UNIVERSITÉ DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE SSBCV INRA Unité ISP Equipe PGBA, Tours-Nouzilly ANSES Unité Antibiorésistance et Virulence Bactérienne, Lyon

THÈSE présentée par : Eliette Schultz - Ascensio soutenue le : 28 Mars 2018

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Tours Discipline/ Spécialité : Infectiologie et Vaccinologie

Diffusion d’îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques chez Proteus mirabilis

THÈSE dirigée par : Dr. CLOECKAERT Axel Directeur de recherche, INRA (Tours-Nouzilly, France) Dr. MADEC Jean-Yves Directeur de recherche, ANSES (Lyon, France) co-encadrée par : Dr. DOUBLET Benoît Chargé de recherche, INRA (Tours-Nouzilly, France) Dr. HAENNI Marisa Chargée de recherche, ANSES (Lyon, France) RAPPORTEURS : Dr. BRISABOIS Anne Directeur de recherche, ANSES (Maisons-Alfort, France) Pr. CATTOIR Vincent Professeur des Universités-Praticien Hospitalier, CHU (Rennes, France)

JURY : Dr. BRISABOIS Anne Directeur de recherche, ANSES (Maisons-Alfort, France) Pr. CATTOIR Vincent Professeur des Universités-Praticien Hospitalier, CHU (Rennes, France) Dr. CLOECKAERT Axel Directeur de recherche, INRA (Tours-Nouzilly, France) Dr. DOUBLET Benoît Chargé de recherche, INRA (Tours-Nouzilly, France) Pr. GOUDEAU Alain Professeur des Universités-Praticien Hospitalier, CHU (Tours, France) Dr. HAENNI Marisa Chargée de recherche, ANSES (Lyon, France) Dr. LE HELLO Simon Chargé de recherche, Institut Pasteur (Paris, France) « Chaque fois que la science avance d’un pas, c’est qu’un imbécile la pousse,

sans le faire exprès » - Emile Zola

J’espère avoir réussi à en être un, d’imbécile…

2 Remerciements

Ce travail de thèse a été réalisé grâce au soutien financier de l’INRA et de l’ANSES et s’est déroulé au sein de l’équipe Plasticité Génomique, Biodiversité, Antibiorésistance du centre INRA de Tours-Nouzilly, sous la direction d’Axel Cloeckaert et de Benoît Doublet ainsi que de l’unité Antibiorésistance et Virulence Bactérienne de l’ANSES de Lyon, sous la direction de Jean-Yves Madec et Marisa Haenni.

Tout d’abord, je tiens à exprimer toute ma gratitude à Axel Cloeckaert et Jean-Yves Madec pour m’avoir accueillie au sein de leur équipe. Travailler sous leur direction m’a beaucoup apportée et j’ai pu apprécier leur rigueur et leur expertise scientifique tout au long de cette belle aventure !

Par ailleurs, ce travail de thèse n’aurait pas été le même sans le soutien de mes encadrants, Benoît Doublet et Marisa Haenni. Il n’y a pas de mot assez fort pour vous montrer à quel point je suis reconnaissante pour tout ce que vous avez fait pour moi. De longues discussions, des remises en question, des solutions à trouver, des erreurs à rectifier, mais des beaux résultats à la clé ! Je n’aurai pas pu espérer mieux comme encadrants pour m’épauler que vous deux.

Je tiens ensuite à remercier le Docteur Anne Brisabois et le Professeur Vincent Cattoir d’avoir accepté d’être rapporteur de mon travail. Merci également au Docteur Simon Le Hello pour avoir accepté d’être examinateur de ces travaux et le Professeur Alain Goudeau pour avoir bien voulu présider mon jury.

Merci à tous les membres des équipes PGBA et Antibiorésistance et Virulence Bactérienne pour leur accueil chaleureux, leur gentillesse et leur bienveillance à mon égard.

Merci à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce projet de thèse.

Et pour conclure, je veux remercier Anthony, mon amour, pour avoir été à mes côtés, pour sa patience dans les moments plus difficiles, et pour m’avoir aidé à achever ce travail avec le plus beau des cadeaux, notre petite princesse, Esperanza...

3 Résumé

La résistance aux antibiotiques est une menace non négligeable pour la santé publique.

Ces résistances peuvent être portées par différents supports dont les îlots génomiques. Il a été démontré que les îlots génomiques Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) et Proteus Genomic

Island 1 (PGI1) sont des acteurs importants de la multirésistance aux antibiotiques. Quelques variants de SGI1 et PGI1 ont déjà été décrits au sein de l’espèce P. mirabilis. Dans ce contexte, ce projet de thèse se proposait d’approfondir notre connaissance de la situation

épidémiologique de la diffusion de SGI1 et PGI1 chez P. mirabilis chez l’homme et l’animal en France, en ce qui concerne la diversité des isolats, mais aussi celles des variants de

SGI1/PGI1. En parallèle, une autre volonté a été d’identifier d’autres facteurs et acteurs permettant l’acquisition de gènes de résistance d’intérêt (E-Lactamases à Spectre Etendu, céphalosporinase AmpC, Plasmid-mediated Quinolone Resistance…) au sein des

Morganellaceae. Au final, cette étude a permis en outre de révéler les premiers cas de SGI1 et

PGI1 chez P. mirabilis chez l’animal en France. De nouveaux variants de SGI1 ont également

été mis en évidence. Et pour la première fois, SGI1 a été décrit chez Morganella morganii, une autre espèce d’entérobactérie.

Mots-clés : Proteus, SGI1, PGI1, antibiorésistance

4 Abstract

The antibiotic resistance is a major treat for public health. These resistances can be hold by different element and genomic islands are one of them. Salmonella Genomic Island 1

(SGI1) and Proteus Genomic Island 1 (PGI1) are important genetic elements for the spread of antibiotic resistance. A few SGI1 and PGI1 variants were already described in P. mirabilis. In this context, this thesis project aimed to improve our knowledge about the epidemiological spread of SGI1 and PGI1 in P. mirabilis in humans but also in animals in France (diversity of isolates and SGI1/PGI1 variants). Moreover, medically-important antimicrobial resistances

(Extended-Spectrum E-Lactamases, AmpC cephalosporinase, Plasmid-mediated Quinolone

Resistance...) were also characterized in the Morganellaceae family. Finally, this study revealed the first cases of SGI1 and PGI1 in P. mirabilis in animals in France. New SGI1 variants were also described. And for the first time, SGI1 was described in Morganella morganii, another enterobacterial species.

Keywords : Proteus, SGI1, PGI1, antibiotic resistance

5 Table des matières

Remerciements ...... 3 Résumé ...... 3 Abstract...... 5 Table des matières ...... 6 Liste des figures ...... 9 Introduction ...... 13 Première partie : Étude bibliographique ...... 17 A. La famille des Morganellaceae ...... 18 A.1. Les membres de la famille des Morganellaceae, qui sont-ils ? ...... 18 A.2. Portraits de famille : les caractéristiques des Proteus ...... 19 A.3. Où trouver les Morganellaceae ? ...... 24 A.4. Infections par les Proteus ...... 25 A.5. Épidémiologie des Morganellaceae ...... 26 A.6. Sensibilité aux antibiotiques chez les Morganellaceae ...... 27 B. Les antibiotiques : un outil de lutte contre les bactéries...... 30 B.1. Usage des antibiotiques ...... 30 B.1.1. Chez l’homme ...... 30 B.1.2. Chez l’animal ...... 33 B.2. Quels sont les risques sanitaires pour l’homme et l’animal ? ...... 35 B.3. Quelle législation pour les antibiotiques ? ...... 37 B.4. Rester vigilant : l’importance d’un réseau de surveillance ...... 38 C. L’antibiorésistance chez les Morganellaceae : mécanismes et diffusion ...... 41 C.1. La résistance intrinsèque ...... 42 C.2. La résistance acquise grâce aux éléments génétiques mobiles ...... 43 C.2.1. Les plasmides ...... 45 C.2.3. Les intégrons, les séquences d’insertion et les transposons ...... 48 C.2.4. Les îlots génomiques ...... 51 C.2.4.1. Eléments intégratifs conjugatifs : les îlots génomiques SXT ...... 51 C.2.4.2. Eléments intégratifs mobilisables : Salmonella et Proteus Genomic Islands ...... 54 C.2.4.3. Eléments intégratifs et mobilisables en cis ...... 67

6 Deuxième partie : Étude expérimentale...... 68 A. Problématique et objectifs de travail...... 69 B. Résultats ...... 73 B.1. Les éléments intégratifs mobilisables de multirésistance aux antibiotiques SGI1 et PGI1 chez Proteus mirabilis, une étude chez l’homme et le chien en France, 2010-13...... 73 B.2. Détection d’éléments SGI1 et PGI1 et de résistances aux céphalosporines à large spectre chez les Morganellaceae d’origine animale en France...... 88 B.3. Séquences complètes de plasmides porteurs de qnrD chez Proteus spp. d’origine animale en France...... 104 B.4. L’îlot génomique de multirésistance aux antibiotiques SGI1 chez une souche clinique humaine de Morganella morganii subsp. morganii, France...... 110 B.5. Un regard sur le passé : étude d’une collection de Morganellaceae 1992-2000...... 117 Discussion et perspectives...... 121 Résumé ...... 170 Abstract...... 170

7 Liste des tableaux

Tableau 1 : Quelques caractéristiques biochimiques permettant l'identification des Morganellaceae...... 22

Tableau 2 : Résistance intrinsèque chez quelques espèces de Morganellaceae (d'après EUCAST intrinsic resistance and exceptional phenotypes, 2016) ...... 43

Tableau 3 : Caractéristiques des souches de P. mirabilis SGI1 et PGI1 positives...... 118

8 Liste des figures

Figure 1 : L'usage d'antibiotique exerce une pression de sélection qui permet l'émergence de bactéries résistantes (adaptation d’après Mulvey & Simor, 2009)...... 15

Figure 2 : Photographie d'une boîte de pétri contenant une culture de P. mirabilis ...... 21

Figure 3 : Évolution de la consommation de β-lactamines entre 2009 et 2014 (d’après Réseau de surveillance ATB Raisin, 2014)...... 33

Figure 4 : Mortalité estimée en 2050 due à des infections par bactéries résistantes aux antibiotiques (d’après WHO Report, 2014) ...... 42

Figure 5 : Intégration des éléments génétiques mobiles selon le principe des poupées russes (d'après Amabile-Cuevas & Chicurel, 1992) ...... 44

Figure 6 : Structure d'un intégron et d'une cassette de résistance (d'après Gillings et al., 2014) ...... 49

Figure 7 : Les Séquences d'insertion ...... 50

Figure 8 : Organisation génétique de SGI1 (d'après Boyd et al., 2001)...... 56

Figure 9 : Vue schématique de l'intégron complexe de classe 1 du variant SGI1-V (d’après Siebor & Neuwirth, 2011)...... 58

Figure 10 : Vue schématique de l'intégron complexe de classe 1 du variant SGI1-X (d’après Lei et al., 2014) ...... 58

Figure 11 : Vue schématique de SGI1-Z et comparaison de la région MDR de SGI1-Z avec la structure du squelette In4-like du plasmide pBDE0502 d’E. coli (d’après Qin et al., 2015). .. 59

9 Figure 12 : SGI1 est un élément intégratif (d’après Doublet et al., 2005)...... 61 Figure 13 : Comparaison du backbone de PGI1 avec SGI1 et l'îlot de Salmonella Heidelberg SL476 (Siebor & Neuwirth, 2014)...... 63

Figure 14 : Vue schématique du squelette de l'IME PGI1-PmPEL (d'après Girlich et al., 2014) ...... 64

Figure 15 : Vue schématique de la région MDR du variant PGI1-PmPEL et comparaison avec le plasmide pM131 de A. baumannii, le plasmide pNDM-1 Saitama de K. pneumoniae, la région MDR du variant SGI1-V de P. mirabilis, la région MDR du variant SGI1-O de P. mirabilis et la région MDR du variant SGI1-K5 de S. enterica (Girlich et al., 2014)...... 65

Figure 16 : Vue schématique du variant PGI1 décrit par Mac Aogáin (d’après Mac Aogáin et al., 2016) ...... 66

Figure 17 : Vue schématique de la région MDR du variant PGI1-PmESC (d'après Siebor et al., 2016) ...... 66

Figure 18 : Schéma représentatif du variant SGI1 de la souche Proteus mirabilis N° 11819 ...... 119

10 Liste des annexes

Annexe 1 : Variants de l’îlot génomique SGI1...... 161

11 Abréviations

AMM : Autorisation de Mise sur le Marché

ANSES : Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l’alimentation, de l’environnement & du travail

ANSM : Agence Nationale de Sécurité du Médicament

BLSE : β-Lactamase à Spectre Etendu

ICE : Integrative and Conjugative Element

IME : Integrative Mobilizable Element

Inc : Incompatibilité

InVS : Santé Publique France

IS : Insertion Sequence (Séquence d'Insertion)

IR : Inverted repeat (Séquence répétée inversée)

MDR : Multi-Drug Resistant

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

ORF : Open Reading Frame pBRT : plasmid Based Replicon Typing

PCR : Polymerase Chain Reaction

PGI1 : Proteus Genomic Island 1

SGI1 : Salmonella Genomic Island 1

12 Introduction

13 « A post-antibiotic era—in which common infections and minor injuries can kill—far from being an apocalyptic fantasy, is instead a very real possibility for the 21st century. »

(Keiji Fukuda, 2014)

La résistance aux antibiotiques est aujourd’hui un problème majeur de santé publique

à l’échelle mondiale. Le dernier rapport de l’Organisation Mondial de la Santé (OMS) dresse

à ce sujet un bilan alarmant : l’évolution des résistances aux antibiotiques continue de croître et n’épargne aucun pays, au point que l’absence de traitement efficace contre certaines infections est désormais une réalité (WHO Report, 2014). Pourtant à ses débuts au XXème siècle, l’usage des antibiotiques a été une vraie révolution médicale qui a permis de guérir des infections graves et de sauver de nombreuses vies. En ces temps, l’apparition de résistance aux antibiotiques n’était qu’un fait de laboratoire isolé qui était peu représenté au sein de la population des malades. De plus, jusque dans les années 1970, de nombreuses nouvelles molécules actives ont été découvertes et sont venues réapprovisionner un arsenal thérapeutique que nous utilisons toujours à l’heure actuelle. Malheureusement, il devient de plus en plus difficile de trouver de nouveaux antibiotiques. Sachant qu’il faut en moyenne une quinzaine d’années entre la découverte et la mise sur le marché effective d’une nouvelle molécule anti-infectieuse, l’apparition de résistance aux antibiotiques chez les bactéries devient problématique lors de cette « course à l’armement ». Pour autant, les antibiotiques à notre disposition ont été largement utilisés en médecine humaine et vétérinaire. Mais employé

à mauvais escient, cela a accéléré l’émergence et la diffusion de résistance à ces mêmes antibiotiques.

14 Figure 1 : L'usage d'antibiotique exerce une pression de sélection qui permet l'émergence de bactéries résistantes (adaptation d’après Mulvey & Simor, 2009).

Le succès de cet accroissement des bactéries résistantes aux antibiotiques peut s’expliquer par la forte plasticité du génome bactérien. Cette dernière a conduit à des

évolutions des génomes grâce à des mutations des supports moléculaires porteurs des gènes de résistance aux antibiotiques. Cela a généré l’acquisition de nouveaux gènes de résistances.

Ainsi, ces mutations sont un avantage pour la survie et la reproduction, permettant ainsi à la bactérie porteuse de cet avantage de se multiplier plus facilement et de transmettre les mutations à sa descendance. L’utilisation d’antibiotiques va ainsi exercer une pression de sélection qui va encourager l’émergence de résistance spécifique à cet antibiotique (Figure 1).

Ils existent différents supports moléculaires porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques qui seront abordés dans l’étude bibliographique. Dans le cadre de ce travail de thèse, l’accent a été mis sur les supports porteurs de résistances d’intérêt (β-lactamases à spectre étendu, céphalosporinases de haut niveau, gènes de résistance aux quinolones) tels que les plasmides mais aussi les îlots génomiques de multi-résistance aux antibiotiques de type Salmonella

Genomic Island 1 (SGI1). En effet, SGI1 constitue un modèle de choix pour l’étude de l’émergence et de la dissémination des résistances aux antibiotiques.

Initialement mise en évidence chez Salmonella enterica, la mobilité de cet îlot a été démontrée en laboratoire et sa découverte sur le terrain chez une autre entérobactérie, Proteus mirabilis, vient appuyer la capacité qu’a ce type de support de gènes de résistance à se disséminer dans les populations bactériennes. De plus, la forte variabilité des résistances aux 15 antibiotiques portées par SGI1 présente un intérêt tout particulier pour une espèce bactérienne telle que P. mirabilis, qui n’est pas décrite comme étant un pathogène à surveiller en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques. En effet, plus d’une trentaine de variants différents de SGI1 ont déjà été décrits, dont certains, identifiés chez P. mirabilis, présentent des gènes de résistance à des antibiotiques majeurs tels que la β-lactamases à spectre étendu (BLSE) blaVEB-6 ou les carbapénèmases. Acquérir un îlot SGI1 permettrait ainsi à P. mirabilis de passer du simple statut de bactérie opportuniste au statut de bactérie multirésistante. De ce fait, au lieu de causer des infections souvent bénignes et facilement traitables, ces bactéries pouraient potentiellement déclencher des bactériémies beaucoup plus compliquées à traiter, voire provoquer la mort. Ainsi, en l’absence de données, il est intéressant d’étudier plus en détails la prévalence et la diffusion de tels îlots génomiques au sein de la famille des

Morganellaceae, dont P. mirabilis, sur le territoire français et cela à la fois chez l’homme mais aussi chez l’animal. Découvrir l’histoire commune de P. mirabilis et des îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques nous permettra alors de tirer des conclusions utiles afin de mettre éventuellement en lumière de nouvelles pistes dans la lutte de la diffusion de ces gènes de résistance.

16 Première partie :

Étude bibliographique

17 A. La famille des Morganellaceae

A.1. Les membres de la famille des Morganellaceae, qui sont-ils ?

La famille des Morganellaceae (Adeolu et al., 2016) regroupe les genres Proteus

(Hauser, 1885), Morganella (Fulton, 1943), Providencia (Ewing, 1962), Arsenophonus

(Gherna et al., 1991), Cosenzaea (Giammanco et al., 2011), Moellerella (Hickmann-Brenner et al.,1984), Photorhabdus (Boemare et al., 1993) et Xenorhabdus (Thomas & Poinar Jr,

1979). Dans le cadre de ce travail de thèse, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à trois genres qui forment ce qui anciennement était appelé la tribu des Proteae :

Proteus, Morganella et Providencia.

Six espèces du genre Proteus sont citées dans les Approved Lists of Bacterial Names

(1989) : Proteus inconstans, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Proteus myxofaciens,

Proteus rettgeri et Proteus vulgaris. La nomenclature de Proteus inconstans n’est pratiquement plus utilisée car les différentes souches de cette espèce se sont avérées être des souches de Providencia alcalifaciens (Ewing, 1962).

Parmi les autres espèces citées dans les Approved Lists, Proteus morganii est un synonyme homotypique de Morganella morganii et Proteus rettgeri est un synonyme homotypique de Providencia rettgeri (Brenner et al., 1977). Deux espèces sont dites homotypiques si elles ont la même souche type. En fait, les études d’homologies ADN-ADN montrent que Proteus morganii doit être exclu du genre Proteus et que Proteus rettgeri est plus proche de Providencia stuartii que de Proteus mirabilis et de Proteus vulgaris (Brenner et al., 1978). Par ailleurs, il a été suggéré que Proteus myxofaciens soit reclassé au sein d’un autre genre et soit renommé Cosenzaea myxofaciens (Giammanco et al., 2011).

18 Le genre Plesiomonas a également été rapproché du genre Proteus sur la base d’études phylogénétiques (analyses des séquences des ARNr 16S et ARNr 5S). En 1985, MacDonell &

Colwell ont même proposé de donner le nom de Proteus shigelloides à l’unique espèce du genre Plesiomonas, Plesiomonas shigelloides. Toutefois, cette nouvelle nomenclature n’a jamais été validée officiellement.

Actuellement, le genre Proteus comporte donc quatre espèces : Proteus hauseri,

Proteus mirabilis, Proteus penneri et Proteus vulgaris, ainsi que trois genomospecies encore non baptisées (Proteus genomospecies 4, 5 et 6) (O’Hara et al., 2000).

Le genre Providencia regroupe également cinq espèces : Providencia alcalifaciens

(Ewing, 1962), Providencia heimbachae (Müller et al., 1986), Providencia rettgeri (Brenner et al., 1978), Providencia rustigianii (Hickman-Brenner et al., 1983) et Providencia stuartii

(Ewing, 1962).

Enfin, le genre Morganella consiste quant à elle à une espèce unique, Morganella morganii avec deux sous-espèces, morganii et sibonii (Jensen et al., 1992).

Chacune de ces espèces bactériennes possèdent ses points communs et ses différences qui seront détaillés dans les paragraphes suivants, avec un accent qui sera tout particulièrement mis sur le genre Proteus et l’espèce P. mirabilis.

A.2. Portraits de famille : les caractéristiques des Proteus

Les Proteus sp. sont des bactéries à Gram négatif très généralement mobiles, polymorphes et mesurent de 0,4 à 0,8 µm de diamètre sur 1 à 80 µm de longueur (Abbott,

2007).

19 Les Proteus tiennent leur nom de la divinité grecque Protée dont le récit relaté en outre dans l’Odyssée d’Homère montre qu’il avait la capacité de se métamorphoser pour échapper à ses poursuivants. Ainsi, le nom Proteus a été utilisé la première fois par Hauser en 1885 pour décrire une bactérie isolée de viande en putréfaction et qui pouvait changer d’aspect. En effet, en milieu liquide, cette bactérie est sous forme « nageuse » et se présente alors comme un court bacille de 1 à 3 µm pourvus de 6 à 10 flagelles. En milieu solide cependant, Proteus se transforme et devient « rampant », on parle alors d’un phénomène d’ « essaimage » (ou

« swarming » en anglais) (Belas, 1992). Ensemencées au centre d’une boite de milieu gélosé, les bactéries se multiplient pour donner une colonie. Quand le milieu s’épuise, on voit apparaître des bactéries de formes longues, fortement mobiles, aptes à se déplacer à la surface du milieu afin de coloniser un endroit de la gélose riche en nutriments. Elles donnent alors naissance à des bactéries de formes courtes et faiblement mobiles mais l’appauvrissement progressif du milieu provoquera à nouveau l’apparition de bactéries de formes longues qui repartiront vers des zones de milieu neuf. Ces cycles périodiques de migration, dus à la transcription d’une série de gènes (40 à 60 gènes seraient impliqués) se traduisent par la formation caractéristique de halos de culture concentriques (Figure 2).

Le « swarming » requiert une réelle transformation des bactéries. Les cellules peuvent s’allonger jusqu’à 80 µm, elles deviennent polyploïdes (par exemple, les formes de 40 µm de longueur contiennent environ 20 chromosomes), leur membrane externe devient plus fluide, le lipopolysaccharide (LPS) possède des chaînes latérales plus longues, la synthèse d’uréase, de protéase et d’hémolysine extracellulaire augmente et elles sont pourvues d’une abondante ciliature (de plusieurs centaines à plusieurs milliers de flagelles) (Rather, 2005).

Le « swarming » est également un phénomène collectif et coordonné car une cellule isolée est incapable d’essaimer à la surface d’une gélose. L’induction du « swarming » est

20 déclenchée par des facteurs inhibant la rotation des flagelles (telle que l’augmentation de la viscosité du milieu) et par la présence de signaux extracellulaires (Morgenstein et al., 2010).

De ce point de vue, la glutamine semble jouer un rôle important. En effet, dans un milieu minimum, la glutamine est le seul acide aminé capable d’initier la transformation des bactéries en formes longues pourvues d’une forte ciliature. Des mutants incapables de coder pour le système de transport de la glutamine ont un comportement analogue aux souches sauvages ce qui montre bien que l’induction par la glutamine est indépendante du système de transport de cet acide aminé (Hernandez et al., 1999). Ainsi, il semble que les flagelles se comportent comme des structures capables d’analyser les conditions du milieu ambiant et de transmettre des signaux à la bactérie.

Les capacités à générer le « swarming » sont variables selon les espèces et les souches.

Le « swarming » est peu prononcé chez P. penneri et il peut ne pas exister avec certaines souches de P. mirabilis et P. vulgaris qui forment alors soit un voile continu car l’envahissement de la gélose ne présente aucune périodicité, soit des colonies parfaitement isolées (absence totale d’envahissement).

Au final, cette capacité à ramper sur les surfaces est donc un avantage non négligeable pour les Proteus dans leur processus de colonisation de leur milieu.

Figure 2 : Photographie d'une boîte de pétri contenant une culture de P. mirabilis. 21 Par ailleurs, les caractères biochimiques d’identification les plus couramment rencontrés sont présentés dans le Tableau 1 et permettent de différencier chaque espèce de

Proteus (Zunino et al., 1999). Un caractère positif pour 90% des souches ou plus, est observé pour les tests tryptophane désaminase, phénylalanine désaminase, uréase, rouge de méthyl croissance dans un bouillon au KCN (cyanure de potassium) et acidification du glucose. Plus de 90 % des souches de P. mirabilis et Cosenzaea myxofaciens (anciennement Proteus myxofaciens) sont gélatinase positive et produisent du gaz lors de la fermentation du glucose.

En ce qui concerne P. penneri et P. vulgaris environ 56 % des souches sont gélatinase positive et environ 45 % des souches de P. penneri et 86 % des souches de P. vulgaris produisent du dioxide de carbone lors de la fermentation du glucose. Une réponse négative pour 90 % des souches ou plus est obtenue avec les tests ONPG (ortho-nitrophényl-β- galactoside), LDC (lysine décarboxylase), ADH (arginine dihydrolase), fermentation de l’adonitol, du L-arabinose, du D-arabitol, du cellobiose, du dulcitol, de l’érythritol, du myo- inositol, du lactose, du D-mannitol, du D-mannose, du mélibiose, du mucate, du D-sorbitol, du raffinose et du L-rhamnose.

P. mirabilis P. vulgaris P. penneri M. morganii Providencia Fermentation du glucose + + + + + Réduction des nitrates en + + + + + nitrites Métabolisme du tryptophane en - + - + + indole Ornithine décarboxylase + - - + - H2S + + - - - Uréase - + + + + (P. rettgerii +) Tableau 1 : Quelques caractéristiques biochimiques permettant l'identification des

Morganellaceae.

22 Ainsi, la majorité des souches de Morganellaceae donne une réponse positive aux tests suivants :

- Uréase (à l’exception de Providencia alcalifaciens, Providencia heimbachae,

Providencia rustigianii, 70% des souches de Providencia stuartii, 14% des

souches de P. vulgaris et 2% des souches de P. penneri.)

- Rouge de méthyle (à l’exception de 14% des souches de Morganella morganii

subsp. sibonii, de 15% des souches de Providencia heimbachae, de 35% des

souches de Providencia rustigianii et de 14% des souches de P. vulgaris.)

- Croissance dans le milieu Braun au KCN (à l’exception de 21% des souches de

Morganella morganii subsp. sibonii, de 92% des souches de Providencia

heimbachae, de 2% des souches de P. penneri et de 10% des souches de Proteus

genomospecies 6.)

- Mobilité à 36°C (à l’exception de 54% des souches de Providencia heimbachae,

de 70% des souches de Providencia rustigianii, de 11% des souches de P. penneri,

de 43% des souches de P. vulgaris, de 6% des souches de Proteus genomospecies

5, et de la majorité des souches de Morganella morganii subsp. morganii)

En ce qui concerne les caractères culturaux, sur les géloses nutritives ou sur géloses au sang incubées à 37°C, P. mirabilis, P. vulgaris et parfois P. penneri peuvent envahir la surface des milieux en formant soit des halos de culture en ondes concentriques soit, lorsque l’envahissement est moins important, en donnant des images en hérisson ou en fil barbelé.

Sur les milieux d’isolement classiquement utilisés pour les entérobactéries, les colonies sont proches de celles du genre Salmonella. Ces milieux contiennent des substances destinées à inhiber l’envahissement par les Proteus sp. qui empêcherait l’isolement des autres bactéries. Sur gélose Salmonella-Shigella, les colonies de P. mirabilis, de P. penneri et de P.

23 vulgaris sont incolores avec ou sans centre noir. Les colonies dépourvues de centre noir sont fréquentes avec P. penneri. Sur gélose désoxycholate-citrate-lactose, P. mirabilis et P. vulgaris donnent des colonies incolores au centre noir alors que les colonies de P. penneri sont souvent dépourvues de centre noir. Sur gélose Hektoen, les colonies ont une coloration saumon et un centre noir ou elles sont bleues avec ou sans centre noir. Sur gélose de Drigalski aux sels biliaires, les colonies sont bleutées, peu irisées et plates. En milieu liquide, la croissance se traduit par un trouble abondant avec parfois un voile en surface et un dépôt.

Dans les milieux d’enrichissement utilisés pour les salmonelles (milieu au sélénite de Leifson ou milieu tétrathionate de Müller-Kauffmann) et incubés à 37°C, les Proteus sp. ont une croissance comparable à celle des Salmonella sp. Par contre, lorsque ces milieux sont incubés

à 42 ou 43°C, leur croissance est inférieure à celle des salmonelles (Carbonelle et al., 1987 ;

Pilet et al., 1979).

A.3. Où trouver les Morganellaceae ?

A l’exception de C. myxofaciens et P. hauseri, les microorganismes du genre Proteus sont largement répandus dans l’environnement naturel, cela incluant les eaux souillées, les sols, et le fumier (Drzewiecka, 2016). Du fait de leur activité protéolytique, leur habilité à hydrolyser l’urée en ammoniaque et en dioxyde de carbone, ainsi que la déamination oxydative des acides aminés, ces bactéries sont impliquées dans la décomposition des matières organiques d’origine animales. De plus, ces bactéries sont également des commensaux du tractus digestif chez l’homme et l’animal (souris, rats, chiens, chats, bovins, porcins, oiseaux, reptiles...). On remarque toutefois que P. mirabilis est plus fréquemment isolé chez les canidés, les bovins et les oiseaux, alors que P. vulgaris est plus souvent retrouvé chez les porcins et les vertébrés à sang froid.

24 P. myxofaciens n’a été isolé que des adultes et des larves du papillon zigzag

(Porthétrica dispar) lors d’épidémie observées aux États-Unis (états de New-York et du

Connecticut). L’habitat et le pouvoir pathogène de P. hauseri sont inconnus. Les deux souches décritent par O’Hara., et al (2010) ont une origine inconnue.

A.4. Infections par les Proteus

La présence naturelle des Proteus dans le tractus digestif des mammifères et l’environnement facilitent la contamination opportuniste qui amène à un phénomène infectieux. Les espèces du genre Proteus (P. mirabilis à 90%) sont souvent responsables d’infections symptomatiques des voies urinaires hautes et peuvent générer des urolithiases

(formation de cailloux dans les reins ou la vessie), des cystites et des pyélonéphrites aiguës

(Coker et al., 2000). En effet, après fixation aux parois et colonisation des voies urinaires, les bactéries libèrent de l’uréase dont la catalyse de l’urée va entrainer une diminution du pH des urines ce qui favorise la formation de calculs rénaux et vésicaux. De plus, ces infections peuvent aussi générer des bactériuries asymptomatiques, particulièrement chez les personnes

âgées (Matthews & Lancaster, 2011) et les patients diabétiques de type 2 (Papazafiropoulou et al., 2010).

De part leur présence naturelle dans le tube digestif, il est admis que la majorité des infections urinaires par Proteus résultent de l’ascension des bactéries depuis le tractus gastro- intestinal (O’Hara et al., 2000). Cette hypothèse est supportée par le fait que chez de nombreux patients souffrant d’infections urinaires, la souche de Proteus mise en cause est

également retrouvée dans des échantillons de selles du malade (Mathur et al., 2005).

En plus des infections du système urinaire, les Proteus peuvent causer des infections des voies respiratoires, des yeux, des oreilles, de la peau, de la gorge, des surinfections de

25 brûlures et plaies. Par ailleurs, des cas de bactériémie ont également été signalés dans le cadre de patients immunodéprimés, de même que des cas de septicémie (Kim et al., 2003). Enfin, certaines études ont montré un lien entre Proteus et l’arthrite rhumatoïde (Rashid & Ebringer,

2007).

Chez l’animal, les Proteus sp. sont responsables d’infections urinaires (chevaux, porcs, carnivores), d’endométrites (chevaux et bovins), de mammites (vaches), de diarrhées

(veaux, porcs), d’arthrites (veaux), de surinfections des plaies, ou encore d’otites externes

(notamment chez les carnivores où ils sont souvent isolés en association avec Pseudomonas aeruginosa ou avec des staphylocoques à coagulase positive).

A.5. Épidémiologie des Morganellaceae

Les infections imputables aux Morganellaceae sont observées partout dans le monde.

Ces bactéries sont souvent en cause dans les infections urinaires nosocomiales mais aussi acquises dans la collectivité. En Europe et en Amérique du Nord par exemple, entre 4 à 6 % des infections par Morganellaceae sont acquises dans le cadre de la collectivité, contre 3 à 6

% en milieu hospitalier (Abbott, 2007). Et de façon plus critique, P. mirabilis est la deuxième cause de bactériémie en France parmi les bactéries à Gram-négatif, se plaçant ainsi juste derrière E. coli et devant K. pneumoniae (Rapport d’activité 2015, ONERBA).

Les espèces du genre Proteus sont le plus souvent considérées comme pathogènes chez les enfants et opportunistes chez les personnes âgées et immunodéprimées (Coker et al.,

2000). Parmi ces derniers, le taux d’infection est supérieur, notamment chez les patients porteurs d’une sonde à demeure ou recevant une antibiothérapie fréquente (Ronald, 2003).

Les autres groupes à risque concernent les enfants prépubères, particulièrement chez les

26 garçons incirconcis. Le risque de développer une infection imputable à une Morganellaceae est aussi augmenté chez les patients présentant des anomalies structurelles des voies urinaires.

En ce qui concerne l’épidémiologie des Morganellaceae chez l’animal, la surveillance menée par le Réseau d’épidémiosurveillance de l’antibiorésistance des bactéries pathogènes animales (RESAPATH) nous permet de prendre une juste mesure de la situation. Le

RESAPATH surveille l’antibiorésistance des bactéries pathogènes animales en France. Il fonctionne en partenariat entre l’ANSES et des laboratoires départementaux publics ou privés participant volontairement au réseau. Dans son dernier bilan 2016, le RESAPATH a mis en

évidence que P. mirabilis est un pathogène privilégié des canidés. En effet, sur 12132 prélèvements bactériens cliniques chez le chien, 10% étaient des Proteus (n=1187) et concernaient majoritairement des otites (n= 478) ou des pathologies urinaires et rénales (n=

377). Ainsi, même si cette espèce bactérienne reste peu prévalente, elle n’en reste pas moins la quatrième espèce bactérienne la plus souvent isolée chez les chiens en 2016. Encore majoritairement multisensible, P. mirabilis présente néanmoins des proportions de résistance importantes à la streptomycine (33 %) et aux fluoroquinolones (3-13 % suivant la molécule observée). En parallèle, P. mirabilis peut présenter un phénotype BLSE ou de céphalosporinase hyperproduite, même si la prévalence reste faible (3 % de résistance au ceftiofur et 4 % à la cefquinome).

A.6. Sensibilité aux antibiotiques chez les Morganellaceae

Les souches indole-négative de P. mirabilis sont généralement plus sensibles aux antibiotiques que P. vulgaris, P. penneri et P. hauseri. P. mirabilis possède des résistances naturelles pour les furanes (nitrofurantoïne), les cyclines (tétracycline) et la colistine, mais est généralement sensible aux amino- et uréido-pénicilline (ampicilline, amoxicilline et

27 piperacilline), aux céphalosporines (céfazoline, céfoxitine, céfuroxime, céfotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, ceftizoxime et céfépime), aux aminoglycosides (amikacine, gentamicine et tobramycine), à l’imipénème, la ciprofloxacine et le triméthoprime- sulfaméthoxazole (Ronald, 1994 ; Fuchs et al., 1996 ; Thornsberry & Yee, 1996 ; Yao &

Moellering, 1999). Cependant, de hauts niveaux de résistance à la ciprofloxacine ont été décrits chez P. mirabilis et Providencia spp. dans des hôpitaux où cet antibiotique était utilisé sans restriction (Thomson et al., 1994).

P. penneri est généralement plus résistant à la pénicilline que P. vulgaris et son profil de résistance est plus proche de celui de M. morganii que de P. vulgaris. Ces Morganellaceae sont généralement sensibles à la céfoxitine, aux céphalosporines à large spectre (céfotaxime, ceftriaxone, ceftizoxime et ceftazidime), à la céfépime, à l’aztréonam, aux aminoglycosides, à la ciprofloxacine, au tazobactam et à l’imipénème (Fuchs et al., 1996 ; Yao & Moellering,

1999). Mais elles peuvent aussi être résistantes à la céfazoline, le cefprozile, le céfuroxime, le céfamandole, le cefdinir, le céfopérazone, la loracarbef, l’ampicilline et les uréidopénicillines

(Biedenbach & Jones, 1994).

P. rettgeri et P. stuartii sont généralement résistants à la gentamicine et la tobramycine mais sensibles à l’amikacine. Les isolats urinaires sont sensibles aux céphalosporines à large spectre par prise oral, cela incluant le céfaclor, le céfuroxime, le céfétamet, le céfpodoxime, la ciprofloxacine et l’amoxicilline-acide clavulanique (Cornaglia et al., 1995). Les Providencia spp. sont également sensibles à la thiénamycine, le ceftazidime, le céfotaxime, le ceftizoxime et le moxalactame. Une alternative dans le choix thérapeutique peut aussi inclure l’utilisation du ceftriaxone, de la mezlocilline, de l’imipénème et du triméthoprime-sulfaméthoxazole (Spach & Liles, 1999).

M. morganii est sensible à de nombreux antibiotiques d’usage courant, tels que le ceftazidime, le céfépime, l’aztréonam, l’imipénème, le tazobactam, la ciprofloxacine, la

28 tobramycine et la gentamicine. Les souches sont souvent résistantes aux céphalosporines de nouvelles générations, telles que le cefprozile, le céfuroxime, le loracarbef, le cefdinir et le céfétamet (Biedenbach et al., 1993). Par ailleurs, M. morganii possède des résistances intrinsèques à l’oxacilline, l’ampicilline, l’amoxicilline, la plupart des céphalosporines de première et seconde génération, aux macrolides, aux lincosamides, aux glycopeptides, à la fosfomycine, et à la colistine. Comme les souches de Providencia spp., les Morganella spp. sont capables de produire des β-lactamases.

D’une manière générale, les Morganellaceae sont capables d’acquérir de nombreuses résistances ce qui impose le recours à un antibiogramme. Les antibiotiques les plus souvent utilisés sont les quinolones, les aminosides et l’associaion triméthoprime-sulfaméthoxazole.

29 B. Les antibiotiques : un outil de lutte contre les

bactéries.

Un antibiotique est défini comme étant une substance qui peut être naturellement produite par des micro-organismes ou être synthétisée artificiellement et qui a la capacité d’enrayer la multiplication des bactéries (effet bactériostatique) ou de les détruire (effet bactériolytique).

En 2015 en France, 786 tonnes d’antibiotiques destinés à la santé humaine et 514 tonnes d’antibiotiques destinés à la santé animale ont été vendues (Joint Interagency

Antimicrobial Consumption and Resistance Analysis (JIACRA) Report, 2015).

B.1. Usage des antibiotiques

B.1.1. Chez l’homme

En médecine humaine, les antibiotiques sont considérés comme des médicaments.

C’est en 1929 qu’Alexander Fleming découvrit un antibiotique majeur : la pénicilline (Ligon,

2004). Mais ce n’est qu’à partir de 1941 que cette molécule fait son apparition à l’hôpital.

Depuis lors, les médecins prescrivent des antibiotiques afin de prévenir ou guérir des infections bactériennes.

Il est aussi important de faire la distinction entre l’usage des antibiotiques en ville

(pratique communautaire) de celle faite à l’hôpital. En 2015, plus de 90 % des antibiotiques ont été consommés en médecine de ville et 7 % en établissements de santé (ANSM, Evolution des consommations d’antibiotiques en France entre 2000 et 2015, Rapport 2017). Mais la facilité d’accès à des infrastructures d’analyses biologiques dans le milieu hospitalier permet

30 le plus souvent de prescrire au plus vite un traitement antibiotique adapté à chaque infection.

Ceci n’est pas toujours le cas en ville où les démarches sont parfois plus contraignantes et amène les malades à attendre plus longtemps avant de voir leur traitement réadapté. Ceci est d’autant plus problématique que 30 à 50% des prescriptions peuvent être inappropriées

(Willemsen et al., 2007). En effet, les prescriptions d’antibiotique devraient découler d’un diagnostic qui a été étayé par des analyses de prélèvements biologiques. Le plus souvent ces analyses consistent à l’isolement des bactéries présentes dans les prélèvements, leur mise en culture et la détermination de leurs résistances aux antibiotiques grâce à la technique de l’antibiogramme. Ces analyses prennent plusieurs jours et dans l’attente des résultats, les médecins prescrivent parfois un traitement de première intention (Haute Autorité de Santé,

Principes généraux et conseils de prescription des antibiotiques en premier recours, Rapport

2014). Cette antibiothérapie probabiliste pourra alors être adaptée selon les résultats des analyses biologiques. De plus, l’hôpital se réserve l’usage de certains antibiotiques de dernière intention car il est nécessaire de placer le patient sous surveillance à cause de certains effets secondaires.

En outre, les antibiotiques ne sont pas des médicaments comme les autres. Leur utilisation n’a pas pour vocation de soigner un symptôme ou guérir une maladie non- infectieuse mais a pour but de détruire des bactéries. Après introduction dans l’organisme, l’antibiotique va alors cibler toutes les bactéries, qu’elles soient commensales ou pathogènes.

L’usage d’un tel traitement ne doit donc pas se faire de manière anodine et le corps médical est encouragé à avoir un « juste usage » des antibiotiques pour minimiser l’apparition de nouvelles résistances (InVS, Rapport d’élaboration : Principes généraux et conseils de prescription des antibiotiques en premier recours. 2014). Pour se faire, les médecins doivent mettre dans la balance plusieurs facteurs dans leur choix de prescription d’antibiotique : les bénéfices à court terme pour le patient, les effets néfastes pour la flore commensale 31 (Jakobsson et al., 2010) et les effets néfastes pour l’écologie bactérienne de par la sélection de bactéries multirésistantes.

Il est donc primordial de veiller à ne pas faire de mésusage des antibiotiques. Le mésusage des antibiotiques peut correspondre à l’une des situations suivantes (Gyssens et al.,

1992) :

- antibiotiques prescrits inutilement,

- mise en route du traitement antibiotique approprié retardée pour des patients présentant une infection grave,

- antibiotiques à large spectre utilisés trop souvent, ou antibiotiques à spectre étroit mal utilisés,

- posologie d’antibiotique trop faible (patient obèse) ou trop élevée (risque toxique),

- durée du traitement antibiotique trop courte ou trop longue,

- traitement antibiotique non réévalué en fonction des résultats microbiologiques et de l’évolution clinique.

L’enjeu d’une meilleure pratique dans la prescription des antibiotiques en médecine humaine est capital. Entre 2008 et 2012, la consommation d’antibiotiques a augmenté de

7,2% dans les établissements de santé (ATB-RAISIN, cohorte de 565 établissements). Cela est d’autant plus inquiétant que la consommation des céphalosporines de 3ème génération a progressé en moyenne de 33% (Figure 3).

32 Figure 3 : Évolution de la consommation de β-lactamines entre 2009 et 2014 (d’après Réseau de surveillance ATB Raisin, 2014).

B.1.2. Chez l’animal

En 2015, 96 % des antibiotiques prescrits en médecine vétérinaire sont consommés par les animaux destinés à la consommation humaine et 4 % par les animaux domestiques

(ANSES, Suivi des ventes d’antibiotiques vétérinaires, Rapport 2016).

Il existe deux types d’utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire et en

élevage : l’utilisation thérapeutique et l’utilisation zootechnique.

Tout d’abord, l’usage thérapeutique, qui utilise principalement les mêmes classes d’antibiotiques que celles utilisées en médecine humaine, peut poursuivre 3 buts (Schwarz et al., 2001) :

33 - un but curatif :

L’animal sujet à une infection bactérienne est déclaré cliniquement malade. L’objectif est donc de le soigner et le guérir afin d’éviter la mort de l’animal. Le traitement antibiotique à forte dose vise alors à détruire les bactéries responsables de l’infection. L’éthique impose

également l’usage curatif des antibiotiques pour réduire la souffrance de l’animal et favoriser son bien-être. Ce n’est qu’à son rétablissement que l’animal sain pourra alors à nouveau fournir des denrées alimentaires sans risque pour la santé du consommateur.

- un but prophylactique :

Dans ce cas là, l’animal n’est pas cliniquement malade mais il est exposé à certains facteurs de risque tels que le sevrage ou le transport. La probabilité de développer une maladie à court terme est alors très forte. L’utilisation prophylactique des antibiotiques à faible dose comme traitement préventif permet alors à la maladie de ne pas s’exprimer. Par exemple, il est d’usage de procéder à un traitement prophylactique dans les cas de figure suivants : chez les porcelets lors du sevrage car c’est une période propice aux épisodes diarrhéiques, chez les vaches laitières lors du tarissement (période de quelques semaines avant une nouvelle mise- bas, pendant laquelle l'éleveur interrompt la traite) car il y a un risque élevé de développer des mammites (une inflammation de la mamelle)… Cependant, il est important que l’intérêt pratique sur le terrain de procéder à ces traitements prophylactiques reste raisonnable pour

éviter la sélection des bactéries résistantes.

- un but métaphylactique :

Dans un élevage avec de grands effectifs, il peut arriver qu’une infection contagieuse se déclare chez quelques individus. Si cette infection a pour responsable une bactérie, l’usage métaphylactique vient en prévention traiter l’ensemble des animaux, qu’ils soient ou non

34 cliniquement malades à ce moment, pour une plus grande efficacité de traitement. La métaphylaxie, ou traitement de contrôle, est généralement mise en place dès que 10 à 15 % des animaux d’un même lot sont malades.

La prise des antibiotiques chez l’animal se fait le plus souvent via l’alimentation ou l’eau de boisson car c’est une façon rapide et simple pour traiter le plus grand nombre d’animaux en même temps et cette pratique reste sous la surveillance d’un vétérinaire.

Ensuite, l’usage zootechnique consiste à utiliser les antibiotiques comme facteurs de croissance. En effet, administré à faible dose, certains antibiotiques peuvent permettre aux animaux d’élevage de prendre jusqu’à 10% de poids en plus lors de leur croissance. L’unique but de cet usage est la rentabilité, l’animal grossissant plus en mangeant moins. Cependant depuis 2006, l’usage d’antibiotiques en vue d’améliorer la croissance et les performances des animaux, toutes espèces confondues, est formellement interdit dans l’Union Européenne

(Directive 96/22/CE modifiée par les Directives 2003/74/CE et 2008/97/CE). Cet usage est en revanche toujours autorisé en Amérique du Nord et du Sud et dans certains pays d’Asie.

Cependant, les mentalités commencent à changer comme ce fut le cas pour la Chine en novembre 2016 quand le ministère chinois pour l’agriculture a banni l’usage de la colistine comme facteur de croissance.

B.2. Quels sont les risques sanitaires pour l’homme et l’animal ?

De manière générale, la prise de médicaments n’est pas sans risque. Les antibiotiques ne font pas exception à cette règle.

En médecine humaine, les risques d’effets secondaires des antibiotiques sont étudiés lors de la démarche d’autorisation de mise sur le marché de la molécule. Les risques les plus 35 courants sont des réactions allergiques (Legendre et al., 2014). Par exemple, l’allergie à la pénicilline et ses dérivés fait partie des allergies aux antibiotiques les plus courantes

(Bhattacharya, 2010). L’autre risque est celui de l’échec thérapeutique lors de l’infection par des bactéries multirésistantes aux antibiotiques. En effet, selon l’étude Burden BMR (2012), conduite en France, il y a 158 000 cas d’infections à bactéries résistantes aux antibiotiques par an dans les établissements de santé dont 16 000 infections invasives (infections graves : méningites, bactériémies/septicémies) et 12 500 décès par an directement associés à ces infections. La menace est donc bien réelle.

En médecine vétérinaire, il est possible que l’utilisation régulière d’antibiotiques dans les élevages affaiblisse les défenses naturelles de l’animal au niveau de sa flore intestinale et par la même occasion favorise l’occurrence d’infections opportunistes. Par ailleurs, le monde animal n’est pas non plus épargné par l’échec thérapeutique (Teuber, 2001). A force d’utilisation, certains antibiotiques peuvent exercer une telle pression de sélection que l’émergence de bactéries résistantes est accrue. Ces résistances sont d’autant plus critiques que la plupart du temps, le traitement antibiotique est prescrit sans avoir connaissance des résultats des analyses par antibiogrammes. Cependant, un décret de 2016 a mis un frein ce genre de pratique en ce qui concerne les antibiotiques critiques. Ainsi, les médicaments contenant une ou plusieurs substances antibiotiques d’importance critique listées par arrêté sont interdits en médecine vétérinaire pour un usage préventif. Pour les autres usages (curatif ou métaphylaxique), ils peuvent être prescrits sous conditions, ou interdits. Mais les conditions pour leur prescription sont la réalisation d’un examen clinique et l’obtention de résultats de laboratoire indiquant que la souche bactérienne identifiée n’est sensible qu’à cette substance antibiotique d’importance critique (Décret n° 2016-317 https://www.legifrance.gouv.fr/eli/decret/2016/3/16/AGRG1515288D/jo/texte).

36 B.3. Quelle législation pour les antibiotiques ?

La mise sur le marché, la prescription et l’usage des antibiotiques en médecine humaine et animale sont régis par de nombreuses lois et décrets, au niveau national mais

également européen.

Pour pouvoir être commercialisé et utilisé en médecine humaine et animale, un antibiotique doit obtenir une autorisation de mise sur le marché (AMM). Cette autorisation est délivrée par les autorités compétentes européennes (Commission européenne, après avis de l’Agence Européenne du Médicament) ou nationales (Agence Nationale de Sécurité du

Médicament et des produits de santé pour l’Homme, Agence Nationale du Médicament

Vétérinaire pour l’animal).

En plus de l’obtention de l’AMM, il est nécessaire, en ce qui concerne l’usage vétérinaire en élevage, de respecter un délai d’attente entre l’usage de l’antibiotique et la mise en vente pour consommation de l’animal ou de ses productions (œufs, lait). Cette mesure protège les consommateurs d’une exposition à de possibles résidus d’antibiotiques dans la viande et les produits dérivés de la production animale. Par ailleurs, il existe également une législation européenne qui vise à contrôler et limiter ces résidus. Ainsi, il a été fixé des limites maximales de résidus (LMR) antibiotiques, seuils au-delà desquels les denrées alimentaires d’origines animales ne sont plus acceptables pour la consommation.

De plus, depuis fin 2014, la loi n° 2014-1170 d’avenir pour l’agriculture, l’alimentation et la forêt a été votée en France. Cette loi a pour but de réglementer l’utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire et en élevage afin de favoriser un usage raisonné et pour limiter la prescription d’antibiotiques critiques à des traitements strictement de seconde intention qui ont été validées par des tests antibiogrammes. L’objectif est ainsi de ralentir

37 l’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques. Pour aider les professionnels, un guide des bonnes pratiques a été publié au journal officiel le 22 juillet 2015

(https://www.legifrance.gouv.fr/eli/arrete/2015/7/22/AFSP1517963A/jo/texte).

Cette loi s’est inscrite dans le plan pluriannuel EcoAntibio 2012-2016 mis en place par le ministère en charge de l’agriculture et qui espèrait réduire l’utilisation des antibiotiques de

25% dans le domaine vétérinaire. Dans les faits, le plan Ecoantibio a permis une diminution de 37 % de la consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire (ANSES - Suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2016, Rapport d’Octobre 2017 ; Le Plan Écoantibio 2012-2016 : Synthèse et principales réalisations). Ce plan est cohérent avec le troisième plan national d’alerte sur les antibiotiques 2011-2016 en médecine humaine qui a été conduit par le ministère en charge de la santé et qui a permis de lutter contre le développement de résistances aux antibiotiques et de limiter le nombre croissant de situations d'impasses thérapeutiques, ainsi qu’avec le plan d’action de la

Commission européenne pour combattre les menaces croissantes de la résistance aux antimicrobiens. Afin de consolider ces premiers résultats et soutenir les démarches de réductions de l’usage abusif des antibiotiques, il a été mis en place le plan EcoAntibio² 2017-

2021. Les objectifs globaux du plan EcoAntibio² sont d'évaluer les impacts du premier plan, d'en valoriser les résultats et de poursuivre la dynamique en consolidant les acquis et en poursuivant les actions précédemment engagées. EcoAntibio² vise également à maintenir dans la durée la tendance à la baisse de l'exposition des animaux aux antibiotiques.

B.4. Rester vigilant : l’importance d’un réseau de surveillance

En France, Santé Publique France (ex-InVS) coordonne la surveillance de la résistance bactérienne aux antibiotiques grâce à la collaboration de nombreux partenaires et réseaux.

38 Cette surveillance repose sur la coopération et le volontariat des laboratoires, qu’ils soient publics ou privés, dans des établissements de santé ou en ville. Parmi les différents acteurs de cette surveillance nous pouvons mettre en évidence :

- Les Centres Nationaux de Référence (CNR) : Nommés par arrêté du ministère de la santé, ces centres ont pour mission l’expertise, la surveillance, l’alerte et le conseil en ce qui concerne la microbiologie, la pathologie des agents infectieux et leur sensibilité.

- Le Réseau d’Alerte, d’Investigation et de Surveillance des Infections Nosocomiales

(RAISIN) : Ce réseau contribue à la surveillance de la résistance aux antibiotiques dans les

établissements de santé.

- L’Observatoire National de l’Epidémiologie de la Résistance Bactérienne aux Antibiotiques

(ONERBA) : Crée en 1997, cet observatoire fédère plus d’une quinzaine de réseaux de surveillance de la résistance bactérienne qui traitent avec des laboratoires d’analyses médicales de ville, des laboratoires hospitaliers, ou encore des laboratoires vétérinaires.

- European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) : Depuis janvier

2010, le Centre européen de prévention et de contrôle des maladies (ECDC) coordonne la surveillance au niveau européen de la résistance aux antibiotiques en santé humaine via l’EARS-Net. En 2014, 29 pays faisaient parti de ce réseau, dont la France.

- Le Réseau de Surveillance de l’Antibiorésistance des Bactéries Pathogènes Animales

(RESAPATH) : Crée en 1983 et contrairement aux autres acteurs décrits plus haut, ce réseau de surveillance s’intéresse aux bactéries pathogènes isolées uniquement chez l’animal. Sous la responsabilité de l’Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l’alimentation de l’environnement & du travail (ANSES), le RESAPATH a pour mission de récolter des informations à but statistique pour mesurer l’évolution générale de la résistance aux

39 antibiotiques chez l’animal. Il travaille en collaboration avec les laboratoires vétérinaires départementaux et analyse plus de 50 000 souches bactériennes issues de cas cliniques par an

(https://www.resapath.anses.fr/).

40 C. L’antibiorésistance chez les Morganellaceae :

mécanismes et diffusion

La résistance à un antibiotique donné est possible pour la bactérie qui possède un mécanisme de défense lui permettant de survivre et poursuivre sa multiplication malgré la présence dudit antibiotique. Est également résistante toute bactérie qui nécessite une utilisation d’antibiotique à une concentration toxique pour le patient afin d’obtenir un effet bactériostatique ou bactériolytique.

En 2011, un groupe de travail formé sous l’impulsion des CDC d’Europe et des États-

Unis a établi une classification des souches bactériennes selon leurs profils de résistance aux antibiotiques (Magiorakos et al., 2012). Ainsi, il est défini qu’une bactérie est dite :

- multi-résistante si elle résiste au minimum à une molécule de trois familles

d’antibiotiques différentes.

- extrêmement résistante si elle résiste à toutes les classes d’antibiotiques à

l’exception de deux au maximum.

- totalement résistante si elle a développé une insensibilité à toutes les classes

d’antibiotiques.

L’antibiorésistance est donc une menace majeure à ne pas négliger. En effet, les tendances et pronostics pour l’avenir prédisent une forte hausse au niveau mondiale de la mortalité humaine à cause de la résistance aux antibiotiques, placant ainsi l’antibiorésistance comme première cause de mortalité chez l’homme d’ici 2050 avec 10 millions de décès par an dans le monde entier (O’Neill, 2016) (Figure 4).

41 Figure 4 : Mortalité estimée en 2050 due à des infections par bactéries résistantes aux antibiotiques (d’après WHO Report, 2014).

Dans cette partie, l’accent sera placé sur la résistance aux antibiotiques chez les Morganellaceae et particulièrement P. mirabilis, avec un focus sur les éléments mobiles apportant une résistance acquise.

C.1. La résistance intrinsèque

La résistance intrinsèque, ou résistance naturelle, est due à une capacité ou une propriété structurale, biochimique ou physiologique innée chez la bactérie, indépendamment de tout contact avec l’antibiotique. Cette résistance est alors propre à l’espèce bactérienne.

Elle est stable et transmise à la descendance mais est peu ou pas transmissible horizontalement.

Un exemple de résistance intrinsèque consiste en un mécanisme d’efflux actif grâce à des pompes qui évacuent l’antibiotique hors de la bactérie et diminue ainsi la concentration cellulaire de ce dernier (Van Bambeke et al., 2000). Bien souvent, ces pompes sont capables de transporter différentes familles d’antibiotiques car elles possèdent une grande variété de substrats ; il s’agit alors de pompes dites « multirésistantes ». 42 Parmi les exemples les plus connus de résistance intrinsèque chez les Morganellaceae, il existe :

- chez M. morganii : résistance aux β-lactamines telles que la pénicilline et l’ampicilline et à la combinaison amoxicilline/ acide clavulanique (Stock I & Wiedemann B., 1998)

- chez Proteus sp : résistance à la tétracycline, la tigecycline, la nitrofurantoïne, la polymyxine

B et la colistine (Stock I, 2003)

Le tableau ci-dessous regroupe les résistances intrinsèques les plus communes chez quelques espèces de Morganellaceae : Colistine Céfazdine, Céfalotine, Céfalixine, Sulbactame Céfadroxile Tigécycline Ampicilline Céfuroxime Tétracyclines Ampicilline + Polymixine B, Amoxicilline + Nitrofurantoine Acide clavulanique M. morganii R RR R R R R R R P. mirabilis R R R R P. penneri R R R R R R R P. vulgaris R R R R R R R P. rettgeri R RR R R R R R R P. stuartii R RR R R R R R R

Tableau 2 : Résistance intrinsèque chez quelques espèces de Morganellaceae (d'après EUCAST intrinsic resistance and exceptional phenotypes, 2016)

C.2. La résistance acquise grâce aux éléments génétiques mobiles

Des éléments génétiques mobiles sont des fragments d’ADN considérés comme mobiles s’ils sont capables de se mouvoir, de se « transposer », au sein d’un même génome ou d’un génome bactérien à un autre. Ces éléments constituent la clé de la dissémination de la

43 résistance aux antibiotiques parmi les populations bactériennes (Partridge, 2011). Comme l’a montré Amabile-Cuevas et Chicurel en 1992, ces différents éléments mobiles sont capables de s’intégrer les uns dans les autres, un peu comme des poupées russes (Figure 5).

Figure 5 : Intégration des éléments génétiques mobiles selon le principe des poupées russes (d'après Amabile-Cuevas & Chicurel, 1992).

Les cassettes de résistance se retrouvent très souvent sur des intégrons, eux-mêmes présents sur des éléments transposables dits transposons. Ces derniers sont quant à eux intégrer au sein de plasmides ou d’îlots chromosomiques, formant ainsi les plus grandes structures capable d’accumuler des transposons et des intégrons et de les disséminer horizontalement.

Ces différents types d’éléments génétiques mobiles seront abordés dans les paragraphes suivants.

44 C.2.1. Les plasmides

En plus de l’ADN chromosomique, les procaryotes possèdent très souvent d’autres molécules d’ADN généralement circulaire ayant une taille de 2 à plusieurs centaines de kb : les plasmides. Cet ADN extra-chromosomique est une structure stable, capable de se répliquer de façon autonome et n’est pas nécessaire à la survie de la bactérie dans des conditions normales. Cependant, les plasmides peuvent porter des gènes codant des fonctions ou molécules d’intérêt critique pour la bactérie dans des conditions de vie particulière.

Techniquement, pour conserver cet avantage, le plasmide doit être capable de se répliquer, de gérer son nombre de copies au sein de la cellule, et se transmettre aux cellules filles lors de la multiplication cellulaire. Pour cela, les plasmides possèdent différents modules génétiques spécifiques. Classiquement, ces modules se retrouvent au nombre de quatre :

- un module de réplication qui code pour la machinerie essentielle à la réplication autonome du plasmide (Del Solar et al., 1998). A savoir que des plasmides ayant le même système de réplication ne peuvent pas cohabiter au sein de la même cellule, nous parlons alors d’incompatibilité (Novick, 1987). Cette incompatibilité a mené à une classification des plasmides par groupe d’incompatibilité (Inc).

- un module de stabilité qui permet d’assurer la bonne ségrégation des plasmides en suivant une stratégie de partition. Il existe des mécanismes passifs comme pour les plasmides à fort nombres de copies au sein d’une bactérie, ou des mécanismes actifs plus complexes (Baxter &

Funnell, 2014 ; Million-Weaver & Camps, 2014)

- un module de propagation qui assure la mobilité du plasmide entre des cellules différentes

(transfert horizontal). Certains plasmides dits conjugatifs possèdent toute la machinerie nécessaire à la conjugaison pour leur transfert. D’autres plasmides non-conjugatifs restent

45 mobilisables pour le transfert mais nécessite la présence d’un autre plasmide conjugatif porteur de toute la machinerie pour que le transfert soit effectif.

- un module d’adaptation qui porte tous les autres gènes additionnels. Ces gènes peuvent coder pour différentes fonctions (physiologie, virulence, résistance) qui vont apporter un avantage à la bactérie pour sa survie dans des conditions particulières.

En 2013, les séquences de 580 plasmides d’intérêt clinique chez les entérobactéries

étaient déjà disponibles (Carattoli, 2013). Et parmi ces plasmides, certains sont d’un intérêt majeur dans la résistance. En effet, une bactérie porteuse d’un plasmide ayant des gènes de résistance aux antibiotiques a ainsi la faculté de s’adapter. Les plasmides conférant ces multi- résistances font le plus souvent plus de 50 kb et sont conjugatifs (Nordstrom, 2006).

Parmi les familles de plasmides impliquées dans la diffusion des résistances il existe les plasmides appartenant à des groupes d’incompatibilités tels que les plasmides IncA/C qui sont largement présent au sein des entérobactéries (Carattoli, 2009). Ces plasmides sont connus pour diffuser des gènes de résistance aux β-lactamines tels que blaCMY-2 et blaNDM-1

(Lindsey et al., 2009 ; Carattoli et al., 2012). Il peuvent aussi être porteurs de régions de multi-résistances aux aminosides, sulfamides et chloramphénicol (Colinon et al., 2007 ;

Harmer & Hall, 2015). De plus, les plasmides IncN sont connus pour leur rôle dans la diffusion de gènes de résistance aux β-lactamines tels que blaVIM et blaCTX-M et cela dans des espèces d’entérobactéries d’importance majeure comme les klebsielles. (Caratolli et al.,

2010). Et ces mêmes plasmides, tout comme les plasmides IncF et IncL/M, sont impliqués dans la diffusion de carbapénèmases de type blaKPC et les gènes de résistances aux quinolones telles que qnrB19 et qnrS1 (Leavitt et al., 2010 ; Carattoli, 2013). Les plasmides IncI1 sont aussi intéressant de part leur association avec de nombreux gènes de résistance aux β-

46 lactamines tel que blaCTX-M-1 qui se disséminent ainsi au sein de nombreuses espèces animales

(Dahmen et al., 2012).

Il est également intéressant de noter que la première souche animale de P. mirabilis porteuse du gène blaCTX-M-15 sur un plasmide F2 :A- :B- a été décrite en 2011 chez un macaque importé du Vietnam vers la France (Dahmen et al., 2013).

Une autre famille de plasmides montre un intérêt dans la résistance plus particulièrement aux quinolones. Un des mécanismes de résistance aux quinolones médiés par des plasmides (plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR) consiste à la protection de la cible de la quinolone par des protéines codées par des gènes de la famille qnr (Jacoby et al.,

2014). Les gènes qnr ont été mis en évidence dans presque tous les genres de la famille des entérobactéries et 5 classes sont actuellement connues (qnrA, qnrB, qnrC, qnrD et qnrS) dont qnrA, qnrB et qnrS ayant plusieurs allèles. Le gène qnrD est le plus récemment décrit. Il a été par exemple mis en évidence dans des isolats cliniques humains en Europe, Afrique, Asie et

Amérique du Sud (Veldman et al., 2011 ; Ogbolu et al., 2011 ; Hu et al., 2012 ; Albornoz et al., 2014). Contrairement aux autres gènes qnr, qnrD a toujours été localisé sur des petits plasmides qui peuvent être séparés en deux groupes comportant des membres très similaires : un groupe comprend des plasmides non-conjugatifs d’environ 2,7 kb tandis que l’autre groupe comporte des plasmides mobilisables ayant une taille d’environ 4,3 kb (Cavaco et al., 2009 ;

Guillard et al., 2012 ; Zhang et al., 2013). Enfin, entre autre particularité d’intérêt, le gène qnrD a été principalement décrit chez des espèces bactériennes de la famille des

Morganellaceae (Mazzariol et al., 2012 ; Mokracka et al., 2012).

Ainsi, les plasmides représentent aujourd’hui un souci majeur dans la problématique de la résistance aux antibiotiques car ils ont la capacité de diffuser et sont capables de

47 mobiliser de nombreux éléments génétiques porteurs de résistances (Thomas & Nielsen,

2005).

C.2.3. Les intégrons, les séquences d’insertion et les transposons

Spécifiques des procaryotes, et tout particulièrement des bactéries à Gram négatif où ils sont retrouvés dans 40 à 70% des génomes bactériens séquencés, les intégrons forment une structure génétique capable d’intégrer par recombinaison en son sein des fragments d’ADN appelés cassettes de gènes exogènes et de les exprimer (Domingues et al., 2012). Pour pouvoir fonctionner, un intégron a besoin de 3 éléments (Figure 6A) :

- un gène codant pour une intégrase (int), cette dernière étant capable d’insérer et d’exciser les cassettes de gènes.

- un site de recombinaison (attI) généralement situé juste à côté du gène exprimant l’intégrase et qui accueille les cassettes de gènes dans l’intégron,

- un promoteur (Pc) en sens inverse du gène de l’intégrase qui permet l’expression des cassettes de gènes intégrées dans l’intégron.

48 Figure 6 : Structure d'un intégron et d'une cassette de résistance (d'après Gilligs et al., 2014)

A) Structure d’un intégron. B) Intégration d’une cassette.

Les cassettes de gènes quant à elles sont de petites molécules circulaires d’ADN lorsqu’elles sont excisées. Elles possèdent un site de recombinaison (attC) permettant par recombinaison avec le site attI leur intégration. Etant incapable de s’exprimer du fait de l’absence de promoteur, leur expression va donc dépendre du promoteur Pc de l’intégron

(Collis & Hall, 1995). De plus, le niveau d’expression d’une cassette diminue de façon proportionnelle à son éloignement du promoteur Pc, cela pouvant expliquer que les intégrons d’intérêt clinique se limitent généralement à 5 à 6 cassettes (Collis & Hall, 1995 ; Gillings,

2014) (Figure 6B).

Beaucoup de cassettes peuvent porter des gènes conférant un phénotype de résistance aux antibiotiques (Partridge et al., 2009). Les intégrons porteurs de ces cassettes sont très souvent sur des éléments mobiles (Gillings, 2014). De part leur présence accrue dans de

49 nombreux environnement et sur divers éléments mobiles, l’acquisition de nouvelles cassettes de résistance aux antibiotiques participe à la dissémination des résistances au sein des populations bactériennes.

De plus les transposons et les séquences d’insertion (IS) représentent les principaux

éléments mobiles intra-cellulaires de la cellule bactérienne. Les IS sont en fait de petits

éléments mobiles flanqués de part et d’autre de séquences répétées inversées (IR) (Partridge,

2011) (Figure 7A). La séquence d’insertion code une transposase qui reconnait et coupe de manière spécifique les IR. Ceci permet alors à l’IS de s’exciser et de générer son mouvement

(Siguier et al., 2014). Les IS ne présentent cependant pas de résistances. Malgré cela, deux copies d’une même IS sont capable entre elles de mobiliser par exemple un intégron en s’excisant en un seul bloc : il s’agit alors d’un transposon composite (Partridge, 2011) (Figure

7B).

Figure 7 : Les séquences d’insertion

A) Structure d'une IS. B) Mobilisation d'un intégron par deux IS

Enfin, il existe des transposons complexes ayant la particularité de pouvoir transposer sans s’exciser (Grindley, 2002). Pour se faire, un cointégrat entre la molécule donneuse et la molécule cible se forme et il est alors résolu grâce à la recombinase à sérine TnpR sur les sites

50 res (Grindley, 2002). Parmi eux, les transposons de classe II de la famille de Tn3 qui participent à la diffusion de gènes de résistance aux antibiotiques (Grindley, 2002). Ils sont constitués le plus souvent par deux gènes : une transposase (tnpA) et une résolvase (tnpR), flanquées de deux IR de 38 pb (Grindley, 2002). Par la suite, différents gènes codant pour des résistances aux antibiotiques peuvent alors s’insérer.

C.2.4. Les îlots génomiques

Intégrés au sein du chromosome des bactéries, les îlots génomiques sont des éléments particuliers souvent capables de s’exciser et de s’intégrer au niveau de sites spécifiques

(Bellanger et al., 2014).

Certains sont capables de se transférer par eux-même (les ICEs pour integrative and conjugative element). D’autres peuvent se transférer en trans (les IMEs pour integrative and mobilizable element). Enfin, il existe des îlots qui se transferent en cis (les CIMEs pour cis integrative mobilizable element). Chacun de ces trois types d’îlots sera décrit dans les paragraphes suivants.

C.2.4.1. Eléments intégratifs conjugatifs : les îlots génomiques SXT

Les ICEs (éléments intégratifs conjugatifs) sont reconnus comme des médiateurs majeurs du transfert horizontal de gènes au sein des procaryotes (Burrus et al., 2002). Ces

éléments mobiles ont à la fois des similitudes avec les plasmides et avec les phages. Tels que les plasmides conjugatifs, les ICEs se transfèrent par conjugaison, cependant, contrairement aux plasmides, les ICEs ne se répliquent pas de façon autonome. Et tels que de nombreux bactériophages, les ICEs s’intègrent dans le chromosome de la bactérie hôte et se répliquent avec le chromosome. Les ICEs sont capables de s’exciser du chromosome pour former un 51 intermédiaire circulaire non-réplicatif qui peut se transférer de lui-même par conjugaison dans une autre cellule bactérienne et s’y intégrer. Cela leur est possible car il possède toute la machinerie nécessaire à la mise en place de l’appareil conjugatif.

Le terme « ICE » a été introduit en 2002 et désigne les transposons conjugatifs (Burrus et al., 2002). Le premier transposon conjugatif identifié, Tn916, a été isolé en 1980 d’une souche d’Enterococcus feacalis (Franke & Clewell, 1981). Un autre transposon conjugatif a

été découvert en 1984 chez Bacteroides fragilis (Smith et al., 1985). Pendant de nombreuses années, ces deux ICEs ont été les seuls décrits et il semblait que cette classe d’éléments mobiles était restreinte à deux sous-espèces d’eubactéries, les bactéries Gram-positive ayant un faible taux en G/C et le groupe des Bactéroides (Scott & Churchward, 1995 ; Whittle et al.,

2002). Cependant durant les dernières décennies, un nombre croissant d’ICEs a été décrit chez des microorganismes provenant d’autres sous-espèces majeures de bactéries (Burrus &

Waldor, 2004).

Un exemple d’ICE est l’îlot SXT. Le transfert de cet îlot est très fortement induit sous des conditions de stress et est dépendant de la réponse SOS (Beaber et al., 2004). Il s’intègre dans le chromosome bactérien au niveau du gène prfC, qui est un gène conservé dans de nombreuses espèces bactériennes et qui code pour un facteur de libération de la chaine peptidique (Hochhut & Waldor, 1999).

A l’origine, SXT fut découvert à Madras en Inde au sein d’un des isolats cliniques initiaux de Vibrio cholerae O139, à savoir MO10. Ce nouveau sérogroupe de V. cholerae a

émergé dans le Sud-Est de l’Inde à la fin de l’année 1992 et fut le premier sérogroupe de V. cholerae non-O1 qui a donné lieu à une épidémie de choléra (Cholera Working Group, 1993).

V. cholerae O139 s’est ensuite rapidement répandu à travers le continent asiatique et a remplacé la souche V. cholerae O1 qui était à l’origine le principal responsable des cas de

52 choléra en Inde et au Bangladesh en 1993. Outre son nouvel antigène O, V. cholerae O139 diffèrent de la souche V. cholerae O1 El Tor qu’il a remplacé de part un profil de résistance aux antibiotiques différent. En effet, contrairement à la souche O1 El Tor, les isolats cliniques

O139 d’Inde et du Bangladesh étaient résistants à quatre antibiotiques : le sulfaméthoxazole, le triméthoprime, le chloramphénicol et la streptomycine. Et chez MO10, les gènes responsables de ces résistances étaient tous portés par le même ICE : l’îlot SXT (Hochhut et al., 2001 ; Waldor et al., 1996).

L’espèce Vibrio ne semble pas être l’hôte primaire des ICEs de type SXT. En effet, il a

été démontré que SXT était génétiquement et fonctionnellement relié à l’élément R391. Ce dernier provient d’une souche de Providencia rettgeri isolée en 1967 en Afrique du Sud.

R391 est capable de médier la résistance à la kanamycine et au mercure (Coetzee et al., 1972).

De plus, il s’intègre au même site dans le chromosome bactérien que SXT, le gène prfC. Les gènes int de SXT et de R391 sont presque identiques (Hochhut et al., 2001). Et la comparaison de séquences des génomes complets de SXT et R391 ont confirmé l’idée que ces

ICEs étaient fortement liés (Beaber et al., 2002 ; Boltner et al., 2002).

Ainsi, l’îlot SXT a été mis en évidence dans d’autres espèces bactériennes que Vibrio.

Cinq ICEs de type SXT/R391, R997 (Inde), ICEPmiUSA1 (États-Unis), ICEPmiJpn1 (Japon,

Espagne, France et Irlande), ICEPmiSpn1 (Espagne) et ICEPmiChn1 (Chine), ont été décrit chez P. mirabilis (Waldor et al., 1996 ; Harada et al., 2010 ; Lei et al., 2016). ). Il est intéressant de noter que le gène blaCMY-2 responsable de la résistance aux céphalosporines est inséré chez ICEPmiJpn1 et ICEPmiSpn1 via une transposition médiée par les IS10, indiquant que les ICEs de type SXT/R391 sont d’importantes plateformes mobiles d’acquisition de nouveaux gènes de résistance aux antibiotiques (Mata et al., 2011 ; Aberkane et al., 2015 ;

Mac Aogáin et al., 2016).

53 C.2.4.2. Eléments intégratifs mobilisables : Salmonella et Proteus

Genomic Islands

Les éléments intégratifs mobilisables (IMEs pour integrative and mobilizable element) constituent un groupe d’éléments génétiques capables de s’exciser du chromosome bactérien et former une molécule circulaire intermédiaire incapable de se répliquer ou de se transférer.

Ce sont donc des éléments génétiques transférables en trans car même s’ils codent pour leur excision/intégration, ils sont dépourvus des fonctions nécessaires à leur conjugaison. Pour pouvoir conjuguer, il est donc indispensable d’avoir recours à un autre élément conjugatif présent dans la cellule (Burrus et al., 2002). Cet élément « helper » va alors apporter à l’IME la machinerie de conjugaison dont il a besoin pour transférer (Bellanger et al., 2014).

L’objet de notre étude se porte ici sur certains IMEs particuliers, des îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques : les Salmonella Genomic Islands et Proteus Genomic Island

1.

x Salmonella Genomic Islands

x Identification

C’est au tout début du 21ème siècle que Boyd et al. décrivent pour la première fois l’IME Salmonella Genomic Island 1 (SGI1). Cet îlot tient son nom de la bactérie dans laquelle il a été identifié : Salmonella Typhimurium de lysotype DT104. Dans les années

1980-1990, cette bactérie a été responsable d’une épidémie chez les bovins et l’homme en

Grande-Bretagne, qui se propagea par la suite sur toute la planète par diffusion clonale

(Threlfall, 2000 ; Hall, 2010). Ce lysotype est caractérisé par un phénotype de penta- résistance aux antibiotiques. Ces résistances concernent donc 5 familles d’antibiotiques : les aminopénicillines (amoxicilline), les phénicolés (chloramphénicol), les aminosides 54 (streptomycine), les sulfamides et les cyclines (tétracycline). L’ensemble présente ainsi un phénotype ACSSuT. Tous les gènes codant ces résistances sont portés par SGI1.

x Organisation

Etant un IME, SGI1 se trouve intégré au chromosome bactérien. Chez les salmonelles,

SGI1 s’intègre classiquement en 3’ du gène trmE codant une protéine modifiant des ARNt

(Cabedo et al., 1999). Mais il peut arriver qu’en l’absence de ce site d’insertion, SGI1 puisse s’intégrer lors d’expérience in vitro dans un site secondaire entre les gènes sodB et purR.

Cette intégration est certes moins efficace mais il a été montré que SGI1 pouvait s’y intégrer en tandem jusqu’à 6 copies (Doublet et al., 2008). D’une taille de 43 kb environ, SGI1 est composé de 44 ORFs (nommés S001 à S044) qui peuvent être classées en 7 groupes en fonction de leur implication : recombinaison, réplication de l’ADN, transfert conjugatif, régulation, résistance aux antibiotiques, ainsi que d’autres fonctions et des fonctions inconnues (Figure 8). Cependant, très peu de gènes de SGI1 ont été étudiés de façon précise et les analyses in silico ne donnent que de rares informations sur les fonctions des différentes

ORFs (Hall, 2010). Le gène le mieux caractérisé est celui de l’intégrase int (S001) qui code une recombinase à tyrosine indispensable pour l’excision et l’intégration de SGI1 (Doublet et al., 2005). Par ailleurs, TraN, TraG et TraH (S005, S011 et S012 respectivement) quant à eux codent des fonctions putative potentiellement impliquées dans la mobilisation de SGI1

(Carraro et al., 2014).

55 Figure 8 : Organisation génétique de SGI1 (d'après Boyd et al., 2001).

Une des particularités de SGI1 réside en son intégron qu’il porte. Il s’agit de l’intégron

In104, qui appartient à une classe similaire mais divergente des intégrons de classe 1 : les intégrons complexe de classe 1 et plus précisément la famille In4 (Levings et al., 2005). Ces intégrons complexes dans le cadre de SGI1 sont en fait constitué de plusieurs intégrons porteurs chacun de gènes de résistances aux antibiotiques. D’une taille d’environ 13 kb, In104 est alors le porteur de toutes les résistances aux antibiotiques responsable de la penta- résistance. Il est donc le locus de multirésistance de SGI1 (Sandvang et al., 1998 ; Briggs &

Fratamico, 1999).

x Plasticité et variabilité

Depuis sa première caractérisation au début des années 2000 et de par l’acquisition et le remaniement des cassettes de résistance au sein de l’intégron, plus d’une trentaine de nouveaux variants de SGI1 ont été découverts chez différents sérovars de Salmonella (Mulvey et al., 2006 ; Hall, 2010) (Annexe 1). Les variants SGI1-A, F, H, I, L, M diffèrent de SGI1 par la présence de cassettes de résistance supplémentaires et/ou différentes (Boyd et al., 2002 ;

56 Doublet et al., 2003 ; Doublet et al., 2004 ; Cloeckaert et al., 2006 ; Vo et al., 2007). Par ailleurs, les variants SGI1-B, C, D, G et O ont été probablement générés par recombinaisons homologues entre les séquences 3’-CS, 5’-CS et attI (Boyd et al., 2002 ; Doublet et al., 2004 ;

Boyd et al., 2008). Parfois, ces évènements de recombinaison entrainent l’acquisition de nouvelles cassettes (variant SGI1-W) ou leur remplacement (variant SG1-U et Y) (Lei et al.,

2014). Finalement, il est également possible que des mutations soient à l’origine de nouveau variant comme ce fut le cas pour SGI1-R qui porte une mutation non-sens au niveau du gène sul1 (Djordjevic et al., 2009). De plus, certaines recombinaisons ont généré le déplacement et/ou l’acquisition d’IS qui ont amené à la création de nouveaux variants. Les variants SGI1-E et T ont ainsi pu apparaitre suite au déplacement de l’IS6100 et d’un évènement de recombinaison homologue (Boyd et al., 2002 ; Targant et al., 2010). Le variant SGI1-S a quant à lui acquis cinq IS différentes (Wilson & Hall, 2010). Il en va de même pour SGI1-K et ses variants ainsi que SGI1-P et Q qui ont été largement remaniés par l’IS26 (Levings et al., 2007 ; Doublet et al., 2008).

Mais SGI1 ne s’est pas limité à un seul genre bactérien. En 2006, un patient diabétique en Palestine a été traité pour une infection au pied avec du sulfaméthoxazole et du triméthoprime (Bactrim®). L’échec thérapeutique de cette prescription en première intention a amené l’équipe médicale à s’intéresser plus attentivement au pathogène responsable de cette infection et aux éléments génétiques porteurs des résistances aux antibiotiques. C’est ainsi qu’a été décrit pour la première fois un variant SGI1 (en l’occurrence SGI1-L) intégré au niveau de trmE au sein de l’espèce P. mirabilis (Ahmed et al., 2007). Puis en 2007, le premier cas clinique humain de SGI1 (en l’occurrence SGI1-O) chez P. mirabilis a été découvert en

France (Doublet et al., 2010). Et depuis lors de nombreux autres variants ont été mis en

évidence chez P. mirabilis en France, en Asie et en Afrique (Siebor & Neuwirth, 2011 ;

Siebor & Neuwirth, 2013 ; Lei et al., 2014 ; Lei et al., 2015 ; Qin et al., 2015 ; Soliman et al., 57 2017 ; Sung et al., 2017). Le variant SGI1-V est d’un intérêt tout particulier (Siebor &

Neuwirth, 2011). En effet, ce variant n’a été décrit qu’au sein de P. mirabilis et il a été le premier variant à présenter une résistance aux céphalosporines de 3ème génération ainsi qu’aux fluoroquinolones grâce à la présence des gènes blaVEB-6 et qnrA1 (Figure 9). Un tel variant porteur de gènes de résistances critiques est un réel risque pour la sécurité sanitaire.

Figure 9 : Vue schématique de l'intégron complexe de classe 1 du variant SGI1-V (d’après Siebor & Neuwirth, 2011).

Un autre variant, SGI1-X, a été décrit comme possédant un gène qnr (qnrB2) dont l’origine serait plasmidique (Lei et al., 2014) (Figure 10).

Figure 10 : Vue schématique de l'intégron complexe de classe 1 du variant SGI1-X (d’après Lei et al., 2014).

Et Qin et ses collaborateurs ont décrit en 2015 pour la première fois un variant, SGI1-

Z, issu de la recombinaison entre SGI1 et un plasmide, pBDE0502. En effet, l’intégron de

SGI1-Z présente 99,89% d’identité avec un intégron présent sur le plasmide (Qin et al., 2015)

(Figure 11).

58 Figure 11 : Vue schématique de SGI1-Z et comparaison de la région MDR de SGI1-Z avec la structure du squelette In4-like du plasmide pBDE0502 d’E. coli (d’après Qin et al., 2015).

Enfin, il existe un autre type de variant de SGI1 qui a généré et génère toujours un débat au sein de la communauté scientifique. Il s’agit du variant SGI1-J qui a la particularité de voir son intégron complexe de classe 1 intégré au niveau de l’ORF S023 (Levings et al.,

2005). De plus, la séquence génétique cet îlot présente une différence de 0,53 % avec la séquence de SGI1, et de par ce fait, certains scientifiques ont voulu considérer cet îlot comme un nouvel élément baptisé alors SGI2 (Levings et al., 2008 ; Hamidian et al., 2015).

Cependant, certains spécialistes de SGI1 refusent une telle dénomination au détriment de

SGI1-J car ils estiment que le changement de site d’insertion de l’intégron ne justifie pas ce changement de nomenclature (Doublet et al., 2009). Il serait donc nécessaire pour la communauté scientifique de se pencher définitivement sur la question de la nomenclature des

IME SGI car la méthode actuelle qui consiste à nommer les IME de façon chronologique suivant leur description s’essouffle et ne fait plus sens.

59 Pour conclure, le très grand nombre de variants de SGI1 déjà décrits dans la littérature montre très clairement l’importante plasticité et variabilité de cet îlot génomique de multirésistance aux antibiotiques.

x Mobilité et stabilité

La mobilité de SGI1 a été démontrée en 2005 par Doublet et al. L’intégrase codée par le gène int permet à SGI1 de s’exciser du génome pour former un intermédiaire circulaire. Ce dernier se forme par recombinaison spécifique entre les répétitions directes DR-L et DR-R de

18 pb. Sous forme circulaire, SGI1 est alors transférable par conjugaison. Cependant, ne possédant pas la machinerie nécessaire pour la conjugaison, il est indispensable pour sa mobilisation que SGI1 soit en présence d’un plasmide « helper ». Il a été démontré que les plasmides de la famille IncA/C sont ainsi capables de complémenter la fonction de conjugaison manquante à SGI1 pour permettre son transfert (Douard et al., 2010). Pour se faire, les régulateurs globaux AcaCD des plasmides IncA/C activent l’excision de SGI1 qui, une fois sous forme d’un intermédiaire extrachromosomique circulaire, va pouvoir être transféré en utilisant la machinerie de conjugaison encodée par les plasmides IncA/C (Carraro et al., 2014). Une fois transféré, SGI1 peut ensuite s’intégrer dans le chromosome bactérien via la recombinaison spécifique entre le site attB qui correspond à la séquence de 18 pb présente en 3’ du gène chromosomique trmE et le site attP qui correspond à la séquence de 18 pb présente sur la forme circulaire de SGI1 (Figure 12). Ainsi, SGI1 est bien un IME (élément mobilisable intégratif) mobilisable mais qui nécessite une machinerie de conjugaison apportée en trans par les plasmides IncA/C.

Paradoxalement, alors que SGI1 a besoin des plasmides IncA/C pour transférer, il n’a jamais été montré de coexistence de ces deux éléments au sein d’un même isolat clinique suggérant une incompatibilité entre ces deux éléments génétiques mobiles. 60 Cette hypothèse a également été suggérée au laboratoire en raison des difficultés à maintenir

SGI1 et les plasmides IncA/C dans une même souche bactérienne. De plus, Kiss et ses collaborateurs ont mené des expériences pour tester la stabilité de SGI1 et ils ont été incapables de détecter des cellules ayant perdu SGI1 après 350 générations et plus de 16 000 clones testés, cependant ces travaux ont été réalisés en l’absence de plasmides IncA/C (Kiss et al., 2012). Cette haute stabilité suggère que SGI1 pourrait coder un mécanisme capable de le stabiliser au sein de la cellule hôte. Parmi tous les systèmes de stabilisation connus, le plus classique en ce qui concerne les îlots génomiques sont les systèmes Toxine-Antitoxine (TA).

Les ORFs S025-S026 de SGI1 ont été montré comme codant un système TA impliqué dans le maintien de cet îlot jouant notamment un rôle important en présence de plasmides IncA/C

(Huguet et al., 2016). Ce système TA a alors été nommé sgiAT.

Figure 12 : SGI1 est un élément intégratif (d’après Doublet et al., 2005).

61 x Proteus Genomic Island 1

En 2014, Eliane Siebor et Catherine Neuwirth ont découvert un nouvel îlot génomique de multirésistance aux antibiotiques appelé Proteus Genomic Island 1 (PGI1) chez deux souches cliniques humaines de P. mirabilis appelées PmCHA et PmCHE. PmCHA a été isolé en Mars 2012 chez une patiente de 75 ans ayant une plaie chirugicale dans un service de chirurgie cardiaque. PmCHE quant à lui a été isolé en Juillet 2012 chez un patient de 84 ans hospitalisé dans un service de gériatrie (Siebor & Neuwirth, 2014).

PGI1 est un IME qui possède les caractéristiques d’un îlot génomique de multi- résistances aux antibiotiques tel que SGI1: il est constitué d’un large segment d’ADN intégré dans le chromosome bactérien, son taux de GC diffère de celui du génome bactérien l’entourant, il est flanqué par des séquences répétées de 18 pb, possède un intégrase, contient plusieurs éléments impliqués dans la mobilisation de l’ADN (IS et transposons) et plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques.

Chez PmCHA et PmCHE, PGI1 est inséré en 3’ du gène trmE et adjacent au gène hipB. Dans ces deux isolats, PGI1 est divisé en deux fragments. Le premier fragment inclut la partie 5’ du squelette de PGI1 (24,8 kb) suivi de la région MDR de 22 kb pour PmCHA et 20 kb pour PmCHE. Le second fragment inclut la partie 3’ du squelette de l’îlot (0,9 kb) et 33,4 kb de la région multi-drogue. Les deux fragments sont séparés par un fragment d’ADN chromosomique de 197 kb. Une hypothèse qui expliquerait une telle configuration suggère qu’il y aurait eu des évènements de recombinaisons médiés en outre par les IS26.

Le squelette de l’IME de 25,7 kb est presque identique (seulement 4 nucléotides diffèrent) à un IME localisé en 3’ du gène sodB au sein de Salmonella Heidelberg SL476

(Figure 13). De plus, la synténie de gènes est très fortement conservée entre PGI1 et SGI1, 62 suggérant que ces deux îlots appartiennent à la même famille d’îlots génomiques. En ce qui concerne l’organisation de PGI1, cet IME contient 25 ORFs nommés P001-P025. Le squelette de PGI1 est 1,7 kb plus court que celui de SGI1 (la région S023-S024 étant manquante chez

PGI1). Le pourcentage d’identité des différentes ORFs varient de 67 à 98 %, dont 80% en ce qui concerne l’intégrase (Figure 13). Par ailleurs, le taux de GC du squelette de PGI1 (47 %) est plus élevé que celui de P. mirabilis (39 %) et cela laisse supposer que son origine pourrait venir d’une autre espèce bactérienne, potentiellement Shewanella sp. (dont le taux de GC varie de 44 à 53 %). Par conséquent, ces différences indiquent que PGI1 est bien une nouvelle structure et non pas un variant de SGI1 (Siebor & Neuwirth, 2014).

En ce qui concerne le profil d’antibiorésistance, ces souches de P. mirabilis possédant

PGI1 présentaient un phénotype de résistance à l’amoxicilline, la ticarciline, la kanamycine, la gentamicine, la tobramycine, la streptomycine, la spectinomycine, les sulfonamides et la doxycycline.

Figure 13 : Comparaison du backbone de PGI1 avec SGI1 et l'îlot de Salmonella Heidelberg SL476 (Siebor & Neuwirth, 2014).

Depuis lors, d’autres variants de PGI1 ont été identifiés. Isolé en 2012 d’un

échantillon d’urine d’un patient de l’hôpital de Chambery en France, le variant PGI1-PmPEL fait 67 kb et est intégré entre les gènes chromosomiques trmE et hipB/hipA (Girlich et al.,

63 2014). Au niveau du squelette de l’îlot, la région MDR interrompt l’orf C1566 de Salmonella

Heidelberg, suggérant qu’il ait eu une large insertion entre le gène res (C1584) et C1566

(Figure 14).

Figure 14 : Vue schématique du squelette de l'IME PGI1-PmPEL (d'après Girlich et al., 2014).

Ce variant partage 99 % d’identité avec PGI1-PmCHA et PGI1-PmCHE. Le variant

PGI1-PmPEL est d’un intérêt tout particulier car il est porteur à la fois du gène blaNDM-1 et du gène blaVEB-6 permettant ainsi la résistance aux carbapénèmes et aux céphalosporines de dernières générations respectivement. Chez les entérobactéries, le gène blaNDM-1 est généralement localisé sur des plasmides (Poirel et al., 2011). Par conséquent, il est remarquable de retrouver un tel gène sur un îlot génomique intégré dans le chromosome bactérien, permettant ainsi d’ancrer de façon plus stable cette résistance au sein de la souche.

L’origine de ce variant semble complexe et pluridirectionelle. La comparaison de la région

MDR de PGI1-PmPEL montre des similitudes très fortes de la région entourant blaNDM-1 avec les plasmides pNDM-1 Saitama (isolé chez Klebsiella pneumoniae) et pM131 (isolé chez

Acinetobacter baumanii). De plus, une autre comparaison montre également une grande similitude entre la région proche de blaVEB-6 et la région MDR du variant SGI1-V. Il en va

également de même avec SGI1-O pour dfrA1 et SGI1-K5 pour les gènes mer de l’opéron mercure (Figure 15). Ainsi, ce variant est le premier décrit comme ayant un gène de résistance

64 aux carbapénèmes, en l’occurence le gène blaNDM-1 au sein d’un îlot de résistance. Associé au gène BLSE blaVEB-6 sur le même IME, ce variant forme alors une structure stable conférrant de hauts niveaux de résistance à toutes les β-lactamines, dont l’aztréonam. Cette résistance à l’aztréonam est d’autant plus problématique que cet antibiotique est souvent réservé à des prescriptions de dernier recours dans des cas d’infections sévères.

Figure 15 : Vue schématique de la région MDR du variant PGI1-PmPEL et comparaison avec le plasmide pM131 de A. baumannii sp. (GenBank: JX072963.1), le plasmide pNDM-1 Saitama de K. pneumoniae (GenBank: AB759690), la région MDR du variant SGI1-V de P. mirabilis, la région MDR du variant SGI1-O de P. mirabilis et la région MDR du variant SGI1-K5 de S. enterica (Girlich et al., 2014).

Enfin, Mac Aogáin et ses collaborateurs ont récemment mis en évidence un autre variant de PGI1 chez un isolat clinique humain de P. mirabilis en Irlande. La région MDR possède les gènes aadB, aad2, aphA1b, blaTEM-1 et sul1 mais ne présente pas les évènements de recombinaison médiés par les IS26 comme cela a été décrit à l’origine par Siebor et

Neuwirth (Mac Aogáin et al., 2016) (Figure 16).

65 Figure 16 : Vue schématique du variant PGI1 décrit par Mac Aogáin (d’après Mac Aogáin et al., 2016).

Concernant la mobilité de PGI1, il a été démontré qu’il était possible de transférer

expérimentalement PGI1 dans une autre espèce bactérienne grâce à un plasmide IncA/C2

(Siebor et al., 2016). Pour se faire, Siebor et collaborateurs ont utilisé un nouvel îlot PGI1,

PGI1-PmESC. Le squelette de PGI1-PmESC est identique à celui de PGI1-PmCHA (Siebor

& Neuwirth, 2014). PGI1-PmESC possède un intégron de classe 1 présentant une cassette

aadB-aadA2 et des régions dérivant du transposon Tn501 et d’un transposon hybride

Tn502/Tn5053 (Figure 17). Cet îlot confère à la souche une résistance à la streptomycine, la

spectinomycine, la kanamycine, la tobramycine, la gentamicine et les sulfonamides ainsi

qu’une résistance au mercure grâce à l’opéron mer.

0 10 kb 16.8 kb P024 intI1 aadB aadA2 qacEΔ1 sul1 orf5Δ tnpA tnpR mer genes urf2 tni module P025

R T P F A D E R Q B A ●

● ●

AAATT Class 1 integron Tn501 Tn5053/502 AAATT

IRi IR501 IRt5053 IRmer IRt502

Figure 17 : Vue schématique de la région MDR du variant PGI1-PmESC (d'après Siebor et al., 2016)

66 Le transfert conjugatif de PGI1-PmESC d’une souche de P. mirabilis vers une souche d’Enterobacter aerogenes a été réalisé dès le premier essai et a montré que l’îlot s’intégrait

également au niveau du site attB exactement comme SGI1. Cette étude a démontré que PGI1 pouvait être mobilisé par un plasmide IncA/C2, alors que Girlich et al, 2015 avait échoué à transférer PGI1-PmPEL de P. mirabilis vers E. coli et Salmonella Typhimurium avec le plasmide IncA/C pR55.

C.2.4.3. Eléments intégratifs et mobilisables en cis

Récemment découverts, les éléments CIMEs seraient des dérivés des ICEs et/ou des

IMEs. Ils auraient perdu leurs machineries de conjugaison et de recombinaison ainsi que leur oriT (Pavlovic et al., 2004). Par contre, comme cela est le cas des ICEs, ils sont toujours flanqués des site att permettant leur mobilisation (Bellanger et al., 2011). Ainsi, les CIMEs sont uniquement mobilisables en cis, suite à leur co-intégration à un ICE (Bellanger et al.,

2011).

67 Deuxième partie :

Étude expérimentale

68 A. Problématique et objectifs de travail

La résistance aux antibiotiques est une des principales menaces sanitaires du XXIème siècle. A ce titre la répartition au niveau mondial des entérobactéries porteuses de β- lactamases à spectre étendu face aux céphalosporines de dernières générations constitue un défi majeur pour la santé humaine et animale. Ce succès épidémiologique incontestable est en outre possible grâce à leurs supports plasmidiques et donc ayant un grand potentiel de diffusion de la plupart des gènes codant des BLSE ou grâce à leurs associations avec certains clones dominants ou épidémiques.

En parallèle à ceci, certains gènes de résistance aux antibiotiques sont localisés sur des

îlots génomiques, dont la dissémination dans l’environnement dépend le plus souvent de l’expansion clonale de la bactérie hôte. La diffusion massive dans les années 1990 chez l’homme et les bovins de souches épidémiques de S. enterica serovar Typhimurium de lysotype DT104 porteuses de l’îlot génomique de multirésistance aux antibiotiques SGI1 est un exemple incontournable d’un tel phénomène. L’incroyable variabilité de cet îlot génomique et sa capacité à la mobilité en font un sujet d’étude d’un très grand intérêt. De plus, la récente découverte de cet îlot génomique et de certains de ses variants ainsi que d’un nouvel îlot appelé PGI1 au sein de Proteus mirabilis est venue renforcer la nécessité de sérieusement étudier la prévalence et la diffusion de tels éléments génomiques et tout particulièrement au sein des Morganellaceae.

Ainsi, ce projet de thèse voulait porter un intérêt tout particulier à cette famille bactérienne que sont les Morganellaceae et les résistances aux antibiotiques et leurs supports

69 génétiques et génomiques qui s’y présentent. Pour se faire, deux questions majeures se sont posées:

- Quels sont les risques de diffusion de SGI1/PGI1 chez P. mirabilis à la fois au sein du

réservoir humain, mais aussi animal ?

- Quels autres supports génétiques de résistances aux antibiotiques peuvent être mis en

évidence chez les Morganellaceae ?

S’agissant du premier objectif, le projet voulait explorer la situation épidémiologique

(la diversité clonale des souches et aussi la diversité des espèces animales concernées) et la diversité moléculaire de SGI1/PGI1 chez P. mirabilis chez l’homme et l’animal (ainsi que la présence ou non de gènes de résistance aux β-lactamines de dernières générations). Les avancées attendues par rapport à l’état de l’art étaient de connaitre la situation actuelle de la diffusion de SGI1 et PGI1 chez P. mirabilis et d’identifier le(s) réservoir(s) potentiel(s), mais aussi d’identifier de nouveaux îlots de multirésistance ayant acquis des résistances aux molécules thérapeutiques d’intérêt telles que les résistances aux céphalosporines de dernières générations.

Pour ce faire, plusieurs méthodes expérimentales ont été choisies. Un criblage sur phénotype de résistance aux antibiotiques par antibiogramme de Morganellaceae issues de cas cliniques chez l’animal et l’homme en France et une détection moléculaire de SGI1 et

PGI1 par PCR a permis de constituer une collection de plusieurs centaines de Morganellaceae d’intérêt. Une cartographie PCR a permis de procéder à la caractérisation moléculaire des variants de SGI1 et PGI1 identifiés. De plus, l’épidémiologie moléculaire et la comparaison génomique des souches hébergeant SGI1 et PGI1 a été possible grâce à la technique de champ pulsé PFGE.

70 Le second objectif de cette thèse fut de mettre en évidence d’éventuels autres supports de résistance aux antibiotiques au sein des Morganellaceae. La constitution d’une collection de souches comme expliqué précédemment a permis de réaliser cela. Au cours du criblage phénotypique des résistances au sein de ces souches de Morganellaceae, les isolats présentant des résistances d’intérêt telles que les résistances aux quinolones et fluoroquinolones ou encore aux céphalosporines à spectre étendu ont été choisis pour des analyses plus poussées.

Des analyses par PCR et séquençage ont permis de déterminer précisément les gènes porteurs de ces résistances et de détecter d’éventuelles mutations. Des expériences de Southern-blot ont alors affiné la localisation de ces gènes.

En ce qui concerne la résistance aux céphalosporines à spectre étendu, cette étude a en outre permis de faire un premier point sur la prévalence de ces résistances, cette dernière étant significative pour les BLSE et AmpC chez les P. mirabilis d’origine animale. Par ailleurs, un intérêt tout particulier a été porté pour les résistances aux quinolones et aux fluoroquinolones.

Les analyses ont mis en évidence le rôle majeur des plasmides porteurs du gène qnrD dans ces résistances. En effet, cette étude a abouti à la description pour la première fois de souches de Proteus spp porteuses de tels plasmides chez l’animal en Europe et a présenté le gène qnrD comme ayant un rôle clé au sein des plasmides porteurs de résistances de bas niveau aux quinolones et aux fluoroquinolones chez les Morganellaceae isolées d’animaux en France.

De plus, au cours de ces différents criblages, la volonté a été manifeste de chercher à mettre en évidence la présence d’un autre type d’îlot génomique porteur de résistance aux antibiotique : il s’agit des îlots SXT. Ainsi, une détection par PCR a pu démontrer pour la première fois la présence à la fois de l’îlot SXT et soit de l’îlot SGI1 ou PGI1 au sein d’une même souche de P. mirabilis.

71 Pour conclure, la finalité de ce projet a été d’approfondir notre connaissance de la situation épidémiologique de la diffusion de SGI1 et PGI1 chez P. mirabilis chez l’homme et l’animal en France, en ce qui concerne la diversité des isolats, mais aussi celles des variants de SGI1/PGI1. En parallèle, une autre volonté a été d’identifier d’autres facteurs et acteurs permettant l’acquisition de gènes de résistances d’intérêt au sein des Morganellaceae.

L’ensemble de ces résultats a alors pu être valorisé grâce à quatre publications scientifiques dans des revues internationales de rang A qui sont développées dans la partie suivante.

72 B. Résultats

B.1. Les éléments intégratifs mobilisables de multirésistance aux antibiotiques

SGI1 et PGI1 chez Proteus mirabilis, une étude chez l’homme et le chien en

France, 2010-13.

Survey of multidrug resistance integrative mobilizable elements SGI1 and PGI1 in Proteus mirabilis in humans and dogs in France, 2010-13

Eliette Schultz, Marisa Haenni, Laurent Mereghetti, Eliane Siebor, Catherine Neuwirth, Jean-

Yves Madec, Axel Cloeckaert and Benoît Doublet.

J. Antimicrob Chemother, May 2015. doi : 10.1093/jac/dkv154.

Les tous premiers cas de souches de P. mirabilis porteuses des îlots de multirésistance

SGI1 et PGI1 ont été décrits uniquement chez l’homme et ces cas étaient sporadiques et isolés

(Ahmed et al., 2007 ; Doublet et al., 2010 ; Siebor & Neuwirth 2011-2013-2014 ; Girlich et al., 2015). Notre étude a eu pour objectif de détecter chez P. mirabilis la présence des îlots

SGI1 et PGI1 à la fois chez l’homme mais aussi pour la première fois chez l’animal en

France.

Un total de 52 souches cliniques humaines et 46 souches cliniques animales de P. mirabilis ont été étudiées sur la période 2010-2013. Douze souches (5 humaines et 7 provenant de chiens) sont porteuses d’un élément SGI1 ou PGI1. Ces îlots ont alors été caractérisés par une cartographie PCR. Trois de ces souches (2 humaines et 1 animal) sont porteuses du variant SGI1-V uniquement décrit chez P. mirabilis et caractérisé par la présence d’un gène BLSE blaVEB-6. Pour quatre autres souches de P. mirabilis provenant de l’homme ou du chien, d’autres variants de SGI1 ont été identifiés tels que SGI1-A, SGI1-H, SGI1-L et

73 SGI1-PmABB. Plus surprenant, une souche de P. mirabilis possède un îlot génomique composé uniquement du squelette de l’îlot, l’intégron complexe de classe 1 étant absent.

Enfin, 4 dernières souches de notre étude présentent un îlot PGI1 (2 isolats humains, 2 isolats canins).

Afin d’étudier la diversité génomique de ces souches de P. mirabilis porteuses de

SGI1/PGI1, une électrophorèse en champ pulsé SmaI a été réalisée. Une grande diversité de fonds génomiques des souches est ainsi observable, à quelques exceptions près. En effet, les souches SGI1-V constituent un cluster commun. Et deux souches PGI1 sont très similaires et correspondent à celles déjà décrites dans la littérature (Siebor & Neuwirth, 2014).

Finalement, nous avons également cherché à déterminer la présence de gène de la famille blaCMY et de l’îlot SXT par PCR (données non présentées dans l’article). Trois souches d’origine canine sont particulièrement intéressantes. La souche 33184 PGI1 positive présente à la fois un gène blaCMY et l’îlot SXT. La souche 24236 SGI1-H est porteuse

également de l’îlot SXT. Et la souche 33448 qui possède l’îlot SGI1 dépourvu de région

MDR possède un gène blaCMY. C’est la première fois que les îlots PGI1 et SGI1 se retrouvent au sein d’une même souche avec l’îlot SXT. Et la présence d’un gène blaCMY indique

également que P. mirabilis est un réservoir potentiel pour divers supports de la résistance aux antibiotiques.

En conclusion, cette étude a mis en lumière la dispersion sur le territoire français de plusieurs variants SGI1/PGI1 au sein des souches de P. mirabilis diverses, suggérant plusieurs évènements indépendants de transferts horizontaux de ces éléments de multirésistance. Cette étude a également été la première à décrire SGI1 et PGI1 dans des souches de P. mirabilis d’origine animale en Europe. Il est désormais nécessaire de poursuivre nos investigations pour déterminer de façon plus précise les liens

épidémiologiques qui peuvent exister entre l’homme et l’animal, particulièrement les chiens,

74 qui sont des animaux de compagnie proches de l’homme. De plus, la mise en évidence du variant SGI1-V conférant une résistance BLSE confirme la nécessité de faire des efforts de surveillance en ce qui concerne P. mirabilis et les résistances aux antibiotiques qui lui sont affiliés.

75 76 77 78 79 Survey of multidrug resistance integrative mobilizable elements SGI1 and PGI1 in Proteus

mirabilis in humans and dogs in France, 2010-13

Eliette Schultz, Marisa Haenni, Laurent Mereghetti, Eliane Siebor, Catherine Neuwirth, Jean-

Yves Madec, Axel Cloeckaert and Benoît Doublet.

Supplementary Data

80 81 82 83 84 Figure S2.Comparison of the SGI1 and PGI1 backbones. Genes and ORFs are shown as arrows, with their orientations of transcription indicated by the arrowheads. attL and attR are indicated by thick black bars and represent the 18-bp direct repeats defining the left and right ends of the islands. The grey shaded areas indicate nucleotide identity between ORFs based on previously published analysis by Siebor and Neuwirth.11 Genetic organizations were drawn from Genbank accession numbers AF261825 (SGI1) and KJ439039 (PGI1-PmCHE) and KF856624 (PGI1-PmPEL).

variable MDR region

S004 S005 S011 S012 S014 S019-20 res trmE int xis rep (traN) S006-10 ( traG) (traH) S013 S015-18 S021-22 S023 S024 S025 S026 (tnpR) S044 SGI1

attL attR (DR-L) (DR-R)

80% 77% 67% 70% 70% 77% 80% 76% 87% 93% 87% 98% 97% 83% 96%

attL attR (DR-L) (DR-R) PGI1

tr mE int xis rep P004 P005-08 P009 P010 P011 P012-15 P016 P017-18 P022 P023 res P025 (traN) (traG) P019-21 (tn pR )

var iable M DR region

85 86 87 B.2. Détection d’éléments SGI1 et PGI1 et de résistances aux céphalosporines à large spectre chez les Morganellaceae d’origine animale en France.

Detection of SGI1/PGI1 Elements and Resistance to Extended-Spectrum Cephalosporins in

Proteae of Animal Origin in France

Eliette Schultz, Axel Cloeckaert, Benoît Doublet, Jean-Yves Madec and Marisa Haenni.

Front. Microbiol. January 2017. doi: 10.3389/fmicb.2017.00032

Il existe peu de résultats dans la littérature au sujet de l’antibiorésistance en médecine vétérinaire en France en ce qui concerne les Morganellaceae et plus particulièrement Proteus mirabilis. Afin de faire le point sur la situation et déterminer des bases solides pour répondre

à cette problématique, nous avons lors de cette étude procédé de façon systématique en analysant sur la période d’avril 2013 à février 2015 468 isolats de Morganellaceae

(majoritairement P. mirabilis). Ces souches proviennent du réseau Résapath et ont été prélevées en clinique vétérinaire sur des hôtes animaux d’origines diverses (majoritairement chez les chiens mais aussi chez les chats, les chevaux, les bovins, les lapins, les ovins, les ferrets, les reptiles et les oiseaux). Nous nous sommes focalisés sur le profil de résistance aux antibiotiques de ces souches et principalement sur les résistances aux céphalosporines à large spectre, en déterminant les gènes responsables de ces résistances et leur localisation chromosomique ou plasmidique, ainsi que la détection des îlots génomiques SGI1/PGI1.

En ce qui concerne la détection d’îlots de multirésistance aux antibiotiques par PCR, sur les 468 souches étudiées, 17 P. mirabilis (17/468, soit 3,6%) sont positives pour SGI1 (11 souches) ou PGI1 (6 souches). Ces souches ont été principalement isolées de chiens (13/411, soit 3,2%), mais aussi de chats (2/25, soit 8%) et de chevaux (2/13, soit 15,4%). La caractérisation de chaque variants de l’îlot SGI1 a été réalisée par PCR. Sur les 11 souches 88 SGI1-positive, 6 présentent un profil BLSE du fait de la présence du variant SGI1-V porteur du gène blaVEB-6. Les 5 autres variants de SGI1 correspondent soit à SGI1-H (1 souche),

SGI1-PmABB (3 souches) ou SGI1-PmMAT (1 souche).

La détermination des résistances aux céphalosporines a permis de mettre en évidence

18 souches (18/468, soit 3,8 %) arborant un profil BLSE (9 souches), un profil AmpC (8 souches) ou une combinaison des deux (1 souche). Outre les 6 souches SGI1-V positive, 4 autres souches ont montré un phénotype BLSE. Les souches n° 38327 et 39081 de P. mirabilis présentent un gène blaVEB-6 indépendamment de la présence d’un élément SGI1, la souche n° 34146 de P. mirabilis présente le gène blaCTX-M-15 et la souche n° 39465 de P. rettgeri présente le gène blaCTX-M-1. Concernant les phénotypes de résistance AmpC, le gène blaCMY-2 est détecté seul dans 7 souches de P. mirabilis, et la souche n° 38375 de P. mirabilis présente quant à elle le gène blaDHA-16. Enfin, la souche n° 39214 de P. mirabilis a la particularité de présenter à la fois blaCMY-2 et blaDHA-16. La présence de multiples gènes conférant une résistance aux céphalosporines au sein d’une même souche montre la capacité de P. mirabilis à accumuler de nombreux gènes de résistance et ainsi à agir comme un réservoir potentiel.

La localisation chromosomique de ces gènes par Southern-blot IceuI a montré que tous les gènes blaCMY-2 et blaDHA-16 sont localisés sur le chromosome bactérien. Il en va bien sûr de même pour les gènes blaVEB-6 portés par le variant SGI1-V ainsi que la souche n° 39081 de P. mirabilis blaVEB-6 positive mais SGI1-négative. En revanche, la localisation plasmidique par

électrophorèse en champ pulsé traité par la nucléase S1 a montré que la souche n° 38327 de P. mirabilis blaVEB-6 positive mais SGI1-négative ainsi que la souche n° 39465 de P. rettgeri blaCTX-M-1 sont porteuses de ces gènes sur des plasmides non typable par amplification PBRT.

Enfin la souche n° 34146 de P. mirabilis porteuse du gène blaCTX-M-15 révèle la présence de deux copies du gène, une sur le chromosome et l’autre sur un plasmide non-typable, laissant

89 alors supposer que ce plasmide non-typable a peut-être la capacité de s’intégrer dans le chromosome bactérien. Ces résultats suggèrent fortement que les Morganellaceae sont plus à même d’intégrer des déterminants de résistance dans leur chromosome bactérien à l’instar des autres Enterobactericeae qui privilégient la localisation plasmidique de ces gènes de résistance.

Par ailleurs, nous avons voulu observer également la diversité génétique des souches d’intérêt grâce à une électrophorèse en champ pulsé SmaI. Les profils de macrorestriction montrent une forte diversité des souches que ce soit entre les souches SGI1/PGI1 et les souches résistantes aux céphalosporines. A l’exception des souches SGI1-V qui elles, se regroupent dans un même cluster.

Enfin, nous avons vérifié par PCR la présence de l’îlot SXT parmi les souches d’intérêt (données non présentées dans l’article). Six souches, toutes SGI1/PGI1 négatives, sont porteuses de l’îlot SXT. De plus, parmi ces 6 souches SXT positives, 5 d’entre elles sont

également porteuse du gène de résistance aux céphalosporines blaCMY-2. Cette donnée est intéressante du fait que le gène blaCMY-2 est localisé sur le chromosome bactérien dans ces souches et qu’il existe un variant de SXT porteur de ce gène. Des expériences complémentaires seront nécessaires pour déterminer si dans ce cas là, blaCMY-2 est ou non porté par SXT et s’il est possible de le transférer.

En conclusion, cette étude a permis de faire un premier bilan en ce qui concerne la prévalence des résistances aux céphalosporines ainsi que la présence d’îlots de multirésistance de type SGI1/PGI1 au sein des Morganellaceae chez l’animal en France. Ces premières données montrent une prévalence significative des BLSE/AmpC chez les P. mirabilis d’origine animale. Ces résultats posent désormais la question de savoir si ce phénomène est

émergeant et si à l’avenir l’occurrence de telles résistances au sein de la famille des

Morganellaceae va s’accroitre ou non. La présence d’îlots génomiques de multirésistance

90 SGI1 et PGI1 a également été démontrée chez P. mirabilis dans différentes espèces animales.

Ces îlots jouant un rôle majeur dans la dissémination de résistances aux antibiotiques, de tels résultats montrent toute l’importance de rester vigilant, surtout en ce qui concerne le variant

SGI1-V porteur du gène BLSE blaVEB-6. Ainsi, l’ensemble de ces données suggère une voie d’inter-transmission d’îlots de multirésistance aux antibiotiques au sein de la famille des

Morganellaceae et en particulier entre différentes souches de P. mirabilis. Ces résultats relèvent d’un intérêt sanitaire pour le public et il est nécessaire de poursuivre nos investigations pour clarifier ces voies de dissémination des résistances et des supports qui les portent au sein du réservoir animal.

91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 Detection of SGI1/PGI1 Elements and Resistance to Extended-Spectrum Cephalosporins in

Proteae of Animal Origin in France

Eliette Schultz, Axel Cloeckaert, Benoît Doublet, Jean-Yves Madec and Marisa Haenni.

Supplementary data

Table S1. Primers used for preparing the Southern blot probes

Primer Nucleotide sequence (5'-3') Region amplified

23S-for AATGATGGCCAGGCTGTCTCC 23S rRNA 23S-rev CCGCCGTCGATATGAACTCTTG

Veb-Ext-Up ATTTAACCAGATAGGAGTACA blaVEB Veb-Ext-Low CGGTTTGGGCTATGGGCAG

MA_1 SCSATGTGCAGYACCAGTAA blaCTXM(all groups) MA_2 CCGCRATATGRTTGGTGGTG

MulticaseDHA-for TGATGGCACAGCAGGATATTC blaDHA MulticaseDHA-rev GCTTTGACTCTTTCGGTATTCG

CF1 ATGATGAAAAAATCGATATG blaCMY CF2 TTATTGCAGTTTTTCAAGAATG

101 102 103 B.3. Séquences complètes de plasmides porteurs de qnrD chez Proteus spp. d’origine animale en France.

Complete sequences of qnrD-carrying plasmids in Proteus spp. collected from French animals

Eliette Schultz, Sylvie Baucheron, Agnese Lupo, Estelle Saras, Axel Cloeckaert, Benoît

Doublet, Jean-Yves Madec and Marisa Haenni.

Soumis le 12/06/2017 à Journal of Global Antimicrobial Resistance

Les fluoroquinolones sont des antibiotiques largement utilisés en médecine humaine et vétérinaire et il n’est pas rare de voir des phénotypes de résistance émergés au sein des espèces bactériennes qui leur sont exposées. C’est le cas chez les entérobactéries, où de hauts niveaux de résistance sont le plus souvent dus à des mutations dans les régions déterminant la résistance aux quinolones (quinolone-resistance determining regions, QRDRs) de l’ADN gyrase (GyrA et GyrB) et l’ADN-topoisomérase IV (ParC et ParE) (Dalhoff, 2012). De plus, il existe des plasmides porteurs de gènes de résistance aux quinolones (plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR) (Drlica & Malik, 2003). Les gènes qnr en font partie. Ils codent pour des protéines qui ont un rôle de protection pour l’ADN gyrase et l’ADN topoisomérase envers les quinolones. Cela permet ainsi de conférer une résistance de bas niveau mais qui est transférable du fait de sa localisation plasmidique. Le gène qnrD est d’un intérêt tout particulier. Découvert initialement chez Salmonella, des études récentes ont montré que les

Morganellaceae pouvaient représenter un réservoir pour ce gène, qui a toujours été décrit sur des petits plasmides de 2,7 à 4,2 kb non-transmissibles et hautement conservés. Notre étude s’est donc portée sur la détermination de la prévalence de qnrD au sein de Morganellaceae issues de cas cliniques chez des animaux et de caractériser les plasmides porteurs.

104 Un total de 454 Morganellaceae collectées via le Resapath entre 2008 et 2015 ont été analysées par antibiogramme pour déterminer leur phénotype de résistance aux antibiotiques.

Ainsi, 175 souches (38,5%) ont montré une résistance aux quinolones (acide nalidixique

NAL) et 80 (17,6%) une résistance aux fluoroquinolones (enrofloxacine ENR). Ces souches résistantes ont été testées par PCR pour caractériser la présence ou non des gènes qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, oqxAB, acc(6’)-Ib-cr et qepA. Au final, seul qnrD a été détecté dans 12 souches non-clonales de P. mirabilis, une souche de P. penneri et une souche de P. vulgaris

(14/175, 8%), isolées chez 3 bovins et 11 chiens. Les CMIs de NAL, ENR et de la ciprofloxacine (CIP) ont été réalisées et les mutations dans les QRDRs ont été détectées par

PCR et séquençage. Trois souches ayant des CMIs de NAL, ENR et CIP de 8 - 0,5 - 0,125 mg/L respectivement ont montré une absence de mutation dans les QRDRs, suggérant que l’augmentation des CMIs par rapport à la souche contrôle est le reflet de l’impact direct de la présence du gène qnrD dans ces souches. Deux autres souches ayant une résistance moindre aux quinolones et fluroquinolones présentaient une unique mutation dans ParC(S80G/I). Les 9 souches restantes avaient de haut niveaux de résistances à NAL et ENR et étaient uniquement porteuses de mutations dans ParC(S80I/R, E84K) et GyrA(S83I).

Les 14 plasmides porteurs de qnrD ont été séquencés par plasmid genome walking.

Les gènes qnrD étaient présents avec une identité de 100% à l’exception de la souche N°

39224 qui présentait une mutation silencieuse G1601T et tous ces gènes étaient localisés sur de petits plasmides non-typable et non-conjugatif. Huit plasmides étaient identiques au plasmide pEAD1-1 découvert initialement chez P. vulgaris, qui est aussi identique au plasmide pCGH15 de P. mirabilis et présente 3 mutations par rapport au plasmide pDIJ09-518a de P. rettgeri (Zhang et al., 2013 ; Guillard et al., 2012). Trois autres plasmides étaient hautement similaires à pEAD1-1. Enfin, les trois derniers plasmides étaient semblables à pEAD1-2

(Albornoz et al., 2014).

105 Tous ces plasmides ont été transférés dans une souche réceptrice d’E. coli et les transformants obtenus ont tous montrés une augmentation des CMIs pour NAL de 4 fois, et pour CIP et ENR de 8-16 fois. Par conséquent, malgré diverses mutations sur ces plasmides, la résistance conférée par qnrD restait présente.

Cette étude montre pour la première fois des souches de Proteus spp. possédant des plasmides porteurs de qnrD chez l’animal en Europe. Les prévalences pour qnrD décrites ici

(14/454, 3%) sont similaires aux prévalences rapportées en Argentine pour des cas cliniques en médecine humaine (3,1%)(Albornoz et al., 2014) et supérieures à celles trouvées en Chine

(1%) (Chen et al., 2016) et chez des chiens au Japon (1,9%) (Harada et al., 2014). De plus l’absence de clonalité entre ces souches suggère qu’il y a eu plusieurs évènements d’acquisition de ces plasmides.

En conclusion, qnrD se présente comme le gène majeur de PMQR conférant un bas niveau de résistance aux quinolones et aux fluoroquinolones chez les Morganellaceae isolées d’animaux en France. De plus ces plasmides qnrD sont particulièrement conservés. Ainsi, il semble nécessaire de poursuivre et accroitre la surveillance de ce phénomène et rester vigilant quant à la dynamique de transmission de ces plasmides.

106 107 108 Complete sequences of qnrD-carrying plasmids in Proteus spp. collected from French

animals

Eliette Schultz, Sylvie Baucheron, Agnese Lupo, Estelle Saras, Axel Cloeckaert, Benoît

Doublet, Jean-Yves Madec and Marisa Haenni.

Supplementary Data

109 B.4. L’îlot génomique de multirésistance aux antibiotiques SGI1 chez une souche clinique humaine de Morganella morganii subsp. morganii, France.

Multidrug resistance Salmonella genomic island 1 in a Morganella morganii subsp. morganii in human clinical isolate, France

Eliette Schultz, Olivier Barraud, Jean-Yves Madec, Marisa Haenni, Axel Cloeckaert, Marie-

Cécile Ploy and Benoît Doublet. mSphere, 2017 Apr 19;2(2). pii: e00118-17. doi : 10.1128/mSphere.00118-17.

Dans cette étude nous avons analysé la première souche de Morganella morganii subsp. morganii porteuse d’un IME de multirésistance SGI1 et isolée d’un cas clinique humain en France.

Le patient était un homme de 52 ans, séropositif pour le VIH et le virus de l’hépatite

C. Il a été hospitalisé en janvier 2013 pour de l’hypertension et une cirrhose aggravée par un carcinome hépatocellulaire. La souche M. morganii LIM90 a été isolée d’un échantillon d’urine lors de son séjour à l’hôpital. Le profil de résistance aux antibiotiques de cette souche a été déterminé par antibiogramme. Outre les résistances intrinsèques à divers antibiotiques de la famille des β-lactamines (amoxicilline, acide clavulanique, céfalotine, céfuroxime), à la colistine, la tétracycline, la nitrofurantoine, et la fosfomycine, la souche de M. morganii

LIM90 était également résistante au chloramphénicol, florfénicol, streptomycine, spectinomycine, sulfonamides, triméthoprime et ticarcilline. Un tel phénotype de résistance pouvait s’expliquer par la présence de l’îlot SGI1. Cette hypothèse a pu être confirmée par une PCR de détection qui a montré la présence d’un îlot SGI1 au sein de cette souche.

Pour identifier le variant de SGI1, sa localisation sur le chromosome et son contenu en gènes de résistance, le génome complet de la souche LIM90 a été séquencé par le système

IonProton et assemblé en utilisant le logiciel MIRA. Les outils ResFinder et PlasmidFinder 110 ont été respectivement utilisés pour l’identification des gènes de résistance acquis et la détection de plasmides. La séquence complète de SGI1 a été assemblée par BLAST, des PCR et du séquençage. Ensuite, elle fut annotée via la plateforme Microbial Genome Annotation and Analysis Platform MicroScope (Genoscope, France) et déposée à l’ENA (European

Nucleotide Archive) sous le numéro d’accession LT630458. Ainsi, la souche M. morganii

LIM90 est porteuse du variant SGI1-L. Auparavant ce variant avait déjà été décrit chez S. enterica et P. mirabilis mais n’avait jamais été décrit chez M. morganii.

La séquence complète du génome de cette souche a aussi révélé la présence du gène blaDHA-17. De plus cette souche présentait également sur son chromosome un intégron de classe 2 porteur de deux cassettes de gènes de résistance, sat2 et aadA1, conférant respectivement les résistances à la streptothricine et la streptomycine/spectinomycine.

En conclusion, l’identification de l’îlot SGI1 chez M. morganii est d’un intérêt majeur en ce qui concerne la diffusion de tels îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques, principalement au sein d’espèces bactériennes naturellement résistantes aux E-lactamines comme M. morganii. Le transfert horizontal joue donc un rôle majeur dans la dissemination de SGI1 au sein de différentes espèces bactériennes de la famille des entérobactéries.

111 112 113 114 115 116 B.5. Un regard sur le passé : étude d’une collection de Morganellaceae 1992-

2000.

Les précédentes études que nous avons mené nous ont permis de démontrer que la présence d’IME de multirésistance SGI1 et PGI1 ne sont pas des évènements sporadiques au sein des Morganellaceae en France, que ce soit en médecine humaine ou animale. Mais quand de tels îlots génomiques ont-ils émergé au sein de cette famille bactérienne ?

En collaboration avec le CNR des Entérobactéries de l’Institut Pasteur de Paris, nous avons pu avoir accès à une de leur collection de souches de Morganellaceae datant de Janvier

1992 à Novembre 2000. Nous avons alors décidé de les répertorier pour voir si de tels

éléments génétiques sont contemporains à leur première découverte chez P. mirabilis en 2006 ou s’il était possible de les retrouver dans des souches plus anciennes.

Matériels et méthodes

Souches bactériennes et tests de résistance aux antibiotiques

Entre Janvier 1992 et Novembre 2000, 248 souches de Morganellaceae ont été mise en collection à l’Institut Pasteur de Paris (P. mirabilis n=165, M. morganii n=32, Providencia stuartii n=18, Providencia rettgeri n=13, P. vulgaris n=10, Providencia rustigianii n=6,

Providencia alcalifaciens n=3, P. penneri n=1). Ces souches ont été collectées dans différentes localités françaises et proviennent de divers origines et échantillonnages

(prélèvements humains, prélèvements alimentaires, prélèvements vétérinaires).

Ces isolats ont alors été caractérisés pour leurs résistances aux antibiotiques par la méthode de diffusion par disque suivant les conditions d’usage du comité EUCAST avec 30 antibiotiques d’intérêt en médecine humaine et/ou vétérinaire (The European Committee on

Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint Tables for Interpretation of MICs and Zone

Diameters. Version 4.0, 2014. http://www.eucast.org). 117 Détection et caractérisation des IME SGI1/PGI1

La détection de SGI1 a été réalisée par amplification PCR avec des amorces

dégénérées qui permettent l’amplification de tous les gènes de l’intégrase de SGI1 et PGI1

connus (FwintSGI1HR, 5’ATGTTGCGTCAGGCYGAGGC ; RvintSGI1HR,

50GAGTGYCCAAGAAGSCGAGAG). La localisation chromosomique a été confirmée par

amplification PCR des jonctions gauche et droite dans le chromosome, comme cela a déjà été

décrit (Schultz et al., 2015).

La diversité génétique de SGI1 a été caractérisée par cartographie PCR en parcourant

l’ensemble de l’îlot en utilisant des amorces déjà décrites auparavant (Siebor & Neuwirth,

2011, 2013). La détection et la localisation chromosomique de PGI1 ainsi que la cartographie

du squelette de l’îlot ont été réalisées en suivant le protocole déjà décrit (Siebor & Neuwirth,

2014).

Résultats

Sur les 248 souches analysées, trois souches se sont révélées positives pour la

détection d’un îlot SGI1/PGI1 (Tableau ci-dessous).

Souche Espèce Echantillon Date Ville Ilot Profil de résistance

7470 P. mirabilis prélèvement humain 28/08/1996 Angers SGI1-D ChlTetCsSssTmp(Nal)

11819 P. mirabilis selles 04/12/1996 Strasbourg SGI1-V-like KanAprChlTetCsSssTmp(Nal)

8213 P. mirabilis selles 31/08/1997 La Flèche PGI1 (Amx)PipTicStrKanAprGenTobraChlTetCsSssNal

Tableau 3 : Caractéristiques des souches de P. mirabilis SGI1 et PGI1 positives.

La souche N° 7470 a été isolée en 1996 à Angers et était porteuse d’un îlot de type

SGI1-D. Ce variant avait été décrit pour la première fois chez S. enterica serovar Agona

118 (Boyd et al., 2002). La souche N° 11819, isolée en 1996 à Strasbourg était d’autant plus intéressante car elle possédait une similitude avec le variant SGI1-V (Figure 18). En effet, comme pour SGI1-V, le variant de cette souche possède au niveau du squelette de l’îlot l’insertion des ORF PM1, PM2 et PM3 ainsi que la délétion au niveau des ORF S023 et S024.

De plus, comme pour SGI1-V, il y a une insertion d’ADN pour l’heure encore non-identifiée au niveau de la jonction droite. Enfin en ce qui concerne la région de multirésistance, cette souche présente un intégron complexe de classe 1 de type InSGI1-O, qui en dehors de la présence de la cassette aacA4 et aadB et des gènes blaVEB-6 et qnrA1, est très proche de la synthénie du variant SGI1-V.

Figure 18 : Schéma représentatif du variant SGI1 de la souche Proteus mirabilis N° 11819.

Enfin, la souche N° 8213 isolée en 1997 à La Flèche a révélé qu’elle était porteuse de l’IME PGI1.

Ainsi, ces trois souches sont d’un intérêt tout particulier car elles mettent en évidence le fait que l’histoire entre P. mirabilis et les IME SGI1 et PGI1 a commencé dans les années

1990 et coïncide avec l’apparition de SGI1 chez les salmonelles. L’origine de la présence de

SGI1 et PGI1 au sein de ces espèces d’entérobactéries est loin d’être totalement élucidée mais

119 de telle étude montre que l’émergence de ces supports de résistance a peut-être une origine bactérienne et temporelle ainsi qu’une mécanistique commune.

120 Discussion et perspectives

121 Les éléments génétiques tels que les îlots génomiques SGI1 et PGI1 sont des acteurs cruciaux dans l’émergence et la dissémination des résistances aux antibiotiques. Leur découverte récente au sein de l’espèce bactérienne P. mirabilis et en parallèle l’important accroissement des cas de résistances majeures à des antibiotiques d’intérêt clinique et sanitaire au sein des Morganellaceae dans la littérature ont montré toute la nécessité de porter une attention particulière à cette famille bactérienne et aux résistances qui s’y trouvent associées. Cependant, les cas rapportés restaient sporadiques et ciblaient uniquement des souches cliniques humaines.

Quelle part prennent SGI1 et PGI1 dans cet accroissement ? Quelle est la réalité de leur dissémination au sein des Morganellaceae en France, chez l’homme mais aussi chez l’animal ? Quels autres supports génétiques sont responsables de résistances à des antibiotiques majeurs utilisés en médecine humaine et vétérinaire chez les Morganellaceae ?

C’est à ces questions que ce travail avait pour objectif de répondre.

La question de la prévalence et de la diversité de SGI1 et PGI1 chez les

Morganellaceae ainsi que de la situation épidémiologique chez l’homme et l’animal a été développée grâce à une étude approfondie d’une collection de souches collectées au cours de ce travail. Pour la première fois en Europe, les îlots SGI1 et PGI1 ont été décrits dans des souches de P. mirabilis d’origine animale diverses.

Un intérêt particulier a été porté sur le variant SGI1-V porteur du gène BLSE blaVEB-6.

Parmi l’ensemble des variants SGI1 et PGI1 décrits, il est remarquable de noter la similitude des souches porteuses de SGI1-V. Dans notre première étude (Schultz et al., 2015), toutes les souches SGI1-V positives se regroupaient au sein du même cluster car leurs fonds génétiques

étaient très similaires. Ces isolats provenaient de plusieurs régions françaises, avaient des origines humaines et canines distinctes, et n’avaient pas de lien ou connexion quelconque entre eux. De plus, des souches de P. mirabilis positives pour VEB-6 et isolées de viande crue

122 de dinde en Suisse ont été décrites récemment comme étant proche génétiquement avec la première souche originelle SGI1-V, la souche PmVB1248 (Seiffert et al., 2013). Ces premières données suggèrent une dissémination en France mais plus largement en Europe de ce variant SGI1-V dont les gènes de résistances aux antibiotiques sont une menace majeure pour la santé des populations et du monde animal. Par ailleurs, les résultats de l’étude Schultz et al., 2017 montraient également la présence du variant SGI1-V au sein d’isolats provenant de différents cas cliniques d’origine animale. Ces souches présentaient une forte similitude génétique qui les regroupait dans un même cluster, mais cependant différent du cluster de souches de notre précédente étude. Ce regroupement spécifique suggère qu’il y ait eu un

évènement de dissémination du variant SGI1-V au travers de différentes populations clonales n’ayant pas de lien entre elles. De plus, une telle dominance d’une population clonale de souches de P. mirabilis SGI1-V positives à la fois chez l’homme et chez l’animal de compagnie peut résulter du contact étroit qui existe entre ces deux populations. En effet, il a déjà été démontré la transmission de clones bactériens entre l’homme et l’animal via des contacts physiques, ou bien des contacts avec de la salive ou des fécès contaminés (Espinosa-

Gongoraetal et al., 2015 ; Ljungquist et al., 2016). Est-ce que cela aurait pu être possible dans le cas des souches P. mirabilis SGI1-V déjà décrites dans la littérature ? La question de la mobilité et de la diffusion de ce variant reste ouverte. Mais des récentes données expérimentales ont montré que le variant SGI1-V était bien mobilisable et transférable (Siebor et al., 2016).

A l’inverse, les souches hébergeant d’autres variants SGI1 et PGI1 ont montré une grande diversité clonale. Ces résultats suggèrent l’occurrence de plusieurs évènements de transfert horizontal des éléments SGI1 et PGI1, comme cela fut déjà observé au sein de différents serovars de S. enterica.

123 Au cours de la cartographie des variants de SGI1, un nouveau variant particulier a été découvert. Il s’agit d’un îlot génomique composé uniquement du squelette de l’îlot, l’intégron complexe de classe 1 étant absent (Schultz et al., 2015). Cet îlot baptisé SGI1-like est génétiquement différent à la fois de SGI1 et de SGI2. L’étude a montré que cet îlot ne présentait aucune cicatrice témoignant de l’occurrence de cassette de résistance qui aurait pu s’exciser du squelette de l’îlot, laissant ainsi l’îlot vide de tout gène de résistance aux antibiotiques. Pour reprendre l’idée des poupées russes d’Amabile-Cuevas & Chicurel (1992),

SGI1-like est comme une poupée vide. La question qui se pose est donc de savoir si SGI1-like est capable d’accueillir une « nouvelle petite poupée » en son sein, c'est-à-dire d’intégrer un intégron complexe de classe 1 ? Si cela est effectivement confirmé à l’avenir par l’expérimentation, ce variant représentera une menace importante car son potentiel d’acquisition de résistances critiques à des familles d’antibiotiques telles que les céphalosporines à large spectre ou les carbapénèmes en fera un IME particulièrement intéressant.

Par ailleurs, cette étude a également permis de détecter pour la première fois SGI1 chez un autre membre des entérobactéries, M. morganii. Cette découverte appuie la menace d’une dissémination au sein d’autres espèces d’entérobactéries (telle que E. coli) et en dehors de cette famille bactérienne. Une étude précédente menée au sein de notre laboratoire avait d’ailleurs déjà soulevé ce point (Doublet et al., 2007). En effet, une analyse de séquences au travers des bases de données disponibles avait mis à jour plusieurs espèces bactériennes potentiellement capables d’intégrer SGI1 : Shigella spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp.,

Brucella spp., Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae ou encore Shewanella spp. De part leur importance en médecine humaine et vétérinaire, il serait donc fortement intéressant de creuser également la piste de SGI1 et même de PGI1 au sein de ces espèces bactériennes.

Aucune donnée n’est actuellement disponible concernant la présence de ces îlots de façon

124 naturelle chez ces espèces. Mais récemment, il a été montré en laboratoire le transfert possible de SGI1 et PGI1 vers les espèces suivantes : E. coli, Enterobacter cloacae, K. pneumoniae, P. mirabilis, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, P. vulgaris, P. stuartii et Serratia marcescens (Siebor et al., 2016). De tels résultats ne peuvent que venir

étayer l’hypothèse d’une possible dissémination de ces îlots également de façon naturelle dans ces espèces. Par ailleurs, il a été mis en évidence d’autres îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques notamment chez S. marcescens et Acinetobacter baumanii, nommé respectivement SmrGI1-1 et AGI1 (Mataseje et al., 2014 ; Hamidian et al., 2015). Ces îlots présentent des points communs avec SGI1 et PGI1. Il n’est donc pas impensable de potentiellement pouvoir retrouver de tels îlots dans d’autres espèces bactériennes que celles où ils ont été originellement décrits, dont des Morganellaceae. Ainsi, les barrières inter- espèces ne sembleraient pas freiner la propagation de tels îlots génomiques de résistances aux antibiotiques et l’étude de ces échanges, émergences et disséminations sera primordiale pour prendre la pleine mesure de la menace sur la santé publique.

De plus, un autre îlot génomique porteur de résistance aux antibiotiques a montré son intérêt au cours de cette étude : l’ICE SXT. En effet, cet ICE étant un élément intégratif conjugatif, sa détection au sein de notre collection a permis de soulever de nouvelles interrogations. Pour la première fois, l’ICE SXT a été révélé au sein de souches de P. mirabilis étant également porteuse de SGI1 ou PGI1. La question qui peut se poser est alors de savoir si les IME SGI1 ou PGI1 sont capables d’utiliser la machinerie de conjugaison de l’ICE SXT pour se transférer d’une cellule à une autre. Des investigations seraient nécessaires en ce sens. Par ailleurs, comme il a déjà été décrit dans la littérature, il existe des variants de

SXT porteur en leur sein d’un gène blaCMY-2 (Harada S et al, 2010). Certaines des souches que nous avons caractérisées comme SXT-positives étaient aussi porteuses d’un gène blaCMY-2.

Cependant, nous n’avons pas pu déterminé si le gène blaCMY-2 était ou non porté par SXT et si

125 le transfert de SXT avait alors un rôle dans la dissémination probable de ce gène de résistance aux céphalosporines au sein des Morganellaceae. Des recherches plus poussées concernant l’îlot SXT et son rôle chez les Morganellaceae dans la dissémination de résistances aux antibiotiques seraient donc une piste intéressante à exploiter.

Enfin, une démarche tournée vers le passé des Morganellaceae a eu pour but de chercher SGI1 et PGI1 dans une collection de souches plus anciennes. En ce qui concerne

SGI1, il a été démontré que les premiers cas connus ont été mis en évidence au cours des années 1990 chez les salmonelles. Nous voulions savoir si l’histoire de SGI1 et PGI1 au sein des Morganellaceae avaient alors débuté avant, pendant ou après celle que nous connaissions chez les salmonelles. Ainsi, deux souches SGI1-positives isolées en 1996 et une souche PGI1- positive isolée en 1997 ont montré que les salmonelles et les Morganellaceae semblent avoir rencontré ces îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques dans une même période.

Mais même si l’apparition de ces îlots au sein des Morganellaceae est loin d’être résolue, cette étude laisse supposer que l’émergence de ces supports génomiques chez différentes espèces d’entérobactéries a peut-être une origine et des mécanismes en commun. Une piste

éventuelle à suivre pour prendre une plus grande mesure de la dissémination de SGI1 et PGI1 au travers de souches plus anciennes serait d’utiliser les souches dont le génome a déjà été séquencé et qui est disponible dans les bases de données. Il existe des outils de recherche bioinformatique qui ont été crée en ce sens tel que le logiciel GIPSy (Soares et al., 2016).

En ce qui concerne les autres éléments génétiques porteurs de résistances aux antibiotiques chez les Morganellaceae, notre intérêt s’est porté dans un premier temps sur deux familles d’antibiotiques : les quinolones/fluoroquinolones et les céphalosporines à large spectre.

126 Les quinolones et les fluoroquinolones sont des antibiotiques dont l’utilisation est courante en médecine humaine et animale. La recherche de résistance à ces antibiotiques chez les Morganellaceae avait donc une finalité intéressante. L’étude que nous avons menée a permis de mettre en évidence l’importance du gène qnrD dans cette résistance. Ce gène porté par des plasmides confère des bas niveaux de résistance aux quinolones et aux fluoroquinolones et s’est montré particulièrement bien conservé au sein des isolats que nous avons caractérisés. Il semble donc indispensable de garder une surveillance attentive sur ce phénomène et ne pas minimiser la dynamique de transmission de ces plasmides.

Par ailleurs, les céphalosporines à large spectre représentent une autre famille d’antibiotique clé et dont l’émergence de résistance chez les Morganellaceae est source de difficulté de traitements adéquates pour les professionnels de santé. L’étude qui a été menée a permis d’identifier plusieurs gènes responsables des phénotypes de résistances observés au sein de notre collection de souches de Morganellaceae : blaVEB-6, blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaDHA-16 et blaCMY-2. La localisation de ces gènes a montré que seules la souche porteuse de blaCTX-M-1, celle porteuse de blaCTX-M-15 et une unique souche ayant blaVEB-6 possédaient ces gènes de résistances sur des plasmides non-typables. Toutes les autres souches avaient intégrés les gènes de résistances aux céphalosporines au sein de leur chromosome bactérien.

Par ailleurs, certaines souches ont même montré une présence concomittante de plusieurs gènes de résistances aux céphalosporines.

Ces résultats démontrent l’aptitude des Morganellaceae et particulièrement de P. mirabilis à l’accumulation de nombreux gènes de résistance, avec une nette préférence pour une intégration dans leur chromosome bactérien à la différence des autres entérobactéries qui privilégient plutôt les plasmides. L’ensemble de ces données révèlent donc une prévalence non négligeable de gènes BLSE et AmpC chez les Morganellaceae. La question en suspens

127 est de savoir si cette observation marque une émergence et si dans un avenir proche, de telles occurrences de résistance chez les Morganellaceae vont aller en s’accroissant ou non.

Pour conclure, ce travail a répondu à certaines questions, en a soulevé d’autres, et un certain nombre attendent encore des réponses. C’est le cas des questions qui se portent à l’étude du potentiel d’acquisition de gènes de résistance au sein de SGI1 et PGI1. Il serait absolument nécessaire d’explorer précisément les processus de transfert et d’acquisition de

SGI1 et PGI1 au sein des Morganellaceae, mais aussi la mobilité des gènes de résistances de divers supports génétiques vers SGI1/PGI1, et cela au sein de différents fonds génétiques bactériens (Proteus, Salmonella, Escherichia). Il en va de même en ce qui concerne les conditions physiologiques favorables à de telles acquisitions (le stress antibiotique, la réponse

SOS…). Décrypter les mécanismes et les conditions environnementales responsables de la mobilité et de la plasticité des îlots génomiques SGI1 et PGI1 au sein des Morganellaceae et dans une vision plus large au sein des entérobactéries seraient d’une importance cruciale dans la lutte qui est actuellement menée pour essayer de limiter la dissémination des résistances aux antibiotiques.

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158 Annexes

159 Annexe 1

Variants de l’îlot génomique SGI1

160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 Eliette SCHULTZ - ASCENSIO Diffusion d’îlots génomiques de multirésistance aux antibiotiques chez Proteus mirabilis

Résumé La résistance aux antibiotiques est une menace non négligeable pour la santé publique. Ces résistances peuvent être portées par différents supports dont les îlots génomiques. Il a été démontré que les îlots génomiques Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) et Proteus Genomic Island 1 (PGI1) sont des acteurs importants de la multirésistance aux antibiotiques. Quelques variants de SGI1 et PGI1 ont déjà été décrits au sein de l’espèce P. mirabilis. Dans ce contexte, ce projet de thèse se proposait d’approfondir notre connaissance de la situation épidémiologique de la diffusion de SGI1 et PGI1 chez P. mirabilis chez l’homme et l’animal en France, en ce qui concerne la diversité des isolats, mais aussi celles des variants de SGI1/PGI1. En parallèle, une autre volonté a été d’identifier d’autres facteurs et acteurs permettant l’acquisition de gènes de résistances d’intérêt au sein des Morganellaceae (E-Lactamases à Spectre Etendu, céphalosporinase AmpC, Plasmid-mediated Quinolone Resistance...). Au final, cette étude a permis en outre de révéler les premiers cas de SGI1 et PGI1 chez P. mirabilis chez l’animal en France. De nouveaux variants de SGI1 ont également été mis en évidence. Et pour la première fois, SGI1 a été décrit chez M. morganii, une autre espèce d’entérobactérie. Mots-clés : Proteus, SGI1, PGI1, antibiorésistance

Abstract The antibiotic resistance is a major treat for public health. These resistances can be hold by different element and genomic islands are one of them. Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) and Proteus Genomic Island 1 (PGI1) are important genetic elements for the antibiotic resistance. A few SGI1 and PGI1 variants were already described in P. mirabilis. It is in this context that this thesis project aimed to improve our knowledge about the epidemiological spread of SGI1 and PGI1 in P. mirabilis in humans but also in animals in France (diversity of isolates and SGI1/PGI1 variants). Moreover, another wish was to identify other factors and actors for the acquisition of antibiotic resistance in the Morganellaceae tribe (Extended-Spectrum E-Lactamases, AmpC cephalosporinase, Plasmid-mediated Quinolone Resistance…). Finally, this study revealed the first cases of SGI1 and PGI1 in P. mirabilis in animals in France. New SGI1 variants were also described. And for the very first time, SGI1 was found in M. morganii, another entrobacterial species. Keywords : Proteus, SGI1, PGI1, antibiotic resistance 170