Protein-Engineering Von Enzymen Des Hydantoinase-Prozesses

Protein-Engineering von Enzymen des Hydantoinase-Prozesses

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Geoffrey A. Behrens

geboren am 14.08.1985

in Buchholz i. d. N.

Greifswald, im August 2014

Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser

1.Gutachter : Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer

2. Gutachter: Prof. Dr. Christoph Syldatk

Tag der Promotion: 20.10.2014

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung...... 1 1.1 α-Aminosäuren...... 1 1.1.1 Herstellung...... 1 1.1.2 Einsatzgebiete...... 3 1.2 α-,α-disubstituierte Aminosäuren...... 4 1.3 β-Aminosäuren...... 5 1.3.1 Herstellung...... 6 1.3.1.1 Chemische Wege zur Synthese von β-Aminosäuren...... 6 1.3.1.2 Biokatalytische Wege zur Synthese von β-Aminosäuren...... 8 1.3.2 Einsatzgebiet...... 10 1.4 Enzyme in der Biotechnologie...... 11 1.5 Der Hydantoinase-Prozess...... 12 1.5.1 Chemische Synthesen von racemischen Hydantoinen...... 14 1.5.2 Hydantoinasen...... 15 1.5.2.1 Hydantoinasen zur Synthese von β-Aminosäuren...... 16 1.5.3 Carbamoylasen...... 18 1.5.3.1 D-Carbamoylasen...... 18 1.5.3.2 L-Carbamoylasen...... 19 1.5.4 Carbamoylase-verwandte Enzyme...... 22 1.5.5 Hydantoin-Racemasen...... 23 1.6 Methoden des protein-engineering...... 24 1.6.1 Gerichtete Evolution...... 26 1.6.2 Rationales Design...... 29 1.6.3 Semi-rationales Design oder fokussierte gerichtete Evolution...... 30 1.7 Computer Modelling...... 32 1.7.1 Docking...... 34 2 Zielsetzung...... 37 3 Ergebnisse...... 41 3.1 Entwicklung eines Mittel- bis Hochdurchsatzassays zur Detektion von Carbamoylase-Aktivität...... 41 3.1.1 Wachstumsassay auf Basis von Ammoniummangel...... 42

I 3.1.2 Glutamat-Dehydrogenase (GluDH) gekoppelter Assay...... 44 3.1.2.1 Etablierung des GluDH gekoppelten Assays auf einer Roboterplattform...... 46 3.2 Modelling von Carbamoylasen...... 47 3.3 Theoretische Überlegungen zur Umsetzung von β-Aminosäuren...... 48 3.4 Rationales Design der Arthrobacter aurescens Carbamoylase...... 50 3.4.1 Identifizierung geeigneter Positionen in der Arthrobacter aurescens Carbamoylase...... 50 3.4.1.1 Geeignete Positionen für eine Vergrößerung des aktiven Zentrums durch homologe Mutationen...... 50 3.4.1.2 Deletionen im Peptidrückgrat, um Strukturelemente im aktiven Zentrum zu verschieben...... 53 3.4.1.3 Schaffung neuer Interaktionspunkte an geeigneten Stellen durch Mutation nicht beteiligter Aminosäuren...... 54 3.4.1.4 Mutationen auf Grundlage der verwandten β-Ureidopropionasen...... 55 3.4.1.5 Insertion im Peptidrückgrat zur Verschiebung von Strukturelementen im aktiven Zentrum...... 57 3.4.2 Ergebnisse des rationalen Designs in vitro...... 58 3.5 CASTing der Arthrobacter aurescens Carbamoylase...... 59 3.5.1 Erstellung und Selektion der CAST-Bibliotheken...... 60 3.5.2 Gezielte Erstellung von Mutanten auf Basis der CASTing-Ergebnisse von Bereich I...... 62 3.6 Gene shuffling der Carbamoylasen aus Arthrobacter aurescens, Saccharomyces kluyveri und Agrobacterium tumefaciens...... 63 3.7 Weitere Untersuchungen an der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens...... 67 3.7.1 Strukturaufklärung der AauHyuC...... 67 3.7.2 Konstruktion einer Carbamoylase-Variante mit zwei entfernbaren Affinitätstags...... 69 3.7.3 Kristallstruktur der katalytischen Domäne von AauHyuC...... 72 3.8 Mutagenese der β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri...... 74 3.8.1 Arbeiten in silico...... 75 3.8.2 Arbeiten in vitro...... 78 3.9 Rationales Design von Hydantoinasen zur Synthese von α-,α-disubstituierten Aminosäuren...... 78 3.9.1 Vorarbeiten in silico...... 79

II 3.9.2 Experimentelle Arbeiten an der D-Hydantoinase aus Ochrobactrum sp.. 81 3.10 A. aurescens Carbamoylase Mutante V216A ...... 82 3.10.1 Docking...... 82 3.10.2 HPLC und NADH-Assay-Messung von Mutante V216A im Vergleich zum Wildtyp...... 84 4 Diskussion...... 89 4.1 Assayentwicklung zur Detektion verbesserter Carbamoylase-Aktivität gegenüber β-Aminosäuren...... 89 4.1.1 Hochdurchsatzselektionsassay auf Basis von Stickstoffmangel...... 89 4.1.2 Glutamat-Dehydrogenase gekoppelter Assay...... 92 4.1.3 Leitfähigkeitsassay und HPLC-Messung...... 96 4.2 Zum Einsatz von Homologiemodellen zum rationalen Enzymdesign.....96 4.3 Semirationales Design der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens. 99 4.4 Gerichtete Evolution der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens..101 4.5 Rationales Design der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens.....104 4.6 Rationales Design von β-Ureidopropionasen...... 110 4.7 Rationales Design von Hydantoinasen...... 111 4.8 Strukturaufklärung der Arthrobacter aurescens Carbamoylase...... 112 5 Zusammenfassung...... 117 6 Materialien und Methoden...... 123 6.1 Geräte...... 123 6.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien...... 124 6.3 Bakterienstämme...... 124 6.4 Enzyme...... 124 6.5 Plasmide...... 125 6.6 Primer...... 125 6.7 Medien und Zusätze...... 128 6.7.1 Medien...... 128 6.7.2 Zusätze...... 130 6.7.2.1 Antibiotika...... 130 6.7.2.2 Induktoren...... 130 6.7.2.3 Spurenelemente...... 130

III 6.8 Puffer und Lösungen...... 130 6.8.1 Agarosegelelektrophorese...... 130 6.8.1.1 50x TAE-Puffer...... 130 6.8.1.2 6x-DNA-Auftragespuffer...... 131 6.8.1.3 DNA-Marker...... 131 6.8.2 Coomassie-Färbung/Entfärbung...... 131 6.8.2.1 Färbelösung...... 131 6.8.2.2 Entfärber-Lösung...... 131 6.8.3 Herstellung kompetenter Zellen...... 131 6.8.3.1 RF 1-Puffer (400 mL, in A. dest.)...... 131 6.8.3.2 RF 2-Puffer (80 mL, in A. dest.)...... 131 6.8.4 Lösungen und Puffer für SDS-PAGE...... 132 6.8.4.1 10x SDS-PAGE-Laufpuffer, pH 8,4...... 132 6.8.4.2 APS-Lösung...... 132 6.8.4.3 Acrylamid-Lösung (Roth)...... 132 6.8.4.4 Auftragepuffer für SDS-PAGE...... 132 6.8.4.5 Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) „Lower Tris“...... 132 6.8.4.6 Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) „Upper Tris“...... 132 6.8.5 Zell- und Protein-Puffer...... 133 6.8.6 Proteinreinigung...... 133 6.8.6.1 Histidin-Tag Reinigungspuffer für die ÄKTA...... 133 6.8.6.2 Strep-Tag Reinigungspuffer für die ÄKTA...... 133 6.8.7 Assay Lösungen...... 134 6.8.7.1 Leitfähigkeitsassay-Substratlösung...... 134 6.8.7.2 Ehrlich-Reagenz...... 134 6.9 Methoden...... 134 6.9.1 Mikrobiologische und Molekularbiologische Methoden...... 134 6.9.1.1 Stammhaltung...... 134 6.9.1.2 Herstellung chemisch kompetenter Zellen...... 134 6.9.1.3 Transformation...... 135 6.9.1.4 Plasmidisolation...... 135 6.9.1.5 Sequenzierung...... 135 6.9.1.6 Agarosegelelektrophorese...... 135 6.9.1.7 PCR zur Genamplifikation...... 136 6.9.1.8 Positionsgerichtete Mutagenese...... 136 6.9.1.9 degenerate oligonucleotide gene-shuffling (DOGS)...... 137 6.9.1.10 Restriktionsverdau...... 140

IV 6.9.1.11 Ligation...... 141 6.9.1.12 fast cloning...... 141 6.9.1.13 Random Insertion and Deletion (RID)...... 143 6.9.2 Biochemische Methoden...... 148 6.9.2.1 Proteinexpression der L-N-Carbamolyase (WT und Mutanten) aus A. aurescens DSM 3747, der β-Ureidopropionase aus S. kluyveri und der D-Hydantoinase aus Ochrobactrum sp. G 21 in E. coli...... 148 6.9.2.2 Zellaufschluss...... 148 6.9.2.3 Proteingehaltsbestimmung mit BC-Assay...... 149 6.9.2.4 SDS-PAGE...... 149 6.9.2.5 Reinigung von Histidin-Tag-Proteinen...... 150 6.9.2.6 Reinigung von StrepTag-Proteinen...... 151 6.9.2.7 Proteinreinigung durch Gelfiltration...... 151 6.9.2.8 Entfernung der Affinitätstags von der L-N-Carbamoylase aus A. aurescens durch Endoproteasen...... 151 6.9.3 Biokatalyse...... 152 6.9.3.1 GluDH gekoppelter Assay...... 152 6.9.3.2 Leitfähigkeitsassay ...... 153 6.9.3.3 Ehrlich Test zum Nachweis von α-,α-disubstituierten Aminosäuren...... 153 6.9.3.4 HPLC-Analyse...... 153 6.9.4 Chemische Synthese...... 154 6.9.4.1 Herstellung von Phenyldihydrouracil aus Zimtsäure und Harnstoff...... 154 6.9.4.2 Herstellung von N-Carbamoyl-β-Phenylalanin aus Phenyldihydrouracil...... 155 6.9.5 Methoden des molecular modelling...... 155 6.9.5.1 Erstellung eines Homologiemodells...... 155 6.9.5.2 Energieminimierung...... 156 6.9.5.3 Docking...... 156 6.10 Verwendete Computerprogramme...... 156 7 Literatur...... 157

Eigenständigkeitserklärung...... I Lebenslauf...... III Danksagung...... V

7 Literatur

Abkürzungsverzeichnis

.pdb Dateiformat für MTP Mikrotiterplatte(n) Proteinkristallstrukturen aus der Proteindatenbank % Prozent NCαTrp N-Carbamoyl-α-Tryptophan % (v/v) Volumenprozent NCβAla N-Carbamoyl-β-Alanin % (w/v) Massenprozent NCβPhe N-Carbamoyl-β-Phenylalanin °C Grad Celsius ns Nanosekunde

Å Angstrom OD600 Optische Dichte bei 600 nm A. Arthrobacter aurescens OspHyuH Hydantoinase aus aurescens Ochrobactrum spec. G21 A. dest destilliertes Wasser PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese AauHyuC Carbamoylase aus Arthrobacter PAM Phenylalanin Aminomutase aurescens Amp Ampicillin PCR Polymerasekettenreaktion APS Ammoniumpersulfat Pfu Pyrococcus furiosus BCA Bicinchoninsäure-Assay PheDU Phenyldihydrouracil BES N,N-Bis (2-hydroxyethyl)-2- ps Pikosekunde aminoethansulfonsaure Bis-Tris Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris QC QuikChangeTM (hydroxymethyl) methan BSA Rinderserumalbumin QM quantum mechanics CAL-B Candida antarctica Lipase B RID random insertion and deletion mutagenesis cm Zentimeter RMSD root mean square deviation DMSO Dimethylsulfoxid rpm Umdrehungen pro Minute DNA Desoxyribonukleinsäure RT Raumtemperatur dNTP Desoxynukleosidtriphosphat rv reverse DOGS degenerate oligonucleotide s Sekunde gene shuffling ds Doppelstrang S Siemens DTT Dithiothreitol SDS Natriumdodecylsulfat E. coli Escherichia coli SklbUp β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri EC Enzyme Commission SmeHyuC Carbamoylase aus Sinorhizobium meliloti EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ss Einzelstrang epPCR error prone PCR StEP staggered extension process FACS fluorescence activated cell taq Thermus aquaticus sorter fw forward TEMED N,N,N‘,N‘- Tetramethylethylendiamin

7 7 Literatur

GluDH Glutamat-Dehydrogenase TFA Trifluoressigsäure GstHyuC Carbamoylase aus Geobacillus TRIS Tris(hydroxymethyl)- stearothermophilus aminomethan h Stunde U Units [μmol/min] HPLC Hochleistungsflüssigkeitschroma ÜN über Nacht tographie kD kiloDalton wt Wildtyp MD Molekulardynamik αTrp α-Trytophan min Minuten βCarAT β-Ureidopropionase aus Agrobacterium tumefaciens ml Milliliter βPhe β-Phenylalanin MM molecular mechanics µL Mikroliter mM Millimolar µM Mikromolar MOPS 3-(N-Morpholino)- Propansulfonsäure

Es wurden die üblichen Abkürzungen für Kernbasen und Aminosäuren verwendet.

8 EINLEITUNG

“always pass on what you have learned“

Yoda

1 Einleitung

1.1 α-Aminosäuren α-Aminosäuren sind die Grundbausteine der Proteine und somit essentiell für alle uns bekannten Lebensformen. α-Aminosäuren haben als gemeinsames Strukturmerkmal die Aminofunktion am α-Kohlenstoffatom der Säuregruppe. Die 20 kanonischen Aminosäuren tragen, abgesehen von Glycin, alle einen weiteren Rest am α-Kohlenstoffatom. Dieser kann sauer, basisch, aromatisch oder aliphatisch sein. Durch diesen Aufbau sind die kanonischen Aminosäuren (außer Glycin) chiral. In natürlichen Proteinen kommt dabei ausschließlich die L-Form vor. Für gewisse strukturelle Anforderungen werden allerdings auch D-Aminosäuren benötigt, zum Beispiel D-Alanin in der bakteriellen Zellwand. In Stoffwechselprozessen sind α-Aminosäuren wichtige Intermediate, zum Beispiel Orni- thin oder Citrullin im Harnstoffzyklus oder L-Homoserin in der Argininsynthese. Zudem dienen sie als Vorläufer vieler Botenstoffe (Hormone), wie Thyroxin, Adrenalin, Serotonin oder Stickstoffmonoxid.

1.1.1 Herstellung Für die Herstellung von α-Aminosäuren können vier Verfahren unterschieden werden, Extraktion, chemische Synthese, enzymatische Synthese und fermentative Herstellung. Die Extraktionsmethode ist die einfachste der vorgestellten Methoden. Hierbei werden Proteine mittels Säuren hydrolysiert und anschließend die Aminosäuren chromatografisch aufgetrennt. Durch dieses Verfahren sind nur proteinogene Aminosäuren zugänglich. Inzwischen ist das Verfahren nicht mehr von großer Relevanz, wird allerdings noch für L-Serin, L-Prolin, L-Hydroxyprolin, und L-Tyrosin genutzt.[2] Als chemische Synthese ist insbesondere die Strecker-Synthese bekannt.[17] Die Synthese erfolgt hierbei aus einem Aldehyd, Ammoniak und Kaliumcyanid, es handelt sich um eine abgewandelte Mannich Reaktion. Ein Vorteil sind die günstigen Edukte und die hohen Ausbeuten. Nachteilig ist allerdings, dass die Reaktion zu racemischen Aminosäuren führt, womit die Ausbeute auf 50% reduziert wird. Weiterhin ist die Arbeit mit toxischem Cyanid im industriellen Maßstab unerwünscht und daher zu vermeiden. Eine Variante der Strecker-Synthese nutzt einen chiralen Amin-Donor (β-D-Galactosamin) anstelle von Ammoniak, hiermit können in einigen Fällen bereits ausreichende Enantiomerenüber- schüsse erzeugt werden.[18]

1 1 Einleitung

Im Übersichtsartikel von Gröger sind vielfältige Varianten der Strecker Synthese gezeigt, die verschiedene chirale Katalysatoren nutzen, um die Enantioselektivität der Synthese zu erhöhen (Abbildung 1.1.1).[1]

wässriges O 3 H2N-R Reaktionsmedium + R1 R2 HCN one-pot-Synthese Route (a): Originale Strecker Reaktion (Drei-Komponenten- Kondensationsreaktion) (R2=H; R3=H)

H R3 H R3 N Hydrolyse N CN CO H R1 R1 2 R2 R2

Hydrocyanierung Route (b): modifizierte + HCN Strecker Reaktion (Hydrocyanierung des zuvor R3 O Imin-Bildung gebildeten Imins) 3 N + H2N-R R1 R2 R1 R2 Abbildung 1.1.1: Reaktionsschema der ursprünglichen Strecker-Reaktion, sowie der modifizierten Variante, die eine größere Flexibilität der beteiligten Reaktanden erlaubt. In der Route (b) kann, ausgehend vom Imin mittels chiraler Metall- oder Organokatalysten, Enantioselektivität generiert werden.[1]

Generell ist zu sagen, dass die chemischen Synthesen entweder direkt stereoselektiv unter Verwendung von chiralen Katalysatoren erfolgen oder zunächst ein Racemat erzeugt wird, das im Anschluss getrennt wird. Im ersten Fall ist die theoretische Ausbeute 100%, allerdings sind die benötigten Katalysatoren meist sehr teuer und limitieren so den Nutzen dieser Methode. Im zweiten Fall ist die Ausbeute des gewünschten Enantiomers nur 50% und die chromatografische Trennung der beiden Enantiomere ist schwierig und teuer. Alternativ kann durch stereoselektive Enzyme (Acylasen, Lipasen) ein Enantiomer gezielt modifiziert werden und so die Trennung vereinfacht werden, im besonders günstigen Fall kann das verbleibende Enantiomer wieder racemisiert werden und so die theoretische Ausbeute auf 100% steigen (Dynamisch-kinetische-Racematspaltung, DKR).[19] Die enzymatischen Prozesse verlaufen meist in einem oder wenigen Schritten von einer achiralen Aminosäurevorstufe zu der α-Aminosäure. Durch die Stereoselektivität der eingesetzten Enzyme ist hier zumeist eine exzellente Enantiomerenreinheit der dargestellten α-Aminosäure möglich, allerdings ist gleichzeitig, bedingt durch die Substratspezi- fität der eingesetzten Enzyme, der Zugang zu nicht-natürlichen Aminosäuren nur bedingt möglich. L-Aspartat wird großtechnisch, katalysiert durch Aspartase, aus Ammoniak und Fumarat hergestellt.[20] Das so in einem Schritt gewonnene Aspartat kann als Vorstufe zur Produk- tion von L-Alanin, unter Verwendung einer Aspartat β-Decarboxylase, genutzt werden.[21]

2 1 Einleitung

Die fermentative Herstellung von Aminosäuren hat bereits eine lange Tradition. Der erste fermentative Prozess zur Gewinnung von Glutamat wurde 1957 etabliert[22-23]. C. glutamicum, als natürlicher Glutamat-Überproduzent, ermöglichte die fermentative Herstellung dieser α-Aminosäure. Durch umfangreiche Mutationen in C. glutamicum konnte die Ausbeute um den Faktor 10 (von 10 g/L beim Wildtyp auf über 100 g/L bei modernen Industriestämmen) gesteigert werden. Andere Mutationen erlaubten bereits früh die Gewinnung anderer α-Aminosäuren, zum Beispiel Lysin[24], Valin[25] und Trypto- phan[26] mit hohen Ausbeuten in enantiomerenreiner Form. Auch hier konnte die Produkti- vität durch den Einsatz klassischer Mutagenese[27], gezielter Mutagenese[28] oder genome breeding [29] noch deutlich gesteigert werden.

Tabelle 1.1.1: Fermentativ hergestellte α-Aminosäuren nach Ikeda 2003.[30]

Aminosäure Stamm/Mutante Titer Geschätzter Ertrag [g/L] [g/100 g Saccharose]

L-Lysin HCl C. glutamicum β-6 100 40-50

L-Threonin E. coli KY 10935 100 40-50

L-Tryptophan C. glutamicum KY9218/pIK9960 58 20-25

L-Tryptophan E. coli 45 20-25

L-Phenylalanin E. coli MWPWJ304/pMW16 51 20-25

L-Arginin Brevibacterium flavum AJ12429 36 30-40

L-Histidin C. glutamicum F81/pCH99 23 15-20

L-Isoleucine E. coli H-8461 30 20-30

L-Serin Methylobacterium sp. MN43 65 30-35

L-Valin C. glutamicum VR 3 99 30-40

1.1.2 Einsatzgebiete

Der größte Teil der Aminosäuren wird in der Humanernährung eingesetzt, insbesondere in Form von Glutamat, als klassischer Speisezusatz im asiatischen Raum. In der westlichen Welt wird es jedoch häufig als Geschmacksverstärker in Fertiggerichten eingesetzt. Glutamat wird ausschließlich mittels Fermentation hergestellt, der Weltjahresbedarf liegt bei 1,5 Mt.[31]

3 1 Einleitung

Durch den geringen pro kg Preis für Glutamat ist allerdings der Sektor der landwirtschaftli- chen Tierernährung finanziell von größerer Bedeutung. Hier ist insbesondere L-Lysin hervorzuheben, traditionelle Futtermittel (Mais, Weizen oder Gerste) sind arm an L-Lysin, eine Zugabe von 0,5% Lysin erhöht die Qualität des Futtermittels gleichermaßen wie die Zugabe von 20% Sojamehl. Gleichzeitig wird die Stickstoffausscheidung verringert. Der Lysin-Weltmarkt lag im Jahr 2001 bereits bei 550.000 t mit geschätzten 7% jährlichem Wachstum. Threonin wird analog zu Lysin eingesetzt, hier lag der Bedarf allerdings nur bei 30.000 t in 2002 mit einem jährlichen Wachstum von 15%.[32] Tryptophan wird als essentielle Aminosäure, sowohl in der humanen, als auch in der Tierernährung zugesetzt. Für den Menschen dient es als Nahrungsergänzung und auch als antidepressives und schlafförderndes Mittel, da Tryptophan die Vorstufe des Hormons Serotonin ist. L-Aspartat und L-Phenylalanin sind die Ausgangsstoffe für den Süßstoff Aspartam, der in Diätlimonaden weltweit eingesetzt wird. Der weitaus geringste Teil der weltweit hergestellten α-Aminosäuren wird als chirale Vorstufe von Feinchemikalien oder als spezielle Nahrungsergänzungsmittel vor allem in der medizinischen Spezialernährung genutzt. Auch in der Kosmetikindustrie finden α-Amino- säuren Verwendung.

Abbildung 1.2.1: Marktanteil von α-Aminosäuren nach Leuchtenberger et al.[2] (Gesamtmarktwert 4,5 Mrd USD).

1.2 α-,α-disubstituierte Aminosäuren Im Rahmen einer von mir mit betreuten Diplomarbeit im Arbeitskreis Bornscheuer wurden der Einsatz des Hydantoinase-Prozess (Kapitel 1.5) zur Synthese von α-,α-disubstituierten Aminosäuren untersucht. α-,α-disubstituierte Aminosäuren sind nicht-proteinogene Aminosäuren, mit einer erhöhten Stabilität am α-Kohlenstoffatom. Integriert in Proteine weisen sie interessante

4 1 Einleitung

Eigenschaften auf.[33] So führte zum Beispiel der Einbau des achiralen α-Methylalanins in Peptiden zu einer erhöhten Ausbildung helikaler Sekundärstrukturen.[34] Auch für pharmakologische Anwendungen können α-,α-disubstituierte Aminosäuren von Interesse sein, so finden sich diese Bausteine auch in Blutdruckregulatoren oder Antibio- tika.[35-36] Bereits vorhandene und untersuchte Wirkstoffe können durch den Einsatz von α-,α-disubstituierten Aminosäuren in ihren Eigenschaften verbessert werden: Tauscht man das Tyrosin 4 in dem Oktapeptid Angiotensin II, einem Peptidhormon, das an dem Blutdruck- regulationssystem mitwirkt, gegen (S)-α-Methyltyrosin (Abbildung 1.2.2) aus, führt dies zu einer Resistenz gegenüber dem Abbau durch Chymotrypsin.[37] O

NH2 HO Abbildung 1.2.2: (S)-α-Methyltyrosin, eine chirale α-,α-disubstituierte Aminosäure.

In der Grundlagenforschung können α-,α-disubstituierte Aminosäuren zur Untersuchung der Transportmechanismen von Aminosäuren eingesetzt werden.[38]

1.3 β-Aminosäuren β-Aminosäuren tragen die Aminogruppe im Gegensatz zu den α-Aminosäuren am β-Kohlenstoffatom, je nach Position der Reste wird zwischen β2-, β3- und β2,3-Aminosäuren unterschieden (siehe Abbildung 1.3.1).

NH3 NH3 NH3 H3N O O R O R O

R O R O O R O a b c d

Abbildung 1.3.1: Vergleich einer α-Aminosäure (a) mit β2- (b), β3- (c) und β2,3-Aminosäuren (d)

Häufig in der Natur vorkommende β-Aminosäuren sind β-Alanin und β-Aminoisobutter- säure als finale Abbauprodukte der Pyrimidinbasen Uracil und Thymin. Zudem wird β-

Alanin von Bakterien, Pilzen und Pflanzen zum Aufbau von Pantothensäure (Vitamin B5) benutzt. Häufig kommen β-Aminosäuren als aktive Sekundärmetabolite in der Natur vor. Ein wichtiges Beispiel hier ist das β-Tubulin bindende Antikrebsmittel Paclitaxel, welches aus der

5 1 Einleitung

Rinde der Pazifischen Eibe (Taxus brevifolia) gewonnen werden kann. Teil des Grundgerüst ist hier ein α-hydroxyliertes β-Phenylalanin.[39] Ähnlich interessante Eigenschaften weißt Jasponamid auf, welches aus dem Schwamm Japsis splendens isoliert wurde. Es zeigt neben der Antitumorwirkung auch antihelminthi- sche und antifungale Wirkung. β-Tyrosin bildet hier einen Teil des Grundgerüsts.[40] Beide Sekundärmetabolite sind in Abbildung 1.3.2 gezeigt und die β-Aminosäuren hevorge- hoben.

HO NH O

O O Br HN O

HN O HO O O N O O O O O OH NH

O O Paclitaxel Jasponamide

Abbildung 1.3.2: Sekundäre Metabolite mit β-Aminosäuren im Gerüst, die β-Aminosäure ist hervorgehoben.

1.3.1 Herstellung

1.3.1.1 Chemische Wege zur Synthese von β-Aminosäuren Liu und Sibi teilen die chemische Synthese von chiralen β-Aminosäuren in die folgenden Kategorien ein: der chiral pool Ansatz, die Racematspaltung, sowie die asymmetrische Synthese.[40-41] Der chiral pool Ansatz nutzt die Verfügbarkeit chiraler α-Aminosäuren zur Synthese chiraler β-Aminosäuren. Die meist genutzte Reaktion ist hier die Arndt–Eistert-Reaktion, die eine Verlängerung einer Kohlenstoffkette um ein Kohlenstoffatom ermöglicht. Seebach et al. nutzten die Arndt–Eistert-Reaktion zur Herstellung von β-Homoleucin und β-Homovalin in der jeweils N-Boc und O-Methyl geschützten Form, aus den kommerziell erhältlichen Boc-geschützten α-Aminosäuren. Die Ausbeute betrug 87%, beziehungsweise 93%.[42] Im industriellen Maßstab ist die Arndt–Eistert-Reaktion nicht anwendbar, da der Preis des Silberkatalysators zu hoch und die Handhabung von Diazomethan als Methylierungsmittel

6 1 Einleitung zu schwierig ist. Weiterhin ist man auf die kommerzielle Verfügbarkeit der chiralen α-Ami- nosäuren angewiesen.[41] Eine weitere Variante, bei der sich der bereits vorhandene chirale Pool von α-Aminosäuren zunutze gemacht wird, sind Methoden die von Asparagin oder Aspartat ausgehen, da bei beiden Aminosäuren die Aminogruppe β-ständig zur funktionalen Seitenkette liegt. Jefford et al. waren in der Lage unter anderem die N-terminalen Säuren der bioaktiven Natur- stoffe Bestatin und Microginin aus L-Aspartat zu synthetisieren. Eine klassische Methode Carbonsäuren zu deracemisieren ist, das racemische Gemisch durch Komplexierung mit einer chiralen Base in ein diastereomeres Salz zu überführen. Durch Wahl eines geeigneten Lösungsmittels kann das Salz durch fraktionierte Kristallisa- tion getrennt werden. Nach der Trennung kann das Salz einfach in die freie Säure zurück überführt und die chirale Base zurückgewonnen werden. Ephedrin ist eine häufig genutzte Base für diese Zwecke. Das Verfahren ist allerdings langwierig und mühsam.[41] Für die asymmetrische Synthese von chiralen β-Aminosäuren gibt es eine Vielzahl von Wegen, von den unterschiedlichsten Startverbindungen ausgehend, die in unterschiedlichen Publikationen im Detail diskutiert werden.[3, 41, 43] Gemeinsam ist allen Varianten der asymmetrischen Synthese, dass entweder ein chiraler Katalysator oder ein Auxiliar benö- tigt wird. In einem aktuellen Übersichtsartikel werden Rhodium- oder Ruthenium-Kataly- satoren zur selektiven Hydrogenierung als interessantester Syntheseweg für die Herstel- lung von β-Aminosäuren betrachtet, da sie eine hohe Selektivität (>90% ee) bei geringen Katalysatormengen aufweisen.[3] In Abbildung 1.3.3 ist das Schema einer Rhodium-kataly- sierten Reaktion aufgezeigt.

[Rh(COD)Cl]2 (0,15 mol%) NH2 NH2 3 (0,30 mol%) t P Bu2 Co2Me Co2Me Fe R MeOH oder TFE, 50°C R PPh2 6,2 - 6,9 bar H2 1 2 3 9 Beispiele 74-98% Ausbeute 82-97% ee Abbildung 1.3.3: Rhodium-katalysierte Hydrogenierung von ungeschützten Enaminen unter Einsatz des chiralen Liganden 3, nach Weiner et al.[3].

Die organische Katalyse hat in den letzten Jahren insbesondere bei Mannich-Reaktion basierten Strategien an Bedeutung gewonnen, noch sind allerdings die benötigten Kataly- satormengen zu hoch. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass (S)-Prolin als natürliche Aminosäure als günstiger Katalysator zur Verfügung steht.[3]

7 1 Einleitung

1.3.1.2 Biokatalytische Wege zur Synthese von β-Aminosäuren Biokatalytische Wege zu β-Aminosäuren sind schwieriger als zu α-Aminosäuren: Wegen des verhältnismäßig seltenen natürlichen Vorkommens von β-Aminosäuren sind nur wenige Enzyme bekannt, die diese als Substrate akzeptieren. Häufig zeigen die Enzyme bei β-Aminosäuren zudem eine stark verringerte Stereoselektivität. Somit sind viele der aus der α-Aminosäure-Produktion etablierten Wege nicht für die Synthese von β-Amino- säuren geeignet.

NH3 NH3 COO COO

H3C NH3 NH3 COO COO PAM COO F R

NH3 NH3 NH3 COO COO S

H3CO NH3 NH3 COO COO

Abbildung 1.3.4: β-Aminosäuren, die durch die enzymatische Umsetzung der entsprechenden α-Aminosäuren zugänglich sind, modifiziert nach Klettke et al.[4]. PAM: Phenylalanin Aminomutase

Die biokatalytischen Strategien zur Synthese kann man analog der chemischen Wege einteilen: a) ausgehend von chiralen α-Aminosäuren, b) Racematspaltung und c) asymmetrische Synthese. Klettke et al. zeigten, dass die Taxus Phenylalanin-Aminomutase (PAM) in der Lage ist eine große Varianz an α-Phenylalanin-Derivaten zu den entsprechenden β-Aminosäuren umzusetzen. Interessant ist dabei, dass die Konfiguration von (S)-α-Aminosäure nach (R)-β-Aminosäure umgekehrt wird (Abbildung 1.3.4).[4] Zudem gelang es Wu et al. durch eine einzelne Mutation in der PAM an Position C107 eine Tyrosin-Aminomutase (TAM) zu erzeugen. Die Mutante C107S erzeugt stereoselektiv (R)-β-Tyrosin aus (S)-α-Tyrosin mit einem ee von > 99%. Zudem katalysiert diese

8 1 Einleitung

Mutante auch die Addition von Ammonium an 4-Hydroxyzimtsäure in hoher Selektivität an die β-Position, so dass > 99% β-Tyrosin erzeugt werden konnte.[44] Die zur Zeit am häufigsten genutzten biokatalytischen Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen β-Aminosäuren sind die Racematspaltung mittels Hydrolasen. Eine Vielzahl unterschiedlicher Wege kann hier, je nach eingesetztem Substrat, genutzt werden. Allen gemeinsam ist, dass solange das verbleibende Enantiomer nicht erneut in das Racemat überführt werden kann (dynamisch kinetische Racematspaltung), die Ausbeute bei maximal 50% liegt. Im Übersichtsartikel von Liljeblad und Kanerva sind eine Vielzahl der Hydrolasen-basierten Methoden aufgeführt (Abbildung 1.3.5).[5] OH

N H R2 O N R O NH Acylierung durch 2 3 - Lipase PS NHCOR - Lipase AK Hydrolyse durch CO2Et CAL-B R2 CO2Et Acylierung durch R2 CAL-A oder -B Alkoholyse, Hydrolyse oder Umesterung durch CAL-B NH3 NHCOR COO R2 CO2Et Ar HN O enantiomerenreine ß3-Aminosäure Hydrolyse durch - α -chymotrypsin (R=Ac) COO - Lipase PS (R=H) R2 Cl O Hydrolyse durch Penicillin Acylase O HN NH HN O HN COO Ph O Ar COO Ar Hydrolyse durch Hydrolyse durch Hydantoinase Acylase I Hydrolyse durch Peptiddeformylase

Abbildung 1.3.5: Hydrolytische enzymatische Methoden zur Synthese enantiomerenreiner β3-Aminosäuren modifiziert nach Liljeblad und Kanerva[5].

Exemplarisch behandelt sei hier die Nutzung der Lipase CAL-A zur Synthese enantiomerenreiner β-Aminosäuren. Ausgehend von einem racemischen Gemisch wird ein Enantiomer selektiv verestert und kann so leicht aus dem Reaktionsgemisch getrennt werden. In Abbildung 1.3.6 ist das grundsätzliche Schema für die Reaktion dargestellt.

9 1 Einleitung

O NH O NH O 2 PrCO2R' 2 Pr NH O R OH CAL-A R OH R OH rac-1a-g (R)-oder(S)-1a-g (R)-oder(S)-2a-g

Ac O O 2

NH O

R OH (R)-oder(S)-3a-f Abbildung 1.3.6: Schema des Einsatze von CAL-A zur Gewinnung enantiomerenreiner β-Aminosäuren nach [6]. a: R = Me; b: R = Et; c: R = n-Pr; d: R = i-Pr; e: R = CHEt2; f: R = Cyclohexyl; g: R = Ph,

R' = CH2CF3 oder Bu

Gedey et al. gelang es auf diese Weise beide Enantiomere der sieben in Abbildung 1.3.6 gezeigten Verbindungen mit ee%-Werten zwischen 79 (1e(S)) und 99 (1a(R), 1d(S) und 1f(R/S)) zu erzeugen. Die Nutzung von Hydantoinasen zur enantiomerenreinen Herstellung von α- und β-Amino- säuren wird in Kapitel 1.5 ausführlich beschrieben.

1.3.2 Einsatzgebiet Einfache β-Aminosäuren kommen durchaus im Primärmetabolismus vor, β-Alanin ist für die Synthese von Pantothensäure und damit Coenzym A von Bedeutung. Ebenso sind β-Alanin und β-Aminoisobuttersäure Abbauprodukte aus dem reduktiven Abbau von Uracil und Thymin des Pyrimidinkatabolismus in Säugetieren.[45] Darüber hinaus, und von größerer pharmakologischer Bedeutsamkeit, sind β-Aminosäuren Bestandteil vieler biologisch wirksamer Agenzien des Sekundärstoffwechsels, genannt wurden bereits Paclitaxel und Jasponamid. Natürlicherweise bisher nicht bekannt sind Peptide die aus β-Aminosäuren aufgebaut sind. Diese wurden allerdings synthetisch hergestellt und zeigen viele interessante und potentiell nutzbare Eigenschaften. Die β-Peptide bilden analog zu α-Peptiden Sekundärstruk- turen aus, sowohl stabile Helices[42] als auch Turns und stabile Faltblätter[46] kommen vor. Die zusätzliche Methylengruppe zwischen Amino- und Säuregruppe und die Variabilität in der Positionierung der Seitenkette erlauben eine größere strukturelle Diversität in β-Peptiden. Zudem können β-Peptide auch die von Proteinen bekannten Aufgaben erfüllen,

10 1 Einleitung so ist sowohl die Protein-Protein-Interaktion, als auch die Protein-Nukleinsäure-Interaktion möglich, diese Tatsache erhöht die medizinische Einsatzfähigkeit von β-Peptiden.[47] Kritzer et al. konnten eine stabile 14-Helix basierend auf β3-Aminosäuren zu erzeugen. Sie zeigten, dass die Helix auch mit einer Vielzahl an Seitenkettensubstitutionen stabil die Sekundärstruktur beibehält. Zudem konnte durch gezielte Modifikation der Helix ein Prote- in-Protein-Interaktionsinhibitor für den Komplex p53 und HDM2 erzeugt werden.[48] Gleichzeitig sind β-Peptide in vitro[49] und in vivo[50] stabiler als die analogen α-Peptide, da sie von den üblichen Peptid-abbauenden Enzymen nicht als Substrate akzeptiert werden. Die Biodegradation von β-Peptiden ist dennoch möglich[51], bis 2012 sind fünf Enzyme charakterisiert worden, die β-Peptide abdauen.[52] Durch die hohe Stabilität gegenüber Proteasen können β-Aminosäure-beinhaltende Peptide auch als starke Inhibitoren gegenüber diesen Enzymen wirken. So zeigten Aguilar et al. das der Austausch eines Prolin zu β-Prolin in einem Dipeptid zu einer 500-fachen

[53] Erhöhung des Ki-Wertes gegenüber der mikrobiellen Aminopeptidase P (APP) führte.

1.4 Enzyme in der Biotechnologie Enzyme sind biologische Katalysatoren, die in der Lage sind chemische Reaktionen zu beschleunigen. Sie verfügen im Allgemeinen über eine hohe Regio-, Stereo- und Chemos- elektivität und finden daher in der Industrie häufig Anwendung.[54] Mögliche Anwendungs- gebiete sind die Herstellung von Feinchemikalien und Medikamenten (zum Beispiel: Synthese von semi-synthetischen Antibiotika und Aminosäuren), die Nahrungsmittelindus- trie (Herstellung von high fructose corn sirup aus Maisstärke) und die Detoxifikation (Abbau von 1,3-Dichloropropen durch Alkandehalogenasen[55]). Enzyme stehen dabei in direkter Konkurrenz zu den meist etablierteren chemischen Methoden. Die Vorteile der Enzyme im Vergleich zu chemischen Katalysatoren sind die hohe Aktivität bei vergleichsweise moderaten Bedingungen (Temperatur, Druck), sowie die Vermeidung oder Reduzierung von toxischen Metallverbindungen oder Lösungsmitteln, was die enzymatischen Prozesse im allgemeinen umweltfreundlicher macht. Durch den natürlichen Selektionsdruck sind die Enzyme meist auf ihr natürliches Anwen- dungsgebiet im lebenden Organismus hin optimiert. Diese Optimierung umfasst sowohl das Temperatur- und pH-Optimum als auch das Substratspektrum und die Nutzung von Cofaktoren. Die meisten Enzyme eignen sich daher nicht uneingeschränkt zur industriellen Nutzung, wo insbesondere eine hohe Aktivität und hohe Stabilität, auch über mehrere Produktionszyklen, bei hohen Substrat- und Produktkonzentrationen wichtig sind. Um diese Probleme zu lösen werden die Enzyme häufig nicht in isolierter Form, sondern immobilisiert, oder in ganzen Zellen eingesetzt, wobei letzteres insbesondere die günstige

11 1 Einleitung

Regeneration von Cofaktoren erlaubt. Beispiele für die Nutzung von isolierten Enzymen ist der Aufschluss von Maisstärke durch Amylasen und Glukoamylasen bei der Synthese von high fructose corn sirup, wohingegen der nachfolgende Schritt mit der teureren Xylose-Isomerase (Glukose-Isomerase) mit immobilisierten Enzymen erfolgt. Der Hydan- toinase-Prozess ist ein Beispiel, bei dem mehr als ein Enzym im Ganzzellsystem eingesetzt wird.[56-58] Bei den oben genannten Methoden wird das Enzym in seiner Primärsequenz nicht verän- dert, die verbesserten Eigenschaften werden durch verbesserte Prozessbedingungen für das Enzym erzeugt. Im Gegensatz dazu können Enzyme auch durch Methoden des protein-engineering für die industrielle Nutzung optimiert werden. Es wird entweder durch die gerichtete Evolution oder durch ein rationales Design an die neuen Bedingungen angepasst (Kapitel 1.6). Weitere Quellen für Enzyme, die den Anforderungen von industriellen Prozessen genügen, liegen in Metagenomdatenbanken. Geschätzt sind nur etwa 1% der Mikroorganismen kulti- vierbar. Durch Metagenomansätze, in denen nur das Genmaterial von Umweltproben genutzt wird, können insbesondere Enzyme aus extremophilen Organismen zugänglich gemacht werden.[59]

1.5 Der Hydantoinase-Prozess Der Hydantoinase-Prozess ist ein etablierter industrieller Prozess zur Synthese enantiomerenreiner natürlicher und nicht-natürlicher Aminosäuren. Ein wichtiges Beispiel ist die Herstellung von D-para-Hydroxyphenylglycin im Maßstab von >10.000 Jato.[60] D-p-Hydroxphenylglycin wird im Weiteren zur Herstellung des β-Lactam-Antibiotikum Amoxicillin genutzt (Abbildung 1.5.1).

NH2 H H N S

O HO O COOH

Abbildung 1.5.1: Struktur von Amoxicillin, das D-p-Hydroxyphenylglycin ist rot hervorgehoben

12 1 Einleitung

Der Hydantoinase-Prozess umfasst eine Kaskade von drei Enzymen, die das chemisch synthetisierte racemische Hydantoin in die enantiomerenreine korrespondierende Amino- säure überführen (Abbildung 1.5.2). Eine stereoselektive Hydantoinase hydrolysiert den Hydantoin-Ring, so dass eine N-carbamoylierte Aminosäure entsteht. Eine selektive Carbamoylase setzt schließlich unter Wasserverbauch die enantiomerenreine Aminosäure frei. In der Carbamoylase-Reaktion entstehen Ammonium und Kohlenstoffdioxid, das die Reaktion in Richtung der Produkte treibt. Das verbleibende Hydantoin kann unter alkali- schen Bedingungen[61], oder durch den Einsatz einer Hydantoin-Racemase racemisiert werden. Die Racemisierung der Substrate erlaubt somit eine theoretische Ausbeute von 100%. Während der Hydantoinase-Prozess zunächst mit isolierten, immobilisierten Enzymen im Festbettreaktor durchgeführt wurde[62], werden inzwischen E. coli Zellen eingesetzt, die alle drei benötigten Enzyme coexprimieren.[56-58]

O O Racemase oder pH > 8 R NH R NH HN HN O O H2O H2O

L-Hydantoinase D-Hydantoinase

O O R R O O

HN NH3 HN NH3

O O H2O H2O L-Carbamoylase D-Carbamoylase

NH3 + CO2 NH3 + CO2 O O R R O O

NH3 NH3 L-Aminosäure D-Aminosäure Abbildung 1.5.2: Übersicht über den Hydantoinase-Prozess.

13 1 Einleitung

1.5.1 Chemische Synthesen von racemischen Hydantoinen

4 4 4 R R1 R R R1 3 3 3 R N R NH R N

O O O O O X N N N H R2 R2 a b c

4 4 4 R R1 R R1 R 3 3 3 R N R N R NH

O X O X O X N N N R2 R2 R2 d e f Abbildung 1.5.3: Strategien zur Synthese von Hydantoinen nach Meusel und Gutschow[7]. a: aus Carbonylen und Harnstoffderivaten b: nach der Bucherer-Bergs-Synthese c: nach der Read-Synthese d: aus Aminosäuren oder Estern und Isocyanaten e: aus Aminosäuren und Carbonsäurederivaten f: Reaktionen von Carboxamiden

Die Synthese von 5'-monosubstituierten oder 5'-5'-disubstituierten Hydantoinen kann durch viele verschiedene Syntheserouten durchgeführt werden (Abbildung 1.5.3). Die historisch älteste Synthese folgt dabei der Variante c. Im Jahr 1873 publizierte Friedrich Urech die Synthese von 5'-monosubstituierten Hydantoinen aus Aminosäuren und Kalium- cyanat mit anschließendem Ringschluss mittels Salzsäure.[63] Im Jahr 1922 veröffentlichte Read die Synthese von 5'-5'-disubstituierten Hydantoinen mit der gleichen Methode.[64] R1 1 1 1 R R - R R2 NH3 CN R2 CO2 NH R2 R2 NH2 O NH NC O N O H Keton Imin Aminonitril Hydantoin Abbildung 1.5.4: Bucherer-Bergs-Synthese, modifiziert nach Murray et al.[8].

Die Bucherer-Bergs-Synthese (b) ist eine der vielseitigsten Methoden zur Synthese von Hydantoinen. Sie wird heute noch eingesetzt[65] und basiert auf dem Umsatz von Carbonyl- verbindungen mit Kaliumcyanid und Ammoniumcarbonat (Abbildung 1.5.4). Problematisch ist teilweise die Nutzung von Wasser und Ethanol als Lösungsmittel, in denen einige Substrate eine zu geringe Löslichkeit aufweisen.[8]

14 1 Einleitung

Neben der vorgestellten Synthese sind viele andere Strategien, teils für spezifische Anwendungen, entwickelt worden; der Übersichtsartikel von Meusel und Gutschow beschreibt dies umfassend.[7]

1.5.2 Hydantoinasen Hydantoinasen sind Hydrolasen, die den Hydantoinring unter Wasserverbrauch spalten, und so eine N-carbamoylierte Aminosäure erzeugen; sie zählen daher zu den cyclischen Amidasen (EC 3.5.2). Die bekannten Hydantoinasen zeigen nur eine geringe Sequenzhomologie von unter 15%, sind allerdings dennoch einer Protein-Superfamilie zuzuordnen: alle Hydantoinase zeigen ein konserviertes Metallbindemotiv aus Histidinresten. Die metabolische Funktion der Hydantoinasen ist häufig unklar, da die biotechnologische Anwendung zumeist im Vordergrund steht. Beispiele für Hydantoinasen im natürlichen Metabolismus sind die Carboxymethylhydantoinase im Pyrimidinkatabolismus, oder die Carboxyethylhydantoinase im Histidinkatabolismus. Es wurde bereits eine Vielfalt von Microorganismen identifiziert, die für die Biotechnologie interessante Hydantoinase-Aktivität aufweisen, da sie Aminosäurevorstufen (also 5'-mono- substituierte Hydantoine) umsetzen können. Von besonderer Bedeutung sind dabei Hydan- toinasen, die zur Synthese nicht-proteinogener Aminosäuren genutzt werden können, da die proteinogenen Aminosäuren meist fermentativ günstiger hergestellt werden. Tabelle 1.5.1 zeigt eine Übersicht bisher identifizierter Hydantoinasen und die jeweils produzierte Aminosäure.

Tabelle 1.5.1: Beispiele von Organismen mit Hydantoinase-Aktivität und der produzierten Aminosäure, modifiziert nach Syldatk et al.[66].

Organismus Beispiel einer Referenz produzierten Aminosäure Arthrobacter L-Tryptophan [67-69] Nocardia L-Leucin [70] Flavobacterium L-Tryptophan [71-72] Bacillus, Pseudomonas, Aerobacter, L-Glutamat [73] Micrococcus, Flavobacterium Pseudomonas, Aerobacter, D-Methionin [74] Agrobacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Actinoplanes, Streptomyces Agrobacterium, Brevibacillus D-p-OH-Phenylglycin [75-76] Arthrobacter D-Serin, D-Alanin [77] Bacillus D-Phenylglycin [78]

15 1 Einleitung

Burkholderia D-Phenylalanin [79] Bacillus D-/L-α-methylcystein [80]

Flavobacterium D-Leucin und andere [56] Rinderleber D-Phenylglycin [81] Pisum, Phaeolus D-Methionin [82]

Sowohl die Strukturen von L-[9] als auch von D-spezifischen[83-84] Hydantoinasen sind bereits aufgeklärt. Dies erlaubt es, die strukturellen Gemeinsamkeiten festzustellen, sowie die Unterschiede, die die unterschiedliche Enantioselektivität bedingen, zu identifizieren. Beide Enzymen teilen sich im Monomer eine (α/β)-barrel-Struktur und liegen als Tetra- mere vor. Das aktive Zentrum wird durch zwei Zinkionen gebildet, die durch Histidin, Aspartat und ein carboxyliertes Lysin koordiniert werden (Abbildung 1.5.5). Dieses Struk- turmerkmal teilen die Hydantoinasen mit den Ureasen, Dihydroorotasen und Phosphotries- terasen.

Abbildung 1.5.5: Vergleich des aktiven Zentrums der L-Hydantoinase aus Arthrobacter (Kugelstabdarstellung) und der D-Hydantoinase aus Thermus (grüne Stabdarstellung). Aus Abendroth et al.[9].

Interessanterweise ist die Quartärstruktur der L-Hydantoinase aus Arthrobacter und der D-Hydantoinase aus Thermus deutlich unterschiedlich. In der L-Hydantoinase sind die Dimere in Richtung des Zentrums deutlich geöffnet, womit die Interaktionsfläche zwischen den zwei Dimeren verringert wird.[9]

1.5.2.1 Hydantoinasen zur Synthese von β-Aminosäuren Sollen Hydantoinasen zur Synthese enantiomerenreiner β-Aminosäuren eingesetzt werden, so ist das Ausgangssubstrat anstelle eines 5'-substituierten Hydantoins ein 5' oder 6'-substituiertes Dihydrouracil. Die Decarbamoylierung kann chemisch, oder durch

16 1 Einleitung eine nachfolgende Carbamoylase, analog zum Hydantoinase-Prozess für α-Aminosäuren, erreicht werden. Die Aktivität von Hydantoinasen gegenüber Dihydrouracilderivaten konnte bereits für rekombinante Hydantoinasen aus verschiedenen Quellen und Bakterienstämmen für 6'-Phenyldihydrouracil und para-Chlor- und Fluor-Derivate, mit zum Teil hohen Enantiose- lektivitäten gezeigt werden (Tabelle 1.5.2).[85-86] O H2O H2O NH L-spezifische D-spezifische Hydantoinase R N O Hydantoinase H

O O

R NH R NH

H2N O H2N O carbamoylierte carbamoylierte L-ß-Aminosäure D-ß-Aminosäure Abbildung 1.5.6: Darstellung von β-Aminosäuren aus Dihydrouracilderivaten mit Hydantoinasen, ein 6'-substituiertes Dihydrouracil führt zu einer β3-Aminosäure.

Tabelle 1.5.2: Auswahl untersuchter Hydantoinasen bezüglich der Umsetzung von Dihydrouracilderivaten (L/DβPhe: L/D-β-Phenylalanin, L/DβpClPhe: L/D-β-para-Chlor- Phenylalanin, LβpFPhe: L-β-para-Fluor-Phenylalanin).

Organismus Beispiel einer Enantio- Referenz produzierten selektivität Aminosäure Vigna angularis (rekombinant) LβPhe, LβpClPhe, LβpFPhe E > 100 [85] Ochrobactrum sp. G21 LβPhe, LβpClPhe 61%ee [86] (rekombinant) Arthrobacter polychromogenes DβPhe 90%ee [86] DSM20136 A. polychromogenes DSM342 DβPhe 96%ee [86] Aminobacter sp. 735 DSM24755 DβPhe, DβpClPhe 61%ee [86]

17 1 Einleitung

1.5.3 Carbamoylasen

1.5.3.1 D-Carbamoylasen

Biochemische Eigenschaften D-Carbamoylasen wurden bereits aus einer Vielzahl von Mikroorganismen isoliert und biochemisch charakterisiert. Die erste D-Carbamoylase stammt vermutlich aus Agrobacte- rium[75], bis heute folgten weitere aus Agrobacterium[87-90], Arthrobacter[77], Blastobacter[91], Brevibacillus[92], Comamonas[93], Pseudomonas[94], Sinorhizobium[95], Flavobacterium und Pasteurella[96]. Das pH-Optimum liegt zwischen 7 und 9, die optimale Reaktionstemperatur zwischen 40°C[93] und 70°C[88]. Alle D-Carbamoylasen reagieren empfindlichen gegenüber Metallionen und Sulfhydrilreagenzien, zudem zeigen sie eine große oxidative Empfindlich- keit. Tendentiell werden lange aliphatische, sowie von Phenylalanin abgeleitete, N-carbamoylierte Aminosäuren bevorzugt umgesetzt, geladene und polare Aminosäuren bilden keine guten Substrate. Eine Aktivität gegenüber N-formylierten und N-acetylierten Verbindungen konnte bisher nicht gezeigt werden. D-Carbamoylasen zeigen häufig sowohl Substrat [88] als auch Produktinhibierung[93].

Strukturelle Eigenschaften Die Strukturen zweier D-Carbamoylasen aus Agrobacterium wurden bereits aufgeklärt (pdb-codes 1FO6 und 1ERZ).[97-98] Es wurde eine konservierte katalytische Triade aus Cys- Glu-Lys identifiziert. Das Cystein ist das angreifenden Nukleophil, Lysin stabilisiert den Übergangszustand und Glutamat fungiert als Protonen-Shuttle. D-Carbamoylasen gehören zur Nitrilase-Superfamilie und bilden ebenso eine α-β-β-α Faltung, die in der Quartär- struktur meist als α-β-β-α:α-β-β-α Dimer vorliegt.

protein-engineering Da der Hydantoinase-Prozess insbesondere für die Synthese von D-Aminosäuren eine bedeutende Rolle spielt, sind D-Carbamoylasen bereits durch rationales und ungerichtetes protein-engineering (Kapitel 1.6) intensiv untersucht wurden. Ein besonderes Augenmerk galt hier der geringen oxidativen und thermischen Stabilität. 1998 konnten Ikenaka et al. durch Zufallsmutagenese die Thermostabilität und Oxidationsstabilität einer A. tumefaciens D-Carbamoylase erhöhen[99]. Das gleiche erreichten Oh et al. durch eine Kombination von Zufallsmutagenese und gene-shuffling.[100] Durch gene-shuffling konnte ebenso eine D-Carbamoylase aus A. radiobacter thermisch und oxidativ stabilisiert werden.[101] Inter-

18 1 Einleitung essanterweise zeigte keine der identifizierten, stabileren Mutanten eine Mutation in den als anfällig geltenden Cysteinen. Die gerichtete Mutation von neun Methionin-Resten zu Leucin in der A. radiobacter D-Carbamoylase führte in den meisten Fällen zu stark verringerten Aktivitäten, zwei Mutanten zeigten ähnliche Aktivität wie der Wildtyp. Die oxidative Stabilität wurde allerdings in allen Fällen verbessert.[102]

1.5.3.2 L-Carbamoylasen Insgesamt sind L-Carbamoylasen nicht so gut untersucht wie die D-Carbamoylasen. Da es weniger L-spezifische Hydantoinasen gibt und zudem L-Aminosäuren häufig leichter durch Fermentation als durch enzymatische Prozesse gewonnen werden können, ist der Bedarf an L-Carbamoylasen geringer.

Biochemische Eigenschaften Etwa seit 1980 wurden die L-Carbamoylasen vermehrt untersucht, da in Bacillus, Pseudo- monas und Flavobacterium entsprechende Aktivitäten gezeigt werden konnten. Inzwischen wurden aus verschiedensten Quellen L-Carbamoylasen isoliert: Alcaligenes [103], Arthrobacter[104], Blastobacter[105], Microbacterium[106] und Sinorhizobium[107]. Sowohl das pH- als auch das Temperatur-Optimum liegen ähnlich dem der D-Carbamoylasen zwischen 7-9, beziehungsweise 30-70°C. Im Gegensatz zu den D-Carbamoylasen sind die L-Carbamoylasen Metalloenzyme, die auf zweiwertige Kationen angewiesen sind. Mn2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ und Fe2+ wurden als hyperak- tivierend, hingegen wurden Cu2+, Cd2+ und Hg2+ als inhibierend beschrieben, allerdings ebenso die oben genannten in hohen Konzentrationen. EDTA wirkt ebenso inhibierend. Sulfhydryl-Reganzien beeinflussen die Aktivität ebenfalls, obwohl kein Cystein an der Katalyse beteiligt ist, es werden strukturelle Einflüsse vermutet.[10] Das Substratspektrum ist breiter als das der D-Carbamoylasen und auch N-formylierte und N-acetylierte Verbindungen werden akzeptiert. Eine Klassifizierung anhand des Substratspektrums ist am ehesten nach a) aliphatisch, b) aromatisch und c) ohne Prefe- renz möglich, allerdings ist diese Klassifizierung selten eindeutig festlegbar.

Strukturelle Eigenschaften L-Carbamoylasen sind strukturell nicht mit den D-Carbamoylasen verwandt, die Sequenzi- dentität liegt bei unter 15%. L-Carbamoylasen gehören zur Peptidase Familie M20/M25/M40, wie anhand der bisher einzigen Kristallstruktur einer L-Carbamoy- lase aus Bacillus stearothermophilus CECT43 (pdb code: 3N5F)[108-109] gezeigt werden

19 1 Einleitung konnte. Die L-Carbamoylasen zeigen zwei Domänen, die katalytische Domäne und eine Lid- oder Dimerisierungsdomäne (Abbildung 1.5.7).

Abbildung 1.5.7: Dimer der L-Carbamoylase aus Bacillus stearothermophilus CECT43 (pdb code: 3N5F), die Dimerisierungsdomänen sind blau, die katalytischen Domänen rot dargestellt, die katalytisch wichtigen Metallionen in grün.

Ein konserviertes bimetallisches Zentrum, bestehend aus zwei Me2+-Ionen, drei Histidinen, einem Aspartat und einen Glutamat, bildet das aktive Zentrum innerhalb der katalytischen Domäne (Abbildung 1.5.8). Das Glutamat dient hierbei als Protonen-Shuttle. Ein essenti- elles Arginin (Arginin 291 in der A. aurescens Carbamoylase (AauHyuC)) aus der Dimeri- sierungsdomäne bindet zunächst die Carboxylgruppe des Substrats, anschließend findet eine Verlagerung der beiden Domänen zueinander statt, die die Carbamoylgruppe des Substrats in die Nähe des Bimetallzentrums bringt.[109] Wichtig ist zu beachten, dass wahrscheinlich auch Reste der Dimerisierungsdomäne des anderen Protomers bei der Substrat- bindung beteiligt sind.[11] Der bisher etablierte Mechanismus ist in Abbildung 1.5.9 dargestellt. Das Substrat wird über die Carboxylgruppe durch ein Asparagin, ein Histidin und ein Arginin gebunden. Ein durch die Metallionen komplexiertes Wassermolekül wird durch Glutamat zum Hydroxylion aktiviert und es findet ein nukleophiler Angriff auf die Carba- moylgruppe statt. Die dabei freigesetzte Carbamidsäure zerfällt spontan zu CO2 und NH3.

20 1 Einleitung

Abbildung 1.5.8: Bimetallisches Zentrum einer Carbamoylase.

21 1 Einleitung

Arg292 Arg292 His 230 His 230 Asn279 Asn279

HN NH2 HN NH2

NH NH OH O R H Glu124 O Glu124 O HN O

O O H2N N-carbamoyl-α-Aminosäure

H H H H O Substratbindung O

Glu133 His87 Glu133 His87

Me2+ Me2+ Me2+ Me2+

His386 His194 His386 His194

Asp96 Asp96

- Freisetzung der L-α- Aminosäure - Entstehung des - Freisetzung von CO 2 Hydroxylions und NH (Wasseraktivierung) 3 Arg292 - Nukleophiler Angriff (spontaner Zerfall der His 230 Carbamidsäure) Asn279 - Einlagerung von Wasser HN NH2

NH OH O R H Glu124 OH HN O

O H2N

HO-

Glu133 His87

Me2+ Me2+ His386 His194

Asp96

Abbildung 1.5.9: Reaktionsmechanismus von L-N-Carbamoylasen modifiziert nach Martinez- Rodriguez[10]; basierend auf Studien von Sinorhizobium meliloti CECT4114 L-N-Carbamoylase Mutanten[11] und Ähnlichkeiten zur β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri.[12].

1.5.4 Carbamoylase-verwandte Enzyme Sowohl strukturell als auch in der durchgeführten Reaktion sind β-Ureidopropionasen enge Verwandte der L-Carbamoylasen. β-Ureidopropionasen (auch β-Alanin-Synthasen genannt) katalysieren die Decarbamoylierung von β-Ureidopropionsäure, der letzte metabolische Schritt beim Abbau von Uracil und Thymin. Die Struktur einer β-Ureidopropionase wurde aufgeklärt (pdb-code: 1R3N).[12] Durch die Nutzung einer inaktiven Mutante konnte die Struktur mit dem Substrat β-Ureidopropionsäure gelöst werden (pdb-code: 2FVK).[110] Hier

22 1 Einleitung zeigte sich die bereits in Kapitel 1.5.3.2 beschriebene Verschiebung zwischen katalytischer und Dimerisierungsdomäne, im Fall der β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri wurde eine Drehung um ~ 30° beobachtet.[111] Gleichermaßen ähnlich ist die Allantoat-Amidohydrolase welche Allantoat hydrolytisch zu Ureidoglycin überführt. Dies war die erste Struktur in der das Bimetallzentrum für diese Enzymgruppe eindeutig gezeigt werden konnte. In der Kristallstruktur befindet sich zudem ein Wassermolekül zwischen den beiden Metallionen, welches wahrscheinlich das agie- rende Nukleophil bildet. Ebenso wurde für die Allantoat-Amidohydrolase eine offene und geschlossene Form analog zur β-Alanin-Synthase vorgeschlagen, jedoch experimentell noch nicht gezeigt.[112]

1.5.5 Hydantoin-Racemasen Hydantoin-Racemasen beschleunigen die bei Raumtemperatur nur sehr langsam ablau- fende Racemisierung[113] von 5'-monosubstituierten Hydantoinen. Es wurden bereits aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen Hydantoin-Racemasen identifiziert und teilweise charakterisiert, darunter Arthrobacter[114], Pseudomonas[115-116], Agrobacterium[87, 117-118], Microbacterium[119] und Sinorhizobium.[120] Die bisher einzigen gelösten 3D-Strukturen stammen von der Sinorhizobium meliloti CECT 4114 Hydantoin-Racemase und der Pyrococcus horikoshii OT3 Hydantoin-Racemase (pdb-code: 2EQ5).[121] In dieser konnten zwei Cysteinreste identifiziert werden, die für die zweibasig-katalysierte Racemisierung verantworlich sind. Auf diese Weise konnte bereits ein Mechanismus für die Hydantoin-Racemasen theoretisiert werden: Ein Cystein abstra- hiert das 5'-Proton des Hydantoins, dies führt zur Ausbildung eines enolischen Zwischen- zustands mit achiralem Kohlenstoffatom, anschließend erfolgt die Reprotonierung mit gleicher Wahrscheinlichkeit von beiden Seiten, so dass das Hydantoin racemisiert wird (Abbil- dung 1.6.1).[13] Dies stimmt mit früheren Beobachtungen anhand der Arthrobacter und Agrobacterium Hydantoin-Racemasen überein, hier wurde eine vollständige Inaktivierung durch Quecksilberionen und Iodacetamid, sowie eine Hyperaktivierung durch DTT beschrieben.[118, 122]

23 1 Einleitung

HN NH HS H S R O L g - n n a u c r H H h

e O i O N N s D i r O - I

e O s

HN o m HN m o HS HS s e I - SH SH R r

L R i s i h e c r a u n n - g

D O

HN NH

R SH H O S

Abbildung 1.6.1: Vorgeschlagener Mechanismus der Hydantoin-Racemase aus Sinorhizobium meliloti nach Martinéz-Rodriguez et al.[13].

1.6 Methoden des protein-engineering Enzyme sind durch die Evolution an ihre natürlichen Aufgaben angepasst. Dies gilt für das pH- und Temperaturoptimum, regulatorische Mechanismen, Cofaktoraffinität, Lösungsmit- telverträglichkeit und Substrat- und Reaktionsspektrum. Nur in seltenen Fällen sind die natürlichen Enzyme gleichzeitig gut für den Einsatz in der Industrie geeignet. In den vergangenen Jahren konnten durch vielfältige protein-engineering Anwendungen bereits erstaunliche Anpassungen der Biokatalysatoren an die neuen Aufgabengebiete durchgeführt werden. Behrens et al. haben in einem Übersichtsartikel für ausgewählte Enzymklassen Beispiele für die unterschiedlichsten Anpassungen aufgeführt.[123]

24 1 Einleitung

Methoden des protein-engineering

Gerichtete Evolution Semi-Rationales Design Rationales Design (Zufallsmutagenese) (gezielte Punktmutationen) f r d a n d a e w b f s u n a o g i t n i a n m e r e r o f c n S I

epPCR CASTing/ISM Homologiemodelle gene shuffling ProSAR + gedockte Substrate Insertion/Deletion consensus approach Kristallstrukturen circular permutation 3DM + Übergangszustandsanloga

Abbildung 1.6.2: Schematische Darstellung der Methoden des protein-engineering.

Hervorgehoben sei hier ein Beispiel: Durch gerichtete Evolution und gene shuffling konnte eine Amin-Transaminase (ATA) durch die Einführung von 27 Einzelmutationen zur Umset- zung von Prositagliptin zu Sitagliptin mit 92% Ausbeute und 99,95 %ee gebracht werden, die Ausgangsaktivität des ATA-117 Wildtyps war dabei kaum detektierbar.[124] Durch dieses neue Enzym konnte die Effektivität des etablierten Prozesses erhöht und gleichzeitig die Abfallproduktion verringert und der Bedarf an Schwermetallen eliminiert werden. Als Strategie wurde hier zunächst ein sterisch weniger anspruchsvolles, aber ähnliches, Substrat genutzt. Durch eine Einzelmutation konnte hier bereits messbare Aktivität erzeugt werden, so dass diese Mutante als Ausgang für die weitere Mutagenese mit dem gewünschten Substrat genutzt wurde. Es wurden vier weitere Mutationen eingeführt, um die gewünschte Aktivität zu erzeugen, drei davon in der kritischen kleineren Substratbin- detasche. In einer weiteren Mutageneserunde wurden eine Variante mit 12 Mutationen identifiziert (10 davon im Bereich der Substratbindung), diese Mutante zeigte eine 75 fache Verbesserung gegenüber der parentalen Variante. Die weiteren Mutationsrunden waren zur Verbesserung unter industriellen Bedingungen nötig, so musste zusätzlich zur Substratakzeptanz, die Lösungsmittelstabilität, sowie die Aktivität unter hohen Substrat- konzentrationen und die Akzeptanz des Amin-Donors Isopropylamin verbessert werden.[124-125]

25 1 Einleitung

Unterschieden wird beim protein-engineering zwischen der gerichteten Evolution, die analog zu natürlich Evolution zufällige Veränderungen im Zielprotein erzeugt, und dem rationalen Design, bei dem den eingeführten Mutationen gezielte Überlegungen voran- gehen (Abbildung 1.6.2).

1.6.1 Gerichtete Evolution Die natürliche Evolution ist die Grundlage der Vielfalt irdischen Lebens. Zwei Grundprinzi- pien sind dabei ausschlaggebend für die Evolution: Die Variabilität des Erbguts und die Selektion durch äußere Einflüsse. Das gleiche Prinzip nutzt auch die gerichtete Evolution zum engineering neuer Proteine. Die Variabilität wird hier im Labor eingeführt, so dass ein Pool vieler unterschiedlicher Varianten eines Enzyms entsteht. Diese Varianten werden anschließend einem Selektions- druck ausgesetzt. Hierbei entscheidet der Experimentator über die jeweilige Fitness der untersuchten Variante. Erfolgreiche Varianten werden erneut mutagenisiert. Das Vorgehen ist in Abbildung 1.6.3 schematisch dargestellt.

Wildtyp Gen und verwandte Gene Wildtyp-Gen oder Varianten des Wildtyp-Gens

Mutagenese W n

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d n

nicht-rekombinierend: rekombinierend: e a i

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h a epPCR gene shuffling o V

u n Mutationsstämme STEP n e

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chemische Mutagenese ITCHY s

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d Klonierung und Expression

t e

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n W X X X X X X X X X X

Selektion oder Screening auf verbesserte Varianten Abbildung 1.6.3: Prinzip der gerichteten Evolution.

26 1 Einleitung

Die Mutagenese kann mit einer Vielzahl von Methoden erfolgen, als grundsätzliche Unter- scheidung lassen sich rekombinierende und nicht-rekombinierende Methoden unterscheiden. Bei nicht-rekombinierenden Methoden wird nur ein Ausgangsgen verwendet. Die am häufigsten angewandte Methode ist die error-prone-PCR (epPCR), bei der das Zielgen durch eine Polymerase ohne proof-reading-Funktion (meist taq-Polymerase) amplifiziert wird. Durch Variation der dNTP-Konzentrationen und durch Zugabe von Manganionen kann die Fehleranfälligkeit noch weiter erhöht werden. Als Hauptproblem für die epPCR muss der bias der Mutationen genannt werden. So sind aus sterischen Gründen Transversions- mutationen (Purin nach Pyrimidin) unwahrscheinlicher, zudem werden wegen der schwä- cheren Bindung zwischen Adenin und Thymin diese häufiger mutiert.[126] Ebenso problematisch ist die geringe Wahrscheinlichkeit dafür, dass zwei, oder sogar drei, aufeinanderfolgende Nukleotide mutiert werden,[127] aus diesen Gründen ist nicht jede Aminosäure an jeder Position gleich wahrscheinlich.[128-130] Verschiedene Techniken verringern oder eliminieren diesen bias, zum Beispiel durch die Verwendung anderer oder kombinierter Polymerasen oder degenerierter Trinukleotide, sind dabei aber durch den erhöhten Aufwand nicht unbedingt effizienter.[131-132] Rekombinierende Methoden nutzen neben dem Zielgen auch noch verwandte Gene mit hoher Sequenzhomologie.[133] Diese werden zufällig zu Hybridgenen kombiniert, die dann kombinierte Eigenschaften der parentalen Gene, oder teilweise auch gegenüber allen parentalen Varianten verbesserte Eigenschaften zeigen. So konnte zum Beispiel durch gene shuffling der Candida antarctica Lipase B (CAL-B) mit homologen Genen die Aktivität gegenüber Diethyl-3-(3',4'-dichlorphenyl)glutarat über die Aktivität aller beteiligten Enzymvarianten hinaus gesteigert werden.[134] Ähnlich zur epPCR zeigt auch das gene-shuffling einen bias in der Generierung der Hybridgene. Die crossover-Ereignisse treten gehäuft an Positionen mit hoher Sequenzho- mologie auf, zudem treten bestimmte parentale Sequenzabschnitte überdurchschnittlich häufig auf.[135] Beide Varianten sind nicht notwendigerweise als getrennte Methoden zu betrachten, so kann auch die Kombination der Mutagenese und des gene shuffling zielführender sein, als beide Methoden für sich betrachtet.[136] Aufgrund der großen Zahl an generierten Varianten kommt der Überprüfung dieser Vari- anten eine besondere Bedeutung bei der gerichteten Evolution zu. So führen drei Amino- säureaustausche in einem 200 Aminosäure langem Protein bereits zu über 9 Milliarden möglichen Varianten.[126] Es können generell zwei Methoden dafür unterschieden werden: Selektion und Screening. In beiden Fällen ist es wichtig, möglichst viele Varianten möglichst genau zu durchmus-

27 1 Einleitung tern, zudem ist es besser das reale Substrat und kein testspezifisches Substrat zu nutzen, da sonst unter Umständen nur Varianten identifiziert werden, die das Testsubstrat besser akzeptieren. Bei der Selektion erhalten verbesserte Varianten einen Überlebensvorteil, dies kann zum Beispiel durch eine Antibiotikaresistenz, Toxinabbau oder Nutzung einer alternativen Ener- gie- oder Metabolitquelle implementiert werden. Mit Selektion können sehr schnell große Bibliotheken überprüft werden, meist durch Wachstum auf Agarplatten. Die Hauptnachteile sind, dass die Fragestellung der gerichteten Evolution auf ein metabolisches Problem zurückzuführen sein muss, sowie, dass die Selektion in den meisten Fällen nur eine ja/nein Antwort liefert und selten die Qualitäten der einzelnen Varianten gut unter- scheidbar sind. Durch Anpassung des Selektionsdrucks kann dieses Problem teilweise umgangen werden. Sandersjöö et al. entwickelten ein Selektionssystem für die TEV-Protease, indem sie ein Chloramphenicolresistenzgen über einen TEV-Protease-sensitiven linker an ein Degradati- onssignal (ssrA-tag) knüpften. Nur bei aktiver TEV-Protease wird somit eine Chloram- phenicolresistenz erzeugt.[137] In einem ähnlichen Ansatz konnten Chautard et al. einen thermostabilen Antiobiotika-Re- sistenzmarker, fusioniert an das Zielprotein, einsetzen, um nach thermostabilen Varianten zu selektieren.[138] Screening Methoden entsprechen eher der quantitativen Auswertung der Varianten. Spezi- ellere Systeme, wie beispielsweise Fluorescence-activated cell sorting (FACS) oder phage- display bieten einen sehr hohen Durchsatz, sind allerdings auch nur für bestimmte Frage- stellungen anwendbar. Fernández-Álvaro et al. verfolgten beispielsweise einen toxinbasierten FACS-Ansatz um die Enantioselektivität einer Esterase zu erhöhen. Die Verwendung eines Pseudoracemats, mit einem toxischen und einem nicht-toxischen Esterasesubstrat erlaubte die Selektion auf Varianten mit einer hohen Enantioselektivität gegenüber dem nicht-toxischen Substrat, da die überlebenden Zellen mittels FACS von den, durch das Toxin abgetöteten Zellen, getrennt werden konnten.[70] Weiterhin werden im enzyme engineering häufig fluorometrische oder spektrometrische Assays in Miktrotiterplatten eingesetzt. Der Durchsatz ist damit nicht so hoch wie bei den weiter oben beschriebenen Methoden. Allerdings können, je nach Art des Assays, Aussagen über Aktivität, Enantioselektivität, Substratspezifität oder Stabilität gewonnen werden. Die Messung beruht dabei auf der Erzeugung oder Umsetzung fluoreszenz- oder photoaktiver Verbindungen, dies kann der Cofaktor des Enzyms sein, das Substrat oder auch ein pH-Indikator.

28 1 Einleitung

1.6.2 Rationales Design Das rationale Design steht der gerichteten Evolution gegenüber. Wenn eine hohes Maß an Information über das zu verändernde Protein vorliegt (Struktur, aktives Zentrum, Mecha- nismus) können durch Methoden des Molekularen modelling Vorhersagen über den Einfluss bestimmter Aminosäurereste getroffen und diese dann gezielt verändert werden (Abbildung 1.6.4).

Proteinstruktur Rationales Design Positionsgerichtete Klonierung & Optimierte in silico Mutagenese Expression Mutante

Abbildung 1.6.4: Prinzip des rationalen Designs.

Die Auswahl der zu verändernden Aminosäuren ist dabei das entscheidende Kriterium für den Erfolg des rationalen Designs. Häufig orientiert man sich an verwandten Enzymen, die die gewünschte Eigenschaft (Thermostabilität, Enantioselektivität, Lösungsmittelstabilität, oder andere) bereits aufweisen und versucht am Computer die Unterschiede und Gemein- samkeiten aufzudecken. Generell gilt, je umfangreicher die bereits vorliegenden Kenntnis des zu verändernden Enzyms, desto zuverlässiger können Mutationen vorhergesagt werden. Eine gemessene Struktur ist besser als ein Homologiemodell, welches allerdings je nach Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen auch bereits sehr gut sein kann. Die Lage des Substrats im aktiven Zentrum ist ebenfalls von großer Bedeutung, dieses kann am Computer durch docking hinzugefügt oder gebunden in einer inaktiven Mutante gemessen werden. Die Genauigkeit der genutzten Computerprogramme nimmt fortlaufend zu, so dass die Anwendbarkeit vom rationalen Design ebenso steigt. Durch die Beschränkung auf einige, wenige Top-Kandidaten, kann hier auf ein Selektionsverfahren oder einen Screeningassay verzichtet werden. Die wenigen Mutanten können klassisch mittels Gaschromatografie (GC) oder high pressure liquid chromatography (HPLC) charakterisiert werden. Der Vorteil des rationalen Designs ist die hohe Trefferrate, so ist, solange die vorhandenen Informationen ausreichen, unter den vorgeschlagenen Varianten mit hoher Wahrschein- lichkeit eine verbesserte dabei. Die erzeugten rationalen Mutanten können mittels gerich- teter Evolution häufig noch weiter verbessert werden. Ein großer Nachteil des rationalen

29 1 Einleitung

Designs ist die Fixierung auf die vorliegenden Daten. So können, im Gegensatz zur gerichteten Evolution, keine Lösungen gefunden werden, die auf neuen, unentdeckten Varianten beruhen. Trotz der gegenteiligen Grundvoraussetzungen der Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Designs können beide Methoden parallel genutzt werden und einander sinnvoll zu ergänzen. So können beispielsweise durch randomisierte Mutagenesen hot-spots aufgedeckt werden, die dann im rationalen Design weiter ausgenutzt werden können. Umgekehrt können häufig auch Ergebnisse aus Zufallsmutagenesen später in silico analysiert und erklärt werden. So konnten zum Beispiel Hackenschmidt et al. die aus einer error prone PCR erhaltene Bacillus subtilis Esterase Mutante mit erhöhter Amidase Aktivität durch Methoden des molecular modelling rational erklären. Das aufgeklärte π-π-Netzwerk in der Nähe des aktiven Zentrums des Enzyms konnte so genutzt werden, um die Amidase/Esterase-Pro- miskuität zu modulieren.[139]

1.6.3 Semi-rationales Design oder fokussierte gerichtete Evolution In den vergangenen Jahren wurde versucht, die beiden Möglichkeiten des Proteindesigns zu vereinen und so die Vorteile beider Konzepte zu nutzen. Bei der fokussierten gerichteten Evolution wird die Zufallsmutagenese der gerichteten Evolution nur auf Teile des Zielgens angewandt. Dies können einzelne Aminosäuren sein (Sättigungsmutagenese), Aminosäuren im aktiven Zentrum (CAST), oder bestimmte Sekundärstrukturen die vermutlich eine Rolle in der gewünschten Eigenschaft spielen.[140] Combinatorial active-site saturation testing (CAST) ist eine der am häufigsten genutzten Methoden des semi-rationalen Designs. Anhand der Proteinstruktur werden Gruppen von Aminosäuren in der Nähe des aktiven Zentrums, deren Seitenketten in Richtung des aktiven Zentrums positioniert sind, ausgewählt. Diese werden durch alle 19 alternativen Aminosäuren ausgetauscht. Dadurch, dass Gruppen von Aminosäuren gleichzeitig analysiert werden, können kooperative Effekte beobachtet werden. Von Bartsch et al. wurde durch den Einsatz eines CAST-Konzepts gegenüber der Bacillus subtilis Esterase (BS2), an einen für die Enantiopräferenz bedeutsamen Rest, sowie den beiden benachbarten Aminosäuren, die Enantioselektivität der Esterase von ER > 100 auf

[141] ES = 64 umgekehrt. Gleichzeitig steigt aber auch die Zahl der zu überprüfenden Klone, während bei zwei Aminosäuren 3.000 Klone geprüft werden müssen, sind es bei drei Aminosäuren bereits 98.000.[142]

30 1 Einleitung

Eine Fortführung des CAST ist die iterative Sättigungsmutagenese (ISM), hier wird die jeweils beste Mutante einer Gruppe als Matrize für die Mutagenese der zweiten Gruppe genutzt. Wählt man zum Beispiel drei Gruppen (A-C), bestehend aus jeweils zwei Aminosäuren, müssen aufgrund kooperativer Effekte der einzelnen Aminosäurereste insgesamt 15 Biblio- theken mit je 3000 Klonen durchmustert werden. In Abbildung 1.6.5 ist der Ablauf eines solchen ISM-Experiments gezeigt. Die unterschiedlichen Pfade können dabei zu derselben Mutante führen, müssen es aber nicht.[14, 143]

A B C

B C A C A B

C B C A B A

Top Mutante(n)

Abbildung 1.6.5: Schematischer Ablauf eines ISM Experiments, modifiziert nach Reetz et al.[14].

Anhand der Epoxidhydrolase aus Aspergillus niger (ANEH) konnten Reetz et al. den Verlauf des Pfads des ISM-Experiments in der Fitness-Landscape des Enzyms nachvollziehen. Es konnte eine sehr gute Variante (E-Wert 115 gegenüber 4,6 beim Wildtyp) durch eine rein zufällige Auswahl des CAST-Pfades erzeugt werden[144], der molekulare Mechanismus der erhöhten Enantioselektivität konnte ebenso schlüssig erklärt werden.[145] Jedoch blieb die Frage offen, ob eine andere Auswahl des Mutagenesepfads zu den Gleichen, oder zu anderen Ergebnissen geführt hätte. Es zeigte sich, dass 45% der Pfade energetische begünstigt sind, also in jedem weiteren iterativen Schritt eine weitere Verbesserung erfahren. Hingegen enthalten die restlichen 55% der mögliche Mutagenesewege lokale Minima, so dass hier die ISM-Strategie möglicherweise nicht zu der optimalen Mutante geführt hätte.[146] Die Auswahl der Aminosäuregruppen muss dabei nicht immer auf das aktive Zentrum ausgerichtet sein. Zur Thermostabilisierung eines Enzyms wurden dabei die B-Faktoren

31 1 Einleitung

(Maß für die Flexibilität einer Aminosäure in einer Kristallstruktur) als Auswahlkriterium genutzt und damit das Enzym erfolgreich stabilisiert. Für die Bacillus subtilis Lipase LipA

60 konnte so in einem ISM-Experiment der T50 Wert von 48°C beim Wildtyp auf 89°C und 93°C für die besten Mutanten gesteigert werden. Dabei wurden zunächst sechs verschiedene Bibliotheken erzeugt und durchmustert, die beste Variante aller Bibliotheken wurde im Anschluss durch Sättigungsmutagenesen weiter verbessert. Dabei wurde jeweils die Bibliothek, die als nächstbestes identifiziert wurde, ausgehend von der zuvor erhaltenen Variante erneut durchmustert.[140] Erkennbar ist, dass auch beim semi-rationalen Design schnell Bibliotheksgrößen erreicht werden, deren Überprüfung, ähnlich der Bibliotheken von gerichteten Evolutionsexperi- menten, nur mit viel Aufwand erreicht werden kann. Zusätzlich sinkt dabei auch die Tref- ferquote. Diesem Problem kann durch die Wahl der Codons für die Mutagenese entgegengewirkt werden, so müssen bei drei Aminosäuren mit NNK-Codon (alle 20 Aminosäuren) 98.000 Klone überprüft werden, mit NDT-Codon (12 Aminosäuren, alle Aminosäuretypen) nur 5.000.[142] Noch effizienter kann die Codongestaltung erfolgen, wenn Informationen zu verwandten Enzymen vorliegen. Jochens et al. zeigten, dass durch die Auswertung vieler verwandter Enzyme mittels einer 3DM-Datenbank, die Wahl der Codons auf wenige sinnvolle eingeschränkt werden können.[147] 3DM nutzt dabei Sequenz- und Strukturdaten, Informationen über Protein-Protein- und Protein-Ligand Interaktion, sowie bekannte Mutationen. Alle diese Daten werden in einer Protein-Superfamilien-Datenbank gespeichert und vernetzt. Die Zuordnung der Daten basiert dabei auf dem System des strukturbasierten-multiplen Sequenzalignments. Zusätzlich werden allen Positionen im Alignment 3DM Nummern übergeben, die eine einfa- chen Vergleich zwischen den gleichen Positionen in verschiedenen Enzymen oder Subfami- lien erlauben. Insbesondere die Detektion von korrelierenden Mutationen wird so signifikant vereinfacht.[148]

1.7 Computer Modelling Computer Modelling beschreibt die Simulation von (Makro-) Molekülen in silico. Zwei grundsätzlich verschiedene Methoden werden im Computer modelling genutzt, die quan- tenmechanische Berechnung (QM) und die Molekulardynamik oder Molekularmechanik (MD/MM). Die QM-Rechnungen sind sogenannte ab initio Rechenmethoden, die nur auf Naturkon- stanten und nicht auf empirischen Parametern beruhen. Die Berechnung erfolgt für alle Elektronen eines Systems, wobei wiederum die Wechselwirkungen aller Elektronen unter-

32 1 Einleitung einander beachtet werden müssen. Somit sind die Lösungen nur iterativ möglich und nie vollständig. Die benötigte Rechenleistung ist damit sehr groß, sodass QM-Berechnungen nur für kleine Moleküle (circa 40 Elektronen) und kurze Zeiträume (Femtosekunden) oder nur statische Elektronendichteberechnungen möglich sind. Grundsätzlich unterschieden wird zwischen den Hartree-Fock-Methoden[149] und den weniger genauen Dichtefunktio- naltheorien, die auch die Berechnung mehrerer dutzend Elektronen erlauben.[150] Aufgrund des hohen Rechenaufwands können reine QM-Methoden bisher nicht zur Berech- nung von Enzymen genutzt werden. Häufig werden allerdings QM/MM Methoden angewandt, bei denen das aktive Zentrum quantenmechanisch berechnet wird, der Rest des Enzyms mit der schnelleren Molekularmechanik.[151-152] Ist die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms hoch genug, kann so zum Beispiel der Katalysemechanismus aufgeklärt werden.[153] Im Gegensatz zu den QM-Berechnungen sind MM-Berechnungen empirisch basiert. Sie basieren auf drei grundlegenden Konzepten: Jedes Atom wird als einzelnes Partikel dargestellt, jedes Partikel erhält eine Größe (üblicherweise der van der Waals Radius) und eine Ladung; Bindungen werden als Federn zwischen zwei Partikeln betrachtet. Die Daten (Ladung, Größe, Bindungslänge, Bindungswinkel, Atommassen) stammen aus experimentellen Beobachtungen oder quantenmechanischen Berechnungen. Die Gesamt- heit dieser Daten und die Formeln die genutzt werden, um aus diesen Daten die potenti- elle Energie des Systems zu berechnen, werden als Kraftfeld (force field) bezeichnet. Die Grundlegende Energieberechnung durch ein Kraftfeld folgt dabei der Formel = + + + + (1) E Gesamt E Bindungen E Winkel ETorsion Eelektrostatisch E vanderWaals Wobei die letzten beiden Terme als nichtkovalenter Beitrag und die ersten drei Terme als kovalenter Beitrag bezeichnet werden. Die nichtkovalenten Terme sind dabei schwieriger zu berechnen, da sie wesentlich mehr Interaktionen umfassen und über weitere Entfer- nungen wirken.[154] Weiterhin müssen Kraftfelder noch parametrisiert, das heißt an die Ergebnisse von gemes- senen oder mit QM-Methoden berechneten Werte angepasst werden. Dabei werden die so genannten Gewichtungsfaktoren der Kraftfelder so verändert, dass die berechneten Ergeb- nisse möglichst nahe an den realen Werten liegen. Dies kann auch durch evolutive Tech- niken geschehen.[155] Zudem ist wichtig zu beachten, dass die Kraftfelder in sich konsistent sind, aber Parameter oder Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Kraftfeldern ausgetauscht werden können. Bekannte Kraftfelder sind AMBER[156-158], CHARMM[159-161] und GROMOS[162-163]. Eine Sonderrolle in der Molekularmechanik kommt dem Solvens, üblicherweise Wasser, zu. Während Berechnungen zwar auch im Vakuum durchgeführt werden können, wird dies

33 1 Einleitung

üblicherweise nicht gemacht, da dies, insbesondere mit geladenen Molekülen, die Ergeb- nisse verfälscht. Das Solvens kann zum einen explizit, also wie das Zielmolekül, als Partikel berechnet werden, oder implizit, als Continuum über das gesamte Volumen. Die erste Möglichkeit ist normalerweise genauer und erlaubt zum Beispiel auch die Wechsel- wirkungen von Solvensmolekülen mit dem Zielmolekül, je nach Detailgrad (Wasser kann Beispielsweise als ein Partikel, oder drei Partikel dargestellt werden, mit unterschiedlichen Freiheitsgraden) ist diese Strategie aber weitaus rechenintensiver. Die implizite Variante liefert, mit geringerer Rechenleistung, basierend auf den physikalischen Eigenschaften des Solvents (zum Beispiel Dielektrizitätskonstante) gute Aussagen.

1.7.1 Docking Molekulares docking ist der Überbegriff für computerbasierte Methoden, die versuchen nicht-kovalente Bindungen zwischen Makromolekülen oder Makromolekül und Ligand vorherzusagen. Ausgangsstrukturen dafür sind Kristallstrukturen ohne Ligand, MD-Simula- tionen oder Homologiemodelle. Für das docking können zwei Methoden unterschieden werden, das matched docking und die docking Simulationsmethoden. Beim matched docking wird ein Modell des aktiven Zentrums erstellt und im Anschluss versucht eine gegebene Struktur als rigiden Körper geometrisch darin einzupassen. Dieses Verfahren ist relativ schnell und kann genutzt werden, um zum Beispiel Wirkstoffbiblio- theken zu durchmustern.[164] Die docking Simulationsmethoden sind die genaueren Methoden, sie erlauben Flexibilität des Liganden, und in Maßen auch des Rezeptors. Der Ligand wird dabei durch eine Serie von Konformations-, Translations- und Orientierungsänderungen optimal in das aktive Zentrum angepasst. Diese Methoden nutzen ebenfalls die klassischen Kraftfelder zur Berechnung der optimalen Konfiguration.[165] Bedingt durch die große Anzahl an Freiheitsgraden kann die optimale Konfiguration des Substrats nicht direkt berechnet, sondern nur iterativ gelöst werden.[166] AutoDock Vina nutzt dafür einen Iterated Local Search global optimizer[167], dieser nähert sich der optimalen Konfiguration in zwei sukzessiven Schritten, die repetitiv ablaufen. Der erste Schritt ist eine Randomisierung (Mutation) der aktuellen Konfiguration, der zweite Schritt die Bewertung (scoring) der aktuellen Konformation. Beim scoring wird die Summe der inter- und intramolecularen Kräfte berechnet, ähnlich wie bei den Kraftfelder werden auch hier artifizielle Gewichtungsfaktoren zur Feinabstimmung der Ergebnisse verwendet. Für das scoring nutzt Vina die Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS) Methode die nicht nur den Wert der scoring Funktion, sondern auch deren Ableitung berechnet.[168

34 ZIELSETZUNG

“difficult to see. always in motion is the future...“

Yoda

2 Zielsetzung

2 Zielsetzung Der Hydantoinase-Prozesses wird bereits großtechnisch zur Herstellung von α-Amino- säuren genutzt. Ziel dieser Doktorarbeit war die Anpassung der beteiligten Biokatalysa- toren an die Synthese von ungewöhnlichen β-Aminosäuren und α,α-disubstituierten Aminosäuren, durch enzyme-engineering. Dafür wurden als Modellenzyme die Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens, sowie die Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. G21 ausgewählt. Als Modellsubstrate standen N-carbamoyl-β-Phenylalanin und 5,5-Dimethyl-Hydantoin, sowie 5,5-Methyl- Phenyl-Hydantoin zur Verfügung. Die Modellenzyme sollten zunächst mittels in silico Methoden, wie Homology-Modelling, Docking und in silico-Sättigungsmutagenese untersucht werden, um geeignete Strategien für die Mutagenese der Enzyme zu entwickeln. Parallel dazu war es notwendig, Assaysysteme zu entwickeln, die die Aktivität der mutierten Enzyme sowie der Wildtypen vergleichbar machen. Neben den bereits bekannten Assays, basierend auf HPLC und Leitfähigkeit, war es insbesondere nötig, Hochdurchsatzassays zu etablieren, um größere Mengen an Mutanten durchmustern zu können. Als probates Mittel wurde hier ein Wachstumsassay auf Agarplattenbasis gesehen. Verschiedene Strategien der Anpassung, der Arthrobacter aurescens Carbamoylase an das geänderte Substrat sollten evaluiert werden. Es sollten gezielte Punktmutationen auf Basis der in silico Ergebnisse eingeführt werden, die Performance dieser Mutanten sollte wiederum weitere Anregungen für die fortführende Mutagenese geben. Neben streng rationalen Ansätzen sollten auch semi-rationale Methoden, sowie Methoden der gerichteten Evolution eingesetzt werden. CASTing ist eine, insbesondere zur Modifikation des Substratspektrums, viel genutzte Methode, die auch in diesem Fall angewendet werden sollte. Zur Auswahl der CAST-Posi- tionen war es angedacht, ebenfalls die Ergebnisse der Computervorarbeiten zu nutzen. Zusätzlich wurde die Option der gerichteten Evolution diskutiert, hier war insbesondere die Insertion einer Aminosäure gewünscht. Diese Form der Mutation kann über in silico Design schlecht adressiert werden und sollte somit zufällig erfolgen. Für das Design der Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. G21 war ein rein rationales Design geplant, um das Substratspektrum auf sterisch anspruchsvollere Substrate zu erweitern.

ERGEBNISSE

“do or do not. there is no try.“

Yoda

3 Ergebnisse

3 Ergebnisse Zur Bearbeitung der gesetzten Zielstellung, der Herstellung nicht-natürlicher Aminosäuren im Hydantoinase-Prozess wurden zunächst Assaysysteme entwickelt, die in der Lage sein sollten 103 bis maximal 105 Mutanten zu durchmustern (Kapitel 3.1). Hierfür wurde unter anderem auf einen Selektionsassay auf Basis von Ammoniummangel zurückgegriffen (Kapitel 3.1.1). Neben diesem rein qualitativen Assay wurde ebenso ein semi-quantitativer Assay entwickelt. Dieser erzeugt mittels eines Detektorenzyms ein photometrisches Signal und ist somit zur spektrofotometrischen Messung in Mikrotiterplatten geeignet (Kapitel 3.1.2). Dieses Assaysystem wurde schließlich auch zum Einsatz in der Arbeits- kreis-eigenen Thermo-Fisher Roboterplattform getestet (Kapitel 3.1.2.1). Als erstes Vorgehen des protein-engineering wurde das rationale Design gewählt, hierfür wurde ein Modell des gewählten Enzyms erstellt (Kapitel 3.2) und anhand dessen, mittels Überlegungen welche Ansprüche die jeweiligen Substrate an das aktive Zentrum stellen (Kapitel 3.3), geeignete Positionen zur Mutagenese vorgeschlagen und in vitro untersucht (Kapitel 3.4). Zudem wurden in einem semi-rationalen Ansatz Mutationen mit der CAST- Strategie in das aktive Zentrum eingeführt (Kapitel 3.5) und der Einfluss der Mutation auf die Aktivität gegenüber NCβPhe bestimmt. In einem weiteren Ansatz wurde ein Verfahren der gerichten Evolution, eine Variante des gene shuffling mit homologen Genen der Carbamoylasen, β-Ureidopropionasen, angewandt (Kapitel 3.6). Ebenso wurde die β-Ureidopropionase aus S. kluyveri durch Methoden des molecular modelling untersucht und im Anschluss mutagenisiert (Kapitel 3.8). Zur Unterstützung des rationalen Designs wurde ein Versuch der Strukturaufklärung der L-N-Carbamoylase aus A. aurescens unternommen (Kapitel 3.7.1). Hierfür wurde das Gen umkloniert und verschiedene Aufreinigungstechniken angewandt. Die Performance der Top-Mutante wurde sowohl in silico als auch in vitro weiter untersucht und die Ursache der verbesserten Aktivität weiter aufgeklärt (Kapitel 3.10).

3.1 Entwicklung eines Mittel- bis Hochdurchsatzassays zur Detektion von Carbamoylase-Aktivität Um eine größere Anzahl an Carbamoylase-Varianten durchmustern zu können wurden zwei verschiedene Assaysysteme entwickelt: Ein Selektionsassay auf Agarplattenbasis mit Mangelmedium, sowie ein Mikrotiterplattenassy mit einem gekoppelten Nachweisenzym.

41 3 Ergebnisse

3.1.1 Wachstumsassay auf Basis von Ammoniummangel Als Selektionsassay wurde ein Assay auf der Basis von Stickstoffmangel etabliert. Die Grundannahme war, dass die Carbamoylase-Reaktion Ammonium freisetzt, das von der enzymproduzierenden E. coli Zelle als Stickstoffquelle genutzt werden kann. Das Assaykonzept wurde zunächst mit N-Carbamoyl-α-Tryptophan (NCαTrp) getestet, welches von der Wildtyp Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens (AauHyuC) gut umgesetzt wird. Als Medium wurde ein M9-Medium ohne Zusatz einer Stickstoffquelle gewählt. Zunächst wurde der AauHyuC WT und ein pJOE Leervektor in E. coli DH5α transformiert. Die Zellen wurden auf dem M9-Medium mit 20 mM NCαTrp, Rhamnose als Induktor, sowie Ampicillin ausplattiert; das NCαTrp war in DMSO vorgelöst, so dass die Platten zusätzlich 2,5% DMSO enthielten. Nach sieben Tagen waren bei den Carbamoylase enthaltenden Klonen deutliche Kolonien zu sehen, die Kolonien der Leervektor enthaltenden Klone waren nur sehr klein. Also weiterer Test wurden nun auch Mutanten mit geringerer Aktivität gegenüber NCαTrp eingesetzt (AauHyuC A130L und A130V mit circa 60% Aktivität des Wildtyps [169]), weiterhin wurde die Substratkonzentration auf 5 mM verringert, da NCαTrp durch den zusätzlichen Abbau des entstehenden Tryptophans dreimal mehr Stickstoff freisetzt als NCβPhe. Die E. coli Zellen wurden erneut frisch transformiert und auf dem M9-Medium mit den gleichen Zusätzen ausplattiert. Nach sieben Tagen wurde das Wachstum überprüft (Abbildung 3.1.1). Auch mit verringerter NCαTrp-Konzentration und geringerer Aktivität ist das Wachstum aktiver Varianten deutlich von den E. coli Zellen ohne funktionelle Carba- moylase zu unterscheiden.

42 3 Ergebnisse

Leervektor Wildtyp

AauHyuC AauHyuC A130L A130V

Abbildung 3.1.1: Ergebnis des Wachstumsassays nach sieben Tagen mit AauHyuC Wildtyp und den Mutanten A130L und A130V. Die Agarplatte enthielt M9-Medium ohne N-Quelle, 5 mM NCαTrp, 2,5 % DMSO, 0,2 % Rhamnose und 100 µg/ml Ampicillin.

Parallel dazu wurde untersucht, ob β-Phenylalanin, als Reaktionsprodukt, das Wachstum von E. coli stört. Dazu wurden die Zellen auf M9-Medium mit 10 und 20 mM β-Phenyl- alanin und 5 mM Ammoniumchlorid ausplattiert, es wurde ebenso eine Kontrolle ohne zugegebenes β-Phenylalanin überprüft. Die Zellen zeigten auf allen Platten ein normales Wachstum. Nachfolgend wurde neben E. coli DH5α auch E. coli BL21 getestet. Dieser Stamm zeigte dabei ein vergleichbares Verhalten, bildete jedoch größere Kolonien. Daher wurde er, unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Kolonien bei der realen Selektion insgesamt kleiner sein dürften, als besser erachtet. Als weitere Optimierung wurden die E. coli Zellen bereits vor dem Ausplattieren induziert. Nach der Aufnahme in LB-SOC wurden die Zellen wie üblich 1 h bei 37°C inkubiert, anschließend wurden sie in die zehnfache Menge LBAmp mit 0,2% (w/v) Rhamnose über- führt und dann für weitere 2 h inkubiert, danach wurden die Zellen mit Natriumphosphat- puffer gewaschen und ausplattiert. Mit der vorherigen Induktion konnte mit E. coli BL21 auf Mangelmediumsplatten mit NCαTrp bereits nach vier Tagen schwaches und nach fünf Tagen deutliches Wachstum gezeigt werden.

43 3 Ergebnisse

Bei dem ersten Versuch mit NCβPhe als Substrat und dem AauHyuC Wildtyp konnte nach elf Tagen Wachstum identifiziert werden, die Inkubationszeit des Ansatzes ist also wichtig um falsch-positive Varianten auszuschließen. Durch Verringerung der Ampicillinkonzentra- tion von 100 µg/ml auf 50 µg/ml konnte dieser Zeitraum auf 13 Tage erhöht werden. Das Wachstumsfenster für aktive Varianten gegenüber NCβPhe liegt also zwischen 4 und 13 Tagen. Mit diesen Modifikationen wurde der Selektionsassay als angemessen nutzbar für die Selektion größerer Bibliotheken erachtet.

3.1.2 Glutamat-Dehydrogenase (GluDH) gekoppelter Assay Nachfolgend zum rein qualitativen Selektionsassay auf Agarplattenbasis sollte ein quantitativer Screening-Assay auf Mikrotiterplattenbasis folgen. Die Grundlage des Assays war dabei ebenfalls die Freisetzung von Ammonium als Teil der Carbamoylasereaktion. Das freigesetzte Ammonium sollte durch eine kommerzielle Glutamat-Dehydrogenase unter Verbrauch von α-Ketoglutarat und NADH umgesetzt werden. Die Reaktion von NADH zu NAD+ lässt sich dabei spektrophotometrisch messen (Abbildung 3.1.2). Die grundsätzlichen Assayparameter, sowie die Anwendbarkeit wurden durch C. Thöle im Rahmen einer Bachelorarbeit mit aufgereinigten Enzymen bestimmt. Es zeigte sich, dass insbesondere bei hohen Carbamoylaseaktivitäten die Konzentration der Glutamat-Dehy- drogenase entscheidend ist, da diese in diesem Fall den limitierenden Schritt darstellt. ß-Aminosäure NADH H2O HCO3 2-Ketoglutarat

O H3N O NAD NH4 O NH Glutamat R 1. Carbamoylase 2. Glutamat Dehydrogenase

Abbildung 3.1.2: Schematischer Ablauf des NADH Assays, der gemessene Reaktand ist hervorgehoben.

In der gleichen Arbeit wurde der beschriebene Assay mit dem Prescott-Jones Assay (Stick- stoffnachweis) und dem Leitfähigkeitsassay (Nachweis von Hydrogencarbonat und Ammo- nium als geladene Spezies) verglichen und eine annehmbare Übereinstimmung festgestellt.[170] Davon ausgehend wurde der GluDH-Assay für die Durchmusterung von Enzym- bibliotheken in Mikrotiterplatten weiterentwickelt.

44 3 Ergebnisse

Zwei größere Probleme wurden für den Einsatz des Assays zur Überprüfung von Biblio- theken in Mikrotiterplatten identifiziert: a) Die geringe Menge des Zielenzyms nach der Kultivierung in Mikrotiterplatten und b) große Hintergrundaktivität bei der Verwendung des NADH-Assays im Ganzzellextrakt. Die E. coli Zellen wurden in Mikrotiterplatten kultiviert, anschließend geerntet und mit BugBusterTM aufgeschlossen, der Zellextrakt wurden von den Zelltrümmern getrennt und für den Assay genutzt. Als Negativkontrollen wurden eine inaktive Mutante der AauHyuC (E127D) sowie eine Epoxidhydrolase (EchA[171]) im gleichen Plasmid verwendet. Bei der Kultivierung in der oben beschriebenen Weise und unter Benutzung von LB-Me- dium konnte kein eindeutiges Signal für den Wildtyp erhalten werden. Die im Zellextrakt vorliegende Enzymmenge war zu gering, um den aktiven Wildtyp bei großer Hintergrund- aktivität, von den Negativkontrollen unterscheiden zu können. Zur Optimierung der Enzymmenge wurde die Kultivierung in DeepWell-Platten (DW-Platten), im 1 ml Maßstab durchgeführt. Weiterhin wurde neben LB auch das reich- haltigere TB Medium genutzt, um ein besseres Zellwachstum und damit eine bessere Expression zu ermöglichen. Durch die Kultivierung in DW-Platten konnte eine klare Identi- fizierung der aktiven Varianten ermöglicht werden, das Signal : Hintergrund-Verhältnis lag für die LB-Expression nur bei etwa drei, für die Expression in TB-Medium allerdings erneut bei eins, insgesamt war bei der Expression in TB-Medium das Signal zusätzlich schwächer. Als weitere Optimierung des Assays wurde für die Expression der Carbamoylase ein Stick- stoff-limitierendes Medium (tNL-Medium) verwendet. Die Zellen wurden bis zur Induktion in LB-Medium vorgezogen und anschließend in tNL-Medium überführt. Durch den geringen Stickstoffanteil und das dadurch bedingte langsame Zellwachstum ist zwar hier das Signal

EchA Wildtyp Inaktive Mutante E127D

n 0 i m / -0,01 m n 0

4 -0,02 3

i e

b -0,03

n o i

t -0,04 p r o

s -0,05 b A

Abbildung 3.1.3: Vergleich des NADH-Assays in LB-Medium (dunkelgrau) und tNL-Medium (hellgrau). Positive Werte wurden null gesetzt.

45 3 Ergebnisse ebenfalls schwächer, allerdings ist der Hintergrund fast eliminiert. Durch den stark verringerten Reaktionshintergrund liegt somit das Signal:Hintergrund-Verhältnis bei etwa 12 und wurde damit als ausreichend erachtet (Abbildung 3.1.3). In einem größeren Ansatz wurde der Assay auf Verlässlichkeit getestet und je 13 Klone des Wildtyps, der inaktiven Mutante und des Kontrollenzyms EchA gemeinsam kultiviert und mit dem Assay und NCαTrp als Substrat gemessen. Es zeigte sich eine große Spann- breite innerhalb der Aktivität des Wildtyps. Wird die Grenze für eine aktive Variante bei 10% der maximalen Aktivität gesetzt, würden in diesem Fall zwei (15%) inaktive Mutanten als aktiv identifiziert werden (falsch positive) und zwei (15%) der Wildtypen nicht als positiv erkannt werden (falsch negative). Insgesamt kann der Assay so als Vortest gesehen werden, jedoch muss definitiv eine quantitative Überprüfung folgen (Abbildung 3.1.4).

100

90 ] t r 80 e w

s 70 s e M t 60 ä n t i e t v

i 50 s t h k c A

ö 40 h

m 30 o v 20 % [ 10

Variante

Abbildung 3.1.4: Assaytest über 39 unterschiedliche Klone, 13 Wildtypen (schwarz), 13 inaktive Mutanten (dunkelgrau) und 13 EchA (hellgrau). Der höchste Messwert wurde 100%, negative Werte wurden null gesetzt. Die Grenze oberhalb derer eine Variante als aktiv klassifiziert wurde ist rot eingezeichnet.

3.1.2.1 Etablierung des GluDH gekoppelten Assays auf einer Roboterplattform Nach den erfolgreichen Assayvortests sollte dieses Assaysystem auf der Roboterplattform LARA[172] eingesetzt werden, um so den Durchsatz zu erhöhen und die Arbeitszeit zu verringern.

46 3 Ergebnisse

Ziel war die komplette Assayprozedur auf der Roboterplattform durchzuführen, der Start- punkt war eine Masterplatte (Glycerolkultur einer Carbamoylase-Bibliothek). Diese wurde in eine frische Mikrotiterplatte überführt und über Nacht inkubiert. Von der frischen Über- nachtkultur wurden zwei identische Expressionsplatten erstellt, die bis zum Zellaufschluss entsprechend behandelt wurden. Der Zellextrakt in den Expressionsplatten wurde in die Assayplatten überführt und dort nach der Vorinkubation photometrisch gemessen. Insge- samt nimmt die Durchführung im Roboter so drei Tage in Anspruch, kann jedoch völlig automatisch durchgeführt werden (Abbildung 3.1.5).

OD  t A) Zellinokulation (MTP) B) Wachstum und C) Zellernte Induktion

t D) Zellaufschluss E) Glu-DH Assay F) Datenauswertung

Abbildung 3.1.5: Schematische Darstellung des Assayablaufs in der Roboterplattform.

Die Methode wurde mit einer Bibliothek des DOGS gene shuffling (Kapitel 3.6) getestet. Jedoch konnten trotz maschineller Durchführung die Multiplikate der Messungen nicht in Einklang gebracht werden, das heißt besonders aktive Variante in Platte A waren nur durchschnittlich oder wenig aktiv in Platte B.

3.2 Modelling von Carbamoylasen Zu Beginn der Arbeit war lediglich die Kristallstruktur der L-N-Carbamoylase aus Geoba- cillus stearothermophilus (pdb-Code 3N5F) bekannt.[109] Das aktive Zentrum dieses Enzyms zeigte überraschenderweise nur ein Metallion pro Monomer, obwohl klar die Aminosäurereste des Bimetallzentrums erkennbar waren Abbil- dung 3.2.1.

47 3 Ergebnisse

Abbildung 3.2.1: Metallzentrum in der Kristallstruktur der Geobacillus stearothermophilus, die Bindestelle des zweiten Metallions ist markiert.

Mit circa 39% Sequenzidentität war diese Kristallstruktur dennoch die beste Matrize für die Erstellung eines Homologiemodells. Das Homologiemodell zeigte ebenfalls nur ein Metal- lion im aktiven Zentrum, das fehlende Metallion wurde anschließend durch ein Alignment mit der β-Alanin Synthase aus Saccharomyces kluyveri (pdb-Code 1R3N)[12] eingefügt. Das so veränderte Modell wurde über 1000 ps verfeinert und diente anschließend als Homolo- giemodell für alle weiteren Experimente.

3.3 Theoretische Überlegungen zur Umsetzung von β-Aminosäuren Das Substratspektrum sollte von einer N-carbamoylierten-α-Aminosäure zu einer N-carbamoylierten-β-Aminosäure geändert werden. Die L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens (AauHyuC) bevorzugt aromatische Aminosäure (Tryptophan, Phenylalanin), aber auch nicht-natürliche Aminosäuren wie L-Thienylalanin[104]. Damit wurde sie als geeignetes Modellenzym für das protein-engineering betrachtet. Als Modellsubstrat für die N-carbamoylierten-β-Aminosäuren wurde dabei das N-carbamoyl-β-Phenylalanin (NCβPhe) gewählt. Die Strukturen von α-Aminosäuren und β-Aminosäure wurden verglichen (Abbil- dung 3.3.1).

48 3 Ergebnisse

His 230 Asn 278 His 230 Asn 278 Gln 196 Arg 291 Arg 291 2,92 Å 3,17 Å Gln 196 2,54 Å 2,81 Å 3,34 Å 3,09 Å Δ 0,25 Å OH- Glu 127 OH- Glu 127 Δ 0,25 Å Δ 0,27 Å Gly 384 Gly 384 His 385 His 385

Abbildung 3.3.1: Vergleich der 3D-Struktur der gewählten Modellsubstrate, links α-Aminosäure, rechts β-Aminosäure. Dargestellt sind die hauptsächlich zur Substraterkennung und Katalyse beitragenden Aminosäurereste in AauHyuC.

Es zeigte sich, dass die hauptsächlich zur Interaktion beitragenden funktionellen Gruppen der Substrate eine Abstandsdifferenz von etwa 0,25 Å aufwiesen. Somit war festzustellen, dass das Rückgrat der β-Aminosäure einen geringfügig größeren Platzbedarf im aktiven Zentrum zeigt, der jedoch etwa nur ein Viertel der intuitiv geschätzten Dimension aufweist. Weiterhin zeigt sich eine Verschiebung der Aminosäureseitenkette zwischen den beiden Substraten. Dies wurde als weniger wichtig erachtet, da die Bindetasche für die aromatische Seitenkette des Substrats in der AauHyuC sehr flexibel ist und eine Vielzahl an aromatischen Gruppen akzeptiert. Als Grundlage für das rationale Design wurde demnach die bessere Akzeptanz des β-Aminosäurerückgrats durch Vergrößerung des aktiven Zentrums, beziehungsweise durch Erhöhung des Abstands zwischen den Hauptinteraktionsgruppen, festgelegt. Um dieses Ziel zu erreichen wurden folgende grundsätzlichen Strategien des rationalen Designs über- legt: 1. Vergrößerung des aktiven Zentrums durch Mutation beteiligter Aminosäuren zu homologen aber kleineren Aminosäuren. 2. Deletion im Peptidrückgrat, um Strukturelemente im aktiven Zentrum zu verschieben. 3. Schaffung neuer Interaktionspunkte an geeigneten Stellen durch Mutation nicht beteiligter Aminosäuren.

49 3 Ergebnisse

4. Mutationen auf Grundlage der verwandten β-Ureidopropionasen. 5. Insertion im Peptidrückgrat, um Strukturelemente im aktiven Zentrum zu verschieben.

3.4 Rationales Design der Arthrobacter aurescens Carbamoylase Das rationale Design basierte auf den Vorüberlegungen anhand des Substrates aus Kapitel 3.3. Für die genannten Strategien wurden zunächst in silico entsprechende Mutanten erstellt (Kapitel 3.4.1) und die als potentiell wirkungsvoll identifizierten Mutationen schließlich in vitro eingeführt (Kapitel 3.4.2).

3.4.1 Identifizierung geeigneter Positionen in der Arthrobacter aurescens Carbamoylase Für die in Kapitel 3.3 genannten vier Varianten zur Umsetzung von β-Aminosäurederivaten wurden die geeigneten Positionen in der AauHyuC identifiziert und relevante Mutationen in silico eingeführt.

3.4.1.1 Geeignete Positionen für eine Vergrößerung des aktiven Zentrums durch homologe Mutationen Für die Strategie 1, Vergrößerung des aktiven Zentrums durch Mutation zu homologen Aminosäuren, konnten zwei Positionen in der AauHyuC identifiziert werden, die für diese Strategie geeignet schienen. Zunächst wurden die beiden Substrate NCαTrp und NCβPhe in das aktive Zentrum der AauHyuC gedockt. Die besten Positionen für beide Substrate wurden nach Bindungs- energie und korrekter Positionierung ausgewählt. Wichtige Merkmale waren dabei die Ausrichtung der Säuregruppe des Substrats in Richtung Arginin 291, sowie die Ausrichtung der Carbamoylgruppe in Richtung des Bimetallzentrums. Die mit dem Substrat interagierenden Aminosäureseitenketten des Wildtyps wurden anschließend auf mögliche Kollisionen oder veränderte Wechselwirkungen mit dem neuen Substrat hin analysiert. Wichtig ist dabei die für die Katalyse benötigten Wechselwirkungen nicht zu manipulieren. Die aktive Spezies in der L-N-Carbamoylasereaktion ist ein, durch die Metallionen aktiviertes, Wassermolekül (vgl. Kapitel 1.5.3.2). Somit waren an der Metallbindung beteiligte Reste (Histidin und Aspartat) nicht zu verändern. Die katalytisch aktive Aminosäure Glutamat 127 positioniert ein Hydroxylion zum Angriff auf die Carbamoylgruppe. Im docking-Experiment zeigte sich, dass der Abstand zwischen der Säuregruppe des Glutamat 127 und dem Carbonylkohlenstoff der Carbamoylgruppe

50 3 Ergebnisse etwa 4,7 Å beträgt, wohingegen, durch den erhöhten Raumbedarf, der Abstand bei der β-Aminosäure um etwa 0,7 Å verringert ist (Abbildung 3.4.1).

Abbildung 3.4.1: Aktives Zentrum der AauHyuC, links: docking mit NCαTrp (grün), rechts: docking mit NCβPhe (violett). Der Abstand zwischen der Säuregruppe des katalytisch aktiven Glutamat 127 (orange) und dem Carbonylkohlenstoff der Carbamoylgruppe ist bei der β-Aminosäure um circa 0,7 Å verringert.

Für Glutamat als Aminosäure mit einer Carboxylgruppe in der Seitenkette gibt es nur eine homologe Variante, Aspartat, welches eine um circa 1 Å verkürzte Seitenkette trägt und daher als gute Mutation erachtet wurde. Die Mutation wurde in silico eingeführt und anschließend die Entfernungen zwischen den interagierenden Gruppen bestimmt (Abbildung 3.4.2).

51 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.2: Aktives Zentrum der AauHyuC mit der eingeführten Mutation E127D (orange). Links: docking mit NCαTrp (grün), rechts: docking mit NCβPhe (violett). Die Entfernung zwischen Säuregruppe des Restes 127 und Carbonylkohlenstoff der Carbamoylgruppe beträgt nun bei NCβPhe (violett) circa 4,70 Å und weniger als 0,1 Å abweichend zum Wildtyp mit α-Aminosäure (grün) (4,77 Å).

Es zeigte sich, dass die Mutante für das neue Substrat einen nahezu identischen Abstand aufweist wie der Wildtyp für das α-Aminosäurederivat. In silico bewirkte die Mutation den gewünschten Effekt und wurde daher als geeignetes Ziel ausgewählt. Glutamin 196 ist nicht an der Katalyse beteiligt, liegt allerdings so positioniert, dass die Seitenkette in Richtung des Substrats zeigt und eventuell auch von einer Wechselwirkung ausgegangen werden kann. Um den Raumbedarf von Glutamin zu verringern wurde, analog zu der Mutation an Glutamat 127, Asparagin gewählt. Die Mutation wurde in silico eingeführt und die Schleife in der die Aminosäure 196 liegt (193-199) energieminimiert, so dass sich das Asparagin 196 neu ausrichten konnte. Bestimmt man die Abstände zwischen dem Carbonylkohlenstoff des Säureamins mit der Carbamoylgruppe, so liegen die beiden Gruppen im Wildtyp mit NCαTrp als Substrat etwa 7,5 Å voneinander entfernt, zum NCβPhe allerdings nur 6,6 Å, wird die Mutation durchge- führt so sind es 7,4 Å (Abbildung 3.4.3).

52 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.3: Aktives Zentrum der AauHyuC, Wildtyp mit NCαTrp (grün) links und Mutante (orange) mit NCβPhe (violett).

Die Entfernung der beiden Gruppen mit minimal 6,6 Å war recht groß, so dass nicht eindeutig geschlussfolgert werden konnte, ob die Mutation tatsächlich einen Einfluss auf den Umsatz des β-Aminosäurederivats haben kann, dennoch wurde die Mutation als sinnvoll erachtet und in vitro eingeführt. Ein weiterer Aminosäurerest, der den erhöhten Raumbedarf der β-Aminosäure entgegen- wirkt ist Valin 216. Der Abstand der geometrischen Zentren zwischen dem Substrat NCαTrp und Valin 216 liegt bei 6,8 Å, bei NCβPhe sind es nur 6,5 Å. Valin ist bereits die sterisch anspruchsloseste der hydrophoben Aminosäuren, so dass eine Mutation zu Alanin oder Glycin als sinnvolle Möglichkeit betrachtet wurde. Beide Mutationen wurde in silico durchgeführt und die Positionierung des Substrats im aktiven Zentrum bewertet. Die Mutation schafft im aktiven Zentrum mehr Platz für die β-Aminosäure (Abbildung 3.4.4), wobei die Differenz bereits durch die Mutation V216A mehr als ausgeglichen wird. Insge- samt war auch hier festzustellen, dass die Entfernung mit mehr als 6 Å unter Umständen keinerlei Einfluss auf die Substratbindungen haben kann, dennoch wurden beide Muta- tionen (V216A und V216G) als relevant erachtet und in vitro eingeführt (Kapitel 3.4.2 ).

53 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.4: Die Mutation von Valin 216 zu Alanin schafft mehr Platz im aktiven Zentrum. Das Tryptophansubstrat ist etwa 6,8 Å vom Valin 216 entfernt, β-Phenylalanin nur 6,5 Å, nach der Mutation liegt die Entfernung zu β-Phenylalanin bei 7,0 Å.

3.4.1.2 Deletionen im Peptidrückgrat, um Strukturelemente im aktiven Zentrum zu verschieben Die Deletionsmethode war nicht so zugänglich wie die Substitution einzelner Aminosäuren. Zunächst wurde analog vorgegangen: ein docking beider Substrate wurde genutzt, um störende Sekundärstrukturelemente zu identifizieren. Es war zu erkennen, dass die Schleife 127 bis 135 im Bereich der Carbamoylgruppe mit dem Substrat in Kontakt steht. In silico wurde die Aminosäure Alanin an Position 130 deletiert und das Peptidrückgrat, durch das manuelle einfügen einer kovalenten Bindung wieder hergestellt. Anschließend wurde das Protein bis auf die betreffende Schleife fixiert und eine Energieminimierung durchgeführt. Die Ausgangsstruktur und die Mutante wurden übereinandergelegt und der Effekt der Deletionsmutante bewertet. Es zeigte sich, dass sich der Effekt der Deletionsmutante am stärksten im Bereich von 127-131 auswirkt. Die Schleife der Deletionsmutante wird in dem Bereich gestrafft und nimmt daher vor allem in Richtung des aktiven Zentrums, aber auch in der Gegenrichtung etwas weniger Platz ein (Abbildung 3.4.5). Der Effekt der Deletionsmutante konnte nicht, anders als bei den Substitutionsmutanten, in eindeutigen Abständen ausgedrückt werden, dennoch war ein positiver Effekt bezüglich einer Vergrößerung des aktiven Zentrums deutlich zu erkennen, somit wurde die Mutation als sinnvoll erachtet und in vivo durchgeführt (Kapitel 3.4.2).

54 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.5: Vergleich der Schleife 127-135 des Wildtyps (blau) und der Alanin 130 Deletionsmutante (orange).

Eine Deletion ist ein starker Eingriff und führt häufig zu fehlgefalteten oder inaktiven Enzymen.[173] Um die gleiche Mutationsposition in etwas schwächerer Form zu testen wurden auch die Mutation Alanin 130 zu Glycin durchgeführt. Das Glycin verleiht der Schleife an dieser Position eine größere Flexibilität und ist gleichzeitig eine Mutation bei der das Risiko einer fehlgefalteten, inaktiven Variante, im Vergleich zur Deletionsmutante, verringert wird. Obwohl es sich bei der Mutation A130G um einen gewöhnlichen Amino- säureaustausch handelt, wird diese Mutation aufgrund der zugrunde liegenden Strategie, bei der Deletionstechnik genannt.

3.4.1.3 Schaffung neuer Interaktionspunkte an geeigneten Stellen durch Mutation nicht beteiligter Aminosäuren Ziel dieser Strategie war es, durch die Mutation von Aminosäuren, die zuvor nicht an der Substratbindung beteiligt waren, neue Interaktionspunkte für die Substratbindung zu erzeugen. Die beiden Hauptinteraktionspunkte des Substrats sind hier die negativ geladene Carboxylgruppe und die positiv geladene Carbamoylgruppe. Durch Einführung einer jeweils gegenteilig geladenen Gruppe sollte die Bindung von NCβPhe verbessert werden. Die Carboxylgruppe des Substrats wird bei der α-Aminosäure durch das konservierte Arginin 291 und durch den Rückgratstickstoff des Glycin 360 gebunden, diese Interaktion konnte gleichermaßen für die β-Aminosäure beobachtet werden. Die Carbamoylgruppe der α-Aminosäure wird von Glutamat 128 und dem Carbonylsauerstoff von Glutamat 127 gebunden, bei der β-Aminosäure ist keine entsprechende Interaktion vorhanden. In unmittelbarer Nähe der Carbamoylgruppe sind nicht viele Aminosäuren, deren Reste in

55 3 Ergebnisse

Richtung der Carbamoylgruppe zeigen und nicht gleichzeitig aufgrund der funktionellen Bedeutsamkeit stark konserviert sind. Als relevanter Rest wurde Methionin 136 identifiziert, dessen Seitenkette in Richtung des Substrats positioniert ist. Zur Mutation an dieser Stelle kamen nur Glutamat und Aspartat in Frage, da sie, aufgrund ihrer negativ geladenen Seitenkette, in der Lage wären eine Wasserstoffbrücke mit dem Substrat einzu- gehen. Glutamat wurde aus sterischen Gründen nicht gewählt, die Mutation M136D wurde in silico durchgeführt und anschließend eine lokale Energieminimierung durchgeführt. Die Seitenkette des Aspartats war nach der Energieminimierung so positioniert, dass eine Wasserstoffbrücke zum Substrat ausgebildet werden konnte (Abbildung 3.4.6), somit wurde theoretisch ein neuer Interaktionspunkt für das β-Aminosäuresubstrat geschaffen. Die Mutation wurde für sinnvoll befunden und in vitro eingeführt (Kapitel 3.4.2).

56 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.6: Aktives Zentrum der AauHyuC; die Säuregruppe des NCbPhe bildet eine Wasserstoffbrücke zum Arginin 291 aus. Die Carbamoylgruppe hat im Wildtypenzym keinerlei Interaktionen, in der M136D Mutante (orange) wird eine Wasserstoffbrücke ausgebildet.

3.4.1.4 Mutationen auf Grundlage der verwandten β-Ureidopropionasen Die Mutagenese anhand homologer Enzyme mit den gewünschten Eigenschaften ist eine andere Form des rationalen Designs. Hier wird das Homologiemodell nicht zur Vorhersage von sinnvollen Mutationen genutzt, sondern anhand des Homologiemodells werden die Aminosäuren ausgewählt, die sich zwischen dem zu mutierendem Enzym und dem Enzym mit den gewünschten Eigenschaften unterscheiden. Basierend auf der Tatsache, dass β-Ureidopropionasen, also Enzyme mit Decarbamoylierungsaktivität gegenüber N-Carba- moyl-β-Alanin (NCβAla), bereits das β-Aminosäurerückgrat akzeptieren, wurden geeignete Positionen in der AauHyuC identifiziert. Zunächst wurde die Struktur der β-Alanin-Synthase aus Saccharomyces kluyveri (pdb-code: 1R3N, 2V8G) mit dem Homologiemodell der AauHyuC aligned. Anschließend wurden die Aminosäuren in unmittelbarer Nähe das Substrats auf Unterschiede analysiert. Es zeigte sich, dass das aktive Zentrum beider Enzyme nicht nur strukturell sehr ähnlich ist, sondern auch eine hohe Sequenzidentität zeigt. In der zweiten Sphäre konnte Glutamat 126 als interessanter Kandidat identifiziert werden. In der Carbamoylase aus Arthrobacter bildet dieser Rest zwei Wasserstoffbrücken mit einer benachbarten Schleife (128-136), mit dem Rückgrat der Reste Arginin 131 und Phenylalanin 132. In der β-Alanin-Synthase ist an der homologen Position des Glutamat 126 ein Asparagin, welches nicht durch Wasserstoffbrücken mit der homologen Schleife in Wechselwirkungen tritt (Abbildung 3.4.7).

57 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.7: Aktives Zentrum der Arthrobacter aurescens Carbamoylase (links) und der Saccharomyces kluyveri β-Ureidopropionase (rechts). Die Aminosäure Glutamat 126 (orange) bildet Wasserstoffbrücken (gelb) mit einer benachbarten Schleife, die positionshomologe Aminosäure Asparagin 158 in der β-Ureidopropionase jedoch nicht.

Es wurde vermutet, dass diese Schleife dadurch in der β-Ureidopropionase flexibler vorliegt und so das sterisch anspruchsvollere Substrat besser gebunden werden kann. Die Effektivität dieser Mutation war nur schwer zu bewerten, der Einfluss der Position 126, beziehungsweise 158 auf die Schleife ist sicherlich vorhanden, so dass durch die Mutation E126N, sicher die Flexibilität der Schleife erhöht werden würde. Wie groß der Einfluss dieser Schleife allerdings auf die Bindung des Substrats oder die mögliche Umsetzung ist, blieb fraglich. Die Mutation wurde dennoch als relevant eingestuft und in vitro eingeführt.

3.4.1.5 Insertion im Peptidrückgrat zur Verschiebung von Strukturelementen im aktiven Zentrum Die Insertion einer Aminosäure um das aktive Zentrum aufzuweiten war schwierig. In der dreidimensionalen Proteinstruktur konnte keine Position identifiziert werden, die bei einer Insertion eine Vergrößerung des aktiven Zentrums herbeigeführt hätte. Um das Problem anschaulicher zu machen wurde eine zweidimensionale Karte des Enzyms erstellt.

58 3 Ergebnisse

Abbildung 3.4.8: Zweidimensionale Karte der AauHyuC. α-Helices sind blau, β-Faltblätter rot dargestellt. Die Interaktionspunkte mit der Säuregruppe des Substrats (blaue Sterne) liegen in einer anderen Domäne als die mit der Carbamoylgruppe interagierende Aminosäuren (rote Sterne).

In dieser Darstellung zeigte sich, dass die mit der Säuregruppe interagierenden Aminosäu- rereste in einer anderen Domäne liegen, als die mit der Carbamoylgruppe interagierenden Reste (Abbildung 3.4.8). Somit wäre eine Insertion nötig, die die beiden Domänen gering- fügig voneinander entfernt. Dies war jedoch schwer zu realisieren, da die Domänen untereinander ohnehin Flexibilität aufweisen (Kapitel 1.5.3.2). Somit wurde auf eine rationale Insertion verzichtet und die Zufallsinsertionsmutagenese RID[16] (Random Insertion and

59 3 Ergebnisse

Deletion) als Technik gewählt (Kapitel 6.9.1.13). Mit dieser Methode wurde zufällig ein Alanin oder ein Glycin in die AauHyuC inseriert. Dabei würde das Alanin als Platzhalter an einigen Stellen relevante Domänen zueinander verschieben, das Glycin hätte die gleiche Funktion, würde jedoch zusätzlich noch mehr Flexibilität im Zielenzym erzeugen.

3.4.2 Ergebnisse des rationalen Designs in vitro Alle vorgestellten Mutationen wurden mittels QuikChangeTM in das Gen der Arthrobacter aurescens Carbamoylase eingeführt. Die Mutanten wurden exprimiert, durch ion metal affinity chromatography (IMAC) gereinigt und mit dem Leitfähigkeitsassy (Kapitel 6.9.3.2) und/oder dem Glutamat-Dehydrogenase gekoppelten Assay (Kapitel 6.9.3.1) bezüglich Aktivität gegenüber NCβPhe gemessen (Tabelle 3.4.1).

Tabelle 3.4.1: Aktivität der vorgestellten rationalen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp gegenüber NCβPhe.

 = 0%  < 70%  70%-120%  > 120% Strategie Position Ausgangs- Zielaminosäure Veränderung der aminosäure Aktivität 127 Glutamat Aspartat  Vergrößerung des 196 Glutamin Asparagin  aktiven Zentrums Alanin  216 Valin Glycin 

-  Deletion im Rückgrat 130 Alanin Glycin 

Neue 136 Methionin Aspartat  Interaktionspunkte

Mutation anhand 126 Glutamat Asparagin  homologer Enzyme

Beide Assays sind nicht eindeutig quantitativ, jedoch in der Kombination dennoch aussage- kräftig, so konnte festgestellt werden, dass nur die Mutation Valin 216 zu Alanin die Akti- vität gegenüber NCβPhe verbessert. Die Mutation der katalytisch aktiven Aminosäure Glutamat 127 zur homologen Aminosäure Aspartat zerstört die Aktivität des Enzyms völlig. Die Mutationen Glutamin 196 zu Aspa- ragin, Alanin 130 zu Glycin und Glutamat 126 zu Asparagin, haben alle keinen nennens- werten Einfluss auf die Aktivität gegenüber NCβPhe. Die Einführung eines Aspartat an der Position 136 zerstörte einen Teil der Enzymaktivität. Interessant war die Position 216 an der im Wildtyp Valin vorliegt: der Ersatz durch Alanin - zur Vergrößerung des aktiven Zentrums - erhöht die Aktivität gegenüber dem Zielsubstrat erheblich. Die Einführung der noch kleineren Aminosäure Glycin hingegen verringert die Aktivität des Enzyms.

60 3 Ergebnisse

Insgesamt ließ sich feststellen, dass nur die Mutation V216A aus allen vorgestellten Muta- tionen einen relevanten Nutzen hatte. Die Mutante V216A wurde genauer untersucht (Kapitel 3.10).

3.5 CASTing der Arthrobacter aurescens Carbamoylase Neben dem rationalen Design wurde mit der CASTing-Methode auch eine semi-rationale Methode angewandt, um die Arthrobacter aurescens Carbamoylase an das neue Substrat anzupassen. Basierend auf den Ergebnissen des rationalen Designs und Untersuchungen an homologen Enzymen[174] wurden vier Aminosäuregruppen für den CAST Ansatz ausge- wählt (Abbildung 3.5.1).

Abbildung 3.5.1: Das aktive Zentrum der AauHyuC, die für den CAST-Ansatz ausgewählten Aminosäuregruppen sind farblich hervorgehoben.

Es wurden die folgenden Gruppen für den CAST-Ansatz ausgewählt:

Bereich I: Valin 216 und Alanin 218 (grün) Beide Aminosäureresten sind in Richtung des Substrats positioniert, ein Einfluss des Valins auf die Aktivität der Carbamoylase gegenüber NCβPhe konnte im rationalen Ansatz bereits gezeigt werden (Kapitel 3.4.2). Ein Einfluss von Alanin 218 war aufgrund der geringeren

61 3 Ergebnisse

Seitenkettengröße und des größeren Abstands zum gebundenen Substrat zwar unwahrscheinlicher als vom benachbarten Valin, konnte aber auch nicht ausgeschlossen werden. Zudem konnte ein kooperativer Effekt, aufgrund der räumlichen Nähe und ähnlichen Ausrichtung, zwischen den beiden Aminosäuren vermutet werden, so dass eine parallele Mutagenese beider Reste sinnvoll erschien.

Bereich II: Histidin 229, Glycin 231 und Threonin 232 (blau) Insbesondere das Glycin und das Histidin sind in Richtung des Substrates positioniert, das Threonin ist eher weiter entfernt, kann jedoch dennoch, auch durch Wechselwirkungen mit den beiden anderen Aminosäuren, einen Einfluss haben. Die Mutation Histidin zu Serin in der homologen L-N-Carbamoylase aus Sinorhizobium meliloti (SmeHyuC) zeigte eine erhöhte Aktivität gegenüber NCβPhe.[174]

Bereich III: Histidin 361 und Aspartat 362 (violett) Beide Aminosäuren sind in Richtung des Substrats positioniert, das Histidin ist geringfügig an der Bindung der Metallionen beteiligt. Dennoch wurde auch hier eine Erhöhung der Aktivität gegenüber NCβPhe in der homologen SmeHyuC gezeigt, wenn das Histidin durch ein Aspartat ersetzt wurde.[174]

Bereich IV: Serin 133, Glycin 135 und Methionin 136 (orange) Methionin 136 und Glycin 135 sind in Richtung des Substrates positioniert. Methionin wurde bereits ohne Erfolg im rationalen Designansatz zu Aspartat mutiert (Kapitel 3.4.2), doch selbst diese Mutation könnte positiv sein, falls kooperative Effekte durch die parallele Mutagenese von Glycin 135 die Mutation unterstützen. Serin 133 liegt weiter entfernt vom aktiven Zentrum, ist jedoch am Eingang des Substrattunnels positioniert. Dadurch wurden positive Effekte bei gleichzeitig geringem Einfluss auf das sensitive aktive Zentrum erhofft.

3.5.1 Erstellung und Selektion der CAST-Bibliotheken Für die Erstellung der CAST-Bibliotheken wurden NDT-Primer genutzt, um die entstehenden Bibliotheken überschaubarer zu halten. Zur Selektion wurde der entwickelte Wachstumsassay verwendet (Kapitel 3.1.1). Das nachfolgende Screening wurde mit dem Leitfähigkeitsassay und/oder dem Glutamat-Dehydrogenase gekoppeltem Assay durchge- führt (Kapitel 3.1.2).

Zuerst wurde der Bereich I mutagenisiert. Es wurden circa 7300 Klone selektiert, diese Anzahl sollte mit einer Wahrscheinlichkeit von >99,99% alle möglichen Variante an den Positionen Valin 216 und Alanin 218 beinhalten. Nach der Selektion wurden 14 Klone iden-

62 3 Ergebnisse tifiziert, die auf dem Ammoniummangelmedium ein besseres Wachstum zeigten. Von diesen konnten sieben sequenziert und unaufgereinigt mit dem Leitfähigkeitsassay über- prüft werden. Die verbleibenden sieben Klone konnten nicht in ausreichender Qualität für eine Plasmidisolation zurückgewonnen werden, vermutlich war der betreffende E. coli durch den Stress des Wachstumsassays zu geschädigt. Alle Varianten die sequenziert und gemessen werden konnten, zeigten bei etwa gleicher Expression eine erhöhte Aktivität.

Tabelle 3.5.1: Messung der selektierten und sequenzierten Klone der ersten CAST-Generation im Leitfähigkeitsassay.

Klon Position Position Erhöhung der Aktivität im 216 218 Vergleich zum Wildtyp GTT GCA WT 1,0 Val Ala CTT CAT 1 1,3 Leu His CTT TAT 2 1,3 Leu Tyr CTT AAT 3 1,8 Leu Asn TTT ATT 4 1,8 Phe Ile TTT TAT 5 2,2 Phe Tyr GAT GAT 6 2,6 Asp Asp CTT TTT 7 3,5 Leu Phe

Die fünf besten Varianten (3-7) wurden als Ausgangspunkte für die zweite Generation des CAST-Ansatzes gewählt. Dafür wurden circa 4500 Klone, die im Bereich II mutiert wurden, selektiert. Damit wurden mit 93% Wahrscheinlichkeit alle möglichen Varianten überprüft. Es zeigten etwa 400 Klone verbessertes Wachstum. Parallel dazu wurden die Bereiche III und IV gleichzeitig mutagenisiert, es dienten ebenfalls die fünf besten Varianten aus Generation 1 als Template. Es wurden ~6500 Klone selektiert und 126 zeigten Wachstum. Die Bibliotheksabdeckung war bei der Kombination von zwei Positionen bei weitem nicht erreicht. Die durch den Selektionsassay erhaltenen Klone konnten in diesem Fall nicht direkt quantitativ überprüft werden. Stattdessen wurden sie mit dem GluDH-Screeningassay (Kapitel 3.1.2) weiter überprüft. Allerdings konnte mit dem Screeningassay die Anzahl der Vari-

63 3 Ergebnisse anten nicht weiter eingeschränkt werden, da die Ergebnisse der Screening-Multiplikate nicht kohärent waren. Der CAST-Ansatz wurde an dieser Stelle nicht weiter verfolgt.

3.5.2 Gezielte Erstellung von Mutanten auf Basis der CASTing-Ergebnisse von Bereich I Das CASTing wurde in der zweiten Generation abgebrochen. Durch den Wachstumsassay (Kapitel 3.1.1) konnte zwar eine Vorauswahl getroffen werden, die daraus resultieren Anzahl an möglichen positiven Klonen war allerdings immer noch zu groß, um sie im Leit- fähigkeitsassay einzeln zu untersuchen. Der NADH-gekoppelte Assay lieferte an dieser Stelle keine kohärenten Ergebnisse für die Multiplikate. Jedoch konnte auch aus den Sequenzierungsergebnissen der ersten CAST-Generation ein Schema für die Mutagenese der beiden Positionen abgeleitet werden. An Position 216 traten vermehrt Phenylalanin (2 von 7) und Leucin (4 von 7) auf. An Position 218 traten vermehrt aromatische Aminosäuren auf (3 von 7) (Tabelle 3.5.1). Die entsprechenden Varianten wurden gezielt erstellt, ebenso wie die entsprechenden Einzelmutanten (Tabelle 3.5.2).

Tabelle 3.5.2: Gezielt erstellte Mutanten auf Basis des CAST-Ergebnisses. Fett hervorgehoben sind Mutanten, die der Häufung (Phe und Leu an Position 216, aromatisch an Position 218) entsprechen. Die mit Nummern versehenen Klone sind identisch mit den im CASTing identifizierten.

Klon Position Position 216 218

Val Tyr

Phe Ala

Leu Ala

2 Leu Tyr

5 Phe Tyr

7 Leu Phe

Alle Mutanten wurden als Varianten mit Histidin-Tag erstellt, kultiviert, gereinigt und auf den gleichen Proteingehalt eingestellt; in dieser Form wurden sie mit dem Leitfähigkeit- sassay gemessen (Abbildung 3.6.1). Es zeigte sich, dass keine der erstellten, gereinigten Varianten eine erhöhte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp besaß.

64 3 Ergebnisse

5 ] n i t 4 ä m t

i / v

i l t

o 3 k A m n [ 2

0 WT Val Tyr Phe Ala Leu Ala Leu Tyr Phe Tyr Leu Phe Variante

Abbildung 3.6.1: Ergebnis der Leitfähigkeitsmessung der Mutanten auf Basis des CAST Ansatzes gegenüber NCβPhe.

3.6 Gene shuffling der Carbamoylasen aus Arthrobacter aurescens, Saccharomyces kluyveri und Agrobacterium tumefaciens Ein gene-shuffling drei verschiedener Carbamoylasen wurde durchgeführt und neben der Arthrobacter aurescens Carbamoylase wurden β-Ureidopropionasen aus Saccharomyces kluyveri (SklβUp) und Agrobacterium tumefaciens (βCarAT) zum shuffling gewählt. bCarAT ------ATGACGGCGGGTAA 14 SklbUp ATGTCTAAAGACGTATCTAGTACTATTACTACTGTTTCCGCCAGCCCTGATGGCACCTTA 60 AauHyuC ------AGTGACC-CTGCAGA 14 *** * : * bCarAT AAACT---TGACGGT----CAATGGCGACCGTCTGTGGGACAGTCTGATGGACATGGCGA 67 SklbUp AATCTGCCTGCTGCTGCTCCATTGTCCATCGCTTCTGGGCGTCTTAACCAGACCATCCTC 120 AauHyuC AAGCG--CAAGCGGAGCG-CATTGAGAAAGAGATCCGGGAG-CTCTCCCGGTTCT--CGG 68 ** * :. * : **:** * . * ***. * : . .*: .: * bCarAT AAATCGG---CCCCG------GCATTGC-CGGCGG---CAATAATCGC------102 SklbUp GAAACGGGCTCCCAGTTTGGTGGTGTTGCTCGTTGGGGTCAGGAATCTCATGAATTCGGC 180 AauHyuC CAGAAGG---CCCCG------GTGTTAC------87 *.:.** ***.* * .**.* bCarAT ---CGCACGCTGACGGACGAAGATGCGGAAG--GCCG---CAGCCTG-TTCAAGAGCTGG 153 SklbUp ATGCGCAGGCTCGCAGGCACTGCTTTGGATGGTGCTATGAGAGATTGGTTTACGAATGAG 240 AauHyuC -----CCGGCTGACCTACACTCCAGAGCATGCCGCCGCGCGGGAAACGCTCAT-TGCGGC 141 *. *** .* .*..: .: * *:* ** . .*. : * * :. . bCarAT TGCGAAG-CGGCCGGCCTGACGATGGGCGTCGACCGCATGGGAACCATGTTCGCCACCCG 212 SklbUp TGTGAGT-CGCTCGGCTGTAAAGTTAAGGTCGACAAAATTGGGAACATGTTTGCTGTCTA 299 AauHyuC TATGAAAGCGGCCGCCTTGAGCGTTCGTGAAGACGCACTCGGAAACATCATCGGCCGACG 201 *. **. ** ** * * .* . *:.*** ..* **.*.*** :* * . . bCarAT CCCCGGCGAGGATCCGGACGCGCTGCCGGTCTATATCGGCAGCCATCTCGACACCCAGCC 272

65 3 Ergebnisse

SklbUp TCCCGGTAAG-AACGG--CGGTAAGCCTACTGCTACTGGCTCCCATCTAGACACTCAACC 356 AauHyuC TGAAGGCACTGATCCGGAGCTTCCTGCGATCGCGGTCGGTTCACACTTCGATTCTGTCCG 261 ..** .. *:* * . * . . . ** : .** *.** :* : * bCarAT GACCGGCGGCAAGTTCGATGGCGTGCTTGGTGTGCTGGCTGGACTGGAAGTCGTCCGCAG 332 SklbUp CGAAGCTGGTAAGTATGATGGTATCCTCGGAGTTCTTGCAGGTCTTGAGGTCTTGAGGA- 415 AauHyuC AAACGGCGGGATGTTTGATGGCACTGCAGGCGTGGTGTGCGCCCTTGAGGCTGCCCGGGT 321 ...* ** *:**: ***** . ** ** * * ** **.* .* . bCarAT CCTGAA--CGATCTCAACATAAAGACGAAACACCCTATTGT-CGTCACCAACTGGTCCAA 389 SklbUp CTTTCA--AGGACAATAACTACGTTCCTAACTATGACGTGTGTGTTGTAGTTTGGTTTAA 473 AauHyuC GATGCTGGAGAACGGCTACGTGAATCGGCATCCATTTGAGTTCATCGCGATCGTG---GA 378 * .: .*.:* :.. : . :* .* . : :** .* . .: * .* bCarAT TGAGGAAGGCGCGCGCTTTGCCCCGGCCATGCTGGCCTCCGGCGTCT--TCGCCGGCATT 447 SklbUp CGAAGAAGGTGCACGTTTTGCTCGTTCCTGTACTGGTTCTAGTGTCTGGTCACACGACTT 533 AauHyuC GGAGGAAGGGGCCCGCTTCAGCAGTGGCATGTTGGGCGGCCGGGCCA--TTGCAGGGTTG 436 **.***** ** ** ** . . *: * * * *: * .*. * * bCarAT CACGATCTCGATTACGCCTATAGCCGCACCGATACCG--ACGGCAAGACC-TATGGCG-- 502 SklbUp GTC--TCTTGAAGAGGCCTATGGTTTGATGTCTGTCGGTGAGGACAAGCC-AGAATCAGT 590 AauHyuC GTCG--CCGACAGGGAACTGGACTCTTTGGTTGATGAGGATGGAGTGTCCGTTAGGCAGG 494 :* * ..: . ..**. . : . . . **. :. ** : :. *. bCarAT --ACGAG---CTGAAGCGCATCGGCTGGCTGGGCGAAG-AAGAGGTGGGCGCCCGCAGGA 556 SklbUp TTACGATTCTCTTAAGAATATCGGTTATATTGGTGATACTCCAGCTTCTTACAAGGAGAA 650 AauHyuC CGGCTACTGCCTTCGGCTTGAAGCCGGGCGAACTGCAG--GCTGCAGCCCGCTCCGCGGC 552 .* * ** ..*. .:.* . . . *.:. :* : .* . .*.. bCarAT TGCAT-----GCCTATTTCGAATATCATATCGAGCAGGGGCCGATCCTCGAGGCCGAAGG 611 SklbUp TGAAATCGACGCTCATTTCGAATTGCACATCGAACAGGGACCAATCCTCGAAGACGAAAA 710 AauHyuC GGACCTGCGTGCTTTTATCGAACTACACATTGAACAAGGACCGATCCTCGAGCAGGAGCA 612 *.. ** :*:***** : ** ** **.**.**.**.********. . **. . bCarAT CAAGCAGATCGGCGTCGTTACCCATGGTCAGGGTCTGTGGTGGCTGGAAGTGACGCTGAC 671 SklbUp CAAGGCGATCGGTATTGTTACAGGTGTTCAGGCCTACAACTGGCAAAAGGTTACTGTGCA 770 AauHyuC AATAGAGATCGGAGTTGTAACCTCCATCGTTGGCGTTCGCGCATTGCGGGTTGCCGTCAA 672 .*:. .****** .* **:**. . : * : . . :. ..** .* * .. bCarAT CGGCAAGGAAGCCCATACCGGCTCGACGCCGATGGCGATGCGCGTCAATGCCGGCCTTG- 730 SklbUp TGGTGTCGGTGCCCATGCCGGTACTACCCCG-TGGAGATTAAG---AAAGGATGCTTTG- 825 AauHyuC AGGCAGAAGCGACCACGCCGGCACAACCCCCATGCACCTGCGC----CAGGATGCGCTGG 728 ** . .. *.*** .**** :* ** ** ** . .* .. .:* . ** ** bCarAT CCGCCGCCCGCATCCTCGAAAAGGTTCAGGAAGTG-GCGATGGCCCACCAGCCGG--GTG 787 SklbUp TTGATGTCT---TCAAAGATGATCGTCGCGGCGAGCGAGATTGCTCAACGTCACA--ACG 880 AauHyuC TACCCGCCGCTCTCATGGTGAGGGAGGTCAACCGGTTCGTCAACGAGATCGCCGATGGCA 788 . * * **.: *: .. ... * .*: .* ... *. . . . bCarAT CCGTTGCCGGCGTCGGCCAGATGATCTTCACACCCAATTCGCGTAACGTGCTGCCCGGCA 847 SklbUp GTTTGTTCACCTGTGGTATTATTGATGCTAAGCCTTACTCGGTCAACATCATTCCAGGTG 940 AauHyuC CAGTGGCTACCGTTGGCCACCTCACAGTGGCCCCCGGTGGAGGCAACCAGGTCCCGGGGG 848 * . * ** .: .* . .. ** . . *** : * ** ** . bCarAT AGGTGGTTTTCACCATCGATCTTCGAACCCCTTCGCAGGCAAAGCT--CGACAACATGCG 905 SklbUp AAGTTTCCTTCACTTTGGATTTCAGACATCCATCAGACGATGTCCTGGCAACGATGTTAA 1000 AauHyuC AGGTGGACTTCACACTGGACCTGCGTTCTCCGCATGAGGAGTCGCT--CCGCGTGCTGAT 906 *.** ***** * ** * .*: . ** . * *. ** * .*.: * . bCarAT CGCCATCTTCGAGCGCGAGGTGCCTGTTATCGCCGAAGAACTCGGCGTCGGCTGCTCGAT 965 SklbUp AGGAAGCTGC-TGCGGAGTTTGACAG-ATTAATCAAAATTAACGACGGTGG-TGCTTTGT 1057 AauHyuC CGACCGCATCTCGGTCATGGTCGGCGAGGTCGCCTCCCAGGCCGGT-GTGGCTGCCGATG 965 .* .. *: * * . * * *.. * .. : **. ** *** bCarAT CGAAGCCATCGG--CCATTTCGA------TCCCGTCACCTTCGATCCGGTGCTGGTCG 1015 SklbUp CGTACGAATCTGAAACTTTACAAGTGTCTCCTGCTGTCAACTTCCATGAGGTTTGCATCG 1117 AauHyuC TGGATGAATTTTT-CAATCTCAGCCCGGTGCAGCTGGCTCCTACCAT--GGTGGACGCCG 1022

66 3 Ergebnisse

* * .** ..:* :*.. : * * *:.**:* ** *** . ** bCarAT GGCGCGTG---CGCTCTGCCGCCGAAAGACTGGGTTACACCCACATGG---ACATCATCT 1069 SklbUp AATGCGTTTCTAGATCTGCCTTTGCTCAATTTAAGAAGGACCAAGTTAGACAAATCTGGT 1177 AauHyuC TTCGCGAAG------CGGCCTCGGCCT---TGCAGTTCACACACCGGG---ATATCAGCA 1070 ***: * *** *. * . :: ...**. . * ***: : bCarAT CCGGCGCCGGCCACGATGCCTGCTGGACGGCAAGGGTCGCTCCATCAACCATGATCTTTT 1129 SklbUp CCGGTGCTGGTCACGATTCTTGCCAAACGGCACCTCATGTTCCTACCTCGATGATCTTCA 1237 AauHyuC GTGGGGCGGGCCACGACTCGATGTTCATCGCCCAGGTCACGGACGTCGGAATGGTTTTCG 1130 ** ** ** ***** * : * **.. : . . . ***.* ** bCarAT GCCCCTGCGTGGGTGGGCTTTCCCATAACGAGGCGGAAGAAATTTCGCCGGAATGGGCCG 1189 SklbUp TTCCTTCCAAGGATGGTTTGTCCCACAACTACTATGAGTATTCATCTCCAGAAGAGATTG 1297 AauHyuC TTCCAAGCCGTGCTGGCCGGAGCCACGTTCCCGAAGAATGGACCGATTTCGATGACCTTC 1190 ** : * * *** : *** .: . . **. . : . **: . bCarAT CCGCCGGCTGCGACGTGCTGCTGCATGCGGTG------CTGGAGACTGCGGAG-----A 1237 SklbUp AAAACGGTTTCAAAGTCCTGTTGCAAGCCATCATCAACTATGACAACTACAGAGTGATTA 1357 AauHyuC GCAAAGGAACTGAGGTTGTCCTCCGGGTAATG------AAGGCACTTGACCGG------1237 ....** : .* ** * * *. * .* .:*.... *.. .* bCarAT TCGTGCAATGA 1248 SklbUp GAGGGCACTGA 1368 AauHyuC ------TAAGA 1242 :.:** Abbildung 3.6.2: Sequenzalignment der drei zum gene shuffling ausgewählten Gene; die konservierten Bereiche, die jeweils als Primerbindestellen für die Amplifikation der einzelnen Segmente dienen, sind blau markiert.

Die drei Enzyme wiesen eine Sequenzübereinstimmung von etwa 42-48% auf Genebene und zwischen 27% und 37% auf Proteinebene auf (Abbildung 3.6.2). Die genetische Über- einstimmung war damit zu gering für ein randomisiertes, homologiebasiertes gene shuffling mittels DNase-Verdau nach Stemmer et al.[133]. Es wurde die alternative Methode des degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS) gewählt[175]. Die Gene wurden dafür in sieben Abschnitte zwischen 135 bp und 377 bp unterteilt, so dass eine Bibliothek von 2187 Varianten möglich ist. Um die Hybriden näher an dem parentalen AauHyuC-Gen zu halten, wurde dies im 2,6 fachen Überschuss eingesetzt. Dies sollte im Mittel zu einer Verteilung von vier parentalen und drei β-Ureidopropionase Abschnitten führen. Unter diesem Aspekt würde die Bibliotheksgröße nur bei 280 Varianten liegen. Betrachtet man auch die Hybride mit drei und fünf parentalen Abschnitten sind 780 Varianten möglich. Die Primer für die DOGS Methode sind speziell für die folgende homologe Rekombination erstellt, in der Mitte weisen die Primer eine 16 bp lange nicht degenerierte Kernsequenz auf, sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende wird diese durch eine 6 bp lange, degenerierte Consensussequenz flankiert.

67 3 Ergebnisse

Segment 1 2 3 4 Marker 5 6 7 Größe 272 bp 169 bp 228 bp 135 bp 185 bp 257 bp 178 bp

300 bp

200 bp

100 bp

Abbildung 3.6.3: Agarosegel der Amplifikation aller Segmente der AauHyuC. Durch die degenerierten Primer wurden meist verschiedene Abschnitten amplifiziert, die gewünschten Segmente waren durch die Größe im low-range Marker Bereich und die Intensität eindeutig zuordbar.

Die Abschnitte wurden einzeln amplifiziert und mittels Agarosegel auf die korrekte Länge überprüft. Es zeigte sich, dass in allen Fällen auch weitere unerwünschte Abschnitte amplifiziert wurden (Abbildung 3.6.3), über die Intensität und Größe konnten die gewünschten Amplifikate ausgewählt und aus dem Agarosegel aufgereinigt werden (Kapitel 6.9.1.6). Der Gehalt der Segmente wurde bestimmt, anschließend wurden diese in definitiven Verhältnissen zusammengegeben und rekombiniert. Die rekombinierten Gene wurden kloniert und in E. coli transformiert. Die Sequenzierung willkürlich herausgegriffener Klone zeigte die Funktionalität der Methode, es konnten aus vier Klonen zwei mit jeweils zwei Segmenten der β-Ureidopropionasen und einer mit jeweils einem β-Ureidopropionasen- Segment erhalten werden, ein Klon war AauHyuC Wildtyp. Im Anschluss wurde eine Bibliothek von 2000 Klonen mit dem Wachstumsassay überprüft und 80 Klone mit verbes- sertem Wachstum identifiziert. Diese wurden weiter mit dem NADH-Assay überprüft, zeigten dort jedoch keine eindeutigen Ergebnisse. Fünf, der im NADH-Assay am auffäl- ligsten Klone, wurden dennoch sequenziert. Es zeigte sich, dass vier der fünf Klone ein Gen mit einer Stoppcodon-Mutation innerhalb des Gens trugen, das verbleibende Gen war ein AauHyuC Wildtyp. Ebenso wurde eine, nicht durch den Wachstumsassay vorselektierte, vollständige Biblio- thek mit dem NADH-gekoppelten Assay auf der Roboterplattform gescreent. Hier konnten keine gegenüber NCβPhe aktiven Varianten identifiziert werden.

68 3 Ergebnisse

3.7 Weitere Untersuchungen an der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens Es wurden weitere Versuche mit der Carbamoylase durchgeführt, mit dem Ziel die Aufrei- nigung des Enzyms soweit zu optimieren, dass eine Strukturaufklärung mittels Röntgen- kristallografie möglich wäre.

3.7.1 Strukturaufklärung der AauHyuC Mittels Röntgenkristallografie wurde die Struktur der L-N-Carbamoylase aus A. aurescens durch Paul Waack aus der Arbeitsgruppe Hinrichs (Institut für Biochemie, Universität Greifswald) teilweise aufgeklärt. Die Carbamoylase wurde zunächst mittels Affinitätschro- matographie über ihren Histidin-Tag aufgereinigt, im Anschluss daran auf einer Superdex 200 Säule über Gelfiltration von den verbleibenden Proteinverunreinigungen getrennt (Abbildung 3.7.5).

69 3 Ergebnisse

70 3 Ergebnisse

200 kDa 200 kDa 119 kDa 119 kDa 66 kDa 66 kDa

43 kDa 43 kDa

29 kDa 29 kDa

20 kDa 20 kDa

Abbildung 3.7.1: Aufreinigung der L-Carbamoylase (grüner Kasten), mittels Histidin-Tag (links) und anschließender Gelfiltration (rechts). Hauptsächliche Verunreinigungen finden sich bei etwa 66 kDa.

Die Gelfiltration unter Verwendung von Tris-HCl-Puffer zeigte zunächst einen sehr breiten, flachen Peak, der auf ein undefiniertes Multimerisierungsstadium hinweist und daher für die Kristallisation ungeeignet ist (Abbildung 3.7.2).

Abbildung 3.7.2: Reinigung der AauHyuC mittels Superdex 200 Gelfiltration unter Verwendung von Tris-HCl-Puffer. Blau: Absorption bei 280 nm, dunkelrot: Leifähigkeit in %.

Durch Verwendung von BES-BisTris-Puffer konnte ein deutlich schärferer Peak erreicht werden, der so eine homogenere Spezies von AauHyuC ermöglicht, sowie eine bessere Abtrennung der verbleibenden Verunreinigungen (Abbildung 3.7.3).

71 3 Ergebnisse

Abbildung 3.7.3: Reinigung der AauHyuC mittels Superdex 200 Gelfiltration unter Verwendung von BES-BisTris-Puffer. Blau: Absorption bei 280 nm, dunkelrot: Leifähigkeit in %.

Das so erhaltene Protein wurden mittels hanging drop vapour diffusion zur Kristallisation gebracht. Die Bedingungen hierfür waren 100 mM MES (pH 6,5) und 1,6 M MgSO4 bei einer Proteinkonzentration von 20 mg/ml. Die Kristalle wurden am Synchroton vermessen, führten allerdings nur zu Refraktionsdaten der katalytischen Domäne, die Dimerisierungs- domäne konnte nicht aufgelöst werden (Kapitel 3.7.3). Zur Stabilisierung der Kristallisation wurde Tryptophan (als Produkt der natürlichen Enzymreaktion) in äquimolarer Konzentration zum Kristallisationsansatz gegeben, dies führte jedoch zu keinem besseren Ergebnis. Ebenso wurde die inaktive Mutante E127D zusammen mit N-Carbamoyl-α-Tryptophan in äquimolaren Mengen eingesetzt. Diese konnte jedoch nicht zur Kristallisation gebracht werden.

72 3 Ergebnisse

3.7.2 Konstruktion einer Carbamoylase-Variante mit zwei entfernbaren Affinitätstags

Abbildung 3.7.4: In silico Klonierung des hyuC-Gens aus A. aurescens in pET25b.

Das AauHyuC-Gen wurde dafür in den pET52b Vektor kloniert, der einen N-terminalen Strep-Tag und einen C-terminalen Histidin-Tag ermöglicht (Abbildung 3.7.4). Das so erhaltene Konstrukt ließ sich schlechter exprimieren als die im Vektor pAW 178 vorliegende Carbamoylase, die ausschließlich den Histidin-Tag aufweist. Durch Verringerung der Kulti- vierungstemperatur von 30°C auf 20°C konnte die Bildung von inclusion bodies verringert werden. Gleichzeitig musste die Expressionsdauer verlängert werden, um eine für die Kris- tallisation ausreichenden Menge AauHyuC zu erhalten. Dafür wurde die Expression über einen Zeitraum von 22 h ab Induktion überwacht und neben der OD600nm die Volumen- und spezifische Aktivität (bezogen auf Gesamtprotein) mittels des Leitfähigkeitsassays bestimmt (Abbildung 3.7.5).

73 3 Ergebnisse

Es zeigte sich, dass die optimale Expressionszeit sowohl für die Volumen- als auch für die spezifische Aktivität bei 20°C 15 h beträgt.

9,00

8,00

] 7,00 g ] m l / l 6,00 a m t / l a a k t 5,00

0 µkatal/ml µ a [ 0

k t 6 µ

ä µkatal/mg [ t

4,00 D i t v ä i O t t OD i k v 3,00 i A t

. k z A

e 2,00 p s 1,00

0,00 0 3 6 9 12 15 22 Zeit [h]

Abbildung 3.7.5: Übersicht über eine Kultivierung von AauhyuC bei 20°C. Dunkelgrau:

Volumenaktivität, hellgrau: spezifische Aktivität, schwarze Linie, OD600.

Mit diesen Voraussetzungen wurde eine 500 ml Kultivierung durchgeführt und anschlie- ßend unter Nutzung von beiden Affinitätstags aufgereinigt (Abbildung 3.7.6). Zunächst wurde eine Histidin-Tag basierte Aufreinigung durchgeführt, die dann von einer Strep-Tag basierten Aufreinigung gefolgt wurde. Wie im Gel zu erkennen, ist in der Strep-Tag Eluti- onsfraktion ein sehr reines Protein erhalten worden. Mit diesem Konstrukt konnten aus 500 ml circa 20 mg gereinigtes Protein erhalten werden. Trotz der hohen Reinheit konnten mit diesem Konstrukt keine weiteren Kristalle erhalten werden, so dass zur weiteren Optimierung die Tags nach der Aufreinigung entfernt werden sollten.

74 3 Ergebnisse

200 kDa

119 kDa

66 kDa

43 kDa

29 kDa

20 kDa

ZE HD HW HE SD SE M

Abbildung 3.7.6: Übersicht über die vollständige Aufreinigung der AauHyuC mittels His- und Strep-Tag Affinitätschromatografie. ZE: Zellextrakt, HD: Durchfluss der Histidin-Tag Aufreinigung, HW: Waschfraktion der Histidin-Tag Aufreinigung, HE: Elutionsfraktion der Histidin-Tag Aufreinigung, SD: Durchfluss der Strep-Tag Aufreinigung, SE: Elutionsfraktion der Strep-Tag Aufreinigung, M: Marker.

Zunächst wurde mittels QuikChangeTM die vorhandene HRV-Protease-Schnittstelle durch eine TEV-Protease Schnittstelle ersetzt. Die Carbamoylase wurde anschließend wie gewohnt exprimiert und mittels beider Affinitätstags gereinigt. Das so erhaltene reine Protein wurde dann mit TEV-Protease und Thrombin parallel verdaut. Auf dem SDS-Gel konnte eine Doppelbande an der Position der Carbamoylase beobachtet werden, deren oberer Anteil mit zunehmender Konzentration an zugesetzten Proteasen abnahm (Abbil- dung 3.7.7). Die so erhaltene Tag-freie Carbamoylase wurde noch über eine Gelfiltration von den Proteasen getrennt und zu einer Konzentration von 7 mg/ml aufkonzentriert. Mit der so erhaltenen reinen, Tag-freien Carbamoylase wurde ein Kristallisationsscreening angesetzt. Jedoch konnten bislang auf diese Weise keine Kristalle erhalten werden.

75 3 Ergebnisse

200 kDa

119 kDa

66 kDa

43 kDa

29 kDa unverdaute Carbamoylase

20 kDa

verdaute Carbamoylase 1 2 3 4 14,3 kDa

Abbildung 3.7.7: Überprüfung des Proteaseverdaus mittels SDS-Gel. 1: unverdaute L-N-Carbamoylase 2-4: Verdau nach 4 d mit zunehmender Konzentration an TEV (1:100, 1:50, 1:20) und Thrombin (30, 60, 90 U/mg)

3.7.3 Kristallstruktur der katalytischen Domäne von AauHyuC Wie bereits vorhergehend beschrieben konnte die Struktur der katalytische Domäne der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens mittels Röntgenkristallografie aufgeklärt werden (Kapitel 3.7.1). Die kristallografischen Daten waren wie folgt:

Tabelle 3.7.1: Daten der Einheitszelle der katalytischen Domäne von AauHyuC.

Länge [Å] Winkel [°] a = 64,60 α = 90.00 b = 90,41 β = 90.00 c = 102,73 γ = 90.00 Raumgruppe: I 222 (23) Auflösung: 1,59 Å R Value: 0.179 Free R Value: 0.209 Der Datensatz enthält die Reste Lys 5 - Gly 215 und Leu 333 – Ile 414.

76 3 Ergebnisse

Die erhaltene Struktur wurde mit dem zuvor erstellten Homologiemodell verglichen. Es zeigte sich insgesamt eine gute Übereinstimmung beider Strukturen. In Abbildung 3.7.8 ist exemplarisch das Alignment der katalytisch wichtigen Metallbindestelle gezeigt. Hier erkennt man deutlich, dass nur kleinere Abweichungen zwischen den Strukturen vorliegen.

Abbildung 3.7.8: Alignment der Metallbindestelle der AauHyuC-Kristallstruktur (orange) und des Homologiemodells (blau).

Insgesamt zeigt der Vergleich eine root mean sqaure deviation (RMSD) von 1.198 Å über 287 alignbare Reste. Der für die Mutagenese interessante Rest Valin 216 und das für die Katalyse bedeutsame Arginin 291 waren nicht Teil der gelösten Kristallstruktur. Um dennoch den Einfluss dieser beiden Aminosäuren darstellen zu können, wurden ein Hybridmodell mit Yasara erstellt, welches die katalytische Domäne der Kristallstruktur, sowie die Dimerisierungsdomäne des Homologiemodells vereinte (Abbildung 3.7.9).

77 3 Ergebnisse

Abbildung 3.7.9: Hybridmodell der Carbamoylase, bestehend aus der katalytischen Domäne aus der Kristallstruktur (orange) und der Dimerisierungsdomäne des Homologiemodells (blau). Die in dieser Arbeit relevanten Reste Val 216 und Arg 291 (pink) sind Teil des Homologiemodells.

Das aktive Zentrum wird zum großen Teil von der katalytischen Domäne gestellt, die das wasseraktivierende Bimetallzentrum enthält. Arginin 291 liegt in der Dimerisierungsdo- mäne, allerdings ist der Rest nur etwa 13-14 Å vom Bimetallzentrum entfernt. Das Arginin spielt eine wichtige Rolle bei der Substratbindung und interagiert mit der Säuregruppe des Substrats. Valin 216 liegt bereits etwa 15-16 Å vom Bimetallzentrum entfernt, allerdings direkt benachbart zu Arginin 291; neben einem direkten Einfluss auf das Substrat könnte auch ein Einfluss auf das Arginin vorliegen. Dieser würde sich dann allerdings völlig auf die Homologiemodell-Daten beschränken und wäre mit der gut aufgelösten Kristallstruktur nicht zu erklären. Mit dem erhaltenen Hybridmodell wurden Docking-Experimente durchgeführt bei denen sowohl die Wildtyp-Variante, als auch die V216A Mutante genutzt wurden. Die erhaltenen Docking-Ergebnisse wurden genutzt, um die erhöhte katalytisch Effizienz der V216A Mutante zu erklären (Kapitel 3.10).

3.8 Mutagenese der β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri Neben der AauHyuC wurde auch die β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri zur Mutagenese genutzt. Vorteile waren hier, dass die Struktur des Enzyms sowohl mit

78 3 Ergebnisse

Substrat (inaktive Mutante E159A; pdb-code: 2v8h) als auch mit Produkt (pdb-code: 2v8g) im aktiven Zentrum bereits aufgeklärt waren.

79 3 Ergebnisse

Abbildung 3.8.1: Aktives Zentrum der β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri (SklβUp) mit Substrat NCβAla (links) und Produkt β-Alanin (rechts).

3.8.1 Arbeiten in silico Das Enzym wurde in silico zunächst für ein Docking-Experiment vorbereitet, um mögliche Positionierungen für NCβPhe im aktiven Zentrum zu detektieren. In der Struktur mit enthaltendem Substrat (pdb-code: 2v8h) wurde zunächst wieder der Wildtyp hergestellt, indem das Alanin 159 durch ein Glutamat ersetzt wurde. Anschließend wurde alle Aminosäurereste, bis auf den Rest 159, und das gebundene NCβAla fixiert. Im Anschluss wurde eine Energieminimierung durchgeführt. Aus der so erhaltenen Struktur und aus der Struktur mit gebundenem Produkt wurde der gebundene Ligand entfernt. Damit waren die Strukturen geeignete Rezeptoren für ein Docking-Experiment. In beide Strukturen wurde das gewünschte Substrat NCβPhe gedockt, um so die Amino- säurereste zu erkennen, die die Anbindung einer carbamoylierten β-Aminosäure mit größerer Seitenkette behindern. In den Docking-Experimenten konnte kein Cluster erhalten werden, bei dem NCβPhe in einem produktiven Zustand, also in ähnlicher Weise wie NCβAla gebunden wurde. Dieses Ergebnis stützt zwar auch in silico die Tatsache, dass keine größeren Aminosäurederivate als NCβAla umgesetzt werden, erlaubt aber auch keine Aussage über die Mutationen, die eine Anbindung und den Umsatz von größeren Substraten, wie beispielsweise NCβPhe erlauben würden. Als Alternativansatz wurde hier die Tatsache genutzt, dass bereits eine Struktur mit gebundenem Substrat und Produkt vorliegt, das im produktiven Zustand vorliegt.

80 3 Ergebnisse

Ausgehend von dem Wildtyp-Enzym mit β-Alanin im aktiven Zentrum wurde das gewünschte Substrat in der korrekten Orientierung in das aktive Zentrum gebaut. Durch das vorliegende Rückgrat, sowie den Phenylring im Substrat NCβPhe, waren nicht viele undefinierte Freiheitsgrade vorhanden, so dass das Verfahren durchaus korrekte Ergeb- nisse liefern sollte. Das so erstellte Substrat wurde anschließend durch eine Energiemini- mierung in das aktive Zentrum angepasst, dabei wurde das Protein insgesamt fixiert, jedoch alle Reste im Abstand < 5 Å vom chiralen Kohlenstoffatom des Substrates flexibel gelassen. Während der Energieminimierung zeigte sich, dass vor allem die Reste Glutamat 159, Serin 167 und Cystein 168 den Phenylring des neuen Substrates blockieren (Abbildung 3.8.2). Glutamat 159 ist allerdings wichtig für die Bindung und Positionierung des Zinkatoms, so dass es nicht mutiert werden sollte.

Abbildung 3.8.2: SklβUp mit NCβPhe (Orange) im aktiven Zentrum. In Stäbchenform dargestellt sind die Aminosäuren Glutamat 159 (im Hintergrund), sowie Serin 167 und Cystein 168. Deutlich zu erkennen ist die gegenseitige sterische Hinderung zwischen dem Phenylring und Serin 167 sowie Cystein 168.

Nach der visuellen Inspektion wurden die Aminosäuren Serin 167 und Cystein 168 zur Mutation ausgewählt. Das Ziel musste eine Vergrößerung des aktiven Zentrums sein. Sowohl Serin als auch Cystein zählen bereits zu den eher kleinen Aminosäuren. Um die Vergrößerung des aktiven Zentrums zu erreichen, wurden in silico zunächst Alanin und Glycin als auszutauschende Aminosäuren gewählt. Die Mutanten wurden aus dem Wildtyp mit gebundenem NCβPhe erstellt und erneut eine Energieminimierung wie oben beschrieben durchgeführt, anschließend wurde in Yasara unter Verwendung des Yasara 2 force fields[176] die Bindungsenergie des Enzyms zum neuen Substrat berechnet (Tabelle 3.8.1).

81 3 Ergebnisse

Tabelle 3.8.1: Errechnete Bindungsenergien für die SklβUp-Mutanten zum Substrat NCβPhe. Positivere Bindungsenergien bedeuten eine bessere Bindung.

Name Position 167 Position 168 Bindungsenergie Differenz zum wt [kJ/mol] [ΔkJ/mol] wt Serin Cystein 1341,53 0 GC Glycin Cystein 1356,36 14,83 SG Serin Glycin 1392,80 51,27 GG Glycin Glycin 1520,27 178,74 GA Glycin Alanin 1389,78 48,25 AC Alanin Cystein 1401,00 59,47 SA Serin Alanin 1373,32 31,79 AA Alanin Alanin 1434,46 92,93 AG Alanin Glycin 1453,92 112,39

Insgesamt zeigten alle in silico durchgeführten Mutationen den gewünschten Effekt, bei allen gewählten Mutationen konnte eine erhöhte Bindungsenergie erreicht werden. Zudem zeigten die Doppelmutanten mit Alanin (AA, AG und GA) einen additiven Effekt, die Glycin- Glycin Doppelmutante sogar einen kooperativen Effekt. Abbildung 3.8.3 zeigt exemplarisch die Glycin-Glycin Doppelmutante in der die Entspannung des Phenylrings deutlich zu erkennen ist. Zur in vitro Mutagenese wurde Glycin für beide Positionen als zu mutierende Aminosäure ausgewählt. Zwar war die Einzelmutante S167G weniger stark als die entsprechende Alanin Mutante, allerdings konnte nur bei Glycin ein kooperativer Effekt der beiden Einzel- mutationen beobachtet werden, somit wurde diese Mutation insgesamt als stärker betrachtet.

82 3 Ergebnisse

Abbildung 3.8.3: SklβUp GG-Doppelmutante mit NCβPhe (Orange) im aktiven Zentrum. In Stäbchenform dargestellt sind die Aminosäuren Glutamat 159 (im Hintergrund), sowie Glycin 167 und Glycin 168.

3.8.2 Arbeiten in vitro Es wurden mittels QuikChangeTM sowohl die beiden einzelnen Glycin-Mutanten S167G und C168G, als auch die Doppelmutante erstellt. Die Mutanten wurden exprimiert und mittels Histidin-Tag aufgereinigt, anschließend wurden sie mit dem GluDH-gekoppelten Assay (Kapitel 6.9.3.1) gemessen. Bei den im Assay genutzten niedrigen Substratkonzentra- tionen von 2 mM zeigten alle Mutanten eine erhöhte Aktivität, bis zu vierfach erhöht für die Einzelmutanten, etwa doppelt so hoch für die Doppelmutante. Zudem wurden mit den Mutanten Biokatalysen angesetzt (Substratkonzentration 20 mM) und über 2 Tage Proben entnommen (letzte Probennahme nach 46 h). Die Biokatalysen wurden mit der HPLC ausgewertet (Kapitel 6.9.3.4). Der Umsatz liegt bei circa 3 mM (15%) für den Wildtyp nach 46 h, die Mutante S167G zeigt etwa 0,04 mM Umsatz (0,2%), die anderen Mutanten sind unterhalb der Nachweisgrenze. Die Aktivität des Wildtyps liegt damit bei circa 1,10 nmol/min * mg und ist damit 2-3 mal höher bei zehnfach höherer Substratkonzentra- tion, die Mutante S167G hat nur etwa 0,002 nmol/min pro mg Protein und ist damit sehr viel weniger aktiv.

3.9 Rationales Design von Hydantoinasen zur Synthese von α-,α-disubstituierten Aminosäuren Für diese Arbeit wurde primär die D-Hydantoinase aus Ochrobactrum sp. G21 verwendet. Diese zeigte in Vorversuchen die beste Expression und konnte in guter Reinheit und Ausbeute erhalten werden.

83 3 Ergebnisse

3.9.1 Vorarbeiten in silico Die D-Hydantoinase Ochrobactrum sp. G21 zeigt 47% Sequenzidentität mit der D-Hydan- toinase aus Bacillus sp. Ar9.[177] Drei Matrizen wurden für die Erstellung des Homologiemodells der D-Hydantoinase verwendet. Die Matrizen waren ausschließlich Dihydropyrimidinasen aus folgenden Orga- nismen: Sinorhizobium meliloti (pdb Code: 3DC8-B), Homo sapiens (pdb Code: 2VR2-A), Dictyostelium discoideum (pdb Code: 2FTW-A). Die so erhaltene Struktur, ein Tetramer, wies, wie zu erwarten, in jedem Monomer ein Bimetallzentrum auf. Mit dieser Struktur wurden die weiteren Versuche durchgeführt. Das Docking des Modellsubstrats Methyl-Phenyl-Hydantoin (MPH) diente als Vorarbeit zur Identifikation von Aminosäureresten, die die von Katalyse von 5′,5′-disubtituierten Hydan- toinen behindern. Es wurde wie in Kapitel 6.9.5.3 beschrieben vorgegangen. Dabei wurde das Methyl-Phenyl-Hydantoin (MPH) in das aktive Zentrum der Ochrobactrum Hydanto- inase gedockt. Mit Hilfe der Wildtyp-Substrate Benzylhydantoin (BnH) und Dihydrouracil (DHU), die ebenso wie Wasser in die aktiven Zentren gedockt und anschließend aligned wurden, konnte die richtige Positionierung des Hydantoinrings für die Hydrolyse und somit die relevanten Docking-Cluster bestimmt werden. So wurden die Aminosäurereste identifiziert, die vermutlich an der Bindung des MPH beteiligt sind. Weiterhin wurde, als Parallelansatz zum Docking-Versuch eines disubstituierten Hydan- toins, die Struktur des im aktiven Zentrum gedockten, 5′-monosubstituierten Benzylhy- dantoins zu dem 5′,5′-disubstituierten Zielsubstrat MPH geändert. Dazu wurde zunächst der Hydantoin-Ring fixiert, und nur die beiden 5′-Reste und das Kohlenstoffatom an der 5′-Position wurden relaxed. Anschließend wurde die Energie des MPH insgesamt mini- miert. Die Abbildung 3.9.1 zeigt das Ergebnis dieses Ansatzes.

84 3 Ergebnisse

Abbildung 3.9.1: BnH wurde in das aktive Zentrum der Hydantoinase aus Ochrobactrum (blau) gedockt, der Hydantoin-Ring fixiert und zu MPH (grün) modifiziert und relaxed. Mit Hilfe der van-der-Waals-Radien (hellgrüne Oberfläche) können Reste, die die Katalyse behindern identifiziert werden, diese sind in orange dargestellt.

Durch die in silico Analyse wurden sieben Aminosäurereste bestimmt, die die Anbindung von MPH, und damit die Katalyse, behindern. An diesen sieben Aminosäurepositionen, Phe63, Leu92, Lys146, Phe148, Tyr151, Leu155, His179, wurden in silico Sättigungsmuta- genesen durchgeführt und die Bindungsenergien mit Yasara berechnet. Anschließend wurden jeweils Aminosäuren für jede Position ausgewählt, um diese Mutationen in vitro durchzuführen. Es gab zwei Entscheidungskriterien für die gewählte Aminosäure: Erstens wurden höhere Bindungsenergien bevorzugt. Zweitens wurden im Fall von ähnli- chen oder geringfügig kleineren Bindungsenergien für unterschiedliche Substitutionsmu- tanten, der Austausch zur kleineren Aminosäure präferiert. So sollte die Bindungstasche vergrößert und somit mehr Platz im aktiven Zentrum für den zweiten Rest an der 5′-Posi- tion geschaffen werden. Letztlich wurden aus den in silico Vorarbeiten 12 Einzelmutanten, vier Doppelmutanten und eine Vierfachmutante für die in vitro Mutagenese ausgewählt (Tabelle 3.9.1).

85 3 Ergebnisse

Tabelle 3.9.1: In die D-Hydantoinase aus Ochrobactrum sp. eingeführten Mutationen.

Einzelmutanten Doppelmutanten Vierfachmutanten F63S L155A K146A/F148A K146A/F148A/Y151A/L155A

F148V K146A K146C/F148V F63V L155T F148A/Y151A Y151A K146C F148V/Y151G L92G H179A F148A H179G

3.9.2 Experimentelle Arbeiten an der D-Hydantoinase aus Ochrobactrum sp. Die ausgewählten Mutanten wurden mittels QuikChangeTM eingeführt. Die Mutanten wurden im 400 ml Maßstab kultiviert (Kapitel 6.9.2.1) und anschließend mittels StrepTag am ÄKTA Purifier aufgereinigt (Kapitel 6.9.2.6). Hierbei konnte festgestellt werden, dass sich alle mutierten Hydantoinasen exprimieren lassen, wobei der Grad der Expression mit der des Wildtyps vergleichbar ist. Dabei wird ein großer Teil als unlösliches Protein exprimiert. Mittels Ehrlich-Test (Kapitel 6.9.3.3) konnten für die aufgereinigten Mutanten F63S, K146C, F148A, F148V und die Doppelmutante K146A/F148A Umsätze im Bereich von 0,01%-0,32% bei 10 mM Substratkonzentration in 10 min gezeigt werden. Die Doppelmu- tante wies dabei die geringste Aktivität auf, während die Variante F63S am stärksten aktiv war. Zusätzlich wurden mit allen gereinigten Enzymvarianten Biokatalysen (Kapitel 6.9.3), sowohl mit BnH, als Ausgangssubstrat, sowie mit MPH, als Zielsubstrat, mit anschlie- ßender HPLC Analytik durchgeführt (Kapitel 6.9.3.4). Für MPH als Substrat konnte bei keiner der Mutanten N-Carbamoyl-α-Methyl-α-Phenyl-α-Aminosäure mittels HPLC detek- tiert werden. Somit zeigte keine der Mutanten Aktivität gegen das MPH. Gegenüber dem Ausgangssubstrat BnH waren alle Mutanten aktiv. Dabei konnte vor allem bei den Mutanten K146A/C, F148A/V und Y151A, sowie deren Kombination eine etwa verdoppelte Aktivität gezeigt werden. Lediglich die Mutante H179A zeigt eine signifikant verringerte Aktivität. Interessanterweise zeigt die Mutation zu Glycin an der gleichen Posi- tion eine ebenfalls etwa verdoppelte Aktivität. (Tabelle 3.9.2).

86 3 Ergebnisse

Tabelle 3.9.2: HPLC-Ergebnisse des Umsatzes und der Volumenaktivität der Hydantoinase aus Ochrobactrum spec., sowie deren Mutanten mit Benzylhydantoin als Substrat.

Mutante Volumenaktivität Umsatz [U/ml Enzym] [%] WT 1,79 1,29 F63S 2,12 1,52 F63V 2,61 1,88 L92G 1,63 1,18 K146A 3,13 2,25 K146C 3,31 2,38 F148A 3,58 2,58 F148V 3,32 2,39 Y151A 3,42 2,46 L155A 1,73 1,24 L155T 2,74 1,97 H179A 1,00 0,72 H179G 3,42 2,46 K146/F148A 3,04 2,19 K146/F148V 2,76 1,99 F148A/Y151A 2,70 1,95 F148V/Y151G 3,21 2,30 K146A/F148A/Y151A/L155A 2,69 1,93

3.10 A. aurescens Carbamoylase Mutante V216A Aus den oben beschriebenen Methoden und Strategien zur Optimierung der L-N-Carba- moylase ist die Mutante V216A hervorgegangen, die eine erhöhte Aktivität gegenüber dem Zielsubstrat NCβPhe zeigt. Zum weiteren Verständnis über die bessere Katalysefähigkeit dieser Variante wurde weitere Versuche, in silico und in vitro unternommen, um die Verbesserung zu verstehen und auch zu quantifizieren.

3.10.1 Docking Es wurde ein neues Homologiemodell der AauHyuC in Yasara erstellt, das aus einer größeren Vielzahl von Matrizen erzeugt wurde. Aus diesem wurde durch einen Aminosäu- reaustausch die Variante V216A erstellt. Diese Modelle wurden nun zum docking von NCαTrp, sowie von NCβPhe genutzt. Die vier Dockingexperimente wurden mit den üblichen Parametern (Kapitel 6.9.5.3) durchgeführt. Im Anschluss daran wurden die cluster visuell auf Sinnhaftigkeit überprüft und das jeweils beste cluster mit sinnvoller Substratorientie- rung gewählt. Es zeigte sich, dass sowohl im Wildtyp als auch in der Mutante V216A beide

87 3 Ergebnisse

Substrate in der gleichen Konformation im aktiven Zentrum gebunden werden können. So wurde für beide Substrate die gleiche Optimalkonfiguration identifiziert. In jedem Fall ist die Carbamoylgruppe des Substrats in Richtung des Bimetallzentrums orientiert, die Säuregruppe interagiert mit dem essentiellen Rest Arginin 291. Durch diese Orientierung muss die voluminöse Seitenkette von der Mutationstelle wegzeigen. Die Mutation sollte also in erster Linie das veränderte Rückgrat des Substrats beeinflussen. In den Abbbildungen 3.10.1 und 3.10.2 sind die beiden aktiven Zentren mit dem jeweils passenden Substrat gezeigt.

Abbildung 3.10.1: Ergebnis des Docking-Experiments von NCαTrp (Orange) im aktiven Zentrum des Wildtyps. Die Mutationsstelle ist violett hervorgehoben.

Abbildung 3.10.2: Ergebnis des Docking-Experiments von NCβPhe (Orange) im aktiven Zentrum des Wildtyps. Die Mutationsstelle ist violett hervorgehoben.

88 3 Ergebnisse

Vergleicht man die Orientierungen der beiden Substrate ist zu erkennen, dass die β-Aminosäure etwas weiter eingedreht ist, die Carbamoylgruppe also näher am Metallzen- trum liegt. Dies gilt jedoch auch für den Wildtyp mit NCβPhe als Substrat. Wie in den Abbildungen deutlich zu erkennen, ist die Entfernung zwischen dem Substrat und der Mutationsstelle mit etwa 10 Å recht groß. Eine direkte Einflussnahme kann daher eher ausgeschlossen werden. Als zusätzliche Untersuchung wurden mit Yasara die Bindungsenergien beider Substrate in beiden Enzymvarianten bestimmt. Die Bindungs- energien sind in Tabelle 3.10.1 aufgelistet. Nach den errechneten Ergebnissen, hätte die Mutante V216A eine erhöhte Bindungsaffinität für beide Substrate, wenn auch mit einer größeren Verbesserung gegenüber NCβPhe.

Tabelle 3.10.1: Errechnete Bindungsenergien der Docking-Experimente mit Wildtyp und V216A Mutante.

Variante Substrat Bindungsenergie Δ Bindungsenergie (WT) [kJ/mol] [kJ/mol] Wildtyp NCαTrp 5,796 0 Wildtyp NCβPhe 4,969 0 V216A NCαTrp 5,919 + 0,123 V216A NCβPhe 5,118 + 0,149

3.10.2 HPLC und NADH-Assay-Messung von Mutante V216A im Vergleich zum Wildtyp Neben den in silico Berechnungen wurde die Mutante auch im Experiment im Vergleich zum Wildtyp untersucht. Dabei wurde sowohl der NADH-gekoppelte Assay als auch die HPLC-Methode nach einer Biokatalyse genutzt. Für beide Messungen wurde mittels Histidin-Tag aufgereinigtes Enzym verwendet. Zudem wurden jeweils äquimolare Mengen Enzym eingesetzt, so dass die Ergebnisse direkt vergleichbar waren. Der NADH-gekoppelte Assay wurde wie in Kapitel 6.9.3.1 durchgeführt. Für die Biokata- lyse wurde 20 mM Substrat in BES-Puffer eingesetzt. Die Biokatalyse wurde über 25 h durchgeführt, die Laufzeit des GluDH-gekoppelten Assay betrug 30 min. Die Ergebnisse beider Messungen sind in Abbildung 3.10.3 zusammengefasst.

89 3 Ergebnisse

5 0,16% ] g m /

4 n i 0,12% m / ] l o % y [ m

a 3 n h s [

s t 5 C ä 2 A t

0,08% L i n v H i i P

t D H z k t

A 2 A a

N s e h m c U s

i 0,04% i f i 1 z e p s

0 0,00% wild type V216A

Abbildung 3.10.3: Ergebnisse der Messung des Wildtypen und der Variante V216A gegenüber NCβPhe. Hellgrau: Glu-DH-Assay, Dunkelgrau: HPLC Messung nach 25 h.

In beiden Assays zeigt die Mutante eine etwa fünffach erhöhte Aktivität. Da die V216A Mutante sowohl bei der kürzeren Messung (30 min) mit geringerer Substratkonzentration und bei der Biokatalyse über 25 h bei 20 mM Substratkonzentration eine etwa fünffach erhöhte Aktivität aufweist, kann von einer ähnlichen Stabilität ausgegangen werden.

DISKUSSION

“you will find only what you bring in.“

Yoda

4 Diskussion

4 Diskussion Im nachfolgenden sollen die im Abschnitt 3 aufgeführten Ergebnis diskutiert werden. Dabei wird die Qualität der Ergebnisse bewertet und diese in aktuelle publizierte Ergeb- nisse in Zusammenhang gebracht. Weiterhin sollen zukünftige Ansatzpunkte und mögliche Verbesserungen der verwendeten Methoden analysiert werden.

4.1 Assayentwicklung zur Detektion verbesserter Carbamoylase-Aktivität gegenüber β-Aminosäuren In dieser Arbeit wurden, je nach Anforderungsbereich, unterschiedliche Assaysysteme genutzt, um die Aktivitäten der Carbamoylasevarianten zu bestimmen. Diese sind in Abbil- dung 4.1.1 schematisch dargestellt und sollen in ihrer Funktion und Anwendung im Weiteren diskutiert werden. Ein besonderes Augenmerk gilt dabei den innerhalb dieser Doktorarbeit entwickelten Assaysystemen mit einem höheren Durchsatz als den bisher bekannten. hoher Durchsatz hohe Präzision

M9 Minimalmedium GluDH gekoppelter Leitfähigkeitsassay: HPLC Messung: Selektionsassay Assay: - quantitativ - quantitativ - qualitativ - in MTPs - direkte Kinetik- - hohe Präzision - semi-quantitativ messung möglich

Abbildung 4.1.1: Schema der in dieser Arbeit verwendeten Assaysysteme.

4.1.1 Hochdurchsatzselektionsassay auf Basis von Stickstoffmangel Selektionsassays werden häufig für Assaykonzepte mit einem gewünschten hohen Durch- satz, als traditionellere Alternative zu auf Mikrofluidik basierenden Assays, eingesetzt. Die zu messende Aktivität wird dabei auf ein kataboles Problem zurückgeführt, das dem Expressionswirt einen Wachstumsvorteil verschafft, sofern das exprimierte Genprodukt die gewünschten Eigenschaften aufweist. Optimal ist es, wenn dafür die generellen Eigenschaften der Zielreaktion genutzt werden können und auf spezielle Substrate verzichtet werden kann, so dass die Selektion nicht fehlgeleitet wird. Vorteilhafter ist es, wenn die Selektion auch unabhängig von dem gewählten Substrat eingesetzt werden kann.

95 4 Diskussion

In dem in dieser Arbeit gewählten Selektionsassay ist dies der Fall, jede Carbamoylase- Reaktion erzeugt eine freie Aminosäure, Kohlenstoffdioxid und Ammonium (Abbildung 4.1.2). Die Selektion von E. coli auf Kohlenstoffdioxid ist schwierig, so dass die Amino- säure und Ammonium als Selektionsmöglichkeit verbleiben. Eine Selektion mittels der freien Aminosäure ist prinzipiell, unter Verwendung eines auxotrophen E. coli Stammes möglich,[178] jedoch im Fall dieser Arbeit nicht anwendbar, da die entstehende β-Amino- säure von dem exprimierenden E. coli nicht genutzt werden kann, oder zumindest nicht essentiell ist. Die Verwendung von Ammonium als Selektionsmarker erschien somit am sinnvollsten und wurde entsprechend eingesetzt. Es ist zu beachten, dass so die Selektion zwar prinzipiell unabhängig vom gewählten Substrat ist, jedoch, je nach gebildeter freier Aminosäure unterschiedliche Mengen Stickstoff für den Wirtsorganismus verfügbar werden. Da β-Aminosäuren üblicherweise nicht abgebaut werden können, liefert die Reaktion in diesem Fall nur ein Äquivalent Stickstoff, bei einer N-Carbamoyl-α-Aminosäure kann jedoch auch noch die freie Aminosäure in den Katabolismus überführt werden und damit, je nach Aminosäure, mindestens ein weiteres Stickstoffäquivalent einbringen (Abbildung 4.1.2). R O R O Carbamoylase HN O + CO2 + NH3 H3N O H3N O Abbildung 4.1.2: Reaktionsschema von Carbamoylasen. Grüne Kästen: für die Selektion verfügbare Stickstoffspezies; gestrichelter Kasten: je nach Aminosäure verfügbar oder nicht verfügbar.

Für die Vorversuche zur Funktionalität des Assays wurde NCαTrp als Substrat verwendet, da dieses gut von der AauHyuC umgesetzt werden kann. Wie in Abbildung 4.1.3 allerdings zu erkennen ist, bringt NCαTrp beim vollständigen Abbau, neben dem einen Äquivalent Stickstoff aus der Carbamoylgruppe noch zwei weitere Äquivalent Stickstoff aus dem Tryp- tophan Grundkörper mit, wohingegen aus NCβPhe nur ein Äquivalent sicher erhalten werden kann.

96 4 Diskussion

H H N H3N N O

H NH3 O O N O O O Abbildung 4.1.3: NCαTrp (links): Die drei Stickstoffatome, die über den Tryptophanabbau und die Carbamoylasereaktion gewonnen werden können, sind grün hervorgehoben. NCβPhe (rechts): Das grün hervorgehobene Stickstoffatom kann aus der Carbamoylase-Reaktion erhalten werden, das orangene nur, wenn der Organismus β-Aminosäuren zumindest zum Teil abbauen kann.

Um bei der Assayetablierung diesem Effekt entgegen zu wirken, wurden die Mutanten A130L und A130V der AauHyuC genutzt, die etwa 60% der Wildtypaktivität gegenüber NCαTrp aufweisen. Zusätzlich wurde die Substratkonzentration auf 5 mM verringert (die spätere Konzentration im Assay betrug 10 mM). Kalkuliert man nun die zu erwartende Menge an freigesetztem Stickstoffäquivalenten (Formel 2) liegt man bei 0,9. Somit sollte also der Assaytest die Realität angemessen widerspiegeln.

= ⋅ ⋅ SubstratkonzentrationTest (2) N Äquivalenteverfügbar N ÄquivalenteSubstrat relative Aktivität Substratkonzentrationreal Es ist zu erwarten, dass die erzeugte Aktivität gegenüber NCβPhe weitaus geringer ist, als die bereits vorhandene Aktivität gegenüber NCαTrp. Einen verlässlichen Zahlenwert für die erwartete initiale Aktivität gegenüber einem neuen Substrat zu benennen ist schwierig und somit wurde dieser Faktor ignoriert. Unter Verwendung von NCαTrp und den angepassten Parametern zeigten die Positivkon- trollen deutliches Wachstum nach fünf Tagen, die Negativkontrollen allerdings Wachstum nach dreizehn Tagen. Somit lag der verlässliche Selektionszeitraum des so optimierten Assays zwischen fünf und dreizehn Tagen. Mit einer CAST-Bibliothek der AauHyuC konnte der Assay erfolgreich eingesetzt werden, zeigte allerdings auch gleichermaßen bereits die Schwächen der Selektion. Bei der voll- ständigen Überprüfung einer Zwei-Positionen-NDT-Bibliothek wurden 14 Kolonien auf den Screening-Platten erhalten. Von diesen konnten allerdings nur sieben mittels Sequenzie- rung identifiziert werden. Die anderen sieben Klone konnten nach dem Selektionsassay nicht mehr zurückgewonnen werden. Vermutlich waren die Zellen durch die stringenten Wachstumsbedingungen zu geschädigt oder hatten als Stressantwort das Plasmid nicht mehr repliziert.

97 4 Diskussion

Ein anderes Problem ergab sich bei dem Einsatz des Assays auf die DOGS-Bibliothek (Kapitel 3.6). Im Gegensatz zu der CAST-Bibliothek sind die Mutationen wegen der homologen Rekombination weit vielfältiger und können so, wenn auch mit geringer Wahrschein- lichkeit, zum Beispiel auch zu Mutationen mit verfrühtem Stopp-Codon führen. Mit einem Screening-Assay würden diese Mutationen zwar als inaktiv identifiziert, jedoch aufgrund der geringen Häufigkeit nicht weiter als störend bewertet werden. In einem Selektions- assay auf Basis von Stickstoffmangel kann eine derartige Mutation größere Folgen haben: Wie weiter oben bereits erwähnt, ist die zu erwartende initiale Aktivität gegenüber NCβPhe äußerst gering. Unter diesen Voraussetzungen kann es für den Hostorganismus attraktiver sein, nicht das rekombinante Enzym mit geringer Aktivität, sondern eine verkürzte Vari- ante zu exprimieren (unter Umständen wird die mRNA mit verfrühtem Stopp-Codon auch erkannt und vor der Expression abgebaut), um so die knappen Ressourcen zu sparen. Dieser Effekt wurde, wie in Abschnitt 3.6 beschrieben auch in dieser Arbeit beobachtet. Diese Beobachtung kann auf „Ohno's Dilemma“ zurückgeführt werden, das besagt, dass ein neutrales Gen durch Mutationen verloren geht.[179] In diesem Fall ist die Verbesserung der Carbamoylaseaktivität gegenüber dem Selektionssubstrat NCβPhe so gering, dass auch die neue Variante als neutrales Gen betrachtet werden kann. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass der Selektionsassay für unkomplexe Muta- genesestrategien (Sättigungsmutagenesen) eingesetzt werden kann, wie in Abschnitt 3.5 anhand der CAST-Bibliotheken gezeigt. Die Anwendung gegenüber komplexeren Biblio- theken (epPCR, gene shuffling) jedoch nicht erfolgreich war.

4.1.2 Glutamat-Dehydrogenase gekoppelter Assay Wie im vorhergehenden Kapitel erläutert, ist der Einsatz des von mir entwickelten Selekti- onsassays nicht für die Selektion von Bibliotheken aus Methoden der gerichteten Evolution verwendbar. Zusätzlich war die Selektion bei großen Bibliotheken nicht ausreichend hoch, so dass ein weiterer Assay eingesetzt werden musste, um die Anzahl der positiven Vari- anten so weit zu verringern, dass eine Messung mit dem Leitfähigkeitsassay oder der HPLC möglich ist. Als Grundlage hierfür wurde ein Enzymkaskadenassay genutzt, bei dem ein kommerzielles Enzym (Glutamat-Dehydrogenase) mit dem Produkt der ersten Enzymreaktion (Ammo- nium) ein photometrisch messbares Signal (NADH-Abnahme) erzeugt. Die Grundidee der Messung von Enzymkinetiken auf Basis des NAD+/NADH-Systems ist bereits seit 1935 bekannt[180] und wurde ausführlich durch Passonneau und Lowry beschrieben.[181]

98 4 Diskussion

Der in dieser Arbeit genutzte Assay wurde im Rahmen einer von mir mitbetreuten Bache- lorarbeit von C. Thöle entwickelt und optimiert. Die in dieser Situation entwickelten finalen Parameter für die Konzentrationen der beteiligten Substrate findet sich auch in der Lite- ratur wieder (Tabelle 4.1.1).

Tabelle 4.1.1: Vergleich zwischen den von C. Thöle und Ellis und Goldberg entwickelten Assayparametern.

Substrat Konzentration Konzentration Konzentration [mM] [mM] [mM] nach C. Thöle nach Ellis und nach Walton und Goldberg[182] Chica[183] α-Ketoglutarat 10 7-10 Detektierte Spezies NADH 0,5 0,2 0,5 OH- * 10-6,5 10-6,6 10-6 Puffer 50 50 100

+ NH4 Detektierte Spezies 100 15 GluDH >5 U n. A. 1 U * basierend auf den pH-Werten 7,5, 7,4 und 8,0 n. A.: nicht anwendbar

Aus der Tabelle 4.1.1 deutet sich direkt eine Problematik des Assays an: die benötigte Ammonium-Konzentration für optimale Bedingungen für die Glutamat-Dehydrogenase ist mit 100 mM sehr hoch. Diese kann durch die Carbamoylase, auch bei Maximalumsatz, nicht erreicht werden, da das Carbamoylase-Substrat nur mit 2 mM eingesetzt wurde. Aufgrund der geringen Löslichkeit der aromatischen, N-carbamoylierten α-Aminosäure, kann diese, ohne Zusatz von Lösungsmitteln, auch nicht weiter gesteigert werden. Dennoch konnte der Assay in dieser Form erfolgreich für die Messung von aufgereinigter Carbamoylase eingesetzt werden und korrelierte auch mit alternativen Assaymethoden.[170] Es gilt allerdings zu beachten, dass gerade bei der Messung von Mutanten mit neu erzeugter Aktivität nur eine sehr geringe Aktivität zu erwarten ist.

+ Der KM-Wert der Glutamat-Dehydrogenase aus Bos taurus gegenüber NH4 liegt bei etwa 4 mM[184], somit liegt die Konzentration, selbst bei optimaler Carbamoylase-Aktivität, darunter. Wie hoch die Geschwindigkeit der Glutamat-Dehydrogenase unter den Assaybe- dingungen ist, ist schwer abzuschätzen, allerdings konnten auch bei 0,25 mM Ammonium- konzentration noch eindeutige Aktivität gemessen werden. Es wurde ebenso eine gewisse Abhängigkeit der bestimmten L-N-Carbamoylase-Aktivität zur eingesetzten Konzentration an Glutamat-Dehydrogenase beobachtet, diese war umso ausgeprägter, je höher die Carbamoylase-Konzentration war. Dies ist ein zu erwartender

99 4 Diskussion

Effekt, da bei großen Carbamoylase-Aktivitäten die Glutamat-Dehydrogenase der limitie- rende Faktor ist. Aus diesen beiden konträren Effekten lässt sich ableiten, dass der Assay, sofern verläss- liche kinetische Daten erhalten werden sollen, nur in einem kleinen Bereich von Carba- moylase-Aktivität einsetzbar ist. Der Einsatz des Assays zum Screening einer Bibliothek von Carbamoylase-Varianten bringt weitere Probleme mit sich. So ist die Histidin-Tag basierte Aufreinigung einer Bibliothek aus mehreren hundert Varianten nicht trivial und der Assay sollte nach Möglichkeit mit E. coli-Zelllysat erfolgen. Walton und Chica zeigten die Einsatzfähigkeit eines gekoppelten Assays mit Glutamat-Dehydrogenase unter Verwendung von E. coli-Zelllysat in Mikrotiter- platten.[185] Allerdings wurde dort nach D-Aminosäure Aminotransferase (DAAT)-Aktivität gescreent, so dass das im ersten Schritt gebildete α-Ketoglutarat die zu detektierende Spezies ist. Der

KM-Wert für α-Ketoglutarat liegt allerdings bei circa 0,36 mM und damit etwa eine Größen-

+ ordnung unter dem von NH4 .

O O O NH4 OH O O NADH NH 3 O D-Alanin a-Ketoglutarat DAAT GluDH

O O NAD

O O O O O Pyruvat HO O HO O

NH2 NH2 D-Glutamat L-Glutamat Abbildung 4.1.4: Einsatz des GluDH-gekoppelten Assays zur Detektion von DAAT-Aktivität nach Walton und Chica.[15]

Zur Verringerung des Einfluss von im Zelllysat vorhandenen, potentiell störenden Spezies, verwendeten Walton und Chica[183] die gleichen Strategien wie in dieser Arbeit: – Preinkubation des Assaygemisches – Einsatz eines E. coli Zelllysats ohne Zielenzym als Blank (in dieser Arbeit inaktive Variante E127D und EchA) Mit diesen Strategien erhalten sie ein Signal zu Rausch-Verhältnis von 14 : 1, also nur geringfügig über den in dieser Arbeit erhaltenen 12 : 1, das aber nur unter Verwendung

100 4 Diskussion des spezielleren t-NL-Mediums und der Kultivierung in DeepWell-Platten erhalten werden konnte. In einem Screening-Ansatz einer Sättigungsmutantenbibliothek des aktiven Zentrums war es möglich, eine Variante mit 632-fach geringerer katalytischer Effizienz zu identifizieren, die Absorptionsänderung war dabei noch deutlich größer, als die der Negativkontrolle. Um Varianten noch geringerer Aktivität zu identifizieren, wird vorgeschlagen die Substrat- oder Zelllysatmenge zu erhöhen.[183] Ob der hier entwickelte Assay eine derartig gering aktive Variante eindeutig identifiziert hätte, ist fraglich. In den überprüften Bibliotheken des gene shuffling wurden keinerlei eindeutige Ergebnisse identifiziert. Nimmt man an, dass die aus der DOGS-Methode enthaltene Bibliothek aktive Varianten enthielt, so muss man festhalten, dass der Assay nicht sensitiv genug war, diese zu identifizieren. Die Möglichkeit die Substrat- oder Zellly- satmenge zu erhöhen, wurde in dieser Arbeit untersucht. Es musste festgestellt werden, das die in dieser Arbeit genutzten Mengen bereits an der oberen Grenze des Einsetzbaren liegen. Eine Erhöhung der Zelllysatmenge hatte, auch unter Verwendung von t-NL-Me- dium, stets auch eine Erhöhung der Hintergrundreaktion zur Folge. Die Substratkonzentra- tion konnte, wie bereits oben erwähnt, aufgrund der geringen Löslichkeit nicht mehr weiter erhöht werden. Es bleibt festzuhalten, dass das Assaykonzept zwar grundsätzlich möglich ist, jedoch die Verwendung von Ammonium als zu detektierende Spezies, bedingt durch den hohen

KM-Wert, nicht die beste Lösung für den GluDH-Assay ist. Obwohl der Assay an der Greifswalder Roboterplattform eingerichtet werden konnte, schlug das tatsächliche Screening mit diesem Assay fehl. Die Duplikatplatten zeigten kein übereinstimmendes Muster, so dass davon ausgegangen werden muss, dass der Assay so nicht verwendet werden kann. Ein Hauptproblem ist sicherlich das mangelnde Feedback an der Roboterplattform. So konnte bei der manuellen Durchführung stets überprüft werden, ob nach der einstündigen Präinkubation noch ein Abfall der NADH-Konzentration zu sehen ist und die Inkubationszeit beliebig verlängert werden. Zudem musste auch über die OD 340 geprüft werden, ob am Ende der Präinkubationszeit noch genügend NADH vorlag, welches sonst manuell nachgefügt wurde. Diese Schritte konnte die Roboterplattform mit der hier entwickelten Programmierung so nicht durchführen. Für zukünftige Arbeiten sollte daher ein derartiger Feedback-Loop programmiert und eingesetzt werden. Neben diesen Problemen ist auch die Entnahme des Zellextraktes von den abzentrifu- gierten Zelltrümmern nicht immer einfach und bedarf häufig eines vorsichtigen handlings, um das Pellet nicht wieder aufzulösen.

101 4 Diskussion

4.1.3 Leitfähigkeitsassay und HPLC-Messung Der Leitfähigkeitsassay basiert auf der Arbeit von Schätzle et al.[186] und wurde bereits erfolgreich zur Bestimming von L-N-Carbamoylase-Aktivität eingesetzt.[169] Der Leitfähig- keitsassay ist, ähnlich wie der GluDH-Assay, am einfachsten mit aufgereinigtem Enzym durchzuführen, da so die Beeinflussung durch gut leitfähige Ionen im Zellextrakt eliminiert wird. Unter diesen Bedingungen zeigte der Leitfähigkeitsassay der HPLC vergleichbare Ergebnisse mit nur geringfügigen Abweichungen. Vergleicht man die Ergebnisse der Messungen des Leitfähigkeitsassays gegenüber unauf- gereinigten CAST-Mutanten (Kapitel 3.5.1), mit den Messungen der zum Teil gleichen Vari- anten in aufgereinigter Form (Kapitel 3.5.2), zeigt sich, dass der Leitfähigkeitsassay nicht für die Messung von Zelllysaten eingesetzt werden kann. Eine in unaufgereinigter Form 3,5-fach aktivere Variante (bei etwa gleicher Expressionsstärke) zeigt in aufgereinigter Form keinerlei Verbesserung gegenüber dem Wildtyp. Ebenso problematisch ist die Messung von sehr geringen Aktivitäten, wie sie zunächst beim protein-engineering zu erwarten sind. Mit einem α-Koeffizienten von 2,1%/°C im Bereich von 23°C ist das gemessene System sehr anfällig für Temperaturschwankungen. Wenn auch das verwendete Messinstrument den Temperatureinfluss in die Messung einfließen lässt, ist die Leitfähigkeitsmessung von sehr kleinen Aktivitäten nicht mehr verlässlich möglich. Die HPLC-Messung ist weiterhin die verlässlichste Methode für die Charakterisierung von Carbamoylase-Aktivität. Sie diente auch zur endgültigen Überprüfung der Variante V216A als verbesserte Mutante. In der Standardgeraden ließen sich noch Konzentrationen von 0,3 mM deutlich nachweisen. So muss, trotz des geringen Durchsatzes, die HPLC-Methode als robusteste und verlässlichste Methode genannt werden.

4.2 Zum Einsatz von Homologiemodellen zum rationalen Enzymdesign Es kommt häufig vor, dass von biotechnologisch interessanten Enzymen keine Protein- struktur vorliegt. Die Strukturaufklärung ist meist mit einem großen Zeitaufwand verbunden und daher nicht in jedem Fall möglich. Die Verwendung von computergene- rierten Modellen, die auf homologen Enzymen beruhen, ist eine legitimes Hilfsmittel, um dennoch die Möglichkeiten des rationalen Design nutzen zu können. Gute Modelle basieren auf Templaten mit mehr als 50% Sequenzidentität und zeigen etwa 1 Å root mean square deviation (rmsd) für die Peptidrückgratatome, die ist in etwa vergleichbar mit einer NMR- Struktur mittlerer oder eine Röntgenkristallstruktur niedriger Auflösung. Die meisten

102 4 Diskussion

Fehler treten in den Seitenketten und loops auf oder sind kleine Abweichungen im Pepti- drückgrat. Bei etwa 30-50% Sequenzidentität ist ein Modell mittlerer Qualität zu erwarten. Etwa 90% des Peptidrückgrat sind mit etwa 1,5 Å rmsd vorhanden und es treten vermehrt Fehler in der Packung der Seitenketten, den loops und auch dem Peptidrückgrat auf, vereinzelt können auch Fehler im alignement auftreten. Unter 30% Sequenzidentität sind schlechte Modelle zu erwarten, die alignment-Fehler häufen sich und werden so zur größten Fehlerquelle.[187] Generell gilt, je höher die Sequenzidentität und je mehr entsprechende Matrizen vorliegen, desto genauer und damit aussagekräftiger kann das Homologiemodell sein. Zur Bewertung von Homologiemodellen gibt es viele Möglichkeiten, die meist statistisch die vorliegenden Bindungslängen und -winkel, sowie die Packungsdichte im Modell mit den aus echten Proteinstrukturen bekannten Werten vergleichen. Yasara selbst führt bereits selbst entsprechende Test während der Erstellung des Modells aus und bewertet das Modell selbständig. Eine weitere bekannte Option ist die Funktion des WhatIf Webservers.[188] Letztlich basieren diese Methoden darauf, dass die Validität des gesamten Modells erhöht ist, wenn mehr Aminosäuren in der natürlichen Konformation vorliegen. Dies muss allerdings gerade im aktiven Zentrum nicht unbedingt richtig sein. Insbesondere wenn im Modell kein Substrat enthalten ist, haben die Aminosäurereste, die das aktive Zentrum bilden, viel Raum zur Verfügung. Die Reste können so auch unterschiedliche Rotamere einnehmen, die zwar alle die richtigen Bindungslängen und -winkel aufweisen können, aber nicht alle die richtige Konformation abbilden. So kann das meist nachfolgende docking durch eine einzige falsch liegende Aminosäure inkorrekt werden.[189] Die Auswahl der Matrizen ist ebenso kritisch für dich Richtigkeit des nachfolgenden Modells. Zu Beginn dieser Arbeit war noch keine Kristallstruktur einer L-N-Carbamoylase vorhanden. Somit war die β-Ureidopropionase aus S. kluyveri die primäre Matrize (Sequenzidentität 30%). Mit dieser konnte auch ein von Yasara als zufriedenstellend bewertetes Modell mit einem Z-score von -1.118 erhalten werden. Dennoch muss beachtet werden, dass eine Sequenzidentität von < 30% in der sogenannten „twilight zone“ liegt und somit das homology modelling extrem schwierig ist, da eindeutige Sequen- zalignments nicht mehr gewährleistet sind.[190] Zusätzlich ist gerade bei der Matrize die Problematik gegeben, dass dieses Enzym bereits β-Aminosäuren akzeptiert. Im weiteren Verlauf konnte die Struktur einer L-N-Carbamoylase aus G. stearothermophilus gelöst werden.[108] Auch auf Basis dieser Matrize wurde ein Homologiemodell erstellt (Sequenzi- dentität 36 %). Dieses erhielt einen Z-score von -1.136, also geringfügig schlechter, dennoch wurde es als das bessere Modell erachtet, da es auf einem näher verwandten

103 4 Diskussion

Enzym basiert. Es galt allerdings zu beachten, dass es sich bei G. stearothermophilus im Gegensatz zu A. aurescens um einen thermophilen Organismus handelt. Somit sind an die L-N-Carbamoylase strukturell andere Bedingungen gestellt als an ein Enzym aus einem mesothermen Organismus, wie A. aurescens. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem auch die Struktur der katalytischen Domäne der A. aurescens L-N-Carbamoylase gelöst werden. Letztlich lagen also drei Strukturen vor, die alle nicht eindeutig richtig oder falsch waren. Auch die hier gelöste Struktur der katalytischen Domäne muss nicht vollständig richtig sein, da durch die fehlende Dimerisierungs- domäne Fehler in der vorhandenen Domäne auftreten können, wenn beispielsweise Inter- aktionspartner fehlen, oder stabilisierende Wechselwirkungen nicht mehr vorhanden sind. In Abbildung 4.2.1 sind die katalytischen Domänen aller Modelle übereinandergelegt. Grundsätzlich zeigt sich, dass die strukturelle Übereinstimmung zwischen allen drei Struk- turen recht hoch ist. Im linken Teil der Abbildung ist allerdings zu erkennen, dass das von der L-N-Carbamoylase aus G. stearothermophilus abgeleitete Modell einige Schleifen etwas anders positioniert hat, hier liegen die beiden anderen Modelle enger beieinander und somit wohl auch näher an der tatsächlichen Struktur.

Abbildung 4.2.1: Strukturvergleich der beiden Homologiemodelle auf Basis β-Ureidopropionase aus S. kluyveri (blau) und auf Basis der L-N-Carbamoylase aus G. stearothermophilus (orange), sowie der Kristallstruktur (grün).

Ebenfalls auffällig ist die schlechte Übereinstimmung zwischen den beiden Dimerisierungs- domänen der Modelle (unten rechts in der Abbildung). Dies liegt daran, dass die katalytische Domäne flexibel im Vergleich zur Dimerisierungsdomäne ist und sich auch im Zuge

104 4 Diskussion der Reaktion verändern kann.[109] Die Matrize des in blau dargestellten Modells hatte ein Substratanalogon gebunden und befindet sich daher eher in der katalytisch aktiven Konformation. Kann nun überhaupt ein rationales Design anhand eines Homologiemodells durchgeführt werden, oder ist dafür eine Kristallstruktur mit gebundenem Substrat(analogon) zwingend notwendig? Ein CAST-Ansatz um die Substratspezifität zu ändern ist, sofern die ungefähre Bindungsta- sche bekannt ist, sicherlich auch auf Basis eines Homologiemodells eine valide Option. Die Aminosäurereste in der Nähe des aktiven Zentrums sind, auch im Homologiemodell, einfach und sicher zu identifizieren. Unabhängig von der Genauigkeit des Modells, sollte auch die Ausrichtung der Seitenkette klar erkennbar sein, wenn auch das genaue Rotamer nicht übereinstimmen muss. Durch die Regelmäßigkeit der Sekundärstrukturen eines Proteins kann die Seitenkette, insbesondere in α-Helices und β-Strängen, nur in eine Rich- tung zeigen, dennoch konnte, wie in Abschnitt 4.3 diskutiert mittels CASTing keine verbesserte Variante erzeugt werden. Hingegen konnte durch das, auf den diskutierten Homologiemodellen basierende rationale Design, eine verbesserte Variante erzeugt werden. Diese wird in Abschnitt 4.5 weiter erläutert.

4.3 Semirationales Design der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens Trotzdem der CAST-Ansatz eine der erfolgreichsten Methoden für diese Problemstellung ist,[146] sowie anzunehmen ist, dass die korrekten Aminosäuren mutiert wurden, konnte keine eindeutig aktivere Variante mit diesem Ansatz identifiziert werden. Im Modellversuch des CASTing von Reetz et al. wurde das Konzept auf eine Lipase zur Vergrößerung des Substratspektrums angewandt. Es wurden 5 Bibliotheken (jeweils 2 gesättigte Positionen) mit je 3000 Klonen gescreent und letztlich acht „Hits“ (bemerkens- wert verbesserte Mutanten) identifiziert, dies entspricht also einem Hit pro etwa 1875 getesteten Varianten, oder fast zwei „Hits“ pro Bibliothek. Es muss allerdings auch beachtet werden, dass alle verbesserten Mutanten in zwei der fünf Bibliotheken auftraten und somit nicht gleich verteilt waren und das ein Screening gegenüber 12 verschiedenen Substraten erfolgte, so das die Einordnung als Hit weniger stringent war.[191] In dieser Arbeit wurden vier Bibliotheken mit zwei oder drei NDT-Codons erstellt, jedoch nur die Bibliotheken mit zwei Substitutionen (Bereich I und Bereich II) vollständig selektiert. In beiden Fällen konnten zwar im Selektionsassay Mutanten erhalten werden, diese zeigten aber letztlich keine erhöhte Aktivität gegenüber dem Zielsubstrat. Die aus drei

105 4 Diskussion

Aminosäuren bestehenden Bereiche wurden aus Zeitgründen nicht mit vollständiger Biblio- theksabdeckung untersucht. Warum konnte keine bessere Variante erhalten werden? Wie bereits oben erwähnt enthielten in der erfolgreichen Anwendung der CAST-Methode nur zwei der fünf erstellten Bibliotheken aktivere Varianten und das obwohl die Auswahl der CAST-Positionen auf einer Kristallstruktur basierte. Somit kann es letztlich dem unglücklichen Zufall geschuldet sein, dass die Bereiche III und IV, die nur sehr oberflächlich gescreent wurden, möglicherweise bessere Varianten enthielten. Dennoch muss festgehalten werden, dass Bereich I eine sinnvoll gewählte Position war, da die in dieser Arbeit durch rationales Design identifizierte, verbesserte Mutante V216A in diesem Bereich liegt. Somit hätte der Selektionsassay eigentlich zumindest einen „Hit“ zeigen müssen. Hier kommt allerdings der Einsatz der NDT-Codons zum Tragen. Diese codieren nur zwölf Aminosäuren (Phe, Leu, Ile, Val, Tyr, His, Asn, Asp, Cys, Arg, Ser, Gly), die in ihrer Gesamtheit die unterschiedlichen Aminosäuretypen (basisch,sauer, aromatisch, aliphatisch, polar, unpolar) abdecken. Folglich können bestimmte Kombinationen nicht erzeugt werden. Der Vorteil dieser Codonnutzung liegt in dem weit verringerten Scree- ning/Selektionsaufwand, so müssen für zwei Positionen nur 430 statt 3.000 und für drei Positionen nur 5.000 statt 100.000 Klone überprüft werden.[142] Gerade jedoch die beste Variante V216A ist mit Alanin an Position 216 und ebenso Alanin an Position 218 (Wildtyp) nicht vertreten. Die richtige Mutation an Position 216 kann durch NDT-Codons nicht erzeugt werden und die neutrale Position 218 muss mutiert werden. Wie die rationale Mutante V216G, die eine geringere Aktivität als der Wildtyp aufweist, zeigt, ist die Arthrobacter aurescens Carbamoylase sehr selektiv gegenüber den einge- führten Mutationen. Somit wäre für die nur aus zwei Aminosäuren bestehenden Bereiche I & II, die Verwen- dung von NNK-Codons sinnvoller gewesen, da der Selektionsaufwand von 3.000 Klonen noch gut mit dem Ammoniummangelassay hätte erfolgen können. Jedoch war zu Beginn geplant, die Bibliotheken nicht nur in einem CAST, sondern auch einem ISM-Ansatz[143] einzusetzen, bei dem die besten Varianten der ersten Runde als Matrizen der nächsten Runde dienen. Würde man die besten fünf Varianten in die nächste Runde überführen, müsste man dementsprechend 5 * 430 = 2150 oder 5 * 3.000 = 15.000 Klone selektieren, so dass in diesem Fall die Verringerung der Bibliotheksgröße von Bedeutung ist.

106 4 Diskussion

4.4 Gerichtete Evolution der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens Als Alternative zu den rationalen und semirationalen Methoden wurden ebenso Methoden der gerichteten Evolution in Betracht gezogen. Diese Methoden sind unabhängig von der Qualität des Homologiemodells und wurden daher als sinnvolle Ergänzungen betrachtet. Die klassische Methode der epPCR wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten getestet[169], so dass in dieser Arbeit die Methoden des RID und des DOGS genutzt wurden. Die RID-Methode ermöglicht die zufällige Insertion eines kompletten Codons. In dieser Arbeit wurden Glycin- und Alanin-Codons gewählt, um den sterischen Stress so gering wie möglich zu halten und nur das Peptidrückgrat zu verlängern. Es muss allerdings beachtet werden, dass durch Insertionen die nicht in frame sind, in zwei von drei Fällen eine Aminosäure mutiert und eine weitere eingefügt wird (Abbildung 4.4.1). CCA GAG CCG ACT ATA GAC P E P T I D CCA GAG CCG GCC ACT ATA GAC P E P A T I D CCA GAG CCG AGC CCT ATA GAC P E P S P I D CCA GAG CCG ACG CCT ATA GAC P E P T P I D Abbildung 4.4.1: Schema einer Zufallsinsertion eines Alanin-Codons. Nur in einer der drei Varianten wird tatsächlich ein Alanin eingeführt. In den anderen beiden Fällen sind zwei Aminosäuren betroffen. Aufgrund des degenerierten Codes sind die Mutationen zum Teil still.

Die RID-Methode wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um die Fluoreszenzeigenschaften von GFP und DsRed zu modifizieren.[16] Murakami et al. betonen, dass einige der erhaltenen Mutationen nicht durch epPCR erhalten werden könnten, da RID, neben Insertion und Deletion, auch Mutationen, die zwei oder mehr aufeinanderfolgende Codons beinhalten, einführen kann. Die Mutagenese von GFP wird häufig genutzt um die generelle Durchführbarkeit einer Methode zu zeigen (proof of principle). Aber die Mutation eines Proteins, das eine katalytische Funktion hat, flexible Domänen aufweist, größer ist und zudem nicht durch einfache Fluoreszenzmessung gescreent werden kann, kann nur bedingt mit der Mutagenese von GFP verglichen werden. Die RID-Methode wurde ausführlich untersucht, führte jedoch nicht zu einer Bibliothek von ausreichender Größe. Dies ist wohl vor allem auf die komplexen molekularbiologischen Arbeiten, die diese Methode beinhaltet, zurückzuführen. So müssen drei Restriktionsverd- auschritte, ein Zufallsverdau und vier Ligationsschritte durchgeführt werden. Darüber

107 4 Diskussion hinaus finden drei der acht Schritte mit Einzelstrang-DNA statt. Aufgrund der Vielzahl an Schritten konnte diese Methode somit nicht zu einem erfolgreichen Abschluss gebracht werden, da nur eine sehr kleine Bibliothek erhalten werden konnte. Für zukünftige Arbeiten können dennoch die Erkenntnisse der Anwendung von RID gegenüber großen Enzymen von Relevanz sein. Die gene shuffling Methode war gewählt worden, da die verwandten β-Ureidopropionasen das Grundgerüst der β-Aminosäuren akzeptieren und damit potentiell ebenso für die gewählt Aufgabe geeignet sind wie L-Carbamoylasen.[192] Jedoch ist das Substratspektrum bezüglich der Seitenketten bei den β-Ureidopropionasen zu klein; ein gene shuffling könnte hier beide Vorteile vereinen. Bedingt durch die geringe Sequenzidentität zwischen den beiden Enzymklassen konnte ein klassisches gene shuffling nach Stemmer[133] nicht durchgeführt werden, stattdessen wurde die DOGS[175] Variante gewählt. Diese ist weniger zufällig, da hier die gewählten Gene in definierte Abschnitte (jeweils zwischen Bereichen hoher Homologie) eingeteilt werden, die dann untereinander rekombiniert werden können. Während damit die Methode zunächst in der Varianz der erhaltenen Bibliothek unterlegen erscheint, muss beachtet werden, dass auch beim klassischen shuffling die crossover-Ereignisse in den Bereichen hoher Homologie erfolgen (Hot-Spots).[135] In dieser Arbeit wurden sechs dieser Bereiche identifiziert, so dass die Gene in sieben Abschnitte unterteilt wurden. Ein weiterer Unterschied zwischen DOGS und gene shuffling ist das Maß der zufälligen Mutation: Während beim traditionellen gene shuffling durch den zufälligen DNase-Verdau und die nachfolgende Rekombination insbesondere im Bereich der Hot Spots häufig Muta- tionen auftreten, sind diese Positionen beim DOGS durch die an diesen Positionen anlie- genden Primer geschützt. Durch das degenerierte Primerdesign bei DOGS werden an dieser Stelle zwar auch Mutationen eingeführt, diese führen aber in Richtung des Consensus an dieser Position. Mit der DOGS-Methode konnte, im Gegensatz zur RID-Methode, eine ausreichend große Bibliothek erstellt werden, jedoch war das Screening schwierig. Während der Mangelmedi- umsselektionsassay wie weiter oben erläutert (Kapitel 3.6) zu einer Anreicherung inaktiver Varianten führte, konnte der GluDH-gekoppelte Assay auf der Roboterplattform ebenfalls nicht zufriedenstellend durchgeführt werden, so dass aus der DOGS-Bibliothek keine verbesserte Variante identifiziert werden konnte. Für zukünftige Arbeiten sollte der Assay durch Einführung eines Feedback-Loops am Robotersystem für diese Fragestellung besser geeignet sein. Alternativ könnten über einen pooling-Ansatz die benötigten Varianten an der HPLC gemessen werden.[193]

108 4 Diskussion

Obwohl in dem gesetzten Zeitraum kein sichtbarer Erfolg erzielt werden konnte, ist ein gene shuffling Ansatz meines Erachtens nach sinnvoll, um die beiden Eigen- schaften -Akzeptanz des ß-Aminosäurerückgrats und Akzeptanz großer Seitenketten- zu vereinen. Um das gene shuffling mit den gegebenen Assays erfolgreich durchzuführen, müsste vermutlich die initiale Aktivität der L-N-Carbamoylase gegenüber NCßPhe zunächst gesteigert werden, um die Carbamoylase „attraktiver“ für den E. coli-Host zu machen. In der Literatur ist das gene shuffling ein häufiger Schritt nach den ersten Runden epPCR, um so die positiven Mutationen zu vereinen und die neutralen Mutationen zu deletieren. Garcia-Ruiz et al. konnten das Sekretionsverhalten einer versatile peroxidase durch die sukzessive Anwendung von epPCR und gene shuffling verbessern, im Anschluss daran wurde durch den staggered extension Process (StEP) und gene shuffling zusätzlich die Thermostabilität um circa 8°C erhöht. Hier wurde bei der Evolution der Thermostabilität ebenso sukzessive der Selektionsdruck (von 60 auf 90°C) erhöht, dies war möglich, da die Varianten der vorhergehenden Generation circa 30% residuale Aktivität unter den neuen Screeningbedingungen zeigten.[194] Die de novo designte Kemp-Eliminase KE70 wurde von Khersonsky et al. ebenso zunächst durch epPCR optimiert, erst im darauf folgenden Schritt wurde gene shuffling eingesetzt um das KE70 Enzym weiter zu verbessern. Im weiteren Verlauf der Evolutionsrunden wurden alternierend epPCR und gene shuffling eingesetzt. Zudem wurde in silico als hilf- reich vorhergesagte Mutationen über die Methode des gene shuffling zusätzlich eingeführt. Insgesamt wurde so eine 400-fache Verbesserung der katalytischen Effizienz von KE70 erreicht. Die Substratbindung wurde bis zu Faktor 12 verbessert und die Wechselzahl bis zu Faktor 53 erhöht.[195] Analog gingen auch Blomberg et al. vor, ebenfalls ausgehend von einer de novo erstellten Kemp-Eliminase (HG3[196]) verwendeten sie epPCR, gefolgt von gene shuffling und im Anschluss eine semi-rationale iterative Sättigungsmutagenese. Weitere alternierende Runden von epPCR und gene shuffling, sowie fokussierte Bibliotheken führten schließlich

-1 -1 -1 zu einer enorm verbesserten Variante (kcat = 700 s , kcat/KM=230000 M s ) mit insgesamt 28 Mutationen, von denen 11 durch das in silico Design vorgegeben waren. Über den Verlauf der Mutagenese wurden im Schnitt nur etwa eine Mutation pro Mutationsrunde eingeführt und somit die Wahrscheinlichkeit positive Mutationen zu akkumulieren erhöht. Dies zeigte sich auch in der ungewöhnlichen Tatsache, dass die Thermostabilität des Enzyms mit zunehmender Mutagenese zunahm.[197] Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass gene shuffling besser mit der Variante V216A und anderen optimierten Varianten als zweiter Schritt erfolgen sollte.

109 4 Diskussion

Eine zusätzlich Option wäre es, die Akzeptanz von ß-Ureidopropionasen gegenüber aroma- tischer Seitenketten zu verbessern und im Anschluss die jeweils verbesserten Mutanten zu rekombinieren.

4.5 Rationales Design der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens Das rationale Design dieser Carbamoylase wurde auf Basis der beiden unterschiedlichen Substrate (NCαTrp und NCβPhe) geplant. Die Substrate wurden verglichen und die, für die Bindung und Katalyse relevanten, Unterschiede festgestellt. Anhand dieser Unterschiede wurden drei Strategien entwickelt, die eine Katalyse ermöglichen sollten. Mit diesen Stra- tegien wurden fünf Positionen ausgewählt und insgesamt sieben Mutationen durchgeführt. Nur eine dieser Mutationen führte zum gewünschten Ergebnis, die Mutante V216A zeigt eine fünffach erhöhte Aktivität gegenüber NCβPhe. Im Prinzip ist eine erfolgreiche Variante unter nur sieben bereits ein gutes Ergebnis. Rottici et al. konnten bei CAL-B mit drei rationalen Mutanten (und einer Doppelmutante), die auf zwei verschiedenen Strategien beruhten, eine Verdopplung der Enantioselektivität bei einer Variante erzielen, allerdings wurde die Aktivität gleichzeitig etwa halbiert. Im Gegensatz zu meinen Strategien wurde hier eine Depolarisierung der für die Stereoselekti- vität zuständigen Bindetasche durchgeführt (Thr und Ser nach Val und Ala), sowie an einer anderen Position eine Polarisierung und Vergrößerung (Trp nach His). Die Strategie der Bindungstaschenvergrößerung wurden auch in dieser Arbeit angewandt (V126A/G, Q196N und E127D).[198] Garrabou et al. konnten beim rationalen Design der L-Rhamnulose-1-Phosphat Aldolase unter fünf Varianten eine identifizieren, die die gewünschte verbesserte Aktivität gegen- über Dihydroxyaceton (DHA) zeigte. Die Strategie hier war, basierend auf einer Kristall- struktur, die Phosphatbindetasche, bestehend aus polaren Resten, durch Aspartate zu ersetzen um so das ursprüngliche phosphorylierte Substrat nicht mehr zuzulassen und dem DHA neue Bindestellen zu ermöglichen. Diese Strategie ähnelt der in dieser Arbeit verwendeten Strategie der neuen Interaktionspunkte (M136D). Die einzig erfolgreiche Variante war die eher konservative Mutation N29D.[199] Das rationale Design wird mit zumeist größerem Erfolg bei der (Thermo-)Stabilisierung von Enzymen angewandt. Die Auswahl der zu mutierenden Reste ist in diesen Fällen zumeist einfacher, da auf die B-Faktoren oder oxidationsempfindliche Reste zurückge- griffen werden kann. Eine valide Alternative ist die Insertion von Disulfidbrücken. Die Arbeitsgruppe Janssen zeigte erfolgreich die generelle Anwendbarkeit, der von ihnen entwickelten FRESCO (Framework for Rapid Enzyme Stabilization by Computational libra-

110 4 Diskussion ries) Strategie. Die Vorhersage erfolgt hier aufgrund der berechneten Faltungsenergien von Einzelmutanten und vorhergesagten Mutationsstellen für Disulfidbrücken. Unter 64 vorhergesagten Varianten waren 21 mit erhöhtem Schmelzpunkt. Durch die Kombination von 10-12 der positiven Varianten konnte der Schmelzpunkt von 50°C auf 85°C erhöht werden, bei gleichbleibender Aktivität.[200]

Im nachfolgenden sollen nun die in dieser Arbeit durchgeführten rationalen Mutationen bewertet und hinterfragt werden. Die Strategie der Deletion im Rückgrat war erfolglos. Durch molekulares Modelling konnte zwar gezeigt werden, dass durch die Deletion von Alanin 130 mehr Raum im aktiven Zentrum geschaffen werden sollte, dennoch konnte in vitro keine verbesserte Aktivität gegenüber NCβPhe gezeigt werden. Rationale Deletionsmutationen zur Änderung des Substratspektrums werden nicht häufig eingesetzt, meist werden loops oder die N- oder C-termini des Enzyms deletiert, um die Stabilität zu erhöhen, oder leichter Kristalle für die Strukturaufklärung zu erhalten.[201-202] Damnjanović et al. konnten bei der Deletion eines neun Aminosäurereste umfassenden loops nur geringfügige Verschlechterungen im katalytischen Verhalten feststellen[202], während Zhay et al. bei einer zwei Aminosäurereste-Deletionsmutante der Triosephospha- tisomerease ein Verschlechterung um den Faktor 105 beobachteten.[173] Es bleibt also festzuhalten, dass der Effekt einer Deletionsmutation schwer vorhersagbar ist, da in diesem Fall das komplette Proteinrückgrat neu orientiert werden muss. Es wurde in dieser Arbeit nur eine Deletionsmutante erzeugt und getestet. Diese wies weitaus weniger Aktivität als der Wildtyp auf. Aufgrund der schweren Vorhersagbarkeit hätten eventuell mehr Mutanten im Bereich von Alanin 130 erstellt werden müssen; auch denkbar wäre ein Deletionsscanning, nach der Art des Alanin-Scanning,[203] bei dem jede Aminosäure einzeln deletiert wird. Die Variante A130G basierte auf der gleichen Strategie wie die Alanin 130 Deletionsmu- tante. Durch diese Mutation sollte die Flexibilität erhöht werden und Räume für das β-Aminosäuregrundgerüst geschaffen werden. Es ist grundsätzlich bekannt, dass Glycine im Proteinrückgrat für eine erhöhte Flexibilität sorgen, der genau Einfluss ist jedoch schwer vorherzusagen.[204] Diese Mutation verhielt sich jedoch neutral und zeigte keine positiven Effekte auf den Umsatz von β-Aminosäurederivaten. Davon ausgehend, dass grundsätzlich ein Glycin an der richtigen Stelle im Rückgrat die gewünschte Flexibilität im aktiven Zentrum auslösen könnte, wäre hier ebenso ein Glycin-Scanning sinnvoll. Weinglass et al. konnten mit dieser Technik eine, durch eine Glutamat nach Aspartat Muta- tion nahezu völlig inaktivierte (10-fach geringere Aktivität), Laktose-Permease wieder

111 4 Diskussion aktivieren. Durch die Verkürzung des katalytisch aktiven Glutamats in der E325D-Variante der Permease war die räumliche Ausrichtung des aktiven Zentrums gestört wurden, da eine Salzbrücke von Position 325 mit Position R302 nicht mehr gebildet werden konnte. Ein Glycin-Scanning erzeugte die Variante V316G/E325D mit im Vergleich zur E325D-Mu- tante ~3,5-facher Verbesserung. Diese Reaktivierung war möglich, da durch die erhöhte Flexibilität an Position 316 die beiden, durch die Salzbrücke interagierenden Helices, sich einander annähern können.[205] Bezüglich der Deletionsstrategie lässt sich also festhalten, dass ein weniger rationaler Ansatz vermutlich eher zum Erfolg hätte führen können. Ein Deletions- und Glycin-Scan- ning wäre, mit einer Bibliothek von je circa 400 Varianten (bei ~400 Aminosäuren Enzym- länge), unter Verwendung des GluDH-gekoppelten Assays, ein guter zukünftiger Ansatz, um die Problemstellung dieser Arbeit zu lösen. Die Schaffung neuer Ankerpunkte wurde nur anhand der Mutante M136D versucht, die allerdings keine verbesserten Eigenschaften aufwies. Die Insertion einer negativ geladenen Spezies sollte hier die Interaktion mit der Carba- moylgruppe des β-Aminosäure Substrats verstärken und so die Umsetzung verbessern. Wie bereits erwähnt, führten Garrabou et al. ein vergleichbares rationales Design durch. Die polare, aber ungeladene Phosphatbindetasche der L-Rhamnulose-1-Phosphat Aldolase wurde durch ein eingeführtes Aspartat zerstört, aber gleichzeitig die Bindung des neuen Substrats ohne Phosphatgruppe verbessert. Die Verbesserung im Vergleich zum Wildtyp gegenüber dem neuen Substrat war allerdings nur zweifach, während die alte Aktivität fast vollständig zerstört wurde. Ein vergleichbaren Ansatz zur rationalen Modulation der Cofaktoraffinität führten Wulf et al. durch. Die Cofaktorspezifität der Polyol-Dehydrogenase PDH-11300 aus Deinococcus geothermalis wurde durch die Einzelmutation D55N von NADH zu NADPH geändert. Hier wurde durch die Entfernung einer negativen Ladung im Enzym die Bindung der negativ geladenen Cofaktor-Spezies ermöglicht. Interessanterweise blieb die Mutation ohne Einfluss auf die katalytischen Eigenschaften des Enzyms.[206]

112 4 Diskussion

Beide der hier vorgestellten Beispiele für die Schaffung neuer Ankerpunkte verwendeten die sehr konservative Mutation zwischen Aspartat und Asparagin bei der keinerlei sterische Änderungen erfolgen, sondern nur eine negative Ladung eingeführt oder entfernt wird. Bei der in dieser Arbeit durchgeführten Mutation von Methionin wird neben der gewünschten Veränderung der Ladung auch eine sterische Änderung eingeführt. So ist Methionin zwar länger, Aspartat jedoch durch die zweite Säuregruppe an dieser Stelle sterisch anspruchs- voller (Abbildung 4.5.1).

Abbildung 4.5.1: Vergleich der sterischen Ansprüche und Elektrostatiken (van der Waals Oberfläche und Adaptive Poisson-Boltzmann Elektrostatik[15]) von Methionin (links, blau) und Aspartat (rechts, orange). Aspartat zeigt wie gewünscht und erwartet die erhöhte negative Ladung, ist jedoch auch weitaus kürzer als Methionin. Im Bereich der Carboxylgruppe allerdings breiter.

Es gilt also, dass die Strategie der neuen Interaktionspunkte sehr vorsichtig durchgeführt werden muss, um das Enzym nicht zu inaktivieren. Eine Mutation von Glutamat/Aspartat nach Glutamin/Asparagin, oder umgekehrt, scheint hier die sicherste Möglichkeit zu sein. Die Strategie der Vergrößerung des aktiven Zentrums war die umfangreichste der drei Strategien und auch die erfolgreichste. An drei verschiedenen Positionen wurde insgesamt vier Mutationen durchgeführt, die ein breites Spektrum von Effekten zeigten. Die Mutation E127D, also der Ersatz des katalytisch aktiven Aspartats, führte zur vollstän- digen Inaktivierung des Enzyms. Vermutlich war die Verkleinerung der Seitenketten, im Vergleich zum erhöhten Raumanspruch der β-Aminosäure zu groß, so dass eine Katalyse nicht mehr möglich war. Interessanterweise entspricht diese Situation der bereits geschil- derten E325D-Mutante in der Laktose-Permease[205]. Eventuell könnte auch hier durch Flexibilisierung der richtigen Sekundärstrukturelemente eine Aktivierung der E127D Mutante erreicht werden. Die Mutante Q196N verhielt sich neutral, wie bereits vermutet war der Abstand zum Substrat zu groß um tatsächlich einen Einfluss auf den Umsatz auszuüben. Gleichzeitig

113 4 Diskussion brachte die Mutation keine Ladungsänderung und keinen sterischen Stress mit sich, so dass die Faltung der Carbamoylase nicht beeinflusst wurde. Am interessantesten sind sicherlich die Mutationen an Position 216, die mit einer Entfer- nung von > 6,5 Å ebenso relativ weit vom gebundenen Substrat entfernt liegen, aber dennoch die Aktivität gegenüber NCβPhe signifikant beeinflussen. Die Mutation V216A erzeugt wie geplant mehr Raum für die β-Aminosäure und erhöht die Aktivität gegenüber dem neuen Substrat um den Faktor 5. Die Glycin-Mutante hingegen sollte den gleichen Effekt erzeugen, verringert jedoch die Aktivität. Dies kann vermutlich auf die bereits erwähnte hohe Flexibilität von Glycin zurückzuführen sein. Die Position 216 liegt genau in der hinge-Region, also der Verbindung zwischen katalytischer und Dimerisierungsdomäne. Wird diese Region also strukturell geschwächt, wird damit die Katalyse negativ beeinflusst, insbesondere da der Rest Arginin 291 in der Dimerisierungsdomäne liegt, aber dennoch einen wichtigen Einfluss auf die Substratbindung hat, da er die Carboxylgruppe des Substrats komplexiert (Abbildung 4.5.2).

Abbildung 4.5.2: Monomer der L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens Mutante V216G. Glycin 216 (orange) liegt genau am Übergang der katalytischen Domäne (rot) zur Dimerisierungsdomäne (blau). Das Arginin 291 (grün) der Dimerisierungsdomäne bindet das Substrat NCβPhe (violett) an der Carboxylgruppe.

Für den positiven Effekt der Mutante V216A gibt es zwei mögliche Erklärungen: Der verringerte sterische Anspruch der V216A Mutante gibt dem neuen Substrat die Möglichkeit sich besser in die Bindungstasche anzupassen und verbessert dadurch die Katalyse. Dem widersprechen allerdings die Ergebnisse des Dockings von Wildtyp und

114 4 Diskussion

V216A (Kapitel 3.10.1), die für beide Varianten eine ähnliche Positionierung für NCβPhe und NCαTrp zeigen. Ebenso sind die Bindungsenergien zwischen beiden Substraten kaum unterschiedlich und für die Variante V216A für beide Substrate leicht erhöht. Die andere Möglichkeit ist, dass durch die Mutation von Valin zu Alanin die hinge-Region geringfügig flexibler geworden ist, so dass das neue Substrat besser gebunden werden kann. Dieser Effekt wäre durch ein Docking-Experiment nicht erkennbar, da hierfür das Proteinrückgrat als flexibel betrachtet werden müsste, dies ist mit aktuellen Dockingalgo- rithmen nicht möglich. Eine mögliche Umgehung dieser Limitation wäre eine MD-Simula- tion über einen längeren Zeitraum (~10 ns),[207] der es ermöglicht die Bewegung der beiden Domänen zueinander zu erfassen und ein anschließendes Docking der Substrate in die, im Laufe der Simulation erhaltenen, Screenshots. Wong et al. verwendeten diese Strategie erfolgreich für Docking-Experimente an der Protein Kinase A mit Balanol als Ligand bei einer MD-Simulationslänge von 1 ns.[208] Totrov und Abagyan weisen allerdings auch auf den immensen Rechenaufwand derartiger Methoden bei gleichzeitig nur gering- fügig erhöhter Effizienz hin.[189] Welche anderen Möglichkeiten um die Vorhersagekraft des rationalen Designs zu verbessern existieren? Ein wichtiger Faktor der enzymatischen Aktivität sind die elektrostatischen Wechselwirkungen innerhalb des Enzyms und zwischen Enzym und Substrat,[209-210] diese können jedoch durch den force-field-Ansatz des molekular modelling nur unzureichend wiedergegeben werden.[176, 211] Wu et al. konnten die Taxus chinensis Phenylalanin-Aminomutase (PAM) in eine selektive β-Lyase mutieren. Es war bekannt, dass die Regioselektivität durch elektrostatische Effekte kontrolliert wird, indem entweder der aromatische Ring, oder die Carboxylgruppe als Elektronensenke agieren und damit eine α-, beziehungsweise β-Addition fördern. Da die Berechnung der Elektrostatik mit den force-fields nicht möglich war, wurde eine Sätti- gungsmutagenese an Positionen um die aromatische- und die Carboxylbindetasche durch- geführt. Durch zwei kombinierte Mutation an den jeweiligen Bindetaschen konnte so die β-Selektivität von 49 auf 95% gesteigert werden.[212] In Zukunft werden klar die Methoden der quantum mechanics (QM) im Vordergrund stehen, da diese ein weitaus umfangreicheres Bild des aktiven Zentrums und aller beteiligten Wechselwirkungen zeigen. Es gilt allerdings festzustellen, dass bis heute die Computer basierten Methoden schon häufig scheitern, die in vitro beobachteten Tatsachen korrekt wiederzugeben. Somit ist das rationale Design weiterhin eine Methode des trial and error, die aber durch das Nachvollziehen der durch gerichtete Evolution erhaltenen Ergebnisse sicherlich verbessert werden kann.[213]

115 4 Diskussion

4.6 Rationales Design von β-Ureidopropionasen Das in Kapitel 3.8 beschriebende Design der β-Ureidopropionase aus Saccharomyces kluyveri war die alternative Herangehensweise zur Arbeit an der L-N-Carbamoylase. In diesem Fall sollte die β-Ureidopropionase, die bereits das β-Aminosäure-Grundgerüst in Form von NCβAla akzeptiert, dazu gebracht werden, die aromatische Seitenkette von NCβPhe zu akzeptieren. Martínez-Gómez et al. zeigten bereits die mögliche Verwendung der Agrobacterium tumefaciens β-Ureidopropionase zur Synthese von β-Aminosäuren. Sie konnten zeigen, dass diese Methylgruppen an der Position 3 und sogar einen Phenylring an der Position 2 akzeptiert, allerdings mit dramatisch verringerter Aktivität. Ebenso stellten sie, anhand eines Homologiemodells, fest, dass die sterischen Hinderungen für die Akzeptanz der größeren Substrate zum Teil von den katalytischen wichtigen oder an der Metallionenbindung beteiligten Glutamaten herrühren, was ein Redesign schwierig macht. Allerdings konnten sie auch zwei weitere Reste (A139, W218) identifizieren, die ebenfalls die vergrößerte Seiten- kette der neuen Substrate inhibieren. Eine erfolgreiche rationale Mutagenese auf dieser Basis konnte allerdings bis jetzt nicht erzielt werden.[192] In dieser Arbeit konnte auf die Kristallstruktur der entsprechenden β-Ureidopropionase zurückgegriffen werden und anhand dieser ein rationales Design geplant werden. Neben dem üblichen docking-Ansatz wurde auch, ausgehend von dem in der Kristallstruktur gebundenen Substrat, das NCβPhe in das aktive Zentrum eingebracht. Eine Energiemini- mierung zeigte drei Reste, die sterische Hinderungen aufweisen: das katalytisch aktive

Glutamat (ebenso wie in der βCarAT), sowie Serin 167 und Cystein 168. Beide Reste wurde in silico zu den kleineren Resten Alanin und Glycin mutiert und anschließend die Bindungs- energie zum Substrat bestimmt. Alle acht erstellten Mutanten zeigten einen positiven Effekt, die Doppelmutante additive Effekte, die Glycin-Glycin-Doppelmutante sogar einen kooperativen Effekt. In vitro wurden die Glycin-Einzelmutanten, sowie die Glycin-Glycin- Doppelmutante erstellt und mit dem GluDH-gekoppeltem Assay und durchgeführte Bioka- talysen mit der HPLC analysiert. Während bei der niedrigen Substratkonzentration (2 mM) im GluDH-gekoppelten Assay alle Mutanten eine verbesserte Aktivität zeigten, konnte bei den gemessen Biokatalysen über 46 h bei 20 mM Substratkonzentration kaum Aktivität für die Mutanten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Schlussfolgerung des rationalen Design, dass erhöhte Bindungsenergie auch einer verbesserten Aktivität entsprechen, nicht automatisch richtig ist.[214] Es ist leicht ein Szenario vorstellbar, das die erhaltenen Ergebnisse in silico und in vitro erklärt: Die beim modelling beobachtete erhöhte Bindungsenergie entspricht einem verrin-

116 4 Diskussion

gerten KM-Wert für das Substrat NCβPhe. Da es sich um ein nicht-natürliches Substrat handelt, kann davon ausgegangen werden, dass eine Substratkonzentration von 2 mM bereits unterhalb des KM-Werts des Wildtyps liegen, jedoch vermutlich der KM-Wert der Mutante darunter liegt. Bei den Biokatalysen über 46 h Stunden bei 20 mM Substratkon- zentration ist der Effekt des verbesserten KM-Werts zu vernachlässigen und anderen Effekte treten in den Vordergrund. So ist die Wechselzahl des Wildtyps vermutlich höher, da alle beteiligten Reste in der durch die Natur optimierten Anordnung zueinander stehen. Zudem ist die Stabilität des Wildtyps vermutlich weitaus höher, da die eingeführten Glycine eine Destabilisierung des aktiven Zentrums, oder des gesamten Enzyms bewirken können. Dieser Effekt kommt insbesondere bei längeren Biokatalysen zum tragen. Inter- essant für zukünftige Arbeiten wäre hier zunächst eine Stabilisierung des Enzyms durch bekannte Methoden und das anschließende Einführen der hier beschriebenen Mutationen. Eine derartig erzeugte Variante könnte unter Umständen die gewünschten Eigenschaften zeigen. Der problematischen Zusammenhang zwischen Bindungsenergie und katalytischer Effi- zienz zeigt sich besonders deutlich im de novo Enzymdesign, hier werden die aktiven Zentren spezifisch auf die Bindung des vermuteten Übergangszustandes hin ausgerichtet. Die erhaltene Aktivität hingegen ist meist äußerst gering und kann nur durch extensive gerichtete Evolution wieder hergestellt werden.[215]

4.7 Rationales Design von Hydantoinasen Wie auch bei der Carbamoylase, stand für das rationale Design der Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. G21 keine Kristallstruktur zur Verfügung, so dass ein Homologiemo- dell verwendet werden musste. Neben dem docking der disubstituierten Aminosäuren wurde hier zur Evaluierung ebenfalls das Substrat aus dem natürlichen Substrat heraus erstellt, um Aminosäurereste, die eine Anbindung verhindern zu identifizieren. So konnten sieben Positionen identifiziert werden, an denen in silico eine vollständige Sättigungsmutagenese durchgeführt wurde. Es wurden also 140 Varianten am Computer auf verbesserte Bindungsenergie gegenüber MPH gescreent. Das screening am Computer ist eine alternative Strategie des rationalen Designs, es werden nicht nur wenige Mutationen vorgeschlagen, geprüft und dann in vitro durchge- führt, sondern größere Bibliotheken am Computer erstellt und zunächst in silico auf die gewünschten Eigenschaften geprüft. Die Varianten werden dann in einem Ranking gelistet und die besten in vitro getestet. Funke et al. haben beispielsweise das klassische Alanin-Screening an einer B. subtilis Lipase mit 1-(2-Naphthyl)ethylacetat als Substrat mit QM-Methoden durchgeführt und

117 4 Diskussion dabei insbesondere elektrostatische Einflüsse studiert. Der am Computer identifizierte Rest Histidin 76 zeigte, wie vorhergesagt, einen starken Einfluss auf die Enantioselektivität gegenüber diesem Substrat.[216] Gegenüber dem Substrat MPH konnte bei keiner der 17 erstellten Mutanten eine eindeutige Aktivität gezeigt werden, lediglich geringe Umsätze im Bereich von 0,01-0,32% bei 10 mM Substratkonzentration wurden beobachtet, diese konnten allerdings durch HPLC- Messung nicht bestätigt werden. Interessanterweise zeigten alle erstellten Varianten noch Aktivität gegenüber dem ursprünglichen Substrat BnH, viele sogar eine höhere Aktivität als der Wildtyp und nur eine Histidin- zu Alanin-Mutation eine signifikant verringerte Akti- vität. Diese Tatsache könnte für die Erzeugung einer neutral genetic drift Bibliothek genutzt werden. Insbesondere bei Enzymen, die durch Mutationen im aktiven Zentrum, leicht destabilisiert oder in der Faltung gestört werden, kann eine derartige Vorgehensweise von Vorteil sein.[217] So nutzt man die eher natürliche Evolution von Proteinen aus, bei der die neue Funktion erzeugt wird, ohne die ursprüngliche Funktion zu zerstören.[218] Eine Kombination neutraler Mutationen erzeugt so eine große Enzymvarianz, die mögliche neue Funktionen beeinhaltet. Bloom et al. zeigten in einer aus 34 Varianten bestehenden neutral genetic drift Bibliothek der P450-BM3 Monooxygenase, dass diese zum Teil dramatisch veränderte Substratspek- tren aufwiesen. Bei gleichbleibender Aktivität gegenüber dem ursprünglichen Substrat konnten teilweise bis zu vierfach erhöhte Aktivitäten gegen neue Substrate erreicht werden. Relevant ist hier, dass nicht gezielt auf ein neues Substrat hin designed wurde, sondern lediglich die erzeugten Varianten an einer Bibliothek aus sechs verschiedenen Substraten getestet wurden.[219] Eventuell könnte also für ein erfolgreiches Abschließen des Hydantoinase-Designs ein größeres Spektrum an Substraten getestet werden. Alternativ könnte man die erhaltenen Varianten mittels gene shuffling oder epPCR weiter dem neutralen gene drift überlassen und so eine größere Varianz erzeugen und diese anschließend, auch durch pooling,[193] mit einer größeren Auswahl an Substraten untersuchen.

4.8 Strukturaufklärung der Arthrobacter aurescens Carbamoylase Im Verlauf dieser Arbeit wurde die Struktur der hauptsächlich untersuchen Carbamoylase teilweise aufgeklärt. Durch eine Kombination aus Ni-basierter IMAC und Gelfiltration konnte ausreichend reines Protein erhalten werden, um Kristalle zu gewinnen. Unter den

Bedingungen 100 mM MES (pH 6,5) und 1,6 M MgSO4 und 20 mg/ml Proteinkonzentration

118 4 Diskussion kristallisierte die Carbamoylase. Allerdings konnte nur die Struktur der katalytischen Domäne (K5 - G215/E332 - R412) erhalten werden. Die Dimerisierungsdomäne war in der Kristallisationszelle nicht vorhanden. Die Auflösung war mit 1,59 Å sehr gut und gleichzeitig konnte auch eine gute Übereinstimmung mit den vorher erstellten Homologiemo- dellen gezeigt werden. Die gelöste Kristallstruktur konnte allerdings nicht dafür genutzt werden, die verbesserte Mutante V216A zu erklären, da in diesem Bereich die Elektronen- dichte nicht mehr eindeutig zuzuordnen war. Für die weitere Strukturaufklärung wurde das Carbamoylasegen optimiert und ein weiterer Affinitätstag einkloniert. Zudem wurden Proteaseschnittstellen eingeführt, die eine proteo- lytische Abspaltung der zumeist ungeordneten Tags erlauben. Bis zum Abschluss der Arbeit konnten allerdings auch mit dem verbesserten Konstrukt keine weiteren Kristalle erhalten werden. Eine weitere Möglichkeit die vollständige Struktur aufzuklären wäre die Flexibilität zwischen der Dimerisierungsdomäne und der katalytischen Domäne zu minimieren. Dies könnte in einem ähnlichen Ansatz wie die rationale Thermostabilisierung durchgeführt werden. Potentiell zu flexible Reste, wie Glycine, werden durch stabilisierende Reste ausgetauscht. Da die bisher einzige aufgeklärte Struktur einer L-Carbamoylase aus einem thermostabilen Organismus stammt, liegt es Nahe, die in dieser Arbeit verwendete Carba- moylase dahingehend zu mutieren. Ericsson et al. zeigten bereits den Zusammenhang zwischen Thermostabilität und guter Eignung zur Strukturaufklärung. Durch Einsatz des Thermofluor-Assays wurden mit hohem Durchsatz thermostabilisierende Additive identifiziert. Der Einsatz dieser Additive in den Kristallisationsscreenings führte zu doppelt so vielen Kristallisationserfolgen.[220]

119

ZUSAMMENFASSUNG

“many of the truths that we cling to depend on our point of view.“

Yoda

5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung Das Ziel dieser Arbeit war die Adaption des etablierten Hydantoinase-Prozess an die Herstellung nicht-natürlicher Aminosäuren, wie zum Beispiel β-Phenylalanin oder 2-Me- thyl-Phenylglycin. Zunächst wurden in dieser Arbeit Assaysysteme entwickelt, die Carbamoylase und Hydan- toinase-Aktivität nachweisen konnten. Darunter war ein Selektionsassay auf Basis von Stickstoffmangel, dessen prinzipielle Anwendbarkeit gegenüber der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens und dem Substrat NCαTrp gezeigt werden konnte. Die Limitationen dieses Assays wurden ebenfalls aufgezeigt, da aufgrund des hohen Selektionsdrucks die Selektion von komplexen Biblio- theken zur Selektion von verkürzten Mutanten führt. Als Alternative wurde ein, auf der Messung der Oxidation von NADH zu NAD + basierender, Assay im Mikrotiterplattenformat entwickelt. Dazu wurde die Aktivität der zu messenden Carbamoylase über das erzeugte Ammonium an die Aktivität einer kommerziellen Glutamat-Dehydrogenase gekoppelt. Unter Verwendung von aufgereinigtem Enzym konnte der Assay erfolgreich mit bereits etablierten und ebenso in dieser Arbeit verwendeten, Methoden der HPLC oder der Leitfähigkeitsmessung validiert werden. Zur Veränderung des Substratspektrums der gewählten Enzyme wurde verschiedene Methoden des protein-engineering genutzt. Als Varianten der gerichteten Evolution wurden gene shuffling und Zufallsinsertions-Methoden eingesetzt. Es zeigte sich allerdings, dass die Methoden stärker gewesen wären, wenn sie in einem zweiten Optimierungsschritt verwendet worden wären. Zusätzlich wurde ein CASTing Ansatz angewandt. Diese semi-rationale Methode ist eine verlässliche Methode zur Änderung des Substratspektrums und wurde bereits vielfach eingesetzt. In dieser Arbeit wurden drei verschiedenen Bibliotheken, bestehend aus zwei, drei und fünf mutagenisierten Aminosäuren, erstellt. Insgesamt wurden in diesen Biblio- theken 18.000 Varianten durchmustert, dennoch konnte damit kein Erfolg erzielt werden. Vermutlich war die überprüfte Variantenanzahl immernoch zu klein, oder die Varianz der Bibliotheken, durch die Verwendungen von NDT-Primern zu gering. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf dem rationalen Design; auf Grundlage von Homolo- giemodellen oder Kristallstrukturen wurden, mit Hilfe von docking-Ansätzen und moleku- lardynamischen Methoden, Mutationen mit den gewünschten Eigenschaften vorhergesagt.

123 5 Zusammenfassung

7 erzeugte Varianten, V216A mit 5-fach erhöhter Aktivität gegenüber Wachstums- und 2000 überprüfte NCβPhe GluDH-Aassay Varianten ohne Leitfähigkeitsassay erhöhte Aktivität und HPLC gegenüber NCβPhe

Rationales Design Gene shuffling basierend auf einem mittels DOGS Homologiemodell und Docking- Rationales Design Experimenten basierend auf einer Kristallstruktur mit Substrat/Produkt im aktiven Zentrum

Semirationales Design mittels CASTing Drei Varianten mit verbesserter AauHyuC SklβUp HPLC initialer Aktivität ~18.000 gegenüber überprüfte NCβPhe Varianten ohne erhöhte Aktivität Wachstums-, gegenüber GluDH- und NCβPhe Leitfähigkeitsassay OspHyuH Rationales Design basierend auf einem Homologiemodell und substrate-building im aktiven Zentrum

Ehrlich-Test und HPLC

14 Varianten mit bis zu 2-fach erhöhter Aktivität gegenüber dem Ausgangssubstrat

Abbildung 5.1: Übersicht über die in dieser Arbeit durchgeführten Mutagenesen an der Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens (AauHyuC), der β-Alanin Synthase aus Saccharomyces kluyveri (SklβUp) und der Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. (OspHyuH).

Im Fall der untersuchten Carbamoylase wurden die Eigenschaften des ursprünglichen und des neuen Substrats verglichen und anhand dessen Strategien für die Mutagenese entwickelt. Mit vier verschiedenen Strategien wurden sieben verschiedene Mutationen vorgeschlagen. Letztlich zeigte eine von sieben rationalen Varianten die gewünschte geänderte Substratspezifität und setzt das Zielsubstrat mit fünffach erhöhter Geschwindigkeit im Vergleich zum Wildtyp um.

124 5 Zusammenfassung

Das rationale Design der Hydantoinase verlief nicht so erfolgreich. Auf Basis des Homolog- modells wurde ein docking des Wildtypsubstrats durchgeführt. Anhand dessen konnte das gewünschte Substrat in das aktive Zentrum gelegt und sterisch behindernde Aminosäure- reste identifiziert werden. Es wurden sieben Positionen identifiziert und dann, zum Teil in Kombination, mutiert. Es konnten nur minimale, nicht reproduzierbare Aktivitäten gegen- über dem neuen Zielsubstrat erreicht werden. Es wurde jedoch eine 14 Varianten umfas- sende Bibliothek erzeugt, die als Basis für eine neutral-drift Evolution verwendet werden kann, da alle erzeugten Mutanten immer noch solide und größtenteils erhöhte Aktivität gegenüber dem Wildtypsubstrat zeigen. In Abbildung 5.1 sind die in dieser Arbeit durchgeführten Mutagenesen und deren Ergeb- nisse schematisch zusammengefasst. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass trotz der, unter Anderem, durch fehlende Kristallstrukturen bedingten schwierigen Ausgangsposition, das Projekt durch die Verwen- dung vieler unterschiedlicher Methoden zum erfolgreichen Abschluss gebracht werden konnte. Das rationale Design brachte die Variante V216A mit fünffach erhöhter Aktivität gegenüber NCβPhe hervor. Weitere der etablierten Methoden, insbesondere der Assays, aber auch der Mutagenesetechniken, sowie die in dieser Arbeit erzeugten Bibliotheken sind für zukünftige Arbeiten interessant.

125

MATERIALIEN & METHODEN

“already know you that which you need.“

Yoda

6 Materialien und Methoden

6.1 Geräte

Gerät/ Anwendung Bezeichnung Hersteller

Autoklav V-120 Systec (Wettenberg) Brutschränke Friocell MMM Medcenter-Einrichtungen Incucell GmbH (Grafelfing) DNA-Elektrophorese Sub Cell G Mini-Sub Cell GT Bio-Rad (München) Homogenisator FastPrep®-24 MP Biomedicals (Solon, USA) HPLC ELITE LaChrome Hitachi High-Technologies Europe Column Oven L-2300 GmbH (Mannheim) Organiser Autosampler L-2200 UV-Detektor L-2400 Pumpe L-2130 Inkubatoren Unitron Infors AG (Bottmingen-Basel, Schweiz) Leitfähigkeitsmessung multifunction meter CX-401 Elmetron® (Zarbrze, Polen) Magnetrührer IKAMAG® safty control MR 3001K IKA® Labortechnik (Staufen) (heizbar) IKAMAG®R RCT basic IKATRON® ETS-D4 fuzzy PCR-Geräte Thermocycler Progene Techne (Cambridge, UK) Touchgene Gradient FlexCycler Analytik Jena (Jena) TPersonal Thermal Cycler Biometra (Göttingen) Proteinaufreinigung ÄKTA™ Purifier GE Healthcare Europe (München) UV-900 pH/C-900 Frac-95 Proteinelektrophorese Mini-PROTEAN 3 BioRad (München) Minigel-Twin Biometra (Göttingen) Roboterplattform Liquid Handling Robot - Bravo Agilent (Santa Clara, CA, USA) Spektrofotometer für Thermo Fisher Scientific Mikrotiterplatten - VarioSkan (Waltham, MA, USA) Spektrofotometer für Mikrotiterplatten – Omega BMG Inkubatoren - Cytomats: 2x 1550, Thermo Fisher Scientific 1x 470, 1x 450 (Waltham, MA, USA) Fast Liquid dispenser - Multidrop Thermo Fisher Scientific Combi (Waltham, MA, USA) Zentrifuge - Rotanta Robotic 460 Hettich AG (Bäch, Schweiz) Roboterarm - Fanuc F5 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) [172] Sicherheitswerkbank HeraSafe KS15 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) Spektrofotometer für VarioSkan Thermo Fisher Scientific Mikrotiterplatten (Waltham, MA, USA) Tecan infinite® M200 Pro Tecan Group Ltd. (Männedorf,

129 6 Materialien und Methoden

Schweiz) Thermomixer Thermomixer comfort R Eppendorf (Wessling-Berzdorf)

Ultraschall Sonoplus HD2070 und UW2070 BANDELIN electronic (Berlin)

UV-VIS Spektrophotometer UV mini 1240 Shimadzu (Duisburg) V-550 JASCO Labor-und Datentechnik GmbH (Gross-Umstadt) Vortex-Mixer 7-2020 Vortex-Genie neoLab (Heidelberg) Zentrifugen Heraeus Labofuge 400R Thermo Fisher Scientific Heraeus Multifuge 3S-R (Waltham) Heraeus Biofuge pico Heraeus Fresco 17

6.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Soweit nicht anders bezeichnet, wurden Chemikalien und Verbrauchsmaterialien von Fluka (Bruchs, Schweiz), Sigma (Steinheim, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), VWR (Hannover, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland) und StarLab (Ahrensburg, Deutschland) bezogen. Restriktionsenzyme und Polymerasen wurden von New England Biolabs GmbH (Beverly, MA, USA) bezogen. Primer wurden bei Invitrogen™ Life Technolo- gies GmbH (Darmstadt, Deutschland) bestellt .

6.3 Bakterienstämme

Organismus Stamm Genotyp

E. coli BL21 T1-resistent (fhuA2 [Ion] ompT gal (λ DE3) [dcm] ΔhsdS) E. coli JM109 endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–, mk+),relA1, supE44, Δ( lac-proAB) E. coli Top10 F mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ 80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) end A1 nupG

6.4 Enzyme

Enzym Organismus Kürzel Herkunft Literatur Glutamat- Bos taurus GDH Kommerziell von Sigma Aldrich Dehydrogenase L-N-Carbamoylase A. aurescens DSM 3747 AauHyuC Rekombinant hergestellt in E. coli [104] L-N-Carbamoylase G. stearothermophilus GstHyuC Rekombinant hergestellt in E. coli [108] L-N-Carbamoylase S. meliloti SmeHyuC Rekombinant hergestellt in E. coli [107] β-Ureidopropionase A. tumefaciens C58 βCarAT Rekombinant hergestellt in E. coli [192] β-Ureidopropionase S. kluyveri SklbUp Rekombinant hergestellt in E. coli [221] D-Hydantoinase Ochrobactrum spec. G21 OspHyuH Rekombinant hergestellt in E. coli [177]

130 6 Materialien und Methoden

6.5 Plasmide

Name Resistenzma Codiertes Gen Anmerkungen Literatur rker p491 Ampicillin SklbUp C-terminaler Histidin-Tag [221] pAMG4 Ampicillin βCarAT [192] pAW178-2 Ampicillin AauHyuC [104] pET52b Ampicillin AauHyuC N-terminaler Strep Tag diese Arbeit C-terminaler Histidin-Tag pET52b Ampicillin SklbUp N-terminaler Strep Tag diese Arbeit C-terminaler Histidin-Tag pJAVI80 Ampicillin GstHyuC [108] pSER35 Ampicillin SmeHyuC [107]

6.6 Primer Alle verwendeten QuikChangeTM-Primer (QC-Primer) wurden mit dem QuikChangeTM-Primer Design Tool von Stratagene erstellt. Alle Primer wurden getrocknet bestellt und nach Erhalt mit MilliQ-Wasser zu einer Konzentration von 100 pmol aufgefüllt. Vor der Verwen- dung wurden die Primerlösungen 1:10 mit MilliQ-Wasser verdünnt. Sequenzierungsprimer wurden zusätzlich direkt bei GATC-Biotech AG (Konstanz, Deutschland) bestellt.

Name Sequenz 5'-3' Verwendung 3'-Anker 5'-ctggtcctctagtatccacagcannnnnnnnnn-3' Einführung einer BciVI-Schnittstelle 3'-gaccaggagatcataggtgtccgt-5' 3'-NH2 5'-PO4 5'-Anker (Alanin) 5'-acgggtaccgtatccactcaggcg-' Einführung einer BciVI-Schnittstelle 3'-tgcccatggcataggtgagtccgcnnnnnnnnnn-5' und eines zusätzlichen zusätzlichen GCG-Codons 5'-Anker (Glycin) 5'-acgggtaccgtatccactcagggc-' Einführung einer BciVI-Schnittstelle 3'-tgcccatggcataggtgagtcccgnnnnnnnnnn-5' und eines zusätzlichen zusätzlichen GGC-Codons A130del ggaggaggaagggcgcttcagcagtg Deletion von Position 130 in AauHyuC A130del as cactgctgaagcgcccttcctcctcc Deletion von Position 130 in AauHyuC A130G aggaggaagggggccgcttcagcag Mutation A130G in AauHyuC A130G as ctgctgaagcggcccccttcctcct Mutation A130G in AauHyuC AauHyuCPuri fw cgcggatccgaccctgcagaaag Amplifikation der AauHyuC fügt BamH1 Schnittstelle am 5' ein AauHyuCPuri rv tttgacgtcgacccggtcaagtgccttc Amplifikation der AauHyuC fügt Sal1 Schnittstelle am 3' ein AtbCar fw atgacggcgggtaaaaacttga Amplifikation der βCarAT aus pAMG4 AtbCar rv tcattgcacgatctccgcagt Amplifikation der βCarAT aus pAMG4

131 6 Materialien und Methoden

Biotin fw 5'-acgggtaccgtatccactcag-3' Biotinylierung nach der Anlagerung 5'-Biotin des 3'-und 5'-Ankers Biotin rv 5'-ctggtcctctagtatccacagc-3' Biotinylierung nach der Anlagerung 5'-Biotin des 3'-und 5'-Ankers CAST Bereich I gttgtaacctccatcgttggcndtcgcndtttgcgggttgccg Erstellung einer CAST-Bibliothek in tcaaaggc Bereich I CAST Bereich I as gcctttgacggcaacccgcaaahngcgahngccaacgatg Erstellung einer CAST-Bibliothek in gaggttacaac Bereich I CAST Bereich II gccgtcaaaggcagaagcgacndtgccndtndtcccatgc Erstellung einer CAST-Bibliothek in acctgcgc Bereich II CAST Bereich II as tggcgcaggtgcatgggggtahnahnggcahngtcgcttc Erstellung einer CAST-Bibliothek in tgcctttgacg Bereich II CAST Bereich III ggatatcagcagtggggcgggcndtndttcgatgttcatcg Erstellung einer CAST-Bibliothek in cccaggtca Bereich III CAST Bereich III tgacctgggcgatgaacatcgaahnahngcccgccccact Erstellung einer CAST-Bibliothek in as gctgatatcc Bereich III CAST Bereich IV gttgtaacctccatcgttggcndtcgcndtttgcgggttgccg Erstellung einer CAST-Bibliothek in tcaaaggc Bereich IV CAST Bereich IV gcctttgacggcaacccgcaaahngcgahngccaacgatg Erstellung einer CAST-Bibliothek in as gaggttacaac Bereich IV DOGS bCarAT fw agaacatatgacggcgggtaaaaacttgac 5'-DOGS-Primer für βCarAT DOGS bCarAT rv aaaaggatcctcattgcacgatctccgcagtc 3'-DOGS-Primer für βCarAT DOGS SklbUP fw agaacatatgtctaaagacgtatctagtactattac 5'-DOGS-Primer für SklbUp DOGS SklbUP rv aaaaggatcctcagtgccctctaatcactctgta 3'-DOGS-Primer für SklbUp DOGS1 GSH fw ggywsmcacttcgattctgtccsvrmmg DOGS 5' Primer für Segment 2 DOGS1 GSH rv ckkybsggacagaatcgaagtgkswrcc DOGS 3' Primer für Segment 1 DOGS2 EEGARF fw bgargaaggggcccgcttcagcaskkscw DOGS 5' Primer für Segment 3 DOGS2 EEGARF rv wgsmmstgctgaagcgggccccttcytcv DOGS 3' Primer für Segment 2 DOGS3 HIEQ fw dcayatygaacaaggaccgatcctcgarg DOGS 5' Primer für Segment 4 DOGS3 HIEQ rv cytcgaggatcggtccttgttcratrtgh DOGS 3' Primer für Segment 3 DOGS4 GTTP fw ccayrccggcacaacccccatgsmsmt DOGS 5' Primer für Segment 5 DOGS4 GTTP rv akskscatgggggttgtgccggyrtgg DOGS 3' Primer für Segment 4 DOGS5 VPGE fw bccvggbgaggtggacttcacactsgayy DOGS 5' Primer für Segment 6 DOGS5 VPGE rv rrtcsagtgtgaagtccacctcvccbggv DOGS 3' Primer für Segment 5 DOGS6 SGAG fw swsyggbgcgggccacgactcgatgyyvr DOGS 5' Primer für Segment 7 DOGS6 SGAG rv ybrrcatcgagtcgtggcccgcvccrsws DOGS 3' Primer für Segment 6 DOGS7 hyuCrv aaaaggatcctcaccggtcaagtgccttca 3'-DOGS-Primer für AauHyuC E126N catcgcgatcgtgaacgaggaaggggccc Mutation E126N in AauHyuC E126N as gggccccttcctcgttcacgatcgcgatg Mutation E126N in AauHyuC E127D gatcgtggaggatgaaggggcccgc Mutation E172D in AauHyuC E127D as gcgggccccttcatcctccacgatc Mutation E172D in AauHyuC F148A ggcatcaacaccttcaaacacgccatggcctataagggcgc Mutation F148A in OspHyuH F148A as gcgcccttataggccatggcgtgtttgaaggtgttgatgcc Mutation F148A in OspHyuH F148A_Y151A cggcatcaacaccttcaaacacgccatggccgctaagggcg Kombinierte Mutation F148A und

132 6 Materialien und Methoden

cgttgatg Y151A in OspHyuH F148A_Y151A as catcaacgcgcccttagcggccatggcgtgtttgaaggtgtt Kombinierte Mutation F148A und gatgccg Y151A in OspHyuH F148V tcaacaccttcaaacacgtcatggcctataagggc Mutation F148V in OspHyuH F148V as gcccttataggccatgacgtgtttgaaggtgttga Mutation F148V in OspHyuH F148V_Y151G ggcatcaacaccttcaaacacgtcatggccggtaagggcgc Kombinierte Mutation F148V und gttgat Y151G in OspHyuH F148V_Y151G as atcaacgcgcccttaccggccatgacgtgtttgaaggtgttg Kombinierte Mutation F148V und atgcc Y151G in OspHyuH F63S acccatctgcaaatgcccagcatggggacctattcttc Mutation F63S in OspHyuH F63S as gaagaataggtccccatgctgggcatttgcagatgggt Mutation F63S in OspHyuH F63V ccatctgcaaatgcccgtcatggggacctattc Mutation F63V in OspHyuH F63V as gaataggtccccatgacgggcatttgcagatgg Mutation F63V in OspHyuH H179A ccatgccgctcgtcgctgctgaaaacggcg Mutation H179A in OspHyuH H179A as cgccgttttcagcagcgacgagcggcatgg Mutation H179A in OspHyuH H179G ccatgccgctcgtcggtgctgaaaacggcg Mutation H179G in OspHyuH H179G as cgccgttttcagcaccgacgagcggcatgg Mutation H179G in OspHyuH K146A gcgcggcatcaacaccttcgcacacttcatggcctataag Mutation K146A in OspHyuH K146A as cttataggccatgaagtgtgcgaaggtgttgatgccgcgc Mutation K146A in OspHyuH K146A_F148A cgcggcatcaacaccttcgcacacgccatggcctataaggg Kombinierte Mutation K146A und cgc F148A in OspHyuH K146A_F148A as gcgcccttataggccatggcgtgtgcgaaggtgttgatgccg Kombinierte Mutation K146A und cg F148A in OspHyuH K146A_F148A_Y15 cgcggcatcaacaccttcgcacacgccatggccgctaaggg Kombinierte Mutation K146C, F148A 1A cgcggcgatggtgaatgatgacga und Y151A in OspHyuH K146A_F148A_Y15 tcgtcatcattcaccatcgccgcgcccttagcggccatggcgt Kombinierte Mutation K146C, F148A 1A as gtgcgaaggtgttgatgccgcg und Y151A in OspHyuH K146A_F148V_Y15 cggcatcaacaccttcgcacacgtcatggccggtaagggcg Kombinierte Mutation K146A, F148V, 1G_L155T cgacgatggtgaatgatgac Y151G und L155T in OspHyuH K146A_F148V_Y15 gtcatcattcaccatcgtcgcgcccttaccggccatgacgtgt Kombinierte Mutation K146A, F148V, 1G_L155T as gcgaaggtgttgatgccg Y151G und L155T in OspHyuH K146C gcgcggcatcaacaccttctgccacttcatggcctataagg Mutation K146C in OspHyuH K146C as ccttataggccatgaagtggcagaaggtgttgatgccgcgc Mutation K146C in OspHyuH K146C_F148V cgcggcatcaacaccttctgccacgtcatggcctataagggc Kombinierte Mutation K146C und g F148V in OspHyuH K146C_F148V as cgcccttataggccatgacgtggcagaaggtgttgatgccg Kombinierte Mutation K146C und cg F148V in OspHyuH L155A tggcctataagggcgcggcgatggtgaatgatga Mutation L155A in OpsHyuH cg L155A as cgtcatcattcaccatcgccgcgcccttataggcca Mutation L155A in OpsHyuH L155T tggcctataagggcgcgacgatggtgaatgatgacg Mutation L155T in OpsHyuH L155T as cgtcatcattcaccatcgtcgcgcccttataggcca Mutation L155T in OpsHyuH L92G gtggtcgatttcgtggggccggattccgaagg Mutation L92G in OspHyuH L92G as ccttcggaatccggccccacgaaatcgaccac Mutation L92G in OspHyuH Linker 5'-cagtcgcctgcagggcatggtggg-3' Einführung einer weiteren

133 6 Materialien und Methoden

3'-gtcagcggacgtcccgtaccacccttaa-5' PstI-Schnittstelle M136D cgcttcagcagtggcgatttgggcggccgggcc Mutation M136D in AauHyuC M136D as ggcccggccgcccaaatcgccactgctgaagcg Mutation M136D in AauHyuC PET52 HRV to TEV ccacccgcagttcgaaaagggtgcagagaaaccctctacttt Umwandlung der HRV-Protease cagggacccgggtacc Schnittstelle in pET52b in eine TEV Schnittstelle PET52 HRV to TEV ggtacccgggtccctgaaagtagaggttcttctgcaccctttt Umwandlung der HRV-Protease as cgaactgcgggtgg Schnittstelle in pET52b in eine TEV Schnittstelle Q196N gtgcttttatcgaactacacattgaaaacggaccgatcctcg Mutation Q196N in AauHyuC a Q196N as tcgaggatcggtccgttttcaatgtgtagttcgataaaagcac Mutation Q196N in AauHyuC SklPYD3 fw aaataagctatccaagaaatcatcaaaa Amplifikation der SklbUp aus p491 SklPYD3 rv cattgaaatgcatacgtcttaaagt Amplifikation der SklbUp aus p491 SklPYD3_55 fw atgtctaaagacgtatctagtactattact Amplifikation der SklbUp aus p491 mit 55°C annealing Temperatur SklPYD3_55 rv tcagtgccctctaatcactctg Amplifikation der SklbUp aus p491 mit 55°C annealing Temperatur V216A ctccatcgttggcgcgcgcgcattgcgggt Mutation V216A in AauHyuC V216A as acccgcaatgcgcgcgcgccaacgatggag Mutation V216A in AauHyuC V216G ctccatcgttggcggccgcgcattgcgggt Mutation V216G in AauHyuC V216G as acccgcaatgcgcggccgccaacgatggag Mutation V216G in AauHyuC Y151A cttcaaacacttcatggccgctaagggcgcgttgatggtg Mutation Y151A in OspHyuH Y151A as accatcaacgcgcccttagcggccatgaagtgtttgaag Mutation Y151A in OspHyuH Y151G cttcaaacacttcatggccggtaagggcgcgttgatggtg Mutation Y151G in OspHyuH Y151G as caccatcaacgcgcccttaccggccatgaagtgtt Mutation Y151G in OspHyuH tgaag

6.7 Medien und Zusätze

6.7.1 Medien LB-Medium: Luria Bertani[222] LB-SOC: Sambrook[223] M9 Mangelmedium ohne Stickstoff[223]:

Salze: 6 g Na2HPO4

3 g KH2PO4 2,5 g NaCl

Zusätze: 100 µL 3 mg/ml CaCl2

100 µL 1 M MgSO4 • 7 H2O 2,5 mL 80% Glycerol 10 µL 0,5% Vitamin B1

134 6 Materialien und Methoden

100 µL 1000x Spurenelementlösung 0,5 mL 100% DMSO 50 mL 200-400 mM Substrat pNL-Medium:

Salze: 10,5 g K2HPO4

4,5 g KH2PO4

Zusätze: 0,1 g MgSO4 • 7 H2O 4 g Glucose 3,2 g L-Glutamin 0,005 g Thiamin HCl 0,054 g Fe(III)citrat

0,0025 g CoCl2 • 6 H2O

0,015 g MnCl2 • 4 H2O

0,0015 g CuCl2 • 2 H2O

0,003 g H3BO3

0,0025 g Na2MoO4 •2 H2O

0,008 g Zn(CH3COO)2 • 2 H2O auf 1 l, pH 6,8-6,9 tNL-Medium:

Salze: 5,4 g Na2HPO4

13,3 g KH2PO4 Zusätze: 1,7 g Zitronensäure 0,0084 g EDTA

0,1 g MgSO4 • 7 H2O 10 g Glucose

0,336 g NH4Cl 0,005 g Thiamin HCl 0,054 g Fe(III)citrat

0,0025 g CoCl2 • 6 H2O

0,015 g MnCl2 • 4 H2O

0,0015 g CuCl2 • 2 H2O

0,003 g H3BO3

0,0025 g Na2MoO4 •2 H2O

0,008 g Zn(CH3COO)2 • 2 H2O auf 1 l, pH 6,8-6,9

135 6 Materialien und Methoden

Die entsprechenden festen Nährböden / Agarplatten enthielten 1,5% Agar. Alle Medien wurden für 20 min bei 121°C autoklaviert. Zusätze wurden sterilfiltriert.

6.7.2 Zusätze

6.7.2.1 Antibiotika Ampicillin Stammlösung: 100 mg/ml Endkonzentration: 100 μg/ml

6.7.2.2 Induktoren L-Rhamnose Stammlösung: 20% (w/v) Endkonzentration: 0,2% (w/v)

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Stammlösung: 1 M Endkonzentration: 1 mM

6.7.2.3 Spurenelemente

1000 x Spurenelementlösung: 0,01 g CuSO4 • 5 H2O

0,0089 g MnCl2 • 4 H2O

0,005 g CoCl2 • 6 H2O

0,002 g H3BO3

0,0025 g Na2MoO4 • 2 H2O

0,00654 g ZnCl2

0,218 g Na2MoO4

0,01 g NiSO4 • 6 H2O

0,4 g FeSO4 • 7 H2O

6.8 Puffer und Lösungen

6.8.1 Agarosegelelektrophorese

6.8.1.1 50x TAE-Puffer Tris 242 g Essigsäure 57,1 mL 0,5 M EDTA 100 mL mit destilliertem Wasser auf 1 L auffüllen, pH 8,0 einstellen

136 6 Materialien und Methoden

6.8.1.2 6x-DNA-Auftragespuffer 10x TAE-Puffer Bromphenolblau 0,25% (w/v) Glycerol 30% (v/v)

6.8.1.3 DNA-Marker 1 kbp DNA-Leiter von Roth (Karlsruhe, Deutschland) (0,5 bis 10 kbp)

6.8.2 Coomassie-Färbung/Entfärbung

6.8.2.1 Färbelösung Coomassie Brilliant BlueG250 1 g Essigsäure 100 mL Methanol 300 mL A. dest. 600 mL

6.8.2.2 Entfärber-Lösung Essigsäure 100 mL Ethanol 300 mL A. dest. 600 mL

6.8.3 Herstellung kompetenter Zellen

6.8.3.1 RF 1-Puffer (400 mL, in A. dest.)

RbCl2 100 mM

MnCl2 • 4 H2O 50 mM

CH3COOK 30 mM

CaCl2 • 6 H2O 10 mM Glycerol 15%

pH auf 5,8 mit 0,2 M CH3COOH einstellen, sterilfiltrieren

6.8.3.2 RF 2-Puffer (80 mL, in A. dest.) RbCl 10 mM

CaCl2 • 6 H2O 75 mM MOPS 10 mM Glycerol 15% pH auf 7,0 einstellen (mit NaOH), sterilfiltrieren

137 6 Materialien und Methoden

6.8.4 Lösungen und Puffer für SDS-PAGE

6.8.4.1 10x SDS-PAGE-Laufpuffer, pH 8,4 Tris 30,3 g Glycin 144 g SDS 10 g A. dest. ad. 1 l

6.8.4.2 APS-Lösung Ammoniumpersulfat 10%

6.8.4.3 Acrylamid-Lösung (Roth) Acrylamid 30% Bisacrylamid 0,8% in A. dest.

6.8.4.4 Auftragepuffer für SDS-PAGE A. dest. 3,55 mL Tris-HCl (0,5 M; pH 8,0) 1,25 mL Glycerol 2,5 mL SDS (10%) 2 mL Bromphenolblau (0,5%) 0,2 mL β-Mercaptoethanol 0,5 mL A. dest. ad. 10 mL

6.8.4.5 Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) „Lower Tris“ Tris 18,2 g SDS 0,1 g A. dest. ad. 100 mL

6.8.4.6 Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) „Upper Tris“ Tris 6 g SDS 0,1 g A. dest. ad. 100 mL

138 6 Materialien und Methoden

6.8.5 Zell- und Protein-Puffer

Natriumphosphatpuffer 50 mM, pH 7,5

NaH2PO4 • H2O 8 mM

Na2HPO4 • 12 H2O 42 mM A. dest. ad. 1 l

BES Puffer (20 mM, pH 7,5) BES 20 mM mit gesättigter Bis-Tris-lösung auf pH 7,5 einstellen

6.8.6 Proteinreinigung

6.8.6.1 Histidin-Tag Reinigungspuffer für die ÄKTA

Wasch und Auftragepuffer A

NaH2PO4 • H2O 8 mM

Na2HPO4 • 12 H2O 42 mM NaCl 500 mM A. dest. ad. 1 l

Elutionspuffer B

NaH2PO4 • H2O 8 mM

Na2HPO4 • 12 H2O 42 mM NaCl 500 mM Imidazol 300 mM A. dest. ad. 1 l

6.8.6.2 Strep-Tag Reinigungspuffer für die ÄKTA

NP-Puffer

NaH2PO4 50 mM NaCl 300 mM A. dest. ad. 1 L pH mit NaOH auf 8 einstellen

NPD-Puffer

NaH2PO4 50 mM NaCl 300 mM

139 6 Materialien und Methoden

Desthiobiotin 2,5 mM A. dest. ad. 1 L pH mit NaOH auf 8 einstellen

6.8.7 Assay Lösungen

6.8.7.1 Leitfähigkeitsassay-Substratlösung DMSO 5% Substrat (NCαTrp oder NCβPhe) 20 mM in BES Puffer (20 mM, pH 7,5)

6.8.7.2 Ehrlich-Reagenz 4-Dimethylaminobenzaldehyd 1 g Salzsäure, 6 N 5 mL A. dest. 5 mL (Lösung lichtgeschützt aufbewahrt)

6.9 Methoden

6.9.1 Mikrobiologische und Molekularbiologische Methoden

6.9.1.1 Stammhaltung Zur längeren Aufbewahrung der Stämme wurden Glycerinkulturen angefertigt. Dazu wurden Übernachtkulturen mit Glycerin (Endkonzentration 36%) vermischt und bei -80°C gelagert. Alle Stämme wurden außerdem auf entsprechenden Agarplatten ausgestrichen, bei 4°C aufbewahrt und alle 6-8 Wochen auf frische Platten überimpft.

6.9.1.2 Herstellung chemisch kompetenter Zellen Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen erfolgte nach der Rubidiumchlorid- Methode.[224] Dafür wurden zunächst 100 mL LB-Medium mit einer Übernachtkultur des entsprechenden Stammes angeimpft und bei 37°C (E. coli JM 109 bei 30°C) bis

OD600 = 0,3 – 0,5 geschüttelt, anschließend 15 min auf Eis inkubiert und die Zellkultur zentrifugiert (20 min, 3112 g) Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 20 mL RF1-Puffer resuspendiert, erneut auf Eis für 15 min inkubiert und zentrifugiert (20 min, 3112 g, 4°C). Schließlich wurde das erhaltene Zellpellet in 4 mL RF2-Puffer resuspendiert, 15 min auf Eis inkubiert und in Reaktionsgefäße in Portionen von 50 μl aliquotiert. Die Aliquots wurden sofort schockgefroren und bei –80°C gelagert.

140 6 Materialien und Methoden

6.9.1.3 Transformation Zu 50 μl chemisch kompetenten Zellen wurde 5 μl Plasmid-DNA-Lösung gegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Hitzeschock für 45 s bei 42°C wurden die Zellen erneut auf Eis gekuhlt (2 min) und mit 250 μl LB-SOC versetzt. Anschließend wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und jeweils 100 μl des Transformationsansatzes zur Selektion auf LB-Agarplatten mit Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

6.9.1.4 Plasmidisolation Zur Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli wurde das GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) sowie das innuPREP Plasmid Mini Kits (Analytik Jena, Jena, Deutschland) verwendet. Dafür wurden jeweils 5 mL Übernachtkultur zentrifugiert (15 min, 3939 xg) und der Überstand verworfen. Die weitere Durchführung erfolgte wie im Protokoll des Kits beschrieben. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte mit 50 μl Eluti- onspuffer.

6.9.1.5 Sequenzierung Die Sequenzierung der DNA erfolgte bei der Firma GATC Biotech AG (Konstanz, Deutsch- land) mit den entsprechenden Primern.

6.9.1.6 Agarosegelelektrophorese

Analytische Agarosegelelektrophorese Zur Durchführung der DNA-Elektrophorese wurde ein horizontales Mini-Gel-System verwendet. 40 mL einer circa 80°C heißen, 1% Agaroselösung in TAE-Puffer wurden mit 2 μl Ethidiumbromid versetzt. In ein Flachbett wurde dann das Gel gegossen. Nach erfolgter Polymerisation wurde es in die Elektrophoresekammer gesetzt und mit 1x TAE-Puffer überschichtet. Die zu analysierenden DNA-Lösungen wurden mit Probenpuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Die elektrophoretische Trennung erfolgte 30 - 45 min bei einer Spannung von 85 – 100 V bis die Bromphenolblau-Bande etwa 2/3 des Gels durchlaufen hatte. Zur Auswertung und Dokumentation werden die DNA-Banden im Gel auf dem UV-Leuchttisch zur Fluoreszenz angeregt und das Bandenmuster fotografiert.

Präparative Agarosegelelektrophorese Die präparative Agarosegelelektrophorese erfolgte analog zur analytischen Variante, es wurden allerdings größere Probenmengen (bis zu 50 µL) eingesetzt. Nach der Gelelektro- phorese wurden die Banden mit den theoretisch vorhergesagten Größen verglichen, wobei die UV-Exposition so gering wie möglich gehalten wurde. Anschließend wurden die korrekten Banden aus dem Gel ausgeschnitten.

141 6 Materialien und Methoden

Mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (250) (Qiagen, Deutschland) wurden aus den Gelstücken die DNA-Fragmente isoliert. Es wurde zweimal mit 15 μl Elutionspuffer eluiert. Der DNA-Gehalt wurde mittels Photometer bestimmt.

6.9.1.7 PCR zur Genamplifikation Für gene shuffling Methoden und Klonierungen wurden die relevanten Gene zunächst mittels PCR amplifiziert, ein typischer Ansatz war dabei wie folgt (Tabelle 6.9.1):

Tabelle 6.9.1: Ansatz für eine PCR

Komponente Volumen [µL] 10x Reaktionspuffer 5 DMSO 0-1 ds Matrize 1 Primer fw 1 Primer rv 1 dNTP-Mix (10 mM je dNTP) 1 Pfu+-Polymerase 1

H2O ad. 50

Die das übliche Programm zur Amplifizierung war folgendes (Tabelle 6.9.2):

Tabelle 6.9.2: Programm zur Amplifizierung von Genen.

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 1 Denaturierung 95 30 Primeranlagerung je nach Primer 45 20-30 Verlängerung 72 60/kbp Verlängerung 72 300 1

6.9.1.8 Positionsgerichtete Mutagenese Die positionsgerichtete Mutagenese wurde nach der QuikChangeTM-Methode (Stratagene, Agilent Technologies, La Jolla, USA) durchgeführt, um spezifische L-N-Carbamoylase-Mu- tanten zu generieren. Diese Methode ist vergleichbar mit einer PCR. Es werden komple- mentäre Primer verwendet, welche die gewünschten Nukleotidaustausche enthalten. Der Ansatz wurde wie folgt zusammengesetzt (Tabelle 6.9.3):

Tabelle 6.9.3: Reaktionsansatz zur positionsgerichteten Mutagenese mit der QuikChangeTM-Methode.

142 6 Materialien und Methoden

Komponente Menge [µL] 10x Reaktionspuffer 6 DMSO 0- 1 dNTP-Mix (10 mM je dNTP) 1 ds Matrizenplasmid 1 (ca. 80 ng) Pfu+-Polymerase 0,5 QC-Primer fw 0,5 QC-Primer rv 0,5 A dest. ad. 50

Der Ansatz wurde in folgendem PCR-Programm eingesetzt (Tabelle 6.9.4):

Tabelle 6.9.4: Programm zur positionsgerichteten Mutagenese mit der QuikChangeTM-Methode.

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 1 Denaturierung 95 30 Primeranlagerung je nach Primer 60 24 Verlängerung 72 60 s pro 1 kb Verlängerung 72 10 1

Im Anschluss wurde das parentale, methylierte Plasmid mit DpnI verdaut. Dazu wurde der Ansatz mit 1 μl DpnI versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert, anschließend folgte eine Hitzeinaktivierung von 80°C für 5 min. Ein Kontrollansatz (44 μl A. dest, 5 μl 10x Reakti- onspuffer und 1 μl ds Matrizenplasmid) wurde zur Überprüfung der Vollständigkeit des DpnI-Verdaus, auf die gleiche Art verdaut. Der fertige Ansatz und der Kontrollansatz wurden in chemisch kompetente E. coli Zellen transformiert (Kapitel 6.9.1.3). Sofern die Platte mit dem Kontrollansatz am nächsten Tag leer geblieben war, konnten die entstandenen Kolonien genutzt werden.

6.9.1.9 degenerate oligonucleotide gene-shuffling (DOGS)

Vorbereitung In Vorbereitung zum DOGS wurden zunächst die Gesamtgene der Carbamoylase aus A. aurescens, sowie der β-Ureidopropionasen aus S. kluyveri und A. tumefaciens wie in Kapitel 6.9.1.7 angegeben amplifiziert.

143 6 Materialien und Methoden

Erstellung der Einzelsegmente Die jeweils sieben Segmente eines Gens wurden parallel amplifiziert, dazu wurde folgender Ansatz und folgendes Programm genutzt (Tabelle 6.9.5):

Tabelle 6.9.5: Reaktionsansatz zur Amplifikation der Segmente für DOGS.

Komponente Volumen Volumen SklbUp Segment 2 [µL] [µL] 10x Reaktionspuffer 2,5 5 DMSO - 2 amplifiziertes Gen 0,5 1 Primer fw 0,5 2 Primer rv 0,5 2 dNTP-Mix (10 mM je dNTP) 0,5 4 Pfu+ 0,25 - Taq - 1

H2O 20,25 33

Die Segmente wurden mit folgendem Programm amplifiziert (Tabelle 6.9.6):

Tabelle 6.9.6: Programm zur Amplifikation der Segmente für DOGS.

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 (150 für SklβUP S2) 1 Denaturierung 95 30 (45 für SklβUP S2) Primeranlagerung 35 20 (40 für SklβUP S2) 35 Verlängerung 72 40 (50 für SklβUP S2) Verlängerung 72 600 1

Alle Segment wurden in einem 2% Agarosegel aufgetrennt und mittels Gel Extraktion isoliert. Die Größe der Einzelsegmente war wie folgt (Tabelle 6.9.7):

144 6 Materialien und Methoden

Tabelle 6.9.7: Größe der Einzelsegmente des DOGS-Ansatzes.

Größe [bp] Segment Nr. AauHyuC bCarAT SklbUp 1 272 295 377 2 169 177 172 3 228 240 248 4 135 141 144 5 185 191 195 6 227 276 281 7 178 198 212

Die Extraktion erfolgte nach Vorschrift, die Elution wurde mit 15 µL Elutionspuffer durch- geführt. Von allen Segmenten wurde der DNA-Gehalt bestimmt. Und der Quotient aus DNA-Gehalt in µg/µL und Größe in bp gebildet.

Rekombination der Segmente Von dem Fremd-Segment mit dem zweitkleinsten Quotienten wurden 3 µL eingesetzt, alle anderen Segmente wurden daran orientiert. Die parentalen Gensegmente wurden jeweils im 2,66 fachen Überschuss eingesetzt. Mit diesem Ansatz (Tabelle 6.9.8) wurde eine Rekombinations-PCR mit folgendem Programm (Tabelle 6.9.9) durchgeführt.

Tabelle 6.9.8: Ansatz für die Rekombinations-PCR für DOGS.

Komponente Menge [µL] 10x Reaktionspuffer 6 Segmente 49,5 dNTP-Mix (10 mM je dNTP) 2 Pfu+ 1 H2O 1,5

Tabelle 6.9.9: Programm für die Rekombinations-PCR für DOGS

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 1 Denaturierung 95 30 Segmentanlagerung 35 20 35 Verlängerung 72 40 Verlängerung 72 300 1

145 6 Materialien und Methoden

Die Produkte der Rekombinations-PCR werden anschließend in einer weiteren PCR mit folgendem Ansatz amplifiziert (Tabelle 6.9.10):

Tabelle 6.9.10: Ansatz für die Amplifikations-PCR der rekombinierten Produkte.

Komponente Menge [µL] 10x Reaktionspuffer 5 Rekombinations-PCR-Produkt 10 fw Primer 3 • 0,5 rv Primer 3 • 0,5 dNTP-Mix (10 mM je dNTP) 2 Pfu+ 1

H2O 29

Für die Amplifikation wurde das nachfolgende Programm genutzt (Tabelle 6.9.11):

Tabelle 6.9.11: Programm für die Amplifikation der rekombinierten Produkte.

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 1 Denaturierung 95 30 Primeranlagerung 53 45 30 Verlängerung 72 90 Verlängerung 72 300 1

Die rekombinierten und amplifizierten Produkte wurden mit geeigneten Restriktionsen- zymen verdaut und im Anschluss über eine Gelextraktion aufgereinigt. Die so erhaltenen Fragmente konnten anschließend in den komplementär verdauten Vektor einkloniert werden.

6.9.1.10 Restriktionsverdau Ein Verdau mit Restriktionsenzymen wurde genutzt um mutierte Gene zurück in den Vektor zu klonieren oder die Wildtyp-Variante in einen neuen Vektor zu überführen. Ein typischer Restriktionsverdau wurde wie folgt angesetzt (Tabelle 6.9.12):

Tabelle 6.9.12: Ansatz für den Verdau.

Komponente Menge [µL] Puffer 4 2,5 PCR-Produkt / Vektor 20,5 Restriktionsenzym 1 1 Restriktionsenzym 2 1

146 6 Materialien und Methoden

Der Verdau erfolgte für 3 h bei 37°C, anschließend wurden die Restriktionsenzyme für 15 min bei 80°C inaktiviert.

6.9.1.11 Ligation Die Ligation diente zur Einklonierung geschnittener Fragmente in einen entsprechend komplementär geschnittenen Vektor. Der typische Ansatz für eine Ligation sah dabei wie folgt aus (Tabelle 6.9.13):

Tabelle 6.9.13: Ansatz für eine Ligation.

Komponente Menge [µL] Puffer 5x 3 Plasmid 30 ng/µL 1 Insert x (30 ng) T7 Ligase 1

H2O ad. 15 µL

Dieser Ansatz wurde mit dem nachfolgenden Programm ligiert: Tabelle 6.9.14.

Tabelle 6.9.14: Programm einer typischen Ligation.

Schritt Temperatur Zeit [°C] [h] 20 2 16 4 Ligation 14 3 12 3 10 2 Hitzeinaktivierung 70 0,17

6.9.1.12 fast cloning

Primererstellung Es wurden vier Primer erstellt die je circa 30 bp umfassen, von denen 15 bp die Zielposi- tion binden und 15 bp für die spätere Rekombination dienen. Für das Primerdesign wurde das zu klonierende Gen in silico in den Zielvektor an die gewünschte Position eingefügt. Die Primer entsprachen nun den 30 bp um die Insertionstelle herum, und deren reverse complement, endeten die Primer auf A oder T wurde dieser um so viele Basenpaare verlängert das eine Endung auf G oder C möglich war.

147 6 Materialien und Methoden

Mit Hilfe der erstellten Primer wurde der Vektor und das gewünschte Gen nach folgendem Ansatz amplifiziert (Tabelle 6.9.15):

Tabelle 6.9.15: Ansatz zur Amplifikation von Vektor und Zielgen beim fast cloning.

Komponente Menge [µL] 10x Reaktionspuffer 5 Vektor oder Vektor mit Zielgen 1 Primer forward 1 Primer reverse 1 dNTP-Mix (10 mM je dNTP) 2 Pfu+ 0,5

H2O 39,5

Das hierfür verwendete Programm war wie folgt: Tabelle 6.9.16.

Tabelle 6.9.16: Programm zur Vektor- und Zielgenamplifikation für das fast cloning.

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 1 Denaturierung 95 30 Primeranlagerung 55 45 30 Verlängerung 72 300 (Vektor) 90 (Gen) Verlängerung 72 600 (Vektor) 300 (Gen) 1

Im Anschluss wurde die parentale, methylierte DNA mit DpnI verdaut. Dazu wurde der Ansatz mit 1 μl DpnI versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert, anschließend folgte eine Hitzeinaktivierung von 80°C für 5 min. Zwei Kontrollansätze (44 μl A.dest, 5 μl 10x Reak- tionspuffer und 1 μl ds Matrizenplasmid (Vektor und Vektor mit Zielgen) wurden zur Über- prüfung der Vollständigkeit des DpnI-Verdaus auf die gleiche Art verdaut. Der fertige Ansatz und der Kontrollansatz wurde in chemisch kompetente E. coli Zellen transformiert. Sofern die Platte mit dem Kontrollansatz am nächsten Tag leer geblieben war, konnten die entstandenen Kolonien genutzt werden.

148 6 Materialien und Methoden

6.9.1.13 Random Insertion and Deletion (RID) Die RID Methode diente der zufälligen Insertion einer Aminosäure (Alanin oder Glycin) im Gen der Arthrobacter aurescens Carbamoylase. Ein Schema über den vollständigen Ablauf der RID-Methode findet sich in Abbildung 6.9.1.

Abbildung 6.9.1: Ablauf der RID-Methode nach Murakami et al. [16]

149 6 Materialien und Methoden

Vorbereitung Das gesamte Gen wurde wie unter Kapitel 6.9.1.7 beschrieben amplifiziert. Im Anschluss daran wurde das Gen wie folgt verdaut (Tabelle 6.9.17):

Tabelle 6.9.17: Ansatz für den ersten Verdau des hyuC-Gens aus A. aurescens.

Komponente Menge [µL] Puffer 3 PCR-Produkt 15 NdeI (FD) 1 H2O 11

Der Ansatz wurde für 2 h bei 37°C verdaut und anschließend für 10 min bei 80°C hitzeinaktiviert. Der Ansatz wurde mit dem Roche PCR Clean-Up Kit von den abgedauten Oligo- nukleotiden befreit (300 µL Bindepuffer + 100 µL Bindeverstärker). Die Elution erfolgte mit 10 µL Elutionspuffer.

Schritt 1 Nach der Aufreinigung wurde an die NdeI Schnittstelle der Linker angelagert (Tabelle 6.9.18):

Tabelle 6.9.18: Ansatz für den ersten Verdau des hyuC-Gens aus A. aurescens.

Komponente Menge [µL] Puffer (10x FD) 4 Restriktionsprodukt 10 ATP (10 mM) 1 Linker (10 µM) 4 50 % PEG 4000 4 T4 DNA-Ligase 1 H2O 11

Der Ansatz wurde für 2 h bei 37°C ligiert und anschließend für 10 min bei 70°C hitzeinaktiviert. Zu dem Ansatz der Linker-Ligation wurde 1 µL BamHI (FD) gegeben und anschließend für 2 h bei 37°C verdaut und für 10 min bei 80°C hitzeinaktiviert. Der Ansatz wurde mit dem Roche PCR Clean-Up Kit von den abgedauten Oligonukleotiden befreit (300 µL Bindepuffer + 100 µL Bindeverstärker). Die Elution erfolgte mit 15 µL Elutionspuffer.

150 6 Materialien und Methoden

Schritt 2 Das mit BamHI verdaute Fragment wurde nach der Aufreinigung zirkularisiert (Tabelle 6.9.19,Tabelle 6.9.20):

Tabelle 6.9.19: Ansatz für die Zirkularisierung.

Komponente Menge [µL] Puffer (5x Rapid DNA 4 Ligation) Restriktionsprodukt 15 T4 DNA-Ligase 1

Tabelle 6.9.20: Programm für die Zirkularisierung.

Schritt Temperatur Zeit [°C] [h] 20 2 16 4 Ligation 14 3 12 3 10 2 Hitzeinaktivierung 70 0,17

Schritt 3 Zu dem zirkulären ds-Gen wurden 3 µL T4-DNA-Polymerase gegeben um den genickten Einzelstrang abzudauen. Der Ansatz wurde für 2 h bei 37°C und für 10 min bei 75°C inkubiert. Der Ansatz wurde mittels Ethanolfällung aufgereinigt.[225]

Schritt 4 Der so erstellte Einzelstrang wurde anschließend mit DNase unvollständig abgedaut. Der DNase-Verdau wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt (Tabelle 6.9.21):

Tabelle 6.9.21: Ansatz des DNase-Verdau

Komponente Menge [µL] ssDNA (circulär) 5 TrisHCl pH7,5 (500 mM) 4 MgCl2 (200 mM) 2 BSA (1 mg/ml) 1 Wasser 27,2 DNase (0,05 U/µL) 0,8

151 6 Materialien und Methoden

Im Anschluss wurde das Reaktionsgemisch mit 10 U Polynucleotidkinase für 10 min bei 37°C behandelt und anschließend mit Ethanolfällung aufgereinigt.

Schritt 5 An die so erhaltenen teilverdauten Einzelstrang DNA Segmente wurde der Anker ligiert (Tabelle 6.9.22):

Tabelle 6.9.22: Ansatz der Ankerligation

Komponente Menge [µL] ssDNA 5 TrisHCl pH7,5 (500mM) 4 MgCl2 (200mM) 2 BSA (1mg/ml) 1 PEG 6000 3,2 DTT (100 mM) 4 ATP (10 mM) 4 NaCl2 (1,5 M) 4 3' Anchor (200 µM) 1 5' Anchor (200 µM) 1 Wasser 9,8 T4-DNA-Ligase 1

Die Ligation wurde mit folgendem Programm durchgeführt (Tabelle 6.9.23):

Tabelle 6.9.23: Programm der Ankerligation.

Schritt Temperatur Zeit [°C] [h] 20 2 16 4 Ligation 14 3 12 3 10 2 Hitzeinaktivierung 70 0,17

Schritt 6 Mit den, mit Ankern ligierten Produkten wurde eine PCR mit Biotin-markierten Primern durchgeführt (Tabelle 6.9.24):

152 6 Materialien und Methoden

Tabelle 6.9.24: Ansatz der Biotin-PCR.

Komponente Menge [µL] ssDNA-Ankerligiert 5 Pfu+-Puffer 5 3' Primer (10 µM) 1 5' Primer (10 µM) 1 dNTPs (10 mM) 2 Wasser 35 Pfu+-Polymerase 1

Die PCR wurde mit folgendem Programm durchgeführt (Tabelle 6.9.25):

Tabelle 6.9.25: Programm der Biotin-PCR

Schritt Temperatur Zeit Zyklen [°C] [s] Denaturierung 95 60 1 Denaturierung 95 30 Primeranlagerung 58 45 20 Verlängerung 72 90 Verlängerung 72 300 1

Schritt 7 Das PCR-Produkt wurde mit BciVI verdaut, dabei wurden 5 U BciVI eingesetzt, der Verdau wurde 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 μl Avidin-Agarose zum Ansatz hinzugegeben und für 30 Minuten inkubiert, so wurden DNA mit Biotin und nicht geschnittene DNA entfernt. Der Ansatz wurde als nächstes mit dem High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche, Deutsch- land) (300 μl Bindepuffer + 100 μl Bindeverstarker) aufgereinigt. Es wurde mit 15 μl Eluti- onspuffer eluiert. Um überstehende Enden an den 3‘-Ende des Genfragments zu entfernen, wurden 10 μl Klenow-Fragment und 33 μM dNTPs für fünfzehn Minuten bei 25°C hinzugegeben. Anschließend wurde eine weitere Ethanolfällung durchgeführt.

Schritt 8 Im Anschluss wurde das Genfragment erneut zirkularisiert. Dabei wurden 15 μl von dem Ethanolfällungsprodukt mit 4 μl Puffer (5 X rapid DNA Ligation) und mit 1 μl T4-DNA-Ligase versetzt und anschließend wie folgt zirkularisiert (Tabelle 6.9.26):

153 6 Materialien und Methoden

Tabelle 6.9.26: Programm für die Zirkularisierung des Genfragments

Schritt Temperatur Zeit [°C] [h] 20 2 16 4 Ligation 14 3 12 3 10 2 Hitzeinaktivierung 70 0,17

Nach dem die dsDNA wieder zirkulär vorlag, wurde ein weiterer Verdau durchgeführt. Dazu wurden die Restriktionsendonucleasen BamHI und NdeI benutzt. Von jedem Enzym wurden 1 μl zum Reaktionsansatz der Ligation hinzugegeben. Der Ansatz wurde für zwei Stunden bei 37°C verdaut und anschließend bei 80°C für zehn Minuten hitzeinaktiviert. Das so erhaltene Produkt mit Insertion von Alanin oder Glycin an zufälliger Position konnte nun in den Vektor ligiert werden (Kapitel 6.9.1.11).

6.9.2 Biochemische Methoden

6.9.2.1 Proteinexpression der L-N-Carbamolyase (WT und Mutanten) aus A. aurescens DSM 3747, der β-Ureidopropionase aus S. kluyveri und der D- Hydantoinase aus Ochrobactrum sp. G 21 in E. coli Als Vorkulturen für die Kultivierung in Schüttelkolben wurden 5 ml Übernachtkulturen verwendet. Nach Zugabe der Antibiotika wurde mit den entsprechenden E. coli JM109 oder E. coli BL21 Klonen angeimpft. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C über Nacht. Angeimpft wurde die Kultur 1:50 mit der ÜN-Kultur. Die Kultivierung im 50 mL Maßstab erfolgte im 250 mL Schüttelkolben, für 400 ml im 2 l Schüttelkolben, jeweils mit Schikane bei 37°C.

Bei Erreichen einer OD600 = 0,5 - 0,6 wurde mit der L-Rhamnose-Lösung (Endkonzentra- tion 0,2%) oder IPTG (Endkonzentration 1 mM) induziert. Sechs Stunden nach der Induk- tion wurden die Kulturen durch Zentrifugieren geerntet (die Enzymvarianten mit Strep und Histidin-Tag wurden nach 16 h geerntet und bei 20°C nach der Induktion kultiviert). Die Pellets wurden einmal mit 20 mL kaltem Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) gewaschen und eingefroren gelagert.

6.9.2.2 Zellaufschluss

FastPrep®-24 Homogenisator Der Zellaufschluss im Homogenisator erfolgte in einem Volumen von 10-15 ml des Zielpuf- fers. Zu den suspendierten Zellen wurden etwa 5 ml Glaskugeln (0,2 mm Ø) gegeben. Die

154 6 Materialien und Methoden

Zellen wurden im Homogenisator mit 4 m/s für 40 s homogenisiert und im Anschluss für 5 min auf Eis gekühlt. Für jede Probe wurden dabei drei Durchgänge durchgeführt.

French Press Der Zellaufschluss in der French Press erfolgte in einem minimalen Volumen von 10 ml des Zielpuffers. Der Puffer, sowie die Druckzelle der French Press wurden dabei für mindestens 30 min auf Eis vorgekühlt. Der Aufschluss wurde in der mittleren Druckeinstellung bei 1500 psi durchgeführt. Die Öffnung der Druckzelle wurde dabei so eingestellt, das der Zellextrakt tropfenweise herausgedrückt wurde. Für jede Probe wurden dabei drei Durch- gänge durchgeführt.

Ultraschall Der Ultraschallaufschluss wurde für Proben mit kleinem Volumen genutzt. Kultivierungs- proben von 5/OD600 in mL wurden in 200 µL Puffer aufgenommen und für 1 min bei 40% Leistung und einer Pulsrate von 50% aufgeschlossen. Die Suspension wurde 5 min auf Eis gekühlt und im Anschluss mit den gleich Einstellungen erneut aufgeschlossen. Für größere Probenvolumina von etwa 10 ml erfolgte der Aufschluss für zweimal 5 min bei ansonsten gleichen Einstellungen.

6.9.2.3 Proteingehaltsbestimmung mit BC-Assay Der Proteingehalt wurde mit dem BC-Assay-Kit (Uptima/Interchim, Montlucon, Frankreich) nach Herstellerangaben bestimmt. Als Standard wurde BSA im geeigneten-Puffer eingesetzt.

6.9.2.4 SDS-PAGE Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese erfolgte wie in der Literatur beschrieben[226] in einem diskontinuierlichen System. Es wurden 12,5%ige Trenngele sowie 4%ige Sammel- gele verwendet (Tabelle 6.9.27):

Tabelle 6.9.27: Zusammensetzung der SDS-Gele.

Komponente Trenngel 12,5 % Sammelgel 4% Lower Tris, pH 8,8 2 mL - Upper Tris, pH 6,8 - 1 mL Acrylamidlösung 3,33 mL 0,53 mL A. dest. 2,67 mL 2,47 mL APS-Lösung 40 µL 40 µL TEMED 4 µL 4 µL

Tabelle 6.9.28: Proteinmarker Roti®-Mark Standard (Roth)

155 6 Materialien und Methoden

Protein Molekulargewicht [kDa] Myosin (Rind) 200 Β-Galactosidase (rekombinant aus E. coli) 119 Serumalbumin (Rind) 66 Ovalbumin (Huhn) 43 Carboanhydrase 29 Trypsin-Inhibitor 20 Lysozym (Huhn) 14,5

Für die Untersuchung mittels SDS-PAGE wurden 15 μL der Probe mit 5 µL Probenpuffer vermischt und bei 95°C 10 min denaturiert. Nach kurzem Zentrifugieren wurden die Proben aufgetragen. Die Proteine wurden zuerst bei 200 V und 12,5 mA (Stromstärke pro Gel) getrennt, bis der Indikator sich im Trenngel befand. Danach wurde die Stromstärke auf 25 mA pro Gel erhöht und die elektrophoretische Trennung für etwa 1 h fortgeführt, bis die blaue Lauffront aus dem Gel heraustrat.

Coomassie-Färbung-Entfärbung Um die Proteine im Gel sichtbar zu machen, wurde das Gel in die Coomassie-Färbelösung getaucht und unter leichtem Schütteln für 1 h inkubiert. Anschließend wurde das Gel solange in Entfärber-Lösung inkubiert, bis der Hintergrund nahezu farblos war und die Proteinbanden gut zu erkennen waren.

6.9.2.5 Reinigung von Histidin-Tag-Proteinen

Vorbereitung Der Zellaufschluss erfolgte in circa 10 ml Puffer A + 10% Puffer B in der French Press oder mittels FastPrep®-24 Homogenisator. Der Zellextrakt wurde mit 3112 g für 45 min zentrifugiert um die unlöslichen Zelltrümmer abzutrennen. Der Überstand wurde durch einen 0,2 µm Sterilfilter gepresst und konnte anschließend in der ÄKTA verwendet werden.

156 6 Materialien und Methoden

Reinigung Der Zellextrakt wurde unter Verwendung von 10% Puffer B auf die HisTrap FF Crude, 5 ml Säule (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) geladen. Anschließend wurde mit zwei Säulenvolumen und 20% Puffer B (60 mM Imidazol) gewaschen. Die Elution erfolgte über sieben Säulenvolumen mit 100% Puffer B (300 mM Imidazol), während der Elution wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Die Elutionsfraktionen die das Zielprotein enthielten wurden mittels Centricon (10 kDA cutoff) konzentriert und in den geeigneten Puffer umgepuffert. Nach Elution wurde die Säule zur Regeneration mit 6 Säulenvolumen Puffer A gewaschen.

6.9.2.6 Reinigung von StrepTag-Proteinen

Vorbereitung Der Zellaufschluss erfolgte in circa 10 mL Puffer NP in der French Press oder mittels Fast- Prep®-24 Homogenisator. Der Zellextrakt wurde mit 3112 g für 45 min zentrifugiert um die unlöslichen Zelltrümmer abzutrennen. Der Überstand wurde durch einen 0,2 µm Sterilfilter gepresst und konnte anschließend in der ÄKTA verwendet werden.

Reinigung Der Zellextrakt wurde unter Verwendung von Puffer NP auf die 1 ml Strep-Tactin Superflow Plus Cartridge-Säule von QIAgen (Hilden, Deutschland) geladen. Für drei Säulenvolumen wurde mit Puffer NP gewaschen. Die Elution erfolgte mit acht Säulenvolumen Puffer NPD, während der Elution wurden Fraktionen von 0,5 ml gesammelt. Die Elutionsfraktionen die das Zielprotein enthielten wurden mittels Zentricon (10 kDA) konzentriert und in den geeigneten Puffer umgepuffert. Nach Elution wurde die Säule 10 Säulenvolumen Puffer NP gewaschen und anschließend wie im Handbuch beschrieben regeneriert.

6.9.2.7 Proteinreinigung durch Gelfiltration Im Anschluss an eine Histidin-Tag oder Histidin- und Strep-Tag basierte Affinitätschroma- tografie wurde eine Gelfiltration durchgeführt, wenn das Protein zur Kristallisation eingesetzt werden sollte. Es wurde eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule verwendet. Der Fluss lag bei 0,2 ml/min und es wurden Elutionsfraktionen von 0,5 ml Größe gesammelt. Die Fraktionen die das Zielenzym enthielten wurden zusammengeführt und nach Bedarf im Zentricon aufkonzentriert.

157 6 Materialien und Methoden

6.9.2.8 Entfernung der Affinitätstags von der L-N-Carbamoylase aus A. aurescens durch Endoproteasen Im Anschluss an eine His und Strep-Tag basierte Affinitätschromatografie konnten die Tags mittels Endoproteaseverdau entfernt werden. In dem verwendeten pET52b(+) mit der Carbamoylase waren dafür eine TEV-Protease und eine Thrombin Schnittstelle vorge- sehen. Das zu verdauende Enzym wurde mit TEV-Protease im Verhältnis 1:50, besser 1:20 und Thrombin mit 60-90 U pro mg Zielenzym in NDP Puffer versetzt. Der Verdau lief über 10 d bei 4°C. Der Fortschritt des Verdaus wurde dabei mittels SDS-Gel überprüft.

6.9.3 Biokatalyse

6.9.3.1 GluDH gekoppelter Assay Im Zuge dieser Arbeit wurde ein GluDH gekoppelter Assay zur Messung von Carbamoyla- se-Aktivität unter Verbrauch von NADH mittels Glutamat-Dehydrogenase und Messung bei 340 nm etabliert. Die nachfolgend beschriebene Variante ist die finale Version des Assays.

Kultivierung Die zu testende Bibliothek wurde zunächst in einer Mikrotiterplatte über Nacht vorkulti- viert und anschließend in eine Deepwell-Platte mit frischem LB-Medium (2 ml pro Well) 1:50 überimpft. Die Zellen wurden für 4 h bei 37°C inkubiert anschließend abzentrifugiert und in frischem t-NL-Medium (2 ml pro Well) mit Induktor wieder aufgenommen. Die Expression erfolgte für 16 h bei 20°C. Im Anschluss daran wurden die Zellen durch Zentri- fugation geerntet und das Zellpellet für die spätere Verwendung bei -20°C gelagert.

Assaydurchführung Das Pellet wurde in 100 µL BugBusterTM aufgenommen und in eine Mikrotiterplatte über- führt. Die Lysis erfolgte für eine Stunde bei Raumtemperatur. Im Anschluss wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3112 g für 60 min abgetrennt. Der lösliche Über- stand konnte für den Assay verwendet werden. Der Assay wurde wie folgt zusammengesetzt (Tabelle 6.9.29):

Tabelle 6.9.29: Bestandteile des NADH gekoppelten Assays

Komponente Konzentration Volumen Endkonzentration [µL] Zellextrakt - 20-50 - α-Ketoglutarat 100 mM 20 10 mM Substrat 10 mM 40 2 mM NADH 2 mM 40 0,4 mM 60 min Inkubation bei 30°C

158 6 Materialien und Methoden

NADH 2 mM 40 0,4 mM Glutamat- 5 mg/ml 10 0,25 mg/ml Dehydrogenase

Zunächst wurden nur die ersten vier Bestandteile zusammengeführt und im Anschluss für 60 min bei 30°C inkubiert. Erst danach wurde das Nachweisenzym, sowie erneut NADH zugegeben und die Messung bei 340 nm über 30 min durchgeführt.

6.9.3.2 Leitfähigkeitsassay Zur Analyse im Leitfähigkeitsassay wurde das Pellet in BES-Puffer (20 mM, pH 7,5) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte mit Hilfe einer Ultraschallsonde (2*5 min bei 40% Leistung und einer Pulsrate von 50%) unter Eiskühlung. Anschließend wurde mit 3112 g für 45 min zentrifugiert. Der Überstand, in dem sich das lösliche Protein befand, wurde für den Assay verwendet. Aufgereinigtes Protein musste zuvor in BES-Puffer umgepuffert werden. Der Leitfähigkeitsassay dient der quantitativen Aktivitätsbestimmung von Carba- moylasen und wurde im 1 mL-Maßstab durchgeführt. Von der Substratlösung wurden 950 μl in einem 2 mL Reaktionsgefäß vorgelegt und in einem auf Raumtemperatur befindlichen Wasserglas für etwa 10 min vortemperiert. Zu Beginn der Messung wurde ein Magne- trührer in das Reaktionsgefäß gegeben und im Anschluss 50 μl Zellextrakt. Schnell wurde die Leitfähigkeitsmesselektrode in das Reaktionsgefäß eingebracht und dieses über den Rührer in ein bei Raumtemperatur befindliches ebenfalls durchgerührtes Wasserglas gestellt. Ein Thermometer maß konstant die Temperatur des Wassers. Über den Computer wurde die Messung verfolgt und alle 2 s ein Messpunkt aufgenommen. Zur Auswertung wurden die ersten 100 Messpunkte stets verworfen.

6.9.3.3 Ehrlich Test zum Nachweis von α-,α-disubstituierten Aminosäuren Es wurden 650 μL einer 10 mM Hydantoin-Lösung mit 50 μL Enzymlösung bei 50°C inkubiert und die Reaktion nach 10 min mit 400 μl 12%iger TCA abgestoppt. Im Anschluss wurden die unlöslichen Bestandteile abzentrifugiert. Jeweils 500 μl der Reaktionslösung wurden mit 300 μl Ehrlichreagenz gemischt und photometrisch bei 430 nm gemessen. Anschließend konnte, mittels Kalibrierung mit N-Carbamoyl-α-Phenylalanin, die Aktivität der Hydantoinase bestimmt werden.

6.9.3.4 HPLC-Analyse Zur Messung des Umsatzes der Mutanten gegen NCβPhe musste eine HPLC-Analytik etabliert werden. Die Analytik basiert auf Umkehrphasen-HPLC (reverse phase HPLC, RP- HPLC) und einer C18-Säule. Das gewählte Laufmittel war ein 20/80% Gemisch von Methanol und 0,1% TFA in Wasser. Bei einer Flussrate von 1 mL mit isokratischen Lauf-

159 6 Materialien und Methoden mittel konnte eine Trennung der carbamoylierten Aminosäure (NCαTrp und NCβPhe) und der freien Aminosäuren (αTrp und βPhe) erreicht werden. Durch die größere Polarität der freien Aminosäure wird diese zuerst eluiert. Die Tabelle 6.9.30 zeigt die Retentionszeiten der unterschiedlichen Substanzen:

Tabelle 6.9.30: Retentionszeiten der carbamoylierten und freien Aminosäuren.

Substanz Retentionszeit [min] β-Phenylalanin 1,5 N-carbamoyl-β-Phenylalanin 2,0 Phenyldihydrouracil 2,3 α-Tryptophan 2,4 N-carbamoyl-α-Tryptophan 4,5

Das gleiche System wurde für die α-,α-disubstituierten Aminosäuren gewählt, die Retenti- onszeiten waren wie folgt (Tabelle 6.9.31):

Tabelle 6.9.31: Retentionszeiten der α-,α-disubstituierten Aminosäuren und Derivaten.

Substanz Retentionszeit [min] Benzylhydantoin 18,7 Methyl-Phenylhydantoin 19,2 N-C-α-Phenylalain 17,5 N-C-α-Methyl-α-Phenyl-α-Aminosäure 14,5

Zur Messung der Biokatalysen verschiedener Enzymvarianten gegenüber den gewünschten Substraten wurden diese im 1 mL-Maßstab angesetzt. Zu 950 μl 10-20 mM Substratlösung in BES-Puffer (Carbamoylasen) oder Natriumphosphatpuffer (Hydantoinasen) wurden 50 μl des jeweiligen Zellextraktes, oder aufgereinigtes Enzym gegeben gegeben und die Reaktion bei 30°C und 650 rpm in einem Eppendorf-Schüttler inkubiert. Zum gegebenen Zeitpunkten wurden 100 µL Proben genommen und die Reaktion mit 5 μl konzentrierter Salzsäure abgestoppt. Zu dem Reaktionsansatz wurden 100 µL eiskaltes Methanol gegeben und so die Proteine gefällt. Die gefällten Proteine wurden für 20 min bei 17.000 g abzentrifugiert. Von dem Überstand wurden 20 μl in die HPLC injiziert.

160 6 Materialien und Methoden

6.9.4 Chemische Synthese

6.9.4.1 Herstellung von Phenyldihydrouracil aus Zimtsäure und Harnstoff 100 g Zimtsäure und 202,7 g Harnstoff (= 5facher Überschuss) wurden in einen 2L-Rund- kolben gegeben. Das Gemisch wurde im Ölbad bei 190°C für 2-3h unter Rückflusskühlung gerührt. Die während der Reaktion entstehende orangefarbene Schmelze wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Die erstarrte Schmelze wurde gemörsert und mit ~1,5 l Wasser 1-2 h gekocht und anschließend heiß abfiltriert. Das Filtrat wurde über Nacht bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Die entstehenden weißlich-gelben PheDU Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Das so gewonnene Rohprodukt war laut NMR noch verunreinigt. Für eine Feinreinigung von 10 g PheDU-Rohprodukt wurde dieses zusammen mit 200 ml Aceton für 5-10 min unter Rückfluss erhitzt und dann heiß abfiltriert. Der Filterrückstand wurde getrocknet. So gewonnenes PheDU war laut NMR reiner und wurde zur Synthese von N-Carbamoyl-β-Phenylalanin eingesetzt.

6.9.4.2 Herstellung von N-Carbamoyl-β-Phenylalanin aus Phenyldihydrouracil Phenyldihydrouracil wurde 50 mM in A. dest eingesetzt und mit 12,5% 1 M NaOH versetzt, die Reaktionslösung wurde so lange gerührt bis alles PheDU aufgelöst war. Die Reaktion konnte dann als vollständig betrachtet werden. Anschließend wurde die Lösung mit 11% 1 M HCl neutralisiert, um eine 40 mM neutrale Lösung an N-Carbamoyl-β-Phenylalanin zu erhalten oder mit 11% 2 M HCl ins Saure überführt, um NCβPhe über Nacht bei 4°C auszufällen. Das ausgefällte NCβPhe konnte im Anschluss abfiltriert und über Nacht im Exsikkator getrocknet werden.

6.9.5 Methoden des molecular modelling

6.9.5.1 Erstellung eines Homologiemodells Zur Erstellung eines Homologiemodells wurde Yasara genutzt. Die Proteinsequenz der L-N-Carbamyolase aus A. aurescens DSM 3747 wurde im .fasta-Format eingesetzt. Folgende Parameter wurden für die Erstellung genutzt: • Modeling speed (slow = best): Slow • Number of PSI-BLAST iterations in template search (PsiBLASTs): 6 • Maximum allowed PSI-BLAST E-value to consider template: 0.5 • Maximum number of templates to be used: 10 • Maximum number of templates with same sequence : 1

161 6 Materialien und Methoden

• Maximum oligomerization state: 2 (dimeric) • Maximum number of alignment variations per template: 10 • Maximum number of conformations tried per loop: 50 • Maximum number of residues added to the termini: 10

Es wurde das von Yasara vorgeschlagene Modell mit den besten Scores benutzt.

6.9.5.2 Energieminimierung Das Homologiemodell wurde mit dem md_refine.mcr von Yasara energieminimiert. Es wurde das YAMBER3-Kraftfeld[211] verwendet, welches auf dem AMBER99-Kraftfeld basiert. Es wurden einige Parameter des AMBER-Kraftfeldes mit Kristallstrukturen optimiert, wodurch sich das YAMBER3-Kraftfeld besonders für die Minimierung von Homologiemo- dellen eignet. Das Skript führt nach Definition der periodischen Simulationszelle, dem Hinzufügen von Wasser, der pKA-Berechnung und der Minimierung der Anfangsstruktur eine moleküldynamische Simulation von 500 ps durch. Wahrend dessen wird alle 25 ps die Simulationszelle gespeichert (“snapshots“). Die 20 snapshots werden anschließend einzeln energieminimiert. Am Schluss werden die freien Energien der minimierten snapshots in einer Tabelle ausgegeben. Es wurde stets der energieärmste Zustand als finales Model ausgewählt.

6.9.5.3 Docking Es wurde das Yasara beiliegende Macro dockrun.mcr genutzt. Als Rezeptor wurde das energieminimierte Homologiemodell genutzt, zum Teil mit durch docking erhaltenem Hydroxylion im aktiven Zentrum. Die Simulationszelle wurde über das Kohlenstoffatom der Guanidiniumgruppe des zentralen Arginin 291 gelegt und auf eine Größe von 12 • 12 • 12 Å festgelegt. Der Dockrun umfasste mindestens 100 Einzeldurchläufe und nutzte den VINA-Algorithmus. Alle Ligandenpositionen mit einer geringeren RMSD als 2,5 Å wurden zu einem Cluster zusammengefasst und die Ligandenposition mit der geringsten Energie pro Cluster angezeigt. Alle erhaltenen Cluster wurden durchmustert und neben der von Yasara erhaltenen Bindungsenergie auch die Qualität des Docks bestimmt.

6.10 Verwendete Computerprogramme

Programm Anwendung Firma/Quelle ACD/NMR Processor Bearbeitung und Auswertung von Advanced Chemistry Academic Edition NMR-Spektren Development, Inc. (ACD/Labs)[227]

162 6 Materialien und Methoden

Geneious Pro ab 5.0.2 Arbeiten mit Nukleotid- und Biomatters Ltd.[228] Proteinsequenzen YASARA ab 10.6.1 molecular modelling und docking YASARA 10.6.1 YASARA Bioscience, Graz, Österreich[229]

163 7 Literatur

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Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-Natur- wissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.