Les transfertsdu mercurebioaccumulé dansles carcassesde poisson vers les organismesaquatiques et vers les invertébrésterrestres nécrophages

JoséSarica

Thèseprésentée pour I'obtention du grade Philosophiaedoctor (Ph.D) en sciencesde l'eau et de l'environnement

Octobre2004

Juryd'évaluation

Examinateur externe : Dr. JulesBlais, Universitéd'Ottawa

Examinateur externe : Dr. Gilbert Cabana,UQTR

Examinateur interne : Dr. CharlesGobeil, INRS-ETE

Co-directeurde recherche: Dr. Landis Hare,INRS-ETE

Directeur de recherche: Dr. Marc Amyot, Université de Montréal

tDroits réservésde JoséSarica, 2004

< Les mouchesbourdonnaient sur ce ventre putride, D'où sortaientde noirs bataillons De larves, qui coulaient comme un épais liquide Le long de cesvivants haillons >.

CharlesBaudelaire, Les Fleurs du Mal.

< Le pourrissementdu cadavrea commencé.L'admirable travail de l'embaumeusen'aura duré que ce que durent les roses.Voilà que la peaupart en lambeaux,que la chair seride, que le pigment n'est plus qu'un souvenir.Voici que les asticotsprospèrent, que la vermine accourt pour se nourrir de ma viande en décomposition,que les larves s'extirpent de mes orbites creusées.Voilà que les os deviennentfriables, qu'ils se détachentdu squelette,se brisent en chutant,qu'ils forment un tas de détritus, ou de cendres.[...] C'est un autre spectaclequi sejoue. Il y a encoreune vie aprèsla mort, celle descharognards. >

Philippe Besson,Un Garcond'Italie.

1ll

Encore unefois pour Francis. Plus quejamais.

< On peut croire ce que I'on veut, On peut s'accrocheraux fontainesde certitudespour se protégerà desidées fossilisées, Par l'habitude on peut empruntertoujours des voies bien balisées, Et puis soudainchanger d'avis : improviserle chemin,improviser le chemin... >

JérômeMinière, Amenter

Avant-propos

Cette thèse < par articles ) comporte d'abord une synthèse qui fait état de la problématique et de la pertinence ce cette recherchedoctorale tout comme elle décrit les principaux résultatsobtenus et discute de leurs implications. Trois articles soumis dansdes revues avec comité de lecture (dont un est publié et deux sous presse)viennent ensuite appuyer la synthèse.Mentionnons que des ajouts suite aux commentairesdes membresdu jury aprèslecture du document lors du dépôt initial ont été insérésdans le texte et que par conséquent,le contenude certainsarticles présentés dans ce documentfinal peut légèrement différer de celui retrouvé dans les articles orisinaux.

La contribution desauteurs des articles aux divers projets de recherches'établit commesuit :

l. SaricaJ., Amyot M., Hare L., Blanchfield P., Bodaly D., HintelmannH. et Lucotte M. 2004. Transfer of mercury from fish to scavenginginvertebrates in boreal lakes: the use of stableisotopes of mercury.Environmental Pollurion. (Souspresse)

2. Sarica J., Amyot M., Hare L., Doyon M.R. et Stanfield L.W. 2004. Salmon-derived mercury and nutrients in a Lake Ontario spawning stream.Limnologt and Oceanography. 49(4),891-899.

3. SaricaJ., Bey J., Amyot M. et Hare L.2004. The fate of mercuryin Calliphoridaelarvae feeding on fish carcasses.Environmental Toxicologt ctndChemistry. (Sous presse)

José Sarica : Conception,réalisation des projets (échantillonnage, analyses, traitement des données)et rédaction des articles; Marc Amyot : Conceptiondes projets, contributionaux traitementsdes données et rédaction finale des articles; Landis Hare : Conception des projets, contribution aux traitements des donnéeset à la

vll rédactiondes articles; Paul Blanchfield: Conceptiondu projet et contributionà la rédactionde I'article; Drew Bodaly: Conceptiondu projet et contributionà la rédactionde l'article; Holger Hintelmann : Conception du projet et contribution aux analyses du mercure isotopiqueen excèsainsi qu'à la rédactionde l'article; Marc Lucotte : Conceptiondu projet et contributionà la rédactionde I'article; Marie-Renée Doyon : Conceptiondu projet et contribution aux analysesdu mercuretotal ainsi qu'à la rédactionde l'article; Les William Stanfield : Conceptiondu projet ainsi qu'à la rédactionde l'article; Julien Bey : Conceptiondu projet et contribution aux analysesdu mercuretotal ainsi qu'à la rédactionde l'article.

vlll Remerciements

Quand on parvient à cette étapedu doctorat, celle des remerciements,on sent à quel point une nouvelle page se toume. Je compareraices trois annéesà un marathon et sur ce parcours,plusieurs personnes m'ont fortement encouragéet soutenu.Les remerciementsqui suivent découlentaussi facilement que le jus d'un fruit bien mûr.

Tout d'abord,je tiens à remercierbien chaleureusementM. Marc Amyot et M. Landis Hare, respectivementdirecteur et co-directeur de recherche,pour leurs judicieux conseils toujours formulés avec une grande diplomatie ainsi que leurs encouragementslors des missions de terrain et durant la rédaction de ce document. Marc, j'ai énormémentappris avectoi au coursde cescinq années,sur tous les plans etj'en ressorsgrandi. Cinq années r1.thméespar desdiscussions, des remises en question,des tensions et desmoments de répits: nous avonsappris à nous connaître,non sansmal, mais sacheque l'image queje gardede toi est celle d'un homme emprunt d'une grandeintelligence mais surtout d'une belle humanité : merci de m'avoir fait conhance. Landis, merci pour tous nos échanges,sur le plan scientifique certes,mais surtout sur le plan humain. Quelle chanced'avoir pu côtoyer votre Sagesse: I'image que je conserveprécieusement de vous est celle de nos rencontres matinales autour d'un bon café au cours desquellesnous parlions de nos résultats pour aboutir à nos vies. Vous représentezpour moi un modèle à suivre dans le domaine des sciences puisque vous conjuguezà merveille l'Excellence et I'Humilité. Je pensequ'à l'avenir chacunde mes messasessera suivi d'une citation de Gandhi...

Je souhaite égalementremercier M. Jules Blais (examinateurexterne), M. Gilbert Cabana(examinateur externe) et M. CharlesGobeil (examinateurinteme) pour avoir accepté de figurer parmi les membresdu jury.

L'aide précieusede plusieurs personneslors des échantillonnages,des analysesen laboratoire et lors de la rédaction de ce document ont permis d'aboutir à ce travail; ainsi, je

IX remercie : Marie-RenéeDoyon, Pierre Marcoux, JérômeLaroulandie, Xavier de Rouvroi de Saint-Simon,Alexandre Poulain, Jord Orvoine, Anne Gosselin,Bonnie Andersonet ses élèves,Les Stanfield, Julien Bey, JaneOrihel, Paul Blanchfield, Ken Sandilands,Danielle Godard, Sheryl Podemski, Dolors Planas, Édenise Garcia, Valérie Girard, David Lean, Jonathan Holmes, Holger Hintelmann, Michelle G. Bordeleau, Pauline Fournier, Sylvie Saint-Pierre,Sébastien Duval, Philippe Cantin, Céline Gallon et Martin Daigneault.

Comment passer sous silence tous mes amis qui ont été si présentslors de cette formation. Merci à mes amis rencontrésà I'INRS: je penseplus particulièrementà toi Alexandre: que de bons moments nous avons eu; tous les deux français, tous les deux en congrès,toujours à sesoutenir et à nous épauler : ce fut un plaisir immensede travailler avec toi et de te voir évoluer. Merci à Corinne, Bryan, Laurence,Gaétan, Pierre, Yves, Sandrine, Alain, Zachary,Marie-Noële, Michel, Louisa,René, Manon, André, Diane etNorbert. Plus particulièrement,merci Brillant pour ta grandegénérosité et pour m'avoir permis de rédiger une partie de mon document dans des conditions optimales. Corinne, sans vous, le rêve n'aurait pas eu lieu et je tiens à vous dire merci pour avoir cru en moi.

Ma Famille... Merci maman, merci papa pour avoir toujours été présents,pour m'avoir soutenu,pour votre Amour tout simplement. La fterté que je vois dans vos yeux quandil s'agit de vos enfantsest une sourceinfinie de réconfort. Jordan,mon complice,mon frère, mon jumeau: qui sait mieux que toi ce queje ressensau moment où la page setourne puisque tu as récemment terminé ton doctorat: merci pour ta présenceau quotidien qui défuayaitfacilement I'espaceet le temps: l'Atlantique n'était pas une barrière pour toi et tu me l'as démontréplus d'une fois, merci. Nathalie, ma grande sæur,toujours présente, toujours fière, toujours prête à intervenir et à me défendredans les périodesde doute: merci. Marina, Catherineet Mathilde: toutes les trois si differentes mais si complémentairespour moi; vous êtesles sæursque chaquefrère souhaiteraitavoir; je me considèretrès privilégié de partagervos vies: merci d'avoir cru en moi et d'avoir étési présentes.Enfin, mes nièces et neveux,Charline, Camille, Baptiste,Justine, Jules, Anatole, Louis et Félix : vos sourires d'enfantssont à jamais I'endroit où je viens puisermes plus grandesforces. Enfin, je tiens à remercier bien spécialementM. Francis Boudreaupour son aide au quotidien, sa Gentillesse, sa Générosité, ses nombreux conseils ainsi que sa grande Disponibilité lors de la rédaction de ce document mais surtout pour la place si particulière qu'il occupedans ma vie. Francis,tu esun êtrede lumièreet c'est le plus beaucadeau de la vie que de te côtoyer. Je te dédie ce doctorat sans l'ombre d'un doute car, dans cette formation, tu es le pilier central.

Je vous suis, à toutes et à tous, extrêmementreconnaissant.

Ce doctorat a été financé par le CRSNG et le FCAR de M. Marc Amyot. Une bourse, délivrée par DFO, a permis de réaliserle projet sedéroulant à la stationde recherchede ELA.

X1

Résumé

On a longtempspris pour acquisque les poissonsétaient le dernier maillon duréseau trophique aquatique.Or les nécrophagesse nourrissantdes carcassesde poisson et les prédateurs naturels de ces nécrophages se situent encore plus hauts dans la chaîne alimentaire. Il est établi que le rôle des organismesnécrophages est fondamental dans le fbnctionnementdes écosystèmespuisqu'il permet le recyclaged'énergie. Par contre,aucune étudene s'est encoreintéressée aux transfertsde contaminants,dont le mercure(Hg), àuntel niveau trophique.

L'objectif principal de cetterecherche consiste, par conséquent,à mesurerles transferts du Hg bioaccumulédans les carcassesde poissonvers les invertébrésaquatiques et terrestres nécrophages.Pour y répondre, nous avons considéré deux cas contrastés de mortalité naturelle: ( I ) la mortalité naturelle annuellenon liée à la prédationdes poissons dans les lacs; (2) la mortalité naturelle annuelle du saumon Quinnat après le frai au sein d'une rivière ontarienne.

Lors d'une expérience préliminaire menée au sein d'un lac boréal (lac Laflamme,

Québec,Canada), au cours de laquelle despoissons morts avaientété placés en zonelittorale, nous avons observé que les sangsuesétaient fortement attirées par les carcassesen décompositionet augmentaientleurs concentrations de Hg en fonction dutemps d'exposition aux poissonsmorts. Afin de démontrer que de tels transferts de Hg entre les carcassesde poisson et les organismesnécrophages (i.e., sangsues)existaient, nous avons profité de l'avantage unique qu'offre le projet METAALICUS (Mercury Experiment to Assess Atmospheric Loadings inCanadaand the United States),conduit à la stationde recherchede ELA (Experimental Lakes Area, Ontario), en nourrissantdes sangsuesavec desperchaudes enrichiesin situ aux isotopesstables de Hg ('otHg) au seind'aquarium, en laboratoire.Ces perchaudesenrichies en'02Hgont été égalementplacées danslazonelittoraled'un lac boréal

xlll dans lequel aucun ajout de Hg'o'n'avaitété effectué (lac240). En laboratoire,nos résultats ont démontré clairement que les sangsuesaccumulaient efficacement et rapidement une quantité significative de Hg des carcassesde poisson et que leurs signaturesisotopiques atteignaientcelles des perchaudesen moins de deux semaines.En nature, de tels transferts ont égalementété mesurésmais à desniveaux moins élevésétant donné le plus grandnombre de sangsuesinteragissant avec les carcasses.Par conséquent,le fait de ne pasvisualiser de carcassesde poissonen nature seraitexpliqué par la vitesserapide à laquelleles nécrophages décomposentces demières. Nous concluons,par conséquent,que les organismesnécrophages comme les sangsuespeuvent retourner le Hg des carcassesde poisson vers les chaînes trophiques lacustreset que ce recyclage de Hg dépend de la structure des communautés d'organismesnécrophages spécif,rque aux lacs.

En rivière, nousavons validé l'hypothèseselon laquelle les concentrationsde Hg et de nutriments (l.{Ho*,NOr-, P, COD) au sein de composantesbiotiques (invertébrésaquatiques et terrestres)et abiotiques(eau, sédiment)du systèmeétaient altérées par la décomposition des carcassesde saumon après le frai. Nous avons échantillonné durant deux années consécutives(2000 et 2001) au sein d'une frayère ontarienne,tributaire du Lac Ontario, qui reçoit chaqueannée 20 000 saumonsQuinnat (Oncorhyncustshawytscha). Ces deux années contrastentpar la présenceexceptionnelle en 2001 d'un ours qui a prélevé toutes les carcassesà une station aval de la frayère. Nos résultats ont démontré que les stations d'échantillonnage,où les densitésde carcassesétaient les plus élevées,présentaient des concentrationsaqueuses de Hg total, MeHg, Hg total particulaire et de nutriments plus élevées que les stations où les densités de carcassesétaient les plus faibles. Les concentrationsde Hg mesuréesdans les invertébrésaquatiques etterrestres se nourrissant des carcassesde saumonont augmentéjusqu'à 25 fois. En 2001, suite au prélèvementdes carcassespar l'ours en aval, aucuneaugmentation dans les concentrationsaqueuses de Hg et de nutriments n'a été mesuréeà ce site contrairementà celles mesuréesau même endroit un aîauparavant sansla présencede l'ours. Un budgetpréliminaire au sein de la frayeremontre que: 1) les carcassesde saumonreprésentent une sourceimportante de Hg et de nutriments pour les réseauxtrophiques aquatiqueset terrestreset que 2) les invertébrés et vertébrés

xiv terrestrespeuvent être d'importants vecteursde Hg du milieu aquatiquevers le milieu terrestre.

Après le frai du saumonQuinnat, un tiers descarcasses sont retrouvées échouées sur les rives de la frayère et ces dernières sont rapidement coloniséespar les diptères calliphoridésfemelles venant y pondre leurs æufs (cf. encadré3). Nous avons placé des

carcassespoisson au bord d'un lac (lac Le-Petit, Québec,Canada) et attendu que ces dernièressoient colonisées par les femellescalliphoridés. Au coursde I'expériencein situ, nous avonsprélevé les stadescalliphoridés suivants:les femellesadultes venantpondre leurs oeufsdans les carcasses,les oeufsde calliphoridés,les larvesde calliphoridésséparées en deux classede taille (i.e, inférieureou supérieureà I cm de longueur),les prépupes,les pupes et les nouveaux adultes émergés Nous avons,pour chacunde ces stades,mesuré les concentrationsde Hg total et de MeHg. Nos résultats indiquent clairement que les larves accumulentrapidement le Hgprovenant descarcasses dont ellesse nourrissentjusqu'au stade ' pupal. Après leur émergence,jusqu à g}yodesteneurs en Hg sontexcrétées par les nouveaux adultesvia le meconium.Nous concluonsque les calliphoridéspossèdent un mécanisme efficace d'excrétion du Hg inorganique et organique qu'elles ont accumulé à partir des carcassesde poisson.Le devenirde ce Hg excrétédans l'environnement n'est pas encore connu.

Cette recherchedoctorale est la première à s'intéresserau devenir du méthylmercurelors de la mortalité naturelledes poissons non liée à la prédationet à considérerla nécrophagie comme une voie importante dans le recyclagede ce composéorganométallique en terme d'accroissementde concentrationscar l'ajout d'un maillon dansla chaînetrophique pour cet élément peut résulter en une augmentationdans ses concentrationspar bioamplification. Davantaged'études sont nécessairespour clairement démontrerles risques toxicologiques reliésà cettevoie de au seindes s s aquatlques. r Sarica,INRS-ETE Directeur:Marc Amyot, Un versitéde Montréal

XV

Tabledes matières

Avant-propos..... vll Remerciements.. ix Résumé. xiii Tabledes matières...... xvii Liste desfigures.. xviii Liste desencadrés.... xix

Chapitre 1 : Synthèse

l. Introduction.. 3 1.1 Origines,transport et accumulationdu Hg. . . . 3 2. Problématique. 10 3. Objectifset intérêtsde cetterecherche. 12 4. Rappelsdu modèlecinétique. .. 14 5. Méthodeset analyses...... 15 5.1Échantillonnageenmilieulacustre(chapitre 2)..... 18 202Hg 202Hg 5.1.1 Prise en chargedu par les sangsueset le biofilm et perte du par les sangsues:expériences en laboratoire... 18 202Hg 5.1.1.1Prise en chargedu par les sangsueset le biofilm: expérience1 . . . . 20 'o'Hg 5.I .l .2 Taux de pertedu par les sangsues:expérience 2 ...... 2A 202Hg 5.1.2Accumulation du par les sangsueset le biofilm : expériencein situ. 2l 202Hg. 5.1.3 Méthodede déterminationet calculsdes sourcesde 22 5.2Écharrtillonnagelors de la mortalité massive du saumonQuinnat au sein d'une frayère ontarienne(chapitre 3)..... z) 5.3 Echantillonnagelors de l'étude portant sur l'accumulationet la perte du Hg chez les larvescalliphoridés (chapitre 4)..... 25 5.4 Statistiques.. 25 6. Intégrationdes résultats et discussion...... 27 6.1 Les transfertsde mercuredes carcassesde poissonversles nécrophagesdans des lacs boréaux:I'utilisation desisotopes stables de mercure 27 6.2 Libération du mercure et des nutriments lors de la décomposition des carcassesde saumon au seln d'une frayère bordant le lac Ontario. 31 6.3 Le devenirdu mercureaccumulé par les larvescalliphoridés se nourrissant des carcasses aa de poisson JJ 6.4 Conclusion.. 34 an 7. Bibliographie. )t

Chapitre2 :Mercury transferfrom fish carcassesto scavengersin boreallakes: the useof stableisotopes of mercury(article 1) 49

XV11 Chapitre3 : Salmon-derivedmerçury and nutrientsin aLake Ontario spawning stream(article 2).... 79

Chapitre 4: The fate of mercury by blowflies feeding on fish carcasses (article3).... 111

Liste desfigures

Figure 1.1 Profil historique de la concentrationde Hg total (ngll-) enregistrédans deux carottes d'une longueur de 29 m issues du glacier supérieur Fremont culminant à une altitudede 4 189 m. Le taux de dépositionest de 90 cm de glacepour un an.L'erreur dans la prédiction chronologique est de + 10 ans. Issu et adapté de Schuster et al., 2002.

Figure 1.2 Cycle biogéochimiquedu MeHg en milieu lacustre.

Figure 1.3 Microcosmemesurant le recyclagedu mercurelors de la decompositiond'une carcassede poisson(issu de Bloom et Kuhn, 1996). 10

Figure 1.4 Représentationschématique d'unpiège à sangsuesplacé dans lazone littorale du lac 240 à ELA. 20

Figure 1.5 Photographiedu laboratoireinstallé à ELA représentantles aquariumsnumérotés de1à6 20

Figure 1.6 (A) Carte bathymétrique du lac 240 indiquant l'emplacement des boîtes d'échantillonnage dans la zone littorale et (B) schémad'une boîte d'échantillonnage(vue latérale)contenant les carcassesde perchaude..... 22

Figure 1.7 Chromatogrammeissu de I'ICP/MS pour un échantillonde sédimentincubé avec , tgs-- leeHg. ou ng morgamquemontrant une augmentation dans le signalde Issude Hintelmann et Ogrinc(2003). 23

Figure 1.8 Photographiesde carcassesde perchaudeaprès un séjourde 1.5jours dansla zone littorale du lac 240. 30

XVll1 Liste desencadrés

Encadré 1 : Les causesde mortalité de poissonsnon liée à la prédation

Encadré 2 : Recyclagedu MeHg accumulédans les poissonsmorts au sein des systèmes aquatiques. 13

Encadré 3 : METAALICUS (Mercury Experimentto AssessAtmospheric Loadings in Canadaand the United States). t9

Encadré 4: Cycle de vie des diptères calliphoridéset description du développement postembryonnaire. 26

xlx

ChapitreI : Synthèse Chapitre1 : Synthèse ChapitreI : Synthèse

1. Introduction

Depuis l'aube de la préhistoire,les métaux ont fait l'objet de la convoitisedes hommes.Recherchés pour une largepart à desfins utilitairesou commesource de richesse, ils I'ont égalementété pour leurspropriétés, celles-ci moins nobles,de toxicité.A ce titre, celle du mercure(Hg) est connuedepuis fort longlemps.Il apparaîtmême, selon des cycles alternantvrais-faux, que la mort deNapoléon, d'Ivan le Tenibleet de CharlesII d'Angleterre, seraitattribuée à l'intoxicationau Hg (Sorensen,1991). Dans le casde Napoléon,l'hypothèse d'un empoisonnementà I'arsenic est aussi retenue. Plus récemment, la catastrophede la baie de Minamataau Japona illustréles conséquencesdramatiques sur la santéhumaine de rejets irréfléchisdans la mer d'effluentsindustriels riches en méthylmercure(MeHg). Ces rejets, provenantde l'usineChisso Chemicals (fabriquant de I'acétaldéhyde),ont causéla mort de 48 personneset provoquél'invalidité de 2952 individus(Takizawa,2000). Ils ont, par ailleurs, entraînéune augmentationdes concentrations de MeHg dansles mollusques,les crustacéset les poissonsà la basedu régimealimentaire des habitants de la baie (Kurlandet al., 1960, revudans D'Itra et D'Itra. 1977:Takizawa.2000 ).

Une formede Hg organique,le MeHg, augmentepar bioamplificationtout au long de la chaînealimentaire aquatique. Les concentrationschez les poissonspiscivores, situés au sommetde celle-ci,se trouventdonc parfoistrès élevées.D'ailleurs, la consommationde poissonsconstitue la principalesource de contaminationau Hg pour I'homme (Clarkson, 1990).On reconnaîtque le MeHg agit commeune neurotoxine pouvant entraîner des troubles nerveuxvariés, sensoriels, moteurs et psychiqueschez les humainset les animauxà régime piscivore(Clarkson, 1990). Sur le plan de la santé,le MeHg estune < espèce> chimiquequi présenteun risqueréel de toxicitépour l'Homme.

1.1Origines, transport et accumulationdu Hg

Le Hg, émisdans l'atmosphère, provient de sourcesnaturelle et anthropique(Mason er al., 1994;Hudson et al., 1994;Morel et al., 1998;Ullrich et a1.,2001;Schuster et al., 2002, Seigneuret a|.,2004).Les sourcesatmosphériques naturelles de Hg incluentle dégazagede la croûteterrestre, les éruptionsvolcaniques, les incendiesde forêtsainsi que le dégazagedes ChapitreI : Synthèse eauxde surface(Rasmussen,1994; Seigneur et a|.,2004). Les sourcesd'origine humaine, quantà elles,incluent principalement les servicesélectriques, I'incinération des déchets,les centralesà combustionau charbonet les usinesde chlore-alkali(Schuster et al., 2002).En Amériquedu Nord, cesquatre sources représentent, respectivement,26Yo, l6yo, 6yoet3%o des émissionsanthropiques totales sur ce continent(Seigneur et aL.,2004).

Les analysesde Hg total dans des carottesglacières issues du glacier supérieur Fremont(Wyoming, U.S.A.), ont permisd'enregistrer I'historique des accumulations de Hg atmosphériqueà l'échellerégionale, au coursdes 270 dernièresannées (figure 1.1).Ces enregistrements confirment que les sources atmosphériquesde Hg sont d'originesnaturelle et anthropique.En 270 Mont St. Hélène(1980) années,les sourcesd'origine anthropique ont contribuépour 52%odes apports totaux Deuxième Guerre Mondiale ( l e3e-r945) de Hg atmosphérique.Parmi les évènementsles plus marquants,on note Cracatoa l'exploitationminière dans le contextede la ruée vers I'or (< Gold rush>) dans .()0.) l'Ouestdes Etats-Unis au coursdes années I 8t0 1850, suivie des activités de l'ère industrielleau tournantdu XX" siècle (1900-1970)incluant les apportsde Hg lors de la fabrication de machineries lourdes durant la Deuxième Guerre Mondiale(figure l.l). --- l0Ètcore -+- 18Bl core Les éruptions volcaniques 0510 1510 1,13035{0 (incluantcelles du Tamboraen 1815,du [Hg total] ngll- Cracatoaen 1883et du Mont St-Hélèneen Figure l.l Profil historique de la concentration de Hg total (ng/L) enregistrédans deux carottesd'une longueur de 1980;figure 1.1),ne constituentque 6yo 29 m issues du glacier supérieur Fremont culminant à une desapports totaux de Hg atmosphériqueau altitudede 4189m. Le taux de dépositionest de 90 cm de glace pour un an. L'erreur dans la prédiction chronologique cours de ces 270 dernièresannées. La est de + l0 ans. lssu et adaptéde Schusteret a1.,2002. balance (42o/o)est attribuéeaux autres sourcesnaturelles de Hg mentionnéesprécédemment (figure 1.1).Ainsi, les deux sources Chapitre1 : Synthèse atmosphériquesde Hg d'originesanthropique et naturellesemblent équivalentes. Ces dix dernièresannées, une tendanceà la baisseest observéedans les apportsde Hg atmosphérique de natureanthropique (figure 1.1).Afin de comprendrecomment des régionséloignées de sourcesponctuelles de Hg puissentêtre contaminées en Hg, un rappelsuccinct de la chimiede ce métal dansI'atmosphère s'impose.

Dansla mythologieromaine, Mercure, le messagerdes dieux, pouvait se déplacer dans les airs sur de grandesdistances au moyend'ailes à la basede sespieds. Un lien allégorique peut être établi entrece m1,theet le métal, puisquele Hg présenteégalement la facultéd'être < un grandvoyageur > dansl'atmosphère. En effet, 95oÂdu mercureatmosphérique est sous formede mercureélémentaire HgO, forme volatile réduite du Hg. (Morel et a1.,1998;Mason et Sheu,2002). Sa réoxidationtrès lenteen Hg(II) et sa faible solubilitédans l'eau font de HgO,une espècechimique pouvant voyager dans I'atmosphèreau moins deux ans et, par conséquent,être répartiesur I'ensembledu globe(Mason et Sheu,2002). Les précipitations humides(pluie, neige) ou sèches(particules d'aérosols) le déposentaussi bien dans les milieux terrestres(57%) que dans les milieux aquatiques(43%; Mason et Sheu,2002). Ainsi, depuis la révolution industrielle,I'enrichissement en Hg des couchessuperficielles de sédimentslacustres suggère que le dépôtatmosphérique de Hg a augmentéd'un facteurtrois à cinq (Radaet al., 1989;Swain et al., 1992),quoique dans certains cas, ces enrichissements peuventrésulter de processusdiagénétiques (Gobeil et al.,1999).

Dans les systèmesaquatiques d'eau douce, la chimie du Hg est très complexe. Rappelons,que le MeHg estI'espèce organique du Hg qui présenteun dangerréel de toxicité pour les animaux à régime piscivore dont I'Homme. Par conséquent,nous allons nous intéresseraux sourcesde MeHg au seindes lacs (figure 1.2).Une faiblequantité de MeHg se retrouvedans l'atmosphère(0-5% du Hg total est du MeHg, qui peut augmenteravec I'altitude; Lindqvist, 1991) et, pour cette raison,peu de MeHg est amenéaux lacs par précipitations(St. Louiser al., 1995)et par les eauxde ruissellement.Cela suggère qu'un ou plusieursmécanismes internes aux lacssont responsablesde la formation in situ du MeHg.

Tout d'abord,en milieu aquatique,les formes de Hg dansl'état d'oxydationII, Hg(II), déposéespar les précipitationssèches et humides(figure 1.2), tendentà s'adsorberaux particulesen suspensioninorganiques et organiques(ph1'toplancton, bactéries, algues, débris ChapitreI : Synthèse organiques)ainsi qu'au carboneorganique dissous (COD constituéentre 50o et 90oÂde substanceshumiques dans les eaux naturelles; Morel et al.,1998).Ces complexes de mercure

Déposition sècheet vAd <( )> humidede âY{ Hs (ll) Volatilisationde

Entrée So rtie -> + (Photo)réduction Photodégradation + {- SâJimentsde surface Hs(ll) Hg(g) MeHg oxydation

r r r I t r. ) = recyclage de MeHg inclétermirÉ

Ofll) - ie*t-"ato" J

Figure 1.2 Cyclebiogéochimique du MeHgen milieu lacustre. vont sédimenter,en partie,au fond des lacsoù, dépendantde leur biodisponibilité,ils vont pouvoirêtre méthylés.Il sembledésormais établi que la sourcemajeure de MeHg dansles systèmesaquatiques provient de la méthylationbactérienne (plus spécifiquement des bactéries sulfatoréductrices)du Hg inorganiquedans les sédimentsanoxiques superficiels avec comme donneurenvironnemental de groupementsméthyl, le méthylcobalamine(Gilmour et Henry, l99l; Ullrichet a|.,2001;figure 1.2). D'autres sources mineures de biométhylationpeuvent avoir lieu dans d'autres compartiments environnementaux(périphyton et matière en suspensiondans I'eau, tractusintestinaux; Ullrich et al., 2001). La méthylationabiotique (purementchimique : photométhylation),quant à elle, sembleavoir une importancemineure (Ullrich et al., 2001), bien que son influence puisse augmenterdans les lacs où la concentrationen matièreorganique est élevéepouvant ainsi représenterjusqu'à 35olodes intrantsde MeHg (Leanet Siciliano,2003). Chapitre1 : Synthèse

La biométhylationdu Hg inorganiquedans les eaux et dans les sédimentsen conditionsanaérobiques constitue donc une étape clé dans le cycle du Hg au sein des systèmesaquatiques. Le rôle de la matièreorganique dans la méthylationdu Hg n'est pas encorebien connu. Lors du processusde méthylation,les bactériesutilisent la matière organiquecomme sourced'énergie laquelle est reconnuepour être un importantvecteur contrôlantla mobilitéet le transportdu Hg dansles systèmesaquatiques (Warren et al.,1964; Grieb et al., 19901'Spry et Wiener, 1991). Les sulfates sont particulièrementimportants puisqu'ilsvont stimuler,à faible concentration,la méthylationbactérienne du Hg (Craig et Bartlett,1978; Gavis et Fergusson,1972;Compeau et Bartha,1983,1987; Gilmour et Henry, 1991).Les concentrationsde MeHg dansles sédimentspeuvent également être influencées par le cycle rédox des oxides de fer et de manganèselesquels contrôlent en partie les concentrationsde Hg dissous dans les eaux interstiellesce qui va influencer la biodisponibilitédu Hg (Gobeilet Cossa,1993; Gagnon et al., 1997).

Non seulementles bactériesont la capacitéde méthylerle Hg inorganiquedisponible (le produitfinal de la méthylationserait le diméthylmercure,DmeHg, forme volatile de Hg organique)mais, elles peuventégalement déméthyler le MeHg (le produit final de la déméthylationserait Hg0. forme volatilede Hg inorganique;Gilmour et Henry; 1991).Cette déméthylationsemble être un processusde détoxificationinduit et régulépar le mer opéron, situésur le plasmidebactérien, quand les concentrationsde MeHg excèdent50 pM (Morel er al., 1998;Ullrich et a1.,2001).La déméthylationabiotique (photodégradation par les ultra- violets)peut égalementse produireet être importantedans les eauxoxiques épilimnétiques (Sellerset al.,1997;figure 1.2).

Les taux de méthylationet de déméthylationdu Hg dansles systèmesaquatiques sont clairementinfluencés tous deux par la spéciationet la disponibilitébiochimique du Hg inorganiqueainsi que par un grandnombre de variablesenvironnementales, dont plusieurs sont interreliées.Les variablessuivantes ont toutesdes effetssignificatifs sur le taux net de productionde MeHg : I'activitébiologique (i.e, capacitédes organismesà méthyleretlou à réduirele Hg2*;Summers et Silver, 1978;Robinson et Tuovinen,1984); la disponibilitédes nutriments(Jernelôv, 1970; Wright et Hamilton, 1982);le pH (Gilmour et Henry, 1991);la température(Winfrey et Rudd, 1990;Watras et al., 1995);le potentielrédox (Olsonet ctl., 1978; Compeauet Bartha, 1984) et la présencede ligands inorganiquesou organiques (Matilainenet al., 1991; Driscoll et al., 1994).L'importance relative d'une variablepar Chapitre1 : Synthèse rapport à une autre varie dans l'espaceet dans le temps. Cependant,il sembleque la formation de MeHg est prépondérantedans des conditionsanaérobiques alors que les conditionsaérobiques favorisent les processusde déméthylation.Le MeHg, une fois forméà l'interface sédiment/eau,peut être soit transportédans la colonned'eau par diffusion et advection(Morel et al., 1998),où, de part sa naturehydrophobe, il va se lier facilementaux particulesorganiques en suspensiondans l'eau (plancton,périph1.ton, bactéries), soit êtrepris en chargepar les organismesbenthiques vivant à l'interfacesédiment/eau.

Le MeHg, comparé aux autre formes inorganiquesde Hg, est très sujet à la bioaccumulation(Clarkson, 1976; Hare, 1992;Porcella, 1994; Morel et al., 1998;Ullrich er a1.,2001).Ce phénomèneest lié à la propriétéque possède les complexesneutre de MeHg de traverserfacilement les membranescellulaires, de se lier fortementaux groupementsthiols desprotéines dans le cytoplasmedes cellules et de ne s'éliminerque très lentement (Clarkson, 1976;Mason et al., 1996;Morel et al., 1998;Ullrich et a1.,2001;Tsui et Wang,2004; Twining et Fisher, 2004). Par conséquent,la concentrationen MeHg augmenteà chaque niveau trophique de la chaîne alimentaire aquatique(phénomène de bioamplification) et atteint les concentrationsles plus élevéeschez les vertébréspiscivores. Watras et Bloom (1992) évaluent que le MeHg représentel0o du Hg total dans l'eau, 15% dans le phltoplancton,30oÂdans le zooplanctonet95o dans la chairdes poissons.

Le rôle significatif des poissonsdans les budgetsde contaminantsorganiques est souventomis des modèlessoit, parce que les donnéesnécessaires (e.g., concentrations, biomasses)sont non disponiblessoit, parce que l'influencedes poissons sur les budgetset les flux est considéréecomme négligeable (Mackenzie et al., 2004).Cependant, parce que les poissonsoccupent les niveaux supérieursdes réseauxtrophiques et peuventprésenter de longues durées de vie, ils présententhabituellement les concentrationsélevées de contaminantsorganiques comparés aux organismesdes niveaux trophiques inferieurs. En se basant sur une approchede bilan de masse,des étudesconcluent que la majeure partie (usqu'à 70%) du MeHg total présentdans la colonned'eau d'un lac se retrouvedans les poissons(Meili, 1991;Porcella,1994; Watras et al.,1994).S'il existede nombreusesétudes surles mécanismesd'accumulation du MeHg dansles poissons,pratiquement aucune ne s'est interrogéesur le devenirde ce MeHg lors de la mortaliténon liéeà la prédationdes poissons dansles systèmes aquatiques (figure 1.2et encadré1). ChapitreI : Synthèse

EncadréI : Les causesde mortalité de poissonsnon liée à la prédation

<> Dansle monde: 27 million de tonnespar an (Alversonet al., 1994;Naylor et a1..2000:Groenewold et Fonds.2000:Bozzano et Sardà.2002:Pitcher et a|..2002\. En aquaculture: 1l millionsde tonnespar an (Holmlundet Hammer,1999).

< Summerkill,winterkill >> < produisent(Barica et al.,1983i Mortalité des communautés Vanni el al., 1990;Danylchuk et ichtyologiques variant entre 50 et 95% dépendantde I'intensité de la Tonn.2003). pollution (DeMelo et al., 1992; Carpenteret al., 19951'Rask er a/,. <> Berrymanet Jalbert,2003).

eaux douces: mortalité naturelle annuellevariant de 0.10 à .67au sein des lacs (Ricker, 1945; Kipling et Frost, 1970; Rawstron et Hasagen, 1972; Rangaswany, 1976;' Nakashima et Leggett,1980; Pauly, 1980; Craig, 1984; Lorenzen, 1996; Schneider, 1997; Allenet al., 1998;'Mills et a1.,2002). eaux marines: mortalité naturelle annuellevariant de 0.20à 0.95en milieu océanique(Pauly, 1980; Clark, 1999; Sparholtet a1.,2002;Dutil e/ a1.,2003; Savenkoffet Castonguay,2003 ).

à moyenne acceptée pâr les biologistes ichtyologuesde 0.20-0.25 dans les eaux naturelles (Reznicket al.. 2002:Dutil et a|..2003). l0 Chapitre1 : Synthèse

Jusqu'àmaintenant, une seuleétude en laboratoire(Bloom et Kuhn, 1996; donnéesnon publiées)a tenté d'expliquerce recyclageen suivantles changementstemporels dans la spéciationdu Hg avantet aprèsla décompositiond'un poissondans les sédimentset I'eauau sein d'un microcosme(figure 1.3). Après 15 jours de décomposition bactérienne,Bloom et Kuhn observent Trappeen or que la majoritédu MeHg contenudans le poisson retourne dans I'eau sous Contenant en vene de 2.5 L forme de mercureélémentaire Hgo (37%)et sous formede MeHg aqueux 2.25 L d'eat du lac (28%). Le reste du MeHg est retrouvé 100 g de sediment dans les sédiments(13%) et 2lo de du lac Air ouNr Carcassede poisson Hg serait adsorbésur les parois du

Figure 1.3 Microcosmemesurant le recyclagedu mercure microcosme. Cependant, Bloom et lors de la décompositiond'une carcasse de poisson(issu de Bloom et Kuhn. 1996). Kuhn (1996) dans cette étude expérimentalenégligent la consommationprobable des carcassesde poisson par les nécrophagesce qui renddifficile l'applicationde cesrésultats en milieunaturel.

2. Problématique

Les flux de l'énergiedans les écosystèmescirculent selon deux types de réseaux trophiques: le réseautrophique de la prédationet le réseautrophique de la décomposition.Au sein des écosystèmesterrestres et littoraux, le réseaude la décompositionest considéré commela voie majeuredu flux de l'énergie(Smith et Smith, 1998).Les organismesdits <

Cette thèse comporte deux problématiques principales :

i) Est-ce que les organismesnécrophages peuvent accumuler directementle mercure issu despoissons morts en milieu lacustre?

ii) Est-ceque les carcassesde poissonen décomposition,lors d'un cas de mortalité massive(i.e., après le frai du saumondu Pacifique),influencent les concentrationsdu mercureau seindes frayères?

Ces deux problématiquessont importantes puisqu'elles s'intéressentà la biodisponibilitédu Hg chez des organismesvivants appartenantà un niveau trophique presquecomplètement ignoré dans le cycledes contaminants organiques (i.e., la nécrophagie). De plus, si certainspoissons ont toujoursété considéréscomme des vecteurs de nutriments, jamais ils n'ont encore été considéréscomme des vecteursde mercure.Pour I'heure, Krûmmel et al. (2003) ont démontréque les saumonsdu Pacifique(Oncorhyncus nerka), aprèsle frai, délivraientles BPC qu'ils avaientaccumulé toute leur vie en milieu océaniqueau sein de leur frayère natale. La réponseà ces problématiquesva ainsi accroîtrenos connaissancessur le recyclagedu mercurelors de la monaliténon liée à la prédationdes poissons. t2 Chapitre1 : Synthèse

3. Objectifset intérêtsde cetterecherche

L'objectif principal soulevé dans cette recherche doctorale est de mesurer les transferts du Hg des carcasses de poisson vers les organismes aquatiques et vers les invertébrés terrestre,cnécrophages (ces transferts sont indiqués par les flèches rayées dans l'encadré 2) lors de deux cas de mortalité: (1) la mortalité naturelle annuelle des poissonsnon liée à la prédation en milieu lacustre (encadré 2A); (2) la mortalité massive lors du frai du saumon

Quinnat (Oncorhyncus tshawytscha) en rivière (encadré 2B).

Les objectifs spécifiquesde cefterecherche sont :

1) lors la mortalité annuellenaturelle non liée à la prédationau sein des lacs : en laboratoire, dans des aquariums : 202Hg a) de mesurerles taux d'accumulation du Hg (Hg total, et MeHg) des poissons morts enrichis naturellement aux isotopes stables de Hg (totHg) par les organismes aquatiques (sangsues et biofilm recouvrant les carcasses)non totHg, to'Hg enrichis en de même que le taux de perte du par les sangsues nécrophagesà des fins de modélisation (encadré 2A et section 4 du présent chapitre); 202Hg b) d'établir un bilan de masse du au sein des aquariums afin d'évaluer I'importance relative des sangsuesnécrophages par rapport au biofilm lors de la décompositiondes carcassesde poisson; en nature : 202Hg c) de comparer les concentrations de Hg (Hg total, et MeHg) dans les sangsues et le biofilm mesurées sur le terrain avec celles mesuréesen laboratoire en to'Hg plaçant des carcassesde poisson enrichies en dans un lac sans ajouts de 'otng.

2) lors de la mortalitémassive du saumonQuinnat en rivière: a) de déterminerI'impact des carcasses de saumonsur les concentrationsaqueuses desnutriments et les concentrationsde Hg au seindes differents compartiments de la frayère(eau, sédiments, invertébrés) avant et aprèsle frai; b) de comprendrela dynamique du Hg durant le développementdes larves nécrophagesterrestres calliphoridés se nourrissantdes carcassesde poisson échouées(encadré 2B); ChapitreI : Synthèse

Encadré 2 : Recyclagedu MeHg accumulé dans les poissonsmorts au sein des systèmesaquatiques.

A) Recyclaselors de la mortaliténaturelle annuelle non liée à la orédation:

Voies à explorer en dehors de cette recherchedoctorale

B) Recyclagelors de la mortalitémassive du saumonOuinnat après le frai :

adultescalliphoridés

métamorphose

Prédateurs terresiles

Objectifsspécifiques

Voies à explorer en dehors de Aval cetterecherche doctorale (vers le lac Ontario) T4 ChapitreI : Synthèse

L'intérêtet I'originalitéde cetterecherche doctorale sont multiples :

ils relèventl'existence probable d'une voie trophiquesous-évaluée pour le recyclagedu Hg en milieu aquatique(poissons morts ) nécrophages) poissonsrésidents benthivores ) poissonspiscivores); il s'agit du premiertravail visant à mesurerde façondirecte le transfertde Hg des poissonsmorts vers les nécrophagesen utilisantun isotopestable de Hg comme( traceur); son originalitéréside également dans la mesurede transfertsde Hg du milieu aquatiquevers le milieu terrestre(après le frai dessaumons). 4. Rappelsdu modèlecinétique

Le premier objectif spécifique,lors de la mortalité naturelledes poissonsen milieu lacustre,consiste à mesurerde façondirecte des transferts de Hg despoissons morts vers les sangsuesnécrophages en utilisantcomme traceur un desisotopes stables de Hg (totHg),afin de 202Hg déterminerles taux d'accumulationet de pertedu chezles sangsues. Ces deux paramètres sonten effet essentielspuisqu'ils vont permettrel'interprétation et la prédictiondes transferts de Hg dansla chaînealimentaire (Tsui et Wang,2004). L'accumulation des élémentstraces dansles organismesaquatiques peut être décrite au moyende modèlescinétiques. Ces modèles sebasent sur un principeconceptuel simple selon lequel la concentrationtemporelle d'un métal au sein d'un organismeest contrôléepar la différenceentre la prise en chargedu métal et l'élimination de celui-ci (Reinfelderet al., 1998).Cette relation est décritepar l'équation suivante:

Eq"utio perte biodilution

d fHgl*,-, .1,Hg1,",,) . 'l = (k"o,, + (,a.a IR.lHglno,,*,,u,") k HÇ)on,*o, k rroirron r"' lH gl'r,- o, d, 0,,,, Y =ffi-

Avec: [Hg]*64: concentrationdu Hg mesuréedans I'animal (pg/g) t: temps d'exposition au Hg (our) k"u, - constante du taux de prise en charge du Hg de l'eau (parjour) [Hg]"",: concentrationdu Hg dans I'eau (pgll) - [Hg]no,.itu," concentration de Hg dans la nourriture (pglg) ChapitreI : Synthèse 15

AE : efficacité d'assimilationdu Hg de la nourriture ingérée(i.e., fraction du Hg ingéré qui traversela paroi intestinale)(%) IR: taux d'ingestionspécifique de I'animal(mg/g/jour) Kperte:constante du taux de perte(parjour) Kc,oissance: constante du taux de croissance(par.iour)

Comme le démontrecette équation,I'accumulation temporelle du Hg dans un organismeaquatique dépend enpartie de la quantitédu Hg prélevéede l'eau et de la quantité du Hg prélevéede la nourriture.L'efficacité d'assimilationdu Hg de la nourriturepeut être influencéepar plusieursfacteurs tels que la quantitéde nourritureingérée, la compositionde la nourriture,le contenuprotéinique dans la nourriture,la température,le temps de passage dansl'intestin et le pH dansl'intestin de l'animal étudié(Reinfelder et al., 1998).Quant à l'éliminationdu Hg assimilépar I'organismeen question,elle seraiteffectuée par excrétion. Enfin, la croissancede l'animal peut induireune biodilutiondu Hg (voir revuesynthèse de Reinfelderet al., 1998).

Dansnotre étude, nous supposons que les sangsuesnécrophages prennent toutes leur Hg de la nourriture(i.e., carcasses de poisson)et, par conséquent,les changementsdans les concentrationsde Hg mesuréesdans les sangsuesen fonctiondu tempsvont résulterde la differenceentre I'accumulation du Hg issudes carcasses de poissonet l'éliminationdu Hg par lessangsues.

L'équationI devientalors :

Equation 2 :

d lHgl*'" - ' - ('ar n)'lHgf nou,,,u,,, & r k,,o,,,on"")'1Hg1,,,,,, d, o"r"

Simplifions encorecette équationen regroupant: (l) AE et IR en une constantek1 que nous appelonsconstante d'accumulation; (2) kp..t"avec Çroirrunceen une constantek2 appelée, constanted'élimination. Ainsi, l'équation 2 devient :

Equation 3 :

d lHg-]*'" - - kt'fHgf nou,,i,u," k,'l,Hgf",,.", dt t6 Chapitre1 : Synthèse

Quandle tempsd'exposition au métalest assez long, les concentrationsde métaldans l'organisme(on considèreI'organisme comme un compartimentunique) atteignent un état stationnaire (< steady state,,) signifiant que les quantités de métal qui entrent dans I'organismeéquivalent celles qui sontéliminées par l'organisme(: scénario1). Sousforme algébrique,on obtient : Équation4 :

lHEf",,,"r lHg),o,r,,,, kr'lHgln,,o,u,,"= k,'LHgf,,,,, o, I = = k2 lHgl,ouuuu,n lH8l"or"o""", de poisson : FC (facteurde concentration)

Graphiquement,cela donne :

o èo € état stationnaire .o xO o () I ô0 f1'

Jour La penteinitiale de cettecourbe permet de déterminerla valeurde k1 et, connaissantla concentrationde Hg dansles sangsuesà l'état stationnaireainsi que la concentrationde Hg dansles carcassesde poisson,on déterminela valeurde k2 à partir de l'équation4. L'intérêt d'un tel modèleconsiste à pouvoirprédire les concentrationsde mercuredans les sangsuesà un tempsdonné en milieu naturel,connaissant kr et kz.

Nousvenons d'expliquer brièvement l'accumulation d'un métaldans un organismequand l'état stationnaireest atteint.Cependant, on peut se demandersi un état stationnairepeut être atteint en 30 jours (durée de l'expérienceen laboratoire).En effet, étant donné les caractéristiquesparticulières du MeHg soit,une efficacité d'assimilation souvent élevée et des taux d'éliminationtrès lentspour plusieursespèces (Cunningham et Tripp, 1975;Fowler et al., 1978,Riisgaard et al., 1985;Trudel et Rasmussen,1997; Tsui et Wang,2004 ), un autre scénarioprobable peut être envisagé : o Scénario2 : L'état stationnairen'est pas atteint à l'échellede tempsconsidéré parce que 202Hg les pertesde Hg sont négligeables.Dans ce cas, la concentrationde dans les ChapitreI : Synthèse t7

sangsuesà un tempsdonnée seraitdirectement proportionnelle au produit k1'[202Hgen

excès]r-*rr*

o oo d

.o X o

O ôo ir'

D'autresscénarios peuvent être cités comme : (1) la dilutiondu Hg par la croissancede la sangsueet (2) despertes non négligeables du MeHg accumulé.

5. Méthodeset analyses

Cettesection décrit de façongénérale, l'approche expérimentale ainsi que les analyses utiliséesà la réalisationde cettethèse. Elle estdivisée en trois parties: l'étudedes transferts directsde Hg despoissons morts vers les organismes nécrophages en milieu lacustre(chapitre 2),l'étude du recyclagedu mercurelors de la mortalitémassive du saumonQuinnat au sein d'une frayèreontarienne (chapitre 3) ainsi que l'étudeportant sur I'accumulationet la perte du mercurechez les larvescalliphoridés (chapitre 4). Pourplus de détailssur les méthodeset analysesd'une étudedonnée, il importede seréférer au chapitrecorrespondant.

Danstoutes nos manipulations.la vaisselleen contactavec l'échantillona étélavée dans des conditionsultra-propres selon le protocolesuivant sauf indicationscontraires : nettoyageà l'acide HNOr 15 oÂ(grade ACS réactit J. T. Baker,Phillipsburg, U.S.A.), HCI I oÂ(grade ACS réactit J. T. Baker,Phillipsburg, U.S.A.) suivis de septrinçages à I'eau ultrapure(Milli-Q system;> 18 MQ'cm). Toutesles manipulationsdurant les analysesainsi quedurant l'échantillonnage ont étéeffectuées au moyende gantsen latexsans poudre. 18 Chapitre1 : Synthèse

5.1 Echantillonnageen milieu lacustre(chapitre 2)

202Hg 5.1.1 Prise en charge du 202Hgpar les sangsueset le biofilm et perte du par les sangsues: expériencesen laboratoire

Dansle but de suivreet de mesurerde façondirecte la priseen chargedu Hg dansles poissonsmorts par les organismesnécrophages, I'utilisation d'un <r s'avère essentielle.A cette fin, nous avons profité de l'occasion unique qu'offre le projet METAALICUS (encadré3) en utilisant des perchaudes(Perca flavescens) du lac 658 (ExperimentalLakes Area (ELA), ON, Canada)enrichies naturellement aux isotopesstables de Hg (to'Hg).Ces travaux ont étéréalisés au coursde l'été 2002. ChapitreI : Synthèse

Encadré3 : METAALICUS (Mercury Experimentto AssessAtmospheric Loadings in Canadaand the United States).

o Ce projet,regroupant un total de 60 scientifiques, est le premier au monde à avoir ajouté des isotopes stables de Hg dans un écosystème lacustreentier dansle but de pouvoir relier de façondirecte le Hg atmosphériqueavec celui que I'on retrouvedans les poissons. En d'autresmots, leschercheurs veulent savoir si le MeHg retrouvé dans les poissonsest du < vieux > MeHg déjà présentdans le lac oir,du ( nouveau> MeHg issu de la méthylationdu Hg inorganiquesuite aux dépositionsrécentes de Hg atmosphérique.

Lieu et lac sélectionnéspour cette expérience unique:

Parce que la station de recherche scientifique de ELA (Experimental Lakes Area, nord-ouest de I'Ontario, Canada) reçoit de faibles dépositionssèches de Hg atmosphérique,ce lieu a été sélectionné.Plus précisément, le lac 658 (figure l) estle lac danslequel des ajouts de Hg isotopiqueinorganique ont été effectuésà partir de l'été 2000.Rappelons que les isotopesstables sont des éléments chimiquesne se différenciantque par leur nombre de neutronset par le fait même,leur masseatomique. Le Hg comprendsept isotopesstables dont I'abondancerelative naturelle(%) varie' tntHg (0.15); 'e8Hg(10.2); teeHg (16.9);200Hg(23.1); 20'Hg (13.2);2o2Hg (29.7); 'o4Hg (6.8). reeHg Dans le cadredu projet METAALICUS, du a été 200Hg ajouté dans la zone marécageusedu lac, du a été ajoutédans le bassinversant du lac et du 202Hga étéajouté (figure Figure I Photographieaérienne du lac 658 (ELA, directementdans le lac 1). Grâceà cestrois isotopes différentsil va êtrepossible de déterminerla ou les sources ON. Canada). de MeHg retrouvéesdans le poisson(figure 2). La perchaude(Percaflavescens,' figure 3), âgéede ba{f un an, est I'espècesélectionnée dans le cadre de Hg lætope I Hq Iætope I Hg Istùpr 3 Ffq notreétude. En effet,des analyses de Hg isotopique {Lakê) effectuéesen 2002 ont révélé la présencede Hg t isotopiqueen excès('o'Hg) uniquementau seindes ii# perchaudes(sur l5 perchaudesde 7 cm, la t concentrationmoyenne de 202Hgest de 19.1 nglg, ?? poidssec; Dr. P. Blanchfield,Freshwater Institute, Winnipeg,MB, ON, communicationpersonnelle, .ëd 2002). Un an après le début de I'expériencedu projet METAALICUS, il semble que seuls les poissonsse nourrissantd'invertébrés benthiques (commeles jeunesperchaudes; Scott et Crossman, 1974)présentent des concentrationsdétectables de 202Hg Ët non les poissonspiscivores (comme les Figure 2 Contributionrelative destrois sourcesde Hg brochets). isotopiquedans les niveaux de Hg retrouvésdans les Doissons.

Figure 3 Percaflavescens.

Source: d'aprèsle site intemet suivant:http://www.biology.ualberta.calold site/metaalicus//metaalicus.htm 20 ChapitreI : Synthèse

5.I.l.I Priseen charqedu 202Hq par lessanqsues et Ie bio-frlm: expëriencel Un total de 82 sangsues(Percymoorensis marmorata, espèce identifiée sur place par le Dr. S. Podemski,Freshwater Institute, Winnipeg, MB, Canada)a étéprélevé au moyende ( piègesà sangsues> (figure 1.4)dans le lac 240 (: lac de référencenon enrichien isotopes stablesde Hg; ELA, ON, Canada)au débutdu moisd'août 2002. La plupartont

surface du lac 240 sangsueentrant dans le bocal en verre entonnoir

bocal en vene (pot Masson)

sangsuepiégée à I'intérieur du bocal tissu en nylon (empêche la sangsue d'entrer en contact direct avec I'appât) contenanten plastique (: 50 e de fbie de boeuf)

Figure 1.4 Représentationschématique d'un piège à sangsuesplacé dans lazone littorale dulac240 à ELA. ensuiteété placéesdans six aquariumsde plastiquescellés (longueur : I m; hauteur: 40 cm),

-aa-.* aérés(pompe à oxygène)et remplisd'eau du lac 240 à d:*xalffi I Aquariumtémoin ELA. Dans les aquariums,le nombrede sangsuesse (= eau+ sangsues) t\ répaftitcomme suit : huit sangsuesdans les aquariums t\ numérotéde 1 à 5 que nous avonsnourries avec des . ,4f \ 'otrf; 2)51 perchaudesenrichies en 24 sangsuesdans l'aquariumnuméro 6 (: aquariumtémoin; figure 1.5) dans lequel aucune carcassede perchauden'a été ajoutée.Les temps d'échantillonnage ainsi que la façon dont les échantillons ont été prélevés dans les aquariumssont décrits au chapitre 2 à la section Figure 1.5 Photographiedu laboratoire installéà ELA représentantles aquariums < Methods:ELA laboratoryexperiments ). numérotésdel à6. 202 5.l. 1.2 Taux de perte du Hg par les sanqsues: expérience 2

La première partie de l'expérienceen laboratoireavait pour but de mesurer la prise en charge 202Hg du des carcassesde perchaude par les sangsuesP. marmorata eT par le biofilm. La 202Hg deuxième partie de l'expérience visait à mesurer les taux de perte du des sangsuesen 202Hg. contact,cette fois, avec des perchaudesnon enrichiesen Le 16"jour de décomposition en laboratoire,il restait quatre sangsuesdans les aquariumsnumérotés de I à 4. Nous avons Chapitre1 : Synthèse 2l supposéque toutes ces sangsues avaient été en contactavec des perchaudes enrichies au'otHg pendantau moins 16jours. Par conséquent,nous avons considéré que ces demièresétaient désormaisenrichies en 202Hg.Nous avonsnettoyé minutieusement les quatreaquariums afin 202Hg, d'enlevertoute trace de nousles avonsrempli d'eauprovenant du lac240, puis nous avonsreplacé ces sangsues (quatre par aquarium)à l'intérieur.Par la suite,nous avons ajouté totHg. desperchaudes non enrichiesau Lestemps d'échantillonnage sont décrits au chapitre2 à la section< Methods:ELA laboratoryexperiments >>.

202Hg 5.1.2 Accumulation du par les sangsueset le biofilm : expérieîce in situ

202Hg Dans le but de comparernos résultatsd'accumulation du Hg total, du et du MeHg des carcassesde perchaudepar la sangsueP. marmorataet le biofilm recouvrantles carcassesobtenus en laboratoireavec ceux en nature,nous avonsplacé des carcassesde perchaudeenrichies en 202Hgdans la zone littorale du lac 240 à uneprofondeur variant entre 30 et 50 cm.

Seizeboîtes de plastiquecontenant chacune des carcasses de perchaudesenrichies en 202Hgont été placéesdans la zone littorale du lac 240 (figure 1.6A, B). Les invertébrés nécrophages(sangsues et écrevisses)pouvaient entrer et sortirlibrement de la boîtepuisque le grillageplacé à I'ouverturede celle-ciétait grossier(ouverture de 5 X3 cm; figure 1.68). Nousavons opté pour ce < systèmeouvert > plutôtque pour uneboîte retenant les invertébrés nécrophagesafin de vérifier si les invertébrésnécrophages avaient un comportement sédentaireou non en présencede nourriture.Tous les invertébrésobservés dans, à côtéou à unedistance supérieure de 3 m desboîtes d'échantillonnage ont été prélevéssur une période de 1l jours. Les tempsd'échantillonnage ainsi que les espècesd'invertébrés prélevées au coursde cetteexpérience in situ sontprécisés au chapitre2 dansla section< Methods:ELA field experiment>>. 22 ChapitreI : Synthèse

A) ment desboîtes d'échantillonnaee LAKE2ZIO

<-êL r#ffia

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boîteen plastique corde cÉrcassede perchaude

pierre

sangsuecachée sous la pierre Figure 1.6 (A) Carte bathymétrique du lac 240 indiquant l'emplacement des boîtes d'échantillonnagedans la zone littorale et (B) schéma d'une boîte d'échantillonnage(vue latérale)contenant les carcassesde perchaude.

202Hg 5.1.3 Méthode de détermination et de calculs des sources de

Les rapportsisotopiques dans les tissusbiologiques sont déterminésà I'aide d'un spectromètred'émission atomique à plasma induit couplé à un spectromètrede masse (ICP^4S) avec la collaborationdu Dr. H. Hintelmann (Université de Trent, Peterborough, ON, Canada).Les détailstechniques de cesanalyses sont résuméesdans la revue synthèsede Hintelmannet Ogrinc (2003).La limite de détectionde I'appareilest estiméeà 30 pg pour le 'otHg à la fois sousforïne organique et inorganique.

202Hg Dans le cadrede notre étude,nous supposonsque deux sourcesde peuventêtre retrouvéesdans les sangsues: une sourcenaturelle (F1) et une sourceliée aux carcassesde perchaudesenrichies en 202Hg(F2). Après avoir assignéune compositionisotopique aux types de Hg de chaquesource, on calcule la compositionfractionnelle de Hg de chaquesource, en utilisant les équationsde conservationde masse: ChapitreI : Synthèse 23

Ft+F2=1 ('otHgltot%g)*p, + ('otHgl'o'Hg)* F, = ('o'Hgr'o'Hg)nn,u,é do,,to,o,p,,,,

Connaissantle rapportisotopique de la sourceFr (: 0.444),le rapportisotopique mesurédans la sourceFz ainsi que celui mesurédans la sangsue(ces deux valeurssont obtenuespar ICP/MS),on résoutce systèmeà deux inconnues(F1 et F2) pour trouver les valeursdes fractions F (%) pourchaque sangsue.

L'exemplequi suit concernele leeHgutilisé commeun traceurdans les sédiments totHg mais cette application est la même que celle utilisée pou. dans le cadre de notre étude. Ajouter une solutionenrichie à 97.36Yode leeHs -æ21-19 à un échantillon de sédiment induit lesHg - measured un changement dans le rapport isotopique --- leeflg n21u1slly leeHg du inorganique dans cet échantillon. L'amplitude mesuréeentre le rapport de reeHgretrouvé dans les sédiments après leeHgmesuré; ajout(i.e., figure1.7) va être égaleà la quantitéde traceurretrouvée dans Figure 1.7 Chromatogrammeissu de I'ICP/MS pourun tnnHg échantillon de sédiment incubé avec du l'échantillonde sédiment. inorganiquemontrant une augmentationdans le signal tnnHg. de Issude Hintelmannet Ogrinc(2003).

Les analysesde Hg total,de MeHg et desisotopes stables d'azote (ô"N) effectuées danstous les échantillons de cetteétude sont décrites à la section< Materialand methods > du chapitre2.

5.2 Echantillonnagelors de la mortalité massivedu saumonQuinnat au sein d'une frayèreontarienne (chapitre 3)

Aprèsle frai de novembre2000, nous avons échantillonné deux ruisseaux : le ruisseau Wilmot (43o59'N,78"38'0;figure 3.1, chapitre3) danslequel fraient les saumonset le ruisseauGanaraska dans lequel peu de saumonsfraient. Pour chacunde ces systèmes,la densitéde carcassesde saumon(individu/mr) a été mesurée.Nous avons prélevé des 2,4 Chapitre1 : Synthèse

échantillonsd'eau et d'invertébrésaquatiques (une espècecollectrice-filtreuse et deux espècesprédatrices) pour ces deux ruisseaux ainsi que des échantillons de sédiment,de tissus de saumon(i.e., muscle dorsal, foie et æufs), de biofilm recouvrantles carcasses,et d'invertébréstenestres (diptères calliphoridés adultes et larves)aux sitesamont 1, centreI et aval I du ruisseauWilmot uniquementà desfins d'analysesde Hg total et de nutriments.De plus, 28 carcassesde saumonmarquées sur une distancede 240 m ont été suiviesdu début jusqu'à la fin de leur décompositionpar des élèvesde l'école Wilmot afin de mesurerla vitessede décompositiondes carcasses dépendant de leur étatd'immersion dans le ruisseau. Ces28 carcassesétaient réparties de la façonsuivante : dix carcasseséchouées, neufcarcasses à moitiéimmergées et neufcarcasses complètement immergées.

En 2001,seul le ruisseauWilmot a étééchantillonné (avant et aprèsle frai; i.e.,août et novembre,respectivement). Nous y avons prélevé l'eau et les sédimentsà trois sites supplémentairessoit, amont2, centre2 et aval2 dans le but de mieux comprendrela distributionspatiale du Hg dansle ruisseau(figure 3.1, chapitre3). Afin de mesurerI'impact de la décompositiondes carcasses de saumonsur le partitionnementdu Hg dansl'eau (i.e., inorganiqueversus organiqueet dissousver,\us particulaire), nous avons, en plus des concentrationsde Hg total,mesuré les concentrationsaqueuses de MeHg, de Hg total dissous (Hgo) et de Hg total particulaire(Hgp). Parcequ'une augmentation de Hg total dans une rivièreentre les sitesamont et avalpeut résulter d'un gradientnaturel en particulesau seindu ruisseau(i.e., les sitesaval sont considéréscomme plus richesen particulesque les sites amont donc, plus riches en Hgp), nous avons échantillonnéla matière particulaireen suspension(MPS) aux six sitesdu ruisseauWilmot cettemême année. De plus, dansle but d'écarterI'hypothèse selon laquelle des fuites au niveaudes fosses septiques ont engendrédes augmentationsdans les concentrations aqueuses de nutrimentset de Hg, nousavons récolté le coliformefécal Escherichia coli.En effet, ce coliformea été reconnupour être un excellent indicateur de contaminationsrécentes dans les cours d'eau lors des rejets des eaux domestiques,des effluents industriels ainsi que desfeces des animaux à sangchaud. Enfin, un taxond'invertébré aquatique (trichoptère), en plusdes trois autresmentionnés précédemment, a étéprélevé afin de représenterles invertébrés aquatiques déchiqueteurs.

Pour plus de détailssur l'échantillonnageainsi que sur les analysesen laboratoire,il importede seréférer à la section< Materialand methods > du chapitre3. ChapitreI : Synthèse 25

5.3 Echantillonnagelors de l'étudeportant sur l'accumulationet la perte du Hg chezles larvescalliphoridés (chapitre 4)

Quatretruites mouchetées(Salvelinus fontinalis) ont été placéesà deux mètresde la rive du lac Le Petit situéà la basede plein air de Sainte-Foy(Québec, Canada) au mois de mai 2002. Ces carcassesont été coloniséespar les femellescalliphoridés (diptères) venant y pondre leurs æufs. Nous avons prélevé au cours de cette expériencein situ, tous les échantillonsen contact avec les carcasses(femelles adultes calliphoridés,æufs de calliphoridés,larves calliphoridés séparées en deuxclasses de taille : inférieureou supérieure à 1 cm de longueur,adultes calliphoridés après l'émergence, chair de poisson)afin de suivre la dynamiquedu Hg lors du développementpostembryonnaire des larves calliphoridés (encadré4). Pourplus de détailssur l'échantillonnageet sur les analysesde Hg, il importede seréferer à la section< Materialand methods > du chapitre4.

5.4Statistiques

Pour toutes les données présentéesdans ce document, la normalité des données et l'homogénéitédes variancesont été vérifiées et validées.Aucune donnée n'a ététransformée. Toutes les analysesstatistiques ont été effectuéesau moyen du logiciel SYSTAT, version 10, de SPSSScience Marketing Department(Chicago, IL, Etats Unis). ChapitreI : Synthèse

Encadré4 : Cycle de vie desdiptères calliphoridés et descriptiondu développementpostembryonnaire.

Cycle de vie des diptères calliphoridés

Léeende ffiA?È**''nï',ïu. l. Ponte des oeufs dans la carcasse; - 2. Développementdes larves; €rr 3. Stadeprépupal; lulte2 adulte 4. Stadepupal; ,çffil 5. Métamorphose et émergenceen adulte.

larves

prépupesI 4il:n:: pupes

o L'embryogenèseà I'intérieurdes æufs crée une forme larvairetotalement différente de la forme adulte(ou imaginale)qui ne peutêtre atteinte qu'après une véritable métamorphose.

r Chaquestade larvaire est séparépar une mue (i.e., changementde I'exosquelette),contrôlée par I'hormonede mue (ou ecdysone)produite par les cellulesneurosécrétrices cérébrales dont I'activitédépend de stimuli externeset internes.Au total, les larveseffectuent quatre mues au coursde cettephase de leur vie.

o Avant la formationdu puparium(i.e., coconentourant la pupe)à partir de la cuticulelarvaire, la larve mobile cessede senourrir (: prépupe),vide sontube digestifet quitte généralement la carcassepour s'enfouir dans le sol.

o La mue entre la prépupeet pupe est marquéepar une modification de la forme du corps de la larve qui prend l'aspectd'un < tonnelet> en raisonde la contractiondes muscles longitudinaux et par le tannagede la cuticulequi se teinteen brunfoncé et durcit.Ces transformations aboutissent à I'immobilisationde la pupe.

o Durantla métamorphose,tout I'organismeimaginal se construità partir de cellulesrestées en réserve(: cellules imaginales)et qui ne sontpas intervenues dans l'édification de la larve.Parmi ces remaniements profonds, on note: (l) unedégénération des cellules épidermiques larvaires suite à unefragmentation de leurcytoplasme et le rejetde ces cellulesdans la cavitégénérale de la larveoù ellessont phagocytées; (2) un renouvellementtotal de l'épithéliumde I'intestinmoyen puisquela métamorphoses'accompagne d'un changementde régimealimentaire. Les cellulesde l'épithéliumintestinal larvaire dégénèrent et sont rejetéesdans la lumièrede I'intestinmoyen où ellesforment une massecompacte appelée le corpsjaune. Ce corpsjaune persiste dans la tubedigestif de I'imagojusqu'à l'émergence de la mouchequi l'éjecteravia le méconium;(3) desmuscles purement imaginaux (nécessaires au vol parexemple) se construisententièrement pendant la nymphose;(4) desmuscles larvaires disparaissent complètement; (5) desmuscles présentschez la larve sont maintenuschez l'imago mais après avoir été profondémentremaniés. Tous ces changementsdépendent d'un contrôleendocrine complexe.

o La diapause,arrêt de développementà un stadebien précis,donne aux diptèrescalliphoridés la possibilitéde résisterefficacement à I'adversitédes saisons.

lnsoiréde Gullanet Cranston.1994 ChapitreI : Synthèse 27

6. Intégrationdes résultats et discusslon

Cette sectionrenferme les principauxrésultats de la thèseainsi que leur interprétation en trois parties.La premièrepartie résumel'étude portantsur les transfertsdirects de Hg des carcassesde poissonsvers les organismesaquatiques (sangsues nécrophages et biofilm) en milieu lacustre(chapitre 2). La deuxièmepartie de cettesection concerne le devenirdu Hg lors de la mortalitémassive du saumonQuinnat au seind'une frayèreontarienne (chapitre 3). La troisième partie s'intéresseà la dynamique du Hg durant le développement postembryonnairedes larves nécrophages terrestres calliphoridés se nourrissant des carcasses de poissonéchouées (chapitre 4). Enfin, la dernièrepartie de cettesection propose des voies de rechercheà explorerdans le but d'aboutirà un bilan de massein situ lors de cesdeux cas de mortaliténaturelle.

6.1 Les transfertsde mercure des carcassesde poisson vers les nécrophagesdans des lacs boréaux: l'utilisation des isotopesstables de mercure

Les résultatsde cetteétude sont résumés dans le manuscritaccepté pour publication dansle journal EnvironmentalPollution (chapitre 2). Il importede préciserque desrésultats préliminairesissus de la maîtrise(Sarica,200l) ont été insérésdans cette rechercheet constituentun quartdes résultats (figure 2.7, chapitre2). Tous les autresrésultats découlent de cefferecherche doctorale.

Lors d'une expériencepréliminaire menée au lac Laflamme(Parc des Laurentides, Québec,Canada) enjuillet 2000,au coursde laquelle24 carcassesde poissonont étéplacées dansla zone littoralede ce lac, seulesdeux espècesde sangsuesont toujoursété prélevées soit, à côté des poissonsmorts (la sangsueNephelopsis ob,scura), soit à l'intérieur des carcasses(la sangsueHaemopis sp.) sur une période de 20 jours. En mesurantleurs concentrationsde Hg total en fonction du temps d'expositionaux carcasses(figure 2.1, chapitre 2) nous avons observé une régressionpositive pour ces deux espèces: les concentrationsde Hg total mesuréeschez N. obscuraet Haemopissp. ont en effet augmenté de 100%et 5000Â,respectivement, entre lesjours 0 et20 alorsqu'aucune augmentation dans les concentrationsde Hg total n'a été mesuréechez d'autres invertébrésbenthiques 28 Chapitre1 : Synthèse

(l'amphipodeHyalella aztecaet la larvede libelluleLibellula sp.)proches ou éloignéesdes poissonsmorts (figure 2.1, chapitre2). En observantle profil desconcentrations de Hg total dansles sédimentsen fonctiondu temps(figure 2.1, chapitre2), nos résultatsn'indiquent aucunevariation dans ces concentrationspour les sédimentstémoins (i.e., sanspoissons morts) mais indiquentune augmentationsignificative (+ 30%) de ces concentrationsau sein dessédiments prélevés sous et à côtédes carcasses durant les 13 premiersjours, suivi d'une diminution significative (- 24%) au jour 20. Cette augmentationserait probablementle résultatdes débris de poissonsdéposés à la surfacedes sédiment et digéréslors desanalyses de Hg; quant à la diminution subséquente,elle seraitprobablement due à I'ingestiondes débris de poisson par des organismesnécrophages. Nous en avons conclu que le Hg provenantdes poissons morts ne s'accumulaitpas dans les sédimentsmais semblait être repris en partiepar lesorganismes nécrophages (sangsues) et par conséquent,pouvait retourner dans la chaînealimentaire lors de la prédationde ces sangsuespar les poissonsrésidents et les oiseaux(Sawyer, 1986; Davies et Gates,1991).

Cependant,nos conclusions ne sontfondées que sur descorrélations entre la teneuren Hg total dans les poissonsmorts et celle dans les sangsuessans un lien causaldirect. Par conséquent,nous avonsutilisé un traceurpour suivredirectement les transfertsde Hg des poissonsmorts vers les organismesnécrophages : ce traceurétait un isotopestable du Hg, le totHg.Rappelons que nousavons conduit à la fois une expérienceen laboratoire(composée de deux parties: l) expérienced'accumulation, 2) expériencede perte du Hg202chez les sangsuesnécrophages) et une expériencesur le terrain (lac 240: lac sansajouts de Hg isotopique).

A) Expériencesen laboratoire:

1) SangsuesP. marmorata

Nos résultatsen laboratoiremontrent clairement que les concentrationsde Hg total, MeHg et 202Hgen excès augmententde façon quasi linéaire chez les sangsuesen présence uniquementdes carcassesde perchaudesenrichies (figure 2.2a, chapitre2). En effet, les quantitésde Hg total, MeHg, et202Hgen excès(figure 2.2b, chapitre2) augmententen fonctiondu tempsd'exposition aux carcassesalors que le poidssec des sangsues ne variepas (figure 2.2c, chapitre2). Ces résultatsindiquent clairementque les sangsuesP. marmorata Chapitre1 : Synthèse 29 accumulentdirectement le Hg despoissons morts ce qui confirme les résultatsobtenus dans le lac Laflammepour les sangsuesNephelop,sis obscura et Haemopissp. (scénario2 du modèle 202Hg cinétique,section 4 du présentchapitre). Le taux de pertedu calculéchez les sangsues P. marmoralaest évaluéà 0.60 ng202Hgliour(figure 2.3, chapitre2) ce qui est environ4 fois 202Hg 202Hg4our;; moinsélevé que le taux d'accumulationdu chezcette espèce (2.25 ng par conséquent,il en résulte une accumulationnette de Hg chez les sangsueset cette accumulationnette chez certains individus dépasse légèrement, à la fin de I'expérience,les concentrationsmesurées chez les carcasses(i.e., bioamplification, facteur de concentration: 1.13).Le tempsde demi-viedu MeHg chez les sangsuesP. marmorata,défrni comme le tempsrequis pour que la quantitédu MeHg dans un organismediminue de moitié quand l'organismen'est plus en contactavec le MeHg (Hare,1992), est de 22 jours.Cette valeur est compriseentre les tempsde demi-viedéterminés pour l'amphipodeHyalella azteca(11-18 jours : Tsui et Wang, 2004;40 jours : Lloyd, 1979)et l'écrevisseOrconectes virilis (2000 jours : Headon,1994). Enfin, les sangsuesqui se sont nourriesdes carcassesde perchaude enrichiesatteignent les proportionsde MeHg (%) et la signatureisotopique des poissons mortsdans un intervallede tempscompris entre 8 et 16jours seulement(figure 2.4b, chapitre 2). Au débutde l'expérienceseulement 20%o du Hg total dansles sangsuesest sousforme de MeHg alorsqu'après 8 jours, 80%du Hg estsous forme de MeHg (figure2.4a, chapitre 2).

2) Carcassesde oerchaudes

Les concentrationsde Hg total, MeHg et202Hgen excèsdiminuent significativement chezles perchaudes enrichies dont se nourrissent les sangsues au fur et à mesuredu processus de décomposition(figure 2.5, chapitre2). Cela suggèreque soit : l) P. mqrmorataingère préferentiellementles tissusriches en Hg (Sawyer,1986) soit, 2) que la décomposition bactériennea résultéen la libérationdu Hg contenudans les carcasses sous forme de HgOsuite à la déméthylationdu MeHg etlouen la libération(i.e., solubilisation) directe de MeHg dans l'eau(Bloom et Kuhn,1996; figure 1.3, chapitre l).

3) Biofilm

202He Les concentrations de Hs total et de en excès mesurées dans le biofilm augmententfortement durant les 4 premiersjours pour ensuitedéclinées vers les niveauxde 30 ChapitreI : Synthèse base(figure 2.6b, chapitre2) ce qui suggèreque le Hg accumulédans le biofilm est possiblementperdu sous forrne de HgO(Bloom et Kuhn,1996)

Un bilan de masseau seindes aquariums (figure 2.6c, chapitre2) indiqueque la majorité du Hg (70%) contenudans les carcassesde perchaudesest soit :l) perdu lors de la volatilisationdu HgOsuite à la déméthylationbactérienne du MeHg des carcassessoit, 2) libérésous forme directe de MeHgdans I'eau (Bloom et Khun,1996) et que16yo du Hg des carcassesest retrouvédans les sangsuesnécrophages. En termede biodisponibilité,il est reconnuque le HgOest une espècechimique du Hg qui ne s'accumulepas dans les organismes vivants à l'inversedu MeHg aqueuxet tissulaire,dont la proportionatteint 80% du Hg total chezles sangsuesaprès seulement 8 jours.

B) Expériencede transplantationin,silz

La décomposition des carcassesdans la zone littorale du lac 240 a été extrêmement rapide et la majorité des carcassesétaient complètementvidées de leur contenu après seulement1.5 jours (figure 1.8). Cette décompositionrapide expliqueraitpar conséquentla raisonpour laquelleon visualisepeu de poissonsmorts en naturedans la zone littorale des lacs.

Figure 1.8 Photographiesde carcassesde perchaudeaprès un séjour de 1.5jours dans la zone littorale du lac 240.

On peut de se demander si cette décomposition rapide in situ est le résultat de I'interventionsimultanée de : l) plusieursespèces de nécrophages,2) d'un plus grandnombre de nécrophagesappartenant à la même espèce(densité élevée). À la vue des résultats, la deuxième hypothèseest retenue.En effet, au cours des I I jours de l'expérience in situ, nous avons prélevé deux espècesde sangsues,P. marmorata et Macrobdella decora ainsi que deux écrevisses O. virilis. Seuls les individus de P. marmorata ont présenté des ChapitreI : Synthèse 31 concentrationsde 202Hgen excèset les concentrationsmesurées chez ces derniers in situ sont équivalentesà cellesmesurées en laboratoiredurant les deuxpremiers jours d'expositionaux carcassespour les individusde la même espèce(figure 2.6a, chapr:tre2). Le fait que ces concentrationsen 2o'Hg en excès ln situ n'atteignentjamais celles élevéesmesurées en laboratoireest expliquéepar la mobilité de P. marmorataen natureen présencede nourriture. Cettehypothèse est validéepar le fait que nousavons prélevé des individusP. marmorata enrichisen totHg à plus de 3 m desboîtes sous les pierres,suggérant que cesderniers sont venusse nourrir des carcasses enrichies pour ensuitealler secacher sous les pierres à l'abri de leursprédateurs naturels (poissons, oiseaux). Une expériencesimple, consistant à placerle mêmenombre de trappesà sangsues(figure 1.4, chapitrel) dansle lac 240 et dansle lac Laflamme permet d'affirmer que la densitédes sangsuesP. msrmorata est nettementplus élevéedans le lac 240 (2 sangsues.m-2après seulement une nuit) que celle des sangsues Haemopis sp. du lac Laflamme (0.16 sangsuesseulement après 5 jours) et que, par conséquent,le tempsrequis pour décomposerles carcasses de poissonest spécifique au lac et dépenden grandepartie de la structureet la densitédes communautés des nécrophages.

6.2 Libération du mercureet des nutrimentslors de la décomposition descarcasses de saumonau sein d'une frayèrebordant le lac Ontario

Les résultatsde cetteétude sont résumésdans le manuscrit publié dansle journal Limnolog,, and Oceanography(chapitre 3). Il importe de préciser que des résultats préliminairesissus de la maîtrise(Sarica,200l) ont été insérésdans cette rechercheet constituentun tiersdes résultats (figure 3.1, chapitre 3). Tousles autresrésultats découlent de cetterecherche doctorale.

Il estmaintenant établi que le frai dessaumons du Pacifiqueaugmente non seulement les concentrationsaqueuses en phosphore,en azoteet en carboneorganique dissous mais aussiles concentrations des BPC dansles sédimentsde leursfrayères natales (Kriimmel et al., 2003)par excrétion(gamètes et frces) mais surtoutlors de la décompositionde leur carcasse (Larkin et Slaney,1997; Cederholm et a|.,2000; Krûmmelet a1.,2003).Cette augmentation dansla concentrationdes nutrimentspeut stimuler: (l) la productionprimaire (Stockner et Shortreed,1978; Peterson e/ al., 1993;Cederholm et al., 2000); (2) l'activité hétérotrophe (Sobczak,1996) et (3) la productionsecondaire (Peterson e/ al., 1993;Stockner et Maclsaac, JZ ChapitreI : Synthèse

1996)ce qui accroîtles chancesde survie de la future générationdes saumons(Hyatt et Stockner,1985; Ward et Slaney,1988; Kline et al., 1990;Bilby et al., 1996;Larkin et Slaney,1997).

Dans le cadre de cette étude, nous avons testé l'hypothèseselon laquelle les concentrationsde Hg et de nutriments (NHa*, NO3-, P, COD) au sein de composantes biotiques (invertébrésaquatiques et terrestres)et abiotiques (eau, sédiment)du système seraientaltérées par la décompositiondes carcassesde saumonaprès le frai. Nous avons échantillonnédurant deux annéesconsécutives (2000 et 2001) au sein d'une frayère ontarienne,tributaire du T,acOntario, qui reçoit chaqueannée 20 000 saumonsQuinnat (Oncorhyncustshowytscha). Ces deux annéescontrastent par la présenceexceptionnelle en 2001 d'un ours qui a prélevétoutes les carcassesà une stationaval de la frayère.Nos résultatsont démontréque les stationsd'échantillonnage, où les densitésde carcassesétaient les plus élevées,présentaient des concentrationsaqueuses de Hg total, MeHg, Hg total particulaireet de nutrimentsplus élevéesque les stationsoù les densitésde carcassesétaient les plus faibles (figures 3.3 et 3.4, chapitre3). Ces augmentationsne sont pas une conséquencede l'hydrologiedu ruisseau(i.e., variationstemporelles du débit; figure 3.2, chapitre3), ni le résultatde fuitesau niveaudes fosses septiques puisque les concentrations aqueusesd'E. coli ne varientpas avant et aprèsle frai.

Les concentrationsde Hg total mesuréesdans les sédiments(figure 3.6, chapitre3) présententune grandevariabilité inter et intra-stationen fonction du temps. Parce que les sédimentspeuvent être déplacésde l'amont vers I'aval durant des tempêtes(Sarica et al., 2004a),il est difficile d'utiliser les sédimentscomme variable pour faire un suivi du Hg provenantdes saumonsmorts. Cette grandevariabilité au sein des sédimentsserait aussi probablementle résultatdes saumons femelles qui lesperturbent fortement au momentdu frai poury déposerleurs æufs.

Les concentrationsde Hg total mesuréesdans les invertébrés aquatiques et terrestresse nourrissantdes carcassesde saumonont augmentéjusqu'à 25 fois (tableau3.1, chapitre3). En milieu aquatique,les principauxtaxa (collecteurs,déchiqueteurs et prédateurs)collectés à la stationavec une densitéélevée de carcasses(station Ml) étaientde 1.4 à 3.1 fois plus contaminésen Hg total que les individus du même genreprélevés aux stationstémoins (stationsGR et U1). De plus,les insecteséchantillonnés après le frai 2001à une stationoù se aa Chapitre1 : Synthèse JJ décomposaientdes carcasses (station Ml) étaientde 1.4à 2.0 fois pluscontaminés en Hg que ceuxcollectés à ce mêmesite avant le frai (tableau3.1, exceptépour le prédateurHexatoma sp.,chapitre 3). Cettedifference parmi les taxa semble être liée au niveautrophique de chaque taxa influençantainsi le degréauquel ils ont accumuléle Hg provenantdes saumonsmorts commeil I'a été démontrépour les nutriments(Chaloner et Wipfli, 2002).Les larvesdes mouchesterrestres calliphoridés se nouffissantdes carcassesde saumonéchouées ont présentésdes concentrationsde Hg total 25 fois plus élevéesque cellesde leurs parents prélevésau momentde la pontedes æufs à la mêmestation et deuxfois plus élevéesque les saumonsmorts (tableau 3.1, chapitre 3). Parconséquent, les larvesnécrophages calliphoridés bioamplifientle Hg et le transferentdu milieu aquatiquevers le milieu terrestre(figure 3.8, chapitre3).

En 2001, le prélèvementdes carcassespar l'ours en aval, a engendrédes baisses significativesdans les concentrationsaqueuses de Hg et de nutrimentscomparées à celles mesuréesau même endroit un an auparavantsans la présencede l'ours. Un budget préliminaireau seinde la frayère(figures 3.8 et 3.9, chapitre3) suggèreque: 1) les carcasses de saumonreprésentent une sourceimportante de Hg et de nutrimentspour les réseaux trophiquesaquatiques et terrestreset que 2) les invertébrés(calliphoridés) et vertébrés terrestres(ours) peuvent être d'importants vecteurs de Hg du milieu aquatiquevers le milieu terrestreen plusd'être d'importants vecteurs de nutriments(Gende et a1.,2004).

6.3 Le devenir du mercureaccumulé par les larvescalliphoridés se nouffissant des carcassesde poisson

Les résultatsde cette étude sont résumésdans le manuscritsoumis en vue d'une publicationdans le journal EnvironmentalToxicology and Chemistry(Chapitre 4). Tous ces résultatsdécoulent de cetterecherche doctorale.

Après le frai du saumondu Pacifique,il est désormaisétabli que de nombreuses carcassesretrouvées au sein de la frayère(i.e., 10 000 - 300 000 carcassesdépendant de l'intensitédu frai en terme d'individus;Gende et al., 2004)s'échouent et sont rapidement coloniséespar les diptèrescalliphoridés femelles venant y pondreleurs æufs.Nous avons démontréque les larvesde calliphoridésqui senourrissent des carcasses de saumonéchouées 34 Chapitre1 : Synthèse pouvaientreprésenter un vecteursignificatif de mercuredes écosystèmes aquatiques vers les milieux terrestresdurant les événementsde mortalité massiverencontrés après le frai du saumonQuinnat (Sarica et al., 2004b). Ces larves nécrophagesbioamplifiaient le Hg provenantde saumonsmorts et étaientjusqu'à 25 fois plus contaminéesen Hg que leurs parents.Nous avonsvoulu vérifier danscette étude si ces larvespossédaient un mécanisme natureld'excrétion du Hg lors de leurdéveloppement postembryonnaire (encadré 4, cf. p.26).

Nos résultatsont clairementindiqué que les larves calliphoridéspossédaient un mécanismenaturel d'excrétion du mercurepuisqu'elles accumulaient le Hg des poissons mortsjusqu'au stadepupal pour le perdreen grandequantité (usqu'à 95oÂpour le MeHg) aprèsavoir émergées(figures 4.1 et 4.2, chapitre4). Les proportionsde MeHg par rapportau Hg total ont augmentéde 30Yochez les larvesdont la taille estinferieure à 1 cm de longueur, de 65Yochez celles dont la taille est supérieureà I cm de longueurpour atteindre90Yo chez larvesparvenues au stadepupal, ce qui indiqueque le MeHg prélevédes carcasses de poisson est retenu en grande partie au cours du développementpostembryonnaire. Le facteur de concentrationcalculé pour chacunde cesstades est en effet de 0.6 pour lespetites larves, 1.0 pour les grandeslarves et 1.9 pour les pupes.Nuorteva etNuorteva (1982) ont démontréen laboratoireque les larvescalliphoridés se dépuraientnaturellement de leur Hg aprèsleur émergencevia le meconium.Les concentrationsainsi que les quantités de Hg total (figure4.1, chapitre4) et de MeHg (figure 4.2, chapitre4) mesuréeschez les adultescalliphoridés venant pondreles æufsetchez les adultesvenant d'émergés sont identiques ce qui appuiefortement les conclusionsde ces auteurs.Le devenir de ce Hg excrété via le meconium dans l'environnementn'est pas encore connu à cejour.

6.4 Conclusion

Cette thèseest la premièreà s'intéresserau devenirdu Hg bioaccumulédans les poissonslors de deuxcas contrastés de mortaliténaturelle des poissons: 1) lors de la mortalité annuelledes poissonsdans les lacs;2) lors de la mortalitémassive du saumonQuinnat en rivière.

Dans le cas de la mortalité massivedes saumons,nos résultatsdémontrent que I'excrétiondu Hg suite à la décompositionde carcassesde saumonprésente un impact écosystémiquenon seulementsur les ruisseauxeux-mêmes mais aussisur l'environnement Chapitre1 : Synthèse 35 terrestreconnexe à ces systèmesvia l'action des vertébréset invertébrésnécrophages. En effet, après la décompositiondes carcassesde saumon,la chimie de l'eau peut être complètementaltérée et les concentrationsaqueuses de nutrimentset de Hg (dont le MeHg) peuventaugmenter jusqu'à 25 fois. Ces augmentationsdans les concentrationsaqueuses de Hg serépercutent sur les concentrationstissulaires de Hg au seindes invertébrés aquatiques. Les invertébrésterrestres nécrophages calliphoridés qui se nourrissentde carcassesde saumonéchouées ou à moitié immergéesbioamplifient le Hg des saumonsmorts pouvant représenter,par conséquent,un importanttransfert de Hg du milieu aquatiquevers le milieu terrestre.Cependant, il semblequ'en présencede prédateursterrestres comme des ours, le recyclagedu mercureissu des saumons morts est complètement modifié. En effet,un budget préliminaireindique que 80% de ce Hg peutêtre transferédu milieu aquatiquevers le milieu terrestrepar de tels prédateurs.

Les larvesnécrophages calliphoridés présentent des concentrations de Hg trèsélevées par rapportà cellesmesurées chez leurs parents en plus de bioamplifierle Hg des saumons morts dont elles se nourrissent.Nos résultatsdémontrent que les larves possèdentun mécanismed'excrétion naturel du Hg (inorganiqueet organique)juste aprèsl'émergence via le méconium.Nous concluons,par conséquent,que seulesles larves et non les adultes calliphoridésreprésentent un risque réel de contaminationen Hg pour leurs prédateurs naturels(oiseaux, insectes, jeunes saumons etc.). Le devenirdu MeHg lié au mécomiumdans I'environnementn'est pas encore connu.

Dansle casde mortalitéplus faible de poissonsen milieu lacustre,bien que nousne démontronspas un impactécosystémique du Hg provenantde cescarcasses, nous prouvons que des transfertsdirects de Hg existentà un niveautrophique jusqu'alors complètement ignoré (i.e, les nécrophages).Nos résultatsindiquent que les sangsuesse nourrissentdes poissonsmorts et que leur proportionde MeHg par rapportau Hg total atteint 80% après seulement8 jours d'expositionaux carcassesalors que sans poissons morts, le pourcentagede 202Hg MeHg dans les sangsuesest de 20Yo.lJn budgetdu en aquariumsuggère que les sangsuesreprésentent l6Yo de ce recyclageet que les < pertes> comptent portr 70oÂ.Par pertes,on entend: pertepar volatilisationdu HgO,solubilisation du MeHg et adsorptionsur les parois de I'aquarium.Le biofilm est responsablede la formation du HgOsuite à la déméthylationbactérienne du MeHg suivie d'une réductionbactérienne ainsi que de la solubilisationdu MeHg. Cependant,l'extrapolation de cesrésultats en natureest dangereuse 36 ChapitreI : Synthèse car le nombrede sangsuesintéragissant avec les carcassespeut être plus élevéet la présence de brouteurspeuvent tous deux diminuer I'activité du biofilm.

Que ce soit en milieu lacustreou en rivière, cetterecherche doctorale constitue un premierpas afin d'établirun budgetfinal du Hg libéré par les poissonsmorts au sein des systèmesaquatiques. D'autres études sont nécessaires pour y parvenir,entre autres, il serait intéressantde connaître,dans le casde la mortalitémassive des saumons, le taux d'ingestion des invertébrésterrestres et aquatiquespar les jeunes saumonsainsi que la proportion des carcassesconsommées par les ours et autresvertébrés (reptiles, oiseaux, mammiÊres). En milieu lacustre,il estnécessaire de connaîtrele taux annuelde monalité naturellenon liée à la prédationdes poissons de mêmeque le taux d'ingestiondes nécrophages et desbrouteurs par leursprédateurs naturels à l'échelledu lac. ChapitreI : Synthèse JI

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Chapitre 2 : Mercury transfer from fish cafcassesto scavengersin boreal lakes:the useof stableisotopes of mercury(article 1)

JoséSarical, Marc Amyot2,Landis Harel, Paul Blanchfield3, R.A. (Drew)Bodaly3, Holger Hintelmannaand Marc Lucotte5. l Institut National de la RechercheScientifique (INRS) - Eau, Terre et Environnemen! Universitédu Québec,C.P. 7500, Sainte-Foy, QC, GIV 4C7, Canada; 2 Départementdes sciencesbiologiques, Université de Montréal,C.P. 6128, Succ.Centre- Ville, Montréal,QC, H3C3I7, Canada; 3 FreshwaterInstitute, Fisheries and Oceans Canada, 501 University Crescent, Winnipeg, MB, R3T 2N6,Canada; a Departmentof Chemistry,Trent University, 1600 West Bank Drive, Peterborough,ON, K9J 788, Canada;[email protected]: 5 Institutdes sciences de I'environnement,Université du Québecà Montréal,C.P. 8888, Succ. Centre-ville,Montréal, QC, H3C 3P8,Canada.

EnvironmentalPollution (sous presse) 50 Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers

Résumé

Les nécrophagesjouent un rôle importantdans le flux de l'énergie,de la matièreet des polluants au sein des réseauxtrophiques. Dans le cas du méthylmercure(MeHg), qui se bioamplifie le long des réseaux trophiques aquatiques,le mouvement de ce composé organométalliquedes carcassesde poisson vers les nécrophagesn'a encore jamais été démontré.Nous avons mesuré les transfertsde MeHg des carcassesde poisson vers les sangsuesnécrophages dans deux lacs boréaux et en laboratoire.Les résultatsobtenus lors d'une expériencepréliminaire in situ ont indiqué que les sangsuesétaient fortement attirées par les carcassesde poisson et que leurs concentrationsde Hg augmentaientjusqu'à un facteur 5 durant le temps d'exposition aux poissonsmorts. Dans le but de mesurer des transfertsdirects de Hg en conditionscontrôlées, nous avons nourri des sangsuesavec des carcassesde poissons naturellementenrichies en 'o'lHg. Les sangsuesont rapidement accumuléle Hg de ces poissonsmorts et en moins de deux semainesont affeint la signature isotopiquede cescarcasses. Les invertébrésnécrophages, comme les sangsue,pourraient ainsi retourneren partie le Hg des carcassesde poissonvers d'autres niveaux trophiquesau sein deslacs. Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 51

Abstract

Scavengersplay an importantrole in the flow of energy,matter and pollutantsthrough food webs. [n the caseof methylmercury(MeHg), which biomagnifiesalong aquatic food chainsand can reachvery high concentrationsin fish, the movementof this metal from fish carcassesto aquaticscavengers has never been demonstrated.We measuredthe transfer of MeHg from fish carcassesto scavengingleeches in two boreal lakes and in the laboratory. The resultsof an initial field experimentindicated that leecheswere stronglyattracted to fish carcassesand that their Hg concentrationsincreased by as much as a factor of 5 during the time that Hg-rich fish were availablefor consumption.To measurethe transferof Hg under 202Hg-labelled controlledconditions, we exposedleeches to fish that had beenmarke d in situ following a whole lake 202Hgaddition. Leeches rapidly accumulatedHg from fish carcasses, and within two weeks assumedthe isotopic signature of the carcasses.Necrophageous invertebratessuch as leechescould thereforereturn Hg from fish carcassesto other trophic levelsin lakes.

Key words: scavengers,leeches, fish carcasses,methylmercury, stable isotopes of mercury 52 Chaoitre2: Mercurv transferfrom fish carcâssesto scavengers

1. Introduction

Methylmercury(MeHg) is a neurotoxicantthat is accumulatedby aquaticorganisms and biomagnifiedalong food chains(Porcella, 1994; Morel et al., 1998;Ullrich et al., 2001). Even lakes remote from point sourcescan have high mercury (Hg) concentrationsbecause inorganicHg is carriedover greatdistances in the atmosphereand can be methylatedlocally (Fitzgeraldet al., i998). BecauseHg biomagnifiesalong aquatic food chains,the majorityof the MeHg presentin the watercolumn of lakesis in fish (Porcella,19941'Watras et al., 1994). When thesefish die, their Hg could be recycled(Sarica et al., 2004b).The mortality of fish can result from a variety of causesincluding senescence(Ricker, 1945;Schneider, 1997; Savenkoffand Castonguay,2003), starvation(Lambert and Dutil, 1997;Dutil and Lambert, 2000;Savenkoffand Castonguay,2003), depleted oxygen (Barica et al., 1983;Danylchuk and Tonn, 2003),or industrialaccidents (Naylor et al., 2000).The nutrients(DeVault et al., 2003) and MeHg in fish carcassesdo not necessarilyenter the microbial loop but can be assimilated by scavengerssuch as leeches.Because fish carcassesrepresent a large potential sourceof MeHg for aquatic scavengers,we set out to determineif MeHg is indeedtransfened from carcassesto necrophageousinvertebrates in the field and in the laboratory.

First, we carried out a preliminary experiment in a small boreal lake in southern Quebec (Lake Laflamme) to monitor the successionof freshwaterinvertebrates on fish carcasses and to measure Hg concentrations in these scavengers during carcass decomposition.Based on these initial findings, we designedparallel laboratory and field experimentsin which we followed the uptakeof 202Hgby scavengersfrom yellow perchthat had been exposedto this stableHg isotope in anotherboreal lake (Lake 658, Experimental LakesArea (ELA), Ontario). Throughthis combinationof field and laboratoryexperiments, we hopeto determineif Hg in fish carcassesis likely to be takenup by scavengersin nature.

2. Methods

2.1. Field experimentin LakeLaflamme

Ultra-clean techniquesassociated with mercury sampling were used in this study. Samplebottles and laboratoryglassware were acid washedwith 15% HNO3 (v/v), l% HCI (v/v) and carefully rinsed seventimes with ultrapurewater (Milli-Q systemwater, > 18 Mohmcm-r) while wearingunpowdered latex gloves. Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 53

In early June 2000, 24 carcassesof smallmouthbass (Micropterus dolomieu) were placedat a depthof 2 metersin the littoral zoneof Lake Laflamme(47"19'N, 71"07'W),a boreal lake locatedjust north of QuebecCity, Quebec,Canada. Littoral zonesof lakes are consideredto be sites of natural fish mortality becausethey are the feeding and spawning grounds for many fish (Elder and Smith, 1988). Furthermore,carcasses were placed on sedimentbecause dead fish are assumedto sink to the lake bottom at the low temperatures encounteredduring our experiment(10-15"C; Parker 1970; Elder and Smith, 1988). Individualcarcasses, set 5 m apart,were placed on large-meshplastic screens (2.8 x 2.1 cm aperture)and anchoredto the sedimentsusing cords and stakes.Additional screeningwas installed above half of the fish carcassesto restrict feeding by vertebrates(referred to as "protected carcasses").Carcasses were grouped into three classesaccording to their total length:class 1 :20-25 cm;class 2:25-30 cm andclass 3 : 30-45cm.

Diverscollected two fish of eachsize class (one protected and one unprotected) on 1, 6, 13 and 20 d afterthe fish were placedin Lake Laflamme.The majority of carcasseswere completelydecomposed by day 20. Each carcasswas gently placed in a plastic box while underwaterto retainassociated scavengers. Divers then used cores (4.4 cm diam.x 10 cm) to collect sedimentsunderlying and adjacentto carcasses,as well as at a nearbycontrol site withoutcarcasses. Invertebrates were also collected in cores(7.8 cm diameterx 15 cm) from sediment underlying and adjacentto the carcasses.Lastly, additional invertebrateswere obtainedby dragginga benthic net (0.5 mm mesh aperture)along the sedimentsituated on one side of each fish carcass.In the laboratory,approximately 0.259 (wet weight) of fish dorsalmuscle was placedin plastic bagsand frozen.The uppermostcentimeter was removed from each sedimentcore and frozen in a high-densitypolyethylene container. Invertebrates were sorted to the lowest taxonomic level possible (Klemm, 1985; Menit and Cummins, 1996)and allowedto depuratefor 48 h to eliminateHg boundto gut contents.They were then placedon Teflon sheetsin either 1.5 ml high-densitypolyethylene microcentrifuge tubes (small invertebrates;Croteau et al., 2001) or in a Petri dish (large invertebrates;Hare et al., 1989)and frozen.

2.2. Laboratoryandfield experimentsat ELA

To measureHg transferfrom fish carcassesto necrophageousleeches, we userl'o'Hg- rich yellow perch (Percaflcwescens) from Lake 658 (latitude and longitude:49o 44'N, 93" 54 Chaoitre2: Mercurvtransfer from fish carcassesto scavengers

44'W; ELA, Ontario,Canada); this lake had been spiked in June 2001 with three stable isotopesof Hg (includingtotHg) as part of the whole-ecosystemexperiment (METAALICUS: Mercury Experimentto AssessAtmospheric Loadings in Canadaand the United States).As a result,the yellow perchused in our laboratoryand field experimentshave a specific isotopic 202Hg signaturefor that they acquiredin the wild. Yellow perchwere caughtby gill netswith meshsizes of either8 mm or 10 mm (2-m high x 15-m long). Gill netswere set for short periodsof time (<15min) andcaptured yellow perchwere immediately anaesthetized in clove oil and thentransported on ice backto the ELA field station.

2.2.1.ELA Laboratoryexperiments

In separateexperiments, we measured:(1) 202Hguptake by leechesand biofilm from to'Hg-labelled yellow perch;(Z)tot$g lossfrom leechesthat had fed on theseperch. We also measuredNisotope ratios in scavengersand carcasses.

To measureHg transferfrom carcassesto scavengersand biofilm, a total of 78 leeches (Percymoorensismarmorata; mean(* standarddeviation: SD) dry weight of 0.45 + 0.10 g) were collectedfrom ELA Lake 240, to which no Hg isotopeshad been added.Ten leeches were immediatelyfrozen to determineinitial Hg concentrationsand five were sacrificedfor taxonomicidentification. Forty leecheswere placedin five aquaria(8 leechesper aquarium), and thirteen in a sixth aquariumthat servedas a control. Nine isotopicallyenriched, freshly- killed yellow perch(age 0; mean(* SD) lengthof 9.0 + 0.4 cm anddry weightof 1.8+0.2 e) from Lake 658 were placedin eachaquarium, except for the control aquariumto which no fish were added. Temperature, pH and dissolved oxygen concentrations in aquaria (temperature: 18 * loC; pH: 7.04+ 0.02; oxygen: 8.3 * 0.6 mg L-r) remainedsimilar to thosein Lake240.

Four leecheswere removedfrom eachof four aquariumson days 2, 4, 8 and 16 after perchaddition. Leeches in the fifth aquariumwere not sampledduring the first 16 days. totlFrg Becausecarcasses were completely decomposedby day 16, we added additional enrichedyellow perch(n : 9) to the fifth aquariumand collectedthree leeches from it on each of days 28 and 32. Two leecheswere collectedfrom the referenceaquarium on eachof days 2, 4, 8, 16 and 28 and three leecheswere taken from this aquariumon day 32. All leeches collectedwere rinsed with deionisedwater and frozenindividually on cleanTeflon sheeting, Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 55 insertedin a clean polypropylenecentrifuge tube (volume : 15 mL; Eppendorf)and frozen until Hg andôl5N analyses.

Fish carcasseswere collectedfrom the aquariaon days 0, 8 and 16 to measurefish Hg concentrationsduring decomposition.Biofilm growing on fish carcasseswas collectedon days2,4, 8 and 16,by carefullyrinsing each carcass with deionisedwater. The rinsewater was filtered througha cleanQM-A filter (pore size:0.7 pm). Eachfilter was then placedin a cleanplastic Petri dish (4.7 cm diam.)and frozen until analysis.

totHg-labelled To measureHg loss from scavengers,16 leechesthat had fed on fish for 16 d were transferredfrom the first four aquariumsof the precedingexperiment to four aquariumscontaining unlabelled yellow perch collectedfrom Lake 240. The samecollection protocolfor perchfrom Lake658 was usedfor perchfrom Lake240. On days2, 4,8 and 16, one leechwas collectedfrom eachof the four aquariaand storedin the samemanner as that for leechesin the uptakeexperiment.

2.2.2.ELA field experiment

To study the transfer of Hg from carcassesto leechesin the wild, we anchored16 plasticboxes (30 x 15 cm) on the sedimentat a water depthof 30 cm in the littoral zoneof Lake 240(no addedtotHg). Eachbox containedten 2o2Hg-labelledyellow perchcarcasses and the apertureof theseboxes was screenedwith a large mesh netting (2.5 x 2.0 cm) to allow invertebratescavengers to passthrough but to keep out fish. We collectedfour boxesat each of days2, 4,8 and 11.By day 11,the majorityof the carcasseswere completely decomposed. We collectedall scavengersin and underthe boxesas well as underrocks in the littoral zone up to a distanceof 3 m from the boxes.Biofilm on fish carcasseswas also collected.Storage proceduresfor thesescavengers were the sameas for thosementioned above for leeches.

2.3. Hg analyses

For total Hg, all frozen sampleswere freeze-dried(lyophilizer FTS Systems)and blendedin the laboratory.Dorsal muscleof fish sampledin the Lake Laflamme experiment was measuredusing method 207-Hg 1.0 of the Ministèrede I'Environnementet de la faune du Québec(1986). Briefly, sampleswere placed in 75 ml glassPyrex tubes with concentrated 56 Chapitre2: Mercurytransferfrom fish carcassesto scavengers

HzSO+and HNO: (3:1) and held at 90"C for 2 h in 60lopotassium permanganate (w/v) on a hot plate. Hg2*generatedwas reducedto HgOwith a combinationof lo stannoussulfate (w/v), 0.6% sodium chloride (w/v) and 1% hydroxilamine sulfate (w/v). GaseousHg was measuredby UV photometrywith vapour formation (Milton Roy; detectionlimit :7 ng of Hg). Samplesof similar weight of a certified referencematerial (marine dogfish, DORM-2, National ResearchCouncil of Canada(NTRCC), Ottaw4 Ont.) were submittedto the same procedures;measured Hg concentrationsin the standardsvaried little over time (DORM-2, CV : 6%) and were not significantly different (p > 0.05) from certified values.Blanks were alsorun andno appreciableHg contaminationwas detected.

For all other typesof biological samples(i.e., aquaticinvertebrates, yellow perch and biofilm), total Hg concentrationswere measuredby a Direct Mercury Analyzer(DMA-80, Monroe, C.T., detectionlimit : 0.01ng Hg) using thermal combustion(drying: 10 s at oC; 160 thermal desorption:150 s at 750oCfor 150s). QA/QC was assessedby using referencematerial for appropriatematrices: Hg concentrationsin referencematerial varied little over time and were not significantly different from certified values (DORM-2, CV : 7%; TOF*T-I, NRCC, Offaw4 ON, CV : 4Yo;oyster, National Bureauof Standards(NBS)- 1566;Washington, DC, CV :2%). For measurementsof Hg in biofilm growingon carcasses, we followed the procedureof Saricaetal. (2004a)using a direct combustionmethod. Samples of a certifiedreference material (oyster, NBS-1566, Washington, DC) were submittedto the sameprocedures. Measured Hg concentrationsin the standardvaried little over time (CV : 2- &Yo)and were not significantly different from certified values.Blanks were also run and no appreciableHg contaminationwas detected.

We determinedtotal Hg concentrationsin Lake Laflamme sedimentusing US EPA method 7471A (1933). Briefly, sampleswere digestedin 50-mL glass Pyrex tubes in a mixture of concentratedHCI and HNO: (3:1) and heatedat 95oC for 2.5 h on a hot plate (Technicon,BD-40). The oxidant used was a combinationof 57o potassiumpermanganate (w/v) and 5% potassium persulfate (w/v). Following digestion, excess potassium permanganatewas neutralisedwith 12%(wlv\ sodiumchloride and l2Yo (w/v) hydroxilamine chloride.The reductantwas 3olostannous chloride (w/v). GaseousHg was detectedby cold- vaporatomic absorption spectrometry (Varian Spectrometer AA-20; detectionlimit: 0.7 Vg of Hg). Hg concentrationsin reference material varied little over time and were not Chapitre2: Mercurytransfer from fish carcassesto scavengers significantlydifferent from certifiedvalues (marine sediments, BEST-1, NRCC, Ottawa, ON, CY :4%o).

Concentrationsof mercury isotopes in biological tissues were determined by continuousflow cold vaporgeneration coupled on-line to inductivelycoupled plasma mass spectrometry[CP/MS). Briefly, sampleswere digestedin 20 mL Pyrex glass tubes in a mixtureof concentratedHNO: andHzSO+ (7:3 vlv). The digestwas mixedon-line with 10% (w/v) stannouschloride using a peristalticpump. GaseousHg was separatedfrom the liquid streamin a gas-liquid-separatorusing Hg-free argonand directly introducedinto the plasma to'Hg of a high resolutionICP/MS (Thermo-Finnigan Element2). The concentrationof excess wascalculated following the methodof Hintelmannand Ogrinc (2003).

Extraction and ethylation of MeHg from biological tissues was accomplished following the methodsof Bloom (1989, 1992\.Briefly, MeHg was extractedwith a 25 Yo (w/v) KOH/MeOH solution at a temperatureof 68 oC over 8 h. For MeHg ethylation, lactic acid and l% (w/v\ sodium tetraethylboratewere added.Ethylated MeHg from the solution was purgedon a Tenax@column, which was then dried for 10 minutes.The derivatizedHg speciesare eventuallythermodesorbed onto a GC column. MeHg was detectedby atomic fluorescencewith a detectionlimit of l.l ng Hg g-'. MeHg concentrationsin reference material varied little over time and were not significantly different from certified values (TORT-2,NRCC, Ottawq ON, CV : l0%).

2.4. Stableisotopes of N

Stable isotopesof N (ôlsN) were measuredin scavengersto establishtheir trophic level (Cabana and Rasmussen,1994). Stable isotopes of N in biological tissues were determinedusing the methoddescribed in Fry et al. (1992). Sampleswere combustedin an elementalanalyser (Carlo Erba NC2500) and resultinggases were deliveredvia continuous flow to an isotoperatio massspectrometer (IRMS; Thermo Finnigan Delta Plus XP). Stable nitrogenisotope values are expressedin ô notationas a parts per thousanddifference from a standardby the following equation: - ôX: [(R'u-pre/&tandard) l] X 1000 15N 1tN:toN. where Xis and R is the ratio For nitrogen, &t*da.d is atmospheric (AIR) nitrogen. 58 Chapitre2: Mercurytransfer from fish carcassesto scavengers

3. Resultsand Discussion

3.1. Field experimentsat Lake Laflamme

3.l. l. Carcasscolonisation

Seventeenof the 24 smallmouthbass carcasses placed in Lake Laflammeremained at their initial location,and the remainderwere found intact on shorewithin the first few daysof the experiment(excluded from subsequentanalyses). No significantdifference was found in the time for complete decompositionof the remaining carcassesbetween protectedand unprotectedcarcasses (r test,p > 0.05, n variedbetween 3 and 6 for eachsampling date). This result suggeststhat residentfish and macroinvertebratesbigger than the mesh size of the screeningthat we used(i.e., 2.8 xZ.l cm aperture)were not responsiblefor the decomposition of fish carcasses.Because no significant differences were observed in the numbers of invertebratetaxa under carcassesvs. those adjacent to carcasses,or on protected vs. unprotectedcarcasses or with carcasslength (ANOVA, p > 0.05,n variedbetween 12 and24) thesedata were combinedfor subsequentanalyses.

Densitiesof both the dragonflyLibelulla sp. and the amphipodHyalella aztecawere not significantly different betweensites with carcassesand at referencesites (ANOVA, p > 0.05,n:66), whereasthe densitiesof Chironomidaewere significantly lower (ANOVA,p: 0.027,n: 66)in sedimentsnear carcasses (Table 1).

Leecheswere not found at the referencesite, but were present in and near fish carcasses.Eight Haemopissp. (3 on days 1 and 6; 1 on days 13 and 20) were collectedon or in fish carcasseswhereas 19 Nephelopsisobscura were found in sedimentnear carcasses(4, 6, 0 and9 individualson days1,6,13 and20,respectively). Note thatof these2Tleeches, only 14 leecheswere used for Hg analysesbecause eight were lost during the depuration experimentand five were sacrificedfor identification. BecauseHaemopis sp. are reportedto eat other leeches(Sawyer 1986), their presencecould also explainthe absenceof Nephelopsis obscuraon carcasses.Furthermore, because leeches can repulse(Broenmark and Malmqvist, 1986) or consumesmall invertebrates(Anholt, 1986; Dahl, 1998),their presencecould explainthe lowerdensities of Chironomidaenear carcasses (Table 1). Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 59

3.1.2.Hg concentrations

Mercury concentrationsin dorsal muscle varied with smallmouthbass (Micropterus r, dolomieu)size class, with biggercarcasses (class 3 : 1.37+ 0.30mg kg dry weight)being morecontaminated than smaller ones (class I :0.69 + 0.10mg kg-I,dry weight).

Mercury concentrationsin sedimentsat the referencesite (Fig. 1) did not vary significantly among sampling dates(ANOYA, p > 0.05, n : l2). At sites with carcasses, sedimentHg (Fig. l) increasedsignificantly between days I and 6 and decreasedsignificantly afterday 13 (ANOVA, p : 0.014-0.022,n: l8). The initial increase(30%) in sedimentHg is probablythe result of fish debrisaccumulating at the sedimentsurface. Likewise, Bloom and Kuhn (1996)observed that methylmercuryin a fish carcasswas transferredto the surrounding sediment(73Yo after 15 d). The decrease(24Yo) in sedimentHg after day 13 is likely explained both by the ingestion of fish debris by benthic invertebratesand by bacterial decomposition(more details are given on bacterialdecomposition below). A returnto pre- carcasssediment Hg concentrationssuggests that much of the Hg in fish carcassesis not incorporatedinto the sedimentbut is transferredto benthic invertebratesor to the water column.

No significant differencesin Hg concentrationsof both Libelulla sp. and Hyalella aztecawere detected between the referencesite and sites near careasses (ANOVA, p>'0.05, n : 8 for Libelulla sp. and n : 16 for Hyalella azteca; Fig. l). tn addition, no sip5nificant temporal increase(regression, r2 : 0.000-0.003,p : 0.45-0.95)was observedin Hg concentrationsin either of thesetaxa. These results suggest that eitherthese taxa did not feed on fish carcassesor that theseinvertebrates did not remainfor long periodsnear carcassesor both. In contrast, Hg concentrationsin both species of leeches increasedsignificantly (regression,I : O.lO-0.95,p : 0.002-0.02)over time (Fig. 1); suggestingthat theseannelids ingested, either directly or indirectly, substantial amounts of Hg-rich fish. Mercury concentrationsin Haemoprssp. rose by 500% during the experiment,whereas those of Nephelopsisobscura rose by 100% (Fig. l). However, the relationshipbefween total Hg concentrationsand exposure duration for Haemopls sp. is tentative because the Hg measurementon the last samplingday (day 13) is basedon a singleindividual. Overall, the resultsof this preliminaryfield experimentsuggest that leechescan play a key role in recycling the Hg presentin fish carcasses.To measureHg exchangeby these scavengers 60 Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers under controlled conditions, we conducted laboratory experiments at the Experimental Lakes Area.

3.2. Laboratory experiments

202Hg Total Hg, and MeHg concentrations in leeches (P. marmorata) feeding on 202Hg-enriched perch carcassesin the laboratory increased over time (ANOVA, p : 0.000- 0.001, n:44,Fig.2a), whereasHg levels in starved leechesdid not change.The burdensof both non-isotopic Hg (total Hg and MeHg) and isotopic Hg ('o'Hg) increased over time (Fig. 2b), whercas leech dry weight did not (Fig. 2c). Together, these data indicate that P. 202Hg marmorata accumulated Hg from the -labelled yellow perch carcassesand is consistent with our findings from Lake Laflamme for Haemopis sp. and N. obscura. Accumulation rates of total Hg for P. marmorata, Haemopfo ,p., and N obscura were 18, 6l and 6 ng d-1, respectively. The specieswith jaws (i.e. Haemopls sp. and P. marmorata; Sawyer, 1986) are capable of feeding directly on fish tissue and attained somewhat higher Hg concentrations than those of the carcasseson which they fed; the ratio of leech to carcasstotal Hg was 1.10 (after 15 d) and 1.13 (after 32 d), respectively,for these taxa. These data suggestthat Hg is biomagnified between carcassesand leeches.

totHg The accumulation rate of by P. marmorata (2-25 ng d-r) was higher than the correspondingloss rate for this species(0.60 ng d-t;. To estimate the biological half-life of 202Hg in P. marmorata from the Hg-loss experiment,we useda linear model (y: -0.60x + 40: totHg i:0.32; Fig.3) becausethe strength of the relationship between concentrationsand time was slightly stronger than with an exponential model (y:43.e-00'^, f : 0.21). The estimated biological halÊlife of 22 d falls between the halÊlives of MeHg reported for the amphipod Hyalella azteca ( I 1- I S d, Tsui and Wang 2004) and the crayfish Orconectes virilis (2,000 d; Headon 1994). At the beginning of the lab experiment only 20oÂof the total Hg burden of P. marmordta was MeHg, whereas 80% of the Hg in P. marmorata was MeHg at 2otHg day 16 (Fig.4a). The proportions of MeHg and of in P. marmorata reacheda plateau after 16 d (Fig. 4b), approaching values found in fish carcasses (dotted line on Fig. 4b). Overall, the above results suggest that leeches accumulate Hg and reach the levels and speciation of Hg of their prey within about two weeks. Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 6l

202Hg Total Hg, andMeHg concentrationsmeasured in labelledyellow perchcarcasses decreasedsignificantly as a function of time in the presenceof leeches(ANOVA, p : 0.000- 0.009,n: 12;Fig. 5). This suggeststhat: either (L\ P. marmoratapreferentially fed on tissues rich in Hg, suchas muscleand liver, which is in agreementwith the observationsof Sawyer (1986),and/or (2) that bacterialdecomposition resulted in a releaseof aqueousMeHg (i.e, bacterialsolubilisation) and HgO1i.e, bacterial demethylation) from fish tissue(Bloom and Kuhn, 1996). Indeed, microbial demethylationof methylmercurycan form volatile Hg(O) leadingto Hg lossesfrom carcasses(Bloom and Kuhn, 1996)and the breakdownof amino acidscan decreasethe concentrationof Hg-bindingsites such as thoseon cystine.

Total Hg and 202Hgconcentrations measured in biofilm (Fig. 6à) increasedstrongly during the first 2-4 daysand declinedthereafter to backgroundlevels (note that on day 16, no biofilm was found on carcasses).It has been speculatedthat Hg accumulatedin biofilm is releasedto the watercolumn after transformationinto HgOlBloom and Kuhn 1996).

The overall massbalance of 202Hgin the aquariums(Fig. 6c) for days 0, 8 and 16, suggeststhat the majority (up to 70oÂ)of the Hg in labelledfish carcasseswas probably lost (evasionof HgO,adsorption on aquarium walls which was not transferredto scavengers.; and/orfound as aqueousMeHg (Bloom and Kuhn, 1996).The remainingHg was mainly found in leechesrather than the biofilm. The recyclingof Hg to the food web would therefore more likely involve scavengersthan biofilm grazers-

ôr5Nvalues can be usedto indicatethe trophic positionof organismsin food webs (Cabanaand Rasmussen,1994). In our study,ôtsN 1Eig.7) valuesmeasured in leechesnot exposedto carcasseswere not signif,rcantlydifferent from thosemeasured in yellow perch or in leechesexposed to carcasses(ANOVA, p > 0.05,n:23). This ratiowas however over 4Yoo higher than the ratio measuredin crayfish, anotherpotential scavenger.Consequently, our results suggestthat some leechesmay include fish in their natural diet becausethe ô15Nis similar for control leechesthan thosefeeding on fish carcasses.In addition,no correlation wasobserved between Hg concentrationsand ôr5N values measured in leechesfeeding on fish carcasses,which contrasts with studies where ôl5N is strongly correlated with Hg concentrations(Cabana and Rasmussen,1994; Atwell et al., 1998).However, the durationof the experimentdescribed in this study was most likely not long enoughto significantly alter ô15Nvalues. The fact that%MeHs fluctuateson a muchshorter time scalethan ôl5N values is 62 Chapitre2: Mercurv transferfrom fish carcassesto scavengers an important hnding suggestingthat %MeHg can be used as an integratorindicating short term changesof bioamplificationof pollutants,whereas ôr5N can not track suchchanges in diets.

3.3. Transplantationexperiments in Lake 240

202Hg-rich Carcasseslabelled with isotopic Hg were transplantedfrom Lake 658 to unspikedLake 240, in order to follow Hg transferfrom carcassesto scavengersin the wild. After only two days,most carcasseswere emptiedof their internalorgans. This loss of mass occurredfaster than in either our laboratoryexperiment or in Lake Laflammeand may have resulted from a wider diversity and a higher number of scavengersinteracting with fish carcassesinLake 240.

During our field experiment,we collected several speciesof scavengers:1) 28 P. marmorataat the followinglocations: 10 in boxes,14 closeto boxes(<30 cm) andfour under rocks in the littoral zone(>3 m from boxes);2) five leeches,Macrobdella decora, (2 in boxes, 3 closeto boxes)and 3) two crayfish,Orconectes virilis (1 in box, 1 at >3 m distance).

202Hg The and MeHg concentrationsmeasured in P. marmoratawere similar in the totHg lake and in the laboratory during the first four days (Fig. 6a). In addition, high concentrationswere measuredonly in this speciesand not in the other invertebrates.These resultssuggest that the fast decompositionin Lake 240 is causedby the higher densityof P. marmorata and not by the presenceof other potential scavengers.To test this ide4 we comparedleech densities on a littoral band of 50 m of Lake 240 (fast decomposition)and in Lake Laflamme(slow decomposition),using the samenumber of leechtraps. We captured2 leechesm-2 after one night in Lake 240 and only 0.16 leechesm-2 after 5 days in Lake Laflamme.Consequently, it seemsthat the time for completedecomposition of fish carcasses is lake specificand depends on the densityof the scavengercommunity.

totHg The profiles of total Hg and concentrationsmeasured in biofilm in the field (Fig. 6ô) show similar pattemsto thosemeasured in the laboratory,which suggestssimilar'o'lFrg 202Hg uptake,transformation and excretion.Note, however,that concentrationsobserved in biofilm in the laboratorystudy are nearly 3 fold higher than thosemeasured in the field on dav4. Chapitre2: Mercury transferfrom fTshcarcasses to scavengers 63

4. Conclusion

In both of our study lakes, we observedthat leecheswere the main scavengers interactingwith fish carcasses.The decompositionof carcassesin lakescan be rapid, which could explain why fish carcassesare rarely seenin lakes. Direct Hg transferwas measured from fish carcassesto the leechP. marmorataand to the biofilm growing on carcassesrich in "'Hg. A preliminarymass balance showed that lîYoof the Hg in fish is transferredto leeches and 3Yois found in biofilm. It is possiblethat a significant fraction of carcass-boundMeHg was directly transferto the wateras aqueousMeHg andlortransformed to Hg(O)and degassed from the water body. Further studiesare neededto evaluatethe relative importanceof Hg recyclingby scavengersas opposed to Hg lossdue to degassing.Nevertheless, after only 8 d, leechesin contactwith carcassesreached a steadystate with respectto their percentageMeHg and their isotopic Hg content. Since leechesare important prey for resident fishes in a majority of lakesin North America (Sawyer,1986; Daviesand Gates, l99l), they likely representan importanttransfer vector of mercury from dead to living fish. Our experiments constitutea first steptowards understanding the recyclingof Hg from fish carcassesin boreal lakes.To fully evaluatethe impactof recycledHg boundto carcasses,other processes need to be further investigated,namely: (l) the naturalnon-predatory mortality of fish; (2) the ratesof scavenger-inducedfish decompositionin lakeshaving varioustypes of fish and scavenger communities;(3) the consumptionrate of fish by scavengersand the consumptionrate of scavengersby residentfish at the whole-ecosystemscale. & Chapitre2: Mercury transferfrom hsh carcassesto scavengers

Acknowledgements

This is contributionno. 9 of the METAALICUS initiative.Funding was providedto M.A. by the NSERC CollaborativeMercury ResearchNetwork, Fisheriesand Oceans(DFO) and the CanadianFoundation for Innovation.J.S. was supportedby a scholarshipfrom INRS. We thank Dr. Cheryl Podemski(DFO) for identificationof the leeches.For the experimentin Lake Laflamme, we thank Marie-RenéeDoyon, René Rodrigue, Jord Orvoine and Anne Gosselinfor their technicalassistance in the field and Louise Simoneau,Gertrude Guay, and Brian Dimock for their help with Hg analyses.Thanks also to Michel Lagacé, Denis Laliberté, Guy Nadeau and Daniel Houle for their help with the experimentaldesign. Technicalassistance at ELA by JaneOrihel, Jeff Rose, Ken Sandilands,Danielle Godard, Lori Flavelle and AlexandrePoulain is also acknowledged.Lastly, we would like to thank F- Boudreau,G. Cabana,C. Gobeil, R. Schetagneand A. Tessierfor their commentson an earlierversion of the manuscript. Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 65

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Table 2.1 Mean density(number of individuals.m-2+ SE)of invertebratescollected at the referencesite and near carcasses(n : 3 for the referencesite and n : 9-18 at sitesnear b) carcasses).For Chironomidae,different letters 1u and indicate a sisnificant difference (ANOVA,p < 0.05). Referencesite Near carcasses Day 6t3 613

Taxon: Libelulla sp. 33+0 17+10 17+l0 l7+10 23+15 38+15 t2+10 l0+ 6

Hyalella azteca 40+20 52+31 87+58 20r10 80r25 73+42 47+32 ll +7

Chironomidae 70u+35 354+15 68u+ 18 52"+20 48u+ 16 10b+4 lob+4 6b+12 Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 7l

Libellula sp. Hvalella azteca 150 ôO U o o

T o 50 OT v g

0 1200 Haemopis sp. Nephelopsis obscura

I br) bb 800 ?: o.ss rz:0.70 p - 0.02 p:0.002 oo 400

+)

ç;1 L 0 280 Sediments

A tA v H A

A 200 H x v v o U

l5 20 Day

Figure 2.1 Temporalchanges in total Hg concentrations(ng.g-r dry weight)in the dragonfly Libelulla sp. (uppermostleft panel),in the amphipodHyalella azteca(uppermost right panel), in the leechesHaemopis sp. (middle left panel) andNephelopsis obscura (middle right panel), and in sediments(lower panel)adjacent to (dark trianglepointed downwards) and under(grey triangle pointed upwards)carcasses as well as in control sedimentwithout carcasses(open symbols).Each point represents one individual or sedimentcore; 12 and p valuesare presented for significant relationships. 72 Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers

---!- Total Hg l 000 100 b9 O Total Hg b0 _ -1,_ MeHg (1. 800 A MeHg 80 ,orHg ôo I ô{) n ,ot{g bb I 600 6(ld C) -ôo t< 400 40 FE c.I I c-l U 3 A' 200 - ,/À 20 ,À I

0 0 ô0 al 600 50 .''! c) ôo t< 40 l1 - 400 (,) bo .-1 10 y I (l) )o ôI) Fî 200 fi C\l t'l I l0

ça

ôo

d ôo (l)

h

t0 20 30 Day

Figure 2.2 Temporalvariations in Hg in the leechPercymoorensis marmorata in the presence 202Hg-enriched (closedsymbols) or absence(open symbols) of fish carcasses:a) mean(+SD) 2o2Hg concentrations(ng g-t, dry weight) of total Hg, MeHg (left Y axis) and lright Y axis); b) meanburdens (ng, dw) of total Hg, MeHg (left Y axis)and'otHg f.ight Y Axis); c) meandry weight(g). Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers IJ

I - 0.32,p: o.oo9r è0 êù40

ô0 :É 20 I bp (-ôo60

bI) T| .. 940 r..' c.l H* IE5 II @ +

Day

202Hg Figure 2.3 Temporal variations in mean (+SD) concentrations(ng g-l) of measuredin 202Hg-enriched the leech Percymoorensismarmorata either in the presenceof fish (dark square),or with unlabelledfish substitutedfor Hg-enrichedfish on day 16 (greysquares), or in the absenceof fish carcasses(white squares).The insetshows individual valuesfor the Hg- lossmeasurements (grey squaresin main graph). 74 Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers

- \{sflg g 80 I æ*æ b9 800 inorganic Hg bI) ôo :) ôo +) 40 400 bo

q) 4

bo t+ t2 \-/ 400 lç ô0 C) t-{ 3 zoo ôo bo

ô.1 ô{

Day

Figure 2.4 a) Concentrations(ng g-'; upperpanel) and Hg burden(ng indiv.-';lower panel) of organic(MeHg) and inorganicHg and b) Mean (+SD) proportion(%) of MeHg (upperpanel) 202Hg and (lower panel) measuredin the leechPercymoorensis marmorata as a function of time (days)in the presenceof 202Hg-enrichedfish carcassesin the laboratory.The dashedline representsthe fractionsthat MeHg and202Hg represent of the total Hg in fish carcasses. Chapitre2: Mercurytransfer from fish carcassesto scavengers t)

1000

I o0 ôb 8oo

I ô0 ôo 600 60 ôb E .l ()I -, ô{) . 400 40 Fli C\

I (-.l x 200 fa L'

8 Day

Figure 2.5 Temporalvariations in the meanconcentrations (+SD) of total Hg (circles),MeHg (triangles)and 202Hg(squares) in 202Hg-enrichedfish carcassesin the presenceof the leech Percymoorensismarmorata in the laboratory. 76 Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers

^2000 ,^.800 î b) Biofilm I ô0 ôo obt soo abooo

E 1000 6 4oo

6) soo \a 200 Ë a Li L-r 0 0 800 'b9 80 r ôo ô0 ôo

b0 40 b0 c.'l c.t 200 (..l c.n

0 l0 20 8 t2 Day Day -l- ,_. 100 Fish carcasses -f- Loss -V- Leeches (.) -l- Biofilm O

È50 (t) (t)

â0

c..l c'l o 8 Day

Figure 2.6 Temporal changes in mean (+SD) concentrations(ng g') of: a) MeHg (upper 202Hg panel) and (lower panel) in the leech Percymoorensis marmorata in the laboratory 202Hg-enriched (dark symbols) and in the field (grey symbols) in the presence of fish 202Hg carcasses;b) total Hg (upper panel) and (lower panel) concentrations (ng g-1) in biofilm to2Hg-enriched growing on fish carcassesin the laboratory (dark symbols) and in the field 202Hg (grey symbols); c) mass balance (%) calculated for aquaria. Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers 77

.R 8 o\

lr) ico V leechlab. V leechlab. control V leechfield @ fish E crayf,rsh

Day

Figure 2.7 Temporal changesin mean (+SD) ô''N (7*; measured:(1) in the leech Percymoorensismarmorata in the laboratory(triangles) and in the field (crossin triangles)in 202Hg the presence(solid triangles) or in the absence(control; open triangles) of enrichedfish carcasses;(2) in yellow perch(grey diamond)and (3) in the crayfish Orconectesvirilis (cross in square). Chapitre2: Mercury transferfrom fish carcassesto scavengers Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients 79

Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrientsin a Lake Ontario spawning stream(articLe 2)

JoséSaricat, Marc Amyot2,Landis Harel, Marie-RenéeDoyonl and Les William Stanfield'.

I Institut National de la Recherche Scientifique (INRS), Eau, Terre et Environnement,

Universitédu Québec,2800rue Einstein,C.P. 7500,Sainte-Foy, QC, GIV 4C7, Canada; 2 Départementdes sciencesbiologiques, Université de Montréal, C.P. 6128, succ. Centre-

Ville, Montréal,QC, H3C 3IT,Canada; 3 Ontario Ministry of Natural Resources,Picton, ON, KOK 2T0, Canada;

Limnology and Oceanography. 200 4. 49(4), 891 -899. 80 Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients

RESUME

En rivière, nous avons testé I'hypothèse selon laquelle les concentrationsde Hg et de nutriments (NFI4*, NO3-, P, COD) au sein de composantes biotiques (invertébrés aquatiqueset terrestres)et abiotiques (eau, sédiment) du système seraient altérées par la décomposition des carcassesde saumon après le frai. Nous avons échantillonné durant deux annéesconsécutives (2000 et 2001) au sein d'une frayère ontarienne, tributaire du

Lac Ontario, qui reçoit chaque année 20 000 saumons Quinnat (Oncorhyncus tshawytscha).Ces deux annéescontrastent par la présenceexceptionnelle en 2001 d'un ours qui a prélevé toutes les carcassesà la station aval de la frayère. Nos résultats ont démontré que les stations d'échantillonnage, où les densitésde carcassesétaient les plus élevées, présentaient des concentrations aqueuses de Hg total, MeHg, Hg total particulaire et de nutriments plus élevées que les stations où les densités de carcasses étaient les plus faibles. Les concentrations de Hg mesurées dans les invertébrés aquatiqueset terrestresse nourrissant des carcassesde saumon ont augmentéjusqu'à 25 fois. En 200l,le prélèvementdes carcassespar I'ours en aval, a engendrédes baisses significatives dans les concentrationsaqueuses de Hg et de nutriments comparéesà celles mesurées au même endroit un an auparavant sans la présence de l'ours. Un budget préliminaire au sein de la frayère montre que: 1) les carcassesde saumon représentent une source importante de Hg et de nutriments pour les réseauxtrophiques aquatiqueset terrestres et que 2) les invertébrés et vertébrés terrestres peuvent être d'importants vecteursde Hg du milieu aquatiquevers le milieu terrestre. Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients 8l

ABSTRACT

We tested the hypothesis that concentrations of mercury species (Hg) and nutrients (NH+*, NO:-, P, dissolved organic carbon) in abiotic and biotic components would be altered by the decomposition of salmon carcassesin streams.We investigateda tributary stream of Lake Ontario receiving spawning runs of Chinook salmon (Oncorhyncus tshawytscha) for two years with contrasting bear activity. Stations with high carcass densities had significantly higher levels of aqueous total Hg, MeHg, particulate Hg and nutrients than did stations with lower carcassdensities. Hg levels in aquatic and terrestrial invertebratesfeeding on carcassesincreased by up to 25 fold. In 2001, a bear removed most carcassesat the downstream station and aqueous Hg and nutrient concentrationswere significantly lower comparedto the preceding year, when no bear was active at that station. A preliminary budget for this stream shows that (1) salmon carcassescan be an important source of Hg and nutrients to aquatic and terrestrial food webs and (2) tenestrial invertebrates and vertebrates can be important water-to-land vectorsof Hs. 82 Chapitre 3: Salmon-derivedmercury and nutrients

INTRODUCTION

In North America and Scandinavia,mercury (Hg) is present in some native fish at unacceptably high concentrations (>0.5 mg kg-r wet weight; Ontario Ministry of the Environment 1999). Because methylmercury (MeHg) concentrations increase along aquatic food chains, the majority of the MeHg in the water column of lakes tends to be present in fish (Porcella 1994). In spite of the importance of fish as a MeHg sink, processesinvolved in the recycling of MeHg following fish death are little known. The majority of Pacific salmon species, including Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha), die after spawning, resulting in a great number of fish carcasses in receiving streams(Cederholm et al. 2000). Studies have concluded that salmon carcasses, eggs and gametes can contribute nutrients and dissolved organic carbon to streams (Cederholm et al. 1999), resulting in the stimulation of primary production (Cederholm et al. 2000), heterotrophicactivity (Sobczak 1996), and secondaryproduction (Cederholm et al. 2000). These increasesin primary and secondary production can result in aquatic invertebrate densities 25 fold higher in streamsreceiving Pacific salmon runs compared to other streams (Wipfli et al. 1998). Salmon carcassesinfluence invertebrate densities through changes in the quantity or quality of biofilm for scrapers, of fine particulate organic material for collectors, of coarseparticulate organic material for shredders,and of invertebratesfor predators(Chaloner and V/ipfli 2002). Recently, Krûmmel et al. (2003) demonstratedthat sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) can assimilate polychlorinated biphenyls (PCBs) from the ocean and deliver these contaminantsto their natal spawning lakes after spawning. Indeed, theseauthors reported that sedimentaryPCB concentrations were strongly correlatedwith the density of salmon runs.

We testedthe hypothesisthat salmon carcassescan also be an important source of Hg to streams receiving Chinook salmon runs from Lake Ontario. We considered the impact of fish decomposition on mercury levels in both abiotic (sediment and water) and biotic (invertebratesfeeding on carcasses)compartments in one of those streams,Wilmot Creek. Furthermore, we were able to compare Hg transfer between the aquatic and terrestrial environment at one site in the presenceand absenceof bear consumption, as Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients 83 during the secondyear of our study a black bear took up residencein the lower reachesof our study stream.

MATERIAL AND METHODS

Study design

In the first year of our study, we used a control-impact design, in which control sites were: (1) upstream sites on Wilmot Creek where no salmon spawned or died; (2) a site in a neighboring stream similar to Wilmot Creek, but in which few salmon spawned. The second year, we added a temporal component to our sampling protocol by sampling sites in Wilmot Creek before and after the spawning of Chinook salmon.

Study site

Wilmot Creek (43o59'N, 78"38'V/; Fig. 3.1) is a cold water streamthat drains into Lake Ontario approximately 22km downstream of its origin. The mean width is 7 m (Gibson 1996). The most abundant migratory piscivorous fish in Wilmot Creek is the Chinook salmon of which approximately 20,000 spawn in the autumn of each year (Stanfreld et al. 2002).

We selectedsix sampling stations along this creek (Fig. 3.1). Each sampling "upstream "mid-stream station correspondedto a stretch of 250 m. Stations 1" (U1), 1" (Ml) and "downstream 1"(D1) were sampledin 2000 after Chinook spawning(20 Oct). These stations were sampled again in 2001 before (20 Aug) and after (26 Oct) Chinook "upstream "mid-stream spawning with three additional stations,that is, 2" (U2), 2" (M2) and "downstream 2"(D2). Chinook can usually reach station M1, whereas few salmon were observedupstream of this site (i.e., at U1).

The discharge of Wilmot Creek was measuredbetween station D2 and the creek mouth by the Ontario Ministry of Natural Resources(Fig. 3.1). Although it varied 84 Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients between882 and t334Lls from 1991 to 2001 (Fig. 3.2A), streamdischarge was similar for our two sampling periods (summer and fall 2000: 740 * 140 L s-l; su*-"r and fall 2001:765 + 219L s-r;Fig. 3.2B.. C).

In 2000, we also sampled a second watercourse,the GanaraskaRiver, which is located 20 km east of Wilmot Creek. This stream receives few salmon. We collected samplesat a station (GR) located 10 km upstreamfrom the mouth of this river.

Sampling and analysis

Aqueousmercury

All sampling bottles and laboratory glassware were washed in l5%o HNO:, followed by l% HCI and then rinsed seven times in ultrapure water (Milli-Q system water, >18 Mohm cm-'; *hil" wearing unpowderedlatex gloves. To obtain samplesfor total aqueousHg, we filled five 60 ml Teflon bottles with creek water at each sampling station in each year. For dissolved Hg ([Hg]o) and particulate Hg ([Hg]p), we collected water in three 60 ml Teflon bottles at each station in 2001 both before and after spawning. Samples for total [MeHg]1uqywere collected in four Teflon bottles (1 L) at eachstation in 2001,preserved with HCI (SoÂ,vlv)and held in the dark.

We determined total Hg and Hgp (QM-A filters, pore size : 0.7 pm) concentrations in water following method 1631 (revision D) from the United States EnvironmentalProtection Agency (U.S.E.P.A. 2001). Briefly, BrCl oxidation is followed by hydroxylamine addition, reduction with SnClz, sparging of elemental Hg to gold amalgamationtraps, thermal desorption of the Hg followed by detection through Atomic FluorescenceSpectrometry (AFS) using a Tekran 2600 (detection limit, estimated as 3 times the standarddeviation of 10 blanks, was 60 pg L-t). Samplesof inter-laboratory referencematerial diluted 50 fold (rain water, FP-HG77-5 and FP-HG77-2, Environment Canada,Ottawa, Ontario, Canada;mean (+ SD) certified values :2.22 + 0.08 ng L-l and 0.11 + 0.04 ng L-1, respectively)were submittedto the sameprocedures; measured Hg Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients 85

concentrationsin the standardsvaried little over time (mean (+SD) measured values : 2.27 + 0.06 ng L-r and 0.13 + 0.005 ng L-l; coefficient of variation, CV, of 2-4oÂ, respectively) and were within the intercalibrated ranges. Blanks were also run and no appreciableHg contamination was detected.

For measurementsof particulate Hg, we followed the procedure of Sarica et al.

(2004). Briefly, water samples were passedthrough QM-A filters (pore size: 0.7 pm) in the field and then the filters were freeze-dried (FTS Systems lyophilizer) for storage. Total particulate Hg was measuredwith a Direct Mercury Analyzer (D.M.A.-80, Monroe, oC; Connecticut, U.S.A.) using thermal combustion (drying: l0 s at 160 thermal oC). desorption: 150 s at750 Samplesof a certified referencematerial (oyster,National Bureau of Standards(N.B.S.)-1566; Washington, District of Columbia, U.S.A; mean (+ SD) certified values : 5l + 15 ng g-1dry weight) were submitted to the sameprocedures. Measured Hg concentrations in the standard varied little over time (mean (t SD) : measured values 67 + 4.69 ng g-l; CV : 7o ) and were within the certified range. Blanks were also run and no appreciable Hg contamination was detected.The detection limit of the DMA-80 was 0.01 ng Hg.

MeHg(aq) was pre-concentratedand extracted following the procedure of Cai et al. (1997) using a gas chromatography - atomic fluorescence spectrometric system (Hewlett Packardmodel 5860, Ringoes,New Jersey,U.S.A.; detectionlimit: 0.02 ng L- l). A methylmercury chloride stock solution was prepared by dissolving approximately 20 mg MeHgCl (Aldrich ACS reagent 99%) in 20 ml of methanol (EM Science, ACS reagent 99.91%) to yield a concentration of approximately 1000 ppm MeHgCl as Hg. Further dilutions with water were made as needed. Recoveries from internal standard addition were within acceptablelimits (i.e., greaterthan 90%).

Hg in sediments

At each sampling station, four cores (4.4 cm diameter) were used to collect sediments at about 1 m from the shore. The uppermost centimetre was removed from 86 Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients each sediment core and frozen in a plastic container until total Hg analysis. QA/QC was assessedby using certified material (BEST-l, National Research Council of Canada (N.R.C.C.), Ottawa, Ontario, Canada;mean (+ SD) certihed values :92 + 9 ng g-r dry weight; mean(+ SD) measuredvalues : 86 * 3 ng g-t; CV :3%).

Hg infish, invertebratesand biofilm

To assessthe level of contamination of fresh carcasses,10 salmonswere captured by electrofishing and samplesof their dorsal muscle and livers were retrieved, placed in a plastic bag and frozen until analysis.

Aquatic macroinvertebratesin the vicinity of the carcasseswere collected with a Surber sampler until a sufficient biomass of invertebrateswas obtained. Principal species of aquatic invertebrateswere sorted to the lowest taxonomic level possible (Menit and Cummins 1996; Wiggins 1996) and allowed to depurate for 48 h to eliminate Hg bound to gut contents. They were then placed on Teflon sheets in 1.5 ml high-density polyethylene microcentrifuge tubes (small invertebrates;Croteau et al. 2001) and frozen until Hg analyses. The four most abundant taxa collected were two caddisflies, (Hydropsyche sp. and Limnephilus sp.), a tipulid (Hexatoma sp.) and a stonefly (Claassenia sp.). Hydropsyche feeds on algae, detritus and animals, Limnephilus is a shredder that feeds on leaf litteç Hexatoma coîsumes oligochaetes and dipterans and Claqssenia feeds on trichopterans, ephemeropterans and chironomids (Merritt and Cummins 1996)- Terrestrial fly (Diptera: Calliphoridae) eggs and larvae found on beached salmon carcasseswere also collected, placed on Teflon sheets in 1.5 ml microcentrifuge tubes, ffid hozen. We also collected the biofilm growing on three : submerged salmon c.rcasses. Samples were filtered with QM-A filters (rore size 0.7 pm) and the filters were frozen until analysis.

For all biological samples, Hg concentrations were measured by direct combustion, using the same anall.tical protocol as for particulate Hg. QA/QC was assessedby using reference material for appropriate matrices: Hg concentrations in Chapitre3; Salmon-derivedmercury and nutrients 87 referencematerial varied little over time and were within the certified ranges (DORM-2, Environmental Chemistry Institute, Ottawa, Ontario, Canada; mean (+ SD) certified values:230 + 50 ng g-t dry weight, mean (+ SD) measuredvalues :205 + 2l ngg-t; CV : lÙYo;TORT-I, N.R.C.C.,Ottawa, Ontario, Canada,mean (+ SD) certified values: 330 + 30 ng g-t dry weight; mean (+ SD) measuredvalues : 325 + 10 ng g-1,CV : 3oÂ; oyster, N.B.S.-l566, Washington,District of Columbia, U-S.A., mean (+ SD) certified values: 57 t 15 ng g-1dry weight; mean (+ SD) measuredvalues : 56 r 2 ng g-r,CV : 4%).

Carcassdensities

To estimatecarcass densities at each station in 2000 and 2001, flags were first attached on trees along the shore every 50 m, over a distance of 250 m. Then, the numbers of submerged,half-submerged and beachedcarcasses were counted. At the time the census was conducted, spawning had just ended; therefore, the total number of carcassesdid not changeduring sampling.

Rate ofcarcass decay

A stretch of 250 m of the creek was intensively monitored: (1) to determine the partitioning of carcassesbased on their state of immersion (beached,half submergedand submerged) and (2) to estimate the decomposition time of carcasses.Twenty-eight carcassespresent on this stretch of creek were monitored for 24 d, at which point all carcasseshad completely decayed.

Water chemistry

Five high density polyethylene (HDPE) bottles (250 ml) were filled with water at

each station for [NHa*]1u4,[NOl-]tuql, [P]tuqi analyses. Nitrates were determined with method 300.0 from U.S. E.P.A. (1993) using ionic chromatography(DIONEX DX300, Sunnyvale,California, U.S.A.; detection limit: 0.02 pg ml-r) and an anionic column 88 Chapitre 3: Salmon-derivedmercury and nutrients

(DIONEX AS14). Ammonium and total phosphorus were measured following U.S. E.P.A. methods 351.2 (1983) and 365.1 (1993), respectively, by spectrophotometry

(LACHAT instruments, QuickChem FIA+ 8000, Milwaukee, Wisconsin, U.S.A.; detectionlimit for ammonium : 0.003 pg ml-t; detectionlimit for total phosphorus: 1 tg mft).

Four amber bottles filled with water were collected at each site to measure "C dissolved organic carbon (DOC). These bottles were pre-treatedby heating at 400 in a combustion oven for 6 h and were rinsed with ultrapure ELGA water (Milli-Q system organofree,>18 Mohm cm-I). Total and dissolved organic carbon (filtered with GFÆ frlters, pore size : 0.45 pm) were determined with an organic carbon analyzer(Shimadzu TOC-5000A, Columbia, Maryland, U.S.A.; detectionlimit: 0.05 mg L-t;. In our study, more than 90Yo of the total organic carbon was dissolved. For this reason, only DOC concentrationsare mentioned in this paper.

For all of theseanalyses, samples of a certified referencematerial were submitted to the same procedures; measuredconcentrations in the reference material varied little over time (ammonium: nutrients 2185, Belpre, Ohio, U.S.A., mean (+ SD) certified values:5.53 + 0.05mg-N Ll, mean(+ SD) measuredvalues:5.55 + 0.11mg-N L-t; CV : 2%o;nitrates: rain water, FP-73SW-7, Burlington, Ontario, Canada, mean (r SD) certifiedvalues :2.1 * 0.1 mg L-1,mean (+ SD) measuredvalues :2.00 + 0.06 mg L-r; CV: 3%; phosphorus:nutrients 2185 mean (+ SD) certified values : 6.55 + 0.02 mg-P L-t, mean (+ SD) measuredvalues : 6.54 + 0.19 mg-P L-1, CV :3oÂ; organic carbon: DEMAND 42.02, Belpre, Ohio, U.S.A., mean (+ SD) certified values:42.02 + 0.17 mg L-1, mean (* SD) measuredvalues :41.94 + 1.26mg L-1,CV: 3Yo)andwere within the certified range. Blanks were also run and no appreciablecontamination was detected.

Suspendedparticulate matter (SPM)

Three 1 L Teflon bottles were filled with creek water at each sampling station (before and after spawning 2001) and then filtered on a pre-heated clean filter (GF/F, Chapitre 3: Salmon-derivedmercury and nutrients 89

'Whatman, pore size - 0.45 pm). These filters were placed in a Teflon in-line filtration unit (series 47 filter holder, Savillex, Minnesota, U.S.A.) and water from each 1 L bottle was pumped (Cansunfield pump, Winnipeg, Manitoba, Canada)through the unit. Filters were then frozen for transport, freeze-dried and re-weighed to determine the weight of suspendedparticulate matter.

Fecal coliforms

To assessif our water chemistry data were biased by leaks from neighboring septic tanks, we measured fecal coliforms in the water. Four water samples were collected at each site in 2001 (before and after spawning), filtered on a sterile membrane (pore size : 0.45 pm) and incubatedfor 24 t 2 h at 44.5+zoc on a m-Fc environment. The identification of fecal coliforms was confirmed by a negative reaction with cl.tochrome-oxydase, a positive reaction with ONPG (ortho-nitrophenyl-B-D- galactopyranoside) and with MUG (4-methyl-umbelliferyl-B-D-glucoronide). The detection limit of this method is 1 unit representingone colony. In our study, 80-100% of fecal coliform colonies were formed of Escherichia coli. For this reason,we use the term E. coli to refer to fecal coliforms in water.

RESULTS AND DISCUSSION

Effect of carcassdensities on Hg and nutrient concentrations in water and sediments

The smallest densities of salmon carcasses(Fig. 3.3, lowermost panels) were observedat the GanaraskaRiver station in 2000 as well as at the Wilmot Creek upstream stationsin both 2000 (U1) and 2001 (Ul and U2). After spawning in 2000, the highest density of salmon carcasseswas observed at station Dl. In 2001, most carcasses disappearedfrom Dl (mostly as a result of bear activity) and the site with the highest density of salmon carcassesremaining was Ml (Fig. 3.3). Note that bears have been absentfrom this watershedfor many decades,and that the presenceof bears in our study was exceptional. 90 Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients

Concentrationsof total Hg, Hgp, MeHg, DOC, P, NH4", NO3- and SPM were significantly higher at stations of maximum carcassdensity than at other stations in both years(ANOVA,p<0.02, k:15-30; Fig. 3.3).Furthermore, in 2001,the concentrationsof these substanceswere higher at station Ml after spawning than before spawning (/-test,' p : 0.001-0.007,n : 6-10; Fig. 3.3). When pooling all data (after spawning in both years), concentrationsof these substanceswere positively correlated with carcassdensity (r" : 0.70-0.85;p : 0.003 - 0.035; Fig. 3.4A-F). These results strongly indicate that salmon carcassesaltered the water chemistry of the stream. Although similar nutrient increases at spawning stations have been reported previously (Cederholm et al. 1999; Cederholm et al. 2000), this is the first evidence of carcass-inducedcontamination of a stream by mercury. Note that inter-annual or monthly variations in stream hydrology are unlikely to explain these differences in water chemistry, since discharges varied little during the summerand fall of 2000 and 2001 (Fig. 3.28 and C).

The influence of carcasseson water chemistry is fuither evidenced by the fact that, after spawning, DOC and SPM were correlated to total and particulate Hg as well as MeHg, whereasno such correlation was observedbefore spawning (Fig. 3.5A, B and C). The presence of carcasses,a source of DOC and SPM, likely caused these positive correlations. Indeed, many studies have shown that salmon carcassescan provide an important source of allochthonous organic matter (Cederholm et al. 2000). For instance, Bilby et al. (1996) estimated that small salmon runs (approximately 1,000 individuals) can contribute 25 to 40%oof allochthonous organic matter inputs to a given stream. Since measureddensities of E. coli were not significantly different (paired /-test,p>0.05) before and after spawning at all stations, thesepattems in water chemistry were more likely due to the presence of fish carcassesthan to inputs from septic tanks. At the station of maximum carcass density (Ml in 2001), we measured 2 and 3 fold increases in the concentrations of particulate Hg and total Hg, respectively (Fig. 3.3). [MeHg] also increased dramatically at this station (Fig. 3.3). Prior to spawning, MeHg and Hgp represented,respectively, 2 and 40o of the total Hg, whereas after spawning these proportions increasedto l0 and 60%. We measuredno increase in the concentration of dissolved Hg, [Hg]o, after spawning in 2001, and the station of maximum carcassdensity Chapitre 3: Salmon-derivedmercury and nutrients 9l was not the site with the highest [Hg]n. These results can be explained if carcass decomposition resulted in the releaseof fish tissue as small particles, therefore increasing the levels of particulate and total Hg, but not of dissolved Hg. Hg in particles of fish tissue must first be metabolizedby bacteria to yield dissolved Hg, which could take some time. Furtherrnore, laboratory experiments by Bloom and Kuhn (1996) suggest that bacteria releaseHg assimilated from fish carcassesas elemental Hg, u gaseousform that would be lost to the atmosphere.The low concentrationsmeasured in biofilm on salmon carcasses(Table 3.1) are also consistentwith low [Hg]p and the releaseof Hg assimilated by the biofrlm as volatile gaseousHg.

An alternative explanation for the link between Hgp concentrationsand carcass density could be that salmon resuspendedsediments during spawning. However at the time of sampling, salmon had been dead for -3 d; it is therefore unlikely that sediment resuspensionwas a contributing factor.

In sediments, Hg concentrationsvaried greatly among stations and at the same station in two consecutive years (Fig. 3.6). Because sediments can move downstream during spates(Sarica et aL.2004), it would be diffrcult to use sedimentsto monitor Hg inputs from salmon carcasses.This high variability may be causedby salmon which can disturb sedimentsduring spawning.

Effect of carcasseson Hg in biota

The main taxa of aquatic insects (collectors, shreddersand predators) collected at the site of maximum carcassdensity were 1.4 to 3.1times more contaminatedwith Hg than individuals of the samegenera at Ul and at GR stations(Table 1; /-test;p : 0.000- 0.041, n : 6-10 individuals per taxa). Also, insectscollected after spawning at Ml in 2001 were 1.4 to 2.0 times more contaminatedthan thosecollected before spawning.The only exception to these pattems was the lack of a statistical difference between Hg concentrationsin Hexatoma before and after spawning in 2001. This difference among 92 Chapitre 3: Salmon-derivedmercury and nutrients taxa suggeststhat their biology and trophic relationships influence the degree to which they accumulateHg from spawning salmon.

Mercury concentrations in two taxa (Hydropsyche and Claassenia) differed between 2000 and 2001, at a site with similar carcassdensities (station Ml). These differences may be due to yearly changes in invertebrate growth and total biomass. Alternatively, our estimate of carcass density may not fully reflect the mean carcass density to which invertebrates were exposed prior to our arrival. Indeed, we expect carcass densities to be more directly related to short term indicators such as water chemistry variables.

From a survey conductedon a240 m stretch of the stream, approximately 680Âof carcasseswere fully or partly available for colonization by terrestrial insects (beachedor half submerged;Fig. 3.7). Calliphorid fly maggots used carcassesas a source of food and acceleratedthe time for complete decomposition by a factor of 2 for beachedcarcasses (Fig. 3.7). The 12 d decompositiontime in the presenceof maggots is similar to those reported elsewhere for salmon (Cederholm et al. 2000). Calliphorid larvae feeding on carcasseshad Hg concentrations25 times those of their parents collected at the same station, and levels two fold higher than those in salmon (Table 3.1). Consequently, terrestrial larvae feeding on carcassesbiomagnified Hg and transferredit from the aquatic to the tenestrial ecosvstem.

Influence of carcassremoval bv bears

Bears can be important vectors of salmon-derived nitrogen to the terrestrial environment, transporting between 70 and 80% of salmon to the forest during spawning (Reimchen2000). In 2001, a bear removedapproximately 80% of the carcassesat station Dl, the site of maximum carcassdensity in 2000. As a consequence,concentrations of total Hg, Hgp, Hgo. NO3- and P were not statistically different at D1, before and after spawning in 2001, whereas these elements peaked at this station in 2000 (Fig. 3.3). Furthermore, concentrationsof DOC and NH+* at station D1 were lower after spawning Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients 93 than those at upstreamstations Ml and M2. Removal of carcassesby bears likely led to a decreasein local levels of mercury and nutrients in the water column at station Dl. These results indicate that bears likely transported substantialamounts of salmon-derivedHg to the terrestrial ecosystem.

A budget for salmon-derived Hg in Wilmot Creek

In figure 3.8, we integrate our data from station Dl to describethe fate of salmon- derived Hg in the presenceand absenceof bears and other potential scavengers. We assumedthat whole salmon have a mean concentrationof total Hg of 0.20 + 0.05 mg kg-l wet weight and a mean wet weight of 6.6. kg (adult salmon from Lake Ontario; Scott and Crossman1984). We also assumedthat stationDl (length:250 m) is representativeof a 3 km stretch of streamhaving a mean width of 5 m, and thus an area of 15,000 r.rt. Sin"e a carcassdensityof 0.24salmonm-t*urmeasuredatstationDl intheabsenceof bears, the total flux of salmon-bound Hg from Lake Ontario to this reach of stream is 4.75 g (Fig. 3.8), for the 21 d period coveredby this study. Without bears,we presumethat all of the Hg in beached salmon, which represent 36Yoof the total number of carcasses(Fig. 3.7), andwhich thus contait I.7l g of Hg, is transferredto the riparian zone by maggots (Fig. 3.8, left panel). The assumption that beached carcasseswere totally eaten by maggots was supportedby regular visual inspections of decaying carcasses,and has also been establishedby others (Cederholm et al., 2000). Downstream transport is calculated from the difference between total water-column Hg concentrationswhen carcassesare presentand thosewhen they are absent(Fig. 3.3). This difference(0.35 ng L-t) multiplied by the median streamdischarge during salmonrun in 2001 (765 L s-t; Fig. 3.2C) gives a downstream Hg flux of 0.49 g over 21 d. By diflerence, we obtain the amount of Hg remaining in the aquatic system at station Dl (2.55 g). As shown in Fig. 3.8 (left panel), 54oÂof the carcass-boundHg stays at the site where salmon died, and 36Yois transferred to the riparian zone.

The salmon carcassesremoved by bearscorresponds to the difference betweenthe densityof carcassesmeasured at stationD1 in 2000 and in 2001 after spawning,i.e., 0.20 94 Chapihe 3: Salmon-derivedmercury and nutrients salmon m-t 1Fig. 3.8, right panel). Therefore, 83%oof the salmon-bound Hg was consumedby bearsand other scavengers.When considering the added impact of maggots on the beached carcasses,approximately 90o of the Hg (4.2a g) will end up in the terrestrial system in the presenceof bears,compared to 36Yoin their absence.

During our 21 d study, the amount of Hg transported by salmon to the whole stream(Fig. 3.9) was 10.3g, which correspondsto an annualflux of 29.4 g if we assume that the salmon run lasted 60 d. This annual Hg flux is close to the 26.4 g of Hg that we calculated from published estimatesof salmon runs in Wilmot Creek, assuming the same mean salmon weight and Hg concentrationas above (Stanfield et aL.2002).For the whole stream(Fig. 3.9), we observethat: (l) when bearsare active at site Dl, they are the main force dictating the fate of salmon-boundHg, leading to a water-to-land transfer of 40Yoof the salmon-boundHe; Q) without bears, the majority of the Hg pool (54%) stays at the site of salmon death, with a third being transferred to the terrestrial systemsby maggots. As shown by the dashedlines in Fig. 3.8, many of the processesinvolved need to be further investigatedto refine this assessment.

At the scale of the drainage basin (94 km2), total Hg inputs by salmon runs represent approximately 1 to 3Yo of the atmospheric deposition (wet and dry: 10- 30 pgHg --'yr-l; InternationalJoint Commission and Commission for Environmental Cooperation 2003). Assuming that MeHg represents more than 95%oof total Hg in piscivorous fish (Watras and Bloom 1992) and less than 5Yoof atmospheric deposition t) (Lindqvist 1991),salmon runs likely representa large MeHg flux (i.e., 27.9 gMeHg yr at the drainagebasin scale(wet and dry deposition: 47-141g MeHg yr-t;- However, one must remember that most methylation (and demethylation) affecting aquatic bioaccumulation likelv occurs in situ. near or in the stream.

This study, along with the one by Kriimmel et al. (2003), provides evidence that toxic substancescan be effrciently transported by Pacific Salmon and delivered to their native streams.Further studies are neededto clearly assessthe toxicological risk related to this pathway for the streamand terrestrial communities. Chapitre 3: Salmon-derived mercury and nutrients 95

ACKNOWLEDGEMENTS

We gratefully acknowledge financial support from NSERC, COMERN and FQRNT to M.A. J.S. was supported by a scholarship from INRS. Special thanks to B. Anderson and her pupils from Wilmot Creek School and to S. Marriott and her pupils from Trinity College. J. Laroulandie, X. de Rouvroy de Saint-Simon provided technical assistancein the field. D. Lean and J. Holmes helped in MeHg analysis and M. G. Bordeleau, P. Foumier, S. Saint-Pierreand S. Duval did nutrient analysis. I.D. Cameron, and F. Smith from the Ontario MNR provided dischargedata. F. Boudreau, G. Cabana,C. Gobeil, M. Lucotte, R. Schetagne and A.Tessier reviewed an earlier version of the manuscript. 96 Chapitre 3: Salmon-derivedmercury and nutrients

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Table 3.1. Density of salmoncarcasses (indiv nt-'; as well as mean concentrationsof Hg (ng g-t, dry-weight) in dorsal muscle and liver of salmon carcasses,in aquatic and terrestrial invertebratesand in biofilm as measuredin spawnings 2000 (after) and 2001 (before and after) at various stations in V/ilmot Creek and in one station in the Ganaraska * River (GR) in 2000. Values in parenthesesrepresent SD; - indicates no data; represents a significant difference at a given station between upstream (U1) and spawning station (M1) in 2000, or between upstream and GanaraskaRiver stations in 2000, or before and after spawningin 2001 (/-test,p<0.05).

Spawningyear 2000 2001

UI MI Station GR UI MI DI Before After Before After Carcassdensity 0.08 0.08 0.22 0.24 0.20

[total Hgl Chinook salmon Dorsal muscle 740 990 (e0) (380) Llver 580 540 (100) (250) Aquatic invertebrates Hydropsyche sp. 163 tl4 352. 75 tr7 lll 224 (s4) (34) (35) (10) (30) (e) (22) Claassenia sp. 210 153 338. t73 162 163 225. (60) (1s) (43) (18) (26) (26) (14) Hexatoma sp. 183 t92 285. 206 135 345 289 (40) (36) (15) (2e) (54) (68) (103) Limnephilus sp. 126 155 136 240' (4) (35) (8) (24) Biofilm on carcasses -54 (2) Terrestrial invertebrates Calliphoridae adults 56 (30) Calliphoridae larvae 1650 (200) Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients t0l

1*I I 0 I 2 3km t.----r---r

manville

Figure 3.1 Locationof Wilmot Creek(43o59'N, 78'38'W) andour six samplingstations (U1, U2, M1, }i42,Dl, D2). The opencircle at the mouthof the streamindicates the locationwhere thedischarge was measured. Redrawn from Gibson(1996). t02 Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients

r400

1200

1000

i rt) d 8oo 1400 1400 c.) ;r 1200 ^ 1200 ôo 1 Lr j rooo î rooo -E 600 ÈJ o o 800 I roo (n èo bI) <É btrt, b ooo 3 +oo 3 4oo 400 - 200 2000 H 200 2001 0 0 07 08 09 l0 ll 07 08 09 l0 ll Month Month

r99l 1992 1993 1994 r99s 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Year

Figure 3.2 A) The yearlymean discharge (L s-t; of Wilmot Creekfor the periodof 1991to 2001 as well as its monthlymean (+SD) discharge(L s-') measuredin (B) 2000 and in (C) 200l. Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients 103

-:.- before

{- after bn ,aa aa._. ttj

o'ot -', ,.,1i,.,!

;'l*3!"-.

^ 80 I [NH4-l ]a I a T40 .f- -l.at o- - 0 40 tPl -1^ lræ AJZ ôo Ezq H. .!i)-..-_- VO :.t_ {- to E 0.3 Carcass density E o.z €.Eo.r €o.o GR Ul MI Dl U1U2MIM2DI D2 Stations 2000 20ol Figure 3.3 Meanconcentrations (+ SD) of Hg (ng L-t), dissolvedorganic carbon, DOC, (mg r), t) L nitrate(mg L-t), ammonium(pg L-'), phosphorus(ntg L and the densityof salmon carcasses(individuals m-t) measuredin the GanaraskaRiver (GR; invertedtriangle) and at each stationin Wilmot Creek in 2000 (left panel) and in 2001 (right panel).Data were collectedbefore and after spawning.* indicatesdata under the detectionlimit. 104 Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients

-f 1.6 0.8 'I

,l b0 t.z 0.6 c'1 bo é. = 0.8 0.4 ôo E bo 0.2 o.+ F ! Ë o.o 0.0 iJ 4 40 i-â-+T '1 3 ,t oo e! e30 f4 ir2 È! () al Ezo f-.] 0 t0 l0 -80 T .l .l 8 ôo 60 bo t È1 6 ,- 40 4 T 220 z L LJ 0 0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.0 0.1 0.2 0.3 Density of salmon carcasses(individuals m-2;

Figure3.4 Meanconcentrations (+ SD) of A) totalHg (ng L-'), B) totalparticulate Hg (ng L- r;, Cl dissolvedorganic carbon, DOC, (*g L-t), D) phosphorus(mg L-t), E) ammonium(pg L-l) andF) nitrates(*g L-t) asa functionof the densityof salmoncarcasses (individuals m-2) in the streamafter spawnings2000 and 2001 Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients 105

-1.2 'l èo - 0.8 bo ?r

E 0.4 ,3

0.0 0.16

-- 12:0.66 Jo.tz p:0.001 -ôo É.0, () 4o.oa

0.00 234 1234 IDOCI(*g L-') tDocl (rneL-t) 0.8 c) a 12:0.19 r2: 0.58 a ;^ p>0.05 p:0.013 -f 0.0 bo ooso o-0.4 bo FTi &o 0.2 oo& 0.0 468 46 ISPMI(*g L-') ISPMI(*g L-')

Figure 3.5 Relationshipsbetween A) total Hg (ng L-t; anddissolved organic carbon, (DOC, mg L-t) concentrations,B) MeHg (ng L-t) and DOC (-g L') concentrationsas well as betweenC) total particulateHg (ng L-r) and suspendedparticulate matter (SPM, mg L-t) concentrationsbefore (open circles) and after (closed circles) spawning in 2001.Each syrnbol representsone sampleand data from all stationsare combined.Regression coefficients (r2) and associatedp valuesare given for significantrelationships. The dashedline for MeHg regressionsindicate the instrumentaldetection limit. 106 Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients

6 î o0

t -4, o0 F -l

-2

1-l c i 0.3

-l

- nt +r' (hé C) E 0.1 rn v) C) ! ,q 0.0 UI U2 MI M2 Sites Z00l

Figure 3.6 Meanconcentrations (+ SD) of total Hg (ng g-1dry weight) in sedimentsand the density of salmoncarcasses (individuals m-'; meururedat each station in the streamduring spawnings2000 and 2001. Mercury data were collected before and after spawning. Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients to7

I decompositiontime l------l relative abundance

t .9 30 30 -] a d) o- o C) )fi -o Ezo 6 () ()

a.)

L ;lo

L2

Submerged HalÊsubmerged Beached

Figure 3.7 Time of completedecomposition and relativeabundance for submerged,halÊ submergedand beachedsalmon carcassesin Wilmot Creek. Different letters representa significantdifference (ANOVA, p<0.05).SD is presented. 108 Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients

Without bears With bears

Evasion"'T'"" to the atmosohere I I Forest soil

3.96 g

tl ritl Resident i-___-- I Sedimentation fish1 Calliphoridaelarv i Evasion

Trees Terrestrial*-- Soil +A invertebrates I I Salmon V rl! 4.75gyrl Trees Aquatic invertebrates

Salmon Downstreamtransport 4.75 gyr-l 0.14g yrt \ Aquatic invertebrates

Aquatic invertebrates

Figure 3.8 Assessmentsof Hg pools(g) and Hg fluxes (g yr ') at stationD1 (riparianarea, water,downstream transport and forestsoil) with or without bears.The dashedlines represent processesfor which fluxes areunknown. Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients t09

V7- downstreamtransport NSSNIwater 8ffi forestsoil

U2 MT M2 Dl D2 without bears with bears Stations Whole stream

Figure 3.9 Assessmentsof Hg pools (g) at each station and for the whole stream, with or without the presenceof bears. Chapitre3: Salmon-derivedmercury and nutrients Chapitre4 : The fateof mercuryin blowfly larvae. lll

Chapitre 4: The fate of mercury accumulatedby blowflies feedingon fish catcasses(article 3)

José Sarica,TMarc Amyot,l Julien B"y,$ and Landis HareT

1 Institut national de la recherche scientifrque (INRS), Eau, Terre et Environnement,

Université du Québec, 2800 rue Einstein, C.P. 7500, Sainte-Foy,Québec, GlV 4C7, Canada; r Départementdes sciencesbiologiques, D223, Pavillon Marie-Victorin, Université de Montréal, 90, Vincent d'Indy, Montréal, H2V 259, Canada; $ Institut universitairetechnologique de Clermont-Ferrand,B.P. 86, 63172 Aubière cédex, France.

Environmental Toxicology and Chemistry (souspresse) tt2 Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae.

R-ESUME

Parceque les poissonsreprésentent le principal réservoir de méthymercure (MeHg) dans la colonne d'eau des systèmesaquatiques d'eau douce, la libération du MeHg issue de leur carcassepourrait représenterun flux important vers I'environnement. Les larves d'invertébrés nécrophagespeuvent jouer un rôle important dans ce recyclagede Hg. Nous avons étudié en nature l'accumulation du Hg dans les larves des mouches domestiques (diptère, Calliphoridae) se nourrissant des carcassesde poisson échouées.Nos résultats ont indiqué que le MeHg accumulé dans ces larves nécrophagesétait retenu jusqu'au stade pupal pour être finalement éliminé après l'émergence par les nouveaux adultes. Nous concluons que les calliphoridés possèdentun mécanisme efficace d'excrétion du MeHg qu'elles ont accumuléà partir des carcassesde poisson. Chapitre4 : The fateof mercuryin blowfly larvae. 113

ABSTRACT

Because fish represent the principal methylmercury (MeHg) pool in the water column of freshwater systems, MeHg released from their carcassescould represent an important flux to the environment. Necrophageousinvertebrates such as fly larvae can play an important role in this Hg recycling. We studied Hg accumulation by blowflies (Diptera, Calliphoridae) feeding on beachedfish carcassesin the field. We found that the MeHg these flies accumulatedas larvae is retained in their pupal stagebut is eliminated by the adult following emergence. We conclude that calliphorids possessan efficient mechanismfor excreting the MeHg that they accumulatefrom carcasses.

Keywords- Methylmercury, Fish carcasses,Necrophageous, Blowfly, Calliphorid tl4 Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae.

INTRODUCTION

The largest pool of methylmercury (MeHg) in the biota of freshwatersis found in fish tissues [1,2]. BecauseMeHg is a neurotoxicant, the health of natural predatorsof fish (including man) can be affected by fish consumption [3]. It has generally been considered that piscivorous animals are at the top of aquatic food chains, and thus contain the highest amount of MeHg. However, necrophageousnecrophagousinsects and their predators can be even higher up the food web than fish [a]. The results of recent studies [5, 6] suggest that necrophageousnecrophagousinvertebrates recycle mercury (Hg) from fish carcasses. In particular, calliphorid larvae feeding on beached Pacific salmon carcasses can accumulateand biomagnifu Hg to levels up to 30 fold higher than their parents,and twice that of the salmon carcasseson which they feed. However, it is unclear if these fly larvae retain this Hg through all of their development stages.This is important to know because adults would be more likely to transfer Hg to the terrestrial environment than would larvae. Previous Other studieshave already indicated that emerging aquatic insectscan be important in the transfer of contaminantsfrom the aquatic to the terrestrial environment s could be signifrcant, such as in the case of emerging aquatic larvae [7,8]. In this paper, we present the results of a field experiment in which we measured changes in Hg in carcass-associatedblowflies through their various developmentalstages (egg, larva, pupa, adult).

MATERIAL AND METHODS

Collection offield samples

Four brook trout carcasses(Salvelinus fontinalis; mean (t standarddeviation, SD) dry weight : 532 + 72 g; mean (+SD) length : 34 t 3 cm) were inserted individually in minnow traps (n : 4) placed close to the shore of Le Petit Lake (Sainte-Foy, Québec, Canada)in mid-May 2002. Chapitre4 : The fateof mercuryin blowfly larvae. ll5

Carcasseswere monitored continuously for 12 hours at the start of the experiment, during which time and native adult blowflies (referred to as adults (lay)) were collected sampled immediately after they had laid their eggs ointo a the carcassduring this time period. After 12 hours, each minnow trap was inserted into a perforated plastic bag to avoid subsequentcolonisation by other flies and to keep blor,vfly larvae in fish carcasses for the full duration of the experiment. Day 0 began started when we placed inserted the carcasses in plastic bags. To follow changes in the Hg content of fish during decomposition, we collected fish tissues at times 0 and 12 days. On day 0 we collected dorsal muscle, whereas on day 12 we collected a mixture of decomposing muscles and internal organs.The collection of all blowfly stageswas done over a period of one month. Specifically, we sampled blolvfly adults (lay), eggs, larvae less than I cm of length, larvae greater than 1 cm of length, prepupae,pupae and adults emerging from carcasses (refened to as adults (emerg.)) from each fish carcass.Individual animals or fish tissues were then inserted on Teflon sheetsin 1.5 ml high density polyethylene microcentrifuge tubes and frozen [9]. Samples were then freeze dried (lyophilizer FTS SystemsrM; Mountain View, CA, USA) and subsequentlyhomogenized with a Teflon-coated piston, using the centrifuge tube as the mortar.

Hg analyses

Ultraclean techniquesassociated with mercury sampling were used in this study. Sample bottles and laboratory glasswarewere acid washed with 15% HNO3 (vlv), lYo HCI (vlv) and carefully rinsed seventimes with ultrapure water (Milli-Q system water, > l8 Mohmcm-l; while wearing unpowdered latex gloves. All frozen sampleswere freeze- dried (lyophilizer FTS Systems)and blended in the laboratory.

We measuredthe total Hg concentrationin each blor,vfly development stageand in the dorsal muscle of fish using a Direct Mercury Analyzer (DMA-80, atomic absorption oC; spectrophotometry,Monroe, CT, USA) with thermal combustion (drying: 10 s at 160

thermal desorption: 150 s at 750oC).Quality control was assessedby using reference material for appropriate matrices: Hg concentrations in reference material varied little ll6 Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae. over time and were not significantly different from certified values (marine dogfish: DORM-2, coefficientof variation:9Yo and lobsterhepatopancreas: TORT-I, coefficient of variation : 3Yo: National Research Council of Canada , Ottawa, Ontario, Canada; oyster, coefficient of variation: 4Yo:National Bureau of Standards-1566,Washington, District of Columbia.USA).

The extraction and ethylation of MeHg from the various developmental stagesof blowflies collected from carcass 3 and from fish tissues (carcasses I and 3) were conductedaccording to the methodsdescribed by Bloom [10,11]. Fish carcass3 was used for MeHg analysesin blowflies becauseit was the one that provided suffrcient biomass for all of the developmental stages. Briefly, MeHg was extracted with a 25 Yo (w/v) KOH/MeOH solution at a temperatureof 68 oC for 8 h. For MeHg ethylation, lactic acid and IYo (w/v) sodium tetraethylborate were added. Ethylated MeHg from the solution was purged on a Tenax@ column (Scientific instrument Services, Ringoes, NJ, USA), which was then dried for 10 minutes. The derivatized Hg specieswere thermodesorbed onto a GC column. MeHg was detectedby atomic fluorescencewith a detection limit of 5.4 pg of Hg. MeHg concentrationsin referencematerial varied little over time and were not significantly different from certified values (TORT-2, coefficient of variation : l0%o: National ResearchCouncil of Canada,Ottawa, Ontario, Canada).

STATISTICS

We used multifactorial analysesof variance (ANOVA; factor I: Hg in carcasses; factor II: Larval stages)to test for the effect of Hg in different carcasses.This ANOVA indicated that there was no direct effect or interaction of total Hg in different carcasseson total Hg in larval stages(p> 0.05,n:99). We thereforepooled all the data (Fig.4.1). Differences in MeHg concentrations and burdens between developmental stages of blowflies in carcass3 were testedwith a one-way ANOVA (Fig. a.4. Differences in total Hg and MeHg concentrationsfor each frsh carcassbetween days 0 and 12 were tested with a / test. All analyseswere performed using SYSTAT, version 10, from SPSS ScienceMarketing Department (Chicago, IL, USA)>. Chapitre4 : The fateof mercuryin blowfly larvae. rt7

RESULTS AND DISCUSSION

Total Hg and MeHg concentrationsin brook trout carcasses(Table 4.1) decreased significantly between days 0 and 12 (r test, p : 0.005-0.04,n : 4 per carcass).This suggeststhat either blowfly larvae preferentially fed on tissuesrich in Hg, such as muscle and liver, and/or the activity of larvae in carcassescaused a mixing of Hg rich muscle tissueswith less contaminatedinternal organs.

For all carcasses,both total Hg and MeHg concentrationsand burdens increased significantly from eggs to pupae(mutifactorial ANOVA, p : 0.0004-0.017 , n : 99; Fig. 4.Ia,b and Fig. 4.2a,b). Maximum Hg values in pupae were from 4 times higher than those in colonizing adults.

Small and large blor,vfly larvae had similar total Hg concentrations(ANOVA, p > 0.05; Fig. 4.1a) but differed in their total Hg burdens(ANOVA, p : 0.001, n: 37; Fig. 4.1b), suggestingthat total Hg accumulation occurred at the samerate as did the addition of larval tissues (Fig. a.1c). In contrast, large larvae had higher MeHg concentrationsand burdensthan did small larvae (ANOVA, p : 0.001, n : 14; Fig. 4.2a,b),which suggests that MeHg is biomagnifred between fish and blowfly larvae. Note that this conclusion is based on the data collected on a single carcassand should therefore be consideredwith caution. The concentration factor, calculated as the ratio of the total Hg concentration in

blowflies to that in fish [12], was lower for larvae (0.84) than for prepupaeand pupae (1.3 and 1.6, respectively). The concentration factor calculated this time withusing MeHg concentrations (blowflies collected on carcass3) reached 0.57 for small larvae, 1.0 for large larvae,1.7 for prepupaeand 1.93 for pupae. However, all of theseconcentration factors were lower than those reported forin calliphorid larvae feeding on Pacific salmon

carcasses(concentration factor : 2.3 for total Hg; [5]). The difference is likely explained by the fact that in our study less than 50% of the Hg in the dorsal muscle of brook trout is MeHg (Table 4.1), whereasin the dorsal muscle of Pacific salmon carcassesmore than

80% of the Hg is MeHg [5]. The relatively higher concentration factors reported for Pacific salmon suggest that blowfly lawae arc able to excrete inorganic mercury much ll8 Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae. more effectively than MeHg (strongly bound to proteins), which is in agreementwith results obtained in a laboratory experiment on blowflies by Nuorteva and Nuorteva [4]. The proportion of MeHg increasesdfrom small larvae (30%) to large larvae (65%) to pupae (90oÂ),suggesting that MeHg taken up from fish is largely retained through the various stages. This result contrasts with the trends reported for some other Diptera

[13,14,15]and Lepidoptera[16,17] for which somemetals are is eliminatedbetween the larval and pupal stages.

Adults 2 had much lower total Hg (Fig. 4.1a) and MeHg (Fig. 4.2a) concentrationsthan did pupae, suggestingthat the considerablequantities of Hg taken up by blowfly larvae were eliminated after emergence of the adult flies. Indeed, Hg concentrationsand Hg burdens 70 o + 20 (standarderror) ng g-l) decreasedby .(i.e,105 and 96 Yo(i.e, 2.7 + 0.5 (standarderror) ng), respectively, after emergence.Both MeHg concentrations and MeHg burdens decreased also by more than 95Yo (i.e, 130 + 10 (standarderror) ng g-r and2 + 0.4 (standard error) ng), after emergence.Episodic metal elimination through processes such as molting, larval defecation and voiding of the meconium(wastes in the gut) by adults has been reportedfor various insecttaxa [15,16]. The meconium is reported to be an effective means of eliminating metals for insects of severalorders including the Neuroptera[5], Lepidoptera|6,171and Diptera [4,13]. For example, Kazimirova and Ortel [15] showed that the following emergence flies can eliminated via the meconium 30% of their Cd, 50% of their Pb and 40oÂof their Cu, after emergence.Nuorteva and Nuorteva [4] observed in the laboratory that up to 80% of the Hg measuredin pupae was defecatedin the meconium of adult blowflies. Thus blowflies have a well-developed ability to decreasetheir Hg content via the meconium.

'We conclude that blor,vfly larvae efficiently accumulateMeHg from fish carcasses up to the pupal stage,but lose most of this MeHg after emergence.Thus, beetles,spiders and birds feeding on these larvae [4,18] would be exposedto high Hg concentrationsand could develop symptoms of mercury poisoning (i.e, leg paralysis) causing death [4], whereas predators of calliphorid adults would be less likely to suffer such a fate. The ecosystemfate of the MeHg associatedto the meconium is unknown. Chapitre4 : The fateof mercuryin blowfly larvae. 120 Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae-

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors gratefully acknowledge financial support to M. Amyot from the Collaborative Mercury ResearchNetwork, Natural Sciences and Engineering Research

Council of Canadaand The QuébecFonds pour la Formation de Chercheurset I'Aide à la Recherche.J. Sarica was supported by a scholarship from INRS. We thank A. Vachon from la Base de Plein-Air de Sainte-Foy for his help in the field experimental design. Lastly, we would also like to thank F. Boudreau, G. Cabana,C. Gobeil and R. Schetagne for their comments on an earlier version of the manuscript, and J.C. Auclair for his commentson statisticaltests. Chapitre4 : The fateof mercuryin blowfly larvae. 12l

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Table 4.1 Mean (+ standarddeviation) concentrationsof total Hg and MeHg (ng g-r, dry weight) measuredin fish tissuesfrom four brook trout carcassesat day 0 (dorsal muscle) and day 12 (mixture of muscles and internal organs). ND means no data. A and b represent a significant difference in the Hg concentrations measured in fish carcasses betweendays 0 and 12 (t test,p < 0.05).

Carcassnumber

[total Hg]

Days 0 l2l+5" 118r 10u 145+ 30u 123+7u

t2 100+ 5b 96+8b 102+ 4b 94+4b

IMeHg]

Days 0 53+4" 70+5u

t2 40+3b ND 50+6b ND Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae. 125

tou :^ o, Przo o) I :80(u o 40

0 :-4

]f,.s e3 g c (D Ez -o o) - (tr 1 o

0

30

(t) g E20 .9) o = à Elo

adults eggs larvaelarvae pp. pupaeadults (lay) <1cm>1cm (emerg.) Developmentalstages of blowflies

Figure 4.1. a) Total Hg concentrations (ng g-r, dry weight), b) total Hg burden (trg individual-r) and c) dry weight (mg individuafr) for the various developmentalstages of blowflies: adults (lay), eggs, larvae smaller than lcm, larvae longer than lcm, prepupae "pp.", pupae and adults (emerg.) collected from four brook trout carcasses.Different letters represent a significant difference between stages (multifactorial analyses of variance,p < 0.05). The standarderror is shown. 126 Chapitre 4 : The fate of mercury in blowfly larvae.

:^'o) o) c =80 o) I o

40

.> E .c o) s.4 c o o =L -o (')^ Tz(|)

adults eggs larvae larvae pp, pupae adults (lay) <1cm >1cm (emerg.) Developmentalstages of bloMlies

Figure 4.2. a)MeHg ioncentrations(ng g-'dry weight), b) MeHg burden (ng individual- t) for the different developmental stagesof blowflies: adults (lay), eggs, larvae smaller than 1cm, larvae longer than 1cm, prepupae "pp.", pupae and adults (emerg.) collected from brook trout carcass number 3. Different letters represent a significant difference between stages(analyses of variance,p < 0.05). The standarddeviation is shown except for blowfly eggs for which the single value was below the detection limit (shown by *).