Poecilotheria Regalis (Pocock,1899)”

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA

“IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES TOXINAS PEPTÍDICAS PRESENTES EN EL VENENO DE LA TARÁNTULA Poecilotheria regalis (Pocock,1899)”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

PRESENTA

Q.F.Bt. LUIS FERNANDO DÍAZ PEÑA

DIRIGIDO POR

Dr. JOSÉ ALEJANDRO GARCÍA ARREDONDO

SANTIAGO DE QUERÉTARO, QUERÉTARO, 2017

AGRADECIMIENTOS

A Daniela, hasta el último instante.

C’est tout

El presente trabajo se realizó en el Departamento de Investigación Química y Farmacológica de Productos Naturales de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de Querétaro, bajo la dirección del Dr. José Alejandro García Arredondo, con apoyo de una beca completa CONACYT (número de becario 588445), otorgada por parte del proyecto de investigación titulado “CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LOS VENENOS DE TARÁNTULAS DEL GÉNERO Poecilotheria”, mismo que tiene financiamiento por parte del Fondo Sectorial de Investigación para la Educación con clave CONACYT CB-2013- 01/223591. Agradezco atentamente al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por haberme apoyado durante la realización de este proyecto. Además, quisiera agradecer al posgrado en Ciencias Químico Biológicas por abrirme sus puertas. "Science is a method for deciding whether what one believes obeys the laws of nature or not." "Cuanto más alto escala el mono, mejor se le ve el culo..."

RESUMEN

El veneno de las tarántulas está constituido por una mezcla heterogénea de compuestos bioactivos, cuya acción sinérgica sobre receptores predeterminados permite a estos arácnidos subyugar a sus presas y ahuyentar a sus depredadores. Así mismo, estos componentes varían en su composición y concentración en virtud de múltiples factores, siendo el sexo uno de los más importantes. Un aspecto importante a considerar es el hecho que, cuando estas toxinas son estudiadas individualmente, pueden ser utilizadas para el desarrollo de fármacos, útiles para tratar diversos padecimientos, en especial los péptidos, los cuales exhiben una alta afinidad por receptores específicos y son resistentes a la temperatura y a la degradación enzimática, debido a que presentan arreglos tridimensionales que les provee de una estructura química estable. Por otro lado, la tarántula ornamental de la India Poecilotheria regalis, representa una de las especies arborícolas más comercializadas en el mundo, a pesar de que los síntomas por envenenamiento sean más severos y prolongados con respecto a los de otras especies. Aunque el proceso de obtención del veneno de P. regalis es sencillo y se pueden realizar múltiples extracciones, existe escasa información sobre la composición e identidad de las toxinas peptídicas presentes en su veneno. En este trabajo se exploraron las diferencias de la expresión y composición de las toxinas presentes en el veneno de tarántulas hembras y machos de P. regalis, a través de electroforesis, espectrometría de masas y cromatografía de líquidos. Además, se identificaron toxinas peptídicas con potencial aplicación biotecnológica mediante técnicas acopladas de cromatografía de líquidos y espectrometría de masas. También se evaluó el potencial toxicológico del veneno en ratones (DL50 = 10.76 ± 2.038 µg/g) y en larvas de Drosophila melanogaster (DL50 = 0.01685 ± 0.008 µg/g). Mediante este estudio, se establecieron diferencias entre la composición de los venenos de machos y hembras de P. regalis, se encontró homología con algunas toxinas con efecto insecticida con mecanismos que involucran canales de calcio operados por voltaje y se observó que este veneno es letal en modelos de vertebrados e invertebrados.

(Palabras Clave: P. regalis, composición química, veneno, aplicaciones biotecnológicas).

SUMMARY

Venoms from tarantulas are composed by mixtures of heterogeneous bioactive compounds whose synergistically action in predetermined cell receptors allows these arachnids to subdue their prey and deter predators. Moreover, these compounds differ in their concentration and composition by virtue of multiple factors, being gender the most meaningful. Interestingly, when these toxins are studied individually, they can be useful for drug development and to treat diverse diseases, especially peptides because of their high affinity for specific receptors and their thermic and enzymatic resistance, due to their key tridimensional arrangements. Furthermore, the Indian ornamental tarantula Poecilotheria regalis represents one of the most commercialized arboreal tarantulas, regardless the symptoms produced by its envenomation are more severe and harder than other species. In spite of the ease related to milking procedure, and the possibility of multiple extractions, there is scarce information regarding concentration and composition of peptide toxins. In this study, we explored the differences in venom composition and expression from male and female tarantulas of P. regalis through electrophoresis, mass spectrometry, and liquid chromatography. Likewise, we identified peptide toxins with a biotechnological potential application using hyphenated techniques as HPLC-MS/MS. Also, we tested the toxicity of the venom in mice (LD50 = 10.76 µg/g ± 2.038 µg/g) and in Drosophila melanogaster larvae (LD50 = 0.01685 µg/g ± 0.008 µg/g). We established the differences concerning toxins composition and concentration in the venom from male and female P. regalis tarantulas and found homology with some toxins with insecticidal activity with mechanisms that relate voltage-gated calcium channels, lethality effects were also observed in vertebrate and invertebrate animal models.

(Keywords: P. regalis, venom, chemical composition, biotechnological applications)

ÍNDICE GENERAL

Página Contenido ÍNDICE GENERAL i ÍNDICE DE TABLAS iii ÍNDICE DE FIGURAS iv

1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 4 2.1 Importancia del estudio de toxinas de origen animal 4 2.2 Las tarántulas como animales venenosos 7 2.3 Composición del veneno de tarántulas 9 2.3.1 Toxinas de bajo peso molecular 11 2.3.2 Toxinas de alto peso molecular 13 A. Enzimas 13 B. Péptidos 15 2.4 Efectos principales de los venenos de tarántulas 21 2.5 Métodos de extracción y almacenamiento de veneno de tarántulas 25 2.6 Aplicaciones prácticas de péptidos purificados del veneno de 27 tarántulas 2.6.1 Aplicaciones de péptidos como herramientas farmacológicas 27 2.6.2 Descubrimientos concomitantes a la aplicación biotecnológica de péptidos 29 2.7 Tarántula ornamental de la India Poecilotheria regalis (Pocock,1899) 30 2.8 Técnicas empleadas en venómicas 32 2.8.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida ‘Tricine SDS–PAGE’ 33 2.8.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa 34 ‘RP–HPLC’ 2.8.3 Espectrometría de masas ‘MALDI–TOF’ 34 2.8.4 Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem ‘LC–ESI–Q–TOF–MS’ 35 2.8.5 Ensayos de toxicidad 37

3. JUSTIFICACIÓN 38 4. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 39 5. HIPÓTESIS 40 6. OBJETIVOS 41 6.1 Objetivo principal 41 6.2 Objetivos específicos 41 7. METODOLOGÍA 43 7.1 Obtención y mantenimiento de tarántulas de la especie Poecilotheria regalis 43 7.2 Extracción de veneno 43 7.3 Liofilización 44 7.4 Cuantificación de proteína 44 7.5 Electroforesis en gel de poliacrilamida ‘Tricine SDS–PAGE’ 44 7.6 Cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa ‘RP–HPLC’ 44 7.7 Espectrometría de masas ‘MALDI–TOF–MS’ 45 7.8 Secuenciación parcial ‘RP–HPLC–ESI–MS/MS’ 45 7.9 Ensayos de toxicidad 46 8. RESULTADOS 48 8.1 Extracción del veneno 48 8.2 Distribución de los componentes del veneno de P. regalis de acuerdo a su peso molecular 48 8.3 Distribución de las toxinas peptídicas presentes en el veneno de 51 P. regalis de acuerdo a su peso molecular 8.4 Identificación de péptidos presentes en las fracciones representativas 54 8.5 Ensayos de toxicidad 54 9. DISCUSIÓN 58 10. CONCLUSIÓN 63 11. BIBLIOGRAFÍA 64 12. ANEXO 74

ÍNDICE DE TABLAS

TABLAS Página

Identificación de las toxinas peptídicas presentes en las Tabla 1 55 fracciones 6, 8 y 23 separadas del veneno de P. regalis

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Página

Esquema de la distribución de animales venenosos en el Figura 1 5 reino animal

Figura 2 Convergencia de acción toxicológica 6

Figura 3 Glándula de veneno de P. regalis 8

Cromatogramas de ‘RP–HPLC’ del veneno de hexatélidas Figura 4 10 machos y hembras de la especie Atrax robustus

Compuestos de bajo peso molecular presentes en el Figura 5 12 veneno de arañas

Clasificación de las proteínas identificadas en el veneno de Figura 6 14 Grammostola inheringi, con base en su actividad catalítica

Distribución de péptidos de acuerdo a su peso molecular, Figura 7 16 presentes en el veneno de múltiples tarántulas y arañas

Estructuras conservadas de péptidos purificados del Figura 8 19 veneno de tarántulas

Arquitectura de las toxinas peptídicas purificadas de Figura 9 20 diversas especies de Hexatélidas Representaciones tridimensionales de la superficie Figura 10 molecular de la toxina peptídica PcTx1 interactuando con el 23 bolsillo acídico del receptor ASIC1a Esquema de la nomenclatura de toxinas peptídicas Figura 11 24 propuestas por Glenn King en 2008

Figura 12 Métodos de extracción de veneno 26

Figura 13 Distribución geográfica de la tarántula P. regalis 31

Estrategias analíticas en el descubrimiento de toxinas, Figura 14 33 basadas en venómicas

Diagrama de flujo empleado en la búsqueda de toxinas Figura 15 peptídicas con potencial biotecnológico del veneno de G. 36 inheringi Exploración de las toxinas presentes en el veneno de Figura 16 tarántulas hembras y machos de la especie P. regalis, 49 mediante electroforesis ‘Tricine SDS–PAGE’ Exploración del peso molecular de las toxinas peptídicas Figura 17 presentes en el veneno de tarántulas de ambos sexos de la 50 especie P. regalis Perfil cromatográfico del veneno de tarántulas de ambos Figura 18 52 sexos de la especie P. regalis

Histograma de abundancia de toxinas peptídicas con base Figura 19 53 en su peso molecular Distribución de las toxinas peptídicas de acuerdo a su peso Figura 20 molecular presentes en las fracciones separadas del 53 veneno de P. regalis Curvas dosis–respuesta que muestran la toxicidad del Figura 21 56 veneno de P. regalis Fotografías representativas de microscopía de luz que Figura 22 muestran el análisis histológico de los ratones a los que se 57 les administró el veneno de P. regalis

1. INTRODUCCIÓN

Las tarántulas son un grupo de 962 especies descritas de animales venenosos que, con respecto a otros arácnidos, se caracterizan por su gran tamaño y amplia distribución mundial (World Spider Catalog, 2017). Estos animales pueden ser clasificados en función del hábitat que ocupan para la elaboración de sus madrigueras, como tarántulas arborícolas o excavadoras, las cuales tienen presas y depredadores diferentes (Pérez-Miles et al., 2015). Por otro lado, con el fin de mantener el status quo de su entorno, administran secreciones producidas por glándulas especializadas a través de dispositivos puntiformes, evolucionados con el fin de infligir heridas en sus presas y depredadores. Dichas secreciones son conocidas como veneno y están elaboradas de múltiples compuestos orgánicos denominados toxinas, las cuales han sido diseñadas por presiones evolutivas acoplando su acción biológica de manera sinérgica hacia una misma dirección: parálisis para alimentarse y dolor para defenderse (Vassilevski et al., 2009; Morales- Gonzalez et al., 2015). De manera general, los venenos de tarántulas están compuestos por moléculas peptídicas y proteínas codificadas por genes expresados en la glándula venenosa, mismos que abarcan pesos moleculares desde 1 a 100 kDa. Los péptidos son los componentes más abundantes de estas secreciones y comparten entre ellos estrechas similitudes tanto estructurales como fisicoquímicas (Escoubas y Rash, 2004). En relación a su actividad biológica, los péptidos actúan principalmente como neurotoxinas alterando la fisiología de canales iónicos operados por voltaje, mientras que entre las proteínas destacan enzimas que ayudan a la propagación del resto de los componentes, desde la zona de la mordedura, hacia su sitio de acción. De este modo, los componentes del veneno intervienen conjuntamente para inducir los efectos toxicológicos durante el envenenamiento (Siemens et al., 2006). Curiosamente, cuando los péptidos purificados del veneno son analizados de manera individual, pueden ser desarrollados como herramientas biotecnológicas útiles en virtud de la alta potencia y especificidad que presentan por sus blancos biológicos. De esta manera, el estudio venómico de toxinas peptídicas ha permitido dilucidar

nuevos estados conformacionales de canales iónicos operados por voltaje y receptores que integran múltiples señales (Siemens et al., 2006; Liao et al., 2013). Por ejemplo, con respecto al receptor TRPV1a, se ha propuesto una nueva conformación activa provocada por la interacción de la toxina peptídica de doble nudo inhibitorio de cistina DkTx, purificada del veneno de la tarántula tigre de tierra de Malasia Haplopelma schmidti, sobre el sexto segmento transmembranal de dos de las subunidades formadoras del poro del canal (Bohlen et al., 2010; King, 2011). Este receptor se ha caracterizado como un receptor farmacológico que involucra parte de los componentes fisiológicos relacionados con la nocicepción, por lo cual el conocimiento de su fisiología impulsa el desarrollo de fármacos útiles para el tratamiento de este padecimiento (Eskander et al., 2015). Por otro lado, se han encontrado toxinas peptídicas que interactúan específicamente sobre diversas isoformas de canales iónicos operados por voltaje de sodio y que se han aplicado como herramientas farmacológicas, como el péptido ‘µ–theraphotoxin–Tp1a’ purificado del veneno de la tarántula de terciopelo verde de Perú Thrixopelma pruriens, el cual retarda la apertura del canal iónico de sodio operado por voltaje

Nav1.7 con una especificidad de 2.1 y 2.5 nM, empleando la toxina nativa y recombinante respectivamente (Cardoso et al., 2015). Por otra parte, los péptidos ‘Hm1a’ y ‘Hm2a’, purificados del veneno de la tarántula radiante de Togo Heteroscodra maculata actúan individualmente con canales iónicos operados por voltaje de sodio Nav1.1 en fibras mielinizadas de la asta dorsal de la médula espinal produciendo dolor mecanosensitivo, lo cual ha ayudado a caracterizar a este receptor como una diana farmacológica implicada en la propagación del potencial de acción de la nocicepción mecanosensitiva (Osteen et al., 2016). Además, se ha determinado mediante ensayos de toxicidad in vivo e in vitro el efecto insecticida selectivo para distintos insectos del veneno crudo y de toxinas purificadas del veneno de arañas. Por consiguiente, estas secreciones son consideradas una nueva fuente de bioinsecticidas que pueden ser aplicadas en la agroindustria (Hardy et al., 2013). Otra característica que resalta de las toxinas peptídicas es su secuencia primaria dotada de aminoácidos en posiciones claves, misma que inducen conformaciones

terciarias con arreglos estructurales que les proveen a las toxinas de resistencia a altas temperaturas y a diferentes proteasas con elementos denominados nudos inhibitorios de cistina (Kikuchi et al., 2015). La presencia de estos arreglos es muy importante en la búsqueda de toxinas oralmente activas del veneno de tarántulas, algunas de las cuales han sido patentadas y se emplean como herramientas de investigación e incluso algunas de ellas han llegado a convertirse en fármacos (McGivern, 2007; King, 2011). Por otra parte, se cree que los péptidos han evolucionado produciendo múltiples variantes discretas de aminoácidos localizados alrededor de la estructura del nudo inhibitorio, en respuesta a la necesidad de adaptarse a las diferencias estructurales de los receptores de sus diversas presas. Como consecuencia, cada tarántula produce en promedio 700 péptidos con variantes discretas de cada uno, lo cual hace que los venenos de tarántulas representen verdaderas bibliotecas de química combinatoria de péptidos con potencial aplicación biotecnológica (Chen et al., 2009; Cunha, 2013; Pineda et al., 2014a). La tarántula ornamental hindú Poecilotheria regalis, es una especie de tarántula arborícola endémica del sur de la India que se caracteriza por su largo tamaño y su amplia comercialización como mascota (Nanayakkara et al., 2015; Andreev-Andrievskiy et al., 2017). En contraste con otras especies, la mordedura de esta tarántula ocasiona dolor, inflamación y entumecimiento prolongado desde la zona de la mordedura hacia el resto de las extremidades lesionadas, lo cual difiere con los efectos producidos por la mordedura de otras especies de tarántulas tanto terrestres como arborícolas (Ahmed et al., 2009; Fuchs et al., 2014). Es por esta razón que, los componentes del veneno de P. regalis son, desde el punto de vista toxinológico, interesantes. Desafortunadamente, a pesar de su amplia comercialización y facilidad de extracción de sus secreciones venenosas, la información sobre la composición química y funcional de sus toxinas es escasa. En este trabajo de investigación, se realizó un estudio dirigido del veneno de P. regalis con el fin de buscar toxinas peptídicas potencialmente útiles en el desarrollo de herramientas farmacológicas y/o biotecnológicas. 2. ANTECEDENTES

2.1 Importancia del estudio de toxinas de origen animal Los animales venenosos son organismos que se distribuyen en diferentes clados en el reino animal y se caracterizan por sobrevivir en entornos hostiles donde son asediados continuamente por depredadores y por condiciones ambientales amenazantes [Figura 1]. De manera interesante, durante millones de años de evolución, estos animales han logrado diseñar, a partir de los componentes básicos de su metabolismo, compuestos orgánicos especializados que participan en diversos procesos claves en su vida como la alimentación, la defensa, la reproducción, la comunicación, la competencia, entre otras (Casewell et al., 2013; Zhang, 2015). Estos compuestos orgánicos se denominan toxinas y son en su mayoría péptidos y proteínas codificados por genes que se expresan en glándulas especializadas, los cuales son secretados mediante mecanismos holocrinos y apocrinos en un líquido discreto conocido como veneno (Vassilevski et al., 2009; Kuhn-Nentwig et al., 2011; Harvey, 2014). Cada animal venenoso está dotado de un dispositivo anatómico conectado directamente con las glándulas especializadas, el cual es capaz de producir heridas que permiten el acceso al medio interno de quienes atacan, para administrar simultáneamente al veneno. Este proceso es conocido como envenenamiento y permite subyugar a sus presas y ahuyentar a sus depredadores (Lucas, 2015). Los componentes del veneno varían según la predisposición genética de los animales productores, las condiciones ambientales, la edad, el sexo, las especies de sus presas y depredadores, etc. Sin embargo, estos componentes actúan, de manera conjunta, alterando procesos fisiológicos en sus presas y/o depredadores para producir efectos sistémicos inmediatos [Figura 2]. Los principales sistemas afectados suelen ser el sistema nervioso central, el sistema circulatorio y el sistema inmunológico (Fry, 2005; Gonçalves-Machado et al., 2016). Es importante agregar, que las toxinas actúan en conjunto de manera sinérgica alterando, con alta potencia y especificidad, distintas dianas biológicas de procesos fisiológicos determinados para producir los efectos toxicológicos durante el envenenamiento (Utkin, 2015).

Figura 1. Esquema de la distribución de animales venenosos en el reino animal. Las ramas con color indican animales que cuentan con un sistema de inyección de veneno bien definido (modificado de Casewell et al., 2013).

Figura 2. Convergencia de acción toxicológica. Las neurotoxinas purificadas del veneno de múltiples animales venenosos actúan en común sobre dianas biológicas expresadas por sus presas y depredadores (modificado de King, 2015).

De manera interesante, cuando las toxinas son separadas del veneno y analizadas de manera individual, pueden ser desarrolladas como herramientas farmacológicas útiles para investigar con más detalle los mecanismos fisiopatológicos involucrados en diversos padecimientos (Middleton et al., 2002; Abdelhamid y Sluka, 2015; Zhang, 2015). De hecho, algunas toxinas han logrado conquistar el mercado farmacéutico y actualmente se cuentan con múltiples patentes en fase de experimentación clínica (King, 2011). Por otro lado, las técnicas analíticas actuales han impulsado significativamente el descubrimiento de nuevas características estructurales de las toxinas de venenos y, gracias a esto, se ha logrado adjudicar nuevas funciones a receptores fisiológicos de vertebrados (Guette et al., 2006; Chen et al., 2009; Osteen

et al., 2016). Además, gracias al uso de herramientas bioinformáticas se han determinado nuevos elementos fisiológicos denominados proteínas semejantes a toxinas, los cuales se ha comprobado que regulan mecanismos de señalización de algunos receptores fisiológicos. En concreto, las toxinas no sólo ofrecen un uso potencial en el desarrollo de medicamentos y compuestos con aplicación biotecnológica, sino que nos permiten caracterizar, clasificar y adjudicar nuevas funciones a receptores fisiológicos en el ser humano que anteriormente se desconocían (Fernández-Ballester et al., 2011; Weiss et al., 2011; Emery et al., 2016).

2.2 Las tarántulas como animales venenosos Las tarántulas (Filo: Arthropoda, Clase: Arachnida, Orden: Araneae, Suborden: Mygalomorphae, Infraorden: Opisthothelae, Familia: Theraphosidae), son una familia de animales venenosos que forma parte del mismo orden que las arañas y que hasta el momento cuenta con 962 especies descritas distribuidas en 144 géneros (Fernández-Montraveta y Moya-Laraño, 2007; Petersen et al., 2007; Bond et al., 2012). Un rasgo particular de las tarántulas es su gran tamaño, algunas especies pueden alcanzar de 28 a 30 cm de longitud y pesar hasta 100 g, lo cual las contrasta significativamente con las arañas del suborden Aranomorphae, características por su tamaño milimétrico (Fernández-Montraveta y Moya-Laraño, 2007). Además, las tarántulas pueden ser clasificadas con base al entorno que habitan, como excavadoras o arborícolas. Las tarántulas excavadoras habitan madrigueras producidas regularmente debajo de la hojarasca y piedras, mientras que las arborícolas elaboran sus madrigueras en los árboles (Pérez-Miles et al., 2015). Cabe destacar que, como producto de la evolución, las tarántulas han desarrollado estrategias de supervivencia y defensa. Por ejemplo, las tarántulas arborícolas presentan colores en su cuerpo que les permite camuflarse en los troncos de los árboles, o en algunos casos colores amenazantes para ahuyentar a sus depredadores, mientras que las tarántulas excavadoras presentan apéndices que les permiten elaborar sus madrigueras en el suelo con mayor facilidad (Gawryszewski

et al., 2017). Curiosamente, los colores extravagantes de algunas tarántulas arborícolas las hacen ser muy atractivas para los coleccionistas por lo cual, se han convertido en animales ampliamente comercializados en el mundo como mascotas ornamentales. Con respecto a su anatomía, estos animales están conformados por dos secciones bien definidas denominadas prosoma y opistosoma, las cuales están posicionadas en el plano anterior y posterior respectivamente (Pérez-Miles et al., 2015). Del prosoma se distinguen los primeros apéndices conocidos como quelíceros, de donde emergen un par de estructuras puntiformes compuestas de quitina densa llamadas colmillos [Figura 3B]. Estas estructuras componen al dispositivo de producción de heridas característico de los animales venenosos, el cual se cree que fue modificado a partir del primer par de apéndices. Así mismo, en el segmento parabasal de cada quelícero se encuentran dos glándulas especializadas para la producción de veneno, las cuales están conectadas a los colmillos (Vassilevski et al., 2009) [Figura 3A]. Estos dispositivos son utilizados cuando se enfrentan a una presa o a un depredador con el fin de alimentarse o defenderse. Para esto, los colmillos son introducidos violentamente en una mordedura sobre la capa de quitina de sus presas o en la piel de sus depredadores, al mismo tiempo que liberan el veneno (Hoffmann, 1998).

Figura 3. Glándula de veneno de P. regalis. A) La glándula de veneno está conectada discretamente a los colmillos. B) Los colmillos son una estructura rígida de quitina que se ubican en los quelíceros.

El veneno de las tarántulas consiste en una secreción líquida generalmente transparente, la cual contiene múltiples componentes capaces de alterar procesos fisiológicos del sistema nervioso con el fin de paralizar a sus presas o producir dolor en sus depredadores (Escoubas y Rash, 2004). Por lo que se refiere a su toxicidad, las tarántulas arborícolas producen síntomas de envenenamiento más prolongados y exacerbados con respecto a las tarántulas excavadoras (Fuchs et al., 2014). Es importante mencionar, que hasta la fecha no se ha registrado la muerte como consecuencia de envenenamiento por mordedura de tarántulas en humanos. Sin embargo, el envenenamiento produce síntomas exacerbados como calambres musculares, dolor intenso y entumecimiento (Isbister et al., 2003; Ahmed et al., 2009; Fuchs et al., 2014; Pouraghaei et al., 2015).

2.3 Composición del veneno de tarántulas

El veneno de tarántulas está compuesto por múltiples compuestos orgánicos elaborados a partir de elementos básicos del metabolismo celular, de los cuales la mayoría son producidos únicamente en las glándulas especializadas. De acuerdo a su peso, los componentes del veneno son clasificados en toxinas de alto y bajo peso molecular (Dauly et al., 2011; Palagi et al., 2013; Touchard et al., 2015; Quinton et al., 2016). Por otro lado, estas mezclas producen efectos paralizantes en sus presas, interactuando sobre diferentes blancos involucrados en la contracción muscular, mientras que en vertebrados producen dolor (King, 2011, 2015). Así mismo, con el propósito de producir las manifestaciones del envenenamiento mencionadas, las toxinas deben actuar de manera dinámica y conjunta con sus receptores biológicos (Estrada y Corzo, 2007). Por otro lado, cabe mencionar que tanto la composición como la concentración de toxinas varía en virtud de múltiples factores como la edad, el sexo, la distribución, la variabilidad genética intraespecífica, entre otras. Sin embargo, estos estudios proteómicos y ecológicos son novedosos y existe escasa evidencia con respecto a venenos de tarántulas. De manera interesante, se ha comprobado que los venenos de arañas machos [Figura 4A] producen toxinas peptídicas que no se presentan en las hembras [Figura 4B], y los

cuales parecen ser de mayor interés debido a que se ha comprobado que algunos podrían estar involucrados directamente con el envenenamiento. Por lo tanto, con la finalidad de obtener un perfil amplio de la composición del veneno de una especie de tarántula, se debe tomar en consideración al sexo como un factor de variabilidad fundamental (Wilson, 2016).

Figura 4. Cromatogramas de ‘RP–HPLC’ del veneno de hexatélidas A) machos y B) hembras de la especie Atrax robustus. Se emplearon condiciones estandarizadas de separación. *Denota el pico del péptido –HXTX–Ar1a, presente únicamente en el veneno de machos. Esta neurotoxina podría estar involucrada con los síntomas ocasionados por el envenenamiento (tomada de Wilson, 2015).

2.3.1 Toxinas de bajo peso molecular

Las toxinas de bajo peso molecular abarcan pesos menores a 1 kDa y están altamente conservadas en venenos de arañas (Orden: Araneae), aunque se expresan de manera diferencial en sus diferentes familias. Los compuestos que se han caracterizado son: i) acilpoliaminas, ii) análogos de nucleósidos, iii) bis(agmantin) oxalamidas, iv) alcaloides derivados de ß–carbolina, v) compuestos organometálicos diazenarilicos, vi) análogos dioxopiperidínicos, vii) poliaminas, viii) ácidos inorgánicos, ix) sales inorgánicas y x) aminoácidos libres (Estrada-Gomez et al., 2013) [Figura 5]. Particularmente, la familia Theraphosidae las produce discretamente en comparación con otras familias pertenecientes al suborden Aranomorphae, las cuales constituyen la mayoría de arañas verdaderas productoras de tela, en donde sorprendentemente también se han purificado algunos de estos componentes (Skinner et al., 1990; Rash y Hodgson, 2001; Estrada-Gomez et al., 2013). Por otro lado, estas toxinas han sido caracterizadas gracias a la información proporcionada por el uso de diversas técnicas analíticas que incluyen cromatografía multidimensional de líquidos de alta resolución, espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear. Desafortunadamente, debido a las limitantes analíticas, muchos investigadores se han enfocado en las toxinas de alto peso molecular, las cuales son más sencillas de caracterizar, mientras que las toxinas de bajo peso molecular, no se han estudiado sistemáticamente, desaprovechando el potencial biotecnológico de estos componentes (Nentwig, 2013; Matavel et al., 2015). En relación a sus dianas biológicas, se ha determinado mediante técnicas electrofisiológicas su actividad sobre múltiples canales iónicos dependientes de ligando como los receptores pentaméricos de GABAa (ácido γ–aminobutírico), receptores serotoninérgico, receptores tetraméricos de glutamato del tipo NMDA (N– metil–D–Aspartato), AMPA (ácido α–amino–3–hidroxi–5–metil–4– isoxazolpropionico), kainato, una isoforma caracterizada en insectos denominada ibotenato cuya acción es inhibitoria, y finalmente sobre canales iónicos operados por + + +2 voltaje de potasio Kv , sodio Nav y calcio Cav del tipo P y L, (Estrada-Gomez et al.,

2013; Kuhn-Nentwig et al., 2011). Así mismo, se ha reportado que las actividades biológicas de las toxinas son, en su mayoría, inductoras de parálisis, proconvulsivantes y nociceptivas (Tedore et al., 2015). Es importante mencionar, que para una gran parte de estas toxinas no se han caracterizado dianas determinadas y que las acilpoliaminas son las toxinas más estudiadas (Vassilevski et al., 2009)

Figura 5. Compuestos de bajo peso molecular presentes en el veneno de arañas. A) Amina biogénica (octopamina), B) Poliamina (espermina), C) Acilpoliamina (argiotoxinaI), D) Nucleósidos modificados (2,5 disulfuro de guanosina), E) Bis– (agmantin)oxalamida (N,N–Bis(4–guanidinobutil)oxalamida), F) ß-Carbolinas (Pw– Tx1), G) Diazenarilicos (1–(diazenilaril)etanol) y H) Dioxopiperidínicos (nigriventi). 2.3.2 Toxinas de alto peso molecular

Los péptidos y proteínas conforman a los componentes de alto peso molecular del veneno de tarántulas y de la mayoría de arañas. Estos, están codificados por genes expresados exclusivamente en glándulas especializadas para su producción y constituyen más del 90 % del peso del veneno (Liao et al., 2007; Bordon et al., 2012). Por su parte, los péptidos se caracterizan por poseer en su estructura primaria arreglos de aminoácidos que les provee de conformaciones claves para su acción biológica, mientras que las enzimas y proteínas actúan sobre estructuras clave de la matriz extracelular o potenciando el efecto de toxinas de bajo peso molecular respectivamente (King, 2015). A. Enzimas Las toxinas con actividad enzimática son componentes clave del veneno de tarántulas para desencadenar los efectos toxicológicos del envenenamiento (Kreil, 1995; Clement et al., 2015; Cheng et al., 2016). Así mismo, se ha determinado mediante técnicas como electroforesis y espectrometría de masas, que las enzimas y proteínas del veneno abarcan pesos moleculares que van desde 15 a 100 kDa. Desafortunadamente, los registros de las toxinas identificadas suelen ser confusos, debido a la facilidad de contaminación entre las secreciones venenosas y salivales, causadas por la cercanía anatómica que existe entre la zona preoral y los colmillos (Borges et al., 2016). Además, existen factores de riesgo de contaminación inherentes a la bioeconomía de las secreciones venenosas, pues para compensar los volúmenes discretos producidos de estas secreciones, los investigadores se ven obligados a acumular los venenos de múltiples especímenes. En general, se han identificado enzimas y proteínas involucradas con el metabolismo celular, diversas proteasas que actúan sobre diversos aminoácidos, proteínas de adhesión y proteínas musculares, sin embargo, considerando su función se cree que son parte de la contaminación durante el proceso de extracción [Figura 6]. Por otro lado, existen componentes que fácilmente son detectados mediante técnicas como electroforesis, que permanecen sin ser caracterizados química o funcionalmente (Liao et al., 2007).

Figura 6. Clasificación de las proteínas identificadas en el veneno de Grammostola inheringi, con base en su actividad catalítica (modificado de Borges et al., 2016).

Al contrario, las enzimas semejantes a hialuronidasas son los componentes más conservados de los cuales incluso se ha encontrado actividad en el veneno tanto de arañas como de tarántulas arborícolas y excavadoras mediante métodos turbidimétricos y de zimografía (Clement et al., 2012; García-Arredondo et al., 2015). En particular, estas toxinas hidrolizan el ácido hialurónico constituido por un polisacárido de unidades repetitivas de [ácido D–glucorónico (1–β–3) N–acetil–D– glucosamina (1–β–4)]. Este polímero se encuentra predominantemente en la matriz extracelular de los vertebrados, donde se sintetiza y forma soluciones espesas lo que proporciona viscosidad (Kemparaju et al., 2006). Estas enzimas catalizan una reacción de transglicosilación produciendo tetra y disacáridos mediante la ruptura del enlace glicosídico (1–β–3) o (1–β–4) del ácido hialuronico presente en la matriz extracelular de vertebrados. Estas enzimas de entre 32 y 44 kDa, se han detectado también en venenos de víboras, serpientes, peces, avispas, escorpiones y arañas (Wahby et al., 2012; Gunasekara et al., 2017). En el veneno de la tarántula arborícola Poecilotheria regalis se ha determinado una actividad enzimática superior a la de los venenos de tarántulas terrestres. Es importante mencionar, que estas enzimas son consideradas como factores de dispersión debido a su acción propagadora que actúa sobre blancos de sus depredadores, por lo cual constituyen también un componente defensivo del veneno (Rodríguez-Rios et al., 2017)

B. Péptidos Los péptidos presentes en el veneno de tarántulas, también conocidos como toxinas peptídicas, constituyen los componentes de mayor abundancia. De manera puntual, se ha determinado mediante cromatografía de líquidos de alta resolución y espectrometría de masas que en promedio cada tarántula produce 700 péptidos, lo cual contrasta con la cantidad de enzimas y proteínas (Kozlov et al., 2006; Lau et al., 2016). Estas toxinas se caracterizan por abarcar pesos moleculares desde 1 a 8 kDa y están conformadas por estructuras conservadas denominadas nudos inhibitorios de cistina (ICK: inhibitor cystine knot), que les proveen de resistencia a ambientes físicos y químicos hostiles (Mourão et al., 2013; Park et al., 2014; Kikuchi et al., 2015) [Figura 7]. Otra característica a resaltar, es que los péptidos se encuentran presentes en el veneno con variantes muy discretas en su secuencia primaria lo cual les dota de características fisicoquímicas similares. No obstante, se cree que estas variaciones no son producto de ‘splicing alternativo’ sino de un proceso de duplicación y divergencia genética que han producido modificaciones en la estructura primaria a partir de un gen ancestral, posiblemente como una estrategia para aumentar su población de presas y contrarrestar los mecanismos evolutivos de sus depredadores (Casewell et al., 2013; Pineda et al., 2014a; Dugon, 2015). Con respecto a su función, estas toxinas actúan modificando las cinéticas de + activación e inactivación de canales iónicos operados por voltaje de sodio Nav , + 2+ potasio Kv y calcio Cav , y como bloqueadores de poro o modificadores de potencial de activación de algunos otros receptores como los canales sensibles a ácido (ASICs: acid sensing ion channels), purinérgicos de ATP (P2X) y receptores de vanilloides de potencial transitorio (TRPV: transient receptor potential vanilloid) (Bohlen et al., 2010; Saez et al., 2011; Min et al., 2013; Tao et al., 2013; Franceschini y Adinolfi, 2014; Harvey, 2014). Es importante mencionar, que estas toxinas actúan sobre sus blancos a partir de concentraciones nanomolares e incluso logran identificar a sus blancos biológicos entre diferentes isoformas, lo cual difiere con las de metabolitos secundarios purificados de plantas y microorganismos (Cardoso et al., 2015). De manera sorpresiva, cuando los péptidos son estudiados individualmente, pueden ser útiles en el campo de la biotecnología en virtud su alta

potencia y especificidad (Grishin et al., 2010; King, 2011; Gui et al., 2014; Saez et al., 2011, 2010). Desafortunadamente, a pesar de la relativa facilidad de extracción del veneno en tarántulas, menos del 9 % de las especies descritas han sido caracterizadas, por lo cual resta cerca de 608,000 variantes de péptidos por analizar (Herzig et al., 2011). Por esta razón, se considera al veneno de tarántulas como una biblioteca de química combinatoria de péptidos (Olivera et al., 1995; Sollod et al., 2005).

Figura 7. Distribución de péptidos de acuerdo a su peso molecular, presentes en el veneno de múltiples tarántulas y arañas. El número en paréntesis refleja los

registros (modificado de Kuhn–Nentwig et al., 2011). Con la finalidad de conocer con detalle los péptidos purificados del veneno de tarántulas, los investigadores los exploran, mediante las técnicas de dicroísmo

circular y resonancia magnética nuclear, determinando estructuras secundarias y terciarias respectivamente. De esta manera, se logra clasificar a los péptidos ya caracterizados funcionalmente con base en sus dianas biológicas y, mediante técnicas bioinformáticas y de química computacional, se adjudican posibles funciones a aquellas que aún no han sido caracterizadas (Fernández-Ballester et al., 2011; Herzig y King, 2015). En cuanto a la información actual sobre los péptidos purificados del veneno de tarántulas, se ha comprobado que poseen un motivo estructural altamente conservado denominado nudo inhibidor de cistina ‘ICK’ o plegamiento de nudo (knot folding). De manera puntual, este motivo está compuesto por tres puentes disulfuro que enlazan a 3 ß–plegadas antiparalelas. Estos puentes son producidos por la oxidación de 6 grupos funcionales sulfhidrilo provenientes de 6 residuos de cisteínas del péptido, los cuales están distribuidos específicamente en la estructura primaria con un consenso: CI–CIV, CII–CV y CIII–CVI, desde el extremo amino al carboxilo terminal (Domingues et al., 2015; King, 2015) [Figura 8A, E]. Así mismo, con el fin de provocar un espacio químico apropiado para la formación de los puentes disulfuro, el resto de los aminoácidos forman parte de la estratagema que conduce al plegamiento que dará lugar, tanto a la cercanía de los residuos para la formación del nudo inhibitorio, como al componente de unión a su diana biológica (Pineda et al., 2014a), [Figura 8 C y D]. Por otro lado, se ha comprobado mediante mutagénesis sitio dirigida que la formación de este nudo inhibitorio le provee a los péptidos de resistencia a diversas proteasas y estabilidad en condiciones de temperatura alta. De hecho, se ha confirmado que existen toxinas con estabilidad en suero de humano hasta por 12 días, y que han presentado vida media prolongada en fluidos gástricos simulados, por lo cual las convierte en herramientas de investigación farmacológica interesantes (Saez et al., 2010; Zhang, 2015). Adicionalmente, se han encontrado otras estructuras que, aunque con registros muy limitados, promueven el conocimiento de estos péptidos. Las horquillas ß–DDH son un motivo estructural que carece de nudo inhibidor de cistina y el cual está conformado por una horquilla beta antiparalela estabilizada por dos puentes

disulfuro. Su secuencia consenso consta de CI–CIII, CII–CV, CIV–CVI. Este motivo estructural se caracteriza por tener 3 puentes disulfuro y, a diferencia de los motivos ‘ICK’, no se encuentran dos residuos de cisteína contiguos, por lo que se consideran péptidos laxos con mayor susceptibilidad a ser degradados (Saez et al., 2015) [Figura 8C, F]. Es importante mencionar, que estos motivos se encuentran predominantemente en el orden Araneae y, en menor proporción, en la familia Theraphosidae. Debido a esto, algunos investigadores proponen que este motivo estructural es un punto de inflexión en la evolución de los nudos inhibitorios de cistina y que definen a las estructuras ‘ICK’ actuales (Casewell et al., 2013). Por otro lado, también se han encontrado otras estructuras conservadas como el dominio inhibidor de Kunitz, también denominado inhibidor de tripsina pancreático bovino (BPTI: bovine pancreatic trypsine inhibitor), el cual pertenece a una familia de inhibidores de proteinasas, ricos en residuos de cisteína, cuyo marco de lectura en su estructura primaria se caracteriza por tener la unión de 3 puentes disulfuro, mediante residuos de cisteína en: CI–CVI, CII–CIV, CIII–CV y un plegamiento consenso –, denominado motivo Kunitz, el cual constituye el dominio responsable de la inhibición de serina proteasas como: tripsina, quimiotripsina, catepsina y plasmina (King, 2015) [Figura 8B].

Figura 8. Estructuras conservadas de péptidos purificados del veneno de tarántulas. A) Nudo inhibidor de cistina ‘ICK’, B) dominio inhibidor de ‘Kunitz’, C) 6 secuencias de toxinas de tarántulas con motivos estructurales de horquilla  dirigido por disulfuro ‘DDH’, D) estructura tridimensional del nudo de cistina, E) estructura secundaria del nudo inhibidor de cistina (las líneas en verde y rojo representan los puentes disulfuro), F) estructura secundaria del arreglo del asa ß-hairpin presentes en un nudo ICK (modificado de Escoubas & Rash 2004; Saez et al., 2010; King, 2015).

Otra característica interesante de las toxinas peptídicas es que son producidas en variantes discretas que pueden diferenciarse por la secuencia de aminoácidos en su estructura primaria, y que les permite ejercer funciones similares sobre regiones y conformaciones diferentes de sus blancos biológicos. De esta manera, se pueden encontrar en el mismo veneno una variedad tanto de péptidos agonistas como antagonistas de un receptor en particular. Así mismo, se ha propuesto que las variantes mencionadas son producidas por un proceso evolutivo, el cual asemeja al diseño basado en receptor usado en química medicinal. Estas variantes se generan induciendo cambios mínimos en las secuencias señales y propeptídicas del RNAm maduro, los cuales forman al péptido y son indispensables para su síntesis y maduración [Figura 9].

Figura 9. Arquitectura de las toxinas peptídicas purificadas de diversas especies de Hexatélidas. Las toxinas se componen por una secuencia señal, un propéptido y la toxina madura, (modificado de Pineda et al., 2014a). Además, esta hipótesis evolutiva explica la razón por la cual se producen péptidos que se adaptan a las diferencias estructurales de los blancos en común, inherentes

al genoma de las diversas especies de presas que incluye su dieta. En concreto, los venenos de tarántulas son una fuente de péptidos con potencial aplicación biotecnológica y, gracias al proceso coevolutivo de sus presas y depredadores, son considerados como una librería combinatoria de péptidos (Casewell et al., 2013; Pineda et al., 2014a; Allcock, 2015; Kerkkamp et al., 2015; Haney et al., 2016).

2.4 Efectos principales de los venenos de tarántulas La función primordial del veneno es producir parálisis y dolor. Estos efectos son causados por los péptidos que actúan sobre blancos fisiológicos clave, involucrados en dichos procesos. Generalmente, los canales iónicos, operados por voltaje, de + + 2+ sodio Nav , de potasio Kv y de calcio Cav , son los receptores más relevantes de las toxinas peptídicas debido a su función reguladora en la formación y propagación del potencial de acción, que comunica a las neuronas del sistema nervioso de manera altamente efectiva (Cunha, 2013; Cherki et al., 2014). Para llevar a cabo la contracción muscular, la placa neuromuscular juega un papel fundamental en la formación de los potenciales de acción que se propagan a través de la membrana de las neuronas presinápticas y la membrana sarcoplásmica. Al ser estimulados eléctricamente, los canales iónicos dependientes de voltaje de sodio en las neuronas presinápticas, cambian su estado conformacional de cerrado a abierto, permitiendo el flujo de iones sodio. De esta manera, una alta concentración de estos iones es transportada desde el espacio extracelular al espacio intracelular, cambiando el potencial electroquímico de la membrana hasta el estado conocido como despolarización. Dicha despolarización es proporcional al número de canales iónicos operados por voltaje de sodio estimulados y, al repolarizarse nuevamente la membrana plasmática, modifican su conformación de abierto a inactivo, impidiendo el flujo de iones. Simultáneamente, al producirse la despolarización de la membrana plasmática, los canales iónicos operados por voltaje de potasio modifican su conformación del estado cerrado a activo, permitiendo de esta manera la salida de iones potasio del espacio intracelular al espacio extracelular, con el propósito de reestablecer el potencial electroquímico hasta un estado conocido como repolarización. Durante este estado, los canales iónicos dependientes de voltaje de

sodio cambian su conformación de inactivo a reposo, y sólo en este último estado es que pueden ser estimulados nuevamente, cumpliendo con el ciclo que produce y propaga el potencial de acción. Una vez que se lleva a cabo la propagación del potencial sobre la membrana sarcoplásmica, los canales iónicos operados por voltaje de calcio estimulan el aumento de la concentración de este catión en el músculo, lo cual tiene como consecuencia la contracción muscular, que se mantiene o culmina según el grado de aumento o disminución de dicho ion. Por otro lado, la nocicepción involucra el transporte de impulsos eléctricos a lo largo y a través de neuronas predeterminadas en donde los componentes de la propagación del potencial de acción son semejantes a los expuestos anteriormente. En este proceso, la transmisión sináptica se produce entre neuronas del sistema nervioso aferente y eferente, haciendo relevo en el hasta dorsal de la médula espinal. En contraste con el mecanismo comentado anteriormente, la propagación del potencial de acción estimula la actividad de canales iónicos operados por voltaje de calcio, localizados estratégicamente en las neuronas, lo cual permite la entrada de calcio desde el espacio extracelular hasta el espacio intracelular, donde dirige la fusión de membranas vesiculares con la membrana plasmática, a partir de proteínas que modifican su conformación al coordinar al ion calcio. La fusión de las vesículas con la membrana plasmática da como resultado la liberación de neurotransmisores, los cuales permitirán la propagación o inhibición del potencial de acción en las neuronas postsinápticas, dependiendo de si el neurotransmisor liberado es excitatorio o inhibitorio (Bohlen et al., 2010; Tang et al., 2010; Weiss et al., 2011, Hill et al., 2012, Flórez et al., 2013). Los mecanismos de acción de las toxinas peptídicas sobre los canales iónicos operados por voltaje, se ha estudiado, utilizando diversas técnicas, incluyendo electrofisiología y flurimetría, y se ha determinado que este tipo de toxinas actúa como bloqueadores de poro y modificadores de las propiedades eléctricas ‘gating modifiers’ (Kaczorowski et al., 2008; Lau et al., 2016). Los bloqueadores de poro actúan como antagonistas, inhibiendo el paso de los iones a través del poro del canal, mientras que los modificadores de las propiedades eléctricas actúan modificando las cinéticas de activación e inactivación de estos canales (Balaji et al., 2000). De esta

manera logran inhibir o estimular la propagación del potencial de acción sobre la membrana pre y post sináptica respectivamente. La parálisis muscular producida por las toxinas peptídicas, es consecuencia de la inhibición de la propagación del potencial de acción en un proceso conocido como parálisis flácida, y en contraste puede ser provocada por una sobre estimulación del potencial de acción que induce al proceso que conoce como parálisis tetánica. Así mismo, los péptidos actúan sobre isoformas específicas de los canales de sodio, potasio y calcio, así como de otras dianas que se han caracterizado sobre las membranas presinápticas de neuronas nociceptoras: canales TRPV1a (Transient Receptor Potential Vanilloid 1a), canales ASIC1a (Acid Sensing Ion Channel 1a) [Figura 10 A y B] y receptores P2X (Purinergic receptor), mismos que son permeables tanto a iones de sodio y calcio, contribuyendo a la formación del potencial de acción en la transmisión sináptica de estas neuronas (Bohlen et al., 2010; Grishin et al., 2010; Saez et al., 2011; Liu et al., 2015).

A B

Figura 10. A) Representaciones tridimensionales de la superficie molecular de la toxina peptídica PcTx1 interactuando con el bolsillo acídico del receptor ASIC1a. B) Diferentes perspectivas de unión al ligando. Los aminoácidos señalados están involucrados en el espacio químico que produce la especificidad por el receptor, (modificado de Saez et al., 2015). Antes de la caracterización electrofisiológica de los péptidos contenidos en los venenos, no existía un consenso estricto con relación a la nomenclatura de las toxinas, las cuales eran denominadas en remembranza a la especie de la cual fue purificada, y en algunos casos en honor a sus descubridores. Sin embargo, el

profesor Glenn King publicó un artículo en 2008, proponiendo un nuevo sistema de clasificación, el cual incluye la descripción de los péptidos en virtud de su familia filogenética, su actividad biológica, su especificidad, su género, su especie y su homología con otros péptidos. Con respecto a los péptidos presentes en el veneno de tarántulas, estos son clasificados conforme a su función biológica como µ, ß y , para las toxinas que modulan la actividad de canales iónicos de sodio operados por voltaje,  para canales iónicos de potasio operados por voltaje, ω para canales iónicos de calcio operados por voltaje, π para los canales iónicos sensibles a ácido y U para aquellas que producen efectos biológicos sin un blanco definido. Con relación a la familia a la cual pertenecen, son denominados ‘theraphotoxins’ (Familia: Theraphosidae). Es importante mencionar, que algunos péptidos pueden actuar de manera promiscua sobre dianas biológicas diferentes. Por esta razón, se ha propuesto que la clasificación incluya a ambos descriptores de acción biológica (King et al., 2008) [Figura 11]

Figura 11. Esquema de la nomenclatura de toxinas peptídicas propuesta por Glenn King en 2008 (modificado de King et al., 2008).

2.5 Métodos de extracción y almacenamiento de veneno de tarántulas Gracias al tamaño de las tarántulas, la extracción de su veneno, proceso también conocido como ordeña o recolección, resulta ser más sencillo. Actualmente, los

métodos más comunes son los denominados mordedura espontánea y estimulación eléctrica (Celerier et al., 1993; Balaji et al., 2000; Sutti et al., 2014) [Figura 12 A y B]. En la técnica de mordedura espontánea se requiere amedrentar al animal para que éste tome la posición de ataque y exponga sus quelíceros. Así, mediante un capilar se toma el volumen de veneno que es eyectado de los colmillos cada vez que el animal es atacado, con objetos en movimiento que confunden con sus presas. Sin embargo, la mordedura espontánea resulta el método más peligroso y menos efectivo, debido a que el proceso de recolección es complicado y no se obtiene el volumen total de secreción. Por el contrario, en la técnica de estimulación eléctrica el animal es previamente anestesiado e inmovilizado, lo cual permite obtener la mayor cantidad de veneno sin correr el riesgo de ser mordido por los especímenes. En esta técnica, una vez que los animales son inmovilizados, se estimula eléctricamente la zona parabasal de los quelíceros mediante un par de electrodos conectados a una fuente eléctrica que produce descargas con voltaje y frecuencia específicos sobre los músculos que rodean a la glándula, lo cual induce su contracción y liberación de las secreciones venenosas, mismas que son simultáneamente recolectadas (Rocha-e-Silva et al., 2013). Con el fin de preservar y almacenar los venenos, se recomienda su almacenamiento como liofilizado. Sin embargo, algunos laboratorios diluyen las secreciones en agua grado HPLC con una solución de 0.1 % de ácido trifluoroacético (v/v) o de glicerol, para posteriormente congelarse a –70 ºC (Ono et al., 2011; Palagi et al., 2013).

Figura 12. Métodos de extracción de veneno. A) Estimulación eléctrica y B) Mordida espontánea.

2.6 Aplicaciones prácticas de péptidos purificados del veneno de tarántulas

Un rasgo interesante de los venenos de tarántulas, es que exhiben su potencia toxicológica exclusivamente cuando sus componentes actúan en conjunto. Así mismo, cuando estos son separados por métodos cromatográficos y analizados individualmente, no producen los síntomas del envenenamiento en comparación con el veneno crudo. Debido a la alta especificidad y potencia de los componentes del veneno y a los mecanismos de acción involucrados en su actividad biológica, es posible desarrollar múltiples aplicaciones biotecnológicas (Chaim et al., 2011). De manera adicional, los péptidos son los componentes más estudiados, en virtud de la dinámica de interacción sobre sus blancos biológicos. Dentro de la misma secreción, se pueden encontrar variantes discretas de péptidos que pueden exhibir un efecto contrario o semejante, mediante mecanismos alternos (Pineda et al., 2014b). Por estas razones, la investigación de venenos de tarántulas se ha transformado de la elaboración de antivenenos y faboterápicos, en la búsqueda de péptidos como herramientas biotecnológicas útiles (Calvete et al., 2009; Gonçalves-Machado et al., 2016; Quinton et al., 2016).

2.6.1 Aplicaciones de péptidos como herramientas farmacológicas Las dianas biológicas de las toxinas peptídicas se encuentran distribuidas en los organismos de sus presas y depredadores en variedades que cuentan con un alto porcentaje de homología (Mourão et al., 2013). Sin embargo, las mínimas diferencias en su estructura primaria las dotan de características diferenciales tanto estructurales como electrofisiológicas. De este modo, existen isoformas de cada una de estas dianas, dependiendo del fenotipo de cada célula excitable, las cuales se expresan de diferente manera (Gilchrist y Bosmans, 2012; Klint et al., 2015; Zamponi et al., 2015). Actualmente, se han caracterizado 9 isoformas de canales iónicos de sodio operados por voltaje, una gran variedad de canales iónicos de potasio operados por voltaje, producidos por 75 genes y, al menos, 5 subtipos con múltiples variedades de canales iónicos de calcio operados por voltaje (Deng et al., 2014; Berecki et al., 2016). De manera interesante, las características químicas y funcionales de los

péptidos purificados de veneno de tarántulas permiten discriminar específicamente a las variantes de sus dianas biológicas, de tal forma que son utilizados como herramientas farmacológicas en ensayos diseñados para dilucidar los mecanismos de acción de otros péptidos o moléculas (Cardoso et al., 2015; Prashanth et al., 2017). Entre las toxinas que pueden ser utilizadas como herramientas farmacológicas, se encuentra la toxina π–theraphotoxin–Pc1a, purificada de la tarántula cabría de Trinidad Psalmopoeus cambridgei, la cual actúa directamente como bloqueador en el bolsillo acídico con su estructura consenso de ß–hairpina, en los canales sensibles a ácidos ASIC1a. En la actualidad, esta toxina es la única molécula capaz de interactuar con este receptor con alta potencia y especificidad. La toxina π– theraphotoxin–Pc1a se caracteriza por poseer una estructura primaria con 40 aminoácidos que opera a partir de una concentración de ~1 nM, logrando discriminar con alta especificidad a otras isoformas a concentraciones de hasta 50 nM. Es importante mencionar, que gracias al estudio in silico de esta toxina, se han logrado dilucidar nuevos estados conformacionales del receptor (Saez et al., 2015). Por otro lado, en el veneno de la misma tarántula se ha purificado un péptido denominado toxina de doble nudo DkTx: Double Knot Toxin, el cual estimula la conformación activa del canal TRPV1a, mediante la interacción con dos de las cuatro unidades formadoras de poro. A su vez, esta toxina podría utilizarse como herramienta farmacológica en la búsqueda de inhibidores de isoformas del mismo canal (Bohlen et al., 2010). De igual modo, se han encontrado toxinas capaces de modular canales iónicos de sodio operados por voltaje como la toxina µ–theraphotoxin–Tp1a, purificada de la tarántula de terciopelo verde de Perú Thrixopelma pruriens, la cual es capaz de inhibir selectivamente la isoforma Nav1.7, a partir de una concentración de 220 nM, utilizando la toxina nativa y a unidades de concentración µM, empleando las toxinas recombinantes y sin modificaciones postraduccionales (Cardoso et al., 2015). Por lo que se refiere al estudio de canales iónicos de potasio operados por voltaje, es importante mencionar que uno de los impedimentos de caracterizar nuevos receptores, es la escasa variedad de agonistas y antagonistas disponibles. Sorpresivamente, se han encontrado péptidos purificados de veneno de tarántulas

que logran interactuar con isoformas específicas, tal es el caso del péptido ß– theraphotoxin–Cj1α, purificado del veneno de la tarántula cervatillo de China Chilobrachys guangxiensis, cuya caracterización funcional se describió en un principio como regulador de canales iónicos de sodio operados por voltaje específicos a la variante Nav1.5 (Rong et al., 2011). Sin embargo, estudios posteriores determinaron la existencia de una secuencia conservada entre esta variante y el canal iónico de potasio operado por voltaje isoforma Kv2.1, por lo cual se describió a esta toxina peptídica como promiscua con la capacidad de interactuar con ambas variantes a partir de concentraciones µM semejantes (Tao et al., 2016). Así mismo, es importante mencionar que no se han encontrado inhibidores de éstas u otras variantes de canales iónicos de sodio, que actúen con la especificidad que ofrecen los péptidos purificados del veneno de tarántulas. A su vez, la toxina – theraphotoxin–Hg1a, purificada de la tarántula roja de Camerún Hysterocrates gigas, actúa bloqueando selectivamente a canales iónicos de calcio dependientes de voltaje del tipo R, a partir de concentraciones de 15 a 30 nM, sin tener actividad sobre otras isoformas (Newcomb et al., 1998; Klint et al., 2015). 2.6.2 Descubrimientos concomitantes a la aplicación biotecnológica de péptidos

El uso de toxinas peptídicas como herramientas de investigación ha permitido la determinación de nuevas características estructurales y funcionales de sus principales dianas biológicas, lo cual ha conducido al descubrimiento de su participación en nuevos procesos fisiológicos, así como a la búsqueda racional de agonistas y antagonistas (Pimentel et al., 2006; Zhang et al., 2015). Esto ocurre en virtud de la interacción química que se produce cuando se une un ligando a su receptor, lo cual ha conducido a la determinación de nuevos estados conformacionales y a la identificación de características estructurales que hacen diferentes a las isoformas. Un descubrimiento interesante, es el de la toxina π– theraphotoxin–Pc1a, cristalizada con el receptor ASIC1a, la cual ha permitido, mediante técnicas in silico, dilucidar un nuevo estado conformacional del estado activo del receptor (Saez et al., 2015). Además, es importante mencionar que los registros electrofisiológicos producidos al administrar la toxina en neuronas

nociceptoras, han ayudado a identificar el rol de este receptor en la transmisión sináptica del dolor (Duan et al., 2007). Adicionalmente, la información proporcionada sobre el espacio químico aportado por la toxina, conduce al descubrimiento racional de nuevas moléculas con propiedades semejantes a fármacos, las cuales podrían proponerse para la investigación en el desarrollo terapéutico de fármacos analgésicos (Fernández–Ballester et al., 2011). Por otro lado, se han encontrado péptidos con actividad cruzada entre distintas dianas, como la toxina β– theraphotoxin–Cj1α, la cual actúa sobre estructuras conservadas donde convergen los canales iónicos, operados por voltaje, de potasio Kv2.1 y de sodio Nav1.5. Así mismo, mediante mutagénesis sitio dirigida en la toxina, se han determinado los aminoácidos de la estructura primaria del receptor que hacen específica a cada una de las isoformas (Tao et al., 2016). De este modo, modificar la estructura primaria de este péptido podría permitir diseñar toxinas que actúen específicamente sobre cada una de las isoformas caracterizadas de estas dianas. Por otro lado, dentro de las toxinas mencionadas en el apartado anterior, resalta el péptido de doble nudo inhibitorio de cistina DkTx que interactúa específicamente sobre el receptor TRPV1a (Bohlen et al., 2010). Es importante mencionar, que gracias a esta toxina se logró determinar la importancia de los aminoácidos que tapizan la unidad formadora de poro en uno de sus estados conformacionales activos y que podrían ser clave para producir inhibidores de estos receptores que, junto a los ASICs, son dianas interesantes en la investigación terapéutica del dolor (Liao et al., 2013; Li et al., 2014; Abdelhamid y Sluka, 2015).

2.7 Tarántula ornamental de la India, Poecilotheria regalis (Pocock, 1899). La tarántula ornamental de la India Poecilotheria regalis, (Filo: Arthropoda, Clase: Arachnida, Orden: Araneae, Suborden: Mygalomorphae, Infraorden: Opisthothelae, Familia: Theraphosidae, Subfamilia: Poecilotheriinae, Género: Poecilotheria, Especie: regalis), también conocida como tarántula rey paracaidista o tarántula real paracaidista, es una tarántula arborícola endémica del sur de india que se distribuye en los estados de Andhra Pradesh, Tamil Nadu, Karnataka, Maharashtra y Kerala, en una superficie de 50,000 m2 [Figura 13]. Fue descrita por Pocock en 1899, aunque

anteriormente estaba clasificada dentro de la subfamilia Ornithoctoninae como Ornithoctonus gadgili, la cual forma parte de su sinonimia (World Spider Catalog, 2017).

Figura 13. Distribución geográfica de la tarántula P. regalis. En la imagen se denota en color rosa los estados del sur de la India donde se distribuye; a la derecha un espécimen hembra en su hábitat natural.

Una característica interesante de esta especie, es que es ampliamente comercializada a nivel mundial entre los coleccionistas, a pesar de que se ha reportado como una tarántula que produce una mordedura con síntomas de envenenamiento que resaltan sobre otras tarántulas arborícolas (Fuchs et al., 2014). Cabe señalar que la sintomatología del envenenamiento en el ser humano incluye dolor, eritema, inflamación, calambres musculares mantenidos y entumecimiento, desde la zona de la mordedura hasta el resto de la extremidad, por lo cual resalta el interés bioquímico de su veneno (Andreev-Andrievskiy et al., 2017). Sin embargo, la información recabada sobre los componentes de sus secreciones venenosas se

limita a la identificación de enzimas semejantes a hialuronidasas, mientras que la información sobre la identidad de sus toxinas peptídicas permanece sin ser estudiada (Rodríguez-Rios et al., 2017).

2.8 Técnicas empleadas en venómicas

La toxinología, mejor conocida como biología de toxinas o toxinas medicinales, es una disciplina científica que se enfoca en la caracterización química, funcional, dilucidación de mecanismos de acción biológicos, farmacología de péptidos y al estudio de los efectos toxicológicos producidos por productos purificados de plantas, microorganismos, animales venenosos o ponzoñosos. Así mismo, al conjunto de técnicas usadas en la biología de toxinas que estudia las secreciones venenosas, se conoce como venómicas, e incluyen técnicas destinadas a la separación de toxinas del veneno, así como algunas que aportan información sobre la estructura primaria y la función biológica de toxinas purificadas del veneno o de las secreciones venenosa (Zhang, 2015) [Figura 14].

Figura 14. Estrategias analíticas en el descubrimiento de toxinas, basadas en venómicas; las tecnologías empleadas en conjunto derivan en el descubrimiento de toxinas interesantes a partir de cantidades ínfimas de veneno, (modificado de King, 2015). 2.8.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida ‘Tricine SDS–PAGE’ Con el objeto de obtener un perfil general de las toxinas peptídicas y proteínicas presentes en el veneno de tarántulas, se emplean técnicas que permiten visualizar específicamente a estos componentes. En toxinología, la electroforesis en gel de poliacrilamida con amortiguadores de tricina ‘Tricine SDS–PAGE’: ‘Tricine sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel–electrophoresis’, es una herramienta primordial para dicho análisis, ya que se pueden diferenciar fácilmente ambos componentes (péptidos y proteínas) con respecto a su peso molecular. En concreto, esta técnica lleva a cabo la separación de péptidos y proteínas, mediante un procesamiento previo del veneno, el cual consiste en desnaturalizar, cargar y teñir a los péptidos y proteínas. Así mismo, una vez procesado, el veneno es embebido en una matriz

tamizada de poliacrilamida que es sometida a un campo eléctrico, la cual provoca la migración de las toxinas cargadas hacia el ánodo. Finalmente, durante esta migración, las toxinas peptídicas y las proteínas quedan retenidas en una zona específica de la matriz que, comparándole con estándares de proteínas previamente caracterizadas, permite identificar su peso molecular aproximado (Kavoosi y Ardestani, 2012).

2.8.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa ‘RP–HPLC’ El objetivo principal, previo al análisis químico y funcional, es la separación de las toxinas analitos del veneno matriz. Para este propósito, se utilizan métodos estandarizados, diseñados a partir de las características fisicoquímicas de las toxinas blanco. En particular, la técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa ‘RP–HPLC’: ‘Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography’, es primordial para la separación de péptidos presentes en venenos, por lo cual es ampliamente utilizada en las venómicas. En síntesis, el proceso se lleva a cabo mediante la interacción de una fase móvil polar, en la cual está disuelta el veneno, con una fase estacionaria apolar que, al penetrar sobre esta a alta presión, provoca que los péptidos queden adsorbidos mediante interacciones hidrofóbicas y puedan ser separados lenta y simultáneamente por el gradiente (polar–apolar). Durante la elución, los péptidos son detectados como picos gracias al enlace peptídico que los compone y que también funge como cromóforo, mismo que absorbe energía a una longitud de onda de 210 nm. Un punto importante a considerar, es que debido a las variedades discretas de los péptidos presentes en el veneno, se produce un fenómeno conocido como coelución, por lo cual la purificación de péptidos conlleva al uso de fases estacionarias con distinta composición (Aguilar, 2017).

2.8.3 Espectrometría de masas ‘MALDI–TOF’

Una vez que se lleva a cabo la separación mediante ‘RP–HPLC’, es importante identificar si los picos cromatográficos eluídos corresponden a péptidos purificados o

a una mezcla. Para realizar esta identificación, se emplean técnicas enfocadas en la determinación del peso molecular. Puntualmente, la técnica de ionización por desorción laser asistida por matriz, acoplada a un detector de tiempo de vuelo ‘MALDI–TOF’: ‘Matrix Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight’, es la más utilizada en toxinología y permite revelar perfiles tanto de las fracciones separadas del veneno, como del extracto venenoso. En resumen, la determinación se lleva a cabo cuando la muestra es cocristalizada con una matriz e incidida por un haz de láser a cierta frecuencia que permite la ionización y desorción de él o los componentes. Posteriormente, estos se desplazan con ayuda de su carga a través de un tubo hermético hacia el detector de tiempo de vuelo. Así, el peso molecular es determinado en proporción directa a la relación masa–carga, la cual es proporcionada por el tiempo que tardan estos iones desde su ionización hasta alcanzar al detector. A su vez, los espectros que se obtienen durante el análisis se tratan de líneas proporcionales al número de péptidos ionizados y su intensidad se basa en el número de iones que rozan o colisionan con el detector (Hoffmann y Stroobant, 2007).

2.8.4 Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem ‘LC–ESI–Q–TOF–MS’

Para generar un perfil exhaustivo de las toxinas peptídicas presentes en el veneno de tarántulas, se determina parcialmente la estructura primaria de péptidos presentes, ya sea en una mezcla o individualmente. Con el fin de determinar parte de su secuencia primaria, se emplean técnicas que logran separar y acondicionar a estos componentes, con el fin de determinar parte de su secuencia primaria. Particularmente, la técnica de cromatografía de líquidos acoplada a un sistema de espectrometría de masas de ionización por electroespray con detectores de cuadropolos y tiempo de vuelo ‘LC–ESI–Q–TOF–MS’: ‘Liquid Chromatography– Electrospray Ionization–Quadrupole–Time Of Flight–Mass Spectrometry’, logra dichos objetivos y, con algunas modificaciones en cuanto al sistema de fragmentación y al principio de detección, es el sistema fundamental para secuenciar

parcialmente toxinas peptídicas y proteínicas en toxinología. En concreto, el principio de la técnica se basa en la reconstrucción de espectros de masas de múltiples fragmentos provenientes de un péptido con el fin de determinar parcialmente su estructura primaria. En primer término, los péptidos son previamente acondicionados en un medio químico o enzimático que permite producir múltiples fragmentos de manera altamente específica. Posteriormente, estos fragmentos son separados por cromatografía y ionizados en una interfase que los conduce a un gradiente de voltaje y temperatura que los carga y evapora durante su recorrido. Después, estos iones son dispersados en partículas cargadas hacia el primer detector que los deflacta con base en sus propiedades eléctricas con el fin de seleccionarlos y desviarlos hacia la cámara de fragmentación, donde partículas de gases inertes colisionan con los enlaces peptídicos, de manera que se forman productos de estos fragmentos. En seguida, estos productos son conducidos al segundo detector donde se obtienen los espectros de masas, los cuales al analizarse permiten caracterizar secciones de la secuencia primaria de un péptido en particular [Figura 14]. Además, herramientas como ‘MASCOT’ o ‘SEQUEST’ relacionan bases de datos con el objeto de identificar a partir de estas secuencias, péptidos o proteínas reportadas previamente (Steen y Mann, 2004).

Figura 15. Diagrama de flujo empleado en la búsqueda de toxinas peptídicas con potencial biotecnológico del veneno de G. inheringi (tomado de Borges et al., 2016).

2.8.5 Ensayos de toxicidad

Las toxinas están diseñadas para actuar primariamente sobre receptores de invertebrados. Sin embargo, es trascendental determinar si los efectos tóxicos son semejantes en modelos de animales vertebrados, considerando sus aplicaciones en las diversas áreas de la investigación. Por otro lado, comparar la letalidad de los extractos venenosos en modelos de invertebrados también resulta interesante, debido a las hipótesis evolutivas y a los descubrimientos recientes con respecto a sus transcriptomas. En general, los ensayos de toxicidad de veneno de tarántulas se basan en el peso de los animales de experimentación y en la cantidad de proteína del extracto venenoso que se administra para determinar su dosis letal media (Hu et al., 2014). Por otro lado, el uso de animales vivos permite hacer evaluaciones toxicológicas tomando en cuenta múltiples parámetros en condiciones fisiológicas que no se pueden realizar en ensayos in vitro o ex vivo. La rata es el animal de experimentación más empleado para estos ensayos, aunque se han empleado a otros animales como perros, conejos, gatos y puercos. Dependiendo del sistema de liberación y administración de las toxinas en cuestión, los investigadores pueden monitorear la presión arterial, el ritmo cardiaco y respiratorio, entre otros. Por ejemplo, la actividad del péptido natriurético aislado del veneno de la serpiente Pseudocerastes persicus fue determinado mediante el uso de animales íntegros (King, 2015).

3 JUSTIFICACIÓN

Las tarántulas son una familia de arañas que, con el fin de adaptarse a sus ecosistemas, administran tanto a sus presas como a sus depredadores, secreciones venenosas constituidas por un arsenal bioquímico, diseñado para actuar sinérgicamente, alterando procesos fisiológicos predeterminados evolutivamente. Sin embargo, a pesar de inducir efectos nocivos en conjunto, cuando los componentes son separados y analizados individualmente, pueden ser utilizados para el desarrollo de aplicaciones biotecnológicas útiles. Entre estos destacan las toxinas peptídicas, las cuales se presentan en múltiples variantes discretas que proveen al veneno de una biblioteca combinatoria de péptidos y lo convierten en una fuente potencial de compuestos bioactivos. Por otro lado, debido a que la mordedura de las tarántulas no representa un peligro significativo para los humanos, muchas especies arborícolas se comercializan ampliamente en cautiverio como mascotas exóticas en todo el mundo. En especial, la tarántula Poecilotheria regalis, produce un potente veneno que utiliza como estrategia para adaptarse a su difícil ritmo de alimentación. Además, esta especie presenta la ventaja de que su gran tamaño facilita la extracción de veneno, de tal modo que es posible realizar extracciones consecutivas sin necesidad de sacrificar especímenes. Por lo tanto, en virtud de la necesidad de adaptarse a una dieta diferente, esta tarántula se considera bioquímicamente interesante y, aunque existen registros de actividad enzimática en su veneno, la identidad y la caracterización química de sus toxinas peptídicas permanecen sin ser estudiadas.

4. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Cuál es la identidad de las principales toxinas peptídicas presentes en el veneno de la tarántula Poecilotheria regalis?

5. HIPOTESIS

El efecto biológico de las toxinas peptídicas presentes en el veneno de P. regalis puede ser inferido a través de su homología con péptidos purificados de otros animales venenosos previamente caracterizados química y funcionalmente.

6. OBJETIVOS

6.1 Objetivo principal

Identificar las principales toxinas peptídicas presentes en el veneno de la tarántula arborícola P. regalis.

6.2 Objetivos específicos

1. Obtener las secreciones venenosas producidas por especímenes machos y hembras de la tarántula P. regalis, mediante la técnica de estimulación eléctrica. 2. Determinar la concentración de proteína en la secreción venenosa de la tarántula P. regalis, mediante la técnica colorimétrica de ácido bicinconínico ‘BCA’. 3. Establecer las condiciones óptimas de separación de las toxinas peptídicas presentes en el veneno de machos y hembras de la especie P. regalis, mediante la técnica de cromatografía de líquidos ‘RP–HPLC’. 4. Determinar la distribución de peso molecular de los componentes proteínicos y peptídicos del veneno de especímenes machos y hembras de la especie P. regalis, mediante las técnicas de electroforesis ‘Tricine SDS–PAGE’, cromatografía de líquidos ‘RP–HPLC’ y espectrometría de masas ‘MALDI– TOF’. 5. Establecer las diferencias entre la concentración y composición de los componentes del veneno de especímenes machos y hembras de P. regalis mediante las técnicas de ‘Tricine SDS–PAGE’, ‘RP–HPLC’ y ‘MALDI–TOF’. 6. Caracterizar parcialmente la secuencia primaria de las fracciones de toxinas peptídicas más representativas del veneno de especímenes hembras de la especie P. regalis, mediante la técnica acoplada de cromatografía de líquidos y espectrometría de masas en tandem ‘RP–HPLC–ESI–MS/MS’.

7. Analizar las secuencias de aminoácidos obtenidas de novo mediante el uso conjunto de recursos bioinformáticos ‘ExPASy’ y bases de datos genómicas, transcriptómicas y proteómicas. 8. Determinar la dosis letal media del veneno de especímenes hembras de P. regalis en un modelo de vertebrado y un modelo de invertebrado, mediante ensayos de toxicidad, empleando un ajuste de dosis no lineal. 9. Determinar el daño en riñón y pulmón producido por la administración de las secreciones venenosas de especímenes hembras de tarántulas de la especie P. regalis en ratones, mediante cortes histológicos y tinciones diferenciales.

7. METODOLOGÍA

7.1 Obtención y mantenimiento de tarántulas de la especie Poecilotheria regalis Las tarántulas de la especie P. regalis de ambos sexos fueron adquiridas en los criaderos oficiales: Tarántulas de México® (SEMARNAT–UMA–IN–0062–JAL), en la unidad de manejo para la conservación de la vida silvestre ARACHNIDA® (DGVS– PIMVS–CR–IN–0977–DV08), y en el aracnario de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro (CITES/DGVS–CR–IN–0619–QRO/00), mismos que cuentan con registros de especiación y determinación de género. Las tarántulas fueron mantenidas individualmente en jaulas altas de polimetilmetacrilato con fibra de coco molida como sustrato y un recipiente para agua, con el propósito de mimetizar su hábitat natural. Las tarántulas fueron alimentadas cada 15 días con grillos Acheta doméstica, además de agua purificada ad libitum.

7.2 Extracción de veneno Con el fin de extraer el veneno, las tarántulas de la especie P. regalis fueron anestesiadas con una solución concentrada de isoflurano, para posteriormente colocarse en una superficie adecuada, inmovilizándolas con ligas de goma entrelazadas para la estimulación eléctrica y recolección de veneno. Las puntas de los colmillos se colocaron cuidadosamente alrededor de la boca de un tubo para microcentrifuga de 2 mL de capacidad previamente pesado, con la finalidad de evitar posible contaminación con saliva de la zona preoral. Después, con ayuda de dos electrodos humedecidos con solución amortiguadora de corrida, se aplicaron estímulos eléctricos de 15 V en los quelíceros durante 20 segundos en intervalos de 2 segundos, utilizando una fuente de poder para electroforesis (Bio–Rad 164–5050). Una vez obtenido el veneno, el tubo fue centrifugado e inmediatamente fue pesado y almacenado en un ultracongelador a –70 °C. Por último, el peso del veneno líquido, obtenido en la extracción, fue calculado por la diferencia en masa. Es importante mencionar, que este procedimiento fue realizado mensualmente, adaptándose al lapso de tiempo necesario para la producción de estas secreciones por el animal.

7.3 Liofilización Para llevar a cabo el proceso de deshidratación del veneno, se utilizó un equipo de liofilización ‘FreeZone 4.5 L Benchtop’ marca Labconco®. La muestra de veneno se congeló en un ultracongelador ‘Irilab 800’ marca Angelatoni® a –40 ºC y se liofilizó.

7.4 Cuantificación de proteína El veneno fue disuelto en 0.4 mL de agua grado HPLC (J.T. Baker). El contenido de proteína del veneno de cada extracción se determinó mediante el método de ácido bicinconínico ‘BCA’, descrito por Smith (1985), utilizando albúmina sérica bovina (Bio–Rad) como estándar.

7.5 Electroforesis en gel de poliacrilamida ‘Tricine–SDS–PAGE’ Con el propósito de analizar la complejidad del veneno de tarántulas hembras y machos de P. regalis, se empleó la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida, empleando la solución amortiguadora de tricina ‘Tricine–SDS–PAGE’, bajo los métodos convencionales previamente descritos en condiciones reductoras y no reductoras (Laemmli, 1970). Estos análisis se realizaron utilizando geles de poliacrilamida a diferentes concentraciones (12–18 %) con tricina como solución amortiguadora de corrida, los cuales fueron sometidos a una corriente de 120 V durante aproximadamente 2 h. Las bandas de proteína se visualizaron mediante la técnica de tinción de Coomassie. Se emplearon marcadores de peso molecular de amplio espectro (Bio–Rad, Cat # 161–0318).

7.6 Cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa ‘RP-HPLC’ El veneno, producto de la extracción de múltiples especímenes de tarántulas de la especie P. regalis previamente separadas según su sexo, fue sometido a un proceso de separación por HPLC en fase reversa. Se prepararon volúmenes de inyección de 20 µL a una concentración de 12.5 µg de proteína/μL disueltos en agua grado HPLC (J.T. Baker). Tomando como modelo métodos de separación previamente establecidos para otros venenos de otras tarántulas (Cardoso et al., 2015), el

fraccionamiento cromatográfico del veneno de P. regalis, se llevó a cabo utilizando una columna de fase reversa C18 (Waters® 250 mm x 4.6 mm, 5 μm; Symmetry, CA, USA). Para la composición de la fase móvil se utilizó un gradiente de fase A (Agua en 0.1 % ácidotrifluoroacético) y fase B (90 % acetonitrilo, 10 % agua en 0.09 % ácidotrifluoroacético), utilizando una pendiente proporcional a 0.5 % de solución B/min. El programa utilizado fue compuesto por un flujo isocrático de 3 minutos de solución A y un gradiente que alcanzo el 45% de la fase B en 93 minutos con un flujo constante de 1 mL/min. Las fracciones eluídas fueron detectadas a una longitud de onda de 215 nm y recolectadas en tubos de polipropileno para microcentrifuga de 2 mL.

7.7 Espectrometría de masas ‘MALDI–TOF–MS’ Tanto las fracciones recolectadas como las secreciones venenosas, fueron tratadas con filtros ‘ZIP–TIP’ C18 con el propósito de remover la mayor cantidad de sales, y posteriormente fueron analizadas utilizando MALDI–TOF–MS (Ultraflex, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). El proceso de ionización se llevó a cabo por irradiación con un láser de nitrógeno a 337 nm con un voltaje de aceleración de 20 kV. La matriz empleada fue de ácido sinapínico a una concentración de 10 mg/mL. Para analizar las fracciones obtenidas por ‘RP-HPLC’, 1 µL fue diluido en un mismo volumen de matriz. Los datos fueron obtenidos utilizando el software ‘Bruker Daltonics Flexcontrol’ (Bremen, Alemania). Todos los análisis fueron realizados en modo reflector.

7.8 Secuenciación parcial ‘RP–HPLC–ESI–MS/MS’ Las fracciones de péptidos 6, 8 y 23 separadas por ‘RP–HPLC’ del veneno de P. regalis, fueron sometidas a un proceso de digestión con tripsina, reducción con ditiotreitol (DTT) y alquilación con iodoacetamida. Los péptidos resultantes del tratamiento fueron inyectados en un sistema LC–MS constituido por un cromatógrafo de líquidos de micro-flujo ‘Accela’ (Thermo–Ficher Co. San Jose, CA) con ‘spliter’ (1/20) acoplado a un espectrómetro de masas ‘LTQ-Orbitrap Velos’ (Thermo-Ficher Co., San Jose, CA) con sistema de ionización tipo nano-electrospray (ESI). Para el

sistema de cromatografía de líquidos se utilizó un sistema gradiente de 10-100 % de solvente B (acetonitrilo/ácido acético 0.1 %) en 120 minutos sobre una columna capilar ‘PicoFrit Proteopep 2 C18 75 μm ID × 50 mm’ (New Objective Inc., Woburn, MA). El flujo del sistema LC fue de 400 nanolitros/minuto. Para la fragmentación de los péptidos se utilizaron los métodos de CID (Collision–Induced Dissociation) y HCD (High Energy Collision Dissociation). La ejecución y captura de los datos de fragmentación fueron realizados de forma dependiente del escaneo total de iones siguiendo las cargas predeterminadas con un ancho de aislamiento de 3.0 (m/z), energía de colisión normalizada de 35 unidades arbitrarias, activación Q de 0.250, tiempo de activación de 40 ms y tiempo máximo de inyección de 10 ms por micro- escaneo. Los espectros de líneas obtenidos fueron sometidos a la base de datos ‘MASCOT’ y las secuencias fueron alineadas en bases de datos especializadas para animales del orden Araneae ‘ARACHNOSERVER’ (Herzig et al., 2011).

7.9 Ensayos de toxicidad Con la finalidad de obtener parámetros farmacológicos más completos que ayuden a estimar el grado de toxicidad del veneno de P. regalis en comparación con otros venenos, se evaluó su toxicidad en ratones y en larvas de mosca Drosophila melanogaster. Para realizar los ensayos toxicológicos se preparó una mezcla de varias extracciones de veneno de P. regalis, a fin de contar con cantidades suficientes de proteína. Se evaluó la toxicidad en larvas de mosca (Drosophila melanogaster) de 2.34 mg y en ratones (Mus musculus) de 12 g, siguiendo el método previamente reportado por Herzig et al (2008). Para esto, se inyectó el veneno, disuelto en 30 µL de solución salina para insectos (pH 7.2; NaCl 200 mM, KCl 3.1 mM, 2 mM NaHCO3, 4 mM MgCl2, 5.4 mM CaCl2, 0.1 mM Na2HPO4) a diferentes concentraciones (0.002, 0.02, 0.2 y 2 μg de proteína) en el segmento abdominal A6 con un capilar pulido milimétrico y un equipo de inyección de nanolitros. Se realizaron 100 inyecciones para cada concentración de veneno y se contó el número de muertes en cada concentración después de 5 días de la administración. Así mismo, se determinó también la toxicidad del veneno de P. regalis en ratones machos CD1 de 12 g de peso mediante inyección intraperitoneal a diferentes dosis de proteína (0.2,

1.3, 1.33, 2.0, 6.3 y 20 μg de proteína/g de peso corporal). Cada dosis de proteína se disolvió en 0.1 ml de solución salina fisiológica esterilizada (NaCl al 0.9 %). Las muertes que ocurrieron durante las primeras 24 horas después de la administración del extracto fueron registradas para calcular la dosis letal media (DL50) mediante un ajuste no lineal. Los ratones sobrevivientes, incluyendo a los controles a los que se les administró solamente la solución salina, se observaron por un periodo de 24 horas antes de sacrificarlos por dislocación cervical. Tanto a los animales que murieron por la administración del veneno, como a los que se sacrificaron por dislocación cervical a las 24 horas de la administración, se les extrajeron inmediatamente los pulmones y los riñones. Estos órganos, una vez extraídos, se fijaron en una solución de formol al 10 % durante 2 a 3 días a 4 °C. Las muestras de los diferentes tejidos se deshidrataron, utilizando concentraciones graduales de alcohol etílico en agua (70, 80, 90, 96 %), para después embeberlas en parafina. Se realizaron cortes de 5 a 6 μm mediante un micrótomo manual, los cuales fueron teñidos mediante la técnica de hematoxilina-eosina para ser examinadas con un microscopio de luz.

8. RESULTADOS

8.1 Extracción del veneno

El veneno de tarántulas de la especie P. regalis es una secreción amarilla densa de la cual se obtuvo un volumen aproximado de 100 µL (8.7 ± 2.7 mg de líquido/espécimen). Tomando en consideración que el 90 % del veneno está compuesto por péptidos y proteínas, se determinó la concentración de proteína del veneno, la cual fue de 5.9 ± 0.7 % de peso de veneno.

8.2 Distribución de los componentes del veneno de P. regalis de acuerdo a su peso molecular Con el fin de explorar la complejidad de los componentes del veneno de tarántulas hembras y machos de la especie P. regalis, las secreciones venenosas obtenidas fueron analizadas tomando como base el peso molecular. De este modo, el análisis de ‘Tricine–SDS–PAGE’ reveló 5 bandas con diferentes pesos moleculares [Figura 16A], de las cuales las bandas 2 y 3 se expresan en mayor proporción en el veneno de tarántulas machos [Figura 16B]. Además, ambos venenos presentaron una banda concentrada y homogénea, cuyo peso molecular se encuentra entre 6 y 13 kDa, la cual corresponde a toxinas peptídicas. Debido a la limitante de la electroforesis para visualizar componentes peptídicos, y con el propósito de obtener mayor información sobre los péptidos, se realizó el análisis mediante ‘MALDI–TOF’, el cual mostró 34 líneas de espectros en un rango de 3.8 a 8.0 kDa que se expresan de manera muy similar entre ambos sexos, pero que muestran diferencias en la intensidad relativa [Figura 17].

Figura 16. Exploración de las toxinas presentes en el veneno de tarántulas hembras y machos de la especie P. regalis, mediante electroforesis ‘Tricine SDS– PAGE’. A) Se muestran 5 bandas bien definidas de diversos pesos moleculares cercanos a 1 (114,283 kDa), 2 (83,403 kDa), 3 hialuronidasas (42 kDa), 4 y 5 (17,832 kDa). B) Representación tridimensional que denota las diferencias en la expresión de las toxinas proteínicas 1 y 2 con base en el sexo. Los carriles fueron cargados con 50 ug de proteína.

tarántulas de ambos sexos detarántulas la especie

igura 17 igura

Exploración peso molecular de del veneno peptídicas toxinas en el las presentes de

toxinas peptídicas.toxinas

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8.3 Distribución de las toxinas peptídicas presentes en el veneno de P. regalis de acuerdo a su peso molecular Los péptidos representan los componentes más atractivos de los venenos de tarántulas en virtud de sus aplicaciones biotecnológicas (King, 2015). Por lo tanto, para conocer con más detalle algunas características de los péptidos presentes en el veneno de P. regalis de ambos sexos, la separación cromatográfica mediante ‘RP- HPLC’ del veneno presentó 23 fracciones, que fueron eluídas de la fase estacionaria con tiempos de retención de 10–20, 40–55 y 65–90 minutos, correspondientes a porcentajes de acetonitrilo cercanos a 0–10, 30–45 y 55–80 %, respectivamente [Figura 18]. Simultáneamente, las fracciones fueron colectadas individualmente desde el cromatógrafo con el fin de determinar el peso molecular de las toxinas peptídicas presentes en cada una. De manera general, los péptidos neurotóxicos presentes en el veneno de tarántulas presentan pesos moleculares en un rango de 2–8 kDa (Kuhn–Nentwig et al., 2011). Así mismo, las fracciones colectadas mostraron el fenómeno de coelución de péptidos con pesos moleculares cercanos a aquellos mostrados en el perfil de espectrometría de masas del extracto venenoso. Se presentaron 12.5 líneas de espectros por fracción con un promedio de peso molecular de 3.402 kDa [Figura 19]. Además, en total se determinaron 225 líneas de espectros que corresponden al número de péptidos presentes en el extracto venenoso que contrastaron levemente entre venenos de tarántulas hembras y machos. Por otra parte, las fracciones de péptidos eluídos a diferentes concentraciones de acetonitrilo se ajustan al peso molecular promedio [Figura 20].

toxinas de composición la de relación ** 1,2, y peptídicas entre Las fracciones ambos sexos. no mostraron líneas 3 espectros 4 de de masas. en Diferencias * peptídicas. toxinas algunas con homología la especifica se 23 y F

igura 18 igura

Perfil cromatográfico del veneno de tarántulas de ambos sexos de la especie la de sexos ambos de tarántulas de veneno del cromatográfico Perfil

P. regalis P.

. En las fracciones las En .

6,8

Figura 19. Histograma de abundancia de toxinas peptídicas con base en su peso molecular. La curva muestra el acumulado de péptidos por cada fracción.

Figura 20. Distribución de las toxinas peptídicas de acuerdo a su peso molecular presentes en las fracciones separadas del veneno de P. regalis. Las fracciones contienen péptidos con pesos moleculares semejantes, mientras que las fracciones 10, 21, 22 y 23 presentan péptidos mayores a 6 kDa.

8.4 Identificación de péptidos presentes en las fracciones representativas Conocer parcialmente la secuencia primaria de péptidos separados en conjunto o individualmente, permite adjudicar posibles funciones biológicas a través del porcentaje de homología con otras toxinas previamente descritas. En consonancia con esta premisa, se obtuvieron patrones de fragmentación de las fracciones 6, 8 y 23, las cuales corresponden a etiquetas de péptidos conformados por 9–14 aminoácidos que poseen homología con múltiples toxinas con blancos biológicos desconocidos, y algunas involucradas con la inhibición de canales iónicos de calcio dependientes de voltaje, mismas que poseen actividad insecticida [Tabla 1].

8.5 Ensayos de toxicidad La evaluación de la toxicidad del veneno de P. regalis en larvas de la mosca

Drosophila melanogaster mostró una DL50 de 0.01685 ± 0.008 µg de proteína/g de peso corporal, mientras que en los ratones fue de 10.76 ± 2.038 µg de proteína/g de peso corporal [Figura 21 A y B] Al inyectar el veneno de P. regalis a la dosis de 6.3 µg de proteína/g se observó que los ratones presentaron movimientos más rápidos con respecto a los controles, seguido de saltos y respiración forzada. Uno de ellos presentó convulsiones y muerte

a los 20 minutos después de haberle administrado el veneno, los otros ratones se recuperaron en el transcurso de una hora. A la dosis de 20 µg de proteína/g, todos los ratones presentaron saltos, convulsiones y muerte en menos de 4 minutos después de haberles administrado el veneno. El análisis histológico de los tejidos de los ratones inyectados indicó que ninguno de los ratones administrados con el veneno presentó daños visibles con respecto a los controles [Figura 22].

A A A A A

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1 0

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Tabla Tabla

9 9 0 9

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7 8 3 9

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Figura 21. Curvas dosis-respuesta que muestran la toxicidad del veneno de P. regalis en larvas de D. melanogaster (A) y en ratones (B).

Pulmón Control Tratado

Riñón Control Tratado

Figura 22. Fotografías representativas de microscopía de luz que muestran el análisis histológico de los ratones a los que se les administró el veneno de P. regalis a una dosis de 6.3 μg de proteína por g de peso corporal por vía intraperitoneal. Cortes teñidos con hematoxilina-eosina, magnificación x100.

9. DISCUSIÓN

El veneno de tarántulas está compuesto por una mezcla heterogénea de compuestos bioactivos cuya acción sinérgica sobre múltiples dianas biológicas produce el desequilibrio de procesos fisiológicos clave que permiten al animal subyugar a sus presas y defenderse de sus depredadores (Rash y Hodgson, 2002). Además, estos compuestos presentan estructuras químicas variadas, los cuales se encuentran en diferentes concentraciones en virtud de factores como el sexo, distribución, edad, entre otras. Para conseguir estas alteraciones fisiológicas, los componentes enzimáticos presentes en el veneno cumplen un rol trascendental al distribuir el resto de los componentes desde la zona de la mordedura, hacia el sitio de acción toxicológico (Bordon et al., 2012, 2015). En general, se han identificado en venenos de arañas enzimas como glicosidasas, nucleasas, proteasas y lipasas, así como múltiples proteínas involucradas en el metabolismo intracelular, mismas que en conjunto poseen pesos moleculares en un rango de 10–100 kDa (Hu et al., 2014; Borges et al., 2016). En particular, el veneno de P. regalis contiene una variedad de proteínas con pesos moleculares que abarcan un rango de 15 a 110 kDa coincidentes con aquellos de las enzimas mencionadas. Sin embargo, debido a los escasos registros de actividad y a la improductiva presencia de factores metabólicos en el veneno, se ha especulado que estos componentes son producto de la contaminación inherente tanto al tipo de secreción de las glándulas venenosas, como al proceso de extracción de veneno (Vassilevski et al., 2009; Grishin et al., 2010; Andreev- Andrievskiy et al., 2017). Así mismo, se encontró una mayor expresión de proteínas cercanas a 114 y 83 kDa en los venenos de los especímenes machos de P. regalis. Hasta el momento, la identidad y función de estas proteínas son desconocidas, y no existe evidencia sobre el efecto sinérgico o toxicológico en el veneno de esta u otras tarántulas. Sin embargo, nuestro equipo de trabajo comprobó que estas proteínas sobreexpresadas están altamente conservadas en el veneno de otras especies de tarántulas macho (evidencia no mostrada). Por otro lado, las enzimas con actividad semejante a hialuronidasa están altamente conservadas y su actividad ha sido determinada plenamente en las secreciones venenosas de tarántulas y otros

animales (Sutti et al., 2014). Específicamente, el veneno de tarántulas hembras y machos de P. regalis presenta una banda intensa aproximadamente de 40 kDa que concuerda con enzimas con actividad de hialuronidasa, misma que nuestro grupo de trabajo ha comprobado que produce mayor actividad con respecto al veneno de otras tarántulas, tanto del mismo género taxonómico, como a otras con hábitos excavadores (Rodriguez–Ríos et al., 2017). Por otra parte, se han purificado proteínas responsables de los efectos toxicológicos por envenenamiento de ciertas arañas, como las latrotoxinas (>100 kDa) y necrotoxinas (30–35 kDa) presentes en el veneno de arañas del género Latrodectus y Loxosceles, respectivamente (Chaves- Moreira et al., 2017; Ryan et al., 2017), las cuales concuerdan con el peso molecular de toxinas proteínicas presentes en el veneno de múltiples tarántulas y que actualmente no cuentan con evidencia química o funcional. Es importante mencionar, que las manifestaciones clínicas ocasionadas por envenenamiento de P. regalis, a pesar de reportar síntomas más vigorosos con respecto al de otras tarántulas, no son semejantes a aquellos producidos por el latrodectismo o loxoscelismo. Por otro lado, con el propósito de adaptarse a su medio ambiente, los venenos de tarántulas contienen neurotoxinas encargadas de interrumpir los procesos fisiológicos involucrados con la contracción muscular y la producción de dolor. Para esto, los péptidos actúan modificando las cinéticas de activación e inactivación en diferentes estados conformacionales de canales iónicos de sodio, potasio y calcio, operados por voltaje, lo cual inhibe la formación del potencial de acción en neuronas presinápticas y postsinápticas (King, 2015). Así mismo, se han reportado pesos moleculares de ‘–theraphotoxins’ (3929–4331 Da), ‘–theraphotoxins’ (3681–5298 Da), ‘µ-theraphotoxins’ (3612–8612 Da), ‘–theraphotoxins’ (3280–6172 Da) y ‘– theraphotoxins’ (2938–8752 Da) (Kuhn-Nentwig et al., 2011). En general, el veneno de tarántulas machos y hembras de la especie P. regalis contiene péptidos cuya distribución de peso molecular se encuentra en un rango de 1000–2000 Da y 3500– 4500 Da presentes en la mayoría de las fracciones eluídas, además de 9 péptidos entre 6500–8000 Da. De igual modo, se han determinado funcionalmente péptidos de 8000 Da capaces de enaltecer la actividad de neurotoxinas de mayor peso

molecular, como los péptidos adaptadores de latrotoxinas, así como otras que poseen un doble nudo inhibitorio de cistina y que modulan canales TRPV1a (Vassilevski et al., 2009; Bohlen et al., 2010). Hasta el momento, las evidencias toxicológicas entre el veneno de tarántulas del género Poecilotheria, no han mostrado un efecto sinérgico entre proteínas y neurotoxinas. Por lo tanto, las toxinas cercanas a 8000 Da podrían estar compuestas por dobles nudos inhibitorios de cistina que deben ser analizadas puntualmente debido a su interés farmacológico. Por otro lado, dado que uno de los factores de variabilidad primordiales en la expresión de toxinas es el sexo, durante la búsqueda de péptidos con potencial biotecnológico es indispensable comparar los perfiles de composición del veneno de especímenes hembras y machos (Escoubas et al., 2002; Herzig y Hodgson, 2009; Palagi et al., 2013; Albalat y Cañestro, 2016). Por ejemplo, el veneno de arañas de la especie Atrax robustus presenta la toxina peptídica –HXTX–1a que actúa selectivamente sobre canales iónicos operados por voltaje de sodio. Esta toxina ha sido ampliamente estudiada con el propósito de utilizarse como bioinsecticida y únicamente se expresa en machos maduros (Wilson, 2015). De manera puntual, el veneno de tarántulas macho de P. regalis presenta variaciones en la composición y concentración de péptidos con respecto al veneno de hembras, lo cual amplía las posibilidades de encontrar toxinas con potencial biotecnológico en el veneno de esta tarántula. Por otra parte, múltiples toxinas peptídicas con potencial biotecnológico han sido identificadas del veneno de tarántulas y arañas mediante el porcentaje de homología de las toxinas secuenciadas y almacenadas en bases de datos. Tal es el caso de las toxinas peptídicas del veneno de la tarántula Grammostola iheringi, la cual mediante el uso de técnicas multidimensionales se logró adjudicar diferentes funciones a los péptidos presentes en su veneno (Borges et al., 2016). Así mismo, las toxinas peptídicas presentes en las fracciones 6, 8 y 23 separadas del veneno de P. regalis en este estudio, exhiben un alto porcentaje de homología con toxinas involucradas en la inhibición de canales iónicos de calcio operados por voltaje, como la toxina ω– theraphotoxin–Asp3a de 4850 Da purificada del veneno de la tarántula Aphonopelma

sp, misma que bloquea canales de calcio operados por voltaje de invertebrados de manera inespecífica. Curiosamente, esta toxina cuenta con una patente desde 1994 y se ha utilizado en la investigación para el desarrollo bioinsecticidas, debido a su parecido estructural con la toxina peptídica ω–theraphotoxin–Bs2a de 4922 Da, de la tarántula de Rodillas Rojas Brachypelma smithi. Esta toxina posee homología con la fracción 8 del veneno de P. regalis, y actúa específicamente sobre canales de calcio de invertebrados. Por otro lado, algunos péptidos presentes en todas las fracciones analizadas mostraron homología con toxinas peptídicas, las cuales no han sido relacionadas con un efecto o blanco biológico hasta el momento. Tal es el caso de las toxinas U26–theraphotoxin–Cg1a y 1b de 4609 y 4619 Da respectivamente, purificadas del veneno de la tarántula pardo clara de China Chilobrachys guangxiensis. Sin embargo, cabe mencionar que las toxinas con blanco desconocido presentan pesos cercanos y un alto grado de homología con , , µ,  y  theraphotoxinas que deben ser analizadas detalladamente (Herzig et al., 2011). Por otra parte, se encontró homología con toxinas peptídicas de otros animales venenosos, como el precursor de la conotoxina Bu6 de Conus bullatus y el péptido putativo maduro semejante a toxina CIGES. La alta homología entre precursores de toxinas peptídicas es común, debido a que provienen de genes ancestrales comunes, que han evolucionado mediante duplicación y divergencia, lo cual los hace ser semejantes (Pineda et al., 2014a; Kerkkamp et al., 2015). Así mismo, se encontró un 100 % de homología con fragmentos de péptidos U1–theraphotoxin–Pf2, Pf3 y U5– theraphotoxin–Pf3, obtenidos mediante enfoques transcriptómicos de la glándula venenosa de la tarántula Poecilotheria formosa, por lo que podría tratarse de péptidos parálogos presentes en el veneno de P. regalis. Considerando la necesidad de adaptarse a las diferencias estructurales de los blancos biológicos en las múltiples especies de presas, se ha propuesto que las toxinas peptídicas se presentan en las secreciones venenosas de tarántulas en variantes discretas (Pineda et al., 2014b). De igual manera, se han identificado mediante métodos transcriptómicos, péptidos neurotóxicos parálogos y ortólogos en las glándulas de veneno extraídas de distintas especies de arañas de la familia

Hexatelidae. El veneno de P. regalis produce una letalidad en ratones equivalente a la mitad de la concentración producida por el veneno de la ampliamente estudiada tarántula asiática Selenocosmia Jiafu (Hu et al., 2014). Además, nuestro equipo de trabajo determinó que la letalidad del veneno en grillos de la especie Acheta domestica es menor con respecto al veneno de otras tarántulas africanas y americanas (García-Arredondo et al., 2015), y finalmente en este trabajo determinamos que la letalidad del veneno de P. regalis es mayor en larvas de la mosca Drosophila melanogaster que en el resto de las especies analizadas. Es importante mencionar, que la letalidad del veneno de múltiples arañas ha sido analizada en diversas especies incluyendo a la mosca D. melanogaster y que actúa de manera específica a la especie estudiada. Acorde con esta evidencia, algunas neurotoxinas con actividad insecticida se han purificado del veneno de tarántulas con pesos moleculares de 1–8 kDa, de las cuales algunas actúan específicamente sobre canales iónicos de calcio operados por voltaje de invertebrados, y que concuerdan con los pesos aproximados a las toxinas identificadas en este estudio (Hardy et al., 2013; Smith et al., 2013; Herzig y King, 2015).

10. CONCLUSIÓN

En este trabajo se determinó la complejidad de la composición del veneno de tarántulas de ambos sexos de la especie P. regalis, con lo que se lograron establecer diferencias importantes, ya que el veneno de los machos presenta toxinas proteínicas en mayor concentración que el veneno de las hembras, mismas que podrían proponerse como marcadores para la determinación de sexo en esta especie. Los análisis de secuenciación de fragmentos de las toxinas peptídicas sugirieron la presencia de toxinas insecticidas con mecanismos de acción que involucran a los canales iónicos de calcio dependientes de voltaje específicos para invertebrados, así como péptidos parálogos de la especie cercana del mismo género taxonómico Poecilotheria formosa. Además, se identificaron péptidos precursores de toxinas peptídicas de otras especies venenosas que sugiere que los péptidos producidos por esta tarántula provienen de genes ancestrales. Finalmente, se determinó que el veneno de P. regalis es tóxico en ratones a concentraciones más bajas que otras tarántulas asiáticas, provocando un efecto letal principalmente neurotóxico. Este estudio presenta datos metodológicos importantes para el desarrollo de futuras estrategias de investigación que permitirán la obtención de toxinas con efectos farmacológicos, útiles en el desarrollo de fármacos. Actualmente se está trabajando en la obtención de información sobre los efectos farmacológicos de este veneno en diferentes modelos biológicos y en la determinación de los mecanismos de acción involucrados. Los análisis químicos obtenidos en este estudio serán de gran utilidad para la purificación de los compuestos responsables de los efectos observados hasta el momento.

11. BIBLIOGRAFÍA

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12.ANEXO

Espectros de líneas de masas de las fracciones separadas mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de la especie P. regalis.

‘Peptide mass fingerprint’ de las toxinas peptídicas presentes en el veneno de P. regalis’ CONTENIDO PÁGINA

Figura A1. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 6 77

Figura A2. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 7 78

Figura A3. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 8 79

Figura A4. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 9 80

Figura A5. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 10 81

Figura A6. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 11 82

Figura A7. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 12 83

Figura A8. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 13 84

Figura A9. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 14 85

Figura A10. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 15 86

Figura A11. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 16 87

Figura A12. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 17 88

Figura A13. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 18 89

Figura A14. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 19 90

Figura A15. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 20 91

Figura A16. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 21 92

Figura A17. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 22 93

Figura A18. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 23 94

Figura A1. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 6 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A2. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 7 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A3. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 8 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A4. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 9 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A5. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 10 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A6. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 11 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A7. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 12 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A8. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 13 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A9. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 14 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A10. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 15 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A11. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 16 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A12. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 17 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A13. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 18 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A14. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 19 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A15. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 20 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A16. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 21 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A17. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 22 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.

Figura A18. Espectro de líneas de los péptidos presentes en la fracción 23 separada mediante ‘RP-HPLC’ del veneno de tarántulas hembras de P. regalis.