CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA
Estudio de la biología reproductiva y análisis molecular de la reproducción sexual y asexual de Agave tequilana Weber var. azul
Tesis que presenta
M.C. ROCIO ELIZABETH ESCOBAR GUZMÁN
Para Obtener el Grado de
Doctora en Ciencias
En la Especialidad de
Biotecnología de Plantas
Directora de la Tesis: Dra. June Simpson Williamson
Irapuato, Guanajuato. Julio del 2009
DEDICATORIA
A Dios: Por permitirme emprender esta gran aventura.
A mi esposo: José Prado Pérez Porque gracias a su apoyo, su amor incondicional, su esfuerzo y su confianza, he logrado una meta más en mi vida profesional. Muchas gracias amor por ser como eres.
A mis hijas: Daniela Andrea, Katherine Nicoll y Alejandra El tesoro más grade que tengo, son la luz que me impulsa a seguir adelante y fuente de mi inspiración.
A mis padres: Santiago Escobar Pérez Elsa Guzmán Morales Muchas gracias por toda la ayuda incondicional, aunque separados por miles de kilómetros, nuestros corazones siempre permanecieron juntos. Papitos este logro también es suyo.
A mis hermanos: Ivan, Carla, Claudia y Ramiro Gracias por su cariño y por estar siempre cerca de mi.
i AGRADECIMIENTOS
Agradezco el apoyo financiero brindado por el CONACYT con la beca nº 139917 para la realización de este trabajo de investigación.
Al CINVESTAV por la oportunidad que me dieron para realizar mis estudios dentro de la institución y permitirme forjar la pasión por la investigación.
A la Dra. June Simpson Williamson, mi directora de tesis, por permitirme trabajar en su laboratorio, por los consejos y sugerencias, por la paciencia y las enseñanzas compartidas.
A los Doctores Luis Herrera Estrella, Jean Philippe Vielle Calzada, John Délano Frier y Abisaí García Mendoza, mis sinodales, por sus valiosas y acertadas sugerencias.
A la Dra. Guadalupe Palomino, por la colaboración desinteresada en parte de este trabajo.
A mis compañeros de laboratorio, Mónica, Katia, Corina, Miriam, Silvia, Jazmín, Francisco, Celso y Alfredo por la amistad y ayuda brindada, sin duda fueron buenos los momentos de diversión y alegrías que compartimos. En especial a Flor Zamudio por realizar parte del trabajo de este proyecto y a Emigdia Alfaro por la asistencia técnica brindada.
También deseo agradecer a todo el personal administrativo del CINVESTAV – UNIDAD IRAPUATO por las acciones de operación y mantenimiento que apoyaron esta investigación.
A todas y cada una de las personas que de alguna manera hicieron posible la realización de este trabajo.
ii ÍNDICE
Dedicatoria .……………………………………………………………………………… i Agradecimientos…………………………………………………………………………. ii Índice………………………………………………………………………………..…… iii Índice de tablas…………………………………………………………………………... vi Índice de figuras…………………………………………………………………………. vii Resumen…………………………………………………………………………….…… ix Abstract………………………………………………………………………...... ……. x 1.INTRODUCCIÓN…………………………………………………...………………… 1 2.ANTECEDENTES………………………………………………………………...…… 3 2.1. Historia……………………………………………………………………… 3 2.2. Clasificación taxonómica……………………………………………………. 4 2.3. Descripción del género Agave……………………………………………….. 5 2.4. Diversidad genética………………………………………………………….. 7 2.5. Biología reproductiva en el género Agave………………………….……….. 9 2.6. Agave tequilana F.A.C.Weber var. azul……………………………………… 11 2.6.1. Propagación de Agave tequilana Weber var. Azul…...……...…… 13 2.6.2. Reproducción sexual……………………………………………… 13 2.6.2.1. Desarrollo del gametofito femenino……………………. 13 2.6.2.2. Desarrollo del gametofito masculino…………………… 15 2.6.3.Reproducción asexual………………………………………….….. 17 2.6.4. Citogenética de Agave tequilana…………………………………. 18 2.6.5. Bioquímica de Agave tequilana………………………………...... 19 2.6.6. Estudios moleculares en Agave tequilana ………………………... 19 2.6.7. Retrotransposones en Agave tequilana……………………………. 19 2.7. Agave americana var. Americana……………………………………...…… 20 2.7.1. Reproducción de Agave americana………………………………. 20 2.8. Marcadores moleculares……………………………………………………. 20 2.8.1. AFLP………………………………………………………………… 22
iii 2.8.2. SSAP…………………………………………………………...... 23 2.8.3. IRAP………………………………………………………………… 23 2.9. Elementos móviles en plantas………………………………………………. 24 3.OBJETIVOS……………………………………………………………………...…… 25 3.1. Objetivo general…………………………………………………………….. 25 3.2. Objetivos específicos……………………………………………………….. 25 4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………...... 26 4.1. Material vegetal……………………………………………………...……… 26 4.2. Determinación de flores, frutos y semillas…………………………………. 26 4.3. Procedimientos de polinización…………………………………………….. 28 4.4. Germinación de semillas……………………………………………………. 29 4.5. Estudios histológicos………………………………………………..…….... 29 4.6. Viabilidad del polen………………………………………………………… 30 4.7. Análisis por citometría de flujo……………………………………………... 30 4.8. Extracción de DNA genómico……………………………………………… 31 4.9. AFLP………………………………………………………………………... 32 4.10. Análisis de datos……………………………………………………...…… 35 4.11. IRAP……………………………………………………………………..... 35 4.12. Aislamiento, clonación y transformación de productos amplificados por IRAP….………………………………………....………...... 36 4.13. SSAP……………………………………………………………………… 36 4.14. Búsqueda de retrotransposones en la base de datos de Agave…………….. 37 5. RESULTADOS…………………………………………………………...………….. 38 5.1. Producción de frutos y semillas en polinización abierta……………………. 38 5.2. Producción de frutos y semillas obtenidos por cruzas……………………… 41 5.3. Viabilidad de semillas……………………………………………………… 42 5.4. Análisis histológico del desarrollo de los gametofitos…………………...… 45 5.4.1. Desarrollo del gametofito femenino……………………………… 45 5.4.2. Desarrollo del gametofito masculino…………………………...… 49 5.5. Viabilidad de los granos de polen…………………………………...……… 50 5.6. Análisis morfológico y genético de cruzas inter e intraespecíficas.…...... 51
iv 5.7. Análisis por citometría de flujo……………………………………………... 53 5.8. Variación genética sexual en Agave tequilana………………………...…… 55 5.8.1. Análisis genético de cruzas inter e intraespecíficas……………… 59 5.9. Variación genética asexual en Agave tequilana……………………………. 63 5.9.1. Variación genética en hijuelos de rizoma………………………… 63 5.9.2. Variación genética en bulbilos……………………………………. 64 5.10. IRAP………………………………………………………………………. 67 5.11. SSAP……………………………………………………………………... 70 5.12. Elementos transponibles en la base de datos de Agave tequilana…...…… 72 6. DISCUSIÓN………………………………………………………………………….. 77 6.1. Producción de frutos y semillas en Agave tequilana y Agave americana….. 77 6.2. Análisis histológico del desarrollo de los gametos en Agave tequilana……. 81 6.3. Análisis del contenido de DNA de Agave tequilana……………………...... 84 6.4. Variación genética sexual y asexual en Agave tequilana…………………... 85 6.5. Análisis de retrotransposones en Agave tequilana………………………….. 88 7. CONCLUSIONES……………………………………………………………………. 90 8. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………... 91 9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………...…… 93
v ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Combinación de oligonucleótidos usados en los AFLP…………………...... 34 Tabla 2. Producción de frutos y semillas en polinización abierta de Agave tequilana y Agave Americana……………………………..……………. 39 Tabla 3. Producción de frutos y semillas en autopolinización de Agave tequilana and Agave americana………….…………… 42 Tabla 4. Producción de frutos y semillas obtenidos por cruzas de Agave tequilana and Agave americana …………………………..... 42 Tabla 5. Porcentaje de germinación del tubo polínico……………………………………. 51 Tabla 6. Contenido de DNA nuclear en hojas de Agave tequilana analizadas por citometría de flujo………….…………………… 55 Tabla 7. Estimación del tamaño del genoma de Agave tequilana…………………...... 55 Tabla 8. Proporción de polimorfismos obtenidos de cruzas intraespecíficas e interespecíficas…………………………………………………. 59 Tabla 9. Tamaños de secuencias clonadas y primera correlación de BLAST a nucleótidos realizado en la base de datos del NBCI……………………………………………………… 69 Tabla 10. Secuencias encontradas en la base de datos de Agave con similitud significativa a retrotransposones...... 72 Tabla 11. Proporción de secuencias en diferentes tejidos de A. tequilana que dieron similitud a retrotransposones…………….………...... 74 Tabla 12. Secuencias encontradas en la base de datos de Agave con similitud significativa a transposones...... 75
vi ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diosa Mayahuel…………………………………………...... 3 Figura 2. Inflorescencias de Agave tequilana y Agave americana……………………….. 6 Figura 3. Representación esquemática del desarrollo del gametofito femenino ………………………………………………………...... 14 Figura 4. Representación esquemática del desarrollo del gametofito masculino ………………………………………………………..... 16 Figura 5. Croquis de localización de las plantas progenitoras…………………………….. 27 Figura 6. Semillas de Agave tequilana y Agave americana………………………………. 40 Figura 7. Germinación de semillas ……………………………..…..…………………….. 44 Figura 8. Desarrollo del gametofito femenino en A.tequilana…………………………….. 47 Figura 9. Óvulos con tubos polínicos en A.tequilana ……………………………...……… 48 Figura 10. Desarrollo del gametofito femenino en A.americana………………………….. 48 Figura 11. Desarrollo del gametofito masculino………………………………………….. 49 Figura 12. Granos de polen de A. americana……………………………………………… 50 Figura 13. Germinación de los granos de polen de A. tequilana………………………….. 51 Figura 14. Análisis de AFLP mostrando genotipos recombinantes…………………...... 52 Figura 15. Plantas de Agave tequilana obtenidas de semillas con diferentes eventos de polinización………………………………………...... 53 Figura 16. Estimación del contenido de DNA nuclear en plantas de cultivo de Agave tequilana ……………………………………………………. 54 Figura 17. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1, At2 .………… 57 Figura 18. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1, At2, At3 y At4………………………………………………….…… 58 Figura 19. Dendrograma de cruzas intra e interespecíficos ……………………………… 61 Figura 20. Dendrograma de cruzas intra e interespecíficos obtenido con el programa de NTSYS 2.0…………………………………………. 62 Figura 21. Dendrograma de hijuelos y su progenitor……………………………………... 64 Figura 22. Bulbilos de Agave tequilana mostrando lista amarilla………………………… 65 Figura 23. Dendrograma de bulbilos ……………….………………………………… 66
vii Figura 24. Productos de amplificación obtenidos por IRAP-PCR……………………. 67 Figura 25. Clonación de productos de amplificación generados por IRAP-PCR……. 68 Figura 26. Gel de poliacrilamida mostrando los productos de amplificación generados por SSAP…………………………………………… 71
viii RESUMEN
Agave tequilana Weber var. Azul es la única especie permitida por la norma oficial como materia prima para la producción de la bebida mexicana más conocida, el tequila. A pesar de la enorme importancia económica y cultural que representa esta especie son pocos los estudios realizados tanto a nivel de su fisiología, bioquímica y genética. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar diferentes aspectos de la biología reproductiva en plantas de A. tequilana y A. americana incluyendo formación de gametofitos, eficiencia de polinización, germinación de semillas y niveles de variabilidad bajo reproducción sexual y asexual. Se determinó que el desarrollo del gametófito femenino en A. tequilana y A. americana es de tipo Polygonum monospórico mientras que el desarrollo del gametofito masculino termina con la formación de granos de polen que muestran una ornamentación reticulada y disulcada con una viabilidad hasta del 36% para A.tequilana y 79% para A. americana. Semillas obtenidas por polinización abierta en A. tequilana mostraron niveles de germinación de hasta un 40% mientras los de A. americana mostraron porcentajes más altos de germinación (>80%). Las semillas producidas por autofecundaciones tanto de A. tequilana como de A. americana también mostraron altos niveles de viabilidad (>60% para At y >90% para Aa). Por medio de cruzas interespecificas se obtuvieron semillas híbridas con una viabilidad que va desde 58 al 73% cuando A. tequilana es el progenitor paterno y del 1 al 10% cuando A. tequilana es progenitor materno. La variabilidad genética en reproducción sexual determinada por AFLP en promedio fue de 62%, mientras que en las cruzas interespecificas la variabilidad genética alcanzó un 69% y en cruzas intraespecíficas llego hasta el 64%. En reproducción asexual tanto en hijuelos de rizoma como en bulbilos el nivel de polimorfismo encontrado fue alto, sugiriendo que existen mecanismos que generan variabilidad genética en reproducción asexual. Por medio de marcadores moleculares basados en retrotransposones tipo IRAP y SSAP se determinó la presencia de retrotransposones del tipo copia Ty1 en el genoma de A. tequilana y se confirmó la presencia de elementos transponibles activos en el genoma de A. tequilana encontrandose estos en la base de datos de su transcriptoma.
ix ABSTRACT
Agave tequilana Weber var. “azul” is the only species allowed under the denomination of origin as the raw material for the production of the most well-known Mexican drink around the world, tequila. In spite of the enormous economic and cultural importance that this species represents, few studies have been carried out concerning it´s physiology, biochemistry and genetics. The primary objective of this work was to study different aspects of reproductive biology in plants of A. tequilana and A. americana including formation of gametophytes, efficiency of pollination and germination of seeds and levels of variability under sexual and asexual reproduction. In this work it was determined that the development of the female gametophyte in A. tequilana and A. americana is of the monosporic Polygonum type whereas the development of the male gametophyte culminates with the formation of pollen grains that shows a reticulate and disulcate architecture with a viability of up to 36% for A.tequilana and 79% for A. americana. Seeds obtained by open pollination in A. tequilana showed an efficiency of germination of up to 40% while those of A. americana showed a higher percentage of germination (> 80%). The seeds produced by self- fertilization in both A. tequilana and A. americana also showed high levels of viability (> 60% for At and > 90% for Aa). From interspecific crosses, hybrid seeds were obtained with a viability of 58 to 73% when A. tequilana is the male progenitor and 1 to 10% when A. tequilana is the female progenitor. The genetic variability observed for sexual reproduction as determined by AFLP on average was 62%, whereas in interspecific crosses the genetic variability reached 69% and in intraspecific crosses up to 64%. In asexual reproduction either in offsets of rhizomes or in bulbils the level of polymorphism found was relatively high, suggesting that mechanisms exist that generate genetic variability during this process. From analysis of molecular markers based on retrotransposons type IRAP and SSAP the presence of retrotransposons copia Ty1 type was determined in the genome of A. tequilana and confirmed by analysis of the transcriptome data base.
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1. INTRODUCCIÓN
La familia Agavaceae con nueve géneros y 330 especies es endémica de América. México es el centro de origen y diversidad del género, donde se localizan 251 especies, de las cuales 177 son endémicas, lo que significa que el 70% de las especies sólo se encuentran en México (García-Mendoza, 2004). Las plantas de agave han sido utilizadas desde tiempos prehispánicos para una gran variedad de aplicaciones. Actualmente los Agaves o magueyes son explotados comercialmente para la producción de fibras y bebidas alcohólicas tales como tequila y mezcal (Colunga-García y Zizumbo-Villarreal. 2007).
La preparación de bebidas alcohólicas es la actividad económica más importante asociada al cultivo de agave. Aunque el mezcal puede ser preparado a partir de una amplia variedad de especies de agave, bajo la “Denominación de Origen” (Diario Oficial, 1993), al menos el 51% de los azúcares usados para producir tequila deben provenir de Agave tequilana Weber variedad azul. El Consejo Regulador del Tequila (CRT), organismo no gubernamental dedicado a promover la calidad, la cultura y el prestigio del tequila reporta que en México se plantan alrededor de 120,000 hectáreas con agave y se estima que más de 600,000 familias dependen directa o indirectamente de su cultivo y procesamiento.
A pesar de la importancia económica de A. tequilana, existe muy poca información en términos de genética, mejoramiento y fisiología de ésta especie, especialmente en relación a su proceso de reproducción. Esto se debe principalmente al ciclo de vida largo de la planta y al difícil acceso a las inflorescencias. Aunado a esto, la práctica agronómica en plantaciones comerciales de agave de cortar el eje floral tan pronto como éste emerge para conservar las reservas de azúcar en el tallo, conocido comúnmente como piña.
Las plantas de A. tequilana son monocárpicas perennes que producen flores una sola vez al final de su ciclo de vida después del cual mueren. A. tequilana Weber var. azul es propagado normalmente en forma asexual a través de hijuelos de rizoma y es muy raro encontrar plantas en floración en campos de cultivo.
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Por las razones antes mencionadas, hasta el momento no existen reportes sobre la reproducción sexual en A. tequilana, ni análisis moleculares de plantas obtenidas de semillas. La formación de híbridos entre A. tequilana y otras especies de agave tampoco ha sido documentado. Dicha información es necesaria para desarrollar investigación en genética y mejoramiento del Agave en términos de resistencia a enfermedades, acumulación de azúcares, producción de hijuelos y precocidad en este importante cultivo.
Este es el primer estudio que revela información detallada sobre el desarrollo del gametofito tanto femenino como masculino en A. tequilana, así como información básica relacionada a la biología reproductiva sexual, desarrollo de semillas y frutos, porcentajes de germinación de los granos de polen y eficiencia en producción y viabilidad de semillas, así como el análisis de la variabilidad genética tanto en la reproducción sexual como asexual por medio de marcadores moleculares en A. tequilana.
En este trabajo de tesis se realizaron análisis tanto teóricos como experimentales para identificar la fuente de variación genética en reproducción asexual y se demuestra la presencia de retrotransposones genéticamente activos tanto por medio de marcadores moleculares tipo IRAP y SSAP como por búsquedas informáticas en la base de datos del transcriptoma de A. tequilana.
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2. ANTECEDENTES
2.1. Historia
El Agave no es sólo una planta; también supone una cultura y tradición e implica una forma de vida y en tiempos prehispánicos, una forma de supervivencia. Mesoamérica y Aridoamérica, han sido escenario del origen y evolución del maguey (Agave spp.). En ambas regiones esta planta ha sido utilizada, desde los primeros pobladores hasta la actualidad, para satisfacer y complementar una serie de necesidades básicas como alimento, forraje, medicamentos y construcción, entre otros (Granados, 1993). Una de las especies con registros arqueológicos más antiguos de uso es el maguey pulquero Agave salmiana, cuya importancia era tal que fue deificado por los mexicas como la diosa Mayahuel (Figura 1), la diosa del maguey, por todas las bondades que ésta les brindaba y se encuentra representado en pinturas, murales y códices provenientes de ésta y otras culturas indígenas del centro de México (García-Mendoza, 2004). Según los Figura 1. Diosa Mayahuel códices mexicas, los Aztecas durante su migración al Valle de México, extrajeron el aguamiel y elaboraron el pulque entre 1172 y 1291 D.C., aunque evidencias arqueológicas muestran que las personas que habitaban este lugar antes de la llegada de los Aztecas habían usado el maguey previamente por miles de años (Gentry, 1982). Se conoce que los mexicas extendieron el cultivo del maguey y sus productos; también se sabe que nuevas variedades podrían haber sido introducidas de fuentes silvestres, por medio de selección de las mejores plantas. Los mexicas conocían a los magueyes con el nombre genérico de metl y no fue hasta 1753 que Linneo ubica a éstas plantas en el género Agave. La palabra Agave proviene de la raíz griega que significa “admirable” y describe no sólo su rara apariencia sino también su longitud y floración que ocurre sólo una vez en el ciclo de vida de la planta para después morir. Las culturas prehispánicas utilizaron los
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magueyes de manera integral desde las raíces hasta las semillas, recibiendo cada órgano un nombre especial.
2.2. Clasificación taxonómica
La delimitación genérica de la familia Agavaceae y su reconocimiento han variado a través del tiempo. En la actualidad la circunscripción familiar más aceptada es la propuesta por Dahlgren et al. (1985), quienes delimitan la familia con 8 géneros. Actualmente se considera un noveno género (Hesperoyucca), segregado de Yucca. La familia Agavaceae es endémica de América. Se encuentra en un amplio rango de hábitats y se distribuye desde el sur de Canadá hasta Bolivia, incluyendo las islas del Caribe, desde las Bahamas hasta Aruba y Trinidad y Tobago (García-Mendoza, 2004).
División: Angiospermae Clase: Monocotyledonae Orden: Asparagales Familia: Agavaceae Subfamilia: Agavoideae Género: Agave Subgénero: Agave Especie: Agave tequilana F.A.C.Weber Variedad: azul
El género Agave, según el tipo de inflorescencia que presenta, se divide en dos subgéneros; el subgénero Agave que tiene una inflorescencia en panícula, en el cual se encuentran las especies de importancia económica tales como A. tequilana, A. fourcroydes y A. angustifolia, y el subgénero Littaea que presenta una inflorescencia en forma de espiga (Irish, 2000).
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2.3. Descripción del género Agave
La primera especie de Agave que fue descrita científicamente fue Agave americana. Las plantas de agave, las cuales algunas veces son confundidas con cactos, pertenecen a la familia Agavaceae y son plantas suculentas con hojas arregladas en forma de espiral formando una roseta, del cual las hojas emergen de un mismo punto de crecimiento sobre el tallo formando una cabeza radialmente simétrica (Irish, 2000).
Los agaves pueden ser considerados como rosetas perennes porque requieren muchos años para crecer y florecer; el crecimiento y la acumulación de reservas duran entre 8 a 20 años, hasta conseguir el cambio del meristemo apical por meristemo floral, surgiendo una superestructura, la inflorescencia. Algunos de ellos son poliploides estériles que rara vez o nunca consiguen formar semillas viables; como es el caso de A. fourcroydes. El desarrollo de hijuelos de rizoma a partir del tallo se presentan en la base y alrededor de las rosetas en la mayoría de las especies. Otras especies nunca proliferan por hijuelos, algunas sólo cuando la roseta es joven, mientras que otras lo hacen a lo largo de su vida, y aún otras sólo durante la maduración, con la emergencia de la inflorescencia (Gentry, 1982).
Sin embargo, muchas de las poblaciones silvestres de agave se reproducen sexualmente con la consecuente formación de semillas. Algunas veces en conjunción con bulbilos e hijuelos, como en el caso de A. tequilana. Entonces, ambos tipos de reproducción tanto sexual como asexual están disponibles en cada generación. Las flores protándricas indican entrecruzamiento, pero algunas plantas han demostrado autofertilidad, como en el caso de A. funkiana Koch and Bouche (Gentry, 1982).
Los agaves son plantas rizomatosas, de tallos acaules, de hojas grandes suculentas y fibrosas que terminan en una espina, los márgenes de las hojas presentan pequeñas espinas conocidas como dientes y de orientación variable; inflorescencia en espiga o panícula, con escapo largo semileñoso; las flores son de color amarillo verdoso, protándricas con perianto infundibuliforme de tubo de longitud variable y seis segmentos casi iguales, seis estambres filiformes, con anteras amarillas, ovario ínfero, trilocular, tricarpelar, con placentación
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axilar, multiovulado, fruto capsular leñoso alargado, dehiscente; con 3 alas con numerosas semillas aplanadas algo triangulares y de testa negra. Los agaves son monocárpicos, semélparos, esto es que sólo tienen una floración al final de la cual la planta muere. Son plantas adaptadas a condiciones de aridez; las raíces someras y ramificadas, cutícula gruesa, suculencia, estomas hundidos y metabolismo fotosintético del tipo CAM, son algunos de los atributos que le permiten establecerse en zonas carentes de agua (Granados, 1993).
Figura 2. Inflorescencias de A. americana (arriba) y A. tequilana (abajo).
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2.4. Diversidad genética
En Mesoamérica las especies de Agave fueron seleccionadas por el hombre, dando lugar a nuevas combinaciones genéticas que pudieron analizar empíricamente enfocando sus ventajas a la producción y calidad de fibra, alimento, bebida, y otros productos especiales. A medida que se especializó la civilización, se especializó también al agave, seleccionando características acorde a sus necesidades. Aunque no se conocía de genética, se fomentó en gran medida la diversificación del agave (Gentry, 1982). La familia Agavaceae con nueve géneros y 330 especies, es endémica de América; se distribuye desde los límites entre Canadá y Estados Unidos hasta Bolivia, incluyendo las islas del Caribe. El centro de mayor riqueza y diversidad del género Agave se encuentra en México, donde se identificaron 251 especies, 76% de las descritas en el mundo, de las cuales 177 son endémicas, lo que corresponde al 70% (García-Mendoza, 2004). Los estados en los que se encuentran representados al menos seis géneros de Agave son Oaxaca, Jalisco, Puebla y Querétaro, siendo Oaxaca el estado más rico con 58 especies (García-Mendoza, 2004). Con el transcurso del tiempo los agaves fueron seleccionados según las necesidades del hombre, así algunas especies se convirtieron en fuente de materia prima para diferentes industrias como el A. fourcroydes para la industria cordelera, el A. tequilana en la producción de tequila y A. angustifolia, A. americana y A. salmiana entre otros se convirtieron importantes como materia prima para la producción de bebidas alcohólicas como el mezcal.
En comparación con otros géneros y especies, el nivel de conocimiento de la diversidad genética en Agave spp es limitado y se basa principalmente en características morfológicas y citológicas (Gil-Vega et al., 2001). Los datos genéticos-moleculares que consideran la estructura y variabilidad existente en las poblaciones de Agave son escasos.
Sin embargo, en un reciente estudio de la diversidad genética en seis poblaciones de agaves pulqueros tales como A. salmiana var. Salmiana (manso), A. salmiana var. Ayoteco (ayoteco), A. mapisaga (verde), del Nororiente del Estado de México, analizados por RAPD,
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se encontró que el porcentaje total de loci polimórficos fue de 73.2%, pero dentro de las poblaciones hubo una reducida variabilidad genética, con porcentajes de loci polimórficos que variaron de 12.2% para el maguey ´Verde´ hasta 32.5% en los magueyes ´Manso´ y ´Ayoteco´ (Alfaro et al., 2007). En un estudio similar en A. angustifolia Haw., la variabilidad genética encontrada en tres poblaciones de maguey por medio de marcadores moleculares tipo AFLP, fue del 82.8% generando en promedio 78.6 marcadores por combinación, el mayor polimorfismo se observó con la combinación ACG/CTT, alcanzando un 96.1% de polimorfismo (Barraza-Morales et al., 2006).
En otro estudio de diversidad genética donde se utilizaron isoenzimas en A. victoriae- reginae, se encontró un promedio de polimorfismo del 83 % en cada población, mientras que entre diferentes poblaciones el nivel de diversidad era más alto. Este tipo de agaves son especies diploides reproducidas principalmente por semillas (Martínez-Palacios et al., 1999).
En A. schotii la estructura genética está mantenida por efectos combinados de reproducción clonal, longevidad clonal y limitada dispersión de semillas, lo que reduce considerablemente la diversidad genética de la población (Trame et al., 1995). Por otro lado, se estimó una depresión por endogamia del 25% para la producción de semillas, con una estructura genética estrecha debido a la dispersión limitada y clonalidad en las poblaciones.
También, se realizaron estudios que sugieren variabilidad genética en las plántulas de agave propagadas por reproducción asexual, en un estudio de diversidad genética realizado en A. fourcroydes (Henequén) utilizando marcadores moleculares tipo AFLP demostraron que existen diferencias en el genoma de la población; esta diferencia fue medida como cambios en el patrón de bandas de AFLP de plantas de diversas poblaciones de la península de Yucatán. Comparando el patrón de AFLP de dos plantas madre y de sus hijuelos, se encuentra variabilidad genética en reproducción asexual. Se reportó un 83% de polimorfismo entre hijuelos de rizoma de diferentes campos, y un 20.67% de polimorfismo entre hijuelos de rizoma de la misma planta, debida posiblemente a mutaciones somáticas que fueron acumuladas formando mosaicos sin relevancia ontogénica, pero que durante la reproducción asexual fueron fijadas y transmitidas a la descendencia (Infante et al., 2003).
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En un estudio posterior, González y colaboradores (2003), demostraron para A. fourcroydes la conservación de las características morfológicas y los patrones de AFLP en plantas micropropagadas por embriogénesis somática, concluyendo que las plantas micropropagadas conservaron las características superiores de las plantas madre, aunque si reportaron un 19.99% de bandas polimórficas en las plantas micropropagadas. Se ha estudiado la estructura genética de varias especies de este género, y los niveles de variación genética parecen ser elevados dentro de cada población.
Sin embargo, se han realizado otros estudios que contrastan con los anteriormente reportados. Gil-Vega y colaboradores (2001), realizaron estudios de diversidad genética en A. tequilana azul usando RAPD. Encontraron una diversidad genética casi nula en una población muestreada en el estado de Jalisco. La baja diversidad genética en los plantíos de A. tequilana azul en el estado de Jalisco podría deberse a varias causas, según reporta Valenzuela (1994): el uso de plantas propagadas asexualmente (súrculos o vástagos) para establecer nuevas plantaciones y la preferencia por la variedad “azul”.
Respecto a la genética de poblaciones del género Agave, los datos disponibles indican que en poblaciones silvestres los niveles de variación son elevados, y la endogamia es baja, y la diferenciación entre poblaciones puede ser alta. En contraste, las especies cultivadas prácticamente no presentan variación genética, seguramente resultado de las prácticas de propagación vegetativa que se utilizan (Eguiarte et al., 2000)
2. 5. Biología reproductiva en el género Agave
La familia Agavaceae abarca nueve géneros con biologías de reproducción contrastantes, ya que algunas especies pueden ser iteróparas (policárpicas) y los individuos se pueden reproducir cada año, mientras otros son semélparas (monocárpicos) produciendo sólo una inflorescencia espectacular en su vida, para después morir. Se ha sugerido que varias especies de agave no presentan reproducción sexual, solo propagación vegetativa (Gentry, 1982). Esto es posible ya que algunas especies, principalmente del subgénero Agave del
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norte de México y del sur de Estados Unidos, son poliploides. Sin embargo, existen otras especies, como Agave vilmoriniana, que produce un número alto de bulbilos y semillas viables (Szarek et al., 1996); otras son especies híbridas generadas por padres de diferentes especies (Gentry, 1982).
La floración en el género Agave se reconoce por algunos cambios en la estructura foliar de la roseta, que se extiende para captar más luz y empieza a perder turgencia por la pérdida de humedad (Valenzuela, 1997) y se inicia el crecimiento rápido del eje floral como resultado de la elongación del meristemo apical. En A. deserti desde que emerge la inflorescencia a principios de marzo hasta el desarrollo de semillas viables a mediados de agosto, la inflorescencia llega a crecer más de 16 cm por día, y alcanzar en promedio 3.6 metros de altura y 1.25 kg de peso seco. La materia necesaria para generar la inflorescencia se moviliza desde las hojas, las cuales pierden el 36% de su peso seco y 77% de su peso húmedo, además de esto, se dan pérdidas de agua también por las ramas laterales de la inflorescencia, así como por las flores cuando producen abundante néctar. Por lo tanto, la pérdida de agua constante es alta en la reproducción sexual, comparada con la pérdida de ésta en plantas con reproducción vegetativa.
Nobel (1977, 1988) estudió la capacidad fotosintética de las plantas al llegar el momento de la reproducción y comparó las demandas de la inflorescencia en crecimiento, el movimiento masivo de carbohidratos y otros materiales desde las hojas provoca la muerte de la planta debido al tremendo gasto energético y de agua en un sólo periodo sexual. Las especies estudiadas en el género comparten las siguientes características florales: 1) Sus flores son grandes usualmente blanquecino-verdosas, amarillentas o a veces rojizas; 2) Los tubos de las flores son más o menos cerrados; 3) El polen se produce al anochecer y los estambres son exertos; 4) Se produce néctar abundante y diluido, principalmente de noche con el cual atraen a diferentes polinizadores de acuerdo a la especie (Arizaga et al., 2000b); 5) Las flores duran varios días y son protándricas, en el primer día producen polen y en los siguientes el estigma es receptivo y 6) Las especies son autocompatibles, pero presentan intensa depresión por endogamia (Eguiarte, et al., 2000).
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En Agave palmeri, las flores son nocturnas, y la dehiscencia de las anteras ocurre entre las 20 y las 22 horas. Howell y Roth (1981) consideran que su principal polinizador es el murciélago nectarívoro Leptonycteris curasoae, además de otros insectos y aves. Sus datos de polinizaciones controladas junto con los de Sutherland (1987) indican que la especie es autocompatible, pero presentan una fuerte depresión por endogamia y está limitada por polinizadores, ya que las polinizaciones manuales aumentan la fecundidad. Esta especie tiene una producción de frutos del 16.6%. Otra especie en la que se ha estudiado la biología reproductiva es A. macroacantha. La floración ocurre de mayo a julio y tiene una duración promedio de 29 días en las rosetas individuales (Arizaga y Ezcurra, 2002). Las flores son protándricas y la antesis ocurre en la tarde, después del tercer día de la apertura floral y los pistilos maduran después del quinto día. La formación de frutos por autopolinización en ésta especie es de 1.6%, mientras que en las cruzas intraespecíficas la producción de frutos alcanzó un 19.5%. Por lo tanto, esta especie produce frutos y semillas casi exclusivamente por entrecruzamiento y presenta un alto grado de autoincompatibilidad con una marcada dependencia de los polinizadores nocturnos para su éxito reproductivo (Arizaga et al., 2000a).
En un reciente estudio en A. angustifolia y A. subsimplex, Molina-Freaner y Eguiarte, (2003) reportan que el éxito en establecimiento de frutos es en promedio de 30%, existiendo una relación inversa con la producción de bulbilos. En los tratamientos de polinizaciones reportan que los entrecruzamientos generan un mayor establecimiento de frutos y semillas que los controles y las autofecundaciones manuales no generan fruto ni semillas, sugiriendo que los polinizadores nocturnos como los murciélagos de la especie Leptonycteris curasoae son importantes para el éxito reproductivo de A. angustifolia. A la fecha no se cuenta con estudios sobre la biología reproductiva de A. tequilana ni A. americana.
2.6. Agave tequilana F.A.C.Weber var. azul
Es una de las especies que más importancia tiene en la agricultura del estado de Jalisco y por tanto de México, debido a que es materia prima para la elaboración de la bebida mundialmente conocida como tequila. La historia del tequila y otros destilados de agave se
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inicia en el siglo XVI, cuando la población indígena que vivía en las estribaciones de los volcanes de Colima sometió por primera vez a las bebidas fermentadas de agave al destilador. Durante el siglo XIX, una de estas bebidas destiladas de agave que se producía en la ciudad de Tequila, en el estado de Jalisco, se hizo famosa con el nombre de la localidad en donde era elaborada (Walton, 1977).
Desde 1949, las Normas Oficiales de Calidad han estipulado que sólo las bebidas destiladas producidas por la variedad conocida como Agave tequilana F.A.C.Weber var. azul pueden ser llamados Tequila. El explosivo crecimiento de esta industria basada en una variedad, ha tenido un efecto negativo en el cultivo de otras especies y variedades de agave (Valenzuela, 1994; 1997).
De acuerdo con información del Consejo Regulador del Tequila (CRT), el agave de la variedad destinada a la producción de la bebida típica mexicana, solamente se puede sembrar en el Territorio de Denominación de Origen (TDO) que consta de 181 municipios: 125 de Jalisco, ocho de Nayarit, siete de Guanajuato, 30 de Michoacán y 11 municipios de Tamaulipas. Actualmente se cultiva una superficie de 120 mil hectáreas con alrededor de 504 millones de plantas de agave azul en el territorio de denominación según el último inventario de agave realizado por el CRT en enero del 2008 (www.crt.org.mx).
Agave tequilana, presenta cierta resistencia a plagas y enfermedades, debido principalmente a las características como: cutícula gruesa y cerosa en sus hojas y el porcentaje de fibra que poseen. Sin embargo, si las condiciones ambientales no son las adecuadas para el cultivo, la entrada de patógenos es relativamente fácil y la gran cantidad de azúcares almacenados en el tallo propician la proliferación de éstos (Loera, 2000). Las principales enfermedades que afectan a este cultivo son, el marchitamiento causado por Fusarium oxysporum que afecta tanto a hojas, cogollo y piña, la pudrición del cogollo cuyo agente causal es Erwinia carotovora, mancha anular causada por Didymosphaeria sp que lesiona las hojas reduciendo la capacidad fotosintética y el crecimiento de la planta y la antracnosis causada por Colletotricum sp. que provoca manchas hundidas y chancros que secan las hojas (CRT; CESAVEG. Manuales técnicos). Recientemente se ha reportado que Thielaviopsis paradoxa
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causa marchitamiento y muerte en más del 23% de plantas de A. tequilana en el estado de Jalisco, atacando principalmente raíces y tallos (Sanchez, et al., 2007).
2.6.1. Propagación de Agave tequilana Weber var. azul
A.tequilana es una de las especies que se puede reproducir por las dos formas de reproducción: vía sexual, con la formación de semillas y vía asexual formando hijuelos de rizoma, bulbilos o por micropropagación de tejidos. Actualmente las grandes empresas productoras de tequila, están utilizando la técnica de cultivo de tejidos in vitro para la propagación masiva de plantas de A. tequilana.
2.6.2. Reproducción sexual
En plantas que florecen, el ciclo de vida reproductivo inicia con el cambio en el crecimiento del meristemo de un modo vegetativo indeterminado a un modo de floración determinado que lleva a la producción de semillas y frutos (O’Neill y Roberts, 2002). Los óvulos son los precursores directos de las semillas y éstos juegan un papel central en la reproducción sexual de las plantas y la nutrición de los humanos (Gasser et al., 1998). La doble fecundación se realiza en el óvulo; esto involucra la fusión de las células espermáticas con dos células específicas del gametofito femenino o saco embrionario, la célula huevo y la célula central, los cuales van a dar origen al embrión y al endospermo de la semilla respectivamente (O’Neill y Roberts, 2002). Un botón floral es uno de los órganos más complicados en las plantas, y muchos procesos morfológicos y bioquímicos son únicos a este órgano reproductivo (Lim et al., 1996), los cuales son necesarios para la propagación por semilla y la generación de diversidad genética.
2.6.2.1. Desarrollo del gametofito femenino en plantas.
La reproducción sexual en plantas depende de la formación de los gametos femenino y masculino los cuales son haploides. El gametofito femenino tiene una función central en la reproducción de las angiospermas (Shimizu et al., 2008). El patrón de desarrollo del
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gametofito femenino en Arabidopsis es del tipo Polygonum el cual está presente en el 70% de las angiospermas (figura 3) (Coimbra et al., 2007). En el óvulo de Arabidopsis thaliana, usualmente un sólo megasporocito entra en meiosis y produce cuatro megasporas haploides, tres de ellas entran en el programa de muerte celular programada, mientras que la megaspora funcional se divide mitoticamente para dar origen al saco embrionario (figura 3a). Después de tres ciclos de divisiones nucleares se tiene ocho núcleos (figura 3b), los cuales se celularizan y diferencian en cuatro tipos celulares (figura 3c y 3d). La célula huevo como la célula central son fertilizados por una célula espermática cada uno, formando el embrión y el endospermo respectivamente. Las células gaméticas están flanqueadas por células accesorias; dos sinérgidas, ubicadas en el zona micropilar, son el punto de entrada del tubo polínico. Las sinérgidas son necesarias para la atracción del tubo polínico e inducen también la liberación de las células espermáticas. La zona opuesta, está ocupada por tres células antípodas que degeneran antes de la fertilización, cuya función aún no está clara (Groß- Hardt, et al., 2007). a b
d c
Figura 3. Representación esquemática del desarrollo del gametofito femenino del tipo Polygonum monospórico. a. Después de la meiosis, se forma la megaspora funcional haploide. b. Sincitio octonucleado, resultado de tres divisiones mitóticas. c. Después de la migración nuclear y celularización, se forma el gametofito femenino con siete células: en la zona micropilar se encuentran una célula huevo (rojo) y dos sinérgicas (verde oscuro), con dos núcleos polares, mientras que en la zona calazal, se encuentran tres células antípodas (verde claro). d. Antes de la fertilización, los dos núcleos polares se fusionan y las células antípodas degeneran.
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2.6.2.2. Desarrollo del gametofito masculino en plantas.
Las principales características del desarrollo del polen se muestran en la figura 4, el cual se basa en un análisis ultraestructural de la microesporogénesis en Arabidopsis (Owen y Makaroff, 1995). El gametofito masculino o grano de polen, es un organismo tricelular derivado de divisiones celulares. Su historia comienza dentro la antera, cuando las células madre del polen entran en meiosis para formar tétradas, cada tétrada está unida por una pared de callosa. Las microsporas son liberadas por la acción de la calasa, una enzima producida por el tapetum, después del cual cada microspora entra en mitosis asimétrica, porque el núcleo que se divide está adyacente a la pared, de tal manera que después de la división, una célula es mucho más pequeña que la otra. Las dos células de este grano de polen bicelular tienen distintos destinos celulares (McCormick, 2004). La célula más grande es llamada célula vegetativa, y la pequeña es la célula generativa. La célula vegetativa no vuelve a dividirse, mientras que célula generativa entra en mitosis para formar las céluas espermáticas. El tiempo de la segunda mitosis varia en diferentes familias de plantas, algunas veces ocurre dentro de las anteras (como en pastos y crucíferas), aunque más comúnmente ocurre durante el crecimiento del tubo polínico.
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Figura 4. Representación esquemática del desarrollo del gametofito masculino.
A. tequilana no se reproduce por via sexual, debido a su bajo porcentaje de germinación, información que obedece a observaciones hechas en campo, no existen investigaciones formales sobre la reproducción sexual y la generación de plantas a partir de semillas (Valenzuela, 1997). Por otro lado las condiciones de germinación no son siempre adecuadas,
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por lo que su reproducción es principalmente en forma asexual por hijuelos del rizoma (Granados Sánchez, 1993).
A. tequilana Weber var. azul florece de los 6 a los 8 años de edad, dependiendo del lugar donde se cultive, sus características genéticas y el tamaño del hijuelo plantado (Valenzuela, 1997). A la fecha no existen datos sobre la relación de frutos y semillas que producen, ni la viabilidad de las semillas producidas.
Entre los pocos estudios que existe sobre el desarrollo de gametos tanto femenino como masculino en agaves se encuentra el realizado por Piven et al. (2001) en A. fourcroydes y A. angustifolia, quienes reportan que el gametofito femenino en estas especies se forma a partir de dos megasporas viables ubicadas en la región micropilar (tipo bispórico). También observaron que durante la megasporogénesis cuando la célula madre de la megaspora entra en meiosis ocurre fragmentación cromosomal. Mientras que el gametofito masculino genera granos de polen binucleares con baja viabilidad, que sólo llega al 0.5% y en medio de cultivo ajustado con vitaminas incrementa al 1% en A. fourcroydes y al 3% en A. angustifolia.
Por otro lado Ruvalcaba-Ruiz y Rodríguez-Garay (2002) observaron que las células madre del polen de A. tequilana presentaban irregularidades meióticas que sugerían aberraciones cromosómicas tales como deleciones y duplicaciones, intercambios entre cromátidas hermanas e inversiones los cuales se ven reflejadas en la baja viabilidad de los granos de polen.
2.6.3. Reproducción asexual
Es aquella que no implica el proceso sexual, tanto las hojas como los tallos y las raíces pueden llevar a cabo la reproducción vegetativa en varios tipos de plantas. Los individuos obtenidos de este tipo de reproducción constituyen un clon, y estos clones a excepción de las mutaciones espontáneas, son genéticamente idénticas a la planta madre (Loera, 2000). La forma más conocida de reproducción asexual en agave es mediante la formación de hijuelos
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de rizoma, usada ampliamente por los agricultores. Existe otra forma de reproducción asexual, que es la formación de bulbilos en las inflorescencias que se desarrollan cuando la producción de frutos es baja o nula (Valenzuela, 1997).
Existen siete especies que producen bulbilos en forma silvestre: A. angustifolia, A. fourcroydes, A. murpheyi, A. sisalana, A. wercklei, A. vilmoriniana y A. macroatanta de éstas, cuatro especies además producen semillas no germinables, (Szarek et al., 1996), una quinta especie A. vilmoriniana además de producir gran cantidad de bulbilos produce copiosas cantidades de semilla viable pero no produce hijuelos de rizoma. Por otro lado, A. tequilana sólo produce bulbilos cuando se inducen por medio de la eliminación de sus flores, en condiciones naturales sólo produce frutos con semillas. Hasta el momento se desconoce la fisiología y la biología del desarrollo de bulbilos, que podrían ser importantes para evaluar su impacto en la reproducción del género Agave.
2.6.4. Citogenética de Agave tequilana
Existen varios estudios sobre citogenética del género Agave (Doughty, 1936; Palomino, et al., 2003); sin embargo, son pocos los estudios realizados específicamente en A. tequilana. El primer análisis citogenético de A. tequilana fue realizado por Banerjee y Sharma (1987), quienes estimaron el DNA nuclear en diferentes especies y variedades de agave incluido el de A. tequilana reportando el número somático de cromosomas como 2n=90. Sin embargo, en estudios posteriores Castorena-Sánchez et al., (1991) y Cavallini et al., (1996) reportaron que A. tequilana era una especie diploide con 60 cromosomas. Años después esto fue confirmado por Palomino et al., (2003) quienes estimaron el tamaño del genoma nuclear en diferentes variedades de A. tequilana incluido la variedad azul, confirmando que es diploide (2n=2x=60) y que variedades de la misma especie tienen diferentes niveles de ploidía; tal es el caso de la variedad bermejo que es triploide y chato que es tetraploide.
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2.6.5. Bioquímica del Agave tequilana
Agave tequilana Weber presenta un metabolismo ácido de las crasuláceas (CAM) al igual que otros agaves. Cerca del 87% de la fijación del CO2 ocurre en la noche y está acompañada por un incremento en la acidificación de los tejidos. La máxima acumulación ácida nocturna se da cuando las temperaturas día/noche fluctúan entre 25ºC/15ºC aproximadamente. También existe un incremento en la acidez nocturna cuando incrementa la radiación fotosintéticamente activa sobre las hojas, logrando hasta un 90% de acidez. Por otro lado la sequía reduce la acumulación ácida en 50% después de 7 días y hasta 90% después de 30 días. Esta especie tiene poca tolerancia a las temperaturas bajas y limitada capacidad de aclimatación a estas temperaturas (Pimienta-Barrios et al., 2007).
2.6.6. Estudios moleculares en Agave tequilana
Recientemente se están realizando estudios a nivel molecular para entender las bases genético moleculares de esta especie en diferentes campos, como es la identificación de genes involucrados en la síntesis de fructanos, como la sacarosa 1-fructosiltransferasa, enzima clave en formación de azucares de reserva, que fue identificado y caracterizado por Ávila Fernández et al. (2007). Por otro lado se tiene secuenciado alrededor de 30 mil ESTs de diferentes órganos de A. tequilana como son las hojas, el tallo o piña, la raíz, el meristemo apical, los ovarios, las anteras y los bulbilos, (http://mazorka.ira.cinvestav.mx) los cuales son parte de varios proyectos de investigación que tienen la finalidad de identificar y caracterizar genes involucrados en diferentes funciones biológicas que realiza esta especie.
2.6.7. Retrotransposones en Agave tequilana
Recientemente ha sido publicado un reporte sobre el aislamiento y la caracterización de retrotransposones tipo Ty1-copia en A. tequilana Weber var. azul para el desarrollo de marcadores moleculares tipo SSAP aplicado al análisis filogenético de esta especie, encontrando un 96% de polimorfismo dentro de agave con el cebador Teq1 y un 41%
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representan inserciones únicas en las accesiones de Agave. También se encontró la existencia de bandas únicas para una accesión en particular, sugiriendo que Teq1 ha estado activo a través de la evolución de Agave de un antecesor común (Bousios et al. 2007).
2.7. Agave americana L. var. americana
Agave americana, que es cultivado en distintos climas alrededor del mundo, fue la primera especie de Agave que fue descrita científicamente (Granados, 1993). Las flores de A. americana, son caracterizadas por un ovario corto afilado; los tépalos externos son gruesos, carnosos y alargados, y los tépalos ligeramente internos más pequeños (Gentry, 1982).
2.7.1. Reproducción de Agave americana L. var. americana
El tipo de reproducción que presenta esta especie es por medio de hijuelos de rizoma y algunas veces por semillas y no existen reportes de bulbilos (Gentry, 1982; Granados, 1993; Arizaga 2002). A. americana florece después de 10 años de crecimiento en tierras con climas cálidos y puede tardar de 35 años o más en florecer si se encuentra en climas fríos (Irish e Irish, 2000).
2.8. Marcadores moleculares como herramientas para detectar variabilidad genética
En sentido amplio, un marcador molecular es cualquier característica química o molecular medible, que es heredada según un modelo Mendeliano simple. En sentido más restringido, los marcadores moleculares son segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos de referencia para el análisis del genoma. Estos segmentos usualmente tienen variantes o sitios polimórficos que pueden ser identificados empleando diferentes estrategias y técnicas. Los marcadores moleculares o marcadores del ADN revelan sitios de variación de la secuencia de ADN. A diferencia de los marcadores morfológicos, las variaciones no se muestran por sí mismas en el fenotipo, porque pueden tener diferencias en un sólo nucleótido del gen en una secuencia repetitiva del ADN. El uso de técnicas moleculares permite la estimación de la diversidad genética dentro de especies y entre ellas para estudios
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poblacionales, clasificación de germoplasma y mejoramiento e identificación de genes (Rodríguez y Arencibia, 2002).
El desarrollo y subsiguiente aplicación de marcadores moleculares ha incrementado grandemente el número de marcadores que pueden ser identificados entre dos progenitores y por consecuencia aumentar el poder del análisis genético en plantas como en animales. Los marcadores moleculares han revolucionado el análisis genético de plantas de cultivo donde juegan un rol central en el análisis de ligamientos, mapeos físicos, análisis de QTL (de quantitative trait loci) y selección asistida por marcadores (Syed, et al., 2005).
La detección y análisis de la variación genética puede ayudar a entender las bases moleculares de varios fenómenos biológicos en plantas. Debido a que muchas especies de plantas no son cubiertas por proyectos de secuenciación, los marcadores moleculares y su correlación a fenotipos proveen información para la elucidación de la variación genética.
Dentro de los diferentes tipos de marcadores moleculares que existen están los RFLP (de restriction fragment length polymorphism), los RAPD (de random amplified polymorphic DNA), los SSR (de simple sequence repeats) y los AFLP (de amplified fragment length polymorphism), las cuales son técnicas usadas rutinariamente en estudios genéticos de ecología, evolución, taxonomía y filogenia en plantas. Estas técnicas están bien establecidas y sus ventajas como desventajas han sido analizadas. En años recientes, nuevas clases de técnicas avanzadas están emergiendo principalmente de la combinación de técnicas básicas, aumentando su sensibilidad y la resolución. Las nuevas técnicas de marcadores también utilizan nuevas clases de elementos de DNA tales como los retrotransposones, microsatélites, y marcadores basados en DNA de mitocondrias y cloroplastos, revelando variación genética incrementada del genoma (Agarwal, et al., 2008).
Recientemente uno de los marcadores más ampliamente usando está basado en retrotransposones y conocido como SSAP (de sequence-specific amplification polymorphism); este sistema explota el polimorfismo insercional de los fragmentos repetidos terminales (LTR) de los retrotransposones presentes en todo el genoma.
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2.8.1. Polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP)
AFLP es una técnica que combina PCR y análisis de fragmentos de restricción para detectar polimorfismos debidos a cambios en el genoma (Simpson, 1997).
La técnica consiste en la amplificación de múltiples regiones arbitrarias del genoma (Vos et al., 1995). Se basa en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción de ADN ligados a adaptadores; utiliza cebadores con la secuencia complementaria al adaptador en el extremo 5’e involucra cinco etapas: 1. Digestión del ADN genómico con dos enzimas de restricción: una de corte raro EcoRI (que reconoce secuencias de 6 nucleótidos) y otra de corte frecuente MseI (que reconoce secuencias de 4 nucleótidos) generando pequeños fragmentos de ADN. 2. Ligación de adaptadores específicos de doble cadena a los extremos de los fragmentos de ADN generados por digestión. 3. Pre-amplificación, en el cual dos oligonucleótidos complementarios a los extremos de los adaptadores-ligados con un nucleótido preseleccionado en el extremo 3’es empleado para amplificar las regiones que contienen el sitio de unión al oligonucleótido y al sitio de restricción. 4. Amplificación selectiva en el cual los oligonucleótidos complementarios con tres o cuatro nucleótidos extra en el extremo 3’ de los oligonucleótidos de la pre-amplificación, son empleados para amplificar subgrupos de los templados pre-amplificados. 5. Los fragmentos resultantes de la segunda amplificación, se desnaturalizan para que puedan ser visualizados por electroforesis en geles de poliacrilamida.
El polimorfismo detectado por la presencia o ausencia de bandas es debido a las mutaciones en los sitios de restricción ó por inserciones o deleciones dentro de los fragmentos amplificados. Los AFLP son marcadores moleculares confiables y reproducibles. El número de polimorfismos por reacción identificado por AFLP es mucho más alto que aquéllos realizados por RFLP o RAPD. Además, no es necesario predeterminar las secuencias de ADN genómico y se puede usar para organismos procarióticos y eucarióticos (Lin y Kuo, 1995). Las ventajas que ofrece la técnica (Gil-Vega, 1997) sobre otras son:
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Reproducibilidad y robustez No requiere conocimiento previo del genoma El número de polimorfismos detectado por esta técnica es mucho mayor que en otras.
2.8.2. Polimorfismo en la amplificación de secuencias específicas (SSAP).
Los retrotransposones con repetidos terminales largos (LTR) de son una clase de elementos genéticos móviles que han sido aprovechados para el desarrollo de marcadores moleculares en plantas. Los retrotransposones se mueven y replican en todo el genoma del hospedero vía intermediarios de ARN. Los LTR de retrotransposones están presentes como poblaciones heterogéneas grandes en todos los genomas de la plantas y muestran grandes variaciones en el número de copias y en la localización del genoma entre especies estrechamente relacionadas. El polimorfismo en la amplificación de secuencias específicas (SSAP) es el método de marcadores moleculares basado en transposones más usado actualmente (Waugh et al., 1997). Este método explota la variación generada por el movimiento de los retrotransposones y revela más altos niveles de polimorfismo entre individuos que los marcadores tipo AFLP en cebada, chicharos, trigo y alfalfa (Waugh et al., 1997; Kalendar et al., 1999; Queen et al., 2004). El método SSAP es similar a los AFLP pero usa sólo un cebador adaptador y el otro es un cebador anclado a una secuencia de un LTR de un retrotransposon (Kalendar et al., 1999).
2.8.3. Polimorfismo en la amplificación de regiones Inter-Retrotransposon (IRAP).
Otro método que aprovecha la inserción y la dispersión de los retrotransposones en el genoma de las plantas es el conocido como IRAP. Este método, a diferencia del anterior, no requiere la digestión del genoma por enzimas de restricción; por lo tanto, se basa en la amplificación de secuencias que se encuentran entre dos retrotransposones, lo suficientemente cerca para ser amplificados. Este método tiene muchas ventajas sobre los
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AFLP, se obtiene mayor distribución cromosomal y además permite detectar ambos alelos en individuos heterocigotos (Kalendar et al., 1999).
2.9. Elementos transponibles en plantas
Los elementos transponibles fueron descubiertos en plantas debido a los fuertes efectos sobre la estructura del genoma y función genética. Aunque sólo pocos o ninguno de los elementos están activos en el genoma, ellos pueden causar cambios en su estructura cuando se activan. Todos los tipos de elementos están presentes en todas las especies de plantas, pero sus contribuciones cuantitativas y cualitativas son enormemente variables entre linajes muy relacionados. En algunas plantas con genomas grandes, los elementos móviles componen la mayoría del genoma nuclear. Ellos pueden rearreglar genomas y alterar la estructura genética individual y regular algunas funciones que ellos promueven como la transposición, inserción, escisión, cambios cromosómicos y recombinación ectópica. Muchos genes pueden haber sido sobre-expresados o amplificados por la acción de los elementos transponibles y por lo tanto la mayoria de los genes tienen el legado de múltiples elementos transponibles (Bennetzen, 2000). Los cambios cromosómicos puede llevar a la infertilidad en la progenie heterozigótica; los elementos transponibles pueden ser también responsables de la incompatibilidad que se genera en diferentes poblaciones de plantas.
Todos los elementos transponibles comparten dos propiedades básicas: la primera es la habilidad para moverse de un lugar a otro en el genoma y la segunda es la habilidad para amplificar el número de copias dentro el genoma vía su transposición. Existen dos grandes clases de elementos transponibles: los transposones y los retrotransposones (Bennetzen, 2000) y más recientemente otro grupo de elementos móviles llamados helitrones, que se replican por círculo rodante (Kapitonov y Jurka, 2001).
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Estudiar la biología reproductiva y analizar la variabilidad genética producida por reproducción sexual y asexual en Agave tequilana Weber var. azul.
3.2. Objetivos específicos
• Generar plantas híbridas por medio de cruzas interespecíficas entre A. tequilana y A. americana, así como cruzas intraespecíficas.
• Caracterizar los diferentes estados de desarrollo del gametofíto femenino y masculino de A. tequilana y A. americana.
• Analizar y comparar la diversidad genética de plantas generadas de semillas de polinización abierta con plantas híbridas por medio de AFLP.
• Analizar la diversidad genética de ambos tipos de reproducción asexual.
• Explorar la actividad de elementos móviles como un posible mecanismo para producir variación somática en individuos propagados asexualmente.
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Material vegetal.
Se trabajó con seis plantas de A. tequilana (At1, At2, At3, At4, At5, At8) provenientes de un campo de cultivo ubicado en Pénjamo y una planta de A. americana (Aa), las cuales alcanzaron la madurez y desarrollaron la inflorescencia simultáneamente hasta la formación de semillas. Las plantas se encontraban localizadas en el jardín del CINVESTAV, Campus Irapuato, a una distancia de 2 a 15 m. entre las plantas de A. tequilana y 100 m. de distancia de éstas con A. americana (ver croquis, figura 5). Los tratamientos de polinización se realizaron entre los meses de junio y julio del 2003 y 2004. Los datos del número de umbelas, cápsulas y semillas por planta fueron posteriormente recolectados entre los meses de noviembre y diciembre antes de la dispersión de las semillas. Bulbilos. Se trabajó con bulbilos que se indujeron en la planta At8 cortando los botones florales antes de su apertura. Los bulbilos emergen de los meristemos de pedúnculos florales hasta desarrollar plántulas que van desde 5 a 15 cm de longitud. Estos fueron colectados, plantados en macetas y mantenidos en invernadero. Hijuelos. Se recolectaron muestras de hijuelos de la planta At8, los cuales se encontraban próximos a la planta progenitora, se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -80° C.
4.2. Determinación del número de flores, frutos y semillas en plantas de polinización abierta de A. tequilana y A. americana.
El número total de flores, frutos y semillas fue estimado para cada planta polinizada naturalmente. El número de flores formados en cinco umbelas para A. tequilana y de 3 umbelas para A. americana fueron contados. Todas las umbelas se encontraban en la parte media de la inflorescencia. Después de las polinizaciones abiertas, los frutos producidos también fueron contados. Basados en el número de umbelas de cada planta, se realizó una estimación del número total de flores y frutos para cada planta. Los frutos fueron dejados en la inflorescencia hasta estar completamente secos y de color café; sólo entonces fueron
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N PLANTA At4 3.2 m 15 m
PLANTA PLANTA At3 PLANTA At5 At2
2.1 m PLANTA At1
CAMINO DE ENTRADA A CINVESTAV U.I.
Figura 5. Croquis de localización de las plantas progenitoras en el jardín del CINVESTAV - UNIDAD IRAPUATO
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recogidos. La estimación del número de semillas negras por planta fue realizada contando el número de semillas negras de diferentes frutos tomados al azar para cada planta dejada a la polinización abierta.
4.3. Procedimientos de polinización
Se realizaron cuatro diferentes tratamientos a cada una de las plantas escogidas tanto en A. tequilana y A. americana. a. Autopolinización. Las anteras fueron removidas de botones florales cerrados los cuales fueron inmediatamente cubiertos con bolsas de papel hasta que los estigmas fueran receptivos lo cual ocurre en un periodo entre 5 y 6 días después de la emasculación. Después de este periodo de tiempo, se colectaron anteras con granos de polen maduros de alrededor de 10 flores de la misma planta inmediatamente antes de la polinización y usando un pincel el polen fue transferido a los estigmas maduros los que se caracterizan por presentar las papilas húmedas y los lóbulos abiertos. Las flores polinizadas fueron nuevamente cubiertas y dejadas hasta el desarrollo de frutos. El mismo procedimiento fue llevado a cabo tanto para A. tequilana como para A. americana. b. Polinización cruzada. Las cruzas intraespecíficas fueron llevadas a cabo entre diferentes plantas de A. tequilana en ambos sentidos, directas como recíprocas de la siguiente manera: At3 como progenitor materno por At5 como progenitor paterno y su recíproco, At5 como progenitor materno y At4 como progenitor paterno. Las cruzas interespecificas fueron llevadas a cabo entre plantas de A. tequilana y una planta de A. americana. El procedimiento fue esencialmente el mismo que las cruzas intraespecíficas, con la excepción del uso de granos de polen de otra especie. c. Polinización abierta. En este grupo, las umbelas fueron marcadas y dejadas para la polinización natural.
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d. Emasculación sin polinización. Como control, en este experimento las anteras fueron removidas de botones florales cerrados los cuales luego fueron cubiertos con bolsas de papel para evitar la polinización.
4.4. Germinación de semillas.
Las semillas negras de los experimentos anteriores fueron lavadas con agua destilada tres veces con agitación suave y dejadas remojando por 30 min. Luego fueron escarificadas cortando la región micropilar con un bisturí para aumentar la eficiencia de germinación; en estas condiciones, las semillas fueron puestas sobre algodón húmedo e incubadas a 28° C en oscuridad por 3 a 4 semanas. Las semillas de la planta At1 se germinaron sin escarificación. Las plántulas obtenidas por semilla, fueron puestas en macetas y mantenidas en invernadero bajo condiciones controladas. El número de semillas germinadas para cada tratamiento de polinización varió. En el caso de las polinizaciones abiertas, había muchos frutos disponibles por lo tanto se escogieron al azar 20 frutos de cada planta y sus semillas fueron germinadas por separado permitiendo la comparación de la viabilidad de semillas de diferentes frutos al igual que para las autofecundaciones. Para las cruzas inter e intraespecíficas, las semillas de todos los frutos disponibles fueron germinadas juntas y la viabilidad de semillas de diferentes frutos no fue comparada.
4.5. Estudios histológicos
Se colectaron botones florales de entre 20 mm a 60 mm de desarrollo y se dividieron en dos partes. La parte superior que contiene las anteras fue usada para estudiar el desarrollo del gametofito masculino y la parte inferior que contiene los óvulos, fue usada para el análisis de los gametos femeninos en desarrollo. Los óvulos fueron extraídos individualmente bajo un estereo-microscopio y fijados por 24 h en solución FAA conteniendo los 10: 50: 5: 35 volúmenes de formaldehído al 40%, etanol al 95%, ácido acético glacial y agua destilada, respectivamente. Luego fueron transferidos a etanol al 70%, para posteriormente ser clareados con soluciones de metil salicilato y etanol por periodos sucesivos de una hora en los siguientes volúmenes 3:1, 1:1, 1:3 y metil
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salicilato concentrado al final, respectivamente. Luego los óvulos fueron observados y fotografiados usando un microscopio de contraste de interferencia Leica DMR. Las anteras fueron obtenidas de botones florales de entre 20 mm a 30 mm de desarrollo, por la técnica de “squash”, mediante la cual los granos de polen fueron teñidos con DAPI (4’, 6- Diamidina-2-fenilindol) y observados usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX60. Un total de 100 anteras y 100 óvulos de diferentes flores y de diferentes plantas fueron analizados.
4.6. Viabilidad del polen
La viabilidad fue evaluada por la germinación in vitro de los granos de polen por el método de la gota colgante. Para esto, los granos de polen recolectados el mismo día fueron puestos sobre el medio conteniendo 2% de glucosa, 200 mg/L cloruro de calcio, 0.06% de ácido bórico, 2 mg/L de glicina y adicionado con las siguientes vitaminas: 0.05 mg/L de ácido fólico, 0.5 mg/L de tiamina, 0.5 mg/L de ácido nicotínico, 0.5 mg/L de piridoxina y 0.05 mg/L de biotina ( Piven et al., 2001), e incubadas a temperatura ambiente. Los granos de polen fueron observados al microscopio cada 15 min hasta determinar el tiempo en el que empiezan a germinar y sólo los tubos polínicos largos fueron considerados viables.
4.7. Análisis por citometría de flujo
Con el propósito de confirmar el nivel de ploidía de plantas de A. tequilana por medio de su contenido genómico se realizó el análisis de citometría de flujo en 4 plantas de un campo de cultivo ubicado en el municipio de Irapuato; para esto se muestrearon 3 hojas de la parte más externa a la interna con el fin de estimar el contenido de ADN nuclear y el nivel de ploídia que estas presentaran. El análisis fue realizado según Otto (1990) con las mismas modificaciones descritas por Dolezel y Göhde (1995). El citómetro de flujo usado para estimar el contenido de ADN fue un Partec CA II (Partec GmbH, Münster, Germany). Se pesaron 120 mg de hoja de agave y 25 mg de hoja de maíz
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el cual se utilizó como control; estas cantidades se depositaron en una caja Petri con 1 ml de solución Otto 1 (Otto, 1990) inmediatamente se picaron finamente ambos tejidos con una hoja de afeitar, la suspensión se filtró en mallas de 50 µm, se incubó por 10 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 1000 rpm por 3 minutos. Después de decantar, los núcleos que se depositaron en la pastilla se lavaron con 1 ml de solución de Otto 1 y se volvieron a centrifugar como arriba se menciona. Finalmente los núcleos fueron mezclados con 500 µl de solución Otto 1, 2 ml de solución Otto 2 (Otto F., 1990), 125 µl de ARNasa 1mg/ml y se tiñeron con yoduro de propidio. Esta mezcla se filtró y se leyó en el citómetro de flujo; entre 11000 y 16000 núcleos fueron analizados en cada muestra. Los promedios de los picos, las áreas y los coeficientes de variación fueron calculados usando el software DPAC (Partec). El tamaño del genoma nuclear fue calculado con la siguiente fórmula:
Promedio pico Go/G1 muestra Contenido de 2C ADN muestra = ------x contenido de 2C ADN estándar (pg) Promedio pico Go/G1 estándar
El estándar interno fue seleccionado de acuerdo al nivel de ploidía de la variedad azul, en este caso fue maíz con 2C ADN = 5.433 pg para A. tequilana var. azul. Para saber si existieron diferencias significativas entre las distintas plantas o entre las hojas de la misma planta se realizó un análisis de varianza. El estudio se realizó en 4 plantas y de cada planta se analizó 3 hojas con 3 réplicas cada una.
4.8. Extracción de ADN genómico de hojas de agave
La extracción de ADN de hojas de A. tequilana es por si dificultosa por el hecho de presentar altas concentraciones de azúcares y fibra junto con otras sustancias como saponinas y esteroides. Sin embargo, basados en el protocolo descrito por Doyle y Doyle (1989) y con algunas modificaciones pudimos obtener un ADN de buena calidad para empezar con el análisis molecular. Una de las modificaciones fue empezar la extracción con 3.5% de CTAB en vez de 2.5% y posteriormente precipitar el ADN con 500 µL de acetato de amonio 7M y 500 µL de isopropanol en vez de isopropanol sólo. Los lavados finales también deben de hacerse con una mezcla de etanol al 70% con acetato de amonio, seguidos
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de dos lavados sólo con etanol al 70%, de ésta manera se obtendrá un ADN libre de sustancias indeseadas, esto se comprueba corriendo el ADN en un gel de agarosa al 1% y teniendo la relación de absorbancia a 260/280 nm de longitud de onda, obtenido al ajustar la concentración a 100 ng/µL en el Nanodrop®.
4.9. Análisis por marcadores moleculares tipo AFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados)
Los análisis moleculares para estudiar la variabilidad genética sexual (semillas) como asexual (hijuelos y bulbilos) de A. tequilana fueron realizados por la técnica de AFLP de acuerdo a Vos et al. (1995), con algunas modificaciones que se detallan abajo y usando el analizador de ácidos nucleícos LI-COR Biosciences, IRDye™ Fluorescent. La técnica consta de los siguientes pasos:
1) Digestión de ADN genómico
Para la digestión se tomó1 µL de ADN a una concentración de 100 ng/µL, 0.5 µL de Eco RI 10U/µL, 0.3 µL de Mse I 10U/µL, 1.25 µL de buffer RL 10X y se llevó con agua desionizada estéril a un volumen final de 12.5 µL, se mezcló y se incubó a 37° C por 3 horas. Luego, se inactivaron las enzimas a 70° C por 15 min.
2) Ligación de adaptadores
Los fragmentos resultantes de la digestión se ligaron en ambos extremos a unos adaptadores específicos, añadiendo 0.3 µL del adaptador EcoRI /EcoRI a una concentración de 5 pmol, 0.3 µL del adaptador MseI/MseI a una concentración de 50 pmol, 1.2 µL de ATP 10 mM, 1.2 µL de buffer RL 10 X, 0.5 µL de la enzima T4 ligasa 10 U/µL y finalmente se ajustó a un volumen total de 12.5 µL con agua desionizada estéril. La reacción se realizó a 16° C toda la noche.
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3) Preamplificación
Se realizaron diluciones 1:10 de las ligaciones anteriores y se transfirieron 2.5 µL de la dilución a tubos de PCR en hielo; a éstos se adicionaron oligonucleótidos más una base selectiva Eco RI + A y Mse I + A de 50 ng/µL cada uno, dNTPs 0.2 mM, 0.2 µL de Taq ADN polimerasa 10U/µL, 2.5µL de buffer 10 X de la taq ADN polimerasa, 0.75 µL de
MgCl2 (50 mM), y agua desionizada estéril hasta alcanzar un volumen total de 23.5 µL. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94° C por 30s, 56° C por 1min y 72° C por 1 min y una temperatura final de mantenimiento de 4° C.
4) Amplificación selectiva
Se realizaron diluciones 1:40 de la amplificación previa y se transfirieron 2 µL de esta dilución a tubos de PCR, donde se añadieron dNTPs 0.2 mM, 0.2 µL de Taq ADN polimerasa 10U/µL, 1µL de buffer 10 X de la Taq ADN polimerasa, 0.3 µL de MgCl2 (50 mM) y oligonucleótidos más cuatro bases selectivas para MseI el cual no estaba marcado y más tres bases selectivas para Eco RI marcado con IRDye que emite fluorescencia a 700 nm y otro que emite fluorescencia a 800 nm; se añadió agua desionizada estéril para alcanzar un volumen final de 11 µL y se mezcló cuidadosamente, trabajando siempre en este paso en oscuridad para evitar la exposición de la luz a los oligonucleótidos que son fotosensibles. Las combinaciones de oligonucleótidos se especifican en la Tabla 1.
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Tabla 1. Combinación de oligonucleótidos usados en los AFLP
OLIGONUCLEÓTIDO SIN OLIGONUCLEÓTIDO MARCAR MARCADO Mse I + AGTC Eco RI + ACA (700 nm) Mse I + AGTC Eco RI + AGC (800 nm) Mse I + ACCC Eco RI + ACA (700 nm) Mse I + ACCC Eco RI + AGC (800 nm)
Las condiciones de PCR fueron: 94° C por 30 s, 65° C por 30 s y 72° C por 1 min (1 ciclo). 94° C por 30 s, seguido por un gradiente que empieza en 65° C y baja cada ciclo 0.7° C, 72° C por 1 min, esto por 12 ciclos. Luego, 94° C por 30 s, 56° C por 30 s y 72° C por 1 min hasta alcanzar 23 ciclos.
5) Desnaturalización
Se adicionaron 3 µL de muestra y 2 µL de “blue stop”, se incubaron a 94° C por 3 min con una temperatura final de mantenimiento de 4° C, inmediatamente se pusieron las muestras en hielo y se corrió un gel de poliacrilamida al 6.5%; las imágenes se capturaron automáticamente en la computadora.
6) Gel de poliacrilamida
Se preparó un gel de poliacrilamida al 6.5%, con urea 8 M y TBE 1 X (Tris 1 M, ácido bórico 1 M, EDTA 20 mM pH 7.0); la separación de los fragmentos se realizó en la cámara de electroforesis del secuenciador de ADN marca LI-COR. Los tiempos y las condiciones de pre-corrida y corrida fueron los siguientes: pre-corrida de 13 a 20 minutos aproximadamente
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a 200 V con el amortiguador TBE 0.5 X hasta alcanzar 30 mA. Después se cargó 0.2 µL de cada muestra desnaturalizada, en los carriles de los extremos se cargó la misma cantidad de marcador de peso molecular de 50 pb. La corrida se llevó a cabo en un tiempo de 3 horas a 1500 V, 40 W y 40 mA.
4.10. Análisis de datos
Los fragmentos o bandas obtenidos por medio del software SAGA del secuenciador fueron reportados en una matriz de signos (+) y (-) con la cual se identificó la presencia de banda como (+) y la ausencia de banda como (-), posteriormente se realizó un reemplazo de los signos (+) por (1) y (-) por (0), con la ayuda del programa Microsoft® Word 2000; finalmente se importó esta matriz al programa Microsoft® Excel 2000, con el formato requerido para continuar con el análisis.
Los datos obtenidos fueron analizados calculando la similitud genética con los índices de
Simple Matching y Sokal y Sneath 1, (Skroch et al., 1992) y el análisis de agrupamiento para construir el dendrograma a partir de esta matriz de similitud genética se realizó utilizando el método de promedio aritmético de grupos de pares no ponderados (UPGMA) con la ayuda del programa de computo FreeTree (Hampl et al., 2001) con el cual también se realizó un análisis de remuestreo para obtener los índices de confianza “bootstrap” realizando 1000 réplicas.
4.11. Análisis por marcadores moleculares tipo IRAP (Inter-Retrotransposon Amplifed Polimorfism).
Para identificar la presencia de retrotransposones en A. tequilana, se realizaron análisis moleculares tipo IRAP (Kalendar et al., 1999), para lo cual se partió de 50 ng/µL de ADN genómico para realizar un IRAP-PCR utilizando 0.12 µM del oligonucleótido 3’LTR específico de BARE (cebador específico de retrotransposon) de cebada del grupo copia Ty 1 de retrotransposones, cuya secuencia es 5’-TGTTTCCCATGCGACGTTCCCCAACA-3’
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0.2 mM dNTPs, 0.2 µL de Taq ADN polimerasa 10 U/µL, 2 µL de buffer 10 X de la Taq
ADN polimerasa, 0.75 µL de Mg Cl2 (50 mM), y agua desionizada estéril hasta alcanzar un volumen total de 23.5 µL. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94° C por 2 min, 94° C por 30 s, 40° C por 1 min con un aumento de 0.5° C en cada ciclo y 72° C por 2 min con un incremento de 0.3 s por ciclo y 72° C por 10 min, con una temperatura final de mantenimiento de 4° C. Los productos de amplificación fueron observados en geles de agarosa al 1%.
4.12. Aislamiento, clonación y transformación de productos de amplificación procedentes de IRAP.
Para el aislamiento de las secuencias amplificadas por IRAP se utilizó el protocolo del kit Qiaquick Gel Extracción de Quiagen. La clonación se realizó en el vector PCR II-TOPO 4 de Invitrogen y se transformó en células de E. coli DH5 electrocompetentes. La extracción de ADN plasmídico se realizó siguiendo el protocolo de Birnboim clásico (Birnboim y Dolly, 1979). Se secuenciaron 10 clonas de este ADN plasmídico y se realizaron los análisis bioinformáticos para encontrar homologías en la base de datos del NBCI por medio de “BLAST” a nivel nucleótidos y proteínas.
4.13. Análisis por marcadores moleculares tipo SSAP (Specific Sequence Amplified Polymorphisms)
Para determinar el nivel de polimorfismo en base a la distribución de retrotransposones en el genoma de bulbilos de A. tequilana, se realizaron análisis tipo SSAP como se describe en Syed y Flavell (2006) con algunas modificaciones; para esto se partió de 600 ng/µL de ADN genómico de buena calidad, el cual fue digerido con 10 U/µL de las enzimas de restricción Eco RI y Mse I, se dejó incubando toda la noche a 37° C. Para inactivar las enzimas se incubó a 80º C por 20 min. Para verificar los patrones de digestión se corrió un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Para ser válidas, todas las muestras deben mostrar patrones de digestión completos y similares. Si existen patrones de digestión diferentes, es necesario revisar la calidad del ADN y repurificar el ADN.
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La ligación de adaptadores se realizó para cada muestra del ADN digerido de la siguiente manera, a 25 µL de ADN digerido se añadió 0.5 µL de adaptador Eco RI/Eco RI de 5 pmol/µL y 0.5 µL de adaptador Mse I/Mse I de 50 pmol/µL, 3 µL de ATP 10 mM y 10 U/µL de T4 ADN ligasa. Se dejó incubando a 16º C toda la noche. Se inactivó la ligasa a 65º C por 10 min. El ADN ligado se almacenó a -20º C. Utilizando estos fragmentos de ligación de secuencia conocida como templados se realizó la primera amplificación con el primer Eco RI/A con una base selectiva y Mse I/A también con una base selectiva a una concentración de 100 ng de ADN, 2.5 µL de buffer PCR (10 X), 0.5 µL de dNTPs 10 mM ,0.2 µL de taq ADN polimerasa de 5 U/µL , 0.75 µL de cloruro de magnesio y agua destilada estéril lo suficiente para completar a 23 µL más 2 µL del ADN digerido y ligado. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 1 min a 95º C, 1 ciclo; 1 min a 94º C, 1 minuto a 60º C, 1 min a 72º C por 30 ciclos. Para finalizar se incubó la reacción por 7 min a 72º C. Se verificó la presencia de los productos de amplificación usando una alícuota de 5 μl. De los productos amplificados se realizó una dilución 1:20 la cual se utilizó para la amplificación selectiva con el cebador específico para amplificar retrotransposones marcado con fluorescencia Teq1 (5´-GATTGTAACCTTGGGCCAACAG-3´) a una concentración de 1 pmol/μl, y el primer sin marcar fue Eco RI con dos bases selectivas (Eco RI/AA). Las condiciones de PCR utilizadas fueron las mismas de Vos et.al. (1995). Los fragmentos amplificados fueron separados en gel de secuenciación de poliacrilamida al 6.5% y visualizados por medio del software SAGA del secuenciador.
4.14. Búsqueda de retrotransposones en la base de datos de Agave
Se realizó la búsqueda de retrotransposones en la base de datos de ESTs de Agave tequilana depositados en Mazorka. Esto se realizó con el lenguaje MySQL, por medio de variables que se introducen en la sección consultar la base de datos. Esto nos permite buscar la información en las tablas blast-hit y blastclu, proporcionando información sobre todos los hits encontrados en la base de datos de Agave.
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5. RESULTADOS
5.1. Producción de frutos y semillas en plantas de polinización abierta de A. tequilana y A. americana
El número de umbelas por planta fue determinado y con base en los datos de 5 umbelas de cada planta para el caso de A. tequilana (At) y 3 umbelas para A. americana (Aa), el número de flores, frutos y semillas por planta fue estimado. El número estimado de flores por umbela varió entre las 3 plantas de At estudiadas, de 283 ± 100.9 para At2 hasta 444 ± 43.4 para At3 con una media general de 352.6 ± 82.6 flores por umbela. El número de flores por planta para At fue estimado en promedio en 12,341 con un intervalo entre (9,450-15,232). En el caso de Aa el número de flores por umbela fue de 295.3 ± 51.6 y el estimado de flores por planta fue en promedio en 8,268 con un intervalo de variación de 6,823 hasta 9,712 flores/planta. Los datos presentados en la tabla 2 muestran que, sólo en promedio el 17.24% de las flores dejadas para la polinización abierta son convertidas en fruto en At y el 8.80% en Aa (asumiendo que cada flor tiene el potencial para desarrollar un fruto). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el número de semillas por fruto entre las 3 plantas de At estudiadas F = 0.37, df = 2, P = 0.68, mientras que entre polinizaciones abiertas y autofecundaciones en el número de semillas por fruto, las diferencias son muy significativas F = 17.82, df = 3 P<0.00001. Lo mismo ocurre en el caso de Aa cuando comparamos el número de semillas obtenidas de polinización abierta con las obtenidas por autofecundaciones, existen diferencias altamente significativas F = 12.02, df = 1, P = 0.00084. Los frutos de At de polinización abierta, contenían principalmente semillas abortivas, arrugadas y blancas, con una pequeña proporción de aproximadamente 10% de semillas negras de apariencia normal como se muestra en la figura 6a. Los frutos de Aa también contenían una alta proporción de semillas blancas de tamaño y forma normal los cuales se encontraban vacíos, con solo un 11% de semillas negras de apariencia normal (figura 6b).
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Tabla 2. Producción de frutos y semillas en polinización abierta de Agave tequilana (At) y Agave americana (Aa). Los datos son promedios ± SD. N = número de umbelas; n = número de frutos.
Producción Plantas Flores/umbela Flores/planta Frutos/umbela Fruitos/planta Semillas/fruto Semillas/planta Frutos (%)
40.6 ± 13.0 24.33 ± 9.04 At2 N = 5 283.0 ± 100.9 9,056 (5,827-12,284) 1,299 (883-1,715) 14.34 % 31,604 (19,485-42,867) n = 18 83.0 ± 23.1 26.76 ± 9.35 At3 N = 5 444.0 ± 43.4 16,428 (14,822-18,033) 3,071 (2,216-3,925) 18.69 % 82,179 (49,136-110,556) n = 17 58.8 ± 19.1 27.22 ± 13.10 At4 N = 5 330.8 ± 32.6 11,908 (10,735-13,082) 2,116 (1,429-2,804) 17.76 % 57,597 (29,624-84,640) n = 18 Media 352.6 ± 82.6 12,341 (9,450-15,232) 60.8 ± 21.2 2,128 (1,386-2,870) 17.24 % 26.10 ± 1.55 55,540 (52,241-58,838) At 36.70 ± 9.28 Aa N = 3 295.3 ± 51.6 8,268 (6,823-9,712) 26 ± 5,5 728 (574-882) 8.80 % 26,936 (16,744-37,128) n = 78
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No se observaron frutos que contuvieran sólo semillas blancas y arrugadas, parece ser necesaria para el desarrollo del fruto, tanto en At como en Aa, que se desarrolle al menos una semilla negra. Las semillas de At son opacas a diferencia de las semillas de Aa que son
Figura 6. Semillas de agave. a. Fruto y semillas de Agave tequilana. b. Fruto y semilla de Agave americana. c. Semillas opacas de Agave tequilana (izquierda) y semillas brilantes de Agave americana (derecha). d. Comparación de semillas sin embrión ni endospermo (izquierda) y semillas normales (derecha).
brillantes (figura 6c). Las semillas lisas y brillantes de Aa tienen elevados niveles de germinación en comparación a las semillas negras de At que presentan bajos niveles de germinación debido principalmente a que sus semillas se encuentran vacías, es decir, sin embrión ni endospermo (figura 6d).
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5.2. Producción de frutos y semillas obtenidos por medio de cruzas.
Para determinar la eficiencia de producción de semillas bajo diferentes condiciones de polinización, cuatro diferentes eventos de polinización fueron estudiados. Una umbela por planta fue usada para cada tratamiento de polinización y los porcentajes de frutos formados fueron determinados con base en el número de flores por umbela (ver tabla 3 y 4). Cuando las flores fueron emasculadas y cubiertas para evitar la polinización, ningún fruto fue formado en At ni en Aa, las flores sin polinización abortaron masivamente indicando que la polinización manual estuvo bien controlada y que éstas especies no desarrollan semillas sin polinización.
Las autofecundaciones tanto en At como en Aa presentaron bajos niveles de frutos, como de semillas por fruto (tabla 3). Los porcentajes de frutos formados en relación al número de flores observadas en cada umbela el número de semillas negras por fruto para cada cruza fueron bajos, en comparación con las muestras de polinización abierta como se muestra en la tabla 4. La cruza At5 × At4 dío los porcentajes más altos de frutos (15.78%) de todos los eventos de polinización, mientras que la cruza At3 × Aa formó el número más alto de semillas negras por fruto de todas las cruzas realizadas (23.70 ± 11.14).
Todas las cruzas interespecíficas con At como progenitor materno formaron mayor número de semillas negras por fruto en comparación con las cruzas intraespecíficas (tabla 4). En contraste, el porcentaje de frutos y el número de semillas negras formadas con Aa como progenitor materno fueron los más bajos comparados con su cruza recíproca existiendo diferencias significativas F = 13.06, df = 1, P = 0.0035 en el número se semillas por fruto entre At3 × Aa y Aa × At3.
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Tabla 3. Porcentaje de producción de frutos y semillas por fruto formados en autopolinización en Agave tequilana (At) y Agave americana (Aa). Los datos son promedios ± SD. N = número de flores autopolinizadas; n = número de frutos.
Autopolinización Frutos (%) Semillas/fruto 8.55 ± 2.92 At5 N = 315 6,66 n = 20
12.25 ± 9.42 Aa N = 94 4,25 n = 4
Tabla 4. Porcentaje de producción de frutos y semillas por fruto formados en diferentes eventos de polinización en Agave tequilana (At) y Agave americana (Aa). Los datos son promedios ± SD. N = número de flores con polinización manual; n = número de frutos.
Cruzas Frutos Cruzas Frutos Semillas/fruto Semillas/fruto Intraespecificas (%) Interespecificas (%) 13.60 ± 3.30 23.70 ±11.14 At3×At5 N = 206 9.70 At3×Aa N = 328 12.19 n =10 n = 10 5.20 ± 1.61 12.62 ± 5.60 At5×At3 N = 139 13.66 At4×Aa N = 81 9.87 n = 10 n = 8 4.66 ± 1.58 16.50 ± 6.70 At5×At4 N = 57 15.78 At5×Aa N = 263 9.12 n = 9 n = 10 3.00 ± 1.40 Aa×At3 N = 168 2,38 n = 4 5.50 ± 6.00 Aa×At4 N = 91 2,19 n = 2
5.3. Viabilidad de las semillas
Por otro lado, para determinar si las semillas negras obtenidas de los diferentes tratamientos de polinización y las obtenidas por polinización abierta eran viables, se escogieron al azar semillas de diferentes frutos las cuales fueron germinadas. En principio se germinaron semillas provenientes de polinización abierta de A. tequilana (At1) dando una eficiencia de germinación del 9.1%. Basados en previos reportes donde Peña-Valdivia et al. (2006)
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describen los efectos de la vernalización y escarificación sobre la eficiencia de germinación, se decidió escarificar las semillas, cortando la testa de la zona micropilar para las plantas At2, At3 y At4. Durante el proceso de escarificación observamos que ciertas semillas negras de At se encontraban vacías, es decir, no presentaban embrión ni endospermo, ver figura 6d. Esta fue la principal causa de los niveles de viabilidad tan bajos presentados en At; sin embargo, también se encontraron semillas negras que contenían embrión y endospermo pero fueron inviables y no germinaron.
En este trabajo mostramos el incremento de la germinación, en semillas de polinización abierta de At hasta un 40% con la escarificación, siendo que sólo el 9.1% de las semillas germinan sin escarificar en At1 (figura 7a). Por otro lado, las semillas de Aa mostraron porcentajes altos de germinación (>80%) comparados con las semillas de At provenientes de polinización abierta, como se muestra en la figura 7a. Las semillas producidas por autofecundaciones tanto de At5 como de Aa mostraron altos niveles de viabilidad (>60% para At5 y >90% para Aa, figura 7a). Para las cruzas intraespecíficas, la cruza reciproca entre At3 y At5 produjo números similares de semillas viables, vacías e inviables; sin embargo, en la cruza At5 × At4 aumentó ligeramente la viabilidad de las semillas con respecto a las anteriores cruzas (figura 7b). Para las cruzas interespecíficas, se observó una marcada diferencia en la viabilidad de las semillas dependiendo de que especie sea usada como progenitor femenino. En todas las cruzas que tienen como progenitor femenino a At, más del 80% de las semillas se encontraban vacías y bajos niveles de viabilidad fueron observados. Sin embargo, cuando la planta de Aa fue progenitor femenino, bajos niveles de semillas vacías e inviables fueron encontrados y los niveles de germinación alcanzaron hasta 60% (figura 7b). Esto demuestra, que la relación directa o inversa de las cruzas interespecíficas altera fuertemente la viabilidad de las semillas.
43
120
100 a
80 Semillas viables 60 Semillas vacias Semillas inviables 40
20
0 At1 At2 At3 At4 Aa At5 Aa n=469 n=443 n=492 n=479 n=709 n=91 n=49 Polinización Abierta Autopolinización
120 b 100
80 Semillas viables 60 Semillas vacias Semillas inviables 40
20
0 At3xAt5 At5xAt3 At5xAt4 At3xAa At4xAa At5xAa AaxAt3 AaxAt4 n=100 n=98 n=36 n=196 n=93 n=197 n=11 n=12 Cruzas intraespecíficas Cruzas Interespecíficas
Figura 7. Porcentaje de germinación de semillas y porcentaje de semillas vacías e inviables bajo diferentes eventos de polinización en Agave tequilana y Agave americana. a. En polinización abierta y autofecundaciones. b. En cruzas intraespecíficas e interespecíficas. n = número de semillas que se germinaron.
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5.4. Análisis histológico del desarrollo de los gametofitos
Para determinar si la producción de semillas vacías o sin embrión en At y Aa se debía al no desarrollo de los gametos nos dimos a la tarea de estudiar el desarrollo del gameto femenino y masculino. Previamente, el desarrollo de los gametos de Agave ha sido estudiado por Wunderlinch (1950) y posteriormente Dalgren y colaboradores (1985) reportan el tipo de desarrollo de gametos femenino y masculino en el género Agave en forma general, más recientemente Piven y colaboradores (2001) describen el desarrollo de los gametos en A. fourcroydes y A. angustifolia. Para proveer información y para intentar identificar posibles errores en el desarrollo de los gametos femeninos como masculinos, se realizó un estudio histológico tanto en At como en Aa, así como la determinación de la viabilidad de los granos de polen.
5.4.1. Desarrollo del gametofito femenino.
El proceso de desarrollo del gametofito femenino en At y Aa empieza con la diferenciación de la célula madre de la megaspora del tejido nucelar (figura 8a y b), la cual entra en divisiones meióticas para dar lugar a una tétrada de megasporas haploides (figura 8c), donde las tres megasporas de la zona micropilar degeneran y sólo se desarrolla la que se encuentra en la zona calazal llegando a ser la megaspora funcional (figura 8d). Por lo tanto, dado su desarrollo el gametofito femenino en At y Aa se considera como de tipo Polygonum monospórico. Posteriormente el núcleo de la megaspora funcional sufre tres rondas de divisiones mitóticas (figura 8e-f) con la consecuente formación de la pared celular, formando las 7 células típicas del desarrollo del gametofito femenino tipo Polygonum.
En este estudio también se observó que entre 2-5% de los óvulos de At no producen gametofito maduro. En lugar de este se observaron células nucelares alargadas (figura 8g). Por el contrario, este fenómeno no fue observado en Aa. Por otro lado, en un intento por estudiar el patrón de desarrollo del embrión en At, nos dimos a la tarea de realizar polinizaciones y observar los óvulos fertilizados en diferentes estados de desarrollo, constatando de esta manera que el tubo polínico penetra por la zona micropilar al óvulo,
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llevando consigo las células espermáticas (figura 9a). Al cabo de 72 horas se observa un proembrión en la zona micropilar del saco embrionario (figura 9b). Esto nos sugiere que los óvulos son fecundados; sin embargo, después de las 72 horas no se logró observar desarrollo del embrión, por el contrario, se vieron sacos embrionarios con evidente degeneración posiblemente debido a aberraciones cromosómicas que generan el desarrollo de semillas sin embrión ni endospermo; esto se debe posiblemente al aborto de éstas en etapas tempranas del desarrollo, esto fue observado al escarificar las semillas, en la zona micropilar se encontraban vestigios de lo que seria el endospermo. El desarrollo del gametofito femenino en A. americana también se lo puede clasificar como tipo Polygonum monospórico, debido a la presencia de tétradas después de la segunda división meiótica, condición que sólo se da en el desarrollo monospórico (figura 10).
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Figura 8. Megasporogénesis y desarrollo del saco embrionario de A. tequilana. a. Óvulo mostrando integumento interno (Ii), integumento externo (Oi), saco embrionario (Es), nucela (N). b. Célula madre de la megaspora (Mmc). c. Tétrada linear (T). d. Desarrollo de la megaspora funcional (Fm) y megasporas degeneradas (Dm). e. Saco embrionario mostrando los núcleos polares (Pc). f. Saco embrionario mostrando las sinérgidas (S) y célula huevo (Ec). g. Óvulo sin saco embrionario.
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a b
Figura 9. Óvulos de At con tubos polínicos. a. Introducción del tubo polínico en la zona micropilar del óvulo. b. Formación del proembrión después de 72 horas de fecundación.
Figura 10. Desarrollo del gametofito femenino en A. americana. a. Tétrada (T). b. Saco embrionario después de la primera mitosis. c. Saco embrionario mostrando 2 sinérgidas (S) y la célula huevo (Ch) en zona micropilar. d. Zona calazal con 3 antípodas (A) y 2 núcleos polares (Np).
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5.4.2. Desarrollo del gametofito masculino.
El desarrollo del gametofito masculino en At como en Aa es esencialmente el mismo. Después de las divisiones meióticas de las células madre del polen, se forman tétradas en forma tetragonal, lo que demuestra que la microsporogénesis es el tipo sucesivo, formando células haploides (figura 11a, b, d), las cuales al estar separadas forman microsporas uninucleadas (figura 11c), después los núcleos de las microsporas entran en sucesivos ciclos de divisiones mitóticas. Como resultado de la primera división mitótica se forman dos células, la célula generativa que está muy cercana al núcleo vegetativo (figura 11e). Los granos de polen de A. tequilana
presentan abertura disulcada y ornamentación reticulada (figura 11f) al igual que los granos de polen de A. americana. En una segunda división mitótica la célula generativa da lugar a dos células espermáticas. Esto ocurre dentro del tubo polínico en desarrollo de granos de polen maduros.
Figura 11. Desarrollo del gametofito masculino. a. Primera división meiótica de una célula madre del polen donde se observan los cromosomas (c). b y d. Formación de tétradas haploides tetragonales (t), se observa microsporas disulcadas (s). c. Microsporas uninucleadas (Mu). e. Microspora binucleada con el núcleo vegetativo (Vn) estrechamente relacionado a la célula generativa (Gc). f. Granos de polen maduros disulcados con ornamentación reticulada.
En el caso de A. americana, se puede observar microsporas unicleadas haploides como resultado de divisiones meióticas y granos de polen binucleadas resultado de la primera mitosis (figura 12).
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Figura 12. Granos de polen de A. americana. a. Microspora uninucleada. b y c. Granos de polen binucleados. d. Grano de polen mostrando ornamentación reticulada y disulcada con germinación del tubo polínico.
5.5. Viabilidad de los granos de polen
Para determinar la viabilidad de los granos de polen producidos por las plantas de At y Aa, se realizaron ensayos de germinación del tubo polínico in vitro. Los granos de polen empiezan a desarrollar el tubo polínico a los 30 minutos en medio de germinación tanto para At como Aa (figura 13a). Alrededor del 36 ± 5.9 % de los granos de polen de At y 79.5 ± 3.6 % de Aa germinaron en estas condiciones (tabla 5). Después de 1.5 horas de crecimiento en medio de germinación, los tubos polínicos empezaron a eliminar todo el contenido citoplasmático (figura 13b). Por otro lado cuando se germinaron granos de polen almacenados por más de 24 horas, se observaron tubos polínicos aberrantes (figuras 13c y d)
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que dieron porcentajes de germinación mucho más bajos comparado con polen fresco, que oscilaron entre 11% y 54% para At y Aa, respectivamente. En la figura 13e se puede observar el tubo polínico en crecimiento llevando en su interior las células espermáticas.
Figura 13. Germinación de los granos de polen de A. tequilana. a. Grano de polen germinando a los 30 minutos. b. Granos de polen después de 1.5 horas. c y d. Granos de polen aberrantes. e. Grano de polen germinado y mostrando las células espermáticas. Tubo polínico (Pt), células espermáticas (Sc).
Tabla 5. Porcentajes de germinación de tubos polínicos de A. tequilana (At) y A. americana (Aa) in vitro
Polen con Polen sin % de Polen con Polen sin % de germinación germinación germinación germinación germinación germinación At At en At Aa Aa en Aa Conteo 1 109 237 31.5 87 28 75.6 Conteo 2 142 187 43.0 97 20 82.9 Conteo 3 89 169 34.5 92 23 80.0 Promedio 113.33 197.66 36.33±5.9 92.00 23.66 79.5±3.6
5.6. Análisis morfológico y genético de las cruzas inter e intraespecíficas
Los experimentos de polinización descritos anteriormente sugieren que los niveles de contaminación con polen desconocido fueron nulos, debido a que las flores emasculadas y sin polinización abortaron. Sin embargo, para confirmar que las cruzas intra e interespecificas fueron exitosas se realizó un análisis de marcadores moleculares usando
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AFLP de las plantas progenitoras y las muestras de la progenie F1. Un ejemplo de estos resultados para la cruza At5 × Aa se muestra en la figura 14. Como se puede observar, nuevas combinaciones de bandas exclusivas de uno u otro progenitor se encuentran presentes en la progenie, indicando que ellos llevan información genética de ambos progenitores debido al éxito de la reproducción sexual.
Por otro lado, las plántulas obtenidas de cruzas intra e interespecíficas, autofecundaciones y polinización abierta, han sido crecidas en condiciones de invernadero alrededor de 3 años. En general, las plantas obtenidas por autofecundaciones son más pequeñas y menos vigorosas comparadas a las obtenidas por polinización abierta o de cruzas.
Las plantas provenientes de semillas de polinización abierta y crecidas en invernadero presentaron 2 fenotipos bien marcados: uno propio de A. tequilana, donde las hojas son lanceoladas (largas y delgadas) de color verde azulado, con espinas pequeñas retrorsas (dirigidas hacia la base); el otro, muestra el fenotipo de A. americana con hojas anchas de
color verde claro y espinas rojas grandes, principalmente la espina
Figura 14. Análisis de AFLP mostrando genotipos recombinantes de plantas obtenidas de semilla. a. Cruza interespecífica entre A. tequilana (At5) y A. americana (Aa). C6, C7, C9 y C11 indican las plantas obtenidas de diferentes semillas. b. Cruza intraespecífica entre A. tequilana (At5) y A. tequilana (At4). C1, C2 y C4 indican las plantas obtenidas de diferentes semillas. Las flechas blancas indican alelos paternos y las fechas negras alelos maternos. terminal. Estos resultados demuestran que en la polinización abierta las flores de A. tequilana pueden ser polinizadas con polen de A. americana y de esta manera formar semillas híbridas en forma natural. Al igual que otras especies de Agave, A. tequilana
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combina la hibridación y la reproducción asexual como estrategias evolutivas y de adaptación.
Todas las plantas obtenidas de cruzas intraespecíficas, presentaron el fenotipo característico de A. tequilana, donde las hojas son lanceoladas de color verde azulado; por el contrario, todas las plantas provenientes de cruzas interespecíficas presentaron rasgos fenotípicos característicos de A. americana, incluyendo las cruzas ínterespecificas donde At es el progenitor materno, lo que confirma que se puede obtener semillas híbridas de la cruza de At con Aa (figura 15).
Figura 15. Plantas de Agave tequilana de tres años crecidas de semillas de plantas polinizadas por diferentes tratamientos. a. Plantas mostrando los siguientes fenotipos: 1. Planta de A. tequilana obtenida por auto-polinización. 2. Planta de A. tequilana obtenida por polinización abierta. 3. Cruza inter-especifica A. tequilana × A. americana. 4. Cruza intra- específica A. tequilana × A. tequilana. b. Acercamiento del tratamiento 3 mostrando las hojas anchas y la espina terminal robusta características de A. americana; Tt, espina terminal.
5.7. Análisis por citometría de flujo
Debido a la confusión en el nivel de ploidia que presentaba A. tequilana donde los escasos reportes difieren (Banerjee y Sharma, 1987; Castorena-Sánchez et al., 1991; Cavallini et al., 1996; Palomino et al., 2003) y donde las aberraciones cromosómicas durante la meiosis han sido reportadas en varias especies (Piven et al., 2001, Ruvalcaba y Rodríguez, 2002), podrían explicar los bajos porcentajes de semillas viables observados en nuestro estudio. Por tal motivo, realizamos el análisis del nivel de ploidía que presentaba esta especie.
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El análisis por citometría de flujo confirma que A. tequilana es una especie diploide. El análisis simultáneo de núcleos aislados de hojas de Agave, así como del control interno, en este caso de maíz, generó un histograma del contenido relativo del ADN, en el que nos muestra la generación de dos picos G1 dominantes (picos1 y 2) los cuales corresponden a maíz y agave respectivamente; el pico 3 representa los núcleos que se encuentran en la fase G2 de maíz, la fase G2 de agave prácticamente no existe debido a que las divisiones celulares en Agave son muy lentas (Palomino et al., 2003) (figura 16). La cantidad de 2C ADN, calculada con base en el promedio de picos de las tres hojas de cada planta se resumen en la tabla 6. Mediante estas mediciones pudimos determinar que no existen diferencias significativas en el contenido de ADN nuclear entre diferentes plantas de un campo de cultivo, ni en la posición que presentan las hojas en una planta. Por otro lado, con base en el contenido de ADN nuclear también se pudo estimar el tamaño del genoma de A. tequilana, que en promedio es de 4077 Mpb (tabla 7).
úmero de núcleos de úmero N
Contenido relativo de ADN
Figura 16. Estimación del contenido de ADN nuclear en plantas de cultivo de Agave tequilana usando citometría de flujo. Se muestra un análisis simultáneo de núcleos aislados de Agave tequilana y maíz el cual fue usado como un control interno. Los picos 1 y 2 representan los núcleos en fase G1 de maíz y Agave tequilana. El pico 3 representa los núcleos en fase G2 de maíz.
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Tabla 6. Contenido de ADN nuclear en hojas de Agave tequilana analizadas por citometría de flujo. Los datos corresponden a promedios ± E.S.
Contenido de ADN nuclear 2C (pg) (x±e.s.)
Planta/Hoja Hoja1 Hoja2 Hoja3
Planta-1 8.256 ± 0.196 8.187 ± 0.114 8.290 ± 0.079 Planta-2 8.402 ± 0.166 8.203 ± 0.001 8.365 ± 0.097
Planta-3 8.220 ± 0.032 8.201 ± 0.107 8.447 ± 0.037
Planta-4 8.425 ± 0.172 8.382 ± 0.112 8.475 ± 0.054
Tabla 7. Estimación del tamaño del genoma de Agave tequilana con base en su contenido de ADN nuclear por medio de citometría de flujo. Los datos corresponden a promedios ± E.S.
Planta Nivel de ploidia Contenido de ADN Tamaño del genoma
nuclear 2C(pg)(x±e.s.) (Mpb)¹ ¹ Planta1 2x 8.2443 ± 0.129 4039 Planta2 2x 8.3236 ± 0.088 4078 Planta3 2x 8.2894 ± 0.071 4061 Planta4 2x 8.4277 ± 0.112 4129
1pg = 980 Mbp¹ (Bennett et al., 2000)
5.8. Variación genética sexual de Agave tequilana Weber var. azul analizado por AFLP
Para determinar el nivel de diversidad genética y el nivel de entrecruzamiento que existe entre los individuos provenientes de semillas obtenidas de polinización abierta, se analizaron
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cuatro plantas progenitoras de A. tequilana con su respectiva progenie. Las plántulas germinadas de semillas fueron tomadas al azar y analizadas; se estudiaron 17 plántulas de la planta progenitora 1 (At1), 14 plántulas de la planta progenitora 2 (At2), 16 de la planta progenitora 3 (At3) y finalmente de la planta progenitora 4 (At4), se analizaron 15 plántulas. Los AFLP nos muestran perfiles de variación entre individuos de diferentes plantas progenitoras. Para At1 se analizaron 385 marcadores de los cuales 257 fueron polimórficos con un 67% de polimorfismo; esta planta se encontraba a 2.1 metros de distancia de la planta At2 la cual presentaba el mismo estado de floración que At1. Sin embargo, At2, mostró que de los 385 marcadores obtenidos, solo un 56% de ellos fueron polimórficos, indicando que en esta planta la autofecundación fue evidente, como se muestra en la figura 17 donde las distancias genéticas son estrechas entre las plántulas S18, S9, S7, S6, S13, S12 y su progenitor At2. Por otro lado, las plantas progenitoras At3 y At4 las cuales se ubicaban a 3.2 m de distancia entre ellas y 15 m de distancia de At1 y At2 presentaron patrones similares de polimorfismo, ya que de los 324 marcadores analizados para cada planta progenitora, 186 fueron polimórficos para el caso de At3 (57% de polimorfismo) y 219 para At4 (67% de polimorfismo).
Como se puede ver en la figura 18 (dendograma general), la progenie de las 4 plantas se encuentra distribuida de manera dispersa entre ellas sin haber un claro agrupamiento por planta progenitora, lo que indica que en A. tequilana se favorece fuertemente la polinización cruzada, a excepción de At2, que se encuentra agrupada con algunos individuos provenientes de ésta, lo que sugiere que también ocurren autofecundaciones. En la figura 18, se observa dos agrupamientos bien definidos con distancias genéticas similares: el grupo I, donde se encuentra la progenie de At1 y At2 y el grupo II, donde se encuentra la progenie de At3 y At4, lo que demuestra que en condiciones de polinización abierta la cercanía de plantas de A. tequilana que se encuentran en sincronía de floración garantizan la formación de semillas por entrecruzamiento entre diferentes individuos.
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P1S17 100 P1S6 62 P2S102 P1S3S8P2S 58 10P1S5 60 P1S1 42 P2S17 36 P1S9 28 P1S11 34 P1S4 P1S12 21 P1S10 P2S3 P2S15 P1S2 P2S5 P1S16 P2S8 P1S20 P2S12 P2S13 44 P2S6 P2S7 44 P2S9 P2S18 30 PM2 P1S18 P1S19 63 P2S1 58 P2S2 P1S7 58 P1S8
0.7 0.8 0.9 1.0
Coeficiente de similitud
Figura 17. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1 y At2 obtenido con el programa FreeTree y utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo bootstrap. P1S1-20, P2S1-19: progenie obtenida de semillas de At1 y At2. PM2-Muestra directa de At2 (ver croquis figura 5).
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PM3 P1S17 P4S8 P3S3 P4S17 P1S5 P1S11 100 P1S12 P1S4 13 P1S10 P1S2 P1S20 P1S16 P2S12 100 P2S13 I P2S6 36 35 P2S7 47 16 P2S9 P1S18 40 P1S19 P2S18 44 PM2 24 P1S7 P2S8 P2S1 55 P2S2 56 P2S3 25 25 P2S5 P2S15 37 P2S17 P1S8 25 P1S9 P1S1 21 P1S3 P4S5 P4S2 35 P3S10 30 P3S1 P4S6 P3S8 42 P4S4 PM4 II P3S15 P3S14 23 P3S2 23 P4S16 P3S6 20 P3S9 P3S12 17 P3S17 P3S7 13 34 P4S1 P3S13 22 P4S3 23 P3S11 32 P3S18 P4S12 96 P4S13 62 P4S9 P3S16 47 P4S15 P1S6 15 P2S10 P4S18 68 P4S20
0.7 0.9 1.0 0.8
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Figura 18. Dendrograma de semillas de polinización abierta plantas At1, At2, At3 y At4 obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo bootstrap. P1S1-20, P2S1-19, P3S1-18, P4S1-20: progenie obtenidos de semillas de At1, 2, 3 y 4. PM2, 3, 4-Muestra directa de At2, 3y 4 (ver croquis figura 5).
5.8.1. Análisis genético de cruzas intra e interespecíficas.
Para el análisis genético de los híbridos obtenidos a través de las cruzas dirigidas, se tomaron al azar muestras de plántulas de 2 meses de edad. Se obtuvieron las huellas genéticas de las siguientes cruzas intraespecíficas: At5 × At3, At3 × At5 y At5 × At4 mientras las cruzas interespecíficas fueron At5 × Aa y At3 × Aa, usando cuatro combinaciones de oligonucleótidos, se obtuvieron un total de 253 marcadores moleculares en un rango de 50 a 300 pb, de los cuales 200 fragmentos fueron polimórficos lo que representa un 79 % de polimorfismo total. En la tabla 8 se muestra la proporción de polimorfismos para cada cruza en forma individual.
Tabla 8. Proporción de polimorfismos obtenidos de cruzas intraespecíficas e interespecíficas
Cruzas Marcadores Marcadores Proporción de obtenidos polimórficos polimorfismo (%) At5 ×At3 234 149 64 At3 × At5 234 144 62 At5 × At4 247 138 56 At5 × Aa 252 157 62 At3 × Aa 251 172 69 Global 253 200 79
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En la cruza At5 × At3 como en su inversa At3 × At5 el nivel de polimorfismo fue muy similar, lo que sugiere que a nivel genético la relación directa o inversa de las cruzas no altera el nivel de polimorfismo. En las dos cruzas interespecíficas el nivel de polimorfismo que presentan son similares.
El dendrograma obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de similaridad Sokal y Sneath 1 (figura 19), nos muestra el agrupamiento de las cruzas intraespecificas (grupo A) formando 2 subgrupos en las cuales se encuentran las cruzas intraespecificas realizadas en diferentes sentidos y por otro lado, las cruzas interespecificas (grupo B) (figura 19). El análisis de remuestreo bootstrap, en el cual se realizaron 1000 replicas, nos indica el nivel de confianza en cada nodo o agrupamiento, presentando valores mayores a 50 en los nodos A y B (figura 19). Del mismo modo en el dendrograma obtenido con el programa NTSYS 2.0 utilizando el índice de similitud Simple Matching se puede ver claramente la formación de dos grupos, en los cuales se encuentran las cruzas intraespecificas (grupo A) que al igual que en el anterior programa, forma a su vez 2 subgrupos que agrupan las cruzas intraespecificas en los diferentes sentidos realizados, mientras las cruzas interespecificas (grupo B) forma una sola agrupación sin distinguir la procedencia del progenitor materno (figura 20). Es importante mencionar, que sin importar el índice de similitud utilizado ni los diferentes programas utilizados, las distancias genéticas existentes entre los individuos analizados se mantienen, lo que también nos demuestra la verosimilitud de los datos.
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P5 P5 X P4 (3) P3 P3 X Aa (5) 72 P5 X Aa (3) P3 X P5 (1) 91 17 P5 X P4 (1) 1 33 P5 X P4 (2) 100 31 A P3 X P5 (2) 27 94 79 P3 X P5 (3) 97 P5 X P3 (1) P5 X P3 (2) 39 56 P5 X P3 (4) 80 2 P5 X P3 (3) 56 29 P5 X P3 (5) 48 P5 X Aa (1) 91 20 P3 X Aa (3) 3 P3 X Aa (1) 90 60 P3 X Aa (8) 32 B P3 X Aa (4) 27 P3 X Aa (6) 39 30 P3 X Aa (7) P3 X Aa (2) 33 P5 X Aa (2) 89 Aa P4 100 P3 X P5 (4) P5 X P4 (5)
0.7 0.8 0.9 1.0 Coeficiente de similitud
Figura 19. Dendrograma obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo bootstrap. P3, 4, 5 y Aa progenitores; P3 × P5 (1-4), P5 × P3 (1-5), P5 × P4 (1,2,3,5), P3 × Aa (1-8), P5 × Aa (1-3) progenie de las diferentes cruzas.
61
P5 X P3 (1) P5 X P3 (2) 1 P5 X P3 (4) P5 XP 3 (3) P5 X P3 (5) P3 X P5 (1) P3 X P5 (4) P3 X P5 (2) P3 X P5 (3) A 2 P5 X P4 (1) P5 X P4 (2) P5 X P4 (3) P5 X P4 (5) P5 X Aa (1) P5 X Aa (2) P3 X Aa (2) P3 X Aa (1) P3 X Aa (8) P3 X Aa (3) P3 X Aa (4) B 3 P3 X Aa (6) P3 X Aa (7) P5 X Aa (3) P4 P3 X Aa (5) P3 Aa P5 0.51 0.63 0.76 0.88 1.00 Coeficiente de similitud
Figura 20. Dendrograma obtenido con el programa de NTSYS 2.0 utilizando el índice de Simple Matching (Skroch et al., 1992).
62
5.9. Variación genética asexual de Agave tequilana Weber var. azul analizado por AFLP Como se describió anteriormente, A. tequilana es una especie que presenta reproducción sexual como asexual y esta última no sólo está dada por hijuelos de rizoma, sino también por la formación de bulbilos cuando la producción de semillas es baja. Analizamos la variabilidad genética que presentan tanto hijuelos de rizoma como bulbilos con relación a su progenitor y la variabilidad genética que presentan entre ellas por medio de marcadores moleculares tipo AFLP.
5.9.1. Hijuelos de rizoma
De los 7 hijuelos de rizoma provenientes de la planta At8, todos mostraron alto grado de variación genética con relación a su progenitor y también entre ellos. Con la combinación de cuatro oligonucleótidos obtuvimos 393 loci, de los cuales, 167 fueron polimórficos, presentando un 42% de polimorfismo y compartiendo 58% de los marcadores entre hijuelos y su progenitor.
Estos resultados sugieren que ocurren cambios a nivel genómico durante la etapa vegetativa de las plantas de agave los cuales podemos detectar en los individuos generados a través de la reproducción asexual. Estos cambios pueden ocurrir debido a mutaciones puntuales, rearreglos en el genoma, actividad de transposones y retrotranspones, entre otros. Por lo tanto, los datos de AFLP en estas condiciones son capaces de discriminar las variaciones que existen a nivel genómico entre hijuelos de rizoma provenientes de un progenitor común. Los altos valores bootstrap (>50%) en todos los nodos de las ramificaciones del dendrograma nos demuestran la consistencia de los datos, mientras los controles externos están separados de las muestras, los cuales fueron plantas de frijol como se muestra en figura 21.
63
PM8 100 H8
H4 98 H6 76 H1 54 56 100 H2 74 H10 71 H9
F3 100 F1 50 F2 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Coeficiente de similitud
Figura 21. Dendrograma de hijuelos y su progenitor obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo. PM8 (progenitor), H (hijuelos), F (control-externo).
5.9.2. Bulbilos
Este tipo de reproducción asexual está limitado a ciertas especies del género Agave, entre ellas A. tequilana. Se han observado cambios fenotípicos en algunos bulbilos obtenidos de un sólo progenitor, como la presencia de listas amarillas en hojas (figura 22), lo que sugiere eventos de mutación que ocurren en el desarrollo de brotes obtenidos por vía asexual. A nivel molecular, se obtuvieron 329 loci usando iniciadores Eco RI con 4 oligonucleótidos selectivos de los cuales 132 fueron polimórficos, alcanzando un nivel de polimorfismo del 40%. En la figura 23 se puede ver que ningún bulbilo es geneticamente idéntico a su
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progenitor y a su vez varían entre ellos. Los altos niveles de los valores bootstrap obtenidos para cada nodo nos indica la robustez del dendrograma obtenido. Los niveles de variabilidad genética comparados con los hijuelos son ligeramente menores.
Figura 22. Bulbilos de Agave tequilana mostrando lista amarilla en el envés de una hoja de un bulbilo.
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B1 100 B6
B3 84 91 B2
PM8 42 B4
50 B7 57 B15 45 C-3 60 100 C-1 98 35 C-2
B12 46 B13 0.8 0.9 1.0
Coeficiente de similitud
Figura 23. Dendrograma de bulbilos con su progenitor obtenido con el programa FreeTree utilizando el índice de Sokal y Sneath 1 (Skroch et al., 1992) con análisis de remuestreo. PM8 (progenitor), B (bulbilos), C (control).
Los resultados obtenidos con los bulbilos confirman la ocurrencia de cambios genéticos durante la etapa vegetativa en Agave. Basados en reportes recientes (Bousios, et al., 2007) sobre la presencia de retrotransposones en diferentes variedades de A. tequilana y también en otras especies de Agave, se investigó la posibilidad de que la actividad de retrotransposones pudiera ser al menos en parte responsable de la variabilidad observada en plantas reproducidas asexualmente. Para ello, analizamos bulbilos de la planta At8 por
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medio de diferentes marcadores moleculares que se basan en retrotransposones, como IRAP y SSAP.
5.10. Análisis por marcadores moleculares tipo IRAP
Por medio de esta técnica utilizando oligonucleótidos específicos para retrotransposones pudimos generar múltiples fragmentos aledaños a retrotransposones de ADN genómico tanto en bulbilos como en hijuelos de A. tequilana. Los fragmentos amplificados se encuentran en un rango comprendido entre 500 pb y 2 kb (figura 24).
B2 B3 B7 B12 H1 H4 H6 H7 H8 M
1Kb
Figura 24. Productos de amplificación obtenidos por IRAP-PCR de bulbilos e hijuelos de Agave tequilana usando el primer 3´LTR de cebada. B (bulbilos), H (hijuelos), M (marcador de peso molecular de 1Kb)
El patrón de amplificación por esta técnica, no detectó polimorfismo ni entre hijuelos de rizoma ni entre bulbilos; sin embargo, la amplificación de secuencias de ADN aledañas a retrotransposones nos indica la presencia de retrotransposones tipo copia Ty1 en Agave. Para identificar el tipo de secuencias que se encuentran contiguas a los retrotransposones, se
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clonaron 10 secuencias de diferentes tamaños, las cuales se pueden ver en la figura 25. Las secuencias clonadas se encuentran entre 700 pb y 1 kb. De estas se escogieron 10 secuencias en base a su tamaño las cuales se mandaron a secuenciar y posteriormente se realizaron los análisis bioinformáticos. El alineamiento multiple realizado con las secuencias escogidas no presentó identidad entre ellas lo cual nos confirma que las secuencias escogidas todas son diferentes y que los retrotransposones se encuentran insertados en diferentes regiones del genoma.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1.6K 1Kb b 500p b
M 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1.6K b 1Kb 500pb
Figura 25. Clonación de productos de amplificación generados por IRAP-PCR
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Al realizar BLAST a nucleótidos de cada secuencia a la base de datos del NCBI, se encontró secuencias con altos porcentajes de identidad, en la tabla 9 se muestra las mejores correlaciones de cada BLAST con valores esperados menores a e-5 lo cual nos muestra identidad altamente significativa. Del mismo modo, se realizaron BLAST a proteínas sin encontrar identidades significativas, lo que nos sugiere que los retrotransposones analizados se encuentran insertados en regiones no codificantes.
Tabla 9. Tamaños de secuencias clonadas y primera correlación de BLAST a nucleótidos realizado en la base de datos del NCBI.
Nombre Tamaño Secuencia Valor E
Dany1 831 pb Secuencia genómica de Mus musculus, cromosoma 17 2e-21
Dany2 1026 pb Clon VV78X109580.4 de Vitis vinifera, 2e-34
Dany3 679 pb Sin hit significativo
Dany4 739 pb Transposon Rim2-M325 de Oryza sativa 0.056
Dany5 843 pb Clon VV78X015273.10 de Vitis vinifera 2e-08
Dany6 895 pb Clon POPOO6-NO1 de Populus trichocarpa 6e-53
Dany7 726 pb Hordeum vulgare subsp. vulgare clone BAC 673I14 2e-3
Dany8 724 pb Hordeum vulgare subsp. vulgare clone BAC 635P2 chromosome 5H 1e-6
Dany9 862 pb Sin hit significativo
Dany10 824 pb Sin hit significativo
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5.11. Análisis genético por marcadores moleculares tipo SSAP
El perfil de bandeo generado por SSAP dio un patrón con elevado polimorfismo. Se obtuvieron marcadores desde 50 pb hasta 530 pb, mientras que con sólo una combinación de oligonucleótidos se obtuvieron un total de 55 marcadores lo que indica que estos elementos están en un alto número de copias, Sin embargo, también se puede observar que varios marcadores están siendo compartidos entre todos los bulbilos, lo que sugiere que estos elementos móviles se heredan de generación en generación; por lo tanto, los bulbilos comparten elementos móviles con su antecesor. Por otro lado, también se puede observar marcadores que sólo se encuentran en bulbilos y no en su progenitor, lo que sugiere que estos se activan en el proceso de formación de cada bulbilo. (figura 26).
Por el perfil generado en los SSAP podemos afirmar que los retrotransposones del tipo copia Ty1 se encuentran en un alto número de copias por el polimorfismo insercional que generaron y que están distribuidos ampliamente en el genoma de A.tequilana. Sin embargo las inconsistencias entre las repeticiones de las muestras no permitieron llegar a unas conclusiones definitivas sobre la variabilidad entre bulbilos y su antecesor.
Con estos resultados se demostró la presencia de retrotransposones del tipo copia Ty1 que probablemente se encuentran activos en el genoma de A. tequilana e incrementan su actividad en el proceso reproductivo asexual asegurando de esta manera su reproducción y la variabilidad genética requerida para adaptarse al medio ambiente árido donde se desarrollan.
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M P P B1 B1 B2 B2 B3 B3 B4 B4 B5 B5 565 500 530 + 460
400 + * 364 350
300 - 255 -
204 200 + + 145
100
50 -
Figura 26. Gel de poliacrilamida mostrando los productos de amplificación generados por SSAP en bulbilos de Agave tequilana. M. marcador de peso molecular, P progenitores, B bulbilos. (*)indica marcadores en bulbilos y no en su progenitor. (+) indica marcadores tanto en bulbilos como en su progenitor. (-) indica polimorfismo entre bulbilos.
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5.12. Elementos transponibles en la base de datos de Agave.
En la base de datos de EST de Agave se encontraron diferentes tipos de elementos transponibles como transposones y diferentes clases de retrotransposones con valores esperados tan bajos de hasta e-97, lo que significa que los transcritos tienen muy alta significancia. Este dato confirma la presencia de transposones y retrotransposones activos en el genoma de agave que se encuentran expresando al menos algunos genes de estos elementos en los diferentes órganos de la planta como hojas, tallos, raíz, bulbilos, meristemos, anteras y ovarios (tabla 10). Se encontró un total de 24 secuencias con similitud a retrotransposones de un total de 23 825 EST. La relación por el tipo de tejido se puede ver en la tabla 11.
Tabla 10. Secuencias encontradas en la base de datos de Agave con similitud significativa a retrotransposones.
Nombre de la Hit Hit_nombre secuencia esperado gi|34334112|gb|AY357214.1| Cucumis melo mitochondrial ajswinirp015_e08 1e-97 Ty1/copia retrotransposon pol polyprotein pseudogene ajswinirp002_c11 1e-45 At2g19830 copia-like retroelement pol polyprotein gi|21553484|gb|AAM62577.1| copia-like retroelement pol ajswinirp023_e02 5e-13 polyprotein [Arabidopsis thaliana] gi|9294088|dbj|BAB01940.1| non-LTR retrolelement reverse aamhmqmeq010_b01 3e-05 transcriptase-like protein [Arabidopsis thaliana] gi|10998138|dbj|BAB03109.1| retroelement pol polyprotein [Arabidopsis thaliana] gi|12322008|gb|AAG51046.1| aamhmqmeq007_c23 1e-58 gypsy/Ty-3 retroelement polyprotein; 69905-74404 [Arabidopsis thaliana] gi|46200512|gb|AF466200.2| putative non-LTR retroelement ajswininm007_h03 4e-4 reverse transcriptase ajswnvnov005_c03 5e-34 gi|48209910|gb|AAT40504.1| putative polyprotein [Solanum
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demissum] gi|31431495|gb|AAP53268.1| putative 22 kDa kafirin ajswnvnov006_e07 3e-06 cluster; Ty3-Gypsy type [Oryza sativa (japonica cultivar- group)] gi|21594892|gb|AAM66053.1| copia-like retroelement pol aamhhphoc002_i15 2e-43 polyprotein [Arabidopsis thaliana] gi|18390096|gb|AF466199.1 putative copia polyprotein| aamhhphoc022_d08 3e-14
gi|21594892|gb|AAM66053.1| copia-like retroelement pol aamhhphoc032_l23 1e-40 polyprotein [Arabidopsis thaliana] gi|21594892|gb|AAM66053.1| copia-like retroelement pol aamhhphoc032_l19 1e-40 polyprotein [Arabidopsis thaliana] gi|18568260|gb|AF466646.1| Zea mays putative polyprotein, aamhhphoc032_l07 3e-08 putative retrotransposon protein gi|48209910|gb|AAT40504.1| putative polyprotein [Solanum ajswflant008_a10 1e-32 demissum] gi|55168096|gb|AAV43964.1| putative polyprotein [Oryza aamhflovo005_a01 3e-63 sativa (japonica cultivar-group)] TR:Q9SJC1 Q9SJC1 putative retroelement pol polyprotein, aamhflovo003_p23 2.6e-2 mARN sequence aamhflovo006_j14 3e-31 gi|18390096|gb|AF466199.1| putative GAG-POL precursor. gi|4755191|gb|AAD29058.1| putative non-LTR retroelement aamhflovo006_e09 1e-02 reverse transcriptase [Arabidopsis thaliana] gi|9755737|emb|CAC01849.1| telomerase reverse ajswble01018_a08 9e-23 transcriptase [Arabidopsis thaliana] gi|27901709|gb|AAO26690.1| gag-pol polyprotein [Vitis ajswble02011_d04 2e-17 vinifera] gi|60920257|gb|AAX37310.1| polyprotein [Verbena ajswble02011_b10 4e-27 canadensis potyvirus MA-2005] aamhhppib014_e05 1e-05 gi|46200512|gb|AF466200.2| putative non-LTR retroelement
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reverse transcriptase gi|478218|pir||G47759 retrovirus-related reverse aamhhppib018_k15 2e-03 transcriptase homolog - maize retrotransposon copia-like (fragment) gi|168449|gb|AAA33449.1| reverse transcriptase gi|31430568|gb|AAP52462.1| putative gag-pol polyprotein aamhraraz019_f02 1e-05 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
Como se puede ver en la tabla 11, las secuencias que dieron similitud significativa a retrotransposones provienen de diferentes tejidos, encontrándose en mayor proporción en hoja, lo que sugiere que los retrotransposones se están transcribiendo activamente a lo largo del desarrollo de las plantas. La presencia de retrotransposones en alta proporción en piña y ovarios también sugiere que estos elementos se encuentran en zonas de crecimiento y diferenciación y pudieran estar jugando algún rol en el desarrollo y diferenciación de tejidos.
Tabla 11. Proporción de secuencias en diferentes tejidos de A. tequilana que dieron similitud a retrotransposones.
Tejido Cantidad Nº total de secuencias Proporción (%) Meristemo 8 7337 0.10 Hojas 5 3353 0.15 Ovarios 4 3400 0.11 Anteras 1 1966 0.05 Bulbilos 3 4035 0.074 Piña 2 1763 0.11 Raíz 1 1971 0.05 Total 24 23825 0.10
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Otros elementos móviles que se encuentran activos en el genoma de A. tequilana son los transposones, los cuales fueron también identificados en la base de datos de EST y que presentan similitudes altamente significativas que van de 1e-155 a 3e-8. En la tabla 12 se muestra la relación en la que se encuentran estos elementos. Al igual que los retrotransposones, los genes de los transposones se encuentran expresados en todos los tejidos y están más representados en el meristemo. De las 12 secuencias encontradas, 4 se encuentran en el meristemo apical en estado de inmadurez sin señales de inicio de emergencia de la estructura floral, con un porcentaje de 0.23, el más elevado de todos los tejidos. Esto sugiere que durante el desarrollo de las hojas los transposones están activos y las mutaciones que causan pueden fijarse y pasar a la descendencia.
Tabla 12. Secuencias encontradas en la base de datos de Agave con similitud significativa a transposones.
Nombre de la Hit Nombre del hit secuencia esperado gi|5738083|gb|AF162223.1| Shigella flexneri transposon ajswininm011_g08 1e-155 Tn10 ajswininm005_h10 3e-88 gi|57434477|emb|CAI43894.1| transposase for IS10 gi|10957274|ref|NP_058298.1| IS10 transposase ajswininm008_c04 6e-85 [Salmonella typhi] gi|6175165|gb|AAF04891.1| Mutator-like transposase aamhraraz001_e09 3e-84 [Arabidopsis thaliana] gi|20465953|gb|AAM20162.1| putative mutator ajswble02012_e01 9e-79 transposase [Arabidopsis thaliana] gi|6175165|gb|AAF04891.1| Mutator-like transposase ajswflant002_f08 1e-58 [Arabidopsis thaliana] gi|6175165|gb|AAF04891.1| Mutator-like transposase ajswble01011_d01 1e-42 [Arabidopsis thaliana] gi|50918347|ref|XP_469570.1| putative transposase aamhhppib022_e06 1e-39 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|50918347|ref|XP_469570.1| putative transposase ajswininm003_e08 3e-27 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|50920375|ref|XP_470548.1| Putative transposase aamhhphoc020_h08 3e-18 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]
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gi|31433604|gb|AAP55096.1| putative transposase [Oryza aamhflovo005_c19 3e-17 sativa (japonica cultivar-group)] gi|18568260|gb|AF466646.1| Zea mays clone aamhhphoc032_l07 3e-08 ZMMBBb_Z195D10 putative transposase gene,
Por otro lado, en la base de datos de agave se encontró 2 secuencias que dieron similitud a proteínas codificadas por helitrones, como replicasa/helicasa/endonucleasa que sirven para la replicación por círculo rodante. En el primer caso, el transcrito se encuentra en el meristemo con el nombre de (aamhmqmeq003o04) y tiene un valor esperado de 4e-11, lo que significa que es significativo; el segundo transcrito se encuentra en piña designado como (aamhhppib026_p06) con un valor esperado no significativo de 6.6.
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6. DISCUSIÓN
Para discutir más ampliamente los resultados de este trabajo, se dividió la discusión en cinco partes: 1) Producción de frutos y semillas bajo diferentes eventos de polinización en Agave tequilana y Agave americana. 2) Análisis histológico del desarrollo de los gametos. 3) Análisis por citometría de flujo. 4) Niveles de variación genética sexual y asexual de Agave tequilana. 5) Análisis de transposones en Agave tequilana
6.1. Producción de frutos y semillas bajo diferentes eventos de polinización en Agave tequilana y Agave americana.
El género Agave tiene mecanismos de reproducción tan complejos que varían de especie a especie y que fueron evolucionando para adaptarse a las condiciones del medio ambiente donde se desarrollan. De esta manera muchas especies tienen reproducción sexual y asexual incluyendo a A. tequilana y A. americana. En general, los resultados del desarrollo de frutos y semillas en las flores de polinización abierta están dentro del rango reportado para otras especies de Agave, (Arizaga et al., 2000a, b; Molina- Freaner y Eguiarte, 2003; Rocha et al., 2005).
Como ha sido reportado para otras especies de Agave (Sutherland, 1987; Arrizaga et al., 2000a, b) las plantas de A. tequilana y A. americana analizadas en este estudio produjeron un número de flores mucho más grande que frutos cuando las flores fueron polinizadas en forma natural. Sutherland (1987) sugirió, basado en estudios en A. mckelveyana, que esta situación permite un incremento en las formas masculinas y que el exceso de flores contribuye a la producción y dispersión de polen, pero no a la producción de frutos maduros (una indicación de formas femeninas) lo cual ocurre también en A. tequilana y A. americana al haber un exceso de flores comparado con la cantidad de frutos producidos. Los porcentajes de frutos producidos por polinización natural fueron bajos comparados con estudios realizados en A. angustifolia (Molina-Freaner y Eguiarte, 2003) donde se reportan porcentajes entre el 20 y el 34 %. La baja producción de frutos pudiera deberse a varios
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factores, tales como la carencia de polinizadores (Slauson, 2000), errores durante el desarrollo de los gametos o durante la fertilización. Sin embargo, durante la realización de las polinizaciones manuales se observaron colibríes y una variedad de insectos como abejas, abejorros y avispas que visitan las flores durante el día. Además, los murciélagos son comunes en el área de estudio durante la noche. Por lo tanto, debido a que en las polinizaciones naturales la formación de frutos fue mayor que en las polinizaciones controladas descartamos la carencia de polinizadores efectivos. Estos bajos porcentajes en la formación de frutos en polinizaciones controladas se debieron principalmente a que éstas fueron realizadas sólo una vez durante la mañana, debido a la inaccesibilidad a las inflorescencias.
Los porcentajes de frutos obtenidos en las cruzas intraespecíficas de A. tequilana (tabla 3 y 4) son similares a los observados en cruzas reportadas para A. macroacantha tanto para frutos generados por cruzas entre diferentes plantas como por autofecundación donde se reportan valores muy bajos del 1.6% (Arizaga y Ezcurra, 2002). Aquí se reporta 6.6% para A. tequilana y 4.2% para A. americana, lo que sugiere que las dos especies estudiadas en este trabajo sufren de depresión por endogamia y el éxito reproductivo sexual se da por entrecruzamientos.
Previos reportes consideraron a las semillas negras equivalentes a semillas fértiles y el fenómeno de semillas vacías o semillas sin embrión no ha sido reportado previamente para otras especies de Agave, aunque Trame et al. (1995) mostraron una reducción de alrededor de 40 a 50% entre el número de semillas maduras por fruto y el número promedio de semillas germinadas por flor polinizada en A. schottii. Por lo tanto es posible que un fenómeno similar esté también ocurriendo en esta especie.
Dos de las plantas autopolinizadas de A. tequilana no produgieron frutos y por lo tanto semillas, mientras que las autofecundaciones de las plantas At5 y Aa produjeron muy pocos frutos y semillas. Estos resultados son similares a los reportados por Molina-Freaner y Eguiarte (2003) donde ningún fruto ni semillas fueron obtenidas de autopolinización manual de plantas de A. angustifolia y A. subsimplex. Por otro lado, Rocha et al. (2005) reportaron
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bajos niveles de producción de frutos por autopolinización en A. striata y Agave sp., sugiriendo que A. tequilana y A. americana se favorece la polinización cruzada. Una explicación para los bajos niveles de producción de frutos y semillas es el efecto de endogamia, donde alelos recesivos pueden tener efectos deletéreos tempranos, generando abortos después de la fertilización. En general encontramos una relación inversa entre el número de semillas por fruto y el número de semillas capaces de germinar, sugiriendo que el desarrollo del embrión puede estar afectado en etapas tempranas del desarrollo (semillas vacías), pero también se observa en muchos casos semillas con embriones aparentemente normales incapaces de germinar (semillas inviables).
Es posible que también existan efectos de endogamia entre las plantas At3, At4 y At5 aún en entrecruzamientos debido a que estas plantas fueron obtenidas de la misma plantación comercial y consecuentemente están estrechamente relacionadas geneticamente (Gil- Vega et al. 2001, 2006). Esto puede ser un problema generalizado para A. tequilana debido a que esta especie es propagada exclusivamente en forma asexual y distribuida masivamente en todas las plantaciones comerciales, y esto puede contribuir a reducir la fertilidad bajo condiciones naturales.
Por lo tanto, la generación de cruzas entre diferentes cultivares de A. tequilana puede contribuir a mejorar el nivel de fertilidad y ayudar a mantener una base genética más amplia del germoplasma. Sin embargo, para que estos germoplasmas sean comercialmente aceptados, la restricción al uso solo de A. tequilana Weber var. azul para la producción del tequila debe de ser reconsiderada.
Tanto A. tequilana como A. americana tienen un complemento cromosómico diploide de 2n = 2x = 60 (Castorena et al., 1991; Granados, 1993; Palomino et al., 2003). Anteriormente, se reportó al menos un híbrido producido manualmente entre A. amaniensis y A. angustifolia (Lock, 1962; Boulanger, 1985). Sin embargo, poco se conoce acerca de la hibridación entre especies en el género Agave bajo condiciones naturales. Los resultados presentados aquí indican claramente que las cruzas entre A. tequilana y A. americana pueden ocurrir y
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producir progenie viable, confirmado tanto por el fenotipo de la progenie como por marcadores moleculares tipo AFLP. La hibridación inter-específica es otra opción para incrementar la variabilidad genética de A. tequilana aunque implica implementar programas de mejoramiento a largo plazo para desarrollar plantas comercialmente y legalmente aceptables bajo la norma. Estos resultados también sugieren que es necesario monitorear fenotípicamente a plantas obtenidas de A. tequilana polinizadas naturalmente en el campo.
En la cruza At × Aa, donde At es el progenitor femenino, se produjeron más semillas negras que en la cruza At × At, muy poco de estas semillas fueron viables, sugiriendo que aunque la fertilización en las cruzas inter-específicas es relativamente más eficiente, el desarrollo del embrión es pobre. Las cruzas que presentan a Aa como progenitor femenino son menos fértiles que las cruzas que tienen alguna planta de A. tequilana como progenitor femenino, produciendo los niveles más bajos de frutos y semillas por fruto. Estos resultados sugieren que alguna forma de incompatibilidad genética puede afectar el desarrollo de frutos y la producción de semillas tanto en cruzas intra como interespecíficas. La presencia de una alta proporción de semillas vacías aparentemente normales, sugiere que otros factores tales como la formación de gametos inviables pueden también contribuir a los bajos niveles de fertilidad.
Como ha sido documentado en otros taxa (Haga y Channell, 1982; Saunders y Sipes, 2006) las semillas arrugadas y blancas encontradas en los frutos de A. tequilana y las semillas blancas encontradas en los frutos de A. americana probablemente corresponden a óvulos los cuales no fueron fertilizados, mientras que las semillas negras podrían corresponder a óvulos fertilizados. Por otro lado las semillas negras pero vacías pueden corresponder a óvulos los cuales fueron fertilizados exitosamente pero los cuales abortaron en estados de desarrollo muy tempranos. Una posible explicación para que ocurra esto, puede ser la fertilización de óvulos por células espermáticas provenientes de granos de polen anormales. Los ensayos de germinación de los granos de polen in vitro indican que la proporción de granos de polen capaces de producir tubos polínicos no discrimina si las células dentro del tubo germinativo son viables o no. Ruvalcaba-Ruiz y Rodríguez-Garay (2002), reportaron que errores en las
80
divisiones meióticas durante la formación de los granos de polen son comunes para A. tequilana, donde arriba del 42% de los granos producidos son deformes. Por otro lado, Piven et al. (2001) reportaron arriba del 66.4% de granos defectuosos para A. fourcroydes una especie pentaploide. Es posible que una cierta proporción de granos aparentemente viables puedan contener aberraciones cromosómicas menos severas las cuales pueden producir problemas durante las subsecuentes mitosis para formar las células espermáticas o en la fertilización, trayendo consigo problemas en estados tempranos de desarrollo. Estas observaciones pueden en parte explicar los bajos niveles de viabilidad de los granos de polen determinados en este trabajo por medio de la germinación in vitro del polen descritos para A. tequilana el cual sólo alcanzó el 36% comparados con el 58% observados por Ruvalcaba- Ruíz y Rodríguez- Garay (2002).
En este estudio una proporción más alta de granos de polen de A. americana lograron germinar en comparación a A. tequilana indicando la presencia de más granos viables para esta especie. Esto también correlaciona con las observaciones de los bajos niveles de semillas vacías encontradas en todos los regímenes de polinización donde A. americana fungía como progenitor paterno. Por el contrario, cuando los granos de polen A. tequilana fueron usados como progenitor paterno, proporciones más altas de semillas vacías fueron encontradas.
La escarificación de las semillas incrementó la eficiencia de germinación tanto para A. tequilana como para A. americana. Peña-Valdivia et al. (2006) reportaron que la escarificación de las semillas en A. salmiana aceleraba su germinación. Sin embargo, una base biológica para la necesidad de escarificación bajo condiciones naturales no está clara. Las semillas de la mayoría de las especies de Agave son normalmente dispersadas por el viento cuando las cápsulas se abren.
6.2. Análisis histológico del desarrollo de los gametos en A. tequilana y A. americana.
Existen muy pocas especies en las cuales se han realizado estudios a nivel histológico en el género Agave. Este es el primer reporte sobre el desarrollo del gametofito femenino como
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masculino en A. tequilana y A. americana. Nuestros resultados demuestran que el desarrollo del gametófito femenino en A. tequilana y A. americana es de tipo Polygonum monospórico, siendo la megaspora funcional, que se encuentra en la zona calazal, la que da origen al saco embrionario. Piven et al. (2001) en un estudio similar realizado en A. fourcroydes y A. angustifolia reportan que el desarrollo del gametofito femenino en esta especie es del tipo bispórico tipo Allium y que el gametofito femenino en henequén desarrolla directamente de dos megasporas viables. Sin embargo, de acuerdo con Dahlgren, Clifford y Yeo (1985) los cuales indican que el gametofito femenino de la familia Agavaceae es generado de una sóla megaspora funcional tipo Polygonum, los resultados presentados en este trabajo indican que al menos A. tequilana y A. americana confirman esta aseveración. Por lo tanto, es necesario realizar más estudios de este tipo en diferentes especies para confirmar si toda la familia Agavaceae presenta la misma estrategia en el desarrollo del gametofito femenino.
Piven et al. (2001) también reportan fallas en la meiosis, lo que conduce a la formación de megasporas abortivas con un balance de cromosomas anormal, dando como consecuencia la formación de sacos embrionarios vacíos. Un evento similar pudiera estar pasando en A. tequilana debido a la presencia de óvulos sin sacos embrionarios (figura 8g), y por lo tanto contribuyendo a los bajos niveles de fertilidad de las semillas. Sin embargo, no existe ningúna información detallada sobre la ocurrencia de aberraciones meióticas femeninas en el género Agave.
El desarrollo del saco embrionario en A. tequilana y A. americana termina con la formación de siete células las cuales se encuentran ubicadas de la siguiente manera: en la zona micropilar se encuentran 2 sinérgidas y la célula huevo, y en la zona calazal 3 antípodas y la célula central. También es importante mencionar la presencia de tubos polínicos en la zona micropilar de los óvulos, lo que nos sugiere fuertemente que las células espermáticas son depositadas en el interior del saco embrionario. Sin embargo, esto no garantiza la fecundación y el desarrollo del embrión y del endospermo.
Por otra parte, el desarrollo del gametofito masculino, tanto en A. tequilana como en A. americana, presentan la misma estrategia de desarrollo que la reportada para A. fourcroydes,
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del tipo sucesivo, las cuales darán origen a granos de polen con exina reticulada. Sin embargo, las descripciones de la anatomía de los granos de polen reportados en este trabajo contrastan con reportes previos (Ojeda 1995). El polen para el grupo Rigidae del subgénero Agave al cual A. tequilana pertenece, se describe como monosulcado con la presencia de sólo un sulco. Sin embargo, observaciones en este trabajo muestran una abertura disulcada. Sin embargo, estudios realizados por Ludlow-Wiechers y Ojeda (1983) reportan diversos tipos de variaciones en la apertura de A. fourcroydes, A. sisalana y A. angustifolia donde se observan granos de polen disuldados, estas especies también pertenecen al grupo Rigidae y son las que forman bulbilos.
Bajo estas condiciones, aunque la mayor parte del desarrollo de los granos de polen se ve aparentemente normal, éstos mostraron bajos niveles de germinación in vitro para A. tequilana (del 36%), lo que sugiere la existencia de aberraciones cromosómicas ocurridas durante las divisiones celulares. Estas mismas observaciones fueron reportadas por Ruvalcaba y Rodríguez (2002) en A. tequilana. Por lo tanto, la inviabilidad de los granos de polen en A. tequilana es la principal limitante para obtener semillas y frutos en esta especie de importancia comercial.
En contraste los granos de polen de A. americana alcanzaron el 79% de viabilidad, lo que se vió reflejado también en los altos niveles de viabilidad de sus semillas (>80% en polinización abierta), encontrando una correlación positiva entre la viabilidad de los granos de polen y la viabilidad de las semillas tanto en A. tequilana como A. americana.
Aunque la germinación in vitro no reproduce exactamente las condiciones in vivo, creemos que esto puede servir como una herramienta útil para medir la calidad del polen (viabilidad) en otras especies del género Agave.
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6.3. Análisis del contenido de ADN de A. tequilana.
La importancia de realizar un análisis del contenido de ADN por citometría de flujo en A. tequilana fue principalmente para confirmar el nivel de ploidía y también para buscar diferencias cuantitativas de ADN entre plantas de A. tequilana de un campo de cultivo.
En general, existen pocos estudios que demuestran el nivel de ploídia que presenta A. tequilana, siendo estos contradictorios, debido principalmente a la estructura bimodal de sus cromosomas con 5 cromosomas grandes y 25 pequeños, lo que dificulta un estudio preciso de éstos. El primer reporte realizado por Banerjee y Sharma en (1987) indica que esta especie es triploide con 2n = 3x = 90. Cavallini et al. (1996) encontraron un número de cromosomas diploide 2n = 2x = 60, estando éstos de acuerdo con un trabajo previo realizado por Castorena-Sánchez et al. (1991). Los resultados presentados en este trabajo confirman que A. tequilana es una especie diploide (2n = 2x = 60) y que el contenido de su ADN genómico no presenta diferencias significativas en relación a otras plantas de A. tequilana que se encuentran en el mismo campo de cultivo al igual que lo reportado por Palomino et al. (2003). Por otra parte, también existe poca información disponible sobre el tamaño del genoma nuclear. Según Cavallini et al. (1996) las plantas diploides presentaron un contenido de ADN para 2C de 7.43 pg. Una estimación similar de 8.8 pg fue reportado para plantas triploides (Banerjee y Sharma, 1987). En este trabajo reportamos en promedio el contenido de ADN para A. tequilana de 8.31 pg; resultados similares fueron reportados en un estudio previo por Palomino et al. (2003). También se estimó el tamaño de su genoma que es en promedio de 4077 Mpb. La resolución de la carencia de información básica, como el número de cromosomas y el tamaño de ADN nuclear, son indispensables para desarrollar programas encaminados al mejoramiento de la diversidad genética en estas especies con reproducción exclusivamente asexual que pueden reproducirse también sexualmente.
Es importante mencionar, que por este método no es posible identificar diferencias a nivel estructural en el ADN de una planta como variaciones genéticas o mutaciones que podrían existir en el genoma de una población. Sin embargo, esta técnica es utilizada para diversas
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aplicaciones, la más utilizada siendo para determinar el nivel de ploidía, análisis del contenido de ADN, estimación del tamaño del genoma (Palomino et al., 2003) y, últimamente, para medir la expresión de GFP en células de plantas individuales (Halweg et al., 2005).
6.4. Variación genética sexual y asexual de A. tequilana.
En años recientes, se han reportado varios estudios sobre la diversidad genética en diferentes especies del género Agave. Tal es el caso de A. lechuguilla, una especie que crece en forma silvestre y cuya variabilidad genética dentro de sus poblaciónes es alta y está estrechamente correlacionada con la variación de las características florales y la visita de polinizadores (Silva-Montellano y Eguiarte, 2003). De manera similarmente, altos niveles de variación genética fueron reportados en A. victoriae-reginae una especie endémica del norte de México (Martinez-Palacios et al. 1999). Es importante mencionar que estas especies se reproducen principalmente por semillas. En el presente trabajo se analizó la variabilidad genética en A. tequilana, una especie domesticada que presenta reproducción sexual como asexual. La estimación de la variabilidad genética sexual se realizó en la progenie obtenida tanto de polinización abierta como de cruzas intra-específicas e inter-especificas. Al igual que en estudios previos, el nivel de variabilidad genética obtenido en la progenie de polinización abierta fue del 67% de polimorfismo; sin embargo, no alcanza los niveles de variabilidad genética encontrados en las especies silvestres mencionadas, probablemente debido a la cercanía genética entre los progenitores, los cuales fueron recolectados en un mismo campo de cultivo, donde las plantas son multiplicadas exclusivamente por reproducción asexual. Sin embargo, realizando el análisis genético de los progenitores, éstos no fueron idénticos ya que presentaron variabilidad genética, lo que sugiere que estas plantas, generaron variaciones por medio de mutaciones, las cuales se ven reflejadas en el perfil de AFLP y abre la posibilidad de adaptación a las condiciones medio ambientales en las cuales se desarrollan los agaves.
Esto contrasta con los altos niveles de variabilidad genética presentados en especies silvestres y que tienen éxito con la reproducción sexual (Silva-Montellano y Eguiarte, 2003).
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El moderado polimorfismo presente en la progenie de origen sexual de At nos indica que existe poco flujo genético debido principalmente al alto grado de homocigosis presente en la población de esta especie al impedir la floración y facilitar las prácticas agronómicas de cortar el eje floral para concentrar los azúcares en el tallo y evitar la muerte de la planta hasta la jima (eliminación de las hojas y cosecha de piñas). En este trabajo se demostró que A. tequilana puede reproducirse en forma sexual y puede obtenerse progenie viable generando variación genética y de esta manera incrementar los bajos niveles de variación reportados por Gil-Vega et al. (2001) en un campo de cultivo.
Por otra parte, la variabilidad genética sexual encontrada tanto en cruzas intra-específicas como inter-específicas es similar, lo que sugiere que A. tequilana sufre depresión por cruzamientos porque las plantas utilizadas para las cruzas intraespecificas crecieron en una proximidad espacial muy estrecha, por lo que seguramente son plantas genéticamente similares. En un estudio similar realizado en A. schottii, Trame et al. (1995) demostraron que la progenie proveniente de las cruzas con plantas muy cercanas, tiende a disminuir la eficiencia en desarrollar semillas y frutos y en la variabilidad genética. Un fenómeno similar pudiera estar pasando con A. tequilana ya que las plantas utilizadas para las cruzas por el tipo de reproducción que presenta (asexual) son genéticamente similares, y por lo tanto tienden a conservar su estructura genética. Proponemos que las plantas de A. tequilana van generando su variabilidad genética a medida que desarrollan y con el transcurso de los años van acumulando mutaciones que son fijadas y transmitidas a las siguientes generaciones. En este trabajo, la progenie analizada fueron plántulas con 2 a 3 hojas con poco tiempo de desarrollo, por lo tanto sólo observamos variación debida a recombinaciones, mientras que en plantas adultas existe mayor grado de variación por las posibles mutaciones y/o rearreglos generados en el transcurso de su existencia que generalmente se extiende de 6 a 8 años.
La progenie de las cruzas inter-especificas interesantemente tiene los mismos niveles de variación genética que las cruzas intra-especificas y la que resultó de la polinización abierta, lo que significa que aun habiendo intercambio genético con otra especie no se aumenta
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significativamente la variabilidad genética, probablemente debido a la estructura genética estrecha que tienen y al bajo nivel de recombinación.
En contraste, en el análisis genético de la reproducción asexual de A. tequilana se encontró altos niveles de variación, 40% de polimorfismo en el caso de bulbilos y 42% para hijuelos de rizoma. Estos niveles de variación en bulbilos pueden haberse generado durante el desarrollo, cuando la planta progenitora cambia el tipo de desarrollo de frutos y semillas por bulbilos, esto ocurre cuando las flores no son polinizadas o son cortadas antes de ser polinizadas, entonces comienza el desarrollo de bulbilos a partir de meristemos ubicados en los pedúnculos flores, este cambio del tipo de desarrollo ocurre en un lapso de tiempo relativamente corto el cual puede no estar bien regulado. De igual forma, el nivel de estrés que presenta la planta induce la activación de retrotransposones que se encuentran distribuidos en todos los tejidos (Bousios et al., 2007) generando mutaciones y causando cambios fenotípicos como aparición de listas amarillas en los bordes de las hojas o formación de estructuras florales en bulbilos poco desarrollados.
En el caso de hijuelos de rizoma, el nivel de variación genética que presenta este género ha sido reportado para especies como A. fourcroydes donde los niveles de variabilidad genética alcanzados entre hijuelos de rizoma de diferentes campos fue del 83%, y estudios realizados de hijuelos de la misma planta también alcanzaron altos niveles de variación con un polimorfismo del 20.67% (Infante et al., 2003). Del mismo modo, en el complejo A. deserti, también se han reportado altos niveles de variabilidad genética (Navarro-Quezada et al. 2003). De igual manera, reportamos que la reproducción asexual en A. tequilana presenta altos niveles de variación genética tanto en hijuelos de rizoma como en bulbilos; esto se explica principalmente por la pérdida de la ventaja evolutiva que le confiere la reproducción sexual, ya que ésta especie se cultiva con propagación exclusivamente asexual, creando de esta manera una estructura genética cerrada. Esta especie, por lo tanto, tienden a desarrollar mecanismos para generar variación genética y adaptarse a las condiciones medio ambientales hostiles donde crecen. Entre los mecanismos de variación genética que desarrolla esta especie muy probablemente se encuentra la activación de elementos móviles, tanto en hijuelos de rizoma como en bulbilos.
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6.5. Análisis de retrotransposones en A. tequilana.
El uso de retrotransposones como marcadores moleculares para estimar diversidad y variabilidad genética ha sido aprovechado para analizar varias especies como cebada, cítricos, banana, tomate y otros cultivos de interes agronómico por el gran polimorfismo que estos pueden generar (Bernet y Asíns, 2003; Vicient et al., 2005; Cheng et al., 2009).
En el único reporte realizado por Bousios et al. (2007) en el que se usaron retrotransposones como marcadores moleculares para estimar la diversidad genética entre variedades de A. tequilana, se demostró que estos elementos están presentes en gran cantidad en el genoma del agave y se encuentran distribuidos ampliamente. En el presente trabajo usamos retrotransposones del tipo copia Ty1 como marcadores para estudiar la variabilidad genética que existe entre bulbilos e hijuelos generados de un solo progenitor. Se estima que una planta puede generar en promedio entre 2 mil a 3 mil bulbilos dependiendo del grado de aborto de sus flores ya que dicha relación es directamente proporcional. El grado de variación genética generada en este tipo de reproducción puede ser estimada debido al alto grado de polimorfismo que generan los retrotransposones. Al igual que Bousios et al. (2007) se encontró que A. tequilana presenta retrotransposones que están activos o que posiblemente se activan durante el rápido desarrollo de los bulbilos y de los hijuelos de rizoma.
Por otro lado, la presencia de transcritos de elementos móviles en la base de datos de EST de Agave, confirma que no sólo se encuentran en el genoma de A. tequilana como elementos crípticos (inactivos) como en la mayoría de los genomas de las plantas, lo que sugiere que se están moviendo y como consecuencia de este movimiento se generan cambios en la estructura del genoma. También en la base de datos de Agave se encontró diferentes clases de elementos móviles como, transposones, retrotransposones y helitrones, todos como posibles responsables de la alta variabilidad genética encontrada en la progenie de reproducción asexual.
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Este es el primer reporte sobre el desarrollo de frutos y semillas y viabilidad de semillas en A. tequilana y A. americana. También describe por primera vez el desarrollo de los gametofitos tanto femeninos como masculinos, así como el análisis molecular de la variación genética sexual y asexual, además de evidenciar la presencia de retrotransposones como causa de variabilidad genética en reproducción asexual. Esto enfatiza la necesidad de realizar mucha más investigación básica a nivel genético y fisiológico usando como modelo una planta con un rol de gran importancia en la economía de México.
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7. CONCLUSIONES
Se logró generar híbridos por medio de cruzas inter-específicas entre A.tequilana y A. americana como cruzas intra-específicas logrando obtener semillas viables y plantas híbridas mantenidas en invernadero. La formación de híbridos en forma natural es una estrategia evolutiva y de adaptación para Agave. Sin embargo, esto puede ser explotado en especies como A. tequilana y A. americana.
Se caracterizó por medio de estudios histológicos, que el desarrollo del gametofito femenino en A. tequilana como en A. americana, es del tipo Polygonum monospórico y el desarrollo del gametofito masculino es de tipo sucesivo, con la generación de granos de polen reticulados y disulcados.
Se estimó el tamaño del genoma de A. tequilana que en promedio es de 4077 Mpb por medio de citometría de flujo y se confirmó el nivel de ploidía, siendo A. tequilana una especie diploide.
Se estimó por análisis de marcadores moleculares los diferentes niveles de polimorfismo entre plantas de reproducción sexual y asexual y se mostró polimorfismo entre plantas madre, hijuelos y bulbilos.
Se identificó la presencia de retrotransposones en el genoma de A. tequilana por medio de SSAP y determinó la posibilidad que la actividad de estos elementos podría contribuir a la variabilidad observada.
Se identificó ADNc de genes de retrotransposones y otros tipos de transposones en la base de datos de Agave, lo que confirma que estos elementos están transcripcionalmente activos y potencialmente pueden ser una de las causas más importantes de las mutaciones y rearreglos cromosómicos presentes en Agave.
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8. PERSPECTIVAS
Con el estudio de la biología reproductiva de A. tequilana y con la demostración que es posible obtener semillas viables, se puede empezar a realizar mejoramiento genético para obtener líneas más eficientes en la producción de azúcares, o con resistencia a plagas que han sido un problema importante en el cultivo de esta especie. También se pueden seleccionar plantas más precoces y de esta manera reducir el tiempo de crecimiento. Además, el mejoramiento genético asociado a marcadores moleculares puede ser útil para esta especie de interés comercial.
La generación de híbridos con otras especies abre la posibilidad de obtener líneas que tengan valor de interés agronómico. Ésto sólo ha sido realizado una vez en Tanzania con la obtención de la línea 11648 que resultó de la cruza de (A. angustifolia × A. amaniensis) que producía la fibra más resistente de todos los Agaves, la cual fue utilizada en la industria cordelera. Algo parecido puede ser realizado con A.tequilana una especie con exclusiva reproducción asexual que puede reproducirse sexualmente.
Por otro lado, es necesario realizar más estudios de este tipo en diferentes especies para confirmar si toda la familia Agavaceae presenta la misma estrategia en el desarrollo del gametofito femenino y masculino.
La presencia de un número elevado de elementos móviles activos en el genoma de A. tequilana, como transposones y retrotransposones, aun no esta clara. Sin embargo, éstos pueden estar involucrados en la generación de la variabilidad genética y jugar un rol importante en la evolución y especiación. Será interesante analizar el nivel de expresión de estos elementos móviles e identificar las zonas de expresión.
Los SSAP claramente nos muestra que los retrotransposones del tipo copia Ty1 están ampliamente distribuidos en genoma de A. tequilana y el polimorfismo insercional generado debe de ser cuantificado para tener un punto de comparación con los AFLP.
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Sería interesante también identificar otro tipo de retrotransposones como gypsy Ty3, en el genoma de Agave tequilana y estimar el número de copias, para entender mejor el impacto que estos elementos causan en el genoma de Agave.
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