MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Brno 2013 Martin Ivanecký

0

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie

Studium genové exprese u ryb (Štúdium génovej expresie u rýb)

Bakalářská práce

Martin Ivanecký

Vedoucí práce: Mgr. Kristína Civáňová, Ph.D. Brno 2013

1

Bibliografický záznam

Autor: Martin Ivanecký Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Studium genové exprese u ryb Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Molekulární biologie a genetika Vedoucí práce: Mgr. Kristína Civáňová, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 58 Klíčová slova: genová exprese; kvantitativní PCR; kaprovité ryby

Bibliografický záznam

Autor: Martin Ivanecký Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie Názov práce: Štúdium génovej expresie u rýb Študijný program: Experimentálna biológia Študijný odbor: Molekulárna biológia a genetika Vedúci práce: Mgr. Kristína Civáňová, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet strán: 58 Kľúčové slová: génová expresia; kvantitatívna PCR; kaprovité ryby

2

Bibliographic Entry

Author: Martin Ivanecký Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Study of gene expression in fish Degree Programme: Experimental Biology Field of Study: Molecular Biology and Genetics Supervisor: Mgr. Kristína Civáňová, Ph.D. Academic year: 2012/2013 Number of Pages: 58 Keywords: gene expression; quantitative PCR; cyprinid fish

3

Abstrakt

Tato bakalářská práce se věnuje tematu genové exprese. V první části jsou popsány jednotlivé procesy genové exprese s přihlédnutím k současným poznatkům, druhá část pojednává o analýze genové exprese a nejčastějších metodách k tomu používaných. Třetí část se zaobírá využitím ryb jako modelových organismů. V poslední části je navrhnutý konkrétní postup analýzy genové exprese genů DAB1 a DAB3 u vybraných kaprovitých ryb pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce.

Abstrakt

Táto bakalárska práca sa venuje téme génovej expresie. V prvej časti sú opísané jednotlivé procesy génovej expresie s prihliadnutím na súčasné poznatky, druhá časť pojednáva o analýze génovej expresie a najčastejších metódach k tomu používaných. Tretia časť sa zaoberá využitím rýb ako modelových organizmov. V poslednej časti je navrhnutý konkrétny postup analýzy génovej expresie génov DAB1 a DAB3 u vybraných kaprovitých rýb pomocou kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie.

Abstract

In my bachelor’s thesis the topic of gene expression is addressed. Individual processes of gene expression with regard to recent findings are described in the first part of the thesis, and analysis of gene expression and the most common methods it employs are discussed in the second part. The third part is dedicated to fish and their use as model organisms. Actual analysis of DAB1 and DAB3 gene expression in chosen cyprinid fishes by quantitative polymerase chain reaction is proposed in the last part of the thesis.

4

5

6

Poďakovanie

Ďakujem svojej školiteľke Kristíne Civáňovej za jej ochotné, ústretové a odborné vedenie, za jej trpezlivosť a dôveru. Ďakujem svojej rodine za hmotnú a duchovnú podporu v každom čase a okolnostiach.

Prehlásenie

Prehlasujem, že som túto bakalársku prácu vypracoval samostatne a s využitím zdrojov, ktoré sú v práci citované.

Brno, 3. máj 2013 ...... Martin Ivanecký

7

OBSAH

1. Úvod ...... 9 2. Génová expresia ...... 10 2.1. Génová transkripcia ...... 11 2.2. Úpravy primárneho transkriptu ...... 14 2.3. Génová translácia ...... 17 2.4. Post-translačné úpravy ...... 20 3. Štúdium génovej expresie ...... 22 3.1. Western blotting ...... 23 3.2. Proteínové čipové technológie (proteínové microarrays) ...... 25 3.3. Proteíny alebo mRNA? ...... 29 3.4. DNA čipy (DNA microarrays) ...... 29 3.5. Kvantitatívna PCR ...... 33 3.5.1. Sondy ...... 34 3.5.2. Detekcia signálu ...... 36 3.5.3. Vyhodnotenie signálu a kvantifikácia produktov PCR ...... 37 3.5.3.1. Absolútna kvantifikácia ...... 37 3.5.3.2. Relatívna kvantifikácia ...... 38 3.5.4. Normalizácia...... 40 4. Ryby ako modelové organizmy ...... 41 4.1. Ryby z čeľade Cyprinidae ako modelové organizmy ...... 42 5. Návrh experimentu ...... 46 6. Záver ...... 49 Zoznam použitých skratiek ...... 50 Literatúra ...... 52 Internetové zdroje ...... 58

8

1. Úvod

Ryby sú druhovo najpočetnejšou a fylogeneticky najstaršou skupinou stavovcov. Sú to vodné organizmy, ktorých morfológia, anatómia i fyziológia sú prispôsobené životu vo vodnom prostredí. Odkedy človek zakladal svoje sídla v blízkosti riek, jazier a pobreží, odvtedy sa stretával s rybami. V mnohých oblastiach sveta sa stali súčasťou jeho jedálnička, zo záľuby ich začal chovať v akváriách a pre komerčné účely i v umelých rybníkoch a vodných nádržiach. Za posledné polstoročie sa k týmto využitiam pridalo i ďalšie – výskumné. Ryby sa stali bežným výskumným i modelovým organizmom v mnohých prírodovedných disciplínach, menujúc napríklad ekológiu, fyziológiu či genetiku. Diverzitu a komerčné využitie rýb ale narúšajú patogény. Hlavnou obranou rýb voči parazitom je imunitný systém, ktorého súčasťou je aj hlavný histokompatibilný komplex (angl. major histocompatibility complex, MHC). Jeho úlohou je rozpoznať parazitický organizmus a vyburcovať telo hostiteľa k obrane voči nemu; túto funkciu na povrchu imunitných buniek vykonávajú receptory MHC. Ako všetky proteíny, i receptory MHC vznikajú prekladom mediátorových RNA (transláciou), ktoré vznikajú prepisom DNA (transkripciou). Procesy transkripcie a translácie sa súhrnne nazývajú génová expresia. Cieľom tejto bakalárskej práce je: poskytnúť prehľad aktuálnej literatúry zaoberajúcej sa génovou expresiou u rýb; poskytnúť prehľad najčastejších techník, ktorými sa génová expresia u rýb analyzuje; teoreticky zvládnuť metodiku kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (angl. quantitative polymerase chain reaction, qPCR) a princípy relatívnej kvantifikácie génovej expresie a navrhnúť postup analýzy expresie génov MHC triedy IIB u vybraných druhov rýb pre riešiteľské pracovisko, ktorým je Ústav botaniky a zoológie (oddelenie parazitológie) Prírodovedeckej fakulty Masarykovej univerzity.

9

2. Génová expresia

Už Johann Gregor Mendel pred zhruba jeden a pol storočím pochopil, že fenotyp závisí na genotype. Túto závislosť postupne genetici odhaľovali viac a viac, keď rôzne znaky organizmu spojili s určitými génmi alebo alelami. Biologické bádanie dospelo do bodu, kedy sa často nedá vyhnúť genetickému pozadiu určitého javu či procesu. Aj vďaka tomu zaznamenáva genetika a z nej odvodené disciplíny (genomika, transkriptomika, proteomika a iné) svoj rozmach, spoločne s molekulárnou biológiou, ktorej metódy umožňujú študovať dedičnosť a premenlivosť živých organizmov do detailu. A vďaka novoobjaveným detailom sa poznanie rozširuje, upravuje, spresňuje a prípadne opravuje. A to je aj prípad génovej expresie. Pôvodne sa totiž malo za to, že komplexnosť a rozmanitosť živých systémov dostatočne vysvetľuje ústredná dogma molekulárnej biológie. Tá bola postulovaná v druhej polovici 20. storočia a hovorí, že genetická informácia je „zapísaná“ v DNA, odkiaľ sa „prepisuje“ do RNA, ktorá sa „číta“ a „prekladá“ do proteínov. A proteíny tvoria štruktúru organizmov a zabezpečujú všetky dôležité procesy v nich. Koncom 20. storočia sa však ukázalo, že tento model nie je schopný vysvetliť všetky otázky, ktoré si biológovia kladú. Vedci si uvedomili, že na tvorbe fenotypu sa podieľa i zložka negenetická, t.j. prostredie, a ďalej zložka „nadgenetická“ – epigenetická. Epigenetické procesy majú schopnosť meniť fenotyp organizmu bez toho, aby sa zmenila jeho genetická informácia. To sa deje rôznymi procesmi (napr. metyláciou či acetyláciou DNA), ktoré prebiehajú podľa jednotného princípu: mení sa miera použitia genetickej informácie, nie informácia samotná. Inak povedané, mení sa génová expresia. Doteraz nie je známy žiaden živý organizmus, ktorý by k životu nepotreboval genetickú informáciu. Tá je u eukaryotických organizmov uložená v DNA a predstavuje akúsi štvorkovú číselnú sústavu, ktorá namiesto čísel využíva štyri typy deoxyribonukleotidov (deoxyadenín, deoxycytozín, deoxyguanín a deoxytymín). O konkrétnom poradí týchto štyroch striedajúcich sa zložiek hovoríme ako o sekvencii DNA. Génová expresia súhrnne pomenúva génovú transkripciu a transláciu, pri ktorých sa informácia v DNA využíva na syntézu RNA a proteínov. Ide o jedny z najdôležitejších bunkových procesov, ktorých úlohou je uchovávať genetickú informáciu tak, aby sa mohla kedykoľvek použiť, a zároveň ju v každej bunke správne použiť. Pri génovej transkripcii i translácii rozlišujeme tri etapy:

10 iniciáciu, elongáciu a termináciu. Hlavnou časťou oboch procesov je elongácia, t.j. samotná syntéza RNA (počas transkripcie) či proteínu (pri translácii). Niekedy zahŕňa génová expresia iba transkripciu. Ide o tie prípady, kedy konečným génovým produktom nie je proteín, ale určitý druh RNA, napríklad ribozomálna (rRNA), transférová (tRNA), mikro-RNA (miRNA) a ďalšie. V ďalšom texte však tieto prípady nebudú brané do úvahy a výraz génová expresia bude zahŕňať iba transkripciu štruktúrnych génov a následnú transláciu mRNA do proteínov.

2.1. Génová transkripcia

Prvou časťou génovej expresie je transkripcia, teda prepis sekvencie deoxyribonukleotidov v DNA do sekvencie ribonukleotidov v RNA. Táto etapa sa skladá z viacerých parciálnych procesov a schematicky prebieha takto: 1. chromatínová štruktúra sa upraví tak, aby bola promótorová oblasť génu prístupná pre transkripčný aparát; 2. k promótoru sa pripoja transkripčné faktory a enzým (RNA polymeráza), ktoré vytvoria stabilný a funkčný transkripčný aparát. Tým dôjde v promótorovej DNA k dočasnej lokálnej denaturácii a vzniká transkripčná bublina; 3. k jednovláknovej DNA v mieste transkripčnej bubliny sa pripájajú voľné komplementárne ribonukleotidy. Transkripčný komplex sa posúva ku koncu génu (teda od 3‘ konca k 5‘ koncu templátovej DNA) a enzým, ktorý je jeho súčasťou, vytvára pevné väzby medzi susednými ribonukleotidmi. V tejto elongačnej etape vzniká reťazec ribonukleotidov – RNA; 4. po dosiahnutí konca génu sa transkripčný komplex rozpadá, zaniká transkripčná bublina, transkripčné faktory sa uvoľňujú a vzniknutá RNA sa osamostatňuje; 5. reťazec RNA prechádza dodatočnými úpravami, a to čiastočne už počas transkripcie a čiastočne až po jej skončení. Enzýmom, ktorý spája voľné ribonukleotidy do reťazca RNA, je DNA-dependentná RNA polymeráza, skrátene RNA polymeráza. U eukaryotických organizmov existujú tri hlavné typy: RNA polymeráza I syntetizuje rRNA (okrem 5S rRNA), RNA polymeráza II syntetizuje mRNA a tzv. malé RNA (snRNA, snoRNA a miRNA), a RNA polymeráza III syntetizuje tRNA a 5S rRNA. Carter et Drouin (2009) porovnali dve najväčšie podjednotky

11 všetkých troch enzýmov a zistili, že proteínové domény primárne zodpovedné za syntézu RNA majú silno konzervovaný počet aminokyselín a nízku mutačnú rýchlosť naprieč rôznymi eukaryotickými organizmami. To podporuje názor, že gény kódujúce rôzne typy polymeráz vznikli duplikáciou ich spoločného predchodcu a následným rozrôznením jeho kópií, a to ešte pred vznikom eukaryotických organizmov (Carter et Drouin, 2009). V genóme Arabidopsis thaliana boli objavené i gény kódujúce RNA polymerázu IV. Luo et Hall (2007) zistili ich výskyt aj u všetkých majoritných skupín suchozemských rastlín a predpokladajú, že vznikli duplikáciou génov pre RNA polymerázu II v období po oddelení suchozemských rastlín od zelených rias. RNA polymeráza IV sa vyskytuje v dvoch formách (IVa a IVb) a podieľa sa na umlčovaní génov (Onodera et al., 2005; Pikaard et al., 2008). RNA polymeráza samotná nie je schopná rozpoznať iniciačné miesto transkripcie a preto musí spolupracovať s ďalšími transkripčnými faktormi (TF). Niektoré z týchto faktorov sú potrebné pri každej transkripcii a označujú sa ako všeobecné (angl. general transcription factors, GTFs). Pre RNA polymerázu II sú to transkripčný faktor II A (TFIIA), TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF a TFIIH. Najdôležitejším z nich je TFIID; tvorí ho viacero podjednotiek a jeho štruktúra a funkcia sa v súčasnosti detailne študujú (napr. Cler et al., 2009). Jeho hlavná podjednotka, TBP (angl. TATA box binding protein), sa u evolučne mladších eukaryotov vyskytuje v mierne odlišných formách, a Akhtar et Veenstra (2011) upozornili na skutočnosť, že rôzne formy TBP (navyše v rôznych kombináciách s ostatnými faktormi) môžu spôsobovať bunkovo-špecifické vzorce génovej transkripcie. Po interakcii TFIID s promótorom (Obr. 1A) dochádza k väzbe ďalších transkripčných faktorov, ktorých úlohou je celý transkripčný komplex stabilizovať (Obr. 1B). Napríklad sa preukázalo, že väzba TFIID k špecifickému promótoru pri zvýšenej koncentrácii solí a väzba TFIID k nešpecifickému promótoru pri normálnej hladine solí je stabilizovaná faktorom TFIIA (Hieb et al., 2007). RNA polymeráza II sa do transkripčného aparátu viaže ako jedna z posledných zložiek (Obr. 1C). Tak vzniká preiniciačný komplex (angl. pre-initiation complex, PIC), ktorý iniciuje transkripciu a posúva celý proces do fázy elongácie (Obr. 1D). Samotná syntéza RNA sa označuje ako fáza elongácie - podľa sekvencie DNA sa vytvára sekvencia RNA. Správnosť prepisu genetickej informácie závisí na komplementárnom párovaní báz. Po každom predĺžení RNA sa polymeráza posunie o jeden nukleotid ďalej (inak povedané: polymeráza sa translokuje). Elongácia je tým rýchlejšia, čím rýchlejšie polymeráza spája susedné ribonukleotidy. To ale ohrozuje správnosť prepisu, lebo „rýchlejšia“ polymeráza sa častejšie dopúšťa chýb. Bunky tak musia korigovať pomer medzi rýchlosťou prepisu DNA a jeho správnosťou (angl. fidelity). Larson et al. (2012) zistili, že

12

RNA polymeráza II reguluje rýchlosť a korektnosť transkripcie sama, a to vďaka jednej z proteínových domén tvoriacich jej najväčšiu podjednotku. Larson et al. (2011) tiež vyvinuli rekombinantnú fluorescenčnú techniku, ktorá umožňuje sledovať rýchlosť iniciácie a elongácie transkripcie v reálnom čase.

Obrázok 1: Preiniciačný transkripčný komplex. A) K TATA oblasti promótoru sa viaže TFIID, ktorý sa skladá z TBP (angl. TATA box binding protein) a viacerých TAFs (angl. TBP-associated factors). B) Ako ďalšie sa viažu TFIIA a TFIIB, ktoré štruktúru stabilizujú a určujú vzdialenosť medzi promótorom a počiatkom transkripcie. C) RNA polymeráza II sa k promótoru viaže v spojení s TFIIF. D) Preiniciačný komplex vzniká po naviazaní TFIIE a TFIIH. Súčasťou TFIIH je i helikázová podjednotka, ktorá hydrolýzou ATP odvinie malý úsek DNA v oblasti počiatku transkripcie. CTD (angl. C-terminal domain) označuje karboxylový koniec RNA polymerázy II. Zdroj: Pollard et al. (2008) (upravené).

Elongácia RNA je hlavnou časťou transkripcie. Vzniká pri nej primárny transkript, ktorý sa dodatočnými úpravami mení na finálny transkript, ktorý sa účastní translácie. Dĺžka primárneho transkriptu je daná prepisovanou DNA. RNA polymeráza nesyntetizuje celý 13 transkript rovnako rýchlo – pri niektorých sekvenciách DNA spomaľuje alebo zastavuje, čo destabilizuje transkripčný komplex. Ak je komplex príliš nestabilný (pri dlhom zastavení polymerázy), rozpadne sa. Vtedy hovoríme o terminácii – ukončení prepisu DNA. K terminácii dochádza i vtedy, ak transkript vytvára určité sekundárne štruktúry brániace polymeráze v pohybe. Príkladom takejto sekvencie je 5‘-AAUAAA-3‘ nasledovaná úsekom s vysokým obsahom adenínu alebo uracilu; takýto transkript brzdí RNA polymerázu. Terminačnú sekvenciu rozpoznajú endonukleázy, ktoré RNA v tomto mieste rozštiepia – vzniká samostatný primárny transkript: jeho 3‘ koniec sa hneď polyadenyluje a jeho zvyšok (ešte stále pripojený k transkripčnému komplexu) degradujú exonukleázy, čo vedie k rozpadu celého transkripčného aparátu (Shandilya et Roberts, 2012). Tým transkripcia končí.

2.2. Úpravy primárneho transkriptu

Produktom transkripcie štruktúrnych génov je prekurzorová mRNA (pre-mRNA), označovaná aj ako heterogénna jadrová RNA (heterogenous nuclear RNA, hnRNA). Prekurzorová mRNA je dodatočne upravovaná: úpravy 5‘ a 3‘ koncov chránia transkript pred degradáciou a propagujú génovú transláciu, vyštiepenie intrónov zase zaisťuje syntézu správneho polypeptidu. Úprava 5‘ konca sa anglicky nazýva 5‘-capping (angl. cap = čiapka). Jedná sa o pridanie obráteného 7-metylguanozínu (m7G) na 5‘ koniec pre-mRNA prostredníctvom atypickej 5‘-5‘ fosfotriesterovej väzby (typicky sú nukleotidy spojené 3‘-5‘ fosfodiesterovou väzbou; Obr. 2). Táto modifikácia vzniká v troch krokoch: odštiepením jednej fosfátovej skupiny z 5‘ konca transkriptu, pripojením invertovaného guanozínmonofosfátu (GMP) k tomuto koncu a metyláciou tohto GMP v pozícii 7 (Pollard et al., 2008). Čiapočka sa vytvára už počas transkripcie, čo súvisí s fosforyláciou karboxylového konca (angl. C- terminal domain, CTD) veľkej podjednotky RNA polymerázy II (Egloff et Murphy, 2008), na ktorej sa podieľa aj TFIIH (Helenius et al., 2011). Táto fosforylácia podporuje interakciu s komplexom formujúcim čiapočku. Kvôli tomu obsahujú čiapočku i chybné alebo nekompletné transkripty. To využil napríklad Papic et al. (2012) pri štúdiu vzťahu hostiteľ- patogén, keď pomocou sekvenovania RNA sledoval génovú expresiu v bunkách napadnutých vírusom hepatitídy C.

14

Obrázok 2: Štruktúrna úprava 5' konca pre-mRNA. Zdroj: Pollard et al. (2008) (upravené).

Okrem ochrany 5‘ konca transkriptu pred exonukleázami má čiapočka význam i pre transláciu, lebo drvivá väčšina mRNA sa k ribozómom viaže prostredníctvom väzby medzi 5‘ čiapočkou a eIF4E, eukaryotickým iniciačným faktorom 4E (Merrick, 2004). Úpravou 3‘ konca je polyadenylácia, t.j. pripojenie mnohých ATP k mRNA. Tým vzniká koncová sekvencia pozostávajúca výlučne z nukleotidov obsahujúcich adenín. Polyadenylácii predchádza endonukleolytické štiepenie v neprekladanej oblasti 3‘ konca transkriptu; signálom pre tento proces je hlavne sekvencia 5‘-AAUAAA-3‘ nachádzajúca sa 10 – 30 bp pred miestom štiepenia a ďalej sekvencia s vysokým obsahom guanínu a uracilu nachádzajúca sa 20 – 40 bp za miestom štiepenia (Colgan et Manley, 1997) (Obr. 3). Tian et al. (2005) ale preukázali, že polyadenylačných signálnych sekvencií môže byť v jednom genóme viac a dochádza tak k alternatívnej polyadenylácii. Zistilo sa tiež, že aktivácia polyadenylačných mechanizmov súvisí s fosforyláciou karboxylového konca (CTD) veľkej podjednotky RNA polymerázy II, jedná sa ale o iný fosforylačný vzorec než v prípade modifikácie 5‘ konca transkriptu (Egloff et Murphy, 2008).

15

Obrázok 3: Polyadenylácia 3' konca pre-mRNA. Dolná časť obrázku zobrazuje konzervovanosť polyadenylačného signálu u živočíchov. Zdroj: Pollard et al. (2008) (upravené).

Transkripty génov kódujúcich proteíny podliehajú okrem koncových modifikácií i vnútorným úpravám. Dôležitou úpravou je odstránenie intrónov (nekódujúcich oblastí) a spojenie exónov (kódujúcich úsekov) do zrelej molekuly mRNA (Obr. 4). Tento jav sa nazýva zostrih (angl. splicing): pre-mRNA je zostrihaná a prearanžovaná, pričom z jednej pre-mRNA môžu týmto spôsobom vzniknúť rôzne mRNA, ktoré sa následne prekladajú do korešpondujúcich proteínov. Vďaka zostrihu preto vzniká viac typov proteínov, než by vznikalo prekladom nezostrihovaných mRNA. Zostrih vykonávajú spliceozómy (čítaj splajsozómy), komplexy tvorené malými jadrovými nukleoproteínmi (angl. small nuclear ribonucleoproteins, snRNP) a proteínmi. Vznikajú v miestach zostrihu, ktoré rozdeľujú mRNA na exóny a intróny. Typicky ide o dinukleotid pGU v 5‘ mieste zostrihu a dinukleotid pAG v 3‘ mieste zostrihu. Samotný zostrih prebieha v dvoch krokoch. Najprv jeden špeciálny intrónový adenínový nukleotid, tzv. vetviaci bod (angl. branching point), napadne fosfátovú skupinu v 5‘ mieste zostrihu a prostredníctvom svojho 2‘-hydroxylu na seba naviaže 5‘ koniec intrónu, čím vznikne lasovitá štruktúra a voľný exón. V druhom kroku 3‘-hydroxyl voľného exónu napadne fosfátovú skupinu v 3‘ mieste zostrihu, čím sa exóny (pôvodne obklopujúce intrón) spoja a lasovitý intrón sa vyštiepi (Black, 2003).

16

Obrázok 4: Zostrih pre-mRNA. Zdroj: Pollard et al. (2008) (upravené).

Miesta zostrihu sú často konštitutívne, t.j. k zostrihu v týchto miestach dochádza vždy, no podobne ako pri alternatívnej polyadenylácii, aj tu existujú alternatívne miesta zostrihu a teda alternatívny zostrih. Všetky formy zostrihu majú ale spoločné to, že od nich priamo závisí, aká sekvencia mRNA bude použitá pre syntézu proteínu. V oveľa menšej miere než zostrih menia túto sekvenciu i procesy známe ako editácia RNA. Ide o chemické modifikácie báz, ktoré menia ich väzbové vlastnosti. Príkladom môže byť úprava adenínu na inozín: inozín vystupuje pri translácii ako guanín, takže môže vzniknúť proteín pôvodne nekódovaný genómom (Maas et al., 2002). Všetky vyššie spomenuté úpravy primárnych transkriptov (teda pre-mRNA) majú za cieľ spoločne a vhodne regulovať metabolizmus RNA: na jednej strane predĺžiť životnosť aktuálne potrebných molekúl mRNA a propagovať ich transláciu, na druhej strane likvidovať tie neúplné alebo chybné a zamedziť ich translácii – proteíny vytvorené podľa chybných mRNA sú rovnako chybné a musia byť degradované, takže bunka by zbytočne mrhala energiou na ich syntézu a súčasne na ich degradáciu. Translácia je náročná na energiu a suroviny, preto jej správna regulácia je pre bunku kľúčová.

2.3. Génová translácia

Génová translácia je preklad genetickej informácie z jazyka nukleotidov do jazyka aminokyselín. Sekvencia ribonukleotidov v mRNA určuje sekvenciu aminokyselín v peptide. Súbor pravidiel, ktorými sa tento preklad riadi, nazývame genetický kód. Špecifikom

17 translácie je, že informácia sa neprekladá po jednotlivých nukleotidoch (ako pri transkripcii), ale po ich trojiciach – tripletoch. Triplet v mRNA sa označuje ako kodón a triplet v tRNA (transférovej RNA) ako antikodón. K prekladu genetickej informácie dochádza v ribozómoch, hlavnú úlohu pri translácii teda hrajú ribozómy, mRNA a tRNA. Schematicky prebieha translácia nasledovne: 1. aminoacyl-tRNA syntetáza „nabije“ molekulu tRNA aminokyselinou daného typu (nabitie každej tRNA vyžaduje ATP); 2. iniciátorová tRNA (nabitá aminokyselinou metionínom) a malá ribozomálna podjednotka vytvoria preiniciačný komplex (za spotreby GTP, viď ďalej), ku ktorému sa pripojí mRNA; 3. komplementárne párovanie antikodónu tRNA s kodónom mRNA vyvolá hydrolýzu GTP, po ktorej dôjde k väzbe veľkej ribozomálnej podjednotky a vzniku iniciačného komplexu; 4. po pripojení ďalšej tRNA k mRNA sa ribozóm posunie o jeden triplet vpred (za spotreby GTP) a medzi susednými aminokyselinami sa tvorí peptidická väzba – celý tento krok sa opakuje, čím sa vznikajúci peptid elonguje; 5. keď ribozóm dosiahne terminačný kodón, translácia končí. Transférová RNA dostala svoj názov podľa svojej funkcie, ktorou je prenos (transfér) aminokyseliny do ribozómu. Ten sa riadi dvoma pravidlami: 1) daný typ tRNA (jej 3‘ koniec) sa kovalentne viaže vždy iba s jedným typom aminokyseliny, ale jeden typ aminokyseliny sa môže viazať s viacerými druhmi tRNA; 2) antikodón tRNA zaručuje zaradenie príslušnej aminokyseliny na správne miesto polypeptidového reťazca. „Nabitie“ (angl. charging) tRNA tou správnou aminokyselinou prebieha enzymaticky: aminoacyl-tRNA syntetáza najprv premení voľnú aminokyselinu na aminoacyl-AMP (čo vyžaduje energiu v podobe ATP) a následne presunie aminoacylovú skupinu na 3‘ koniec tRNA, čím vzniká aminoacyl-tRNA (aa-tRNA). Molekuly tRNA majú charakteristické sekundárne štruktúry prirovnávané k trojlístku. Oproti zmieňovanému aminoacylovému ramenu je antikodónové rameno, ktorého triplet sa v ribozóme viaže s kodónom mRNA. Translácia kánonicky začína iniciačným kodónom (AUG) a končí jedným z terminačných kodónov (UAA, UAG alebo UGA). tRNA komplementárna k iniciačnému kodónu sa nazýva iniciátorová tRNA a je k nej pripojený metionín (Pollard et al., 2008). Iniciácia translácie závisí na eukaryotickom iniciačnom faktore 2 (eIF2). Tento heterotrimér sa po väzbe s GTP a metionyl-tRNA viaže na malú (40S) ribozomálnu podjednotku (Obr. 5A). Na tento komplex sa prostredníctvom svojej m7G čiapočky a eIF4E

18 viaže mRNA (Merrick, 2004) (Obr. 5C). Komplex ribozomálnej podjednotky s eIF2-GTP- metionyl-tRNA sa posúva pozdĺž mRNA, pokým nenájde iniciačný kodón (AUG) (Obr. 5D). Po jeho nájdení dôjde ku komplementárnemu párovaniu medzi metionyl-tRNA a mRNA, hydrolyzuje sa GTP a eIF2 opúšťa ribozóm (Stolboushkina et Garber, 2011) (Obr. 5E). Hydrolýza GTP musí nasledovať až po tom, čo sa kodón a antikodón komplementárne spárujú; tomu napomáha eIF5, ktoré po tomto spárovaní zmení konformáciu eIF2 a umožní hydrolýzu GTP (Kozak, 1999). K malej podjednotke sa nakoniec pripojí veľká (60S) ribozomálna podjednotka (Obr. 5G) a ribozóm sa skompletizuje – vzniká úplný ribozomálny komplex (Obr. 5H).

Obrázok 5: Translácia. A) tRNA nabitá metionínom (met-tRNA) a GTP sa spolu s eIF2A a ďalšími iniciačnými faktormi viaže na malú (40S) ribozomálnu podjednotku. B) Niektoré iniciačné faktory viažuce mRNA bránia vzniku jej sekundárnych štruktúr, niektoré jej naopak pomáhajú cirkularizovať sa. C) Preiniciačný komplex sa viaže s mRNA. D) Preiniciačný komplex prechádza mRNA a hľadá štartovací kodón. E) Po väzbe met-tRNA so štartovacím kodónom nastáva hydrolýza GTP a F) eIF2A a ďalšie iniciačné faktory opúšťajú komplex. G) Na aktivovanú malú podjednotku sa viaže veľká ribozomálna podjednotka, H) čím sa ribozóm kompletizuje a translácia prechádza do elongačnej fázy. Zdroj: Pollard et al. (2008) (upravené).

Kompletný ribozóm obsahuje tri hlavné miesta: A (akceptorové), kam sa viaže aa- tRNA, P (peptidylové), kde sa viaže peptidyl-tRNA, a E (exitové), kde polypeptid opúšťa ribozóm. Elongácie sa účastnia tri hlavné eukaryotické elongačné faktory (eEF): eEF1A, eEF1B a eEF2 (Andersen et al., 2003). eEF1A sa vďaka eEF1B viaže s GTP a následne i aa- tRNA: v ribozóme naviaže aa-tRNA do prázdneho akceptorového miesta (iniciátorová metionyl-tRNA je viazaná v mieste P). Ak je daná tRNA komplementárna k mRNA,

19 dochádza medzi nimi k väzbe. Len pri stabilnej väzbe (t.j. úplnej komplementarite antikodónu a kodónu) má eEF1A dostatok času na hydrolýzu GTP, po ktorej opúšťa ribozóm. Ak antikodón a kodón nie sú stabilne viazané, molekula eEF1A-GTP-aminoacyl-tRNA opustí ribozóm ešte pred hydrolýzou GTP a uvoľní tak akceptorové miesto pre vhodnú aa-tRNA (Andersen et al., 2003). Týmto mechanizmom sa zabezpečuje správnosť translácie; napriek tomu sa však udáva, že chybne zaradená je približne jedna aminokyselina z 10 000 (pri bežnej rýchlosti elongácie 20 aminokyselín za sekundu) (Pollard et al., 2008). Peptidická väzba vzniká v mieste P, a to medzi karboxylovým koncom aminoacyl- tRNA (resp. peptidyl-tRNA) v mieste P a amínovým koncom aminoacyl-tRNA v mieste A, teda vzniká peptidyl-tRNA (resp. sa predlžuje už existujúci peptidyl-tRNA). Po tomto elongačnom kroku nastáva translokácia ribozómu: voľná tRNA a peptidyl-tRNA sú z miest P a A presunuté do miest E a P, zároveň sa mRNA posunie tak, aby bol v mieste A nový kodón, čím sa umožní ďalšie kolo elongácie. Presné mechanizmy translokácie nie sú známe, ale existuje viacero hypotéz, ktoré hovoria o vzniku dočasných hybridných väzieb vo vnútri ribozómu (Noble et Song, 2008). Analýzy však poukazujú na skutočnosť, že posun ribozómu po mRNA úzko závisí na vyššie spomínanom eEF2 (Kaul et al., 2011). Vyššie uvedený proces sa opakuje dovtedy, kým sa v akceptorovom mieste neobjaví niektorý z ukončovacích kodónov (UAA, UAG alebo UGA). K týmto kodónom neexistuje komplementárna tRNA. V týchto prípadoch sa do miesta A viaže eukaryotický uvoľňovací faktor 1 (angl. eukaryotic release factor 1, eRF1), ktorý indukuje hydrolýzu esterovej väzby medzi peptidom a tRNA. Tým sa z peptidylového miesta ribozómu uvoľní samotný peptid i posledná tRNA (Noble et Song, 2008). eRF1 rozpoznáva všetky tri terminačné kodóny a svoju funkciu vykonáva vďaka svojej štruktúrnej podobnosti s molekulami tRNA (Drugeon et al., 1997). Na terminácii translácie u eukaryotických organizmov sa podieľa i eRF3. Jeho funkcia nie je objasnená, ale predpokladá sa, že podporuje hydrolýzu peptidyl-tRNA vyvolanú eRF1 (Noble et Song, 2008).

2.4. Post-translačné úpravy

Podobne ako transkripty, i peptidy sú rôzne modifikované tak, aby čo najlepšie plnili svoju biologickú funkciu. Jedná sa o chemické úpravy jednotlivých aminokyselín (napr. metyláciu či acetyláciu) a vznik sekundárnej, terciárnej a kvartérnej proteínovej štruktúry.

20

Nakoľko však tieto úpravy nespadajú do procesov génovej expresie, lebo sa odohrávajú až po proteosyntéze (post-translačne), nebudú v tejto práci vysvetlené podrobnejšie.

21

3. Štúdium génovej expresie

Ako sa hromadili poznatky o génovej expresii, stále viac a viac sa ukazovalo, že mnohé procesy a javy v živých systémoch možno študovať i z tohto nového hľadiska – hľadiska génovej expresie. Expresia génov je takpovediac globálny biologický fenomén, lebo genetická informácia sa využíva univerzálne vo všetkých živých organizmoch. Nechýba ale ani lokálny rozmer, t.j. časová a priestorová lokalizácia expresie jednotlivých génov. Dôkazom globálneho charakteru môžu byť všeobecné transkripčné faktory, ktoré umožňujú exprimovať gén v ktorejkoľvek bunke, v akomkoľvek čase a v konštantnej miere. Lokálny charakter bol odhalený vtedy, keď sa pozorovali odlišné množstvá génových produktov v rôznych tkanivách, bunkových typoch či vývinových štádiách. Nerovnaké využívanie genetickej informácie za rôznych okolností sa postupne dalo do súvisu s mnohými biologickými javmi, napríklad embryogenézou alebo patologickými stavmi. Kvalitatívne a kvantitatívne analýzy génovej expresie sa ukázali ako veľmi informatívne a dôležité; dnes je na nich postavená napríklad diagnostika nádorových ochorení. Cieľom kvalitatívnych analýz je určiť, či k expresii daných génov za daných okolností dochádza alebo nie. Základná otázka znie: je expresia určitého génu pre skúmaný stav charakteristická? Odpoveďou je vždy „áno“ alebo „nie“. Na druhej strane, kvantitatívne analýzy génovej expresie zabiehajú do hlbších detailov. Ich základná otázka znie: od akej hladiny expresie určitého génu závisí skúmaný jav? Odpoveďou už nie je iba jednoduché „áno“ či „nie“ (t.j. dva hraničné stavy), ale i všetky prechodné stavy medzi nimi. Matematicky povedané, kvalitatívne analýzy vyhodnocujú génovú expresiu ako jednotku alebo nulu, kvantitatívne analýzy vyhodnocujú interval medzi nulou a jednotkou (vrátane nuly a jednotky) a následne vytvárajú korelácie medzi kvantitou génovej expresie a biologickými javmi. Kvalitatívna (niekedy nazývaná aj komparatívna) analýza génovej expresie je dostačujúca tam, kde sledujeme kvalitatívny fenotypový prejav, t.j. znak, ktorý môže nadobudnúť len jednu z presne vymedzených a zreteľne oddelených foriem. Takým znakom je napríklad počet krčných stavcov, ktorých môže byť 7 či 8, ale nikdy nie 7,5, 7,1, 7,8, atď. Druhou skupinou sú kvantitatívne fenotypové znaky, ktorých prejav závisí od expresie viacerých génov a jej hladiny. Takéto znaky môžu nadobudnúť ľubovoľnú formu v rámci určitého rozmedzia; typickým príkladom je dĺžka tela, ktorá môže dosahovať napr. 1 alebo 2 metre, ale aj ktorúkoľvek hodnotu z intervalu medzi týmito hodnotami. Pri kvantitatívnych

22 znakoch teda kvalitatívne analýzy nepostačujú, lebo nie sú schopné vysvetliť ich veľkú variabilitu. V súčasnosti preto prevažujú kvantitatívne analýzy génovej expresie. Opísať všetky kvalitatívne i kvantitatívne metódy by vyžadovalo viac priestoru, než je prípustné poskytnúť v tejto práci. Nasledujúce kapitoly preto pojednávajú len o tých, ktoré sú dnes najpoužívanejšie.

3.1. Western blotting

Westernový blotting (angl. western blotting, skrátene western blot) je jednou z troch blotovacích techník (Southern, northern a western blotting), ktoré pre detekciu DNA alebo proteínov využívajú ich väzbu na pevný povrch. Southernov blotting je určený pre detekciu DNA (Southern, 1975), northernový blotting pre detekciu RNA (Alwine et al., 1977) a westernový blotting pre detekciu proteínov (Burnette, 1981). Proteíny sa pri western blote analyzujú imunologicky, preto sa táto metóda nazýva aj imunoblotting (angl. immunoblotting). Western-blotová analýza začína rozdelením proteínov gélovou elektroforézou. Proteíny sú veľké makromolekuly so zložitými štruktúrami a ich separácia je ťažšia než separácia nukleových kyselín. Namiesto agarózovej elektroforézy používanej väčšinou pri nukleových kyselinách sa pri proteínoch používa denaturujúca polyakrylamidová elektroforéza (angl. polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE). Denaturujúce podmienky sú vytvorené pridaním dodecylsulfátu sodného (angl. sodium dodecyl sulfate, SDS), ktorý rozrúša proteínové štruktúry (denaturuje ich) a zhruba v konštantných odstupoch sa viaže na denaturované polypeptidové reťazce a dodáva im negatívny náboj. Pri zapojení elektrického poľa sa tak proteíny pohybujú smerom ku kladnému pólu a rýchlosťou závislou iba na ich molekulovej hmotnosti. Následným krokom je prenos proteínov z gélu na blotovaciu membránu. Na poréznu podložku sa umiestni niekoľko vrstiev filtračného papiera, elektroforetický gél, nitrocelulózová membrána, opäť niekoľko vrstiev filtračného papiera a znova porézna podložka. Tento tzv. sendvič sa umiestni do vhodného pufru a zapojí sa do elektrického poľa (strana s membránou smeruje k anóde, strana s gélom ku katóde) (Obr. 6). Proteíny obalené v SDS migrujú kvôli elektrickému náboju z gélu na membránu, kde sa pevne zachytia. Nasleduje zablokovanie membrány pre nešpecifické väzby detekčného činidla: membrána sa obmýva roztokom nešpecifického proteínu (zväčša lacného, napr. hovädzieho sérového albumínu, angl. bovine serum albumin, BSA). Nasleduje

23 niekoľkonásobné premývanie membrány v pufri Tris-HCl (pH = 7,4) a nakoniec premývanie roztokom značených primárnych protilátok. Posledným krokom je dôkladné vysušenie membrány, vyvolanie rádiografického signálu a jeho zachytenie na fotografickom papieri (Burnette, 1981); dnes sa používajú hlavne chemiluminiscenčné spôsoby detekcie. Prítomnosť signálu svedčí o prítomnosti študovaného proteínu (kvalitatívny rozmer), množstvo tohto signálu o množstve viazaných protilátok, t.j. množstve študovaného proteínu (kvantitatívny rozmer).

Obrázok 6: Western blotting. Zdroj: http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotSetup.gif (2013) (upravené).

Hlavnými výhodami western blottingu sú nenáročnosť a nízka cena. Proteíny sú na membránu viazané pevne, takže detekovať ich protilátkami možno opakovane a aj po dlhšom čase (Burnette, 1981). Hoci sa western blotting stal bežnou súčasťou laboratórnej praxe, má aj nedostatky. Každý proteín vyžaduje protilátku preň špecifickú, preto je z praktických dôvodov nereálne analyzovať mnoho proteínov súčasne. Pri SDS-PAGE navyše dochádza k denaturácii proteínov, teda aj k denaturácii ich epitopov – k detekcii monovalentnou (viažucou len jeden epitop) protilátkou preto niekedy nedochádza. Výroba špecifických protilátok je navyše zdĺhavá, ťažkopádna a finančne nákladná. Ďalšou nevýhodou je zdravotné riziko plynúce z práce s neurotoxickým akrylamidom. Ako príklad použitia western blottingu pri výskume rýb možno uviesť štúdiu glykoproteínu PSTBP (puffer fish saxitoxin and tetrodotoxin binding protein) a jeho homológov u siedmych druhov štvorzubcotvarých rýb (Tetraodontiformes) (Yotsu-Yamashita et al., 2010). 24

3.2. Proteínové čipové technológie (proteínové microarrays)

Článok o western blottingu najprv nebol prijatý k publikácii, lebo – ako autor poznamenal o tridsať rokov neskôr, – „technika (western blotting) bola priehľadne jasná, neprinášala žiaden zásadný príspevok do vedeckej literatúry“ a „dostala ľahkomyseľný názov ‚Western blotting‘“ na počesť Edwina Southerna (pôvodcu prvej blotovacej techniky) a západného pobrežia USA (angl. West Coast), kde bola vytvorená (Burnette, 2011). Keď sa však do popredia dostali tzv. „omiky“ (ako prvé genomika, transkriptomika a proteomika), western blotting sa ukázal ako nedostačujúci, lebo nebol schopný analyzovať veľké množstvo proteínov súčasne. Podľa vzoru čipových technológií využívaných pri hybridizácii nukleových kyselín sa ako alternatívne riešenie ukázali proteínové mikročipy.

Obrázok 7: Proteínový mikročip. Zdroj: MacBeath et Schreiber (2000) (upravené).

Rané proteínové čipy boli mikroskopické sklíčka, ktorých povrch bol upravený aldehydom (MacBeath et Schreiber, 2000). Aldehydy reagujú s primárnymi amínmi, napr. s aminoskupinou na konci proteínu; táto úprava zvyšuje afinitu proteínov k čipovému povrchu. Kapacita čipu sa zvýšila tak, že na jeho povrch sa vysoko precíznou robotickou tlačou (angl. high-precision contact-printing robot) umiestnilo niekoľko tisíc rovnakých mikrobodov (alebo mikrospotov, angl. microspots) (Obr. 7). Na 1 cm2 povrchu sklíčka bolo možné pripevniť až 1 600 mikrobodov. Jednotlivé mikrobody boli v skutočnosti nanolitrové objemy proteínových sond, mali priemer 150 až 200 µm a ich rozmiestnenie tvorilo mriežku (Obr. 8A). Vďaka nanášaniu proteínov na čip (Obr. 8B) v hydratovanom stave (v roztoku) sa sekundárne a terciárne proteínové štruktúry uchovali nepoškodené pre neskoršiu väzbu protilátok (Obr. 8C). Po vytvorení mikrospotov (proces angl. označovaný ako arraying) a inkubácii bolo sklíčko obmývané v BSA (podobne ako pri western blottingu), čím sa 25 odstránili nezreagované aldehydy, čip sa zablokoval pre nešpecifické väzby a znížilo sa množstvo nešpecifického signálu vznikajúceho pri detekcii. Ak však boli ako sondy použité peptidy alebo malé proteíny, molekuly BSA prečnievali ponad nich a znemožňovali viazanie protilátok. MacBeath et Schreiber (2000) preto prišli s inou úpravou: namiesto aldehydov aplikovali na sklíčko samotný BSA a ten aktivovali N-hydroxysukcínimidom (NHS). Aktivované aminokyseliny lyzín, asparagín a glutamín v BSA potom viazali a imobilizovali proteíny. Pri tomto druhom postupe sa sklíčko pre ďalšie väzby zablokovalo glycínom.

Obrázok 8: Detekcia proteínov pomocou proteínového mikročipu. A) Na povrch mikročipu sa viažu proteínové sondy. B) K sondám sa špecificky viažu analyzované proteíny. C) Na imobilizované proteíny sa viažu značené protilátky. D) Mikrospoty s prítomným proteínom produkujú fluorescenčný signál. Zdroj: http://tools.invitrogen.com/content/sfs/gallery/high/4953.jpg (upravené).

Dnes sa vyrábajú sklenené a plastové čipy, ktorých povrchy sú potiahnuté rôznymi chemickými látkami zvyšujúcimi ich afinitu k proteínom. Medzi takéto látky patria napríklad aldehydy, epoxidy, nitrocelulóza, polystyrén, poly-L-lyzín či aminosilany (Templin et al., 2002). Rôzne úpravy majú rôzne výhody a nevýhody a interagujú s proteínmi rôznymi spôsobmi (Zhu et Snyder, 2003; Guilleaume et al., 2005). Zaujímavou skupinou sú čipy s trojrozmernými gélmi na povrchu: v chemicky aktivovanom poréznom géle sa pomocou určitého spájacieho činidla viaže veľké množstvo proteínov, ktoré vďaka trojrozmernosti a tekutosti gélu zostávajú v natívnom stave a uchovávajú si aj svoju biologickú aktivitu (Arenkov et al., 2000). Príprava takýchto čipov je však zložitejšia a drahšia než príprava iných typov čipov. Mikrospoty možno na čipe vytvoriť kontaktným alebo bezkontaktným spôsobom. Medzi kontaktné spôsoby patrí litografia, t.j. robotické umiestňovanie drobných objemov na pevné povrchy. Veľkosť a vzdialenosť mikrospotov závisia viac-menej iba na rozlíšení, ktoré

26 je robot schopný dosiahnuť. Najmenšie mikrospoty majú v súčasnosti priemer 100 µm (Malainou et al., 2012). Bezkontaktnou metódou tvorby mikrospotov je napríklad fotolitografia. Ako jej názov naznačuje, ide o svetlom riadenú litografiu (Obr. 9). Proces začína tým, že aminoskupiny tzv. spájacích (angl. linker) molekúl pripevnených na čipe sú derivované určitými fotochemickými ochrannými skupinami. Svetlo spôsobuje fotolýzu týchto skupín (čo sa označuje ako fotodeprotekcia) a sprístupnenie aminoskupín pre reakcie (ich aktiváciu). Nasleduje tvorba mikrospotov pomocou fotolitografických masiek: maska má pre svetlo priepustné a nepriepustné oblasti; osvetlením čipu cez masku sa aktivujú iba určité (želané) oblasti. Po pridaní aminokyseliny vznikne medzi ňou a aktivovanou aminoskupinou normálna peptidová väzba. Pridávané aminokyseliny majú N- konce takisto fotochemicky derivované, preto sa nemôžu reťaziť. Použitím masiek s rôznymi vzorcami priepustnosti svetla sa aktivujú rôzne oblasti čipu, ku ktorým je následne možné pripojiť želanú aminokyselinu. Fotolitografia teda spočíva v opakovaní priestorovo špecifickej fotolýzy a následnej aplikácie aminokyselín na mikročip v špecifickom poradí (Fodor et al., 1991). Aj táto metóda však má svoje nedostatky: v dôsledku difrakcie svetla, jeho odrazu a rozptylu dochádza k neúplnému odstráneniu fotochemických ochranných skupín alebo ich odstráneniu v nesprávnych oblastiach, čím vznikajú peptidy s chýbajúcimi alebo nesprávnymi aminokyselinami; presnosť fotolitografie tak dosahuje iba 85 až 95 % (Fodor et al., 1991). Pokiaľ ide o detekciu signálu, niekdajšiu rádiografiu nahradili novšie (a bezpečnejšie) metódy. Sú založené prevažne na fluorescencii alebo enzymaticko-imunologických reakciách (napr. ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), pri ktorých sa signál detekuje opticky (CCD kamerou). Avšak aj tieto metódy majú svoje nevýhody: fluorescenčné značky môžu meniť schopnosť proteínu viazať sa na čip a kvantifikácia fluorescenčného signálu nie je presná; pri enzymaticko-imunologických esejach zase dochádza k nešpecifickým reakciám proteín-protilátka, ktoré poskytujú falošne pozitívny signál. Vyvíjajú sa aj detekčné metódy spojené s hmotnostnou spektrometriou, tie sú však zatiaľ príliš drahé. Hlavnou výhodou proteínových čipových technológií je schopnosť analyzovať veľa proteínov naraz, lebo každý mikrospot môže obsahovať inú sondu a viazať tak iné proteíny. Napriek tomu, že koncentrácia molekúl v mikrospote je vysoká, mikrospoty samotné sú miniatúrne a koncentrácia analyzovaného proteínu vo vzorke sa po aplikácii na čip zmenší len minimálne. Pre úspešnú analýzu teda postačujú oveľa menšie objemy roztokov než sú nutné pre western blotting. Postačujúca koncentrácia sondy v mikrobode je 1 - 1000 µg/ml

27 a postačujúca koncentrácia analyzovaného proteínu vo vzorke je 150 pg/ml (MacBeath et Schreiber, 2000).

Obrázok 9: Fotolitografia. A) Na povrch čipu sa priloží fotolitografická maska, cez ktorú sa čip osvetlí. B) Aktivujú sa len tie oblasti čipu, ku ktorým maska prepustí svetlo. C) Na aktivované aminoskupiny sa peptidovými väzbami viažu pridané aminokyseliny. D) Na povrch čipu sa priloží maska s iným vzorcom priepustnosti svetla. E) Na aktivované aminoskupiny sa naviažu aminokyseliny iného typu. F) Opakovaním krokov A) až C) a použitím masiek s rôznymi vzorcami priepustnosti svetla vznikajú na čipe charakteristické peptidy. Zdroj: Fodor et al. (1991) (upravené).

Mohlo by sa zdať, že citlivosť čipu je kvôli mnohonásobnému zmenšeniu väzbového povrchu (oproti western blottingu) nižšia. MacBeath et Schreiber (2000) otestovali citlivosť proteínového čipu tak, že na sklíčku vytvorili 10 799 mikrobodov s proteínom G a jediný mikrobod (na presne definovanej pozícii) s podjednotkou proteínu viažuceho rapamycín. Po väzbe protilátok špecifických pre tieto proteíny bol signál pozitívny len v mikrobode s podjednotkou proteínu viažuceho rapamycín (viditeľné po zväčšení), mikrobody s proteínom G poskytovali signály negatívne. Pri dosiahnutí určitej malej veľkosti mikrospotov majú signály vysokú hustotu, ktorá nezávisí na koncentrácii analyzovanej látky a je konštantná aj pri menších mikrospotoch (Templin et al., 2002). Proteínové čipy analyzujú veľký súbor proteínov naraz. Aby bola analýza hodnoverná, mikrospoty musia mať správny tvar a byť homogénne rozložené (Dufva, 2005). To je obmedzené výrobnými technológiami, či už chemickými alebo robotickými. V súčasnosti je možné vyrobiť už aj nanočipy, ale ich používanie je limitované vysokými kúpnymi cenami.

28

Problémom je aj zachovanie natívneho stavu proteínov. Detekcia proteínov na mikročipe je veľmi špecifická a závislá na ich neporušených štruktúrach. Tie zase závisia na post-translačných modifikáciách (napr. fosforylácii či glykozylácii), ktoré menia väzbové vlastnosti proteínov a ich interakcie s protilátkami. Ako bolo spomenuté v texte o western blottingu, výroba protilátok je náročná a nákladná a ich špecifickosť predstavuje problém. Dosiahnuť vysokú protilátkovú špecifickosť pri obrovskom počte proteínov prítomných v bunkách (nehovoriac už o rekombinantných proteínoch, ktoré sa v prírode prirodzene nevyskytujú) je veľmi ťažké a nie vždy možné. Naopak, pri nízkej špecifickosti (väzbe rôznych proteínov) hrozí vznik falošne pozitívneho signálu. Ďalšou prekážkou pri používaní mikročipov je nutnosť používať kvalitné optické zariadenia, ktoré sú veľmi drahé. Podobne i vyhodnocovanie mikročipových dát vyžaduje výkonné počítače.

3.3. Proteíny alebo mRNA?

Proteíny sú veľké a zložité molekuly, často tvoria komplexy s inými proteínmi alebo membránami, majú charakteristické fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH) a ťažko sa izolujú, purifikujú aj identifikujú. Naproti tomu mRNA sú malé molekuly, nemajú osobité chemické vlastnosti, štruktúry ani špeciálne funkcie. Vďaka polymerázovej reťazovej reakcii ich možno rýchlo a pohodlne syntetizovať a kopírovať, preto ich malé množstvo nepredstavuje problém. Identifikované sú podľa svojich primárnych sekvencií, ktoré sa ľahko určujú sekvenovaním alebo hybridizáciou s inými nukleovými kyselinami. Pre ich charakteristické post-transkripčné úpravy sa ľahko izolujú a purifikujú. Kvôli všetkým týmto výhodám je ich analýza v súčasnosti uprednostňovaná pred analýzou proteínov. Analýza génovej expresie prostredníctvom kvantifikácie mRNA zahŕňa rôzne metódy, ale nasledujúci text sa zameriava na dve z nich: DNA čipy a kvantitatívnu PCR.

3.4. DNA čipy (DNA microarrays)

Čipové technológie určené k analýze nukleových kyselín sú staršie než proteínové mikročipy. Využívajú rovnaký princíp ako Southern a northern blotting – hybridizáciu nukleových kyselín. Dva polynukleotidové reťazce hybridizujú, ak sú navzájom

29 komplementárne, bez ohľadu na to, či ide o DNA alebo RNA. Rovnako ako pri proteínových čipoch, aj povrch DNA čipov obsahuje tisícky mikrospotov, v tých sú však ako sondy imobilizované nukleové kyseliny (DNA alebo RNA). Vzorky sú fluorescenčne značené a hybridizované na čip, kde sa na základe svojej sekvencie viažu k patričným mikrospotom. Špecifický súbor pozitívnych a negatívnych signálov z jedného čipu sa nazýva expresný profil vzorky (Rinaldis et Lahm, 2007). Prvé DNA čipy vznikli v polovici 90. rokov 20. storočia (Schena et al., 1995). Ako hybridizačné sondy (tzv. próby) boli použité komplementárne DNA (angl. complementary DNA, cDNA) špecifické pre 45 génov rastliny Arabidopsis. cDNA boli amplifikované pomocou PCR a mikrolitrové objemy produktov PCR boli roboticky nanesené na povrch laboratórneho sklíčka. Aby sa DNA na sklíčku imobilizovala a aby denaturovala (čo je podmienkou následnej hybridizácie), sklíčko bolo chemicky a tepelne ošetrené. K analýze sa použila celková mRNA rastliny Arabidopsis (mRNA bola počas reverznej transkripcie flurescenčne označená). Značená cDNA sa naniesla na čip, kde sa viazala (hybridizovala) s komplementárnou sondou (t.j. v určitom mikrospote). Nakoniec bol vyvolaný fluorescenčný signál a čip bol naskenovaný. Ako kalibračná kontrola bola použitá mRNA pre ľudský acetylcholínový receptor, ktorá bola pred reverznou transkripciou v známej koncentrácii pridaná k celkovej mRNA z Arabidopsis; táto kontrola umožnila nastaviť vhodnú citlivosť detekcie (Schena et al., 1995). Ak sa analyzuje fluorescenčne značená mRNA z jednej vzorky, ide o kvalitatívnu analýzu. Tá hovorí o tom, ktoré gény sa vo vzorke exprimujú a ktoré nie. Ak sa však mRNA z jednej vzorky označí jedným typom fluorescenčnej farbičky a mRNA z inej vzorky iným typom farbičky, ich zmiešaním a aplikovaním na jeden čip možno získať i údaje o relatívnej miere expresie génov v jednej či druhej vzorke (Shalon et al., 1996). Pri tomto postupe je jedna vzorka štandardne referenčná a druhá vzorka sa analyzuje. Obe fluorescenčné značky majú vlastné excitačné i emisné spektrá a produkujú rozdielne signály. Ak v danom mikrospote prevláda signál analyzovanej DNA, môžeme povedať, že expresia daného génu v analyzovanej vzorke je väčšia než jeho expresia v referenčnej vzorke. Analogicky, ak v mikrospote prevláda signál referenčnej DNA, expresia daného génu je v analyzovanej vzorke menšia v porovnaní s referenčnou vzorkou. Ak vzniká signál zmiešaný, expresia génu je v oboch vzorkách porovnateľná (Shalon et al., 1996). Počet porovnávaných vzoriek je teda limitovaný iba počtom druhov fluorescenčných značiek. Povrch mikročipu môže obsahovať viac rovnakých polí, možno tak analyzovať i viac vzoriek naraz (napr. 4 či 8).

30

Hybridizačné próby môžu byť na čip imobilizované opäť dvoma spôsobmi: kontaktne a bezkontaktne. Kým bezkontaktné metódy (napr. fotolitografia) poskytujú vyššiu hustotu mikrospotov (až niekoľko miliónov na jeden čip), kontaktná tlač umožňuje syntetizovať dlhšie molekuly sond (až niekoľko tisíc bp). Tvorba mikrospotov sa niekedy nazýva deponovanie (alebo spotovanie) a v prípade kontaktných metód sa jedná o imobilizáciu vopred pripravených polynukleotidových reťazcov na čip. Naproti tomu bezkontaktné metódy predstavujú in situ syntézu, lebo polynukleotidové reťazce vznikajú až priamo na povrchu čipu. Vďaka robotickému spotovaniu možno na jeden čip umiestniť až 30 000 mikrospotov (Howbrook et al., 2003), pri bezkontaktnom spotovaní môže počet spotov dosiahnuť 100 000 (Dufva, 2005). DNA čipy možno kategorizovať a to z rôznych hľadísk. Napríklad podľa veľkosti a množstva prób na čipe možno hovoriť o malých a veľkých čipoch: malé sa používajú skôr pre diagnostické účely, obsahujú niekoľko stoviek vopred pripravených prób a dajú sa zhotoviť priamo v laboratóriu (pomocou komerčne dostupných spotovacích zariadení); veľké čipy sa využívajú v genomických a transkriptomických štúdiách, obsahujú tisíce až desaťtisíce prób a vyrábajú sa často fotolitograficky (buď ako štandardizované čipy alebo na objednávku) (Dufva, 2005). Výkon a kvalita mikročipov závisia na mnohých faktoroch. Medzi ne patrí spôsob ich výroby (napr. spôsob deponovania prób na čip, vlhkosť a teplota pri spotovaní, atď.), ich technické parametre (napr. vzdialenosť mikrospotov či ich hustota), použitá chémia (napr. typ látky využitej k imobilizácii prób či látky používané k blokovaniu nešpecifických čipových miest) a v neposlednom rade i samotné prevedenie hybridizácie, typy analyzovaných nukleových kyselín, ich sekvencia a spôsob získania. Dufva (2005) poskytuje prehľad parametrov, podľa ktorých možno definovať výkonnosť mikročipovej analýzy, a prehľad faktorov, ktoré ich ovplyvňujú. DNA čipy nachádzajú svoje využitie nielen pri analýzach génovej expresie, ale i pri detekcii jednobodových polymorfizmov (angl. single nucleotide polymorphisms, SNPs), analýze alternatívneho zostrihu, štúdiu genómovej DNA, a pod. Ich výhodou je (rovnako ako pri proteínových čipoch) najmä miniaturizácia. Jeden čip môže obsahovať veľké množstvo mikrospotov (alebo dokonca nanospotov), pričom jeden mikrospot môže obsahovať veľký počet prób; v konečnom dôsledku dochádza na jednom čipe k obrovskému počtu interakcií naraz a teda k urýchleniu celej analýzy. Vyššia hustota spotov a prób v nich oproti proteínovým čipom je spôsobená menšou veľkosťou imobilizovaných molekúl (v porovnaní s DNA). Oligonukleotidy navyše hybridizujú s inými nukleotidovými reťazcami na základe

31 svojej primárnej sekvencie, ktorej dĺžka môže byť malá (iba niekoľko desiatok nukleotidov) a ktorá nevytvára zložité či trvalé štruktúry. Identifikovať nukleové kyseliny je preto ľahké a rýchle. Výhodou je dnes už aj možnosť vyrobiť si čip v laboratóriu, lebo všetky potrebné komponenty a prístroje sa dajú ľahko zadovážiť. Analýza génovej expresie pomocou DNA čipov má samozrejme i iné výhody: mRNA sa ľahko izoluje a ľahko sa s ňou manipuluje (napr. vďaka jej poly(A) koncu). Jej kvantifikácia je tak oveľa rýchlejšia než kvantifikácia proteínov a analýza mRNA preto poskytuje rýchlo získateľnú a robustnú informáciu o génovej expresii. Pokiaľ ide o nevýhody, aj DNA čipy ich majú niekoľko. Pri pokračujúcom miniaturizačnom trende je potrebné dbať na pomer špecifického a nešpecifického signálu. Čím menšie sú mikrospoty, tým menší fluorescenčný signál vzniká, avšak šum pozadia zostáva približne rovnaký, čo sťažuje odlíšenie špecifického signálu od nešpecifického. Šum sa do analýzy vnáša pri väčšine jej krokov, preto je treba zdokonaliť súčasné metódy a technológie používané pri výrobe mikročipov (Rinaldis et Lahm, 2007). Určitý problém predstavuje i fotolitografická príprava čipov. Watson et al. (1998) udáva, že účinnosť jedného fotolitografického kroku (t.j. deprotekcia a syntéza nukleotidu) je približne 95 %. Pri syntéze reťazcov dlhších než 25 nukleotidov je už efektivita syntézy príliš nízka. Pokiaľ ide o analyzované oligonukleotidy, za vyhovujúce sa pokladajú reťazce s dĺžkou do 200 báz (Graves, 1999). V súvislosti s mikročipovými technológiami je problémom i masovosť dát, ktoré poskytujú. Pre analýzu takého množstva dát sa požadujú výkonné informačné technológie a pokročilé štatistické postupy, aby boli konečné výsledky hodnoverné a biologicky relevantné. Pohľad na štatistickú náročnosť mikročipových analýz poskytuje napr. Allison et al. (2006). Všeobecne platí, že čím väčší je súbor pokusných objektov (v tomto prípade počet hybridizačných reakcií), tým skôr sa pri analýze preukáže štatistická významnosť, čo však nemusí zodpovedať skutočnosti. V súčasnosti nie sú DNA čipy používané v takej miere, ako by to zodpovedalo ich výhodám. Príčinou je najmä ešte stále vysoká cena v porovnaní s konkurenčnými technikami. Hlavným konkurentom DNA mikročipov je kvantitatívna PCR. Kým mikročipy umožňujú analyzovať veľké množstvo génov z málo vzoriek naraz, kvantitatívna PCR dokáže analyzovať rôzne množstvo génov i z veľkého počtu vzoriek súčasne. Navyše je oveľa lacnejšia a rýchlejšia než mikročipy; hybridizácia jednej vzorky na veľkom čipe trvá hodiny až dni, kým analýza mnohých vzoriek pomocou kvantitatívnej PCR trvá zvyčajne iba minúty až hodiny. Aj napriek tomu sú zatiaľ DNA mikročipy pri celogenómových analýzach

32 nenahraditeľné. Je ale otázne, kedy budeme vedieť všetky informácie, ktoré nám takéto analýzy poskytujú, správne a biologicky relevantne interpretovať. Naproti tomu kvantitatívna PCR neprodukuje také množstvo informácií a preto patrí (spoločne s DNA čipmi) na prvé miesto techník používaných pri analýze génovej expresie. Nasledujúca kapitola pojednáva práve o kvantitatívnej PCR.

3.5. Kvantitatívna PCR

V polovici 80. rokov 20. storočia bol publikovaný princíp polymerázovej reťazovej reakcie: cyklické opakovanie denaturácie, hybridizácie a extenzie, pri ktorom dochádza k amplifikácii úseku DNA ohraničeného špecifickými oligonukleotidmi (primérmi) polymerázou (Mullis et al., 1986). Produkty PCR sa analyzovali až po skončení reakcie. O niekoľko rokov neskôr bola zverejnená modifikácia tohto postupu, ktorá dovoľovala analyzovať produkty PCR v reálnom čase – počas amplifikácie (Higuchi et al., 1993). Pôvodne sa táto modifikácia označovala ako kinetická analýza PCR, neskôr sa zaužívali názvy PCR v reálnom čase (angl. real-time PCR) či kvantitatívna PCR (angl. quantitative PCR, qPCR). Modifikácia qPCR v porovnaní s PCR spočíva v dvoch bodoch: 1) v každej reakčnej zmesi je prítomná sonda, ktorá sa viaže s DNA; 2) všetky simultánne amplifikačné reakcie sú počas každého hybridizačného/amplifikačného kroku snímané kamerou. Sonda je fluorescenčná molekula, ktorá po svojej excitácii produkuje fluorescenčný signál a ten je zachytávaný kamerou. Keďže nárast koncentrácie produktov PCR je pri všetkých reakciách rovnaký (paralelný) a intenzita fluorescencie úmerná množstvu týchto produktov, rozdiely v množstve fluorescenčného signálu medzi reakciami po určitom cykle PCR sú spôsobené iba rozdielnym počiatočným množstvom DNA v jednotlivých reakciách (Higuchi et al., 1993). Z hľadiska génovej expresie sa meria množstvo mRNA: tá je najprv reverznou transkriptázou prepísaná na cDNA a následne použitá ako templát pre qPCR. V tejto súvislosti sa qPCR niekedy označuje ako RT-qPCR (angl. reverse transcription-qPCR). Táto skratka (RT-qPCR) nezastupuje anglický výraz real-time PCR (ak literatúra neuvádza opak).

33

3.5.1. Sondy

Pre sondy sú typické dva aspekty: viažu sa s DNA a produkujú signál. Na základe toho prvého rozlišujeme sondy špecifické a sondy nešpecifické. Nešpecifické sondy (farbičky, angl. dyes) sa viažu so všetkými molekulami DNA, ku ktorým majú prístup. Špecifické sondy (próby, angl. probes) sa viažu len s komplementárnou DNA. Pokiaľ ide o tvorbu signálu, k tej dochádza rôznymi spôsobmi, napríklad v dôsledku hydrolýzy, denaturácie či hybridizácie (VanGuilder et al., 2008). Väčšina sond používaných v súčasnosti funguje na princípe fluorescencie: sonda obsahuje fluorescenčnú časť (fluorofór), ktorá po excitácii (ožiarení svetlom určitej vlnovej dĺžky) fluoreskuje (Cardullo, 1988). Sondy zvyknú mať aj tzv. vnútornú (angl. intrinsic) fluorescenciu, ktorá je nešpecifická a znižuje presnosť analýzy. Vyvíjajú sa preto také sondy, ktoré fluoreskujú bez väzby s DNA minimálne a po väzbe s DNA maximálne (napr. Singer et al., 1997; Dragan et al., 2010). Z praktických dôvodov, najmä kvôli tzv. zhášaniu fluorescencie (angl. photobleaching), sa sondy uchovávajú v tme a pri nízkej teplote. Nešpecifické sondy (farbičky) sa viažu na všetky dostupné molekuly DNA. Najčastejším mechanizmom tejto väzby je interkalácia (vmedzerenie) farbičky medzi bázy DNA alebo jej väzba do malého žliabku DNA (angl. minor groove binding, MGB). Špecifické sondy (próby) sú založené na rezonančnom prenose fluorescenčnej energie (angl. fluorescence resonance energy transfer, FRET). Na tomto prenose sa podieľajú dve molekuly: donorový a akceptorový fluorofór (Cardullo, 1988; Clegg, 1995). Akceptorový fluorofór má schopnosť potlačiť fluorescenciu donovorého fluorofóru (pohltením jeho fluorescenčnej energie), ak sú dostatočne blízko, preto sa označuje ako zhášač (angl. quencher). Ak dôjde k oddialeniu oboch fluorofórov, donorová molekula môže voľne fluoreskovať, preto sa označuje ako reportér (angl. reporter) (Zhang et al., 2001; McChlery et Clarke, 2003). Existujú rôzne typy špecifických sond. Hydrolyzačné próby majú reportér na 5‘ konci (Obr. 10A vľavo), pričom ten je pri amplifikácii Taq polymerázou odštiepený (Taq polymeráza má 5‘ exonukleázovú aktivitu) – tým dochádza k fluorescencii reportéru (Holland et al., 1991; McChlery et Clarke, 2003; VanGuilder et al., 2008) (Obr. 10A vpravo). Molekulárne majáky (angl. molecular beacons) naopak ťažia zo svojej sekundárnej štruktúry: konce oligonukleotidu sú navzájom komplementárne, takže próba vytvára vlásenkovú štruktúru (Obr. 10C vľavo). Prostredná časť oligonuekleotidu tvorí laso a je komplementárna k amplifikovanej DNA. Hybridizácia s DNA neumožňuje próbe zaujať vlásenkovú formu

34 a vzďaľuje zhášač od reportéru, ktorý tak môže fluoreskovať (Zhang et al., 2001; McChlery et Clarke, 2003; VanGuilder et al., 2008) (Obr. 10C vpravo). Ďalším typom špecifických prób sú duálne hybridizačné próby, ktoré pozostávajú z dvoch oligonukleotidov: 5‘ koniec jedného oligonukleotidu je značený jedným fluorofórom a 3‘ koniec druhého oligonukleotidu je značený druhým fluorofórom (Obr. 10B vľavo). Oligonukleotidy sú navrhnuté tak, aby hybridizovali s DNA v tesnom závese za sebou, čím sa fluorofóry dostanú do blízkosti a fluorescencia jedného vyvolá fluorescenciu druhého (McChlery et Clarke, 2003; VanGuilder et al., 2008) (Obr. 10B vpravo).

Obrázok 10: Typy špecifických sond. A) Hydrolyzačná sonda je aktivovaná 5‘ exonukleázovou činnosťou Taq polymerázy. B) Hybridizačná sonda pozostáva z dvoch oligonukleotidov, ktorých vzájomná blízkosť spôsobí fluorescenciu. C) Molekulárny maják sa aktivuje rozrušením svojej sekundárnej štruktúry a hybridizáciou s DNA. Zdroj: http://img.medscape.com/article/774/873/774873-fig1.jpg (upravené).

Rôzne typy sond majú rôzne výhody a nevýhody. Výhodou nešpecifických sond je to, že pomocou jedného typu farbičky možno analyzovať ľubovoľný produkt PCR. Keďže sa môže na jednu molekulu DNA viazať väčší počet farbičiek, detekcia je citlivá i pri malom množstve DNA. Okrem toho sú lacné a ľahko sa používajú. Na druhej strane, nešpecifické sondy môžu produkovať falošný signál (viažu sa aj s kontaminujúcou DNA či nešpecifickými produktmi amplifikácie) a s ich pomocou je možné porovnávať iba produkty rovnakej dĺžky, lebo amplifikácia dlhších produktov poskytuje väčší signál už z podstaty veci. Navyše ich nemožno použiť pri mnohonásobných (angl. multiplex) qPCR. Naproti tomu výsadou špecifických sond je práve ich špecifickosť, t.j. že sa aktivujú len v prítomnosti špecifickej

35

DNA. Z toho dôvodu sú vhodné i pre mnohonásobné qPCR. Špecifickosť próby je do istej miery aj jej nevýhodou, pretože pri malom množstve DNA nemusí byť signál dostatočne silný a v prípade jednobodových nukleotidových polymorfizmov (SNP) nemusí próba hybridizovať dostatočne dobre. Okrem toho je výroba špecifických sond náročnejšia a drahšia a tieto sondy sú citlivé na manipuláciu a podmienky amplifikácie. Produkty amplifikácie a kvantifikácie je pri niektorých typoch sond (najmä nešpecifických a molekulárnych majákoch) nutné overiť analýzou teplotných kriviek (angl. melting curve analysis) (VanGuilder et al., 2008). V počiatkoch qPCR sa ako nešpecifická sonda najviac využíval etídiumbromid (EtBr). Dnes sú dostupné mnohé ďalšie varianty nešpecifických sond, napríklad SYBR Green, PicoGreen či Alexa Fluor. Gudnason et al. (2007) porovnáva 15 druhov farbičiek vzhľadom na ich schopnosť inhibovať PCR, ich prednostnú väzbu v oblastiach s vysokým obsahom guanínu a ich vplyv na analýzu teplotných kriviek. Aj špecifických sond existuje v súčasnosti veľa druhov; päť najbežnejších hydrolyzačných sond napríklad porovnáva Sohni et al. (2008).

3.5.2. Detekcia signálu

Ku kvantifikácii DNA dochádza pri qPCR simultánne s jej amplifikáciou. Prístroje pre qPCR obsahujú výkonný zdroj žiarenia (zväčša laser), ktorý je schopný produkovať svetlo želanej vlnovej dĺžky či dĺžok. Ďalej obsahujú veľmi citlivý detektor (najmä diódy či CCD kameru), ktorý dokáže rozpoznať svetlo jednotlivých vlnových dĺžok i pri malej intenzite fluorescencie; tento aspekt je osobitne dôležitý pri multiplexových reakciách. Takéto optické zariadenia sú ale drahé a ich citlivosť a presnosť sú úmerné ich cene. Navyše, v dôsledku prechodu signálu potrebnými filtrami a optickou dráhou dochádza k jeho oslabeniu a stratám. Z týchto dôvodov zatiaľ nie je možné využívať multiplexovú qPCR s viac ako troma či štyrmi odlišnými sondami (Wittwer et al., 2001). Existujú však aj také optické systémy, v ktorých sa všetky signály zbierajú naraz a triedia sa až na konci optickej dráhy; takáto simultánna detekcia ale vyžaduje špeciálne prístroje (Lee et al., 2004). Popri inovovaní a skvalitňovaní optických zariadení existujú aj snahy vyvinúť rovnako účinné, ale lacnejšie alternatívy. Príkladom môže byť elektrochemický detekčný systém, ktorý je založený na rovnakom princípe ako hydrolyzačné sondy, ale namiesto fluorofórov využíva redoxné molekuly a namiesto svetelného žiarenia zaznamenáva elektrochemický potenciál (Luo et al., 2011; Deféver et al., 2011).

36

3.5.3. Vyhodnotenie signálu a kvantifikácia produktov PCR

Nárast signálu v priebehu qPCR musí byť úmerný nárastu množstva DNA, inak by amplifikáciu nebolo možné kvantifikovať. Množstvo DNA rastie počas PCR exponenciálne (Mullis et al., 1986), rovnako i množstvo fluorescenčného signálu. Kvantifikácia signálu môže byť dvojaká – absolútna alebo relatívna.

3.5.3.1. Absolútna kvantifikácia

Pri absolútnej kvantifikácii sa najprv zostrojí štandardná kalibračná krivka. Z roztoku mRNA o známej koncentrácii sa pripraví niekoľko presne definovaných riedení, u ktorých sa po reverznej transkripcii určí koncentrácia DNA (napríklad spektrofotometricky). Počet kópií cieľovej DNA v každom riedenom roztoku sa určí podľa vzorca

kde x je počet kópií cieľovej DNA v 1 µl roztoku, c je nameraná koncentrácia DNA (g/µl) a b je dĺžka amplikónu vyjadrená počtom párov báz (Whelan et al., 2003). Presný počet molekúl mRNA v reakcii získame vynásobením čísla x objemom reakčnej zmesi. Riedené roztoky sa podrobia amplifikácii. Ako počas qPCR narastá množstvo produktu, narastá i fluorescenčný signál. Dosiahnutie určitej zvolenej intenzity fluorescencie sa označuje ako dosiahnutie tzv. hodnoty Cq (z angl. quantification cycle), niekedy tiež označovanej ako hodnota Ct (z angl. treshold cycle, voľne preložené ako prahový cyklus). Čím viac DNA je prítomnej na začiatku reakcie, tým skôr dosiahne fluorescencia svoju prahovú hodnotu (Cq). Hodnoty Cq sa zobrazia v grafe a proti každej Cq sa vynesie logaritmus korešpondujúcej hodnoty x (t.j. počiatočný počet cieľových molekúl v reakcii) – vzniká

štandardná krivka. Ak potom v grafe znázorníme hodnotu Cq pre sledovanú DNA a odčítame patričnú hodnotu x, získavame informáciu o tom, aký počet cieľových molekúl bol v reakcii prítomný na začiatku amplifikácie (Whelan et al., 2003; Lee et al., 2006; Dhanasekaran et al., 2010). Nutnosť použiť spoľahlivý štandard a poznať jeho koncentráciu je hlavnou nevýhodou absolútnej kvantifikácie. Z toho dôvodu sa tento spôsob kvantifikácie používa prevažne iba v tých prípadoch, kedy je naozaj dôležité poznať presnú koncentráciu DNA, ako napríklad v medicínskej diagnostike.

37

3.5.3.2. Relatívna kvantifikácia

Relatívna kvantifikácia vyjadruje množstvo DNA v reakcii relatívne, t.j. porovnáva ho s iným množstvom DNA. Výsledkom relatívnej kvantifikácie je teda pomer dvoch množstiev DNA (Van Guilder et al., 2008).

Pre relatívnu analýzu hodnôt Ct existujú rozličné metódy, ale najpoužívanejšou je metóda (Livak et Schmittgen, 2001). Tá vychádza z rovnice amplifikácie:

( ) kde je počiatočné množstvo cieľových molekúl, je množstvo cieľových molekúl po cykle n, je účinnosť amplifikácie a n je počet cyklov. Ako bolo spomenuté v predošlom texte, cyklus, po ktorom intenzita signálu (t.j. množstvo amplifikátu) dosiahne zvolenú hodnotu, sa označuje Ct. Preto možno n nahradiť hodnotou Ct:

( ) kde CT,X je prahový cyklus, XT je množstvo cieľových molekúl dosiahnuté pri prahovom cykle a MX je konštanta zastupujúca danú rovnicu (použitá kvôli zjednodušeniu, viď ďalej). Ako bolo uvedené na začiatku tejto kapitoly, pri relatívnej kvantifikácii sa množstvo cieľovej DNA dáva do pomeru s iným množstvom DNA. Do analýzy je však potrebné zahrnúť vplyvy pôsobiace na amplifikáciu, a pre tento účel sa využívajú endogénne kontroly. Endogénnou kontrolou sa rozumie referenčná DNA, ktorá sa amplifikuje spoločne s cieľovou DNA, ale ktorej množstvo je naprieč reakciami rovnaké (narozdiel od množstva cieľovej DNA). Amplifikácia endogénnej kontroly (v nasledujúcom texte označenej písmenom R ako referenčná) má rovnakú rovnicu ako amplifikácia študovanej DNA, ich vzájomný pomer tak predstavuje prvú operáciu relatívnej kvantifikácie:

( )

( ) kde MR reprezentuje amplifikáciu endogénnej kontroly a M je konštanta zastupujúca normalizovanú amplifikáciu cieľovej DNA. Amplifikácia cieľovej a kontrolnej DNA by mala ideálne prebiehať rovnako, t.j. s rovnakou účinnosťou (EX = ER). Relatívna kvantifikácia navyše predpokladá, že táto účinnosť sa rovná jednej. Ak sa teda pomer X0 a R0 označí ako XN (N značí normalizáciu), rovnicu možno zapísať v tomto tvare:

38

Úpravou vzniká rovnica

.

Normalizovaná hodnota prahovej fluorescencie sa následne porovná s inou vzorkou alebo kontrolou (kalibrátorom, ktorý nepodliehal pokusnému zásahu); až v tomto bode pristupujeme k samotnej relatívnej kvantifikácii, doteraz sa iba normalizovala hodnota prahovej fluorescencie. Pre kontrolnú vzorku platí rovnaký matematický zápis, vzájomný pomer analyzovanej vzorky (index A) a kalibrátora (označeného indexom K) preto možno napísať ako

kde ( ). Množstvo cieľovej DNA je teda (Livak et Schmittgen, 2001). Ako endogénne kontroly sa často používajú tzv. údržbové (angl. housekeeping) gény, ktorých produkty zabezpečujú základné bunkové procesy, preto sa v rôznych bunkách exprimujú konštantne (to sa však v súčasnosti spochybňuje). Faktory, ktoré pôsobia počas reverznej transkripcie a amplifikácie (napr. koncentrácie jednotlivých zložiek, funkčnosť enzýmov, manipulácia s roztokmi, a pod.), musia nutne pôsobiť na cieľovú DNA i na endogénnu kontrolu zároveň, ktorých pomer by tak mal byť pre vzorku konštantný (aj keby sa zmenilo ich absolútne množstvo, ich vzájomný pomer by sa zmeniť nemal). Ak je táto podmienka splnená, môžeme tento pomer porovnať s pomerom získaným z inej vzorky, čím dostávame informáciu o pomere množstva cieľovej DNA v jednej vzorke k jej množstvu v druhej vzorke. Bežne sa ako referenčné gény používajú gény pre rRNA, aktín, tubulín, β2- mikroglobulín či glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (angl. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH). Použitie jedného referenčného génu nemusí byť dostatočne vierohodné a použitie rôznych referenčných génov môže poskytnúť odlišné výsledky, preto je ich výber a experimentálne overenie veľmi dôležité (Thellin et al., 1999; Radonić et al., 2004; Dheda et al., 2005).

39

3.5.4. Normalizácia

Kvantitatívna PCR patrí k obľúbeným laboratórnym technikám, ale pre jej maximálne využitie je nutná jej normalizácia. Cieľom normalizácie je vylúčiť z analýzy akékoľvek vplyvy, ktorých dôsledkom by bolo skreslenie obrazu o skutočnom stave génovej expresie (Dheda et al., 2005). Medzi takéto vplyvy patrí napríklad veľkosť vzorky, z ktorej sa mRNA izoluje. Prvým normalizačným krokom je zaručiť, aby bolo reverzne transkribované rovnaké množstvo RNA z každej vzorky. mRNA všetkých vzoriek by mala byť izolovaná vždy rovnakým postupom a vždy z rovnakého množstva biologického materiálu. Tým sa uchová reprezentatívnosť vzoriek. Keďže je mRNA po izolácii veľmi citlivá, musí sa s ňou zaobchádzať rýchlo a opatrne, pozornosť sa musí venovať i jej vhodnému uskladneniu, aby sa zachovala jej najvyššia kvalita (niekedy sa hovorí o hodnote integrity RNA, angl. RNA integrity number, RIN. Ďalšou požiadavkou je čistota RNA; izoláty by nemali obsahovať DNA, nukleázy a inhibítory. Všetky tieto vplyvy znižujú dôveryhodnosť analýzy a účinnosť reverznej transkripcie (Bustin et Nolan, 2004). Ďalším normalizačným krokom je použitie už spomínaných endogénnych kontrol. Prostredníctvom nich možno určiť účinnosť reverznej transkripcie a amplifikácie a odhaliť tak faktory, ktoré negatívne vplývajú na tieto procesy (Thellin et al., 1999). V súčasnosti možno pre overenie referenčných génov použiť viaceré počítačové programy, ako napríklad Gnorm (Vandesompele et al., 2002), BestKeeper (Pfaffl et al., 2004) či Norm-Finder (Andersen et al., 2004). qPCR analýza si vyžaduje aj ďalšiu normalizáciu, predovšetkým je potrebné venovať sa návrhu primérov, výberu nešpecifických či špecifických sond, podmienkam amplifikácie, výpočtu účinnosti amplifikácie, výberu metódy pre analýzu dát, použitiu analýzy teplotných kriviek, a ďalším. Z priestorových dôvodov však ďalšie detaily nebudú v tomto texte uvedené.

40

4. Ryby ako modelové organizmy

Modelové organizmy sú neodmysliteľnou súčasťou vedeckého bádania. Za modelové sa považujú tie organizmy, ktoré svojimi vlastnosťami vyhovujú danej vedeckej disciplíne a jej metódam. Takpovediac osobitné postavenie v tomto smere má genetika a z nej vychádzajúce vedy, ktoré boli (a z veľkej časti stále sú) založené na pokusoch s modelovými organizmami. Stačí spomenúť dva príklady: hrach siaty (Pisum sativum) a pokusy s ním umožnili J. G. Mendelovi v druhej polovici 19. storočia odhaliť princípy dedičnosti a položiť základy genetiky; pokusy s vínnou muškou (Drosophila melanogaster) zase umožnili T. H. Morganovi na začiatku 20. storočia objaviť princípy génovej väzby a chromozómovú podstatu dedičnosti, čo umožnilo neskorší vznik molekulárnej genetiky. Ryby ako modelový organizmus v genetike prvýkrát použil G. Streisinger v druhej polovici 20. storočia (Snustad et Simmons, 2009). Išlo o danio pruhované (Danio rerio), malú akváriovú rybku, vďaka pruhom na povrchu tela nazývanú zebrička. Danio spĺňa mnohé kritériá kladené na modelové organizmy, ako sú malá veľkosť, nenáročný chov, rýchly životný cyklus (pri optimálnych podmienkach vzniká potomstvo každých 5 až 6 mesiacov), veľký počet potomkov a navyše vonkajšie oplodnenie a priehľadnosť vajíčok. Avšak bežným modelovým organizmom sa táto ryba stala až v 90. rokoch 20. storočia. Dnes už je známy aj jej genóm, ktorý tvorí zhruba 1,6 miliárd bázových párov a 23,5 tisíc génov (Snustad et Simmons, 2009). Ryby sú dnes obľúbenými výskumnými organizmami v mnohých disciplínach. Keďže ide o fylogeneticky najstaršie a druhovo najpočetnejšie stavovce, sú vhodným objektom pre komparatívne disciplíny a vedy zaoberajúce sa fylogenézou a evolúciou (napr. Levin et al., 2012). Druhovú početnosť a rozmanitosť rýb využívajú vedci takisto pre populačné štúdie, výskum hybridizácie a medzidruhových reprodukčných bariér (napr. Broughton et al., 2011). Priehľadnosť ich vajíčok či tiel (u niektorých druhov) je v spojení s molekulárnymi fluorescenčnými technikami dôležitým nástrojom v embryológii, bunkovej a molekulárnej biológii, vedách o vývine a vlastne všade, kde sa študuje bunková diferenciácia, medzibunková komunikácia alebo vzorce génovej expresie (napr. Marandel et al., 2012). Aplikovaný výskum používajúci ryby ako model zahŕňa sledovanie vplyvu znečistenia vody na vodné organizmy, sledovanie vplyvu globálneho otepľovania na diverzitu a zloženie rybích spoločenstiev, štúdium správania rýb (skupinové, individuálne, symbiotické, parazitické, atď.) a ich biologických rytmov, a iné (napr. Yu et al., 2013). Medzi najdôležitejšie aplikácie

41 výskumu rýb patrí snaha o ich ochranu (napr. Sousa et al., 2010) a genetické inžinierstvo akvakultúrnych druhov (napr. Nam et al., 2001).

4.1. Ryby z čeľade Cyprinidae ako modelové organizmy

Na riešiteľskom pracovisku sa k parazitologickým a molekulárno-genetickým štúdiám využívajú jedince z rodov Chondrostoma a Parachondrostoma (slov. podustva, čes. ostroretka), Cyprinus (slov. kapor, čes. kapr) a Leuciscus (slov. jalec, čes. jelec). Všetky tieto druhy patria do čeľade kaprovitých (Cyprinidae). S viac než 200 rodmi a asi 2 900 druhmi ide o druhovo najpočetnejšiu čeľaď rýb a dokonca i stavovcov, ktorej zástupcovia sa vyskytujú v sladkých a brakických vodách Eurázie, Afriky a Severnej Ameriky (Eschmeyer et Fond, 2013; Froese et Pauly, 2012). Medzi typické anatomické znaky týchto rýb patrí: 1 až 3 rady faryngeálnych zubov s maximálne 8 zubami v jednom rade, prečnievajúca horná čeľusť, a dĺžka niekoľko milimetrov (u najmenších druhov) až tri metre (u najväčších druhov). Pre reprodukčné správanie je charakteristické, že rodičia sa o potomstvo nestarajú. Z genetického hľadiska ide o diploidné eukaryotické organizmy s typickým počtom chromozómov okolo 50, ale vyskytuje sa u nich i polyploidia (Froese et Pauly, 2012). Jedným z hlavných dôvodov, prečo sa kaprovité ryby často využívajú ako výskumné organizmy, je ich hojný výskyt. Sú bežné v sladkých vodách Severnej Ameriky, Afriky a Eurázie, takže poskytujú stály a bohatý zdroj biologického materiálu. Keďže sladkovodné biotopy sú do určitej miery izolované (na rozdiel od morských prostredí), aj populácie rýb sú v danom biotope dostatočne izolované a teda dobre definovateľné. Práve táto schopnosť odlíšiť jednotlivé druhy a populácie ponúka možnosť zaznamenávať a chrániť ohrozené druhy, monitorovať invazívne druhy, sledovať medzidruhovú hybridizáciu, a ďalšie. Štúdie predošlého typu sú tradične založené na morfometrických popisoch. Príkladom môže byť analýza výskytu hrúzovca sieťovaného (Pseudorasbora parva, čes. střevlička východní) v Poľsku (Rechulicz, 2011). Tento druh pochádzajúci z Ázie je v európskych tokoch invazívny, t.j. súťaží s pôvodnými (domácimi) druhmi o potravu a vytláča ich z ich prirodzených lokalít. Populácie invazívneho druhu z rôznych lokalít a rôznych odchytov boli popísané pomocou parametrov ako hustota rýb vztiahnutá k počtu a biomase rýb či hmotnosť rýb a ich dĺžka (Rechulicz, 2011). Čím ďalej, tým viac sa do takýchto štúdií zapájajú poznatky a techniky molekulárnej biológie a genetiky. Príkladom môže byť štúdia sledujúca mieru hybridizácie medzi rybami

42 troch druhov rodu jelčík (Cyprinella) (Broughton et al., 2011). Miera hybridizácie bola stanovená vďaka genetickým analýzam (stanovili sa genotypy a haplotypy jedincov, ďalej pre ktorý druh sú alely pôvodné a v akej miere prebehlo zanesenie jednotlivých alel – odrážajúce hybridizáciu – do druhov nepôvodných), ktoré vyžadovali použitie metód molekulárnej biológie (izoláciu jadrovej a mitochondriálnej DNA, jej amplifikáciu pomocou PCR a automatizované sekvenovanie); použité boli takisto nástroje bioinformatiky, napríklad sekvenčné priloženie (angl. alignment) pri rekonštrukcii fylogenetických vzťahov (Broughton et al., 2011). Ďalšou výhodou kaprovitých rýb je veľkosť tela: mnohé druhy dosahujú dĺžku iba niekoľko desiatok centimetrov a menšiu, takže ich odchyt je jednoduchý a prípadná manipulácia a chov nenáročné. Náročnosť chovu je znížená i tým, že kaprovité ryby – ako všetky ryby – sú ektotermné, teda teplotne prispôsobivé svojmu okoliu. Tak je možné sledovať napríklad i vplyv teploty vody na rýchlosť embryogenézy (napr. Nunn et al., 2003). Reprodukčná biológia môže ťažiť z jednoduchosti a frekvencie rozmnožovania. Oplodnenie je vonkajšie, t.j. samica uloží vajíčka do substrátu, kde ich oplodní samec. Týmto spôsobom dochádza k oplodneniu mnohých vajíčok a vzniku mnohých embryí. Príkladom výskumu reprodukčného správania ohrozených a geneticky málo variabilných druhov a populácií môže byť sledovanie súvislosti medzi počtom rodičov, dĺžkou reprodukčnej periódy a efektívnou veľkosťou populácie a jej genetickou diverzitou u ohrozeného druhu Tanakia tanago (čes. tanakie tokijská) (Kubota et Watanabe, 2012). Štúdie o reprodukčnej biológii rýb sú osobitne dôležité pre komerčných chovateľov. V snahe získať konkurenčnú výhodu na trhu s rybími produktmi sa títo usilujú o šľachtenie chovaných druhov a získanie nových variant (hybridov). Práve u kaprovitých rýb je prirodzená medzidruhová hybridizácia veľmi častá. Ideálnym prípadom cielenej hybridizácie je získanie plodného potomstva vykazujúceho určité fenotypové „vylepšenie“, preto sa mnoho štúdií venuje mechanizmom hybridizácie, fertilite hybridov, diferenciácii pohlavia a s tým spojeným znakom (napr. Nzau Matondo et al., 2011). Už spomínané danio pruhované (Danio rerio) slúži ako najčastejší a azda nenahraditeľný modelový organizmus v embryológii a vývinovej biológii. Jeho prednosťou je priehľadnosť vajíčok a embryí, takže za využitia mikroskopických alebo molekulárnych fluorescenčných techník je možné zviditeľniť a lokalizovať bunky, bunkové procesy i jednotlivé biochemické deje, a sledovať ich dynamiku. Medzi takéto techniky patrí napríklad histologické farbenie embryí, celostná hybridizácia in situ a mikroskopické pozorovania,

43 ktoré použil Teittinen et al. (2012) pri sledovaní úlohy proteínu SAP30L v regulácii srdcového vývinu a hematopoézy počas embryogenézy u dania. Súčasné techniky dokážu zviditeľniť nielen jednotlivé biochemické dráhy, ale i individuálne molekuly, ktoré sa ich zúčastňujú. V tomto smere dominuje molekulárno- genetický výskum. Ide najmä o fluorescenčné zvýraznenie proteínov a nukleových kyselín, čo odkrýva obrovské pole možností pre štúdium molekulových interakcií, enzýmovej kinetiky, subcelulárnej lokalizácie molekúl, a ďalších javov, ktoré podmieňujú život a funkciu buniek a organizmov. V prípade nukleových kyselín môže ísť o detekciu určitých molekúl RNA v rôznych fázach bunkového cyklu, pri rôznych stupňoch diferenciácie bunky alebo v regulácii niektorého biochemického procesu. Zvlášť regulačné mechanizmy reagujúce na exogénne podnety si udržujú veľkú pozornosť vedcov, lebo ide o zatiaľ nie úplne prebádaný priestor značných rozmerov a rastúcej dôležitosti. Príkladom výskumu tohto zamerania môže byť popis génov kódujúcich estrogénový receptor u Gobiocypris rarus (čes. dánio dadunské) a vplyv endokrinných disruptorov na ich expresiu (Wang et al., 2011). V súvislosti s pohlavnými hormónmi a diferenciáciou pohlavia existuje snaha objaviť aké gény sa na týchto procesoch podieľajú a v akej miere. Cao et al. (2012) napríklad sledoval expresiu génov dmrt1, cyp19a1a a cyp19a1b u zástupcov druhu Gobiocypris rarus vzhľadom na ich vývinové štádium a pohlavie a na základe svojich výsledkov predpokladá, že spomínané gény hrajú dôležitú úlohu pri určení a vývoji pohlavia u týchto rýb. Na druhej strane sa sledujú zmeny génovej expresie vyvolané vonkajšími činiteľmi. Príkladom môže byť farmakologicky zameraná analýza, pri ktorej Pruvot et al. (2012) skúmal letálne účinky niekoľkých bežne používaných liečiv na jedince druhu Danio rerio v rôznych fázach ich embryonálneho vývoja. Analýza génovej expresie však môže poskytnúť dôkazy i o účinkoch rôznych iných vonkajších faktorov na organizmus. Liu et al. (2012) napríklad sledoval vplyv zvýšenej koncentrácie medi a kadmia na expresiu génu kódujúceho šaperón HSP90 u kardinálky čínskej (Tanichthys albonubes) a zistil, že po niekoľkých dňoch dochádza pri zvýšenej koncentrácii niektorého z kovov k zníženiu expresie daného génu. Rodrigues et al. (1998) zase sledoval súvislosť medzi expresiou dvoch „imunitných“ génov (Cyca-B2m a Cyca-UA) u kapra obyčajného (Cyprinus carpio L.) a nízkou teplotou vody a zistil, že vystavenie rýb dostatočne nízkej teplote (6 °C) po dobu dvoch týždňov mení expresiu oboch génov. Tzv. imunitné gény sú výborným objektom pri štúdiu imunologických javov. Expresia týchto génov u rýb môže poskytnúť obraz o tom, ako dané jedince či populácie rozpoznávajú patogénne organizmy, aká mohutná či presná je ich imunitná odpoveď, alebo či súvisí

44 variabilita imunitných génov s variabilitou parazitov, ktorým sú jedince vystavené. Rakus et al. (2012) napríklad pomocou DNA mikročipov sledoval génovú expresiu u dvoch línií kapra obyčajného (Cyprinus carpio L.) infikovaných koi herpesvírusom (angl. koi herpesvirus, KHV) a okrem významného zvýšenia či zníženia expresie rôznych génov u oboch skupín pozoroval i významné zvýšenie expresie imunologicky relevantných génov u rezistentnejšej línie. Dodatočná qPCR analýza preukázala zvýšenú aktiváciu CD8+ T-lymfocytov u rezistentnejších jedincov a celá analýza podľa autora poskytuje dôkaz o tom, že prekonanie infekcie KHV je v dominantnej miere kontrolované genetickými faktormi hostiteľa (Rakus et al., 2012). Súhrnne by sa dalo povedať, že ryby sú vhodným modelovým organizmom pre štúdium väčšiny javov v živej prírode, či už ide o úroveň druhu, populácie, jedinca, bunky, génov alebo molekúl. Ryby predstavujú veľký rezervoár biologickej variability, ktorá poslúžila pri vzniku mladších skupín stavovcov, vrátane človeka. Skupina Cyprinidae (kaprovité ryby), druhovo najpočetnejšia a veľmi rozmanitá skupina stavovcov, sa teda výborne hodí pre skúmanie tejto variability, jej vzniku a udržiavania.

45

5. Návrh experimentu

Okrem spracovania relevantnej literatúry na zadanú tému je cieľom tejto bakalárskej práce i navrhnúť analýzu expresie génov DAB1 a DAB3 u vybraných druhov rýb metódou qPCR (ďalej len analýza). Prvým krokom analýzy by mala byť izolácia mRNA génov DAB1 a DAB3, jednoduchšou alternatívou je ale izolovať celkovú RNA. Na riešiteľskom pracovisku – Ústav botaniky a zoológie (oddelenie parazitológie) Prírodovedeckej fakulty Masarykovej univerzity (ďalej len pracovisko) – sa pre tento účel používa RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Nakoľko sa gény DAB1 a DAB3 podieľajú na imunitnej reakcii rýb (Stet et al., 1998), možno predpokladať, že ich expresia prebieha najmä v tkanivách asociovaných s imunitným systémom, konkrétne napríklad v slezine; tento predpoklad je potrebné vziať do úvahy pri výbere tkanív pre izoláciu RNA a takisto pri výbere referenčných génov (Ingerslev et al., 2006). Všetky vzorky by mali byť izolované z rovnakého množstva tkaniva a za rovnakých podmienok. Na pracovisku sú uskladnené i vzorky z predošlých izolácií – tieto možno použiť pre overenie a optimalizáciu jednotlivých krokov analýzy. Druhým krokom by mala byť reverzná transkripcia mRNA. K tomuto účelu sa na pracovisku využíva High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems). Všetky vzorky (vrátane negatívnej kontroly) by mali byť reverzne transkribované za rovnakých podmienok a účinnosť reverznej transkripcie by mala byť ideálne 100 % (Bustin et Nolan, 2004). Pre výpočet tejto účinnosti je potrebné pripraviť kalibračnú krivku, t.j. zahrnúť do reverznej transkripcie i niekoľko vzoriek s definovaným riedením. V treťom kroku analýzy by sa vzorky cDNA mali po prečistení podrobiť polymerázovej reťazovej reakcii. Je nutné optimalizovať koncentrácie jednotlivých zložiek PCR a teplotné parametre reakcie (najmä hybridizačnú teplotu primérov). Špecifickosť a optimálnosť PCR sa overuje gélovou elektroforézou produktov PCR, prípadne automatizovaným sangerovským sekvenovaním. PCR i qPCR vyžadujú vhodné a špecifické priméry. K ich návrhu možno použiť voľne dostupný softvér (napr. Primer3; Thornton et Basu, 2011). Priméry musia byť špecifické pre sekvencie génov DAB1 a DAB3 i pre sekvencie referenčných génov (dvojica primérov pre každý gén). Z homologických sekvencií spomínaných génov (ktoré sú na pracovisku k dispozícii) možno zhotoviť konsenzuálnu nukleotidovú sekvenciu pre oba gény (napr. v programe Clustal Omega). V tejto sekvencii je vhodné vyhľadať málo variabilné (t.j. konzervované) oblasti a priméry navrhnúť komplementárne k týmto oblastiam. 46

Odporúčaná dĺžka amplikónu je menej ako 150 bázových párov. Vzhľadom na malú veľkosť amplikónu sa navrhuje použiť elektroforetický gél s vyššou koncentráciou agarózy, než sa na Pracovisku používa bežne (3% namiesto 2%). Štruktúru a nukleotidové sekvencie navrhnutých primérov je vhodné vopred overiť, napríklad pomocou softvéru Oligo Analyzer. Priméry by nemali vytvárať stabilné sekundárne štruktúry, nemali by byť navzájom komplementárne, obsah guanínu a cytozínu by mal byť okolo 50 % (po sčítaní), 3‘ konce by mali byť stabilné a špecifické pre daný gén. Programom BLAST je vhodné overiť, či priméry nebudú hybridizovať s neželanými cDNA. Priméry nemusia byť navrhnuté nanovo, možno použiť i priméry, ktoré sa opisujú v odbornej literatúre. Stále však platí, že všetky priméry musia byť skontrolované vzhľadom na konkrétne podmienky analýzy. Takpovediac nevyhnutnou súčasťou qPCR je jej normalizácia, pre ktorú sa najčastejšie používajú referenčné gény (Dheda et al., 2005). Pri ich výbere môže veľmi dobre pomôcť odborná literatúra (Radonić et al., 2004). Je dobré zvoliť si viacero génov, ktoré boli vedeckou verejnosťou overené a sú odporúčané pre normalizáciu qPCR (t.j. ich expresia je stála i pod vplyvom experimentálnych podmienok). Pri výbere týchto génov je potrebné pamätať na to, že expresia určitého génu závisí od mnohých parametrov – od typu tkaniva, pohlavia jedinca či jeho ontogenetického štádia, od podmienok životného prostredia, atď. (McCurley et Callard, 2008). Gény, ktoré prejdú výberovým procesom na základe literatúry (napr. gény pre ribozomálne RNA, transkripčné či translačné faktory, ribozomálne podjednotky, a pod.), ďalej treba porovnať s databázou nukleotidových sekvencií (napr. GenBank) a vyhľadať ich sekvencie u vybraných druhov rýb. Ak je dostupných viacero sekvencií, je vhodné postupovať ako pri návrhu primérov pre cieľové gény, t.j. zhotoviť konsenzuálnu sekvenciu každého génu, nájsť jej konzervované oblasti a podľa nich navrhnúť možné priméry. Všetky priméry by mali byť analyzované tak, ako to bolo uvedené v predchádzajúcom texte. Po výbere dobrých referenčných génov, overení primérov a optimalizácii PCR možno pristúpiť k hlavnému kroku – qPCR. Pracovisko umožňuje použiť Power SYBR Green PCR Master Mix, ktorý obsahuje nešpecifickú sondu SYBR Green. Najprv sa navrhuje overiť expresia zvolených referenčných génov, ktorá by mala byť naprieč vzorkami približne rovnaká. Ak vybrané gény obstoja v tejto skúške, možno pokračovať samotnou kvantitatívnou analýzou. Súčasťou každej amplifikácie by mali byť i kontrolné vzorky a ďalej niekoľko vzoriek s presne definovaným riedením, podľa ktorých by bolo možné zostrojiť kalibračnú krivku. Keďže budú pri analýze využité nešpecifické sondy, vzniknuté produkty qPCR je

47 nutné podrobiť analýze teplotných kriviek. Analýza teplotných kriviek nasleduje hneď za samotnou qPCR a overuje, či boli amplifikované iba špecifické produkty v každej reakcii (Ririe et al., 1997). Dôležité je všetky reakcie (izoláciu RNA, reverznú transkripciu, PCR i qPCR) vykonávať v replikátoch (duplikátoch alebo triplikátoch). Získané hodnoty sa pre korešpondujúce vzorky spriemerujú a pri matematických operáciách by sa mali používať iba tieto priemerné hodnoty. Posledným krokom Analýzy je vyhodnotenie získaných dát. Keďže úmyslom Analýzy je porovnať expresiu dvoch génov medzi sebou, vhodnejšou sa javí relatívna kvantifikácia. Pre tento účel možno použiť program Bio-Rad CFX Manager od firmy Bio-Rad, ktorý je na Pracovisku k dispozícii. Najprv by sa mala z hodnôt Cq riedených vzoriek zostrojiť kalibračná (štandardná) krivka a z nej vypočítať účinnosť qPCR. Akceptovateľné sú hodnoty účinnosti v rozmedzí 90 - 110 %. Vypočítaná účinnosť by sa mala dosadiť do vzorca pre relatívnu kvantifikáciu (napr. podľa metódy -∆∆Ct; Livak et Schmittgen, 2001), čím by sa dospelo k finálnym výsledkom Analýzy. S koncovými dátami Analýzy možno narábať podľa potreby či záujmu. Navrhujem porovnať expresiu génov DAB1 a DAB3 u vybraných rýb a asociovať ju s parazitárnym osídlením týchto rýb. Týmto spôsobom možno skúmať napríklad evolúciu vzťahu parazit-hostiteľ či účinok génovej duplikácie v imunitnom systéme hostiteľa (gén DAB3 vznikol duplikáciou génu DAB1) na jeho obranu pred určitými druhmi patogénov.

48

6. Záver

Predložená bakalárska práca poukazuje na dôležitosť štúdia génovej expresie, ktorú znázorňuje ako komplexnú sieť mnohých naväzujúcich procesov. Každý z týchto procesov môže poslúžiť ako terč regulačných faktorov; ako jeden takýto regulátor bol uvedený patogén, ktorého vplyv na génovú expresiu v bunkách hostiteľa závisí od imunitného systému hostiteľa. Práca ďalej porovnáva rôzne metódy využívané k analýze génovej expresie. Vymenúva ich silné i slabé stránky a upozorňuje na to, že pri výbere vhodnej analytickej metódy je nutné brať do úvahy parametre ako cenu, technické prevedenie, citlivosť či špecifickosť každej metódy, ale najmä biologické okolnosti plánovaných analýz. Metódy študujúce proteíny a metódy študujúce mediátorovú RNA sa uberajú inými cestami a poskytujú odlišné informácie o génovej expresii. Ako lacná, rýchla, jednoduchá, špecifická a veľmi citlivá metóda bola identifikovaná kvantitatívna real-time PCR. Pomocou real-time qPCR možno génovú expresiu kvantifikovať absolútne alebo relatívne. Relatívnu kvantifikáciu považuje táto práca za jednoduchšiu a viac vyhovujúcu pre navrhovaný experiment. Návrh experimentu tvorí poslednú časť tejto práce; ide o konkrétny postup analýzy expresie dvoch génov hlavného histokompatibilného komplexu u kaprovitých rýb pomocou kvantitatívnej real-time PCR. Daný experiment by mal byť praktickou súčasťou mojej diplomovej práce, na ktorú má byť táto bakalárska práca predprípravou.

49

Zoznam použitých skratiek aa-tRNA – aminoacyl-tRNA ATP – adenozíntrifosfát bp – bázové páry (angl. base pairs) BSA – hovädzí sérový albumín (angl. bovine serum albumin) CCD – angl. charge-coupled camera cDNA – komplementárna DNA (angl. complementary DNA)

Cq – kvantifikačný prah (angl. quantification cycle)

Ct – kvantifikačný prah (angl. treshold cycle) CTD – C-koncová doména (angl. C-terminal domain) DNA – deoxyribonukleová kyselina (angl. deoxyribonucleic acid) eEF – eukaryotický translačný elongačný faktor (angl. eukaryotic elongation factor) eIF – eukaryotický translačný iniciačný faktor (angl. eukaryotic initiation factor) ELISA – enzymaticko-imunologická esej (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) eRF – eukaryotický translačný uvoľňovací faktor (angl. eukaryotic release factor) EtBr - etídiumbromid FRET – rezonančný prenos fluorescenčnej energie (angl. fluorescence resonance energy transfer) GAPDH – glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza (angl. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) GMP – guanozínmonofosfát GTF – všeobecný transkripčný faktor (angl. general transcription factor) GTP – guanozíntrifosfát hnRNA – heterogénna jadrová RNA (angl. heterogenous nuclear RNA) KHV – koi herpesvírus m7G – 7-metylguanozín MGB – molekula viažuca sa do malého žliabku DNA (angl. minor groove binder) MHC – hlavný histokompatibilný komplex (angl. main histocompatibility complex) mi-RNA – mikro-RNA mRNA – mediátorová RNA NHS – N-hydroxysukcínimid PAGE – polyakrylamidová gélová elektroforéza PIC – preiniciačný transkripčný komplex 50 pre-mRNA – prekurzorová mRNA PSTBP – proteín viažuci saxitoxín a tetrodotoxín (angl. puffer fish saxitoxin and tetrodotoxin binding protein) qPCR – kvantitatívna PCR (angl. quantitative PCR) RIN – hodnota integrity RNA (angl. RNA integrity number) RNA – ribonukleová kyselina (angl. ribonucleic acid) RT-qPCR – reverzne transkriptázová qPCR SDS – dodecylsulfát sodný (angl. sodium dodecyl sulfate) snoRNA – malá jadierková RNA (angl. small nucleolar RNA) SNP – jednobodový nukleotidový polymorfizmus (angl. single nucleotide polymorphism) snRNA – malá jadrová RNA (angl. small nuclear RNA) snRNP – malý jadrový nukleoproteín (angl. small nuclear ribonucleoprotein) TAFs – faktory asociované s TBP (angl. TBP-associated factors) TBP – proteín viažuci TATA box (angl. TATA box binding protein) TF – transkripčný faktor rRNA – ribozomálna RNA tRNA – transférová RNA

51

Literatúra

Akhtar W, Veenstra GJC. 2011. TBP-related factors: a paradigm of diversity in transcription initiation. Cell Biosci 1(1): 23. doi:10.1186/2045-3701-1-23 Allison DB, Cui X, Page GP, Sabripour M. 2006. Microarray data analysis: from disarray to consolidation and consensus. Nat Rev Genet 7(1): 55–65. doi:10.1038/nrg1749 Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. 1977. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA 74(12): 5350–5354. doi:10.1073/pnas.74.12.5350 Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF. 2004. Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets. Cancer Res 64(15): 5245–5250. doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0496 Andersen GR, Nissen P, Nyborg J. 2003. Elongation factors in protein biosynthesis. Trends Biochem Sci 28(8): 434–441. doi:10.1016/S0968-0004(03)00162-2 Arenkov P, Kukhtin A, Gemmell A, Voloshchuk S, Chupeeva V, Mirzabekov A. 2000. Protein Microchips: Use for Immunoassay and Enzymatic Reactions. Anal Biochem 278(2): 123–131. doi:10.1006/abio.1999.4363 Black DL. 2003. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem 72(1): 291–336. doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161720 Broughton RE, Vedala KC, Crowl TM, Ritterhouse LL. 2011. Current and historical hybridization with differential introgression among three species of cyprinid fishes (genus Cyprinella). Genetica 139(5): 699–707. doi:10.1007/s10709-011-9578-9 Burnette WN. 1981. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 112(2): 195–203. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5 Burnette WN. 2011. Western Blotting. Clin Chem 57(1): 132–133. doi:10.1373/clinchem.2010.149765 Bustin S, Nolan T. 2004. Pitfalls of Quantitative Real-Time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction. J Biomol Tech 15(3): 155–166. Cao M, Duan J, Cheng N, Zhong X, Wang Z, Hu W, Zhao H. 2012. Sexually dimorphic and ontogenetic expression of dmrt1, cyp19a1a and cyp19a1b in Gobiocypris rarus. Comp Biochem Phys A 162(4): 303–309. doi:10.1016/j.cbpa.2012.03.021 Cardullo RA. 1988. Detection of Nucleic Acid Hybridization by Nonradiative Fluorescence Resonance Energy Transfer. Proc Natl Acad Sci USA 85(23): 8790–8794. doi:10.1073/pnas.85.23.8790 Carter R, Drouin G. 2009. Structural differentiation of the three eukaryotic RNA polymerases. Genomics 94(6): 388–396. doi:10.1016/j.ygeno.2009.08.011 Clegg RM. 1995. Fluorescence resonance energy transfer. Curr Opin Biotech 6(1): 103–110. doi:10.1016/0958-1669(95)80016-6

52

Cler E, Papai G, Schultz P, Davidson I. 2009. Recent advances in understanding the structure and function of general transcription factor TFIID. Cell Mol Life Sci 66(13): 2123– 2134. doi:10.1007/s00018-009-0009-3 Colgan DF, Manley JL. 1997. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Gene Dev 11(21): 2755–2766. doi:10.1101/gad.11.21.2755 Deféver T, Druet M, Evrard D, Marchal D, Limoges B. 2011. Real-Time Electrochemical PCR with a DNA Intercalating Redox Probe. Anal Chem 83(5): 1815–1821. doi:10.1021/ac1033374 Dhanasekaran S, Doherty TM, Kenneth J. 2010. Comparison of different standards for real- time PCR-based absolute quantification. J Immunol Methods 354(1-2): 34–39. doi:10.1016/j.jim.2010.01.004 Dheda K, Huggett J, Chang J, Kim L, Bustin S, Johnson M, Rook G, Zumla A. 2005. The implications of using an inappropriate reference gene for real-time reverse transcription PCR data normalization. Anal Biochem 344(1): 141–143. doi:10.1016/j.ab.2005.05.022 Dragan A, Casas-Finet J, Bishop E, Strouse R, Schenerman M, Geddes C. 2010. Characterization of PicoGreen Interaction with dsDNA and the Origin of Its Fluorescence Enhancement upon Binding. Biophys J 99(9): 3010–3019. doi:10.1016/j.bpj.2010.09.012 Drugeon G, Jean-Jean O, Frolova L, Le Goff X, Philippe M, Kisselev L, Haenni A. 1997. Eukaryotic release factor 1 (eRF1) abolishes readthrough and competes with suppressor tRNAs at all three termination codons in messenger RNA. Nucleic Acids Res 25(12): 2254–2258. doi:10.1093/nar/25.12.2254 Dufva M. 2005. Fabrication of high quality microarrays. Biomol Eng 22(5-6): 173–184. doi:10.1016/j.bioeng.2005.09.003 Egloff S, Murphy S. 2008. Cracking the RNA polymerase II CTD code. Trends Genet 24(6): 280–288. doi:10.1016/j.tig.2008.03.008 Eschmeyer WN, Fong JD. 2013. Catalog of Fishes: Species by Family/Subfamily [online]. [Použité 29-01-2013]. Fodor S, Read J, Pirrung M, Stryer L, Lu A, Solas D. 1991. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 251(4995): 767–773. doi:10.1126/science.1990438 Froese R, Pauly D. 2012. FishBase [online]. [Použité 29-01-2013]. Graves DJ. 1999. Powerful tools for genetic analysis come of age. Trends Biotechnol 17(3): 127–134. doi:10.1016/S0167-7799(98)01241-4 Gudnason H, Dufva M, Bang D, Wolff A. 2007. Comparison of multiple DNA dyes for real- time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature. Nucleic Acids Res 35(19): e127. doi:10.1093/nar/gkm671 Guilleaume B, Buneß A, Schmidt C, Klimek F, Moldenhauer G, Huber W, Arlt D, Korf U, Wiemann S, Poustka A. 2005. Systematic comparison of surface coatings for protein microarrays. Proteomics 5(18): 4705–4712. doi:10.1002/pmic.200401324 Helenius K, Yang Y, Tselykh TV, Pessa HKJ, Frilander MJ, Makela TP. 2011. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, 53

transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Res 39(12): 5025–5035. doi:10.1093/nar/gkr107 Hieb AR, Halsey WA, Betterton MD, Perkins TT, Kugel JF, Goodrich JA. 2007. TFIIA Changes the Conformation of the DNA in TBP/TATA Complexes and Increases their Kinetic Stability. J Mol Biol 372(3): 619–632. doi:10.1016/j.jmb.2007.06.061 Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. 1993. Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nat Biotechnol 11(9): 1026–1030. doi:10.1038/nbt0993-1026 Holland PM. 1991. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 88(16): 7276–7280. doi:10.1073/pnas.88.16.7276 Howbrook DN, van der Valk AM, O'Shaughnessy MC, Sarker DK, Baker SC, Lloyd AW. 2003. Developments in microarray technologies. Drug Discov Today 8(14): 642–651. doi:10.1016/S1359-6446(03)02773-9 Ingerslev H, Pettersen EF, Jakobsen RA, Petersen CB, Wergeland HI. 2006. Expression profiling and validation of reference gene candidates in immune relevant tissues and cells from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Mol Immunol 43(8): 1194–1201. doi:10.1016/j.molimm.2005.07.009 Kaul G, Pattan G, Rafeequi T. 2011. Eukaryotic elongation factor-2 (eEF2): its regulation and peptide chain elongation. Cell Biochem Funct 29(3): 227–234. doi:10.1002/cbf.1740 Kozak M. 1999. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234(2): 187– 208. doi:10.1016/S0378-1119(99)00210-3 Kubota H, Watanabe K. 2012. Effects of parental number and duration of the breeding period on the effective population size and genetic diversity of a captive population of the endangered Tokyo bitterling Tanakia tanago (Teleostei: Cyprinidae). Zoo Biol 31(6): 656–668. doi:10.1002/zoo.20429 Larson DR, Zenklusen D, Wu B, Chao JA, Singer RH. 2011. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science 332(6028): 475–478. doi:10.1126/science.1202142 Larson MH, Zhou J, Kaplan CD, Palangat M, Kornberg RD, Landick R, Block SM. 2012. Trigger loop dynamics mediate the balance between the transcriptional fidelity and speed of RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA 109(17): 6555–6560. doi:10.1073/pnas.1200939109 Lee DS, Wu MH, Ramesh U, Lin CW, Lee TM, Chen PH. 2004. A novel real-time PCR machine with a miniature spectrometer for fluorescence sensing in a micro liter volume glass capillary. Sensor Actuat B-Chem 100(3): 401–410. doi:10.1016/j.snb.2004.02.012 Lee C, Kim J, Shin SG, Hwang S. 2006. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol 123(3): 273–280. doi:10.1016/j.jbiotec.2005.11.014 Levin BA, Freyhof J, Lajbner Z, Perea S, Abdoli A, Gaffaroğlu M, Özuluğ M, Rubenyan HR, Salnikov VB, Doadrio I. 2012. Phylogenetic relationships of the algae scraping cyprinid genus Capoeta (Teleostei: Cyprinidae). Mol Phylogenet Evol 62(1): 542–549. doi:10.1016/j.ympev.2011.09.004

54

Liu H, Chen H, Jing J, Ma X. 2012. Cloning and characterization of the HSP90 beta gene from Tanichthys albonubes Lin (Cyprinidae): effect of copper and cadmium exposure. Fish Physiol Biochem 38(3): 745–756. doi:10.1007/s10695-011-9556-2 Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods 25(4): 402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262 Luo J, Hall BD. 2007. A Multistep Process Gave Rise to RNA Polymerase IV of Land Plants. J Mol Evol 64(1): 101–112. doi:10.1007/s00239-006-0093-z Luo X, Xuan F, Hsing I. 2011. Real time electrochemical monitoring of PCR amplicons using electroactive hydrolysis probe. Electrochem Commun 13(7): 742–745. doi:10.1016/j.elecom.2011.04.027 Maas S, Rich A, Nishikura K. 2002. A-to-I RNA Editing: Recent News and Residual Mysteries. J Biol Chem 278(3): 1391–1394. doi:10.1074/jbc.R200025200 MacBeath G, Schreiber SL. 2000. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science 289(5485): 1760–1763. Malainou A, Petrou P, Kakabakos S, Gogolides E, Tserepi A. 2012. Creating highly dense and uniform protein and DNA microarrays through photolithography and plasma modification of glass substrates. Biosens Bioelectron 34(1): 273–281. doi:10.1016/j.bios.2012.02.020 Marandel L, Labbe C, Bobe J, Le Bail P. 2012. nanog 5′-upstream sequence, DNA methylation, and expression in gametes and early embryo reveal striking differences between teleosts and mammals. Gene 492(1): 130–137. doi:10.1016/j.gene.2011.10.037 McCurley AT, Callard GV. 2008. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male- female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC Mol Biol 9(1): 102. doi:10.1186/1471-2199-9-102 McChlery SM, Clarke SC. 2003. The Use of Hydrolysis and Hairpin Probes in Real-Time PCR. Mol Biotechnol 25(3): 267–274. doi:10.1385/MB:25:3:267 Merrick WC. 2004. Cap-dependent and cap-independent translation in eukaryotic systems. Gene 332: 1–11. doi:10.1016/j.gene.2004.02.051 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51(Part 1): 263–273. Nam YK, Noh JK, Cho YS, Cho HJ, Cho K, Kim CG, Kim DS. 2001. Dramatically accelerated growth and extraordinary gigantism of transgenic mud loach Misgurnus mizolepis. Transgenic Res 10(4): 353–362. doi:10.1023/A:1016696104185 Noble CG, Song H. 2008. Structural studies of elongation and release factors. Cell Mol Life Sci 65(9): 1335–1346. doi:10.1007/s00018-008-7495-6 Nunn AD, Cowx IG, Frear PA, Harvey JP. 2003. Is water temperature an adequate predictor of recruitment success in cyprinid fish populations in lowland rivers? Freshwater Biol 48(4): 579–588. doi:10.1046/j.1365-2427.2003.01033.x Nzau Matondo B, Ovidio M, Philippart JC, Poncin P. 2011. Reproductive behaviour and sexual production in the first-generation hybrids of roach Rutilus rutilus L. × common bream Abramis brama L. J Appl Ichthyol 27(3): 859–867. doi:10.1111/j.1439- 0426.2010.01603.x

55

Onodera Y, Haag JR, Ream T, Nunes PC, Pontes O, Pikaard CS. 2005. Plant Nuclear RNA Polymerase IV Mediates siRNA and DNA Methylation-Dependent Heterochromatin Formation. Cell 120(5): 613–622. doi:10.1016/j.cell.2005.02.007 Papic N, Maxwell CI, Delker DA, Liu S, Heale BSE, Hagedorn CH. 2012. RNA-Sequencing Analysis of 5' Capped RNAs Identifies Many New Differentially Expressed Genes in Acute Hepatitis C Virus Infection. Viruses 4(12): 581–612. doi:10.3390/v4040581 Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. 2004. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett 26(6): 509– 515. doi:10.1023/B:BILE.0000019559.84305.47 Pikaard CS, Haag JR, Ream T, Wierzbicki AT. 2008. Roles of RNA polymerase IV in gene silencing. Trends Plant Sci 13(7): 390–397. doi:10.1016/j.tplants.2008.04.008 Pollard TD, Earnshaw WC, Lippincott-Schwartz J. 2008. Cell biology, 2nd edn. Saunders/Elsevier, Philadelphia. Pruvot B, Quiroz Y, Voncken A, Jeanray N, Piot A, Martial JA, Muller M. 2012. A panel of biological tests reveals developmental effects of pharmaceutical pollutants on late stage zebrafish embryos. Reprod Toxicol 34(4): 568–583. doi:10.1016/j.reprotox.2012.07.010 Radonić A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Bioph Res Co 313(4): 856–862. doi:10.1016/j.bbrc.2003.11.177 Rakus KŁ, Irnazarow I, Adamek M, Palmeira L, Kawana Y, Hirono I, Kondo H, Matras M, Steinhagen D, Flasz B, Brogden G, Vanderplasschen A, Aoki T. 2012. Gene expression analysis of common carp (Cyprinus carpio L.) lines during Cyprinid herpesvirus 3 infection yields insights into differential immune responses. Dev Comp Immunol 37(1): 65–76. doi:10.1016/j.dci.2011.12.006 Rechulicz J. 2011. Monitoring of the Topmouth Gudgeon, Pseudorasbora Parva (Actinopterygii: Cypriniformes: Cyprinidae) in a Small Upland Ciemięga River, Poland. Acta Icth et Piscat 41(3): 193–199. doi:10.3750/AIP2011.41.3.07 Rinaldis E de, Lahm A. 2007. DNA Microarrays: Current Applications. Horizon Bioscience, Great Britain. Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. 1997. Product Differentiation by Analysis of DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction. Anal Biochem 245(2): 154–160. doi:10.1006/abio.1996.9916 Rodrigues PNS, Dixon B, Roelofs J, Rombout JHMW, Egberts E, Pohajdak B, Stet RJM. 1998. Expression and Temperature-Dependent Regulation of the Beta2-Microglobulin (Cyca-B2m) Gene in a Cold-Blooded Vertebrate, the Common Carp (Cyprinus carpio L.). Dev Immunol 5(4): 263–275. doi:10.1155/1998/15984 Shalon D, Smith SJ, Brown PO. 1996. A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Res 6(7): 639– 645. doi:10.1101/gr.6.7.639 Shandilya J, Roberts SG. 2012. The transcription cycle in eukaryotes: From productive initiation to RNA polymerase II recycling. BBA-Gene Regul Mech 1819(5): 391–400. doi:10.1016/j.bbagrm.2012.01.010

56

Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. 1995. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science 270(5235): 467– 470. doi:10.1126/science.270.5235.467 Singer VL, Jones LJ, Yue ST, Haugland RP. 1997. Characterization of PicoGreen Reagent and Development of a Fluorescence-Based Solution Assay for Double-Stranded DNA Quantitation. Anal Biochem 249(2): 228–238. doi:10.1006/abio.1997.2177 Snustad DP, Simmons MJ. 2009. Principles of Genetics, 5th edn. John Wiley & Sons, Inc., New York. Sohni Y, Kanjilal S, Kapur V. 2008. Performance evaluation of five commercial real-time PCR reagent systems using TaqMan assays for B. anthracis detection. Clin Biochem 41(7-8): 640–644. doi:10.1016/j.clinbiochem.2008.01.007 Sousa V, Penha F, Pala I, Chikhi L, Coelho MM. 2010. Conservation genetics of a critically endangered Iberian minnow: evidence of population decline and extirpations. Anim Conserv 13(2): 162–171. doi:10.1111/j.1469-1795.2009.00317.x Southern E. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98(3): 503–517. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0 Stet RJM, Kruiswijk CR, Saeij JPJ, Wiegertjes GF. 1998. Major histocompatibility genes in cyprinid fishes: theory and practice. Immunol Rev 166(1): 301–316. doi:10.1111/j.1600- 065X.1998.tb01271.x Stolboushkina EA, Garber MB. 2011. Eukaryotic type translation initiation factor 2: Structure–functional aspects. Biochemistry-Moscow+ 76(3): 283–294. doi:10.1134/S0006297911030011 Teittinen KJ, Grönroos T, Parikka M, Junttila S, Uusimäki A, Laiho A, Korkeamäki H, Kurppa K, Turpeinen H, Pesu M, Gyenesei A, Rämet M, Lohi O. 2012. SAP30L (Sin3A-associated protein 30-like) is involved in regulation of cardiac development and hematopoiesis in zebrafish embryos. J Cell Biochem 113(12): 3843–3852. doi:10.1002/jcb.24298 Templin MF, Stoll D, Schrenk M, Traub PC, Vöhringer CF, Joos TO. 2002. Protein microarray technology. Drug Discov Today 7(15): 815–822. doi:10.1016/S1359- 6446(00)01910-2 Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, Borman B de, Coumans B, Hennen G, Grisar T, Igout A, Heinen E. 1999. Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J Biotechnol 75(2-3): 291–295. doi:10.1016/S0168-1656(99)00163-7 Thornton B, Basu C. 2011. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ 39(2): 145–154. doi:10.1002/bmb.20461 Tian B, Hu J., Zhang H, Lutz C. 2005. A large-scale analysis of mRNA polyadenylation of human and mouse genes. Nucleic Acids Res 33(1): 201–212. doi:10.1093/nar/gki158 Vandesompele J, Preter K de, Pattyn F, Poppe B, van Roy N, Paepe A de, Speleman F. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3(7): research0034.1. doi:10.1186/gb- 2002-3-7-research0034 VanGuilder H, Vrana K, Freeman W. 2008. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques 44(4): 619–626. doi:10.2144/000112776

57

Wang H, Wang J, Wu T, Qin F, Hu X, Wang L, Wang Z. 2011. Molecular characterization of estrogen receptor genes in Gobiocypris rarus and their expression upon endocrine disrupting chemicals exposure in juveniles. Aquat Toxicol 101(1): 276–287. doi:10.1016/j.aquatox.2010.10.009 Watson A, Mazumder A, Stewart M, Balasubramanian S. 1998. Technology for microarray analysis of gene expression. Curr Opin Biotech 9(6): 609–614. doi:10.1016/S0958- 1669(98)80138-9 Whelan JA, Russell NB, Whelan MA. 2003. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods 278(1-2): 261–269. doi:10.1016/S0022-1759(03)00223-0 Wittwer CT, Herrmann MG, Gundry CN, Elenitoba-Johnson KS. 2001. Real-Time Multiplex PCR Assays. Methods 25(4): 430–442. doi:10.1006/meth.2001.1265 Yotsu-Yamashita M, Yamaki H, Okoshi N, Araki N. 2010. Distribution of homologous proteins to puffer fish saxitoxin and tetrodotoxin binding protein in the plasma of puffer fish and among the tissues of Fugu pardalis examined by Western blot analysis. Toxicon 55(6): 1119–1124. doi:10.1016/j.toxicon.2009.12.021 Yu D, Chen M, Zhou Z, Eric R, Tang Q, Liu H. 2013. Global climate change will severely decrease potential distribution of the East Asian coldwater fish Rhynchocypris oxycephalus (Actinopterygii, Cyprinidae). Hydrobiologia 700(1): 23–32. doi:10.1007/s10750-012-1213-y Zhang P, Beck T, Tan W. 2001. Design of a Molecular Beacon DNA Probe with Two Fluorophores. Angew Chem Int Ed 40(2): 402–405. doi:10.1002/1521- 3773(20010119)40:2<402:AID-ANIE402>3.3.CO;2-9 Zhu H, Snyder M. 2003. Protein chip technology. Curr Opin Chem Biol 7(1): 55–63. doi:10.1016/S1367-5931(02)00005-4

Internetové zdroje http://fishbase.org/ http://img.medscape.com/article/774/873/774873-fig1.jpg http://leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotSetup.gif http://research.calacademy.org/research/ichthyology/catalog/SpeciesByFamily.asp http://tools.invitrogen.com/content/sfs/gallery/high/4953.jpg

58