Paula García-Novo

CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE ESPÉCIES DOS GÊNEROS Anurogryllus, Urogryllus e Paranurogryllus (ORTHOPTERA, GRYLLIDAE). MORFOLOGIA, CITOGENÉTICA, ACÚSTICA, DNA

MITOCONDRIAL.

PAULA GARCÍA-NOVO

Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Julho de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Zoologia).

RIO CLARO Estado de São Paulo - Brasil Julho de 2004 CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE ESPÉCIES DOS GÊNEROS Anurogryllus, Urogryllus e Paranurogryllus (ORTHOPTERA, GRYLLIDAE). MORFOLOGIA, CITOGENÉTICA, ACÚSTICA, DNA

MITOCONDRIAL.

PAULA GARCÍA-NOVO

Orientador: Prof. Dr. ODAIR CORREA BUENO Co-Orientador: Prof. Dr. VANDERLEI G. MARTINS

Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Câmpus de Rio Claro,, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Zoologia).

RIO CLARO Estado de São Paulo - Brasil Julho de 2004

595.704 Mesa, Paula Cecília Garcia Novo M578c Caracterização e análise filogenética de espécies dos gêneros Anurogryllys, Urogryllus e Paranurogryllus (Orthoptera, Gryllidae) : morfologia, citogenética, acústica, DNA mitocondrial / Paula Cecília Garcia Novo Mesa. – Rio Claro : [s.n.], 2004 111 f. : 22 il., gráfs., tabs., fots., mapas

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Odair Correa Bueno Co-orientador: Vanderlei Geraldo Martins

1. Inseto - Morfologia. 2. Inseto – Taxonomia. 3. Som de chamado. 4. Citocromo. 5. Grilo. I. Título Ficha Catalográfica elaborada pela STATI – Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP

XXIX

Caminante, son tus huellas el camino, y nada más; caminante, no hay camino, se hace camino al andar. Al andar se hace camino, y al volver la vista atrás se ve la senda que nunca se ha de volver a pisar. Caminante, no hay camino, sino estelas en la mar.

Proverbios y cantares Antonio Machado España (1875-1939) ii

Agradecimentos

Ao Dr Odair Correa Bueno, por ter feito possível o desenvolvimento deste trabalho, através do espaço que abriu para mim ao aceitar-me sob sua orientação.

Ao Dr. Vanderlei G. Martins, que me introduziu no mundo da genética molecular e me conduziu passo a passo no laboratório, pacientemente.

Ao Dr. Maurício Bacci Jr que generosamente permitiu o uso dos equipamentos e reagentes do laboratório de genética molecular.

Ao Dr. Thomas J. Walker, que atendeu várias consultas e criou em laboratório os exemplares de Anurogryllus arboreus aqui estudados.

Ao Dr Jeng-Tze Yang, por ter cedido gentilmente exemplares de Brachytrupes portentosus.

Ao Centro de Estudos de Insetos Sociais pelas facilidades para o uso das instalações e equipamentos dos laboratórios

À CNPq pela bolsa e o apoio proporcionado a este trabalho através da taxa de bancada.

Aos colegas Akio Ronaldo Miyoshi e Cauré B. Portugal, que acompanharam coletas e me facilitaram exemplares por eles coletados.

Às generosas colegas do laboratório que me auxiliaram inúmeras vezes: Ana Carla,

Elissena, Carla Carolina, Aline e Sofia

À Secretária do CEIS, Nessis, pela disposição em nos atender muito gentilmente sempre que necessário. iii

Aos proprietários da Fazenda Capricórnio, especialmente ao Sr. Carlos Antonio, que nos permitiram realizar várias coletas no local. Às bibliotecárias Silvia e Márcia pela revisão das Referências Bibliográficas e elaboração da ficha catalográfica. A todos que, de uma forma ou outra, colaboraram para tornar possível a conclusão deste trabalho.

E um agradecimento especial a meu marido, Alejo Mesa, que me regalou a experiência incomparável da maternidade e que fez possível, querendo e sem querer, sabendo e sem saber, que eu seja hoje uma pessoa feliz.

ÍNDICE

Página

I-RESUMO...... 1 II-ABSTRACT...... 3 III-INTRODUÇÃO GERAL...... 5 1-A importância da bioacústica...... 6 2-O estudo dos cariótipos...... 7 3-O gênero Anurogryllus...... 7 4-As seqüências de DNA mitocondrial e a análise filogenética...... 9 5-Algumas considerações sobre o conceito de espécie...... 9 IV-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...... 12 1-Situação taxonômica de Anurogryllus, Urogryllus, Paranurogrylluse Brachytrupes.. 12 2. Morfologia, bioacústica e citogenética...... 13 3. Análise filogenética...... 14 V-REFERÊNCIAS...... 16 VI-ARTIGO1- Genitalia, acoustic and chromosomes of Urogryllus toledopizai 23 (Orthoptera, Gryllidae)…………………………………………………………………. VII-ARTIGO 2- Six new Species of the Cricket Genus Anurogryllus.(Orthoptera, 38 Gryllidae): Morphology and Bioacustic. ………………………………………………. VIII-ARTIGO 3-Citogenética de espécies de Anurogryllus: possibilidades e 71 dificuldades do seu uso na taxonomia...... IX-ARTIGO 4- Análise filogenética de espécies de Anurogryllus (De Geer) 91 (Orthoptera, Gryllidae) inferida a partir de dados morfológicos, bioacústicos e moleculares...... X- CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 109

I-RESUMO Foram estudadas espécies de grilos do gênero Anurogryllus, através de análises morfológicas, bioacústicas, citogenéticas e moleculares. Usando os mesmos métodos, Urogryllus toledopizai, Paranurogryllus capricórnio e Brachytrupes portentosus foram estudadas e incluídas como grupos externos na análise filogenética. Entre as populações de Anurogryllus foi detectada a ocorrência de seis espécies novas que são descritas taxonomicamente. As semelhanças morfológicas entre as espécies estudadas no gênero fazem necessário o emprego de outras fontes de informação na descrição das novas espécies. Nestes casos, foram utilizados outros caracteres disponíveis. Assim, apresenta-se uma chave de identificação para dez espécies do gênero, a partir de dados morfológicos e bioacústicos. Análises citogenéticas mostraram que é possível determinar um cariótipo básico entre as espécies estudadas com 2n=23,X0 nos machos com todos os autossomos acrocêntricos e diferença gradual de tamanho. Esse cariótipo está presente em A. timidus e A.arboreus. Em cinco espécies, A. magnobadius, A. polymorphus, A. marimontanus, A. flavus, e A. muticus, foram encontrados rearranjos interpretados como sendo fusões cêntricas, presentes até em número de três na mesma população, em estado hetermórfico. Este fato promove um alto grau de polimorfismo intraespecífico, o que dificulta a

discriminação específica, a partir dos cariótipos. Essa dificuldade se agrava pela impossibilidade de determinar quais são os pares do cariótipo básico que participam de cada rearranjo. Em A. walkeri, no entanto, um cariótipo muito singular para o gênero foi encontrado, com 2n=12, XX e 2n=13,XX nas fêmeas, sendo a variação no número de autossomos provocada pela ocorrência de um rearranjo em estado heteromórfico. O número de braços autossômicos, que em todas as demais espécies é de 22, caiu nesta para 18, indicando que outros tipos de rearranjos ocorreram neste caso e não apenas fusões cêntricas. A análise filogenética realizada a partir de dados morfológicos, bioacústicos e moleculares resultou em uma única árvore mais parcimoniosa que evidenciou a monofilia do gênero Anurogryllus, confirmou o status de grupo irmão de Urogryllus toledopizai. Os caracteres morfológicos e bioacústicos analisados separadamente resultaram em 20 árvores mais parcimoniosas cujo consenso semi-estrito não é muito resolvido e não permite afirmar a monofilia de Anurogryllus. Retirando-se da matriz a espécie Paranurogryllus capricórnio obtém-se quatro árvores mais parcimoniosas em que Anurogryllus é monofilético mas seu grupo irmão é Brachytrupes portentosus. As hipóteses resultantes dos dados morfológicos e bioacústicos não definem as relações entre as espécies de Anurogryllus. Na proposta filogenética de evidência total, A. arboreus aparece como a espécie mais basal, o que era esperado por ser uma espécie da América do Norte, que apresenta características bioacústicas e da morfologia da pars stridens que a aproximam de Urogryllus toledopizai. No entanto, A. timidus, que apresenta também características que pareciam colocá-la próximo de A. arboreus, aparece em um dos dois ramos em que se distribuem os Anurogryllus, com exceção de A. arboreus. Assim, esses caracteres são interpretados como reversões. Fica em evidência a dificuldade para encontrar caracteres nestas espécies tão semelhantes morfologicamente, mas que foram bem diferenciadas e analisadas a partir das seqüências de DNA mitocondrial. A análise de uma amostra mais representativa de populações de Anurogryllus, que se distribui desde o sul da América do Norte até Buenos Aires, poderia ajudar a discriminar novas espécies e compreender a evolução do gênero.

II-ABSTRACT

Species of crickets belonging to the genus Anurogryllus where studied by means of morphological, bioacustics, cytogenetics and molecular data. Using the same kind of techniques the species Urogryllus toledopizai, Paranurogryllus capricornio and Brachytrupes portentosus where phylogenetically analysed and included as out group. For populations of Anurogryllus it was disclosed the presence of six new species which where taxonomically described, including Anurogryllus muticus. The description of species where difficult because the occurrence of many morphological similarities between species of the genus. In such cases, the uses of new data were done. Those new data allowed the construction of an identification key for ten species of the genus, using morphological and bioacustics characters. On the other hand, cytological analysis allowed the determination of a basic karyotype among the studied species with 2n=23, XO for males and with all the autosomes acrocentrics and gradual decrease in size. This kind of karyotype is present in A. timidus and A. arboreus. For other five species - A. magnobadius, A. polymorphus, A. marimontanus, A flavus and A. muticus, some variations in relation to the basic karyotypes where found and interpreted as the result of centric fusions. Some populations of the last five species had three kinds of morphological changes in heteromorphic state. So,

karyotype analyses showed a high intraspecific polymorphism and for this reason it is impossible to get specific differences using such kind of study. Another consequence of this high polymorphism is the impossibility to get a correct interpretation of which chromosomes from the basic karyotypes are engaged in each kind of rearrangement. A. walkeri has some remarkable karyotypes with 2n=12, XX and 2n=13, XX for female specimens, being those karyotypes interpreted as the result of centric fusions, with the chromosome arms decreasing from twenty-two to eighteen and variations in autosome numbers due to polymorphism in heteromorphic state. The phylogenetic analyses from morphology, bioacustic and molecular data indicated the most parsimonious of the trees that evidences the monophyly origin for the genus Anurogryllus, the status of sister clade in relation to Urogryllus toledopizai and a common ancestral origin in relation to the Brachytrupinae subfamily species. The morphological and bioacustic data when analysed apart from the other characters resulted in twenty MPT´s whose semi-strict consensus did not show a good resolution and do not present a monophyly origin for Anurogryllus. When the Paranurogryllus capricornio species was removed out from the data matrixes, four AMPs were constructed and the monophyletism for the genus Anurogryllus was evident with Brachytrupes portentosus as a sister branch. The resulting hypothesis from morphological and bioacustic data do not determinate the relationship between Anurogryllus species. In the phylogenetic proposal of whole evidence, the most basal species was A. arboreus as expected, because its Neartic origin and because biacustic and morphology of the pars stridens turns it closely related to Urogryllus toledopizai. However, A. timidus whose characters seems closely related to A. arboreus appears instead in an branch where the Anurogryllus species are distributed with exception of A. arboreus. So, it is concluded that those characters are the result of reversions. It was difficult found distinctive characters in the morphology of the species but they are clearly differentiated when mitochondrial DNA sequences are considered. Analysis of a more wide geographical samples of Anurogryllus species, that has a geographic distribution comprising the South of the Neartic region until Buenos Aires Province, should help to understand the speciation story of the genus.

A espiritualidade é uma

dimensão de cada ser humano. Essa dimensão espiritual que cada um de nós tem se revela pela capacidade de diálogo consigo mesmo e com o próprio coração, se traduz pelo amor, pela sensibilidade, pela compaixão, pela escuta do outro, pela responsabilidade e pelo cuidado como atitude fundamental. Leonardo Boff

Assim, os desenvolvimentos disciplinares das ciências não só trouxeram as vantagens da divisão do trabalho, mas também os inconvenientes da superespecialização, do confinamento e do despedaçamento do saber. Não só produziram o conhecimento e a elucidação, mas também a ignorância e a cegueira. Edgar Morin

Introdução e Revisão Bibliográfica

III-INTRODUÇÃO GERAL

Os insetos constituem o maior grupo zoológico da Terra e a maioria de suas espécies é desconhecida, especialmente nas regiões tropicais. Estima-se que apenas entre 10 e 15% da fauna de insetos foi descrita (GREEN, 1998). Seus habitats naturais estão sendo continuamente destruídos, o que pode provocar dois tipos de conseqüências antagônicas, embora associadas ao desequilíbrio: a extinção e o surgimento de pragas. A situação da América do Sul em relação ao conhecimento da fauna de Orthoptera é extremamente precária, especialmente em relação a alguns grupos como por exemplo Grylloidea. Ainda, da maioria das espécies descritas não se conhecem as necessidades ecológicas, as características comportamentais ou a dinâmica populacional. O impedimento taxonômico se torna um obstáculo ao se pensar na conservação das espécies, assim como no caso de espécies que se tornam extintas antes de serem conhecidas (SAMWAYS e LOCKWOOD, 1998). Sendo assim, parece que focalizar os esforços na conservação dos habitats poderia ser a estratégia mais apropriada para a situação. Não é esse um trabalho ou uma responsabilidade apenas do cientista, mas também do educador que, através das diversas possibilidades oferecidas pela educação ambiental, pode formar e/ou atingir o cidadão, intelectual e emocionalmente, para que ele tenha acesso ao

conhecimento sobre o ambiente e se sinta também responsável pela Biosfera que compartilha com as outras espécies. O estado do conhecimento sobre a diversidade de grilos (superfamília Grylloidea) é muito precário. OTTE (1994) cataloga mais de 3500 espécies na superfamília Grylloidea e sugere que, provavelmente, esse número representa apenas 10% do total de espécies que ocorrem na natureza. Essa informação é corroborada pela nossa experiência de campo na qual de cada dez espécies coletadas na natureza, ao redor de nove são novas para a ciência. Sem a conservação dos habitats não será possível desenvolver o lento e laborioso trabalho de descrevê-las e nomeá-las. Estas dificuldades são agravadas ainda por outro problema: a falta de taxonomistas que se ocupem do grupo. Boa parte das descrições de espécies de grilos data do século passado ou início deste, como pode ser verificado nas Tabelas 1 e 2 da Revisão Bibliográfica em relação às espécies que serão objeto deste trabalho, e não permitem uma identificação segura das espécies. A maior parte das descrições é pobre e sem boas ilustrações e por outro lado, a maioria das mais recentes foi feita com base na morfologia externa e na genitália masculina. Em alguns casos, porém, como em gêneros da subfamília Gryllinae, esse tipo de informação, apesar de necessária, não é suficiente para uma diagnose segura das espécies, já que é comum a ocorrência de espécies crípticas entre as quais as diferenças morfológicas são freqüentemente escassas (ALEXANDER, 1962; ZEFA, 1995). As espécies de Anurogryllus se encontram nessa situação tendo sido caracterizadas através do exame conjunto de caracteres morfológicos e bioacústicos (WALKER, 1973). Incorporamos neste trabalho, além da análise morfológica e bioacústica, técnicas citogenéticas e moleculares, na tentativa de obter informações mais precisas sobre o status específico das diferentes populações, assim como realizar inferências sobre as relações filogenéticas entre as espécies.

1. A importância da bioacústica A divergência sonora entre as espécies usualmente precede diferenças morfológicas visíveis (OTTE, 1992). Espécies anteriormente indiferenciáveis têm sido

reconhecidas em quase todos os grupos nos quais os sinais sonoros foram estudados. OTTE (1992) indica uma extensa bibliografia em que isso foi mostrado. Estudos do som de chamado e do ciclo de vida dos grilos têm revelado a existência de muitas espécies que não eram distinguíveis com base em estudos morfológicos. Uma vez reconhecidas, em tais espécies crípticas usualmente são encontrados caracteres morfológicos que as identificam. A existência de espécies crípticas demonstra a falta de correlação entre isolamento reprodutivo e grau de diferenciação morfológica. Portanto, o tratamento de populações morfologicamente similares, alopátricas ou alocrônicas, deve permanecer subjetivo e arbitrário até termos critérios confiáveis para predizer as conseqüências evolutivas de que essas populações se tornem simpátricas e sincrônicas (WALKER, 1964). Outra fonte potencial importante de informações específicas é pesquisar onde e quando os machos emitem a estridulação. WALKER e WHITESELL (1982) estudaram o horário e locais de estridulação de Anurogryllus muticus e encontraram características diferentes daquelas estudadas por WALKER (1980) em Anurogryllus arboreus.

2. O estudo dos cariótipos Assim como a bioacústica, o estudo dos cariótipos têm sido de importância no reconhecimento de espécies crípticas entre os grilos (WHITE, 1973; HEWITT, 1979). Por outra parte, apesar de haver poucas informações disponíveis sobre a citogenética de Grylloidea, é possível evidenciar que o grupo apresenta variabilidade cariotípica, assim como comportamentos meióticos e polimorfismos cromossômicos interessantes (DAS, 1989; DAS e DAS, 1992). A análise cromossômica, constitui-se assim numa fonte de informação que contribui para a caracterização das espécies de grilos.

3. O gênero Anurogryllus As espécies de Anurogryllus apresentam comportamento subsocial, hábitos subterrâneos e noturnos (LIEBERMANN, 1955; ALEXANDER, 1961; WEST E ALEXANDER, 1963). Já foram apontadas nos Estados Unidos como pragas agrícolas (WEAVER E SOMMERS, 1968) atacando sementes e plântulas de pinheiros.

Ultimamente vem sendo indicadas como praga também na América do Sul, em informes agronômicos da Argentina (DEL PINO, 2000) e Brasil (SALVADORI, 1999; GASSEM, 2000) e em trabalhos como o de GASSEM (2002) que a chama de “praga subestimada”. Atacam principalmente plântulas de soja, milho, girassol, cortando as folhas e transportando-as para sua toca onde as armazenam (Fig.1). Os referidos informes apontam que as populações do “grilo subterrâneo” ou “grilo marrom”, como são popularmente conhecidos os Anurogryllus, têm aumentado nos últimos anos, indicando inclusive que o eficiente controle de ervas que se realiza atualmente não lhes deixa alternativa a não ser cortar o cultivo. Não há ainda estudos sistemáticos sobre inimigos naturais. Em 1987, FOWLER e MESA informaram que o taquinídio Euphasiopteryx depleta, que nos Estados Unidos estava sendo usado no controle de paquinhas, tinha sido encontrado também parasitando ninfas de Anurogryllus sp, e que tinha sido criado com sucesso após colocar as larvas sob o pronoto do grilo. Nós encontramos, em duas ocasiões, ninfas parasitadas por larvas (Fig. 2) provavelmente de vespas da tribu Larini (FOWLER, H. com. pess.) mas não foi possível obter o adulto do parasita em nenhuma ocasião. GASSEN (2002) menciona como possíveis agentes de controle biológico aranhas, lacraias, reduvídeos e carabídeos predadores, assim como fungos. A importância dos Anurogryllus como praga atualmente não é de grande destaque, mas o gênero apresenta características que o tornam uma praga em potencial, sobretudo a partir da diminuição dos habitats naturais. Segundo SAMWAYS e LOCKWOOD (1998) essas características são: conseguir utilizar áreas com distúrbios antrópicos, ter uma ampla distribuição geográfica, alta mobilidade e alimentação polífaga. O hábito subterrâneo de Anurogryllus, intimamente relacionado ao comportamento subsocial, constitui uma dificuldade para o controle, como apontado nos informes agronômicos citados. Os inseticidas não são eficientes, ainda que aplicados no período noturno para provocar o maior contato possível com o inseto. O uso de iscas tóxicas foi sugerido, mas não está sendo praticado por causa das dificuldades de implementação e da falta de pesquisas a respeito.

O hábito subterrâneo também faz os anurogrilos terem uma relação estreita com o solo. Não há na literatura estudos que apontem alguma preferência ou alguma restrição de solo para os Anurogryllus. Nossos registros de coleta mostram que nunca os encontramos em cerrados, mas nenhum teste experimental foi conduzido para verificar se o solo do cerrado impede ou prejudica o desenvolvimento dos indivíduos de alguma forma.

4. As seqüências de DNA mitocondrial e a análise filogenética Numa tentativa para encontrar maneiras de diferenciar as espécies e obter informações que permitissem buscar hipóteses de relacionamento filogenético, foi empreendida a tarefa de seqüenciar um fragmento do DNA mitocondrial das populações de Anurogryllus estudadas, assim como das espécies que usaríamos na análise como grupo externo.

5. Algumas considerações sobre o conceito de espécie Provavelmente não há nenhum outro conceito na biologia que tenha permanecido tão controverso como o conceito de espécie. Uma grande quantidade de definições de espécie pode ser encontrada na literatura. MAYDEN (1997, apud HEY, 2001) apresenta uma lista de suas dúzias de conceitos. Segundo MAYR (1982), grande parte da confusão neste assunto tem sido causada pela aplicação do termo “espécie” a duas categorias lógicas diferentes: a espécie como táxon e a espécie como categoria. O táxon é um objeto zoológico ou botânico concreto. Grupos de indivíduos como lobos, pássaros azuis ou moscas são táxons. A espécie como categoria é uma classe cujos membros são os táxons específicos. A definição particular da categoria de espécie que venha a adotar um autor determina os táxons a serem por ele indicados como espécies. O problema da espécie como categoria é simplesmente um problema de definição. A determinação do status de espécie é, por isso, segundo MAYR (1982) um procedimento de dois tempos. O primeiro consiste na delimitação do táxon específico presuntivo, e o segundo é a localização do táxon dado na categoria apropriada segundo a definição adotada, por exemplo população, subespécie, espécie.

HEY (2001) faz uma análise dos debates sobre o conceito de espécie e faz, também, uma distinção entre a espécie como táxon e a espécie como grupo evolutivo. Neste ponto, embora sua distinção parece compatível com a de MAYR (1982), HEY usa um vocabulário diferente e faz uma distinção mais clara. Nas nossas mentes, diz a autora, espécies são categorias. As categorias são motivadas por observações recorrentes do mundo. Os nomes de espécies e o uso desses nomes têm um papel completamente convencional e sintático, como todas as outras categorias. Categorias são coisas na nossa mente e na nossa linguagem, que são usadas para organizar nosso pensamento e nossa linguagem a respeito da diversidade de organismos. Mas, “espécies são categorias” é só o ponto de partida. O que faz com que uma dada espécie seja um táxon? Uma resposta pode ser: uma simples observação de um grupo de organismos que parecem similares entre si e diferentes de outros. Mas essa simples observação varia muito, dependendo do observador. Uma espécie é, então, uma categoria que é o resultado de dois processos: 1) o processo evolutivo que causa a diversidade biológica; e 2) o aparato mental humano que reconhece e dá nomes a padrões recorrentes. É importante ressaltar que, neste ponto HEY (2001) está chamando a atenção para o papel do observador como sujeito que, com suas características individuais, influencia no processo e no resultado da sua pesquisa. Mas as espécies podem também ser entendidas, diz HEY, como grupos evolutivos. Essa idéia teórica envolvendo grupos é proveniente dos ensinamentos de Darwin e marca uma divergência drástica em relação às idéias puramente categóricas sobre espécies. Estes dois significados se referem a coisas que são fundamentalmente e ontologicamente diferentes. Os grupos evolutivos existem independentemente de que sejamos ou não capazes de reconhecê-los, e eles podem ou não ser diferentes entre si. A tarefa do biólogo evolutivo é encontrar a maneira de fazer o táxon ser o mesmo que o grupo evolutivo, o que seria a correspondência ideal. É preciso lembrar as razões pelas quais esses dois tipos de coisas têm pouca correspondência uma com a outra: 1) Os padrões que observamos são uma função da nossa capacidade de percepção e julgamento. Quando delimitamos um táxon não somos objetivos.

2) Grupos evolutivos reais não precisam ser distintos e podem superpor-se, aninhar- se juntos, enquanto categorias são criadas como uma função direta da percepção de diferenças. 3) Os processos evolutivos que causaram os padrões que reconhecemos, e que usamos para os táxons, são processos que atuaram durante muito tempo. Com o passar do tempo, a onda de frente dos processos evolutivos deixa atrás fortes padrões de similaridade e diferença entre organismos. São esses padrões que usamos para os táxons, mas o lugar onde se encontram os grupos evolutivos é na onda de frente. Eles são causados por processos evolutivos que estão acontecendo neste momento. Os padrões que nós reconhecemos são remanescentes dos primeiros grupos evolutivos que podem ter se transformado e dividido longo tempo atrás. HEY (2001) sugere que seria uma abordagem apropriada usar os táxons como hipóteses iniciais para grupos evolutivos, concordando com MAYR (1982) em que a determinação do status de espécie é um procedimento de dois tempos.

Este trabalho se propôs: -realizar a caracterização morfológica, bioacústica, cromossômica e molecular de populações do gênero Anurogryllus; -a partir dessas informações, agrupar as populações em espécies, de modo a poder identificá-las ou descrevê-las; -caracterizar em detalhe a espécie Urogryllus toledopizai, empregando características morfológicas, cromossômicas e bioacústicas, já que Urogryllus é gênero irmão de Anurogryllus; -obter hipóteses de relacionamento filogenético entre as espécies de Anurogryllus, usando como grupos externos Urogryllus toledopizai, Paranurogryllus capricornio e Brachytrupes portentosus, consideradas como estreitamente relacionadas pela taxonomia tradicional.

IV-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1. Situação Taxonômica de Anurogryllus, Urogryllus, Paranurogryllus e Brachytrupes

O gênero Anurogryllus apresenta doze espécies nominais descritas (OTTE, 2003), uma delas com duas subespécies (Tabela 1 do Artigo 2, pág. 39). Como pode ser apreciado na referida Tabela, a maioria das descrições data do século XIX, e só três das espécies foram descritas na segunda metade do século XX. A situação taxonômica do gênero é revisada no Artigo 2, no qual se descrevem seis espécies novas. No citado artigo é apresentada uma chave para identificação de dez espécies de Anurogryllus, baseada em características morfológicas e acústicas assim como retiram-se da lista de espécies de Anurogryllus as espécies A. cubensis, A. forcipatus e A. fulvaster, que fazem parte do catálogo de OTTE et al (2003) porque, com base nas descrições originais dessas espécies, é possível verificar que não pertencem ao gênero Anurogryllus. O gênero Urogryllus, descrito por RANDEL (1964), possui quatro espécies conhecidas, como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1- Relação das espécies conhecidas de Urogryllus Randell, 1964. ESPÉCIE AUTOR, ANO PROCEDÊNCIA REFERÊNCIA U. fulvaster (Chopard, 1956) Bolivia: Lower Madidi River OTTE et al, 2003 U. rufipes (Redtembacher, 1892) Caribbean: St. Vincent Island OTTE et al, 2003 U. toledopizai Mello, 1988 Piracicaba, SP, Brasil MELLO, 1988 U. toltecus (Saussure, 1874) México OTTE et al, 2003

Neste trabalho é analisada a espécie Urogryllus toledopizai do ponto de vista morfológico, citogenético e bioacústico, a partir da descrição de MELLO (1988). As genitálias masculinas das espécies de Anurogryllus e de Urogryllus não se diferenciam morfologicamente (GARCÍA-NOVO, 2002) o que representa uma forte indicação da estreita proximidade filogenética entre as espécies desses dois gêneros. Paranurogryllus foi descrito por MESA e GARCÍA (1999) com duas espécies, P. capricórnio e P. boraceia, procedentes da Fazenda Capricórnio, Ubatuba, SP e da Estação Biológica de Boracéia, Salesópolis, SP, respectivamente. O gênero foi colocado taxonomicamente na subfamília Brachytrupinae com base em características morfológicas da genitália masculina, e por apresentar semelhanças com Anurogryllus (construção de tocas, ovipositor reduzido, subsocialidade). Brachytrupes portentosus (Lichtenstein, 1796), conhecido como “grilo gigante do Taiwan” pertence, segundo a taxonomia tradicional, à subfamília, Brachytrupinae, e à tribu Gimnogryllini, como Anurogryllus , Urogryllus e Paranurogryllus.

2. Morfologia, Bioacústica e Citogenética No que diz respeito ao gênero Anurogryllus, há disponíveis na literatura algumas informações morfológicas, bioacústicas e biológicas das espécies A. arboreus, A. celerinictus e A. muticus (WEST E ALEXANDER, 1963; WEAVER e SOMMERS, 1968; WALKER, 1973, WALKER, 1979; PAUL e WALKER, 1979; WALKER e WHITESELL, 1982; LEE e LOHER, 1995). Informações morfológicas, bioacústicas e biológicas relativas a seis espécies novas de Anurogryllus são apresentadas no Artigo 2, e informações citogenéticas no Artigo 3.

As espécies de Anurogrylus são muito parecidas morfologicamente, inclusive a genitália masculina, estrutura que é freqüentemente útil para diferenciar espécies de grilos, não apresenta diferenças específicas significativas. As descrições mais antigas, que constituem a maioria (Tabela 1 do Artigo 2), se tornam imprecisas na hora de comparar as espécies. Essas descrições não apresentam informações sobre as emissões acústicas, que tem sido importantes para estabelecer comparações, assim como as características qualitativas e quantitativas da pars stridens. Assim, a maioria das informações morfológicas e bioacústicas, tanto as disponíveis na literatura como as novas, sobre Anurogryllus, se encontram no Artigo 2. Algumas informações morfológicas sobre Urogryllus toledopizai aparecem em MELLO (1988). Em GARCIA-NOVO (2002) encontram-se dados morfológicos que enriquecem os apresentados por MELLO (1988) além de bioacústicos e citogenéticos. As duas espécies conhecidas de Paranurogryllus são caracterizadas morfológica e citogeneticamente em MESA e GARCÍA (1999). Ambas são ápteras e, em conseqüência, não estridulam. YANG (1995) descreve aspectos da morfologia e da emissão sonora de Brachytrupes portentosus, embora não apresente desenho da estrutura genital masculina dissecada, onde apareceriam caracteres importantes para avaliar suas relações com as outras espécies estudadas neste trabalho. Para sanar essa dificuldade a genitália de um exemplar foi dissecada e desenhada.

3. Análise Filogenética São muito escassas ainda as informações sobre relações filogenéticas em grupos de Orthoptera em geral e especialmente os trabalhos com espécies Neotropicais. No caso da fauna da América do Sul se conjugam e se retroalimentam duas dificuldades: a falta de sistematas e o enorme desconhecimento da diversidade. Grande parte dos trabalhos em que se realizam análises filogenéticas a partir de caracteres morfológicos em Orthoptera se refere a relações entre grandes grupos (DESUTTER, 1987; GWYNNE, 1995; DESUTTER-GRANDCOLAS,1995; DESUTTER-

GRANDCOLAS,1997;DESUTTER-GRANDCOLAS,1998; DESUTTER-GRANDCOLAS e ROBILLARD, 2003; ELZINGA, 1996). No que diz respeito ao emprego de dados moleculares, a maioria dos trabalhos se ocupa também de relações entre grandes grupos. FLOOK e ROWELL (1997a) testaram o valor de seqüências de RNA ribossômico mitocondrial para analisar as relações entre as diferentes famílias na ordem Orthoptera. A filogenia da subordem Caelifera foi estudada a partir de seqüências dos genes mitocondriais do RNA ribossômico por FLOOK e ROWELL (1997b). Em 1998, FLOOK e ROWELL estudaram as relações filogenéticas entre representantes dos grupos chamados ortopteróides, com base em seqüências de DNA ribossômico nuclear. MAEKAWA et al (1999) também analisaram as relações entre os insetos ortopteróides, baseados em seqüências do gene mitocondrial COII (Citocromo Oxidase II). Mais escassos ainda são os estudos realizados entre espécies de um gênero ou gêneros próximos. HARRISON e BOGDANOWICZ (1995) partem da obtenção de uma filogenia baseada em dados de sítios de restrição do DNA mitocondrial para fazer inferências sobre a evolução dos diferentes ciclos de vida, emissões sonoras e preferências de habitats exibidas por dez espécies do gênero Gryllus da América do Norte. SHAW (1996) estudou espécies do gênero Laupala do Hawai a partir do DNA ribossômico mitocondrial. WALTON e BUTLIN (1997) analisaram as relações filogenéticas entre espécies de gafanhotos do gênero Chitaura da Indonésia, com base em seqüências do gene mitocondrial COI (Citocromo Oxidase I). Nestes dois últimos casos, trata-se de espécies que habitam em ilhas e os autores realizaram considerações biogeográficas sobre especiação. WILLET et al (1997) trabalharam com duas espécies do gênero Gryllus da América do Norte, abordando um estudo populacional numa região de hibridização, seqüenciando os genes mitocondriais COI e COII. Não há na literatura, trabalhos que analisem grupos de ortópteros a partir de conjuntos de dados de várias origens (moleculares, morfológicos, bioacústicos, etc), usando a abordagem de evidência total, ou seja, a análise de todos os conjuntos de dados simultaneamente.

V-REFERÊNCIAS

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Espiritualidade é aquilo que produz uma transformação em nosso interior. Mas essa transformação não começa e termina no interior de cada ser. A partir do interior, ela desencadeia uma rede de transformações na comunidade, na sociedade, nas relações com a natureza e com o universo inteiro. Leonardo Boff

O conhecimento do conhecimento, que comporta a integração do conhecedor em seu conhecimento, deve ser, para a educação, um princípio e uma necessidade permanentes. Edgar Morin

Artigo 1

VI-Artigo 1

Genitalia, Acoustics and Chromosomes of Urogryllus toledopizai (Orthoptera: Gryllidae)

PAULA GARCÍA-NOVO

Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista,

13506 900, Rio Claro, São Paulo, Brasil.

Artigo publicado em Transactions of the America Entomological Society, v.128, n.1, p.31-42, 2002. 24

Abstract Morphological structures of male and female genitalia and the pars stridens of a population of Urogryllus toledopizai Mello (1988) as well as the karyotype of the species are illustrated. The characteristics of the song signals and associated behavior are described and information on the sazonality of the species is provided. Disagreements with the results published by other authors are discussed. Keywords: male genitalia, calling song, courtship, karyotype, Gryllidae. 25

Introduction The genus Urogryllus was erected by Randell (1964) who included in it the following five species: U. toltecus (Saussure, 1874), U. rufipes (Redtenbacher, 1892), U. forcipatus (Saussure, 1897), U. cubensis (Rehn, 1937) and U. fulvaster (Chopard, 1956); and in 1988 Mello described the new species U. toledopizai from specimens collected in Piracicaba (SP), Brazil. According Otte & Naskrecky (1997), Urogryllus includes at present four Neotropical species: U. toltecus, U. rufipes, U. fulvaster and U. toledopizai, beeng transfered U. forcipatus and U. cubensis to Anurogryllus.

Specimens examined Twelve males and seven females of Urogryllus toledopizai were collected in the Campus of the Paulista State University (UNESP) in Rio Claro, São Paulo State, Brazil (22o23’43”S – 47o32’39”W) and deposited in the collection of the Departamento de Biologia of that University.

Methods The drawings of the male and female genital structures were made under stereoscopic microscope after previous diluted KOH treatment in order to remove the soft tissues. For the pars stridens analysis the right tegmen of specimens, already kept in 75% alcohol, were removed and glued to stubs, sprayed with gold and observed under SEM. Songs were recorded both in the laboratory and in the field, with NAGRA E or DAT Sony TCD-D8 recorder, using a Seinnheiser ME80 microphone. The analysis was done either with UNISCAN II or with the Avisoft Light program. Mitotic and meiotic chromosomes were obtained from nymph testes without colchicina pretreatment.

Results Morphology The external morphology of the species was described by Mello (1988). In Fig. 1 photographs of adult male and female are shown. In Table I presents measurements of several adult males. Male and female genitalia- the phallic structure of the species as well as the female copulatory papillae of three specimens are shown in Fig. 2. Pars stridens- In Fig. 3 the pars stridens and an adjacent hair sensilla plate are shown and the teeth of the center and extremes of the file are shown in detail. Means and standard deviations of the teeth number, of the length of the stridulum and the density of teeth are presented in Table I.

Acoustic Behavior Calling song- The calling song of U. toledopizai (Fig. 4) is formed by sequences of syllable (pulse) grouped in trills. The length of the trills as well as the gaps between them are extremely variable within and between specimens. The range of the trills length was between 2.0 and 10.0 seconds and the gaps between trills 1.1 and 12.0 seconds. The syllable lengths and the gaps between them were, however, very uniform (Table 2). The syllables that form the trills are not uniform. The intensity of syllables increases for the first several syllables of a syllable sequence and remains constant thereafter, while the syllable repetition rate is uniform throughout (Fig. 4A and 4B). The majority of males observed in the field stridulated on tree trunks or in the foliage (Fig. 5A) and some few of them on the soil. Courtship song and mating- The courtship song and the mating behavior were only observed once. At the beginning of the contact the male producing the song takes a position in front of the female. After a mutual antennal contact, the male started to produce courtship stridulation. This song consists of trills composed of two kinds of syllables (Fig. 4C). The first type, made with the tegmina nearly horizontal, are of lower intensity and produced at a slower, irregular rate. The second type, made with the tegmina nearly vertical, are much more intense and produced at a faster, more uniform rate. 27

To copulate, the female climbs on the male dorsum and after coupling rotats the body into an end to end position (Fig. 5B). The time of copulae was not noted.

Cytogenetics Four males were analyzed -all of them with 2n=21,X0 with all the autosomes acrocentric and with graded differences in length (Fig. 6A). The X chromosome is metacentric and the largest of the set. In Fig. 6B a spermatogonial anaphase is shown with 21 chromosomes, including the Xs going to opposite poles and in Fig. 6C a first metaphase with 10 bivalents and the univalent X. The meiosis stages confirmed an X0:XX sex determining mechanism.

Habits and sazonability The species has subterranean habits and remains hidden inside borrows during the day. A female was observed laying eggs with the ovipositor buried in the substrate, and this behavior probably means that the female does not take care of them. The population observed showed an univoltine life cycle and the adults appear during spring.

Discussion Randell (1964) described the phallic structure of the genus Urogryllus giving special attention to the differences that could be detected in relation to Anurogryllus. The species studied in his paper were U. fulvaster and U. cubensis. García-Novo (2000) shows that the characteristics that Randell considered as diagnostic between these genera are not observed in the four species of Anurogryllus that she studied. The phallic structures therefore do not differentiate the genera since no significative differences were detected between them. The phallic sclerites of other species of the genus Urogryllus (Chopard, 1956; Randell,1964; Mello, 1988) looks very similar to those of U. toledopizai, but none of the cited papers present details of dissected structures and the drawings are very simplified. 28

The copulatory papillae of U. toledopizai show a certain degree of intraspecific variation and remarkably similar with those observed in species of the genus Anurogryllus (García-Novo, 2000). The presence of a well-developed ovipositor in Urogryllus, in contrast with the rudimentary one of the Anurogryllus species, is however an excellent diagnostic character. The number of teeth reported in the present paper is in agreement with that found by Mello (1988). The teeth morphology is constant along the length of the file of Urogryllus in contrast with that observed in species of Anurogryllus (García-Novo, 2000) where three different forms of teeth are present along the pars stridens. There is no information about the stridulum in the remaining species of the genus Urogryllus In this paper, the complete song repertory of U. toledopizai is not described, instead the description focuses on to the calling song which provides the best species-specific information. The temporal pattern that carries the specific information is the syllable repetition rate since it remain unchanged in many recorded specimens. The trill range and the intervals between them were variable even within a single specimen. The courtship song seema to be more complex than the courtship song of Anurogryllus because it is formed by two different syllabic sequences. There is no information about the song characteristics of the other species of the genus Urogryllus. The karyotype of U. toledopizai is the only one reported in the genus. The subterranean habits of the species were observed, including a female inserting the eggs in the soil as expected from species with well developed ovipositor. U. forcipatus was described based only on male specimens, the female remaining unknown. Saussure (1897) states that the taxonomic position was in doubt and in case the female has rudimentary ovipositor, the species should be removed to Anurogryllus. Rehn’s (1937) description of U. cubensis states that the females of this species show a normal well developed ovipositor and, in consequence, Otte and Nasckrecky (1997) transference to the genus Anurogryllus seems to be unjustifiable. Some characteristics considered remarkable for Brachytrupinae species by Alexander and Otte (1967), as the presence of a rudimentary ovipositor and the tendency to take care of the offspring are not present in U. toledopizai. 29

Acknowledgements The author is indebted to Dr. T. J. Walker and Dr. A. Mesa for the critical evaluation of the manuscript, to Dr. E. Zefa who collaborated to collect the specimens and to Dr. E. Kitajima who allowed to use the SEM in the ESALQ, USP. I also aknowledge CNPq for the financial support.

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Table 1. Measurements of several male body variables in U. toledopizai.

Variavels n Mean Range Standard desviation PL 12 3.3 3.0-3.8 0.20 PW 12 4.2 4.0-4.5 0.14 TL 11 9.0 8.5-10.0 0.42 FIII 12 11.2 10.5-11.7 0.37 TIII 12 7.3 6.7-8.2 0.41 NTPS 4 105.5 97-114 8.73 LPS 4 2.6 2.4-2.8 0.25 NT/mm 4 40.07 39.18-41.30 0.89 PL-pronotum length; PW-pronotum width; TL- tegmen length; FIII-hind femur lenght; TIII-hind tibiae length; NTPS- number of teeth in the pars stridens; LPS- pars srtidens length; NT/mm-teeth number by mm.

Table 2. Measurements of several variables from the song of U. toledopizai.

Variavels n Mean Range Standard desviation FREQ 12 4.9 4.7-5.3 0.20 SR 12 44.2 43-47 0.96 SD 12 0.016 0.012-0.017 0.0014 GD 12 0.0009 0.007-0.012 0.0016 FREQ=frequence in kHz; SR=syllable rate; SD=syllable duration in seconds; GD=gap between syllables duration in seconds.

Figura 1- U. toledopizai A. Male. B. Female. Enlargement bar=1cm.

Figura 2- U. toledopizai male and female genitalia. A, B and C. Phallic structure in dorsal, ventral and lateral views respectively. D, E and F. Female copulatory papillae of three specimens in rear view. G. Idem in lateral view from specimen F. Enlargement bar=1mm.

Figura 3- U. toledopizai pars stridens A. Whole structure. B. Hair sensilla plate. C, D and E. Teeth of both file extremes and from the central region. F. Teeth of the central region in detail.

Figure 4- U. toledopizai song signals. A. Calling song showing two kind of syllables. B. Calling song showing in detail syllables of the group A and the transition towards the group B. C. Courtship song with a group A of syllables of a greater length than that on the calling song.

Figure 5- U. toledopizai behavior. A. Male calling in a trunk tree. B. Mating observed in the laboratory.

Figure 6- U. toledopizai chromosomes. A. Male karyotype with 2n=21,X0. B. Spermatogonial metaphase. C. First metaphase.

Há dentro de nós uma chama sagrada coberta pelas cinzas do consumismo, da busca de bens materiais, de uma vida distraída das coisas essenciais. É preciso remover tais cinzas e despertar a chama sagrada. Então irradiaremos. Seremos como um sol. Leonardo Boff

Mais vale uma cabeça bem-feita que bem cheia. Montaigne

Artigo 2

VII-Artigo 2

Seis Novas Espécies do Gênero Anurogryllus (De Geer) (Orthoptera, Gryllidae): Morfologia, Bioacústica e Biologia.

PAULA GARCÍA-NOVO

Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 13506 900, Rio Claro, São Paulo, Brasil.

Palavras chave: grilo, taxonomia, som de chamado, biologia

Introdução O gênero Anurogryllus inclui, segundo OTTE (2003), onze espécies válidas (Tabela 1). A partir das descrições originais, elaborou-se neste trabalho uma lista que inclui algumas diferenças em relação à lista de OTTE (2003), como mostrado também na Tabela 1.

Tabela 1- Espécies de Anurogryllus Saussure, 1877.

OTTE (2003) Este trabalho AUTOR, ANO LOCALIDADE REFERÊNCIA A. abortivus A. abortivus (Saussure, 1874) Cuba SAUSSURE, 1874 A. antillarum A. antillarum (Saussure, 1874) Cuba SAUSSURE, 1874 A. arboreus A. arboreus Walker, 1973 USA, Florida, Gainesville WALKER, 1973 A. brevicaudatus A. brevicaudatus Saussure, 1877 Brasil, Bahia SAUSSURE,1877 A. celerinictus A. celerinictus Walker, 1973 Jamaica, Westmoreland Parish WALKER, 1973 A. cubensis ------Rehn, 1937 Cuba REHN, 1937 A. forcipatus ------(Saussure, 1897) México SAUSSURE, 1897 A. fulvaster ------Chopard, 1956 Bolivia CHOPARD, 1956 A. fuscus A. fuscus n.d. Caudell, 1913 Peru, Pampaconas River CAUDELL, 1913 A. muticus muticus A. muticus muticus (De Geer, 1773) Suriname OTTE, 2003 A. m. caraibeus A. m. caraibeus (Saussure, 1874) St. Thomas OTTE, 2003 A. typhlos A. typhlos Otte e Peck, 1998 Ilhas Galápagos OTTE E PECK, 1998 A. australis n.d. ------Saussure, 1877 Australia OTTE, 2003

Três espécies, A. cubensis, A. forcipatus e A. fulvaster, foram retiradas da lista de OTTE (2003) pelas seguintes razões: 1) Na descrição original de Gryllita cubensis, REHN (1937) diz: “…ovipositor valves strongly produced, more elongate than in G. tolteca or arizonae, in length nearly one and one-half times that of the caudal tibiae, slender, straight…”. A presença de ovipositor bem desenvolvido exclui esta espécie do gênero Anurogryllus. 2) Anurogryllus fulvaster foi descrito por CHOPARD (1956) como Acheta fulvastra e o autor declara que a fêmea apresenta ovipositor de 8.5mm de comprimento, o que impede a colocação desta espécie no gênero Anurogryllus. 3)Urogryllus forcipatus foi descrito por SAUSSURE (1897) com base só em espécimes machos e como pertencendo ao gênero Gryllodes. SAUSSURE (1897) afirma que a posição taxonômica é duvidosa e que, caso a fêmea apresentasse ovipositor rudimentar, a espécie devia ser removida para Anurogryllus. Até o presente momento,

não há informações sobre as fêmeas desta espécie, portanto, ela deve permanecer no gênero Urogryllus onde foi colocada por RANDELL (1964) com base na genitália masculina. As espécies de Anurogryllus mencionadas na literatura como tendo sido coletadas na América do Sul são: A. brevicaudatus do Brazil (Bahia), A. fuscus do Peru, A. muticus que também ocorre na América do Norte e A. typhlos das lhas Galápagos. A. brevicaudatus Saussure, 1877 foi descrito a partir de fêmeas ápteras, sendo os machos desconhecidos. Nenhuma das outras espécies conhecidas de Anurogryllus têm fêmeas ápteras. Há um gênero próximo a Anurogryllus, Paranurogryllus Mesa e García 1999, cujas espécies são ápteras, mas não apresentam tímpano enquanto que a espécie descrita por Saussure possui esse órgão auditivo. A. fuscus Caudell, 1913 foi descrita com base num casal coletado na Bolívia, mas os caracteres mencionados na descrição poderiam ser aplicados a várias outras espécies de Anurogryllus. CAUDELL (1913) designou a fêmea como o holótipo, sendo que as fêmeas são muito pobres em caracteres específicos. Portanto, A. fuscus será aqui considerada como nomem dubium. A. muticus foi estudada por WALKER (1973) e incluída na sua chave de identificação. As menções desta espécie em localidades da América do Sul são anteriores a esse trabalho e WALKER sugere que o grilo estudado por LIEBERMANN (1955) na Argentina e considerado A. muticus pode ou não pertencer realmente a essa espécie. Por último, A. typhlos apresenta vários caracteres diagnósticos morfológicos, como a redução dos olhos pela diminuição no número de ommatídios, seu tamanho excepcionalmente pequeno e suas pernas excepcionalmente longas (Tabela 6) que tornam a espécie fácil de reconhecer, embora é provável que só ocorra em Galápagos. Não há em OTTE e PECK (1998) informações sobre a pars stridens nem sobre o som de chamado. Para caracterizar as espécies incluídas no presente trabalho foi necessário o uso de uma abordagem baseada em características morfológicas, acústicas e biológicas.

Materiais e métodos Os desenhos da estrutura genital masculina foram feitos sob microscópio estereoscópico, depois de um tratamento com KOH diluído em água para remover os tecidos moles. Para a análise da pars stridens o tegmen direito do espécimen foi removido e montado entre lâmina e lamínula e observado ao microscópio. As gravações do som foram realizadas no laboratório e no campo, com gravador NAGRA E ou DAT Sony TCD-D8, usando um microfone Seinnheiser ME80. A análise foi realizada com o programa Avisoft Light.

Anurogryllus sp1 n. sp. (Fig. 1A, 2A, 3A)

Holótipo- Espécimen macho, identificado como 96-52. Parátipos-Brasil, SP, Município de Ubatuba, Fazenda Capricórnio, 23o23’31”S – 45o04’31”W, coletores P. García-Novo e A. Mesa. 04-10-96: dois ♂♂, 25-08-96: dois ♂♂ e dois ♀♀; 17-12-96: três ♀♀ e um ♂; 19-12-96: um ♀; 06-10-96: um ♂ e uma ♀. Brasil, SP, Município de Ubatuba, 23o34’11”S – 45o17’41”W, mesmos coletores. 24-08-96: um ♂ e três ♀♀; 22-09-96: um ♀. Brasil, SC, 26o24’10”S-49O20’20”W, 02-01-98: 1 um ♂; 18-02-03: dois ♂ e 4 ♀, mesmos coletores. Holótipo depositado no Museu de Zoologia de São Paulo, parátipos na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, SP. Diagnose- Tamanho menor entre as espécies estudadas aqui, coloração do corpo marrom (Fig. 1A). Padrão de coloração da região superior da cabeça com listras claras sobre fundo escuro e do pronoto em vista dorsal com duas manchas póstero-laterais tênues (Fig. 2A). Tégmina cobrindo entre metade e 2/3 do abdome nos machos e nas fêmeas. Estridulação de chamado descontinua e de menor intensidade do que as outras espécies, com taxa de emissão de sílabas de 90/segundo em média a 24-26o C. Pars stridens com 49-60 dentes. Descrição-Medidas de várias partes do corpo são apresentadas na Tabela 6 e da pars stridens na Tabela 7. Som de chamado- Estridulação descontínua e de intensidade menor comparada com as outras espécies conhecidas (Fig. 3A). Não exibe o comportamento de construir uma depressão no solo para amplificar o som emitido, em algumas ocasiones foram

observados indivíduos estridulando em locais de até 1,5m de altura. Medidas dos parâmetros físicos do som e algumas características comportamentais associadas se encontram na Tabela 8. Distribuição- Foram coletados espécimes desta espécie nas seguintes localidades: Fazenda Capricórnio (SP), Praia do Lázaro (SP), Picinguaba (SP), Caraguatatuba (SP), Corupa (SC) (Fig. 5).

Anurogryllus sp2 n. sp. (Fig. 1B, 2B, 3B)

Holótipo- Espécimen macho, identificado como 96-62. Parátipos- Brazil, SP, Município de Rio Claro, Campus Unesp, 22o23’43”S – 47o32’39”W, coletores P. García-Novo e A. Mesa. 8-9-94: um ♂; 28-9-94: um ♂; 12-10-96: quatro ♂♂; 14-10-96: um ♂; 19-10-96: dois ♂♂ e um ♀; 28-10-96: cinco ♂♂ e um ♀. Brasil, SP, Município de Rio Claro, Horto Florestal Navarro de Andrade, 22o25’06”S – 47o31’33”W, coletores P. García-Novo e A. Mesa. 13-9-96: um ♀; 18-9-96: um ♂; 13-9-97: um ♀. Ninfas:. 10-05-97: dois ♂; 24-05-97: um ♂; 28-07-97: três ♂; 22-06-97: três ♂; 19-04-98: um ♀; 24-04- 98: dois ♂; 22-06-98: quatro ♂. Município de Salesópolis, Estação Biológica de Boracéia, 23o40’05”S-45o53’57”W, 6-11-92: um ♂ e uma ♀; 23-08-96: uma ♀; 22-07-98: 3 ♂ e 5 ♀; mesmos coletores. Município de Águas de Lindóia (SP), 22o28’00”S-46O37’00”W, 12-09-98: 5 ♂ e 1 ♀; mesmos coletores. Holótipo depositado no Museu de Zoologia de São Paulo, parátipos na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, SP. Diagnose- Tamanho maior entre as espécies estudadas aqui, coloração geral de tonalidade terracota escuro (Fig. 1B). O padrão de coloração da parte superior da cabeça uniformemente muito escuro e da região dorsal do pronoto, também, quase completamente uniforme e escuro (Fig. 2B). Tégmina cobrindo quase totalmente o abdome nos machos e fêmeas. Estridulação de chamado continua e intensa, com taxa de emissão de sílabas de 123/segundo em média a 24-26o C. Pars stridens com 47- 53dentes.

Descrição- Medidas de várias partes do corpo são apresentadas na Tabela 6 e da pars stridens na Tabela 7. Som de chamado- Estridulação contínua e intensa (Fig. 3B). Apresenta comportamento de construção de uma pequena depressão no solo para estridular. Medidas dos parâmetros físicos do som e algumas características comportamentais associadas se encontram na Tabela 8. Distribuição- Foram coletados espécimes desta espécie nas seguintes localidades: Rio Claro (SP); Estação Biológica de Boraceia (SP); Águas de Lindóia (SP) (Fig. 5).

Anurogryllus sp3 n. sp. (Fig. 1C, 2C, 3C, 6)

Holótipo- Espécimen macho, identificado como 96-61. Parátipos- Brasil, SP, Município de Rio Claro, Campus Unesp, 22o23’43”S – 47o32’39”W, coletores P. García-Novo e A. Mesa. 4-5-94: sete ♀♀ e três ♂♂; 9-94: dois ♀♀, 8-9-94: um ♀; 28-9-94: um ♂; 2-10-94: um ♂; 15-10-94: dois ♂♂; 14-5-96: dois ♂♂; 16-5-96: um ♀; 19-5-96: três ♂♂ e um ♀; 1-6-96: um ♂; 7-6-96: um ♂; 13-10-96: dois ♂♂; 18-10-96: um ♂; 20-10-96: um ♂; 25-10-96: um ♂; 28-10-96: dois ♂; 30-11-96: dois ♀♀; 1-12-96: um ♂; 13- 12-96: um ♀; 14-1-97: um ♂; 10-03-97: um ♂; 14-3-97: quatro ♀♀; 16-3-97: quatro ♂♂ e um ♀; 18-3-97: dois ♀♀; 22-3-97: quatro ♂♂; 15-5-98: um ♂; mesmos coletores. Brasil, SP, Município de Rio Claro, Sítio Christofoletti, 22o17’15”S-47o34’43”W, mesmos coletores. 5-96: uma ninfa ♂ e uma ninfa ♀; 27-5-96: um ♂ e três ♀; 28-5-96: quatro ♂. Município de Águas de Lindóia, (SP), ), 22o28’00”S-46O37’00”W: 12-09-98: dois ♂ e uma ♀, mesmos coletores..Estância Santa Clara, (PR),51O58’00”S-25O40’00”W: 27-03-97: 4 ♂, mesmos coletores. Holótipo depositado no Museu de Zoologia de São Paulo, parátipos na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, SP. Diagnose- Tamanho médio entre as espécies estudadas aqui, coloração do corpo marrom amarelada (Fig. 1C). Padrão de cor na parte superior da cabeça com listras claras sobre um fundo também claro e na região dorsal do pronoto duas manchas póstero-laterais grandes e estendidas para os lobos laterais do pronoto (Fig. 2C). Tégmina cobrindo quase totalmente o abdome nos machos e fêmeas. Estridulação de chamado continua e intensa, com taxa de emissão de sílabas de 158/segundo em média a 24-26o C. É a estridulação mais aguda e a emissão de sílabas mais rápida entre as

espécies do gênero, sendo que só A. celerinictus alcança valores próximos e dela se diferencia pelo tamanho. Pars stridens com 41-47dentes. Descrição-Medidas de várias partes do corpo são apresentadas na Tabela 6 e da pars stridens na Tabela 7. Som de chamado- Estridulação contínua e intensa (Fig. 3C). Comportamento de construção de depressão no solo para produzir o som presente. Medidas dos parâmetros físicos do som e algumas características comportamentais associadas se encontram na Tabela 8. Distribuição- Foram coletados espécimes desta espécie nas seguintes localidades: Rio Claro (SP); Sitio Christofoletti (SP); Águas de Lindóia (SP); Estância Santa Clara (PR) (Fig. 5).

Anurogryllus sp4 n. sp. (Fig. 1D, 2D, 3D)

Holótipo- Espécimen macho, identificado como 98-49. Parátipos- Brasil (SP), Parque Estadual da Serra do Mar, Núcleo Santa Virgínia, 23O22’00”S-45O53’57”W. Coletores P. García-Novo e Alejo Mesa. 28-08-96: um ♂ e dois ♀; 7-10-96: 11 ♀; 2-10-96: um ♂; 9-11-96: um ♂; 18-12-96: um ♂ e uma ♀; 19-12-96: duas ♀; 20- 11-98: três ♂ e uma ♀. Holótipo depositado no Museu de Zoologia de São Paulo, parátipos na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, SP. Diagnose- Tamanho médio entre as espécies estudadas aqui, coloração do corpo marrom (Fig. 1D). O padrão de coloração da parte superior da cabeça sem listras claras bem definidas (Fig. 2D). Tégmina cobrindo quase completamente o abdome nos machos e fêmeas. Estridulação de chamado continua e intensa, com taxa de emissão de sílabas de 122/segundo em média a 24-26o C. Pars stridens com 40-45 dentes. Descrição-Medidas de várias partes do corpo são apresentadas na Tabela 6 e da pars stridens na Tabela 7. Som de chamado- Estridulação contínua e intensa (Fig. 3D). Apresenta comportamento de construção de depressão próxima à entrada da toca para produção do som de chamado. Medidas dos parâmetros físicos do som e algumas características comportamentais associadas se encontram na Tabela 8.

Distribuição- Foram coletados espécimes desta espécie no Núcleo Santa Virgínia do “Parque Estadual da Serra do Mar” (SP) (Fig. 5).

Anurogryllus sp5 n. sp. (Fig.1E, 2E, 3E)

Holótipo- Espécimen macho, identificado como 98-62. Parátipos- URUGUAI, Montevidéu, 05-01-98: 5 ♂, coletores Paula García-Novo, Alejo Mesa. Holótipo depositado no Museu de Zoologia de São Paulo, parátipos na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, SP. Diagnose- Tamanho médio entre as espécies estudadas aqui, coloração do corpo amarelada, é a espécie mais clara entre as descritas (Fig. 1E). Padrão de coloração da parte superior da cabeça com listras quase brancas e da região dorsal do pronoto com uma região central escura e as regiões laterais muito claras (Fig. 2E). Tegmina cobrindo quase completamente o abdome nos machos e fêmeas. Estridulação de chamado continua e intensa, com taxa de emissão de sílabas de 111/segundo em média a 24-26o C. Pars stridens com 48-50 dentes. Descrição-Medidas de várias partes do corpo são apresentadas na Tabela 6 e da pars stridens na Tabela 7. Som de chamado- Estridulação contínua e intensa (Fig. 3E). Medidas dos parâmetros físicos do som e algumas características comportamentais associadas se encontram na Tabela 8. Distribuição- Foram coletados espécimes desta espécie em ambiente urbano na cidade de Montevidéu (Fig. 5).

Anurogryllus sp6 n. sp. (Fig.1F, 2F, 3F)

Holótipo- Espécimen fêmea, identificado como 98-24. Parátipos-Brasil (SP), Município de Salesópolis, Estação Biológica de Boracéia, 23o40’05”S-45o53’57”W: 30-09-96: uma ♀; 27-08-98:3 ♀ e um ♂. Coletores P. García-Novo e Alejo Mesa. Holótipo depositado no Museu de Zoologia de São Paulo, parátipos na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, SP.

Diagnose- Tamanho pequeno entre as espécies estudadas, coloração do corpo escura quase negra (Fig. 1F). Padrão de coloração da parte superior da cabeça uniformemente escuro e da região dorsal do pronoto, também, uniformemente escuro (Fig. 2F). Tégmina cobrindo ¾ do abdome nos machos e ½ nas fêmeas. Estridulação de chamado continua e intensa, com taxa de emissão de sílabas de 98/segundo a 24-26o C. Esta espécie apresenta um cariótipo singular, com 2n=12,XX ou 2n=13,XX nas fêmeas, que a diferencia drasticamente de todas as outras espécies de Anurogryllus conhecidas citogeneticamente (Artigo 3). Descrição- Medidas de várias partes do corpo são apresentadas na Tabela 6. Som de chamado- Estridulação contínua e intensa (Fig. 3F). Constrói uma pequena depressão no solo a poucos centímetros da entrada da toca para estridular. Medidas dos parâmetros físicos do som se encontram na Tabela 8. Distribuição- Foram coletados espécimes desta espécie em Estação Biológica de Boracéia, SP, Brasil. (Fig. 5)

Anurogryllus muticus (De Geer) (Fig. 4)

Material examinado: BRASIL, (GO), Município de Itumbiara,18O58’00”S- 49o13’00”W: 07-11-97, 3 ♂.Coletores P. García-Novo e A. Mesa. O material se encontra na coleção do Departamento de Biologia da UNESP, Campus de Rio Claro, SP, Brasil. Em Itumbiara (GO) foi encontrada uma população que se encaixa na chave de Walker (1973) como A. muticus tanto do ponto de vista morfológico como acústico (Fig. 4).

Chave de espécies de Anurogryllus (modificada a partir de Walker, 1973)

1-Abdome do macho completamente coberto por tégmina...... ….…...... 2 1’-Não mais que ¾ do abdome do macho coberto por tégmina...... 8

2- Número de dentes na pars stridens maior que 60, taxa de emissão de sílabas do som de chamado menos que 90/segundo a 25oC; largura caudal do pronoto não maior que 5.4 mm...... …...... arboreus 2’- Número de dentes na pars stridens menor que 60...... 3 3- Taxa de emissão de sílabas do som de chamado maior do que 150/seg. a 25oC...... …...... 4 3’-Taxa de emissão de sílabas do som de chamado menor do que 150/seg. a 25oC...... …..5 4- Largura caudal do pronoto do macho maior que 5,5mm, número de dentes por mm na pars stridens 16-19……...... …..celerinictus 4’- Largura caudal do pronoto do macho menor que 5,5mm, número de dentes por mm na pars stridens 14-21…...... …...... ……..sp3 n.sp. 5- Largura caudal do pronoto do macho maior que 5,5mm, número de dentes por mm na pars stridens 14-19………………...…...... …sp2 n.sp. 5’- Largura caudal do pronoto do macho menor que 5,5mm...... … …6 6-Frequência do som de chamado maior que 6.0 KHz……...... muticus 6’- Frequência do som de chamado menor que 6.0 KHz ……...... 7 7- Coloração do corpo marrom, número de dentes na pars stridens 40-45, número de dentes por mm 17-18 ……...... …...... …………sp4 n.sp. 7`- Coloração do corpo amarelada, número de dentes na pars stridens 48-50, número de dentes por mm 17-20 ……...... sp5 n.sp. 8-Tegmina da fêmea mais longo que o pronoto não em forma de escama, som de chamado descontinuo, com taxa de emissão de sílabas de 88-108, largura caudal do pronoto 3,5-4,5, número de dentes na pars stridens 49-60, número de dentes por mm 31-36...... sp1 n.sp. 8`- Tegmina da fêmea mais curto que o pronoto em forma de escama...... 9 9-Tegmina da fêmea tocando-se na região mediana, tegmina do macho cobrindo só 2/3 do abdome ...... antillarum 9’- Tegmina da fêmea não tocando-se na região mediana (macho desconhecido)...... abortivus

Análise estatística de variáveis morfológicas e acústicas Na Fig. 7 aparecem as médias e desvios padrão de algumas das variáveis analisadas. As Fig. 7A , 7B e 7C mostram variáveis relacionadas ao tamanho dos espécimes; as Fig. 7D, 7E e 7F apresentam as variáveis referentes à pars stridens; e as Fig. 7G e 7H variáveis acústicas. A espécie Anurogryllus sp6 não foi estatisticamente analisada porque, até o presente momento, só foi coletado um espécimen macho que, após ser fotografado, gravado e medido foi, acidentalmente, perdido. Do ponto de vista estatístico, com base nos dados morfológicos e acústicos analisados por um teste multivariado, a Análise de Funções Discriminantes, as seis espécies analisadas, A.sp1, A.sp2, A. sp3, A. sp4, A. sp5 e A. muticus podem ser discriminadas. Os valores obtidos de F, p e as distancias quadradas de Mahalanobis aparecem nas Tabelas 2, 3 e 4 respectivamente, enquanto que as porcentagens de alocação correta para cada espécie aparecem na Tabela 5.

Table 2. Valores de F nas seis espécies de Anurogryllus.

A. sp1 A. sp2 A. sp3 A. sp4 A. sp5 A. muticus A. sp1 77,01250 62,70169 39,79923 19,94606 10,10660 A. sp2 77,01250 ----- 45,28043 9,49736 17,27020 11,35345 A. sp3 62,70169 45,28043 ----- 23,38303 5,35992 4,53143 A. sp4 39,79923 9,49736 23,38303 ----- 9,69461 8,69681 A. sp5 19,94606 17,27020 5,35992 9,69461 ----- 2,93183 A. muticus 10,10660 11,35345 4,53143 8,69681 2,93183 -----

Table 3. Valores de p nas seis espécies de Anurogryllus. A. sp1 A. sp2 A. sp3 A. sp4 A. sp5 A. muticus A. sp1 ----- 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 A. sp2 0.000000 ----- 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 A. sp3 0.000000 0.000000 ----- 0.000000 0.000011 0,000078 A. sp4 0.000000 0.000000 0.000000 ----- 0.000000 0.000000 A. sp5 0.000000 0.000000 0.000011 0.000000 ----- 0.004427 A. muticus 0.000000 0.000000 0,000078 0.000000 0.004427 -----

Table 4. Valores das distâncias quadradas de Mahalanobis entre s seis espécies de Anurogryllus.

A. sp1 A. sp2 A. sp3 A. sp4 A. sp5 A. muticus A. sp1 0,0000 126,3795 73,36525 75,80807 72,18574 65,45227 A. sp2 126,3795 0,0000 58,28877 19,20346 64,52601 74,85789 A. sp3 73,3652 58,2888 0,0000 36,26755 17,50177 27,74344 A. sp4 75,8081 19,2035 36,26755 0,0000 38,77843 59,63525 A. sp5 72,1857 64,5260 17,50177 38,77843 0,0000 25,13001 A. muticus 65,4523 74,8579 27,74344 59,63525 25,13001 0,0000

Table 5. Matriz de classificação indicando a pordentagem de alocação correta para cada espécie de Anurogryllus

Percent A. sp1 A. sp2 A. sp3 A. sp4 A. sp5 A. muticus Correct A. sp1 100.0000 16 0 0 0 0 0 A. sp2 100.0000 0 14 0 0 0 0 A. sp3 100.0000 0 0 29 0 0 0 A.sp4 100.0000 0 0 0 11 0 0 A. sp5 100.0000 0 0 0 0 5 0 A. muticus 66.6667 0 0 1 0 0 2 TOTAL 98,7179 16 14 30 11 5 2

Habitats, Hábitos e Ciclos de Vida As espécies de Anurogryllus estudadas são subterrâneas e apresentam comportamento subsocial. Começam suas atividades ao início da noite, permanecendo durante o dia dentro de suas tocas, cujas entradas são fechadas com barro se a umidade do solo o permitir. A sp1, A. sp4 e A. sp6 foram coletados em clareiras da Mata Atlântica, embora A. sp1 também foi coletado em ambiente urbanizado. As espécies A. sp2, A. sp3, A. sp5 e A. muticus foram coletadas em vegetação aberta ou ambiente urbano. Em várias localidades, duas espécies foram encontradas simultaneamente. Isto foi observado em Águas de Lindóia, Rio Claro, Corupá e Boracéia (Fig. 5). Em todos os casos havia uma diferença importante de tamanho entre as espécies e, como esperado, som de chamado também diferente. Três diferentes ciclos de vida foram detectados entre as espécies estudadas. A. sp1 apresenta ninfas e adultos durante todo o ano, ao menos nas populações coletadas no estado de São Paulo. A. sp2 e A. sp4 são univoltinas nas localidades estudadas com os adultos nas estações da primavera e verão. A. sp3 apresenta um ciclo bivoltino com adultos na primavera e no outono.

As tocas foram encontradas sob pedras, troncos que não estivessem em decomposição, ou em gramados abertos em ambientes urbanos (praças, quadras de futebol, jardins). Ao chegar ao estágio adulto, ao menos alguns indivíduos apresentam o segundo par de asas bem desenvolvido. Estas asas se desprendem do corpo após alguns dias. Variação intraespecífica no comprimento das asas foi observada inclusive dentro de uma prole de A. sp1. Os indivíduos com asas posteriores bem desenvolvidas são capazes de voar o que foi verificado em A. sp3. A estridulação nas espécies estudadas começa pouco depois do crepúsculo e se prolonga por, aproximadamente, três horas, exceto em A. sp1 que pode ser escutado até a madrugada. Enquanto estridulam, os grilos permanecem perto da entrada da toca e se perturbados fogem para dentro e em alguns casos continuam estridulando lá. Os machos de A. sp2, A. sp3 e A. sp4 constroem uma pequena depressão a poucos centímetros da entrada da toca onde se acomodam para estridular. A. sp1 não apresenta tal comportamento.

Discussão Além das espécies novas apresentadas neste trabalho, três outras têm sido estudadas anteriormente do ponto de vista morfológico, acústico e biológico: A. muticus, A. celerinictus e A. arboreus. É em relação a essas espécies que poderemos comparar nossos dados dentro do gênero Anurogryllus e em relação a Urogryllus toledopizai, gênero irmão de Anurogryllus que tem sido também estudada por nós. Como acontece com outros gêneros de Gryllinae em que as espécies estão mal estudadas e se parecem entre si, a maioria das referências a Anurogryllus da literatura, especialmente as publicadas antes do trabalho de WALKER (1973), que se referem à espécie muticus, na verdade devem estar referindo-se a varias espécies. No entanto, somente uma população entre todas as estudadas neste trabalho, é que pertence a esta espécie, mostrando que não é tão comum.

Morfologia Do ponto de vista morfológico, foi necessária a associação de várias características (coloração geral do corpo, coloração do vértex e do pronoto, e tamanho)

para contribuir para a diagnose das espécies. Estas características, ainda, precisam ser combinadas com as acústicas e consideradas em conjunto.

Genitália Os escleritos fálicos não mostraram diferenças específicas na sua estrutura. Assim, como um exemplo, apresentamos o desenho da genitália de A. sp3 na Fig. 6 em comparação com U. toledopizai. Nossas observações em geral concordam com as de RANDELL (1964) feitas a partir da análise de A. muticus e as de OTTE e PECK (1998) em A. typhlos, confirmando que há uma grande uniformidade entre as estruturas fálicas das diferentes espécies de Anurogryllus. RANDELL (1964) desenhou as estruturas fálicas de Anurogrylus nas figuras 8a, 8b e 8c do seu trabalho e de Urogryllus toltecus Saussure que aparecem nas figuras 9a, 9b e 9c, em vistas lateral dorsal e ventral. Os espécimes dissecados para obter a genitália foram os tipos dos respectivos gêneros e, a julgar pelos desenhos, os escleritos fálicos não foram separados para estudar suas conexões e a estrutura foi desenhada no mesmo estado em que foi extraída. Como conseqüência desta técnica alguns erros de interpretação foram cometidos por Randell. As espécies dissecadas em nosso estudo são Urogryllus toledopizai e as seis espécies novas de Anurogryllus aqui descritas. As estruturas fálicas foram dissecadas e totalmente separadas em seus cinco componentes básicos (MESA e GARCÍA, 1999): esclerito ectofálico proximal (EECP), esclerito ectofálico distal (EECD), esclerito endofálico proximal (EENP), esclerito endofálico distal (EEND) e estilete. Uma comparação com os resultados obtidos por RANDELL (1964) na comparação dos dois gêneros é a seguinte (a nomenclatura usada por Randell está entre parênteses): EECP (rami)- Randell considera a existência de um esclerito que ele designa como “ramal plate” intermediário entre o extremo posterior dos EECP e o anterior do EECD. Esse esclerito não existe. Trata-se de um tecido de conexão levemente endurecido e flexível entre os dois escleritos citados. Essa conexão está presente em praticamente todas as espécies de grilos (MESA e GARCIA-NOVO, 1997; MESA et al., 1998; MESA e GARCÍA, 1999; MESA et al., 1999a; MESA et al., 1999b; MESA e

GARCÍA-NOVO, 2001). As diferenças encontradas por Randell no aspecto lateral dos EECP são completamente irrelevantes e podem variar de espécie para espécie nos dois gêneros e ainda entre diferentes indivíduos da mesma espécie. EECD (epiphallus)- Não foram observadas as diferenças genéricas apontadas por Randell. O esclerito em sua região proximal apresenta uma curvatura em direção dorso-posterior como observado na Fig. 6C e 6C’ nos dois gêneros. Da região proximal partem dois braços laterais projetados caudalmente e tornando-se agudos em seu ápice posterior. A aproximadamente ½ mm de seu extremo posterior, uma entrada é observada na borda inferior desses braços nas duas espécies. Nenhuma diferença na falta de esclerotização da região média deste esclerito, como a descrita por Randell, foi observada entre as espécies aqui estudadas. EENP (endoparameres)- A observação de Randell de que este esclerito é “J shaped” é conseqüência da ausência de uma dissecção cuidadosa. O aspecto real deste esclerito em vista dorsal ventral e lateral das espécies aqui estudadas está ilustrado nas Fig. 6D, 6D’, 6E e 6E’. EEND (ectoparameres)- Estes escleritos formam duas barras paralelas, seus extremos proximais conectados com os extremos distais do EENP. Estas conexões ocorrem em praticamente todas as espécies de grilos (MESA e GARCIA-NOVO, 1997; MESA et al., 1998; MESA e GARCÍA, 1999; MESA et al., 1999a; MESA et al., 1999b; MESA e GARCÍA-NOVO, 2001). Os extremos apicais destes escleritos são muito similares, com uma pequena projeção interior e outra exterior menos evidente nos dois gêneros. Quando observados em determinado ângulo, estas projeções não são evidentes e o extremo aparece arredondado como apontado por Randell para Urogryllus (“undirected and acutely rounded”). A conexão com o EECP (rami) apontada por Randell para Anurogryllus não existe nas espécies aqui analisadas e a observação equivocada de Randell deve ser conseqüência de uma dissecção incompleta de cada um dos escleritos. U. toledopizai apresenta um par de quase imperceptíveis filamentos (Fig. 6G) que devem corresponder aos observados por Randell em U. toltecus, e devem ser remanescentes dos “mesal lobes” de outras espécies de Gryllidae e que em Anurogryllus não foram observados.

Estilete (virga)- Segundo Randell, este esclerito é mais longo em Urogryllus que em Anurogryllus. Nas espécies analisadas, os comprimentos são quase idênticos (1,3 mm) e, portanto, essa medida não pode ser considerada de valor genérico. Provavelmente esse comprimento varia de espécie para espécie dentro de cada gênero. Como apontado em GARCÍA-NOVO (2002), a estrutura fálica não diferencia ambos gêneros. A presença de ovipositor bem desenvolvido nas fêmeas associada à genitália do gênero é que permitem distingui-lo de Anurogryllus. A falta de diferenciação morfológica nos escleritos fálicos pode significar especiação recente no gênero ou baixa taxa de mutação na estrutura.

Pars stridens A análise da pars stridens das espécies de Anurogryllus aqui estudadas confirmou o observado por GARCÍA (2000) quanto à ocorrência de três tipos morfológicos de dentes que se sucedem através de suaves transições ao longo da estrutura. Há uma forte semelhança na morfologia dos dentes das espécies de Anurogryllus em relação à observada por WALKER e CARLYSLE (1975) em Anurogryllus arboreus, mas estes autores nada comentam sobre a sua morfologia ao longo da fileira. A partir da constatação de três tipos morfológicos de dentes na pars stridens das espécies estudadas, surge a importância de se verificar se os machos de Anurogryllus utilizam a fileira inteira para estridular ou somente parte dela, já que as diferenças na forma dos dentes poderiam acarretar modificações do som ao longo de cada sílaba, ou seja, o som emitido por um fechar de asas poderia apresentar modulação. No entanto, ANGULO et al. (1987), apesar de observarem que a primeira sílaba da estridulação de uma espécie de Gryllus é diferente das demais em frequência e duração e que as subseqüentes são mais agudas no início do que ao final, afirmam que os dentes da pars stridens são semelhantes entre si. Esta questão permanece, então, em aberto e a sua solução escapa aos objetivos deste trabalho. As características da pars stridens diferenciam Anurogryllus timidus entre as espécies das quais se tem informação, por ser a que apresenta a fileira menor e com um alto número de dentes, só sendo superada neste ponto por Anurogryllus arboreus (Tabela 7). Essas duas espécies, por sua vez, apresentam a densidade de dentes mais

alta e aproximadamente da mesma ordem. Essas características as aproximam do gênero Urogryllus, grupo irmão de Anurogryllus, cuja espécie Urogryllus toledopizai apresenta, uma fileira com aproximadamente 100 dentes e uma densidade ao redor de 40 dentes por mm (GARCÍA-NOVO, 2002; MELLO, 1988). Ainda, levando-se em conta o fato de que A. arboreus estridula sobre troncos de árvores, como faz Urogryllus toledopizai, e de que Anurogryllus sp1 não apresenta o comportamento de construir uma depressão no solo para estridular, poderíamos sugerir que ambas as espécies podem estar entre as que possuem características mais plesiomórficas no gênero.

Outras estruturas morfológicas Pode-se verificar, do mesmo modo, que outras estruturas morfológicas apresentam também algo grau de semelhança entre a maioria das espécies (dentes da pars stridens, tégmina, papila copulatória, espermateca) (GARCÍA 2000). Apesar de terem sido úteis em outros grupos de ortópteros, as estruturas da genitália feminina, estudadas nas espécies de Anurogryllus não se mostraram adequadas como caracteres diagnósticos. GARCÍA (2000) estudou a papila copulatória de quatro espécies aqui descritas como A. sp1, A. sp2, A. sp3 e A. sp4 encontrando um alto grau de variação intraespecífica. A análise da espermateca, por outro lado, mostrou uma estrutura muito uniforme entre as espécies. É provável que, como ocorre em outros grilos (ALEXANDER e BIGELOW, 1960; WALKER, 1964; OTTE e ALEXANDER, 1983; OTTE, 1992), as divergências no som de chamado precedam as divergências morfológicas visíveis no processo de especiação do gênero.

Bioacústica Vários pares de espécies com gerações adultas sincrônicas e simpátricas foram encontradas: A. sp2 e A. sp3 em Rio Claro e Águas de Lindóia; A. sp1 e Anurogryllus sp em Corupá; A. sp6 e A. sp2 na Estação Biológica de Boracéia. Como esperado, cada espécie no par apresenta sons de chamado diferentes. Entre as espécies acusticamente estudadas, A. sp1 é a única que produz um som descontínuo e de baixa intensidade, que lembra Urogryllus toledopizai (GARCÍA- NOVO, 2002).

A estridulação de A. sp1, assim como a de A. arboreus se caracterizam também por terem os menores valores de Taxa de Emissão de Sílabas (TES) além do que nenhuma das duas espécies exibe o comportamento de construir uma depressão no solo onde acomodar-se para estridular. No caso de A. arboreus, a estridulação é produzida sobre troncos, como em U. toledopizai. A. sp1 tem sido observado estridulando no chão e em paredes de barrancos. O padrão temporal do som, a TES, parece uma boa característica para a diferenciação entre as espécies associando-a as características morfológicas.

Hábitat, Hábitos e Ciclos de Vida O estudo da produção sonora e os comportamentos associados a ela são de grande importância já que o som está diretamente relacionado ao sucesso reprodutivo do indivíduo e, em conseqüência, da população, e da espécie. Mas não só as fêmeas prontas para a reprodução são atraídas pelo som de chamado de um grilo, outros machos, parasitas e predadores também o são. Assim, a quantidade, o tempo de duração e a qualidade do som emitido dependem, em parte, dos animais que foram atraídos por esse som nas gerações anteriores (WALKER, 1978). Anurogryllus é um gênero representado por espécies subterrâneas e que exibem comportamento subsocial. Todas as espécies conhecidas começam a atividade pouco depois do crepúsculo e a produção do som é interrompida umas duas a três horas mais tarde em todas as espécies estudadas menos em A. sp1 e A. muticus. O caso de A. sp1 não foi estudado em profundidade, mas WALKER e WHITESELL (1982) estudaram os horários e locais de emissão do som em A. muticus no Panamá. Os autores verificaram que, coletivamente, os machos de A. muticus estridulavam a noite inteira, mas identificando e acompanhando cada indivíduo, notaram que cada um deles não estridula por mais de três horas. Quanto aos locais de estridulação, foram encontrados machos que o faziam próximo a entrada da toca e se escondiam nela se perturbados, enquanto outros estridulavam no chão movendo-se entre 1 e 6 m a intervalos durante a emissão sonora. Os autores apontam que verificaram uma especialização individual quanto ao local e horário da estridulação. Nenhum estudo desse tipo tem se desenvolvido em outras espécies.

Como foi apontado na Introdução, a capacidade das espécies de Anurogryllus de colonizar ambientes modificados pelo homem e, inclusive, aumentar suas populações neles, as torna uma praga potencial, por enquanto incipiente ou até subestimada, como diz GASSEN (2002). A maioria das populações estudadas neste trabalho foi coletada em ambientes urbanizados, sendo que as coletadas em mata foram encontradas em clareiras e em locais alterados por construções, por exemplo.

Análise estatística As Figuras 7A, 7B e 7C mostram as médias e desvios padrão de três das variáveis analisadas que se relacionam ao tamanho dos espécimes: a largura caudal do pronoto (LPR), o comprimento do pronoto (CPR) e o comprimento do fêmur posterior (CFP). Pode-se apreciar no gráfico que Anurogryllus muticus apresenta uma proporção diferente à das outras espécies entre a largura e o comprimento do pronoto. O comprimento do fêmur posterior acompanha as diferenças de tamanho observadas nas outras duas variáveis. Nas Fig. 7D, 7E e 7F se encontram as medidas da pars stridens, comprimento (CPS), número de dentes (ND) e número de dentes por mm (ND/mm), que mostram que o número de dentes e a densidade dos dentes (no de dentes/mm) não estão sempre relacionados à variação de tamanho entre as espécies. Observe-se que A. sp1 apresenta a pars stridens mais curta, o que concorda com o seu tamanho corporal menor, e no entanto apresenta o maior número de dentes por mm. O mesmo ocorre em A. arboreus (Tabela 7) e em Urogryllus toledopizai (GARCÍA-NOVO, 2002) que apresentam um maior número de dentes por mm na pars stridens. As variáveis que representam a emissão sonora, taxa de emissão de sílabas (TES) e freqüência (FkHz) estão representadas nas Fig. 7G e 7H que evidenciam que não há uma relação direta entre os valores de freqüência e TES. A distribuição espacial das espécies como resultado da Análise das Funções Discriminantes pode ser apreciado na Fig. 8. A. sp1 é bem discriminada pela Variável Canônica 1, enquanto que A. sp2 e A. sp4 são razoavelmente discriminados também pela Variável Canônica 1. O conjunto das três espécies mencionadas é discriminado do conjunto formado por A. sp3, A. sp5 e A. muticus pela Variável Canônica 2, embora entre essas três espécies haja um certo grau de sobreposição.

Embora não são todas as espécies perfeitamente discriminadas na apresentação gráfica, os valores de p e F resultantes do teste aplicado indicam uma clara discriminação entre as seis espécies analisadas. Corroborando isso, cinco das espécies apresentaram uma porcentagem de alocação correta de 100%, sendo que um exemplar de A. muticus foi alocado como A. sp3. No entanto, as diferenças na emissão sonora e na coloração do corpo são caracteres que os diferenciam.

Literatura Citada

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Tabela 6. Medidas de machos de espécies de Anurogryllus (mm) (X=média±desvio padrão). ESPÉCIES LPR CPR CAA CFP CTP X Range X Range X Range X Range X Range N A. sp1 3.94±0.29 3.50-4.50 3.06±0.16 2.80-3.40 7.84±0.67 6.75-8.50 10.06±0.76 8.80-11.30 7.02±0.42 6.55-7.85 16 A. sp2 6.01±0.34 5.45-6.60 4.42±0.35 3.90-5.00 13.14±0.77 11.60-13.70 13.31±0.66 12.60-14.30 8.85±0.52 8.20-9.70 14 A. sp3 4.96±0.28 4.30-5.55 3.50±0.20 3.05-3.90 11.97±0.69 10.20-13.50 10.31±0.53 9.10-11.45 7.00±0.39 5.70-7.55 29 A. sp4 5.22±0.28 4.90-5.80 3.76±0.19 3.50-4.10 12.02±0.88 10.90-13.50 11.76±0.64 10.80-12.75 8.07±0.30 7.70-8.50 11 A. sp5 4.86±0.26 4.50-5.0 3.42±0.14 3.20-3.60 11.14±1.24 9.30-12.50 9.70±1.79 6.70-11.20 6.16±0.27 5.90-6.60 5 A. sp6 4.3 3.1 10.5 11.0 7.5 1

A. muticus Itumbiara 4,7±0.26 4.40-4.80 3.86±0.20 3.70-4.10 10.93±0.20 10.70-11.10 10.76±0.55 10.20-11.30 6.56±0.28 6.40-6.90 3 A. muticus* 5.20-5.60 ------*** A. arboreus* 4.70 3.50 11.10 13.10 7.50 A. celerinictus* 5.70-6.10 3.90 13.0 11.6 8.10 *** A. typhlos** 2.2 2.0 3.18 6.2 4.60 LPR=largura caudal do pronoto; CPR=comprimento do pronoto; CAA=comprimento da asa anterior; CFP=comprimento do fêmur posterior; CTP=comprimento da tíbia posterior. Quando aparece um único valor refere-se ao valor do holótipo. * WALKER (1973) ** OTTE e PECK (1998) *** não informado

Tabela 7. Medidas da pars stridens de espécies de Anurogryllus (X=média±desvio padrão). ESPÉCIES CPS ND ND/mm X Range X Range X Range N A. sp1 1.70±0.21 1.36-1.87 57.00±4.42 49.0-60.0 33.05±2.19 31.0-36.0 6 A. sp2 2.77±0.16 2.60-3.10 45.70±4.66 40.0-53.0 16.51±1.79 14.1-19.2 10 A. sp3 2.49±0.19 2.20-2.70 42.61±3.15 37.0-47.0 17.21±2.14 14.2-21.3 13 A. sp4 2.41±0.11 2.33-2.49 42.5±3.53 40.0-45.0 17.70±0.42 17.4-18.0 2 A. sp5 2.50±0.00 2.50-2.50 48.50±1.00 48.0-50.0 19.40±0.40 19.2-20.0 4 A. muticus Itumbiara 2.53±0.05 2.50-2.60 49.66±2.88 48.0-53.0 19.62±1.41 18.4-21.2 3 A. muticus* 1.90-2.90 45-60 18-26 A. arboreus* 2.10-2.70 63-78 33 A. celerinictus* 2.40-2.90 40-50 16-19 CPS=comprimento da pars stridens; ND= número de dentes da pars stridens; ND/mm=número de dentes por mm. * WALKER (1973).

Tabela 8. Características da estridulação de espécies de Anurogryllus. ESPÉCIES FkHz TES N LOCAL DEPRESSÃOHORARIO X Range X Range

A. sp1 5.58±0.38 4.96-6.24 96.00±6.55 88.00-108.00 9 Chão-altura Não Extenso A. sp2 5.53±0.18 5.24-5.72 124.33±4.45 116.00-128.00 6 Chão Sim restrito A. sp3 6.62±0.39 5.72-7.24 159.90±12.48 140.00-184.00 22 Chão Sim Restrito A. sp4 5.15±0.29 4.59-5.64 124.00±3.22 118.00-128.00 11 Chão Sim Restrito A. sp5 5.49±0.15 5.25-5.59 110.40±2.60 108.00-114.00 5 Chão Sim Restrito A. sp6 5.77 98 Chão Sim Restrito A. muticus Itumbiara 6.31±0.10 6.20-6.37 139.33±1.15 138-140 3 Chão ? ? A. muticus* 6.5 110-150 Chão Sim ? A. arboreus* 5.0-5.5 60-80 Árvores Não Restrito A. muticus* 6.5 110-150 Chão Sim ? A. celerinictus* 6.8 150-185 Chão ? ? FkHz=Frequencia em kHz; TES=Taxa de emissão de sílabas. * WALKER (1973)

Figura 1- Machos das seis espécies de Anurogryllus. A. A. timidus, B.A. magnobadius, C. A. polymorphus, D. A. marimontanus, E. A. flavus, F. A. walkeri. Barra=1cm

A B C

D E F

Figura 2- Detalhe da região superior da cabeça e do pronoto. A. A. timidus, B. A. magnobadius, C. A. polymorphus, D. A. marimontanus, E. A. flavus, F. A.walkeri.

Figura 3-Som de chamado. A. A. timidus, B. A.magnobadius, C. A. polymorphus; D. A. marimontanus; E. A. flavus; F. A. walkeri.

Figura 4-Anurogryllus muticus. A. Macho adulto. B. Sonograma do som de chamado. 67 68

__ EENP

__ A EEND A’ D D’

E G

E’

F ______ESTILETE

B B’ F’

_ C EECD C’ ___ EECP

Figura 6- Escleritos fálicos- A, B, C, D, E, F, E e G: Urogryllus toledopizai. A’, B’, C’, D’, E’, F’ e E’: Anurogryllus polymorphus. A. Estrutura completa, vista dorsal. B.Idem, vista ventral. C. Idem, vista lateral. D.Escleritos endofálicos, proximal e distal, vista ventral. E. Idem, vista lateral. F. Estilete, vista lateral. G. Detalhe do extremo distal do esclerito endofálico distal mostrando os “mesal lobes”. Barra=1mm

Pronotum Pronotum Lenght Comprimento do Fêmur Posterior 7,0 15 C 6,5 5,4 A B 14

6,0 5,0 13 5,5 4,6 12 5,0 4,2

PRL 11

L CFP 4,5 3,8 Mean+SD P Mean+S Mean- Mean-SD 10 4,0 Mean+ 3,4 Mean+SE Mean+SD Mean- Mean-SE 9 Mean-SD 3,5 Mea 3,0 Mean Mean+SE 8 Mean-SE Outlier Outliers Mean 3,0 2,6 Extrem Extremes Outliers 1 2 3 4 5 6 123456 7 123456 Extremes SP SP Número de Dentes Número de Dentes por mm 64 E 40 SP Comprimento da Pars Stridens D E F 3,2 36 58 F 32 2,8 52 28

2,4

ND 24

46 ND/mm CPS 2,0 20 40 Mean+SD Mean+SD Mean-SD Mean-SD 16 Mean+SD Mean+SE Mean+SE 1,6 Mean-SD Mean-SE Mean-SE Mean Mean Mean+SE 34 12 Mean-SE 123456 Outliers 123456 Outliers Mean 1,2 SP SP 123456 Outliers SP Figura 7- Taxa de Emissão de Sílabas 7,6 Frequencia in KHz 200 G 7,2 1-Anurogryllus sp1 180 H 6,8 2-Anurogryllus sp2 160 6,4

6,0 3-Anurogryllus sp3 140 FkHz TES 5,6 4-Anurogryllus sp4 120 Mean+SD Mean+SD 5,2 Mean-SD Mean-SD Mean+SE 5-Anurogryllus sp5 100 Mean+SE Mean-SE Mean-SE 4,8 Mean Mean Outliers Outliers 4,4 80 123456 Extremes 6-Anurogryllus muticus 123456 Extremes SP SP

Variável Canônica 1 vs. Variável Canônica 2 8 A. timidus 7 A. magnobadius 6 A. polymorphus 5 A. marimontanus 4 A. flavus 3 A. muticus 2 1 0 -1

Variável Canônica 2 -2 -3 -4 -5 -6 -10-8-6-4-20 2 4 6 810

Variável Canônica 1 Figura 8- Distribuição espacial das espécies analisadas como resultado da Análise das Funções Discriminantes.

Realidade é apenas um caso particular do possível. Henri Bergson

Chegou o tempo de novas alianças, desde sempre firmadas, durante muito tempo ignoradas, entre a história dos homens, de suas sociedades, de seus saberes, e a aventura exploradora da natureza. Ilya Progogine

Artigo 3

VIII-Artigo 3

Citogenética de espécies de Anurogryllus: possibilidades e dificuldades do seu uso na taxonomia

PAULA GARCÍA-NOVO

Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 13506 900, Rio Claro, São Paulo, Brasil.

Palavras chave: polimorfismo cromossômico, Orthoptera, cariótipo, grilo.

Para a publicação deste trabalho serão incluídos os resultados obtidos na Dissertação, assim, esta é uma versão parcial do que será o artigo completo. 72

Introdução

Os grilos (superfamília Grylloidea) não têm sido estudados do ponto de vista citogenético tão extensamente como o foram outros grupos de ortópteros, como por exemplo os Acrididae. Segundo DAS e DAS (1992), o total de espécies estudadas não ultrapassa 20% em relação às espécies descritas. Mesmo com as poucas informações disponíveis, é possível evidenciar que o grupo apresenta importante variabilidade cariotípica, assim como comportamentos meióticos e polimorfismos cromossômicos interessantes (DAS, 1989; DAS e DAS, 1992). Sendo assim, a análise cromossômica constitui uma fonte de informação que pode contribuir para a caracterização das espécies de grilos. Corroborando isto, HEWITT (1979) apresenta casos em que foi evidenciado através de estudos cariotípicos que, o que se acreditava ser uma única espécie eram, em realidade, duas ou mais espécies crípticas. Anurogryllus apresenta, como é comum na subfamília Gryllinae, espécies muito semelhantes, dificilmente diferenciáveis utilizando apenas características morfológicas. As descrições mais recentes (WALKER, 1973, GARCÍA-NOVO, Artigo no 2) combinam caracteres morfológicos e bioacústicos. Outros representantes de Gryllinae já analisados citogeneticamente, mostram número cromossômico entre 2n=11 e 2n=29 para os machos, sendo 2n=21 o número diplóide mais comum. As fêmeas têm número par de cromossomos por terem constituição XX, enquanto os machos são X0. Algumas das variações no número de cromossomos se devem a fusões cêntricas, embora translocações recíprocas e, provavelmente, inversões também possam ter tido um papel importante na evolução cariológica do grupo (HEWITT, 1979). Este autor considera possível que Gryllinae tenha um genótipo particularmente propenso à reorganização cariotípica. No que diz respeito às espécies da região Neotropical, as informações da literatura sobre cromossomos de Gryllinae são extremamente escassas, centradas quase que exclusivamente no gênero Gryllus e baseadas, em geral, em análises apenas com coloração convencional (DRETS e STOLL, 1974; CARDOSO et al., 1984; LAMBOROT e ALVAREZ-SARRET, 1985; MAFLA e CEVALLOS, 1989, ZEFA, 1999). 73

Na revisão feita por CARDOSO (1987) sobre bandamento C em Orthoptera existe apenas um trabalho referente a Gryllus argentinus, no qual DRETS e STOLL (1974) descrevem o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva em células mitóticas e meióticas. Vários trabalhos recentes estudam diversas espécies de grilo (superfamília Grylloidea) da fauna brasileira, incluindo a caracterização de seus cromossomos, não só com coloração convencional, mas também, ocasionalmente, com técnicas de bandamento (MESA e RIBAS, 1996; ZEFA e MESA, 1997; PASSETTI et al.; 1999, ZEFA, 1999; MESA et al, 2002), inclusive com a utilização de fluorocromos (FONTANETTI et al., 1998). É interessante constatar que, apesar do acúmulo de informações sobre citogenética dos grilos brasileiros, há um número relativamente pequeno de publicações. A principal razão decorre do fato de que 90% das espécies e alguns dos gêneros estudados são novos para a ciência, o que implica na necessidade de realizar um extenso trabalho taxonômico paralelo, incluindo estudos sobre a morfologia e a bioacústica, antes de se publicar o resultado citológico. Assim, há vários trabalhos em que se inclui a caracterização cariotípica na descrição das espécies (MESA e GARCÍA, 1999; MESA et al, 1999b; MESA et al, 1999c; MESA e GARCÍA-NOVO, 2001; SPERBER et al, 2003). O gênero Anurogryllus compreende onze espécies descritas mais seis espécies novas (Artigo no 2), todas Neárticas e/ou Neotropicais. Do ponto de vista cromossômico foram estudadas por GARCÍA (2000) sete populações pertencentes às espécies provisoriamente designadas como A. “sp1”, A. “sp2”, A. “polimorphus” e A. “sp4” (identificadas no referido trabalho com numeração de 1 a 4 respectivamente) usando técnicas de coloração convencional, banda C e RON. Essas técnicas de coloração diferencial não se mostraram informativas em relação à discriminação entre espécies.

Material e Método

Foram estudadas do ponto de vista citogenético as espécies A. arboreus Walker, A. muticus (De Geer), as espécies descritas no Artigo 2: Anurogryllus sp1, A. magnobadius, A. polymorphus, A. marimontanus, A. sp5 e A. sp6, além de uma espécie que ainda não tem 74

nome provisório denominada como Anurogryllus sp7. As localidades em que foram coletadas as espécies aparecem na Tabela 1.

Tabela 1. Localidades de coleta, para localização geográfica e coordenadas ver Artigo 2.

ESPÉCIE LOCALIDADES COORDENADAS Fazenda Capricórnio, SP (GARCÍA, 2000) 23o23’31”S–45o04’31”W A. sp1 Praia da Mococa, SP (GARCÍA, 2000) 23o34’11”S – 45o17’41”W Corupa, SC 26o24’10”S-49o20’20”W A. arboreus Florida, USA Unesp, Rio Claro, SP (GARCÍA, 2000) 22o23’43”S – 47o32’39”W Horto Florestal, Rio Claro, SP (GARCÍA, 2000) 22o25’06”S – 47o31’33”W A. sp2 Estação Biológica de Boracéia, SP 23o40’05”S-45o53’57”W Águas de Lindóia, SP 22o28’00”S-46o37’00”W Unesp, Rio Claro, SP (GARCÍA, 2000) 22o23’43”S – 47o32’39”W Sítio Christololetti, Rio Claro, SP (GARCÍA, A. sp3 22o17’15”S-47o34’43”W 2000) Águas de Lindóia, SP 22o28’00”S-46o37’00”W A. sp5 Montevidéu, Uruguai A. muticus Itumbiara, GO 18O58’00”S-49o13’00”W A. sp6 Estação Biológica de Boracéia, SP 23o40’05”S-45o53’57”W Anurogryllus sp7 Céu Azul, PR

As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de cecos gástricos e gônadas. Com exceção dos exemplares de A. arboreus, os demais indivíduos foram injetados com colchicina 0,05% e após aproximadamente quatro horas foram dissecados. Os tecidos a serem fixados foram submetidos a tratamento hipotônico com solução de KCl 0,075 M, à temperatura ambiente, durante 10 minutos e colocados em Carnoy 1. As preparações foram obtidas por esmagamento ou suspensão celular e a coloração realizada com orceína lacto-acética 0,5%. 75

Resultados

Anurogryllus sp1 Foram analisados dois machos e duas fêmeas da população de Corupá (SC), que apresentaram o cariótipo básico com 2n=23,X0 nos machos e 2n=24,XX nas fêmeas, todos os autossomos acrocêntricos variando gradativamente em tamanho. O número de braços autossômicos é de 22. O cromossomo X é metacêntrico e o maior do cariótipo (Fig. 1).

Anurogryllus arboreus A análise de três exemplares machos, dos quais foram obtidas preparações meióticas de testículos, mostraram um cariótipo com 2n=23,X0. Foram observados 11 bivalentes autossômicos e um univalente correspondente ao cromossomo X nas células em metáfase I (Fig. 2A e 2B). Segundo pode ser observado na anáfase I apresentada na Fig. 1C, todos os autossomos são acrocêntricos com variação gradativa de tamanho e o cromossomo X é metacêntrico e o maior do cariótipo.

Anurogryllus sp2 Foram analisadas três fêmeas desta espécie procedentes da Estação Biológica de Boracéia (SP), e dois machos e uma fêmea procedentes de Águas de Lindóia. Em ambas localidades foi detectada a presença de uma fusão cêntrica entre pares grandes de autossomos. Entre os exemplares de Boracéia, que ilustram o cariótipo da espécie na Fig. 3, foram encontrados os seguintes cariótipos: A primeira fêmea apresentou 2n=24,XX, com todos os autossomos acrocêntricos variando gradativamente em tamanho. O cromossomo X é metacêntrico e o maior do cariótipo (Fig. 3A). Na segunda fêmea, foi encontrado um cariótipo com 2n=23,XX, no qual o número de autossomos ficou diminuído pela ocorrência de um cromossomo metacêntrico fruto de um rearranjo do tipo fusão cêntrica (Fig. 3B). Na terceira fêmea foi observado um cariótipo com 2n=23,XX+S. Entre os autossomos há um metacêntrico grande ímpar. Este elemento foi interpretado como 76 resultante de uma fusão cêntrica ocorrida, provavelmente, entre os cromossomos maiores. Além disso, este exemplar apresentou um cromossomo metacêntrico ímpar de tamanho médio que foi interpretado como sendo um supernumerário (Fig. 3C). De Águas de Lindóia foram analisados: Um macho com 2n=23,X0, com todos os autossomos acrocêntricos variando gradativamente em tamanho. O cromossomo X é metacêntrico e o maior do cariótipo. Um macho com 2n=22,X0 no qual aparece um metacêntrico grande ímpar entre os autossomos fruto de uma fusão cêntrica. Uma fêmea com 2n=24,XX, com todos os autossomos acrocêntricos.

Anurogryllus sp3 Os representantes desta espécie foram duas fêmeas e um macho provenientes de Águas de Lindóia (SP). Estes exemplares apresentaram um cariótipo com 2n=17,X0 para o macho (Fig. 4A) e 2n=18,XX para as fêmeas (Fig. 4B), com três pares de cromossomos metacêntricos grandes, dois pares de acrocêntricos de tamanho médio e três pares pequenos. O número de braços autossômicos é de 22 e por essa razão interpretamos que aconteceram nesta população três fusões cêntricas entre cromossomos pertencentes aos pares maiores do cariótipo básico. O cromossomo X é metacêntrico e o maior do cariótipo.

Anurogryllus sp5 O cariótipo obtido desta espécie é proveniente do estudo de um único indivíduo do sexo feminino. Apresenta 2n=19,X0 (Fig. 5), com dois pares de cromossomos metacêntricos grandes, conjunto de três autossomos formado por um cromossomo ímpar metacêntrico acompanhado de dois acrocêntricos, dois pares de autossomos acrocêntricos de tamanho médio e três pares de acrocêntricos pequenos. O número de braços autossômicos é de 22, por essa razão interpretamos que ocorreram nesta população três fusões cêntricas sendo que pelo menos uma delas não se apresenta fixada na população. O cromossomo X é metacêntrico e o maior do cariótipo.

Anurogryllus muticus As metáfases de uma fêmea analisadas mostraram um cariótipo com 2n=22,XX com um par de cromossomos metacêntricos, seis pares acrocêntricos de tamanho médio e três pares de tamanho pequeno (Fig. 6). O número de braços autossômico é de 22 e se assume que o par metacêntrico seja resultado de uma fusão cêntrica em estado homomórfico neste exemplar, ocorrida entre pares de tamanho grande.

Anurogryllus sp6 Desta espécie, proveniente da Estação Biológica de Boracéia, foram analisadas cinco fêmeas que apresentaram dois cariótipos diferentes. Um cariótipo com 2n=12,XX, com quatro pares de autossomos metacêntricos e 1 par de acrocêntricos pequenos (Fig. 7A) foi observado em três exemplares. O outro cariótipo com 2n=13,XX, com um número ímpar de autossomos (Fig. 7B) foi observado em dois exemplares. O número de braços autossômicos caiu para 18 o que indica que outros rearranjos além de fusões cêntricas, provavelmente inversões, ocorreram nesta espécie.

Anurogryllus sp7 Somente fêmeas foram coletadas desta espécie na localidade de Céu Azul (PR) e provavelmente pertencem a uma espécie não descrita. O cariótipo observado é de 2n=22,XX, com um par de cromossomos submetacêntricos grandes, e nove pares de acrocêntricos com variação gradativa de tamanho (Fig. 8).

Discussão

As informações disponíveis sobre cromossomos de espécies de Anurogryllus são as obtidas no presente trabalho e as apresentadas por GARCÍA (2000) em que se analisam cariótipos de populações pertencentes a quatro espécies do gênero. No Artigo 2 essas espécies foram descritas como A. sp1, A. sp2, A. sp3 e A. sp4. Neste trabalho apresentamos populações de A. sp1, A. sp2 e A. polimorphus diferentes das apresentadas em GARCÍA (2000), assim como os cariótipos de A. arboreus Walker, A. sp5, A. muticus (De Geer), A. sp6 e uma espécie que chamamos de Anurogryllus sp7. Em GARCÍA (2000) foi considerado como cariótipo básico aquele com 2n=23,X0 para os machos e 2n=24,XX para as fêmeas. Todos os autossomos são acrocêntricos com uma variação gradual de tamanho, sendo o número de braços autossômicos igual a 22. O cromossomo X é um metacêntrico grande, o maior do cariótipo. Até agora, em exemplares de A. sp1 e A. arboreus só foram encontrados exemplares com o cariótipo básico. Além dessa característica, estas duas espécies apresentam outras que fazem pensar que poderiam ser espécies relacionadas: são as espécies menores em tamanho, apresentam um número comparativamente alto de dentes na pars stridens, e emitem sons de chamado com número relativamente baixo de sílabas por segundo. As variações cromossômicas observadas em A. sp2, A. sp3, A. sp5, A. muticus e Anurogryllus sp7 podem ser interpretadas como decorrentes de rearranjos do tipo fusão cêntrica, pelo fato do número de braços autossômicos permanecer inalterado em todos os cariótipos que divergem do básico. A. sp2 e A. muticus apresentaram apenas um rearranjo entre cromossomos de tamanho grande, provavelmente os pertencentes aos pares 1 e 2. GARCÍA (2000) estudou exemplares de A. sp4, denominada como Anurogryllus sp4 no referido trabalho, que também apresentaram uma fusão cêntrica em estado heteromórfico. Em A. sp2 e A. sp4 (GARCÍA, 2000) foi observada a ocorrência de cromossomos B, em ambos casos de morfologia metacêntrica. Estas duas espécies apresentam grande semelhança na coloração, som de chamado e cromossomos. Não obstante, a diferença de tamanho entre elas é grande e estatisticamente significativa (Artigo 2). 79

Anurogryllus sp7 apresentou também uma fusão cêntrica, mas os pares participantes são claramente diferentes daqueles das espécies A. sp2, A. muticus e A. sp4, já que o cromossomo rearranjado é submetacêntrico, indicando a participação de um par de tamanho menor. Entre os exemplares de A. sp3 e A. sp5 foi constatada a ocorrência de três rearranjos ocorridos entre os pares de tamanho maior. Nos indivíduos de A. sp3 procedentes de Águas de Lindóia foram observados rearranjos homomórficos, mas na amostra estudada por GARCÍA (2000) procedente de Rio Claro, foram encontrados três diferentes cariótipos originados por duas das fusões parcialmente estabelecidas na população. Da espécie A. sp5 só foi analisado até o presente momento um exemplar que apresenta duas fusões em estado homomórfico e a terceira em estado heteromórfico. A. sp6 constitui um caso muito diferente dos outros conhecidos até agora. Com 2n=12-13,XX nas fêmeas estudadas, o seu número de braços autossômicos não é de 22 senão de 18, o que significa que outros rearranjos, provavelmente inversões, ocorreram na espécie. O cariótipo desta espécie é tão distinto que constitui seu principal caráter diagnóstico. Não é possível saber se os cromossomos participantes das fusões nas diferentes espécies são homeólogos, e ainda, mesmo que o fossem, não é possível afirmar se estamos diante de um rearranjo que se originou de um evento único ou se houve eventos repetidos de fusão após a separação das espécies. Seria preciso uma análise com técnicas que permitissem a identificação individual dos cromossomos, de coloração diferencial longitudinal, como a Banda G que muito raramente tem sido obtida em Orthoptera ou incorporação de BrdU. Com esta última técnica GARCÍA (2000) obteve alguns resultados preliminares que apontam para a possibilidade de que um aperfeiçoamento do procedimento poderia proporcionar resultados. Ou ainda técnicas de hibridação total do cariótipo que permitiriam encontrar cada cromossomo do cariótipo básico nos demais cariótipos. Os estudos citogenéticos, ainda aqueles baseados apenas em coloração convencional, têm se mostrado de grande utilidade para a discriminação entre espécies em vários grupos de Orthoptera (WHITE, 1973; HEWITT, 1979). Em alguns grupos, os 80 cromossomos são importantes indicadores de relações filogenéticas e podem, por exemplo, fundamentar hipóteses de polifilia dentro de um gênero. Um exemplo desta situação se encontra entre espécies de gafanhotos do gênero Eurotettix, que compartilham a presença de um mecanismo X1X2Y (♂) de determinação do sexo. Uma das espécies atualmente incluída no gênero, E. minor, apresenta um mecanismo neo XY de determinação do sexo junto com detalhes estruturais da genitália masculina, caracteres que poderiam justificar uma proposta para a retirada de minor do gênero Eurotettix (MESA, A., com. pess). No caso das espécies de Anurogryllus, existem casos em que os dados cromossômicos não ajudam na discriminação em um primeiro momento, mas foi observada uma coerência cariotípica entre as diferentes populações de cada espécie estudada. Os polimorfismos presentes em cada uma se encontram em todas as populações estudadas. Em outros casos, no entanto, como em A. sp6, o cariótipo constitui um caráter de principal importância diagnóstica. Essas características fazem com que a análise dos cromossomos nestas espécies que são tão dificilmente diferenciáveis morfologicamente, se torne um caráter a ser adicionado na identificação específica. A dificuldade evidente para a obtenção da informação cromossômica é a necessidade de trabalhar a partir do material vivo. Os exemplares de museu não proporcionam nenhuma informação citogenética e tampouco bioacústica, com exceção da estrutura da pars stridens, importantes fontes de evidências entre os Orthoptera e especialmente ao se tratar de espécies crípticas. Isto põe de relevo a importância do trabalho de campo como passo inicial da pesquisa, que permite, ademais, realizar outros tipos de observações como, por exemplo, sobre preferência de habitat ou comportamento acústico. No que se refere à preparação do material para análise cromossômica, a técnica de fixação do material pode simplificar-se a tal ponto que é possível executá-la no campo, com pouquíssimos requerimentos de reagentes e instrumentos. A preparação, exame das lâminas e registro das informações, embora sejam procedimentos trabalhosos e demorados, requerem apenas de um fotomicroscópio e uma câmara escura, de ocorrência comum em Institutos que lidam com Biologia de um modo geral. Verifica-se então que não é grande o grau de dificuldade para incorporar estas informações, que podem ser importantes para 81 aceitar ou refutar a hipótese de que uma determinada população pertence a uma determinada espécie.

Literatura Citada

CARDOSO, H. C-bands in Orthoptera. Cytobios, Cambridge, v.49, p.153-161, 1987.

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DAS, N.; DAS, R. C. Karyotypes and meiosis in Gryllus bimaculatus De Geer (Orth.: Gryllidae) with a note on the N-banding pattern. Caryologia, Firenze, v.45, n.1, p.91-103, 1992.

DRETS, M. E.; STOLL, M. C-banding and non-homologous association in Gryllus argentinus. Chromosoma, Berlin, v.48, p.367-390, 1974.

FONTANETTI, C. S.; ZEFA, E.; MARIN-MORALES, M.A.; MESA, A. Characterization of the chromosomes of Gryllus assimilis by Band C, RON, DA/CMA/DAPI (Orthoptera, Gryllidae). In: INTERNATIONAL CHROMOSOME CONFERENCE, 13, 1998, Ancona, Itália, Cytogenetics and Cell Genetics, v.81, September, 1998, p.128.

GARCÍA, P. Caracterização da morfologia, das emissões sonoras e da citogenética de 4 espécies de Anurogryllus (Orthoptera, Gryllidae) do estado de São Paulo. Rio Claro, 2000. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista.

HEWITT, G. M. Animal Cytogenetics 3. Insecta 1. Gebrüder Borntraeger, Berlin, Stuttgart, 1979, 170p.

LAMBOROT, M.; ALVAREZ-SARRET, E. The chromosomes of Gryllus field cricket populations in central Chile (Insecta: Grylloptera: Gryllidae). Canadian Journal of Zoology, Ottawa, v.63, p.2626-2631, 1985.

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Figura 1- Anurogryllus timidus. Cariótipo de fêmea com 2n=24,XX. 85

__ X A

_ X B

__ X C

Figura 2- Anurogryllus arboreus- A.Metáfase I com 11 bivalentes e um univalente correspondente ao cromossomo X. B.Metáfase I com 11 bivalentes e um univalente correspondente ao cromossomo X. C. Anáfase I com 11 autossomos e o cromossomo X num pólo e 11 autossomos no outro pólo.

1 234 56

A 7891011XX

B XXS

Figura 3-Anurogryllus magnobadius- A.Cariótipo de Fêmea com 2n=24,XX. B. Cariótipo de fêmea com 2n=23,XX+B, portador de fusão cêntrica heteromórfica e cromossomo supernumerário.

Figura 4-Anurogryllus polymorphus-A. Fêmea com 2n=18,XX. B. Macho com 2n=17,X0.

Figura 5-Anurogryllus flavus- Cariótipo de fêmea com 2n=19,XX portadora de duas fusões cêntricas homomórficas. 89

Figura 6- Anurogryllus muticus- Cariótipo de fêmea com 2n=22,XX portadora de uma fusão cêntrica homomórfica. 90

Figura 7-Anurogryllus walkeri- A.Cariótipo de fêmea com 2n=12,XX. B.Cariótipo de fêmea de 2n=13,XX, portadora de um rearranjo heteromórfico.

A vida inteira do indivíduo não é mais que o processo de dar-se nascimento a si mesmo. Erich Fromm

Todos os seres vivos são membros de comunidades ecológicas ligadas umas às outras em uma rede de interdependências. Quando essa percepção ecológica profunda torna-se parte de nossa consciência cotidiana, emerge um sistema de ética radicalmente novo. È uma visão do mundo que reconhece o valor inerente da vida não-humana. Fritjof Capra

Artigo 4

IX-Artigo 4

Análise filogenética de espécies de Anurogryllus (De Geer) (Orthoptera, Gryllidae) inferida a partir de dados morfológicos, bioacústicos e moleculares.

Paula García-Novo1; Vanderlei Geraldo Martins2, Vitor F. O. de Miranda3

1Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 13506 900, Rio Claro, São Paulo, Brasil. 2Departamento de Fonoaudiologia, Faculdade de Filosofia e Ciência, Universidade Estadual Paulista, Marília, São Paulo, Brasil. 3Área de Ciências e Saúde, Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), Mogi das Cruzes, São Paulo Brasil.

Palavras chave: DNA mitocondrial, citocromo oxidase, grilo, sistemática, som de chamado.

Introdução

Grande parte dos trabalhos que trata sobre filogenia em Orthoptera se refere a relações entre grandes grupos. Em alguns casos são utilizadas características morfológicas como as da genitália masculina (DESUTTER, 1987), as estruturas dos cercos (DESUTTER-GRANDCOLAS, 1998), do aparelho estridulador (DESUTTER- GRANDCOLAS, 1997) ou dos microespinhos do canal alimentar (ELZINGA, 1996). Em outros são empregadas informações sobre biologia e comportamento (DESUTTER- GRANDCOLAS, 1995; GWYNNE, 1995). Alguns trabalhos estabelecem hipóteses filogenéticas baseadas em dados moleculares, também entre grandes grupos. FLOOK e ROWELL (1998) estudaram as relações filogenéticas entre representantes dos grupos chamados ortopteróides, com base em seqüências de DNA ribossômico nuclear. MAEKAWA et al. (1999) também analisaram as relações entre os insetos ortopteróides, baseados em seqüências do gene mitocondrial COII (Citocromo Oxidase II). FLOOK e ROWELL (1997a) testaram o valor de seqüências de RNA ribossômico para analisar as relações entre várias famílias da ordem Orthoptera. A filogenia da subordem Caelifera foi estudada a partir de seqüências dos genes mitocondriais do RNA ribossômico por FLOOK e ROWELL (1997b). São escassos os estudos realizados entre espécies de um gênero ou gêneros próximos. HARRISON e BOGDANOWICZ (1995) partem da obtenção de uma filogenia baseada em dados de sítios de restrição do DNA mitocondrial para fazer inferências sobre a evolução de caracteres ecológicos e comportamentais como o ciclo de vida, as emissões sonoras e as preferências de habitats exibidas por espécies do gênero Gryllus da América do Norte. SHAW (1996) estudou espécies de grilos do gênero Laupala do Hawai a partir do DNA ribossômico mitocondrial. WALTON e BUTLIN (1997) analisaram as relações filogenéticas entre espécies de gafanhotos do gênero Chitaura da Indonésia, com base em seqüências do gene mitocondrial COI (Citocromo Oxidase I). Nestes dois últimos casos, trata-se de espécies que habitam em ilhas e os autores realizaram considerações biogeográficas sobre especiação. WILLET et al. (1997) trabalharam com duas espécies

93 do gênero Gryllus da América do Norte, abordando um estudo populacional numa região de hibridização, seqüenciando os genes mitocondriais COI e COII. Espécies de grilos da América do Sul não foram ainda objeto de análises filogenéticas a partir de dados moleculares, no que diz respeito às relações entre espécies ou gêneros próximos. A presente análise inclui dados obtidos a partir do seqüenciamento de um fragmento de DNA mitocondrial correspondente ao Citocromo Oxidase I, RNA transportador de leucina, e Citocromo Oxidase II de 10 espécies de Anurogryllus que .foram analisadas considerando como grupo-externo Urogryllus toledopizai, Paranurogryllus capricórnio, Brachytrupes portentosus seqüenciadas para o trabalho e as espécies Acheta domesticus e Teleogryllus emma cujas seqüências se encontram no GenBank (Tabela 1).

Material e Métodos

Material examinado O material examinado neste estudo se encontra relacionado na Tabela 1 e depositado na coleção do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP, Rio Claro.

Caracteres morfológicos e bioacústicos Foram tabulados 18 caracteres morfológicos e bioacústicos (Tabelas 2 e 3). As informações referentes às espécies Acheta domesticus, Teleogryllus emma, Paranurogryllus capricórnio, Brachytrupes portentosus e Urogryllus toledopizai foram obtidos da literatura (WEISSMAN e RENTZ, 1977; WEISSMANN et al., 1980; GWYNNE; 1995; YANG, 1995; MESA e GARCÍA, 1999; GARCÍA-NOVO, 2002). Os das espécies A. timidus, A. magnobadius, A. polimorphus, A. marimontanus, A. flavus e A. muticus foram obtidos do Artigo 2. Todos os caracteres de A. sp1, A. sp2 e A. sp3 foram obtidos especialmente para este estudo assim como os caracteres morfológicos de Brachytrupes portentosus.

Isolamento, amplificação e seqüenciamento do DNA Para realizar a extração do DNA foi usado o kit GenomicPrepTM da Amersham Pharmacia Biotech Inc., seguindo o procedimento recomendado pelo fabricante, com algumas modificações. A amplificação do fragmento correspondente à parte da seqüência do Citocromo Oxidase I, o RNA transportador de leucina e o Citocromo Oxidase II foi obtida em reações de 25µl, com 1,5U de Taq DNA polimerase, 10mM Tris-HCl, 50mM de KCl, 2.0 mM de

MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 pM de cada iniciador e de 200 a 500 ng de DNA. Fragmentos de cerca de 1000 pares de bases foram amplificados com o termociclador PTC 200 MJ Research programado da seguinte forma: 95o C por 7 min.; e 35 ciclos de 94o C por 1 min.; 45o C por 1 min, 65o por 8 minutos e extensão final a 65o por 15 minutos. Foram utilizados os primers C1-J-2773 e TK-N-3785 (SIMON et al., 1994) que se encontram representados na Tabela 4. O produto de PCR foi purificado a partir de um gel de agarose a 1% usando o kit de reagentes “Wizard PCR Preps” (Promega, Madison, WI), seguindo protocolo do fabricante. O seqüenciamento dos genes foi feito em seqüenciador automático ABI 377, da Perkin Elmer, alocado no Centro de Estudos de Insetos Sociais do Instituto de Biociências, Rio Claro, UNESP, com “Dye termination chemistry”. Foram seqüenciadas as fitas senso (5’→3’) e anti-senso (3’→5’) de cada amostra. As seqüências obtidas foram alinhadas com o uso do Programa Clustal W (TOMPSON et al., 1994) através do aplicativo BioEdit versão 5.0.9 (Hall, 1999).

Análise filogenética As análises filogenéticas de máxima parcimônia foram realizadas com o Programa PAUP* 4B8 (SWOFFORD, 1999). As árvores foram obtidas mediante o tipo de busca branch-and-bound. Das árvores mais parcimoniosas foram obtidas as árvores de consenso semi-estrito por ser consideradas mais informativas que as de consenso estrito. O suporte dos ramos foi inferido pela análise de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985; SWOFFORD et al., 1996), conduzida através da busca heurística com 1000 replicações. Os cladogramas foram desenhados com o auxílio do programa TreeView (PAGE, 1998).

Tabela 1- Espécies estudadas Táxon Número LOCALIDADES COORDENADAS Acheta domesticus M83961 Teleogryllus emma AB005469 Brachytrupes portentosus 391 o o Paranurogrylls capricornio 434 Fazenda Capricórnio, SP 23 23’31”S–45 04’31”W o o Urogryllus toledopizai 377 Unesp, Rio Claro, SP 22 23’43”S – 47 32’39”W A. arboreus 438 Florida, USA A. sp1 378 Céu Azul, PR 25o09’20”S-53o 51’09”W o o A. sp2 396 Corupa, SC 26 24’10”S-49 20’20”W A. sp3 252 Arapongas, PR 23 o24’55”S-51o25’48”W o o A. magnobadius 389 Estação Biológica de Boracéia, SP 23 40’05”S-45 53’57”W A. marimontanus 192 Parque Estadual Serra do Mar, SP 23o21’33”S-45o18’02”W o o A. timidus FC 386 Fazenda Capricórnio, SP 23 23’31”S–45 04’31”W o o A. timidus C 472 Corupa, SC 26 24’10”S-49 20’20”W O o A. muticus 437 Itumbiara, GO 18 58’00”S-49 13’00”W A. flavus 380 Montevidéu, Uruguai o o A. polymorphus 379 Águas de Lindóia, SP 22 28’00”S-46 37’00”W

Tabela 2- Descrição dos caracteres morfológicos e bioacústicos e seus estados empregados na análise filogenética. Caracteres Estados 1-Esclerito ectofálico proximal 0-formado por duas barras; 1-em forma de U 2-Esclerito ectofálico distal 0-externo distal bifurcado; 1-extremo distal não bifurcado 3-Esclerito ectofálico distal 0-região proximal com cresta; 1-região proximal sem cresta 4- Esclerito ectofálico distal 0-extremo distal com curvatura; 1-extremo distal sem curvatura 5-Tegmina 0-ausentes; 1-presentes 6-Ovipositor 0-desenvolvido; 1-vestigial; 2-reduzido 7-Número de dentes/mm na pars 0-até 25; 1-mais de 25; 2-inaplicável stridens 8-Taxa de emissão de sílabas do 0-até 50; 1-mais de 60; 2-inaplicável som de chamado 9-Estrutura do som 0-chirps; 2-trills com interrupções; 2-trills contínuos; 3-inaplicável 10-Local da emissão do som de 0-chão; 1-altura; 3-inaplicável chamado 11-Construção de toca 0-ausente; 1-presente 12-Cuidado parental 0-ausente; 1-presente 13-Ciclo de vida 0-sobreposição de gerações; 1-univoltino; 2-bivoltino 14-Acúmulo de folhas na entrada 0-ausente; 1-presente da toca 15-Coloração do pronoto 0-com duas manchas laterais claras; 1-sem manchas 16-Morfologia dos dentes da pars 0-todos com a mesma morfologia; 1-com mais de um tipo morfológico stridens 17-Tegmina da fêmea 0-cobrindo menos de 2/3 do abdome; 1-cobrindo mais de 2/3 do abdome; 2-inaplicável 18-Depressão para estridular 0-não constrói; 1-constrói

Tabela 3- Matriz dos caracteres morfológicos e bioacústicos empregados na análise filogenética. Taxa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Acheta domesticus 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 ? 0 ? 0 ? 0 Teleogryllus 0 1 1 0 0 0 1 ? 0 0 0 0 ? 0 ? 0 ? 0 Paranurogryllus capricórnio 1 1 1 1 1 1 2 2 3 2 1 1 1 1 1 2 - 0 Urogryllus toledopizai 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 A. sp3 1 0 0 0 0 1 ? ? ? 0 1 1 ? 1 1 1 1 1 A. timidus FC 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 A. timidus C 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 ? 1 1 1 0 0 A. flavus 1 0 0 0 0 1 0 1 2 0 1 1 1 1 0 1 0 1 A. arboreus 1 0 0 0 0 1 1 1 2 1 1 1 ? 1 ? 1 ? 0 A. polymorphus 1 0 0 0 0 1 0 1 2 0 1 1 2 1 0 1 1 1 A. magnobadius 1 0 0 0 0 1 0 1 2 0 1 1 ? 1 1 1 1 0 A sp1 1 0 0 0 0 1 ? ? ? 0 1 1 ? 1 0 1 1 1 A marinontanus 1 0 0 0 0 1 0 1 2 0 1 1 1 1 1 1 1 1 A muticus 1 0 0 0 0 1 0 1 2 0 1 1 1 1 1 1 1 1 A. sp2 1 0 0 0 0 1 0 ? 2 0 1 1 1 1 0 1 1 1 Brachytrupes portentosus 1 0 0 0 0 2 0 0 1 0 1 1 1 ? 0 0 1 0

Tabela 4- Primers empregados para a amplificação do segmento que compreende o COI, RNALeu, COII do DNA mitocondrial.

Primers Sequências Autores C1-J-2773 5’-ATACCTCGACGTTATTCAGA-3’ SIMON et al., 1994 TK-N-3785 5’-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’ SIMON et al., 1994

Resultados

Caracteres morfológicos e bioacústicos. A análise filogenética da matriz morfológica e bioacústica mostrou que 15 dos 18 caracteres são parcimoniosamente informativos. Foram obtidas 20 árvores igualmente parcimoniosas com 34 passos, com índice de consistência CI=0,79, índice de retenção RI=0,83 que resultaram na árvore de consenso semi-estrito apresentada na Fig. 1A. Os valores de bootstrap da maioria dos ramos são baixos. Na Fig 1 aparecem apenas os três valores maiores a 50%. Os resultados obtidos não permitem afirmar a monofilia do gênero Anurogryllus já que, no mesmo ramo, se encontram as espécies Paranurogryllus capricornio e Brachytrupes portentosus. Urogryllus toledopizai aparece como grupo-irmão desse ramo polifilético que contem as espécies de Anurogryllus. Caracteres moleculares. Foram obtidos dois tipos de moléculas a partir do seqüenciamento na maioria dos exemplares analisados. Uma foi interpretada como o gen funcional e a outra como um pseudogen. A matriz molecular foi obtida a partir de seqüências que tinham, no máximo, 890 bases. De cinco espécies foram obtidas seqüências entre 400 e 600 bases. Para a análise filogenética foi obtida uma matriz com 394 caracteres, selecionando o fragmento das seqüências iniciais comum a todas as espécies, que correspondem a parte do Citocromo Oxidase II. Desses 394 caracteres 120 foram parcimoniosamente informativos resultando em duas árvores mais parcimoniosas com 361 passos, com CI=0,60 e RI=0,62 (Fig. 1B). A análise do consenso mostra ramos bem suportados por bootstrap (10 ramos com valores maiores que 75%). O ramo das espécies de Anurogryllus aqui se apresenta como monofilético. Evidência total. A análise combinada das duas matrizes resultou em apenas uma árvore mais parcimoniosa, com 403 passos, com CI=0,61 e RI=0,61 (Fig. 1C), valores próximos aos da árvore somente molecular. A análise de bootstrap apresentou nove ramos suportados por valores maiores que 75% (Fig. 1C). A árvore da análise combinada é a melhor resolvida, com os mesmos ramos que apresentou a árvore molecular, mas sem as suas politomias.

Acheta domesticus Acheta domesticus Teleogryllus emma Teleogryllus emma

Urogryllus toledopizai Brachytrupes portentosus 95 92 Paranurogyllus capricornio Paranurogyllus capricornio

78 Urogryllus toledopizai 69 Brachytrupes portentosus A.arboreus A.arboreus

90 A.timidus FC A. sp2 66 A.timidus C A. sp3 87 A. sp3 96 87 A.magnobadius A.marimontanus 57 A.marimontanus A.muticus 100 A.timidus FC A.flavus 76 Morfologia- 53 A.timidus C Bioacústica A. sp2 DNA A.flavus 20 AMP A.polymorphus 2 AMP 92 A.muticus 34 passos 361 passos A sp1 CI=0,60 CI=0,79 100 A.polymorphus RI=0,82 A.magnobadius RI=0,62 A sp1 Car=18 Car=394 Cpi=15 A Cpi=120 B

Acheta domesticus Teleogryllus emma

Brachytrupes portentosus

99 Paranurogryllus capricornio

74 Urogryllus toledopizai

A.arboreus 83 A. sp2 67 A. sp3 99 84 79 A.magnobadius 50 EVIDÊNCIA TOTAL A.marimontanus 1 AMP 403 passos 100 A.timidus FC CI=0,61 77 RI=0,61 A.timidus C Car=412 Cpi=135 A.muticus 94 A.flavus 55 A.polymorphus 100 C A. sp1

Figura 1- A.Análise filogenética dos caracteres morfológicos e bioacústicas.B. Análise filogenética dos caracteres moleculares. C. Análise filogenética combinada. A e B árvores de consenso semi-estrito. Valores acima de cada ramo=bootstrap>50%. (AMP=árvores mais parcimoniosas; CI=índice de consistência; RI=índice de retenção; car=no total de caracteres; cpi=caracteres parcimoniosamente informativos).

Discussão

O debate acerca de se e como analisar diferentes fontes de dados apresenta algumas questões importantes. Uma delas é sobre o emprego de dados não-morfológicos, como por exemplo os comportamentais e ecológicos e outra é sobre a maneira de analisar esses conjuntos da dados, ou seja, se devem ser analisados simultânea ou sucessivamente. A inclusão de dados comportamentais e ecológicos também tem sido discutida na literatura a partir da seguinte questão: dados dessa natureza devem ser incluídos na análise ou devem ser analisados a partir de uma hipótese de relacionamento filogenético obtida a partir de outros caracteres? ZRZAVÝ (1997) comenta os argumentos de diferentes autores a favor e contra a inclusão de caracteres ecológicos e comportamentais quando se quer saber sobre sua evolução num determinado grupo de táxons. O autor afirma que eles devem ser incluídos, ainda quando essa inclusão modifique a topologia da árvore. O principal argumento contra a inclusão dos caracteres ecológicos é que se considera que eles são provavelmente adaptativos e, em conseqüência, homoplásticos. No entanto, é preciso ter uma base para afirmar que eles são homoplásticos e não há modo de distinguir homologia secundária de homoplasia antes de formular uma hipótese filogenética. Este autor ainda afirma que os caracteres ecológicos e comportamentais evoluem mais rapidamente, são mais polimórficos individualmente e são menos hereditários que os morfológicos, mas não considera isto, sobretudo a última observação, como problemático. GRANDCOLAS et al. (2001), no entanto, observam justamente esse ponto. Estes autores se declaram favoráveis à inclusão de todos os caracteres disponíveis, sempre que possam ser plausivelmente postulados como hereditários e que a análise filogenética seja baseada no princípio de descendência com modificação. O debate sobre a maneira de analisar diferentes conjuntos de dados é representado pelos defensores da evidência total: análise combinada de todos os dados; da congruência taxonômica; análise separada para verificar o acordo ou consenso entre topologias suportadas pelos diferentes conjuntos de dados; e da combinação condicionada que propõe verificar previamente, mediante testes estatísticos, se há conflito ou não entre os dados e só analisar conjuntamente se não houver. A evidência total é defendida por argumentos como o que diz que um teste múltiplo resulta mais rigoroso do que o teste dos seus componentes, que a classificação por consenso

100

é um procedimento indutivo, que a árvore deve ser dos táxons e não dos genes, que a partição dos dados é arbitrária e que se obtêm árvores sub-ótimas retirando informações da análise, que é possível amplificar um sinal filogenético fraco através da análise combinada (KLUGE, 1989; BARRET et al., 1991). Os autores que defendem a análise separada dos dados de diferentes origens afirmam que obter árvores congruentes a partir de dados independentes representaria uma corroboração do resultado e que a independência é mais provável para caracteres de diferentes sets (MIYAMOTO e FITCH, 1995; SWOFFORD, 1991). São defensores da combinação condicionada autores como BULL et al. (1993) e de QUEIROZ (1996). Ao pretender analisar as relações filogenéticas entre táxons, deve-se considerar que o organismo apresenta caracteres morfológicos, moleculares, comportamentais, ecológicos que, respeitando as condições de hereditariedade, homologia primária (de PINNA, 1991) e independência, deve-se realizar uma análise combinada. GRANDCOLAS et al., no entanto, apontam para a dificuldade de estabelecer uma precisa hipótese de homologia primária em caracteres ecológicos e comportamentais que, em ocasiões, estão muito amplamente definidos. No entanto, pode ser útil visualizar as árvores de cada fonte por separado para perceber onde se encontram as incongruências entre elas. Assim, no nosso caso, percebemos claramente que a análise que conseguiu uma resolução mais precisa foi a combinada. A árvore da evidência total não difere profundamente da obtida a partir das seqüências de DNA. A árvore não-molecular da Fig.1A não apresenta sinapomorfias que sustentem a monofilia do gênero Anurogryllus. As características da genitália masculina somadas à presença de ovipositor reduzido não são suficientes para corroborar a monofilia do gênero nessa análise. O gênero Paranurogryllus, representado por P. capricornio, apresenta uma autapomorfia, a ausência de tégmina, que torna inaplicáveis os caracteres relacionados à morfologia da pars stridens e à bioacústica. Se a análise não-molecular for realizada sem este táxon obtêm-se apenas quatro árvores mais parcimoniosas (Fig 2A) e Anurogryllus aparece como monofilético, mas o seu grupo-irmão é Brachytrupes portentosus e não Urogryllus toledopizai, como na árvore molecular e da evidência total.

101

A análise não-molecular não consegue resolver razoavelmente as relações entre as espécies de Anurogryllus que formam, na sua maioria, parte de politomias. Observar o comportamento dos caracteres morfológicos e bioacústicos na hipótese de evidência total pode trazer informações importantes. Na Fig. 2 é possível observar a árvore de consenso estrito obtida a partir da matriz morfológico-bioacústica excluindo o táxon Paranurogryllus capricórnio (Fig. 2A) e a árvore de evidência total da qual foi apenas removido o mesmo terminal (Fig. 2B). Nos ramos desta última foram plotados os caracteres morfológicos e bioacústicos. Dois caracteres (1 e 11) sustentam o ramo que inclui as espécies consideradas como pertencendo à sub-família Brachytrupinae (todas as analisadas menos A. domesticus e T. emma): a forma em U do esclerito ectofálico proximal (1), que por ser parte da estrutura fálica é uma indicação importante e o outro é a construção de toca (11), ou seja, o hábito subterrâneo. Entre as espécies de Brachytrupinae analisadas, Urogryllus toledopizai é a única com ovipositor bem desenvolvido e que não apresenta cuidado parental. Apesar destas diferenças importantes, a semelhança entre as genitálias de Urogryllus e Anurogryllus é um indício muito forte de que Urogryllus é o gênero mais estreitamente relacionado a Anurogryllus, como aparece na árvore de análise combinada. No entanto, não é possível encontrar sinapomorfias morfológicas ou bioacústicas que suportem esse ramo porque ele não existe na árvore não-molecular. As espécies do gênero Anurogryllus aparecem em um ramo que apresenta seis caracteres como sinapomorfias e no ramo seguinte composto por todos os Anurogryllus menos A. arboreus aparecem mais dois caracteres sinapomórficos. Este ramo é uma politomia na árvore morfológica que exclui a espécie A. timidus. Esta espécie cujo posicionamento é conflitante nas duas análises, apresenta características da bioacústica, da morfologia, da pars stridens e inclusive dos cromossomos que faziam prever que era estreitamente relacionada a A. arboreus e ambas próximas de Urogryllus toledopizai. A. arboreus efetivamente, se apresentou como a espécie mais basal no gênero, mas A. timidus aparece como espécie basal em um dos dois ramos em que se distribuem as demais espécies de Anurogryllus (Fig. 2B). Sendo assim, temos que considerar como reversões características de A. timidus que correspondem aos caracteres não-moleculares 7,

102

Acheta domesticus Acheta domesticus

Teleogryllus emma Teleogryllus emma 12 Brachytrupes portentosus Urogryllus toledopizai 1 1 2 2 11 11 Brachytrupes portentosus

12 Urogryllus toledopizai 14 A. timidus FC

6 A.arboreus 8 A. timidus C 16 6 A. sp2 A. arboreus 8 9(2) 12 A. sp3 14 9 A.flavus 16 A.magnobadius A. sp3 7 A.marimontanus 18 A. polimorphus 7(1) 9(1) 7(0) 18(0) A.timidus FC MORFOLOGIA A. magnobadius 18(1) BIOACÚSTICA A.timidus C 4AMP A.sp1 24 passos A.muticus CI= A. marimontanus RI= A.flavus Car=18 A. muticus Cpi=14 A.polymorphus A. sp2 A. sp1 A B

Figura 2- A. Análise filogenética dos caracteres morfológicos e bioacústicos excluindo o táxon P. capricórnio. B. Análise filogenética combinada da qual foi retirado o terminal correspondente a P. capricórnio para facilitar a comparação e a colocação dos caracteres nos ramos.

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9 e 18. Os dois ramos em que se distribuem os Anurogryllus com exceção de A. arboreus não apresentam sinapomorfias morfológicas ou bioacústicas e só puderam ser obtidos pela análise molecular e combinada. A partir da árvore combinada é possível perceber que alguns dos caracteres não- moleculares devem ser considerados homoplásticos. Eles são o comprimento dos élitros da fêmea (17) e o ciclo de vida (13), este último provavelmente mais relacionado ao clima do que a determinação genética.

A análise das características citogenéticas das espécies de Anurogryllus a partir da árvore de evidência total (Fig. 1C ) mostra que a espécie mais basal, A. arboreus, apresenta o cariótipo básico. No ramo de A. timidus, A.sp2, A.sp3, A. magnobadius e A. marimontanus, a espécie mais basal apresenta o cariótipo básico, do ramo seguinte se separa A. sp2, também com o cariótipo básico, e um ramo com três espécies. Entre estas, de A. sp3 não conhecemos o cariótipo, enquanto que A. magnobadius e A. marimontanus apresentam uma única fusão cêntrica entre cromossomos de tamanho grande. No ramo de A. muticus, A. flavus, A. polimorphus e A. sp1, a espécie mais basal (A. muticus) apresenta apenas um rearranjo, enquanto que A. flavus e A. polymnorphus apresentam três e A. sp1, embora apresente apenas um este é caracteristicamente diferente dos demais porque resulta em um par cromossômico submetacêntrico, implicando na participação de um par pequeno e um grande. Parece confirmar-se a hipótese de que o cariótipo chamado de básico, que não apresenta rearranjos, constitui uma característica mais plesiomórfica. Fica em destaque, mais uma vez, a dificuldade para encontrar caracteres não- moleculares nestas espécies tão semelhantes morfologicamente, mas que foram bem diferenciadas e analisadas a partir das seqüências de DNA mitocondrial. O cladograma dos dados bioacústicos e morfológicos resultou numa boa resolução, o que se reflete pelos altos índices de consistência, embora não apresentou o gênero Anurogryllus como monofilético. Uma estudo mais amplo, incluindo maior número de amostras de populações de Anurogryllus, assim como um maior número de caracteres moleculares e não-moleculares, poderia ser esclarecedor no sentido de compreender melhor a evolução do gênero. Mas também se faz necessário no sentido de proporcionar elementos para a melhor resolução da taxonomia das espécies do gênero Anurogryllus.

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Onde está o conhecimento que perdemos na informação? Onde está a sabedoria que perdemos no conhecimento? T. S. Elliot

O amor é a única coisa que cresce quando se reparte. Antoine de Saint-Exupéry

Considerações Finais

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X- CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este trabalho começou a partir das coletas realizadas ainda durante o mestrado (1998-2000), em que foram sendo coletados espécimens de Anurogryllus de diversas localidades, observando suas semelhanças, procurando descobrir suas diferenças, e, ainda, tentando decifrar se as diferenças encontradas eram constantes e significativas. Nas análises morfológicas foram encontradas diferenças que mostraram ser variações intraespecíficas, como a forma do labro, e grande uniformidade quanto à forma dos escleritos fálicos. Coloração, tamanho e características do som, associados, foram os caracteres que fizeram possível determinar as espécies tal como aparecem neste trabalho. Começando com 21 populações, no início tudo parecia confuso. Só depois de muito tempo de comparações, de medidas, de desenhos de estruturas é que foi realizado o agrupamento em espécies, sem nunca deixar de ter em mente a problemática do conceito de espécie. Se a definição de espécies é um procedimento de dois tempos, como citado na Introdução, no caso das espécies deste trabalho a análise se encontra apenas no primeiro tempo, ou seja, na definição das espécies em quanto categorias. Assim, é proposta uma 110 primeira classificação e são dados nomes a esses grupos de populações que interpretamos como distribuídos em seis espécies novas e uma já descrita (A. muticus). Mas temos consciência de que este trabalho apenas começa a labor de compreender a complexa rede das relações e dos efeitos do caminho evolutivo percorrido por cada população. Não estamos propondo que nossa classificação corresponde a espécies biológicas, isso precisa ser ainda testado, é apenas uma classificação que, com base nos dados disponíveis, nos parece um ponto de partida. Há vários caminhos possíveis e complementares de continuação deste trabalho. Imagino uma equipe de trabalho em que cada um tenha sua especialidade (morfologia, cotogenética, bioacústica, etologia, genética molecular, taxonomia, sistemática filogenética), mas a desenvolva sem perder contato com o problema geral: interpretar a evolução biológica e biogeográfica de um gênero de espécies dificilmente diferenciáveis aos nossos olhos. O gênero ocorre em toda a América do Sul, pelo menos desde Buenos Aires para o norte, até América Central e Sul de América do Norte (Florida). A coleta é relativamente fácil já que a maioria das espécies convive com os seres humanos e ocorre em praças e gramados nas cidades. Comparações minuciosas de amostras de machos e fêmeas quanto a características morfológicas qualitativas e quantitativas poderiam determinar mais precisamente padrões que possam ajudar a identificar as espécies. Isso seria importante para trabalhar com espécimes que se encontrem em museus, que poderiam fornecer dados importantes sobre a distribuição geográfica, se pudessem ser classificados com razoável segurança. Análises citogenéticas sofisticadas poderiam ser realizadas para averiguar quais pares do cariótipo básico estão envolvidos em cada rearranjo. A ocorrência de cromossomos supernumerários em várias populações poderia também ser objeto de estudo mais detalhado. Ainda no que diz respeito ao estudo citogenético, as características da meiose no macho de Anurogryllus, que ocorre durante um período bem determinado do desenvolvimento, poderia merecer um estudo da espermatogênese nessas espécies. Do ponto de vista da bioacústica e comportamento, testes experimentais de preferência das fêmeas por diferentes emissões sonoras poderiam ser feitos para verificar o grau de isolamento pré-zigótico entre as populações. 111

Cruzamentos controlados acompanhados do estudo morfológico, citogenético e bioacústico das sucessivas gerações que, eventualmente forem obtidas contribuiria grandemente para determinar se as espécies inicialmente determinadas podem ser consideradas como tais do ponto de vista biológico ou não. Essas populações analisadas molecularmente poderiam oferecer uma hipótese filogenética sobre a qual colocar os dados citogenéticos e sonoros e acompanhar suas transformações.