Molekulare und biochemische Charakterisierung der purinergen Rezeptoren P2X4 und P2X7 im Alveolarepithel der Lunge

D I S S E R T A T I O N

zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt

der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden von

Dipl.-Chem. Karina Weinhold

geboren am 27. Juli 1977 in Freiberg

Tag der Einreichung: 30. 07. 2010 Datum der Verteidigung: 01.11.2010

Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Gerhard Rödel Prof. Dr. rer. nat. habil. Michael Kasper

Betreuer: Dr. rer. nat. Kathrin Barth

Diese Dissertation wurde im Institut für Anatomie an der Medizinischen Fakultät „Carl Gustav Carus“ in Kooperation mit dem Institut für Genetik der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden angefertigt.

Aus aktuellem Anlass wurden Teile der vorliegenden Arbeit bereits veröffentlicht.

Karina Weinhold, Udo Krause-Buchholz, Gerhard Rödel, Michael Kasper, Kathrin Barth (2010). Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci. 67 (15), 2631-42.

Barth K*, Weinhold K*, Guenther A, Linge A, Gereke M and Kasper M (2008). Characterization of the molecular interaction between caveolin-1 and the P2X receptors 4 and 7 in E10 mouse lung alveolar epithelial cells. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2230-2239. * These authors contributed equally to this work

Barth K.*, Weinhold K.*, Guenther A., Young M. T., Schnittler H. and Kasper M. (2007). Caveolin-1 influences P2X(7) receptor expression and localization in mouse lung alveolar epithelial cells. FEBS J. 274, 3021-3033. * These authors contributed equally to this work

Ernst zu nehmende Forschung erkennt man daran, dass plötzlich zwei Probleme existieren, wo es vorher nur eines gegeben hat.

Thorstein Bunde Veblen (1857-1929) amerik. Soziologe und Ökonom

I I NHALTSVERZEICHNIS

I I NHALTSVERZEICHNIS

II A BKÜRZUNGSVERZEICHNIS

III A BBILDUNGSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 1

1.1 Bau und Funktion der Lunge 1 1.2 Das alveoläre Lungenepithel 2 1.3 Mikrodomänen in der Zellmembran und deren Funktionen 5 1.4 Caveolen- spezielle Mikrodomänen in der Zellmembran 8 1.5 Struktur und Funktion von Cav-1 und Cav-2 10 1.6 Adenosintriphosphat in der Lunge 12 1.7 Aufbau und Funktion von P2X-Rezeptoren 13 1.8 Assoziation der P2XR mit Mikrodomänen und downstream -Effektoren 15 1.9 Verteilung der P2XR in der Lunge 17 1.10 Zielsetzungen 19

2 MATERIAL UND METHODEN 20

2.1 Materialien 20 2.1.1 Chemikalien und Fertiglösungen 20 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 22 2.1.3 Kit und ready-to-use Systeme 22 2.1.4 Puffer und Lösungen 23 2.1.5 Größenstandards 31 2.1.6 Antikörper 31 2.1.7 Verwendete Zelllinien und transgene Tiere 34 2.1.8 Lösungen und Medien für die Zellkultur 35 2.1.9 Lösungen und Medien für die Molekularbiologie 37 2.1.10 Enzyme 39 2.1.11 Verwendete Escherichia coli -Stämme 40 2.1.12 Vektoren und Plasmide 40

2.2 Methoden 41 2.2.1 Zellbiologische Methoden 41 2.2.1.1 Zellkultivierung 41 2.2.1.2 FKS-Hitzeinaktivierung 42 2.2.1.3 Einfrieren von Zellen 42 2.2.1.4 Auftauen von Zellen 42

2.2.2 Biochemische Methoden 42 2.2.2.1 Präparation der Detergenzien-löslichen und -unlöslichen Membranfraktion 42 2.2.2.2 Präparation von DRMs mittels diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation 43 2.2.2.3 Lipidextraktion aus den Fraktionen der Dichtegradienten 43 2.2.2.4 Dünnschichtchromatographie (DC) 44 2.2.2.5 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz (Dieckmann-Schuppert and Schnittler, 1997) 44 2.2.2.6 BCA-Proteinbestimmung 45 2.2.2.7 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 45 2.2.2.8 blue native -PAGE und high resolution clear native -PAGE (Wittig et al., 2007) 46 2.2.2.9 2D/SDS-PAGE 48 2.2.2.10 Western Blot 48 2.2.2.11 Ponceau-Färbung 48 2.2.2.12 Coomassie Brilliantblau-Färbung 48 2.2.2.13 Immundetektion 49 2.2.2.15 Co-Immunpräzipitation 49 2.2.2.16 Oberflächenbiotinylierung 50

2.2.3 Immunfluoreszenzmikroskopie 51 2.2.3.1 Beschichtung von Deckgläschen 51 2.2.3.2 Immunfluoreszenz mit fixierten Zellen 52 2.2.3.3 Detektion des acceptor bleaching Förster-Resonanz-Energie-Transfers (König et al., 2006) 52

2.2.4 Molekularbiologische Methoden 54 2.2.4.1 Kultivierung von E. coli 54 2.2.4.2 Plasmid-Minipräparation 54 2.2.4.3 Plasmid-Maxipräparation 54 2.2.4.4 Spektrometrische Bestimmung der DNA-Konzentration 55 2.2.4.5 Herstellung von GST-fusionierten Konstrukten 55

INHALTSVERZEICHNIS

2.2.4.6 In vitro Membranlipid-Bindeassay 62 2.2.4.7 Herstellung von short hairpin (sh)RNA 63 2.2.4.8 Erzeugung von Lentiviren 68 2.2.4.9 HIV-1 p24 Antigen ELISA 70 2.2.4.10 Replikationstest mit X-Gal-Färbung (Price et al., 1987) 70 2.2.4.11 Virale Transfektion von E10-Zellen 70 2.2.4.12 Überexpression der mP2XR in E10-Zellen 71

3 ERGEBNISSE 73

3.1 Nachweis der purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R im Lungengewebe der Maus und in der Alveolarepithelzelllinie E10 73 3.2 Untersuchungen zur Lokalisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen 75 3.2.1 Assoziation von P2X4R und P2X7R mit DRMs 75 3.2.2 Untersuchung zur Lokalisation von P2X4R und P2X7R mittels Immunfluoreszenzmikroskopie 79 3.2.3 Charakterisierung der räumlichen Assoziation von P2X7R und Cav-1 mittels Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analyse 81 3.2.4 Molekulare Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen 83 3.2.4.1 Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe (2D/SDS-PAGE) 85

3.2.5 Nachweis der Assoziation von P2X7R mit P2X4R und Cav-1 87

3.3 Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Membranlipiden 89 3.3.1 Untersuchung der direkten Interaktion von P2X4R und P2X7R mit Membranlipiden – in vitro Lipid-Bindeassay 91

3.4 Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R auf den Proteingehalt von P2X7R, Cav-1 und Cav-2 93 3.5 Auswirkungen der Reduzierung von P2X7R auf den Proteingehalt von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 96 3.6 Auswirkungen des P2rx7 knockout auf den Proteingehalt von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 im Lungengewebe der Maus 99 3.7 Verteilung von P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung von P2X4R in E10-Zellen 100 3.8 Verteilung von P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung von P2X7R in E10-Zellen 103

3.9 Molekulare Organisation der Proteinkomplexe nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen 107 3.10 Überexpression von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen 109 3.10.1 Auswirkungen der Überexpression von P2X4R auf den Proteingehalt von P2X7R, Cav-1 und Cav-2 111 3.10.2 Auswirkungen der Überexpression von P2X4R auf die Verteilung von P2X7R, Cav-1 und Cav-2 112 3.10.3 Auswirkung der Überexpression von P2X4R auf die Assoziation von P2X7R und Cav-1 mit DRMs 114

3.11 Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt von Calmodulin und der Proteinkinase CβI 115 3.12 Auswirkung des P2rx7 knockout auf den Proteingehalt von Calmodulin und der Proteinkinase C βI im Lungengewebe der Maus 117

4 DISKUSSION 119

4.1 Lokalisation und molekulare Organisation von P2X7R in E10-Zellen 119 4.2 Lokalisation und molekulare Organisation von P2X4R in E10-Zellen 123 4.3 Wechselbeziehungen zwischen P2X4R und P2X7R 126 4.4 Beziehung zwischen P2X4R- und Cav-1-assoziierten Mikrodomänen 129 4.5 Assoziation von P2X4R und P2X7R mit negativ geladenen Phospholipiden 130 4.6 P2X7R beeinflusst die Proteinkinase C βI und Calmodulin in E10-Zellen 133 4.7 Phänotyp der P2rx7 (-/-) Maus 135 4.8 Modelle zur Lokalisation von P2X7R in der Zellmembran und zur intrazellulären Aktivierung von Calmodulin und der Proteinkinase C 137

5 ZUSAMMENFASSUNG 139

6 LITERATURVERZEICHNIS 142

IV V ERSICHERUNG 169

V D ANKSAGUNG 171

II A BKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abs 260 Absorption des Lichtes bei 260 nm Wellenlänge AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfluorid-Hydrochlorid Amp Ampicillin-Natriumsalz APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäure ATP Adenosin-5´-triphosphat AT I/II-Zellen Alveolarepithel Typ I/II-Zellen BCA Bicinchonin- 4-carbonsäure BN-PAGE Blue native PAGE bp Basenpaar BSA bovine serum albumine BzATP 2´-3’-O-(4-benzoyl)benzoyl- adenosin-5´-triphosphat Cav-1/-2 Caveolin-1/-2 cDNA complementery deoxyribonucleic acid Chol Cholesterol CLSM confocal laser scanning microscopy Cy3/5 Carbocyanin 3/5 β-cop β-Coatomer-Protein Da Dalton DABCO 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]-octan DC Dünnschichtchromatographie ddH 2O doppelt destilliertes Wasser DDM n-Dodecyl-β-D-maltosid DEPC Diethylpyrocarbonat DMEM Dulbecco´s modified eagle medium DNA deoxyribonucleic acid dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol DOC Deoxycholat Natriumsalz DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline DRM Detergenzien-resistente Membran

E. coli Escherichia coli ECL enhanced chemiluminescence Eco RI Gen aus E. coli RY13 EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´,N´- tetraessigsäure EGFP/GFP (enhanced) green fluorescent protein ER Endoplasmatisches Retikulum Esp3 I Gen aus Hafnia alvei et al. et alia (und andere) FITC Fluorescein-5-isothiocyanat FKS fetales Kälberserum g relative Zentrifugalbeschleunigung GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase GenTG Gentechnikgesetz GlcCer glycoceramide GST Glutathion S-transferase GVO Gentechnisch veränderter Organismus h Stunde HEK human embryonic kidney HeLa Henrietta Lacks HEPES 2-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethansulfonsäure HMW high molecular weight hrCN-PAGE High resolution clear native PAGE HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) Ig Immunglobulin IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid K Kontrolle LB-Agar / -Medium Luria-Bertani-Agar/ -Medium MβCD Methyl-β-cyclodextrin MBS Mes buffered saline (Mes-gepufferte Saline) MCS multiple cloning site Mes 4-Morpholinoethansulfonsäure

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS min Minute mRNA messenger Ribonukleinsäure MSD membrandurchspannende Domäne NP-40 Nonidet P-40 Not I Gen aus Nocardia otitidis-caviarum OD Optische Dichte PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS phosphate buffered saline (Phosphat-gepufferte Saline) PE Phosphatidylethanolamine PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PDI Protein-Disulfid-Isomerase PEI Polyethylenimin PFA Paraformaldehyd PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PVDF-Membran Poly(vinyl)difluorid-Membran RIPA radio immunoprecipitation assay RISC RNA -induced silencing complex RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rounds per minute ROI region of interests RT Raumtemperatur s Sekunde SAP Shrimp Alkaline Phosphatase S.D. standard difference SDS sodium dodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat) shRNA Short hairpin RNA siRNA small interfering RNA SOC super optimal broth with catabolite repression TBS Tris buffered saline TBS-T Tris buffered saline mit Tween TCA trichloroacetic acid TCEP Tris(2-carboxyethyl) phosphin TEMED N, N, N’, N’ –Tetramethylethylendiamin TGN Trans-Golgi Netzwerk

Tm temperature of melting Tricin N-(Tri(hydroxymethyl)methyl)glycin Tris Trihydroxymethylaminomethan TU Transfection units U Unit V Volt v/ v Volumenprozent w/ v Gewichtsprozent Xba I Gen aus Xanthomonas badrii X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid YTA Yeast -Tryptone -Ampicillin

III A BBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb. 1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Atemwege und des gasaustauschenden Systems. 1 Abb. 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Alveolen (1:50000). 3 Abb. 3: Ionenkanäle im alveolären Epithel der Lunge 4 Abb. 4: Mehrschichtige Mikrodomänen. 6 Abb. 5: Homogene Mikrodomänen. 6 Abb. 6: Heterogene Mikrodomänen. 7 Abb.7: Schematische Darstellung der Mikrodomänen 9 Abb.8: Schematische Darstellung von Caveolin-1 (Cav-1). 10 Abb. 9: Übersicht über den strukturellen und funktionellen Aufbau der P2XR. 14 Abb. 10: Anordnung der Untereinheiten der wichtigsten ionotropen Rezeptorfamilien. 15 Abb. 11: Schematische Darstellung des von Pfizer hergestellten P2rx7 (-/-)-Konstruktes 35 Abb. 12: Immunologischer Nachweis von P2X4R und P2X7R im Lungengewebe der Maus. 73 Abb. 13: Immunologischer Nachweis von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen 74 Abb. 14: Löslichkeit von P2X4R und P2X7R in nicht-ionischen Detergenzien. 75 Abb. 15: Verteilung von P2X4R und P2X7R in den Fraktionen eines Dichtegradienten nach Solubilisierung mit Brij 35. 77 Abb. 16: Dünnschichtchromatographische Auftrennung der Lipide aus den Fraktionen eines Dichtegradienten nach der Solubilisierung mit Brij 35. 78 Abb. 17: Verteilung von P2X4R und P2X7R in den Fraktionen eines Dichtegradienten nach Solubilisierung mit Triton X-100. 79 Abb. 18: Fluoreszenz-mikroskopischer Nachweis der Verteilung von P2X4R und Cav-1 in E10-Zellen. 80 Abb. 19: Fluoreszenz-mikroskopischer Nachweis der Verteilung von P2X7R und Cav-1 in E10-Zellen. 80 Abb. 20: Anordung der regions of interest (ROIs) während der Messungen der Fluoreszenzintensitäten. 81 Abb. 21: Datenanalyse der abFRET-Ergebnisse. 82 Abb. 22: Löslichkeit von P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2 in Digitonin. 83 Abb. 23: Immundetektion von P2X7R und P2X4R in hochmolekularen Proteinkomplexen. 85

Abb. 24: Immunologischer Nachweis der Proteinzusammensetzung der hochmolekularen Komplexe. 86 Abb. 25: Co-Immunpräzipitationen nach der Solubilisierung mit NP-40. 88 Abb. 26: Co-Immunpräzipitationen nach der Solubilisierung mit Digitonin. 89

Abb. 27: Verteilung von PI(4,5)P 2 in den Fraktionen eines Dichtegradienten nach der Solubilisierung mit Brij 35. 91 Abb. 28: Nachweis der direkten Interaktion von GST-P2XR-Fusionsproteinen mit negativ geladenen Membranlipiden. 92 Abb. 29: Auswirkungen der siRNA-vermittelten Reduzierung von P2X4R auf P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2. 94 Abb. 30: Auswirkungen der Kontroll-shRNAs auf den Proteingehalt von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2. 95 Abb. 31: Auswirkungen der siRNA-vermittelten Reduzierung von P2X7R auf P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2. 97 Abb. 32: Auswirkungen der Kontroll-shRNAs auf den Proteingehalt von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2. 98 Abb. 33: Immunologischer Nachweis der Auswirkungen des P2rx7 (-/-) knockout auf den Proteingehalt von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 im murinen Lungengewebe. 99 Abb. 34: Immunreaktivitäten von P2X7R, Cav-1 und Cav-2 in Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X4R. 101 Abb. 35: Quantitativer Nachweis der Zunahme von P2X7R in der Zellmembran nach der durch shRNA3 vermittelten Reduzierung von P2X4R. 102 Abb. 36: Immunologischer Nachweis der Verteilung des P2X7R in den Fraktionen der Dichtegradienten von Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X4R 103 Abb. 37: Immunreaktivitäten von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 in Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X7R. 104 Abb. 38: Quantitativer Nachweis der Zunahme von P2X4R in der Zellmembran nach der durch shRNA3 vermittelten Reduzierung von P2X7R. 105 Abb. 39: Immunologischer Nachweis der Verteilung von P2X4R und Cav-1 in den Fraktionen der Dichtegradienten von Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X7R 106 Abb. 40: Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe solubilisiert aus Kontrollzellen und Zellen mit reduzierter P2rx4 -mRNA. 107

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb. 41: Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe solubilisiert aus Kontrollzellen und Zellen mit reduzierter P2rx7 -mRNA. 108 Abb. 42: Fluoreszenzbilder von überexprimierten und endogenen P2X4R und P2X7R in E10-Zellen. 110 Abb. 43: Immunologischer Nachweis der Veränderungen im Proteingehalt von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 nach der Überexpression von P2X4R. 111 Abb. 44: Bilder der Fluoreszenzen des überexprimierten P2X4R mit den endogenen, immunreaktiven Proteinen P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2 113 Abb. 45: Verteilung von P2X4R, P2X7R und Cav-1 in den Fraktionen der Dichtegradienten nach der Überexpression von P2X4R. 115 Abb. 46: Western Blot-Analysen von Calmodulin in Kontrollversuchen und nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R. 116 Abb. 47: Western Blot-Analysen der Proteinkinase C βI in Kontrollversuchen und nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R. 117 Abb. 48: Immunologischer Nachweis von Calmodulin und Proteinkinase C βI im Lungengewebe von P2rx7 (+/+) Wildtyp und (-/-) knockout Mäusen. 118 Abb. 49: Lokalisation von P2X7R in der Zellmembran von E10-Zellen 137 Abb. 50: Mögliche Aktivierung der down stream -Effektoren CaM und PKC durch 2+ Ca und PI(4,5)P 2 138

1 E INLEITUNG

1.1 Bau und Funktion der Lunge

Das Atmungssystem des Menschen besteht aus den Luftwegen, der Lunge und seinen elastischen Bestandteilen, dem Diaphragma (Zwerchfell) und der Pleura (Abb. 1). Die Luftwege reichen von der Nase und dem Mund über die Luftröhre (Trachea) zu den zwei Hauptbronchien, welche die Luft in die Lunge leiten. Die menschliche Lunge besteht aus einer rechten und linken Lunge, welche nochmals durch sogenannte Lungenlappen unterteilt werden. Dabei teilen sich die rechte Lunge in drei Lappen und die linke Lungen in nur zwei Lappen, da dieser Raum für das Herz benötigt wird. Die Bronchien verzweigen sich in den Lungen zu unzähligen kleinen Ästen, den Bronchien und Bronchiolen. Die Bronchien dienen nicht nur der Luftverteilung, sondern sie filtern mit Hilfe des mit Zilien besetzten Epithels ebenso Fremdkörper und Keime bis zu einer Größe von ~10 µm aus der Luft. Das luftführende System der Bronchien terminiert schließlich blind im gasaustauschenden Teil der Lunge, den Bronchioli terminales und den Alveolen (lat. alveolus = kleine Mulde).

Abb. 1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Atemwege und des gasaustauschenden Systems. (A) Aufbau des Atemwegsystems, (B) Struktur der Alveolen mit Kapillarnetz und (C) Gasaustausch in den Alveolen, entnommen aus www.nhlbi.nih.gov.

1

Das gasaustauschende System der Lunge beginnt dabei mit den Bronchioli respiratorii, aus denen jeweils bis zu 10 Alveolargänge hervorgehen und die sich wiederum in 3-5 Alveolarsäckchen verzweigen. Die Alveolen sind durch dünne Interalveolarsepten voneinander getrennt. Das bindegewebige Grundgerüst der Alveolarwand besteht hauptsächlich aus elastischen Fasern, den Kollagenfibrillen, denen ein Netz aus Kapillaren aufliegt. Über die Pulmonalarterie wird dabei sauerstoffarmes (venöses) Blut zu den Alveolen gepumpt, mit Sauerstoff angereicht (arterialisiert), über die Lungenvenen zum Herz gebracht und dem Körperkreislauf zugeführt.

1.2 Das alveoläre Lungenepithel

Die Alveolen sind mit einem einschichtigen Plattenepithel ausgekleidet (Crapo and Crapo, 1983), welches zu 95% bis 97% aus Alveolarepithel Typ I-Zellen (AT I-Zellen), und zu 3% bis 5% aus kubischen Alveolarepithel Typ II-Zellen (AT II-Zellen) besteht (Morgenroth, 1986) (Abb . 2). Die AT II-Zellen sind prismatisch geformt und stellen die Vorläuferzellen von AT I-Zellen dar (Adamson and Bowden, 1975). Sie produzieren einen oberflächenaktiven Film, den sogenannten Surfactant ( surface active agent ). Dieser besteht aus Phospholipiden (hauptsächlich Phosphatidylcholin), verschiedenen Proteinen und Ca 2+ . Die Phospholipide setzen dabei die Oberflächenspannung herab, während die Surfactantproteine und Ca 2+ u. a. den Umsatz des Surfactant regulieren. Die AT I-Zellen sind flache, organellenarme, ausdifferenzierte, 50 µm bis 150 µm breite Zellen. Sie liegen apikal dem Bindegewebsgerüst auf, welches basolateral vom Kapillarnetz überzogen wird. Die AT I-Zellen bilden zusammen mit dem Kapillarendothel und der gemeinsamen Basalmembran die Blut-Luft-Schranke. Die Hauptaufgabe dieser Blut-Luft- Schranke ist die Gewährleistung des Gasaustausches. Zur Blut-Luft-Schranke gehört auch der von den AT II-Zellen gebildete Surfactant. Er bedeckt die AT I-Zellen und verhindert durch die Herabsetzung der Oberflächenspannung den Kollaps der Alveolen beim Atmen.

2 EINLEITUNG

Abb. 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Alveolen (1:50000). Darstellung der Blut-Luft-Schranke mit AT I-Zellen, Basalmembran und Endothel, entnommen aus www.anatomy.iupui.edu.

Lange Zeit dachte man, dass neben den Endothelzellen nur die AT II-Zellen aktiv am Stoffwechselgeschehen der alveolar-kapillaren Einheit beteiligt sind (Fehrenbach, 2001). Aktuelle Studien belegen jedoch, dass auch AT I-Zellen eine aktive Funktion bei der Aufrechterhaltung der Flüssigkeitshomöostase im Alveolarraum übernehmen (Borok et al., 2002; Johnson et al., 2002; Sartori and Matthay, 2002; Johnson et al., 2006). Es handelt sich dabei um komplexe Mechanismen, die für die Einhaltung des Gleichgewichts zwischen der alveolär-interstitiellen und der intravasalen Flüssigkeit verantwortlich sind (Abb. 3). Der Transport durch das einschichtige Epithel ist fein reguliert und erlaubt damit die kontrollierte Absorption oder Sekretion von Wasser und wasserlöslichen Substanzen. Dafür stehen neben aktiven Transportmechanismen auch Mechanismen des passiven Transportes in der Zellmembran von alveolaren Epithelzellen zur Verfügung (Johnson et al., 2006). Apikal weisen die Alveolarepithelzellen Ionenkanäle auf, welche die intrazellulären Ionenkonzentrationen beeinflussen. Dies sind im Fall der AT I-Zellen u. a. der Wasserkanal Aquaporin-5, der cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) sowie die sogenannten cyclic nucleotide-gated (CNG) Kanäle und epithelial Na + channels (ENaCs) (Johnson et al., 2006). 3

Abb. 3: Ionenkanäle im alveolären Epithel der Lunge (Johnson et al., 2006)

Die Vermittlung des hochselektiven und regulierten Ionenflusses über die apikale und basolaterale Membran von Epithelzellen ist für die Funktion der Lunge von größter Bedeutung. So sterben ENaC-defiziente Mäuse kurz nach der Geburt an Lungen – und Nierenleiden (Hummler and Rossier, 1996; Barker et al., 1998; McDonald et al., 1999).

Grundsätzlich sind Epithelzellen asymmetrisch aufgebaut, d.h. apikale und basolaterale Membran sind histologisch und physiologisch unterschiedlich. Diese funktionelle Asymmetrie ermöglicht den vektoriellen Transport von Substanzen durch die Epithelzellen. Die Asymmetrie ist eine komplexe Eigenschaft von Epithelzellen, die noch nicht ausreichend verstanden ist. So werden bestimmte Membranproteine nach ihrer Synthese am endo- plasmatischen Retikulum in die apikale oder in die basolaterale Membran eingebaut (Kawai et al., 1974; van Meer and Simons, 1988; Sargiacomo et al., 1989). Die Verankerung dieser Proteine verhindert einen Ausgleich der Proteindichte zwischen apikaler und basolateraler Membran, und gewährleistet damit die funktionelle Asymmetrie der Epithelzellen. Die apikale Membran besitzt eine andere Proteinzusammensetzung als die basolaterale Membran (van Meer and Simons, 1988; Le Bivic et al., 1989). Die Proteine und Lipide werden dabei über unterschiedliche Transportvesikel zur apikalen oder zur basolateralen Zellmembran transportiert (Wandinger-Ness et al., 1990; Ikonen et al., 1995). Der Transport von Proteinen zur apikalen Zellmembran wird über mit Cholesterol und Sphingolipiden angereichten Mikrodomänen vermittelt. Diese fusionieren im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) selektiv zu Clustern, welche sich als Transportvesikel abschnüren und in die Zellmembran einlagern (Zurzolo et al., 1994b; Harder et al., 1998; Lipardi et al., 2000; Schuck and Simons, 2004). Weiterhin ist die Assoziation von Proteinen mit den Mikrodomänen für die Formation von hochmolekularen Signalproteinkomplexen notwendig. Es wird vermutet, dass die

4 EINLEITUNG

Verbindung mit hochmolekularen Komplexen die Lokalisation von Proteinen in den Lipid- Mikrodomänen stabiliziert und die Vereinigung von kleineren Abschnitten zu einer funktionellen apikalen Sortierdomäne zur Folge hat (Zurzolo et al., 2003).

1.3 Mikrodomänen in der Zellmembran und deren Funktionen

Grundsätzlich besitzen die beiden Monolayer der Zellmembran eine unterschiedliche Lipid- Zusammensetzung, so dass die Lipid-Doppelschicht asymmetrisch aufgebaut ist. Die extrazelluläre Hälfte der Doppelschicht besteht überwiegend aus Phosphatidylcholin und dem Glykosphingolipid Sphingomyelin, wogegen die zytoplasmatische Hälfte hauptsächlich aus Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin aufgebaut ist. Neben Phospho- und Sphingolipiden kommt in beiden Hälften der Lipid-Doppelschicht das Sterol Cholesterol vor (Zachowski, 1993; Holthuis and Levine, 2005). Je nach Lipid- und Membranaufbau können sich Proteine, Lipide und Cholesterol durch freie Diffusion zwischen den beiden Membranschichten bewegen (Backer and Dawidowicz, 1981), wobei die asymmetrische Verteilung der Lipide in der Membran von Enzymen (Flippasen und Translokatoren) kontrolliert wird (Holthuis and Levine, 2005). Das traditionelle Fluid-Mosaik-Modell (Singer and Nicolson, 1972) erklärt die Zellmembran als dynamisches, in permanenter Veränderung begriffenes Lipidgerüst. In der Zellmembran kommt es neben einer unstrukturierten Ansammlung von Lipiden ( lipid-disordered ), auch zur Ausbildung von strukturierten ( lipid-ordered ) Mikrodomänen, welche reich an Glykosphingoplipiden und Cholesterol sind (Ipsen et al., 1987; Simons and van Meer, 1988; Brown and London, 1997; Simons and Ikonen, 1997; Brown and London, 1998). Die Anziehungskräfte zwischen Cholesterol und den Sphingolipiden mit gesättigten Kohlenhydratketten führen in einer Umgebung mit ungesättigten Glycerophospholipiden zur Bildung von lateralen Mikrodomänen in der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran. Die Größe dieser Mikrodomänen wird kontrovers diskutiert, jedoch wurde eine Größe von 50 nm bis 100 nm postuliert (Kurzchalia and Parton, 1999; Simons and Toomre, 2000). Da diese Lipid-Mikrodomänen wie Flöße in der Phospholipidmembran schwimmen, werden sie auch als lipid rafts bezeichnet (Simons and Ikonen, 1997). Da Lipid-Mikrodomänen in nicht-ionischen Detergenzien wie Triton X-100 bei 4°C unlöslich sind und darin Glycolipid-angereicherte Komplexe ausbilden (Brown and London, 1997), werden sie auch detergent-resistent membranes (DRMs) genannt. Pike (2004) postulierte drei mögliche Modelle, welche die Struktur und die Eigenschaften von DRMs

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aufgrund von experimentell erhaltenen Daten beschreiben können. Das erste Modell beschreibt die DRMs mit einem zentralen, strukturierten Kernbereich, der von Zonen mit abnehmender Lipidordnung umgeben ist, d.h. der Anteil an Cholesterol und Sphingolipiden nimmt von innen nach außen ab. Mit unterschiedlichen Detergenzien können unterschiedliche Bereiche isoliert werden, welche sich in ihrer Protein- und Lipidzusammensetzung unterscheiden (Abb. 4).

Abb. 4: Mehrschichtige Mikrodomänen. Der mit Cholesterol und Sphingolipiden angereicherte Kernbereich ist von Schichten abnehmender Lipidordnung umgeben. Die verschiedenen Detergenzien lösen Bereiche mit unterschiedlichen Lipid- zusammensetzungen aus der Zellmembran.

Das zweite Modell beschreibt die DRMs als homogene, strukturierte Domänen, die von der ungeordneten Zellmembran umgeben sind. Unterschiedliche Detergenzien können aufgrund ihrer Selektivität unterschiedliche Bereiche der DRMs extrahieren bzw. unterschiedliche Lipide und/oder Proteine solubilisieren (Abb. 5).

Abb. 5: Homogene Mikrodomänen. Die geordneten und dicht gepackten Mikrodomänen sind von der ungeordneten Zellmembran umgeben. Die verschiedenen Detergenzien können unterschiedliche Bereiche der DRMs extrahieren.

6 EINLEITUNG

Das dritte Modell beschreibt die Co-Existenz von hetergenen DRMs. Die Mikrodomänen besitzen aufgrund der unterschiedlichen Lipid- und Proteinzusammensetzung verschiedene Affinitäten zu den eingesetzten Detergenzien (Abb. 6).

Abb. 6: Heterogene Mikrodomänen. Mikrodomänen mit verschiedenen Lipid- und Proteinzusammensetzungen co-existieren in der Zellmembran. Durch die verschiedenen Detergenzien können DRMs mit unterschiedlicher Lipid- und Proteinzusammensetzung isoliert werden.

Die Ergebnisse der Isolation von Mikrodomänen werden bevorzugt mit dem Modell der heterogenen DRMs beschrieben (Pike, 2004). Mischformen können dabei nicht ausgeschlossen werden, da DRMs mit unterschiedlicher Lipid- und Proteinzusammensetzung transient miteinander fusionieren können (Zajchowski and Robbins, 2002). Durch die Solubilisierung mit Triton X-100 und anschließender Aufreinigung der DRMs durch eine Dichtegradientenzentrifugation konnte gezeigt werden, dass bestimmte Membranproteine spezifisch in DRMs angereichert sind (Brown and Rose, 1992). Mikrodomänen können aufgrund ihrer speziellen Lipidzusammensetzung mit bestimmten Proteinen assoziiert vorliegen, während andere Proteine ausgeschlossen werden. Weiterhin werden Lipid-Mikrodomänen als Plattformen angesehen, die sich schon im Golgi-Apparat ausbilden und als Sortiereinheiten für Membranproteine gelten (Brown and London, 1998). Die Lipide verstärken die Effizienz bei Interaktionen zwischen Rezeptoren und deren Signaltransduktionspartnern (Anderson and Jacobson, 2002). Es wird vermutet, dass durch diesen Mechanismus nur ganz bestimmte Bereiche innerhalb einer Zelle von einem äußeren Signal aktiviert werden (Gomez-Mouton et al., 2004). Proteine, die eine derartige DRM-Affinität besitzen, sind Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerte Proteine, doppelt acylierte Proteine wie Src-Proteinkinasen oder α- Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine (Resh, 1999). Die DRMs in der Zellmembran besitzen entscheidende Funktionen bei Signaltransduktionsprozessen, indem sie eine

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Plattform für zahlreiche Rezeptoren bilden, die durch Ligandenbindung aktiviert werden. Dies sind u. a. die Fc εRI-, T-Zell-, B-Zell-, EGF-, Insulin- und EphrinB1-Rezeptoren (Brown and London, 1998; Simons and Toomre, 2000). Außerdem wurde gezeigt, dass die Autophosphorylierung des platelet-derived growth factor (PDGF)-Rezeptors und die Phosphorylierung des Tyrosins von zellulären Substraten besonders effizient in Mikrodomänen stattfindet (Liu et al., 1997). DRMs besitzen somit die Fähigkeit, die Aktivität von in ihnen lokalisierten Proteinen zu modulieren (Pike et al., 2002; Ringerike et al., 2002).

1.4 Caveolen - spezielle Mikrodomänen in der Zellmembran

Eine spezielle Form von DRMs sind die Caveolen. Sie wurden zum ersten Mal in den 50er Jahren beschrieben (Palade, 1955; Yamada, 1955). Ungefähr 40 Jahre nach ihrer ersten morphologischen Beschreibung wurde begonnen, die biochemische Beschaffenheit und die Struktur von Caveolen genauer zu untersuchen. Caveolen besitzen die spezifischen Eigenschaften von DRMs, was die Basis für die biochemische Identifikation, Reinigung und Charakterisierung der Caveolen bildet (Brown and Rose, 1992; Kurzchalia et al., 1992; Lisanti et al., 1994b). Die typische Form der Caveolen wird durch die hohe exoplasmatische Konzentration an Cholesterol (Bacia et al., 2005) sowie die Insertion von Caveolin-1 in die zytoplasmatische Hälfte der Membrandoppelschicht hervorgerufen. Da die Oberfläche relativ zur exoplasmatischen Membranhälfte vergrößert ist, kommt es zur Einstülpung der Membran. Die Stabilisierung der gekrümmten Membran durch Caveoline unterscheidet die Caveolen strukturell und funktionell von anderen Mikrodomänen (Brown and London, 1998; Simons and Toomre, 2000; Meder et al., 2006) (Abb. 7). So sind bestimmte Proteine in Caveolen oder in nicht-caveolaren Mikrodomänen lokalisiert (Schnitzer et al., 1995; Liu et al., 1997; Sprenger et al., 2004) (Abb. 7). Caveolen existieren in zwei Formen: als omega-förmige Invaginationen der Zellmembran und als Transportvesikel, die vom TGN stammen (Kurzchalia et al., 1992; Rothberg et al., 1992). Ihr Durchmesser beträgt zwischen 50 nm und 100 nm.

8 EINLEITUNG

Abb.7: Schematische Darstellung der Mikrodomänen (A) planare DRM und (B) Caveole in der Zellmembran (Razani et al ., 2002)

Die Caveolen sind an wichtigen dynamischen und regulatorischen Prozessen in der Zelle beteiligt, u. a. an verschiedenen zellulären Transportvorgängen (Endozytose, Transzytose, Potozytose (Anderson et al., 1992) und Pinozytose) und der intrazellulären Cholesterol- Homöostase (Smart et al., 1996). Zusätzlich gibt es Hinweise, dass die Caveolen in den apikalen Transport von Proteinen zur Zellmembran involviert sind (Zurzolo et al., 1994a; Lipardi et al., 1998). Dabei enthalten die mit den Caveolen interagierenden Proteine eine oder mehrere Myristoyl-, Palmitoyl- oder Prenylgruppen (Garcia-Cardena et al., 1996; Resh, 1999). Weiterhin spielen die Caveolen eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion. Durch die selektive Assoziation von verschiedenen Signalmolekülen oder Rezeptoren mit den Caveolen ist es möglich direkte Interaktionen durch das Zusammenführen verwandter Moleküle zu vermitteln oder Interaktionen zwischen funktionell nicht verwandten Botenstoffen zu verhindern (Kenworthy, 2002; Razani et al., 2002a). Die Zellmembran des alveolaren Epithels der Lunge besteht zu über 70% aus Caveolen (Gumbleton, 2001). Dieser hohe Anteil an Caveolen und folglich ihrer Strukturproteine, den Caveolinen, deutet auf eine wichtige Rolle in der Lungenphysiologie hin (Lisanti et al., 1994b; Razani et al., 2002a). Bis heute sind drei Mitglieder der Caveolin-Familie bekannt: Caveolin-1 (Cav-1), Caveolin-2 (Cav-2) und das muskelspezifische Caveolin-3 (Cav-3) (Tang et al., 1996). Cav-1 und Cav-2 wurden spezifisch in den AT I-Zellen des alveolaren Lungenepithels nachgewiesen (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001; Razani et al., 2002b). Aufgrund der ausgeprägten Lungenpathologie in Cav-1(-/-) und Cav-2(-/-) Mäusen wurden die Caveolen im Bereich der Physiologie und der pathologischen Anatomie Gegenstand intensiver Forschungen.

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1.5 Struktur und Funktion von Cav-1 und Cav-2

Cav-1 existiert in zwei Isoformen, α und β. Beide unterscheiden sich darin, dass Cav-1β die 31 N-terminalen Aminosäuren im Vergleich zu Cav-1α (AS 1-178) nicht aufweist. Die Isoformen entstehen durch differentielles Spleißen und unterschiedliche Translationsinitiation (Kogo and Fujimoto, 2000). Beide Cav-1 Isoformen bilden Caveolen aus (Li et al., 1996), wobei Cav-1α hauptsächlich in die Bildung von tief invaginierten Caveolen involviert ist, während Cav-1β vorwiegend zur Formation von flach eingestülpten Caveolen führt (Scherer et al., 1995; Fujimoto et al., 2000). Cav-1 besitzt drei strukturelle Domänen, die N- und C-terminale Domäne auf der zytosolischen Seite der Zellmembran und einen kurzen membranintegrierter Bereich (AS 102-134), der eine Haarnadel-ähnliche Struktur in der Zellmembran ausbildet (Glenney and Soppet, 1992; Dietzen et al., 1995) (Abb. 8).

Abb.8: Schematische Darstellung von Caveolin-1 (Cav-1). (a) Membrantopologie von Cav-1 dargestellt als Dimer; (b) strukturelle Unterteilung der Domänen von Cav-1 (Williams and Lisanti, 2004).

Da Cav-1 keine klassische N-terminale Signalsequenz besitzt, fungiert die hydrophobe Membrandomäne als Signalpeptid und bewirkt den co-translationalen Transport des Peptids durch die Membranen des endoplasmatischen Retikulums (Monier et al., 1995). Cav-1 lagert sich mit Hilfe der N–membrane attachment domain (MAD) und C-MAD an die Zellmembran an (Schlegel and Lisanti, 2000). Außerdem besitzt Cav-1 im C-terminalen

10 EINLEITUNG

Abschnitt drei palmitoylierte Cystein-Reste, welche die Stabilisierung von Cav-1 an der Zellmembran unterstützen. Im N-terminalen Bereich befindet sich die Oligomerisierungsdomäne, die für die Ausbildung der Caveolin-Oligomere verantwortlich ist. Die Cav-1-Oligomere besitzen molekulare Massen von 200 bis 400 kDa und setzen sich aus 14 bis 16 Caveolin-Monomeren zusammen (Scherer et al., 1997). Interaktionen von Cav-1 mit anderen Proteinen wird durch die so genannte scaffolding -Domäne (engl.: scaffold = Gerüst) vermittelt, die sich innerhalb der Oligomerisierungs-domäne befindet (Li et al., 1996; Okamoto et al., 1998). Cav-1 spielt eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion über die Caveolen, da es mit einer Vielzahl von Signalmolekülen interagiert und deren Aktivität regulieren kann (Razani et al., 2002a). Eines der am besten untersuchten Beispiele für die regulierende Eigenschaft von Cav-1 ist die Interaktion mit der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS). Während der Interaktion mit Cav-1, wobei sowohl der N- als auch der C-terminale Bereich von Cav-1 involviert sind, ist die eNOS inaktiv. Wird die Interaktion durch einen intrazellulären Anstieg von Ca 2+ und der folgenden Ausbildung des Ca 2+ /Calmodulin/eNOS- Komplexes zerstört, kommt es zur Aktivierung der eNOS und zur Synthese von Stickstoffmonoxid (Garcia-Cardena et al., 1996; Shaul et al., 1996; Garcia-Cardena et al.,

1997; Michel et al., 1997). Weiterhin ist bekannt, dass Cav-1 die Aktivierung des epidermal growth factor receptor (EGFR) und des platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) inhibiert (Liu et al., 1996; Mineo et al., 1996). Dadurch ist Cav-1 in die pro-proliferativen, mitogen-activated protein kinase (MAPK)-abhängigen und anti-apoptotischen, phosphoinositide 3– kinase (PI3K)-bedingten Signalwege involviert (Couet et al., 1997a; Engelman et al., 1998). Ebenso wird die Aktivität verschiedener Tyrosin- (z. B. Src) und Serin/Threonin-Kinasen (z. B. PKA und PKC α) sowie von Lipid-modifizierten G-Proteinen (z.B. Gα) blockiert (Sargiacomo et al., 1993; Lisanti et al., 1994b; Couet et al., 1997a; Engelman et al., 1998; Razani et al., 1999; Rybin et al., 1999). Aufgrund dieser inhibierenden Wirkung wurde Cav-1 die Funktion eines Tumorsuppressors zugeschrieben (Razani et al., 2002a).

Ein weiteres Mitglied der Caveolin-Familie ist Cav-2. Das Cav-2-Protein ist 162 AS lang und wurde bei der Mikrosequenzierung von Caveolin-reichen Membranen der Adipozyten identifizieren (Scherer et al., 1996). Cav-2 liegt co-lokalisiert mit Cav-1 in den Caveolen vor. Cav-1 und Cav-2 bilden Heterooligomere aus, was für die korrekte Membranlokalisierung von Cav-2 ausschlaggebend ist (Scherer et al., 1997; Parolini et al., 1999).

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Neben Cav-2α sind zusätzlich die Isoformen β und γ bekannt, wobei Cav-2β als alternative Spleißvariante gilt, die nicht mit Cav-1 in die Caveolen rekrutiert wird (Kogo et al., 2002). Zur funktionellen Bedeutung von Cav-2β und γ fehlen bislang genauere Untersuchungen und Daten.

1.6 Adenosintriphosphat in der Lunge

ATP gehört zu den bekanntesten organischen Molekülen und ist als Energieträger an der Steuerung zahlreicher intrazellulärer Prozesse beteiligt. Weiterhin kann ATP auch als extrazelluläres Signalmolekül auftreten. Heute gibt es zahlreiche Befunde, die eine Freisetzung von ATP auch aus nicht-neuronalen Zellen belegen, z.B. aus Astrozyten, aus Endothelzellen der Blutgefäße, aus Gliazellen und epithelialen Zellen (Cotrina et al., 1998a; Cotrina et al., 2000; Patel et al., 2005; Faigle et al., 2008). Neben der exozytotischen Freisetzung (Bodin and Burnstock, 2001b) werden Transporter-induzierte Freisetzungsmechanismen (Schwiebert et al., 1998; Bodin and Burnstock, 2001a) oder die Abgabe durch Connexin-Halbkanäle (Cotrina et al., 1998b) diskutiert. Die nachgewiesene Freisetzung von ATP aus den AT I-Zellen der Lunge beeinflusst u. a. die autokrine und/oder parakrine Regulation von spezifischen alveolar-epithelialen Funktionen. So wird z. B. die durch die AT II-Zellen vermittelte Sekretion des Surfactants durch ATP stimuliert (Patel et al., 2005). Zur Erhöhung des extrazellulären ATP-Gehaltes kommt es durch Veränderungen im Epithel in Folge von mechanischem und oxidativen Stress, Trauma, extrazellulärer Hypotonizität und Infektionen mit Pathogenen. Dabei übt das freigesetzte ATP vermutlich eine Schutzfunktion aus und verhindert u. a. den Ozon-vermittelten Zelltod. Daran sind Serin/Threonin- Proteinkinasen (PKB/Akt)- und/oder ex tracellular-signal regulated Kinasen (ERK)- Signalwege und deren metabolische Auswirkungen beteiligt (Ahmad et al., 2005; Ahmad et al., 2006). Extrazelluläre Nucleoside und Nucleotide bringen ihre Signalwirkung über membranständige purinerge Rezeptoren (P-Rezeptoren) zur Geltung. Die P-Rezeptoren werden weiter unterteilt in die P1-Rezeptoren, welche durch Adenosin aktivierbar sind, und die P2-Rezeptoren, die durch entsprechende Nukleosidtriphosphate und -diphosphate stimuliert werden.

12 EINLEITUNG

1.7 Aufbau und Funktion von P2X-Rezeptoren

Die P2-Rezeptoren werden in zwei molekular unterschiedliche Familien eingeordnet: 1. die P2X-Rezeptoren, welche Liganden-abhängige Kationenkanäle darstellen und 2. die P2Y- Rezeptoren, welche ihre Wirkung als metabotrope Rezeptoren über G-Proteine vermitteln (Ralevic and Burnstock, 1998; North, 2002). Bis heute sind sieben verschiedene P2X-Untereinheiten kloniert und pharmakologisch charakterisiert (Brake et al., 1994; Valera et al., 1994). Sie werden in Kurzform als P2X1-7R beschrieben. Die P2XR-Subtypen bestehen aus einem intrazellulär lokalisierten N- und C-terminalen Bereich, zwei Transmembrandomänen und einer extrazellulären Domäne mit ~285 Aminosäuren (Abb. 9). Die extrazelluläre Schleife ist N-glykosyliert und enthält zehn Cysteinreste, die intramolekulare Disulfidbindungen ausbilden. Die N-Glykosylierungen und die ausgebildeten Disulfidbrücken sind wichtig für die korrekte Proteinfaltung, den intrazellulären Transport und die Lokalisation der P2XR in der Zellmembran (Ennion and Evans, 2002b). Zusätzlich ist die ATP-Bindetasche in der extrazellulären Domäne lokalisiert (Hansen et al., 1997; North, 2002). Die genaue Struktur der Agonistenstelle ist jedoch bisher nicht identifiziert worden. Mutationsstudien ergaben, dass die nahe am Kanaleingang liegende ATP-Bindestelle positiv geladene Aminosäurereste enthält und die Aminosäure K309 (hP2X1R) vermutlich direkt mit den negativ geladenen Phosphatgruppen von ATP interagiert (Ennion et al., 2000; Roberts and Evans, 2004, 2007). Die intrazelluläre N-terminale Domäne enthält ein in der P2X-Familie konserviertes Bindemotiv für die Proteinkinase C (PKC). Bekannt ist, dass die PKC in die Desensibilisierung und Internalisierung der P2XR involviert ist (Boue-Grabot et al., 2000; Ennion and Evans, 2002a). Im C-terminalen Bereich konnte eine weitere konservierte Sequenz identifiziert werden. Das YXXXK -Motiv ( X = beliebige AS) ist verantwortlich für die Stabilisierung der P2XR in der Zellmembran und vermittelt möglicherweise die Interaktion mit zytoskeletalen Proteinen, welche die Desensibilisierung der P2XR regulieren (Parker, 1998; Chaumont et al., 2004) (Abb. 9).

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Abb. 9: Übersicht über den strukturellen und funktionellen Aufbau der P2XR. Die Abbildung basiert auf den Ergebnissen aus den Studien an P2X2R (Khakh and North, 2006).

Die Quartärstruktur der P2XR wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie ( atomic force microscopy , kurz AFM) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die P2XR-Kanäle aus drei Untereinheiten bestehen (Abb. 10) und die P2XR in der Lage sind, sowohl homotrimere (außer P2X6R) als auch heterotrimere Kanäle auszubilden (Barrera et al., 2005). Nachgewiesen wurden die Kombinationen P2X1/2R, P2X1/3R, P2X1/4R, P2X1/5R, P2X2/3R und P2X4/6R (Radford et al., 1997; Le et al., 1998; Nicke et al., 1998; Torres et al., 1998; Nicke et al., 2005). Alle P2XR-Kanäle können sich durch die Bindung von ATP innerhalb von Millisekunden öffnen (North, 2002). Sie sind durchlässig für Na +-, K +- sowie Ca 2+ -Ionen und dadurch besonders zur schnellen Signalübertragung und einer lokalen Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration befähigt (Schwiebert, 2000; Egan and Khakh, 2004). Eine wichtige Eigenschaft ist dabei, dass die Aktivität und die Selektivität der P2XR-Kanäle durch Signalmoleküle moduliert werden kann (Khakh et al., 1999).

14 EINLEITUNG

Abb. 10: Anordnung der Untereinheiten der drei wichtigsten ionotropen Rezeptorfamilien. Von links nach rechts: die ionotropen Glutamat(iGlu)-Rezeptoren, die nikotischen Acetylcholin(nACh)- Rezeptoren und die ATP-aktivierbaren purinergen Rezeptoren (P2XR). TM=Transmembrandomäne

An der Ionenleitung und der Ausbildung der Kanalpore sind beide Transmembrandomänen (TMs) der P2XR beteiligt. Die zweite Transmembrandomäne (TM2) steht dabei im direkten Kontakt mit dem Ionenstrom, während die TM1 peripher zur TM2 angeordnet ist (Abb. 10). Es wird vermutet, dass die TM1 Einfluss auf die Ionenselektivität der Kanalpore hat (Li et al., 2008).

1.8 Assoziation der P2XR mit Mikrodomänen und downstream-Effektoren

Bis vor einigen Jahren wurde die funktionelle Bedeutung der P2XR auf die verschiedenen Bereiche des vegetativen Nervensystems begrenzt. Jedoch zeigten weitere Studien, dass die P2XR ebenfalls wichtige zelluläre Prozesse in Endothel- und Epithelzellen regulieren (Glass et al., 2002; Schwiebert and Zsembery, 2003; Burnstock, 2007). Die Funktion der P2XR ist nicht auf die Kanalaktivität beschränkt, sondern kann komplex an verschiedene Signalwege gekoppelt sein (Kim et al., 2001a; Glass et al., 2002; Murrell-Lagnado and Qureshi, 2008). Da die mit Signalmolekülen angereichten DRMs die P2XR wahrscheinlich modulatorisch beeinflussen, könnte die Assoziation mit den DRMs wichtig für die Funktionalität der Rezeptoren sein (Garcia-Marcos et al., 2006c; Vial et al., 2006). Eine Lokalisation in Mikrodomänen wurde für P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis von Ratten und in Makrophagen (Garcia-Marcos et al., 2006b; Gonnord et al., 2009), für P2X3R in neuronalen Zellen (Vacca et al., 2004) und für P2X1R in glatten Muskelzellen (Vial and Evans, 2005) gezeigt. Die Interaktion mit den DRM-Strukturen der Zellmembran bringt die P2XR in räumliche Nähe zu einer Vielzahl an Signalmolekülen. Bekannt ist, dass P2X7R einige Signalmoleküle wie Phosphatidsäure (PA), Arachidonsäure (AA) und Diacylglycerol (DAG) durch die Modulation von unterschiedlichen Phospholipasen (PLC, PLA, PLD) beeinflussen kann. Bislang wurde nicht geklärt, ob der P2X7R mit diesen Lipiden und Enzymen direkt oder indirekt assoziiert ist. Die Lipid-vermittelten Signalwege werden in Zusammenhang mit der

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DRM-Lokalisation von P2X7R gebracht und als möglicher Link zwischen P2X7R und weiteren downstream -Signalwegen beschrieben (Garcia-Marcos et al., 2006c; Garcia-Marcos et al., 2006a).

Das Phosphoinositid PI(4,5)P 2 nimmt dabei eine zentrale Stellung ein (Toker, 2002).

PI(4,5)P 2 ist hauptsächlich in der Zellmembran lokalisiert und in DRM-Strukturen angereichert (Pike and Casey, 1996; Pike and Miller, 1998; Brown and London, 2000). Die

PLC-vermittelte Hydrolyse von PI(4,5)P 2 führt zur Bildung der sekundären Botenstoffe DAG und Inositol-3,4,5-triphosphat (IP3) (Berridge and Irvine, 1989; Berridge, 1993). IP 3 bindet an spezifische Rezeptoren des endoplasmatischen Retikulums und löst dadurch die Freisetzung von Ca 2+ aus den intrazellulären Speichern aus. Die Ca2+ -Ionen ihrerseits regulieren durch die Interaktion mit verschiedenen downstream -Effektoren, z.B. Calmodulin (CaM) und der Proteinkinase C (PKC), zahlreiche zelluläre Vorgänge (Clapham, 1995). CaM ist ein ubiquitär vorkommender Ca 2+ -Sensor, welcher u. a. über die Bindung an verschiedene Ionenkanäle deren Aktivität reguliert und dadurch das Ionengleichgewicht der Zelle aufrecht erhalten kann (Maylie et al., 2004; Derler et al., 2006). Der zweite Botenstoff DAG führt zusammen mit Ca 2+ zu einer Aktivierung von Isoformen der PKC. Die PKCs gehören zu den Serin/Threonin-spezifischen Kinasen, die durch die Übertragung von Phosphatresten auf Serin- oder Threoningruppen die Aktivität nachgeordneter Enzyme und Proteine steuern (Yang and Kazanietz, 2003). Auch die Funktionalität der P2XR wird durch die PKCs beeinflusst (Boue-Grabot, Archambault and Seguela 2000, Ennion and Evans 2002b). Die Familie der PKCs umfasst 12 bekannte Isoformen, die anhand ihrer Primärstruktur und biochemischen Eigenschaften in drei Klassen eingeteilt werden: classic PKC (cPKC), novel PKC (nPKC) und atypical PKC (aPKC) (Newton, 1997; Dempsey et al., 2007). Zu den cPKCs zählen die Isoformen PKC α, PKC βI, PKC βII und PKC γ, welche durch die Signalmoleküle Ca 2+ und DAG aktiviert werden. Neben den klassischen Aktivatoren konnte die Aktivierung der PKCs durch Fettsäuren und die Lipidmediatoren PA, PI(4,5)P 2 and

PI(3,4,5)P 3 gezeigt werden (Kochs et al., 1993; Stasek et al., 1993; Yang and Kazanietz, 2003). In der Lunge ist die Familie der PKCs für viele wichtige zelluläre Funktionen von großer Bedeutung, wie für die Steuerung der Permeabilität, der Proliferation, der Apoptose und der Zytokinsekretion (Yang and Kazanietz, 2003; Dempsey et al., 2007). Zusätzlich werden sie mit der Vermittlung der Zellantwort auf extrazelluläre Stimuli, dem Membrantransport sowie

16 EINLEITUNG der Organisation des Zytoskeletts und der extrazellulären Matrix in Zusammenhang gebracht (Carter, 2000).

1.9 Verteilung der P2XR in der Lunge

Aktuelle Studien zeigen, dass die P2XR in Endothel- und Epithelzellen exprimiert werden und dort spezifische Funktionen ausüben (Schwiebert et al., 2002; Schwiebert and Zsembery, 2003). Die P2XR sind in den verschiedenen Gewebetypen der Lunge subtyp-spezifisch verteilt. In den mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge von Maus, Ratte und Mensch wurden P2X1R, P2X2R, P2X4R, P2X5R und P2X7R nachgewiesen (Ahmad et al., 2006). Im humanen Bronchialepithel werden P2RX4 , P2RX5 und P2RX6 exprimiert, wobei die Verteilung in den verschiedenen Zelltypen nicht geklärt ist (Taylor et al., 1999; Liang et al., 2005). Die alveolaren Makrophagen der Ratte und die zilientragenden Zellen des respiratorischen Epithels von Kaninchen weisen P2X4R und P2X7R auf (Smith et al., 2001; Bowler et al., 2003; Ma et al., 2006). Weiterhin konnte in den neuro-epithelialen Körperchen der Lunge von Hamstern P2X1R und P2X2R nachgewiesen werden (Fu et al., 2004). Die Untersuchungen des alveolaren Epithels ergaben, dass in den AT I-Zellen von murinen Lungen P2rx4 und P2rx7 exprimiert werden (Qiao et al., 2003; Chen et al., 2004; Barth et al., 2007; Barth et al., 2008). Dagegen wurden in AT II-Zellen keine P2XR nachgewiesen. Aufgrund der spezifischen Expression in den alveolaren Epithelzellen werden P2X4R und P2X7R als Markerproteine der AT I-Zellen eingesetzt. Obwohl P2X4R und P2X7R zu einer Rezeptor-Familie gehören, existieren einige strukturelle und funktionelle Unterschiede. P2X4R besteht aus 388 AS und ist somit das kürzeste Mitglied der P2XR-Familie. Nach der post-translationalen N-Glykosylierung weist P2X4R im Lungengewebe ein molekulares Gewicht von ~62 kDa auf (Sim et al., 2006; Barth et al., 2008). P2X4R lässt sich mit anderen P2XR-Subtypen co-immunopräzipieren und kann in der Zellmembran sowohl als funktioneller homotrimerer als auch als heterotrimerer Kanal vorliegen (Le et al., 1998; Nicke et al., 2005). Bisherige Studien zeigten, dass P2X4R an der Ca 2+ -abhängigen Stimulation von Cl --Kanälen in den Epithelien der Lunge beteiligt ist (Taylor et al., 1999; Zsembery et al., 2003). Ungeklärt ist, ob der durch P2X4R vermittelte Ca 2+ -Einstrom die Ca 2+ -sensitiven Cl --Kanäle direkt oder indirekt durch die Aktivierung von Ca 2+ -abhängigen Proteinkinasen (PKC α) stimuliert (Taylor et al., 1999). Weitere funktionelle Eigenschaften von P2X4R im Lungenepithel sind bisher nicht bekannt.

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Im Gegensatz zum P2X4R ist der P2X7R-Subtyp mit 595 AS das längste Mitglied der P2XR-Familie. Er besitzt ein deutlich längeres carboxy-terminales Ende mit einer dritten hydrophoben Domäne, welche eine große, unselektive Kanalpore ausbilden kann (North, 2002). Auch P2X7R wird post-translational modifiziert und ist mit einem Molekulargewicht von ~80 kDa im Lungengewebe nachweisbar (Sim et al., 2004; Barth et al., 2007). 1999 wurde postuliert, dass P2X7R nicht mit anderen P2XR interagiert und nur als Homotrimer in der Zellmembran existieren (Torres et al., 1999). In den letzten Jahren zeigte sich jedoch, dass P2X4R und P2X7R in einigen Zelltypen nicht nur partiell co-lokalisiert in Membranen vorliegen, sondern auch miteinander assoziiert auftreten (Dubyak, 2007; Guo et al., 2007; Nicke, 2008; Boumechache et al., 2009; Casas-Pruneda et al., 2009). In den zilientragenden Epithelzellen der Lunge werden P2X4R und P2X7R co-exprimiert und eine heteromere Verbindung der beiden P2XR wird vermutet (Ma et al., 2006). Weitere Daten über P2X7R im Lungenepithel, speziell den AT I-Zellen, wurden bisher nicht publiziert. Generell sind für P2X7R eine Reihe von Interaktionen mit anderen Proteinen sowie second messenger -abhängigen Signalwegen beschrieben worden, welche für andere P2X-Rezeptoren bislang nicht bekannt sind (Ralevic and Burnstock, 1998; North, 2002). Zum Beispiel weisen P2X7R-vermittelte Effekte auf die Beteiligung bei Il-1β-assoziierten Entzündungsvorgängen hin (Ferrari et al., 1997; Solini et al., 1999; Di Virgilio and Solini, 2002; Pelegrin and Surprenant, 2006).

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1.10 Zielsetzungen

Gegenstand dieser Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R des Alveolarepithels der Lunge. Nach einem Modell von Garcia-Marcos et al. (2006c) ist P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R hängen dabei von der Lokalisation in der Zellmembran ab. Beide P2XR werden in den AT I-Zellen exprimiert und sowohl P2X4R als auch P2X7R weisen potentielle Cav-1-Bindemotive auf, die unsere Arbeitsgruppe bei einer Sequenzanalyse identifizieren konnte (Couet et al., 1997b). Die mögliche Assoziation mit den Caveolen würde die Rezeptoren in die räumliche Nähe einer Vielzahl von Signalmolekülen bringen und die Beteiligung an Signaltransduktionswegen ermöglichen. Für die folgenden Untersuchungen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, deren Zellen AT I-typische Zelleigenschaften besitzen (Kathuria et al., 2004). Das Ziel dieser Arbeit ist möglichst detailliert die Verteilung und Assoziation der P2XR mit den Mikrodomänen, speziell den Caveolen, mittels biochemischer und fluoreszenz- mikroskopischer Untersuchungen aufzuklären. Da die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen in Zusammenhang mit der DRM-Lokalisation gebracht wird (Zurzolo et al., 2003), soll die molekulare Organisation von P2X4R und P2X7R in den Membranen mittels blue native - und high resolution clear native - PAGE untersucht werden. Anschließend werden die möglichen Assoziationen zwischen P2X7R, P2X4R und Cav-1 durch Immunpräzipitationen verifiziert. Die P2XR sind Subtyp-spezifisch im Lungengewebe verteilt, was vermuten lässt, dass die P2XR charakteristische Funktionen in den verschiedenen Geweben besitzen. Die Reduzierung von P2X4R und P2X7R durch siRNA-vermittelten knockdown der spezifischen mRNAs in den E10-Zellen soll zeigen, ob die beiden P2XR regulatorisch miteinander verbunden sind. Darüber hinaus soll die Auswirkung auf die molekulare Organisation der P2XR untersucht werden. Die Mikrodomänen der Zellmembran sind u. a. mit Phospholipiden angereichert, welche wiederum mit verschiedenen downstream -Effektoren verbunden sind. Mittels eines in vitro Bindetests soll geprüft werden, ob die C-terminalen Domänen von P2X4R und P2X7R mit spezifischen Membranlipiden direkt interagieren können. Zusätzlich soll untersucht werden, wie die Reduzierung des Proteingehaltes der P2XR die Signalmoleküle PKC βI und CaM beeinflusst.

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2 M ATERIAL UND METHODEN

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien und Fertiglösungen Chemikalien und Fertiglösungen Hersteller

AEBSF Merck KGaA, Darmstadt Aceton Merck KGaA, Darmstadt Acrylamid (30%) /Bisacrylamid (0,8%) Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Agarose (Elektrophorese) Serva, Electrophoresis GmbH, Heidelberg Albumin Standard Pierce, Rockford, USA Ameisensäure Merck KGaA, Darmstadt Amidoschwarz Merck KGaA, Darmstadt 6-Aminocapronsäure Applichem GmbH, Darmstadt Ammoniumperoxodisulfat Merck KGaA, Darmstadt Ampicillin-Natriumsalz Applichem GmbH, Darmstadt Bacto trypton Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Bacto yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Betainhydrochlorid Applichem GmbH, Darmstadt Brij35 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Bromphenolblau Serva, Electrophoresis GmbH, Heidelberg Bovines Serum-Albumin Serva, Electrophoresis GmbH, Heidelberg Calciumchlorid-Dihydrat Merck KGaA, Darmstadt Chloroform Merck KGaA, Darmstadt Complete Mini Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Coomassie Brilliantblau G250 Merck KGaA, Darmstadt Deoxycholat Natriumsalz Merck KGaA, Darmstadt 1,4-Diazabizyklo-[2.2.2]-oktan Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Digitonin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim 1,4-Dithiothreitol Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe n-Dodecyl-β-D-maltosid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

DPBS (steril filtriert) PAN TM Biotech GmbH, Aidenbach EDTA Merck KGaA, Darmstadt EGTA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Essigsäure Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe

20 MATERIAL UND METHODEN

Chemikalien und Fertiglösungen Hersteller Ethanol Merck KGaA, Darmstadt Ethidiumbromid Applichem GmbH, Darmstadt Ethylacetat Merck KGaA, Darmstadt Glucose Merck KGaA, Darmstadt Glycerin Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Glycin Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Imidazol (BioUltra) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München iso-Hexan Merck KGaA, Darmstadt Kaliumacetat Merck KGaA, Darmstadt Kaliumchlorid Merck KGaA, Darmstadt Kanamycinsulfat Applichem GmbH, Darmstadt LB-Broth , Miller Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München LB-Agar, Luria/Miller Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Magermilchpulver Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Magnesiumacetat Merck KGaA, Darmstadt Magnesiumchlorid Merck KGaA, Darmstadt Methanol Merck KGaA, Darmstadt Mes Hydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Methyl-β-cyclodextrin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Natriumchlorid Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Nonidet P-40 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Paraformaldehyd Merck KGaA, Darmstadt PMSF Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 2-Propanol Merck KGaA, Darmstadt Poly-L-Lysin Biochrom AG, Berlin Ponceau S-Lösung Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Rotiphorese® 10x SDS-PAGE Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe D(+)- Saccharose Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe SDS-Lösung (10%) Applichem GmbH, Darmstadt D-Sorbitol Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe TCEP Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim TEMED Bio-Rad Laboratories GmbH, München Tricin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

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Chemikalien und Fertiglösungen Hersteller Triethylamin Merck KGaA, Darmstadt Tris (ultra Qualität) Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Tris-HCl Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe Triton X-100 Serva, Heidelberg Trypsin Merck KGaA, Darmstadt Tween 20 Applichem GmbH, Darmstadt

2.1.2 Verbrauchsmaterialien Material Hersteller

Immobilon -P PVDF- Membran Millipore GmbH, Schwalbach Cellulose-Acetat Membran für Elektrophoresen Sartorius, Göttingen Gel Blotting Papier Schleicher & Schuell GmbH, Dassel Gene Pulser Küvette Bio-Rad Laboratories GmbH, München Küvetten (Polystyrol) Sarstedt AG & Co., Nümbrecht Mikrotiterplatten TPP Techno Plastic Products AG,Schweiz MF-Millipore ® Membranfilter ø 0,025 µm Millipore GmbH, Schwalbach Cellstar ® Well-Platten Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen Zellkulturschale (145 x 20 mm) Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen Cellstar ® Zellkulturflaschen Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen Cellstar ® Pipetten (25ml, 10ml, 5ml) Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen Cellstar ® Tubes (50ml, 15ml) Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen Deckgläser (Menzel; ø 12 mm) Thermo Fisher Scientific Germany Ltd. & Co. KG, Bonn Objektträger (Menzel; 76 x 26 mm) Thermo Fisher Scientific Germany Ltd. & Co. KG, Bonn

2.1.3 Kit und ready-to-use Systeme

BCA TM Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA Dynabeads ® Protein G Invitrogen Dynal, Oslo, Norwegen Dynabeads ® M-280 Streptavidin Invitrogen Dynal, Oslo, Norwegen

22 MATERIAL UND METHODEN

® FuGENE HD Transfection Reagent Roche Applied Science, Indianapolis, USA EZ-Link ® Sulfo-NHS-Biotin Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA Glutathione Sepharose TM 4B GE Healthcare, Uppsala, Schweden TM GST-PI(4,5)P 2 Grip Protein Echelon Biosciences, Inc., Salt Lake City, UT, USA Immobilon TM Western Chemiluminescent HRP Millipore GmbH, Schwalbach Substrate JetQuick Gel Extraction Spin Kit/250 Genomed GmbH, Löhne JetQuick Plasmid Miniprep Spin Kit Genomed GmbH, Löhne JetStar2.0 Plasmid Purification Maxi Kit/20 Genomed GmbH, Löhne Membrane Lipid Strips Echelon Biosciences, Inc., Salt Lake City, UT, USA NativePAGE TM 3-12 % Bis-Tris-Gel Invitrogen GmbH, Karlsruhe PD-10 Columns Sephadex TM G-25M GE Healthcare, Uppsala, Schweden

® ProteoExtract Native Membrane Protein Merck KGaA, Darmstadt Extraction Kit ReadyPrep TM ProteinExtraction Kit (Signal) Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA RETROtek HIV-1 p24 Antigen ELISA ZeptoMetrix Corp., Buffalo, NY, USA RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Total RNA Isolation Kit-Nucleo Spin Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren

2.1.4 Puffer und Lösungen Alle angegebenen Konzentrationen sind Endkonzentrationen. Soweit nicht anders beschrieben, wurden die Reagenzien in ddH 2O gelöst und die Puffer/ Lösungen bei Raumtemperatur gelagert.

Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE 10% Ammoniumperoxodisulfat (APS): 10% (w/v) APS
aliquotiert und bei -20°C gelagert

23

6x SDS-Probenpuffer: 300 mM Tris-HCl, pH 6,8 10% (w/v) SDS 30% (v/v) Glycerol 0,6% (w/v) Bromphenolblau 100 mM DTT (frisch zugegeben)

1x Trenngelpuffer: 1,5 M Tris, pH 8,8
mit HCl auf pH 8,8 eingestellt

1x Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris, pH 6,8
mit HCl auf pH 6,8 eingestellt

1x SDS-PAGE-Puffer: 25 mM Tris 192 mM Glycin 0,1% (w/v) SDS
pH 8,3 (nicht eingestellt)

Puffer für Western Blot und die Immundetektion 1x Transferpuffer: 25 mM Tris 192 mM Glycin 20% (v/v) Methanol
pH 8,3 (nicht eingestellt)

1x TBS: 16,5 mM Tris 137 mM NaCl 2,7 mM KCl
mit HCl auf pH 7,4 eingestellt

24 MATERIAL UND METHODEN

1x TBS-T: 1x TBS + 0,2% (v/v) Tween 20

Blockierungslösung: 1x TBS + 5% (w/v) Magermilchpulver
frisch hergestellt und bei 4°C gelagert

Antikörperinkubationslösung:
Blockierungslösung + 0,05% (v/v) Tween 20

Lösungen für die Coomassie Brilliantblau-Färbung Coomassie-Färbelösung: 0,25% (w/v) Coomassie Brilliantblau G250 50% (v/v) Methanol 10% (v/v) Essigsäure

Entfärbelösung: 25% (v/v) Methanol 7% (v/v) Essigsäure

Puffer und Lösungen für die Proteinbestimmung mit Amidoschwarz Färbelösung: 0,5% (w/v) Amidoschwarz 45% (v/v) Methanol

45% (v/v) ddH 2O 10% (v/v) Essigsäure
Lösung dunkel und bei 4°C gelagert

Entfärbelösung: 47,5% (v/v) Methanol

47,5% (v/v) ddH 2O 5% (v/v) Essigsäure
Lösung immer frisch hergestellt

25

Auflöselösung: 80% (v/v) Ameisensäure 10% (v/v) Essigsäure 5% (w/v) Trichloressigsäure
Lösung dunkel und bei 4°C gelagert

Probenpuffer: 0,187 M Tris, pH 6,9 10 mM DTT 30% (v/v) Glycerin 6% (w/v) SDS 8% (w/v) Bromphenolblau
Puffer aliquotiert und bei -20°C gelagert

Puffer und Lösungen für die Immunfluoreszenzanalyse Eindeckflüssigkeit: 2,5% (w/v) DABCO
in PBS/Glycerin (1:10)

1x TBS: 16,5 mM Tris 137 mM NaCl 2,7 mM KCl
mit HCl auf pH 7,4 eingestellt

Paraformaldehyd (PFA)-Fixierlösung 4% (w/v) PFA
in 1x TBS suspendiert, auf 60°C erwärmt und mit HCl auf pH 7,0 eingestellt, immer frisch hergestellt

26 MATERIAL UND METHODEN

Puffer für biochemische Untersuchungen 1x MBS-Puffer: 25 mM Mes 150 mM NaCl
mit NaOH auf pH 6,5 eingestellt

Extraktionspuffer (Gewebeproben) 20 mM Tris, pH 8,5 125 mM NaCl 1% (v/v) Triton X-100
Puffer aliquotiert und bei -20°C gelagert, Proteaseinhibitor-Cocktail frisch zugegeben

Puffer für Co-Immunpräzipitation Lysispuffer: 50 mM Tris, pH 7,5 150 mM NaCl 1% (v/v) oder (w/v) NP-40 oder Digitonin 100 mM PMSF
Proteaseinhibitor-Cocktail frisch zugegeben

Puffer für BN-PAGE und hrCN-PAGE-3 Lysispuffer: 50 mM NaCl 5 mM 6-Aminocapronsäure 50 mM Imidazol, pH 7,0

3x Gelpuffer: 1,5 M 6-Aminocapronsäure 75 mM Imidazol, pH 7,0

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Kathodenpuffer A: 50 mM Tricin 7,5 mM Imidazol 0,02% (w/v) Coomassie Brilliantblau G250
pH 7,0 (nicht eingestellt)

Kathodenpuffer B: 50 mM Tricin 7,5 mM Imidazol 0,002% (w/v) Coomassie Brilliantblau G250
pH 7,0 (nicht eingestellt)

Kathodenpuffer hrCN-PAGE-3: 50 mM Tricin 7,5 mM Imidazol 0,01% (w/v) n-Dodecyl-β-D-maltosid 0,05% (w/v) Natrium-Deoxycholat
pH 7,0 (nicht eingestellt)

Anodenpuffer: 25 mM Imidazol
mit HCl auf pH 7,0 eingestellt

Probenpuffer: 0,1% (w/v) Ponceau S

Equilibrierungspuffer: 5 mM TCEP 1 mM AEBSF 1% (w/v) SDS

28 MATERIAL UND METHODEN

Puffer und Lösungen für die Aufarbeitung von GST-gebundenen Konstrukten Bindepuffer (1x PBS): 140 mM NaCl 2,7 mM KCl

10 mM Na 2HPO 4

1,8 mM KH 2PO 4
pH 7,3 (nicht eingestellt)

Resuspensionspuffer: Bindepuffer mit 1% (v/v) Triton X-100 10 µM Lysozym
Proteaseinhibitor-Cocktail frisch zugegeben

Elutionspuffer: 50 mM Tris, pH 8,0 10 mM reduziertes Glutathion
aliquotiert und bei -20°C gelagert

Induktionslösung: 0,1 mM IPTG
aliquotiert und bei -20°C gelagert

Lösung für in vitro Membranlipid-Bindeassay Blockierungslösung: 1x TBS + 3% (w/v) BSA
frisch hergestellt und bei 4°C gelagert.

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Puffer für die Aufarbeitung biotinylierter Oberflächenproteine RIPA-Puffer: 25 mM Tris-HCl, pH 7,6 150 mM NaCl 1% (v/v) NP-40 1% (w/v) Natrium-Deoxycholat 0,1% (w/v) SDS

High salt -Puffer: 50 mM Tris, pH 7,5 500 mM NaCl 5 mM EDTA 0,1% (v/v) NP-40
mit HCl auf pH 7,5 eingestellt

Low salt -Puffer: 50 mM Tris, pH 7,5
mit HCl auf pH 7,5 eingestellt

1 x PBS mit Ca 2+ und Mg 2+ : 137 mM NaCl 2,7 mM KCl

6,5 mM Na 2HPO 4 · 2 H 2O

1,5 mM KH 2PO 4

0,1 mM CaCl 2 · 2 H 2O

1,0 mM MgCl 2 · 2 H 2O
pH 7,3 (nicht eingestellt)

Stopp-Lösung: 100 mM Glycin
in 1x PBS mit Ca 2+ und Mg 2+ gelöst, frisch hergestellt

30 MATERIAL UND METHODEN

2.1.5 Größenstandards

GeneRuler 100 bp DNA Ladder Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

MagicMark  XP Western Standard Invitrogen GmbH, Karlsruhe PageRuler  Prestained Protein Ladder Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

NativeMark™ Unstained Protein Standard Invitrogen Corp., Carlsbad, CA HMW Native Protein Marker Kit GE Healthcare, Uppsala, Schweden

2.1.6 Antikörper Die Antikörper wurden nach Angaben der Hersteller gelöst und wie angegeben mit Antikörperinkubationslösung verdünnt.

Primäre Antikörper monoklonale Antikörper (SDS-PAGE) Hersteller Verdünnung

Mouse anti-Caveolin-1 (Clone 2297) BD Transduction 1:500 Mouse anti-Caveolin-2 (Clone 65) BD Transduction 1:500 Mouse anti-γ-Tubulin (Clone GTU-88) Sigma-Aldrich 1:2000 Mouse anti-Transferrin-Rezeptor (TfR) Zymed-Invitrogen 1:700 (Clone H68.4) Mouse anti-PDI (Clone 1d3) Assay Design/ StressGen 1:750 Rabbit anti-Calmodulin (CaM, C-term) Epitomics, Inc. 1:1000 Syrian Hamster anti-Podoplanin (T1 α) (Clone Santa Cruz Biotech., Inc. 1:1000 8.1.1) Rabbit anti-GAPDH (14C10) Cell Signaling Tech., Inc. 1:2500 polyklonale Antikörper (SDS-PAGE) Hersteller Verdünnung

Rabbit anti-β-cop Oncogene Science 1:1000

Rabbit anti-P2X4 Purinergic Receptor Sigma-Aldrich 1:500

Rabbit anti-P2X7 Purinergic Receptor Alomone Laboratories 1:500 Rabbit anti-PKC βI (C-16) Santa Cruz Biotech., Inc. 1:500

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monoklonale Antikörper (native PAGE) Hersteller Verdünnung

Mouse anti-Caveolin-1 (Clone 2297) BD Transduction 1:250 Mouse anti-Caveolin-2 (Clone 65) BD Transduction 1:250 polyklonale Antikörper (native PAGE) Hersteller Verdünnung

Rabbit anti-P2X4 Purinergic Receptor Sigma-Aldrich 1:1000 Rabbit anti-P2X7 Purinergic Receptor Alomone Laboratories 1:1000 polyklonale Antikörper (Lipid-Bindeassay) Hersteller Verdünnung

Goat anti-GST Amersham Bioscience 1:1000

Die folgenden Antikörper wurden in 1x TBS + 1% BSA verdünnt. monoklonale Antikörper (Immunfluoreszenz) Hersteller Verdünnung

Mouse anti-Caveolin-1 (Clone 2297) BD Transduction 1:25 Mouse anti-Caveolin-2 (Clone 65) BD Transduction 1:20 polyklonale Antikörper (Immunfluoreszenz) Hersteller Verdünnung

Goat anti-Caveolin-1 Abcam PLC 1:50 Rabbit anti-P2X4 Purinergic Receptor Sigma-Aldrich 1:25

Rabbit anti-P2X7 Purinergic Receptor Alomone Laboratories 1:25 monoklonale Antikörper (FRET-Analysen) Hersteller Verdünnung

Mouse anti-Caveolin-1 (Clone 2297) BD Transduction 1:20 Mouse anti-Caveolin-2 (Clone 65) BD Transduction 1:10

polyklonale Antikörper (FRET-Analysen) Hersteller Verdünnung

Goat anti-Caveolin-1 Abcam PLC 1:50 Rabbit anti-P2X7 Purinergic Receptor Alomone Laboratories 1:20

32 MATERIAL UND METHODEN

Sekundäre Antikörper Die folgenden sekundären Antikörper waren mit Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt.

Antikörper (SDS- und native PAGE) Hersteller Verdünnung

Sheep anti-Mouse IgG Amersham Bioscience 1:2000 Goat anti-Rabbit IgG Bio-Rad Laboratories 1:4000 Rabbit anti-Goat IgG Dianova GmbH 1:10000 Rabbit anti-Hamster IgG Dianova GmbH 1:10000

Antikörper (Lipid-Bindeassay) Hersteller Verdünnung

Rabbit anti-Goat IgG Dianova GmbH 1:15000

Die folgenden sekundären Antikörper waren mit Fluorophoren gekoppelt. Antikörper (Immunfluoreszenz) Hersteller Verdünnung

Goat anti-Mouse IgG, FITC-gekoppelt Dianova GmbH 1:100 Donkey anti-Goat IgG, FITC-gekoppelt Dianova GmbH 1:100

Donkey anti-Mouse F(ab´) 2 Fragment IgG, Dianova GmbH 1:150 Cy3-gekoppelt

Goat anti-Rabbit F(ab´) 2 Fragment IgG, Dianova GmbH 1:150 Cy3-gekoppelt

Antikörper (FRET-Analysen) Hersteller Verdünnung

Donkey anti-Mouse F(ab´) 2 Fragment IgG, Dianova GmbH 1:100 Cy5-gekoppelt

Donkey anti-Mouse F(ab´) 2 Fragment IgG, Dianova GmbH 1:100 Cy3-gekoppelt Donkey anti-Goat IgG, Cy3-gekoppelt Dianova GmbH 1:100

Donkey anti-Rabbit F(ab´) 2 Fragment IgG, Dianova GmbH 1:100 Cy5-gekoppelt

33

2.1.7 Verwendete Zelllinien und transgene Tiere

E10 Die E10-Zelllinie ist eine nicht-tumorale, spontan immortalisierte Alveolarepithel Typ I- Zelllinie, die kontaktabhängige Wachstumsinhibierung zeigt (Malkinson et al., 1997). Die E10-Zellen wurden ursprünglich aus normalem BALB/c-Lungengewebe gewonnen (Bentel et al., 1989) und exprimieren die AT I-Zellmarker T1 α, Cav-1 sowie Aquaporin-5. Weiterhin sind in den E10-Zellen keine Surfactant-Proteine nachweisbar (Kathuria et al., 2004).

HEK293 Die Zelllinie HEK293 wurde 1977 etabliert. In menschliche embryonale Nierenzellen ( human embryonic kidney , kurz HEK) wurden mittels Scherkraft fragmentierte DNA-Stücke des Adenovirus Typ 5 transformiert. Die 293-Zellinie ist damit permissiv für die Infektion mit Adenovirus Typ 5 und anderen humanpathogenen Adenoviren. HEK293 sind hypotriploide Epithelzellen, welche adhärent wachsen. Da die Transfektion der menschlichen embryonalen Nierenzellen nicht mit rekominanter DNA durchgeführt wurde, handelt es sich bei HEK293- Zellen gemäß § 3 GenTG nicht um GVO (Graham et al., 1977; Harrison et al., 1977).

HEK293T 293T-Zellen exprimieren zusätzlich das temperatursensitive SV40 T-Antigen, welches die DNA-Replikation von episomalen Plasmiden mit dem SV40 origin of replication ermöglicht. Somit lassen sich Retroviren, zu denen die Lentiviren gehören, in 293T-Zellen vermehren (Lu and Menon, 1996) .

208F Bei der nicht transformierten 208F-Zelllinie handelt es sich um immortalisierte, nicht-maligne Rattenfibroblasten. Sie zeichnet sich in Kultur durch ausgeprägte Kontaktinhibition, eine niedrige spontane Transformationsrate, sowie ein sehr stabiles Wachstumsverhalten aus (Quade, 1979).

34 MATERIAL UND METHODEN

P4 HeLa.CD4.LTR-β-gal Die verwendete Indikator-Zelllinie exprimiert den CD4 +-Rezeptor und kann deshalb durch HIV-1 infiziert werden. Dabei wird bedingt durch die HIV-Infektion das trans-activator of transcription (Tat)-Protein gebildet, welches das integrierte lac Z Gen aktiviert. Das lac Z Gen steht dabei unter transkriptioneller Kontrolle des HIV-long terminal repeat (LTR)-Promotors (Kimpton and Emerman, 1992; Charneau et al., 1994). Durch das gebildete Enzym β- Galactosidase (LacZ) können HIV-infizierte Zellen mit 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D- galactopyranosid ( X-Gal) identifiziert werden.

P2rx7 (-/-) Mäuse Die Generierung der transgenen Mäuse wurde 2001 beschrieben (Solle et al., 2001). Die von Pfizer erzeugten P2rx7 (-/-) Mäuse wurden 2002 genotypisiert (Le Feuvre et al., 2002). Für die Deletion des C-terminalen Abschnittes (Nukleotide 1527-1607) wurde ein Target-Vektor mit Neomycin-Resistenzgen und murinen Phosphoglycerolkinase-Promotor genutzt. Das Konstrukt wurde in E14TG2a-Stammzellen eingebracht, welche aus 129P2/OlaHsd-Mäusen isoliert wurden. Positive Zellen wurden in C57BL/6 Blastozyten injiziert und die erhaltenen chimären Mäuse mit C57BL/6 Mäusen zurück gekreuzt.

Abb. 11: Schematische Darstellung des von Pfizer hergestellten P2rx7 (-/-)-Konstruktes TM = Transmembrandomäne, Neo = Neomycinkassette, 1527-1607 = deletierte Nukleotide (Sim et al., 2004)

2.1.8 Lösungen und Medien für die Zellkultur GIBCO ® DMEM/ HAM´s F12 (1:1) Invitrogen GmbH, Karlsruhe GIBCO ® DMEM mit GlutaMax TM Invitrogen GmbH, Karlsruhe GIBCO ® DMEM Invitrogen GmbH, Karlsruhe GIBCO ® EMEM Invitrogen GmbH, Karlsruhe

DMEM (1,5 g/l NaHCO 3) PAN Biotech GmbH, Aidenbach

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DPBS (steril filtiert) PAN Biotech GmbH, Aidenbach FKS (Fetales Kälberserum) Biochrom AG, Berlin L-Glutamin Biochrom AG, Berlin Natriumpyruvat (100 mM) Biochrom AG, Berlin G418 (Geneticin) Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Zellkulturmedien Soweit nicht anders angegeben, wurden die Medien bei 4°C gelagert.

Komplettmedien (steril): E10 DMEM/HAM´s F12 (1:1) 2,5 mM L-Glutamin 10% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert)

TM HEK293/ 293T DMEM mit GlutaMax für 7,5% CO 2 10% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert)

HEK293/ 293T DMEM (1,5 g/l NaHCO 3) für 5% CO 2 2,5 mM L-Glutamin 1 mM Natriumpyruvat 10% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert)

208F EMEM 2,5 mM L-Glutamin 5% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert)

P4 HeLa.CD4.LTR-β-gal DMEM 2,5 mM L-Glutamin 10% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert) 1 µM G418 (Geneticin)

Trypsin/EDTA-Lösung (steril): 0,05% (w/v) Trypsin 0,02% (w/v) EDTA in 1x PBS

36 MATERIAL UND METHODEN

Einfriermedium (steril): 70% (v/v) Medium je nach Zelllinie 20% (v/v) FKS (hitzeinaktiviert) 10% (v/v) DMSO
Medium frisch hergestellt und 30 min auf Eis gelagert

2.1.9 Lösungen und Medien für die Molekularbiologie

Medien für die Kultivierung von Escherichia coli (E. coli) LB-Medium: 25 g/l LB-Broth

mit ddH 2O aufgefüllt, autoklaviert
vor Benutzung 100 µg/ml Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin zugegeben

LB-Agarplatten: 40 g/l LB-Agar

mit ddH 2O aufgefüllt, autoklaviert

Der flüssige Agar wurde mit 100 µg/ml Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin versetzt und unter einer Sterilbank in sterile Petrischalen gegossen. Die abgekühlten Agarplatten wurden bei 4°C gelagert.

SOC-Medium: 2% (w/v) bacto trypton 0,5% (w/v) bacto yeast extract 10 mM NaCl 2,5 mM KCl

10 mM MgCl 2

10 mM MgSO 4 20 mM Glukose

mit ddH 2O aufgefüllt, autoklaviert

2x YTA-Medium: 1,6 % (w/v) bacto trypton 1 % (w/v) bacto yeast extract 85 mM NaCl

mit ddH 2O aufgefüllt, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt, autoklaviert
vor Benutzung 100 µg/ml Ampicillin zugegeben

37

Medium mit Betainhydrochlorid und D-Sorbitol: 0,8 M D-Sorbitol (mit Medium autoklaviert) 2,5 mM Betain · HCl (frisch zugegeben!)

Betainhydrochlorid-Stammlösung: 500 mM Betain · HCl

in ddH 2O gelöst, steril filtriert und bei -20°C gelagert

Puffer für molekularbiologische Methoden 1x Annealing Puffer: 100 mM Kaliumacetat 30 mM HEPES, pH 7,4 2 mM Magnesiumacetat
Puffer aliquotiert und bei -20 °C gelagert

20x Borax-Puffer:

100 mM Na 2B4O7 · 10 H2O
mit Borsäure auf pH 8,0 eingestellt

Puffer zur Herstellung kompetenter E.coli

Chemo-kompetente E.coli Transformationspuffer 1:

30 mM CH 3COOK; pH 5,8 100 mM RbCl

50 mM MnCl 2 · 4 H 2O

2,5 mM CaCl 2 · 2 H 2O 15% Glycerol
mit 0,2 µm Filter steril filtriert

38 MATERIAL UND METHODEN

Transformationspuffer 2: 10 mM MOPS; pH 6,8 mit NaOH eingestellt 10 mM RbCl

75 mM CaCl 2 · 2 H 2O 15% Glycerol
mit 0,2 µm Filter steril filtriert

Elektro-kompetente E.coli 10%ige Glycerinlösung: 10 % (v/v) Glycerin

2.1.10 Enzyme

BIOTAQ  DNA Polymerase Bioline GmbH, Luckenwalde Platinum Taq-Polymerase Invitrogen GmbH, Karlsruhe Shrimp Alkaline Phosphatase Bioline GmbH, Luckenwalde T4 DNA Ligase Bioline GmbH, Luckenwalde T4 DNA Polynukleotid Kinase Bioline GmbH, Luckenwalde

Schnittstellen Eco RI New England BioLabs GmbH, Frankfurt

Not I New England BioLabs GmbH, Frankfurt

Esp 3I New England BioLabs GmbH, Frankfurt

Xba I New England BioLabs GmbH, Frankfurt

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2.1.11 Verwendete Escherichia coli -Stämme

Stamm Genotyp Referenz - - - + S ® BL21 F [dcm ], ompT, hsdS (r B , mB ), gal [malB ]K-12 (λ ) New England BioLabs GmbH, Frankfurt a. M. (Studier et al., 2009) – + ® JM109 end A1, rec A1, gyr A96, thi-1, hsd R17 (r k , m k ), New England BioLabs rel A1, sup E44, ( lac-pro AB), [F´, tra D36, pro AB, GmbH, Frankfurt a. M. lacIqZM15]

2.1.12 Vektoren und Plasmide

Plasmid Genotyp Referenz pAcGFP1-N1 Kan R/Neo R, HSV TK polyA, pUC ori, CMV- Clontech Labs, Inc., Promotor /MCS/AcGFP1, SV/polyA, fi ori, P Mountain View, CA,USA Kan R, SV40/ori, SV40-Promotor pGEX-4T-3 Amp R, Tac-Promotor /GST/ MCS , lacI q Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden pLL3.7 ESP Amp R, CMV-Promotor /5´LTR, Ψ, FLAP, U6- M. Gessler, Würzburg Promotor /MCS , lox P, CMV-Promotor /EGFP, (Rubinson et al., 2003) lox P, WRE, 3´SIN-LTR /pUC pCMV-R8.74 Amp R, colE1/ori, SV40/ori, GPT, CMV- A. Benebnans, Lausanne Promotor , SV40/polyA, gag, pro, pol, delVpr, delVpu, del env RRE (Tat/rev), h/Insulin/pA pMD2.G Amp R, CMV-Promotor , β-Globin-Intron , VSV-G, A. Benebnans, Lausanne β-Globin-pA

Rekominantes Plasmid Eigenschaften Referenz pAcGFP1-N1-P2X4Ra Kan R/Neo R, CMV -Promotor, P2X4Ra- Menge (2008) AcGFP (C-terminale AcGFP-Fusion) Bachelorarbeit pAcGFP1-N1-P2X7R Kan R/Neo R, CMV -Promotor, P2X7R- (K. Pehlke, 2008, AcGFP (C-terminale AcGFP-Fusion) interne Aufzeichnungen des Institutes für R pGEX-4T3-P2X7RCT Amp , GST-P2X7R(N 356 -Y595 ) Fusion Anatomie)

40 MATERIAL UND METHODEN

R pGEX-4T3-P2X4RCT Amp , GST-P2X4R(C 360 -Q388 ) Fusion diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X4RshRNA1 Amp R, mouse P2rx4 -mRNA (624-644) diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X4RshRNA2 Amp R, mouse P2rx4 -mRNA (626-646) diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X4RshRNA3 Amp R, mouse P2rx4 -mRNA (926-946) diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X4RscshRNA1 Amp R, scrambled P2X4RshRNA1 diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X4RscshRNA2 Amp R, scrambled P2X4RshRNA2 diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X4RscshRNA3 Amp R, scrambled P2X4RshRNA3 diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X7RshRNA1 Amp R, mouse P2rx7 -mRNA (239-259) diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X7RshRNA2 Amp R, mouse P2rx7 -mRNA (870-890) diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X7RshRNA3 Amp R, mouse P2rx7 -mRNA (3600-620) diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X7RscshRNA1 Amp R, scrambled P2X7RshRNA1 diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X7RscshRNA2 Amp R, scrambled P2X7RshRNA2 diese Arbeit pLL3.7ESP-P2X7RscshRNA3 Amp R, scrambled P2X7RshRNA3 diese Arbeit

2.2 Methoden

2.2.1 Zellbiologische Methoden

2.2.1.1 Zellkultivierung

Die Epithelzellen wurden bei 37°C und 5% CO 2-Begasung kultiviert. Alle Arbeitsschritte sind unter einer Sterilwerkbank durchgeführt worden. Die Zellen wurden in Konzentrationen von 1,5·10 4 bis 3·10 4 Zellen/ml in Standardkulturflaschen mit 25 cm 2 (T25) oder 75 cm 2 (T75) oder 175 cm 2 (T175) Fläche kultiviert. Das Passagieren erfolgte bei 90% Konfluenz der Zellen alle 2 bis 3 Tage. Das bei 4°C gelagerte DMEM/Ham´s F12-Medium ist vor Gebrauch im Wasserbad auf 37°C erwärmt worden. Nach Absaugen des Mediums wurden die Zellen kurz mit DPBS (ohne Ca 2+ , Mg 2+ ) gewaschen. Das Ablösen der Zellen erfolgte durch Zugabe von 3 ml vorgewärmter (37°C) Trypsin/EDTA-Lösung. Nach 2 min wurde die Wirkung des Trypsins mit der dreifachen Menge Komplettmedium abgestoppt und alles in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zentrifugation (5 min, 200 x g, RT) wurde der Überstand abgenommen und das Pellet in 10 ml Komplettmedium resuspendiert. Die Bestimmung der Gesamtzellzahl und Lebendzellzahl erfolgte mithilfe eines Zellzählgerätes (CASY , Schärfe System). Anschließend wurden die Zellen in der erforderlichen Zelldichte ausgesät. Die Zellen sind von Passage +10 bis +30 für Versuche genutzt worden.

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2.2.1.2 FKS-Hitzeinaktivierung Das FKS wurde über Nacht bei 4°C aufgetaut. Anschließend sind die FKS-Flaschen in ein Wasserbad gestellt und das FKS auf eine Temperatur von 56°C erwärmt worden. Das FKS wurde für 30 min unter leichtem Schwenken bei 56°C inkubiert, danach aliquotiert und bei -20°C eingefroren.

2.2.1.3 Einfrieren von Zellen Das Einfriermedium wurde frisch hergestellt und auf Eis gelagert. Nach dem Abtrypsinieren, Zentrifugieren und Resuspendieren der Zellen in Komplettmedium wurde die Zellzahl bestimmt (Zellzählgeräte, CASY , Schärfe System), wie in Abschnitt 2.1.14.1 erläutert. Die Zellsuspension wurde erneut zentrifugiert (200 x g, 5 min, RT) und der Überstand entfernt. Anschließend erfolgte die Resuspendierung 1 · 10 6 Zellen in 1 ml Einfriermedium und die Überführung in gekühlte Kryoröhrchen. Diese wurden zunächst für 2h bei -20°C gelagert und anschließend über Nacht bei -80°C eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff überführt.

2.2.1.4 Auftauen von Zellen In ein 15 ml-Falconröhrchen wurden 8 ml Komplettmedium vorgelegt. Ein Kryoröhrchen mit den entsprechenden Zellen wurde im Wasserbad bei 37°C schnell aufgetaut, bis nur noch ein Eiskern zu sehen war. Anschließend wurde der Inhalt des Röhrchens zum Medium in das Zentrifugenröhrchen pipettiert und alles bei 150 x g für 5 min zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in frischen, warmen Komplettmedium resuspendiert und in eine T25-Kulturflasche überführt. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel.

2.2.2 Biochemische Methoden

2.2.2.1 Präparation der Detergenzien-löslichen und -unlöslichen Membranfraktion Zur Untersuchung der Löslichkeiten in verschiedenen Detergenzien wurden die E10-Zellen einer subkonfluenten T75-Kulturflasche mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 500 µl eiskaltem MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren + 1% Detergenz (Brij35 oder Triton X-100) mit einem Zellschaber abgeschabt. Die Zellen wurden 30 min lysiert und

42 MATERIAL UND METHODEN anschließend zentrifugiert (2000 x g, 10 min, 4°C). Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 500 µl MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren + 0,1% SDS resuspendiert. Zur Senkung der Viskosität wurde das gelöste Pellet 10 s mit Ultraschall (Ultraschallgerät UP 100H von Dr. Hielscher; Zyklus: 0,7; Amplitude: 70%) behandelt. Alle Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt. Gleiche Proteinmengen von Überstand und Pellet wurden über eine SDS- PAGE aufgetrennt und mittels Western Blot-Analyse untersucht.

2.2.2.2 Präparation von DRMs mittels diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation Es wurden subkonfluente Zellen aus fünf T75-Kulturflaschen mit eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden 500 µl eiskalter MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren + 1% Detergenz in jede T75 Flasche gegeben und die Zellen mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden 30 min auf Eis unter gelegentlichem Schwenken lysiert und anschließend zentrifugiert (2000 x g, 10 min, 4°C). Der Überstand wurde bis auf 50 µl, welche auf dem Pellet verbleiben, abgenommen und das Pellet in 1 ml MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren resuspendiert. Die Suspension wurde mit 30 Hüben im 2 ml-Dounce Homogenisator durchmischt. Für die anschließende Zentrifugation sind 1 ml des homogenisierten Pellets mit 1 ml 80%iger (w/v) Saccharose (in MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren) gemischt und anschließend vorsichtig in ein 4 ml Zentrifugenröhrchen gegeben worden. Das Gemisch ist mit 1,4 ml 30%iger (w/v) Saccharose (in MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren) und 0,8 ml 5%iger (w/v) Saccharose (in MBS-Puffer + Proteaseinhibitoren) überschichtet worden. Alle Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Der Gradient wurde für 4 h bei 200.000 x g und 4°C in einer Beckman Optima  Max Ultrazentrifuge (Rotor: MLS-50) zentrifugiert. 13 Fraktionen zu je 300 µl wurden vorsichtig, von oben beginnend, vom Gradienten abgenommen. Die Fraktionen wurden bei -20°C gelagert und je 25 µl sind für Western Blot-Analysen eingesetzt worden.

2.2.2.3 Lipidextraktion aus den Fraktionen der Dichtegradienten 200 µl von jeder Gradientenfraktion wurden mit 800 µl Methanol/Chloroform (2:1) vermischt. Mittels Zentrifugation bei 4000 rpm für 5 min sind die Proteine aus dem Gemisch entfernt worden. Die Überstände wurde mit 200 µl 20 mM Essigsäure und 200 µl Chloroform gemischt. Nach erneuter Zentrifugation bei 4000 rpm für 5 min wurden die unteren Lipidphasen (L1) vorsichtig abgenommen und in neue Falconröhrchen überführt. Der pH- Wert der oberen wässrigen Phasen sollte unter pH 4,0 liegen, gegebenenfalls wurden 10 µl

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1 M Essigsäure zugegeben . Danach wurden 400 µl Chloroform zu den wässrigen Phasen gegeben und gemischt. Nach der Zentrifugation bei 4000 rpm für 5 min wurden die unteren Lipidphasen (L2) wieder vorsichtig abgenommen und zu den ersten Lipidphasen (L1) pipettiert. Die Röhrchen mit den organischen Lipidphasen wurden in ein 37°C warmes Wasserbad unter Stickstoffbegasung gestellt und getrocknet. Anschließend wurden die trockenen Lipidpellets in 50 µl Methanol/Chloroform (1:2) resuspendiert. Bis zur Dünnschichtchromatographie erfolgte die Lagerung bei -20°C.

2.2.2.4 Dünnschichtchromatographie (DC) Die extrahierten Lipide wurden dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Dazu wurden die in Methanol/Chloroform (1:2) gelösten Lipide im Abstand von 1 cm auf eine Kieselgelplatte getüpfelt. Die Kieselgelplatte wurde getrocknet und in eine mit Laufmittel gefüllte und äquilibrierte DC-Kammer gestellt. Das erste Laufmittel war ein Gemisch aus Chloroform,

Triethylamin, Ethanol und ddH 2O im Verhältnis 35:35:40:9. Wenn die Laufmittelfront 2/3 der Laufstrecke erreicht hatte, wurde die Platte aus der Kammer genommen und mit einem Fön getrocknet. Anschließend wurde die getrocknete Platte in eine Kammer mit einem Laufmittelgemisch aus Iso-Hexan und Ethylacetat (5:1) gestellt. Wenn die Laufmittelfront ca. 1 cm unterhalb der Plattenoberkante angekommen war, wurde die Platte aus der Kammer genommen und getrocknet. Die trockene Platte wurde in einer speziellen Abzugkammer mit 20%iger Schwefelsäure besprüht und anschließend in einen 250°C warmen Ofen gestellt. Sobald die Lipidbanden gut sichtbar waren, wurde die Platte zum Abkühlen aus dem Ofen genommen. Die Lipidbanden auf der Kieselgelplatte wurden eingescannt und digital gespeichert.

2.2.2.5 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz (Dieckmann-Schuppert and Schnittler, 1997) Die lentiviral-transfizierten E10-Zellen wurden komplett in Probenpuffer lysiert und der Gesamtproteingehalt mit Hilfe der Amidoschwarz-Proteinbestimmung nach Dieckmann- Schuppert und Schnittler (1997) ermittelt. Im Probenpuffer enthaltenes Bromphenolblau, SDS, DTT und Glycerin stören diese Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration nicht. Als Standard wurde eine BSA Verdünnungsreihe in Probenpuffer mit folgenden BSA- Konzentrationen erstellt:

44 MATERIAL UND METHODEN

8 µg/ µl 4 µg/ µl 2 µg/ µl 1 µg/ µl 0,5 µg/ µl 0,25 µg/ µl

5 µl Standard oder Probe wurden auf eine, in 1 cm breite Abschnitte unterteilte, Zelluloseacetat-Membran aufgetragen. Als Standard-Nullwert wurden 5 µl Probenpuffer genutzt. Mit Hilfe eines Föns wurde die Membran gründlich getrocknet und für 10 min auf einem Schüttler mit der Amidoschwarz-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran dreimal 5 min mit der Entfärbelösung gewaschen. Nach dem Entfärben wurde die Membran erneut getrocknet. Die 1 cm breiten Membranfelder wurden nacheinander abgeschnitten und in je ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt und nach Zugabe von 1 ml Auflöselösung bei 50°C für 30 min im Thermoschüttler inkubiert. Die Extinktion der aufgelösten Membranabschnitte mit den immobilisierten Proteinen wurde photometrisch bei 650 nm (Nanophotometer TM , IMPLEN) gemessen. Aus den Standardproben wurde eine Eichkurve erstellt und die entsprechende Proteinkonzentration der Proben errechnet.

2.2.2.6 BCA-Proteinbestimmung Für die Proteinbestimmung wurde das BCA TM Proteinassay Kit nach den Angaben des Herstellers verwendet. 25 l Probe und 200 l Reaktionslösung wurden in einer Mikrotiterplatte bei 37°C für 30 min inkubiert. Für die BSA-Standardkurve wurden bekannte

Konzentrationen an BSA eingesetzt, als Leerwert diente ddH 2O. Die photometrische Messung der Absorption erfolgte bei 562 nm mit einem ELISA Reader (TECAN Sunrise reader ) und die Auswertung mit der Photometersoftware Magellan V 2.5. Nach Abzug des Leerwertes ließ sich anhand der erstellten BSA-Standardkurve die Proteinkonzentration der Proben bestimmen.

2.2.2.7 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteine wurden mittels der diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (1970) aufgetrennt. Die Gelelektrophorese erfolgte in Elektrophoresekammern der Firma Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH, München).

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Die gemischte Trenngellösung wurde zum Polymerisieren zwischen zwei Glasplatten pipettiert und mit Wasser überschichtet. Nach erfolgter Polymerisierung des Trenngels wurde das Wasser entfernt, die Sammelgellösung auf das Trenngel pipettiert und der Probenkamm eingesteckt. Das vollständig polymerisierte Gel wurde in die Elektrophoresekammer eingebaut und diese mit 1x SDS-PAGE-Puffer aufgefüllt. Der Probenkamm wurde vorsichtig aus dem Gel gezogen.

SDS-PAGE Gelzusammensetzung

Trenngel (10%) Trenngel (12%) Sammelgel (4%) Acrylamid/Bisacrylamid 3,33 ml 4,0 ml 0,65 ml

ddH 2O 4,02 ml 3,35 ml 3,05 ml Trenngelpuffer, pH 8,8 2,5 ml 2,5 ml Sammelgelpuffer, pH 6,8 1,25 ml 10% (w/v) SDS-Lösung 100 µl 100 µl 50 µl TEMED 10µl 10 µl 10 µl 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl 50 µl Gesamtvolumen 10 ml 10 ml 5 ml

Die Proteinproben wurden mit 6x SDS-Probenpuffer versetzt und bei 95°C für 5 min im Heizblock inkubiert. Als Größenmarker wurden 5 l PageRuler TM und 2,5 l MagicMarker TM aufgetragen. Das Gel lief zu Beginn mit einer Elektrophoresespannung von 80 V. Nachdem die Lauffront das Trenngel erreicht hatte, wurde die Spannung auf 120 V erhöht.

2.2.2.8 BN-PAGE und hrCN-PAGE-3 (Wittig et al., 2007) Die nativen Membranen wurden mit dem ProteoExtract ® Native Membrane Protein Extraction Kit und DRM´s mit dem ReadyPrep TM Protein Extraction Kit isoliert. Die isolierten Membranen wurden mit Lysispuffer + 4% Digitonin versetzt, homogenisiert und 20 min auf Eis lysiert. Die Solubilisierung der Proteinkomplexe für BN-PAGE und hrCN-PAGE-3 war identisch. Anschließend wurden die Proben mit 60000 x g bei 4°C für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit Ponceau S (0,01%) und Glycerol (10%) versetzt. Je 50 µg Gesamtprotein wurden auf ein natives Gel aufgetragen . Als Größenstandard wurden zweimal nebeneinander 5 µl NativeMark™ aufgetragen.

46 MATERIAL UND METHODEN

Pipettierschema für Gradientengele: Trenngel Sammelgel 3% 5% 10% 13% 2,5% 4,5% Acrylamid/Bisacrylamid 30% 1,0 ml 1,67 ml 3,33 ml 4,33 ml 0,41 ml 0,74 ml 3x Gelpuffer 3,33 ml 3,33 ml 3,33 ml 3,33 ml 1,67 ml 1,67 ml Glycerin - - 1,3 ml 1,6 ml - -

ddH 2O 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 5 ml 5 ml TEMED 4 µl 3,5 µl 2,5 µl 2 µl 5 µl 9 µl 10 % APS 40 µl 35 µl 25 µl 20 µl 25 µl 45 µl

Für beide Formen der nativen PAGE wurde der Anodenpuffer genutzt, wie in 2.1.4.8 beschrieben. Die Kathodenpuffer unterscheiden sich in ihren anionischen Zusätzen. Für die BN-PAGE wurde der anionische Farbstoff Coomassie Brillantblau G-250 und für die hrCN- PAGE das anionische Detergenz Natriumdeoxycholat (DOC) genutzt. Zusätzlich wurde dem Kathodenpuffer das nicht-ionische Detergenz n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) zugesetzt, was zur Ausbildung von gemischten Micellen führt. Diese gemischten Micellen gewährleisten den Transport der Membranproteine im nativen Gel sowie die Löslichkeit der Membraneproteine während der Elektrophorese. Diese verbesserte CN-PAGE bietet eine hohe Auflösung von Membraneproteinkomplexen vergleichbar mit der BN-PAGE. Die Elektrophoresekammer mit den beladenen Gelen wurde für die Separation der Proteinkomplexe in Eis gestellt und die Initialspannung auf 80 V (limitiert auf 10 mA) eingestellt. Während der BN-PAGE wurde Kathodenpuffer A gegen Kathodenpuffer B getauscht, wenn die Lauffront von Kathodenpuffer A die Mitte des Gels erreicht hatte. Beide nativen PAGEs liefen über Nacht in Eis gelagert bei 40 V und wurden gestoppt, wenn die Ponceau S-Front aus dem Gel gelaufen war. Um die Proteine der Komplexe auf eine PVDF-Membran überführen oder eine anschließende SDS-PAGE (2. Dimension) durchführen zu können, wurden die nativen Gele für 1 h bei RT in Equilibrierungspuffer inkubiert und anschließend zweimal mit ddH 2O gewaschen. Für die Western Blot-Analysen wurden die Gele in Transferpuffer gelegt und, wie unter Abschnitt 2.2.2.10 beschrieben, behandelt. Eine Spur mit NativeMark ™-Standard wurde mit dem Skalpel ausgeschnitten und mit Coomassie Brillantblau gefärbt, beschrieben in Abschnitt 2.2.2.13.

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2.2.2.9 2D/SDS-PAGE Die equilibrierten Gele wurden, den Probenverlauf folgend, in Streifen geschnitten und waagerecht im oberen Drittel zwischen zwei Glasplatten geklemmt. Vorsichtig wird der Gelstreifen mit einem 10%igen Trenngel unterschichtet und anschließend in ein 2,5%iges Trenngel, welches 0,002% Coomassie und 0,1% SDS enthielt, eingebettet. Nach der Polymerisation wurden die Elektrophoresebedingungen, wie unter 2.2.2.8 beschrieben, gewählt. Als Größenmarker wurden MagicMark  und PageRuler  verwendet.

2.2.2.10 Western Blot Um die Zielproteine immunologisch nachweisen zu können, wurden die Proteine mittels tank blot Methode aus dem Gel auf eine PVDF-Membran transferiert. Dazu wurde eine tank blot Apparatur der Firma Biorad verwendet. Die PVDF-Membran wurde zur Aktivierung kurz in Methanol inkubiert und mit Transferpuffer gespült. Das ebenfalls in Transferpuffer getränkte Filterpapier, die Membran und das Gel wurden luftblasenfrei in eine Kassette gestapelt und diese in eine mit Transferpuffer gefüllte tank blot Apparatur eingesetzt. Der Transfer erfolgte bei 100 V (limitiert auf 40 mA) für 2 h in der Kühlkammer bei 4°C.

2.2.2.11 Ponceau-Färbung Der Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran wurde mithilfe einer Ponceau-Färbung überprüft. Dazu wurde die Membran nach dem Transfer 5 min in Ponceau S-Färbelösung inkubiert. Nicht gebundenes Ponceau wurde durch Spülen der Membran mit ddH 2O entfernt, bis nur die Proteinbanden sichtbar blieben.

2.2.2.12 Coomassie Brilliantblau-Färbung Die SDS-Gele wurden 1 h in Coomassie-Färbelösung inkubiert, um die im Gel befindlichen Proteine anzufärben. Unspezifisch an die Gelmatrix gebundener Farbstoff wurde durch Inkubation in Entfärbelösung entfernt, bis ein klar sichtbares Bandenmuster im Gel erkennbar war. Während der Entfärbung wurde die Entfärbelösung mehrfach erneuert.

48 MATERIAL UND METHODEN

2.2.2.13 Immundetektion Bis zur Detektion erfolgten alle Arbeitsschritte bei RT auf einem Schüttler oder einem Drehrad. Zuerst wurde die PVDF-Membran für 60 min in Blockierungslösung und anschließend mit dem in Antikörperinkubationslösung verdünnten Antikörper inkubiert. Die Inkubationsdauer betrug 2 h. Danach wurde die Membran dreimal 5 min mit 1x TBS-T gewaschen. Anschließend wurde die Membran für 45 min mit dem in Antikörper- inkubationslösung verdünnten sekundären Antikörper inkubiert. Nach erneutem Waschen (dreimal 5 min mit 1x TBS-T) erfolgte die Detektion der Zielproteine mit dem Immobilon TM Western Chemiluminescent HRP Substrate nach Angaben des Herstellers. Dazu wurde die Membran in Detektionslösung inkubiert, anschließend gut abgetropft und zwischen eine Klarsichtfolie gelegt. Die Chemilumineszenz wurde mit dem Bioimager LAS 3000 (Fujifilm) bei verschiedenen Belichtungszeiten gemessen.

2.2.2.14 Dot Blot Beim dot Blot werden die Proteine direkt auf eine adsorbierende Zelluloseacetat-Membran (Sartorius, Göttingen) aufgetragen. Die Proteine wurden nicht denaturiert und nicht elektrophoretisch aufgetrennt. 2 µl von jeder Fraktion der Dichtegradienten wurden auf die Membran gegeben. Die Membran wurde getrocknet und 1 h mit Blockierungslösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran für 1 h mit anti-PI(4,5)P 2 in Antikörperinkubationslösung inkubiert. Die Membran wurde weiter behandelt, wie unter Abschnitt 2.2.2.14 beschrieben.

2.2.2.15 Co-Immunpräzipitation Von subkonfluenten E10-Zellen aus fünf T75-Standardkulturflaschen wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Die Extraktion der Membranproteine erfolgte mittels Proteo Extract Membrane Protein Extraction Kit nach Angaben des Herstellers. Nach dem Abschaben der Zellen in Extraktionspuffer mit Proteaseinhibitoren (Kit-Komponenten) und dem Überführen in je ein 2 ml-Eppendorfgefäß erfolgte die Inkubation auf Eis für 10 min. Danach wurde die Zellsuspensionen bei 16000 x g und 4°C für 15 min (Allegra TM 64R Centrifuge von Beckman Coulter; Rotor: F2402H, 99E4324) zentrifugiert und die Überstände abgenommen. Die Pellets wurden in Lysispuffer aufgenommen, in einem Eppendorfgefäß vereint und unter Rotation für 30 min bei 4°C inkubiert. Nach anschließender Zentrifugation bei 16000 x g und 4°C für 15 min wurde der

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Überstand (NP40-lösliche oder Digitonin-lösliche Membranproteine) in ein neues Eppendorfgefäß überführt und nach Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration für die Coimmunpräzipitation eingesetzt. Für die Proteinbestimmung wurde das BCA TM Protein Assay Kit nach den Angaben des Herstellers verwendet. Die Co-Immunpräzipitation wurde nach dem Protokoll von Invitrogen (Dynabeads ® Protein G) durchgeführt. Zunächst wurden 100 l Dynabeads ® (Protein G) einmal mit Lysispuffer + Proteaseinhibitoren und danach zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Dynabeads ® mit 200 l PBS inklusive 5 g Antikörper sowie 0,4 l 10% (v/v) Tween20 versetzt und für 45 min bei RT auf einem Drehrad inkubiert. Für die Negativkontrolle erfolgte der identische Ansatz, jedoch ohne Antikörper. Die Zugabe von Tween 20 verhindert die Zusammenlagerung der Dynabeads® während der Inkubation. Danach wurden 500 µg des Membranprotein-Lysates zum Antikörper-Dynabeads ®-Komplex gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Der präzipitierte Komplex wurde einmal mit kaltem Lysispuffer und zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Anschließend wurden 40 µl PBS und 8 µl Probenpuffer zugesetzt und die präzipitierten Proteine durch Aufkochen bei 95°C für 5 min von den Dynabeads ® gelöst. Die Zusammensetzung des Präzipitats wurde durch SDS-PAGE und Western Blot-Analyse bestimmt.

2.2.2.16 Oberflächenbiotinylierung E10-Zellen wurden in T75-Standardkulturflaschen kultiviert, lentiviral-transfiziert und nach 48h Inkubation für die Oberflächenbiotinylierungsexperimente eingesetzt. Die Zellen wurden in den T75-Kulturflaschen zweimal mit eiskaltem PBS (Ca 2+ , Mg 2+ ) gewaschen und anschließend mit 5 ml 2 mM Sulfo-NHS-biotin in PBS (Ca 2+ , Mg 2+ ) für 1 h bei 4°C auf einem Schüttler (MiniRocker MR-1 von peQLab Biotech. GmbH) inkubiert. Zum Abstoppen der Biotinylierung wurden die Zellen zweimal mit PBS (Ca 2+ , Mg 2+ ) + 100 mM Glycin gewaschen und anschließend mit diesem Puffer für 30 min bei 4°C auf einem Schüttler inkubiert. Die biotinylierten Zellen wurden mit RIPA-Puffer + Proteaseinhibitoren versetzt, abgeschabt, in ein Eppendorfgefäß überführt und 1 h bei 4°C unter Rotation lysiert. Nach einer Zentrifugation bei 16000 x g und 4°C für 15 min wurde der Überstand abgenommen und die Proteinkonzentration mit dem BCA TM Proteinassay Kit ermittelt. Ein Aliquot von 30 µg Gesamtprotein wurde mit 6x Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C aufgekocht und anschließend bei -20°C eingefroren. 500 µg Gesamtprotein wurden mit 100 µl Dynabeads ® M-280 Streptavidin über Nacht bei 4°C unter Rotation inkubiert. Der Dynabeads ®- Membranprotein-Komplex wurde einmal mit RIPA-Puffer, zweimal mit high salt - und einmal 50 MATERIAL UND METHODEN mit low salt -Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Dynabeads ® mit 35 µl low salt - Puffer und 7 µl 6x Probenpuffer versetzt, aufgekocht (95°C, 5 min) und bei -20°C eingefroren. Die Zusammensetzung des Präzipitats wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

2.2.2.17 Extraktion von Proteinen aus Gewebeproben Die eingefrorenen Lungen wurden aufgetaut, 1 ml Extraktionspuffer zugegeben und die komplette Lunge mit einem Skalpell im Extraktionspuffer zerkleinert. Die Gewebestücke und der Puffer wurden in ein Falconröhrchen überführt und mit einem Stab-Homogenisator (Xenox, Niersbach) weiter zerkleinert. Das Homogenat wurde anschließend über Nacht unter Rotation bei 4°C inkubiert. Danach wurde das Lysat bei 15000 x g und 4°C für 15 min abzentrifugiert. Die Proteinbestimmung wurde mit dem BCA TM Protein Assay Kit nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.3 Immunfluoreszenzmikroskopie Die Verteilung der mit entsprechenden Fluorochromen markierten Proteine wurden an einem inversen Mikroskop (Olympus IX81, Olympus Deutschland, Hamburg, Germany) mit einem 40x Wasserimmersionsobjektiv, der Olympus Kamera DP70 und der Olympus Software cell^R aufgenommen und ausgewertet. Die Weiterbearbeitung der Bilder erfolgte mit einer Photoshop Software von Adobe.

2.2.3.1 Beschichtung von Deckgläschen Die Deckgläschen wurden 5 min in Ethanol/Salzsäure (970 ml Ethanol, 10 ml Wasser, 20 ml Salzsäure) unter leichtem Schwenken inkubiert und anschließend mit Ethanol (absolut) gewaschen. Nach gründlichem Spülen mit ddH 2O (dreimal 5 min) wurden die Deckgläschen unter Schwenken für 10 min in der Poly-L-Lysinlösung (0,01 mg/ml) inkubiert. Die

Deckgläschen wurden nochmals zweimal mit ddH 2O gewaschen und zum Trocknen vereinzelt auf Zellstoff in einer Sterilbank ausgelegt. Danach wurden sie mindestens 30 min mit UV-Licht bestrahlt. Die getrockneten Deckgläschen wurden steril gelagert.

51

2.2.3.2 Immunfluoreszenz mit fixierten Zellen Die E10-Zellen (6·10 4 Zellen/Well) wurden für 24 h in 12-Wellplatten auf Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen kultiviert. Die mit E10-Zellen subkonfluent bewachsenen Deckgläschen wurden in den Wells mit kaltem 1x TBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgte mit -20 °C-kaltem Methanol/Aceton (1:1) bei -20 °C für 10 min. Anschließend wurde das Methanol/Aceton-Gemisch abgesaugt und die Zellen zweimal mit 1x TBS gewaschen. Für die Fixierung mit Paraformaldehyd (PFA) wurden die E10-Zellen gewaschen und für 15 min mit kalter 4%iger PFA-Lösung bei RT inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit kaltem 1x TBS gewaschen, zur Permeabilisierung der Zellmembran für 10 min mit 0,1% Triton X-100 in 1x TBS inkubiert und wiederum dreimal mit 1x TBS gewaschen. Die fixierten Zellen wurden 60 min bei RT mit 1% BSA in 1x TBS blockiert. Im Anschluss wurden je Deckgläschen 100 µl des entsprechenden primären Antikörpers auf einem Streifen Parafilm pipettiert. Die Deckgläschen wurden mit einer Pinzette aus der 12-Wellplatte entnommen und mit dem Zellrasen nach unten auf die Antikörpertropfen gelegt. Die Inkubationszeit betrug 1 h bei RT. Anschließend wurden die Zellen mit 1x TBS gewaschen und mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen der Zellen mit 1x TBS wurden die Deckgläschen kurz in ddH 2O getaucht, abgetropft und mit Eindeckflüssigkeit auf einen Objektträger gelegt. Die Präparate wurden dunkel und bei 4°C gelagert.

2.2.3.3 Detektion des acceptor bleaching Förster-Resonanz-Energie-Transfers abFRET, modifiziert nach (König et al., 2006) FRET ist ein strahlungsloser Energietransfer zwischen zwei Fluorophoren (Donor und Akzeptor). Dieser erfolgt, wenn die beiden Fluorophore weniger als 10 nm voneinander entfernt sind. Die FRET-Analysen wurden mit konventionellen Doppelimmunfluoreszenzen und einem confocal laser scanning microscopy (CLSM) durchgeführt. Die E10-Zellen wurden mit Methanol/Aceton fixiert und die Zielproteine mit spezifischen Antikörpern markiert. Zunächst wurden die Zellen mit den primären Antikörpern für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit 1x TBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen zuerst für 1 h mit dem Cy3-gekoppelten sekundären Antikörper und folgend mit dem Cy5- gekoppelten Antikörper inkubiert. Als Fluorophore wurden Cy3 und Cy5 gewählt, da sich die Spektren der Emission von Cy3 und der Absorption von Cy5 überlagern, was eine Voraussetzung für den FRET ist.

52 MATERIAL UND METHODEN

Um die Spezifität des FRET-Signals kontrollieren zu können, wurden die E10-Zellen jeweils nur mit einem der primären Antikörper und mit beiden sekundären Antikörpern inkubiert. Nach der Markierung der Zielproteine wurden die Deckgläschen mit Eindeckmedium auf die Objektträger gebracht und zusätzlich mit farblosem Nagellack befestigt. Die Intensität beider Fluorophore wurde vor und nach dem Bleichen gemessen, wobei die Zunahme der Cy3- Donorintensität ( IF) als Maß für den FRET gilt:

IF = I DA – I DB

IDA , die Intensität der Donorfluoreszenz nach dem Bleichen des Akzeptors

IDB , die Intensität der Donorfluoreszenz vor dem Bleichen des Akzeptors

Die abFRET-Messungen wurde an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica CLSM TCS SP5 AOBS; Leica, Bensheim) mittels 40x Ölimmersionsobjektiv und einer nummerischen Apertur von 1,25 durchgeführt. Folgende CLSM-Einstellungen wurden bei den Messungen benutzt: Anregung von Cy3 mit HeNe-Laser 543 nm (50% Laseraktivität), Anregen von Cy5 mit HeNe-Laser 633 nm (20% Laseraktivität); Wellenlänge der gemessenen Emission von Cy3: 555-620 nm, Wellenlänge der gemessenen Emission von Cy5: 650-730 nm. Die Lochblende wurde auf drei Beugungseinheiten eingestellt. Die Photomultipliereinstellungen lagen zwischen 480 und 591 V im linearen Messbereich. Die Einstellungen wurden bei jedem Versuch konstant gehalten. Die Bereiche von Interesse (region of interest = ROI) wurden anhand der Cy5-Intensität ausgewählt und zehnmal mit der höchstmöglichen Nachvergrößerung (Zoom 32fach) mit 100% der Laseraktivität des 633 nm HeNe-Lasers geblichen. Vor und nach dem Bleichen wurden gleichzeitig jeweils von den Cy3- und Cy5-markierten Proteinen Bilder aufgenommen. Um Hintergrundsignale zu reduzieren, wurden die Bilder dreimal eingescannt und das Signal gemittelt. Zur Kontrolle der Stabilität des Messsystems wurden Bereiche von gleicher Fläche um die zu bleichenden ROI´s gelegt und sowohl vor als auch nach dem Bleichen gemessen. Wenn in diesen Regionen abFRET-Effizienzwerte

FRET eff = ((I DA -IDB )/I DA ) · 100 von über 2% gemessen wurden, wurde die Messserie von der weiteren Auswertung ausgeschlossen.

53

Statistische Auswertung Alle statistischen Analysen wurden mit dem Softwareprogramm SPSS Version 12.0 (SPSS GmbH Software, München) durchgeführt. Die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität wurden als Anstieg in der Donorfluoreszenz ( IF) dargestellt. Alle Gruppen wurden untereinander mittels Kruskal-Wallis-Test verglichen (signifikant: *p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01). Wenn sich in diesem Test eine Signifikanz von p ≤ 0,05 ergab, wurden nachfolgend zwei einzelne Gruppen durch den Mann-Whitney-Test miteinander verglichen (Maurer et al., 1995).

2.2.4 Molekularbiologische Methoden

2.2.4.1 Kultivierung von E. coli Für die Transformationen wurden die E. coli Stämme JM109 und BL21 verwendet. Das Wachstum und die Selektion erfolgten auf LB-Agarplatten bei 37°C im Brutschrank. Suspensionskulturen wurden in flüssigem LB-Medium bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Die eingesetzten Plasmide enthalten für die Selektion der transformierten Bakterien geeignete Ampicilin- oder Kanamycin-Resistenzgene. Deshalb wurden den LB-Medien Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml bzw. Kanamycin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugegeben.

2.2.4.2 Plasmid-Minipräparation Eine Einzelkolonie transformierter Bakterien wurde in 4 ml LB-Medium + Antibiotikum über Nacht bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Die Bakterien konnten am nächsten Tag durch Zentrifugation (4000 x g, RT, 10 min) geerntet werden. Aus dem Pellet wurde mittels Jetquick Miniprep Kit die Plasmid-DNA nach Herstellerangaben extrahiert. Die Plasmid- DNA wurde bei -20°C gelagert.

2.2.4.3 Plasmid-Maxipräparation Als Vorkultur wurde eine Einzelkolonie der transformierten Bakterien in 4 ml LB-Medium + Antibiotikum für 8 h auf dem Schüttler inkubiert. 2 ml dieser Vorkultur wurden zu 200 ml LB-Medium + Antibiotikum gegeben und über Nacht bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Die Ernte der Bakterien erfolgte am nächsten Tag durch die Zentrifugation bei 4000 x g für

54 MATERIAL UND METHODEN

10 min bei RT. Die Maxipräparation erfolgte mittels Jetquick Maxiprep Kit nach Herstellerangaben. Die Plasmid-DNA wurde bei -20°C gelagert.

2.2.4.4 Spektrometrische Bestimmung der DNA-Konzentration Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte mithilfe eines Photometers (Nanophotometer TM , IMPLEN). Es wurde die Extinktion bei bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. In wässrigen Lösungen entspricht die optische Dichte (OD) von 1 einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml.

Der Reinheitsgrad der DNA leitet sich aus dem Verhältnis von OD 260 zu OD 280 ab, welches zwischen 1,8 und 2,0 liegen sollte. Werte unter 1,8 oder über 2,0 deuten auf Verunreinigungen hin.

2.2.4.5 Herstellung von GST-fusionierten Konstrukten Gewinnung von RNA aus E10-Zellen Die RNA-Präparation wurde mit dem NucleoSpin (RNA II) Kit durchgeführt. Das Kulturmedium wurde aus einer T25-Kulturflasche entfernt und die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit 350 µl RA1-Lysispuffer (Kit- Komponente) + 1% β-Mercaptoethanol versetzt und abgeschabt. Die Aufarbeitung wurde nach Angaben des Herstellers fortgesetzt und die gereinigte RNA mit RNase-freiem Wasser eluiert. Die anschließende DNase-Behandlung der RNA wurde mit DNaseI (Fermentas) in einem 40 µl Ansatz durchgeführt.

wassergelöste RNA bis 50µg RNA

10 x Reaktionspuffer mit MgCl 2 4 µl DNaseI (50 U/µl) 50 U

DNase/ RNase-freies H 2O variabel

Der Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert und nach Zugabe von 4 µl 25 mM EDTA für 10 min auf 65°C erhitzt. Anschließend wurde die Konzentration der RNA mit Hilfe eines Photometers ermittelt. Als

Referenzlösung wurde ddH 2O verwendet. Die RNA wurde im Photometer bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm vermessen. Über den ermittelten Extinktionswert bei 260 nm wurde

55

die Konzentration der gemessenen Probe errechnet. Da die OD von 1 bei 260 nm einer RNA- Konzentration von 40 ng/ l entspricht lässt sich die RNA-Konzentration photometrisch wie folgt bestimmen:

Konzentration [ng/ l] = E 260 · Verdünnung · 40

Mit dem Verhältnis der beiden Absorptionen bei 260 nm und 280 nm konnte eine Aussage über die Reinheit der präparierten RNA getroffen werden. Wenn der Koeffizient kleiner als 1,8 bis 2 ist, dann wurde die Präparation mit Proteinen, genomischer DNA und/oder aromatischen Substanzen verunreinigt. Die ermittelten Extinktionswerte lagen zwischen 1,8 und 2,0. Zur Aufbewahrung wurde die RNA bei -80°C eingefroren.

Reverse Transkription Die cDNA-Synthese erfolgte mit dem RevertAid First Strand cDNA Synthesis- Kit. Für die reverse Transkription wurden je Probe zwei verschiedene Primer für die cDNA-Synthese verwendet. Einerseits kamen oligo(dT)18-Primer und andererseits random hexamer -Primer zum Einsatz. Das Ansatzvolumen betrug 20 µl.

Ansätze für die reverse Transkription mit oligo(dT)18- oder random hexamer -Primer

Total RNA in RNase-freien H 2O bis 5 µg bis 5 µg oligo(dT)18-Primer (0,5 µg/µl) 1 µl - random hexamer -Primer (0,2 µg/µl) - 1 µl 5x Reaktionspuffer 4 µl 4 µl Ribonuclease-Inhibitor (20 U/µl) 1 µl 1 µl dNTP-Mix (10 mM) 2 µl 2 µl Reverse Transkriptase (200 U/µl) 1 µl 1 µl

dH 2O, DEPC-behandelt variabel variabel

Die Probenansätze für die reverse Transkription mit oligo(dT)18- oder random hexamer - Primern wurden mit folgenden Temperaturprogrammen im Cycler inkubiert:

56 MATERIAL UND METHODEN

Temperaturprogramme 42°C 60 min oligo(dT)18-Primer 70°C 10 min 4°C ∞ 25°C 10 min 42°C 60 min random hexamer -Primer 70°C 10 min 4°C ∞

Die cDNA-Ansätze wurden für Versuchszwecke mit ddH 2O auf eine Endkonzentration von 0,05 µg/µl verdünnt. Für anschließende PCR-Ansätze wurde ein 1:1 Gemisch von beiden cDNA-Produkten verwendet.

Polymerasekettenreaktion (PCR) Durch PCR wurden die ausgewählten DNA-Fragmente für die Klonierung in E. coli erhalten. Den verwendeten Oligonukleotidprimer wurden 5´seitig Restriktionsschnittstellen eingefügt, somit besitzen sie einen nicht homologen Bereich. Aus diesem Grund wurde zur Amplifizierung der DNA-Fragmente mit diesen Primern eine PCR mit zwei verschiedenen Annealingtemperaturen durchgeführt. Die optimale Annealingtemperatur wird wie folgt ermittelt:

Tm = 69,3°C + (0,42 · (G+C)) – 650/n

Tm: Schmelztemperatur G + C: prozentualer Guanin- und Cytosin-Gehalt des Primers n: Anzahl der Basen des Primers

Verwendete Primer für:
P2rx4 N-Terminus (111 bp) forward NT: 5´-TATATA GAATTCC ATGGCAGGCTGCTGCTCCGTG- 3´ reverse NT: 5´-TATATA GCGGCCGC TCATTTACGGCTGCGGATGAGCAC- 3´

Gesamtprimer/ sequenzspezifischer Abschnitt forward NT: GC-Gehalt: 50,0%, Tm2: 71°C / GC-Gehalt: 66,7%, Tm1: 66°C reverse NT: GC-Gehalt: 55,3%, Tm2: 75°C / GC-Gehalt: 54,2%, Tm1: 65°C

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P2rx4 C-Terminus (120 bp) forward CT: 5´-TATATA GAATTCC ATGTGTATGAAGAAGAGATACTACTACCGG- 3´ reverse CT: 5´-TATATA GCGGCCGC TCACTGGTCCGTCTCTCC- 3´

Gesamtprimer/ sequenzspezifischer Abschnitt forward CT: GC-Gehalt: 34,9%, Tm2: 69°C / GC-Gehalt: 40,0%, Tm1: 64°C reverse CT: GC-Gehalt: 59,4%; Tm2: 74°C / GC-Gehalt: 61,1%, Tm1: 59°C

Für die Ermittlung der Annealing -Temperaturen wurden für die ersten 5 Zyklen der PCR die Schmelztemperatur des homologen Primerbereiches (Tm1) berechnet und 5°C abgezogen. Für die Berechnung der folgenden 25 Zyklen wurde die Schmelztemperatur der gesamten Primer (Tm2) berechnet und 5°C abgezogen. Für einen PCR-Ansatz wurden 100 µl Gesamtvolumen von folgenden Komponenten eingesetzt:

PCR-Reaktionsansatz Komponente Volumen/Menge Template 1µg DNA oder gepickte Kolonie 10x PCR-Reaktionspuffer 10 l

MgCl 2 (50 mM) 5 µl dNTP-Mix (10 mM) 2 µl Primer forward (100 pM) 1 µl Primer reverse (100 pM) 1 µl Taq-Polymerase (5 U/ l) 1 µl

ddH 2O variabel

PCR-Bedingungen Denaturierung 94°C 5 min Denaturierung 94°C 1 min NT: 61°C Annealing 1 min 5 Zyklen CT: 56°C Elongation 72°C 2 min Denaturierung 94°C 1 min NT: 69°C Annealing 1 min 25 Zyklen CT: 66°C Elongation 72°C 2 min

58 MATERIAL UND METHODEN

Elongation 72°C 7 min Abkühlung 4°C ∞

Agarose-Gelelektrophorese von DNA Zur Auftrennung der DNA-Fragmente wurden 1%ige Agarosegele verwendet, die angelegte Spannung betrug 85 V. Zur Herstellung der Gele und als Laufpuffer wurde 1x Borax-Puffer eingesetzt. Die Agaroselösung wurde vor dem Aushärten mit Ethidiumbromid (0,1 g/ml) versetzt.

Isolierung von DNA aus Agarosegelen Die Identifizierung der DNA-Fragmente erfolgte über die Länge der Konstrukte mittels GeneRuler TM -Größenstandard. Die DNA wurde unter einem UV-Transilluminator (Wellenlänge 365 nm; Biostep) mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und nach Anleitung des Herstellers mit dem JetQuick Gel Extraction Spin Kit eluiert.

Restriktionsverdau Für die Restriktion des Vektors pGex-4T-3 wurden die Enzyme Eco RI und Not I verwendet. Der Restriktionsansatz betrug 50 µl und die Inkubation erfolgte bei 37°C für 1 h.

Restriktionsansatz Eco RI

Komponente Volumen/Menge Vektor pGex-4T-3 10 µg EcoR I (20 U/µl) 0,5 l 10x NEBuffer 3 5 µl

ddH 2O variabel

Der Verdau wurde 20 min bei 65°C inkubiert, um Eco RI zu inaktivieren, und mit dem DNA Clean-Up Kit nach Herstellerangaben aufgereinigt. Der gereinigte, mit Eco RI geschnittene Vektor wurde für 2 h bei 37°C mit Not I in einem 50 µl-Ansatz verdaut.

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Restriktionsansatz Not I

Komponente Volumen/Menge Vektor pGex-4T-3 ( Eco RI geschnitten) 10 µg Not I (10 U/µl) 1 µl 10 x NEBuffer 3 5 µl 100 x BSA 0,5 µl

ddH 2O variabel

Der Verdau wurde 20 min bei 65°C inkubiert, um Not I zu inaktivieren, und mit dem DNA Clean-Up Kit nach Herstellerangaben aufgereinigt. Anschließend wurde die DNA- Konzentration bestimmt (siehe Abschnitt 2.2.3.4).

Ligation Das Gesamtvolumen der Ligationsansätze betrug 20 l. Für die Ligation wurde ein molares Verhältnis von Insert- und Vektor-DNA von 3:1 gewählt.

ng Vektor · kb Insert · molares Verhältnis Insert = ng Insert kb Vektor Vektor

Komponente Volumen/Menge Insert 150 - 300 ng geschnittener pGex-4T-3 Vektor 50 - 100 ng 10x T4 Ligase Puffer 2 µl T4 Ligase (10 U/µl) 1 µl

ddH 2O variabel

Der Ligationsansatz wurde über Nacht bei 16°C inkubiert.

Dialyse Im Vorfeld der Elektroporation wurden 4 l des Ligations- und Kontrollansatzes auf einen auf ® ddH 2O schwimmenden MF-Millipore Membranfilter pipettiert. Die Dialyse erfolgte für 15 min.

60 MATERIAL UND METHODEN

Transformation von E. coli mittels Elektroporation 400 ml LB-Medium wurden mit 4 ml einer Übernachtkultur von E. coli BL21 angeimpft. Diese Hauptkultur wurde bis zu einer OD von ungefähr 0,5 kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien für 15 min auf Eis inkubiert und danach mit 4000 x g, 10 min, bei 4°C zentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen der Bakterien mit kaltem ddH 2O (200 ml und 100 ml) wurde einmal mit 20 ml sterilem 10%igem Glycerin gewaschen. Anschließend wurden der E. coli in 2 ml 10%igem Glycerin aufgenommen, in 40 µl Aliquots aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Bakterien werden bei -80°C gelagert und sind ca. 6 Monate haltbar. Es wurden 40 l elektrokompetente Bakterien ( E. coli BL21) auf Eis aufgetaut, mit 4 l dialysiertem Ligationsansatz versetzt und in eine vorgekühlte Transformationsküvette (ø 0,2 cm, BioRad) überführt. Der elektrische Impuls erfolgte mit dem MicroPulser TM Electroporation Apparatus (BioRad) mit einer Spannung von 2,5 kV, einer Kapazität von 25 µF und einem Widerstand von 200 für 6 ms. Nach der Elektroporation wurden die E. coli mit 1 ml vorgewärmtem SOC-Medium versetzt und für 1 h bei 37°C auf einen Schüttler inkubiert. Im Anschluss wurden die E. coli auf LB-Agarplatten mit Ampicillin ausplattiert.

Sequenzierung Zur Sequenzierung wurden die DNA-Proben beim Max-Planck-Institut (MPI) für Entwicklungsgenetik, Dresden, eingereicht. Die eingesetzten Mengen an DNA und Primern richteten sich nach den Vorgaben des MPI. pGex3´-Primer: 5´-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3´ pGex5´-Primer: 5´-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3´

Expression und Aufreinigung aus E. coli Um die Formation von Einschlusskörpern zu verhindern wurde das 2x YTA-Medium mit D- Sorbitol und Betainhydrochlorid versetzt. 3 ml einer frischen Übernachtkultur wurden zu 300 ml 2x YTA-Medium gegeben und bis zum Erreichen einer OD von 0,5 bei 37°C kultiviert. Danach wurde mit 0,1 mM IPTG die Expression der Fusionsproteine induziert und die Kulturen für 45 min bei 25°C kultiviert. Die Zellen wurden bei 3000 x g und 4°C für 10 min (Zentrifuge: Hereaus Biofuge primo R,

61

Rotor:#7590) abzentrifugiert, in 6 ml eiskaltem PBS mit 1% Triton X-100 und 1 mM PMSF resuspendiert und für 15 min auf Eis inkubiert. Danach wurden 10 µg/ml Lysozym zur Bakteriensuspension gegeben. Die E. coli wurden 15 min bei 37°C inkubiert und mit einer French Press (dreimal 100 MPa) vollständig lysiert. Das Lysat wurde bei 4000 x g und 4°C für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in Resuspensionspuffer aufgelöst. Von beiden Fraktionen wurde ein Aliquot abgenommen und bei -20°C eingefroren. 250 µl GST-Sepharose 4B (75% Suspension) wurden in ein Eppendorfgefäß überführt und bei 500 x g und 4°C für 5 min sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt und dreimal mit 1 ml eiskaltem Bindepuffer gewaschen. Anschließend wurde die Sepharose in 375 µl Bindepuffer resuspendiert (50% Suspension) und bis zu einem Monat bei 4°C gelagert. Zum abzentrifugierten Überstand der Bakteriensuspension wurden 120 µl GST-Sepharose 4B (50% Suspension) gegeben und für 2 h bei 4°C auf einem Drehrad inkubiert. Danach wurde die Sepharose bei 500 x g und 4°C für 5 min sedimentiert, der Überstand entfernt und dreimal mit 1 ml Bindepuffer gewaschen. Die GST- Fusionsproteine wurden mit Hilfe von 120 µl Elutionspuffer von den GST-Sepharose beads verdrängt und über eine Sephadex TM G-25M- Säule nach Angaben des Herstellers mit 1x TBS gereinigt. Danach erfolgte eine Proteinbestimmung mit dem BCA TM Proteinassay Kit , wie in Abschnitt 2.2.2.7 beschrieben.

2.2.4.6 In vitro Membranlipid-Bindeassay Die Bindung von GST-P2X Fusionsproteinen an Membranlipide wurde mit Hilfe von in speziellen Membranen immobilisierten Membranlipiden untersucht. Diese Membranlipid- Streifen wurden mit 1x TBS + 3% BSA 60 min bei RT blockiert und anschließend über Nacht

TM bei 4°C mit 1 µg/ml GST-P2X Fusionsprotein oder GST-PI(4,5)P 2 Grip Protein (N-terminal GST-gekoppelte, rekombinante PLC-δ1 PH Domäne) oder nur GST in 1x TBS + 3% BSA

TM inkubiert. GST-PI(4,5)P 2 Grip Protein wurde als Positivkontrolle genutzt, während GST als Negativkontrolle fungierte. Nach dem Waschen mit 1x TBS (dreimal 5 min) wurden die Membranlipid-Streifen mit in 1x TBS + 3% BSA verdünntem anti-GST Antikörper für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurden sie dreimal 5 min mit 1x TBS-T gewaschen, 45 min bei RT mit HRP-gekoppelten, sekundären Antikörper inkubiert, nochmals dreimal 5 min mit 1x TBS-T gewaschen und anschließend analysiert. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

62 MATERIAL UND METHODEN

2.2.4.7 Herstellung von short hairpin (sh)RNA Zur Unterdrückung der P2XR Expression wurden shRNA-Konstrukte genutzt, die spezifische, gegen die P2rx4 und P2rx7 mRNA gerichtete Abschnitte enthält. Die shRNA ist eine kurze doppelsträngige RNA, welche in der Zelle von einem RNA-silencing Mechanismus erkannt wird. Dabei zerschneidet eine Dicer genannte Ribonuklease die doppelsträngige shRNA in 18 bis 21 Nukleotide lange Fragmente. Diese siRNA ( small interference RNA) bildet mit einer Endonuklease den RISC-Komplex (RNA-Induced Silencing Complex ). Der RISC-Komplex bindet spezifisch an die Ziel-mRNA ( P2X mRNA) und führt zu deren Abbau. Aus der mRNA-Sequenz des P2rx4 ( mus musculus/ NM_011026) und P2rx7 (mus musculus/ NM_011027) wurden mit Hilfe der Software „RNAi Explorer “ (von Gene Link , http://www.genelink.com/sirna/shrnai.asp) verschiedene shRNA-Konstrukte erzeugt. Diese Konstrukte bestehen aus einer 18 bis 21 Nukleotide langen, zur P2rx mRNA homologen Sequenz, einer 7 Nukleotide langen Spacer-Sequenz, gefolgt von der komplementären und invertierten P2rx mRNA homologen Sequenz und 6 Thymin-Nukleotiden. Die Enden sind mit den entsprechenden Überhängen für eine Ligation in den Esp 3I und Xba I geschnittenen Vektor versehen. Eine kurze TA Sequenz an den Enden soll die Effizienz der shRNA erhöhen. Folgende shRNA-Konstrukte wurden verwendet:

P2X4RshRNA

1 (s) 5´- TTTG CATTACCACCTCCTACCTCAA TTCAAGA TTGAGGTAGGAGGTGGTAATG CTTTTTT -3´ (as) 3´- GTAATGGTGGAGGATGGAGTT AAGTTCT AACTCCATCCTCCACCATTAC GAAAAAAGATC -5´

2 (s) 5´- TTTG TTACCACCTCCTACCTCAAGT TTCAAGA ACTTGAGGTAGGAGGTGGTAA CTTTTTT -3´ (as) 3´- AATGGTGGAGGATGGAGTTCA AAGTTCT TGAACTCCATCCTCCACCATT GAAAAAAGATC -5´

3 (s) 5´- TTTG GCACACTCACCAAGGCATATG TTCAAGA CATATGCCTTGGTGAGTGTGC CTTTTTT -3´ (as) 3´- CGTGTGAGTGGTTCCGTATAC AAGTTCT GTATACGGAACCACTCACACG GAAAAAAGATC -5´

P2X4RscshRNA

1 (s) 5´- TTTG CTCCCCTCAACCTAACACTAT TTCAAGA ATAGTGTTAGGTTGAGGGGAG CTTTTTT -3´ (as) 3´- GAGGGGAGTTGGATTGTGATA AAGTTCT TATCACAATCCAACTCCCCTC GAAAAAAGATC-5´

2 (s) 5´- TTTG CTGCCCTTCCCTACCAATAAT TTCAAGA ATTATTGGTAGGGAAGGGCAG CTTTTTT -3´ (as) 3´- GACGGGAAGGGATGGTTATTA AAGTTCT TAATAACCATCCCTTCCCGTC GAAAAAAGATC-5´

3 (s) 5´- TTTG GAACGACCACTCCGGATCATA TTCAAGA TATGATCCGGAGTGGTCGTTC CTTTTTT -3´ (as) 3´- CTTGCTGGTGAGGCCTAGTAT AAGTTCT ATACTAGGCCTCACCAGCAAG GAAAAAAHATC-5´

63

P2X7RshRNA

1 (s) 5`- TTTG AGCCATGTTCTCTGACTTCCA TTCAAGA TGGAAGTCAGAGAACATGGCT CTTTTTT -3´ (as) 3´- TCGGTACAAGAGACTGAAGGT AAGTTCT ACCTTCAGTCTCTTGTACCGA GAAAAAAGATC -5´

2 (s) 5`- TTTG TGACGAAGTTAGGACACAGCA TTCAAGA TGCTGTGTCCTAACTTCGTCA CTTTTTT - 3´ (as) 3´- ACTGCTTCAATCCTGTGTCGT AAGTTCT ACGACACAGGATTGAAGCAGT GAAAAAAGATC -5´

3 (s) 5`- TTTG CTACAACTTCAGATATGCCAA TTCAAGA TTGGCATATCTGAAGTTGTAG CTTTTTT – 3´ (as) 3´- GATGTTGAAGTCTATACGGTT AAGTTCT AACCGTATAGACTTCAACATC GAAAAA AGATC -5´

P2X7RscshRNA

1 (s) 5`- TTTG GTTCGCTCATCCCGATTTACA TTCAAGA TGTAAATCGGGATGAGCGAAC CTTTTTT – 3´ (as) 3´- CAAGCGAGTAGGGCTAAATGT AAGTTCT ACATTTAGCCCTACTCGCTTG GAAAAAAGATC-5´

2 (s) 5`- TTTG GAGCAACGGGATCGATACAAT TTCAAGA ATTGTATCGATCCCGTTGCTC CTTTTTT– 3´ (as) 3´- CTCGTTGCCCTAGCTATGTTA AAGTTCT TAACATAGCTAGGGCAACGAG GAAAAAAGATC-5´

3 (s) 5`- TTTG GACCAACTTCATTCGAAATCA TTCAAGA TGATTTCGAATGAAGTTGGTC CTTTTTT– 3´ (as) 3´- CTGGTTGAAGTAAGCTTTAGT AAGTTCT ACTAAAGCTTACTTCAACCAG GAAAAAAGATC-5´

Die shRNA-Konstrukte wurden als 64 bis 66 lange Einzelstrang-Nukleotide bei der Firma

Sigma-Aldrich bestellt und nach Herstellerangaben in ddH 2O resuspendiert.

Polymerasekettenreaktion In dieser Arbeit erfolgte die Überprüfung transfizierter Klone auf ein positives Insert mittels PCR. Die Primer wurden so gewählt, dass sie die verwendete Esp 3I/ Xba I cloning site einschließen. Bei einer erfolgreichen Ligation wird demzufolge zusätzlich das Insert amplifiziert, was in einem größeren PCR-Produkt verglichen mit einem Vektor ohne Insert resultiert. Für die PCR wurden Einzelkolonien gepickt und in den PCR-Ansatz gegeben.

Es wurden folgende Primer verwendet: U6-Promotor forward: 5` - CAGCACAAAAGGAAACTCACC - 3` LentiLox reverse: 5` - ACCTGCTGGAATCTCGTGAA - 3`

Der PCR-Reaktionsansatz betrug 20 µl und wurde mit dem BIOTAQ  DNA Polymerase Kit durchgeführt.

64 MATERIAL UND METHODEN

PCR-Reaktionsansatz

Komponente Volumen/Menge Template gepickte Kolonie

10 x NH 4 Reaktionspuffer 2 µl

MgCl 2 (50 mM) 0,5 µl dNTP-Mix (10 mM) 0,4 µl Primer, forward (100 pmol/µl) 0,2 µl Primer, reverse (100 pmol/µl) 0,2 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,2 µl

ddH 2O 16,5 µl

PCR-Bedingungen

Denaturierung 95 °C 5 min 1 Zyklus

Denaturierung 95 °C 45 s Annealing 55°C 30 s 32 Zyklen Elongation 72 °C 30 s

Elongation 72 °C 8 min 1 Zyklus Abkühlung 4 °C ∞

Die PCR-Produkte wurden in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.

Restriktionsverdau und Dephosphorylierung des Plasmides Das Plasmid wurde zur Vorbereitung für die Ligation mit Restriktionsenzymen geschnitten und die entstandenen Enden anschließend dephosphoryliert. Der Verdau des Vektors pLL3.7 mit Esp 3I erfolgte über Nacht bei 37°C. Der Restriktionsansatz betrug 50 µl.

Restriktionsansatz Esp 3I

Komponente Volumen/Menge Vektor pLL3.7 ESP 10 µl Esp 3I (10 U/µl) 2 µl 10 x Puffer γ/Tango 5 µl DTT (10 mM) 5 µl

ddH 2O variabel

65

Der Verdau wurde mit dem DNA Clean-Up Kit nach Herstellerangaben aufgereinigt. Der gereinigte, mit Esp 3I geschnittene Vektor wurde für 2,5 h bei 37°C mit Xba I verdaut.

Restriktionsansatz XbaI

Komponente Volumen/Menge Vektor pLL3.7 ESP (Esp 3I geschnitten) 30 µl Xba I 2 µl 10x Puffer γ/Tango 5 µl

ddH 2O 13 µl

Nach dem Verdau wurde der gesamte Ansatz mit der Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) dephosphoryliert.

Dephosphorylierungsansatz

Komponente Volumen/Menge Vektor pLL3.7 ESP ( Esp 3I/ Xba I) 50 µl 10x SAP-Puffer 7 µl SAP (1 U/µl) 16 µl

Die Dephosphorylierung erfolgte für 30 min bei 37°C. Zur Inaktivierung der Phosphatase wurde der Ansatz anschließend für 20 min bei 65°C inkubiert. Der gesamte Dephosphorylierungsansatz wurde auf ein 1%iges Agarose-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die Vektorbanden wurden ausgeschnitten und mit Hilfe eines JetQuick Gel Extraction Spin Kit nach Herstellerangaben extrahiert. Nach der Bestimmung der DNA-Konzentration konnte der geschnittene Vektor für die Ligation eingesetzt werden.

Annealing der shRNA-Oligonukleotide Es wurden je 2 µl der komplementären, einzelsträngigen Oligonukleotide in 46 µl Annealing Puffer gegeben und für 4 min bei 95°C inkubiert. Danach wurde das Nukleotidgemisch für 10 min bei 70°C inkubiert und anschließend über einen Zeitraum von 3 h bei RT langsam abgekühlt. Die doppelsträngigen shRNA-Nukleotide wurden bei -20°C gelagert.

66 MATERIAL UND METHODEN

Phosphorylierung der shRNA-Oligonukleotide Die doppelsträngigen shRNA-Oligonukleotide wurden für die Ligation an den 5`-Enden phosphoryliert. Der Ansatz ist für 30 min bei 37°C inkubiert worden. Zur Inaktivierung der Polynukleotid-Kinase wurde der Ansatz 10 min bei 70°C erhitzt.

Phosporylierungsansatz

Komponente Volumen/Menge Doppelsträngige shRNA 5 µl T4 Ligase Puffer (enthält 1 mM ATP) 2 µl T4 Polynukleotid Kinase 1 µl

ddH 2O 12 µl

Ligation Die phosphorylierten shRNA-Konstrukte wurden in den geschnittenen und dephosphorylierten pLL3.7 ESP Vektor ligiert. Der Ansatz von 20 µl wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Der frisch ligierte Vektor wurde für eine Hitzeschocktransformation in E. coli verwendet.

Ligationsansatz

Komponente Volumen/Menge Phosphorylierte shRNA-Konstrukte 5 µl Geschnittener pLL3.7 ESP Vektor 50 – 100 ng T4 Ligase Puffer 2 µl T4 Ligase (10 U/µl) 1 µl

ddH 2O variabel

Hitzeschocktransformation In dieser Arbeit ist mit einem chemisch kompetenten E. coli Stamm JM109 gearbeitet worden, welcher DNA durch Hitzeschock aufnehmen kann. 2 ml einer E. coli-Übernachtkultur wurden in 200 ml LB-Medium mit Ampicillin gegeben und bei 37°C bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,3 kultiviert. Die Bakterien wurden 30 min

67

auf Eis inkubiert und anschließend bei 2500 rpm und 4°C für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 80 ml Transformationspuffer resuspendiert und bei 3500 rpm und 4°C für 10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet wurde in 8 ml Transformationspuffer resuspendiert und 15 min auf Eis inkubiert. Die E. coli -Suspension wurde aliquotiert, schockgefroren und bei -80°C gelagert. Für die Transformation wurden diese kompetenten Bakterien auf Eis aufgetaut. 100 µl Bakteriensuspension wurden mit 10 µl Ligationsansatz vermischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein Hitzeschock bei 42°C für 2 min. Der Ansatz wurde für 5 min auf Eis inkubiert, anschließend mit 900 µl vorgewärmten SOC-Medium vermischt und für 2 h bei 37°C geschüttelt. 50 µl, 100 µl und 300 µl Bakteriensuspension wurden auf vorgewärmte Agarplatten mit Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt und mittels PCR auf ein shRNA-Insert überprüft.

Sequenzierung des Inserts Klone, die nach der PCR ein Insert der richtigen Größe aufwiesen, wurden zur Kontrolle zur Sequenzierung eingeschickt (Max-Planck-Institut für Entwicklungsgenetik, Dresden). Die Plasmid-DNA wurde mittels Minipräparation aus den positiven Klonen isoliert und nach Angaben der MPI-Sequenzierabteilung mit den Sequenzierprimern verdünnt .

Es wurden folgende Sequenzierprimer verwendet: U6-Promotor forward: 5` - CAGCACAAAAGGAAACTCACC - 3` LentiLox reverse: 5` - ACCTGCTGGAATCTCGTGAA - 3`

Die Sequenzierergebnisse wurden mit den ursprünglichen shRNA Sequenzen abgeglichen. Nur Klone mit unverändertem und mutationsfreiem shRNA-Insert wurden für die Viruspräparation genutzt.

2.2.4.8 Erzeugung von Lentiviren Um die P2X Proteinexpression in den E10-Zellen zu unterdrücken, wurde die shRNA mittels Lentiviren in die Zellen eingebracht. Lentiviren gehören zu den Retroviren. Sie können auch nicht teilungsaktive Zellen transfizieren und integrieren ihr virales Genom stabil in das Wirts- Genom.

68 MATERIAL UND METHODEN

Das verwendete Lentilox-System besteht aus einem speziell für das Einbringen von RNAi konzipierten Transfer-Vektor (pLL3.7 ESP), einem Plasmid für die Verpackung der shRNA und einem Plasmid zur Herstellung der Virushülle (Naldini et al., 1996). Die in den Transfer- Vektor ligierte shRNA steht unter der Kontrolle eines U6-Promotors. EGFP wird koexprimiert, so konnte die Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft werden.

Transfektion der HEK293T Zellen Alle Arbeiten mit Viren sind im S2 Bereich durchgeführt worden. Die 293T-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion auf 10 Kulturschalen (10 x 15 cm) ausgesät (1,4·10 7 Zellen in 20 ml Medium pro Kulturschale). Am nächsten Tag wurden vor der Transfektion pro Kulturschale 5 ml Medium abgenommen und die Lösungen A und B wie folgt angesetzt:

Lösung A Komponente Volumen/Menge Transferplasmid Lentilox 3.7 pLL3.7 ESP 23 µg/Kulturschale Verpackungsplasmid pCMV-∆R8.74 23 µg/Kulturschale Hüllplasmid pMD2.G 11,5 µg/Kulturschale Totales Volumen in DMEM 1,725 ml/Kulturschale ohne FKS, mit L-Glutamin Lösung B Komponente Volumen/Menge PEI Lösung (100 µg/ml) 172,5 µl/Kulturschale Totales Volumen in DMEM 1,725 ml/Kulturschale ohne FKS, mit L-Glutamin

Lösungen A und B wurden 30 min bei RT inkubiert, anschließend gemischt und für weitere 15 min bei RT inkubiert. Das Gemisch wurde tropfenweise in die Kulturschale gegeben. Nach 16 h wurde das Medium durch 20 ml frisches Medium ersetzt. Am nächsten Tag wurde das Virus aus dem Überstand geerntet. Das Medium wurde abgenommen und bei 3000 rpm für 10 min bei RT zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Zur vollständigen Entfernung von Zelltrümmern wurde der Überstand zusätzlich filtriert (0,45 nm, PVDF-Filter). Durch Ultrazentrifugation bei 25000 rpm und 4°C für 1,5 h (Sorvall: SW40 Rotor) wurde das Virus

69

pelletiert, danach der Überstand verworfen und das Viruspellets in 100 µl PBS + 1% BSA (steril) aufgenommen. Nach der Inkubation von 1 h bei 4°C wurde das Virus vollständig durch auf- und abpipettieren resuspendiert, aliquotiert und bei -80°C gelagert.

2.2.4.9 HIV-1 p24 Antigen ELISA Zur quantitativen Bestimmung des Virusgehaltes wurde ein ELISA nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Dabei wurde das p24-Antigen auf der Hülle der hergestellten Viren nachgewiesen. Die in PBS/BSA gelösten Viren wurden dafür 1:50000 und 1:100000 mit assay diluent (Kit-Komponente) verdünnt und Doppelbestimmungen angesetzt. Durch den mitgeführten p24-Antigen-Standard konnte die Konzentration der hergestellten Viren in pg/ml ermittelt werden. 1 pg/ml entspricht 10 transfection units (TU)/ml.

2.2.4.10 Replikationstest mit X-Gal-Färbung (Price et al., 1987) 208F-Zellen und P4 HeLa-Zellen wurden jeweils 8 h vor der Transduktion bzw. der Übertragung des Überstandes mit 8·10 5 Zellen/Well in 6-Well-Platten ausgesät. Zu kultivierten 208F-Zellen wurden 2 µl frisch präparierter Virus gegeben. Nach einer

Inkubationszeit von vier Tagen bei 37°C und 7,5% CO2 wurden 500 µl Medium auf frisch ausgesäte 208F-Zellen gegeben. Dies wurde nach drei Tagen wiederholt. Nach weiteren vier Tagen wurden 500 µl Medium der 208F-Zellen auf frisch ausgesäte P4 HeLa-Zellen gegeben und drei Tagen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 1x PBS gewaschen, mit 4% PFA in TBS fixiert und nochmals mit 1x PBS gewaschen. Anschließend wurde die fixierten Zellen mit X-Gal-Färbelösung (500 µl/Well) für 18 h bei 37°C inkubiert.

2.2.4.11 Virale Transfektion von E10-Zellen E10-Zellen wurden in einer Konzentration von 6·10 4 Zellen/Well in einer 12-Wellplatte ausgesät. Am nächsten Tag wurde die shRNA lentiviral in die subkonfluenten E10-Zellen transduziert. Dazu wurde für jedes Well das entsprechende Virus (10 TU/Zelle) mit 500 µl Medium (FKS-frei) angesetzt. Für die Kontrolle wurden 500 µl Medium (FKS-frei) ohne

Virus verwendet. Nach einer Inkubationszeit von 1 h bei 37°C und 7,5% CO 2 wurden 2 ml Komplettmedium zugegeben. Nach 16 h erfolgte ein Mediumwechsel mit Komplettmedium. Die Zellen wurden weitere 48 h kultiviert und anschließend für Western Blot-Analysen aufgearbeitet. Alle Arbeiten sind im S2 Bereich durchgeführt worden.

70 MATERIAL UND METHODEN

Zellernte für Western Blot Zur Ernte der mit Virus transfizierten Zellen wurde das Medium abgesaugt, zweimal mit PBS gewaschen und 50 µl Probenpuffer in jedes Well gegeben. Anschließend wurden die Zellen mittels einer Pipettenspitze in Probenpuffer abgeschabt und lysiert. Das Zelllysat wurde für 10 s mit Ultraschall (Zyklus: 0,7; Amplitude: 70%) behandelt und danach für 5 min bei 95°C aufgekocht. Die Proteinbestimmung der Proben erfolgte mittels der Amidoschwarz-Methode (siehe Abschnitt 2.2.2.6). Die Proben wurden bei -20°C gelagert oder direkt für die SDS- PAGE eingesetzt.

Quantitative Auswertung Die durch Western Blot-Analyse erhaltenen, relativen Signalintensitäten der untersuchten Proteine wurden mit dem Programm ScienceLab2003 ImageGauge Version 4.23 (Fujifilm) quantifiziert. Der Hintergrund der Membran diente als Leerwert und wurde von allen Proteinsignalen subtrahiert. Die Signalintensitäten der untersuchten Proteine wurden auf die jeweiligen Signalintensitäten des internen Standardproteins γ-Tubulin bezogen. Die Änderung im Proteingehalt wurde in Prozent angegeben, wobei die Ergebnisse der Kontrollexperimente auf 100% normiert wurden.

Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels der einseitigen Varianzanalyse (ANOVA). Bei erreichter Signifikanz wurde anschließend ein posthoc Bonferroni-Test durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL) durchgeführt. Die Signifikanz wurde für signifikant * p<0,05 und hochsignifikant ** p<0,01 angezeigt. Die dargestellten Daten sind aufzufassen als Mittelwerte ± Standardabweichung.

2.2.4.12 Überexpression der mP2XR in E10-Zellen

Transfektion für Western Blot-Analysen Die Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit einer Zelldichte von 6·10 4 Zellen/Well in 12-Wellplatten ausgesät. Mit Hilfe des Transfektionsreagenz FuGENE® HD wurde die Transfektion nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Dabei wurden das Transfektions- reagenz und die DNA im Verhältnis 7:2 eingesetzt.

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Transfektionsansatz pro Well: Komponente Volumen/Menge OPTI-MEM 30 µl DNA (pAcGFP1-N1-P2X4Ra, 0,6 µg pAcGFP1-N1-P2X7R) FuGENE ® HD 2 µl

Der Ansatz wurde 15 min bei RT unter einer Sterilbank inkubiert und anschließend tropfenweise auf die mit 500 µl Komplettmedium bedeckten Zellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 48 h erfolgte die Aufarbeitung der Zellen wie unter Abschnitt 2.2.2.5 beschrieben.

Transfektion für Immunfluoreszenzanalysen Für die Transfektion wurden die E10-Zellen mit einer Zelldichte von 6·10 4 Zellen/Well auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläschen in 12-Wellplatten ausgesät. Die Transfektion erfolgte wie unter 2.2.5.12 erläutert. Nach der Inkubationszeit von 48 h wurden die Deckgläschen mit Methanol/Aceton fixiert (siehe Abschnitt 2.2.3.2).

72

3 E RGEBNISSE

3.1 Nachweis der purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R im Lungengewebe der Maus und in der Alveolarepithelzelllinie E10

Zunächst wurden die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R im Lungengewebe von C57BL/6 Wildtyp Mäusen und der Alveolarepithelzelllinie E10 nachgewiesen. Dafür wurde das Lungengewebe der Mäuse in 1% Triton X-100 lysiert und die solubilisierten Proteine über ein 12%iges SDS-Gel aufgetrennt. Die Immundetektionen ergaben ein Molekulargewicht von ~62 kDa für P2X4R sowie ~80 kDa und ~55 kDa für P2X7R (Abb. 12).

73

Modellsystem genutzt (Kathuria et al., 2004). Die E10-Zellen exprimieren P2rx4 und P2rx7 sowie die Caveoline cav-1 und cav-2 (Daten nicht gezeigt). Die Western Blot-Analyse zeigte, dass in den E10-Zellen mit dem P2X4R-Antikörper eine zusätzliche Proteinbande von ~38 kDa auftrat, welche im Lungengewebe der Maus nicht nachweisbar war (Barth et al., 2008). In einem parallelen Ansatz wurde zum P2X4R- Antikörper das entsprechende Antigen gegeben. Die spezifischen Antikörper-Bindestellen wurden durch das Antigen abgesättigt und anschließend konnte nur die unspezifisch auftretende Proteinbande immundetektiert werden (Abb. 13). Daraus ergab sich für die folgenden Untersuchungen, dass fluoreszenz-mikroskopische Ergebnisse stets durch biochemische Methoden mit anschließender Western Blot-Analyse verifiziert werden mussten, da die Fluoreszenzsignale der beiden Proteine nicht differenziert werden können. Die Ergebnisse der P2X7R-Immundetektion in den E10-Zellen entsprachen den Daten des Lungengewebes. P2X7R wurde immunologisch bei ~80 kDa und ~55 kDa nachge- wiesen (Abb. 13). Nach der Inkubation mit dem P2X7R-Antikörper-Antigen-Gemisch konnten die beide Proteine nicht detektiert werden, d. h. die P2X7R-Proteine werden spezifisch durch den Antikörper erkannt (Barth et al., 2007).

Abb. 13: Immunologischer Nachweis von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen 50 µg Protein wurden in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und die Proteine P2X4R und P2X7R mit entsprechenden Antikörpern immunologisch nachgewiesen. Ergänzend wurde die Spezifität der P2XR-Antikörper mit Hilfe der entsprechenden Antigene (Ag) überprüft.

Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse zum P2X7R im Lungengewebe und der Alveolarepithelzelllinie E10 beziehen sich auf den N-glykosylierten P2X7R mit einem molekularen Gewicht von 80 kDa (Barth et al., 2007; Barth et al., 2008; Weinhold et al., 2010).

74 ERGEBNISSE

3.2 Untersuchungen zur Lokalisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen

3.2.1 Assoziation von P2X4R und P2X7R mit DRMs

Die Caveolen sind Mikrodomänen in der Zellmembran und durch ihre Unlöslichkeit in nicht- ionischen Detergenzien gekennzeichnet . Sowohl P2X4R als auch P2X7R weisen C-terminal potentielle Bindesequenzen für das Hauptstrukturprotein der Caveolen, das Cav-1, auf. Um die mögliche Assoziation von P2X7R und P2X4R mit diesen DRMs charakterisieren zu können, wurde zuerst das Löslichkeitsverhalten der P2XR in den nicht-ionischen Detergenzien Triton X-100 und Brij 35 untersucht. Diese Detergenzien denaturieren Proteine im Gegensatz zu SDS nicht und werden zur Solubilisierung von DRMs eingesetzt. Mit Triton X-100 und Brij 35 können DRMs isoliert werden, die sich in ihrer Protein- und Lipidzusammensetzung voneinander unterscheiden (Pike, 2004). Cav-1 wurde als Kontrollprotein mitgeführt und kennzeichnet die Fraktionen, welche die Detergenzien- unlöslichen Zellbestandteile enthalten. Die Ergebnisse der Löslichkeitsuntersuchungen zeigten, dass P2X4R in 1% Brij 35 nahezu unlöslich war (Abb. 14, A), was mit dem Löslichkeitsverhalten von Cav-1 überein- stimmte. Dagegen wurde der überwiegende Anteil von P2X7R durch Brij 35 aus den E10-Zellen gelöst (Abb. 14, A). Nur eine Subpopulation von P2X7R verhielt sich wie Cav-1. Die beiden P2XR wiesen in Gegenwart von Brij 35 und Triton X-100 ein divergentes Löslichkeitsverhalten auf. Die Löslichkeit von P2X4R und P2X7R ist in Triton X-100 höher als in Brij 35. Mit Triton X-100 konnte P2X4R zum überwiegenden Teil und P2X7R nahezu vollständig solubilisiert werden (Abb. 14, B). Jedoch ist eine Subpopulation von P2X4R, wie auch Cav-1, resistent gegen die Solubilisierung mit Triton X-100.

A 1% Brij 35 B 1% Triton X-100

Abb. 14: Löslichkeit von P2X4R und P2X7R in nicht-ionischen Detergenzien. E10-Zellen wurden in 1% Brij 35 ( A) oder 1% Triton X-100 ( B) lysiert. Die Proteine der löslichen und unlöslichen Fraktion (je 30 µl) wurden in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit spezifischen Antikörpern gegen P2X4R, P2X7R und Cav-1 immundetektiert.

75

Die Löslichkeitsuntersuchungen zeigten, dass P2X4R mit einer Teilpopulation von P2X7R und Cav-1 in Brij 35-resistenten Zellbestandteilen nachweisbar war. Zusätzlich sind Cav-1 und ein Teil von P2X4R unlöslich in Triton X-100. Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass die P2XR in den E10-Zellen teilweise mit verschiedenen DRMs assoziiert sind. DRMs sind aufgrund ihrer Lipid-Zusammensetzung nicht nur resistent gegenüber nicht- ionischen Detergenzien, sondern besitzen auch eine geringere Dichte als andere Membranfragmente und Zellbestandteile. Aus diesem Grund können die DRMs durch eine Dichtegradientenzentrifugation von den übrigen Zellfragmenten abgetrennt werden. Um die Assoziation der P2XR mit DRMs nachzuweisen, wurden die E10-Zellen in Triton X-100 oder Brij 35 lysiert und die resistenten Zellbestandteile in diskontinuierlichen Saccharose- Dichtegradienten durch eine Ultrazentrifugation aufgetrennt. Mit dem Nachweis des Transferrin-Rezeptors (TfR), des β-Coatomer Proteins ( β-cop) und der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) wurde die Qualität der separierten DRMs überprüft. Der TfR wird vorwiegend in Membranabschnitten außerhalb von DRMs nachgewiesen und dient als Markerprotein für den unstrukturierten Bereich der Zellmembran. β-cop ist eine Untereinheit des Coatomer-Komplexes COPI, welcher an Transportvorgängen zwischen endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat beteiligt ist. Es wurde als Markerprotein für Golgi-assoziierte Membranen eingesetzt. PDI ist essenziell für die Proteinfaltung und im Lumen des ER lokalisiert. Nach der Auftrennung der Detergenzien-resistenten Zellbestandteile sollten diese Kontrollproteine in den Fraktionen höherer Dichte nachweisbar sein und nicht mit Cav-1 co-migrieren. Cav-1 flotiert in die Fraktionen mit geringer Dichte und kennzeichnet die Fraktionen, welche die isolierten Caveolen bzw. DRMs enthalten. Die Ergebnisse der Dichtegradientenzentrifugation nach der Solubilisierung mit 1% Brij 35 zeigten, dass P2X4R hauptsächlich in den Fraktionen geringer Dichte (2 bis 4) nachweisbar war. Das Sedimentationsprofil von P2X4R entsprach dabei dem von Cav-1, wobei beide Proteine insbesondere in den Fraktionen 3 und 4 angereichert waren (Abb. 15). Auch ein geringer Anteil von P2X7R konnte in diesen Fraktionen nachgewiesen werden, jedoch migrierte P2X7R vorwiegend in die Fraktionen höherer Dichte (9 bis 13) (Abb. 15). Die Kontrollproteine β-cop und PDI wurden ebensfalls in diesen Fraktionen nachgewiesen. Der TfR co-sedimentierte teilweise mit Cav-1 in den Fraktionen 3 und 4 sowie mit β-cop und PDI in den Fraktionen 9 bis 13.

76 ERGEBNISSE

Abb. 15: Verteilung von P2X4R und P2X7R in den Fraktionen eines Dichtegradienten nach Solubilisierung mit Brij 35.

E10-Zellen wurden in 1% Brij 35 lysiert und die DRMs in einem Saccharose-Dichtegradienten separiert. Die Proteine (je 25 µl) jeder Fraktion (1-13) wurden in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt, auf eine PVDF- Membran transferiert und die Verteilung von P2X4R, P2X7R und Cav-1 sowie den Transferrin-Rezeptor (TfR), β-cop und PDI mit entsprechenden Antikörpern untersucht. 1 = Fraktion geringster Dichte, 13 = Fraktion höchster Dichte.

Durch den Nachweis des TfR, dem Kontrollprotein für die Membranbereiche außerhalb von DRMs, in den Fraktionen niedriger Dichte entstand der Eindruck, dass die Qualität der isolierten DRMs nicht den Anforderungen entsprach. Aufgrund der unterschiedlichen Solubilisierungseigenschaften von Triton X-100 und Brij 35 besitzen die solubilisierten Mikrodomänen jedoch eine variierende Lipid- und Proteinzusammensetzung (Pike, 2004). Aufgrund dessen bestand die Möglichkeit, dass der TfR eventuell über Mittlerproteine mit den DRMs assoziiert war. Zum Nachweis, dass die Brij 35-resistenten Mikrodomänen mit Cholesterol und Sphingolipiden angereichert sind und somit eine DRM-charakteristische Lipidzusammensetzung besitzen, wurden die Lipide der 13 Dichtegradientenfraktionen mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie untersucht. Dafür wurden die Lipide aus den Fraktionen extrahiert, aufkonzentriert und auf eine Kieselgelplatte getüpfelt. Nach der chromatographischen Auftrennung wurden die Lipide visualisiert und die Ergebnisse zeigten, dass die Fraktionen niedriger Dichte 2 und 3 Cholesterol (Chol), Ceramide (Cer, GlcCer) und Sphingomyelin (SM), aber ebenso Phospholipide, wie Phosphatidylethanolamin (PE), enthielten (Abb. 16).

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Abb. 16: Dünnschichtchromatographische Auftrennung der Lipide aus den Fraktionen eines Dichtegradienten nach der Solubilisierung mit Brij 35.

Aus den Fraktionen (1-13) eines Dichtegradienten wurden die Lipide extrahiert, komplett auf eine Kieselgel- Dünnschichtplatte getüpfelt und chromatographisch getrennt. Als Standards (St) wurden Cholesterol (Chol), Phosphatidylethanolamin (PE), Sphingomyelin (SM) mitgeführt. Gekennzeichnet wurden weiterhin das Ceramid (Cer) und Glykoceramid (GlcCer).

Folglich waren die Brij 35-resistenten DRMs mit Cholesterol und Sphingolipiden angereichert. Sie wiesen jedoch auch Phospholipide, vermutlich aus der inneren Membranschicht und der DRM-Randbereiche auf. Ein Grund dafür könnte die weniger stringente Wirkung von Brij 35 im Vergleich zu Triton X-100 sein. Zudem bleiben durch die Solubilisierung mit Brij 35 mehr Lipid-Protein-Interaktionen erhalten als nach der Lyse mit Triton X-100 (Barth et al., 2009). Die Lipidzusammensetzung der mit Triton X-100 solubilisierten DRMs wurde bereits untersucht und ergab, dass Cholesterol in Fraktionen 2 und 3 angereichert, aber auch in den Fraktionen 7 bis 13 nachweisbar war (Diplomarbeit R. Bläsche, 2008). Nach der Solubilisierung mit 1% Triton X-100 co-migrierten Cav-1 und eine Subpopulation von P2X4R in die Fraktionen 2 und 3 (Abb. 17). Jedoch wurde der überwiegende Anteil von P2X4R gemeinsam mit P2X7R in den Fraktionen 7 bis 13 detektiert. P2X7R flotierte im Gegensatz zur Solubilisierung mit Brij 35 nicht in die Fraktionen niedriger Dichte, sondern war gemeinsam mit den Kontrollproteinen TfR, β-cop und PDI in den Fraktionen höherer Dichte (7 bis 13) nachweisbar (Abb. 17). Die Verteilung der Kontrollproteine in den Fraktionen höherer Dichte zeigte, dass die separierten DRMs frei von Membranfragmenten dieser Zellkompartimente waren.

78 ERGEBNISSE

Abb. 17: Verteilung von P2X4R und P2X7R in den Fraktionen eines Dichtegradienten nach Solubilisierung mit Triton X-100.

E10-Zellen wurden in 1% Triton X-100 lysiert und die DRMs in einem Saccharose-Dichtegradienten separiert. Die Proteine (je 25 µl) jeder Fraktion (1-13) wurden in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt, auf eine PVDF- Membran transferiert und die Verteilung von P2X4R, P2X7R und Cav-1 sowie den TfR, β-cop und PDI mit entsprechenden Antikörpern untersucht. 1 = Fraktion geringster Dichte, 13 = Fraktion höchster Dichte.

Die Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen ergaben, dass eine Subpopulation des P2X7R zusammen mit dem P2X4R und Cav-1 in Brij 35-resistenten DRMs lokalisiert ist. Dagegen wurde P2X7R durch Triton X-100 vollständig aus den Membranen gelöst. Nur ein Teil von P2X4R und Cav-1 waren gegen Triton X-100 resistent und vermutlich in denselben DRM-Strukturen verteilt. Die Assoziation von P2X7R mit Triton X-100-resistenten DRMs konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, da schwache Proteinbindungen durch das Detergenz und die Ultrazentrifugation zerstört werden können.

3.2.2 Untersuchung zur Lokalisation von P2X4R und P2X7R mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Die erhaltenen biochemischen Daten zeigten teilweise eine Co-Lokalisation von Cav-1 mit P2X4R und P2X7R. Um die Verteilung in den E10-Zellen untersuchen zu können, wurden die P2XR über Antikörper mit Carbocyanin 3 (Cy3) und das Kontrollprotein Cav-1 mit Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) markiert. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie wurde die Lokalisation der Proteine anschließend verglichen. Cav-1 wurde vorwiegend in der Zellmembran nachgewiesen, was der typischen Lokalisation der Caveolen entsprach. Zudem war es teilweise im Zytoplasma lokalisiert. Konträr verhielt sich P2X4R, das vorwiegend punktförmig im Zytoplasma und um den Zellkern verteilt war. Eine kleine Subpopulation von P2X4R konnte jedoch auch in der Zellmembran lokalisiert werden. Um eine Aussage über die Co-Lokalisation von P2X4R und Cav-1 in E10- Zellen treffen zu können, wurden die digitalen Einzelbilder der beiden Proteine übereinander gelegt. 79

Gelbe Signale weisen auf mögliche Co-Lokalisationen von P2X4R (rot) mit Cav-1 (grün) an (Abb. 18) hin. Die überlagerten Bilder der Fluoreszenz zeigten keine Co-Lokalisation von P2X4R und Cav-1 in der Zellmembran der E10-Zellen. Gelb markierte Bereiche waren partiell um den Zellkern sichtbar (Abb. 18).

Abb. 18: Fluoreszenz-mikroskopischer Nachweis der Verteilung von P2X4R und Cav-1 in E10-Zellen. E10-Zellen wurden mit Methanol/Aceton fixiert und mit Antikörpern gegen P2X4R und Cav-1 inkubiert. Die entsprechenden sekundären Antikörper waren mit Cy3 (rot) den P2X4R und FITC (grün) für Cav-1 markiert. Die übereinander gelegten Fluoreszenzbilder (P2X4R + Cav-1) zeigen mögliche Co-Lokalisationen durch gelbe Signale an. Der Standardbalken entspricht einer Länge von 20 µm.

Im Gegensatz zu P2X4R besitzen Cav-1 und P2X7R eine ähnliche Verteilung in den E10- Zellen. P2X7R war ebenfalls vorwiegend in der Zellmembran der E10-Zellen nachweisbar und wurde nur teilweise im Zytosol lokalisiert. Die übereinander gelegten Fluoreszenzbilder von P2X7R und Cav-1 zeigten gelbe Signale in der Zellmembran, was auf eine partielle Co- Lokalisation des P2X7R mit Cav-1 hinwies (Abb. 19).

Abb. 19: Fluoreszenz-mikroskopischer Nachweis der Verteilung von P2X7R und Cav-1 in E10-Zellen. E10-Zellen wurden mit Methanol/Aceton fixiert und mit Antikörpern gegen P2X7R und Cav-1 inkubiert. Die entsprechenden sekundären Antikörper waren mit Cy3 (rot) für P2X7R und FITC (grün) für Cav-1 markiert. Die übereinander gelegten Fluoreszenzbilder (P2X7R + Cav-1) zeigen die Co-Lokalisationen durch gelbe Signale an. Der Standardbalken entspricht einer Länge von 20 µm.

80 ERGEBNISSE

Die Immunfluoreszenzanalyse für P2X4R in Kombination mit P2X7R konnte nicht durchgeführt werden, da nur Antikörper der gleichen Spezies zur Verfügung standen.

3.2.3 Charakterisierung der räumlichen Assoziation von P2X7R und Cav-1 mittels Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analyse

Durch die Untersuchung der Verteilung der P2XR konnte die partielle Co-Lokalisation des P2X7R mit Cav-1 in der Zellmembran von E10-Zellen gezeigt werden. Die räumliche Assoziation von Cav-1 und den P2X7R kann durch eine abFRET-CLMS- Analyse verifiziert werden. Falls beide Proteine einen geringeren Abstand als 10 nm zueinander haben, kommt es nach der Zerstörung des Akzeptorfluorochroms zu einer messbaren Erhöhung der Donorfluoreszenz. Cav-1 wurde dafür mit Cy3, dem Akzeptormolekül, und P2X7R mit Cy5, dem Donormolekül, markiert. Mit Hilfe der confocal laser scanning microscope (CLSM)-Software wurde ein definierter Bereich festgelegt, in dem das Akzeptorfluorochrom gebleicht wurde. Dieses region of interest (ROI) wurde als ROI 1 bezeichnet. Ergänzend wurde das Akteptorsignal (blau) innerhalb von ROI 1 individuell markiert (ROI 2). Die ROIs 3 bis 6 wurden um ROI 1 gruppiert und dienten als Kontrollen für die Effizienz des Messsystems. Wenn diese Regionen FRET-Effizienzwerte über 2% aufzeigten, wurde die Messreihe von der weiteren Auswertung ausgeschlossen (Abb. 20).

Abb. 20: Anordung der regions of interest (ROIs) während der Messungen der Fluoreszenzintensitäten. Aufnahmen der Donor- und Akzeptorfluoreszenzen vor und nach dem Bleichprozess. Cy5 wurde im ROI 1 geblichen und die Änderung der Donorfluoreszenz von Cy3 ( IF) gemessen. ROI 2: zusätzlich per Hand markierte Region der Zellmembran von E10-Zellen im gebleichten Bereich; ROI 3-6: Kontrollbereiche außerhalb der gebleichten Region.

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Die Zunahme der Donorfluoreszenz in der ROI 1 wurde ausgewertet und zeigte nach dem Bleichen von Cy5 im Mittel einen Anstieg von IF um 4,12 ± 1,99 (Abb. 21). Durch unerwünschte Kreuzreaktionen der sekundären Antikörper können falsch positive Signale entstehen. Dies wurde durch entsprechende Kontrollversuche überprüft. Dafür wurden die Proteine Cav-1 und P2X7R einzeln mit dem entsprechenden primären Antikörper markiert und anschließend beide sekundäre Antikörper zu den E10-Zellen gegeben. Die Messungen erfolgten parallel zu den Versuchen, bei denen Cav-1 und P2X7R immunmarkiert waren. Nach der Inkubation mit dem Antikörper gegen Cav-1 wurde ein Anstieg der Donorfluoreszenz IF von 0,00 ± 0,91 (n=30) ermittelt. Die separate Markierung von P2X7R ergab eine Zunahme von IF um 0,36 ± 0,30 (n=30). Die erhaltenen Differenzen zwischen den Kontrollen und dem untersuchten Proteinpaar Cav-1/P2X7R waren mit p < 0,01 signifikant (Abb. 21).

Abb. 21: Datenanalyse der abFRET-Ergebnisse. Darstellung der IF-Werte des gebleichten Bereiches von ROI 1 aus 34 Experimenten und 30 entsprechenden Kontrolluntersuchungen, die aus je vier unabhängigen Versuchsansätzen resultieren. Boxplots: Angabe von Minimum, Maximum und Medianwerten sowie der 25 und 75 Perzentile. ** p < 0,01 signifikant, ° Ausreißerwert, Mann-Whitney-Test.

Die Ergebnisse bestätigten, dass P2X7R mit Cav-1 co-lokalisiert ist und zeigten, dass beide Proteine teilweise einen kleineren Abstand als 10 nm zueinander haben. Dieser geringe Abstand deutete auf eine mögliche Assoziation von P2X7R mit Cav-1 bzw. den Caveolen hin.

82 ERGEBNISSE

3.2.4 Molekulare Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen

Die Daten der biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Analysen zeigten, dass P2X7R teilweise mit Cav-1-haltigen DRMs räumlich eng assoziiert in der Zellmembran der E10-Zellen vorliegt. Zusätzlich lassen die biochemischen Daten eine Co-Lokalisation des P2X7R und des P2X4R in DRM-Strukturen vermuten, da beide Rezeptoren in Brij 35- unlöslichen DRMs nachweisbar waren. Die Assoziation mit den DRMs war ein Hinweis darauf, dass die P2XR zusammen mit Cav-1 in supramolekularen Komplexen vorliegen könnten. Aus diesem Grund wurde die molekulare Organisation der P2XR mittels nativer Gelelektrophoresen untersucht. Dafür wurden die Membranen der E10-Zellen vom Zytosol separiert und die Proteinkomplexe mit dem milden, nicht-ionischen Detergenz Digitonin aus den Membranen solubilisiert. Anschließend konnten diese in nativen Gelen mit Hilfe der blue native - (BN-) und clear native -PAGE (CN-PAGE) nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Für die Separation der solubilisierten Proteinkomplexe wurde eine von Wittig et al . (2007) etablierte Variante der CN-PAGE genutzt, die sogenannte high resolution clear native -PAGE (hrCN-PAGE). Diese besitzt ein zur BN-PAGE äquivalentes Trennvermögen, unterscheidet sich jedoch in der Zusammensetzung des Kathodenpuffers, was zu voneinander abweichenden Separations- profilen führen kann (Wittig et al., 2007). Zuerst wurde das Löslichkeitsverhalten von P2X7R, P2X4R, Cav-1 und Cav-2 in 1%, 2% und 4% Digitonin untersucht. Die Western Blot-Analysen ergaben, dass die Proteine durch die drei verschiedenen Digitonin-Konzentrationen aus den Membranen der E10-Zellen gelöst werden konnten (Abb. 22). Da Cav-1 am besten mit 4% Digitonin solubilisiert werden konnte, wurden die folgenden Untersuchungen mit dieser Detergenzien-Konzentration durchgeführt.

Abb. 22: Löslichkeit von P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2 in Digitonin. Aus isolierten Membranen der E10-Zellen wurden die Proteine mit 1%, 2% und 4% Digitonin solubilisiert. Je 10 µg Gesamtprotein wurden in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2 mit entsprechenden Antikörpern immundetektiert.

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Die Proteinkomplexe wurden über BN- und hrCN-PAGE aufgetrennt und anschließend konnte die Proteinzusammensetzung immunologisch nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Western Blot-Analysen zeigten, dass P2X7R sowohl nach der BN-PAGE als auch nach der hrCN-PAGE in Proteinkomplexen mit molekularen Gewichten von ~760 kDa, ~580 kDa und ~430 kDa detektierbar war. Der P2X7R-assoziierte Komplex von ~580 kDa trat dabei dominant auf (Abb. 23, A+B). Aufgrund der vorangegangenen immunfluoreszenz-mikroskopischen Untersuchungen wurde vermutet, dass Cav-1 und P2X7R miteinander assoziiert in der Zellmembran vorliegen. Die Immundetektion ergab, dass Cav-1 und Cav-2 in beiden nativen PAGEs bei ~580 kDa und ~760 kDa co-migrierten. Ebenso wie P2X7R konnten die Caveoline vorwiegend im Komplex von ~580 kDa nachgewiesen werden. Ein vergleichsweise geringer Anteil von Cav-1 und Cav-2 wurde bei ~760 kDa detektiert (Abb. 23, A+B). Diese Übereinstimmungen der Separationsprofile der Caveoline und von P2X7R wiesen darauf hin, dass die Proteine Bestandteile derselben Komplexe sein könnten. Darüber hinaus wurde auch P2X4R in hochmolekularen Proteinkomplexen nachgewiesen. Nach der Separation der Proteinkomplexe mittels BN-PAGE und hrCN-PAGE wurde P2X4R in Übereinstimmung mit einem Subkomplex von P2X7R bei ~430 kDa detektiert (Abb. 23). Das deckungsgleiche molekulare Gewicht deutete auf eine Assoziation der P2XR in diesem Proteinkomplex hin. Zusätzlich migrierte P2X4R zusammen mit P2X7R und den Caveolinen nach der Auftrennung in der BN-PAGE bei ~580 kDa (Abb. 23, A). Im Gegensatz dazu konnte dieser P2X4R-assoziierte Komplex nicht mehr nachgewiesen werden, wenn die Komplexe mittels hrCN-PAGE aufgetrennt wurden (Abb. 23, B). Eine Ursache für dieses Ergebnis könnten die dem Kathodenpuffer zugesetzten Detergenzien sein, welche labile Protein-Protein- oder Lipid-Protein-Interaktionen beeinflussen können.

84 ERGEBNISSE

A Blue native-PAGE B High resolution clear native -PAGE

Abb. 23: Immundetektion von P2X7R und P2X4R in hochmolekularen Proteinkomplexen.

Die isolierten Membranen von E10-Zellen wurden in 4% Digitonin lysiert und je 20 µg Gesamtprotein in einem nativen Gel (3%-12%) aufgetrennt. Nach der Separation der Proteinkomplexe durch BN-PAGE (A) oder hrCN- PAGE (B) wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran übertragen und die Proteine P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2 mit entsprechenden Antikörpern immundetektiert.

3.2.4.1 Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe (2D/SDS-PAGE) Zur Analyse der Komplexzusammensetzung wurden die Proteine in einer zweiten Dimension unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Miteinander assoziierte Proteine können nach der Separation in einer senkrechten Linie untereinander detektiert werden. Die Ergebnisse der 2D/SDS-PAGE verifizierten die auf Grund der ersten Dimension vermutete Proteinzusammensetzung der hochmolekularen Komplexe. Sowohl nach BN-/SDS-PAGE als auch nach hrCN-/SDS-PAGE konnten in einer Reihe untereinander detektiert werden: P2X7R mit Cav-1 und Cav-2 in einem Proteinkomplex von ~760 kDa und P2X7R mit P2X4R bei ~430 kDa (Abb. 24). Die Zusammensetzung der Proteinkomplexe bei ~580 kDa variierte nach der Auftrennung mittels BN-/ oder hrCN-/SDS-PAGE. Dementsprechend wurde P2X4R zusammen mit P2X7R und den Caveolinen Cav-1 und Cav-2 bei ~580 kDa nachgewiesen, wenn die Proteine mit BN-/SDS-PAGE aufgetrennt wurden (Abb. 24, A). Dagegen konnte P2X4R nach der hrCN-/SDS-PAGE in diesen Komplexen nicht detektiert werden (Abb. 24, B).

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Abb. 24: Immunologischer Nachweis der Proteinzusammensetzung der hochmolekularen Komplexe. Die Proteinkomplexe der ersten Dimension wurden denaturiert und die Proteine anschließend über 10%ige SDS- Gele aufgetrennt. (A) BN-/SDS-PAGE und (B) hrCN-/SDS-PAGE. Mittels Western Blot-Analyse wurde die Verteilung der Proteine untersucht.

Die Separationsprofile der P2XR zeigten, dass P2X7R und P2X4R mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. Dabei ist die Verteilung von P2X7R komplexer als die von P2X4R. P2X7R wurde in Proteinkomplexen mit Molekulargewichten von ~760 kDa, ~580 kDa und ~430 kDa nachgewiesen. Diese Ergebnisse implizierten, bedingt durch die Co- Migration der Caveoline und von P2X7R, dass Cav-1 und Cav-2 zusammen mit dem P2X7R in denselben Komplexen von ~760 kDa und ~580 kDa lokalisiert sind. Weiterhin migrierten beide P2XR bei ~430 kDa, was die Assoziation von P2X4R und P2X7R in einem Komplex mit diesem molekularen Gewicht vermuten ließ. Die nach der BN-PAGE detektierte Assoziation von P2X4R mit dem hochmolekularen Proteinkomplex von ~580 kDa ist dabei möglicherweise auf eine labile bzw. leicht reversible Bindung von P2X4R an diesen Komplexe zurückzuführen. Außerdem könnte die Bindung von P2X4R über ein weiteres Protein oder Lipide vermittelt werden. Durch die verwendeten Detergenzien (DDM und DOC) könnte diese labile Protein-Protein- oder Lipid-Protein-Bindung während der hrCN- PAGE zerstört worden sein.

86 ERGEBNISSE

3.2.5 Nachweis der Assoziation von P2X7R mit P2X4R und Cav-1

Die Ergebnisse der BN-PAGE und hrCN-PAGE haben gezeigt, dass P2X7R zusammen mit P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 in hochmolekularen Proteinkomplexen detektierbar war. Diese Assoziationen sollten durch Co-Immunpräzipitationen (Co-IPs) bestätigt werden. Dafür wurden die Proteinkomplexe mit 1% NP-40 (Abb. 25) oder 1% Digitonin (Abb. 26) aus den Membranen der E10-Zellen gelöst. Nach der Solubilisierung mit 1% NP-40 und anschließender Co-IP mit einem gegen P2X7R gerichteten Antikörper konnte P2X7R im Immunpräzipitat nachgewiesen werden (Abb. 25, A). In dieser Fraktion wurden ebenfalls die copräzipitierten Caveoline Cav-1 und Cav-2 detektiert. Beide Caveoline wurden nur zum Teil gebunden, was auf die Assoziation einer P2X7R-Subpopulation mit dem Cav-1 der Caveolen hindeutete. Im Gegensatz dazu war P2X4R nicht im Präzipitat, sondern ausschließlich im Überstand nachweisbar. Ausschlaggebend für dieses Ergebnis könnte gewesen sein, dass P2X7R nicht vollständig an den Antikörper-Dynabeads ®-Komplex gebunden werden konnte und dadurch nach der Co-IP deutlich im Überstand detektierbar war (Abb. 25, A). Dagegen konnte durch die Co-IP mit einem entsprechenden Antikörper gegen P2X4R gezeigt werden, dass der vollständig gebundene P2X4R mit einem Teil von P2X7R im Immunpräzipitat nachweisbar war. Cav-1 und Cav-2 wurden dagegen nicht copräzipitiert (Abb. 25, B). Demzufolge waren P2X4R und P2X7R teilweise miteinander assoziiert, während keine Assoziation von P2X4R mit den Caveolinen gezeigt werden konnte. Zur Verifizierung der erhaltenen Ergebnisse wurde anschließend die Co-IP mit einem Antikörper gegen Cav-1 durchgeführt. Cav-1 konnte vollständig gebunden werden und war im Präzipitat nachweisbar. In dieser Fraktion wurde erwartungsgemäß ebenfalls das copräzipitierte Cav-2 detektiert (Abb. 25, C). P2X7R konnte zu einem Teil zusammen mit Cav-1 und Cav-2 im Immunpräzipitat nachgewiesen werden, während P2X4R nicht copräziptiert wurde. Diese Ergebnisse bestätigten die zuvor erhaltenen Daten aus den Co-IPs mit Antikörpern gegen P2X7R und P2X4R und verifizierten, dass P2X7R mit Cav-1 assoziiert ist. Die mitgeführten Negativkontrollen zeigten, dass die untersuchten Proteine lediglich in den Überständen nachweisbar waren. Damit konnten unspezifische Bindungen der solubilisierten Proteine an die Protein G-Dynabeads ® ausgeschlossen werden.

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Abb. 25: Co-Immunpräzipitationen nach der Solubilisierung mit NP-40. Die isolierten Membranen der E10-Zellen wurden mit 1% NP-40 lysiert und das Lysat mit dem vorbereiteten Antikörper-Dynabeads ®-Komplex inkubiert. Danach wurde der Überstand (ÜS) abgenommen und das Immunpräzipitat (IP) von den Dynabeads ® gelöst. Die Negativkontrolle wurde entsprechend, aber ohne Antikörper durchgeführt. Co-Immunpräzipitation (Co-IP) mit Antikörpern gegen P2X7R (A) , P2X4R (B) und Cav-1 (C).

Die in BN- und hrCN-PAGE aufgetrennten, hochmolekularen Proteinkomplexe wurden zuvor mit Hilfe des nicht-ionischen Detergenz Digitonin solubilisiert. Um die Ergebnisse der nativen PAGE mit den Daten der Co-IPs vergleichen zu können, wurden die Präzipitationen mit Antikörpern gegen P2X7R sowie P2X4R nach Solubilisierung mit Digitonin wiederholt. Die Ergebnisse der Western Blot-Analysen zeigten, dass P2X7R nach der Co-IP mit dem P2X7R-Antikörper im Immunpräzipitat nachweisbar war (Abb. 26, A). Ein geringer Anteil von Cav-1 und Cav-2 copräzipitierte mit P2X7R und konnte ebenfalls in dieser Fraktion detektiert werden. Dagegen wurde P2X4R erwartungsgemäß nicht im Präzipitat nachgewiesen werden und ausschließlich im Überstand detektiert (Abb. 26, A). Die Ergebnisse stimmen mit den Daten der Co-IPs nach der Solubilisierung der Proteine mit NP-40 überein. Jedoch konnten die Assoziationen der Proteine mit NP-40 besser verifiziert werden. Die Analyse des Immunpräzipitats nach der Co-IP mit einem entsprechenden Antikörper gegen P2X4R ergab, dass P2X4R vollständig aus dem Lysat präzipitiert werden konnte (Abb. 26, B). Jedoch konnte kein spezifisches Co-Präzipitat detektiert werden. Erwartungsgemäß wurden Cav-1 und Cav-2 nicht im Präzipitat nachgewiesen, aber auch P2X7R wurde nicht copräzipiert. Die Caveoline und P2X7R wurden ausschließlich im Überstand detektiert (Abb. 26, B).

88 ERGEBNISSE

Abb. 26: Co-Immunpräzipitationen nach der Solubilisierung mit Digitonin. Die isolierten Membranen der E10-Zellen wurden mit 1% Digitonin lysiert und das Lysat mit dem vorbereiteten Antikörper-Dynabeads ®-Komplex inkubiert. Danach wurde der Überstand (ÜS) abgenommen und das Immunpräzipitat (IP) von den Dynabeads ® gelöst. Die Negativkontrolle wurde entsprechend, aber ohne Antikörper durchgeführt. Co-Immunpräzipitationen (Co-IP) mit Antikörpern gegen P2X7R (A) und P2X4R (B) .

Die Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen nach Gebrauch von NP-40 und Digitonin wurden vermutlich durch die unterschiedlichen Solubilisierungseigenschaften der beiden Detergenzien hervorgerufen. Digitonin ist ein schwächeres Detergenz als NP-40 und solubilisiert möglicherweise einen geringeren Anteil der untersuchten Proteine aus den Membranen, was die Untersuchung der Assoziationen beeinträchtigt. Die Ergebnisse der Co-Immunpräzipitationen bestätigten, dass eine Subpopulation von P2X7R mit Cav-1 und Cav-2 assoziiert ist. Demzufolge könnten die Caveoline und P2X7R zusammen in den hochmolekularen Proteinkomplexen von ~580 kDa und ~760 kDa vorliegen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass P2X7R teilweise mit P2X4R assoziiert vorliegt, möglicherweise in dem Proteinkomplex von ~430 kDa. Unter den gewählten Versuchsbedingungen wurde keine Verbindung zwischen P2X4R und Cav-1 oder Cav-2 nachgewiesen, wobei eine transiente bzw. labile Interaktion mit den Caveolinen über P2X7R oder auch Lipide nicht ausgeschlossen werden kann.

3.3 Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Membranlipiden

P2X4R konnte nach der BN-PAGE in hochmolekularen Komplexen von ~580 kDa und ~430 kDa nachgewiesen werden, war jedoch nach der hrCN-PAGE ausschließlich bei ~430 kDa detektierbar. Es ist bekannt, dass die dem Kathodenpuffer zugesetzten Detergenzien labile Protein-Protein-Bindungen und vermutlich ebenso Protein-Lipid- Beziehungen beeinflussen (Wittig et al., 2007). Eine leicht reversible Assoziation von P2X4R mit P2X7R oder Lipiden könnte dadurch zerstört werden. Eine mögliche Assoziation von 89

P2X4R mit P2X7R könnte in Brij35-resistenten DRMs stattfinden, da P2X4R und P2X7R nachweislich darin co-lokalisiert sind. Die isolierten DRMs beinhalten spezifische Lipide, die für die Struktur und die Funktionalität verantwortlich sind. Bei der Analyse der Aminosäuresequenzen von P2X4R und P2X7R wurden C-terminal lokalisierte Cluster von positiv geladenen Aminosäureresten identifiziert. Diese Motive können mit der negativen

Phosphat-Kopfgruppe von Lipiden, wie Phosphatidylinositol (4,5)-biphosphat (PI(4,5)P 2) interagieren (Suh and Hille, 2005). Im Folgenden sind die potentiellen Bindesequenzen von P2X4R und P2X7R dargestellt, wobei die positiven Lysin- (K) und Arginin- (R) Reste mit einem + gekennzeichnet wurden.

+ + + + + + + mP2X4R … C 360 MKKRYYYRDKKYKY V375 E …

+ + + + + mP2X7R … N 380 EYYRKKCESIMEPKPTLKY 400 V…

PI(4,5)P 2 ist ein Phospholipid, welches in Mikrodomänen angereichert und als Precursor der second messenger IP 3 und DAG an verschiedenen Lipid-vermittelten Signalwegen beteiligt ist

(van Rheenen et al., 2005). Die Co-Lokalisation von PI(4,5)P 2 mit P2X4R und P2X7R in Brij 35-resistenten DRMs wurde mittels Dichtegradientenzentrifugation untersucht. Da das

Molekulargewicht von PI(4,5)P 2 nur 1,05 kDa beträgt, wurde das Lipid über dot-Blots nachgewiesen. Als Kontrollproteine wurden Cav-1, PDI und β-cop mitgeführt.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Verteilung von PI(4,5)P 2 mit dem Separationsprofil von

Cav-1 übereinstimmte. PI(4,5)P 2 und Cav-1 wurden vorwiegend in den Fraktionen geringer Dichte 2 und 3 nachgewiesen. P2X4R und P2X7R co-sedimentierten ebenfalls in diesen

Fraktionen und waren somit mit PI(4,5)P 2 in Brij 35-resistenten DRMs co-lokalisiert (Abb. 27). Die Kontrollproteine PDI und β-cop wurden erwartungsgemäß in den Fraktionen höherer Dichte 7 bis 13 nachgewiesen.

90 ERGEBNISSE

Abb. 27: Verteilung von PI(4,5)P 2 in den Fraktionen eines Dichtegradienten nach der Solubilisierung mit Brij 35.

E10-Zellen wurden in 1% Brij 35 lysiert, abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Pellet wurde resuspendiert und die Zellbestandteile über einen Saccharose-Dichtegradienten aufgetrennt. Je 25 µl jeder Fraktion (1-13) wurden in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X4R, P2X7R sowie die Kontrollproteine Cav-1, PDI und β-cop immunologisch nachgewiesen. Zum Nachweis von PI(4,5)P 2 wurden 2 µl jeder Fraktion (1-13) auf einer Zelluloseacetat-Membran immobilisiert und PI(4,5)P 2 mit einem entsprechenden Antikörper immundetektiert.

PI(4,5)P 2 konnte in Korrelation mit P2X4R und P2X7R in DRM-Strukturen nachgewiesen werden. Die Assoziation des PI(4,5)P 2 mit den beiden purinergen Rezeptoren könnte auf eine direkte Interaktion zurückzuführen sein, da sowohl P2X4R als auch P2X7R potentielle Bindesequenzen für negativ geladene Lipide aufweisen.

3.3.1 Untersuchung der direkten Interaktion von P2X4R und P2X7R mit Membranlipiden – in vitro Lipid-Bindeassay

Um die direkte Interaktion von negativ geladenen Lipiden mit den C-terminalen Abschnitten von P2X4R (C360-Q388) und P2X7R (N356-Y595) nachweisen zu können, wurden Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine hergestellt. Dafür wurden die C-terminalen Bereiche der beiden P2XR N-terminal mit GST fusioniert, in den E. coli Expressionsstamm BL21 transformiert und anschließend mittels Glutathion-S-Sepharose (GSH-Sepharose) aufgereinigt. Parallel wurde GST als Negativkontrolle mitgeführt, um unspezifische Bindungen der Lipide mit dem GST-Anteil der Fusionsproteine ausschließen zu können. Die aufgereinigten GST-Fusionsproteine sowie GST wurden von der GSH-Sepharose mit Hilfe von reduziertem Glutathion entfernt und mit den Membranlipiden inkubiert, welche auf einer speziellen Membran immobilisiert waren. Der Nachweis der direkten Interaktion erfolgte über das fusionierte GST mittels Immundetektion. Die Ergebnisse des in vitro -Bindetests ergaben,

91

dass die GST-fusionierten, C-terminalen Domänen von P2X4R und P2X7R mit negativ geladenen Membranlipiden interagierten (Abb. 28). Dabei zeigte das P2X4R-Fusionsprotein das gleiche Bindeprofil wie das P2X7R-Fusionsprotein. Nachgewiesen wurde die direkte Interaktion mit: • Phosphatidsäure (PA) • Phosphatidylserin (PS) • Phosphatidylglycerol (PG) • Cardiolipin

• Phosphatidylinositiden: PI(4)P, PI(4,5)P 2, PI(4,5)P 3 sowie • 3- Sulfogalactosylceramid.

Das nicht-fusionierte GST zeigte keine Wechselwirkungen mit den immobilisierten Membranlipiden. Demzufolge waren die nachgewiesenen Interaktionen der P2XR mit den Lipiden spezifisch und wurden nicht durch GST vermittelt. Die Spezifität der P2XR-Lipid- Bindungen wurde ebenfalls durch die mitgeführte Positivkontrolle bestätigt. Die rekombinante PLC-δ1 PH-Domäne interagierte erwartungsgemäß mit PI(4,5)P 2 sowie mit

PI(4)P, PI(4,5)P 3, PA und 3-Sulfogalactosylceramid. Die unterschiedlichen Bindeprofile der PLC- und P2XR-Fusionsproteine verifizierten die charakteristische Interaktion der C- terminalen P2X-Konstrukte mit den Membranlipiden (Abb. 28).

Abb. 28: Nachweis der direkten Interaktion von GST-P2XR-Fusionsproteinen mit negativ geladenen Membranlipiden.

Immundetektion der direkten Interaktion von negativ geladenen Membran-Lipiden mit dem GST-gebundenen C- terminalen Bereich von P2X4R (GST-P2X4CT) und P2X7R (GST-P2X7CT) in vitro . Jeweils 1 µg/ml GST- Fusionsprotein oder GST wurde mit den Membranlipid-Streifen inkubiert. Anschließend wurden die Membranen TM gewaschen und GST mit einem Antikörper immundetektiert. GST-PI(4,5)P 2 Grip (N-terminal GST-gekoppelte PLC-δ1 PH Domäne) wurde als Positivkontrolle und GST als Negativkontrolle genutzt.

92 ERGEBNISSE

Die Assoziation der beiden P2XR und die Wechselbeziehung mit denselben Membranlipiden implizierten, dass P2X4R und P2X7R zusammen mit PI(4,5)P 2 in einem Komplex vorliegen könnten. Zudem wäre es möglich, dass die P2XR über die Lipide transient miteinander assoziiert bzw. in dieselben Lipid-vermittelten Signalwege involviert sind.

3.4 Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R auf den Proteingehalt von P2X7R, Cav-1 und Cav-2

Um die P2XR unter funktionellen Gesichtspunkten untersuchen zu können, wurde der Proteingehalt von P2X4R und P2X7R mit Hilfe der RNA-Interferenz in E10-Zellen herabreguliert (Fire et al., 1998). Dafür wurden short hairpin ribonucleotide acid (shRNA)- Konstrukte mit einem lentiviralen System in die E10-Zellen transduziert. Die shRNA bildet eine Haarnadelstruktur aus, in der sich sense und antisense Sequenz der siRNA aneinander lagern. Diese shRNA wird in der Zelle von einer Ribonuklease (dicer ) in die 18 bis 21 Nukleotide umfassende siRNA-Fragmente zerschnitten, welche mit weiteren Proteinen den RNA induced silencing complex (RISC–Komplex) bilden. Dieser Komplex bindet, bedingt durch die siRNA-Sequenz, komplementär an die P2rx4 und P2rx7 mRNA. Eine im RISC- Komplex befindliche Endonuklease zerschneidet daraufhin die mRNA der P2XR. Durch die Degradierung der mRNA wird die Translation der Proteine verhindert, was sich in der Abnahme des steady state -Proteingehaltes äußert. Das Reportergen green fluorescence protein (gfp) wurde co-exprimiert. Über die GFP- Fluoreszenz konnten die Qualität und die Quantität der Transduktion ausgewertet werden. Die Transduktionsraten wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und betrugen zwischen 85% und 95%. Die Effizienz der verschiedenen shRNAs und die Auswirkungen der siRNA- vermittelten Reduzierung der mRNA des P2X4R und P2X7R wurden mittels Western Blot- Analyse auf Proteinebene untersucht und quantitativ ausgewertet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bisher gezeigt werden, dass P2X4R mit P2X7R in einem hochmolekularen Proteinkomplex vorliegt, jedoch konnte keine Assoziation von P2X4R mit Cav-1 und Cav-2 nachgewiesen werden. Mit Hilfe der siRNA-vermittelten Herabregulierung der P2rx4 -mRNA sollte geklärt werden, ob der Proteingehalt von P2X7R, Cav-1 und Cav-2 durch die Reduzierung von P2X4R beeinflusst wird. Drei verschiedene shRNA-Konstrukte wurden eingesetzt und diese führten im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen jeweils zu einer deutlichen Abnahme von P2X4R in E10- Zellen (Abb. 29 A). Die Quantifizierung zeigte, dass der steady state -Proteingehalt von

93

P2X4R durchschnittlich auf 26% durch shRNA1, auf 14% durch shRNA2 und auf 10% mit shRNA3 reduziert wurde. Die Abnahme von P2X4R war dabei im Vergleich zur Kontrolle mit p<0,01 signifikant (Abb. 29 B). Die Reduzierung von P2X4R wirkte sich nachweislich auf P2X7R aus und führte zu einer Zunahme des Proteingehaltes um 45% (shRNA1+2) bis 100% (shRNA3). Der Anstieg von P2X7R war unter Verwendung von shRNA3 in Relation zur Kontrolle mit p<0,05 signifikant (Abb. 29 B). Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass P2X4R und P2X7R möglicherweise regulatorisch miteinander verbunden sind. Im Gegensatz dazu wurden Cav-1 und Cav-2 kaum beeinflusst (Abb. 29 A). Der Proteingehalt von Cav-1 wurde auf durchschnittlich 92% und von Cav-2 auf 93% vermindert (Abb. 29 B).

A

B Statistische Auswertung P2X4R P2X7R Cav-1 Cav-2

shRNA shRNA shRNA shRNA

Abb. 29: Auswirkungen der siRNA-vermittelten Reduzierung von P2X4R auf den Proteingehalt von P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2.

(A) Verschiedene shRNAs (1 bis 3) wurden in E10-Zellen transduziert. In die Kontrollzellen (K) wurde keine shRNA eingebracht. Nach 72h wurden die Zellen lysiert und je 30 µg Gesamtprotein in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt. Anschließend wurden P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 mit spezifischen Antikörpern immundetektiert. γ-Tubulin wurde als Standardprotein mitgeführt.

94 ERGEBNISSE

(B) Die gespeicherten Daten der Western Blot-Analysen wurden quantifiziert und die Veränderungen im Proteingehalt errechnet. Die angegebenen Diagramme zeigen die ermittelten Mittelwerte ± Standardabweichung. n=8, Signifikanz * p < 0,05, ** p < 0,001

Um gewährleisten zu können, dass ausschließlich die eingebrachte, spezifische shRNA für die Veränderungen im steady state -Proteingehaltes von P2X4R verantwortlich war, wurden die spezifisch interferierenden siRNA-Abschnitte in ihrer Nukleotidabfolge mit Hilfe des Programms siRNA wizard TM (v2.6; InvivoGen, San Diego, CA, USA) verändert. Dabei blieb der Anteil aller Nukleotide gleich. Mit den so hergestellten Negativkontrollen (shRNA sc ; sc = scramble ) wurden die Versuche parallel durchgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollen hatten die shRNAsc keinen Einfluss auf den Proteingehalt des P2X4R, des P2X7R bzw. Cav-1 und Cav-2 (Abb. 30 A). Die Quantifizierung der Ergebnisse ergab erwartungsgemäß keine signifikanten Veränderungen für P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2 nach der Transduktion mit shRNAsc1- 3 (Abb. 30 B). In Folge dessen waren die detektierten Auswirkungen spezifische Effekte, hervorgerufen durch die Herabregulation der P2rx4 -mRNA.

A

B Quantitative Auswertung P2X4R P2X7R Cav-1 Cav-2

shRNAsc shRNAsc shRNAsc shRNAsc

Abb. 30: Auswirkungen der Kontroll-shRNAs auf den Proteingehalt von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2.

(A) Verschiedene shRNAsc (1 bis 3) wurden in E10-Zellen transduziert. In die Kontrollzellen (K) wurde keine shRNA eingebracht. Nach 72h wurden die Zellen lysiert und je 30 µg Gesamtprotein in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt. Anschließend wurden P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 mit spezifischen Antikörpern immundetektiert. γ-Tubulin wurde als Standardprotein mitgeführt.

95

(B) Die gespeicherten Daten der Western Blot-Analysen wurden quantifiziert und die Veränderungen im Proteingehalt errechnet. Die angegebenen Diagramme zeigen die ermittelten Mittelwerte ± Standardabweichung. n=8

Die Reduzierung von P2X4R führt in den E10-Zellen zur signifikanten Zunahme von P2X7R, während die Caveoline nicht beeinflusst wurden. Aus diesem Grund könnten die P2XR auch regulatorisch miteinander verbunden sein. Zudem unterstützten die Ergebnisse die Annahme, dass P2X4R und die Caveoline nicht miteinander assoziiert sind.

3.5 Auswirkungen der Reduzierung von P2X7R auf den Proteingehalt von P2X4R, Cav-1 und Cav-2

Die Reduzierung der P2rx7 -mRNA sollte Aufschluss darüber geben, ob P2X4R durch die Verringerung von P2X7R beeinflusst wird. Außerdem könnte sich die Reduzierung von P2X7R auf Cav-1 und Cav-2 auswirken, da P2X7R mit den Caveolinen in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert ist. Nach der Transduktion der drei shRNA-Konstrukte (1 bis 3) reduzierte sich der Proteingehalt von P2X7R im Vergleich zur Kontrolle effektiv (Abb. 31 A) und der steady state - Proteingehalt wurde auf durchschnittlich 18% herabreguliert (Abb. 31). Die Abnahme des P2X7R-Proteingehaltes war im Vergleich zur Kontrolle mit p<0,01 signifikant (Abb. 31 B). Die Reduzierung der P2rx7 -mRNA führte in Bezug auf die Kontrolle zu einem deutlichen Anstieg des P2X4R-Proteingehaltes um durchschnittlich 50% (shRNA1 + shRNA2) bis 120% (shRNA3) (Abb. 31, A). Die Erhöhung des P2X4R-Proteingehaltes nach der Transduktion mit shRNA3 war mit p<0,05 signifikant (Abb. 31, B). Diese Ergebnisse bestätigten, dass es eine Verbindung zwischen P2X4R und P2X7R gibt. Konträr zu P2X4R nahm der Proteingehalt von Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung von P2X7R im Vergleich zur Kontrolle ab (Abb. 31, A). Cav-1 wurde dabei stärker beeinflusst als Cav-2. Der Proteingehalt von Cav-1 wurde auf durchschnittlich 64% vermindert. Die Abnahme von Cav-1 war im Vergleich zur Kontrolle mit p<0,05 signifikant (Abb. 31, B). Auch der Proteingehalt von Cav-2 verringerte sich der nach der Reduzierung des P2X7R. Jedoch konnte nur unter Verwendung von shRNA2 eine signifikante Reduzierung des Proteingehaltes von Cav-2 auf 76% nachgewiesen werden (Abb. 31, B). Nach der Transduktion mit shRNA1 und shRNA3 wurde der Cav-2 steady state-Proteingehalt kaum beeinflusst und lediglich auf durchschnittlich 93% vermindert (Abb. 31, B). Bezogen auf diese Ergebnisse könnte die Verminderung von Cav-2 (shRNA2) durch einen unspezifischen

96 ERGEBNISSE off-target Effekt hervorgerufen werden. Beispielsweise wird durch Aktivierung einer RNA- abhängigen Proteinkinase (PKR) die Proteinsynthese unspezifisch inhibiert (Levin and London, 1978). Dieser off-target Effekt wurde für dsRNAs, shRNAs oder siRNAs mit weniger als 30 Nukleotiden beschrieben (Jackson and Linsley, 2004).

A

B Statistische Auswertung P2X7R P2X4R Cav-1 Cav-2

shRNA shRNA shRNA shRNA

Abb. 31: Auswirkungen der siRNA-vermittelten Reduzierung von P2X7R auf den Proteingehalt von P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2.

(A) Verschiedene shRNAs (1 bis 3) wurden in E10-Zellen transduziert. In die Kontrollzellen (K) wurde keine shRNA eingebracht. Nach 72h wurden die Zellen lysiert, je 30 µg Gesamtprotein in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X7R, P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 mit entsprechenden Antikörpern immundetektiert. γ-Tubulin wurde als Standardprotein mitgeführt. (B) Die gespeicherten Daten der Western Blot-Analysen wurden quantifiziert und die Veränderungen im Proteingehalt errechnet. Die angegebenen Diagramme zeigen die ermittelten Mittelwerte ± Standardabweichung. n=8, Signifikanz * p < 0,05, ** p < 0,001

Um die Spezifität der siRNA-vermittelten Reduzierung des P2X7R verifizieren zu können, wurden Negativkontrollen (shRNAsc 1-3) erzeugt. Dafür wurde die Nukleotidabfolge der siRNA-Targetsequenzen „vermischt“, wobei der Anteil der Nukleotide gleich blieb.

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Nach der Transduktion mit der shRNAsc1-3 wurden keine Veränderungen im Proteingehalt von P2X7R, P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 detektiert (Abb. 32, A). Die quantitativen Auswertungen der Western Blot-Analysen ergaben, wie erwartet, keine signifikanten Änderungen im Proteingehalt des P2X7R, P2X4R, Cav-1 und Cav-2 (Abb. 32, B). Somit waren die shRNA-induzierten Auswirkungen auf den P2X7R spezifisch.

A

B Quantitative Auswertung P2X7R P2X4R Cav-1 Cav-2

shRNAsc shRNAsc shRNAsc shRNAsc

Abb. 32: Auswirkungen der Kontroll-shRNAs auf den Proteingehalt von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2.

(A) Verschiedene shRNAsc (1 bis 3) wurden in E10-Zellen transduziert. In die Kontrollzellen (K) wurde keine shRNA eingebracht. Nach 72h wurden die Zellen lysiert, je 30 µg Gesamtprotein in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert und anschließend P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 mit spezifischen Antikörpern immundetektiert. γ-Tubulin wurde als Standardprotein mitgeführt. (B) Die digital gespeicherten Daten der Western Blot-Analysen wurden quantifiziert und die Veränderungen im Proteingehalt errechnet. Die angegebenen Diagramme zeigen die ermittelten Mittelwerte ± Standardabweichung. n=8

Die Ergebnisse zeigten, dass der Proteingehalt des P2X4R sowie der Caveoline Cav-1 und Cav-2 durch die Reduzierung des P2X7R beeinflusst wurde. Die siRNA-vermittelte Herabregulation der P2rx7-mRNA führte zur signifikanten Abnahme des steady state- Proteingehaltes von Cav-1 in E10-Zellen. Dagegen waren die Auswirkungen auf den Proteingehalt von Cav-2 gering. Nur die Verminderung von P2X7R mittels shRNA2 führte zu einer signifikanten Cav-2-Abnahme. Dieses Resultat könnte möglicherweise auf einen off- target Effekt zurückzuführen sein. Generell beeinflusste die Reduzierung von P2X7R weniger

98 ERGEBNISSE den Proteingehalt von Cav-2 als von Cav-1. In Folge dessen wurde vermutet, dass P2X7R vorwiegend mit Cav-1 assoziiert ist, während Cav-2 in Bezug auf P2X7R kaum eine Rolle spielt. Weiterhin stieg durch die Reduzierung von P2X7R der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen signifikant an. Dies bestätigte, dass die beiden P2XR sich gegenseitig beeinflussen.

3.6 Auswirkungen des P2rx7 knockout auf den Proteingehalt von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 im Lungengewebe der Maus

Ergänzend zu den Untersuchungen an der Alveolarepithelzelllinie E10 wurden der Proteingehalt von P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 im Lungengewebe von P2rx7 knockout (P2rx7 (-/-)) und den dazugehörigen P2rx7 (+/+) Wildtyp-Mäusen analysiert. Für die Untersuchungen wurden von Pfizer (Groton, CT) generierte P2rx7 (-/-) Mäuse genutzt. Der knockout wurde in diesen Mäusen durch die Deletion der Nukleotide 1527 bis 1607 (AS 506 bis 532) und dem Einfügen einer Neomycin-Kassette (3´
5´) induziert. Das Lungengewebe von zwei Mäusen wurde analysiert und die Ergebnisse zeigten, dass der P2rx7 knockout im Vergleich zum Wildtyp nur geringe Veränderungen des steady state - Proteingehaltes von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 im Lungengewebe zur Folge hatte. Der Proteingehalt des P2X4R nahm um ~10% und von Cav-2 um ~25% zu, während der Cav-1 auf ~90% reduziert wurde (Abb. 33).

Abb. 33: Immunologischer Nachweis der Auswirkungen des P2rx7 (-/-) knockout auf den Proteingehalt von P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 im murinen Lungengewebe.

Die eingefrorenen Lungen von Mäusen wurden aufgetaut, zerkleinert und die Proteine mit 1% Triton X-100 solubilisiert. 50 µg Gesamtprotein in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt und P2X7R, P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 mit spezifischen Antikörpern immundetektiert.

99

Das untersuchte Lungengewebe besteht u. a. aus Endothel- und Epithelzellen sowie Zellen des Immunsystems (Makrophagen), welche P2rx4 und P2rx7 co-exprimieren (Barth and Kasper, 2009). Weiterhin weisen Endothel- sowie Epithelzellen Cav-1 und Cav-2 auf (Razani et al., 2002b; Kogo et al., 2004). Die möglicherweise auftretenden Zelltyp-spezifischen Effekte, hervorgerufen durch den P2rx7 knockout, können folglich nicht differenziert werden. Immunhistochemische Untersuchungen am Lungengewebe von P2rx7 Wildtyp und knockout Mäusen bestätigten jedoch, dass Cav-1 in AT I-Zellen des Lungenepithels von P2rx7 (-/-) Mäusen reduziert ist (Barth and Kasper, 2009).

3.7 Verteilung von P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung von P2X4R in E10-Zellen

Die Reduzierung von P2X4R führte zur Zunahme des steady state -Proteingehaltes des P2X7R, während Cav-1 und Cav-2 unbeeinflusst blieben. Um eine Aussage über mögliche Veränderungen in der Lokalisation und Verteilung von P2X7R und der Caveoline in den E10- Zellen treffen zu können, wurden die Proteine über die entsprechenden Antikörpern mit Cy3 immunmarkiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Verminderung des P2X4R-Proteingehaltes wirkte sich nicht auf die Lokalisation von P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 aus. Sowohl in den Kontrollzellen als auch in den Zellen mit verringertem P2X4R war P2X7R überwiegend in der Zellmembran lokalisiert und nur teilweise punktförmig im Zytosol verteilt. Allerdings nahm P2X7R scheinbar in der Zellmembran zu (Abb. 34, links). Auch die Lokalisation der beiden Caveoline änderte sich nicht. Cav-1 und Cav-2 wurden vorwiegend membranständig und zu einem geringen Teil im Zytosol verteilt lokalisiert (Abb. 34).

100 ERGEBNISSE

Abb. 34: Immunreaktivitäten von P2X7R, Cav-1 und Cav-2 in Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X4R.

Die mit Methanol/Aceton fixierten Zellen wurden mit Antikörpern gegen P2X7R, Cav-1 oder Cav-2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Cy3-markiertem Sekundärantikörpern inkubiert und die Lokalisation der Proteine mit Hilfe eines inversen Mikroskops analysiert. Der Größenstandard entspricht einer Länge von 20 µm.

Mit den Ergebnissen der Immunfluoreszenzanalysen konnte keine quantitative Aussage über die mögliche Zunahme von P2X7R in der Zellmembran getroffen werden. Zur Ermittlung der prozentualen Anteile an membranständigen Rezeptoren wurden die extrazellulär präsenten Domänen der Membranproteine von Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X4R mit einem membran-undurchlässigen Biotin-N-Hydroxy-succinimid (NHS)- Ester vernetzt. Die Zellen wurden lysiert und die biotinylierten Membranproteine mittels Streptavidin vom Gesamtlysat entfernt. Nach der immunologischen Detektion konnte eine Aussage über die Verteilung von P2X7R in den beiden Fraktionen getroffen werden. Als Kontrollprotein für die Qualität der Oberflächenbiotinylierungen wurde die ausschließlich intrazellulär lokalisierte Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) genutzt. Relativ zu dem ermittelten GAPDH-Proteingehalt wurde anschließend die Quantifizierung durchgeführt. Die Ergebnisse belegten die zuvor erhaltenen Daten und zeigten, dass der Proteingehalt von P2X7R nach der Reduzierung von P2X4R im Gesamtlysat zunimmt. Die quantitative Auswertung ergab einen durchschnittlichen Anstieg von 70% (Abb. 35, gesamt ). Dem entsprechend wurde in der Fraktion mit den biotinylierten Membranproteinen ebenfalls ein erhöhter P2X7R-Anteil detektiert. Der P2X7R-Proteingehalt stieg im Vergleich zur Kontrolle um durchschnittlich 65% an (Abb. 35, Membran ). Die prozentuale Zunahme von P2X7R in

101

der Zellmembran und im Gesamtlysat stimmte annähernd überein. In Bezug auf die ausgeprägte membranständige Lokalisation von P2X7R konnte somit die Zunahme von P2X7R in der Zellmembran nachgewiesen werden. Jedoch blieb die Verteilung von P2X7R in den E10-Zellen unbeeinflusst.

Abb. 35: Quantitativer Nachweis der Zunahme von P2X7R in der Zellmembran nach der durch shRNA3 vermittelten Reduzierung von P2X4R.

P2rx4-shRNA3 wurde in E10-Zellen transduziert. Die Kontrollzellen (K) wurde nicht mit shRNA behandelt. 72 h nach der Transduktion wurden die Zellen oberflächlich biotinyliert, lysiert und die biotinylierten Membranproteine mit Streptavidin von den restlichen Zellbestandteilen getrennt. Gleiche Mengen an Gesamtprotein wurden in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X7R sowie GAPDH mit entsprechenden Antikörpern im Gesamtlysat ( gesamt ) und in der Fraktion mit den extrazellulär präsenten Membranproteinen ( Membran ) immundetektiert (links ). Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung des Proteingehaltes von P2X7R im Gesamtlysat ( gesamt ) und in der Zellmembran ( Membran ). n=3

Aufgrund des veränderten steady state -Anteils des membranständigen P2X7R könnte ebenfalls die DRM-Lokalisation von P2X7R beeinflusst werden. Die folgende Untersuchung sollte klären, ob P2X7R verstärkt mit DRMs assoziiert war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten bereits, dass P2X7R in Brij 35-resistenten DRMs nachweisbar ist. Aus diesem Grund wurden die Kontrollzellen und die Zellen mit reduziertem P2X4R mit Brij 35 lysiert und die Zellfragemente anschließend über einen Dichtegradienten aufgetrennt. Als Kontrollproteine wurden wiederum PDI, β-cop und Cav-1 mitgeführt. PDI und β-cop wurden nach der Aufarbeitung der Zellen erwartungsgemäß in den Fraktionen höherer Dichte (7 bis 13) nachgewiesen. Cav-1 konnte hauptsächlich in den Fraktionen niedriger Dichte (2 und 3) detektiert werden. Diese Fraktionen enthalten die isolierten DRMs (Abb. 36). Die Separationsprofile der Dichtegradienten zeigten, dass P2X7R mit Cav-1 in den Fraktionen 2 und 3 co-migrierte. Nach der Reduzierung von P2X4R nahm P2X7R in diesen Fraktionen zu und konnte zusätzlich verstärkt in den Fraktionen 4 bis 7 nachgewiesen werden (Abb. 36). Bedingt durch die Zunahme von P2X7R in der Zellmembran und den DRMs könnte der Anstieg des P2X7R-Proteingehaltes in den Fraktionen 4 bis 7 auf das verstärkte endosomale Recycling von P2X7R hindeuten (Sheff et al., 1999; Odley et al., 2004).

102 ERGEBNISSE

Abb. 36: Immunologischer Nachweis der Verteilung von P2X7R in den Fraktionen der Dichtegradienten von Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X4R.

Die Kontrollzellen und mit P2rx4 -shRNA3 transduzierte Zellen wurden mit Brij 35 lysiert und gleiche Mengen an Gesamtprotein (750 µg) über einen Dichtegradienten aufgetrennt. Die Proteine der Fraktionen (1-13) wurden in einem 12%igen SDS-Gel separiert, auf eine PVDF-Membran transferiert und der P2X4R, P2X7R sowie die Kontrollproteine Cav-1, β-cop und PDI immundetektiert. Fraktion 1 = Fraktion geringster Dichte, Fraktion 13 = Fraktion höchster Dichte.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Reduzierung von P2X4R die Lokalisation und Verteilung von P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 nicht beeinflusst. Jedoch kommt es zum Anstieg des P2X7R-Proteingehaltes in der Zellmembran und in Brij 35-resistenten DRM-Strukturen. Da P2X4R und P2X7R in diesen DRMs co-lokalisiert sind, implizierten die Ergebnisse, dass P2X7R teilweise strukturell P2X4R in diesen DRMs ersetzt .

3.8 Verteilung von P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung von P2X7R in E10-Zellen

Wie bereits im Rahmen dieser Arbeit gezeigt wurde, hatte die Reduzierung von P2X7R im Gegensatz zu P2X4R Auswirkungen auf den Proteingehalt von Cav-1 und führte zu einer signifikanten Abnahme von Cav-1 in den E10-Zellen. Außerdem war der Proteinanteil von P2X4R in Zellen mit reduziertem P2X7R erhöht. Um die Verteilung der Proteine in den Zellen charakterisieren zu können, wurden diese indirekt mit Cy3 markiert und die Lokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In Folge dessen konnte gezeigt werden, dass Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung von P2X7R mittels P2rx7 -shRNA3 nicht mehr dominant in der Zellmembran der E10-Zellen nachweisbar waren. Beide Caveoline wurden im Vergleich zu den Kontrollzellen verstärkt im Zytoplasma verteilt lokalisiert (Abb. 37).

103

Im Gegensatz dazu war P2X4R in den Kontrollzellen vorwiegend punktförmig im Zytosol verteilt und erst nach der Reduzierung von P2X7R konnte P2X4R zunehmend in der Zellmembran nachgewiesen werden. Dabei blieb jedoch die ausgeprägte zytosolische Verteilung bestehen (Abb. 37).

Abb. 37: Immunreaktivitäten von P2X4R, Cav-1 und Cav-2 in Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X7R.

Die mit Methanol/Aceton fixierten Zellen wurden mit spezifischen Antikörpern gegen P2X4R, Cav-1 oder Cav- 2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Cy3-markiertem Sekundärantikörpern inkubiert und die Lokalisation der Proteine mit Hilfe eines inversen Mikroskops analysiert. Der Größenstandard entspricht einer Länge von 20 µm.

Durch die Fluoreszenzanalyse wurde die veränderte Verteilung von P2X4R nach der Verringerung von P2X7R in den E10-Zellen sichtbar. Jedoch gab diese keine Auskunft über den tatsächlichen Anstieg von P2X4R in der Zellmembran. Aus diesem Grund wurde anschließend der Anstieg des P2X4R-Proteinanteils in der Zelllmembran mittels Oberflächen- biotinylierung quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse bestätigten, dass der P2X4R steady state -Proteingehalt nach der Reduzierung von P2X7R im Gesamtlysat zunahm. Die Erhöhung betrug durchschnittlich 85% (Abb. 38, gesamt ). Weiterhin stieg der P2X4R-Anteil in der Fraktion mit den biotinylierten Membranproteinen im Mittel um 50% an (Abb. 38, Membran ). Die Differenz zwischen dem Anstieg des gesamten P2X4R und dem membranständigen P2X4R machte deutlich, dass der P2X4R zwar in der Zellmembran zunahm, sich aber das Verhältnis von zytosolischem zu membranständigem P2X4R zugunsten des im Zytosol lokalisierten P2X4R verschob. Das

104 ERGEBNISSE bedeutete, der P2X4R nahm nach der Reduzierung des P2X7R in der Zellmembran weniger als im Zytosol zu.

Abb. 38: Quantitativer Nachweis der Zunahme von P2X4R in der Zellmembran nach der durch shRNA3 vermittelten Reduzierung von P2X7R.

P2rx7-shRNA3 wurde in E10-Zellen transduziert. Die Kontrollzellen (K) wurde nicht mit shRNA behandelt. 72 h nach der Transduktion wurden die Zellen oberflächlich biotinyliert, lysiert und die biotinylierten Membranproteine mit Streptavidin von den restlichen Zellbestandteilen getrennt. Gleiche Mengen an Gesamtprotein wurden in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X7R sowie GAPDH mit entsprechenden Antikörpern im Gesamtlysat ( gesamt ) und in der Fraktion mit den extrazellulär präsenten Membranproteinen ( Membran ) immundetektiert (links ). Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung des Proteingehaltes von P2X4R im Gesamtlysat ( gesamt ) und in der Zellmembran ( Membran ). n=3

Ergänzend wurde die Verteilung von P2X4R in Triton X-100-resistenten DRMs mittels Dichtegradientenzentrifugation überprüft (Abb. 39). Als Kontrollproteine wurden wiederum Cav-1, PDI und β-cop mitgeführt. Wie erwartet wurden PDI und β-cop in den Fraktionen höherer Dichte (7 bis 13) nachgewiesen. Cav-1 wurde in den Fraktionen 2 und 3 detektiert und markierte somit die Fraktionen mit den separierten Cav-1-assoziierten DRMs. Interessanterweise flotierte Cav-1 nach der Reduzierung von P2X7R in die Fraktionen niedriger Dichte, obwohl die Fluoreszenzanalysen eine verstärkt intrazelluläre Verteilung im Vergleich zur Kontrolle zeigten. Die Abnahme von Cav-1 war in Fraktion 3 nachweisbar (Abb. 39). P2X4R co-migrierte mit Cav-1 in den Fraktionen niedriger Dichte (2 und 3) und nahm nach der Herabregulierung von P2X7R in diesen Fraktionen zu (Abb. 39).

105

Abb. 39: Immunologischer Nachweis der Verteilung von P2X4R und Cav-1 in den Fraktionen der Dichtegradienten von Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X7R.

Die Kontrollzellen und mit P2rx74-shRNA3 transduzierte Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und gleiche Mengen an Gesamtprotein (750 µg) über einen Dichtegradienten aufgetrennt. Die Proteine der Fraktionen (1-13) wurden in einem 12%igen SDS-Gel separiert, auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X4R, P2X7R sowie die Kontrollproteine Cav-1, β-cop und PDI immundetektiert. 1 = Fraktion geringster Dichte, 13 = Fraktion höchster Dichte

Zusammenfassend ließ sich sagen, dass es durch die Reduzierung von P2X7R zu einer veränderten Verteilung von P2X4R sowie Cav-1 und Cav-2 in den E10-Zellen kam. Die Ergebnisse zeigten, dass der Anteil von P2X4R in der Zellmembran zunahm, wobei die charakteristische zytosolische Lokalisation bestehen blieb. In diesem Zusammenhang erhöhte sich die Konzentration des membranständigen P2X4R in DRM-Strukturen. Diese Daten bestätigten, dass sich der jeweilige P2XR-Anteil in der Membran immer dann erhöhte, wenn der jeweils andere Rezeptor deutlich reduziert wurde. Dagegen wurde der steady state -Proteingehalt der Caveoline nach der Reduzierung der P2rx7 -mRNA verringert. Zudem waren Cav-1 und Cav-2 zunehmend intrazellulär verteilt, was auf eine veränderte Zusammensetzung der Cav-1-assoziierten DRMs hinwies. Die DRMs konnten allerdings mittels Dichtegradientenzentrifugation separiert werden, womit eine veränderte Cholesterol-Lipid-Zusammensetzung der Cav-1-assoziierten Mikrodomänen als Grund für die differente Verteilung der Caveoline ausgeschlossen werden konnte. Auf Grund der partiellen Assoziation von P2X7R mit Cav-1 in einem hochmolekularen Komplex lag die Vermutung nahe, dass die intrazelluläre Verteilung der Caveoline nach der Verminderung des P2X7R auf eine veränderte molekulare Organisation zurückzuführen war.

106 ERGEBNISSE

3.9 Molekulare Organisation der Proteinkomplexe nach der Reduzierung des P2X4R und des P2X7R in E10-Zellen

Bedingt durch die vorangegangenen Untersuchungen wurde vermutet, dass die Veränderungen nach der Reduzierung der P2XR mit einer differenten Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe einhergehen könnten. Aus diesem Grund wurden im Folgenden die Proteinkomplexe aus den Membranen der Kontrollzellen und Zellen mit reduziertem P2X4R oder P2X7R solubilisiert, mittels hrCN-PAGE aufgetrennt, die Proteine mit entsprechenden Antikörpern markiert und immundetektiert. Anschließend konnten Änderungen im Molekulargewicht der Komplexe analysiert werden. Nach der Reduzierung von P2X4R blieb das molekulare Gewicht der hochmolekularen Proteinkomplexe von ~760 kDa, ~580 kDa und ~430 kDa bestehen. Die Abnahme von P2X4R konnte bei ~430 kDa detektiert werden. Diese Verringerung resultierte in einer geringen Zunahme von P2X7R bei ~580 kDa (Abb. 40). Es wurde vermutet, dass sich die Stöchiometrie des Komplexes von ~580 kDa nicht änderte, sondern der Anteil des gesamten P2X7R-assoziierten Komplexes zunahm. Dieser Komplex kann womöglich, zumindest teilweise, die Verminderung des Komplexes von ~430 kDa kompensieren. Weitere Änderungen, wie z. B. im Cav-1/P2X7R-Proteinkomplex von ~760 kDa, waren nicht detektierbar. Auch blieb der Anteil des P2X7R-Komplexes von ~430 kDa offenbar unbeeinflusst, was möglicherweise auf eine nicht ausreichende Herabregulation von P2X4R zurückzuführen war (Abb. 40).

Abb. 40: Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe solubilisiert aus Kontrollzellen und Zellen mit reduzierter P2rx4 -mRNA.

Die isolierten Membranen von E10-Zellen wurden in 4% Digitonin solubilisiert und je 50 µg Gesamtprotein in einem ein nativen Gel (3% bis 12%) aufgetrennt. Danach wurden die Proteine auf eine PVDF- Membran übertragen und P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 mit Hilfe entsprechender Antikörper immundetektiert.

107

Im Gegensatz zur P2X4R-Reduzierung zeigten sich nach der Verminderung der mRNA des P2X7R deutliche Veränderungen in der Zusammensetzung der hochmolekularen Komplexe. Die Abnahme von P2X7R führte zu einer deutlichen Zunahme des P2X4R-assoziierten Komplexes bei ~430 kDa (Abb. 41). Dies bestätigte die bisherigen Ergebnisse und implizierte, dass P2X4R zumindest die struktuellen P2X7R-Defizite in den E10-Zellen ausgleichen kann. Weiterhin konnte Cav-1 nach der Verminderung von P2X7R nicht mehr bei ~760 kDa nachgewiesen werden, was die Assoziation von Cav-1 und P2X7R in diesem Komplex verifizierte (Abb. 41). Zusätzlich stieg die Proteingehalt von Cav-1 und Cav-2 bei ~580 kDa sichtbar an. In Folge dessen wurde vermutet, dass dieser Cav-1-Subkomplex eine Untereinheit des Proteinkomplexes von ~760 kDa darstellen könnte (Abb. 41).

Abb. 41: Zusammensetzung der hochmolekularen Proteinkomplexe solubilisiert aus Kontrollzellen und Zellen mit reduzierter P2rx7 -mRNA.

Die isolierten Membranen von E10-Zellen wurden in 4% Digitonin solubilisiert und je 50 µg Gesamtprotein in einem ein nativen Gel (3% bis 12%) aufgetragen. Danach wurden die Proteine auf eine PVDF- Membran übertragen und P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 mit entsprechenden Antikörpern immundetektiert.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Reduzierung von P2X4R nur geringe Auswirkungen auf die Zusammensetzung der untersuchten hochmolekularen Proteinkomplexe hatte. Die Zunahme des P2X7R-Komplexes von ~580 kDa deutete darauf hin, dass es sich um einen separaten, von Cav-1 und Cav-2 unabhängigen, Proteinkomplex handeln könnte und die beiden purinergen Rezeptoren miteinander assoziiert sind. Diese Vermutung wurde durch die Ergebnisse nach der Reduzierung von P2X7R gestützt, da der P2X4R-assoziierte Proteinkomplex von ~430 kDa erheblich zu nahm. Ein weiteres, wesentliches Ergebnis war

108 ERGEBNISSE der Nachweis, dass P2X7R und Cav-1 miteinander verbunden im Proteinkomplex von ~760 kDa vorliegen.

3.10 Überexpression von P2X4R und P2X7R in E10- Zellen

Die Reduzierung des P2X7R in den E10-Zellen führte zur Zunahme des P2X4R. Umgekehrt erhöht sich der P2X7R-Proteingehalt nach der Verminderung der mRNA des P2X4R. Die Überexpression der beiden purinergen Rezeptoren sollte zeigen, ob diese korrelierenden Effekte bei der induzierten Erhöhung des Proteingehaltes der P2XR ebenfalls auftreten. Dafür wurden die P2rx C-terminal mit dem aus Aequorea coerulescens gewonnenen, monomeren green fluorescent protein ( AcGFP1 ) fusioniert. Die Expression stand unter Kontrolle des human cytomegalovirus ( CMV )-Promotors. Mit Hilfe der AcGFP-Fluoreszenz wurden die Transfektionsraten und die Verteilung der P2XR-Fusionsproteine überprüft. Zur Kontrolle wurde der Vektor pAcGFP1-N1 ohne Insert in die E10-Zellen transfiziert und die Verteilung des nicht-fusionierten AcGFP bestimmt. Die Bilder der fluoreszenz-mikroskopischen Analysen zeigten, dass sich AcGFP in den E10- Zellen intrazellulär verteilte und keine spezifische Lokalisation erkennbar war (Abb. 42, links oben). Generell ist bekannt, dass sich GFP im Zytoplasma und Zellkern anreichert, aber nicht in den Kernkörperchen und vesikulären Orangellen zu finden ist (Cubitt et al., 1995). Um die Qualität der Überexpressionen besser beurteilen zu können, wurden die endogenen P2X4R und P2X7R separart über spezifische Antikörper mit Cy3 immunmarkiert und die Verteilung mit den überexprimierten P2XR verglichen. Zur Kontrolle wurden die Zellen nur mit dem sekundären, Cy3-fusioniertem Antikörper inkubiert (Abb. 42). Die Fluoreszenzsignale der Fusionsproteine P2X4Ra-AcGFP und P2X7R-AcGFP waren dagegen durch eine spezifische punktförmige Verteilung in den E10-Zellen gekennzeichnet. Die Ergebnisse der Fluoreszenzanalysen zeigten, dass der überexprimierte P2X4R vorwiegend im Zytosol lokalisiert, aber auch punktförmig verteilt in der Zellmembran nachweisbar war(Abb. 42). Dieses Verteilungsmuster wurde ebenfalls für den endogenen P2X4R gezeigt (siehe auch Abschnitt 3.2.2). Dabei wurde bereits darauf hingewiesen, dass der verwendete P2X4R-Antikörper im Western Blot ein zweites, unspezifisches Protein markiert, was die Auswertung der Fluoreszenzanalyse beeinträchtigt. Die punktförmigen, zytosolischen Fluoreszenzsignale des P2X4R-Fusionproteins deuteten auf die Akkumulation, vermutlich bedingt durch die trimere Struktur der P2XR, und den vesikulären Transport innerhalb der Zelle hin. Die Transfektionsraten für pP2X4Ra-N1-AcGFP1 betrugen

109

durchschnittlich 45%. Demgegenüber lag die Transfektionseffizienz für pP2X7R-N1- AcGFP1 bei maximal 15%. Im Gegensatz zu P2X4R war der endogene P2X7R in den E10-Zellen hauptsächlich in der Zellmembran und nur zu einem geringen Anteil punktförmig zytosolisch verteilt (siehe auch Abschnitt 3.2.2). Für den überexprimierten P2X7R konnte dagegen keine membranständige Lokalisation belegt werden. Das Fusionsprotein P2X7R-AcGFP war hauptsächlich im Zytosol und nur partiell in der Zellmembran nachweisbar (Abb. 42).

Abb. 42: Fluoreszenzbilder von überexprimierten und endogenen P2X4R und P2X7R in E10-Zellen. Die Zellen mit überexprimierten AcGFP, P2X4R und P2X7R wurden 48 h nach der Transfektion mit Methanol/Aceton fixiert und die Verteilung der Fusionsproteine fluoreszenz-mikroskopisch untersucht. Die endogenen P2XR wurden in mit Methanol/Aceton fixierten E10-Zellen über spezifische Antikörper mit Cy3 markiert und die Lokalisation mit einem inversen Mikroskop analysiert. Der Standardbalken entspricht einer Länge von 20 µm.

Die punktförmigen Akkumulationen in den E10-Zellen könnten Cluster von P2X7R- Fusionsproteinen darstellen, die durch ein falsche Faltung des P2X7R-Fusionsproteins oder einen störenden Einfluss des C-terminalen AcGFP entstanden sind. Bekannt ist, dass P2X7R mit dem Aktin-Zytoskelett assoziiert ist (Pfeiffer et al., 2004). GFP interferiert mit einigen Proteinen, u. a. Aktin, wodurch die Struktur der Zelle, die Zellteilung, die Beweglichkeit und Kommunikation mit anderen Zellen beeinflusst wird (Uttamapinant et al., 2010). Da das P2X7R-Fusionsprotein keine vorwiegend membranständige Verteilung aufwies und somit die

110 ERGEBNISSE

Funktionalität von P2X7R in der Zellmembran nicht untersucht werden konnte, wurden weiterführende Experimente nur mit dem P2X4R-Fusionsprotein durchgeführt.

3.10.1 Auswirkungen der Überexpression von P2X4R auf den Proteingehalt von P2X7R, Cav-1 und Cav-2

Bisher konnte gezeigt werden, dass durch die Reduzierung des steady state-Proteingehaltes von P2X7R der P2X4R-Proteingehalt deutlich anstieg, während der Proteingehalt von Cav-1 verringert war. Die nachfolgenden Untersuchungen sollten zeigen, ob die Überexpression von P2X4R vergleichbare Auswirkungen auf P2X7R und die Caveoline hat. Die Western Blot-Analysen ergaben erwartungsgemäß für das P2X4R-Fusionsprotein ein Molekulargewicht von ~90 kDa, zusammengesetzt aus dem 62 kDa P2X4R- und 27 kDa GFP-Protein. Durch die Überexpression des P2X4R konnte der Proteingehalt des P2X4R um durchschnittlich 90% erhöht werden (Abb. 45). Der Cav-1 als auch der Cav-2 steady state- Proteingehalt war nach der Überexpression von P2X4R um rund 20% reduziert, während die P2X4R-Überexpression keine Auswirkungen auf den Proteingehalt von P2X7R hatte (Abb. 43).

Abb. 43: Immunologischer Nachweis der Veränderungen im Proteingehalt von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 nach der Überexpression von P2X4R.

Die Plasmide pAcGFP1-N1-P2X4Ra und pAcGFP1-N1 (Kontrolle) wurden in E10-Zellen transfiziert und die Zellen nach 48 h lysiert. Je 50 µg Gesamtprotein wurden in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt und die Proteine mit spezifischen Antikörpern immundetektiert ( links ). Das dargestellte Diagramm zeigt die errechneten Mittelwerte ± Standardabweichung von P2X4R, P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 ( rechts ).

Die Abnahme des Proteingehaltes der Caveoline wies auf eine Assoziation zwischen P2X4R und Cav-1 bzw. Cav-2 hin. Eine unspezifische Beeinträchtigung durch den AcGFP-Abschnitt 111

war dabei nicht auszuschließen. Dagegen ließen die Ergebnisse vermuten, dass sich P2X4R und P2X7R nicht direkt beeinflussen. Die Zunahme von P2X4R nach der Reduzierung von P2X7R könnte demzufolge auf einen sekundären Effekt zurückgeführt sein.

3.10.2 Auswirkungen der Überexpression von P2X4R auf die Verteilung von P2X7R, Cav-1 und Cav-2

Die Überexpression von P2X4R führte zwar zu einer geringfügigen Abnahme der Caveoline, hatte aber keinen Einfluss auf den Proteingehalt von P2X7R. Um zu klären, ob die Überexpression von P2X4R Auswirkungen auf die Lokalisation von P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2 hat, wurden diese endogenen Proteine nach der P2X4R-Überexpression immunmarkiert und die Verteilung mittels Fluoreszenzanalysen untersucht. Zuerst wurde geprüft, ob es Unterschiede in der Lokalisation von überexprimierten und endogenen P2X4R gibt . Der Vergleich der beiden Fluoreszenzsignale ergab, dass beide Proteine eine übereinstimmende Verteilung aufwiesen, da die Überlagerung der einzelnen Bilder zu gelben Signalen führte (Abb. 44, A). Weiterhin wurde die Verteilung der Caveoline in Abhängigkeit nach der Überexpression von P2X4R analysiert. Die Auswertung der Fluoreszenzsignale zeigte, dass Cav-1 und Cav-2 wie erwartet vorwiegend in der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch wurden beide Caveoline auch zunehmend im Zytosol nachgewiesen. Co-Lokalisationen von Cav-1 und Cav-2 mit P2X4R waren wiederum nicht erkennbar (Abb. 44, B+C). Bisher war es nicht möglich, die Lokalisation der beiden P2XR vergleichend in den E10- Zellen zu untersuchen. Im Anschluss an die Überexpression von P2X4R konnte nun jedoch der endogene P2X7R immunmarkiert werden. Die Verteilungsmuster der beiden P2XR waren in den E10-Zellen sehr unterschiedlich. Wie bereits gezeigt wurde, ist P2X4R vorwiegend intrazellulär verteilt, während der überwiegende Anteil von P2X7R in der Zellmembran lokalisiert ist. Allerdings wurde durch die Überlagerung der Fluoreszenzbilder partiell gelbe Signale in der Zellmembran sichtbar, welche die Co-Lokalisationen von Proteinen kennzeichnen (Abb. 44, D).

112 ERGEBNISSE

A

B

C

D

Abb. 44: Bilder der Fluoreszenzen von überexprimierten P2X4R mit den endogenen, immunreaktiven Proteinen P2X4R, P2X7R, Cav-1 und Cav-2.

Die Zellen mit überexprimierten P2X4R wurden 48 h nach der Transfektion mit Methanol/Aceton fixiert. Mit entsprechenden Antikörpern konnten die Proteine P2X4R ( A), P2X7R ( B), Cav-1 (C) und Cav-2 ( D) anschließend indirekt mit Cy3 markiert werden. Co-Lokalisationen sind an gelben Signalen erkennbar. Die Fluoreszenzsignale wurden mittels eines inversen Mikroskops analysiert. Der Standardbalken entspricht einer Länge von 20 µm.

113

Die Untersuchung der Verteilung ergab, dass sich das Verteilungsmuster von Cav-1 und Cav-2 nach der Überexpression von P2X4R zugunsten einer zunehmenden intrazellulären Lokalisation veränderte. Auch unter diesen Bedingungen waren P2X4R und die Caveoline nicht co-lokalisiert, was für die Verteilung der Proteine in unterschiedlichen Strukturen sprach. Dagegen wurde das Fluoreszenzprofil von P2X7R durch die Zunahme von P2X4R nicht beeinflusst. Die partiell auftretenden Überlagerungen der P2XR-Fluoreszenzsignale könnten auf die teilweise Co-Lokalisation der Rezeptoren in der Zellmembran hindeuten.

3.10.3 Auswirkung der Überexpression von P2X4R auf die Assoziation von P2X7R und Cav-1 mit DRMs

Da die Überexpression von P2X4R in den E10-Zellen in der Abnahme von Cav-1 und Cav-2 Proteingehaltes und in einer zunehmenden intrazellulären Lokalisation der Caveoline resultierte, wurde ergänzend die DRM-Assoziation von Cav-1 und der P2X4R-Proteine untersucht. Nach der Solubilisierung mit Triton X-100 und der Separation der DRMs über einen Dichtegradienten wurde P2X4R erwartungsgemäß in den Fraktionen 2 und 3 sowie in den Fraktionen 7 bis 13 detektiert. Das P2X4R-Fusionsprotein war dabei im Vergleich zum endogenen P2X4R nicht adäquat verteilt und co-migrierte vorwiegend in den Fraktionen 7 bis 13 mit den Kontrollproteinen PDI und β-cop. Die Zunahme von P2X4Ra-AcGFP in den Fraktionen niedriger Dichte war dennoch verifizierbar (Abb. 45). Zusätzlich änderte sich das Separationsprofil von Cav-1 nach der Überexpression von P2X4R. Während sich Cav-1 in den Kontrollversuchen über die Fraktionen 2 und 3 verteilte, wurde Cav-1 nach der P2X4R-Überexpression zusätzlich in den Fraktionen 4 bis 7 nachgewiesen. P2X7R wurde durch die Überexpression von P2X4R nicht beeinflusst und sedimentierte ausschließlich in den Fraktionen höherer Dichte (7 bis 13) (Abb. 45).

114 ERGEBNISSE

Abb. 45: Verteilung von P2X4R, P2X7R und Cav-1 in den Fraktionen der Dichtegradienten nach der Überexpression von P2X4R.

Die E10-Zellen mit AcGFP (Kontrolle) und überexprimiertem P2X4R wurden lysiert und gleiche Mengen an Gesamtprotein (je 750 µg) in einem Dichtegradienten aufgetrennt. Die Proteine der Fraktionen (1-13) wurden in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und P2X4R, P2X7R sowie die Kontrollproteine Cav-1, β-cop und PDI mit entsprechenden Antikörpern immunologisch nachgewiesen.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Zunahme des P2X4R-Fusionsproteins in den DRMs nicht dem Anstieg außerhalb der DRMs entsprach. In Bezug auf den unveränderten P2X7R- Proteingehalt könnte dies ein Hinweis darauf sein, dass die Lokalisation der beiden P2XR- Subtypen in der Zellmembran streng reguliert ist. Ein unerwünschter Einfluss des AcGFP- Anteils auf die Lokalisation des P2X4R-AcGFP-Proteins ist nicht bekannt. Desweiteren wirkte sich die Überexpression von P2X4R auf den Proteingehalt und die Verteilung von Cav-1 in den E10-Zellen aus. Die Migration von Cav-1 in Fraktionen höherer Dichte könnte auf die Assoziation mit weniger strukturierten Membranen von Zellkompartimenten hinweisen.

3.11 Auswirkungen der Reduzierung des P2X4R und des P2X7R auf den Proteingehalt von Calmodulin und der Proteinkinase CβI

Die Assoziation der P2XR mit den DRMs und die mögliche direkte Interaktion mit dem in

DRMs angereichten PI(4,5)P 2, deuten auf die Beteiligung der P2XR an der Lipid-vermittelten 2+ Signalweiterleitung hin. So wird durch PI(4,5)P2-generierte second messenger das Ca -Level innerhalb der Zelle reguliert, was eine Assoziation der Ca 2+ -durchlässigen P2XR-Kanäle mit weiteren Signalmolekülen vermuten ließ. Die P2XR sind bedingt durch ihre Kanalaktivitäten und die Assoziation mit DRMs vermutlich an der Erhaltung der Ca 2+ -Homöostase in der Zelle beteiligt.

115

Freies Ca 2+ wird in der Zelle durch Calmodulin (CaM) gebunden, wodurch dieses aktiviert wird und anschließend eine Reihe von Phosphorylierungsreaktionen ausgelöst. Weiterhin werden die klassischen Proteinkinase C (PKC)-Isoformen, welche Serin- und Threonin-Reste in vielen Zielproteinen phosphorylieren, durch Ca 2+ -Ionen sowie Diacylglycerol (DAG) aktiviert (Newton, 1997). Zu diesen klassischen PKCs gehört die PKC βI. Die Untersuchung des Proteingehaltes von CaM und der PKC βI nach der Reduzierung des P2X4R- oder P2X7R-Proteingehaltes sollten zeigen, ob die P2XR diese durch Ca 2+ aktivierbaren Signalmoleküle beeinflussen können. Die Ergebnisse ergaben, dass nach der Verminderung von P2X4R mit P2rx4 -shRNA3 der CaM-Proteingehalt zunahm und um 20% anstieg. Dagegen wurde nach der Reduzierung des P2X7R mittels shRNA3 die Abnahme des CaM-Proteingehaltes auf durchschnittlich 60% nachgewiesen (Abb. 46). Die Negativkontrollen ( P2rx4sc , P2rx7sc ) zeigten keine Veränderungen für CaM. In Bezug auf die bisherigen Daten wurde vermutet, dass der vorwiegend mit DRMs assoziierte P2X4R keine Kanalaktivitäten aufweist, während durch den vorwiegend außerhalb von Mikrodomänen lokalisierte P2X7R ein Einstrom von Ca 2+ -Ionen initiiert wird (Garcia- Marcos et al., 2006c), welcher indirekt durch CaM nachweisbar ist. Dabei kann die second messenger -induzierte Freisetzung von Ca 2+ aus intrazellulären Speichern nicht ausgeschlossen werden.

Abb. 46: Western Blot-Analysen von Calmodulin in Kontrollzellen und nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R.

E10-Zellen wurden mit der entsprechenden shRNA transduziert, nach 72 h lysiert und je 50 µg Gesamtprotein in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt. Calmodulin (CaM) wurde mit Hilfe eines Antikörpers immundetektiert. Als Standardprotein wurde γ-Tubulin mitgeführt. Die Kontrollen wurden nicht mit shRNA behandelt. Das Diagramm zeigt die errechneten Mittelwerte ± Standardabweichung des CaM-Proteingehaltes nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R. n=3

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Verminderung von P2X4R keinen Einfluss auf den steady state-Proteingehalt von PKC βI hatte. Im Gegensatz dazu führte die Reduzierung von

116 ERGEBNISSE

P2X7R zur Abnahme der PKC βI auf durchschnittlich 75% (Abb. 47). Durch die Negativkontrollen ( P2rx4sc , P2rx7sc ) wurde der Proteingehalt der PKC βI nicht beeinflusst. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die PKC βI nicht nur durch die Veränderung des Ca 2+ -Levels – indirekt nachweisbar durch CaM – moduliert wird.

Abb. 47: Western Blot-Analysen der Proteinkinase C βI in Kontrollzellen und nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R.

E10-Zellen wurden mit der entsprechenden shRNA transduziert, nach 72 h lysiert und je 50 µg Gesamtprotein in 12%igen SDS-Gelen aufgetrennt. Die Proteinkinase C βI (PKC βI) wurde mit einem Antikörper immundetektiert. Als Standardprotein wurde γ-Tubulin mitgeführt. Die Kontrollen wurden nicht mit shRNA behandelt. Das Diagramm zeigt die errechneten Mittelwerte ± Standardabweichung des CaM-Proteingehaltes nach der Reduzierung von P2X4R und P2X7R. n=3

Die Ergebnisse zeigten, dass die Veränderungen des CaM-Proteingehaltes mit der Zu- und Abnahme von P2X7R korrelierten. CaM wird als Sensor für das Ca 2+ -Level in der Zelle angesehen und reguliert die Aktivität verschiedener Ionenkanäle, um das Ca 2+ -Gleichgewicht aufrecht zu erhalten. Nach der Reduzierung von P2X7R war ebenfalls der PKC βI-Proteingehalt verringert. Da der steady state -Proteingehalt von Cav-1 nach der Reduzierung von P2X7R gleichermaßen vermindert war, wurde vermutet, dass die Cav-1-assoziierten DRMs in die Regulation der PKC involviert sind.

3.12 Auswirkung des P2rx7 knockout auf den Proteingehalt von Calmodulin und der Proteinkinase CβI im Lungengewebe der Maus

Zusätzlich wurde der Proteingehalt von CaM und die PKC βI im Lungengewebe von P2rx7 (+/+) und P2rx7 (-/-) Mäusen untersucht. Der Proteingehalt von CaM war im Lungengewebe der P2rx7 (-/-) Mäuse im Vergleich zum Wildtyp auf etwa 75% reduziert. Weiterhin wurde die Abnahme der PKC βI im Lungengewebe der P2rx7 (-/-) Mäuse auf etwa 70% nachgewiesen (Abb. 48).

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Abb. 48: Immunologischer Nachweis von Calmodulin und der Proteinkinase CβI im Lungengewebe von P2rx7 (+/+) Wildtyp und (-/-) knockout Mäusen.

Das Lungengewebe von Mäusen wurde lysiert und je 50 µg Gesamtprotein in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt. Calmodulin (CaM) und die Proteinkinase C βI (PKC βI) wurden mit Hilfe von spezifischen Antikörpern immunologisch nachgewiesen. n=2

Die Ergebnisse bestätigten, dass durch die Deletion bzw. die signifikante Verringerung des P2X7R die Signalmoleküle CaM und PKC βI reduziert werden.

118

4 D ISKUSSION

4.1 Lokalisation und molekulare Organisation von P2X7R in E10-Zellen

Während der Differenzierung polarisieren sich die Epithelzellen und bilden zwei deutlich voneinander getrennte Zellmembranbereiche aus, die apikale und basolaterale Membran. Die Lokalisation und Verteilung der Ionenkanäle in der jeweils spezifischen Zellmembran spielen eine wichtige Rolle bei der physiologischen Funktion der epithelialen Zellen. Nach der Synthese im endoplasmatischen Retikulum werden die Membranproteine über verschiedene Transportvesikel zur apikalen oder basolateralen Zellmembran transportiert und verankert (van Meer and Simons, 1988; Ikonen et al., 1995). Der Transport zur apikalen Membran und die Verankerung in der Zellmembran erfolgt über Mikrodomänen, die mit Cholesterol und Sphingolipiden angereichert sind. Die am besten charakterisierten DRM-Strukturen sind dabei die Caveolen (Brown and Rose, 1992; Lisanti et al., 1994a; Simons and Toomre, 2000; Meder et al., 2006). Erste Befunde lassen vermuten, dass die Stimulation der P2XR zum Einstrom von Ca 2+ in Epithelzellen der Atemwege führt, was eine Vielzahl von zellulären Prozessen und auch die Aktivität weiterer Ionenkanäle modulieren würde (Schwiebert and Zsembery, 2003; Zsembery et al., 2003). Dabei wurde die mögliche Beeinflussung der P2XR-Funktionalität durch die Mikrodomänen der Zellmembran kaum beachtet. Der P2X7R wird spezifisch in den ATI-Zellen der Lunge exprimiert (Chen et al., 2004), welche bis zu 70% mit Caveolen belegt sind (Gil, 1983; Lisanti et al., 1994a). Die Assoziation des P2X7R mit den Caveolen wäre ein wichtiger Hinweis auf die mögliche Regulation des P2XR. Infolge ihrer spezifischen Lipidzusammensetzung können die DRMs in einem Dichtegradienten durch Ultrazentrifugation von den übrigen Zellbestandteilen isoliert werden (Brown and London, 1997). Durch die Analyse der DRM-Zusammensetzung kann die Beteiligung der assoziierten Proteine an zellulären Prozessen vorhergesagt werden (Razani et al., 2002a; Pike, 2004). Drei mögliche Modelle wurden postuliert, welche die Struktur und die Eigenschaften von DRMs beschreiben (Pike, 2004). Das erste Modell unterteilt die Mikrodomänen in einen zentralen strukturierten Kernbereich, der von Zonen mit abnehmender Lipidordnung umgeben ist. Diese Zonen werden durch verschiedene Detergenzien individuell solubilisieren, was in einer Detergenzien-abhängigen Lipid- und Proteinzusammensetzung resultiert. Im zweiten Modell werden die DRMs als homogene Domänen beschrieben, aus denen mit verschiedenen Detergenzien selektiv Lipide und Proteine extrahiert werden können. Dagegen geht das dritte Modell davon aus, dass heterogene DRMs in der Zellmembran co-existieren und eine

119

variierende Sensitivität zu den unterschiedlichen Detergenzien aufweisen (Pike, 2004). Zur Interpretation von Ergebnissen wird bevorzugt das dritte Modell herangezogen, wobei Mischformen nicht ausgeschlossen werden können, da die verschiedenen DRMs transient miteinander fusionieren können (Zajchowski and Robbins, 2002). Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Detergenzien mit verschiedenen Solubilisierungs- eigenschaften genutzt, Triton X-100 und Brij 35. Brij 35 ist ein schwächeres Detergenz als Triton X-100. Es löst weniger Lipide und Proteine aus den Membranen und schwache Protein-Protein- bzw. Lipid-Protein-Assoziationen bleiben erhalten (Schuck et al., 2003). Die Ergebnisse zeigten, dass zwei Populationen von P2X7R in der Zellmembran der E10-Zellen nachweisbar waren. Ein P2X7R-Anteil war mit Brij 35-resistenten DRMs assoziiert, während die zweite Population in Brij 35 löslich war und folglich im unstrukturierten Bereich der Zellmembran lokalisiert ist. Nach der Solubilisierung mit Triton X-100 konnte keine Assoziation des P2X7R mit den DRM-Strukturen detektiert werden. Jedoch können durch die Extraktion mit Triton X-100 schwache Protein-DRM-Interaktionen zerstört werden, welche u. a. wichtig für verschiedene Sortiermechanismen und die Funktion von Proteinen sind (Shvartsman et al., 2003). Diese Vermutung wurde durch die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen bestätigt. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 in der Zellmembran von E10-Zellen co-lokalisiert. Zusätzlich konnte mit Hilfe der FRET-Analysen gezeigt werden, dass P2X7R und Cav-1 teilweise einen Abstand von weniger als 10 nm haben. Dieser geringe Abstand wies auf eine partielle Assozation zwischen P2X7R und Cav-1 hin. Die Verteilung von P2X7R in der Zellmembran von E10-Zellen stimmt mit Befunden aus der Glandula submandibularis der Ratte und den Zellen von Lymphknoten aus Mäusen überein (Bannas et al., 2005; Garcia-Marcos et al., 2006c). P2X7R ist demnach zum Teil mit DRMs assoziiert und vermutlich sind diese DRM-assoziierten P2X7R an downstream Ereignissen beteiligt, während die P2X7R außerhalb der DRMs die bekannten Kanalfunktionen aufweisen (Garcia- Marcos et al., 2006c). Die Assoziation von Proteinen mit den DRMs wird durch die Bildung von Proteinkomplexen stabilisiert (Zurzolo et al., 2003). Aufgrund dessen wurde angenommen, dass P2X7R in hochmolekularen Komplexen assoziiert ist. Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X7R in E10-Zellen zeigte, dass P2X7R in Komplexen mit Molekulargewichten von ~430 kDa, ~580 kDa und ~760 kDa nachweisbar war. Bekannt ist, dass P2X7R als Trimer (240 kDa) in der Zellmembran lokalisiert ist. Die P2X7R-assoziierten Proteinkomplexe weisen größere Molekulargewichte auf, was die Assoziation mit weiteren Proteinen vermuten ließ. Dafür spricht, dass aus P2X7R-exprimierenden HEK293-Zellen und peritonealen

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Makrophagen der Ratte P2X7R-Proteinkomplexe mittels Co-Immunpräzipitation isoliert werden konnten. Diese Komplexe enthielten folgende Proteine: Laminin α3, Integrin β3, die Rezeptor Protein Tyrosin Phosphatase β (RPTP β), α-Actinin 4, β-Aktin, Supervillin, die Hitzeschock-Proteine Hsp90, Hsp71 und Hsp70 sowie die Phosphatidylinositol 4-Kinase 230 (PI4K) und die Membran-assoziierte Guanylatkinase P55 (MAGuK) (Kim et al., 2001a). Weiterhin wurde gezeigt, dass die Zusammensetzung der P2X7R-Komplexe in den verschiedenen Zelltypen variieren kann (Li et al., 2003). Western Blot-Analysen von nativen Proteinkomplexen ergaben, dass P2X7R multimere Komplexe in Zellen des Knochenmarkes und in peritonealen Makrophagen der Ratte ausbildet, während P2X7R in den Gliazellen des Gehirns und in Astrozyten nur als Monomer auftritt (Kim et al., 2001b). Diese Unterschiede weisen auf die gewebespezifische Regulation und Funktion von P2X7R hin und können u. a. durch Proteine entstehen, welche das Öffnen der Kanalpore modulatorisch beeinflussen. So verläuft in murinen Zellen der Parotis die Aktivierung von P2X7R schnell und unabhängig vom Zytoskelett, während P2X7R in azinösen Zellen langsamer aktiviert wird, beschränkt durch die Beteiligung des Aktin-Zytoskelettes (Li et al., 2003). Wie bereits erwähnt, konnten in den E10-Zellen zwei P2X7R-Subtypen in der Zellmembran nachgewiesen werden (Barth et al., 2007). Eine Subpopulation von P2X7R ist mit DRM- Strukturen assoziiert, während die andere in den unstrukturierten Bereichen der Membran verteilt ist. Die Zusammensetzung der P2X7R-Komplexe könnte ebenfalls in Abhängigkeit von der Funktion und Lokalisation von P2X7R variieren. Einen Hinweis darauf ergaben die Ergebnisse der BN- und hrCN-PAGE, da P2X7R und Cav-1 bei Molekulargewichten von ~580 kDa und ~760 kDa co-migrierten. Bekannt ist, dass Cav-1 bereits im TGN Oligomerkomplexe ausbildet, welche die Morphologie der Caveole bestimmen und über die Protein-Protein-Interaktionen vermittelt werden. I n vivo und in vitro Untersuchungen zeigten, dass Cav-1 in Proteinkomplexen von ~400 kDa und ~600 kDa nachweisbar ist (Monier et al., 1995; Sargiacomo et al., 1995). Der 400 kDa-Komplex enthält dabei ausschließlich Cav-1 und besteht aus 14 bis 16 Cav-1- Monomeren (Monier et al., 1995). Dementsprechend bilden auch Cav-1 und Cav-2 stabile hochmolekulare Hetero-Oligomere aus (Scherer et al., 1997). Die Immpräzipitationen bestätigten, dass P2X7R mit Cav-1 und Cav-2 in einem Komplex assoziiert vorliegt. Aufgrund dessen wurde vermutet, dass die Proteine in den Komplexen von ~580 kDa und ~760 kDa co-existieren. Jedoch hatte die Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen unterschiedliche Auswirkungen auf die molekulare Zusammensetzung der beiden Proteinkomplexe. Nach der P2X7R-Verringerung wurde der Cav-1-assoziierte

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Proteinkomplex von ~760 kDa nicht mehr nachgewiesen, während der Cav-1/Cav-2- Proteinkomplex bei ~580 kDa zunahm. Diese Ergebnisse bestätigten, dass P2X7R und Cav-1 Bestandteile des hochmolekularen Komplexes von ~760 kDa sind und der Cav-1-Subkomplex von ~580 kDa wahrscheinlich eine Untereinheit dieses Komplexes darstellt (Weinhold et al., 2010). Das bedeutet, dass Cav-1 und P2X7R zwar bei ~580 kDa co-migrieren, aber nicht in demselben Proteinkomplex co-lokalisiert vorliegen. Das dominante Auftreten des 580 kDa schweren P2X7R-Komplexes in Bezug auf die Verteilung von P2X7R in den unstrukturierten Bereichen der Zellmembran, weist auf die Lokalisation außerhalb der DRM-Strukturen hin. Dagegen ist der 760 kDa-Proteinkomplex mit Cav-1 und P2X7R mit den Caveolen assoziiert. Es ist weiterhin bekannt, dass Cav-1 die Lokalisation von Kanälen in der Zellmembran bestimmt. So sind der membranständige Rezeptor transient receptor potential channel

(TRPC1) und der IP 3-Rezeptor mit den Caveolen über die Interaktion mit Cav-1 assoziiert (Hardin and Vallejo, 2009). Dabei kann Cav-1 die Ionenkanäle direkt durch physiko- chemische Interaktionen regulieren (Remillard and Yuan, 2006). Beispielweise besitzt der TRPC1 ein Cav-1-Bindemotiv, nach dessen Deletion sich die membranständige Lokalisation von TRPC1 verändert (Brazer et al., 2003). Auch der P2X7R weist C-terminal ein potentielles Bindemotiv für Cav-1 auf (Couet et al., 1997b). Diese Daten ließen vermuten, dass Cav-1 direkt oder indirekt die Stabilität und die molekulare Organisation von P2X7R beeinflussen kann. Erste Hinweise, dass sich die Veränderung des Cav-1-Proteingehaltes auf die Verteilung von P2X7R auswirkt, konnten durch immunhistochemische Untersuchungen am Lungengewebe von cav-1(-/-) Mäusen gewonnen werden (Barth et al., 2007). Im Lungengewebe der cav-1 knockout Mäuse werden keine Caveolen ausgebildet (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001) und der Proteingehaltes von P2X7R ist reduziert (Barth et al., 2007). Ebenso führte die Herabregulation der cav-1-mRNA in den E10-Zellen zur Abnahme des P2X7R-Proteingehaltes und zur partiellen Reorganisation von P2X7R (Barth et al., 2007; Barth et al., 2008). Hinsichtlich der teilweisen Assoziation von P2X7R mit Cav-1 wiesen die Ergebnisse darauf hin, dass vorwiegend der Cav-1-assoziierte P2X7R beeinflusst wird, während P2X7R außerhalb der DRMs weniger beeinträchtigt werden. Vice versa führte die Reduzierung des P2X7R in den E10-Zellen zur Abnahme des Cav-1- Proteingehaltes, was mit der Umverteilung von Cav-1 und einer steigenden intrazellulären Lokalisation einher ging (Weinhold et al., 2010). Die spezifische Lipid- und Cholesterolzusammensetzung der Caveolen wurde allerdings nicht beeinflusst, da die DRMs durch Dichtegradientenzentrifugationen isoliert werden konnten. In Bezug auf die molekulare Organisation nach der Reduzierung der P2rx7 -mRNA, bei welcher der Cav-1/P2X7R-

122 DISKUSSION assoziierte Proteinkomplex von ~760 kDa nicht mehr detektierbar war und der Cav-1- Proteinkomplex bei ~580 kDa zunahm, könnte die intrazelluläre Verteilung für den Verlust einer Caveolin-Protein-Interaktion sprechen. Für P2X7R sowie Cav-1 sind eine Vielzahl von Interaktionspartnern beschrieben und beide Proteine werden mit dem Aktinzytoskelett in Verbindung gebracht (Kim et al., 2001a; Pfeiffer et al., 2004; Hagiwara et al., 2009; Kuehnel et al., 2009). So reguliert PI(4,5)P 2 die P2X7R-abhängige Aktinpolymerisierung während der Phagozytose in Makrophagen (Kuehnel et al., 2009). Auch das durch ATP-Stimulation induzierte blebbing der Zellmembran geht mit der Reorganisation des Aktinzytoskelettes in murinen Makrophagen einher (Pfeiffer et al., 2004). Die Inhibierung der Aktinpolymerisierung mittels Cytochalasin D vermindert das P2X7R-vermittelte blebbing der Zellmembran, jedoch ohne die Kanalfunktionen des P2X7R zu beeinflussen. Die Zerstörung des Aktinzytoskelettes führt außerdem zum Verlust der caveolären Strukturen und zur Umverteilung von Rezeptoren in die unstrukturierten Bereiche der Zellmembran (Head et al., 2006; Allen et al., 2007). Aktin-bindenden Proteine, wie Filamin und α-Actinin, sind in die Verankerung der Caveolen mit dem Aktin-Zytoskelett involviert (Stahlhut and van Deurs, 2000). Durch die zytoskelettale Regulation der DRM-Strukturen werden zelluläre Reaktionen mit diversen Signalwegen verbunden (Meiri, 2004). Dies spricht für die essentielle Bedeutung der Cav-1/P2X7R-Assoziation bei zellulären Abläufen in AT I-Zellen.

4.2 Lokalisation und molekulare Organisation von P2X4R in E10-Zell en

Bislang gibt es wenige Erkenntnisse über die Lokalisation und Regulation der P2XR- Subtypen im Alveolarepithel der Lunge. P2X4R wurde genau wie P2X7R in ATI-Zellen nachgewiesen und in Verbindung mit der alveolaren Flüssigkeitshomöostase gebracht (Qiao et al., 2003; Zsembery et al., 2003). Bisher war über die Assoziation des P2X4R mit DRMs nichts bekannt. Im Gegensatz zu P2X7R ist P2X4R in den E10-Zellen fast vollständig in Brij 35-resistenten DRM-Strukturen integriert und eine kleine Subpopulation ist in Triton X-100, dem klassischen Detergenz zur Isolierung von DRMs, unlöslich. Da P2X4R hauptsächlich in DRM-Strukturen detektierbar war, wurde eine vorwiegend membranständige Lokalisation vorausgesagt. Jedoch zeigten die Immunfluoreszenzanalysen eine vorwiegend intrazelluläre Verteilung von P2X4R in den E10-Zellen. Nur zum Teil war P2X4R in der Zellmembran lokalisiert, wobei die Verteilung nicht mit der Lokalisation des membranständigen Cav-1 übereinstimmte und keine Co-Lokalisation der beiden Proteine erkennbar war.

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Die ausgeprägte intrazelluläre Lokalisation wurde ebenfalls in Makrophagen, der Mikroglia, in vaskulären Endothelzellen, in Neuronen sowie in den T-Tubuli der Skelettmuskulatur nachgewiesen (Bobanovic et al., 2002; Sandona et al., 2005; Qureshi et al., 2007; Boumechache et al., 2009). Aufgrund der biochemischen Daten und der Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen wurde vermutet, dass P2X4R mit Transportvesikeln assoziiert ist, die mit Cholesterol und Sphingolipiden angereichert und an dem Transport von Proteinen zur apikalen Zellmembran beteiligt sind (Nelson and Yeaman, 2001; Schuck and Simons, 2004). Diese Vesikel entstehen durch die Zusammenlagerung von Mikrodomänen im TGN, wodurch die Assoziation von Proteinen und Lipiden mit den DRMs stabilisiert wird, während Komponenten ohne Affinität zu den strukturierten Mikrodomänen ausgeschlossen werden (Harder et al., 1998; Verkade et al., 2000). Die charakteristische Lokalisation des P2X4R wird zudem auf einen schnellen turnover des Rezeptors zurückgeführt. Wahrscheinlich fusionieren die Transportvesikel mit der Zellmembran und der überwiegende Teil des P2X4R wird zeitnah wieder internalisiert. Für P2X4R wurde die Interaktion mit dem Adapterprotein AP-2 und die Lokalisation in Clathrin-Vesikeln beschrieben (Royle et al., 2005; Toulme et al., 2006). Dabei ist das identifizierte Bindemotiv (YEQGL) in P2X4R von Säugetieren hoch konserviert, fehlt aber in allen anderen P2XR-Subtypen. Von den bisher getesteten P2XR zirkuliert nur P2X4R konstitutiv zwischen Zellmembran und den Zellkompartimenten (Bobanovic et al., 2002). Demzufolge sind die Clathrin-vermittelte Endozytose und das Recycling von P2X4R essentiell für die hohe Geschwindigkeit des turnovers . Durch die Änderung der relativen Raten von endozytotischer Internalisierung und dem Einbau von P2X4R in die Zellmembran kann die P2X4R-Dichte in den verschiedenen Bereichen der Zellmembran und den unterschiedlichen Zellkompartimenten variiert werden (Burrone and Murthy, 2001; Bobanovic et al., 2002). Beispielsweise ist P2X4R mit Kompartimenten des endo-lysosomalen Systems assoziiert, u. a. mit dem frühen Endosom in Neuronen und mit den Lysosomen der Makrophagen, der Mikroglia und von Endothelzellen (Bobanovic et al., 2002; Qureshi et al., 2007). Bekannt ist, dass einige membranständige Rezeptoren nach der Bindung ihrer Liganden in DRMs wechseln, während andere sich aus den Mikrodomänen in den unstrukturierten Bereich der Zellmembran bewegen. Die Funktion solcher dynamischen Rezeptoren ist generell mit der Modulation durch Signalmoleküle und der Internalisierung der Rezeptoren verbunden (Zajchowski and Robbins, 2002). Ein bekannter Rezeptor, der in DRM-Strukturen (auch Caveolen) lokalisiert ist, und dessen Lokalisation in der Zellmembran durch Clathrin- abhängige Endozytose reguliert wird, ist der EGFR (Mineo et al., 1999; Ringerike et al.,

124 DISKUSSION

2002). Nach der Aktivierung transloziert der EGFR aus den DRMs und wird anschließend Clathrin-abhängig internalisiert und degradiert (Vieira et al., 1996; Barbieri et al., 2004). Generell können die DRMs die Aktivität von assoziierten Proteinen modulieren (Pike et al., 2002, Ringerike et al., 2002). Zum Beispiel sind der EGFR und der PDGFR sowie die Enzyme eNOS und PKA in den Caveolen lokalisiert und werden durch die Interaktion mit Cav-1 inhibiert (Liu et al., 1996; Garcia-Cardena et al., 1997; Mineo et al., 1999; Razani et al., 1999). Des Weiteren wurde für den P2X7R der Glandula submandibularis gezeigt, dass die Assoziation mit DRMs hauptsächlich in der Beteiligung an der Signaltransduktion resultiert und die Kanalfunktionen eingeschränkt sind (Garcia-Marcos et al., 2006c). Da der P2X4R in den E10-Zellen fast ausschließlich in DRM-Strukturen nachweisbar war, wird angenommen, dass der P2X4R in der Zellmembran an der Modulation verschiedener Signalwege beteiligt, aber die Kanalaktivität unter physiologischen Bedingungen im Alveolarepithel der Lunge nicht maßgeblich ist. Bedingt durch die DRM-Lokalisation wurde erwartet, dass auch P2X4R ein Bestandteil von hochmolekularen Proteinkomplexen ist. Diese Vermutung wurde bestätigt und P2X4R vorwiegend in einem Komplex von ~430 kDa nachgewiesen. Bisher ist bekannt, dass der P2X4R mit der AP-50-Untereinheit des AP-2-Adaptors (Royle et al., 2002), mit einigen Phosphoinositiden (Bernier et al., 2008b), mit dem P2X6R im Atemwegsepithel und in Neuronen (Le et al., 1998; Liang et al., 2005) sowie mit VE-Cadherin in humanen Endothelzellen (Glass et al., 2002) interagiert. Außerdem zeigen aktuelle Studien, dass P2X7R mit P2X4R Oligomere ausbilden kann (Guo et al., 2007; Boumechache et al., 2009; Casas-Pruneda et al., 2009). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Subpopulation von P2X7R mit P2X4R bei ~430 kDa co-migrierte, was auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R in diesem Komplex hindeutet. Die Ergebnisse der Immunpräzititationen verifizierten die teilweise Assoziation der beiden P2XR in einem Proteinkomplex. Zudem korrelierten die Ergebnisse mit den biochemischen Daten. P2X4R war fast vollständig und P2X7R zu einem Teil in Brij 35-resistenten DRMs nachweisbar, was auf die Verteilung des P2XR-Proteinkomplexes von ~430 kDa in diesen DRM-Strukturen hinwies. Nach der Auftrennung der Proteinkomplexe mittels BN-PAGE konnte P2X4R zusätzlich in einem Komplex von ~580 kDa detektiert werden. Dabei co-migrierte P2X4R mit P2X7R sowie Cav-1 und Cav-2. In Zusammenhang mit dem Resultat der Immunpräzipitationen, die keine Assoziation des P2X4R mit Cav-1 oder Cav-2 erkennen ließen, wurde vermutet, dass P2X4R mit P2X7R über eine transiente Bindung assoziiert ist. Diese Assoziation könnte für die Modulation der ATP-induzierten Kationenströme und der

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Signalweiterleitung in den AT I-Zellen wichtig sein (Guo et al., 2007; Casas-Pruneda et al., 2009).

4.3 Wechselbeziehungen zwischen P2X4R und P2X7R

Die spezifische Expression der P2XR-Untereinheiten in den verschiedenen Geweben stellt einen wichtigen physiologischen Mechanismus dar, der für die Vermittlung charakteristischer Zellantworten verantwortlich ist (Murrell-Lagnado, 2009). P2X4R und P2X7R werden häufig co-exprimiert, nicht nur in Immunzellen, sondern ebenso in Epithel- und Endothelzellen (Xiang and Burnstock, 2005; Bours et al., 2006; Nicke, 2008; Surprenant and North, 2009). Auch in den AT I-Zellen der Lunge sind P2X4R und P2X7R die dominant auftretenden P2XR-Subtypen (Barth and Kasper, 2009). Bislang ist über die Mechanismen, welche die subzellulare Verteilung der Ionenkanäle regulieren, wenig bekannt. Die präzise Lokalisation von Ionenkanälen ist notwendig, um die effiziente Weiterleitung von intrazellulären und extrazellulären Signalen abzusichern. So wurde die DRM-Assoziation als ein subzellulärer Sortiermechanismus identifiziert, welcher spezifische Kanäle zu Zellmembranabschnitten transportiert, die reich an Signalmolekülen sind. Die co-existierenden, multiplen DRM-Populationen in einer Zellmembran, welche verschiedene Proteine oder einen unterschiedlichen Gehalt der gleichen Proteine aufweisen, könnten an der funktionellen Regulation der Rezeptoren basierend auf deren räumlichen Organisation beteiligt sein (Martens et al., 2001; Pike, 2004). Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen in Verbindung mit den Daten der Immunpräzipitationen zeigten, dass P2X7R über Cav-1 mit den Caveolen assoziiert und der P2X4R vermutlich zum Teil in nicht-caveolären DRM-Strukturen lokalisiert ist. Diese Isoform-spezifische Lokalisation in individuellen DRM-Populationen wurde ebenfalls für spannungsabhängige K +-Kanäle (Kv1.5 und Kv2.1) nachgewiesen. Kv1.5 bindet dabei spezifisch an Caveolen, während Kv2.1 in nicht-caveolären DRM-Strukturen lokalisiert ist (Martens et al., 2001). Die unterschiedliche Affinität der Kv-Subtypen zu Caveolen und nicht- caveolären DRMs in einer Membran ermöglicht die Isoform-spezifische Modulation der Kanal-Funktionalität (Martens et al., 2001) . Zudem ergab die siRNA-vermittelte Reduzierung der mRNA der P2XR in den E10-Zellen, dass P2X7R und P2X4R direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So stieg der P2X4R-Proteingehalt nach der Verminderung von P2X7R um mehr als 200% an, was mit der Zunahme von P2X4R in der Zellmembran verbunden war. Diese adversative Regulation

126 DISKUSSION zeigte sich ebenfalls nach der Reduzierung der P2rx4 -mRNA. Der P2X7R-Proteingehalt stieg insgesamt um ca. 200% an, wobei der Anstieg von P2X7R vorwiegend in der Zellmembran nachgewiesen wurde (Weinhold et al., 2010). Diese Wechselbeziehung zwischen P2X4R und P2X7R könnte, zumindest teilweise, auf einen kompensatorischen Mechanismus zurückzuführen sein. P2X7R besitzt zu P2X4R eine größere Homologie als zu den anderen P2X-Untereinheiten. Für den humanen P2X4R und P2X7R sind 49% der Aminosäuren der Transmembrandomänen und der extrazellulären Domäne identisch (North, 2002). Zusätzlich sind die Gene beider Rezeptoren auf einem Chromosom lokalisiert und besitzen nur einen geringen Abstand zueinander. Die Distanz der Gene P2rx7 und P2rx4 auf Chromosom 5 beträgt nur 26 kbp und lässt vermuten, dass die Gene durch Genduplikation entstanden sind (Dubyak, 2007; Nicke, 2008). Ein vergleichbarer Aufbau und die ähnlichen funktionellen Eigenschaften der beiden Rezeptoren könnten dazu führen, dass P2X7R zumindest teilweise die Abnahme von P2X4R kompensieren kann und umgekehrt. Die Assoziation von P2X4R und P2X7R könnten weiterhin durch einen Feedback- Mechanismus verschiedene Sortiermechanismen beeinflussen, welche die Verteilung von Proteinen in die verschiedenen Bereiche der Zellmembran regulieren. Dies würde erklären, warum sich nach der Überexpression von P2X4R in den E10-Zellen weder der Proteingehalt von P2X7R noch die subzelluläre Verteilung veränderte. Aufgrund der partiellen Co- Lokalisation von überexprimierten P2X4R mit dem endogenen P2X7R in der Zellmembran könnte die Verteilung der P2XR in der Zellmembran von der Ausbildung eines P2X4R/P2X7R-Komplexes abhängig sein. Die Ergebnisse der Immunpräzipitationen zeigten, dass P2X4R und P2X7R teilweise miteinander assoziiert in einem Komplex vorliegen. Die bisher veröffentlichen Daten zur Charakterisierung dieser Interaktion sind widersprüchlich. Einerseits treten P2X7R und P2X4R in verschiedenen Geweben ausschließlich als Homotrimere auf (Nicke, 2008), während andererseits die Ausbildung von P2X4/7R-Heteromeren in Makrophagen des Knochenmarkes beschrieben wurde (Dubyak, 2007; Guo et al., 2007). Die Ergebnisse dieser Arbeit gaben keine Hinweise auf die Existenz von P2X4/7R-Heterotrimeren in E10-Zellen, ließen aber vermuten, dass beide P2XR als Homotrimere miteinander assoziiert sind. Die Interaktion von homomeren P2X4R- und P2X7R-Kanälen wurde bereits in Immunzellen und Epithelzellen der Speicheldrüse von Mäusen nachgewiesen (Boumechache et al., 2009; Casas-Pruneda et al., 2009). Eine Ursache für diese unterschiedlichen Ergebnisse könnte die Gewebe-spezifische Organisation und Regulation von P2X4R und P2X7R sein (Murrell- Lagnado, 2009). Aber möglicherweise spielen methodische Differenzen, wie die Verwendung

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von verschiedenen Detergenzien, ebenfalls eine Rolle. Auch die differierenden Ergebnisse für P2X4R nach der BN-PAGE und hrCN-PAGE könnten auf die verwendeten Detergenzien zurückzuführen sein. P2X4R war nach der Auftrennung mittels BN-PAGE in Komplexen bei ~430 kDa und ~580 kDa immunologisch nachweisbar, aber wurde nach der hrCN-PAGE nur im Proteinkomplex von ~430 kDa detektiert. Die Detergenzien DOC und DDM können labile Protein-Protein-Interaktion zerstören (Wittig et al., 2007) und es wird vermutet, dass auch wichtige Lipid-Protein-Verbindungen beeinflusst werden. Dadurch ist die Isolation der P2X4R-assoziierten Proteinkomplexe wahrscheinlich abhängig von den eingesetzten Detergenzien (Soto et al., 1996; Nicke, 2008). Die Ausbildung von Clustern und die Verweildauer der Ionenkanäle in der Zellmembran werden u. a. durch die Interaktion mit Aktin, Aktin-bindenden Proteinen oder scaffolding Proteinen vermittelt. Zusätzlich spielt die Interaktion zwischen den Ionenkanälen und dem Aktin-Zytoskelett eine Rolle bei der Regulation der Kanalaktivität und dem subzellulären Transport der Proteine. Die Assoziation zwischen den epithelialen Ionenkanälen und Aktin ist vorwiegend indirekt und wird über scaffolding oder Aktin-bindende Proteine, wie Cav-1 oder α-Actinin, vermittelt (Mazzochi et al., 2006). P2X7R ist teilweise mit Cav-1 assoziiert und interagiert mit Proteinen, die in Caveolen lokalisiert sind und in einem engen Zusammenhang mit dem Zytoskelett stehen (Kim et al., 2001a; Nebl et al., 2002; Chen et al., 2005; Singleton et al., 2005; Barth et al., 2007; Zhao,

2007; Weinhold et al., 2010). Wie bereits beschrieben, ist PI(4,5)P 2 in Caveolen bzw. DRMs angereichert und interagiert mit dem C-terminalen Bereich von P2X7R in vitro . PI(4,5)P 2 ist mit Aktin-bindenden Proteinen, wie Profilin (Lassing and Lindberg, 1985), Gelsolin (Janmey et al., 1987), α-Aktinin (Fukami et al., 1992) und Filamin (Furuhashi et al., 1992) assoziiert. Diese so genannten Actin-capping Proteine halten die Aktin-Monomere (G-Aktin) von der spontanen Polymerisation ab. Durch PI(4,5)P 2 werden die Aktin-bindenden Proteine von G- Aktin entfernt und die Aktinpolymerisierung stimuliert (Schafer et al., 1996). Die Aktin- bindenden Proteine Filamin und α-Aktinin sind auch in die Verankerung der Caveolen mit dem Aktin-Zytoskelett involviert (Stahlhut and van Deurs, 2000). Damit stellt die DRM- vermittelte, zytoskelettale Regulation einen konservierten Mechanismus dar, der zelluläre Reaktionen mit diversen Signalwegen verbindet (Meiri, 2004). Somit könnte die intrazelluläre Verteilung der Caveoline nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen auf eine zerstörte P2X7R/Cav-1-Aktinzytoskelett-Verbindung zurück- zuführen sein. Dies könnte indirekt auch P2X4R beeinflussen, der nach der Verringerung von P2X7R in der Zellmembran zunahm. Die Verweildauer von P2X4R in der Zellmembran wird

128 DISKUSSION durch die Clathrin-abhängige Endozytose reguliert, wobei das intakte Aktin-Zytoskelett für den korrekten Verlauf der Endozytose notwendig ist (Durrbach et al., 1996; Lamaze et al., 1997; Newpher et al., 2006). Diese Ergebnisse weisen auf eine gestörte Exozytose- gekoppelte-Endozytose hin, möglicherweise hervorgerufen durch eine fehlende Assoziation des P2X7R/Cav-1-Komplexes mit dem Aktinzytoskelett. Im Gegensatz zu P2X7R hatte die Reduzierung von P2X4R keine nachweislichen Auswirkungen auf Cav-1 oder das exo-/endozytotische System. Die Zunahme von P2X7R in den Fraktionen 4 bis 7 nach der Dichtegradientenzentrifugation wurde zwar mit einer erhöhten Internalisierungsrate und der verstärkten Assoziation mit dem endosomalen System in Verbindung gebracht wird (Nichols, 2003). Jedoch ist die zunehmende Internalisierung vermutlich durch die erhöhte Exozytoserate von P2X7R bedingt.

4.4 Beziehung zwischen P2X4R- und Cav-1-assoziierten Mikrodomänen

Wie bereits zu Beginn erläutert wurde, sind die Mikrodomänen an zellulären Prozessen, wie der Signaltransduktion, der Endozytose und dem Cholesterol-Transport, beteiligt. Die Vielfalt der Funktionen steht dabei der diversen Zusammensetzung der DRMs gegenüber. So können Proteine in nicht-caveolären DRMs lokalisiert und die Verteilung unabhängig von der Existenz der Caveolen sein (Fernow et al., 2007; Rajendran et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit konnte keine Assoziation von P2X4R mit den Caveolinen gezeigt werden. Dies ließ vermuten, dass P2X4R in den E10-Zellen in nicht-caveolären DRM- Strukturen lokalisiert und die Verteilung nur indirekt von der Existenz der Caveolen abhängt. Es ist nicht bekannt, ob die P2X4R-assoziierten Mikrodomänen mit anderen Struktur- oder Markerproteinen angereichert sind. Zum Beispiel ist P2X1R in Zellen der glatten Muskulatur mit den DRM-spezifischen Proteinen Flotillin-1 und 2 co-lokalisiert (Vial and Evans, 2005). Durch die Reduzierung von P2X4R in E10-Zellen wurde der Cav-1- und Cav-2-Proteingehalt sowie die Lokalisation der Caveoline nicht veränderte, was auf die Lokalisation in verschiedenen DRM-Strukturen hinwies. In CHO-Zellen (Ovarzellen des chinesischen Hamsters Cricetulus griseus ) wurden die Markerproteine der verschiedenen DRMs untersucht. Dabei führte die Reduzierung von Glykosylphosphatidylinositol (GPI)- verankerten Proteinen zur Zunahme der caveolae-spezifischen Proteine Cav-1 und Cav-2, während sich der Proteingehalt von Flotillin-1 und Monosialotetrahexosylganglioside (GM)1 nicht veränderte (Abrami et al., 2001).

129

Im Unterschied zur Reduzierung zeigten die Ergebnisse der Überexpression von P2X4R, dass der Proteingehalt von Cav-1 und Cav-2 abnahm, die Caveoline eine zunehmend intrazelluläre Lokalisation aufwiesen und Cav-1 nach der Dichtegradientenzentrifugation zusätzlich in Fraktionen höherer Dichte nachweisbar war. Bekannt ist, dass Cav-1 nach der Internalisierung der Caveolen mit Markern des frühen Endosomes, u. a. Rab5, in intrazellulären Vesikeln co- lokalisiert ist. Diese so genannten Caveosomen sind intermediär vorkommende Organelle und größer als die Caveolen in der Zellmembran (Nichols, 2003; Parton, 2004; Aoki et al., 2007). Rab5 stimuliert durch die Interaktion mit Cav-1 die Endozytose der Caveolen (Hagiwara et al., 2009) und reguliert die Clathrin-abhängige Endozytose des EGFR (Vieira et al., 1996; Chen et al., 2009). Da P2X4R ebenfalls durch Clathrin-vermittelte Endozytose internalisiert wird (Royle et al., 2005), führt die Überexpression von P2X4R vermutlich nicht nur zur Erhöhung der Internalisierungsrate von P2X4R, sondern auch indirekt zur verstärkten Internalisierung der Caveolen. Die Assoziation der verschiedenen DRMs mit dem endo- lysosomalen System könnte einen möglichen feedback -Mechanismus zur Regulierung von DRM-Funktionen darstellen (Abrami et al., 2001; Vassilieva et al., 2009).

4.5 Assoziation von P2X4R und P2X7R mit negativ geladenen Phospholipiden

Garcia-Marcos et al. (2006a) beschrieben die Assoziation von P2X7R mit den Phospholipid- Signalwegen und schlug diese Verbindung als möglichen Link zwischen den Rezeptoren und downstream -Effektoren vor. Bekannt ist, dass P2X7R das zelluläre Level von einigen Lipid-

Messengern, wie PA und AA, durch die Modulation der Phospholipasen (C, A 2, D) kontrollieren kann. Diese Signalwege werden wahrscheinlich unabhängig von der Kanalfunktion reguliert und in Zusammenhang mit der DRM-Lokalisation der P2XR gebracht (Garcia-Marcos et al., 2006c). Jedoch war über die Art dieser Assoziation sehr wenig bekannt. Die P2XR besitzen C-terminal ein charakteristisches Bindemotiv, welche mit negativ geladenen Lipiden interagieren kann (Bernier et al., 2008b; Bernier et al., 2008a). Die Ergebnisse des in vitro Bindetests zeigten, dass die Fusionsproteine aus GST und den C- terminalen Abschnitten von P2X4R und P2X7R (GST-P2XRCT) mit negativ geladenen

Lipiden interagieren. Diese Lipide sind die Phospoinositide PI(4)P, PI(4,5)P 2 und PI(3,4,5)P 3, PA, Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerol (PG), das Mitochondrien-spezifische Cardiolipin und das am häufigsten in Myelin-produzierenden Glia-Zellen vorkommende 3-Sulfogalactosylceramid. Diese Lipide sind eng mit Signaltransduktionswegen verbunden

130 DISKUSSION und die direkte Interaktion mit P2X4R und P2X7R unterstützt die Annahme, dass die P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen beteiligt sind (Garcia-Marcos et al., 2006a). Die untersuchten Phosphoinoside besitzen innerhalb von Zellen wichtige regulatorische

Funktionen. PI(4,5)P 2 nimmt dabei eine zentrale Stellung ein (Toker, 2002). PI(4,5)P 2 reguliert eine Vielzahl wichtiger zellulärer Funktionen, wie die Reorganisation des Aktinzytoskelettes (Sechi & Wehland, 2000), die Aktivität von Ionenkanälen (Hilgemann & Ball, 1996; Shyng et al., 2000) sowie endozytotische (Fensome et al., 1996; Way et al., 2000) und exozytotische Vorgänge im Vesikeltransport (Jost et al., 1998; Marsh et al., 1999).

PI(4,5)P 2 und PI(3,4,5)P 3 sind überwiegend in der Zellmembran lokalisiert und in DRM- Strukturen angereichert (Pike and Casey, 1996; Pike and Miller, 1998; Brown and London, 2000). Dagegen kommt PI(4)P hauptsächlich in den Membranen des Golgi-Komplexes vor (Di Paolo and De Camilli, 2006).

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass PI(4,5)P2 mit P2X4R und P2X7R in DRMs co- lokalisiert ist und in vitro direkt mit den P2XR interagiert. Die Aktivität einer Vielzahl von

Ionenkanälen und Transporter wird durch PI(4,5)P 2 moduliert, u. a. der ENaC, die transient receptor potential channels (TRPs), die K+-Kanäle, der CFTR und die CNGs (Hilgemann et al., 2001; Edinger, 2007; Nam et al., 2007; Qin, 2007). Im Zusammenhang mit P2X4R und

P2X7R wird PI(4,5)P 2 als essentieller Cofaktor beschrieben, der für die korrekte Kanalaktivität notwendig ist (Zhao, 2007; Bernier et al., 2008b). So nehmen die gemessenen

Ionenströme beider purinergen Rezeptoren rapide ab, wenn PI(4,5)P2 mit Wortmannin inhibiert wird (Zhao, 2007).

Das in DRMs angereicherte PI(4,5)P 2 beeinflusst nicht nur verschiedene Rezeptoren und Transporter, sondern dient der Phospholipase C (PLC) und der Phosphoinositid-3-kinase

(PI3K) auch als Substrat. Dabei steht der PI(4,5)P 2-Pool in den Caveolin-assoziierten DRMs selektiv als Substrat der PLC zur Verfügung, was auf die funktionelle Kompartimentierung des zellulären PI(4,5)P 2 hinweist (Pike & Miller, 1998). Die PLC-vermittelte Hydrolyse von

PI(4,5)P 2 führt zur Bildung der sekundären Botenstoffe DAG und Inositol-3,4,5-triphosphat

(IP 3) (Berridge and Irvine, 1989; Berridge, 1993). IP 3 bindet an spezifische Rezeptoren des endoplasmatischen Retikulums und löst dadurch die Freisetzung von Ca 2+ aus den intrazellulären Speichern aus. Die Ca 2+ -Ionen ihrerseits regulieren durch die Interaktion mit verschiedenen downstream -Effektoren, z.B. von Calmodulin (CaM) und der PKC, zahlreiche zelluläre Vorgänge (Clapham, 1995).

PI3K phosphoryliert PI(4,5)P 2 zu PI(3,4,5)P 3, welches als second messenger an eine Reihe weiterer Proteine bindet. Ein wichtiges Zielprotein mit anti-apoptotischer Funktion ist u. a.

131

AKT/PKB. Für beide purinergen Rezeptoren, P2X4R und P2X7R, konnte im Rahmen dieser

Arbeit mittels in vitro Bindeassay die direkte Interaktion mit PI(3,4,5)P 3 nachgewiesen werden. Bisherige Studien an astrozytischen glialen Zellen zeigten, dass die Stimulation von P2X7R zur Phosphorylierung der ERK1/2 und der AKT sowie zur Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) führt (Gendron et al., 2003; Jacques-Silva et al., 2004a; Jacques-Silva et al., 2004b). Ein weiteres Lipid, was in vitro direkt mit dem C-terminalen Bereich von P2X4R und P2X7R interagiert ist Phosphatidylserin (PS). PS ist ein Aminophospholipid, das in der inneren Lipidschicht der Zellmembran angereichert ist. Die Umverteilung von PS in den extrazellulären Bereich der Zellmembran wird als frühes Zeichen des apoptotischen Zelltods angesehen (Fadok et al., 2000). In humanen Erythrozyten wurde festgestellt, dass die ATP- induzierte Aktivierung des P2X7R zur Exposition von PS führt und dieser Vorgang unabhängig von einem Ca 2+ -Einstrom ist (Sluyter et al., 2007). Außerdem ist PS im Zusammenhang mit DAG wichtig für die Aktivierung und Verankerung der PKCs in der Zellmembran (Luo et al., 1993; Bolsover et al., 2003). Ein unerwartetes Ergebnis des Membranlipid-Bindeassays war die Interaktion der P2XR- Fusionsproteine mit Cardiolipin. Cardiolipin ist ein Derivat des Phosphatidylglycerols, d. h. zwei Phosphatidylglycerole sind über ein Glycerolrückgrat miteinander verbunden (Houtkooper and Vaz, 2008). Dieses spezielle Lipid wird in Mitochondien synthetisiert und ist fast ausschließlich in der inneren Membran der Mitochondrien lokalisiert (Schlame et al., 2000). Cardiolipin ist an wichtigen apoptotischen Prozessen beteiligt und wird als Oberflächenmarker apoptotischer Zellen diskutiert (Sorice et al., 2000; Esposti, 2002; Epand et al., 2007; Gonzalvez and Gottlieb, 2007). Die Hefe Saccharomyces cerevisiae benötigt für die Synthese von Cardiolipin drei Enzyme, die Phophatidylglycerol-Phosphat-Synthase (codiert durch PGS1 ), die Phophatidylglycerol-Phosphat-Phosphatase und die Cardiolipin- Synthase (Gu et al., 2002). Die Deletion von PGS1 führte zu Störungen im PKC-Signalweg, zu einer verringerten Glucan-Synthese und zu einer anormalen Zellwandbiosynthese (Zhong et al., 2007). Dies weist darauf hin, dass Cardiolipin und Phosphatidylglycerol nicht nur mit mitochondrialen Funktionen verbunden sind, sondern auch bei weiteren zellulären Prozessen eine wichtige Rolle spielen (Chen et al., 2008).

Die Daten lassen vermuten, dass die P2XR, PI(4,5)P 2 und weitere Proteine, welche regulierende Auswirkungen auf PI(4,5)P 2 haben, in DRM-Strukturen co-lokalisiert vorliegen und Signal-Proteinkomplexe ausbilden. Diese Zusammenstellung würde einen Mechanismus bereitstellen, welcher den crosstalk zwischen P2X7R und anderen Rezeptoren ermöglicht und

132 DISKUSSION die durch ATP stimulierbaren Zellfunktionen fein aufeinander abgestimmt kontrolliert (Zhao, 2007).

4.6 P2X7R beeinflusst die Proteinkinase C βI und Calmodulin in E10-Zellen

Die Lipid-vermittelten Signalwege sind eng mit weiteren downstream -Effektoren verbunden. Die klassischen PKCs werden durch Ca 2+ und DAG aktiviert und über PS an die Zellmembran rekrutiert (Abe et al., 1998; Newton, 2001). Neben den klassischen Aktivatoren wurde die Aktivierung der PKCs durch Fettsäuren und andere Lipidmediatoren, wie PA,

PI(4,5)P 2 and PI(3,4,5)P 3 gezeigt (Kochs et al., 1993; Stasek et al., 1993; Yang and Kazanietz, 2003). Die PKC-Isoformen sind an zahlreichen Signalwegen beteiligt, die ein weites Feld an physiologischen Prozessen umfassen, wie den Membrantransport und die Organisation des Zytoskeletts und der extrazellulären Matrix (Carter, 2000). Untersuchungen zur Regulation der P2XR durch die verschiedenen PKC-Isoformen wurden bisher nicht durchgeführt. Die Daten dieser Arbeit implizierten jedoch, dass die PKC βI mit P2X7R verbunden ist, vermutlich indirekt über den P2X7R/Cav-1-Komplex. Die Reduzierung des P2X7R führte zur Verminderung des PKC βI- sowie des Cav-1-Proteingehaltes, wobei Cav-1 zunehmend intrazellulär verteilt war. Infolge dessen könnten die Abnahme von Cav-1 und die zerstörte Assoziation mit dem Aktin-Zytoskelett Auswirkungen auf die PKC βI haben. Unterstützt wurde diese Vermutung durch die Ergebnisse der P2X4R-Reduzierung, bei der weder Cav-1 noch die PKC βI beeinflusst wurden. Bekannt ist, dass die aktivierte PKC βI im Epithel von humanen Darmzellen einerseits die Polymerisierung des stabilen F-Aktins stimuliert und schützend auf das Aktin-Zytoskelett wirkt. Andernseits reguliert die PKC βI das Ca 2+ -Level in der Zelle durch die Phosphorylierung verschiedener Rezeptoren, die für die Ca 2+ -Homöostase wichtig sind (Banan et al., 2002; Banan et al., 2004). Diese Rezeptoren besitzen

Bindesequenzen für die PKC, wie der IP 3-Rezeptor (Willems et al., 1989; Nucifora et al., 1995) und die Ca 2+ -ATPase der Zellmembran (Zylinska et al., 1998). Auch die P2XR weisen N-terminal ein potentielles Bindemotiv für die PKC auf (Khakh and North, 2006). Für P2X1R und P2X3R wurde jedoch gezeigt, dass die PKC die P2XR nicht direkt phosphoryliert, sondern die Phosphorylierung und damit die PKC-vermittelte Regulation über ein unbekanntes Helferprotein delegiert wird (Boue-Grabot et al., 2000; Vial et al., 2004). Zudem hatte die Aktivierung der PKC keine Auswirkungen auf die ATP-induzierbaren Ionenströme der rekombinanten P2X4R und P2X7R der Ratte in HEK293-Zellen (Brown and Yule, 2007). Dies implizierte, dass zumindest die Kanalfunktionen der beiden Rezeptoren nicht durch die

133

PKC beeinflusst werden. Daten über die Einflüsse der PKCs auf P2X4R und P2X7R der Maus fehlen bislang. Aktuelle Publikationen zeigen jedoch, dass die P2XR selektiv und spezifisch durch die PKCs moduliert werden, was weitreichende Auswirkungen auf die P2XR-assoziierten Signalwege hat (da Cruz et al., 2006; Bie et al., 2009). Im Gegensatz zur PKC βI korrelierten die Veränderungen des Proteingehaltes von CaM mit der Zu- oder Abnahme von P2X7R in den E10-Zellen. Nach der Reduzierung von P2X7R war auch der Proteingehalt von CaM vermindert und die Herabregulation der P2rx4 -mRNA führte zur Zunahme von P2X7R und CaM. CaM ist ein wichtiger Ca 2+ -Sensor und reguliert das Ca 2+ -Level in der Zelle über die direkte Bindung an verschiedene Ionenkanäle. Die Überladung der Zelle mit Ca 2+ wird durch die Inaktivierung von spannungsabhängigen Kalzium-Kanälen (Halling et al., 2006) oder TRP-Kanälen (Derler et al., 2006), und durch die Aktivierung von Ca 2+-abhängigen Kalium-Kanälen verhindert (Maylie et al., 2004). CaM bindet auch Ca 2+ -abhängig an P2X7R der Ratte, stimuliert den P2X7R-vermittelten Ionenstrom und infolge dessen den Ca 2+ -Einstrom (Roger et al., 2008). Dem humanen P2X7R und auch dem P2X7R der Maus fehlt dieses CaM-Bindemotiv. Aus diesem Grund zeigt der humane P2X7R bei der Stimulation mit ATP eine verzögerte Zunahme des Ionenstromes und eine geringere Stromdichte (Roger et al., 2010). Die indirekte Assoziation von CaM mit dem humanen P2X7R und P2X7R der Maus kann dabei nicht ausgeschlossen werden. So reguliert die durch den Ca 2+ /CaM-Komplex aktivierbare Calmodulin-Kinase Typ II (CaMKII) in DRMs lokalisierte Ionenkanäle, wie den Kv1.5-Kanal (Tessier et al., 1999), Na +-Kanäle

(Carlier et al., 2000), L-Typ Kalzium-Kanäle (O-Uchi et al., 2005) und den IP 3-Rezeptor (Bare et al., 2005). Die Tatsache, dass CaMKII in DRMs lokalisiert ist (Tsui et al., 2005) und P2X7R im Gegensatz zu P2X4R eine potentielle Bindesequenz für die CaMKII besitzt, könnte für eine Assoziation und die CaMKII-abhängige Regulation von P2X7R sprechen (Gomez-Villafuertes et al., 2009). Die Zunahme von P2X7R in den DRM-Strukturen und der erhöhte CaM-Proteingehalt nach der Reduzierung von P2X4R wiesen ebenfalls darauf hin. Der P2X4R scheint durch die vorwiegend intrazelluläre Verteilung und die Lokalisation in den DRMs nicht an der Initiierung des Ca 2+ -Einstrom beteiligt zu sein. Allerdings kann die indirekte Modulation des Ca 2+ -Levels und somit von CaM durch den P2X4R nicht ausgeschlossen werden. Untersuchungen zur Co-Expression der ENaCs und P2XR in Xenopus oocytes ergaben, dass der ENaC-Proteingehalt in der Zellmembran durch die Aktivierung von P2X4R reduziert wird (Wildman et al., 2005). Demzufolge können weitere Ionenkanäle durch die Herabregulation der beiden purinergen Rezeptoren beeinflusst werden,

134 DISKUSSION die einen Einstrom von Na + und Ca 2+ fördern oder inhibieren und damit indirekte Auswirkungen auf CaM haben. Zusätzlich zeigten Studien an der Hefe S. cerevisiae , dass CaM essentiell für die Organisation des Aktin-Zytoskelettes und die Endozytose ist (Kubler et al., 1994; Ohya and Botstein,

1994). CaM aktiviert die PI5K-vermittelte Synthese von PI(4,5)P 2 und reguliert die Reorganisation des Aktin-Zytoskelettes (Desrivieres et al., 2002). CaM und α-Actinin interagieren zudem mit den schweren Ketten des Clathrin-Trimers im Hirngewebe von Kälbern (Merisko et al., 1988). Aufgrund dessen könnte durch die Verminderung von CaM nach der Reduzierung des P2X7R die Clathrin-vermittelten Endozytose negativ beeinflusst und die verlängerte Verweildauer des P2X4R in der Zellmembran hervorrufen werden.

4.7 Phänotyp der P2rx7(-/-) Maus

Zusätzlich zu dem Modellsystem der Alveolarepithelzelllinie E10 wurde das homogenisierte Lungengewebe von P2rx7 (-/-) Mäusen untersucht. Die untersuchten P2rx7 (-/-) Mäuse weisen phänotypisch ein reduziertes Körpergewicht, eine abnormale Skelettentwicklung und -physiologie sowie eine erhöhte Osteoklastenanzahl verbunden mit einer verringerten Apoptoserate auf (Ke et al., 2003). Weiterhin wurde eine verstärkte Interleukin-6 (Il-6) sowie eine reduzierte Interleukin-1β (Il-1β) Sekretion nachgewiesen (Solle et al., 2001; Le Stunff et al., 2004). Außerdem wurde die Rolle von P2X7R bei entzündlichen und fibrotischen Veränderungen in der Niere der Maus nach unilateraler ureteraler Obstruktion untersucht. In P2rx7 (-/-) Mäusen wurde eine geringere Anzahl von entzündlichen Zellen, der reduzierte Proteingehalt des pro-fibrotischen Zytokins TGF βI, die verringerte Infiltration durch Makrophagen und Ablagerung von extrazellulärer Matrix sowie eine verminderte tubuläre Apoptose nachgewiesen. Diese Ergebnisse ließen auf eine pro-fibrotische Wirkung des aktivierten P2X7R schließen (Goncalves et al., 2006). Über die Veränderungen im Lungengewebe von P2rx7 (-/-) Mäusen war bislang nur wenig bekannt. Gezeigt wurde, dass Cav-1 in AT I-Zellen des alveolaren Lungengewebes von P2rx7 (-/-) Mäusen reduziert ist (Barth and Kasper, 2009). Cav-1 wird als Immunmodulator der alveolaren Makrophagen der Maus diskutiert und spielt u. a. eine Schlüsselrolle in der anti- inflammatorischen Immunantwort (Medina et al., 2006; Wang et al., 2006). Dabei reguliert Cav-1 z. B. die Endozytose des Typ 1 Il-1-Rezeptors und somit Il-1β-abhängige Signalwege (Oakley et al., 2009). Die Interaktion von P2X7R mit Cav-1 in den Epithelzellen der Lunge

135

könnte somit ein wichtiges Bindeglied in der Vermittlung von pro- und anti- inflammatorischen Signalen sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von P2X7R zu einem Anstieg des Proteingehaltes von P2X4R führte. Bisher wurde publiziert, dass nach der Verletzung der peripheralen Nerven der Proteingehalt von P2X4R, Il-6 und tumour necrosis factor α (TNF α) in den spinalen Mikrogliazellen erhöht ist (Inoue, 2006). Die Ergebnisse zeigten weiterhin, dass im Lungengewebe der P2rx7 (-/-) Mäuse der Proteingehalt der Signalmoleküle PKC βI und CaM herabreguliert war. Die Überexpression von PKC β führt in humanen proximalen, tubulären Epithelzellen zur Sekretion von TGF βI und die Freisetzung von Fibronektin, was vermuten lässt, dass die PKC β in die Entstehung der tubulo-interstitialen Fibrose involviert ist (Slattery et al., 2008). Die Aktivierung der PKC β ist außerdem mit Veränderungen im Blutfluss, der Verdickung von Membranen, Ablagerung von extrazellulärer Matrix, erhöhter vaskulärer Permeabilität, einer erhöhten Apoptoserate und Veränderungen in der enzymatischen Aktivität z. Bsp. der Na +/K +-ATPase, der cPLA2, PI3K und MAPK verbunden (Das Evcimen and King, 2007). Des Weiteren war der Proteingehalt von CaM im Lungengewebe der P2rx7 (-/-) Mäuse reduziert. CaM wirkt in Immunzellen u. a. regulatorisch auf die Aktivität der PI3K ein. So kann PI3K in den alveolaren Makrophagen nicht aktiviert werden, wenn CaM inhibiert wird, was in einer höheren Apoptoserate bei der Infektion mit Pneumocystis Pneumonia resultiert (Lasbury et al., 2009). CaM wirkt aber nicht nur modulatorisch auf den anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalweg, sondern auch auf die Aktivität von verschiedenen Ionenkanälen und die Organisation des Aktin-Zytoskelettes (Desrivieres et al., 2002; Maylie et al., 2004; Halling et al., 2006). Die Ergebnisse des untersuchten Lungengewebes der P2rx7 (-/-) Mäuse bestätigten die Resultate, die aus den E10-Zellen gewonnen wurden. Die weniger ausgeprägten Effekte waren wahrscheinlich durch die Mischung der verschiedenen Zelltypen bedingt. So weisen die Endothelzellen der Lunge P2X1R, P2X2R, P2X4R, P2X5R und P2X7R, die glatte Muskulatur der Blutgefäße P2X1R, P2X4R und P2X7R, die alveolären Makrophagen P2X4R und P2X7R, die neuroepithelialen Körperchen P2X2R und P2X3R und die zilienbesetzten Zellen P2X4R und P2X7R auf, zusammengefasst in (Barth and Kasper, 2009). Die Zelltyp- spezifische Organisation und Regulation der verschiedenen P2XR-Subtypen könnte ein Grund für die geringere Erhöhung des Proteingehaltes des P2X4R im Lungengewebe der P2rx7 (-/-) Mäuse sein (Murrell-Lagnado and Qureshi, 2008). Zudem werden Cav-1 und Cav-2 nicht nur in den Epithel-, sondern auch in den Endothelzellen der Lunge exprimiert (Razani

136 DISKUSSION and Lisanti, 2001). Die Zunahme von Cav-2 könnte eine zelltypische Reaktion auf den Verlust von P2X7R sein und die Abnahme von Cav-1 kompensieren. Dabei ist nicht geklärt, welchem Zelltyp dieses Ereignis zugeordnet werden kann. In den E10-Zellen, welche überwiegend AT I-typische Eigenschaften besitzen, nehmen Cav-1 und Cav-2 nach der Reduzierung der P2rx7 -mRNA ab.

4.8 Modelle zur Lokalisation von P2X7R in der Zellmembran und zur intrazellulären Aktivierung von Calmodulin und der Proteinkinase C

Die Lokalisation des P2X4R in den E10-Zellen konnte nicht vollständig geklärt werden. Zwar ist der P2X4R fast völlig in DRM-Strukturen integriert, aber eine Assoziation mit Cav-1 wurde nicht gezeigt. Jedoch kann eine Verbindung mit den Caveolen nicht ausgeschlossen werden, da diese möglicherweise über einen Mediator vermittelt wird. Die Immun- fluoreszenzanalysen konnten aufgrund des verwendeten P2X4R-Antikörpers, der ein zusätzliches unspezifisches Protein erkennt, nur bedingt in die Auswertung einbezogen werden. Im Gegensatz dazu könnte die subzelluläre Verteilung von P2X7R, aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten, wie folgt aussehen:

Abb. 49: Lokalisation von P2X7R in der Zellmembran der E10-Zellen modifiziert nach Razani et al. (2002a) und Garcia-Marcos et al. (2006c).

P2X7R ist zum Teil mit den Caveolen über Cav-1 assoziiert und eine Subpopulation ist außerhalb der DRMs lokalisiert. Dabei sind in Bezug auf das Modell von Garcia-Marcos et al. die mit den Mikrodomänen assoziierten P2X7R an verschiedenen Signaltransduktionswegen beteiligt, während die externen P2X7R die Kanalfunktionen übernehmen.

137

P2X4R ist vorwiegend in DRM-Strukturen verteilt und die Ergebnisse ließen keine Verbindung zwischen P2X4R und den Signalmolekülen CaM und PKC βI erkennen. Aufgrund dessen wurde angenommen, dass nur die außerhalb der Caveolen lokalisierten P2X7R für einen ATP-vermittelten Ca 2+ -Einstrom in Frage kommen. Jedoch interagierten beide purinergen Rezeptoren in vitro mit dem in DRM-Strukturen angereichtertem PI(4,5)P2, welches als Precursormolekül an der Generierung von second messengern und der Freisetzung von Ca 2+ aus intrazellulären Speichern beteiligt ist (Berridge, 1993; Nishizuka, 1995). Hinsichtlich der bekannten Signaltransduktionswege und der Daten dieser Arbeit könnten die P2XR mit den down stream -Effektoren CaM und der PKC βI in den alveolären Epithelzellen wie folgt verknüpft sein:

2+ Abb. 50: Mögliche Aktivierung der down stream -Effektoren CaM und PKC durch Ca und PI(4,5)P 2. Der Ca 2+ -Einstrom durch die P2X7R-Kanäle könnte die Signalmoleküle Calmodulin (CaM) und Proteinkinase C (PKC) aktivieren und weitere downstream -Ereignisse beeinflussen. Die Modulation dieser Signalwege kann ebenso durch die Phospholipase C (PLC)-vermittelte Hydrolyse von PI(4,5)P 2 zu Diacylglycerol (DAG) und 2+ Inositoltriphosphat (IP 3) erfolgen. IP 3 initiiert die Freisetzung von Ca aus intrazellulären Speichern, was wiederum CaM aktivieren und in Zusammenhang mit DAG die PKC stimulieren kann.

Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Beteiligung von P2X4R und P2X7R an den dargestellten Signalwegen differenzieren und verifizieren zu können.

138

5 ZUSAMMENFASSUNG

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Beiden P2XR-Subtypen werden in den AT I-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanaleigenschaften in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit den Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR in E10- Zellen. Besonders wurde dabei auf die Assoziation mit Cav-1, dem Markerprotein der Caveolen, eingegangen. Zusätzlich wurde die Interaktion der C-terminalen Bereiche der P2XR mit Membranlipiden in vitro untersucht und die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca 2+ -aktivierbaren downstream -Effektoren PKC βI und CaM analysiert. Die Auswertungen ergaben Folgendes:

P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Lokalisation von P2X4R und P2X7R in DRM-Strukturen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei die FRET-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp- spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der DRMs moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001).

P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native - und high resolution clear native -PAGE zeigte, dass beide P2XR in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und die Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind.

139

P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Die Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Dies ließ vermuten, dass die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System führt. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den DRM-Strukturen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin.

Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phospholipiden PI(4)P, PI(4,5)P 2, PI(3,4,5)P 3, PA, PS, PG, Cardiolipin sowie 3-Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P 2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream -Signalen dar. Diese Verbindung ist anscheinend abhängig von der Lokalisation in Mikrodomänen und unabhängig von der Kanalfunktion der P2XR (Garcia-Marcos et al., 2006a).

Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream -Effektoren PKC βI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7 (-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKC βI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf die PKC βI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream -Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca 2+ -Einstrom aktiviert und reguliert werden.

140 ZUSAMMENFASSUNG

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation an unterschiedliche Mikrodomänen wahrscheinlich auch mit verschiedenen Signalwegen verbunden sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit P2X4R, wird P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein.

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IV VERSICHERUNG

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Dresden, den 30.07.2010

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V D ANKSAGUNG

An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. M. Kasper und bei Dr. Kathrin Barth für die Überlassung des interessanten Themas und für die intensive fachliche Betreuung bedanken.

Prof. Dr. G. Rödel danke ich für die Begutachtung dieser Arbeit und die inspirierende Zusammenarbeit bei der Publikation der Ergebnisse.

Bei Dr. Udo Krause-Buchholz, Dr. Jochen Seebach sowie Dr. med. Annett Linge bedanke ich mich für die konstruktive Kritik zu meinen Schreibkünsten und das Interesse an meiner Arbeit.

Mein ausdrücklicher Dank geht abermals an Dr. Udo Krause-Buchholz, der mich bei der Durchführung der nativen PAGE mit tatkräftiger Hilfe unterstützt hat.

Prof. Dr. W. Kummer danke ich für die freundliche Aufnahme im Institut für Anatomie und Zellbiologie der Justus-Liebig-Universität Gießen und seiner Mitarbeiterin Dr. med. Gabriella Krasteva für die Einführung in die Geheimnisse der abFRET-Analyse.

Außerdem danke ich Sylvia Großklaus, die immer ein offenes Ohr hatte und mich bei Bedarf auf den Boden der Tatsachen zurück gebracht hat, für die gute Zusammenarbeit und die vielen wichtigen Hinweise bei molekularbiologischen Fragestellungen.

Einen ganzen lieben Dank auch an die Mitarbeiter des Institutes für Anatomie, besonders Frau Anja Neißer, Frau Silvia Bramke und Frau Kerstin Pehlke, die mir im Laboralltag mit Rat und Tat zur Seite standen.

Auch meinen Mitkollegiaten Robert Bläsche möchte ich für die vielen schönen Stunden im Labor und die moralische Unterstützung danken.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden, die unerschütterlich an mich geglaubt haben und denen ich hiermit sagen möchte: „Danke, ihr seid toll!“.

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