Research Collection

Doctoral Thesis

Electrical signals in cerebellar Purkinje cells

Author(s): Staub, Christoph Markus

Publication Date: 1992

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000692257

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Diss. ETH No. 9860

Electrica! Signals in Cerebellar Purkinje Cells

A dissertation submitted to the

SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY, ZÜRICH

for the degree of

DOCTOR OF NATURAL SCIENCES

presented by

CHRISTOPH MARKUS STAUB

Dipl. phys. ETH

born November 22, 1963

Citizen of Richterswil/ZH

aeeepted on recommendation of

Prof. Klaus Hepp, examiner

Prof. Beat H. Gähwiler, co-examiner

1992 4

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit, welche in zwei Teile gegliedert ist, behandelt verschiedene Aspek¬ te der Erzeugung und Ausbreitung elektrischer Signale in Purkinje-Zellen des Kleinhirns.

Erster Teil. Durch Aktivierung sogenannter metabotroper Glutamat-Rezeptoren in Purkin¬ je-Zellen aus Gewebekulturen des Kleinhirns werden verschiedene Effekte hervorgerufen, die mit Hilfe intrazellulärer Ableittechniken ('single-electrode voltage-clamp') und mikro- fluorometrischer Messungen der freien intrazellulären Kalziumkonzentration untersucht wurden. Applikation von t-ACPD (50 - 100 uM), einem selektiven Agonisten solcher

Rezeptoren, rief einen transienten Einwärtsstrom hervor, dem ein Auswärtsstrom folgte.

Der Einwärtsstrom war mit einer Zunahme der Membranleitfähigkeit verbunden und kon¬ nte durch die K+-Kanalblocker Ba2+ (1 mM) und Tetraethylammonium (10 mM) nicht beeinflusst werden. Aus diesen Beobachtungen folgerten wir, dass dieser Strom nicht durch eine Reduktion einer tonisch aktivierten K+-Leifähigkeit zustande kam. Weiterhin konnte eine Beteiligung der Cs+-sensitiven Einwärtsrektifikation, welche in Purkinje-Zel¬ len vorhanden ist, ausgeschlossen werden, da der Einwärtsstrom durch Cs+ nicht beein¬ flusst wurde. Das extrapolierte Umkehrpotential des t-ACPD-induzierten Einwärtsstromes lag über 0 mV. Im Gegensatz dazu lag das Umkehrpotential von Cl'-Strömen, welche durch Iontophorese des spezifischen GABA^-Agonisten Muscimol hervorgerufen wurden, unter -60 mV. Aufgrund dieser Beobachtung konnten Cl'-Ionen als Hauptladungsträger des Einwärtsstromes ausgeschlossen werden. Der Einwärtsstrom konnte durch Aus¬ tauschen des extrazellulären Natriums durch Lithium oder Cholin unterdrückt werden.

Diese Beobachtung Hess auf eine massgebliche Beteiligung von Na+-Ionen an diesem

Strom schliessen. Mikrofluorometrische Messungen der intrazellulären Kalziumkonzentra¬ tion mit dem fluoreszierenden Kalziumindikator Fura-2 ergaben, dass t-ACPD, nicht aber

AMPA, zu einem transienten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in Purkin-

Zusammenfassung 5

je-Zellen führte. Bei solchen Messungen wurde das Membranpotential der Zellen konstant gehalten ('voltage-clamp'). Daher ist es unwahrscheinlich, dass unter diesen Bedingungen

ein Einstrom von Ca+-Ionen durch spannungsgesteuerte Kalziumkanäle für den beo¬ bachteten Anstieg der Kalziumkonzentration verantwortlich ist. Wahrscheinlich liegt dem

Kalziumanstieg eine Ausschüttung von Kalzium aus intrazellulären Speichern zugrunde.

Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration wurden durch Injektion des Kal- ziumchelators BAPTA gepuffert. Dadurch waren die durch t-ACPD induzierten Einwärts¬ ströme signifikant reduziert. Dies legt den Schluss nahe, dass der durch t-ACPD vermit¬ telte Kalziumanstieg ein notwendiges Signal für die Induktion des Einwärtsstromes dar¬ stellte. Der Austausch von extrazellulärem Natrium gegen Lithium oder Cholin hatte keine

Auswirkung auf die Ruhekonzentration des intrazellulären Kalziums. Die durch t-ACPD induzierte Erhöhung der Kalziumkonzentration hielt unter diesen Bedingungen an, bis

Natrium wieder eingewaschen wurde. Wir schlagen daher vor, dass der durch t-ACPD hervorgerufene Einwärtsstrom durch einen Na+/Ca2+-Austauscher erzeugt wird.

Zweiter Teil. Intrazelluläre Ableittechniken wurden mit Mikrofluoreszenzmessungen span¬ nungsabhängiger Fluoresenzfarbstoffe kombiniert. Der Einsatz solcher optischer

Methoden erlaubt es, elektrische Signale gleichzeitig von verschiedenen Orten der Mem¬ bran eines Neurons abzuleiten. Wir konnten zeigen, dass mittels solcher spannungsab¬ hängiger Farbstoffe und dem Einsatz geeigneter bildgebender Verfahren Membranpoten¬ tialänderungen einzelner Purkinje-Zellen aus Gewebekulturen des Kleinhirnes aufgezeich¬ net werden können. Mit einer Photodiodenmatrix (10 x 10) oder einer CCD-Kamera

(charge coupled device) wurden Fluoreszenzsignale von Purkinje-Zellen gemessen, welche zuvor mit dem Fluophor di-4-ANEPPS angefärbt worden waren. Die Beziehung zwischen relativer Fluoreszenänderung und dem Membranpotential konnte durch eine lineare Funk¬ tion mit einer Steigung von bis zu -3% / 100 mV beschrieben werden. Die grösste absolute

Fluoreszenz und die grössten Fluoreszenzänderungen stammten vom Dendritenbaum der

Zusammenfassung 6

Purkinje-Zellen. Diese Beobachtung lässt sich durch die starke Verästelung, und die dem¬

entsprechend hohe Membrandichte pro Einheitsfläche erklären. Sowohl hyperpolarisie-

rende, als auch depolarisierende Spannungspulse, welche im Zellkörper durch eine Mikro-

elektrode erzeugt wurden, riefen Aenderungen der Fluoreszenzintensität in den Dendriten

hervor. Ein Vergleich der CCD-Bilder solcher Signale mit der Zellmorphologie zeigte,

dass im Zellkörper angelegten Spannungspulse sich in sämtliche dendritische Fortsätze

ausbreitete. Im Gegensatz zu den Fluoresenzänderungen, die durch hyperpolarisierende

Pulse erzeugt wurden, waren die durch depolarisierende Pulse ausgelösten Fluoreszenz¬

änderungen in den Dendriten deutlich weniger ausgeprägt. Diese Beobachtung kann

dadurch erklärt werden, dass die elektrotonische Abschwächung der Spannungsamplitude

(Voltage attenuation') zwischen Zellkörper und Dendriten erhöht ist, da durch die depo¬ larisierenden Pulse spannungsgesteuerte Membranleitfähigkeiten aktiviert wurden. Durch hyperpolarisierende Pulse ausgelöste dendritische Fluoreszenzsignale wurden verkleinert, nachdem die Membranleitfähigkeit durch Applikation von Muscimol, einem GABA^-

Agonisten, erhöht worden war. Diese Beobachtung legt den Schluss nahe, dass die elek¬ trotonische Abschwächung zwischen Zellkörper und Dendriten durch das Öffnen chemisch aktivierter Membranleitfähigkeiten verstärkt wurde. Wir kamen zum Schluss, dass der

Einsatz spannungsabhängiger Fluoreszenzfarbstoffe, in Kombination mit optischen Mess¬ methoden, ein geeignetes Mittel ist, um Kabeleigenschaften von Dendriten zu unter¬ suchen. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die mittlere elektrotonische Länge der

Dendriten zunahm, wenn die Membranleitfähigkeit durch Depolarisation oder mittels chemischer Botenstoffe vergrössert wurde.

Zusammenfassimg 7

Summary

The present thesis has two parts, dealing with two distinct aspects of electrical signalling

in cerebellar Purkinje cells.

Part one. Responses to activation of metabotropic glutamate receptors (mGluRs) of

Purkinje cells in cerebellar slice cultures were investigated using intracellular recordings in

the single-electrode voltage-clamp mode and microfluorometric measurements of cytosolic

free calcium using fura-2. Bath applied t-ACPD (50 - 100 uM), a selective agonist of

mGluRs, induced a transient inward current that was followed by an outward current. The

response to t-ACPD was not affected by the specific ionotropic antagonist CNQX (up to

40 uM), indicating that this response was directly mediated by mGluRs. Inward currents

generated by quisqualate (0.25 uM) were only partially depressed by CNQX (5-40 u.M),

confirming previous reports showing that quisqualate is an agonist of both the AMPA

receptor and mGluRs. The inward current induced by t-ACPD in Purkinje cells was unaf-

fected by external application of the K+ Channel blockers, Ba2+ (1 mM) and TEA (10

mM), and was associated with an increase in apparent input conductance of the cell. These results showed that the present inward current was not arising due to a decrease of persis¬ tent K+ conductances. Furthermore, Cs+ (1 mM) did not affect the inward current, exclud- ing a contribution of the Cs+-sensitive inward rectification of Purkinje cells to the ob- served current. The extrapolated reversal potential of t-ACPD-induced inward currents was above 0 mV while Cl"-currents, activated by iontophoresis of the specific GABA^ agonist muscimol, reversed below -60 mV. These observations rule out chloride as a ma¬ jor charge carrier of this current. Replacement of external Na+ by either choline or Li+ de¬ pressed the inward current induced by t-ACPD. These observations provide circumstantial evidence that Na+ is a major charge carrier of this current. Optical recordings using the calcium indicator füra-2 revealed that t-ACPD, but not AMPA, caused a transient eleva-

Summaiy 8

tion of [Ca2"1"], in Purkinje cells. Since this elevation was measured under voltage-clamp

conditions, influx of Ca2+ by voltage-gated calcium Channels is unlikely to account for the

observed rise in [Ca2+]j. We suggest, that this rise was due to release of Ca2+ from intra¬

cellular stores. When changes of [Ca2+]{ were buffered by injection of the calcium chelator

BAPTA, t-ACPD-induced inward currents were significantly reduced, suggesting that the

rise in [Ca2+]j caused by t-ACPD was necessary for the induction of the inward current.

Replacement of external Na+ by choline or Li+ per se had no effect on [Ca2+]j. However, the elevation of [Ca2+], upon t-ACPD application, under these conditions, persisted until

Na+ was washed in again. We hypothesize that the inward current induced by t-ACPD in

Purkinje cells is generated by a Na+/Ca2+ exchanger, extruding Ca2+ from the cell. This hypothesis is consistent with all our observations.

Part two. We combined optical methods using a voltage-sensitive fluorescent dye with intracellular recordings to evaluate the applicability of this technique for imaging voltage changes in Single Purkinje cells of cerebellar slice cultures. Fluorescence signals from

Purkinje cells in cultures stained with the styryl indicator di-4-ANEPPS were detected by a 10 X 10 photodiode array and a charge coupled device (CCD). The relation between fractional fluorescence changes and membrane potential could be described by a linear fünction with a slope of up to -3 % / 100 mV. Absolute fluorescence and fluorescence changes were much larger at the dendrites than at the soma of Purkinje cells. This is ex- plained by the extensive branching of the dendritic tree which results in a large density of membrane per unit area. Hyperpolarizing as well as depolarizing voltage jumps imposed on Purkinje cells, voltage-clamped with an intrasomatic microelectrode, gave rise to den¬ dritic dye signals. Comparison of CCD-images of these signals with Lucifer yellow fluo¬ rescence microphotographs demonstrated that voltage jumps applied at the somatic mem¬ brane invaded all the dendrites. Dye signals induced by depolarizing voltage Steps were less pronounced in dendritic regions compared to those in response to hyperpolarizing

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voltage steps. This Observation can be explained by an increased voltage attenuation be- tween soma and dendrites caused by activation with depolarization of voltage-gated mem¬ brane conductances. Dendritic dye signals induced by hyperpolarizing voltage pulses were reduced, compared to control, when membrane conductance was increased by muscimol, an agonist for GABAa. receptors. This Observation suggests that voltage attenuation was increased due to activation of ligand-gated membrane conductances. We conclude that optical methods provide a usefül tool for the study of dendritic cable properties. Further- more, we could demonstrate that the electrical compactness of Purkinje cells decreased at depolarized potentials or following neurotransmitter-dependent increases in membrane conductance.

Summary