Bakalářská Práce

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE

Bakalářská práce

Brno 2012 Ondřej Knápek MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE

Evoluce velikosti genomu a obsahu DNA bazí v rodě Nepenthes

Bakalářská práce Ondřej Knápek

Vedoucí práce: Mgr. Petr Šmarda, PhD. Brno 2012

Bibliografický záznam

Autor: Ondřej Knápek Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie Evoluce velikosti genomu a obsahu DNA bazí v rodě Název práce: Nepenthes

Studijní program: PřF B-BI Biologie

Studijní obor: PřF BISE Systematická biologie a ekologie

Vedoucí práce: Mgr. Petr Šmarda, Ph.D.

Akademický rok: 2011/2012

Počet stran: 41+7 Klíčová slova: průtoková cytometrie, láčkovka, Nepenthes, velikost genomu, zastoupení AT/GC bazí, délka průduchů Bibliographic Entry

Author: Ondřej Knápek Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology Evolution of genome size and DNA base composition in Title of Thesis: Nepenthes

Degree programme: PřF B-BI Biology

Field of Study: PřF BISE Systematic Biology and Ecology

Supervisor: Mgr. Petr Šmarda, Ph.D.

Academic Year: 2011/2012

Number of Pages: 41+7 Keyword: flow cytometry, pitcher plant, Nepenthes, genome size AT/GC content, stomatal length Abstrakt

Rod Nepenthes je tropickým rodem masožravých rostlin s cca 120 druhy, rostoucími v pralesních a horských oblastech převážně v Indomalajsii. Pestrost stanovišť, ekologie, geografická izolace ostrovů a masožravá strategie výživy, zde umožňuje testovat řadu hypotéz souvisejících s evolucí genomu rostlin za různých podmínek prostředí. Velikost genomu a AT/GC genomový poměr byly změřeny pro 109 vzorků 97 druhů rodu Nepenthes. Z rostlin byly odebrány vzorky mladých listů pro cytometrická měření a použitím mikroreliéfové metody byly také sejmuty u starších listů otisky spodních stran listů pro měření průduchů. K analyzovaným druhům byly z dostupné literatury dohledány informace o ekologii, morfologii a rozšíření. Velikost genomu u Nepenthes se pohybuje od 1,37 5,95 pg a obsah GC bazí je v rozsahu 35,54 45,13 %, což je v případě velikosti genomu nejvíce u zatím známých masožravých rostlin. Menší velikosti genomu mají primitivní druhy na západním okraji areálu rodu a nejvetší pak radiující druhy, zejména na Sumatře a Borneu, kde by některé druhy (N. lavicola, N. bicalcarata) mohly být polyploidní. Větší velikost genomu na ostrovech naznačuje, že místní radiace by mohla být spojena s amplifikací GC bohaté DNA, vzhledem k signifikantní korelaci velikosti genomu a obsahu GC. Velikost průduchů v rodu je ovlivněna jak velikostí genomu, tak prostředím ve kterém se druhy vyskytují. Abstract

Nepenthes is a tropical genus of carnivorous plants comprising about 120 species, growing in rainforest and montane areas of Indomalaysia. The diversity of habitats, ecology, geographical isolation of islands and carnivorous nutrition strategy, allows testing a number of hypotheses related to the evolution of plant genome under various environmental conditions. Genome size and AT / GC genomic ratio was measured for 109 samples of 97 species of the genus Nepenthes. Samples of young leaves were collected for cytometric measurements. Microrelief reprint method was used for the measurement of the leaf stomatal length. Data about ecology, morphology and distribution were obtained from the available literature. Genome size of Nepenthes ranges from 1.37 up to 5.95 pg; the content of GC bases ranges from 35.54 to 45.13%, which is the largest genome size yet known in carnivorous plants. Smaller genome size are found in the primitive species in the western edge of Nepenthes distribution area and larger genome sizes are typical of radiating species, in particular on Sumatra and Borneo island, where some species with large genomes (N. lavicola, N. bicalcarata) could be polyploids. Larger genome size on the islands suggests that local radiation may be associated with amplification of GC-rich DNA, as supported by the significant correlation of genome size and GC content. Stomatal size in the genus seems affected both by genome size and habitat conditions.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěl poděkovat všem, kteří se fyzicky či psychicky podíleli na zdárném dokončení této práce. Na prvním místě bych tedy chtěl poděkovat mému vedoucímu, panu Mgr. Petru Šmardovi, Ph.D.1) za ochotu při konzultacích a trpělivost při vysvětlování; dále pak patří velký dík Mgr. Lucii Horové1) a Ing. Alexandře Březinové1) za pomoc s cytometrickými měřeními a Mgr. Adamu Velebovi1) za fotografie druhů. Také bych chtěl moc poděkovat RNDr. Vlastiku Rybkovi Ph.D.2) a Mgr. Martinu Dančákovi, Ph.D.3) za poskytnutí rostlinného materiálu k měřením a pomoc při dotváření výsledné matice znaků. Bez jejich ochotné spolupráce by tato studie nevznikla. Děkuji také všem, kteří mi dodávali dobrou náladu a optimismus. Finanční zázemí této práce zajistily projekty LC06073 a MSM0021622416 poskytnuté Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy a projekt GAČR505/11/0881 poskytovaný Grantovou agenturou České republiky.

1) Ústav botaniky a zoologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně 2) Botanická zahrada Praha–Trója 3) Katedra botaniky, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Souhlasím s uložením této bakalářské práce v knihovně Ústavu botaniky a zoologie PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a využitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, že převzaté informace budou řádně citovány a nebudou využívány komerčně.

Brno 9. května 2012 ……………………………… Jméno Příjmení Obsah

1. Čeleď Nepenthaceae ...... 10

1.1. Taxonomie ...... 10

1.2. Historie výzkumu ...... 10

1.3. Morfologie ...... 11

1.4. Rozšíření ...... 12

1.4.1. Teorie osidlování indomalajské oblasti ...... 13

1.5. Ekologie ...... 14

1.6. Pasti (láčky) ...... 15

2. Obsah DNA a poměr AT/CG bazí...... 18

2.1. Velikost genomu ...... 18

2.2. Poměr AT/CG bazí ...... 19

2.3. Velikost průduchů ...... 20

3. Cíle práce ...... 21

4. Materiál a metodika ...... 22

4.1. Materiál ...... 22

4.2. Průtoková cytometrie ...... 22

4.3. Mikroreliéfová metoda ...... 23

4.4. Newick formát, TreeGraph, Phylocom...... 23

4.5. Statistická analýza ...... 25

5. Výsledky ...... 26

6. Diskuse ...... 32

7. Literatura ...... 34

8. Přílohy ...... 41

- 9 -

1. Čeleď Nepenthaceae

1.1. Taxonomie

Čeleď Nepenthaceae Dumortier patří do řádu Caryophyllales Berchtold & J. Presl a obsahuje pouze jediný rod Nepenthes - láčkovka čítající přibližně 120 druhů (McPherson 2009). Kromě toho je známa i řada přírodních a umělých hybridů. Typovým druhem rodu je Nepenthes distillatoria L.

1.2. Historie výzkumu

Rostliny z rodu Nepenthes poprvé zmiňuje Etienne de Flacourt (1658), francouzský guvernér na Madagaskaru. Láčkotvaré rostlině popisované v jeho práci Histoire de la Grande Isle de Madagascar dal jméno Amramatico, pocházející z jazyka místních domorodců. Validně byla rostlina popsána až r. 1797 Jeanem Louisem Maria Poiretem jako N. madagascariensis (Poiret 1797). Další zmínku o rostlině z tohoto rodu, tentokrát ze Srí Lanky, najdeme v práci Acta Medica et Philosophica Hafniensia (Thomas Bartolin 1677; pod jménem „miranda herba“ = „podivuhodná bylina“). Validně tento druh pak popisuje Carl von Linné (1753) pod jménem Nepenthes distillatoria L. Roku 1790 popsal portugalský kněz João Loureiro, ve svém díle Flora Cochinchinensis, druh Phyllamphora mirabilis de Loureiro (1790), dnes známý jako N. mirabilis (Druce 1916). Mnoho druhů láčkovek bylo objeveno a popsáno zejména během řady botanických výprav začátkem 19. století (McPherson 2009). Množství druhů těchto podivuhodných rostlin upoutalo pozornost nejen přírodovědců, ale také veřejnosti, hlavně v tehdejší viktoriánské Anglii, kde pokusy o pěstování láčkovek sahají do roku 1789 (Veitch 1897). Zájem veřejnosti vyvolal také snahu pěstovat láčkovky komerčně. Nejznámější pěstírnou byla bezpochyby firma Veitch Nurseries. Ta podnikala objevné expedice a zabývala se sběrem a dovozem semen i celých rostlin do Velké Británie. Zde je pěstovala ve velkých vytápěných sklenících a dodávala je zprvu botanickým institucím, později pak i bohatým nadšencům a nakonec i širší veřejnosti. V polovině 19. století již láčkovky byly celkem běžně pěstovány v botanických zahradách Velké Británie. První monografii rodu, čítající tehdy 22 druhů, sepsal Ernst Wunschmann (1872). Tuto monografii posléze doplnil o dalších 11 druhů Sir Joseph

- 10 -

Dalton Hooker. Jeho práce Nepenthaceae, zaměřená hlavně na druhy z Bornea, byla publikována v díle Prodromus systematis universalis regni vegetabilis (Hooker in de Candolle 1873). O další monografické zpracování rodu se zasloužil John Muirhead Macfarlane (1908). Jeho práce tehdy popisovala 58 druhů a navíc všechny tehdy známé umělé hybridy. V pozdější monografii Benedictus Danser (1928) sjednocením taxonomickéhho pojetí a synonymiky zredukoval původní počet Macfarlanových 58 druhů na 47, zároveň také přidal popis dalších 17 nových druhů, pocházejících hlavně z Indonésie, Malajsie a Nové Guiney. Ze Sumatry popsali 18 nových druhů Tamin a Hotta (1986), i když se ale později ukázalo, že některé z těchto druhů představují pouze přírodní hybridy. K novějším monografiím rodu patří práce Matthew Jebb & Martin Cheek (1997). Australský botanik a ekolog Charles Clarke zkoumal láčkovky ze Sumatry, Bornea a Malajského poloostrova. Své poznatky publikoval ve dvou knihách Nepenthes of Borneo (Clarke 1997) a Nepenthes of Sumatra and Peninsular Malaysia (Clarke 2001). Poslední ucelený přehled rodu pak podává ve svém dvousvazkovém díle Pitcher Plants of the Old World Stewart McPherson (2009). V této práci autor popisuje 120 druhů rodu Nepenthes a také 5 dalších provizorních druhů.

1.3. Morfologie1

Láčkovky jsou vytrvalé, dvoudomé, dřevnaté nebo polodřevnaté byliny polokeřovitého či liánovitého vzrůstu. Některé druhy rostou poléhavě při zemi, jiné se šplhají po keřích, někdy i vysoko do korun stromů. Stonky jsou válcovité, mírně hranaté nebo v případě sbíhavých listů křídlaté, zpravidla 1–10 m dlouhé, u liánovitých typů pak délka může dosahovat až 40 m (N. bicalcarata). Rostliny rostou zprvu růžicovitě, po několika letech se však začnou nová internodia protahovat a mladá rostlina začne růst do délky. U mnoha druhů se může stonek větvit, a to jak u země, tak nad zemí. K tvorbě postranních větví dochází nejčastěji po odkvětu nebo po poškození hlavního vrcholu. S přibývající délkou stonek odspodu postupně dřevnatí. V úžlabí listů se nachází pupen, ze kterého může v případě poškození vrcholu nebo i samovolně vyrůst postranní větev. Listy jsou střídavé, nejčastěji kožovité. Fylotaxe u

1 Zpracováno převážně podle McPherson (2009) a Clarke (1997; 2001)

- 11 -

láčkovek je spirální, nejčastěji 2/5 nebo 1/2. Tvar, velikost, struktura a připojení listu na stonek jsou druhově specifické. Na konci listové čepele se vytváří úponka, nesoucí láčku. Kořenový systém většiny láčkovek je redukovaný, slouží v podstatě jen k získávání vody a uchycení rostliny k podkladu. Za ideálních podmínek láčkovky rostou a koření v půdě. Mnohdy rostou také pouze jako epifyty (N. fusca) nebo litofyty (např. N. clipeata). Některé druhy láčkovek, rostoucích na sušších stanovištích (N. kampotiana, N. kongkandana a N. smilesii) tvoří ztlustlý kořen jako zásobárnu vody a živin pro suché období. Všechny druhy láčkovek jsou dvoudomé. Samičí i samčí květenství většiny druhů jsou hroznovité, některé druhy mají květenství latnaté (např. N. pervillei). Struktura a délka květenství se u druhů liší, všechny ale tvoří květy se čtyřmi okvětními lístky a bez zřetelných korunních a kališních lístků. Semeník nebo tyčinky, podle pohlaví rostliny, pak vyrůstají uprostřed. O opylování je dosud známo jen relativně málo. Veitch (1897) předpokládal, že květy jsou anemogamní. Pozorování však ukázalo, že láčkovky jsou opylovány hlavně mouchami a nočními motýly (Kato 1993; Stewart McPherson 2009). Drobná, křídlatá semena v tobolce dozrávají přibližně za dva až čtyři měsíce a po otevření tobolky se šíří větrem.

1.4. Rozšíření2

Rod Nepenthes patří mezi rostlinné druhy tropů Starého světa. Nejvíce druhů se vyskytuje v indomalajské oblasti. Druhově nejbohatšími ostrovy jsou Borneo (36 druhů, z toho 29 endemických), Sumatra (37 druhů, 30 endemických) a Jáva (3 druhy). Na dalším místě co do počtu druhů jsou Filipíny (21 druhů, z toho 20 endemických), Malajský poloostrov a Indočína (16 druhů, z toho 11 endemických), Nová Guinea a Moluky (11 druhů, z toho 8 endemických), Sulawesi (9 druhů, z toho 5 endemických), Madagaskaru (2 druhy, oba endemické), Seychelách (1, endemický), Srí Lance (1, endemický), Nové Kaledonii (1 druh) a v Austrálii (2, z toho 1 endemický). Nížinné druhy mají zpravidla větší areály, avšak výrazná většina druhů (přes 70 %) je horských. V této skupině se také vyskytuje nejvíce endemických druhů s areálem omezeným mnohdy jen na jeden horský vrchol.

2 Zpracováno podle McPherson (2009)

- 12 -

Obr. 1: Mapka rozšíření rodu Nepenthes. Mapka z http://en.wikipedia.org/wiki/File:Nepenthes_distribution.svg a doplněna počty druhů dle McPherson (2009). První číslo vyjadřuje celkový počet druhů, číslo v závorce druhy endemické.

1.4.1. Teorie osidlování indomalajské oblasti

Na současné rozšíření rodu Nepenthes mělo vliv mnoho biogeografických faktorů, jako kontinentální drift nebo propojování a oddělování Sundských ostrovů. Důležité jsou také klimatické změny a schopnost druhů šířit se a osidlovat nová stanoviště. Danser (1928), Kurata (1973) a Clarke (1997, 2001) rozlišuji dvě teorie, které mohou vysvětlovat nynější rozšíření rodu Nepenthes. Jedna teorie poukazuje na to, že rod Nepenthes je poměrně mladý. Láčkovky se mohly vyvinout v Jihovýchodní Asii, možná na Sumatře nebo Borneu a to relativně nedávno, pravděpodobně v období rozdělení Gondwany. Odtud se pak rozšířily pomocí větru či jiných vektorů. Clarke (1997, 2001) však v této teorii poukázal na několik trhlin. Nejnápadnější trhlinou je malá schopnost šíření semen. Přestože jsou semena láčkovek drobná a křídlatá, nejsou schopna plachtit větrem a dopadají nedaleko mateřské rostliny. Navíc všechny druhy rodu Nepenthes jsou dvoudomé, takže pravděpodobnost, že se semena dostanou na vzdálené stanoviště, vyrostou z nich jedinci obou pohlaví, vykvetou ve stejnou dobu a dojde k opylení, je velmi malá. Zoochorní šíření semen je také málo pravděpodobné, neboť semena nejsou pro tento způsob šíření nijak adaptována. Pokud by

- 13 -

se na šíření semen podílela zvířata, byl by rod ve vlhkých tropických oblastech pravděpodobně hojněji rozšířen. Další trhlinou v této teorii je, že odlehlé druhy láčkovek, tedy N. distillatoria, N. khasiana, N. mirabilis a N. vieilardii, jsou si morfologicky velmi podobné a možnost nezávislého rozšíření těchto druhů z Jihovýchodní Asie se jeví jako velmi nepravděpodobná. Druhou teorii poprvé nastínil Danser (1928). Podle této teorie je rod Nepenthes mnohem starší a vyvinul se ještě před úplným rozdělením Gondwany, které proběhlo před přibližně 167 miliony lety ve střední Juře. Vzhledem k neschopnosti šířit se semeny na dlouhé vzdálenosti se musely láčkovky vyvinout před oddělením východních částí Gondwany, aby se mohly populace zachovat na následně izolovaných částech. Láčkovky se pravděpodobně vyskytovaly mimo Gondwanu, např. v oblasti kontinentální Asie, v Africe, Jižní Americe a na Antarktidě. Na těchto kontinentech však vyhynuly pravděpodobně vlivem klimatických změn nebo byly vytlačeny jinými druhy. Pohyb částí Gondwany však zanesl láčkovky až do Jihovýchodní Asie. Díky periodickému ochlazování a oteplování ve čtvrtohorách se měnila hladina oceánů. To umožnilo láčkovkám rozšířit se po ostrovech Sundského šelfu. Zde ve vhodném prostředí, obzvláště na Borneu a Sumatře, došlo k jejich radiaci. Tuto teorii podporuje také evoluční historie rodů Dioncophyllum, Habropetalum a Triphyophyllum, které mají s rodem Nepenthes společný původ a jsou si v mnohém podobné (McPherson 2008). Geograficky odlehlé druhy láčkovek na Madagaskaru (N. madagascariensis, N. masoalensis), Seychelách (N. pervillei) a Srí Lance (N. distillatoria) jsou nejbazálnějšími druhy rodu, jak ukazují současné výsledky z fylogenetických analýz sekvencí plastidové DNA (Meimberg et al. 2001; Meimberg & Heubl 2006).

1.5. Ekologie3

Láčkovky jsou vázány na teplotně stabilní klima tropů. Podle tolerance k chladu můžeme láčkovky dělit na dvě hlavní ekologické skupiny: nížinné, zahrnující druhy rostoucí v nadmořských výškách do 1000 m a horské, rostoucí zpravidla nad hranicí 1000 m n. m. Druhy v těchto skupinách mají často podobnou morfologii.

3 zpracováno podle McPherson (2009)

- 14 -

Nížinné druhy obsazují stanoviště s vyššími průměrnými teplotami a malými rozdíly mezi denními a nočními teplotami. Teploty ve dne a v noci zde bývají přibližně v rozmezí 17–35 °C. Druhy horské naopak snášejí relativně nízké teploty a poklesy teplot v noci jim nevadí. Teploty zde během dne mohou dosahovat až 27 °C, v noci pak mohou poklesnout k 7 °C, někdy dokonce mohou dosahovat blízko k bodu mrazu. Mráz však všechny druhy láčkovek nenávratně poškozuje. Všechny láčkovky jsou masožravé a rostou na chudých substrátech, obzvláště na dusík a fosfor (Lloyd 1942). Díky masožravosti jsou schopny obsazovat niky, které nejsou pro jiné rostliny výhodné. Na živinami bohatých půdách většinou nejsou při svém pomalém růstu schopny konkurovat ostatní vegetaci. Substráty na stanovištích, osidlovaných láčkovkami, jsou tvořeny rašelinou, pískem, organickými sedimenty nebo horninami, pokrytými tenkou vrstvou opadu. Bývají převážně kyselé, i když řada druhů je schopná růst i na bazickém podloží (např. vápence, sádrovce a laterity) a ultrabazických hadcích. K dobrému růstu potřebují láčkovky také dostatek světla, vody a vzdušné vlhkosti. Stinné podmínky většinou omezují tvorbu květů a pastí. Na dostatek slunečního záření jsou náročné zejména horské druhy. Vodu láčkovky mohou získávat také z pastí, na jejichž povrchu voda kondenzuje za nižších teplot po ránu nebo kam se zachytává při deštích. Díky zásobě vody v pastech jsou schopny láčkovky přežít i krátký přísušek.

1.6. Pasti (láčky)4

Střední žilka listu prochází jeho špičkou a vytváří úponku, na jejímž konci se po dosažení její maximální délky z „láčkového pupenu“ obvykle vyvine láčka. Úponky a láčky se u zdravých rostlin mohou vyvinout na všech listech. Některé druhy však tvoří pasti pouze na některých listech (N. ampullaria, N. argentii, N. pectinata). Pokud však rostlina nemá příznivé růstové podmínky, pasti se na úponkách nevyvinou. Pastmi jsou podlouhlé duté nádobky s ústím (Obr. 2). Jejich velikost i tvar jsou druhově specifické a mohou do jisté míry záviset na stáří rostliny. Nejmenší láčky tvoří N. argentii (cca 5 cm dlouhé), mezi druhy s největšími pastmi se řadí např. N. rajah (cca 35 cm dlouhé, objem až 3 litry).

4 Zpracováno převážně podle McPherson (2009)

- 15 -

Rostliny tvoří dva druhy láček, tzv. spodní a horní. Horní a spodní pasti se vzhledově často liší, nápadně např. u N. lowii, jen vzácněji jsou tvarem téměř totožné (např. N. clipeata). Spodní láčky vyrůstají na listech v růžici nebo na krátkém stonku, jsou nejčastěji vejčité nebo kulovité, často se opírají o zem a jejich ústí je orientováno ke stonku. K listu jsou připojeny úponkou, vycházející z báze láčky. Na úponce není vytvořena klička. Po vnější stěně láčky od ústí až k bázi sbíhají dvě třepená křidélka, navádějící potenciální kořist k obústí. Horní láčky jsou obvykle protáhlejší, válcovité či nálevkovité, s ústím směřujícím od stonku (Obr. 2). Křidélka jsou buď redukována na žebra, nebo úplně chybí. Úponka se připojuje k láčce na bázi nebo mírně zezadu a na rozdíl od spodních pastí vytváří na horních pastech kličku.

Obr. 2: Morfologické rozdíly mezi horní láčkou (vlevo) a spodní láčkou (uprostřed). Vpravo řez láčkou. Převzato z Clarke (1997).

Ústí láček je lemováno obústím s hladkým povrchem, často vybaveným žebry, ztěžujícími bezpečný pohyb. Na zadní straně láčky se obvykle obústí zvedá a nese víčko. Na víčku a vnitřní straně obústí jsou umístěna nektaria lákající případnou kořist. K vábení kořisti k láčkám napomáhají i nektaria umístěná na listech. Některé druhy se často specializují na lapání jednoho druhu kořisti, např. termitů (N. albomarginata), nebo dokáží využít k zisku živin ptačí trus (N. lowii). Jiné zase nepohrdnou produkty rostlinného původu, např. opadem ze stromů (N. ampullaria).

- 16 -

Když se láčka vyvine a dosáhne plné velikosti, aktivují se sekreční žlázy, které láčku postupně naplní trávicí tekutinou. Teprve po naplnění se láčka otevře a jistou dobu ještě trvá, než pletiva láčky plně vyzrají a získají definitivní barvu. Dospělá láčka je uvnitř přibližně ve spodní třetině poseta trávicími žlázami, které vstřebávají živiny a zároveň také produkují trávicí tekutinu (Shivas 1984). Láčka bývá tekutinou naplněna přibližně z jedné poloviny, ale u mnoha druhů (např. N. ampullaria) se může vlivem dešťů naplnit celá. Tekutina bývá rozdělena na dvě frakce. Horní je tvořena vodou a poskytuje životní prostředí některým druhům živočichů (např. larvy mravence Camponotus schmitzi; Robinson et al. 2009). Spodní frakce obsahuje proteolytické enzymy, kyseliny a vodu (Athauda et al. 2004). Několik druhů (např. N. aristolochioides) tvoří také silně viskoelastickou složku (Hopkins et al. 1990; Salmon 1993), která pokrývá celý vnitřní povrch láčky a zachycenému hmyzu znesnadňuje pohyb vzhůru ven z láčky (Clarke 2001). Jinak jsou horní dvě třetiny láčky obvykle potaženy voskovými šupinkami (Juniper et al. 1989; Gorb et al. 2005), které se snadno stírají, lepí se kořisti na končetiny a zabraňují jí vylézt ven.

- 17 -

2. Obsah DNA a poměr AT/CG bazí

Měření množství DNA a poměru AT/CG bazí je jednoduchým způsobem jak pozorovat globální trendy v evoluci genomu napříč širokým spektrem rostlin. První údaje o obsahu DNA a GC pocházejí z 50. let minulého století (Chargaff 1950; Swift 1950a). Velikost genomu je v současné době známa pro několik tisíc rostlinných druhů (Bennett & Leitch 2011), dat o zastoupení DNA bazí je zatím mnohem méně (Shapiro 1976; Meister & Barow 2007; Šmarda et al. 2008). Navíc hodnoty nejsou vždy shodné, což je důsledkem používání různých detekčních metod. V současné době se k měření obou parametrů používá s úspěchem zejména průtokové cytometrie (Šmarda et al. 2008, 2012; Šmarda & Bureš 2012).

2.1. Velikost genomu

Variabilita velikosti genomu je u rostlin vysoká. Nejmenší genom mezi cévnatými rostlinami byl změřen u masožravého druhu Genlisea margaretae 2C=0,13 pg (Greilhuber et al. 2006) z čeledi Lentibulariaceae. Největší genom má oktoploidní Paris japonica 2C=304,46 pg (Pellicer et al. 2010) z čeledi Melanthiaceae. Velmi malé genomy provázejí celou čeleď Lentibulariaceae (Greilhuber et al. 2006; Veleba ústní sdělení) a obecně malé genomy se dají očekávat i u dalších masožravých rostlin z důvodů popsaných níže. Pro mnohé rody však relevantní data zatím chybí. V rodu Nepenthes byla velikost genomu změřena jen u N. pervillei (2C=548 Mbp, Hanson 2001) Velikost DNA, obsažené v jádře gamet organismu, bez ohledu na ploidii, bývá označována jako C-value (Swift 1950b). Velikost monoploidního genomu označujeme jako Cx-value (Greilhuber et al. 2005), obsah jaderné DNA v somatické buňce pak 2C-value (Greilhuber et al. 2007). Vyjadřuje se v pikogramech (pg) nebo megapárech bazí (Mbp). Velikost genomu se nejčastěji mění v důsledku polyploidizace, amplifikace nebo delece repetitivní DNA, nejčastěji retrotranspozonů (Bennetzen et al. 2005), což jsou částice, schopné samovolného zmnožení a začlenění se do genomu. Pro druhy s velkými genomy je dělení buněk zdlouhavější a replikace většího množství DNA je energeticky náročnější (Benett 1987; Francis et al. 2008). Rostliny s velkými genomy také méně často speciují (Knight et al. 2005). Některá pozorování také naznačují, že velikost genomu může hrát roli v osidlování a adaptivní radiaci na izolovaných ostrovech. Na Kanárských

- 18 -

ostrovech má například většina místních a druhově bohatých rodů překvapivě malé genomy (Suda et al. 2005). Zda je toto obecný trend v osidlování ostrovů však není dosud známo. Schopnost masožravosti se u masožravých rostlin vyvinula jako adaptace na nedostatek živin (Darwin 1875; Givinish et al. 1984; Adamec 1997; Ellison 2006). S přihlédnutím k ekologii a ke zjištěným velikostem genomů několika druhů masožravých rostlin (Greilhuber et al. 2006; Veleba ústní sdělení) se tedy dá předpokládat, že masožravé rostliny obecně budou disponovat spíše malými genomy a dostupnost živin, nebo strategie jejich získávání (různé tvary pastí, epifytismus versus zakořeněný růst) by mohly do jisté míry souviset s tím, jak velký genom budou jednotlivé druhy tolerovat.

2.2. Poměr AT/CG bazí

Poměr zastoupení komplementárních bazí adeninu a thyminu (AT) a cytosinu a guaninu (CG) je dalším zajímavým genomickým parametrem. Zastoupení GC bazí u rostlin se pohybuje přibližně mezi 33 – 49 % (Meister & Barow 2007; Veselý et al. 2012; Šmarda & Bureš 2012). Vztahem mezi poměrem AT/GC a velikostí genomu se zabývalo několik studií. Narayan (1988) zjistil pozitivní vztah v rodu Allium, další pozitivní korelace byla objevena mezi skupinami druhů z čeledí Brassicaceae, Cyperaceae, Poaceae a Salicaceae (Bureš et al. 2007). U živočichů objevil pozitivní vztah Vinogradov (1994). Koopman (2002) objevil negativní vztah u rodu Lactuca. Barow & Meister (2002) vybrali několik druhů ze 17 čeledí z hlavních linií krytosemenných rostlin, ale pozitivní vztah mezi poměrem AT/CG a velikostí genomu se jim nepodařilo prokázat ani mezi jednotlivými druhy v těchto čeledích. Pozitivní trend byl zjištěn u rodu Festuca (Šmarda et al. 2008). Unimodální trend a pozitivní korelaci pro malé genomy a negativní trend pro hodně velké geonomy pak zjistili (Veselý et al. 2012). Obecně může sledování změn obsahu GC bazí a velikosti genomu detekovat změny v genomu spojené v nárůstem či poklesem GC nebo AT bohatých úseků, jako jsou některé retrotranspozony nebo další GC bohaté typy sekvencí (Šmarda et al. 2008; Šmarda & Bureš 2012).

2.3. Velikost průduchů

- 19 -

Hlavní úlohou průduchů je přijímat oxid uhličitý a regulovat transpiraci. Podle Edwards et al. (1998) hrály průduchy jednu z hlavních rolí v evoluci vyšších rostlin. Velikost buněk a tudíž i průduchů ovlivňuje množství jaderné DNA (Strasburger 1893; Trombetta 1942; Mirsky & Ris 1951; Cavalier-Smith 2005; Jovtchev et al. 2006; Knight & Beaulieu 2008; Beaulieu et al. 2008; Hodgson et al. 2010; Veselý et al. 2012) a s velikostí genomu se tedy mění i velikost průduchů. Závislost velikosti genomu na velikosti buňky byla potvrzena kromě krytosemenných rostlin i u řas (Connolly et al. 2007), ryb (Hardie & Hebert 2003) nebo u ptáků (Organ et al. 2007). Tato korelace vyplývá z poměru mezi objemem jádra (obsahem jaderné DNA) a objemem cytoplazmy (Hertwig 1903; Cavalier-Smith 2005; Jorgensen et al. 2007). Beualieu et al. (2008) na základě silné pozitivní závislosti délky průduchů na velikosti genomu předpokládají, že velikost genomu určuje minimální velikost buňky a ostatní faktory již velikost pouze upravují v daném rozmezí. Hodgson et al. (2010) naproti tomu předpokládají, že velikost genomu se přizpůsobila velikosti buněk. Hralová et al. (in prep.) však ukazují, že pro rostliny s malým genomem (rod Carex), kde jádro je mnohem menší, než by odpovídalo velikosti nejmenšího možného průduchu, je ale velikost průduchů spíše ovlivněna ekologií druhů a podobný trend by se dal tedy očekávat i u masožravých rostlin s obecně malými genomy. U krytosemenných rostlin se k měření velikosti používají svěrací buňky průduchů. Nacházejí se na povrchu a jsou tedy snadno pozorovatelné pod optickým mikroskopem. Neprocházejí endopolyploidizací, jak je tomu běžně u jiných buněk (Melaragno et al. 1993; Barow 2006) a jejich velikost je druhově specifická, s určitými odchylkami způsobenými tlakem prostředí (Lomax et al. 2008).

- 20 -

3. Cíle práce

Cílem této práce bylo:

- Změřit velikost genomu a zjistit AT/GC genomový poměr u co největšího počtu druhů rodu Nepenthes

Dále jsme zjišťovali, zda:

- genomické znaky sledují nějaký globální trend a zda vykazují fylogenetický signál - se jednotlivé ostrovy liší ve velikosti genomu a GC obsahu - spolu koreluje velikost genomu a velikost průduchů - spolu koreluje velikost genomu, GC a průduchů s ekologií druhů nebo s některými vybranými morfologickými znaky

- 21 -

4. Materiál a metodika

4.1. Materiál

Materiál k cytometrickému měření byl získáván během let 2010-2011 z Botanické zahrady v Praze-Tróji (Vlastik Rybka) a z pěstebního skleníku PřF UP v Olomouci (Martin Dančák). Z rostlin byly odebírány do plastových sáčků mladé listy na cytometrické analýzy a starší popřípadě suché listy na měření velikosti průduchů.

4.2. Průtoková cytometrie

Velikost genomu a zastoupení AT bazí v DNA byly změřeny pomocí průtokové cytometrie. Jako standard byly použity listy Lycopersicon esculentum ’Stupické polní tyčkové rané‘ (2C=1,74 pg, obsah AT=61,15 %) a Oryza sativa subsp. japonica 'Nipponbare' (2C=0.76 pg, obsah AT=56,4 %). Ze vzorku i ze standardu byly odebírány nejmladší části listových čepelí. Ty pak byly v Petriho misce společně nasekány žiletkou v 0,5 ml roztoku Otto I (4,2 g monohydrátu kyseliny citrónové a 1 ml 0,5% polyoxyethylenesorbitanu monolaurátu, rozpuštěno ve 200 ml destilované vody). Po přidání dalšího 0,5 ml Otto I byly vzorky filtrovány a rozděleny stejným dílem do dvou zkumavek. Vzorek v jedné zkumavce byl obarven AT specifickým fluorochromem DAPI (4 μg/ml 4 ,6-diamidino-2-fenylindol) a analyzován na průtokovém cytometru PA-1 (Ploidy Analyser 1, HBO lamp, Partec GmbH., Německo) za účelem zjištění zastoupení AT bazí. Vzorek ve druhé zkumavce byl obarven interkalárním fluorochromem PI (50 μg/ml propidium jodid) a analyzován na průtokovém cytometru Partec Cy-flow ML (Green Laser 532 nm, Partec GmbH., Německo) za účelem zjištění absolutní velikosti genomu. Tento postup byl u každého vzorku zopakován třikrát, pokaždé v jiný den. Naměřené hodnoty byly následně zprůměrovány. Zastoupení AT bazí bylo spočteno v programu Microsoft Excel pomocí spreadsheetu, vytvořeného P. Šmardou (Šmarda et al. 2008)*. Všechna měření byla prováděna v Laboratoři průtokové cytometrie rostlin na Ústavu botaniky a zoologie PřF MU.

*http://www.sci.muni.cz/botany/systemgr/Data/Festuca/ATGCFlow.xls

- 22 -

4.3. Mikroreliéfová metoda

K zjištění velikosti průduchů byla použita mikroreliéfová metoda. Na místo přibližně uprostřed spodní strany čepele staršího listu byla nanesena slabá vrstvička rychleschnoucího transparentního laku na nehty. Po zaschnutí byla tato vrstvička přenesena proužkem transparentní lepicí pásky na podložní sklíčko. Takto byl vytvořen trvalý preparát, který byl pozorován pod mikroskopem Olympus BX-51 pod celkovým zvětšením 200x. Pomocí kamery Color View II a programu cell^F (Olympus Europa GmbH, Hamburg, Německo) byla změřena délka průduchů (Obr. 3). Průměrná velikost průduchů byla vypočítána z alespoň 100 průduchů. Tato pozorování a měření byla prováděna v Karyologické laboratoři Ústavu botaniky a zoologie PřF MU.

Obr. 3: Výřez ze snímku po změření délky průduchů v programu cell^F

4.4. Newick formát, TreeGraph 2 a Phylocom.

Pro potřeby fylogenetických testů jsme použili existující fylogenetický strom rodu založených na sekvencích chloroplastové DNA (trnK; Meimberg et al. 2006). Pro potřeby testování jsme existující publikovaný strom ručně přepsali v běžném textovém editoru do formátu Newick, bez informace o délkách větví. Ukázka stromu je zobrazena na obr. 4. Ze stromu odstranili ty druhy, ke kterým jsme neměli naměřena žádná data (Obr. 10).

- 23 -

Způsob zápisu formátu Newick bez délky větví: (N._pervillei,N._distillatoria,(N._madagascariensis,N._masoalensis));

Obr. 4: Fylogenetický strom odpovídající výše uvedenému Newick zápisu.

Fylogenetický strom, zapsaný ve formátu Newick, lze zobrazit a upravovat jeho parametry například v programu TreeGraph, který vytvořili Ben Stöver a Kai Müller (Stöver & Müller 2010). Program i návod jsou volně dostupné na této adrese http://treegraph.bioinfweb.info/. Program Phylocom (Webb et al. 2008) slouží k počítání fylogenetických statistik s ekologickými a fylogenetickými daty. Umí pracovat s dichotomickými i polytomickými fylogenetickými stromy, a to i bez délek větví. Délku větví pak nastavuje automaticky na hodnotu = 1. Do programu je možné zadávat pouze data kontinuální či binární. S ordinálními daty pracuje Phylocom jako s kontinuálními. Klasická statistika považuje data za nezávislá. To ale v případě fylogeneze téměř nikdy neplatí, neboť blízce příbuzné druhy se mohou hodnotami některých znaků (např. velikost genomu, velikost průduchů apod.) vzájemně podobat. Ve výsledku je pak stupeň volnosti v analýzách menší, než předpokládá klasická lineární statistika a k testování takovýchto dat je potřeba použít fylogenetické korekce nebo další typy fylogenetických analýz. Míru fylogenetické závislosti dat testuje např. fylogenetický signál. Test fylogenetického signálu v programu Phylocom vychází z předpokladu, že v případě velké fylogenetické závislosti dat budou mít příbuzné druhy podobné hodnoty znaku a získané fylogenetické kontrasty (rozdíly mezi sesterskými druhy) budou menší, než kdyby byly hodnoty znaku po stromě rozmístěny náhodně (Bloomberg et al. 2003). Test v programu Phylocom proto náhodně zamíchá existující hodnoty znaku taxonů a sleduje, do jaké míry je výsledný součet kontrastů na všech uzlech u našeho stromu menší, než součty kontrastů na všech uzlech počítaných na stejném stromu se zamíchanými hodnotami.

- 24 -

4.5. Statistická analýza

Pro analýzu byly vzorky od stejného druhu s podobnou velikostí genomu a obsahem GC sloučeny a zprůměrovány (rozdíly ve velikosti genomu do 8 % a obsahu GC do 1 %). . Vzorky vedené jako jeden druh s většími rozdíly v genomických parametrech sloučeny nebyly. Do analýzy byl vybrán jen ten, který se hodnotami více podobal příbuzným druhům a druhý byl označen jako aff. druhovejmeno. Tím je snad možné vyloučit případné špatné determinace nebo některé nejasnosti spojené s taxonomií některých okruhů v některých méně probádaných oblastech. Dále byla ke vzorkům, vstupujícím do analýzy vytvořena matice prezenčně/absen- čních morfologických a ekologických znaků. Pro zjednodušení byly lokality Madagaskar, Seychely a Indie sloučeny do oblasti Západ. Kambodža, Thajsko a Vietnam pak byly sloučeny do oblasti Indočína. Data byla nejprve testována Shapiro-Wilk testem na normalitu rozložení. Jak surová data pro velikost genomu, tak obsah GC kritérium normality zpočátku nesplňovala (P<0,05) a bylo je nutné proto transformovat. U velikosti genomu se hodnoty transformovaly pomocí přirozeného logaritmu (proměnná ln2C). V případě GC obsahu ne- normalitu způsobovaly dvě malé, odlehlé hodnoty pro N. pervillei a N. truncata a žádná rozumná transformace nepomáhala data normalizovat. Nakonec byl problém vyřešen přičtením 1 % k oběma odlehlým hodnotám (proměnná transfGC), kde pak dat už byla normálně rozložená (p>0,05). Pro genomická data a průduchy byl v prvním kroku testován fylogenetický signál v datech. Tato analýza byla provedena v AOT modulu programu Phylocom (Ackerly in Webb et al. 2008) se standardním nastavením délek větví = 1. U všech tří testovaných znaků (transfGC, ln2C, velikost průduchů) nebyl fylogenetický signál významný (p>0,05) a od dalších fylogenetických testů bylo proto upuštěno. Data pak byla následně testována pomocí klasické lineární statistiky. Byla testována Pearsonova korelace mezi VG, GC a průduchy. Pro prezenčně absenční morfologická a ekologická druhová data bylo t-testem zjišťováno, zda a jak se mezi sebou liší jednotlivé skupiny ve VG, GC a velikosti průduchů liší (Tab. 1). Pro testování rozdílů v těchto znacích mezi jednotlivými oblastmi (ostrovy) byla použita Analýza variance (ANOVA). Podobnost nebo rozdílnost jednotlivých oblastí pak byla následně testována pomocí post Hoc Tukey HSD testu (Tab. 2). Statistická analýza dat byla provedena v programu Statistica 10 (StatSoft, Inc. USA).

- 25 -

5. Výsledky

Průměrná velikost genomu u námi měřených druhů je 2817,45 Mbp, průměrný obsah GC bazí je 41,72 %. Největší velikost genomu mezi změřenými druhy jsme objevili u N. lavicola (2C=5819,75 Mbp) ze Sumatry. Nejmenší genom pak má N. madagascariensis (2C=1348,08 Mbp) z Madagaskaru. Největší obsah GC bazí jsme zjistili u N. macrophylla (45,13 %) z Bornea, nejmenší obsah GC pak u N. pervillei (35,90 %) ze Seychel.

S velikostí genomu významně narůstal obsah GC (p<0,0001; Obr. 5) a velikost průduchů (p=0,0012; Obr. 6).

GC (%)

ln2C:GC %: y = 10,3447 + 3,9696*x; r = 0,6718; p = 0.0000; r2 = 0,4513 34 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8

ln2C (Mbp)

Obr. 5: Závislost velikosti genomu a obsahu GC bazí. Pro obsah GC bylo v tomto případě použito netransformovaných hodnot.

- 26 -

46 ln2C:Pruduchy: y = -6.5788 + 5.0119*x; r = 0.3425; p = 0.0012; r2 = 0.1173 44

Průduchy (um) 32

22 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 ln2C (Mbp)

Obr. 6: Závislost velikosti genomu a délky průduchů.

Západ 40 Sulawesi Malajský poloostrov Indočína

Obsah GC (%) GC Obsah 38 Čína Palavan Moluky Waigeo 36 Nová Guinea S. Austrálie Nová Kaledonie Filipíny 34 Borneo 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Jáva 1500 2500 3500 4500 5500 Sumatra 2C VG (Mbp) Obr. 7: Velikost genomu a obsah GC se zvýrazněnými územími.

- 27 -

Území 2C (Mbp) GC (%) Západ 1717,54 38,98 Indočína 2257,08 40,86 Malajský pol. 2226,71 40,67 Čína 2203,72 41,84 Filipíny 2834,70 41,24 Sumatra 3220,09 42,35 Palavan 2174,34 40,04 Borneo 2623,92 42,12 Jáva 3242,48 42,45

Sulawesi 2168,36 41,36 Moluky 2130,41 40,69 Waigeo 2140,76 40,78 Nová Guinea 2125,40 40,75 Nová Kaledonie 2446,84 40,67 Sev. Austrálie 2160,93 41,15

Tab. 1: Průměrné velikosti genomu a obsahu GC bazí druhů rostoucích v jednotlivých územích .

Faktor N celkové (N p p N celkové (N p délka pozitivní) ln2C transfGC pozitivní) průduchů Hory 97 (59) 0,795 0,009 87 (52) 0,002 Nížiny 97 (31) 1,000 1,000 87 (28) 0,004 Epifyt 97 (29) 0,183 0,017 87 (26) 0,456 Svinutá 97 (95) 0,002 0,002 87 (85) 1,000 Latnaté 97 (7) 1,000 0,069 87 (7) 1,000 Vápenec 97 (7) 1,000 1,000 87 (5) 0,854 Ultramafické 97 (24) 0,177 1,000 87 (23) 0,082 Málo pastí 97 (3) 1,000 1,000 87 (3) 1,000 Speciální pasti 97 (38) 0,611 0,062 87 (35) 0,563 Tab. 2: Výsledky t testů (hodnoty pravděpodobnosti) v genomických parametrech a velikosti průduchů mezi prezenčně/absenčními morfologickými a ekologickými daty. Hodnoty pravděpodobností jsou upraveny pomocí Bonferoniho korekce. Statisticky významné výsledky jsou uvedeny tučně.

Jednotlivé oblasti se liší ve velikosti genomu a obsahu GC (Tab. 1; Obr. 8, 9). Nejmenší genomy mají bazální druhy vyskytující se izolovaně v západní části areálu, největší naopak mají moderní odvozené druhy, které radiovaly na Indomalajských ostrovech jako jsou Filipíny, Jáva, Borneo a Sumatra (Obr. 10, 11). Primitivní druhy se složenou čepelí mají menší genomy, než druhy se svinutou čepelí (Tab. 2). Větší GC obsahy měly druhy schopné růst v horských oblastech, druhy epifytické a se svinutou čepelí. V délce průduchů se však oblasti významně neliší (p>0,05). - 28 -

9,0 bc 8,8 c

8,6 abc 8,4

8,2 ab

8,0

ln2C (Mbp) ln2C 7,8 a

7,6

7,4

7,2

7,0

Čína

Jáva

Západ

Borneo

Moluky Filipíny

Waigeo

Palavan

Sumatra

Indočína

Sulawesi

S Austrálie Median

Nová Guinea Nová 25%-75%

Nová Kaledonie Nová Non-Outlier Range

Malajský poloostrov Outliers Oblast Extremes

Obr. 8: Rozdíly ve velikosti genomu mezi jednotlivými oblastmi. Oblasti označené stejným písmenem se statisticky neliší (Tukey post-hoc test, =0.05).

46 b ab

42 a

transfGC (%) transfGC 40

Čína

Jáva

Západ

Borneo

Moluky Filipíny

Waigeo

Palavan

Sumatra

Indočína

Sulawesi

S Austrálie Median

Nová Guinea Nová 25%-75%

Nová Kaledonie Nová Non-Outlier Range

Malajský poloostrov Outliers Oblast Extremes

Obr. 9: Rozdíly v obsahu GC mezi jednotlivými oblastmi. Oblasti označené stejným písmenem se statisticky neliší (Tukey post-hoc test, =0.05).

- 29 -

Obr. 10: Fylogenetické vztahy mezi studovanými druhy podle Meimberg et al. (2006) s grafickým vyznače- ním naměřených velikostí genomu.

- 30 -

Obr. 11: Průměrné velikosti genomu v jednotlivých oblastech. Mapka je převzata z Meimberg et al. (2006).

- 31 -

6. Diskuse

Čeleď Nepenthaceae je s průměrnou velikostí genomu 2817 Mbp největší mezi dosud známými skupinami masožravých rostlin. Ostatní masožravé čeledi, např. Lentibulariaceae mají průměrnou velikost genomu 958 Mbp (Greilhuber et al. 2006), Droseraceae pak průměrnou velikost genomu 1447 Mbp (Rothfels & Heimburg 1968). Z rodu Nepenthes zatím byla změřena velikost genomu pouze u N. pervillei, 2C=548 Mbp (Hanson 2001). My jsme u N. pervillei naměřili velikost genomu 2C=1391 Mbp. Také jsme zjistili rozdíl ve velikosti genomu mezi vzorky N. tentaculata ze Sulawesi (2C=1759 Mbp, GC%=40,06) a N. tentaculata z Bornea (1930 Mbp, GC%=40,62). Zde by se mohlo jednat o dva různé, blízce příbuzné druhy. V rodu Nepenthes jsme objevili rozdíly ve velikosti genomu mezi jednotlivými územími. Suda et al. (2005) zjistili, že druhy, rostoucí na Kanárských ostrovech, disponují menšími genomy než příbuzné druhy na kontinentu. Knight et al. (2005) naznačují, že druhy s většími genomy tvoří méně často nové druhy. Z toho by se mohlo zdát, že radiace druhů na ostrovech bude nějak souviset se zmenšováním genomu. Pokud se rod Nepenthes vyvinul ještě před rozpadem Gondwany a při jejím rozpadu se postupně druhy šířily po ostrovech Sundského šelfu (Danser 1928; Kurata 1973; Clarke 1997, 2001; McPherson 2009), pak naše výsledky ukazují pravý opak. Druhy rodu Nepenthes, radiující na indonéských ostrovech a zvláště ty, které rostou v centru areálu na Sumatře či Borneu, mají větší genomy, než primitivní druhy na západní hranici areálu (Obr. 8). Pozitivní vztah mezi velikostí genomu a obsahu GC bazí nasvědčuje, že by tato situace by mohla být způsobena např. aktivitou GC bohatých transpozonů. Efekt transpozonů na genomové přestavby je dobře znám (Bennetzen et al. 2005). Ačkoliv se předpokládá že aktivita transpozonů bude mít vliv na intenzitu vzniku nových druhů (Vitte & Panaud 2005), nikdo to zatím netestoval. Rod Nepenthes by v tomto ohledu mohl do budoucna dobře posloužit jako modelová skupina. Druhy s velkými genomy ale relativně nízkými obsahy GC bazí jsou nejspíš polyploidní. U rodu Nepenthes je počet chromozomů v somatických buňkách znám u 15 druhů a je vždy 2n=80 (Heubl 1996; Heubl & Wistuba 1997). Polyploidi jsou obecně u masožravých rostlin vzácní a ani u Nepenthes nikdo zatím polyploidní rostliny neočekává. U několika druhů Nepenthes s velkými genomy (N. lavicola, N. bicalcarata) by proto bylo vhodné v budoucnu chromozomové počty ověřit. Ačkoliv jsme se o to pokoušeli u - 32 -

kořenových špiček a klíčících semen, chromozomy se nám u těchto druhů zatím spočítat nepodařilo. Při porovnání velikosti genomu jsme objevili sice pozitivní vztah, ale mnohem slabší než jak obecně předpokládá dostupná teorie (Beaulieu et al. 2008). To by mohlo být obecně způsobené variabilitou v délce průduchů mezi jednotlivými listy, kterou jsme detailně nesledovali. Vzhledem k tomu, že velikosti průduchů se významně liší mezi horskými a nížinnými druhy (více než velikosti genomu), mohlo by na velikost průduchů mít vliv i prostředí, jak to předpokládá Hralová (2010) v rodu Carex.

- 33 -

7. Literatura

Adamec L. 1997. Mineral nutrition of carnivorous plants: A review. Botanical Review 63: 273–299.

Athauda SBP, Matsumoto K, Rajapakshe S, Kuribayashi M, Kojima M, Kubomura- Yoshida N, Iwamatsu A, Shibata C, Inoue H, Takahashi K. 2004. Enzymatic and structural characterization of nepenthesin, a unique member of a novel subfamily of aspartic proteinases. Biochemical Journal 381: 295–306.

Barow M. 2006. Endopolyploidy in seed plants. BioEssays 28: 271–281.

Barow M, Meister A. 2002. Lack of correlation between AT frequency and genome size in higher plants and the effect of nonrandomness of base sequences on dye binding. Cytometry 47: 1–7.

Bartolini T. 1677. Acta Medica et Philosophica Hafniensia. Copenhagen.

Beaulieu JM, Leitch IJ, Patel S, Pendharkar A, Knight CA. 2008. Genome size is a strong predictor of cell size and stomatal density in angiosperms. New Phytologist 179: 975–986.

Bennett MD. 1987. Variation in genomic form in plants and its ecological implications. New Phytologist 106 (Suppl.): 177–200.

Bennett MD, Leitch IJ. 2011. Nuclear DNA amounts in angiosperms: targets, trends and tomorrow. Annals of Botany 107: 467–590. Bennetzen JL, Ma J, Devos KM. 2005. Mechanisms of recent genome size variation in flowering plants. Annals of Botany 95: 127–132.

Blomberg, SP, Garland T Jr, Ives AR. 2003. Testing for phylogenetic signal in comparative data: behavioral traits are more labile. Evolution 57: 717–745.

Bureš P, Šmarda P, Hralová I, Fuentes-Soriano S, Lysák M, Řepka R, Helánová K, Rotreklová O, Procházková J, Úradníček L, Kůrová J. 2007. Correlation between GC content and genome size in plants. Cytometry 71A: 764.

Cavalier-Smith T. 2005. Economy, speed and size matter: evolutionary forces driving nuclear genome miniaturization and expansion. Annals of Botany 95: 147–175.

Clarke CM. 1997. Nepenthes of Borneo. Natural History Publications (Borneo), Kota Kinabalu, Malaysia. - 34 -

Clarke CM. 2001. Nepenthes of Sumatra and Peninsular Malaysia. Natural History Publications (Borneo), Kota Kinabalu, Malaysia.

Connolly JA, Oliver MJ, Beaulieu JM, Knight CA, Tomanek L, Moline MA. 2007. Correlated evolution of genome size and cell volume in diatoms (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 44: 124–131.

Danser B. 1928. The Nepenthaceae of the Netherland Indies. Bulletin de Jardin de Botanique, Buitenzorg, 3: 249–438

Darwin C. 1875. Insectivorous plants. John Murray: London, England.

De Flacourt E. 1658. Histoire de la Grande Isle de Madagascar. Paris, France.

De Loureiro J. 1790. Flora Cochinchinensis: Plantas in Regno CochinChina Nascentes. Volume I. Lisbon.

Druce G. 1916. Nomenclatural notes; chiefly African and Australian. Report of the Botanical Society and Exchange Club of the British Isles. Seccond Suppl.: 637.

Edwards D, Kerp H, Hass H. 1998. Stomata in early land plants: an anatomical and ecophysiological approach. Journal of Experimental Botany 49: 255–278.

Ellison AM. 2006. Nutrient limitation and stoichiometry of carnivorous plants. Plant Biology 8: 740–747.

Francis D, Davies MS, Barlow PW. 2008. A strong nucleotypic effect on the cell cycle regardless of ploidy level. Annals of Botany 101: 747–757.

Givnish TJ, Burkhardt EL, Happel RE, Weintraub JD. 1984. Carnivory in the bromeliad Brocchinia reducta, with cost/benefit model for the general restriction of carnivorous plants to sunny, moist, nutrient poor habitats. American Naturalist 124: 479–497.

Gorb E, Haas K, Henrich A, Enders S, Barbakadze N, Gorb S. 2005. Composite structure of the crystalline epicuticular wax layer of thhe slippery zone in the pitchers of the carnivorous plant Nepenthes alata and its effect on insect attachment. Journal of Experimental Biology 208: 4651–4662.

Greilhuber J, Borsch T, Miller K, Worberg A, Porembski S, Barthlott W. 2006. Smallest angiosperm genomes found in Lentibulariaceae, with chromosomes of bacterial size. Plant Biology 8: 770–777.

- 35 -

Greilhuber J, Doležel J, Lysák M, Bennett MD. 2005. The origin, evolution and proposed stabilization of the terms ‘genome size’ and ‘C-value’ to describe nuclear DNA contents. Annals of Botany 95: 255–260.

Greilhuber J, Temsch EM, Loureiro JCM. 2007. Nuclear DNA content measurement. In: Doležel J, Greilhuber J, Suda J. (eds.) Flow cytometry with plant cells. Wiley- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp. 67–101.

Hanson L, McMahon KA, Johnson MAT, Bennett MD. 2001. First nuclear DNA C- values for 25 angiosperm families. Annals of Botany 87: 251–258.

Hardie DC, Hebert PD. 2003. The nucleotypic effects of cellular DNA content in cartilaginous and ray-finned fishes. Genome 46: 683–706.

Hertwig R. 1903. Über die Korrelation von Zell-und Kerngrösse und ihre Bedeutung für die Geschlechtliche Differenzierung und die Teilung der Zelle. (On the correlation of cell and nuclear size and its significance for the sex distinction and the division of the cell.) Biologisches Centralblatt 23: 4–62.

Heubl GR. 1996. Bemerkungen zur Karyologie der Cochlearia pyrenaica-Gruppe unter besonderer Berücksichtigung von C. macrorrhiza (Schur) Pobed. Berichte der Bayerischen Botanischen Gesellschaft 66/67: 153–156.

Heubl G, Wistuba A. 1997. A cytological study of the genus Nepenthes L. (Nepenthaceae). Sendtnera 4: 169–174.

Hodgson JG, Sharafi M, Jalili A, Díaz S, Montserrat-Martí G, Palmer C, Cerabolini B, Pierce S, Hamzehee B, Asri Y, Jamzad Z, Wilson P, Raven JA, Band SR, Basconelo S, Bogard A, Carter G, Charles M, Castro-Díez P, Cornelissen JHC, Funes G, Jones G, Khoshnevis M, Pérez-Harguindeguy N, Pérez-Rontomé MC, Shirvany FA, Vendramini F, Yazdani S, Abbas-Azimi R, Boustani S, Dehghan M, Guerrero-Campo J, Hynd A, Kowsary E, Kazemi-Saeed F, Siavash B, Villar- Salvador P, Craigie R, Naquinezhad A, Romo-Díez A, De Torres Espuny L, Simmons E. 2010. Stomatal vs. genome size in angiosperms: the somatic tail wagging the genomic dog? Annals of Botany 105: 573–584.

Hooker JD. Nepenthaceae. In: De Candolle AP. 1873. Prodromus: Systemis Naturalis Regni Vegetabilis. SG Mason, Paris.

Hopkins M, Maulder R, Salmon B. 1990. A real nice trip to Southeast Asia. Carnivorous Plant Newsletter 19: 19–28.

- 36 -

Hralová I. 2010. Obsah DNA a AT/GC genomový poměr u druhů rodu Carex. Master thesis, Masaryk university, Brno.

Chargaff E. 1950. Chemical specifity of nucleic acids and mechanism of their chemical degradation. Experientia 6: 201–209. International Rice Genome Sequencing Project. 2005. The map-based sequence of the rice genome. Nature 436: 793–800.

Jebb M, Cheek M. 1997. A skeletal revision of Nepenthes (Nepenthaceae). Blumea 42: 1– 106.

Jorgensen P, Edgington NP, Schneider BL, Rupeš I, Tyers M, Futcher B. 2007. The size of the nucleus increases as yeast cells grow. Molecular Biology of the Cell 18: 3523– 3532.

Jovtchev G, Schubert V, Meister A, Barow M, Schubert I. 2006. Nuclear DNA content and nuclear and cell volume are positively correlated in angiosperms. Cytogenetic and Genome Research 114: 77–82. Juniper BE, Robins RJ, Joel D. 1989. The carnivorous plants. Academic Press: London, England.

Kato M, Hotta M, Tamin R, Itino T. 1993. Inter–and intra–specific variation in prey assemblages and inhabitant communities in Nepenthes pitchers in Sumatra. Tropical Zoology, 6: 11–25.

Knight CA, Beaulieu JM. 2008. Genome size scaling through phenotype space. Annals of Botany 101: 759–766.

Knight CA, Molinari NA, Petrov DA. 2005. The large genome constraint hypothesis: evolution, ecology and phenotype. Annals of Botany 95: 177–190.

Koopman WJM. 2002. Zooming in on the lettuce genome: species relationships in Lactuca s.l., inferred from chromosomal and molecular characters. Ph.D. thesis, Wageningen University, Wageningen.

Kurata S. 1973. Nepenthes from Borneo, Singapore and Sumatra. Gardens' Bulletin, Singapore 26: 227–232.

Linnaeus C. 1753. Species Plantarum. First edition, Laurentii Salvii: Stockholm: Sweden.

Lloyd FE. 1942. The carnivorous plants. Ronald Press: New York, USA.

- 37 -

Lomax BH, Woodward FI, Leitch IJ, Knight CA, Lake JA. 2008. Genome size as a predictor of guard cell length in Arabidopsis thaliana is independent of environmental conditions. New Phytologist 181: 311–314.

Macfarlane JM. 1908. Nepenthaceae. In: Engler A. Das Pflanzenreich. 4: 1–91. Engelmann W, Leipzig.

McPherson S. 2008. Glistening carnivores, the sticky-leaved insect-eating plants. Redfern Natural History Publications: Poole, England..

McPherson S. 2009. Pitcher plants of the Old World volume one. Redfern Natural History Publications: Poole, England.

McPherson S. 2009. Pitcher plants of the Old World volume two. Redfern Natural History Publications: Poole, England.

Meimberg H & Heubl G. 2006. Introduction of a nuclear marker for phylogenetic analysis of Nepenthaceae. Plant Biology 8: 831–840.

Meimberg H, Wistuba A, Dittrich P, Heubl G. 2001. Molecular phylogeny of Nepenthaceae based on cladistic analysis of plastid trnK intron sequence data. Plant Biology 3: 164–175.

Meister A, Barow M. 2007. DNA base composition of plant genomes. In: Doležel J, Greilhuber J, Suda J. (eds.) Flow cytometry with plant cells. Wiley-VCH Verlag GmBH & KGaA: Weinheim, Netherland, pp 177–215.

Melaragno JE, Mehrotra B, Coleman AW. 1993. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell 5: 1661–1668.

Mirsky AE, Ris H. 1951. The desoxyribonucleic acid content of animal cells and its evolutionary significance. Journal of General Physiology 34: 451–462.

Organ CL, Shedlock AM, Meade A, Pagel M, Edwards SV. 2007. Origin of avian genome size and structure in non-avian dinosaurs. Nature 446: 180–184.

Pellicer J, Fay MF, Leitch IJ. 2010. The largest eukaryotic genome of them all? Botanical Journal of the Linnean Society 164: 10–15.

Poiret J. 1797. Népente. In: Lamarck J. Encyclopédie Méthodique, Botanique. 4: 459. Panckoucke, , Paris 1783-1808.

Robinson AS, Fleischmann AS, McPherson SR, Heinrich VB, Gironella EP, Peña CQ. 2009. A spectacular nev species of Nepenthes L. (Nepenthaceae) Pitcher plant - 38 -

from central Palawan, Phillippines. Botanical Journal of the Linnean Society 159: 195–202.

Rothfels K, Heimburg M. 1968. Chromosome size and DNA values in sundews (Droseraceae). Chromosoma 25: 96–103.

Salmon B. 1993. Some observations on the trapping mechanisms of Nepenthes inermis and N. rhombicaulis. Carnivorous Plant Newsletter 22: 11–12.

Shivas RG. 1984. Pitcher plants of Peninsular Malaysia and Singapore. Maruzan Asia Pte: Singapore, Singapore.

Stöver BC, Müller KF. 2010. TreeGraph 2: Combining and visualizing evidence from different phylogenetic analyses. BMC Bioinformatics 11: 7.

Strasburger E. 1893. Über die Wirkungssphäre der Kerne und die Zellgrösse. Histologische Beitrag 5: 97–124.

Suda J, Kyncl T, Freiová R. 2003. Nuclear DNA amounts in Macronesian angiosperms. Annals of Botany 92: 153–164. Suda J, Kyncl T, Jarolímová V. 2005. Genome size variation in Macaronesian angiosperms: forty percent of the Canarian endemic flora completed. Plant Systematics and Evolution 252/3–4: 215–238. Swift HH. 1950a. The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 36: 643–654.

Swift HH. 1950b. The desoxyribose nucleic acid content of animal nuclei. Physiological Zoology 23: 169–198.

Šmarda P, Bureš P, Horová L, Foggi B, Rossi G. 2008. Genome size and GC content evolution of Festuca: ancestral expansion and subsequent reduction. Annals of Botany 101: 421–433.

Šmarda P, Bureš P. 2012. The variation of base composition in plant genomes. In: Wendel JF, Greilhuber J, Doležel J, Leitch IJ (eds.), Plant genome diversity. Vol. 1, Springer, Wien, pp. 209 235.

Šmarda P, Bureš P, Šmerda J, Horová L. 2012. Measurements of genomic GC content in plant genomes with flow cytometry: a test for reliability. New Phytologist 193: 513–521.

- 39 -

Tamin R, Hotta M. 1986. Nepenthes di Sumatera: The genus Nepenthes of the Sumatra Island. In: Hotta M. (ed.) Diversity and dynamics of plant life in Sumatra 1. Kyoto University: Kyoto, Japan, pp. 75–109.

Trombetta VV. 1942. The cytonuclear ratio. Botanical Review 8: 317–336.

Veitch HJ. 1897. Nepenthes. Journal of Royal Horticultural Society. 21: 226–262.

Veselý P, Bureš P, Šmarda P, Pavlíček T. 2001. Genome size and DNA base composition of geophytes: the mirror of phenology and ecology? Annals of Botany 109: 65–75.

Vinogradov AE. 1994. Measurement by flow cytometry of genomic AT/GC ratio and genome size. Cytometry 16: 34–40.

Vitte C, Panaud V. 2005. LTR retrotransposons and flowering plant genome size: emergence of the increase/decrease model. Cytogenetic and Genome Research 110: 91–107.

Webb CO, Ackerly DD, Kembel SW. 2008. Phylocom: software for the analysis of phylogenetic community structure and trait evolution. Bioinformatics, 24: 2098– 2100.

Wunschmann E. 1872. Über die Gattung Nepenthes besonders in Rücksicht auf ihre physiologische Eigenthümlichkeit. Inaugural–Disertation von der Philosophischen Fakultät der Friedrich–Wilhelms–Universität Berlin. Berlin, Germany.

- 40 -

8. Přílohy

Seznam příloh:

Tabulka vzorků s lokalitami a cytometrickými daty

Tabulka s maticí ekologických a morfologických znaků

- 41 -

Nep77 Nep77 Nep48 Nep08 Nep03 51 Nep Nep46 Nep27 Nep90 Nep11 Nep24 57 Nep Nep37 Nep117 Nep105 Nep20 Nep39 58 Nep Nep91 Nep106 Nep67 Nep29 Nep18 62 Nep 59 Nep Nep07 Nep01 Nep93 Nep109 měření cytometrických výsledky a původ jejich vzorků, měřených Seznam 1: Příloha

Vzorek distillatoria L. distillatoria Cheek & Jebb diatas Danser densiflora Cheek & Jebb danseri Macfarl. Merr. Ex copelandii Danser clipeata Kurata Sh. campanulata Mast. burkei exBurb. Hook.f. burbidgeae Korth. boschiana Korth. bongso Mey bokorensis f. Hook. bicalcarata f. Hook. bicalcarata Clarke C. benstonei Kondo K. belii Macfarl. beccariana Cheek & Jebb aristolochioides Cheek & Jebb aristolochioides Cheek & Jebb argentii Jack ampullaria ex Lindl. Lobb T. albomarginata ex Lindl. Lobb T. albomarginata Ridl alba/gracilima Blanco alata Danser spathulata / adrianii Hotta M. & Tamin adnata dubia Danser dubia

Druh N111A N08A N21A N15C 2829 1845 2877 2868 N09C 2838 2870 A N114 N07B N07B 2830 2837 2886 2831 N276 2270 2871 2841 2840 2887 2839 2836 ID Sumatra Indonesia; Sri-Lanka Sumatra Indonesia; Sumatra Indonesia; Waigeo Indonesia; Apo Mt. Mindanao; Kelam Mt. Kalimantan, Indonesia; Kalimantan Philippines Kinabalu Mt. Sabah, Malaysia; Selatan Kalimantan Indonesia; Sago Gunung Sumatra, Indonesia; Bokor Phnom Cambodia; Sabah Malaysia; Sabah Malaysia Mindanao Philippines; Sumatra Indonesia; Sumatra Indonesia; Sumatra Indonesia; Philippines Songkhla Thailand; Malaysia Malaysia Tahan Gunung Malaysia, Pass Guerilla Luzon, Philippines; Java Sumatra

Lokality Troja 2009 Pásek K. Pásek K. Pásek K. 2009 Švarc D. Trója Praha- BG 2007 Troja Praha- BG 2006 Rybka V. Troja Praha- BG 2009 M.Dančák 2009 Pásek K. Trója Praha- BG 2009 Pásek K. 2009 D.Švarc 2006 Rybka V. Trója Praha- BG 2007 Trója - Praha BG 2007 M.Dančák Pásek K. N276 N02B ID Rybka V. původně

Poznámka 3406 4936 5061 2626 2017 2721 2030 2437 3318 4129 2065 3179 2249 2733 2451 2078 2682 3249 3438 3441 2161 2077 3756 2328 5742 5733 2136 3010 2C VG (Mbp) 41,74 43,67 44,01 39,47 40,03 40,69 39,93 41,06 40,37 42,82 40,54 42,51 40,54 42,72 42,36 39,73 40,42 42,05 41,93 42,93 41,15 40,63 43,80 39,98 43,38 43,53 40,07 43,17 GC (%) rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce

Standard 1,72 2,24 2,25 1,49 1,11 1,45 1,12 1,27 1,80 1,96 1,11 1,54 1,21 1,31 1,19 1,16 1,45 1,61 1,71 1,62 1,12 1,11 1,69 1,29 2,64 2,62 1,18 1,40 DAPI průměr 0,21 0,39 0,64 0,12 0,31 0,90 0,25 0,36 0,76 0,38 0,20 0,83 0,36 0,27 0,48 0,32 0,31 0,47 0,81 0,23 1,03 0,24 0,43 0,84 0,51 0,96 0,16 0,68 CV DAPI měření 2,01 2,91 2,98 1,55 1,19 1,60 1,20 1,44 1,96 2,43 1,22 1,87 1,33 1,61 1,44 1,22 1,58 1,92 2,03 2,03 1,27 1,22 2,21 1,37 3,38 3,38 1,26 1,77 PI průměr 1,03 2,47 0,42 0,68 1,95 0,16 1,80 1,23 1,86 0,23 0,86 1,71 1,47 1,41 0,28 1,99 0,59 1,26 0,14 1,02 0,73 0,29 0,57 2,36 1,55 0,55 0,61 1,91 CV PI měření 0,86 0,77 0,75 0,96 0,94 0,90 0,94 0,89 0,92 0,81 0,91 0,82 0,91 0,81 0,83 0,95 0,92 0,84 0,85 0,80 0,88 0,91 0,76 0,94 0,78 0,78 0,93 0,79 DAPI/PI průměr 0,82 2,14 0,92 0,75 2,27 0,75 1,67 0,93 2,19 0,61 0,87 1,18 1,23 1,19 0,76 2,20 0,78 1,73 0,67 0,79 0,51 0,53 0,73 1,57 1,55 0,53 0,75 1,28 CV DAPI/PI

Délka 29,19 40,80 38,34 28,65 35,48 34,36 30,98 32,95 27,73 33,02 38,02 33,74 33,92 32,35 34,74 35,32 35,98 29,55 31,07 36,08 33,98 34,41 průduchů (µm) Nep34 Nep70 Nep28 Nep100 Nep44 Nep31 Nep104 Nep118 Nep76 Nep115 Nep49 Nep26 Nep64 Nep15 Nep22 Nep96 Nep114 Nep111 Nep16 61 Nep Nep72 Nep120 Nep120 Nep119 Nep110 Nep80 Nep87 Nep04

Vzorek Tamin Tamin & TroyDavis Clarke, C. jacquelinae Tamin & Clarke C. TroyDavis, izumiae Danser insignis Danser insignis Danser inermis McPherson S. & Lee C. Chi Clarke, C. chaniana 2010) (M. Catal chang Lamb L. A. & Cheek hurrelliana f. Hook hirsuta f. Hook hirsuta Middleton A.T. & Thurnbull J.R. hamata Nees gymnamphora Nees gymnamphora gracilisKorth. Blanco Elmer/alata graciliflora globosa var. mirabilis / globosa globosa var. mirabilis / globosa Middleton A.T. & Thurnbull J.R. glabrata Danser fusca Fleischmann A. & Nerz Wistuba, flava Wilcock & Adam H. J. faizaliana Wilcock & Adam H. J. faizaliana Wilcock & Adam H. J. faizaliana Wilcock & Adam H. J. faizaliana Kurata Sh. eymae Miq. eustachya Danser ephippiata Hernawati & Akhriadi & Hernawati C.Lee, Chi jamban

Druh N24A 2842 2862 B N106 A N117 102A N N32C 2874 N31E 2859/ N30A 2845 2844 N02G A N107 A N107 2843 3068 C N104 N34C N34C N34B N34B N25D 2860 2846 N36C 2863 ID Sumatra Gadang Gunung Sumatra, Indonesia; Talang Gunung Sumatra, Indonesia; Jaya Irian Indonesia; Jaya Irian Indonesia; Talang Gunung Sumatra, Indonesia; Malaysia Mts. Banthad Thailand; Malaysia Sarawak Malaysia; Sarawak Malaysia; Sulawesi Indonesia; Java Indonesia; Java Indonesia; Sabah Malaysia; Sibuyan Philippines; Thailand Thailand Sulawesi Indonesia; Sabah Malaysia; Sumatra Indonesia; Sarawak Malaysia; Sarawak Malaysia; Sarawak Malaysia; Sarawak Malaysia; Sulawesi Indonesia; Tjampo G. Sumatra; Sumatra Indonesia;

Lokality samec Švarc D. 2009 Švarc D. Pásek K. Nerz 2009 Švarc D. 2009 Švarc D. 2008 Trója Praha- BG 2009 Švarc D. Pásek K. Trója Praha- BG Pásek K.

Poznámka 2496 1956 2154 2075 2611 2946 1898 1951 2398 2479 2184 2727 2423 2725 3278 2921 2636 3669 2644 2556 2547 3194 2670 2779 2358 2248 3394 1687 2C VG (Mbp) 39,49 40,91 42,23 41,87 43,09 42,27 39,38 39,40 40,77 41,30 40,71 41,97 42,51 42,36 42,67 42,31 41,76 43,25 42,40 43,01 40,39 43,14 44,43 44,95 43,85 41,36 42,70 40,47 GC (%) rajce Oryza Oryza Oryza rajce rajce Oryza rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce Oryza Oryza rajce Oryza

Standard 1,41 2,91 2,99 2,93 1,22 1,44 3,06 1,11 1,27 1,28 1,16 1,36 1,17 1,33 1,57 1,43 1,33 1,70 1,29 1,20 1,38 1,49 1,16 1,17 2,99 3,25 1,62 2,57 DAPI průměr 0,73 0,89 0,39 0,41 1,04 1,22 0,50 0,87 0,84 0,38 0,76 0,11 0,07 0,45 1,13 0,57 1,70 0,21 0,42 1,17 1,07 1,00 0,57 0,46 1,22 1,95 0,47 0,43 CV DAPI měření 1,47 2,52 2,77 2,67 1,54 1,74 2,44 1,15 1,41 1,46 1,29 1,61 1,43 1,61 1,93 1,72 1,55 2,16 1,56 1,51 1,50 1,88 1,57 1,64 3,03 2,89 2,00 2,17 PI průměr 1,49 1,35 1,78 1,31 1,31 1,89 0,16 2,29 1,86 1,46 1,03 1,62 1,68 0,72 1,95 2,12 1,73 0,99 1,20 1,82 2,28 1,93 2,61 1,09 1,80 1,74 0,32 0,85 CV PI měření 0,96 1,16 1,08 1,10 0,79 0,83 1,25 0,97 0,90 0,88 0,90 0,84 0,82 0,83 0,81 0,83 0,85 0,79 0,83 0,80 0,92 0,79 0,74 0,71 0,99 1,13 0,81 1,18 DAPI/PI průměr 1,50 2,17 2,15 1,31 0,47 0,78 0,66 2,26 1,54 1,75 0,27 1,55 1,74 1,10 1,75 1,54 1,22 0,83 1,45 1,20 1,51 1,78 2,56 0,98 1,45 1,96 0,58 0,84 CV DAPI/PI

Délka 38,65 37,16 25,95 37,14 37,01 31,52 34,63 31,87 38,78 33,03 31,55 31,22 28,83 32,46 27,39 32,77 30,18 33,39 32,68 32,60 25,23 29,40 průduchů (µm) Nep112 Nep124 Nep32 Nep116 Nep50 Nep79 Nep83 Nep42 Nep101 Nep99 Nep121 55 Nep Nep23 Nep17 Nep108 Nep41 Nep45 Nep107 Nep38 Nep95 Nep75 Nep30 Nep36 Nep85 Nep123 Nep06 Nep06

Vzorek petiolata Danser petiolata Danser petiolata Blume pervillei Blume pervillei Nees a Danser/gymnamphor pectinata papuana Danser Wistuba Nerz & ovata f. Hook northiana Macfarl. neoguinensis M.Hotta muluensis Wilcock & J.H.Adam ex Slack (Hook.f.) echinostoma var. Druce (Lour.) mirabilis Druce (Lour) mirabilis Cheek & Jebb mira Kurata Sh. mindanaoensis Maulder & Salmon R. B. mikei Macfarl. merrilliana Nees ex Reinw. maxima Poir. madagascariensis Middleton A.T. & Thurnbull J.R. macrovulgaris Cheek & Jebb macrophylla Hemsl. macfarlanei f. Hook lowii Wistuba Nerz & longifolia Rischer & Wistuba lavicola f. Hook. khasiana f. Hook. khasiana Macfarl. philippinensis

Druh 2832 N60D 2875 N56A N55A N53A 2849 2850 2848 2876 2864 2869 N44A N43B 2835 1853 N91B N38B N87A N62A 1854 N61B 2872 N59A ID Palawan Philippines; Hilong Hilong Mt. Mindanao, Philippines; Hilong Hilong Mt. Mindanao, Philippines; Mahé Seychelles; Mahé Seychelles; Talang Gunung Sumatra, Indonesia; Guinea New Pangulubao Gunung Sumatra, Indonesia; Sarawak Malaysia; Jaya Irian Indonesia; Mulu Gunung Sarawak, Malaysia; Palawan Philippines; Sumatra Indonesia; Mindanao Philippines; Madagascar Silam G. Sabah: Sabah Malaysia; Malaysia Sabah Malaysia; Sumatra Aceh Sumatra, Indonesia; India India

Lokality 2005 Jirova A. Troja Praha- BG 2008 Trója Praha- BG Nerz 2009 Pásek K. 2007 Troja - Praha BG 2007 Trója, Praha- BG 2006 Pásek K. Troja 2009 Pásek K. 2009 Pásek K. Troja 2008 Trója Praha- BG BEX Švarc D. Trója Praha- BG

Poznámka 2346 4246 3195 2110 1348 2248 3402 2201 2812 3340 5820 1493 1485 2154 1745 1852 1340 1443 3447 3644 3547 2206 2689 2105 2212 2196 2195 2C VG (Mbp) 38,77 43,14 43,76 40,49 38,68 39,43 45,13 40,13 43,49 41,99 43,78 39,37 39,19 39,70 40,73 41,50 35,54 36,26 43,48 43,58 42,57 41,70 41,20 42,29 41,88 41,79 40,39 GC (%) rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce Oryza rajce rajce Oryza Oryza Oryza Oryza rajce rajce rajce rajce rajce Oryza rajce rajce rajce

Standard 1,38 1,98 1,44 1,14 0,80 1,28 1,42 1,21 1,29 1,66 2,62 2,40 0,85 1,21 2,62 2,67 2,60 2,71 1,58 1,66 1,71 1,11 1,39 2,91 1,11 1,10 1,19 DAPI průměr 0,30 0,46 0,10 0,43 0,40 0,52 1,40 0,44 0,57 1,90 1,70 0,56 0,29 0,22 2,45 0,56 0,38 0,52 0,93 0,93 0,24 2,48 0,58 0,43 0,57 0,52 0,35 CV DAPI měření 1,38 2,50 1,88 1,24 0,79 1,32 2,00 1,30 1,66 1,97 3,43 1,92 0,88 1,27 2,24 2,38 1,72 1,86 2,03 2,15 2,09 1,30 1,58 2,71 1,30 1,29 1,29 PI průměr 0,42 1,58 0,70 1,14 0,85 0,54 1,74 0,30 0,38 2,16 2,24 3,07 0,66 0,33 1,94 1,10 0,91 1,70 1,07 1,57 0,96 1,69 2,02 2,03 1,92 0,67 2,71 CV PI měření 1,00 0,79 0,77 0,91 1,00 0,96 0,71 0,93 0,78 0,84 0,76 1,25 0,98 0,95 1,17 1,12 1,51 1,46 0,78 0,77 0,82 0,86 0,88 1,07 0,85 0,85 0,92 DAPI/PI průměr 0,65 1,94 0,79 0,99 0,57 0,22 0,34 0,32 0,67 0,26 2,48 2,69 0,82 0,10 0,52 0,55 1,30 1,17 1,19 0,67 1,04 3,03 1,50 1,95 1,83 1,18 2,49 CV DAPI/PI

Délka 36,74 34,68 33,90 34,24 26,93 41,09 23,36 25,69 25,34 26,56 33,54 35,40 32,56 33,60 27,95 33,00 32,19 31,07 27,81 36,20 33,07 průduchů (µm) Nep19 63 Nep 60 Nep Nep113 Nep09 Nep102 53 Nep Nep40 Nep103 Nep81 Nep125 Nep122 Nep43 Nep47 Nep98 Nep10 56 Nep Nep05 Nep35 Nep86 Nep33 Nep13 Nep73 Nep12 Nep65 Nep25 Nep14 Nep02 Nep21 Nep78

Vzorek vieillardii Hook. f. Hook. vieillardii Blanco ventricosa f. Hook veitchii Macfarl. truncata Macfarl. truncata Danser tomoriana Danser tomoriana Danser tobaica Lecomte thorelii Wistuba Nerz & tenuis f. Hook tentaculata aff. f. Hook tentaculata f. Hook tentaculata Wistuba Nerz & talangensis Beck sumatrana Mast. stenophylla Danser spectabilis Danser spectabilis Danser spathulata Macfarl. Hemsl./anamensis smilesii Becc. singalana Nerz sibuyanensis Lindl. sanguinea Lindl. sanguinea Kurata Sh. rhombicaulis Miq. reinwardtiana Ridl. ramispina f. Hook rajah Jack rafflesiana Lee C. Chi platychila

Druh 2851 N97A 2867 N76C N92B N75A N75F 2865 N80D N74A 2879 3176 BE- 2866 N05B 1852 2858 N69E 2854 N68B N67E 2855/ 2852 N32/1 2833 2883 2882 N81B 03 BE32 N78A ID Grande Terre Grande Caledonia; New Luzon Philippines; Sarawak Borneo- Mindanao Mindanao Philippines; Bay Tomori Sulawesi; Bay Tomori Sulawesi; Sumatra Indonesia; Thailand Sumatra Indonesia; Lumut Sulawesi; Borneo Talang G. Sumatra; Sibolga Sumatra; Malaysia Sumatra Indonesia; Sumatra Indonesia; Sumatra Indonesia; Vietnam Tujuh Gunung Sumatra, Indonesia; Sibuyan H. Genting Malaysia; H. Genting Malaysia; Sumatra Indonesia; road Tambunan Sabah, H. Genting Malaysia; Kinabalu Mt. Sabah, Malaysia; Brunei Sarawak Malaysia;

Lokality BG Praha- BG 2007 Pásek K. 2007 Trója - Praha BG 2007 M.Dančák Pásek K. BE3203 Wistuba 2009 Švarc D. 2009 Pásek K. 2007 Švarc D. N80D 2007 D.Švarc, Pásek K. BE-3176 2009 Pásek K. Švarc D. 2007 Praha-Troja BG N86B; 2006 Pásek K. BE-0024 2007 Troja, Praha- BG 2007 Praha-Troja BG N66C; D.Švarc 2007 N32/1 Trója

Poznámka 3300 3628 2363 2401 3326 2140 2182 2230 2991 2971 2447 3315 2576 2757 2829 2969 2972 4499 2547 3384 1759 1956 1904 4183 3451 2157 3000 3230 4985 2572 2C VG (Mbp) 41,88 43,99 40,23 40,47 42,45 42,04 39,31 42,09 43,54 41,45 40,67 43,92 42,93 36,68 37,07 41,37 41,77 43,25 41,00 42,46 40,06 40,71 40,54 43,34 41,69 40,85 41,97 42,93 43,52 40,94 GC (%) rajce rajce rajce rajce rajce Oryza rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce Oryza Oryza Oryza rajce rajce rajce rajce rajce rajce rajce

Standard 1,65 1,61 1,29 1,29 1,61 3,00 1,25 1,10 1,37 1,52 1,30 1,48 1,22 1,80 1,81 1,53 1,49 2,09 1,34 1,64 2,74 2,94 2,89 1,93 1,74 1,14 1,49 1,53 2,28 1,35 DAPI průměr 0,33 0,10 0,96 0,16 0,79 0,63 0,22 0,14 1,02 0,27 0,36 1,21 1,14 1,31 0,44 1,23 0,48 0,71 0,23 1,39 0,74 0,33 0,39 0,54 0,53 0,16 0,15 1,00 0,32 0,89 CV DAPI měření 1,94 2,14 1,39 1,42 1,96 2,75 1,29 1,31 1,76 1,75 1,44 1,95 1,52 1,62 1,67 1,75 1,75 2,65 1,50 1,99 2,26 2,52 2,45 2,47 2,03 1,27 1,77 1,90 2,94 1,52 PI průměr 2,93 1,01 2,23 0,34 0,86 1,90 1,10 0,42 1,65 1,03 0,99 1,76 1,93 1,85 0,89 1,79 0,70 1,48 0,66 1,96 0,61 0,82 0,97 0,46 0,77 0,44 1,89 1,02 2,00 0,95 CV PI měření 0,85 0,76 0,93 0,91 0,82 1,09 0,97 0,84 0,77 0,87 0,90 0,76 0,80 1,11 1,08 0,87 0,85 0,79 0,89 0,82 1,21 1,17 1,18 0,78 0,86 0,90 0,84 0,80 0,78 0,89 DAPI/PI průměr 3,14 1,04 1,30 0,50 1,28 2,22 1,17 0,55 2,58 1,23 1,33 2,94 0,79 1,23 0,89 1,57 0,37 1,87 0,81 0,77 0,18 1,15 0,90 0,71 0,94 0,48 1,75 1,24 2,34 0,79 CV DAPI/PI

Délka 29,11 32,93 32,99 33,01 35,19 28,01 24,20 34,79 28,79 41,98 34,74 29,44 33,58 39,24 35,10 33,24 34,99 37,51 41,33 31,73 46,20 31,51 28,84 31,63 30,08 31,80 33,19 32,90 28,00 30,24 průduchů (µm) Nep66 54 Nep 52 Nep

Vzorek gymnamphora Nees gymnamphora Maulder/ & Salmon B. xiphioides Vogel de & Schuit. vogelii f. Hook villosa

Druh N93C 2878 ID Sumatra Indonesia; Sarawak Malaysia; Kinabalu Mt. Sabah, Malaysia;

Lokality 2009 Švarc D. 2009 Pásek K.

Poznámka

2787 2587 2728 2C VG (Mbp) 42,35 41,65 44,41 GC (%) rajce rajce rajce

Standard

1,36 1,31 1,19 DAPI průměr

0,68 0,37 0,29 CV DAPI měření 1,64 1,52 1,61 PI průměr

2,42 1,13 1,48 CV PI měření

0,83 0,86 0,74 DAPI/PI průměr 1,74 0,93 1,23 CV DAPI/PI

Délka 37,30 37,05 33,98 průduchů (µm)

Příloha 2: Matice morfologických a ekologických prezenčně absenčních znaků

Seychelly Lanka Srí Indie Indočína Kambodža Thajsko Vietnam pol. Malajský Čína Filipíny Sumatra Palavan Borneo Jáva Sulawesi Moluky Waigeo NováGuinea Kaledonie Nová SAustrálie Hory Nížiny Epifyt Svinutá Latnaté Vápenec Ultramafické pastí Málo pasti Speciální Vzorek Druh Madagaskar Nep109 adnata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep93 adrianii 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep125 aff. tentaculata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 Nep01 alata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 Nep07 alba 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep59 albomarginata 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 Nep18 ampullaria 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 Nep29 argentii 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 Nep106 aristolochioides 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep91 beccariana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Nep58 belii 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 Nep39 benstonei 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep20+105 bicalcarata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 Nep117 bokorensis 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep37 bongso 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep57 boschiana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 Nep24 burbidgeae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 Nep11 burkei 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 Nep90 campanulata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 Nep27 clipeata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep46 copelandii 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 Nep51 danseri 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 Nep03 densiflora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep08 diatas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep48 distillatoria 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Nep77 dubia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep04 ephippiata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 Nep87 eustachya 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 Nep80 eymae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 Nep110+119 faizaliana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 Nep72 flava 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep61 fusca 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep16 glabrata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep111 globosa 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 Nep96 graciliflora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep22 gracilis 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 Nep15 gymnamphora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 Nep26 hamata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep49+115 hirsuta 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 Nep76 hurrelliana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 Nep118 chang 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Nep104 chaniana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep31 inermis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep44 insignis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 Nep28 izumiae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep70 jacquelinae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep34 jamban 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep06 khasiana 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep123 lavicola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep85 longifolia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep36 lowii 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 Nep30 macfarlanei 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep75 macrophylla 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 Nep95 macrovulgaris 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 Nep38 madagascariensis 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 Nep107 maxima 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 Nep45 merrilliana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 Nep41 mikei 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep108 mindanaoensis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Nep17 mira 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 Nep23+55 mirabilis 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 Nep121 muluensis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Nep99 neoguinensis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 Nep101 northiana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 Nep42 ovata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1