Curva estándar de Cefalosporina C. La determinación de la curva estándar de Cefalosporina C se realizó mediante el método de bioensayo en placa, las concentraciones de antibiótico empleadas así como el correspondiente halo de inhibición de Staphylococcus aureus se presentan en la Tabla 17.
Tabla 17. Curva estándar de Cefalosporina C.
Concentración de Cefalosporina C ln de la concentración de Halo de inhibición (µg/ml) Cefalosporina C (mm) 63 4.1431 7.0 125 4.8283 9.0 250 5.5214 11.0 500 6.2146 14.0 1000 6.9077 17.0 2000 7.6009 22.0 4000 8.2940 25.0 8000 8.9872 29.0
La relación entre la concentración y el halo de inhibición es de tipo lineal, de acuerdo con los datos obtenidos y como se observa en la Figura 22. Al hacer
74 2014 regresión lineal de estos datos, podemos calcular las concentraciones equivalentes a Cefalosporina C en las muestras (Tabla 19).
Curva estandar de inhibición
35 30 y = 4.6322x - 13.638 25 R² = 0.9826 20 15 10 5 0 Halo de inhibición ) ( mm inhibición de Halo 0 2 4 6 8 10
ln Concentración de Cefalosporina C
Figura 22. Curva estándar de Cefalosporina C
Curva estándar de Ketoconazol. La determinación de la curva estándar de Ketoconazol se realizó mediante el método de bioensayo en placa, las concentraciones de antimicótico empleadas así como el correspondiente halo de inhibición de Candida albicans se presentan en la Tabla 18.
Tabla 18. Curva estándar de Ketoconazol.
Concentración de Ketoconazol ln de la concentración de Halo de inhibición (µg/ml) Ketoconazol (mm) 1.25 0.2231 8 2.5 0.9163 13 5 1.6094 18.25 10 2.3026 20.5
75 2014
La relación entre la concentración y el halo de inhibición es de tipo lineal, de acuerdo con los datos obtenidos y con lo observado en la Figura 23. Al hacer regresión lineal de estos datos podemos calcular las concentraciones equivalentes a Ketoconazol en las muestras (Tabla 19).
25
20
15
10 y = 6.1675x + 7.1488 R² = 0.9742
Halo de inhibición mm inhibición de Halo 5
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 ln Concentración de Ketoconazol
Figura 23. Curva estándar de Ketoconazol
Para la determinación de la actividad antimicrobiana de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. se realizó con un bioensayo in vitro, utilizando el método de disco-placa (Kirby-Bauer modificado). Los microorganismos de prueba fueron Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Bacillus cereus y Candida albicans. Una vez transcurridas las 24 horas de incubación se retiraron las placas y se procedió a medir los halos de inhibición encontrados para cada microorganismo empleado reportando en la Tabla 19 los resultados obtenidos en µg equivalentes a Cefalosporina C y Ketoconazol respectivamente.
76 2014
Tabla 19. Concentraciones inhibitorias en equivalentes a µg de Cefalosporina C y equivalentes a µg de Ketoconazol.
BACTERIAS Microorganismo Planta y estructura (µg equivalentes a Cefalosporina C) Barkleyanthus salicifolius tallo 5.1 Barkleyanthus salicifolius hoja 6.1
Chenopodium sp. tallo ND Salmonella typhi Chenopodium sp. hoja ND Chenopodium sp. flor ND Chenopodium sp. raíz 4.4 Barkleyanthus salicifolius tallo 5.1 Barkleyanthus salicifolius hoja 6.3
Chenopodium sp. tallo ND Bacillus cereus Chenopodium sp. hoja ND Chenopodium sp. flor ND Chenopodium sp. raíz ND Barkleyanthus salicifolius tallo ND Barkleyanthus salicifolius hoja ND
Chenopodium sp. tallo ND Escherichia coli Chenopodium sp. hoja ND Chenopodium sp. flor ND Chenopodium sp. raíz ND Barkleyanthus salicifolius tallo 5.1 Barkleyanthus salicifolius hoja 5.1
Chenopodium sp. tallo ND Staphylococcus aureus Chenopodium sp. hoja ND Chenopodium sp. flor ND Chenopodium sp. raíz ND
HONGO Microorganismo Planta y estructura (µg equivalentes a Ketoconazol) Barkleyanthus salicifolius tallo 2.1 Barkleyanthus salicifolius hoja 0.3
Candida albicans Chenopodium sp. tallo ND Chenopodium sp. hoja ND Chenopodium sp. flor 2.4 Chenopodium sp. raíz ND
77 2014
Los halos de inhibición encontrados para ambas plantas tuvieron diámetros entre los 7 y 22 mm y las dosis utilizadas en los sensidiscos fueron de 10.04 mg/100µL (tallo de B. salicifolius), 8.96 mg/100µL (hoja de B. salicifolius), 2.56 mg/100µL (tallo de Chenopodium sp.), 5.04 mg/100µL (hoja de Chenopodium sp.), 1.96 mg/100µL (flor de Chenopodium sp.) y 1.7 mg/100µL (raíz de Chenopodium sp.).
En la Tabla 19 se observa que Chenopodium sp., presenta actividad antimicrobiana contra S. typhi y C. albicans, Ahmad et al., 2003 reportan que Chenopodium murale presentó actividad inhibitoria frente E. coli con un halo de inhibición de 15 mm para el extracto crudo de la planta. También se probó dicho extracto contra S. typhi y C. albicans, obteniendo resultado negativo para la inhibición de dichos microorganismos, utilizando un método de difusión distinto al del presente trabajo.
Por otro lado Barkleyanthus salicifolius (jarilla) presentó inhibición frente a S. typhi, B. cereus, S. aureus y C. albicans. En un estudio realizado a una especie del mismo género que la jarilla (recordando que B. salicifolius = S. salignus) Huacuja González, 1995 reporta que S. candidissimus presenta actividad antimicrobiana frente a S. typhi, E. coli, S. aureus y S. cereus en sus diferentes extractos utilizando como solventes etanol, etanol y hexano con halos de inhibición entre los 2.5 y 10 mm al tomar 50 µL de extracto equivalentes a 5 mg del mismo. Sanabria y Mantilla, 1986 mencionan que las especies pertenecientes a la familia Compositae (a la cual pertenece B. salicifolius) son consideradas una buena fuentes de sustancias con actividad antifúngica. Ochoa Pumaylle et al., 2012 atribuye la actividad antimicrobiana a los compuestos terpénicos presentes en los aceites esenciales de las plantas y Pereira Cabrera et al., 2013 menciona que los metabolitos responsables de esta actividad son los alcaloides y triterpenos o esteroides y quinonas. Sabiendo que la “jarilla” contiene los tres metabolitos secundarios antes mencionados era de esperar que presentaran actividad antimicrobiana.
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En la Tabla 19 se muestra que para las bacterias S. typhi y B. cereus el tallo de Barkleyanthus salicifolius tuvo la mayor concentración inhibitoria (6.1 y 6.3 µg equivalentes de Cefalosporina C respectivamente), así mismo, la raíz de Chenopodium sp. presentó una concentración de inhibición de 4.4 µg equivalentes de Cefalosporina C contra Salmonella typhi.
Para el hongo C. albicans la flor de Chenopodium sp., mostró la mayor concentración inhibitoria (2.4 µg equivalentes de Ketoconazol) mientras que el tallo de Barkleyanthus salicifolius presentó la menor concentración de inhibición (0.3 µg equivalente de Ketoconazol).
7.6 Evaluación de la actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp.
En esta parte de la de la investigación se evaluó la actividad antiinflamatoria por el método de edema auricular inducido con aceite de crotón.
Se seleccionaron 6 lotes con 5 ratones cada uno. En tres de estos lotes se probó la actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp., utilizando extractos de la planta completa obtenidos con los solventes hexano, acetona y metanol de los cuales se administraron 100 µL a cada ratón respectivamente. Los otros tres lotes fueron: un lote control positivo (aceite de crotón), un lote con indometacina 10 mg/kg de ratón y un lote control negativo (sin tratamiento)
La Tabla 20 muestra el rendimiento de los extractos obtenidos a partir de 5 g de Chenopodium sp., así como la dosis administrada a los ratones de cada grupo tratado. Podemos observar que la menor dosis administrada fue la del extracto metanólico mientras que el extracto de acetona tuvo la mayor.
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Tabla 20. Rendimiento de los extractos de Chenopodium sp. y dosis administrada.
Solvente utilizado para el Rendimiento del extracto de Dosis administrada a extracto de Chenopodium sp. Chenopodium sp. (g) cada ratón (g/kg) Hexano 0.7947 5.3 Acetona 0.9143 6.07 Metanol 0.1569 1.05
Nota: los extractos fueron resuspendidos en 500 µL de agua destilada.
En la Tabla 21 se muestran los pesos individuales de las orejas de ratón así como el peso promedio ± desviación estándar (DS) para cada grupo. Nótese que la mayor actividad inhibitoria de la inflamación la presenta el grupo “metanol”.
Tabla 21. Peso de las orejas de ratón de los diferentes grupos estudiados.
Peso de las orejas de ratón de cada grupo (g)
Número Fármaco de de oreja Control Control Extractos de Chenopodium sp. referencia negativo positivo Indometacina “crotón” Hexano Acetona Metanol 1 0.0097 0.0190 0.0162 0.0172 0.0074 0.0196 2 0.0073 0.0214 0.0204 0.0190 0.0.161 0.0177 3 0.0119 0.0202 0.0129 0.0150 0.0148 0.0177 4 0.0080 0.0181 0.0208 0.0170 0.0151 0.0140 5 0.0098 0.0229 0.0166 0.0187 0.0202 ----- Peso promedio 0.00934±0.0018 0.02032±0.0018 0.01738±0.0033 0.01738±0.0016 0.01472±0.0046 0.01725±0.0023 (g) ± DS
Los datos representan una n=5 para cada grupo; DS= desviación estándar
7.6.1 Determinación del porcentaje de actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp. (% inhibición y % inflamación)
Utilizando como agente irritante aceite de crotón y mediante la Ec. 1 se obtuvo el valor del porcentaje de inhibición de cada uno de los extractos de Chenopodium
80 2014 sp., así como el del fármaco de referencia (indometacina) los cuales se muestran en la Tabla 22.
( ) % ó = × 100 …. (Ec. 1)
푝푒푠표 푐푟표푡표푛−푝푒푠표 푒푥푡푟푎푐푡표 푖푛ℎ푖푏푖푐푖 푛 푝푒푠표 푐푟표푡표푛 De igual manera se determinó el porcentaje de inflamación que tuvo el aceite de croton en los pabellones auriculares de los ratones tratados con él mediante la Ec. 2, los resultados se reportan en la Tabla 22.
( ) % ó = 100 …. (Ec. 1)
푇푥100 푖푛푓푙푎푚푎푐푖 푛 푆푇 − Donde: T = Peso promedio de la orejas tratadas con cada extracto ST = Peso promedio de las orejas sin tratar (control negativo)
Tabla 22. Actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp. (% inhibición y % inflamación).
Solvente utilizado para el extracto de % inhibición % inflamación Chenopodium sp. Hexano 14.47 86.08 Acetona 14.47 86.08 Metanol 27.56 57.60 Fármaco de Indometacina 15.11 84.68 referencia
Franco Ospina et al., 2013 reporta que los extractos totales de Tabebuia rosea y Tabebuia ochracea, mostraron una reducción significativa del edema inducido por aceite de Croton en ratones. Los porcentajes de inhibición para estas preparaciones fueron de: 38.6 y 25.1 respectivamente, el fármaco de referencia en este estudio fue indometacina la cual presento un % inhibitorio de 59.7. Podemos decir que en comparación con estos resultados Chenopodium sp., presenta mayor actividad antiinflamatoria ya que su extracto metanólico obtuvo un porcentaje de
81 2014 inhibición (27.56 %) mayor al de la Indometacina (15.11 %) utilizada como fármaco de referencia en el presente trabajo.
7.7 Actividad cicatrizante de Chenopodium sp.
A continuación se muestran fotografías (Tablas 23 y 26) con las cuales se logra observar la evolución que presentaron los individuos sometidos a la prueba de cicatrización durante los 9 primeros días después de inducir la herida. Los datos se presentan en tablas (Tablas 24 y 27) que ayudan a denotar los resultados obtenidos durante el proceso de cicatrización. De esta manera se comprobó mediante un análisis visual e histológico la capacidad cicatrizante de la “hediondilla” (Chenopodium sp.), así como su efectividad al emplearse como tratamiento para lesiones cutáneas.
7.7.1 Actividad cicatrizante en animales sanos (normoglucémicos)
En la Tabla 23 se muestran fotografías del progreso obtenido en el proceso de cicatrización de las heridas realizadas en el lomo de las ratas. El tratamiento que consistía en la aplicación de geles de los distintos extractos de Chenopodium sp. se administró durante un periodo de nueve días y la evaluación visual se realizó cada tercer día, observando si existía presencia de: secreción, infección, edema, pelo, eritema, formación de costra y curación completa de la herida.
La Tabla 23 muestra las fotografías del día 1, 3, 5, 7 y 9 después de la cirugía. Se observo que había una secreción moderada en la herida que tiende a decrecer con el tiempo. Esto ocurre en todos los grupos estudiados, sin embargo en el grupo sin tratamiento la presencia de una secreción moderada permaneció por más tiempo.
Un factor desfavorable para la curación de la herida es la presencia de infección, porque puede provocar que se haga lenta o que se detenga la curación, sin embargo, no se presentó infección en ninguno de los animales del estudio.
82 2014
El proceso inflamatorio fue moderado para cada grupo durante los tres primeros días y disminuyó con el tiempo a excepción del grupo control negativo en el que perduró dos días más.
La aparición del pelo se observó primeramente en las ratas tratadas con la hoja de Chenopodium sp. dos días después se presentó en los otros grupos.
El edema fue grave durante los tres primeros días en animales sin tratamiento y los tratados con Nitrofurazona (pomada Furacil 2 mg/g). Para los animales tratados con los extractos de Chenopodium sp. el edema fue moderado hasta el cuarto día, luego decreció con el tiempo. Fueron las ratas tratadas con la hoja de Chenopodium sp. a las que el edema les duró menos tiempo.
Los extractos de la flor, la hoja y el tallo de Chenopodium sp. (Tabla 23) tuvieron excelentes resultados pues las fotografías muestran que las heridas están totalmente curadas para el noveno día, sin embargo, los extractos de raíz y planta completa de Chemopodium sp., además de mostrar un gran progreso en la sanación de las heridas (siendo estos los lotes con las heridas más agudas) también promovieron el crecimiento de pelo alrededor de las mismas. Entiéndase por heridas agudas como más largas y profundas.
Las ratas tratadas con Chemopodium sp. presentaron un eritema leve alrededor del área de la herida mientras que para los demás animales el eritema fue muy marcado.
83 2014
Tabla 23. Comparación visual de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp. en ratas normoglucémicas.
Día 1 3 5 7 9 Gel aplicado
Control negativo
Control positivo (Nitrofurazona 2 mg/g)
Gel de flor de Chenopodium sp. (1.016 mg/g)
Gel de hoja de Chenopodium sp. (0.4 mg/g)
Gel de raíz de Chenopodium sp. (0.5 mg/g)
Gel de tallo de Chenopodium sp. (2.01 mg/g)
Gel de planta completa de Chenopodium sp. (42.4mg/g)
Cada grupo representa una n = 3 ratas, entre paréntesis están los mg/g de gel de cada extracto utilizado
84 2014
En la Tabla 24 se presenta un estimado visual del progreso que tuvo cada extracto de Chenopodium sp. al sanar la heridas en la piel de los roedores en comparación con el fármaco de referencia (Nitrofurazona 2 mg/g).
Se observa que la actividad cicatrizante más elevada la presentan dos lotes: raíz y planta completa, ambos incrementaron su eficacia a partir del 5° día. Por otro lado, se observa que el control positivo tuvo resultados poco favorables. Así mismo es notable que el efecto de los extractos de Chenopodium sp. es mucho más potente que el efecto del fármaco de referencia (Nitrofurazona 2 mg/g).
Tabla 24. Actividad cicatrizante (%) de las heridas cerradas en ratas normoglucémicas.
Grupo Día Día Día Día Día Día Día Día Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ------+ + + Control negativo - - - + + ++ ++ ++ ++ Control positivo (Nitrofurazona 2 mg/g)
Gel de flor de Chenopodium sp. - + + + ++ +++ +++ +++ ++++ (1.016 mg/g) Gel de hoja de Chenopodium sp. - ++ + + ++ ++ +++ +++ ++++ (0.4 mg/g) Gel de raíz de Chenopodium sp. - - + ++ +++ +++ +++ +++ +++ (0.5 mg/g) Gel de tallo de Chenopodium sp. - ++ +++ ++ + + + + + (2.01 mg/g) Gel de planta completa de - + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ Chenopodium sp. (42.4 mg/g)
Cada grupo representa una n = 3 ratas
Simbología: (-) No detectable. (+) Poco o escaso. (++) Moderado. (+++) Abundante. (++++) Actividad cicatrizante más alta.
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En otra serie de experimentos con animales sanos se realizaron cortes histológicos de las heridas y su proceso de cicatrización con los geles del extracto completo de Chenopodium sp. (Tabla 25). Las imágenes que se presentan son vistas de microscopio en aumentos de 10 y 40 X.
Después de llevarse a cabo procedimientos mediativos y postvitales con el fin de preservar las muestras de tejido epitelial de rata siguiendo el proceso tradicional que consiste en: toma de muestra, fijación, inclusión, microtomía, coloración o tinción y montaje, se realizó la observación de los tejidos con el fin de comprobar mediante la aparición de los diferentes tipos celulares presentes en cada etapa de la cicatrización si dicho proceso se llevó a cabo de manera adecuada.
Fase inflamatoria: Una vez terminado el proceso de coagulación se presentan los diferentes tipos de leucocitos en secuencia ordenada. Las primeras células que se presentan son los neutrófilos polimorfonucleares (granulocitos) y los monocitos sanguíneos. Los neutrófilos aparecen durante las primeras horas después de producida la herida, éstos migran por quimiotaxis desde el tejido no dañado adyacente al sitio dañado y permanecen en grandes cantidades por dos a tres días aproximadamente, después su número disminuye. La función que desempeñan es la de remover los detritus celulares y los elementos del coágulo.
Homeostasis y limpieza de la herida: Abarca el periodo desde el trauma al 3er día, hay presencia de: reacciones inflamatorias (rubor, calor, dolor), coagulación y homeostasia, fagocitosis y defensa contra la infección y macrófagos.
Fase proliferativa: Reconstrucción de los tejidos granulares ocurre en el periodo del 4° al 6° día y se presenta reconstrucción vascular y vascularización, tejido granular y fibroblastos.
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Fase de diferenciación y de reconstrucción: Maduración, cicatrización y epitelización que va del 6° al 10° día y hay contracción de la herida, epitelización, mitosis y migración.
En la Tabla 25 se muestran los resultados del grueso de la epidermis en los diferentes periodos de evaluación: 3, 5, 7 y 9 días. Se observó que la capa epidérmica fue más gruesa durante los primeros días, y que disminuyó con el tiempo, esta capa fue más gruesa en los animales tratados con Chenopodium sp., el grupo control positivo presentó la epidermis más delgada.
En las micrografías de los cortes histológicos se observa la migración de las células epiteliales por debajo de la costra aumentando el grosor de la capa epidérmica, la cual se desplaza hacia la zona de daño para culminar el proceso de reepitelización. Este proceso fue más rápido en el grupo tratado con Chenopodium sp. Por debajo del epitelio en migración y la costra se observa la capa dérmica con gran cantidad de fibroblastos y fibras de colágeno. Se observa una vascularización muy marcada en el grupo tratado con Chenopodium sp., mientras en el grupo control positivo se observa una escasa vascularización.
La densidad de los folículos pilosos es muy alta en el grupo tratado con Chenopodium sp., mientras en el grupo control positivo se observa escasa.
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Tabla 25. Comparación histológica de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp., en ratas normoglucémicas.
Día 3 5 7 9
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Acotaciones de la Tabla 25.
En esta etapa del estudio se trabajo con cortes longitudinales de piel de las heridas de las ratas.
Las micrografías presentadas en la primera imagen de la Tabla 25 son vistas de microscopio óptico con aumento de 10X. Los cuadros a, b, c y d corresponden al grupo tratado con el gel de Chenopodium sp. (planta completa, 46.91 mg/g). Los cuadros e, f, g y h representan al grupo Control positivo (Nitrofurazona 2 mg/g) y i, j, k y l pertenecen al grupo Control negativo (sin tratamiento).
Las micrografías presentadas en la segunda imagen de la Tabla 25 son vistas de microscopio óptico con aumento de 40X. Los cuadros a’, b’, c’ y d’ corresponden al grupo tratado con el gel de Chenopodium sp. (planta completa, 46.91 mg/g). Los cuadros e’, f’, g’ y h’ representan al grupo Control positivo (Nitrofurazona 2 mg/g) y i’, j’, k’ y l’ pertenecen al grupo Control negativo (sin tratamiento).
Las flechas en color azul indican vasos sanguíneos. Las flechas en color amarillo señalan folículos pilosos. Las flechas en color rojo apuntan a glándulas sebáceas. Los círculos amarillos muestran colágeno y fibroblastos.
7.7.2 Actividad cicatrizante en animales diabéticos tipo II
La Tabla 26 muestra fotografías del proceso cicatrizante de las heridas inducidas en el lomo de las ratas. El tratamiento consistió en la aplicación de geles de los distintos extractos de Chenopodium sp. los cuales fueron administrados durante nueve días. La evaluación visual se realizó cada tercer día, observando si existía presencia de: secreción, infección, edema, pelo, eritema, formación de costra y curación completa de la herida.
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La Tabla 26 muestra las fotografías de los días 1, 3, 5, 7 y 9 (de ratas con diabetes inducida) después de la cirugía. Se observó que había una secreción moderada de la herida y que tiende a decrecer con el tiempo. Esto ocurre en todos los grupos estudiados, sin embargo en el grupo sin tratamiento la presencia de una secreción moderada permaneció por más tiempo.
El proceso inflamatorio fue moderado para cada grupo durante los 5 primeros días y disminuyó con el tiempo a excepción del grupo control negativo en el que perduró dos días más.
La aparición del pelo se observó primeramente en las ratas tratadas con la raíz y la hoja de Chenopodium sp.
El edema fue grave durante los cinco primeros días en animales sin tratamiento y los tratados con Nitrofurazona 2 mg/g. Para los animales tratados con los extractos de Chenopodium sp. el edema fue moderado hasta el cuarto día, luego decreció con el tiempo. Fueron las ratas tratadas con la hoja de Chenopodium sp. a las que el edema les duró menos tiempo.
En la Tabla 26 se observa que los extractos de flor, hoja, raíz y tallo de Chenopodium sp. tuvieron excelentes resultados ya que las heridas se ven totalmente cicatrizadas al noveno día.
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Tabla 26. Comparación visual de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp. en ratas diabéticas.
Día
1 3 5 7 9 Gel aplicado
Control negativo
Control positivo sano (Nitrofurazona 2 mg/g)
Control positivo Diabético (Nitrofurazona 2 mg/g)
Gel de flor de Chenopodium sp. (1.016 mg/g)
Gel de hoja de Chenopodium sp. (0.4 mg/g)
Gel de raíz de Chenopodium sp. (0.5 mg/g)
Gel de tallo de Chenopodium sp. (2.01 mg/g)
Cada grupo representa una n = 3 ratas; entre paréntesis están los mg/g de gel de cada extracto utilizado
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La Tabla 27 presenta un estimado visual del progreso que tuvieron los extractos de Chenopodium sp. al sanar las heridas en la piel de los roedores comparados con el medicamento de referencia Nitrofurazona 2 mg/g. Podemos ver que los extractos Chenopodium sp. presentan mejores resultados que los obtenidos incluso en el control positivo sano (Nitrofurazona 2 mg/g).
Tabla 27. Actividad cicatrizante (%) de las heridas cerradas en ratas diabéticas.
Grupo Día Día Día Día Día Día Día Día Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ------+ + + Control negativo
Control positivo sano (Nitrofurazona 2 - - + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ mg/g) Control positivo Diabético - - + + ++ ++ ++ ++ +++ (Nitrofurazona 2 mg/g) Gel de flor de Chenopodium sp. - - + + ++ +++ +++ ++++ ++++ (1.016 mg/g) Gel de hoja de Chenopodium sp. - - + ++ +++ +++ +++ ++++ ++++ (0.4 mg/g) Gel de raíz de Chenopodium sp. - - ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ (0.5 mg/g) Gel de tallo de Chenopodium sp. - - + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ (2.01 mg/g)
Simbología: (-) No detectable. (+) Poco o escaso. (++) Moderado. (+++) Abundante. (++++) Actividad cicatrizante más alta.
Los cortes histológicos de las heridas y su proceso de cicatrización en las ratas diabéticas tratadas con el gel de Chenopodium sp. (planta completa), Nitrofurazona 2 mg/g y control negativo se muestran en la Tabla 28. Las imágenes que se presentan son vistas de microscopio y tienen aumentos de 10 y 40 X.
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La evaluación fue a los 3, 5, 7 y 9 días. Se observó que la capa queratina fue más gruesa durante los primeros días y que disminuyó con el tiempo, esta capa fue más gruesa en los animales tratados con Chenopodium sp., el grupo control positivo presentó la epidermis más delgada.
En las micrografías de los cortes histológicos de las ratas diabéticas de a los 7 y 9 días de tratamiento Chenopodium sp., se observa la migración de las células epiteliales por debajo de la costra, un mayor número de células de colágeno y fibroblastos que en los otros grupos de experimentación. Se observa una vascularización muy marcada en el grupo tratado con Chenopodium sp., mientras en el grupo control positivo se observa una escasa vascularización.
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Tabla 28. Comparación histológica de la actividad cicatrizante de Chenopodium sp., en ratas diabéticas.
Día 3 5 7 9
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Acotaciones de la Tabla 28.
En esta etapa del estudio se trabajo con cortes transversales para el grupo tratados con Chenopodium sp. y cortes longitudinales de piel de las heridas de las ratas para ambos grupos control.
Las micrografías presentadas en la primera imagen de la Tabla 28 son vistas de microscopio óptico con aumento de 10X. Los cuadros a, b, c y d corresponden al grupo tratado con el gel de Chenopodium sp. (planta completa, 46.91 mg/g). Los cuadros e, f, g y h representan al grupo Control positivo (Nitrofurazona 2 mg/g) y i, j, k y l pertenecen al grupo Control negativo (sin tratamiento).
Las micrografías presentadas en la segunda imagen de la Tabla 28 son vistas de microscopio óptico con aumento de 40X. Los cuadros a’, b’, c’ y d’ corresponden al grupo tratado con el gel de Chenopodium sp. (planta completa, 46.91 mg/g). Los cuadros e’, f’, g’ y h’ representan al grupo Control positivo (Nitrofurazona 2 mg/g) y i’, j’, k’ y l’ pertenecen al grupo Control negativo (sin tratamiento).
Las flechas en color azul indican vasos sanguíneos. Las flechas en color amarillo señalan folículos pilosos. Las flechas en color rojo apuntan a glándulas sebáceas. Los círculos amarillos muestran colágeno y fibroblastos.
El género Chenopodium (familia Chenopodiaceae) está formado por unas 250 especies, entre las cuales hay algunas comestibles como Chenopodium album sus granos contienen gran cantidad de proteínas como lisina y metionina. Entre las especies domesticadas esta el amaranto y el trigo Turco (alforfón) los cuales contienen abundantes aminoácidos esenciales (Bhargava et al., 2005).
Las especies del género Chenopodium son utilizadas como cultivos forrajeros en todo el mundo, son una rica fuente de minerales como potasio, sodio, calcio, zinc,
95 2014 cobre y hierro. Recientemente el género ha sido reconocido por tener actividad antitumoral, antifúngica y antioxidante (Nascimento et al., 2006; Kumar et al., 2007).
Los minerales son importantes en la dieta humana porque ellos son cofactores en muchos procesos fisiológicos y del metabolismo (Bhargava et al., 2010).
El calcio juega un papel importante en la regulación de la diferenciación celular y descamación de los queratinocitos epidérmicos y cumple una función clave en la regulación y coordinación de la diferenciación terminal de las células. El Ca++ también está involucrado en la formación de las capas lipídicas.
El zinc es el segundo metal más abundante en el cuerpo humano y se encuentra presente en todas las células y secreciones del cuerpo. La concentración en sangre del zinc en un humano adulto va de 90 a 130 mg/mL y de ésta 20 % del total se encuentra localizado en la piel, en forma de metaloproteínas. El zinc forma parte de más de 70 metaloproteínas presentes en el organismo, polimerasas de DNA y RNA, transcriptasas reversas, proteasas y en las proteínas que tienen un papel central en la reconstrucción de la piel lesionada. El zinc es esencial para la actividad de muchas enzimas involucradas en la síntesis de proteínas y lípidos.
Se ha reportado que las concentraciones de zinc cambian dependiendo del proceso de cicatrización de la herida. Estudios experimentales muestran que las concentraciones de zinc en los márgenes de las heridas son 15–20 % más altos que en el resto de la piel, este incremento es suministrado por el zinc en el plasma.
También se ha demostrado que la administración tópica de zinc reduce la fase inicial de la hemorragia de una herida en piel y promueve el crecimiento tanto de la piel dañada como del pelo (Piña-Barba et al., 2002).
El género Chenopodium presenta los minerales de calcio y zinc los cuales contribuyeron en el proceso de cicatrización en las ratas.
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8. RESUMEN DE RESULTADOS
El tamiz fitoquímico de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. dio positivo a fenoles, esteroides, alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas, glucósidos cardiacos y sesquiterpenlactonas.
La hoja de Barkleyanthus salicifolius presento la mayor concentración de fenoles (4.98±0.178 de mg equivalentes a ácido gálico/g de muestra) y en la hoja de Chenopodium sp. la cantidad fue de 0.87±0.0.20 de mg equivalentes a ácido gálico/g de muestra.
Barkleyanthus salicifolius en la hoja presento la mayor concentración de flavonoides 67.904±3.950 de mg equivalentes a rutina/g de muestra, mientras que la hoja de Chenopodium sp. contiene 4.456±0.155 de mg equivalentes a rutina/g de muestra.
Las hojas de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. presentaron gran cantidad de esteroides 453.06±0.0 y 179.55±5.499 mg equivalentes a colesterol/g de muestra respectivamente.
Las concentraciones de taninos en las hojas de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. fueron de 5.377±0.070 y de 1.199±0.015 mg equivalentes a ácido tánico/g de muestra respectivamente.
En el extracto cetónico de la hoja y flor Chenopodium sp. mediante electroforesis capilar se identificó Catequina, en la raíz se encontró Miricetina y Epigalocatequina, mientras que en el tallo se identificó 4 flavonoides; Rutina, Catequina, Quercetina y Naringenina.
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Por electroforesis capilar se identificó en el tallo y en la hoja de Barkleyanthus salicifolius Catequina, Quercetina y Luteolina, y la hoja además contenía Epigalocatequina.
El tallo y la hoja de Barkleyanthus salicifolius presentan concentraciones de 96 y 1006 µM equivalentes de Trolox.
El tallo de Chenopodium sp. tiene una concentración de 13 µM equivalentes de Trolox.
Se comprobó que el extracto de Chenopodium sp. posee propiedades antimicrobianas frente a Salmonella typhi. El extracto de Barkleyanthus salicifolius tiene actividad contra Salmonella typhi, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus. Ambas plantas tienen propiedades antifúngicas contra Candida albicans.
En la actividad antiinflamatoria de Chenopodium sp. el extracto metanólico presento la mayor actividad inhibitoria de la inflamación (27.56 % de inhibición).
En el proceso de cicatrización utilizando Chenopodium sp. en ratas wistar normoglucémicas y diabéticas se observó un edema menor, menos inflamación, formación de costra y curación completa de la herida en menor tiempo que el grupo control negativo. También se observó en la capa dérmica gran cantidad de fibroblastos, fibras de colágeno y vasos sanguíneos en mayor cantidad que los grupos controles.
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9. CONCLUSIONES
Se evaluó la actividad farmacológica de Barkleyanthus salicifolius y Chenopodium sp. determinando que ambas especies poseen propiedades antioxidantes y antimicrobianas, por su cuenta Chenopodium sp. presento actividad antiinflamatoria y cicatrizante.
Debido a las cualidades atribuidas y comprobadas de los flavonoides en cuanto a beneficios para la salud se trata, en el presente trabajo se realizaron distintos ensayos con el fin de comprobar la presencia de dichos metabolitos mediante pruebas rápidas de coloración así como su concentración por cuantificación. También se logró identificar algunos de estos compuestos presentes en B. salicifolius y Chenopodium sp. mediante el uso de Electroforesis Capilar, una técnica poco utilizada para dicho fin pero con grandes ventajas en cuanto a costos y tiempos de análisis en comparación con otras técnicas como HPLC.
En cuanto a la actividad antiinflamatoria se determinó que el extracto metanólico de Chenopodium sp. presenta una alta actividad desinflamatoria ya que obtuvo mejores resultados que la indometacina, fármaco utilizado con gran frecuencia en la medicina para tratar inflamaciones.
Se comprobó que Chenopodium sp. ayuda en el proceso de cicatrización incluso en individuos diabéticos ya que las heridas tratadas con esta planta sanaron completamente en un período menor al que lo harían de forma natural inclusive al que lo harían con ayuda de ciertos fármacos como la Nitrofurazona. También se observó que dicha planta estimula el crecimiento capilar aún en zonas afectadas.
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10. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO
Purificar los extractos de B. salicifolius y Chenopodium sp. para obtener las distintas fracciones que los componen.
Determinar cuáles son las fracciones que confieren las distintas actividades farmacológicas determinadas en el presente trabajo (antioxidante, antimicrobiana, antiinflamatoria y cicatrizante).
Una vez identificadas las fracciones con las distintas actividades farmacológicas realizar la identificación de sus componentes mediante alguna técnica como IR, RMN, espectrometría de masas, etc.
Probar nuevamente el efecto antiinflamatorio de Chenopodium sp. con la fracción responsable de dicha actividad.
Repetir las pruebas de cicatrización para Chenopodium sp. habiendo realizado una formulación adecuada para la fracción que haya presentado dicha actividad.
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11. REFERENCIAS
Abbas M.N., Rana S.A., Shahid M., Rana N., Mahmood-ul-Hassan M. y Hussain M., 2012. Chemical evaluation of weed seeds mixed with wheat grains at harvest. The Journal of Animal & Plants Sciences, 22(2), Page: 283-288.
Agrawal M.Y., Agrawal Y.P. y Shaunkuwar P.B., 2014. Phytochemical and Biological Activities of Chenopodium album. International Journal of PharmTech Research, Vol. 6, No. 1, pp. 383-391, India.
Ahmad B., Jan Q., Bashir S., Nisar M., Shaheen F. y Ahmad M., 2003. Pharmacological and Biological Investigations of Chenopodium murale Linn. Asian Journal of Plant science 2(15.16): 1107.1111.
Alarcón Aguilar F.J., 1997. Investigación experimental de la acción hipoglucemiante de plantas usadas en el control de la diabetes mellitus. Universidad Autónoma Metropolitana, México.
Almeida J., 2012. Caracterización y evaluación de la capacidad antioxidante del de maíz negro (Zea mais L) y su colorante. Escuela Politécnica Nacional.
Alonso Peña D., 2007. Atlas de dermatología del pie. 14ª ed. Edit. Medica Panamericana, Buenos Aires; Madrid, p. 207-208.
Amat A.G., 1983. Taxones de Compuestas Bonaerenses críticos para la Investigación Farmacológica. Acta Farm. Bonaerense 2(1):2-36. Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de la Plata, Argentina.
Amaya-Chávez A., Dolores-Ledezma E., Álvarez-Sánchez P., Ferreira-Rubio G., Gómez-Oliván L.M., Galar-Martínez M. Evaluación de un modelo de diabetes tipo 2 para estudiar la actividad hipoglucemiante de la glibenclamida. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 38.
101 2014
Angulo Castro B.J., 2013. Efecto de la radiación UV-C sobre el contenido de compuestos antioxidantes de mora de castilla (Rubus glaucus) sin espinas. Universidad Tecnológica Equinoccial, Facultad de Ciencias de la Ingeniería, Carrera de Ingeniería de Alimentos. Quito.
Ávalos García A. y Pérez-Urria Carril E., 2009. Metabolitos secundario en plantas. Departamento de biología Vegetal I (Fisiología Vegetal). Facultad de Biología. Universidad Complutense, Madrid, Reduca (Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2 (3): 119-145.
Berlanga-Acosta J., Valdéz-Pérez C., Savigne-Gutiérrez W., Mendoza-Marí Y., Franco-Pérez N., Vargas-Machiran E., Poll-Marrón N., Álvarez-Duarte H., Echavarría-Requeijo H. y Pérez-Aguilar R. M., 2010. Particularidades celulares y moleculares del mecanismo de cicatrización en la diabetes. Biotecnol Apl (online), vol. 27, n. 4, pp. 255-261.
Bhargava A., Shukla S. y Ohri D., 2005. Chenopodium quinoa - An Indian perspective. Industrial Crops and Products 23, 73-86.
Bhargava A., Shukla S., Srivastava J., Singh N. y Ohri D., 2008. Genetic diversity for mineral accumulation in the foliage of Chenopodium spp. Scientia Horticulturae 118, 338-346.
Bhargava A., Shukla S. y Ohri D., 2010. Short communication. Mineral composition in foliage of some cultivated and wild species of Chenopodium. Spanish Journal if Agricultural Research, 8(2), 371-376.
Bozin B., Mimica-Dukic N., Samojlik I., Goran A., Igic R., 2008. Phenolics as antioxidants in garlic (Allium sativum L., Alliaceae). Food Chem 111: 925-929.
Brito Álvarez G., Frías Vázquez A.I., Morón Rodríguez F.J., García Delgado N., Cabrera Suárez H.R., Morejón Rodríguez Z., Martínez Hormaza I. y Victoria*
102 2014
*Amador M.C., 2014. Validación preclínica del efecto antiinflamatorio tópico de cinco plantas medicinales. Revista Cubana de Plantas Medicinales., Vol. 19, No. 1.
Cabrera Rodríguez D.D., Sánchez García Y., Guerra Sánchez D., Espinosa Reyes A.L., Almeida Saavedra M., 2011. Tamizaje fitoquímico y actividad antimicrobiana de Bryophyllum pinnata. Química viva Vol. 10 Núm. 1, pp. 51.58. Universidad de Buenos Aires, Argentina.
Castillo Rodríguez M.A., Revilla Vázquez A.L., López Arellano R., Rivera García P., 2005. Fundamentos de electroforesis Capilar. Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México, p. 9, 19-20.
Committee Report, 1997. Report of the expert committee on the diagnostic and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 20: 1183-1197.
Choy Y., Jeong H.S. y Lee J., (2007). Antioxidant activity of methanolic extracts from some grains consumed in Korea. Food Chemistry (103):130-138 2.
Chuquimia F., Alvarado J.A., Peñarrieta J.M., Bergenstahl B. y Akesson B., 2008. Determinación de la capacidad antioxidante y la cuantificación de compuestos fenólicos y flavonoídicos de cuatro especies vegetales de la región andina de Bolivia. Revista Boliviana de Química. Volumen 25, No. 1, 75-83.
Clement J.S., Mabry T.J., Wyler H. y Dreiding A.S., 1994. Chemical review and evolutionary significance of the betalains. In Caryphyllales: evolution and systematic, H. D. Behnke and T.J. Mabry (eds.) 247-261. Springer Verlag, Berlín.
De Albuquerque Sarmento P., da Rocha Ataíde T., de Souza e Pinto A.P., de Araújo-Júnior J. X., Leite Lúcio I. M. y de Assis Bastos M. L, 2014. Evaluación del extracto de la Zeyheria tuberculosa en la perspectiva de un producto para cicatrización de heridas. Rev. Latino-Am. Efermagem; 22(1), Brasil.
103 2014
Dimitris P., George B. y Nikolaosk K., 2007. Recovery of antioxidant phenolics from White vinification solid by products employing water-etanol mixtures. Bioresource technology (78): 584- 587.
Domínguez Suárez A., Acosta Ulloa L. y Cuello D., 2001. Efecto cicatrizante de extracto fluido de hojas de siempreviva. Facultad de Ciencias Médicas de Matanzas. Revista Cubana de Plantas Medicinales; (1): 16-8.
El Shazly a., Doral G. y Wink M., 2002. Chemical composition and Biological activity of the essential oils of Senecio aegyptius Var., discoideus Boiss. Zeitschrift fur, Naturforschung Section C. Biosciences 57(516): 434-439.
Enríquez Flores A.M., Orieto Vela E.P., de los Ríos Martínez E. y Ruíz Reyes S.G., 2008. Estudio farmacognóstico y fitoquímico del rizoma de Zingiber officinale Roscoe “Jengibre” de la ciudad de Chanchamayo – Región de Junín. Perú. Rev. Med Vallejiana, Vol. 5 No. 1, p.p. 50-64.
Espitia-Baena E.J., Duran-Sandoval H.R., Fandiño Franky J., Díaz-Castillo F., Gómez Estrada H.A., 2011. Química y Biología del extracto etanólico del epicarpio de Crescentia cujete L. (totumo). Universidad de Cartagena. Cartagena, Colombia. Revista Cubana de Plantas Medicinales Vol.16 –No.4, Ciudad de la Habana.
Farizano J., Lizárraga E. y Perotti M., 2008. Fenoles y Flavonoide totales en extractos de Senecio argophylloides Griseb. (ASTERACEAE). IX Jornadas científicas y encuentro de Jóvenes Investigadores "Augusto Palavecino", Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia – UNT. San Miguel de Tucumán.
Franco Ospina L.A., Castro Guerrero J.P., Ocampo Buendía Y.C., Pájaro Bolívar I.B. y Díaz Castillo F., 2013. Actividad antiinflamatoria, antioxidante y antibacteriana de dos especies del género Tabebuia. Revista Cubana de Plantas Medicinales; 18(1) 34-46.
104 2014
Galindo W.F., Rosales M., Murgueitio E. y Larrahondo J.E., 1989. Sustancias antinutricionales en las hojas de guamo, naceredo y matarratón. Livestock Research for Rural Development, Vol.1, Núm. 1, Colombia.
García-Quintana H., Reyes P. de E. A. y Sandoval S., 1977. Acción antimicrobiana de extractos y flavonoides de especies de Senecio. Arch. Med. Vet. 9(1): 36- 44.
Gaviria Montoya C., Ochoa Ospina C., Sánchez Mesa N., Medina Cano C., Lobo Arias M., Galeano García P., Mosquera Martínez A., Tamayo Tenorio A., Lopera Pérez Y. y Rojano B., 2009. Actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica de extracto de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8(6), 519-528.
Gawlik-Dziki U., Swieca M., Sulkowski M., Baraniak B. y Czyz J., 2013. Antioxidant and anticancer Activities of Chenopodium quinoa leaves extracts - In vitro study. Food and Chemical Toxicology, 57: 154-160.
Gioanetto F., Díaz Vilchis J.T. y Quintero Sánchez R., 2010. Manual de utilización de las malezas silvestres Michoacán. Usos alelopáticos, agroecológicos, medicinales, alimentarios, vegetarianos y rituales de las adventicias silvestres y arvenses. Grafópolis S.A. de C. V. Morelia Michoacán, México 2010: p.p. 6, 7, 20, 54, 55, 56.
Gómez Castellanos J.R., 2008. Epazote (Chenopodium ambrosioides). Revisión a sus características morfológicas, actividad farmacológica y biogénesis de su principal activo, ascaridol. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, Vol.7, número 001. Sociedad Latinoamericana de Fitoquímica Santiago, Chile. p.p. 3-9.
Gómez Sánchez I., 2012. Tratamiento tradicional del síndrome diarreico con infusión de hojas de P. guajava L (Guayaba). Fundación Universitaria Iberoamericana, Universidad Europea Miguel de Cervantes, Guatemala.
105 2014
González Elizondo M., López Enríquez I.L., González Elizondo M.S., Tena Flores J.A., 2004. Plantas Medicinales del Estado de Durango y Zonas Aledañas. CIIDIR Durango, Instituto Politécnico Nacional, pág. 41.
González Guevara M.C., Ospina Giraldo L.F. y Rincón Valendia J., 2011. Actividad antiinflamatoria de extractos y fracciones de Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia, Curatella americana y Physalis peruviana en los modelos edema auricular por TPA, edema planta por carragenina y artritis inducida por colágeno. Biosalud, Volumen 10 No.1, págs. 9 – 18, Colombia.
González P.S., Fajardo V. y Cuadra P., 2013. Adaptive variation of Patagonian Senecio patagonicus Hook. & Arn., Adesmia bononioides Hook. F. and Lepidophyllum cupressiforme (Lam) Cass. as a plant response to environmental stress. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales Aromáticas, 12(4):365-371.
Guillermo Navarro R.F., 2002. Comprobación del efecto cicatrizante de Peperomia scutellaefolia R. et P., Aspectos etnofarmacológicos, botánicos y estudio químico. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
Hromádkova y Ebringerová, 2003. Ultrasonic extraction of plant materials- investigation of hemicelluloses release from buckwhweat hulls. Ultrasonics Sonochemistry.10: 127-133.
Huacuja-González E.R., 1995. Contribución al estudio fitoquímico y determinación de la actividad antimicrobiana de Senecio candidissimus. Universidad Nacional Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, División de Estudios de Posgrado. San Nicolás de Garza N.L.
106 2014
Ibarra-Alvarado C., Rojas A., Mendoza S., Bah M., Gutiérrez D.M., Hernández- Sandoval L. y Martínez M., 2010. Vasoactive and antioxidant Activities of plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of cardiovascular diseases. Pharmaceutical Biology; 48(7):732-739.
IICA, 2005. Plantas medicinales y otras especies útiles. Diagnóstico situacional sobre, la producción, industrialización y comercialización. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA). Centro de Desarrollo de la Medicina Tradicional (CEDEMETRA), Managua. Pág. 30.
Julián Loaeza A.P., 2009. Propiedades Físicas y Químicas de Tres Variedades de Fruto de Annova diversifolia. Universidad Tecnológica de la Mixteca. Huajuapan de León, Oaxaca, México.
Kalofoutis C., Piperi C., Kalofoutis A., Harris F., Phoenix D. y Singh J., 2007. Type II diabetes mellitus and cardiovascular risk factors: Current therapeutic approaches. Department of Biological Chemistry, University of Athens. Athens, Greece. Exp Clin Cardiol; 12(1):17-28. Canadá.
Kumar R., Mishra A.K., Dubey N.K. y Tripathi Y.B., 2007. Evaluation of Chenopodium ambrosioides oil as a potential source of antifungal, antiaflatoxigenic and antioxidant activity. Int J. Food Microbiol. 115, 159-164.
Kuskoski E.M., Asuero A.G., Troncoso A.M., Macini-Filho J. y Fett R., 2005. Aplicación de diversos métodos químicos para determinar actividad antioxidante en pulpa de frutos. Cienc. Tecnol. Aliment.. Campinas. V. 25, p. 726-732.
León Sarabia J.E., Rosales Clares V.P., rosales Clares R.A. y Pavón Hernández V., 1999. Actividad antiinflamatoria y cicatrizante del ungüento rectal de Aloe vera L. (Sábila). Rev Cubana Plant Med; 3(3):106-9.
107 2014
Liu M., Xin Q.L., Weber C., Yong L.C., Brown J. y Liu R.H., 2002. Antioxidant and Antiproliferative Activities of Raspberries. (J, Agric. Food Chem. 2002, 50, 2926- 2930).
Makkar Harinder P.S., 2000. Quantification of tannins in tree foliage. A Laboratory Manual. Joint fao/iaea división of nuclear techniques in food and agricultura laea, Vienna 26-28 p.p.
Martínez M.M., Ocampo D.M., Galvis J.H., Valencia A., 2011. Actividad Antibacteriana y citotoxicidad de extracto etanólico de Bauhinia variegara L. (Fabaceae). Universidad de Caldas, A. A. 275. Manizales, Colombia. Revista Cubana de Plantas Medicinales Vol.16 –No.4, Ciudad de la Habana.
Mayor Oxilia R., 2010. Estrés Oxidativo y Sistema de Defensa Antioxidante. Servicio de Pediatría del Instituto de Medicina Tropical. Rev. Inst. Med. Trop.; 5(2):23-29. Asunción. Paraguay.
Martínez M.A., 2005. Flavonoides. Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Medellín.
Melgarejo M., Almanza G. Sterner O. y Masson L., 2013. Lipid content, fatty acids, tocopherols and tocotrienols composition of ten Bolivian quinoa cultivars. SILAE XXII, Fitoquímica posters, p. 125-126.
Méndez Martínez M.G., Montalvo-Javé E.E., Wintergerst Toledo E., Téllez Sánchez M., Castell Rodríguez A., Gómez Campos A., Laguna Hernández G., Osuna Fernández R. y Brechú Franco A.E., 2008. Efecto cicatrizante de la pomada preparada con Dorstenia drakena L. (Moraceae) en heridas cutáneas. Cirujano General Vol. 30 Núm. 4.
108 2014
Mercado-Mercado G., de la Rosa Carrillo L., Wall-Mercado A., López Díaz J.A. y Álvarez-Parrilla E., 2013. Compuestos polifenólicos y capacidad antioxidante de especias típicas consumidas en México. Nutr. Hops.; 28(1):36-46.
Mercado Sánchez J.M., 2010. Determinación de la capacidad antioxidante de flavonoides de plantas medicinales e identificación por electroforesis capilar. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Instituto Politécnico Nacional, p. 14.
Mohamed S.A.A., Mohamed S.S., Aziza A.E-N. y Mosaad A.A-W., 2013. Antioxidant and antibacterial activity of silver nanoparticles biosynthesized using Chenopodium murale leaf extract. Journal of Saudi Chemical Society. King Saud University.
Morales León J.A., Fonseca García A., Almeida Saavedra C.M., Morales Torres C.G., Torres Rodríguez E., 2011. Tamizaje fitoquímico de Cassia uniflora Mill. Universidad de Granma, Cuba. Revista Cubana de Plantas Medicinales Vol.16 – No.4, Ciudad de la Habana.
Nascimento F.R., Cruz G.V., Pereira P.V., Maciel M.C., Silva L.A., Azevedo A. P., Barroquiero E.S. y Guerra R.N., 2006. Ascitic and solid Ehrlich tumor inhibition by Chenopodium ambrosioides L. treatment. Life Sci. 78, 2650-2653.
Ndom J.C., Mbafor J.T., Kakam Z., Happi N., Vardamides J.C., Meva’a L.M., Ngando T.M. y Fomum Z.T., 2007. Strylphyrone glucosides whit antimicrobial activity from Senecio Mannii Hook (Asteraceae). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, Vol. 6(3), 73-80.
Ochoa Pumaylle K., Quiroz Paredes L.R., Bejarano Luján D.L. y Silva Paz R.J., 2012. Extracción, caracterización y evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Senecio graveolens Wedd (Wiskataya). Scientia Agropecuaria, 3:291-302.
109 2014
Olazo Marinero A., 2010. Efecto de la obesidad y la inducción de diabetes sobre los valores de glucosa, colesterol y triglicéridos en modelo de rata. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Veracruzana, p. 51.
Oliva-Hernández Y., Sánchez-Carelo J., Abad Martínez M.J., Bermejo-Benito P. y Marrero-Faz E., 2013. Evaluación del efecto antiinflamatorio de un extracto orgánico de Allophytus cominia (L) Sw. Sobre la actividad de COX-2 FLA-2s. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, Vol. 12, núm. 2, pp. 150-153. Universidad de Santiago de Chile. Santiago, Chile.
Osuna Fernández R. y Brechú Franco A.E., 2008. Efecto cicatrizante de la pomada preparada con Dorstenia drakena L. ( Moraceae) en heridas cutáneas. Departamento de Ecología y Recursos Naturales, Facultad de Ciencias. Departamento de Cirugía y Departamento de Biología Celular y Tisular, facultad de Medicina, UNAM. Medigraphic Artemisa en línea. Cirujano General, Vol. 30, núm. 4, México.
Payá M., Ferrándiz M.L., Sanz M.J., Bustos G., Blasco R., Ríos J.L., et. al., 1993. Study of the antioedema activity of some seaweed and sponge extracts from the Mediterranean coast in mice. Phytother Res 7:159-62.
Pereira Cabrera S., Vega Torres D., Almeida Saavedra M., Morales Torres G., Viena Tamayo Y. y Sánchez García Y., 2013. Actividad antimicrobiana in vitro de Cederla adorata L. (Cedro). Revista Cubana de Plantas Medicinales; 18(4): 513- 521.
Pérez Jiménez J., 2007. Metodología para la evaluación de ingredientes funcionales antioxidantes. Efecto de Fibra Antioxidante de Uva en status antioxidante y parámetros de riesgo cardiovascular en humanos. Facultad de Ciencias - Departamento de Química Física Aplicada, Universidad Autónoma de Madrid.
110 2014
Pérez Trueba G. 2003. Los Flavonoides: Antioxidantes o prooxidantes. Rev. Cubana Invest. Biomed, Vol. 22(1), p. 48-57.
Picazo J.J., 2000. Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos. Procedimientos en microbiología clínica. Recomendaciones de la sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
Piña –Barba M.C., Tejeda-Cruz A., Regalado-Hernández M.A., Arenas-Reyes M.I., Martín-Mandujano S. y Montalvo C., 2002. Cerámicas mexicanas para cicatrización de piel. Gac Méd Méx Vol. 140, No.1.
Raederstorff D. Pantze M., Bachmann H., Moser U. Anti-inflammatory properties of docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids in phorbol-ester-induce mouse ear inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 1996. 111(3): p. 284-90
Rassoul F., Salvetter J., Reissig D., Schneider W., Thiery J., Richter V., 2006. The influence of garlic (Allium Sativum) extract on interleukin 1α-induced expression of endothelial intercellular adhesion molecule-1 and vascular adhesion molecule-1. Phytomedicine 13: 230- 235.
Repo de Carrasco R. y Encina Zelada C.R., 2008. Determinación de la capacidad antioxidante y compuestos fenólicos de cereales andinos: quinua (Chenopodium quinoa), kañiwa (Chenopodium pallidicaule) y kiwicha (Amaranthus caudatus). Rev. Soc. Quím. Perú, 74, No. 2 (85-99).
Robards K., Prentzler P.D., Tucker G., Swatsitang P. y Glover W., 1999. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry 66: 401- 436.
Rodman J.E., 1981. Divergence, convergence and parallelism in phytochemical characters: The glucosynolate-myrosinase system. “En: Phytochemistry and angiosperm phytogeny. D. A. Young y D.S. Seigler (editors) 43-79. Praeger, Nueva York.
111 2014
Rodman J.E., Soltis P.S., Soltis D.E., Sytsma K.J. y Karol K.G., 1998. Parallel evolution of glucosinolate biosynthesis inferred from congruent nuclear and plastid gene phytogenies. Am. J. Bot. 85: 997-1006.
Rodríguez de Vera B.C., Navarro García E., Jiménez Díaz J.F., Navarro García R., 2007. Efectos farmacológicos y cicatrizantes de extracto de Rumex lunaria L. Canarias Médica y quirúrgica, Vol.5- No.13
Rojas Montoya W., 2004. Inmunología. 13ª Edición, Edit. Corporación para investigaciones biológicas, Medellín Colombia, p. 79-80.
Russo S., Yaber Grass M. y Leicach S.R., 2011. Efectos de extractos de Chenopodium album L. sobre los estados larval y adulto de Oryzaephilus surinamensis L. (Coleoptera: Silvanidae). IDESA (Chile), Vol. 29, No. 1. Páginas 51-57.
Rzedowski, G.C. de y J. Rzedowski, 2001. Flora fanerogámica del Valle de México. 2ª ed. Instituto de Ecología y Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad. Pátzcuaro, Michoacán, México.
Rzedowski, G.C. de, J. Rzedowski y colaboradores, 2005. Flora fanerogámica del Valle de México. Instituto de Ecología, A. C. y Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad. Pátzcuaro, Michoacán. (Edición digital: INECOL 2010) p: 121, 946
Saleem M., Ahmed B., Imran Qadir M., Mahrukh, Rafiq M., Ahmad M. y Ahmad B., 2014. Hepatoprotective effect of Chenopodium murale in mice. Bangladesh J Pharmacol; 9: 124-128.
Sanabria A. y Mantillas J.R., 1986. Actividad antifúngica de plantas superiores colombianas. Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Farmacia. RCCQF-No. 15: 17-21.
112 2014
Sánchez-Michel y González- Gálvez G., 1997. Tipos intermedios de diabetes. En Tratamiento de Diabetología de Gómez-Pérez y Rull-Rodrigo J. A. Instituto Nacional de la Nutrición (México). Pp. 287-297.
Sikarwar I., Wanjari M., Singh Baghel S. y Vashishtha P., 2013. A Review On Phytopharmacological Studies On Chenopodium album Linn. Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 3(4).
Spanos G.A. and Wrolstad R.A., 1990. Influence of processing and storage on the phenolic composition of Thompson seedless grape juice. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 38, 1565-1571Sun Y., Fang N., Chen D. y Donhor K., 2008. Determination of potentially anti-carcinogenic flavonoids in wines by micelar electrokinetic chromatography. Food Chemistry (106):415-420.
Taiz L. y Zeiger E., 2006. Fisiología vegetal. 3a ed. Publicaciones de la Universitat Jaume I, D.L. Castelló de la Plana, p. 533-534.
Téllez Flores M.L., 2006. Determinación de las propiedades antioxidantes de seis vegetales comestibles autóctonos del departamento de Alta Verapaz. Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Guatemala.
Torres- Martínez R., Fulgencio-Negrete R., Hernández-García A., García- Rodríguez Y., Ramírez-Chávez E., López-Gómez R., Martínez-Pacheco M.M., Bello-González M.A., Molina-Torres J. y Salgado-Garciglia R., 2013. Efectos de la etapa fenológica sobre los compuestos volátiles de plantas silvestres de Satureja macrostema (BENTH.) BRIQ. SILAE XXII, Fitoquímica posters, p. 127-128.
Tundis R., Menichini F., Loizzo M.R., Bonesi M., Solimene U. & Menichini F., 2012. Studies on the potential antioxidant properties of Senecio stabianus Lacaita (Asteraceae) and its inhibitory activity against carbohydrate-hydrolysing enzymes, Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, 26:5, 393-404
113 2014
Valencia Ortiz C., 1995. Fundamentos de fitoquímica. 1ª ed. Edit. Trillas, México D.F.
Vásquez Procopio J., 2012. Evaluación de la actividad farmacológica de metabolitos secundarios de plantas medicinales. Instituto Tecnológico de Tuxtepec, México.
Vega Montalvo R. y Lagarto Parra A., 1999. Evaluación del efecto antiinflamatorio del extracto de Piper auritumm H.B.K. y toxicidad aguda oral. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Departamento de Investigaciones biológicas. Revista Cubana de Plantas Medicinales, Vol.4, núm. 1, Ciudad de la Habana.
Velho G. y Froguel P., 1997. Genetic determination of non-insulin-dependent diabetes mellitus: strategies and recent results. Diabetes Metabolic 23, pp. 7-17.
Villaseñor R., J.L. y Espinosa G., F.J., 1998. Catálogo de malezas de México. Universidad Nacional Autónoma de México. Consejo Nacional Consultivo Fitosanitario. Fondo de Cultura Económica. México, D.F.
Waizel Bucay J., 2011. La medicina por medio de las plantas. Su recorrido a través de las culturas y la historia. 1ª ed. Dirección de publicaciones del Instituto Politécnico Nacional, México, 100-101.
Waizel-Bucay J y Martínez Rico I.M., 2011. Algunas plantas usadas en México en padecimientos periodontales. Revista ADM/ Vol. LXVIII. No. 2, p.p.73-88.
Williams C.A. y Grayer R.J., 2004. “Anthocyanins and other flavonoids”. Nat. Prod. Rep. 21: 539-573.
Wink M., 2003. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective. Phytochemistry 64, 3-19.
114 2014
Moffatt C., Vowden P. y Soldevilla Ágreda J., 2008. Documento de Posicionamiento: Heridas de difícil cicatrización: un enfoque integral. European Wound Management, Londres: MEP Ltd.
Young J.M., de Young L.M., Kheifets J.B. y Ballaron S.J., 1989. Edema and cell infiltration in the phorbol ester-treated mouse ear are temporally separated and can be differentially modulated by pharmacologic agents. Agents Actions 26:335-41.
11.1 Referencias electrónicas
Valls M.J., 2008. Agentes Antimicrobianos. Disponible en: http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/AGENTES-ANTIMICROBIANOS.pdf
Apéndice 11. Disponible en: http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lqf/barranco_l_sl/apendiceA.pdf
Zabala Canedo C., 2011. Farmacología de los antimicrobianos. Farmacología básica y clínica. Disponible en: http://www.umss.edu.bo/epubs/etexts/downloads/30.pdf
Fernández Urquiza F. y Torres Fuentes M., 2004. Inflamación y planta medicinales. Disponible en: http://www.paho.org/cub/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid =896&Itemid=226
Ramírez Murillo E. J., 2011. Variabilidad química de extractos y fracciones obtenidos de tres especies de la tribu Senecioneae: Gunoxys hirsute, Pentacalia ledifolia, Senecio pampae. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, disponible en: http://hdl.handle.net/10554/1563
115 2014
12. ANEXOS
ANEXO 1. Caracterización de las plantas estudiadas.
(a) Barkleyanthus salicifolius
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FAMILIA: COMPOSITAE.
TRIBU: Senecioneae
NOMBRE CIENTÍFICO: Senecio salignus DC. (Barkleyanthus salicifolius (H.B.K.) Rob &
Brettell.)
N.V.: Jarilla
LOCALIDAD: Mercado de Sonora
REFERENCIA: Sureste del Centro Histórico, Cd. de México
DIRECCIÓN: Fray Servando Teresa de Mier 419, Col. Merced Balbuena,
DELEGACIÓN: Venustiano Carranza
EDO.: Distrito Federal.
COORDENADAS: 19´´26´40´´N, 99´´07´21.8´´W 2254 msnm
FECHA: Febrero 2011
COLECTOR: Aasith Arellano Castro
#COLECTA: 2
DET.: Abigail A. Santiago Sánchez
OBSERVACIONES: inflorescencias particulares, flores de tipo compuesta de color amarillo brillante, hojas verdes lanceoladas.
Usos Medicinales: Remedio contra fiebres intermitentes, reumatismo y antimicótico.
117 2014
b) Chemopodium murale L.
118 2014
FAMILIA: Chenopodiaceae.
NOMBRE CIENTÍFICO: Chenopodium murale L
N.V.: “Hediondilla”, “pie de Ganso”
LOCALIDAD: Mercado de Sonora; mercado de plantas
REFERENCIA: Sureste del Centro Histórico, Cd. de México
DIRECCIÓN: Fray Servando Teresa de Mier 419, Col. Merced Balbuena,
DELEGACIÓN: Venustiano Carranza
EDO.: Distrito Federal.
COORDENADAS: 19´´26´40´´N, 99´´07´21.8´´W 2254 msnm
FECHA: Febrero 2011
COLECTOR: Aasith Arellano Castro
#COLECTA: 1
DET.: Abigail A. Santiago Sánchez
OBSERVACIONES: inflorescencias pequeñas de color morado, frutos globulosos y carnosos.
Usos Medicinales: Antiinflamatorio y cicatrizante.
119 2014
ANEXO 2. Cálculos
A. Cálculos para la cuantificación de fenoles totales
De la ecuación obtenida de la regresión lineal de la curva tipo de ácido gálico (ecuación 4); despejamos la concentración para poder determinar la concentración equivalente en las muestras (ecuación 5) y ésta se multiplica por el factor de dilución utilizado. y = 57.188x + 0.0107…………. (4)
Donde: y= Absorbancia x= Concentración de ácido gálico a la absorbancia obtenida [mg/ml]
Despeje:
y − 0.0107 x = C = * dilución ……………… (5) ácido _ gálico 57.188
Posteriormente se utiliza la ecuación 6 para determinar los mg equivalentes de ácido gálico por 1 g de muestra:
V C = C * ……………… (6) fenoles ácido _ gálico W
Donde:
Cácido_gálico = Concentración de ácido gálico a la absorbancia obtenida [mg/ml]; V = Volumen del extracto obtenido [ml], W = Peso de las hojas utilizadas para el extracto [g];
Cfenoles =Concentración de fenoles totales [mg eq. de ácido gálico/1 g de muestra]
120 2014
B. Cálculos para la cuantificación de flavonoides totales
De la ecuación obtenida de la regresión lineal de la curva patrón de Rutina (ecuación 7); despejamos la concentración para poder determinar la concentración equivalente en las muestras (ecuación 8) y ésta se multiplica por el factor de dilución utilizado. y = 0.0042x - 0.0038…………….. (7)
Donde: y= Absorbancia x= Concentración de Rutina [µg/ml]
Despeje:
y + 0.0038 x = C = * dilución ……………… (8) Rutina 0.0042
Posteriormente se utiliza la ecuación 9 para determinar los µg equivales de Rutina por 1 g de muestra:
V C = C * ……………… (9) flavonoides Rutina W
Donde:
CRutina = Concentración de rutina a la absorbancia obtenida [µg/ml] V = Volumen del extracto obtenido [ml] W = Peso de las hojas utilizadas para el extracto [g]
Cflavonoides = Concentración de flavonoides totales [µg eq. de Rutina/1 g de muestra]
121 2014
C. Cálculos para la cuantificación de esteroides
De la ecuación obtenida de la regresión lineal de la curva tipo de colesterol (ecuación 10); despejamos la concentración para poder determinar la concentración equivalente en las muestras (ecuación 11) y ésta se multiplica por el factor de dilución utilizado. y = 1.35x + 0.007…………. (10)
Donde: y= Absorbancia x= Concentración de colesterol a la absorbancia obtenida [mg/ml]
Despeje:
y + 0.0032 x = C = * dilución ……………… (11) colesterol 0.0422
Posteriormente se utiliza la ecuación 12 para determinar los mg equivalentes de colesterol por 1 g de muestra:
V C = C * ……………… (12) esteriodes colesterol W
Donde:
Ccolesterol = Concentración de colesterol a la absorbancia obtenida [mg/ml]; V = Volumen del extracto obtenido [ml], W = Peso de las hojas utilizadas para el extracto [g];
Cesteriodes =Concentración de esteroides [mg eq. de colesterol/1 g de muestra]
122 2014
D. Cálculos para la cuantificación de taninos
De la ecuación obtenida de la regresión lineal de la curva estándar de ácido tánico (ecuación 13); despejamos la concentración para poder determinar la concentración equivalente en las muestras (ecuación 14) y ésta se multiplica por el factor de dilución utilizado.
y = 0.0422x + 0.0032…………. (13)
Donde: y= Absorbancia x= Concentración de ácido tánico a la absorbancia obtenida [µg/ml]
Despeje:
y + 0.0032 x = C = * dilución ……………… (14) ácido _ tánico 0.0422
Posteriormente se utiliza la ecuación 15 para determinar los µg equivalentes de ácido tánico por 1 g de muestra:
V C = C * ……………… (15) tan inos ácido _ tánico W
Donde:
Cácido_tánico = Concentración de ácido tánico a la absorbancia obtenida [µg/ml]; V = Volumen del extracto obtenido [ml], W = Peso de las hojas utilizadas para el extracto [g];
Ctaninos =Concentración de taninos [µg eq. de ácido tánico/1 g de muestra]
123 2014
E. Cálculos para la determinación de la capacidad antioxidante con el radical ABTS
Primero se calcula el % inhibición de cada muestra utilizando la ecuación (16):
(Absorbancia del Radical − Absorbancia de la muestra) %inhibición = *100 Absorbancia del Radical …… (16)
Para la determinación de la concentración equivalente de Trolox (TEAC), simplemente se despejo la concentración de Trolox de la ecuación de la regresión lineal de la curva tipo de Trolox (ecuaciones 17 y 18); y se sustituyo con las absorbancias obtenidas para cada muestra multiplicándose por el factor de dilución utilizado. y = 67.896x + 9.6459…………….. (17)
Despeje:
y − 9.6459 x = TEAC = * dilución ……………… (18) 67.896 Donde: y = %inhibición x = TEAC = Concentración de Trolox [mM];
124 2014
ANEXO 3. Preparación de reactivos y soluciones.
Buffer PBS: pesar 27 g de cloruro de sodio, 1.15 g de fosfato de sodio, 0.2 g de cloruro de potasio y 0.2 g de fosfato de potasio, disolver con agua destilada, ajustar el pH a 7.2 y aforar a 1 L. Adicionar 10.8 mL de formaldehido por cada 100 mL de buffer.
Reactivo de Baljet: solución A: pesar 1g de ácido pícrico disolver con etanol y aforar a 100 mL. Solución B: pesar 10 g de hidróxido de sodio aforar a 100 ml con agua destilada (Apéndice 11).
Reactivo de Benedict: pesar 8.65 g de citrato de sodio y 5 g de carbonato de sodio anhidro, disolver en 30 mL de agua destilada, añadir lentamente y agitando
0.865 g de CuSO4 disueltos en 7.5 mL de agua destilada, aforar a 50 mL.
Reactivo de Dragendorff: en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, disolver 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado con 20 mL de ácido nítrico (cuya densidad sea 1.18 g/ml, o sea al 30%). En otro matraz colocar 27.2 g de yoduro de potasio con 50 ml de agua destilada. Mezclar las dos soluciones y dejar en reposo durante 24 horas. Decantar la solución (para separar residuos de cristales de nitrato de potasio) y aforar a 100 mL con agua destilada. Se puede recoger el precipitado marrón naranja una vez agregado el reactivo al extracto y liberar los alcaloides con solución de carbonato de sodio. Extraer con éter etílico (Apéndice 11).
Reactivo de Erlich: mezclar 15 mL de ácido clorhídrico concentrado, 25 mL de agua destilada, 25 mL de etanol al 95% y 1 g de para-dimetilaminobenzaldehido.
Reactivo de Gelatina: pesar 0.5 g de grenetina pura, disolver con agua destilada y aforar a 50 mL.
125 2014
Reactivo de Grignard: pesar 0.5 g de carbonato de sodio y 50 mg de ácido pícrico, disolver en agua destilada y llevar hasta 50 mL.
Reactivo de Lieberman: mezclar 10 ml de anhídrido acético con 10 mL de cloroformo y agregar 10 gotas de ácido sulfúrico. El reactivo es estable durante un día.
Reactivo de Mayer: pesar 0.1355 g de cloruro de mercurio y 2.5 g de yoduro de potasio, disolver en agua y aforar a 50 mL.
Reactivo de Sonneschain: a una solución saturada de de fosfato disódico a 40°C añadir lentamente a una solución saturada se molibdato de amonio en agua, se forma un precipitado. Lavar con agua destilada y pasar a un vaso, agregar una solución concentrada de carbonato de calcio (puede ser al 40%).
Soluciones de Fehling: solución A: pesar 3.5 g de CuSO4•5H2O, aforar a 50 mL con agua destilada. Solución B: pesar 17.5 g de tartrato de sodio y potasio y 5 g de NaOH, aforar a 50 mL con agua destilada.
Solución amortiguadora de boratos 40 mM: pesar 0.247 g de ácido bórico, disolver en agua destilada y ajustar el pH a 9, aforar a 100 mL. A parte pesar 0.2884 g de SDS y disolver en 25 mL de agua destilada. Posteriormente mezclar ambas soluciones.
126 2014
ANEXO 4. Preparación de laminillas para histología.
Lavar las laminillas con esponja y jabón neutro.
Reposar 30 minutos en agua corriente.
Enjuagar con aguas destilada 2 veces durante 10 minutos.
Sumergir en alcohol absoluto o acetona pura 10 minutos dos veces.
Secar al aire.
Sumergir en silano 2% en acetona por 10 minutos.
Secar a 42°C por una noche.
127