Universidade Federal De Pernambuco Centro De Ciências Biológicas Departamento De Genética

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES Chamaesyce hirta (L.) Millsp., Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp. (EUPHORBIACEAE) E Xylopia frutescens

AUBL. (ANNONACEAE) ATRAVÉS DE FINGERPRITING DE DNA EM FRAGMENTOS DA FLORESTA ATLÂNTICA DE PERNAMBUCO

DIEGO SOTERO DE BARROS PINANGÉ

RECIFE 2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA POPULACIONAL NAS ESPÉCIES

Chamaesyce hirta (L.) Millsp., Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp.

(EUPHORBIACEAE) E Xylopia frutescens Aubl. (ANNONACEAE) ATRAVÉS DE

FINGERPRITING DE DNA EM FRAGMENTOS DA FLORESTA TLÂNTICA DE

PERNAMBUCO.

DIEGO SOTERO DE BARROS PINANGÉ

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade

Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE

Orientador: Profª. Drª. Ana Maria Benko Iseppon

Co-orientador: Prof. Dr. Marccus Vinicius Alves

RECIFE 2009

Pinangé, Diego Sotero de Barros Análise da diversidade genética populacional nas espécies Chamaesyce hirta (L.) Millsp., Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp. (Euphorbiaceae) Xylopia frutescens Aubl. (Annonaceae) através de Fingerpriting de DNA em fragmentos da Floresta Atlântica de Pernambuco / Diego Sotero de Barros Pinangé. – Recife: O Autor, 2009.

91 f., il., fig., tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Genética, 2009.

Inclui bibliografia e apêndice

1. Genética de populações 2. Fingerprinting de DNA 3. Floresta Atlântica I Título.

575.17 CDU (2.ed.) UFPE 576.58 CDD (22.ed.) CCB – 2009- 121

SUMÁRIO Página

Lista de Tabelas...... i

Lista de Figuras...... ii

Lista de Abreviações...... iii

Resumo...... 1

1. Introdução Geral...... 2

2. Revisão da literatura...... 4

2.1. Mata Atlântica...... 4

2.1.1. Distribuição e Ocorrência...... 5

2.1.2. Fragmentação...... 6

2.1.3. Fragmentos Urbanos e Peri-urbanos...... 8

2.2. A Família Euphorbiaceae e o Gênero Chamaesyce...... 10

2.2.1. Biologia e Estudos Ecológicos...... 12

2.3. A Família Annonaceae e o Gênero Xylopia...... 13 2.3.1. Biologia e Estudos Ecológicos...... 15

2.4. Análises Genéticas em Populações Vegetais...... 17

2.5. Marcadores Moleculares...... 20

2.5.1. Marcador DAF...... 22

2.5.2. Marcador ISSR...... 23

2.6. Análise de Diversidade e Parentesco...... 24

3. Referências Bibliográficas...... 27

4. Manuscrito de Artigo Científico...... 39

5. Manuscrito de Artigo Científico...... 58

6. Conclusões...... 85 7. Abstract...... 86

8. Apêndice...... 87

A minha Vó Iracema, núcleo e força propulsora da alegria do Clã Sotero.

Dedico. Agradecimentos

Primeiramente, gostaria de iniciar agradecendo a minha mãe Nilde Maria de Sotero Caio e minhas irmãs Daniella Sotero de Barros Pinangé e Dayse Rosângela Sotero Pinangé, pelo constante e inapelável apoio durante todo o processo aqui realizado, uma vez que sem elas esse caminho ficaria ainda mais árduo. Gostaria de agradecer ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão do auxílio financeiro, essencial na realização do trabalho em pauta. Ao Horto de Dois Irmãos e a Usina de São José por permitirem o acesso às áreas de coleta, Reserva Ecológica de Dois Irmãos e os fragmentos de Mata (Zambana, Pezinho e Piedade) respectivamente, sendo indispensáveis na consolidação desta pesquisa. À Prefeitura da Cidade do Recife por ter disponibilizado a Guarda da Brigada Municipal para nos acompanhar nas coletas dos fragmentos urbanos da região metropolitana do Recife, em especial na Ilha do Bananal, ponto de coleta fundamental neste trabalho. À minha orientadora Ana Maria Benko Iseppon, por mais uma vez ter acreditado em mim, disponibilizando a continuidade de meu processo acadêmico. Agradeço pela paciência, pelos ensinamentos, sempre disposta a me ajudar tanto no meu crescimento profissional quanto pessoal, deixando-me orgulhoso em participar de um grupo tão importante. Neste caso tornou-se uma amiga singular e por isso serei eternamente grato. Ao meu co-orientador Marccus Vinicius Alves, fundamental na indicação dos materiais a serem estudados, pelos ensinamentos em campo, pela paciência e conselhos prestados desde o início de sua colaboração. Adicionalmente, gostaria de ressaltar seu importante apoio na reta final da minha dissertação, bem como os conselhos dados para planos futuros. Aos membros do MTV (Morfo-Taxonomia Vegetal) Anderson Alves, Bruno Amorim e Catarina Pinheiro pela ajuda e ensinamentos nas coletas realizadas ao longo do trabalho. Aos membros da Banca Ariadna Lopes, Valdir Balbino e Rodrigo Torres pelas fundamentais sugestões, auxiliando no enriquecimento das abordagens do presente trabalho. Em especial gostaria de agradecer ao Profº Rodrigo pela intensa ajuda e colaboração durante a realização das análises do presente trabalho. À Professora Ana Christina Brasileiro Vidal pelas colaborações, ensinamentos, e conselhos, sempre se mostrando harmoniosa em suas colocações. Gostaria de registrar a importância da minha noiva Nara Diniz Soares Pessoa, pois de início, de uma amiga de turma do Mestrado 2007, logo me mostrou um belo caminho de companheirismo, cumplicidade, amor e paz imprescindíveis, tornando-me um homem muito feliz em tê-la ao meu lado. De fato, esteve presente na alegria e na tristeza. Gostaria ainda de agradecer a sua filha Laís Diniz por ter-me apresentado a amizade mais pura que pude receber. Aqui registro meus sinceros agradecimentos a elas. A todos os meus familiares representados na figura da minha Vó e matriarca do clã Sotero – Dona Iracema Sotero (Don Soterone!), pelo carinho, atenção amor, torcida e fé, tornando-me muito felicitado em estar rodeado de pessoas tão boas. Em especial gostaria de agradecer aos primos-irmãos Rafael Sotero e Rodrigo Sotero, pois desde o início de minha caminhada acompanharam-me com a mais genuína força e carinho. Aos irmãos Geyner Cruz e Diego Pontes por todos os momentos de companheirismo, dedicação, amizade, auxílio e aprendizado, sendo mais do que importantes na construção desta caminhada, a eles um muito obrigado! Á Helena Macedo e Islene Araújo, pela amizade e por serem importantes na vida dos irmãos supracitados. A Mário Correia, por ter participação ímpar nos ensinamentos laboratoriais que culminaram no meu crescimento profissional, sendo possível a concretização dos projetos propostos no início dessa caminhada, e pela incansável amizade, agradeço. Ainda neste parágrafo gostaria de agradecer a Heidi Lacerda pela amizade, auxílio, apoio e incentivo prestados desde os tempos da graduação, mostrando uma infinita capacidade de fazer o bem. A Amaro de Castro e Ebenézer Bernardes, inicialmente colegas de laboratório, mas que tão logo tornaram-se amigos/tutores, por toda a atenção, amizade e apoio prestados desde o início da minha participação no grupo LGBV. Fico grato pela participação ímpar deles na minha vida acadêmica e pessoal. Aos colegas do Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal: Kyria Bortoleti, Hayana Azevedo, Luciene Silva, Isaac Cansansão, Alberto Vinícius, Giovane Feitosa, Bruno Leite, Rafaela Oliveira, Rodrigo Oliveira, Lidiane Amorim, Nina Mota, Ana Carolina, Jaílson Gitaí, Luis Belarmino, Agatha Silva, Derovil Santos, Claudete Marques, Vanessa Souza e Valéria Fernandes pelos momentos importantes gerados na interação laboratorial, gerando ensinamentos mútuos em diversas esferas. Em especial a Santelmo Vasconcelos e Karla Barbosa pela amizade, incentivos, apoio e carinho construídos. À turma do Mestrado 2007 pelo ótimo relacionamento gerado durante o período das aulas, em especial a Petra Barros, Gabriela Souto, Felipe Alecrim e Will Barros pelo estreitamento gerado decorrente das afinidades durante as infindáveis leituras de artigos e preparações de seminários, além claro, dos momentos de descontração. Ao Departamento de Genética e a Pós-Graduação pela disponibilidade de todos os recursos diretos e indiretos necessários para concretização do meu trabalho.

LISTA DE TABELAS

1º Manuscrito

Página Tabela 1. Indivíduos utilizados na seleção de primers com as respectivas descrições das áreas de coleta...... 51 Tabela 2. Desenho experimental da aplicação dos primers selecionados, número de indivíduos analisados por população e descrição dos locais de coleta...... 51 Tabela 3. Relação dos primers utilizados no processo de seleção...... 52 Tabela 4. Primers mais informativos selecionados usados em DAF...... 53 Tabela 5. Análise da estrutura genética das espécies de Chamaesyce...... 53

2º Manuscrito

Página

Tabela 1. Populações e indivíduos utilizados na análise de diversidade e populacional...... 76 Tabela 2. Seleção de primers DAF...... 76 Tabela 3. Relação dos primers utilizados no processo de seleção do DAF...... 77 Tabela 4. Relação dos primers utilizados para ISSR...... 78 Tabela 5. Análise da estrutura genética das populações de Xylopia frutescens...... 79

LISTA DE FIGURAS

Revisão da Literatura

Página Figura 1. Mapa da distribuição da Mata Atlântica...... 5 Figura 2. Posicionamento filotaxonômico da família Euphorbiaceae...... 10 Figura 3. Posicionamento filotaxonômico da família Annonaceae...... 13

1º Manuscrito

Página

Figura 1. Imagem de satélite dos fragmentos urbanos analisados...... 54 Figura 2. Fragmentos amplificados a partir da reação de DAF do primer P15-1...... 55 Figura 3. Dendrograma gerado a partir da análise de dados da reação de DAF...... 56

2º Manuscrito Página

Figura 1. Imagem de satélite dos fragmentos urbanos e peri-urbanos analisados...... 80 Figura 2. Análise de similaridade em Xylopia frutescens. Dendrograma gerado a partir da análise de dados da reação de DAF...... 81 Figura 3. Análise de similaridade em Xylopia frutescens. Dendrograma gerado a partir da análise de dados da reação de ISSR...... 82 Figura 4. Análise de similaridade em Xylopia frutescens. Dendrograma gerado a partir da análise dos dados agrupados de DAF e ISSR...... 83

LISTA DE ABREVIATURAS

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism AMOVA Analysis of Molecular Variance BVDV Bovine Viral Diarrhea Virus BSA Bulked Segregant Analysis CTAB Cetyl-trimethyl-amoniumbromide DAF DNA Amplification Fingerprinting Dg Divergência genética DNA Deoxyribonucleic Acid, Ácido Desoxirribonucleico DNAr Ácido desoxirribonucleico ribossomal dNTP Dinucleotídeo Trifosfato ha. Hectare Ind/ha Indivíduos/hectare ISSR Internal Simple Sequence Repeat ITS Internal Transcribed Spacer Km2 Quilômetro quadrado m2 Metro quadrado MEGA Molecular Evolutionary Genetic Analysis mM Mili Molar µL Microlitro µM Micromolar ng Nanogramas NJ Neighbor-Joining pb Pares de Bases PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RMR Região Metropolitana do Recife SSR Simple Sequence Repeat STMS Sequence Tagged Microsatellite Site Taq Thermophylus aquaticus UFPE Universidade Federal de Pernambuco

iii

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

RESUMO

Devido à ocupação humana e consequente fragmentação, a floresta Atlântica nordestina constitui- se em um cenário de extinção local e global de espécies nativas, especialmente quando considerada a riqueza em endemismos regionais. Os gêneros Chamaesyce (Euphorbiaceae) e Xylopia (Annonaceae) destacam-se por incluir espécies pioneiras e bioindicadoras importantes no processo de regeneração de mata. No presente estudo foram analisadas duas populações da região metropolitana do Recife de duas espécies herbáceas Chamaesyce hirta (L.) Millsp. e C. thymifolia (L.) Millsp., totalizando 30 indivíduos estudados (15 de cada espécie). Para a espécie lenhosa Xylopia frutescens Aubl., 24 indivíduos de quatro populações de fragmentos de Floresta Atlântica nos municípios de Recife e Igarassu (Açude do Prata - Apr, Zambana – Zam, Pezinho – Pez e Piedade – Pie) foram estudadas. O fragmento Apr é caracterizado por uma clareira de mata sob intensa influência antrópica ao passo que os fragmentos da Usina de São José (USJ – Igarassu) são caracterizados pelo domínio de tabuleiros e terras planas sob intenso cultivo de cana-de-açúcar. Foram utilizados marcadores DAF (Impressão Genômica do DNA Amplificado) e ISSR (Sequências Simples Internas Repetidas), sendo este último tipo aplicado somente em X. frutescens. A construção dos fenogramas foi realizada pelo método de neighbor-joining (bootstrap de 1000 replicações), sendo os cálculos de diversidade genética e fluxo gênico (Nm) . Nas espécies herbáceas, 10 primers foram aplicados nos 30 indivíduos revelando 258 loci polimórficos. O fenograma gerado nas duas espécies herbáceas apresentou dois grupos principais, sendo os indivíduos separados coerentemente em níveis específicos, no entanto C. thymifolia mostrou uma maior tendência a separação entre as populações do que C. hirta. Isso foi corroborado a partir das análises de Gst (diversidade genética) e Nm (número de migrantes), tendo em C. hirta, o valor de 0.1815 e 2.2547, respectivamente, apontando uma não-estruturação, ao passo que em C. thymifolia os valores foram de 0.2977 e 1.1777, respectivamente, indicando uma estruturação entre as populações. Esses dados podem estar relacionados às distinções ecológicas de cada espécie. Por sua vez, em X. frutescens 10 primers do tipo DAF geraram 261 loci polimórficos. Os cinco primers de ISSR resultaram em 126 loci. Os Dg globais e próprios apontaram Apr como a população de maior variabilidade enquanto que as populações de Pezinho (ISSR) e Zambana (DAF) mostraram menores índices de variabilidade Os fenogramas gerados apontaram para uma maior separação dos indivíduos de Apr e uma maior miscigenação dos indivíduos de Igarassu. Os valores de Gst e Nm foram coerentes com os dados fenéticos, pois apontaram nas três formas de análises (DAF, ISSR e DAF+ISSR) uma maior tendência a estruturação da população Apr e um maior indício de conectividade entre os fragmentos de Igarassu, apesar de serem observados, também, indícios de estruturação nesta última. Os valores globais de Gst apontam uma tendência a estruturação das quatro populações. No entanto, os valores do número de migrantes (Nm) acima de 1 sugerem que a fragmentação da Floresta Atlântica deu-se antes do processo de colonização (500 anos), no período do Quaternário, a partir das expansões e retrações da mata e da coluna d’água. Apesar da tendência de separação, os indivíduos ainda mantêm uma conectividade histórica. As inclusões de um maior número de variáveis aos dados aqui apresentados como aspectos fenológicos contribuiriam ainda mais no entendimento da estrutura e dinâmica de populações dessas espécies.

Palavras-chave: Floresta Atlântica, fingerprinting de DNA, Fluxo Gênico, Chamaesyce, Xylopia.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

1. INTRODUÇÃO

O processo de fragmentação e destruição das florestas tropicais tem despertado o interesse não só da comunidade científica, mas da população como um todo, pois se trata de um fenômeno mundial com elevada importância. Ao longo do tempo, de acordo com o avanço das pesquisas, o homem tenta estabelecer um equilíbrio entre o desenvolvimento humano e essa conservação, o desenvolvimento sustentável (MMA, 2000). A floresta Atlântica nordestina é o “cenário” da extinção local, regional e global de espécies, pois se trata de um centro de endemismos. Infelizmente, outros ecossistemas brasileiros apresentam altos níveis de fragmentação de habitats, onde a caça, a extração seletiva de madeira e os incêndios florestais ocorrem de forma associada. Não é por acaso que atualmente, pelo menos 510 espécies de plantas, aves, mamíferos, répteis e anfíbios registrados na floresta Atlântica brasileira estão oficialmente ameaçadas de extinção no bioma, no Brasil ou no planeta (MMA, 2000; Tabarelli et al., 2002). Muitos desses fragmentos hoje estão localizados em centro urbanos, onde a interação com o homem é constante. Trata-se de fragmentos muito importantes para o conforto ambiental urbano, ao lado de outros espaços livres que incluem além de florestas, jardins, parques, áreas cultivadas, entre outros, possuem funções essenciais na área urbana, contribuindo para o equilíbrio do clima local. Estas “ilhas verdes” auxiliam na prevenção de inundações e deslizamentos, neutralizam ruídos, poeira e mau-cheiro, reduzindo a poluição com ozônio. Grande parte dos trabalhos produzidos para a caracterização da vegetação das florestas tropicais brasileiras consiste de levantamentos florísticos e fitossociológicos (van den Berg & Oliveira-Filho, 2000). Entende-se que os estudos de estrutura populacional sejam um primeiro passo no sentido de compreensão de quais fatores são responsáveis pela variação dos processos populacionais, da regeneração e de perturbações em um determinado local. A estrutura populacional de uma espécie de planta é um parâmetro da forma como uma espécie está explorando um ambiente e respondendo às condições ambientais (Oliveira et al. 1989). Segundo Hamrick (1983), do ponto de vista da conservação genética, a perda de uma parte da população subdividida em estrutura de famílias pode ser tão crítica quanto à perda de uma população inteira. Isso porque a variabilidade genética dentro das populações 2

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

é, principalmente, garantida pela variabilidade genética existente entre subpopulações. Assim, a estrutura genética das populações envolve os níveis de variabilidade genética e sua distribuição entre e dentro das populações, sendo este conhecimento muito importante por permitir a adoção de estratégias de manejo mais adequadas para a conservação genética e também na exploração desta variabilidade em melhoramento vegetal (Kageyama, 1987; Dias & Kageyama, 1991). No âmbito dos marcadores moleculares, a metodologia DAF (DNA Amplification Finferpriting) foi utilizada para avaliar a variabilidade genética em populações de Ricinus communis L. e revelou um elevado número de polimorfismo confirmando a variabilidade de populações subespontâneas, demonstrando a eficiência deste tipo de marcador (Oliveira, 2004). Outro marcador utilizado para testar variabilidade vegetal é o ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Suas sequências-alvo são abundantes ao longo do genoma de eucariontes e evoluem rapidamente (Fang & Roose, 1997; Esselman et al., 1999). Esses marcadores têm sido utilizados em diversos estudos para análise de variabilidade entre linhas híbridas de cultivares, híbridos naturais e variabilidade genética de populações. (Wolfe & Randle 2001; Souza et al., 2005; Woods et al., 2005; Slotta & Potter, 2006) O presente estudo objetivou analisar, através das inferências citadas, a diversidade genética e estrutura populacional de indivíduos das espécies Chamaesyce hirta (L.) Millsp. e C. thymifolia (L.) Millsp. (Euphorbiaceae), bem como indivíduos de Xylopia frutescens Aubl. (Annonaceae) indicadoras de ambientes antropomórficos de áreas remanescentes de Mata Atlântica urbana e periurbana na Região Metropolitana do Recife (RMR) e Igarassu.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Mata Atlântica

No Brasil há duas grandes regiões florestais: a Amazônia e a Mata Atlântica. Uma diferença primordial entre essas regiões se dá quanto à localização, uma vez que a Amazônia ocupa predominantemente a faixa equatorial, sendo sua variação, portanto, mais longitudinal que latitudinal, enquanto a Mata Atlântica ocupa uma ampla faixa latitudinal (1.200.000 km2), com uma reduzida variação longitudinal (Neto & Tabarelli, 2002). Agregada a variação latitudinal, a floresta Atlântica apresenta uma considerável variação altitudinal (>1200 m de altitude), decorrente da intensa atividade neotectônica na região durante o Cenozóico (Neto & Tabarelli, 2002). Por conta de usos anteriores, grande parte da paisagem dos remanescentes florestais brasileiros e, em particular da Mata Atlântica, é formada por paleoterritórios que evidenciam, no presente, os efeitos cumulativos de atividades humanas em diferentes épocas. A identificação e a investigação de paleoterritórios nos espaços florestados representa, portanto, importante ferramenta para a interpretação sobre a composição, estrutura e funcionalidade dos ecossistemas (Oliveira, 2007).Em relação à composição dos ecossistemas florestais, considera-se que os processos históricos de ocupação do território da Mata Atlântica tenham alterado severamente os padrões de diversidade deste bioma. Assim, áreas abandonadas e anteriormente submetidas à tradicional prática de agricultura de subsistência mostram, de uma maneira geral, uma redução no número de espécies de porte arbóreoarbustivo e uma predominância de espécies pioneiras e secundárias, em detrimento das climáxicas (Oliveira, 2007).. A idéia de área da Mata Atlântica tem se transformado através dos tempos, tendendo cada vez mais à sua expansão, uma vez que são compreendidas as características fitofisionômicas da mesma, bem como seus componentes naturais intrínsecos. Portanto, dependendo do ponto de vista de cada pesquisador, a Mata Atlântica possui níveis de distribuição e ocorrência distintas (Conselho Nacional da Reserva da Biosfera da Mata Atlântica, 1996). A Floresta Tropical Atlântica é um dos 34 hotspots mundiais, sendo uma área prioritária para conservação. Estas áreas, que são compostas por um mosaico de 4

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... biodiversidade, abrigam mais de 60% de todas espécies terrestres do planeta (Conservation International do Brasil, 2005). Os climas variam de regimes sub-úmidos com estações secas, no Nordeste, até ambientes de pluviosidade extrema, em alguns locais da Serra do Mar (Câmara, 2005). A história da Floresta Atlântica indica que esta cobria uma extensão de aproximadamente 1.400.000 km², onde mais de 75% de sua área eram formadas por florestas, com enclaves de campo rupestres, caatingas, matas secas xeromórficas e cerrados, assim como mangues e restingas (Silva & Casteleti, 2005). Algumas áreas de endemismo, como Pernambuco, agora possuem menos de 5% de sua floresta original (Galindo-Leal & Câmara, 2003).. Antes cobrindo áreas enormes, as florestas remanescentes foram reduzidas a vários agrupamentos de fragmentos florestais muito pequenos, bastante separados entre si (Gascon et al., 2000). As matas do nordeste já estavam em grande parte devastadas (criação de gado e exploração de madeira mandada para a Europa) no século XVI (Coimbra-Filho & Câmara, 1996). O domínio de Floresta Atlântica é considerado uma das unidades biogeográficas mais singulares da América do Sul, por conta de sua conformação e interação fisionômica com outros tipos de vegetações, sendo uma região destacadamente heterogênea. A composição e diversidade da fauna e flora deste ecossistema também foram moduladas pela história geológica e climática da região como um todo (Galindo-Leal et al., 2005). Em função disto, a biota da Mata Atlântica é composta não só apenas por elementos muitos antigos, que se diferenciaram há pelo menos 3 milhões de anos, durante o Plioceno, mas também por elementos que colonizaram a região mais recentemente, durante a transição do Pleistoceno- Holoceno, há cerca de 10 mil a 20 mil anos (Hacckett e Lehn, 1997). __ Nas última três décadas, a perda e a fragmentação de habitats alteraram seriamente a maior parte da Floresta Atlântica, levando a extinção local de muitas espécies. Ainda assim o bioma provou ser bastante resiliente, como comprovam a recuperação de algumas áreas e a contínua descoberta de novas espécies (Pinto & Brito, 2005).

2.1.1. Distribuição e Ocorrência

Alguns autores usam a designação Mata Atlântica restringindo-a às florestas densas que ocorrem ou ocorriam ao longo da costa, do Nordeste ao Rio Grande do Sul. Todavia, outros optam por incluir também as formações florestais mais interioranas, de caráter 5

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... caducifólio ou semicaducifólio existentes, em sua maior parte, nas Regiões Sudeste e Sul, bem como as florestas mistas de pinheiros e lauráceas que se encontram na sua quase totalidade nos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Conselho Nacional da Reserva da Biosfera da Mata Atlântica, 1996). A Floresta Atlântica pode penetrar no bioma Cerrado, localizado no Brasil central, através de cursos de água (Oliveira-Filho & Ratter, 2000) e no bioma Caatinga, no topo de serras e planaltos do semi-árido nordestino (Tavares et al., 2000). A Mata Atlântica se estende ao longo da costa, de 07° S a 23° S, sendo composta por um mosaico de distintas fisionomias e floras ambientalmente diversas, apresentando um número estimado de 20.000 espécies de plantas (Silva & Andrade, 2005). Fundamentado no critério de endemismo específico e grau de degradação, a citada floresta foi identificada como um dos pontos mais críticos para prioridades de conservação por Myers et al.

(2000), corroborando a afirmação anterior. Figura 01. Mapa da distribuição da Mata Atlântica. Fonte: SOS Mata Atlântica 2.1.2. Fragmentação

A fragmentação de matas decorre da perda de hábitat tratando-se ambos de processos intimamente relacionados (Laurance & Bierregaard, 1997). Pode ser conceituado, ainda, sob ponto de vista da conservação biológica, como sendo a separação ou desligamento não natural de áreas com diferentes tamanhos, forma, grau de isolamento, tipos de vizinhança e histórico de perturbações, comprometendo a composição da biodiversidade (Korman, 2003). De acordo com Brooker et al. (1999) a fragmentação compromete os processos de dispersão dos organismos entre os remanescentes da vegetação uma vez que várias das espécies da fauna, relacionadas com os processos de polinização e dispersão, têm sua migração dificultada entre os fragmentos. Assim sendo, as populações vegetais que

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... dependem desses vetores são afetadas. Essas afirmações corroboram Foré et al. (1992) que constataram que modificações nos padrões de dispersão de sementes e pólen podem promover alterações na estrutura e na diversidade genética. Há três efeitos principais da fragmentação sobre as espécies: (i) redução do número total de indivíduos; (ii) redução do tamanho populacional médio, pois restringe indivíduos em pequenos fragmentos e (iii) isolamento espacial de populações remanescentes (Brandão, 2008 apud Young & Boyle, 2000) Um dos efeitos mais evidentes, oriundos deste processo, refere-se ao aumento da relação perímetro/superfície das florestas e ao aumento da permeabilidade às condições impostas pelo ecossistema periférico, fator conhecido como “efeito de borda” (Fleury, 2003 apud Turner, 1996; Hill & Curran, 2001; Estrada & Coates-Estrada, 2002; Honnay et al., 2002). Grande parte dos sistemas fragmentados não consegue sustentar a mesma composição biológica do respectivo ambiente original, justamente em decorrência do “efeito de borda”. A transição é muito abrupta, criando uma borda que expõe a floresta às condições encontradas na matriz adjacente. A porção externa desta mata adjacente à borda se torna parte da zona de transição, gerando mudanças micro-climáticas, como a instabilidade na temperatura e a perda de umidade, provocando profundas alterações estruturais (Fleury, 2003). Essas alterações resultam na formação de um micro-hábitat antrópico, distinto dos florestais, com uma composição biológica diferenciada (Lovejoy et al., 1986; Laurance, 1991; Saunders et al., 1991; Brown & Hutchings, 1997; Restrepo & Gómez, 1998; Restrepo et al., 1999). Em longo prazo, estas modificações podem perturbar drasticamente os processos ecológicos como polinização, predação, comportamento territorial e hábitos alimentares das espécies, fatores relacionados à perda da diversidade biológica, acarretando, em casos extremos, na completa eliminação da fauna (Terborgh, 1988; Brown & Heske, 1990; Redford, 1992). Todavia, vale salientar que alguns autores observaram que em determinadas situações e registros experimentais, o processo de fragmentação não levou ao aumento da divergência entre as populações, nem alterou o fluxo gênico entre os fragmentos (Young et al. 1993; Sun, 1996; González-Astorga & Núñes-Fárfan, 2001; Dick et al. 2003). Desta forma, direcionar destino de espécies em fragmentos florestais incluindo a adequação de programas de manejo, faz-se necessário avaliar os efeitos da fragmentação e entender a 7

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... dinâmica das populações, bem como seu estreitamento com os elementos da paisagem (Brandão, 2008).

2.1.3. Fragmentos Urbanos e Periurbanos

Os fragmentos urbanos exibem recursos mais limitados e com uma forte influência externa. As atividades antropogênicas vêm aumentando a disrupção das barreiras biogeográficas, resultando na disseminação e estabelecimento de espécies além de seus registros naturais de ocorrência. Por conta disso, consequências acerca da composição, estrutura e funções das comunidades ecológicas são observadas (Vitousek et al., 1997; Mack et al., 2000; Lockwood, 2004; Hobbs & Mooney, 2005; McNeely, 2005). Tabarelli et al. (1999) analisaram os efeitos da fragmentação na composição de lenhosas no estado de São Paulo, estudo que levou em consideração também a viabilidade a longo prazo da manutenção desses fragmentos remanescentes de Mata Atlântica. Para tal análise foram escolhidos cinco fragmentos circunvizinhos ao Rio Tietê (São Paulo, capital), verificando-se um decréscimo na diversidade biológica destes fragmentos, com predominância de espécies ruderais (bioindicadoras). As mudanças ecológicas (síndromes de polinização e dispersão de sementes, etc.) favoreceram este perfil tipicamente apresentado em fragmentos sob forte pressão negativa, uma vez que afetavam também as interações secundárias e terciárias. Santana et al. (2005) estudaram fragmentos residuais urbanos e periurbanos na cidade do Rio de Janeiro, verificando que maiores restrições estão associadas preferencialmente aos espaços onde a malha urbana avançou de forma mais efetiva. Constatou-se ainda que os moradores das propriedades lindeiras utilizavam-se de madeira do fragmento estudado, dando preferência às espécies com madeira resistente para a confecção de cercas e construções rústicas, causando, portanto, uma forte pressão antrópica sobre tais fragmentos. Khün & Klotz (2006) compararam floras em áreas urbanas e rurais na Alemanha, focando a correlação urbana espacial juntamente com a homogeneização taxonômica das floras locais em escala regional, a partir da comparação dos níveis de urbanização observados com a composição vegetacional existente. Os autores observaram que embora a homogeneização biótica seja frequentemente estimada como única consequência das

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... invasões biológicas, o processo de urbanização também tem relevante papel neste âmbito, atuando de forma conjunta na diferenciação das espécies existentes. Em um estudo similar, Stadler et al. (2000) avaliaram espécies nativas e invasoras no sudeste do Quênia. Os resultados encontrados foram similares aos encontrados na Europa no que diz respeito ao crescimento de espécies invasoras em áreas de elevada diversidade. Entretanto, os mesmos, ressaltaram que o processo de urbanização no Quênia é bem mais recente quando comparado àquele ocorrido na Europa, denotando que numa escala curta de tempo, espécies invasoras puderam ser mapeadas em zonas biogeográficas de espécies nativas, estando esses fatores diretamente relacionado às atividades humanas. La Sorte et al. (2007) analisando o impacto da ação antropogênica na β-diversidade entre representantes vegetais nativos (Archeófitos e Neófitos) predominantes em 22 áreas urbanas européias, constataram que 52% das espécies analisadas em tais locais são invasoras. Estes resultados indicaram que tais espécies possuem um papel fundamental na diversidade de plantas vasculares, pertencentes à flora urbana européia. Deste modo os autores concluíram que com o crescimento da extensão das áreas urbanas a consequente influência destas espécies deve permanecer como um importante indicador dos impactos da interferência humana na diversidade biológica. Atualmente há um elevado número de fragmentos de Mata Atlântica urbana, com os quais as populações humanas interagem, fazendo uso dos recursos disponíveis. Tal situação ocorre no estado de Pernambuco, onde existem inúmeras comunidades situadas na Região Metropolitana do Recife (RMR), Zona do Litoral e Mata de Pernambuco (próximas a Unidades de Conservação). No Município de Igarassu localizam-se as comunidades de Engenho Piedade, Engenho D’água e Maria Feia, todas adjacentes à Reserva Ecológica da Mata da Usina São José (07º50’S, 35º00’W Gr.), incluindo vilas rurais e sítios pequenos, situados próximos à Usina São José, onde habitam famílias que trabalham na produção canavieira, no campo e na indústria. A Mata da Usina São José, localizada junto a tais comunidades, ocupa uma área de 323,3 ha. sendo considerada um remanescente de Mata Atlântica. Em 1987 foi enquadrada na categoria de Reserva Ecológica da Mata da Usina São José, através da Lei Estadual nº. 9989, de 1987, que reconhece como Reservas Ecológicas as matas de preservação permanente da RMR e dispõe sobre os procedimentos básicos relativos à sua preservação (Silva & Andrade, 2005).

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

2.2. A Família Euphorbiaceae e o Gênero Chamaesyce Gray

A família Euphorbiaceae é representada por 222 gêneros e cerca de 5.970 espécies, podendo se apresentar como arbóreas, arbustivas, subarbustivas e ervas. Insere-se na ordem Malpighiales, pertencente ao grupamentoEudicota, classe Rosidae, subclasse Eurosidae I, que inclui 39 famílias, 716 gêneros e 15935 espécies (APG, 2003). A divergência deste grupo ocorreu provavelmente em algum momento do Cretáceo tardio (www.mobot.org). Esta diversificação parece ter sido rápida, entretanto sugerem-se datas discrepantes com grupos correlatos (grupos herbáceos de muitas famílias) evidentes antes do início do Terciário. As euforbiáceas mais conhecidas são a seringueira (Hevea brasiliensis (Willd. ex A.Juss.) Müll. Arg.) e a mamona (Ricinus communis L.). Entre suas características temos a presença de substâncias latescentes, visíveis quando a planta é submetida às injúrias mecânicas. Muitos gêneros, pela nova classificação filogenética, encontram-se classificados em outras famílias ou formaram novas famílias, exemplo com as Phyllantaceae (APG II, 2003). O gênero Chamaesyce pertence às euforbiáceas, incluindo ervas monóicas, perenes, anuais ou de ciclo de vida curto, podendo ser de hábito ereto, subereto, ascendente ou prostrados (Chen & Wu, 2004). Sob o aspecto morfológico, os representantes deste gênero apresentam a porção caulinar com algumas diferenças em virtude do hábito. Observa-se uma conformação geral circular, ligeiramente oblonga (Remus, 1979). Estípulas são em geral triangulares, dentadas e com margens ciliadas. Folhas opostas, sem glândulas, cartáceas glabras ou raramente com pêlos longos e esparsos; margem serreada, na porção apical da folha; lâminas geralmente verdes, algumas vezes com pontos roxos nas superfícies, C. hypericifolia (L.) Millsp. De oblonga a elíptica ou de oblonga a oblanceolato, obliquamente truncados na base (Chen & Wu, 2004). Apresenta um tipo de inflorescência altamente especializada, chamada de ciátio, onde se observa um pequeno invólucro composto na periferia de quatro glândulas nectaríferas, cada uma contendo um apêndice petalóide. O Fruto caracteriza-se por ser capsulado (Wagner et al., 1999).

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Figura 02. Posicionamento filotaxonômico da família Euphorbiaceae. Fonte: APG II, 2003.

O Gênero Chamaesyce apresenta uma distribuição cosmopolita, sendo mais bem representado no Novo Mundo (ca. 80% das espécies). Chen & Wu (2004) afirmam que as espécies distribuem-se através do sudeste dos Estados Unidos, México, América Central, oeste Indiano e América do Sul. Segundo Gordillo et al. (2002), em um estudo sobre os gêneros de Euphorbiaceae do México, existem 50 gêneros e 826 espécies, onde destas 55,52% são endêmicas, consolidando assim a referida família como a sexta em importância nacional e a quarta em nível de endemismo. A subfamília com o maior número de caracteres apomórficos é Euphorbioideae. Os gêneros desta apresentam 63,04% de endemismo. Euphorbia L.e Chamaesyce destacam-se como grupos mais diversos com 1000 e 250 espécies respectivamente, todas com ampla distribuição nos neotrópicos. Existem 22 espécies de Chamaesyce nas ilhas havaianas, sendo 15 delas endêmicas ao arquipélago e sete introduzidas, subespontâneas. As espécies endêmicas são subarbustivas a 11

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... arbóreas e supostamente derivadas de um único ancestral C. fosbergii J. Flo., oriundo do pacífico (Mothley & Lauren, 2004).

2.2.1. Biologia e Estudos Ecológicos

Leite & Andrade (2003) consolidaram um importante estudo temporal (50 anos) sobre as modificações da vegetação de dunas relacionadas à crescente pressão antrópica. A amostragem da análise em questão foi comparada a estudos anteriores realizados no mesmo local. Foram encontradas 47 espécies, onde dez foram halófitas, 34 ruderais e três cultivadas. Leguminosae, Poaceae e Euphorbiaceae se destacaram no levantamento, onde nesta última a espécie C. thymifolia foi amostrada nas duas épocas e classificada como ruderal. Uma das conclusões de merecido destaque desta averiguação referiu-se à alteração significativa na composição florística entre os dois períodos estudados. Kita & Souza (2003) realizaram um levantamento florístico e fitofisionômico na Lagoa Figueira (Paraná - PR), identificando três famílias mais representativas: Poaceae, Cyperaceae e Euphorbiaceae. O porte predominante incluiu espécies herbáceas (79,78% das espécies) com prevalência de espécies terrestres (50,56%) sobre as aquáticas (37,08%). Houve predominância de herbáceas na composição da fitofisionomia, apresentando diferenciações entre as margens e ao longo da lagoa, havendo uma considerável diminuição da cobertura vegetal no período de cheias. Erasmo et al. (2004) realizaram um levantamento fitossociológico para identificar as principais plantas daninhas existentes em áreas de produção de arroz irrigado sob diferentes sistemas de manejo, onde diferentes variáveis (área sem rotação de cultura com mais de cinco anos, área com rotação de cultura arroz/soja e arroz/melancia) foram levadas em consideração para notificação dos grupos de ervas daninhas predominantes. As espécies C. prostata (Alton) Small. e C. thymifolia destacaram-se somente nas áreas de rotação de cultura arroz/melancia, denotando assim uma particularidade quanto ao processo adaptativo. Silva et al. (2005) determinaram o estado da conservação de 104 espécies de uso tradicional no Peru, levando em consideração a distribuição geográfica, abundância, extrativismo, endemismo e confinamento em unidades de conservação, concluindo que

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... haviam 22 espécies endêmicas no Peru, incluindo C. hirta L. com baixo grau de extrativismo, atividade agropecuária moderada, sendo comum e abundante. No que tange à biologia reprodutiva, Ehrenfeld (1979) efetuou observações sobre os agentes polinizadores de espécies de Chamaesyce, relatando que estes vegetais são polinizados predominantemente por abelhas, mas também por moscas, formigas e vespas. Por sua vez as cápsulas de sementes de muitas Euforbiáceas são autocóricas, ou seja, possuem conformações explosivamente deiscentes, ejetando as sementes numa distância próxima, embora algumas sementes sejam dispersadas por formigas (Pemberton, 1988). Taura et al. (2007) realizaram um levantamento de abelhas (Anthophila) no Parque Florestal dos Pioneiros (Maringá - PR) e suas respectivas visitações florais (protocooperação). Foram coletados 1913 exemplares (1515 fêmeas e 398 machos) de abelhas silvestres, nas flores de 85 espécies de plantas pertencentes a 36 famílias, sendo a família Euphorbiaceae representada por três espécies: Chamaesyce hirta, Croton glandulosus L. e R. Communis L., registrando assim a polinização por esse grupo de abelhas nestas espécies. Ohnish et al. (2008), investigaram as formas de dispersão de sementes em C. maculata (L.), encontrando duas maneiras principais de dispersão dependentes da sazonalidade: no verão as sementes são dispersadas autocoricamente e no outono mirmecoricamente, corroborando os dados anteriores. Os autores ressaltaram ainda que esta conformação dispersiva é desconhecida para outras espécies. No outono, das 18 espécies de formigas que visitaram representantes da espécie em pauta, apenas duas (Tetramorium tsushimae e Pheidole noda) participaram de forma frequente do processo de dispersão das sementes de C. maculata.

2.3. Família Annonaceae e o Gênero Xylopia L.

A família Annonaceae constitui-se na principal família do clado Magnoliales, posicionando-se basalmente dentro das angiospermas juntamente com Canellales, Laurales, Piperales, Chloranthales e as monocotiledôneas (APG II, 2003). É uma das maiores famílias entre as Angiospermas, com cerca de 140 gêneros e 2.500 espécies (Chatrou et al., 2004), possuindo distribuição pantropical, embora aproximadamente 40 gêneros e 900 espécies apresentem distribuição neotropical (Chatrou et al., 2004) enquanto no Brasil

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... estima-se a ocorrência de 26 gêneros (sete endêmicos) com cerca de 260 espécies (Maas et al., 2001).

Figura 03 . Posicionamento filotaxonômico da família Annonaceae. Fonte: APG II, 2003 Os membros do gênero Xylopia apresentam-se como árvores ou arbustos. Seus tricomas são simples, flores em inflorescência, axilares ou caulinares, monoclinas; botão estreitamente piramidal; sépalas três, conatas na base, valvares, raramente imbricadas; pétalas seis, livres, valvares, as internas menores; estames numerosos, anteras septadas transversalmente, ápice do conectivo dilatado, truncado, estaminódios presentes; carpelos poucos a muitos, óvulos 2-8. Fruto apocárpico, carpídios elipsóides, em geral estipitados, deiscentes ou indeiscentes; sementes 2-8, com arilo (Lobão et al., 2005). Maas et al. (2001) realizaram uma listagem comentada das Annonaceae do centro- leste do Brasil, compreendendo o Distrito Federal e os estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo e Tocantins. Vale ressaltar que neste estudo 14

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

19 gêneros e 153 espécies de Annonaceae da região foram listados e comentados. Para o gênero Xylopia foram notificadas 10 espécies. Richardson et al. (2004) analisando a história biogeográfica de duas famílias (Annonaceae e Rhamnanaceae) constataram a distribuição notadamente pantropical do gênero Xylopia, com uma dispersão datada de aproximadamente 23.8-27.5 ≈ 3.7 milhões de anos atrás. Engelbretch et al. (2007) analisaram padrões de distribuições de 48 espécies – entre elas representantes de gênero Xylopia – em florestas tropicais (Panamá) sob o aspecto da sensibilidade à seca. Os autores sugeriram que a diferenciação de nicho no que diz respeito ao recurso hídrico no solo é diretamente determinante na distribuição de árvores tropicais. Mudanças na composição do solo, em geral causados pela mudança climática global agregada à fragmentação florestal afetam diretamente na distribuição, composição e diversidade destas espécies.

2.3.1. Biologia e Estudos Ecológicos

Os registros biogeográficos mais antigos, no que concerne à família Annonaceae, são sementes encontradas na Nigéria, bem como grãos de pólen oriundos da Colômbia

(Chesters, 1955; Sole de Porta, 1971). Primordialmente, os propágulos de Annonaceae são dispersos por primatas e aves frugívoras (van Tol & Meijdam, 1991). Já os estudos sobre biologia polínica retratam que representantes da família Annonaceae são polinizados predominantemente por besouros (van Heusden, 1992). Corner (1988) descreveu componentes aromáticos em flores de espécies da Malásia que atraem muitas espécies de besouros. Na região Indo-Malasiana em Sarawak, 20 das 22 espécies de Annonaceae estudadas foram polinizadas por besouros diminutos (Momose et al., 1998c). Todas as árvores de Annonaceae estudadas em floresta tropical do oeste da Índia foram polinizadas por besouros (inespecíficos), corroborando todos os dados apresentados anteriormente (Devy & Davidar, 2003). Por outro lado, registros a respeito do grupo Blattodea (Baratas), apesar de suas características onívoras, indicam que algumas espécies visitam e são principais polinizadores de Uvaria elmeri Merr. (Annonaceae) (Nagamitsu & Inoue, 1997). Jürgens et al. (2000) relataram que Xylopia aromatica (Lam.) Mart. é polinizada por insetos do grupo

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Thysanoptera (80% dos registros) e secundariamente por pequenos besouros (Nitidulidae – 16% e Staphylinidae – 4%). Brando & Durigan (2004) verificaram o impacto na vegetação do Cerrado após a geada, no estado de São Paulo. O impacto causado reduziu a cobertura do dossel de 88 para 19%. Por outro lado, a riqueza florística não sofreu mudanças significativas, porém a dominância das espécies mudou drasticamente devido à suscetibilidade adaptativa de muitas espécies. As maiores taxas de redução foram observadas em X. aromatica e Vochysia tucanorum Mart.. A regeneração da estrutura padrão foi consideravelmente rápida, onde a estrutura dos dosséis foram recuperadas após cinco meses, com reaparecimento das espécies intolerantes as geadas. Outro dado referente a análises no cerrado diz respeito ao apresentado por Marimon et al. (2006). Eles analisaram a densidade vegetacional no nordeste do Mato Grosso, na Serra do Roncador, um ecótono distinguido por ser uma faixa de transição entre os biomas da Amazônia e Cerrado. Não houve registro de espécies comuns nas áreas plotadas, no entanto as famílias Annonaceae (com representantes do gênero Xylopia), Chrysobalanaceae, Connaraceae, Myrtaceae e Sapotaceae tiveram registro nos dois biomas, confirmando a plasticidade observada anteriormente. Toriola et al. (1998) investigaram os padrões de distribuição em uma floresta localizada na Guiana Francesa em estágio sucessional secundário, registrando a presença de representantes do gênero Xylopia. Nesta averiguação, os testes aplicados no entendimento do padrão da distribuição revelaram uma tendência total no recolonização na floresta secundária. Entende-se que os estudos de estrutura populacional sejam um primeiro passo no sentido de compreender quais fatores são responsáveis pela variação dos processos populacionais, pela regeneração e por pertubarções em um determinado local. A estrutura populacional de uma espécie é um parâmetro da forma como ela está explorando o ambiente (Dirzo & Sarukhan 1984, Oliveira et al., 1989) Nesse contexto, estudos de estruturas populacionais foram conduzidos por Miranda- Melo et al. (2007) em populações da espécie Xylopia aromática (Lam.) Mart, e Roupala montana Aubl. espécie caracterizada por ser pioneira e intolerante à sombra (Felfili & Silva 1992). Os estádios ontogenéticos foram analisados em fragmentos diferentes e em fisionomias diferentes de um mesmo fragmento. A heterogeneidade espacial das variáveis 16

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... ambientais (diferenças na cobertura vegetal), as características reprodutivas das espécies (R. montana pode se reproduzir assexuadamente, enquanto X. aromatica se reproduz apenas por sementes) e os padrões fenológicos (anual em X. aromatica e supra-anual em R. montana) parecem ser as principais variáveis associadas à variação das estruturas ontogenéticas e podem atuar de forma diferente nas espécies em cada local. Para que se possa avaliar adequadamente a dinâmica populacional de espécies vegetais é necessário realizar uma avaliação detalhada não só dos padrões espaciais de mortalidade e recrutamento, como das taxas de crescimento. Além disso, sabe-se que os padrões de mortalidade, recrutamento e crescimento podem variar consideravelmente ao longo dos anos. Estas variações podem estar ligadas ao clima ou ciclos biológicos inerentes às espécies (Crawley, 1997). Um dado importante acerca de estudos de dinâmica populacional no gênero Xylopia foi realizado por Corrêa & Van de Berg (2002) em populações da X. brasiliensis Sprengel. Os fatores acima descritos foram analisados em três setores da mata – borda, meio e margem, com dados populacionais acerca das mudanças estruturais na borda bem como os níveis de penetração dos indivíduos. As populações desta espécie mostraram que a dinâmica populacional foi mais diferenciada na borda devido ao maior recrutamento e ganho em área basal, onde em todas as esferas de análise as taxas de recrutamento excedeu as taxas de mortalidade, mesmo com a notificação de competição intra-específica assimétrica.

2.4. Análises Genéticas em Populações Vegetais

Com a redescoberta dos trabalhos de Mendel, no final do século XIX, por Hugo de Vries, Carl Correns e Erick von Tschermak-Seysenegg, realizaram-se inúmeras pesquisas a fim de esclarecer os mecanismos básicos da herança. Esses trabalhos culminaram na formulação da Teoria Cromossômica da Herança por W. Sutton e T. Boveri, em 1902, que estabeleceram as relações entre cromossomos e fatores Mendelianos (genes), segundo a qual os cromossomos são elementos celulares portadores dos genes (Carneiro & Vieira, 2002). No mesmo ano (1902), W. Bateson, E.R. Saunders e R.C. Punnet demonstraram, em ervilha-doce, que as segregações dos caracteres cor da flor e formato do pólen não ocorriam

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... de forma independente (Lander & Weinberg, 2000). Com isso, muitos estudos de caráter genético foram realizados em vegetais, tendo os mais variados focos: econômicos, evolutivos, ecológicos e taxonômicos. Com o avanço das pesquisas, as estratégias clássicas que incluíam a anatomia comparativa, os aspectos fisiológicos e a embriologia foram aplicados nas análises genéticas para de determinar a variabilidade inter e intraespecífica. Houve uma intensa sobreposição de informações pré-existentes com as novas abordagens (biotecnológicas) que cada vez mais vêm sendo agregadas aos processos de inferências genéticas (Carneiro & Vieira, 2002). O mapeamento genético tornou-se rapidamente uma importante ferramenta para os geneticistas, não obstante a prova definitiva da associação entre mapas de ligação e cromossomos tenha vindo mais tarde, com os estudos realizados por B. McClintock em cromossomos de milho. Creighton e McClintok (1931) demonstraram que o crossing-over resulta da troca entre segmentos cromossômicos. Os primeiros mapas genéticos eram fundamentados em marcadores morfológicos e citológicos. Estes se originaram de estoques cromossômicos com aberrações (como aneuploidias, translocações, deleções e inversões), principalmente nas culturas do milho, tomate e ervilha (Coe et al., 1988; Rick & Yoder, 1988). Lesley (1928) realizando cruzamentos experimentais entre plantas diplóides e triplóides obteve a primeira série de trissômicos em tomate. Com base na análise desses trissômicos, esse autor foi pioneiro em estudos de mapeamento genético em tomate, atribuindo sete mutantes, quatro no cromossomo A (cromossomo 2) e três em diferentes cromossomos. Mais de 1.200 mutantes foram descritos em tomate, dos quais pelo menos 400 foram localizados nos respectivos cromossomos e suas distâncias de ligação estabelecidas (Quiros, 2001). A dispersão inter-populacional é um importante determinante na estrutura das metapopulações e permite uma definição das unidades dentro do que se considera a respeito da dinâmica e evolução – fluxo gênico – das mesmas (Husband & Barrett, 1996). Além disso, a dispersão é um aspecto de acentuada importância nos diversos tópicos de sua aplicação, incluindo a análise da viabilidade em populações de espécies fragmentadas, a avaliação dos riscos de escape de organismos geneticamente modificados em populações naturais, controle de doenças epidêmicas e invasões envolvendo espécies exóticas (Ouborg et al., 1999). 18

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Na espécie Arabis serrata Fr. & Sav. (Brassicaceae), a partir de dados gerados por isoenzimas, informações de estrutura genética demonstraram que os grupos de populações japonesas amostrados apresentaram valores de diversidade (Gst = 0.416) elevados, indicando diferenciações genéticas. Por sua vez os dados de fluxo gênico (Nm = 1.203) corroboraram com as discrepâncias encontradas, onde uma desconectividade entre as populações estudadas foi sugerida (Oyama, 1998). Estudos genéticos em populações naturais de espécies arbóreas tropicais, baseados em marcadores genéticos, foram feitos na Malásia em 1981, contudo tiveram grande avanço nas florestas neotropicais do Panamá, Costa Rica e Brasil. Estudos com grupos sucessionais mostraram que a sucessão, a densidade populacional e as características de reprodução podem indicar espécies-modelo para representar parte da comunidade deste grupo (Kageyama et al., 2003). Markwith et al. (2007) investigaram a diversidade genética, estrutura genética e inferências acerca do fluxo gênico em Hymenocallis coronaria (LeConte) Kunth (Amaryllidaceae). Por se tratar de uma espécie aquática, quatro rios foram plotados e os indivíduos (divididos em 12 populações) foram analisados, por marcadores de microssatélites. Os valores de Gst foram relativamente baixos e demonstrou não existir uma relação significante entre os parâmetros de diversidade e tamanho populacional. A ausência dessa relação indica uma recente expansão populacional ou um gargalo na evidência do efeito do fundador. Wang et al. (2007), numa inferência similar, examinaram a diversidade genética e a estrutura populacional na leguminosa Caragana korshinskii Kom., através do marcador AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Foram analisadas 10 populações revelando-se um elevado percentual de loci polimórfico (p=93.9%). A análise molecular de variância (AMOVA) indicou que 77% da variedade em nível intra-populacional, assim como os valores de fluxo gênico (Nm = 1.7) indicaram elevada conectividade entre as populações. As bases moleculares destes estudos têm auxiliado também na resolução de muitas questões taxonômicas, onde um grande número de reclassificações foi realizado a partir do advento das sobreposições dos diferentes focos de pesquisa, gerando assim profundas modificações nas correntes científicas relacionadas à classificação botânica (Carneiro & Vieira, 2002). 19

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

2.5. Marcadores Moleculares

Primeiramente, no início da década de 60, as isoenzimas foram descobertas (Market & Moller, 1959), passando a ser usadas como marcadores bioquímicos, permitindo a construção de mapas genéticos (além de outras aplicações) potencialmente em todas as espécies de plantas (Garvin & Weeden, 1994). Os marcadores isoenzimáticos apresentam um controle genético normalmente simples, em que a ação alélica é, na maioria dos casos, codominante. O fluxo gênico em plantas também tem sido estudado intensivamente através dessa técnica, uma vez que a frequência de determinado gene é atribuída de acordo com a variação aloenzimática entre as populações (Ouborg et al., 1999). É plausível afirmar que o uso das aloenzimas forneceu uma riqueza de informações a respeito de polens e sementes, mediante à análise de genes ligados, como descrito acima. As aloenzimas exibem uma herança Mendeliana, com taxas de mutação na ordem de 10-6 (Voelker et al., 1980), podendo ser aplicadas extensivamente. Portanto, devido a essas propriedades e dependendo do objetivo do trabalho, este tipo de análise ainda é indicado. Uma outra técnica molecular, o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) requeria de um maior refinamento técnico, sendo mais demorada que as outras técnicas na obtenção de resultados; além de ter custos relativamente altos. A citada metodologia revelou um grau de polimorfismo de intermediário a baixo, conforme a espécie, a despeito disso foi utilizada em um grande número de estudos de caracterização de cultivares, principalmente devido à sua alta consistência e reprodutibilidade (Millach, 1999). A técnica de RAPD consiste na amplificação de DNA genômico através de PCR utilizando primers de sequência arbitrária com 10 nucleotídeos. O escopo da técnica é muito simples: o primer se liga às sequências complementares em fitas opostas do DNA alvo e ocorre a amplificação in vitro do segmento de DNA entre dois primers adjacentes com o auxílio da enzima Taq polimerase. Os sítios de ligação dos primers devem estar separados por no máximo 3 a 4 mil pares de bases, uma vez que a Taq polimerase não é capaz de percorrer segmentos maiores nas condições normalmente usadas durante a amplificação (Ferreira & Grattapaglia, 1995; Fritsch & Rieseberg, 1996). Por serem pequenos, é muito provável que os primers encontrem diversas regiões do genoma para se

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... ligarem, fazendo com que diversos fragmentos de tamanhos diferentes resultem de uma reação (Williams et al., 1990). Williams et al. (1990) destacaram que alterações de uma única base no sítio de ligação do primer podem inviabilizar o anelamento impedindo a amplificação do fragmento correspondente, o que não significa que todos os fragmentos amplificados resultem de um pareamento perfeito entre primer e sítio de ligação. Marcadores RAPD são dominantes, o que significa que indivíduos homozigotos dominantes para um determinado loco e indivíduos heterozigotos não podem ser diferenciados a partir do perfil de amplificação, uma vez que ambos serão representados pela presença de uma banda no gel. Marcadores oriundos do RAPD são considerados neutros e aparentemente estão distribuídos ao acaso por todo o genoma (Williams et al., 1993), representando desde sequências de cópia única até sequências altamente repetitivas (Williams et al., 1990; Ferreira & Grattapaglia, 1995). Entre as vantagens frequentemente citadas para a técnica de RAPD, destacam-se: simplicidade, rapidez, baixo custo, demanda de quantidades mínimas de DNA para realização das análises, possibilidade de estudo de espécies sobre as quais não se tem nenhum tipo de informação genética e espécies com pouco ou nenhum polimorfismo em locos isoenzimáticos. Este marcador torna-se também interessante no estudo de espécies raras ou ameaçadas, nas quais pode ser bastante complicado obter amostras de tecido em quantidade suficiente para a extração de maior quantidade de DNA (Lacerda et al., 2002). Entre as limitações da mesma, duas podem ser consideradas as mais críticas. Uma delas se refere à característica dominante do marcador RAPD que não permite a diferenciação de indivíduos heterozigotos e, consequentemente, a obtenção de outras informações relevantes para estudos genéticos. A característica dominante da técnica de RAPD certamente traz alguns inconvenientes, principalmente do ponto de vista da análise estatística. Outra limitação, amplamente avaliada durante os primórdios de aplicação da técnica, refere-se à questão da baixa reprodutibilidade (Lacerda et al., 2002). A técnica de AFLP possui grande capacidade para detecção de variabilidade genética e uso em caracterização de cultivares. De fato, tem sido utilizada com sucesso, por exemplo, em girassol para essa finalidade (Hongtrakul et al., 1997). Entre as prerrogativas do uso desta estão o alto grau de polimorfismo e o mais alto número de marcadores obtidos por gel analisado (Millach, 1999). A dispersão de Populus nigra L. foi analisada, ao longo dos rios holandeses, usando marcadores de AFLP. Esta espécie é rara, no entanto os 21

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... genótipos de 94 árvores adultas em duas populações foram distintos (Ouborg et al., 1999 apud Arens et al., 1998). 2.5.1. Marcador DAF

A técnica de DNA Amplification Fingerprinting (Impressão Genômica do DNA Amplificado) é também baseada na aplicação de primers arbitrários, tendo, portanto uma estreita relação com o RAPD. No entanto, há uma distinção fundamental com esta última que é a concentração do DNA-molde utilizado. Enquanto na técnica de RAPD utiliza-se em média 25 ng, nesta a concentração ideal está entre 0,1-1,0 ng, conferindo uma maior especificidade e reprodutibilidade. Por sua vez a concentração dos primers é muito maior nesta última do que no RAPD e muitos autores consideram o Fingerprinting de DNA uma técnica mais segura, justamente devido à reprodutibilidade. Ambas as metodologias foram publicadas quase simultaneamente, destacando-se, portanto que o DAF não é uma variação ou adaptação da técnica de RAPD (Williams et al., 1990), incluindo o uso de primers de outros tamanhos (Caetano-Anollés et al., 1991). Jiang & Gresshoff (1997), desempenharam uma análise genética clássica e molecular em Lotus japonicus L. considerada, tal como Arabidopsis thaliana L. um modelo ideal de estudo (gerações curtas, genoma pequeno, facilidade de transformação, autofertilização, etc.). Além das análises de cruzamentos (hibridizações) os mesmo realizaram um estudo usando a técnica de DAF. Os marcadores morfológicos segregaram de forma Mendeliana na população F2 que incluiu 100 indivíduos. Um sistema para designação de loci e marcadores moleculares oriundos de DAF foi proposto neste legume modelo, sendo o primeiro registro de uma correlação molecular (DAF) e morfológica. He & Prakash (1997) por sua vez, aplicaram as técnicas de AFLP e DAF em amendoim (Arachis hypogaea L.) detectando marcas polimórficas pela primeira vez nesta espécie. O número de polimorfismos gerado entre as duas técnicas foi eficiente, sendo que no estudo de DAF, 559 primers de variados tipos foram utilizados, onde na maior parte foi detectado polimorfismo, produzindo um percentual de 3.7 bandas polimórficas por primer num total de 63 marcas polimórficas. Men et al. (1998), demonstraram a eficiência do mapeamento genético através da combinação da BSA (Bulked Segregant Analysis) com o DAF, na investigação do grupo de genes (sym-genes) responsáveis por mutações fenotípicas e de herdabilidade em Pisum 22

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... sativum L. As técnicas de DAF e STMS foram usadas na verificação de polimorfismos em grão-de-bico (Cicer arietinum L.) e mostraram-se como marcadores altamente eficientes na geração de polimorfismos, a despeito da estreita base genética desta cultura (Winter et al., 2000). 2.5.2. Marcador ISSR

Os microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeats) compreendem sequências curtas de nucleotídeos repetidas na mesma ordem, cujo nível de polimorfismo produzido é devido à variação no número de unidades de repetição em um determinado locus (Morgante & Olivieri, 1993). Marcadores SSR são obtidos com o uso de primers que flanqueiam regiões contendo os microssatélites. Os primers para SSR são desenhados a partir do sequenciamento de fragmentos de DNA, obtidos de bibliotecas genômicas, onde os últimos foram previamente localizados (Millach, 1999). Zietjiemicz et al. (1994) desenvolveram um tipo de marcador baseado em SSR, os ISSR ou Inter Simple Sequence Repeats. Este marcador contorna a problemática da informação prévia das sequências que flanqueiam o microssatélite. O método proporciona alta reprodutibilidade dos resultados e gera abundante polimorfismo em muitos sistemas (Liu & Wendel, 2001). Os primers ISSR são mais robustos porque apresentam maior superfície de ancoragem e possuem maiores temperaturas de anelamento, aumentando a reprodutibilidade dos produtos de ISSR, quando comparados as mesmas características do marcador RAPD (Tsumura et al., 1996). Devido à distribuição preferencial nas regiões não codificadoras, os microssatélites podem não sofrer com a seleção natural, sendo um marcador seletivamente neutro e útil para estudos da genética de populações naturais (Villela, 2004). O ISSR é considerado um marcador semi-arbitrário, ampliado por PCR em presença de oligonucleotídeos complementares para o microssatélite designado, podendo ser ancorado no final 3´ ou 5´ de 1 a 4 bases de purina ou pirimidina (Patzack, 2001; Souza et al., 2005). As sequências-alvo dos ISSR são abundantes ao longo do genoma de eucariontes e evoluem rapidamente (Fang & Roose, 1997; Esselman et al., 1999). Esses marcadores têm sido utilizados em diversos estudos para análise de variabilidade entre linhas híbridas de cultivares, complexos híbridos naturais e 23

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... variabilidade genética de populações. (Wolfe & Randle, 2001; Souza et al., 2005; Woods et al., 2005; Slotta & Potter, 2006 Xiao et al. (2004) corroboram a premissa de se utilizar ISSRs na análise de populações naturais, uma vez que os mesmos analisaram populações da espécie Cycas guizhouensis Lan & Zou (Cycadaceae). Nesta inferência, os marcadores ISSRs foram utilizados para verificar a variação genética de 12 populações desta espécie, identificando valores elevados de Gst (0.4321). Eles concluíram que os efeitos da lenta evolução bioquímica, deriva genética, endocruzamento e o limitado fluxo gênico entre as populações influenciaram diretamente na conformação da estrutura genética. A aplicação do marcador ISSR, juntamente com o RAPD na importante espécie ornamental da China Zinnia elegans Jacq. foi útil para estimar a variabilidade genética de 20 linhagens endocruzantes desta espécie. Foram aplicados 12 primers randômicos e nove primers do tipo ISSR. O teste de Mantel indica estreita correlação entre os dados de RAPD e ISSR, todavia os resultados oriundos da segunda técnica, citada nesta menção, foram considerados levemente superiores. Adicionalmente, houve um contraste no que tange as matrizes morfológicas montadas de acordo com as duas técnicas, com indicação de discrepância pelo teste de Mantel (Ye et al., 2008)

2.6. Análise de Diversidade e Parentesco

Santos et al. (2002) verificaram a variabilidade genética de três populações de Solanum lycocarpum St. HIL, estabelecidas em dois ecossistemas (Cerrado e Mata Atlântica) a partir de caracteres morfológicos. De acordo com os resultados obtidos, os autores observaram a existência de variabilidade genética para número médio de folhas, comprimento médio dos cotilédones e porcentagem de germinação, indicando que o estudo de parâmetros morfológicos é relevante na análise da divergência genética para uma dada espécie. Kageyama et al. (2003) realizaram um estudo de diversidade genética em espécies arbóreas, plotando vários locais de ocorrência das espécies-modelo. As análises genéticas foram realizadas por eletroforese de isoenzimas, marcadores microssatélites e RAPD. Os resultados apontaram para uma padronização de taxa multilocos, indicando que as espécies plotadas são alógamas ou de sistema misto de reprodução com predominância da alogamia. 24

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Em todas as espécies e suas populações foram detectados cruzamentos entre indivíduos aparentados, sugerindo a existência de estruturas de famílias dentro das populações. O respaldo da pesquisa destaca-se ainda por constatar que todas as espécies revelaram fortes desvios dos esperados cruzamentos aleatórios, observando-se, no entanto que algumas espécies apresentaram alta correlação de paternidade, sugerindo que a relação de parentesco entre plantas dentro das progênies seria de irmãos-completos. Holderegger et al. (2003), por sua vez, analisando populações de Deschampsia antarctica Desv., oriundas da Antártica revelaram por meio de marcador AFLP que as populações apresentavam uma baixa diversidade genética. Para tal, realizaram um estudo preliminar, examinando a variação nos polimorfismos entre pontos de coleta, sugerindo que as populações foram fundadas por poucos indivíduos, cuja manutenção é estabelecida através da autofertilização e/ou propagação vegetativa. Em ambientes fragmentados a ausência de conectividade, diminui a chegada de propágulos reprodutivos, a formação do banco de sementes, comprometendo o processo sucessional. O fluxo gênico das espécies também pode ser extremamente comprometido, impossibilitando ou dificultando a formação de metapopulações, reduzindo, na imensa maioria dos casos, o tamanho efetivo populacional. Esta diminuição acarreta aumento dos níveis de endogamia e dos efeitos de deriva genética, ocasionando redução da variabilidade genética. Vale ressaltar que esta redução acumula-se ao longo do tempo (Rogalski et al., 2003). Wadt & Kageyama (2004) avaliaram a estrutura genética e o sistema de acasalamento da pimenta-longa (Piper hispidinervum C. DC.) utilizando marcadores RAPD, em arbustos ocorrentes em áreas antropizadas no estado do Acre. A diversidade genética entre e dentro de populações naturais foi avaliada em 13 populações do Vale do Rio Acre, distribuídas nas regiões do Baixo e Alto Acre. Esta espécie apresentou diversidade genética estruturada no espaço segundo um padrão de isolamento por distância. A maior parte da variabilidade genética foi encontrada dentro das populações, porém a diferenciação entre populações, como um todo, foi alta. Na família Euphorbiaceae, há estudos relevantes sobre a filogenia dos gêneros, uma vez que a mesma apresenta relações complexas, sendo a investigação molecular uma importante ferramenta no esclarecimento dos graus de parentesco existentes na família. A

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... associação das espécies e o entendimento detalhado deste grupo permitem um maior esclarecimento dos aspectos evolutivos (Wagner et al., 1999). Lakshmi et al. (2000) realizaram um estudo da diversidade intraespecífica em 84 indivíduos (sete populações diferentes) de Excoecaria agallocha L. através das técnicas de RAPD e RFLP. O polimorfismo dentro das populações variou de 20 a 31%. Em nível interpopulacional 74% das marcas por RAPD foram polimórficas, enquanto o RFLP revelou um nível de polimorfismo na ordem de 62,%, indicando uma divergência genética. O dendrograma mostrou agrupamento das populações das costas ocidentais e orientais da Índia em conjuntos separados, no nível da similaridade de 60%. Os resultados apresentados por esses autores indicam que variações genéticas consideráveis (intra e inter-populacional) existem na espécie, não se associando a falta da variação genética identificada com a uniformidade morfológica das espécies dos locais analisados. Van et al. (2006) estudaram também as regiões de ITS, 5.8S e trnL trnF (cloroplasto), além do AFLP, para realizar um estudo sobre as relações filogenéticas e biogeográficas de Croton alabamensis E.A.Sm., nos estados do Texas e Alabama. A maioria da variação molecular foi explicada pelas diferenças intrapopulacionais. Uma variação similar foi também encontrada dentro e entre os estados. A distância genética entre as populações de Texas foi significativamente menor do que a distância genética entre as populações do Alabama. Na família Annonaceae, o gênero Anaxagorea St. Hil. tem sido alvo de pesquisas, no que diz respeitos às questões taxonômicas, evolutivas e, por sua vez, filogenéticas. Scharaschkin & Doyle (2006) examinaram 25 espécies do referido gênero utilizando dados moleculares, a partir de sequências de DNA provenientes dos genes atpB-rbcL, psbA-trnH, trnL-trnF e a região de íntron do gene plastidial trnL. Além dos dados citados, matrizes de similaridade com dados morfológicos também foram geradas e sobrepostas aos dados de DNA. Os autores concluíram que no gênero Anaxagorea muitas das características, que as distinguem de outras Annonaceae, são certamente ancestrais e homólogas às peculiaridades presentes em Magnoliales. Outro dado similar em Annonaceae diz respeito ao estudo realizado no gênero Pseuduvaria Miq.. Relações filogenéticas foram investigadas utilizando sequências de DNA plastidial de 5 regiões: psbA-trnHr, trnL-F, matK, rbcL e atpB-rbcL, onde dados de Máxima Parsimônia e Inferência Bayesiana foram aplicados em 51 espécies do gênero. Os 26

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... dendrogramas gerados deram suporte a monofilia do grupo, importante dado uma vez que este gênero ocupa um lugar basal dentro das Magnoliidae. A presente inferência destacou ainda mudanças evolutivas em sete caracteres morfológicos selecionados para agregar-se aos dados moleculares (sexo floral, números do estame e do carpelo, cor interna da pétala, presença de glândulas internas da pétala, comprimento de florescência do pedúnculo e tamanho do monocarpo), respaldando as análises agregadas de filogenia na família e em outras angiospermas (Su et al., 2008)

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

APG II. An Update of the angiosperm phylogeny group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean. Society 141: p. 399-436. 2003.

BRANDÃO, M. M. Diversidade genética de Myrcia splendens (SW.) DC. (Myrtaceae) por marcadores ISSR em sistema corredor-fragmento semideciduais no Sul de Minas Gerais. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Lavras, Lavras – MG, 88p. 2008.

BRANDO, P.M.; DURIGAN, G. Changes in cerrado vegetation after disturbance by frost (São Paulo State, Brazil). Plant Ecology, 175: 205-215p. 2004.

BROOKER, L.; BROOKER, M.; CALE, P. Animal dispersal in fragmented habitats: measuring habitat connectivity, corridor use, and dispersal mortality. Conservation Ecology, 14(1): 1-4p. 1999.

BROWN, J.H.; HESKE, E.J. Control of a desert-grassland transition by a keystone rodent guild. Science, 250: 1705-1707p. 1990

BROWN-JR., K.S.; HUTCHINGS, R.W. Disturbance, fragmentation, and the dynamics of diversity in Amazonian forest butterflies. 91-110p. In: LAURANCE, W.F. & BIERREGAARD-JR., R.O. (Eds.). Tropical forest remnants: ecology, management and conservation of fragmented communities. Chicago: The University of Chicago Press. 1997.

CAETANO-ANOLLÉS, G.; BASSAM, B.J.; GRESSHOFF, P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology, 9: 553- 556p. 1991.

CÂMARA, I.G. Breve história da conservação da Mata Atlântica. Belo Horizonte. Fundação SOS Mata Atlântica/Conservation-International, 2005.

CARNEIRO, M.S.; VIEIRA, M.L.C. Mapa genéticos em plantas. Bragantia, 61: 89-100p. 2002. 27

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

CHATROU, L.W.; RAINER, H.; MAAS, P.J.M. Annonaceae (Soursop Family). 18-20p. In: Smith, N.; Mori, S. A.; Henderson, A.; Stevenson, D. W. & Heald, S. V. (eds.). Flowering Plants of the Neotropics. The New York Botanical Garden. 2004.

CHEN, S.H.; WU, M.J. Chamaesyce hypericifolia (L.) Millsp., A Newly Naturalized Spurge Species in Taiwan. Taiwania, 49: 102-108p. 2004.

CHESTERS, K.I.M. Some plant remains from the Upper Cretaceous and Tertiary of West Africa. Annals and Magazine of Natural History, 8: 498-504p. 1955.

COE, H.E.; NEUFFER, M.G.; HOISINGTON, D.A. The genetics of corn. 81-237p. In: SPRAGUE, G. F.; DUDLEY, J.W (Eds.). Corn and Corn Improvement. 1988.

COIMBRA-FILHO, A.F.; CÂMARA, I.G. Os limites originais do bioma Mata Atlântica na Região Nordeste do Brasil. Fundação Brasileira para a Conservação da Natureza FBCN, Rio de Janeiro, Brasil. 1996.

CONSELHO NACIONAL DA RESERVA DA BIOSFERA DA MATA ATLÂNTICA (Orgs.).; CÂMARA, I.G. Caderno 04: Plano de Ação para a Mata Atlântica. Companhia Energética de São Paulo & Ministério do Meio Ambiente. 22p. 1996.

CONSERVATION-INTERNATIONAL. Avaliação e ações prioritárias para a conservação da biodiversidade da Mata Atlântica e campos sulinos. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, 2005.

CORNER, E.J.H. Wayside Trees of Malaya, 3rd Edn. Malayan Nature Society. 861p. 1988.

CORREA, B.S. AND VAN DE BERG, E. Estudo da dinâmica da população de Xylopia brasiliensis Sprengel em relação a parâmetros populacionais e da comunidade em uma floresta de galeria em Itutunga, MG, Brasil. CERNE, 8(1): 001-012p. 2002.

CREIGHTON, H.B.; MCCLINTOCK, B. A Correlation of Cytological and Genetical Crossing-over in Zea Mays. Proceedings of the National Academy of Sciences 17: 493-497p. 1931.

DEVY, M.S.; DAVIDAR P. Pollination systems of trees in Kakachi, a mid-elevation wet evergreen forest in Western Ghats, India. American Journal of Botany, 90: 650–657p. 2003.

DIAS, L.A.S.; KAGEYAMA, P.Y. Variação genética em espécies arbóreas e conseqüências para melhoramento florestal. Agrotrópica, 3(3): 119-127p. 1991.

DICK, C.W.; ETCHELECU, G.; AUSTERLITZ, F. Pollen dispersal of tropical trees (Dinizia excels: Fabaceae) by native insects and Africans honeybees in fragmented Amazonian rainforest. Molecular Ecology, 12(3): 753-764p. 2003.

DIRZO, R.; SARUKHÁN, J. Perspectives on plant population ecology. Massachusetts: Sinauer Associates. 478p. 1984.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

EHRENFELD, J. Pollination of three species of Euphorbia subgenus Chamaesyce, with special reference to bees. American Midland Naturalist, 101(1): 87-98p. 1979.

ENGELBRECHT, B.M.J.; COMITA, L.S.; CONDIT, R., KURSAR, T.A.; TYREE, M.T.; TURNER, B.J.; HUBBELL, S.P. Drought sensitivity shapes species distribution patterns in tropical forests. Nature, 447: 80–82p. 2007.

ERASMO, E.A.L.; PINHEIRO, L.L.A.; COSTA, N.V. Levantamento Fitossociológico das Comunidades de Plantas Infestantes em áreas de produção de arroz irrigado cultivado sob diferentes sistemas de manejo. Planta Daninha, 22: 195-201p. 2004.

ESSELMAN, E. J.; JIANQIANG, L.; CRAWFORD, D.J.; WINDUSS, J.L.; WOLFE, A.D. Clonal diversity in the rare Calamagostis porter ssp. Insperata (Poaceae): comparative results for allozymes and random amplified polymorphic DNA (RAPD) and inter simple sequence repeat (ISSR) markers. Molecular Edinburgh, 8: 443-451p. 1999.

FANG, D.Q.; ROOSE, M.L. Identification of closely related citrus cultivars with inter- simple sequence repeat markers. Theoretical and Applied Genetics, 95: 408-417p. 1997.

FELFILI, J.M.; SILVA JÚNIOR, M.C. Floristic composition, phytosociology and comparison of cerrado and gallery forests at Fazenda Agua Limpa, Federal District, Brazil. 393-429p. In Nature and dynamics of the forestsavanna boundaries (P.A. Furley, J. Procter & J.A. Ratter, eds.). Chapman & Hall, London. 1992.

FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2a. Editora EMBRAPA/CENARGEN, 220p. 1995.

FLEURY, M. Efeito da fragmentação florestal na predação de sementes da palmeira jerivá (Syagrus romazoffiana) em florestas semidecíduas da cidade de São Paulo. Dissertação de mestrado. Escola Superior Agrícola Luiz de Queiroz – ESALQ – USP. 88p. 2003.

FORÉ, S.A.; HICKEY, R.J.; VANKAT, J.L.; GUTTMAN, S.J.; SCHAEFER, R.L. Genetic structure after forest fragmentation and landscape ecology perspective on Acer saccharum. Canadian Journal of Botany, 70(8): 1659-1668p. 1992.

FRITSCH, P.; RIESEBERG, L. H. The use of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) in conservation genetics. 54-73p. In: Smith, T. B. & Wayne, R. K. (Ed.). Molecular genetic approaches in conservation, New York: Oxford University Press, 1996.

GALINDO-LEAL, C.; CÂMARA, I.G. (eds.). The Atlantic Forest of South America: biodiversity status, threats, and outlook. . Center for Applied Biodiversity Science e Island Press, 3-11p. 2003.

GARVIN, D.F.; WEEDEN, N.F. Genetic-linkage between isozyme, morphological, and DNA markers in tepary bean. Journal of Heredity, 85: 273-278p. 1994.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

GASCON C, WILLIAMSON G.B., DA FONSECA G.A.B. Receding forest edges and vanishing reserves. Science, 288: 1356–1358p. 2000.

GONZÁLEZ-ASTORGA, J.; NÚÑES-FÁRFAN, J. Effect of habitat fragmentation on the genetic structure of the narrow endemic Brongniartia vazquezii. Evolution Ecology Research, 3(7): 872-961p. 2001.

GORDILLO, M.M.; RAMÍREZ, J.J.; DURÁN, R.C.; ARRIAGA, E.J.; GARCÍA, R.; CERVANTES, A.; HERNÁNDEZ, R.M. Los géneros de la familia Euphorbiaceae en México. Anales del Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Serie Botánica, 73: 155-281p. 2002.

HACKETT, S. J. AND C. A. LEHN. Lack of genetic divergence in a genus of Neotropical birds (Pteroglossus): The connection between life-history characteristics and levels of genetic divergence. Pp. 267-280. In: Studies in Neotropical Ornithology honoring Ted Parker (J. V. Remsen, Jr. , ed.).: American Ornithologists’ Union. 1997.

HAMRICK, J. L. The distribution of genetic variation within and among natural plant population, 335-348p. In: SCHONE-WALD-COX, C.M.; CHAMBERS, S.H.; MacBYDE, B.; THOMAS, L. Genetics and conservation. Menlo Park: Califórnia: Benjamin Cummings Publishing Company.1983.

HE G.; PRAKASH, C.S. Identification of polymorphic DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogea L.). Euphytica, 97: 143–149p. 1997.

HOBBS, R.J. & MOONEY, H.A. Invasive species in a changing world: the interaction between global change and invasives, 285–309p. In: H.A. MOONEY, R.N. MACK, J.F. MCNEELY, L.E. NEVILLE, P.J. SCHEI AND J.K. WAAGE (eds). Invasive alien species. Island Press. 2005.

HOLDEREGGER, R.; STEHLIK, I; SMITH, R.I.; ABBOTT, LR.J. Populations of Antarctic Hairgrass (Deschampsia antarctica) Show Low Genetic Diversity. Arctic, Antarctic, and Alpine Research, 35: 214–217p. 2003.

HONGTRAKUL, V.; HUESTIS, G.M.; KNAPP, S.J. Amplified fragment length polymorphisms as a tool for DNA fingerprinting sunflower germplasm: genetic diversity among oilseed inbred lines. Theoretical and Applied Genetics, 95: 400-407p. 1997.

HUSBAND, B.C.; BARRETT, S.C.H. A metapopulation perspective in plant population biology. Journal of Ecology, 84: 461–469p. 1996.

JIANG, Q.; GRESSHOFF, P.M. 1997. Classical and molecular genetics of the model legume Lotus japonicus. Molecular Plant-Microbe Interactions, 10: 59-68p. 1997.

JÜRGENS, A.; WEBBER, A.C.; GOTTSBERGER, G. Floral scent compounds of Amazonian Annonaceae species pollinated by small beetles and thrips. Phytochemistry, 55: 551-558p. 2000.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

KAGEYAMA, P.Y. Conservação in situ de recursos genéticos de plantas. IPEF, 35: 7-37p. 1987.

KAGEYAMA, P.Y.; SEBBENN, A.M.; RIBAS. L.A; GANDARA, F.B.; CASTELLEN, M; PERECIM, M.B; VECOVSKY, R. 2003. Diversidade genética em espécies arbóreas tropicais de diferentes estágios sucessionais por marcadores genéticos. Scientia Forestalis, 64: 93-107p. 2003.

KITA, K.K.; SOUZA, M.C. Levantamento florístico e fitofisionomia da lagoa Figueira e seu entorno, planície alagável do alto rio Paraná, Porto Rico, Estado do Paraná, Brasil. Maringá, 25: 145-155p. 2003.

KORMAN, V. 2003. Proposta de integração das glebas do Parque Estadual de Vassununga (Santa Rita do Passo Quatro, SP). Dissertação de Mestrado. Escola Superior Agrícola Luiz de Queiroz, ESALP-USP. 135p. 2003.

KÜHN, I.; KLOTZ, S. Urbanization and homogenization – Comparing the floras of urban and rural areas in Germany. Biological Conservation, 127: 292-300p. 2006.

LA SORTE, F.A.; MCKINNEY, M. L.; PYEK, P.; KLOTZ, S.; RAPSO, G.L. CELESTI- GRAPOW, L.; K. THOMPSON. Distance decay of similarity among European urban floras: the impact of anthropogenic activities on diversity. Global Ecology and Biogeography, 1-9p. 2007.

LACERDA, D.R.; ACEDO, M. D. P.; FILHO, J.P.L.; LOVATO, M. B. 2002. A técnica de RAPD: uma ferramenta molecular em estudos de conservação de plantas. Lundiana, 3(2): 87-92p. 2002.

LAKSHMI, M.; PARANI, M.; RAM, N.; PARIDA, A. Molecular phylogeny of mangroves VI. Intraspecific genetic variation in mangrove species Excoecaria agallocha L. (Euphorbiaceae). Genome, 43: 110–115p. 2000.

LANDER, E.S.; WEINBERG, R.A. Genomics: journey to the century of biology. Science, 287 (5459): 1777-1782p. 2000.

LAURANCE, W.F. Edge effects in tropical forest fragments: application of a model for design of nature reserves. Biological Conservation, 57: 205-219p. 1991.

LAURANCE, W.F.; BIERREGAARD-JR., R.O. Tropical forest remnants: ecology, management and conservation of fragmented communities. Chicago: The University of Chicago Press. 504p. 1997.

LEITE, A.V.L.; ANDRADE, L.H.C. Riqueza de espécies e composição florística em um ambiente de duna após 50 anos de pressão antrópica: um estudo na Praia de Boa Viagem, Recife, PE – Brasil. Universidade Federal de Santa Catarina, UFSC. Biotemas, 171: 29-46p. 2003.

LESLEY J.W.; MANN MARGARET C. Triploidy in the Tomato. Science, 61(1573): 208– 208. 1925. 31

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

LIU B.; WENDEL J.F. Intersimple sequence repeats (ISSR) polymorphisms as a genetic marker system in cotton. Molecular Ecology Notes, 1: 205–208p. 2001.

LOBÃO, A.Q., ARAÚJO, D. S. D.; KURTZ, B.C. Annonaceae das Restingas do Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Rodriguésia, 56(87): 85-96p. 2005.

LOCKWOOD, J.L. How do biological invasions alter diversity patterns? Frontiers of biogeography: new directions in the geography of nature (ed. by M.V. Lomolino and L.R. Heaney), Sinauer, 297– 309p. 2004.

LOVEJOY, T.E. ; BIERREGAARD, R.O. JR.; RYLANDS, A.B.; MALCOLM, J.R.; QUINTELA, C.E.; HARPER, L.H.; BROWN, K.S. JR.; POWELL, A.H.; POWELL, G.V.N.; SCHUBART, H.O.R.; HAYS, M.B. . Edge and other effects if isolation on Amazon Forests fragments. 257-285p. In: SOULÉ, M.E. (Ed.). Conservation biology: the science of scarcity and diversity. Sunderland: Sinauer Associates. 1986.

MAAS P.J.M.; KAMER H.M.; JUNIKKA L., MELLO-SILVA R.; RAINER H. 2001. Annonaceae from Central-eastern Brazil. Rodriguésia 52: 65-98p.

MACK, R.N., SIMBERLOFF, D., LONSDALE, W.M., EVANS, H., CLOUT, M.; BAZZAZ, F.A. Biotic invasions: causes, epidemiology, global consequences, and control. Ecological Applications, 10: 689–710p. 2000.

MARIMON, B.S. LIMA, E. DE S.; DUARTE, T. G.; CHIEREGATTO, L.C.; RATTER, J. Observations on the vegetation of Northeastern Mato Grosso, Brazil: An Analysis of the Cerrado – Amazonian forest ecotone. Edinburgh Journal of Botany, 63 (2&3): 323– 341p. 2006.

MARKERT, C.L.; MOLLER, F. Multiple forms of enzyme: tissues, ontogenetic, and species specific patterns. Proceedings of the National Academic of Sciences, 45: 753- 763p. 1959.

MARKWITH, S.H.; SCANLON, M.J. Multiscale analysis of Hymenocallis coronaria (Amaryllidaceae) genetic diversity, genetic structure, and gene movement under the influence of unidirectional stream flow. American Journal of Botany, 94(2): 151– 160p. 2007.

MCNEELY, J.A. Human dimensions of invasive alien species. Invasive alien species (ed. by H.A. Mooney, R.N. Mack, J.F. McNeely, L.E. Neville, P.J. Schei and J.K. Waage), 285– 309p. Island Press, Washington, DC. 2005.

MEN, A.E.; BORISOV, A.Y.; ROZOV, S.M.; USHAKOV, K.V.; TSYGANOV, V.E.; TIKHONOVICH, I.A.; GRESSHO, P.M. Identification of DNA amplification fingerprinting (DAF) markers close to the symbiosis-ineffective sym31 mutation of pea (Pisum sativum L.). TAG Theoretical and Applied Genetics, 98: 929-936p. 1999.

MILLACH, S.C.K. Marcadores moleculares nos recursos genéticos e no melhoramento de plantas. In: Recursos Genéticos e Melhoramento de Plantas para o Nordeste

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Brasileiro. Editora Embrapa Semi-árido, Petrolina-PE/ Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Distrito Federal – DF. 1999.

MIRANDA-MELO, A.A.; MARTINS, F.R.; SANTOS, F.A.M. Estrutura populacional de Xylopia aromatica (Lam.) Mart. e de Roupala montana Aubl. em fragmentos de cerrado no Estado de São Paulo. Revista Brasileira de Botânica 30(3): 501-507p. 2007.

MMA – MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, DOS RECURSOS HÍDRICOS E DA AMAZÔNIA LEGAL. Avaliação e ações prioritárias para a conservação da biodiversidade da Mata Atlântica e Campos Sulinos. Conservation International do Brasil, Fundação SOS Mata Atlântica e Fundação Biodiversitas, Brasília. 2000.

MOMOSE, K.; NAGAMITSU, T.; INOUE, T. Thrips crosspollination of Popowia pisocarpa (Annonaceae) in a lowland dipterocarp forest in Sarawak. Biotropica, 30: 444–448p. 1998.

MORGANTE, M.; OLIVIERI, A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. The Plant Journal, 3(1): 175-182p. 1993.

MOTHLEY, T.; LAUREN, R. Origins, Evolution, and Systematics of Hawaiian and Pacific Chamaesyce (Euphorbiaceae). Botany Conference. 2004.

MYERS, N.; MITTERMEIER, R.A.; MITTERMEIER, C.G.; FONSECA, G.B.; KENTS, J. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature, 403: 853-858p. 2000.

NAGAMITSU, T.; INOUE, T. Cockroach pollination and breeding system of Uvaria elmeri (Annonaceae) in a lowland mixed-dipterocarp forest in Sarawak. American Journal of Botany, 84: 208–213p. 1997.

NETO, C.M.U.; TABARELLI, M. Diagnóstico e Estratégia de Conservação do Centro de Endemismo Pernambuco. Centro de Pesquisas Ambientais do Nordeste – CEPAN, Conservation International do Brasil, 69p. 2002.

OHNISHI Y.; SUZUKI N.; KATAYAMA N.; TERANISHI S. Seasonally different modes of seed dispersal in the prostrate annual, Chamaesyce maculata (L.) Small (Euphorbiaceae), with multiple overlapping generations. Ecology Research, 23: 299- 305p. 2008.

OLIVEIRA, N.S. Variabilidade genética em populações de Ricinus communis (Euphorbiaceae) pela metodologia DAF (DNA Amplification Fingerprinting). Dissertação de Mestrado, UFPE, 73p. 2004.

OLIVEIRA, P.E.A.M., RIBEIRO, J.F.; GONZALES, M.I. Estrutura e distribuição espacial de uma população de Kielmeyera coriaceae Mart. De cerrados de Brasília. Revista Brasileira de Botânica, 12: 39-47p. 1989.

OLIVEIRA, R.R. . Mata Atlântica Paleoterritórios e História Ambiental. Ambiente & Sociedade 10(2): 11-23p. 2007.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

OLIVEIRA-FILHO, A.T.; RATTER, J.A. Padrões florísticos das matas ciliares da região do Cerrado e a evolução das paisagens do Brasil central durante o quaternário tardio. In: RODRIGUES, R.R. & LEITÃO-FILHO, H.F. (eds.). Matas ciliares: conservação e recuperação. Editora EDUSP, 73-90p. 2000.

OUBORG, N.J.; PIQUOT, Y.; VAN GROENENDAEL, J.M. Population genetics, molecular markers and the study of dispersal in plants. Journal of Ecology, 87: 551- 568p. 1999.

OYAMA, K. Genetic differentiation among populations of Arabis serrata (Brassicaceae) along its geographic distribution. Plant Systematics Evolution, 213:91-102. 1998.

PATZAK, J. Comparison of RAPD, STS, ISSR and AFLP molecular methods used for assessment of genetic diversity in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica, 121: 9–18p. 2001.

PEMBERTON, R.W. Myrmechorchory in the introduced range weed, leafy spurge (Euphorbia esula L.). American Midland Naturalist, 119(2):431-435p. 1988.

PINTO, L.P. AND BRITO. C.W. Dinâmica da perda da biodiversidade na Mata Atlântica brasileira: uma introdução. Belo Horizonte: SOS Mata Atlântica / Conservation International do Brasil

QUIROS, C.F. Solanaceae: Tomato (Lycopersicon esculentum). Disponível em: . Acesso em 22 de Dezembro de 2008.

REDFORD, K.H. The empty forest. BioScience, 42: 412-422p. 1992.

REMUS, J. Status of two endangered Florida species of Chamaesyce (Euphorbiaceae). Florida Scientist, 42 (3):130-137p. 1979.

RESTREPO, C.; GOMEZ, N. Responses of understory birds to anthropogenic edges in a Neotropical montane forest. Ecological Applications, 8: 170-183p. 1998.

RESTREPO, C.; GOMEZ, N.; HEREDIA, S. Anthropogenic edges, treefall gaps and fruit- frugivore interactions in a neotropical montane forest. Ecology, 80: 668-685p. 1999.

RICHARDSON, J.E.; CHATROU, L.W.; MOLS, J.B; ERKENS, R.H. J.; PIRIE, M.D. Historical biogeography of two cosmopolitan families of flowering plants: Annonaceae and Rhamnaceae. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 359: 1495– 1508p. 2004.

RICK, C.M.; YODER, J.I. Classical and molecular genetics of tomato highlights and perspectives. Annual Review of Genetics, 22: 281-300p. 1988.

ROGALSKI, J.M.; BERKENBROCK, I.S.; REIS, A; REIS, M.S. Sucessão e manutenção da diversidade biológica e da variabilidade genética: ferramentas básicas para 34

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

restauração ambiental. Sobrade, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, 8p. 2003.

SANTANA, C.A; LIMA, K.C.D.; MAGALHÃES, L.M.S. Fragmentos florestais urbanos e periurbanos: estudos na cidade do rio de janeiro. Acta Scientiarium. No prelo. 2005.

SANTOS, M.O.; COELHO, A.D.F.; MONTANARI; R.M.; E.S. PINTO; Viccini, L.F. Variabilidade genética entre populações de lobeira (Solanum lycocarpum). Floresta e Ambiente, 9(1) 158 – 164p. 2002.

SAUNDERS, D.A.; HOBBS, R.J.; MARGULES, C.R. Biological consequences of ecosystem fragmentation: a review. Conservation Biology, 5: 12-32p. 1991.

SCHARASCHKIN, T.; DOYLE, J.A. Character evolution in Anaxagorea (Annonaceae). American Journal of Botany, 93(1): 36–54p. 2006.

SILVA, A.J.R.; ANDRADE, L.H.C. Etnobotânica nordestina: estudo comparativo da relação entre comunidades e vegetação na Zona do Litoral - Mata do Estado de Pernambuco, Brasil. Acta Botanica. Brasílica, 19(1): 45-60p. 2005.

SILVA, H.C.; POLLITO, P.A.Z.; SEGOVIA G.V. Status de conservación de lãs espécies vegetales silvestres de uso tradicional em la província de Canta, Lima-Peru. Ecología Aplicada, 4: 9-16p. 2005.

SILVA, J.M.C. & CASTELETI, C.H.M. Estado da biodiversidade da Mata Atlântica brasileira. Belo Horizonte: SOS Mata Atlântica/Conservation-International, 2005.

SLOTTA, T.A.B.; POTTER, D.M. Genetic variation within and between Iliamma corei and I. remota (Malvaceae): implications for species delimitation. Botanical Journal of the Linnean Society, 151: 345-354p. 2006.

SOLE DE PORTA, N. Algunos generos nuevos de polen procedentes de la formación Guaduas (Maastrichtiense-Paleocene) de Colombia. Stud. Geol. Salamanca, 2: 133– 143p. 1971

SOUZA, V.Q.; PEREIRA, A.S.; KOPP, M.M.; COIMBRA, J.L.M.; CARVALHO, F.I.F.; LUZ, V.K.; OLIVEIRA, A.C. Dissimilaridade genética em mutantes de aveia tolerantes e sensíveis a ácidos orgânicos. Bragantia, 64(4): 569-575p. 2005.

STADLER, J.; TREFTLICH, A.; KLOTZ, S.; BRANDL, R. Exotic plant species invade diversity hot spots; the alien flora of northwestern Kenya. Ecography, 23:169-176p. 2000.

SU, Y.C.F.; SMITH, G.J.D.; SAUNDERS, R.M.K. Phylogeny of the basal angiosperm genus Pseuduvaria (Annonaceae) inferred from five chloroplast DNA regions, with interpretation of morphological character evolution. Molecular Phylogenetics and Evolution, 48: 188–206p. 2008.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

SUN, M. Effects of population size, mating system, and evolutionary origin on genetic diversity in Spiranthes sinensis and S. hongkongensis. Conservation Biology, 10(3): 785-795p. 1996.

TABARELLI M.; MARINS J.F.; SILVA J.M.C. La biodiversidad brasileña amenazada. Investigación y Ciencia (in press). 2002.

TABARELLI, M.; MANTOVANI, W.; PERES, C.A. Effects of habitat fragmentation on plant guild structure in the montane Atlantic forest of southeastern Brazil. Biological Conservation, 91: 119-127p. 1999.

TAURA, H.M.; LAROCA S.; BARBOSA J.F.; RODRIGUES J. Melissocenótica (Hymenoptera, Anthophila) no Parque Florestal dos Pioneiros, Maringá, PR. (sul do Brasil) — I. Abundância relativa e diversidade. Acta Biológica Paranaense, 36(1-2): 47-65p. 2007.

TAVARES, M.C.G.; RODAL, M.J.N.; MELO, A.L.; ARAÚJO, M.F. Fitossociologia do componente arbóreo de um trecho de Floresta Ombrófila Montana do Parque Ecológico João Vasconcelos Sobrinho, Caruaru, Pernambuco. Naturalia, 25: 17-32p. 2000.

TERBORGH, J. The Big things that run the world – a sequel to E.O. Wilson. Conservation Biology, 2: 402-403p. 1988.

TORIOLA, D. Fruiting of a 19-year old secondary forest in French Guiana. Journal of Tropical Ecology, 14: 373-379p. 1998.

TSUMURA, Y.; OHBA, K.; STRAUSS, S. H. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theoretical and Applied Genetics, 92: 40-45p. 1996.

VAN DEN BERG, E.; OLIVEIRA FILHO, A.T. Composição florística e fitossociologia de uma Floresta Estacional Semidecidual Montana em Itutinga, MG, e comparação com outras áreas. Revista Brasileira de Botânica, 22: 231-253p. 2000.

VAN EE, B.W.; JELINSKI, N.; BERRY, P.E.; HIPP, A. L. Phylogeny and biogeography of Croton alabamensis (Euphorbiaceae), a rare shrub from Texas and Alabama, using DNA sequence and AFLP data. Molecular Ecology, 15: 2735–2751p. 2006.

VAN HEUSDEN, E.C.H. Flowers of Annonaceae: morphology, classification and evolution. Blumea Supplement 7: 1–218p. 1992.

VAN TOL, I.A.V.; MEIJDAM, N.A.J. Field research on pollination and seed dispersal of Annonaceae (Soursop family). Unpublished internal report, Projectgroep Herbarium, Rijksuniversiteit Utrecht. 1991.

VILLELA, P.M.S. Caracterização genética de populações de jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris), utilizando marcadores microssatélites. Dissertação de Mestrado, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Quieiroz”, Piracicaba, 127p. 2004.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

VITOUSEK, P.M.; D’ANTONIO, C.M.; LOOPE, L.L.; REJMÁNEK, M.; WESTBROOKS, R. Introduced species: a significant component of human-caused global change. New Zealand Journal of Ecology, 21: 1–16p. 1997.

VOELKER, R.A.; SCHAFER, H.E.; MUKAI, T. Spontaneous allozyme mutations in Drosophila melanogaster: rate of occurrence and nature of mutants. Genetics, 94: 961- 968p. 1980.

WADT, L.H.O.; KAGEYAMA, P.Y. Estrutura genética e sistema de acasalamento de Piper hispidinervum. Pesquisa Agropecuária Brasileira,39(2): 151-157p. 2004.

WAGNER, W.L.; HERBST D.R.; SOHMER S.H. Manual of the Flowering Plants of Hawai‘i. Revised edition. Vol. 2. University. of Hawai‘i Press/Bishop Museum Press. 1357p. 1999.

WANG, Z.; GAO, H.W.; WU, Y.Q.; HAN, J.G. Genetic Diversity and Population Structure of Caragana korshinskii Revealed by AFLP. Crop Science, 47: 1737-1743p. 2007.

WILLIAMS, J.G.K.; HANAFEY, M.K.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.V. Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers. Methods in Enzymology, 218:704-740p. 1993.

WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18: 6531-6535p. 1990.

WINTER, P.; BENKO-ISEPPON, A.M.; HUTTEL, B.; RATNAPARKHE, M.; TULLU, A.; SONNANTE, G.; PFAFF, T.; TEKEOGLU, M.; SANTRA, D.; SANT, V.J.; RAJESH, P.N.; KAHL, G.; MUEHLBAUER, F.J. A linkage map of the chickpea (Cicer arietinum L.) genome based on recombinant inbred lines from a C. arietnum x C. reticulatum crosss: localization of resistance genes for fusarium wilt races 4 and 5. TAG Theoretical and Applied Genetics, 101: 1155-1163p. 2000.

WOLFE, A.D.; RANDLE, C.P. Relationships within and among species of the holoparasitic genus Hyobanche (Orobanchaceae) inferred from ISSR banding patterns and nucleotide sequences. Systematic Botany, 26(1): 120-130p. 2001.

WOODS, K.; HILU, K.W.; WIERSEMA, J.H.; BORSCH, T. Pattern of variation and systematic of Nymphaea odorata: I. evidence from morphology and inter-simple sequence repeats (ISSRs). Systematic Botany, 30:471-480p. 2005.

XIAO, L.Q.; GE, X.J.X.; GONG HAO, G.; ZHEN, S.X. ISSR Variation in the Endemic and Endangered Plant Cycas guizhouensis (Cycadaceae). Annals of Botany, 94: 133- 138p. 2004.

YE, Y.M.; ZHANG, J.W.; NING, G.G; BAO, M.Z. A comparative analysis of the genetic diversity between inbred lines of Zinnia elegans using morphological traits and RAPD and ISSR markers. Scientia Horticulturae, 118: 1–7p. 2008. 37

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

YOUNG, A.G.; MERRIAN, H.G.; WARWICK, S.I. The effects of forest fragmentation on genetic variation in Acer saccarum Marsh. (sugar maple) populations. Heredity, 71(4): 277-289p. 1993.

ZIETJIEWICZ, E.; RAFALSKI, A.; LABUDA, D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20: 176-183p. 1994.

4. MANUSCRITO DO ARTIGO CIENTÍFICO

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

ESTRUTURA E DIVERSIDADE POPULACIONAL EM DUAS ESPÉCIES DE Chamaesyce (C. hirta L. E C. thymifolia Millsp.; EUPHORBIACEAE) PRESENTES EM DOIS FRAGMENTOS URBANOS DE RECIFE (BRASIL) ATRAVÉS DO MARCADOR DAF (DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING).

A ser submetido ao periódico

Genetics and Molecular Research

Ribeirão-Preto, SP, Brasil

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

ESTRUTURA E DIVERSIDADE POPULACIONAL EM DUAS ESPÉCIES DE Chamaesyce (C. hirta L. E C. thymifolia Millsp., EUPHORBIACEAE) PRESENTES EM DOIS FRAGMENTOS URBANOS DE RECIFE (BRASIL) ATRAVÉS DO MARCADOR DAF (DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING).

Pinangé, D. S. B. (1); Cruz, G. A. S(1). Santana, K. C. B.(1); Torres, R. A. (2) Araújo, M. F.(3); Alves, M. V.(3) e Benko-Iseppon, A.M.(1,4)

(1)Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Genética, Av. Prof. Moraes Rego, s/no, CEP 50732-970, Recife – PE. E-mail: [email protected]

(2) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Zoologia, Av. Prof. Moraes Rego, s/no, CEP 50732-970, Recife – PE.

(3) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Botânica, Av. Prof. Moraes rego, s/no, CEP 50732-970, Recife – PE. (1)Author for correspondence.

Resumo A Floresta Atlântica nordestina constitui-se em um cenário de extinção local e global de espécies, especialmente quando considerada a riqueza em endemismos regionais e seu estado progressivo de fragmentação. Muitos desses fragmentos estão localizados em centros urbanos, com níveis de antropização observados. O gênero Chamaesyce Gray. (Euphorbiaceae) destaca-se pela presença de espécies-chave nos processos iniciais da mata, especialmente na recuperação de solos, apresentando membros com grande plasticidade adaptativa a diferentes ambientes, inclusive aqueles com níveis de antropização significativos. Analisaram-se populações urbanas e peri- urbanas de duas espécies herbáceas (Chamaesyce hirta e C. thymifolia) no entorno de fragmentos de Mata em Recife. Para isso foi utilizada a metodologia de DAF, aplicando-se 10 primers em 30 indivíduos (15 de cada espécie), distribuídos em duas populações do entorno da Reserva de Dois Irmãos. A análise dos polimorfismos gerados incluiu a geração de um fenograma (método Neighbor-Joining, Bootstrap de 1.000 replicações), bem como cálculo de Gst e. A matriz gerou 258 loci polimórficos. Em C. hirta, Gst foi de 0.1815 e Nm igual a 2.2547, diferindo dos valores encontrados para C. thymifolia, que apresentou 183 loci polimórficos e valores 40

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

respectivos de Gst e Nm de 0.2977 e 1.1777. O fenograma gerado apresentou dois grupos principais, sendo os indivíduos separados coerentemente em níveis específicos, porém com diferenças populacionais para C. hirta. Os valores de diversidade e fluxo gênico obtidos em Chamaesyce, quando comparados com os padrões (Gst ≥ 0,25 e Nm ≥ 1), denotaram diferenças no padrão de conexão das populações nas duas espécies, com níveis de estruturação distintos. A metodologia de DAF mostrou-se eficiente para a análise de diversidade e estrutura populacional de espécies naturais.

Palavras-Chave: Floresta Atlântica, conectividade, marcadores moleculares, bioindicadoras, polimorfismos.

Introdução

A Mata Atlântica possui alta diversidade biológica e endemismo, tratando-se de um dos ecossistemas mais ameaçados do mundo, despontando como um dos cinco mais importantes “hot spots” na conservação da biodiversidade do planeta (Myers et al., 2000). Desde as primeiras fases da colonização do Brasil esta floresta tem passado por processos de transformação, onde atualmente a maior parte dos ecossistemas nativos foi eliminada, resultando na destruição de habitats ricos em recursos biológicos (Andrade et al., 2003). Para o estado de Pernambuco reportou-se que 48% dos fragmentos florestais remanescentes seriam menores que 10 ha., com apenas 7% maiores que 100 ha. (Meunier, 1998). Euphorbiaceae apresenta grande riqueza e endemismos na região nordeste do Brasil. Chamaesyce destaca-se pela presença de espécies pioneiras e bioindicadoras de ambientes degradados. As plantas deste gênero em geral possuem grande plasticidade quanto a seus mecanismos de adaptação a ambientes degradados, tratando-se de um grupo de ampla ocorrência (Erasmo et al., 2004), o que desperta o interesse de pesquisadores para o entendimento dos processos ecológicos, genéticos e biossistemáticos do grupo. Poucos têm sido os estudos envolvendo populações de Chamaesyce, no entanto um trabalho relevante, aplicando marcadores moleculares, foi conduzido por Morden & Gregoritza (2005), que utilizaram a metodologia de RAPD associada ao seqüenciamento da região de ITS do DNAr na investigação filogenética em duas populações de C. skottsbergii var. skottsbergii oriundas do Havaí. No trabalho 30 primers foram utilizados em 84 indivíduos das duas populações. Foram encontrados 340 loci polimórficos (numa taxa de 20-46 loci por primer) tanto intra como interpopulacional. O Gênero Chamaesyce é 41

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... caracterizado por incluir espécies ocorrentes em fragmentos urbanos, bioindicadores de ambientes com níveis de antropização acentuada, tratando-se de importantes modelos de estudos de diversidade e conectividade populacional. Embora o Brasil seja detentor de porção significativa da diversidade vegetal do planeta, estudos com marcadores de DNA têm sido na sua maioria direcionada a plantas cultivadas ou, menos freqüentemente, ao esclarecimento de relações filogenéticas em nível interespecífico ou em níveis taxonômicos maiores. O presente estudo visou à análise da diversidade e estrutura genética de duas populações de espécies simpátricas do gênero Chamaesyce (C. hirta L. e C. thymifolia Millsp.) ocorrentes em fragmentos urbanos, visando auxiliar no esclarecimento futuro da diversidade, dos mecanismos adaptativos e da dinâmica populacional existente na região.

Materiais e Métodos

Coleta de Material Biológico Representantes de Chamaesyce hirta e C. thymifolia foram coletados em fragmentos de mata atlântica na cidade de Recife, localizados no entorno da Reserva Ecológica de Dois Irmãos e áreas do entorno da mata .(Apipucos – área 1, Ilha do Bananal – área 2, Estrada dos Passarinhos – área 3) e do campus Universidade Federal de Pernambuco – área 4. Estas áreas são compostas em sua maioria por mata de capoeira e vegetação higrófila, sob forte interferência antrópica.

Extração de DNA Genômico Folhas jovens e livres de patógenos foram coletadas no campo, sendo transportadas em local fresco para posterior extração do DNA genômico. O isolamento foi realizado conforme o protocolo descrito por Weising et al. (2004), com modificações no que concerne à proporção do material utilizado (1 g), tampão de extração (15 mL) e ainda em relação à purificação do material extraído, onde este foi submetido apenas uma vez no CIA (Clorofórmio/Álcool isoamílico; proporção 24:1). A quantificação do DNA total foi efetuada pelo método comparativo em gel de agarose a 1,2 % usando-se diferentes concentrações de λ-DNA de 50 ng como referencial.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Geração dos Dados Moleculares A geração de marcadores DAF seguiu metodologia descrita por Caetano-Anollés et al. (1991), com as modificações introduzidas por Winter et al. (2000) e Benko-Iseppon et al. (2003). A reação foi composta por 5ng/µL de DNA0,5 µL de DNA), 1,5 µL 10x PCR buffer, 2,5 mM de MgCl2, 10 mM de dNTP-mix (LGC), 20 µM de primers decâmeros e 0,2 µL (concentração final de 1 U) de ‘Taq DNA polimerase’ com volume final da reação de 15 µL. A amplificação da reação ocorreu em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradiente com 2 min de desnaturação inicial a 95°C, seguidos de 40 ciclos compostos de três etapas: desnaturação de 15 seg a 95°C; anelamento de 1 min a 35°C e alongamento final de 2 min a 72°C. Ao final dos 40 ciclos a reação foi completada com um alongamento final de 2 min a 72°C. Os produtos amplificados foram separados em gel de agarose (1,8%), corados com brometo de etídio (5 µL/100 mL de gel), sendo visualizados sob luz ultravioleta e fotografados com câmera digital Sony Cybershot W5 (zoom óptico 3.0 Megapixel).

Seleção e Aplicação dos Primers mais informativos. Inicialmente, quatro indivíduos das localidades das áreas 2, 3 e 4 foram utilizados para seleção dos primers mais polimórficos (Tabela 1), sendo três da espécie C. hirta (indivíduos 1 e 2, coletada na área 3 e indivíduo 1 da área 4 e uma da espécie C. thymifolia (indivíduo 5 coletado na área 2). Foram utilizados 41 decâmeros para uma etapa de seleção inicial usando-se os 10 primers mais informativos para amplificação de marcadores em 30 indivíduos, sendo 15 por espécie. No que se refere às populações, 10 indivíduos de cada espécie foram oriundos do bairro de Apipucos e cinco da Ilha do Bananal (Figura 1 e Tabela 2), onde indivíduos desta última localidade foram utilizados nas duas fases da geração dos marcadores DAF (seleção e aplicação) devido a sua co-ocorrência.

Análise de Polimorfismos Analisou-se tanto a variabilidade (Tabela 3) quanto a estrutura genética das populações estudadas (Tabela 4). Assim, os géis, depois de fotografados, foram analisados pelo critério visual de presença (1) e ausência (0) de bandas (fragmentos de DNA) para cada tamanho (peso molecular) encontrado nos distintos iniciadores, gerando matrizes

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... binárias para duas finalidades: similaridade genética e estimativas de estrutura - fluxo gênico (Nm) e diversidade genética (Gst), segundo Yeh et al. (1999). Foi realizada uma matriz binária para análise da variabilidade, pelo método

NEIGHBOR-JOINING (bootstrap de 1.000 replicações), com os parâmetros ajustados para p- distance, através do programa MEGA 4.1, gerando um fenograma (Figura 2). Dos 30 indivíduos analisados, três foram excluídos (01, 02 e 08 da população de Apipucos, pertencentes à espécie C. hirta) por apresentarem valores de bootstrap ainda mais significativos. Já a matriz gerada para as análises populacionais, foi analisada pelo programa PopGene v.32 (Yeh & Boyle, 1997), sendo este usado para determinar a diversidade genética e inferência de fluxo gênico a partir dos índices de Gst e Nm.

Resultados

As observações de campo apontaram tanto uma maior ocorrência, bem como uma maior diversidade fenotípica em indivíduos da espécie C. hirta, diferentemente dos indivíduos de C. thymifolia, que se apresentaram mais homogêneos e com uma distribuição mais restrita nos plots visitados em comparação a primeira. Os 41 primers randômicos testados nos quatro indivíduos amplificaram 920 fragmentos de DNA, dos quais 760 (82,6%) foram polimórficos (Tabela 3). Dentre as bandas polimórficas 173 foram geradas a partir da espécie C. hirta quando comparada em nível intra-populacional (entre os indivíduos da Estrada dos Passarinhos), 217 quando comparadas em nível inter-populacional (entre as áreas 3 e 4), enquanto que 370 fragmentos foram polimórficos em nível interespecífico. Os níveis de polimorfismo foram significativos, onde 48,6% do polimorfismo ocorreu interespecificamente, 28,1%, interpopulacional e 22,76%, intrapopulacional. A partir da aplicação dos 10 primers mais informativos nos 30 indivíduos das duas populações analisadas foram gerados 350 loci polimórficos, compreendendo 2.048 marcas de DNA. Dos fragmentos gerados, o primer que mais contribuiu foi o OPA-04 com 44 loci amplificados (12,57%), enquanto o que obteve menor número de loci foi o primer OPI-1, com 30 loci, representando 8,57%.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Para C. hirta foram obtidos 257 loci polimórficos em nível interpopulacional, enquanto para C. thymifolia, 158 loci foram suscitados. No que tange às análises intrapopulacionais, os indivíduos de C. hirta provenientes da população de Apipucos deram origem a 223 bandas, ao passo que aqueles oriundos da população da Ilha do Bananal resultaram em 112. Para C. thymifolia esses valores para Apipucos e Ilha do Bananal foram de 129 e 44, respectivamente (Tabela 4). Ilustração dos marcadores gerados pode ser visualizada pelo perfil de fragmentos de DAF obtidos após corrida eletroforética do primer P15-1 (Figura 2). O fenograma gerado a partir do programa MEGA 4.1 pelo método de Neighbor- Joining revelou uma separação tanto em nível específico quanto populacional para C. thymifolia. No caso de C. hirta, houve separação em nível específico, o que não ocorreu em nível populacional. No fenograma foi possível identificar a divisão de grupos de espécies (I e II) e clara subdivisão populacional, com a maioria dos valores de bootstrap acima de 50 (Figura 3). Os valores referentes à análise de estrutura genética apresentaram médias de Gst e Nm, em 258 loci analisados de C. hirta, 0,1815 e 0,2547 respectivamente. Por sua vez, os espécimes de C. thymifolia apresentaram valores respectivos de Gst e Nm iguais a 0,2977 e 0,1797, quando considerados os 183 loci desta espécie (Tabela 5).

Discussão

Análise de diversidade genética via marcadores moleculares de DNA, têm contribuído significativamente para o entendimento dos processos históricos (bióticos e abióticos) que modulam a diversificação intraespecífica da biota, especificamente a diversidade populacional (Avise, 2000; Posada & Crandall 2001; Brant & Ortí 2003). Nas análises de diversidade genética em vegetais, diversos tipos de marcadores genéticos vêm sendo utilizados. Os marcadores constituídos por primers de sequências arbitrárias como DAF (DNA Amplification Fingerprinting; Impressão genômica do DNA amplificado), são importantes, pois fornecem dados informativos, primordialmente quando inexiste conhecimento genético prévio da espécie a ser estudada, tanto em nível de estudos fenéticos quanto filogenéticos. As espécies de Chamaesyce estudadas no presente trabalho, classificam-se na formação anterior, onde as sequências de DNA são desconhecidas 45

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Os dados moleculares oriundos do DAF foram consistentes, em relação ao número de loci polimórficos acessados nas populações das duas espécies (uma vez que para C. hirta 257 marcas polimórficas foram encontradas, ao passo que em C. thymifolia observaram-se 158 bandas).. Este fato pode ser corroborado pelo trabalho realizado por Simon et al., (2007), onde foram geradas 212 marcas polimórficas em acessos de Vigna revelando uma elevada consistência na estimativa da diversidade genética dos diferentes acessos, assim como observados no presente trabalho para as duas espécies. Inferências de reprodutibilidade foram realizadas no estudo da diversidade em espécies de Araceae a partir da utilização dos marcadores DAF, onde foram realizadas repetições das reações de DAF constatando que os resultados obtidos foram altamente reprodutíveis (dados não publicados de nosso grupo). Neste contexto, o presente trabalho é suportado em termos metodológicos uma vez que faz uso do mesmo protocolo. Os dados obtidos permitiram a identificação dos níveis de polimorfismo das duas espécies, onde C. hirta apresentou-se mais polimórfica nos dois níveis inter e intrapopulacionais, quando comparada a C. thymifolia. Isso pode ser correlacionado com a evidenciação de um hábito diferenciado, a partir do grau de incidência luminosa e a disponibilidade de recursos hídricos da primeira espécie citada. Assim, notificou-se que C. hirta apresentava-se tanto na forma ereta, quanto na condição completamente prostrada, com folhas bastantes reduzidas. De acordo com as diferenças nos níveis de luminosidade, condições edáficas e disponibilidade hídrica, C. hirta apresentou uma maior tolerância adaptativa, colonizando áreas com diferentes condições e. Barros et al., (2005) inferiram que a correlação entre a variabilidade genética e adaptativa em Stylosanthes macrocephala (caracterizada por também apresentar porte de ereto a prostrado) é positiva. Portanto, é admissível sugerir que quanto maior a capacidade em responder as alterações ambientais maior será o seu polimorfismo. Os dados apresentados por Snell & Burch (1975), também fundamentam o que foi citado, em relação aos indivíduos de Chamaesyce. Eles analisaram a capacidade de alocação de recursos em C. hirta e notificaram a alta plasticidade adaptativa em decorrência das mudanças de disponibilidade de recursos. Por sua vez, a espécie C. thymifolia revelou um menor número de loci polimórficos tanto inter quanto intrapopulacional. Sob o aspecto adaptativo, esta espécie mostrou-se menos tolerante às condições do ambiente, uma vez que possuía uma freqüência de ocorrência menor do que C. hirta, indicando resultando em uma ocorrência mais restrita. 46

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Os estudos que correlacionam diversidade genética a partir da mensuração dos lócus polimórficos, com caracteres morfológicos foram conduzidos por Conti et al. (2002), analisando cultivares de morangueiro selvagem (Fragaria xananassa), averiguou a similaridade entre os fenogramas gerados a partir de três tipos de análises, a morfológica, a agronômica e molecular. Este trabalho sugere uma estreita relação entre características morfológicas e moleculares, o que possivelmente respalda o que foi verificado no presente trabalho, em relação a C. hirta. Outro estudo que confirma essa relação é o de Vargas et al. (2006). Neste, 26 populações da espécie de Lolium multiflorum foram estudadas sob os critérios morfológicos e moleculares (RAPD) apresentando uma boa associação entre esses caracteres. A partir do fenograma gerado pelo algoritmo de Neighbor-Joining, percebeu-se a evidente divisão de grupos em nível específico, onde o Grupo I agregou as populações de C. thymifolia e o Grupo II de C. hirta. O valor de bootstrap (98%), que separou as duas populações do Grupo I, foi bastante significativo, revelando uma divergência genética entre as diferentes populações das duas espécies. O grupo II não apresentou o nível de estruturação populacional apresentado no grupo I, percebendo-se pela disposição dos ramos uma miscigenação entre os indivíduos das duas populações para este grupo. De acordo com Ali et al., (2004)., os marcadores que utilizam primers arbitrários constituem-se numa importante ferramenta de acesso à diversidade genética, pois permitem a ecólogos e biólogos evolutivos determinar a arquitetura geral do genoma, verificando como esta interage em uma ampla variedade de indivíduos relacionados proximamente. Neste sentido, os dados de similaridade obtidos foram significativos, pois indicaram graus de correlação entre os indivíduos estudados. Assim, o fornecimento dos dados sobre níveis de divergência e conectividade puderam ser úteis na compreensão destas populações tipicamente urbanas, que possuem pressão de seleção em relação à adaptabilidade e diversidade genética distintos. Os dados acima, quando confrontados com os apresentados pela análise de diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm) mostram acentuada coerência (Tabela 5). De acordo com os valores padrão de cada estimativa (Gst ≥ 0.25 e Nm ≥ 1) percebe-se que C. hirta apresentou um elevado valor de Nm (2.2547) e um baixo valor de Gst (0.1815), indicando uma maior tendência a conectividade entre as populações. Para C. thymifolia o valor de Gst foi de 0,2977 indicando uma forte tendência a estruturação, contudo com uma 47

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... conectividade com valor de Nm 1,17. Percebe-se, portanto, que apesar da simpatria entre as espécies nos dois plots analisados, as populações apresentaram diferenças no padrão de conexão. Os dados de conexão apresentados denotam a importância dos estudos com espécies bioindicadoras de áreas degradadas, uma vez que estas espécies são bastante relevantes no desenvolvimento urbano principalmente, no manejo das Megacidades, onde se faz necessário o desvendamento do panorama genético adaptativo para futuros esforços de preservação e conservação. Outra questão interessante diz respeito à observação do alto polimorfismo encontrado em relação aos níveis de divergência aferidos (Gst e Nm), especialmente em C. hirta, indicando uma possível retenção da variabilidade em suas populações. Uma provável explicação da retenção encontrada no presente trabalho pode ser respaldada por Morden & Gregoritza (2005). Neste estudo foram realizadas análises de marcadores do tipo RAPD em populações de C. skottsbergii (Sherff) Croizat & O.Deg., detectando-se altos níveis de variabilidade genética (>95%). Os autores justificam esta retenção nas populações havaianas pela preferência das flores monóicas dos indivíduos dessa espécie em promover o sistema de fecundação cruzada, o que manteria o alto índice de polimorfismos dentro e entre as populações. Portanto é coerente pensar que um mecanismo similar provavelmente esteja ocorrendo em C. hirta visto que suas flores também são monóicas com altos níveis de variabilidade genética. Em relação aos níveis de conectividade notificados nas populações de C. hirta, um fator que pode sugerir esse panorama diz respeito aos processos de polinização, podendo neste caso ser mais eficientes quando comparado as populações de C. thymifolia. Taura et al. (2007) notificou a presença de abelhas Anthophilas na polinização de indivíduos de C. hirta. Nesse contexto, em áreas urbanas, as atividades humanas criam novos habitats, os quais tornam possível a sobrevivência de algumas espécies de Anthophila. Desta forma, aquelas que ocorrem em áreas antrópicas podem ser favorecidas por locais propícios para nidificação, como também, por recursos alimentares oferecidos pelas flores cultivadas e m parques e jardins (Tischler, 1973; Laroca, Cure & Bortoli, 1982; Taura & Laroca, 2001). Assim o cenário ecológico encontrado nos fragmentos urbanos nas populações de C. hirta sugere esse favorecimento em relação ao padrão de conectividade encontrado. Já para C. thymifolia, não há registros específicos sobre grupos polinizadores. Por tal motivo, assume- se que a polinização é realizada através do que já foi descrito para o gênero Chamaesyce 48

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

(abelhas, moscas e vespas, segundo Ehrenfeld, 1979). Os indícios de estruturação aqui apresentados para as populações de C. thymifolia podem estar relacionados a uma possível menor eficácia desses polinizadores. Os dados apresentados possibilitaram o acesso à variabilidade genética e o entendimento dos aspectos populacionais dos materiais estudados, revelando sua complexidade genético-ecológica. Foi possível inferir dados de conexão populacional de espécies ocorrentes das chamadas “ilhas verdes” em fragmentos urbanos, o que possibilitaria planejamentos na conservação dessas ilhas, visto que são vitais no desenvolvimento de grandes centros urbanos (Benko-Iseppon et al., 2007). A continuidade deste trabalho com a inclusão de um maior número de populações possibilitaria a visualização dos fenômenos biológicos numa escala maior, respaldando os tipos de marcadores utilizados na análise de populações de acentuada importância na construção do cenário ecológico desses ambientes. Referências Bibliográficas

Ali, BA, Huang TH, Qin, DN, Wang, XM (2004). A review of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in fish research. Rev .F. Biol.. Fish., 14: 443–453.

Andrade HMLS, Ferraz JS and Barbosa MD (2003). Análises preliminares de um fragmento urbano de Mata Atlântica: “Maristão” Recife-PE: Uma Aplicação das Análises de Fitossociologia, Riqueza e Diversidade. Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, Recife-PE, 9.

Avise, JC (2000). Phylogeography. The history and formation of species. Harvard University Press. Cambridge, Massachusetts.

Barros, A.M., Faleiro, F.G. Karia, C.T., Shiratsuchi, L.S. Andrade, R. P., Lopes G.K.B. (2005). Variabilidade genética e ecológica de Stylosanthes macrocephala determinadas por RAPD e SIG. Pesq. agropec. bras., 40(9): 899-909.

Benko-Iseppon AM, Morawetz W, Gaese, H, Gomes ETA, Alheiros MM, Heinrich J, Meunier IMJ, Cavalcanti HWV, Coutinho LQ, Alves MV, Freitas R, Sobral MC, Carvalho P, Carvalho-Filho AC, Jende O, Janssens M, Coy M, Roehrig J, Sandholz S, Silva HP, Gitaí JF, Alves AM, Wesenberg J (2007). Projeto “Recife Megacity”: Gerenciando Espaços Livres em Megacidades Emergentes. 123-149p. In: Oliveira, M.G. e Monteiro, S.Q.M. Cooperação Internacional Acadêmica: experiências e desafios", Editora Universitária UFPE, 214.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Benko-Iseppon AM, Winter P, Hüttel B, Stagginus C, Mühlbauer, F and Kahl G (2003). Markers closely linked to Fusarium resistance genes in chickpea show homology to pathogenesis-related genes located on Arabidopsis chromosome 5 and 1. Theo. App. Gen. 103: 379-286.

Brant, SV & Orti, G (2003). Phylogeography of the Northern short-tailed shrew, Blarina brevicauda (Insectivora: Soricidae): past fragmentation and postglacial recolonization. Mol. Ecol., 12: 1435–1449.

Caetano-Anollés G, Bassam BJ and Gresshoff PM (1991). DNA amplification fingerprinting using short arbitrary oligonucleotide primers. Bio. Tech. 9: 553557.

Conti JH, Minami K and Tavares FCA (2002). Comparação de caracteres morfológicos e agronômicos com moleculares em morangueiros cultivados no Brasil. Hort. Bras. 20(3): 419-423.

Erasmo EAL, Pinheiro LLA and Costa NV (2003). Levantamento Fitossociológico das Comunidades de Plantas Infestantes em áreas de produção de arroz irrigado cultivado sob diferentes sistemas de manejo. Plant. Dan. Viçosa-MG, 22(2): 195-201.

Laroca SJR, Cure and de Bortoli C 1982. A associação de abelhas silvestres (Hymenoptera, Apoidea) de uma área restrita no interior da cidade de Curitiba (Brasil): uma abordagem biocenótica. Dusenia 13(3): 93-117.

Meunier I (1998). Conservação da reserva ecológica de Dois Irmãos: potencial e carências para condução de um plano de manejo de área silvestre. In: Machado IC, Lopes AV, Pôrto KC (Org.). Reserva ecológica de Dois Irmãos: estudos em remanescente de Mata Atlântica em área urbana. Recife: Editora Universitária. 291-307.

Morawetz W & Benko-Iseppon AM (Orgs.) (2005). Emerging Megacities: Open spaces in megacities- Potential for a nature orientated living – Pesquisa para o Desenvolvimento Sustentável das Megacidades Emergentes, Divisão Global Changes. Coordenadores Alemão e Brasileiro de projeto aprovado no Edital BMBF de Março/2005. BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung; Ministério Alemão de Educação e Pesquisa).

Morden CW and Gregoritza M (2005). Population variation and phylogeny in the endangered Chamaesyce skottsbergii (Euphorbiaceae) based on RAPD and ITS analyses. Cons. Gen. 6: 969–979.

Myers N, Mittermeier RA Mittermeier CG, Fonseca GB and Kents J (2000). Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 403: 853-858.

Posada, D and Crandall, KA (2001). Intraspecific gene genealogies: trees grafting into networks. Trends Ecol. Evol., 16: 37–45.

Simon MV, Benko-Iseppon AM, Resende LV, Winter P and Kahl G (2007). Genetic diversity and phylogenetics relationships in Vigna Savi revealed by DNA Amplification Fingerpriting. Genome 50: 538-547. 50

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Snell W and Derek G 1975. The effects of density on resource partitioning in Chamaesyce hirta (Euphorbiaceae). Ecology 56(3): 742-746.

Taura HM and Laroca S 2001. A associação de abelhas silvestres em um biótopo urbano de Curitiba (Brasil), com comparações espaço temporais: abundância relativa, fenologia, diversidade e explotação de recursos florais (Hymenoptera, Apoidea). Acta Biol. Par. 30: 35 – 137

Taura, HM, Laroca S, Barbosa JF and Rodrigues J 2007. Melissocenótica (Hymenoptera, Anthophila) no Parque Florestal dos Pioneiros, Maringá, PR. (sul do Brasil) — I. Abundância relativa e diversidade. Acta Biol. Par., 36(1-2): 47-65.

Tischler W 1973. Ecology of arthropod fauna in man-made habitats: the problem of synanthropy. Zool. Anz. 109 (3/4): 157-161.

Vargas CRCJ, Oliveira AC, Carvalho FIF, Zimmer PD, Kopp MM, Freitas FA & Bernardi EC (2006). Dissimilaridade genética entre populações de Azevém anual do Rio Grande do Sul. Rev. Bras. Agro., 12(2): 133-138.

Weising K, Nybom H, Wolff K., Kahl G (2004). DNA fingerprinting in plants. CRC Press, Boca Raton, USA. 322 .

Yeh, FC, Boyle, T, Ye, Z and Xiyan, JM (1999). POPGENE Version 1.31: Microsoft Windows-based freeware for population genetic analysis. University of Alberta and Center for International Forestry Research.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Tabela 1. Indivíduos utilizados na seleção de primers com as respectivas descrições das áreas de coleta.

Coordenada Local de coleta Indivíduos analisados Descrição da área Geográfica

Considerada menos Indivíduo 5 (C. degradada uma vez que a 08º01’29.75’’S Ilha do Bananal thymifolia) intervenção antrópica é 34º56’08.79’’W menor sendo isolada pelo rio Capibaribe.

Localizada no entorno da mata de Dois Irmãos e Estrada dos Indivíduos 1 e 2 (C. caracterizada por 08º00’45.08’’S Passarinhos hirta) apresentar maior 34º56’25.35’’W degradação.

Espaço livre caracterizado pela vegetação ruderal sob 08º02’59.24’’S Campus UFPE Indivíduo 1( C. hirta) freqüente intervenção 34º56’51.36’’W humana.

Tabela 2. Desenho experimental da aplicação dos primers selecionados, número de indivíduos de Chamaesyce analisados por população e descrição dos locais de coleta.

Local de Coleta Nº. de Indivíduos Descrição da Área Coordenada Geográfica

C. hirta (10) Fragmento urbano localizado 08º01’05.64’’S Apipucos próximo ao remanescente da 34º56’16.61’’W Mata Atlântica de Dois Irmãos. C. thymifolia (10)

C. hirta (05) Considerada menos degradada uma vez que a intervenção 08º01’29.75’’S Ilha do Bananal antrópica é menor sendo isolada 34º56’08.79’’W pelo rio Capibaribe. C. thymifolia (05)

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... A

A Tabela 3 . Relação dos primers utilizados no processo de seleção, com respectivas seqüências, quantidade de bandas polimórficas entre os níveis intra-específico, inter-populacional e interespecífico e total. Destaque em vermelho para os primers selecionados e aplicados nas populações das espécies. A Primer Polimorfismos Por Níveis Nº. A Nome Seqüência Intraespecífico Interpopulacional Interespecífico Total 5’ 3’ 1 OP-N11 TCGCCGCAAA 11 15 15 41 2 15_12 AGGTCTTGGGTAGGC 9 10 20 39 3 U03-1 CTATGCCGAC 8 11 17 36 4 OPK-14 CCCGCTACAC 8 10 16 34 5 OPI-16 TCTCCGCCCT 7 8 17 32 6 OPN-6 GAGACGCACA 6 7 19 32 7 R160-5 GTCCTCAACG 6 10 16 32 8 OPI-1 ACCTGGACAC 6 7 17 30 9 R-160-9 CGTCGTTACC 9 8 13 30 10 15_4 TGTGCGCTTGTATAA 4 6 19 29 11 OPL-5 ACGCAGGCAC 5 8 15 28 12 OPN-5 ACTGAACGCC 6 7 15 28 13 OP-A4 AATCGGGCTG 7 9 11 27 14 DIII GCGATAGCAGA 7 9 11 27 15 P15-1 GGAAGCCAAC 5 6 13 24 16 OPK-4 CCGCCCAAAC 3 5 15 23 17 H03 AGACGTCCAC 4 8 9 21 18 R370-9 CGCACTCGTC 4 5 12 21 19 R470-10 GACCGACACG 5 6 10 21 20 OPG12 CAGCTCACGA 3 3 14 20 21 OPK2 GTCTCCGCAA 5 5 9 19 22 R260-10 GACCGACACG 5 5 9 19 23 OPJ-16 TCTCCGCCCT 3 3 10 16 24 OPA03 AGTCAGCCAC 6 10 0 16 25 OPG18 GGACTGCAGA 4 5 7 16 26 OPJ-13 CCACACTACC 0 3 12 15 27 OPA18 AGGTGACCGT 2 5 7 14 28 H18 GAATCGGCCA 2 2 9 13 29 OPD-7 TTGGCACGGG 3 3 5 11 30 E12 TTATCGCCCC 5 5 0 10 31 OPI-5 TGTTCCACGG 2 3 4 09 32 OPAIV GCGAAAGCCAA 3 5 0 08 33 OPG-5 CTGAGACGGA 3 4 0 07 34 R460-2 GCAGGATACG 6 0 0 06 35 OPM-6X CTGGGCAACT 1 1 3 05 36 OP-L14 GTGACAGGCT 0 0 1 01 37 C09 CTCACCGTCC 0 0 0 0 38 8_15 CTGATGAC 0 0 0 0 39 E07 AGATGCAGCC 0 0 0 0 40 B11 GTAGACCCGT 0 0 0 0 41 OPE12 TTATCGCCCC 0 0 0 0 - - Total 173 217 370 760

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Tabela 4. Primers mais informativos selecionados usados em DAF (DNA Amplification Fingerprinting), indicando número total de bandas polimórficas, polimorfismo interespecífico, intra- e interpopulacional. CH001 – Chamaesyce hirta, CH002 – C. thymifolia, API – Apipucos e IB – Ilha do Bananal. Primer Polimorfismos Sequência Interpopulacional Intrapopulacional Nº Nome Interespecífico Total 5’3’ CH001 CH002 API/001 IB/001 API/002 IB/002 1. OP-A4 AATCGGGCTG 37 26 44 36 12 20 7 43 2. OPK-14 CCCGCTACAC 29 16 38 23 9 6 10 38 3. OP15-1 GGAAGCCAAC 29 16 38 28 8 7 4 38 4. 15_4 TGCGTGCTTGATATA 19 30 37 18 16 29 4 37 5. 15_12 AGGTCTTGGGTAGGC 28 11 34 23 10 6 2 34 6. OP-DIII GCGATAGCAGA 27 15 34 22 11 7 4 34 7. OPN-6 GAGACGCACA 15 23 33 12 11 23 2 33 8. OPN-11 TCGCCGCAAA 30 5 32 21 20 5 0 32 9. OPL-5 ACGCAGGCAC 23 16 31 22 11 12 11 31 10. OPI -1 ACCTGGACAC 20 0 30 18 4 14 0 30 Total 257 158 350 223 112 129 44 350

Tabela 5. Análise da estrutura genética das espécies de Chamaesyce, distribuídas em duas populações (Apipucos e Ilha do Bananal). Média dos valores de diversidade genética (Gst) e número de migrantes (Nm). Dados gerados pelo PopGen32. C. hirta C. thymifolia

Nº de indivíduos 15 15 Loci analisados 258 183 Gst (média) 0.1815 0.2977 Nm (média) 2.2547 1.1797

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

API

Figura 1. Imagem de satélite dos fragmentos urbanos analisados. IB: Ilha do Bananal, caracterizada pela confluência do rio Capibaribe; API: Apipucos. A seta indica remanescente da Mata Atlântica de Dois Irmãos. No detalhe esquerdo da figura, dados de georeferenciamento da área. Fonte: Google Earth, com modificações.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Figura 2. Fragmentos amplificados a partir da reação de DAF do primer P15-1, após eletroforese em gel de agarose. Foram analisado 15 indivíduos de cada espécie, sendo 10 de Apipucos e 5 da Ilha do Bananal. M- DNA padrão de 100pb; CH001- Chamaesyce hirta; CH002- Chamaesyce thymifolia; API- Apipucos; IB- Ilha do Bananal.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

CH002-API-05 GRUPO I 54 CH002-AP I-06

93 CH002-API-03

99 CH002-API-04 CH002-API-01 72 54 CH002-API-02 CH002-API-07 CH002-API-08 98 88 CH002-API-09 73 CH002-API-10 CH002-IB-05 A CH002-IB-01 65 CH002-IB-04

CH002-IB-02 51 52 CH002-IB-03 CH001-IB-05 CH001-AP I-03 GRUPO II CH001-API-05

59 CH001-AP I-06

CH001-AP I-04 52 CH001-API-07 CH001-API-09 CH001-AP I-10 86 CH001-IB-04 65 CH001-IB-01 82 B 81 CH001-IB-02 85 CH001-IB-03

0.05

Figura 3. Fenograma gerado a partir da análise de dados da reação de DAF pela análise de Neighbor-joining com bootstrap de 1000 replicações. Legenda: CH001 - Chamaesyce hirta ; API - população de Apipucos; IB – população da Ilha do Bananal; CH002 – Chamaesyce thymifolia;. Números na base dos clados indicam valores de bootstrap. e – Indicam separação em nível específico Grupo I e II respectivamente. Foto-documentação de Chamaesyce Thymifolia (A) e Chamaesyce hirta (B).

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

5. MANUSCRITO DO ARTIGO CIENTÍFICO

ANÁLISE POPULACIONAL E DIVERSIDADE GENÉTICA EM XYLOPIA FRUTESCENS AUBL. (ANNONACEAE) PRESENTE EM QUATRO FRAGMENTOS DE MATA DE RECIFE E IGARASSU, PE (BRASIL) ATRAVÉS DE MARCADORES DAF (DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING) E ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

A ser submetido ao periódico

Genetic and Molecular Research

Ribeirão-Preto, SP, Brasil

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

ANÁLISE POPULACIONAL E DIVERSIDADE GENÉTICA EM XYLOPIA FRUTESCENS AUBL. (Annonaceae) PRESENTE EM QUATRO FRAGMENTOS DE MATA DE RECIFE E IGARASSU, PE (BRASIL) ATRAVÉS DE MARCADORES DAF (DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING) E ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

Pinangé, D. S. B. (1); Cruz, G. A. S(1); Torres, R. A. (2); Alves, M. V.(3) e Benko-Iseppon, A.M.(1,4)

(1) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Genética, Av. Prof. Moraes rego, s/no, CEP 50732-970, Recife – PE. E-mail: [email protected]

(2) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Zoologia, Av. Prof. Moraes Rego, s/no, CEP 50732-970, Recife – PE. E-mail: [email protected]

(3) Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Botânica, Av. Prof. Moraes rego, s/no, CEP 50732-970, Recife – PE.

(4) Autor para correspondência.

Resumo

Entende-se que os estudos de estrutura populacional sejam um primeiro passo na identificação de fatores responsáveis pela variação dos processos populacionais, da regeneração e de perturbações em um determinado local. A estrutura populacional de uma espécie vegetal é um parâmetro da forma como uma espécie está explorando um habitat e respondendo às condições do meio. O gênero Xylopia (Annonaceae) destaca-se pela presença de espécies-chave no processo de sucessão de matas. Estes representantes se encontram, em sua maioria, em bordas de mata. Foram analisadas quatro populações urbanas e peri-urbanas de Xylopia frutescens em fragmentos de mata de Recife (Açude da Prata – Apr) e Igarassu (Usina São José – USJ). Para tanto, foram utilizadas as metodologias de DAF e ISSR. 10 primers DAF e cinco ISSR foram aplicados em 24 indivíduos, seis de cada uma das quatro populações (Açude da Prata e fragmentos de USJ: Zambana - Zam, Pezinho - Pez e Piedade - Pie). O fenograma foi efetuado, bem como os cálculos de Gst e Nm . A matriz gerou 261 loci polimórficos totais para DAF e 126 para ISSR. Os fenogramas gerados usando-se matrizes geradas com os dois tipos de marcadores apresentaram dois grupos distintos, principalmente na abordagem DAF+ISSR, onde os valores de bootstrap mostraram-se mais consistentes, indicando uma maior tendência de separação da população Apr

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

em comparação com os fragmentos. Estes dados foram suportados pelos encontrados para Gst, que indicaram tendência a estruturação nas três esferas analíticas (DAF, ISSR e DAF+ISSR) para Apr, enquanto que os valores para as populações de Igarassu apresentaram uma tendência a estruturação, no entanto em menor grau. Todos os valores de Nm foram > que 1 indicando conectividade histórica entre os fragmentos estudados. que os valores de Nm que indicam o fluxo gênico. As técnicas de DAF e ISSR mostraram eficiência na análise de diversidade e estrutura populacional de espécies naturais. Palavras-Chave: Estrutura genética, Fragmentação, Espécies pioneiras, Nm, Gst, polimorfismo.

Introdução

A mata Atlântica é o ecossistema brasileiro que abrange a costa litorânea, percorrendo desde o Rio Grande do Norte até o Rio Grande do Sul, o qual tem sofrido paulatina devastação (Peixoto et al., 2002), particularmente no Nordeste Brasileiro, devido à monocultura açucareira e à expansão da especulação imobiliária. Apesar de sua história, a Mata Atlântica ainda possui remanescentes florestais de extrema beleza e importância que contribuem para que o Brasil seja considerado o país de maior diversidade biológica do planeta. Grande parte dos trabalhos produzidos para a caracterização da vegetação das florestas tropicais brasileiras consiste de levantamentos florísticos e fitossociológicos (van den Berg & Oliveira-Filho, 2000). Entende-se que os estudos de estrutura populacional sejam um primeiro passo na identificação de fatores responsáveis pela variação dos processos populacionais, da regeneração e de perturbações em um determinado local. A estrutura populacional de uma espécie vegetal é um parâmetro da forma como uma espécie está explorando um habitat e respondendo às condições ambientais (Oliveira et al., 1989). Segundo Hamrick (1983), do ponto de vista da conservação genética, a perda de uma parte da população subdividida em estrutura de famílias pode ser tão crítica quanto a perda de uma população inteira. Isso porque a variabilidade genética dentro das populações é garantida, principalmente, pela variabilidade genética existente entre subpopulações. Assim, a estrutura genética das populações envolve os níveis de variabilidade genética e sua distribuição entre e dentro das populações, tratando-se de fatores muitos importantes na definição de estratégias de manejo mais adequadas para a conservação genética e também

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... para a exploração desta variabilidade em melhoramento vegetal (Kageyama, 1987; Dias & Kageyama, 1991). Espécies do gênero Xylopia L. (Annonaceae) são caracterizadas, em sua maioria, por uma predominância em borda de mata e zonas de transição, possuindo participação nos processos de regeneração de mata, devido às suas características pioneiras. Portanto, podem ser importantes indicadores em fragmentos ou remanescentes de matas, pois servem como termômetros ambientais, visto que suas particularidades exibem uma escala de degradação ambiental, que indica o nível de interferência ou o estágio sucessional destes (Brando & Durigan, 2004; Neri et al., 2005; Marimon et al., 2006). No âmbito dos marcadores moleculares, a metodologia de DAF (DNA Amplification Fingerprinting) foi utilizada para avaliar a variabilidade genética em populações de Ricinus communis L., revelando um elevado número de polimorfismos e confirmando a variabilidade de populações subespontâneas, além de demonstrar a eficiência deste tipo de marcador (Oliveira, 2004). Outro marcador utilizado para testar variabilidade vegetal é o ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), cujas sequências-alvo são abundantes ao longo do genoma de eucariontes, evoluindo rapidamente devido ao seu caráter preferencialmente não- codificante (Fang & Roose, 1997; Esselman et al., 1999). Esses marcadores têm sido utilizados em diversos estudos para análise de variabilidade entre linhas híbridas de cultivares, em híbridos naturais e na detecção da variabilidade genética de populações (Wolfe & Randle 2001; Souza et al., 2005; Woods et al., 2005; Slotta & Potter, 2006). No presente estudo foram avaliados fatores como a diversidade e a estrutura genética de populações nativas da espécie X. frutescens ocorrentes nos municípios de Recife e Igarassu, através dos marcadores DAF e ISSR, visando auxiliar no esclarecimento dos processos de conectividade e divergência entre as áreas, fornecendo um panorama do padrão de conexão entre as áreas. Tal iniciativa objetivou revelar dados que possam auxiliar em futuros programas de recuperação da Mata Atlântica, estabelecendo possíveis corredores de biodiversidade.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Material e Método

Coleta de Material Biológico Representantes da espécie X. frutescens (Annonaceae) foram coletados em fragmentos de mata do Município de Igarassu, na Usina São José (USJ) (Zambana - Zam, Pezinho - Pez e Piedade - Pie), caracterizada por cobrir uma área aproximada de 247 km² bem como em Recife, na Reserva Ecológica Parque de Dois Irmãos (Açude da Prata - Apr), evidenciados na Figura 1, perfazendo seis indivíduos por população. Indivíduos adicionais foram coletados em Mirandiba (população Mir, vegetação de caatinga, na entrada da cidade, três indivíduos) e no estado de Sergipe (população Ser, Parque Nacional Serra de Itabaiana, três indivíduos). A Tabela 1 indica todos os pontos de coleta com suas respectivas coordenadas.

Extração de DNA Genômico Para a extração do DNA genômico, folhas jovens e livres de patógenos foram coletadas no campo, sendo transportadas em local fresco e imediatamente acondicionadas em freezer a -80°C para posterior extração do DNA genômico. O isolamento foi realizado conforme o protocolo descrito por Weising et al. (2004), com modificações no que se referiu à proporção do material utilizado (1 g), relativamente ao volume de tampão de extração (15 mL). Adicionalmente, houve uma única lavagem do material em CIA (Clorofórmio/álcool Isoamílico, proporção de 24:1). A quantificação do DNA foi efetuada pelo método comparativo em gel de agarose a 1,2 % usando-se diferentes concentrações de λ-DNA como referencial.

Geração de Marcadores Moleculares A geração de marcadores DAF seguiu a metodologia descrita por Caetano-Anollés et al. (1991) com as modificações introduzidas por Winter et al. (2000) e Benko-Iseppon et al. (2003). A reação foi composta por 9,3 µL do DNA (na concentração de ≈ 0,5 ng), 1,5

µL 10x PCR buffer, 2,5 mM de MgCl2, 10 mM de dNTP-mix (LGC), 20 µM de primers decâmeros e 0,2 µL (concentração final de 1 U) de ‘Taq DNA polimerase’ (LGC) com concentração final da reação de 15 µL. A reação de amplificação ocorreu em termociclador

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Eppendorf Mastercycler Gradiente com 2 min. de desnaturação inicial a 95°C, seguidos de 40 ciclos compostos de três etapas: desnaturação de 15 seg a 95°C; anelamento de 1 min. a 35°C e alongamento final de 2 min. a 72°C. Ao final dos 40 ciclos a reação foi completada com um alongamento final de 2 min. a 72°C. Os produtos amplificados foram separados eletroforeticamente com tampão Buffer 0,5 por 4 horas a 80 V em gel de agarose (1,8%), corados com brometo de etídio (5 µL/100 mL de gel), visualizados e fotografados sob luz ultravioleta com câmera digital Sony Cybershot W5 (zoom óptico 3.0 Megapixel). As reações de ISSR seguiram a metodologia descrita por Bornet & Branchard (2001) com modificações de Amorim, 2009 (dados não publicados). O volume total da reação consistiu de 20 μL com reagentes distribuídos da seguinte forma: 5 ηg (4 μL) do

DNA genômico, 10x buffer (2 μL), 25 mM MgCl2 (2 μL), 10 mM dNTP-mix (1,5 μL), 50 pmol de primer (1 μL) e 5 U Taq DNA polimerase (0,15 μL). As condições dos ciclos de PCR foram: desnaturação a 94ºC por 4 min. e 35 ciclos a 94ºC por 30 s, a fase de anelamento a 52°C por 45 s, 72ºC por 2 min. com extensão final de 7 min. a 72ºC. Os produtos de ISSR foram separados da mesma forma que os descritos para o DAF, no entanto, a separação eletroforética se deu por 5 h a 70 V, seguido do mesmo processo anteriormente descrito para fotodocumentação.

Seleção e Aplicação dos Primers mais informativos Foram aplicados dois tipos de marcadores moleculares, o DAF (DNA Amplification Fingerprinting) e o ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Inicialmente, para a primeira metodologia citada, quatro indivíduos das localidades de Piedade e Zambana (um e três indivíduos, respectivamente) foram utilizados para seleção de primers mais polimórficos (Tabela 2). Para tal, foram empregados 30 iniciadores testados em uma sub-amostra, sendo utilizados na fase de aplicação, os dez mais informativos. No que diz respeito ao ISSR, cinco primers degenerados foram aplicados diretamente no desenho experimental. Porquanto, o experimento consistiu em um total de 30 indivíduos, sendo estes distribuídos em seis populações citadas anteriormente. As populações de Igarassu e Recife compreenderam seis espécimes cada, enquanto que as populações de Sergipe e Mirandiba apenas três. Como os fragmentos da USJ apresentam diferenças significativas de tamanho (de 380 ha. para Zam até 22 ha. para Pez) o número de indivíduos deu-se por conta de uma

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... adequação amostral, uma vez que no menor fragmento (Pez), apenas seis indivíduos foram encontrados. As populações de Sergipe e Mirandiba foram inseridas exclusivamente na geração dos fenogramas. No que diz respeito às quatro populações restantes (Recife e Igarassu), análises populacionais e de diversidade foram aplicadas além da montagem do fenograma.

Análise de Polimorfismos Analisou-se tanto a variabilidade (Tabelas 3 e 4) quanto a estrutura genética das populações estudadas (Tabela 5). Nestas, tanto a análise interpopulacional global (Apr/Zam/Pez/Pie) quanto às análises interpopulacionais parciais (Apr/Zam – Apr/Pez – Apr/Pie – Zam/Pez – Zam/Pie e Pez/Pie) foram realizadas. Foi possível, ainda, para estudos de variabilidade, anexar dados de polimorfismos intrapopulacionais. Destarte, os géis, depois de fotografados, foram analisados quanto à presença (1) e ausência (0) de bandas (marcas de DNA) para cada tamanho de fragmento encontrado nos distintos iniciadores, gerando matrizes binárias para duas finalidades: similaridade genética e estimativas de estrutura – fluxo gênico (Nm) e diversidade genética (Gst), para os dois marcadores. Por fim, as matrizes de DAF e ISSR foram agrupadas para o cálculo das estimativas supracitadas. Mediante as matrizes de similaridade, foram calculados índices percentuais de divergência genética (Dg%) para cada população a partir da divisão do número total de loci variantes (Ntlv) gerados, em relação ao número total de loci (Ntl - Dg total), bem como o número de polimorfismos em relação ao número total de loci de cada população (Dg próprio) de acordo com Nei (1972). As matrizes geradas (DAF e ISSR) para averiguação da variabilidade foram alinhadas e analisadas pelo método NEIGHBOR-JOINING (NJ,J bootstrap de 1.000 replicações) com os parâmetros ajustados para pairwise deletion e p-distance, através do programa MEGA 4.1, gerando dois fenogramas (Figura 4 e 5). Assim como os dados populacionais, as matrizes de similaridade (DAF e ISSR) foram agrupadas, gerando um terceiro fenograma (Figura 6). Na matriz de DAF os indivíduos 05 e 06 das populações de Piedade e Açude da Prata, respectivamente, foram excluídos, assim como os indivíduos 03, 04 e 05 de Piedade, os quais foram eliminados da matriz agrupada DAF/ISSR, devido a distorções nos agrupamentos genéticos. As matrizes geradas para as análises populacionais foram amostradas pelo programa PopGene v.32 (Yeh & Boyle, 1997). 64

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Resultados

Os 30 primers randômicos testados pela metodologia DAF nos quatro indivíduos pré-selecionados amplificaram 404 bandas polimórficas (Tabela 2), onde o primer A11 gerou o maior número de bandas (29) enquanto o primer menos informativo (15-19) originou apenas quatro amplicons. A partir da aplicação dos 10 primers mais polimórficos para DAF em 24 indivíduos de Recife e Igarassu foram encontrados 261 loci polimórficos (98,86%) dos 264 analisados, num total de 1.646 marcas de DNA. Dos fragmentos gerados, o primer que mais contribuiu foi o 15-8 com 40 (15,32%) loci amplificados, enquanto que o que obteve menor número de loci foi o A-17 com oito loci, representando 3,06% (tabela 3). No que diz respeito aos primers de ISSR, 126 loci polimórficos (97,6%) foram observados num total de 129 loci gerados com 997 fragmentos gerados. O primer que possibilitou uma maior contribuição de polimorfismo foi o 891 que gerou 34 loci, enquanto o menor foi 886 com 18 loci (Tabela 4). Os cálculos dos percentuais de Dg globais para os dois marcadores apontaram a população Apr como a mais divergente em relação às demais populações, com 157 loci polimórficos apresentando um Dg total igual a 60,15% para DAF, enquanto que para ISSR foi gerado 81 loci polimórficos, com índice percentual de 64,28%. Os menores níveis de variabilidade genética populacional foram observados na população Pie, para o DAF com 114 loci polimórficos (43,67%), enquanto que para o ISSR as populações de Pez e Pie obtiveram um menor número de marcas polimórficas totalizando 55 loci cada uma, representados pelo valor Dg igual a 43,65% (Tabela 3 e 4). Em relação aos índices de variabilidade intrapopulacionais representados pelos Dg próprios, notificou-se que para o DAF a população que apresentou maior índice de dissimilaridade entre os indivíduos foi Apr com 91,27%, o mesmo ocorrendo para o marcador ISSR, onde os indivíduos também apresentaram um Dg próprio elevado (81%). No que tange à menor variabilidade entre indivíduos por população, Zam revelou um valor de 80,62% para metodologia DAF enquanto que Pez, para o ISSR, apresentou os menores dados de variabilidade intrapopulacional com 67,07%. Os fenogramas gerados a partir da análise de NJ revelaram uma tendência à estruturação das populações, embora em alguns pontos tenham ocorrido grupamentos

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... mistos. Os indivíduos de Sergipe e Mirandiba ocuparam uma porção mais basal nas árvores fenéticas. O fenograma gerado pela metodologia DAF (figura 2) apresentou dois grupamentos distintos, sendo o I formado apenas por espécies do semi-árido (Mir e Ser). O Grupamento II apresentou as demais populações de Apr e as populações da USJ. Foi possível observar uma correlação entre indivíduo de Ser de Apr (R-II), bem como a relação de indivíduos desta última população com os provenientes das populações de Igarassu (R- III). Os demais ramos mostraram-se com uma separação das populações excetos nos indivíduos de Pez e Pie que apresentaram maior proximidade (R-V e VI). No fenograma de ISSR (figura 3) dois grupamentos foram notificados, no entanto um maior nível de miscigenação populacional foi observado. No grupamento I indivíduos de Zam, Pie, Mir e Ser foram agrupados (R-I). No grupamento II observamos uma proximidade dos indivíduos de Zam e Apr (RII e III) bem como entre representantes de Pez e Zam (R-IV) O fenograma gerado pela junção das metodologias (figura 4) gerou dois grupamentos com maior suporte, tendo somente os indivíduos das populações distantes (semi-árido) agrupados nele. No grupamento II os valores de bootstrap foram consistentes onde se observou a separação da população de Apr das demais com 99% (R-II). Os indivíduos de Zam mostraram proximidade com os indivíduos de Pie (R-IV), assim como esta última com a população de Pez (R-V). A análise estatística gerada pelo PopGene revelou valores de Nm e Gst globais para metodologia DAF iguais a 1,1638 e 0,3005 respectivamente. No marcador ISSR esses valores foram de 1,0946 (Nm) e 0,3136 (Gst) e nos dados agrupados os valores apresentaram valores respectivos de Gst e Nm iguais a 0,3048 e 1,1405. Assim como análise de diversidade, valores pareados das estimativas foram calculados para as três esferas analíticas. No DAF os valores de Nm variaram desde 1,3985 (Apr/Pez) até 2,1345 (Apr/Pie) e os de Gst, desde 0,1898 (Apr/Pie) até 0,2695 (Apr/Pez). No ISSR os valores de Nm geraram um intervalo de 1,1170 (Pez/Pie) a 3,6223 (Apr/Zam), enquanto que os de Gst variaram de 0,1213 (Apr/Zam) até 0,3092 (Pez/Pie). Os dados agrupados (DAF/ISSR) apresentaram valores de Nm compreendidos entre 1,3842 (Apr/Pez) e 2,1992 (Apr/Zam) ao passo que os valores de Gst diferiram de 0,1852 (Apr/Zam) até 0,2654 (Apr/Pez). Os detalhes de cada análise pareada, bem como os valores globais, podem ser conferidos na Tabela 5. 66

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Discussão

No que concerne ao número de loci polimórficos acessados nas populações de X. frutescens destaca-se a eficiência da metodologia DAF em inferir índices de variabilidade genética nos indivíduos analisados para as duas espécies. Este fato pode ser ratificado pelo trabalho realizado por Simon et al. (2007), onde foram geradas 212 marcas polimórficas em acessos de Vigna, revelando uma elevada consistência na estimativa da diversidade genética dos diferentes acessos, assim como observados no presente trabalho, onde 261 bandas polimórficas foram geradas. O marcador ISSR também se mostrou, ao longo dos estudos, relevante na detecção da diversidade genética em plantas. Vijayan et al. (2004) analisaram cinco espécies de amora (Morus sp.) da Ásia utilizando 15 primers, o que permitiu a obtenção de 150 fragmentos polimórficos. Chen et al. (2006) utilizaram cinco primers ISSR em estudos genéticos de populações de Caldesia grandis Samuel., obtendo um total de 60 fragmentos. Quando comparado aos dados apresentados no presente trabalho, o ISSR mostrou-se bastante eficiente na análise de X. frutescens, pois, como já mencionado, cinco primers geraram 126 loci polimórficos. A escolha da metodologia de DAF justifica-se pela sua sensibilidade e maior reprodutibilidade quando comparada à de RAPD, pois a quantidade de DNA utilizada é significativamente menor, aumentando assim o nível de estringência do anelamento do DNA molde com o primer. Esta afirmação foi corroborada por Winter et al. (2000) e Benko-Iseppon et al. (2001) estudando acessos de grão-de-bico (Cicer arietinum). Inferências de reprodutibilidade foram realizadas no estudo da diversidade em espécies de Araceae a partir da utilização dos marcadores DAF. Neste foram realizadas repetições das reações de DAF constatando que tanto número como peso molecular das bandas permaneceram inalterados, denotando alta reprodutibilidade (dados não publicados de nosso grupo). Neste contexto, o presente trabalho é suportado em termos de reprodutibilidade dos polimorfismos gerados uma vez que faz uso do mesmo protocolo. Segundo Amos & Harwood (1998) a variabilidade genética representa o mais importante componente biológico da evolução, fundamentando a diversidade e a adaptação. Um dos principais critérios a ser considerado quando se deseja analisar a variabilidade genética refere-se ao número de loci polimórficos encontrados. Segundo Telles et al.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

(2001), fazem-se necessários no mínimo 60 loci para uma estimativa consistente da variação genética, considerando-se que a partir desta quantidade reduções significativas nos desvios-padrão e, conseqüentemente, nos coeficientes-de-variação podem ser observadas. .Ainda sobre a consistência dos números de loci aferidos, Hollingsworth e Ennos (2004), sugerem que uso de no mínimo 50 loci para marcadores RAPD revela alta consistência no que se refere à recuperação de topologias não resolvidas, apresentando altos índices de diferenciação populacional (ex. FST _ 0,15). Os dados da presente análise para as populações de X. frutescens incluem 261 marcas polimórficas para DAF e 126 para ISSR, indicando a disponibilidade de dados consistentes no acesso à variabilidade genética nas populações naturais dessa espécie. A estimativa dos índices de divergência genética aqui calculada a partir da leitura dos números de polimorfismos acessados nos permite inferir sobre o panorama de variabilidade genética em diferentes esferas analíticas. No contexto global, Apr mostrou-se nos dois marcadores como a população que mais divergiu em relação aos demais fragmentos com elevados índices de polimorfismo, o que provavelmente indica que quanto maior o polimorfismo maior capacidade na resposta às instabilidades ecológicas. No sentido contrário vemos as populações de Pez e Pie como as que menos contribuíram para a variabilidade global. Neste sentido é coerente pensar que possivelmente essas populações apresentem uma menor capacidade de retenção do polimorfismo e por sua vez, menor capacidade de responder as alterações ambientais, quando comparadas a Apr. Neste sentido, um vasto número de estudos em populações naturais correlaciona variabilidade genética com componentes adaptativos, especialmente em ambientes ecologicamente instáveis onde um elevado nível de diversidade corresponde a uma maior aptidão ao meio (Parsons, 1996a, 1996b; Rankevich et al.,1996; Nevo et al.,1997). No que se refere às análises de diversidade própria das populações, observamos que para os dois tipos de marcadores os indivíduos de Apr possuem elevada diversidade intrapopulacional (91,2% e 81%, DAF e ISSR respectivamente). Esta constatação parece fundamentar a afirmação de que manchas vegetacionais são importantes refúgios de biodiversidade (Viana et al., 1998). Machado et al. (1998) observaram uma clareira de mata no Açude de Dois Irmãos com presença de plantas indicadoras de ambientes não eutrofizados e eutrofizados, assim como a deposição de matérias orgânicas com indícios de

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... avanço sucessional, denotando a complexidade do fragmento e a existência de possíveis fatores que propiciem a variabilidade aqui encontrada. Em relação aos menores valores de Dg próprios, Zam e Pez obtiveram menores índices para o DAF e ISSR respectivamente. Neste caso o efeito de borda do fragmento parece estar diretamente relacionado ao menor número de variabilidade encontrado, visto que esse fenômeno possui estreita relação ao tamanho efetivo e recorte do fragmento, apresentando diferentes microhábitats e micro-climas, principalmente para o fragmento Pez que apresenta um menor tamanho. Silva et al. (2008) acessando a variabilidade genética em populações naturais de lenhosas nos fragmentos da USJ através de isoenzimas, verificou uma perda de alelos e um acréscimo de homozigosidade no fragmento Pez, podendo este estar correlacionado com o presente trabalho em termos de decréscimo de variabilidade. Os fenogramas gerados a partir das três esferas analíticas (DAF; ISSR; DAF+ISSR) apresentaram grupamentos genéticos que sugerem uma tendência à estruturação, principalmente quando observamos as análises de NJ envolvendo DAF+ISSR, onde a visualização dos grupamentos genéticos foi mais coerente. É plausível pensar que a agregação dos marcadores (que acessam partes distintas no DNA) pareceu dar maior sustentabilidade nas análises de similaridade. Neste fenograma observamos dois grupamentos genéticos distintos (I e II), foi possível observar a coerência dos dados fenéticos em relação à separação dos grupos do semi-árido (I- Mir e Ser) e os da Floresta Atlântica (II - Apr e os fragmentos de Igarassu). Adicionalmente, neste último, a população de Apr apresentou mais indícios de estruturação, onde seus indivíduos ocuparam um ramo notadamente separado com uma consistência elevada (bootstrap – 99%) (R-II – SR-A). Por sua vez, os indivíduos de Igarassu (Zam, Pie e Pez) apresentaram menores indícios de estruturação, observando-se uma conexão entre eles, principalmente em relação aos indivíduos de Pez e Pie, que se agruparam próximos (R-V). Todavia, ao observar a disposição dos ramos (sub-ramos) no que diz respeito às populações da USJ, percebemos uma forte tendência à estruturação também suportada por um bootstrap aceitável (61%), sugerindo o início de separação, principalmente aos indivíduos de Zam que indicaram maior tendência a separação em relação às demais (R-III). A idéia da tendência à estruturação por parte de Apr, associada aos dados de fenética tem suporte adicional pelas comparações pareadas do Gst, onde em 67% das comparações possíveis (DAF; ISSR ou DAF+ISSR, totalizando nove comparações) nos 69

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

índices de diferenciação interpopulacional foram acima de 0,20. No entanto, observaram-se valores maiores que 0,26 nas comparações em relação à Apr em 33,3% das comparações possíveis. Segundo Wright (1978) valores de Gst acima de 0,25 apontam para uma estruturação evolutiva bem acentuada. Os valores pareados encontrados para as populações de Igarassu seguem os mesmos padrões (valores de Gst moderadamente altos) com 70% das comparações acima de 0,20. No entanto, nenhum valor acima de 0,26 foi evidenciado nas populações de Igarassu, sugerindo uma menor estruturação destas em relação à Apr. Acerca dos valores de Nm, de acordo com Almeida et al. (2003), valores < 1 sugerem um favorecimento a divergência genética. Portanto mesmo com a evidência da estruturação, valores próximos a 1,0 foram constatados indicando que as populações mantêm ainda um padrão histórico de conexão. Os mecanismos de fluxo entre esses fragmentos podem ser relacionados à diversidade de espécies de insetos encontradas na região de USJ, o que poderia facilitar o fluxo de pólen entre as populações do estudo (Schessl et al., 2005). Possivelmente os indícios de conectividade são coerentes com os dados obtidos por Jürgens et al. (2000), onde esses pesquisadores relataram a presença de insetos na polinização em espécies do gênero Xylopia, enquanto a dispersão por aves indicaria mais um fator em favor da conexão entre os fragmentos (Jaeger, 2004). Os índices de Gst globais apontaram clara evidência de estruturação entre todas as populações nas três análises (com destaque para DAF+ISSR: 0,3048) no entanto os valores de Nm também se mostraram elevados (destaque para DAF+ISSR=1,1405). Dados acerca do fluxo gênico histórico em populações naturais de Tapirira guianensis da Usina São José (fragmentos Macacos, Piedade – Pie, Pezinho – Pez e Santa Helena) também indicaram valores elevados de Nm (2,45) sugerindo ausência de isolamento (Silva et al., 2008). Neste estudo os autores também encontraram elevados índices de variabilidade e fluxo gênico histórico para a mesma região analisada no presente estudo. Uma possível explicação para a persistência da conectividade entre populações que apresentam indícios de estruturação pode ser a proposta por Cardoso et al. (1998) e Lira et al. (2003) onde os autores apontam que a fragmentação ocorrente na Mata Atlântica deu-se bem antes dos 500 anos de ocupação humana, decorrendo da expansão e retração natural das florestas atlânticas brasileiras em diferentes períodos juntamente com os avanços e recuos da coluna d’água do Atlântico, no Quartenário. Como a estimativa do fluxo gênico faz-se em centenas de anos, assim como a maioria das inferências genéticas, sugere-se que 70

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies... mesmo com a evidência da estruturação (que pode ter sido acelerada pela ação antropogênica) índices de conectividade histórica ainda são evidentes. Os esforços de conservação, portanto devem tentar agregar tanto os índices de variabilidade quanto a manutenção desta a partir do padrão de conexão. Esses fragmentos apresentaram elevada diferenciação conjuntamente com um alto nível de conectividade. Nesse caso todo o complexo da Usina de São José, especialmente, deve ser levado em consideração nos que diz respeito a um planejamento de conservação, visto que provavelmente todos os fragmentos participam da manutenção desta variabilidade onde determinados fragmentos, por exemplo, podem estar se comportando como tampão em relação ao mais próximo garantindo a troca de material virtualmente entre todos os fragmentos. Em conclusão, a conservação de espécies tem por base a manutenção dos níveis naturais de variabilidade genética nas populações (Yeeh et al., 1996). Frankel (1983) afirma que o conhecimento dos níveis e distribuição da variação genética dentro e entre populações é de fundamental importância para o estabelecimento de práticas conservacionistas eficientes. Portanto, os níveis de variabilidade aqui notificados estão de acordo com o proposto acima, a partir da elucidação das relações espaciais inerentes à fragmentação, bem como aspectos genéticos populacionais. Estudos que incluam outras metodologias para se analisar estruturas populacionais direta ou indiretamente, como análises de estádios ontogênicos, dados fenológicos, composição de solo, correlação filogeográfica, contribuiriam ainda mais no entendimento do panorama ecológico desta espécie.

Referências Bibliográficas

Almeida FS, Sodré LMK and Contel EPB (2003). Population structure analysis of Pimelodus maculatus (Pisces, Siluriformes) from the Tietê and Paranapanema Rivers (Brazil). Genet. Mol. Biol. 26: 301-305.

Amos W and Harwood J (1998). Factors affecting levels of genetic diversity in natural populations. Phil. Trans. R. Soc. 353: 177-186.

Benko-Iseppon AM, Winter P, Hüttel B, Stagginus C, Mühlbauer F and Kahl G (2003). Markers closely linked to Fusarium resistance genes in chickpea show homology to 71

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

pathogenesis-related genes located on Arabidopsis chromosome 5 and 1. Theor. App. Gen. 103: 379-286.

Byrne M, Moran GF (1994). Population divergence in the chloroplast genome of Eucalyptus nitens. Heredity, 73: 18–28.

Bornet B and Branchard M (2001). Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers: Reproducible and Specific Tools for Genome Fingerprinting. Plant Mol. Biol. Rep. 19: 209-215.

Brando PM and Durigan G (2004). Changes in cerrado vegetation after disturbance by frost (São Paulo State, Brazil). Plant Ecol. 175: 205–215.

Caetano-Anollés G, Bassam BJ and Gresshoff PM (1991). DNA amplification fingerprinting using short arbitrary oligonucleotide primers. Bio. Tech. 9: 553557.

Cardoso MA, Provan J, Powell W, Ferreira PCG, de Oliveira DE (1998) High genetic differentiation among remnant populations of the endangered Caesalpinia echinata Lam. (Leguminosae Caesalpinioideae). Mol. Ecol., 7: 601–608.

Lira CF, Cardoso SRS, Ferreira PCG, Cardoso MA and Provan J (2003). Long-term population isolation in the endangered tropical tree species Caesalpinia echinata Lam. revealed by chloroplast microsatellites Mol. Ecol. 12: 3219-3225.

Chen JM, Gituru WR, Wang YH, Wang QF (2006). The extent of clonality and genetic diversity in the rare Caldesia grandis (Alismataceae); comparative results for RAPD and ISSR markers. Aqua. Bot. 84: 301-307.

Conservation-International. (2000). Avaliação e ações prioritárias para a conservação da biodiversidade da Mata Atlântica e campos sulinos. Brasília: Ministério do Meio Ambiente.

Dias LAS and Kageyama PY (1991). Variação genética em espécies arbóreas e conseqüências para melhoramento florestal. Agrotrópica 3(3): 119-127.

Frankel OH (1983). The place of management in conservation. In: Schoenwald-Cox CM et al. (Ed.). Genetics and conservation: a reference for managing wild animal and plant populations. The Benamin/Cumming.1-14.

Hamrick JL (1983). The distribution of genetic variation within and among natural plant population. In: Schone-Wald-Cox, C. M.; Chambers, S. H.; MacByde, B.; Thomas, L. Genetics and conservation. Menlo Park: Califórnia: Benjamin Cummings Publishing Company, 335-348.

Kageyama PY (1987). Conservação in situ de recursos genéticos de plantas. IPEF 35: 7-37.

Jaeger P (2004). Caracterização genética e demográfica de populações de Xylopia emarginata Mart. (Annonaceae). Dissertação de Mestrado, UFLA, 113.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Jürgens A, Webber AC and Gottsberger G(2000). Floral scent compounds of Amazonian Annonaceae species pollinated by small beetles and thrips. Phytochemistry 55: 551- 558.

Levy F, Antonovics J, Boyton JE, Gilham NW (1996). A population genetic analysis of chloroplast DNA in Phacelia. Heredity, 76: 143–155.

Machado IC, Lopes AV and Pôrto KC (1998). Reserva Ecológica de Dois Irmãos: Estudos em um Remanescente de Mata Atlântica em Área Urbana, Recife, Pernambuco, Brasil. Recife. SECTMA (Secretaria de Ciência, Tecnologia e Meio Ambiente), Universitária da UFPE 326.

Marimon BS Lima EDES, Duarte TG, Chieregatto LC and Rattier J (2006). Observations on the vegetation of Northeastern Mato Grosso, Brazil: An Analysis of the Cerrado – Amazonian forest ecotone. Edinb. J. Bot. 63(2&3): 323–341.

Morawetz W and Benko-Iseppon AM (Orgs.) (2005). Emerging Megacities: Open spaces in megacities- Potential for a nature orientated living – Pesquisa para o Desenvolvimento Sustentável das Megacidades Emergentes, Divisão Global Changes. Coordenadores Alemão e Brasileiro de projeto aprovado no Edital BMBF de Março/2005. BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung; Ministério Alemão de Educação e Pesquisa).

Myers N, Mittermeier RA, Mittermeier CG, Fonseca GB and Kents J (2000). Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 403: 853-858.

Nei, M (1972). Genetic distance between populations. Am. Nat. 106: 283-292.

Neri AV, Campos EP, Duarte TG, Neto JAAM, Silva AF and Valente GE (2005). Regeneração de espécies nativas lenhosas sob plantio de Eucalyptus em área de Cerrado na Floresta Nacional de Paraopeba, MG, Brasil. Acta Bot. Bras. 19(2): 369- 376.

Nevo E, Appelbaum-Elkaher I, Garty J, and Beiles A (1997). Natural selection causes microscale allozyme diversity in wild barley and a lichen at “Evolution Canyon”, Mt. Carmel, Israel. Heredity 78: 373–382.

Oliveira PEAM, Ribeiro JF and Gonzales MI (1989). Estrutura e distribuição espacial de uma população de Kielmeyra coriaceae Mart. De cerrados de Brasília. Rev. Bras. Bot. 12: 39-47.

Oliveira NS (2004). Variabilidade genética em populações de Ricinus communis (Euphorbiaceae) pela metodologia DAF (DNA Amplification Fingerprinting). Dissertação de Mestrado, UFPE, 73.

Parsons PA (1996) Stress, resources, energy balances, and evolutionary change. Evol. Biol. 29: 39–72.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Peixoto AL, Rosa MMT da and Silva IM (2002). Caracterização da Mata Atlântica. in: Sylvestre, L. da S. & Rosa, M.M.T. da. Manual metodológico para estudos botânicos na mata Atlântica. Seropédica,: EDUR, 09-23.

Pimm SL (1998). The forest fragment classic. Nature 393: 23-24

Pomper KW, Crabtree SB, Brown SP, Jones SC and Bonney TM (2003). Assessment of genetic diversity of Pawpaw (Asimina triloba) cultivars with inter simple sequence repeat markers. J. Am. Soc. Hort. Sci. 128(4): 521-525.

Rankevich, D., Lavie, B., Nevo, E., Beiles, A., and Arad, Z. (1996) Genetic and physiological adaptations of the prosobranch landsnail Pomatia olivieri to microclimatic stresses on Mount Carmel, Israel. Isr. J. Zool. 42: 425–441.

Schessl M, Krause L, Piechowski D and Gorrsberger G (2005). A fragmentação da Mata Atlântica em Pernambuco e suas conseqüências biológico-reprodutivas In: Franke CB, Rocha PLB, Klein W, Gomes SL (Orgs) Mata Atlântica e Biodiversidade 43- 164.

Silva EF, Oliveira CAM, Lins-e-Silva ACB and Rodal MJN (2008). Diversity and genetic structure of natural fragmented populations of Tapirira guianensis Aubl. In northeastern Brazil. Biorem. Biodiv. Bioavail. 2(1): 35-40.

Simon MV, Resende LV, Winter P, Kahl G and Benko-Iseppon AM (2007). Genetic diversity and phylogenetic relationships in Vigna Savi germplasm revealed by DNA amplification fingerprinting. Genome, 50(6): 538-547.

Slotta TAB and Potter DM (2006). Genetic variation within and between Iliamma corei and I. remota (Malvaceae): implications for species delimitation. Bot. J. Linnean Soc. 151: 345-354.

Souza VQ, Pereira AS, Kopp, MM, Coimbra JLM, Carvalho FIF, Luz VK and Oliveira AC (2005). Dissimilaridade genética em mutantes de aveia tolerantes e sensíveis a ácidos orgânicos. Bragantia 64(4): 569-575.

Telles MPC, Monteiro MSR, Rodrigues FM, Soares TN, Resende LV, Amaral AG and Marra PR (2001). Marcadores RAPD na análise da divergência genética entre raças de bovinos e número de locos necessários para a estabilidade da divergência estimada. Ciênc. Anim. Bras. 2(2): 87-95.

Van den Berg E and Oliveira-Filho AT (2000). Composição florística e fitossociológica de uma floresta estacional semidecidual montana, município de Itutinga, MG. Rev. Bras. de Bot. 23(3): 231-253.

Viana VM and Pinheiro LAFV (1998). Conservação da biodiversidade em fragmentos florestais. IPEF 12: 25-42.

Vjayan K, Srivastava PP, Awasthi AK (2004). Analysis of phylogenetic relationship among five mulberry (Morus) species using molecular markers. Genome, 47: 439-448. 74

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Weising K, Nybom H, Wolff K, Kahl G (2004). DNA fingerprinting in plants. CRC Press, Boca Raton, USA. 322.

Winter P, Benko-Iseppon AM, Hüttel B, Ratnaparkhe M, Tullu A, Sonnante G, Pfaff T, Tekeoglu M, Santra D, Sant V J, Rajesh PN, Kahl G, Muehlbauer FJ (2000). A linkage map of the chickpea (Cicer arietinum L.) genome based on recombinant inbred lines from a C. arietinum x C. reticulatum cross: localization of resistance genes for fusarium wilt races 4 and 5. Theor. App. Gen., 101: 1155-1163.

Wolfe AD and Randle CP (2001). Relationships within and among species of the holoparasitic genus Hyobanche (Orobanchaceae) inferred from ISSR banding patterns and nucleotide sequences. Syst. Bot. 26(1): 120-130.

Wright S (1978). Evolution and genetics of populations. The theory of gene frequencies. University of Chicago Press, London. 2: 511.

Yeeh Y, Kang SS, Chung, MG (1996). Evaluation of the natural movement in populations of Camellia japonica (Thearaceae) in Korea based on allozyme studies. Bot. Bull. Acad. Sin. 37: 141-146.

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Tabela 1. Populações e indivíduos utilizados na análise de diversidade e populacional com suas respectivas coordenadas.

Local de Coleta População Indivíduos Coordenadas geográficas Ind. 01 08º00’21.7’’S – 34º57’00.1’’W Ind. 02 08º00’23.8’’S – 34º57’59.4’’W Ind. 03 08º00’26.3’’S – 34º57’58.0’’W Dois Irmãos (Recife) Açude da Prata Ind. 04 08º00’26.8’’S – 34º57’57.8’’W Ind. 05 08º00’28.0’’S – 34º57’57.4’’W Ind. 06 08º00’28.3’’S – 34º57’57.3’’W Ind. 01 07º42’09.3’’S – 03º45’25.0’’W Ind. 02 07º42’09.3’’S – 03º45’25.9’’W Ind. 03 07º42’09.8’’S – 34º59’28.2’’W Usina São José (Igarassu) Zambana Ind. 04 07º42’09.8’’S – 34º59’28.3’’W Ind. 05 07º42’09.8’’S – 34º59’28.6’’W Ind. 06 07º42’08.6’’S – 34º59’32.2’’W Ind. 01 07º47’20.0’’S – 35º01’09.4’’W Ind. 02 07º47’20.1’’S – 35º01’09.5’’W Ind. 03 07º47’20.8’’S – 35º01’09.4’’W Usina São José (Igarassu) Pezinho Ind. 04 07º47’20.9’’S – 35º01’07.4’’W Ind. 05 07º47’23.3’’S – 35º01’08.3’’W Ind. 06 07º47’21.8’’S – 35º01’07.2’’W Ind. 01 07º50’32.6’’S – 34º59’31.1’’W Ind. 02 07º50’37.2’’S – 34º59’39.9’’W Ind. 03 07º50’41.4’’S – 34º59’41.6’’W Usina São José (Igarassu) Piedade Ind. 04 07º50’46.3’’S – 34º59’43.3’’W Ind. 05 07º50’51.0’’S – 34º59’44.8’’W Ind. 06 07º50’55.2’’S – 34º59’51.1’’W Ind. 01 Parque Nacional Sergipe Ind. 02 10º41’15.2”S – 37º24’30.5”W Serra de Itabaina Ind. 03 Ind. 01 Mirandiba Mirandiba Ind. 02 8º07’02.6”S e 38º43’37.4”W Ind. 03

A Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

B Tabela 2. Seleção de primers DAF, com respectivas sequências e quantidade de bandas polimórficas. Destaque em vermelho dos oligonucleotídeos utilizados no experimento.B

Primers Nº. Nome Sequência Polimorfismos 5’ 3’ 1 OP-A11 CAATCGCCGT 29 2 OP-A06 GGTCCCTGAC 27 3 OP-A10 GTGATCGCAG 26 4 15-5 TGCGTGCTTGAGAGA 22 5 OP-A17 GACCGCTTGT 20 6 15-10 AGGTCTTGGGTATAA 18 7 15-7b TGCGTGCTTGCACAA 18 8 OP-A12 TCGGCGATAG 18 9 15-13 AGGTCTTGGGTAAGG 17 10 15_8 TGCGTGCTTGTTAATC 15 11 15-4 TGCGTGCTTGATATA 15 12 15-14 GTGGGCTGACGTGGG 15 13 15-7a TGCGTGCTTGCACAA 15 14 15-17 TCTCCGCAACGCAAC 14 15 15-6 TGCGTGCTTGAAGAA 14 16 15-2 TGCGTGCTTGCGCGG 13 17 15-15 ACATCGCCCAACATC 13 18 15-9 TGCGTGCTTGTTCAT 13 19 15-16c GAACCTACGGTAGGG 13 20 15-16a GAACCTACGGTGAAG 12 21 15-16d GAACCTACGGTAAGG 12 22 15-20 ACCTGGGGAGGGGAG 10 23 15-12 AGGTCTTGGGTAGGC 09 24 15-18 CCTCTGACTGCCTCT 08 25 15-1 TGCGTGCTTGTATAA 07 26 15-11 AGGTCTTGGGTAGGG 07 27 15-19 CTATGCCGACCCGAC 04 28 15-16 GAACCTACGGTACGG - 29 15-16b GAACCTACGGTATAA - 30 15-16f GAACCTACGGTTATA - Total 404

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Tabela 3. Relação dos primers utilizados no processo de seleção do DAF, com respectivas sequências, quantidade de bandas polimórficas entre os intrapopulacional, interpopulacional parcial e interpopulacional total.

Primer Polimorfismos Interpopulacional Intrapopulacional Interpopulacional Parcial Nº Nome Sequência 5’3’ Apr/Zam/Pez/Pie Apr Zam Pez Pie Apr/Zam Apr/Pez Apr/Pie Zam/Pez Zam/Pie Pez/Pie 1. 15-5 TGCGTGCTTGAGAGA 17 11 05 18 21 20 24 16 25 22 25 2. 15-7b TGCGTGCTTGCACAA 07 05 02 11 13 14 17 07 16 14 18 3. 15-8 TGCGTGCTTGTTAAT 28 27 21 11 36 37 35 34 34 27 40 4. 15-10 AGGTCTTGGGTATAA 15 18 25 24 28 32 32 31 36 35 38 5. 15-13 AGGTCTTGGGTAAGG 18 11 13 10 25 26 23 19 19 19 27 6. A-06 GGTCCCTGAC 20 15 16 12 27 28 28 24 26 20 32 7. A-10 GTGATCGCAG 15 08 14 11 22 26 26 17 31 20 26 8. A-11 CAATCGCCGT 08 10 11 08 14 14 13 12 13 13 14 9. A-12 TCGGCGATAG 22 20 14 06 32 30 26 24 23 16 33 10. A-17 GACCGCTTGT 07 04 05 03 07 08 08 05 05 05 08 Total 157 129 126 114 225 235 232 189 228 191 261

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Tabela 4. Relação dos primers utilizados para ISSR, com respectivas sequências, quantidade de bandas polimórficas entre os níveis intrapopulacional, inter-populacional parcial e interpopulacional total. Primer Polimorfismos Interpopulacional Intrapopulacional Interpopulacional Parcial Nº Nome Sequência 5’3’ Apr/Zam/Pez/Pie Apr Zam Pez Pie Apr/Zam Apr/Pez Apr/Pie Zam/Pez Zam/Pie Pez/Pie 1. 884 HBHAGAGAGAGAGAGAG 11 11 12 13 18 19 22 18 22 21 23 2. 886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 06 12 02 14 16 11 21 14 20 20 18 3. 889 DBD ACACAC ACA CAC AC 12 12 09 05 17 18 17 14 14 15 20 4. 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 28 14 11 06 31 29 29 20 19 15 31 5. 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 24 22 21 17 32 34 31 30 25 28 34 Total 81 71 55 55 114 111 120 96 100 99 126

Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética populacional nas espécies...

Tabela 5. Análise da estrutura genética das populações de Xylopia frutescens. Dados referentes às metodologias DAF, ISSR e o agrupamento DAF/ISSR. Média dos valores de diversidade genética (Gst) e número de migrantes (Nm). Dados gerados pelo PopGen32.

DAF ISSR DAF/ISSR

Nº de loci- GsT Nm Nº GsT Nm Nº loci- GsT Nm DAF loci- DAF/ISSR ISSR Apr/Zam 229 0,2157 1,8180 119 0,1213 3,6223 348 0,1852 2,1992 Apr/Pez 238 0,2695 1,3985 123 0,2698 1,3531 361 0,2654 1,3842

Apr/Pie 235 0,1898 2,1345 120 0,2621 1,4074 355 0,2152 1,8237

Zam/Pez 204 0,2271 1,7013 103 0,1714 2,4167 307 0,2084 1,8992

Zam/Pie 233 0,2433 1,5550 100 0,2103 1,8771 333 0,2324 1,6514

Pez/Pie 199 0,2260 1,7125 99 0,3092 1,1170 298 0,2563 1,4512

Apr/Zam/Pez/Pie 264 0,3005 1,1638 129 0,3136 1,0946 393 0,3048 1,1405

A Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

≈ 32Km

≈ 11 km

≈ 14 km Apr Pez

≈ 5 km Pie

B C Figura 1. Imagem de satélite dos fragmentos urbanos e peri-urbanos analisados. A) Visualização agrupada dos quatro fragmentos de Igarassu e Recife. Linha tracejada branca: distância média entre a Usina São José e Dois Irmãos. B) Imagem ampliada dos três fragmentos da Usina de São José; Zam: Zambana; Pez: Pezinho; Pie: Piedade. C) Imagem do Horto de Dois 80 Irmãos; no detalhe em azul, o Açude da Prata (Apr). Fonte: Google Earth, com modificações. Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

86 PE-Iga-Pie-02 51 PE-Iga-Pie-03 44 PE-Iga-Pie-01

R-VI PE-Iga-Pie-04

PE-Iga-Pez-06 R-V 70 PE-Iga-Pie-06 66 PE-Iga-Pez-01 PE-Iga-Pez-02

61 PE-Iga-Pez-04 PE-Iga-Pez-03 R-IV 45 58 PE-Iga-Pez-05 II 90 PE-Iga-Zam-05 40 PE-Iga-Zam-06 R-III PE-Iga-Zam 01 45 PE-Iga-Zam-02 PE-Iga-Zam-03 93 71 PE-Iga-Zam-04

PE-Rec-Apr-06 R-II 57 68 PE-Rec-Apr-01 PE-Rec-Apr-02

PE-Rec-Apr-04

PE-Rec-Apr-03 79 PE-Rec-Apr-05

Ser-01

95 Ser-02 Ser-03 R-I PE-Mir-01 I 100 PE-Mir-02 51 PE-Mir-03

0.05 Figura 2. Análise de similaridade em Xylopia frutescens. Fenograma gerado a partir da análise de dados da reação de DAF pela análise de Neighbor-joining com bootstrap de 1000 replicações. PE: Pernambuco; Iga: Igarassu; Pie: Piedade; Pez: Pezinho; Zam: Zambana; Rec: Recife; Apr: Açude da Prata; Ser: Sergipe; Mir: Mirandiba. De 01-06: indivíduos analisados. Números na base do ramo indicam valores de bootstrap. Colchetes destacam os grupamentos.

81 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

PE-Iga-Pez-03 PE-Iga-Pez-04 PE-Iga-Pez-05 PE-Iga-Pez-02 PE-Iga-Pez-06 PE-Iga-Zam-06 R-IV 40 PE-Iga-Pez-01 PE-Iga-Zam-04

84 PE-Iga-Zam-01 PE-Iga-Zam-02 R-III II PE-Rec-Apr-01 PE-Rec-Apr-04 49 R-II 59 75 PE-Rec-Apr-05 PE-Rec-Apr-02

54 PE-Rec-Apr-03 PE-Rec-Apr-06 PE-Iga-Zam-05

57 PE-Mir-01 44 PE-Mir-02 PE-Iga-Pie-06 R-I PE-Iga-Pie-01 PE-Iga-Zam-03

73 PE-Iga-Pie-02 PE-Iga-Pie-05 PE-Mir-03 I PE-Iga-Pie-04 Ser-01 58 Ser-02 40 58 Ser-03

0.02 Figura 3. Análise de similaridade em Xylopia frutescens. Fenograma gerado a partir da análise de dados da reação de ISSR pela análise de Neighbor-joining com bootstrap de 1000 replicações. PE: Pernambuco; Iga: Igarassu; Pie: Piedade; Pez: Pezinho; Zam: Zambana; Rec: Recife; Apr: Açude da Prata; Ser: Sergipe; Mir: Mirandiba. De 01-06: indivíduos analisados. Números na base do ramo indicam valores de bootstrap. Quadrados em cores indicam as populações. Os grupamentos genéticos estão representados pelos colchetes.

82 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

55 PE-Iga-Pez-03 57 PE-Iga-Pez-05 66 PE-Iga-Pez-04 56 PE-Iga-Pez-02

PE-Iga-Pez-01 R-V 49 PE-Iga-Pez-06

PE-Iga-Pie-06 R-IV 80 PE-Iga-Pie-01 97 PE-Iga-Pie-02 PE-Iga-Zam-05 R-III 61 II 42 PE-Iga-Zam-06

61 PE-Iga-Zam-01 PE-Iga-Zam-02 99 R-II PE-Iga-Zam-03 PE-Iga-Zam-04

59 PE-Rec-Apr-01 PE-Rec-Apr-02

49 PE-Rec-Apr-06 SR - A PE-Rec-Apr-04 63 77 PE-Rec-Apr-05

94 Ser-01 Ser-02 R-I Ser-03 PE Mir 01 I 49 PE Mir 02 100 57 PE Mir 03

0.05

Figura 4. Análise de similaridade em Xylopia frutescens. Fenograma gerado a partir da análise dos dados agrupados de DAF e ISSR pela análise de Neighbor-joining com bootstrap de 1000 replicações. PE: Pernambuco; Iga: Igarassu; Pie: Piedade; Pez: Pezinho; Zam: Zambana; Rec: Recife; Apr: Açude da Prata; Ser: Sergipe; Mir: Mirandiba. De 01-06: indivíduos analisados. Números na base do ramo indicam valores de bootstrap . Quadrados em cores indicam as populações. Colchetes destacam os grupamentos.

83 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

6. CONCLUSÕES

 As populações das espécies de Chamaesyce apresentaram diferenças nos parâmetros aqui analisados. C. hirta apresentou maior número de polimorfismo, tendo os dados fenéticos e populacionais indicando uma forte tendência a conectividade com retenção de variabilidade entre as populações estudadas.  Já C. thymifolia mostrou-se com menor número de loci polimórficos. Todavia, os dados de NJ e os de Gst e Nm indicaram uma forte tendência à diferenciação genética entre as populações desta espécie. Os padrões ecológicos relacionados ao padrão de conexão destas espécies diferiram, mesmo com a simpatria das mesmas.  Nas populações de Xylopia frutescens, Apr, nas duas análises, possuiu os maiores índices de Dg global e próprio, revelando-se como a população que mais reteve a variabilidade.  As populações de Pez e Pie revelaram menores valores percentuais globais para os marcadores aplicados. Neste sentido, as conformações específicas dos fragmentos analisados (tamanho, recorte – invaginação), juntamente com o efeito de borda, parece ter influenciado na dinâmica dos polinizadores e dispersores.  O fenograma gerado indicou maior tendência à separação para a população Apr. No entanto as populações de Igarassu também apresentaram indícios de separação, principalmente para Zam. Esses dados são corroborados pelas análises populacionais que apontaram valores moderadamentes altos para estruturação (Gst).  Os valores de Nm foram maiores que 1 em 100% das análises propostas, indicando que, mesmo com a diferenciação entre as populações, houve uma manutenção da conectividade histórica entre os fragmentos. Uma possível explicação seria os indícios de fragmentação da Floresta Atlântica antes do início da exploração antrópica, devido às retrações e expansões da mata no Quaternário.  Os marcadores moleculares DAF e ISSR provaram ser eficientes no acesso a variabilidade nas populações das três espécies, onde elevados números de polimorfismos foram notificados. Portanto, foi possível apontar indícios das relações genético-ecológicas das populações.

84 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

7. ABSTRACT

Due to human occupation and the consequent fragmentation, the northeastern Atlantic Rainforest is a scenario of global and local extinction of native species, especially when considered the wealth of regional endemics. The genera Chamaesyce (Euphorbiaceae) and Xylopia (Annonaceae) include pioneer species and important bioindicators in the process of forest regeneration. In the present study urban and peri-urban populations of two herbaceous species Chamaesyce hirta (L.) Millsp. and C. thymifolia (L.) Millsp. were analyzed (15 of each species). For the woody species Xylopia frutescens Aubl. 24 individuals were analyzed from four populations in the cities of Recife and Igarassu (Açude do Prata - Apr, Zambana – Zam, Pezinho – Pez e Piedade – Pie). Apr is a fragment that suffers a strong anthropic influence. In the other hand the fragments of Usina de São José (USJ – Igarassu) are characterized by “tabuleiros” and flat plains. This region is intensively used for sugar cane cultivating. DAF (DNA Amplification Fingerprinting) and ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), markers were used, the latter being applied only in X. frutescens. The construction of phenograms was performed using the neighbor-joining method (bootstrap 1000 replications; MEGA v.6), while the calculations of genetic diversity and gene flow (Nm) made using POPGENE 32. In herbaceous species, 10 primers were applied to 30 individuals revealing 258 polymorphic loci. The phenogram generated for two herbaceous species showed two main groups and individuals consistently separated into specific levels. However, populations of C. thymifolia were separated from C. hirta populations, a feature corroborated by Gst and Nm analysis. In C. hirta, the value of Gst was 0.1815 and Nm was 2.2547, indicating a non-structuring. By the other hand, the values of Gst and Nm found for C. thymifolia (0.2977 and 1.1777, respectively) indicated structuring of populations. These data may be related to ecological differences of each species. In X. frutescens 10 DAF primers generated 261 polymorphic loci, while five ISSR primers revealed 126 loci. The global and own Dg pointed Apr as the population with greater variability while the populations Pezinho (ISSR) and Zambana (DAF) showed lower levels of variability. The generated phenogram pointed to a greater separation of individuals from Apr and mixing of Igarassu populations. The values of Gst and Nm were consistent with phenetic data. Considering the three forms of analysis (DAF, ISSR and DAF + ISSR) a greater tendency to structuring in the population of Apr and greater connectivity between the fragments of Igarassu were evident. The global Gst values showed a trend to structuring of the four populations. However, the historical values of connectivity (Nm) were above 1, suggesting that the fragmentation of the Atlantic Rainforest occurred before the colonization process (500 years), during the Quaternary. These fragmentations were performed by expansions and retractions of the forest. Despite the trend to separation the individuals remain a historical connectivity. The inclusion of a greater number of variables to the presented data, such as phenological aspects, would contribute the understanding of the structure and dynamics populations of these species.

Keywords: Atlantic Rainforest, DNA fingerprinting, gene flow, Chamaesyce, Xylopia

85 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

8. APÊNDICE

INSTRUÇÕES PARA AUTORES

REVISTA

GENETICS AND MOLECULAR RESEARCH Ribeirão Preto, Brasil

86 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

Genetics and Molecular Research (GMR) publishes research articles, research reports, technical notes, scientific commentaries, news, views, and review articles with regard to genetics, evolution, molecular biology and bioinformatics. It is an exclusively online journal. The journal is maintained by the not-for-profit scientific foundation Ribeirão Preto Foundation for Scientific Research (FUNPEC-RP). The fee per accepted submission is R$ 700.00 for Brazilian authors and US$400.00 for authors from other countries. The US dollar amount reflects the approximate current foreign exchange rate and is subject to change. This fee covers part of the expenses for final language and technical revision, for page setup, and for publishing online. Payment of the publishing fee should be made by the authors only after receiving a letter of acceptance. After payment is received by our office, the manuscript will be processed further for publication. Payment, both from within or outside Brazil, should be made by bank deposit (Banco do Brasil or Commerce Bank) or by credit card (Visa). Instructions for payment of the publishing fee will be sent together with the letter of acceptance for publication. Please contact the editorial office ([email protected]) if you have any questions. All GMR articles must meet the highest scientific quality standards, both in terms of originality and significance, and the research reported should make substantial advances. As it is a journal serving a wide and varied scientific community, article abstracts, introduc- tions and conclusions should be accessible to the non-specialist, stressing any wider implications of the work. However, the papers should not compromise on the scientific rigor and detail demanded by an international research journal. The broad readership that GMR attracts gives authors an opportunity to convey to a large audience, as well as to specialists, the importance of their work. The journal is currently indexed in over 64 services (see http://www.funpecrp.com.br/gmr/indexers.htm). Contributions should be sent either by e-mail as attachments to [email protected]. It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been published and will not be simultaneously published elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the publishers acquire full and exclusive copyright for all languages and countries. The use of registered names, trademarks, etc., in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use. All papers should be prepared in U.S. English. An initial evaluation of the language will be made upon receipt of each manuscript. Those that are considered inadequate for initial review will be returned or sent out for correction, at the discretion of the author. The manuscript will be considered officially received when the corrected version is ready to be sent to the referees. Before final acceptance, a submission letter with the title of the article and names and

87 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

2 signatures of all the authors should be posted to the above address or faxed to the journal at 55 (16) 3621-1991. Galley proofs will be sent in “pdf” form via e-mail for final revision. All authors are co-responsible for their submissions and they should make every effort to check the paper before this final step to avoid costly reformatting and possible introduction of new errors. GMR articles have no rigid length restrictions. They should contain sufficient technical detail for an expert reader to understand and assess the methods and results. There is no page limit for GMR articles, but authors should still be concise, for two main reasons. First, our electronic refereeing system relies on e-mail, and very large files occasionally cause problems. Second, lengthy manuscripts can be cumbersome to read and study. Referees tend to dislike them, and they take longer to process. In addition, readers of electronic journals often print articles to read them. Remember that a 10,000-word article takes up around 11 pages. How many pages would you be willing to read on-screen or print out? Editorial policies: Genetics and Molecular Research is a refereed journal. Only original manuscripts will be considered for publication. Manuscripts will be reviewed by at least two independent reviewers before a decision is made on publication. The whole process is conducted electronically to speed progress and final publication. Papers will be published (placed online) within two months after final acceptance. Papers accepted in their final form from January 1 to March 31 constitute the first issue of each volume, and so on. There are four issues per year. Manuscripts (in U.S. English), together with a cover letter from the author responsible for all correspondence, should be submitted to the Editor at [email protected] in electronic format as .doc files saved in Microsoft Word 97 for Windows, or later version. Do not use formatting such as Word’s “Heading” or “Style Sheets.” Spelling, punctuation, sentence structure, spacing, length, and consistency of usage in form and descriptions should be checked before submission. Please also check references for accuracy. Ensure that all figures and tables are mentioned in the text, and that all references are cited in the text. Figure and table files (see below) should be separate. Submission information Authors are required to provide the following information with their electronic submissions: Article submitted by, Article title, Authors (full list), Article type and session, Status of article (e.g., new, revised, etc.), Postal address, E-mail address, Phone number, Fax number, Names and types of the files sent. Brazilian authors should not translate their institutional addresses. These should remain in the original (Portuguese) language. Revised versions: Authors submitting a revised version of an article, must remember to include a list of changes, and replies to the referees (or technical editor). All the files, not just those revised, for the final draft of paper should be sent. Acknowledgment of electronic submissions: Successful receipt and processing of the author’s submission will be acknowledged by e-mail when the submitted manuscript has been checked. If no reply has been received within one week, the author should contact the editor at [email protected].

88 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

3 Review: Articles are reviewed anonymously by independent referees. Authors are encouraged to suggest names of expert reviewers, but selection remains the prerogative of the editors. To facilitate the review process, the authors can send supplementary material, such as cited accepted but not yet published papers, which may be important for assessment of the manuscript. A review article should contain: an abstract of 250 words or less, no more than 6 key words, a running tittle and no more than 60 references. It should be divided into sections with appropriate tittles and subtitles. Preparation of the manuscript Order the sections comprising the manuscript as follows: title, running title, author, address, abstract, key words, introduction, material and methods, results, discussion, acknowledgments, and references. Title Page: The title page should include the title of the article, authors’ names, and authors’ affiliation. The affiliation should comprise the department, institution (usually university or company), city, and state (or nation). The title page should include the name and complete mailing address, telephone number, fax number, and e-mail address of the author designated to review proofs. The title page should start below the top margin, be single-spaced, and have no space left before the Summary/Abstract. A running title of no more than 60 characters (including spaces) should be provided. Abstract: An abstract of up to 250 words, single-spaced, is required of research articles and reports and should be arranged in one paragraph. The following information (without headings) should be included: purpose, methods, results, and conclusions. Review articles also require an abstract, which need not include all of these items. Key words: A list of key words or indexing terms (up to six) should be included. Text Format: Headings should be bold, first letters capitalized and left-aligned. All text should be set in Times New Roman font, 12 point, left-aligned, single-spaced. Do not justify the right margin. Leave only one (1) space after periods. Paragraphs should not be indented; there should not be any blank lines between them. Use line returns only at the end of paragraphs. Do not use tabs or spaces to create indents. Use the Symbol font for symbols and special characters. Do not use equation editors or footnoting utilities. Save equations as images. Equations should be numbered consecutively with Arabic numerals in parentheses on the right hand side of the page. Footnotes: Footnotes should be avoided. When their use is absolutely necessary, footnotes should be numbered consecutively using Arabic numerals and should be placed at the bottom of the page to which they refer. Place a line above the footnote, so that it is set off from the text. Tables/Charts: Special care should be taken to ensure that all tables are properly formatted. Scientific symbols used should be in Symbol or Times New Roman. Tables should be on a separate page, numbered consecutively (with Arabic numerals) referred to by number in the text and designed to fit the column or page size of the journal. Use tables with cells to separate columns. Do not use spaces, tabs or vertical lines. Left justify the title above the table. 4

89 Pinangé, D.S.B. Análise da diversidade genética e estrutura populacional...

Indicate each table’s location within the manuscript. Illustrations: Illustrations/figures (photographs, drawings, diagrams, and charts) should each be in a single file, numbered in a consecutive series of Arabic numerals in the order in which they are cited in the text. Illustrations must be submitted as separate files. All illustrations are to be supplied in JPEG (jpg) format in either color or black and white. Images must be saved as separate, stand-alone files. The image resolution should be 300 dpi. Do not embed images within the text file. The placing of graphics in the paper should be indicated in the text and should include the captions for the figures. The authors should also send, by mail, a printed version of the figures. These should be at least 10 x 15 cm, up to US letter size, so that figures can be scanned to guarantee good quality for publishing online. Abbreviations: Try to use abbreviations in the text sparingly. Write out abbreviations in full the first time they are cited in text. Use the metric system for all measurements without periods (cm, mL, s). Define all symbols used in equations and formulas. Do not abbreviate the word “Figure” or “Table” in titles or text. Acknowledgments: All acknowledgments (including those for grant and financial support) should be typed in one paragraph directly preceding the reference section. Authors of manuscripts submitted to GMR are requested to state the source of all funding that enabled the described research to be undertaken. Reference: References in the text should include the name of the author and the year in parentheses, e.g. (Searle, 1961) or (King and Wilson, 1975). When a reference with more than two authors is cited, only the first author is named, e.g., (Comstock et al., 1958). The references must be cited in the text in chronological order, e.g., (Ideber, 2001; Uetz, 2002; Ottavai, 2004). References to “unpublished results” and “submitted papers” should appear in the text in parentheses following the name(s) of the individual(s). Example: (Pereira KS, Martins PK and Silva TM, unpublished results). No more than 40 references should be cited in a Full-length paper, 20 references in a Short Communication and 60 references in a Review article. Reference, under the heading “References”, should include only works referred to in the text. It should be arranged in alphabetical order under the first author’s last name. References should be cited as follows: journal papers - names and initials of the first four authors (after that using et al.), year, full title, journal abbreviated according to Index Medicus or I.S.I. web of science, volume number, first and last page numbers; books - names of authors, year, full title, edition, publishers, address (city); articles published in symposia - names of authors, year, full title of book, name(s) of editor(s) in parentheses, publisher, address (city), first and last page numbers. The references should consist of indexed articles only. References for techniques that are essential for understanding or repeating the methodology should always be in easily accessible journals. Reference style: The list of references at the end of the paper should follow the format requested by GMR. The link below can be accessed to see how the references should appear. Examples of reference style