Posttranslationale Modifikationen und Interaktionspartner der Heterochromatin Protein 1-Homologe HcpA und HcpB in Dictyostelium discoideum
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
im Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften der Universität Kassel
Vorgelegt von
Christian Joppich
Kassel im Juli 2015
Datum der Disputation: 18.12.2015
1. Zitat(e)
„Quo nos fata trabunt retrahunque sequamur“
Vergil
„Wenn Du einen Bock geschossen hast, sei froh, denn den daraus kannst Du etwas lernen“
Michael Frese
„The two most important days in your life are the day you are born and the day you find out why“
Mark Twain
1 2. Inhaltsverzeichnis
2. Inhaltsverzeichnis
1. Zitat(e) 1 2. Inhaltsverzeichnis 2 3. Zusammenfassung 7 4. Summary 9 5. Abkürzungsverzeichnis 10 6. Einleitung 14 6.1 Dictyostelium discoideum als Versuchsorganismus 14 6.2 Heterochromatin und Euchromatin als Chromatinstrukturen 16 6.3 Bestandteile von Heterochromatin 18 6.4 Epigenetik 19 6.5 Dictyostelium discoideum in der epigenetischen Forschung 21 6.6 Posttranslationale Modifikationen und der epigenetische Code 21 6.7 An der Bildung von Heterochromatin beteiligte Komponenten 26 6.8 Heterochromatin Protein 1 27 6.9 Su(Var)3-9 39 6.10 Chromatin Assembly Factor 1 41 6.11 Zielsetzung 44 7. Materialien 48 7.1 Geräte 48 7.2 Verbrauchsmaterialien 51 7.3 Chemikalien und Reagenzien 52 7.4 Affinitätsmatrices für Immunpräzipitationen 55 7.5 Kits 55 7.6 Enzyme und Puffer 55 7.7 Längen- und Größenstandards 56 7.8 Antikörper 56 7.8.1 Monoklonale Primär-Antikörper 56 7.8.2 Polyklonale Primär-Antikörper 57 7.8.3 Sekundärantikörper 57 7.9 Antibiotika 57
2 2. Inhaltsverzeichnis
7.10 Kultivierungsmedien 58 7.10.1 Medien für E. coli 58 7.10.2 Medien für D. discoideum 58 7.11 Nukleotide 59 7.12 Oligonukleotide 60 7.12.1 Oligonukleotide anderer Arbeiten 60 7.12.2 Oligonukleotide dieser Arbeit 62 7.13 Plasmide 67 7.13.1 Plasmide anderer Arbeiten 67 7.13.2 Plasmide dieser Arbeit 68 7.14 Biologische Stämme 83 7.14.1 Bakterien-Stämme 83 7.14.2 D. discoideum-Stämme 83 7.14.2.1 Stämme aus vorherigen Arbeiten 83 7.14.2.2 Generierte Stämme der vorliegenden Arbeit 84 7.15 Puffer und Lösungen 86 7.16 Sequenzen 94 7.17 Programme und Datenbanken 95 7.17.1 Installations-Programme 95 7.17.2 Online-Programme 96 7.12.3 Datenbanken 96 8. Methoden 97 8.1 Zellbiologische Methoden 97 8.1.1 Anzucht von E. coli Zellen 97 8.1.2 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen 97 8.1.3 Transformation von E. coli Zellen 98 8.1.4 Herstellung von Klebsiella aerogenes Platten (KA-Platten) 98 8.1.5 Kultivierung von Dictyostelium discoideum Zellen 98 8.1.6 Transformation von Dictyostelium discoideum Zellen 99 8.1.7 Subklonierung von Dictyostelium discoideum Zellen 99 8.1.8 Herstellung von Sporen-Suspensionen 100 8.1.9 Wachstumsassay 100
3 2. Inhaltsverzeichnis
8.1.10 Mikroskopie Pikrinsäure-PFA-fixierter Zellen 100 8.1.11 Mikroskopie PFA-fixierter Zellen ohne Antikörperfärbung 102 8.1.12 Mikroskopie lebender Zellen 102 8.2 Molekularbiologische Methoden 103 8.2.1 Isolation genomischer DNA aus Dictyostelium discoideum 103 8.2.2 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli (Plasmid-Mini-Präparation) 104 8.2.3 Isolation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli (Plasmid-Maxi-Präparation) 104 8.2.4 Isolation von Plasmid-DNA aus Dictyostelium discoideum 105 8.2.5 Isolation von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum 105 8.2.6 Phenol-Chloroform-Extraktion 105 8.2.7 Fällung von Nukleinsäuren 106 8.2.8 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA 106 8.2.9 Gelelution von DNA-Fragmenten 107 8.2.10 Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA auf GTC-Gelen 107 8.2.11 Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren 108 8.2.12 Sequenzierung von DNA-Abschnitten 108 8.2.13 Schneiden von DNA-Sequenzen (Restriktionsverdau) 108 8.2.14 Dephosphorylierung von Vektor-DNA 109 8.2.15 Erzeugen von A-Überhängen an blunt-end-DNA (A-tailing) 110 8.2.16 Auffüllen von 5´- und 3´-Überhängen (Fill-in) 110 8.2.17 Ligation von DNA-Fragmenten 111 8.2.18 PCR (Polymerase Kettenreaktion), Gradienten-PCR und Colony-PCR 112 8.2.19 PCR-vermittelte Punkt-Mutagenese von DNA-Fragmenten 113 8.2.20 Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) 114 8.2.21 Quantitative PCR (Real Time PCR, qPCR) 115 8.2.22 Southern Blot 116 8.3 Biochemische Methoden 119 8.3.1 Herstellung von Proteinproben 119 8.3.2 Expression rekombinanter Proteine 120 8.3.3 Time Course 120 8.3.4 Löslichkeitstest 121 8.3.5 Fällung von Proteinen 122
4 2. Inhaltsverzeichnis
8.3.6 SDS-PAGE 123 8.3.7 Färbung von SDS-Gelen 124 8.3.8 Western Blot 124 8.3.9 Immunologischer Nachweis von Proteinen 125 8.3.10 Immunpräzipitation von Proteinen mittels GFP-Pulldown 126 8.3.11 Immunpräzipitation von Proteinen mittels His-Pulldown 128 8.3.12 Immunpräzipitation von Proteinen mittels GST-Pulldown 130 8.3.13 Co-Immunpräzipitation mittels GFP-Nanotrap 131 8.3.14 Co-Immunpräzipitation mittels Tandem Affinity Purification (TAP) 132 8.3.15 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) 133 8.3.16 Massenspektrometrische Analyse von Proteinen 135 9. Ergebnisse 136 9.1 Posttranslationale Modifikationen der HP1-Homologe HcpA und HcpB 136 9.2 Analyse der Modifikationen HcpA K203ac und HcpB K222ac 150 9.2.1 Generierung von Klonen für ein Gal4-UAS-GFP-Reportersystem 150 9.2.2 Expressionskontrolle der generierten Hcp-Gal4-DBD-Klone 152 9.2.3 Einfluss der generierten Klone im Gal4-UAS-GFP-Reportersystem 154 9.3 Interaktionspartner von HcpA und HcpB 157 9.3.1 Analyse der massenspektrometrischen Daten 157 9.3.2 Bioinformatischer Ansatz zur Identifikation potentieller Interaktionspartner 160 9.3.3 Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1) 163 9.3.4 Interaktion von SuvA mit dem HP1-Homolog HcpB 167 9.4 Heterologe Expression von humanem HP1α in Dictyostelium discoideum 168 9.4.1 Heterologe Expression von hHP1α in HP1-Einzelknockout-Stämmen 168 9.4.2 Phänotypisierung von hHP1α-exprimierenden Zellen im Einzel-KO 174 9.4.3 Generierung von hHP1α-Doppelknockout Zelllinien 176 9.4.4 Einfluss von Gal4-DBD-hHP1α im Gal4-UAS-GFP-Reportersystem 177 9.5 Etablierung eines induzierbaren Expressionssystems 178 10. Diskussion 182 10.1 Posttranslationale Modifikationen der HP1-Homologe HcpA und HcpB 182 10.2 Analyse der Modifikationen HcpA K203Ac und HcpB K222Ac 192 10.3 Interaktionspartner von HcpA und HcpB 195
5 2. Inhaltsverzeichnis
10.4 Heterologe Expression von humanem HP1α in Dictyostelium discoideum 199 10.5 Etablierung eines induzierbaren Expressionssystems 201 11. Literaturverzeichnis 204 12. Danksagung 233 13. Erklärung 235 14. Anhang (beiliegender Datenträger) 236 14.1 Plasmidkarten 236 14.1.1 Plasmidkarten anderer Arbeiten 236 14.1.2 Plasmidkarten dieser Arbeit 243 14.2 Posttranslationale Modifikationen in HcpA und HcpB 264 14.2.1 Spektren der posttranslationalen Modifikationen in HcpA 264 14.2.2 Spektren der posttranslationalen Modifikationen in HcpB 288 14.2.3 Massen und statistische Werte zu HcpA 308 14.2.4 Massen und statistische Werte zu HcpB 311 14.2.5 Ascore und Lokalisationswahrscheinlichkeit 314 14.3 Potentielle Interaktionspartner von HcpA und HcpB 315 14.3.1 Massenspektrometrisch detektierte Proteine 315 14.3.2 Strukturmerkmale der putativen CAF1-Untereinheiten 338
6 3. Zusammenfassung
3. Zusammenfassung
Die Epigenetik repräsentiert einen Teilbereich der Genetik, der sich mit Regulationsmechanismen befasst, welche Einfluss auf die Genexpression nehmen und dabei nicht auf Veränderungen in der DNA-Sequenz beruhen. Ein verbreiteter Mechanismus beruht auf der Kontrolle des Kondensationsgrades der DNA durch posttranslationale Modifikationen, die mit der DNA selber, aber auch mit Proteinen assoziiert sein können. Die Proteine können ein struktureller Bestandteil des Chromatins oder aber an dessen Etablierung und Aufrechterhaltung beteiligt sein. Heterochromatin Protein 1 (HP1) ist ein Schlüsselprotein bei der Bildung und Aufrechterhaltung heterochromatischer Strukturen. Daneben erfüllt es eine Reihe weiterer Funktionen und interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen. Wie HP1 diese unterschiedlichen Funktionen ausführen kann und die Interaktion mit den verschiedenen Interaktionspartnern kontrolliert wird ist in weiten Teilen unbekannt.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die HP1-Homologe aus Dictyostelium discoideum umfangreich mit posttranslationalen Modifikationen versehen sind. Eine in der als Interaktionsdomäne bezeichneten Chromo-Shadow-Domäne gelegene Acetylierung steht zumindest in HcpB im Zusammenhang mit der Bildung von Heterochromatin. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass HcpB physisch mit der Histonmethyltransferase SuvA interagiert. Der Einfluss der oben genannten Acetylierung auf die Bildung von Heterochromatin könnte dabei sowohl auf der Kontrolle der Homo- bzw. Heterodimerisierung als auch auf der Kontrolle der Interaktion mit SuvA beruhen.
Der hohe Konservierungsgrad von HP1-Proteinen führte darüber hinaus zu der Frage, ob das humane Homolog HP1α den Verlust der endogenen HP1-Homologe in Dictyostelium discoideum kompensieren könnte. Humanes HP1α ist in der Lage im Einzel-Knockout mit heterochromatischen Strukturen zu assoziieren, der Knockout des zweiten Homologes scheint hingegen letal zu sein. Dies legt nahe, dass HP1α nur einen Teil der Funktionen übernehmen kann.
Um potentielle Interaktionspartner von HcpA und HcpB zu bestimmen wurden mit bioinformatischen Methoden drei Proteine aus Dictyostelium als potentielle Komponenten 7 3. Zusammenfassung des Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1) identifiziert. Zwei der Proteine, die potentielle kleine Untereinheit (RbbD) und die potentielle große Untereinheit (DDB_G0287815), lokalisieren im Zellkern. Vorhergehende Experimente aus anderen Arbeiten stützen die Annahme, dass es sich hierbei um Komponenten des Chromatin Assembly Factor 1 handelt.
8 4. Summary
4. Summary
The term epigenetics represents a part of genetics that deals with mechanisms involved in regulation of gene-expression without alteration of the DNA-sequence. A common mechanism is based on controling condensation by posttranslational modifications that effect DNA as well as associated proteins. These proteins can be a part of chromatin or be involved in its establishment and maintenance. Heterochromatin Protein 1 (HP1) is a keyplayer in this process. Furthermore HP1 achieves a wide range of functions and interacts with a large number of proteins. The way HP1 fulfill this functions and interacts with its partners remains largely unknown.
The present work has been shown that the HP1-homologues HcpA and HcpB are extensively decorated with posttranslational modifications. An acetylation located in the section responsible for the interaction with other proteins (the so called Chromo-Shadow-Domain) seems to be linked at least in HcpB with heterochromatin-formation. Furthermore it could be shown that HcpB physical interacts with the histonemethyltransferase SuvA. The effect of the above mentioned acetylation on heterochromatin-formation can be mediated by either effecting homo- respectively heterodimerization properties of HP1-proteins or having an effect on the interaction with SuvA.
High conservation of HP1 leads to the question if human HP1α is able to offset loss of endogenous HP1-homologues in Dictyostelium discoideum. It could be shown that HP1α associates with heterochromatic structures in HP1-single-knockout cells while double- knockout cells seem not to be viable. This suggests that HP1α can only achieve a limited number of functions of the endogenous homologues.
To assign potential interaction-partners of HcpA and HcpB bioinformatical approaches have been used to identify three proteins as putative components of the Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1). Two of them, the potential small subunit (RbbD) and the potential large subunit (DDB_G0287815), are located in the nucleus. Essays from preceded works support the assumption that the identified proteins represent subunits of the CAF1-complex.
9 5. Abkürzungsverzeichnis
5. Abkürzungsverzeichnis
Ac Acetylierung Acal Acetaldehyd ADH Alkoholdehydrogenase AP Alkaline Phosphatase (Alkalische Phosphatase) APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosintriphosphat BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxylphosphat BSA Bovines Serumalbumin BSr Blasticidin-Resistenz bzw. beziehungsweise CAF1 Chromatin Assembly Factor 1 cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat Carb Carbamidomethylierung CBP Cyclic AMP-responsive element binding protein CBX Chromobox-Protein (CBX1-3) cDNA complementary DNA DAPCO 1,4-Diaminobenzidin DAPI 4´-6-Diamidin-2-Phenylindol DEPC Diethylpyrocarbonat DiMe Dimethylierung DMSO Dimethyl Sulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTBP Dimethyl 3,3´-dithiobispropionimidate DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Endkonz Endkonzentration Exp Exposition Fml Formylierung g Gramm Gal4-DBD Gal4-DNA-Bindedomäne
10 5. Abkürzungsverzeichnis
GFP Green Fluorescant Protein GST Glutathion-S-Transferase GTC Guanidiniumthiocyanat h Stunden
H2O Wasser
H2Odd Bidestilliertes Wasser H3K9 Lysin an Position 9 des Histons H3 H3K9me mono-methyliertes Lysin an Position 9 des Histons H3 H3K9me2 di-methyliertes Lysin an Position 9 des Histons H3 H3K9me3 tri-methyliertes Lysin an Position 9 des Histons H3 H3S10ph mono-phosphoryliertes Serin an Position 10 des Histons 3 HAT Histon-Acetyltransferase HDAC Histon-Deacetylase HDMT Histon-Demethylase HMT Histon-Methyltransferase HOAP HP1-ORC-associated Protein HP1 Heterochromatin Protein 1 iPSC inducible pluripotent stemcells IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid J Joule l Liter KA Klebsiella aerogenes KAc Kaliumacetat KCl Kaliumchlorid
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat kV Kilovolt µF Mikrofarad µg Mikrogramm µl Mikroliter MCS Multiple Cloning Site Me Methylierung mg Milligramm
11 5. Abkürzungsverzeichnis
Mg2Cl Magnesiumchlorid min Minuten ml Milliliter
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaAc Natriumacetat NaCl Natriumchlorid NAD+ Nicotinamidadenindinukleotid
NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat NaOH Natriumhydroxyd NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid NiNTA Nickel-Nitrilotriessigsäure NSLC-Zellen Non-Small Lung Cancer Zellen ORC Origin Recognition Complex PCNA Profilerating Cell Nuclear Antigen PEV Position Effect Variegation PFA Paraformaldehyd Ph Phosphorylierung PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PTM(s) Posttranslationale Modifikation(en) qPCR quantitative Realtime PCR Ras Rat Sarcoma Protein Rb Retinoblastoma Protein rcf Relative Centrifuge Forces (Relative Zentrifugationseinheit) RNA Ribonukleinsäure rpm Revolution Per Minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur SAM S-Adenosylmethionin SDS Sodium Dodecyl Sulfat sec Sekunden Su(Var)2-5 Suppressor of Variegation 2-5 (Heterochromatin-Protein 1) Su(Var)3-9 Suppressor of Variegation 3-9 (Histonmethyltransferase) TAP Tandem Affinity Purification
12 5. Abkürzungsverzeichnis
TCA Trichloressigsäure TEMED Tetramethylethylendiamin TriMe Trimethylierung TSLCs Lung Tumor Stem-like Cells UAS Upstream Activating Sequence ÜN über Nacht vgl. vergleiche ZB Zellbiologie (Abteilung für Zellbiologie)
13 6. Einleitung und Zielsetzung
6. Einleitung
6.1 Dictyostelium discoideum als Versuchsorganismus
Der Versuchsorganismus Dictyostelium discoideum gliedert sich systematisch in die Gruppe der Amoebozoa ein. Molekularphylogenetische Analysen von Genen des Pyrimidin- Biosynthese-Stoffwechselweges haben nahe gelegt, dass es sich bei den Amoebozoa um ein Schwestertaxon der Fungi sowie der Metazoa handelt (Nara et al., 2000). Die Abspaltung von Dictyostelium als einzelligem Organismus erfolgte demnach kurz nach der Aufspaltung in die beiden Domänen des Tier- und des Pflanzenreiches (Bapteste et al., 2002; Eichinger et al., 2005). Die Sequenzierung des Genoms wurde 1998 initiiert und erfolgte in den Jahren 2000 bis 2005 (Ogawa et al., 2000; Gloeckner et al., 2002; Sucgang et al., 2003; Eichinger et al., 2005). Die Ergebnisse der Sequenzierung beziehen sich auf den Laborstamm AX4. Bei dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Stamm handelt es sich hingegen um den Laborstamm AX2, welcher wie auch der AX4-Stamm in der Lage ist in axenischem Medium zu wachsen (Watts & Ashworth, 1970). Beide Stämme leiten sich von dem ursprünglichen Laborstamm NC4 (Raper, 1935) ab. Das Genom von Dictyostelium discoideum ist etwa 34MB groß und kodiert für ca. 12.000 bis 13.000 Gene (Eichinger et al., 2005). Es ist auf sechs Chromosomen und ein in ca. 100 Kopien vorliegendes, extrachromosomales Palindrom verteilt, welches insbesondere für rRNA-Gene kodiert (Eichinger et al., 2005). Immerhin 10% des Genoms kodieren für transponierbare Elemente (Glockner et al., 2001). Ein weiteres Merkmal stellt der hohe AT-Gehalt von Dictyostelium discoideum dar. Im kodierenden Bereich liegt er im Exonbereich bei 73%, im Intronbereich hingegen sogar bei 88%, während der intergenische Bereich mit 85% geringfügig darunter liegt (Eichinger et al., 2005). Zudem zeichnet sich Dictyostelium durch drei verschiedene Lebenszyklen aus (siehe Abbildung 6.1; Strassmann & Queller, 2011). Beim vegetativen Zyklus, welcher unter optimalen bis ausreichenden Lebensbedingungen stattfindet, erfolgt die Reproduktion durch mitotische Teilungen. Dictyostelium ernährt sich in der freien Natur durch die phago- und pinozytotische Aufnahme seiner Nährsubstrate. Hierzu zählen in erster Linie Bakterien (Kessin, 2001). Durch die Mutation von Genen war es möglich einen Stamm zu generieren,
14 6. Einleitung und Zielsetzung der unter Laborbedingungen in axenischem Medium wächst, wobei die Generationszeit ca. 8-12 Stunden beträgt. Obwohl sich dieser Zyklus durch eine solitäre Lebensweise der Zellen auszeichnet findet auf molekularer Ebene über den sogenannten Prestarvation Factor ein informativer Austausch mit der Umgebung statt (Clarke et al., 1987; Kessin, 2001). Im sexuellen Zyklus, der während Phosphatmangel bei gleichzeitig ausreichender Zelldichte und Umgebungsfeuchtigkeit auftritt, kommt es zur Fusion von Zellen, die einem von drei unterschiedlichen Paarungstypen zugeordnet werden können. Des Weiteren kommt es zum Austausch von genetischem Material (Bonner, 1967; Kessin, 2001; Bloomfield et al., 2010; Strassmann & Queller, 2011). Besonders hervorzuheben ist der soziale Lebenszyklus, welcher auch als Entwicklungszyklus bezeichnet wird. Er wird ausgelöst, wenn Nahrungsmangel und eine niedrige Feuchtigkeit in der Umgebung ungünstige Lebensbedingungen anzeigen. In diesem Fall kommt es zu einer durch Chemotaxis ausgelö-
Abbildung 6.1 – Lebenszyklus von Dictyostelium discoideum: Unter normalen Umweltbedingungen sind Dictyostelium-Zellen in der Lage sich in einem vegetativen Zyklus mitotisch zu teilen. Des Weiteren können sie in einen sexuellen Zyklus eintreten, der mit einer Rekombination des genetischen Materials einhergeht. Unter Mangelbedingungen und bei zunehmender Trockenheit können die Zellen zudem während des sozialen Zyklus aggregieren und zusammen verschiedene morphologische Stadien durchlaufen, die in der Bildung eines Fruchtkörpers und schließlich in der Entlassung von Sporen unter besseren Umweltbedingungen resultieren. Diese Sporen können dann wieder zu Einzelzellen auskeimen (verändert nach Strassmann & Queller, 2011).
15 6. Einleitung und Zielsetzung sten Aggregation von Zellen, welche dann verschiedene vielzellige Stadien durchlaufen (Kessin, 2001; Alvarez-Curto et al., 2005; Bonner, 2006; Kuzdzal-Fick et al., 2007; Chen et al., 2007). Diese Stadien sind durch Arbeitsteilung und ein hohes Maß an Spezialisierung gekennzeichnet. Zu Beginn des sozialen Zyklus kommt es zur Aggregation von einzelnen Zellen, ausgelöst durch die Ausschüttung von cAMP bei bestehender Nahrungsknappheit (Gross et al., 1976; Gross, 1994; Dormann et al., 2002). Es bildet sich eine Struktur, die als Mound bezeichnet wird (siehe Abbildung 6.1). In dieser Struktur finden auch die ersten Differenzierungsprozesse statt. In der Folge hebt sich das Aggregat im sogenannten Finger- Stadium vom Substrat ab um wenig später in das horizontale Slug-Stadium überzugehen. In diesem nicht obligatorischem Stadium ist es dem Zellverband möglich zu migrieren, um einen Standort mit günstigeren Umweltbedingungen zu erreichen. Ist dies der Fall geht das Aggregat über eine als Mexican hat bezeichnete Struktur zur Bildung eines Fruchtkörpers über, in dem letztlich die terminale Differenzierung der Sporen stattfindet. Die Vorteile von Dictyostelium discoideum als Versuchsorganismus liegen vor allem in seiner leichten Kultivierbarkeit, in der Möglichkeit die während des Entwicklungszyklus gebildeten Sporen leicht isolieren und dauerhaft lagern zu können sowie in der leichten genetischen Manipulierbarkeit der Zellen. Zudem stellt Dictyostelium einen geeigneten Organismus für die Untersuchung zellulärer Prozesse wie z.B. Signaltransduktion dar. Auch verfügt er über eine Vielzahl von Komponenten, die für epigenetische Prozesse wie RNA-Interferenz und Chromatin-Remodeling von Bedeutung sind.
6.2 Heterochromatin und Euchromatin als Chromatinstrukturen
In der eukaryotischen Zelle ist die Desoxyribonukleinsäure (DNA) im Zellkern kompartimentiert und liegt über weite Teile des Zellzyklus kondensiert vor. So lassen sich zytologisch zwei mikroskopisch sichtbare Formen der DNA-Verpackung unterscheiden, die man als Heterochromatin und Euchromatin bezeichnet (Heitz, 1928). Sie unterscheiden sich in ihrem Kondensationsgrad, dem Zeitpunkt ihrer Replikation und ihrer transkriptionellen Aktivität. Während Heterochromatin in der Regel strukturell sehr kompakt gestaltet ist, eine geringe Gendichte aufweist, in der Mitose spät repliziert wird und nur eine geringe transkriptionelle Aktivität besitzt, ist Euchromatin im allgemeinen strukturell aufgelockert,
16 6. Einleitung und Zielsetzung wird früh repliziert und weist eine hohe transkriptionelle Aktivität auf (Heitz, 1928; für eine Übersicht der Charakteristika von Eu- und Heterochromatin siehe Weiler & Wakimoto (1995), Struhl (1999) oder Richards & Elgin (2002)). Zudem sind sowohl Hetero- als auch Euchromatin durch die Anwesenheit bestimmter Proteine gekennzeichnet (James & Elgin, 1986; Reuter et al., 1990; Wreggett et al., 1994). Während die Hypoacetylierung und die Hypermethylierung von Histonen ein weiteres Merkmal von Heterochromatin darstellt korreliert der Methylierungsstatus der DNA nicht zwangsweise mit dem Chromatinzustand. So ist Hypermethylierung in Säugerzellen z.B. bei der Inaktivierung eines X-Chromosoms zu beobachten, während die DNA-Methylierung in Drosophila kontrovers diskutiert wird (Rae & Steele, 1979; Hebbes et al., 1994; Lyko et al., 2000; Litt et al., 2001; Capuano et al., 2014; Übersicht in Henikoff, 2000 und Krauss & Reuter, 2011). Es wird daher angenommen, dass DNA-Hypermethylierung eher der Stabilisierung des Chromatinstatus dient. Durch die bereits erwähnte Kondensation der DNA erreicht diese einen 5- bis 10-fachen Kompaktierungsgrad (Kornberg, 1974). Diese Kompaktierung schließt mehrere Ebenen der Verpackung ein (Abbildung 6.2 (A)). Die kleinste strukturelle Einheit bildet hierbei das Nucleosom (Abbildung 6.2 (B)). Bei einem Nucleosom winden sich 147bp der im Durchmesser 2nm messenden DNA um ein Histon-Oktamer (siehe Abschnitt 6.3) und bilden eine 11nm dicke perlenschnurartige Struktur (Abbildung 6.2 (A)). Durch eine weitere Quervernetzung dieser Nucleosomen entsteht ein im Durchmesser 30nm messender Strang, der durch Aufwindung und Faltung einen Durchmesser von 300nm bzw. 700nm erreicht. Die DNA, die z.B. in der menschlichen Zelle eine Länge von ca. 2m aufweist, liegt somit in einer stark kompaktierten Form vor. Transitionen zwischen Eu- und Heterochromatin werden über sogenannte posttranslationale Modifikationen an den Aminosäuren der an der Bildung von Chromatin beteiligten Proteine oder den Basen der DNA gesteuert, die wiederum durch andere Proteine in einem dynamischen Prozess vermittelt werden (siehe z.B. Lachner, 2001; vgl. Abschnitt 6.6).
17 6. Einleitung und Zielsetzung
A B
Abbildung 6.2 – Ebenen der DNA-Verpackung und Nucleosomenstruktur: (A) Verschiedene Ebenen der Verpackung durch Faltung und das Einfügen von Windungen führen zu einer starken Verdichtung der DNA, ausgehend von der kleinsten Einheit des Heterochromatins, dem Nucleosom. (B) Das Nucleosom als kleinste Einheit des Heterochromatins. Die Abbildung zeigt, wie sich die Doppelhelix der DNA um ein Oktamer aus Histonproteinen wickelt (verändert nach Felsenfeld & Groudine, 2003).
6.3 Bestandteile von Heterochromatin
Wie bereits in Abschnitt 6.2 erwähnt bildet das Nucleosom die kleinste strukturelle Einheit des Heterochromatins. Sie besteht aus DNA und Histonproteinen. Acht dieser Histonproteine formen hierbei ein tonnenförmiges Oktamer, um welches sich die DNA windet. Es handelt sich um jeweils zwei Histone H2A, H2B, H3 und H4, die sich wie in Abbildung 6.3 gezeigt zu einem Oktamer konstituieren. Dabei bilden je zwei H3- und H4- Histone bzw. je zwei H2A- und H2B-Histone vier Dimere. Die beiden H3-H4-Dimere fusionieren zu einem Tetramer (Roark et al., 1974; Kornberg & Thomas, 1974), während sich zwei H2A-H2B-Dimere anschließend separat an dieses Tetramer anlagern (Kelley, 1973) und so die Bildung des Histon-Oktamers finalisieren.
18 6. Einleitung und Zielsetzung
Abbildung 6.3 – Selfassembly von Histonen: Die Abbildung zeigt die Zusammenlagerung der acht einzelnen Histonproteine zu einem Oktamer, wobei zuerst jeweils zwei Dimere der Histone H3-H4 und H2A-H2B entstehen, die sich dann zu einem Tetramer vereinen. Die beiden Tetramere fusionieren letztlich zu einem Oktamer (veränderte, GNU-lizensierte Abbildung von Richard Wheeler, Wikimedia-Datenbank).
Neben den Histonen gibt es noch eine Reihe weiterer Komponenten, die temporär mit Heterochromatin assoziiert sind und für dessen Bildung und Aufrechterhaltung von essentieller Bedeutung sind (siehe Abschnitt 6.7).
6.4 Epigenetik
Der Begriff Epigenetik wurde erstmals im Jahre 1942 als derjenige Bereich der Biologie definiert welcher die Wechselwirkungen untersucht, die zwischen DNA und den aus ihren Genen hervorgehenden Produkten bestehen (Waddington, 1942). Nach neueren, differenzierteren Definitionen fasst der Begriff Epigenetik Veränderungen in der Expression von Genen zusammen, welche nicht auf Veränderungen in der DNA-Sequenz beruhen (Fischle et al., 2003; Egger et al. 2004). Diese Veränderungen beruhen im Wesentlichen auf vererbbaren Modifikationen an der DNA und den an der Verpackung beteiligten Histonen (Transkriptionelles Gen-Silencing, vgl. Abschnitt 6.6), aber auch an anderen Proteinen. Des Weiteren spielt der Vorgang der RNA-Interferenz (RNAi) als epigenetischer Regulationsmechanismus eine wichtige regulatorische Rolle, durch den transkribierte mRNA in der Zelle abgebaut werden kann, indem Fragmente der mRNA unter Beteiligung einer
19 6. Einleitung und Zielsetzung
Reihe von Enzymen mit dieser interagieren (Fire et al., 1998). Ein Mechanismus, den man als Posttranskriptionelles Gen-Silencing (PTGS) bezeichnet. Epigenetische Mechanismen nehmen dabei über den Verpackungsgrad der DNA Einfluss auf die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie und somit auf die Transkription von Genen. Auf der Ebene der DNA stellt die Methylierung von Cytosinen, fast ausschließlich im Bereich von Cytosin-Guanosin-Nukleotidpaaren (CpG-Methylierung), innerhalb der 5´-UTR von Genen einen verbreiteten Mechanismus zur Kontrolle der Genexpression dar (für eine Übersicht siehe Bird, 2002 oder Suzuki et al., 2008). Die oben bereits erwähnten Modifikationen von Histonen treten häufig in Form von Methylierungen und Acetylierungen hauptsächlich an deren freistehenden Enden auf, wobei auch andere Modifikationen wie z.B. Phosphorylierungen, Ubiquitinylierungen, Glycosylierungen oder Sumoylierungen von funktioneller Bedeutung sind (Davie & Murphy, 1990; Liebich et al., 1993; Hebbes et al., 1994; Grunstein, 1997; Sterner & Berger, 2000; Zhang & Rheinberg, 2001; Litt et al., 2001; Nowak & Corces, 2004; Nathan et al., 2003). Das Fehlen oder vermehrte Auftreten epigenetischer Markierungen in der DNA-Sequenz von Genen mit epigenetischer Funktion konnte bereits mit einer großen Zahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Die erste Erkrankung, bei der eine Korrelation mit epigenetischen Mechanismen gezeigt werden konnte, war die Entstehung von Tumoren (Feinberg & Vogelstein, 1983). So konnten onkologische Studien zeigen, dass ihr Auftreten mit einer Veränderung des Methylierungsstatus im Promotorbereich von Onkogenen und der Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen einhergeht (Ng & Bird, 1999; für eine Übersicht siehe Baylin & Herman, 2000 oder Feinberg & Tycko, 2004). Somit korrelieren bestimmte Krebsarten nicht nur wie lange angenommen mit Mutationen in der DNA- Sequenz, sondern auch mit Veränderungen im Epigenom. Aber auch andere Proteine, die an epigenetischen Prozessen beteiligt sind, konnten mit der Tumorgenese in Verbindung gebracht werden. So ist die Expression des humanen Homologs von HP1 (Heterochromatin Protein 1) HP1γ (kodiert durch das Gen cbx3) in NSLC-Zellen (Non-small-Lung-Cancer Zellen) erhöht (Saini et al., 2012, vgl. Abschnitt 6.8). Die genauen Mechanismen sind hier noch nicht bekannt, eine Veränderung im Methylierungsniveau der Promotorregion von cbx3 ist an dieser Stelle nicht auszuschließen. Auch verschiedene neurodegenerative Erkrankungen wie das ATR-X Syndrom (Gibbons & Higgs, 2002), das Angelmans Syndrom (Nicholls et al., 1998), das Prader-Willi Syndrom
20 6. Einleitung und Zielsetzung
(Goldstone, 2004), das Fragile-X Syndrom (Oostra & Willemsen, 2002), oder das Rubinstein- Taybi Syndrom (Ausio et al., 2003) haben eine Disregulation epigenetischer Faktoren zur Ursache. Hier spielen sowohl Veränderungen im Methylierungsstatus der DNA-Sequenzen als auch Mutationen in der DNA-Sequenz selbst eine Rolle. Auch die Stilllegung von Retrotransposons, welche für die Integrität des Genoms von entscheidender Bedeutung ist, steht mit den Mechanismen der DNA-Methylierung und der RNA-Interferenz in einem engen Zusammenhang (Hall et al., 2003; Kaller2 et al., 2006).
6.5 Dictyostelium discoideum in der epigenetischen Forschung
Die Tatsache, dass in Dictyostelium discoideum bereits eine Reihe von Faktoren identifiziert wurden, die einen Einfluss auf epigenetische Prozesse nehmen, machen ihn zu einem geeigneten Organismus für derartige Studien und die Suche nach weiteren epigenetischen Komponenten und deren funktionelles Zusammenspiel. Zu diesen Komponenten gehören unter anderem die HP1-Homologe HcpA, HcpB und HcpC (Kaller, 2006; Kaller1 et al., 2006; Kaller et al., 2007), das Dictyostelium discoideum Homolog SuvA der Histon H3K9- Methyltransferase Su(var)3-9 (Essid, 2004; Dubin, 2010), die H3K4-Methyltransferase Set1 (Chubb et al., 2006) oder entsprechende Histonvarianten wie das centromerische Histon H3 (CenH3, Dubin et al., 2010). Somit ergibt sich die Möglichkeit die teilweise nur in ihren Grundzügen verstandenen Funktionen dieser Komponenten weiter zu entschlüsseln und auf ihre evolutionäre Konservierung hin zu untersuchen sowie weitere an diesen Prozessen beteiligte Komponenten zu identifizieren. In Verbindung mit den unter 6.1 genannten experimentellen Vorteilen stellt Dictyostelium discoideum somit einen geeigneten Versuchsorganismus für die Bearbeitung epigenetischer Fragestellungen dar.
6.6 Posttranslationale Modifikationen und der Epigenetische Code
Bei posttranslationalen Modifikationen (PTMs) handelt es sich um Moleküle, die reversibel nach der Translation an eine oder mehrere Aminosäuren eines Proteins angefügt werden. Ihre Bedeutung wurde zuerst im Zusammenhang mit ihrem Einfluss auf die enzymatische Aktivität der Protein-Kinase A (Walsh et al., 1968) und der Phosphorylase-Kinase (Fischer &
21 6. Einleitung und Zielsetzung
Krebs, 1955) sowie auf den Prozess der Proteindegradation (Hershko et al., 1980; für eine Übersicht siehe Hershko, 2009) entdeckt. In Abhängigkeit von der an das Protein addierten Modifikation lassen sich verschiedene Arten von PTMs unterschieden. Im Folgenden sollen einige Modifikationen, die für diese Arbeit von Bedeutung sind, genauer erläutert werden. Methylierung: bei der Methylierung handelt es sich um die Übertragung einer Alkylgruppe auf ein Akzeptormolekül (vgl. Abbildung 6.4 (B)). Bereits im Jahre 1964 wurde die Methylierung von Histonen beschrieben (Murray, 1964; Allfrey et al., 1964). Hierbei wird eine Methylgruppe durch eine Histon-Methyltransferase (HMT) von S-Adenosylmethionin (SAM) auf das entsprechende Akzeptormolekül übertragen. Die am häufigsten als Akzeptormolekül fungierenden Aminosäuren sind Lysin und Arginin, aber auch auf die Aminosäuren Phenylalanin, Histidin, Asparagin, Glutamat und Cystein kann die Übertragung einer Methylgruppe erfolgen (Lu1 et al., 2013). Obwohl die Demethylierung von Histonen bereits seit mehr als 30 Jahren bekannt war (Paik & Kim, 1973) erfolgte die Identifikation einer Histon-Demethylase (HDMT) erst 2004 mit dem Amin-Oxidase Homolog LSD1, welches spezifisch H3K4me demethyliert (Shi et al., 2004). Acetylierung: als Acetylierung bezeichnet man den Transfer einer Acetylgruppe von Acetyl- CoA auf ein Akzeptormolekül (vgl. Abbildung 6.4 (B)). Die Entdeckung der Acetylierung von Histonen erfolgte zeitgleich mit der Entdeckung der Histon-Methylierung (Allfrey et al., 1964). Bei Histonen erfolgt die Übertragung durch Histon-Acetyltransferasen (HATs). Das Entfernen der Acetylgruppe erfolgt wiederum durch sogenannte Histon-Deacetylasen (HDACs). Zu den acetylierbaren Aminosäuren gehören Lysin, Alanin, Serin, Methionin (Lu1 et al., 2013). Phosphorylierung: als Phosphorylierung bezeichnet man die reversible Übertragung einer Phosphatgruppe auf eine Aminosäure. Die Übertragung erfolgt in der Regel von einem ATP- Molekül (vgl. Abbildung 6.4 (B)) und wird durch sogenannte Proteinkinasen katalysiert (Burnett & Kennedy, 1954; Krebs & Fischer, 1956), die aufgrund ihrer hohen Spezifizität gegenüber einer bestimmten Aminosäure z.B. als Tyrosin- oder Serin-Kinasen bezeichnet werden. Zu den phosphorylierbaren Aminosäuren gehören in erster Linie Serin, Threonin und Tyrosin, doch sind auch Aminosäuren wie Histidin, Lysin, Arginin, Aspartat und Cystein phosphorylierbar (Guan & Dixon, 1991; Matthews, 1995; Pannifer et al., 1998; Seyda &
22 6. Einleitung und Zielsetzung
Robinson, 2000; Wagner & Vu, 2000; Feng et al., 2008; Fuhrmann et al., 2009; Lu1 et al., 2013). Aber auch andere, nicht so häufig auftretende Modifikationen (vgl. Abbildung 6.4 (A)) wie z.B. Glycosylierungen, Ubiquitinylierungen und Sumoylierungen spielen eine wichtige regulatorische Rolle bei der Funktion von Proteinen (Oikarinen et al., 1976; Gronostajskl et al., 1985; Wilkinson, 1987; Maison et al., 2011). Aufgrund der durchschnittlichen Massenveränderungen, die ein Protein durch eine hinzugefügte posttranslationale Modifikation erfährt, ist es möglich diese massenspektrometrisch zu identifizieren (vgl. Tabelle 6.1).
Tabelle 6.1 – Massenveränderungen ausgewählter PTMs: die nachfolgende Tabelle zeigt die durchschnittliche Massenveränderung, die eine Aminosäure nach Konjugation der entsprechenden Modifikation an die in Klammern aufgeführte Aminosäure bzw. Aminosäuren erfährt.
Modifikation Durchschnittliche Massenveränderung (m/z) Mono-Methylierung (Lys, Ser, Thr, Asn) 14 Oxidation (Lys) 15 Oxidation (Met) 16 Oxidation (Pro) 16 Di-Methylierung (Lys, Arg) 28 Formylierung 28 Acetylierung (Lys, Ser) 42 Tri-Methylierung (Lys) 42 Phosphorylierung (Ser, Thr, Tyr, Asp, Lys) 80
Bei Histonen erfolgt die Erkennung und Interpretation solcher posttranslationaler Modifikationen durch verschiedene Domänen spezifischer Bindeproteine und teilweise mit einer sehr hohen Spezifität sowohl in Bezug auf die zu modifizierende Aminosäure als auch auf die Differenzierung zwischen unterschiedlichen Modifikationen (z.B. Taunton et al., 1996; Lachner et al., 2001; Bannister et al., 2001; Muslin et al., 1996; Yaffe et al., 1997; für eine Übersicht siehe Taverna et al., 2007). Aufgrund der fundamentalen Bedeutung posttranslationaler Modifikationen für die Epigenetik geht man von der Existenz eines Epigenetischen Codes aus (Turner, 2007) der nicht nur die Histone, sondern auch andere Chromatin bindende Proteine betrifft. Dieser 23 6. Einleitung und Zielsetzung fasst alle Formen von Modifikationen zusammen, die einen Einfluss auf die Genregulation ausüben und aufgrund der Existenz der entsprechenden modifizierenden Proteine vererbt werden können.
A
B
Abbildung 6.4 – Posttranslationale Modifikationen und deren enzymatischer Transfer: (A) Ausgewählte posttranslationale Modifikationen und deren Strukturformeln, wie sie für Histonoktamere (Mitte) beschrieben sind. Hierzu gehören die Methylierung von Lysinen und Argininen, die Glykosylierung von Asparaginen, Serinen, Threoninen und Tryptophanen, die Hydroxylierung von Prolinen, die Phosphorylierung von Tyrosinen, Serinen, Threoninen, Histidinen und Asparaginsäure, die Sulfylierung von Tyrosinen sowie die Acetylierung und die Ubiquitynilierung von Lysinen. (B) Übersicht über den Transfer ausgewählter funktioneller Gruppen und den daran beteiligten Donormolekülen und Enzymen. (verändert nach Liu et al., 2011 und Seet et al., 2006).
24 6. Einleitung und Zielsetzung
Hierzu gehören vor allem auch die in Verbindung mit den Histonen erwähnten PTMs, die in hoher Zahl an allen Histonproteinen vertreten sind (vgl. Abbildung 6.5). Diese stehen in einem hochgradig dynamischen Verhältnis zueinander. Ein Beispiel stellen die Methylierungen von H3K4 und H3K9 dar. Während erstere die Acetylierung von H3K9, H3K14, H3K17, H3K23 und H4K8 fördert und somit als euchromatischer Marker betrachtet werden kann, bewirkt die Methylierung von H3K9 eine Blockierung der Acetylierung von H3K14, H3K17, H3K23 und H4K8 (Wang et al., 2001) und wird allgemein als Heterochromatin-Marker bewertet. Da es sich hier also um einen dynamischen und eigenständigen Code handelt, bei dem die Modifikation einer Aminosäure in einem Histon Einfluss auf den Modifikationsstatus einer anderen Aminosäure in demselben oder einem anderen Histon nehmen kann, bezeichnet man diesen auch als Histon-Code (Jenuwein & Allis, 2001; Rice & Allis, 2001). Aber nicht nur die Form der Modifikation ist an dieser Stelle für den Histon-Code von Bedeutung. Auch die quantitative Ausprägung (z.B. Mono-, Di- oder Tri-Ubiquitinylierung sowie die räumliche Anordnung (Davie & Murphy, 1990) der Modifikationen spielen eine Rolle. Ein weiterer Sub-Code, dessen Existenz seit 2006 postuliert wird, ist der HP1-Code (Lomberk2 et al., 2006). Diese Überlegung beruht zum einen auf der Tatsache, dass HP1-Isoformen eine Schlüsselfunktion bei der Etablierung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin ausüben (vgl. Abschnitt 6.8). Zum anderen konnte in Experimenten gezeigt werden, dass HP1-
Abbildung 6.5 – Posttranslationale Modifikationen an Histonproteinen - der Histon-Code: Übersicht der an den Histonen H1, H2A, H2B, H3 und H4 vertretenen posttranslationalen Modifikationen. (verändert nach Cota et al., 2013)
25 6. Einleitung und Zielsetzung
Isoformen verschiedene Modifikationen wie Phosphorylierungen, Acetylierungen und Methylierungen aufweisen. Gleichzeitig erfolgte der exemplarische Nachweis, dass die Phosphorylierung von Serin 85 in HP1γ eine Funktion ausübt (Lomberk2 et al., 2006). Auch einer Reihe von Erkrankungen liegen etablierte Veränderungen im Modifikationsstatus von Proteinen zugrunde. Hierzu gehören zum Beispiel der Verlust von Phosphorylierungen in Bezug auf bestimmte Krebserkrankungen (Radivojac et al., 2008), der Einfluss auf die Bildung von Morbus Huntington (Rubinsztein & Carmichael, 2003) oder dem Schlafphasensyndrom (Toh et al., 2001).
6.7 An der Bildung von Heterochromatin beteiligte Komponenten
Wie in Abschnitt 6.3 beschrieben sind neben den Histonen auch andere Proteinkomponenten für die Bildung von Heterochromatin von Bedeutung. So erfolgt die Übertragung von Methylgruppen auf die DNA durch Proteine, die man als DNA- Methyltransferasen (DNMT) bezeichnet (Bestor et al., 1988; Okano et al., 1998). Ebenso sind bei der Übertragung von Methylgruppen auf die Seitenketten von Histonen bzw. das Entfernen solcher Markierungen spezifische Enzyme beteiligt, die als Histonmethyltransferasen (HMT; Rea et al., 2000) oder Histondemethylasen (HDMT; Shi et al., 2004) bezeichnet werden. Hierzu gehört unter anderem die in Drosophila melanogaster identifizierte Histonmethyltransferase Su(var)3-9, welche in Zusammenarbeit mit dem Heterochromatin Protein 1 (HP1) für die Etablierung heterochromatischer Strukturen von großer Bedeutung ist (vgl. Abschnitte 6.8 und 6.9). Da Histone aber in vielfältiger Weise modifiziert werden (vgl. Abschnitt 6.6) sind in diesem Zusammenhang auch noch andere Proteine von Bedeutung, wie z.B. Histonacetyltransferasen (HAT; Brownell et al., 1996) und Histondeacetylasen (HDAC; Taunton et al., 1996). Ebenfalls relevant für die Bildung von Heterochromatin ist der Chromatin Assembly Factor (CAF1), welcher mit dem Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) assoziiert ist und daher seine Funktion bei der DNA-Replikation im Zuge der DNA-Duplikation oder der DNA-Reparatur erfüllt (Mathews et al., 1984; Übersicht in Wang, 2014). Dem CAF1-Komplex kommt an dieser Stelle in Verbindung mit HP1 eine besondere Rolle bei der Aufrechterhaltung von Methylierungsmustern an der DNA und der de-novo-Methylierung von Histonen zu (Maison & Almouzni, 2004).
26 6. Einleitung und Zielsetzung
Einige der genannten Proteine, die für diese Arbeit von besonderer Bedeutung sind, werden nachfolgend vorgestellt.
6.8 Heterochromatin Protein 1
Das Heterochromatin Protein 1 (HP1) wurde in Drosophila melanogaster im Zuge eines Screenings nach Komponenten identifiziert, welche einen Einfluss im PEV-System (Position- Effect-Variegation System) ausüben (Muller, 1930; Schultz, 1936; James & Elgin, 1986; Eissenberg et al., 1990; Reuter & Spierer, 1992). HP1 wurde zunächst als NHCP-19 (Non- Histone-Chromatin-Protein-19) bezeichnet (Bhattacharya et al., 1981), später aber aufgrund seiner vornehmlichen Lokalisation in heterochromatischen Bereichen von Polytänchromosomen, seines Einflusses auf das PEV-System in Drosophila melanogaster und der Tatsache, dass es einen integralen Bestandteil von Heterochromatin-Komplexen darstellt, in Heterochromatin Protein 1 umbenannt (James & Elgin, 1986; Eissenberg et al., 1990). In Drosophila melanogaster wird HP1 durch das Gen su(var)2-5 kodiert (Eissenberg et al., 1990). In Dictyostelium discoideum existieren drei HP1-Homologe, die durch die Gene hcpA, hcpB und hcpC kodiert werden, wobei für hcpC keine Expression des Gens festgestellt werden konnte (Kaller, 2006; Kaller1 et al., 2006; Kaller et al., 2007). Die evolutionäre Bedeutung von HP1 wird durch seine hohe Konservierung in den unterschiedlichsten Organismen unterstrichen (siehe Tabelle 6.2). Dabei zeigt sich sowohl in Hinblick auf die Namensgebung als auch auf die Zahl der Homologe eine große Diversität. Neben den genannten Organismen wurden HP1-Homologe in einer Vielzahl weiterer Wirbeltiere wie z.B. dem Zebrafisch identifiziert (Blake et al., 2014) und sind vermutlich ubiquitär vorhanden. HP1 gehört zur Familie der Chromo-Domain-Proteine (für eine Übersicht siehe z.B. Kyoko & Zhou, 2011 oder Blus et al., 2011) und besteht aus zwei hochkonservierten Domänen, die durch eine sogenannte Hinge-Region voneinander getrennt sind (siehe Abbildung 6.6; Richards & Elgin, 2002). Über die N-terminale Chromo-Domäne (CD) ist HP1 in der Lage methyliertes H3K9 zu erkennen (Bannister et al., 2001) und an dieses zu binden (Lachner et al., 2001), während die C-terminale Chromo-Shadow-Domäne (CSD; Aasland & Stewart, 1995) die eigentliche Proteininteraktionsdomäne von HP1 repräsentiert (siehe Tabelle 6.3).
27 6. Einleitung und Zielsetzung
Tabelle 6.2 – HP1-Homologe verschiedener Organismen: die nachfolgende Tabelle listet eine Auswahl an HP1-Homologen aus unterschiedlichen Organismen auf. Sowohl die Namensgebung der Proteine als auch die Benennung der Gene weisen eine hohe Vielfalt auf. Referenzen: (1) Sinclair et al., 1983; Smothers & Henikoff, 2001 (2) Friedrich & Soriano, 1991; Singh et al., 1991 (3) Saunders et al., 1993; Ye & Worman, 1996; Furuta et al., 1997 (4) Lorentz et al., 1994; Thon & Verhein-Hansen, 2000; Sadaie et al., 2004 (5) Couteau et al., 2002; Coustham et al., 2006 (6) Larsson et al., 1998 (7) Kaller et al., 2007.
Organismus HP1-Homolog Kodierendes Gen Referenzen Drosophila melanogaster HP1 su(var)205 (1) HP1b hp1b HP1c hcp1c Mus musculus HP1α cbx5 (2) HP1β cbx1 HP1γ cbx3 Homo sapiens HP1α (Cbx5) cbx5 (3) HP1β (Cbx1; Mod1 ;M31) cbx1 HP1γ (Cbx3; Mod2; M32) cbx3 Schizosaccharomyces pombe Swi6 swi6 (4) Chp2 chp2 Caenorhabditis elegans HPL-1 hpl-1 (5) HPL-2 hpl-2 Arabidopsis thaliana LHP1 (TFL2) lhp1 (6) Dictyostelium discoideum HcpA hcpA (7) HcpB hcpB HcpC hcpC
Das Vorkommen dieser beiden Domänen charakterisiert HP1 gegenüber anderen Chromatin- assoziierten Proteinen, die ebenfalls eine Chromo-Domäne besitzen, und definiert sie als eigenständige Proteinfamilie (Lomberk1 et al., 2006). N- und C-terminal wird das Protein durch kurze Aminosäureabschnitte begrenzt. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Mutation eines Tyrosins an Position 24 bzw. eines Valins an Position 26 ein supprimierender Effekt auf den PEV in Drosophila melanogaster induziert und die Bindungsfähigkeit von H3K9me beeinflusst wird (Richards & Elgin, 2002; Jacobs et al., 2001). Die Größe der HP1- Homologe variiert relativ gering um einen Größenbereich von 200 Aminosäuren. Zudem sind einige HP1-Homologe wie z.B. in Dictyostelium discoideum frei von Introns. HP1 übt in der Zelle eine Vielzahl von Funktionen aus. Obwohl HP1 über das gesamte Organismenreich eine hohe Konservierung aufweist überlappen die Funktionen der einzelnen Homologe in den verschiedenen Organismen nach derzeitigem Kenntnisstand nur
28 6. Einleitung und Zielsetzung
Abbildung 6.6 – Struktur von HP1-Proteinen und funktionelle Charakterisierung der Domänen: Die Abbildung beschreibt den charakteristischen Aufbau von HP1-Proteinen mit einer N-terminal gelegenen Chromo-Domäne und einer C-terminal gelegenen Chromo-Shadow-Domäne, die durch eine Hinge-Domäne voneinander getrennt sind. Die Chromo-Shadow-Domäne repräsentiert die eigentliche Proteininteraktions-Domäne und interagiert unter anderem mit der Histon- Methyltransferase Su(var)3-9. Die Chromo-Domäne hingegen bindet exklusiv an methyliertes Lysin-9 des H3-Histons (H3-mLys9) während die Hinge-Domäne die Fähigkeit besitzt an DNA und RNA zu binden. Durch Mutation eines Tyrosins an Position 24 bzw. eines Valins an Position 26 konnte ein supprimierender Effekt auf den PEV in Drosophila melanogaster induziert werden (verändert nach Richards & Elgin, 2002). teilweise. Dies zeigt sich auch in der Vitalität von Knockout-Linien. So sind z.B. Dictyostelium discoideum Zellen weiterhin lebensfähig und zeigen unter Laborbedingungen nur einen schwachen mutanten Phänotyp, wenn lediglich eines der exprimierten Homologe hcpA oder hcpB ausgeschaltet wird (Kaller1 et al., 2006). Der Knockout von HP1 (su(var)2-5) in Drosophila melanogaster hingegen verläuft mit dem Erreichen des 3. Larvalstadiums letal (Eissenberg et al., 1990). Zudem ist bei den humanen Homologen HP1α und HP1β fluoreszenzmikroskopisch nur eine partielle Kolokalisation in heterochromatischen Bereichen, vornehmlich der Centromere, zu beobachten, was das Vorhandensein gemeinsamer Funktionen in bestimmten Bereichen nahelegt (Dialynas et al., 2007). Gleichzeitig ergibt sich daraus aber auch die Annahme, dass beide Homologe distinkte Funktionen innerhalb des Zellkerns erfüllen. Im Vergleich dazu lokalisiert das dritte humane HP1-Homolog HP1γ sowohl in eu- als auch in heterochromatischen Bereichen (Minc et al., 2000) und ist mit der DNA aktiv transkribierter Gene assoziiert (Vakoc et al., 2005). Dennoch ist von allen drei humanen Homologen bekannt, dass sie in der Lage sind über ihre CSD Homo- und Heterodimere zu bilden, was zumindest ein temporäres Zusammenspiel aller drei HP1-Formen nahelegt (Nielsen2 et al., 2001). In Dictyostellium konnte gezeigt werden, dass die beiden Homologe HcpA und HcpB unterschiedliche Affinitäten bezüglich ihrer Fähigkeit zur Dimierisierung haben (Kaller et al., 2007). Eine Übersicht der Funktionen und
29 6. Einleitung und Zielsetzung der damit verbundenen Interaktionspartner von HP1 zeigt Tabelle 6.3., wobei fortlaufend neue Funktionsbereiche und Interaktionspartner bekannt werden.
Tabelle 6.3 – Funktionen und Interaktionspartner von HP1: die nachfolgende Tabelle listet Beispiele für die unterschiedlichen Funktionen und die damit verbundenen bekannten Interaktionspartner von HP1-Proteinen nach Homolog und Organismus auf. Die Bindung der meisten Proteine an HP1 erfolgt durch ein konserviertes Aminosäure-Motiv der Form PxVxL. Die Tabelle fasst Daten aus verschiedenen Publikationen zusammen. Abkürzungen: Sp = Schizosaccharomyces pombe; Dm = Drosophila melanogaster; Mm = Mus musculus; Hs = Homo sapiens; Dd = Dictyostelium discoideum; Ce = Caenorhabditis elegans; N.d. = nicht definiert; CSD = Chromo Shadow Domäne; CD = Chromo Domäne. Hinge = Hinge Region.
Interaktionspartner Spezies/HP1-Homolog Domäne Referenz Heterochromatinbildung, Chromatin-Remodeling und Transkriptionskontrolle Clr4 Sp Swi6 N.d. Bannister et al., 2001 Su(var)3-9 (Dm) Dm HP1 CSD Schotta et al., 2002 Suv39 (Mm/Hs) Mm HP1β, CSD Aagaard et al., 1999 Hs HP1β Czvitkovich et al., 2001 Su(var)3-7 Dm HP1 CSD Cleard et al., 1997; Delattre et al., 2000 G9a Hs HP1α, Hs HP1γ N.d. Chin et al., 2007 SETDB1 Hs HP1 N.d. Ayyanathan et al., 2003 dSETDB1 Dm HP1a N.d. Font-Burgada et al., 2008 EpeI Sp Swi6 N.d. Zofall und Grewal, 2006 Dnmt3a/3b Mm HP1α N.d. Bachmann et al., 2001 ATRx/HP1-BP38 Mm HP1α, Mm HP1β CSD Lechner et al., 2005 Pim-1 Hs HP1γ CSD Koike et al., 2000 CKII Dm HP1 N.d. Zhao und Eissenberg, 1999 dAF10 Dm HP1 CSD Linder et al., 2001 MITR, HDAC4/5 Mm HP1α Hinge Zhang et al., 2002 Hs HP1α Hs HP1β, Hs HP1γ CSD Nielsen2 et al., 2001 Hs HP1β Hs HP1α, Hs HP1γ CSD Nielsen2 et al., 2001 Hs HP1γ Hs HP1α, Hs HP1β CSD Nielsen2 et al., 2001 Dd HcpA Dd HcpB N.d. Kaller1 et al., 2006 Dd HcpB Dd HcpA N.d. Kaller1 et al., 2006 Histon H1 Dm HP1 N.d. Nielsen2 et al., 2001 Histon H3 Dm HP1, Mm HP1α, CD Nielsen2 et al., 2001; Mm HP1β, Mm HP1γ Polioudaki et al., 2001 Histon H4 Dm HP1, Mm HP1α CSD Zhao et al., 2000; Polioudaki et al., 2001 Polycomb Mm HP1α, Mm HP1β CSD Ogawa et al., 2002; Yamamoto et al., 2004 Kap-1/Tif1ß Mm/Hs HP1α CSD Brasher et al., 2000; Ryan et Mm/Hs HP1β al., 1999; Nielsen et al., 1999 Mm/Hs HP1γ Rb Hs HP1γ N.d. Nielsen1 et al., 2001
30 6. Einleitung und Zielsetzung
BRG1 Mm HP1α CSD Nielsen1 et al., 2002 TAF21-30 Hs HP1α, Hs HP1γ CSD Vassalo und Tanese, 2002 HIRA Sp Swi6 N.d. Yamane et al., 2010 Asf1 Sp Swi6 N.d. Yamane et al., 2010 RNA-Polymerase II Dm HP1a, Dm HP1b CD Kwon und Workman 2008; Hs HP1γ N.d. Piacentini et al., 2009; Vakoz et al., 2005 Su(z)12 Hs HP1α, Hs HP1β CSD Yamamoto et al., 2004 Hs HP1γ Tif1α / Τif1β Mm HP1α CSD Nielsen et al., 1999; Le Duarin et al., 1996 SNF2β Mm HP1α CSD Nielsen1 et al., 2002 TAFII130 Hs HP1α HP1β CSD Vassallo und Tenese, 2002 E2F-6 Hs HP1γ N.d. Ogawa et al., 2002 Lin-13 Ce HPL-2 CSD Couteau et al., 2002 Hinge PIMI Hs HP1γ CSD Koike et al., 2000 DDP1, PEP, Hrb87F Dm HP1a N.d. Piacentini et al., 2009 PIWI Dm HP1a CSD Brower-Toland et al., 2007 RNA Mm HP1α, Mm HP1γ Hinge Murchardt et al., 2002 Hip Dm HP1 CSD Schwendemann et al., 2008 DEK Dm HP1 N.d. Kappes et al., 2011 KDM4A Dm HP1a N.d. Lin et al., 2004 Mod/mdg4 Dm HP1 N.d. Branco et al., 2013 DNA-Repair, Replikation, Zell-Zyklus, Centromer-Struktur und Chromosomale Seggregation INCENP Hs HP1α, Hs HP1γ Hinge Hiragami und Festensetin, 2005; Ainsztein et al., 1998 CAF1-P180 Dm HP1a N.d. Houlard et al., 2006; Quivy et al., 2008 CAF1-P150 Mm HP1α, Mm HP1β CSD Brasher et al., 2000; Hs HP1α Lechner et al., 2005 Ku70 Hs HP1α, Hs HP1γ CSD Lomberk1 et al., 2006; Song et al., 2005 BRCA1 Hs HP1α N.d. Maul et al., 1998 ORC1 – ORC6 Dm HP1 CD CSD Pak et al., 1997 Psc3 Sp Swi6 CD Nonaka et al., 2002 Hsk1/CDC7 Sp Swi6 N.d. Bailis et al., 2003 Ki-67 Mm HP1α, Mm HP1β, CSD Scholzen et al., 2002 Mm HP1γ SP100 Hs HP1α, Hs HP1β, CSD Seeler et al., 1998 Hs HP1γ SuUR Dm HP1 CSD Scholzen et al., 2002 Hinge Telomer-Integrität Umbrea (HP6) Dm HP1 CSD Joppich et al., 2008; Greil et al., 2007
31 6. Einleitung und Zielsetzung
HOAP Dm HP1 CSD Badugu et al., 2005; Shareef Hinge et al., 2001 HIP (HP4) Dm HP1 CSD Schwendemann et al., 2008 Organisation des Zellkerns LAP2β Mm HP1β CD Kourmouli et al., 2000 Lamin B Hs HP1α, Hs HP1β, CD CSD Polioudaki et al., 2001; Ye et Hs HP1γ, Mm HP1β al., 1997; Kourmouli et al., 2000 Entwicklung Eyg Dm HP1a N.d. Salvany et al., 2012
Ein prominentes Motiv für die Bindung zwischen HP1 und seinen Interaktionspartnern ist die Aminosäure-Sequenz Prolin-Valin-Leucin, wobei die drei Aminosäuren jeweils durch eine beliebige Aminosäure getrennt sind (PxVxL). Es ist in vielen, jedoch nicht in allen Interaktionspartnern vertreten (Smothers & Henikoff, 2000; Thiru et al., 2004; Lechner et al., 2005). Zu den Proteinen, für die das Vorhandensein eines solchen Motivs beschrieben wurde, gehören unter anderen TIF1α, TIF1β, TAFII130 sowie die große Untereinheit des CAF1-Komplexes CAF1 p150 (LeDouarin et al., 1996; Murzina et al., 1999; Vassallo & Tanese, 2002). Zudem konnte kürzlich festgestellt werden, dass bestimmte Aminosäuren in der CSD und am C-terminalen Ende von HP1 für die Spezifität gegenüber Interaktionspartnern von Bedeutung sind (Mendez et al., 2013). Die wohl bekannteste und am besten untersuchte Funktion von HP1 ist dessen Beteiligung an der Etablierung und Aufrechterhaltung heterochromatischer Strukturen. Wie bereits erwähnt ist hierfür die Fähigkeit von HP1 über seine CD an H3K9me zu binden von grundlegender Bedeutung (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001; Hines et al., 2009). Nach der Bindung an H3K9me ist HP1 in der Lage die Histonmethyltransferase Su(var)3-9 über die CSD zu binden (Aagaard et al., 1999; Bannister et al., 2001; Schotta et al., 2003). Su(var)3-9 kann dadurch das H3K9 eines benachbarten Nucleosoms methylieren und bildet so eine neue Bindestelle für ein weiteres HP1-Molekül (vgl. Abbildung 6.7 (A)). Dieser Mechanismus ermöglicht eine kaskadenartig fortlaufende Ausbreitung der Histonmethylierung und somit auch der Bindung von HP1 an H3K9me. Hierbei ist der Einfluss einer Acetylierung im Bereich der CSD der Homologe HcpA und HcpB auf die Bildung von Heterochromatin diskutiert worden (Földesi, 2010). In Abhängigkeit vom Methylierungsgrad ist zudem eine unterschiedliche Bindungsaffinität von HP1 zu H3K9me zu beobachten (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). So bindet HP1 bevorzugt an di- und
32 6. Einleitung und Zielsetzung trimethyliertes H3K9, wobei die Affinität zu trimethyliertem H3K9 die stärkste Ausprägung aufweist. Beeinflusst wird die Bindung von HP1 an H3K9me zudem über die Phosphorylierung von H3S10 (H3S10ph), welche durch die Aurora B Kinase vermittelt wird (Fischle et al., 2005; Kyoko & Zhou, 2011). In Dictyostelium konnte zudem eine Kolokalisation der Aurora-Kinase mit HP1 werden (Li et al., 2008). Die H3S10-Phosphorylierung bewirkt während der Mitose, dass HP1 nicht an H3K9me binden kann, die Methylierung von H3K9 aber dennoch aufrechterhalten bleibt. Erst kürzlich wurde festgestellt, dass neben der Beteiligung der CD auch die CSD für die Bindung von HP1 an H3K9me von Bedeutung ist (Mishima et al., 2013). Zudem scheint zumindest in Drosophila melanogaster das Histon H1 für die Rekrutierung von Su(var)3-9 wichtig zu sein (Lu2 et al., 2013). Auch die Methylierung des Heterochromatinmarkers H4K20me erfolgt in Abhängigkeit von HP1 (Schotta et al., 2004). Neben der Methylierung von Histonen ist HP1 aber auch an den Prozessen der Histondeacetylierung und der Histondemethylierung, insbesondere von H3K36me, beteiligt (Honda et al., 2012; Crona et al., 2013). Die Fähigkeit von HP1 über die CSD sowohl Homo- als auch Heterodimere zu bilden führt zu einer Stabilisierung der gebildeten Chromatinstruktur (vgl. Abbildung 6.7 (B); Brasher et al., 2000; Kaller, 2006; Kaller1 et al., 2006). Eine weitere Quervernetzung in-vitro durch die Bindung zweier CDs konnte kürzlich beschrieben werden (Canzio et al., 2011). Durch die Interaktion sowohl zweier CSDs als auch zweier CDs können so geschlossene HP1-Dimere gebildet werden, über die eine kompetitive Regulation der Bindung an H3K9me erfolgen könnte (Canzio et al., 2013). Über diese Konformationsänderung könnte aber nicht nur die Regulation der HP1-Bindung an H3K9me erfolgen, sondern auch eine Steuerung der Interaktion von HP1 mit anderen Interaktionspartnern über die CSD. Es wird zudem diskutiert, dass die Dimerisierung für die Bildung einer Bindungstasche von Bedeutung ist, welche für die Erkennung und Bindung von PxVxL-Motiven in der Aminosäuresequenz von HP1-Bindungspartnern notwendig ist (Cowieson et al., 2000; Brasher et al., 2000).
33 6. Einleitung und Zielsetzung
A
B
Abbildung 6.7 – Mechanismus der Bildung und Ausbreitung von Heterochromatin: (A) Der obere Teil der Abbildung zeigt die Bindung von HP1 an methyliertes H3K9 und die Rekrutierung der Histon- Methyltransferase Suv39h über die Chromo-Shadow-Domäne von HP1. Aktives und inaktives Chromatin werden durch sogenannte „Boundary-Elemente“ voneinander getrennt. Der untere Teil beschreibt die Ausbreitung von Heterochromatin. Hierbei wird durch Suv39h ein benachbartes H3K9 methyliert und somit eine neue Bindestelle für weitere HP1-Proteine generiert. (B) Die Stabilisierung von gebildetem Heterochromatin erfolgt durch die Bildung von HP1-Dimeren über die CSD (blau = CSD, rot = CD; verändert nach Felsenfeld & Groudine, 2003 und Vermaak & Malik, 2009).
Bei der oben beschriebenen Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin erfolgt die Bindung von HP1 an Chromatin durch die H3K9-Methylierung. Dieser Vorgang ist vor allem bei der de-novo Synthese von DNA zu beobachten und setzt die randomisierte Integration parentaler, H3K9-methylierter Nulceosomen voraus (Felsenfeld & Groudine, 2003). Dies wirft die Frage auf, wie HP1 an Chromatinstrukturen rekrutiert wird, die keine Methylierung von H3K9 aufweisen. Dies kann durch zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgen. Zum einen ist es mit dem Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1) assoziiert. In diesem Zusammenhang besitzt HP1 die Fähigkeit zur Rekrutierung von Histondeacetylasen, Histonmethyltransferasen und DNA-Methyltransferasen (vgl. Abbildung 6.8 (A); Maison & Almouzni, 2004). Der Gesamtkomplex wiederum ist mit dem Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) im Bereich der Replikationsgabel verknüpft. Durch die enzymatische
34 6. Einleitung und Zielsetzung
Ausstattung dieses Komplexes ist es möglich, H3K9-Methylierungsmarkierungen zu setzen, die anschließend für die Bindung von HP1-Molekülen zur Verfügung stehen. Für die Rekrutierung in Bereichen perizentrischen Heterochromatins hingegen spielen die RNA- Bindungsfähigkeit von HP1 sowie die posttranslationale Modifizierung des Proteins eine Rolle (vgl. Abbildung 6.8 (B); Maison et al., 2011). So kann in humaner Zellkultur sumoyliertes HP1α über seine Hinge-Region an gerade in der Transkription befindliche RNA- Abschnitte retrotransposabler Elemente binden, wie sie im Bereich des perizentromerischen Heterochromatins zu finden sind (Muchardt et al., 2002; Maison et al., 2011; für eine Übersicht zur Bindung von HP1 an RNA siehe Schuldt, 2012). Das so gebundene HP1 kann über die CSD die Methyltransferase Su(var)3-9 rekrutieren und die Methylierung von H3K9 initiieren, womit die Grundlage für die oben genannte Etablierung und Ausweitung heterochromatischer Strukturen gegeben ist. Funktionell ist die Bildung von Heterochromatin für die Stilllegung von Genen in konstitutiv heterochromatischen als auch in euchromatischen Regionen von Bedeutung. Dies dient sowohl der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität als auch der differentiellen Genexpression im Zuge der Entwicklung eines Organismus. Jüngere Studien haben allerdings gezeigt, dass in der Hefe die transkriptionelle Stilllegung von Genen im Bereich von äußerem und inneren pericentromerischen Heterochromatin die Proteine HIRA und Asf1 benötigt, um HP1 für die Heterochromatisierung zu rekrutieren (Yamane et al., 2010). In C. elegans nimmt das HP1-Homolog HPL Einfluss auf die Individualentwicklung, indem es an der Steuerung von Hox-Genen beteiligt ist (Studencka1 et al., 2012; Studencka2 et al., 2012). Auch in Drosophila wurden Einflüsse von HP1 auf die Individualentwicklung beobachtet. So beeinflussen HP1- Su(var)3-9-Komplexe verschiedene Cluster entwicklungsbedingt co-exprimierter Gene (Greil et al., 2003). Auch ist HP1 für die Augen- und Testisentwicklung von Bedeutung (Salvany et al., 2012; Branco et al., 2013). Analysen in Drosophila melanogaster haben gezeigt, dass die Rekrutierung von HP1 für die Stilllegung von Genen in euchromatischen Regionen überraschenderweise nicht unbedingt von H3K9me abhängt (Cowell et al., 2002; Fanti et al., 2003; Figueiredo et al., 2012). Zudem ist HP1 in Drosophila in die positive Regulation der Expression von Genen involviert, die in euchromatischen Bereichen lokalisiert sind (Piacentini et al., 2003; Piacentini et al., 2009). Erst kürzlich wurde zudem entdeckt, dass in Drosophila drei HP1-Isoformen an der differentiellen Regulation verschiedener Gene beteiligt ist (Lee et al., 2013).
35 6. Einleitung und Zielsetzung
A
B
Abbildung 6.8 – de-novo Rekrutierung von HP1-Proteinen: Die Rekrutierung von HP1 an Chromatin in Abwesenheit von methyliertem H3K9 kann auf unterschiedlichem Wege erfolgen. (A) Bei der de- novo Synthese von DNA wird HP1 durch den Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1) rekrutiert, der seinerseits mit dem Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) assoziiert ist. (B) In Bereichen pericentromerischen Heterochromatins, die sich durch die Anwesenheit retrotransposabler Elemente auszeichnen, kann sumoyliertes HP1 an neu synthetisierte RNA binden (verändert nach Maison & Almouzni, 2004 und Maison et al., 2011).
Auch die Reprogrammierung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) geht mit einer intensiven Umstrukturierung von Chromatin einher. Dabei übernehmen HP1γ und die Methylierung von H3K9 eine kritische Funktion (Sridharan et al., 2013). Wie Tabelle 6.3 zu entnehmen ist stellt die Reparatur von DNA-Schäden eine weitere wichtige Funktion von HP1 dar. In menschlichen Zelllinien sind alle HP1-Isoformen an der DNA-Reparatur beteiligt, wobei die Rekrutierung von HP1 in diesem Fall unabhängig von der H3K9-Methylierung erfolgt (Luijsterburg et al., 2009). Ob HP1 dabei eigenständig an Nucleosomen im Bereich der DNA-Schädigung bindet und DNA-Reparatur-Proteine
36 6. Einleitung und Zielsetzung rekrutiert, oder dies erst erfolgt nachdem HP1 seinerseits durch bestimmte Proteine an den entsprechenden Bereich gebunden wurde, ist noch nicht geklärt. In jedem Fall scheint die Phosphorylierung eines Threonins an Position 51 für die Funktion von HP1 bei der DNA- Reparatur von grundlegender Bedeutung zu sein (Ayoub et al., 2008). Bei der Bildung primordialer Keimzellen übt HP1γ einen Zell-Zyklus regulierenden Einfluss aus (Kanae et al., 2011). Eine Erklärung hierfür könnte in der von H3K9me abhängigen Bindung an die Promotor-Region von Cyclin-E liegen (Sherr & Roberts, 1999; Nielsen1 et al., 2001). HP1 könnte somit über die Expression von Cyclin-E Einfluss auf den Fortschritt der Zell-Zyklus Progression nehmen. Auch aus der Hefe ist ein kontrollierender Einfluss von HP1 auf den Zell-Zyklus bekannt, wo das Homolog Swi6 die Expression von Faktoren kontrolliert, welche die G1/S-Zell-Zyklus Transition beeinflussen (Schulze et al., 2009). Ebenfalls aus Saccharomyces pombe ist bekannt, dass Swi6 für die de-novo Etablierung der Centromere essentiell ist (Folco et al., 2008; Durand-Dubieff & Eckwall, 2008). In Dictyostelium discoideum nimmt HP1 Einfluss auf die Verteilung der Chromosomen (Kaller, 2006). Eine weitere Funktion von HP1 liegt im Schutz der Telomere. So ist z.B. die Anwesenheit von HP1 in Drosophila melanogaster für die Rekrutierung der Proteine Umbrea (HP6) und HOAP notwendig (Joppich et al., 2009), um Fusionsereignisse der Telomer-Enden zu verhindern (Cenci et al., 2003; Fanti et al., 1998). Der Umstand, dass in Drosophila sowohl Umbrea als auch das HP1-Homolog HP1b für die Funktion der Centromere von Bedeutung sind (Ross et al., 2013) lässt die Überlegung zu, dass auch in diesem Bereich eine Interaktion von Bedeutung ist. Da wie in Abschnitt 6.4 bereits erwähnt eine große Zahl von Erkrankungen mit epigenetischen Veränderungen in Verbindung gebracht werden konnte liegt nahe, dass HP1 als Schlüsselprotein bei der Bildung von Heterochromatin ebenfalls für die Entstehung solcher Erkrankungen relevant ist. Es konnte bereits gezeigt werden, dass HP1α (CBX5) Einfluss auf die Entstehung von Lungentumoren nimmt, indem es die Stammzell- Eigenschaften von TSLCs (Lung Tumor Stem-like Cells) reguliert (Yu et al., 2012). Außerdem beeinflusst es die Invasion und Metastasierung von Brustkrebs (Kirschmann et al., 2000). Auch von HP1γ (CBX3) ist bekannt, dass es die Entwicklung von Tumoren durch Veränderungen des epigenetischen Status einer Zelle beeinflusst (Han et al., 2014). Eine erhöhte Expression von HP1γ wurde mit der Entstehung von NSLCs (Non-Small Lung Cancer Cells), Osteosarkomen, Liposarkomen, Cervical-Tumoren, Ösophageal-Tumoren, Colon-
37 6. Einleitung und Zielsetzung
Tumoren und Brusttumoren in Verbindung gebracht. HP1γ könnte daher als Tumormarker dienen (Takanashi et al., 2009; Saini et al., 2012; Han et al., 2014). Da HP1 auch in apoptotischem Chromatin aktiv ist könnte hier ebenfalls ein Zusammenhang zur Entstehung von Krankheiten bestehen (Legartova et al., 2013). Aber auch im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen konnte HP1 eine indirekte Bedeutung nachgewiesen werden. Eine Überexpression des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau bewirkt eine Veränderung im Expressionsniveau von HP1 und H3K9me. Tau kann somit indirekt über HP1 Einfluss auf die Chromatinstruktur nehmen (Bess et al., 2014). Die beschriebenen Interaktionen und damit verbundenen Funktionsbereiche zeigen, wie vielfältig HP1 in zelluläre Prozesse involviert ist. Dies wirft die Frage auf welche Regulationsmöglichkeiten bestehen, um differenziert die beschriebenen Funktionen wahrnehmen zu können. Dem in Abschnitt 6.6 genannten HP1 Sub-Code könnte an dieser Stelle eine besondere Bedeutung zukommen. In der Tat wurden für die humanen HP1- Homologe bereits eine Vielzahl von PTMs beschrieben, die in diesem Zusammenhang eine Funktion erfüllen könnten (LeRoy et al., 2009). Auch für das HP1-Homolog HcpB in Dictyostelium discoideum konnte eine Di-Methylierung im Bereich des N-Terminus (K7me2) sowie eine Acetylierung im Bereich der Chromo Shadow-Domäne (K222ac) identifiziert werden (Földesi, 2010). Wie oben bereits erwähnt werden fortlaufend neue Funktionen und Interaktionspartner von HP1 beschrieben. Im Jahr 2011 konnten 15 neue Interaktionspartner identifiziert werden die teils Homolog-spezifisch interagieren (Rosnoblet et al., 2011). Unter anderem wurde die Interaktion der beiden humanen HP1-Homologe HP1β und HP1γ mit ADNP2 nachgewiesen, einem Protein, welches für den Schutz von Nervenzellen von Bedeutung ist (Kushnir et al., 2008). Für HP1α konnte der Nachweis einer Interaktion nicht erbracht werden. Ebenso interagieren die ATP-abhängigen Helikasen CHD3 und CHD4 lediglich mit HP1β und HP1γ. Die Untereinheiten des Importin-α-Komplexes IMA2, IMA3 und IMA4, die für den Transport von Proteinen in den Zellkern mitverantwortlich sind, interagieren hingegen mit allen HP1- Homologen.
38 6. Einleitung und Zielsetzung
6.9 Su(var)3-9
Wie bereits erwähnt ist die Histonmethyltransferase Su(var)3-9 ein weiterer wichtiger Faktor, der an der Bildung von Heterochromatin beteiligt ist. Ebenso wie HP1 ist auch Su(var)3-9 hochkonserviert und in den verschiedensten Organismen beschrieben worden (Ekwall & Ruusala, 1994; Ivanova et al., 1998; Jenuwein et al., 1998; Aagaard et al., 1999 Eissenberg & Elgin, 2000; O´Carroll et al., 2000). Die wesentlichen Strukturmerkmale des Proteins bilden eine Chromo- und eine SET-Domäne (vgl. Abbildung 6.9). Das Su(var)3-9-Homolog aus Drosophila melanogaster wird N-terminal durch einen 81 Aminosäuren langen Abschnitt des Gens eIF2γ begrenzt, mit dem su(var)3-9 eine bi-cistronische Einheit bildet (Krauss & Reuter, 2000). Er entsteht vermutlich durch differentielles Splicing der Pre-mRNA beider Gene und kodiert für das GTP-Bindemotiv des Elongationsfaktors. Während die Chromo-Domäne für die Bindung an methyliertes H3K9 verantwortlich ist vermittelt der zwischen CD und dem durch differentielles Splicing verbleibenden eIF2γ-Abschnitt gelegene N-Terminus die Interaktion mit HP1 und dem centromerischen Chromatinfaktor Su(var)3-7 (Schotta et al., 2003). Im Bereich des C- Terminus wird Su(var)3-9 durch eine SET-Domäne begrenzt, welche einen als Pre-SET und Post-SET bezeichneten Bereich mit einschließt. Die SET-Domäne charakterisiert das Protein hinsichtlich seiner Hauptfunktion, der Methylierung des Histon H3-Lysins an Position 9 (Partridge et al., 2000; Rea et al., 2000; Lachner et al., 2001). Wie oben bereits erwähnt führt die H3K9-Methylierung zur Generierung einer Bindedomäne von HP1. Allgemein erfolgen Methylierungen von Histon-Lysinen meist durch Enzyme, die eine solche SET-Domäne (Su(var)3-9; Enhancer of Zeste; Trithorax) aufweisen (Jones & Gelbart, 1993; Tschiersch et al., 1994; Jenuwein & Allis, 2001; Rea et al., 2000). Die verschiedenen Enzyme weisen dabei eine hohe Spezifität in Bezug auf das Sequenzumfeld des zu methylierenden Lysins auf. In humanen Zelllinien konnte gezeigt werden, dass diese Markierung durch die Histondemethylase Jmjd2c selektiv aus dem Promotorbereich von für die Neuronalentwicklung relevanten Genen entfernt werden kann (Cascante et al., 2014). Mit SuvA ist aus Dictyostelium discoideum ebenfalls ein Su(var)3-9-Homolog bekannt (Essid, 2004; Kaller2 et al., 2006). Die Generierung einer SuvA-Knockout-Zelllinie in Dictyostelium war bisher nicht erfolgreich (Essid, 2004). Dies legt nahe, dass SuvA in Dictyostelium entsprechend seiner Beteiligung beim Aufbau von Heterochromatin eine essentielle
39 6. Einleitung und Zielsetzung
Funktion in der Zelle erfüllt (vgl. Abschnitt 6.8). In Drosophila konnte ein solch letaler Effekt hingegen nicht beobachtet werden woraus sich die Annahme ergibt, dass alternative Mechanismen für den Aufbau von Heterochromatin existieren (Tschiersch et al., 1994). Aus humanen Zelllinien ist bekannt, dass der Verlust von Suv39h sich phänotypisch in einer verminderten Heterochromatisierung und Genomstabilität äußert (Peters et al., 2001). Des Weiteren kommt es, wie auch beim Verlust von HP1, zu einer starken Reduktion der H4K20- Methylierung, einem weiteren Heterochromatinmarker (Schotta et al., 2004). Der Knockout von SuVar3-9h in Mauszellen hingegen äußert sich in einer Störung der Chromosomen- Segregation und Telomer-Elongation, verbunden mit einer Reduktion der H3K9- Methylierung und damit der Bindung von HP1 (Moss & Wallrath, 2007). Experimente mit Knockout-Mäusen haben gezeigt, dass der Ausfall nur eines der beiden Homologe Suv39h1 und Suv39h2 in der Embryonalentwicklung keine Auswirkungen hat und somit von einer Redundanz der beiden Homologe auszugehen ist (Peters et al., 2001). Der Doppelknockout hingegen äußert sich in einer hohen Letalitätsrate am zwölften Tag. Überlebende Tiere zeigen eine reduzierte Wachstumsrate und das vermehrte Auftreten von B-Zell-Lymphomen. Weibliche Tiere zeichnen sich zudem durch Sterilität aus. Den Erwartungen entsprechend gehen die genannten Phänotypen mit einer Reduzierung der HP1-Lokalisation und der H3K9- Methylierung, einer starken Verlängerung der Telomere und einer Störung bei der Trennung der Chromosomen einher. Das bereits beschriebene vermehrte Auftreten von B-Zell- Lymphomen und die Beobachtung, dass die Überexpression von Suv39h1 zu Veränderungen in der Expression des Rb-Proteins (Retinoblastoma-Protein) führt, legen nahe, dass Suv39h1 eine Funktion bei der Vermeidung von Tumorerkrankungen spielt (Czvitkovich et al., 2001). Rb bindet an Suv39h1 und HP1 (vgl. Tabelle 6.3) und wird durch das Proto-Onkogen Ras (Rat-Sarcoma Protein) reguliert (Palmero et al., 1998). Es ist zudem involviert in die Kontrolle von E2F-regulierten Zellzyklus-Genen. Es wird vermutet, dass der Verlust der Interaktion zwischen Suv39h1 und Rb zu einer verstärkten Expression des Rb-Proteins und sekundär zu einer Störung der Zellzyklus-Kontrolle führt (Braig et al., 2005; Palmero et al., 1998). Neben der in Abschnitt 6.8 beschriebenen Interaktion mit HP1 ist das Su(var)3-9-Homolog Clr4 aus Schizosaccharomyces pombe auch mit dem an der RNA-Interferenz beteiligten RITS- Komplex assoziiert und erfüllt weitere Funktionen in Bezug auf die Modellierung von Chromatin (Pidoux & Allshire, 2006).
40 6. Einleitung und Zielsetzung
Abbildung 6.9 – Struktur des Su(Var)3-9 Proteins: Die Abbildung zeigt den Aufbau des Drosophila Homologs Su(var)3-9. N-terminal ist das Protein durch eine eIF2γ-Domäne begrenzt, welche die ersten 81 Aminosäuren umfasst. Sie entsteht durch differentielles Splicing des in 5´-Orientierung angrenzenden Gens eIF2γ, mit dem su(var)3-9 eine bi-cistronische Einheit bildet. Die Chromo- Domäne wie auch die SET-Domäne und ihre vor- und nachgeschalteten Bereiche dienen der Methylierung von H3K9 (verändert nach Schotta et al., 2003).
6.10 Chromatin Assembly Factor 1
Der Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1) ist ein Histon-Chaperon, welches Histone nach der DNA-Replikation bzw. der DNA-Reparatur im Bereich der neugebildeten DNA integriert (Smith & Stillman, 1989; Shibahara & Stillman 1999; Nakagawa et al., 2001). CAF1 wurde zuerst aus den Zellkernen humaner Zellen isoliert und besteht aus drei Untereinheiten (vgl. Abbildung 6.10; Smith & Stillman, 1989), welche sich in ihrer Größe und der Zusammensetzung der Domänen unterscheiden. Ein Vergleich der Untereinheiten aus Homo sapiens, Saccharomyces cerevisiae und Arabidopsis thaliana zeigt, dass die kleine Untereinheit sowohl in Bezug auf Größe als auch auf die Anordnung der Domänen die größte Konservierung aufweist (vgl. Abbildung 6.10; Ramirez-Parra & Gutierrez, 2007). Die kleine Untereinheit besteht in allen drei Homologen aus sieben WD-Domänen. Hierbei handelt es sich um Proteindomänen, die aus ca. 40 Aminosäuren bestehen und häufig durch ein Motiv aus den beiden Aminosäuren Tryptophan und Asparaginsäure (WD) begrenzt werden (Neer et al., 1994). WD-Domänen sind in Protein-Protein-Interaktionen involviert und nehmen unter anderem Einfluss auf Prozesse wie Transkriptionskontrolle, Zell-Zyklus-Kontrolle und Apoptose (Stirnimann et al., 2010). Zwar erfüllt die kleine Untereinheit aus Arabidopsis MSI1 (IRA1) auch andere Funktionen außerhalb des CAF1-Komplexes (Kuzmichev et al., 2002; Köhler et al., 2002), innerhalb des Komplexes konnte sie aber mit der Bindung von Histondeacetylasen in Verbindung gebracht werden (Martinez-Balbas et al., 1998; Vermaak et al., 1999). Interessanterweise ist für MSI1 zudem eine Interaktion mit Regulatoren der
41 6. Einleitung und Zielsetzung
E2F-Expression beschrieben (Gutierrez, 2005), während die große Untereinheit des CAF1- Komplexes in Arabidopsis (FAS1) in seiner Promotorregion zwei Bindestellen für Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie besitzt (Ramirez-Parra2 & Gutierrez, 2007). Die in Abbildung 6.10 abgebildeten Vertreter der mittleren Untereinheit weisen ebenfalls sieben WD-Domänen auf, die Größe der drei abgebildeten Untereinheiten variiert aber über einen Bereich von knapp 80 Aminosäuren, wobei die humane Variante die größte Abweichung zeigt. Die größte Varianz weisen in diesem Zusammenhang die Vertreter der großen Untereinheiten auf. So ist die große Untereinheit aus Saccharomyces cerevisiae Cac1 mit 606 Aminosäuren ca. 1/3 kleiner als die humane Variante P150, während die große Untereinheit aus Arabidopsis hingegen immerhin noch etwas mehr als 100 Aminosäuren kleiner ist. Allen drei großen Untereinheiten ist das Vorhandensein jeweils einer KER- und einer ED-rich- Domäne gemeinsam, die eine azide Region für die Interaktion mit Histonen bilden. Das humane Homolog P150 verfügt zudem über eine PEST-Domäne, welche reich an den Aminosäuren Prolin (P), Glutaminsäure (E), Serin (S) und Threonin (T) ist und möglicherweise als Signalsequenz für die Proteindegradation dient (Rogers et al., 1986). Eine solche PEST- Domäne ist in Kaufman et al. (1995) ebenfalls für die P60-Untereinheit beschrieben. In der P150-Untereinheit ist die PEST-Domäne wiederum Bestandteil der sogenannten MIR- Domäne, welche für die Interaktion mit den HP1-Homologen HP1α und HP1β von Bedeutung ist (Murzina et al., 1999; Ridgway & Almouzni, 2000). Für die P150-Untereinheit konnten zudem Interaktionen mit den Histonen H3.1 und H4 sowie mit PCNA nachgewiesen werden (Ridgway & Almouzni, 2000), wobei PCNA die essentielle Plattform für die Bindung von CAF1 im Bereich der Replikationsgabel bildet (Shibahara & Stillman, 1999; Moggs et al., 2000). In Saccharomyces cerevisiae sind die für die CAF1-Untereinheiten kodierenden Gene CAC1, CAC2 und CAC3 anscheinend nicht essentiell, führen aber zu einer zunehmenden genomischen Instabilität (Kaufman et al., 1997; Shibahara & Stilman, 1999). Dies legt nahe, dass möglicherweise ein weiterer Mechanismus existiert, der in Abhängigkeit von der Replikation Chromatinstrukturen aufbaut. In humanen Zelllinien, die eine CAF1-Defizienz aufweisen, konnte eine Störung der Heterochromatinbildung und damit verbunden der Zellzyklus-Progression beobachtet werden, welche mit der Auslösung der Apoptose
42 6. Einleitung und Zielsetzung einherging (Hoek & Stillman, 2003; Ye at al., 2003; Nabatiyan & Krude, 2004). CAF1 scheint hier also für die Überlebensfähigkeit des Organismus essentiell zu sein.
A
B
Abbildung 6.10 – Aufbau und Konservierung des Chromatin Assembly Factors 1 (CAF1) in verschiedenen Organismen: Bei CAF1 handelt es sich um einen heterotrimerischen Komplex, der im Organismenreich hoch konserviert ist. (A) Aufbau des CAF1-Komplexes. Im Menschen ist CAF1 durch die Untereinheiten p150, p60 und p48 vertreten. Aus der Hefe sind die Cac1, Cac2 und Cac3 bekannt, während in Arabidopsis die Homologe FAS1, FAS2 und MSI3 identifiziert wurden. (B) Übersicht über den Aufbau der einzelnen Untereinheiten. Die kleinste Untereinheit zeigt eine geringe Varianz bezüglich der Größe und besitzt in allen drei Organismen sieben WD-Domänen. Dieser Domänenaufbau gilt auch für die mittlere Untereinheit, wobei die Größe der Untereinheiten zwischen den einzelnen Organismen insbesondere im Hinblick auf die humane Variante stärker variiert. Die große Untereinheit weist hier die stärkste Varianz auf. Alle drei Homologe der großen Untereinheit besitzen eine KER- und eine ED-rich-Domäne, die humane Variante weist zudem eine PEST-Domäne auf. (verändert aus Ramirez-Parra1 & Gutierrez, 2007).
Wie bereits erwähnt interagiert CAF1 mit den Histonen H3.1 und H4 und vermittelt deren Einbau in die replizierte DNA, gefolgt von der Assoziation mit H2A-H2B-Dimeren (siehe Abbildung 6.11; Tagami et al., 2004). Dieser Vorgang initiiert die Bildung von Heterochromatin nach der DNA-Replikation. Insbesondere die Integration des Histons H3 erfolgt differentiell. So ist CAF1 zwar für die Integration der Histon H3-Variante H3.1 nach der DNA-Replikation und der DNA-Reparatur verantwortlich, die Integration der Histon H3-
43 6. Einleitung und Zielsetzung
Variante H3.3 erfolgt hingegen durch das Histon-Chaperon HIRA unabhängig von der DNA- Synthese (Tagami et al., 2004). In beiden Fällen erfolgt der Prozess unter Beteiligung des Histon-Chaperon Antisilencing Factor 1 (ASF1).
Abbildung 6.11 – Chaperonfunktion von CAF1 und Interaktion mit ASF1: Unter dem Einfluss von ASF1 vermitteln CAF1 und HIRA den Einbau der Histone H4 und H3 nach der DNA-Replikation. Ein Unterschied besteht hier in der Integration der integrierten Histon H3-Variante. Während CAF1 den Einbau von H3.1 vermittelt, ist HIRA für den Einbau der H3.3-Variante verantwortlich (verändert aus Ramirrez-Parra1 und Gutierrez, 2007).
Zudem vermittelt CAF1 die Rekrutierung von HP1 an DNA-Regionen, die durch einen Doppelstrangbruch gekennzeichnet sind (Ball & Yokomori, 2009; Baldeyron et al., 2011). Ebenso ist die Interaktion von CAF1 mit HP1 während der DNA-Replikation von Bedeutung, um HP1 im Bereich der Replikationsgabel für weitere Komponenten zur Verfügung zu stellen (vgl. Abschnitt 6.8 und Abbildung 6.8 (A)). Der dabei gebildete HP1-Pool ist aufgrund seiner Interaktion mit CAF1-P150 unabhängig von einer etwaigen H3K9-Methylierung oder einer Interaktion mit RNA (Quivy et al., 2004).
6.11 Zielsetzung
Das zentrale Ziel dieser Arbeit liegt in der Identifikation von posttranslationalen Modifikationen (PTMs) der beiden in Dictyostelium discoideum exprimierten HP1-Homologe HcpA und HcpB. Für die humanen Homologe wurden bereits eine Vielzahl an PTMs beschrieben (LeRoy et al., 2009). Für HcpB konnten derzeit ebenfalls zumindest eine Di-
44 6. Einleitung und Zielsetzung
Methylierung (K7me2) und eine Acetylierung (K222ac) nachgewiesen werden (Földesi, 2010). Hier stellten sich für die vorliegende Arbeit folgende Fragen:
• sind weitere PTMs in HcpB identifizierbar? • in welchem Umfang liegen Modifikationen in HcpA vor? • gibt es Homologien zwischen den Modifikationen in HcpA bzw. HcpB und denen in humanen HP1-Homologen? Welche Konsequenzen hätte dies für einen möglicherweise existierenden HP1-Code?
Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit betraf die Funktion der bereits identifizierten Acetylierung in HcpB (Földesi, 2010). In Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl HcpB als auch HcpA in der Lage sind in einem Gal4-UAS-GFP-Reportersystem das Signal des GFP- Reporters stillzulegen. Zudem wurde für HcpA gezeigt, dass eine an der homologen Aminosäure K203 punktmutierte Variante (K203R) die Fähigkeit zur Reporterstilllegung verliert. Dies führte zu der Annahme, dass die zu K222 korrespondierende Aminosäure K203 vermutlich ebenfalls acetyliert vorliegt und eine solche Modifikation möglicherweise mit der Funktion der Heterochromatinbildung zusammenhängt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher folgende Fragen beantwortet werden:
• führt die Mutation K222R in HcpB ebenfalls zu einem Verlust der Fähigkeit zur Stilllegung des GFP-Reportersignals? • ist es möglich durch eine geeignete Mutation (K203Q bzw. K222Q) den Zustand der Acetylierung zu imitieren (Wand & Hayes, 2008) und die Stilllegung des Reporters wieder herbeizuführen? • liegt der Stilllegung des GFP-Signals eine Bildung von Heterochromatin oder ein anderer Mechanismus zugrunde?
Um der Fragestellung des zugrundeliegenden Mechanismus weiter nachgehen zu können ist es möglicherweise notwendig, weitere Interaktionspartner von HcpA und HcpB in Dictyostelium zu identifizieren. Sofern der Vorgang der Reporterstilllegung in einen engeren Zusammenhang mit der Bildung von Heterochromatin gebracht werden kann sollte die Suche nach Interaktionspartnern solche Proteine zum Ziel haben konzentrieren, die an der
45 6. Einleitung und Zielsetzung
Etablierung heterochromatischer Strukturen beteiligt sind. Physische Interaktionen, die an dieser Stelle von Bedeutung sein könnten, sind die Interaktion zwischen HcpA bzw. HcpB mit:
• ihren jeweiligen Homo- und Heterologen. • SuvA. • dem Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1).
Ebenfalls stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, wie sich eine der oben genannten Mutationen außerhalb des Wildtyp-Hintergrundes phänotypisch äußern würde. In diesem Zusammenhang stellen sich folgende Fragen:
• wirkt sich die Mutation von HcpA K203R bzw. HcpB K222R im Doppelknockout letal aus? • welches experimentelle Design ermöglicht die Aufklärung einer solchen Fragestellung?
Ein weiterer Themenkomplex befasste sich mit der heterologen Expression von humanem HP1α (hHP1α) in Dictyostelium discoideum. Aufgrund des hohen Konservierungsgrades von HP1-Homologen ist denkbar das hHP1α die Funktionen der Homologe HcpA und HcpB zu übernehmen und deren Verlust im Knockout zu kompensieren. Hierfür sollten folgende Fragen beantwortet werden:
• beeinflusst die heterologe Expression hHP1α die Vitalität von Dictyostelium discoideum Zellen, in denen jeweils eines der Homologe HcpA bzw. HcpB ausgeschaltet ist? • wirkt sich in solchen Zellen die heterologe Expression von hHP1α phänotypisch aus? • kann hHP1α bei einem Verlust beider HP1-Homologe deren Funktionen kompensieren?
46 6. Einleitung und Zielsetzung
Ein solches System ist auch dahingehend von Bedeutung, da die zu HcpA K203 bzw. HcpB K222 homologe Aminosäure K159 in hHP1α mit einer Formylierung ebenfalls eine Modifikation aufweist (K159fm) und somit im oben genannten Fall eine Analyse dieser Modifikation möglich wäre.
47 7. Materialien
7. Materialien
7.1 Geräte
• Autoclav LVSA50/70 (Zirbus, Bad Grund, Deutschland) • Blotting-Apparatur FastBlot B449 (Biometra, Göttingen, Deutschland) • Blotting-Apparatur Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell (Biorad, München, Deutschland) • Brutschrank LabShaker (Adolf Kühner, Birsfelden, Schweiz) • Elektrophoresekammern: Agarose-Gelelektrophorese: Metallwerkstatt (Uni Kassel, Kassel, Deutschland) GTC-Gelelektrophorese: PerfectBlue Gelsystem (PeqLab, Erlangen, Deutschland) Protein-Gelelektrophorese: Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Biorad, München, Deutschland) • Elektroporator GenePulser® (Biorad, München, Deutschland) • Filmkassette 20x40cm (Kisker-Biotech, Steinfurt, Deutschland) • Fluoreszenzmikroskope und Zubehör: -Leica DM IRB (Leica, Bensheim, Deutschland) Kamera DC350F (Leica, Bensheim, Deutschland) Kamera DFC 480 (Leica, Bensheim, Deutschland) Lichtquelle Jena ebq 100 (Leistungselektronik Jena, Jena, Deutschland) Software Leica IM50 4.0 (Leica, Bensheim, Deutschland) -Zeiss Axio Imager Z1m Kamera Zeiss AxioCam MRm Lichtquelle EXFO X-Cite Series 120 Software AxioVision 4.6 • Geldokumentationssystem Intas Gel IX Imager (Intas, Göttingen, Deutschland) • Geigerzähler Berthold LB 124 (Berthold ,Bad Wildbad, Deutschland) • Heizblock Ikamag RCT (Ika, Staufen, Deutschland) • Hybridisierungsofen Compact Line OV4 (Biometra, Göttingen, Deutschland) • Hybridisierungsröhren (Biometra, Göttingen, Deutschland) • Kühlfalle KF-2-60 (Bachofer Labortechnik, Reutlingen, Deutschland)
48 7. Materialien
• Magnetrührer: Heidolph MR3000 (Bachofer Labortechnik, Reutlingen, Deutschland) Ikamag RCT (Ika, Staufen, Deutschland) • Mikroskope und Mikroskop-Zubehör: Binokular Olympus SZ61 (Olympus, Hamburg, Deutschland) Kamera für Olympus SZ61: SIS Altra20 (Olympus-SIS, Münster, Deutschland) Software für SIS Altra 20: analySIS getIT 5.0 (Olympus-SIS, Münster, Deutschland) Binokular Wild M3 (Wild, Heerbrugg., Schweiz) Lichtquelle für Wild M3: KL 1500 electronic (Schott Labortechnik, Mainz, Deutschland) Durchlichtmikroskop Zeiss Axiolab (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) • Mikrowelle Lunik 250 (Aldi, Essen, Deutschland) • Milli-Q Integral System (Millipore-Merck, Darmstadt, Deutschland) • PCR-Thermocycler: Eppendorf Mastercycler® ep RealPlex (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Eppendorf Mastercycler® ep Gradient 5341 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Eppendorf Mastercycler® ep Gradient 5332 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Eppendorf Mastercycler® ep Personal 5331 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) • Phosphor-Imager FLA-7000 (Fujifilm, Düsseldorf, Deutschland) • Photometer: GeneQuant RNA-DNA Calculator (Gemini, Apeldoorn, Niederlande) Spekol 1300 (Analytik Jena, Jena, Deutschland) • pH-Meter Mettler Toledo (Gemini, Apeldoorn, Niederlande) • Pipetten: Abimed 2µl Einkanalpipette (Abimed, Langenfeld, Deutschland) Gilson 2µl Einkanalpipette (Gilson, Middleton, USA) Gilson 20µl Einkanalpipette (Gilson, Middleton, USA) Gilson 200µl Einkanalpipette (Gilson, Middleton, USA) Gilson 1000µl Einkanalpipette (Gilson, Middleton, USA) Eppendorf Multipette Plus (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) • Pipettierhilfe Pipetboy Accu (Integra Biosciences, Ruhberg, Schweiz) • Quartzküvetten 105.202-QS (Hellma Analytics, Müllheim, Deutschland) • Rollenmischgerät Hecht Assistent RM5 (Schütt Labortechnik, Göttingen, Deutschland)
49 7. Materialien
• Rotationsinkubator (Schütt Labortechnik, Göttingen, Deutschland) • Schüttelinkubatoren: Lab Shaker (Adolf Kühner, Birsfelden, Schweiz) • Spannungsgeräte: Pharmacia EPS200 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Dutschland) Pharmacia EPS600 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Dutschland) Pharmacia EPS3500 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Dutschland) Biometra Power Pack P25 T (Biometra, Göttingen, Deutschland) Bio-Rad PowerPac Basic (Bio-Rad, München, Deutschland) • Speicherfolie Fuji 20x40cm (Fujifilm Europe, Düsseldorf, Deutschland) • Speicherfolien Imager FujiColor FLP7000 (Fujifilm, Billingham, England) • Sterilbänke: Dictyostelium discoideum: Nunc Microflow (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) E. coli: Bench Series NB (Gelaire, Opera, Italien) • Stickstofftank Chronos Biosafe / Apollo (Messer Griesheim, Muddersbach, Deutschland) • Thermomixer Eppendorf 5436 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) • Ultraschallprozessor UP200S (Dr. Hielscher, Hamburg, Deutschland) • UV-Tisch Bachofer FL-20-M Fluo-Link (Bachofer Labortechnik, Reutlingen, Deutschland) • Vakuum Zentrifuge Bachofer BaVaCo Mini 30 (Bachofer Labortechnik, Reutlingen, Deutschland) • Vortex Heidolph REAX top (Bachofer Labortechnik, Reutlingen, Deutschland) • Waagen und Feinwaagen: Sartorius BP210S (Sartorius, Göttingen, Deutschland) Denver Instruments MXX-612 (Denver Instruments, Göttingen, Deutschland) Sartorius Extend (Sartorius, Göttingen, Deutschland) Mettler PC 440 (Gemini, Apeldoorn, Niederlande) • Wasserbad Julabo F25 / Thermostat Julabo MP (Julabo, Seelbach, Deutschland) • Neubauer Zählkammer 0,1mm Tiefe, 0,0025m2 (Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland) • Zellzähler Coulter Counter Z2 (Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) • Zentrifugen: Eppendorf 5417C (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Eppendorf 5417R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
50 7. Materialien
Eppendorf 5810R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Eppendorf 5804R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Eppendorf 5810 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Beckman AvantiTM 30 Centrifuge (Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) Sigma 3K30 (Sigma, Osterode am Harz, Deutschland)
7.2 Verbrauchsmaterialien
• Costar-Platten (24-well) (Hersteller, Ort, Land) • CryoPure-Röhrchen 1,6ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Deckgläschen 20x20mm (Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) • Einmalhandschuhe Nobaglove® Nitril (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Einmalskalpell (Bayha, Tuttlingen, Deutschland) • Einmalküvetten (1,6ml) (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Einwegspritzen und Kanülen (B. Braun, Melsungen, Deutschland) • Einwegtücher (Kimberly-Clark, Mainz, Deutschland) • Elektroporationsküvetten GenePulser® 0,4cm (BioRad, München, Deutschland) • Whatman 3MM Filterpapier (Biometra, Göttingen, Deutschland) • Glasartikel (Schott, Mainz, Deutschland) • Glaspipetten 5ml, 10ml, 20ml (Hirschmann, Eberstadt, Deutschland) • Mikroliterplatten (96-Well) MICROTEST IIITM (Becton Dickinson & Company, New Jersey, USA) • qPCR 96-Well Mikroliterplatten twin.tec (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) • Poly-Prep Chromatography Columns 0,8x4cm (Biorad, München, Deutschland) • PorablotTM NCP Nitrocellulose-Transfermembran 0,45µm Porendurchmesser (Machery- Nagel, Düren, Deutschland) • PorablotTM NY amp Nylon-Transfermembran 0,2µm Porendurchmesser (Machery- Nagel, Düren, Deutschland) • Parafilm (Schütt, Göttingen, Deutschland) • PCR-Reaktionsgefäße 0,2ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Petrischalen 5ml, 10ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • pH-Indikatorstäbchen (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
51 7. Materialien
• Pipettenspitzen (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • qPCR 96-Well Mikroliterplatten twin.tec (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) • qPCR Adhesive Clear Seals (4titude, Surrey, England) • Reaktionsgefäße 1,5ml, 2,0ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Reaktionsgefäße mit Schraubverschluß 1,5ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Reaktionsgefäße 15ml, 50ml (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) • Röntgenfilme Contatyp CX-BL / Medical X-ray film (Raymed Imaging AG, Krauchtal, Deutschland) • Sterilfilter Filtropur 0,2µm / 0,4µm (Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland)
7.3 Chemikalien und Reagenzien
• Rotiphorese® Gel Acrylamid/Bisacrylamid - 30% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Aceton (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) • Agar (Euler, Frankfurt am Main, Deutschland) • Agarose (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) • Aluminiumsulfat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Ammoniumsulfat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • APS - Ammoniumperoxodisulfat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Bacto-Pepton (Merck, Darmstadt, Deutschland) • Bacto-Trypton (BD-Biosciences, New Jersey, Frankreich) • BCIP - 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxylphosphat (Thermo Fisher, Schwerte, Deutschland) • ß-Mercaptoethanol (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) • Borsäure (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Bromphenolblau (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) • BSA - Bovines Serumalbumin (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
• CaCl2 - Calciumchlorid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Chloroform - >99% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva, Heidelberg, Deutschland) • DAPCO - 1,4-Diaminobenzidin (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • DAPI - 4´-6-Diamidin-2-Phenylindol (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • DEPC - Diethylpyrocarbonat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 52 7. Materialien
• DMF - Dimethylformamid (Merck, Darmstadt, Deutschland) • DMSO - Dimethyl Sulfoxid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • DTBP - Dimethyl 3,3´-dithiobispropionimidate (Thermo Fisher, Schwerte, Deutschland) • DTT - Dithiothreitol (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Essigsäure - 100% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Ethanol - >99,8% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Ethidiumbromid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Ficoll 400 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) • Formaldehyd - 37% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Formamid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Gelvatol Typ II (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) • Glucose (D-) (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Glutathion - reduced L-Glutathione (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) • Glycerin / Glyerol - 86% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Glycin (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • GTC - Guanidiniumthiocyanat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Hefeextrakt (Thermo Fisher, Schwerte, Deutschland) • HEPES (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Imidazol (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • IPTG - Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Isopropanol - 2-Propanol, 99,5% (Roth, Karlsruhe Deutschland) • Isoton II Diluent (Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) • KAc - Kaliumacetat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • KCl - Kaliumchlorid (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
• KH2PO4 - Kaliumdihydrogenphosphat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • LiCl - Lithiumchlorid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Methanol – 99,98% (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
• Mg2Cl - Magnesiumchlorid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Milchpulver - Blotting-grade (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • NaAc - Natriumacetat (Merck, Darmstadt, Deutschland)
53 7. Materialien
• NaCl - Natriumchlorid (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
• Na2HPO4 - Dinatriumhydrogenphosphat (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
• NaH2PO4 - Natriumdihydrogenphosphat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • NaOH - Natriumhydroxyd (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Natriumcitrat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • NBT - Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Nonident® P40 (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) • Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt, Deutschland) • Pepton aus Casein (Merck, Darmstadt, Deutschland) • Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Phosphorsäure - 85% (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) • Pikrinsäure (Merck, Darmstadt, Deutschland) • PIPES (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • PMSF - Phenylmethylsulfonylfluorid (Serva, Heidelberg, Deutschland) • Polyvinylpyrrolidone (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Protease Inhibitor Cocktail Complete Mini (Roche, Mannheim, Deutschland) • Saccharose (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Salzsäure - 37% (Merck, Darmstadt, Deutschland) • SDS - Sodium Dodecyl Sulfat (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Sepharose - Sephadex® G50 (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) • Sodium Deoxycholat (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) • TCA - Trichloressigsäure, >99% (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • TEMED - Tetramethylethylendiamin (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Tris (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Triton X-100 (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • TRIzol®Reagent (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) • Tween® 20 (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Xylencyanol (Fluka, Deisenhofen, Deutschland)
54 7. Materialien
7.4 Affinitätsmatrices für Immunpräzipitationen
• GFP-trapA (Nanotrap GBP) (Chromotek, Planegg-Martinsried, Deutschland) • Glutathione Sepharose 4B (GE-Healthcare Europe, Freiburg, Deutschland) • NiNTA-SepharoseTM (Nickel-Nitrilotriesseigsäure) (Qiagen, Hilden, Deutschland) • ProteinA Sepharose CL-4B (GE-Healthcare Europe, Freiburg, Deutschland) • Rabbit IgG-Agarose (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
7.5 Kits
• CloneJETTM PCR-Cloning Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • NucleoBond® PC100 (Machery-Nagel, Düren, Deutschland) • NucleoSpin® Extract II (Machery-Nagel, Düren, Deutschland) • pGEM®-T Easy Vector System (Promega, Mannheim, Deutschland) • Bioline SensiFastTM SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, Luckenwalde, Deutschland)
7.6 Enzyme und Enzympuffer
• FastAPTM Thermosensitive Alkaline Phosphatase und Puffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • DNAse I (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • Klenow Fragment (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • Polymerasen: Dreamtaq Green DNA-Polymerase und Puffer (5U/µl) (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) KOD Hot Start DNA-Polymerase und Puffer (Novagen, Darmstadt, Deutschland) Pfu-Polymerase und Puffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase und Puffer (Thermo Fisher, Schwerte, Deutschland) Taq-Polymerase und Puffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland)
55 7. Materialien
Taq-Polymerase (homemade) in Verbindung mit Taq-Puffer (+ MgCl2 + (NH4)2SO4) (Abteilung für Genetik, Kassel, Deutschland und Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • Proteinase K (Roth, Karlsruhe, Deutschland und Fermentas, st. Leon-Rot, Deutschland) • Restriktionsenzyme und jeweilige Puffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland und New England Biolabs, Frankfurt am Main, Deutschland) • Revert AidTM M-MuLV Reverse Transkriptase und Puffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • RiboLock® Ribonuklease Inhibitor (40U/µl) (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • RNase A (Roth, Karlsruhe, Deutschland und Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • T4-DNA-Ligase und Puffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • TEV-Protease und Puffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland oder homemade, Uni Kassel, Deutschland)
7.7 Längen- und Größenstandards (DNA / Protein)
• GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • GeneRulerTM 100bp DNA Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • GeneRulerTM 1kb DNA Ladder Plus (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) • PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland)
7.8 Antikörper
7.8.1 Monoklonale Primär-Antikörper
• α-GFP: Hybridoma-Nr. MAB 264-449-2; Verdünnung 1:3; Wienke et al., 2006 • α-Coronin (CorA): Hybridoma-Nr. MAB 176-3 D6; Verdünnung 1:3; Wienke et al., 2006 • α-His: Hybridoma-Nr. 2324705; Verdünnung 1:2 • α-Myc: Hybridoma-Nr. MAB 9E10; Verdünnung 1:3; Evan et al., 1985 • α-Severin (SevA): Hybridoma-Nr. MAB 42-65-11; Verdünnung 1:3; Schleicher et al., 1984 • α-Gal4DBD (SC-510): Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA; Anwendung laut Herstellerangaben; Johnston 1987; Ma & Ptashne, 1987; Fields et al., 1989
56 7. Materialien
• α-GST Z-5 (SC-459): Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA; Anwendung laut Herstellerangaben • α-HA F-7 (SC-7392): Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA; Anwendung laut Herstellerangaben
7.8.2 Polyklonale Primär-Antikörper
• rabbit-α-Gal4-DBD (SC-577): Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA, Anwendung laut Herstellerangaben; Ma et al., 1987; Johnston 1987; Fields et al., 1989; Ptashne et al., 1990 • rabbit-α-H3K9me3 (07-523) Millipore, Billerica, USA; Anwendung laut Herstellerangaben • rabbit-α-HA Y-11 (SC-805): Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA; Anwendung laut Herstellerangaben • rabbit-α-TAP (CAB1001): Open Biosystems, Huntsville, USA; Anwendung laut Herstellerangaben; Rigaut et al., 1999
7.8.3 Sekundärantikörper
• AP-konjugierter goat-α-mouse: Dianova, Hamburg, Deutschland; 1:5000 • AP-konjugierter goat-α-rabbit: Dianova, Hamburg, Deutschland; 1:5000 • Alexa Fluor® 488-konjugierter AffiniPure goat-α-rabbit IgG (H+L): Jackson Immuno Research, Carlsbad, USA, Anwendung laut Herstellerangaben • Alexa Fluor® 488-konjugierter AffiniPure goat-α-mouse IgG (H+L): Jackson Immuno Research, Carlsbad, USA, Anwendung laut Herstellerangaben
7.9 Antibiotika (Stockkonzentration)
• Amphotericin (0,25mg/ml) (PAA, Cölbe, Deutschland) • Ampicillin (50mg/ml) (Roth, Karlsruhe, Deutschland) • Blasticidin (5mg/ml) (MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland) • Geniticin G418 (100mg/ml) (PAA, Cölbe, Deutschland) • Kanamycin (10mg/ml) (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
57 7. Materialien
• Penicillin/Streptomycin (1000 U/ml bzw. 10mg/ml) (PAA, Cölbe, Deutschland) • Doxycyclin (1mg/ml) (MP Biomedicals, Illkirch, Frankreich)
7.10 Kultivierungsmedien
7.10.1 Medien für E. coli
• LB-Medium (pH7,0, Bertani, 1951) 10g Bacto-Trypton 5g Hefeextrakt 5g NaCl ddH2O ad 1l
• LBAmp-Medium wie LB-Medium +Ampicillin (Endkonz. 50µg/ml)
• LB-Agar LB-Medium +13g/l Bacto-Agar
• LBAmp-Agar LB-Agar +Ampicillin (Endkonz. 50µg/ml)
7.10.2 Medien für D. discoideum
• HL5-Medium (pH 6,7; Watts & Ashworth, 1970) 2,5g Bacto-Trypton 2,5g Pepton aus Casein 5,0g Protease-Pepton 5,0g Hefeextrakt 10,0g D-Glucose 1,2g KH2PO4
0,35g Na2HPO4 · 2H2O ddH2O ad 1l
• HL5+-Medium HL5-Medium +Ampicillin (Endkonz. 50µg/ml) +Amphotericin (Endkonz. 0,25µg/ml) +Penicillin (Endkonz. 100U/ml) +Streptomycin (Endkonz. 100µg/ml)
• G10-Medium HL5+-Medium +Geniticin (G418, Endkonz. 10µg/ml)
58 7. Materialien
• B10-Medium HL5+-Medium +Blasticidin (Endkonz. 10µg/ml)
• G10B10-Medium HL5+-Medium +Geniticin (G418, Endkonz. 10µg/ml) +Blasticidin (Endkonz. 10µg/ml)
• SM-Agarplatten (pH6,5, Singleton et al., 1987) 15,0g Bacto Agar 10,0g Pepton 10,0g D-Glucose 1,0g MgSO4 ⋅ 7H2O 2,2g KH2PO4 1,0g K2HPO4 ddH2O ad 1l
• Phosphat-Agarplatten (pH6,0) 15g Bacto-Agar Soerensen-Phosphatpuffer ad 1l
• KA-Platten SM-Agarplatten Inkubation mit Klebsiella aerogenes für 24h
7.11 Nukleotide
• dATP (Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) • dCTP (Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) • dGTP (Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) • dTTP (Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) • [α-32P] dATP (110TBq/mmol) (Hartmann Analytic, Braunschweig, Deutschland)
59 7. Materialien
7.12 Oligonukelotide
Die Synthetisierung von Oligonukleotiden erfolgte durch die Firma Invitrogen.
7.12.1 Oligonukleotide aus anderen Arbeiten
Tabelle 7.1 – Oligonukelotide anderer Arbeiten: Auflistung der Oligonukleotide aus anderen Arbeiten, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden. Abkürzungen, die sich nicht auf den Namen des Oligonukleotids beziehen: ZB = Zellbiologie; k.A. = keine Angabe.
Primer Stock # HP3 1203 CATATGGGAAAAAGAGATAAGAGAATAATAG HP4 1204 GGATCCTTTTAACTTTGTTGACCCTTATAACC HP6 1205 GGATCCACTTTGTTGACCCTTATAACC HcpB 5´-Outer 1221 GACAAATTCGCTCAATATTCCG HcpB 3´-Outer 1222 GGGAAATTAACGAACATTTTGAC Trx1-F 688 GAACGAGCTCCATGGCCAATAGAGTAATTCATG Trx1-R 689 CGCGGATCCTTATTTGTTTGCTTCTAGAGTACTTC CinD-Fwd 2570 GCCAGAAATGCTTTGAAAATGACAC CinD-Rev 2571 GAGTGGTTTGCCAATTTCTTTTCCT Gal4-DBD-fwd 2626 CTGCAGTGAAGCTACTGTCTTCTATCGAAC Gal4-DBD-rev 2627 GTCGACGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTC
60 7. Materialien
K-R122 fw (HcpB) 2325 GAAATCCTTAAACATAGAGAACCATTACAATTAATTGAG K-R122 rev (HcpB) 2326 CTCAATTAATTGTAATGGTTCTCTATGTTTAAGGATTTC K-Q122-for (HcpB) 2327 GAAATCCTTAAACATCAAGAACCATTACAATTAATTGAG K-Q122-rev (HcpB) 2328 CTCAATTAATTGTAATGGTTCTTGATGTTTAAGGATTTC HcpA BamHI pGEX 2592 GGATCCATGGGAAAAAGAGATAAGAGAATAATAG HcpB 5 outer Balint k.A. AAAAGATATAGAATCTACAACTATC GFP-Fwd 6 (ZB) GAGAAAGCTTAAAATGAGTAAAGGAGAAGAAC GFP-Rev 7 (ZB) TTATTTGTATAGTTCATCCATGC Act8-Term 304 (ZB) CCGAATTCAAAATGAATACTTCAACAACAAC 3-PR CA A8 Term 306 (ZB) GGGCAATTAAAATAACTTAATAATTATTAA 5-Pr Actin15Prom 307 (ZB) CGGTTTCAGATTGCATAAAAA BB019 pjet1.2-for 2214 CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC T7-GEM-PCR 282 TGTAATACGACTCACTATAGGG SP6-GEM-PCR 283 ATTTAGGTGACACTATAGAATAC
61 7. Materialien
7.12.2 Oligonukleotide dieser Arbeit
Tabelle 7.2 – Oligonukelotide dieser Arbeit: Auflistung der Oligonukleotide, die im Rahmen dieser Arbeit erstellt wurden. Schnittstellen sind in der Sequenz durch einen Unterstrich, andere Primer- Merkmale kursiv gekennzeichnet. Die Reihenfolge der Auflistung entspricht der aufsteigenden Stocknummer.
Primer Stock # HP6_modified 2397 TTTTTAACTTGGCTGACCTCTATAACC HP3_HcpB_optimiert 2398 CATATGGGAAAAAGAGATAAAAAAATAATAA pET15b_5_UTR_Forward 2412 GAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCT pET15b_3_UTR_Reverse 2413 AGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTC HcpAB_Southern_HcpB_ko_Fwd 2415 CATCAACAACAGCAGCAGCACCA HcpAB_Southern_HcpB_ko_Rev 2416 GACCATTTTCAAAACCAACACCTTCAAT HcpAB_Southern_Sonde_2_Fwd 2543 GTAGCATAACTAAATTATAACTA HcpAB_Southern_Sonde_2_Rev 2544 CCCACCGTAATCAGATAATCTA HcpAB_Southern_Sonde_3_Fwd 2545 GAGTTCAGCATGGAAGGATTCAAT HcpAB_Southern_Sonde_3_Rev 2546 CCCATGTATCATAATCTGAT HcpAB_Southern_Sonde_4_Fwd 2547 CATCATCAACAACAGCAGCAGCACC HcpAB_Southern_Sonde_4_Rev 2548 GACCAAAGGGTTTACAACCTATA HcpA_deltaCSD_NdeI_Fwd_1 2565
62 7. Materialien
GCGCCATATGGGAAAAAGAGATAAGAGAATAATAGAAGAACC HcpA_deltaCSD_BamHI_Rev_1 2566 GCGCGGATCCTTAGGGTTTACAACCTATAATCTCC SuvA_EspI_Rev_2 2572 TTCCTTGCTGAGCTTATTTTCTTTTTTTTGAGACTTCGGGTACCC HP1AlphaEcoRIrev 2574 CTTATGAATTCTTAGCTCTTTGCTGTTTCTTTCTC pET15b_6x_HIS-Fwd 2656 CAGCAGCCATCATCATCATCATCAC SuvA_BamHI_Fwd_2 2756 GGCCTTGGATCCGGATATAAAGGATATTTTTTTTATAGATGATAGC SuvA_Mid_ClaI_Rev 2761 ATCGATGCAATCCCCAAATTTCATTCC SuvA_Mid_4_BamHI 2762 TTACGGGGATCCCAAATCAAATAAATCCCTCATCAGAGT HcpB_BamHI_Rev 2763 GGATCCTTAACTTGGCTGACCACTATAAC HcpB_SalI_Fwd 2764 GTCGACATGGGAAAAAGAGATAAAAAAATAATAATAGAAG SuvA-Seq-1 2765 CTTCAATCCTCACAACAAATCCAAT SuvA-Seq-2 2766 AGATCGTCATCATCATCAAATTCATC SuvA-Seq-3 2767 ACAAAATCAAATAGAACAATCATCAGGAAC SuvA-Seq-4 2768 ATAGATATGCCATATTTTGAACCTTTAAATG SuvA-Seq-5 2769 ATAATGATAATAATAATAATAATGATAGTTATAATG pDNeo_Gal4_System_Rev 2794 CGAGATCTAGATATCGATGAATTCGAGCT
63 7. Materialien
CAF1_NdeI_Fwd (DDB_G0287815 large SU) 2797 CCGTTCATATGGATGAATCAATTGATATGGATAGTGGAAGTGA CAF1_BamHI_Rev (DDB_G0287815 large SU) 2798 CCGTTGGATCCTTAATGTTTTGGAAACTTAATTGGCTCAATATGG DDB_G0269800_XhoI_Fwd 2799 ACTCGAGATGAAATGCGAAACCGTTATGATTCTTTGG RbbD_NdeI_fwd 2800 CCGTTCATATGATGACAACACAAATGGAAGATGTTGAAGAAAAAG RbbD_BamHI_Rev 2801 CCGTTGGATCCTCATTCACCAATTTGAGCATTTGTAACTTTAC DDB_G0269800_EspI_Rev 2802 GCTGAGCTTATTTCTTTATTAAATTTGGTTGAATTCTTCTTTTAGGTTTG DDB_G0287815_Seq_1 2803 CAATTGAAGCACCAATTAAGCCACA DDB_G0287815_Seq_2 2804 CTTGAACCATATTTTAATCAATATCCAACA DDB_G0287815_Seq_3 2805 CCAAATTCAGCACCAGTTCAAACAA DDB_G0269800_Seq_1 2808 GTTAGTACTGATAATAGTGTTTCAATTTGGA DDB_G0269800_Seq_2 2809 GAATGTTTTATGATGAAAGAGCATCAACCT DDB_G0269800_Seq_3 2810 CTATTGATTACTTCATCTGATGGTTTTTGT RbbD_Seq_1 2811 GTTAACAGGTCATAAGAAAGAAGGTTAT SuvA-gDNA-ClaI-Fwd 2821 ATCGATGCAGTTACATCTGAGGTGATAGTGAAG SuvA-gDNA-BaeI-Rev 2822 GATACTTTTGTACTACTACTAGTTGCAATCTTTGTT Gal4-1-qPCR-Fwd 2823
64 7. Materialien
TTCCTCGAGAAGACCTTGACA Gal4-qPCR-Rev 2824 ATTCCGGCGATACAGTCAAC Gal4-2-qPCR-Fwd 2825 CATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCT Gal4-HcpAB-qPCR-Rev 2826 GTTCTGGACAACCTGCAACA Gal4-HP1alpha-qPCR-Rev 2827 TAGCTCAGGGCAATCCAAGT SuvA-gDNA-XbaI-Rev 2833 TCTAGAATGATTATGATGACCATTATTATGTTCATCAATACTC RT-PCR-HcpAB-Fwd 2834 AATTTTAGATAAAAGAGTTCAGCATGGAAGG RT-PCR-HcpAB-Rev 2835 AGAAAAATAGTGTATTATCTTGACCAAAGGG RT-PCR-HcpB-Rev 2836 GGTGTGTTGATGTAGTATTATTAGAAAAATATGTATCT RT-PCR-HP1alpha-Fwd 2837 GCGGACAGCTGACAGTTCTTCTTCA RT-PCR-HP1alpha-Rev 2838 TTGGATTTCCTCTTGTTACTTTCTGACTTC HP1alpha_BamHI_Veltman_Fwd 2969 GGATCCAAAATGGGAAAGAAAACCAAGCGGACAG HP1alpha_SpeI_Veltman_Rev 2970 ACTAGTGCTCTTTGCTGTTTCTTTCTCTTTGTTTTC HcpA_BamHI_Veltman_Fwd 2971 GGATCCAAAATGGGAAAAAGAGATAAGAGAATAATAGAAGAAC HcpA_SpeI_Veltman_Rev 2972 ACTAGTACTTTGTTGACCCTTATAACCAAATTTAAGTC HcpB_BamHI_Veltman_Fwd 2973 GGATCCAAAATGGGAAAAAGAGATAAAAAAATAATAATAGAAGAACCAG
65 7. Materialien
HcpB_XbaI_Veltman_Rev 2974 TCTAGAACTTGGCTGACCACTATAACCAAATTTAAGTC pTX-UAS-GFP-Fwd 3047 ATGCATCATCATCATCATCATCATCATGATATC pTX-UAS-GFP-Rev 3048 TTAATTTAAATCTTCTTCTGATAATAATTTTTGTTCTAATGCATC CAF1_large_BclI_Veltman_Fwd 3049 TGATCAAAAATGAAATGCGAAACCGTTATGATTCTTTGG CAF1_large_SpeI_Veltman_Rev 3050 ACTAGTTTTCTTTATTAAATTTGGTTGAATTCTTCTTTTAGGTTTGAC CAF1_middle_BglII_Veltman_Fwd 3051 AGATCTAAAATGGATGAATCAATTGATATGGATAGTGGAAG CAF1_middle_XbaI_Veltman_Rev 3052 TCTAGAATGTTTTGGAAACTTAATTGGCTCAATATGGAC CAF1_small_BamHI_Veltman_Fwd 3053 GGATCCAAAATGACAACACAAATGGAAGATGTTGAAGAAAAAG CAF1_small_NheI_Veltman_Rev 3054 GCTAGCTTCACCAATTTGAGCATTTGTAACTTTACTATTTTC SuvA Veltman Entry BamHI Fwd 3157 GGATCCAAAATGGATATAAAGGATATTTTTTTTATAGATGATAGCTCAG SuvA_AT_Generierung_Rev 3158 GCTGAGCCGGCATCGGCCATATGGTTCATAAGTTGATTGTTTTGCTAATTTCTT Gal4 ChIP 1 Fwd 3159 TGTTTAGCTTGTTCAGCTGCGCTTGTTTAT Gal4 ChIP 2 Rev 3160 GGAGTATAAATAGAGGCGCTTCGTCTACGG Gal4 ChIP 3 Fwd 3161 ACTCTAGCGAGCGCCG Gal4 ChIP 4 Rev 3162 TGTAATCATTTGTAATCTATTTAATTC Gal4 ChIP 5 Fwd 3163
66 7. Materialien
TTTCAGATTGCATAAAAAGATTT Gal4 ChIP 6 Rev 3164 GTACCGATATCATGATGATGAT pGEM NdeI Remove Fwd 3165 GTCGACCCCTTTGGTCAAGATAATACACTATTTTTCTTT pGEM NdeI Remove Rev 3166 GAGCTCCCAAGATAATTTTTCTTGACCTCTCCATTTAA pDM-N-HA-Fwd 3167 GGATCCAAAAATGTATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGAGGATACCCTTATGATGTACTGACTACGCA pDM-N-HA-Rev 3168 h pDM-C-HA-Fwd 3169 ACTAGTACATATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGAGGATACCCTTATGATGTACTGACTACGCA pDM-C-HA-Rev 3170 TCTAGACCCACCTGCATAATCTGGAACATCGTATGGATAACCACCTGCGTAGTCAGGTACATCATAAGGG
7.13 Plasmide
7.13.1 Plasmide anderer Arbeiten
Die nachfolgend beschriebenen Plasmide wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet und sind, sofern verfügbar, als Vektorkarten in Abbildung 14.1.1 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers abgebildet.
Tabelle 7.3 – Plasmide anderer Arbeiten: Auflistung der Plasmide aus anderen Arbeiten, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden. Die nachfolgend beschriebenen Plasmide sind, soweit verfügbar, als Vektorkarten in Abbildung 14.1.1 des Anhangs abgebildet. (A) = Nummer aus Plasmidstock-Liste bis 2010. (ZB) = Abteilung für Zellbiologie.
Plasmid Stock-# Urheber pN-TAP P396 (A) Meima et al., 2007 pDV-N-TAP HcpA P407 (A) Balint Földesi pDV-N-TAP HcpB P403 (A) Balint Földesi pDNeo2 Gal4-DBD cmyc P534 (A) Balint Földesi pDNeo2 Gal4-DBD cmyc HcpA P535 (A) Balint Földesi pDNeo2 Gal4-DBD cmyc HcpA-K203R P135 Sonja Kasten
67 7. Materialien pDNeo2 Gal4-DBD cmyc HcpB P536 (A) Balint Földesi pDNeo2 Gal4-DBD cmyc hHP1α P162 Sonja Fuhrmann pTX 5xUAS-GFP BSr P547 (A) Balint Földesi pET15b HcpA P365 (A) Sonja Kasten pET15b HcpA K203R P46 Sonja Kasten pET15b HcpA K203Q P45 Sonja Kasten pET15b HcpB P366 (A) Balint Földesi pET15b HcpB ΔCSD P406 (A) Balint Földesi pGEM7z HcpA KO P198 Markus Kaller pGEM7z HcpB KO P199 Markus Kaller pDNeo2a-SuvA-6xMyc P101 Vladimir Maximov pDNeo2a hHP1alpha GFP P792 (A) Sonja Kasten pDM304 P145 Veltman1 et al., 2009 pDM309 Tet-OFF rTA P277 Veltman2 et al., 2009 pDM317 P279 Veltman1 et al., 2009 pDM323 P150 Veltman1 et al., 2009 pDM326 P151 Veltman2 et al., 2009 pDM340 Dox ON P203 / P274 Veltman1 et al., 2009 A15-GFP w/o ATG P48 (ZB) Hanakam et al., 1996 pJET1.2 - Fermentas pGEM® T-easy - Promega
7.13.2 Plasmide dieser Arbeit
Die nachfolgend beschriebenen Plasmide sind, soweit verfügbar, als Vektorkarten in Abbildung 14.1.2 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers abgebildet. Soweit verfügbar ist die Stocknummer des jeweiligen Plasmids hinter der Plasmidbezeichnung in Klammern angegeben. Erfolgte eine Lagerung des Plasmids in Form eines Glycerolstocks beginnt die Stocknummer mit #E. Die Primer-Bezeichnungen entsprechen den Stock-Nummern aus den Tabellen 7.1 und 7.2. Einige Vektoren werden nicht namentlich im Ergebnisteil erwähnt, sind aus Gründen der Vollständigkeit aber dennoch aufgelistet. Sofern die Klonierung durch Dritte oder in Zusammenarbeit mit Dritten erfolgte ist eine entsprechende Erwähnung im jeweiligen Abschnitt zu finden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Plasmide kloniert:
Vektoren zur Mutagenese von HcpB pJET1.2 HcpB K222R (#P184): Für die Generierung des Vektors pJET1.2 HcpB K222R wurde mittels PCR-vermittelter Mutagenese (vgl. 8.2.19) und unter Verwendung der Primer #2325 und #2326 ein entsprechendes DNA-Fragment amplifiziert. Dieses wurde anschließend
68 7. Materialien gelelektrophoretisch aufgetrennt, mittels NucleoSpin® Extract II Kit aufgereinigt, in den Klonierungsvektor pJET1.2 ligiert und anschließend in kompetente E. coli Zellen transformiert. pJET1.2 HcpB K222Q (#P185): Die Generierung des Vektors pJET1.2 HcpB K222Q erfolgte wie für den Vektor pJET1.2 HcpB K222R beschrieben unter Verwendung der Primer #2327 und #2328.
Vektoren des Gal4-UAS-GFP-Reportersystems pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpA K203Q (#P48): Für Assays unter Verwendung von Vektoren des in Balint Földesis Dissertation erwähnten Gal4-UAS-GFP-Reportersystems (Földesi, 2010) kamen Backbones des Vektors pDNeo2 (Witke et al., 1987) zum Einsatz. Um eine weitere punktmutierte Variante der bereits bestehenden Vektoren pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpA bzw. pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpA K203R herzustellen wurde der entsprechende Bereich innerhalb aus dem Vektor pET15b HcpA K203Q (#P45) mit den Enzymen BclI und BamHI herausgeschnitten, gelelektrophoretisch aufgetrennt und aufgereingt und anschließend in den auf gleiche Weise präparierten Vektor pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpA ligiert. pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpB K222R (#P186): Die Generierung des Vektors erfolgte wie für den vorherstehenden Vektor (#P48) beschrieben unter Verwendung der Restriktionsenzyme SalI und EcoRI Als Ausgangsvektor für die zu inserierende Sequenz diente in diesem Fall der Vektor pJET1.2 HcpB K222R (#P184). pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpB K222Q (#P187): Die Generierung des Vektors erfolgte wie für den vorherstehenden Vektor (#P48) beschrieben unter Verwendung der Restriktionsenzyme SalI und EcoRI. Als Ausgangsvektor für die zu inserierende Sequenz diente in diesem Fall der Vektor pJET1.2 HcpB K222Q (#P185).
Vektoren des Veltman-Systems pJET1.2 HcpA Veltman Entry (#P291): Der kodierende Bereich von HcpA wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer #2971 und #2972 und dem Plasmid pDNeo2a-Gal4-DBD-cmyc-
69 7. Materialien
HcpA amplifiziert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, unter Verwendung des NucleoSpin® Extract II-Kits isoliert und laut Herstellerangaben in den Vektor pJET1.2 ligiert. Über die Primer wurden am 5´-Ende des Produktes eine BamHI-Schnittstelle sowie eine Kozak-Sequenz (Kozak, 1986; Kozak1/2, 1987) sowie am 3´-Ende eine SpeI-Schnittstelle eingefügt. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 HcpA-K203R Veltman Entry (#P292): Die Generierung erfolgte analog zu dem Plasmid pJET1.2 HcpA Veltman Entry unter Verwendung des Plasmids pDNeo2a-Gal4-DBD-cmyc-HcpA- K203R als Template für die PCR-Reaktion. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 HcpA-K203Q Veltman Entry (#P293): Die Generierung erfolgte analog zu dem Plasmid pJET1.2 HcpA Veltman Entry unter Verwendung des Plasmids pDNeo2a-Gal4-DBD-cmyc-HcpA- K203Q als Template für die PCR-Reaktion. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 HcpB Veltman Entry (#P294): Der kodierende Bereich von HcpB wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer #2973 und #2974 und dem Plasmid pDNeo2a-Gal4-DBD-cmyc- HcpB amplifiziert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, unter Verwendung des NucleoSpin® Extract II-Kits isoliert und laut Herstellerangaben in den Vektor pJET1.2 ligiert. Über die Primer wurden am 5´-Ende des Produktes eine BamHI-Schnittstelle und eine Kozak-Sequenz (Kozak, 1986; Kozak1/2, 1987) sowie am 3´-Ende eine XbaI-Schnittstelle eingefügt. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 HcpB-K222R Veltman Entry (#P295): Die Generierung erfolgte analog zu dem Plasmid pJET1.2 HcpB Veltman Entry unter Verwendung des Plasmids pDNeo2a-Gal4-DBD-cmyc-HcpB- K222R als Template für die PCR-Reaktion. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 HcpB-K222Q Veltman Entry (#P296): Die Generierung erfolgte analog zu dem Plasmid pJET1.2 HcpB Veltman Entry unter Verwendung des Plasmids pDNeo2a-Gal4-DBD-cmyc-HcpB-
70 7. Materialien
K222Q als Template für die PCR-Reaktion. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 hHP1alpha Veltman Entry (#P297): Der kodierende Bereich des humanen HP1α wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer #2969 und #2970 und dem Plasmid pDNeo2a-Gal4- DBD-cmyc-hHP1α amplifiziert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, unter Verwendung des NucleoSpin® Extract II-Kits isoliert und laut Herstellerangaben in den Vektor pJET1.2 ligiert. Über die Primer wurden am 5´-Ende des Produktes eine BamHI-Schnittstelle und eine Kozak- Sequenz (Kozak, 1986; Kozak1/2, 1987) sowie am 3´-Ende eine SpeI-Schnittstelle eingefügt. Klone wurden mittels Colony-PCR (Abschnitt 8.2.18) untersucht und nachfolgend sequenziert. pJET1.2 RbbD (DDB_G0282529) ΔAAA Veltman Entry (#P000): Vektor mit der putativen kleinen Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor 1. Die Amplifikation der kodierenden Sequenz erfolgte unter Verwendung der Primer #3053 und #3054 sowie des Vektors pJET1.2 RbbD (DDB_G0282529) gDNA deltaAAA (#P313) als Template. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde in den Vektor pJET1.2 ligiert. Über die Primer wurden am 5´-Ende des Produktes eine BamHI-Schnittstelle und eine Kozak-Sequenz (Kozak, 1986; Kozak1/2, 1987) sowie am 3´-Ende eine NheI-Schnittstelle eingefügt. Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Frau Sonja Kasten. pGEM T-easy DDB_G0287815 Veltman Entry (#P000): Vektor mit der putativen großen Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor 1. Die Amplifikation der kodierenden Sequenz erfolgte unter Verwendung der Primer #3051 und #3052 (die Bezeichnung der Primer gibt die mittlere UE an, kodiert aber für das oben genannte Gen DDB_G0287815). Als Template für die Amplifikation diente genomische DNA des Stammes AX2. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde in den Vektor pGEM T-easy ligiert. Durch Verwendung der oben genannten Primer wurden am 5´-Ende des Produktes eine BglII-Schnittstelle und eine Kozak-Sequenz (Kozak, 1986; Kozak1/2, 1987) sowie am 3´-Ende eine XbaI-Schnittstelle eingefügt. Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Frau Sonja Kasten.
SuvA Veltman Entry Vektor: Ein spezifischer Vektor als Eingangsvektor für das Veltman-System wurde nicht kloniert. Der weiter unten unter pJET1.2 SuvA Volllänge gDNA mit Kozak-Sequenz
71 7. Materialien
(AAA) und ATG (#P290) aufgeführte Vektor ist in begrenztem Umfang für diesen Zweck geeignet. pJET1.2 3xHA-N (#P288): Für die Generierung des Vektors wurde die Gesamtsequenz
GGATCCAAAAATGTATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGAGGATACCCTTATGATGTACCTGACTACGCAGGTGGTTATCC ATACGATGTTCCAGATTATGCAGGTGGGTTCAGATCT im Zuge einer rekursiven PCR unter Verwendung der Primer #3167 und #3168 amplifiziert. Dabei kennzeichnen die mit einem Unterstrich gekennzeichneten endständigen Basen die am 5´-Ende gelegene BamHI- bzw. die am 3´-Ende gelegene BglII-Schnittstelle. Die benachbarten kursiv geschriebenen Basen markieren hingegen die eingefügte Kozak-Sequenz (vgl. Veltman1 et al, 2009 für den allgemeinen Aufbau von Veltman-Vektoren) bzw. eine der BglII-Schnittstelle vorgeschaltete Linker-Sequenz. Die mittig mit einem Unterstrich markierten Basen kennzeichnen den überlappenden Bereich der PCR-Fragmente für die rekursive PCR. Dabei wurde unter Anwendung des folgenden Programms
Initiale Denaturierung: 95°C / 5min Denaturierung: 95°C / 30sec Annealing: 67°C / 40sec Denaturierung - Annealing - Elongation: 34x Elongation: 72°C / 20sec Finale Elongation: 72°C / 5min zunächst für die Dauer von 5 Zyklen das Volllänge-Produkt generiert und die PCR unterbrochen, um die entsprechenden Primer (#3167 und #3168) erneut hinzuzufügen. In den nachfolgenden Zyklen erfolgte dann die Amplifikation des Volllänge-Produktes. Das PCR-Produkt wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, mittels NucleoSpin® Extract II Kit aufgereinigt, in den Klonierungsvektor pJET1.2 ligiert und anschließend in kompetente E. coli Zellen transformiert. pJET1.2 3xHA-C (#P289): Für die Generierung des Vektors wurde die Gesamtsequenz
ACTAGTACATATCCATACGATGTTCCAGATTATGCAGGAGGATACCCTTATGATGTACCTGACTACGCAGGTGGTTATCCATAC GATGTTCCAGATTATGCAGGTGGGTCTAGA
72 7. Materialien im Zuge einer rekursiven PCR mit den Primern #3169 und #3170 amplifiziert. Dabei kennzeichnen die mit einem Unterstrich markierten endständigen Basen die am 5´-Ende gelegene SpeI- bzw. die am 3´-Ende gelegene XbaI-Schnittstelle. Die der SpeI-Schnittstelle benachbarten kursiv geschriebenen Basen markieren eine nachgeschaltete Linker-Sequenz. Die mittig mit einem Unterstrich markierten Basen kennzeichnen wiederum den überlappenden Bereich der PCR-Fragmente für die rekursive PCR. Das Vorgehen erfolgte analog zur Generierung des pJET1.2 N-3x-HA-Vektors (PCR-Parameter vgl. pJET1.2 3xHA-N). pDM304 3xHA-N (#P286): Für die Generierung eines N-terminal HA-getaggten Veltman-Vektors wurde der Vektor pDM304 mit dem Enzym BamHI verdaut, dephosphoryliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und die isolierte DNA mit dem NucleoSpin Extract II Kit aufgreinigt. Der Vektor pJET1.2 3xHA-N wurde parallel mit den Enzymen BamHI und BglII verdaut und der HA-Tag wie beschrieben isoliert, aufgereinigt, in den geschnittenen und dephosphorylierten pDM304-Vektor ligiert und anschließend in E. coli Zellen transformiert. Klone wurden unter Verwendung der Primer #306 (ZB) und #307 (ZB) auf eine einmalige Integration des HA-Tags hin untersucht. Identifizierte Klone mit einfacher Integration des Tags wurden anschließend sequenziert. Eine der BamHI-Schnittstellen im pDM304-Vektor wird durch die Integration des Inserts mit dem HA-Tag zerstört, da es sich bei BglII um ein Isocaudomer handelt. Die Generierung des Vektors erfolgte in Zusammenarbeit mit Doreen Meier. pDM304 3xHA-C (#P285): Für die Generierung eines C-terminal HA-getaggten Veltman-Vektors wurde der Vektor pDM304 mit dem Enzym SpeI verdaut, dephosphoryliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und die isolierte DNA mit dem NucleoSpin Extract II Kit aufgreinigt. Der Vektor pJET1.2 3xHA-C wurde parallel mit den Enzymen SpeI und XbaI verdaut und der HA-Tag wie beschrieben isoliert, aufgereinigt, in den geschnittenen und dephosphorylierten pDM304-Vektor ligiert und anschließend in kompetente E. coli Zellen transformiert. Klone wurden unter Verwendung der Primer #306 (ZB) und #307 (ZB) auf eine einmalige Integration des HA-Tags hin untersucht. Identifizierte Klone mit einfacher Integration des Tags wurden anschließend sequenziert. Eine der SpeI-Schnittstellen im pDM304-Vektor wird durch die Integration des Inserts mit dem HA-Tag zerstört, da es sich bei XbaI um ein
73 7. Materialien
Isocaudomer handelt. Die Generierung des Vektors erfolgte in Zusammenarbeit mit Doreen Meier. pDM304 3xHA-N HcpA (#P247): Durch Verdau des Vektors pJET1.2 HcpA Veltman Entry mit den Enzymen BamHI und SpeI und des Vektors pDM304 3xHA-N mit den Enzymen BglII und SpeI und anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung und Aufreinigung wurden Insert und Vektor-Backbone isoliert und im Anschluss ligiert. Der Ligationsansatz wurde anschließend in kompetente E. coli Zellen transformiert. Positive Klone wurden mittels Colony-PCR identifiziert und anschließend sequenziert. Durch die Ligation in den Zielvektor kommt es zum Verlust der BamHI-/BglII-Schnittstelle. pDM304 3xHA-N HcpA BSr (#P252): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Austausch der Resistenzkassette aus dem vorhergehenden Vektor wie in Veltman1 et al., 2009 beschrieben. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen HA-Tag sowie ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Blasticidin und wurde durch Frau Sonja Fuhrmann kloniert. pDM304 3xHA-N HcpA-K203R (#P253): Die Klonierung erfolgte analog zur Klonierung des pDM304 3xHA-N HcpA Vektors, wobei das zu ligierende Insert aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpA K203R Veltman Entry isoliert wurde. pDM304 3xHA-N HcpA-K203R BSr (#P257): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Austausch der Resistenzkassette aus dem vorhergehenden Vektor wie in Veltman1 et al., 2009 beschrieben. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen HA-Tag sowie ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Blasticidin und wurde durch Frau Sonja Fuhrmann kloniert. pDM304 3xHA-N HcpB (#P248): Die Klonierung erfolgte analog zur Klonierung des pDM304 3xHA-N HcpA Vektors, wobei das zu ligierende Insert aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpB Veltman Entry stammte. Durch die Ligation in den Zielvektor kommt es zum Verlust der BamHI- /BglII- sowie der XbaI-/SpeI-Schnittstellen.
74 7. Materialien pDM304 3xHA-N HcpB BSr (#P251): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Austausch der Resistenzkassette aus dem vorhergehenden Vektor wie in Veltman1 et al., 2009 beschrieben. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen HA-Tag sowie ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Blasticidin und wurde durch Frau Sonja Fuhrmann kloniert. pDM304 3xHA-N HcpB-K222R (#P254): Die Klonierung erfolgte analog zur Klonierung des pDM304 3xHA-N HcpA Vektors, wobei das zu ligierende Insert aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpB K222R Veltman Entry isoliert wurde. pDM304 3xHA-N HcpB-K222R BSr (#P258): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Austausch der Resistenzkassette aus dem vorhergehenden Vektor wie in Veltman1 et al., 2009 beschrieben. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen HA-Tag sowie ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Blasticidin und wurde durch Frau Sonja Fuhrmann kloniert. pDM304 3xHA-N DDB_G0287815 (#P211): Vektor mit der putativen großen Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor 1. Als Ausgangsvektor für die Klonierung diente der Vektor pGEM T-easy DDB_G0287815 Veltman Entry. Dieser wurde mit den Enzymen BglII und XbaI verdaut und das entsprechende DNA-Fragment gelelektrophoretisch aufgetrennt, aufgereinigt und in den mit den Enzymen BglII und SpeI präparierten Zielvektor ligiert. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen HA-Tag und wurde durch Frau Sonja Kasten kloniert. pDM304 3xHA-N DDB_G0287815 BSr (#P249): Vektor mit der putativen großen Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor 1. Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Austausch der Resistenzkassette aus dem vorhergehenden Vektor wie in Veltman1 et al., 2009 beschrieben. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen HA-Tag sowie ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Blasticidin und wurde durch Frau Sonja Fuhrmann kloniert. pDM304 3xHA-C DDB_G0287815 (#P212): Vektor mit der putativen großen Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor 1. Die Generierung des Vektors erfolgte analog zur Generierung des Vektors pDM304 3xHA-N DDB_G0287815 (#P211). Der klonierte Vektor verfügt über einen C-terminalen HA-Tag und wurde durch Frau Sonja Kasten kloniert.
75 7. Materialien pDM304 3xHA-C DDB_G0287815 BSr (#P250): Vektor mit der putativen großen Untereinheit des Chromatin-Assembly-Factor 1. Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Austausch der Resistenzkassette aus dem vorhergehenden Vektor wie in Veltman1 et al., 2009 beschrieben. Der generierte Vektor verfügt über einen C-terminalen HA-Tag sowie ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Blasticidin und wurde durch Frau Sonja Fuhrmann kloniert. pDM317 SuvA (#P298): Der Vektor pDM317 SuvA wurde durch Verdau des Vektors pJET1.2 SuvA Volllänge gDNA mit Kozak-Sequenz (AAA) und ATG (#P290) mit den Enzymen BamHI und NheI sowie des nativen Vektors pDM317 mit den Enzymen BglII und SpeI, anschließende Gelelektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung sowie die nachfolgende Ligation der beiden Fragmente generiert. Da die ligierte SuvA-Sequenz über ein Stop-Codon verfügt ist nur die N-terminale Markierung der SuvA-Sequenz einem Tag möglich, der Veltman-Vektor pDM317 verfügt über einen solchen N-terminalen GFP-Tag. pDM317 HcpA (#P299): Das für die Ligation benötigte Insert wurde aus dem Vektor pJET1.2 HcpA Veltman Entry durch Verdau mit den Enzymen BamHI und SpeI und anschließende gelelektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung mit dem NucleoSpin® Extract II Kit isoliert und in den mit BglII und SpeI verdauten und aufgereinigten Vektor pDM317 ligiert. Der Ligationsansatz wurde anschließend wie in Abschnitt NNN beschrieben in kompetente E. coli Zellen transformiert. Die Integration des Inserts führt zum Verlust der BamHI-/BglII- Schnittstelle. Der Vektor pDM317 verfügt über einen N-terminalen GFP-Tag. pDM317 HcpA-K203R (#P300): Die Generierung des Plasmids erfolgte wie bei dem Vektor pDM317 HcpA beschrieben, jedoch unter Verwendung des Klonierungsvektors pJET1.2 HcpA- K203R für die Isolation des gewünschten Inserts. Der Vektor pDM317 verfügt über einen N- terminalen GFP-Tag. pDM317 HcpB (#P301): Die Klonierung erfolgte ebenfalls analog zur Klonierung des Vektors pDM317 HcpA beschrieben, wobei das für die Ligation benötigte Insert aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpB Veltman Entry durch Verdau mit den Enzymen BamHI und XbaI isoliert wurde. Durch die Ligation in den Zielvektor kommt es zum Verlust der BamHI-/BglII-
76 7. Materialien sowie der XbaI-/SpeI-Schnittstellen. Der Vektor pDM317 verfügt über einen N-terminalen GFP- Tag. pDM317 HcpB-K222R (#P302): Die Generierung des Vektors erfolgte wie bei dem Vektor pDM317 HcpB beschrieben, das für die Ligation benötigte Insert wurde hierbei aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpB-K222R Veltman Entry isoliert. Der Vektor pDM317 verfügt über einen N-terminalen GFP-Tag. pDM323 HcpA (#P303): Das für die Ligation benötigte Insert wurde aus dem Vektor pJET1.2 HcpA Veltman Entry durch Verdau mit den Enzymen BamHI und SpeI, anschließende gelelektrophoretische Auftrennung und Aufreinigung mit dem NucleoSpin® Extract II Kit isoliert und in den mit BglII und SpeI verdauten und aufgereinigten Vektor pDM323 ligiert. Der Ligationsansatz wurde wie in Abschnitt 8.1.3 beschrieben in E. coli Zellen transformiert. Der Vektor pDM323 verfügt über einen C-terminalen GFP-Tag. pDM323 HcpA-K203R (#P304): Die Generierung des Plasmids erfolgte wie bei dem Vektor pDM323 HcpA, jedoch unter Verwendung des Klonierungsvektors pJET1.2 HcpA-K203R für die Isolation des gewünschten Inserts. Der Vektor pDM323 verfügt über einen C-terminalen GFP- Tag. pDM323 HcpB (#P305): Die Klonierung erfolgte ebenfalls analog zur Klonierung des Vektors pDM323 HcpA, wobei das für die Ligation benötigte Insert aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpB Veltman Entry durch Verdau mit den Enzymen BamHI und XbaI isoliert wurde. Durch die Ligation in den Zielvektor kommt es zum Verlust der BamHI-/BglII- sowie der XbaI-/SpeI- Schnittstellen. Der Vektor pDM323 verfügt über einen C-terminalen GFP-Tag. pDM323 HcpB-K222R (#P306): Die Klonierung erfolgte analog zur Klonierung des Vektors pDM323 HcpB, wobei das für die Ligation benötigte Insert aus dem Klonierungsvektor pJET1.2 HcpB-K222R Veltman Entry isoliert wurde. Der generierte Vektor verfügt über einen C- terminalen GFP-Tag.
77 7. Materialien pDM323 RbbD (DDB_G0282529) (#P210): Putative kleine CAF1-Untereinheit. Als Ausgangsvektor für die Klonierung diente der Vektor pJET1.2 RbbD (DDB_G0282529) ΔAAA Veltman Entry. Dieser wurde mit den Enzymen BamHI und NheI verdaut, das entsprechende DNA-Fragment gelelektrophoretisch aufgetrennt, aufgereinigt und in den mit den Enzymen BglII und SpeI präparierten Zielvektor ligiert. Der generierte Vektor verfügt über einen C- terminalen GFP-Tag und wurde durch Frau Sonja Kasten kloniert. pDM340 Dox-OFF (#P287): Für die Generierung des induzierbaren Plasmids pDM340 Dox-OFF (Veltman2 et al, 2009) wurde zunächst der rtTA-M2s* Transaktivator aus dem pDM340 Dox-ON Vektor entfernt, indem dieser mit dem Enzym NgoMIV verdaut und der Vektorbackbone isoliert wurde. Aus dem Vektor pDM309 Tet-Off rTA wurde ebenfalls durch Verdau mit dem Enzym NgoMIV der rTA Transaktivator isoliert, aufgereinigt, in den präparierten pDM340 Vektor ligiert und anschließend in E. coli Zellen transformiert. Klone wurden mittels Colony-PCR auf die Integration des rTA Transaktivators hin überprüft. Solche, die in der PCR positiv waren, wurden mit den Enzymen BglI und SalI im Orange-Puffer verdaut, um die korrekte Orientierung des Transaktivators zu überprüfen. Der generierte Vektor verfügt über einen C-terminalen GFP-Tag. pDM340 Dox-OFF HcpA (#P307): Der Vektor pDM340 Dox-OFF HcpA wurde durch den Transfer des durch Verdau mit den Enzymen BamHI und SpeI aus dem Vektor pJET1.2 HcpA Veltman Entry isolierten HcpA-Inserts in den BglII/SpeI verdauten und aufgereinigten Vektor pDM340 Dox-OFF generiert. Der Vektor verfügt über einen C-terminalen GFP-Tag.
SuvA-Klonierungsvektoren pGEM® T-easy SuvA cDNA Volllänge (#P183): Für die Generierung des Vektors wurde Gesamt- RNA wie in Abschnitt 8.2.5 beschrieben isoliert und in cDNA umgeschrieben (vgl. Abschnitt 8.2.20). Anschließend wurde die kodierende Region von SuvA mittels PCR amplifiziert und aufgereinigt (vgl. Abschnitte 8.2.18 und 8.2.9). Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung der Phusion-Polymerase (Thermo Fisher) bei einer Elongationstemperatur von 60°C, da die Sequenz häufig wiederholende Basenabschnitte wie z.B. das Triplett AAT aufweist, welches sich 39x wiederholt (vgl. unten). Da die Phusion-Polymerase blunt-Ends erzeugt und das Produkt in den pGEM® T-easy Vektor ligiert werden sollte wurde mittels A-tailing (vgl. Abschnitt 8.2.15) ein A-
78 7. Materialien
Überhang für die Klonierung in den mit einem T-Überhang versehenen Zielvektor angefügt. Anschließend erfolgten die Ligation in den Vektor pGEM® T-easy und die Transformation in E. coli Zellen. Die abschließende Sequenzierung zeigte die Deletion eines AAT-Tripplets im Bereich der Basen 3601-3717 (cDNA-Sequenz), welche jedoch lediglich zum kompletten Verlustes eines Asparagins führt. Da diese Mutation in unabhängigen PCR-Reaktionen beobachtet werden konnte liegt nahe, dass es sich hier um das Wildtyp-Allel des Stammes AX2 handelt, da die als Referenz für die Auswertung der Sequenzierung verwendeten Daten aus der Dictybase- Datenbank auf den Stamm AX4 referenzieren (Ogawa et al, 2000; Gloeckner et al, 2002; Sucgang et al, 2003; Eichinger et al, 2005). Die amplifizierte SuvA-Sequenz verfügt über kein Start-Codon und wird am 5´-Ende von einer BamHI- sowie am 3´-Ende von einer Bpu1102I- Schnittstelle flankiert. pJET1.2 SuvA gDNA-Fragment (#E0076): Die Generierung des Vektors erfolgte durch Amplifikation eines definierten Abschnitts des Gens SuvA. Für die Amplifikation wurden die Primer #2821 und #2822 sowie genomische DNA als Template verwendet. Das Amplifikat wurde nach der Aufreinigung in den Vektor pJET1.2 ligiert und verfügt über eine ClaI- und eine BaeI-Schnittstelle. pGEM® T-easy SuvA gDNA Volllänge (#P309): Der Vektor pGEM® T-easy SuvA gDNA Volllänge entstand durch Umklonierung des SuvA gDNA-Fragments des Vektors pJET1.2 SuvA gDNA- Fragment (#E0076) in den Vektor pGEM® T-easy unter Verwendung der Schnittstellen ClaI und BaeI. Das SuvA-Gen des Vektors kodiert für die gDNA des Gens in voller Länge, verfügt allerdings nicht über ein Start-Codon. pJET1.2 SuvA 5´-Fragment mit Kozak-Sequenz und ATG (#E0086): Die Klonierung des Vektors diente der Generierung eines Fragments in der 5´-Region des SuvA-Gens, welches über eine BamHI-Schnittstelle für die Umklonierung in Vektoren des Veltman-Systems und eine Kozak- Sequenz verfügt. Das Fragment wurde in den Vektor pJET1.2 SuvA Volllänge gDNA (#P311) umkloniert (vgl. auch Vektor #P290). Zudem ergänzt es das fehlende Start-Codon des Vektors pGEM® T-easy, welcher als Ausgangsvektor für die Herstellung eines gDNA-Volllänge- Konstruktes des SuvA-Gens diente.
79 7. Materialien pJET1.2 NdeI-Remove-Linker (#P310): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Generierung eines kurzen Fragments, welches durch die Schnittstellen SacI und SalI flankiert wird und der Entfernung der NdeI-Schnittstelle aus der MCS des Vektors pGEM® T-easy SuvA cDNA Volllänge (#P183) dient. pJET1.2 SuvA Volllänge gDNA (#P311): Der Vektor entstand durch die Umklonierung der SuvA gDNA Volllänge-Sequenz aus dem Vektor pGEM® T-easy SuvA gDNA Volllänge (#P309) in den Vektor pJET1.2. pJET1.2 SuvA Volllänge gDNA mit Kozak-Sequenz (AAA) und ATG (#P290): Der Vektor diente als Ausgangsvektor für den Transfer des SuvA-Volllänge-Konstruktes in Vektoren des Veltman- Vektor-Systems über die Schnittstellen BamHI und SpeI (NheI). Für die Herstellung des Vektors wurde die entsprechende Sequenz des Vektors pJET1.2 SuvA 5´-Fragment mit Kozak-Sequenz und ATG (#E0086) in den Vektor pJET1.2 SuvA Volllänge gDNA (#P311) kloniert. Aufgrund des noch vorhandenen Stop-Codons ist bei Verwendung des Vektors für die Umklonierung in Vektoren des Veltman-System nur die Generierung von Vektoren mit einem N-terminalen Tag möglich. pET15b-Vektoren pET15b HcpA K203Q (#P45): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Amplifikation der Gesamtsequenz des Gens HcpA aus dem Vektor pDNeo2 Gal4-DBD-cmyc HcpA K203Q (#P48) unter Verwendung der entsprechenden Primer und der anschließenden Aufreinigung und Ligation in den Vektor pJET1.2. Über die PCR-vermittelten Schnittstellen NdeI und BamHI wurde das Gen in den mit den gleichen Enzymen präparierten Vektor pET15b transferiert. Der Vektor verfügt über einen N-terminalen His-Tag. pET15b HcpA ΔCSD (#P156): Der Vektor pET15b HcpA ΔCSD dient der rekombinanten Expression eines trunkierten HcpA-Proteins, welches einen N-terminalen His-Tag aufweist, am C-Terminus aber um die Chromo-Shadow-Domäne trunkiert ist. Für die Klonierung des Vektors wurde die entsprechende Sequenz mit den Primern #2565 und #2566 unter Verwendung genomischer DNA amplifiziert, aufgereinigt und zunächst in den Vektor pJET1.2 ligiert. Nach Selektion positiver Klone und nachfolgender Sequenzierung wurde die trunkierte Sequenz mit
80 7. Materialien den Enzymen NdeI und BamHI aus dem pJET1.2-Vektor isoliert, aufgereinigt und in den ebenfalls mit den Enzymen NdeI und BamHI präparierten Vektor pET15b ligiert. pET15b SuvA Volllänge (#E0050): Für die Klonierung des Vektors wurden die Plasmide pGEM® T-easy SuvA cDNA Volllänge und pET15b mit den Plasmiden BamHI und Bpu1102I verdaut und die entsprechenden Fragmente gelelektrophoretisch aufgetrennt, isoliert und aufgereinigt. Anschließend wurde das Insert in den Vektor ligiert und in E. coli Zellen transformiert. Der generierte Vektor kodiert die SuvA cDNA, verfügt über einen N-terminalen His-Tag und hat kein Start-Codon. pET15b DDB_G0287815 deltaCAA (#E0070): Der Vektor pET15b DDB_G0287815 deltaCAA dient der rekombinanten Expression der putativen großen Untereinheit des CAF1-Komplexes. Für die Klonierung wurde der Vektor pJET1.2 DDB_G0287815 cDNA deltaCAA (#P314) mit den Enzymen NdeI und BamHI verdaut und das isolierte Insert nach der gelelekrophoretischen Auftrennung und Aufreinigung in den ebenfalls mit den Enzymen NdeI und BamHI präparierten Vektor pET15b ligiert. Der Vektor verfügt über einen N-terminalen 6xHis-Tag. pGEX-6P-3 Vektoren pGEX-6P-3 HcpA (#P159): Die Klonierung des Vektors erfolgte durch Amplifikation der Gesamtsequenz für HcpA mit den Primern #2592 (HcpA BamHI pGEX) und #1204 (HP4) aus dem Vektor pET15b HcpA. Das PCR-Produkt wurde anschließend gelelektrophoretisch Aufgetrennt, unter Verwendung des NucleoSpin® Extract II-Kits laut Herstellerangaben aufgereinigt und in den Vektor pGEM® T-easy ligiert. Einzelklone wurden auf die Integration des Gens hin untersucht und sequenziert. Die HcpA-Sequenz wurde über ihre Primer-generierten flankierenden BamHI-Sequenzen ausgeschnitten, gelelektrophoretisch isoliert und aufgereinigt und in den Zielvektor pGEX-6P-3 ligiert. Da die Ligation ungerichtet erfolgte wurden Einzelklone der Ligation mittels Restriktionsverdau auf ihre Orientierung hin untersucht. Der generierte Vektor verfügt über einen N-terminalen GST-Tag. Die Generierung des Vektors erfolgte durch Frau Sonja Kasten.
81 7. Materialien pGEX-6P-3 HcpA K203R (#P161): Der Vektor pGEX-6P-3 HcpA K203R wurde analog zum Vektor pGEX-6P-3 HcpA genriert, als Template für die PCR wurde in diesem Fall der Vektor pET15b HcpA K203R verwendet. Die Generierung des Vektors erfolgte durch Frau Sonja Kasten. pGEX-6P-3 HcpA K203Q (#P160): Der Vektor pGEX-6P-3 HcpA K203Q wurde analog zur Generierung des Vektors pGEX-6P-3 HcpA erstellt, als Template für die PCR wurde in diesem Fall der Vektor pET15b HcpA K203Q verwendet. Die Generierung des Vektors erfolgte durch Frau Sonja Kasten.
CAF1-Klonierungsvektoren pJET1.2 RbbD (DDB_G0282529) cDNA (#P312): Der generierte Vektor kodiert für die cDNA- Sequenz der putativen kleinen Untereinheit des CAF1-Komplexes. Die kodierende Sequenz wurde durch Verwendung von cDNA sowie der Primer #2800 und #2801 amplifiziert. Flankiert wird die Sequenz durch die Restriktionsschnittstellen NdeI und BamHI. pJET1.2 RbbD (DDB_G0282529) gDNA deltaAAA (#P313): Der klonierte Vektor kodiert für die gDNA-Sequenz der putativen kleinen CAF1-Untereinheit. Die Generierung erfolgte durch Amplifikation der kodierenden Sequenz mit den Primern #2800 und #2801 aus genomischer DNA und anschließende Aufreinigung und Ligation in den Vektor pJET1.2. Die Sequenzierung des Vektors zeigte eine AAA-Deletion im Intron-Bereich und eine Punktmutation an der Basenposition 180 (stille Mutation: GAA>GAG). Zudem zeigte die erste Sequenzierung eine Punktmutation an der Basenposition 420 (G>A), welche zum Austausch der kodierten Aminosäure führen würde (E110K). Diese Mutation konnte in der Resequenzierung aber nicht bestätigt werden. Der Vektor verfügt über eine NdeI- und eine BamHI-Schnittstelle. pJET1.2 DDB_G0287815 cDNA deltaCAA (#P314): Der generierte Vektor kodiert für die putative große Untereinheit des CAF1-Komplexes. Die Amplifikation der kodierenden Sequenz erfolgte unter Verwendung der Primer #2797 und #2798 und genomischer DNA als Template. Die Sequenzierung des Vektors zeigte die Deletion eines CAA-Motivs im Bereich der Basen 1308 und 1406 (Region mit CAA-Repeats) in der kodierenden Sequenz, welche aber auch beim Plasmid #P315 auftaucht und vermutlich auf Sequenzunterschiede zwischen den Stämmen AX2
82 7. Materialien und AX4 zurückzuführen ist. Die kodierende Sequenz wird von einer NdeI- und einer BamHI- Restriktionsschnittstelle flankiert. pJET1.2 DDB_G0287815 gDNA deltaTT (#P315): Der klonierte Vektor kodiert für die gDNA- Sequenz der putativen großen CAF1-Untereinheit. Die kodierende Sequenz wurde unter Verwendung von gDNA sowie der Primer #2797 und #2798 amplifiziert, aufgereinigt und in den Vektor pJET1.2 ligiert. Die nachfolgende Sequenzierung zeigte eine Deletion zweier Basen im Intron-Bereich (TT-Deletion). Über die verwendeten Primer wurden am 5´- und 3´-Ende des kodierenden Bereichs die Schnittstellen NdeI und BamHI eingefügt.
7.14 Biologische Stämme
7.14.1 Bakterien-Stämme
• E. coli DH5αTM (Hanahan, 1983) (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) • E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) • E. coli BL21DE3 Rosetta (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Deutschland) • E. coli BL21DE3 pLysS (Promega, Mannheim, Deutschland) • Klebsiella aerogenes (Williams & Newell, 1976) (Universität Kassel, Kassel, Deutschland)
7.14.2 Dictyostelium discoideum-Stämme
7.14.2.1 Stämme aus vorherigen Arbeiten
Tabelle 7.4 – Dictyostelium discoideum Stämme aus anderen Arbeiten: die nachfolgenden Stämme wurden im Zuge anderer Arbeiten generiert und fanden Anwendung als Referenz- oder Ausgangsstämme für eigene Experimente und Transformationen.
Stamm Urheber AX2 Watts & Ashworth, 1970 AX2-N-TAP Moog, 2011 HcpB N-TAP Klon #9 Földesi, 2010 ΔHcpA rox Klon #1 Kaller, 2006
83 7. Materialien
ΔHcpB (HP2-ko) Klon #1.1 Kaller, 2006 ΔHcpA HcpA-GFP Klon #21 Kaller, 2006 pDNeo SuvA-myc Dubin, 2011
7.14.2.2 Generierte Stämme der vorliegenden Arbeit
Tabelle 7.5 – Dictyostelium discoideum Stämme, die im Rahmen dieser Arbeit generiert wurden: die nachfolgenden Stämme wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit aus den in Tabelle 7.4 genannten Stämmen erzeugt. (P) = Population.
Stamm pN-TAP HcpA Klon #2 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pN-TAP HcpA Stamm pN-TAP HcpB Klon #1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pN-TAP HcpB Stamm ΔHcpA hHP1α-GFP Klon #1.1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor ΔHcpA rox Klon #1 pDNeo2a hHP1α-GFP Stamm ΔHcpA hHP1α-GFP Klon #2.4 Ausgangsstamm Transformierter Vektor ΔHcpA rox Klon #1 pDNeo2a hHP1α-GFP Stamm ΔHcpA pDM340 Dox-OFF GFP-HcpA (P) Ausgangsstamm Transformierter Vektor ΔHcpA rox Klon #1 pDM340 Dox-OFF GFP-HcpA Stamm ΔHcpAB pDM340 Dox-OFF GFP-HcpA (P aus EP1/EP2) Ausgangsstamm Transformierter Vektor ΔHcpA pDM340 Dox-OFF GFP-HcpA (P) pGEM7z HcpB KO Stamm Gal4-DBD Klon #1.2 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc Stamm Gal4-DBD Klon #2.9
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Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc Stamm Gal4-DBD myc-HcpA Klon #1.3 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpA Stamm Gal4-DBD myc-HcpA Klon #2.1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpA Stamm Gal4-DBD myc-HcpA-K203R Klon #1.1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpA K203R Stamm Gal4-DBD myc-HcpA -K203R Klon #2.2 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpA K203R Stamm Gal4-DBD myc-HcpA-K203Q Klon #1.17 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpA K203Q Stamm Gal4-DBD myc-HcpA-K203Q Klon #2.1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpA K203Q Stamm Gal4-DBD myc-HcpB Klon #1.1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpB Stamm Gal4-DBD myc-HcpB Klon #2.5 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpB Stamm Gal4-DBD myc-HcpB-K222R Klon #1.2 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpB K222R Stamm Gal4-DBD myc-HcpB-K222R Klon #2.5 Ausgangsstamm Transformierter Vektor
85 7. Materialien
AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpB K222R Stamm Gal4-DBD myc-HcpB-K222Q Klon #1.8 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpB K222Q Stamm Gal4-DBD myc-HcpB-K222Q Klon #2.9 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc HcpB K222Q Stamm Gal4-DBD myc-hHP1α Klon #1.17 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc hHP1α Stamm Gal4-DBD myc-hHP1α Klon #2.1 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a Gal4-DBD cmyc hHP1α Stamm ΔHcpB hHP1α-GFP Klon #11 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a hHP1α-GFP Stamm ΔHcpB hHP1α-GFP Klon #13 Ausgangsstamm Transformierter Vektor AX2 pDNeo2a hHP1α-GFP
7.15 Puffer und Lösungen (alphabetisch)
• 5x Probenpuffer incomplete (Co-Immunpräzipitation) 310mM Tris HCl pH 6.8 10% (w/v) SDS 50mM Glycerin 0,18% (w/v) Bromphenolblau ad ddH2O auf 100ml
• 5x Probenpuffer complete (Co-Immunpräzipitation) 10ml 5x Probenpuffer incomplete 1ml ß-Mercaptoethanol ad ddH2O auf 50ml
86 7. Materialien
• AP-Puffer 100mM Tris-HCl pH 9.5 100mM NaCl 5mM MgCl2
• APS (10%)
10% (w/v) APS in ddH2O
• BCIP (50mg/ml) 50mg BCIP in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF)
• Blockierlösung (5%) 5% (w/v) Milchpulver in 1x PBS
• CoIP-Lysepuffer (Co-Immunpräzipitation) 10mM Tris HCl pH 7.5 150mM NaCl 0,5mM EDTA 0,5% (v/v) NP40 25mM MgCl2 ad ddH2O vor Gebrauch wurde ein Protease Inhibitor in Form einer Complete Mini Tablette (Roche) je 10ml Puffer hinzugeben
• CoIP-Waschpuffer (Co-Immunpräzipitation) 10mM Tris HCl pH 7.5 150mM NaCl 0,5mM EDTA 25mM MgCl2 ad ddH2O
• Coomassie-Lösung 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250 2% (v/v) Phosphorsäure 5% (w/v) Ammoniumsulfat ad ddH2O
• Coomassie-Lösung (kolloidal) 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250 2% (v/v) Phosphorsäure 5% (w/v) Aluminiumsulfat ad ddH2O
87 7. Materialien
• Denaturierungslösung (Southern Blot) 0,5M NaOH 1,5M NaCl
• Denhardt-Lösung (100x) 2% (v/v) Ficoll 2% (w/v) Polyvinylpyrrolidone 2% (w/v) BSA ad ddH2O
• Denhardt-Puffer (Southern Blot) 5x Denhardt-Lösung 5x SSC 50% (v/v) Formamid 1% (w/v) SDS 120mM Phosphatpuffer pH 6.7 ad ddH2O
• Dilution-Puffer (ChIP) 20mM Tris HCl pH 7.0 150mM NaCl 3mM MgCl2 ad ddH2O
• DNA-Auftragungspuffer 10mM Tris HCl pH 7.6 60% Glycerol (v/v) 0,03% Bromphenolblau (w/v) 0,03% Xylencyanol (w/v)
• Elutions-Puffer (ChIP) 20mM Tris HCl pH 7.0 150mM NaCl 3mM MgCl2 ad ddH2O
• EP-Puffer
10mM Na2HPO4 50mM Sucrose in ddH2O lösen pH-Wert auf pH 6.1 einstellen sterilfiltrieren
88 7. Materialien
• Ethidiumbromid-Lösung 10mg/ml Ethidiumbromid in TBE-Puffer
• gDNA-Kernlysepuffer 0,3% (w/v) SDS in TE-Puffer
• gDNA-Zelllysepuffer 50mM HEPES pH 7.5 40mM MgCl2 20mM KCl 5% (w/v) Saccharose
• gDNA-Zelllysepuffer (low scale DNA Isolation) 0,7% (w/v) SDS in TE-Puffer
• Gevatol
0,1M KH2PO4 0,1 Na2HPO4 Einstellung des pH-Wertes auf 7.2 Lösung 1:10 verdünnen 20g Polyvinylalkohol zugeben und ÜN durch rühren lösen 40ml Glycerin zugeben und ÜN durch rühren lösen 15min/12.000rcf zentrifugieren Überstand abnehmen und mit 25µg/ml DABCO versetzen
• GFP-Lysepuffer (GFP-Pulldown) 10mM Tris-HCl pH 7.5 150mM NaCl 0,5mM EDTA 0,5% (v/v) NP40 25mM MgCl2 Protease Inhibitor: in Form einer Complete Mini Tablette (Roche) je 10ml Puffer vor Gebrauch frisch hinzugeben
• GFP-Waschpuffer (GFP-Pulldown) 10mM Tris-HCl pH 7.5 150mM NaCl 0,5mM EDTA 25mM MgCl2
• Glycin-Lösung (1,25mM)
1,25mM Glycin in ddH2O
89 7. Materialien
• GST-Bindungspuffer I (GST-Dimerisierungsassay / GST-Pulldownassay) 20mM Tris-HCl pH 7.9 125mM NaCl 5mM MgCl2 0,1mM PMSF 0,5mM DTT
• GST-Bindungspuffer II (GST-Dimerisierungsassay / GST-Pulldownassay) 20mM Tris-HCl pH 7.9 125mM NaCl 5mM MgCl2 0,1mM PMSF 0,5mM DTT 10% (v/v) Glycerol 0,1% (v/v) NP-40
• GST-Elutionspuffer I (GST-Dimerisierungsassay / GST-Pulldownassay) 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 5 mM reduced Glutathione
• Laemmli-Puffer pH 6.8 (10x) 0,2M Tris-HCl 33% (w/v) Glycin 6,7% (w/v) SDS 16,7% (v/v) ß-Mercaptoethanol 10mg/ml Bromphenolblau
• Lyse-Puffer (ChIP) 20mM Tris HCl pH 7.0 150mM NaCl 0,5% (v/v) NP40 3mM MgCl2 ad ddH2O Protease Inhibitor: in Form einer Complete Mini Tablette (Roche) je 10ml Puffer oder in Form von PMSF vor Gebrauch frisch hinzugeben
• NBT (75mg/ml) 75mg NBT in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder 70% Dimethyl- formamid (DMF)
• Neutralisierungslösung (Southern Blot) 1,5M NaCl 0,5M Tris-HCl pH 7.0
90 7. Materialien
• Ni-NTA-Elutionspuffer (His-Dimerisierungsassay / His-Pulldownassay) 250mM Imidazol 300mM NaCl
• Ni-NTA-Startpuffer (His-Dimerisierungsassay / His-Pulldownassay) 10mM Imidazol 300mM NaCl vor Gebrauch wurde ein Protease Inhibitor in Form einer Complete Mini Tablette (Roche) je 10ml Puffer hinzugeben
• Ni-NTA-Waschpuffer I (His-Dimerisierungsassay / His-Pulldownassay) 20mM Imidazol 300mM NaCl um unspezifische Bindungen zu reduzieren kann die NaCl-Konzentration auf 150mM verringert werden
• Ni-NTA-Waschpuffer II (His-Dimerisierungsassay / His-Pulldownassay) 50mM Imidazol 300mM NaCl um unspezifische Bindungen zu reduzieren kann die NaCl-Konzentration auf 150mM verringert werden
• NP40-Lösung (10%)
10% (w/v) NP40 in ddH2O
• OLB-Mix (5x / Southern Blot) 100µl 1M Tris/Cl pH 7,5 12,5µl 1M MgCl2 1,7µl ß-Mercaptoethanol 2,5µl 50mM dCTP 2,5µl 50mM dGTP 2,5µl 50mM dTTP 250µl 2M Hepes pH 6.6 150µl 90 A260 Units/ml Oligos (PL)
• PBG 0,5% BSA 0,045% Fischgelatine
• PBS (10x) 1,37M NaCl 27mM KCl 81mM Na2HPO4 15mM KH2PO4
91 7. Materialien
ad ddH2O
• PFA (1%) 1% (w/v) Paraformaldehyd in Phosphatpuffer lösen durch schütteln und erhitzen bei maximal 60°C
• Pikrinsäure-PFA-Fixativ
0,2g PFA in 3,2ml ddH2O lösen, auf 40°C erwärmen, mit 2M NaOH lösen 5ml 20mM PIPES-Puffer zugeben 1,5ml gesättigte Pikrinsäure zugeben pH-Wert mit 3,7% HCl auf 6.0 einstellen
• Proteinase K-Puffer (ChIP) 250mM EDTA 1M Tris HCl pH 7.0 ad ddH2O
• Proteingel-Laufpuffer (10x) 0,3% (w/v) Tris-HCl 1,44% (w/v) Glycin
• PIPES (20mM) 20mM PIPES in ddH2O pH 6.0 mit 37% HCl einstellen ad ddH2O
• RIPA-Puffer (ChIP) 50mM Tris HCl pH 7.5 150mM NaCl 0,5% (v/v) NP40 0,5% (w/v) Sodium Deoxycholat 1mM EDTA 0,1% (w/v) SDS ad ddH2O
• RNA-Auftragspuffer (3x) 950µl Formamid 50µl 0,5M EDTA Spatelspitze Bromphenolblau Spatelspitze Xylencyanol
• Sammelgel-Puffer (SDS-PAGE) 0,5M Tris-HCl
92 7. Materialien
0,4% (w/v) SDS in ddH2O lösen pH 6.8 einstellen ad ddH2O
• Semi-dry Blotting Puffer pH 8.4 (Western Blot) 48mM Tris-HCl 39mM Glycin 0,0375% (w/v) SDS 20% (v/v) Methanol ad ddH2O
• Soerensen Phosphatpuffer
2mM Na2HPO4 15mM KH2PO4 in ddH2O lösen autoklavieren
• SSC-Puffer (20x) 3M NaCl 0,3M Natriumcitrat
• TAP-Lyepuffer (Tandem Affinity Purification) 10mM Tris HCl pH 8.0 400mM KCl 100mM Galaktose 1% (v/v) Triton X-100 ad ddH2O vor Gebrauch wurde ein Protease Inhibitor in Form von einer Complete Mini Tablette (Roche) je 10ml Puffer hinzugeben
• TAP-Waschpuffer (Tandem Affinity Purification) 10mM Tris HCl pH 8.0 400mM KCl 100mM Galaktose 0,1% (v/v) NP40 ad ddH2O
• TBE-Puffer (5x) 445mM Tris 445mM Borsäure 10mM EDTA • TE-Puffer 10mM Tris
93 7. Materialien
in ddH2O lösen pH8.0 mit 37% HCl einstellen 1mM EDTA ad ddH2O
• TEV-Cleavage Puffer (Tandem Affinity Purification) 10mM Tris HCl pH 8.0 400mM KCl 0,1% (v/v) NP40 0,5mM EDTA 1mM DTT
• Trenngel-Puffer (SDS-PAGE) 1,5M Tris-HCl 0,4% (w/v) SDS in ddH2O lösen pH 8.8 einstellen ad ddH2O auf finales Volumen
• Waschlösung I (Southern Blot) 2x SSC 0,1% (w/v) SDS
• Waschlösung II (Southern Blot) 0,2x SSC 0,1% (w/v) SDS
• Wasch-Puffer (ChIP) 100mM Tris HCl pH 7.0 150mM KCl 2mM MgCl2 ad ddH2O
• Wet-Blotting-Puffer (1x / Western Blot) 25mM Tris-HCl 192mM Glycine ad ddH2O
7.16 Sequenzen
Nachfolgende DNA- und Protein-Sequenzen wurden für die Planung von Klonierungen sowie Sequenz- und Verwandtschaftsanalysen verwendet.
94 7. Materialien
Tabelle 7.6 – Ursprung verwendeter DNA-Sequenzen: Die nachfolgende Tabelle zeigt eine Auflistung der Datenbanken und Identifikationsbezeichnungen, unter denen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für Analysen oder die Planung von Klonierungen bezogen wurden.
Gen Datenbank-ID Datenbank Dictyostelium discoideum hcpA DDB_G0283023 Dictybase Dictyostelium discoideum hcpB DDB_G0282987 Dictybase Dictyostelium discoideum suvA DDB_G0269554 Dictybase Dictyostelium discoideum rbbD DDB_G0282529 Dictybase Dictyostelium discoideum putative CAF1 DDB_G0287815 Dictybase Subunit A Dictyostelium discoideum putative CAF1 DDB_G0269800 Dictybase Subunit B Drosophila melanogaster CAF1 – CAF1p180 FBpp0071172 Flybase Drosophila melanogaster CAF1 – CAF1p105 FBgn0033526 Flybase Drosophila melanogaster CAF1 – CAF1p55 FBpp0082511 Flybase Drosophila melanogaster Su(var)205 (HP1) FBgn0003607 Flybase Mus musculus Chaf1A MGI:1351331 MGI Saccharomyces cerevisiae CAF1A (RLF2/CAC1) YPR018W Saccharomyces Genome DB Saccharomyces cerevisiae CAF1B (CAC2) YML102W Saccharomyces Genome DB Saccharomyces cerevisiae CAF1C (MSI(CAC3) YBR195C Saccharomyces Genome DB Homo sapiens HP1α NM_001127322 NCBI
7.17 Programme und Datenbanken
7.17.1 Installations-Programme
• Geneious 5.3.3 (Biomatters, Auckland, Neuseeland) • Photoshop CS5 12.0.4 (Adobe, San Jose, USA) • Illustrator CS5 15.0.2 (Adobe, San Jose, USA) • Office:Mac 2011 (Microsoft, Richmond, USA) • ClustalW 2.1 (Larkin et al., 2007; University of Dublin, Dublin, Irland) • Scaffold 4.3.4 (Proteomesoftware, Portland, USA) • Scaffold PTM 2.1.3 (Proteomesoftware, Portland, USA)
95 7. Materialien
7.17.2 Online-Programme
• Oligo Calc 3.26 (Northwestern University, Evanston, USA) http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html • Reverse Complement (University of Alberta, Edmonton, Kanada) http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html • Primer3 (National Human Genome Research Institute, Bethseda, USA)) http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ • Isoschizomere Finder (New England Biolabs, Whitby, Kanada) http://www.neb.ca/finder_iso.php • DoubleDigest (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) http://www.thermoscientificbio.com/webtools/doubledigest/ • Peptide Mass Calculator (PeptideSynthetics, Fareham, England) http://www.peptidesynthetics.co.uk/tools/
7.17.3 Datenbanken
Nachfolgende Datenbanken wurden für die Suche nach Sequenzen, Annotationen oder Sequenzanalysen genutzt: • Dictybase: http://www.dictybase.org (Kreppel et al., 2004) • ExPASy: http://www.expasy.org (Artimo et al., 2012) • Flybase: http://flybase.org (St Pierre et al, 2014) • GeneOntology: http://www.geneontology.org (The Gene Ontology Consortium, 2000) • Mouse Genome Database: http://www.informatics.jax.org (Blake et al., 2014) • NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Geer et al., 2010) • PTM DataBase: http://dbptm.mbc.nctu.edu.tw (Lu et al., 2013) • Saccharomyces Genome Database: http://www.yeastgenome.org (Cherry et al., 2012) • InterPro: http://www.ebi.ac.uk/interpro/ (Mitchel et al., 2011) • UniProt: http://www.uniprot.org/ (Jain et al., 2009)
96 8. Methoden
8. Methoden
8.1. Zellbiologische Methoden
8.1.1 Anzucht von E. coli Zellen
E. coli Zellen wurden bei 37°C in LB-Medium in kontinuierlicher Schüttelkultur kultiviert. Dem Medium wurden Antibiotika in den in Abschnitt 7.8 beschriebenen Konzentrationen zugefügt. Zellen auf LB-Agar-Platten wurden mit dem entsprechenden Antibiotikum bei 37°C im Brutschrank inkubiert und anschließend bei 4°C gelagert. Sofern von diesen Kultivierungsbedingungen abgewichen wurde wird dies in den entsprechenden Abschnitten erwähnt.
8.1.2 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen
Für die Herstellung chemisch kompetenter Zellen nach der Calciumchlorid-Methode (Oishi & Cosloy, 1972) wurde eine 5ml Vorkultur des entsprechenden E. coli Stammes in LB-Medium auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 37°C und 200rpm über Nacht (ÜN) inkubiert. Am Folgetag wurde eine Hauptkultur von 100ml LB-Medium mit 2ml der Vorkultur inokuliert und bei 37°C und 200rpm inkubiert. Bei erreichen einer OD595 von 0,3-0,4 wurden die Zellen in zwei vorgekühlte 50ml Reaktionsgefäße überführt, 7min bei 4000rcf/4°C pelletiert und das Pellet des einen Reaktionsgefäßes vorsichtig in 20ml eiskalter 50mM CaCl2-Lösung resuspendiert. Die Lösung mit den resuspendierten Zellen wurde dann in das zweite Reaktionsgefäß überführt und das zweite Pellet ebenfalls vorsichtig resuspendiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß erneut für 5min bei 4000rcf/4°C zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden wiederholt vorsichtig in 20ml eiskalter 50mM CaCl2-Lösung resuspendiert und für 30min auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen für 5min bei
4000rcf/4°C abzentrifugiert und das Pellet in 2ml eiskalter 50mM CaCl2-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann in vorgekühlte 1,5ml Reaktionsgefäße zu je 100-200µl aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C aufbewahrt.
97 8. Methoden
8.1.3 Transformation von E. coli Zellen
Die Transformation von Plasmiden in kompetente E. coli Zellen erfolgte mit der Hitzeschock- Methode (Oishi & Cosloy, 1972; Cohen et al., 1972). Hierfür wurden chemisch kompetente Zellen der unter 7.11.1 aufgeführten Stämme in einem 1,5ml Reaktionsgefäß auf Eis aufgetaut. Anschließend wurde im Falle einer Retransformation 1µg Plasmid-DNA zu 70- 100µl kompetenter Zellen in das Reaktionsgefäß gegeben, gemischt und die Suspension für 10-15min auf Eis gestellt. Bei einer Ligation wurde analog zum beschriebenen Vorgehen der gesamte Ligationsansatz oder alternativ 5µl bzw. 15µl des Ligationsansatzes eingesetzt. Für die Aufnahme der DNA wurden die Zellen für 90 Sekunden bei 42°C in einen Heizblock und anschließend erneut für 60 Sekunden auf Eis gestellt. Nach Ablauf der Zeit wurde 1ml Antibiotika-freies LB-Medium zu der Suspension gegeben, diese für ca. 30 Minuten bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert, für 5 Minuten bei 4000rcf/RT zentrifugiert und das resuspendierte Pellet auf einer LB-Platte, welche das entsprechende Antibiotikum enthält, ausplattiert.
8.1.4 Herstellung von Klebsiella aerogenes Platten (KA-Platten)
Für die Herstellung von KA-Platten wurden 200µl KA-Suspension auf einer SM-Agar-Platte ausplattiert und im Brutschrank über Nacht bei 30°C inkubiert. Am Folgetag wurden die Platten für weitere 6-8h bei 22°C gelagert und anschließend bei 4°C bis zum weiteren Gebrauch gelagert.
8.1.5 Kultivierung von Dictyostelium discoideum Zellen
Dictyostelium discoideum Zellen wurden bei einer Temperatur von 22°C unter Dauerlicht in axenischem Medium kultiviert (Sussman & Sussman, 1967). Bei in Petrischalen kultivierten Zellen erfolgte alle zwei Tage ein Mediumwechsel, wobei angewachsene Zellen mit dem auszuwechselnden Medium abgespült wurden, bevor frisches Medium in die Petrischale gegeben wurde. Die Kultivierung in Erlenmeyerkolben erfolgte auf horizontalen Rotationsschüttlern bei einer Umdrehung von 150rpm, wobei die Dichte der Zellkultur mittels Zellzähler regelmäßig bestimmt und bei einer Dichte von 1x105 bis 5x106 Zellen/ml
98 8. Methoden
Medium gehalten wurde. Beim Erreichen einer Dichte von 5x106 Zellen/ml wurde zur Verdünnung der Kultur Medium zugegeben oder eine neue Kultur angesetzt. Zelldichten, die von dem oben beschriebenen Dichtebereich abweichen, werden in den entsprechenden Experimenten erwähnt.
8.1.6 Transformation von Dictyostelium discoideum Zellen
Für die Transformation von intra- oder extrachromosomaler DNA in Dictyostelium discoideum Zellen (Gaudet et al., 2007) wurden 2x107 Zellen einer axenisch gewachsenen Kultur in einem geeigneten Reaktionsgefäß für 10min auf Eis gelagert und anschließend bei 370rcf/4°C für 5min pelletiert. Im Anschluss wurde das Pellet mit 10ml EP-Puffer gewaschen und die Zellen erneut wie beschrieben abzentrifugiert. Der Puffer wurde dekantiert und der im Reaktionsgefäß verbleibende Puffer mit einer Pipette abgenommen. Nach Resuspension des Pellets in 700µl EP-Puffer wurden die Zellen in eine EP-Küvette überführt, 10µg der zu transformierenden DNA zugegeben und die Küvette für 10min auf Eis gelagert. Nach der Inkubation erfolgte nach kurzer Durchmischung der Suspension die Elektroporation unter Verwendung eines GenePulser® (BioRad) bei einer elektrischen Spannung von 1kV und einer Kondensatorkapazität von 25µF. Die EP-Küvette wurde erneut für 10min auf Eis gelagert und die gesamte Suspension anschließend zur Regeneration in eine Petrischale mit 8µl sterilem
100mM MgCl2 und 8µl sterilem 100mM CaCl2 gegeben und 30min inkubiert. Nach Ablauf der 30min wurden 10ml HL5+-Medium zu den Zellen gegeben. Das Medium wurde am Folgetag gegen ein entsprechendes Selektionsmedium ausgetauscht. Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei 22°C und Dauerlicht. War die Identifikation von Einzelklonen notwendig wurden angewachsene Klone wie unter 8.1.7 beschrieben subkloniert.
8.1.7 Subklonierung von Dictyostelium discoideum Zellen
Um Klone einer unter 8.1.6 beschriebenen Transformation zu vereinzeln wurde das Medium aus der Petrischale entfernt, die Zellen mit 1ml Soerensen-Phosphatpuffer abgespült und 20µl der Suspension in einer Verdünnungsreihe von 1:10 bis 1:100.000 verdünnt, wobei die Verdünnung in 200µl KA-Suspension erfolgte, welche in entsprechenden 1,5ml-Gefäßen vorgelegt wurde. Die Verdünnungen wurden auf SM-Agar-Platten ausplattiert und bei 22°C
99 8. Methoden gelagert. Nach der Bildung von Plaques wurden mit einem sterilem Zahnstocher Zellen vom Rand der Plaques entnommen und in eine 24er Multiwellplatte mit 1ml des entsprechenden Mediums überführt und bei 22°C unter Dauerlicht kultiviert.
8.1.8 Herstellung von Sporen-Suspensionen
Für die Gewinnung von Sporen wurden 1,5x108 Zellen einer Schüttelkultur mit einer Zelldichte von ca. 5x106 Zellen/ml in einem geeigneten Reaktionsgefäß bei 370rcf/4°C für 5min pelletiert. Die Zellen wurden 1x mit 10ml sterilem Phosphatpuffer gewaschen und erneut wie beschrieben pelletiert. Das Zellpellet wurde in 500µl Phosphatpuffer aufgenommen und die Zellen auf einer Phosphat-Agar-Platte ausplattiert. Nach dem Verdunsten des Phosphatpuffers wurde die Platte bis zur Nährstoffmangel bedingten Auslösung des Entwicklungszyklus und der damit verbundenen Ausbildung von Fruchtkörpern bei 22°C und Dauerlicht gelagert. Nach der Ausbildung der Fruchtkörper wurden diese durch abklopfen in den Deckel der Petrischale mit 1ml Phosphatpuffer geerntet und in ein Cryo-Gefäß überführt. Die Sporen wurden entweder direkt in flüssigem Stickstoff gelagert oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt.
8.1.9 Wachstumsassay
Für die Durchführung eines Wachstumsassays wurden Zellen aus einer Schüttelkultur mit einer Zelldichte von ca. 2x106 Zellen/ml, welche beim Überführen von stationärer in Schüttelkultur eine Anfangsdichte von ca. 2x105 Zellen/ml besaß, auf eine Zelldichte von 1x105 Zellen/ml herunterverdünnt. Für die Durchführung des Assays wurde HL5+-Medium verwendet. Die mittels Zellzähler gemessene Zelldichte durfte dabei um +/- 0,05x105 Zellen/ml variieren. Nach der Verdünnung wurde in regelmäßigen Abständen die Zelldichte mit einem Zellcounter bestimmt, bis eine Zelldichte 1x107 Zellen/ml erreicht wurde.
8.1.10 Mikroskopie Pikrinsäure-PFA-fixierter Zellen
Für die Anfertigung von Pikrinsäure-PFA-fixierten Präparaten (Humbel & Biegelmann, 1992) wurden ca. 3-5x105 Zellen einer Schüttelkultur mit einer Dichte von ca. 1x106 Zellen/ml oder
100 8. Methoden
Zellen von einer Petrischale auf mit 3,7% HCl vorbehandelte runde Deckgläschen gegeben. Nach dem Absitzen der Zellen für 20-30min in einer mit feuchtem Whatman-Papier ausgelegten Plastikkammer wurde das Medium entfernt und die Zellen 2x für 10-15min mit 300µl sterilem Phosphatpuffer gewaschen, um den Zellen das Ausscheiden autofluoreszierender Partikel aus dem Medium zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen mit 250µl Pikrinsäure-PFA-Fixativ für maximal 30min bei Raumtemperatur (RT) in der abgedunkelten Plastikkammer fixiert. Alle nachfolgend beschriebenen Schritte wurden ebenfalls in einer abgedunkelten Kammer bei RT durchgeführt. Nach 30min wurde das Fixativ entfernt, die Deckgläschen kurz in einem Becherglas mit 10mM PIPES pH 6.0 und PBS/Glycin pH 7.4 getaucht und anschließend für 5min mit 300µl PBS/Glycin überschichtet. Dieser Waschschritt wurde 1x wiederholt. Um die Zellmembran für Antikörper permeabel zu machen wurden die Zellen für 10min mit 300µl 70% Ethanol inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Deckgläschen 2x für 5min mit 300µl PBS/Glycin pH7.4 gewaschen. Anschließend wurde das PBS/Glycin abgenommen, durch 300µl PBG ersetzt und für 15min inkubiert. Die Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte unter Verwendung der entsprechenden Verdünnung in einem Volumen von 200µl bei RT über Nacht. Am Folgetag wurde das Präparat nach der Entfernung des Primärantikörpers 6x für jeweils 5min mit 300µl PBG gewaschen und anschließend mit 200µl des im entsprechenden Verhältnis in PBG verdünnten Sekundärantikörpers für 2h bei RT inkubiert. Anschließend wurde der Sekundärantikörper entfernt und das Präparat 3x für 5min mit 300µl PBG sowie weitere 2x für 5min mit 300µl PBS gewaschen. Abschließend wurden die Deckgläschen in einem
Becherglas mit ddH2O gespült und auf einem Objektträger mit einem Tropfen Gevatol eingedeckelt und ÜN bei 4°C gelagert. Um Zellen, die ein Fluorophor-getaggtes Fusionsprotein exprimieren, für fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zu fixieren, wurde das Protokoll wie beschrieben bis zur Anwendung des Fixativs durchgeführt, die Zellen anschließend 3x für 5min mit 300µl PBS gewaschen, 5min mit 300µl 0,2% Triton X-100 (v/v in Phosphatpuffer) inkubiert und erneut 3x für 5min mit 300µl PBS gewaschen. Für die Färbung des Zellkerns wurde das Präparat für 2-3min mit 200µl DAPI-Lösung (1:15.000) inkubiert, anschließend 5x mit 300µl PBS gewaschen, kurz in einem Becherglas mit ddH2O gespült und auf einem Objektträger mit einem Tropfen Gevatol eingedeckelt.
101 8. Methoden
8.1.11 Mikroskopie PFA-fixierter Zellen ohne Antikörperfärbung
Für die Mikroskopie von Paraformaldehyd-fixierten Zellen (PFA-fixierte Zellen) wurden 3- 5x105 Zellen einer Schüttelkultur mit einer Zelldichte von ca. 1x106 Zellen/ml oder direkt von einer Petrischale auf ein rundes Deckgläschen gegeben und für 20-30min bei 22°C in einer mit feuchtem Whatman-Papier ausgelegten Kammer gelagert. Anschließend wurde das Medium abgenommen, gegen 300µl Phosphatpuffer ausgewechselt und die Zellen für 10min bei 22°C in der mit dem Deckel verschlossenen Kammer stehen gelassen. Der Vorgang wurde 1x wiederholt. Im Anschluss wurde der Phosphatpuffer entfernt, gegen 200µl PFA-Fixativ ausgetauscht und die Zellen für 20min bei RT in der Kammer fixiert, wobei die Kammer für diesen und die nachfolgenden Schritte mit Aluminiumfolie lichtdicht abgeschlossen wurde. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das Fixativ entfernt, das Deckglas kurz in einem Becherglas mit PBS gespült und 2x für 5min bei RT mit 300µl PBS gewaschen. Für die Färbung des Zellkerns wurden 200µl DAPI-Lösung (1:15.000 in PBS) auf die Zellen gegeben und diese für 2-3min bei RT abgedunkelt inkubiert. Anschließend wurde das Deckglas kurz in einem Becherglas mit PBS gespült und 3x für 5min mit 300µl PBS gewaschen. Abschließend wurde das Deckglas in einem Becherglas mit ddH2O gespült und auf einem Objektträger mit einem Tropfen Gevatol eingedeckelt.
8.1.12 Mikroskopie lebender Zellen
Um lebende Zellen zu mikroskopieren wurden ca. 3x105 Zellen wie unter 8.1.10 beschrieben auf einem in einer Petrischale gelagerten Deckglas abgesetzt und anschließend 4x für 5min mit 200µl Phosphatpuffer gewaschen. Anschließend wurde der Phosphatpuffer sorgfältig abgenommen, das Deckglas auf einen Objektträger mit 10µl Phosphatpuffer gegeben und umgehend mikroskopiert.
102 8. Methoden
8.2 Molekularbiologische Methoden
8.2.1 Isolation genomischer DNA aus Dictyostelium discoideum
Für die Amplifikation definierter Genabschnitte mittels PCR, bei denen keine großen Templatemengen benötigt wurden, wurde 1ml einer dicht bewachsenen Kultur aus einer Costar-Platte oder einer Petrischale abgespült, in ein geeignetes Reaktionsgefäß überführt, 5min bei 390rcf/4°C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 200µl gDNA-Zelllysepuffer resuspendiert. Anschließend wurden 2µl RNase A (2mg/ml) zugegeben und der Ansatz für 30min bei 37°C inkubiert. Für den Abbau der Proteine wurden nachfolgend 5µl Proteinase K (25mg/ml) zugegeben und der Ansatz für 1-3h bei 60°C inkubiert. Dann wurde die Probe mit 200µl Phenol-Chloroform versetzt, mehrmals invertiert und 20min bei mindestens 14.000rcf/4°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die DNA durch Zugabe von 0,1 Volumen NaAc und 0,8 Volumen Isopropanol (invertieren) für 15min auf Eis oder über Nacht bei -20°C gefällt. Der Fällungsansatz wird anschließend 30min bei 14.000rcf/4°C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 500µl 70% Ethanol gewaschen, für 15min bei 14.000rcf zentrifugiert, an der Luft oder in einer Vakuum Zentrifuge (SpeedVac) getrocknet und in 20µl sterilem ddH20 aufgenommen. Für Southern Blot Analysen erfolgte die Präparation genomischer DNA aus isolierten Zellkernen. Hierfür wurden 1-2x108 Zellen (absolut Zellzahl) aus einer Schüttelkultur mit einer Zelldichte von 1-5x106 Zellen/ml 5min bei 390rcf/4°C abzentrifugiert und 2x mit jeweils 20ml eiskaltem Soerensen Phosphatpuffer gewaschen (Zentrifugation der Zellen wie beschrieben). Anschließend wurde der Überstand vollständig verworfen, das Pellet in 45ml gDNA-Zelllysepuffer resuspendiert und unter Schütteln 10% NP40 bis zu einer Endkonzentration von 1% NP40 zugegeben. Die Lyse der Zellen wurde durch eine Aufklarung der Lösung angezeigt. Die Kerne wurden für 15min bei 3220rcf/4°C (Ausschwingrotor) pelletiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 5ml gDNA-Kernlysepuffer resuspendiert. Anschließend wurden 100µl Proteinase K (25mg/ml) zugegeben und der Ansatz für 2h bei 60°C inkubiert. Es folgte die Phenolisierung des Ansatzes wie in Abschnitt 8.2.6 beschrieben. Die DNA wurde anschließend aus der wässrigen Phase gefällt (vergleiche
103 8. Methoden
Abschnitt 8.2.7), in einer SpeedVac oder an der Luft getrocknet und in 100µl sterilem ddH2O oder TE-Puffer aufgenommen. Alternativ erfolgte die Aufreinigung genomischer DNA für Southern Blot Analysen auch unter Verwendung des GeneJetTM Genomic DNA Purification Kits (Fermentas), wobei 5x106 Zellen (absolute Zellzahl) nach Herstellerangaben prozessiert wurden.
8.2.2 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli (Plasmid-Mini-Präparation)
Die „Quick & Dirty“ Isolation von Plasmiden aus E. coli erfolgte in Anlehnung an die von Birnboim und Dolby beschriebene alkalische Lyse (Birnboim & Doly, 1979). 1-1,5ml einer Übernachtkultur wurden in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und die Zellen 5min bei 4000rcf pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 100µl Lösung I resuspendiert. Nach Zugabe von 200µl Lösung II wurde das Gefäß mehrmals invertiert und 5min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 150µl eisgekühlte Lösung III zugegeben, die Lösung durch mehrmaliges Invertieren gemischt und 10min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß für 15min bei 14.000rcf (RT) zentrifugiert, der Überstand in ein neues Gefäß überführt, mit Isopropanol gefällt (vgl. 8.2.7) und erneut wie beschrieben zentrifugiert. Abschließend wurde das Pellet nach Trocknung bei RT oder in der SpeedVac in
20µl ddH2O resuspendiert. Für eine saubere Isolation von Plasmiden zum Zwecke der Sequenzierung erfolgte die Aufreinigung unter Verwendung des GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) gemäß Herstellerangaben.
8.2.3 Isolation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli (Plasmid-Maxi-Präparation)
Die Isolation größerer Mengen aufgereinigter Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte mit dem Nucleobond® PC 100 Kit (Macherey & Nagel) laut Herstellerangaben aus einer 100ml Übernachtkultur.
104 8. Methoden
8.2.4 Isolation von Plasmid-DNA aus Dictyostelium discoideum
Die Isolation von Plasmid-DNA aus Dictyostelium discoideum erfolgte unter Verwendung des GeneJetTM Genomic DNA Purification Kits (Fermentas) oder des GeneJETTM Plasmid Miniprep Kits (Fermentas) gemäß Herstellerangaben, wobei 2x107 Zellen (absolute Zellzahl) für die Präparation eingesetzt wurden.
8.2.5 Isolation von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum
Die Isolation von Gesamt-RNA erfolgte unter Verwendung von 2x107 Zellen (absolute Zellzahl) aus einer Schüttelkultur mit einer Zelldichte von 1-3x106 Zellen/ml. Die Zellen wurden 5min in einem geeignetem Reaktionsgefäß bei 390rcf/4°C abzentrifugiert und der Überstand vollständig abgenommen. Das Zellpellet wurde in 1ml Trizol (Chomczynski, 1993) resuspendiert, 5min bei RT inkubiert, in ein 2ml Reaktionsgefäß überführt und 10min bei 14.000rcf/4°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand in ein neues 1,5ml Reaktionsgefäß überführt, mit 200µl Chloroform versetzt und durch vorsichtiges Invertieren gemischt. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei RT erfolgte die Phasentrennung durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 10.000rcf/4°C. Nach der Phasentrennung wurden 500µl der oberen wässrigen Phase abgenommen, in ein neues 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und mit 400µl Isopropanol ÜN, mindestens jedoch für 2h bei -20°C gefällt. Nachfolgend wurde der Fällungsansatz für 30min bei 14.000rcf abzentrifugiert, das Pellet mit 1ml 70% Ethanol (v/v in DEPC-H2O) und wie beschrieben erneut abzentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen, das Pellet an der Luft oder in der SpeedVac getrocknet und in 100µl
DEPC-H2O resuspendiert. Die Kontrolle der RNA-Präparation erfolgte mittels GTC- Gelelektrophorese (Abschnitt 8.2.10). Sofern notwendig wurde die Konzentration der RNA photometrisch wie unter 8.2.11 beschrieben bestimmt.
8.2.6 Phenol-Chloroform-Extraktion
Um Proteine bei DNA-Isolationen oder aus Nukleinsäurelösungen zu entfernen wurde die Lösung mit Phenol-Chloroform im Verhältnis 1:1 versetzt, durch vorsichtiges Invertieren
105 8. Methoden gemischt, nach 5-minütiger Inkubation (RT) für 10min bei 20.000rcf/4°C zentrifugiert und der wässrige Überstand anschließend wie unter 8.2.7 beschrieben mit Isopropanol gefällt.
8.2.7 Fällung von Nukleinsäuren
Isopropanol-Fällung: Die Fällung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen mittels Isopropanol-Fällung erfolgte durch Zugabe von Isopropanol zur Probe im Verhältnis 1:1 gefolgt von der Zugabe von 3M Natriumacetat (pH 4.7) im Verhältnis 1:10. Die Lösung wurde durch mehrmaliges Invertieren gemischt und anschließend für 30min bei 20.000rcf/4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit 1ml 70% Ethanol gewaschen und erneut 15min mit den erwähnten Parametern zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Pellet an der Luft oder in der SpeedVac getrocknet und anschließend in einem adäquaten Volumen sterilem ddH2O gelöst.
Ethanol-Fällung: Die Fällung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen mittels Ethanol- Fällung erfolgte durch Versetzung der Probe mit dem 2 ½-fachen Probenvolumen Ethanol gefolgt von der Zugabe von 3M Natriumacetat (pH 4.7) im Verhältnis 1:10. Die Lösung wurde durch mehrmaliges Invertieren gemischt, ÜN (mindestens aber für 2h) bei -20°C gefällt und am Folgetag für 30min bei 20.000rcf/4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit 1ml 70% Ethanol gewaschen und erneut 15min mit den erwähnten Parametern zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Pellet an der Luft oder in der
SpeedVac getrocknet und in einem adäquaten Volumen sterilem ddH2O gelöst.
8.2.8 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA
Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte unter Verwendung von nicht denaturierenden Agarosegelen mit einer Konzentration von 0,7-2,0% Agarose. Die benötigte Menge Agarose wurde hierfür mit 1xTBE versetzt und nach Zugabe von 10µl Ethidiumbromidlösung (10mg/ml) je 100ml Agarosegellösung in der Mikrowelle erhitzt, bis sich die Agarose vollständig gelöst hatte. Nach Abkühlen der Lösung auf ca. 60°C wurde diese in eine abgedichtete horizontale Gelkammer gegossen. Nach dem Erkalten der Agarose wurde das Gel mit 1xTBE überschichtet und die mit DNA-Auftragungspuffer versetzten DNA-
106 8. Methoden
Proben aufgetragen. Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte in Abhängigkeit von der Größe der verwendeten Kammer bei einer Spannung von 80-120 Volt. Die Dokumentation der Gele erfolgte unter Verwendung eines Intas-Geldokumentationssystems unter UV-Licht (312nm), wobei die DNA aufgrund des zwischen die DNA-Doppelstränge interkalierten Ethidiumbromids bei einer Wellenlänge von 560nm fluoresziert. Sofern notwendig wurden Gele in einem Ethidiumbromidbad (5µl Ethidiumbromidlösung (10mg/ml) je 100ml TBE- Puffer) nachgefärbt. Bei der Auftrennung kleiner DNA-Fragmente wurden zusätzlich zum Ethidiumbromid 10µl Ethidiumbromidlösung in den TBE-Puffer im Bereich der Anode gegeben, um das Herauslaufen des zur Kathode wandernden Ethidiumbromids aus dem Gel zu kompensieren.
8.2.9 Gelelution von DNA-Fragmenten
Die Elution von DNA-Fragmenten spezifischer Größe aus Agarosegelen erfolgte unter Verwendung des NucleoSpin® Extract II Kits (Macherey & Nagel). Hierfür wurde der gewünschte Gelbereich unter Verwendung einer sterilen Skalpell-Klinge unter UV-Licht (312nm) aus dem Gel ausgeschnitten und gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt.
8.2.10 Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA auf GTC-Gelen
Für die Auftrennung oder Kontrolle von isolierter RNA wurde diese auf denaturierende Guanidinthiocyanat-Gele (GTC-Gele) aufgetragen. Hierfür wurden 1-2% Agarose in 1xTBE aufgekocht und auf einem Magnetrührer unter Kontrolle der Temperatur auf 60°C abgekühlt. Zu der abgekühlten Lösung wurden unter dem Abzug 2ml Guanidinthiocyanat- Lösung (1M) zugegeben und die Lösung auf 40°C abgekühlt. Nach dem Gießen und Erstarren des Gels wurde dieses mit 1xTBE-Puffer überschichtet, die isolierte RNA (vgl. Abschnitt 8.2.5) mit RNA-Auftragspuffer und 2µl Ethidiumbromid-Lösung (10mg/ml) versetzt, für 5min bei 80°C erhitzt und auf das Gel geladen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in Abhängigkeit von der Kammergröße bei 50-100V im Kühlraum.
107 8. Methoden
8.2.11 Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren
Die Quantifizierung von Nukleinsäuren erfolgte photometrisch durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260nm. Für die Messung der Proben wurden diese
1:100 in ddH2O verdünnt und gegen den Leerwert der Verdünnungslösung im Photometer gemessen. Die Konzentration wurde unter Verwendung der Formel
Nukleinsäurekonzentration [µg/ml] = Absorptiongemessen · Multiplikator · Verdünnungsfaktor berechnet, wobei die Multiplikatoren 50µg/ml für doppelsträngige DNA und RNA
(DNAds/RNAds), 33µg/ml für einzelsträngige DNA (DNAss) und 40µg/ml für einzelsträngige
RNA (RNAss) verwendet wurden.
8.2.12 Sequenzierung von DNA-Abschnitten
Sequenzierungen erfolgten bei den Firmen Seqlab (Göttingen, Deutschland), Microsynth (Balgach, Schweiz) und GATC (Konstanz, Deutschland). Die Sequenzierungsansätze wurden entsprechend den Angaben des jeweiligen Dienstleisters angefertigt.
8.2.13 Schneiden von DNA-Sequenzen (Restriktionsverdau)
Der Restriktionsverdau von DNA-Sequenzen erfolgte im Zuge von Klonierungen als analytischer Ansatz, um die erfolgreiche Inserierung eines DNA-Fragments innerhalb einer Zielsequenz zu überprüfen, oder als präparativer Ansatz für die Gewinnung spezifischer DNA-Fragmente für weitere Klonierungen. In beiden Fällen wurden Restriktions- endonukleasen vom Typ II verwendet. Analytische Ansätze erfolgten unter Verwendung von ca. 0,5-1,0µg DNA aus einer Plasmid- Mini-Präparation (vgl. Abschnitt 8.2.2) mittels eines geeigneten Enzymes bzw. geeigneter Enzyme und eines geeigneten Puffers. Die Auswahl erfolgte mit Hilfe des Online- Programmes „DoubleDigest“ (vgl. Abschnitt 7.17.2). Unterschiede in der enzymatischen Aktivität aufgrund unterschiedlicher Aktivität in den entsprechenden Puffern wurden über den Einsatz unterschiedlicher Enzymmengen kompensiert. Sofern der Abbau von RNA nicht
108 8. Methoden durch RNase im Puffer der Plasmid-Mini-Präparation erfolgte wurde diese dem Reaktionsansatz zugefügt. Die Enzymmenge wurde wenn möglich so gewählt, dass 1 Unit Enzym für den Verdau von jeweils 1µg DNA bei einer Temperatur von 37°C für 1h zum Einsatz kam. Gegebenenfalls wurde das kleinst-möglich zu pipettierende Volumen eingesetzt. Der Ansatz wurde für 1-2h in einem Heizblock oder im Brutschrank inkubiert. Die nachfolgende Tabelle 8.1 zeigt exemplarisch einen Ansatz für einen analytischen Restriktionsverdau.
Tabelle 8.1 – Analytischer Restriktionsverdau: die nachfolgende Tabelle zeigt beispielhaft einen Ansatz für einen analytischen Restriktionsverdau unter Angabe der entsprechenden Konzentrationen.
Komponente Konzentration Volumen DNA 0,5-1,0µg 1,0µl (1,0µg/µl) Enzym I 1U/µg DNA bei 100% Enzymaktivität 0,2µl Enzym I (10U/µl) Enzym II 1U/µg DNA bei 100% Enzymaktivität 0,2µl Enzym II (10U/µl) Enzympuffer 10x 2,0µl RNase 1µg 1,0µl (1µg/µl)
ddH2O - ad 20µl
Präparative Ansätze erfolgten wie in Tabelle 8.1 beschrieben, jedoch wurden ca. 5µg DNA aus einer Plasmid-Maxi-Präparation (vgl. Abschnitt 8.2.3) für den Verdau eingesetzt, die Enzymmengen entsprechend gewählt und das Gesamtvolumen des Verdauansatzes von 20µl auf 50µl erhöht. Verdauansätze wurden, sofern notwendig, entsprechend den Herstellerangaben inaktiviert, mittels Gelelektrophorese (vgl. Abschnitt 8.2.8) aufgetrennt und wie in Abschnitt 8.2.9 aufgereinigt.
8.2.14 Dephosphorylierung von Vektor-DNA
Sofern eine Religation der verdauten und aufgereinigten Vektor-DNA während der Ligationsreaktion aufgrund kompatibler Überhänge oder dem Vorhandensein von blunt-ends möglich war wurden die 3´-Phosphatgruppen durch Inkubation mit einer Alkalischen
109 8. Methoden
Phosphatase entfernt. Hierfür wurde die FastAPTM thermosensitive Alkaline Phosphatase (Fermentas) entsprechend den Herstellerangaben eingesetzt.
8.2.15 Erzeugen von A-Überhängen an blunt-end-DNA (A-tailing)
Um eine DNA-Sequenz mit blunt-Enden aus einer PCR-Reaktion oder einem Verdau mittels TA-Klonierung in den mit einem T-Überhang ausgestatteten Vektor pGEM® T-Easy zu ligieren wurden A-Überhänge erzeugt, indem der in Tabelle 8.2 gezeigte Ansatz für 20-30min bei 72°C in einem PCR-Cycler oder Heizblock inkubiert, für 1min bei 6000rcf/RT zentrifugiert und 1,5µl des Ansatzes für die Ligation in den Vektor pGEM® T-easy verwendet wurden.
Tabelle 8.2 – A-tailing von PCR-Produkten: die Tabelle zeigt den Ansatz einer Reaktion für das Tailing von aufgereinigtem PCR-Produkt.
Komponente Volumen Aufgereinigtes PCR-Produkt 5,0µl
10x Taq-Puffer (MgCl2 / (NH4)2SO4) 2,0µl dATP (100mM) 0,5µl Taq-Polymerase 0,5µl
ddH2O ad 20µl
8.2.16 Auffüllen von 5´- und 3´-Überhängen (Fill-in)
Um im Zuge einer Klonierung oder Umklonierung DNA-Fragmente mit nicht kompatiblen Enden ligieren zu können wurden 5´- und 3´-Überhänge unter Verwendung einer T4-DNA- Polymerase aufgefüllt. Diese ist in der Lage sowohl 5´-Überhänge aufzufüllen als auch 3´- Überhänge zu glätten. Hierfür wurde der in Tabelle 8.3 gezeigte Ansatz gemischt, für 20min bei 11°C inkubiert und anschließend für 10min bei 75°C inaktiviert.
110 8. Methoden
Tabelle 8.3 – Reaktionsansatz für das Blunten von 5´- und 3´-Überhängen: die Tabelle zeigt den Ansatz für die Glättung von 5´- und 3´-Enden unter Verwendung einer T4-DNA-Polymerase.
Komponente Konzentration Volumen DNA 1µg 1,0µl (1µg/µl) T4-DNA-Polymerase Puffer 5x 4,0µl dNTPs 2mM 0,5µl T4-DNA-Polymerase 5U/µl 0,2µl ddH2O - ad 20µl
8.2.17 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte mit entsprechend geschnittenen (vgl. Abschnitt 8.2.13) und gegebenenfalls dephosphorylierten DNA-Sequenzen (vgl. Abschnitt 8.2.14) unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase. Hierfür wurde der in Tabelle 8.4 gezeigte Ansatz für 30min bei RT oder alternativ ÜN bei 16°C im Wasserbad inkubiert und jeweils 5µl bzw. 15µl des Ansatzes in getrennten Transformationen (vgl. Abschnitt 8.1.2) in E. coli Zellen transformiert. Für die Ligation von ungeschnittenen PCR-Produkten wurden das CloneJETTM PCR-Cloning Kit (Fermentas) für die Ligation von blunt-end PCR-Produkten oder das pGEM®-T Easy Vector System (Promega) für die Ligation von PCR-Produkten mit einem A-Überhang (Clark, 1988) gemäß Herstellerangaben verwendet.
Tabelle 8.4 – Ligation von DNA-Fragmenten: die nachfolgende Tabelle listet den standardmäßigen Reaktionsansatz einer Ligationsreaktion unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase auf. Dabei wurde beachtet, dass das molare Verhältnis Vektor-DNA:Insert-DNA im Bereich 1:3 bis 1:5 lag.
Komponente Konzentration Volumen Plasmid-DNA ca. 100ng/µl 1,0µl Insert-DNA ca. 100ng/µl 4,0µl T4-DNA-Ligase Puffer 10x 2,0µl T4-DNA-Ligase 5U/µl 1,0µl
ddH2O - ad 20µl
111 8. Methoden
8.2.18 PCR (Polymerase Kettenreaktion), Gradienten-PCR und Colony-PCR
Um eine spezifische DNA-Sequenz zu amplifizieren (Mullis et al., 1986) wurde genomische DNA oder cDNA mithilfe von Primern amplifiziert. Diese wurden unter Verwendung der in 7.17.1 und 7.17.2 genannten Programme entworfen und wie in 7.13 beschrieben synthetisiert. Um eine DNA-Sequenz spezifisch zu vervielfältigen wurde der in Tabelle 8.5 beschriebene Ansatz mit dem in Tabelle 8.6 beschriebenen Programm in einem PCR-Cycler amplifiziert. Die Beschreibung sowohl des Ansatzes als auch des Programms ist exemplarisch und kann von Ansatz zu Ansatz variieren. Für PCR-Ansätze mit Primern, für die keine PCR-Parameter bekannt waren oder bei denen die oben beschriebene PCR nicht erfolgreich war, wurde eine Gradienten-PCR durchgeführt. Hierfür wurden in einem PCR-Cycler bis zu 12 PCR-Ansätze parallel inkubiert, wobei sich die Ansätze lediglich in der Annealing-Temperatur unterschieden. Die Elongations-Zeit, während der die Polymerase den entsprechenden DNA-Abschnitt vervielfältigt, wurde sowohl bei PCRs mit bekannter Annealing-Temperatur als auch bei Gradienten-PCRs in Abhängigkeit von der Produktlänge, der verwendeten Polymerase und der Elongations-Temperatur gewählt. Für die Amplifikation von DNA-Sequenzen wurde meist die Taq-Polymerase verwendet, wobei bei einer Elongations-Temperatur von 72°C davon ausgegangen wurde, dass pro Minute 1000bp amplifiziert werden. Bei einer Reduktion der Elongations-Temperatur auf 67°C, wie sie für die Amplifikation AT-reicher Sequenzen oder repetitiver Sequenzmuster zum Einsatz kam, wurde hingegen eine Amplifikationsrate von 500bp pro Minute zugrunde gelegt. Die weitere Prozessierung der amplifizierten DNA erfolgte in Abhängigkeit vom jeweiligen Verwendungszweck. Um E. coli Zellen bezüglich der Aufnahme eines Plasmides nach einer Transformation zu untersuchen wurden Einzelklone von einer Masterplatte mittels Colony-PCR gescreent. Hierfür wurde eine entsprechende Zahl von 50µl PCR-Ansätzen wie in Tabelle 8.5 beschrieben vorbereitet, wobei auf die Zugabe der Template-DNA verzichtet und das entsprechende Volumen durch ddH2O ersetzt wurde. Vor der PCR-Reaktion wurde für die Bereitstellung von DNA Zellmaterial mit einem sterilen Zahnstocher von der Masterplatte in das PCR-Reaktionsgefäß übertragen.
112 8. Methoden
Tabelle 8.5 – Ansatz einer Standard-PCR: Die nachfolgende Tabelle zeigt den Reaktionsansatz für eine Amplifikation des trx-Gens (Thioredoxin) aus Dictyostelium discoideum. Standardmäßig erfolgte der Ansatz in einem Gesamtvolumen von 50µl, wobei im Zuge bestimmter Fragestellungen auch andere Gesamtvolumina gewählt wurden. Das einzusetzende Volumen an Template-DNA hängt von der Art des Templates ab. gDNAAX2 = genomische DNA des Wildtyp-Stammes AX2 aus Dictyostelium discoideum.
Komponente Ausgangskonzentration Volumen Template-DNA (gDNAAX2) 500ng/µl 1,0µl Fwd-Primer: Trx-1Fwd #688 5mM 2,0µl Rev-Primer: Trx-1Rev #689 5mM 2,0µl dNTP-Mix 2,5mM each 1,0µl Taq-Puffer (MgCl2 + (NH4)2SO4) 10x 5,0µl Taq-Polymerase (homemade) - 0,5µl ddH2O - ad 50µl
Tabelle 8.6 – PCR-Parameter für die Amplifikation des in Tabelle 8.5 aufgelisteten Reaktionsansatzes: Die nachfolgenden Parameter wurden für die Amplifikation des trx-Gens aus Dictyostelium discoideum verwendet. Bei der initialen Denaturierung kommt es zur vollständigen Denaturierung der DNA. In den nachfolgenden, sich zyklisch wiederholenden Schritten aus Denaturierung, Annealing (Anlagerung der Primer) und Elongation (Vervielfältigung des DNA- Abschnittes) wird die gewünschte DNA-Sequenz exponentiell amplifiziert. In der finalen Elongation wird sichergestellt, dass die Amplifikate bezüglich ihrer Länge vollständig amplifiziert wurden. Die Amplifikation des trx-Gens liefert ein PCR-Produkt von ca. 700bp Größe, so dass bei einer Elongations-Temperatur von 72°C eine Elongationsdauer von 45sec gewählt wurde.
Schritt Temperatur Zeit Zyklenzahl Initiale Denaturierung 95°C 5min 1x Denaturierung 95°C 30sec Annealing 58°C 40sec 34x Elongation 72°C 45sec Finale Elongation 72°C 5min 1x Kühlung 18°C ∞ 1x
8.2.19 PCR-vermittelte Punkt-Mutagenese von DNA-Fragmenten
Für die PCR-vermittelte Punkt-Mutagenese wurden Primerpaare mit einer Länge von ca. 40 Basen entworfen, die zu 100-Prozentige überlappen und an der gewünschten Primerposition einen entsprechenden Basenaustausch im Vergleich zur Wildtypsequenz aufweisen. Mit flankierenden Primern für die Gesamtsequenz des Gens wurden in zwei ersten, getrennt durchgeführten PCR-Reaktionen die entsprechenden Teilfragmente des Gens wie in
113 8. Methoden
Abschnitt 8.2.18 beschrieben amplifiziert und gelelektrophoretisch aufgereinigt (vgl. Abschnitt 8.2.9). Anschließend wurde in einer dritten PCR-Reaktion die mutierte Volllängesequenz des Gens amplifiziert, indem zunächst die aufgereinigten Fragmente aus den ersten beiden PCR-Reaktionen für die Dauer von 5 Zyklen aufgrund ihrer überlappenden Sequenz sowohl als Primer als auch als Template fungierten. Das PCR-Programm wurde dann unterbrochen und die flankierenden Primer aus den ersten beiden PCR-Reaktion hinzugegeben. Anschließend wurde das PCR-Programm fortgesetzt, wobei die PCR- Bedingungen bezüglich der Annealing-Temperatur gegebenenfalls angepasst wurden. Das amplifizierte Volllänge-Produkt wurde aufgereinigt und in den gewünschten Vektor kloniert.
8.2.20 Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)
Für die Umschreibung einer RNA-Sequenz in die entsprechende cDNA-Sequenz (Baltimore, 1970) wurde die isolierte Gesamt-RNA (vgl. Abschnitt 8.2.5) zunächst wie in Tabelle 8.7 angesetzt und für 1h bei 37°C verdaut um genomische DNA-Verunreinigungen zu degradieren. Anschließend wurde der Ansatz mit DEPC-H2O wie in Abschnitt 8.2.6 beschrieben phenolisiert, gefällt (vgl. Abschnitt 8.2.7), getrocknet und in 10µl DEPC-H2O resuspendiert. Für die reverse Transkription wurde der in Tabelle 8.8 aufgelistete Ansatz mit den in Tabelle 8.9 folgenden Parametern in einem PCR-Cycler inkubiert.
Tabelle 8.7 – DNAse-Verdau von isolierter Gesamt-RNA: Ansatz für den Verdau potentieller DNA- Kontaminationen.
Komponente Konzentration Volumen Gesamt-RNA 1µg/µl 10,0µl DNaseI (RNase-free) 1U/µl 1,0µl DNase-Puffer 10x 2,0µl DEPC-H2O - ad 20,0µl
114 8. Methoden
Tabelle 8.8 – Ansatz der reversen Transkription: Auflistung der Komponenten für die Reaktion der reversen Transkription.
Komponente Volumen Gesamt-RNA 2,0µl Oligo(dT)26 10mM (#906) 2,0µl Revert Aid 5x Reaction Buffer 4,0µl RiboLockTM RNase Inhibitor 0,5µl dNTP-Mix (10mM) 2,0µl Revert AidTM Reverse Transkriptase 1,0µl DEPC-H2O ad 20,0µl
Tabelle 8.9 – PCR-Parameter für die reverse Transkription: Auflistung der Parameter, die gemäß Herstellerangaben für die reverse Transkription verwendet wurden.
Programm-Parameter Dauer und Temperatur Denaturierung 5min / 65°C Primer-Annealing und Elongation 60min / 42°C Inaktivierung 10min / 70°C
2µl der synthetisierten cDNA wurden für nachfolgende PCR-Reaktionen verwendet. Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.
8.2.21 Quantitative PCR (Real Time PCR, qPCR)
Um die Expression von Genen auf RNA-Ebene im Vergleich zu einem Referenzstamm mittels quantitativer PCR zu überprüfen (Abbott et al., 1988; Syvanen et al., 1988; Wong und Medrano, 2005) wurde der in Tabelle 8.10 beschriebene Ansatz auf Eis in einer qPCR- zertifizierten 96-Well Platte zusammenpipettiert, abzentrifugiert und in einem Eppendorf Mastercycler® ep RealPlex unter Verwendung geeigneter PCR-Parameter amplifiziert. Hierfür wurde das SensiFastTM SYBR No-ROX One-Step Kit der Firma Bioline laut Herstellerangaben verwendet. Der Ansatz der PCR-Proben erfolgte als Triplikat. Die Daten wurden mittels ΔΔCT-Methode (Pfaffl, 2001) ausgewertet und relativ quantifiziert. Sofern die Quantifizierung gegen ein housekeeping-Gen notwendig war erfolgte diese gegen die gpdA (Glycerinaldehyde-3-phosphate-Dehydrogenase). Als Template diente Gesamt-RNA, die wie in 8.2.5 beschrieben isoliert und auf einem GTC-Gel (vgl. Abschnitt 8.2.10) kontrolliert wurde.
115 8. Methoden
Tabelle 8.10 – Pipettierschema für die Einzelreaktion eines Standard qPCR-Ansatzes: Die nachfolgende Tabelle zeigt das Pipettierschema für den Ansatz einer qPCR. Die Amplifikationsrate wurde nach jedem Zyklus durch Messung der Fluoreszenz des Farbstoffes SYBR-Green, welcher zwischen die Doppelstränge der DNA interkaliert, ermittelt.
Komponente Konzentration Volumen SensiFASTTM SYBR No-ROX One-Step Mix 2x 10,0µl Forward-Primer 10µM 0,8µl Reverse-Primer 10µM 0,8µl Reverse Transcriptase - 0,2µl RiboSafe RNase Inhibitor - 0,4µl Template - 4,0µl
ddH2O oder HPLC-H2O - ad 20µl
Die Parameter für eine Standard-qPCR sind in der Tabelle 8.11 aufgeführt.
Tabelle 8.11 – PCR-Parameter für eine Standard-qPCR mit dem SensiFastTM SYBR No-ROX One-Step Kit: In der nachfolgenden Tabelle sind die PCR-Parameter für das verwendete Kit der Firma Bioline aufgeführt.
2-Step qPCR Programm-Parameter Temperatur Zeit Zyklenzahl Reverse Transkription 45°C 10min 1x Aktivierung der Polymerase 95°C 2min 1x Denaturierung 95°C 5sec Annealing 60°C 10sec 40x Elongation 72°C 5sec 3-Step qPCR Programm-Parameter Temperatur Zeit Zyklenzahl Reverse Transkription 45°C 10min 1x Aktivierung der Polymerase 95°C 2min 1x Denaturierung 95°C 5sec 40x Annealing und Elongation 60°C 20sec
8.2.22 Southern Blot
Für die Verifizierung von knockout-Klonen auf genomischer Ebene mittels Southern Blot (Southern, 1975) wurde aus Zellkernen oder mit dem GeneJetTM Genomic DNA Purification Kit (Fermentas) isolierte genomische DNA (vgl. Abschnitt 8.2.1) wie in Tabelle 8.12
116 8. Methoden beschrieben bei 37°C über Nacht verdaut, wie in Abschnitt 8.2.6 Phenol-Chloroform- extrahiert und mit Isopropanol gefällt (vgl. Abschnitt 8.2.7). Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung auf einem 0,8-prozentigem Gel (vgl. Abschnitt 8.2.8; Parameter: 10-15V ÜN) wurde das Gel mit dem Intas-Geldokumentationssystem dokumentiert, wobei mit Hilfe eines fluoreszenzfähigen Lineals die Laufweite der Markerbanden ebenfalls dokumentiert wurde.
Tabelle 8.12 – Ansatz eines allgemeinen Restriktionsverdaus für Southern Blot Analysen: die nachfolgende Tabelle zeigt eine für Southern Blot Analysen allgemein verwendeten Restriktionsverdau unter Verwendung von genomischer DNA, die mit dem Fermentas GeneJetTM Genomic DNA Purification Kit gewonnen wurde. Der Verdau ist für nur ein Enzym beschrieben. Abweichend hiervon kann der Restriktionsverdau in Abhängigkeit von der Zielstellung auch mit zwei oder mehr Enzymen erfolgen. Volumina können in diesem Fall entsprechend angepasst werden. Der Verdau erfolgte ÜN bei 37°C.
Komponente Volumen Genomische DNA (GeneJetTM Genomic DNA Purification Kit) 150,0µl Enzym-Puffer (10x) 20,0µl Enzym 3,0µl RNaseA 2,0µl
ddH2O ad 200µl
Anschließend wurde das Gel für 30min in Denaturierungslösung auf einem Schüttler bei RT inkubiert, die Denaturierungslösung gegen Neutralisierungslösung ausgetauscht und das Gel für weitere 30min auf dem Taumeler geschwenkt. Anschließend erfolgte der Transfer auf eine Nitrocellulose-Membran mittels Kapillartransfer ÜN bei RT. Hierfür wird eine Glasschale, die teilweise mit einer Glasplatte bedeckt war, mit 20x SSC-Puffer gefüllt. Ein 3mm-Whatman-Cellulosepapier wurde so zurecht geschnitten, dass es auf der Glasplatte liegend über deren Ränder hinaus in den 20x SSC-Puffer in der Glasschale ragt. Auf das Whatmann-Papier wurde das Gel und darüber die Nitrocellulose-Membran gelegt. Über die Nitrocellulose-Membran wurden 3 weitere Whatman-Papiere gelegt. Die oberste Schicht bildete eine ca. 7-8cm hohe Schicht Industriepapier, welche mit einem Gewicht von ca. 500g fixiert wurde. Nach dem Transfer wurde die Nitrocellulose-Membran getrocknet und bei einer Wellenlänge von 256nm mit einer Dosisleistung von 0,56J/cm2 gecrosslinkt. In diesem
117 8. Methoden
Zustand wurde die Membran, sofern nötig, für mehrere Wochen in einer Plastikfolie trocken in einer geschlossenen Schublade aufbewahrt. Für die Herstellung der Sonde wurde eine PCR mit den entsprechenden Primern für das im Southern Blot nachzuweisende Fragment durchgeführt (vgl. Abschnitt 8.2.18), auf einem Agarosegel aufgetrennt und aufgereinigt (vgl. Abschnitte 8.2.8 und 8.2.9). Um die Sonde radioaktiv zu markieren wurde der in Tabelle 8.13 beschriebene Ansatz in einem 1,5ml Reaktionsgefäß für 5min bei 95°C denaturiert und anschließend für 3min bei 55°C erhitzt.
Tabelle 8.13 – Denaturierung der Sonde: der nachfolgende Ansatz wurde in der vorgegebenen Reihenfolge zusammenpipettiert, für 5min bei 95°C denaturiert und anschließend für weitere 3min bei 55°C erwärmt.
Komponente Volumen PCR-Fragment (aufgereinigte Sonde) 5,0µl OLB-Mix 10,0µl ddH2O 26,0µl
Dann wurden die in Tabelle 8.14 aufgelisteten Komponenten hinzugegeben und der Ansatz für 60min bei 37°C inkubiert.
Tabelle 8.14 – Ansatz für die P32-Markierung der Sonde: Aufgelistet sind die für die radioaktive Markierung der Sonde verwendeten Komponenten. Der Ansatz wurde für 60min bei 37°C inkubiert, anschließend mit 70µl ddH2O aufgefüllt und über eine G50-Sephadex Säule aufgereinigt.
Komponente Volumen BSA (10mg/ml) 2,0µl P32 dATP (ß-ATP) 5,0µl Klenow 2,0µl
Nach Ablauf der Zeit wurden 70µl ddH2O dazu pipettiert und die markierte Sonde über eine 1ml G50-Sephadex Säule mittels Zentrifugation (5min/4000rcf/RT) aufgereinigt. Die Herstellung der Sephadex-Säule erfolgte, indem eine kleine Menge Glaswolle mit Hilfe des Stempels in eine 1ml Einwegspritze gedrückt wurde. Die Glaswolle sollte hierbei maximal das Volumen von 100µl einnehmen. Die Spritze wurde nun mit Sephadex-Lösung (in 1xTE-Puffer, steril) beschickt, bis sie vollständig bis zum Rand gefüllt war. Durchlaufende Flüssigkeit wurde durch neue Sephadex-Lösung ersetzt, bis keine Lösung mehr von alleine aus dem Spritzenkonus ablief. Anschließend wurde die Spritze in einem 15ml Reaktionsgefäß
118 8. Methoden stehend in einer Zentrifuge mit Ausschwenkrotor für 1min bei 1000-1500rcf/RT zentrifugiert. Im Idealfall war die Spritze nach der Zentrifugation bis zur 1ml-Markierung mit Sephadex- Kügelchen gefüllt. Die getrocknete Membran wurde während der Herstellung der OLB-Sonde in einer Hybridisierungsröhre für 1h bei 42°C mit Denhard-Puffer inkubiert. Anschließend wurde die radioaktiv markierte und aufgereinigte Sonde für 5min bei 95°C in Denhard-Puffer aufgekocht, in die Hybridisierungsröhre gegeben und ÜN bei 42°C inkubiert. Am Folgetag wurde die Lösung mit der Sonde abgenommen und zunächst für 5min mit 50ml und anschließend mit 100ml Waschlösung I bei 42°C gewaschen. Nach Ablauf der Zeit erfolgte ein zweiter Waschschritt mit 100ml Waschlösung II für 60min bei 42°C. Anschließend wurde die Membran getrocknet und in einer Speicherfolienkassette zur Exposition gegeben.
8.3 Biochemische Methoden
8.3.1 Herstellung von Proteinproben
Escherichia coli: Die Herstellung von Proteinproben aus E. coli erfolgte durch Entnahme von 1ml einer Schüttelkultur, der Pelletierung der Zellen bei 4000rcf/RT für 5min und der Resuspension des Pellets in 100µl 10x Laemmli-Puffer. Die resuspendierten Zellen wurden anschließend 5min bei 95°C erhitzt und direkt aufgetragen oder bei -20°C gelagert und vor dem Auftragen erneut für 5min auf 95°C erhitzt. Sofern genomische DNA und andere Zellkomponenten zu einer zähflüssigen Suspension führten wurde die Probe vor dem Auftragen für 5min bei 14.000rcf/RT zentrifugiert.
Dictyostelium discoideum: Für die Herstellung von Proteinproben aus D. discoideum wurde die Zelldichte der entsprechenden Kultur gemessen, das gewünschte Volumen in ein geeignetes Reaktionsgefäß überführt und für 3min bei 370rcf/4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig abgenommen, die Zellen in 10x Laemmli-Puffer resuspendiert (1µl 10x Laemmli-Puffer je 5 x 104 Zellen) und anschließend für 5min bei 95°C erhitzt. Die Proben wurden entweder direkt aufgetragen oder bei -20°C gelagert.
119 8. Methoden
Coomassie-Schnelltest: die Herstellung von Proteinproben wurde mittels Coomassie- Schnelltest überprüft. Hierfür wurden 20µl der Proteinprobe vor dem Aufkochen mit Laemmli-Puffer abgenommen und auf einen schmalen Streifen Whatmann-Papier geeigneter Größe auf eine mit Kugelschreiber markierte Stelle aufgetragen. Zur Kontrolle einer unspezifischen Färbung des Papiers wurden 20µl H20 aufgetragen. Die aufgetragenen Proben wurden getrocknet, das Whatmann-Papier anschließend in einem 50ml Reaktionsgefäß mit nicht-kolloidalem Coomassie für ca. 1min gefärbt. Anschließend wurde überschüssiges Coomassie unter fließendem Wasser ausgewaschen und das Whatman- Papier auf einem Heizblock bei 60°C getrocknet.
8.3.2 Expression rekombinanter Proteine
Die Expression rekombinanter Proteine erfolgte unter Verwendung der in Abschnitt 7.11.1 aufgelisteten E. coli Stämme BL21DE3 Rosetta und BL21DE3 pLysS. Nach der Transformation des entsprechenden Plasmids (vgl. Abschnitt 8.1.3) wurde ein Einzelklon in einer 10ml Vorkultur mit dem entsprechenden Selektionsmedium angeimpft und ÜN bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Am Folgetag wurden 100ml des entsprechenden Selektionsmediums mit 1ml der Übernacht-Kultur angeimpft und bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert, bis die Kultur eine OD595 von 0,6 erreichte. Dann erfolgte die Induktion der Expression durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1-1,5mM), wobei die Bedingungen für die optimale IPTG- Konzentration, die optimale Temperatur und die optimale Expressionsdauer wie unter 8.3.3 und 8.3.4 beschrieben ermittelt wurden. Die induzierten Kulturen wurden entweder direkt prozessiert oder für 5min bei 4000rcf/RT abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet bei -80°C aufbewahrt.
8.3.3 Time Course
Um die Expression rekombinanter Proteine im zeitlichen Verlauf nach Induktion mit IPTG zu untersuchen wurden 50ml des entsprechenden Selektionsmediums mit 1ml einer über
Nacht angewachsenen Vorkultur angeimpft und bis zu einer OD595 von 0,6 inkubiert. Dann erfolgte die Induktion mit IPTG (vgl. Abschnitt 8.3.2). Um die optimale Expression unter verschiedenen IPTG-Konzentrations-Bedingungen zu ermitteln wurden Konzentrationen von
120 8. Methoden
0,1mM, 0,5mM, 1,0mM und 1,5mM IPTG bei 37°C für die Inkubation getestet. Probenentnahmen erfolgten unmittelbar vor der Induktion (Nicht induziert; NI) sowie nach 0,5h (Induziert; IN0,5), 1,0h (IN1), 2,0h (IN2), 3,0h (IN3) und 4,0h (IN4). Für die Probenentnahme wurde 1ml der Schüttelkultur entnommen, bei 4000rcf/RT für 5min abzentrifugiert, der Überstand vollständig verworfen, das Pellet in 100µl 10x Laemmli-Puffer resuspendiert und für 5min bei 95°C aufgekocht (vgl. Abschnitt 8.3.1). Die Proben wurden anschließend auf einem SDS-Gel aufgetrennt (vgl. Abschnitt 8.3.6) und mit Coomassie angefärbt (vgl. Abschnitt 8.3.7). Die Auswertung der SDS-Gele gab Aufschluss darüber, bei welcher IPTG-Konzentration und nach welcher Zeit das rekombinante Protein am stärksten exprimiert wurde.
8.3.4 Löslichkeitstest
Um zu untersuchen, ob ein rekombinantes Protein in seiner löslichen Form oder als Aggregat in seiner unlöslichen Form in der Zelle vorliegt wurden 50ml des entsprechenden Selektionsmediums mit 1ml einer über Nacht gewachsenen Vorkultur angeimpft und bei
37°C inkubiert, bis eine OD595 von 0,6 erreicht wurde. Anschließend wurde eine Probe der nicht induzierten Kultur gezogen (NI) und wie unter 8.3.1 bzw. 8.3.3 beschrieben verarbeitet. Die restliche Kultur wurde mit IPTG induziert, wobei die entsprechende Konzentration wie unter 8.3.3 beschrieben zuvor ermittelt wurde. Da die Löslichkeit des Proteins sich in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur verändern kann erfolgte die Expression mit der entsprechenden IPTG-Konzentration bei unterschiedlichen Temperaturen. Hierbei wurden Temperaturen von 37°C, 30°C, 22°C und 16°C gewählt. Nach Ablauf der in 8.3.3 ermittelten Inkubationsdauer wurde eine weitere Probe genommen und wie beschrieben verarbeitet (IN). 40ml der restlichen Kultur wurden für 15min bei 6500rcf/4°C abzentrifugiert, der Überstand vollständig abgenommen und das Pellet in 4ml kaltem 20mM Tris-HCl (pH 7.5) resuspendiert (Konzentrationsfaktor = 10x). Für die Zelllyse wurden 40µl Lysozym (10mg/ml) zu der Lösung gegeben, der Ansatz 15min auf Eis inkubiert und anschließend 6x für 10sec sonifiziert (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 50%), wobei die Probe zwischen den Sonifikationsschritten für 10sec auf Eis abgekühlt wurde. 1,5ml des Lysates wurden in ein neues 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und 10min bei 14.000rcf/4°C abzentrifugiert. Aus dem Überstand mit der löslichen Fraktion wurden 100µl entnommen
121 8. Methoden und mit 100µl 10x Laemmli-Puffer aufgekocht (lösliche Fraktion; SCF). Der restliche Überstand wurde verworfen, das Pellet in 750µl 20mM Tris-HCl (pH 7.5) resuspendiert und für 10min bei 10.000rcf/4°C erneut abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet erneut in 750µl 20mM Tris-HCl (pH 7.5) resuspendiert und wie beschrieben zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand vollständig abgenommen und das Pellet für 5min in 1,5ml 1% SDS bei 95°C aufgekocht und resuspendiert. Von der Probe wurden 100µl abgenommen, mit 100µl 10x Laemmli-Puffer versetzt und 5min bei 95°C aufgekocht (nicht-lösliche Fraktion; ICF). Anschließend wurden die Proben auf einem SDS-Gel aufgetrennt (vgl. Abschnitt 8.3.6). Um den Anteil des Proteins in der löslichen und unlöslichen Fraktion beurteilen zu können wurde das Gel entweder mit Coomassie gefärbt (vgl. Abschnitt 8.3.7) oder immunologisch mittels Western Blot und Immundetektion analysiert (vgl. Abschnitte 8.3.8 und 8.3.9).
8.3.5 Fällung von Proteinen
Chloroform-Methanol-Fällung: Die Eluate der unter 8.3.14 aufgereinigten Proteinproben wurden 2min bei 2000rcf/4°C zentrifugiert. Um das gesamte Eluat parallel fällen zu können wurden aus dem Überstand Volumina von je 200µl in ein 2ml Reaktionsgefäß aliquotiert und auf Eis gestellt. Anschließend wurde jedes Aliquot mit 800µl Methanol versetzt, 5sec bei maximaler Intensität gevortext und 30sec bei 9000rcf/RT zentrifugiert. Dann wurden 200µl Chloroform zugegeben, der Ansatz 5sec gevortext und erneut für 30sec bei 9000rcf/RT zentrifugiert. Nachfolgend wurden 400µl ddH2O zu den Proben gegeben und diese wiederum 5sec gevortext und für 1min bei 9000rcf/RT zentrifugiert. Nach vorsichtigem Abnehmen des Überstandes wurden die in der Interphase befindlichen Proteine mit 600µl Methanol versetzt, 10sec gevortext und auf Eis gelagert. Um die Proben zu poolen wurde das Reaktionsgefäß 2min bei 16000rcf/RT zentrifugiert, der Überstand vorsichtig mit einer Pipette abgenommen, und das Volumen aus den verbliebenen Reaktionsgefäßen sequentiell in dieses Reaktionsgefäß überführt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Pellet unter der Cleanbench getrocknet und weiter prozessiert oder bei -80°C gelagert.
122 8. Methoden
TCA-Fällung: Proteinproben wurden mit 1 Volumen 100% Trichloressigsäure und 4 Volumen Probe in einem 1,5ml Reaktionsgefäß versetzt, durch invertieren gemischt und 10min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Probe 5min bei 14.000rcf/4°C zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgenommen und das Pellet mit 200µl kaltem Aceton gewaschen. Der Waschschritt mit Aceton wurde 2x wiederholt, wobei die Probe wie beschrieben zentrifugiert wurde. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Aceton vollständig abgenommen und das Pellet für 5-10min im Heizblock bei 95°C getrocknet. Die Probe konnte dann bei -80°C gelagert oder in einem adäquaten Volumen 10x Laemmli-Puffer aufgekocht werden.
8.3.6 SDS-PAGE
Für die Auftrennung von Proteinen-Proben unter denaturierenden Bedingungen in diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970) wurden Acrylamid-Gele mit einer Konzentration von 10-15% verwendet. Der Ansatz von Sammel- und Trenngelen erfolgte wie in Tabelle 8.15 beispielhaft für ein 10%-Gel beschrieben. Für die Polymerisation des Trenngels wurde dieses mit Isopropanol überschichtet, um die Bildung von Luftblasen zu reduzieren und eine gerade Gelfläche im Kontaktbereich von Trenn- und Sammelgel zu erhalten. Nach der Polymerisation der Gele erfolgte die gelelektrophoretische Auftrennung in einer BioRad Mini-PROTEAN® Tetra Cell Apparatur unter Verwendung eines 1xProteingel- Laufpuffers, wobei die Proben bei einer Spannung von 100V das Sammelgel passierten und die Spannung beim Übergang in das Trenngel auf 200V erhöht wurde.
Tabelle 8.15 – Pipettierschema für den Ansatz eines SDS-Gels: Die nachfolgende Tabelle zeigt das Pipettierschema für die Herstellung von zwei diskontinuierlichen SDS-Gelen mit einer Konzentration von 10%. Nach der Herstellung des Trenngels in einem Biorad Gelgießstand wurde das Gel mit einem geringen Volumen Isopropanol überschichtet, um eine gerade Oberfläche zu erhalten und die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Das Isopropanol wurde nach der Polymerisation mit Whatman- Papier entfernt.
Trenngel (10%) – Angaben für 2 Gele Komponente Volumen Trenngelpuffer 3,5ml Acrylamid (Rotiphorese Gel 30) 4,65ml ddH2O 5,8ml TEMED 0,01ml APS (10%) 0,1ml
123 8. Methoden
Sammelgel - Angaben für 2 Gele Komponente Volumen Sammelgelpuffer 1,25ml Acrylamid (Rotiphorese Gel 30) 0,5ml ddH2O 3,2ml TEMED 0,01ml APS (10%) 0,1ml
8.3.7 Färbung von SDS-Gelen
Die unspezifische Färbung von aufgetrennten Proteinen in SDS-Gelen erfolgte mit Coomassie- oder kolloidaler Coomassie-Lösung. Hierfür wurde das SDS-Gel in einer Schale mit heißem ddH2O für 10min auf dem Schüttler (RT) geschwenkt. Anschließend wurde das Wasser abgegossen, gegen die entsprechende Coomassie-Lösung ausgetauscht und abgedeckt ÜN weiter bei RT geschwenkt. Am Folgetag wurde die Coomassielösung abgegossen und überschüssiges Coomassie mit ddH2O (kolloidales Coomassie) oder Coomassie-Destain-Lösung (nicht-kolloidales Coomassie) entfärbt. Die Dokumentation erfolgte mittels Scanner oder Intas-Geldokumentationssystem.
8.3.8 Western Blot
Um in einer SDS-PAGE aufgetrennte Proteine spezifisch nachweisen zu können wurden diese mittels Western Blot auf eine Nitrocellulose-Membran (NC-Membran) transferiert (Towbin et al., 1979) und wie in 8.3.9 beschrieben immunologisch detektiert. Bei Proteinen <100 kDa erfolgte der Transfer in einem vertikalen System mittels Semi-dry Blot. Hierfür wurden die folgenden Komponenten wie in der dargestellten Reihenfolge in einer FastBlot B449 Apparatur (Biometra) angeordnet:
Kathode (Deckel) 3x Whatman Papier SDS-Gel NC-Membran 3x Whatman Papier Anode
124 8. Methoden
Alle Komponenten wurden vorher 5min in Semi-dry Blotting-Puffer inkubiert. Der Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran erfolgte für 45min bei 4mA/cm2 NC- Membranoberfläche. Bei Proteinen >100kDa erfolgte der Transfer in einem horizontalen System mittels Wet-Blot in einer Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell Apparatur der Firma Biorad. Die Anordnung der Komponenten erfolgte gemäß Herstellerangaben wie folgt:
Anode Schwamm (Mini Trans Blot® System) 2x Whatman-Papier NC-Membran SDS-Gel 2x Whatman-Papier Schwamm (Mini Trans Blot® System) Kathode
Die Komponenten wurden für 5min in Wet-Blotting-Puffer inkubiert. Der Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran erfolgte unter Verwendung eines Kühl-Akkus auf einem Magnetrührer für 1h bei 100V und 350mA.
8.3.9 Immunologischer Nachweis von Proteinen
Für die Detektion spezifischer Proteine unter Verwendung entsprechender Antikörper, die wie in 8.3.8 beschrieben auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert wurden, wurde die Membran zunächst für 5min in 20ml 1xPBS bei RT auf einem Schüttler gewaschen. Dann erfolgte die Blockierung freier Bindestellen auf der NC-Membran durch Inkubation mit 5% Blockierlösung für 1h bei RT auf einem Schüttler. Anschließend wurde die Membran 3x für jeweils 5min mit 1xPBS auf einem Schüttler gewaschen. Für die Inkubation mit dem Primärantikörper wurde dieser entsprechend den Angaben in den Abschnitten 7.8.1 und 7.8.2 in PBS verdünnt und die Membran ÜN bei 4°C auf dem Schüttler inkubiert. Am Folgetag wurde der Primärantikörper abgenommen und die Membran wie oben beschrieben 3x in PBS gewaschen. Die Inkubation der Membran mit dem jeweiligen Sekundärantikörper
125 8. Methoden erfolgte entsprechend der in Abschnitt 7.8.3 aufgeführten Verdünnung in PBS schüttelnd für 1h bei RT. Anschließend wurde die Membran jeweils 2x für 5min in 20ml 1xPBS und 20ml 1xAP-Puffer inkubiert. Für die Färbereaktion wurden 100µl BCIP (Konz) mit 5ml AP-Puffer versetzt, gemischt und auf die in einer Schale befindliche Membran gegeben. Die Inkubation, bei der das Chromogen BCIP durch die an den Sekundärantikörper konjugierte Alkalische Phosphatase zu 5-Brom-4-Chlor-Indolyl + Phosphat hydrolysiert und 5-Brom-4-Chlor-Indolyl durch den Luftsauerstoff zu dem Farbstoff 5,5´-Dibrom-4,4´-Dichlor-Indigo oxidiert wird, erfolgte unter Lichtausschluss in einer Schublade. Die Färbung konnte durch Zugabe von 50µl NBT (75mg/ml) intensiviert werden, sofern nur mit einer schwachen Reaktion zu rechnen war.
8.3.10 Immunpräzipitation von Proteinen mittels GFP-Pulldown
Um in-vitro die Interaktion von GFP-getaggten Proteinen mit anderen Proteinen unter Verwendung eines GFP-Binders zu untersuchen wurden 5x108 Zellen einer Dictyostelium discoideum Kultur mit einer Zelldichte von ca. 3-5x106 Zellen/ml in einem 50ml Reaktionsgefäß Röhrchen sequentiell für 3min bei 370rcf/4°C abzentrifugiert und zusätzlich eine Probe von 5x106 Zellen genommen (Input-Probe 1 = IN1). Die Zellen für die Probe wurden, wie bereits beschrieben, abzentrifugiert und das Pellet für 5min bei 95°C in 100µl 10x Laemmli-Puffer aufgekocht und anschließend bei -20°C gelagert. Die sequentiell abzentrifugierten Zellen wurden 2x mit 20ml Soerensen Phosphatpuffer gewaschen und wie beschrieben pelletiert. Anschließend wurde das Pellet in 10ml GFP-Lysepuffer resuspendiert und 5x für 10sec (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 50%) auf Eis sonifiziert. Anschließend wurden 100µl als Probe entnommen, mit 100µl 10x Laemmli-Puffer versetzt, für 5min bei 95°C aufgekocht und anschließend bei -20°C gelagert (Sonifizierungs-Probe = SON1). Das verbleibende Lysat (im folgenden als GFP-Lysat bezeichnet) wurde 15min bei 10.000rcf/4°C abzentrifugiert, in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt, erneut wie beschrieben zentrifugiert und in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert. Zwischenzeitlich wurden 250-300µl Sephadex G-50 mit 1ml GFP-Lysepuffer in einem 1,5ml Reaktionsgefäß für 5min bei 4°C auf dem Drehrad äquilibriert, für 2min bei 2000rcf/4°C abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Beads mit 1ml des GFP-Lysats resuspendiert und dann in das Reaktionsgefäß mit dem
126 8. Methoden restlichen GFP-Lysat überführt. Anschließend wurde der Ansatz für 30min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert, um unspezifische Bindungen an die Sepharose zu reduzieren. Zur Vorbereitung auf den eigentlichen Bindungsassay wurden parallel 30µl GBP-NHS-Sepharose GFP-trapA (Rothbauer et al., 2008) mit 1ml GFP-Lysepuffer für 5min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Sephadex G-50 Beads für 2min bei 2000rcf/4°C abzentrifugiert. Aus dem Überstand wurden 100µl als Probe entnommen (Prääquilibrierungs-Probe 1 = PRÄ1; für die weitere Behandlung der Probe siehe Probe SON1) und der verbleibende Überstand in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert. Die GFP-trapA Beads wurden ebenfalls wie beschrieben abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Beads mit 1ml des praeäquilibrierten GFP-Lysats resuspendiert und in das Reaktionsgefäß mit dem restlichen GFP-Lysat überführt. Der Ansatz wurde für 90min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert. Während der Inkubation erfolgte die Vorbereitung des Interaktionspartners wie oben beschrieben. Nach der Praeäqulibrierung mit den Sephadex G-50 Beads wurde der Überstand des Lysates bis zum weiteren Gebrauch auf Eis gelagert. Die Probenbezeichnungen erfolgten analog zu den oben genannten Proben mit IN2, SON2 und PRÄ2. Das Lysat wird im Folgenden als Binder-Lysat bezeichnet. Von dem mit GFP-trapA Beads äquilibrierten Lysat wurde eine Probe entnommen (Output Probe 1 = OUT1; die weitere Behandlung der Probe erfolgte wie bei Probe SON1), die Beads wie beschrieben abzentrifugiert und der restliche Überstand verworfen. Anschließend wurden die Beads 5x für 5min bei 4°C mit 1ml GFP-Waschpuffer auf dem Drehrad inkubiert und wie bereits erwähnt abzentrifugiert, wobei die Beads für die Waschschritte in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt wurden. Nach jedem Waschschritt wurde eine Probe entnommen (Wasch-Proben 1-5 = W1-W5) und wie beschrieben prozessiert. Anschließend wurde das Binder-Lysat in das 15ml Reaktionsgefäß mit den GFP-trapA Beads gegeben und der Ansatz für 90min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurden die Beads wie beschrieben abzentrifugiert, eine Probe entnommen (Output-Probe = OUT), der verbleibende Überstand verworfen und die Beads 5x mit 1ml GFP-Waschpuffer gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde eine Probe entnommen (Waschproben 6-10 = W6-W10) und wie beschrieben verarbeitet. Für die Elution wurden die Beads mit 100µl 10x Laemmli-Puffer versetzt, 10min bei 95°C aufgekocht (Eluat Probe = E) und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
127 8. Methoden
8.3.11 Immunpräzipitation von Proteinen mittels His-Pulldown (His-Dimerisierungsassay)
Eine 10ml Vorkultur wurde mit dem entsprechenden E. coli Klon angeimpft und ÜN bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Am Folgetag wurden 100ml LB-Selektionsmedium mit 2ml der
Vorkultur angeimpft und die Kultur bis zu einer OD595 von 0,6 inkubiert. Durch Zugabe von 1mM IPTG und die Inkubation für 3h bei 37°C erfolgte die Induktion der Proteinexpression. Anschließend wurden die Zellen für 5min bei 4000rcf/4°C pelletiert und der Überstand sorgfältig abgegossen. Sofern der Assay nicht unmittelbar im Anschluss durchgeführt werden sollte konnten die pelletierten Zellen bei -20°C gelagert werden. Um die Zellen zu lysieren wurde das Pellet in 10ml Ni-NTA-Startpuffer resuspendiert, NP40 hinzugegeben bis die Lösung deutlich klarer wurde (Endkonzentration NP40 maximal 1%) und der Ansatz für 15min auf Eis inkubiert. Alternativ zur Lyse mit NP40 konnte auch Lysozym verwendet werden. Um die Zelllyse zu unterstützen erfolgten sechs Sonifizierungsschritte auf Eis für die Dauer von 15sec (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 100%), wobei zwischen den Sonifizierungsschritten eine Pause von 30sec auf Eis erfolgte. Nach der Zelllyse wurde der Ansatz für 10min bei 10.000rcf/4°C zentrifugiert und der Überstand abgenommen und in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert. Von dem Überstand wurden 100µl abgenommen (Input Probe 1 = IN1), mit 20µl 10x Laemmli-Puffer versetzt, 10min bei 95°C erhitzt und bei -20°C gelagert. Um die Bindung der His-getaggten Proteine aus der Lösung an die Ni-NTA Matrix vorzubereiten (Porath et al., 1975; Sulkowski 1985; Hochuli 1989) wurden 400µl Ni-NTA- Sepharose (Qiagen) in ein 1,5ml Reaktionsgefäß gegeben und die Beads mit 1,5ml Ni-NTA- Startpuffer für 15min bei 4°C auf dem Drehrad äquilibriert. Anschließend wurde der Ansatz für 1min bei 300rcf/4°C zentrifugiert und der Überstand vorsichtig mit der Pipette abgenommen. 1ml des oben hergestellten E. coli Lysates mit den His-getaggten Proteinen wurden zu den Beads in das 1,5ml Reaktionsgefäß gegeben, die Beads aufgeschwemmt und in das 15ml Reaktionsgefäß mit dem restlichen Lysat gegeben. Der Vorgang wurde 1x wiederholt. Das Reaktionsgefäß wurde zusätzlich mit Parafilm verschlossen und für 1-3h bei 4°C auf einem Drehrad inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationsdauer wurden die Beads für 1min bei 300rcf/4°C abzentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen (Glaspipette / Mikroliterpipette). Vom entnommenen Überstand wurden 100µl wie oben bei Probe IN1 beschrieben für die Auftrennung auf einem SDS-Gel aufbereitet (Output Probe 1 = OUT1).
128 8. Methoden
Die Beads und die daran gebundenen Proteine wurden für 20min rotierend mit 10ml Ni-NTA Waschpuffer I gewaschen, wie bereits erwähnt abzentrifugiert und erneut mit 10ml Ni-NTA Waschpuffer II wie oben beschrieben gewaschen. Von den Waschüberständen wurden jeweils 100µl als Probe genommen (Wasch Probe 1 = W1; Wasch Probe 2 = W2). Während der Waschschritte erfolgte die Herstellung des Lysates des Interaktionspartners. Handelte es sich um Dictyostelium discoideum Zellen, so wurden 1x108 Zellen aus einer Kultur mit einer Zelldichte von ca. 2x106 Zellen/ml verwendet. Diese wurden für 5min bei 370rcf/4°C pelletiert, 2x mit 20ml Soerensen-Phosphatpuffer gewaschen und das Pellet anschließend in 10ml Ni-NTA-Startpuffer vollständig resuspendiert. Durch Zugabe von NP40 (Endkonzentration 1%) und Inkubation auf Eis für 5min wurde die Lyse eingeleitet. Um diese zu unterstützen wurde die Suspension anschließend 3x für 15sec auf Eis sonifiziert (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 100%). Der Überstand wurde in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt, auf Eis gestellt und von diesem 100µl als Probe (Input Probe 2 = IN2) entnommen und wie oben beschrieben prozessiert. Wurde das Lysat aus E. coli Zellen gewonnen, so wurde das Lysat wie bereits erwähnt hergestellt. Nach den oben genannten Waschschritten wurden die Beads wie oben geschildert abzentrifugiert und der Waschpuffer vorsichtig abgenommen. Das Lysat des Interaktionspartners wurde auf die Beads gegeben, diese resuspendiert und das Reaktionsgefäß wie beschrieben 1-3h auf dem Drehrad bei 4°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Beads wieder für 1min bei 300rcf/4°C abzentrifugiert, das Lysat des Interaktionspartners vorsichtig abgenommen und von diesem eine weitere Probe genommen (Output Probe 2 = OUT2) und wie erwähnt verarbeitet. Anschließend wurden die Beads wie oben bereits beschrieben mit Waschpuffer I und II gewaschen, wobei von den Überständen nach dem Zentrifugieren wiederum zwei Proben genommen wurden (Wasch Probe 3 = W3; Wasch Probe 4 = W4). Die Elution der Proteine von der Ni-NTA Matrix erfolgte in zwei Schritten mit jeweils 1ml Ni-NTA-Elutionspuffer, wobei die Eluate in zwei getrennten 2ml Reaktionsgefäßen gesammelt und auf Eis gestellt wurden. Direkt nach der Elution wurden die Proteine durch Zugabe von 1ml 20% TCA für 30min auf Eis gefällt, bei 20.000rcf/4°C für 30min abzentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgenommen, das Pellet 1x mit 1,5ml eiskaltem Aceton gewaschen und erneut wie zuletzt beschrieben abzentrifugiert. Das Aceton wurde vorsichtig abgenommen, das Pellet unter der Sterilbank luftgetrocknet, zunächst in 25-50µl 1xPBS gelöst, mit 25-50µl 10x Laemmli-Puffer versetzt
129 8. Methoden und auf dem Heizblock für 10min bei 95°C erhitzt. Die anschließende Lagerung der Proben erfolgte bei -20°C.
8.3.12 Immunpräzipitation von Proteinen mittels GST-Pulldown
Um die Interaktion eines rekombinanten GST-Fusionsproteins mit einem anderen getaggten Proteins zu untersuchen (Benard und Bokoch, 2002; Ren et al., 2003) wurde eine entsprechende 100ml Kultur wie unter 8.3.2 beschrieben exprimiert, in 20ml GST- Bindungspuffer I resuspendiert und nach Zugabe von 1mg/ml Lysozym für 30min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz 6x für 15sec auf Eis sonifiziert (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 75%). Zwischen den Sonifizierungsschritten wurde die Probe für jeweils 30sec auf Eis aufbewahrt. Nach der Sonifikation wurden Glycerol (10% Endkonzentration) und NP40 (Endkonzentration 0,1%) hinzugegeben und das Lysat für 20min bei 10.000rcf/4°C abzentrifugiert. Anschließend wurden 1,8ml des Lysats in ein 2ml Reaktionsgefäß gegeben und die GST-getaggten Proteine nach Zugabe von 100µl 50% Glutathion-Sepharose durch 10-minütige Inkubation bei RT und anschließende Inkubation für 60min bei 4°C unter Rotation immobilisiert. 100µl des Lysats wurden zusätzlich als Probe genommen und mit 20µl 10x Laemmli-Puffer für 10min bei 95°C aufgekocht (Input Probe 1 = IN1) und bei -20°C aufbewahrt. Nach der Immobilisation wurden die Beads für 1min bei 1000rcf/4°C abzentrifugiert, 100µl des Überstandes erneut als Probe abgenommen und wie oben beschrieben prozessiert (Output Probe 1 = OUT1), der restliche Überstand abgenommen, die Beads mit 1,8ml GST-Bindungspuffer II unter Rotation gewaschen (15min bei 4°C) und erneut wie bereits erwähnt zentrifugiert. Der Waschschritt wurde wie beschrieben 1x wiederholt, das Lysat zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen. Anschließend wurden von dem Lysat des Interaktionspartner, der wie oben bereits erwähnt hergestellt wurde, 100µl als Input-Probe entnommen (Input Probe 2 = IN2), wie bereits erwähnt aufbereitet und 1,8ml des verbleibenden Lysates in das Reaktionsgefäß mit den vorinkubierten Beads gegeben. Im Anschluss wurde der Ansatz für 2h rotierend bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads wie beschrieben abzentrifugiert und 100µl des Überstands als Probe genommen (Output Probe 2 = OUT2) und prozessiert. Der restliche Überstand wurde verworfen und die Beads 5x für 10min bei 4°C mit jeweils 1,5ml GST- Bindungspuffer II gewaschen. Von den Waschfraktionen 1, 3 und 5 wurden jeweils 100µl als
130 8. Methoden
Probe entnommen (Wasch Probe 1-3 = W1, W2, W3) und wie bereits erwähnt aufbereitet. Für die Elution wurden die Beads 2x mit 60-100µl GST-Elutionspuffer für 20min rotierend bei 4°C inkubiert, wie oben beschrieben abzentrifugiert, mit 20µl 10x Laemmli-Puffer versetzt und 10min bei 95°C aufgekocht (Eluat Probe 1 und 2 = E1, E2). Abschließend wurden die Beads für 10min in 60µl 10x Laemmli-Puffer aufgekocht, abzentrifugiert und der Überstand als Probe entnommen (Bead Probe = B).
8.3.13 Co-Immunpräzipitation mittels GFP-Nanotrap
Um die Interaktion von Proteinen in-vivo mittels Co-Immunpräzipitation (CoIP) zu untersuchen wurden 5x108 Zellen einer Dictyostelium discoideum Kultur mit einer Zelldichte von 2x106 Zellen/ml für 5min bei 370rcf/4°C abzentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet mit 20ml Phosphatpuffer gewaschen und die Zellen erneut wie beschrieben abzentrifugiert. Nach Resuspension in 10ml 1xPBS erfolgte das Crosslinking durch Zugabe von 5mM DTBP bei RT auf einem Drehrad. Anschließend wurden die Zellen unter den oben genannten Bedingungen abzentrifugiert, das Pellet mit 10ml 1xPBS gewaschen, erneut abzentrifugiert und in 10ml CoIP-Lysepuffer resuspendiert. Um die Zelllyse zu unterstürzen wurde die Suspension 3x für 10sec sonifiziert (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 50%), wobei zwischen den Sonifikationsschritten eine Pause von 30sec auf Eis erfolgte. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch dreimaliges Zentrifugieren für 15min bei 10.000rcf/4°C. Zwischen den Zentrifugationsschritten wurde der Überstand vorsichtig abgenommen, in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und nach der letzten Zentrifugation auf Eis gelagert. 250-300µl G50-Sephadex wurden praeäquilibriert, indem diese in einem 1,5ml Reaktionsgefäß mit 1ml CoIP-Lysepuffer für 15min auf dem Drehrad bei 4°C inkubierten. Die Beads wurden für 3min bei 300rcf/4°C abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und die pelletierten Beads zum oben hergestellten Lysat gegeben. Die Inkubation erfolgte rotierend für 30min bei 4°C, anschließend wurden die Beads wie beschrieben abzentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen und auf Eis gelagert. Die Beads wurden in 300µl 5x Probenpuffer complete für 10min bei 95°C aufgekocht. Die Probe (Preclearing Probe = PC) wurde bei -20°C gelagert. Parallel wurden 30µl GBP-NHS-Sepharose (Rothbauer et al., 2008) mit 1ml CoIP-Lysepuffer für 30min rotierend bei 4°C äquilibriert, wie oben beschrieben abzentrifugiert und der
131 8. Methoden
Überstand verworfen. Anschließend wurde vom oben genannten Lysat aus dem Preclearing eine 100µl Probe genommen (Input Probe = IN) und mit 20µl 5x Probenpuffer complete für 10min bei 95°C aufgekocht. Die äquilibrierten Beads wurden zu dem Lysat gegeben und der Ansatz für 90min rotierend bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Beads wie beschrieben abzentrifugiert, vom Überstand eine Probe genommen (Output Probe = OUT) und die Beads 5x mit CoIP-Waschpuffer gewaschen. Von den Waschschritten 1,3 und 5 wurde eine Probe genommen und wie beschrieben verarbeitet (Wasch Proben 1-3 = W1, W2, W3). Zwischen den Waschschritten wurden die Beads für 3min bei 2000rcf/4°C abzentrifugiert. Für die Elution wurden die Beads in 100µl 5x Probenpuffer complete aufgenommen, für 15min bei 95°C aufgekocht, abzentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und bei -20°C gelagert.
8.3.14 Co-Immunpräzipitation mittels Tandem Affinity Purification (TAP)
Um Proteine für massenspektrometrische Untersuchungen zur Indentifikation posttranslationaler Modifikationen und zur Identifikation putativer Interaktionspartner der HP1-Homologe HcpA und HcpB mit Hilfe der Tandem Affinity Purification (TAP) aufzureinigen (Rigaut et al., 1999; Puig et al., 2001) wurde der erste Schritt der TAP-Aufreinigung angewandt. Für die Aufreinigung von Interaktionskomplexen ist gemäß Literatur weiter zu verfahren. Für die Aufreinigung wurden 2x109 Zellen einer Kultur mit einer Zelldichte von ca. 2x106 Zellen/ml sequentiell in einem 50ml Reaktionsgefäß für 5min bei 370rcf/4°C abzentrifugiert und anschließend 3x mit 30ml Soerensen Phosphatpuffer gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde der Puffer vollständig abgenommen, das Pellet in 10ml TAP- Lysepuffer resuspendiert, für 30min auf Eis inkubiert und 2x für 15sec auf Eis sonifiziert (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 100%) wobei die Probe zwischen den Sonifikationsschritten für 15sec auf Eis abgekühlt wurde. Anschließend wurde der Ansatz für 15min bei 10.000rcf/4°C zentrifugiert und der Überstand vorsichtig in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gestellt. Zur Vorbereitung der IgG-Sepharose wurden 300µl IgG-Sepharose Beads (Sigma-Aldrich) auf eine Chromatographie-Säule (Poly-Prep Chromatography Column) geladen und mit 5ml TAP- Lysepuffer gewaschen. Der Durchfluss wurde verworfen, die Säule unten verschlossen, die
132 8. Methoden
Beads mit 2x 2ml des oben erzeugten Lysat-Überstandes aufgeschwemmt und in das 15ml Reaktionsgefäß mit dem restlichen Lysat überführt. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß zusätzlich mit Parafilm verschlossen und der Ansatz auf dem Drehrad rotierend für 2h bei 4°C inkubiert. Die Chromatographie-Säule wurde für diese Zeit unten verschlossen, mit 5ml TAP-Lysepuffer beladen und mit Parafilm verschlossen senkrecht aufbewahrt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Lysepuffer abgelassen, der aus Beads und Lysat bestehende Inkubationsansatz auf die Säule geladen und 2x mit 10ml TAP-Waschpuffer gewaschen. Um den TEV-Protease-Verdau vorzubereiten wurden die Beads auf der Säule 2x mit 5ml TEV- Cleavage Puffer gewaschen. Anschließend wurden diese mit 800-1000µl TEV-Cleavage Puffer in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt, 100U einer kommerziellen TEV-Protease oder 10µl homemade TEV-Protease hinzugegeben und der Ansatz für 4h bei 4°C drehend inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde das Reaktionsgefäß für 2min bei 3000rcf/4°C abzentrifugiert, der Überstand vorsichtig in ein neues 1,5- oder 2ml Reaktionsgefäß überführt und die Proteine wie in Abschnitt 8.3.5 beschrieben gefällt.
Bei einer Wiederholung der oben beschriebenen Aufreinigung wurden 5x109 Zellen verwendet, wobei die Kultur eine Dichte von bis zu 5x106 Zellen/ml erreichen durfte und die Volumina der Puffer entsprechend angepasst wurden. Die Proben aus dieser Aufreinigung wurden für die im Ergebnisteil beschriebenen Massenspektrometrischen Analysen verwendet.
8.3.15 Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
Für die Antiköper-vermittelte Präzipitation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Chromatin- Immunpräzipitation wurden 2x108 Zellen einer axenisch gewachsenen Kultur mit einer Zelldichte von ca. 2x106 Zellen/ml für 10min bei 370rcf/4°c abzentrifugiert, der Überstand verworfen, dass Pellet in 30ml kaltem Phosphatpuffer gewaschen und die Zellen erneut für 5min bei 370rcf/4°C pelletiert. Anschließend folgte das Crosslinking durch Zugabe von 10ml 1% Paraformaldehyd und einer 10-minütigen Inkubation auf Eis. Nach Ablauf der Zeit wurde der Crosslinking-Vorgang durch Inkubation für 5min auf Eis nach Zugabe von 1,12ml 1,25mM Glycin gestoppt und die Zellen für 10min bei 370rcf/4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet mit 30ml kaltem Phosphatpuffer gewaschen und die Zellen
133 8. Methoden erneut für 5min bei 370rcf/4°C pelletiert. Dann wurde der Überstand vollständig abgenommen, das Pellet in 9ml Lysepuffer (Zugabe einer Proteinase-Inhibitor-Tablette complete-mini je 10ml Lysepuffer, alternativ wurde zusätzlich PMSF in einer Endkonzentration von 0,1mM zugegeben) resuspendiert und 1ml 10% NP40 (1% NP40 Endkonzentration) zugegeben. Um die DNA zu scheren wurde der Ansatz 5x für 10sec sonifiziert (Cycle: 0,5sec; Amplitude: 25%), wobei die Probe zwischen den Sonifikationsschritten für jeweils 50sec auf Eis gekühlt wurde. Anschließend wurde der Ansatz für 30min bei 10.000rcf/4°C abzentrifugiert. Der Überstand von ca. 10ml wurde in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und eine Probe von 100-200µl entnommen und bei - 20°C eingefroren (= Input Probe IP). Das Volumen der entnommenen Probe wurde für die spätere Quantifizierung notiert. Der restliche Überstand wurde für das PreClearing (unspezifische Bindung von Komponenten aus dem Überstand an die Säulenmatrix) mit 20- 30µl Sephadex versetzt und 1h auf einem Drehrad im Kühlraum inkubiert. Die Sephadex- Beads wurden dann für 3min bei 10.000rcf/4°C abzentrifugiert, der Überstand in ein neues 15ml Reaktionsgefäß überführt und 1/10 des Überstandes als Probe in ein neues 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und eingefroren (= PreClearing / kein Antikörper-Kontrolle PC). Anschließend wurde der restliche Überstand auf mehrere 1,5ml Reaktionsgefäße aufgeteilt, der Antikörper zugegeben (Chromotek GFP-Binder GFP-TRAP: 20µl; H3K9me3-Antikörper: 2µl je 2x107 Zellen) und der Ansatz ÜN bei 4°C rotierend inkubiert. Bei Verwendung des H3K9me3-Antikörpers wurden am Folgetag 30µl Protein-A-Sepharose zugegeben und der Ansatz für weitere 60min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurden die Beads für 3min bei 300rcf/4°C abzentrifugiert und 2x mit 500µl Wasch-Puffer gewaschen (Zentrifugation wie oben beschrieben). Es folgten zwei weitere Wasch- und Zentrifugationsschritte unter der Verwendung von RIPA-Puffer. Für die Elution wurden die Beads auf einem Thermomixer mit 250µl Elutions-Puffer für 15min bei 65°C inkubiert. Der Überstand wurde abgenommen und in einem 1,5ml Reaktionsgefäß auf Eis gestellt. Der Elutionsschritt wurde wie beschrieben wiederholt und die Elutionsüberstände vereint ( = Elution E). Für das reverse Crosslinking wurden den aufgetauten Proben 20µl 5M NaCl zugegeben und diese ÜN bei 65°C schüttelnd auf dem Thermomixer inkubiert. Am Folgetag erfolgte der Abbau der Proteine durch Zugabe von 20µl Proteinase K-Puffer und 2µl Proteinase K (20mg/ml) und einer nachfolgenden Inkubation von 3h bei 45°C. Die Proben wurden anschließend wie in Abschnitt 8.2.6 und 8.2.7 beschrieben Phenol-Chloroform
134 8. Methoden
extrahiert, mit Ethanol gefällt und das Pellet nach dem trocknen in 50µl ddH2O aufgenommen. Die „Input“-Probe und die „PreClearing“-Probe wurden in einem entsprechenden Volumen resuspendiert, um die Konzentrationsverhältnisse zu wahren.
8.3.16 Massenspektrometrische Analyse von Proteinen
Die Durchführung massenspektrometrischer Analysen (Thomson, 1907; Aston, 1919) für die Identifikation putativer Interaktionspartner und posttranslationaler Modifikationen der HP1- Homologe HcpA und HcpB erfolgten in der Abteilung für Biochemie von Prof. Dr. F. W. Herberg an der Universität Kassel und am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen in der Abteilung Bioanalytical Mass Spectrometry von Prof. Dr. H. Urlaub. Die mittels Tandem-Affinity-Purification aufgereinigten (vgl. Abschnitt 8.3.14) und gefällten (vgl. Abschnitt 8.3.5) Proteinproben wurden der Abteilung für Biochemie übergeben und nach den dort gängigen Methoden tryptisch verdaut und vermessen. Für die Messungen am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen wurden die getrockneten Proben verschickt und vor Ort nach den dort etablierten Protokollen tryptisch verdaut und auf einem LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific) massenspektrometrisch analysiert. Die Auswertung der Rohdaten erfolgte unter Verwendung der in 7.17.1 aufgeführten Software Scaffold und Scaffold PTM. Die Nomenklatur der Ionen-Sequenzen in den Massenspektren fand Anwendung wie in Fohlman (1984) beschrieben.
135 9. Ergebnisse
9. Ergebnisse
9.1 Posttranslationale Modifikationen der HP1-Homologe HcpA und HcpB
Um posttranslationale Modifikationen der HP1-Homologe HcpA und HcpB zu identifizieren wurden die Plasmide pDV-N-TAP HcpA und pDV-N-TAP HcpB wie in Abschnitt 8.1.6 beschrieben in den Stamm AX2 transformiert. Die Selektion positiver Klone erfolgte mittels PCR auf genomische DNA. Da die Expression des integrierten Konstrukts vom Ort der Integration abhängig ist wurde diese mittels Western Blot überprüft. Als Positivkontrolle wurde der Stamm AX2-N-TAP (Moog, 2011) verwendet. Abbildung 9.1 (A) zeigt, dass in den selektierten Klonen HcpA-TAP #2 und HcpB-TAP #1 keine Einschränkung der Expression aufgrund einer möglichen Heterochromatin-nahen Integration besteht. Zunächst wurden die Proteine in einem Vorversuch mit dem ersten Aufreinigungsschritt der in Abschnitt 8.3.14 beschriebenen Tandem Affinity Purification aus 2x109 Zellen einer axenisch gewachsenen Kultur mit einer Zelldichte von 2x106 Zellen/ml aufgereinigt und mit den in Abschnitt 8.3.5 genannten Methoden gefällt und getrocknet. Da hierbei die Chloroform-Methanol-Fällung im Hinblick auf Ausbeute und Trocknungsfähigkeit deutliche Vorteile gegenüber der TCA- Fällung aufwies wurde diese für nachfolgende Proteinpräparationen verwendet. Abbildung 9.1 (B) zeigt die SDS-PAGE der Präparation. Die mit 1 und 3 markierten Banden sind mit hoher Wahrscheinlichkeit dem aufgereinigtem HcpA bzw. HcpB zuzuordnen. Ihre etwas höhere Lage gegenüber dem Western Blot in Abbildung 9.1 (A) dürfte auf ein Laufartefakt zurückzuführen sein, welches durch eine abweichende Konzentration des SDS-Geles zu begründen wäre. Bei ca. 35 kDa laufen vergleichbare Banden, welche möglicherweise dem endogenem HcpA bzw. HcpB zuzuordnen sind. Die Aufreinigung der Proteine für massenspektrometrische Analysen erfolgte ebenfalls aus jeweils 2x109 Zellen einer axenisch gewachsenen Kultur mit einer Zelldichte von 2x106 Zellen/ml unter Anwendung der in Abschnitt 8.3.14 beschriebenen TAP-Aufreinigung, wobei wieder nur der erste Aufreinigungsschritt zur Anwendung kam. Für die massenspektrometrischen Analysen wurden je HP1-Homolog zwei unabhängige Proteinpräparationen angefertigt und separat gemessen. Die Proben wurden wie in Abschnitt 8.3.5 erwähnt mit Methanol-Chloroform gefällt und getrocknet und gemäß den Angaben in Abschnitt 8.3.16 analysiert. Für die Bestimmung der posttranslationalen
136 9. Ergebnisse
Modifikationen wurden die in Abbildung 9.1 (C) markierten Banden mit den in Abbildung 9.1 (D) gezeigten Scores gemessen. In den Messungen konnten die Aminosäuresequenzen der Proteine zu insgesamt 76,9% (HcpA) bzw. 80,7% (HcpB) abgedeckt werden (vgl. Abbildung 9.1 (E)), wobei die Abdeckung der beiden Einzelmessungen von HcpA bei 69% bzw. 66% und bei den Einzelmessungen von HcpB bei 72% bzw. 71% lag.
A B
kDa M HcpA-TAP HcpB-TAP 250 130 100 kDa M AX2 AX2-TAP HcpA-TAP HcpB-TAP 70 250 55 1 3 130 4 1 = HcpA-TAP 100 35 2 70 2 = endogenes HcpA 25 55 3 = HcpB-TAP α-TAP 4 = endogenes HcpB
35
25 15 α-TAP 15
C
AX2-TAP HcpA-TAP (1)HcpA-TAP (2) M kDa kDa M HcpB-TAP (1)HcpB-TAP (2)
250 250 150 150 100 100 75 75
50 50 37 37 2 1* * 25 25 20 20 15 15 10 10 D Bande Protein Score Bande Protein Score HcpA 1-1* HcpA 1664,2 HcpB 1-2* HcpB 1213,8 HcpA 2-1* HcpA 1784,7 HcpB 2-2* HcpB 1173,6
E
Peptdabdeckung HcpA 76,9% (69%/66%)
MGKRDKRIIEEPEEPEEAGDVFEVEKILDKRVQHGRIQYSIRWKGFTADYDTWEDEDNVAGCPELVKEFESSREQEKKKSR KRKNVIVNDDQTAVESSSPPPTTKPSSSSSSTKTTKAATSTTTNTSTQQKTNHLIDDEEYIKNEYIKFGVPYIEGIGFENGHC VEEIIGCKPFGQDNTLFFFVKWRGQEKLSWVLNEILKHKEPLQLIEFYENRLKFGYKGQQS
Peptdabdeckung HcpB 80.7% (72%/71%)
MGKRDKKIIIEEPEELEEAEDVFEVEKILDKRVQHGRIQYNVRWIGFSSDYDTWEDEDNVAGCPELVKEFESSRQQEKKKS KKRKHTIINDDPTAVEISSSSSPPTTKPSSSTTAAAPASSSASVTTKTATATVTTDTYFSNNTTSTHQKTNHSVEVEENIKNEY IKFGVPYIEGVGFENGHCVEEVIGCKPFGQDNTLFFFVKWRDQEKLSWVPNEILKHKEPLQLIEFYESRLKFGYSGQPS
137 9. Ergebnisse
Abbildung 9.1 – Aufreinigung von HP1-Homologen aus Dictyostelium discoideum für massenspektrometrische Untersuchungen: (A) Expressionskontrolle der transformierten Klone HcpA-TAP #2 und HcpB-TAP #1. (B) Darstellung der Expression im Coomassie-gefärbten SDS-Gel. Neben den zu erwartenden Banden (Markierung 1 und 3) fallen zwei weitere Banden auf, die im Bezug auf den Größenstandard und im Vergleich zueinander endogenem HcpA und HcpB entsprechen. (C) SDS-PAGE der aufgereinigten Proteine. Die markierten Banden wurden für die Identifikation posttranslationaler Modifikationen in endogenem HcpA bzw. HcpB analysiert. Die Probe AX2-TAP dient der Identifikation unspezifisch bindender Proteine (vgl. Abschnitt 9.3). (D) Scores der isolierten endogenen Hcp-Proteine. (E) Sequenzabdeckung der massenspektrometrisch analysierten Proteine. Die Gesamtabdeckung wurde aus den jeweiligen Einzelabdeckungen zweier unabhängiger Proteinpräparationen (in Klammern) ermittelt. HcpA konnte mit einer Sequenzabdeckung von 76,9%, HcpB mit einer Abdeckung von 80,7% erfasst werden. Nicht erfasste Sequenzbereiche sind unterstrichen.
Die Rohdaten wurden in Scaffold importiert und standen in dem entsprechenden Dateiformat .sf für ein weiteres Vorgehen zur Verfügung. Sie wurden entsprechend Abbildung 9.2 in der Software Scaffold 4.2.1 in das Format .mzid konvertiert, in Scaffold PTM 2.1.3 importiert und final im Format .sptm gespeichert und analysiert.
Abbildung 9.2 – Datenprozessierung: Darstellung der Datenverarbeitung für die Analyse posttranslationaler Modifikationen. Die Rohdaten der massenspektrometrischen Analyse wurden in Scaffold 4.2.1 importiert, gespeichert und in ein Scaffold PTM-kompatibles Format exportiert. Dieses wurde in Scaffold PTM 2.1.3 importiert und gespeichert und stand somit für die Analyse von posttranslationalen Modifikationen zur Verfügung (Abbildung aus Searle & Turner).
Die Identifikation der posttranslationalen Modifikationen erfolgte unter Verwendung der Software Scaffold PTM in der Version 2.1.3 mit einer gewählten minimalen Lokalisationswahrscheinlichkeit von 95%. Modifikationen, die aufgrund einer geringeren Wahrscheinlichkeit keiner bestimmten Aminosäure innerhalb des Peptids zugeordnet werden konnten, fanden in der Auswertung keine Beachtung. Die zu erwartenden Massen der identifizierten Peptide wurden manuell mit Hilfe des entsprechenden Onlinetools von der Seite www.expasy.org und unter Verwendung der in Tabelle 9.1 genannten
138 9. Ergebnisse monoisotopischen Massen berechnet und den tatsächlich gemessenen Massen gegenübergestellt.
Tabelle 9.1 – Massen posttranslationaler Modifikationen: Die nachfolgende Tabelle zeigt die für Kalkulationen verwendeten Massen posttranslationaler Modifikationen (Lu et al, 2013). Für die Berechnungen fanden die monoisotopischen Massen Anwendung. Da für die monoisotopische bzw. durchschnittliche Masse von Acetaldehyd keine Literaturwerte gefunden wurden erfolgten Kalkulationen unter der Verwendung des in Scaffold PTM angegebenen Massewertes.
Modifikation monoisotopische Masse (m/z) durchschnittliche Masse (m/z) Methylierung 14,0157 14,0269 di-Methylierung 28,0314 28,0538 tri-Methylierung 42,0471 42,0807 Phosphorylierung 79,9663 79,9799 Acetylierung 42,0106 42,0373 Acetaldehyd 28 28 Carbamidomethylierung 57,0340 57,0720
Die Tabellen 9.2 und 9.3 listen die identifizierten Modifikationen mit ihren kalkulierten und gemessenen Massen, den Massedifferenzen und der relativen Abundanz der jeweiligen Modifikation auf (für eine erweiterte Fassung siehe Tabelle 14.2.3-14.2.6 und Abbildung 14.2.1 und 14.2.2 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers). In HcpA wurden 24 posttranslationale Modifikationen identifiziert, die teilweise alleine oder in Verbindung mit anderen Modifikationen auftraten und deren Lokalisationswahrscheinlichkeit für eine bestimmte Aminosäure 95% entspricht oder übersteigt (siehe Tabelle 9.2). Die Spektren der einzelnen Modifikationen sind in Abbildung 14.2.1 und 14.2.2 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers zusammengefasst. Die ausschließlich in Kombination vorkommenden Modifikationen D5Ac und K6Acal weisen eine relative Abundanz von 100% auf. Da insgesamt nur zwei Peptide detektiert wurden ist jedoch nicht auszuschließen, dass an den entsprechenden Positionen auch Aminosäuren existieren, die keine Modifikation tragen. Im Vergleich dazu tritt die Carbamidomethylierung an der Position C62, deren relative Abundanz ebenfalls 100% beträgt, in allen 53 gemessenen Peptiden auf (vgl. Tabelle 14.2.3 und 14.2.4 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers). Weitere detektierte einzeln vorkommende Modifikationen sind I8Ac, K26Me, E68Ac, K77Me, N85Ac, S99Ph, K105Acal, A118Ac, T132Ac, K143Me, L192Ac, K201Me, H202Ac sowie K203Acal, K203Me und K203Ac. Letztere ist nur mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% an der entsprechenden Aminosäure vertreten, findet
139 9. Ergebnisse aber Erwähnung, da ihre Existenz bereits in einer früheren Arbeit postuliert wurde (Földesi, 2010).
Tabelle 9.2 – Posttranslationale Modifikationen in HcpA: nachfolgend sind alle gemessenen posttranslationalen Modifikationen aufgeführt, welche für das endogene HcpA gemessen wurden. Aus den mittels ExPASy kalkulierten und massenspektrometrisch gemessenen Werten wurde der Massendefekt ermittelt und ebenfalls angegeben. Zudem wurde die relative Abundanz durch Bildung des Verhältnisses von modifiziertem zu nicht-modifiziertem Peptid ermittelt.
PTMs m/z m/z Δ Relative (kalkuliert) (gemessen) Abundanz (%) D5Ac K6Acal 2656,233 2656,314 +0,081 100 I8Ac 2229,010 2229,027 +0,017 9,5 K26Me 2201,015 2201,035 +0,020 5,0 C62Carb 2630,125 2630,121 -0,004 100 C62Carb K67Me 2644,135 2644,139 +0,004 9,4 E68Ac 795,328 795,340 +0,012 40,0 K77Me 1281,572 1281,587 +0,015 12,5 K84TriMe S97Ph 3296,555 3296,537 -0,018 3,4 N85Ac 3088,457 3088,472 +0,015 2,2 S97Ph K105Me 3140,429 3140,444 +0,015 0,7 S99Ph K105Acal 3154,413 3154,415 +0,002 0,7 S99Ph 3126,443 3126,440 -0,003 8,3 K105Acal 3074,447 3074,465 +0,018 1,5 K105Me K114Me 3074,482 3074,459 -0,023 1,5 A118Ac 1480,689 1480,704 +0,015 12,5 T132Ac 1530,709 1530,725 +0,016 4,4 K143Me 2150,042 2150,057 +0,015 1,9 L192Ac 1255,706 1255,718 +0,012 11,4 K201Me 1227,711 1227,726 +0,015 1,4 H202Ac 1856,931 1856,947 +0,016 2,9 H202Ac K203Acal 1884,828 1884,947 +0,119 3,4 K203Acal 2083,996 2084,111 +0,115 1,3 K203Me 1828,936 1828,952 +0,016 1,3 K203Ac 1856,931 1856,947 +0,016 2,6
Weitere gefundene Kombinationen von Modifikationen in HcpA sind C62Carb-K67Me, K84TriMe-S97Ph, S97Ph-K105Me, S99Ph-K105Acal, K105Me-K114Me sowie H202Ac- K203Acal. Die Phosphorylierung in S99Ph-K105Acal weist zwar nur eine Lokalisationswahrscheinlichkeit von 93% auf, ist aber in der separat vorkommenden Modifikation S99Ph mit 99% verifiziert. Für die Phosphorylierung des Serins an Position 97 sei erwähnt, dass ihre Lokalisationswahrscheinlichkeit nur zwischen 24 bzw. 35% liegt. Sie findet hier dennoch Erwähnung, da für die Hinge-Region (vgl. Abbildung 9.6) in anderen HP1-
140 9. Ergebnisse
Homologen zahlreiche Phosphorylierungen beschrieben sind, die funktionell relevant sind (siehe Kapitel 10). In HcpB detektierte Modifikationen sind K7Acal, K7Me, I8Ac, K27Me, C63Carb, E69Ac, K85Me, K108Acal, K128Acal, T129Ac, K150Acal, T151Ac, D207Ac, L211Ac und K222Me. Die Acetylierung an Position K222 von HcpB ist auch hier nur mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% vertreten. Im Vergleich zu HcpA wurden in HcpB keine Phosphorylierungen gefunden.
Tabelle 9.3 – Posttranslationale Modifikationen in HcpB: in der nachfolgenden Tabelle sind alle gemessenen posttranslationalen Modifikationen aufgeführt, welche für das endogene HcpB gemessen wurden. Aus den mittels ExPASy kalkulierten und massenspektrometrisch gemessenen Werten wurde der Massendefekt ermittelt und ebenfalls angegeben. Zudem wurde die relative Abundanz durch Bildung des Verhältnisses von modifiziertem zu nicht-modifiziertem Peptid ermittelt.
PTMs m/z m/z Δ Relative (kalkuliert) (gemessen) Abundanz (%) D5Ac K6Acal K7Acal 2857.156 2857.446 +0,290 20,0 K7Acal 2544,127 2544,257 +0,130 11,1 K7Me 2530,246 2530,268 +0,022 3,0 I8Ac 2430,146 2430,171 +0,025 5,1 K27Me 2402,151 2402,171 +0,020 3,0 W44Ac C63Carb 2973,232 2973,279 +0,047 13,3 C63Carb 2931,222 2931,263 +0,039 100 C63Carb K68Me 2945,237 2945,269 +0,032 6,6 E69Ac 795,328 795,341 +0,013 75,0 K85Me 4328,139 4328,160 +0,021 5,0 K108Acal 4214,709 4214,057 -0,139 5,5 K108Acal K128Acal 4369,916 4370,144 +0,228 2,7 K128Acal 4342,020 4342,139 +0,199 2,9 T129Ac 2431,102 2431,119 +0,017 8,4 K150Acal 2416,988 2417,106 +0188 3,1 T151Ac 2087,006 2086,989 -0,017 26,9 D207Ac 1739,898 1739,909 +0,011 8,3 L211Ac 1239,675 1239,691 +0,016 8,3 K222Ac 1829,920 1829,952 +0,032 4,3 K222Me 1801,925 1801,939 +0,014 3,6
Kombinationen von Modifikationen, die in HcpB detektiert wurden, sind D5Ac-K6Acal- K7Acal, W44Ac-C63Carb, C63Carb-K68Me und K108Acal-K128Acal. Eine relative Abundanz von 100% wie bei HcpA beschrieben wurde lediglich bei C63Carb mit zwölf von zwölf modifizierten Peptiden beobachtet (siehe Tabelle 9.3 sowie Tabelle 14.2.5 und 14.2.6 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers).
141 9. Ergebnisse
Um einen Vergleich der oben beschriebenen Modifikationen mit den in LeRoy et al., 2009 publizierten Modifikationen von humanen HP1-Homologen zu ermöglichen wurden die in den entsprechenden Datenbanken annotierten Sequenzen der drei HP1-Homologe HP1α,
N-Terminus
HsHP1α MGKKTKRTADSSSSEDEEEY HsHP1β MGKKQNKKKVEEVLEEEEEE HsHP1γ MASNKTTLQKMGKKQNGKSKKVEEAEPEE DmSu(Var)2-5 MGKKIDNPESSAKVSDAEEEEEE
Chromo Domäne
HsHP1α VVEKVLDRRVVKGQVEYLLKWKGFSEEHNTWEPEKNLDCPELISEFMKKYKKMKEGEN HsHP1β YVVEKVLDRRVVKGKVEYLLKWKGFSDEDNTWEPEENLDCPDLIAEFLQSQKTAHE HsHP1γ FVVEKVLDRRVVNGKVEYFLKWKGFTDADNTWEPEENLDCPELIEAFLNSQKAGKEKDG DmSu(Var)2-5 YAVEKIIDRRVRKGKVEYYLKWKGYPETENTWEPENNLDCQDLIQQYEASRKDEEKSAA
Hinge Region
HsHP1α NKPREKSESNKRKSNFSNSADDIKSKKKREQSNDIARGFERG HsHP1β TDKSEGGKRKADSDSEDKGEESKPKKKKEESEKPRGFAR HsHP1γ TKRKSLSDSESDDSKSKKKRDAADKPRGFARG DmSu(Var)2-5 SKKDRPSSSAKAKETQGRASSSTSTASKRKSEEPTAPSGNKSKRTTDAEQDTIPVSGSTGFDRG
Chromo Shadow Domäne
HsHP1α LEPEKIIGATDSCGDLMFLMKWKDTDEADLVLAKEANVKCPQIVIAFYEERLTWHAYPE HsHP1β GLEPERIIGATDSSGELMFLMKWKNSDEADLVPAKEANVKCPQVVISFYEERLTWHSYPS HsHP1γ LDPERIIGATDSSGELMFLMKWKDSDEADLVLAKEANMKCPQIVIAFYEERLTWHSCPE DmSu(Var)2-5 LEAEKILGASDNNGRLTFLIQFKGVDQAEMVPSSVANEKIPRMVIHFYEERLSWYSDNE
C-Terminus
HsHP1α DAENKEKETAKS HsHP1β EDDDKKDDKN HsHP1γ DEAQ DmSu(Var)2-5 D
Abbildung 9.3 – Aminosäuresequenzen von HP1-Homologen aus Homo sapiens und Drosophila melanogaster für Sequenzanalysen. Die oben stehenden Sequenzen stellen die annotierten Domänen der in den jeweiligen Datenbanken genannten HP1-Homologe dar und wurden für die in Abbildung 9.4 dargestellten Alignments verwendet. Hs = Homo sapiens; Dm = Drosophila melanogaster.
HP1β und HP1γ sowie des Drosophila melanogaster Homologs Su(var)2-5 (vgl. Abbildung 9.3) für Alignments in der Software Geneious 5.3.3 verwendet. Da Alignments in Abhängigkeit des Umfangs der zu vergleichenden Sequenzen unterschiedliche Ergebnisse liefern können wurden zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt. Im ersten Ansatz wurden lediglich die hochkonservierten Chromo- und Chromo-Shadow-Domänen für separate
142 9. Ergebnisse
Sequenzanalysen verwendet. Die N- und C-terminalen Bereiche sowie die dazwischenliegende Hinge-Region resultieren dann aus den nicht ins Alignment einbezogenen Bereichen. Im zweiten Ansatz wurden die jeweiligen Gesamtsequenzen gegeneinander abgeglichen. Bei einem entsprechend hohen Konservierungsgrad, wie es bei HP1-Proteinen der Fall ist, sollten beide Herangehensweisen zu einem ähnlichen Ergebnis führen. Abbildung 9.4 zeigt die Ergebnisse der einzelnen Ansätze. Sowohl ein Alignment der separaten Chromo- bzw. Chromo-Shadow-Domänen der genannten Organismen (siehe Abbildung 9.4 (A) bzw. 9.4 (B)) als auch ein Vergleich der Gesamtsequenzen (Abbildung 9.4 (C)) zeigt keine großen Abweichungen im Ergebnis. Für die Chromo-Domäne erfolgte im N- terminalen Sequenzbereich eine Ausweitung um zwei Glutaminsäuren (EE) für alle humanen Homologe und das Drosophila-Homolog. Im Übergangsbereich zur Hinge-Domäne hingegen kommt es beim Alignment der Gesamtsequenzen zu einer Verschiebung einiger Aminosäuren hinein in die Hinge-Domäne (rot unterstrichene Aminosäuren im Alignment der Abbildung 9.4 (C), welche ursprünglich im weiter hinten liegenden rot unterstrichenen Bereich lokalisiert waren). Diese Verschiebung reduziert die Homologie in der Chromo- Domäne, führt aber nicht zu einer größeren Homologie im Bereich der Hinge-Region. Die entsprechenden Aminosäuren wurden daher manuell an die entsprechende Position verschoben. Auch bei der Chromo-Shadow-Domäne (CSD) kommt es im Übergangsbereich Hinge-Region und Domäne zu einer Abweichung im Alignment der Gesamtsequenzen. Hierbei wurden einzelne Aminosäuren der Hinge-Region in den Bereich der CSD verlagert, was zu einer größeren Homologie in diesem Bereich führt. Dies sind für:
Hs HP1α die Aminosäuren GFERG Hs HP1β die Aminosäuren GFAR Hs HP1γ die Aminosäuren GFARG Dm Su(var)2-5 die Aminosäuren GFDRG.
Die sich daraus ergebende Gliederung der Dictyostelium discoideum HP1-Homologe HcpA und HcpB in N-Terminus, Chromo-Domäne, Hinge-Region, Chromo-Shadow-Domäne und
143 9. Ergebnisse
Abbildung 9.4 – Vergleichende Aminosäuresequenzanalysen von HcpA und HcpB mit HP1- Homologen aus Homo sapiens und Drosophila melanogaster: (A) Vergleich der Aminosäuresequenzen der Chromo-Domäne humaner HP1-Homologe und des HP1-Homologs aus Drosophila melanogaster mit der Gesamtsequenz der HP1-Homologe HcpA und HcpB aus Dictyostelium discoideum. (B) Analog zu (A) durchgeführte Analyse mit den entsprechenden Sequenzen für die Chromo-Shadow-Domäne. (C) Alignment der Gesamtsequenzen der HP1- Homologe aus Homo sapiens und Drosophila melanogaster mit den Gesamtsequenzen aus Dictyostelium discoideum. Die rot unterstrichenen Aminosäuren wurden aus dem rot unterstrichenen Bereich ohne Aminosäuren manuell verschoben. Dd = Dictyostelium discoideum; Hs = Homo sapiens; Dm = Drosophila melanogaster.
144 9. Ergebnisse
C-Terminus ist in Abbildung 9.5 dargestellt. Sie wurde für alle nachfolgenden Abbildungen und Überlegungen verwendet.
N-Terminus
DdHcpA MGKRDKRIIEEPEEPEEAG DdHcpB MGKRDKKIIIEEPEELEEAE
Chromo Domäne
DdHcpA DVFEVEKILDKRVQHGRIQYSIRWKGFTADYDTWEDEDNVAGCPELVKEFESSREQEKK DdHcpB DVFEVEKILDKRVQHGRIQYNVRWIGFSSDYDTWEDEDNVAGCPELVKEFESSRQQEKK
Hinge Region
DdHcpA KSRKRKNVIVNDDQTAVESSSPPPTTKPSSSSSSTKTTKAATSTTTNTSTQQKTNHLID DEEYIKNEYIKFGVPYIEGI DdHcpB KSKKRKHTIINDDPTAVEISSSSSPPTTKPSSSTTAAAPASSSASVTTKTATATVTTDTYF SNNTTSTHQKTNHSVEVEENIKNEYIKFGVPYIEGV
Chromo Shadow Domäne
DdHcpA GFENGHCVEEIIGCKPFGQDNTLFFFVKWRGQEKLSWVLNEILKHKEPLQLIEFYENRLKF DdHcpB GFENGHCVEEVIGCKPFGQDNTLFFFVKWRDQEKLSWVPNEILKHKEPLQLIEFYESRLKF
C-Terminus
DdHcpA GYKGQQS DdHcpB GYSGQPS
Abbildung 9.5 – Zuordnung der Domänen von HcpA und HcpB: Die Abbildung gibt die Zuordnung der Aminosäuresequenzen von HcpA und HcpB zu den charakteristischen Domänen von HP1- Proteinen gemäß den in Abbildung 9.4 gezeigten Alignments an.
Um Überlegungen zu möglichen Funktionen der identifizierten posttranslationalen Modifikationen in den HP1-Homologen HcpA und HcpB aufstellen zu können wurden die Ergebnisse aus den Tabellen 9.2 und 9.3 und des Alignments aus Abbildung 9.4 (C) in der unten stehenden Abbildung 9.6 zusammengefasst und den Ergebnissen aus anderen Publikationen gegenübergestellt. Hierzu wurden die Veröffentlichungen von Bannister et al. (2001), Brasher et al. (2000), LeRoy et al. (2009), Nielsen2 et al. (2002) und Thiru et al. (2004) verwendet, um einen Vergleich zu beschriebenen Modifikationen in den humanen HP1- Homologen bzw. zu funktionell charakterisierten Aminosäuren zu ermöglichen. Hierbei wurden lediglich die humanen Homologe HP1α und HP1β einbezogen, da HcpA die entsprechende Homologie zu HP1α bzw. HcpB die entsprechende Homologie zu HP1β
145 9. Ergebnisse aufweist (HcpA-Homologie zu: HP1α = 30,1%, HP1β = 28,9%, HP1γ = 28,4%; HcpB: HP1α = 27,3%, HP1β = 27,5% und HP1γ = 24,0%). HcpA besitzt im N-terminalen Abschnitt zwei ausschließlich in Kombination auftretende Modifikationen (HcpA: D5Ac-K6Acal), die an homologer Position auch in HcpB vorkommen, dabei aber ausnahmslos mit einer dritten Modifikation auftreten (HcpB: D5Ac-K6Acal- K7Acal). Das Vorkommen eines Acetaldehyds an Lysin 7 konnte hierbei auch ohne die beiden anderen Modifikationen gezeigt werden (HcpB: K7Acal). Zudem wurde an dieser Position auch eine Methylierung identifiziert (HcpB: K7Me). Sowohl HcpA als auch HcpB weisen zudem eine Acetylierung des an Position 8 befindlichen Isoleucins auf (HcpA/HcpB: I8Ac). Das humane HP1α ist im Vergleich zum humanen HP1β umfangreich modifiziert, doch gibt es bezüglich der Modifikationen keine Übereinstimmung sowohl im Vergleich zu HP1β als auch im Vergleich zu den Homologen aus Dictyostelium. Eine Übereinstimmung zeigt sich aber bei einem Phenylalanin bzw. einem Valin (HcpA F22 bzw. HcpB F23 und HcpA V24 bzw. HcpB V25), welche beide in Dictyostelium discoideum und Homo sapiens hoch konserviert und in humanem HP1α für die Bindung von methyliertem Histon H3 Lysin 9 (H3K9me) bzw. Histon H3 Alanin 7 (H3A7me) relevant ist. In der Chromo-Domäne lassen sich zunächst zwei Lysine beschreiben, die gemäß Abbildung 9.4 homolog sind und beide eine Methylierung tragen (HcpA: K26Me; HcpB: K27Me). In den humanen Homologen sind lediglich im näheren Umfeld entsprechend modifizierte Aminosäuren zu finden (HP1α K32Fml/Me; HP1β K33Fml/Ac und K35Fml/Ac/Me). Es schließt sich eine in humanem HP1α als für die Bindung von H3A7me relevant beschriebene Aminosäuren an, die als unpolare Aminosäuren auch in den anderen Homologen wiederzufinden ist (HcpA: I41; HcpB: V42; HP1α: L39; HP1β: L40). In unmittelbarer Nachbarschaft hierzu befinden sich modifizierte Lysine in HP1α und HP1β, nicht aber in HcpA und HcpB (HP1α: K40Ac/Fml/Me; HP1β: K41Ac/Fml). Ebenfalls an einer als funktionell von Bedeutung beschriebenen Position befindet sich ein Tryptophan, welches in allen vier HP1-Homologen konserviert vorliegt und in HcpB zudem modifiziert ist (HcpA: W43; HcpB: W44Ac-C63Carb; HP1α: W41; HP1β: W42). Für drei weitere modifizierte Aminosäuren in HP1α (K42Fml, S45Fml, K55Ac) finden sich weder in HP1β noch in HcpA oder HcpB entsprechende homologe und modifizierte Aminosäuren. Für die Bindung von H3A7me sind in humanem HP1α zwei Threonine beschrieben, die an einer entsprechenden Position auch in HcpA und HcpB zu finden sind (HcpA: T52; HcpB: T53; HP1α: T50; HP1β: T51). Im näheren
146 9. Ergebnisse
Umfeld finden sich drei weitere konservierte Aminosäuren, welche für die Erkennung von H3K9me von Bedeutung sind (HcpA: E54, N58, K59; HcpB: E55, N59 V60; HP1α: E52, N56 L57; HP1β: E53, N57, L58). Für die Erkennung der oben bereits erwähnten H3A7- Methylierung ist zudem ebenfalls ein Cystein von Bedeutung, welches in den HP1- Homologen von Dictyostelium konserviert ist und dort modifiziert vorliegt (HcpA: C62Carb, C62Carb-K67Me; HcpB: C63Carb, W44Ac-C63Carb, C63Carb-K68Me; HP1α: C59; HP1β: C60). In HcpA konnten hierfür Peptide detektiert werden, die sowohl die Modifikation alleine als auch in Verbindung mit einer Methylierung eines weiteren Lysins aufweisen. In HcpB tritt diese Modifikation analog zu HcpA in den genannten Modifikationen vor, ist aber zusätzlich auch noch mit der weiter oben bereits erwähnten Tryptophan-Acetylierung assoziiert. In HP1α ist ein Serin formyliert (S64Fml), welches in seiner Position dem erwähnten K67Me bzw. K68Me in HcpA bzw. HcpB entspricht. Eine acetylierte Glutaminsäure in HcpA (E68Ac) findet sich ebenfalls acetyliert in HcpB (E69Ac), während ein methyliertes Lysin (K77Me) exklusiv in HcpA vorkommt und die gefundenen Modifikationen in der Chromo-Domäne abschließt. In der Hinge-Region sind für HP1β keine Modifikationen beschrieben, während HP1α eine ganze Reihe von Modifikationen aufweist, von denen jedoch nur zwei an Positionen liegen, die modifiziert auch in einer oder beiden Hcp-Formen wiederzufinden ist. Sowohl HcpA als auch HcpB weisen hingegen eine Reihe von Modifikationen oder Kombinationen von Modifikationen auf, die teilweise homologe Aminosäure betreffen. Ein Lysin am Beginn der Hinge-Region ist in beiden Fällen methyliert bzw. tri-methyliert, tritt in HcpA aber nur in Kombination mit einer Serin-Phosphorylierung auf (HcpA: K84TriMe-S97Ph; HcpB: K85Me). Diese Serin-Phosphorylierung kann zudem auch in Kombination mit einer weiteren Methylierung auftreten (HcpA: S97Ph-K105Me). Diese K105-Methylierung wiederum kann neben der bereits genannten Kombination auch in Kombination mit einer K114- Methylierung vorkommen (HcpA: K105Me-K114Me). Es wurden aber auch Peptide gemessen, in denen das Lysin mit einem Acetaldehyd modifiziert ist (HcpA: K105Acal). Diese Modifikation trat auch in Kombination mit einer S99-Phosphorylierung auf (HcpA: S99Ph- K105Acal), wobei die Serin-Phosphorylierung ebenfalls alleine auftreten kann (HcpA: S99Ph). Die Acetylierung eines Asparagins im vorderen Bereich der Hinge-Domäne scheint exklusiv für HcpA zu sein (N85Ac). Dem gegenüber stehen ein Alanin bzw. Threonin sowie zwei
147 9. Ergebnisse
Threonine in beiden Homologen, die alle acetyliert vorliegen können (HcpA: A118Ac, T132Ac; HcpB: T129Ac, T151Ac). Für letztere existiert zudem in HP1α ein formyliertes Serin
HcpA HcpB hHP1α hHP1β D5Ac D5Ac K6Acal K6Acal K7Acal K7Acal K7Me I8Ac I8Ac T8Ph K9Me
N-Terminus S11Ph S12Ph S13Ph S14Ph F22 F23 F23 F23 V24 V25 V22 V23 K26Me K27Me K32Fml/Me K33Ac/Fml K35Ac/Fml/Me I41 V42 L39 L40 K40Ac/Fml/Me K41Ac/Fml W43 W44Ac W41 W42 K42Fml S45Fml T52 T53 T50 T51 CD E54 E55 E52 E53 K55Ac N58 N59 N56 N57 K59 V60 L57 L58 C62Carb C62Carb C63Carb C63Carb C63Carb C59 C60 K67Me K68Me S64Fml E68Ac E69Ac K77Me K84TriMe K85Me N85Ac S97Ph S97Ph S99Ph S99Ph K105Acal K105Acal K105Me K108Acal K108Acal K105Me K114Me K128Acal K128Acal A118Ac T129Ac Hinge K91Ac/Fml/Me S92Fml K150Acal T132Ac T151Ac S95Fml S97Fml/Ph K102Fml S103Fml K143Me K106Ac C171 C190 A129 A125 L180 L199 L136 L132 K143Ac/Fml/Me K139Ac/Fml D207Ac L192Ac L211Ac K201Me K220 N157 N153 H202Ac H202Ac CSD K203Acal K203Acal K160Fml K150Fml K203Ac K222Ac K203Me K222Me
148 9. Ergebnisse
HcpA HcpB hHP1α hHP1β N153 P205 P224 P161 P157 L206 L225 Q162 Q158 I209 I228 I165 I161 F211 F230 F167 F163 CSD Y212 Y231 Y168 Y164 R215 R234 R171 R167 L216 L235 L172 L168 K217 K236 T173 T169 F218 F237 W174 W170 K185Fml
C-Terminus
Aromatische Aminosäuren, welche eine Bindungstasche für die Bindung von methyliertem Lysin bilden (Bannister et al., 2001).
Aminosäuren, welche für die Erkennung von methyliertem Alanin an Position 7 am N-Terminus von Histone H3 verantwortlich sind (Nielsen et al., 2001).
Aminosäuren, welche für die Erkennung von methyliertem Lysin verantwortlich sind (Bannister et al., 2001).
Aminosäuren, welche für die Erkennung des zentralen Valins im PxVxL-Motif von HP1-Interaktionspartnern relevant sind (Thiru et al., 2004).
Aminosäuren, welche für die Dimerisierung von HP1-Proteinen von Bedeutung sind (Brasher et al., 2000).
Aminosäuren, welche für die Erkennung des Prolins bzw. Leucins im PxVxL-Motif von HP1-Interaktionspartnern relevant sind (Thiru et al., 2004).
Abbildung 9.6 – Darstellung der in Tabellen 9.2 und 9.3 identifizierten posttranslationalen Modifikationen in Relation zu bekannten posttranslationalen Modifikationen in humanen HP1- Homologen und funktionell beschriebenen Aminosäuren: Die Spalten 1 und 2 zeigen die in HcpA und HcpB gefundenen Modifikationen. In den Spalten 3 und 4 sind die in LeRoy et al. (2009) beschriebenen Modifikationen dargestellt. Aminosäuren, die in einer Zeile stehen, werden gemäß dem Alignment in Abbildung 9.4 (C) als homolog betrachtet. Ovale weiße Formen markieren modifizierte Aminosäuren. Funktionell relevante aber nicht modifizierte Aminosäuren im Bereich der Chromo-Domäne bzw. des N-Terminus sind als Rechtecke dargestellt und entsprechend den Angaben in der Legende farbig markiert. Funktionell relevante aber nicht modifizierte Aminosäuren im Bereich der Chromo-Shadow-Domäne weisen eine ovale Form auf und sind ebenfalls entsprechend den Angaben in der Legende farbig markiert. Modifizierte Aminosäuren, die entsprechend dem Alignment in Abbildung 9.4 (C) in ihrer Position einer funktionell relevanten Aminosäure homolog sind, sind mit einem entsprechendem grauen Quadrat oder Kreis gekennzeichnet.
(S95Fml). Ein in HcpA methyliertes Lysin an Position 143 besitzt hingegen gemäß dem in Abbildung 9.4 (C) abgebildeten Alignment ein Homolog in HP1α, welches ebenfalls modifiziert ist (HcpA: K143Me; HP1α: K106Ac). In HcpB findet sich, analog zu dem mit einem Acetaldehyd modifizierten K105 in HcpA, ein Lysin an Position 108, welches in Verbindung mit einem weiteren modifizierten Lysin vorkommt (HcpB: K108Acal, K108Acal-K128Acal). Beide Lysine können aber auch mit nur einer Modifikation vorkommen (HcpB: K108Acal, K128Acal). HcpB besitzt zudem ein weiteres mit einem Acetaldehyd modifiziertes Lysin im hinteren Bereich der Hinge-Region (HcpB: K150Acal). Im vorderen Bereich der Chromo-Shadow-Domäne befinden sich nicht modifizierte Cysteine bzw. Alanine, welche im humanen Homolog eine Bedeutung bei der Erkennung des zentralen Valins im PxVxL-Motiv von HP1-Interaktionspartnern hat bzw. eine Rolle bei der
149 9. Ergebnisse
Dimerisierung von HP1-Molekülen spielt (HcpA: C171, L180; HcpB: C190, L199; HP1α: A129, L136; HP1β: A125, L132). Zwei Lysine in HP1α und HP1β (HP1α K143Ac/Fml/Me; HP1β K139Ac/Fml) finden in den Dictyostelium discoideum Homologen keine Entsprechungen. Ebenso finden sich zwei acetylierte Leucine in HcpA und HcpB, nicht aber in HP1α und HP1β (HcpA: L192Ac; HcpB: L211Ac). Ein acetyliertes Asparagin an Position 207 ist bezüglich seines Vorkommens auf HcpB beschränkt. (D207Ac). K201 in HcpA ist methyliert (K201Me), eine Modifikation findet sich aber in keiner entsprechenden Aminosäure der anderen Homologe. Das in Abbildung 9.4 (C) an entsprechender Position befindliche Asparagin in HP1α ist aber als relevant für die Dimerisierung von HP1 beschrieben. In HcpA kommt zudem ein Histidin vor, welches acetyliert ist und allein, aber auch in Kombination mit einem modifizierten benachbarten Lysin vorkommt (HcpA: H202Ac, H202Ac-K203Acal). Das benachbarte Lysin liegt zudem in mehreren Modifikationen vor (HcpA: K203Acal, K203Ac, K203Me) und weist entsprechend Abbildung 9.4 (C) eine Homologie zu einem modifiziertem Lysin in HcpB, HP1α und HPβ auf (HcpB: K222Ac, K222Me; HP1α: K160Fml; HP1β: K150Fml). Weitere Modifikationen in der Chromo-Shadow-Domäne sind nicht bekannt, jedoch findet sich eine Reihe homologer Aminosäuren, die chemisch ähnlich sind und denen in humanem HP1 eine Bedeutung bei der Erkennung des zentralen Valins im PxVxL-Motiv von HP1- Interaktionspartnern, bei der Erkennung des flankierenden Prolins bzw. Leucins oder bei der Bildung von HP1-Dimeren zugeschrieben wird. Im Bereich des C-Terminus ist lediglich für HP1α eine Modifikation beschrieben (K185Fml). Aminosäuren mit einer funktionellen Bedeutung sind für diesen Bereich in humanen HP1- Homologen nicht beschrieben.
9.2 Analyse der Modifikationen HcpA K203Ac und HcpB K222Ac
9.2.1 Generierung von Klonen für ein Gal4-UAS-GFP-Reportersystem
Die unter Abschnitt 9.1 identifizierten Modifikationen legen die Frage nach ihren Funktionen nahe. Die Modifikation K222Ac im HP1-Homolog HcpB wurde bereits durch Balint Földesi identifiziert. Ihr Vorhandensein an der homologen Aminosäure K203 in HcpA wurde ebenfalls postuliert (Földesi, 2010). Versuche mit einem Gal4-UAS-GFP-Reportersystem haben gezeigt, dass punktmutierte Stämme (HcpA-K203R bzw. HcpB-K222R) die Fähigkeit
150 9. Ergebnisse zur Stilllegung des GFP-Reporters verlieren, da das Arginin im Vergleich zum substituierten Lysin nicht acetyliert werden kann (Földesi, 2010; vgl. Abbildung 9.8 (A) unten). Da die im Rahmen der Arbeit aufgestellte Hypothese davon ausgeht das HcpA-K203 ebenfalls acetyliert vorliegt und diese Acetylierung essentiell für die Stilllegung ist wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit weitere Analysen mit diesem System durchgeführt. Das System beruht auf der Fusionierung der HP1-Homologe mit der kodierenden Sequenz für eine Gal4-DNA-Bindedomäne (Gal4-DBD). Diese ist in der Lage an die UAS-Sequenz eines extrachromosomalen Plasmids zu binden. Hierdurch wird das jeweilige HP1-Homolog in räumliche Nähe zum GFP-Reporter gebracht. Da HP1-Proteine an der Bildung von Heterochromatin beteiligt sind (siehe Abschnitt 6.8) besteht die Möglichkeit, dass wildtypisches HcpA bzw. HcpB die Sequenz des Reporters bzw. des vorgeschalteten Actin15- Promotors durch Heterochromatisierung stilllegt. Hätte die Acetylierung von HcpA K203 bzw. HcpB K222 einen Einfluss auf die für die Bildung von Heterochromatin wichtige Dimerisierung der HP1-Homologe (Földesi, 2010), so würde sich möglicherweise hierdurch die fehlende Stilllegung des Reporters erklären. Um dieser Fragestellung weiter nachzugehen wurden entsprechende Stämme generiert. Hierzu gehörten auch punktmutierte Zelllinien, bei denen das beschriebene Lysin gegen ein Glutamin substituiert wurde (HcpA K203Q bzw. HcpB K222Q). Dieser Aminosäureaustausch sollte die Fähigkeit zur Stilllegung des GFP-Reporters besitzen. Diese Annahme beruht darauf dass gezeigt werden konnte, dass Glutamin in der Lage ist eine Acetylierung zu simulieren (Wang & Hayes, 2008). Die für den Assay generierten und verwendeten Stämme sind nachfolgend aufgelistet. Dabei wurden von jedem Stamm zwei in unabhängigen EPs generierte Klone für die Durchführung der Versuche ausgewählt.
Gal4-DBD-HapA Gal4-DBD-HcpA-K203R Gal4-DBD-HcpA-K203Q Gal4-DBD-HcpB Gal4-DBD-HcpB-K222R Gal4-DBD-HcpB-K222Q
Die Integration der Konstrukte erfolgte durch Transformation des Wildtypstamms AX2 mit dem entsprechenden Plasmid. Nach Selektion positiver Klone mittels PCR mit spezifischen Primern für die Gal4-DBD wurden diese auf die Expression des Gal4-DBD-HcpA- bzw. HcpB- Fusionsproteins hin untersucht.
151 9. Ergebnisse
9.2.2 Expressionskontrolle der generierten Hcp-Gal4-DBD-Klone
Wie oben bereits erwähnt erfolgte die Integration der Konstrukte mittels homologer Rekombination. Um zu vermeiden das Klone für den Assay verwendet werden, deren Integrationsort Einfluss auf die Expression des HP1-Gal4-Fusionsproteins nimmt, wurde mittels quantitativer Realtime-PCR (qPCR) die Expression der Fusionsgene zueinander relativ quantifiziert. Als Referenzprobe diente hierbei der Klon HcpB #1.4. Die Quantifizierung erfolgte mit spezifischen Primern für die Gal4-DBD. Wie Abbildung 9.17 (A) zeigt variiert die Expression bei den meisten Klonen zwischen dem 0,4-fachen und dem 4-fachen der Referenzprobe. Die Klone Gal4-DBD-HcpA #1.1 und #1.2 sowie Gal4-DBD-HcpB #2.4 hingegen weisen eine sehr geringe Expression auf (Gal4-DBD-HcpA #1.1 = 2,280 · 10-5; Gal4- DBD-HcpA #1.2 = 5,403 · 10-2; Gal4-DBD-HcpB #2.4 = 2,246 · 10-4), die im geplanten Assay zu falsch positiven Ergebnissen führen könnten. Der Klon Gal4-DBD-HcpB-KQ #2.13 zeichnete sich hingegen durch eine mehr als 17-fache Überexpression aus (Gal4-DBD-HcpB-KQ #2.13 = 17,508). Um Ergebnisartefakte zu minimieren wurden für die Assays die nachfolgenden Klone eingesetzt:
Gal4-DBD-HcpA #1.3 – relative Expression 1,21x Gal4-DBD-HcpA #2.1 – relative Expression 1,34x Gal4-DBD-HcpA-KR #1.1 – relative Expression 2,55x Gal4-DBD-HcpA-KR #2.2 – relative Expression 0,91x Gal4-DBD-HcpA-KQ #1.17 – relative Expression 1,17x Gal4-DBD-HcpA-KQ #2.1 – relative Expression 1,12x Gal4-DBD-HcpB #1.1 – relative Expression 0,40x Gal4-DBD-HcpB #2.5 – relative Expression 1,05x Gal4-DBD-HcpB-KR #1.2 – relative Expression 2,48x Gal4-DBD-HcpB-KR #2.5 – relative Expression 1,73x Gal4-DBD-HcpB-KQ #1.8 – relative Expression 1,37x Gal4-DBD-HcpB-KQ #2.9 – relative Expression 2,50x
152 9. Ergebnisse
A
B
Abbildung 9.7 – Analyse der generierten Klone für das Gal4-UAS-GFP-Reportersystem: Analyse der relativen Expression der generierten Klone für das Gal4-UAS-GFP-Reportersystem unter Verwendung von spezifischen Primern für die Gal4-DBD Sequenz (Referenzierung gegen den Stamm HcpB #1.4). (A) Die Expression variiert beim Großteil der Klone im Bereich des 0,4- bis 4-fachen der Referenzprobe. Bei einzelnen Klonen wurde hingegen eine extrem geringe Expression gemessen (Klone Gal4-DBD-HcpA #1.1 und 1.2 bzw. Gal4-DBD-HcpB #2.4) während die Expression beim Stamm Gal4-DBD-HcpB-KQ #2.13 hingegen die des Referenzstamms um mehr als das 17-fache überstieg. (B) Relative Expressionswerte der für die nachfolgenden Assays ausgewählten Klone. Die Werte variieren zwischen dem 0,4-fachen und dem 2,55-fachen des Referenzstammes.
Ihre individuellen Expressionswerte variieren in einem relativ geringen Bereich zwischen dem 0,4-fachen und dem 2,55-fachen des Referenzstammes Gal4-DBD-HcpB #1.4. Neben den genannten Klonen wurde ebenfalls ein Klon generiert, welcher die Gal4-DBD ohne Fusion eines anderen Proteins exprimiert. Hierdurch sollte kontrolliert werden, ob die Gal4- DBD alleine einen stilllegenden Einfluss auf die Expression des GFP-Reporters ausübt.
153 9. Ergebnisse
9.2.3 Einfluss der generierten Klone im Gal4-UAS-GFP-Reportersystem
In die oben erwähnten Klone sowie den Wildtyp-Stamm AX2 wurde mittels Elektroporation das extrachromosomale Plasmid pTX 5xUAS-GFP BSr (vgl. Tabelle 7.3) transformiert. Neben der Resistenz dienten die Reisolation des Plasmids unter Verwendung des Fermentas Genomic DNA-Kits und die Amplifikation eines Abschnitts aus der UAS-Sequenz mittels PCR unter Verwendung entsprechender Primer als zusätzliche Kontrolle für die Integration. Abbildung 9.8 (A) zeigt wie bereits erwähnt das Prinzip des Gal4-UAS-GFP-Reportersystems. Über die Gal4-DBD bindet das entsprechende Fusionsprotein an die UAS-Sequenz des extrachromosomalen Vektors pTX 5xUAS-GFP BSr. Da von HP1-Proteinen eine funktionelle Bedeutung bezüglich der Bildung von Heterochromatin bekannt ist wird davon ausgegangen, dass durch die unmittelbare räumliche Nähe eine Heterochromatisierung des GFP-Reporters initiiert wird (Földesi, 2010). Hierbei übernimmt die UAS-Sequenz die Funktion der Bindung von HP1, wie sie in nicht-manipulierten Zellen durch die Methylierung von H3K9 erfolgt. Wie in Abbildung 9.8 (B) zu sehen ist konnten lediglich die Klone Gal4-DBD-HcpB #1.1 und #2.5 eine deutliche Reduktion des GFP-Reportersignals bewirken. Dieser Effekt ist bei den Gal4- DBD-HcpA-Klonen nicht zu beobachten. Auch bei den Gal4-DBD-HcpA-K203Q-Klonen, bei denen davon ausgegangen wurde, dass sie eine Acetylierung nachahmen und somit dem Wildtyp entsprechen sollten, zeigten den Effekt nicht. Die Gal4-DBD-HcpA-K203R-Klone zeigten hingegen wie erwartet, dass sie keinen Einfluss auf die Stilllegung des GFP-Reporters ausüben. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus Földesi (2010) konnte hingegen beobachtet werden, dass ein Aminosäureaustausch des relevanten Lysins in HcpB gegen ein nicht acetylierbares Arginin (Gal4-DBD-HcpB-K222R) den stilllegenden Effekt der Wildtypvariante aufhebt. Die HcpB-K222Q-Klone, für welche eine wildtypische Stilllegung des Reporters erwartet wurde, zeigten ebenfalls keinen Einfluss auf die Stärke des GFP- Signals. Diese Ergebnisse bestätigten sich bei der lichtmikroskopischen Kontrolle der betreffenden Klone (siehe Abbildung 9.8 (C)). Ein Großteil der Zellen der Klone Gal4-DBD- HcpB #1.1 und #2.5 exprimierte kein messbares GFP-Signal mehr. Es fiel aber auf, dass bei dem Klon Gal4-DBD-HcpB #1.1 das Signal der noch fluoreszierenden Zellen intensiver ausfiel als bei den Zellen des Klons Gal4-DBD-HcpB #2.5.
154 9. Ergebnisse
A D
Gal4-DBD HcpB #1.1
1kb+ Ladder Eluat αH3K9me
1,0% Input 700 500 0,5% Input 400 0,1% Input 300 kein AK 200 Act15-GFP 75
α-H3K9me
B
PrestainedAX2 Protein LadderAX2 Plus Gal4-DBD Gal4-DBD HcpAGal4-DBD #1.3 HcpAGal4-DBD #2.1 HcpA-KRGal4-DBD #1.1 HcpA-KRGal4-DBD #2.2 HcpA-KQGal4-DBD #1.17 HcpA-KQGal4-DBD #2.1 HcpBGal4-DBD #1.1 HcpBGal4-DBD #2.5 HcpB-KRGal4-DBD #1.2 HcpB-KRGal4-DBD #2.5 HcpB-KQGal4-DBD #1.8 HcpB-KQ #2.9
pTX 5xUAS-GFP - + + + + + + + + + + + + + +
kDa 72 55 α-Coronin
36 α-GFP 28
C HcpA
AX2 AX2 Gal4-DBD #1.3 #2.1 KR #1.1 KR #2.2 KQ #1.17 KQ #2.1 pTX 5xUAS-GFP - + + + + + + + +
Durchlicht
GFP
HcpB #1.1 #2.5 KR #1.2 KR #2.5 KQ #1.8 KQ #2.9 pTX 5xUAS-GFP + + + + + +
Durchlicht
GFP
Abbildung 9.8 – Gal4-UAS-GFP-Reportersystem zur Analyse der Funktion der Acetylierung von HcpA K203 und HcpB K222: Darstellung der Analysen zum Einfluss von mit einer Gal4-DBD fusionierten HcpA- und HcpB-Proteinen auf die GFP-Expression eines extrachromosomalen Vektors, der den kodierenden Bereich für eine UAS-Sequenz und eine nachfolgenden GFP-Sequenz trägt. (A) Schema der Funktion des Gal4-UAS-GFP-Reportersystems. Fusionierte HP1-Homologe sollten potentiell in der Lage sein über die Gal4-DBD an die UAS-Sequenz des extrachromosomalen Vektors
155 9. Ergebnisse zu binden und analog zur Bildung von Heterochromatin in nicht manipulierten Zellen die Sequenz des GFP-Reporters stillzulegen (Abbildung aus Földesi, 2010). (B) Darstellung der Ergebnisse im Western Blot. Lediglich für die Klone Gal4-DBD-HcpB #1.1 und #2.5 konnte eine starke reduzierende Wirkung auf das Signal des GFP-Reporters detektiert werden. (C) Lichtmikroskopische Kontrolle der Ergebnisse des Western Blots. Wie im Western Blot beobachtet ist das Fluoreszenzsignal des GFP- Reporters bei den genannten Klonen stark reduziert. Dabei ist beim Klon Gal4-DBD-HcpB #1.1 die Expression bei einigen Zellen nicht mehr messbar, während andere Zellen unvermindert stark GFP exprimieren. Beim Klon Gal4-DBD-HcpB #2.5 hingegen scheint die Expression in allen Zellen zumindest stark reduziert oder nicht mehr messbar zu sein. (D) ChIP-Analyse zum Nachweis der Heterochromatisierung des pTX 5xUAS-GFP BSr Plasmids. Nach Immunpräzipitation mit einem H3K9me-Antikörper wurde eine PCR unter Verwendung eines Fwd-Primers aus der Act15-Promotor- Sequenz und eines Rev-Primers aus der GFP-Sequenz des pTX 5xUAS-GFP BSr Vektors durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde die Immunpräzipitation parallel ohne H3K9me-Antikörper durchgeführt. Im Eluat konnte mit den genannten Primern ein Fragment von 140bp amplifiziert und somit die Heterochromatisierung des entsprechenden Abschnitts nachgewiesen werden.
Um zu untersuchen, ob die Stilllegung des GFP-Signals auf einer Heterochromatisierung des Vektors beruht, wurde eine ChIP-Analyse unter Verwendung eines H3K9me-Antikörpers durchgeführt (siehe Abbildung 9.8 (D)). Die H3K9-Methylierung gilt als ein typischer Heterochromatinmarker (vgl. Abschnitt 6.6). Die Isolation von entsprechenden Vektor-DNA- Sequenzen mit einem H3K9me-Antikörper kann daher als Nachweis für die Bildung heterochromatischer Strukturen gelten. Wie in Abbildung 9.8 (D) zu sehen ist kann unter Verwendung von Primern, welche spezifisch im Bereich des Act15-Promotors sowie in der GFP-Region des Reporters binden, ein entsprechendes Amplifikat mittels PCR erzeugt werden. Dieses Signal konnte in der Negativkontrolle ohne H3K9me-Antikörper nicht detektiert werden. Der Assay wurde mit dem Klon Gal4-DBD-HcpB #1.1 durchgeführt. Es liegt daher nahe, dass die Reduktion des GFP-Signals beim Klon Gal4-DBD-HcpB #1.1 auf der Bildung heterochromatischer Strukturen im Bereich des Actin-Promotors sowie nachfolgender Abschnitt im Bereich der GFP-Sequenz beruht. Um die funktionelle Bedeutung der Lysin-Acetylierung in den HP1-Homologen HcpA und HcpB untersuchen zu können wurden unter Verwendung des Veltman-Vektorsystem für extrachromosomale Vektoren (Veltman1 et al., 2009) folgende Vektoren generiert:
pDM304 3xHA-N HcpA pDM304 3xHA-N HcpA K203R pDM304 3xHA-N HcpB pDM304 3xHA-N HcpB K222R pDM304 3xHA-N HcpA
156 9. Ergebnisse
pDM317 GFP HcpA pDM317 GFP HcpA K203R pDM317 GFP HcpB pDM317 GFP HcpB K222R
Weitergehende Analysen unter Verwendung der genannten Vektoren wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt. Möglichkeiten, die sich zur Überprüfung von Hypothesen zum Einfluss der genannten posttranslationalen Modifikation unter Verwendung der genannten Vektoren ergeben, sind in Abschnitt 10.2 diskutiert.
9.3 Interaktionspartner von HcpA und HcpB
9.3.1 Analyse der massenspektrometrischen Daten
Um potentielle Interaktionspartner der HP1-Homologe HcpA und HcpB identifizieren zu können wurden die für die Identifikation posttranslationaler Modifikationen gewonnenen Daten aus Abschnitt 9.1 unter Verwendung der Software Scaffold 4.2.1 weitergehend ausgewertet. Da die Aufreinigung der Proteine mittels Tandem Affinity Purification lediglich den ersten Aufreinigungsschritt beinhaltete wurde das TAP-Protein im AX2-Stamm exprimiert und parallel aufgereinigt um unspezifisch an die Matrix bindende Proteine identifizieren zu können. Die Identifikation der massenspektrometrisch detektierten Proteine erfolgt automatisch durch einen Abgleich mit den Einträgen in der NCBI-Datenbank. Dies macht einen manuellen Abgleich mit der Dictyostelium discoideum-Datenbank DictyBase notwendig, da die Aktualität der für Dictyostelium vorhandenen Datenbankeinträge zu in der NCBI-Datenbank nicht dieselbe Aktualität besitzt wie die Datenbankeinträge der DictyBase. Insgesamt wurden 1865 Proteine massenspektrometrisch identifiziert, von denen 960 Proteine (51%) unspezifisch an die Matrix gebunden haben (siehe Abbildung 9.9 (A); für eine vollständige tabellarische Auflistung siehe Tabelle 14.3.1 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers). Von den verbleibenden 905 Proteinen waren 352 Proteine (39%) nicht annotiert (vgl. Abbildung 9.9 (B)) und flossen somit in die weitere Auswertung nicht mit ein. 45 (8%) der 553 annotierten Proteine konnten einem Funktionsbereich zugeordnet werden, für den auch entsprechende Literaturbeschreibungen zu HP1 vorliegen (siehe
157 9. Ergebnisse
Abbildung 9.9 (C) und Abschnitt 6.8). Diese Proteine schlossen die Funktionsbereiche DNA- Replikation, DNA-Reparatur und Chromatin-Komponenten ein (vgl. Abbildung 9.9 (D)). Abbildung 9.9 (E) zeigt eine tabellarische Auflistung der Proteine, die aufgrund ihrer funktionellen Bezeichnung oder ihres Aufbaus potentiell mit HcpA bzw. HcpB interagieren könnten. Wie in Abschnitt 6.8 beschrieben interagiert SNF2β mit der Chromo Shadow Domäne von HP1α in Mus musculus (Nielsen1 et al., 2002). Eine Ähnlichkeit dazu weisen die Proteine mit den Accession-Nummern gi|66811390 und gi|66800671 auf. Im Rahmen der DNA-Replikation und DNA-Reparatur wird die Interaktion von HP1 mit Proteinen diskutiert, welche BRCT-Domäne besitzen (Dinant & Luijsterburg, 2009; Wu et al., 2015), was für die Proteine mit den Accession-Nummern gi|66815607 und gi|66810247 zutreffend ist. Eine direkte oder indirekte Interaktion von HP1 mit denjenigen Structural Maintenance of Chromosome-Proteinen (SMC), welche den Cohesin-Komplex bilden, wird seit längerem diskutiert (Nonaka et al., 2001; Übersicht in Zeng et al., 2010). Der Cohesin-Komplex ist hierbei von Bedeutung für die Cohesion von Schwester-Chromatiden (Michaelis et al., 1997; Losada et al., 1998). Die Proteine mit den Accession-Nummern gi|6680815, gi|66809611, gi|66803272 und gi|66805443 sind laut NCBI-Datenbank als Structural Maintenance of Chromosome-Proteine verzeichnet und könnten Vertreter des Cohesin-Komplexes sein. Das DNA-Recombination/Repair-Protein Rad50 ist von Bedeutung für die Rekrutierung von HP1 mit dem Ziel Telomerfusionen zu verhindern (Ciaponi et al., 2004). Das Protein mit der Accession-Nummer gi|66801073 ist in der NCBI-Datenbank als solches eingetragen und könnte in diesem Zusammenhang ebenfalls von Bedeutung sein. Bemerkenswerter Weise wurde auch die DNA-Methyltransferase DnmA detektiert (Accession-Nummer gi|66806465, vgl. auch Tabelle 14.3.1 des Anhangs bzw. des beiliegenden digitalen Datenträgers), wobei die Identifikation auf ein einzelnes Peptid beschränkt war. Die in Abbildung 9.9 (E) aufgelisteten Proteine übersteigen eine Größe von 100 kDa. Sie können daher aufgrund der genomischen Besonderheiten des Versuchsorganismus (vgl. Abschnitt 6.1) das experimentelle Spektrum mit Hinblick auf Klonierung und Expression unter Umständen stark einschränken. Daher wurde wie unter 9.3.2 beschrieben ein weiterer Ansatz zur Identifikation möglicher HcpA- bzw. HcpB-Interaktionspartner durchgeführt.
158 9. Ergebnisse
A B
C
D
E
Abbildung 9.9 – Auswertung der massenspektrometrischen Daten zur Identifikation potentieller HcpA-/HcpB-Interaktionspartner: Auswertung der in Abschnitt 9.1 verwendeten massenspektrometrischen Daten mit dem Ziel der Identifikation potentieller Interaktionspartner der HP1-Homologe HcpA und HcpB. (A) Von den ursprünglich 1865 Proteinen haben 905 Proteine (49%) unspezifisch an die IgG-Sepharose-Matrix gebunden. (B) Von den verbleibenden 960 Proteinen waren 352 Proteine (39%) nicht annotiert. (C) Die verbleibenden 553 Proteine (61%) wurden
159 9. Ergebnisse unterteilt in solche, die einem im Zusammenhang mit HP1 relevanten Funktionsbereich zuzuordnen sind (45 Proteine bzw. 8%) und solche, die dieses Kriterium nicht erfüllen (508 Proteine bzw. 92%). (D) Diese 45 Proteine gehörten den Funktionsbereichen DNA-Reparatur, DNA-Replikation und Chromatin-Remodeling an. (E) Tabellarische Auflistung der Proteine, von denen aufgrund von Literaturinformationen eine Interaktion mit HcpA bzw. HcpB denkbar ist.
9.3.2 Bioinformatischer Ansatz zur Identifikation potentieller Interaktionspartner
Um weitere potentielle Interaktionspartner neben den in Abschnitt 9.3.1 genannten Proteinen zur Auswahl zu haben wurden bereits bekannte HP1-Interaktionspartner aus anderen Versuchsorganismen für Sequenzanalysen unter Verwendung des entsprechenden BLAST-Tools in der DictyBase-Datenbank herangezogen. Hierfür wurden zunächst die Sequenzen aus Mensch, Maus, Taufliege und Bäckerhefe stammenden Homologe LaminB (Ye et al., 1997), HOAP (Shaaref et al., 2001), HP4 (HIP; Schwendemann et al., 2008), HP6 (Umbrea; Joppich et al., 2009), LAP2β (Kourmouli et al., 2000) und die große Untereinheit des CAF1-Komplexes (Brasher et al., 2000; Lechner et al., 2005; Houlard et al., 2006; vgl. auch Abschnitt 6.10) verwendet. Tabelle 9.4 zeigt die Ergebnisse der BLAST-Analyse der genannten Sequenzen gegen die Datenbank der DictyBase. Während die sequenzbasierte Suche mit den Proteinen HOAP, HP4, HP6 und LAP2β keine signifikanten Treffer erzeugen konnte, erzielte die Suche mit den Aminosäuresequenzen für die Proteine LaminB bzw. die große Untereinheit des CAF1-Komplexes signifikante Treffer erzeugen (Tabelle 9.4 (A)). Die im Zusammenhang mit LaminB angezeigten Proteine Erg24 und DDB_G0267448 werden laut Datenbank funktionell der Ergosterol-Synthese zugeordnet. Ein geringere Übereinstimmung liegt beim Sequenzvergleich zwischen der großen CAF1-Untereinheit und dem bisher nicht näher untersuchten Protein DDB_G0287815 vor, jedoch existiert hier ein Eintrag in der Datenbank welcher aufgrund bislang nicht publizierter Daten nahelegt, dass es sich um das Homolog der großen Untereinheit des CAF1-Komplexes handelt. Da die Ähnlichkeiten in der Sequenz von LaminB und den oben genannten an der Ergosterol-Biosynthese beteiligten Proteinen vermutlich auf der Anwesenheit einer PEMT-Domäne beruht, welche als Phospholipid-Methyltransferase fungiert (siehe Tabelle 9.4 (C) und (D)), wurde das potentielle CAF1-Homolog DDB_G0287815 für das weitere Vorgehen ausgewählt. Da es sich um einen funktionellen Komplex handelt und mit Bezug auf den oben genannten Eintrag das bisher ebenfalls nicht näher charakterisierte Protein DDB_G0269800 als potentielle mittlere Untereinheit des CAF1-Komplexes benannt wurde lag eine BLAST-
160 9. Ergebnisse
Analyse unter Verwendung der Aminosäuresequenz der mittleren CAF1-Untereinheit aus der Maus nahe. Diese lieferte mehr als 50 signifikante Treffer, was vermutlich auf das Vorhandensein der weit verbreiteten WD40-Domäne in allen Proteinen zurückzuführen ist. Die höchste Übereinstimmung in den Sequenzen lag an dieser Stelle dennoch bei dem genannten Protein DDB_G0269800 (vgl. Tabelle 9.4 (B)). Um zu überprüfen, ob auf der Basis eines Sequenzvergleichs auch die putative kleine Untereinheit des CAF1-Komplexes identifiziert werden kann, wurde eine BLAST-Analyse mit der Aminosäuresequenz für die kleine CAF1-Untereinheit aus der Maus durchgeführt. Diese führte zu einer erwartungsgemäß hohen Zahl an signifikanten Ergebnissen, da auch diese Untereinheit über eine WD40-Domäne verfügt. Da die Proteine sich funktionell nicht der DNA-Replikation zuordnen ließen wurde die Analyse mit den Aminosäuresequenzen der kleinen Untereinheit des CAF1-Komplexes aus Drosophila melanogaster und Saccharomyces cerevisae wiederholt. In beiden Fällen lag die größte Übereinstimmung in der Sequenz mit dem Protein RbbD (DDB_G0282529) vor (vgl. Tabelle 9.4 (B)). Dieses ist laut Angaben in der Datenbank noch nicht weiter charakterisiert. Auf der Basis von in-silico gestützten funktionellen Annotationen (IEA) wird es verschiedenen Funktionsbereichen zugeordnet, darunter auch der DNA-Replikation. Zudem liegt laut Annotation eine Ähnlichkeit zum humanen Homolog der kleinen CAF1-Untereinheit RbbP4 vor. Da die Sequenzanalysen der DictyBase sich nur auf bestimmte homologe Abschnitte beschränken wurde wie nachfolgend beschrieben ein Alignment der Gesamtsequenzen durchgeführt.
Tabelle 9.4 – Identifikation potentieller HcpA- und HcpB-Interaktionspartner unter Verwendung bioinformatischer Mittel: In-silico gestütze Analysen zur Identifikation möglicher HcpA- und HcpB- Interaktionspartner unter Verwendung von Sequenzen bereits bekannter HP1-Interaktionspartner. (A) Namen und Größen bekannter HP1-Interaktionspartner, die für eine BLAST-Analyse (DictyBase) zur Identifikation möglicher Homologe in Dictyostelium discoideum verwendet wurden (Spalte 1 und 2). Sofern vorhanden wurden die besten fünf Treffer mit ihrer Bezeichnung und Größe wiedergegeben (Spalte 4 und 5). Zudem wurde die Anzahl identischer bzw. chemisch ähnlicher Aminosäure als absolute Zahl bzw. in Prozent sowie Informationen über bekannte Domänen und Funktionen angegeben (Spalten 6-10). Grau = für weitere Analysen ausgewähltes Protein. (B) BLAST- Analyse zur Identifikation potentieller Kandidaten des CAF1-Komplexes, die zusammen mit dem unter (A) genannten Protein den CAF1-Komplex bilden könnten. Zuordnung der Spalten analog zu (A). (C) Auflistung bekannter Domänen der Proteine, die in die BLAST-Analyse in (A) eingeflossen sind. (D) Domänen der für die BLAST-Analyse verwendeten und gefundenen Proteine mit Angabe der in den entsprechenden Datenbanken (ExPasy, UniProt, NCBI) vermerkten Funktionen. Bezeichnungen: Hs = Homo sapiens; Dm = Drosophila melanogaster; Mm = Mus musculus; Sc = Saccharomyces cerevisiae.
161 9. Ergebnisse C D A B
162 9. Ergebnisse
9.3.3 Chromatin Assembly Factor 1 (CAF1)
Um zu analysieren, in welchem Maß die Gesamtsequenzen der oben genannten Proteine DDB_G0287815 (potentielle große CAF1-Untereinheit), DDB_G0269800 (potentielle mittlere CAF1-Untereinheit) und RbbD (DDB_G0282529, potentielle kleine CAF1-Untereinheit) konserviert sind wurden Alignments unter Verwendung der Software Geneious angefertigt.
A
B
163 9. Ergebnisse
C
D
164 9. Ergebnisse
E
Abbildung 9.10 – Vollständiges Alignment der Kandidatenproteine (grau) aus Tabelle 9.4: Alignments der Gesamtsequenzen der in Tabelle 9.4 ausgewählten Proteine Dd DDB_G0287815 (putative große CAF1-Untereinheit), Dd DDB_G0269800 (putative mittlere CAF1-Untereinheit) und Dd RbbD (DDB_G0282529; putative kleine CAF1-Untereinheit). (A) Alignment der Aminosäuresequenzen der großen CAF1-Untereinheit aus der Maus und dem aus Tabelle 9.4 ausgewählten Kandidaten Dd DDB_G0287815. (B) Alignment der Aminosäuresequenzen der mittleren CAF1-Untereinheit aus der Maus und dem aus Tabelle 9.4 ausgewählten Kandidaten Dd DDB_G0269800. (C) und (D) Alignments der Aminosäuresequenzen der kleinen CAF1-Untereinheit aus Drosophila melanogaster (C) bzw. Saccharomyces cerrevisiae (D) und dem aus Tabelle 9.4 ausgewählten Kandidaten Dd RbbD. (E) Prozentuale Angabe der identischen und der chemisch ähnlichen Aminosäuren in den Alignments aus (A)-(D).
Wie den Abbildungen 9.10 (A)-(F) zu entnehmen ist weist der Vergleich der großen CAF1- Untereinheit aus der Maus mit dem Protein DDB_G0287815 die geringste Homologie auf (A). Mit 26,00% identischen und 13,90% chemisch ähnlichen Aminosäuren weisen die mittlere CAF1-Untereinheit (Mus musculus) und das Protein DDB_G0269800 ein höheres Maß an Homologie auf (B). Der Vergleich zwischen der putativen kleinen CAF1-Untereinheit RbbD aus Dictyostelium mit den beiden CAF1-Homologen CAF1 p55 (Drosophila) und Cac3 (Saccharomyces) resultiert bezüglich der Homologie mit 65,30% identischen und 15,10% chemisch ähnlichen (Dm CAF1 p55) bzw. mit 29,90% identischen und 17,20% chemisch ähnlichen Aminosäuren (Sc Cac3) in sehr unterschiedlichen Ergebnissen ((C) und (D)). Zusammenhängende Abschnitte in der Aminosäuresequenz, welche auf funktionelle Domänen hinweisen könnten, sind fast ausschließlich im Vergleich zwischen RbbD und Dm CAF1 p55 auszumachen (C). Die Annotationen in der Dictyostelium-Datenbank legen aber nahe, dass es sich bei den genannten Proteinen um die Homologe der Untereinheiten des CAF1-Komplexes handelt. Um dies überprüfen zu können wurde zunächst die potentielle große CAF1-Untereinheit DDB_G0287815 für die Expression in E. coli kloniert. Eine Expression als lösliches Protein konnte unter den gewählten Bedingungen nicht erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Die Durchführung von Interaktionsassays mit rekombinantem HcpA bzw. HcpB konnte daher nicht erfolgen. Für die Expression in Dictyostelium discoideum wurden verschiedene Vektoren kloniert, im Rahmen dieser Arbeit konnte jedoch aus zeitlichen Gründen lediglich 165 9. Ergebnisse die Lokalisation des Proteins untersucht werden. Mit einem C-terminalen HA-Tag markiertes DDB_G0287815 lokalisiert ausschließlich im Zellkern (Abbildung 9.11, linke Spalte). Die mit einem C-terminalem GFP-Tag markierte kleine Untereinheit RbbD lokalisiert ebenfalls vorwiegend im Zellkern. Darüber hinaus zeigen einige Zellen auch eine mehr oder weniger ausgeprägte Lokalisation im Zytoplasma (Abbildung 9.11, rechte Spalte). Eine Klonierung der putativen mittleren CAF1-Untereinheit DDB_G0269800 sowohl für eine Expression in E. coli als auch in Dictyostelium war unter Verwendung der zur Verfügung stehenden Mittel nicht erfolgreich.
pDM304 DDB_G0287815-HA pDM323 RbbD-GFP (putative große CAF1 UE) (putative kleine CAF1 UE)
rabbit α-HA / GFP Alexa-Fluor 488-konj. goat-α-rabbit
DAPI DAPI
Überlagerung Überlagerung
Abbildung 9.11 – Lokalisation der HA-getaggten putativen großen und der GFP-getaggten putativen kleinen Untereinheit des CAF1-Komplexes: Sowohl die putative große (linke Spalte) als auch die putative kleine Untereinheit (rechte Spalte) des CAF1-Komplexes lokalisieren im Zellkern. Die große Untereinheit lokalisiert dabei in einer Vielzahl kleiner Spots und zuweilen einem kleineren Spot in der Peripherie (Pfeil Abbildung linker Rand). Bei der putativen kleinen Untereinheit lokalisiert das Protein bei einigen Zellen zudem im Bereich des Cytoplasmas. Die Aufnahmen stammen aus einer Population von transformierten Zellen, da die Aufnahme des Plasmids extrachromosomal erfolgte. In einigen Zellen ist kein Signal detektierbar.
166 9. Ergebnisse
9.3.4 Interaktion von SuvA mit dem HP1-Homolog HcpB
Die Histon-Methyltransferase SuvA ist ein bekannter Interaktionspartner des Heterochromatin Proteins 1, eine physische Interaktion wurde bereits in einer Reihe von Versuchsorganismen beschrieben (Aagaard et al., 1999; Bannister et al., 2001; Schotta et al., 2002). In Dictyostelium discoideum wurde SuvA aufgrund von Sequenzanalysen als Homolog Su(var)3-9 aus Drosophila melanogaster identifiziert (Essid, 2004; Kaller, 2006). Ein Knockout des Gens war bisher nicht erfolgreich und legt die essentielle Bedeutung des Gens nahe (Essid, 2004). Zudem konnte bereits gezeigt werden, dass SuvA mit methyliertem H3K9 ko-
A DAPI GFP Überlagert Durchlicht AX2 / pDM317 GFP-SuvA (Population) / pDM317 GFP-SuvA AX2
B C
Wash 1 Wash 2 Eluat 1 Eluat 2 Wash 1 Wash 2 Eluat 1 Eluat 2 Page Ruler PrestainedWash Proein 1 LadderWash 2 Plus Input HcpB-HA kDa Page RulerInput Prestained SuvA-GFPWash Proein 1 LadderWash 2 Plus Input HcpA-HA kDa Input SuvA-GFP
70 70 55 55
35 AP-konj. goat-α-mouse 35 AP-konj. goat-α-mouse 25
25
Abbildung 9.12 – Lokalisation von GFP-markiertem SuvA-Protein und Interaktion mit HcpB: Lokalisation von GFP-markiertem SuvA-Protein nach Transformation von AX2-Zellen mit einem extrachromosomalen Vektor und Nachweis der Interaktion mit HcpB. (A) N-terminal mit GFP markiertes SuvA lokalisiert im Bereich des Zellkerns mit einem leichten Hintergrundsignal im Bereich des Cytoplasmas. Im Bereich des Zellkerns fällt dabei eine Signalanhebung in einem kleinen Punkt im Bereich der Peripherie auf (Pfeil). (B) Interaktionsassay zur Überprüfung einer Interaktion zwischen SuvA und HcpA. Nach Inkubation des an die Säule gebundenen GFP-SuvA mit dem 167 9. Ergebnisse
Interaktionspartner und Durchführung der Waschschritte eluiert kein HcpA-HA von der Säule. Eine Interaktion zwischen SuvA und HcpA kann somit unter den gewählten Bedingungen nicht nachgewiesen werden. (C) Interaktionsassay zur Überprüfung einer Interaktion zwischen SuvA und HcpB. Nach Inkubation des an die Säule gebundenen GFP-SuvA mit dem Interaktionspartner und Durchführung der Waschschritte eluiert HcpB-HA von der Säule. lokalisiert (Dubin, 2010). Der physische Nachweis einer Interaktion in Dictyostelium discoideum konnte hingegen bisher noch nicht erbracht werden. Um zu untersuchen, ob HcpA und HcpB mit SuvA interagieren, wurde zunächst ein Vektor mit N-terminalem His-Tag für die Expression in E. coli kloniert und exprimiert. Unter den gewählten Expressionsbedingungen konnte kein Protein in der löslichen Fraktion nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Daher wurde die kodierende Sequenz für die Expression in Dictyostelium in einen extrachromosomaler Vektor mit N-terminalen GFP-Tag umkloniert (Veltman1 et al., 2009). Abbildung 9.12 (A) zeigt die Expression und Lokalisation des Proteins in der Zelle. SuvA lokalisiert hauptsächlich im Zellkern, wobei ein prominenter Spot im Bereich der Peripherie auffällt (Pfeil). Auch im Bereich des Cytoplasma konnte ein Signal detektiert werden, dessen Intensität aber unterhalb der Signalstärke im Kern liegt. Um zu überprüfen, ob SuvA mit den beiden HP1-Homologen aus Dictyostelium interagiert wurden Immunpräzipitationen mit HA-getaggtem HcpA bzw. HcpB durchgeführt. Während eine Bindung von HcpA an SuvA in diesem Assay nicht nachgewiesen werden konnte (Abbildung 9.12 (B)) lag HcpB offenbar mit SuvA assoziiert vor (Abbildung 9.12 (C)). Unter den gewählten experimentellen Bedingungen konnte somit eine Interaktion zwischen SuvA und HcpB, nicht aber mit HcpA nachgewiesen werden.
9.4 Heterologe Expression von humanem HP1α (hHP1α) in Dictyostelium discoideum
9.4.1 Heterologe Expression von hHP1α in HP1-Einzelknockout-Stämmen
Wie in Abschnitt 6.8 beschrieben sind HP1-Homologe im Organismenreich weit verbreitet. Ihr hoher Konservierungsgrad legt die Möglichkeit nahe, dass bei einer heterologen Expression von HP1-Homologen die Funktionalität des Proteins erhalten bleibt. Um die Funktion von humanem HP1α (hHP1α) in Dictyostelium discoideum analysieren zu können wurden unter Verwendung des Vektors pDNeo2a hHP1alpha-GFP Zelllinien generiert, die ein hHP1α-GFP-Fusionsprotein exprimieren. Als Ausgangsstamm für die Generierung von ΔHcpA
168 9. Ergebnisse hHP1α-GFP Zelllinien wurde der Stamm ΔHcpA rox Klon #1 verwendet. Die Generierung von ΔHcpB hHP1α-GFP Zelllinien erfolgte unter Verwendung des Ausgangsstammes AX2 und anschließender Transformation des Vektors pGEM7z HcpB KO. Die transformierten Zellen wurden subkloniert und zunächst fluoreszenzmikroskopisch auf die Expression des GFP- gekoppelten hHP1α-Proteins hin untersucht. Abbildung 9.13 zeigt die Expression und Lokalisation des Proteins. Während nicht-fusioniertes GFP sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern lokalisiert ist das HcpA-GFP-Fusionsprotein im Zellkern lokalisiert. Im Interphase- Kern findet sich das Protein zudem vornehmlich in einem prominenten Spot, der perizentromerischen Heterochromatin entspricht (Kaller1 et al., 2006) und sich je nach Phase des Zellzyklus in sechs Spots aufteilen kann. Wie Abbildung 9.13 zeigt lokalisiert heterolog exprimiertes hHP1α-GFP-Protein ebenfalls in einem solchen Spot. Eine Lokalisation im Bereich des Zytoplasmas ist hingegen nicht zu beobachten. Um nachzuweisen, dass in dem verwendeten Ausgangsstamm ΔHcpA rox Klon #1 auf RNA- Ebene keine Expression von wildtypischem HcpA erfolgt, wurde Gesamt-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die für HcpA kodierende cDNA wurde mit entsprechenden Primern bezüglich ihrer Länge überprüft. Abbildung 9.14 (C) zeigt, dass lediglich eine aufgrund des Knockouts trunkierte RNA exprimiert wird (vgl. Anmerkungen der Abbildungsbeschreibung).
169 9. Ergebnisse
AX2 AX2-GFP HcpAB HcpA-GFP
Durchlicht
DAPI
GFP
Überlagerung