LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận này, với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình thực hiện khóa luận tại trường, đặc biệt là sự giúp đỡ của các thầy cô bên bộ môn Công nghệ gen và Di truyền phân tử của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Hà V n Huân và TS i Th M i Hương đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp Đặ iệt, kh luận này nhận được sự hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nước "Xây dựng ơ sở dữ liệu mã vạch DNA (DNA barcode) cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài gỗ có giá tr kinh tế" do PGS TS Hà V n Huân làm Chủ nhiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn hân thành nhất đến thầy , gi đình, ạn bè - những người đã động viên, khích lệ tôi suốt quá trình học tập, rèn luyện và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Do trong quá trình thực hiện còn có nhiều hạn chế về mặt thời gian, kiến thức và kinh nghiệm vì vậy không tránh khỏi những thiếu sót nhất đ nh. Tôi rất mong nhận được những ý kiến đ ng g p ủa thầy cô và các bạn để khóa luận tốt nghiệp củ t i được hoàn thiện hơn Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 24 tháng 5 n m 2019 Sinh viên thực hiện

Vũ Thị Huyền Dịu

MỤC LỤC Lời cảm ơn ...... 1 MỤC LỤC ...... 2 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...... 4 DANH MỤC CÁC BẢNG ...... 6 DANH MỤC CÁC HÌNH ...... 7 ĐẶT VẤN ĐỀ ...... 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...... 2 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ...... 2 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của Tràm năm gân ...... 2 1.1.2. Đặc điểm hình thái ...... 2 1.1.3. Giá trị sử dụng ...... 3 1.2. Tổng quan về mã vạch DNA (DNA barcode)...... 4 1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA ...... 4 1.2.2. C c đặc điểm cơ ản của tr n t N arc ...... 5 1.2.3. t ố c được ử ụng tr ng ương N arc t c t ...... 7 CHƯƠNG 2: ỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 12 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ...... 12 2.2. N i dung nghiên cứu ...... 12 2.3. P ương ng iên cứu ...... 12 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu ...... 12 2.3.2 V t liệu nghiên cứu ...... 12 2.2.3. Dụng cụ, hóa chất sử dụng ...... 13 2.3.4. Tách chiết DNA tổng số ...... 14 2.3.5. Tiến hành phản ứng PCR ...... 16 2.3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR ...... 18 2.3.7. P ương đọc trình t ...... 18 2.3.8. Xử lý số liệu ...... 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...... 20 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ...... 20 3.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thu t PCR ...... 20 3.3. Phân tích kết quả ...... 21 3.3.1.Trình t đ ạn gen matK ...... 21 3.3.3. Trình t đ ạn gen trnH-psbA ...... 25 3.3.3. Trình t đ ạn gen ITS2 ...... 29 3.3.4. So sánh khả năng ân iệt của đ ạn trình t matK, trnH-psbA, ITS2...... 31 CHƯƠNG 4. KẾT UẬN VÀ KIẾN NGH ...... 33

4.1. Kết n ...... 33 4.2. Kiến nghị ...... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...... 1

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tắt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data bp Base pair Cặp base Consortium for the Barcode of Consortium for the Barcode CBOL Life of Life Convention on International C ng ước về buôn bán quốc CITES Trade in Endangered Species of tế các loài nguy cấp Wild Fauna and Flora cpDNA Chloroplast DNA bộ gen lục lạp Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium CTAB bromide bromide Cytb Cytochrome b Cytochrome b DNA (DNA) Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid dNTP triphosphate triphosphate EBA Extraction Buffer A Đệm tách A EBB Extraction Buffer B Đệm tách B axit ethylenediamine EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid tetraacetic F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi IGS Intergenic Spacer vùng liên gen vùng DNA nằm giữa các ITS Internal Transcribed Spacer gen kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể

Nicotinamide adenine Nicotinamide adenine NAD(P)H dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate Trung tâm Quốc gia về NCBI National Center for Thông tin Công nghệ sinh Biotechnology Information học ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone Restriction fragment length Phân tí h đ hình trình tự RFLP polymorphism DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate R-Primer Reverse primer Mồi ngược TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Kí hiệu mẫu tràm n m gân...... 12 Bảng 2.2. Thành phần đệm tách A( 100ml) ...... 13 Bảng 2.3. Thành phần đệm tách B (100ml) ...... 13 Bảng 2.4. Thành phần đệm TE ...... 13 Bảng 3.1. Một số loài có trình tự gen m tK tương đồng với loài quinquenervia trên ngân hàng gen NCBI ...... 23 Bảng 3.2. Một số loài có trình tự gen trnH- ps A tương đồng với loài Melaleuca quinquenervia trên ngân hàng gen NCBI ...... 26 Bảng 3.3. Một số loài có trình tự gen ITS2 tương đồng với loài Melaleuca quinquenervia trên ngân hàng gen NCBI ...... 29

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của 3 mẫu Tràm n m gân ...... 20

Hình 3.2. Kết quả nhân gen matK, trnH-pbsA, ITS2 ...... 21

Hình 3.3. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK tạo bởi NCBI ...... 23

Hình 3.4. Sự sai khác trình tự đo n gen m tK giữa loài Melaleuca quinquenervia và loài Melaleuca viridiflora(các v trí s i kh đượ i đỏ)...... 25

Hình 3.5. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA tạo bởi NCBI ... 27

Hình 3.6. Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA giữa loài Melaleuca quinquenervia và loài Melaleuca viridiflora (các v trí s i kh đượ i đỏ) ... 28

Hình 3.6. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn gen ITS2 tạo bởi NCBI ..... 30

Hình 3.7. Sự sai khác trình tự đoạn gen ITS2 giữa loài Melaleuca quinquenervia và loài Melaleuca viridiflora(các v trí s i kh đượ i đỏ) ...... 31

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên đ dạng và phong phú với rất nhiều loại động vật, thực vật và nấm có giá tr kinh tế o Trong đ , giới thực vật tính đ dạng rất cao về loài Đến nay có khoảng 350.000 loài thực vật đã đượ đ nh dạng. Từ thời x xư nhà kho họ đã iết cách sắp xếp thực vật theo những trật tự nhất đ nh để có thể nhận biết một cách dễ dàng. Tuy nhiên, việc sắp xếp thực vật vào từng nhóm chủ yếu dự vào đặ điểm sinh hình thái và đặ điểm sinh lí hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn đ nh loại có sẵn. Phương ph p này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều kh kh n và hạn chế như nhiều loài có hình thái giống nh u nhưng lại khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Ngoài ra với những mẫu phân biệt dưới loài hoặc những mẫu có nguồn gốc sinh vật đã iến đổi về sinh th i như đã hế, b vùi dưới đất hoặ đã qu hế biến thì không thể x đ nh được bằng chỉ th hình thái. Nhờ vào sự phát triển nhanh chóng của công nghệ và khoa học nói chung ũng như kĩ thuật sinh học phân tử n i riêng đã ho phép húng t khắc phục được những hạn chế kể trên đồng thời òn ho phép x đ nh được những sự khác biệt giữa các loài thậm chí là các cá thể trong một loài một cách chính xác. Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) (Cav.). S.T. Blacke, đượ đ nh gi là loài cây có giá tr kinh tế o, đồng thời ũng là ây khả n ng h u mặn. Tràm đ ng được sử dụng để chiết xuất tinh dầu tràm. Và hiện nay các loài này đ ng khai thác khá nhiều, do vậy húng đ ng nằm trong danh sách loài thực vật cần được bảo tồn của quốc gia. Do đ , t i thực hiện đề tài “Nghiên ứu x đ nh đoạn DNA barcode ho loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) phục vụ gi m đ nh loài ”

1

CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của Tràm năm gân Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) (Cav.). S.T. Blacke là một loài thuộ hi Tràm( mel leu ) Tràm n m gân mặt phần lớn ở Úc (230 loài). ở Việt N m Tràm n m gân được trồng nhiều ở Vì, Th nh H ,… Song hiện òn được nghiên cứu ít về mặt thực vật và hóa học. Giới (regnum) plantae (thực vật) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Melaleuca Lòai (species): M.quinquenervia Tràm n m gân phân ố tự nhiên ở Papua New Guinea (PNG) và ven biển phí đ ng Austr li tại các bang Queesland (Qld) và New South Wales (NSW), từ 8o 16’ vĩ độ N m đến 33o 52’ vĩ độ Nam. Ở Việt N m Tràm n m gân được trồng nhiều ở Thanh Hóa, Ba Vì, Thừa Thiên Huế[23]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái Tràm n m gân là ây gỗ nhỏ h y trung ình, thường xanh, cao 10-15m (đ i khi tới 20-25m), và đường kính có thể đạt 50-60 m Đ i khi là ây ụi, cao 0,5-2m, nếu mọc ở v ng đồi cằn cỗi thân thường không thẳng; vỏ ngoài mỏng, xốp, màu trắng x m, thường bong thành nhiều lớp. Hệ rễ phát triển mạnh. Lá đơn, mọc so le; phiến lá hình mác hay hình trái xoan hẹp, thường kh ng ân đối, kí h thước 4-8(-10)x1-2,0(¬2,5) m; đầu nhọn hoặc tù, gốc tròn hoặ hơi hình nêm; dày; lúc non có lông mềm màu trắng bạc, sau nhẵn, màu xanh lục; gân hính 5 (đ i khi 6), hình ung; uống lá ngắn, có lông. Cụm hoa bông mọc ở đầu cành hay nách lá. Hoa nhỏ, màu trắng, trắng xanh nhạt, trắng vàng nhạt hoặc trắng kem; đài hợp ở gốc thành ống hình trụ hay hình trứng, 5 thuỳ đài rất ngắn; cánh tràng 5, có móng rất ngắn (các thuỳ đài và nh tràng đều sớm rụng); nh nhiều, hợp thành 5 bó, xếp đối diện với thuỳ đài; đĩ mật chia thuỳ, có lông mềm; bầu ẩn trong ống đài, 3

2

Quả nang gần hình chén hoặc hình bán cầu hoặc hình cầu, kí h thước 3¬3,5x3,5-4mm, khi chín nứt thành 3 mảnh. Hạt hình nêm hoặc hình trứng. Sau khi hoa nở, tạo quả; trục cụm hoa tiếp tụ sinh trưởng, phát triển tạo thành từng đoạn mang hoa quả và mang lá xen kẽ nhau. Cây sống thích hợp ở mọi iên độ sinh thái, sống khỏe ở trên các loại đất th t, t, đồi, ẩm, vùng ngập nước và cả trên những v ng đất đồi khô hạn, khí hậu khắc nghiệt. Sau gần h i n m đư vào trồng thử, ây tràm được trồng ở Lộc Bổn đã ph t triển khá tốt, mặt bằng hung đều cao 2,5 - 3m, nhiều cây cao lên tới 4m, lá nhiều, lượng tinh dầu cao. Để cây phát triển tốt, n ng xuất cao, yêu cầu phải h m s thường xuyên, n phân đúng quy trình, ây sẽ sinh trưởng nhanh, tỷ lệ sống o, đạt đến 90% Đối với những hộ gi đình ít h m s , ây vẫn phát triển tự nhiên, nhưng n ng xuất và chất lượng không cao. Cây có thể sống thọ được 25 - 30 n m[24]. 1.1.3. Giá trị sử dụng Đây là loài ây mà hàm lượng tinh dầu trong l tươi thể đạt 1,3- 2,4%, tỷ lệ 1,8- ineole đạt 0,2-65% và hơn nữa, hoặc 5-50%, được coi là loài rất có triển vọng trong sản xuất tinh dầu. tinh dầu tràm n m gân giàu 1,8-cineole có tác dụng diệt khuẩn, kháng virus, được sử dụng trong ngành công nghiệp dượ như thuốc chống xung huyết, chống ho, tác dụng giảm đ u và hống viêm. Ngoài ra, 1,8-cineole òn d ng trong hương liệu, chữa bệnh hen suyễn, viêm xoang và bệnh phi tắc nghẽn mạn tính, thậm hí người cho rằng 1,8-cineole có thể góp phần kiểm soát viêm tụy cấp tính. Với khả n ng kh ng khuẩn mạnh, tràm n m gân được sử dụng để h m s d , làm sạch da nhờn, hỗ trợ tr mụn, mẩn ngứa, nhọt, trầy xướt và vết côn trùng cắn rất tốt. Tinh dầu này đẩy nhanh tố độ thay thế mô và tế bào da, giúp làm mờ và xóa vết sẹo và nám trên da, làm da sạch trở nên tươi mới tương tự như tinh dầu tràm trà. Bên trong cơ thể, tinh dầu này có khả n ng hỗ trợ ng n hặn nhiễm khuẩn đường ruột và hệ tiêu h đồng thời ng n hặn giun sán phát triển Tràm n m gân khả n ng làm th ng mũi, hống nghẹt mũi và đường hô hấp, long đờm và giảm ho. Tinh dầu này có tác dụng làm

3 giảm các triệu chứng đ u đầu, đ u nử đầu, đ u r ng, nhức mỏi và bong gân. Tràm n m gân kí h thí h tuần hoàn máu và bạch huyết, nhờ đ ng n hặn quá trình tích tụ axit uric ở các khớp và làm ấm những bộ phận b thiếu máu, làm giảm đ u khớp và bệnh gout Tương tự tràm trà và tràm gió, tinh dầu tràm n m gân giúp t ng ường tập trung sáng tạo, giảm mệt mỏi trí , t ng mứ độ hưng phấn[25]. 1.2. Tổng quan về mã vạch DNA (DNA barcode) 1.2.1. Giới thiệu về mã vạch DNA Phương ph p phân loại hình thái có l ch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện Phương ph p phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái củ ơ qu n trong ơ thể thực vật, đặc biệt là ơ qu n sinh sản (ho ) Tuy nhiên, phương ph p này ũng gặp rất nhiều kh kh n khi cần x đ nh những mẫu vật đ ng trong gi i đoạn phát triển ( hư r ho ), những mẫu đặ điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện m i trường hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [2] Ngoài r , phương ph p phân loại hình th i thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại đ i khi tốn nhiều thời gian và công sức[3]. N m 2003, P ul He ert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, C n d , đề xuất “DNA r ode” (mã vạ h DNA) như là một h để x đ nh loài. Mã vạ h được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như một máy quét ở siêu th phân biệt được các loài bằng cách nhận diện các sọ màu đen đặ trưng ủa từng loài[4]. DNA barcode có vùng ít b th y đổi (rất ổn đ nh) và có vùng dễ th y đổi trong quá trình tiến hóa. Dựa vào mứ độ th y đổi trong trình tự DNA này để đ nh gi sự sai khác di truyền giữa các sinh vật [5]. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mẫu vật trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được [6]. Một DNA r ode điển hình phải đ p ứng được các yêu cầu sau:

4

• C tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật. • Trình tự tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao. • C khả n ng phân iệt đồng thời được nhiều loài. Điều này ho phép x đ nh một số sinh vật tại bất kỳ gi i đoạn phát triển từ một mô mẫu rất nhỏ, dạng tươi h y ảo tồn từ nhiều n m trước.Việ đ nh dạng mẫu thực vật ở mức phân tử x đ nh các mẫu thực vật có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khoa học và ứng dụng kh nh u Hơn nữa, mã vạch DNA ngoài ý nghĩ giúp đ nh danh mẫu vật còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vậy đ trong tự nhiên[3]. Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả t động đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự x đ nh loài sử dụng phương ph p nhanh là cần thiết để đ nh gi đ dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo vệ loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lưu ý rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng n là ng ụ hữu í h để tạo ra thông tin về đơn v phân loại hư iết. Hiện nay, trên thế giới kỹ thuật này đ ng được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vự kh như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm. 1.2.2. c đặc điểm c n của tr nh t N arco Đặ điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến d và dễ dàng sử dụng Điều này nghĩ là đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn v phân loại, có sự biến đổi giữ loài nhưng ổn đ nh và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đ ng kể Do đ , DNA r ode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuế h đại bằng PCR. Với động vật, hệ gen ty thể với đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu là đột biến thay thế trong v ng mã ho , v ng điều khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tìm ra nguồn gố loài Thêm vào đ , DNA ty thể có số lượng bản sao lớn trong tế bào và bền vững trong thời gian rất dài, hàng nghìn n m trong khi đ

5

DNA nhân chỉ có một bản sao và nhanh chóng b phân huỷ r ngoài m i trường. Do vậy phần lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắn của gen ty thể mã hóa cytochrome oxidase subunit I (COI) làm chỉ th DNA. Mặ d vài trường hợp ngoại lệ, COI được coi là một chỉ th DNA điển hình và chung cho các loài động vật [7], [8]. Quá trình tìm kiếm một chỉ th DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều kh kh n Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ th DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Intern l Tr ns ri ed Sp er) thường được sử dụng làm DNA chỉ th trong một số nghiên cứu [9], [10], [11] Trong vòng 5 n m qu , nhiều v ng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ th DNA cho thực vật [12] Tuy nhiên hư hỉ th DNA nào đượ đ phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [13]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu ũng đã đi tới một qu n điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ th để đ nh d nh loài đối với thực vật [12]. Theo T erlet P và ộng sự (2007), hệ thống mã vạ h DNA lý tưởng phải đ p ứng các yêu cầu s u đây: • Thứ nhất, đoạn DNA chỉ th phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng ũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài. • Thứ hai, hệ thống đ nh danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau. • Thứ , đoạn DNA chỉ th cần chứ đủ th ng tin ph t sinh loài để có thể dễ dàng đ nh danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…) • Thứ tư, khả n ng p dụng với các mẫu vật thô, với v trí cặp mồi nhân gen độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuế h đại và đọc trình tự DNA • Đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản DNA không b sai lệ h Th ng thường, đoạn DNA nghiên cứu kí h thước 150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ b sai lầm trong quá trình nhân bản DNA.

6

1.2.3. t ố oc đ c ử ụng trong ph ng ph p N arco th c t 1.2.3.1. Trình t gen nhân Các trình tự r ode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn th ng tin về các loài cần x đ nh Tuy nhiên kh kh n trong việc khuế h đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả n ng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chứ n ng thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng gen nhân được thử nghiệm trong x đ nh loài bằng phương pháp DNA barcode [8], [14]. 1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome Gen rDNA là hệ thống đ gen mã h phần RNA của ribosome. Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừ tính đ dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như đơn v được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở h i ên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn o hơn h i v ng ITS. Nhìn hung đơn v rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong những tính n ng đ ng hú ý nhất của rDNA là từng đơn v trong hệ thống đ gen kh ng tiến ho độc lập, th y vào đ tất cả đơn v tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn đ nh o hơn trong loài nhưng kh iệt giữa các loài khác nhau. Hiện tại, nrITS vùng ITS củ gen nhân được xem là một trong những công cụ hữu ích nhất để đ nh gi ph t sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chứ n ng Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số mứ độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như l i gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chứ n ng dẫn đến những th y đổi đ Trên ơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân đ nh chính xác và hiệu quả thực vật trong

7 cùng loài với đặ điểm l ch sử đời sống khác nhau (một n m, lâu n m, trên ạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [8], [14] [15]. 1.2.3.3. Gen ục ạp Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạ h vòng kí h thước 120 - 160 kb chia làm hai bản s o đơn là ản s o đơn lớn (large single-copy region) và bản s o đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản s o được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IR và IR ) độ dài trung bình 20 - 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng. Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ o và m ng tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm. Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số lo us là đoạn gen h y gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ th barcode tiềm n ng ho loài thực vật trên tr i đất. Có khoảng 20 gen lục lạp độ dài phù hợp (khoảng 1 k ) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài. Các gen này chứ đựng nhiều mứ độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [7], [8]. 1.2.3.4 Gen rbcL Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặ trưng nhất, mã hóa các tiểu đơn v lớn của rubilose-1,5-bisphosphate cacboxylase/oxygenase (RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật. rbcL đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuế h đại PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã ng nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm n ng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật. Tuy nhiên, do khả n ng phân iệt loài thấp, nên hầu hết nh m đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ th barcode khác, ví dụ như matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [8], [14], [16].

8

1.2.3.5 Gen matK Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, kí h thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ th trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. C OL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuế h đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề ngh sử dụng 1.2.3.6. Trình t gen rpoB và rpoC1 Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn v của RNA polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Diptero rp e e, Tsumur và đồng t giả (1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay rpo là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác đ nh các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi Cùng với gen 16S rRNA, rpo được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác đ nh loài vi khuẩn mới, do vậy gen này đượ đề xuất là chỉ th r ode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần đây, C OL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả n ng phân iệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ th rất hữu í h khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes. Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1 làm chỉ th barcode trong các nghiên cứu gi m đ nh loài [8]. 1.2.3.7. Trình t gen ycf5 ycf5 mã hóa cho một protein có chứ 330 mino ids Gen này được bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA barcode của một vài nh m Tuy nhiên, gen này hư được công nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [7], [8].

9

1.2.3.8. Trình t hai gen trnH-psbA Gen trnH-psbA kí h thước trung bình khoảng 450 p, nhưng th y đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-ps A được chứng minh là có khả n ng x đ nh loài cao. Locus trnH-psbA đã được khuế h đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại kí h thước rất ngắn (~ 300 p), kí h thước củ gen này th y đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-ps A như hỉ th r ode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy rằng khả n ng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 lo us được thử nghiệm và do đ đề ngh n như là hỉ th barode bổ sung. trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả n ng phân tí h [8], [17] 1.2.3.9. Trình t hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) Locus trnL (UAA)-trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA) T erlet và đồng t giả là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật. Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng ưu thế như ấu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nh u Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và sử dụng kỹ thuật PCR để khuế h đại đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong nghiên cứu để x đ nh trnL (UAA) intron nên được sử dụng làm vùng DNA barcode, T erlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một barcode tiềm n ng ho phân tí h, x đ nh các loài thực vật [8], [15], [18]. n ụn N o t n th t Mã vạch DNA thực vật được xem là một công cụ hữu hiệu trong việc nhận diện và phân chia ranh giới giữ loài Đồng thời hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặ hư x đ nh được thuộc loài

10 nào.Vì vậy, hướng nghiên cứu DNA mã vạ h đ ng được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vự liên qu n đến việc thực hiện hoặc sử dụng nhận dạng thực vật như phân loại học, sinh thái học, bảo vệ m i trường, lâm nghiệp, nông nghiệp, hải quan, kiểm d ch và trong nhiều tình huống cần xác đ nh “nh m loài” Sử dụng DNA r ode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩ ngày àng lớn.Theo r ode of Life D t Systems, n m 2011 đã lưu trữ đượ hơn 1 100 000 DNA r ode từ hơn 95 000 đối tượng sinh vật khác nhau. Đã hơn 180 000 trình tự DNA barcode của thực vật đượ lưu trữ trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2 000 ài o kh nh u Để chuẩn hóa ở mứ độ quốc tế và việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng khoa họ đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [2], [5], [6]. Có khoảng 29.000 loài cây trồng được bảo hộ trong C ng ước CITES, và việc phát triển phương ph p hiệu quả để phân biệt loài nằm trong danh sách CITES với những loài không nằm trong danh sách CITES. DNA mã vạ h được sử dụng để t ng ường sự hiểu biết các loài thực vật có hạt, hoặc thông qua đ đ ng g p đến sự khám phá các loài ẩn d nh[19] Phương ph p tiếp cận mã vạ h DNA ũng đã ung ấp các thông tin hữu ích về những bí ẩn trong đ dạng loài của các nhóm thực vật Bryothytes(Rêu) [20].Ngoài ra, DNA mã vạ h òn được sử dụng để x đ nh các rễ cây, cây giống hoặ gi i đoạn sống hư rõ (ví dụ như ây Dương xỉ Gametophytes). Nghiên cứu DNA mã vạch thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so s nh v ng DNA kh nh u để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn ằng cách so sánh mã vạch DNA ở một vài sinh vật khác với các mã vạ h đã được biên soạn trong thư viện thông tin, có thể giúp nhận diện loài, x đ nh các loài mới hoặc các loài quý hiếm.Các nhà khoa họ đã những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn, mở ra một triển vọng mới ho ng t đ nh gi , phân loại, quản lý và bảo tồn đ dạng sinh học.

11

CHƢƠNG : MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Mụ đí h hung: X đ nh đượ đoạn DNA r ode ho loài ây tràm n m gân nhằm mụ đí h xây dựng ơ sở dữ liệu DNA mã vạch, phục vụ cho việ gi m đ nh loài và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật. - Mụ đí h ụ thể: + Phân lập và x đ nh đượ đoạn gen matK, ITS2, trnH- psbA của loài tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia). + X đ nh được mối quan hệ di truyền của loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) với các loài Tràm khác trên ngân hàng gen NCBI. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mẫu l ây Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia). - Nhân bản một số đoạn DNA mã vạch ( matK, ITS2, trnH- psbA). - X đ nh và phân tích trình tự nucleotide củ đoạn gen ( matK, ITS2, trnH- psbA). - X đ nh mối quan hệ di truyền củ loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) dựa trên các chỉ th mã vạch DNA. 3 Phƣơn pháp n hi n ứu 2.3.1. Đối t ng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia). 2.3.2 V t liệu nghiên cứu L ây Tràm n m gân (Melaleuca quinquenervia) thu thập được tại phòng thực vật của cô Khuất Th Hải Ninh. B ng 2.1. Kí hiệu mẫu tràm năm gân Kí hiệu Chú thích M34.1 Tràm n m gân mẫu số 1 M34.2 Tràm n m gân mẫu số 2 M34.3 Tràm n m gân mẫu số 3

12

2.2.3. Dụng cụ, hóa chất sử dụng - Các loại pipet - Các loại tipe - Các loại eppendorf Hóa chất tách - Đệm t h A, đệm t h , đệm TE và một số hóa chất khác. Đệm tách A (EBA- Extraction Bufer A): pha 100ml B ng 2.2. Thành phần đệm tách A( 100ml) STT Thành phần 1 2%( w/v) CTAB ( hexadecyltrimethylammonium bromide) 2,0g 2 100mM Tris ( pH 8,0) ( use 1M stock) 10ml 3 20mM EDTA ( use 0,5M stock) 1ml 4 1,4M NaCl 8,2g 5 4% (w/v) PVP ( polyvinyl pyrrolidone) 4,0g 6 0,1% (w/v) ascorbic acid 0,1g 7 10mM β- mereaptoethanol (BME) * ( use 14,3M stock) Đệm tách B (EBB- Extrction Buffer B): pha 100ml B ng 2.3. Thành phần đệm tách B (100ml) STT Thành phần 1 100mM Tris HCl (pH 8,0) (use 1M stock) 10ml 2 50mM EDTA (use 0,5M stock) 2,5ml 3 100mM NaCl 0,6g 4 10mM β-mereaptoethanol (BME) (use 14,3M stock) 70 l

Đệm TE ( TE Buffer) : pha 100ml B ng 2.4. Thành phần đệm TE STT Thành phần 1 10mM Tris( pH 8,0) ( use 1M stock) 1,0 2 1mM EDTA ( use 0,5M stock) 50 l

13

- Các hóa chất khác: 20% SDS (sodium dodecyl sulphate) 5M CH3COOK (bảo quản ở -20°C) 3M CH3COONa (pH 5,2) 70% ethanol 100% isopropanol ⦁ Bộ hóa chất PCR: 2X PCR Master Mix solution và hóa chất sử dụng trong điện di Redsafe. ⦁ Nước deion. ⦁ DNA khuôn. ⦁ M y PCR, m y điện di, máy ly tâm, bể ủ nhiệt, …và tr ng thiết b khác thuộc bộ môn công nghệ gen và di truyền phân tử thuộc Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp. ⦁ Mồi ( F-Primer, R- Primer).  Hóa chất chạy điện di: Điện di gel agarose gồm các hóa chất: TAE, agarose, thuốc nhuộm RedS fe,… 2.3.4. Tách chiết DNA tổng số Các mẫu thực vật được tách chiết lất DNA tổng số bằng phương ph p Keb- Llanes và cộng sự (2002). Cách lấy mẫu - Thu thập 03 mẫu lá Tràm n m gân - Chất lượng mẫu: Mẫu phải đặ trưng ho từng loại ây, đặ trưng ho gi i đoạn phát triển thành thục của cây. Không lấy mẫu biến dạng, mẫu b sâu bệnh hại, không lấy mẫu ở cây còi cọ ũng kh ng lấy mẫu ở cây quá tốt hoặc cây sinh ra từ chồi non. Chuẩn b dụng cụ, thiết b và hóa chất ( lưu ý: dụng cụ đều được khử trùng ở điều kiện chuẩn).

14

Quy trình 1. Cân 0,2g mẫu lá cho vào cối chày sứ s u đ ổ sung 600 l E và 200μl SDS, nghiền mẫu bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào. 2. Hút 1,5ml mẫu cho vào ống Eppendorf 1,5ml sạch. 3. Ủ mẫu ở 65 trong máy ổn nhiệt, thời gian 10 phút, 3 phút lấy ra lắc đều 1 lần. 4. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 . 5. Hút 1,0 ml dung d ch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml. 6. Bổ sung 410 CH COOK. Trộn đều, đặt trong ống đ 5 phút 7. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 để thu d ch nổi. 8. Thu d ch nổi và bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ Vmẫu : Visopropanol = 1:1, đảo nhẹ và ủ ở -20 trong 20 phút. 9. Ly tâm thu tủa 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 . Loại bỏ d ch nổi, thu tủa. 10. Rửa tủa bằng 500 ethanol 70 ( cồn 70% để rửa các cặn bẩn kết tủa cùng DNA). 11. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 , loại bỏ d ch nổi rồi làm khô tủa ( ít nhất 30 phút). 12. Hòa tan tủa trong 100 đệm Elution. 13. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%.  Pha gel agarose 1% - Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X. - Đun n ng ằng lò vi sóng trong 1 phút 30s. - Bổ sung 4 RedS fe/100ml gel, mĩ ( trộn) đều. - Lắp lược vào bản gel, đổ gel, chờ 15-20 phút ho gel đ ng lại. Điện di - Trộn 5 DNA + 2 lo ding dye, mix đều, tra vào từng giếng. - Chạy điện di trong dung d ch TEA 1X, 90V trong 30 phút. - Soi gel bằng tia UV. 14. Bảo quản mẫu ở -20 15

Ở ước 7, sau khi ly tâm d ch nổi, nếu d ch vẫn còn cặn, hư sạch thì có thể lặp lại ước 6-7. 2.3.5. Tiến hành ph n ứng PCR PCR (Polymerase Chain Reachtion ) là một kỹ thuật nhân gen in vitro nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao của gen quan tâm nhờ enzyme polymerase và cặp mồi đặc hiệu [3],[4]. Bản chất của PCR là phản ứng sinh h để khuế h đại một đoạn DNA trong ống nghiệm theo nguyên lý của phản ứng dây chuyền Nghĩ là phản ứng của cấp bậ trước làm tiền đề cho phản ứng cấp bậc sau xảy ra với ường độ t ng trưởng theo cấp số nhân nhờ xúc tác của enzyme DNA polymerase [2],[3]. - Sử dụng bộ kit 2X PCR M ster solution để thực hiện PCR. - Các cặp mồi sử dụng ho đoạn gen cần nhân: Vùng Tên Nhiệt độ Trình t mồi gen mồi gắn mồi matK- 5’- mLKT F TTCCATGGCCTTCTTTGCATTTGTTGC-3’ matK 59oC matK- 5’- mLKT R TTCCATGGTTTTTTGAGGATCCGCTGT-3’ 5’- Is2P1F TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC- ITS2 3’ 52oC

Is2P1R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

trnPF1 5’- GTTATGCATGAACGTAATGCTC -3’ trnH- 50oC psbA psbPR1 5’- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC -3’

- ước 1: Chuẩn b các hóa chất theo thành phần của một phản ứng PCR như s u 16

STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất 2 lần khử ion 7,0 2 2X PCR Taq buffer 10,0 Master Mix Mg2+ dNTPs Taq DNA polymerase 3 Mồi xuôi (F – Primer) 1,0 4 Mồi ngược (R – Primer) 1,0 5 DNA khuôn 1,0 6 Tổng thể tích 20

- ước 2: Trộn đều các thành phần trên với nh u s u đ ằng pipet, s u đ làm lắng hỗn hợp đ - Lập trình trên m y PCR theo hương trình như s u: 94°C: 5 phút 94°C: 30 giây 48°C: 30 giây 40 chu kỳ 72°C: 1 phút 72°C: 7 phút 4°C: ∞ Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang chuẩn marker 1 kb. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1% - Pha gel agarose 1% Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE1X Đun n ng ằng lò vi sóng Bổ sung 5µl Redsafe s u đ lắ đều - Điện di Tra vào mỗi giếng 5µl sản phẩm PCR Chạy điện di trong dung d ch TAE 1X, 100V trong 30 phút 17

Soi gel bằng tia UV Sản phẩm PCR phải được tinh sạch 2.3.6. Tinh sạch s n phẩm PCR Những sản phẩm s u khi được khuế h đại thành công sẽ được tinh sạch bằng kit PCR Purification Kit củ Norgen C ước tinh sạ h như s u:

 ước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:5 của Buffer Binding vào hồn hợp PCR để được một dung d ch hoàn chỉnh (ví dụ cho mỗi 100 µl của hỗn hợp phản ứng, thêm 500 µl Buffer Binding). Trộn đều và trộn kỹ.

 ước 2: Chuyển tối đ 800 µl dung d ch từ ước 1 vào cột collection tube. Ly tâm 30 – 60s ở 8000 vòng. Loại bỏ các dung d ch thông qua cột.

 Lưu ý: Nếu tổng khối lượng vượt quá 800 µl, dung d ch có thể đượcthêm vào cột thành từng gi i đoạn. Sau khi bổ sung 800 µl dung d ch, ly tâm cột 30 – 60s và loại bỏ dòng chảy thông qua. Lặp lại ho đến khi toàn bộ dung d h đã được thêm vào màng cột.

 ướ 3: Thêm 500 µl W sh uffer (đã được thêm Ethanol) vào cột lọc collection tube. Ly tâm 30 – 60s ở 1000 vòng/phút. Loại bỏ d ch qua cột và đặt các cột lọc trở lại vào ống thu.

 ước 4: Ly tâm collection tube trống thêm 1 phút để hoàn toàn loại bỏ phần đệm rửa còn sót lại.

 Lưu ý: ướ này là điều kiện cần thiết vì ethanol còn sót lại trong mẫu DNA có thể ức chế các phản ứng s u đ

 ước 5: Chuyển collection tube tới một ống 1.5 µl sạch (không kèm theo trong bộ Kit) Thêm 50 µl Elution uffer đến trung tâm màng của cột collection tube và ly tâm trong 1 phút ở 13000 vòng/phút. Sản phẩm PCR được tinh sạ h và đư đi x đ nh trình tự nucleotide. 2.3.7. Ph ng ph p đọc trình t Xác định trình tự bằng phương pháp tự động: nguyên tắc chung của giải trình tự gen tự động là dự theo ơ sở củ phương ph p S nger nhưng qu trình tổng hợp DNA thực hiện nhờ kỹ thuật PCR. Mỗi ddNTP đượ đ nh dấu bằng một loại fluochrom có màu khác nhau nên có thể tiến hành cả 4 phản ứng tổng

18 hợp trong cùng một ống nghiệm Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lí số liệu. 2.3.8. Xử lý số liệu 2.3.8.1. Phân tí h ằng LAST trong NC I LAST ( si Lo l Alignmet Tools) là hương trình so s nh ấu trúc chuỗi DNA, chuỗi amino acid cần phân tích với các chuỗi tương ứng lưu giữ trong Ngân hàng dữ liệu nhằm tìm kiếm chuỗi tương đồng với chuỗi kiểm tra và tìm kiếm x đ nh v ng tương đồng và mứ độ phân ly về cấu trúc của chuỗi phân tích với các chuỗi kh trên Ngân hàng gen Chương trình LAST ho phép x đ nh sự tương đồng cấu trúc ở hai mứ độ là : mang tính cục bộ hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với nhau. 2 3 8 2 ioEdit và DNAst r Phần mềm ioEdit và DNAst r đượ sử dụng để phân tí h so s nh trình tự nu leotide và trinh tự xit min nhằm x đ nh độ tương đồng và độ s i kh qu ảng m trận, thiết lập sơ đồ hình ây

19

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số Các mẫu sau khi thu thập được tiến hành tách chiết DNA tổng số. Chúng t i đã t h hiết thành công DNA tổng số của 3 mẫu Tràm n m gân Kết quả tách chiết đượ điện di trên gel g rose 1% được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1 Kết qu tách chiết DNA tổng số của 3 mẫ Tràm năm gân Các mẫu DNA sau khi tách chiết ng vạ h s ng rõ, DNA thu được ít b đứt gãy. Sản phẩm này đủ để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thu t PCR DNA tổng số được tách chiết ở ướ trên được sử dụng làm khu n để nhân bản đoạn gen matK, ITS2 và trnH-psbA bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi tương ứng đặc hiệu. Kết quả PCR thu được:

20

1000

700 500

Hình 3.2. Kết qu nhân gen matK, trnH-pbsA, ITS2 Kết quả điện di cho thấy ng s ng rõ nét, kh ng xuất hiện ng phụ, ng kí h thướ kh tương đồng. Đoạn gen matK có kí h thước gần 900bp, đoạn gen trnH-psbA kí h thước gần 600bp và đoạn gen ITS2 có kích thước gần 400 p Điều này cho thấy mồi được sử dụng kh đặc hiệu và nhiệt độ bắt mồi là tối ưu 3.3. Phân tích kết quả 3.3.1.Trình t đoạn gen matK Các sản phẩm PCR đều được tinh sạch bằng bộ kit PCR Purification Kit củ Norgen theo phương ph p trình ày ở mụ 2 3 5 và đem đi giải trình tự. Trình tự gen matK đượ phân tí h kí h thước 880 p, trong đ kh ng có sự sai khác nào giữa 3 mẫu nghiên cứu, kết quả tương đồng 100%.

21

5’TCCATCTCGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGCTTGAAAGAT GCCTCTTCTTTGCATTTATTACGTTTCTTTCTCCACGAGTATTGGAATA GTCTTATTACTCCAAAGAAAGATATTCCCTTTTTTTCAAAAGGGAATC CCAGATTATTGTTGTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAATACGAAT CCATCTTTCTTTTTCTCCGTAATCAATCTTCTCATTTACGGTCAACATC TTCTGGAATCTTTTTTGAGCGAATACATTTCTATGTAAAAATAGAACA TTTTGTCAAAGTCCTATTTGAGAATGATTTTCAGTGCATCCTATGGTT CTTCAAAGATCCTTTCATGCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCAA TTCTGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAATAAATGGAAATAT TACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCGTGGTTTCAACCA GGAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCCTGACTTTTG GGGCTATCGTTTAAGCGTGCGACTAAATTCTTTAGTGGTACGAAGTC AAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAAATAATGCTATGAAGAAGTTC GAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCG AATTTTTGTAACACATTCGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGC TGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGTTTTTTGCGTCTATGTAG AAATCTTTTTCATTATCACAGTGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTAT ATCGAGTAAAATATATACTTCGACTTTCTTGTGTTAAAACTTTGGCTC GTAAACACAAAAGGACTGTACG’ 3 Từ sự tương đồng về trình tự, chúng tôi nhận thấy không có sự khác nhau về cấp độ cá thể ở loài Tràm n m gân Do đ t i hỉ lấy trình tự của một ây để phân tích. Các trình tự này s u đ được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm ra sự khác biệt ở cấp độ loài và các loài có trình tự tương đồng theo đoạn gen matK ở loài Tràm n m gân ằng cách sử dụng công cụ BLAST. Một số loài có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Hoàng đàn được trình bày ở bảng 3.1

22

B ng 3.1. M t số loài có trình t g n matK t ng đồng với loài Melaleuca quinquenervia trên ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ t ng đồng 1 Melaleuca viridiflora AF184708.1 99.89% 2 Melaleuca cajuputi AB924992.1 100% 3 Melaleuca nesophila KM065221.1 99.28% 4 Melaleuca diosmifolia KM065193.1 99.28% 5 Melaleuca aff.nesophila cray AY525135.1 98.98% 6 Melaleuca glomerata KM065281.1 99.26% 7 Melaleuca alternifolia KM065337.1 97.84% 8 orbifolia AY521530.1 100%

Dự vào kết quả này húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đượ thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Cây phân loại d a vào trình t trên đoạn matK tạo b i NCBI Từ cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen matK, ta thấy loài Melaleuca quinquenervia có quan hệ gần gũi nhất với loài Melaleuca cajuputi và xa nhất với loài Beaufortia orbifolia. 23

S u đ húng t i so s nh ở cấp độ loài theo đoạn gen matK của loài Melaleuca quinquenervia với trình tự gen của loài Melaleuca viridiflora AF184708.1 trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi nhận được sự sai khác giữa 2 đoạn gen được thể hiện như s u: Score Expect Identities Gaps Strand 1620 bits(877) 0.0 879/880(99%) 0/880(0%) Plus/Plus

Query 1 TCCATCTCGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGCTTGAAAGATGCCTCTTCTTTGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 470 TCCATCTCGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGCTTGAAAGATGCCTCTTCTTTGC 529

Query 61 ATTTATTACGTTTCTTTCTCCACGAGTATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAGAAAGATA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 530 ATTTATTACGTTTCTTTCTCCACGAGTATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAGAAAGATA 589

Query 121 TTCCCtttttttCAAAAGGGAATCCCAGATTATTGTTGTTCCTATATAATTCTCATATAT 180 ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 590 TTCCCTTTTTTTCAAAAGGGAATCCAAGATTATTGTTGTTCCTATATAATTCTCATATAT 649

Query 181 GTGAATACGAATCCATCTTTCTTTTTCTCCGTAATCAATCTTCTCATTTACGGTCAACAT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 650 GTGAATACGAATCCATCTTTCTTTTTCTCCGTAATCAATCTTCTCATTTACGGTCAACAT 709

Query 241 CTTCTGGAATCTTTTTTGAGCGAATACATTTCTATGTAAAAATAGAACATTTTGTCAAAG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 710 CTTCTGGAATCTTTTTTGAGCGAATACATTTCTATGTAAAAATAGAACATTTTGTCAAAG 769

Query 301 TCCTATTTGAGAATGATTTTCAGTGCATCCTATGGTTCTTCAAAGATCCTTTCATGCATT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 770 TCCTATTTGAGAATGATTTTCAGTGCATCCTATGGTTCTTCAAAGATCCTTTCATGCATT 829

Query 361 ATGTTAGATATCAAGGAAAATCAATTCTGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAATA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 830 ATGTTAGATATCAAGGAAAATCAATTCTGGCTTCAAAAGATACGCCTCTTCTGATGAATA 889

Query 421 AATGGAAATATTACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCGTGGTTTCAACCAG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 890 AATGGAAATATTACCTTGTTAATTTATGGCAATATCATTTTTACGCGTGGTTTCAACCAG 949

Query 481 GAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCCTGACTTTTGGGGCTATCGTTTAA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 950 GAAGGATCGATATAAACCAATTATGCAAGTATTCTCCTGACTTTTGGGGCTATCGTTTAA 1009

Query 541 GCGTGCGACTAAATTCTTTAGTGGTACGAAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1010 GCGTGCGACTAAATTCTTTAGTGGTACGAAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTAATAA 1069

24

Query 601 ATAATGCTATGAAGAAGTTCGAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGT 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1070 ATAATGCTATGAAGAAGTTCGAGACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGT 1129

Query 661 CTAAAGCGAATTTTTGTAACACATTCGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGCTGATT 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1130 CTAAAGCGAATTTTTGTAACACATTCGGGCATCCCATTAGTAAACCGACCCGGGCTGATT 1189

Query 721 CATCAGATTCTGATATTATCGACCGTTTTTTGCGTCTATGTAGAAATCTTTTTCATTATC 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1190 CATCAGATTCTGATATTATCGACCGTTTTTTGCGTCTATGTAGAAATCTTTTTCATTATC 1249

Query 781 ACAGTGGATCCTCaaaaaaaaaGAGTTTATATCGAGTAAAATATATACTTCGACTTTCTT 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1250 ACAGTGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAGTAAAATATATACTTCGACTTTCTT 1309

Query 841 GTGTTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGGACTGTACG 880 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1310 GTGTTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGGACTGTACG 1349 Hình 3.4. S sai khác trình t đoan gen matK giữa loài Melaleuca quinquenervia và loài Melaleuca viridiflora(các vị trí ai kh c đ c ôi đỏ). Từ hình trên chúng tôi nhận thấy 1 điểm sai khác giữa trình tự đoạn gen matK của loài Melaleuca quinquenervia với trình tự đoạn gen matK loài Melaleuca viridiflora. 1. Thay thế C bằng A ở v trí 146 3.3.3. Trình t đoạn gen trnH-psbA Trình tự gen trnH-psbA đượ phân tí h kí h thước 568 p, trong đ không có sự sai khác nào giữa 3 mẫu nghiên cứu, kết quả tương đồng 100%. Kết quả giải trình tự đoạn gen trnH-psbA của mẫu Tràm n m gân như sau: 5’CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTAC ATCCGCCCCTATCTATTACTAGTATTTATATTTATTTTGATAACATTTT GAATTAAATTCAAAATAATGGAAAATATTTCATTTCGATTGTTAATTT TTAACATTTTTTTATCTTACTTATGAGATATAAGAAGCAGAAAATGAT AACCTTTCTAATTTATTCAAAAGAAACTAGAAGATAATAATCTCACA AAATATTCCAAAGGGTTGAAAAGAATGGATATAAATTCGAAATTCAT ATATAAGGAAAAAGGATGATACACAATAATAAACCAATCCCTAAGA CTAGACTACTTTTTTTCTTATGTTGAAGTAAAGAAAAACGGAAAAGA 25

GCACTAAATAAAGGAACAATAACCAATTTCTTATTCTATCAAGAGTG TTGGTTATTGCTCCTTTACTTTCCAATCAAAAAATCGCCTACACTTAT ACTAAGACCAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGAGCTTCAATAGCAG CTAGGTCTAGAGGGAAATTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC’3 Các trình tự này s u đ được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm ra sự khác biệt ở cấp độ loài và các loài có trình tự tương đồng theo đoạn gen trnH-psbA ở loài Tràm n m gân ằng cách sử dụng công cụ BLAST. Một số loài có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Tràm n m gân được trình bày ở bảng 3.2. B ng 3.2. M t số loài có trình t gen trnH- p t ng đồng với loài Melaleuca quinquenervia trên ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ t ng đồng 1 Melaleuca cornucopiae EU410220.1 96.73% 2 EU410224.1 97,76% 3 Melaleuca viridiflora EU410242.1 97.51% 4 Melaleuca nervosa EU410231.1 97.51% 5 Melaleuca acacioides EU410219.1 98.24% 6 Melaleuca glomerata EU410221.1 97.22% 7 Melaleuca arcana EU410222.1 100% 8 EU410229.1 100%

Dự vào kết quả này húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đượ thể hiện ở hình 3.5.

26

Melaleuca quinquenervia (GU135332.2)

Hình 3.5. Cây phân loại d a vào trình t trên đoạn trnH-psbA tạo b i NCBI Từ cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gen trnH-psbA, ta thấy loài Melaleuca quinquenervia có quan hệ gần gũi nhất với loài Melaleuca arcana và xa nhất với loài Melaleuca cornucopiae. S u đ húng t i so s nh ở cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA của loài Melaleuca quinquenervia với trình tự gen của loài Melaleuca viridiflora AF184708.1 trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi nhận được sự sai khác giữa 2 đoạn gen được thể hiện như s u:

27

Score Expect Identities Gaps Strand 682 bits(369) 0.0 392/402(98%) 5/402(1%) Plus/Minus

Query 1 CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTATCT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 402 CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCTATCT 343

Query 61 ATTACTAGTATTTATATTT-----ATTTTGATAACATTTTGAATTAAATTCAAAATAATG 115 ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||||| Sbjct 342 ATTACTAGTATTTATATTTTAAATATTTTGATAACATTTTGAATTTAATTCAAAATAATG 283

Query 116 GAAAATATTTCATTTCGATTGTTAATTTTTAACAtttttttATCTTACTTATGAGATATA 175 |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 282 GAAAATATTTCATTTCGATTGTTAATTTTTAACAATTTTTTATCTTACTTATGAGATATA 223

Query 176 AGAAGCAGAAAATGATAACCTTTCTAATTTATTCAAAAGAAACTAGAAGATAATAATCTC 235 |||||||||||||||||||||||||| ||||||| ||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 222 AGAAGCAGAAAATGATAACCTTTCTAGTTTATTCGAAAAAAACTAGAAGATAATAATCTC 163

Query 236 ACAAAATATTCCAAAGGGTTGAAAAGAATGGATATAAATTCGAAATTCATATATAAGGAA 295 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 162 ACAAAATATTCCAAAGGGTTGAAAAGAATGGATATAAATTCGAAATTCATATATAAGGAA 103

Query 296 AAAGGATGATACACAATAATAAACCAATCCCTAAGACTAGACTACtttttttCTTATGTT 355 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 102 AAAGGATGATACACAATAATAAACCAATCCCTAAGACTAGACTACTTTTTTTCTTATGTT 43

Query 356 GAAGTAAAGAAAAACGGAAAAGAGCACTAAATAAAGGAACAA 397 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 42 GAAGTAAAGAAAAACGGAAAAGAGCACTAAATAAAGGAACAA 1

Hình 3.6. S sai khác trình t đoạn gen trnH-psbA giữa loài Melaleuca quinquenervia và loài Melaleuca viridiflora (các vị trí ai kh c đ c ôi đỏ) Từ hình chúng tôi nhận thấy 4 điểm sai khác giữa trình tự gen nghiên cứu với trình tự gen trnH-psbA loài Melaleuca quinquenervia biết trước. 1. Thay thế A bằng T ở v trí 100 2. Thay thế A bằng G ở v trí 203 3. Thay thế A bằng G ở v trí 211 4. Thay thế G bằng A ở v trí 215

28

3.3.3. Trình t đoạn gen ITS2 Trình tự đoạn gen ITS2 đượ phân tí h kí h thướ 372 p, trong đ không có sự sai khác nào giữa 3 mẫu nghiên cứu, kết quả tương đồng 100%. Kết quả giải trình tự đoạn gen ITS2 của mẫu Tràm n m gân như s u: 5’CTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTC TTTGAACGCAAGTTGCGCCCATAACCATCTGGTGAGGGCACGTTTGC CTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCGAATCACTTGCCCTTAATGTG GGCGGGAGGAATTTGGGCGCGTAAGTTGGCCTCCCGTGATGACTTGT CTCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGACTAGCACCACGACAT TCGGTGGTTGATAAGACCCCAATGATCAATGTCGYGTGTGCCGCTCA ATCGCGCGCTTTGCGAATCTATTATTTACCAACGCGACCCCAGGTCA AGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA’3 Các trình tự này s u đ được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm ra sự khác biệt ở cấp độ loài và các loài có trình tự tương đồng theo đoạn gen ITS2 ở loài Tràm n m gân ằng cách sử dụng công cụ BLAST. Một số loài có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài tràm n m gân được trình bày ở bảng 3.3. B ng 3.3. M t số loài có trình t g n ITS2 t ng đồng với loài Melaleuca quinquenervia trên ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ lệ t ng đồng 1 Melaleuca leucadendra MG757258.1 99.10% 2 Melaleuca glomerata KM064819.1 94.51% 3 Melaleuca bracteata KM064860.1 93.37% 4 Melaleuca armillaris KM064887.1 93.70% 5 Melaleuca viridiflora MH731227.1 99.00% 6 Melaleuca stenostachya MH731199.1 99.00% 7 Melaleuca saligna MH731185.1 99.00% 8 Melaleuca clarksonii MH731096.1 93.70%

29

Dự vào kết quả này húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đượ thể hiện ở hình 3.7.

Hình 3.6. Cây phân loại d a vào trình t trên đoạn gen ITS2 tạo b i NCBI Từ cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gen ITS2, ta thấy loài Melaleuca quinquenervia có quan hệ gần gữi nhất với loài Melaleuca leucadendra và có quan hệ xa nhất với loài Melaleuca glomerata. Melaleuca quinquenervia (GU135332.2) S u đ húng t i so s nh ở cấp độ loài theo đoạn gen ITS2 của loài Melaleuca quinquenervia với trình tự gen của loài Melaleuca viridiflora AF184708.1 trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi nhận được sự sai khác giữa 2 đoạn gen được thể hiện như s u: Score Expect Identities Gaps Strand 542 bits(293) 4e-150 298/301(99%) 0/301(0%) Plus/Plus

Query 1 CTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 277 CTGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTT 336

Query 61 GCGCCCATAACCATCTGGTGAGGGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCG 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 337 GCGCCCATAACCATCTGGTGAGGGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCT 396

Query 121 AATCACTTGCCCTTAATGTGGGCGGGAGGAATTTGGGCGCGTAAGTTGGCCTCCCGTGAT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 397 AATCACTTGCCCTTAATGTGGGCGGGAGGAATTTGGGCGCGTAAGTTGGCCTCCCGTGAT 456

Query 181 GACTTGTCTCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGACTAGCACCACGACATTCGGTG 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

30

Sbjct 457 GACTTGTCTCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGACTAGCACCACGACATTCGGTG 516

Query 241 GTTGATAAGACCCCAATGATCAATGTCGYGTGTGCCGCTCAATCGCGCGCTTTGCGAATC 300 |||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 517 GTTGATAAGACCCCAATGATCAATGTCGCGTGTGCCGCTCAATCGCGCGCTCTGCGAATC 576

Query 301 T 301 | Sbjct 577 T 577 Hình 3.7. S sai khác trình t đoạn gen ITS2 giữa loài Melaleuca quinquenervia và loài Melaleuca viridiflora(các vị trí ai kh c đ c ôi đỏ) Từ hình chúng tôi nhận thấy điểm sai khác giữa trình tự đoạn gen ITS2 nghiên cứu với trình tự gen ITS2 loài Melaleuca viridiflora 1. Thay thế Y bằng C ở v trí 270 2. Thay thế T bằng C ở v trí 293 3.3.4. So sánh kh năng phân iệt của đoạn trình t matK, trnH-psbA, ITS2. Dựa vào kết quả so sánh trình tự đoạn gen matK, trnH-psbA, ITS2 của trình tự gen của loài, ta lập được bảng so sánh khả n ng phần biệt củ đoạn trình tự matK, trnH-psbA, ITS2 như s u: T n đoạn gen matK trnH-psbA ITS2 Số điểm sai khác 1 4 2 Kí h thƣớc trình 880bp 568bp 372bp t Tỷ lệ sai khác 0.11% 0.7% 0.53% Nh n xét: Kết quả phân tích cho thấy khi so sánh trình tự matK, rbcL và trnH-psbA củ loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenrvia) với loài Melaleuca viridiflora. Trình tự đoạn gen matK có 1 điểm sai khác, trình tự đoạn gen ITS2 có 2 điểm sai khác và trình tự đoạn gen trnH-psbA có 4 điểm sai khác. Tỉ lệ sai khác của trình tự trnH-psbA là cao nhất (0 7%) do đ khả n ng phân iệt loài của gen trnH- psbA ũng là tốt nhất và tỉ lệ sai khác của trình tự matK là thấp nhất (0.11%) đồng nghĩ với khả n ng phân iệt loài kém nhất trong 3 gen. Tỉ lệ sai khác của trình tự ITS2(0.53%) thấp hơn trnH-psbA (0 7%) kh ng đ ng kể (0,17%) và o

31 hơn matK nên đoạn gen ITS2 vẫn cho kết quả tương qu n độ chính xác không nhỏ. Kết quả tương qu n giữa 2 loài mà gen ITS2 chỉ th hoàn toàn phù hợp với những phân loại loài trướ đ dựa vào hình thái. Mặc dù vậy, cách tốt nhất là sử dụng đồng thời cả 3 đoạn trình tự matK, ITS2 và trnH-psbA để có thể x đ nh chính xác nhất loài cần đ nh danh.

32

CHƢƠNG KẾT UẬN VÀ KIẾN NGH Kết n 1 Đã t h hiết và tinh sạch thành công DNA tổng số của các mẫu Tràm n m gân 2 Đã nhân ản thành công các gen matK, ITS2 và trnH-psbA bằng kỹ thuật PCR từ DNA tổng số của các mẫu thu được. 3 Đã x đ nh được trình tự đoạn gen matK, ITS2 và trnH-psbA của Tràm n m gân. 4 Đã xây dựng đượ ây ph t sinh hủng loại ủ Tràm n m gân với dòng Tràm kh trên ngân hàng gen quố tế 5. Đoạn trnH-psbA có khả n ng phân iệt o hơn so với đoạn matK, và ITS2 khi so sánh loài psbA củ loài Tràm n m gân (Melaleuca quinquenrvia) với loài Melaleuca viridiflora. Mặc dù vậy cách tốt nhất là sử dụng đồng thời cả 3 đoạn trình tự để có thể x đ nh chính xác nhất loài cần đ nh danh. 4.2. Kiến nghị • C ng ố trình tự gen matK, ITS2 và trnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau này. • Tiếp tụ x đ nh đoạn DNA r ode kh trên đối tượng cây Tràm n m gân • Tiếp tục thu thập mẫu Tràm n m gân ở v ng đ lý kh nh u để đ nh gi toàn diện hơn tính đ dạng di truyền của loài này. • Nghiên ứu và ứng dụng các mã vạ h DNA này để xây dựng ơ sở dữ liệu DNA barcode cho các loài thực vật ở Việt Nam. • Sử dụng gen matK, ITS2 và trnH-psbAvào việ gi m đ nh loài Tràm n m gân ở Việt N m, đồng thời tiến hành nghiên cứu với các mồi kh để tìm ra dấu hiệu x đ nh loài khác nhằm phân loại một cách chính xác và cụ thể hơn

33

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. PGS.TS. Triệu V n Hưng (2007 L n ng i g i t , Dự án Hỗ trợ Chuyên ngành Lâm sản ngoài gỗ Việt Nam – Phần II, trang 724-727. 2 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, NX Đại học Quốc Gia Hà Nội. 3. PGS.TS. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 4. Hồ Huỳnh Th y Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191-198. 5. Nguyễn Đứ Lượng (2002), Công ngh gen NX Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 6 Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Th ng (2008), “Cơ ở di truyền học phân tử và tế b ”, NX Đại học Quốc Gia Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 7. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C H , Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-inv sive rel tives”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091. 8. Vij y n K nd Tsou C H (2010), “DNA r oding in pl nts: t xonomy in new perspe tive”, Current science, vol. 99, pp. 1530 - 1540. 9. Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W. (2003), “Non oding pl stid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of s l ngiosperms”, J. Evol. Biol, (6), pp. 558-576. 10. Sh w J , Li key E , S hilling E E , Sm ll R L (2007),” Comp rison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogeneti studies in ngiosperms”, The tortoise and the hare III. Amer. J. Bot, (94), pp. 275-288.

11. Van den Berg C., Higgins W. E., Dressler R. L., Whitten W. M., Soto Aren s M A , Culh m A , Ch se M W (2000), “A phylogeneti n lysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed sp ers (ITS) of ri osom l DNA”, Lindleyana (15), pp.96114. 12. Kress W J , Eri kson D L (2008), “DNA r odes: Genes, genomi s, nd ioinform ti s”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762. 13. Ole S nd Gitte P (2009), “How m ny lo i does it t ke to DNA r ode ro us?”, PLoS ONE, 4(2), pp. 4598. 14. Y o H , Song J , Liu C , Luo K , H n J (2010), “Use of ITS2 region s theunivers l DNA r ode for pl nts nd nim ls”, PLoS ONE (5), pp.13102. 15. Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L. and Hui Y. (18 December, 2010) “Authenti tion of T xillus hinensis using DNA r oding te hnique”, Journal of Medicinal Research Vol. 4(24), pp. 2706-2709. 16. W ng W , Wu Y , Y n Y , Erm kov M , Kerstetter R (2010) “DNA r oding of the Lemn e e, f mily of qu ti mono ots”, BMC Plant Biology (10), pp.205. 17. Stor hov H , M S Olson (2007), “The r hite ture of the hloropl st psbA-trnH non oding region in ngiosperms” Plant systematic and evolution. Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp. 235-256. 18. Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V , Gér rd C , Christi n , nd Eske W (2007),” Power nd limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA r oding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14. 19. Hollings worth Pm, G S Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PloS ONE, 65 20. Miwa H, O.I. Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et, Al. (2009),”Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441, pp 169 – 175.

WEBSITE 21.https://vi.wikipedia.org/w/index.php?search=Melaleuca+quinquenervia&title =%C4%90%E1%BA%B7c+bi%E1%BB%87t%3AT%C3%ACm+ki%E1%BA %BFm&profile=advanced&fulltext=1&advancedSearch- current=%7B%7D&ns0=1 22.http://baothuathienhue.vn/hy-vong-moi-tu-cay-tram-nam-gan-a10125.html 23. https://khoahocvacongnghevietnam.com.vn/file_pdf/12b-31-36.pdf 24. http://www.caycongtrinh.com.vn/cay-cong-trinh/cay-tram 25. tinhdautram.com.vn ngày 23/5/1019