Analýza Obsahových Látok Cudrania Tricuspidata III

FARMACEUTICKÁ FAKULTA

Analýza obsahových látok Cudrania tricuspidata III.

DIPLOMOVÁ PRÁCA

MONIKA ÁRENDÁSOVÁ

Vedoucí práce: prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D.

Konzultant: PharmDr. Markéta Gazdová, Ph.D.

Ústav přírodních léčiv

Program Farmacie

Brno 2021

ANALÝZA OBSAHOVÝCH LÁTOK CUDRANIA TRICUSPIDATA III.

Bibliografický záznam

Autor: Monika Árendásová Farmaceutická fakulta Masarykova univerzita Ústav přírodních léčiv

Názov práce: Analýza obsahových látok Cudrania tricuspidata III.

Študijný program: Farmacie

Vedúci práce: prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D.

Školiteľ špecialista PharmDr. Markéta Gazdová, Ph.D

Rok: 2021

Počet strán: 92

Kľúčová slova: chromatografia, izolácia, M. tricuspidata, Moraceae, prenylované flavonoidy a xantóny

2 ANALÝZA OBSAHOVÝCH LÁTOK CUDRANIA TRICUSPIDATA III.

Bibliographic record

Author: Monika Árendásová Faculty of Pharmacy Masaryk University Department of Natural Drugs

Title of Thesis: Analysis of content compounds of Cudrania tricuspidata III.

Degree Programme: Pharmacy

Supervisor: prof. PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D.

Supervisor specialist PharmDr. Markéta Gazdová, Ph.D

Year: 2021

Number of Pages: 92

Keywords: chromatography, identification, Maclura tricuspidata, Moraceae, prenylated flavonoids and xanthones

3 ANALÝZA OBSAHOVÝCH LÁTOK CUDRANIA TRICUSPIDATA III.

Anotácia

Maclura tricuspidata syn. Cudrania tricuspidata je malý opadavý strom s tŕňmi z čeľade Moraceae vyskytujúci sa prevažne vo východnej Ázii, Amerike či Afrike. Je používaná v tradičnej čínskej a kórejskej medicíne hlavne pre svoje antioxidačné a širokospektrálne účinky. V praktickej časti sa venuje diplomová práca charakteristike obsahových látok izolovaných z M. tricuspidata a ich potenciálnym účinkom, so zameraním na prenylované flavonoidy a xantóny. V praktickej časti sa venuje izolácii obsahových látok z chloroformového podielu etanolového extraktu vetiev rastlinného druhu M. tricuspidata a ich identifikácii. Obsahové látky boli získavané pomocou chro- matografických metód TLC, CC a HPLC a k ich identifikácii bola použitá spektrálna metóda UV-Vis.

4 ANALÝZA OBSAHOVÝCH LÁTOK CUDRANIA TRICUSPIDATA III.

Abstract

Maclura tricuspidate syn. Cudrania tricuspidata is a small deciduous tree with thorns from the family Moraceae, occurring mainly in East Asia, America, or Africa. It is used in traditional Chinese and Korean medicine mainly for its antioxidant and broad-spectrum effects. In the practical part, the diploma thesis deals with the characteristics of the ingredients isolated from M. tricuspidata and their potential effects, with a focus on prenylated flavonoids and xanthones. The practical part deals with the isolation of the contents from the chloroform fraction of the ethanolic extract of the branches of the plant species M. tricuspidata and their identification. The contents were obtained by TLC, CC and HPLC chromatographic methods and the UV-Vis spectral method was used for an attempt to identify them.

ANALÝZA OBSAHOVÝCH LÁTOK CUDRANIA TRICUSPIDATA III.

Čestné prehlásenie

Prehlasujem, že som diplomovú prácu na tému Analýza obsahových látok Cudrania tricuspidata III. spracovala sama. Všetky pramene a zdroje infor- mácií, ktoré som použila k spísaniu tejto práce, boli citované v texte a sú uve- dené v zozname použitých prameňov a literatúry.

V Brne 12. dubna 2021 ...... Monika Árendásová

ANALÝZA OBSAHOVÝCH LÁTOK CUDRANIA TRICUSPIDATA III.

Poďakovanie

Touto cestou by som sa rada poďakovala môjmu vedúcemu diplomovej práce prof. PharmDr. Karolovi Šmejkalovi, Ph.D. a mojej konzultantke PharmDr. Markéte Gazdovej, Ph.D. za ich trpezlivosť, pomoc a ochotu, od- borné vedenie, cenné rady a ich pozitívny prístup pri izolácií rovnako, ako aj pri spracovaní diplomovej práce. Ďalej by som sa rada poďakovala mojej ko- legyni Monike Vraždovej za spoluprácu pri izolácii obsahových látok. V neposlednom rade by som sa chcela poďakovať všetkým, ktorý mi akýmkoľvek spôsobom pomohli a umožnili vypracovanie mojej diplomovej práce.

OBSAH

Obsah

Zoznam obrázkov 14

Zoznam tabuliek 17

Zoznam pojmov a skratiek 18

1 Úvod 21

2 Cieľ práce 23

2.1 Teoretická časť ...... 23

2.2 Praktická časť ...... 23

3 Teoretická časť 24

3.1 Botanická charakteristika rastliny Maclura tricuspidata ...... 25

3.1.1 Taxonomické zaradenie ...... 25

3.1.2 Výskyt ...... 26

3.1.3 Morfológia ...... 26

(1) Koreň, stonka, list ...... 27

(2) Kvet ...... 28

(3) Plod ...... 29

3.1.4 Využitie ...... 30

3.2 Fytochemický profil ...... 32

3.2.1 Flavonoidy ...... 32

(1) Flavóny ...... 33

(2) Flavanoly ...... 36

(3) Flavanóny ...... 39

(4) Izoflavóny ...... 39

11 OBSAH

3.2.2 Xantóny ...... 42

3.2.3 Polysacharidy ...... 46

3.2.4 Organické kyseliny ...... 46

3.2.5 Polyfenoly ...... 46

3.2.6 Ostatné obsahové látky ...... 48

4 Praktická časť 50

4.1 Použitý materiál ...... 50

4.1.1 Použitý rastlinný materiál ...... 50

4.1.2 Chemikálie a rozpúšťadlá ...... 50

(1) Rozpúšťadlá použité pri extrakcii, chromatografii na tenkej vrstve (TLC) a pri stĺpcovej chromatografii (CC) ...... 50

(2) Rozpúšťadlá použité pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) ...... 51

4.1.3 Materiál používaný pri chromatografii ...... 51

(1) Materiál používaný pri TLC ...... 51

(2) Materiál používaný pri CC ...... 51

(3) Materiál používaný pri analytickej HPLC ...... 51

(4) Materiál používaný pri semipreparatívnej HPLC ...... 51

4.2 Použité prístroje ...... 52

4.2.1 Prístroje použité pri HPLC ...... 52

4.3 Použité metódy ...... 52

4.3.1 Separačné metódy ...... 52

(1) Extrakcia ...... 53

(a) Macerácia ...... 53

(b) Liquid-liquid extrakcia ...... 53

12 OBSAH

(2) Chromatografia ...... 54

(a) Chromatografia na tenkej vrstve (TLC) ...... 54

(b) Stĺpcová chromatografie (CC) ...... 56

(i) Analytická HPLC ...... 58

(ii) Semipreparativna HPLC ...... 59

4.3.2 Identifikačné metódy ...... 60

(1) UV-Vis spektrofotometria ...... 60

5 Výsledky 61

5.1 Macerácia a liquid-liquid extrakcia ...... 61

5.2 Stĺpcová chromatografia (CC) ...... 61

5.3 Preparatívna HPLC ...... 63

5.4 Semipreparatívna HPLC ...... 66

5.5 Kontrola čistoty látok pomocou TLC analýzy ...... 68

5.6 Identifikácia izolovaných látok z frakcie CT/CH/113–114/1–6 ...... 68

5.6.1 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/1 pomocou UV-Vis metódy ...... 69

5.6.2 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/2 pomocou UV-Vis metódy ...... 70

5.6.3 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/3 pomocou UV-Vis metódy ...... 71

5.6.4 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/4 pomocou UV-Vis metódy ...... 72

5.6.5 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/5 pomocou UV-Vis metódy ...... 73

5.6.6 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/6 pomocou UV-Vis metódy ...... 74

6 Diskusia 75

7 Záver 77

8 Odkazy 78

13 ZOZNAM OBRÁZKOV

Zoznam obrázkov

Obr. 1: Výskyt druhu M. tricuspidata ...... 26

Obr. 2: Tŕne ...... 27

Obr. 3: Kôra ...... 27

Obr. 4: Listy ...... 28

Obr. 5: Samčie kvety ...... 28

Obr. 6: Samičie kvety ...... 29

Obr. 7: Plody ...... 29

Obr. 8: Rozkrojené plody M. tricuspidata ...... 30

Obr. 9: Tinktúra z koreňa M. tricuspidata ...... 31

Obr. 10: Šťava z M. tricuspidata ...... 31

Obr. 11: Fermentované mlieko obohatené o prach z M. tricuspidata ...... 31

Obr. 12: Základná štruktúra flavonoidov ...... 32

Obr. 13: Cudraflavón B ...... 34

Obr. 14: Cudraflavón C ...... 35

Obr. 15: Kuwanon C ...... 35

Obr. 16: Cyklomorusín (9R) Obr. 17: Cyklomorusín (9S) ...... 36

Obr. 18: Kaempferol Obr. 19: Kvercetín ...... 37

Obr. 20: Rutín ...... 38

Obr. 21: Astragalín Obr. 22: Populnín ...... 38

Obr. 23: Cudraflavanón A ...... 39

Obr. 24: Cudraizoflavón H Obr. 25: Cudraizoflavón I ...... 40

Obr. 26: Cudraizoflavón U entantiomér 1a Obr. 27: Cudraizoflavón U enantiomér 1b ...... 40

14 ZOZNAM OBRÁZKOV

Obr. 28: Cudracusizoflavón B ...... 41

Obr. 29: Základný skelet xantónu ...... 42

Obr. 30: Cudratricusxantón N ...... 42

Obr. 31: Cudracuspixantón A ...... 43

Obr. 32: Cudracuspixantón B Obr. 33: Cudracuspixantón D ...... 43

Obr. 34: Izocudraniaxantón A Obr. 35: Izocudraniaxantón B ...... 43

Obr. 36: Cudraxantón B Obr. 37: Cudraxantón L ...... 44

Obr. 38: Cudraxantón D Obr. 39: Cudraxantón M ...... 44

Obr. 40: Macluraxantón B ...... 44

Obr. 41: Cudratrixantón U ...... 45

Obr. 42: Cudratricusxantón O ...... 45

Obr. 43: Parishin A ...... 47

Obr. 44: Parishin B ...... 47

Obr. 45: Parishin C ...... 47

Obr. 46: Parishin E ...... 48

Obr. 47: Gastrodín ...... 48

Obr. 48: Oxyresveratrol Obr. 49: 5-methoxy-4,5-difenyl-2(5H)-furanón ...... 49

Obr. 50: 3-methyl-2(5H)-furanón Obr. 51: 5-ethyl-2(5H)-furanón...... 49

Obr. 52: Stojatky s vetvami M. tricuspidata ...... 53

Obr. 53: TLC mobilnej fázy pod UV lampou pri λ=254 nm ...... 55

Obr. 54: Spájanie frakcií po CC pomocou TLC pod UV lampou pri λ=254 nm ... 56

Obr. 55: Spájanie frakcií po CC pomocou TLC pod UV lampou pri λ=366 nm ... 56

Obr. 56: CC analýza s 1. mobilnou fázou ...... 57

Obr. 57: Chromatogram frakcie CT/CH/113–114 pri 280 nm ...... 65

15 ZOZNAM OBRÁZKOV

Obr. 58: Chromatogram vzorky CT/CH/113–114 na semipreparatívnom HPLC pri 254 nm ...... 66

Obr. 59: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/1 pri 254 nm ...... 69

Obr. 60: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/ 2 pri 254 nm ...... 70

Obr. 61: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/3 pri 254 nm ...... 71

Obr. 62: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/4 pri 254 nm ...... 72

Obr. 63: Chromatogram s UV/Vis spektrom subfrakcie CT/CH/113–114/5 pri 254 nm ...... 73

Obr. 64: Chromatogram s UV/Vis spektrom subfrakcie CT/CH/113–114/6 pri 254 nm ...... 74

16 ZOZNAM TABULIEK

Zoznam tabuliek

Tab. 1: Zloženie mobilnej fázy pre metódu Cudrania; gradientová elúcia...... 59

Tab. 2: Zloženie mobilnej fázy pre metódu Cudrania_2; gradientová elúcia...... 60

Tab. 3: Spojené frakcie separované pomocou CC a HPLC a ich hmotnosti s hrubo vyznačenou frakciou, vybranej k ďalšej analýze ...... 63

Tab. 4: Pokračovanie Tab. 3 ...... 64

Tab. 5: Hmotnosť jednotlivých subfrakcíí po semipreparativnej HPLC z frakcie CTCH/113–114 ...... 67

17 ZOZNAM POJMOV A SKRATIEK

Zoznam pojmov a skratiek

A2780 – bunková línia ľudského ovariálneho karcinómu

A375.S2 – bunková línia ľudského malígneho melanómu

BGC-823 – bunková línia ľudského karcinómu žalúdka

B16 – bunková línia myšieho melanómu

Caco-2 – bunková línia ľudského kolorektálneho adenokarcinómu cAMP – cyklický adenozín-monofosfát

CC – column chromatography, stĺpcová chromatografia

CCRF-CEM – bunková línia ľudskej T-lymfoblastová leukémie

COX-2 – cyklooxygenáza-2

CRC – colorectal carcinoma, kolorektálny karcinóm

DAD – diode array detector, detektor s diódovým polom

EC50 – half maximal effective concentration, efektívna koncen- trácia zabezpečujúca 50 % účinok daného parametru

EtOAc – etylacetát

EtOH – etanol

HCC2998 – bunková línia ľudského kolorektálneho adenokarcinómu

HCT116 – bunková línia ľudského kolorektálneho adenokarcinómu

HL-60 – bunková línia ľudskej myeloidnej leukémie

HPLC – high-performance liquid chromatography, vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

HR-MS – hmotnostná spektrometria vo vysokom rozlíšení

18 ZOZNAM POJMOV A SKRATIEK

HSC-T6 – hepatálna potkania bunková línia

HT-29 – bunková línia ľudského kolorektálneho karcinómu

CHCl3 – chloroform

IC50 – stredná inhibičná koncentrácia iNOS – inducibilná syntáza oxidu dusnatého

KM12 – bunková línia ľudského kolorektálneho adenokarcinómu

LPS – lipopolysacharid

MAO – Monoaminooxidáza

MCAO/R – Middle cerebral artery occlusion/reperfusion, oklúzia/re- perfúzia strednej mozgovej tepny

MeOH – metanol

MTR-GNP – Maclura tricuspidata root-gold nanoparticles, zlaté nano- častice z koreňa Maclura tricuspidata

MTS-GNP – Maclura tricuspidata stem-gold nanoparticles, zlaté nano- častice z kmeňa Maclura tricuspidata

M. tricuspidata – Maclura tricuspidata napr. – napríklad

NF-κB – nukleárny faktor kappa B

NMR – nukleárna magnetická rezonancia

NO – oxid dusnatý

OGD/R – oxigen glucose deprivation/reoxygenation, deprivácia/re- oxygenácia glukózy kyslíkom

P388 – bunková línia myšacej lymfatickej leukémie

PDE4 – fosfodiesteráza 4

19 ZOZNAM POJMOV A SKRATIEK

PGE2 – prostaglandín E2

PTP1β – proteín-tyrozín-fosfatáza 1beta

RANKL – receptor activators of nuclear factor kappa-B ligand, re- ceptorový aktivátor jadrového faktora kappa-B ligandu

ROS – reaktívne formy kyslíka

SH-SY5Y – bunková línia ľudského neuroblastómu

SW48 – bunková línia ľudského kolorektálneho karcinómu

TCM – tradičná čínska medicína

THP-1 – bunková línia ľudskej monocytovej leukémie

TLC – thin layer chromatography, chromatografia na tenkej vrstve

TNF-α – tumor necrosis factor-alpha, tumor nekrotizujúci faktor- alfa tzv. – takzvane

UV-Vis – ultrafialová viditeľná spektrofotometria

20 ÚVOD

1 Úvod

Rastliny sú už odjakživa našou súčasťou života. Svoje uplatnenie našli ako zdroj potravy, farbív, zdroj účinných látok v medicíne, no svoje využitie majú aj ako znovu-obnoviteľné zdroje bio-surovín. Už od nepamäti boli využívané v tradičnej čínskej medicíne šamanmi, ale aj u nás v období alchýmie, kedy zažili svoj rozkvet v strednej Európe. Postupne sa na základe empírie využívali pri liečení konkrétnych prejavov chorôb. Zväčša išlo o menej závažné prejavy, ako bolesti hlavy, tráviace problémy, bolesti kĺbov, nauzei v rôznych liekových formách. Ich účinky sa tradovali z pokolenia na pokolenie v písomnej podobe. Tieto poznatky boli uchovávané vo forme herbárov, kde sa zaznamenávali ich liečivé, ale ja škodlivé účinky. Najčastejšie sa využí- vali mastičky, roztoky pre prípravu obkladov, čaje, bylinné extrakty či tinktúry a v neposlednom rade aj surové byliny.

Odstupom času, pri rozvoji priemyslu, vedy a rozvoji metodologických postupov, vhodných pre izoláciu, sa začali skúmať izolované látky a skupiny látok, ktoré boli zdrojom liečivého účinku. Novo vyvinuté chromatografické techniky, ktoré umožňovali izolovať látky, boli zave- dené do praxe až po druhej svetovej vojne spolu s identifikačnými spektrálnymi technikami [1].

Dnešné liečivá už poznáme v konkrétnych liekových formách zabudované do rôznych lie- kových foriem a to tabliet, kapsúl, roztokov, prachov, granulovaných práškov či injekcií. Rast- liny však zostali súčasťou nášho života aj v rámci liečby vo forme čajov či fytofarmák. Prevažne ide o voľnopredajné liečivá, ktoré zohrávajú dôležitú skupinu liekov užívaných pri samoliečbe. Sú užívané pri indikáciách rôzneho typu, hlavne pri liečbe krátkodobých, menej závažných ocho- rení. Pri závažnejších ochoreniach môžu zohrávať úlohu doplnkovej terapie popri chemickej, rýchlo účinkujúcej terapii.

V súčasnosti je veľký záujem práve o prípravky rastlinného pôvodu a to z dôvodu nadužíva- nia syntetických liečiv. Ich užívaním sa však človek nezaobíde bez nežiadúcich účinkov, podobne ako pri užívaní chemických. Sú často z interakčného hľadiska s chemickými liečivami podceňované pacientami.

21 ÚVOD

V 21. storočí je veľa závažných ochorení, na ktoré liečba neexistuje, alebo je liečba nepos- tačujúca. Preto sa aj výskum prírodných liečiv zameriava na nové možné zdroje, doposiaľ neob- javených látok a chemických štruktúr, zavedenie nových či vylepšenie už využívaných izolač- ných postupov látok z rastlín. Novo izolované látky môžu byť následne využívané v liečbe sa- mostatne, alebo byť predlohou pre syntézu chemických látok a ich derivátov.

Izolácia a identifikácia prenylovaných flavonoidov je jednou z hlavných zameraní Ústavu prírodných liečiv Farmaceutickej fakulty Masarykovej Univerzity. Preto je aj táto diplomová práca zameraná práve na ich izoláciu a identifikáciu. Pre výskum bol vybraný druh Maclura tricuspidata patriaci do čeľade Moraceae. Ide o čeľaď dlhodobo známu pre svoj vysoký obsah prenylovaných flavonoidov. M. tricuspidata je už dlhodobo využívaná vo východoázijskej me- dicíne. Izolácia látok z častí rastliny M. tricuspidata stále pokračuje a prináša nové, doposiaľ neobjavené štruktúry s potencionálnymi účinkami pre liečbu viacerých ochorení.

Diplomová práca je tiež zameraná na izoláciu a identifikáciu nových alebo už dávnejšie ob- javených známych látok z vetiev M. tricuspidata, ktoré by mohli byť ďalej konkrétne identifiko- vané a testované pre ich možnú biologickú aktivitu.

22 CIEĽ PRÁCE

2 Cieľ práce

2.1 Teoretická časť

Cieľom teoretickej časti tejto práce bolo spracovanie informácii o rastlinnom druhu M. tricuspidata, patriaceho do čeľade Moraceae, ktorý je predmetom tejto diplomovej práce. Charakte- rizovať rastlinný druh a zaradiť taxonomicky do systému rastlín, morfologicky charakterizovať spolu s jeho výskytom a využitím v tradičnej východnej medicíne. Teoretická časť je zároveň za- meraná na fytochemický profil a biologickú aktivitu obsahových látok izolovaných z rastlinného druhu za posledných 10 rokov.

2.2 Praktická časť

Izolácii a identifikácii izolovaných látok, obsiahnutých vo vetvách M. tricuspidata, sa venuje praktická časť tejto diplomovej práce. Pomocou macerácie bol získaný etanolový extrakt z vetiev M. tricuspidata, liquid-liquid extrakciou bol následne získaný chloroformový podiel. Podiel bol ďalej spracovávaný stĺpcovou chromatografiou (CC). Následne bola využitá na spracovanie zís- kaných frakcií preparatívna vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) a semiprepara- tívna kvapalinová chromatografia. Izolované a odseparované látky boli predbežne identifikované pomocou metódy UV-Vis.

23 TEORETICKÁ ČASŤ

3 Teoretická časť

Maclura tricuspidata syn. Cudrania tricuspidata je veľmi rozšírená rastlina v Južnej Kórei, Číne, Japonsku a Amerike. Je využívaná v tradičnej čínskej medicíne pre svoje protizápalové účinky na zápaly žalúdka a liečbu nádorových ochorení tráviaceho traktu [2][3].

M. tricuspidata je v anglickej literatúre známa pod názvom che, storehouse bush, silkworm thorn, cudrang, Chinese mulberry alebo mandarin melonberry. V čínštine je uvádzaná aj pod názvami tsa, tcho sang (wild mulberry) tse-tsang (thorny mulberry), poh-hsi, shih, nu-che a v ja- pončine haringuwa [2][4].

Korene a listy obsahujú farmaceuticky účinné látky s protirakovinovou a antioxidačnou aktivitou [3]. Pri liečbe myší, ktoré mali obezitu vyvolanú stravou, boli preukázané anobezické účinky listov M. tricuspidata a ich potencionálne účinky pre liečbu diabetes mellitus. Listy do- kázali znižovať hladinu glukózy v krvi a zlepšovať sekréciu inzulínu [5][6]. Predchádzajúce štúdie, taktiež skúmajúce extrakty z listov M. tricuspidata, preukázali inhibičný účinok na aktivitu pankreatickej lipázy [7]. Koreňová kôra preukázala protizápalové, antiaterosklerotické, antioxidačné, neuroprotektívne, hepatoprotektívne a cytotoxické účinky [3].

Plody M. tricuspidata boli skúmané pre ich inhibičné pôsobenie na pankreatickú lipázu [7] a MAO [8]. Zároveň boli skúmané pre svoje potencionálne neuroprotektívne účinky [9], spolu s účinkami proti obezite [10]. V literatúre sú popisované aj ich antioxidačné [11] a protizápalové účinky pri liečbe atopickej dermatitídy [12] či hepatoprotektívne účinky [13].

M. tricuspidata sa používa v ľudovom liečiteľstve na liečbu gastrointestinálneho traktu či liečbu alergie. Na základe týchto poznatkov bola vykonaná štúdia etanolového extraktu M. tri-

[14] cuspidata na liečbu gastritídy a refluxu , ktorá potvrdzuje jeho schopnosť blokovať H2r (H2 histamínové receptory) a predchádzať vzniku žalúdočného prekyslenia [15]. Etanolový extrakt M. tricuspidata vykazuje značné neuroprotektívne účinky proti smrti buniek SH-SY5Y [8]. Tak- tiež extrakt z M. tricuspidata významne inhibuje xantínoxidázu porovnateľne s využívaným

24 TEORETICKÁ ČASŤ liečivom proti dne alopurinolom [16].

3.1 Botanická charakteristika rastliny Maclura tricuspidata

3.1.1 Taxonomické zaradenie [17][18]

• Ríša Plantae–rastliny • Podríša Viridiplatae–zelené rastliny • Infraríša Streptophyta–suchozemné rastliny • Nadoddelenie Embryophyta • Oddelenie Tracheophyta–cievnaté rastliny • Suboddelenie Spermatophytina–semenné rastliny • Trieda Magnoliopsida • Nadrad Rosanae • Rad Rosales • Čeľaď Moraceae–morušovité • Rod Maclura Nutt. • Úsek/oddiel Cudrania • Druh Maclura tricuspidata Carriére

Synonymá: Cudrania tricuspidata (Carrière) Bureau ex Lavallée; C. triloba Hance; Mo- rus integrifolia H. Léveillé & Vaniot; Vanieria tricuspidata (Carrière) Hu; V. triloba (Hance) Satake [18].

M. tricuspidata je z rodu Maclura a oddielu Cudrania, je jedna zo šiestich druhov tohto rodu, do ktorého patrí: M. tricuspidata, M. cochinchinensis (Lour.) Corner, M. fruticosa (Roxb.) Corner, M. amboinensis (Bl.) a druhM. pubescens (Trec.) Z. K. Zhou & M. G. Gilbert [19].

25 TEORETICKÁ ČASŤ

3.1.2 Výskyt

Pôvodom je táto rastlina, z čeľade Moraceae, z Číny a juhovýchodnej Ázie [4]. Jej veľkým pestovateľom boli provincie v južnej Číne ako Yunnan, Fujian a Jiangsu, kvôli šťavnatým, duži- natým plodom a drevu. Do Európy sa dostala okolo roku 1870. Stromy sú prispôsobené vlhkým podmienkam stále zelených lesov, vďaka tomu sa jej darí v južných pralesových oblastiach Ame- riky a západného pobrežia, kde bola prvý krát kultivovaná v roku 1909 [2].

Obr. 1: Výskyt druhu M. tricuspidata [20]

Nadmorská výška 500 až 2000 m n. m. je pre rast M. tricuspidata prirodzeným prostredím, výnimkou jej výskytu nie sú ani nížiny, slnečné okraje lesov a horské svahy [2][18]. Nie je náročná na prostredie v ktorom prežíva, dôkazom toho je aj tolerancia voči rôznym druhom pôd, z ktorých sa jej najlepšie darí v kamenistej pôde s kyslím pH v rozmedzí 6,1–6,5 so stredným až vysokým obsahom organických látok [21]. Ide o nenáročnú rastlinu, je tolerantná aj voči suchu a zlej pôde a je schopná odoláva aj chladnejším teplotám do -29 °C [22].

3.1.3 Morfológia

M. tricuspidata sa v prírode vyskytuje prevažne v podobe malého listnatého dvojdomého stromu alebo väčšieho kríku dorastajúceho do výšky 1–7 metrov. Niektoré stromy dorástli do veľ- kosti 18,3 metra, čo je veľmi ojedinelé pri tomto druhu [2][4].

26 TEORETICKÁ ČASŤ

(1) Koreň, stonka, list

M. tricuspidata má pomerne krátke žlté, nepravidelne valcovité korene, ktoré môžu dosa- hovať až do dĺžky 50 cm [2]. Z mladých vetiev M. tricuspidata na začiatku rastu vyčnievajú krycie emergencie o veľ- kosti 0,5–2 cm, ktoré postupom času odpadávajú [2]. Zaujímavosťou je, že samičie stromy doras- tajú do väčšej výšky ako samčie [22]. Súčasťou parenchýmu sú mliečnice s mliečnou šťavou, ktoré sú mierne jedovaté a dráždia pokožku [21].

Obr. 2: Tŕne [4]

Kôra M. tricuspidata je popraskaná, hlboko ryhovaná, sivo-hnedej farby [4][18].

Obr. 3: Kôra [4]

Listy M. tricuspidata sú striedavé, eliptické až oblé, tenké, jednoduché niekedy so stopkou o dĺžke 1–2 cm. Listy majú často rôzny tvar, či už vajcovitý v niektorých prípadoch trojlaločný, kopijovitý poprípade rombicko-vajcovitý. Sú zelenej až žlto-zelenej farby. Listy sú v teplejších oblastiach stále zelené, no v prípade výskytu rastliny v oblastiach chladnejších, menia svoju farbu do červena [21].

27 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 4: Listy [23]

Niektoré listy majú centrálny lalok, ktorý môže byť až dvojnásobne väčší než laloky pos- tranné. Najviac je centrálny lalok charakteristický pre trojlaločný tvar listov [22]. Bifaciálne listy majú výraznú žilnatinu, skladajúcu sa z 4–6 postranných žiliek, sprevádzaných sieťovitými ter- ciárnymi žilkami, vybiehajúcich z centrálnej žily [18]. Opadavé listy dorastajú do dĺžky 5–14 cm a šírky 3–6 cm [2].

(2) Kvet

Kvety sú nenápadné malé, päťpočetné, rastúce v jahňadách, typické pre čeľaď Moraceae. Nakoľko ide o dvojdomú rastlinu, samčie kvety dorastajúce do veľkosti 5 mm, sa nachádzajú na inom strome ako samičie, ktoré sú väčšie a dorastajú do veľkosti 1–1,5 cm [19]. M. tricuspidata prevažne kvitne začiatkom mája do neskorého júna [19][21]. Kvety sú veľmi drobné a nenápadné, kvôli svojej zelenej farbe. Samčie kvety pri dozrievaní žltnú a uvoľňuje sa z nich peľ, ktorý je zachytávaný stigmami na povrchu samičích kvetov [22].

Obr. 5: Samčie kvety [24]

28 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 6: Samičie kvety [25]

(3) Plod

Zdužnatené okvetie nažiek M. tricuspidata tvorí plodstvo o priemere 2,5–5 cm. Plody doz- rievajú od začiatku júna do konca júla, kedy zmäknú a nadobudnú farbu od bledočervenej, cez žltočervenú, tmavoružovú po tmavočervenú až hnedú. Šťavnaté, sladké plody s chuťou pripomí- najúcou šťavnatý melón, obsahujú 3 až 6 malých, hnedých semien vnútri súplodia [2][18][22].

Obr. 7: Plody [26]

Plody nemusia vždy obsahovať semená, je to tak pri tzv. partenokarpii, pri ktorej vzniká bezsemenné ovocie bez opelenia v samičích kultivaroch. Pri zbere, je dôležité zbierať plody po jednom a pri dostatočnej zrelosti, inak môžu spôsobiť gastrointestinálne problémy [21].

29 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 8: Rozkrojené plody M. tricuspidata [27]

3.1.4 Využitie

M. tricuspidata je využívaná už dlhú históriu v tradičnej čínskej medicíne TCM. Bola pestovaná v provinciách ako zdroj výživných plodov pre ľudí a vlákna kôry pre výrobu papiera.

Listy M. tricuspidata sú zdrojom potravy pre priadku morušovú Bombyx mori, ktorá sa využíva ako producent hodvábu. Kôra sa taktiež využíva pre posilnenie imunity, liečbu kvapavky či dysmenorey [15]. V rámci kliník TCM sa využíva na liečbu rakoviny gastrointestinálneho traktu, predovšetkým nádorových ochorení žalúdka ako patentovaný tradičný čínsky liek [2][18].

Vodné odvary z plodov a listov sú často konzumované pre svoje už spomínané protizá- palové účinky pri prejavoch reumatickej artritídy [2]. V Ázii je pomerne bežne konzumovanou rastlinou, pre posilnenie imunity organizmu ako čerstvé ovocie alebo v podobe džúsov, lekvárov, potravinových doplnkov, octu, alkoholických nápojov vo forme vína alebo vo forme lisovaných koncentrovaných ovocných štiav [8][11]. V Kórei našla svoje uplatnenie aj v iných indikáciách napr. tuberkulóze, pneumónii, pri liečbe chrípky, ekzémov či príušníc [2][12]. Pri atopických ochoreniach či iných ochoreniach kože, ako napr. svrabu, sa používa k zmierneniu prejavov vo forme vodného odvaru z koreňov M. tricuspidata spolu s koreňmi odrody M. cochinchinensis [2].

Prevažne sa pestuje ako okrasná rastlina, málokedy ako potravinárska plodina. Plody sa môžu podávať nakrájané s cukrom a citrónovou šťavou alebo vo forme smoothie zmiešané s iným ovocím [21].

30 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 9: Tinktúra z koreňa M. tricuspidata [28]

Obr. 10: Šťava z M. tricuspidata [29]

Sae-Byuk Lee využil vo svojej štúdii drogu M. tricuspidata vo forme rozdrobeného prachu, ktorý sa pridával do fermentovaného mlieka. Pridávaný bol pre svoje antioxidačné a antimu- tagénne účinky. Účinky prachu v mlieku sa podľa štúdie zvyšovali úmerne zvyšujúcou sa koncen- tráciou. Využitie M. tricuspidata preto môže byť veľmi výhodné v rámci potravinového priemyslu [30].

Obr. 11: Fermentované mlieko obohatené o prach z M. tricuspidata [31]

31 TEORETICKÁ ČASŤ

3.2 Fytochemický profil

M. tricuspidata je bohatá na prenylované zlúčeniny flavonoidov a xantónov, ktoré pred- stavujú najväčší podiel zo sekundárnych obsahových látok s potencionálnym účinkom na organizmus [2].

3.2.1 Flavonoidy

Flavonoidy sú sekundárne metabolity rastlín, patriace do skupiny fenolov. Ide o veľmi početnú skupinu derivátov fenylchromanu s C6-C3-C6 skeletom. Odvodzujú sa, podľa naviazania fenylu, do troch základných skeletov. Flavonoidy s naviazaným fenylom v polohe číslo dva sa nazývajú flavóny, flavonoly, flavanony a flavanonoly, alebo katechíny a antokyány, podľa štruk- túr naviazaných na jadre s kyslíkom. Izoflavonoidy (izoflavóny) majú naviazaný fenyl v polohe číslo tri a flavonoidy s fenylom v polohe číslo štyri sú neoflavonoidy [32][33]. Ich biologické účinky na organizmus určuje ich štruktúra.

Obr. 12: Základná štruktúra flavonoidov

Nachádzajú sa iba v rastlinách s najväčším zastúpením v kvetoch a plodoch, ktorým do- dávajú od žltej, červenej až po modrú farbu, alebo len prispievajú k farbe ako kopigmenty [32][33].

Flavonoidy slúžia ako navigátori pre opeľovače, nakoľko sú schopné absorbovať UV žia- renie. V kutikule listov a v epidermálnych bunkách zastupujú úlohu ochranného pletiva pred UV žiarením a jeho deštruktívnym účinkom [32].

32 TEORETICKÁ ČASŤ

Neoflavóny, doposiaľ nemajú takmer žiadne terapeutické využitie a sú obsiahnuté v rastlinách v malom množstve. Naopak flavóny a izoflavóny sú zastúpené pomerne vo veľkom množstve. Delia sa do skupín podľa oxidačného stupňa pyránového kruhu. Tieto podskupiny sú popísané nižšie v kapitolách.

Flavonoidy a izoflavonoidy sú deriváty s hydroxylovými alebo metoxylovými skupinami v polohách 5 a 7, alebo 3, 5, 7 vo forme vo O-glykozidov, menej C-glykozidov rozpustených vo vakuolách. D-glukóza, D-galaktóza a L-rhamnóza sú najzastúpenejšou monosacharidovou zlož- kou flavonoidov, z disacharidov sú to rutinóza a primveróza [32].

V organizme zohrávajú rolu pri oxidačno-redukčných procesoch, využívajú sa ich priaz- nivé účinky proti lámavosti kapilár–vazoprotektívne a protizápalové. Vybrané druhy vykazujú účinok diuretický či spazmolytický [32][33].

Z M. tricuspidata bolo izolovaných niekoľko druhov prenylovaných flavónov, flavano- nov a izoflavónov. Prenylované flavonoidy sú z flavonoidného skeletu s lipofilným prenylova- ným postranným reťazcom. Častejšie nachádzame C-prenyláciu ako O-prenyláciu. C-prenylácia je častá v polohe C-6 alebo C-8 na A-kruhu a prípadne kruhu-B v polohe C-3´ a C-5´ [34]. Navia- zaná prenylovaná jednotka zvyšuje lipofilitu zlúčeniny a jej afinitu voči bunkovým membránam. Antioxidačné, protizápalové, protirakovinové, estrogéne a antibakteriálne účinky, ktoré sú pripi- sované flavonoidom, zvyšuje naviazaná prenylovaná jednotka [2][34].

(1) Flavóny

Flavóny majú dvojitú väzbu medzi uhlíkom C-2 a C-3 a ketónovú skupinu v polohe C-4 [35].

Cudraflavón B je prenylovaný flavón zastúpený vo veľkom množstve v rastline M. tricuspidata. Bol podrobený viacerým štúdiám pre svoje potencionálne telu prospešné účinky. Cudrafla- vón B vykazoval výrazné protizápalové účinky spolu s účinkami na rakovinové bunkové línie, inhibíciou ich prechodu s G1 fázy do fázy S pri štúdii diferenciácií ľudských leukemických buniek

33 TEORETICKÁ ČASŤ

THP-1 [34]. Protirakovinové účinky cudraflavónu B boli preukázané aj voči bunkovej línii ľud- ského karcinómu žalúdka BGC-823 a myšacím bunkám melanómu B16 [34][36]. Protizápalové [37] účinky izolovaného cudraflavónu B boli preukázané v štúdii porovnávajú- cej protizápalové účinky cudraflavónu B s indometacínom. Cudraflavón B v štúdii preukázal pro- tizápalové účinky svojím pôsobením, ako inhibítor COX-1 a COX-2 s vyššou selektivitou ako in- dometacín voči COX-2, avšak bez antioxidačnej aktivity [37]. Cudraflavón B vo vybraných in vitro modeloch vykazoval silný inhibičný účinok proti zápalovým mediátorom génovej expresie a sek- récie nádorového nekrotického faktoru α (TNFα), blokádou translokácie nukleárneho faktoru κB (NF-κB) z cytoplazmy do jadra makrofágov odvodených z humánnej línie monocytov THP-1 [37]. Cudraflavón B sa vyznačuje aj svojím hepatoprotektívnym, antisklerotickým, neuroprotek- tívnym či MAO inhibičným účinkom [2].

Obr. 13: Cudraflavón B

Cudraflavón C bol skúmaný pre svoje antikancerogénne vlastnosti vo viacerých štúdiách. Bol potvrdený jeho inhibičný účinok na rast melanómoch buniek A375.S2 a ich apoptózu zvýše- nou mitochondriálnou výrobou ROS a aktiváciou MAPK [38]. Štúdia skúmajúca účinky cudrafla- vónu C na epitelové bunky kolorektálneho karcinómu ukázala jeho inhibičný účinok na proliferá- ciu v bunkových líniách KM12, Caco-2, HT29, HCC2998, HCT116 a SW48 CRC [39]. Cudrafla- vón C vykazuje pri inhibičných hodnotách IC50 = 0,26 ± 0,02 μM potencionálny inhibičný účinok na fosfodiesterázu-4 (PDE4), ktorá katalyzuje hydrolýzu cAMP. Inhibičný účinok na PDE4 sa využíva pri liečbe viacerých ochorení, ako je erektilná dysfunkcia, schizofrénia, pľúcna hyperten- zia či pri zápalových ochoreniach [40].

34 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 14: Cudraflavón C

Mulberín (syn. kuwanon C) je flavón s prenylovými zložkami naviazanými v pozíciách

[41] 3 a 8. Vykazuje inhibičný β-sekretázový účinok pri koncentrácii IC50 = 3,4 ± 1,3 μm . V roku 2019 vyšla štúdia naznačujúca mulberín ako silný supresor abnormalít Parkinsonovej choroby [42].

Kuwanon C s najvyššou inhibičnou koncentráciou IC50 = 14,2 μM spolu s cudraflavó- nom C pri IC50= 9,2 μM a cudraflavónom B pri IC50 = 12,5 μM vykázali najvyšší cytotoxický

[36] účinok na bunkovú líniu melanómu B16 . Kuwanon C pri porovnaní s vinblastínom s IC50 = 50 μM. na liečbu bunkovej línie B16, vykazoval silnejší inhibičný účinok [36]. Súčasne bola jeho

účinnosť hodnotená aj na bunkovej línii P388, kde bola jeho účinná inhibičná hodnota IC50 = 14,0 μM [34].

Obr. 15: Kuwanon C

Podobne ako aj cudraflavón C a kuwanon C boli skúmané potencionálne inhibičné účinky cyclomorusínu a jeho enantioméru na PDE4. Cyklomorusín (9R) pri IC50 = 0,0054 ± 0,0003 μM a cyklomorusín (9S) pri IC50 = 0,25 ± 0,01 μM vykazovali inhibičnú aktivitu na PDE4, ktorá bola silnejšia oproti kontrolnej látke rolipramu, ktorého hodnota inhibičnej koncentrácie bola

IC50 = 0,62 ± 0,03 μM. Cyklomorusín vykazuje najsilnejšie prírodné inhibičné účinky na PDE4.

35 TEORETICKÁ ČASŤ

Zároveň vykazuje aj vysokú selektivitu na izoformy PDE a môže slúžiť pre vývoj nových inhibí- torov PDE4 [40].

Obr. 16: Cyklomorusín (9R) Obr. 17: Cyklomorusín (9S)

(2) Flavanoly

Svojou štruktúrou sa odlišujú od flavónov naviazanou hydroxylovou skupinou v polohe C3 [35].

Kaempferol je flavonoid prevažne vyskytujúci sa v koreňoch M. tricuspidata má antioxi- dačný, antimikrobiálny, protizápalový, antiulcerózny či XO inhibičný účinok [3]. Kaempferol bol skúmaný v štúdii spolu s viacerými látkami v podobe vodného extraktu z listov M. tricuspidata. Štúdia preukázala, že vodný extrakt pri koncentrácii 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml pri 24 hod. pôsobení zvyšuje hladinu claudínu 1 v ľudských keratynocy- toch, závisle od dávky. Claudín 1 prispieva k zvýšenému medzibunkového obsahu v tesných spo- joch tzv. tight-junction, veľmi dôležitého pri liečbe skin barriere therapy–liečbe kožnej bariéry [43]. Kaempferol spolu s extraktom z listov M. tricuspidata môžu znižovať hepatálnu inzulínovú rezistenciu. Dráhu C/EBPα/glukoneogénneho génu však nepotláčajú [44]. Kaempferol podľa štúdie dokáže taktiež chrániť pred zápalom. Čiastočne inhibuje stres endoplazmatického retikula, ktorý vyvoláva zápal v tele [44]. Kaempferol a kvercetín sú vo veľkom množstve obsiahnuté v listoch M. tricuspidata. Zvý- šením fenolického obsahu v listoch M. tricuspidata laktobacilmi sprostredkovanou fermentáciou, sa získavajú potravinové materiály s pridanou hodnotou. Antioxidačné účinky takto

36 TEORETICKÁ ČASŤ pripravovaných fermentom sú až o 20 % vyššie oproti nefermentovaným. Zvýšený antioxidačný účinok extraktu je pripisovaný práve spomínaným zlúčeninám kaempferolu a kvercetínu, kvôli ich zvýšenému obsahu v extrakte po fermentácii laktobacilmi [45].

Obr. 18: Kaempferol Obr. 19: Kvercetín

Rutín je flavonol s rôznymi farmakologickými účinkami pri liečbe Alzheimerovej choroby, antikonvulzívnymi či protizápalovými účinkami [3]. V dávkach 50-100 mg/kg znižuje hladiny bi- omarkerov u hyperurikemických myší [46]. Nagao a kolektív vo svojej štúdii uvádzajú inhibičnú aktivitu kaempferolu a rutínu XO pri nízkej koncentrácii [3]. Protirakovinové účinky rutínu sú uvádzané proti viacerým druhom nádorových ochorení. Rutín zastavuje alebo účinkuje apoptoticky na bunkové línie kolorektálneho karcinómu, taktiež je uvádzané, že po jeho pôsobení na bunkovú líniu HL-60 leukemických buniek došlo k význam- nému zmenšeniu nádoru. Jeho cytotoxický efekt sa preukázal aj proti bunkám hepatálneho karci- nómu [47]. Je uvádzaný aj jeho hojivý účinok vo forme hydrogélu na kožné poranenia [47]. Choi a Kim vo svojej štúdií z roku 2013 uvádzajú, že topicky aplikovaný rutín má značné účinky proti atopickej dermatitíde či kontaktnej dermatitíde, v rámci ktorej by sa mohol využívať pri liečbe kožných ochorení [48]. V neposlednom rade sú uvádzané jeho antibakteriálne či antifungálne účinky [47].

37 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 20: Rutín

V štúdií publikovanej v roku 2017 sú uvádzané antagonizujúce účinky astragalínu pri liečbe astmy a pri obštrukčnej pľúcnej chorobe skúmanej na myšiach. Astragalín po perorálnom podaní inhiboval zhrubnutie dýchacích ciest a empfyzém vyvolaný ovalbumínom u myší [49]. Na myšiach boli taktiež potvrdené jeho sedatívne a hypnotické účinky [50]. V štúdií z roku 2017 je uvádzaný protizápalový účinok astragalínu a jeho potencionálne využitie pri liečbe zápalových ochorení ma- ternice a jej vyváženie mikroprostredia po infekcii vyvolanej Leptospira interrogans [51]. Ďalej sú uvádzané jeho inhibičné účinky na produkciu zápalových mediátorov NO a PGE2 v chondrocy- toch, indukovanými IL-1β. Tieto účinky by mohli byť ďalej využívané pri liečbe osteoartritídy [52]. Populnín spolu s astragalínom sa skúmali v štúdii porovnávajúcej účinky zo zrelých a ne- zrelých plodov M. tricuspidata, kde boli preukázané ich inhibujúce účinky na pankreatickú li- pázu [3][7].

Obr. 21: Astragalín Obr. 22: Populnín

38 TEORETICKÁ ČASŤ

(3) Flavanóny

Izolovaný cudraflavanón A z koreňov M. tricuspidata v štúdii značil silné preventívne

účinky pri liečbe neurozápalových chorôb. Znížil produkciu TNF-α pri IC50 = 33,0 μM, IL–1β pri

IC50 = 24,7 μM, PGE2 pri IC50 = 20,6 μM a produkciu NO pri IC50 = 22,2 μM. Cudraflavanón A zá- roveň potlačil expresiu indukovateľnej syntázy oxidu dusného iNOS. Štúdia však nepotvrdila jeho vplyv na expresiu COX-2 [53].

Obr. 23: Cudraflavanón A

(4) Izoflavóny

Izoflavóny a ich glykozidy sa radia medzi fytoestrogény, kvôli ich biologickému účinku na produkciu sexuálnych hormónov, rastových faktorov, syntézu proteínov a ich kancerostatických účinkov pri rakovine kože a prostaty [33].

Nguyen Tuan Hiep a spol. uvádza vo svojej štúdií neuroprotektívny účinok izolovaného cud- raizoflavónu H a cudraizoflavónu I z 50% etanolového extraktu z plodov M. tricuspidata. Vy- kazovali na in vitro modeli cerebrálnej ischémie neuroprotektívny účinok proti neuronálnej bunkovej smrti a nadmernej tvorbe ROS. Ich neuroprotektívne účinky na in vitro modeli značil ochranný účinok proti vzniku mozgového infarktu, indukovaným MCAO/R [54]. Izolovaný cudra- izoflavón I z etanolového extraktu plodov M. tricuspidata, vykazoval najsilnejší neuroprotektívny

účinok z cudraizoflavónov L–T, znižujúci poškodenie po mozgovej ischémii pri EC50 3,5 μM proti

39 TEORETICKÁ ČASŤ bunkovej smrti indukovanej 6-hydroxydopamínom v bunkách ľudského neuroblastómu SH- SY5Y [55]. Okrem cudraizoflavónu I vykazoval cudraizoflavón H a cudraizoflavón M mierny neuropro-

[55] tektívny potenciál pri EC50= 3,5 až 11,9 μM proti bunkovej smrti .

Obr. 24: Cudraizoflavón H Obr. 25: Cudraizoflavón I

Cudraizoflavón U podľa štúdie vydanej v roku 2018 spolu s jeho 2 enantiomérmi 1a a 1b vykazuje neuroprotektívne účinky proti smrti neuroblastómových buniek SH-SY5Y pri efektív- nych koncentráciách EC50 5,5 μM; 4,0 μM a 10,0 μM. Ďalej inhibuje OGD/R indukovanú reaktív- nymi formami kyslíka v bunkách SH-SY5Y pri inhibičných koncentráciách IC50 = 6.9 µM, 4.5 µM, a pri 9.5 µM [56].

Obr. 26: Cudraizoflavón U entantiomér 1a Obr. 27: Cudraizoflavón U enantiomér 1b

40 TEORETICKÁ ČASŤ

Cudracusizoflavón B vykazoval najsilnejšiu inhibičnú aktivitu pankreatickej lipázy proti

.[7] triglyceridovému substrátu, inhibičná hodnota predstavovala IC50 41,8 μM .

Obr. 28: Cudracusizoflavón B

41 TEORETICKÁ ČASŤ

3.2.2 Xantóny

Xantóny sú druhou skupinou zastúpenú v M. tricuspidata v najväčšom počte. Xantóny so základným skeletom xantén-9-onom zaradujeme do skupiny sekundárnych metabolitov vyšších rastlín. Táto skupina je známa pre svoje bohaté farmakologické účinky, kde najsilnejší účinok je pripisovaný prenylovaným xantónom. Vykazujú antidiabetické, protinádorové či potenciálne účinky pri liečbe osteoporózy [2]. Sú využívané, hlavne pre svoj silný protizápalový účinok, vďaka ich pôsobeniu na makrofágy [57].

Obr. 29: Základný skelet xantónu

Cudratricusxantón N bol jeden zo zlúčenín, ktorý v kinetickej enzýmovej štúdii preuká- zal najsilnejšiu inhibíciu aktivity PTP1B. Táto inhibícia môže byť považovaná za novú triedu rady antidiabetík využiteľnú pri liečbe obezity [8].

Obr. 30: Cudratricusxantón N

Apoptotické účinky cudracuspixantónu A na bunky HSC-T6 boli vyhodnocované prie- tokovou cytometriou, kde percento apoptotických buniek, pôsobením prenylovaných xantónov a benzofenónov izolovaných z koreňov M. tricuspidata vzrástlo. Pri pôsobení cudracuspixantónu A s koncentráciou 1 μM sa zvýšilo percento apoptotických buniek na 22,1 % a pri pôsobení 3 μM sa zvýšilo na 66,3 % [58].

42 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 31: Cudracuspixantón A

Spolu s cudracuspixantónom A bol izolovaný z koreňov M. tricuspidata aj cudracuspi- xantón B a D, izocudraniaxantón A a B, cudraxantón B a L a 8-prenylxantón. Spomenuté zlúčeniny pri ich pozorovaní vykazovali miernu inhibíciu na LPS-stimulovanú NO produkciu s

[59] hodnotami inhibičnej koncentrácie IC50 v rozmedzí od 16,1 μM do 24,8 μM .

Obr. 32: Cudracuspixantón B Obr. 33: Cudracuspixantón D

Obr. 34: Izocudraniaxantón A Obr. 35: Izocudraniaxantón B

43 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 36: Cudraxantón B Obr. 37: Cudraxantón L

Inhibičné účinky na proteín-tyrozín-fosfatázu PTP1B vyššie spomenutých xantónov cudrat- ricusxantónu N, cudratricusxantónu A, cudraxantónu L spolu s viacerými xantónmi ako cudraxan- tónom D, cudraxantónom M či macluraxantónom B, boli zistené v roku 2016. Ich inhibičná hodnota dosahovala IC50 v rozmedzí 1,9 až 4,6 μM. Tento účinok má potencionálne využitie pri akút- nych ochoreniach diabetes mellitus 2. typu, rakovine prsníka, hrubého čreva či vaječníkov [60].

Obr. 38: Cudraxantón D Obr. 39: Cudraxantón M

Obr. 40: Macluraxantón B

44 TEORETICKÁ ČASŤ

Cudratrixantón U (CTU) je prenylovaný xantón, ktorý bol izolovaný z M. tricuspidata. Bolo zistené, že cudratrixantón U dokáže inhibovať diferenciáciu a kostnú resorpciu osteoklastov v RAW264.7 bunkách, stimulovaných RANKL a makrofágmi z kostnej drene. Môže byť potenci- onálnou terapeutickou zložkou v liečbe osteoporózy. CTU dokáže regulovať tvorbu komplexu v receptorovom aktivátore nukleárneho faktoru κB (RANKL), ktorý je indukovaný práve RAW264.7 bunkách [61].

Obr. 41: Cudratrixantón U

Podobne ako CTU bol pozorovaný pre svoje potenciálne účinky pri liečbe osteoartritídy cud- ratricusxantón O (CTO). Pri skúmaní jeho inhibičných účinkov na poškodené SW1353 chondro-

[62] cyty CTO zabránil apoptóze indukovanej H2O2, reguláciou expresie anti-apoptotických prote-

[62] ínov . Podľa štúdie dokáže CTO regulovať ROS prostredníctvom H2O2 a zároveň regulovať apoptózu SW1353 chondrocytov [62].

Obr. 42: Cudratricusxantón O

45 TEORETICKÁ ČASŤ

3.2.3 Polysacharidy

Polysacharidy sú tiež súčasťou extraktu z koreňov M. tricuspidata, sú však zastúpené v malom množstve a predstavujú 1 % z celkového obsahu. Boli izolované polysacharidy CTP- B1, CTPS-01, CPS-0, CTPS-1A, CTPS-2B a CTPS-3A, ktoré majú imunomodulačné účinky [2]. Z koreňov M. tricuspidata bol izolovaný už vyššie spomenutý xylan označený CTP-B1. Podľa štúdie z roku 2014 uvádzanej v časopise Food Chemistry, stimuluje množenie myšacích spleno- cytov in vitro pri koncentráciách 6,25–100 μg/ml, na základe týchto výsledkov by xylán mohol byť potencionálne využívaným imunostimulantom v potravinárskom priemysle [63].

3.2.4 Organické kyseliny

Extrakty izolované zo stoniek M. tricuspidata boli bohaté na n-hexanovú kyselinu v naj- vyššom zastúpenom množstve v koncentrácií 9,89 μg/g. V koreňoch M. tricuspidata. je obsiah- nutá n-heptanová v koncentrácií 2,05 μg/g [2]. Pri izolácii sekundárnych látok z plodov M. tricuspidata, bolo zistené, že obsah sekundárnych látok bol závislý od zrelosti plodov [12]. V plodoch bola identifikovaná s najväčším zastúpeným podielom kyselina jablčná. Ďalej boli identi- fikované kyseliny: citrónová, šťaveľová, jantárová a kyselina vínna [2].

3.2.5 Polyfenoly

V rastlinnej strave sú polyfenoly veľmi obľúbené kvôli ich pôsobeniu na organizmus ako zachytávače reaktívnych kyslíkových látok ROS. Tento antioxidačný účinok má viacero výhod pre organizmus, ako je posilnenie imunity, protizápalové pôsobenie, vazodilatačné či protirako- vinové [64]. Parishin A, B, C a E spolu s gastrodínom boli izolované z plodov M. tricuspidata, pri štúdií, ktorá sa zaoberala množstvom obsahu sekundárnych metabolitov v závislosti od doz- rievania plodov. Táto štúdia preukázala, že obsah sekundárnych metabolitov je vyšší v nezrelých a nedozretých plodoch ako v úplne dozretých. Predpokladá sa, že vyššie spomínané polyfenoly sú zodpovedné za antioxidačné účinky extraktu plodov z M. tricuspidata [11].

46 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 43: Parishin A

Obr. 44: Parishin B

Obr. 45: Parishin C

47 TEORETICKÁ ČASŤ

Obr. 46: Parishin E

Obr. 47: Gastrodín

3.2.6 Ostatné obsahové látky

Chlorogénová kyselina bola taktiež izolovaná z listov M. tricuspidata, sú jej taktiež pripiso- vané antioxidačné účinky M. tricuspidata.

Z vetiev M. tricuspidata bol izolovaný oxyresveratrol [65] a 5-methoxy-4,5-difenyl-2(5H)- furanón [65], ktorý vykazuje slabé inhibičné účinky na činnosť tyrozinázy. Naopak oxyresveratrol vykazuje silnú inhibičnú aktivitu na činnosť tyrozinázy, ktorá spôsobuje pigmentové škvrny. Oxyresveratrol má preto potencionálne využitie v kozmetike, ako bieliaca zložka a v potravinár- stve proti hnednutiu [65]. V zloženom výťažku z viacerých druhov zastúpených aj M. tricuspidata bol identifikovaný 3-methyl-2(5H)-furanón a 5-ethyl-2(5H)-furanón, ktoré vykazovali antioxi- dačné vlastnosti [66].

Pri štúdii syntetizovaných zlatých nanočastíc extraktov zo stoniek, koreňov, listov, plodov M. tricuspidata sa zistil vysoký obsah fenolových zlúčenín zastúpených aj oxyresveratrolom.

48 TEORETICKÁ ČASŤ

MTS-GNP a MTR-GNP vykazovali inhibičné účinky na metastázy v hepatocelulárnom karci- nóme. V budúcnosti by mohli byť využívané pre zvýšenie účinnosti jeho terapie [65]

Obr. 48: Oxyresveratrol Obr. 49: 5-methoxy-4,5-difenyl-2(5H)-furanón

Obr. 50: 3-methyl-2(5H)-furanón Obr. 51: 5-ethyl-2(5H)-furanón

Z čerstvo zrelého ovocia bol destilovanou parou získaný éterický olej. V najvyššej koncen- trácií bol obsiahnutý v oleji p-krezol 383.5 ± 17.7 µg/g, v nižšej koncentrácií bol obsiahnutý β- karyofylén 145.7 ± 10.5 µg/g spolu s inými zložkami. Éterický olej preukázal mierny antioxi- dačný účinok [67].

49 PRAKTICKÁ ČASŤ

4 Praktická časť

4.1 Použitý materiál

4.1.1 Použitý rastlinný materiál

Pre túto diplomovú prácu bola vybraná rastlina M. tricuspiata, ktorá bola vypestovaná v skle- níku Farmaceutickej fakulty Masarykovej univerzity. Jej zber bol uskutočnený v roku 2019. Na výskum sa použilo 3,2 kg vetiev rastliny, ktoré sa po zbere rozomleli na požadovanú veľkosť. Maceráciou a následnou liquid-liquid extrakciou sa získali štyri podiely a to n-hexánový, chloro- formový, etylacetátový a vodný. Pri spracovávaní materiálu som spolupracovala s Monikou Vraž- dovou, ktorá rovnaký rastlinný materiál použila k spracovaniu svojej diplomovej práce. Chloro- formový podiel etanolového extraktu M. tricuspiata s hmotnosťou 20,02 g bol použitý v experi- mentálnej časti mojej diplomovej práce.

4.1.2 Chemikálie a rozpúšťadlá

(1) Rozpúšťadlá použité pri extrakcii, chromatografii na tenkej vrstve (TLC) a pri stĺpcovej chromatografii (CC)

• etanol p.a. (Penta) • acetón p.a. (Penta) • chloroform p.a. (Penta) • metanol p.a. (Penta) • etylester kyseliny octovej p.a.(Penta) • n-hexán p.a. (Penta)

50 PRAKTICKÁ ČASŤ

(2) Rozpúšťadlá použité pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC)

• acetonitril CHROMASOLV® pro HPLC, gradient grade ˃ 99,9 % (J.T.Baker) • kyselina mravčia p.a.> 98 % (Penta) • metanol CHROMASOLV® pro HPLC, gradient grade ˃ 99,9 % (J.T.Baker) • vysoko čistená voda pre HPLC pripravená pro účely analýzy uvedeným prístrojom

4.1.3 Materiál používaný pri chromatografii

(1) Materiál používaný pri TLC

• hliníková fólia Silikagél 60 F254, 20 × 20 cm, hrúbka vrstvy 200 μm (Merck)

(2) Materiál používaný pri CC

• sklenená kolóna dĺžky 1090 mm, vnútorný priemer 70 mm • silikagél s veľkosťou častíc 40–63 μm (Sigma)

(3) Materiál používaný pri analytickej HPLC

• analytická kolóna Ascentis Express RP-Amide s rozmermi 100 mm × 2,1 mm s veľkosťou častíc 2,7 μm (Supelco)

(4) Materiál používaný pri semipreparatívnej HPLC

• semipreparatívna kolóna Ascentis RP-Amide s rozmermi 250 mm × 10 mm s veľkosťou častíc 5 μm (Supelco)

51 PRAKTICKÁ ČASŤ

4.2 Použité prístroje

• analytické váhy KERN EW 620–3NM (Kern) • rotačná vákuová odparka Rotavapor R–114 Waterbath B–480 (Büchi) • UV lampa s žiarovkami emitujúcimi žiarenie s vlnovými dĺžkami λ=254 nm a λ=366 nm • ultrazvukový vodný kúpeľ Bandelin Sonorex Digitec (Bandelin) • lyofilizátor Alfa 1–2 LD (Christ) • prístroj pre prípravu vysoko čistenej vody použitej pri HPLC MiliQ (Milipore)

4.2.1 Prístroje použité pri HPLC

• HPLC systém Agilent 1100 Series, DAD UV/Vis detektor (Agilent Technologies) • Dionex UltiMate 3000 HPLC systém so zberačom frakcií Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific)

4.3 Použité metódy

4.3.1 Separačné metódy

Separačné metódy sú základné laboratórne metódy slúžiace k oddeleniu rôznych druhov jed- notlivých látok zo zmesí za účasti fyzikálne-chemických vlastností. Slúžia k izolácii sekundárnych látok od vysokomolekulárnych balastných látok z rastlinného materiálu, tvorených z celulózy, hemicelulózy, lignínu, ktoré nie sú v extrakčnom médiu roz- pustné. Aby sa predišlo možnej rušivej analýze, prevádza sa separácia primárnych a sekundárnych metabolitov rozpustných v extrakčnom médiu od vybraných cieľových zlúčenín, ktoré môžu byť následne podrobené analýze [1].

52 PRAKTICKÁ ČASŤ

(1) Extrakcia

Extrakcia je metóda pri ktorej dochádza k deleniu látok medzi dvoma vzájomne nemiešateľ- nými fázami, ktoré môžu byť v rôznom skupenstve (pevná látka/kvapalina; kvapalina/kvapalina), na základe rozdielnej rozpustnosti [1].

(a) Macerácia

Pracovný postup: Rastlinný materiál, v našom prípade išlo o rozdrvené vetvy M. tricuspidata, ktorými sme naplnili osem 5 litrových stojatiek, zaliali etanolom a nechali lúhovať po dobu 24 h. Extrakt bol následne prefiltrovaný cez vatu a zahustený na vákuovej rotačnej odparke do konzistencie podobnej medu. Odparené rozpúšťadlo bolo opätovne použité k extrakcii materiálu. Tento proces bol opakovaný 3 × po dobu 24 hodín a pri poslednej, extrakcii sme po 24 hodinách použili ultrazvukový kúpeľ po dobu 30 min. Získaný extrakt sa následne odparil na vákuovej ro- tačnej odparke do úplného odparenia rozpúšťadla.

Obr. 52: Stojatky s vetvami M. tricuspidata

(b) Liquid-liquid extrakcia

Túto metódu sme použili aby sa predišlo možnej rušivej analýze. Prevádzala sa separácia primárnych a sekundárnych metabolitov rozpustných v extrakčnom médiu od vybraných cieľo- vých zlúčenín, ktoré boli následne podrobené analýze.

53 PRAKTICKÁ ČASŤ

Pracovný postup: Suchý etanolový extrakt z vetiev M. tricuspidata sa rozpustil v 80% metanole, následne sa pridal n-hexán v pomere 1 : 2. Lievik sa opatrne pretrepal za súbežného vypus- tenia vzniknutých pár. Po pretrepaní sa nechala ustáliť hladina, pričom došlo k ustanoveniu kon- centračnej rovnováhy. Následne došlo k difúzii polárnych látok do metanolového podielu rozpúš- ťadla a nepolárnych do n-hexánového podielu. Proces separácie sme opakovali 3× a spojený n- hexánový podiel sa nechal odpariť na vákuovej rotačnej odparke. Metanolový extrakt odparený do sucha sa rozpustil vo vode a následne sa k nemu pridal chloroform v pomere 1 : 1. Chloroformový podiel, ktorý bol naďalej využívaný pri analýze, sa odparil do sucha. K vodnému podielu sa pridal etylacetát za vzniku etylacetátového a vodného podielu.

chloroformový podiel MeOH + 15,20 g H2O + vodný podiel etanolový extrakt M. CHCl3 H2O + tricuspidata v MeOH + EtOAc H2O + n-hexán n-hexánový etylacetátový podiel podiel

(2) Chromatografia

(a) Chromatografia na tenkej vrstve (TLC)

Spomínaná metóda TLC bola v rámci tejto vypracovanej diplomovej práce použitá pri:

• Kontrole mobilnej fázy pre stĺpcovú chromatografiu, nakoľko boli využité poznatky z predošlých výskumov [68] • Jednotlivej analýze frakcií získaných stĺpcovou chromatografiou a pri následnom spájaní analytov využívaných k analýze prostredníctvom HPLC • Overovaní čistoty látok získaných prostredníctvom semipreparatívnej HPLC

54 PRAKTICKÁ ČASŤ

Pracovný postup: Nakoľko z predošlých štúdií na podobnú problematiku už bol využívali istý pomer mobilnej fáze, zhotovila sa porovnávacia vzorka proti predošlej, získanej zo štúdie z roku 2020 [68]. Vzorka sa rozpustila v malom množstve metanolu a naniesla sa na hliníkovú doštičku so silikagélom. Nechala sa vyvíjať v mobilnej fázy zloženej z organických rozpúšťadiel chloroformu, acetónu a metanolu v pomere 20 : 1 : 0,023 (v/v/v) do výšky 1 cm od horného okraja doštičky. Vysušená doštička bola detegovaná pod UV lampou a porovnávala sa so vzorkami z predošlých rokov [68] (kontrolná skúška).

Obr. 53: TLC mobilnej fázy pod UV lampou pri λ=254 nm

Na základe dobrej rozpustnosti vzorky v mobilnej fázy a jej podobnosti so vzorkami z predo- šlých rokov [68], bola mobilná fáza v pomere 20 : 1 : 0,023 (v/v/v) využívaná pri stĺpcovej chromatografii, kde sa vzhľadom na polaritu látok pomer mobilnej fázy menil.

• Stacionárna fáza: hliníková fólia silikagél 60 F254 20 × 20 cm, hrúbka vrstvy 200 μm (Merck) • Mobilná fáza tvorená organickými rozpúšťadlami chloroformu, acetónu a metanolu v pomere 20 : 1 : 0,023 (v/v/v) • Detekcia doštičky pomocou UV lampy pri vlnovej dĺžke 254 nm a 366 nm • Porovnávanie vzoriek

55 PRAKTICKÁ ČASŤ

Obr. 54: Spájanie frakcií po CC pomocou TLC pod UV lampou pri λ=254 nm

Obr. 55: Spájanie frakcií po CC pomocou TLC pod UV lampou pri λ=366 nm

(b) Stĺpcová chromatografie (CC)

Stĺpcová chromatografia (column chromatography) je metóda využívaná prevažne pri spra- covaní väčšieho množstva materiálu [1].

Pracovný postup: Pripravila sa mobilná fáza zložená z organických rozpúšťadiel chloroformu, acetónu a metanolu v pomere 20 : 1 : 0,023 (v/v/v). Táto mobilná fáza bola vybraná na základe skúšobnej TLC chromatografie viď. Obr. 53. Následne sa k mobilnej fázy pridal silikagél (za súčasného miešania suspenzie sklenenou tyčinkou). Takto pripravená suspenzia sa naliala do sklenenej kolóny o dĺžke 1090 mm a o priemere 70 mm. Výška vyvíjajúceho sa stĺpca bola 710 mm. Zmes sa v kolóne nechala odstáť po dobu štyroch dní, počas ktorých došlo k usadeniu silikagélu, ktorý vytvoril súvislú vrstvu, nad ktorou bola mobilná fáza.

56 PRAKTICKÁ ČASŤ

Do takto pripravenej kolóny sa vložil filtračný papier na začiatok kolóny, na ktorý sa naniesla pomocou Pasteurovej pipety vzorka vopred rozpustená v 20 ml mobilnej fáze. Za neustáleho prí- sunu mobilnej fázy do úrovne 50 mm nad úroveň stacionárnej, boli zachytávané frakcie s objemom 125 ml do 250 ml baniek s guľatým dnom. • Stacionárna fáza: silikagél Sigma GDA o pórovitosti 40 až 63 μm (MERK) • Mobilná fáza: pri stĺpcovej chromatografii boli využívané 3 druhy mobilnej fázy v da- ných pomeroch o chloroform : acetón : metanol (v/v/v) v pomere 20 : 1: 0,023 (v/v/v) o chloroform : acetón : metanol (v/v/v) v pomere 14 : 7 : 0,023 (v/v/v) o chloroform : acetón : metanol (v/v/v) v pomere 10 : 11 : 0,023 (v/v/v) • Analyzovaná vzorka: chloroformový podiel etanolového extraktu vetiev M. tricuspidata Rozpúšťadlo zo zachytených frakcií sa odparilo na rotačnej vákuovej odparke pri maximálnej teplote vodného kúpeľa 40 °C. Po odparení rozpúšťadla sa frakcie podrobili TLC analýze a podľa zloženia sa následne spájali. Spojené frakcie sa previedli do vialiek a zvyšné rozpúšťadlo sa ne- chalo voľne odpariť. Frakcie boli ďalej analyzované pomocou HPLC.

Obr. 56: CC analýza s 1. mobilnou fázou

57 PRAKTICKÁ ČASŤ

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HPLC (high-performance liquid chromatography) je separačná metóda, pri ktorej dochádza podobne ako pri ostatných k deleniu látok medzi dve nemiešateľné fázy stacionárnu a mobilnú, pričom oproti klasickej stĺpcovej chromatografii má vyššiu účinnosť [1].

(i) Analytická HPLC

Analytická HPLC bola využívaná počas tejto diplomovej práce v dvoch prípadoch a to:

1. Pri analýze frakcií získaných pomocou stĺpovej chromatografie CC 2. Pri overení čistoty látok získaných semipreparatívnou HPLC

Pracovný postup: Malé množstvá získaných vzoriek, zo stĺpcovej chromatografie, sa roz- pustili v metanole. Vzorky, ktoré obsahovali drobné častice sa prefiltrovali cez membránový filter do vialiek a boli analyzované pomocou HPLC prístroja.

• Prístroj HPLC systém Agilent 1100 Series, detektor DAD UV/Vis • Stacionárna fáza: Analytická HPLC kolóna Ascentis® Express RP-Amide s rozmermi 100 × 2,1 mm s veľkosťou častíc 2,7 μm (Supelco) • Mobilná fáza: acetonitril, 0,2% kyselina mravčia, metanol • Metóda: Cudrania_1 o Teplota: do 40 ⁰C o Tlak: do 400 Bar o Prietok: 0,3 ml/min o Nástrek: 1 μl o Detekcia UV/Vis DAD pri vlnových dĺžkach 254 nm, 280 nm, 350 nm o Gradientová elúcia- Tab. 1

58 PRAKTICKÁ ČASŤ

Tab. 1: Zloženie mobilnej fázy pre metódu Cudrania; gradientová elúcia

Čas min Acetonitril (%) 0,2% HCOOH (%) Metanol (%)

0–36 10 90 0

36,01–40 100 0 0

40,01–45 0 0 100

(ii) Semipreparativna HPLC

Semipreparatívna metóda HPLC bola využívaná v tejto diplomovej práci k separácii látok z frakcie CT/CH/113–114, ktorá vykazovala po analytickej HPLC a TLC možné zaujímavé spektrum látok s dostatočnou hmotnosťou.

Pracovný postup: Celý obsah vzorky sa rozpustil v potrebnom množstve metanolu, tak aby bola zachovaná čo najvyššia koncentrácia vzorky, prefiltrovala sa cez membránový filter do vialiek. Prostredníctvom semipreparatívnej HPLC metódy bola vzorka analyzovaná a vybrané vzorky boli separované, zbierané pomocou zberača frakcií, podľa vopred stanovených parametrov. Po prebehnutí analýzy sa rozpúšťadlá nechali odpariť na rotačnej vákuovej odparke a zbytok vzorky s vodnou fázou sa zamrazil. Následne po tom, čo bola vzorka dostatočne zmrazená, sa voda od- stránila pomocou lyofilizátora počas 48 hod za zníženého tlaku na 1 milibar pri teplote 50 °C.

• Prístroj: Dionex UltiMate 3000 HPLC systém so zberacou hlavicou frakcií • Stacionárna fáza: Semipreparatívna HPLC kolóna Ascentis® Express RP-Amide s rozmermi 250 × 10 mm a o veľkosti častíc 5 μm (Supelco) • Mobilná fáza: acetonitril, 0,2% kyselina mravčia, metanol • Metóda: Cudrania_2: pre frakciu CT/CH/113–114 o Teplota: do 40 ⁰C o Tlak: do 400 Bar o Prietok: 5 ml/min o Nástrek: 30 μl

59 PRAKTICKÁ ČASŤ

o Detekcia UV/Vis DAD pri vlnových dĺžkach 254 nm, 280 nm, 350 nm o Gradientová elúcia- Tab. 2

Tab. 2: Zloženie mobilnej fázy pre metódu Cudrania_2; gradientová elúcia

Metanol (%) Čas min Acetonitril (%) 0, 2% HCOOH (%)

0 0–25 20 80

0 25 62 38

100 25,01–30 0 0

0 30,01–35 0 0

0 35–40 20 80

4.3.2 Identifikačné metódy

Chromatografickými metódami sa získané látky podrobili analýze pomocou spektrofoto- metrie UV-Vis.

(1) UV-Vis spektrofotometria

V tejto diplomovej práci sme pracovali pri analýze vzoriek s HPLC systémom Agilent 1100 Series, ktorého súčasťou bol detektor DAD UV/Vis. Detektorom boli za- chytené absorpčné spektrá analyzovaných látok. Spektrá analyzovaných látok sú podrob- nejšie popísané v kapitole 5.6. Identifikácia izolovaných látok z frakcie CT/CH/113– 114/1–6.

60 VÝSLEDKY

5 Výsledky

5.1 Macerácia a liquid-liquid extrakcia

Trojnásobnou maceráciou po dobu 24 hod. vetiev M. tricuspidata a odparením rozpúš- ťadla na rotačnej vákuovej odparke, sme získali etanolový zahustený extrakt o hmotnosti 114,13 g. S týmto extraktom sa ďalej pracovalo. Bol podrobený liquid-liquid extrakcii. V rámci nej bol extrakt vytrepávaný do n-hexánu, chloroformu, etylacetátu a vody, z ktorých nám vznikli príslušné podiely. Výsledná hmotnosť chloroformového podielu bola 15,20 g, ku ktorému bol pridaný chlo- roformový podiel získaný rovnakým postupom v rokoch 2017–2018 z vetiev M. tricuspidata o hmotnosti 5,0 g [68]. Výsledná hmotnosť chloroformového podielu tak predstavovala 20,20 g. Podiel bol použitý k ďalšej analýze vďaka svojej pomerne veľkej hmotnosti a predpokladu prí- tomnosti hľadaných látok v analyzovanej vzorke, ako sú prenylované flavonoidy a xantóny. Prí- tomnosť prenylovaných zlúčenín v chloroformovom podiele sme predpokladali na základe rovna- kého lipofilného, polárneho charakteru prenylovaných zlúčenín, ako má aj chloroform.

5.2 Stĺpcová chromatografia (CC)

Chloroformový podiel získaný liquid-liquid extrakciou sa podrobil ďalšej analýze na stĺpco- vej chromatografií. Na kolónu bola nanesená vzorka o hmotnosti 20,2 g. Počas tejto analýzy bola použitá mobilná fáza zo zmesi rozpúšťadiel chloroformu, acetónu a metanolu (v/v/v) v pomere 20 : 1 : 0,023 pri 95 frakciách. Použitím prvej mobilnej fázy bolo získaných 95 frakcií. Jednotlivé frakcie boli pomenované CT/CH/príslušné poradové číslo frakcie. Od frakcie č. 96 bol pomer mo mobilnej fázy zmenený na zmes chloroformu, acetónu a metanolu na pomer 14 : 7 : 0,023 (v/v/v) s vyššou elučnou silou. Pôsobením druhej mobilnej fázy sa získalo 74 frakcií. Pomer bol znova zmenený pri frakcii č. 170 na zmes chloroformu, acetónu a metanolu na pomer 10 : 11 : 0,023 (v/v/v), ktorým bolo získaných opätovných 75 frakcií. Od frakcie č. 245 bola kolóna premývaná čistým metanolom po frakciu č. 290.

61 VÝSLEDKY

Touto metódou bolo celkovo získaných 290 frakcií., ktoré sa po odparení rozpúšťadla na vákuovej odparke podrobili TLC analýze. Po detekcii pod UV lampu boli rovnaké frakcie spájané do spojených frakcií, ktorých bolo vo výsledku 74 a boli použité pri ďalšej analýze na HPLC.

62 VÝSLEDKY

5.3 Preparatívna HPLC

Vzorky získané z vyššie popísanej stĺpcovej chromatografie boli pripravené a prevedené do vialiek k analýze, po ich nariedení s metanolom. Po prebehnutí preparatívnej HPLC metódy Cudrania_1 a vyhodnotení chromatogramov získaných látok z chromatografie HPLC, boli spojené rovnaké frakcie. Výsledný počet predstavoval 73 frakcií, ich hmotnosť popisuje Tab. 3 a pokračuje Tab. 4.

Tab. 3: Spojené frakcie separované pomocou CC a HPLC a ich hmotnosti s hrubo vyznačenou frakciou, vybranej k ďalšej analýze

Hmotnosť Hmotnosť Hmotnosť [g] CT/CH/frakcia [g] CT/CH/frakcia [g] CT/CH/frakcia

0.041 1 0.003 61–68 0.098 174–180

0.017 2 0.005 69–70 0.033 181–182

0.034 3–4 0.006 71–72 0.038 183–186

0.014 5–6 0.001 73–81 0.127 187

0.415 7–9 0.006 82–101 0.584 188–207

0.016 10 0.001 102 0.011 208

0.059 11–15 0.035 103 0.008 209–212

0.018 16 0.002 104–109 0.072 213–216

0.076 17 0.002 110–111 0.018 217–220

0.259 18–20 0.023 112 0.658 221–238

0.006 21–22 0.009 113–114 1.801 239

0.032 23–30 0.093 115 0.726 240–242

63 VÝSLEDKY

Tab. 4: Pokračovanie Tab. 3

Hmotnosť Hmotnosť Hmotnosť [g] CT/CH/frakcia [g] CT/CH/frakcia [g] CT/CH/frakcia

0.102 31–35 0.084 116 0.371 243–246

0.470 36–37 0.046 117 0.449 248

3.863 38–39 0.033 118–119 0.533 249

0.728 40–41 0.027 120–122 0.637 250–251

0.149 42 0.006 123–135 1.379 252

0.180 43 0.007 136 0.055 253–254

0.072 44 0.008 137 0.048 255–256

0.151 45–46 0.031 138–149 0.474 257

0.052 47–48 0.032 150–151 0.054 258–259

0.231 49–50 0.073 152–161 0.255 260–270

0.230 51–52 0.057 162–166 0.074 271–290

53–55 0.062 167–168 0.022

56–60 0.051 169–173 0.04

64 VÝSLEDKY

Vzorky CT/CH/113 a CT/CH/114 vykazovali na chromatogramoch rovnaké charakteris- tiky, kvôli tomu boli po HPLC analýze spojené do jednej pomenovanej CT/CH/113–114 spojenej frakcie. Chromatogram vzorky CT/CH/113–114 je zobrazený na Obr. 57. Táto vzorka bola vy- braná k ďalšej analýze kvôli svojmu zaujímavému zloženiu na chromatograme z analytickej HPLC a dostatočnej hmotnosti 1,801 g

Obr. 57: Chromatogram frakcie CT/CH/113–114 pri 280 nm

65 VÝSLEDKY

5.4 Semipreparatívna HPLC

Celý obsah spojenej frakcie CT/CH/113–114 s hmotnosťou 1,801 g bol rozpustený v takom množstve metanolu, aby bola zachovaná čo najvyššia koncentrácia vzorky. Pred analýzou bola vzorka prefiltrovaná cez membránový filter, aby sa predišlo k narušeniu analýzy nerozpustnými časticami. Takto pripravená vzorka sa previedla do vialky a bola analyzovaná na semipreparatív- nej HPLC za použitia metódy Cudrania_2, ktorej výsledný chromatogram je zobrazený na Obr. 58.

Obr. 58: Chromatogram vzorky CT/CH/113–114 na semipreparatívnom HPLC pri 254 nm

Na získanom chromatograme pri 280 nm pozorujeme šesť majoritných píkov, ktoré sa zbierali v prednastavených retenčných časoch pomocou kolektorovej hlavice. Píky na chromatograme sú zobrazené s retenčnými časmi F = 5,455 min; F = 8,818 min; F = 13,406 min; F = 13,651 min; F = 16,269 min a F = 17,956 min a predstavujú šesť látok, ktoré môžu byť dosta- točne oddelené použitím predošlých separačných techník. Ich dostatočnú izoláciu predpokladáme vzhľadom na to, že je medzi píkmi určitá vzdialenosť. Zvyšné okolité menšie píky môžu predsta- vovať ďalšie látky alebo nečistoty. Získané subfrakcie boli označené ako CT/CH/113–114/1–6 a sú popísané nižšie v kapitole 5.6 Identifikácia izolovaných látok z frakcie CT/CH/113–114/1–6.

Po ich izolácii z pôvodnej vzorky z nich bolo odstránené rozpúšťadlo na rotačnej váku- ovej odparke a zbytky vody boli odstránené v procese lyofilizácie.

Vzorky sa zvážili a overila sa ich čistota pomocou TLC a HPLC analýzy za použitia opä- tovnej metódy Cudrania_1. Po overení sa izolované látky identifikovali pomocou UV-Vis spek- trofotometrie, ktorou sme zároveň dokazovali aj čistotu izolovaných látok.

66 VÝSLEDKY

Tab. 5: Hmotnosť jednotlivých subfrakcíí po semipreparativnej HPLC z frakcie CTCH/113–114

Subfrakcie z Hmotnosť (mg) CT/CH/113–114 28,1 1

110,1 2

2,0 3

1,9 4

2,4 5

3,0 6

67 VÝSLEDKY

5.5 Kontrola čistoty látok pomocou TLC analýzy

Všetky vzorky izolované pri semipreparatívnej HPLC analýze sa podrobili kontrole čis- toty pomocou TLC analýzy. Každá jedna vzorka sa pomocou kapilár naniesla na hliníkovú do- štičku so silikagélom a nechala sa vyvíjať v mobilnej fáze zloženej z organických rozpúšťadiel chloroformu, acetónu a metanolu v pomere 14 : 7 : 0,023 (v/v/v) do výšky 1 cm od horného okraja doštičky. Vysušená doštička bola detegovaná pod UV lampou. Podľa TLC analýzy pri kontrole čistoty šiestich izolovaných vzoriek usudzujeme, že ana- lyzované vzorky CT/CT/113–114/1 a CT/CT/113–114/2 boli dostatočnej miere izolované z pô- vodnej vzorky CT/CT/113–114. Ostatné vzorky sa javia ako nedostatočne izolované s možnými prímesami. Ich opätovné čistenie nebolo uskutočniteľné vzhľadom na malú hmotnosť.

5.6 Identifikácia izolovaných látok z frakcie CT/CH/113–114/1–6

Frakcie izolované pomocou oddeľovacích metód uvedených vyššie sa podrobili identifi- kačnej UV-Vis spektrofotometrii. Pri identifikácii látok z chromatogramov boli použité poznatky z predošlých štúdií popisujúcich izolované látky z M. tricuspidata [40][69] a štúdie popisujúce iden- tifikáciu flavonoidov [70][71]. Flavonoidné aglykony sú zložené najmenej z dvoch aromatických kruhov, ktoré dokážu absorbovať UV žiarenie. V štúdiách sú uvádzané rozhrania absorpčných maxím pohlteného UV

žiarenia pre kruh A pri rozmedzí λmax 240–285 nm, rozmedzie λmax 330–550 nm, ktoré je pripiso- vané substitučným a konjugovaným jednotkám na B a C-kruhu [69][70]. Absorpčné maximá derivá-

[58] tov xantónov sú uvádzané v štúdiách pri λmax 265–323 nm . Látky neboli zatiaľ podrobené ďalšej identifikácii za použitia metódy nukleárnej magnetickej rezonancie či hmotnostnej spektrometrie. Bližšia identifikácia izolovaných látok by mohla byť predmetom pokračovania tejto diplomovej práce.

68 VÝSLEDKY

5.6.1 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/1 pomocou UV-Vis metódy

Frakcia získaná pomocou preparatívnej HPLC metódy sa javila ako žltá kryštalická látka s hmotnosťou 28,1 mg. Podľa prevedenej TLC analýzy na chromatograme z preparatívnej HPLC bola zaistená dostatočná čistota frakcie a vzorka je vhodná k identifikácii. Na Obr. 59 je zobrazený chromatogram subfrakcie CT/CH/113–114/1, izolovanej semipre- paratívnou HPLC z preparatívnej HPLC pri 254 nm, s retenčným časom 7,148 min. Vzhľadom k tomu, že pri analýze na HPLC bola na separáciu použitá kolóna s reverznou fázou, v ktorej je stacionárna fáza nepolárneho charakteru a mobilná polárneho, podľa chromatogramu usudzujeme, že ide o látku relatívne polárneho charakteru, nakoľko bola dobre vymývaná mobilnou fázou. Po zmeraní látky UV-Vis spektrofotometriou vykazuje táto látka absorpčné maximá pri vl- nových dĺžkach ~220 nm, ~250 nm a ~325 nm. Spomínané absorpčné maximá odpovedajú po- dobným absorpčným maximám už izolovaných flavonoidov z M. tricuspidata [40]. Na základe zís- kaných absorpčných maxím predpokladáme, že ide o flavonoidnú zlúčeninu s flavónovým [71][72] skeletom [69][70].

Obr. 59: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/1 pri 254 nm

69 VÝSLEDKY

5.6.2 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/2 pomocou UV-Vis metódy

Na chromatograme zobrazenom na Obr. 60 subfrakcie č. 2 izolovanej z frakcie CT/CH/113–114 použitím metódy preparatívnej HPLC o hmotnosti 110,1 mg vidno majoritný pík s retenčným časom 9,370 min. Podobne ako pri predošlej frakcií, predpokladáme aj pri tejto, že je relatívne polárneho charakteru, nakoľko bola dobre vymývaná mobilnou fázou. Spektrum látky vykazuje absorpčné maximá pohlteného UV-Vis svetla látkou v oblasti vlnových dĺžok ~225 nm, ~250 nm, ~300 nm a ~335 nm. Uvedené získané absorpčné maximá odpovedajú podobným ab- sorpčným maximám už izolovaných flavonoidov z M. tricuspidata [40]. Na základe získaných ab- sorpčných maxím predpokladáme, že ide o flavonoidnú zlúčeninu s flavónovým [71][72] skeletom [69][70]. Presnú štruktúru však nevieme iba na základe získaného UV-Vis spektra presne určiť.

Obr. 60: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/ 2 pri 254 nm

70 VÝSLEDKY

5.6.3 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/3 pomocou UV-Vis metódy

Pomocou preparatívnej HPLC metódy bola izolovaná subfrakcia CT/CH/113–114/3 žlto- bielej farby, kryštalického charakteru s hmotnosťou 2,0 mg a s retenčným časom 9,519 min. Vzorka bola analyzovaná na HPLC, kde pri 254 nm absorbovala UV-Vis svetlo pri štyroch ab- sorpčných maximách s vlnovými dĺžkami ~255 nm, ~295 nm a pri ~330 nm. Absorpčné maximá pri vlnových dĺžkach ~255 nm, ~295 nm naznačujú možnú flavonoidnú štruktúru analyzovanej látky. Posledné slabšie rameno pri vlnovej dĺžke ~330 nm môže značiť prítomnosť flavónového [73] skeletu. UV/Vis spektrum flavónov [70][74] je popisované rozmedzí 250–280 nm a 304–350 nm. Na základe získaných absorpčných maxím predpokladáme teda možnú flavónovú [74][75] štruktúru izolovanej látky, ktorá je predmetom izolácie tejto diplomovej práce.

Presnú štruktúru látky by sme však vedeli určiť až po podrobnejšej analýze pomocou nukle- árnej magnetickej rezonancie, hmotnostnej spektrometrie či infračervenej spektrometrie, ktorá doposiaľ nebola vykonaná.

Obr. 61: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/3 pri 254 nm

71 VÝSLEDKY

5.6.4 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/4 pomocou UV-Vis metódy

Obr. 62 zobrazuje chromatogram frakcie bledožltej farby izolovanej zo vzorky CT/CH/113–114 semipreparatívnou HPLC metódou. Na tomto chromatograme pri 254 nm je vi- dieť majoritný pík izolovanej látky č. 4 o hmotnosti 1,9 mg s retenčným časom 12,933 min a 19,301 min. Vzorka obsahovala viac zložiek aj pri TLC analýze, podobne ako aj pri analýze na preparatívnej HPLC. V okolí sú vidieť aj iné píky, z čoho sa dá usúdiť, že táto vzorka nebola dostatočne izolovaná použitými metódami. Vzorka nebola podrobená opätovnej izolácii vzhľadom k jej malému množstvu.

Obr. 62: Chromatogram a UV/Vis spektrum subfrakcie CT/CH/113–114/4 pri 254 nm

72 VÝSLEDKY

5.6.5 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/5 pomocou UV-Vis metódy

Chromatogram izolovanej bielej kryštalickej látky č. 5 o hmotnosti 2,4 mg pomocou se- mipreparatívnej HPLC metódy z frakcie CT/CH113–114 vykazuje majoritný pík s retenčným ča- som 14,758 min. Po analýze na prístroji preparatívnej HPLC sa javila vzorka na chromatograme pri vlnovej dĺžke ~254 nm, ako dostatočne čistá a dobre izolovaná použitými metódami. Na získanom UV spektre vykazuje látka dve absorpčné maximá pri vlnovej dĺžke ~235 nm, ~280 nm. Pri vlnovej dĺžke ~325 nm je na spektre badateľné aj rameno s nízkou inten- zitou. Tieto absorpčné maximá naznačujú možnú prítomnosť flavonoidnej štruktúry zloženej z hydroxylovej alebo karbonylovej skupiny a konjugovaného systému dvojitých väzieb. Na základe podobných absorpčných maxím v porovnaní s inými izolovanými flavonoidmi [54] z M. tricuspidata, predpokladáme možnú prítomnosť flavanónovej [71] štruktúry u tejto látky. Podobné absorp- čné maximá sú uvádzané aj v štúdii analytickej separácii a detekcii flavonoidov [70].

Obr. 63: Chromatogram s UV/Vis spektrom subfrakcie CT/CH/113–114/5 pri 254 nm

73 VÝSLEDKY

5.6.6 Analýza subfrakcie CT/CH/113–114/6 pomocou UV-Vis metódy

Frakcia č. 6 bielej farby o hmotnosti 3,028 mg bola získaná izoláciou z CT/CH/113–114 vzorky pomocou semipreparatívnej HPLC metódy. Látka sa analyzovala TLC metódou a merala na prístroji HPLC. V oboch prípadoch sa látka javila dostatočne čistá a vhodná k identifikácii. Spektrum látky po absorbovaní UV-Vis svetla vykazovalo absorpčné maximá pri vlno- vých dĺžkach ~230 nm a ~280 nm s retenčným časom 17,455 min. Získané absorpčné maximá značia možnú prítomnosť hydroxylovej alebo karbonylovej skupiny naviazanej na aromáte. Vzhľadom k posunutému retenčnému času a lipofilnej povahe látky predpokladáme, že sa jedná o jednoduchú flavonoidnú [74] zlúčeninu, ktorá je predmetom izolácie tejto diplomovej práce.

Presnú štruktúru látky by sme však vedeli určiť až po podrobnejšej analýze pomocou nukle- árnej magnetickej rezonancie, hmotnostnej spektrometrie či infračervenej spektrometrie.

Obr. 64: Chromatogram s UV/Vis spektrom subfrakcie CT/CH/113–114/6 pri 254 nm

74 DISKUSIA

6 Diskusia

Ako už bolo na začiatku spomenuté cieľom tejto diplomovej práce bola izolácia obsahových látok z rastliny čeľade Moraceae. Išlo konkrétne o rastlinný druh M. tricuspidata. Látky boli izo- lované z chloroformového podielu extraktu vetiev M. tricuspidata za použitia chromatografic- kých metód a boli predbežne identifikované využitím spektrálnych metód.

K experimentálnej časti tejto diplomovej práce sa použil rastlinný materiál pochádzajúci zo skleníka Farmaceutickej fakulty Masarykovej univerzity. Z rozomletých vetvičiek bol zhotovený extrakt opakovanou maceráciou v etanole. Zahustením materiálu vákuovou odparkou, bol zís- kaný extrakt s hmotnosťou 114,134 g.

Na ďalšie spracovanie extraktu bola použitá liquid-liquid extrakcia. Na získanie sústavy vzá- jomne nemiešateľných kvapalín, boli k spracovaniu použité vhodné rozpúšťadlá, ktorých výber bol na základe eluotropnej rady. K extrakcii bol následne vybraný a použitý 80% metanol s n- hexánom, aqua purificata s chloroformom a aqua purificata s etylacetátom. Vytrepaním extraktu do príslušných rozpúšťadiel boli získané 4 podiely a to podiel n-hexánový, chloroformový, ety- lacetátový a vodný.

Chloroformový podiel o hmotnosti CT/CH 20,02 g bol vybraný k ďalšiemu spracovaniu. Predpokladalo sa, že pri prevedení liquid-liquid extrakcie, došlo k prechodu prenylovaných flavonoidov do chloroformového podielu etanolového extraktu M. tricuspidata. Prenylované flavonoidy sú lipofilnej povahy [34], práve kvôli ich polarite sa predpokladala ich prítomnosť vo vybranom chloroformovom podiele, vybraného k ďalšiemu spracovaniu. Následne bola použitá k spracovaniu chloroformového podielu stĺpcová chromatografia, ku ktorej sa použil celý obsah chloroformového podielu. Vhodná mobilná fáza bola vybraná na základe poznatkov z diplomovej práce [68] z roku 2020. Zloženie a rozpustnosť extraktu v mobilnej fáze po porovnaní s roz- pustnosťou extraktu z roku 2020, pomocou TLC metódy s následnou UV detekciou, bola takmer zhodná. Mobilná fáza pozostávala z rozpúšťadiel a to chloroformu, acetónu a metanolu v pomere 20 : 1 : 0,023, ktorej pomer sa počas extrakcie dva krát menil a to na pomer 14 : 7 : 0,023 a 10 :

75 DISKUSIA

11 : 0,023. Vymytie látok z kolóny bolo poslednou fázou, ku ktorej bol použitý metanol. Stĺpco- vou chromatografiou bolo získaných 290 frakcií s pomenovaním CT/CH/1–290.

Výsledné získané frakcie boli spájané, po prevedení TLC analýzy a následnej UV detekcie, do 74 vzoriek s rôznou hmotnosťou. Vzorky boli zmerané pomocou analytickej HPLC metódy a na základe ich podobnosti znova spájané. Výsledný počet vzoriek po analytickom HPLC me- raní bol 73. Na základe chromatogramov bola vybraná k spracovaniu spojená frakcia CT/CH/113–114.

Spojená frakcia CT/CH/113–114 o hmotnosti 1,8 g bola separovaná semipreparatívnou HPLC metódou, ktorou bolo získaných 6 subfrakcií CT/CH/113–114/1–6. Subfrakcie CT/CH/113–114/1, CT/CH/113–114/2, CT/CH/113–114/3, CT/CH/113–114/5 a CT/CH/113– 114/6 boli pri opätovnej analýze na chromatogramoch z preparatívnej HPLC dostatočne odsepa- rované a vzorky obsahovali čisté látky. Vzorka CT/CH/113–114/4 nebola dostatočne odseparo- vaná a obsahovala prímesi či nečistoty. Jej opätovné čistenie sa neuskutočnilo.

Flavonoidy boli predmetom izolácie tejto diplomovej práce. Ich prítomnosť sme predpokladali na základe uvádzaného vysokého obsahu v M. tricuspidata [2].

UV-Vis spektrá, získané v priebehu HLPC analýzy, vyššie spomenutých subfrakcií, nazna- čujú prítomnosť flavonoidného skeletu [40][69][70]. Ich prítomnosť predpokladáme na základe zís- kaných absorpčných maxím, ktoré boli v rozmedzí 240–335 nm detegovaných pri 254 nm [70]. Toto rozmedzie spadá do absorpčných maxím flavonoidov, ktoré je uvádzané prevažne pri vlno- vých dĺžkach 240–285 nm a 300–550 nm [70][74].

Cieľom tejto práce bola izolácia prenylovaných flavonoidov z M. tricuspidata. Na základe získaných výsledkov usudzujeme, že sme látky dostatočne odseparovali použitím vhodných me- tód a podľa získaných spektier predpokladáme, že boli izolované flavonoidné zlúčeniny. Avšak presnú štruktúru získaných látok by sme vedeli určiť až po podrobnejšej analýze pomocou nuk- leárnej magnetickej rezonancie, hmotnostnej spektrometrie či infračervenej spektrometrie.

76 ZÁVER

7 Záver

Diplomová práca bola zameraná na izoláciu a identifikáciu obsahových látok z extraktu M. tricuspidata získaného z vetiev rastlinného druhu

Teoretická časť diplomovej práce taxonomicky zaraduje rastlinný druh M. tricuspidata a popisuje jej výskyt, morfológiu a využitie.

Experimentálna časť diplomovej práce popisuje izoláciu látok z chloroformového podielu získaného liquid-liqiud extrakciou extraktu vetiev M. tricuspidata. Ďalej popisuje izoláciu látok za použitia chromatografických metód a to stĺpcovej chromatografie, ktorou bolo získaných 290 vzoriek. Výsledný počet získaných vzoriek predstavuje 73, ktoré boli získané po spájaní na zá- klade podobnosti z TLC metódy s následnou detekciou pod UV lampou a po meraní na analytickej HPLC. Z výsledných meraní bola vybraná jedna spojená vzorka CT/CH/113–114 k separácii na semipreparatívnej HPLC. Semipreparatívnou HPLC metódou bolo získaných 6 subfrakcií. Čistota subfrakcií CT/CH/113–114/1, CT/CH/113–114/2, CT/CH/113–114/3, CT/CH/113– 114/4, CT/CH/113–114/5 a CT/CH/113–114/6 bola meraná pomocou TLC a analytickej HPLC metódy. Výsledky ukázali, že takmer všetky vzorky obsahujú čisté látky a sú vhodné pre identi- fikáciu. Vzorka CT/CH/113–114/4 nebola dostatočne izolovaná a jej prečistenie, kvôli malej hmotnosti nebolo možné.

Identifikácia izolovaných subfrakcií je popisovaná v kapitole Identifikácia izolovaných látok z frakcie CT/CH/113–114/1–6. Podľa získaných UV-Vis spektier v priebehu HPLC analýzy, sa predpokladá prítomnosť flavonoidných zlúčenín v izolovaných vzorkách.

Pre presnejšiu identifikáciu by čisté látky bolo treba podrobiť analýze HR-MS a NMR, ktorá by bližšie určila ich chemickú štruktúru. Ďalšia analýza by mohla byť predmetom pokračovania tejto diplomovej práce.

77 ODKAZY

8 Odkazy

[1] Šmejkal, K., Muselík, J., & Mokrý, P. (2013). Laboratorní metody experimentální fyto- chemie. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 1–130. [cit. 2021-05-01]. ISBN 978-80-7305-649-0.

[2] Xin, L. T., Yue, S. J., Fan, Y. C., Wu, J. S., Yan, D., Guan, H. S., & Wang, C. Y. (2017). Cudrania tricuspidata: An updated review on ethnomedicine, phytochemistry and pharmacology. RSC Advances. 7(51), 31807–31832. [cit. 2021-08-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.1039/C7RA04322H

[3] Song, S. H., Ki, S. H., Park, D. H., Moon, H. S., Lee, C. D., Yoon, I. S., & Cho, S. S. (2017). Quantitative analysis, extraction optimization, and biological evaluation of cudrania tricuspidata leaf and fruit extracts. Molecules, 22(9), 1489. [cit. 2021-08-01]. Do- stupné z: https://doi.org/10.3390/molecules22091489

[4] Growables. (2015). Growables–Grow Florida Edibles [online]. [cit. 2021-06-01]. Do- stupné z: https://www.growables.org/information/TropicalFruit/che.htm#Bibliography

[5] Kim, D. H., Lee, S., Chung, Y. W., Kim, B. M., Kim, H., Kim, K., & Yang, K. M. (2016). Antiobesity and Antidiabetes Effects of a Cudrania tricuspidata Hydrophilic Extract Pre- senting PTP1B Inhibitory Potential. BioMed Research International, 2016, 1–11. [cit. 2021-10-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.1155/2016/8432759

[6] Kim, O. K., Nam, D. E., Jun, W., & Lee, J. (2015). Cudrania tricuspidata water extract improved obesity-induced hepatic insulin resistance in db/db mice by suppressing ER stress and inflammation. Food and Nutrition Research, 59, 1–12. [cit. 2021-11-01]. Do- stupné z: https://doi.org/10.3402/fnr.v59.29165

78 ODKAZY

[7] Jo, Y. H., Kim, S. B., Liu, Q., Do, S. G., Hwang, B.Y., Lee, M. K. (2017). Comparison of pancreatic lipase inhibitory isoflavonoids from unripe and ripe fruits of Cudrania tricuspidata. PLoS One, 12(3), 1–14. [cit. 2021-21-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0172069

[8] Quang, T. H., Ngan, N. T. T., Yoon, C. S., Cho, K. H., Kang, D. G., Lee, H. S., Kim, Y., & Oh, H. (2015). Protein tyrosine phosphatase 1b inhibitors from the roots of cudrania tricuspidata. Molecules, 20(6), 11173–11183. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/mole- cules200611173

[9] Al-Maharik, N. (2019). Isolation of naturally occurring novel isoflavonoids: An update. Natural Product Reports, 2019(36), 1156–1195. [cit. 2021-13-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.1039/c8np00069g

[10] Jo, Y. H., Choi, K. M., Liu, Q., Kim, S. B., Ji, H. J., Kim, M., Shin, S. K., Do, S. G., Shin, E., Jung, G., Yoo, H. S., Hwang, B. Y., & Lee, M. K. (2015). Anti-obesity effect of 6,8- diprenylgenistein, an isoflavonoid of Cudrania tricuspidata fruits in high-fat diet-induced obese mice. Nutrients, 7(12), 10480–10490. [cit. 2021-14-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/nu7125544

[11] Kim, D. W., Lee, W. J., Gebru, Y. A., Choi, H. S., Yeo, S. H., Jeong, Y. J., Kim, S., Kim, Y. H., & Kim, M. K. (2019). Comparison of bioactive compounds and antioxidant activities of maclura tricuspidata fruit extracts at different maturity stages. Molecules, 24(3), 567. [cit. 2021-13-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/molecules24030567

[12] Lee, H., Ha, H., Lee, J. K., Seo, C. S., Lee, N. H., Jung, D. Y., & Shin, H. K. (2012). The fruits of Cudrania tricuspidata suppress development of atopic dermatitis in NC/Nga mice. Phytotherapy Research, 26(4), 594–599. [cit. 2021-12-011]. Dostupné z: https://doi.org/10.1002/ptr.3577

79 ODKAZY

[13] Park, S. Y., Kim, B., Cui, Z., Park, G., & Choi, Y. W. (2020). Anti-metastatic effect of gold nanoparticle-conjugated maclura tricuspidata extract on human hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Nanomedicine, 2020(15), 5317–5331. [cit. 2021- 15-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.2147/IJN.S246724

[14] Kim, J. Y., Jang, S. S., Lee, J. L., Sim, J. H., & Shim, J. J. (2019). Cudrania tricuspidata extract protects against reflux esophagitis by blocking H2 histamine receptors. Preventive Nutrition and Food Science, 24(2), 159–164. [cit. 2021-14-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.3746/pnf.2019.24.2.159

[15] Gardner, E. M., Sarraf, P., Williams, E. W., & Zerega, N. J. C. (2017). Phylogeny and biogeography of Maclura (Moraceae) and the origin of an anachronistic fruit. Molecular Phylogenetics and Evolution, 117, 49–59. [cit. 2021-15-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.ympev.2017.06.021

[16] Nile, S. H., & Kim, D. H. (2015). HPLC analysis, antioxidant, anti-inflammatory and xanthine oxidase inhibitory activity of Cudrania tricuspidata. Natural Product Communi- cations, 10(11), 1839–1842. [cit. 2021-18-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.1177/1934578x1501001112

[17] Maclura tricuspidata Carière. (2021). Integrated Taxonomic Information System [online]. [cit. 2021-07-01]. Dostupné z: https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/Sin- gleRpt?search_topic=TSN&search_value=823733#null

[18] Maclura tricuspidata Carrière. (2003). Flora of China [online]. [cit. 2021-07-01]. Do- stupné z: http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=242331085

[19] Maclura Nuttall. (2003). Flora of China [online]. [cit. 2021-07-01]. Dostupné z: http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=119276

80 ODKAZY

[20] Maclura tricuspidata Carrière. (2019). Global Biodiversity Information Facility [online]. [cit. 2021-07-01]. Dostupné z: https://www.gbif.org/species/9130387

[21] CHE. (2012). Eat The Weeds And Other Things, Too [online]. [cit. 2021-08-01]. Do- stupné z: http://www.eattheweeds.com/tag/mandarin-melon-berry/

[22] Che–Cudrania tricuspidata Bur. ex Lavalle. (1997). California Rare Fruit Growers, Inc. [online]. [cit. 2021-08-01]. Dostupné z: https://crfg.org/wiki/fruit/che/

[23] Leaf of Maclura tricuspidata. (2020). Native plants of Carolinas and Georgia [online]. [cit. 2021-07-01]. Dostupné z: http://www.namethatplant.net/picpage.shtml?path=/Ima- ges/ImagesFire/sbp/sbp_3421.jpg&plant=2211&photo=26362

[24] Maclura tricuspidata. (2005). Zhiwu tong [online]. [cit. 2021-09-01]. Dostupné z: https://www.zhiwutong.com/dan_tu/83/66599.htm

[25] Maclura tricuspidata Carière. (2018). Pl@ntNet [online]. [cit. 2021-10-01]. Dostupné z: https://identify.plantnet.org/the-plant-list/observations/1004861933

[26] Mandarin Melonberry Chinese Che Tree. (2021). Urban Perennials [online]. [cit. 2021- 07-01]. Dostupné z: https://urbanperennials.com/product/mandarin-melonberry-chinese- che-tree-cudrania-tricuspidata/

[27] Maclura tricuspidata-Chinese Mulberry. (2021). Jurassic Plants [online]. [cit. 2021-07- 01]. Dostupné z: https://jurassicplants.co.uk/products/maclura-tricuspidata-chinese-mulberry

[28] Cudrania, Chuan Po Shi (Maclura Tricuspidata) Dried Root Liquid Extract. (2010). Her- balTerra [online]. [cit. 2021-08-01]. Dostupné z: https://herbalterra.com/cudrania-terra- aex

81 ODKAZY

[29] Cudrania Tricuspidata Juice. (2009). Kangwon Food [online]. [cit. 2021-09-01]. Do- stupné z: http://mobile-shop2.sikfum.cafe24.com/product/cudrania-tricuspidata- juice/67/category/1/display/2/#prdDetail

[30] Lee, S. B., Cosmas, B., & Park, H. D. (2020). The Antimutagenic and Antioxidant Acti- vity of Fermented Milk Supplemented with Cudrania tricuspidata Powder. Foods, 9(12), 1762. [cit. 2021-09-01]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/foods9121762

[31] Fermented milk supplemented with different concentrations of Cudrania tricuspidata powder. (2020). Foods [online]. [cit. 2021-20-02]. Dostupné z: https://www.mdpi.com/2304-8158/9/12/1762/htm

[32] Suchý, V., Daňková, I., Dvorská, M., Hrazdilová, E., Kubínová, R., Šmejkal, K., Špač- ková, V., & Žemlička, M. (2013). Praktická cvičení z farmakognozie. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 1–257. [cit. 2021-09-01]. ISBN 978-80-7305-659-9.

[33] Moravcová, J. (2006). Biologicky aktivní přírodní látky. Praha. Interní študijní pomůcka. Vysoká škola chemicko-technologická v Prahe, 1–108, [online]. [cit. 2021-07-01]. Do- stupné z: https://www.yumpu.com/xx/document/view/23052933/pomucka-biologicky- aktivni-prirodni-latky

[34] Prausová, N., & Kollár, P. (2019). Prenylované fenoly s cytotoxickou a antiproliferativní aktivitou izolované z Morus alba. Prenylated phenols with cytotoxic and antiproliferative activity isolated from Morus alba. Česká a slovenská Farmacie; 68, 48-68. [cit. 2021-08- 02]. Dostupné z: https://www.prolekare.cz/casopisy/ceska-slovenska-farmacie/2019-2- 20/prenylovane-fenoly-s-cytotoxickou-a-antiproliferativni-aktivitou-izolovane-z-morus- alba-113128

[35] Říhová, H. (2008). Flavonoidy. Stručný přehled a biologický význam. Praha. Bakalářská práce. Univerzita Karlova v Praze. Vedoucí práce: Prof. RNDr. Kvašničková Eva CSc. 1–58, [online]. [cit. 2021-08-01]. Dostupné z: http://hdl.handle.net/20.500.11956/17036

82 ODKAZY

[36] Arung, E. T., Yoshikawa, K., Shimizu, K., & Kondo, R. (2010). Isoprenoid-substituted flavonoids from wood of Artocarpus heterophyllus on B16 melanoma cells: Cytotoxicity and structural criteria. Fitoterapia, 81(2), 120–123. [cit. 2021-15-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.fitote.2009.08.001

[37] Hošek, J., Bartos, M., Chudík, S., Dall’Acqua, S., Innocenti, G., Kartal, M., Kokoška, L., Kollár, P., Kutil, Z., Landa, P., Marek, R., Závalová, V., Žemlička, M., & Šmejkal, K. (2011). Natural compound cudraflavone B shows promising anti-inflammatory properties in vitro. Journal of Natural Products, 74(4), 614–619. [cit. 2021-15-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1021/np100638h

[38] Lee, C. W., Yen, F. L., Ko, H. H., Li, S. Y., Chiang, Y. C., Lee, M. H., Tsai, M. H., & Hsu, L. F. (2017). Cudraflavone C induces apoptosis of A375.S2 melanoma cells through mitochondrial ROS production and MAPK activation. International Journal of Molecu- lar Sciences, 18(7), 1508. [cit. 2021-14-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/ijms18071508

[39] Soo, H. C., Chung, F. F., Lim, K. H., Yap, V. A., Bradshaw, T. D., Hii, L. W., Tan, S. H, See, S. J., Tan, Y. F., Leong, C. O., & Mai, C.W. (2017). Cudraflavone C Induces tumor- specific apoptosis in colorectal cancer cells through inhibition of the phosphoinositide 3- kinase (PI3K)-AKT pathway. PLoS One; 12(1), 1–20. [cit. 2021-20-02]. Dostupné z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5249192/

[40] Guo, Y. Q., Tang, G. H., Lou, L. L., Li, W., Zhang, B., Liu, B., & Yin, S. (2018). Preny- lated flavonoids as potent phosphodiesterase-4 inhibitors from Morus alba: Isolation, mo- dification, and structure-activity relationship study. European journal of medicinal chemistry, 144, 758–766. [cit. 2021-17-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.ej- mech.2017.12.057

83 ODKAZY

[41] Kočová, K. (2015). Přírodní látky a jejich β-sekretasová inhibiční aktivita. Praha. Diplo- mová práce. Univerzita Karlova v Praze. Vedoucí práce: PharmDr. Chlebek Jakub, Ph.D, 1–96. [online]. [cit. 2021-09-02]. Dostupné z: https://dspace.cuni.cz/handle/20.500.11956/68699

[42] Cao, W., Dong, Y., Zhao, W., Lu, X., & Sun, L. (2019). Mulberrin attenuates 1-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine (MPTP)-induced Parkinson’s disease by promoting Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Chemical Neuroanatomy, 98, 63–70. Do- stupné z: https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2019.04.003

[43] Kim, J., Cho, N., Kim, E. M., Park, K. S., Kang, Y. W., Nam, J. H., Nam, M. S., Kim, K. K. (2020). Cudrania tricuspidata leaf extracts and its components, chlorogenic acid, kaempferol, and quercetin, increase claudin 1 expression in human keratinocytes, enhancing intercellular tight junction capacity. Applied Biological Chemistry, 63(23), 1–9. [cit. 2021-10-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1186/s13765-020-00505-1

[44] Kim, O. K., Jun, W., & Lee, J. (2016). Effect of Cudrania tricuspidata and Kaempferol in Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Inflammation and Hepatic Insulin Resistance in HepG2 Cells. Nutrients, 8(1), 60. [cit. 2021-10-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/nu8010060

[45] Lee, Y., Oh, J., & Jeong, Y. S. (2015). Lactobacillus plantarum-mediated conversion of flavonoid glycosides into flavonols, quercetin, and kaempferol in Cudrania tricuspidata leaves. Food science and Biotechnology, 24, 1817–1821. [cit. 2021-13-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1007/s10068-015-0237-2

84 ODKAZY

[46] Chen, Y. S., Hu, Q. H., Zhang, X., Zhu, Q., & Kong, L. D. (2013). Beneficial effect of rutin on oxonate-induced hyperuricemia and renal dysfunction in mice. Pharmaco- logy, 92(1–2), 75–83. [cit. 2021-15-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1159/000351703

[47] Ganeshpurkar, A., & Saluja, A. K. (2017). The Pharmacological Potential of Rutin. Saudi Pharmaceutical Journal, 25(2), 149-164. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.jsps.2016.04.025.

[48] Choi, J. K., & Kim, S. H. (2013). Rutin suppresses atopic dermatitis and allergic contact dermatitis. Experimental Biology and Medicine, 238(4), 410–417. Dostupné z: https://doi.org/10.1177/1535370213477975

[49] Kim, Y. H., Choi, Y. J., Kang, M. K., Park, S. H., Antika, L. D., Lee, E. J., Kim, D. Y., & Kang, Y. H. (2017). Astragalin Inhibits Allergic Inflammation and Airway Thickening in Ovalbumin-Challenged Mice. Journal of agricultural and food chemistry, 65(4), 836– 845. Dostupné z: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b05160

[50] Li, X., Tang, Z., Fei, D., Liu, Y., Zhang, M., & Liu, S. (2017). Evaluation of the sedative and hypnotic effects of astragalin isolated from Eucommia ulmoides leaves in mice. Na- tural product research, 31(17), 2072–2076. Dostupné z: https://doi.org/10.1080/14786419.2016.1272108

[51] Zhang, W., Lu, X., Wang, W., Ding, Z., Fu, Y., Zhou, X., Zhang, N., & Cao, Y. (2017). Inhibitory Effects of Emodin, Thymol, and Astragalin on Leptospira interrogans-Induced Inflammatory Response in the Uterine and Endometrium Epithelial Cells of Mice. In- flammation, 40(2), 666–675. Dostupné z: https://doi.org/10.1007/s10753-017-0513-9

[52] Ma, Z., Piao, T., Wang, Y., & Liu, J. (2015). Astragalin inhibits IL-1β-induced inflammatory mediators production in human osteoarthritis chondrocyte by inhibiting NF-κB and MAPK activation. International immunopharmacology, 25(1), 83–87. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2015.01.018

85 ODKAZY

[53] Kim, K. W., Quang, T. H., Ko, W., Kim, D. C., Yoon, C. S., Oh, H., & Kim, Y. C. (2018). Anti-neuroinflammatory effects of cudraflavanone a isolated from the chloroform fraction of Cudrania Tricuspidata root bark. Pharmaceutical Biology, 56(1), 192–200. [cit. 2021-12-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1080/13880209.2018.1447972

[54] Hiep, N. T., Kwon, J., Kim, D. W., Hong, S., Guo, Y., Hwang, B. Y., Kim, N., Mar, W., & Lee, D. (2017). Neuroprotective constituents from the fruits of Maclura tricuspidata. Tetrahedron, 73(19), 2747–2759. [cit. 2021-12-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.tet.2017.03.064

[55] Hong, S., Kwon, J., Hiep, N. T., Sim, S. J., Kim, N., Kim, K. H., Lee, D., Mar, W. (2018). The isoflavones and extracts from Maclura tricuspidata fruit protect against neuronal cell death in ischemic injury via induction of Nox4-targeting miRNA-25, miRNA-92a, and miRNA-146a. Journal of Functional Foods, 40, 785–797. [cit. 2021-13-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.jff.2017.12.011

[56] Hiep, N. T., Kwon, J., Hong, S., Kim, N., Guo, Y., Hwang, B. Y., Mar, W., Lee, D. (2019). Enantiomeric Isoflavones with neuroprotective activities from the Fruits of Maclura tricuspidata. Scientific Reports, 9(1759), 1–9. [cit. 2021-12-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1038/s41598-018-36095-8

[57] Ng, I. M., Chua, C. L. (2019). The potential of xanthones as a therapeutic option in mac- rophage‑associated inflammatory diseases. Pharmacognosy Reviews; 12(25), 28-33. [cit. 2021-12-02]. Dostupné z: 10.4103/phrev.phrev_25_18

[58] Jo, Y. H., Shin, B., Liu, Q., Lee, K. Y., Oh, D. C., Hwang, B. Y., & Lee, M. K. (2014). Antiproliferative prenylated xanthones and benzophenones from the roots of cudrania tricuspidata in HSC-T6 cells. Journal of Natural Products, 77(11), 2361–2366. [cit. 2021- 14-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1021/np5002797

86 ODKAZY

[59] Jo, Y. H., Kim, S. B., Liu, Q., Hwang, B. Y., & Lee, M. K. (2017). Prenylated Xanthones from the roots of Cudrania tricuspidata as inhibitors of lipopolysaccharide-stimulated Nit- ric Oxide production. ArchPharm Chemistry in Life Sciences, 350(1), 1–7. [cit. 2021-12- 02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1002/ardp.201600263

[60] Genovese, S., Fiorito, S., Taddeo, V. A., & Epifano, F. (2016). Recent developments in the pharmacology of prenylated xanthones. Drug Discovery Today, 21(11), 1814-1819. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.drudis.2016.06.033

[61] Kim, E. N., Kwon, J., Lee, H. S., Lee, S., Lee, D., & Jeong, G. S. (2020). Inhibitory effect of cudratrixanthone U on RANKL-Induced Osteoclast differentiation and function in macrophages and BMM cells. Frontiers in Pharmacology, 11, 1048. Dostupné z: https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01048

[62] Kim, E. N., Lee, H. S., & Jeong, G. S. (2020). Cudratricusxanthone o inhibits h2o2-induced cell damage by activating nrf2/ho-1 pathway in human chondrocytes. Antioxi- dants, 9(9), 1–13. [cit. 2021-17-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/antiox9090788

[63] Shi, L., Dong, Q., & Ding, K. (2014). Structure elucidation and immunomodulatory activity in vitro of a xylan from roots of Cudrania tricuspidata. Food Chemistry, 152, 291– 296. [cit. 2021-15-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.11.091

[64] Srivastava, T., & Mishra, S. K. (2015). Novel function of polyphenols in human health: A review. Research Journal of Phytochemistry, 9(3), 116–126. [cit. 2021-16-02]. Do- stupné z: https://doi.org/10.3923/rjphyto.2015.116.126

[65] Zheng, Z. P., Tan, H. Y., Chen, J., & Wang, M. (2013). Characterization of tyrosinase inhibitors in the twigs of Cudrania tricuspidata and their structure-activity relationship study. Fitoterapia, 84(1), 242–247. [cit. 2021-16-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.fitote.2012.12.006

87 ODKAZY

[66] Park, S. Y., Kim, B., Cui, Z., Park, G., & Choi, Y. W. (2020). Anti-metastatic effect of gold nanoparticle-conjugated maclura tricuspidata extract on human hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Nanomedicine, 15, 5317–5331. [cit. 2021-20-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.2147/IJN.S246724

[67] Yong, G. R., Gebru, Y. A., Kim, D. W., Kim, D. H., Han, H. A., Kim, Y. H., & Kim, M. K. (2019). Chemical Composition and Antioxidant Activity of Steam-Distilled Essential Oil and Glycosidically Bound Volatiles from Maclura Tricuspidata Fruit. Foods, 8(12), 659. [cit. 2021-18-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/foods8120659

[68] Vaňková, V. (2020). Analýza obsahových látek vybraných druhů čeledi Moraceae I. Brno. Diplomová práce. Masarykova univerzita. Vedoucí práce: PharmDr. Gazdová Markéta, Ph.D. 1–85. [online]. Dostupné z: https://is.muni.cz/th/phv9u/

[69] Chen, L., Duan, Y., Li, C., Wang, Y., Tong, X., Dai, Y., & Yao, X. (2013). Four new prenylated flavonoids from the roots of Cudrania tricuspidata. Magnetic Resonance in Chemistry, 51(12), 842–846. [cit. 2021-23-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1002/mrc.4020

[70] de Rijke, E., Out, P., Niessen, W. M. A., Ariese, F., Gooijer, C., & Brinkman, U. A. T. (2006). Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chroma- tography A, 1112(1–2), 31–63. [cit. 2021-23-02]. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.01.019

[71] Tošović, J., & Marković, S. (2017). Reproduction and interpretation of the UV-vis spectra of some flavonoids. Chemical Papers, 71(3), 543–552. Dostupné z: https://doi.org/10.1007/s11696-016-0002-x

88 ODKAZY

[72] Tsimogiannis, D., Samiotaki, M., Panayotou, G., & Oreopoulou, V. (2007). Characteri- zation of flavonoid subgroups and hydroxy substitution by HPLC-MS/MS. Mole- cules, 12(3), 593–606. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/12030593

[73] Lin, L. Z., & Harnly, J. M. (2007). A screening method for the identification of glycosy- lated flavonoids and other phenolic compounds using a standard analytical approach for all plant materials. Journal of agricultural and food chemistry, 55(4), 1084–1096. Do- stupné z: https://doi.org/10.1021/jf062431s

[74] Feng, W., Hao, Z., & Li, M. (2017). Isolation and Structure Identification of Flavono- ids. Flavonoids-From Biosynthesis to Human Health. London: InTechOpen. 18–43. ISBN: 978-953-51-4697-1.

[75] Kumar, S., & Pandey, A. K. (2013). Chemistry and biological activities of flavonoids: an overview. The Scientific World Journal, 2013, 1–16. Dostupné z: https://doi.org/10.1155/2013/162750