Universidade Do Vale Do Itajaí Estudo Fitoquímico E

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ DANYELA FRANCINE BENVENUTTI BRASIL

ESTUDO FITOQUÍMICO E ANÁLISE GASTROPROTETORA DOS PRINCIPAIS CONSTITUINTES DAS CASCAS DAS RAÍZES DE Maytenus robusta REISS (Celastraceae)

Itajaí 2013 2

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

DANYELA FRANCINE BENVENUTTI BRASIL

ESTUDO FITOQUÍMICO E ANÁLISE GASTROPROTETORA DOS PRINCIPAIS CONSTITUINTES DAS CASCAS DAS RAÍZES DE Maytenus robusta REISS (Celastraceae)

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero

Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de

Andrade

Itajaí, novembro de 2013.

FICHA CATALOGRÁFICA

B736e Brasil, Danyela Francine Benvenutti, 1987- Estudo fitoquímico e análise gastroprotetora dos principais constituintes das cascas das raízes de maytenus robusta REISS (celastracease), 2013. 121f. ; il., tab. ; fig.

Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Prof . Dr Rivaldo Niero” Bibliografia : p. 111-121

1.Celastraceae - analise. 2 Plantas medicinais – química, 3. Química farmacêutica. 4. Produtos naturais. 5. Fitoterapia. 6. Maytenus. I.Título.

CDU: 615.32

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293 5

Dedicatória

Ao meu filho que é minha razão de viver, meu amor incondicional e infinito. Aos meus pais que são meu alicerce, meus melhores amigos, companheiros, orgulho e exemplo de vida, meus amores. Ao meu marido Eduardo pela paciência, apoio e companheirismo.

Agradecimentos

Primeiramente agradeço a Deus, que está sempre presente em minha vida guiando meus passos.

Ao meu pai amado, minha eterna gratidão por todos os anos de sua vida a mim dedicados, sempre me proporcionando mais conhecimento e me mostrando com seu amor infinito o melhor caminho a seguir, meu melhor amigo, melhor amigo do Vini também, melhor pai e melhor vô do mundo. Palavras sempre serão poucas para descrever todo meu amor, ¨eu te amo demais pai.¨

À minha mãe amada, minha melhor amiga, companheira, agradeço do fundo do meu coração todos os anos de sua vida dedicados à mim e ao meu filho, sem você eu nada seria. Exemplo de mulher, guerreira, forte, sempre alegre, melhor mãe do mundo e melhor vó também, ¨Te amo demais minha mãe querida¨.

Ao meu filho amado Vinícius, por seu amor e respeito. Sempre ajudando a mamãe ficando quietinho e como ele mesmo diz: ¨nem uma bolachinha eu não peço pra mamãe quando ela está trabalhando para ajudar ela¨. Amor da minha vida, presente que Deus me deu, motivo pelo qual acordo todos os dias, minha razão de viver, pra sempre meu bebê lindo.

Ao meu esposo, meu amigo e companheiro de todos os dias que está sempre ao meu lado apoiando minhas escolhas e ajudando na criação do nosso filho com muito amor e dedicação, muito obrigada por tudo, te amo.

Aos meus irmãos que estão sempre ao meu lado, me impulsionando a chegar onde desejo, meus eternos amigos, meus amores, amo vocês. E meu querido cunhado Eduardo, meu amigo conselheiro e meu sobrinho Otavio que é outro pedaço de mim e alegra os dias com seu carinho, sorriso lindo e amor, não poderia esquecer meu querido Guilherme que está chegando e já faz parte da minha vida, a tia já te ama demais.

Agradeço também as pessoas que diretamente ou indiretamente colaboraram com realização deste trabalho:

Professor orientador Dr. Rivaldo Niero, agradeço de coração sua amizade, todos os ensinamentos à mim passados, sempre com muita alegria, paciência e compreensão, durante todos esses anos de orientação, que vem desde minha graduação, são ensinamentos que levarei para toda minha vida.

Professor co-orientador Dr. Sérgio F. de Andrade, agradeço sua orientação, foram ensinamentos muito importantes para a minha trajetória como mestranda, um mundo novo para mim na área da pesquisa, obrigada pela paciência e colaboração.

Professor Dr. Franco Delle Monache, pela grande colaboração na identificação das substâncias neste trabalho, sempre bem humorado e disposto a compartilhar seu vasto conhecimento.

Professora Dr. Angela Malheiros, obrigada pelos grandes ensinamentos, pela amizade e carinho, sempre sorridente e pronta para ajudar, é uma pessoa a quem sempre vou lembrar com muito carinho.

Professora Dr. Márcia Maria de Souza, obrigada pela amizade e carinho, sempre muito divertida alegrando todos por onde passa.

Professor Oscar Benigno Iza pela coleta das plantas.

Agradeço também ao técnico de laboratório Pedro Pablo Perez Netto, pela elaboração dos espectros de ressonância magnética, que foram essenciais para a identificação de todos os compostos presentes nesse trabalho, muito obrigada pela grande ajuda.

Agradeço minha colega de mestrado Roseane L. da Rosa, pela sua colaboração com os experimentos farmacológicos e amizade.

A todos os docentes do programa de mestrado que contribuíram para minha formação profissional.

Aos funcionários do laboratório de farmacologia Érica e do laboratório de fitoquímica Joel, pela amizade e ajuda.

¨A ciência e a religião são as alavancas da inteligência humana¨.

Allan Kardec

ESTUDO FITOQUÍMICO E ANÁLISE GASTROPROTETORA DOS PRINCIPAIS CONSTITUINTES DAS CASCAS DAS RAÍZES DE Maytenus robusta REISS (CELASTRACEAE) DANYELA FRANCINE BENVENUTTI BRASIL Novembro/2013

Orientador: Dr.Rivaldo Niero. Co-orientador: Dr.Sérgio Faloni de Andrade. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 121

Maytenus robusta Reiss (Celastraceae) é uma planta originária da América do Sul e utilizada na medicina popular no tratamento de úlceras gástricas. O presente trabalho avaliou por diferentes técnicas cromatográficas e espectroscópicas, a constituição química das cascas das raízes, bem como o potencial antiulcerogênico do extrato bruto, frações e compostos puros, em diferentes modelos em animais. Neste aspecto, o material vegetal foi coletado, seco em estufa por 48 horas a 40 ºC, triturado e macerado em metanol durante 7 dias. Após evaporação do solvente, o extrato foi particionado com solventes de polaridade crescente como: hexano, clorofórmio e acetato de etila obtendo-se as frações semipurificadas. Estas frações foram submetidas à separação e purificação através de cromatografia em coluna aberta e coluna Flash e monitoradas por cromatografia em camada delgada. Entre as sub-frações coletadas da fração hexânica, duas substâncias foram isoladas e identificadas através de cromatografia em camada delgada em comparação com padrões autênticos como sendo os compostos 3,12-dioxofriedelano e estigmasterol. Outra sub-fração denominada MRR-H-25-30 foi identificada através de dados espectroscópicos de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN-1H) e Carbono treze (RMN-13 C), como sendo o 11-hidroxilup-20(29)-en-3-ona. Por outro lado, uma sub-fração obtida da fração de clorofórmio e denominada MRR-C-19-24 foi identificada como sendo a maiteína. Paralelamente, as raízes passaram por um processo de extração direta por maceração durante sete dias utilizando uma mistura éter: hexano (50:50). Após evaporação do solvente, o extrato foi submetido à purificação através de cromatografia em coluna aberta e em coluna Flash, eluídas com diferentes proporções de hexano:acetona e monitoradas através de cromatografia em camada delgada. Deste procedimento foi possível isolar e identificar através de cromatografia em camada delgada em comparação com padrões autênticos o composto 3,12-dioxofriedelano e através de análises espectroscópicas a maiteína e β-sitosterol, além do 3,7-dioxofriedelano. No modelo de úlcera induzida por etanol foi observado que o tratamento com extrato metanólico de M. robusta (50; 250 e 500 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) reduziu significativamente a área total da lesão, porcentagem de área lesada e o índice de lesão em comparação com o controle negativo, demonstrando um índice de cura de 90,42 ± 2,49; 95,58 ± 1,2 e 77,58% ± 3,32%, respectivamente. As frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila (250 mg/kg) também apresentaram redução significativa nos parâmetros analisados, com índice de cura de 72,48± 2,99; 84,95 ± 5,72 e 81,57% ± 3,25%. No modelo de úlcera induzida por AINE, tanto o extrato metanólico (50; 250 e 500 mg/kg) quanto as frações de hexano (125 mg/kg); clorofórmio e acetato de etila (250 mg/kg), demonstraram redução significativa da área total da lesão, porcentagem de área lesada e índice de lesão em comparação com o controle negativo, com valores de índice de cura de 47,64 ± 0,96; 66,04 ±0,24 e 73,80% ± 0,29 para o extrato metanólico e valores de 76,95 ±0,22; 89,50 ± 0,08 e 82,06% ± 0,09% para as frações testadas, respectivamente. Em relação aos compostos testados, 3,12- dioxofriedelano; 3,7-dioxofriedelano; 11 α-hidroxilup-20(29)-en-3-ona e maiteína (30mg/kg), todos mostraram significativa redução nos parâmetros analisados com valores de índice de cura de 74,28 ± 0,01; 77,14 ± 0,09; 76,19 ± 0,04 e 87,61 ± 0,08%, respectivamente. Estes 12

resultados mostram que as raízes de Maytenus robusta pode ser uma fonte promissora de moléculas com futura aplicabilidade no tratamento de distúrbios gástricos.

Palavras-chave: Maytenus robusta , Fitoquímica, Atividade antiulcerogênica.

PHYTOCHEMICAL STUDY AND GASTROPROTECTIVE ANALYSIS OF THE MAIN COM- PONENTS OF THE BARK OF ROOTS FROM Maytenus robusta REISS (Celastraceae)

DANYELA FRANCINE BENVENUTTI BRASIL November/2013

Supervisor: Rivaldo Niero, PhD. Co-supervisor: Sérgio Faloni de Andrade, PhD. Area of concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances. Number of Pages: 121

Maytenus robusta Reiss (Celastraceae) is a native plant of South America, which is used in folk medicine to treat gastric ulcers. Using different spectroscopic and chromatographic techniques, the present work evaluated the chemical composition of the root bark, as well as the antiulcerogenic potential of the crude extract, fractions and pure compounds, in different models in mice. The plant material was dried for 48 hours at 40°C, crushed, and macerated in methanol for seven days. After evaporation of the solvent, the extract was parti- tioned with solvents of increasing polarity such as hexane, chloroform and ethyl acetate, to yield the semi-purified fractions. These fractions were subjected to separation and purification by open column chromatography and flash column, and monitored by thin layer chromatography. From the sub-fractions collected from the hexanic fraction, two substances were isolated and directly identified by thin layer chromatography, in comparison with authentic standards, as 3,12-dioxofriedelane and stigmasterol. Another sub-fraction, named MRR-H- 25-30, was identified by spectroscopic data ( 1H NMR) and ( 13 C-NMR) as the 11 α-hydroxylup- 20 (29)-en-3-one. On the other hand, a sub-fraction obtained from chloroform fraction and named MRR-C-19-24 was identified as maytein. Meanwhile, the roots were submitted to di- rect extraction by maceration for seven days using a mixture of ether:hexane (50:50). After evaporation of the solvent, the extract was subjected to purification by open column and flash chromatography, eluted with different hexane:acetone ratios, and monitored by thin layer chromatography. Using this procedure, it was possible to isolate and identify by thin layer chromatography, in comparison with authentic standards, 3,12-dioxofriedelane and by spectroscopic analysis, maytein and β-sitosterol, and also 3,7-dioxofriedelane. In the ethanol- induced ulcer model, it was observed that treatment with methanolic extract of M. robusta (50, 250 and 500 mg/kg) and cimetidine (100 mg/kg) significantly reduced the total lesion area, the percentage of the injured area, and the lesion index, compared to the negative control, demonstrating a cure index of 90.42 ± 2.49; 95.58 ± 1.2 and 77.58 ± 3.32%, respectively. The fractions of hexane, chloroform and ethyl acetate (250 mg/kg) also showed a significant reduction in the parameters analyzed, with a cure index of 72.48 ± 2.99; 84.95 ± 5.72 and 81.57 ± 3.25%. In the model of NSAID-induced ulcer, both the methanol extract (50, 250 and 500 mg/kg) and hexane fractions (125 mg/kg), chloroform and ethyl acetate (250 mg/kg) showed a significant reduction in total lesion area, percentage of injured area and lesion index compared with the negative control, with cure index values of 47.64 ± 0.96; 66.04 ± 0.24 and 73. 80% ± 0.29 for the methanol extract and values of 76.95 ± 0.22; 89.50 ± 0.08 and 82.06% ± 0.09% for the tested fractions, respectively. In relation to the tested compounds, 3,12-dioxofriedelane; 3,7-dioxofriedelane; 11 α-hidroxilup-20(29)-en-3-one and maytein (30mg/kg) all presented a significant reduction in lesion index with values of 74,28 ± 0.01; 77.14 ± 0.09; 76.19 ± 0.04 and 87.61 ± 0.08%, respectively. These results show that the roots of M. robusta may be a promising source of molecules, with further applicability in the treatment of gastric disorders. Keywords: M. robusta, phytochemistry, antiulcer activity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fotografia das partes aéreas de Maytenus robusta ...... 41 Figura 2 - Esquema da secreção de ácido gástrico através das células parietais...... 49 Figura 3 - Área lesada pelas secreções no estômago caracterizada como úlcera péptica...... 49 Figura 4 - Foto ilustrativa das raízes de Maytenus robusta Reiss...... 53 Figura 5 - Foto ilustrativa da casca das raízes de Maytenus robusta Reiss.... 54 Figura 6 - Foto ilustrativa de uma coluna cromatográfica...... 54 Figura 7 - Foto ilustrativa de Cromatografia em camada delgada...... 55 Figura 8 - Fluxograma do processo cromatográfico em coluna aberta na purificação da fração hexânica...... 59 1 Figura 9 - Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 1,0 a 7,0 ppm da sub-fração 25-30...... 65

1 Figura 10 - Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) de 2,5 a 4,8 ppm da sub-fração 25-30...... 66 13 Figura 11 - Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) de 10,0 a 220,0 ppm da sub- fração 25-30...... 67 13 Figura 12 - Espectro de RMN- C ( CDCl 3 75 MHz) de 70,00 ppm a 220,00 ppm da sub-fração 25 30...... 68 13 Figura 13 - Espectro de RMN- C (CDCl 3 75MHz) ampliado de 14,0 a 56,0 ppm da subfração 25-30...... 69 1 Figura 14 - Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 1,0 a 110,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 74 1 Figura 15 - Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 0,8 a 2,8 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 75 1 Figura 16 - Espectro de RMN- H ( CDCl 3, 300 MHz) da sub-fração MRR-C-19-24.... 76 13 Figura 17 - Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) de 10,0 a 190,0 ppm da sub- fração MRR-C-19-24...... 77 13 Figura 18 - Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 10,0 a 75,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 78 13 Figura 19 - Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 80,0 a 175, 0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 79 13 Figura 20 - Espectro de RMN- C/ Dept (CDCL 3, 75MHz) ampliado de 9,0 a 151,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 80 13 Figura 21 - Espectro de RMN- C/ Dept (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 9,0 a 24,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 81 13 Figura 22 - Espectro de RMN- C / Dept (CDCl 3,75 MHz) ampliado de 30,0 a 80,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24...... 82 Figura 23: Espectro de HMBC da sub-fração MRR-C-19-24...... 83

Figura 24 - Foto ilustrativa da coluna de éter:hexano...... 85 1 Figura 25 - Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 0,0 a 3,0 ppm da sub-fração MRR-EH- 9-10...... 87 13 Figura 26 - Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 6,0 a 211,0 ppm da sub-fração MRR-EH-9-10...... 88 1 Figura 27 - Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 0,6 a 1,7 ppm da sub-fração MRR-EH-12...... 91 16

1 Figura 28 - Espectro RMN- H (CDCl 3, 300MHz) ampliado de 1,75 a 5,5 ppm da sub-fração MRR-EH-12...... 92 13 Figura 29 - Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) da sub-fração MRR-EH-12...... 93 13 Figura 30 - Espectro RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 6,0 a 80,0 ppm da sub-fração de MRR-EH-12...... 94 Figura 31 - Índice de cura do extrato metanólico (EM) de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por etanol...... 99 Figura 32 - Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol...... 99 Figura 33 - Índice de cura das frações de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por etanol...... 100 Figura 34 - Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol...... 100 Figura 35 - Índice de cura dos compostos isolados de M. robusta em lesões induzidas por etanol...... 102 Figura 36 - Imagens de estômagos após indução de úlcera com etanol...... 103 Figura 37 - Índice de cura do extrato metanólico (EM) de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por anti-inflamatório não esteroidal...... 105 Figura 38 - Imagens de estômagos após indução de úlcera por anti-inflamatório não esteroidal...... 105 Figura 39 - Índice de cura das frações de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por anti-inflamatório não esteroidal...... 106 Figura 40 - Imagens de estômagos após indução de úlcera por anti-inflamatório não esteroidal...... 106

LISTA DE ABREVIATURAS

CCD – Cromatografia em Camada Delgada Co-CCD – Coeluição por Cromatografia em Camada Delgada CC – Cromatografa em Coluna EM – Extrato Metanólico RMN-1H – Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio RMN-13 C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 AINE – Antiinflamatório não esteroidal TGI – Trato Gastrointestinal ID – Intestino Delgado SNE – Sistema Nervoso Entérico SNC – Sistema Nervoso Central DA – Dopamina PG – Prostaglandinas CCK – colecistocinina ATP – Adenosina Trifosfato VIP – Polipeptídeo Intestinal Vasoativo COX-1 – Ciclooxigenase-1 COX-2 – Clicooginase-2 OMS – Organização Mundial da Saúde HIV – Human Immunodeficiency Virus EPM – Erro Padrão da Média IL-6 – Interleucina-6 TNF-α – Fator de Necrose Tumoral-α AIDS – Acquired immunodeficiency syndrome 18

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Dados de deslocamentos químicos de RMN-13 C da substância MRR 25-30 com a substância 11 α-Hidroxilup-20(29)-en-3-ona...... 63 Tabela 2 - Dados de deslocamentos qupimicos de RMN- 1H da substância MRR 25-30 com a substância 11 α-Hidroxilup-20(29)-en-3-ona...... 64 Tabela 3 - Dados de deslocamentos químicos de RMN- 1H e RMN-13 C da substância MRR-C-19-24 com a substância Maiteína...... 73

Tabela 4 - Dados de deslocamentos químicos de RMN- 13 C da substância MRR-EH-9-10 com a substância 3,7-dioxofriedelano em comparação com literatura...... 86 Tabela 5 - Dados de deslocamentos químicos de RMN- 13 C da substância MRR-EH-12 com a substância β-sitosterol...... 90 Tabela 6 - Efeitos do extrato metanólico (EM) e frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila de M. robusta no modelo de úlcera induzido por etanol em camundongos...... 98 Tabela 7 - Efeitos dos compostos isolados de M. robusta no modelo de úlcera induzida por etanol em camundongos...... 102 Tabela 8 - Efeitos do extrato metanólico (EM) e frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila de M. robusta no modelo de úlcera induzido por anti-inflamatório não esteroidal em camundongos...... 104 20

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...... 23 2 OBJETIVOS...... 27 2.1 Objetivo Geral...... 27 2.2 Objetivos Específicos...... 27 3 REVISÃO DA LITERATURA...... 29 3.1 Plantas Medicinais...... 29 3.2 Família Celastraceae...... 35 3.3 Gênero Maytenus ...... 39 3.4 Maytenus robusta ...... 41 3.5 Fisiologia do trato gastrointestinal...... 46 3.6 Úlceras pépticas...... 49 4 METODOLOGIA...... 53 4.1 Material botânico...... 53 4.2 Preparação de extratos e frações...... 53 4.3 Isolamento dos constituintes químicos...... 54 4.4 Identificação dos constituintes químicos...... 55 4.5 Ensaios farmacológicos...... 55 4.5.1 Animais...... 55 4.6 Avaliação da atividade antiúlcera...... 56 4.6.1 Modelo de úlcera induzido por etanol...... 56 4.6.2 Modelo de Úlcera Induzida por Antiinflamatório Não-Esteroidal (AINE). 56 4.7 Análise estatística...... 57 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 58 5.1 ANÁLISE FITOQUÍMICA...... 58 5.1.1 Avaliação fitoquímica da fração hexânica...... 59 5.1.2 Avaliação fitoquímica da fração de clorofórmio...... 70 5.1.2.1 Avaliação fitoquímica da sub-fração 98-112 proveniente da coluna de CHCl 3...... 70 5.1.2.2 Avaliação fitoquímica da sub-fração 10-12 coletada da coluna flash da sub-fração 98-112...... 71 5.1.3 Avaliação fitoquímica da fração de Acetato de etila...... 84

5.1.4 Avaliação fitoquímica do extrato de éter:hexano (Extração direta)...... 84 5.2 ANÁLISE FARMCOLÓGICA...... 95 5.2.1 Avaliação da atividade antiulcerativa...... 95 5.2.2 Avaliação farmacológica do extrato metanólico através de experimento de úlcera induzida por etanol...... 96 5.2.3 Avaliação farmacológica dos compostos isolados através de modelo de úlcera induzida por etanol...... 101 5.2.4 Avaliação farmacológica do extrato metanólico e frações através de modelo de úlcera induzido por anti-inflamatório não esteroidal...... 103 6 Conclusão...... 109 REFERÊNCIAS...... 111

1 INTRODUÇÃO

As plantas têm sido utilizadas desde antigos períodos na história, não só como fonte de alimento, mas também, como medicamento através de suas propriedades fitoterápicas, cosméticas e agroquímicas. Juntamente com sua habilidade de produzir uma vasta ordenação estrutural de compostos químicos, dos quais relativamente poucos foram identificados. O alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas podem ser considerados a primeira forma de utilização dos produtos naturais na medicina popular. Por isso, as plantas são as mais importantes fontes de busca para o desenvolvimento de novos fármacos (JÚNIOR, BOLZANI, BARREIRO, 2006; KLAYMAN, 1985). Os produtos naturais têm se mostrado uma fonte abundante de moléculas bioativas. Uma vez que a diversidade estrutural é fundamental na pesquisa para atingir diferentes alvos biológicos, observa-se a importância do estudo de produtos naturais, considerando que, durante os milhões de anos da evolução biológica a seleção natural realizou um processo de química combinatória inigualável (YUNES, CECHINEL FILHO, 2001). Diversos tipos de organismos são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas onde uma grande parcela dos fármacos em uso clínico é de origem natural ou desenvolvidos por síntese planejada a partir de produtos naturais. Embora existam, nos dias atuais, várias estratégias e metodologias disponíveis para que se possa sintetizar e descobrir novos fármacos, a química de produtos naturais representa uma destas alternativas de sucesso historicamente privilegiada. Muitos metabólitos secundários ou especiais se notabilizaram como matérias- primas valiosas para a produção de inúmeros medicamentos contemporâneos comprovando que a parceria entre químicos medicinais e químicos de produtos naturais é estratégica para a descoberta de fármacos inovadores (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Os fármacos produzidos através de produtos naturais são capazes de tratar 87% das enfermidades humanas, podendo ser utilizados como antibacterianos, anticoagulantes, antiparasitários, imunossupressores, anticancerígenos, entre outros (BRANDÃO et al., 2010). Fato este pode ser observado tendo em vista que 60% dos medicamentos anticancerígenos atualmente disponíveis na terapêutica apresentam alguma relação com produtos naturais. Embora poucos compostos orgânicos 24

isolados tornem-se medicamentos clinicamente eficazes, essas moléculas únicas podem servir de modelo para a elaboração de análogos mais eficientes. Os alcaloides vincristina e vimblastina e o paclitaxel (taxol) são exemplos clássicos de fármacos anticancerígenos descobertos a partir de plantas (NEWMAN, CRAGG, 2007). Os fitoterápicos destacam-se com as preparações convencionais. Esta classe encontra-se em franca expansão, em função de necessitar o menor aporte financeiro e curto espaço de tempo para sua comercialização. É um mercado promissor o qual movimenta mundialmente cerca de 21 bilhões de dólares ao ano (NIERO, 2010). Por outro lado, apresentam alguns problemas singulares relacionados ao controle de qualidade. Isso ocorre em função da natureza das plantas, formadas por misturas complexas de compostos que podem variar consideravelmente dependendo dos fatores ambientais e genéticos. Além disso, os princípios ativos responsáveis pelos efeitos terapêuticos são muitas vezes desconhecidos o que impede o nível de controle efetivo de qualidade (ARGENTA et al., 2011). Muitas espécies encontradas na flora mundial vem sendo alvo de estudos para desvendar suas propriedades químicas, botânicas ou farmacológicas. A família Celastraceae pode ser encontrada principalmente nas regiões tropicais. Muita importância tem sido dada às espécies desta família por apresentarem uma grande variedade de atividades farmacológicas, sendo associadas à flavonóides, sesquiterpenos, alcalóides e triterpenos pentacíclicos (MAGALHÃES et al., 2011; FONSECA et al., 2007). M. ilicifolia , popularmente conhecida como espinheira santa tem sido a espécie mais estudada deste gênero devido seu alto valor medicinal. Isto tem levado a um extrativismo predatório, resultando em uma perda de variabilidade genética (MARIOT; BARBIERI, 2007). Por este motivo, a M. robusta foi escolhida para a realização deste trabalho, visto que estudos anteriores realizados pelo nosso grupo de pesquisa (Núcleo de Investigação Químico Farmacêutica-NIQFar) mostraram que esta espécie possui semelhança fitoquímica em relação à M. ilicifolia (NIERO et al., 2001). Estudos mostraram que M. robusta pode ser uma substituta da M. ilicifolia em preparações fitoterapêuticas por apresentar atividade gastroprotetora (ANDRADE et al., 2007; 2008). Em estudos mais recentes com M. robusta foi possível isolar das raízes dois triterpenos (3,7-dioxofriedelano e 3,15-dioxofriedelano) e três sesquiterpenos da 25

classe dos agarofuranos (euonimina, hiponina-C e maiteína) inéditos nesta espécie (BRASIL, 2010). Diante do exposto surgiu a necessidade de estudar mais profundamente quanto sua constituição química bem como analisar a ação gastroprotetora dos compostos nela presentes.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Isolar e identificar os principais constituintes químicos presentes nas cascas das raízes de Maytenus robusta e analisar sua atividade gastroprotetora.

2.2 Objetivos Específicos:

Isolar através de procedimentos cromatográficos os principais constituintes químicos presentes nas cascas das raízes de Maytenus robusta utilizando técnicas cromatográficas como: Cromatografia em Coluna e Cromatografia em Coluna Flash. Identificar as estruturas dos compostos isolados através de técnicas espectroscópicas como: RMN-1H, RMN-13 C e HMBC com padrões autênticos e reveladores específicos. Avaliar a atividade antiulcerativa do extrato metanólico e das frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila através do modelo de úlcera induzida por etanol e induzida por anti-inflamatório não esteroidal (AINE). Avaliar a atividade antiulcerativa dos compostos isolados através do modelo de úlcera induzida por etanol.

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Plantas medicinais: Evidências arqueológicas mostram que o uso de preparados vegetais era amplo em culturas antigas. Nozes de bétele ( Areca catechu ) uma planta aromática que contém substâncias psicoativas eram mascadas há 13 mil anos no Timor. Alguns artefatos descobertos no Equador estendem o uso das folhas de coca a 5000 anos atrás. No século I da era cristã destaca-se o eminente médico grego Dioscóride, autor da notável obra sobre medicina e farmácia intitulada “De Materia Medica” a qual serviu como guia de ensino nestas áreas até a época do Renascimento. No mesmo século, o naturalista latino Plínio, cognominado “O Velho”, escreveu extensa obra sobre história natural. No século seguinte sobressai Galeno, farmacêutico e médico grego, autor de vários livros sobre medicina e farmácia, onde suas formulações medicamentosas originaram a farmácia galênica (PINTO et al., 2002). A civilização árabe, no século VII, descreveu o emprego dos purgativos e cardiotônicos de origem vegetal; as culturas americana, especialmente a Inca, Asteca, Maya, Olmeca e Tolteca consignaram á civilização moderna a quina, a ipecacuanha, a coca e muitas outras drogas vegetais de valor terapêutico, até hoje indispensáveis a medicina moderna. No Brasil, a primeira descrição sobre o uso de plantas como remédio foi feita por Gabriel Soares de Souza, autor do Tratado Descritivo do Brasil, de 1587. Esse tratado descrevia os produtos medicinais utilizados pelos índios, sendo conhecido como “as árvores e ervas da virtude”. Com a vinda dos primeiros médicos portugueses ao Brasil, diante da escassez de remédios empregados na Europa, percebeu-se a importância das plantas utilizadas pelos indígenas como medicamentos (ARGENTA et al., 2011). A era moderna e a química de produtos naturais iniciou-se no século XVIII com o isolamento dos primeiros compostos de origem vegetal: a morfina (1803) ( 1), a quinina (1819) ( 2) e a atropina (1831) ( 3) (NASCIMENTO, TUROLLA, 2006). No Brasil, a comitiva da grã-duquesa austríaca Maria Leopoldina Josefa Carolina de Habsburgo (primeira Imperatriz do Brasil) contribuiu decisivamente para o desenvolvimento científico nacional. O médico e botânico Carl Friederich Von Martius e o zoólogo Johann Baptist Spix, membros da comitiva real, iniciaram uma 30

expedição científica de quatro anos que resultou no primeiro estudo sistemático da flora e da fauna brasileira. Martius ainda teve influência direta na concepção da fitoquímica no Brasil. Ele sugeriu a um jovem farmacêutico alemão, Theodoro Peckolt, que viesse ao Brasil para estudar a flora. Atracando no porto brasileiro em 1847, T. Peckolt se tornou o pai da fitoquímica brasileira e constituiu uma família de cientistas notáveis dedicados profundamente ao estudo químico de plantas brasileiras. O início dos estudos de Química de Produtos Naturais numa instituição pública brasileira foi em 1874, considerado o ano do nascimento da fitoquímica no país (SANTOS et al., 1998; SANTOS, 2005).

(1) (2)

(3)

É notável a importância histórica do uso de plantas em saúde no Brasil, especialmente na área farmacêutica. Isto pode ser justificado ao considerarmos a origem de nossa indústria farmacêutica, voltada inicialmente ao emprego de diversos insumos vegetais (ZUANAZZI; MAYORGA, 2010). Deste período até os dias atuais inúmeras técnicas de obtenção e identificação de substâncias têm sido implantadas, o que tem alavancado consideravelmente a pesquisa de produtos naturais. No entanto, a evolução também 31

depende da forte interação entre farmacologia, botânica, agronomia, biotecnologia, entre outros (BRAZ FILHO, 2010). Todas as plantas produzem compostos químicos como parte de suas atividades metabólicas normais. Estes incluem metabólitos primários, tais como açúcares e gorduras, os quais são constitutivos e alguns metabólitos secundários onde podem ser encontrados apenas em um gênero específico ou espécie. São os metabólitos secundários e pigmentos que podem ter ações terapêuticas em seres humanos e que podem ser refinados para produzir medicamentos (PANDEY et al., 2011). As substâncias naturais bioativas se agrupam em quatro classes principais: os terpenos (hormônios, pigmentos ou óleos essenciais), as substâncias fenólicas (flavonoides, ligninas e taninos), as substâncias glicosídicas (saponinas, glicosídeos cardiotônicos, glicosídeos cianogênicos e glicosinolatos) e os alcaloides (DE ALMEIDA, 2011). O maior grupo de metabólitos secundários presente no reino vegetal é o dos terpenóides, dos quais já foram isoladas aproximadamente 30.000 substâncias. Número este, muito superior ao de qualquer outro grupo de derivado de produtos naturais. Os terpenóides distribuem-se amplamente na natureza e são encontrados em abundância nas plantas superiores, sendo também encontrados em menor quantidades em fungos e organismos marinhos. Os terpenóides de origem vegetal desempenham funções importantes como repelentes de insetos, agentes de atração polínica, agentes de defesa contra herbívoros, feromônios, aleloquímicos, hormônios vegetais, além de funcionarem como moléculas de sinalização (VERPOORTE, 2000). Os vegetais respondem a estímulos ambientais bastante variáveis, de natureza física, química ou biológica. Fatores tais como fertilidade e tipo do solo, umidade, radiação solar, vento, temperatura e poluição atmosférica, dentre outros, podem influenciar e alterar a composição química dos vegetais. Além desses, há interações e adaptações evolutivas complexas, que se produzem entre planta- planta, planta-animal e planta-microrganismos de um dado ecossistema. Como exemplo há a interação inseto-planta que depende da presença, no tempo certo e na quantidade apropriada, de determinados compostos voláteis, responsáveis por aromas característicos. Essas substâncias voláteis, difundidas com facilidade a partir 32

da evaporação, constituem verdadeiro elo de comunicação entre a fonte produtora e o meio ambiente (ALVES, 2001; GOBBO NETO, LOPES, 2007). Como fruto das interações surge substâncias com características específicas que podem ter as mais variadas atividades biológicas. Como exemplo, pode-se citar uma série de medicamentos disponíveis no mercado isolados de plantas, como a morfina ( 1) obtida da Papaver somniferum , planta usada por sumarianos antigos, egípcios e gregos para o tratamento de dores de cabeça, artrite e indução do sono; a quinina ( 2) obtido da Cinchona spp, a qual era usada por índios peruanos para o tratamento de febres; a vimblastina ( 4) e a vincristina ( 5), obtida da Catharanthus roseus L., utilizadas como substâncias anticancerígenas; a artemisinina ( 6) isolada na China a partir de Artemisia annua L. e derivados têm sido utilizados contra a malária; etoposideo ( 7) e teniposideo (8) obtidos da Juniperus communis L.; o paclitaxel ( 9) obtida da Taxus brevifolius e os derivados da camptotecina (10 ), topotecano ( 11 ) e irinotecano ( 12 ) obtidos da Mappia foetida Miers (KINGSTON,

2011; PANDEY et al., 2011).

(6)

(7,8)

Ph= Fenil Bz= Benzil Ac= Acetil

(9)

(10) (11)

(12)

Produtos naturais têm servido como fonte e inspiração para uma grande fração da farmacopeia atual. Apesar das estimativas variarem de acordo com a definição do que é considerado um produto natural derivado exclusivamente de fontes vegetais, é seguro dizer que entre 25% e 50% dos medicamentos atualmente comercializados devem suas origens aos produtos naturais (KINGSTON, 2011). Como já reportado, as plantas são importantes fontes de medicamentos. No último século, cerca de 121 produtos farmacêuticos foram formuladas com base no conhecimento tradicional obtido de várias fontes naturais. As vantagens deste tipo de terapêutica incluem boa disponibilidade, aspectos culturais locais, as preferências individuais, a crescente demanda por produtos naturais e orgânicos, e os efeitos sinérgicos já validados de medicamentos fitoterápicos. No entanto, eticamente, o alcance e os limites destas drogas precisam ser estabelecidos não só por evidências etnofarmacológicas, mas também através de investigações científicas que 34

confirmam os efeitos terapêuticos e a segurança para o uso (PANDEY et al., 2011; CARMONA; PEREIRA, 2013). Muitas áreas estão envolvidas na pesquisa de novas substâncias oriundas de plantas, como a fitoquímica, que trabalha no isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos; a etnobotânica e a etnofarmacologia, que buscam informações a partir do conhecimento de diferentes povos e etnias; e a farmacologia, que estuda os efeitos farmacológicos de extratos e dos constituintes químicos isolados (MACIEL et al., 2002; MENDONÇA-FILHO, MENEZES, 2003; VENDRUSCOLO, RATES, MENTZ, 2005; ALBUQUERQUE, HANAZAKI, 2006). Para a Organização Mundial da Saúde (OMS), plantas medicinais são todas aquelas silvestres ou cultivadas, utilizadas como recurso para prevenir, aliviar, curar ou modificar um processo fisiológico normal ou patológico, ou utilizado como fonte de fármacos e de seus precursores, enquanto fitoterápicos são produtos medicinais acabados e etiquetados, cujos componentes ativos são formados por partes aéreas ou subterrâneas de plantas, ou outro material vegetal, ou combinações destes, em estado bruto ou em formas de preparações vegetais (OMS, 2000; RATES, 2001). Segundo a RDC n°48 de 16 de março de 2004 da Anvisa, fitoterápico é o medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança é validada através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações tecnocientíficas em publicações ou ensaios clínicos fase 3. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais. O surgimento do conceito de "natural" em muito contribuiu para o aumento do uso das plantas medicinais nas últimas décadas. Para muitas pessoas, esse conceito significa a "ausência de produtos químicos", que são aqueles que podem causar algum dano ou, de outra forma, representam perigo. Assim, produtos naturais passaram a ser sinônimo de produtos saudáveis, seguros e benéficos. (VIEIRA et al., 2010). Porém, os conhecimentos acumulados ao longo do tempo mostram que tais produtos podem causar efeitos nocivos e provam que o mito “O que é natural não faz mal” é uma verdade insustentável. A falta de informações adequadas sobre as 35

propriedades das plantas medicinais (principalmente das exóticas), seu consumo concomitante com os medicamentos tradicionais (alopáticos) sem intervenção médica e, finalmente, a perda do conhecimento sobre os efeitos medicinais e tóxicos das plantas, assim como a capacidade de identificá-las pela migração da população rural para as cidades são fatores preocupantes da automedicação (BEZERRA et al., 2012). Além desses fatores, o aumento do uso das plantas medicinais também pode ser explicado pelo avanço ocorrido na área científica que permitiu o desenvolvimento de fitoterápicos confiáveis e eficazes. Porém, ainda faltam estudos científicos que comprovem a utilização segura e eficaz de várias plantas (VIEIRA et al., 2010).

3.2 Família Celastraceae: A família Celastraceae é constituída por ervas, lenhosas, arbustos e árvores que ocorrem em regiões tropicais e subtropicais. A família Celastraceae abrange 100 gêneros e cerca de 1300 espécies que podem ser encontradas principalmente em regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo. Muita importância tem sido dada às espécies desta família por apresentarem uma grande variedade de atividades farmacológicas. A Austroplenckia populnea (Reiss), por exemplo, é utilizada na medicina popular para o tratamento de doenças do trato gastrintestinal, como antidisentérico e anti-reumático. Outras espécies importantes possuem atividades farmacológicas como, antiinflamatória, analgésica, antioxidante, antimalárica, antimicrobiana e hipotensiva (VELLOSA et al., 2006; DIAS et al., 2007; SOSA et al., 2007; COSTA; FERREIRA; BOLZANI, 2008; CRESTANI et al., 2009; MAGALHÃES, 2012; CANESCHI, 2011). As primeiras pesquisas químicas sobre Celastráceas tiveram início no fim do século XIX, a partir do isolamento da maitansina ( 13 ), um alcaloide ansamacrolídeo presente no lenho de plantas do gênero Maytenus sp. provenientes da África Oriental e que exibe atividade antitumoral (KUPCHAN et al., 1972a). O interesse por essa família foi intensificado com a descoberta da ação antitumoral apresentada pela tingenona ( 14 ), um quinonametídeo de natureza triterpênica pentacíclica (MARINI-BETTOLO,1974).

(14)

(13)

Os extratos de diferentes espécies da família Celastraceae têm se mostrado ricos em substâncias de natureza esteroidal e triterpenoídica, como triterpenos pentacíclicos friedelânicos e quinoídicos. No entanto além destas classes também foram isolados derivados agarofurânicos, catequinas, proantocianidinas, glicosídeos, flavonóides glicosilados e alcalóides piridínicos sesquiterpênicos (FONSECA et al., 2007). O maior interesse por espécies desta família ocorre devido à diversidade de atividades biológicas atribuídos aos triterenos, os quais constituem os metabólitos majoritários. Em Moçambique, as raízes de Salacia kraussii são usadas na medicina tradicional para o tratamento de diarreia, malária (BANDEIRA et al.,2001), bilharziose e disenteria (JANSEN, MENDES, 1991). Na África Austral e Oriental, é usada em crianças no tratamento de epilepsia e tenicida (JANSEN, MENDES, 1991). Figueiredo et al.,(1998), isolaram a partir das raízes desta planta três metideo- quinonas, 28-nor-isoiguesterina-17-carbaldeído ( 15 ), 17 - metoxicarbonil-28-nor- isoiguesterina ( 16 ), e 28-hidroxiisoiguesterina ( 17 ), em conjunto com a conhecida celastrol ( 18 ) e pristimerina ( 19), os quais mostraram uma significativa atividade antimalárica.

Através de estudo fitoquímico de diversas espécies de Salacia foram isoladas e identificadas várias substâncias, dentre as quais estão: triterpenos (fridelanos, maiteninos, oleananos, ursanos e lupanos), flavonóides, esteróides, alcalóides (sesquiterpênicos, macrocíclicos ou maitansinóides), além dos triterpenos quinonametideos, os quais são considerados marcadores quimiotaxonômicos da família Celastraceae. Em outro estudo com a Salacia crassifólia , foi observado forte potencial citotóxico na fração hexânica obtida de folhas e galhos (FONSECA et al.;2007; RODRIGUES et al., 2006; CARVALHO, 2013). De uma investigação química das cascas das raízes de Celastrus orbiculatus foram isolados dez terpenóides e oito compostos conhecidos. Celastrol e os seus dímeros exibiram atividade inibidora moderada contra a proliferação de células T, dados importantes para investigações de fármacos contra o HIV (WU et al., 2012). Na tentativa de encontrar agentes antidiabéticos, a partir das cascas das raízes de Celastrus vulcanicola e de M. jelskii , alguns triterpenos friedelanos foram isolados e apresentaram um aumento de sinalização mediada pela insulina, o que sugere que estes triterpenos têm potencial terapêutico em casos de resistência à insulina (ARDILES et al., 2012). Outro estudo foi realizado com C. paniculatus (a qual é utilizada na prevenção e no tratamento de várias doenças, como a tosse, asma, lepra, paralisia, reumatismo, gota e dor de cabeça) demonstrou que o triterpenóide lupeol isolado das suas folhas era o responsável pela atividade de cicatrização. Por outro lado, o 38

extrato metanólico das sementes desta planta apresentou propriedade sequestradora de radicais livres e efeitos antioxidantes. As sementes também demonstraram experimentalmente ação sedativa, antirreumática, antiespasmódica, analgésica e anti-inflamatória. Recentemente um estudo demonstrou que as raízes em pó e as cascas das raízes foram consideradas úteis no tratamento de malária e processos cancerosos (MOHAN et al., 2012). De Salacia verrucosa foi isolado um novo triterpeno (1,3-diketofriedelano, 21 α- hydroxyfriedelano-1,3-diona), juntamente com outros seis triterpenos conhecidos (friedelano, 30-hidroxifriedelano-1,3-diona, friedelano-1,3-diona, 26-hidroxifriedelano- 1,3-diona, friedelina, 21 α-hidroxi-D: a-friedo-olean-3-ona e kokoonol). Análises farmacológicas demonstraram que o friedelano-1,3-diona foi extremamente citotóxico, contra a linhagem celular SW620, enquanto que os compostos 26- hidroxifriedelano-1,3-diona e o 21 α-hidroxi-D: a-friedo-olean-3-ona foram moderadamente ativos contra as linhagens SW620, HepG2 e KATO-III (SOMWONG, SUTTISRI, BUAKEAW, 2011). Osorio e colaboradores (2012) relataram o isolamento de nove novos triterpenos, juntamente com outros três conhecidos, a partir de Cassine xylocarpa e M. jelskii . Alguns compostos foram testados quanto ao seu potencial como inibidores da replicação do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1. Cinco compostos exibiram potente atividade antiviral com IC 50 de 1µm. Estes mostraram atuar pelo mesmo mecanismo que os medicamentos antirretrovirais comercializados. Um estudo de relação estrutura atividade foi estabelecido com base na região de substituição e no grau de oxidação do triterpeno, revelando que estes aspectos eram capazes de modular a intensidade e a seletividade de inibição do HIV.

3.3 Gênero Maytenus : O nome Maytenus é derivado da palavra ¨Maytén¨, um nome usado pela primeira vez pelo povo ¨Mapuche¨ (Homem da terra) do Chile. De acordo com o folclore sul americano, uma série de usos medicinais têm sido atribuídos a várias espécies de Maytenus . Este gênero é amplamente utilizado na medicina tradicional para o tratamento de doenças gástricas, tais como a úlcera (NIERO et al., 2011). O gênero Maytenus é o maior da família Celastraceae compreendendo cerca de 225 espécies, com importante valor terapêutico, como é o caso da M. ilicifolia , conhecida popularmente como Espinheira Santa. Esta é muito utilizada no tratamento de lesões gástricas, possui ação anti-inflamatória, analgésica, cicatrizante e antiasmática. Além disso, ela é utilizada como remédio antitumoral indígena e agente regulador da fertilidade, hábito comum de algumas tribos indígenas e populações rurais do Paraguai e Bolívia. Apresenta como composição química, vários grupos, dentre eles os terpenóides (maitenina, tingenona, isotenginona II, congorosinas A e B, ácido maitenóico, friedelanol e friedelina), taninos, principalmente os gálicos (epicatequina, epigalocatequina e galato de epigalocatequina), glicolipídeos (monogalactosildiacilglicerol, digalactosildiacilglicerol, trigalactosildiacilglicerol, tetragalactosildiacilglicerol e sulfoquinovosildiacilglicerol) e os alcalóides (maiteína, maitanprina e maitensina) (PESSUTO et al., 2009; ALONSO, 1998; CARLINI & FROCHTENGARTEN, 1988; MENDES et al., 2006). A Maytenus ilicifolia juntamente com a M. aquifolium são encontradas no Paraguai, Uruguai e regiões Sul e Sudeste do Brasil. Estudos realizados com animais de laboratório comprovaram o efeito antiulcerogênico do extrato abafado de M. aquifolium e M. ilicifolia , atribuído ao aumento do pH do suco gástrico. Além de, atividade sequestradora de radicais livres, efeito antisséptico e cicatrizante. Alguns autores atribuem o efeito antiulcerogênico aos triterpenos e polifenóis, que possuem a capacidade de aumentar as defesas do organismo, pois estimulam a síntese de mucos e mantêm alta a concentração de prostagladinas da mucosa gástrica (MOSSI et al., 2010). Das M. aquifolium foram isolados os triterpenos friedelina e β- friedelanol e da espécie brasileira M. truncata foram obtidos os epímeros α e β- friedelanol. Por outro lado, os lupanos 3-oxolup-20(29)-en-3-ona, 11- hidroxilup-20(29)-en-3-ona e o (3 β)- lup-20(30)-en-3,29-diol foram isolados de M. imbricata . Um estudo realizado com as 40

raízes de M. acanthophylla foram isolados o polímero natural 1,4-trans-poliisopreno, além de triterpenos da classe dos lupanos, oleano, ursano e quinonemetidos (OLIVEIRA et al., 2006). Alguns trabalhos realizados com raízes de M. vitis-idaea levaram ao isolamento de alguns compostos importantes, como 15α-hidroxitingenona e tingenona, os quais demonstraram ação citotóxica frente a células tumorais humanas (RODRIGUES, 2011; DE ALMEIDA et al., 2010). Também faz parte deste gênero a M. senegalensis de onde foram isolados, em seu extrato metanólico das cascas dos ramos, os glicosídeos flavan-3-ol metilados e uma protoantocianidina metilada denominada de epicatequina, tendo o extrato hidrometanólico apresentado moderada atividade inibidora contra AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Deste extrato também foi isolado o triterpeno ácido maitenônico, maitansina e maitanprina com importante atividade antitumoral (Di STASI; HIRUMA-LIMA, 2002). M. obtusifolia é usada na medicina no tratamento de úlceras, inflamações generalizadas, câncer e contra úlceras externas de pele (MOTA et al., 2008). Assim como, M. rígida que tem ação analgésica, antiinfectante e antiinflamatória. Em análises com os extratos etanólico, aquoso, clorofórmico, acetato de etila e hidroalcoólico destas espécies, estes apresentaram atividade antibacteriana contra Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus . A análise fitoquímica demonstrou a presença de catequinas, quinonas, esteróides, triterpenos, saponinas, flavonóides e compostos fenólicos (DIAS et al., 2007; ESTEVAM et al., 2009). Rodrigues (2011) realizando uma avaliação com extratos e alguns constituintes de M. imbricatta Seuss demonstrou que os mesmos exibem atividade antimicrobiana frente a S. aureus, B. cereus, S. typhimurium, E. coli e C. albicans . Na avaliação da capacidade de inibição da enzima acetilcolinesterase pelo método de bioautografia, os constituintes 11 α-hidroxilup-20(29)-en-3-ona, 3,7- dioxofriedelano e 3-oxo-29-hidroxifriedelano mostraram-se ativos neste modelo. Da mesma forma, todos os extratos e substâncias testadas apresentaram potencial atividade larvicida no modelo utilizando Artemia salina . Outro estudo fitoquímico com polpa dos frutos de M. salicifolia demonstrou a presença do triterpeno pentacíclico lupeol e dois flavonóides, a rutina e a epicatequina. No extrato hexânico das folhas foram identificados α-amirina, β- 41

amirina, isomultiflorenol, multiflorenol, epi -α-amirina, epi -β-amirina, epi -multiflorenol e isolados lupeol, β-sitosterol, tanaceteno e, três compostos inéditos na literatura (3 β-araquidoiloxi-11-oxo-ursan-12-eno, 3 β-esteariloxi-D:C-friedoleanan-7-eno e 1 β,3 α-dihidroxi-D:C-friedoleanan-7-eno) (VALLADÃO, 2011). Estudos mais recentes com esta espécie mostraram que os extratos hexânico, acetato de etila e etanólico das raízes foram efetivos contra micro-organismos encontrados na cavidade oral. Todos os extratos avaliados foram ativos frente ao micro-organismo C. albicans. O lupano rigidenol, composto isolado desta planta, exibiu atividade inibitória frente a Helicobacter pylori , assim como 16 β - hidroxipristimerina, que também apresentou atividade citotóxica frente a células HeLa e A-549. Por outro lado, o palmitato de lupeolila foi citotóxico para a linhagem celular K-562. O caproato de lupeolila inibiu o crescimento de H. pylori , bem como a atividade da enzima acetilcolinesterase. Esta foi inibida também pelo composto 30- hidroxifriedelan-3-ona (MAGALHÃES, 2012).

3.4 Maytenus robusta Maytenus robusta ocorre na vegetação de restinga dos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo e menos frequentemente no Rio de Janeiro e no interior de matas dos estados de São Paulo, Minas Gerais, Goiás (CARVALHO- OKANO; LEITÂO FILHO, 2004; VIANI; VIEIRA, 2007). Ela apresenta flores de setembro a outubro, e frutos em fevereiro, maio, junho e de outubro a dezembro. Esta espécie é caracterizada pelos ramos cilíndricos, frutos geralmente piriformes e folhas de margem crenada ou dentada, frequentemente com coloração acinzentada no material herborizado (Figura 1). Muitos dos materiais examinados apresentam galhas nas folhas (CARVALHO-OKANO, 1998; VIANI; VIEIRA, 2007).

Figura 1: Fotografia das partes aéreas de Maytenus robusta .

Fonte: Unidade amostral 173 do IFFSC – Inventário Florístico Florestal de Santa Catarina, parque estadual da Serra do Tabuleiro.

Esta espécie é conhecida popularmente como Cafezinho-do-mato e utilizada na medicina popular no tratamento de úlceras gástricas (SILVA; SOARES, 2002; NIERO et al, 2001). Análises fitoquímicas das partes aéreas de M. robusta demonstraram que ela contém compostos fenólicos e triterpenos, assim como a M. ilicifolia , conhecida popularmente como espinheira-santa (NIERO et al, 2001). Os triterpenos do tipo friedelano aparecem como os principais componentes responsáveis pela ação destas espécies contra úlceras e gastrites, enquanto em outras plantas têm sido associados à inibição da proliferação de linfócitos humanos (ZANDONAI et al, 2010; ANDRADE et al, 2007). Entre as substâncias já isoladas das partes aéreas e raízes de M. robusta , estão, os triterpenos da classe dos friedelanos, o 3,12-dioxo friedelano ( 20 ); friedelanol ( 21 ); 3,7-dioxo friedelano (22 ); 3,15-dioxo friedelano ( 23 ); 3,15-dioxo 21 α- hidroxi friedelano ( 24 ); Friedelina ( 25 ); o esteroide estigmasterol ( 26 ) e os sesquiterpenos alcalóides euonimina ( 27 ), hiponina C ( 28 ) e maiteína ( 29 ) (NIERO et al., 2006; ANDRADE et al., 2008; BRASIL, 2010).

(21) (20)

29 30

20 27 19 21 22 12 18 11 13 17 28 14 16 1 9 15 2 10 8 25 26 3 5 7 O O 4 6 (22) 24 (23) 23

(25) (24)

(26)

(28)

(27)

(29)

Estudos mais recentes com as folhas desta espécie demonstraram o isolamento de vários triterpenos, entre eles, um novo triterpeno 3 β, 11 β- dihidroxifriedelano ( 30 ) e os já conhecidos 3-oxo-11 β-hidroxifriedelano ( 31 ); 3-oxo- 29-hidroxifriedelano ( 32 ); 3-oxofriedelano ( 33 ); 3-oxo- 21 β-H-hop-22(29)-eno (34 ); 3,4-seco-friedelan-3,11 β-olídeo ( 35 ); 3 β-hidroxi-21 β-H-hop-22(29)-eno ( 36 ); ácido 3,4-seco-21 β-H-hop-22(29)-en-3-óico ( 37 ) e ácido 3,4-seco-friedelan-3-óico ( 38 ) (SOUSA et al., 2012).

(30)

(31) (32)

(34) (33)

(36) (35)

(37) (38)

3.5 Fisiologia trato gastrointestinal O estômago é revestido por várias camadas de músculo liso e possui um revestimento de muco. Anatomicamente este órgão é dividido em três regiões topográficas, o fundo, que é a parte do estômago que fica acima da abertura esofágica, o meio do estômago é denominado corpo e a parte inferior do estômago, que é denominada antro e ainda a parte terminal do estômago, o esfíncter pilórico, que atua como barreira entre o estômago e o duodeno (Figura 2) e duas áreas funcionais sendo, as glândulas parietais e pilóricas (CARVALHO, 2006; SCHUBERT E PEURA, 2008). O trato gastrointestinal (TGI) possui um ambiente bastante peculiar, devido a alta concentração de ácido clorídrico (HCl), o que mantém seu pH oscilando entre 0,9 e 2,0. Apresenta uma grande área de absorção e várias glândulas que secretam sucos digestivos, ocorrendo assim a conversão de grandes partículas sólidas em partículas menores, para posterior absorção no intestino delgado (MERCHANT, 2007; CARVALHO, 2006). 47

É um dos sistemas do organismo de importância fundamental, considerando sua função de prover água, eletrólitos e alimentos. As suas funções dependem de propriedades inerentes à musculatura lisa intestinal, reflexos de neurônios intrínsecos no intestino e no sistema nervoso central (SNC), efeitos parácrinos de mediadores químicos e hormônios gastrointestinais. Porém, a maioria de suas funções é autônoma e controlada predominantemente pelo sistema nervoso entérico (SNE) (SANTOS, 2007). O sistema nervoso entérico (SNE) é localizado inteiramente na parede intestinal, começando no esôfago e se estendendo até o ânus, com aproximadamente 100 milhões de neurônios, esse sistema é especialmente importante no controle dos movimentos e na secreção gastrointestinal, esse sistema é composto basicamente por dois plexos: o plexo externo denominado, plexo mioentérico (Auerbach), localizado entre a camada muscular longitudinal e circular da parede intestinal, e responsável pelo controle de quase todos os movimentos gastrointestinais, e o plexo interno, denominado plexo submucoso (Meissner), localizado na submucosa da parede intestinal, e regula a secreção, transporte de líquidos e o fluxo vascular. Fibras extrínsecas do simpático e parassimpático são responsáveis pela conexão entre estes plexos (GUYTON e HALL, 2011). Vários neurotransmissores estão envolvidos nas múltiplas ações do SNE, a acetilcolina com sua ação excitatória e a norepinefrina com ação inibitória, são os neurotransmissores mais conhecidos. Dentre os outros neurotransmissores atuantes neste sistema, temos a serotonina (5-HT), dopamina (DA), colecistocinina (CCK), adenosina trifosfato (ATP), substância P, polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP), leuencefalina, metencefalina, somatostatina e bombesina (GUYTON e HALL, 2011). A regulação da secreção ácida gástrica é um processo complexo, que envolve muitos tipos celulares, hormônios e mediadores, os quais convergem para a etapa final da secreção que é a atividade da H +, K + ATPase. O produto final desta cadeia, o ácido gástrico, é responsável pela digestão de proteínas, absorção de ferro, cálcio e vitamina B 12, além de prevenir o crescimento bacteriano no estômago e a infecção entérica (SANTOS, 2007). O corpo principal do estômago apresenta várias pregas longitudinais. A mucosa gástrica apresenta glândulas secretoras (células parietais). Estas glândulas estão localizadas no fundo e no corpo e são as responsáveis pela secreção do muco - e dos íons HCO 3 , que atuam na proteção do lúmen estomacal, contra a ação ácida 48

promovida pelo estímulo de agonistas endógenos sobre as células parietais (CARVALHO, 2006). Além disso, as células parietais produzem ácido clorídrico (HCl) e fator intrínseco (necessário para a absorção de vitamina B 12 no intestino), as células mucosas, são produtoras de muco, as células principais, produtoras de pepsinogênio, as células D produtoras do maior inibidor parácrino da secreção ácida, a somatostatina. As glândulas pilóricas são formadas pelas células G, produtoras de gastrina; pelas células enterocromafins (ECL), produtoras de histamina; além dos demais tipos celulares presentes nas glândulas gástricas, com exceção das células parietais (SANTOS, 2007). Quando estimuladas, as células parietais secretam solução ácida contendo um pH da ordem de 0,8 sendo extremamente ácido. Nesse pH a concentração de íons hidrogênio é maior que do sangue arterial, e ao mesmo tempo que esses íons hidrogênio são secretados, os íons bicarbonato se difundem para o sangue, para que o sangue venoso gástrico tenha um pH mais alto que o sangue arterial, quando o estômago esta secretando ácido (GUYTON E HALL, 2011). Na secreção de ácido gástrico pelas células parietais, a membrana apical secreta H + em troca de K + utilizando um transportador ativo primário que é ativado - pela hidrólise ATP (Figura 2). A membrana basolateral secreta bicarbonato (HCO 3 ) em troca de Cl -. O Cl - move-se para o interior da célula contra o seu gradiente - eletroquímico, ativado pelo movimento descendente do HCO 3 para fora da célula. - Esse HCO 3 é produzido pela dissociação do ácido carbônico (H2CO 3), que é formado a partir do CO 2 e da água pela ação da enzima anidrase carbônica. Então, o Cl - deixa a porção apical da membrana por difusão através de um canal da membrana. Sendo assim, as células parietais secretam HCl para o interior do lúmem - gástrico à medida que secretam HCO 3 para a corrente sanguínea (FOX,2007).

Figura 2: Esquema da secreção de ácido gástrico através das células parietais.

Fonte:http://cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/silverthorn2/medialib/Image_Bank/html/custom20.html

3.6 Úlceras pépticas Úlceras pépticas são defeitos da mucosa gastrointestinal que se estendem através da mucosa muscular por causa da presença de ácido e pepsina (LOCKREY; LIM, 2011). É uma doença crônica que afeta milhões de pessoas em todo o mundo e é considerado um problema de saúde global, que está relacionado com o câncer gástrico (KLEIN-JÚNIOR et al., 2010). A área de lesão mais frequente é em torno do piloro, porém também ocorrem com frequência ao longo da pequena curvatura, na extremidade antral do estômago ou, mais raramente na extremidade inferior do esôfago (Figura 3) (GUYTON E HALL, 2011).

Figura 3: Área lesada pelas secreções no estômago caracterizada como úlcera péptica.

Fonte:http://www.drfernandovalerio.com.br/blog/2012/07/19/o-que-e-ulcera-peptica-estomago-e- duodeno/ 50

Quando a barreira mucosa gástrica é rompida, ácido e pepsina difundem-se para a mucosa e a submucosa subadjacente, com consequências patofisiológicas graves. A úlcera aumenta progressivamente à medida que níveis cada vez maiores de ácido e pepsina continuam danificando a parede do estômago. Duas das consequências mais graves das úlceras são hemorragias resultantes de danificação dos capilares da submucosa e perfuração ou erosão completa da parede do estômago, resultando na fuga de conteúdo gástrico para a cavidade abdominal (SHERWOOD, 2011). Úlceras gástricas e duodenais são induzidas por vários fatores como o consumo de álcool, fumo, o stress, deficiências nutricionais e ingestão de anti- inflamatórios não esteroidais como aspirina, ibuprofeno que atuam inibindo a produção de prostaglandinas ou medicamentos mais potentes para o tratamento da artrite ou de outros processos inflamtórios crônicos. A barreira frequentemente se rompe em pacientes debilitados com ferimentos graves ou infecções. Situações estressantes persistentes, em geral, estão associadas à formação de úlceras porque a reação emocional ao estresse pode estimular o excesso de secreção gástrica (DEORE et al., 2011; SHERWOOD, 2011; FOX, 2007). Na síndrome de Zollinger-Ellison , úlceras duodenais são produzidas pelo excesso de secreção de ácido gástrico em resposta a concetrações muito elevadas do hormônio gastrina. A gastrina é normalmente produzida pelo estômago, mas neste caso, pode ser secretada por um tumor pancreático (FOX,2007). Além disso, em uma descoberta no início dos anos 1990, a bactéria helicobacter pylori foi apontada como a causa de mais de 80% de todos os casos de úlcera péptica. Essa bactéria oferece um risco de 3 a 12 vezes maior de se desenvolver úlcera de 10 a 20 anos após adquirir a infecção do que pessoas sem a bactéria, incluindo o maior risco de desenvolver câncer de estômago (SHERWOOD, 2011). Hoje a grande maioria das pesquisas científicas envolvendo úlceras pépticas, direciona-se principalmente para o estudo de H. pylori e de AINEs como os maiores responsáveis pela incidência desta moléstia. Esta bactéria está presente em quase 50% da população mundial e os AINEs são os medicamentos de maior uso; porém, nem todos os indivíduos infectados ou que utilizam este tipo de medicamento manifestam gastrites ou desenvolvem úlceras pépticas (KUSHIMA, 2006). 51

A terapia para a cura de úlceras tem por objetivo a redução da dor, promover a cicatrização e prevenir possíveis úlceras reincidentes. O tratamento farmacológico baseia-se em reestabelecer o equilíbrio entre os fatores ofensivos e defensivos, ou seja, proteger a mucosa da ação do suco gástrico (AIHARA et al., 2003). Geralmente são utilizados fármacos antagonistas de receptores histamínicos

H2 como exemplo a ranitidina, um anti-histamínico que bloqueia o efeito estimulador da histamina sobre os receptores H 2 das glândulas gástricas e, desse modo, reduz a secreção gástrica de ácido por 70% a 80%; inibidores da bomba de próton, esses medicamentos inibem a secreção de ácido ao bloquear diretamente a bomba que transporta H + para o lúmem do estômago, ajudando a reduzir o efeito corrosivo do HCl sobre o tecido exposto, são exemplos: omeprazol, pantoprazol, lanzoprazol; anticolinérgicos e antibióticos também fazem parte do tratamento. Sendo o uso de antibióticos necessário somente nos casos confirmados de infecção por H. pylori , e raramente são empregados procedimentos cirúrgicos (WALLACE E MILLER, 2000; SUNG, 2006; RANG et al. , 2007; SHERWOOD, 2011). Além destes, existem os fármacos citoprotetores, como o misoprostol, um análago da prostaglandina E 2, que atua no estômago inibindo a secreção gástrica ácida, enquanto estimula a secreção de muco e bicarbonato. Outro fármaco utilizado no tratamento de úlceras gástricas é a carbenoxolona ( 39 ), um terpenóide isolado a partir de um extrato da Glycyrrhiza glabra (alcaçuz). Entretanto, devido aos graves efeitos colaterais ambos foram retirados do mercado (SATO et al., 2004; HAWKEY, 2000)

(39)

É possível observar muitos efeitos colaterais nos medicamentos antiúlcera disponíveis, como hipersensibilidade, arritmia, impotência, ginecomastia e desordens hematopoiéticas. Tornando-se evidente a necessidade de terapias alternativas. No Brasil, o tratamento de úlceras gástricas é bastante oneroso, não sendo acessível à grande parte da população (HIRUMA-LIMA et al.,2006; MALFERTHEINER, 2009; SHEEN E TRIADAFILOPOULOS, 2011). Além disso, ainda não há um fármaco que produza 100% de cura das úlceras gástricas e devido ao fato da úlcera gástrica ser considerada um agravo à saúde, a pesquisa de novos fármacos e o desenvolvimento de terapias alternativas é de extrema importância. Neste aspecto os extratos vegetais estão entre os mais promissores no tratamento de úlceras gástricas, tendo em vista que muitos compostos isolados de plantas têm apresentado resultados satisfatórios no tratamento e prevenção de úlceras pépticas, processos inflamatórios e dolorosos (SANNOMIYA et al., 2005; BONACORSI et al., 2009; DONATINI et al., 2009; MASSIGNANI et al., 2009). Sendo assim, promissores candidatos a medicamentos mais eficazes, menos tóxicos e de menor custo para a população (BIGUETTI et al., 2005; JAINU E DEVI, 2006; SANTIN, et al., 2010). Um exemplo disto é o estudo realizado em nossos laboratórios por Andrade e colaboradores (2007 e 2008), o qual comprovou a atividade antiulcerativa do extrato hidroalcoólico e algumas frações das partes aéreas de M. robusta , produzindo efetiva diminuição na secreção gástrica, mostrando assim, ter um alto potencial como futuro fitoterápico antiúlcera. Diante do exposto, este trabalho visa colaborar com a elucidação da atividade antiulcerogênica dos extratos, frações e compostos isolados das cascas das raízes de M. robusta , planta endêmica de nossa região. 53

4 METODOLOGIA

4.1 Material botânico: As raízes de M. robusta (Figura 4) foram coletadas no município de Camboriú e identificadas pelo Prof. Oscar Benigno Iza da Universidade do Vale do Itajaí e uma exsicata foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues de Itajaí – SC sob código VC Filho 12.

Figura 4: Foto ilustrativa das raízes de Maytenus robusta Reiss.

Fonte: Autor.

4.2 Preparação dos extratos e frações: As raízes foram raspadas com o auxílio de uma faca a fim de retirar somente as cascas das mesmas (Figura 5). Posteriormente foram realizados dois tipos de extrações. Na primeira extração o extrato metanólico (EM) do material seco e moído foi obtido através maceração a frio durante sete dias e posteriormente particionado com solventes de polaridade crescente como hexano, clorofórmio e acetato de etila, para obtenção das respectivas frações semipurificadas (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998; VERPOORTE et al., 2008, ROMANIK et al, 2007). A segunda extração foi realizada através da extração direta do material vegetal por maceração utilizando um sistema de solvente composto de éter: hexano na proporção 1:1 durante sete dias e posteriormente extraído diretamente com acetato de etila por um mesmo período.

Figura 5: Foto ilustrativa das cascas das raízes de Maytenus robusta Reiss

Fonte: Autor.

4.3 Isolamento dos constituintes químicos: Nesta etapa foi utilizada cromatografia em coluna (CC) (Figura 6) monitorada por cromatografia em camada delgada (CCD) (Figura 7). Como critério preliminar de pureza foi adotado a visualização de uma única mancha em cromatoplaca obtida por CCD, utilizando eluentes com diferentes polaridades. Na CC foram utilizadas colunas com diferentes diâmetros e altura, de acordo com a quantidade de material a ser purificado, utilizadando-se sílica gel-60 de granulometria 70-230 mesh (0,063 – 0,20 mm). Para cromatografia em camada delgada analítica foram utilizadas placas de sílica gel Merck do tipo GF 254 de 20 x 20 cm. Além disso, foi utilizado a cromatografia em coluna de baixa pressão (Flash), de acordo com a necessidade de cada amostra a ser purificada (HOSTETTMANN, 1997, VERPOORTE et al., 2008, ROMANIK et al, 2007). Figura 6: Foto ilustrativa de uma coluna cromatográfica.

Fonte: Degane; Cass; Vieira, 1998. 55

Figura 7: Foto ilustrativa de Cromatografia em camada delgada.

Fonte: Degani; Cass; Vieira, 1998.

4.4 Identificação dos constituintes químicos: Os constituintes foram identificados através de técnicas espectrométricas, incluindo: Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13 C (1D e 2D) dependo da complexidade da estrutura a ser elucidada (DELLE MONACHE, 2001; ABAD et al., 2007; VERPOORTE, 2008, MALTESE et al., 2009).

4.5 - Ensaios farmacológicos 4.5.1- Animais Nos ensaios biológicos foram utilizados camundongos machos e fêmeas Swiss pesando entre 25 – 35g provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com controle de temperatura (25ºC), umidade e luz (claro/escuro 12 horas cada), tendo ração (Purina Labina) e água ad libitum . Os animais foram mantidos em jejum doze horas anteriores ao experimento e uma grade foi adicionada para inibir a coprofagia. Quanto aos aspectos éticos da experimentação animal, foram respeitadas as normas preconizadas pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal). Todos os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UNIVALI (Parecer nº01/13). Anexo 01.

4.6 Avaliação da atividade antiúlcera 4.6.1 Modelo de úlcera induzido por etanol: Este método foi descrito por Morimoto et al. (1991). Os camundongos foram submetidos inicialmente a jejum de 12 horas e, após esse período, divididos em diferentes grupos (n=6) pré-tratados por via oral com cimetidina na dose de 100mg/kg (controle positivo), água destilada (controle negativo) ou extrato nas doses de 50, 250 e 500 mg/kg, as frações hexânica, clorofórmio e acetato de etila da planta em estudo nas doses de 250mg/kg e compostos isolados na dose de 30mg/kg. Após 1 hora foi administrado aos animais 0,2 mL de etanol absoluto (agente lesivo) por via oral e 1 hora após a administração do agente lesivo, os mesmos foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, tiverem seus estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura maior, sendo esticados em placas de vidro, e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho destas. Posteriormente foi realizado a determinação da área total de lesão, porcentagem de área lesada e índice de úlceras (ULI) calculado através da severidade das lesões da mucosa gástrica, classificadas como: a) área da úlcera < 1 mm 2; b) área da úlcera de 1-3 mm 2; e c) área da úlcera > 3 mm 2. O índice curativo (%) foi determinado como:

IC = 100 – (média área lesada tratado x 100/ média área lesada controle )

4.6.2 Modelo de Úlcera Induzida por Antiinflamatório Não-Esteroidal (AINE) A metodologia utilizada foi descrita por Morimoto et al. (1991). Após 12 horas de jejum, diferentes grupos de animais (camundongos) (n=6) foram tratados com um dos extratos a serem testados na dose de 50, 250 e 500 mg/kg, cimetidina (100 mg/kg) (controle positivo) ou água destilada (controle negativo), e frações hexânica, clorofórmio e acetato de etila da planta em estudo na dose de 250 mg/kg, todos administrados via oral. Uma hora após a administração dos diferentes tratamentos, os animais receberam 100 mg/kg de indometacina (v.o.). Passadas quatro horas após a administração de indometacina os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas 57 por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho destas. Posteriormente foi realizada a determinação da área total de lesão, porcentagem de área lesada e índice de cura, conforme descrito anteriormente.

4.7 Análise Estatística Para análise estatística dos resultados obtidos foi utilizada a análise de variância ANOVA e para comparação das médias dos grupos testados foi utilizado o teste Dunnet, sendo os valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos (SOKAL; ROHLF,2005).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise fitoquímica Na primeira coleta as cascas das raízes de M. robusta após serem trituradas e secas, foram pesadas obtendo-se uma massa de 51,80g. Após o processo de maceração utilizando-se metanol como solvente extrator durante sete dias, o extrato foi seco em estufa de circulação de ar obtendo-se 13,43g. O extrato metanólico (EM) obtido foi particionado em funil de separação com solventes de polaridade crescente, hexano, clorofórmio e acetato de etila (4x 200mL), obtendo-se após evaporação total do solvente 0,82; 0,74 e 2,56g de massa total, respectivamente. A investigação preliminar de constituintes químicos de uma planta possibilita o conhecimento prévio do extrato e indica a natureza das substâncias presentes (GOMES et al., 2011). A análise fitoquímica foi realizada através de procedimentos cromatográficos como a cromatografia em coluna e cromatografia em camada delgada, na tentativa de isolar os possíveis compostos responsáveis pela atividade gastroprotetora, além da possibilidade de encontrar substâncias de diferentes estruturas químicas ainda não isoladas nesta espécie. O processo de fracionamento de extratos vegetais visa a separação dos prováveis metabólitos secundários presentes e é utilizado geralmente quando não se conhece a natureza dos compostos (NIERO et al., 2003; MALHEIROS et al., 2010.). Na segunda coleta após serem cortadas e secas, as cascas das raízes renderam 145g de massa total e o processo de extração foi realizado diretamente com um sistema de solvente éter: hexano (1:1), seguido de extração com acetato de etila (100%) rendendo 7 e 3g de cada extrato, respectivamente. O perfil fitoquímico observado através da cromatografia em camada delgada em comparação com diferentes padrões da espécie estudada, foi possível evidenciar a presença de diferentes compostos pertencentes a classe dos terpenos, agarofuranos, lupanos e esteróis, tendo em vista a coloração específica quando revelados com anisaldeído sulfúrico

. 59

5.1.1 Avaliação fitoquímica da fração hexânica A fração semipurificada de hexano apresentou um rendimento de 0,82g. Toda a fração foi impregnada com cerca de 2g de sílica gel 60 de granulometria 70-230 mesh (0,063-0,20 mm), na forma de uma pastilha. A coluna foi recheada com 34,8g de sílica gel 60 e eluída de forma gradiente iniciando com hexano 100% e a polaridade aumentada gradativamente com acetona (Figura 8). Alíquotas de cinco mL foram coletadas num total de cento e trinta e sete sub-frações, as quais foram evaporadas e reunidas segundo seu perfil cromatográfico verificado por CCD.

Figura 8: Fluxograma do processo cromatográfico em coluna aberta na purificação da fração hexânica.

A sub-fração denominada MRR-H-9 e coletada no sistema de solvente 96:04 (hexano:acetona), apresentou-se na forma de cristais incolores (12,5mg) e foi identificada através de CCD e Co-CCD em comparação com padrões autênticos, obtidos anteriormente de M. robusta , como sendo o triterpeno da classe dos friedelanos denominado 3,12-dioxofriedelano ( 18 ). 60

(18)

Os triterpenos do tipo friedelano apresentam atividades antifúngica, antiulcerogênica, anti-inflamatória e analgésica (DURAIPANDIYAN, GNANASEKAR, IGNACIMUTHU, 2010; NIERO et al., 2006). Análises realizadas com os triterpenos pentacíclicos, celastrol, pristemerina e tingenona, mostraram importante atividade anti-inflamatória, anticancerígena e inseticida (BRINKER et al., 2007). Recentemente, estudos com um derivado friedelano, conhecido como friedelina, relataram atividade antiproliferativa, pró apoptótica (MARTUCCIELLO et al., 2010), anti-inflamatória, analgésica e antipirética (ANTONISAMY et al., 2011). Com relação à atividade antiulcerogênica, alguns triterpenos foram estudados. A carbenoxolona ( 39 ) é provavelmente o mais estudado quanto a esta ação farmacológica. Isolada das raízes de Glycyrrhiza glabra L. (Leguminoseae), este composto reduz as lesões induzidas por etanol quando administrado oralmente, assim como, as lesões induzidas por estresse (100-200 mg/kg) (PINDER et al., 1976; DERELANKO e LONG, 1981; KOO et al., 1986). Strauss e colaboradores (1978) também verificaram que o tratamento profilático de ratos com este composto pode reduzir a ulceração ocasionada por estresse, aumentando as defesas gástricas. Análises farmacológicas com o triterpeno 3,15-dioxo-21 α-hidroxifriedelano, isolado de M. robusta , realizadas em nossos laboratórios, demonstraram que o mesmo diminuiu significativamente as lesões ulcerativas no modelo testado (ANDRADE et al., 2008). Estes resultados promissores estimulou-nos a estudar a ação farmacológica do 3,12-dioxofriedelano, sendo que até o momento não foram encontrados dados na literatura que comprovem qualquer atividade biológica relacionada com este composto. 61

Outra sub-fração isolada e denominada de MRR-H-12-20, também apresentou-se em forma de cristais incolores (10,5 mg) e através de CCD e Co-CCD em comparação com padrões autênticos foi identificada como sendo um composto esteroidal conhecido como estigmasterol ( 26 ). No organismo, os fitosteróis, dos quais os mais comuns são o campesterol, o sitosterol e o estigmasterol, atuam na diminuição da absorção de colesterol no intestino delgado por um mecanismo de competição, com consequente aumento na excreção fecal. Esta competição ocorre porque a estrutura química dos fitosteróis é semelhante à do colesterol, diferindo no tamanho da cadeia (PIIRONEN et al., 2000; NESTEL et al., 2001).

(26)

Outra sub-fração, coletada num sistema de solvente de 92:08 (hexano:acetona) e denominada MRR-H-25-30 (12mg), foi identificada através de ressonância magnética nuclear de Carbono treze (RMN 13 C) e de hidrogênio (RMN 1H), como sendo 11 α-hidroxilup-20(29)-en-3-ona ( 40 ) (SILVA, 2007), isolado pela primeira vez nas raízes de M. robusta . O espectro de RMN-H-1, apresentou um simpleto largo na região de 1,68 ppm típicos de fragmento de lupanos, além dos sinais característicos de metilas nas regiões de 0,78; 0,97; 1,05; 1,05; 1,06 e 1,08 ppm atribuídos aos hidrogênios dos carbonos H-28; H-27; H-26; H-25; H-24 e H-23, respectivamente. Os sinais correspondentes aos hidrogênios metínicos podem der observados nas regiões de 1,48; 1,45; 3,94; 1,82; 1,41 e 2,34- 2,43 ppm e foram relacionados aos hidrogênios dos carbonos H-5; H-9; H-11; H-13; H-18 e H-19, respectivamente (Figura 9–10). Outros sinais observados foram atribuídos a hidrogênios metilênicos , como o triplo dupleto em 3,85-3,90 ppm, correspondente ao hidrogênio H-1α e o multipleto 62 em 2,61-2,71 ppm, correspondente ao hidrogênio H-1β. Outros sinais importantes observados foram os dois simpletos largos em 4,71 e 4,58 ppm, que correspondem aos hidrogênios H-29 α e H-29 β, da dupla ligação terminal, respectivamente (Figura 10). O espectro de RMN-13 C apresentando trinta sinais sustenta a hipótese de que o composto seja um triterpeno (Figura 11). O sinal na região de 218,7 ppm juntamente com os sinais de deslocamentos químicos em 150,1 e 109,9 ppm, são característicos de grupo carbonil e olefínico e foram atribuídos aos carbonos C-3; C- 20 e C-29, respectivamente, sugerindo uma estrutura típica dos triterpenos da classe dos lupanos (Figuras 11-13 ). Além disso, o sinal em 70,4 ppm é característico de carbono oxigenado e atribuído ao C-11. Outros sinais em 27,4; 20,7; 16,6; 16,8; 14,3 e 18,0 ppm foram atribuídos aos carbonos C-23; C-24; C-25; C-26; C-27 e C-28, respectivamente, que são característicos de grupamento metila. Os demais sinais comparativos com dados da literatura encontram-se nas tabelas 1 e 2 (SILVA et al., 2007). Estudos recentes com o triterpeno 11 α-hidroxilup-20(29)-en-3-ona, isolado das raízes de M. imbricata , mostraram que este é ativo contra os microrganismos S. typhimurium, E. coli, S. aureus, B. cereus and C. albicans , Além da capacidade de inibição da enzima acetilcolinesterase pelo método de bioautografia (RODRIGUES et al., 2012). Pesquisas com um derivado lupano, conhecido como NVX-207, confirmaram que tal composto apresentou excelente resposta clínica em cães portadores de câncer, entre eles, carcinoma de células escamosas nasais, sarcoma dos tecidos moles e carcinoma mamário (WILLMANN et al., 2009). Tendo em vista suas propriedades farmacológicas apresentadas em estudos descritos anteriormente, este composto foi testado frente a atividade antiulcerativa pela primeira vez neste trabalho, na busca do provável responsável pela ação farmacológica apresentada por M. robusta .

Tabela 1: Dados de deslocamentos químicos de RMN-13 C da substância MRR-H-25-30 com a substância 11 α-Hidroxilup-20(29)-en-3-ona.

13 RMN C Carbono MR -H-25 -30 11 α-Hidroxilup -20(29) -en -3-ona* C1 42,04 42,07 C2 34,17 34,21 C3 218,78 218,84 C4 47,58 47,63 C5 54,71 54,76 C6 19,60 19,64 C7 34,21 34,27 C8 42,37 42,41 C9 54,83 54,87

C10 38,15 38,20

C11 70,46 70,49 C12 37,41 37,44

C13 37,13 37,17

C14 42,57 42,61

C15 27,37 27,41

C16 35,36 35,40

C17 43,00 43,05

C18 47,58 47,63

C19 47,66 47,70

C20 150,17 150,2 C21 29,73 28,78 C22 39,76 39,80 C23 27,41 27,46 C24 20,74 20,77 C25 16,67 16,71 C26 16,82 16,86 C27 14,38 14,42 C28 18,04 18,08 C29 109,91 109,95 C30 19,33 19,37

*(SILVA et al., 2007). Solvente CDCl 3.

Tabela 2: Dados de deslocamentos químicos de RMN- 1H da substância MRR 25-30 com a substância 11 α-Hidroxilup-20(29)-en-3-ona.

RMN 1H

C MRR -25 -30 11 α-Hidroxilup -20(29) -en -3-ona* 3 4 8 10 14

20 CH 5 1,48 1,49 (m) 9 1,45 1,46(m) 11 3,94 3,91 13 1,82 1,83

18 1,41 1,41 (m) 19 2,34-2,43 (m) 2,34-2,43 (m)

CH 2 1 2,6-2,7 (ddd, H α) 2,67(ddd, H α) 1,58-1,65 (m, H β)

2 2,43-2,47 (m) 2,42-2,47 (m)

6 1,47 1,46 (m) 7 1,43 1,43 (m) 12 1,98-2,0 (m) 1,94-2,0 (m) 15 1,77 1,58-1,65 (m) 16 1,53 (m, H α) 1,5 (m, H α) 1,4 (m, H β) 1,41 (m, H β)

21 1,93- 1,98 (m, H α) 1,9-1,96 (m, H α) 1,37 (m, H β) 1,4 (m, H β) 22 1,43 (H α) 1,44 (m, H α) 1,18 (H β) 1,2 (m, H β)

29 4,58 Ha (m) 4,59 Há 4,71 Hb (m) 4,72 Hb

CH 3 23 1,08 (s) 1,09 (s) 24 1,06 (s) 1,06 (s) 25 1,05 (s) 1,07 (s)

26 1,05 (s) 1,07 (s) 27 0,97 (s) 0,98 (s) 28 0,78 (s) 0,79 (s) 30 1,65 (s) 1,69 (s)

*(SILVA et al., 2007). Solvente CDCl 3. 65

1 Figura 9: Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) de 1,0 a 7,0 ppm da sub-fração 25-30. 66

1 Figura 10: Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 2,5 a 4,8 ppm da sub-fração 25-30.

13 Figura 11: Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) de 10,0 a 220,0 ppm da sub-fração 25-30.

13 Figura 12 : Espectro de RMN- C ( CDCl 3 75 MHz) ampliado de 70,00 ppm a 220,00 ppm da sub-fração 25 30.

Figura 13: Espectro de RMN-13C (CDCl 3 75MHz) ampliado de 14,0 a 56,0 ppm da subfração 25-30.

(40)

5.1.2 Avaliação fitoquímica da fração de clorofórmio Da fração de clorofórmio (0,74g) foram impregnados com cerca de 3g de sílica gel de granulometria 70-230 mesh (0,063-0,20 mm), na forma de uma pastilha. A coluna foi recheada com 84,36g de sílica gel 60 e eluída de forma gradiente com hexano 100% e a polaridade aumentada gradativamente com acetona. Alíquotas de cinco mL foram coletadas num total de cento e trinta e oito alíquotas, que foram evaporadas e reunidas segundo seu perfil cromatográfico verificado por CCD. A sub- fração 98-112 (202mg) coletada num gradiente de solvente de 70:30 (Hexano:Acetona) apresentou-se na forma de um pó amorfo amarelo e quando comparada com padrão autêntico de agarofuranos isolados anteriormente das raízes, dava indícios de que continha esse tipo de composto. No entanto, não apresentava bom grau de pureza. Neste sentido, foi submetido a uma cromatografia em coluna flash na tentativa de purificação.

5.1.2.1 Avaliação fitoquímica por cromatografia Flash da sub-fração 98-112 proveniente da fração de CHCl 3 A sub-fração 98-112 (202mg) foi impregnada com cerca de 1g de sílica gel 60 para cromatografia flash com granulometria 230-400 mesh (0,04 – 0,063 mm) na forma de uma pastilha. A coluna foi recheada com 13,28g de sílica gel 60 (230 -400 mesh) e eluída com uma fase móvel contendo a mistura solventes hexano e acetona numa proporção 75:25, previamente selecionada por CCD. Alíquotas de cinco mL foram coletadas num total de doze. A sub-fração 10-12 apresentou-se na forma de um pó amorfo amarelo (75,36mg) e característica de agarofuranos quando 71 comparada através de CCD com padrão autêntico, utilizando como revelador, ansaldeído sulfúrico. No entanto, encontrava-se ainda impuro, sendo submetida a um novo procedimento utilizando o mesmo sistema de coluna flash.

5.1.2.2 Avaliação fitoquímica por cromatografia Flash da sub-fração 10-12. A sub-fração 10-12 (75,36mg) como mencionado anteriormente, foi totalmente impregnada com cerca de 500mg de sílica gel de granulometria 230 – 400 mesh (0,04 – 0,063 mm) e a coluna foi recheada com cerca de 7,76g de sílica gel de granulometria 230 – 400 mesh (0,04 – 0,063 mm) e eluída com um sistema gradiente de solvente contendo uma mistura de hexano e acetona, iniciando a eluição com uma proporção de 90:10, seguido de misturas com gradientes de 80:20, 75:25 e 70:30 (Hexano : Acetona) e finalizada com 100% Acetona. Foram coletadas alíquotas de cinco mL num total de quarenta e seis alíquotas. A sub-fração 19-24 (16 mg) obtida nesta coluna apresentou-se na forma de um pó amorfo de coloração amarela e foi identificada através de dados espectroscópicos de RMN-1H e RMN-13 C como sendo um composto da classe dos agarofuranos denominado maiteína ( 29 ). Neste sentido, o espectro de RMN-1H (figuras 14-16) apresenta um padrão de absorções típicas de sesquiterpenos da classe dos agarofuranos, 5 sinais na região entre 1,41 a 2,35 ppm de tipo simpleto, atribuídos a metilas de grupo acetil. Quatro simpletos nas regiões de 1,58; 1,72; 1,40 e 1,23 ppm atribuídos aos grupos metilas C-12, C-14, C-9’ e C-10’, respectivamente. Três duplos dupletos em 8,70; 8,08 e 7,28 ppm atribuídos ao H-6’, H-4’ e H-5’, respectivamente. O espectro de RMN-13 C e RMN-13 C/Dept (Figuras 17-22) mostra sete sinais em 173,9; 169,8; 168,2; 170,3; 169,9; 168,4 e 168,8 ppm característicos de carbonos oxidados e foram atribuídos aos carbonos C-11’, C-11-Ac, C-6-Ac, C-9-Ac, C-2- Ac, C-12’ e C-8-Ac, respectivamente. Os sinais em 151,5; 137,8; 121,0 e 124,9 ppm foram relacionados aos carbonos do anel piridinico C-6’; C-4’; C-5’ e C-3`. Os sinais no espectro de RMN/Dept confirmam a presença de dois carbonos CH 2 em 59,9 e 69,9 ppm, relacionados aos carbonos C-11 e C-15, respectivamente. Uma dúvida que persistia era a diferença de valores da literatura em relação ao carbono C4’ a 137,8 e C6’ a 151,5ppm. No entanto, a confirmação por HMBC (Figura 23) mostra a coerência de nossos valores para correlação de sinais do H-4’ a 72

8,09 e com H6’ a 8,7ppp, respectivamente. Todos estes dados em conjunto e comparados com a literatura sugerem que a estrutura proposta seja do composto denominado maiteína. Outros valores em comparação com a literatura encontram-se na tabela 3. Nakagawa e colaboradores (2004) estudaram o extrato metanólico das cascas de M. laevis, os compostos isolados foram testados frente a atividade antitumoral, sendo um deles a maiteína, a qual, induziu a interleucina-6 (IL-6) e, fracamente, o fator de necrose tumoral (TNF-α) em células mononucleares de sangue periférico. Sugerindo então, este composto ter efeito antitumoral e também pro-inflamatório. Embora tenha estudos relacionados com este composto, o mesmo nunca foi testado frente ação antiulcerativa.

Tabela 3: Dados de deslocamentos químicos de RMN- 1H e RMN-13 C da substância MRR- C-19-24 com a substância Maiteína.

Carbo nos 1H-Maiteína* 1H-MRR -19 -24 13 C- 13 C-MRR -19 -24 Maiteína * 1 CH 5,87 d (4,1) 5,87 d (4,2) 73,29 73,4 2 CH 5,36 dd (4,1; 2,4) 5,34 dd (4,0; 2,7) 68,99 69,1

3 CH 4,81 d (2,4) 4,79 d (2,4) 75,91 75,6 4 C 70,69 70,5 5 CH 7,06 (sl) 7,05 (sl) 73,76 73,7 6 CH 2,37 d (4,2) 2,35 d (4,5) 50,41 50,4 7 CH 5,53 dd (5,9; 4,2) 5,53 dd (6,0; 4,2) 68,73 68,8 8 CH 5,42 d (5,9) 5,41 d (6,0) 71,22 71,3 9 C 52,46 52,4 10 C 94,37 94,0 11 CH 2 4,67 e 5,35 d 4,67 e 5,35 d (11,0) 59,90 59,9 (11,7)

12 CH 3 1,59 s 1,58 s 22,92 22,8 13 C 84,22 84,3 14 CH 3 1,73 s 1,72 s 18,50 18,5 15 CH 2 3,71 e 5,97 d 3,71 e 5,97 d (11,0) 71,10 69,9 (11,5) 2’ C 163,37 164,5 3’ C 127,27 124,9 4’ CH 8,09 s 8,08 dd (7,8; 1,8) 142,43 137,8 5’CH 7,28 s 7,28 dd (7,8; 4,2) 123,12 121,0 6’CH 8,71 s 8,7 dd (7,8; 1,8) 148,10 151,5

7’ CH 4,67 q (7,0) 4,66 q (7,0) 36,22 36,1 8’CH 2,61 q (7,0) 2,6 q (7,0) 45,10 44,9 9’CH 3 1,41 d (7,0) 1,4 d (7,0) 11,61 11,8 10’ CH 3 1,23 d (7,0) 1,23 d (7,0) 10,59 9,8 11’ CO 172,87 173,9 12’ CO 168,16 168,4 CO 164,50 165,3 C-1’’ ------129,0 C-2’’, C -6’’ 7,82 7,80 129,47 129,4 C-3’’, C -5’’ 7,40 7,40 128,54 128,5

C-4’’ 7,55 7,55 133,56 133,4 Ac2 2,17 s 2,17 s 169,9 169,9 (20,8) (20,85) Ac5 2,23 s 2,21 s 166,3 168,2 (21,3) (21,35) Ac9 2,33 s 2,35 s 170,2 170,3 (20,9) (20,93) Ac8 1,41 s 1,41 s 168,8 168,8 (19,8) (19,86) Ac11 2,35 s 2,36 s 169,6 169,8 (21,6)

(21,61)

*(HAN et al., 1990). 74

1 Figura 14: Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) de 1,0 a 11,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

1 Figura 15: Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 0,8 a 2,8 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

1 Figura 16: Espectro de RMN- H ( CDCl 3, 300 MHz) da sub-fração MRR-C-19-24.

13 Figura 17: Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) de 10,0 a 190,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

13 Figura 18: Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 10,0 a 75,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

13 Figura 19: Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 80,0 a 175, 0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

13 Figura 20: Espectro de RMN- C/ Dept (CDCL 3, 75MHz) ampliado de 9,0 a 151,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

13 Figura 21: Espectro de RMN- C/ Dept (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 9,0 a 24,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

13 Figura 22: Espectro de RMN- C / Dept (CDCl 3,75 MHz) ampliado de 30,0 a 80,0 ppm da sub-fração MRR-C-19-24.

Figura 23: Espectro de HMBC da sub-fração MRR-C-19-24. 84

(39)

5.1.3 Avaliação fitoquímica da fração de Acetato de Etila 2,56g da fração foram impregnadas com cerca de 5g de sílica gel de granulometria 70-230 mesh (0,063- 0,20 mm), na forma de uma pastilha. A coluna foi recheada com 45,0g de sílica gel 60 e eluída de forma gradiente com clorofórmio 100% aumentando a polaridade de forma crescente com metanol. Alíquotas de cinco mL foram coletadas num total de oitenta e seis alíquotas, evaporadas e reunidas segundo seu perfil cromatográfico verificado por CCD e até o momento não foi possível atingir um bom grau de pureza das sub-frações provenientes desta fração.

5.1.4 Avaliação fitoquímica do extrato de éter:hexano (Extração direta) O extrato de éter:hexano (7g), foi impregnado com cerca de 12g de sílica gel de granulometria 70-230 mesh (0,063- 0,20 mm), na forma de uma pastilha. A coluna foi recheada com 102g de sílica gel 60 e eluída de forma gradiente com hexano 100% e a polaridade aumentada gradativamente com acetona (Figura 24). Alíquotas de cinco mL foram coletadas num total de cento e trinta e sete, evaporadas e reunidas conforme perfil cromatográfico analisado por CCD.

Figura 24: Foto ilustrativa da coluna do extrato éter : hexano.

Fonte: O autor.

As sub-frações denominadas MRR-EH-9-10 e MRR-EH-12 com rendimentos de 78,6 mg e 15 mg, respectivamente, apresentaram-se em forma de cristais incolores e foram identificados através de dados espectroscópicos de RMN-1H e RMN-13 C como sendo os compostos 3,7-dioxofriedelano ( 20 ), um triterpeno do tipo friedelano isolado anteriormente nas raízes de M. robusta e um composto esteroidal denominado β-sitosterol ( 41 ), respectivamente. O espectro de RMN-1H da sub-fração MRR-EH-9-10 (Figura 25) apresentou simpletos em 0,77; 0,86; 0,95; 0,99; 1,06; 1,16 e 1,41 ppm relativos a sete metilas atribuídas aos hidrogênios H-24; H-25; H-26; H-27; H-28; H-29 e H-30. Além disso, o espectro apresenta um dupleto em 0,90 ppm associado a outra metila e atribuído ao H-23, características de triterpenos de esqueleto friedelano. A análise do espectro de RMN-13 C (Figura 26) indicou um total de 30 sinais de carbono, que foram classificados como sendo 8 CH 3, 10 CH 2, 4 CH e 8 Carbonos quaternários. Os sinais em 211,0 e 210,5 ppm confirmaram a presença de duas car- bonilas de cetona, atribuídas aos C-3 e C-7, respectivamente. Estas informações aliadas à comparação com os dados da literatura (MAHATO e KUNDU, 1994) permi- tiram identificar MRR-EH-9-10 como sendo 3,7-dioxofriedelano ( 20 ). Os demais deslocamentos químicos comparativos podem ser observados na tabela 4. 86

Estudos recentes com o triterpeno 3,7-dioxofriedelano, isolado das raízes de M. imbricata , mostraram que este foi ativo na avaliação da capacidade de inibição da enzima acetilcolinesterase pelo método de bioautografia (RODRIGUES et al., 2012).

(20)

Tabela 4: Dados de deslocamentos químicos de RMN- 13 C da substância MRR-EH-9-10 com a substância 3,7-dioxofriedelano em comparação com literatura. Nº Carbono MRR -EH -9- 3,7 -dioxofriedelano * 10**

1 CH 2 21,7 21,6 2 CH 2 41,0 40,8 3 C=O 211,0 210,6

4 CH 57,9 57,8 5 C 47,1 47,0 6 CH 2 57,0 56,9 7 C=O 210,5 210,2 8 CH 63,6 63,4 9 C 42,5 42,4 10 CH 59,1 59,0 11 CH 2 35,6 35,5 12 CH 2 29,9 29,8 13 C 39,5 39,4 14 C 37,5 37,5 15 CH 2 31,7 31,6 16 CH 2 36,4 36,3 17 C 30,2 30,1 18 CH 41,9 41,8 19 CH 2 34,7 34,9 20 C 28,2 28,0 21 CH 2 32,9 32,8 22 CH 2 38,7 38,6

23 CH 3 6,9 6,8 24 CH 3 15,3 15,1 25 CH 3 18,4 18,2

26 CH 3 19,3 19,2 27 CH 3 19,6 19,4 28 CH 32,2 32,1 3 29 CH 3 31,9 31,8 30 CH 3 34,6 34,7

*(MAHATO, KUNDU, 1994). Solvente CDCl 3

. 87

1 Figura 25: Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 0,0 a 3,0 ppm da sub-fração MRR-EH- 9-10.

13 Figura 26: Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 6,0 a 211,0 ppm da sub-fração MRR-EH-9-10.

Com relação ao composto β-sitosterol ( 41 ), o espectro de RMN de 1H apresentou sinais entre δ 0,68 - 1,0 referentes às metilas H-18, H-19, H-21, H-26, H- 27 e H-29 (Figura 27), um multipleto em 3,52 ppm correspondente ao hidrogênio oximetínico H-3, um simpleto largo em 5,36 ppm referente ao hidrogênio H-6 (Figura 28). Estes dados indicaram a presença de esqueleto esteroidal. O esqueleto esteroidal foi evidenciado também pelos espectros de RMN de 13 C (Figuras 29 e 30) devido aos sinais em 121,7 e 140,7 ppm referentes aos carbonos C-6 e C-5, respectivamente; seis sinais entre 11,8; 19,4; 18,8; 19,8; 19,0 e 11,9 ppm atribuídos aos carbonos metílicos C-18, C-19, C-21, C-26, C-27 e C-29, respectivamente. Onze sinais de carbonos metilênicos na região entre 37,2; 31,6; 42,3; 31,9; 21,0; 39,7; 24,3; 28,2; 33,9; 26,0 e 23,0 ppm correspondentes aos carbonos C-1, C-2, C-4, C-7, C-11, C-12, C-15, C16, C-22, C-23 e C-28, respectivamente, além dos sinais de carbonos metínicos na região de 29,1 a 71,8 ppm, atribuídos aos C-25 e C-3, respectivamente. Demais valores de deslocamentos químicos comparativos com dados da literatura estão descritos na tabela 5. Os fitoesteróis em geral e o β-sitosterol em particular são igualmente considerados potentes anti-inflamatórios, tendo igualmente propriedades antioxidantes e analgésicas. Estudos realizados por Aguirre-Hernandez e colaboradores (2007a), com o composto isolado β-sitosterol, mostraram que o mesmo atenuou a ansiedade no plus maze, potencializou o tempo de sono induzido por pentobarbital, diminuiu o número de head dips e também a resposta ambulatória, de modo semelhante ao diazepam.

(41)

Tabela 5: Dados de deslocamentos químicos de RMN- 13 C da substância MRR-EH-12 com a substância β-sitosterol.

C MRR -EH -12 Β-sitosterol*

1 37,2 37,2

2 31,6 31,6

3 71,8 71,8

4 42,3 42,3 5 140,7 140,8

6 121,7 121,7

7 31,9 31,8

8 31,9 31,8 9 50,1 50,1

10 36,5 36,5

11 21,0 21,1

12 39,7 39,7

13 42,3 42,3 14 56,7 56,8

15 24,3 24,3

16 28,2 28,2

17 56,0 56,1 18 11,8 11,9

19 19,4 19,4

20 36,1 36,1

21 18,8 18,9 22 33,9 33,9

23 26,0 26,0

24 45,8 45,8

25 29,1 29,1

26 19,8 19,8 27 19,0 19,0

28 23,0 23,0

29 11,9 12,0

* (KAMBOJ, SALUJA, 2011). Solvente CDCl 3. 91

1 Figura 27: Espectro de RMN- H (CDCl 3, 300 MHz) ampliado de 0,6 a 1,7 ppm da sub-fração MRR-EH-12.

1 Figura 28: Espectro RMN- H (CDCl 3, 300MHz) ampliado de 1,75 a 5,5 ppm da sub-fração MRR-EH-12.

13 Figura 29: Espectro de RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) da sub-fração MRR-EH-12.

13 Figura 30: Espectro RMN- C (CDCl 3, 75 MHz) ampliado de 6,0 a 80,0 ppm da sub-fração de MRR-EH-12. 95

5.2 ANÁLISE FARMACOLÓGICA

5.2.1 Avaliação da atividade antiulcerativa Muitas espécies do gênero Maytenus são popularmente utilizadas na medicina tradicional brasileira, devido às suas atividades antiácida e antiulcerogênica. Alguns estudos comprovaram a ação protetora do abafado (infuso) de M. ilicifolia contra o desenvolvimento da úlcera induzida em ratos, tanto por via oral como por via intraperitoneal. Estes estudos mostraram que o efeito protetor da "espinheira-santa" é semelhante ao da cimetidina, um medicamento utilizado como anti-histamínico de ação inibitória sobre a hemorragia digestiva, comumente observada na úlcera péptica (SILVA al., 2005). No entanto, devido a gestão de coleta inadequada no Brasil, a planta encontra-se em fase de extinção. É oportuno então estudar outras espécies no intuito de uma possível substituição (RAYMUNDO et al., 2012). Neste aspecto, estudos realizados em nossos laboratórios com extratos hidroalcoólicos e frações (hexano, clorofórmio e acetato de etila) das partes aéreas de M. robusta , apresentaram resultados positivos quanto sua ação antiulcerogênica sendo equivalentes á ação de M. ilicifolia (DE ANDRADE, et al., 2007; DE

ANDRADE, et al., 2008). Considerando que estudos com as raízes de M. robusta quanto sua ação antiulcerogênica ainda não tinham sido realizados e, aliados a necessidade da descoberta de novas terapias, este trabalho teve como objetivo avaliar a composição química e a ação antiulcerogênica de extratos e frações obtidos das cascas das raízes. A úlcera péptica tem sido objeto de intensa pesquisa nas últimas décadas, pois cerca de 10 por cento da população mundial são vítimas dessa patologia, com custos altíssimos à sociedade, por tornar a vida do paciente extremamente difícil e ser letal em muitos casos (BRITO, 2002). Essa patologia é desencadeada por um desequilíbrio entre os mecanismos de defesas do hospedeiro, quando há sobreposição de fatores que agridem a mucosa gástrica – ácido clorídrico e pepsina – em relação aos fatores que a protegem – muco e bicarbonato, por exemplo. Hábitos alimentares inadequados, o abuso de álcool, o tabagismo, o uso prolongado de medicamentos anti-inflamatórios não-esteroidais, estresse, a infecção por H. 96 pylori , o vírus herpes simplex e fatores genéticos, podem causar inflamação da mucosa gástrica (CORDEIRO et al., 2012). As opções de tratamento para pacientes que sofrem de úlceras gástricas comumente incluem os fármacos antiácidos e principalmente os antagonistas de receptores de histamina-2 e os inibidores da bomba de prótons. No entanto, foi observado que o uso prolongado dos H 2-Ras e dos inibidores da bomba de prótons provocam hiperplasia em células enterocromafins, o que pode levar a recidiva da doença e indução de câncer gástrico (BABU et al., 2010). Esta terapia provoca ainda outros efeitos colaterais, tais como: hipersensibilidade, arritmia, impotência, ginecomastia e distúrbios hematopoiéticos (LAKSHMI et al., 2010). Portanto há uma necessidade de busca por novos medicamentos antiulcerogênicos, mais eficazes e seguros, ou seja, que apresentem menos efeitos colaterais. Além disso, os tratamentos da medicina clássica baseados em longo tempo de uso de um único fármaco, geralmente quimiosintético, tem sofrido transição gradual para uma nova abordagem multiterapêutica. Esta mudança de paradigma também pode ser caracterizada por novos tratamentos com múltiplos alvos direcionados, principalmente, para a ativação de mecanismos de defesa, proteção e reparo. Tais estratégias se baseiam em experiências clínicas e na constatação de que processos patofisiológicos complexos, como é o caso da úlcera gástrica, podem ser influenciados de forma mais efetiva e com menor incidência de efeitos adversos graves com a combinação de vários compostos ativos em baixa dosagem do que com uma alta dose de um composto isolado (MADALOSSO, 2011).

5.2.2 Avaliação farmacológica do extrato metanólico (EM) e frações através de modelo de úlcera induzida por etanol A atividade gastroprotetora do EM e das frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila foi inicialmente avaliada nos modelos de úlcera induzida por etanol, que é um agente necrosante. Apesar de não representar integralmente a patologia humana, este modelo experimental é clássico no screening para o estudo de fármacos com atividade gastroprotetora. Este modelo fornece importantes indicativos de possíveis mecanismos de ação dos extratos e frações, que podem estar associados a fatores antioxidantes e fatores anti-inflamatórios, ou ainda a diminuição da secreção ácida. O uso desta substância está entre as principais causas 97 envolvidas na etiologia de úlceras gástricas (RAIHA et al., 1998; SCHMASSMANN, 1998; LEVENSTEIN, 1998). O mecanismo da lesão induzida por etanol é bastante variado, incluindo a redução da secreção de bicarbonato e da produção de muco, danos ao fluxo sanguíneo gástrico e lesão de células da mucosa. As lesões ocorrem predominantemente na parte glandular do estômago com formação de leucotrienos

C4 (LTC 4), produtos secretados pelos mastócitos, diminuição do muco e depleção de grupamentos sulfidrílicos, resultando em danos na mucosa gástrica (FEITOSA, 2011). As lesões gástricas induzidas por etanol são também associadas à produção excessiva de radicais livres, que atacam constituintes celulares essenciais como ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos. O aumento do conteúdo de peróxidos lipídicos e radicais livres derivados de oxigênio resulta em alterações significativas em nível celular e causa danos às membranas, morte celular, esfoliação e erosão epitelial (DONATINI et al., 2009). No presente estudo, o grupo controle tratado com etanol, apresentou lesões abundantes e com caráter necrosante, já o grupo tratado com EM de M. robusta , como pode ser observado na tabela 6, nas concentrações de 50, 250 e 500mg/kg apresentou uma diminuição na área total lesada, na porcentagem de área lesada e observado que os índices de cura encontrados para as diferentes doses de extrato foram de 90,42 ± 2,49; 95,58 ± 1,2 e 77,58% ± 3,32%, respectivamente e 47,05% ± 7,17% para cimetidina (Figuras 31 e 32), os quais foram mais efetivos que o controle positivo (cimetidina 100mg/kg) em comparação com o controle negativo. A análise estatística apontou uma diminuição significativa (p˂0,01) indicando assim possuir um efeito gastroprotetor. As frações hexânica, clorofórmica e de acetato de etila (250 mg/kg) também foram testadas no modelo de úlcera induzida por etanol e o resultado obtido foi estatisticamente significativo (p ˂0,01) para todas as frações, com valores mais efetivos que o grupo tratado com cimetidina quando comparados com controle negativo, apresentando índice de cura de 72,48± 2,99; 84,95 ± 5,72 e 81,57% ± 3,25% respectivamente (Figuras 33 e 34). 98

Como pode ser observado a fração de clorofórmio foi a que demonstrou melhor resultado, sugerindo que os compostos existentes nesta fração, sejam, em parte, os principais responsáveis pela atividade gastroprotetora desta espécie. Para a cimetidina, na dose de 100 mg/kg, a proteção obtida foi menor que aquelas induzidas por todas as doses do EM e das frações. De acordo com alguns estudos, as lesões induzidas por etanol são inibidas principalmente por agentes que aumentam a defesa da mucosa gástrica (MALAIRAJAN et al., 2007). A cimetidina é um antagonista de receptor H2 e produz seus efeitos principalmente por meio da inibição da secreção ácida (SCHUBERT e PEURA, 2008; GUSTAFSON e WELLING, 2010). É bem estabelecido que ácido intragástrico exerça papel importante na progressão das lesões (SCHUBERT e PEURA, 2008). Diante de características inerentes do próprio modelo experimental de lesões gástricas induzidas por etanol, como o curto período de tempo entre a administração dos agentes gastroprotetor e agressor e da eutanásia dos animais, parece claro que a ação local (tópica) do EM e frações é importante.

Tabela 6: Efeitos do extrato metanólico (EM) e frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila de M. robusta no modelo de úlcera induzido por etanol em camundongos. Tratamento Dose Área total % de área lesada v.o (mg/kg) da lesão (mm 2)

Controle - 65,34 ± 5,22 11,40 ± 0,45 Cimetidina 100 34,59 ± 7,17 ** 5,48 ± 1,42 ** Ext. Metanólico 500 14,64 ± 3,32 ** 5,09 ± 1,41 ** Ext. Metanólico 250 2,88 ± 1,2 ** 0,90 ±0,36 ** Ext. Metanólico 50 6,25 ± 2,49 ** 1,63 ± 0,61 ** Fração Hexano 250 17,98 ± 2,99 ** 6,04 ± 0,97 ** Fração Clorofórmio 250 9,83 ± 5,72 ** 1,19 ± 0,45 ** Fraçõ Acetato de Etila 250 12,03 ± 3,25 ** 3,54 ± 1,00 ** Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos. A comparação estatística foi utilizada ANOVA seguido pelo teste de Dunnet. **p<0,01 quando comparado com grupo controle.

Figura 31: Índice de cura do extrato metanólico (EM) de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos.

120

** 100 ** Controle (-)

80 ** Controle (+) MeOH 500 mg MeOH 250mg 60 ** MeOH 50mg

Índice Cura(%) 40

0 Controle Negativo

** p< 0,01.

Figura 32: Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol. A= Controle negativo; B= Ext. metanólico 500mg; C= Ext. metanólico 250 mg; D= Ext. metanólico 50mg.

A B C D

100

Figura 33: Índice de cura das frações de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos.

90 ** ** 80 ** Controle (-) 70 Controle (+) 60 Fr. Hexânica ** 50 Fr. Clorofórmio Fr. Acet. Etila 40 Índice Cura(%)

0 Controle Negativo

**p<0,01

Figura 34: Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol. A= Controle negativo; B= Fração Hexânica 250mg; C= Fração Clorofórmio 250mg e D= Fração Acetato de Etila 250mg.

A B C D

101

5.2.3 Avaliação farmacológica dos compostos isolados através de modelo de úlcera induzida por etanol Diversas substâncias de origem vegetal, entre elas flavonóides, taninos e terpenóides, têm apresentado atividade antiúlcera bastante significativa, demonstrando o grande potencial das plantas medicinais como fontes alternativas para o tratamento de úlceras gástricas (DONATINI et al., 2009). Diante dessa afirmação, destacamos a vantagem que o extrato e as frações de M. robusta, poderiam oferecer quando comparados ao tratamento exclusivo com drogas de referência, como a cimetidina. Na tentativa de verificar se os compostos isolados teriam influência nos resultados apresentados pelas frações, foram avaliados no modelo de úlcera induzido por etanol. Os compostos testados foram 3,12-dioxofriedelano, 3,7- dioxofriedelano, 11 α-hidroxilup-20(29)-en-3-ona e maiteína na dose de 30 mg/kg. A tabela 7 mostra que o resultado obtido foi estatisticamente efetivo (p ˂0,01) para todos os compostos em comparação com controle negativo. Como pode ser observado, todos os compostos apresentam área total e porcentagem de área lesada inferiores ao controle negativo, com valores de índice de cura de 74,28 ± 0,01; 77,14 ± 0,09; 76,19 ± 0,04 e 87,61 ± 0,08%, respectivamente e de 47,05 ± 7,17%, para cimetidina. Todos os resultados estão representados nas figuras 35 e 36. Sabendo-se de que a maiteína foi isolada da fração clorofórmica, a qual apresentou melhor efeito frente aos modelos testados, a mesma pode ser considerada, em parte, o composto responsável pela ação antiulcerogênica da planta em estudo.

102

Tabela 7: Efeitos dos compostos isolados de M. robusta no modelo de úlcera induzida por etanol em camundongos.

Tratamento Dose Área total da lesão % de área lesada v.o (mg/kg) (mm 2) Controle - - 1,05 ± 0,12 0,401 ± 0,04 Cimetidina 30 0,05 ± 0,01** 0,02 ± 0,01** 3,12-dioxofriedelano 30 0,27 ± 0,01** 0,100 ± 0,01** 3,7-dioxofriedelano 30 0,24 ± 0,09* 0,166 ± 0,07* 11-hidroxilup-20(29)-en-3-ona 30 0,25 ± 0,04* 0,192 ± 0,05* Maiteína 30 0,13 ± 0,08** 0,04 ± 0,03**

Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos. Na comparação estatística foi utilizada ANOVA seguido pelo teste de Dunnet. **p<0.01, *p<0,05 quando comparado ao grupo controle.

Figura 35: Índice de cura dos compostos isolados de M. robusta em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos.

120

100 ** ** Contole Negativo * ** 80 * Controle Positivo

60 3,12-dioxofriedelano

Índice Cura(%) 3,7-dioxofriedelano 40

11 α-hidroxilup-20(29)-en-3- 20 ona Maiteína

0 Controle Negativo

** p< 0,01 , * p, 0,05.

103

Figura 36: Imagens de estômagos após indução de úlcera com etanol. A= Controle negativo; B= 3,12-dioxofriedelano; C= 3,7-dioxofriedelano; D= 11-hidroxilup-20(29)-en-3- ona; E= Maiteína.

5.2.4 Avaliação da ação gastroprotetora do extrato metanólico (EM) e frações através de modelo de úlcera induzido por anti-inflamatório não esteroidal Outra substância que leva ao desequilíbrio dos fatores protetores da mucosa gástrica são os AINEs. A indometacina é um AINE que se tornou de primeira escolha em modelos experimentais de úlcera gástrica devido ao seu alto potencial ulcerogênico quando comparado a outros da classe. Embora seu mecanismo de ação ulcerogênico não esteja totalmente esclarecido, acredita-se que a indometacina e outros AINEs induzam o dano gástrico principalmente devido aos seus efeitos sistêmicos, ou seja, ao inibir as enzimas COX-1 e COX-2, reduzindo assim as concentrações locais de PGs (SULEYMAN et al., 2010; KUSHIMA et al., 2006). No estômago as prostaglandinas desempenham um importante papel de proteção, estimulando a secreção de bicarbonato e muco, mantendo o fluxo sanguíneo, sendo também responsável pela regulação da renovação das células da mucosa. Deste modo, a inibição da síntese de prostaglandinas enfraquece os fatores protetores da mucosa, diminuindo a sua capacidade de resistir aos agentes agressores (MALFERTHEINER; KLEIN-JÚNIOR et al., 2010). Outros mecanismos descritos na literatura para fármacos capazes de reduzir lesões gástricas induzidas por indometacina inclui aumento de NO, inibição de granulócito elastase, abertura de canais de potássio ATP dependentes, redução das concentrações de adrenalina e proteínas de choque térmico (VANE e BOTTING, 1998; WALLACE, 2008; MUSUMBA et al., 2009). 104

No modelo de úlcera induzida por indometacina (AINE), foi verificado que os animais tratados com EM de M. robusta apresentaram diminuição estatisticamente significativa (p ˂0,01) na área total lesada e na porcentagem de área lesada da mucosa gástrica comparadas com o grupo controle (Tabela 8). Apresentando efeito superior ao grupo tratado com cimetidina. Ainda neste experimento, foi possível constatar que quanto maior a dose administrada de extrato, maior foi o efeito gastroprotetor, obtendo-se assim um efeito dose-resposta. O índice de cura apresentado foi de 47,64 ± 0,96; 66,04 ±0,24 e 73,80% ± 0,29 respectivamente para o extrato metanólico e de 65,58% ± 0,23 para controle positivo (Figuras 37 e 38). Neste mesmo modelo experimental, foram testadas as frações de Hexano (125 mg/kg), clorofórmio e acetato de etila (250 mg/kg). Foi observado que os animais tratados apresentaram diminuição estatisticamente significativa para todas as frações, sendo a fração de clorofórmio a que apresentou maior atividade gastroprotetora, seguida da fração de acetato de etila e por último a hexânica (Tabela 8). Apresentando índice de cura de 76,95 ±0,22; 89,50 ± 0,08 e 82,06% ± 0,09% respectivamente (Figuras 39 e 40).

Tabela 8: Efeitos do extrato metanólico (EM) e frações de hexano, clorofórmio e acetato de etila de M. robusta no modelo de úlcera induzido por anti-inflamatório não esteroidal em camundongos. Tratamento Dose Área total da lesão % de área lesada v.o (mg/kg) (mm 2) Controle (-) - 2,19 ± 0,53 0,63 ± 0,15 Cimetidina 100 0,75 ± 0,23 * 0,27 ± 0,09 * Ext. Metanólico 500 0,57 ± 0,29 * 0,20 ± 0,1 * Ext. Metanólico 250 0,74 ± 0,24 * 0,27 ± 0,08 * Ext. Metanólico 50 1,14 ± 0,96 ** 0,04 ± 0,02 ** Fr. Hexânica 125 0,50 ± 0,22 ** 0,16 ± 0,07 ** Fr. Clorofórmio 250 0,23 ± 0,08 ** 0,07 ± 0,02 ** Fr. Acetato de Etila 250 0,39 ± 0,09 ** 0,12 ± 0,03 ** Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos. A comparação estatística foi utilizada ANOVA seguido pelo teste de Dunnet. ** p< 0,01, * p< 0,05 quando comparado com grupo controle.

105

Figura 37: Índice de cura do extrato metanólico (EM) de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por anti-inflamatório não esteroidal. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos.

80 * 70 * * Controle (-) 60 Controle (+) ** 50 MeOH 500mg MeOH 250mg 40 MeOH 50 mg

Índice Cura(%) 30

0 Controle Negativo

** p< 0,01, * p< 0,05

Figura 38: Imagens de estômagos após indução de úlcera por anti-inflamatório não esteroidal. A= Controle negativo; B= Extrato metanólico 500mg; C= Extrato metanólico 250mg; D= Extrato metanólico 50mg e E= Cimetidina.

A B C D E

106

Figura 39: Índice de cura das frações de M. robusta e cimetidina em lesões induzidas por anti-inflamatório não esteroidal. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis camundongos.

100 ** 90 ** ** 80 Controle (-) 70 ** Controle (+) 60 Fr. Hexânica 50 Fr. Clorofórmio

40 Fr. Acetato de Etila Índice Cura(%) 30

0 Controle Negativo

** p< 0,01.

Figura 40: Imagens de estômagos após indução de úlcera por anti-inflamatório não esteroidal. A= Controle negativo; B= Fração Hexânica; C= Fração Clorofórmio; D= Fração Acetato de Etila e E= Cimetidina.

107

Analisando os resultados obtidos neste trabalho, pode-se afirmar que M. robusta é uma forte candidata a fitoterápico com ação antiúlcera. Dessa forma, um dos fatores de extrema importância para a descoberta de princípios ativos naturais consiste, principalmente, na interação entre a química e a biologia. Quanto mais estreita for esta colaboração, de forma mais rápida e consistente serão alcançados os objetivos almejados.

108

109

6 CONCLUSÃO

De acordo com estudos fitoquímicos e farmacológicos realizados com o extrato metanólico, frações e compostos obtidos a partir das cascas das raízes de M. robusta Reiss, podemos concluir que:

1- Foi possível identificar através de dados espectroscópicos de RMN-1H e RMN-13 C em comparação com dados da literatura, uma substância inédita nesta espécie obtida da fração de hexano e denominada 11 α-Hidroxilup- 20(29)-en-3-ona. Assim como outras substâncias isoladas em estudos anteriores como: o triterpeno 3,12-dioxofriedelano e o esterol denominado estigmasterol, ambos identificados através de CCD e Co-CCD utilizando-se padrões autênticos desta planta;

2- Da fração de clorofórmio foi identificada através de RMN-1H, RMN-13 C/Dept e HMBC o composto da classe dos agarofuranos denominado maiteína;

3- Do extrato éter : hexano foi possível isolar e identificar através de dados espectroscópicos de RMN-1H e RMN-13 C o triterpeno da classe dos friedelanos 3,7-dioxofriedelano e o esterol β-sitosterol;

4- O EM e as frações apresentaram atividade gastroprotetora frente a dois dos principais agentes indutores de úlceras gástricas, o etanol e a indometacina (AINE);

5- Todos os compostos isolados testados em modelo de úlcera induzida por etanol apresentaram resultados positivos quanto sua ação antiulcerativa;

De acordo com os resultados obtidos nos experimentos de atividade gastroprotetora, os EM, frações e compostos de M. robusta atuam provavelmente aumentando a defesa da mucosa gástrica. Estudos complementares devem ser realizados em outros modelos mais específicos na tentativa de evidenciar o possível mecanismo de ação, bem como a relação dose resposta dos compostos isolados. 110

Embora os compostos sejam conhecidos, estão sendo avaliados pela primeira vez como gastroprotetores.

111

REFERÊNCIAS

ABAD, A.; SAN FELICIANO, A.; LÓPEZ-PÉREZ, J. l.; OLMO, E. D. Determinação estrutural de substâncias naturais: Aspectos práticos. In: YUNES R. A.; CECHINEL-FILHO, V. Química de produtos naturais, novos fármacos e a moderna farmacognosia , p. 121- 153, UNIVALI, Itajaí, 2007.

AGUIRRE-HERNÁNDEZ, E.; ROSAS-ACEVEDO, H.; SOTO-HERNÁNDEZ, M.; MARTÍNEZ, A. L.; MORENO, J.; GONZÁLEZ-TRUJANO, M. E. Bioactivity-guided isolation of beta- sitosterol and some fatty acids as active compounds in the anxiolytic and sedative effects of Tilia americana var. mexicana. Planta Medica , v. 73, n. 11, p. 1148-1155, 2007a.

AIHARA, T.; NAKAMURA, E.; AMAGASE, K.; TOMITA, K.; FUJISHUTA, T. Pharmacological control of gastric acid secretion for the treatment of acid related peptic disease: past, present and future. Pharmacology & Therapeutics , n. 98, p. 109-127, 2003.

ALBUQUERQUE, U. P.; HANAZAKI, N. As pesquisas etnodirigidas na descoberta de novos fármacos de interesse médico e farmacêutico: fragilidades e pespectivas. Brazilian Journal of Pharmacognosy , v. 16, p. 678-689, 2006.

ALONSO, J. R. Tratado de fitomedicina: bases clínicas y farmacológicas . Buenos Aires, Isis Ediciones SRL, p. 828-834, 1998.

ALVES, H. M. A diversidade química das plantas como fonte de fitofármacos. Cadernos Temáticos de Química Nova , n. 3, p. 10-14, 2001.

ANDRADE, S. F.; LEMOS, M.; COMUNELLO, E.; NOLDIN, V. F.; CECHINEL FILHO, V.; NIERO, R. Evaluation of the antiulcerogenic activity of Maytenus robusta (Celastraceae) in different experimental ulcer models. Journal of Ethnopharmacology , v. 113, p. 252-257, 2007.

ANDRADE, S. F.; COMUNELLO, E.; NOLDIN, V. F.; MONACHE, F. D.; CECHINEL-Filho, V.; and NIERO, R. Antiulcerogenic activity of fractions and 3,15-dioxo-21 α-hydroxy friedelane isolated from Maytenus robusta (Celastraceae). Archives of Pharmacal Research , v. 31, p. 41-46, 2008.

ANTONISAMY, P.; DURAIPANDIYAN, V.; IGNACIMUTHU, S. Anti-inflammatory, analgesic and antipyretic effects of friedelin isolated from Azima tetracantha Lam. in mouse and rat models. The Journal of Pharmacy and Pharmacology , v. 63, n. 8, p. 1070-1077, 2011.

ARDILES, A. E.; RODRÍGUEZ, A. G.; NÚÑEZ, M. J.; PERESTELO, N. R.; PARDO, V.; JIMÉNEZ, I. A.; VALVERDE, A. M.; BAZZOCCHI, I. L. Studies of naturally occurring friedelane triterpenoids as insulin sensitizers in the treatment type 2 diabetes mellitus. Phytochemistry , v. 84, p. 116-124, 2012.

ARGENTA, S. C.; ARGENTA, L. C.; GIACOMELLI, S. R.; CEZAROTTO, V. S. Plantas medicinais: Cultura popular versus ciência. Vivências , v. 7, n. 12, p. 51-60, 2011.

BABU, T. H.; MANJULATHA, K.; KUMAR, G. S.; HYMAVATHI, A.; TIWARI, A. K.; PUROHIT, M.; RAO, J. M. BABU, K. S. Gastroprotective flavonoid constituents from Oroxylum indicum Vent. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters , v. 20, p. 117-120, 2010.

BANDEIRA, S. O.; GASPAR, F.; PAGULA, F. P. African Ethnobotany and Healthcare: Emphasis on Mozambique. Pharmaceutical Biology , v. 39, n.1, p. 70–73, 2001. 112

BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. S. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova , v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009.

BEZERRA, A. M. F; BEZERRA, K. K. S; SOUSA, L. C. F. S; SOUSA, J. S.; BORGES, M. G. B. Plantas medicinais utilizadas pela comunidade de mimoso no município de Paulista, Paraíba - Brasil, Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável , v. 7, n. 5, p. 6-11, 2012.

BIGUETTI, A. E.; ANTONIO, M. A.; KOHN, L. K.; REHDER, V. L. G.; FOGLI, M. A.; POSSENTI, A.; VILELA, L.; CARVALHO, S. E. Antiulcerogenic activity of a crude hydroalcoholic extract and coumarin isolated from Mikania laevigata Schultz Bip. Phytomedicine , v. 12, p. 72-77, 2005.

BONACORSI, C.; RADDI, M. S. G.; CARLOS, I. Z.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W. Anti- Helicobacter pylori activity and immunostimulatory effect of extracts from Byrsonima crassa Nied. (Malpighiaceae). Complementary and Alternative Medicine , v. 2, n. 9, p. 1-7, 2009.

BRANDÃO, H. N.; DAVID, J. P.; COUTO, R. D.; NASCIMENTO, J. A. P. Química e farmacologia de quimioterápicos antineoplásicos derivados de plantas. Química Nova , v. 33, n. 6, p. 1359-1369, 2010.

BRASIL, D. F. B. Estudo sobre a composição química das raízes de Maytenus robusta Reiss (Celastraceae) . Monografia de conclusão de graduação da Faculdade de Farmácia da Universidade do Vale do Itajaí – Univali, 2010.

Brasil 2004. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução de Diretoria Colegiada no. 48 de 16 de março de 2004 . Aprova o regulamento técnico de medicamentos fitoterápico junto ao Sistema Nacional de Vigilância Sanitária. DOU. Diário Oficial da União, Poder Executivo, DF, Brasília, 18 mar. 2004.

BRAZ FILHO, R. Contribuição da fitoquímica para o desenvolvimento de um país emergente. Química Nova , v. 33, n. 1, p. 229-239, 2010.

BRINKER, A. M.; MA, J.; LIPSKY, P. E.; RASKIN, I. Medicinal chemistry and pharmacology of genus Tripterygium (Celastraceae). Phytochemistry , v. 68, p. 732-766, 2007.

BRITO, A. R. M. S. Plantas do cerrado do Brasil com potencial atividade antiulcerogênica . Pesquisa FAPESP, Universidade estadual de Campinas, 2002.

CANESCHI, C. M. Estudo fitoquímico e atividades biológicas de extratos e constituintes isolados de sâmaras de Austroplenckia populnea Reissek (Celastraceae) . Dissertação de conclusão de mestrado – Universidade Federal de Ouro Preto, 2011.

CARLINI, E. A. & FROCHTENGARTEN, M. L. Toxicologia clínica (Fase I) da espinheira santa ( Maytenus ilicifolia ). In: Central de Medicamentos (Brasil). Estudo de açäo antiúlcera gástrica de plantas brasileiras ( Maytenus ilicifolia "espinheira-santa" e outras). s.l, Central de Medicamentos (Brasil) Brasília- Distrito Federal, p. 67-73, 1988.

CARMONA, F.; PEREIRA, A. M. S. Herbal medicines: old and new concepts, truths and misunderstandings. Brazilian Journal of Pharmacognosy , v. 23, n. 2, p. 379-385, 2013.

CARVALHO, J. S. Estudo Fitoquímico biomonitorado a partir da atividade citotóxica de Salacia crassifolia (Celastraceae) . Dissertação de conclusão de mestrado da Universidade Estadual de Goiás, 2013. 113

CARVALHO, J. E. Atividade antiulcerogênica e anticâncer de produtos naturais e de síntese. In: Constriundo a história dos produtos naturais. Multi Ciência , v. 7, p. 1-18, 2006.

CARVALHO-OKANO, R. M. Novos sinônimos para espécies de Maytenus Mol. Emend. Mol. (Celastraceae). Bradea , v. 8, n. 14, p. 73-76, 1998.

CARVALHO-OKANO, R. M. & LEITÃO FILHO, H. F. O gênero Maytenus Mol. emend. Mol. (Celastraceae) no Brasil extra-amazônico. In: REIS, M. S. & SILVA, S. R. Conservação e uso sustentável de plantas medicinais e aromáticas: Maytenus spp., espinheira santa . Brasília, Ibama, p. 11-51, 2004.

CECHINEL-FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Química Nova , v. 21, n. 1, p. 99- 105, 1998.

CORDEIRO, K. W.; PINTO, L. A.; FORMAGIO, A. S. N.; DE ANDRADE, S. F.; KASSUYA, C. A. L.; FREITAS, K. C. Antiulcerogenic effect of Croton urucurana Baillon bark. Journal of Ethnopharmacology , n. 143. p. 331-337, 2012.

COSTA, P. M.; FERREIRA, P. M.; BOLZANI V. D. A. S. Antiproliferative activity of pristimerin isolated from Maytenus ilicifolia (Celastraceae) in human HL-60 cells. Toxicology in Vitro , v. 22, n. 4, p. 854-63, 2008.

CRESTANI, S.; RATTMANN, Y.D.; CIPRIANI, T. R.; DE SOUZA, L. M.; IACOMINI, M.; KASSUYA, C.A.; MARQUES, M. C.; DA SILVA-SANTOS, J. E. A potent and nitric oxide- dependent hypotensive effect induced in rats by semi-purified fractions from Maytenus ilicifolia . Vascular Pharmacology , v. 51, n. 1, p. 57-63, 2009.

DE ALMEIDA, M. T.; RIOS-LUCI, C.; PADRON, J. M.; PALERMO, J. A. Antiproliferative terpenoids and alkaloids from the roots of Maytenus vitis-idaea and Maytenus spinosa . Phytochemistry , v. 71, n. 14-15, p. 1741-1748, 2010.

DE ALMEIDA, J. M. A. Potencial das folhas de Rudgea viburnoides (Cham.) Benth (RUBIACEAE) no tratamento da obesidade e suas alterações metabólicas induzidas por dieta em camundongos Balb/c . Dissertação de conclusão de mestrado da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, 2011.

DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. Química Nova na Escola , n. 7, 1998.

DELLE MONACHE, F. Determinação estrutural de produtos naturais através da técnica de ressonância magnética nuclear In: CALIXTO, J. B.; YUNES R. A. Plantas Medicinais Sob a Ótica da Química Medicinal Moderna , p. 101-146, Chapecó: Argos, 2001.

DEORE, A. B.; SAPAKAL, V. D.; DASHPUTRE, N. L.; NAIKWADE, N. S. Antiulcer activity of Garcinia indica linn fruit rinds . Journal of Applied Pharmaceutical Science , v. 1, n. 5, p. 151-154, 2011.

DERELANKO, M. J.; LONG, J. F. Carbonoxolen sodium protects rat gastric mucosa against ethanol-induced necrosis. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine , v. 166, p. 394–397, 1981.

114

DIAS, K. S.; MARQUES, M. S.; MENEZES, I. A. et al., Antinociceptive activity of Maytenus rigida stem bark. Fitoterapia , v. 78, p. 460-464, 2007.

Di STASI, L. C.; HIRUMA-LIMA, C. A. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica . 2º ed. rev. e ampl . Editora UNESP, 2002.

DONATINI, R. S.; ISHIKAWA, T.; BARROS, S. B. M.; BCCHI, E. M. Atividades atiúlcera e antioxidante do extrato de folhas de Syzygium jambos (L.) Alston (Myrtaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 19, n. 1, p. 89-94, 2009.

DURAIPANDIYAN, V.; GNANASEKAR, M.; IGNACIMUTHU, S. Antifungal activity of triterpenoid isolated from Azima tetracantha leaves. Folia Histochemica et Cytobiologica , v. 48, n. 2, p. 311-313, 2010.

ESTEVAM, C. S.; CAVALCANTI, A. M.; CAMBUI, E. V. F.; ARAÚJO NETO, V. LEOPOLDO, P. T. G.; FERNANDES, R. P. M.; ARAUJO, B. S.; PORFÍRIO, Z.; SANT’ANA, A. E. G. Perfl ftoquímico e ensaio microbiológico dos extratos da entrecasca de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 19, p. 299-303, 2009.

FEITOSA, M. L. Investigação dos mecanismos de ação da atividade gastroprotetora de 1,4-cineol em modelos de úlcera gástrica em camundongos . 96f. Dissertação de conclusão de mestrado. Universidade Federal do Ceará, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, 2011.

FIGUEIREDO, J. N.; RAZ, B.; SÉQUIN, U. Novel quinone methides from Salacia kraussi with in vitro antimalarial activity. Journal of Natural Product , v. 61, n. 6, p. 718-723, 1998.

FONSECA, A. P. N. D.; SILVA, G. D. F.; CARVALHO, J. J.; SALAZAR, G. D. C. M.; DUARTE, L. P.; SILVA, R. P.; JORGE, R. M.; TAGLIATI, C. A.; ZANI, C. L.; ALVES, T. M. A.; PERES, V.; VIEIRA FILHO, S. A. Estudo fitoquímico do decocto das folhas de Maytenus truncata Reissek e avaliação das atividades antinociceptiva, antiedematogênica e antiulcerogênica de extratos do decocto. Química Nova , v. 30, n. 4, p. 842-847, 2007.

FOX, S. I. Fisiologia humana. 7 ed. p. 726, Barueri – SP. Editora Manole, 2007.

GOBBO NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: Fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova , v. 30, n. 2, p. 374-371, 2007.

GOMES, R. V. R. S.; VILELA, V. L. R.; GOMES, E. N.; MAIA, A. J.; ATHAYDE, A. C. R. Análise fitoquímica de extratos botânicos utilizados no tratamento de helmintoses gastrintestinais de pequenos ruminantes. Revista Caatinga , v. 24, n. 4, p. 172-177, 2011.

GUSTAFSON, J.; WELLING, D. "No Acid, No Ulcer"-100 Years Later: A Review of the History of Peptic Ulcer Disease. Journal of the American College of Surgeons , v. 210, n. 1, p. 110-116, 2010.

GUYTON, A. C.; HALL, J. E. Tratado de fisiologia médica . 12 ed. P. 1151, Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.

HAN, B. H.; PARK, M. K.; RYU, J. H.; PARK, J. H.; NAOKI, H. Sesquiterpene alkaloids from Euonymus japonica . Phytochemistry , v. 29, n. 7, p. 2303-2307, 1990.

HAWKEY, C. J. Nonsteroidal anti-inflamatory drug gastropathy. Gastroenterology , n. 119, p. 521-535, 2000.

115

HIRUMA-LIMA, C. A.; CALVO, T. R.; RODRIGUES, C. M.; ANDRADE, F. D. P.; VILEGAS, W.; SOUZA BRITO, A. R. M. Antiulcerogenic activity of Alchornea castaneaefolia : effects on somatostatin, gastrin and prostaglandin. Journal of Ethnopharmacology , v. 104, p. 215- 224, 2006.

HOSTETTMANN, K. Sample Preparation and Purification . In: Preparative chromatography techniques: Applications in natural product isolation . New York, 2 º ed., p. 4-14, 1997.

JAINU, M.; DEVI, C. S. S. Antiulcerogenic and ulcer healing effects of Solanum nigrum (L.) on experimental ulcer models: possible mechanisms for the inhibition of acid formation. Journal of Ethnopharmacology . v. 104, p. 156-163, 2006.

JANSEN, P. C. M.; MENDES, O. Plantas Medicinais. Seu uso tradicional em Moçambique . Maputo: Gabinete de Medicina Tradicional, v. 4, 1991.

JUNIOR, C. V.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E. J. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova , v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006.

KAMBOJ, A.; SALUJA, A. K. Isolation of stigmasterol and β-sitosterol from petroleum ether extract of aerial parts of Ageratum conyzoides (Asteraceae). International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , v. 3, n. 1, p. 9496, 2011.

KINGSTON, D. G. I. Modern Natural Products Drug Discovery and Its Relevance to Biodiversity Conservation. Journal of Natural Products , v. 74, p. 496–511, 2011.

KLAYMAN, D. L. Qinghaosu (artemisinin): an antimalarial drug from China. Science , v. 228, n. 4703, p. 1049- 1055, 1985.

KLEIN-JÚNIOR, L. C.; GANDOLFI, R. B.; SANTIN, J. R.; LEMOS, M.; CECHINEL FILHO, V.; ANDRADE, S. F. Antiulcerogenic activity of extract, fractions and some compounds obteined from Polygala cyparissias St. Hillaire & Moquin (Poligalaceae). Naunym-Schmiedberg`s Archives of Pharmacology , v. 381, p. 121-126, 2010.

KOO, M. W. L.; OGLE, C. W.; CHO, C. H. Effects of verapamol, carbenoxolone and N- acetylcysteine on gastric wall mucus and ulceration in stressed rats. Pharmacology , v. 32, p. 326–334, 1986.

KUPCHAN, S. M.; KOMODA, Y.; COURT, W. A.; THOMAS, G. J.; SMITH, R. M.; KARIM, A.; GILMORE, C. J.; HALTIWANGER, R. C.; BRYAN, R. F. Maytansine, a novel antileukemic ansa macrolide from Maytenus ovatus . Journal of the American Chemical Society , v. 94, p. 1354-1356, 1972a.

KUSHIMA, H. Avaliação da atividade antiulcerogênica dos extratos e frações das folhas de Davilla elliptica St. Hil. e Davilla nitida (Vahl) Kubitzki (Dileniaceae) . Dissertação de conclusão de mestrado. Instituto de Biociências de Botucatu da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2006.

LAKISHMI, V.; SINGH, N.; SHRIVASTVA, S.; MISHRA, S. K.; DHARMANI, P.; MISHRA, V.; PALIT, G. Gedunin and photogedunin of Xilocarpus granatum show significant anti-secretory effects and protect the gastric mucosa of peptic ulcer in rats. Phytomedicine , v. 17, n. 8-9, p. 560-574, 2010.

116

LEVENSTEIN, S. Stress and peptic ulcer: Life beyond Helicobacter . British Medical Journal , v. 316, n. 7130, p. 538-541, 1998.

LOCKREY, G.; LIM, L. Peptic Ulcer Disease in Older People. Journal of Pharmacy Practice and Research , v. 41, n. 1, 2011.

MACIEL, M. A. M.; PINTO, A.C.; VEIGA, V. F.; GRYNBERG, N. F. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova , v. 25, p. 429-438, 2002.

MADALOSSO, R. C. Avaliação da toxicidade aguda e da atividade gastroprotetora de extratos de Campomanesia lineatifolia Ruiz & Pav. Em roedores. Dissertação de conclusão de mestrado. Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais (FAFAR/UFMG), 2011.

MAGALHÃES, C. G. Estudo fitoquímico do tronco e raiz de Maytenus salicifolia Reissek (Celastraceae) e avaliação da atividade biológica de seus constituintes e de ésteres derivados do lupeol . Tese de conclusão de doutorado. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Química. 2012.

MAGALHÃES, C. G., FERRARI, F. C., GUIMARÃES, D. A. S., SILVA, G. D. F., DUARTE, L. P., FIGUEIREDO, R. C., FILHO, S. A. V. Maytenus salicifolia : triterpenes isolated from stems and antioxidant property of extracts from aerial parts. Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 21, n. 3, p. 415-419, 2011.

MAHATO, S. B.; KUNDU, A. P. 13 C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids – a compilation and some salient features. Phytochemistry , v. 37, n. 6, p. 1517-1575, 1994.

MALAIRAJAN, P. et al. Anti-ulcer activity of crude alcoholic extract of Toona ciliata Roemer (heart wood). Journal of Ethnopharmacology , v. 110, n. 2, p. 348-351, 2007.

MALFERTHEINER, P.; CHAN, F. K. L.; McCOLL, K. E. L. Peptic ulcer disease. The lancet , v. 374, p. 1449-1461, 2009.

MALHEIROS. A.; BITTENCOURT, C. M. S.; NIERO, R.; CECHINEL-FILHO, V. Considerações gerais sobre aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais. In: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL-FILHO, V. Fármacos e medicamentos – Uma abordagem multidisciplinar . São Paulo: Santos, 2010.

MALTESE, F.; DER KOOY, F. V.; VERPOORTE R. Solvent Derived Artifacts in Natural Products Chemistry. Natural Product Communication , v. 4, n. 3, p. 447–454, 2009.

MARIOT, M. P.; BARBIERI, R. L. Metabólitos secundários e propriedades medicinais da espinheira-santa ( Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e M. aquifolium Mart.). Revista Brasileira de Plantas Medicinais , v. 9, n. 3, p. 89-99, 2007.

MARINI-BETTOLO, G. B. Chemistry of the active principles of Celastraceae. Farmaco , v. 29, p. 551-568, 1974.

MARTUCCIELLO, S.; BALESTRIERI, M. L.; FELICE, F.; ESTEVAM, C. S.; SANT`ANA, A. E.; PIZZA, C.; PIACENTE, S. Effects of triterpene derivatives from Maytenus rigida on VEGF-induced Kaposi’s sarcoma cell proliferation. Chemico-Biological Interactions , v. 183, n.3, p. 450-454, 2010.

117

MASSIGNANI, J. J.; LEMOS, M.; MAISTRO, E. L.; SCHAPHAUSER, H. P.; JORGE, R. F.; SOUSA, J. P. B.; BASTOS, J. K.; ANDRADE, S. F. Antiulcerogenic activity of the essential oil of Baccharis dracunculifolia on different experimental models in rats. Phytotherapy Research , v. 23, p, 1355-1360, 2009.

MENDES, B. G.; MACHADO, M. J.; FALKENBERG, M. Triagem de glicolipídios em plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 16, p. 568-575, 2006.

MENDONÇA-Filho, R. F. W.; MENEZES, F. S. Estudo da utilização de plantas medicinais pela população da Ilha Grande - RJ. Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 13, p. 55-58, 2003.

MERCHANT, J. L. Tales from the crypts: regulatory peptides and cytokines in gastrointestinal homeostasis and disease. The Journal of Clinical Investigation , v. 117, p. 6-12, 2007.

MOHAN, K. G.; SACHIN, S. Y.; MANOHAR, P. V.; DIPAK, R. L.; SANJAY, S. J. Pharmacognostical investigation and physicochemical analysis of Celastrus paniculatus Willd. Leaves. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, p. S1232-S1236, 2012.

MORIMOTO, Y.; SHIMOHARA, K.; OSHIMA, S.; SUKAMOTO, T. Effects of the new antiulcer agent KB-5492 on experimental gastric mucosal lesions and gastric mucosal defensive factors, as compared to those of teprenone and cimetidine. Japanese Journal of Pharmacology , v. 57, n. 4, p. 495-505, 1990.

MOSSI, A. J.; MAZUTTI, M. A.; CANSIAN, R. L.; OLIVEIRA, D.; OLIVEIRA, J. V.; DALLAGO, R.; LEONTIEVE-ORLOV, O.; TRIECHEL, H. Variabilidade química de compostos orgânicos voláteis e semivoláteis de populações nativas de Maytenus ilicifolia . Química Nova , v. 33, n. 5, p. 1067-1070, 2010.

MUSUMBA, C.; PRITCHARD, D. M.; PIRMOHAMED, M. Review article: cellular and molecular mechanisms of NSAIDinduced peptic ulcers. Alimentary Pharmacology & Therapeutics , v. 30, n. 6, p. 517-531, 2009.

NASCIMENTO, E.S.; TUROLLA, M.S.R. Informações toxicológicas de alguns fitoterápicos utilizados no Brasil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas , v. 42, p. 289- 306, 2006.

NAKAGAWA, H.; TAKAISHI, Y.; FUJIMOTO, Y.; DUQUE, C.; GARZON, C.; SATO, M.; OKAMOTO, M.; OSHIKAWA, T; AHMED, S. Chemical constituents from the Colombian medicinal plant Maytenus laevis . Journal of Natural Products , v. 67, n. 11, p. 1919-1924, 2004.

NESTEL, P.; CEHUN, M.; POMEROY, S.; ABBEY, M.; WELDON, G. Cholesterol-lowering effects of plant sterol esters and non-esterified stanols in margarine, butter and low-fat foods. European Journal of Clinical Nutrition , v. 55, n. 12, p. 1084-1090, 2001.

NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. Journal of Natural Products , v. 70, p. 461-477, 2007.

NIERO, R.; MOSER, R.; BUSATO, A. C. B.; YUNES, R. A.; REIS, A.; CECHINEL FILHO, V. A comparative chemical study of Maytenus ilicifilia Mart. Reiss. and Maytenus robusta Reiss (Celastraceae). Zeitschrift für Naturforschung , v. 56, p. 158-161, 2001. 118

NIERO, R.; MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; BIAVATTI, M. W.; LEITE, S. N.; CECHINEL-FILHO, V. Aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais e considerações sobre fitoterápicos. In: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL-FILHO, V. Ciências Farmacêuticas: Contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Itajaí: Univali, p. 11-55, 2003.

NIERO, R.; MAFRA, A. P.; LENZI, A. C.; CECHINEL-Filho, V.; TISCHER, C. A.; MALHEIROS, A.; De SOUZA, M. M.; YUNES, R. A.; DELLE MONACHE, F. A new triterpene with antinociceptive activity from Maytenus robusta . Natural Products Research, v. 20, n. 14, p. 1315-1320, 2006.

NIERO, R. Fármacos, Fitofármacos e Fitoterápicos: Abordagem Econômica e de Mercado. In: BRESOLIN, T. M. B. e CECHINEL FILHO, V. (Org.). Fármacos e medicamentos - Uma abordagem multidisciplinar . 2ed.Rio de Janeiro, p. 1-12, 2010.

NIERO, R.; ANDRADE, S. F.; CECHINEL-FILHO, V. A review of the ethnopharmacology, Phytochemistry and Pharmacology of Plants of the Maytenus Genus. Current Pharmaceutical Design , v. 17, n. 18, p. 1851-1871, 2011.

OMS/Organización Mundial de la Salud. Pautas generales para las metodologias de investigación de la medicina tradicional. Ginebra, 2000.

OLIVEIRA, D. M.; SILVA, G. D. F.; DUARTE, L. P.; VIEIRA Filho, S. A. Chemical constituints isolated from roots of Maytenus acanthophylla Reissek (Celastraceae). Biochemical Systematics and Ecology , v. 34, p. 661-665, 2006.

OSORIO, A. A.; MUÑÓZ, A.; TORRES-ROMERO, D.; BEDOYA, L. M.; PERESTELO, N. R.; JIMÉNEZ, I. A.; ALCAMÍ, J.; BAZZOCCHI, I. Olean-18-ene triterpenoids from Celastraceae species inhibit HIV replication targeting NF-kB and Sp1 dependent transcription. European Journal of Medicial Chemistry , v. 52, p. 295- 303, 2012.

PANDEY, M.; DEBNATH, M.; GUPTA, S.; CHIKARA, S. K. Phytomedicine: An ancient approach turning into future potential source of therapeutics. Journal of Pharmacognosy Phytotherapy , v. 3, n. 1, p. 113 -117, 2011.

PESSUTO, M. B.; COSTA, I. C.; SOUZA, A. B.; NICOLI, F. M.; MELLO, J. C. P.; PETEREIT, F.; LUFTMANN, H. Atividade antioxidante de extratos e taninos condensados das folhas de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. Química Nova , v. 32, n. 2, 2009.

PIIRONEN, V.; LINDSAY, D. G.; MIETTINEN, T. A.; TOIVO, J.; LAMPI, A. M. Review - Plant sterols: biosynthesis, biological function and their importance to human nutrition. Journal of Sciences Food and Agriculture , v. 80, n. 7, p. 939-966, 2000.

PINDER, R. M.; BROGDEN, R. N.; SAWYER, P. R.; SPEIGHT, T. M.; SPENCER, R.; AVERY, G. S. Carbonoxole: a review of its pharmaco- logica properties and therapeutic efﬁcacy in peptic ulcer disease. Drugs , v. 11, p. 245–307, 1976.

PINTO, A. C.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R. A. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova , v. 25, n. 1, p. 45-61, 2002.

RAIHA, I.; KEMPPAINEN, H.; KAPRIO, J.; KOSKENVIO, M.; SOURANDER, L. Lifestyle, stress and genes in peptic ulcer disease: a nationwide twin cohort study. Archives of Internal Medicine , v. 158, n. 7, p. 698-704, 1998.

119

RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITTER, J. M. Farmacologia . 6 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, v. 920, 2007.

RATES, S. M. K. Promoção do uso racional de ﬁ toterápicos: uma abordagem no ensino de Farmacognosia . Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 11, p. 57-69, 2001.

RAYMUNDO, T. M.; FAVILLA, M.; NIERO, R.; ANDRADE, S. F.; MAISTRO, E. L. Genotoxicidade da planta medicinal Maytenus robusta em células de mamíferos in vivo. Genética e Moleculas de Pesquisa , v. 11, n. 3, p. 2847-2854, 2012.

RODRIGUES, S. B. V.; MIRANDA, R. R. S.; DUARTE, L. P.; SILVA, G. D. F.; OLIVEIRA, D. M.; LULA, I. S. Triterpenos pentacíclicos isolados de Salacia elliptica (Mart.) Peyr. In: Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química , 29.,Belo Horizonte, MG. 2006 .

RODRIGUES, V. G. Estudo fitoquímico e atividade biológica de raízes de Maytenus imbricata Mart. Ex. Reissek . 170 f. Dissertação de conclusão de Mestrado. Departamento de química, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, 2011.

RODRIGUES, V. G.; DUARTE, L. P.; SILVA, G. D. F.; SILVA, F. C.; GÓES, J. V.; TAKAHASHI, J. A.; PIMENTA, L. P. S. Evaluation of antimicrobial activity and toxic potential os extracts and triterpenes isolated from Maytenus imbricata . Química Nova , v. 35, n. 7, p. 1375 - 1380, 2012.

ROMANIK, G.; GILGENAST, E.; PRZYJAZNY, A.; KAMINSKI, M. Techniques of preparing plant material for chromatographic separation and analysis. Journal Biochemistry Biophysical Methods . v. 70, p. 253-261, 2007.

SANNOMIYA, M.; FONSECA, V. B.; SILVA, M. S.; ROCHA, L. R. M.; SANTOS, L. C.; HITUMA-LIMA, C. A.; BRITO, A. R. M. S.; VILEGAS, W. Flavonoids and antiulcerogenic activity from Byrsonima crassa leaves extracts. Journal of Ethnopharmacology , v. 97, p. 1- 6, 2005.

SANTIN, J. R.; LEMOS, M.; KLEIN-JUNIOR, L. C.; NIERO, R.; ADRADE, S. F. Antiulcer effects of Achyrocline satureoides (Lam.) DC (Asteraceae) (Marcela) a folk medicine plant in different experimental models. Journal of Ethnopharmacology , v. 130, p. 334-339, 2010.

SANTOS, N. P.; PINTO, A. C.; ALENCASTRO, R. B. Theodoro Peckolt: naturalista e farmacêutico do Brasil Imperial. Química Nova , v. 21, N. 5, p. 666-670, 1998.

SANTOS, N. P. Theodoro Peckolt: a produção científica de um pioneiro da fitoquímica no Brasil. História, Ciências, Saúde – Manguinhos , v. 12, N. 2, p. 515-533, 2005.

SANTOS, A. C. Mecanismos de ação envolvidos nos efeitos da Bardana ( Arctium lappa L.) sobre o trato gastrointestinal. Dissertação de Conclusão de Mestrado. Programa de Pós Graduação em Farmacologia do Departamento de Farmacologia, Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná , 2007.

SATO, S.; IKEDA, H.; FURUKAWA, H.; MURATA, Y.; TOMODA, M. Effects of nutriente solution concentration on inorganic and glycyrrhizin contants of Glycyrrhiza glabra Linn. Yakugaku Zasshi , v. 124, n. 10, p. 705-709, 2004.

SCHMSSMANN, A. Mecanismis of ulcer healing and effects of nonsteroidal anti-inflamtory drugs. American Journal of Medicine , v. 14, n. 3A, p. 43S-51S, 1998.

120

SCHUBERT, M. L.; PEURA, D. A. Control of gastric acid secretion in health and disease. Gastroenterology , v. 134, n. 7, p. 1842-1860, 2008.

SHEEN, E.; TRIADAFILOPOULOS, G. Adverse effescts of long-term próton pump inhibitor therapy. Digestive Diseases and Sciences , v, 56, p. 931-950, 2011.

SHERWOOD, L. Fisiologia humana: Das células aos sistemas. 7 ed. p. 845. São Paulo: Cengage learning, 2011.

SILVA, S. R. S. Estudo químico e avaliação do potencial farmacológico e herbicida de Maytenus imbricata Mart. ex. Reissek . Tese de conclusão de doutorado. Universidade Federal de Minas Gerais, 2007.

SILVA, J. L.; SILVA, R. P.; JORGE, R. M.; SILVA, G. D.; VIEIRA FILHO, S. A.; FONSECA, A. P. N. D.; TAGLIATI, C. A. Avaliação da atividade antiulcerogênica da Maytenus truncata Reiss (Celastraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 15, n. 1, p. 30-35, 2005.

SILVA, L. Á. da; SOARES, J. J. Levantamento fitossociológico em um fragmento de floresta estacional semidecídua, no município de São Carlos, SP. Acta Botanica Brasilica , v.16, n.2, p. 205-216, 2002.

SOWMWONG, P.; SUTTISRI, R.; BUAKEAW, A. A new 1,3-diketofriedelane triterpene from Salacia verrucosa . Fitoterapia , v. 82 , p. 1047–1051, 2011.

SOSA, S.; MORELLI, C. F.; TUBARO, A.; CAIROLI, P.; SPERANZA, G.; MANITTO, P. Anti- inflammatory activity of Maytenus senegalensis root extracts and of maytenoic acid. Phytomedicine , v. 14, n. 2 - 3, p. 109-114, 2007.

SOUSA, G. F.; DUARTE, L. P.; ALCÂNTARA, A. F. C.; SILVA, G. D. F.; VIEIRA-FILHO, S. A.; SILVA, R. R.; OLIVEIRA, D. M.; TAKAHASHI, J. A. New Triterpenes from Maytenus robusta : Structural Elucidation Based on NMR Experimental Data and Theoretical Calculations. Molecules , v. 17, p. 13439-13456, 2012.

SOUSA, G. F. de, Estudo fitoquímico do extrato hexânico e da atividade biológica de constituintes das folhas de Maytenus robusta (Celastraceae) . Dissertação de conclusão de mestrado. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Química, 2012.

SOKAL, R.R.; ROHLF, F.J. Biometry. The principles and practice of statistics in biological research, New York: W. H. Freeman Company, p. 887, 1995.

STRAUSS, R. J.; STEIN, T. A.; MANDELL, C.; WIDE, L. Cimetidine, carbenoxolone sodium, and antacids for the prevention of experimental stress ulcers. Archives of Surgery , v.113, p. 858–862, 1978.

SULEYMAN, H.; ALBAYRAK, A.; BILICI, M.; CADIRCI, E.; HALICI, Z. Different Mechanisms in Formation and Prevention of Indomethacin-induced Gastric Ulcers. Inflammation , v. 33, n. 4, p. 224-234, 2010.

SUNG, J. Current management of peptic ulcer bleeding. Natural Clinical Practice Gastroenterology & Hepatplogy , v. 3, n. 1, p. 24-32, 2006.

VALLADÃO, F. N. Estudo fitoquímico de folhas e polpa de fruto de Maytenus Salicifolia (Celastraceae) e análise quimiotaxonômica em Maytenus sp . Tese de conclusão de doutorado. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Química, 2011. 121

VANE, J. R.; BOTTING, R. M. Anti-inflammatory drugs and their mechanism of action. Inflammation Research , v. 47, p. S78-S87, 1998.

VELLOSA, J. C.; KHALIL, N. M.; FORMENTON, V. A. et al. Antioxidant activity of Maytenus ilicifolia root bark. Fitoterapia , v. 77, n. 3, p. 243-244, 2006.

VENDRUSCOLO, G. S, RATES, S. M. K, MENTZ, L. A. Dados químicos e farmacológicos sobre as plantas utilizadas como medicinais pela comunidade do bairro Ponta Grossa, Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Revista Brasileira Farmacognosia , v. 15, p. 361-372, 2005.

VERPOORTE, R.; CHOI, Y. H.; MUSTAFA, N. R.; KIM, H. K. Metabolomics: back to basics. Phytochemistry , v. 7, p. 525–537, 2008.

VERPOORTE, R.; ALFERMANN, A. W. Metabolic engineering of plant secondary metabolism . Kluwer Academic Publishers, 2000.

VIANI, R. A. G; VIEIRA, A. O. S, Tree flora of the Tibagi river basin (Paraná, Brazil): Celastrales sensu Cronquist, Acta Botanica Brasilica , São Paulo, v. 21,n. 2, 2007.

VIEIRA, S. C. H; SOLON, S; VIEIRA, M. C; ZARATE, N. A. H. Levantamento de fitoterápicos manipulados em farmácias magistrais de Dourados-MS. Revista Brasileira de Farmacognosia , v. 20, n. 1, 2010 .

WALLACE, J. L. Prostaglandins, NSAIDs, and gastric mucosal protection: Why doesn't the stomach digest itself?. Physiological Reviews , v. 88, n. 4, p. 1547-1565, 2008.

WALLACE, J. L.; MILLER, M. J. S. Nitric oxide in mucosal defense: A little goes a long way. Gastroenterology , n. 119, p. 512-520, 2000.

WILLMANN, M.; WACHECK, V.; BUCKLEY, J.; NAGY, K.; THALHAMMER, J.; PASCHKE, R.; TRICHE, T.; JANSEN, B.; SELZER, E. Characterization of NVX-207, a novel betulinic acid-derived anti-cancer compound. European Journal of Clinical Investigation , v. 39, n. 5, p. 384-394, 2009.

WU, J.; ZHOU, Y.; WANG, L.; ZUO, J.; ZHAO, W. Terpenoids from root bark of Celastrus orbiculatus . Phytochemistry , v. 75, p. 159–168, 2012.

YUNES, R. A.; CECHINEL FILHO, V. Breve Análise Histórica da Química de Plantas Medicinais: Sua Importância na Atual Concepção de Fármaco Segundo os Paradigmas Ocidental e Oriental. In: Yunes, R. A.; Calixto, J. B. Plantas Medicinais Sob a Ótica da Química Medicinal Moderna . Chapecó: Argos - Editora Universitária. 523p, 2001.

YUNES, R. A.; PEDROSA, R. C.; CECHINEL-FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Química Nova , v. 24, n. 1, p. 147-152, 2001.

ZANDONAI, R. H.; COELHO,F.; FERREIRA,J.; MENDES,A.K.B.; BIAVATTI,M.W.; NIERO,R.; CECHINEL,V.; BUENO,E.C. Evaluation of the proliferative activity of methanol extracts from six medicinal plants in murine spleen cells. Brazilian Journal Pharmaceutical Sciences , v. 46, n. 2, 2010.

ZUANAZZI, J. A. S.; MAYORGA, P. Fitoprodutos e desenvolvimento econômico. Química Nova , v. 33, n. 6, p. 1421-1428, 2010.