Buněčné Interakce a Formování Hostitelsko-Parazitického Rozhraní U Mořských Zástupců Bazálních Výtrusovců

MASARYKOVA UNIVERZITA

Přírodovědecká fakulta

Ústav experimentální biologie

Buněčné interakce a formování hostitelsko-parazitického rozhraní u mořských zástupců bazálních výtrusovců

Bakalářská práce

Michal Kubík

Vedoucí práce: RNDr. Andrea Valigurová, Ph.D. Brno 2015 Bibliografický záznam

Autor: Michal Kubík Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Buněčné interakce a formování hostitelsko-parazitického rozhraní u mořských zástupců bazálních výtrusovců

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní odbor: Speciální biologie

Vedoucí práce: RNDr. Andrea Valigurová, Ph.D.

Akedemický rok: 2014/2015

Počet stran: 46

Klíčová slova: Apicomplexa, parazit, hostitel, interakce

Bibliografický záznam

Autor: Michal Kubík Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie

Názov práce: Bunečné interakcie a formovanie hostiteľsko- parazitického rozhrania u morských zástupcov bazálnych výtrusovcov

Študijný program: Experimentálna biológia

Študijný odbor: Špeciálna biológia

Vedúci práce: RNDr. Andrea Valigurová, Ph.D.

Akademický rok: 2014/2015

Počet strán: 46

Kľúčové slová: Apicomplexa, parazit, hostiteľ, interakcie

Bibliographic Entry

Author: Michal Kubík Faculty of Science, Masaryk University Department of experimental biology

Title of Thesis: Cellular interactions and formation of host-parasite interface in marine representatives of basal apicomplexans.

Degree Program: Experimental Biology

Field of Study: Special Biology

Supervisor: RNDr. Andrea Valigurová, Ph.D.

Academic Year: 2014/2015

Number of Pages: 46

Keywords: Apicomplexa, parasite, host, interactions

Abstrakt

Tato bakalářská práce se zabývá hostitelsko-parazitickými interakcemi u mořských zástupců bazálních výtrusovců (Apicomplexa). Jedná se o četnou skupinu jednobuněčných organizmů parazitujícich bezobratlé i obratlovce včetně člověka, ktěří si během evoluce vyvinuli jedinečné a vskutku různorodé strategie invaze a parazitizmu v různých podmínkách. První část se zaměřuje na morfologii, pohyb a různorodé invazívní strategie a přichycení zoitů výtrusovců k hostitelské buňce. Dále navrhuje vhodný a dostupný modelový systém hostitel-parazit z mořského prostředí a popisuje jednotlivé morfologické, biochemické, molekulární a genetické metody ke studiu těchto interakcí.

Abstrakt

Táto bakalárska práca sa zaoberá hostiteľsko-parazitickými interakciami u morských zástupcov bazálnych výtrusovcov (Apicomplexa). Ide o početnú skupinu jednobunečných organizmov parazitujúcich bezstavovce i stavovce vrátane človeka, ktorí si behom evolúcie vyvinuli jedinečné a vskutku rôznorodé stratégie invázie a parazitizmu v rôznych podmienkach. Prvá časť sa zameriava na morfológiu, pohyb a rôznorodé stratégie invázie a prichytenie zoitov výtrusovcov k hostiteľskej bunke. Ďalej navrhuje vhodný a dostupný modelový systém hostiteľ-parazit z morského prostredia a opisuje jednotlivé morfologické, biochemické, molekulárne a genetické metódy k štúdiu týchto interakcií.

Abstract

The aim of this bachelor thesis is the host-parasite interactions in marine representatives of basal apicomplexans (Apicomplexa). These represent a large group of unicellular organisms parasitizing invertebrates and vertebrates including human, which evolved unique and indeed diverse strategies for invasion and parasitism in different enviroments. The first part of thesis focuses on morfology, motility and various strategies of invasion and attachment of apicomplexan zoites to the host cell. The second part proposes suitable and accessible model systems from a marine environment and describes particular morphological, biochemical, molecular and genetic methods that are useful for studies of these interactions.

Poďakovanie

Na tomto mieste by som sa chcel úprimne poďakovať mojej školiteľke RNDr. Andrei Valigurovej, Ph.D. za venovaný čas, mnoho cenných rád a trpezlivosť.

Prehlásenie

Prehlasujem, že som svoju bakalársku prácu vypracoval samostatne s využitím informačných zdrojov, ktoré sú v práci citované.

V Brne, dňa 11. mája 2015 ………………………... Michal Kubík Obsah 1. Úvod ...... 11

2. Zaradenie a všeobecná charakteristika bazálnych skupín v rámci kmeňa Apicomplexa 13

2.1. Postavenie bazálnych skupín v rámci kmeňa Apicomplexa ...... 13

2.2.Všeobecná charakteristika bazálnych výtrusovcov ...... 15

2.3. Charakteristika vývojových štádií ...... 18

2.4. Pohyb a invázia ...... 19

2.4.1.Invázia zoitu do hostiteľskej bunky a paraziticko-hostiteľské rozhranie ...... 20

2.4.2. Spôsoby prichytenia sa k bunke hostiteľa ...... 24

3. Habitat a biogeografické rozčlenenie morských zástupcov bazálnych výtrusovcov ...... 26

3.1 Habitat ...... 26

3.2.Vhodný model k štúdiu hostiteľsko-parazitických interakcií ...... 27

4. Metódy vhodné k štúdiu hostiteľsko-parazitických interakcií ...... 33

4.1. Morfologické prístupy ...... 34

4.1.1. Svetelná mikroskopia ...... 34

4.1.2. Fluorescenčná mikroskopia ...... 35

4.1.3. Elektrónová mikroskopia ...... 37

4.2. Biochemické prístupy ...... 39

4.3. Molekulárne a genetické prístupy ...... 40

5. Záver ...... 41

6. Literatúra ...... 42

7. Internetové zdroje ...... 46

1. Úvod

Interakcie medzi parazitom a hostiteľom hrajú dôležitú úlohu v evolúcii. Parazitickému spôsobu života sa prispôsobili mnohé organizmy od vírusov cez baktérie, jednobunečných eukaryot až po mnohobunečné organizmy. Ide o jednu z najviac rozšírených životných stratégií organizmov. Evolúcia parazita prebieha najmä formou koevolučného zápasu s jeho hostiteľom. Parazit má výrazne kratšiu generačnú dobu a početnejšiu populáciu, vďaka čomu naň účinnejšie pôsobí selekcia a jeho evolúcia môže prebiehať rýchlejšie. Preto má lepšiu schopnosť rýchlo sa prispôsobiť okolitým podmienkam, ktoré vytvára hostiteľ. Naopak aj hostiteľ je schopný reagovať zlepšením svojich obranných reakcií, výsledkom čoho dochádza ku šíreniu génov pre rezistenciu a toleranciu. Vo všeobecnosti sa s každým zefektívnením obrany hostiteľa mení aj odpoveď parazita v podobe inej stratégie invázie, či efektivite reprodukcie (Volf a Horák, 2007). Kmeň Apicomplexa (výtrusovce) patrí do nadkmeňa Alveolata. Ide o obligátne jednobunkové, často intracelulárne, ale aj extracelulárne, parazity bezstavovcov a stavovcov. Je to veľká skupina vysoko špecializovaných organizmov, ktorá vykazuje širokú škálu morfologických tvarov v závislosti od taxonomického zaradenia, štádia životného cyklu, ale aj od stratégie parazitizmu a adaptácie k okolitému prostrediu hostiteľa. Obývajú suchozemské aj morské prostredia, ktoré úzko súvisia s ich špecifickými hostiteľmi (Hausmann et al., 2003). Predpokladá sa, že prvé výtrusovce boli gregaríny, ktoré najprv parazitovali v morských obrúčkavcoch a ich radiácia a adaptácia na parazitický spôsob života nastal pred érou stavovcov. Potom sa rozšírili aj na iné morské bezstavovce (ploskule, kôrovce, ostnatokožce, atď.) a neskôr na bezstavovce žijúce v sladkých vodách až na suchozemské bezstavovce a nakoniec na stavovce (Cox, 1994). Mnohé z výtrusovcov sú pôvodcami významných chorôb človeka a zvierat. Jedným z najznámejších je rod Plasmodium – pôvodca malárie, vážneho ochorenia, na ktoré ročne zomrie aspoň milión ľudí (Manguin et al., 2010). Kokcídie vyvolávajú vážne ochorenie hospodárskych zvierat – črevného ochorenia nazývaného kokcidióza (Eimeria tenella), ktoré je zodpovedné za vysoké ekonomické straty v chovoch domácej hydiny, či toxoplazmózy (Toxoplasma gondii), ktorého konečným hostiteľom sú mačkovité šelmy (Sharman et al., 2010).

Skupiny výtrusovcov, ktoré parazitujú výhradne na bezstavovcoch sa väčšinou považujú za ekonomicky alebo lekársky bezvýznamné. Práve preto zostali aj napriek svojej obrovskej rozmanitosti a rozšíreniu málo preštudované (Hausmann et al., 2003).

2. Zaradenie a všeobecná charakteristika bazálnych skupín v rámci kmeňa Apicomplexa

2.1. Postavenie bazálnych skupín v rámci kmeňa Apicomplexa

Ako už bolo spomenuté, výtrusovce (Apicomplexa) patria medzi Alveolata. Zaraďujeme sem aj obrnenky (Dinoflagellata) a nálevníky (Ciliophora, Ciliata) (obrázok č. 1). Dinoflagellata sú bičíkaté jednobunkové organizmy, ktoré majú chloroplasty a sú významnou zložkou planktónu. Ciliata sú prvoky, ktorým k pohybu slúži množstvo bŕv - cilie. Nepochybne najzaujímavejší je kmeň Apicomplexa. Táto skupina predstavuje rozmanitú škálu jednobunkových eukaryotických parazitov. Odhaduje sa asi 1,2 – 10 miliónov druhov výtrusovcov, z čoho pomenovaných a opísaných je približne 0,1% z nich (Adl et al., 2007). Analýzou malých podjednotiek rRNA sa ukázalo, že kmeň Apicomplexa je si fylogeneticky bližšie s kmeňom Dinoflagellata než s kmeňom Ciliata (Fast et al., 2002; Van De Peer a De Wachter, 1997).

Ciliata

Alveolata Dinoflagellata

Apicomplexa

Obrázok č. 1: Fylogenetický strom Alveolata (upravené podľa Perkins et al., 2000)

Kmeň Apicomplexa sa vyvinul z voľne žijúceho fotosyntetického predchodcu (Chromerida, Cavalier-Smith, 1993) a je blízko príbuzný s dravými morskými bičíkovcami (Colpodella, Moore et al., 2008). Tradičné delenie výtrusovcov zahrňuje len obligátnych parazitov, a preto sa aj napriek mnohým podobným znakom voľne žijúce skupiny Chromerida a Colpodella z tohto kmeňa vyčleňujú.

Do kmeňa Apicomplexa zaraďujeme nasledovné triedy (Perkins et al., 2000):  Perkinsasida, Levine, 1978  Conoidasida, Levine, 1988  Aconoidasida, Mehlhorn, Peters a Haberkorn, 1980

Trieda Conoidasida zahrňuje skupiny, ktoré majú prítomne všetky organely apikálneho komplexu, teda aj konoid, ktorý chýba u triedy Aconoidasida. Patria sem aj bazálne výtrusovce, medzi ktoré sa najčastejšie radia gregaríny, blastogregaríny, kryptosporídie, a pravdepodobne aj protokokcídie a agamokokcídie (absencia fylogenetických analýz) (Valigurová, Diakin, personálna komunikácia, 23. 4. 2015).

Obrovskú skupinu tvoria gregaríny, ktoré zahrňujú tri rady (Perkins et al., 2000):  Archigregarinorida, Grassé, 1953,  Eugregarinorida, Léger, 1900  Neogregarinorida, Grassé, 1953

Mnohé gregaríny obývajú črevo, celom a reprodukčné orgány morských, sladkovodných a suchozemských bezstavovcov. Podľa dostupnej literatúry je opísaných približne 250 rodov a 1650 druhov gregarín (Hausmann et al., 2003; Levine, 1988, 1977). Blastogregaríny, Chatton a Villeneuve, 1936, zahrňujú iba jeden rod (Siedleckia). Ide o črevné parazity morských mnohoštetinavcov (Polychaeta). I napriek zaradeniu medzi eugregaríny (Perkins et al., 2000), ich taxonomická pozícia nie je stále vyjasnená (Cavalier-Smith, 2014). Agamokokcídie, Levine, 1979 a protokokcídie, Kheisin, 1956 sú skupiny nižších kokcídií, ktoré nájdeme v telách morských obrúčkavcov (Anellida). Medzi kryptosporídiesa radí iba jeden rod, ktorý parazituje na povrchu sliznice gastrointestinálneho traktu stavovcov. Pôvodne sa zaraďovali medzi kokcídie, no vďaka novým molekulárnym a ultraštrukturálnym výskumom sa zistilo, že ich najbližší príbuzní sú gregaríny (Carreno et al., 1999; Valigurová et al., 2008, 2007).

Obrázok č. 2: Hypotetický fylogenetický strom výtrusovcov aj s ich životnými cyklami upravený podľa Jána Šlapetu (2011). Hlavné parazitické skupiny sú vyfarbené, čísla na jednotlivých vetvách, ako aj ich hrúbka, vyznačujú ich diverzitu. Prerušované čiary znamenajú predpokladanú pozíciu taxónu v systéme.

2.2.Všeobecná charakteristika bazálnych výtrusovcov

Základným charakteristickým znakom, podľa ktorého dostal kmeň Apicomplexa názov, je jedinečný aparát na prednom konci nazývaný apikálny komplex. Tento je typický pre invazívne štádiá (tzv. zoity) a vyskytuje sa v rôznych obmenách. Hlavnou funkciou tohto invazívneho aparátu je prichytenie a prienik zoita do bunky hostiteľa. Apikálny komplex pozostáva z niekoľkých častí, ako sú polárne prstence, špirálovitý konoid a sekrečné organely – mikronémy a rhoptrie. Charakteristickým znakom všetkých skupín je apikálny polárny prstenec, ktorý je považovaný za centrum organizujúci mikrotubuly (MTOC). Oproti tomu, konoid nie je prítomný u všetkých výtrusovcov. Má uzavretú kužeľovitú štruktúru, ktorá je zložená zo špirálovite stočených mikrotubulov a predpokladá sa, že plní mechanickú úlohu počas invázie do hostiteľskej bunky (obrázok č. 3).

Rhoptrie spolu s vláskovitými mikronémami sekretujú v apikálnej časti parazita produkty potrebné pre jeho pohyblivosť, adhéziu na substrát a inváziu do hostiteľskej bunky. Kyjovité rhoptrie prechádzajú dutinou konoidu a končia v apikálnej časti. Okrem týchto sekrečných štruktúr sa v bunke parazita nachádzajú aj denzné granule, ktoré sú nerovnomerne rozptýlené po celej bunke. Zástupcovia kmeňu Apicomplexa sú charakteristickí svojou povrchovou krycou štruktúrou nazývanou pelikula – epicyt, ktorá je prepojená s cytoskeletom. Pelikula sa skladá z troch membrán– vonkajšia plazmatická membrána a dve vnútorné membrány, ktoré predstavujú membránu sploštených kortikálnych alveol. Tie ležia tesne pod plazmatickou membránou a tvoria tzv. vnútorný membránový komplex (Morrissette a Sibley, 2002). Bunka zoita je na prednom a zadnom póle krytá len plazmatickou membránou. Tak isto aj v oblasti mikropórov, čo je pre výtrusovce charakteristická invaginácia plazmatickej membrány, kde sa pravdepodobne odohráva endocytóza a má funkciu bunkových úst. Okrem ďalších bežných organel (jadro, mitochondrie, Golgiho aparát, atď.) môže bunka zoita obsahovať aj jedinečné štruktúry, ako je napríklad premenený plastid – apikoplast, ktorý je pozostatkom fotosyntetického predchodcu, ale neobsahuje asimilačné farbivá. Túto organelu kedysi získali predkovia Apicomplexa pohltením červenej riasy a slúži im na syntézu tukových komponentov bunkových membrán. Apikoplast sa nenašiel u eugregarín a kryptosporidií. Zásobné látky si výtrusovce ukladajú vo forme malých granúl amylopektínu, ktorých počet rastie s vekom bunky (obrázok č. 4) (Janouškovec et al., 2010; Valigurová et al., 2007; Valigurová a Koudela, 2005).

Obrázok č. 3: Konoidový komplex (upravené podľa Hausmann et al., 2003). K – konoid, MK – membrány kortikálneho alveolu, PP – polárny prstenec, SM – subpelikulárne mikrotubuly

Obrázok č. 4: Typický schematický obrázok parazita kmeňa Apicomplexa (Long, 1982) upravené podľa (Volf a Horák, 2007)

2.3. Charakteristika vývojových štádií

Charakteristické pre výtrusovce je dvoj- alebo trojfázové striedanie generácií so štádiom „spóry“ (oocysta, sporocysta) v životnom cykle. Vždy sú prítomné infekčné, rastové a rozmnožovacie štádiá. (Hausmann et al., 2003). Vývojový cyklus výtrusovcov zahrňuje ako sexuálnu (pohlavnú), tak aj asexuálnu (nepohlavnú) fázu. Výtrusovce sú haploidné počas celého životného cyklu okrem štádia zygoty, kedy sú diploidné. Ich životné cykly zvyčajne obsahujú tri základné fázy – gametogóniu, sporogóniu a merogóniu, ktoré sa odohrávajú v jednom či vo viacerých hostiteľoch. (Perkins et al., 2000). Pohyblivý sporozoit aktívne vyhľadáva hostiteľskú bunku a po vniknutí do nej sa stáva trofozoitom. Trofozoit v hostiteľskej bunke rastie a mení sa na meronta. U eugregarín chýba fáza merogónie a z trofozoitu sa stáva priamo gamont. Počas merogónie (syn. schizogónia), sa mnohojadrový meront (schizont) nepohlavne delí na jednojadrové merozoity. V tomto štádiu sa môžu vytvoriť viac generácií merozoitov, ktoré môžu byť fyziologicky aj morfologicky rôzne. Nakoniec sa z niektorých merozoitov vytvoria nezrelé pohlavné štádiá – gamonti, gametocyty. Tie sa potom menia v zrelé sexuálne štádiá - samičie makrogaméty a samčie mikrogaméty. Spojením gamét vzniká zygota, ktorá sa začne obaľovať silným obalom a mení sa na oocystu. Vo vnútri oocysty sa niekedy vytvára ďalší obal – sporocysta. V oocyste sa meiózou a viacnásobným delením vytvárajú sporozoity (t.j. infekčné štádiá) a celý cyklus sa opakuje (Long, 1982).

Obrázok č. 5: Vývojový cyklus Apicomplexa: pohlavná a nepohlavná fáza (Perkins et al. 2000).

2.4. Pohyb a invázia

Pod vplyvom rôznych evolučných tlakov v hostiteľsko-parazitických interakciách si Apicomplexa vyvinuli špecifické adaptácie na účinnú inváziu a prežívanie v hostiteľovi. To vyústilo do vzniku rôznorodých stratégií parazita k pohybu a prichyteniu sa na hostiteľskú bunku. Invazívne štádia bazálnych výtrusovcov – zoity, sú pohyblivé a dokážu sa rýchlo premiestňovať po substráte (1-10 µm s-1) bez viditeľnej zmeny tvaru bunky. Presúvajú sa kĺzavým pohybom bez prítomnosti špecializovaných štruktúr ako sú cílie, bičíky alebo pseudopódie. Ich pohyb je umožnený vďaka jedinečnému mechanizmu založenom na prítomnosti aktín-myozinového motoru, subpelikulárnych mikrotubulov a substrátu, po ktorom sa zoit pohybuje vylučovaním proteínov z mikroném – koncept tzv. glideosomu (Kappe et al., 2004; Valigurová et al., 2013). Kĺzavý pohyb sa skladá z troch stereotypných pohybov: „circular gliding“, keď sa bunka pohybuje do kruhu, v protismere hodinových ručičiek, „upright twirling“, vzpriameného otáčania v smere hodinových ručičiek a „helical gliding“, keď sa bunka kĺže špirálovite po substráte čo umožňuje jej pohyb vpred (Wetzel et al., 2005). U trofozoitov a gamontov extracelulárnych gregarín sa vyvinulo niekoľko druhov pohybu. Okrem spomenutého kĺzavého pohybu, ide aj o kyvadlový či valivý pohyb typický pre zástupcov čeľade Seleniididae Brasil, 1907. U coelomových eugregarín rodu Urospora Schneider, 1875 sa vyskytujú prevažne peristaltické pohyby, u ktorých je pohyb zabezpečený pravdepodobne pomocou štruktúr v bunečnom kortexe. Ani o tomto pohybe nie je z mechanicko-chemického hľadiska veľa informácií, pravdepodobne je posun cytoplazmy riadený aktínom (Hildebrand a Vinckier, 1975). Aj napriek prítomnosti subpelikulárnych mikrotubulov u niektorých zástupcov gregarín, stále nie je objasnené, či zohrávajú v ich pohybe nejakú úlohu (Schrével a Philippe, 1993).

2.4.1. Invázia zoitu do hostiteľskej bunky a paraziticko-hostiteľské rozhranie

Zoity sú schopní sa kĺzavým pohybom presúvať v tkanivách a vyhľadať hostiteľské bunky. Po nájdení vhodnej hostiteľskej bunky (napríklad epitelová bunka) sa uchytia a orientujú k jej povrchu tak, aby sa jej dotýkali konoidom. Pri kontakte s plazmatickou membránou hostiteľa dokáže zoit svojím rastom indukovať invagináciu jej povrchu–tzv. internalizácia. To vedie k nalepeniu sa zoita na hostiteľskú bunku – charakteristické pre väčšinu gregarín (Valigurová a Koudela, 2005), či k jeho úplnému uzavretiu do vnútrobunkovej rastovej komôrky – parazitofornej vakuoly (intracelulárne kokcídie) (Long, 1982; Paperna a Vilenkin, 1996). Parazitoforná vakuola predstavuje vnútrobunkovú membránu, v ktorej sa nachádza parazit pri intracelulárnej lokalizácii, zatiaľ čo parazitoforný vak označuje štruktúru vytvorenú hostiteľom pri epicelulárnej lokalizácii parazita. Termín „parazitoforny vak“ po prvýkrát použili Paperna a Vilenkin, 1996 pri označení hostiteľskej štruktúry obaľujúce kryptosporídie pri invázie do bunky. Membrána parazitoforného vaku je pokračovaním apikálnej (mikrovilárnej) plazmalemy hostiteľskej bunky (Valigurová et al., 2015).

Podľa lokalizácii v bunke alebo tkanive hostiteľa rozdeľujeme parazity (Valigurová, 2015; Volf a Horák 2007):

 Intracelulárne – preniknutie parazita do cytoplazmy hostiteľskej bunky (Toxoplasma, Plasmodium) (obrázok č. 6)  intracelulárne epiplazmatické – preniknutie parazita tesne pod hostiteľskú plazmalemu (niektoré druhy kokcídií)  epicelulárne – usadenie parazita na povrch hostiteľskej bunky (kryptosporídie, protokokcídie, eugregaríny, atď.)  extracelulárne – mimobunkové (gamonty gregarín)  intercelulárne – medzibunkové alebo medzitkanivové usadenie parazita u niektorých druhov eugregarín (Sheffield et al., 1971)

Obrázok č. 6: Vniknutie zoitu Toxoplasma gondii do hostiteľskej bunky (intracelulárna lokalizácia) vznik parazitofornej vakuoly (Hoff a Carruthers, 2002).

Zoit sa prichytí a naorientuje konoidom k membráne hostiteľskej bunky (1). Zoit je vťahovaný do invaginovanej časti bunky a následne sa ocitne vo novovytvorenej parazitofornej vakuole (2-3). Parazit je schopný meniť biochemické a antigénne vlastnosti parazitofornej vakuoly vďaka proteínom vytvorených v rhoptriách a denzných granulách a tým zabraňuje apoptóze bunky (4). Parazit sa v parazitofornej vakuole pomnoží a dochádza k produkcii ďalších vývojových štádií, ktoré opúšťajú bunku (5-6). Vysvetlivky skratiek: N – jadro hostiteľa, M – mitochondrie, ER – endoplazmatické retikulum, PM – plazmatická membrána, Tg – zoit (Toxoplasma gondii), PV- parazitoforná vakuola, Mt – mikrotubuly.

Obrázok č. 7: Schematický diagram hostiteľsko-parazitických interakcií u vybraných taxónov (Valigurová et al., 2015). Obrázok znázorňuje hostiteľsko-parazitické interakcie u zástupcu protokokcídií (Eleutheroschizon duboscqi), eugregarín, kryptosporídií a u epicelulárnych kokcídií z čeľade Eimeriidae, Minchin, 19003 (eimérie). Fialovou farbou je označený parazit, ružová farba zvýrazňuje hostiteľskú bunku vrátane jej častí, ktoré sú modifikované v dôsledku prítomnosti parazita a žltou farbou sú označené miesta intímneho kontaktu medzi hostiteľom a parazitom. 22

E. duboscqi (A-D.): A. Prichytený a už úplne obalený zoit v parazitofornom vaku (ps) sa mení na štádium trofozoitu. B. Zrejúci trofozoit s formujúcim sa prstencom zväzkov filamentov (fa) na prichytenej strane a formujúcim sa „chvostom“ (t) v kaudálnej časti parazitoforného vaku. C. Trofozoit s výraznýmchvostom. Prítomné sú prstence plne formovaných prichýtavacích zväzkov filamentov a lalokov (lo). D. Detailné zobrazenie vyznačeného miesta v obrázku C. Prstencový spojovací bod. Eugregaríny (E-H.): E. Sporozoit v okamihu po prichytení sa na epitelovú bunku hostiteľa F. Premena sporozoitu na štádium trofozoitu. G. Rané štádium trofozoitu s dobre vyvinutým epimeritom. H. Detailné zobrazenie vyznačeného miesta v obrázku G. Miesto splynutia dvoch cytoplazmatických membrán. Kryptosporídie (I-L.): I. Prichytený zoit sa mení na štádium trofozoita, čiastočne obaleného parazitoforným vakom. J. Rané štádium trofozoita a vznik dočasného tunelového spojenia (tu) medzi jeho prednou vakuolou (av) a cytoplazmou hostiteľskej bunky. K. Trofozoit s výrazným filamentovým výbežkom (fp) na báze parazitoforného vaku a plne vyvinutou prichytávacou („feeder“) organelou (fo). L. Detailné zobrazenie vyznačeného miesta v obrázku K. Spojenie membrán hostiteľa a parazita do fúzie Y tvaru (j). Epicelulárne eimérie (M-P): M. Invazívny zoit. N. Trofozoit (gamont) obalený parazitoforným vakom s jedinou pripojovacou oblasťou (monopodiálna forma) O. Rozšírenie gamonta ponad oblasť mikrovíl viacero enterocytov (pavúkovitá forma). P. Detailné zobrazenie vyznačeného pripojenia v obrázku O. Vysvetlivky skratiek: av – predná vakuola, b – pupeň epimeritu, cm – cytoplazmatická membrána parazita, cv – koritkálna vezikula epimeritu, db – viacvrstvový denzný pás, f – miesto splynutia (fúzie) membrán, dl – denzná línia („dense line“), fa – pripojenie zväzku filamentov, fo – prichytávacia („feeder“) organela, fom – membrána ohraničujúca fo, fp – filamentózny výbežok, fs – fľaškovitá štruktúra, hc –hostiteľská bunka, hm – hostiteľská plazmatická membrána, if – neúplná fúzia ps, int – rozhranie medzi hc a epimeritom, ipm – vnútorná membrána ps, is – vnútorný priestor medzi parazitom a ps, j – miesto spojenia membrán („junction“), lo – lalok, ms – štruktúra ohraničujúca korikálny vačok od epimeritu, opm – vonkajšia membrána ps, p – pór na ps, pm – plazmatická membrána parazita, ps – parazitoforný vak, r – rhoptrie, t – „chvost“ ps (tail), tu – tunelové spojenie.

2.4.2. Spôsoby prichytenia sa k bunke hostiteľa

Evolúcia Apicomplexa pravdepodobne postupovala z myzocytotickej predácie k myzocytotickému extracelulárnemu parazitizmu až k intracelulárnemu parazitizmu. Tomu sa parazity prispôsobili aj morfologicky. Intracelulárne kokcídie a krvinovky stratili vo štádiu trofozoitu bunečnú polaritu a pohyblivosť. Predstaviteľom epicelulárneho parazitizmu (typicky gregaríny) sa zas u trofozoitov vyvinuli ďalšie modifikácie prichytávacích nástrojov a mechanizmov pohybu (Harley G. Sheffield et al., 1971). Prichytenie u gregarín je zaistené modifikáciou apikálneho konca bunky. Jednou z foriem je jednoduchý mukron, ktorý je typický pre trofozoity archigregarín, blastogregarín a podradu eugregarín – Aseptatorina, Chakravarty, 1960. Prichytávacie štruktúry môžu taktiež slúžiť k príjmu potravy. Archigregaríny vysávajú cytoplazmu hostiteľskej bunky pomocou štruktúr apikálneho komplexu (Simdyanov a Kuvardina, 2007). Mukron u archigregarín je zjednodušene povedané sací ústroj, ktorý im umožňuje prijímať potravu myzocytoticky – modifikovanou fagocytózou, pri ktorej parazit naruší povrch bunky hostiteľa a vysáva z nej cytoplazmu (Gubbels a Duraisingh, 2012). Narozdiel od mnohých eugregarín, ktoré pravdepodobne využívajú myzocytózu k príjmu potravy len vo veľmi skorých štádiách vývoju (Harley G. Sheffield et al., 1971). Ďalšou modifikáciou apikálneho konca na prichytenie u gregarín je epimerit – orgán vyvinutý u trofozoitov podradu eugregarín – Septatorina, Lankester 1885. U skupiny Septatorina je bunka trofozoitu rozdelená septami na tri časti – epimerit, protomerit a deutomerit (obrázok č. 8). Gregaríny, ktoré napadajú bylinožravce majú epimerity jednoduché, zatiaľ čo gregaríny, ktoré napadajú mäsožravce, ich majú vybavené početnými tŕňmi a háčikmi (Schrével a Philippe, 1993). Eugregarínam s jednoduchým epimeritom sa po vývoji trofozoitu neoddeľuje epimerit, ako sa predtým predpokladalo, ale dokážu ho zatiahnuť do protomeritu a tak sa úplne oddeliť od bunky hostiteľa (Valigurová et al., 2009). Niektoré eugregaríny sa prichytávajú k hostiteľovi pomocou protomeritu pozmeneného na prísavku. Kryptosporídie majú vyvinutú obdobnú organelu na báze parazitofórneho vaku, tzv. „feeder“ organelu, ale taktiež ako u eugregarín zostáva nejasné, či tento aparát je zapojený do príjmu potravy (Valigurová et al. 2007, 2008, 2009). U ostatných výtrusovcov, vrátane bazálnych skupín (agamokokcídií a protokokcídií) nie je mukron a epimerit vyvinutý (Valigurová et al., 2015; Perkins et al. 2000). Epicelulárne eimerie a protokokcídie však

24 tvoria rôzne výbežky na báze parazitoforného vaku, ktoré s veľkou pravdepodobnosťou nahradzujú funkciu týchto štruktúr (Valigurová et al. 2015).

Obrázok č. 8: Stavba bunky trofozoitu u podradu Septatorina. Rozdelená na epimerit, bezjadrový protomerit a deutomerit s jadrom (upravené podľa Hausmann et al., 2003).

3. Habitat a biogeografické rozčlenenie morských zástupcov bazálnych výtrusovcov

3.1 Habitat

V koevolučnom zápase medzi parazitom a hostiteľom sa museli u parazita vyvinúť špecifické adaptácie na život v hostiteľskom prostredí. Predovšetkým išlo o obranu pred fyzikálno-chemickými podmienkami vytváranými hostiteľom – pH, teplotou, viskozitou. osmotickým tlakom, parciálnym tlakom CO2 a O2 a jeho imunologickými a fyziologickými reakciami na prítomnosť parazita (Smyth a Wakelin, 1994). Vo všeobecnosti výtrusovce, ktoré parazitujú v suchozemských hostiteľoch, obývajú najmä tukové teleso a črevo, zatiaľ čo u morských hostiteľov je to väčšinou telová dutina (celom). Taktiež bolo pozorované, že u celomových gregarín mnohoštetinavcov existuje vzájomný vzťah medzi životným cyklom hostiteľa a parazita. Dochádza ku synchronizácii ich životných cyklov, ako bolo pozorované napríklad u eugregarín Urospora longissima a jej hostiteľovi Dodecaceria concharum Örsted, 1843 (Polychaeta) (taxonomické zaradenie hostiteľov prevzaté z „World Register of Marine Species“) (URL1) (Schrével a Philippe, 1993). Výtrusovce vykazujú veľmi dobré adaptácie na svojho hostiteľa a ich výraznú diverzifikáciu možno už pozorovať u bazálnych skupín. Archigregaríny obývajú zažívacií trakt morských mnohoštetinavcov (Polychaeta) a hemichordát (Sipunculida, Enteropneusta). Črevné eugregaríny sa často vyskytujú v hmyze, stonožkách a kôrovcoch. Čeľaď Selenidiidae Brasil, 1907 sa vyskytuje najmä v mnohoštetinavcoch, ktoré žijú usadlým spôsobom života (ako napr. Spionidae, Cirratulidae, Serpulidae). Nevyskytujú sa u voľne pohybujúcich mnohoštetinavcov, akými sú čeľade Nereidae, či Eunicidae a u máloštetinavcov (Oligochaeta). Je však nutné spomenúť, že i napriek súčasnému radeniu (podrad Aseptatorina) medzi eugregaríny, zástupcovia čeľade Selenidiidae vykazujú znaky typické pre archigregaríny (Cavalier-Smith, 2014). Eugregaríny rodu Urospora Schneider, 1875 (podrad Aseptatorina, čeľaď Lecudinidae Kamn, 1922) sa vyskytujú taktiež v celome a obehovom systéme ježoviek (Echinoidea) (Schrével a Philippe, 1993). Neogregaríny zase invadujú najmä dvojkrídlovce (Diptera) a motýle (Lepidoptera). Parazitujú ako

26 epicelulárne parazity Malpigiho trubice, črevo, hypodermis, obehový systém, alebo ako intracelulárne parazity v tukovom telese hostiteľa (Perkins et al., 2000). Rod Siedleckia, ktorá patrí do taxónu blastogregarín, invaduje črevá morských Polychaeta. Rovnako tak zástupcovia čeľade Rhytidocystidae Henneguy, 1907, patriaci do radu agamokokcídií, sú črevné parazity nájdené v morských Polychaeta Ophelia bicornis alebo Polygoridus sp. (Leander a Ramey, 2006; Diakin, 2013). Kryptosporídie, ako jediné z bazálnych výtrusovcov, sú typické parazity tráviaceho ústrojenstva stavovcov. Môžu sa príležitostne nájsť aj v iných tkanivách, ako sú pľúca alebo žlčový trakt (Valigurová et al., 2008).

3.2.Vhodný model k štúdiu hostiteľsko-parazitických interakcií

K štúdiu hostiteľsko-parazitických interakcií u morských bazálnych výtrusovcov, je potrebné si určiť vhodný modelový systém, ktorý bude použitý k ďalšiemu výskumu. Medzi najdôležitejšie vlastnosti patrí dostupnosť materiálu, v tomto prípade dostupnosť hostiteľov a ich parazitov. Z geografického hľadiska je výhodné, aby bol hľadaný materiál v ľahko dostupnej lokalite, teda v blízkosti pevniny. Nepriaznivý faktor je výskyt hostiteľov vo veľkých hĺbkach. Výhodnejšie sa javia tie modely, ktoré sa nevyskytujú v sublitorálnom pásme – oblasť nachádzajúca sa vždy pod vodou, ale v plytkých vodách, najlepšie v litorálnom pásme, teda v oblasti, ktorá je pod neustálym vplyvom pohybu vody (napr. pláže). Typickými hostiteľmi Apicomplexa, ktorí žijú v litorálnej oblasti sú kôrovce (Crustacea) alebo mnohoštetinavce (Polychaeta) (Schrével a Philippe, 1993). Hostiteľ by mal ďalej splňovať nasledujúce podmienky: dostatočne dlhá generačná doba, vysoká početnosť jedincov (nie každý hostiteľ je nakazený parazitom), život v kolónií a dobrá viditeľnosť (nežiť „v skrytosti“). Celoročná dostupnosť hostiteľa je nepochybne prínosom, ale ak poznáme životný cyklus hostiteľa, tak sezónnosť hľadaných hostiteľov nám umožňuje predvídať prítomnosť jednotlivých druhov v konkrétom období. Dôležité je, aby po ich odberu bol hostiteľ spolu s parazitom schopný prežiť aspoň nejakú dobu v laboratórnych podmienkach a v ideálnom prípade mať schopnosť sa ďalej rozmnožovať. Pre lepšiu prehľadnosť je žiaduce, aby bol hostiteľ infikovaný iba jedným druhom parazita – monoinfekcia. Naopak, je veľmi prínosné, ak jeden parazit dokáže infikovať viacero hostiteľov. V ideálnom stave by sa parazit, okrem vyššie uvedeného,

27 vyskytoval v kozmopolitných hostiteľoch. Samozrejme, dôležitú rolu hrá aj ekonomická dostupnosť. Na druhej strane, parazit musí byť schopný nájsť hostiteľa, prekonať jeho imunitnú obranu, rýchlo reagovať na zmeny okolia, adaptovať sa a rozmnožiť sa. Z tohto uhla pohľadu je teda výhodou hostiteľská špecifickosť parazita, pretože nájdenie špecifického hostiteľa nám umožní pracovať s konkrétnym druhom parazita. Napríklad zástupcovia eugregarín Gonospora ecaudata a G. minchini patria k špecifickým parazitom, ktoré infikujú iba mnohoštetinavce Arenicolides ecaudata, Johnston, 1835 (Desportes a Schrével, 2013). Kryptosporídie patria medzi bazálne výtrusovce, ktoré je možné udržiavať v laboratórnych chovoch zvierat, ale nie sú vhodné pre túto prácu, pretože ich hostiteľmi sú stavovce a práca s takými hostiteľmi podlieha prísnejším normám a zákonom ako zaobchádzanie s bezstavovcami, a zároveň sa jedná o ekonomicky náročný model. Ako už bolo spomenuté, neogregaríny sú zase typické parazity dvojkrídlovcov a motýľov, ktoré sú viazané na suchozemský život (u niektorých spojený s fázami životného cyklu v sladkej vode). Výhodnejšie je teda vyberať modelový systém z ostatných bazálnych skupín výtrusovcov. Modelový systém sa dá vybrať spomedzi kôrovcov (Crustacea), pretože až šesť čeľadí eugregarín je klasifikovaných ako parazity výhradne kôrovcov: Cephaloidophoridae Kamm, 1922; Cephalolobidae Théodoridès a Desportes, 1975; Ganymedidae Huxley, 1910; Porosporidae Labbé, 1899; Uradiophoridae Grassé, 1953 a nová čeľaď Thiriotiidae (Aseptatorina) (Desportes and Schrével, 2013). Ganymedidae a Uradiophoridae infikujú sladkovodné aj morské kôrovce v litorálnej oblasti. Porosporidae parazitujú v zadnej časti tráviaceho traktu a to výhradne len v litorálnych desaťnožcoch (Decapoda Latreille, 1803). Thiriotiidae sú tiež parazity desaťnožcov, najmä krabov (Brachyura Linnaeus, 1758). Výhodou výberu eugregaríny Thiriotia pisae za modelový organizmus je, že infikuje viacero druhov hostiteľov, nachádza sa v dostupnej lokalite a parazituje pomerne veľkých hostiteľov. Rovnaké podmienky lokality a množstva infikovaných druhov hostiteľov spĺňa aj model eugregarína Pyxinioides balani (Uradiophoridae), ktorá parazituje prisadlých kôrovcov (Cirripedia) (tabuľka č. 1). Ako vhodný model k štúdiu interakcií je možné tiež navrhnúť eugregarínu Cephaloidophora pacifica (Cephaloidophoridae), parazita „krilovcov“ Euphausia superba, ktoré žijú v Južnom oceáne blízkosti Antarktídy. Síce sa nachádzajú v menej dostupnej lokalite, ale tento hostiteľ žije v obrovských kolóniách (až 30 000 jedincov v 1m³) pri

28 hladine a hlavnú sezónu rozmnožovania má od januára do marca. Parazity sa nahromaďujú v prednej časti tráviaceho traktu hostiteľa, ale je dokázané, že počas zvliekania hostiteľa sa presúvajú do bezpečnejšej zadnej časti (Takahashi et al., 2003).

Parazit Hostiteľ Biogeografia Ganymedidae Huxley, 1910 Crustacea

Balanus perforatus Ganymedes fusiformis Stredozemné more (Taliansko) Pollicipes pollicipes Calanus finmarchicus Severné more (Nemecko) G. apsteini Neocalanus gracilis Stredozemné more (Franc.) Clausocalanus arcuicornis G. copiliae Sapphirina sp. Stredozemné more Copilia vitrea Sapphirina maculosa G. haeckeli Stredozemné more S. nigromaculata S. scarlata G. eucopiae Eucopia hanseni Stredozemné more (Francúzsko) G. korotneffi Sergestes robustus Stredozemné more (Francúzsko) Thiriotiidae Decapoda Pisa armata P. muscosa P. nodipes P. tetraodon Stredozemné more (Francúzsko, Thiriotia pisae Herbistia condyliata Španielsko) Lissa chiragra Acanthonyx lunulatus

Porosporidae, Labbé, 1899 Decapoda Nematopsis mizoulei Solenocera membranacea pobrežie Stredozemného mora N. soyeri Aristeus antennatus pobrežie Stredozemného mora pobrežie Stredozemného mora (Fr., N. grassei Calappa granulata Španielsko) Porospora nephropis Nephrops norvegicus Anglický kanál (Fr.) Ethusa mascarone P. theodori pobrežie Stredozemného mora Derilambrus angulifrons Macropipus depurator M. vernalis pobrežie Stredozemného mora (Fr., P. maraisi Carcinus mediterraneus Španielsko, Tunisko) Pirimela denticulata Portumnus latipes Mollusca Mytilius edulis Cardium lamarcki Nematopsis schneideri Cerastoderma edule Francúzsko Ruditapes decussatus Saxifraga rugosa

Tellina sp.; Tapes sp.

Cephaloidophoridae Decapoda Cephaloidophora Pilmnus hirtellus Čierne more caliptrycephala pobrežie Stredozemného mora C. dromiae Dromia personata (Taliansko, Španielsko, Tunisko) C. pacifica Euphasia superba Južný oceán Cephalolobidae Crustacea Phronima atlantica Callynthrochlamys phronimae P. sedentaria Stredozemné more P. elongata Uradiophoridae Crustacea Balanus amphitrite Stredozemné more (Fr.) B. amphitrite albicostatus Japonsko Pyxinioides balani B. balanoides Barentsovo more B. balanus USA Megabalanus tintinnabulum Uradiophora athanasi Athanas nitescens Anglický kanál U. gammari Gammarus locusta Anglický kanál

Tabuľka č. 1: Vybrané modely z morských zástupcov eugregarín, spolu s ich charakteristickými hostiteľmi patriacich medzi Crustacea (popr. Mollusca u Porosporidae) a lokalitou, v ktorej boli doposiaľ nájdení (upravené podľa Desportes a Schrével, 2013).

Rody Urospora, Lithocystis, Cystobia, patriace medzi eugregaríny, ktoré typicky parazitujú v celome ježoviek (Echinoidea) a sumýšov – tzv. „morských uhoriek“ (Holothuroidea) sa k určeniu vhodného modelového systému nehodia, pretože ich hostitelia žijú usadlým spôsobom života vo veľkých hĺbkach a zber týchto hostiteľov je náročný. Výnimkou sú niektoré druhy Urospora, ktoré obývajú aj Polycheata (Desportes a Schrével, 2013). Vhodné modelové systémy sa dajú nájsť aj u iných eugregarín, napríklad u rodov Pterospora a Gonospora (čeľaď Urosporidae), ktoré okrem Holothuroidea sú častým parazitom Polychaeta. Polychaeta sú útočiskom taktiež pre eugregaríny rodu Lecudina. Čeľaď Lecudinidae využívajú často ako hostiteľa Nemertea (pásnice), Polycheata a Echiura (tabuľka č. 2).

Parazit Hostiteľ Biogeografia Urosporidae Léger, 1892 Polychaeta Urospora longissima Dodecaceria caulleryi Anglický kanál U. lagidis Lagis koreni Anglický kanál Pterospora ramificata Nicomache lumbricalis Murmansk (Russia) P. petaloprocti Petaloproctus terricolus Stredozemné more Gonospora varia Cirriformia tentaculata Anglický kanál: Roscoff, Wimereux G. ormieri Notomastus latericus Severné more: Boulogne Lecudinidae Kamm, 1922 Polychaeta Lecudina danielae Vanidis crystallina Stredozemné more: Villefranche-sur-Mer L. legeri Glycera trdactyla Stredozemné more: Villefranche-sur-Mer L. staurocephali Schistomeringos rudolphii Európa (Anglicko) L. hesionis Hesione pantherina Anglický kanál: Roscoff, Wimereux L. criodrilii Criodrilus lacuum Stredozemné more (Taliansko) Ditrypanocystis cirratuli Cirriformia tentaculata Anglický kanál: Roscoff, Wimereux Nemertea Difficilina paranemertis Cerebratulus barentsi Biele more (Rusko) Echiura Hentschelia thalassemae Thalassema neptuni Anglický kanál: Plymouth Zygosoma gibbosum Echiurus caupo Severné more (Nórsko) Tunicata Lankesteria parascidiae Aplidium elegans Stredozemné more: Port de Sète Aplidium punctum Lankesteria amaroucii A. undulatum Anglický kanál: Roscoff A. elegans Anglický kanál: Plymouth Lankestria ascidiae Ciona intestinalis Východný Pacifik (Kalifornia) Lankestria clavellinae Clvelina lepadiformis Stredozemné more: Sète

Tabuľka č. 2: Vybrané modely z eugregarín s typickými hostiteľmi a lokalitou (upravené podľa Desportes a Schrével, 2013)

U archigregarín sa ako najvhodnejšie model javí rod Selenidium Giard, 1884, ktorý je v súčasnosti ako parazit prevažne zažívacieho traktu zástupcov viacerých čeľadí Polycheata už študovaný. U polochordát (Hemichordata) boli opísané dva druhy rodu Selenidium, ktoré parazitujú v črevnom trakte Glossobalanus minutes a Balanoglossus clavigerus (tabuľka č. 3).

Parazit Hostiteľ Biogeografia Selenidiidae Brasil, 1907 Polychaeta

Selenidium terebellae Eupolymnia nebulosa Anglický kanál: Wimereux

S. filifornis Cirratulus cirratus Stredozemné more S. hollandei Sabellaria alveolata Anglický kanál: Plymouth S. pendula Scolelepis squamata Stredozemné more: Sète Hemichordata S. grassei Balanoglossus clavigerus Anglický kanál: Plymouth

S. metchnikovi Glossobalanus minutus Anglický kanál: Plymouth

Tabuľka č. 3: Vybrané modely z archigregarín s typickými hostiteľmi a lokalitou (upravené podľa Desportes and Schrével, 2013)

Pre úplnosť je potrebné zmieniť aj ostatné skupiny bazálnych výtrusovcov – protokokcídie a agamokokcídie, a ich hostiteľov, ktorí môžu tiež poslúžiť ako vhodný modelový systém (tabuľka č. 4). Z nich by vhodný model predstavovali kokcídie, ktoré parazitujú bunky zažívacieho traktu a prídatných orgánov u mnohoštetinavcov, ako sú protokokcídie rodu Eleutheroschizon a agamokokcídie rodu Rhytidocystis.

Parazit Hostiteľ Biogeografia Rhytidocystidae Polycheata (Agamococcidiorida) severo-východné pobrežie Rhytidocystis cyamus Travisia pupa Pacifiku (Rueckert a Leander, 2009) západné pobrežie Atlantického R. polygordiae Polygordius sp. oceánu (Leander a Ramey, 2006) Gemmocystidae Cnidaria (Agamococcidiorida) Agaricia agaricites Dendrogyra cylindrus Diploria strigosa Meandrina meandrites Karibik Gemmocystis cylindrus Montastraea cavernosa (Upton a Peters, 1985) Porites astreoides P. porites Porites sp. Protococcidiorida Polychaeta Anglický kanál: Luc-sur-Mer Eleutheroschizon duboscqi Scoloplos armiger (Brasil, 1905)

Tabuľka č. 4: Vybrané modely z agamokokcídií a protokokcídií s typickými hostiteľmi a lokalitou (zdroje v tabuľke).

4. Metódy vhodné k štúdiu hostiteľsko-parazitických interakcií

K štúdiu interakcií vo vzťahu hostiteľ – parazit je potrebné využiť viaceré metodické prístupy, ktoré sa do istej miery prelínajú a preto je aj rozdelenie podľa jednotlivých prístupov skôr orientačné. Akúkoľvek metódu, ktorou sa rozhodneme hostiteľsko-parazitické interakcie študovať, predchádza zber a príprava materiálu (parazitologický prístup). Medzi základne parazitologické postupy patrí zber parazitov z prirodzene alebo umelo infikovaného hostiteľa a následná izolácia požadovaných štádií parazita. U niektorých druhov parazitov je možné použiť in vitro kultiváciu. Zberom trusu hostiteľa môžeme získať infekčné štádiá uzavreté v gametocystách či oocystách, pitvou hostiteľa zas ostatné vývojové štádiá parazita (Meloni a Thompson, 1996). Ďalším krokom je príprava materiálu, ktorú prispôsobíme podľa toho, ako chceme získané vzorky využiť. Na štúdium motility, poprípade iných životných procesov je vhodné použiť materiál v natívnom stave. Pre účely uskladnenia môžeme materiál zafixovať a tým stabilizovať proti biologickej degradácii. Fixácia je rýchla a šetrná denaturácia bielkovín brániaca autolýze tkanív, ktorá umožňuje udržať spracovávaný objekt vo forme čo najviac podobnom natívnemu stavu. Zároveň zaisťuje chemickú stabilitu a pevnosť tkanív, čím výrazne zlepšuje výsledok ďalších postupov (ako napr. farbenie). Vzhľadom na to, že nevhodná fixácia môže nenávratne poškodiť materiál a taktiež vytvoriť množstvo artefaktov, predstavuje najkritickejší bod pri zapracovávaní vzoriek. Je nutné zabezpečiť, aby organizmy (bunky) vydržali prechod v prostrediach s rôznou osmolaritou a nepoškodili sa (nepraskli). Medzi bežne používané fyzikálne fixácie patrí napr. mikrovlnné ožarovanie a zmrazovanie materiálu (krátkodobo na -20°C, v prípade dlhodobého skladovania je nutné hlboké mrazenie na -80°C). Ďalším typom fixácie je chemická pomocou vhodného chemického činidla (doba použiteľnosti fixovaného materiálu pritom závisí od charakteru fixáže) (Berod et al., 1981).

4.1. Morfologické prístupy

Pod morfologickými prístupmi chápeme histologické a cytologické metódy, ktoré skúmajú makroskopickú a mikroskopickú štruktúru orgánov, tkanív a buniek, ako aj subcelulárne usporiadanie organizmu a zmeny zapríčinené parazitizmom, či bunečnou smrťou. Patria sem aj histochemické a cytochemické metódy, ktoré sa zameriavajú na chemickú stavbu buniek a tkanív, ako aj na lokalizáciu konkrétnych chemických a enzymatických aktivít buniek. Základným princípom morfologických prístupov je využitie mikroskopických metód. Okrem bežných preparačných a svetelných mikroskopov, sa využívajú aj zložitejšie motorizované svetelné mikroskopy, ktoré umožňujú zapracovávať obraz a video vo vysokom rozlíšení, či rôzne fluorescenčné a elektrónové mikroskopy (Alberts et al., 2002a). Táto kapitola sa bude zaoberať najčastejšími metódami, ktoré využívajú morfologické prístupy k štúdiu interakcií organizmov. Bližšiemu popisu a postupu jednotlivých prístrojov a mikroskopických techník sa venujú napríklad v Základoch mikroskopickej techniky (Knoz a Opravilová, 1992) alebo na stránkach firmy Olympus (URL2) .

4.1.1. Svetelná mikroskopia

Mikroskopia v svetelnom poli sa používa k pozorovaní objektov, ktoré spôsobujú amplitudovú moduláciu prechádzajúceho svetla. Objekt má teda tmavé rysy a nachádza sa v svetlom poli. Ak prechádza svetlo priehľadným preparátom, ktorý sa od okolitého prostredia mení len tým, že má vyšší index lomu, potom náš zrak túto zmenu neregistruje. Technika fázového kontrastu je založená práve na princípe zviditeľnenia týchto fázových objektov. Pomocou tejto metódy dosiahneme kontrastného obrazu fázového predmetu. Výhodou využitia metódy fázového kontrastu je, že nepoškodzuje živé bunky a umožňuje ich pozorovanie v čase. Nomarského diferenciálny interferenčný kontrast (DIC) využíva kontrastovú metódu polarizovaného svetla. Slúži k zvyšovaniu kontrastu fázových objektov a výsledkom je obraz, ktorý sa javí ako trojrozmerný. Táto metóda sa často využíva na sledovanie živých buniek, ktoré rastú na tkanivovej kultúre. Kontrastných metód omnoho viac napríklad Hoffmanov modulačný kontrast, metóda šikmého osvetlenia, reliéfny fázový kontrast, atď. (Junqueira a Carneiro, 2005).

4.1.2. Fluorescenčná mikroskopia

Fluorescenčná mikroskopia využíva jav, ktorý sa nazýva fluorescencia. Spočíva v tom, že niektoré látky (fluorofory), ktoré sú ožiarené (excitované) svetlom určitej vlnovej dĺžky, vyžarujú (emitujú) svetlo dlhšej vlnovej dĺžky. Napríklad pri excitácii modrým svetlom fluorofor začne emitovať zelené svetlo. Táto metóda sa môže použiť na látky, ktoré prirodzene fluoreskujú (primárna fluorescencia, tzv. autofluorescencia), alebo za použitia chemických látok, ktoré fluorescenciu vyvolávajú (sekundárna fluorescencia). Sú známe dva typy fluorescencie, a to v prechádzajúcom svetle (diafluorescencia) a v dopadajúcom svetle (epifluorescencia) (obrázok č. 9A). Diafluorescencia sa prakticky už prestala používať. Nevýhodou epifluorescenčnej metódy je rozmazaný obraz, ktorý vzniká v dôsledku excitácie časti vzorky nad a pod zaostrenou rovinou. Ďalším nežiaducim javom je „photobleaching“ (fotovybieľovanie), pri ktorom fluorofor trvalo stráca schopnosť emitovať žiarenie, najmä pri intenzívnom ožiarení, pri ktorom dochádza vo fluorofore k nevratným zmenám štruktúry (Valeur a Berberan-Santos, 2012). Konfokálny mikroskop je špeciálnym typom flourescenčného mikroskopu, v ktorom sa namiesto osvetlenia celej vzorky zaostruje svetlo postupne do jednotlivých bodov v určitej hĺbke vo vzorke. Metóda konfokálnej mikroskopie vyžaduje použitie veľmi intenzívneho zdroja svetla, čo je zabezpečené pomocou lasera, ktorého lúč prechádza cez tzv. konfokálnu dierku („pinhole“). Fluorescencia emitovaná z tohto bodu prejde pred vstupom na detektor cez druhú dierku („pinhole“), ktorá je „konfokálna“ s tou prvou – tzn. nachádza sa presne v tom mieste, kde sa svetlo prechádzajúce z excitovaného bodu za objektívom zaostrí. Výsledný obrázok je potom tvorený signálom, ktorý odpovedá len zaostrenej rovine a neobsahuje obraz z mimofokálnych oblastí preparátu, a preto má omnoho vyššiu rozlišovaciu schopnosť oproti klasickej fluorescenčnej mikroskopie (obrázok č. 9). Pre získanie celého obrazu je preto nutné vytvoriť série snímok. Pomocou špeciálneho softwaru je potom možné tieto jednotlivé optické rezy spracovať do priestorovej rekonštrukcie objektu. Konfokálna mikroskopia sa používa na zobrazenie mnohých priestorových štruktúr, vrátane sietí cytoskeletálnych vlákien v cytoplazme a na zobrazenie usporiadania chromozómov v jadre bunky. Rozlišujeme dva základné typy konfokálnych mikroskopov – konfokálny laserový skenovací mikroskop (obrázok č. 9B), ktorého hlavným princípom je posúvanie excitovaných lúčov pomocou clony postupne do všetkých bodov roviny a

35 konfokálny mikroskop s rotujúcim diskom („Nipkow disk“), ktorý namiesto skenujúceho zariadenia využíva viacero pohybujúcich dierok („pinholes“) na rotujúcom disku (Alberts, 2008; Alberts et al., 2002a). Jedným z najdôležitejších oblastí využitia fluorescenčnej mikroskopie je v imunofluorescencii. Fluorescenčné farbenie sa používa k priamemu alebo nepriamemu značeniu štruktúr a proteínov pomocou protilátok. Priama imunofluorescencia je metóda, ktorá využíva na detekciu cieľového antigénu špecifickú protilátku už s naviazaným fluorochrómom. Oveľa spoľahlivejšia (špecifickejšia) je však nepriama imunofluorescencia. Ide o dvojstupňovú metódu, v ktorej sa na neoznačenú primárnu protilátku proti cieľovému antigénu naviaže sekundárna protilátka, ktorá je označená pomocou fluorochrómu. Molekuly sekundárnej protilátky sa môžu viazať na viacero častí primárnej protilátky, vďaka tomu dochádza k amplifikácii signálu (Alberts, 2008; Alberts et al., 2002a). Fluorochrómy, ktoré sa využívajú k pozorovaniu buniek a tkanív sú napríklad DAPI, farbivo ktoré sa viaže na DNA a tak sa vizualizujú jadrá, mitochondrie, popr. apikoplast. Ďalej je to akridínová oranžová, ktorá sa viaže na DNA (žltozelené svetlo) a RNA (červenooranžové svetlo) (Schrevel et al., 1981). Na vizualizáciu aktínových filamentov sa často používa faloidin (Valigurová et al. 2015).

Obrázok č. 9: Gregarina polymorpha zobrazená metódou: A. epifluorescencia B. konfokálna laserová skenovacia mikroskopia (foto z archívu A. Valigurovej).

4.1.3. Elektrónová mikroskopia

Táto mikroskopická metóda využíva namiesto prúdu fotónov elektróny. Obraz sa vytvára krátkovlnným elektromagnetickým zariadením a viditeľný obraz získame až použitím obrazového meniča. Na tomto princípe je založená elektrónová mikroskopia, ktorá nám umožňuje dosiahnuť oveľa väčšie zväčšenie (až 0,1 nm). Aj keď tieto metódy patria k starším prístupom, v súčasnosti sú opäť v intenzívnom rozvoji a ich využitie je často dôležité na potvrdenie výsledkov svetelnej mikroskopie. Pri skúmaní interakcií majú neodmysliteľnú úlohu v pozorovaní jednotlivých štruktúr na subcelulárnej úrovni, či spresnení ich lokalizácie. V elektrónovom mikroskope nie je možné pozorovať živé bunky, keďže sledované objekty sú vo vákuu. Elektrónová mikroskopia sa delí na dva základné typy – transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) a skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM). Pri SEM získavame trojrozmerný obraz povrchu vzoriek (obrázok č. 10A), ktorý je tvorený pomocou sekundárneho signálu – odrazených alebo sekundárnych elektrónov. Kvôli tomu je zobrazenie v SEM považované za nepriamu metódu. TEM slúži na zobrazenie detailov vnútornej štruktúry sledovaného objektu až do hrúbky 100 nm s veľkou rozlišovacou schopnosťou (obrázok č. 10B) (URL3). Elektróny majú veľmi malú schopnosť prenikania a preto je pri TEM potrebné použiť veľmi tenké rezy (hrúbka menej ako 0,1 µm) fixovanej vzorky. Kvôli veľkému rozlíšeniu elektrónového mikroskopu je veľmi obťažné previesť fixáciu a krájanie vzorky tak, aby sa nepoškodila. Riešením tohto problému môže byť príprava vzorky pre TEM kryofixáciou. Táto metóda je technicky náročná, ale umožňuje zachovať bunky a tkanivá vo veľmi dobrom stave podobnom živým bunkám. Bunky sú pri kryofixácii imobilizované v zlomku sekundy, čo umožňuje sledovať dynamické deje v bunečných interakciách. Ďalšou metódou je mrazové lámanie, kedy sa bunky hlboko zamrazia a nasledovne sa vo vákuu lámu, pričom sa uplatňuje princíp cesty najmenšieho odporu a lom prechádza pozdĺž membrán (v centre dvojvrstvy fosfolipidovej membrány). Zo zlomeného objektu sa pomocou platiny a uhlíku, ktoré sa nachádzajú na povrchu, zhotovia otlačky, tzv. repliky ktoré sa vizualizujú pod elektrónovým mikroskopom (obrázok č. 11). Táto metóda sa zdá byť najvhodnejšia pre štúdium biologických membrán. Umožňuje analyzovať ich štruktúru, zloženie, ako aj zmeny pod vplyvom rôznych faktorov (Alberts, 2008; Gan a Jensen, 2012).

Obrázok č. 10: A. Epimeritzrelého trofozoituG. Polymorpha (SEM); B. Mladý trofozoit G. polymorpha (TEM) (foto z archívu A. Valigurovej)

Obrázok č. 11: Zobrazenie pelikuly a časti cytoplazmy gamontu G. polymorpha metódou „freeze-etching“(TEM) (foto z archívu A. Valigurovej) 38

Medzi ďalšie prístupy v elektrónovej mikroskopii sa zaraďuje imunoznačenie, kde pre pozorovanie špecifických molekúl sa dá opäť použiť princíp založený na značení pomocou protilátok. V tomto prípade sa na sekundárne protilátky najčastejšie naviažu veľmi malé koloidné zlaté častice, ktoré sú vo výslednom obraze dobre rozpoznateľné ako denzné granule na povrchu rezu (Burry, 2010).

4.2. Biochemické prístupy

Medzi biochemické prístupy v bunečných interakciách zaraďujeme imunohistochemické a imunocytochemické metódy, ktoré sa zameriavajú na biologickú a chemickú stavbu buniek a tkanív, lokalizáciu proteínov a glykoproteínov a taktiež na imunologické pochody v nich – stanovenie účinnosti hydrolytických enzýmov, vlastností imunitných buniek, protilátok a komplementu. K tomu sa využívajú sérologické metódy, ELISA, RIA, turbidimetria, nefelometria, spektrofotometria a mnohé ďalšie metódy. S týmito postupmi sa prekrývajú aj niektoré z vyššie popísaných metód ako napr. imunoznačenie. K charakterizácii proteínov a nukleových kyselín existuje niekoľko základných metód, akými sú napríklad gélová elektroforéza, Southern, Northern a Western blot, atď. Niektoré metódy, ktoré sa najčastejšie využívajú k štúdiu interakcií, budú bližšie popísané nižšie. Aby sme získali maximálne množstvo informácii o jednotlivých typoch buniek, musia byť bunky najprv oddelené a potom separované rôznymi triediacimi technikami ako je centrifugácia alebo afinitná separácia. Ďalšou z dôležitých metód je frakcionácia, ktorá slúži k získaniu bunečných frakcií. Začína sa rozbitím hostiteľských buniek, ktoré sa dosahujú, buď to osmotickým šokom, ultrazvukovými vibráciami, alebo homogenizátorom, či rôznymi ďalšími technikami. K izolácii buniek alebo ich organel sa môžu využiť viacero metód, napríklad „free-flow“ elektroforéza, ktorá oddeľuje bunky alebo jej časti na základe elektrostatického náboja (Heidrich et al., 1982). Prietoková cytometria je rýchla a efektívna metóda, ktorá slúži k separácii špecifických buniek (Boissière et al., 2012). Základným princípom gélovej elektroforézy je, že DNA, RNA a proteíny sú elektricky nabité a preto môžu byť separované v elektrickom poli. Podľa veľkosti molekuly (molekulovej hmotnosti) sa používajú agarózové alebo akrylamidové gély. Agarózovou elektroforézou sú bežne charakterizované molekuly DNA a RNA. Separácia

39 proteínov podľa veľkosti môže byť charakterizovaná pomocou polyakrylamidovej elektroforézy za prítomnosti SDS (sodium dodecyl sulfat) detergentu. Táto technika je známa pod skratkou SDS-PAGE. V géle roztriedené molekuly DNA, RNA a proteínu nemôžu byť ďalej charakterizované a preto musia byť prenesené na určitý typ membrány. Tieto techniky prenosu sa označujú ako bloty: Southern blot pre DNA, Northern blot pre RNA a Western blot pre proteíny. V analýze Western blot sú proteíny prenesené z gélu na nitrocelulózovú membránu pôsobením elektrického poľa a detekované pomocou špecifických protilátok. Rekcia s protilátkou je vizualizovaná rôznymi technikami, napríklad kolorimetriou, chemiluminiscenciou alebo rádioaktivitou (Alberts, 2008).

4.3. Molekulárne a genetické prístupy

Molekulárne a genetické prístupy využívame pri skúmaní génov, ktoré sú zodpovedné za určité reakcie parazita a hostiteľa, či pri skúmaní imunitnej odpovede a zmeny fenotypu hostiteľa pod vplyvom parazita, ako aj pri taxonomickom zaradení jednotlivých skupín parazitov. Tak isto by sa tieto postupy dali využiť pri vyhodnocovaní variability génov kódujúcich určitý proteín u výtrusovcov (ako napr. aktín dôležitý pre pohyb či inváziu), prípadne stanoviť mieru jeho odlišnosti od obdobného génu hostiteľského organizmu (dôležité pri navrhovaní chemoterapeutik). Základné metódy, ktoré sa využívajú sú hybridizácia, polymerázová reťazová reakcia (PCR) a sekvenovanie nukleových kyselín. Dôležitou metódou je PCR, ktorá je založená na komplementárnom párovaní DNA báz. Pomocou enzýmov umožňuje replikovať špecifický úsek DNA bez využitia živého organizmu (napr. E. coli, kvasinky). Je to rýchla a ľahká metóda, ktorej výsledkom je veľké množstvo pôvodnej sekvencie DNA (Alberts, 2008; Alberts et al., 2002b). Sekvenovanie nukleových kyselín je postup, v ktorom sa určuje poradie základných nukleotidových báz. Sekvenovanie našlo svoje uplatnenie vo fylogenéze organizmov, vďaka nemu by sa dalo upresniť doposiaľ nejasné taxonomické zaradenie modelových bazálnych výtrusovcov, akými sú napr. agamokokcídie a protokokcídie. Existujú génové databázy, v ktorých sú uložené sekvencie známych génov a umožňujú porovnať ich s novými získanými sekvenciami.

5. Záver

Táto práca si pokladala za cieľ vypracovať literárnu rešerš o hostiteľsko- parazitických interakciách u morských zástupcov bazálnych výtrusovcov. Taktiež navrhuje vhodný a dostupný modelový systém parazit-hostiteľ z morského prostredia, ktorý bude použiteľný pre ďalší výskum a stručne opisuje jednotlivé metódy, ktorými sa môžu tieto interakcie študovať. Práca je rozčlenená podľa tematických kapitol, pričom úvodná kapitola približuje formovanie vzťahu parazita a jeho hostiteľa v priebehu evolúcie a vysvetľuje, prečo je potrebné sa touto problematikou zaoberať. V ďalších kapitolách sa nachádza taxonomické zaradenie bazálnych výtrusovcov a všeobecná charakteristika ich základnej morfológie, pohybu a vývojových štádií. Kľúčovou časťou práce je opis rôznorodosti invazívnych stratégií zoitov Apicomplexa do hostiteľskej bunky a spôsobov prichytávania sa. V texte sú opísané aj habitaty rôznych skupín bazálnych výtrusovcov a ich biogeografické rozčlenenie v morskom ekosystéme. Posledná kapitola sa venuje metódam vhodným k štúdiu hostiteľsko-parazitických interakcíí, ktoré zahrňujú morfologické, biochemické, molekulárne a genetické prístupy. Snahou tejto bakalárskej práce bolo priblížiť málo preskúmanú skupinu výtrusovcov, ktorá aj napriek svojej obrovskej rozmanitosti a rozšíreniu doteraz zostáva bez väčšieho povšimnutia.

6. Literatúra

Adl, S.M., Leander, B.S., Simpson, A.G.B., Archibald, J.M., Anderson, O.R., Bass, D., Bowser, S.S., Brugerolle, G., Farmer, M.A., Karpov, S., Kolisko, M., Lane, C.E., Lodge, D.J., Mann, D.G., Meisterfeld, R., Mendoza, L., Moestrup, Ø., Mozley-Standridge, S.E., Smirnov, A.V., Spiegel, F., 2007. Diversity, nomenclature, and taxonomy of protists. Syst. Biol. 56, 684–689.

Alberts, B. (Ed.), 2008. Molecular biology of the cell, 5th ed. ed. Garland Science, New York.

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P., 2002a. Looking at the Structure of Cells in the Microscope.

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P., 2002b. Figure 8- 39, Amplification of DNA using the PCR technique - Molecular Biology of the Cell - NCBI Bookshelf [WWW Document]. URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/figure/A1590/ (accessed 5.10.15).

Berod, A., Hartman, B.K., Pujol, J.F., 1981. Importance of fixation in immunohistochemistry: Use of formaldehyde solutions at variable pH for the localization of tyrosine hydroxylase. J. Histochem. Cytochem. 29, 844–850.

Boissière, A., Arnathau, C., Duperray, C., Berry, L., Lachaud, L., Renaud, F., Durand, P., Prugnolle, F., 2012. Isolation of Plasmodium falciparum by flow- cytometry: Implications for single-trophozoite genotyping and parasite DNA purification for whole-genome high-throughput sequencing of archival samples. Malar. J. 11.

Brasil, L., 1906. Eleutheroschizon duboscqi, sporozoaire nouveau parasite de Scolopolos armiger O.F. Müller.Arch zool exp gen. 4:17-22.

Burry, R.W., 2010. Immunocytochemistry: A practical guide for biomedical research, Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical Research.

Carreno, R.A., Martin, D.S., Barta, J.R., 1999. Cryptosporidium is more closely related to the gregarines than to coccidia as shown by phylogenetic analysis of apicomplexan parasites inferred using small-subunit ribosomal RNA gene sequences. Parasitol. Res. 85, 899–904.

Cox, F.E.G., 1994. The evolutionary expansion of the Sporozoa. Int. J. Parasitol. 24, 1301–1316.

Desportes, I., Schrével, J. (Eds.), 2013. Treatise on zoology--anatomy, taxonomy, biology. the early branching Apicomplexa /. The gregarines. Brill, Leiden.

Diakin, A., Simdyanov, T., Paskerova, G., Aleoshin, V., Entzeroth, R., Schrével, J., Valigurová, A., 2012. X. České a slovenské parazitologické dny. Program a sborník abstraktů. Brno, hotel Myslivna, 28. 5. - 1.6. 2012.

Fast, N.M., Xue, L., Bingham, S., Keeling, P.J., 2002. Re-examining alveolate evolution using multiple protein molecular phylogenies. J. Eukaryot. Microbiol. 49, 30–37.

Gan, L., Jensen, G.J., 2012. Electron tomography of cells. Q. Rev. Biophys. 45, 27–56.

Gubbels, M.-J., Duraisingh, M.T., 2012. Evolution of apicomplexan secretory organelles. Int. J. Parasitol. 42, 1071–1081.

Hausmann, K., Hülsmann, N., Machemer, H., 2003. Protozoologie, Vyd. 1. ed. Academia, Praha.

Heidrich, H.G., Mrema, J.E.K., Vander Jagt, D.L., Reyes, P., Rieckmann, K.H., 1982. Isolation of intracellular parasites (Plasmodium falciparum) from culture using free-flow electrophoresis: Separation of the free parasites according to stages. J. Parasitol.

Hildebrand, H.F., Vinckier, D., 1975. New observations on the gregarine Didymophyes gigantea Stein. J. Protozool. 22, 200–213.

Hoff, E.F., Carruthers, V.B., 2002. Is Toxoplasma egress the first step in invasion? Trends Parasitol. 18, 251–255.

Janouškovec, J., Horák, A., Oborník, M., Lukeš, J., Keeling, P.J., 2010. A common red algal origin of the apicomplexan, dinoflagellate, and heterokont plastids. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 10949–10954.

Junqueira, L.C., Carneiro, J., 2005. Basic histology text & atlas. McGraw-Hill Medical Publishing, New York.

Kappe, S.H.I., Buscaglia, C.A., Bergman, L.W., Coppens, I., Nussenzweig, V., 2004. Apicomplexan gliding motility and host cell invasion: Overhauling the motor model. Trends Parasitol. 20, 13–16.

Knoz, J., Opravilová, V., 1992. Základy mikroskopické techniky. Masarykova univerzita, Brno.

Leander, B.S., Ramey, P.A., 2006. Cellular identity of a novel small subunit rDNA sequence clade of Apicomplexans: Description of the marine parasite Rhytidocystis polygordiae n. sp. (Host: Polygordius sp., Polychaeta). J. Eukaryot. Microbiol. 53, 280–291.

Levine, N.D., 1988. Progress in Taxonomy of the Apicomplexan Protozoa. J. Protozool. 35, 518–520.

Levine, N.D., 1977. Revision and checklist of the species (other than lecudina) of the aseptate gregarine family Lecudinidae. J. Protozool. 24, 41–52.

Long, P.L. (Ed.), 1982. The biology of the coccidia. Edward Arnold, London.

Manguin, S., Bangs, M.J., Pothikasikorn, J., Chareonviriyaphap, T., 2010. Review on global co-transmission of human Plasmodium species and Wuchereria bancrofti by Anopheles mosquitoes. Infect. Genet. Evol. 10, 159–177.

Meloni, B.P., Thompson, R.C.A., 1996. Simplified Methods for Obtaining Purified Oocysts from Mice and for Growing Cryptosporidium parvum In vitro. J. Parasitol. 82, 757–762.

Paperna, I., Vilenkin, M., 1996. Cryptosporidiosis in the gourami Trichogaster leeri: Description of a new species and a proposal for a new genus, Piscicryptosporidium, for species infecting fish. Dis. Aquat. Organ. 27, 95–101.

Perkins, F.O., Barta, J.R., Clopton, R.E., Peirce, M.M., Upton, S.J. 2000. Phylum Apicomplexa Levine, 1970. In: Lee, J..J, Leedale, G.F., Bradbury, P. (Eds). An Illustrated Guide to the Protozoa. Second Edition, Vol. 1, Society of Protozoologists, Lawrence, Kansas, USA.

Rueckert, S., Leander, B.S., 2009. Phylogenetic position and description of rhytidocystis cyamus sp. n. (Apicomplexa, Rhitidocystidae): a novel intestinal parasite of the north-eastern Pacific ‘stink worm’ (Polychaeta, Opheliidae, Travisia pupa). Mar Biodiv. 4, 227-234.

Schrével, J., Gros, D., Monsigny, M., 1981. Cytochemistry of cell glycoconjugates. Prog. Histochem. Cytochem. 14, I–XV+1–269.

Schrével, J., Philippe, M., 1993. The gregarines. In: Kreier, J.P., editor. Parasitic Protozoa. Second edition, Vol. 4, Academic Press.

Sharman, P.A., Smith, N.C., Wallach, M.G., Katrib, M., 2010. Chasing the golden egg: Vaccination against poultry coccidiosis. Parasite Immunol. 32, 590–598.

Sheffield, H.G., Garnham, P.C.C., Shiroishi, T., 1971. The Fine Structure of the Sporozoite of Lankesteria culicis. J. Protozool. 18, 98–105.

Sheffield, H.G., Garnham, P.C., Shiroishi, T., 1971. The fine structure of the sporozoite of Lankesteria culicis. J. Protozool. 18, 98–105.

Simdyanov, T.G., Kuvardina, O.N., 2007. Fine structure and putative feeding mechanism of the archigregarine Selenidium orientale (Apicomplexa: Gregarinomorpha). Eur. J. Protistol. 43, 17–25.

Smyth, J.D., Wakelin, D., 1994. Introduction to Animal Parasitology. Cambridge University Press.

Takahashi, K.T., Kawaguchi, S., Kobayashi, M., Toda, T., 2003. Parasitic eugregarines change their spatial distribution within the host digestive tract of Antarctic krill, Euphausia superba. Polar Biol. 26, 468–473.

Upton, J., Peters, E.C., 1985. A new and unusual species of Coccidium (Apicomplexa: Agamococcidiorida) from Caribbean Scleractinian Corals. Jurnal of invertebrate Pathology 47, 184-193.

Valeur, B., Berberan-Santos, M.N., 2012. Molecular Fluorescence: Principles and Applications, Second Edition, Molecular Fluorescence: Principles and Applications, Second Edition.

Valigurová, A., Hofmannová, L., Koudela, B., Vávra, J., 2007. An ultrastructural comparison of the attachment sites between Gregarina steini and Cryptosporidium muris. J. Eukaryot. Microbiol. 54, 495–510.

Valigurová, A., Jirků, M., Koudela, B., Gelnar, M., Modrý, D., Šlapeta, J., 2008. Cryptosporidia: Epicellular parasites embraced by the host cell membrane. Int. J. Parasitol. 38, 913–922.

Valigurová, A., Koudela, B., 2005. Fine structure of trophozoites of the gregarine Leidyana ephestiae (Apicomplexa: Eugregarinida) parasitic in Ephestia kuehniella larvae (Lepidoptera). Eur. J. Protistol. 41, 209–218.

Valigurová, A., Michalková, V., Koudela, B., 2009. Eugregarine trophozoite detachment from the host epithelium via epimerite retraction: Fiction or fact? Int. J. Parasitol. 39, 1235–1242.

Valigurová, A., Paskerova, G.G., Diakin, A., Kováčiková, M., Simdyanov, T.G., 2015. Protococcidian Eleutheroschizon duboscqi, an Unusual Apicomplexan Interconnecting Gregarines and Cryptosporidia. PLOS ONE 10, e0125063.

Valigurová, A., Vaškovicová, N., Musilová, N., Schrével, J., 2013. The enigma of eugregarine epicytic folds: Where gliding motility originates? Front. Zool. 10.

Van De Peer, Y., De Wachter, R. 1997. Evolutionary relationships among the eukaryotic crown taxa taking into account site-to-site rate variation in 18S rRNA. J. Mol. Evol. 45, 619–630.

Volf, P., Horák, P., 2007. Paraziti a jejich biologie. Triton, Praha.

Wetzel, D.M., Schmidt, J., Kuhlenschmidt, M.S., Dubey, J.P., Sibley, L.D., 2005. Gliding Motility Leads to Active Cellular Invasion by Cryptosporidium parvum Sporozoites. Infect. Immun. 73, 5379–5387.

7. Internetové zdroje

URL 1: World Register of Marine Species [cit. 2015-02-02] .

URL 2: Olympus [cit. 2015-03-04] .

URL 3: Nebesařová, J., 2001 [cit. 2015-05-04] .