Camila Vieira

Evolução de fluorescência, cripsia e comportamentos em aranhas Thomisidae sobre flores

CAMPINAS 2015 i

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Resumo

Aranhas Thomisidae possuem fotorreceptores sensíveis à radiação ultravioleta

(UV). Quando os átomos desses fotorreceptores são expostos à UV, há uma absorção de

UV e emissão de uma luz denominada fluorescência. Embora recentemente a fluorescência tenha sido descrita em diversos organismos como aves, crustáceos e escorpiões, pouco se sabe como esta propriedade evolui em aranhas. Em Thomisidae a evolução de colorações de camuflagem e reconhecimento de presas é um tema intrigante e ainda pouco explorado, principalmente em espécies tropicais. Várias espécies de aranhas Thomisidae forrageiam por emboscada (i.e., senta-e-espera) sobre flores e se não possuírem características comportamentais e/ou físicas que favoreçam camuflagem a presas e predadores, podem ter sua chance de sobrevivência reduzida. Em contraste, outras espécies de Thomisidae consideradas basais (e.g., Tmarus) geralmente não usam flores para forragear e sua coloração é pálida ou marrom. Até o momento nada se sabe sobre comportamentos, coloração e intensidade de fluorescência entre as espécies que forrageiam em flores e em outros tipos de substrato (folhas e ramos secos), nem tampouco como evoluíram estas características em Thomisidae. Neste trabalho foram investigados especificamente: (1) a variação da intensidade de fluorescência e reflexão de UV em Thomisidae estudando desde gêneros basais até os gêneros que divergiram mais recentemente, (2) se a intensidade de fluorescência e reflexão de UV são maiores em espécies que forrageiam sobre flores quando comparadas às espécies que não forrageiam sobre flores, (3) se as espécies de aranhas que forrageiam sobre flores estão crípticas no sistema visual de visitantes florais e

(4) como características ecológicas relacionadas à cor (intensidade de fluorescência, reflexão UV) evoluíram na família Thomisidae. Esse trabalho revela que a coloração tem

vii um papel fundamental na escolha de sítios de forrageio e na detecção das aranhas por suas presas. Intensidade de fluorescência e reflexão de UV são características ecológicas que evoluíram de forma não correlacionada e apresentam sinal filogenético em Thomisidae da região Neotropical.

Palavras-chave: características ecológicas, coloração, fluoróforos, reflectância, sinal filogenético, UV.

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Abstract

Crab spiders (Thomisidae) have photoreceptors sensitive to ultraviolet (UV) radiation. When atoms of photoreceptors are exposed to UV light, there is UV absorption and emission of the longer wavelength light known as fluorescence. Although fluorescence has recently been described in many organisms such as birds, crustaceans and scorpions, little is known about how this property evolved in spiders. In crab spiders the evolution of crypsis and prey recognition is an intriguing topic and still largely unexplored, especially regarding tropical species. Several crab spider species are sit-and-wait predators hunting on flowers and could require some degree of crypsis to minimize or avoid being detected by floral visitors and predators. In contrast, other crab spider species, sharing plesiomorphic traits (e.g., Tmarus), generally do not forage on flowers and their colour varies from pale to dark brown. To date, nothing is known about the behaviour, coloration and fluorophore concentrations among species that forage on flowers and other types of substrate, nor how these characteristics evolved in Thomisidae. This work specifically investigated: (1) if fluorescence intensity and UV reflectance vary throughout a range of crab spider taxa (from the basal genera to species that diverged more recently), (2) if the fluorescence and reflectance intensities are higher in species foraging upon on flowers, (3) if the species bearing higher fluorescence and reflectance intensities are more cryptic upon on flowers, i.e., less recognized by floral visitors and 4) how ecological traits related to colour

(fluorescence intensity, UV reflection) evolved in crab spiders. This work reveals that colour has a crucial role in site choice for foraging crab spider and prey recognition.

Fluorescence emission and UV reflection are ecological traits that evolve in an uncorrelated manner and have a phylogenetic signal in Neotropical Thomisidae.

Keywords: colouration, ecological traits, fluorophores, reflectance, phylogenetic signal,

UV.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL...... 1 CAPÍTULO I. Aranhas Thomisidae usam a cor do substrato para escolher seus sítios de forrageamento...... 19 RESUMO...... 21 INTRODUÇÃO...... 22 MATERIAL E MÉTODOS...... 25 RESULTADOS...... 31 DISCUSSÃO...... 34 CAPÍTULO II. Cripticidade em Thomisidae é mantida pela elevada intensidade de reflexão de UV e de fluorescência...... 57 RESUMO...... 59 INTRODUÇÃO...... 60 MATERIAL E MÉTODOS…………………………………...... 63 RESULTADOS...... 71 DISCUSSÃO...... 74 CAPÍTULO III. Evolução de coloração em aranhas Thomisidae...... 114 RESUMO...... 116 INTRODUÇÃO...... 117 MATERIAL E MÉTODOS…………………………………...... 119 RESULTADOS...... 129 DISCUSSÃO...... 132 SÍNTESE...... 158

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"As paixões são os ventos que enfunam as velas dos barcos, elas fazem-nos naufragar, por vezes, mas sem elas, não poderiam singrar” François-Marie Arouet (Voltaire) 1694 - 1778 xiii

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AGRADECIMENTOS

Poets say science takes away from the beauty of the stars — mere globs of gas atoms. Nothing is "mere". I too can see the stars on a desert night, and feel them. But do I see less or more? Richard Phillips Feynman, 1963.

Agradeço a todas as pessoas que me transformaram ao longo deste processo de aprendizado. Eu sou apenas o resultado da soma de contribuição de cada uma delas.

Ao meu mestre e orientador Prof. Gustavo Quevedo Romero,

Agradeço por essa gigantesca jornada de 10 anos de aprendizado. A gratidão não é só pela orientação acadêmica, mas sim por ter sido o responsável pela minha formação pessoal e profissional. Agradeço por me apresentar e me conduzir pelo caminho mais desafiante que parece na maioria das vezes não ser o mais fácil, mas certamente é caminho que me trouxe mais coragem. Saiba que esses 10 anos de parceria fez com que você se tornasse um membro integrante da minha história. Talvez eu nunca consiga expressar o tamanho da sua contribuição na minha trajetória como um todo. Mas expresso em palavras simples, mas não com menos intensidade, minha profunda gratidão pela oportunidade de tê-lo como meu mestre e orientador. A você Gustavo, meu mais profundo e sincero, muito obrigada!

Aos amigos e parceiros do laboratório LIM e todos os alunos que passaram sob a orientação do Prof. Gustavo Q. Romero no qual pude conviver ao longo desses anos. Nossa! Eu tive muita sorte de poder compartilhar com vocês todos os momentos de crescimento. Obrigada por toda ajuda que vocês me proporcionaram, por todas as discussões e por todos os momentos de felicidade. Agradeço principalmente pelas reflexões sobre o que deve ser feito para termos um mundo melhor na educação.

A Profa. Claudia M. A. Carareto por toda essencial colaboração no trabalho e por toda infraestrutura para o trabalho em biologia molecular. Acima de tudo agradeço por me acolher junto à equipe do laboratório de Evolução Molecular com toda confiança me permitindo fazer parte de todas as reuniões e decisões como um membro do grupo.

A Dra. Lilian Medeiros pelos fundamentais ensinamentos iniciais no laboratório no qual sem eles não seria possível a realização dessa etapa do projeto. A toda a equipe do Laboratório de Evolução Molecular da UNESP de São José do Rio Preto que sempre esteve disposta a sentar e discutir as inúmeras tentativas de amplificação sem sucesso (Ufa!) durante os três primeiros anos de trabalho. Elaine Dias, Adriana Granzotto, Wellington Santos, Elias Gafa, Maryanna Simão e Joice M.B. Périco obrigada pela amizade e por terem acompanhado a saga da persistência na bancada! Vou levar essa máxima que aprendi com vocês “o comum é dar errado, então ...continue a nadar!”.

Ao Prof. Ronei J. Poppi por todo o suporte nas análises de fluorescência e reflectância no laboratório de UV-Vis-NR no Instituto de Química da Unicamp. A Cláudia Martelli por toda atenção e auxílio nos equipamentos e por achar sensacional quando descobriu que existem aranhas que emitem fluorescência.

Ao Prof. Arno Antônio Lise e ao laboratório de Aracnologia no Museu de Ciência e Tecnologia da PUC-Rio Grande do Sul pelos ensinamentos taxonômicos e identificação das aranhas. Agradeço e por toda a alegria e disposição ao trabalhamos juntos durante minha estadia.

A todos do Evolab no Division of Organism and Environment Departament, University of California, Berkeley, California, USA pelo suporte logístico e colaboração. Agradeço a Prof. Dra. Rosemary Gillespie por ter aceitado a colaboração e ter possibilitado minha ida para UC Berkeley e seu grupo de pesquisa Susan Kennedy, Jenn Weaver, Ashley Adams, Darko Cotoras, Lisa Becking, Misha Leong, Andy Rominger, Jun Ying Lim, Karin Goodman, Brad Balukjian, Erin Brandt, Ignacio Mezza, Cerise Chen e Emily Farrer pela recepção. Ao Prof. Charles Griswold pelas conversas e seus alunos Lina e Doug do California Academy of Sciences (CAS) por ter me recebido com muita atenção e dedicação. Aos amigos do “Rose’s Team” e todos os grandes amigos que a California me deu de presente e foram essenciais na minha estadia em UC Berkeley. Trago todos no coração! Foram os meses mais incrivelmente intensos da minha vida que mudou minha forma de ver Ciência e ver o Mundo!

A todas as pessoas que auxiliaram na coleta, envio das aranhas e alimentação e manutenção em laboratório. Andressa Degressi, Jeferson Bugoni, Bruno Grisolia, Tiago N. Bernabé, Maraísa Braga, Adriana T. Salomão, Suzana Diniz, Pablo A. Antiqueira, Thaís Postali, Gustavo Migliorini, Martin F. Pareja, José Roberto Trigo, Juliana El Ottra, Gustavo C. Picoli, Alexandre Neutzling, Angelo R. Manzotti, Paula M. Omena, Thiago Gonçalves Souza, Ana Zangirolame, Bárbara Mamede, Vivian Lima, Décio Corrêa, Adriano Mendonça e Julia Koricheva.

Ao Tiago Bernabé pelo acompanhamento com muita seriedade durante os experimentos e pelo imenso zelo no cuidado com as aranhas. Noemy S. Pereira pelas contribuições nas dúvidas das análises filogenéticas.

Ao Yuri Messas, Andressa Degressi e Fabrício Marcondes pelas fotos em campo e laboratório e Raduan Soleman pelo desenho das aranhas. Ao Yuri Grandinete pelas identificações dos insetos visitantes florais.

Aos amigos Pablo A. Antiqueira e Paula Omena por estar sempre dispostos a contribuir com as dúvidas e questionamentos. Ao Jeferson Bugoni, por toda a amizade, contribuições e por sempre estar disposto a ajudar.

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Ao Vinícius Brito pela forte contribuição com as análises de coloração e pelas infindáveis discussões sobre os modelos. Obrigada pela paciência e por sempre estar em prontidão respondendo meus e-mails.

Aos amigos que a UNICAMP me trouxe. Ana Gabriela Bieber por ter me recebido na sua casa há quatro anos e ter me apresentado o universo Barão Geraldo. A minha “housemate” Angélica e aos amigos: Nádia, Maru, Sebá, Javier, Mariane, Marianne, Tina, Cris, Mayra, Kamila, Cau, Thais, Emílio, Jana, Orestes, Chris, Elen, Lucas, Jessie, Junia, Edu, Tamara, Fabricio, Marjorie, Glauco, Gulherme, Nat, Hélio, Rachel, Micael, Giulia, Polliana, Melissa, Gabi Monteiro, Mauro, Décio, Deise, André Rech, Marcelo, obrigada por todos os ótimos momentos compartilhados. Eu realmente cresci muito aqui em Barão.

Ao Prof. José Roberto Trigo pelas importantes sugestões e contribuições iniciais na apresentação do projeto e correções fundamentais na pré-banca. Ao Prof. Martin F. Pareja e Prof. João Vasconcellos-Neto pelas discussões e observações em campo durante os experimentos. Ao Prof. Paulo de Oliveira por todas as conversas acadêmicas enriquecedoras.

Aos primeiros mestres da graduação que com suas aulas e discussões me motivaram a gostar de Ecologia e Biologia Evolutiva: Profa. Denise Rossa-Feres, Profa. Lilian Casatti, Prof. Fernando Noll, Profa. Claudia Carareto e aos professores que fizeram parte de minha formação inicial Prof. Classius de Oliveira e Profa. Claudia Bonini.

A minha mais profunda gratidão aos professores Sergio Furtado Reis e Sergio Ivan Perez pela imensa contribuição com discussão de resultados, estudo de teoria e uso de métodos comparativos filogenéticos. Agradeço por todas as conversas, todo aprendizado, paciência e principalmente por acender em nossos estudos a “chama” da inspiração pelo saber. Agradeço aos amigos Prianda Rios Laborda, Carolina Lemes, Carlos Tonhatti e Juliana Yamada por todo o carinho e amizade.

A Prefeitura municipal de Jundiaí e ao setor administrativo da Base de Estudos Ecológicos e Educação Ambiental da Serra do Japi por ter autorizado o desenvolvimento deste projeto. Em especial ao Sr. Lauro por todo carinho, preocupação em campo e proteção desde quando iniciei as pesquisas na graduação. Agradeço também os amigos da Serra do Japi: Fábio, Bruno Grisola, Pablo, Adriana, Andressa, Tiago Bernabé, Maraísa Braga por compartilharem horas de campo e momentos de descontração na Serra.

Em especial ao suporte da minha família e ao pequeno Lorenz boy por me ensinar a sorrir. Aos verdadeiros amigos, seria injusto deixar de agradecê-los, sem precisar citá-los cada um sabe a importância singular que ocupa em meus pensamentos diários.

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Este estudo de doutorado foi desenvolvido no programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo/ FAPESP (2010/51523-5), Projeto Universal CNPQ (470086/2011-4) e pelo Programa Institucional de Bolsas de Doutorado Sanduíche no Exterior(PSDE)-CAPES-PROCESSO:BEX3699/14-5.

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INTRODUÇÃO GERAL

1 Crédito da foto: Yuri Messas

INTRODUÇÃO GERAL

A comunicação animal envolve a troca de estímulos sensoriais entre emissores e receptores (Bradbury & Vehrencamp 1998). Dentre esses estímulos sensoriais, o sinal visual em um contexto evolutivo está associado ao sistema visual dos insetos a milhões de anos (Chittka 1996 a,b, Lunau 2000). Um sinal que classicamente exemplifica a troca de informação em organismos visualmente orientados como os insetos é a coloração das flores

(Chittka 1996 a,b). O reconhecimento da coloração das flores pelos insetos envolve a emissão de luz na faixa do espectro visível aos humanos e no espectro ultravioleta A (UV-

A) pelas flores (Chittka et al. 1994, Johnstone 1997, Bradbury & Vehrencamp 1998). Os insetos, em particular os pertencentes à ordem Hymenoptera, tem uma alta capacidade de reconhecimento de sinais visuais como a coloração das plantas que visitam (Heiling &

Herberstein 2004, Wignall et al. 2006). As cores das flores são sinais claramente importantes para os himenópteros, pois fornecem informações sobre a quantidade e disponibilidade de recursos como néctar ou pólen (Chittka & Walker 2006).

Muitos insetos têm três tipos de células fotorreceptoras para detecção de cor de um determinado objeto, um fotorreceptor com sensibilidade máxima próximo de 340 nm

(fotorreceptores de ultravioleta), outro próximo de 440nm (forrreceptores para cor azul) e

530 nm (fotorreceptores para cor verde) (Briscoe & Chittka 2001). No entanto, os sinais visuais emitidos por um determinado organismo só podem ser detectados por insetos se eles são distinguíveis do ruído do pano de fundo (Endler 1992, Chittka et al. 1994, Chittka &

Raine 2006). Assim, a visão para cores é baseada na reflexão espectral do emissor avaliada

2 pela interação dos tipos de fotorreceptores espectrais e sistema nervoso do receptor (Chittka

1992).

A coloração das flores é uma característica ecológica relacionada às vias sensoriais dos visitantes florais. As flores refletem luz UV visível aos insetos e esses sinais podem ser manipulados por aranhas da família Thomisidae (Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2003).

A manipulação do sinal visual por tomisídeos em seus respectivos substratos pode resultar tanto em detecção e atração por presas pelo acentuado contraste de cor com o pano de fundo (Heiling et al. 2003), como em camuflagem dessas aranhas nos substratos, reduzindo o reconhecimento sob a perspectiva das presas (Stevens & Merilaita 2009, Théry & Casas

2009, Stevens & Merilaita 2011). Experimentos demonstram que aranhas Thomisidae podem detectar a reflexão de UV emitida pelas flores para a escolha de sítios de forrageamento, potencialmente maximizando seu sucesso reprodutivo (Heiling et al. 2003,

Bhaskara et al. 2009).

A reflexão de luz ultravioleta

A radiação ultravioleta (UV) é a radiação eletromagnética com comprimento de onda entre 10 e 400 nm, menor que o da luz visível aos humanos, 400 a 700 nm (Schatz &

Ratner 1993). Essa radiação pode ser subdividida em UV-A (400-300 nm), UV-B (300-250 nm) e UV-C (abaixo de 250 nm) (Schatz & Ratner 1993). A sensibilidade à radiação UV tem sido demonstrada em muitos grupos de artrópodes, como insetos (Briscoe & Chittka

2001, Heiling et al. 2005a,b) e aranhas (Lim et al. 2007) na região espectral do UV-A

(Heiling et al. 2005a,b). A emissão de luz nessa faixa espectral e no espectro visível

3 estimula o comportamento de aproximação ou fuga dos receptores (Heiling et al. 2003,

2005a, Bhaskara et al. 2009).

Aranhas Thomisidae podem tanto refletir luz na região do espectro do UV como absorver esse espectro invisível e transformá-lo em luz de comprimento de onda mais longo denominada fluorescência (Andrews et al. 2008). A reflexão de UV e emissão de fluorescência desempenham um papel fundamental nas interações entre aranhas, substratos e presas (Théry & Casas 2002, Andrews et al. 2008). Algumas espécies de aranhas possuem plasticidade fenotípica e se camuflam mudando a coloração corporal de acordo com a coloração do substrato (e.g., flores) (Chittka 2001, Théry & Casas 2002, Ruxton et al. 2004, Romero & Vasconcellos-Neto 2007). A cor do substrato influencia a escolha da aranha (Chittka et al. 1994). As aranhas podem escolher seus substratos de forrageio de forma a minimizar o efeito visual do sinal emitido com o pano de fundo correspondente, para a visão de seus predadores e presas (cripsia) (Stevens & Merilaita 2009, Théry &

Casas 2002). Entretanto, outra estratégia utilizada por essas aranhas é potencializar o efeito visual do sinal emitido escolhendo sítios de forrageio com contraste de cor favorecendo a atração de presas. Estudos reportam que a aranha australiana Thomisus spectabilis

(Thomisidae) que forrageia sobre flores pode manipular sinais de UV e atrair mais visitantes florais (i.e., abelhas) quando comparadas às flores sem aranhas, devido ao contraste pronunciado de coloração aranha-pétala com o pano de fundo (Heiling et al.

2003, 2005b).

A reflexão e evolução da fluorescência

O fenômeno da fluorescência consiste na absorção de energia por um elétron passando do estado fundamental (S0) para o estado excitado (S1); este elétron, ao retornar ao estado fundamental é acompanhado pela liberação de energia em excesso através da emissão de radiação de fluorescência (Schatz & Ratner 1993). Os átomos de fotorreceptores podem ser excitados por UV absorvendo esta radiação e irradiando em um comprimento de onda mais longo (i.e., fluorescência) (Schatz & Ratner 1993). Em aranhas a fluorescência acontece quando fluoróforos absorvem luz UV e então emitem luz a um comprimento de onda mais longo, resultando na emissão de fluorescência (Oxford &

Gillespie 1998, Andrews et al. 2008). Em aranhas há uma diversidade destes pigmentos e a expressão de fluorescência luminosa parece ser controlada por meio do sequestro de luz pelos fluoróforos em diferentes regiões do corpo (i.e., setas), intensificando a quantidade de luz capturada (Andrews et al. 2008, Romero & Vieira, observações pessoais). Quanto mais espessa e opaca a cutícula das aranhas, maior a inibição de fluorescência, pois há uma absorção da radiação UV antes dos fótons entrarem em contato com os fluoróforos presentes na hemolinfa (Oxford & Gillespie 1998, Andrews et al. 2008). As aranhas habitam muitos ambientes, variando consideravelmente suas histórias de vida com múltiplas estratégias de forrageio, de forma que a seleção natural pode estar atuando sobre a expressão da fluorescência (Oxford & Gillespie 1998, Andrews et al. 2008).

A fluorescência e a reflexão do sinal de UV podem promover a camuflagem em aranhas que usam flores como substrato (Merilaita 2003). Nesse caso, a camuflagem pode agir para facilitar que as aranhas capturem insetos que visitam as flores (Merilaita 2003).

Todavia, a camuflagem pode também ser um processo relevante para as aranhas que não

5 necessariamente usam flores como substrato. Por exemplo, Epicadus heterogaster, uma espécie de tomisídeo que possui o abdômen semelhante a flores, é capaz de atrair e predar abelhas mesmo quando o substrato usado pela aranha são folhas verdes e sem a existência de flores na vizinhança (Vieira & Romero, dados não publicados). Possivelmente, E. heterogaster deve exibir sinais similares às flores, como a alta intensidade de reflexão de

UV (Romero & Vasconcellos-Neto 2007, os autores, observações pessoais).

Métodos filogenéticos como ferramenta de estudo em evolução

Métodos filogenéticos podem ser utilizados como ferramentas para o estudo da evolução dos sinais sensoriais. Por exemplo, os métodos podem ser utilizados nas investigações acerca da posição filogenética dos órgãos sensoriais entre clados, assim como em estudos de evolução de uma característica sensorial herdada em cada linhagem, como visão e olfato (Chittka 1996b, Spaethe & Briscoe 2004, Plachetzki & Oakley 2007). Porém, nosso conhecimento sobre evolução da coloração em espécies juntamente ao seu modo de vida, ainda permanece fragmentado e limitado (Dangles et al. 2009). Em Thomisidae, os estudos filogenéticos de evolução do comportamento e da coloração, mais especificamente evolução da intensidade de fluorescência e UV são praticamente inexistentes. Estudos filogenéticos da família Thomisidae são escassos e as filogenias disponíveis na literatura incluem pouca diversidade de gêneros. O estudo filogenético molecular mais recente publicado por Benjamim et al. (2008) inclui apenas dois gêneros de Thomisidae que ocorrem no Brasil, dois dentro do clado Thomisus (i.e., Tmarus e Aphantochilus) e outro dentro do clado de Stephanopis (i.e., Stephanopis). Este estudo corrobora a monofilia de

Thomisidae por três sinapomorfias moleculares do fragmento do gene 16S. Todas as análises filogenéticas realizadas por Benjamim et al. (2008) dão origem a quatro linhagens

6 bem definidas dentro de Thomisidae. Os clados são informalmente nomeados como clado

Borboropactus, clado Epidius, clado Stephanopis e Thomisus sendo que os tomisídeos que divergiram mais recentemente pertencem ao clado Thomisus (Benjamim et al. 2008).

Portanto, nosso trabalho originou uma nova filogenia com base em espécies que ocorrem no Brasil, tanto basais quanto as que divergiram mais recentemente incluindo gêneros mais especializados como Epicadus. (Capítulo 3). Aparentemente, os grupos mais basais na filogenia proposta por Benjamim et al. (2008, 2011) não usam flores para forragear, têm exoesqueleto espesso e parecem impedir entrada de luz nos tecidos. Em contraste, os grupos que divergiram mais recentemente forrageiam em flores, têm exoesqueleto fino, parecem permitir entrada de luz UV nos tecidos e consequentemente podem emitir maior intensidade de fluorescência.

Sistema de estudo

A família Thomisidae é a sétima maior família de aranhas, incluindo 2158 espécies descritas em 175 gêneros (World Spider Catalog 2015). Aranhas Thomisidae são comumente predadores de emboscada em flores ou folhas e possuem o primeiro e segundo par de pernas laterígrados adaptados à captura de presas (Morse & Fritz 1982, Morse 1984).

Os tomisídeos são ativos principalmente durante o dia, predando borboletas, abelhas e outros visitantes florais (Morse 1984). Essas aranhas podem influenciar a visita de insetos em plantas por meio de emissão de sinais visuais alterando o comportamento e resposta da presa (Dukas & Morse 2003, Heiling et al. 2005a, Gonçalves-Souza et al. 2008). Devido à sua forma de forrageio (i.e., senta e espera), muitos tomisídeos se camuflam em flores que atuam como panos de fundo de disfarce a presas e predadores (Chittka 2001). Alguns deles

(e.g., Misumena, Diaea, Runcinia, Thomisus e Epicadus) possuem plasticidade fenotípica e

7 mudam sua coloração de acordo com a coloração do pano de fundo em que se instalam aumentando a captura de presas (Oxford & Gillespie 1998, Théry et al. 2005, Romero &

Vasconcellos-Neto 2007).

O Brasil apresenta atualmente 32 gêneros de Thomisidae registrados (World Spider

Catalog 2015), com algumas espécies abundantes e outras mais raras. Os gêneros são:

Epicadinus, Deltoclita, Ceraarachne, Aphantochilus, Acracanthostoma, Acentroscelus,

Epicadus, Titidius, Titidiops, Synstrophius, Synema, Tmarus, Uraarachne, Ulocymus,

Tobias, Synaemops, Sidymella, Strophius, Stephanopoidess, Stephanopis, Runcinioides

Platyarachne, Philogaeus, Phireza, Onocolus, Misumenops, Misumenoides, Misumena,

Metadiaea, Martus, Erissus e Erissoides (World Spider Catalog 2015) Embora recentemente a fluorescência tenha sido descrita em diversos organismos (Mazel et al.

2004, Gandia-Herrero et al. 2005, Haddock et al. 2005), pouco se sabe sobre a intensidade de fluorescência, sobre processos que promovem cripticidade e reconhecimento de presas em aranhas Thomisidae. Adicionalmente, apesar de estudos reportarem comportamentos e interações entre poucas espécies de visitantes florais-Thomisidae-flores (Suttle 2003, Dukas

2005, Dukas & Morse 2005, Heiling et al. 2005 a,b, Gonçalves-Souza et al. 2008), pouco se sabe sobre a função ecológica desses pigmentos em organismos que exibem diferentes estratégias de forrageio, nem tampouco como as características relacionadas à cor evoluíram em Thomisidae. Várias espécies de aranhas Thomisidae forrageiam por emboscada (i.e., senta-e-espera) sobre flores e se não possuírem características comportamentais e/ou físicas que favoreçam o disfarce para as presas, podem ter o sucesso de captura de presas reduzido. Em contraste, outras espécies escuras de Thomisidae (e.g.,

Tmarus sp.) comumente não usam flores para forragear. Até o momento nada se sabe sobre

8 comportamentos, colorações, intensidade de fluorescência e reflexão de UV entre as espécies que forrageiam em flores e em outros tipos de substrato (folhas e ramos secos), nem tampouco como estas características evoluíram em Thomisidae.

Uma vez que a intensidade de fluorescência e reflexão de ultravioleta pode variar entre os táxons e essas características podem estar relacionadas à cripsia, pode ser que diferentes colorações de aranhas tomisídeos estejam envolvidas em diferentes estratégias de forrageio (Chittka 2001, Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2003, 2004, Andrews et al.

2008). Nossa hipótese é que tomisídeos mais basais filogeneticamente (e.g., Tmarus) apresentem menor intensidade de fluorescência e reflexão de UV e exibam diferentes estratégias de forrageio (forrageando em substratos escuros, como ramos secos) do que as espécies ou gêneros que divergiram mais recentemente. As aranhas mais basais filogeneticamente de acordo com a filogenia proposta por Benjamim et al. (2008) são mais escuras que as aranhas que divergiram mais recentemente. Desse modo, espécies que divergiram mais recentemente podem apresentar maior intensidade de fluorescência e reflexão de UV, o que permite sua ocorrência sobre flores podendo estar crípticas ou não em posição de emboscada, dado que flores são sítios frequentemente visitados por presas

(insetos), se comparados a ramos secos. Além disso, espera-se que espécies que vivem em folhas e possuem habilidade natural de atrair insetos visitantes mesmo na ausência de flores

(e.g., Epicadus heterogaster) apresentem elevada intensidade de fluorescência e reflexão de

UV uma vez que exibem comportamento de forrageio mais especializado assemelhando-se a própria flor.

Objetivos gerais e específicos

Nesse contexto, nosso estudo teve como objetivo investigar por meio de experimentos em campo e laboratório, adicionalmente às análises filogenéticas utilizando sequências de genes de DNA mitocondrial e nuclear, o papel ecológico da coloração em aranhas Thomisidae Neotropicais (Capítulo 1 e Capítulo 2), bem como compreender como evoluíram as intensidades de fluorescência, reflexão de UV e comportamento de forrageio em Thomisidae (Capítulo 3). As amostragens dos organismos e observações naturalísticas do nosso estudo foram realizadas em 22 áreas naturais que apresentam ocorrência de

Thomisidae (Figura 1). Foram realizadas observações comportamentais, amostragens, bem como manipulações experimentais que testam estratégias de forrageio e efeito de diferentes colorações de aranhas sobre comportamentos de insetos visitantes florais (Capítulo 1).

Além disso, experimentos de reflexão de UV foram realizados para testar o papel de coloração no reconhecimento de insetos visitantes florais (principalmente himenópteros), com o uso de bloqueador de UV (Capítulo 2).

Esta tese é composta por 3 capítulos, nos quais serão abordadas especificamente as seguintes questões em cada um deles.

Capítulo I. No primeiro capítulo, investigamos o papel da reflexão de UV na seleção de sítio de forrageio por aranhas Thomisidae. Adicionalmente, utilizamos modelos de espaço de cor para compreender como esse sinal visual de reflexão de UV das aranhas combinado a reflexão de UV do substrato de escolha pode ser interpretado no sistema visual de Hymenoptera.

Capítulo II. No segundo capítulo, investigamos se a intensidade emissão de fluorescência e reflexão de UV são maiores em espécies que forrageiam sobre flores quando comparadas às espécies que não forrageiam sobre flores. Além disso, investigamos se espécies de aranhas que forrageiam sobre flores estão crípticas no sistema visual de himenópteros e como a coloração afeta a reposta de visitantes florais.

Capítulo III. No terceiro capítulo, nós amostramos a variação na intensidade de coloração dentro da família Thomisidae estudando 14 gêneros e 140 espécies da família

Thomisidae desde gêneros basais até os gêneros que divergiram mais recentemente (Ver algumas espécies amostradas, Figura 2). Neste capítulo, por meio de estimativas filogenéticas e uso dos métodos comparativos filogenéticos buscamos compreender, de uma forma inédita, como evoluiu a coloração (i.e., intensidade de fluorescência e reflexão de UV) em espécies Neotropicais de Thomisidae.

14 12 11 16 15 13 10 6 9 17 8 1 7 5 4 2 3

Figura 1. Distribuição dos 22 locais de amostragens de diferentes espécies de aranhas da família Thomisidae (coordenadas geográficas apresentadas na metodologia do Capítulo 3).

A B

C D

E F

G H

Figura 2. Algumas espécies de Thomisidae amostradas (A) Sidymella multispinulosa, (B) Epicadinus sp., (C) Misumenops sp., (D) Misumenops callinurus, (E) Misumenoides sp.1, (F) Epicadus rubripes, (G) Epicadus heterogaster, (H) Misumenoides sp.2. A barra de legenda apresentada nas figuras corresponde a 1000 µm

(Crédito das fotos: F. Marcondes, C. Vieira e A. Degressi).13

Literatura Citada

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CAPÍTULO I

Aranhas Thomisidae usam a cor do substrato para escolher seus sítios de forrageamento

Camila Vieira, Vinícius L.G. Brito & Gustavo Q. Romero

19 Crédito da foto: Andressa Degressi CAPÍTULO 1

Aranhas Thomisidae usam a cor do substrato para escolher seus sítios de

forrageamento

Camila Vieira1 Vinícius Lourenço Garcia de Brito2 & Gustavo Q. Romero3

1Pós-graduação em Ecologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6109,

CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil

2Pós-graduação em Biologia Vegetal, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP),

CP 6109, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil

3Departamento de Biologia Animal, IB, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP),

CP 6109, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil

Resumo

As aranhas Thomisidae são comumente conhecidas por sua coloração vistosa e podem escolher sítios de forrageio cuja coloração do pano de fundo seja apropriada para tornarem-se crípticas. O grau de conspicuidade das aranhas sob a perspectiva das suas presas depende da combinação da variação espectral na região do UV das aranhas com seu pano de fundo. Nosso estudo teve como objetivo investigar com dados experimentais e três anos de dados observacionais em campo o papel da cor na preferência de substrato por tomisídeos Neotropicais. Nós investigamos especificamente se tomisídeos com maior intensidade de reflexão de UV preferem forragear em flores que exibem também maior intensidade de reflexão de UV, e se tomisídeos com menores intensidades de reflexão de

UV preferem forragear em outros substratos que teriam também baixa intensidade de reflexão de UV. Além disso, investigamos como o sinal visual resultante da interação da reflexão de UV das aranhas, combinado à reflexão de UV do substrato de escolha, é interpretado no sistema visual de abelhas. Nossos resultados demostram experimentalmente que Epicadus heterogaster prefere forragear sobre folhas enquanto Misumenops argenteus e Misumenops callinurus preferem flores. Já Tmarus sp. prefere forragear em troncos ou ramos secos. Esse padrão de seleção de substrato correspondeu ao padrão de ocorrência dessas aranhas em folhas, flores e ramos secos observadas em campo. Todas as aranhas excitam mais fortemente o fotorreceptor do ultravioleta (UV) do que os outros fotorreceptores do sistema visual de Hymenoptera sugerindo a importância desse sinal visual na troca de informação nesse sistema entre predadores e presas. Evidenciamos que apenas a espécie escura Tmarus sp. estaria críptica em ramos secos quando visualizadas por abelhas, enquanto as outras espécies estudadas exibiriam contraste de cor com o pano de

21 fundo. Nosso estudo fornece evidências que espécies de Thomisidae exibem diferentes estratégias de manipulação do sinal visual em diferentes substratos de forrageio que ocupam. A interação da coloração da aranha com a coloração de seu substrato tem um papel importante e fundamental na escolha de sítios de forrageio.

Palavras-chave: camuflagem, coloração, contraste de cor, conspicuidade, reflexão de UV.

Introdução

Aranhas que vivem sobre plantas avaliam e selecionam substratos de forrageio por mecanismos sensoriais, i.e., visual, olfativo e tátil (Morse & Fritz 1982, Morse 1988, Morse

1993, Greco & Kevan 1994, Krell & Kraemer 1998, Morse 2007, Omena & Romero 2010,

Defrize et al. 2014). A escolha de substratos ótimos como sítios de forrageio pode estar estritamente relacionada à estrutura da planta e maior disponibilidade de presas (Romero &

Vasconcellos-Neto 2005, Morse 2007). Além disso, as aranhas que exibem comportamento de predação por emboscada podem utilizar a coloração do substrato como pista indireta para escolha de sítios ótimos de forrageio quando a informação sobre a disponibilidade de presas não está presente (Morse 2007, Defrize et al. 2014). Assim, a coloração do substrato tanto como um sinal visual quanto como uma pista indireta de atração de presas tem um importante papel na seleção de substratos por aranhas tomisídeos (Heiling et al. 2005a,

Bhaskara et al. 2009, Defrize et al. 2014, Gawryszewski et al. 2012, Gawryszewski 2014).

A cor não é uma propriedade intrínseca de um dado objeto, e sim, é a avaliação da reflexão espectral do emissor pela interação dos tipos de fotorreceptores espectrais e sistema nervoso do receptor (Chittka 1992). A percepção da cor pelo receptor envolve troca

22 de sinais visuais e estes podem ser apenas percebidos se forem discriminados de um pano do fundo no qual estão inseridos (Endler 1992, Chittka 1992, Chittka et al. 1994, Chittka

2001). A maioria dos insetos apresenta três tipos de fotorreceptores e cada tipo é responsável por uma variação de espectro: variação na região do espectro ultravioleta (UV), variação na região do espectro do azul (B) e variação na região do espectro do verde (G)

(Chittka 1992, Chittka et al. 1994, Chittka 2001). A variação de espectros no UV no fotorreceptor do visitante floral permite que este seja capaz de reconhecer o sinal visual refletido na região do UV pelas aranhas da família Thomisidae. Assim, o grau de conspicuidade das aranhas (emissores do sinal visual) sob a perspectiva das suas presas receptoras do sinal visual (e.g., abelhas) depende da variação espectral na região do UV.

Espécies da família Thomisidae tipicamente possuem colorações vistosas e escolhem um sítio de forrageio com coloração de fundo apropriado para tornarem-se crípticas para as presas que se aproximam (Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2005b,

Romero & Vasconcellos-Neto 2007, Defrize et al. 2010, Insausti et al. 2012). Embora a cripsia seja bastante reportada como uma adaptação importante para sucesso de forrageio em tomisídeos, essa adaptação não representa a única estratégia utilizada por estes predadores para evitar reconhecimento de presas. Por exemplo, espécies de tomisídeos australianos Thomisus spectabilis de coloração branca são conspícuas para sistema visual de presas e predadores (Heiling et al. 2005a). No entanto, Thomisus spectabilis ao invés de repelir suas presas (Apis mellifera) como o esperado, surpreendentemente utiliza este contraste de cor com as pétalas das flores de Chrysanthemum frutescens para deixar a flor mais atraente (Heiling et al. 2003, Heiling et al. 2005a). Essas aranhas australianas aparentemente exploram as preferências pré-existentes das abelhas de serem atraídas para

23 determinados padrões de colorações das flores (Heiling et al. 2003, Heiling et al. 2005a).

Portanto, as aranhas podem escolher um pano de fundo com contraste de coloração e maximizar o efeito do sinal visual intensificando a atração de presas (Heiling et al. 2003).

Em contraste, alguns tomisídeos de coloração mais opaca ou escura frequentemente forrageiam em substratos mais escuros, e.g., cascas de árvores e ramos secos, e não usam flores para forragear (Gawryszewski 2014). Até o momento pouco se sabe experimentalmente sobre escolhas de substrato por espécies de tomisídeos Neotropicais com distintos padrões de coloração corpórea. Além disso, pouco se conhece como esse contraste de coloração em aranhas é reconhecido por abelhas.

Nosso estudo tem como objetivo investigar com dados experimentais e dados observacionais em campo o papel da cor na preferência de substrato de forrageio por tomisídeos Neotropicais. Nós investigamos especificamente (i) se tomisídeos com maior intensidade de reflexão de UV preferem forragear em flores que possivelmente exibem maior intensidade de reflexão de UV, intensificando o sucesso de captura de presas (Greco

& Kevan 1994), e se tomisídeos com menores intensidades de reflexão de UV selecionam substratos que possivelmente exibem menor intensidade de reflexão de UV favorecendo a camuflagem para presa e possíveis predadores, (ii) como esse sinal visual e reflexão de UV

é interpretado no sistema visual de abelhas, e (iii) quais componentes da cor podem estar influenciando o reconhecimento dessas aranhas no sistema visual das abelhas.

Material e Métodos

Área de estudo e organismos

Nós conduzimos esse estudo na Reserva Biológica da Serra do Japi, situada ao município de Jundiaí, sudeste do Brasil (700 e 1300 m), durante os meses de fevereiro a abril de 2011 a 2013. Nós utilizamos no estudo mudas da planta arbustiva Rubus rosifolius

(Rosaceae) nos períodos específicos de floração da planta. Alguns estudos reportam espécies de Thomisidae (e.g., Misumenops argenteus) associadas a flores dessas plantas

(Mello-Leitão 1929, Gonçalves-Souza et al. 2008). Além disso, esta planta é uma espécie amplamente distribuída em uma variedade de habitats tropicais, sendo comum na área de estudo.

Nós utilizamos no estudo quatro espécies de aranhas Thomisidae: Epicadus heterogaster que são aranhas claras que podem mudar de coloração corporal de acordo com a cor das flores (branca, amarela ou lilás) (Peixoto et al. 2012); possuem o abdômen semelhante a flores e forrageiam em folhas quando atingem a fase adulta e flores quando jovens (Vieira & Romero, dados não publicados). Misumenops argenteus Mello-Leitão

(1929) que são aranhas claras que comumente forrageiam em flores de Rubus rosifolius e flores de Trichogoniopsis adenantha (Romero & Vasconcelos-Neto 2004, Gonçalves-

Souza et al. 2008). Essas aranhas são comumente encontradas forrageando nas pétalas das flores (Figura 1B) ou na parte inferior das flores em brácteas (Antiqueira PAP & Romero

GQ dados não publicados). Misumenops callinurus Mello-Leitão (1929) que são aranhas claras que habitam uma grande variedade de flores e também podem mudar de coloração corporal de acordo com a cor das flores (branca ou amarela) (Figura 1C). As espécies

Misumenops argenteus e Misumenops callinurus aparentam ser pouco crípticas em flores de Rubus rosifolius (Antiqueira PAP, Vieira, C. & Romero GQ dados não publicados). Já

Tmarus sp. Simon (1875) que são aranhas escuras que não forrageiam em flores (Figura

1D).

Amostragem

No período de setembro a abril de 2010 a 2013 coletamos indivíduos das quatro espécies de aranhas em aproximadamente 5000 plantas ao longo de uma trilha de aproximadamente 9 km na Reserva Biológica da Serra do Japi. O método de amostragem utilizado foi inspeção visual principalmente para as espécies que vivem em flores (M. argenteus, M. callinurus) e folhas (E. heterogaster). Já para as espécies que vivem em ramos secos (Tmarus sp.), utilizamos guarda-chuva entomológico que consiste na utilização de uma armação de estacas de madeira que sustenta um tecido branco de 1 m2, sobre o qual as aranhas caem quando a vegetação é batida com um bastão de madeira. Ao longo das trilhas foram escolhidas plantas arbustivas de até 2,5 m de altura e em cada uma delas foram realizadas dez batidas durante a amostragem na vegetação.

Para a realização dos experimentos (ver abaixo) foram utilizadas apenas fêmeas adultas de Thomisidae de tamanho semelhantes. Nós não utilizamos os machos, uma vez que eles não apresentam o mesmo padrão de cores das fêmeas. Além disso, os machos são mais ativos que as fêmeas e não permanecem grande parte do tempo dispendido sobre o mesmo substrato de forrageio. Nós mantivemos as aranhas em frascos de plástico e cuidadosamente as transportamos para o laboratório na Reserva Biológica da Serra do Japi onde realizamos o experimento. As aranhas foram mantidas individualmente com uma dieta

26 semanal de insetos vivos (abelhas, grilos e moscas, que são presas naturais de tomisídeos).

Água era fornecida diariamente em um pedaço de algodão úmido. As aranhas foram mantidas em laboratórios em condições de luminosidade natural e a temperatura variando entre 24°C e 34°C.

Para verificar a frequência de ocorrência das espécies E. heterogaster, M. argenteus,

M. callinurus e Tmarus sp. nos substratos folhas, flor e ramos foram inspecionadas ao longo de trilhas na área de estudo 3167 folhas, 1859 flores e 2434 ramos secos. Essas inspeções foram realizadas entre setembro de 2010 e abril de 2013. Os dados de ocorrência das aranhas em cada tipo de substrato inspecionado foram comparados usando o Qui- quadrado com o uso do software R (R Development Core Team 2014).

Experimento: teste de escolha de local de forrageio

Para testar se a coloração do substrato influencia na escolha de local de forrageio, nós conduzimos experimentos de testes de escolhas com as aranhas sobre mudas da planta

Rubus rosifolius. As aranhas foram colocadas individualmente de modo aleatorizado em mudas distintas de Rubus rosifolius. As mudas escolhidas para o experimento apresentavam os seguintes substratos na mesma planta: ramos secos, folhas verdes e flores. Nós colocamos os indivíduos de cada espécie de aranhas (n=15) separadamente sobre um palito escuro em um ponto aproximadamente equidistante dos substratos na mesma muda e deixamos as aranhas caminharem livremente pela planta até encontrar seu substrato de preferência. Foram utilizadas plantas diferentes a cada teste (n=15) e registramos a escolha com o uso de uma filmadora. Nós delimitamos o tempo máximo de 14 horas diárias de tempo de permanência das aranhas em cada planta. O experimento iniciava-se às 8:30 a.m.

27 e terminava às 22:30 p.m. Após o término do experimento as filmagens foram analisadas e foram computadas as percentagens médias de tempo de permanência em cada substrato. As aranhas e as plantas foram usadas uma única vez.

As porcentagens médias de tempo despendido pelas aranhas em cada substrato foram examinadas usando uma análise de variância ANOVA unifatorial (Quinn & Keough

2002). Todas as análises foram realizadas utilizando o software R (R Development Core

Team 2014).

Espectro de reflectância das aranhas e substratos

Para investigar se a intensidade de reflexão de UV das aranhas é similar à intensidade de reflexão de UV de seu substrato de escolha foi preciso identificar o padrão do sinal visual de cada objeto. Nós mensuramos a reflectância espectral entre 300 a 700 nm dos abdomens das aranhas (n=10) e das pétalas de flores de Rubus rosifolius (n=10) e comparamos a intensidade máxima relativa de reflexão. Nós utilizamos o espectrofotômetro Cary 5000 UV- Vis- NIR (Varian, Australia) com um alto desempenho fotométrico nos espectros de variação entre 175-3300 nm. O abdômen foi escolhido por ser a região do corpo das aranhas que apresentam maior quantidade de fluoróforos (moléculas com pigmentos que refletem UV) (Andrews et al. 2008). Nós utilizamos dois controles acromáticos: preto e branco como fundo de calibração antes da mensuração de cada amostra. Mensuramos dez vezes o espectro de cada aranha e cada flor e utilizamos o número médio dos espectros para computar a distância euclidiana no modelo de espaço da cor no sistema visual de Hymenoptera (Chittka 1992, Chittka 1996). Todas as análises

28 foram realizadas no Laboratório de UV-Vis-NR / Luminescência / Polarimetria no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas.

Os valores de máxima intensidade relativa de reflexão na faixa de UV das aranhas foram comparados usando uma análise de variância ANOVA unifatorial (Quinn & Keough

2002) utilizando o software R (R Development Core Team 2014). Para comparações entre tratamentos foi realizado teste a posteriori de Tukey (Pinheiro & Bates 2000).

Análises de coloração com modelo de hexágono em cores: aranha e pano de fundo

Para testar se as aranhas estão crípticas no seu substrato de escolha, nós utilizamos o modelo do hexágono de cores como um modelo de visualização do espaço da cor no sistema visual de Hymenoptera (Chittka 1992, Chittka 1996b). As extremidades do hexágono representam os fotorreceptores e as possíveis combinações entre eles de acordo com a refletância espectral do objeto que está sendo visualizado. Os valores de receptores de excitação (E) foram calculados para os fotorreceptores das abelhas com suas sensibilidades nos picos do UV, azul e verde (Briscoe & Chittka 2001, Chittka 1996b).

Esses valores são relativos, variando entre 0 e 1. Nós utilizamos um padrão de fundo das folhas verdes e um padrão de iluminação a luz do dia (D65, Wyszecki & Stiles 1982).

Utilizamos também a função de sensibilidade espectral de fotorreceptores de Apis mellifera como referência no modelo para compreender a visualização da aranha no substrato na perspectiva do sistema visual de Hymenoptera (Chittka 1992, Chittka & Kevan 2005).

Após a realização do experimento, calculamos a distância euclidiana média em unidades de hexágono entre os espectros das aranhas e cada um de seus substratos de escolha.

Como referência, as abelhas podem distinguir cerca de 70% entre as cores do objeto e pano de fundo com distância de 0,1 unidades de hexágono de detecção (Chittka 1996b,

Chittka 2001). Portanto, nós comparamos as distâncias calculadas com o limite discriminante pelo teste-t para aranhas e seus substratos de escolha (contraste de cor).

Calculamos a distância euclidiana média em unidades de hexágono entre as espécies de aranhas e seus respectivos substratos de preferência encontrados na natureza: E. heterogaster vs. folha, M. argenteus vs. flor, M. callinurus vs. flor e Tmarus sp. vs. ramo seco. Quando o valor médio da distância euclidiana, em unidades de hexágonos entre essas combinações, está abaixo ou igual ao limiar de distância de detecção (0,1 unidades de hexágono) as abelhas não discriminariam a aranha do pano de fundo; quando o valor está acima do limiar, as abelhas seriam capazes de discriminar essas aranhas.

Quantificação da cor e teste de contraste cromático e acromático para Hymenoptera

As abelhas usam o contraste cromático para detectar objetos quando estão próximas do emissor; quando estão a longas distâncias utilizam o contraste acromático (Hart et al.

2000, Spaethe et al. 2001). Os tipos de receptores para UV e azul estão envolvidos na detecção de contraste cromático, ao passo que os receptores verdes estão envolvidos na detecção de contraste acromático. Além do contraste de cor, as abelhas são conhecidas por utilizar o sinal do contraste de verde e de pureza espectral para objetos em curtas distâncias.

O contraste de verde é um componente cromático da cor. Já a pureza espectral ou saturação pode ser definida como a quantidade de cinza que uma cor contém. Quanto maior a quantidade de cinza, menor a pureza de uma cor (Lunau et al. 1996). Dessa forma, calculamos o contraste de verde e a pureza espectral relativa das aranhas e seus substratos de escolha usando o mesmo modelo de cores do hexágono (Chittka et al. 1994, Lunau et al.

2011). O contraste de verde é medido com a distância entre o locus alvo da cor ao ponto central incolor do hexágono, com locus de fundo verde padrão (Chittka 1992). Por outro lado, a pureza espectral relativa é calculada como a proporção entre a distância do locus de cor a partir do centro do hexágono e a distância do locus espectral do modelo correspondente (Lunau et al. 2011). Nós utilizamos para as análises o modelo de pureza espectral máxima nos fotorreceptores de excitação de Apis mellifera (Lunau et al. 1996). Já para o contraste acromático (brilho), nós calculamos a diferença de excitação dos fotorreceptores verde das aranhas e do substrato.

Nós realizamos um teste-t de variâncias desiguais (test-t de Welch) entre as combinações das aranhas e seus respectivos substratos para explorar as diferenças estatísticas nos componentes da cor no sistema visual de abelhas. Todas as análises foram realizadas utilizando o software R (R Development Core Team 2014).

Resultados

Amostragem

Os dados observacionais em campo demostram a frequência de ocorrência de indivíduos de aranhas Thomisidae nos substratos inspecionados (Tabela 1). A frequência observada das aranhas nos substratos folha, flor e ramo seco difere da frequência esperada pela expectativa nula (folha: χ 2=100,16, g.l.=3, P < 0,001; flor: χ 2=252,41, g.l.=3, P <

0,001 e ramos secos: χ 2=594, g.l.=3, P < 0,001). E. heterogaster são mais frequentemente encontrados em folhas, M. argenteus e M. callinurus em flores e Tmarus sp. em ramos secos (Tabela 1).

Escolha do local de forrageio

As fêmeas adultas de E. heterogaster preferiram forragear sobre folhas (F2,42

=184,43; P < 0,001, Figura 1A e Figura 2), enquanto fêmeas de M. argenteus e M. callinurus preferiram flores como sítio de forrageio (M. argenteus F2,42= 79,15; P < 0,001 ,

M. callinurus F2,42 =367,61; P < 0,001, Figura 1B e C e Figura 2). Já as fêmeas de Tmarus preferiram forragear em troncos ou ramos secos (F2,42 = 488,00; P < 0,001, Figura 1D e

Figura 2). E. heterogaster permaneceu por volta de 0,1% do tempo médio em ramos secos e

Tmarus permaneceu menos de 1% do tempo médio sobre flor e folha (Figura 2). Já M. argenteus e M. callinurus permaneceram aproximadamente 9 vezes mais tempo em flores que folhas (Figura 2).

Espectro de reflectância das aranhas e substratos

E. heterogaster, apresentou maior intensidade de reflectância na região do UV quando comparada às demais espécies de Thomisidae (F3,36= 538,63, P<0,001; espectro na região do UV: E. heterogaster >M. callinurus> M. argenteus> Tmarus; ANOVA/ Tukey

HSD teste post hoc; α=0.05, Figura 3). Em contraste, os indivíduos de Tmarus sp. exibem menor intensidade média de reflectância quando comparado às de outras aranhas; além disso, seu espectro foi semelhante ao do seu substrato preferido (Figura 3).

Coloração com modelo de hexágono em cores: aranha e pano de fundo

A sensibilidade dos fotorreceptores demostra que as aranhas excitam mais fortemente o fotorreceptor de UV do que os outros fotorreceptores no sistema visual das abelhas (E. heterogaster: EUV = 0,76±0,004; M. callinurus: EUV = 0,75±0,001; M. argenteus: EUV = 0,72±0,003 e Tmarus: EUV = 0,67±0,003; Tabela 2). As abelhas

32 conseguiriam discriminar a aranha E. heterogaster sobre folhas (distância entre os loci =

0,14±0,001; contraste de cor, teste t = 26,03; P < 0,001; Tabela 3, Figura 4A), assim como conseguiriam discriminar M. argenteus (0,19±0,001; contraste de cor, teste t =61,76; P <

0,001; Tabela 3) e M. callinurus sobre flores (0,21 ±0,001; contraste de cor, teste t= 82,21;

P < 0,001; Tabela 3; Figuras 4B e 4C). Os valores médios de distância euclidiana entre essas combinações estão acima do limiar de distância de detecção (0,1 unidades de hexágono). No entanto, as abelhas não conseguiriam discriminar Tmarus em ramos secos

(0,02±0,001) (contraste de cor, teste t=42,99; P =1; Tabela 3, Figura 4 D). O valor médio de distância dessa combinação está abaixo do limiar de distância de detecção.

Quantificação da cor e teste de contraste cromático e acromático para Hymenoptera

O contraste verde pronunciado entre todas as combinações aranha-substrato indicam que as aranhas seriam distinguíveis de seus substratos na visão das abelhas em curtas distâncias (E. heterogaster vs. folha, teste t = -2,79; P =0,01; M. argenteus vs. flor, teste t =

30,64; P <0,001; M. callinurus vs. flor, teste t = 45,70; P <0,001; Tmarus vs. ramo seco, teste t = 30,64; P <0,001) (Tabela 3, Figura 5A). Com exceção de E. heterogaster (teste t =

4,03; P =0,071), as aranhas M. argenteus, M. callinurus e Tmarus apresentam maior saturação na cor do que seus respectivos substratos de escolha (M. argenteus, teste t =

85,21; P <0,001; M. callinurus, teste t = 61,76; P <0,001; Tmarus, teste t = -42,99;

P<0,001) (Tabela 3, Figura 5B).

Além disso, com a utilização da visão acromática, as abelhas poderiam detectar todas as aranhas antes de se aproximarem das flores ou dos substratos (E. heterogaster, teste t = 12,36; P <0,001; M. argenteus, teste t =-29,05; P <0,001; M. callinurus, teste t

=43,68; P <0,001; Tmarus, teste t = -12,10; P <0,001) (Tabela 3, Figura 5C). Na visão em

33 longas distâncias das abelhas, E. heterogaster apresenta maior brilho quando comparadas

às folhas que ocupam. M. argenteus e M. callinurus apresenta maior brilho que as flores e

Tmarus sp. maior brilho que ramos secos (Figura 5C).

Discussão

Nosso estudo demonstra o importante papel da coloração na seleção de substrato por aranhas neotropicais da família Thomisidae e como esse sinal visual relacionado à cor influencia o reconhecimento pela perspectiva de suas presas. Estudos anteriores demonstram diferentes padrões de reflexão espectral de aranhas sobre flores, testam o papel da coloração na seleção de flores e, além disso, exploraram como esse sinal visual de coloração atua no reconhecimento por presas e predadores em algumas espécies de

Thomisidae australianas e europeia (Heiling et al. 2003, Heiling et al. 2005, Théry & Casas

2002, Théry et al. 2005, Heberstein et al. 2009, Gawryszewski et al. 2012). Todavia, nosso trabalho é o primeiro a avaliar o papel da coloração em tomisídeos que selecionam diferentes substratos além de flores.

As aranhas que forrageiam em flores não selecionam esse sítio aleatoriamente, mas respondem a pistas visuais florais transmitidas (Heiling et al. 2005b, Wignall et al. 2006,

Bhaskara et al. 2009, Defrize et al. 2010, Defrize 2014, Herberstein & Gawryszewski

2013). Aqui observamos que diferentes espécies de tomisídeos com colorações de diversas tonalidades possuem a habilidade de selecionar ativamente seus substratos de forrageio de acordo com a coloração que ele apresenta. Adicionalmente, observamos que o padrão das respostas da seleção de substrato por essas aranhas testado experimentalmente, corresponde ao mesmo padrão de distribuição das aranhas na natureza em seu substrato de preferência.

As aranhas investigadas aqui exibiram modos distintos de forrageio e selecionaram seus substratos preferenciais depois de algum tempo de avaliação de características dos outros substratos oferecidos. Alguns estudos já reportam que aranhas da família Thomisidae que habitam flores podem ser atraídas por fragrâncias florais (e.g., eugenol) e também utilizam acuidades visuais, táteis e até mesmo coloração para selecionarem os sítios ótimos de captura de presas (Morse 1988, Greco & Kevan 1994, Krell & Krämer 1998, Heiling et al.

2005b, Morse 2007, Defrize et al. 2010, Defrize 2014). No entanto, a seleção de substratos com colorações diferentes (folhas e ramos secos) pode estar fortemente associada à atração de presas (e.g., E. heterogaster sobre folhas) ou potencial camuflagem na visão de vespas e aves predadoras (e.g., Tmarus sp. sobre troncos ou ramos secos).

Os insetos da ordem Hymenoptera se destacam pela sua alta capacidade cognitiva de reconhecimento de sinais visuais em flores e substratos que visitam (Heiling et al. 2004,

Gonçalves-Souza et al. 2008, Romero et al. 2011). Tais insetos são presas preferenciais das aranhas em estudo (Vieira & Romero, observações naturalísticas). Provavelmente, a escolha dos substratos e manipulação do sinal visual pelas aranhas é crucial para sua sobrevivência e sucesso reprodutivo, uma vez que essas aranhas poderiam ser reconhecidas mais facilmente por predadores e presas em folhas ou ramos secos.

A frequência de atividade dessas aranhas possivelmente pode estar relacionada ao sinal visual e escolha de substratos que habitam. Aranhas que habitam flores (M. argenteus e M. callinurus) e folhas (E. heterogaster quando adultas) tem baixa frequência de atividade (deslocam-se poucas vezes por um intervalo de tempo), enquanto as aranhas que habitam substratos mais escuros (Tmarus sp.) tem maior frequência de atividade (deslocam- se mais vezes intervalo de tempo) (Vieira, C. & Romero, G.Q. observações pessoais). Os

35 experimentos que quantificam tempo de permanência das aranhas em determinados substratos demonstraram que as fêmeas de aranhas que forrageiam em flores e folhas tendem a se deslocar muito pouco ao longo do dia, permanecendo até mesmo quase 10 horas seguidas em uma mesma flor ou folha. Já fêmeas que vivem em troncos são muito mais ativas, embora permaneçam no mesmo substrato. A forte tendência a permanecer em um local é consistente com a resposta à saciedade e cessação de caça ativa, e com ela a tendência para procurar outros substratos para forrageio (Morse 1988, Morse 2007).

Predadores que exibem comportamento de emboscada parecem usar regras de decisão de abandono do sítio de forrageio depois de um determinado tempo de espera (Morse 2007).

Esses comportamentos de decisão e abandono de um substrato de escolha por diferentes espécies de aranhas Thomisidae podem representar soluções ótimas de forrageio em ambientes onde as aranhas possam prever escassez de encontro com presas.

As aranhas que escolhem preferencialmente flores (i.e., M. argenteus e M. callinurus) como substratos exibem alta intensidade de reflexão de UV quando comparadas

às aranhas escuras (i.e., Tmarus sp.). Essas aranhas (M. argenteus e M. callinurus) surpreendentemente não exibem a clássica forma de cripsia em flores com relação à presa, uma vez que seriam detectadas no sistema visual de abelhas. Alternativamente, essas aranhas podem estar explorando o fenômeno de intensificação de contraste de cor com o pano de fundo para maximizar o efeito do sinal visual no reconhecimento de presas, assim como, explorado em estudos com espécies de aranhas australianas e européias que forrageiam em flores (Chittka 2001, Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2003, Théry et al.

2005). As aranhas de coloração escura (e.g., Tmarus sp.) apresentam baixa intensidade de reflectância de UV, assim como seu substrato de escolha. Potencialmente, aranhas escuras

36 devem escolher substratos escuros, tornando-se crípticas na visão de presas e, possivelmente, na visão de predadores. No entanto, incrivelmente as aranhas que habitam folhas (E. heterogaster) apresentam a mais alta intensidade espectral de UV quando comparadas a outras aranhas. Essa aranha exibe um comportamento altamente especializado, sendo distinguível no sistema visual de abelhas do pano de fundo verde das folhas. Possivelmente essas aranhas estão mimetizando a própria flor exibindo um pronunciado contraste de cor que atrai visitantes florais (Lunau et al. 1996).

No sistema visual de Hymenoptera, o contraste cromático é utilizado para detectar objetos quando estão próximos do emissor, enquanto o contraste acromático é utilizado para detecção de objetos quando estão a longas distâncias (Hart et al. 2000, Spaethe et al.

2001). Além de todas as aranhas nos substratos em estudo apresentarem contraste de cor em visão de curta distância. As aranhas que vivem em flores (M. argenteus e M. callinurus) e troncos (Tmarus sp.) também se apresentam mais saturadas que o pano de fundo que estão inseridas. Adicionalmente, todas as aranhas em estudo (E. heterogaster, M. argenteus, M. callinurus e Tmarus sp.) apresentam pronunciado contraste acromático com o substrato. As abelhas usam diferentes conjuntos de fotorreceptores em curtas e longas distâncias para visualização de objetos no espaço, e a visualização varia de acordo com o

ângulo visual no qual um objeto com o pano de fundo se encontra (Giurfa et al. 1996,

Giurfa et al. 1997, Dyer 2006). Assim, aparentemente os diferentes atributos de cor, contraste verde (Chittka 1992) e pureza espectral (Lunau et al. 1996) desempenham papéis diferentes no reconhecimento das aranhas pelas abelhas em seus diferentes substratos.

Em geral, as abelhas têm uma preferência inata por cores espectrais puras e contrastantes, o que pode explicar os padrões de cores das estruturas das flores nas

37 angiospermas (Lunau & Maier 1995, Lunau et al. 1996). O contraste acromático é um componente importante para avaliar a visão da abelha em várias tarefas que não envolvem discriminação de cor (Lehrer 1991, 1993). Contraste acromático é um sinal de detecção de imagem em movimento e de estimativa da distância e detecção de borda do objeto

(aranhas) (Lehrer et al. 1988, Lehrer et al. 1990). Como o contraste de cores desperta maior atratividade para a abelha, é possível que esse contraste seja utilizado como estratégia para facilitar a captura de presas no caso das aranhas que habitam flores (M. argenteus, M. callinurus) ou folhas (E. heterogaster), pois se assemelham com os padrões de colorações apresentados por flores de plantas melitofílicas (Faegri & van der Pijl 1979). E. heterogaster é conspícuo sobre folhas e aparenta mimetizar uma flor tanto na visão de curta distância como na visão de longa distância para as abelhas. Flores comumente exibem diferentes regiões de padrões de cor nos componentes cromáticos e acromáticos (Faegri &

Van der Pijl 1979, Lunau 2000). Diferentes contrastes de cores podem variar espacialmente em uma mesma flor em formas de guias específicos de néctar com o objetivo de atrair insetos visitantes florais para as plantas (Faegri & Van der Pijl 1979). Estes contrastes indicam a presença de pólen ou padrões de cores que são similares aos sinais de pólen

(Lunau 1996, Lunau 2000). Assim, ao invés de repelir as abelhas, o contraste da aranha com o substrato poderia tornar o substrato mais atraente para as abelhas. Nosso estudo sugere que os atributos da cor contribuem de maneira combinada com a intensidade de reflexão de UV das aranhas para a interpretação no sistema visual de presas.

Embora neste estudo nós usamos um modelo de visualização de Hymenoptera comumente utilizado para inferir o reconhecimento de aranhas Thomisidae na perspectiva das presas (Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2003), sugerimos que este mesmo modelo

38 poderia ser utilizado também para interpretar o reconhecimento dessas aranhas na visão de predadores. Alguns autores utilizam modelo visual de aves para inferir como tomisídeos em flores estão sendo reconhecidos por predadores (Théry & Casas 2002). No entanto, durante os 3 anos de observações comportamentais e experimentais dessas aranhas nós não observamos nenhum evento de predação por aves, mas observamos oito eventos de predação de tomisídeos por vespas predadoras e vespas parasitóides. Assim como alguns autores (Brechbühl et. al 2010) , nós sugerimos que a predação de tomisídeos por aves é um evento extremamente raro. Adicionalmente sugerimos também que modelos visuais de

Hymenoptera poderiam ser utilizados para uma melhor compreensão no reconhecimento de tomisídeos na visão de potencias predadores. Nesse contexto, E. heterogaster sobre folhas seria detectado tanto na visão de presas quanto na visão de predadores, assim como, M. callinurus e M. argenteus sobre flores. Já a aranha Tmarus sp. em ramos secos estaria críptica sob a perspectiva de predadores e presas (colêmbolos, abelhas, formigas) .

Esse trabalho revela diferentes padrões de escolha de substrato associados à intensidade de reflexão UV em aranhas Thomisidae Neotropicais. A habilidade de refletir luz UV juntamente com outros atributos da cor parece ser uma combinação importante na seleção de sítio de forrageio e na redução do reconhecimento por presas e predadores. As aranhas sobre flores e folhas poderiam favorecer a intensificação por contraste para potencialmente atrair presas. No entanto, evidências experimentais são necessárias para que possamos entender com mais clareza como se dá o reconhecimento dessas aranhas pelas presas e potenciais predadores em seus substratos de escolha. A emissão de espectro na região do UV juntamente com a combinação do sinal dessas aranhas com os respectivos pano de fundo pode variar geograficamente conforme o continente estudado (Heberstein et

39 al. 2009). Nosso estudo sugere que tomisídeos neotropicais com diferentes padrões de colorações devem utilizar estratégias alternativas de manipulação do sinal visual em diferentes substratos além da flor, potencialmente podendo maximizar seu sucesso de forrageio. Podemos concluir que a interação da coloração da aranha com a coloração de seu substrato tem um papel importante e fundamental na escolha de sítios de forrageio via cripsia ou por intensificação de sinal visual do substrato.

Agradecimentos

Os autores agradecem A. Degressi, B. B, Grisolia, T. N. Bernabé, M. Braga, A.T. Salomão, P. A. Antiqueira e P. M. Omena por toda assistência de campo e discussões, Y. Messas e A. Degressi pelas fotos das aranhas. Prof. A. A. Lise pela identificação das Thomisidae. Ao setor administrativo da Base de Estudos Ecológicos da Serra do Japi por ter autorizado o desenvolvimento deste estudo. Este estudo de doutorado foi desenvolvido no programa de Pós- Graduação em Ecologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo/ FAPESP (2010/51523-5) e Projeto Universal CNPq (470086/2011-4).

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Tabela 1. Tabela de frequência de ocorrência das espécies E. heterogaster, M. argenteus, M. callinurus e Tmarus sp. nos substratos inspecionados folha, flor e ramos secos ao longo de trilhas nos períodos de setembro de 2010 a abril de 2013.

Substratos inspecionados Aranhas Total Folhas Frequência Total Flores Frequência Total Ramos Frequência Tamanho das de com de de com de de com de aranhas (mm) Folhas aranhas ocorrência Flores aranhas ocorrência Ramos aranhas ocorrência (média ± SE)

E. heterogaster 3167 42 0,01 1859 1 <0,01 2434 0 0 0,96± 0,002 M. argenteus 3167 3 <0,01 1859 138 0,07 2434 0 0 0,82±0,001 M. callinurus 3167 2 <0,01 1859 112 0,06 2434 0 0 0,83±0,001 Tmarus sp. 3167 1 <0,01 1859 0 0 2434 198 0,08 0,73± 0,003

Tabela 2. Valor médio (± SE) de excitação (E) nos fotorreceptores de ultravioleta (EUV),

azul (EB) e verde (EG) na visão das abelhas nos substratos em Rubus rosifolius. Os valores

variam de 0 (nenhuma excitação) a 1 (máxima excitação) (n=10).

Fonte de Aranhas Substratos variação E.heterogaster M.argenteus M.callinurus Tmarus sp. Flores Folha Ramo Seco

EUV 0,76 ±0,004 0,72±0,003 0,75±0,001 0,67±0,003 0,73±0,002 0,72±0,001 0,73±0,003

EB 0,74±0,007 0,65±0,004 0,69±0,001 0,58±0,002 0,78±0,001 0,65±0,001 0,65±0,005

EG 0,69±0,007 0,55±0,004 0,57±0,001 0,46±0,0008 0,72±0,002 0,54±0,001 0,53±0,006

Tabela 3. Sumário das análises de teste t de contrastes cromáticos e acromáticos de aranhas

em seus substratos de escolha.

Visão de Hymenoptera Contraste da cor Contraste de verde Pureza espectral Relativa Contraste acromático Diferença do fotorreceptor verde

Aranhas sobre substrato t g.l. P t g.l. P T g.l. P t g.l. P

E.heterogaster em folha 26,03 99 <0,001 -2,79 9,51 0,01 -1,90 9,72 0,08 12,36 18 <0,001

M.argenteus em flores 61,76 99 <0,001 30,64 17,01 <0,001 28,08 17,82 <0,001 -29,05 18 <0,001

M.callinurus em flores 82,21 99 <0,001 45,70 17,15 <0,001 39,05 14,91 <0,001 -43,68 18 <0,001

Tmarus sp. em ramos -42,99 99 1,00 30,64 17,01 <0,001 3,30 16,70 <0,001 -12,10 18 <0,001 secos

Lista de Figuras

Figura 1. Espécies de tomisídeos (A) Epicadus heterogaster (B) Misumenops argenteus (C)

Misumenops callinurus e (D) Tmarus sp. nos substratos escolhidos por essas aranhas em

Rubus rosifolius (Crédito das fotos: A. Degressi, Y. Messas e C. Vieira).

Figura 2. Percentagem de tempo de permanência das espécies: Epicadus heterogaster,

Misumenops argenteus, Misumenops callinurus e Tmarus sp. em cada substrato de Rubus rosifolius. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão (P<0,05; ANOVA).

Figura 3. Espectros de reflectância entre os comprimentos de onda de 300 a 700 nm mensurados nas aranhas e seus substratos de escolha: Epicadus heterogaster vs. folha,

Misumenops argenteus vs. flor, Misumenops callinurus vs. flor e Tmarus sp. vs. ramo seco.

A região localizada à esquerda da linha tracejada indica a região do espectro invisível

(UV).

Figura 4. Representação geométrica de estímulo em cada fotorreceptor das abelhas (Apis mellifera) por diferentes espécies de aranhas tomisídeos em seus respectivos substratos (A)

Epicadus herogaster sobre folha, (B) Misumenops argenteus sobre flor, (C) Misumenops callinurus sobre flor, (D) Tmarus sp. sobre ramo.

Figura 5. Valores médios das propriedades cromáticas e acromáticas visualizadas no espaço de cor de abelhas (A) Contraste de verde, (B) Pureza espectral e (C) Contraste acromático. entre espécies de aranhas e os respectivos substratos de escolha. Barras de erro representam

± 1 Erro Padrão (P<0,05; test t).

A) B)

C) D)

Figura 1.

Ramo seco Folha Flor

100

0,1

0,01

Percentagemtempo de substrato cada em E.heterogaster M.argenteus M.callinurus Tmarus sp.

Figura 2.

A) 45 45 Epicadus heterogaster (n=10) Folha (n=10) 40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700

45 45 B) Flor (n=10) 40 Misumenops argenteus (n=10) 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5

Reflectância 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700

de de 45 45 Misumenops callinurus (n=10) Flor (n=10) C) 40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0

300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Percentagem 45 Tmarus sp .(n=10) 45 Ramos seco (n=10) 40 D) 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Comprimento de onda (nm)

Figura 3.

E(B) E(B) A) B)

Aranha Pano de fundo

Pano de fundo Aranha

E(UV) E(G) E(UV) E(G)

Epicadus heterogaster Misumenops argenteus E(B) E(B)C V C) D)

Pano de fundo Aranha

Aranha Pano de fundo C E(UV) E(G) E(UV) E(G)V

Misumenops callinurus Tmarus sp.

Figura 4.

0,2 A) * Aranha Substrato * 0,16 * Hexágono) de * 0,12

Unidades 0,08

0,04

Contraste Contraste de verde ( 0 E. heterogaster M. argenteus M. callinurus Tmarus sp. 0,4 B) * 0,35 * 0,3 *

0,25

0,2 espectral 0,15

Pureza 0,1

0,05

0 E. heterogaster M. argenteus M. callinurus Tmarus sp. C) 0,9

0,8 * * * * 0,7

0,6 0,5 0,4

0,3

Acromático Contraste 0,2 0,1

0 E. heterogaster M.argenteus M.callinurus Tmarus sp

Figura 5.

57 Crédito da foto: Yuri Messas

CAPÍTULO 2

Cripticidade em Thomisidae é mantida pela elevada intensidade de reflexão de UV e de

fluorescência

Camila Vieira1 & Gustavo Q. Romero2

1Pós-graduação em Ecologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP 6109,

CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil.

2Departamento de Biologia Animal, IB, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP),

CP 6109, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil.

Resumo

A coloração desempenha um importante papel na comunicação visual entre predadores e presas. A emissão de fluorescência e reflexão de UV são sinais visuais da cor que podem influenciar a cripsia em Thomisidae, favorecendo o sucesso de captura de visitantes florais. Estudos debatem sobre a vantagem da cripticidade em tomisídeos no reconhecimento pelos visitantes florais e sucesso de captura de presas. Todavia, desconhece-se como a reflexão de UV e emissão de fluorescência influenciam o comportamento de visitantes florais no reconhecimento de diferentes espécies de

Thomisidae. Neste estudo, nós investigamos como aranhas com diferentes colorações são reconhecidas por visitantes florais quando estão sobre flores. Adicionalmente, nós investigamos o papel da reflexão de UV no reconhecimento das aranhas por visitantes florais por meio de experimentos em campo com manipulação desse sinal. Para avaliar o reconhecimento dessas aranhas no sistema visual de Hymenoptera, nós utilizamos o modelo de espaço de cor na visão de abelhas e calculamos os contrastes cromáticos e acromáticos para visualização da aranha em curta e longa distância, respectivamente. Nossos resultados demonstram que as espécies de aranhas claras que forrageiam em flores exibem maior intensidade de fluorescência, bem como maior reflexão de UV que espécies de aranhas escuras. A intensidade da cor está relacionada com cripticidade apenas quando exibidas em elevadas concentrações de fluoróforos como observamos em Epicadus heterogaster. No entanto, cripsia em E. heterogaster não demonstrou vantagem no reconhecimento pelas presas quando comparado à espécie conspícua que vive em flor, Misumenops callinurus. O reconhecimento e fuga de visitantes florais dependem da intensidade coloração do tomisídeo e do contraste de cor que eles apresentam com o pano de fundo. Predadores com

59 menores intensidades de cor (Tmarus sp.) são mais facilmente reconhecidos e evitados por visitantes florais quando comparados a predadores que tem habilidade de combinar a coloração corporal com a coloração das flores. A resposta dos visitantes florais não é uniforme diante as diferentes espécies de aranhas quando estão sobre flores. A intensidade da coloração parece ter um papel crucial na variação de respostas comportamentais de visitantes florais em flores com aranhas da família Thomisidae.

Palavras-chave: cripsia, coloração, interação predador-presa, sinal visual, ultravioleta.

Introdução

O termo camuflagem descreve todas as formas de disfarce, incluindo as estratégias de evitar detecção e reconhecimento do emissor pelo receptor por meio de sinal visual

(Stevens & Merilaita 2009, Théry & Casas 2009, Stevens & Merilaita 2011). Entre os tipos de camuflagem, a coloração críptica é conhecida como uma estratégia na qual o animal possui uma característica fenotípica que minimiza o efeito visual do sinal emitido com o pano de fundo correspondente, para a visão de seus predadores e presas (Stevens &

Merilaita 2009).

A vantagem da coloração críptica em tomisídeos em relação ao reconhecimento por visitantes florais, aumentando o sucesso de captura de presas, tem sido amplamente debatida (Ings & Chittka 2008, Ings & Chittka 2009, Brechbühl et al. 2010a,b, Romero et al. 2011). Tomisídeos são reconhecidas por apresentarem uma grande variação de cores entre espécies e a coloração corporal dessas aranhas comumente é correspondente à cor dos substratos que elas utilizam para forragear (Chittka 2001, Morse 2007, Théry 2005,

Gawryszewski et al. 2012, Vieira, et al. Capítulo 1). Muitos insetos que visitam flores são

60 reconhecidos por sua alta habilidade de reconhecimento de sinais visuais, como coloração floral e, dessa forma, reconhecem e evitam flores com potencial risco de predação (Chittka

2001, Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2003).

No sistema visual de Hymenoptera, a detecção de objetos que estão em longas distâncias envolve diferentes fotorreceptores daqueles utilizados para detectar objetos que estão próximos do emissor (Hart et al. 2000, Spaethe et al. 2001). Dessa forma, objetos podem estar crípticos em longas distâncias e tornarem-se conspícuos quando os insetos aproximam-se, ou ainda, podem estar conspícuos em longas distâncias e crípticos em curtas distâncias (Hart et al. 2000, Spaethe et al. 2001). O contraste cromático é utilizado pelos

Himenópteros para detectar objetos quando estes estão próximos do emissor, enquanto o contraste acromático é utilizado para detecção de objetos que estão mais distantes (Hart et al. 2000, Spaethe et al. 2001).

Tomisídeos refletem luz na região do espectro ultravioleta próximo (UV-A) e no espectro visível, assim como a maioria flores, e a reflexão do sinal de UV pode ter um efeito notável no reconhecimento de presas por duas estratégias mais conhecidas, (i) a estratégia clássica de cripsia que consiste na redução do contraste de reflexão de UV entre aranhas e flores tornando as aranhas menos perceptíveis às suas presas e predadores

(Stevens & Merilaita 2009); e (ii) o contraste pronunciado de reflexão de UV entre aranha e flores tornando a flor a mais atrativa e, assim, mais visitada por visitantes florais (Heiling et al. 2003).

Além de refletirem luz UV, os tomisídeos possuem moléculas chamadas fluoróforos, presentes na hemolinfa e na epiderme, que absorvem a luz em um comprimento de onda na faixa da UV e, em seguida, emitem luz em um comprimento de onda maior do que o absorvido (geralmente na faixa do visível), conhecido como

61 fluorescência (Andrews et al. 2008). A elevada reflexão de UV e emissão de fluorescência pode resultar em cripsia nas aranhas que forrageiam sobre flores, podendo favorecer o sucesso de captura de presas. Em contraste, aranhas de coloração mais escuras podem emitir uma menor intensidade de fluorescência e reflexão de UV. Essas aranhas forrageiam em substratos mais escuros (Vieira & Romero, observações pessoais), pois possivelmente forragear em flores pode resultar na fuga por visitantes florais e na diminuição o sucesso de captura de presas. Estudos reportam o efeito da reflexão de UV em aranhas claras Thomisus spectabilis, Thomisus onustus e Misumena vatia sobre flores e como ocorre o reconhecimento de suas presas (Heiling & Heberstein 2004, Heiling 2003, Heberstein et al.

2009, Théry & Casas 2002, Théry 2005, Théry 2007). No entanto, pouco se sabe como a reflexão de UV e a emissão de fluorescência influenciam no reconhecimento de visitantes florais em tomisídeos neotropicais que forrageiam em diferentes substratos além da flor, como folhas e ramos secos.

Neste estudo nós investigamos (i) se a reflexão de UV nas espécies de Thomisidae que forrageiam em diferentes substratos além da flor influencia a resposta de visitantes florais, (ii) se a intensidade de fluorescência e reflexão de UV são maiores em espécies que forrageiam sobre flores quando comparadas às espécies que não forrageiam sobre flores,

(iii) se as aranhas que forrageiam sobre flores são crípticas no sistema visual de visitantes florais enquanto que aranhas que não forrageiam em flores não são crípticas, podendo ser evitadas por visitantes florais, e (v) como contrastes cromáticos e acromáticos podem estar influenciando no reconhecimento visual e resposta dos visitantes florais.

Material e Métodos

Área de estudo e organismos

O estudo foi realizado na Reserva Biológica da Serra do Japi, situada no município de Jundiaí, sudeste do Brasil (altitude de 700 a 1300 m). Nós utilizamos no estudo mudas da planta arbustiva Rubus rosifolius (Rosaceae) nos períodos específicos de floração da planta. Esta planta é distribuída em uma variedade de habitats tropicais, é comumente encontrada na área de estudo e está bastante associada com a presença de algumas espécies de Thomisidae. As flores de R. rosifolius são pentâmeras de coloração brancas com diâmetro aproximadamente 2 cm e são visitadas por grande diversidade de insetos

(Gonçalves-Souza et al. 2008). Os experimentos foram conduzidos em abril de 2012 e nesse período os visitantes florais mais abundantes pertencem à ordem Hymenoptera.

Para a realização dos experimentos utilizamos quatro espécies de Thomisidae em diferentes estágios de desenvolvimento, descritas a seguir. (1) indivíduos imaturos de

Epicadus heterogaster Guerin (1812), que são aranhas claras, comumente podem mudar de coloração corporal de acordo com a cor das flores (branca, amarela ou lilás) (Peixoto et al.

2012). Essa espécie possui o abdômen semelhante a flores e forrageia em flores nos estágios imaturos e em folhas na fase adulta (os autores, dados não publicados); (2) indivíduos adultos de Misumenops argenteus Mello-Leitão (1929) que são aranhas claras que comumente são encontradas em flores de Rubus rosifolius (Romero & Vasconcelos-

Neto 2004, Gonçalves-Souza et al. 2008); (3) indivíduos adultos de Misumenops callinurus

Mello-Leitão (1929) que são aranhas claras que comumente são encontradas em uma grande variedade de flores e também podem mudar de coloração corporal de acordo com a

63 cor das flores (branca ou amarela) e (4) indivíduos adultos de Tmarus sp. Simon (1875) que são aranhas escuras e não forrageiam em flores. As espécies de aranhas escolhidas para a realização dos experimentos são amostras bem representativas de extremos de coloração na família Thomisidae (Vieira, C. & Romero, G. Q. observações em campo).

Efeito de aranhas sobre visita de insetos polinizadores

Para testar se existe um contínuo de reconhecimento entre aranhas de diferentes colorações do ponto de vista dos visitantes florais nós desenvolvemos um experimento, em blocos aleatorizados, nos períodos específicos de floração da planta herbácea R. rosifolius.

Cada bloco experimental (n = 10 blocos) consistiu de 5 flores, cada uma designada aleatoriamente para receber um dos seguintes tratamentos: (1) flores sem aranha (Figura

1A), (2) flores com E. heterogaster branca (Figura 1B), (3) flores com M. argenteus

(Figura 1C), (4) flores com M. callinurus branca (Figura 1D), ou (5) flores com adulto de

Tmarus sp. (Figura 1E). As aranhas utilizadas no experimento foram colocadas a -15ºC em um freezer por alguns minutos antes do experimento para eliminar qualquer influência do movimento da aranha sobre a escolha dos visitantes florais (Wells & Wells 1985). As aranhas foram colocadas cuidadosamente apenas nas pétalas das flores para simular o modo de forrageio de Thomisidae. Desse modo, não foi impedido o acesso dos visitantes florais

às flores. Nós selecionamos apenas flores novas, recém-abertas, para o experimento de forma a minimizar o efeito variável da qualidade e quantidade de recursos florais. As flores de cada bloco estavam no mínimo 1 m de distância entre si para minimizar qualquer efeito das aranhas na taxa de visitação de outras flores (Gonçalves-Souza et al. 2008). As flores de cada bloco experimental foram filmadas e observadas a uma distância de no mínimo 2 m

64 para evitar qualquer influência do observador no comportamento dos insetos visitantes. As observações foram feitas simultaneamente em seções de 60 min cada, com intervalos de 10 min entre as seções, totalizando 600 min de observações. O número de visitas e o número de fugas dos visitantes florais foram registrados em cada seção. Os insetos visitantes florais foram coletados posteriormente após realização do experimento para identificação até pelo menor o nível de gênero. Os dados foram divididos em ordens de cada grupo taxonômico para as análises estatísticas. Foi definido o termo “visita’ quando o inseto pousou na flor ou permaneceu nesta por no mínimo 2 segundos, e “fuga” quando o inseto voou em direção à flor, mas ao invés de pousar ele se esquivou e foi em direção à outra flor no local mais próximo ou foi embora.

Os dados referentes à visita e foram analisados utilizando modelos lineares mistos

(LME) (Zuur et al. 2009); blocos foram ajustados como aleatório e os tratamentos como efeito fixo. Para controlar a falta de homogeneidade, quando necessário foi utilizada a função varIdent que permite modelar variações diferentes para cada nível de um fator e pode ser usado para ajustar o modelo heterocedástico para os dados (Pinheiro & Bates

2000, Zuur et al. 2009). Para comparações entre tratamentos foi realizado teste a posteriori de Tukey (Pinheiro & Bates 2000). As análises foram realizadas no R versão 3.1.3 com a função lme no pacote “nlme” (R Development Core Team 2014).

Manipulação da coloração da aranha - análise de pistas visuais

Para investigar se reflexão de UV nas espécies de Thomisidae influencia a resposta de visitantes florais, nós aplicamos no corpo das aranhas uma mistura de dois diferentes cromóforos que absorvem luz UV. Ambos os cromóforos Parsol MCX (2-ethylhexyl-p-

65 methoxycinnamate) e Parsol 1789 (4-tert-butyl-4- methoxydibenzoylmethane) têm ingredientes comuns em protetores solares; o primeiro composto absorve luz UV-B, o segundo absorve luz UV-A (Heiling et al. 2005). As espécies utilizadas no experimento foram as mesmas do experimento anterior. Tanto as aranhas experimentais como as controle receberam bloqueadores solares. Entretanto as aranhas experimentais foram tratadas na região dorsal, enquanto as aranhas controle na região ventral (Figuras 2 e 3). O uso de protetor solar nas aranhas não interfere na visitação. Em experimentos prévios verificamos que flores com protetor solar e flores sem protetor solar não diferem com relação a taxa de visitas de visitantes florais (Anova de um fator, F1,18=0,21 P=0,64).

Todavia, aplicamos protetor solar em ambas as aranhas para minimizar qualquer possível influência no reconhecimento pelo visitante floral. Aranhas experimentais com tratadas com bloqueadores solares (n=12) e aranhas controle (n=12) foram colocadas cuidadosamente diretamente sobre flores. Cada bloco experimental (n = 12 blocos) consistiu de 4 flores, cada uma aleatoriamente foi designada para receber os seguintes tratamentos: (1) flores com aranha com bloqueadores solares na parte dorsal, (2) flores com aranha com bloqueador solar na parte ventral como controle ao uso de bloqueador, e como controle do experimento, (3) flores sem aranha e sem bloqueador solar e por fim e (4) flores as quais colocamos um graveto para testar se os visitantes evitam qualquer objeto sobre as flores (“efeito da novidade” ou neofobia, Dukas 2001, Abbot 2009, Romero et al. 2011).

As observações foram feitas simultaneamente em seções de 60 min cada, com intervalos de

10 min entre as seções, totalizando 720 min de observações. Os procedimentos gerais desse experimento são semelhantes aos descritos no experimento anterior. Os dados foram divididos em ordens de cada grupo taxonômico para as análises estatísticas.

Os dados referentes à visita e fuga foram analisados utilizando modelos lineares mistos (LME) (Zuur et al. 2009); blocos foram ajustados como aleatório e os tratamentos como efeito fixo. Para controlar a falta de homogeneidade, quando necessário foi utilizada a função varIdent que permite modelar variações diferentes para cada nível de um fator e pode ser usado para ajustar o modelo heterocedástico para os dados (Pinheiro & Bates

Espectro de reflectância das aranhas e flores

Para investigar se a intensidade de reflexão de UV é maior em espécies que forrageiam sobre flores quando comparadas às espécies que não forrageiam sobre flores foi preciso identificar o padrão do sinal visual de cada objeto. Nós mensuramos a reflectância espectral entre 300 a 700 nm dos abdomens das aranhas e das pétalas de flores em R. rosifolius usando um espectrofotômetro Cary 5000 UV- Vis- NIR (Varian, Australia) com um alto desempenho fotométrico nos espectros de variação entre 175-3300 nm. Nós utilizamos dois controles acromáticos: preto e branco como fundo de calibração antes da mensuração de cada amostra. O espectro de cada aranha e cada flor foram mensurados dez vezes e utilizamos o número médio dos espectros para computar a distância euclidiana no modelo de espaço da cor no sistema visual de Hymenoptera (Chittka 1992, Chittka 1996).

As análises foram realizadas no Laboratório de UV-Vis-NR / Luminescência / Polarimetria no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

Espectros de excitação e emissão de fluorescência

Para investigar se a intensidade de emissão fluorescência é maior em espécies que forrageiam sobre flores quando comparadas às espécies que não forrageiam sobre flores, quantificamos a excitação e emissão de espectro de fluorescência das quatro espécies de

Thomisidae em estudo. Nós utilizamos um espectrômetro de fluorescência molecular Cary

Eclipse Varian. Os abdomens das aranhas foram pesados e triturados em etanol absoluto

Merck. Seccionamos e trituramos 1mg de massa de abdômen em cada espécie de

Thomisidae amostrada e diluímos em 8 ml de etanol. Assim, a concentração da extração manteve-se padronizada em todas as espécies. As soluções foram deixadas em descanso no escuro por 48 h em temperatura ambiente. As extrações foram centrifugadas a 4000 r.p.m. por 5 min., e o sobrenadante foi analisado utilizando uma cubeta de quartzo com caminho

óptico de 10mm. A faixa utilizada para mensurar espectro de excitação e emissão foi de

250 a 600 nm. As fendas de excitação e emissão foram de 5 nm cada. Os dados das análises de espectrofluorimetria foram plotados nos gráficos usando o programa MatLab 7.8.

Coloração com modelo de hexágono em cores: aranha e flores

Para testar cripticidade das aranhas sobre flores no sistema visual de visitantes florais, nós utilizamos o modelo do hexágono em cores como um modelo de visualização do espaço da cor no sistema visual de Hymenoptera (Chittka 1992, Chittka 1996). Apesar de R. rosifolius ser visitada por diferentes ordens de insetos, experimentos prévios no período de estudo evidenciam maior número de visitas de insetos da ordem Hymenoptera

(Gonçalves et al. 2008). No modelo de visualização do espaço da cor de Hymenoptera, as extremidades do hexágono representam os fotorreceptores e as possíveis combinações entre

68 eles de acordo com a refletância espectral do objeto que está sendo visualizado. Os valores de receptores de excitação (E) foram calculados para os fotorreceptores de Apis mellifera com suas sensibilidades nos picos do ultravioleta, azul e verde (Briscoe & Chittka 2001,

Chittka 1996). Esses valores são relativos, variando entre 0 e 1. Nós utilizamos um padrão de fundo das folhas verdes e um padrão de iluminação a luz do dia (D65, Wyszecki &

Stiles 1982). Utilizamos também a função de sensibilidade espectral de fotorreceptores de

Apis mellifera como referência no modelo para compreender a detecção da aranha no sistema visual de Hymenoptera (Chittka 1992, Chittka & Kevan 2005).

A distância euclidiana distribuída aleatoriamente corresponde à hipótese nula

(Chittka 1996, Chittka 2001). Para testar a hipótese alternativa, após a realização do experimento, calculamos a distância euclidiana média em unidades de hexágono entre os espectros das aranhas e flores. Como referência, as abelhas poderiam distinguir cerca de

70% entre as cores do objeto e pano de fundo com distância de 0,1 unidades de hexágono de detecção (Chittka 1996, Chittka 2001). Portanto, nós comparamos as distâncias calculadas com o limite discriminante pelo teste-t para aranhas e flores (contraste de cor).

Calculamos a distância euclidiana média em unidades de hexágono nas seguintes combinações: E. heterogaster vs. flor, M. argenteus vs. flor, M. callinurus vs. flor e

Tmarus sp. vs. flor. Quando o valor médio de distância euclidiana em unidades de hexágonos entre essas combinações está abaixo ou igual ao limiar de distância de detecção

(0,1 unidades de hexágono) as abelhas não discriminariam a aranha do pano de fundo.

Quando o valor está acima do limiar, as abelhas seriam capazes de discriminar essas aranhas.

Quantificação da cor e teste de contraste cromático e acromático para Hymenoptera

Para investigar como contrastes cromáticos e acromáticos podem estar influenciando no reconhecimento visual e resposta dos visitantes florais, quantificamos esses contrastes com o uso de testes de contraste cromático e acromático. As abelhas usam o contraste cromático para detectar objetos quando estão próximas do emissor; quando estão em longas distâncias utilizam o contraste acromático (Hart et al. 2000, Spaethe et al.

2001). Os tipos de receptores para UV e azul estão envolvidos na detecção de contraste cromático, ao passo que os receptores verdes estão envolvidos na detecção de contraste acromático (brilho). Além do contraste de cor, as abelhas são conhecidas por utilizar o sinal do contraste de verde e de pureza espectral para objetos em curtas distâncias. O contraste de verde é um componente cromático da cor. Já a pureza espectral ou saturação pode ser definida como a quantidade de cinza que uma cor contém. Quanto maior a quantidade de cinza, menor a pureza de uma cor (Lunau et al. 1996). Dessa forma, calculamos o contraste de verde e a pureza espectral relativa das aranhas e flores usando o mesmo modelo de cores do hexágono (Chittka et al. 1994, Lunau et al. 2011). O contraste de verde é medido com a distância entre o locus alvo da cor ao ponto central incolor do hexágono, com locus de fundo verde padrão (Chittka 1992). Por outro lado, a pureza espectral relativa é calculada como a proporção entre a distância do locus de cor a partir do centro do hexágono e a distância do locus espectral do modelo correspondente (Lunau et al. 2011). Nós utilizamos para as análises o modelo de pureza espectral máxima nos fotorreceptores de excitação de

Apis melífera (Lunau et al. 1996). Já para o contraste acromático (brilho) nós calculamos a diferença de excitação dos fotorreceptores verde das aranhas e das flores. Realizamos um teste-t de variâncias desiguais (test-t de Welch) entre as combinações das aranhas e flores para explorar as diferenças estatísticas nos componentes da cor no sistema visual de

70 abelhas. Todas as análises foram realizadas utilizando o software R (R Development Core

Team 2014).

Resultados

Efeito de aranhas sobre visita de insetos visitantes florais

Flores sem aranhas são mais visitadas que flores com aranhas (Figura 4A). O número total de visitas é diferente entre aranhas com diferentes colorações (F3,36 =47,36, P

< 0,001, Tabela 1) e foi menor em flores com aranhas escuras (i.e., Tmarus sp.) quando comparado as flores com aranhas claras (Figura 4A). O mesmo padrão foi observado para o número total de fugas (F4.45 = 13,32, P < 0,001, Tabela 1). Flores com aranhas de coloração escura foram mais reconhecidas e evitadas pelos visitantes florais (Figura 4B). O número de visitas foi semelhante em E. heterogaster e M. callinurus, mas foi maior que em M. argenteus (Figura 4A). O mesmo padrão pode ser observado quando analisamos os grupos subdivididos nas duas ordens de visitantes florais “Hymenoptera” e “Diptera +

Lepidoptera” (Figura 4A e 4B). Os insetos da ordem Hymenoptera foram os que mais visitaram as flores. A lista dos visitantes florais, categorizados por Ordem e morfoespécies, encontram-se no Apêndice 1.

Manipulação da coloração da aranha - análise de pistas visuais

A remoção do sinal de UV das aranhas devido ao tratamento com protetor solar influencia claramente a resposta dos visitantes florais. O número total de visitas entre os tratamentos difere (E. heterogaster, F3,33 =231,79, P<0,001; M. argenteus, F3.33 =196,68, P

< 0,001; M. callinurus, F3.33 =47,36, P < 0,001 e Tmarus sp., F3.33 =168,56, P < 0,001.

Tabela 2; Figura 5, 6, 7 e 8). O mesmo padrão foi observado para o número total de fugas

(E. heterogaster, F3.33 =139,76, P < 0,001; M. argenteus, F3.33 =126,15, P < 0,001; M. callinurus, F3.33 =124,57, P < 0,001 e Tmarus sp.; F3.33 =167,11, P<0,001. Tabela 2, Figuras

5, 6, 7 e 8). O bloqueio do sinal de UV reduziu consideravelmente o número de visitas em todas as aranhas que vivem sobre flores (E. heterogaster, M. argenteus e M. callinurus)

(Figura 5A, 6A, 7A). Além disso, o bloqueio de sinal de UV repeliu os visitantes florais em todas as aranhas que vivem sobre flores (Figura 5B, 6B, 7B). No entanto, o bloqueio de sinal de UV não influenciou o comportamento dos visitantes florais flores com aranhas escuras (Tmarus sp.) (Figura 8). Os visitantes florais reconhecem o objeto estranho inserido na flor e evitam o graveto na mesma proporção que evitam (Tmarus sp.) (Tabela 2, Figura

8). Os insetos da ordem Hymenoptera foram os que mais visitaram as flores. A lista dos visitantes florais, categorizados por Ordem e morfoespécies, encontram-se no Apêndice 2.

Espectro de reflectância das aranhas e flores

E. heterogaster apresentou espectro de reflexão de UV distinto das demais espécies de Thomisidae (Figura 9A). Além disso, a intensidade média do espectro dessa espécie é maior quando comparada a intensidade média de reflexão de UV das outras aranhas que forrageiam em flores (M. argenteus e M. callinurus) (Figura 9B e C). Em contraste, os indivíduos de Tmarus sp. que não habitam flores exibem menor intensidade média de reflexão de UV quando comparado às de outras aranhas (Figura 9D).

Espectros de excitação e emissão de fluorescência

Todas as espécies de Thomisidae em estudo exibem curva com máximo pico de fluorescência na região do espectro entre 315 a 400 nm. E. heterogaster, M. argenteus e

Tmarus sp. exibem curva espectral unimodal com pico máximo de excitação em 307 nm e

72 pico máximo de emissão em 343 nm. M. callinurus exibe um padrão de curva bimodal com pico máximo de excitação em 324 nm e pico máximo de emissão em 390 nm. As análises de emissão de fluorescência demonstram que a espécie E. heterogaster tem maior intensidade de emissão de espectro (949 unidades arbitrárias) (Figura 10A, Figura 11A) quando comparada a Tmarus sp.(118 unidades arbitrárias) (Figura 10D, Figura 11D). Já as outras duas espécies estão intermediárias em intensidade de fluorescência entre os outros dois extremos de coloração: M. callinurus (816 unidades arbitrárias) e M. argenteus (263 unidades arbitrárias, Figura 10B, C e Figura 11 B, C). As flores de R. rosifolius utilizadas nesse estudo não emitem fluorescência.

Coloração com modelo de hexágono em cores: aranha e flores

No modelo visual de Hymenoptera, as abelhas não conseguiriam discriminar a aranha E. heterogaster sobre flores (distância entre os loci =0,09 ± 0,001; contraste de cor, teste t = -3,78; P = 0,99; Tabela 3, Figura 12A). O valor médio de distância dessa combinação está abaixo do limiar de distância de detecção (0,1 unidades de hexágono). No entanto, as abelhas conseguiriam discriminar as aranhas M. argenteus (distância entre os loci=0,19±0,001; contraste de cor, teste t =61,76; P < 0,001; Tabela 3; Figura 12B), M. callinurus (distância entre os loci=0,21 ±0,001; contraste de cor, teste t= 82,21; P < 0,001;

Tabela 3; Figura 12C) e Tmarus sp. (distância entre os loci=0,26 ± 0,001, contraste de cor, teste t= 85,27; P < 0,001; Tabela 3; Figura 12D). Os valores médios de distância euclidiana de M. argenteus, M. callinurus e Tmarus sp. sobre flores estão acima do limiar de distância de detecção (0,1 unidades de hexágono).

Quantificação da cor e teste de contraste cromático e acromático para Hymenoptera

E. heterogaster não seria detectada em flores na fase jovem na visão das abelhas em curtas distâncias (contraste de verde, E. heterogaster vs. flor, teste t = 1,77; P =0,09). No entanto, M. argenteus e M. callinurus que vivem sobre flores e Tmarus sp. que não vive sobre flor apresentaram um contraste de verde pronunciado entre todas as combinações aranha-flor, indicando que essas aranhas seriam distinguíveis em flores na visão das abelhas em curtas distâncias (contraste de verde, M. argenteus vs. flor, teste t = 30,64; P

<0,001; M. callinurus vs. flor, teste t = 45,70; P <0,001; Tmarus sp. vs. flor, teste t = 42,17;

P <0,001) (Tabela 3, Figura 13A). Com exceção de E. heterogaster, cuja saturação de cor da aranha não difere com a saturação de cor da flor (teste t =0,21; P =0,82), as aranhas M. argenteus, M. callinurus e Tmarus sp. têm maior saturação de cor quando comparadas a saturação de cor das flores sobre as quais foram colocadas experimentalmente (M. argenteus, teste t = 28,08, P <0,001; M. callinurus, teste t = 39,05; P <0,001; Tmarus sp. , teste t = 36,33, P <0,001) (Tabela 3, Figura 13B).

Além disso, com a utilização da visão acromática em longas distâncias, as abelhas distinguiriam o objeto (aranha) do pano de fundo (flor) antes de se aproximarem das flores

(E. heterogaster, teste t = -5,87; P <0,001; M. argenteus, teste t =-29,05; P <0,001; M. callinurus, teste t =43,68; P <0,001; Tmarus sp., teste t = -74,81; P <0,001) (Tabela 3,

Figura 13C). As flores apresentam brilho mais acentuado que todas as aranhas em estudo

(Figura 13C).

Discussão

A coloração desempenha um importante papel no reconhecimento de visitantes florais em Thomisidae Neotropicais. Em aranhas, a função ecológica da coloração pode

74 estar estritamente relacionada à cripticidade (Oxford & Gillespie 1998). No entanto, no nosso estudo essa relação entre coloração e cripsia não ocorre em todos os organismos estudados. Os experimentos em campo demonstram que a intensidade de reflexão de UV e emissão de fluorescência influenciam a cripticidade dessas aranhas e o reconhecimento de visitantes florais em R. rosifolius. As aranhas escuras com menor intensidade de reflexão de UV são mais reconhecidas e evitadas por visitantes florais, ao passo que as espécies claras com maior intensidade de reflexão de UV são mais visitadas que as aranhas escuras.

Todavia, há variação nos padrões observados.

Nós observamos que a estratégia de cripsia em que há correspondência de reflexão de sinal de UV e emissão de fluorescência entre aranhas e pétalas de algumas espécies de flores (Chittka 2001, Théry & Casas 2002, Morse 2007), não foi evidenciada de forma homogênea em nosso sistema de estudo. A cripticidade só foi evidenciada em aranhas E. heterogaster que exibe elevada intensidade de fluorescência e reflexão de UV. Além disso, ser críptica não permitiu a essa espécie de aranha uma vantagem em evitar o reconhecimento por presas quando comparado à espécie conspícua que exibe contraste de

UV com o as flores (M. callinurus). Experimentos realizados com Misumena vatia em diferentes colorações de flores revelam que essa espécie, quando conspícua em específicas colorações de pano de fundo, não demonstra sucesso de forrageio comprometido quando comparado ao sucesso de forrageio em substratos crípticos, em termos de biomassa capturada de polinizador (Brechbühl et al. 2010). Muitos estudos em coloração de

Thomisidae têm revelado resultados contraditórios, questionando à hipótese da coloração estar estritamente relacionada à cripticidade em aranhas que forrageiam sobre flores. Estes estudos sugerem que apenas aranhas brancas têm habilidade de tornarem-se crípticas ao

75 pano de fundo, pois as aranhas com distintas colorações quando combinadas a flores de diferentes cores não possuem a habilidade de tornarem crípticas (Chittka 2001, Heiling e

Herberstein, 2004, Heiling et al. 2005, Brechbühl et al. 2010, Defrize et al. 2010, Llandres

& Rodríguez-Gironés 2011a).

Nosso estudo demostra que as aranhas que habitam flores (M. callinurus e M. argenteus) e a aranha que naturalmente não habita flor (Tmarus sp.) são conspícuas na visão de Hymenoptera indicando que essas aranhas são distinguíveis em flores na visão das abelhas em curtas e longas distâncias. No entanto, a resposta comportamental do visitante floral frente ao reconhecimento de aranhas que habitam flores é diferente quando comparada ao reconhecimento de aranhas que não habitam flores. As aranhas M. callinurus e M. argenteus são mais visitadas e menos evitadas que Tmarus sp. Aqui o contraste pronunciado de coloração entre as espécies de aranhas M. callinurus e M. argenteus sobre flores não torna a presença do predador indiferente na visão das presas (Heiling et al.

2005). Além disso, não torna as flores mais atraentes como reportado na espécie de aranha australiana Thomisus spectabilis, em Chrysanthemum frutescens (Heiling et al. 2003). É possível que o tamanho do predador, quando comparamos diferentes espécies de aranhas, possa influenciar o reconhecimento e resposta comportamental exibida pelo visitante floral, uma vez que predadores maiores devem exercer maior estímulo e possivelmente maior intensidade de resposta. Todavia, Tmarus sp. apresenta menor tamanho que M. argenteus e

M. callinurus, (Tabela 1, Capítulo 1) e mesmo assim exerceu maior intensidade de resposta aos visitantes florais sugerindo assim que, provavelmente, o tamanho pode não ser um atributo que interfira fortemente no reconhecimento e resposta comportamental de visitantes florais nesse sistema.

Muitos estudos reportam a evidência de alteração comportamental dos insetos visitantes florais com a presença de predadores em plantas (Dukas 2001, Dukas & Morse

2003, Suttle 2003, Morse 2007, Gonçalves et al. 2008). Esses insetos evitam mais as plantas que apresentam traços de presença de predadores que plantas com ausência de predadores (Dukas 2001, Dukas & Morse 2003, Suttle 2003, Morse 2007, Gonçalves et al.

2008). No entanto, nossos experimentos demonstram que os visitantes florais parecem responder de forma variável em sistemas com Thomisidae que exibem diferentes estratégias de forrageio. Ao removermos artificialmente o sinal visual de UV das aranhas, observamos alteração comportamental dos visitantes florais no reconhecimento de E. heterogaster, M. callinurus e M argenteus, mas não observamos o mesmo padrão de resposta para Tmarus sp.. Enquanto, E. heterogaster, M. callinurus e M argenteus se beneficiam da reflexão de UV, o bloqueio desse sinal resulta em resposta indiferente do polinizador em Tmarus sp. que emite baixa intensidade de reflexão de UV e não forrageia em flores. Estudos também demostram a importância do sinal visual de reflexão de UV no reconhecimento de visitantes florais em aranhas que habitam flores (Thomisus spectabilis em Chrysanthemum frutescens) (Heiling et al. 2005a). Nossos resultados demostram que o número médio de visitas não é espelho do número médio de fuga em flores com aranhas de diferentes colorações.

Estudos demonstram a complexidade de associações neuronais envolvidas no comportamento de fuga exibido por insetos (Srinivasan 1994, Srinivasan et al. 1999,

Srinivasan 2010). As associações neuronais envolvidas nas respostas comportamentais de fuga são muito mais complexas que as respostas envolvidas nas respostas comportamentais de visitação (Srinivasan 1994, Srinivasan et al. 1999, Srinivasan 2010). Assim, uma

77 resposta que exige uma associação mais complexa de reconhecimento e interpretação dos insetos não poderia ter um padrão similar à resposta de atração e visita. O comportamento de fuga pode estar associado com neofobia em alguns sistemas (Dukas 2001, Abbot 2009,

Laundré et al. 2010). A neofobia consiste em uma resposta repulsiva do visitante floral frente a qualquer objeto com contraste pronunciado de coloração com a flor (Dukas 2001,

Abbot 2009, Laundré et al. 2010). Possivelmente a presença de algo diferente na flor estimula uma resposta de fuga frente a potencial risco de predação.

As respostas comportamentais das abelhas também são influenciadas pela distância que estas se encontram do objeto (Hart et al. 2000, Spaethe et al. 2001). Em longas distâncias as abelhas são capazes de detectar todas as aranhas em estudo, mas curiosamente a emissão de brilho floral é mais evidente que a emissão de brilho pelas aranhas. Esse contraste de coloração possivelmente permite o visitante ser atraído para as flores pela predominância do sinal floral mesmo detectando espécies de aranhas não crípticas sobre elas. E. heterogaster é detectado pelas abelhas apenas em longas distâncias, possivelmente os jovens se beneficiam da predominância do brilho floral permitindo que ocorra a aproximação dos insetos visitantes, pois os insetos, ao se aproximarem da flor seriam incapazes de detectar essa aranha, segundo os valores de contrastes de coloração e contraste acromático calculado segundo o modelo no sistema visual das abelhas. Já na fase adulta ocorre o inverso com E. heterogaster sobre folhas, pois eles são detectados sobre o pano de fundo verde das folhas (Vieira et al. Ver Capítulo 1). Todavia, a emissão de brilho é mais intensa em E. heterogaster que a emissão de brilho da folha que ele ocupa. Dessa forma, deduz-se que E. heterogaster mimetiza a própria unidade floral quando em estágio adulto.

Experimentos realizados por Llandres & Rodríguez-Gironés (2011a) revelam a importância

78 do sinal UV nos contrastes de curta e longa distância como um dos principais fatores que afetam a resposta de visitantes florais. Nosso estudo evidencia que a intensidade do sinal de

UV e intensidade de fluorescência parecem ser os principais sinais visuais responsáveis pelo reconhecimento de visitantes florais em Thomisidae. Embora nós utilizamos modelos no sistema visual de Hymenoptera comumente utilizado para entender a visão sob a perspectiva das presas, nós também sugerimos aqui que esses modelos poderiam ser utilizados para uma melhor compreensão no reconhecimento de tomisídeos na visão de potencias vespas predadoras. Nesse contexto, E. heterogaster jovens sobre flores estariam crípticos tanto na visão de presas quanto na visão de predadores, assim como, M. callinurus, M. argenteus e Tmarus sp. estariam conspícuos sobre flores tanto sob a perspectiva das presas como dos predadores.

A fluorescência pode desempenhar um papel semelhante ao da reflexão de UV podendo favorecer a cripsia em aranhas na visão de presas e potenciais predadores em certos contextos ecológicos (Andrews et al. 2008). O padrão observado nas análises de reflectância coincide com o padrão observado nas análises de fluorescência. Aranhas

Thomisidae com emissão de baixa intensidade de fluorescência apresentaram baixa reflexão de UV (Tmarus sp.). Já em aranhas claras que apresentaram alta emissão de fluorescência também apresentaram alta reflexão de UV. E. heterogaster apresenta o mais elevado valor de intensidade de fluorescência e de reflexão de UV. Estudos sugerem que moléculas com fotopigmentos (fluoróforos) podem estar desempenhando um papel fotoprotetor contra a radiação UV, principalmente em regiões equatoriais do globo

(Andrews et al. 2008, Insausti & Casas 2008, Théry & Casas 2009, Brechbühl et al. 2010).

Aranhas que permanecem longos períodos sobre as flores possuem cutícula fina e

79 transparente. (Andrews et al. 2008, Insausti & Casas 2008, Théry & Casas 2009,

Brechbühl et al. 2010). Desse modo, a proteção contra raios nocivos pode representar uma condição necessária para esses organismos sobreviverem (Morse & Fritz 982, Insausti &

Casas 2008, Théry & Casas 2009, Brechbühl et al. 2010, Herberstein

& Gawryszewski 2013). Aparentemente o padrão de reflexão em UV em Thomisidae varia em gradiente latitudinal e é evidenciado fortemente na faixa tropical (Heberstein et al.

2009). A reflexão de UV pode ser observada em nosso estudo em aranhas Neotropicais, assim como, em aranhas australianas (Thomisus spectabilis) (Heberstein et al. 2009), aranhas da Malásia (Gawryszewski 2011) e aranhas Indianas (Thomisus sp) (Bhaskara et al

2009). Estudos sugerem que o sinal de reflexão de UV e a fluorescência em aranhas podem ter evoluído independentemente e inúmeras vezes (Andrews et al. 2008, Heberstein et al.

2009, Herberstein & Gawryszewski 2013). No entanto, desconhecemos como sinais de cor evoluíram dentro da família Thomisidae e desconhecemos se há diferentes histórias evolutivas desses atributos da cor em um mesmo gradiente de latitude. Portanto, sugerimos que estudos evolutivos são necessários para compreensão da evolução da coloração nessas aranhas.

Concluímos que a resposta dos visitantes florais não é uniforme diante as diferentes estratégias de forrageio exibidas por aranhas de diferentes colorações quando exposta sobre flores. A intensidade da coloração parece ter um papel crucial na variação de respostas comportamentais de visitantes florais em flores com aranhas Thomisidae.

Agradecimentos

Os autores agradecem V.L.G. Brito pelo auxílio e acompanhamento nas análises de modelos de hexágonos de coloração e discussões. A. A. Lise pela identificação das Thomisidae. Ao Yuri Grandinete pelas identificações dos insetos. A. Degressi, B.B, Grisolia, T. N. Bernabé, M. Braga, A.T. Salomão, P., S. Diniz, A. Antiqueira por toda assistência de campo e discussões, T. N. Bernabé, M. Braga, A.T., B. Mamede e G. Migliorini no auxílio na alimentação das aranhas. Y. Messas e A. Degressi pelas fotos das aranhas. R. Soleman pelos desenhos das aranhas. Ao R. J. Poppi e a C. Martelli por todo o suporte nas análises de reflectância no laboratório de UV-Vis-NR no Instituto de Química da UNICAMP. Ao setor administrativo da Base de Estudos Ecológicos da Serra do Japi por ter autorizado o desenvolvimento deste estudo. Este estudo de doutorado foi desenvolvido no programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo/ FAPESP (2010/51523-5) e Projeto Universal CNPQ (470086/2011-4).

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Théry, M., Debut, M., Gomez D. & Casas, J. 2005. Specific color sensitivities of prey and

predator explain camouflage in different visual systems. Behavioral Ecology 16: 25-

29.

Tabela 1. Modelos lineares de efeitos mistos para avaliar a significância dos efeitos fixos (i.e., Tratamentos) comparando os tratamentos: flores sem aranha, flores com E. heterogaster, flores com M. argenteus, flores com M. callinurus, e flores com Tmarus sp. no comportamento de visita e fuga dos insetos visitantes florais totais, bem como himenópteros e lepidópteros (Grau de liberdade do numerador=3, Grau de liberdade do denominador =36).

Variação entre os Tratamentos F P

Visita Total 47,36 P<0,001 Visita Hymenoptera 45,48 P<0,001 Visita Lepidoptera+Diptera 32,10 P<0,001 Fuga Total 15,23 P<0,001 Fuga Hymenoptera 14,14 P<0,001 Fuga Hymenoptera+Diptera 9,95 P<0,001

Tabela 2. Modelos lineares de efeitos mistos para avaliar a significância dos efeitos fixos (i.e., Tratamentos) comparando os tratamentos: flores com aranhas com bloqueador solar dorsal, flores com aranhas com bloqueador solar ventral, flores sem aranha e flores com graveto no comportamento de visita e fuga dos insetos visitantes florais totais, bem como himenópteros e lepidópteros. (Grau de liberdade do numerador=3, Grau de liberdade do denominador =33).

Variação entre os Tratamentos F P Flores com E. heterogaster Visita Total 231,79 P<0,001 Visita Hymenoptera 155,87 P<0,001 Visita Lepidoptera+Diptera 112,81 P<0,001 Fuga Total 139,76 P<0,001 Fuga Hymenoptera 88,14 P<0,001 Fuga Hymenoptera+Diptera 159,3 P<0,001 Flores com M. argenteus Visita Total 196,68 P<0,001 Visita Hymenoptera 116,65 P<0,001 Visita Lepidoptera+Diptera 126,13 P<0,001 Fuga Total 126,15 P<0,001 Fuga Hymenoptera 122,74 P<0,001 Fuga Hymenoptera+Diptera 93,61 P<0,001 Flores com M.callinurus Visita Total 218,86 P<0,001 Visita Hymenoptera 144,72 P<0,001 Visita Lepidoptera+Diptera 100,76 P<0,001 Fuga Total 124,57 P<0,001 Fuga Hymenoptera 84,82 P<0,001 Fuga Hymenoptera+Diptera 152,00 P<0,001 Flores com Tmarus

Visita Total 168,56 P<0,001 Visita Hymenoptera 89,00 P<0,001 Visita Lepidoptera+Diptera 147,00 P<0,001 Fuga Total 167,11 P<0,001 Fuga Hymenoptera 118,92 P<0,001 Fuga Hymenoptera+Diptera 153,64 P<0,001

Tabela 3. Sumário das análises de teste t de contrastes cromáticos e acromáticos de aranhas sobre flores.

Contraste acromático Visão de Hymenoptera Contraste da cor Contraste de verde Pureza espectral Relativa Diferença do fotorreceptor verde

Aranhas sobre flores t g.l P t g.l. P t g.l. P t g.l. P

E.heterogaster em flores -3,78 99 0,99 1,77 16,55 0,09 0,21 17,84 0,82 -5,87 18 <0,001

M.argenteus em flores 61,76 99 <0,001 30,64 17,010 <0,001 28,08 17,82 <0,001 -29,05 18 <0,001

M.callinurus em flores 82,21 99 <0,001 45,70 17,158 <0,001 39,05 14,91 <0,001 -43,68 18 <0,001

Tmarus em flores 85,27 99 <0,001 42,17 15,01 <0,001 36,33 16,28 <0,001 -74,81 18 <0,001

Lista de Figuras

Figura 1. Foto dos tratamentos do experimento do efeito de aranhas sobre visitantes florais

(A) flores de Rubus rosifolius sem aranha, (B) flores com o tomisídeo Epicadus heterogaster, (C) flores com o tomisídeo Misumenops argenteus, (D) flores com o tomisídeo Misumenops callinurus (E) flores com o tomisídeo Tmarus sp.

Figura 2. Foto sob luz visível das aranhas utilizadas no experimento de manipulação da coloração da aranha. As aranhas da coluna à esquerda foram tratadas com protetor solar na parte ventral e as da direita com protetor solar na parte dorsal. (A) Epicadus heterogaster,

(B) Misumenops argenteus, (C) Misumenops callinurus e (D) Tmarus sp.

Figura 3. Foto sob luz UV das aranhas utilizadas no experimento de manipulação da coloração da aranha. As aranhas da coluna à esquerda foram tratadas com protetor solar na parte ventral e as da direita com protetor solar na parte dorsal. (A) Epicadus heterogaster,

(B) Misumenops argenteus, (C) Misumenops callinurus e (D) Tmarus sp.

Figura 4. Número médio de (A) visitas e (B) fuga /600 min. de insetos visitantes em flores com diferentes espécies de Thomisidae. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (LME com teste a posteriori de Tukey, P < 0,05).

Figura 5. Número médio de (A) visitas e B) fuga /720 min. de insetos visitantes em flores com a aranha Epicadus heterogaster tratada com protetor solar na região dorsal, ventral,

90 flores com graveto e flores controle. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (LME com teste a posteriori de Tukey, P < 0,05).

Figura 6. Número médio de (A) visitas e (B) fugas /720 min de insetos visitantes em flores com a aranha Misumenops argenteus tratada com protetor solar na região dorsal, ventral, flores com graveto e flores controle. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (LME com teste a posteriori de Tukey, P < 0,05).

Figura 7. Número médio de (A) visitas e (B) fugas /720 min de insetos visitantes em flores com a aranha Misumenops callinurus tratada com protetor solar na região dorsal, ventral, flores com graveto e flores controle. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (LME com teste a posteriori de Tukey, P < 0,05).

Figura 8. Número médio de (A) visitas e (B) fugas /720 min de insetos visitantes em flores com a aranha Tmarus sp tratada com protetor solar na região dorsal, ventral, flores com graveto e flores controle. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (LME com teste a posteriori de Tukey, P < 0,05).

Figura 9. Espectros de reflectância das aranhas de 300 a 700 nm sobre flores: Epicadus heterogaster vs. flor, Misumenops argenteus vs. flor, Misumenops callinurus vs. flor e

Tmarus sp. vs. flor. A região localizada à esquerda da linha tracejada indica a região de espectro invisível de UV.

Figura 10. Espectros de intensidade de excitação e emissão de fluorescência das aranhas.

(A) Epicadus heterogaster, (B) Misumenops argenteus, (C) Misumenops callinurus e (D)

Tmarus sp.

Figura 11. Espectros de intensidade de excitação e emissão de fluorescência em três dimensões (comprimento de onda de excitação (eixo x), comprimento de onda de emissão

(eixo y da direita) e intensidade da cor (eixo y da esquerda) (A) Epicadus heterogaster, (B)

Misumenops argenteus, (C) Misumenops callinurus e (D) Tmarus sp.

Figura 12. Representação geométrica de quatro estímulos de diferentes espécies de aranhas baseados na estimulação relativa de cada fotorreceptor no sistema visual de abelhas (Apis melífera) (A) Visualização no espaço de cor de abelhas para Epicadus herogaster, (B)

Misumenops argenteus, (C) Misumenops callinurus, (D) Tmarus sp. sob flores como pano de fundo.

Figura 13. Valores médios das propriedades cromáticas e acromáticas visualizadas no espaço de cor de abelhas (A) Contraste de verde, (B) Pureza espectral e C) Contraste acromático entre espécies de aranhase flores. Barras de erro representam ± 1 Erro Padrão

(P<0,05; test t).

A) B)

C) D)

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

18 A)Visitação SemFlores aranha sem aranha

16 a EpicadusFlores comheterogaster E. heterogaster 1 - 14 M.Flores callinurus com M. callinurus M.Flores argenteus com M. argenteus 12 a TmarusFlores com Tmarus sp.

flores 10

. . 1 - 8 b a 6 b b b 4 c b 2 b b [600 min] d c b 0 Visitantes Totais Hymenoptera Diptera+ Lepidoptera

insetos 18 B)Fuga c 16

(no.de (no.de 14 12 c

orais fl 8 b b 6 b c b b 4 b b b a a b D)2 a Visitantes 0 Visitantes Totais Hymenoptera Diptera+ Lepidoptera

. Figura 4.

A)Visitação 40 TmarusE. heterogastersp. com combloqueador bloqueador dorsal dorsal 40 A)Visitação b Tmarus sp. com bloqueador dorsal c TmarusTmarusE. heterogaster sp.sp. com com bloqueador combloqueador bloqueador ventral ventral ventral

1 35 Flor com graveto - 35 FlorFlor com com graveto graveto FlorFlor sem sem aranha aranha

30 - 30 c b

flores 25 25

. .

1 flores

- 20 . .

1 20 - 15 b 15 c 10 b b 10

[720 min] 5 b [720 min] [720 a a a a a a 0 5 a a a a a a a a a

0 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera insetos

insetos Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera 45 B)FugaB)Fuga 45 c

40 a (no.de (no.de (no.de a 40 a 35 c

30 35 lorais

Florais a a f a 25 30 20 25 15 20a

a b Visitantes 1 15 10 a a a Visitantes b 10 b 5 a a d d d 0 5 b b b 0 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera

Figura 5.

A)Visitação 40 Tmarus sp. com bloqueador dorsal 40 A)Visitação b TmarusM. argenteus sp. comcom bloqueadorbloqueador dorsal dorsal c Tmarus sp. com bloqueador ventral

1 TmarusM. argenteus sp. comcom bloqueadorbloqueador ventral ventral - 35 35 FlorFlorFlor comcom com gravetograveto graveto FlorFlor sem sem aranha aranha 30 Flor com aranha

- 30

flores c b . .

1 25 - 25

flores 20 . .

1 20 - 15 b 15 [720 min] 10 b b 5 10 b a

[720 min] [720 a a a a a a 0 insetos 5 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera a a a a a a a a a 45 0B) Fuga

insetos c (no.de (no.de Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera 40 B)Fuga 35 45 c

lorais a (no.de 30 a f 40 a 25 35 20

Florais 30 a a a 15 a c a

Visitantes 10 25 a 5 20 b b b b b b

0 Visitantes 1 15 Total Hymenoptera Lepidoptera+Dipteraa a a 10 5 Figura 6 b b b 0 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera

A)Visitação Tmarus sp. com bloqueador dorsal 40 TmarusM. callinurus sp. comcom bloqueador bloqueador dorsaldorsal 40 b A)Visitação c TmarusM.Tmarus callinurus sp.sp. com com bloqueador bloqueadorbloqueador ventralventral ventral

3535 FlorFlorFlor comcom com gravetograveto graveto 1 - FlorFlorFlor semcom sem aranha aranha 30 - 30 c b 25

flores 25

. .

1 flores

- 20 . .

1 20 - b 15 c 1015 b b b

[720 min] 105 a a a a a [720 min] [720 a 05 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera a a a insetos a a a a a a 45 0 B)Fuga

insetos c Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera 40 B)Fuga (no.de (no.de 3545 a c

(no.de a

3040 a lorais

f 25 35 20

Florais 30 a a a a 15 a c 1025 b b a Visitantes 520 d b d d

0 Visitantes 1 15 Total Hymenoptera Lepidoptera+Dipteraa a a 10

5 Figura 7. b b b 0 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera

40 Tmarus sp. com bloqueador dorsal A)Visitação b Tmarus sp. com bloqueador dorsal TmarusTmarus sp.sp. com com bloqueador bloqueador ventral ventral 35 FlorFlor com com graveto graveto FlorFlor sem sem aranha aranha 30

1 b - 25

flores 20

. . 1 - 15 b 10

[720 min] [720 5 a a a a a a a a a 0

Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera insetos 45 B)Fuga a a a

40 (no.de 35 a a

30 a Florais 25 20 15 a a a Visitantes 10 5 b b b 0 Total Hymenoptera Lepidoptera+Diptera

Figura 8.

100

45 A) 45 Epicadus heterogaster (n=10) Flor (n=10) 40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700

45 45 B) Flor (n=10) 40 Misumenops argenteus (n=10) 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5

Reflectância 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700

de de Misumenops callinurus (n=10) Flor (n=10) 45 C) 45 40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0

300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Porcentagem

45 D) 45 Tmarus sp (n=10) Flor (n=10) 40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Comprimento de onda (nm)

Figura 9.

101

A B

.) Misumenops argenteus

Epicadus heterogaster u.a

C D

Tmarus sp.

Misumenops callinurus Intensidade de fluorescência ( fluorescência de Intensidade

Comprimento de onda (nm)

Figura 10.

102

A B

)

nm de onda de emissão( de onda de

C D Comprimento Comprimento

Comprimento de onda de excitação(nm)

Figura 11.

103

E(B) E(B) A) B)

Aranha Pano de fundo

Pano de fundo Aranha E(UV) E(G) E(UV) E(G)

Epicadus heterogaster Misumenops argenteus

E(B) E(B) C) D)

Pano de fundo Pano de fundo

Aranha Aranha

E(G) E(UV) E(G) E(UV)

Tmarus sp. Misumenops callinurus

Figura 12.

104

0,2 A) * Aranha Flor * 0,16 *

0,12

0,08

0,04

0 Contraste de verde (Unidades de Hexágono) de (Unidadesverde de Contraste E. heterogaster M. argenteus M. callinurus Tmarus sp.

B) 0,4 *

0,35 * 0,3 * 0,25

0,2

0,15 espectral Relativa espectral 0,1

Pureza 0,05 0 E. heterogaster M. argenteus M. callinurus Tmarus sp. C) 0,9 * 0,8 * * *

0,7 0,6 0,5 0,4

0,3

acromático Contraste 0,2 0,1 0 E. heterogaster M. argenteus M. callinurus Tmarus sp

Figura 13.

105

Apêndice 1. Lista de morfoespécies de insetos visitantes florais em Rubus rosifolius referente ao experimento: Efeito de aranhas sobre a taxa de visitas de insetos.

Ordem Família Morfoespécie

Coleoptera Curculionidae Curculionidae sp1

Diptera Asilidae Asilidae sp.1

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.1

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.2

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.3

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.4

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.5

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.6

Hymenoptera Apidae Apis mellifera

Hymenoptera Apidae Apidae sp.1

Hymenoptera Apidae Apidae sp.2

Hymenoptera Apidae Apidae sp.3

106

Hymenoptera Apidae Apidae sp.4

Hymenoptera Apidae Apidae sp.5

Hymenoptera Apidae Apidae sp.6

Hymenoptera Apidae Apidae sp.7

Hymenoptera Apidae Apidae sp.8

Hymenoptera Apidae Apidae sp.9

Hymenoptera Apidae Apidae sp.10

Hymenoptera Apidae Bombus brasilienses

Hymenoptera Apidae Bombus sp.

Hymenoptera Apidae Melipona sp1

Hymenoptera Apidae Melipona sp2

Hymenoptera Apidae Melipona sp3

Hymenoptera Apidae Trigona sp.1

Hymenoptera Apidae Trigona sp.2

Hymenoptera Apidae Trigona sp.3

Hymenoptera Crabronidae Crabronidae sp.1

107

Hymenoptera Halictidae Halictidae sp.1

Hymenoptera Halictidae Halictidae sp.2

Hymenoptera Halicitida Halictidae sp.3

Hymenoptera Halicitida Halictidae sp.4

Hymenoptera Ichneumonidae Ichneumonidae sp.1

Hymenoptera Sphecidae Sphecidae sp.1

Hymenoptera Sphecidae Sphecidae sp.2

Hymenoptera Vespidae Agelaia vicina

Hymenoptera Vespidae Omicron tuberculatum

Hymenoptera Vespidae Pachymenes sp

Hymenoptera Vespidae Polistes versicolor

Hymenoptera Vespidae Polybia sp.1

Hymenoptera Vespidae Polybia sp.2

Hymenoptera Vespidae Polybia sericea

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.1

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.2

108

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.3

Lepidoptera Nymphalidae Aeria olena

Lepidoptera Nymphalidae Heliconius erato

Lepidoptera Nymphalidae Heliconius sp

Lepidoptera Nymphalidae Hamadryas epinume

Lepidoptera Nymphalidae Nymphalidae sp.1

Lepidoptera Nymphalidae Phyciodes claudina

Lepidoptera Papilionidae Thecla sp

109

Apêndice 2. Lista de morfoespécies de insetos visitantes florais em Rubus rosifolius referente ao experimento: Manipulação da coloração da aranha - análise de pistas visuais.

Ordem Família Morfoespécie

Coleoptera Chrysididae Cleptidea sp

Coleoptera Curculionidae Curculionidae sp1

Diptera Asilidae Asilidae sp.1

Diptera Asilidae Asilidae sp.2

Diptera Chloropidae Chloropidae sp.1

Diptera Ctenostylidae Ctenostylidae sp.1

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.1

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.2

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.3

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.4

Diptera Syrphidae Syrphidae sp.5

Hymenoptera Apidae Apis mellifera

110

Hymenoptera Apidae Apidae sp.1

Hymenoptera Apidae Apidae sp.2

Hymenoptera Apidae Apidae sp.3

Hymenoptera Apidae Apidae sp.4

Hymenoptera Apidae Apidae sp.5

Hymenoptera Apidae Apidae sp.6

Hymenoptera Apidae Apidae sp.7

Hymenoptera Apidae Apidae sp.8

Hymenoptera Apidae Apidae sp.9

Hymenoptera Apidae Bombus brasilienses

Hymenoptera Apidae Bombus sp

Hymenoptera Apidae Melipona sp1

Hymenoptera Apidae Melipona sp2

Hymenoptera Apidae Melipona sp3

Hymenoptera Apidae Trigona sp1

Hymenoptera Apidae Trigona sp2

111

Hymenoptera Apidae Trigona sp3

Hymenoptera Anthophoridae Anthophoridae sp1

Hymenoptera Argidae Argidae sp.1

Hymenoptera Crabronidae Crabronidae sp.1

Hymenoptera Crabronidae Crabronidae sp.2

Hymenoptera Halictidae Halictidae sp.1

Hymenoptera Halictidae Halictidae sp.2

Hymenoptera Ichneumonidae Ichneumonidae sp.1

Hymenoptera Sphecidae Sphecidae sp.1

Hymenoptera Vespidae Agelaia vicina

Hymenoptera Vespidae Omicron tuberculatum

Hymenoptera Vespidae Pachymenes sp

Hymenoptera Vespidae Polistes versicolor

Hymenoptera Vespidae Polybia sericea

Hymenoptera Vespidae Polybia sp.1

Hymenoptera Vespidae Polybia sp.2

112

Hymenoptera Vespidae Polybia sp.3

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.1

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.2

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.3

Lepidoptera Hesperiidae Hesperiidae sp.4

Lepidoptera Hesperiidae Urbanus chalco

Lepidoptera Nymphalidae Aeria olena

Lepidoptera Nymphalidae Hamadryas epinume

Lepidoptera Nymphalidae Nymphalidae sp.1

Lepidoptera Nymphalidae Phyciodes claudina

Lepidoptera Pieridae Appias drussila

Lepidoptera Pieridae Pieridae sp.1

Lepidoptera Pieridae Pieridae sp.2

113

Crédito da foto: Andressa Degressi

114

CAPÍTULO 3

Evolução de coloração em aranhas Thomisidae

Camila Vieira1, Claudia M. Aparecida Carareto2, Ronei Jesus Poppi3, Arno Antônio Lise4,

Andrew Rominger5, Rosemary G. Gillespie5 & Gustavo Q. Romero6

1Pós-graduação em Ecologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CP

6109, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil

2Departamento de Genética, IB, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas

(UNESP), CEP 15054-000, São José do Rio Preto - SP, Brasil

3Departamento de Química Analítica, IQ, Instituto de Química, Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), CP 6154, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil

4Departamento de Biologia, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica

do Rio Grande do Sul (PUC), CP 1429, CEP 9061-9900, Porto Alegre-RS, Brasil

5Department of Environmental Science, Policy & Management, Mulford Hall, University of

California Berkeley, (UC BERKELEY), ZipCode 3114, CEP 94720, Berkeley-CA, EUA

6Departamento de Biologia Animal, IB, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP),

CP 6109, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil

115

Resumo

As relações entre as espécies de Thomisidae, assim como, a compreensão de como características ecológicas relacionadas à coloração evoluíram nesta família é um tema intrigante e ainda pouco explorado, principalmente em espécies tropicais. A diversidade de espécies com colorações e comportamentos diversos e altamente especializados dentro da família nos instiga a compreender como a emissão de fluorescência e reflexão do sinal de

UV evoluiu neste grupo. Nesse estudo, nós investigamos com análises filogenéticas utilizando sequências de genes mitocondriais (COI e 16S) e nuclear (Histona), como a coloração evoluiu (i.e., intensidade de fluorescência e reflexão de UV) em diferentes

Thomisidae tropicais. Especificamente nós investigamos: (1) a variação da intensidade de fluorescência e reflexão de UV estudando desde gêneros basais até gêneros que divergiram mais recentemente; (2) se as diferentes estratégias de forrageio podem estar relacionadas com a evolução da coloração; (3) se as características ecológicas (intensidade de fluorescência e reflexão de UV) evoluíram de modo aleatório e independentemente durante o processo de ramificação de Thomisidae. Esse estudo resultou na proposta de uma nova filogenia molecular de Thomisidae tropicais mapeando pela primeira vez características ecológicas relacionadas à coloração. O estado ancestral de Thomisidae parece exibir baixa intensidade de fluorescência e reflexão de UV. Essas características evoluíram de forma não correlacionada e contém sinal filogenético na família Thomisidae da região

Neotropical. O tipo de substrato parece estar modulando mais a historia de vida dos organismos que a intensidade das características fenotípicas relacionadas a coloração.

Palavras-chave: características ecológicas, emissão de fluorescência, evolução de cor, reflexão de UV, sinal filogenético.

116

Introdução

A emissão de fluorescência, embora tenha sido abordado em estudos para diversos táxons (Haddock et al. 2005, Marshall et al. 1996), em aranhas, esse conhecimento ainda é bastante escasso (Lim et al. 2007, Andrews et al. 2008). Em Thomisidae, especificamente, a evolução de coloração é um tema ainda pouco explorado, principalmente em espécies tropicais. A diversidade de espécies com colorações e comportamentos variados e altamente especializados dentro da família nos instiga a compreender de como a emissão de fluorescência e reflexão de UV evoluiu neste grupo.

Os tomisídeos podem influenciar a visita de insetos em plantas por meio de emissão de sinais visuais alterando o comportamento e resposta da presa (Dukas & Morse 2003, Dukas

& Morse 2005, Heiling et al. 2005a,b, Gonçalves-Souza et al. 2008). Em Thomisidae, os estudos filogenéticos de evolução do comportamento e da coloração, mais especificamente evolução da intensidade de fluorescência e reflexão de UV são praticamente inexistentes.

Além disso, as filogenias de Thomisidae disponíveis na literatura incluemuma diversidade muito pequena dos gêneros existentes. O estudo filogenético molecular mais recente publicado por Benjamim et al. (2008) e Benjamin (2011) inclui apenas dois gêneros de

Thomisidae que ocorrem no Brasil, dois dentro do clado Thomisus (i.e., Tmarus e

Aphantochilus) e outro dentro do clado de Stephanopis (i.e., Stephanopis). Este estudo corrobora a monofilia de Thomisidae por três sinapomorfias moleculares do fragmento do gene 16S. Todas as análises filogenéticas realizadas por Benjamim et al. (2008) dão origem

117 a quatro linhagens bem definidas dentro de Thomisidae. Os clados são informalmente nomeados como clado Borboropactus, clado Epidius, clado Stephanopis e Thomisus sendo que os tomisídeos que divergiram mais recentemente pertencem ao clado Thomisus

(Benjamim et al. 2008).

De acordo com nossas observações pessoais os gêneros que divergiram mais recentemente na filogenia proposta por Benjamim et al. (2008, 2011) forrageiam em flores, têm exoesqueleto fino, parecem permitir entrada de luz UV nos tecidos (grande concentração de fluoróforos) e consequentemente podem expressar maior fluorescência.

Em contraste, os gêneros mais basais não usam flores para forragear, têm exoesqueleto espesso e parecem impedir entrada de luz nos tecidos (pouca concentração de fluoróforos).

As espécies de Thomisidae que forrageiam por emboscada (i.e., senta-e-espera) sobre flores e apresentam coloração clara e se não possuírem características comportamentais e/ou físicas que favoreçam o sucesso de captura de presas pode ter sua sobrevivência reduzida

(Heiling & Heberstein 2004, Heiling et al. 2003, Heiling et al. 2005b, Heberstein et al.

2009, Vieira et al. capítulo 2). Espécies que forrageiam em folhas quando adultos (i.e.,

Epicadus heterogaster) também apresentam coloração clara e tem habilidade de mudar de coloração corporal, possuem o abdômen semelhante a flores e são capazes de atrair abelhas mesmo sobre folhas verdes sem flores nas proximidades (Peixoto et al. 2012, Vieira et al. capítulo 1, os autores, dados não publicados). Em contraste, outras espécies de Thomisidae que forrageiam em ramos secos com baixa densidade de presas tem sua coloração pálida ou marrom (e.g., Tmarus sp.) (Vieira et al. capítulo 1). Uma vez que concentração de fluoróforos é variável entre os táxons e essas moléculas estão relacionadas ao reconhecimento das presas pode ser que diferentes estratégias de forrageio estejam

118 relacionadas à evolução das características relacionadas à coloração (Chittka et al. 1994,

Chittka 2001, Théry & Casas 2002, Heiling et al. 2003, 2004, Andrews et al. 2008).

Neste trabalho nós investigamos com análises filogenéticas utilizando sequências de genes de DNA em genes mitocondriais (COI e 16S) e nuclear (Histona), como evoluiu a coloração (i.e., intensidade de fluorescência e reflexão de UV) em diferentes espécies de aranhas Thomisidae tropicais. Especificamente nós investigamos: (1) a variação da intensidade de fluorescência e reflexão de UV estudando desde gêneros basais até gêneros de divergência mais recente; (2) se as diferentes estratégias de forrageio podem estar relacionadas com a evolução da coloração; (3) se as características ecológicas (intensidade de fluorescência e reflexão de UV) evoluíram de modo aleatório e independentemente durante o processo de ramificação das aranhas. Nossa hipótese é que tomisídeos de coloração escura (e.g., Tmarus) que vivem em substratos com baixa densidade de presas

(ramos secos) apresentem menor concentração de fluoróforos do que as espécies ou gêneros que podem ter divergido mais recentemente. Esperamos que espécies mais aparentadas sejam mais semelhantes entre si fenotipicamente do que o esperado ao acaso e que as características relacionadas à coloração em Thomisidae apresentem um sinal filogenético segundo um modelo de movimento browniano da evolução (Felsenstein 1985).

Material & métodos

Áreas de estudo e organismo

Para estimar a filogenia de Thomisidae, nós amostramos 14 gêneros e 140 espécies de Thomisidae Neotropicais com colorações diversas, incluindo desde gêneros basais até os gêneros que divergiram mais recentemente de acordo com a observação de alguns gêneros

119 tropicais incluídos na filogenia de Thomisidae proposta por Benjamim et al. (2008) e

Benjamim et al. (2011) (Tabela 1). As amostragens e observações naturalísticas foram realizadas em 22 áreas naturais que apresentam ocorrência de Thomisidae: Reserva

Biológica da Serra do Japi (1), situada a oeste do Planalto Atlântico, próximo ao município de Jundiaí-SP, Estação Ecológica da Juréia- Itatins-SP (2), Parque Estadual da Ilha do

Cardoso-SP (PEIC) (3), Parque Estadual da Serra do mar no Núcleo Picinguaba-SP (4),

Parque Estadual da Serra do Mar no Núcleo de Santa Virgínia-SP (PESM) (5), Parque

Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP (6), fragmentos florestais de Campinas (7), fragmentos florestais de Santa Genebra-SP (8), fragmentos florestais da região de Jaú-SP (9), fragmentos florestais da região de Ibirá- SP (10), fragmentos florestais da região de Cedral-

SP (11), fragmentos florestais da região de São José do Rio Preto-SP (12), fragmentos florestais da região de Mirassol-SP (13), fragmentos florestais da região de Magda-SP (14), fragmentos florestais da região de Rosana-SP (15), Reserva Boqueirão-Unilavras-MG (16),

Restinga de Iquipari-RJ (17), Reserva Natural da Vale do Rio Doce Linhares –ES (18),

Ilhéus –BA (19), Salvador-BA (20), fragmentos florestais de Pelotas-RS (21), região do

KM 41 da Amazônia Central-AM (22) (Figura 1 da Introdução Geral p.23 e Tabela 1).

As aranhas amostradas foram cuidadosamente transportadas ao laboratório e mantidas individualmente em frascos plásticos com condições de luz e temperatura ideal variando de 24°C a 34°C até o momento da realização das análises e extração do DNA.

Nós utilizamos partes diferentes do mesmo indivíduo para realização das análises de intensidade de emissão fluorescência e reflexão de UV (abdômen) e extrações de DNA

(pernas).

120

Análise de intensidade de fluorescência

Para quantificar a emissão de fluorescência das espécies em estudo, nós utilizamos um espectrômetro de fluorescência molecular da marca Varian modelo Cary Eclipse. Os abdomens das aranhas foram pesados e triturados em etanol absoluto Merck. Seccionamos e trituramos 1mg de massa de abdômen em cada espécie amostrada de Thomisidae e diluímos em 8 ml de etanol. Assim, a concentração da extração manteve-se padronizada em todas as espécies. As soluções foram deixadas em descanso no escuro por 48 h em temperatura ambiente. As extrações foram centrifugadas a 4000 r.p.m. por 5 min., e o sobrenadante foi analisado utilizando uma cubeta de quartzo com caminho óptico de

10mm. As fendas de excitação e emissão foram de 5 nm cada. Os dados das análises de espectrofluorimetria foram plotados nos gráficos usando o programa MatLab 7.8.

Espectro de reflectância das aranhas e flores

Nós mensuramos a reflectância espectral entre os comprimentos de onda de 300 a

700 nm de todos os abdomens das aranhas amostradas. Nós utilizamos o espectrofotômetro

Cary 5000 UV- Vis- NIR (Varian, Australia) com um alto desempenho fotométrico nos espectros de variação entre 175-3300 nm. Nós utilizamos dois controles acromáticos: preto e branco como fundo de calibração antes da mensuração de cada amostra. Nós utilizamos o número médio dos espectros para estimar a intensidade máxima de reflexão de UV. Todas estas análises foram realizadas no laboratório de UV-Vis-NR / luminescência / Polarimetria no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

121

Sequenciamento de DNA

Nesse estudo nós utilizamos sequências de dois genes mitocondriais citocromo oxidase subunidade I (COI) e 16S rRNA (16S) e um gene nuclear Histona H3 (H3). O

DNA genômico das espécies de Thomisidae foi extraído de 2-4 pernas usando o kit de extração DNeasy Blood & Tissue (Qiagen Valencia, California, USA). Realizamos a extração com material fresco ou de aranhas intactas preservadas em etanol absoluto Merck

46.07 g/mol. Após a extração foi feita uma avaliação da qualidade do DNA obtido através de eletroforese em gel de agarose 1%. A concentração do DNA foi analisada através de espectrofotômetro (NanoDrop). Para os genes mitocondriais: citocromo oxidase subunidade

I (COI) e 16S rRNA (16S) desenhamos e sintetizamos os primers: COIf (5’-

GGDTTTGGDAAYTGR-3’), COIr (5’- GTDGCHGCAGTAAAATADGC-3’) e 16Sf (5-

TGCTAAGGTAGCATAATMA-3’) 16Sr (5’-DTTTWAAAGTCGAACAGAC-3’) e para o gene nuclear Histona H3 utilizamos os primers usados em tomisídeos por Benjamin et al.

(2008). (H3) H3aF: (5’-ATG GCT CGT ACCAAGCAG AC (ACG) GC-3); e H3aR: (5’-

ATA TCC TT (AG) GGC AT (AG) AT (AG) GTG AC-3’) e descritos por Colgan et al.

(1998). Nós desenhamos os primers para citocromo oxidase subunidade I (COI) e 16S rRNA com base em sequências disponíveis no Genbank: COI (DQ174373, DQ174382,

FJ590816, FJ590812, DQ174395, DQ174396, DQ174397, EU168178, EU168187,

KF669342, EU168181, KF975454, EU168167, KF669378, HQ924573, JN817244,

KF367975, JN817246, KF669362) e 16S rRNA (EU168126, EU168129, JN816620,

JN816610, EU168123, JN816611, JN816607, EU168132, EU168127, JN816615,

EU168152, JN816613, EU168124).

122

A reação de PCR foi preparada para um volume final de 25 μL com o uso de 200 ng

DNA genômico, 1 mM de tampão, 1 mM de MgCl2, 1 mM de dNTPs, 1 mM de cada primer e 0.125 unidades de Taq polymerase (Invitrogen). As condições do PCR foram: desnaturação inicial (95°C, 120s); seguido por 35 ciclos de desnaturação (95°C, 30 s), temperatura de hibridização (54°C para Histona e 48°C para 16S e COI, 45 s), extensão

(72°C, 60 s) e 72 ° C de espera por 10 min. Posteriormente a técnica de PCR, fizemos uma nova eletroforese em gel de agarose a 1% para verificar a qualidade e especificidade dos produtos obtidos, comparando-os aos fragmentos de um padrão de peso molecular.

Realizamos a purificação dos produtos da PCR que foram utilizados no sequenciamento com uso do kit “GFX PCR DNA” (GE HEALTHCARE) e quantificamos a concentração do DNA purificado usando o Nanodrop nd-1000 spectrophotometer version 3.0.1

(NanoDrop Technologies).

Sequenciamento e Alinhamento: Os produtos da PCR dos genes H3, 16S e COI foram sequenciados em um sequenciador automático ABI (Applied Biosystems, Foster

City, CA) no Laboratório GENOMA da USP de São Paulo. Após a amplificação e o sequenciamento dos segmentos gênicos de cada um dos três genes, obtivemos sequências de 325 pb para H3, 626 pb para COI e 337 para 16S. Essas sequências foram então concatenadas (1.288 pb) para a realização das análises subsequentes. As sequências obtidas foram editadas e alinhadas com o auxílio do programa Geneious 8.1.4

(http://www.geneious.com). O alinhamento das sequências foi realizado com o programa

MAFFT (Katoh & Standley 2013) incluído no programa Geneious 8.1.4.

Seleção de modelos de substituição nucleotídica.

123

Nós usamos o programa jModeltest 3.06 (Posada & Crandall, 1998,) para seleção do modelo de melhor ajuste de parâmetros de substituição nucleotídica nas sequências em estudo com base no AICc (Critério de informação de Akaike). O modelo com maior valor de AICc (Critério de informação de Akaike corrigido) é escolhido como o modelo de melhor ajuste. Para cada modelo, computamos o valor de máxima verossimilhança (LNL).

A não uniformidade das taxas evolutivas entre os sítios pode ser modelada utilizando uma distribuição discreta Gama (+ G) com certa percentagem invariável (+ I). Estimamos também as frequências de cada base nucleotídica nas sequências e para estimar os valores máxima verossimilhança, uma topologia de árvore foi estimada automaticamente. As sequências concatenadas (H3+ 16S + COI) foram particionadas nas posições de cada gene usando o programa Mesquite v2.75 (Maddison & Maddison 2011) e analisamos cada sequência particionada com o modelo de melhor ajuste.

Estimativa filogenética e estimativa de tempo de divergência

Estimamos a árvore filogenética com os genes concatenados pelo método Bayesiano com cadeias convergentes de MCMC em 100.000.000 gerações com árvores amostradas a cada 10.000 gerações. As primeiras 1.000 árvores amostradas foram descartadas no burn-in por meio do TreeAnnotator (Drummond et al. 2012). Após o descarte das primeiras 1.000

árvores, nós estimamos uma árvore consenso com melhor probabilidade posterior (PP) computada para cada nó. A árvore consenso estimada pelo método bayesiano foi visualizada e editada com o software Figtree 1.4 (Rambaut 2009). Para diagnosticar o padrão das cadeias convergentes e verificar se há independência das amostragens visualizamos o tamanho eficaz da amostra (ESS) no programa Tracer v1.6 (Rambaut &

Drummond 2009). Estimativas com valores baixos de ESS (menores que 100) não devem

124 ser utilizadas para estimar a topologia, pois indicam alta correlação nas amostragens e, portanto não apresentam uma distribuição posterior confiável (Rambaut 2009). Nós utilizamos o método Bayesiano de relógio molecular relaxado lognormal para co-estimar a topologia da árvore consenso e o tempo de divergência utilizando o programa BEAST v1.6.1.(Drummond et al. 2006) . Para datação dos nós da topologia nós utilizamos a idade fóssil de Xysticus archaeopalpus (5,7 milhões de anos) como ponto máximo de calibração

(Leech & Matthews 1971).

Para uma melhor compreensão da história evolutiva de cada gene em Thomisidae, nós também estimamos uma árvore filogenética para os genes individuais (H3, COI e 16S).

Nessa estimativa nós escolhemos os principais representantes de cada gênero e estimamos a filogenia pelo método de Verossimilhança Máxima (ML), as análises foram conduzidas no programa PhyML (Guindon et al. 2010) implementado no programa Geneious 8.1.4

(http://www.geneious.com). As árvores consenso foram visualizadas e editadas com o software Figtree 1.4 (Rambaut 2009). (Apêndice 1, Apêndice 2 e Apêndice 3).

Análises filogenéticas comparativas: Mapeamento do caráter fenotípico na filogenia

Para visualizar a evolução dos caracteres ao longo da filogenia, nós mapeamos e plotamos a intensidade máxima de fluorescência e intensidade máxima de reflexão de UV na filogenia estimada de Thomisidae. Nós utilizamos um método filogenético comparativo de reconstrução de caráter ancestral com base numa abordagem de máxima verossimilhança (Schluter et al. 1997, Revell 2013). Segundo esta abordagem, supõe-se que a característica tenha evoluído no âmbito de um processo de movimento browniano, onde a diferença esperada entre quaisquer duas espécies é proporcional ao tempo de divergência

125 com relação ao ancestral comum mais recente (Felsenstein 1985). Desse modo, os estados de caracteres nos nós pode ser calculado minimizando a soma dos quadrados das mudanças ao longo dos ramos da árvore (McArdle & Rodrigo 1994.). Os estados de caracteres ao longo dos ramos são calculados por interpolação de valores entre os nós (Revell 2013).

Embora a elevada incerteza das estimativas pontuais (Schluter et al., 1997), esta método é extremamente útil para visualização da direção das mudanças evolutivas até os nós mais recentes em uma filogenia (Revell 2013) . Para visualização da evolução do caráter contínuo, o método estima uma figura no qual barra horizontal é ao mesmo tempo uma legenda e escala. As cores vermelhas correspondem a valores fenotípicos relativamente baixos. Já a tonalidade de cor verde e azul representam maiores valores dos traços (Revell

2013). Nós utilizamos o valor máximo de intensidade das características ecológicas para estimar a incerteza do traço fenotípico no ancestral, uma vez que os valores de intensidade máxima são os valores mais informativos das curvas de emissão de fluorescência e reflexão de UV. As análises foram realizadas no software R. versão 3.1.3 com a função contMap no pacote “phytools” (R Development Core Team 2014).

Para não ignorarmos a incerteza considerável inerente à estimativa do estado ancestral ao plotarmos somente o valor estimado do fenótipo ao longo dos ramos da árvore

(Schluter et al. 1997, Losos 2011), nós calculamos os intervalos de confiança de 95% nos nós internos e então interpolamos linearmente ao longo dos ramos. Esta projeção além de mostrar os valores ancestrais estimados para cada característica fenotípica, também mostra a incerteza sobre estados ancestrais ao longo dos ramos e nos nós (Revell 2013). A projeção da filogenia é visualizada em um espaço definido por fenótipo (em y) e tempo (x), desde a origem. A posição vertical dos nós e ramos é calculada por meio de estimativa de

126 caráter ancestral por máxima verossimilhança (Schluter et al. 1997). A incerteza é mostrada com o aumento da transparência das linhas azuis desenhadas em torno das estimativas pontuais e com a variação do intervalo de confiança de 95%. (Revell 2013, 2014). As análises foram realizadas no programa R. versão 3.1.3 com a função fancyTree usando type

='Phenogram95'. fancyTree no pacote “phytools” (R Development Core Team 2014).

Sinal filogenético

Sinal filogenético é definido como a similaridade dos valores das características fenotípicas entre espécies filogeneticamente relacionadas (Blomberg et al. 2003, Zheng et al. 2009). Para testar se existe sinal filogenético usamos um teste de permutação, cuja hipótese nula é a ausência de sinal filogenético (Blomberg et al. 2003, Zheng et al. 2009).

Sob a hipótese nula os valores das características fenotípicas observadas são permutados aleatoriamente entre as espécies na árvore filogenética estimada com as sequências de DNA

(Blomberg et al. 2003, Zheng et al. 2009). A estatística do teste de permutação é a variância dos contrastes filogenéticos independentes normalizados calculada com os valores das características fenotípicas observadas (Felsenstein 1985). A hipótese nula é rejeitada se as variâncias dos contrastes independentes calculadas em 95% dos conjuntos de dados fenotípicos permutados forem maiores do que as variâncias dos contrastes independentes calculados com os dados fenotípicos observados (Blomberg et al. 2003).

Quando a hipótese nula de ausência de sinal filogenético é rejeitada é necessário estimar a força do sinal filogenético (Blomberg et al. 2003). A estatística K de Blomberg et al. (2003) é uma medida da força de sinal filogenético para dados univariados. Esta estatística é calculada como K = (MSE0/ MSE) observado / (MSE0 / MSE) esperado, onde é

MSE0 é o erro quadrático médio dos valores das características mensuradas da média

127 filogenética e MSE é o erro quadrático corrigido pela indução da dependência na filogenia.

O denominador é taxa esperada pela expectativa nula sob um modelo de evolução de caráter por movimento Browniano (BM). Os valores de K próximos de 0 indicam fraco sinal filogenético, enquanto que valores próximos de 1 são valores esperados sob a expectativa nula de movimento Browniano. Os valores acima de 1 são indicativos de uma forte associação entre a filogenia e o caráter em estudo, além do esperado sob o modelo de evolução de movimento Browniano (Blomberg et al. 2003).

Teste de associação entre as variáveis: Método filogenético generalizado de quadrados mínimos (PGLS)

Para avaliar a associação entre as características fenotípicas nós utilizamos o método filogenético generalizado de quadrados mínimos (PGLS) para evolução de caráteres contínuos baseada em modelos de movimento Browniano (Martins & Hansen

1997, Rohlf 2001). Este modelo incorpora a dependência esperada entre as características fenotípicas na estrutura filogenética incorporando as relações filogenéticas como uma matriz de covariância (Martins & Hansen 1997, Rohlf 2001). As análises foram realizadas no software R versão 3.1.3 com a função multiPhylosignal no pacote “picante” para sinal filogenético e a função multiPhylosignal no pacote “caper” para regressão filogenética

(PGLS) (R Development Core Team 2014).

128

Resultados

Seleção de modelos de substituição nucleotídica.

O modelo de melhor ajuste de parâmetros de substituição nucleotídica para estimar a filogenia foi HKY+I para o gene Histona e GTR+G+I para os genes COI e 16S (Tabela

2).

Estimativa filogenética e mapeamento dos caráteres fenotípicos

A filogenia estimada com os genes concatenados pelo método bayesiano demostra que os táxons pertencentes aos gêneros Misumenops, Metadiea, Synema e Strophius compartilham o mesmo ancestral comum e são aranhas que forrageiam em flores (Figura

1).

Esse maior clado compartilhado por essas espécies que habitam flores, apesar de não ter muitos clados internos bem resolvidos, indica que as aranhas que forrageiam em flores compartilham o ancestral comum mais recente entre si do que com aquelas que forrageiam em flores ou apenas folhas, ou troncos (Figura 1). As análises de emissão de fluorescência demonstram que as espécies que vivem em flores emitem em média 290 unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência, com exceção da espécie Misumenops callinurus que emite em média 650 unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência

(Figura 2). A porcentagem média de reflexão de UV emitida em por essas aranhas que compartilham o mesmo ancestral é 16 %. (Figura 3).

No outro grande clado estão as aranhas que vivem em flores, folhas ou ramos secos

(Figura 1). Os gêneros Tmarus, Ascentroscelus e Synaemops habitam substratos escuros compartilham o mesmo ancestral comum que divergiu mais recentemente (Figura 1).

129

Tmarus, Ascentroscelus e Synaemops emitem em média 80 unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência (Figura 2). A porcentagem média de reflexão de UV emitida em por essas aranhas escuras que compartilham o mesmo ancestral é 12 % (Figura 3). As espécies que habitam flores ou folhas compartilham o mesmo ancestral comum (Figura 1).

O gênero Epicadus, que habita folhas, emite a mais elevada intensidade de fluorescência

(816 unidades arbitrárias) (Figura 2) e reflexão média de UV 35% (Figura 3). Observamos que o clado que compartilha os gêneros Tmarus, Ascentroscelus e Synaemops e habitam substratos escuros é homogêneo com relação à intensidade de emissão de fluorescência

(Figura 2) e intensidade de reflexão de UV (Figura 3). Já o clado que compartilha espécies que habitam flores e o clado que compartilha espécies que habitam folhas apresenta uma maior diversidade de intensidade de emissão de fluorescência (Figura 2) e intensidade de reflexão de UV (Figura 3). Os valores mais altos de intensidade de cor só são observados no clado que compartilha espécies que habitam folhas e do clado que compartilha espécies que habitam flores (Figura 2 e Figura 3).

Alguns gêneros do clado que compartilha espécies que habitam flores e do clado que compartilha espécies que habitam flores/folhas exibem padrões contrários de intensidade das características ecológicas. O gênero Sidymella que compartilha espécies que ocupam flores apresenta alta porcentagem de reflexão de UV (33,8 u.a.) e baixa emissão de fluorescência (59,41. u.a.). Misumenops sp.17 e Misumenops sp. 18 apresentam média intensidade de reflexão de UV (14,42 u.a., 14,10 u.a., respectivamente) e baixa intensidade de emissão de fluorescência (176,43 u.a. e 175,4 u.a., respectivamente). O gênero Misumenoides que ocupa o clado que compartilha espécies que habitam flores/folhas também apresentam média intensidade de reflexão de UV (16 u.a.) e baixa

130 intensidade de emissão de fluorescência (231,52 u.a.). Já alguns gêneros do clado que compartilha espécies que habitam folhas apresentam baixa intensidade de reflexão de UV e alta intensidade de emissão de fluorescência (Epicadus planus, intensidade de fluorescência

446,62 u.a. e intensidade de reflexão de UV 12,33 u.a.; Epicadinus intensidade de fluorescência 441,47 u.a. e intensidade de reflexão de UV 13,3 u.a.).

O estado do ancestral mais basal de Thomisidae aparenta emitir uma baixa emissão de fluorescência e reflexão de UV. A projeção da filogenia num espaço definido por fenótipo e tempo demostra incerteza da estimativa do estado ancestral para ambas as características (intensidade de fluorescência e intensidade de reflectância) (Figura 4). É possível verificar o aumento da transparência sobre estados ancestrais ao longo dos ramos e nos nós (Figura 4).

Sinal filogenético

Os valores de P obtidos por meio de testes de permutação indicam presença de sinal filogenético para ambos os caráteres fenotípicos (intensidade de fluorescência, P=0,001 e intensidade de reflectância P=0,001) e os valores da estatística K indicaram baixa magnitude do sinal filogenético (Intensidade de fluorescência, K=0,15 e intensidade de reflectância K=0,13). Além disso, os caráteres fenotípicos evoluem de forma não correlacionada (R2=0,15, P<0,001), pois apesar do resultado do PGLS indicar uma associação significativa entre as variáveis o coeficiente de determinação apresenta baixa percentagem de explicação dos valores observados.

131

Discussão

Nesse estudo demostramos que emissão de fluorescência e reflexão de UV é variável entre os táxons e evoluem de forma não correlacionada, entretanto uma topologia é conservada em organismos que compartilham o mesmo tipo de substrato de forrageio. Os gêneros que exibem coloração escura (Tmarus, Ascentroscelus e Synaemops) compartilham o mesmo ancestral comum e apresentam um padrão de coloração similar (baixa emissão de intensidade de fluorescência e reflexão de UV). Por outro lado, os gêneros que forrageiam sobre folhas quando adultos (e.g., Epicadus) compartilham um mesmo ancestral comum que divergiu mais recentemente e com maiores intensidades de cor.

Estudos sugerem que determinadas características ecológicas dominantes tendem a se preservar nas linhagens que compartilham o mesmo ancestral comum mais recente ao longo do processo evolutivo (Harvey & Rambaut 2000). As espécies de Thomisidae são mais semelhantes entre si com relação ao caráter fenotípico do que o esperado ao acaso, assim como observado em determinados organismos que compartilham similaridade ecológica (Harvey & Pagel 1991, Silvertown et al. 1997). Em um padrão geral, a similaridade ecológica de determinadas características fenotípicas entre duas espécies que compartilham o mesmo ancestral comum mais recente pode estar relacionada com a história de vida destes organismos (Harvey & Pagel 1991, Silvertown et al. 1997). A baixa intensidade do caráter presente no ancestral mais basal de Thomisidae pode refletir o modo de vida desses organismos ancestrais. Uma vez que a datação da topologia foi estimada pela idade do fóssil de Xysticus archaeopalpus (Leech & Matthews 1971) e os indivíduos que vivem na atualidade pertencente a esse gênero forrageiam tipicamente em serrapilheira

(Morse 1993), nós podemos inferir que o caráter ancestral nessa família originou-se com

132 baixa intensidade de coloração. Adicionalmente, sabemos que os grupos externos mais ancestrais aos Thomisidae pertencentes à família Philodromidae e alguns gêneros da família Salticidae também aparentam ser indivíduos de coloração marrom ou pálida, segundo a filogenia proposta por Benjamin et al. (2008).

Nós observamos que embora Thomisidae apresentem sinal filogenético para ambas as características, ou seja, os táxons são mais semelhantes entre si com relação ao caráter fenotípico do que o esperado ao acaso, a magnitude da presença do sinal filogenético é fraca. Podemos evidenciar um grau de heterogeneidade na intensidade das características ecológicas entre espécies que divergiram mais recentemente e compartilham o mesmo ancestral com espécies que forrageiam em flores e também entre espécies que divergiram mais recentemente e compartilham o mesmo ancestral com espécies que forrageiam em folhas. Flores são recursos efêmeros e limitantes na natureza (Graham et al. 2005). Dessa forma, as aranhas que compartilham esse recurso efêmero como sítio de forrageio podem ter evoluído características relacionadas à coloração que permite explorar diferentes regiões espaciais de uma mesma unidade floral (Morse & Fritz 1982, Morse 1984, Morse 1988,

Morse 2007, Bhaskara et al. 2009, Ver Apêndice 4). Essas características podem permitir o uso do recurso limitante de forma particionada diminuindo a potencial competição resultante da coocorrência no mesmo local com possíveis outros artrópodes inquilinos.

O gênero Misumenops, que corresponde o gênero mais representativo comumente encontrado em flores, apresenta uma diversidade de intensidade de emissão de fluorescência e reflexão de UV. Tal diversidade na intensidade de emissão de cores pode ser resultado da heterogeneidade espacial de locais que elas podem forragear em uma mesma flor. Misumenops argenteus pode ocorrer em porções na base da unidade floral

133 como brácteas e assim como outras espécies de Misumenops podem até mesmo apropriar se de espaços de cores distintos em uma mesma flor para forragear (Figura A e Figura B,

Apêndice 4). Espécies do gênero Misumenoides que compartilham o ancestral mais recente com espécies que forrageiam em flor/folhas também apropriam se de diferentes regiões da mesma flor para forragear (Figura B e Figura C, Apêndice 4).

A maior intensidade de emissão de cor pode ser observada em espécies que ocorrem em folhas (e.g., Epicadus heterogaster), no entanto, não é um caráter exclusivo desse tipo de local de forrageio. Algumas espécies que habitam flores (i.e., Misumenops callinurus) também exibem alta intensidade de emissão de fluorescência e de reflexão de UV. O mesmo padrão ocorre para a baixa intensidade de emissão de cor que pode ser observada em espécies que ocorrem em ramos secos ou troncos (e.g., Tmarus). A menor intensidade de emissão de cor distribui-se de modo homogêneo entre espécies que ocorrem em ramos secos (e.g.,Tmarus), no entanto, não é um caráter exclusivo desse tipo de local de forrageio.

Algumas espécies que habitam flores também exibem baixa intensidade de emissão de fluorescência (i.e.Misumenops sp.10) e baixa reflexão de UV (Sidymella multispinullosa).

Dessa forma, podemos sugerir que a intensidade de coloração pode ter evoluído de modo convergente, no qual a similaridade de intensidade desse fenótipo surge em diferentes linhagens como resultado de adaptação as estratégias de vida similares (Barton et al. 2007).

Uma das mais notáveis respostas fisiológicas de tomisídeos é a habilidade de mudar de cor que algumas espécies possuem (Oxford & Gillespie 1998). Estudo filogenético incluindo Misumena vatia (Clerck 1757) Benjamin et al. (2011), sugere que a resposta fisiológica de mudança de cor evoluiu apenas uma vez na família Thomisidae. Todavia, em nosso estudo podemos observar que essa resposta evoluiu no mínimo duas vezes. Epicadus

134 heterogaster que habita folhas quando adultas e Misumenops callinurus que habita flores possue a habilidade mudança de coloração corporal de acordo com o pano de fundo (Mello-

Leitão 1929, Peixoto et al. 2012) e ambas as espécies não compartilham os ancestrais comuns que divergiram mais recentemente. Sugerimos que tanto a intensidade de coloração como a habilidade de mudança de cor são características fenotípicas que podem ter evoluído de modo convergente em Thomisidae.

Evidenciamos também que algumas espécies apresentam padrões contrastantes entre as características estudadas, como refletir alta porcentagem de reflexão de UV e emitir baixa intensidade emissão intensidade de fluorescência (i.e., Sidymella multispinullosa). A emissão de fluorescência é um processo físico associado à absorção de luz no espectro invisível da região do UV (Andrews et al. 2008, Schatz & Ratner 1993) e, apesar de ambos os fenômenos (reflexão de UV e emissão de fluorescência) estarem associados fortemente a questões ecológicas de escolha de substrato e reconhecimento de presas e potenciais predadores, essas características parecem evoluir de forma não correlacionada. A conversão de espectro invisível para um espectro de maior comprimento de onda (fluorescência) é um processo que requer absorção de energia para excitação dos elétrons (Schatz & Ratner 1993). Dessa forma, provavelmente é necessária uma demanda energética para que essas aranhas invistam na síntese de moléculas responsáveis pela emissão de fluorescência. Uma vez que esse processo pode ser custoso, a reflexão de UV quando presente em algumas espécies pode ser uma característica fenotípica suficiente para atração de presas e redução de visibilidade aos predadores em determinados substratos. As diferenças de padrões encontrados nas características fenotípicas das espécies em estudo

135 devem ser diferentemente percebidas por presas e predadores dependendo do habitat, distribuição espacial, demanda fisiológica e variação comportamental de Thomisidae.

Thomisidae é uma família que divergiu recentemente e o tempo de divergência entre táxons que compartilham o ancestral comum mais recente aparenta ser menor que o tempo de divergência entre táxons filogeneticamente distantes. Tal evidência pode justificar o padrão de conservadorismo das características ecológicas que muitas linhagens que compartilham o ancestral comum mais recente apresentam (sinal filogenético), pois o fator temporal é um dos fatores importantes na radiação adaptativa de algumas linhagens

(Felseistein 1985, Harvey & Pagel 1991, Silvertown et al. 1997).

Alguns estudos sugerem que a reflexão de UV possa ter evoluído no mínimo cinco vezes em aranhas da família Thomisidae e alguns autores questionam se a reflexão de UV é uma adaptação de espécies que forrageiam em flores para potencialmente maximizar a captura de presas (Herberstein et al. 2009, Herberstein & Gawryszewski 2013). Nosso estudo demonstra a variação na intensidade de reflexão de UV e emissão de fluorescência em aranhas em Thomisidae Neotropicais com diferentes estratégias de forrageio. A nova filogenia proposta com considerável número de espécies Neotropicais fornece fortes contribuições para a compreensão do padrão de evolução de coloração em Thomisidae.

Em conclusão sugerimos que a função ecológica de emissão de fluorescência e reflexão de UV está associada fortemente com a história de vida dos tomisídeos. Em um contexto evolutivo, o tipo de substrato parece estar modulando mais a historia de vida dos organismos que a intensidade das características fenotípicas relacionadas à coloração.

136

Agradecimentos

Os autores agradecem em especial S.I. Perez e S.F. Reis pelo acompanhamento das análises comparativas filogenéticas e discussões fundamentais. L. Medeiros pelo auxílio inicial e acompanhamento nas análises moleculares e discussões. E. Dias, A. Granzotto, W. Santos, E. Gaffa, M. Simão pelo auxílio em bancada e discussões. A. Degressi, B.B., Grisolia, T. N. Bernabé, M. Braga, A.T. Salomão, S. Diniz, P.A. Antiqueira, G. Migliorini, M. Pareja J.R., Trigo, J. Bugoni, J. El Ottra, G.C. Picoli, A. Neutzling, A.R. Manzotti, P.M. Omena, T. Gonçalves-Souza, A. Zangirolame, B. Mamede, V. Lima, D. Corrêa, J. Koricheva pelo auxílio nas coletas ou envio das aranhas. Y. Messas e A. Degressi pelas fotos das aranhas. N. Serafim Pereira pelas contribuições nas dúvidas. C. Martelli por todo o suporte nas análises de fluorescência e reflectância no laboratório de UV-Vis-NR no Instituto de Química da Unicamp. Ao setor administrativo da Base de Estudos Ecológicos da Serra do Japi por ter autorizado o desenvolvimento deste estudo. A todos do Evolab no Division of Organism and Environment Departament, University of California, Berkeley, California, USA pelo suporte logístico e colaboração e a J.Y. Lim, D. Cotoras, S. Kennedy, J. Weaver, L. Becking, K. Goodman, M. Leong, A. Adams C. Cerise pelas discussões. Este estudo de doutorado foi desenvolvido no programa de Pós- Graduação em Ecologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo/ FAPESP (2010/51523-5), Projeto Universal CNPQ (470086/2011-4) e pelo Programa Institucional de Bolsas de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE)-CAPES - PROCESSO: BEX 3699/14-5.

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143

Tabela 1. Espécies sequenciadas para análises moleculares e locais de amostragem (n=140).

Gênero Espécie Local de coleta Ascentroscelus Ascentroscelus sp. Fragmentos florestais Magda-SP Ascentroscelus Ascentroscelus sp.2 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Ascentroscelus Ascentroscelus sp.3 Fragmentos florestais Magda-SP Epicadinus Epicadinus sp. Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Epicadus Epicadus heterogaster Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Epicadus Epicadus planus Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Epicadus Epicadus rubripes Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Epicadus Epicadus sp.1 Vale do Rio Doce Linhares-ES Epicadus Epicadus sp.2 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Epicadus Epicadus sp.3 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Epicadus Epicadus sp.4 PESM Núcleo Picinguaba-SP Epicadus Epicadus sp.5 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Epicadus Epicadus sp.6 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Epicadus Epicadus sp.7 Ilhéus- BA Metadiaea Metadiaea sp.1 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Metadiaea Metadiaea sp.2 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Metadiaea Metadiaea sp.3 Reserva Boqueirão Unilavras-MG Metadiaea Metadiaea sp.4 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Metadiaea Metadiaea sp.5 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Metadiaea Metadiaea sp.6 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Metadiaea Metadiaea sp.7 Estação Ecológica da Juréia-SP Metadiaea Metadiaea sp.8 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Metadiaea Metadieae sp.9 Estação Ecológica da Juréia-SP Metadiaea Metadieae sp.10 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Metadieae Metadieae sp.11 PESM Núcleo Picinguaba-SP Metadieae Metadieae sp.12 Estação Ecológica da Juréia-SP Metadieae Metadieae sp.13 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Metadieae Metadiaea sp.14 Reserva Boqueirão Unilavras MG Metadieae Metadiaea sp.15 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenoides Misumenoides sp.1 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Misumenoides Misumenoides sp.2 Fragmentos florestais Jaú-SP Misumenoides Misumenoides sp.3 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenoides Misumenoides sp.4 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Misumenoides Misumenoides sp.5 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Misumenoides Misumenoides sp.6 Fragmentos florestais Jaú-SP Misumenoides Misumenoides sp.7 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenoides Misumenoides sp.8 Município de Rosana-SP Misumenoides Misumenoides sp.9 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenoides Misumenoides sp.10 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenoides Misumenoides sp.11 Núcleo de Santa Virgínia-SP Misumenoides Misumenoides sp.12 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Misumenops Misumenops callinurus Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Misumenops Misumenops pallens Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Misumenops Misumenops pallidus Reserva Biológica da Serra do Japi-SP

144

Misumenops Misumenops sp.1 Município de Rosana-SP Misumenops Misumenops sp.2 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.3 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.4 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.5 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Misumenops Misumenops sp.6 Fragmentos florestais Cedral-SP Misumenops Misumenops sp.7 Fragmentos florestais Cedral-SP Misumenops Misumenops sp.8 Fragmentos florestais Cedral-SP Misumenops Misumenops sp.9 Vale do Rio Doce Linhares-ES Misumenops Misumenops sp.10 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Misumenops Misumenops sp.11 Vale do Rio Doce Linhares-ES Misumenops Misumenops sp.12 Fragmentos florestais Cedral-SP Misumenops Misumenops sp.13 Fragmentos florestais Jaú-SP Misumenops Misumenops sp.14 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.15 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Misumenops Misumenops sp.16 Vale do Rio Doce Linhares-ES Misumenops Misumenops sp.17 Vale do Rio Doce Linhares-ES Misumenops Misumenops sp.18 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.19 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.20 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.20 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.21 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.22 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.23 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.24 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.25 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenops Misumenops sp.26 Vale do Rio Doce Linhares-SP Misumenops Misumenops sp.27 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.28 Fragmentos florestais de Sta Genebra-SP Misumenops Misumenops sp.29 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenops Misumenops sp.30 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.31 PESM Núcleo Picinguaba-SP Misumenops Misumenops sp.32 Fragmentos florestais de Pelotas-RS Misumenops Misumenops sp.33 Fragmentos florestais de Pelotas-RS Misumenops Misumenops sp.34 Fragmentos florestais de Pelotas-RS Misumenops Misumenops sp.35 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenops Misumenops sp.36 Fragmentos florestais de Pelotas-RS Misumenops Misumenops sp.37 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.38 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.39 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.40 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.41 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.42 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.43 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.44 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.45 Ortoflorestal, Campos do Jordão-SP Misumenops Misumenops sp.46 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP

145

Misumenops Misumenops sp.47 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Misumenops Misumenops sp.48 Salvador-BA Misumenops Misumenops sp.49 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Misumenops Misumenops sp.50 Fragmentos florestais de Campinas-SP Misumenops Misumenops sp.51 Fragmentos florestais de Campinas-SP Misumenops Misumenops sp.52 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Misumenops Misumenops sp.53 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenops Misumenops sp.54 Restinga de Iquipari-RJ Misumenops Misumenops sp.55 Restinga de Iquipari-RJ Misumenops Misumenops sp.56 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Misumenops Misumenops sp.57 PESM Núcleo de Santa Virgínia-SP Misumenops Misumenops sp.58 Fragmentos florestais de Ibirá-SP Misumenops Misumenops sp.59 Fragmentos florestais de Ibirá -SP Misumenops Misumenops sp.60 Restinga de Iquipari-RJ Misumenops Misumenops sp.61 Estação Ecológica da Juréia-SP Misumenops Misumenops sp.62 Salvador-BA Misumenops Misumenops sp.63 Vale do Rio Doce Linhares -ES Misumenops Misumenops sp.64 Vale do Rio Doce Linhares –ES Misumenops Misumenops sp.65 Vale do Rio Doce Linhares –ES Onoculus Onoculus episcopus Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Onoculus Onoculus sp. Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Stephanopoides Stephanopoides Simoni KM 41 da Amazônia Central-AM Stephanopoides Stephanopoides sp. KM 41 da Amazônia Central-AM Strophius Strophius sp. Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Sidymella Sidymella multispinulosa Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Sidymella Sidymella sp.1 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Sidymella Sidymella sp.2 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Synaemops Synaemops sp.1 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Synaemops Synaemops sp.2 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Synema Synema sp.1 Estação Ecológica da Juréia-SP Synema Synema sp.2 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Tobias Tobias sp. Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Tmarus Tmarus variatus Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Tmarus Tmarus sp.1 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Tmarus Tmarus sp.2 Município de Rosana-SP Tmarus Tmarus sp.3 São José do Rio Preto-SP Tmarus Tmarus sp.4 São José do Rio Preto-SP Tmarus Tmarus sp.5 Fragmentos florestais de Mirassol-SP Tmarus Tmarus sp.6 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Tmarus Tmarus sp.7 São José do Rio Preto-SP Tmarus Tmarus sp.8 Estação Ecológica da Juréia-SP Tmarus Tmarus sp.9 Estação Ecológica da Juréia-SP Tmarus Tmarus sp.10 Parque Estadual da Ilha do Cardoso-SP Tmarus Tmarus sp.11 Estação Ecológica da Juréia-SP Tmarus Tmarus sp.12 Estação Ecológica da Juréia-SP Tmarus Tmarus sp.13 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Tmarus Tmarus sp.14 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP

146

Tmarus Tmarus sp.15 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP Tmarus Tmarus sp.16 Reserva Biológica da Serra do Japi-SP

147

Tabela 2. Método de máxima verossimilhança com estimativa do modelo de melhor ajuste escolhido dentre os outros modelos de substituição nucleotídica. A seleção do modelo foi realizada independentemente para cada sequência em estudo (H3, 16S e COI).

Gene Modelo AICc lnL (+I) (+G) f(A) f(T) f(C) f(G)

H3 HKY+I 17946.25 -8796.57 0,61 n/a 0,30 0,37 0,14 0,17 16S GTR+G+I 17577,33 -8607,08 0,47 0,79 0,28 0,35 0,16 0.19 COI GTR+G+I 17683,54 -8663,21 0,46 0,72 0,29 0,38 0,14 0,17

148

Lista de Figuras

Figura 1. Árvore consenso pós “burn in” estimada pelo método bayesiano das sequencias concatenadas (H3+COI+16S). Os valores de probabilidade posterior estão indicados nos nós dos ramos. Valores em brancos são valores de probabilidade posterior <0,5.

Figura 2. Visualização da estimativa do caráter fenotípico: máxima intensidade de fluorescência no ancestral em aranhas Thomisidae

Figura 3. Visualização da estimativa do caráter fenotípico: máxima intensidade de reflectância no ancestral em aranhas Thomisidae.

Figura 4. Projeção da filogenia em um espaço definido por fenótipo (em y) e tempo.( A) máxima intensidade de fluorescência e (B) máxima intensidade de reflectância. A posição vertical dos nós e ramos é calculada pela estimativa de caráter ancestral. A incerteza é demostrada com o aumento transparência das linhas azuis desenhados em torno das estimativas pontuais mostrando o intervalo de confiança de 95%.

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Figura 1. 150

MisumenoideStephanopoideEpicadusEpicadinusOnoculusTobiasSydmellaAscentroscelusTmarusMisumenopsSynaemops sp sp8sp1sp14sp9sp12sp10sp11variatussp13sp15sp2sp4sp5sp7sp16sp3sp6 sp6heterogastersp3planussp5sp2sp1sp4sp7rubripesepiscopussp sp sp1sp2 sp61sp2 sp10sp11sp12sp3sp1sp2 sp2spsp3simoni MisumenopsMetadiaeaSynemaMetadieaeStrophiusMisumena95SydmellamultisplunosaMisumenoide sp sp vatiasp1spsp2sp14sp5sp6sp3sp13sp8sp7sp4sp12sp10sp11sp9 sp5sp20sp19sp21pallenssp4sp18sp15pallidussp13sp12sp16sp14sp17sp62sp44sp43sp42sp3callinurussp58sp26sp1sp25sp39sp36sp40sp38sp37sp63sp59sp32sp24sp418sp35argenteussp27sp34sp31sp30sp28sp33sp29sp7sp50sp49sp51sp9sp52sp54sp48sp57sp11sp56sp55sp53sp23sp22sp10malicuparssussp64sp60sp45sp6sp46sp47 sp6sp4sp7sp8sp5sp9 Synaemops sp2 AscentroscelusSynaemops sp1 spsp3 TmarusMisumenops sp3sp6 sp2 Tmarus sp5sp7sp16 Tmarus sp15sp2sp4 MisumenopsTmarus sp13 sp61 Tmarus sp10sp11variatus Tmarus sp14sp9sp12 AscentroscelusTmarus sp8sp1 sp2 EpicadusSydmellaOnoculus rubripessp3sp TobiasSydmella sp sp4 EpicadusOnoculus sp4sp7episcopus Epicadus sp5sp2sp1 EpicadusEpicadinus sp3planus sp StephanopoideEpicadus sp6heterogaster simoni MisumenoideStephanopoide sp2 sp Misumenoide sp12sp3sp1 MisumenopsMisumenoide sp47 sp10sp11 Misumenops sp45sp6sp46 MisumenoideMisumenops sp60 sp5sp9 Misumenoide sp7sp8 MisumenoideMisumenops sp64 sp6sp4 Misumenops sp22sp10malicuparssus 95SydmellamultisplunosaMisumenops sp53sp23 MisumenopsMisumena vatia sp56sp55 Misumenops sp48sp57sp11 Misumenops sp9sp52sp54 Misumenops sp50sp49sp51 MisumenopsStrophius sp sp29sp7 Misumenops sp30sp28sp33 Misumenops sp34sp31 Misumenops sp35argenteussp27 Misumenops sp24sp418 Misumenops sp63sp59sp32 Misumenops sp40sp38sp37 Misumenops sp39sp36 Misumenops sp26sp1sp25 Metadieae sp10sp11sp9 MisumenopsMetadiaeaMetadieae sp4sp12 sp58 MetadiaeaMisumenops sp8sp7 callinurus MetadiaeaMetadieae sp3sp13 Metadiaea sp14sp5sp6 MisumenopsMetadiaea spsp2 sp3 MisumenopsSynema sp sp43sp42 MisumenopsMetadiaea sp1 sp62sp44 Misumenops sp14sp17 Misumenops sp13sp12sp16 Misumenops sp18sp15pallidus Misumenops sp21pallenssp4 Misumenops sp5sp20sp19

13.13 trait value 816.16

length=2.811

Figura 2. 151

Synaemops sp2 AscentroscelusSynaemops sp1 spsp3 TmarusMisumenops sp3sp6 sp2 Tmarus sp5sp7sp16 Tmarus sp2sp4 MisumenopsTmarus sp13sp15 sp61 Tmarus sp10sp11variatus Tmarus sp14sp9sp12 AscentroscelusTmarus sp8sp1 sp2 EpicadusSydmellaOnoculus rubripessp3sp OnoculusTobiasSydmella sp sp4episcopus Epicadus sp1sp4sp7 EpicadinusEpicadus sp5sp2 sp Epicadus heterogastersp3planus StephanopoideEpicadus sp6 spsimoni Misumenoide sp1sp2 Misumenoide sp11sp12sp3 MisumenopsMisumenoide sp46sp47 sp10 Misumenops sp60sp45sp6 Misumenoide sp8sp5sp9 MisumenoideMisumenops sp64 sp4sp7 MisumenopsMisumenoide sp10malicuparssus sp6 Misumenops sp53sp23sp22 MisumenopsMisumena95Sydmellamultisplunosa vatia sp55 Misumenops sp57sp11sp56 Misumenops sp52sp54sp48 Misumenops sp49sp51sp9 MisumenopsStrophius sp sp7sp50 Misumenops sp28sp33sp29 Misumenops sp34sp31sp30 Misumenops argenteussp27 Misumenops sp418sp35 Misumenops sp59sp32sp24 Misumenops sp38sp37sp63 Misumenops sp39sp36sp40 Misumenops sp26sp1sp25 Metadieae sp11sp9 MetadiaeaMetadieae sp4sp12sp10 MetadiaeaMisumenops sp7 callinurussp58 MetadiaeaMetadieae sp3sp13sp8 Metadiaea sp14sp5sp6 MisumenopsMetadiaea spsp2 sp3 MisumenopsSynema sp sp43sp42 MisumenopsMetadiaea sp1 sp62sp44 Misumenops sp16sp14sp17 Misumenops sp13sp12 Misumenops sp18sp15pallidus Misumenops sp21pallenssp4 Misumenops sp5sp20sp19

11.48 trait value 38.61

length=2.811

Figura 3.

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A) Fluorescência Epicadus sp.

Misumenoides sp.

Metadieae sp. (u.a.) Sidymella sp.

Misumenops sp. Tmarus sp.

B) Reflectância Epicadus sp.

Misumenoides sp.

Sidymella sp.

Metadieae sp. Intensidade do fenótipo do Intensidade

Misumenops sp.

Tmarus sp.

Tempo (m.a.)

Figura 4.

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Apêndice 1. Estimativa filogenética com os principais representantes de cada gênero de Thomisidae Neotropical para o gene Histona. A árvore foi estimada pelo método de Verossimilhança Máxima com modelo de melhor ajuste (HKY) escolhido pelo Critério de informação de Akaike com o uso do programa MEGA 6.1. Três espécies externas pertencentes à família Philodromidae foram incluídas como grupos externos como adotado por Benjamin et al. (2008) na filogenia de Thomisidae. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap superiores a 50% utilizando 1.000 réplicas.

74 Metadiaea_sp11 97 Misumenops__callinurus 44 Metadiaea_sp8 30 Strophius_sp 34 Synema_sp 43 Misumenops_malicuparssus 58 Misumenops_sp11

83 Misumenops_pallens 94 Misumenops_pallidus 70 74 Misumenoide_sp1 Metadiaea_sp11 97 Ascentroscelus_sp Misumenops__callinurus

44 Ascentroscelus_sp2 Metadiaea_sp8 76 30 Tmarus_angulatus Strophius_sp 74 100 34 60 Tmarus_variatus Synema_sp 8543 Tmarus_sp9 Misumenops_malicuparssus 58 98 Stephanopoide_sp Misumenops_sp11 83 Stephanopoide_simoni Misumenops_pallens 9994 Sydmella_sp4 Misumenops_pallidus 70 82 65 Sydmella_sp3 Misumenoide_sp1 Stephanopis_sp Ascentroscelus_sp 62 Tobias_sp Ascentroscelus_sp2 76 Onoculus_episcopus Tmarus_angulatus 7974 100 5960 Epicadus_sp5 Tmarus_variatus 9885 Epicadinus_sp Tmarus_sp9

98 Pagiopalus_nigriventris Stephanopoide_sp Proernus_stigmaticus Stephanopoide_simoni 100 7399 Philodromus_sp. Sydmella_sp4 65 Sydmella_sp3 82 Stephanopis_sp 62 Tobias_sp Onoculus_episcopus 79 59 Epicadus_sp5 15498 Epicadinus_sp Pagiopalus_nigriventris

100 Proernus_stigmaticus 73 Philodromus_sp. Apêndice 2. Estimativa filogenética com os principais representantes de cada gênero de Thomisidae Neotropical para o gene COI. A árvore foi estimada pelo método de Verossimilhança Máxima com modelo de melhor ajuste (GTR+G) escolhido pelo Critério de informação de Akaike com o uso do programa MEGA 6.1. Três espécies externas pertencentes à família Philodromidae foram incluídas como grupos externos como adotado por Benjamin et al. (2008) na filogenia de Thomisidae. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap superiores a 50% utilizando 1.000 réplicas.

99 Metadiaea_sp8 99 Misumenops_ callinurus 64 Metadiaea_sp11 81 Synema_sp 58 Misumenops_sp11

44 Misumenops_pallidus Epicadus_rubripes Epicadus_sp5 98 100 Epicadus_heterogaster 100 Epicadus_sp6

Ascentroscelus_sp2

98 Tmarus_variatus 52 Tmarus_sp9

Philodromus sp.

100 Pagiopalus nigriventris 85 Proernus stigmaticus

0.05

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Apêndice 3. Estimativa filogenética com os principais representantes de cada gênero de Thomisidae Neotropical para o gene 16S. A árvore foi estimada pelo método de Verossimilhança Máxima com modelo de melhor ajuste (GTR+G) escolhido pelo Critério de informação de Akaike com o uso do programa MEGA 6.1. Três espécies externas pertencentes à família Philodromidae foram incluídas como grupos externos como adotado por Benjamin et al. (2008) na filogenia de Thomisidae. Os números nos ramos indicam valores de bootstrap superiores a 50% utilizando 1.000 réplicas.

Metadiaea_sp8 86 99 Misumenops__callinurus 61 74 Metadiaea_sp11 Metadiaea_sp11 97 Misumenops__callinurus 24 Synema_sp 44 Metadiaea_sp8 Strophius_sp 30 Strophius_sp 43 Misumenops_sp11 34 19 Synema_sp

55 62 43 Misumenops_pallens Misumenops_malicuparssus 58 Misumenoide_sp1 Misumenops_sp11 94 83 Misumenops_pallens Ascentroscelus_sp

44 94 Tmarus_variatus Misumenops_pallidus 70 Misumenoide_sp1 Stephanopoide_sp Ascentroscelus_sp 100 100 Stephanopoide_simoni Ascentroscelus_sp2 76 Tmarus_angulatus Epicadus_sp7 74 100 Epicadus_sp5 60 Tmarus_variatus 99 85 Epicadus_planus Tmarus_sp9 9888 Epicadus_heterogaster Stephanopoide_sp

Epicadus_sp6 Stephanopoide_simoni 99 Pagiopalus_nigriventris Sydmella_sp4 82 65 Sydmella_sp3 Proernus_stigmaticus 100 Stephanopis_sp 41 Philodromus_sp. 62 Tobias_sp Onoculus_episcopus 79

0.05 59 Epicadus_sp5 98 Epicadinus_sp

Pagiopalus_nigriventris

100 Proernus_stigmaticus 73 Philodromus_sp.

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Apêndice 4. Thomisidae ocupando diferentes regiões espaciais das flores (A) Misumenops argenteus em brácteas, (B) Misumenops sp. 35 na porção central da unidade floral que apresenta coloração

distinta da porção periférica, (C) Misumenoides sp. 11 próximo as brácteas, (D) Misumenoides sp.10 em brácteas. Crédito das fotos: (A) P.A.P. Antiqueira, (B) C. Vieira, (C) A.R. Manzotti, (D) T. Postali

A B

C D

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SÍNTESE

Papel da coloração na escolha do substrato e reconhecimento de presas

Neste estudo nós demonstramos que coloração tem um papel importante e fundamental na escolha de sítios de forrageio e reconhecimento de presas e potenciais predadores em diferentes espécies de Thomisidae Neotropicais. A coloração das aranhas influencia no tipo de substrato que elas escolhem para forragear. Aranhas mais claras preferem forragear em substratos com maiores intensidade de cor ou cores em que elas possam intensificar sua sinalização para atração de presas (Epicadus heterogaster), ao passo que, aranhas mais escuras preferem substratos com menores intensidades de cor.

Na visão de Hymenoptera, nós demonstramos que a coloração está relacionada com cripticidade apenas quando exibida em elevada intensidade e a estratégia de cripsia não apresenta vantagem no reconhecimento pelas presas em aranhas que habitam flores. Vimos que a resposta dos visitantes florais não é uniforme diante as diferentes aranhas que exibem estratégias de forrageio distintas. As aranhas com menores intensidades de cor são mais facilmente reconhecidas e evitadas por visitantes florais quando comparadas a aranhas que tem habilidade de combinar a coloração corporal com a coloração das flores. Dessa forma, concluímos que a intensidade da coloração parece ter um papel crucial na variação de respostas comportamentais em insetos que vistam flores com aranhas da família

Thomisidae.

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A evolução da cor

Além da função ecológica da cor nós buscamos compreender como evolui a coloração em Thomisidae e buscamos compreender se a evolução dessas características está relacionada à estratégia de forrageio dentro dessa família.

Thomisidae é uma família que divergiu recentemente e o tempo de divergência entre táxons filogeneticamente próximos aparenta ser menor que entre táxons filogeneticamente distantes. Nós demostramos que emissão de fluorescência e reflexão de UV é variável entre os táxons e evoluem de forma não correlacionada, entretanto uma topologia é conservada em organismos que compartilham o mesmo tipo de substrato de forrageio. A similaridade ecológica das características fenotípicas entre duas espécies que compartilham o mesmo ancestral comum mais recente está fortemente relacionada ao tipo de substrato de escolha por Thomisidae.

Em conclusão sugerimos que a função ecológica de emissão de fluorescência e reflexão de UV está associada fortemente com a história de vida dos tomisídeos. Em um contexto evolutivo, o tipo de substrato parece estar modulando mais a historia de vida dos organismos que algumas características fenotípicas. Os componentes do sistema visitante floral-aranha-substrato parecem interagir e determinar como evoluem as características ecológicas na família Thomisidae.

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