MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodov ědecká fakulta Ústav botaniky a zoologie

Obsah DNA a AT/GC genomový pom ěr v čeledi Apiaceae

Diplomová práce

Brno 2010 Jana Procházková

Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Petr Bureš, Ph.D.

Souhlasím s uložením této diplomové práce v knihovně Ústavu botaniky a zoologie P řF MU v Brn ě, p řípadn ě jiné knihovn ě Masarykovy univerzity v Brn ě, s jejím veřejným p ůjčováním a využitím pro v ědecké, vzd ělávací nebo jiné ve řejn ě prosp ěšné ú čely, a to za p ředpokladu, že převzaté informace budou řádn ě citovány a nebudou využívány komer čně.

V Brn ě, 17. kv ětna 2010 Jana Procházková

Pod ěkování Především si zaslouží pod ěkování m ůj školitel doc. RNDr. Petr Bureš, Ph.D., který nikdy nep řestal projevovat vst řícnost a trp ělivost. Dále bych cht ěla velmi pod ěkovat Mgr. Lucii Horové, která mi byla oporou p ři m ěř ení na cytometrech, stejn ě jako Ing. Jakub Šmerda, Ph.D., který se ochotn ě „vrtal“ v cytometru, když zrovna nefungoval, jak by m ěl. Srde čný dík pat ří doc. RNDr. Vítu Grulichovi, CSc. za pomoc p ři hledání vhodných lokalit a determinaci rostlin, Ing. Ji římu Danihelkovi, Ph.D. děkuji za pomoc s herbá řem. Za pomoc p ři sb ěru rostlin a zvládání po číta čových záludností děkuji kamarád ům Marku Schwarzovi, Karlu Fajmonovi, DAniele Bártové, Viky Hralové, Božce Božkové a Mar ťasovi Jirouškovi. Za rostlinný materiál vd ěč ím také Mgr. Věře Hroudové z botanické zahrady PřF UK, Mgr. Magdalén ě Chytré, Ing. Marii Tupé a celému kolektivu botanické zahrady P řF MU. Mnoha dalším lidem, hlavn ě rodin ě, d ěkuji za veškerou hmotnou i nehmotnou podporu.

„Kopr se nemlátí smykem a po kmínu se nejezdí koly voz ů,

nýbrž kopr se vyklepává prutem a kmín holí. “

Izajáš 28, 27 Abstrakt

V pr ůběhu evoluce dochází neustále k plynulým či skokovým zm ěnám v jaderném genomu. Výsledkem je dnešní vysoká variabilita v obsahu DNA i jejím složení u krytosemenných rostlin. V předkládané práci byly cytometrickým m ěř ením stanoveny absolutní obsah DNA (2C-value), velikost genomu (Cx-value), pr ůměrná velikost chromozom ů a pom ěr AT/GC bazí pro 79 taxon ů čeledi Apiaceae a 2 druhy čeledi Araliaceae . Z čeledi Apiaceae jsou zastoupeny všechny b ěžné rody rostoucí v České republice. Neparametricky byl testován vztah mezi m ěř enými genomickými znaky a jejich závislost na podmínkách prost ředí reprezentovaných Ellenbergovými indika čními hodnotami pro zkoumané druhy. Dále byl testován vztah mezi genomickými parametry a dalšími charakteristikami rostlin, které byly p řevzaty od jiných autor ů: výška rostlin, hmotnost semen, tendence k ohrožení nebo invazivnosti, životní strategie. Zmín ěné znaky byly také testovány korelací nezávislých fylogenetických kontrast ů. V souboru zkoumaných rostlin byl neparametrickou korelací zjišt ěn pozitivní vztah mezi pr ůměrnou velikostí chromozom ů a obsahem GC bazí. V pod čeledi Apioideae výrazn ě korelovala velikost genomu (1Cx) s obsahem GC bazí. Po fylogenetické korekci na pseudoreplikace nebyl však vztah potvrzen. Z výsledk ů nicmén ě vyplývá, že jak velikost genomu, tak obsah GC se m ění v závislosti na evoluci m ěř ených druh ů. Byla zjištena souvislost mezi velikostí genomu druhu a dostupností vody v okolním prost ředí. Také byl potvrzen rozdíl ve velikosti genomu v závislosti na životní strategii rostlin.

Klí čová slova: Apiaceae ( čele ď mi říkovité), pr ůtoková cytometrie, velikost genomu, obsah GC bazí, pr ůměrná velikost chromozom ů, Ellenbergovy indika ční hodnoty, fylogenetické nezávislé kontrasty.

Abstract

During the evolution continuous or jump changes in nuclear genome constantly occure. These processes lead to high nowaday variability in DNA content and its composition in angiosperms. In this study, absolute DNA content (2C-value), monoploid genome size (Cx- value), average chromosome size and AT/GC genomic ratio was measured using flow cytometry for 79 Apiaceae family taxa and 2 Araliaceae family species. All common Apiaceae genera growing in the Czech Republic are included in measurements. Relationship among the genomic characters was nonparametrically tested, as well as the correlations among the genomic characters and environmental variables represented by the Ellenberg's indicator values of the species. Another plant characteristics, adopted from different authors, were tested against genomic parameters: growth size, seed weight, tendency to become vulnerable or invasive, life strategy. Also the test of independent phylogenetic contrasts was performed. In the species data positive nonparametric correlation was detected between average chromosome size and GC content. In the subfamily Apioideae was significantly correlated genome size (1Cx) with GC content. When the phylogenetic correction to avoid pseudoreplications was performed, no relationship was confirmed. Anyway, the results suggest that genome size and GC content evolved side by side with the studied species. The relation was found between genome size of the species and their Ellenberg's indicator values for humidity. The difference in genome size according to the species' life strategy was confirmed.

Key words: Apiaceae (the celery family), flow cytometry, genome size, GC content, average chromosome size, Ellenberg's indicator values, independent phylogenetic contrasts. 1. Úvod ...... 1

1.1. Modelový taxon – čele ď Apiaceae ...... 2 1.1.1. Taxonomie a fylogeneze ...... 2 1.1.2. Morfologie a biologie ...... 4 1.2. Obsah DNA ...... 5 1.2.1. Terminologie...... 5 1.2.2. K čemu slouží m ěř ení obsahu DNA?...... 6 1.2.3. Hlavní mechanismy ve zm ěnách velikosti genomu ...... 6 1.2.4. Velikost genomu a jeho vztah k ekologickým a ekogeografickým parametr ům...... 8 1.2.5. Velikost genomu a jeho vztah k fenotypovým vlastnostem...... 9 1.3. AT/GC genomový pom ěr ...... 9 1.4. Cíle diplomové práce ...... 10

2. Materiál a metodika ...... 11

2.1. Materiál ...... 11 2.2. Pr ůtoková cytometrie ...... 11 2.2.1. Historie...... 12 2.2.2. Stavba a princip pr ůtokového cytometru ...... 13 2.2.3. M ěř ení materiálu...... 13 2.3.5. Ur čení velikosti genomu, chromozom ů a AT/GC genomového pom ěru...... 15 2.4. Sestavení fylogenetického stromu...... 16 2.5. Znaky použité pro analýzy...... 17 2.6. Statistické zpracování dat ...... 18 2.6.1. Phylocom ...... 18 2.5.1. Další použité programy...... 19

4. Výsledky ...... 21

4.1. Velikost genomu a chromozom ů ve vztahu k obsahu GC bazí...... 25 4.2. Evoluce genomických parametr ů v rámci čeledi ...... 26 4.3. Vztah genomických parametr ů k ekologickým prom ěnným...... 29 4.4. Vztah genomických parametr ů k vybraným fenotypovým a dalším znak ům...... 31

5. Diskuse...... 34

5.1. Porovnání s p ředchozími m ěř eními ...... 34 5.2. Variabilita ve velikosti genomu a obsahu GC bazí ...... 35 5.3. Velikost genomu a chromozom ů ve vztahu k obsahu GC bazí...... 36 5.4. Vztah genomických parametr ů k ekologickým prom ěnným...... 36 5.5. Genomické parametry a ostatní znaky ...... 37 5.6. Záv ěrem...... 38

Literatura ...... 39

Přílohy ...... 45

1 1. Úvod

Diplomová práce se zam ěř uje na cytometrické m ěř ení velikosti genomu a pom ěrového zastoupení AT a GC bazí v jaderné DNA u čeledi Apiaceae , do kterého byla zahrnuta v ětšina rod ů rostoucích v České republice. Krom ě toho bylo zm ěř eno i n ěkolik rod ů mediteránních a asijských dostupných v botanických zahradách. Čele ď Apiaceae byla vybrána v souvislosti s následujícími vlastnostmi: nízká tendence k hybridizaci (v České republice je doložena pouze u rod ů Bupleurum a Heracleum ) a polyploidizaci (oproti blízké čeledi Asteraceae, která je též v centru zájmu pracovišt ě, kde tato práce vznikala) a malá variabilita v po čtu chromozom ů. Díky malému zastoupení sou časných hybrid ů v této čeledi lze usuzovat, že ani v historii nedocházelo často k hybridizaci mezi druhy, a proto fylogenetické stromy sestavené na základ ě sekvenování genomu lépe a jasn ěji reprezentují skute čnou evoluční historii. Polyploidizace pat ří mezi nej čast ější a nejlépe interpretovatelné d ůvody k sou časným zm ěnám ve velikosti genomu, avšak ve zkoumané čeledi nejsou novodobí polyploidi příliš častí. Naopak vysoký obsah DNA nam ěř ený u n ěkterých taxon ů, nebo p římé d ůkazy ze sekvenování genomu, m ůžou být d ůsledkem tzv. paleopolyploidizace. Ta mohla prob ěhnout jako reakce na ur čité podmínky prost ředí, či působením jiných organism ů. U čeledi Apiaceae je možné se domnívat, že v případ ě dávných polyploidizací nešlo o allopolyploidie (práv ě z důvodu nízké míry pozorované hybridizace), tudíž nedocházelo k mísení r ůzných genom ů. Tak řka nep řítomnost polyploid ů u českých druh ů usnad ňuje (p ři znalosti základního chromozomového čísla) stanovení monoploidního obsahu DNA bez nutnosti po čítat chromozomy. V sou časnosti je znám obsah jaderné DNA pro více než 6000 druh ů cévnatých rostlin, avšak z čeledi Apiaceae to doposud bylo pouze pro 48 taxon ů (BENNETT & LEITCH 2005). Tato práce p řináší 58 nových hodnot a zárove ň je dopl ňuje o údaje týkající se zastoupení GC bazí. Zm ěř eny byly také dva taxony rodu Hedera ze sesterské čeledi Araliaceae pro fylogenetické srovnávání. Opodstatn ění m ěř ení obsahu DNA a pom ěru AT/GC bude pojednáno v podkapitole kapitole 1.2. 2 1.1. Modelový taxon – čele ď Apiaceae

Čele ď Apiaceae (mi říkovité) je se svými p řibližn ě 270 rody a 2850 druhy sedmnáctou nejbohatší čeledí na sv ětě. Považuje se za kosmopolitní, s těžišt ěm rozší ření v mírných pásech obou polokoulí. V České republice roste asi 80 druh ů člen ěných do více než 50 rod ů (TOMŠOVIC 1997). Krom ě zcela b ěžných druh ů pat ří do této čeledi i n ěkolik u nás kriticky ohrožených taxon ů (Angelica palustris , Bupleurum affine , Bupleurum longifolium subsp. vapincense , Bupleurum rotundifolium , Bupleurum tenuissimum , Eryngium planum , Peucedanum carvifolia a Scandix pecten-veneris ). Na červeném seznamu České republiky (PROCHÁZKA (ed.) 2001) se nachází celkem 40 taxon ů z této čeledi, nep ůvodních, zavle čených taxon ů je u nás 41 (PYŠEK et al. 2002). Mi říkovité rostliny jsou pozoruhodné širokou škálou svého využití. N ěkteré druhy mají blahodárné ú činky na lidské zdraví a p ěstují se jako zelenina nebo ko ření ( Petroselinum crispum , Daucus carota , Carum carvi , Coriandrum sativum , Apium graveolens ), jiné druhy mohou být smrteln ě jedovaté díky p řítomným alkaloid ům ( Conium maculatum , Cicuta virosa , Chaerophyllum temulum ). Díky svým obsahovým látkám nacházejí uplatn ění krom ě kuchyn ě také v kosmetice a farmakologii.

1.1.1. Taxonomie a fylogeneze

Taxonomické za řazení čeledi Apiaceae (starším názvem Umbelliferae ) p řibližuje obr. 1. Ve „vlastních“ dvoud ěložných je sou částí asteridové v ětve v odd ělení Magnoliophyta, t říd ě Magnoliopsida. Čele ď Apiaceae je blízce p říbuzná čeledi Araliaceae . Podle tradi čního systému (DRUDE 1898) bývala člen ěna na t ři pod čeledi: Saniculoideae , Apioideae a Hydrocotyloideae , z nichž poslední jmenovaná se na základ ě kladistických analýz ukázala být polyfyletickou. Po přesunutí rodu Lagoecia ze Saniculoideae do Apioideae se ob ě pod čeledi stávají monofyletickými, dob ře podpo řenými molekulárními znaky. Pod čele ď Hydrocotyloideae byla rozd ělena mezi čeledi Apiaceae a Araliaceae (JUDD et al. 1994, PLUNKETT et al. 2004). Nov ě tedy čele ď sestává z pod čeledí Saniculoideae , Apioideae , Mackinlayoideae , Azorelloideae a klad ů Hermas a Platysace .

3

Cornales Ericales Solanales Lamiales Asteridy Gentianales Boraginaceae Euasteridy I Vahlia Garryales Euasteridy Oncotheca Icacinaceae Aquifoliales Euasteridy II Asterales Escalloniales Bruniales Paracryphiales Dipsacales Pennantiaceae Apiales Torricelliaceae Griseliniaceae Pittosporaceae Araliaceae Hydrocotyloideae Aralioideae Mydocarpaceae Mackinlayoideae Apiaceae Platysace Azorelloideae Hermas Saniculoideae Apioideae

Obr. 1 Příbuzenské vztahy v asteridové v ětvi podle www 1 a STEVENS (2001 onwards).

Sesterskou větev k pod čeledi Saniculoideae tvo ří podle n ěkterých analýz rod Arctopus přeřazený z pod čeledi Hydrocotyloideae , také d řevnaté rody Steganotaenia a Polemanniopsis , jsou pravd ěpodobn ě členy téhož kladu (DOWNIE et al. 2001, LIU et al. 2003, PLUNKETT et al. 2004). O pozici rodu Lichtensteinia se vedou spory. Podle CALVIÑO & DOWNIE (2007) by m ěla být vy člen ěn a p řipojen k Apioideae , v práci NICOLAS & PLUNKETT (2009) oproti tomu tvo ří slab ě podpo řenou sesterskou skupinu k pod čeledi Saniculoideae . Rod Eryngium , který tvo ří sesterskou v ětev k rod ům Sanicula (incl. Hacquetia ) a Petagnea , je rozd ělený do dvou klad ů – na druhy ze Starého a Nového sv ěta. Spolu s Astrantia tvo ří monofyletickou skupinu (CALVIÑO et al. 2008) V rámci pod čeledi Apioideae je podle molekulárních studií možné rozlišit n ěkolik trib ů a subtrib ů (DOWNIE et al. 2000). Z řeteln ě ohrani čené jsou triby Bupleureae ( Bupleurum ), Oenantheae ( Berula , Cicuta , Oenanthe , Sium ), Pleurospermeae ( Pleurospermum ), Smyrnieae (Smyrnium ) a Scandiceae , které lze dále rozd ělit do t ří podtrib ů Daucinae ( Cuminum , Daucus , Laserpitium , Orlaya ), Scandicinae ( Anthriscus , Chaerophyllum , Myrrhis , Scandix) a Torilidinae ( Caucalis , Torilis , Turgenia ). Také rod Ligusticum je vzdálen ě p říbuzný tribu Scandiceae . 4 Nadále zde ovšem z ůstává obsáhlá skupina neza řazených rod ů, která si žádá d ůkladn ější studie. Komplikace jsou spojené hlavn ě s některými tradi čně pojímanými rody, jež se podle nov ějších fylogenetických analýz ukázaly být polyfyletickými či parafyletickými. Důvodem rozpor ů se stal dřív ější přílišný d ůraz na morfologické znaky, zvlášt ě stavbu plod ů. Z rodu Apium musel být vy člen ěn rod Helosciadium a p řesunut do blízkosti tribu Oenantheae , nejasné jsou též vztahy uvnit ř tribu Selineae. Typickými p říklady parafyletických skupin jsou rody Seseli , Peucedanum (SPALIK et al. 2004) a Angelica (FENG et al. 2009). Heracleum , které je však také parafyletické, tvo ří dob ře vymezenou skupinu s Pastinaca a Tordylium (DOWNIE et al. 1998, PIMENOV & LEONOV 1993). Došlo ješt ě k dalším taxonomickým zm ěnám. Nov ě byla popsána pod čele ď Azorelloideae , kam p řipadla až polovina rod ů z dřív ější pod čeledi Hydrocotyloideae . Poslední tři skupiny v čeledi Apiaceae jsou pod čele ď Mackinlayoideae , jejíž n ěkteré rody pochází z čeledi Araliaceae a rody Platysace a Hermas , jejichž umíst ění ve fylogenetickém stromu není zcela jasné (NICOLAS & PLUNKETT 2009). Podle jiných autorů by pod čele ď Mackinlayoideae , dob ře vymezená molekulárními i morfologickými znaky, mohla vytvo řit samostatnou čele ď v rámci Apiales (PLUNKETT & LOWRY 2001).

1.1.2. Morfologie a biologie

Do čeledi Apiaceae pat ří jednoleté až vytrvalé byliny, lysé nebo s chlupy, se sekrečními bu ňkami a kanálky ve vegetativních částech a v oplodí. Obsahují éterické oleje, kumaríny, saponiny, flavonoidy, alkaloidy, glykosidy, acetyleny a jiné aromatické látky. Lodyha bývá v ětšinou dutá a rýhovaná, listy st řídavé, bez palist ů, čepel člen ěná nebo složená, výjime čně celistvá. Řapík lodyžních list ů má zpravidla z řetelnou pochvu. Kv ětenstvím je okolík (jednoduchý či složený z okolí čků) nebo strboul. Pod kv ětenstvím může být z podp ůrných listen ů obal, resp. obalí ček pod okolí čky. Kv ěty v okolíku jsou zpravidla aktinomorfní (okrajové kv ěty bývají n ěkdy zygomorfní), oboupohlavné, z řídka druhotn ě jednopohlavné, nebo dokonce r ůznopohlavné. Kalich tvo ří p ět lístk ů nebo cíp ů (p řípadn ě je zakrn ělý), koruna je složena z pěti volných lístk ů. Ty činek je p ět se žlutými nebo fialovými prašníky, pylová zrna jsou trikolporátní. Spodní semeník je dvoupouzdrý, srostlý ze dvou plodolist ů, se dv ěmi čnělkami na rozší řené bázi (stylopodium). Plodem je dvounažka rozpadající se za zralosti ve dv ě merikarpia, často spojená karpoforem. Jen n ěkolik druh ů je autogamních, v ětšina bývá opylována hmyzem. P řitahují hlavn ě dvouk řídlý a blanok řídlý hmyz, který se živí nektarem z nektárií. Často mívají tyto rostliny 5 zv ětšeny korunní lístky na vn ějších kv ětech okolíku („paprskující“) a jsou tak pro hmyz lákav ější. Ačkoliv mají n ěkteré druhy pouze oboupohlavné kv ěty, mnoho jich bývá andromonoecických (oboupohlavné a sam čí kv ěty na jedné rostlin ě). Sam čí kv ěty obvykle převažují na pozd ěji vykvétajících okolících, dož je z řejm ě adaptace na cizosprašnost. Stejné uspo řádání se m ůže vyskytovat i v rámci okolíku či okolí čku: oboupohlavné kv ěty p řevažují na vn ější, d říve vykvétající části, sam čí kv ěty se nachází ve vnit řní části. Existují však i druhy, kde platí pravidlo zcela opa čné (nap ř. Oenanthe fistulosa ). Plody bývají často uzp ůsobeny na anemochorii (vyvinutá k řídla), hydrochorii (prostory v žebrech napln ěné vzduchem) nebo zoochorii (há čky, chloupky, ostny). N ěkolik druh ů je adaptováno na autochorii, nap říklad Scandix , kde zobákovitý útvar na merikarpiu slouží jako hygroskopický katapult (podle TOMŠOVIC 1997, FROBERG in prep.).

1.2. Obsah DNA

1.2.1. Terminologie

Absolutní obsah DNA se tradi čně uvádí v pikogramech (pg). S rozvojem projekt ů sekvenování genomu se ujalo vyjad řování obsahu DNA po čtem pár ů bazí (bp; 1 pg ~ 978 Mbp, DOLEŽEL et al. 2003) a také se za čal užívat termín „velikost genomu“. Definice tohoto pojmu dlouho nebyla mezi r ůznými autory jednotná. Ve h ře byl také por ůznu používaný pojem „C-value“ (SWIFT 1950). Nebylo vždy jasné, zda se jedná o veškerý obsah DNA v jád ře bu ňky ve fázi G1 bun ěč ného cyklu (2n), zda jde o jednu chromozomovou sadu (x), nebo zda je myšlen polovi ční obsah veškeré DNA (n); rozdíl je podstatný zejména u polyploid ů. Proto p řišel GREILHUBER (2005) s návrhem danou terminologii up řesnit. Pojmem C-value ozna čil množství DNA nazávislé na stupni ploidie, které je možné kvantitativn ě vyjád řit velkými čísly a písmenem C. Proto 1C vyjad řuje obsah DNA v gametách (n; tzv. holoploidní po čet chromozom ů), 2C sd ěluje obsah DNA v somatických bu ňkách (2n) v G1 fázi. Naopak o ploidní úrovni nás informuje Cx-value: 2Cx je obsah DNA v somatické bu ňce diploidního organismu (2n; 2Cx = 2C), jsou to ve skute čnosti dva genomy: jeden od otce a jeden od matky; 4Cx je obsah DNA v somatické bu ňce tetraploidního organismu (2n; 4Cx = 2C). Genom je tedy veškerá DNA, která p ředstavuje jednu úplnou kopii d ědi čné informace organismu. 6 1.2.2. K čemu slouží m ěř ení obsahu DNA?

Obsah DNA (C-value) a další genomové parametry pat ří mezi základní znaky druhové rozmanitosti a v taxonomickém bádání se dostávají do pop ředí p řed morfologické znaky. Vyvíjí se a m ění v pr ůběhu evoluce a mohou tak podpo řit molekulární a fylogenetické studie. Ozna čení místa, kde p řesn ě k diferenciaci došlo a s jakými dalšími zm ěnami to souviselo, je cílem mnoha bádání. Veliké využití nachází parametr Cx-value p ři odhalování hybrid ů a polyploid ů a jejich porovnávání, kde dopl ňuje po čítání chromozom ů. Slouží nap ř. k zjišt ění reproduk čních strategií studovaných organism ů. Také v laboratorních výzkumech je údaj o velikosti genomu často klí čový. Obtížnost aplikace n ěkterých molekulárních metod (AFLP, PCR) u velkých genom ů p ředur čila nap ř. konkrétní taxony ( či chromozomy), které byly jako první sekvenovány. Díky tomu p řišel z rostlin první na řadu husení ček Arabidopsis thaliana (1C = 0,16 pg), nebo pozd ěji, krom ě dalších, rýže Oryza sativa (1C = 0,5 pg) (BENNETT & LEITCH 2005) . U lidského genomu byl nejd říve osekvenován 22. chromozom, který následuje hned po 21. chromozomu, nejmenším z autozom ů (BENNETT et al. 2000, GARNER 2002).

1.2.3. Hlavní mechanismy ve zm ěnách velikosti genomu

Samoz řejm ě, že evoluce v tomto ohledu velice dynamicky p ůsobí a p řináší jak nár ůsty, tak poklesy ve velikosti genomu. Sv ědčí o tom vysoká variabilita v množství DNA uvnit ř krytosemenných rostlin. Rostlinou s nejmenší velikostí nereplikovaného haploidního chromozomového komplementu byla ur čena Genlisea margaretae z čeledi Lentibulariaceae s 0,065 pg (GREILHUBER et al. 2006). Naopak rostlina s nejv ětším obsahem jaderné DNA v nereplikovaném haploidním stavu je Fritillaria assyriaca z čeledi Liliaceae s 127,4 pg (MCLEISH & LACOUR 1971 (ústní sd ělení) in BENNETT & LEITCH 2005). Krytosemenné rostliny se tedy navzájem liší v obsahu DNA až 2000krát. Většina druh ů má ale spíše malé genomy (pr ůměr pro 6288 druh ů krytosemenných rostlin činí 1C = 6,2 pg, medián 2,6 pg; podle BENNETT & LEITCH 2005). Nej čast ějšími p říčinami rozdíl ů ve velikosti genomu jsou tyto:

1) Polyploidizace Jedná se o rychlý mechanizmus, který m ůže b ěhem jedné generace zdvojnásobit p ůvodní obsah DNA a tedy i po čet gen ů, a tím m ůže vést k ustanovení nových druh ů. Nej čast ějšími mechanismy bývají chyby p ři mitóze a meióze, anebo fúze neredukovaných gamet. Dojde-li ke zdvojení chromozomových sad v rámci druhu, jedná se o autopolyploidii. 7 Důsledkem hybridizace často bývá allopolyploidizace. Hybridní jedinec obsahuje sady chromozom ů dvou r ůzných druh ů, které nebývají zcela homologní. Zdvojením všech chromozom ů se vyhne problém ům, které by se následn ě vyskytly p ři dělení bun ěk. Zdá se, že v ětšina, až 70 %, kvetoucích rostlin má n ějakého polyploidního p ředka (MASTERSON 1994). Tuto teorii podporuje i WENDEL (2000), který druhy, u nichž došlo v dávné minulosti (desítky milion ů let) ke zdvojení genomu, nazývá paleopolyploidy. Postupným p ůsobením mutací a přestavbami chromozom ů docházelo častokrát ke ztát ě duplikovaných sekvencí. Díky tomu se dnešní druhy jeví jako diploidi. Cyklus polyploidizace a následné duplikace se mohl b ěhem evoluce mnohokrát opakovat a jeho známky lze odhalit nap ř. p ři komparativním mapování genom ů. Překvapením byl i za diploida vždy považovaný druh Arabidopsis thaliana (ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE 2000). To m ůže p řinést mnoho zm ěn do sou časného nahlížení na stupe ň ploidie podle po čtu chromozom ů. Pouze zcela nedávné genomové duplikace je možné rozpoznat jako klasické polyploidiza ční události. Dle n ěkterých odhad ů je takzvanými neopolyploidy asi 20–40 % sou časných krytosemenných (STEBBINS 1971).

2) Amplifikace retroelement ů Molekulární výzkumy na rostlinné jaderné DNA ukázaly, že nejv ětší vliv na rozdílnost ve velikosti genomu má obsah repetitivní DNA. Že se jedná o úseky mobilní DNA zvané retroelementy, p ředevším o jejich skupinu LTR- (long terminal repeat-) retrotranspozony, bylo prokázáno nap ř. v genomech kuku řice a je čmene (SANMIGUEL et al. 1996; VICIENT et al. 1999). Tyto repetice mohou tvo řit i více než 60 % genomu. Podle výzkum ů nap říč eukaryoty se p ředpokládá, že k akumulacím retrotranspozon ů dochází p ředevším v oblastech mezi geny, tj. v intronech. Pozorování provedená v rodu Gossypium a dalších rostlinných taxonech, které jsou si blízce p říbuzné, však neprokázala korelaci mezi délkou intron ů a velikostí genomu (WENDEL et al. 2002, GROVER et al. 2004).

3) Další postupné zv ětšování Mezi další nástroje k růstu genomu pat ří chyby v replikaci DNA, chromozómové aberace, drobné inzerce, expanze tandemových repetic, nelegitimní rekombinace, nerovnom ěrný crossing-over atd. (HAWKINS et al. 2006). Pochopiteln ě je p řenos takto pozm ěněných chromozom ů do další generace stížen, p řípadn ě m ůže vést ke sterilit ě potomk ů. Někdy se 8 nicmén ě zmutovaný jedinec a jeho genom uchytí, k čemuž mohou dopomoci kup říkladu již zmín ěné mechanismy hybridizace a polyploidizace.

4) Zmenšování genomu Přítomnost mechanism ů brzdících rozpínání genomu je nevyhnutelná. Vzhledem k tomu, že v ětšina krytosemenných rostlin tíhne k menším genom ům, musí být eliminace DNA a potla čování transpozon ů velice rozší řené. Hmatatelným d ůkazem je zmenšování genomu u polyploid ů, jejichž Cx-value je signifikantn ě menší než u jejich diploidních p říbuzných (nap ř. LEITCH & BENNETT 2004, WEISS-SCHNEEWEISS et al. 2006). Zmín ěný pokles koreluje se sklonem mutací up řednost ňovat delece nad inzercemi (PETROV 2002), přičemž se jeví, že taktéž nelegitimní rekombinace mohou eliminovat retrotranspozonové sekvence (MA et al. 2004). Podobné mechanismy se nejspíš liší mezi jednotlivými liniemi druh ů a mohou se stát základem selekce (BENNETZEN et al. 2005).

1.2.4. Velikost genomu a jeho vztah k ekologickým a ekogeografickým parametr ům

Mnohokrát bylo prokázáno, že se i jedinci v rámci jednoho druhu liší velikostí genomu. Často to bývá v souvislosti s různými ekologickými či geografickými faktory. Negativní vztah mezi velikostí genomu a Ellenbergovými indikačními hodnotami pro vlhkost a kontinentalitu byl prokázán v rodu Cirsium (BUREŠ at al. 2005). Naopak pozitivní korelace byla zjišt ěna mezi velikostí genomu a zem ěpisnou ší řkou a délkou životního cyklu (PRICE et al. 2005, CHASE et al. 2005). Poslední jmenované m ůže mít vztah s rychlostí r ůstu, která negativn ě koreluje s velikostí genomu (KAHLAOUI et al. 2009). Terofyty s malými genomy musí r ůst velmi rychle, aby se za vegeta ční sezonu stihly reprodukovat. Mohou být dokonce schopné osídlit prost ředí s kratší vegeta ční sezonou oproti druh ům s většími genomy. Také podle jiných autor ů m ůže být velký genom p řekážkou, kv ůli níž nemohou druhy obsadit tak širokou ekologickou niku jako druhy s malými genomy (KNIGHT et al. 2005). Významn ě se také mohou velikostí genomu odlišovat rostliny kvetoucí brzy na ja ře oproti pozd ějším druh ům (BARANYI & GREILHUBER 1999). BANCHEVA & GREILHUBER (2006) zaznamenali u rodu Centaurea pozitivní korelaci velikosti genomu s nadmo řskou výškou, což logicky korespondovalo také s úhrnem srážek; teplota se pak m ěnila v opa čném trendu vůč i velikosti genomu. 9 1.2.5. Velikost genomu a jeho vztah k fenotypovým vlastnostem

Sou časné práce ukázaly, že obsah DNA může mít významný dopad na fenotypový projev díky modifikaci genové exprese namnožením repetitivních sekvencí. Prokázány byly morfologické zm ěny, které s velikostí genomu p římo souvisejí (velikost bun ěk, velikost jádra – jde o tzv. nukleotypický efekt, nap ř. JOVTCHEV et al. 2006). Od velikosti genomu se odvozují i další znaky, jako velikost semen (KNIGHT et al. 2005), délka meiózy a mitózy (nap ř. VAN'T HOF & SPARROW 1963, BENNETT 1971). Existuje celá řada studií o korelacích, negativních či pozitivních, mezi velikostí genomu a rychlostí fotosyntézy, anatomických vlastností list ů, po čtem pr ůduch ů, velikostí kv ětů a dalších (MEAGHER &

COSTICH 1996, BUREŠ et al. 2004, BEAULIEU et al. 2007a). Byla prokázána také souvislost mezi velikostí genomu a růstovou formou. CHASE et al. (2005) uvádí u orchidejí signifikantní odlišnost epifyt ů (s malými genomy) od terofytních druh ů. DUŠKOVÁ et al. (2010) zjistili u jihoamerických druh ů rodu Lasiocephalus , že ke řové formy mají významn ě vyšší absolutní obsah DNA než úzkolisté horské byliny. Růstová forma zde vznikla jako p řizp ůsobení na nadmo řskou výšku, proto spolu tyto dva znaky korelují. Zárov ěň však auto ři upozor ňují, že pozorovaná variabilita v daných znacích (morfologických i genomických) koreluje s fylogenezí, která m ůže mít v ětší vliv, než samotné faktory prost ředí Celkov ě je p ři hledání vztah ů problematické ur čit, který parametr závisí na kterém. V práci HODGSON et al. (2010) je navržena hypotéza, že by velikost genomu mohla být ovlivn ěna velikostí pr ůduch ů a jejich dopadem na intezitu fotosyntézy.

Z uvedených prací vyplývá, že záv ěry se dají jen st ěží generalizovat. Zdá se, že co platí pro jeden taxon, nemusí platit pro jiný. Vždy navíc o výsledku rozhoduje velké mnoho faktor ů, které vždy nelze ve výzkumech zohled ňovat.

1.3. AT/GC genomový pom ěr

Zastoupení GC bazí je spolu s velikostí genomu dalším kritériem, které m ůže p řisp ět k odlišení taxon ů nebo napov ědět n ěco o původu jednotlivých chromozom ů v případ ě hybridizace. Jedná se o další údaj sv ědčící o diverzit ě v genomech živých organism ů, který je díky pr ůtokové cytometrii pom ěrn ě snadné získat. V praxi se tento parametr pro klasifikaci nepoužívá, ale bylo navrženo, aby se využíval na vyšších úrovních hierarchické klasifiklace u bakterií (WAYNE et al. 1987). 10 Vztah k podmínkám vn ějšího prost ředí byl dokázán nap ř. u bakterií či archeí, které se nízkým procentem GC bazí p řizp ůsobují p řítomnosti, nebo naopak nep řítomnosti, ur čitých chemických prvk ů v okolí (nap ř. DUFRESNE et al. 2005, BOLHUIS et al. 2006). Také u savc ů a jiných obratlovc ů je zastoupení GC bazí zna čně prozkoumáno. GALTIER et al. (2001) píše, že oblasti bohaté na guanin a cytosin obsahují hodn ě gen ů a krátké introny. Proto má z řejm ě rozmíst ění GC obsahu u savc ů funk ční d ůležitost a vzniká tak otázka po jeho původu a evoluci. U rostlin nebyl doposud tento parametr stanoven u dostate čně velkého po čtu druh ů (MEISTER & BAROW 2007) a proto lze význam jeho proměnlivosti t ěžko odhadovat. Jak bylo p ředvedeno v práci SUDA et al. (2007) na jest řábnících podrodu Pilosella , variabilita mezi blízkými taxony m ůže být velmi nízká a neodpovídá zjišt ěné variabilit ě v obsahu DNA. Bylo však zjišt ěno vyšší zastoupení GC bazí u polyploid ů oproti jejich diploidním prot ějšk ům. Z toho by se dalo usoudit, že GC báze lépe odolávají opravným bun ěč ným mechanizm ům, které se aktivují p ři narušení stability jádra. U evolu čně vzdálen ějších skupin zřejm ě budou rozdíly v zastoupení GC bazí větší. To signifikantn ě prokázali u n ěkolika čeledí BAROW & MEISTER (2002). Jak souvisí zastoupením GC s velikostí genomu je stále diskutovanou otázkou. Pozitivní korelaci objevil p ři studiu 20 druh ů obratlovc ů VINOGRADOV (1994). U rostlin byl tento vztah nejd říve zamítnut (BAROW & MEISTER 2002), analýzou v ětšího po čtu blízce příbuzných druh ů byl tento vztah shledán v několika čeledích (BUREŠ et al. 2007). GC pom ěr koreloval jak s monoploidní velikostí genomu, tak s celkovým obsahem DNA. Takový výsledek byl vysv ětlen GC bohatými repeticemi v genomu a mezidruhovou variabilitou v obsahu DNA mezi blízce p říbuznými taxony.

1.4. Cíle diplomové práce

1) Provést genomický pr ůzkum českých druh ů čeledi Apiaceae : Jaká je variabilita ve velikosti genomu, pr ůměrné velikosti chromozom ů či zastoupení GC bazí v rámci čeledi, p řípadn ě v rámci jednoho rodu? 2) Ov ěř it přítomnost/nep řítomnost vztah ů mezi genomickými parametry navzájem: Koreluje velikost genomu s po čtem chromozom ů a obsahem GC bazí? 3) Zjistit, zda existuje vztah mezi genomickými a ekologickými, p řípadn ě vybranými morfologickými parametry u sledovaných taxon ů: Jsou genomické parametry adaptivní vzhledem k prom ěnným prost ředí? 4) Vztáhnout zjišt ěné parametry na fylogenezi čeledi: Mění se genomické či jiné parametry soub ěžn ě s evolucí studovaných druh ů? 11

2. Materiál a metodika

V této kapitole je pojednáno o sbíraném materiálu, lokalitách sb ěru, o zp ůsobu zpracování materiálu a následných analýzách pomocí po číta čového softwaru. Podrobn ě je popsána zvlášt ě pr ůtoková cytometrie jakožto klí čová metoda k získání dat.

2.1. Materiál

V pilotní studii v rámci bakalá řské práce (PROCHÁZKOVÁ 2007) bylo jedním z cíl ů nam ěř it vždy každý druh sebraný ze t ří r ůzných lokalit. Vzhledem k tomu, že mezi jedinci z různých lokalit nebyl nalezen v karyologických parametrech výrazný intraspecifický rozdíl, při diplomové práci se od tohoto zám ěru upustilo. Pro analýzy byla využita data jak z pilotní studie, nashromážd ěná b ěhem srpna a zá ří 2006 (celkem 16 druh ů), tak nová data získaná v letech 2007 a 2009 (63 taxon ů z čeledi Apiaceae , 2 druhy z čeledi Araliaceae ). Jednalo se o rostliny částe čně z volné p řírody, částe čně z botanických zahrad, a n ěkolik exemplá řů pochází ze soukromých zahrádek. Seznam druh ů, jejich p ůvod a odkaz na herbá ř je uveden v tabulkách A až C v p říloze. V diplomové práci byly kladeny vysoké nároky na kvalitu měř eného materiálu, který bylo nutné po dobu m ěř ení uchovávat až 3 dny v lednici. Sbírány byly proto vždy mladé čerstvé listy, p řípadn ě také kv ětenství, které byly transportovány v 50 ml plastových zkumavkách s malým množstvím vody, obložené chladícími kostkami a uložené v polystyrénové krabici. Zárove ň byl ke každé rostlin ě sebrán herbá řový doklad. Tyto herbá řové položky byly poté opat řeny schedami a uloženy v herbá ři Ústavu botaniky a zoologie P řírodov ědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brn ě (BRNU). Nomenklatura českých taxon ů byla sjednocena podle Klí če ke kv ěten ě České Republiky (KUBÁT et al. 2002), ostatní podle INTERNATIONAL PLANT NAMES INDEX – IPNI (2005). Dva taxony (ozna čené za Oenanthe cf. fistulosa a Angelica cf. amurensis ) nebylo možné podle dostupných znak ů na rostlinách jednozna čně determinovat. Na celkovém habitu se snad podepsalo i p ěstování v nep řirozených podmínkách botanické zahrady. Za sm ěrodatný se v těchto p řípadech považoval název uvád ěný u rostlin v botanické zahrad ě. V ětšinou znak ů uvád ěných v ur čovacím klí či tyto rostliny danému jménu odpovídaly.

2.2. Pr ůtoková cytometrie

Tato technologie se stala mocným pomocníkem v mnoha disciplínách, jako jsou bun ěč ná biologie, genetika, imunologie, molekulární biologie a další. Využití nachází nap ř. p ři 12 stanovování obsahu jaderné DNA, ur čení ploidie, analýze bun ěč ného cyklu, stanovení reproduk čního zp ůsobu, po čítání a ur čení typu krevních bun ěk, t říd ění částic, detekci a charakterizaci mikroorganism ů, atd. (SUDA 2005). Pr ůtoková cytometrie spo čívá v měř ení optických vlastností, nap ř. fluorescence nebo rozptylu sv ětla, jednotlivých bun ěk nebo jiných částic, které jsou unášeny v proudu kapaliny skrz paprsek vysoce intenzivního zá ření. Lze tak analyzovat až 100.000 částic za sekundu. Bu ňky jsou dále t říd ěny pro další analýzy (až 70.000 částic za sekundu), nebo odnášeny do odpadní nádoby. Díky modernímu po číta čovému vybavení je dnes s pr ůtokovou cytometrií možné provád ět mnohaparametrové anylýzy v reálném čase, což je pomocí jiných analytických technik tém ěř nemožné (ROBINSON J. & GRÉGORI 2007).

2.2.1. Historie

Základní myšlenka pr ůtokové cytometrie vznikla n ěkdy na za čátku dvacátého století a byla založena na principu laminárního proud ění Osborna Reynoldse. V roce 1934 Andrew Moldavan sestrojil p řístroj, který byl schopen identifikovat jednotlivé bu ňky použitím mikroskopu s fotodetektorem. Specifická barviva schopná identifikovat rakovinné bu ňky předvedl ve čty řicátých letech George Papanicolaou a tak zapo čala éra analýz založených na zpracování obrazu. Výrobu analyzátor ů jednotlivých bun ěk zavedl Louis Kamentsky o dvacet let pozd ěji. Vznikl tak cytometr m ěř ící absorbci a rozptyl zá ření a krátce nato (v roce 1967) byla p řidána schopnost t řídit bu ňky. Ve stejném čase M. J. Fulwyer sestrojil první elektrostatický třídi č bun ěk k separaci červených krvinek. Tímto krokem za čly dějiny rozvoje bun ěč ného t říd ění, zpo čátku p ředevším liských bun ěk (ROBINSON J. & GRÉGORI 2007). Postupn ě p řibývaly metody založené na fluorescenci. P řístroj, který vyvinula ve Stanfordu skupina kolem Herzenberga – The Fluorescence Activated Cell Sorter, primárn ě ur čený k po čítání a izolování lymfocyt ů, se stal p ředch ůdcem cytometr ů dnes vyráb ěných americkou firmou Becton-Dickinson. Druhá velká firma, Partec z Německa, zase komercializovala Göhdeho pulzní cytofotometr z roku 1968 (SHAPIRO 1983). Aplikace do rostlinné biologie byla stížena p řítomností tuhých pletiv, které nebylo tak snadné p řevést na suspenzi, jako živo čišné bu ňky. Dalším problémem byla p řítomnost cytoplazmatického obsahu s fluorochromy a chloroplastovou DNA. Mezníkem se stal v roce 1983 Galbraith ův vynález jednoduché a rychlé metody pro mechanickou izolaci jader pomocí žiletky, ktera je využívána dodnes (SUDA 2004). 13 2.2.2. Stavba a princip pr ůtokového cytometru

Pr ůtokový cytometr je tvo řen t řemi hlavními systémy: fluidním, optickým a elektrickým. Základem fluidního systému je pr ůtoková kom ůrka (obr. 2), kterou velkou rychlostí a pod tlakem proudí unášecí kapalina. Do kom ůrky je jehlou p řinášena suspenze vzorku. Bu ňky se pak díky zrychlení řadí za sebou ve st ředu proudu a

Obr. 2 Stavba pr ůtokové kom ůrky podle www 2 jednotliv ě jsou neseny k laserovému paprsku (nebo jinému zdoji zá ření). Tento proces se nazývá hydrodynamická fokusace. Optický systém je tvo řen z excita ční časti (laser, soustava čoček a hranol ů usm ěrňujících sv ětelný paprsek) a části sb ěrné (zrcadla a filtry k detekci sv ětelných kvant specifické vlnové délky). Jsou-li částice obarveny fluorescen čním barvivem, p ři pr ůchodu sv ětelným paprskem dojde k jeho excitaci. P ři návratu na p ůvodní energetickou hladinu se vyzá ří nadbyte čná energie ve form ě fluorescence. Ta má delší vlnovou délku než p ůvodní excita ční zá ření, a proto je zachycena p řesn ě nastavenými filtry. Elektronický systém p řevádí pomocí fotonásobi čů fluorescenci částic na elektronický signál, který je zpracován po číta čem a na obrazovce se zobrazuje ve form ě histogram ů. U přístroj ů, které jsou vybaveny za řízením k tříd ění částic, elektrický systém částice nabíjí a vychyluje do sb ěrných nádob. (Podle www 2 a SUDA 2005).

2.2.3. Měř ení materiálu

K měř ení přivezeného materiálu byla využita Laborato ř pr ůtokové cytometrie na Ústavu botaniky a zoologie v Brn ě-Řečkovicích. Každý vzorek byl spolu se standardem měř en ve třech opakováních na dvojici cytometr ů, a to v pr ůběhu dvou až t ří dn ů. Používány byly všechny čty ři dostupné cytometry: Ploidy Analyser PA-I a CyFlow ML (pro barvivo DAPI a stanovení pom ěru AT/GC bazí), CyFlow SL a CyFlow ML (pro barvivo PI a zjišt ění velikosti genomu). U všech p řístroj ů krom ě PA-I je zdrojem zá ření laserový paprsek. U zbývajícího je jím UV lampa. Cytometry pochází od firmy Partec (Partec GmbH, Münster, Německo). Unášecí kapalinou ve všech p řístrojích je destilovaná voda. 14 Jako standardy pro m ěř ení byly použity mladé listy kultivaru raj čete Lycopersicon esculentum ‘Stupické polní ty čkové rané’ s obsahem DNA 2C = 1,96 pg (DOLEŽEL et al. 1992) a listy ost řice Carex acutiformis s obsahem DNA 2C = 0,92 pg (zjišt ěno m ěř ením proti raj četi). Carex byla použita v p řípad ě, že se m ěř ená rostlina svou velikostí genomu kryla s velikostí genomu raj čete, takže v histogramech nebylo možné rozlišit jednotlivé vrcholy. Oproti jiným standard ům se vyzna čuje velice úzkým histogramem a nízkými hodnotami CV. Pro m ěř ení rostlin s extrém ě velkým genomem byly použity za standard vhodné druhy z čeledi Apiaceae , které byly p ředtím zm ěř eny proti raj četi a vykazovaly p říznivé vlastnosti při zpracování (nízké koeficienty variance, omezení projev ů vadnutí). Všechny použité standardy byly poté p řepo čteny na raj če. K zjišt ění obsahu GC bazí pro standard bylo t řeba cytometricky zm ěř it raj če oproti rýži (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare, GC % = 43,6), jejíž GC obsah je znám na základ ě sekvenování genomu (INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT 2005). Hodnota pro raj če tedy byla stanovena GC % = 38,85. Z fluorochrom ů byla použita tato barviva: • propidium jodid (PI) – interkalární barvivo vazající se mezi páry bazí v molekule a tak umož ňující zjišt ění relativního obsahu DNA. Váže se však i na šroubovice RNA a proto se do barvící sm ěsi p řidávají i RNAázy, které RNA odstraní. • 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) – specificky se váže na AT bohaté oblasti na dvoušroubovici DNA a díky tomu je možné zastoupení bází vypo čítat. Pro navázání jsou pot řeba čty ři za sebou jdoucí AT báze (BAROW & MEISTER 2002).

Postup p řípravy vzork ů - dvoukroková metoda podle OTTO (1990) a DOLEŽEL & GÖHDE (1995): 1) Z měř ené rostliny a standardu bylo odebráno malé množství materiálu (asi 0,5 cm 2 z každého), a to z listové čepele, řapíku, listové pochvy nebo plodních stopek, vždy podle toho, zda daná rostlinná část vykazovala p říznivé vlastnosti p ři m ěř ení. 2) Rostlinný materiál byl jemn ě nasekán v Petriho misce ostrou žiletkou spolu s 1 ml vychlazeného pufru Otto I (0,1M monohydrát kyseliny citronové, 0,5% Tween 20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurát)) 3) Po p řidání dalšího 1 ml Otto I byla sm ěs p řefiltrována p řes 50 m nylonový filtr a rovnom ěrn ě rozd ělena do dvou kyvet. N ěkdy bylo nutné pro velké množství sekundárních metabolit ů, které interferovaly s barveným jaderným obsahem, vzniklou suspenzi centrifugovat a dále se pracovalo se získaným supernatantem. 15

4) Do obou kyvet byl p řidán 1 ml pufru Otto II (0,4M Na 2HPO 4.12H 2O) spolu s fluorescen čním barvivem: bu ď 4’,6-diamidino-2-fenylindol - DAPI (2 g/ml), nebo propidium jodid (50 g/ml) spolu s RNAázami. 5) Ob ě kyvety se p řed m ěř ením nechaly cca 5 minut inkubovat v temnu p ři laboratorní teplot ě. Poté byly zm ěř eny na dvojici cytometr ů. Po čet m ěř ených částic byl omezen na 5000 pro každý vzorek. Z různých d ůvod ů nebývá fluorescence m ěř ených částic vždy stejná (kv ůli sekundárním metabolit ům, poškození jader p ři sekání, nerovnom ěrnému barvení apod.). Rozptyl hodnot, který se projeví na obrazovce jako r ůzná ší řka histogram ů, popisuje koeficient variance (CV). Vypo čítá se jako podíl sm ěrodatné odchylky a pr ůměrné pozice vrcholu k řivky vynásobený stem. Podle interních konvencí pracovní skupiny Rostlinné biodiverzity a biosystematiky by se m ěly pohybovat koeficienty variance do 2,5 u barviva DAPI a do 3,5 u barviva PI.

2.3.5. Ur čení velikosti genomu, chromozom ů a AT/GC genomového pom ěru

Pom ěr standardu ku vzorku byl vypo čítán z pr ůměrů vrchol ů dvou k řivek (histogram ů) (obr. 3).

Obr. 3 Dvojice histogram ů p ři soub ěžném cytometrickém m ěř ení vzorku a standardu .

Pozice vrchol ů a koeficienty variance byly vygenerovány programem, který je sou částí cytometr ů Partec. Absolutní obsah DNA (2C) vzorku byl zjišt ěn porovnáním pr ůměrné pozice jeho vrcholu s pr ůměrnou pozicí vrcholu standardu se známým obsahem DNA v G1 fázi bun ěč ného cyklu (= p řed duplikací):

Obsah 2C DNA = (vzorek/standard) × obsah 2C DNA standardu.

16 Jelikož byl každý vzorek m ěř en ve t řech opakováních, výsledná hodnota C-value byla vypo čítána jako pr ůměr všech t ří m ěř ení. Byl-li jeden druh odebrán z více lokalit, pr ůměry pro každý z těchto vzork ů byly zpr ůměrovány. Sm ěrodatná odchylka uvád ěná ve výsledcích je vypo čítána ze všech jednotlivých m ěř ení . Chromozomové po čty pro české druhy byly p řevzaty z Kv ěteny České republiky (TOMŠOVIC 1997), ostatní podle databáze Index to Plant Chromosome Numbers (IPCN) (GOLDBLATT & JOHNSON 1979). Jejich pr ůměrná velikost byla vypo čtena takto: (1C (pg)/n)×978, kde platí: 1 pg = 978 Mbp (DOLEŽEL et al. 2003).

K výpo čtu zastoupení jednotlivých pár ů bazí byl použit excelový nástroj, který byl sestrojen Petrem Šmardou a poprvé použit v práci ŠMARDA et al. (2008). Vychází z práce BAROW & MEISTER (2002) a využívá tzv. Godelleho rovnici (GODELLE et al. 1993).

2.4. Sestavení fylogenetického stromu

Blízce p říbuzné taxony si často bývají velice podobné, a ť už ekologicky, morfologicky či ve znacích na molekulární úrovni. Aby bylo možné p ři analýzách a korelacích vylou čit pseudoreplikace zp ůsobené přítomností příbuzenských vztah ů, bylo nutné vztáhnout data k fylogenetickému stromu. Pro ú čely diplomové práce byl takový strom sestaven na základ ě více prací, aby obsáhl co nejvíce studovaných taxonů. Převážná část zkoumaných taxon ů z pod čeledi Apioideae byla do stromu dosazena podle práce ZHOU et al. (2009) (metoda v ětšinového pravidla pro 49.000 strom ů odvozených na základ ě Bayesiánské interferen ční analýzy kombinovaných cpDNA (introny rpl16 a rps16) a nrDNA ITS sekvencí reprezentujících 105 taxon ů pod čeledi Apioideae ). Pod čele ď Saniculoideae a outgroup Araliaceae byly p řidány podle práce DOWNIE et al. (2000a) (Neighbor-joining fylogenetický strom vytvo řený na základ ě 147 jednozna čně alignovaných cpDNA (intron rpl16) sekvencí). Rod Eryngium byl zpracován podle CALVIÑO et al. (2008) (metoda v ětšinového pravidla pro 200.000 strom ů odvozených na základ ě Bayesiánské analýzy 112 sekvencí trnQ–trnK a ITS). Rod Bupleurum je koncipován podle práce NEVES & WATSON 2004 (NJ, ML a MP analýza ITS sekvencí). Rod Angelica byl sestaven podle FENG et al. (2009) (strom sestavený metodou striktní shody, odvozený na základ ě MP analýzy nrDNA ITS). Tribus Selineae vychází z práce SPALIK et al. 2004 (Neighbour-joining fylogenetický strom získaný použitím nukleotidové substitutce modelu Tamura-Nei), tribus Scandiceae a rody Pastinaca , Heracleum , Aegopodium , Athamanta a Chaerophyllum byly p řičlen ěny podle DOWNIE et al. 2000b 17 (Neighbour-joining fylogenetický strom podle 133 jednozna čně alignovaných ITS1 a ITS2 sekvencí). Pozice rodu Silaum ve stromu je podle práce KURZYNA-MLYNIK et al. 2008 (metoda většinového pravidla, strom sestavený na základ ě Bayesiánské analýzy v ětšiny v ětších klad ů pod čeledi Apioideae použitím substitu čního modelu GTR + G + I), rod Meum p řiřazen k rodu Seseli na základ ě práce VALIEJO-ROMAN et al. 2006 (striktní shoda 209.000 maximáln ě parsimonních 2277-krokových strom ů odvozených parsimonní analýzy nrDNA ITS 1 a ITS 2 sekvencí pro 134 taxon ů metodou stejné váhy). Fylogenetická studie byla založena na 80 taxonech (bez Trinia glauca a Ferula campestris , které nemohly být p řiřazeny do stromu kv ůli nedohledatelné topologii). Jelikož n ěkterá data nebyla dostupná pro všechny taxony (EIH, váha semen apod.), byl pro danou analýzu vždy strom náležit ě upraven a o řezán. Jednotlivé uzly stromu byly pojmenovány bu ď podle v ětších skupin, které jimi byly vymezeny, nebo velkými písmeny abecedy.

2.5. Znaky použité pro analýzy

Pro zjišt ění ekologických nárok ů zkoumaných druh ů byly použity Ellenbergovy indika ční hodnoty (ELLENBERG et al. 1992), které odráží vztah st ředoevropských rostlin k parametr ům prost ředí. V úvahu byly brány tyto prom ěnné: závislost na sv ětle, teple, vlhku, kontinentalit ě, úživnosti p ůdy a p ůdní reakci. Pro n ěkteré druhy nejsou hodnoty známy, nebo jsou k danému parametru rostliny indiferentní; tyto druhy pak nebyly zahrnuty do analýz. Ekologické faktory však musí být zkoumány také v evolu čním kontextu, aby nedošlo k nadhodnocení jejich významu na formování velikosti genomu. Proto byly analyzovány v programu Phylocom. Také byl zkoumán vztah genomových parametr ů k hmotnosti semen a maximální výšce rostliny. Údaje o váze semen byly získány ze Seed Information Database (LIU et al. 2008). Jednalo se o hmotnost tisíce vážených semen pro každý druh. Z databáze byly vybrány pouze hodnoty, u kterých byla provedena alespo ň dv ě nezávislá m ěř ení, jenž byla zpr ůměrována (celkem pro 45 taxon ů). Dále nebyly zapo čteny taxony, u nichž nebylo jasné, o jakou ploidní úrove ň se jedná. Jako maximální pozorované výšky rostlin byly vzaty údaje uvád ěné v Kv ěten ě (TOMŠOVIC 1997). Data byla vzájemn ě testována s přihlédnutím k fylogenetickým vztah ům a k nam ěř eným hodnotám o jaderném genomu. 18 Nakonec byl hledán vztah mezi velikostí genomu a ohrožeností rostlin (PROCHÁZKA (ed.) 2001), invazivností (PYŠEK et al. 2002) a délkou životního cyklu (TOMŠOVIC 1997).

2.6. Statistické zpracování dat

Korelace jednotlivých znak ů sou časných druh ů jsou často d ůsledkem nezohledn ění jejich evolu ční historie. Na základ ě toho bývá se znaky zacházeno jako s na sob ě nezávislými, což nemusí odpovídat realit ě. Navíc významné divergence v dávné minulosti (nap ř. mezi jednoděložnými a dvoud ěložnými) mohou zp ůsobit korelaci znak ů u sou časných druh ů, přestože následující evolu ční rozr ůzn ění on ěch znak ů už neprobíhala ve stejném trendu (nap ř. MOLES et al. 2005). Proto je pot řeba p ři studiu znak ů vzít v potaz také fylogenetické vztahy. K tomu byl použit program Phylocom.

2.6.1. Phylocom

PHYLOCOM 4.1 (WEBB et al. 2008 ) je program k m ěř ení fylogenetických souvislostí mezi druhy, umož ňuje testovat hypotézy o struktu ře skupiny a kvantifikovat vzorce v evoluci znak ů. Pro ú čely této práce byl použit modul AOT (Analýza znak ů; ACKERLY 2006) a algoritmus aotf, který umož ňuje testování fylogenetického signálu, po čítá korelaci znak ů a kontribu ční indexy uzl ů na zadaném fylogenetickém stromu. Strom je vytvo řen ve formátu Newick. Pokud není známá délka v ětví, je programem arbitrárn ě nastavena na 1. Ko řen stromu se musí v ětvit dichotomicky, jinak jsou povoleny polytomie pro případ, že není možné p řesn ěji ur čit odšt ěpení ur čitého taxonu. Hodnoty pro všechny v ětve vycházející z takového uzlu jsou rozpo čítávány podle PAGEL (1992).

Fylogenetický signál je definován jako tendence blízce p říbuzných druh ů podobat se jeden druhému a sám o sob ě neindikuje žádný zvláštní proces, který by mohl být zodpov ědný za zp ůsob evoluce znaku (BLOMBERG & GARLAND 2002). Přítomnost fylogenetického signálu pro daný znak se zjiš ťuje tak, že se vypo čítá variabilita mezi hodnotami standardizovaných kontrast ů a ta je testována permuta čním testem (ve Phylocomu nastaveno arbitrárn ě na 999 permutací) oproti náhodn ě zamíchaným znak ům koncových taxon ů. Je-li signál statisticky významný, znamená to, že se znak vyvíjel zárove ň s jeho nositeli v pr ůběhu evoluce. Porovnáním signálu u více znak ů lze říct, který z nich je evolu čně stabiln ější (u zví řat nap ř. morfologické znaky oproti znak ům v chování; BLOMBERG et al. 2003). 19 Korelace znak ů jsou testovány použitím nezávislých fylogenetických kontrast ů (rozdíly hodnot znak ů mezi sesterskými taxony). Ty se po čítají od koncových v ětví sm ěrem ke ko řeni stromu. Vždy je ur čen jeden znak jako nezávislá prom ěnná a v ůč i n ěmu se poté vztahují pro každý uzel ostatní, závislé, znaky. Kontrasty lze poté porovnávat lineární regresí. Míru jejich vzájemné korelace je možné zjistit díky korela čnímu koeficientu, který program vygeneruje. Existuje–li zde korelace, znamená to, že se znaky m ěnily v pr ůběhu evoluce pospolu, ale není jasné, zda se oba znaky měnily stejným sm ěrem. K tomu je pot řeba korelovat p římo dané znaky. AOT m ůže po čítat fylogenetický signál s binárními, ordinálními i kontinuálními daty, výpo čet nezávislých kontrast ů však m ůže být provád ěn jen mezi dvojicemi kontinuálních dat nebo mezi binárními a kontinuálními. Proto je nap ř. s Ellenbergovými indika čními hodnotami zacházeno jako s kontinuálními daty. Dalším úskalím je korelace délek v ětví s kontrasty. P řestože je délka nastavena arbitrárn ě na rovnu jedné, použitý Felsenstein ův algoritmus (FELSENSTEIN 1985) p ři výpo čtu kontrast ů protahuje délku v ětví blíže ke ko řeni, aby tak reflektoval v ětší pravd ěpodobnost zm ěny na vnit řnějších (tedy evolu čně starších) uzlech. Tak m ůže dojít ke zmín ěné korelaci. Výsledek by tímto vyjad řoval pouze to, že znak m ěl více času na diverzifikaci a daná podoba znaku je d ůsledkem náhodného vývoje (GARLAND et al. 1992). Vhodná transformace dat však tento problém vy řeší. Výstupní hodnoty kontrast ů i kontribu čních index ů pak budou standardizované, takže je lze testovat jako normálně rozložená data. Kontribu ční index popisuje p řínos divergence na daném uzlu pro celkovou variabilitu druh ů v analýze (MOLES et al. 2005). Takto lze srovnávat p řísp ěvky jednotlivých uzl ů.

Výstupy z Analýzy znak ů provedené v rámci diplomové práce a vstupní hodnoty jsou k dispozici na p řiloženém CD-ROMu.

2.5.1. Další použité programy

Program STATISTICA 8 (StatSoft Inc.) byl použit k těmto test ům: k otestování korelací byl použit neparametrický test se Spearmanovým koeficientem, k otestování rozdílu mezi dv ěmi skupinami byl použit Mann-Whitney U test. Většina graf ů byla vytvo řena v tomto programu. K testování signifikance korelace fylogenetických kontrast ů byl použit jednoduchý kalkulátor ze stránek www 3, který pracuje se vztahem

t = R ⋅ (n − /()2 1− R 2 ) , df = n − 2 , kde R je korela ční koeficient, df jsou stupn ě volnosti a n je po čet druh ů. 20 Tabulky a n ěkteré grafy byly vytvo řeny v aplikaci Microsoft Excel, kde byly rovn ěž testovány lineární regrese. Stromové grafy byly vytvo řeny v programu TreeGraph 2 (STÖVER & MÜLLER 2010). Pomocí tohoto programu byl také pro řezáván základní fylogenetický strom v Newick formátu pro analýzy v Phylocomu, kde bylo nutné snížit po čet druh ů. 21

4. Výsledky

V rámci diplomové práce bylo zm ěř eno 81 taxon ů v četn ě dvou zástupc ů čeledi Araliaceae . 21 z nich zkoumali v minlosti již také jiní auto ři, 60 taxon ů bylo v rámci práce m ěř eno poprvé. V tabulkách 1 a 2 jsou uvedeny výsledné hodnoty pro absolutní obsah DNA (2C- value), po čet chromozom ů, ploidní úrove ň, monoploidní obsah DNA (1Cx-value), pr ůměrnou velikost chromozom ů a obsah GC bazí. Celkov ě se nam ěř ené hodnoty pro monoploidní DNA (1Cx) v čeledi Apiaceae liší tém ěř 13 krát, p řičemž nejmenší genom byl nam ěř en u Bupleurum falcatum (1Cx = 0,38 pg) a nejv ětší u Levisticum officinale (1Cx = 4,67 pg). Ve srovnání s ostatními krytosemennými rostlinami lze tvrdit, že je velikost genomu v čeledi Apiaceae spíše nižší (obr. 4). Výsledek neparametrického srovnání nezávislých skupin potvrzuje tento rozdíl s vysokou mírou signifikance (Mann-Whitney,

Z = −4,96397, n1 = 6199, n2 = 78, p < 0,00001; (n1: hodnoty „all estimates“ pro krytosemenné rostliny bez čeledi Apiaceae z Plant DNA C-values Database (BENNETT & LEITCH 2005), n2: hodnoty taxon ů Apiaceae měř ené v rámci diplomové práce). Rozdílnost je pravd ěpodobn ě zp ůsobena výrazn ě nízkým zastoupením recentní polyploidie v čeledi Apiaceae .

Velikost genomu v čeledi Apiaceae ve srovnání s ostatními krytosemennými rostlinami 140

120

100

80

60 1C value (pg) 40

20

Medián 0 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé -20 Extrémy Apiaceae Krytosemenné bez Apiaceae Obr. 4 Srovnání velikosti genomu v čeledi Apiaceae (vlastní m ěř ení) a ve zbytku krytosemenných rostlin (data z Plant DNA C-values Database).

22 Rozdíl v obsahu GC bazí nebyl tak vysoký: Berula erecta s 36,5 % a Myrrhis odorata s 40,75 % jsou dva opa čné extrémy v čeledi Apiaceae . Měř ené druhy rodu Hedera mají obsah

GC bazí významn ě nižší (Mann-Whitney, Z = −2,4, n1 = 2, n2 = 78, p < 0,02). Pro srovnání variability v obsahu DNA a GC bazí uvnit ř rod ů byly vybrány rody, u kterých byly zm ěř eny alespo ň 4 druhy: Angelica , Bupleurum , Chaerophyllum , Eryngium , Seseli a Peucedanum . Nejmenší variabilita v obsahu DNA (2C) byla zjišt ěna v rod ě Seseli – rozdíl 1,3násobný. Naopak nejvyšší variabilitu má rod Bupleurum , kde se až 6,5krát odlišuje B. fruticosum svou 2C hodnotou 4,9 pg. Vysokou variabilitu lze nalézt také v rod ě Chaerophyllum (tém ěř 5násobnou), kde lze odlišit dv ě skupiny: Ch. aureum, Ch. aromaticum a Ch. bulbosum , které jsou vývojov ě mladší a tvo ří z genomického hlediska homogenní v ětev (nejen v obsahu DNA, ale i GC bazí). Druhou skupinou jsou Ch.temulum a Ch. hirsutum, které krom ě vysokého obsahu DNA (více než 4 pg) mají i vyšší obsah GC bazí. Rod Eryngium se liší v 2C hodnot ě tém ěř 4krát, kde je, podobn ě jako u Bupleurum, významn ě odlišný jeden druh, a to E. giganteum . Jak už název napovídá, má tento taxon mnohem vyšší obsah DNA. Nep říliš odlišná situace je u rodu Peucedanum , který je však oproti p ředchozím prokazateln ě parafyletický. Druh P. palustre , který pat ří mezi nejmladší z rodu, má hodnotu 2C v ůč i ostatním 2násobnou, což by mohlo sv ědčit o polyploidizaci, ale po čet chromozom ů by tomu neodpovídal. P. alsaticum , které má taky vysoký obsah DNA, má zárove ň nejvyšší obsah GC bazí, který by mohl mluvit ve prosp ěch amplifikace GC bohatých retrotransposon ů. Rod Angelica pat ří svou velikostí genomu v rámci čeledi spíše mezi v ětší a mezi m ěř enými druhy je rozdíl v obsahu DNA tém ěř 1,5násobný. Rozdíl v zastoupení GC bazí byl nejvyšší v rod ě Eryngium , a to 2 %.

Kvalita m ěř ení byla do jisté míry ovlivn ěna vysokým obsahem sekundárních metabolit ů u některých druh ů ( Myrrhis odorata , Carum carvi , Angelica sylvestris ), který se projevil zvlášt ě p ři m ěř ení na propidium jodidu vysokým koeficientem variance. Z 82 m ěř ení s použitím barviva DAPI přesáhlo svými pr ůměrnými CV pro standard a vzorek 39 rostlin hodnotu 2,5 (pr ůměr CV = 2,52, s.d. = ± 0,53), pro PI mělo hodnotu CV nad 3,5 celkem 26 rostlin (pr ůměr CV = 3,22, s.d. = ± 0,7). Z uvedeného je z řejmé, že Apiaceae jist ě není čele ď snadno m ěř itelná na cytometru.

23 Tab. 1 Tabulka s genomickými parametry pro m ěř ené druhy 2C 1Cx 1C/n GC Taxon (pg) s.d. (pg) s.d. 2n x (Mbp) s.d. % Aegopodium podagraria L. 6,74 ± 0,13 3,37 ± 0,07 42 2 156,89 ± 3,04 38,15 Aethusa cynapium L. 2,94 ± 0,04 1,47 ± 0,02 20 2 143,77 ± 2,15 37,89 Ammi majus L. 2,14 ± 0,03 1,07 ± 0,01 22 2 94,96 ± 1,20 38,91 Anethum graveolens L. 2,88 ± 0,09 1,44 ± 0,05 22 2 127,94 ± 4,03 38,99 Angelica archangelica L. 6,17 ± 0,11 3,08 ± 0,05 22 2 274,21 ± 4,73 38,89 Angelica cf. amurensis Schischk. 7,49 ± 0,04 3,74 ± 0,02 44 2 166,40 ± 0,93 39,17 Angelica gigas Nakai 5,42 ± 0,06 2,71 ± 0,03 22 2 240,98 ± 2,78 38,44 Angelica sylvestris L. 5,05 ± 0,05 2,52 ± 0,02 22 2 224,35 ± 2,07 39,00 Anthriscus cerefolium ssp. cerefolium 2,23 ± 0,02 1,12 ± 0,01 18 2 121,26 ± 0,97 40,41 Anthriscus cerefolium ssp. trichosperma 2,17 ± 0,04 1,08 ± 0,02 18 2 117,71 ± 2,04 40,11 Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. 3,89 ± 0,07 1,95 ± 0,04 16 2 237,96 ± 4,45 38,92 Apium graveolens L. 7,08 ± 0,12 3,54 ± 0,06 22 2 314,53 ± 5,18 38,43 Astrantia major L. 1,76 ± 0,03 0,88 ± 0,01 28 2 61,63 ± 0,91 39,48 Athamanta turbith Druce 7,31 ± 0,08 3,66 ± 0,04 22 2 325,10 ± 3,36 38,75 Berula erecta (Huds.) Coville 1,05 ± 0,03 0,53 ± 0,01 18 2 57,25 ± 1,41 36,50 Bupleurum falcatum L. 0,75 ± 0,01 0,38 ± 0,01 16 2 45,93 ± 0,63 37,68 Bupleurum fruticosum L. 4,90 ± 0,05 2,45 ± 0,03 14 2 342,61 ± 3,55 37,04 Bupleurum rotundifolium L. 1,12 ± 0,03 0,56 ± 0,01 16 2 68,47 ± 1,72 37,93 Bupleurum tenuissimum L. 0,80 ± 0,01 0,40 ± 0,00 16 2 49,03 ± 0,56 37,67 Carum carvi L. 4,16 ± 0,08 2,08 ± 0,04 20 2 203,25 ± 3,86 38,59 Caucalis platycarpos L. 1,47 ± 0,02 0,74 ± 0,01 20 2 72,09 ± 1,13 38,04 Chaerophyllum aromaticum L . 1,61 ± 0,09 0,81 ± 0,04 22 2 71,75 ± 3,89 38,36 Chaerophyllum aureum L. 1,64 ± 0,02 0,82 ± 0,01 22 2 72,79 ± 0,85 38,46 Chaerophyllum bulbosum L. 1,57 ± 0,02 0,79 ± 0,01 22 2 69,91 ± 0,86 38,43 Chaerophyllum hirsutum L. 7,43 ± 0,08 3,71 ± 0,04 22 2 330,20 ± 3,61 39,44 Chaerophyllum temulum L. 4,95 ± 0,06 2,48 ± 0,03 14 2 345,82 ± 4,37 39,00 Cicuta virosa L. 2,20 ± 0,04 1,10 ± 0,02 22 2 97,59 ± 1,62 37,76 Cnidium dubium (Schkuhr) Thell. 3,50 ± 0,07 1,75 ± 0,03 22 2 155,50 ± 3,01 37,51 Cnidium silaifolium (Jacq.) Simk. 5,76 ± 0,07 2,88 ± 0,04 22 2 255,90 ± 3,13 38,93 Conium maculatum L. 2,89 ± 0,01 1,45 ± 0,01 22 2 128,63 ± 0,52 37,66 Coriandrum sativum L. 4,66 ± 0,05 2,33 ± 0,02 22 2 207,07 ± 2,08 38,10 Daucus carota L. 1,06 ± 0,03 0,53 ± 0,01 18 2 57,64 ± 1,45 38,21 Eryngium amethystinum L. 2,10 ± 0,03 1,05 ± 0,02 14 2 146,51 ± 2,13 39,52 Eryngium bourgatii Gouan 2,21 ± 0,03 1,11 ± 0,01 16 2 135,33 ± 1,61 38,56 Eryngium campestre L. 3,62 ± 0,11 1,81 ± 0,05 28 2 126,40 ± 3,80 37,26 Eryngium giganteum M.Bieb. 7,72 ± 0,06 3,86 ± 0,03 16 2 471,75 ± 3,81 38,27 Eryngium maritimum L. 2,52 ± 0,03 1,26 ± 0,01 16 2 153,97 ± 1,53 37,92 Eryngium planum L. 2,01 ± 0,04 1,01 ± 0,02 16 2 123,00 ± 2,24 38,96 Absolutní (2C) a monoploidní (Cx) obsah DNA, po čet chromozom ů v somatických bu ňkách (2n), ploidní úrove ň (x), pr ůměrná velikost chromozom ů (1C/n) a zastoupení GC bazí u studovaných taxon ů. S.d. zna čí sm ěrodatnou odchylku. 24 Tab. 2 Tabulka s genomickými parametry pro m ěř ené druhy 2C 1Cx 1C/n GC Taxon (pg) s.d. (pg) s.d. 2n (x) (Mbp) s.d. % Falcaria vulgaris Bernh. 2,75 ± 0,05 1,37 ± 0,02 22 2 122,22 ± 2,17 37,56 Ferula campestris Besser 8,30 ± 0,15 4,15 ± 0,07 22 2 368,92 ± 6,53 37,61 Foeniculum vulgare Mill. 3,41 ± 0,03 1,70 ± 0,01 22 2 151,58 ± 1,12 37,72 Hacquetia epipactis (Scop.) DC. 3,24 ± 0,04 1,62 ± 0,02 16 2 198,34 ± 2,25 39,97 Hedera colchica (K. Koch) K. Koch 10,49 ± 0,07 1,31 ± 0,01 192 8 53,45 ± 0,37 35,40 Hedera helix L. 2,98 ± 0,06 1,49 ± 0,03 48 2 60,82 ± 1,14 36,02 Heracleum mantegazzianum Somm. et 3,70 ± 0,02 1,85 ± 0,01 22 2 164,38 ± 0,83 38,94 Lev. Heracleum sphondylium L. 4,28 ± 0,07 2,14 ± 0,04 22 2 190,29 ± 3,18 39,09 Imperatoria ostruthium L. 4,06 ± 0,05 2,03 ± 0,02 22 2 180,64 ± 2,13 39,39 Laser trilobum (L.) Borkh . 5,79 ± 0,09 2,89 ± 0,05 22 2 257,33 ± 4,03 37,91 Laserpitium latifolium L. 3,99 ± 0,03 2,00 ± 0,02 22 2 177,54 ± 1,43 38,84 Laserpitium prutenicum L. 5,90 ± 0,08 2,95 ± 0,04 22 2 262,23 ± 3,57 37,80 Levisticum officinale W. D. J. Koch 9,33 ± 0,06 4,67 ± 0,03 22 2 414,96 ± 2,46 37,07 Libanotis pyrenaica (L.) Bourg. 2,78 ± 0,04 1,39 ± 0,02 22 2 123,77 ± 1,94 38,32 Libanotis pyrenaica (L.) Bourg . 4,95 ± 0,07 1,24 ± 0,02 44 4 110,11 ± 1,53 38,34 Ligusticum mutellina (L.) Crantz 1,62 ± 0,01 0,81 ± 0,01 22 2 72,02 ± 0,52 37,99 Meum athamanticum Jacq. 1,66 ± 0,02 0,83 ± 0,01 22 2 73,91 ± 0,94 38,38 Myrrhis odorata (L.) Scop. 1,93 ± 0,04 0,96 ± 0,02 22 2 85,64 ± 1,80 40,75 Oenanthe aquatica (L.) Poir. 1,99 ± 0,03 0,99 ± 0,02 22 2 88,34 ± 1,44 39,16 Oenanthe javanica s. l. 1,17 ± 0,02 0,58 ± 0,01 22 2 51,93 ± 1,04 37,75 Oenanthe cf. fistulosa 2,27 ± 0,04 1,14 ± 0,02 42 2 52,93 ± 0,87 37,04 Orlaya grandiflora (L.) Hoffm. 1,57 ± 0,02 0,78 ± 0,01 20 2 76,61 ± 0,96 39,65 Pastinaca sativa L. 3,44 ± 0,02 1,72 ± 0,01 22 2 153,11 ± 0,80 39,02 Petroselinum crispum (Mill.) A. W. Hill 4,35 ± 0,06 2,18 ± 0,03 22 2 193,56 ± 2,66 39,29 Peucedanum alsaticum L. 6,73 ± 0,07 3,37 ± 0,04 22 2 299,30 ± 3,19 39,76 Peucedanum carvifolia Vill. 5,46 ± 0,06 2,73 ± 0,03 22 2 242,66 ± 2,47 38,42 Peucedanum cervaria (L.) Lapeyr. 5,72 ± 0,04 2,86 ± 0,02 22 2 254,10 ± 1,63 38,62 Peucedanum oreoselinum (L.) Moench 4,21 ± 0,02 2,11 ± 0,01 22 2 187,25 ± 0,92 38,35 Peucedanum palustre (L.) Moench 9,20 ± 0,10 4,60 ± 0,05 22 2 408,83 ± 4,31 38,39 Pimpinella anisum L. 4,75 ± 0,10 2,37 ± 0,05 20 2 232,22 ± 4,81 38,40 Pimpinella major (L.) Huds. 5,44 ± 0,08 2,72 ± 0,04 20 2 266,18 ± 3,88 39,46 Pimpinella saxifraga L. 8,18 ± 0,07 2,05 ± 0,02 40 4 200,02 ± 1,72 39,05 Pleurospermum austriacum (L.) Hoffm. 7,78 ± 0,12 3,89 ± 0,06 22 2 345,85 ± 5,43 40,23 Sanicula europaea L. 2,49 ± 0,01 1,25 ± 0,01 16 2 152,26 ± 0,75 39,18 Selinum carvifolia (L.) L. 6,54 ± 0,14 3,27 ± 0,07 22 2 290,57 ± 6,41 38,17 Seseli annuum L. 3,39 ± 0,02 1,69 ± 0,01 16 2 206,93 ± 1,03 38,89 Seseli hippomarathrum Jacq. 2,99 ± 0,03 1,49 ± 0,02 20 2 146,08 ± 1,70 38,21 Seseli montanum L. 2,60 ± 0,03 1,30 ± 0,02 22 2 115,61 ± 1,51 37,21 Seseli osseum Crantz 3,21 ± 0,09 1,60 ± 0,04 18 2 174,15 ± 4,65 38,18 Silaum silaus (L.) Schinz et Thell. 6,88 ± 0,10 3,44 ± 0,05 22 2 306,06 ± 4,39 38,08 Sium latifolium L. 5,29 ± 0,06 2,64 ± 0,03 20 2 258,67 ± 3,06 39,41 Torilis arvensis (Hudson) Link 2,76 ± 0,02 1,38 ± 0,01 12 2 225,15 ± 1,31 38,03 Torilis japonica (Houtt.) DC. 1,26 ± 0,03 0,63 ± 0,01 16 2 77,25 ± 1,82 36,87 Trinia glauca (L.) Dumort. 3,15 ± 0,06 1,57 ± 0,03 18 2 171,06 ± 3,12 37,70 Absolutní (2C) a monoploidní (Cx) obsah DNA, po čet chromozom ů v somatických bu ňkách (2n), ploidní úrove ň (x), pr ůměrná velikost chromozom ů (1C/n) a zastoupení GC bazí u studovaných taxon ů. S.d. zna čí sm ěrodatnou odchylku.

25 4.1. Velikost genomu a chromozom ů ve vztahu k obsahu GC bazí

V rámci celého souboru taxon ů pro čele ď Apiaceae a Araliaceae (82 hodnot) byla nalezena signifikantní korelace mezi pr ůměrnou velikostí chromozomu a obsahem GC bazí (Spearman R = 0,239, p < 0,05). V grafu (obr. 5) je zobrazena závislost těchto dvou hodnot.

Vztah velikosti chromozom ů k obsahu GC bazí

42

41

40

39

GC% 38

37

36

35 0 100 200 300 400 500 Pr ůměrná velikost chromozom ů (Mbp)

Obr. 5 Vztah velikosti chromozom ů k zastoupení GC bazí

Nebyla však nalezena signifikantní korelace mezi velikostí genomu (monoploidního ani holoploidního) a obsahem GC bazí. V samotné čeledi Apiaceae již nebyla potvrzena žádná korelace. V pod čeledi Apioideae (71 taxon ů) byla zjišt ěna signifikantní korelace pro Cx-value a obsah GC bazí (Spearman R = 0,24, p < 0,05). Od druhé pod čeledi Saniculoideae se statisticky neliší v žádném genomickém parametru. Také v tribu Selineae (21 druh ů), ve fylogenetickém stromu (obr. xy) ozna čeném hv ězdi čkou, Cx-value pozitivn ě korelovala s obsahem GC bazí (Spearman R = 0,56, p < 0,01). Tato skupina má také statisticky větší genomy oproti zbytku čeledi: pro 1Cx: Mann-Whitney Z = −2,37, p = 0,017; pr ůměr = 2,32 pg, s.d. = ± 0,97. Zbytek čeledi má pr ůměr 1Cx roven 1,76, s.d. = ± 1,06. Pro žádnou jinou skupinu p říbuzných taxon ů už korelace nalezena nebyla. 26 4.2. Evoluce genomických parametr ů v rámci čeledi

Studované druhy z čeledi Apiaceae a Araliaceae byly uspo řádány do fylogenetického stromu (obr. 6), jehož topologie vychází z více fylogenetických studiích (viz Metodika). Rostliny jsou na n ěm barevn ě rozd ěleny do skupin podle velikosti genomu (Cx), obsahu GC bazí a pr ůměrné velikosti chromozom ů. Analýzou znak ů (AOT) byly hledány korelace mezi obsahem GC bazí a monoploidním či holoploidním obsahem DNA a pr ůměrnou velikostí chromozom ů (tab. 3). Byl zjišt ěn fylogenetický signál jednotlivých parametr ů a vypo čítány kontribu ční indexy. Po korekci přes fylogenezi nebyl již zjišt ěn vztah mezi obsahem GC bazí a jiným genomickým parametrem. Protože má GC obsah vysoký fylogenetický signál (stejn ě jako velikost genomu), lze usuzovat, že se tento parametr m ění v závislosti na evoluci čeledi, avšak s jinou frekvencí, než je tomu u Cx-value. Z kontribu čních index ů je patrné, že nejv ětší p řínos k celkové variabilit ě sou časných druh ů v obsahu DNA má uzel ozna čený AL, což je bod, kdy se od zbytku pod čeledi Apioideae odd ělila skupina Pleurospermae reprezentovaná druhem Pleurospermum austriacum . Tento druh má ve srovnání s variabilitou v sesterském kladu skute čně veliký genom. Pro variabilitu v obsahu GC bazí je nejvýznamn ějším uzlem divergence mezi čeledí Araliaceae a Apiaceae , díky již zmín ěnému nízkému zastoupení GC bazí v genomech obou druh ů rodu Hedera . Velikost chromozom ů nevykazuje žádný fylogenetický signál, který by napovídal, že se daný znak vyvíjí spolu s taxony.

27

Tab. 3 Fylogeneticky korigované korelace genomických parametr ů. Korelace nezávislých kontrast ů Nezávislý Závislý Korela ční Testová genomický parametr genomický parametr koeficient R statistika t df P GC 1Cx 0,16 1,44 78 0,15 GC Chromozom 0,17 1,48 78 0,14 GC 2C 0,07 0,66 78 0,51 Nejvyšší kontribu ční indexy pro GC Název uzlu Apiales AL Apioideae Hodnota 0,79 0,32 0,10 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,001 Nejvyšší kontribu ční indexy pro Cx Název uzlu AL AJ Apiaceae Hodnota 0,88 0,32 0,20 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,012 Nejvyšší kontribu ční indexy pro velikost chromozom ů Název uzlu AL Apiales Apiaceae Hodnota 0,57 0,32 0,17 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,074 Nejvyšší kontribu ční indexy pro 2C Název uzlu AL Apiales AJ Hodnota 0,60 0,39 0,26 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,04 Výstup Analýzy znak ů pro 80 taxon ů a čty ři genomové parametry (zastoupení GC bazí, monoploidní velikost genomu, pr ůměrná velikost chromozom ů a celkový obsah DNA v jád ře). U korelace kontrast ů je uveden korela ční koeficient vypo čítaný programem Phylocom, hodnota t-testu, stupn ě volnosti a hladina významnosti. Pro každý znak jsou uvedeny tři nejvyšší kontribu ční indexy uzl ů se řazené dle významnosti. Signifikantní fylogenetický signál je vyzna čen tu čně. 28

Obr. 6 Fylogenetický strom s intervalovým vyzna čením obsahu GC bazí, velikosti genomu a pr ůměrné velikosti chromozom ů.

29 4.3. Vztah genomických parametr ů k ekologickým prom ěnným

Ellenbergovy indika ční hodnoty (EIH) pat ří pravd ěpodobn ě mezi nejpoužívan ější číselné hodnoty informující o vztahu rostlin k základním charakteristikám prost ředí. Jaké mají ony hodnoty vztah ke genomickým parametr ům bylo testováno p řes fylogenetickou korekci. Jednalo se o tyto Ellenbergovy indika ční hodnoty: sv ětlo, teplo, p ůdní reakce, kontinentalita, vlhkost a úživnost p ůdy. Významné se však ukázaly jen poslední t ři jmenované. Charakteristiky světlo, teplo a půdní reakce v tabulkách uvedeny nejsou, protože v Analýze znak ů p řes Phylocom pro n ě nebyl zjišt ěn žádný fylogenetický signál ani korelace. Studované druhy se z řejm ě nemusely daným faktor ům nijak dramaticky p řizp ůsobovat, aby se to projevilo zm ěnami ve velikosti genomu či kompozici bazí. Náro čnost rostlin na živiny a její porovnání s genomovými parametry je uvedeno v tabulce 4. Tato charakteristika vykazuje silný signál, takže obsah živin v prost ředí nejspíše v pr ůběhu evoluce znateln ě ovliv ňoval vývoj této čeledi. Není však korelována se žádným genomickým parametrem. K nejv ětšímu rozr ůzn ění na základ ě této indika ční hodnoty došlo v subtribu Scandicineae , kde se výrazn ě odlišuje na živiny nenáro čná Athamanta turbith .

Tab. 4 Fylogeneticky korigované korelace genomických parametr ů s nároky druh ů na živiny. Korelace nezávislých kontrast ů Genomický Korela ční Testová EIH parametr koeficient R statistika t df P Úživnost 1Cx −0,11 −0,78 48 0,44 Úživnost chromoz −0,15 −1,07 48 0,29 Úživnost GC 0,14 1 48 0,32 Úživnost 2C −0,23 −1,65 48 0,11 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,007 Nejvyšší kontribu ční indexy Název uzlu Scandicinae AJ AG Hodnota 0,23 0,17 0,17 Výstup Analýzy znak ů pro 50 taxon ů, čty ři genomové parametry (monoploidní velikost genomu, pr ůměrná velikost chromozom ů, zastoupení GC bazí a celkový obsah DNA v jád ře) a Ellenbergovu indika ční hodnotu pro dostupnost živin v prost ředí. U korelace kontrast ů je uveden korela ční koeficient vypo čítaný programem Phylocom, hodnota t-testu, stupn ě volnosti a hladina významnosti. Pro EIH jsou uvedeny t ři nejvyšší kontribu ční indexy uzl ů se řazené dle významnosti. Fylogenetický signál je signifikantní.

EIH pro kontinentalitu (tab. 5) koreluje s celkovým obsahem DNA v jád ře. To by mohlo nasv ědčovat tomu, že rostliny s vyšším obsahem DNA jsou lépe p řizp ůsobené vnitrozemskému podnebí. Vzhledem k tomu, že ale nevykazuje žádný fylogenetický signál, nesouvisí tato hodnota s vývojovými tendencemi čeledi Apiaceae . Nejv ětší p řínos do celkové variability v tomto znaku uvnit ř studovaného souboru taxon ů má oceanický druh Hedera helix (uzel „Apiales“), dále op ět dichotomie „Pleurospermum austriacum vs. zbytek pod čeledi Apioideae“. 30 Neparametrickou korelací tento vztah vychází nesignifikantn ě (Spearman R = 187, p = 0,186; obr. 7).

Tab. 5 Fylogeneticky korigované korelace genomických parametr ů s mírou kontinentality druh ů. Korelace nezávislých kontrast ů Genomický Korela ční Testová EIH parametr koeficient R statistika t df P Kontinentalita 1Cx 0,23 1,66 50 0,1 Kontinentalita chromoz 0,25 1,79 50 0,08 Kontinentalita GC −0,04 −0,28 50 0,78 Kontinentalita 2C 0,32 2,4 50 0,02 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,824 Nejvyšší kontribu ční indexy Název uzlu Apiales AL AG Hodnota 0,50 0,11 0,10 Výstup Analýzy znak ů pro 52 taxon ů, čty ři genomové parametry (monoploidní velikost genomu, pr ůměrná velikost chromozom ů, zastoupení GC bazí a celkový obsah DNA v jád ře) a Ellenbergovu indika ční hodnotu pro kontinentalitu. U korelace kontrast ů je uveden korela ční koeficient vypo čítaný programem Phylocom, hodnota t-testu, stupn ě volnosti a hladina významnosti. Pro EIH jsou uvedeny t ři nejvyšší kontribu ční indexy uzl ů se řazené dle významnosti. Fylogenetický signál není signifikantní.

Vztah obsahu DNA a kontinentality 10

9

8

7

6

5 2C (pg) 2C 4

3

2

1

0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 EIH kontinentalita Obr. 7 Vztah Ellenbergových indika čních hodnot pro kontinentalitu a velikosti genomu.

Ellenbergovy indika ční hodnoty pro vlhkost (tab. 6) mají v evoluci čeledi Apiaceae vysoký fylogenetický signál, dokonce vyšší, než genomické parametry. Sou časná variabilita mezi druhy ve vztahu k vlhkosti tedy nebude náhodou, nýbrž výsledkem dlouhodobého p ůsobení prost ředí na taxony. V tomto p řípad ě také korelují fylogenetické kontrasty EIH s kontrasty pro velikost genomu a velikost chromozom ů. Spolu se zvyšující se vlhkostí v prost ředí z řejm ě roste i velikost 31 genomu (obr. 8), a čkoli tato korelace nebyla potvrzena Spearmanovým testem ( R = 0,148, p = 0,29). Se zjevnou ur čitostí se oba znaky m ění v pr ůběhu evoluce sou časn ě. Stejn ě tak je zm ěna sm ěrem k hygrofilii, nebo naopak xerofilii, vždy v evoluci doprovázena rovn ěž zm ěnou ve velikosti chromozom ů. Nejvyšší kontribu ční index pro vlhkost se nachází na uzlu, kde se oddělují vlhkomilné až vodní Oenantheae . Druhý v po řadí následuje uzel, kde se v tribu Selineae odšt ěpuje klad Angelica , což jsou také spíše vlhkomilné rostliny. Tab. 6 Fylogeneticky korigované korelace genomických parametr ů s vlhkostními nároky druh ů Korelace nezávislých kontrast ů Genomický Korela ční Testová EIH parametr koeficient R statistika t df P Vlhkost 1Cx 0,332 2,49 50 0,02 Vlhkost chromoz 0,299 2,22 50 0,03 Vlhkost GC −0,013 −0,09 50 0,93 Vlhkost 2C 0,238 1,73 50 0,09 Fylogenetický signál (hladina významnosti P) 0,001 Nejvyšší kontribu ční indexy Název uzlu AK AD AH Hodnota 0,94 0,23 0,14

Vztah velikosti genomu a vlhkosti 5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5 1Cx(pg) 2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 EIH vlhkost Obr. 8 Vztah Ellenbergových indika čních hodnot pro vlhkost a velikosti genomu.

4.4. Vztah genomických parametr ů k vybraným fenotypovým a dalším znak ům

Přes fylogenetické kontrasty byly testovány tyto parametry: hmotnost semen (pro 47 druh ů) a maximální výška rostlin (67 druh ů). U dalších znak ů bylo neparametricky testováno, 32 zda se jejich nositelé významn ě odlišují v genomických parametrech od ostatních druh ů: ekologická zranitelnost rostliny pro 69 taxon ů, vyjád řená jako ohroženost vymizením v rámci České republiky, adaptabilita pro 71 taxon ů, vyjád řená jako schopnost rostliny ší řit se v novém prost ředí, přecházející až v invazivnost. Taxony, které spadaly do obou uvedených kategorií, byly po čítány pouze jako ohrožené. Nakonec byla testována životní strategie pro 80 taxon ů (rostliny jednoleté vs. víceleté).

Hmotnost semen nevykazuje žádný fylogenetický signál, proto pravd ěpodobn ě neexistuje postupná zm ěna hodnot tohoto znaku od ancestrálního p ředka do sou časného stavu a vyvíjela se nezávisle na evoluci čeledi Apiaceae . Ani s genomickými parametry významn ě nekoreluje. Nejv ětším p řísp ěvkem do sou časné variability bylo krom ě odd ělení se b řečť anu ( Hedera helix) hlavn ě vy člen ění se druhu Myrrhis odorata s obrovskými merikarpii od rodu Anthriscus .

U maximální výšky rostlin je podle nevýrazného fylogenetického signálu možné soudit, že evolu ční linie rostlin vedla jinudy než vývoj rostlinné výšky. Jinak není zcela vylou čené, že uvedený parametr n ějakým zp ůsobem souvisí s obsahem DNA (2C) v jád ře, protože korelace kontrast ů t ěchto dvou znak ů se nepatrn ě blíží signifikantní hladin ě významnosti ( p = 0,067). Při spole čném testování váhy semen a maximální výšky nebyla shledána korelace fylogenetických kontrast ů t ěchto znak ů.

Ke zjišt ění, zda se odlišují rostliny z čeledi Apiaceae , které jsou uvedené na Červeném seznamu, v C-value, velikosti chromozom ů či v obsahu GC bazí od zbytku čeledi, byl použit Mann-Whitney test. Hypotéza o rozdílnosti byla na jeho základ ě zamítnuta. Stejn ě tak nebyla nalezena odlišnost v genomických parametrech mezi zavle čenými druhy a druhy, které jsou na území České republiky p ůvodní.

Naopak signifikantn ě vyšlo neparametrické srovnání skupin podle životní strategie. Graf na obrázku 9 ukazuje, jak se odlišují svým monoploidním obsahem DNA druhy jednoleté od druh ů vytrvalejších. Je vid ět, že terofyty mají mnohem menší velikost genomu. Rozdíl byl otestován Mann-Whitney testem (Mann–Whitney Z = 2,554, njednoleté = 12, nvíceleté = 67, P < 0,02 two-tailed). Jednoletost je znak, který je rovnom ěrn ě rozd ělen po celém fylogenetickém stromu. Srovnání nabízí nap ř. tribus Apiae , kde výrazn ě menší genomy mají Ammi majus a Anethum graveolens . Také v rámci rodu m ůže platit toto pravidlo: oba jednoleté poddruhy druhu 33 Anthriscus cerefolium mají menší genom než víceletý Anthriscus sylvestris . Naopak v rod ě Bupleurum není jednoletost tak jednozna čně dána velikostí genomu, a čkoli vytrvalý, ke řovitý druh B. fruticosum má obrovský genom oproti terofyt ům B. rotundifolium a B. tenuissimum . V ostatních genomických parametrech se rozdíl mezi jednoletkami a víceletými druhy nepotvrdil.

Cx value u odlišných životních forem 5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

Cx value (pg) value Cx 2,0

1,5

1,0

0,5 Medián 25%-75% 0,0 Min-Max jednoleté víceleté Obr. 9 Životní formy mi říkovitých rostlin a rozsah jejich 1Cx.

34

5. Diskuse

5.1. Porovnání s p ředchozími m ěř eními

Data o velikosti genomu pro 21 taxon ů zm ěř ená v rámci této práce byla srovnána s předchozími m ěř eními jiných autor ů, jejichž výsledky jsou uvedeny v Plant DNA C-values Database (BENNETT & LEITCH 2005). Bylo-li pro jeden druh uvedeno více m ěř ení, byly ve srovnání zahrnuty jen ty s hodnotami, které jsou považovány za nejspolehliv ější (tzv. Prime estimates). Pouze pro t ři z nich byla použita pr ůtoková cytometrie – Petroselinum crispum , Hedera helix a Hedera colchica . Tyto se od nových m ěř ení tém ěř neliší. U ostatních byla použita Feulgenova mikrodenzitometrie. Přestože auto ři DOLEŽEL et al. (1998) a VILHAR et al (2001) ve svých studiích ukázali, že použité metody mohou podat srovnatelné výsledky, z provedeného porovnání vyplývá n ěco jiného. Z grafu (obr. 10) je patrné, že p ůvodní hodnoty jsou oproti novým m ěř ením spíše vyšší. Více než dvakrát se svými hodnotami liší m ěř ení pro Carum carvi , Foeniculum vulgare a Torilis japonica. Pro Bupleurum falcatum je p ůvodní hodnota tém ěř osmkrát vyšší. Nejvíce se nová data rozchází s autory CHATTOPADHYAY & SHARMA, DAS, DAS & MALLICK a LE et al. (loc. cit.).

Porovnání 1C hodnot s databází RBG Kew Měř ení pro DP RBG Kew

6,00

5,00

4,00

3,00 1C-value(pg) 2,00

1,00

0,00 i s v e a a r a ix m r re m o sis c en a um rat osa u aj atu c arota te ga inal l ni hel eol c c ul c m en v ticosum an v odo a sativ la po ra olchica fal u g ffi s c l arv ja c f. fistu m crisp s s gra Carum lum m o u li li era m m gi u u yrrhi c ri ri Hede d urum Daucusu in e gi nic m sphondyliumM the el To To thu n e u istic n Pastina Pimpine He pleurum fr ry Fo ev tros Ane AnthriscusBupl sylvestrisu Coriandrum sativum.E L Pimpinella saxifraga B eracle Oena Pe H Obr. 10 V grafu jsou znázorn ěny rozdíly v holoploidním obsahu DNA mezi hodnotami nam ěř enými v rámci této práce (mod ře) a hodnotami pocházejícími z Plant DNA C-values Database (fialov ě). 35

U autor ů DAS & MALLICK je nejpravd ěpodobn ějším vysv ětlením v případ ě extrémní hodnoty u Bupleurum falcatum zám ěna vzorku, snad s B. candollei , který je uvád ěn ve stejné práci. Další m ěř ený druh ( B. fruticosum ) se již shoduje s novými stanoveními. Starší m ěř ení od stejných autor ů pro druh Foeniculum vulgare se však také vícenásobn ě liší oproti novým dat ům. To by mohlo být d ůsledkem technických problém ů p ři analýze, nebo zastaralých p řístroj ů. Stejný problém se možná týká i ostatních jmenovaných autor ů. Není proto vždy p řesné zahrnovat do jedné analýzy smíšená data, výsledky obou metod m ěř ení velikosti genomu by měly být požívány zvláš ť.

5.2. Variabilita ve velikosti genomu a obsahu GC bazí

Velikostí genomu 1C se druhy čeledi Apiaceae liší až 13krát, podobn ě jako t řeba Asteraceae . Naopak blízké Araliaceae se liší jen 4krát (BENNETT & LEITCH 2005). Obsah GC bazí u této čeledi je srovnatelný s ostatními krytosemennými rostlinami, rozdíl variability 4 % je srovnatelný nap ř. s čeledí Poaceae , kde jsou však hodnoty mnohem vyšší (BAROW & MEISTER 2002, ŠMARDA et al. 2008). V ětší variabilita je uvád ěna nap ř. v čeledi Ranunculaceae (KO ČKOVÁ 2009). Pozornost budí variabilita uvnit ř některých zkoumaných rod ů. Zvlášt ě u rodu Chaerophyllum , kde dva druhy mají zvýšený obsah DNA i GC, by se mohlo jednat o amplifikaci GC bohatých retrotranspozon ů (srov. HAWKINS et al. 2006). V rodech Eryngium a Peucedanum by mohlo jít o p říklad paleopolyploidizace. Ve prosp ěch této teorie nahrává u Eryngium spíše nižší obsah GC oproti ostatním druh ům a naopak veliký genom. Vzhledem k tomu, že se u druhu P. palustre jedná o fylogeneticky mladý druh, je u n ěho možnost paleoploidizace docela vylou čena. Naopak je celkem pravd ěpodobné, že roli zde hrálo p řizp ůsobení se druhu na mok řadní prost ředí, což korelace fylogenetických kontrast ů pro vlhkost jen potvrzují. U druhu P. alsaticum z řejm ě m ůže jít o zmnožení retrotranspozon ů. Pozorovaná polyploidie v rámci m ěř ených druh ů ( Hedera , Libanotis , Pimpinella ) potvrzuje záv ěry uvedené v práci LEITCH & BENNETT (2004) – že totiž polyploidi mají velikost genomu (1Cx) menší než jejich diploidní p říbuzní.

36 5.3. Velikost genomu a chromozom ů ve vztahu k obsahu GC bazí

Vzájemný vztah genomických parametr ů byl testován neparametricky a s korekcí p řes fylogenetické kontrasty. Významná korelace byla nalezena jen p ři neparametrické analýze, a to pro obsah GC a pr ůměrnou velikost chromozom ů. Zřejm ě je však tento jev d ůsledkem zahrnutí dvou druh ů rodu Hedera (u kterých tento vztah výrazn ě platí), protože p ři testování samotné čeledi Apiaceae už korelace p řítomna nebyla. Velikost chromozom ů navíc nemá fylogenetický signál, takže pozorovaná korelace byla spíš dílem náhody. V pod čeledi Apioideae a tribu Selineae neparametricky koreluje velikost genomu s obsahem GC bazí. Oba tyto parametry mají vysoký fylogenetický signál, proto z řejm ě již o náhodu nep ůjde. Mohlo by to snad poukazovat na skute čnost, že dané v ětve jsou monofyletické. Nesignifikantní korelace fylogenetických kontrast ů v rámci celého m ěř eného souboru taxon ů naopak m ůže odpovídat tomu, že nebyly analyzovány všechny pod čeledi a klady, a že tedy výsledný fylogenetický strom je vlastn ě parafyletický. Druhým problémem může být fakt, že strom není sestrojen na základ ě sekvenování celých genom ů, ale jen několika marker ů, takže nemusí za všech okolností popisovat skute čný stav evoluce.

5.4. Vztah genomických parametr ů k ekologickým prom ěnným

Z výsledk ů Analýzy znak ů vyplývá, že velikost genomu souvisí s nároky rostlin na vlhkost a s kontinentalitou. Ze samotných fylogenetických kontrast ů nelze říci, zda se jedná o korelace pozitivní či negativní. Neparametrickým testováním t ěchto znak ů vyšly korelace kladn ě, nicmén ě nesignifikantn ě. Korelace kontinentality a obsahu DNA není podpo řena fylogenetickým signálem pro kontinentalitu, což nejspíš znamená, že velikost genomu byla ovlivn ěna n ěč ím jiným (t řeba vlhkostí) a p ůsobením vn ějších tlak ů se v kontinentáln ějším prost ředí udržely jen druhy s velkými genomy. Pozitivní korelaci velikosti genomu s dostupností vody, ovšem vztaženou na velikost bu ňek, nasti ňují ve svých pracech KNIGHT & ACKERLY (2002) a KNIGHT et al. (2005). Jsou ale dokumentovány také záporné korelace, a to jak pro vlhkost, tak pro kontinentalitu (BUREŠ et al. 2005). Jednozna čně však lze říci, že vztah k vod ě hraje významnou roli v evoluci studované čeledi a m ění se zárove ň se zm ěnami ve velikosti genomu. A po srovnání fylogenetických signál ů jednotlivých znak ů je dále možné spekulovat, že vztah k vlhkosti je u rostlin více vázán k evoluci než genomické parametry. T řeba by se práv ě na základ ě tohoto dalo říct, že velikost genomu je odvozována od vlastností prost ředí. Jak píše HODGSON et al. (2010), 37 větší pr ůduchy zna čí víc fotosyntézy a to vede k v ětšímu genomu. Pro č by nem ělo platit: víc vody, v ětší turgor, v ětší pr ůduchy, v ětší genom?

5.5. Genomické parametry a ostatní znaky

O velikosti ( či hmotnosti) semen bylo mnohokrát napsáno, že pozitivn ě koreluje s velikostí genomu, a to skrze nukleotypický efekt u bun ěk endospermu a dalších částí semen (GRIME et al. 1997; KNIGHT & ACKERLY 2002; KNIGHT et al. 2005). Pozd ěji se však ukázalo, že zmín ěné korelace byly ovlivn ěny vzájemnou p říbuzností studovaných taxon ů a tedy skute čná korelace není tak silná (BEAULIEU et al. 2007b), jak se p ředpokládalo. V této práci byla korelace testována nezávisle na p říbuzenských vztazích p řes fylogenetické kontrasty a žádný vztah nalezen nebyl. Ani maximální výška rostlin se neukázala být závislou na velikosti genomu nebo jiném genomickém parametru. O čividn ě zde neplatí stejný vztah, jaký uvád ějí CHASE et al (2005) a DUŠKOVÁ et al. (2010) pro r ůstové formy, i když se jednotlivé taxony m ůžou ve výšce lišit až 16krát. Možnost, že by se dokonce oba tyto znaky vyvíjely spole čně, jak je nastín ěno v práci MOLES et al. (2005), také nebyla potvrzena. Mělo by se ale vzít v úvahu, že nep řítomnost korelací m ůže být zp ůsobena nep řesn ě pojatou váhou semen. U n ěkterých hmotností v databázi (LIU et al. 2008) totiž chyb ěl údaj, zda hodnota referuje o suché váze či váze čerstvého materiálu.

To, že potenciální ohroženost rostlin a nebo jejich invazivnost pravd ěpodobn ě nezávisí na žádném genomickém parametru, zna čí, že tyto vlastnosti nesouvisí ani tak s konkrétními taxony, jako spíš s daným stanovišt ěm. Rostliny u nás vzácné či vyhynulé mohou stále hojn ě přetrvávat jinde ve sv ětě. Proto není možné na základ ě genomických parametr ů predikovat rychlost ší ření rostliny, nebo její ústup.

Signifikantní rozdíl mezi krátkov ěkými a dlouhov ěkými rostlinami ve velikosti genomu potvrdilo již mnoho autor ů (BENNETT 1972, BUREŠ et al. 2004, PRICE et al. 2005). A ť už je to dáno tím, že rostliny s malým genomem rychleji rostou, protože mají rychlejší mitózu (VAN'T HOF & SPARROW 1963), nebo t řeba nepot řebují p říliš rozsáhlou genetickou výbavu (nejsou nuceny bojovat o stálé stanovišt ě s ostatními vytrvalými druhy), byl tento fenomén ov ěř en i v této práci.

38 5.6. Záv ěrem...

Čele ď Apiaceae má spíše menší velikost genomu ve srovnání s ostatními krytosemennými rostlinami, zastoupením GC bazí se nijak neodlišuje od ostatních čeledí, pro něž jsou tyto hodnoty známy. V rámci diplomové práce byla zjišt ěna pozitivní korelace mezi GC obsahem a velikostí chromozom ů. V pod čeledi Apioideae , která svým zastoupením tvo ří v ětšinu měř eného souboru taxon ů, koreloval také obsah GC bazí s velikostí genomu. Dalším d ůležitým výsledkem je zjišt ění korelace Ellenbergových indika čních hodnot pro vlhkost s velikostí genomu a pr ůměrnou velikostí chromozom ů a dále korelace Ellenbergových indika čních hodnot pro kontinentalitu s celkovým obsahem DNA. Jako poslední bylo u čeledi Apiaceae ov ěř eno, že jednoleté rostliny mají meší genomy než rostliny víceleté. Tato práce je p řínosná hlavn ě novými poznatky o variabilit ě ve velikosti genomu a zastoupení GC bazí uvnit ř čeledi Apiaceae . Krom ě toho byl herbá ř (BRNU) obohacen o desítky nových položek, což má zcela jist ě velký didaktický a v ědecký význam.

39

Literatura

ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE 2000: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana . Nature 408: 796-815. ACKERLY D.D. 2006: ANALYSIS OF TRAITS (AOT): A Module of PHYLOCOM. Version 3.1. http://www.phylodiversity.net/phylocom. BANCHEVA S. & GREILHUBER J. 2006: Genome size in Bulgarian Centaurea s.l. (Asteraceae ). Plant systematics and evolution 257: 95-117. BARANYI M. & GREILHUBER J. 1999: Genome size in Allium : in quest of reproducible data. Annals of Botany 83: 687-695. BAROW M. & MEISTER A. 2002: Lack of correlation between AT frequency and genome size in higher plants and the effect of nonrandomness of base sequences on dye binding. Cytometry 47: 1-7. BEAULIEU J.M., LEITCH I.J. & KNIGHT C.A. 2007: Genome Size Evolution in Relation to Leaf Strategy and Metabolic Rates Revisited. Annals of Botany 99(3): 495-505. BEAULIEU J.M., MOLES A.T., LEITCH I.J., BENNETT M.D., DICKIE J.B. & KNIGHT C.A. 2007b: Correlated evolution of genome size and seed mass. New Phytologist 173: 422-437. BENNETT M.D. 1971: The duration of meiosis. Proceedings of the Royal Society London, Series B, Biological Sciences 178: 277-299. BENNETT M.D. 1972: Nuclear DNA content and minimum generation time in herbaceous angiosperms. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences 181: 109-135. BENNETT M.D., BHANDOL P. & LEITCH I.J. 2000: Nuclear DNA Amounts in Angiosperms and their Modern Uses - 807 New Estimates. Annals of Botany 86: 859-909. BENNETT M.D. & LEITCH I.J. 2005: Angiosperm DNA C-values database (release 6.0) Dostupné z http:// www.kew.org/cvalues/. Visited 18. 4. 2010. BENNETZEN J., MA J. & DEVOS K.M. 2005: Mechanisms of recent genome size variation in owering plants. Annals of Botany 95: 127-132. BLOMBERG S.P. & GARLAND T. Jr. 2002: Tempo and mode in evolution: phylogenetic inertia, adaptation and comparative methods. Journal of Evolutionary Biology 15: 899-910. BLOMBERG S.P., GARLAND T. Jr. & IVES A.R. 2003: Testing for phylogenetic signal in comparative data: behavioral traits are more labile. Evolution 57: 717-745. BOLHUIS H., PALM P., WENDE A., FALB M., RAMPP M., VALERA F.R., PFEIFFER F. & OESTERHELT D. 2006: The genome of the square archaeon Haloquadratum walsbyi : life at the limits of water activity. BMC Genomics 7: 169. BUREŠ P., WANG Y.F., HOROVÁ L. & SUDA J. 2004: Genome size variation in Central European species of Cirsium ( Compositae ) and their natural hybrids. Annals of Botany 94: 353-363. BUREŠ P., ŠMARDA P., HRALOVÁ I., FUNES-SORIANO S., LYSÁK M., ŘEPKA R., HELÁNOVÁ K., ROTREKLOVÁ O., PROCHÁZKOVÁ J., ÚRADNÍ ČEK L. & KŮROVÁ J. 2007: GC Content in Plant Genomes. Analytical Cytometry 4: 19-20. CALVIÑO C.I. & DOWNIE S.R. 2007: Circumscription and phylogeny of Apiaceae subfamily Saniculoideae based on chloroplast DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 44: 175-191. CALVIÑO C.I., MARTINEZ S.G. & DOWNIE S.R. 2008: The evolutionary history of Eryngium ( Apiaceae , Saniculoideae ): Rapid radiations, long distance dispersals, and hybridizations. Molecular Phylogenetics and Evolution 46: 1129-1150. 40 CHASE M.W., HANSON L., ALBERT V.A., WHITTEN W.M. & WILLIAMS N.H. 2005: Life history evolution and genome size in subtribe Oncidiinae ( Orchidaceae ). Annals of Botany 95 (1): 191-199. DAS A. & MALLICK R. 1991: Correlation between genomic diversity and asiaticoside content in Centella asiatica (L.) Urban. Botanical Bulletin of Academia Sinica 32: 1-8. DOLEŽEL J., SGORBATI S. & LUCRETTI S. 1992: Comparison of three DNA fluorochromes for flow cytometric estimation of nuclear DNA content in plants. Physiologia Plantarum 85: 625-631. DOLEŽEL J. & GÖHDE W. 1995: Sex determination in dioecious plants Melandrium album and M. rubrum using high-resolution flow cytometry. Cytometry 19: 103-106. DOLEŽEL J., GREILHUBER J., LUCRETTI S., MEISTER A., LYSAK M.A., NARDI L. & OBERMAYER R. 1998. Plant genome size estimation by flow cytometry: Inter-laboratory comparison. Annals of Botany 82 (Suppl. A): 17-26. DOLEŽEL J., BARTOŠ J., VOGLMAYR H. & GREILHUBER 2003: Nuclear DNA content and genome size of trout and human. Cytometry 51: 127-128. DOWNIE S.R., RAMANATH S., KATZ-DOWNIE D.S. & LLANAS E. 1998: Molecular systematics of Apiaceae subfamily Apioideae: phylogenetic analyses of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer and plastid rpoC1 intron sequences. American Journal of Botany 85: 563-591. DOWNIE S.R., KATZ-DOWNIE D.S. & WATSON M.F. 2000a: A phylogeny of the flowering plant family Apiaceae based on chloroplast DNA rpl16 and rpoC1 intron sequences: towards a suprageneric classification of subfamily Apioidae. American Journal of Botany 87: 273-292. DOWNIE S.R., KATZ-DOWNIE D.S. & SPALIK K. 2000b: A phylogeny of Apiaceae tribe Scandiceae : Evidence from nuclear ribosomal Internal Transcribed Spacer sequences. American Journal of Botany 87(1): 76-95. DOWNIE S.R., PLUNKETT G. M., WATSON M. F., SPALIK K., KATZ-DOWNIE D.S., VALIEJO-ROMAN C. M., TERENTIEVA E. I., TROITSKY A. V., LEE B.-Y., LAHHAM J. & EL-OQLAH A. 2001: Tribes and clades within Apiaceae subfamily Apioideae : The contribution of molecular data. Edinburgh Journal of Botany 58: 301-330. DRUDE C.G.O. 1898: Umbelliferae. In: ENGLER A. & PRANTL K. (eds): Die natürlichen Pflanzenfamilien 3 (8). Engelmann, Leipzig, pp. 63-250. DUFRESNE A., GARCZAREK L. & PARTENSKY F. 2005: Accelerated evolution associated with genome reduction in a free-living prokaryote. Genome Biology 6: R14. DUŠKOVÁ E., KOLÁ Ř F., SKLENÁ Ř P., RAUCHOVÁ J., KUBEŠOVÁ M., FÉR T., SUDA J. & MARHOLD K. 2010: Genome size correlates with growth form, habitat and phylogeny in the Andean genus Lasiocephalus ( Asteraceae ). Preslia 82: 127-148. ELLENBERG H., WEBER H.E., DÜLL R., WIRTH V., WERNER W. & PAULIßEN D. 1992: Indicator-values of plants in Central Europe. Scripta Geobotanica 18: 1-258. FENG T., DOWNIE S.R., YU Y., ZHANG X., CHEN W., HE X. & LIU S.: Molecular systematics of Angelica and allied genera ( Apiaceae ) from the Hengduan Mountains of China based on nrDNA ITS sequences: phylogenetic affinities and biogeographic implications. Journal of Plant Research 122:403-414. FROBERG L. in prep.: Apiaceae . In: KARLSSON T. (ed.): Flora Nordica 6: Thymelaeaeceae through to Apiaceae . Dostupné z http://www.floranordica.org. Visited 19. 4. 2010. GALTIER N., PIGANEAU G., MOUCHIROUD D. & DURET L. 2001: GC-content evolution in mammalian genomes: the biased gene conversion hypothesis. Genetics 159: 907-911. GARNER T.W. 2002: Genome size and microsatellites: the effect of nuclear size on amplification potential. Genome 45: 221-215. 41 GODELLE B., CARTIER D., MARIE D., BROWN S.C., SILJAK-YAKOVLEV S. 1993: Heterochromatin study demonstrating the non-linearity of fluorometry useful for calculating genomic base composition. Cytometry 14: 618-626. GOLDBLATT P. & JOHNSON D.E. (eds.) 1979: Index to plant chromosome numbers. Missouri Botanical Garden, St. Louis. Dostupné z http://mobot.mobot.org/W3T/Search/ipcn.html. Visited 15. 2. 2010. GREILHUBER J., BORSCH T., MUELLER K., WORBERG A., POREMBSKY S. & BARTHLOTT W. 2006: Smallest Angiosperm Genomes Found in Lentibulariaceae, with Chromosomes of Bacterial Size. Plant Biology 8: 770-777. GREILHUBER J. 2005: Intraspecific variation in genome size in angiosperms: identifying its existence. Annals of Botany 95: 91-98. GRIME J.P., THOMPSON K., HUNT R., HODGSON J.G., CORNELISSEN J.H.C., RORISON I.H., HENDRY G.A.F., ASHENDEN T.W., ASKEW A.P., BAND S.R., BOOTH R.E., BOSSARD C.C., CAMPBELL B.D., COOPER J.E.L., DAVISON A.W., GUPTA P.L., HALL W., HAND D.W., HANNAH M.A., HILLIER S.H., HODKINSON D.J., JALILI A., LIU Z., MACKEY J.M.L., MATTHEWS N., MOWFORTH M.A., NEAL A.M., READER R.J., REILING K., ROSS-FRASER W., SPENCER R.E., SUTTON F., TASKER D.E., THORPE P.C. & WHITEHOUSE J. 1997: Integrated screening validates primary axes of specialization in plants. Oikos 79: 259-281. GROVER C.E., KIM H., WING R.A., PATERSON A.H. & WENDEL J.F. 2004: Incongruent patterns of local and global genome size evolution in cotton. Genome Research 14: 1474-1482. HAWKINS J.S., KIM H., NASON J.D., WING R.A. & WENDEL J.F. 2006: Differential lineage-specific amplification of transposable elements is responsible for genome size variation in Gossypium . Genome Research 16 (10): 1252-1261. HODGSON J.G, SHARAFI M., JALILI A., DIAZ S., MONTSERRAT-MARTI, PALMER G.C., CERABOLINI B., PIERCE S., HAMZEHEE B., ASRI Y., JAMZAD Z., WILSON P., RAVEN J.A., BAND S.R., BASCONELO S., BOGARDA., CARTER G., CHARLES M., CASTRO-DÍEZ P., CORNELISSEN J.H.C., FUNES G., JONES G., KHOSHNEVIS M., PÉREZ-HARGUINDEGUY N., PÉREZ-RONTOME M.C., SHIRVANY F.A., VENDRAMINI F., YAZDANI S., ABBAS-AZIMI R., BOUSTANI S., DEHGHAN M., GUERRERO-CAMPO J., HYND A., KOWSARY E., KAZEMI-SAEED F., SIAVASH B., VILLAR-SALLVADOR P., CRAIGIE R., NAQINEZHAD A., ROMO-DÍEZ A., DE TORRES ESPUNY L. & SIMMONS E. 2010: Stomatal vs. genome size in angiosperms: the somatic tail wagging the genomic dog? Annals of Botany 105: 573-584. INTERNATIONAL PLANT NAMES INDEX 2005. Dostupné z http://www.ipni.org/. Visited 29. 4. 2010. INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT 2005: The map-based sequence of the rice genome. Nature 436: 793-800. JOVTCHEV G., SCHUBERT V., MEISTER A., BAROW & SCHUBERT I. 2006: Nuclear DNA content and nuclear and cell volume are positively correlated in angiosperms. Cytogenetic and Genome Research 114: 77-82. JUDD W.S., SANDERS R.W. & DONOGHUE M.J. 1994: Angiosperm family pairs: preliminary phylogenetic analyses. Harvard papers in Botany 5: 1-51. KAHLAOUI S., WALKER D.J, CORREAL E., MARTINEZ-GOMEZ P., HASSEN H. & BOUZID S. 2009: The morphology, chromosome number and nuclear DNA content of Tunisian populations of three Vicia species. African Journal of Biotechnology 8(14): 3184- 3191. KNIGHT C.A. & ACKERLY D.D. 2002: Variation in nuclear DNA content across environmental gradients: a quantile regression analysis. Ecology Letters 5: 66-76. KNIGHT C.A., MOLINARI N.A. & PETROV D.A. 2005: The large genome constraint hypothesis: evolution, ecology and phenotype. Annals of Botany 95: 177-190. 42 KO ČKOVÁ L. 2009: Obsah DNA a AT/GC genomový pom ěr v čeledi Ranunculaceae . Bakalá řská práce, Masarykova univerzita, Brno. KUBÁT K. (ed.) 2002: Klí č ke kv ěten ě České republiky. Academia, Praha. KURZYNA-MŁYNIK R., OSKOLSKI A.A., DOWNIE S.R., KOPACZ R., WOJEWODZKA A. & SPALIK K. 2008: Phylogenetic position of the genus Ferula (Apiaceae ) and its placement in tribe Scandiceae as inferred from nrDNA ITS sequence variation. Plant systematics and evolution 274: 47-66. LEITCH I.J. & BENNETT M.D. 2004: Genome downsizing in polyploid plants. Biological Journal of the Linnean Society 82 (4): 651-663. LIU M., VAN WYK B.-E. & TILNEY P. M. 2003: The taxonomic value of fruit structure in the subfamily Saniculoideae and related African genera ( Apiaceae ). Taxon 52: 261-270. LIU K., EASTWOOD R.J., FLYNN S., TURNER R.M. & STUPPY W.H. 2008: Seed Information Database (release 7.1). Dostupné z http://www.kew.org/data/sid. Visited 29. 4. 2010. MA J., DEVOS K.M. & BENNETZEN J.L. 2004: Analyses of LTR-retrotransposon structures reveal recent and rapid genomic DNA loss in rice. Genomic Research 14: 860- 869. MARIE D. & BROWN S.C. 1993: A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C- values for seventy species. Biology of the Cell 78: 41-51. MASTERSON J. 1994: Stomatal size in fossil plants: Evidence for polyploidy in majority of angiosperms. Science 264: 421-4. MCLEISH & LACOUR 1971 (ústní sd ělení) in BENNETT & LEITCH 2005: Angiosperm DNA C-values database (release 6.0). Dostupné z http:// www.kew.org/cvalues/. MEAGHER T.R. & COSTICH D.E. 1996: Nuclear DNA content and floral evolution in Silene latifolia . Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 263: 1455-1460. MEISTER A. & BAROW M. 2007: DNA base composition of plant genomes. In: DOLEŽEL J., GREILHUBER J. & SUDA J. (eds): Flow cytometry with plant cells: analysis of genes, chromosomes and genomes. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. Kvas, Weinheim, pp 177- 215. MEYERS B.C., TINGEY S.V. & MORGANTE M. 2001: Abundance, distribution, and transcriptional activity of repetitive elements in the maize genome. Genome Research 11: 1660-1676. MOLES A.T., ACKERLY D.D., WEBB C.O., TWEDDLE J.C., DICKIE J.B. & WESTOBY M. 2005: A brief history of seed size. Science 307: 576-580. NEVES S.S. & WATSON M.F. 2004: Phylogenetic Relationships in Bupleurum ( Apiaceae ) Based on Nuclear Ribosomal DNA ITS Sequence Data. Annals of Botany 93: 379-398. NICOLAS A. N. & PLUNKETT G. M. 2009: The demise of subfamily Hydrocotyloideae (Apiaceae ) and the re-alignment of its genera across the whole order Apiales. Molecular Phylogenetics and Evolution 53: 134-151. OTTO F. 1990: DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. In: CRISSMAN H.A. & DARZYNKIEWICZ Z. (eds.): Methods in cell biology 33. Academic Press, New York, pp. 105-110. PAGEL M. 1999: Inferring the historical patterns of biological evolution. Nature 401: 877- 884. PETROV D.A. 2002: DNA loss and evolution of genome size in Drosophila . Genetica 115: 81-91. PFOSSER M., JAKUBOWSKY G., SCHLUTER P. M., FER T., KATO H., STUESSY T.F. & SUN B.-Y. 2006: Evolution of Dystaenia takesimana ( Apiaceae ), endemic to Ullung Island, Korea. Plant Systematics and Evolution 256: 159-170. PIMENOV M.G. & LEONOV M.V. 1993: The genera of the Umbelliferae. A nomenclator . Royal Botanic Gardens, Kew. 43 PLUNKETT G.M. & LOWRY P. P. 2nd. 2001: Relationships among "ancient araliads" and their significance for the systematics of Apiales. Molecular Phylogenetics and Evolution 19(2): 259-76. PLUNKETT G.M., CHANDLER G.T., KOWRY II P.P., PINNEY S.M. & SPRENKLE T. S. 2004: Recent advances in understanding Apiales and a revised classification. South African Journal of Botany 70: 371-381. PRICE H.J., DILLON S.L., HODNETT G.,. ROONEY W.L., ROSS L. & JOHNSTON J.S. 2005: Genome Evolution in the Genus Sorghum ( Poaceae ). Annals of Botany 95: 219-227. PROCHÁZKA F. (ed.) 2001: Černý a červený seznam cévnatých rostlin České republiky (stav v roce 2000). Příroda 18: 1-146, Praha. PROCHÁZKOVÁ J. 2007: Obsah DNA a AT/GC genomový pom ěr v čeledi Apiaceae . Bakalá řská práce, Masarykova univerzita, Brno. PYŠEK P., SÁDLO J. & MANDÁK B. 2002: Catalogue of alien plants of the Czech Republic. Preslia 74: 97–186. ROBINSON J. P. & GRÉGORI G. 2007: Principles of flow cytometry. In: DOLEŽEL J., GREILHUBER J. & SUDA J. (eds): Flow cytometry with plant cells: analysis of genes, chromosomes and genomes. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. Kvas, Weinheim, pp. 19- 21. ROSATO M., CHIAVARINO A.M., NARANJO C.A., HERNANDES J.C. & POGGIO L. 1998: Genome size and numerical polymorphism for the B chromosome in races of maize (Zea mays ssp. mays , Poaceae). American Journal of Botany 85 (2):168-174. SANMIGUEL P., TIKHONOV A., JIN Y. K., MOTCHOULSKAIA N., ZAKHAROV D., MELAKE-BERHAN A., SPRINGER P.S., EDWARDS K.J., LEE M., AVRAMOVA Z. & BENNETZEN J.L. 1996: Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome. Science 274: 765-768. SHAPIRO H.M. 1983: Multistation Multiparameter Flow Cytometry: A Critical Review and Rationale. Cytometry 3: 227-243. SPALIK K., REDURON J.-P. & DOWNIE S.R. 2004: The phylogenetic position of Peucedanum sensu lato and allied genera and their placement in tribe Selineae ( Apiaceae , subfamily Apioideae ). Plant systematics and evolution 243: 189-210. STEBBINS G.L. 1971: Chromosomal evolution in higher plants . Edward Arnold, London. STEVENS P.F. 2001 onwards: Angiosperm Phylogeny Website (Version 5). Dostupné z http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/ Visited 25. 4. 2010. STÖVER B.C. & MÜLLER K.F.: TreeGraph 2: Combining and visualizing evidence from different phylogenetic analyses. BMC Bioinformatics 11: 7. SUDA J. 2004: An employment of flow cytometry into plant biosystematics. Diserta ční práce, Univerzita Karlova, Praha. SUDA J. 2005: Co se skrývá za rostlinnou pr ůtokovou cytometrií? Živa 53/1: 46-48. SUDA J., KRAHULCOVÁ A., TRÁVNÍ ČEK P., ROSENBAUMOVÁ R., PECKERT T. & KRAHULEC F. 2007: Genome Size Variation and Species Relationships in Hieracium Sub-genus Pilosella ( Asteraceae ) as Inferred by Flow Cytometry. Annals of Botany 100: 1323-1335. SWIFT H.H. 1950: The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences, Washington 36: 643-654. ŠMARDA P., BUREŠ P., HOROVÁ L., FOGGI B. & ROSSI G. 2008: Genome size and GC content evolution of Festuca : ancestral expansion and subsequent reduction. Annals of Botany 101: 421-433. TOMŠOVIC P. 1997: Apiaceae LINDL. - mi říkovité (okoli čnaté). In: SLAVÍK B. (ed.): Kv ětena České republiky 5 . Academia, Praha, pp. 269-429. VALIEJO-ROMAN C.M, SHNEYER V.S., SAMIGULLIN T.H., TERENTIEVA E.I. & PIMENNOV M.G. 2006: An attempt to clarify taxonomic relationships in 44 „Verwandtschaftskreis der Gattung Ligusticum“ ( Umbelliferae -Apioideae ) by molecular analysis. Plant systematics and evolution . 257: 25-43. VAN'T HOF J. & SPARROW A. 1963: A relationship between DNA content, nuclear volume and minimum mitotic cycle time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 49: 897-902. VICIENT C. M., SUONIEMI A., ANAMTHAWAT-JÓNSSON K., TANSKANEN J., BEHARAV A., NEVOC E. & SCHULMANA A.H. 1999: Retrotransposon BARE -1 and its role in genome evolution in the genus Hordeum. Plant Cell 11: 1769-1784. VILHAR B., GREILHUBER J., KOCE J.D., TEMSCH E.M. & DERMASTIA M. 2001: Plant genome size measurement with DNA image cytometry. Annals of Botany 87: 719- 728. WAYNE L.G., BRENNER D.J., COLWELL R.R., GRIMONT P.A.D., KANDLER O., KRICHEVSKY M.I., MOORE L.H., MOORE W.E.C., MURRAY R.G.E., STACKEBRANDT E., STARR M.P. & TRUPER H.G. 1987: Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematic. International Journal of Systematic Bacteriology 37 (4): 463-4. WEBB C.O., ACKERLY D.D. & KEMBEL S.W. 2008: Phylocom: software for the analysis of phylogenetic community structure and trait evolution. Bioinformatics 24: 2098-2100. WEISS-SCHNEEWEISS H., GREILHUBER J., SCHNEEWEISS G.M. 2006: Genome size evolution in holoparasitic Orobanche ( Orobanchaceae ) and related genera. American Journal of Botany 93: 148-156. WENDEL J.F. 2000: Genome evolution in polyploids. Plant Molecular Biology 42: 225-249. WENDEL J.F., CRONN R.C., ALVAREZ I., LIU B., SMALL R.L. & SENCHINA D.S. 2002: Intron size and genome size in plants. Molecular Biology and Evolution 19: 2346- 2352. ZHOU J., GONG X., DOWNIE S.R. & PENG H. 2009: Towards a more robust molecular phylogeny of Chinese Apiaceae subfamily Apioideae : Additional evidence from nrDNA ITS and cpDNA intron (rpl16 and rps16) sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 53: 56-68.

Internetové zdroje www 1: http://tolweb.org/tree. Visited 11. 4. 2010. www 2: http://lmcc.ieb.cz/book/basic-principles. Visited 30. 4. 2010. www 3: http://department.obg.cuhk.edu.hk/researchsupport/Correlation_coeff.asp. Visited 4. 5. 2010. 45

Přílohy

Seznam p říloh: Příloha 1: Tabulky s ur čením lokalit m ěř ených vzork ů. Příloha 2: CD-ROM se zdrojovými daty a výstupy analýz, elektronická verze diplomové práce. 46 Příloha 1: Tabulky s ur čením lokalit m ěř ených vzork ů. Rostliny, u nichž je sb ěratelem n ěkdo jiný než autorka diplomové práce, jsou ozna čeny (§).

Tab. A Lokality sb ěru z roku 2006. Místo Název druhu GPS Číslo v herbá ři Tišnov Bupleurum falcatum 49°21'19.37"N,16°24'55.21"E JP06/007 Brno-Líše ň Bupleurum falcatum 49°13'1.17"N,16°40'40.38"E Brno-Řečkovice Bupleurum falcatum 49°14'44.84"N,16°35'37.89"E Příz řenice Conium maculatum 49°8'54.4"N,16°37'43.69"E JP06/005 Radostice Daucus carota 49°8'13.4"N,16°28'21.55"E JP06/010 Brno-st řed Daucus carota 49°11'43.13"N,16°35'35.61"E Brno-Řečkovice Daucus carota 49°14'52.5"N,16°35'51.74"E Radostice Eryngium campestre 49°8'9.13"N,16°29'56.19"E JP06/009 Brno-Řečkovice Eryngium campestre 49°14'46.54"N,16°35'32.51"E Brno-Nový Lískovec Eryngium campestre 49°10'50.12"N,16°33'22.11"E Řebešovice Falcaria vulgaris 49°6'42.9"N,16°38'45.98"E JP06/006 Radostice Chaerophyllum aromaticum 49°8'33.57"N,16°28'37.4"E JP06/008 St řelice Chaerophyllum aromaticum 49°8'34.07"N,16°31'42.85"E Brno-Řečkovice Chaerophyllum aromaticum 49°14'40.7"N,16°35'42.02"E Brno-Komárov Pastinaca sativa 49°9'59.95"N,16°37'36.51"E Brno-Řečkovice Pastinaca sativa 49°14'52.5"N,16°35'51.74"E Brno-Řečkovice Pastinaca sativa 49°15'3.64"N,16°34'35.57"E JP06/003 Troubsko Petroselinum crispum § 49°10'0.98''N, 16°30'57.32''E JP06/015 Brno-Kohoutovice Petroselinum crispum 49°11'35.93"N; 16°32'6.11"E Brno-Černovice Petroselinum crispum § 49°11'7.35"N,16°38'6.75"E Brno-Nový Lískovec Peucedanum alsaticum 49°10'50.12"N,16°33'22.11"E JP06/012 Brno-Nový Lískovec Peucedanum alsaticum 49°10'40.71"N,16°33'23.44"E Brno-Líše ň Peucedanum cervaria 49°13'1.49"N,16°40'29.71"E JP06/013 Brno-Nový Lískovec Peucedanum cervaria 49°10'50.12"N,16°33'22.11"E Brno-Řečkovice Pimpinella major 49°15'3.19"N,16°34'36.05"E JP06/002 Rebešovice Pimpinella major 49°6'48.3"N,16°38'44.88"E Brno-Řečkovice Pimpinella major 49°14'53.59"N,16°35'29.12"E Brno-Řečkovice Pimpinella saxifraga 49°14'44.43"N,16°35'39.49"E JP06/004 Brno-Řečkovice Pimpinella saxifraga 49°15'3.19"N,16°34'36.05"E Brno-Nový Lískovec Pimpinella saxifraga 49°10'50.01"N,16°33'21.78"E Brno-Líše ň Sanicula europaea 49°13'45.41"N,16°41'6.9"E JP06/016 Brno-Nový Lískovec Seseli annuum 49°10'40.71"N,16°33'23.44"E JP06/001 Brno-Nový Lískovec Seseli osseum 49°10'40.71"N,16°33'23.44"E Brno-Líše ň Seseli osseum 49°13'1.37"N,16°40'24.07"E JP06/014 Brno-Řečkovice Torilis japonica 49°14'56.79"N,16°35'49.46"E Brno-Líše ň Torilis japonica 49°12'21.879"N, 16°43'1.79"E Radostice Torilis japonica 49°8'5.95"N,16°31'20.81"E JP06/011

§ Petroselinum crispum (Troubsko) – Daniela Bártová § Petroselinum crispum (Brno-Černovice) – Marek Schwarz

47

Tab. B Lokality sb ěru z let 2007 a 2009. Místo Název druhu GPS Číslo v herbá ři Brno-Kohoutovice Aegopodium podagraria 49°11'37.622"N, 16°32'1.176"E Radostice Aegopodium podagraria 49°8'13.814"N, 16°27'39.115"E JP08/001 Boleradice Aethusa cynapium 48°58'7.333"N, 16°47'51.832"E JP09/011 Brno-Černovice Anethum graveolens § 49°11'8.099"N, 16°38'9.545"E JP08/004 Cikháj Angelica sylvestris 49°39'10.133"N, 15°58'0.636"E JP09/004 Brno-Líše ň Anthriscus trichosperma 49°12'58.99"N, 16°43'7.377"E Brno-Nový Lískovec Anthriscus sylvestris 49°10'59.741"N, 16°33'17.37"E JP08/003 Sedlec Bupleurum tenuissimum 48°46'30.14"N, 16°41'59.464"E JP09/050 Svratouch Carum carvi 49°42'52.851"N, 16°3'53.128"E JP09/006 Ždírec n. Doubravou Cicuta virosa 49°42'28.282"N, 15°48'56.67"E JP09/007 Lanžhot Cnidium dubium 48°42'31.397"N, 16°57'55.583"E JP09/048 Osová Bítýška Heracleum mantegazzianum 49°20'4.94"N, 16°9'49.999"E JP09/008 Brno-Kohoutovice Heracleum sphondylium 49°11'37.622"N, 16°32'1.176"E JP08/002 Hodonín Chaerophyllum bulbosum 48°52'55.271"N, 17°6'31.348"E JP09/046 Cikháj Chaerophyllum hirsutum 49°39'10.133"N, 15°58'0.636"E JP09/003 Malá Morávka Chaerophyllum hirsutum § 50°04'11.2"N, 17°14'25.4"E JP09/059 Brno-Líše ň Chaerophyllum temulum 49°12'38.919"N, 16°42'37.467"E JP09/001 Cikháj Imperatoria ostruthium 49°39'5.237"N, 15°57'53.606"E JP09/002 Boleradice Laser trilobum 48°58'15.859"N, 16°47'15.834"E JP09/010 Horní N ěmčí Laserpitium latifolium 48°53'37.607"N, 17°39'17.649"E JP09/055 Hodonín Laserpitium prutenicum 48°52'53.841"N, 17°6'27.605"E JP09/045 Boleradice Levisticum officinale 48°58'9.442"N, 16°48'23.711"E JP09/009 Sedlec Libanotis pyrenaica 48°47'9.667"N, 16°42'17.158"E JP09/051 Malá Morávka Ligusticum mutelina § 50°04'11.2"N, 17°14'25.4"E JP09/058 Svratouch Myrrhis odorata 49°42'50.914"N, 16°3'52.524"E JP09/005 Brno-Bystrc Oenanthe aquatica 49°14'28.775"N, 16°30'50.602"E JP09/041 Nivnice Peucedanum carvifolia 48°57'15.261"N, 17°38'51.689"E JP09/057 Javorník Pleurospermum austriacum 48°51'19.399"N, 17°32'22.803"E JP09/054 Lanžhot Selinum carvifolia 48°42'20.967"N, 16°58'6.064"E JP09/049 Lanžhot Silaum silaus 48°43'6.449"N, 16°58'13.591"E JP09/047

§ Anethum graveolens (Brno-Černovice) – Marek Schwarz § Chaerophyllum hirsutum , Ligusticum mutelina (Malá Morávka) – Martin Jiroušek

48

Tab. C Materiál z botanických zahrad (*) z roku 2009. Botanická zahrada Název druhu Číslo v herbá ři BZ MU Ammi majus JP09/040 Angelica cf. amurensis JP09/034 Anthriscus cerefolium Apium graveolens JP09/013 Astrantia major JP09/025 Athamanta turbith JP09/036 Berula erecta JP09/006 Bupleurum fruticosum JP09/044 Bupleurum rotundifolium JP09/029 Caucalis platycarpos JP09/061 Cnidium silaifolium JP09/021 Coriandrum sativum JP09/017 Eryngium amethystinum JP09/035 Eryngium bourgatii JP09/023 Eryngium giganteum JP09/053 Eryngium maritimum JP09/024 Eryngium planum JP09/022 Ferula campestris JP09/038 Foeniculum vulgare JP09/016 Hacquetia epipactis JP09/012 Hedera colchica Hedera helix Chaerophyllum aureum JP09/039 Libanotis pyrenaica JP09/030 Libanotis pyrenaica JP09/037 Meum athamanticum JP09/028 Oenanthe cf. fistulosa JP09/027 Oenanthe javanica s. l. JP09/060 Peucedanum oreoselinum JP09/018 Peucedanum palustre JP09/062 Pimpinella anisum JP09/019 Seseli hippomarathrum JP09/014 Seseli montanum JP09/020 Sium latifolium JP09/031 Trinia glauca JP09/015 BZ MENDELU Angelica gigas JP09/043 Orlaya grandiflora JP09/042 BZ UK Angelica archangelica § JP09/063

§ Angelica archangelica (BZ UK) – Ivana Hralová *Adresy botanických zahrad: BZ MU Botanická zahrada P řF MU, Kotlá řská 2, 611 37 Brno BZ MENDELU: Botanická zahrada a arboretum Mendelovy univerzity v Brn ě, Zem ědělská 1, 613 00 Brno BZ UK: Botanická zahrada P řF UK v Praze, Na Slupi 16, 128 01 Praha 2