UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS:

“Actividad antimalárica in vitro por citometría de flujo de extractos de especies vegetales de la familia Apocynaceae de la Región Loreto, LIPNAA- Iquitos, 2016”.

Para optar el Título Profesional de: QUÍMICO FARMACÉUTICO

Autores:

Bach. MEDRANO GARCÍA, ADRIANA ISABEL

Bach. SHAHUANO MUENA, LUCY MARCELITH

Asesores:

Q.F. RUIZ VÁSQUEZ, LILIANA, Dra.

Q.F. CHONN CHANG, ANDRES

Iquitos – Perú

2017

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ii iii

ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA IN VITRO POR CITOMETRÍA DE FLUJO DE EXTRACTOS DE ESPECIES VEGETALES DE LA FAMILIA APOCYNACEAEDE LA REGIÓN LORETO, LIPNAA – IQUITOS, 2016 Medrano García Adriana Isabel y Shahuano Muena Lucy Marcelith

Resumen

Evaluar la actividad antiplasmodial in vitro por citometría de flujo de 17 extractos etanólicos y 15 extractos alcaloidales básicos, obtenidos de ocho especies vegetales de la familia Apocynaceae de la Región Loreto. Las cepas empleadas fueron: Plasmodium falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) y cepa 3D7 (cloroquina sensible), cultivadas por la metodología de Trager y Jensen con modificaciones. El ADN de P. falciparum se tiño con bromuro de etidio para su cuantificación por citometria de flujo. De los extractos ensayados, 15 resultaron activos inhibiendo el crecimiento de alguna de las cepas de Plasmodium, siendo el extracto etanólico de hojas de Odontadenia geminata el que presentó mayor actividad frente a la cepa FCR-3 (cloroquina resistente); y el extracto alcaloidal básico de hojas de Malouetia tamaquarina frente a la cepa 3D7 (cloroquina sensible). El tamizaje fitoquímico reveló la presencia de alcaloides, lactonas y flavonoides, entre otros metabolitos hallados.

Palabras clave: Extractos vegetales, actividad antiplasmodial, citometría de flujo, Plasmodium falciparum, tamizaje fitoquímico.

iv

IN VITRO ANTIMALARIAL ACTIVITY BY FLOW CITOMETRY OF APOCYNACEAE FAMILY’S PLANTS EXTRACTS OF THE REGION LORETO, LIPNAA – IQUITOS, 2016. Medrano García Adriana Isabel and Shahuano Muena Lucy Marcelith

Abstract

The in vitro antimalarial activity of 17 ethanolic extracts and 15 basic alkaloid extracts obtained from eight plant species of the Apocynaceae family coming from the Loreto Region, was evaluated by flow cytometry. The strains used were: Plasmodium falciparum strain FCR-3 (resistant chloroquine) and strain 3D7 (sensitive chloroquine), cultivated by the methodology of Trager and Jensen with modifications. The P. falciparum DNA was stained with ethidium bromide for quantification by flow cytometry. Of the extracts tested, 15 were active inhibiting the growth of some of the strains of Plasmodium. The ethanolic extract of leaves of Odontadenia geminata showed the greatest activity against the strain FCR-3 (resistant chloroquine); and the alkaloidal extract of leaves of Malouetia tamaquarina against the strain 3D7 (sensitive chloroquine). Phytochemical screening revealed the presence of alkaloids, lactones and flavonoids, among other metabolites.

Key words: Vegetal extracts, antimalarial activity, flow cytometry, Plasmodium falciparum, phytochemical screening.

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DEDICATORIA

A Dios Padre Todopoderoso Jehová, por guiarme e iluminarme en cada paso dado.

A mis abuelitos Julio Efraín Medrano Yaya e Isabel Olimpia Vera Salazar, que hoy viven y vivirán en mi corazón, y que desde la eternidad velan cada uno de mis caminos y a mi abuelita Asunción Pérez Saboya, por cada uno de sus sabios consejos en todo momento.

A mis padres Manuel Ubaldo Medrano Vera y Margiori García Pérez, por todo su amor y comprensión, no hay mayor bendición que saber que son mis padres. A mis hermanos Jeannes, Margiori y Alonso, por ser el complemento ideal de mi vida. A mi cuñado Matthew, por cada uno de sus buenos deseos y a mi sobrinito Joseph por ser el nuevo motor de mi vida.

A todos mis familiares que, a pesar de la distancia, siempre han estado presentes y me han brindado todo lo mejor que he podido recibir, en especial a mi tío Raúl Molina Vera, por tener a mi familia siempre presente en sus oraciones y ser el mejor ser humano que he podido conocer.

Bach. Adriana Isabel Medrano García

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DEDICATORIA

Dedicado en primer lugar a Dios Padre Todo Poderoso que ilumina en mi vida, es mi guía en todo momento y me permitió terminar la realización de mi tesis.

A mis queridos abuelitos paternos Vicente Shahuano y Olivia Macedo; también a mi abuelita materna Hermelinda Paredes que a pesar de no tener sus presencias en vida sé que estarían muy orgullosos de este logro y por tal motivo siempre los llevo presente en mi corazón y a mi abuelito Jorge Muena.

A mis padres Pablo y Tulsa, que a pesar de la distancia son mi motor y motivo para seguir adelante, por sus palabras de aliento, su ayuda moral y económica en lo que podían.

A mis hermanos Jimmy, Olivia, María y Gianina por confiar en mí, sentirse orgullosos por mi esfuerzo, por su apoyo emocional, los quiero mucho.

A mi tía Lucy y Primo Daniel por ser las personas que me brindaron su ayuda tanto económica, como moral en cada momento, por sus consejos y enseñanzas de la vida, ellos son las personas a las que yo estaré eternamente agradecida.

En general a toda mi familia y amigos que de una forma u otra me brindaron su apoyo, compartieron conmigo buenos y malos momentos.

Bach. Lucy Marcelith Shahuano Muena

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AGRADECIMIENTOS Al Laboratorio de Productos Naturales Antiparasitarios de la Amazonía – LIPNAA, de forma especial a la Dra. Lastenia Ruiz Mesia, por haber depositado su confianza en nosotras y permitirnos formar parte del “Proyecto Multidisciplinario 2015 – 2017: “Actividad in vitro de compuestos antiparasitarios, como alternativa a las drogas en uso para manejo de malaria Falciparum y Leishmaniasis” y asignarnos este proyecto de tesis.

Al Ing. Juan Celedonio Ruiz Macedo y Dr. Wilfredo Ruiz Mesia, por el apoyo en la identificación y colección de las especies vegetales empleadas en la realización del presente trabajo.

A la Ing. Leonor Arévalo Encinas, Ing. Hively Ericka Ricopa Cotrina e Ing. Jorge Manases Ríos, por el apoyo y tiempo brindado en capacitarnos para la realización de la parte fitoquímica de nuestro proyecto.

Al Q.F Jhesus Jean Pierre López Mesia, Bach. Rafael José Luis Saavedra Langer y Bach. María Esteyner Vásquez Chasnamote por el tiempo, paciencia y dedicación brindada al capacitarnos y guiarnos en la parte biológica de nuestro proyecto.

A nuestros asesores, Q.F Andres Chonn Chang y Dra. Liliana Ruiz Vásquez, por sus conocimientos brindados para la realización de nuestro proyecto, por ser grandes motivadores e incentivarnos a dar lo mejor de nosotras.

De manera especial a todo el equipo del LIPNAA - CIRNA, por brindarnos la más grandiosa recompensa, su amistad y buenos deseos, durante todo el proceso de nuestro proyecto, cada uno permanecerá en nuestros corazones y formará parte de esta etapa tan fructífera de ser tesistas.

Gracias.

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ÍNDICE DE CONTENIDO

Pág. RESUMEN iv ABSTRACT v DEDICATORIA vi AGRADECIMIENTOS viii ÍNDICE DE CONTENIDO ix ÍNDICE DE FIGURAS xiii ÍNDICE DE TABLAS xiv ÍNDICE DE ANEXOS xv LISTA DE ABREVIATURAS xvi

CAPÍTULO I

1.1. INTRODUCCIÓN 02 1.2. OBJETIVOS 04 1.2.1. Objetivo general 04 1.2.2. Objetivos específicos 04

CAPÍTULO II

2.1. MARCO TEÓRICO 06 2.1.1. Extractos y productos naturales con actividad antiplasmodial 06 2.1.2. Familia Apocynaceae 09 2.1.2.1. Especies endémicas de la familia Apocynaceae en el Perú 11 2.1.3. Aspectos generales sobre la malaria 11 2.1.3.1. Género Plasmodium 12 2.1.3.2. Ciclo biológico del Plasmodium 13 2.1.3.3. Estadios del parásito 16 2.1.3.4. Malaria en el Perú y la región Loreto 17 2.1.4. Citometría de flujo 18 2.1.4.1. Estructura básica de un citómetro de flujo 18

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2.1.4.2. Información obtenida por el citómetro de flujo 20 2.1.4.3. Visualización de datos 21 2.1.4.4. Parámetros que se pueden analizar por citometría de flujo 21 2.1.4.5. Actividad antiplasmodial por citometría de flujo 22 2.1.4.6. Ventajas y desventajas de la citometría de flujo 23 2.2. HIPÓTESIS 24

CAPITULO III

3.1. METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN 26 3.1.1. Tipo de estudio 26 3.1.2. Diseño de investigación 26 3.1.3. Población 26 3.1.4. Muestra 26 3.1.5. Criterios de selección 27 3.1.5.1. Criterios de inclusión 27 3.1.5.2. Criterios de exclusión 27 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS 27 3.2.1. Materiales de laboratorio 27 3.2.1.1. Obtención de extractos y tamizaje fitoquímico 27 3.2.1.2. Cultivos in vitro 28 3.2.2. Reactivos 29 3.2.2.1. Obtención de extractos y tamizaje fitoquímico 29 3.2.2.2. Preparación de reactivos 30 3.2.2.3. Cultivos in vitro 31 3.2.3. Equipos 31 3.2.3.1. Obtención de extractos, tamizaje fitoquímico y cultivos in vitro 31 3.2.4. Material vegetal y preparación de extractos 32 3.2.4.1. Descripción y recolección de las especies vegetales 32 3.2.4.2. Procedimiento general de extracción 34 3.2.5. Adaptación al cultivo y actividad antiplasmodial in vitro 35 3.2.5.1. Procedimientos para el cultivo in vitro de P. falciparum 36 A. Preparación de medios de cultivo in vitro 36

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B. Cultivo in vitro de P. falciparum 37 C. Evaluación de la actividad antiplasmodial in vitro 40 D. Medición de la parasitemia por citometría de flujo 43 3.2.6. Tamizaje fitoquímico 43 3.2.6.1. Primera ruta (Dilución etanólica) 44 3.2.6.2. Segunda ruta (Dilución acida) 45 3.2.6.3. Tercera ruta (Dilución clorofórmica) 45 3.3. ASPECTOS ÉTICOS 46 3.3.1. Participación de donantes 46 3.3.2. Proceso de consentimiento informado 46 3.3.3. Medidas de bioseguridad 46 3.3.3.1. Equipos de protección personal 46 3.3.3.2. Técnicas asépticas 46 3.3.3.3. Precauciones universales 46 3.4. PLAN DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS 47

CAPÍTULO IV

4.1. RESULTADOS 49 4.1.1. Extractos 49 4.1.2. Cultivos y ensayos de actividad antiplasmodial in vitro 50 4.1.2.1. Cultivo in vitro de las cepas de P. falciparum 50 4.1.2.2. Ensayos de actividad antiplasmodial in vitro 51 4.1.2.3. Extractos etanólicos de especies vegetales en estudio vs extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa FCR-3 65 4.1.2.4. Extractos alcaloidales de especies vegetales en estudio vs extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa FCR-3 66 4.1.2.5. Extractos etanólicos de especies vegetales en estudio vs extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa 3D7 67 4.1.2.6. Extractos etanólicos de especies vegetales en estudio vs extracto

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alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa 3D7 68 4.1.3. Tamizaje fitoquímico 68 4.2. DISCUSIÓN 70 4.3. CONCLUSIONES 77 4.4. RECOMENDACIONES 78 4.5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 79 4.6. ANEXOS 84

xii

ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1: Aparato conoidal del phylum Sporozoa (apicomplexa) 12 Figura 2: Ciclo sexual o esporogónico del Plasmodium 14 Figura 3: Ciclo asexual o esquizogónico del Plasmodium 14 Figura 4: Diagrama esquemático de una celda de flujo 19 Figura 5: Citómetro de flujo típico de dos colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia: 20 Figura 6: Porcentaje de rendimiento de los extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos 49 Figura 7: Crecimiento de la parasitemia de P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible) 50 Figura 8: Diagrama de cajas comparativo del porcentaje de inhibición de los extractos etanólicos frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible) 55 Figura 9: Diagrama de cajas comparativo del porcentaje de inhibición de los extractos alcaloidales básicos frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible) 56

Figura 10: Gráficos de IC50 de extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos activos frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) 61

Figura 11: Gráficos de IC50 de extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos activos frente a P. falciparum cepa 3D7 (cloroquina sensible) 64

xiii

ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1: Clasificación taxonómica de la familia Apocynaceae 10 Tabla 2: Taxonomía de Plasmodium 13 Tabla 3: Preparación de las diluciones seriales de los extractos 41 Tabla 4: Preparación del control negativo DMSO 0,2% 41 Tabla 5: Preparación del mix de glóbulos rojos 42 Tabla 6: Actividad antiplasmodial de los extractos etanólicos y extractos alcaloidales frente a P. falciparum cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible) 53

Tabla 7: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) 65

Tabla 8: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) 66

Tabla 9: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) 67

Tabla 10: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) 68

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ÍNDICE DE ANEXOS Pág. Anexo 1: Mapa epidemiológico de incidencia de casos de malaria por P. falciparum en el departamento de Loreto 85 Anexo 2: Casos de malaria por P. falciparum por semana. Loreto 2012 – 2015 85 Anexo 3: Flujograma de recolección de datos 86 Anexo 4: Definiciones operacionales 87 Anexo 5: Exicata de las especies vegetales 89 Anexo 6: Lugar de ubicación de las 08 especies vegetales 90 Anexo 7: Obtención de extractos etanólicos 91 Anexo 8: Extracción de alcaloides (Marcha alcaloidal) 91 Anexo 9: Flujograma de evaluación actividad antiplasmodial in vitro 92 Anexo 10: Preparación de medios para cultivo in vitro 93 Anexo 11: Descongelación de las cepas de P. falciparum 93 Anexo 12: Mantenimiento de cultivo in vitro de P. falciparum 94 Anexo 13: Sincronización de cepas de P. falciparum 94 Anexo 14: Evaluación de la actividad antiplasmodial in vitro 95 Anexo 15: Diluciones seriales de los extractos a ensayar 95 Anexo 16: Configuración de la placa de 96 pozos 96 Anexo 17: Medición de la parasitemia por citometría de flujo 97 Anexo 18: Porcentaje de rendimiento de extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos 98 Anexo 19: Procedimiento de tamizaje fitoquímico 99 Anexo 20: Tamizaje fitoquímico de los extractos etanólicos con actividad antiplasmodial 100 Anexo 21: Normas de bioseguridad 101

xv

LISTA DE ABREVIATURAS Y FÓRMULAS QUÍMICAS

AcOEt: Acetato de Etilo CCF: Cromatografía de capa fina

CH2Cl2: Diclorometano Cód.: Código CQ-R: Cloroquina resistente CQ-S: Cloroquina sensible DMSO: Dimetilsulfóxido EtOH: Etanol

Ext H2O/OH: Extracto hidroalcohólico ET: Extracto etanólico EAB: Extracto alcaloidal básico Ext: Extracto

FeCl3: Cloruro férrico

H2SO4: Ácido sulfúrico HCl: Ácido clorhídrico Hx: Hexano

IC50: Concentración inhibitoria 50 KOH: Hidróxido de potasio MeOH: Metanol

Na2CO3: Carbonato de sodio NaCl: Cloruro de sodio NaOH: Hidróxido de sodio

NH4OH: Hidróxido de amonio RPMI: Roswell Park Memorial Institute

RPMIC: Medio completo RPMI

RPMII: Medio incompleto RPMI

S1CN: Stock 1 del control negativo al 10%

S2CN: Stock 2 del control negativo al 0.2%

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CAPITULO I

1

1.1. INTRODUCCIÓN

A nivel mundial la malaria o paludismo es una de las enfermedades más patógenas, originada por protozoarios del género Plasmodium, de mayor presencia en regiones tropicales y sub-tropicales del planeta. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha reiterado que la malaria constituye un problema grave de salud pública. Los esfuerzos para reducir el impacto de la enfermedad, principalmente la resistencia del parásito a los fármacos tradicionalmente empleados, así como la resistencia del mosquito vector a los insecticidas resultan insuficientes, provocando más muertes que cualquier otra enfermedad transmisible con la excepción de la tuberculosis y el sida 1.

Alrededor del 40% de la población mundial vive en áreas consideradas endémicas. El Perú es uno de los países de América Latina con mayor número de casos reportados de malaria, después de Colombia y Brasil, extendida en el 75 % del territorio nacional, donde reside el 35% de la población nor-oriental peruana (19 millones de habitantes), primordialmente zonas rurales. Tres zonas son definidas de transmisión: la región costa norte, la región selva amazónica y la región selva central 1, 2.

A nivel nacional el área con más riesgo de enfermar de malaria es la región Loreto. A la Semana Epidemiológica 51 (SE 51) del año 2015, se notificaron 60 988 casos de malaria, de los cuales el 94,9% fueron notificados en el departamento de Loreto. Para la misma semana del año 2016 (SE 51), se notificó 55 441 casos, siendo un 9% menos comparado con el año anterior, sin embargo, Loreto reportó el 96,6% de los casos notificados (53 550) de los cuales 71,8% fue causado por P. vivax y 28,2% por P. falciparum, reportando 07 muertes, 04 por P. falciparum, de esa forma observando un incremento sostenido de casos de malaria en nuestra región donde son nueve distritos clasificados escenario de muy alto riesgo y 17 de alto riesgo 3.

La carencia de diversidad estructural de los antimaláricos en uso y el rezago de las grandes industrias farmacéuticas en el desarrollo de nuevos prototipos, constituyen una urgente búsqueda de nuevas drogas. La flora amazónica peruana constituye una de las mayores reservas de recursos fitoterapéuticos en el mundo demostrado potencial para proveer drogas efectivas. Desde tiempos ancestrales los pueblos

2 amazónicos han hecho uso de estas para curar enfermedades y síndromes 1, 4, 5. En 1649 los Jesuitas, en el libro “Shedula Romana”, publican el primer informe sobre la “quina” o “Cinchona”, (Cinchona officinalis), de esta planta se aislaron diversos alcaloides entre ellos la quinina, compuesto utilizado durante más de trescientos años y que sigue siendo en la actualidad el fármaco de elección para tratar casos de malaria6. Además, de la especie Artemisia annua (Asteraceae), originaria de China y Vietnam, se aisló un compuesto natural del tipo sesquiterpeno lactona endoperóxido, la artemisina, un potente antimalárico utilizado para tratar la malaria grave multidroga-resistente 7.

En vista de las posibilidades alcanzadas con dos principios activos en la terapia antimalárica, el presente trabajo se plantea evaluar la actividad antiplasmodial in vitro de 17 extractos etanólicos y 15 extractos alcaloidales básicos, obtenidos a partir de ocho especies vegetales seleccionadas de la familia Apocynaceae, frente a las cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible) de P. falciparum. Las cepas utilizadas fueron cultivadas por la metodología descrita por Trager y Jensen con modificaciones y la lectura de actividad de los extractos ensayados se realizó por citometría de flujo, mediante la tinción del ADN del parásito, con la finalidad de encontrar extractos con potencial actividad antiplasmodial.

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1.2. OBJETIVOS

1.2.1. OBJETIVO GENERAL  Determinar la actividad antimalárica in vitro por citometría de flujo de extractos de especies vegetales de la familia Apocynaceae de la región Loreto, LIPNAA- Iquitos, 2016.

1.2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Obtener los extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos de las especies vegetales de la familia Apocynaceae en estudio.  Medir la actividad antimalárica in vitro de los extractos de las especies vegetales seleccionadas de la familia Apocynaceae frente a P. falciparum cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible) por citometría de flujo.  Realizar el tamizaje fitoquímico de los extractos etanólicos que presenten actividad antimalárica.

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CAPITULO II

5

2.1. MARCO TEÓRICO

2.1.1. PRODUCTOS Y COMPUESTOS QUÍMICOS DE ORIGEN NATURALES CON ACTIVIDAD ANTIPLASMODIAL

En los antecedentes se han reportado la actividad antiplasmodial de extractos y compuestos puros de diferentes especies frente a cepas de P. falciparum. Así, se ha descrito cuatro especies vegetales de género Rauwolfia (Apocynaceae), donde se obtuvieron un total de 21 extractos entre extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos, evaluados frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente), por citometría de flujo. Los extractos alcaloidales ácidos y básicos de la raíz de R. macrantha y el extracto alcaloidal básico de tallos de R. sprucei, resultaron con 8 buena actividad (IC50 = 2,80; 3.91 y 3,96 g/mL, respectivamente) .

El extracto metanólico de la corteza de Geissospermum vellosii (Apocynaceae), (IC50 = 2,22 g/mL) y cinco alcaloides indólicos obtenidos de la misma especie: geissolosimina (IC50 = 0,66 g/mL); geissospermina (IC50=0,65 g/mL); geissoschizolina (IC50 = 0,89 g/mL); geissoschizona (IC50 = 1,78 g/mL); vellosiminol (IC50 = 1,04 g/mL), se evaluaron in vitro frente a P. falciparum cepa D10 (cloroquina sensible), mostrando muy buena actividad antimalárica 9.

Veinticuatroextractos etanólicos y extractos alcaloidal básicos, obtenidos de seis especies vegetales de la Región Loreto (Apocynaceae), se evaluaron in vitro frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente), por citometria de flujo, de trece extractos que resultaron activos, los extractos etanólicos de hojas de Aspidosperma camporum (IC50 = 1,60 g/mL), A. cruentum woods (IC50 = 2,70 g/mL),extracto alcaloidal básico de A. sp (IC50 = 3,50 g/mL), y extracto etanólico de corteza de la raíz de A. spruceanum Bent ex Mull Arg. (IC50 = 6,80 g/mL), fueron los que presentaron mejor actividad antimalárica10. Además, de las especies A. pyrifolium y A. megalocarpon se aislaron 12 alcaloides indólicos, que fueron evaluados in vitro frente a P. falciparum (cloroquina sensible) de Nigeria y P. falciparum cepa FcM29 – Cameroon (cloroquina resistente); de los compuestos ensayados: apidospermidina, aspidospermidina, dimetoxi – aspidospermina y palosina fueron los que mostraron

6

11 mejor actividad con una IC50 entre 3,20 y 15,40 M . De A. macrophylla, el alcaloide bis- indólico, villalstonina (IC50 = 0,27 μM), evaluado in vitro frente a P. falciparum, presentó una potente actividad antimalárica, y se compara con la del 12 medicamento estándar cloroquina (IC50 = 0,20 μM) .

El alcaloide bis-indólico voacamina (IC50 = 0,28 µM) aislado de Peschiera fuchsiaefolia (Apocynaceae), presentó potente actividad in vitro contra cepas sensibles y resistentes de P. falciparum 13.

También se reporta especies de otras familias, que mostraron importantes resultados de actividad antimalárica, como los extractos etanólicos de hojas y tallos de especies vegetales del género Piper (Piperácea): P. aduncum; P. auritum Kunth, P. jericoense Trel. & Yunck., P. obrutum Trel. & Yunck y P. marginatum Jacq, colectadas en Antioquia, Colombia, fueron evaluados in vitro frente a P. falciparum cepa NF54 (cloroquina sensible); de los cuales sólo dos extractos presentaron moderada actividad, las hojas de P. jericoense (IC50 = 27,94 g/mL) y P. aduncum (IC50 = 26,50 g/mL) 13.

Los extractos etanólicos de seis especies vegetales utilizadas en la medicina tradicional cubana: Annona glabra L., Bidens pilosa L., Cecropia peltata L., Curcuma longa L., Hura crepitans L. y Pulchea odorata (L.), se evaluaron in vitro frente P. falciparum cepa Ghana (cloroquina sensible); de las cuales sólo el extracto 14 de las hojas de Hura crepitans mostró buena actividad (IC50 = 5,70 g/mL) .

De 50 extractos obtenidos de distintas especies vegetales de la Amazonía Peruana, evaluados in vitro frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) por citometria de flujo, 19 mostraron actividad (IC50< 10 μg/mL), donde los extractos hidroalcohólicos de la corteza de Alchornea triplinervia y hojas de Vismia macrophylla, además de los extractos etanólicos de la corteza de Ormosia macrocalyx mostraron mayor actividad (IC50 = 1,70; 2,10; 1,90 g/mL, respectivamente) 15.

De 9 especies vegetales provenientes de la Amazonía Peruana, obtuvieron 27 extractos que fueron evaluados in vitro frente a P. falciparum cepa FCR-3

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(cloroquina resistente), mediante método visual directo. Presentando buena actividad los extractos diclorometánicos y extracto etanólico de la raíz de Euterpe oleracea

(IC50 = 3,00 y 5,00 μg/mL, respectivamente), los extractos acuoso y extracto etanólico de la corteza Myrciaria dubia (IC50 = 3,00 y 6,00 μg/mL, respectivamente) 16 y el extracto acuoso del látex seco de Croton lechleri (IC50 = 2,00 μg/mL) .

De 13 especies vegetales más citadas sobre el uso popular en el tratamiento de Malaria y Leishmaniasis en once distintas áreas geográficas y étnicas entrevistadas en la región Loreto, 11 mostraron significante actividad antimalárica, de los cuales Aspidosperma rigidum, Curarea tecunarum, Minquartia guianensis, Maytenus spp., Citrus lemon, Curcuma longa, Campsiandra angustifolia, Remijia peruviana, mostraron mayor eficacia (IC50< 10 g/mL), tras ser evaluados in vitro frente a P. falciparum cepa 3D7 (cloroquina sensible) 17.

Veintidós extractos diclorometánicos de 15 especies vegetales recolectadas por su uso en la medicina tradicional para el tratamiento de malaria, leishmaniasis cutánea y muco – cutánea en Colombia, mostraron buena actividad antiprotozoaria, de los cuales 12 extractos evaluados frente a P. falciparum cepa F32 - Tanzania (cloroquina sensible) y P. falciparum cepa D2 (cloroquina resistente), resultaron ser activos; el extracto de la corteza de Aspidosperma megalocarpon mostró una buena actividad frente a la cepa D2 (cloroquina resistente) y F32 - Tanzania (cloroquina sensible):

IC50 = 25,00 y 8,00 g/ml respectivamente, el extracto de las hojas de Tabernaemontana obliqua frente a la cepa F32 (cloroquina resistente), también mostró buena actividad (IC50 = 25,00 g/ml), ambas especies pertenecientes a la familia Apocynaceae 18.

Los alcaloides aporfirinicos de los extractos de acetato de etilo de los tallos de Rollinia pittieri y Pseudomalmea boyacana, se evaluaron in vitro frente a P. falciparum cepa F32 - Tanzania (cloroquina sensible) y P. falciparum cepa W2 (cloroquina resistente). De los compuestos evaluados la liriodenina presentó mayor 19 actividad (IC50 = 8,00 – 10,00 g/ml) .

Se determinó la actividad antimalárica in vitro de 35 extractos hidroalcohólicos obtenidos de 21 especies vegetales más citadas como remedios tradicionales

8 utilizados por poblaciones del río Nanay en la Región Loreto, frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente) y test de inhibición de la biopolimerización de la ferriprotoporfirina IX (FBIT). Del total, 21 extractos evaluados mostraron una

20 actividad interesante (IC50< 10g/ml) y 16 extractos resultaron activos a FBIT .

Mediante cultivo in vitro frente a P. falciparum cepa F32 - Tanzania (CQ-S) y FBIT se determinó la actividad antimalárica de los EAB de corteza Remijia peruviana y Geissospermum reticulatum, siendo activos tanto en FBIT como frente a la cepa ensayada. Mediante fraccionamiento cromatográfico de R. peruviana se identificó una fracción compuesta por alcaloides polares como los responsables de la actividad

(FBIT IC50 = 0,41 mg/ml; P. falciparum IC50 = 2,90 g/ml) y en el caso de G. reticulatum, la fracción estaba compuesta por alcaloides medianamente polares

21 (FBIT IC50 = 1,00 mg/ml; P. falciparum IC50 = 8,00 g/ml) .

En otro estudio por FBIT, se evaluó la actividad antimalárica in vitro de 36 ET crudos de 36 especies medicinales de la etnia Guaraní (Bolivia). Nueve resultaron activos: Vallesia glabra (IC50 = 1,12 mg/ml), Bumelia obtusifolia (IC50 = 1,17 mg/ml), Caesalpinea paraguayensis (IC50 = 1,69 mg/ml), Maclura tindaria (IC50 =

1,76 mg/ml), Enterolobium cotorsiliqum (IC50 = 1,98 mg/ml), Argemone subfusiformis (IC50 = 2,48 mg/ml), Moreria odorata (IC50 = 3,25 mg/ml), Geoffroea 22 decorticans (IC50 = 3,90 mg/ml), Guazuma ulmifolia (IC50 = 4,00 mg/ml) .

2.1.2. FAMILIA APOCYNACEAE

La familia Apocynaceae son unas dicotiledóneas con características botánicas específicas, ricas en alcaloides y muchas de ellas tóxicas, incluye árboles, arbustos, o lianas con látex blanco (claro o coloreado) en todos los órganos; agrupa de 250 a 550 géneros y entre 3700 a 5100 especies, aunque esta familia tiene una distribución cosmopolita, la mayoría de sus especies están concentradas en los trópicos y subtrópicos. Algunas son hierbas perennes de zonas templadas. Estas especies tienen savia lechosa y muchas son venenosas si se ingieren 23, 24.

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Tabla 1: Clasificación taxonómica de la Familia Apocynaceae 23. Familia Apocynaceae Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Gentianales Familia Apocynaceae Apocynoideae Asclepiadoideae Sub-familias Periplocoideae Rauvolfioideae Secamonoideae

Dentro de la familia Apocynaceae algunos géneros de importancia alcaloidal son: Ambelania, Allamanda, Aspidosperma, Condylocarpon, Couma, Forsteronia, Himatanthus, Lacmellea, Laxoplumeria, Macoubea, Malouetia, Mandevilla, Odontadenia, Parahancornia, Prestonia, Strychnos, Rauwolfia y Vinca 24.

Existen 800 alcaloides de tipo indólicos, (derivados del triptófano), en la familia Apocynaceae distribuidos principalmente en los géneros Rauwolfia, Aspidosperma, Strychnos y Vinca, familia considerada fuente principal de alcaloides mono y bis – indólicoscon actividad antiparasitaria. Las especies vegetales Aspidosperma pyrifolium, A. megalocarpon, A. excelsum, A. polineuron, Geissospermum sericeum, G. vellosii, incluyen en su composición alcaloides indólicos que han demostrado tener una variada gama de actividades biológicas, entre destacan la antibacteriana, tripanosomal, leishmanial, antimalárica y anticancerosa 25, 26.

Especies del género Thevetia y Nerium dentro de sus compuestos presentan glúcidos cardiotónicos, utilizados en el tratamiento de enfermedades cardíacas. Los alcaloides de las raíces de Rauwolfia poseen marcada actividad biológica: neurosedante y antihipertensivo y/o antiarrítmico, la especie Rauwolfia serpentina (L.) Kurz, de origen asiático, es conocida por sus propiedades febrífugas y antiepilépticas, en 1952 se aisló la reserpina, alcaloide principal de la raíz, y rescinamina con propiedades hipotensoras y sedantes, de Catharanthus roseus (L.) G. Don, originaria de

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Madagascar (cultivada en nuestro país como ornamental), se obtuvieron más de 90 alcaloides entre ellos la vincristina y la vinblastina empleadas en el tratamiento de la leucemia, cariocarcinomas, etc; y de Aspidosperma quebracho – blanco Schltdl (quebracho blanco) se aislaron alcaloides como la aspidospermina, que tiene aplicación médica como febrífugo 26, 27.

2.1.2.1. Especies endémicas de la familia Apocynaceae en el Perú

En Perú se encuentra de la familia Apocynaceae37 géneros y 158 especies (incluyendo 14 endemismos en 10 géneros), mayormente bejucos y lianas, de las cuales ocho de ellas se encuentran en la Región Loreto 28:

 Allomarkgrafia tubiflora Woodson ex Dwyer  Allomarkgrafia ovalis (Ruiz & Pav. ex Markgr.) Woodson  Malouetia gentryi M.E. Endress  Mesechites acuminatus (Ruiz & Pav.) Müll. Arg. (Bejuco Colorado)  Parahancornia peruviana Monach. (Naranjo podrido)  Odontadenia cordigera Woodson  Tabernaemontana hirtulaMart. ex Müll. Arg. var. maynensis Huber  Prestonia lacerata Woodson

La corteza de Aspidosperma excelsum Bentham (Apocynaceae), comúnmente conocido como Remocaspi, es ampliamente utilizado en la medicina tradicional por el poblador amazónico, para el tratamiento de los síntomas relacionados a la malaria 6.

2.1.3. ASPECTOS GENERALES SOBRE LA MALARIA

La malaria es una antropozoonosis parasitaria causada por protozoarios del género Plasmodium (agente etiológico), transmitida por la picadura de un vector infectado (mosquito hembra) del género Anopheles. El cuadro clínico clásico consiste: escalofríos, fiebre y sudoración profusa 29.

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Hasta fines del siglo XIX la malaria a través de la historia se encontró relacionada a la fiebre y a los sitios pantanosos, lugares donde se encuentran los mosquitos que transmiten la enfermedad, se pensaba que la enfermedad era contraída al respirar los “malos aires” y de ahí, el nombre de malaria (del italiano “malaria”, malos aires, dada su asociación con los malos olores de las ciénagas próximas a Roma), hasta 1980 que se descubrió que la enfermedad era transmitida por los mosquitos. Otro nombre con el que se conoce la enfermedad es paludismo (palus = laguna), que significa literalmente “fiebre de los pantanos” 30.

2.1.3.1. Género Plasmodium

Los miembros del género Plasmodium, son parásitos intraeritrocitarios y de otras células (hepatocitos), pertenecientes al PhylumSporozoa (apicomplexa) (Ver tabla 2); se caracterizan morfológicamente, por la presencia del aparato conoidal o complejo conoidal, integrado por un conjunto de microtúbulos que forman: el anillo polar, las roptrias, los micronemas, el conoide y los microtúbulos subpeliculares 31.

De cien especies de Plasmodium conocidas, cuatro parasitan al hombre: P. vivax, P. falciparum, P. malariae (especies común en el hombre y el mono) y P. ovale siendo las tres primeras descritas en América Latina, cada especie posee características morfológicas, biológicas, manifestaciones clínicas y patológicas particulares, utilizadas para su identificación, más presentan ciclos evolutivos similares, dos huéspedes son necesarios para completar el ciclo: el hombre (huésped intermediario), donde tiene lugar la multiplicación asexuada o esquizogonia, y el mosquito (huésped definitivo) donde se desarrolla la multiplicación sexuada o esporogonia. Los parásitos se multiplican asexuadamente dentro de los glóbulos rojos, los cuales se rompen al cabo de 48 a 72 horas, dependiendo de la especie de Plasmodium, infectando más glóbulos rojos 4, 32.

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Fuente:http://intellectualventureslab.com Figura 1: Aparato conoidal de phylum Sporozoa (apicomplexa)

Tabla 2: Taxonomía del Plasmodium 4.

Taxonomía del Plasmodium Reino Animalia Subreino Protozoa Phylum Sporozoa (ampicomplexa) Clase Sporozoae Subclase Coccidia Orden Euccocidiae Suborden Aconoidina Familia Haemosporidae Género Plasmodium falciparum Especies vivax (en el malariae humano) ovale

2.1.3.2. Ciclo biológico del Plasmodium

El ciclo de vida de Plasmodium incluye dos hospederos, el vertebrado y el mosquito. Durante su desarrollo, Plasmodium expresa proteínas específicas para sobrevivir y desarrollarse en dos ambientes distintos, el intracelular y el extracelular, invadir varios tipos celulares y evadir la respuesta inmunitaria de ambos hospederos 32, 33.

Ciclo sexual o esporogonia: En la sangre, algunos de los plasmodios también pueden pasar a estadios sexuales sanguíneos (los gametocitos). Cuando un mosquito susceptible toma estos gametocitos al picar a un huésped infectado, estos siguen su desarrollo en el tubo digestivo del mosquito dando lugar a otra etapa del ciclo

13 evolutivo del parásito durante el cual las formas sexuales se diferencian en gametos macho (microgametocito), y hembra (macrogametocito) (a) y (b); al producirse una exflagelación del microgametocito, hasta en un número de ocho flagelos que contienen parte de la cromatina en que se ha dividido el núcleo, constituyendo a un microgameto, va en busca del macrogameto, elemento en el que se ha convertido el macrogametocito, dando lugar a la fecundación (c); al madurar en el interior del estómago del mosquito esta unión da lugar al cigoto (d); este último adquiere movimiento (oocinetos móviles). Los oocinetos invaden el epitelio intestinal del mosquito hasta alcanzar la lámina basal, donde se convierte en ooquiste (e), produciéndose miles de esporozoitos. Los esporozoitos se liberan a la hemolinfa, por medio de la cual se distribuyen en todo el cuerpo del mosquito e invaden las glándulas salivales; es desde estas glándulas que son inoculados en el hospedero cuando el mosquito se alimenta y de esa manera se inicia el ciclo asexual 32, 33 (Ver figura 2).

Fuente: http://rbastom08.blogspot.pe/2010/09/reproduccionenprotistas.html Figura 2: Ciclo sexual o esporogónico del Plasmodium.

La duración del ciclo evolutivo en el mosquito depende del mosquito mismo, de la temperatura y de la especie de Plasmodium (siete días para P. vivax, hasta alrededor de 35 días para P. malariae) 32.

Ciclo asexual o esquizogónico: Presenta dos ciclos o fases: exoeritrocitaria (hepática) y eritrocitaria (sanguínea). La fase hepática o exoeritrocitaria comprende al esquizonte tisular y al criptozoito. La fase eritrocitaria comprende el trofozoito, el

14 esquizonte, los merozoitos y los gametocitos. La reproducción asexual se suele denominar esquizogónica por que se lleva a cabo la producción de esquizontes 32.

Fuente: http://rbastom08.blogspot.pe/2010/09/reproduccionenprotistas.html Figura 3: Ciclo asexual o esquizogónico de Plasmodium.

Ciclo exoeritrocítico: Los esporozoitos presentes en las glándulas salivales del mosquito son inyectados con la saliva en el momento de la picadura, los esporozoitos (g) abandonan el sistema vascular penetrando al interior de las células parenquimatosas del hígado (hepatocitos) iniciándose el ciclo, reproduciéndose por fisión binaria en grandes cantidades, dando lugar a formas globosas o irregulares, los esquizontes tisulares (h), que contienen gran cantidad de merozoitos, elementos más redondeados que los esporozoitos, que al cabo de unos días, entre el 6 o 14 días, rompen el hepatocito y bajo la forma de criptozoitos (i), asumen la forma capaz de invadir los glóbulos rojos (j), con lo cual termina la fase tisular o hepática. Sin embargo, en caso de P. vivax y P. malariae, algunos elementos parasitarios quedan en el hepatocito y continúan el ciclo esquizogónico tisular en forma muy lenta, llamados hipnozoitos, los que serán responsables de las recaídas. En el caso de P. falciparum, solo hay un ciclo esquizogónico tisular al inicio de la infección, desapareciendo luego en el curso de la infección 32 (Ver figura 3).

Ciclo eritrocítico: Ocurre cuando los merozoitos se liberan del hígado, pasan en grandes cantidades a la sangre e invaden los glóbulos rojos, produciéndose una esquizogonia, es decir la formación de 4 a 36 nuevos merozoitos (k) produciéndose la destrucción del eritrocito (l). Ello ocurre en 48 horas en P. vivax, P. falciparum y P. ovale, y 72 horas en P. malariae. Esto quiere decir que cada 48 o 72 horas se

15 reinicia un nuevo ciclo eritrocítico (trofozoito - esquizonte - trofozoito) (m), algunos merozoitos no se multiplican asexualmente sino evolucionan en elementos masculinos o femeninos: los gametocitos, formas que crecen sin dividirse en menos de dos semanas para P. falciparum, y en 2 a 3 días para las demás especies. Su evolución puede tener lugar únicamente en el tubo digestivo de algunas especies de mosquito 32 (Ver figura 3).

Al romperse el eritrocito libera productos del metabolismo del parásito y del eritrocito mismo. La ruptura contemporánea de numerosos glóbulos rojos es responsable de la sintomatología en general y del paroxismo palúdico en particular. Debido a que al inicio de la infección la ruptura de los eritrocitos infectados no es sincrónica, la fiebre es raramente intermitente pero más bien continua. Aparentemente la fiebre juega un rol sincronizador en el desarrollo del parásito visto que el incremento de la temperatura mata las formas más viejas dejando una población parasitaria joven y sincrónica. Por lo tanto, después de varios días de desarrollo parasitario, el ciclo febril se vuelve periódico (48 a72 horas según la especie de Plasmodium) 32.

2.1.3.3. Estadios del parásito 32, 33:

Trofozoíto: Es el primer estadio eritrocitario del parásito; se trata de una célula que, al presentar una gran vacuola, da el aspecto de anillo engarzado, con el núcleo de color rojo – violáceo con las coloraciones del Romanowsky, y el citoplasma de color azul. Se suele distinguir el trofozoíto joven y el adulto. En el primer caso, es característico la forma anular, y en el segundo, hay una invasión del parásito en todo el parénquima del hematíe, adoptando la forma ameboide. Se suele observar en la superficie de los hematíes parasitados, granulaciones propias de la especie de Plasmodium de que se trate.

Esquizonte: Es una forma caracterizada por el aspecto globoso o abultado de la cromatina (esquizonte joven) para luego dividirse y rodeado de citoplasma (esquizonte maduro). Estas divisiones se llaman merozoítos.

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Merozoito: Cuando cada esquizonte maduro se rompe, deja en libertad a los merozoitos. Estos son muy pequeños 2 – 4 µm y abandonan a los esquizontes maduros para ir a parasitar nuevos eritrocitos, donde dan lugar a los trofozoítos que seguirán el ciclo esquizogónico o eritrocitario. El periodo de la fase eritrocítica y rompimiento de los esquizontes con la liberación de merozoitos es diferente para cada especie de Plasmodium.

Gametocitos: Luego de varios ciclos eritrocitarios, algunos merozoitos se convierten en elementos sexuados, masculino (microgametocito) y femenino (macrogametocito), diferenciados por las características de la cromatina nuclear, densa en el femenino y laxa en el masculino. Los gametocitos deberán ser ingeridos por los mosquitos en el momento de la succión de la sangre, para continuar el ciclo evolutivo. Ellos no producen daño y sobreviven en los glóbulos rojos por todo el periodo de vida de estos, es decir 120 días.

2.1.3.4. Malaria en el Perú y la región Loreto

En 1955, la Organización mundial de Salud (OMS), comenzó un programa mundial para la erradicación de la malaria. En el Perú en 1957,la malaria fue la primera causa de morbilidad, ante situación tan seria el Gobierno Peruano gestionó y obtuvo con ayuda de UNICEF y la OMS un programa de erradicación de a nivel nacional realizándose una encuesta para definir el universo; por la encuesta malariométrica, se pudo además definir que el área malarígena del país ocupa el 75% del territorio nacional (961,200 Km²) y que en esta quedaban incluidos la totalidad de los territorios correspondientes tanto a selva baja como a selva alta, el sector de todos los valles de la costa comprendido entre 0 y 2000 m.s.n.m., y además la parte correspondiente de los valles interandinos que se encuentran por debajo de los 2300 metros de altitud. Es decir, las áreas donde las altas temperaturas y humedades relativas, con pocas variantes diarias, permitían la supervivencia de los mosquitos y la transmisión de la enfermedad 34.

A principios de la década de 1960, se creyó estar a punto de controlar la malaria. La aplicación extensiva de DDT (diclorodifenil – tricloroetano) pulverizado iba

17 reduciendo la población del mosquito Anopheles, y se disponía de nuevas drogas, como la cloroquina y la pirimetamina, para el tratamiento de los pacientes infectados. Veinte años más tarde, la malaria resurgió de nuevo, ya que el vector (mosquito hembra de Anopheles) se había vuelto resistente al DDT y otros insecticidas, colapsando el programa en 1976, además el parásito de Plasmodium, también había desarrollado resistencia a las drogas utilizadas 30.

Se han descrito varias especies de Anofelinos: Tres son consideradas vectores principales: A. pseudopunctipennis de distribución casi universal puesto que sólo no se le ha encontrado en Selva Baja; A. benerrochi predominante en Selva Baja; A. darlingi distribuida en el área fronteriza con Brasil; y otras 3 especies son consideradas vectores secundarios: A. albimanus en Costa Norte, A. rangeli en la Selva Alta y A. oswaldoi en la Selva Baja Sur 34.

2.1.4. CITOMETRÍA DE FLUJO

Método analítico que permite un análisis simultáneo de características cuantitativas y cualitativas de células o partículas microscópicas en un medio líquido alineadas secuencialmente mediante una corriente líquida laminar, presentadas de una en una, a gran velocidad frente a una luz fija que consiste en uno o más láseres a longitud de onda adecuada, en el cual se miden la emisión de múltiples fluorescencias 35.

El impacto de cada célula, produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula (tamaño, granularidad y presencia de antígenos/ moléculas intracelulares o en la superficie de la membrana) recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que serán digitalizadas para permitir la medida de varios parámetros en una misma célula 35, 36.

2.1.4.1. Estructura básica de un citómetro de flujo 35, 37.

Los citómetros de flujo están formados por tres sistemas:

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a) Sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular de manera que se forme una corriente de células individuales hasta conseguir el alineamiento de las mismas. La suspensión de células individuales pasa a través de una región confinada en la que cada célula es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observación; después de que la muestra de células se introduce en la punta de inyección de muestra combina las células con fluido envolvente isotónico usando un ensamble de boquilla cónica diseñado geométricamente para producir un flujo laminar de fluido. (Ver figura 4).

Fuente: Farmacopea de los Estados Unidos de América USP 36 – Formulario nacional. 2013. EE.UU. NF 31; 1:517 – 522. Figura 4: Diagrama esquemático de una celda de flujo.

b) Sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente. Cuando las células se tiñen con colorantes fluorescentes o con reactivos con anticuerpos fluorescentes, la luz emitida por el láser interacciona con el colorante fluorescente para producir una emisión estimulada que presenta ondas coherentes (paralelas) de luz de longitud de onda, de fase y de polarización uniformes. Las señales de luz fluorescente

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generadas en la interacción de la luz láser con las células se recolectan mediante un arreglo de detectores orientados en línea directa y a 90° con respecto al rayo láser que ingresa. Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:  Óptica de excitación, compuesta del láser y las lentes para enfocar y dirigir el haz de luz.

 Óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.

c) Sistema electrónico, cuando una célula pasa a través del sistema óptico de un citómetro de flujo, los patrones de dispersión de luz o fluorescencia de cualquier fluorocromo sobre la célula o dentro de la misma son detectados por varios tipos de fotodetectores o tubos fotomultiplicadores que transforman la información sobre las características de la célula en una lectura computarizada. Cada célula analizada genera un evento en cada parámetro (dispersión frontal, dispersión lateral, fluorescencia) para el cual se mide. Un ejemplo de una configuración típica de un citómetro de flujo de dos colores. (Ver figura 5).

Fuente: Farmacopea de los Estados Unidos de América USP 36 – Formulario nacional. 2013. EE.UU. NF 31; 1:517 – 522.

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Figura 5: Citómetro de flujo típico de dos colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia 2.1.4.2. Información obtenida por el citómetro de flujo 37:

Básicamente podemos obtener los siguientes datos:

 El tamaño celular relativo (forward scatter o FSC)  La complejidad interna o granularidad relativa (side scatter o SSC)  Intensidades relativas de emisión de fluorescencia (FL1, FL2, FL3, FL4…etc.)

A través de dos tipos de señales:

a) Señales de dispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los citómetros de flujo se miden dos fracciones de dispersión:  La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (10°) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (forward scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.

 La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (side scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula.

b) Señales de fluorescencia: Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos antígenos/anticuerpos marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.

2.1.4.3. Visualización de los datos 37:

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En general todos los citómetros presentan los datos en algunos formatos standard.

 Histograma: Intensidad de fluorescencia por número de células.  Dot plot (Gráfica de puntos): Cualquier combinación de dos parámetros de los datos obtenidos para la población de células.

2.1.4.4. Parámetros que se pueden analizar por citometría de flujo 38:

La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula. Éstos se dividen en:  Parámetros nucleares  Parámetros de citoplasmáticos  Parámetros de superficie  Parámetros estructurales

2.1.4.5. Actividad antiplasmodial por citometría de flujo 4, 10, 38:

Desde el punto de vista cronológico, la citometría de flujo es una tecnología relativamente reciente, sus características especiales como técnica de análisis celular han hecho que su uso en la última década se haya extendido de forma rápida, desde los laboratorios de investigación básica hasta los laboratorios clínicos.

El método de la citometria de flujo vinculada como técnica de laboratorio para selección de sustancias antiplasmodiales, se basa en el análisis de contenido de ADN a través de la determinación de la fluorescencia emitida de un fluorocromo en particular, producida por la detección que un complejo Ag – Ac, con el AND de P. falciparum. Los ensayos biológicos son realizados en microplacas de cultivo, donde los parásitos son confrontados con productos vegetales a diferentes concentraciones. El fluorocromo tiene la facilidad de fijarse sobre los ácidos nucleicos del parásito, y el número de parásitos es directamente proporcional a la cantidad de ADN de los mismos, por tanto, la concentración inhibitoria del 50% se determina a través de la cuantificación de ADN presente en el ensayo biológico. El método para determinación de la parasitemia consiste en tres etapas independientes:

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 Fase pre-citométrica: Consiste en la preparación del material celular de donde se aíslan los núcleos, mediante la lisis de la membrana y destrucción del citoplasma, los cuales son marcados con fluorocromos (reactivos fluorescentes) que se unen estequiometricamente con los ácidos nucleicos (DNA).  Fase de citometría de flujo: Implica el procesamiento de las células marcadas. La suspensión celular se sitúa en el colector de muestras, compartimiento presurizado que va a la cámara de flujo, las partículas en suspensión se sitúan en el centro de flujo y pasan a una velocidad constante por la fuente de excitación (laser de argón). El haz de luz se dispersa al ser interceptado por las partículas y además se produce una excitación de los fluorocromos emitiendo una luz fluorescente. La recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) son realizados en cada célula individual.  Fase de análisis: Análisis de los datos recolectados. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots".

2.1.4.6. Ventajas y desventajas de la citometría de flujo 39:

Ventajas:

 Análisis de un número estadísticamente significativo de células (1000 a más de 100 000 células).  Múltiples marcajes de una sola célula.  Análisis de un alto número de partículas en corto tiempo (5000 eventos/segundo)  Alta sensibilidad y objetividad.  Medidas separadas de cada célula (no solo el promedio).  Medidas cuantitativas: discriminación de las células según la cantidad del marcador.  Múltiples parámetros: define subpoblaciones complejas.

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 Miles de células por segundo.

Desventajas:

 Poca información morfológica de la célula.  No proporciona información de la localización celular de un tejido.  Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células por hora)  Necesita suspensión de células individuales.  Método destructivo.  Incapacidad de visualizar las células que se analizan

2.2. HIPÓTESIS

H0: Los extractos seleccionados para el estudio de las especies vegetales de la familia Apocynaceae no presentan actividad antimalárica in vitro frente a P. falciparum cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible).

Hi: Los extractos seleccionados para el estudio de las especies vegetales de la familia Apocynaceae presentan actividad antimalárica in vitro frente a P. falciparumcepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible).

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CAPITULO III

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3.1.METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN

3.1.1. TIPO DE ESTUDIO: El estudio fue de tipo experimental, prospectivo.

 Experimental: Porque la investigación del presente estudio permitió establecer una analogía de causa y efecto, a través de procedimientos controlados donde se manipuló y controló las variables.  Prospectivo: Se determinó la relación entre las variables sobre los resultados obtenidos. Se registraron los hechos ocurridos a partir de la fecha de ejecución.

3.1.2. DISEÑO DE LA INVESTIGACION

La actividad antiplasmodial de los extractos etanólicos (ET) y extractos alcaloidales básicos (EAB) de los diferentes órganos de las especies vegetales seleccionadas de la familia Apocynaceae fueron medidos por triplicado in vitro frente a P. falciparumcepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S), que fueron cultivadas por la metodologia de Trager y Jansen.

3.1.3. POBLACIÓN

Constituida por géneros de especies vegetales basadas en su clasificación taxonómica (familia Apocynaceae) reportados para el tratamiento de los síntomas relacionados a la malaria.

3.1.4. MUESTRA

Constituida por las especies seleccionadas en base a indicios de su uso tradicional para el tratamiento de los síntomas relacionados a malaria:

 Macoubea sprucei (Müll. Arg.) Markgr.  Malouetia killipii Woodson.  Malouetia tamaquarina (Aubl.) A. DC  Mandevilla pavonii (A. DC.) Woodson.  Marsdenia rubrofusca E. Fourn.  Odontadenia geminata (Hoffmanns. ex Roem.  Schult.) Müll. Arg.

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 Odontadenia macrantha (Roem.  Schult.) Markgr.  Tassadia Kamaensis (Morillo) Morillo

3.1.5. CRITERIOS DE SELECCIÓN

3.1.5.1. Criterios de inclusión  Especies vegetales localizados en el departemento de Loreto, usados tradicionalmente en el tratamiento de los síntomas relacionados a malaria.  Especies vegetales de la familia Apocynaceae que no cuenten con estudios previos de evaluación antiplasmodial in vitro frente a cepas de P. falciparum.  Material vegetal que este en buenas condiciones de conservación.  Material vegetal correctamente identificado y localizado.

3.1.5.2. Criterios de exclusión  Material vegetal que no posean una correcta identificación taxonómica.

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1. MATERIALES DE LABORATORIO

3.2.1.1. Obtención de extractos y tamizaje fitoquímico  Baguetas (NORMAX).  Balón (S35 BUCHI).  Balones para concentrar de 500 y 1000 mL (SCHOTT DURAN).  Capilares  Celda cromatográfica (HEIDELBERG)  Embudo de decantación (NORMAX).  Embudos (NORMAX).  Envases de vidrio (NORMAX).  Espátulas (SELECTA).  Gradillas.  Matraces 100, 500 y 1000 mL (PIREX).  Nueces para soporte.  Papel filtro.

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 Probetas de 5, 10, 50, 100 y 1000 mL (BRAND GERMANY).  Soporte universal.  Tubos de ensayo (PIREX).  Vasos de precipitado de 25, 50, 100, 500 y1000 mL (LBT GERMANY).  Viales pequeños y medianos (PIREX)

3.2.1.2. Cultivos in vitro  Aguja hipodérmica estéril 21G×11/2 (M&M).  Candle Jarr (NORMAX).  Cinta indicadora sin plomo para esterilización a vapor 12 mm × 55 m [1/2” × 60 yd] (3M-COMPLY).  Filtros (Autofil Full Assembly, Sterile 0,22µm filter, 1000 mL)  Filtros Millipore de 0,22 µm (NALGENE).  Frasco de vidrio transparente tapa azul 500 y 1000 mL graduado para esterilización (NORMAX).  Frascos de cultivo de 25 y 75 cm2 de cuello inclinado (NALGENE).  Frascos de vidrio con tapa (NORMAX).  Jeringa descartable estéril (ALFYMEDIX).  Micropipetas de 10-200 µL (EPPENDORF).  Micropipetas de 100-1000 µL (EPPENDORF).  Micropipetas multicanal de 30-300 L (EPPENDORF).  Microplacas de cultivo de 96 alvéolos de fondo plano estériles (FALCON).  Parafilm (LABORATORY FILM).  Pipetas Pasteur (FRISHER BRAND).  Pipetas serológicas de 5 y 10 mL estériles (FALCON).  Placas Petri (NORMAX).  Porta objeto 50und 25,4 × 76.2 mm (1´´ x 3´´) (CITOMED)  Tips con filtro 10-200 µL (EPPENDORF).  Tips con filtro 100-1000 µL (EPPENDORF).  Tubos cónicos de centrífuga de 15 y 50 mL (FALCON).  Tubos criogénicos de 2 mL (NALGENE).

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 Tubos FACS de fondo redondo 5 mL (FALCON).

3.2.2. REACTIVOS

3.2.2.1. Obtención de extractos y tamizaje fitoquímico  Acetato de etilo (MERCK).  Ácido clorhídrico [HClcc] (MERCK).  Anhídrido acético (MERCK).  Ciclohexano (MERCK).  Cloroformo (MERK).

 Cromatofolios de gel de sílice 60 F254con base de aluminio [20 × 20 cm] (MERCK).  Diclorometano (MERCK).  Dietilamina (MERCK).

 Disolución de ácido pícrico [C6H2OH(NO2)3] al 1%

 Disolución de ácido sulfúrico (H2SO4) [0,5 N].

 Disolución de carbonato de sodio (Na2CO3) al 1%.

 Disolución de cloruro férrico (FeCl3) al 5%.  Disolución de hidróxido de potasio (KOH) al 5,7%.  Disolución de hidróxido de sodio (NaOH) al 5% y 10%.

 Disolución de Ninhidrina (C9H6O4) al 5%.  Disolución salina de cloruro de sodio (NaCl) al 85%.  Etanol 96° (ALKOFARMA).  Etanol absoluto (MERCK).  Magnesio metálico (MERCK).  Metanol (MERCK).  N-hexano (MERCK).  Reactivo de Dragendorff.  Reactivo de Óleum.

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3.2.2.2. Preparación de reactivos:

 Reactivo de Dragendorff:

Solución A: Disolver 0,85 g de subnitrato de bismuto (4[Bi(NO)3(OH)2].

BiO(OH) en 10 mL de ácido acético (CH3COOH), y enrasar a 50 mL con agua destilada. Solución B: Disolver 8 g de yoduro de potasio (KI), en 20 ml de agua destilada. *Mezclar 5 mL de solución A y 5 mL de solución B, más 20 mL de ácido acético y enrasar a 100 mL de agua destilada.

 Reactivo de Óleum: Mezclar 5 mL de anhídrido acético [(CH3CO)2O] y 5

mL de ácido sulfúrico (H2SO4), más 50 mL de etanol absoluto y enrasar a 100 mL.

 Disolución de ácido pícrico [C6H2(NO2)3OH] al 1%: Pesar 1 g de ácido pícrico, trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL, enrazar y homogenizar con etanol.

 Disolución de H2SO4 [0,5 N]: Medir 13,87 mL de H2SO4 [1N], trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 mL.

 Disolución de carbonato de sodio (Na2CO3) al 1%: Pesar 1 g de Na2CO3, trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL con agua destilada y homogenizar.

 Disolución de cloruro férrico (FeCl3) al 5%: Pesar 5 g de FeCl3, trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL con una solución salina al 85%, enrazar y homogenizar.  Disolución de hidróxido de potasio (KOH) al 5,7%: Pesar 5,7 g de KOH, trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL con agua destilada, enrazar y homogenizar.  Disolución de hidróxido de sodio (NaOH) al 5% y 10%: Pesar por separado 5 y 10 g de NaOH, trasvasar cuantitativamente a dos matraces aforados de 100 mL, enrazar y homogenizar con agua destilada.

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 Disolución de Ninhidrina (C9H6O4) al 5%: Pesar 5 g de Ninhidrina, trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL con etanol, enrazar y homogenizar.  Disolución salina de cloruro de sodio (NaCl) al 85%: Pesar 85 mg de NaCl, trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL con agua destilada, enrazar y homogenizar.

3.2.2.3. Cultivos in vitro  Aceite de inmersión.  Agua destilada.  Agua destilada autoclavada.  Agua tamponada.  Albumax II (GIBCO).  Bicarbonato de sodio (SIGMA).  Bromuro de etidio 10 mg/mL  Cloruro de sodio (NaCl)  Colorante de Giemsa (GIBCO)  D – sorbitol (SIGMA)  Dimetilsulfóxido (MERCK)  Etanol 96° (ALKOFARMA)  Gentamicina 10 mg/mL (GIBCO)  Glucosa (SIGMA)  HEPES (SIGMA)  Hypoxantina (SIGMA)  Medio-RPMI (Roswell Park Memorial Institute- 1640) (GIBCO)  Metanol (MERCK)  Mezcla de gases (PRAXAIR)  Phosphate buffer solution (PBS) 10x (SIGMA)  Piruvato de sodio (100 mM)  Sorbitol (SIGMA)

3.2.3. EQUIPOS

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3.2.3.1. Obtención de extractos, tamizaje fitoquímico y cultivos in vitro  Balanza analítica (SARTORIUS CP 2245)  Bomba de vacío (VACUBRAND)  Congeladora  Destilador de solventes (THERMO SCIENTIFIC)  Destilador de agua (BRAND)  Rotavapor (Buchi Heating Bath B-490)  Chiller (LAUDA-ALPHA.RA24)  Lámpara UV 115V 60Hz (UVP)  Cabina de flujo laminar (LABCONCO II)  Centrífuga de microtubos (Eppendorf centrifuge 5415 C)  Centrífuga Universal refrigerada (HETTICH 13R)  Citómetro de flujo (BD FACS callibur)  Cronómetro (FISHERBRAND)  Incubadora para cultivo (SANYO MCO-20AIC)  Microscópio (ZEISS)  Potenciómetro  Pro – pipeta automática (ACCU-JET)  Refrigerador  Ultracongelador (SANYO)  Ultrasonicador (BRANSON 3510)  Vortex (VWR Minivortexer)

3.2.4. MATERIALVEGETAL Y PREPARACIÓN DE EXTRACTOS

3.2.4.1 Descripción y recolección delas especies vegetales Las muestras vegetales utilizadas para el presente estudio fueron: hojas, tallos, cortezas y raíces de las especies vegetales seleccionadas de la familia Apocynaceae, previamente identificadas por un botánico especialista, una exicata de cada especie vegetal se encuentra depositada en el Herbarium Amazonense de la Universidad

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Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP-Iquitos), departamento de Loreto, Perú. (Ver anexo 5).

 Macoubea sprucei (Müll. Arg.) Markgr: Arbol de hasta 25 m de altura, con savia lechosa y hojas elípticas de hasta 19 cm de largo, comunmente conocido como “loro micuna”.Hojas y corteza fueron recolectadas el 05 de septiembre del 2015 en la carretera Iquitos-Nauta Km 25.Código de exicata N° 035171.  Malouetia killipii Woodson: Arbol de hasta 15 m de alto, con abundante savia lechosa y hojas opuestas, comunmente conocido como “cuchara caspi”. Hojas, tallo y corteza fueron recolectados el 05 de septiembre del 2015 en la carretera Iquitos-Nauta Km 25. Código de exicata N° 040770.  Malouetia tamaquarina (Aubl.) A. DC: Arbol de hasta 15 m de alto, con abundante savia lechosa y hojas opuestas, comunmente conocido como “cuchara caspi”. Hojas, tallo y raíz de la especie fueron recolectados el 13 de septiembre del 2015 en el cacerio de Manacamiri-Río Nanay. Código de exicata N° 037478.  Mandevilla pavonii (A. DC.) Woodson: Enredaderade hojas verde oscuro perennes ypequeñas florescolor amarillo. Toda la planta fue recolectada el 05 de septiembre del 2015 en la carretera Iquitos-Nauta Km 25. Código de exicata N° 037476.  Marsdenia rubrofusca E. Fourn: Enerdadera herbácea de pequeños tallos con savia lechosa. Hojas y tallos de la especie fueron recolectados el 13 de septiembre del 2015 en el cacerio de Manacamiri-Río Nanay. Código de exicata N° 035894.  Odontadenia geminata (Hoffmanns. ex Roem.  Schult.) Müll. Arg: Enredadera de pequeños tallos verdes con savia llechosa, hojas simples y flores amarillas.Hojas, tallos y raices de la especie fueron recolectados el 13 de septiembre del 2015 en el cacerio de Manacamiri-Río Nanay. Código de exicata N° 035436.  Odontadenia macrantha (Roem.  Schult.) Markgr: Enredadera de pequeños tallos verdes con savia llechosa, tronco marrón, hojas simples y flores

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amarillas, comunmente conocida como “sapo huasca”. Hojas y tallos de la especie fueron recolectados el 05 de septiembre del 2015 en la carretera Iquitos-Nauta Km 25. Código de exicata N° 024164.  Tassadia Kamaensis (Morillo) Morillo: Enredadera herbácea de pequeñas y largas ramas con latex color blanco y hojas dísticas, comunmente conocida como “morillo”. Toda la planta fue recolectada el 13 de septiembre del 2015 en el cacerio de Manacamiri-Río Nanay. Código de exicata N° 015941.

Las muestras recolectadas e identificadas fueron transportadas al Laboratorio de Fitoquímica II del Laboratorio de Productos Naturales Antiparasitarios de la Amazonía (LIPNAA), del Centro de Investigación de Recursos Naturales de la Amazonía (CIRNA) de la UNAP, para ser lavadas, secadas a temperatura ambiente. Las muestras de las especies vegetales seleccionadas para el estudio, los lugares detallados de recolección están especificados en el anexo 6.

Nota: El extracto hidroalcohólico de corteza de Remijia peruviana Standl., utilizado como control positivo, fue otorgado por el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la Amazonía (LIPNAA) de la UNAP.

 Remijia peruviana Standl: Especie perteneciente a la Familia Rubiaceae, comúnmente conocida como “cascarilla”. Las hojas y corteza de esta especie son utilizadas por el poblador amazónico, para el tratamiento de la malaria y síntomas que acompañan a la enfermedad, se han aislado alcaloides como la quinina y cinchonina a partir de la corteza de esta especie, alcaloides de acción ya conocida sobre P. falciparum 40.

3.2.4.2. Procedimiento general de extracción.

Obtención de extractos etanólicos (Ver anexo 7).

Las muestras secas y molidas de cada órgano de las especies vegetales recolectadas, fueron sometidas a un proceso de extracción discontinua bajo maceración en etanol 96° destilado por 48 horas, obteniéndose dos componentes: la solución extraída en su solvente (el extracto) y el residuo (el bagazo), siendo la solución extraída filtrada y

35 concentrada en un rotavapor hasta la eliminación del solvente, proceso realizado interdiariamente hasta agotamiento, finalmente los extractos obtenidos fueron pesados, se determinó el porcentaje de rendimiento y fueron conservados en frascos de vidrio rotulados a – 10°C.

Marcha alcaloidal (Ver anexo 8).

Una fracción de cada ET seco obtenido fue pesado y disuelto en H2SO4 [0.5 N] con la ayuda de un agitador magnético durante 30 minutos, la fracción disuelta fue filtrada, obteniéndose un residuo ácido, seguidamente se basificó con NH4OHcc, a pH = 9; la solución basificada se filtró sobre un embudo de decantación y se extrajo con CH2Cl2, se agitó y dejó en decantación hasta la separación de dos fases la acuosa y la orgánica. Esta última fue concentrada en un rotavapor, obteniéndose de esta forma el EAB, la operación se realizó repetidas veces hasta no observar la presencia de alcaloides, para ello se sembró un punto de la muestra, con la ayuda de un capilar, en un cromatofolio de gel sílice, para la visualización se utilizó una lámpara ultravioleta 115V 60Hz (UVP) y el revelado se realizó utilizando reactivo de Dragendorff, que al reaccionar con el compuesto nitrogenado, característico estructural de los alcaloides, da una coloración anaranjada.

Técnica cromatográfica (CCF).

Cada uno de los ET y EAB, se sembraron en una placa de gel sílice, esta fue eluída en una mezcla de disolventes de diferentes polaridades dependiendo de la muestra, con la finalidad de valorar e identificar de forma individual los diferentes componentes presentes en los extractos, la identificación de alcaloides se realizó con el reactivo de Dragendorff y la presencia de metabolitos no alcaloidales con el reactivo Óleum y revelado con calentamiento a 100° C.

3.2.5. ADAPTACIÓN AL CULTIVO Y ACTIVIDAD ANTIPLASMODIAL IN VITRO (Ver anexo 9).

 Cepas referenciales de P. falciparum, FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible), otorgadas por el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales Antiparasitarios de la Amazonía (LIPNAA) de la UNAP.

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 Eritrocitos humanos sanos de tipo O+.

3.2.5.1. Procedimientos para el cultivo in vitro de P. falciparum.

El método utilizado fue el cultivo continuo in vitro de P. falciparum descrito previamente, pero con algunas modificaciones 41. Todos los procedimientos del cultivo in vitro se realizaron dentro de una cabina de bioseguridad.

A. PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA CULTIVO IN VITRO (Ver anexo 10).

Preparación de medio RPMI incompleto, Roswell Park Memorial Institute –

1640 (RMPII).

Se disolvió con la ayuda de un agitador magnético, 10,4 g de RPMI GIBCO 1640 en 1L de agua destilada/ autoclavada, añadiéndose secuencialmente 5,94 g de HEPES, 4,50 g de glucosa y 1,50 g de bicarbonato de sodio. Seguidamente bajo en la cabina de bioseguridad, se filtró la solución utilizando los sistemas de botellas filtro de 0,22 µm, se añadió 500 µL de gentamicina (50 mg/mL) estéril, obteniéndose el medio de lavado; posteriormente se extrajo 30 mL del medio en un tubo cónico de centrifuga y en este se disolvió 40 mg de hipoxantina, se filtró la solución con un filtro de 0,22 µm, y se homogenizó esta solución filtrada con el medio de lavado, obteniéndose el medio incompleto (RPMII) que fue almacenado a - 4°C por no más de 4 semanas.

Preparación de solución stock de albumax II al 5%.

Se disolvió con la ayuda de un ultrasonido, 2,50 g de albumax II en 30 mL de agua destilada/ autoclavada y enraso a 50 mL, en la cabina de bioseguridad se filtró la solución con un filtro de 0,22 µm en un tubo cónico de centrifuga estéril, obteniéndose la solución stock de albumax II, almacenado a - 4°C por no más de 4 semanas.

Preparación de RPMI completo (RPMIC).

En un tubo cónico de centrifuga estéril de 50 mL, se añadió 2,50 mL de solución stock de albumax II y enraso a 50 mL con medio incompleto, se añadió 500 µl de piruvato de sodio (100 mM), obteniéndose el medio completo (RPMIC), almacenado

37 a - 4°C por no más de cuatro semanas o hasta observarse un cambio de color (oxidación).

Preparación de soluciones de descongelamiento.

Estas soluciones fueron preparadas para la descongelación por grados progresivos de las cepas criopreservadas de P. falciparum.

 Se disolvió 1,8 g de NaCl en 15 mL de agua destilada/autoclavada, y en la cabina de bioseguridad se filtró la solución con un filtro de 0,22 µm en un tubo cónico de centrifuga estéril, obteniéndose la Solución A (NaCl al 12%).  Se añadió 2 mL de la Solución A en un tubo cónico de centrifuga estéril y se enraso con agua destilada/autoclavada a 15 mL, obteniéndose la Solución B (NaCl al 1,6%).  Se añadió 1,125 mL de Solución A en un tubo cónico de centrifuga estéril y

se enraso con RPMII a 15 mL, obteniéndose la Solución C (NaCl al 0,9%).

Preparación de solución de sincronización.

Se disolvieron 2,50 g de D – sorbitol en 50 mL de agua destilada/autoclavada, en la cabina de bioseguridad se filtró la solución con un filtro de 0,22 µm en un tubo cónico de centrifuga, obteniéndose el medio de sincronización.

B. CULTIVO IN VITRO DE P. FALCIPARUM.

Obtención y lavado de glóbulos rojos no parasitados 4, 42.

La sangre extraída se colectó estérilmente en un tubo de venopunción conteniendo anticoagulante K2 EDTA y fue llevada a centrifugar a 3280 rpm durante diez minutos; finalizado este proceso, el plasma sobrenadante y la capa intermedia que contiene los elementos nucleados de la sangre (células blancas) fueron extraídas y descartadas, dejando sólo eritrocitos que se transfirieron a un tubo de centrifuga cónico esterilizado.

38

Para el lavado de eritrocitos, se agregó RPMII en proporción al plasma descartado, se homogenizó cuidadosamente y centrifugó a 2500 rpm por tres minutos; finalizado, el sobrenadante fue descartado, se repitió el procedimiento dos veces y resuspendió los eritrocitos en RPMII en el mismo volumen. Se almaceno a 4°C por no más de seis días.

Descongelación de cepas de P. falciparum 4, 42 (Ver anexo 11).

Los eritrocitos son particularmente sensibles al choque osmótico y más aún los glóbulos rojos infectados por Plasmodium, para impedir el fenómeno de lisis, la criopreservación debe seguir rigurosamente los pasos de enfriamiento con agentes crioprotectores; la eliminación de estas moléculas durante la descongelación fue una etapa clave y se realizó por grados progresivos, las soluciones fueron temperadas a 37°C previamente:

Se tomó un criovial conteniendo la cepa de Plasmodium criopreservada, y fue llevada a baño maría durante tres minutos. En la cabina de bioseguridad, se retiró la tapa del criovial y se le añadió cuatro gotas (200 µl por ml de sangre) desolución A, dejando reposar por tres minutos. Se transfirió la cepa a un tubo cónico de centrifuga estéril y añadió gota a gota homogenizando suavemente 8 ml de solución B, luego fue llevado a centrifugar a 2500 rpm durante tres minutos, el sobrenadante fue descartado y se añadió de igual forma al procedimiento anterior 8 ml de solución C, se llevó a centrifugar una vez más a 2500 rpm durante tres minutos y se descartó el sobrenadante.

* Adaptación del cultivo:

Se transfirió el sedimento a un frasco de cultivo estéril, la suspensión globular (hematocrito) se ajustó a un 5% completando a 500 µl con eritrocitos no parasitados más 9.50 ml de RMPIC. Se añadió la mezcla de gases (5 % O2, 5 % CO2, 90 % N2) durante un minuto y se colocó el frasco en incubación a una temperatura constante de 37°C.

39

Mantenimiento del cultivo in vitro de cepas de P. falciparum 41, 42, 43 (Ver anexo 12).

Para mantener el cultivo en constante crecimiento fue preciso cambiar el medio de cultivo por otro fresco hasta ajustar el hematocrito a un 5% y la adición de mezcla de gases cada 24 horas, así como la adición de eritrocitos no parasitados para la reproducción del parásito. El cambio de medio es necesario por la producción de ácido láctico producido por el parásito, que da lugar a la disminución del pH del medio de cultivo.

*Cambio de medio:

En la cabina de bioseguridad, se inclinó el frasco de cultivo y con la ayuda una pipeta serológica esterilizada se retiró y descartó el medio de cultivo obsoleto sin perturbar los eritrocitos. Se removió una alícuota del precipitado para realizar un frotis sanguíneo para el control de la parasitemia. Se añadió RMPIC ajustando el hematocrito a 5%, así como la adición de la mezcla de gases durante un minuto.

* Control de la parasitemia:

Cada 24 – 48 horas se realizó un control de la parasitemia:

La lámina con el frotis sanguíneo fue introducida en un frasco con metanol para su fijación por cuatro segundos, seguido se cubrió el frotis con solución Giemsa al 10% e incubó durante seis minutos.

Transcurrido el tiempo de incubación se retiró el colorante, lavo con agua destilada y seco. El control se basó en el conteo de un total de 1000 a 3000 eritrocitos entre parasitados y no parasitados y se calculó el porcentaje de los parasitados bajo la siguiente fórmula: 퐸푟푖푡푟표푐푖푡표푠 푝푎푟푎푠푖푡푎푑표푠 % 푑푒 푝푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 = 푥 100 퐸푟푖푡푟표푐푖푡표푠 푡표푡푎푙푒푠

Sincronización de cepas de P. falciparum 4, 43 (Ver anexo 13).

40

La gran permeabilidad de los eritrocitos infectados por P. falciparum a las hexosas es una característica que se aprovecha en el cultivo in vitro para lisar de manera selectiva los eritrocitos infectados con parásitos maduros y concentrar formas jóvenes de P. falciparum, realizando un tratamiento del cultivo con sorbitol a un cultivo parasitado sólo con predominancia de estadíos intraeritrocitarios jóvenes (menor a 10 horas de desarrollo), para ello estos representaron más del 70% de la parasitemia total, tras la determinación del porcentaje de parasitemia de estadios jóvenes.

El cultivo se transfirió a un tubo cónico de centrifuga estéril y fue centrifugado a 2500 rpm por tres minutos, siendo el sobrenadante descartado, seguido se adicionó ocho volúmenes de sorbitol al 5% por volumen de eritrocitos, previamente temperado a 37°C, e incubó durante ocho minutos.

Transcurrido el tiempo, se llevó a centrifugar a 2500 rpm por tres minutos; la aparición del color rojo en el sobrenadante indicó la hemólisis de los eritrocitos con estadios intraeritrocitarios maduros, el cual fue descartado. Se procedió al lavado de las células, enrasando el sedimento obtenido a 10 ml con RMPII, se centrifugó a 2500 rpm por tres minutos, repitiéndose la técnica una vez más y descarte del sobrenadante.

La ausencia de formas intraeritrocitarias maduras se corroboro por medio de un frotis sanguíneo, el cual confirmó el éxito del procedimiento. Los eritrocitos se resuspendieron en RPMIC ajustando la suspensión globular al 5%, se añadió la mezcla de gases e incubó a 37°C por 24 horas.

C. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIPLASMODIAL IN VITRO 4 (Ver anexo 14).

La evaluación de la actividad antiplasmodial in vitro frente a P. falciparum cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S) se realizó después de 48 horas de haber sido sincronizada la cepa (con > 90 % de anillos jóvenes), la misma que presentó una parasitemia mayor al 3 %, la evaluación se realizó de la siguiente manera:

41

Preparación de los extractos vegetales

En un tubo de microcentrífuga se pesaron 2 mg de cada extracto a evaluar y fueron disueltos con 200 L de DMSO (concentración de 10mg/mL), obteniendo la solución stock A partir de esta concentración se realizaron las diluciones, (Ver anexo 15).

Tabla 3: Preparación de las diluciones seriales de los extractos Extracto Volumen de Diluciones Volumen de Volumen Tipo de Cód. (mg) solvente (g/mL) stock (µL) (µL) solvente (µL) (i) - 2 mg - - 200 L DMSO (a) 200 g/mL - 30L (i) - 1470L RPMIi (b) 100 g/mL - - 750 L (a) 750L RPMIi (c) 20 g/mL - - 200 L (b) 800 L RPMIi (d) 2 g/mL - - 100 L (c) 900 L RPMIi (e) 0,2 g/mL - - 100 µL (d) 900 µL RPMIi

Las concentraciones requeridas para los ensayos de actividad antiplasmodial fueron 20, 2 y 0,2 g/mL.

Preparación del control positivo (R. peruviana Standl.)

Se trabajó con el extracto hidroalcohólico y alcaloidalde corteza de la especie vegetal R. peruviana Standl. La concentración stock, método de dilución y concentraciones empleadas en los ensayos de actividad antiplasmodial del control positivo, fueron los mismos que de los extractos vegetales en estudio.

Preparación del control negativo (DMSO 0,2%)

En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml se colocó 100 µL de DMSO y 900 µL de

RPMII, obteniendo una solución Stock de control negativo al 10% (S1CN) y sucesivamente diluir hasta obtener una concentración requerida.

42

Tabla 4: Preparación del control negativo DMSO 0,2% [DMSO] Volumen Volumen Volumen Tipo de Stock (%) DMSO (µL) stock (µL) solvente(µL) solvente S1CN 10% 100 - 900µl RPMII S2CN 0,2% - 30µL 1470µL RPMII

La concentración 0,2% fue el stock empleado para los ensayos de actividad antiplasmodial.

Preparación del mix de glóbulos rojos

Se preparó 7 mL de un mix de glóbulos rojos por cada placa configurada de 96 pozos, con un hematocrito de 4% (para esto se utilizó albumax al 0,5% en RPMII), además de una parasitemia aproximada del 2% en estadio anillo de la siguiente manera:

Tabla 5: Preparación del mix de glóbulos rojos. Componente Volumen(7000 µL) Concentración final RPMII 6020 µL - Albumax 0,5% 700 µL 0,5% Eritrocitos (parasitados y Hematocrito: 4% 280 µL no parasitados Parasitemia: 2%

*Los volúmenes indicados se determinan con la siguiente fórmula: Vi × Ci = Vf × Cf

 Albumax al 0,5%:

Vi = (7000µL × 0,5%)/5%

Vi = 700 µL

 Hematocrito al 4%:

Vi = (7000µL× 4%)/100%

Vi = 280 µL

 Parasitemia al 2%:

Vi = (280 µL× 2%)/Parasitemia del cultivo

Vi = Volumen de eritrocitos parasitados

 Volumen de eritrocitos no parasitados (VENP)

43

VTE = VTE + VENP ≈ VENP = VTE – VEP

Preparación de la placa de 96 alvéolos 4 (Ver anexo 16).

Se configuró una microplaca de cultivo de 96 alvéolos de fondo plano estéril, en 60 pozos se utilizaron para añadir las diluciones seriadas de los extractos, controles negativos (CN), testigos (T) y Ruido de fondo (Rf).

 En los pozos se adicionó 100 L de las diluciones de los extractos por triplicado y se mezcló con 100 L del mix de glóbulos rojos de manera que en cada pozo el volumen fue de 200 L y la concentración final de 10, 1 y 0,1 g/mL.  En los pozos con rótulo “CN” se adicionó 100 L de control negativo (0,2 µg/mL) y 100 µL de mix de glóbulos rojos. La concentración final de control negativo de 0,1 g/mL.

 En los pozos con rotulo “T” se adicionó 100 µL de RPMII más 100 µL de mix de glóbulos rojos.  En los pozos con rotulo “R” se adicionó 200 µL de suspensión de eritrocitos

no parasitados 2% en RMPIC al 0,25%.  En los pozos restantes se adicionó 200 L de agua destilada/autoclavada, para mantener una humedad suficiente y descartar el “efecto borde”.  Se incubó en una estufa a 37°C por 48 horas de acuerdo al método Candle Jar.

D. MEDICIÓN DE LA PARASITEMIA POR CITOMETRÍA DE FLUJO 41, 42, 43 (Ver anexo 17).

Protocolo de tinción con bromuro de etidio.

Pasada las 48 horas se abrió el candlejar, las placas fueron retiradas y el sobrenadante descartado, la suspensión globular se lavó con 200L de PBS 1Xpor cada pozo y fueron llevadas a centrifugara 2300 rpm por cinco minutos y se descartó el sobrenadante.

44

Se añadió 100 µl bromuro de etidio 10 µg/mL a cada pozo e incubó por 30 minutos a 37 °C; pasado el tiempo, las placas se llevaron a centrifugar a 2300 rpm por cinco minutos y se descartó el sobrenadante, consecutivamente se lavó las células con 100 l de PBS por cada pozo, se centrifugó a 2500 rpm por cinco minutos y se descartó el sobrenadante.

Finalmente, se resuspendió cada pozo con 200 µL de PBS 1X, y se transfirió a tubos FACS enumerados por cada muestra. Se encendió el citómetro de flujo media hora antes para la medición de la parasitemia.

3.2.6. TAMIZAJE FITOQUÍMICO

Los extractos etanólicos obtenidos que presentaron actividad antiplasmodial fueron sometidos a pruebas fitoquímicas preliminares para la identificación de metabolitos secundarios por medio de reacciones químicas dando por resultado una manifestación sensible como el cambio de color, formación de precipitado o el desprendimiento de gas, dando indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.

Se realizó de acuerdo a las metodologías propuesta 44, 45, 46 (Ver anexo 19).

3.2.6.1. Primera ruta (Dilución etanólica): Se pesó 5 g, de ET y diluyó en etanol, filtró y se separó en seis tubos de ensayo, el sexto tubo fue el patrón etanólico:

Identificación de fenoles y taninos (FeCl3). En el primer tubo de ensayo, se añadió

1 o 2 gotas de una solución al 5% de FeCl3, la aparición de un color o precipitado verde – rojo indicó la presencia de fenoles, la aparición de un color o precipitado azul – negro, la presencia de taninos.

Identificación de lactonas y cumarinas (Baljet). En el segundo tubo, se le añadió 1 mL de una mezcla de ácido pícrico al 1 % y un 1 mL de NaOH al 10 %. La presencia de un color o precipitado rojo-naranja indicó la presencia de agrupamientos lactónicos (cumarinas).

Identificación de flavonoides (Shinoda). En el tercer tubo, se añadió 1 mL de ácido

HClCC y un trozo de cinta de magnesio metálico, se dejó reposar hasta que termino la

45 reacción con la liberación de hidrogeno. La presencia de un color amarillo indicó la presencia de flavonoides, isoflavonas y violeta o azul la presencia de flavononas.

Ensayo para aminoácidos y aminas (Ninhidrina). En el cuarto tubo se añadió 1 mL de una disolución de Ninhidrina al 5 %. Se llevó a baño maría durante 5 a 10 minutos, la aparición de una coloración azul violácea indicó la existencia de aminas.

Ensayo para saponinas y resinas. En el quinto tubo se añadió 4 mL de agua y se agitó la mezcla fuertemente durante 2 minutos, después se dejó reposar. La aparición de una espuma jabonosa de más de 2 mm de altura en la superficie del líquido persistente por más de 5 minutos confirmó la presencia de saponinas. La presencia de partículas grumosas en el líquido indico la presencia de resinas.

Ensayo de cumarinas fijas: Se sembró en un papel filtro dos puntos de la muestra del patrón etanólico y en uno se sembró un punto de KOH al 5,7%, se visualizó en una lámpara ultravioleta 115V 60Hz (UVP), la presencia de fluorescencia amarilla y/o verde en el punto donde se sembró la muestra con KOH índico un resultado positivo.

Ensayo para catequinas: Se sembró en un papel filtro dos puntos de la muestra del patrón etanólico y en uno se sembró un punto de Na2CO3 al 1%,se visualizó en una lámpara ultravioleta 115V 60Hz (UVP), la presencia de fluorescencia amarilla y/o verde en el punto donde se sembró la muestra con Na2CO3 indicó un resultado positivo.

3.2.6.2. Segunda ruta (Dilución ácida): Se pesó 5 g de ET, se diluyó con H2SO4 [0,5 N], se llevó a baño maría para ayudar a disolver la muestra y se filtró para realizar los siguientes ensayos.

Ensayo directo para alcaloides: Con la disolución ácida de los extractos se realizó una prueba directa para alcaloides, en un tubo de ensayo, se añadió 1 mL de la disolución ácida a la cual se le agregó de 1 a 3 gotas de reactivo de Dragendorff. La formación de precipitado floculoso color anaranjado ladrillo índico de la presencia de alcaloides.

46

3.2.6.3. Tercera ruta (Dilución clorofórmica): Se pesó 5 g de ET, se diluyó en cloroformo, filtró y fue separado en tres tubos de ensayo, el tercer tubo fue el patrón clorofórmico:

Identificación de triterpenos y esteroides (Liebermann-Buchard): En el primer tubo, se añadió 1mL de anhídrido acético y se mezcló; por la pared del tubo de ensayo se dejará correr 2 o 3 gotas de [H2SO4]c, agitar. La presencia de colores rojo – rosado o pardo indicó positivo para estructuras triterpénicas y verde – azul indicó positivo para estructuras esteroidales.

Identificación de quinonas (Borntrager): En el segundo tubo, se añadió 1ml de la solución acuosa de NaOH al 5%, se agitó fuertemente y se dejó en reposo. Se formó una fase alcalina y otra clorofórmica, la fase acuosa alcalina (sobrenadante) al tornarse de color rosado a rojo indicó la presencia de quinonas.

3.3. ASPECTOS ÉTICOS

3.3.1. PARTICIPACIÓN DE LOS DONANTES

Los donantes de sangre para el desarrollo de este proyecto participaron en forma anónima y voluntaria.

3.3.2. PROCESO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

Los donantes de sangre para el cultivo in vitro de los parásitos fueron informados sobre el avance del experimento y tuvieron la potestad de desistir sobre su participación en el proyecto.

3.3.3. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 47, 48 (Ver anexo 21):

Durante la realización de la parte biológica, se cumplió con las normas de bioseguridad en el laboratorio, evitando de esa manera; algún tipo de contaminación a las personas involucradas en el proceso y mala manipulación de los productos biológicos.

3.3.3.1 Equipo de protección personal

47

Utilizar el equipo de protección personal (EPP) apropiado, determinado por las regulaciones del lugar de investigación, el coordinador del estudio y el investigador principal (PI). Un EPP incluye: bata de laboratorio, mangas, mascarilla y guantes de nitrilo.

3.3.3.2. Técnicas asépticas

Los procedimientos se realizaron en una cabina de flujo laminar. Los especímenes derivados de sangre y el medio fueron mantenidos en condiciones estériles en todo momento. Las áreas y equipos fueron descontaminados usando fenol al 5% y alcohol 70% antes y después de su uso.

3.3.3.3 Precauciones universales

Se utilizó siempre las precauciones universales al manipular especímenes. Todos los derivados de sangre deben ser considerados potencialmente infecciosos; es recomendable que los especímenes de humanos sean manipulados utilizando las buenas prácticas de trabajo establecidas en el laboratorio. Siempre cambiarse los guantes, lavarse las manos después de retirarse los guantes y después de finalizar el procedimiento.

3.4. PLAN DE ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS

El porcentaje de inhibición de los extractos, control positivo y control negativo en las diferentes concentraciones se calculó con la siguiente fórmula:

푃푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 푑푒푙 퐶. 푛푒𝑔푎푡𝑖푣표 − 푃푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 푐표푛 푙푎 푑푟표𝑔푎 % 푑푒 퐼푛ℎ. = × 100 푃푎푟푎푠𝑖푡푒푚𝑖푎 푑푒푙 퐶. 푛푒𝑔푎푡𝑖푣표

El valor de IC50 se calculó por una curva de actividad: Porcentaje de inhibición vs. logaritmo de la concentración de la droga, a través del cálculo de interpolación lineal:

50 − 푌1 퐿표𝑔(퐼퐶50 ) = 퐿표𝑔(푋1) + [퐿표𝑔(푋2) − 퐿표𝑔(푋1)] 푌2 − 푌1 Donde:

X1 = Concentración de la droga que da una inhibición de la parasitemia Y1> 50%;

48

X2= Concentración de la droga que da una inhibición de la parasitemia Y2< 50%;

Y1 =Porcentaje de inhibición de X1

Y2 = Porcentaje de inhibición de X2

Los resultados se obtuvieron utilizando los programas estadísticos Microsoft Excel 2013y SPSS v 20.00.

CAPITULO IV

49

4.1. RESULTADOS

4.1.1. EXTRACTOS

Se obtuvo un total de 32 extractos, de diferentes órganos (hojas, tallos, cortezas, raíces y toda la planta) de ocho especies vegetales recolectadas de la familia Apocynaceae, de la cuales tenemos 17 extractos etanólicos (ET) y 15 extractos alcaloidales básicos (EAB). El extracto hidroalcohólico y alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana Standl., se utilizaron como controles positivos. (Ver anexo 18).

Figura 6: Porcentaje de rendimiento de los extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos.

En el diagrama se barras se observa el versus entre el porcentaje de rendimiento de los extractos y en el peso en base a la planta seca y molida para los ET, y en base al ET seco para los EAB. (Ver figura 6).Se obtuvo mayor porcentaje de rendimiento en los extractos etanólicos que en los extractos alcaloidales.

50

4.1.2. Cultivos y ensayos de actividad antiplasmodial in vitro

4.1.2.1. Cultivo in vitro de las cepas de P. falciparum

Para la adaptación de los cultivos in vitro de las cepas de P. falciparum FCR-3 (CQ- R) y 3D7 (CQ-S), estas inicialmente fueron descongeladas, observándose crecimiento de la parasitemia desde el día cero hasta el día seis, indicando un crecimiento adecuado y continuo para realizar los ensayos de actividad antiplasmodial. (Ver figura 7).

6.00 Cepa FCR-3 (CQ-R)

5.00 5.12

4.00

3.00 3.04

2.00 1.59

% Parasitemia % 1.00 0.53 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 Días de culltivo Cepa 3D7 (CQ-S) 7.00

6.00 5.76 5.00

4.00 3.00 2.93 2.00 1.62 % Parasitemia % 1.00 0.45 0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 Días de cultivo

Figura 7: Crecimiento de la parasitemia de P. falciparum cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S).

La tasa de multiplicación promedio (TMP) de P. falciparum cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S) fue de 2.57 y 2.69 veces respectivamente, cada 48 horas. Observándose una mayor TMP en la cepa sensible.

51

4.1.2.2. Ensayos de actividad antiplasmodial in vitro

En este trabajo de investigación se ha evaluado la actividad antiplasmodial in vitro de un total de 32 extractos entre ET (17) y EAB (15) de ocho especies vegetales recolectadas de la familia Apocynaceae, este ensayo se ha realizado frente a P. falciparum cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S); del total de extractos ensayados 15 resultaron activos inhibiendo el crecimiento de las cepas ensayadas. (Ver tabla 6).

De los 17 ET ensayados frente a la cepa FRC-3 (CQ-R) de P. falciparum, ocho no presentaron actividad con IC50> 10 µg/ml, y nueve fueron activos con IC50 < 10

µg/mL, siendo el más significativo las hojas de Odontadenia geminata (IC50 = 0,10

µg/mL), seguido de las hojas de O. macrantha (IC50 = 1,73 µg/mL), el extracto de hojas de O. geminataal ser comparada con los resultados obtenidos para Remijia peruviana (IC50 = 1,53 µg/mL), extracto empleado como control positivo, resulto ser más activo; el ET de las hojas de Malouetia tamaquarina (IC50 = 9,85 µg/mL), fue el que presentó menor actividad antiplasmodial. Mientras, que solo 06 de los ET inhibieron el crecimiento de la cepa 3D7 (CQ-S) de P. falciparum, siendo el más activo la corteza de Malouetia tamaquarina (IC50 = 5,66 µg/mL) y el de menor actividad las hojas de M. tamaquarina (IC50 = 8,73 µg/mL), sin embargo, estos resultados no presentan mucha diferencia con el extracto empleado como control positivo (Ext. H2O/OH de R. peruviana, (IC50 = 6,16 µg/mL). (Ver tabla 6).

También se observó que los ET de las hojas de las especies Malouetia killipii, Malouetia tamaquarina, Marsdenia rubrofusca, Odontadenia geminata y toda la planta de Tassadia kamaensis, presentaron actividad antiplasmodial frente a las dos cepas de P. falciparum ensayados FRC-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S). (Ver tabla 6).

Para el caso de los EAB, cuatro fueron activos frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) de P. falciparum, donde las hojas de Marsdenia rubrofusca (IC50 = 0,28 µg/mL) fue el de mayor actividad antiplasmodial, incluso ligeramente mayor al del EAB de R. peruviana (IC50 = 0,30 µg/mL) empleado como control positivo. Sin embargo, solo dos extractos fueron activos frente a la cepa 3D7 (CQ-S), Malouetia tamaquarina

52 hojas y tallos (IC50= 2,97 y 5,93 µg/mL respectivamente), que al ser comparadas con

R. peruviana (IC50 = 0,91 µg/mL), presentaron menor actividad.

Del total de extractos ensayados solo las hojas de Malouetia tamaquarina resultaron activos tanto el ET y el EAB, frente a las dos cepas ensayadas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S). Además, se observó actividad antiplasmodial solo frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) de los ET y EAB de hojas y tallos de Marsdenia rubrofusca y de toda la planta de Tassadia kamaensis (Ver tabla 6).

53

Tabla 6: Actividad antiplasmodial de los extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos frente a P. falciparum cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible). FCR-3 (CQ-R) 3D7 (CQ-S) Especies Parte Tipo de %Inh (±) %Inh (±) vegetales utilizada extracto IC50 IC50 SD SD ET 68 ± 1 9,23 34 ± 19 >10 hojas Macoubea EAB 35 ± 2 >10 < 50 >10 sprucei ET 34 ± 5 >10 < 50 >10 corteza EAB 33 ± 12 >10 22 ± 5 >10 ET 63 ± 5 6,53 69 ± 0 7,63 hojas EAB 47 ± 0 >10 < 50 >10 Malouetia ET < 50 >10 < 50 >10 tallo killipii EAB 9 ± 3 >10 < 50 >10 ET 26 ± 11 >10 < 50 >10 corteza EAB 31 ± 13 >10 < 50 >10 ET 56 ± 4 9,85 58 ± 1 8,73 hojas EAB 69 ± 10 5,38 86 ± 3 2,97 Malouetia ET < 50 >10 < 50 >10 tallo tamaquarina EAB 25 ± 0 >10 89 ± 1 5,93 ET 31 ± 7 >10 93 ±0 5,66 corteza EAB < 50 >10 20 ± 9 >10 Mandevilla toda la ET 50 ± 2 7,53 26 ± 0 >10 pavonii planta ET 95 ± 0 5,41 80 ± 3 6,41 hojas Marsdenia EAB 75 ± 2 0,28 44 ± 0 >10 rubrofusca ET 77 ± 3 9,19 30 ± 6 >10 tallo EAB 75 ± 9 8,59 13 ± 3 >10 ET 90 ± 4 0,10 71 ± 3 8,13 hojas EAB 31 ± 0 >10 18 ± 21 >10 Odontadenia ET 20 ± 1 >10 < 50 >10 geminata tallo EAB 38 ± 0 >10 1 ± 8 >10 raíz ET 36 ± 2 >10 < 50 >10 ET 68 ± 1 1,73 34 ± 0 >10 hojas Odontadenia EAB 47 ± 1 >10 21 ± 12 >10 macrantha ET 48 ± 0 >10 23 ± 1 >10 tallo EAB < 50 >10 6 ± 10 >10 Tassadia toda la ET 65 ± 0 3,87 56 ± 4 6,36 kamaensis planta EAB 66 ± 0 2,51 19 ± 0 >10

54

Control positivo Ext. Remijia 90 ± 1 1,53 71± 3 6,16 corteza H2O/OH peruviana EAB 91± 0 0,30 56± 4 0,91 Droga de referencia (IC = 380 nM/ (IC = 10 nM/ 0,06 Difosfato de cloroquina 50 50 0,33 µg/mL) 10, 15. µg/mL) 16. Leyenda: los extractos con actividad antiplasmodial se encuentran resaltados.

En las figuras 8 y 9 se observa un diagrama de cajas comparativo del porcentaje de inhibición de los ET y EAB frente a P. falciparum cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-

S) a una concentración de 10 µg/mL, en comparación con el Ext. H2O/OH y EAB de R. peruviana (control positivo).

55

Figura 8: Diagrama de cajas comparativo del porcentaje de inhibición (Media + DS) de los ET frente a P. falciparum cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible).

56

Figura 9: Diagrama de cajas comparativo del porcentaje de inhibición (Media + DS) de los EAB frente a P. falciparum cepas FCR-3 (cloroquina resistente) y 3D7 (cloroquina sensible).

57

Los datos de concentración inhibitoria (IC50) de los extractos con actividad antiplasmodial (%Inh =  50) se determinó a través del cálculo de interpolación lineal, ingresando la fórmula en el programa estadístico Microsoft Excel 2013; y se corroboro a través del gráfico de análisis de regresión tipo logit por una curva de actividad: porcentaje de inhibición vs logaritmo de la concentración del extracto. En las figuras N° 10 y 11, se puede apreciar que el eje de las abscisas (X) está constituido por el logaritmo de las concentraciones del extracto trabajado, incluido el control positivo, mientras que el eje de las ordenadas (Y) está constituido por el porcentaje de parasitemia de los grupos tratados. Cada círculo representa la respuesta parasitaria del grupo tratado a una concentración dada. La unión de las líneas punteadas corresponde a la interpolación entre las dos concentraciones de la droga:

X1 y X2.

58

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.A. Macoubea sprucei (Müll. Arg.) 10.B. Malouetia killipii Woodson. Markgr. ET (hojas) ET (hojas)

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.C. Malouetia tamaquarina (Aubl.) A. 10.D. Malouetia tamaquarina (Aubl.) DC. ET (hojas) A. DC. EAB (hojas)

59

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.E. Mandevilla pavonii (A. DC.) Woodson. 10.F. Marsdenia rubrofusca E. Fourn. ET (toda la planta) ET (hojas)

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.G. Marsdenia rubrofuscaE. Fourn. 10.H. Marsdenia rubrofuscaE. Fourn. EAB (hojas) ET (tallo)

60

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.J. Odontadenia geminata (Hoffmanns. ex Roem. 10.I. Marsdenia rubrofusca E. Schult.) Müll. Arg. ET (hojas) Fourn. EAB (tallo)

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.K. Odontadenia macrantha (Roem.  10.L. Tassadia Kamaensis (Morillo) Morillo. Schult.) Markgr.ET (hojas) ET (toda la planta)

61

FCR-3 (CQ-R) FCR-3 (CQ-R)

10.M. Tassadia Kamaensis (Morillo) Morillo. 10.N. Remijia peruviana Standl. EAB (toda la planta) Ext.H2O/OH (corteza)

FCR-3 (CQ-R)

10.Ñ. Remijia peruviana Standl. EAB (corteza)

Figura 10: Gráficos de IC50 de extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos activos frente a P. falciparum cepa FCR-3 (cloroquina resistente).

62

3D7(CQ-S) 3D7(CQ-S)

11.A. Malouetia killipii Woodson. 11.B. Malouetia tamaquarina (Aubl.) ET (hojas) A. DC. ET (hojas)

3D7(CQ-S) 3D7(CQ-S)

11.C. Malouetia tamaquarina (Aubl.) A. 11.D. Malouetia tamaquarina (Aubl.) DC. EAB (hojas) A. DC. EAB (tallo)

63

3D7(CQ-S) 3D7(CQ-S)

11.E. Malouetia tamaquarina (Aubl.) 11.F. Marsdenia rubrofusca E.

A. DC. ET (corteza) Fourn. ET (hojas)

3D7(CQ-S) 3D7(CQ-S)

11.G. Odontadenia geminata (Hoffmanns. ex 11.H. Tassadia Kamaensis (Morillo) Roem. Schult.) Müll. Arg. ET (hojas) Morillo. ET (toda la planta)

64

3D7(CQ-S) 3D7(CQ-S)

11.I. Remijia peruviana Standl. 11.J. Remijia peruviana Standl. Ext.H2O/OH (corteza) EAB (corteza)

Figura 11: Gráficos de IC50 de extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos activos frente a P. falciparum cepa 3D7 (cloroquina sensible).

65

4.1.2.3. Extractos etanólicos de especies vegetales en estudio vs extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa FCR-3.

En la tabla 7, se postula saber si los extractos mostraron mejor actividad antiplasmodial que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia Peruviana, es decir, poseen una IC50 menor al extracto utilizado como referencia (control positivo).

Tabla 7: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) p-valor Especie vegetal Parte utilizada IC50 T-valor unilateral Macoubea sprucei hojas 9,23 94,31 0,0004 Malouetia killipii hojas 6,53 60,01 0,0023 Malouetia tamaquarina hojas 9,85 101,90 0,0003 Mandevilla pavonii toda la planta 7,53 73,49 0,0010 Marsdenia rubrofusca hojas 5,41 47,52 <0,0001 Marsdenia rubrofusca tallo 9,19 93,82 0,0004 Odontadenia geminata hojas 0,10 -22,15 <0,0001 Odontadenia macrantha hojas 1,73 2,45 0,0352 Tassadia kamaensis toda la planta 3,87 28,66 <0,0001 Remijia peruviana corteza 1,53

Con un error menor al 0,05 %, los extractos que sobrepasaron el valor T (2,132), fueron los extractos etanólicos de Macoubea sprucei(hojas), Malouetia killipii (hojas), Malouetia tamaquarina (hojas), Mandevilla pavonii (toda la planta), Marsdenia rubrofusca (hojas), Marsdenia rubrofusca (tallo), Odontadenia macrantha (hojas), Tassadia kamaensis (toda la planta), es decir no presentaron mejor actividad que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana, en cambio, el extracto que mostró un valor T inferior fue el extracto etanólico de Odontadenia geminata(hojas), por lo tanto este extracto mostró mejor actividad que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana.

66

4.1.2.4. Extractos alcaloidales de especies vegetales en estudio vs extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa FCR-3.

En la tabla 8, se postula saber si los extractos mostraron mejor actividad antiplasmodial que el extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana, es decir, poseen una IC50 menor al extracto utilizado como referencia (control positivo.)

Tabla 8: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132)

p-valor Especie vegetal Parte utilizada IC50 T-valor unilateral Malouetia tamaquarina hojas 5,38 62,22 0,0020 Marsdenia rubrofusca hojas 0,28 -0,25 0,4093 Marsdenia rubrofusca tallo 8,59 101,53 0,0003 Tassadia kamaensis toda la planta 2,51 25,84 <0,0001 Remijia peruviana corteza 0,30

Descripción: Con un error menor al 0,05 %, los extractos que sobrepasaron el valor T (2,132), fueron los extractos alcaloidales de Malouetia tamaquarina (hojas), Marsdenia rubrofusca (tallo), Tassadia kamaensis (toda la planta) es decir no presentaron mejor actividad que el extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana, en adición el extracto alcaloidal de Marsdenia rubrofusca(hojas) presento un IC50 cercano al extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana, sin embargo a pesar de que presento un valor T inferior (<2,132), obtuvo un error mayor al 0,05% (p=0,41) lo que no aseguro que la actividad del extracto alcaloidal en estudio fuese mayor al extracto alcaloidal utilizado como referencia.

67

4.1.2.5. Extractos etanólicos de especies vegetales en estudio vs extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa 3D7.

En la tabla 9 se postula saber si los extractos mostraron mejor actividad antiplasmodial que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana, es decir, poseen una IC50 menor al extracto utilizado como referencia (control positivo.)

Tabla 9: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) p-valor Especie vegetal Parte utilizada IC50 T-valor unilateral Malouetia killipii hojas 7,63 18,00 0,0000 Malouetia tamaquarina hojas 8,73 31,48 0,0000 Malouetia tamaquarina corteza 5,66 -6,12 0,0018 Marsdenia rubrofusca hojas 6,41 3,06 0,0188 Odontadenia geminata hojas 8,13 24,13 <0,0001 Tassadia kamaensis toda la planta 6,36 2,45 0,0352 Remijia peruviana corteza 6,16

Con un error menor al 0,05 %, los extractos que sobrepasan el valor T (2,132) fueron los extractos etanólicos de Malouetia killipii (hojas), Malouetia tamaquarina (hojas), Marsdenia rubrofusca (hojas), Odontadenia geminata (hojas), Tassadia kamaensis (toda la planta), es decir no presentaron mejor actividad que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana, en cambio, el extracto que mostró un valor T inferior fue el extracto etanólico de Malouetia tamaquarina (corteza), por lo tanto este extracto mostró mejor actividad que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana.

68

4.1.2.6. Extractos etanólicos de especies vegetales en estudio vs extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana frente a la cepa 3D7.

En la tabla 10, se postula saber si los extractos mostraron mejor actividad antiplasmodial que el extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana, es decir, poseen una IC50 menor al extracto utilizado como referencia (control positivo).

Tabla 10: Valor T para muestras independientes (GL=4; IC= 95%; α= 0,05; Ttabla= 2,132) p-valor Especie vegetal Parte utilizada IC50 T-valor unilateral Malouetia tamaquarina hojas 2,97 25,23 <0,0001 Malouetia tamaquarina tallo 5,93 61,48 0,0021 Remijia peruviana corteza 0,91

Con un error menor al 0,05 %, los extractos que sobrepasan el valor T (2,132), fueron los extractos alcaloidales de Malouetia tamaquarina (hojas) y Malouetia tamaquarina(tallo) es decirno presentaron mejor actividad que el extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana.

4.1.3. TAMIZAJE FITOQUÍMICO

Los resultados del tamizaje fitoquímico de los ET que presentaron actividad antiplasmodial frente a alguna de las cepas de P. falciparum ensayadas, se muestran a continuación (Ver anexo 20)

Quinonas y fenoles: Ninguno de los extractos presentó este tipo de metabolitos secundarios.

Alcaloides: En todas las especies que mostraron actividad antiplasmodial, excepto en el ET de Mandevilla pavonii (toda la planta), se encontró presencia de este metabolito.

Triterpenos: Sólo las especies de Malouetia tamaquarina (corteza) y Marsdenia rubrofusca (tallo), presentaron este metabolito.

Esteroides: Se observó presencia de esteroides en todos los extractos, excepto en el de Marsdenia rubrofusca (tallo).

69

Lactonas, flavonoides y taninos: Todos los ET con actividad antiplasmodial tienen presencia de estos metabolitos en mayor o menor proporción.

Saponinas: Las especies de Malouetia tamaquarina (hojas), Mandevilla pavonii (toda la planta), Marsdenia rubrofusca (hojas) y Odontadenia geminata (hojas), muestran presencia de saponinas.

Resinas: Se observó presencia de este metabolito en las especies de Malouetia tamaquarina (corteza), Marsdenia rubrofusca (hojas), Tassadia kamaensis (toda la planta).

Aminoácidos: Sólo Marsdenia rubrofusca (tallo), tiene este metabolito.

Catequinas y cumarinas fijas: Malouetia killipii (hojas) y M. tamaquarina (hojas) estas son la únicas especies que no presentan este tipo de compuestos, pero se observa en las demás especies.

70

4.2. DISCUSIÓN

Las especies vegetales de la familia Apocynaceae evaluadas en el presente estudio, Macoubea sprucei (Müll. Arg.) Markgr, Malouetia killipii Woodson, Malouetia tamaquarina (Aubl.) A. DC, Mandevilla pavonii (A. DC.) Woodson, Marsdenia rubrofusca E. Fourn, Odontadenia geminata (Hoffmanns. ex Roem.  Schult.) Müll. Arg, Odontadenia macrantha (Roem.  Schult.) Markgr y Tassadia Kamaensis (Morillo) Morillo, presentaron actividad sobre P. falciparum. En la bibliografía hallamos referencias sobre el uso tradicional de cocimientos e infusiones obtenidos de especies vegetales pertenecientes a diversas familias, para el alivio de dolencias y enfermedades, entre ellas la malaria. El empleo de especies como Physalis angulata L. (Bolsa mullaca); Ruta graveolens L. (Ruda); Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. (Yerba luisa); Curcuma longa L. (guisador); Himatanthus sucuuba (Spruce ex Muell. Arg.) (Bellaco caspi); Aspidosperma excelsum Bentham (Remocaspi), son de uso popular para el tratamiento de los síntomas relacionados a la malaria por el poblador amazónico, siendo las dos últimas pertenecientes a la familia Apocynaceae 6.

Si bien los conocimientos sobre el uso tradicional de plantas medicinales carecen de valor científico, no dejan de ser importantes, pues en base a estos se puede realizar estudios para identificar especies vegetales que presenten muy buena actividad antiplasmodial y de esa manera detectar la sustancia química responsable de la misma y que pudieran servir como modelos para la identificación de nuevos blancos para el tratamiento de los síntomas que acompañan a la enfermedad o para la erradicación del parásito y consecuentemente el desarrollo de nuevas y mejores drogas 1.

En la literatura no se reporta sobre la actividad antiplasmodial de las especies vegetales estudiadas en el presente trabajo, sin embargo, se cuenta con estudios relacionados de especies de la familia Apocynaceae, bien conocida por ser fuente de alcaloides indólicos, compuestos que han despertado gran interés debido a su compleja estructura, así como propiedades farmacológicas y toxicológicas 7. Este es el motivo por el que se evaluó la actividad antiplasmodial in vitro, frente a dos cepas de P. falciparum FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-R), de 17 extractos etanólicos (ET) y 15

71 extractos alcaloidales básicos (EAB), obtenidos de estas nuevas especies de la Amazonía con la finalidad de buscar nuevas alternativas para el tratamiento de la malaria.

En las evaluaciones de actividad antiplasmodial in vitro de 32 extractos (17 ET y 15 EAB), 17 no mostraron actividad, esto puede deberse a causas: como la incapacidad de los metabolitos secundarios presentes en los extractos para atravesar la membrana eritrocitaria y del parásito, y llegar a su diana de acción o a la incapacidad de ligarse al mismo, otro factor seria que el principio activo requiera de activación metabólica a nivel intestinal y/o hepático, como es el caso de proguanil, que requiere ser metabolizado en el organismo a cicloguanil para presentar actividad antiplasmodial 4.

Mientras que de estos mismos 32 evaluados, 15 resultaron activos inhibiendo el desarrollo de las cepas de P. falciparum estudiadas, de estos 09 ET fueron activos frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) y 06 inhibieron el crecimiento de la cepa 3D7 (CQ- S), en tanto de los EAB, 04 fueron activos frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) y 02 activos frente a la cepa 3D7 (CQ-S). La actividad mostrada por estos extractos puede deberse a la presencia de diferentes tipos de metabolitos secundarios presentes como alcaloidales y no alcaloidales. (Ver tabla 6 y anexo 20).

La actividad antiplasmodial frente la cepa FCR-3 (CQ-R),los ET de las hojas de

Odontadenia geminata y O. macrantha (IC50 = 0,10 y 1,73 µg/mL, respectivamente), resultaron ser los más eficaces, siendo el ET de O. geminata15 veces más activo en comparación al extracto utilizado como control positivo R. peruviana (IC50 = 1,53 µg/mL), especie que ha demostrado actividad in vitro frente a esta misma cepa y se caracteriza por presentar compuestos del tipo alcaloidal con esqueleto indólico como quinina y cinconina 40. Cabe destacar que en ambas especies se ha identificado la presencia de compuestos alcaloides, sin embargo, estos extractos no mostraron actividad antiplasmodial, lo que hace suponer que la actividad se deba a la presencia de otros metabolitos secundarios del tipo no alcaloidal, de acuerdo al tamizaje fitoquímico están especies presentan esteroides, flavonoides, lactonas y taninos compuestos que presentan diferentes actividades biológicas.

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Estos resultados al ser comparados con los ET de las hojas de otras especies de la misma familia que nuestras especies (Apocynaceae): Aspidosperma camporum y A. cruentum (IC50 = 1,60 y 2,70µg/mL, respectivamente), resultaron ser más activos frente a la misma cepa FCR-3 (CQ-R) 10. También se comparó la actividad mostrada de Odontadenia geminata con cloroquina (IC50 = 0,33 µg/mL) frente a esta misma cepa, el cual resultó ser tres veces superior 10.

Con lo que respecta al ET de las hojas de O. geminata (IC50 = 8,13 µg/mL), frente a la cepa 3D7 (CQ-S) de P. falciparum, se observó actividad, aunque no muy relevante, mientras que su respectivo EAB fue inactivo, estos resultados sugieren la importancia de los compuestos no alcaloidales en la actividad antiplasmodial de esta especie.

En el caso de la especie Marsdenia rubrofusca, tanto los ET y EAB de las hojas y tallos resultaron activos frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) de P. falciparum, siendo el de mayor actividad antiplasmodial el EAB de las hojas (IC50 = 0,28 µg/mL), que al ser comparado con el EAB de hojas de la especie Aspidosperma sp (IC50 = 3,50 µg/mL), resulto ser 13 veces mayor frente a la misma cepa de Plasmodium10. Cabe mencionar también que el ET de hojas (IC50 = 6,41 µg/mL) también mostró moderada actividad frente a la cepa 3D7 (CQ-S) de P. falciparum, por lo que la actividad antiplasmodial no solo pudiera atribuirse a la presencia de compuestos del tipo alcaloidal, sino también a los metabolitos del tipo no alcaloidal como flavonoides, lactonas, taninos, catequinas y cumarinas fijas, metabolitos en común en hojas y tallos de M. rubrofusca.

Como se muestra en los resultados de las especies del género Malouetia, tenemos que las dos especies ensayadas M. tamaquarina (hojas, tallos y corteza)yM. killipi (hojas), presentaron actividad antiplasmodial frente a alguna de las cepas de P. falciparum o frente ambas, siendo los más efectivos los EAB de las hojas de M. tamaquarina (IC50 = 2,97 y 5,38 µg/mL), frente a las cepas 3D7 (CQ-S) y FCR-3 (CQ-R) respectivamente. En estas especies se han identificado metabolitos del tipo alcaloidal y no alcaloidal principalmente esteroides, flavonoides, lactonas y taninos, que pueden ser los responsables de la actividad antiplasmodial mostrado por los ET.

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En otro estudio el EAB de hojas de las especies de la familia Apocynaceae,

Rauwolfia macrantha (IC50 = 7,14 µg/mL) y tallo de R. sprucei (IC50 = 3,96 µg/mL) de la familia Apocynaceae, mostraron moderada y muy buena actividad biológica, frente a la cepa FCR-3 de P. falciparum, que al ser comparadas con el EAB de hojas de M. tamaquarina, se observa una IC50 parecida, considerando que son especies pertenecientes a la misma familia 8.

El EAB de toda la planta (IC50 = 2,51 µg/mL) de Tassadia kamaensis, presentó buena actividad antiplasmodial frente a las cepa FCR-3 (CQ-R) de P. falciparum, y ligeramente más eficaz que su referente ET (IC50 = 3,87 µg/mL), asimismo el ET

(IC50 = 6,36 µg/mL) también mostró tener moderada actividad frente a la cepa 3D7 (CQ-S) de P. falciparum, mientras que su respectivo EAB fue inactivo, lo cual se atribuiría la actividad biológica no solo a la presencia de alcaloides en esta especie, sino la presencia de otros tipos de metabolitos no alcaloidales.

Estos resultados se pueden comparar con los obtenidos del EAB de R. macrantha

(IC50 = 3,91 µg/mL), especie vegetal de la familia Apocynaceae, que también presentó muy buena actividad antiplasmodial 8. El tamizaje fitoquímico además de alcaloides, reveló la presencia de esteroides, lactonas, flavonoides, taninos, resinas, catequinas y cumarinas fijas.

De la especie de Mandevilla pavonii, el ET de toda la planta (IC50 = 7,53 µg/mL), presentó moderada actividad frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) de P. falciparum, en esta especie no se encontró la presencia de alcaloides, lo que indicaría que la actividad antiplasmodial se debe a compuestos no alcaloidales presentes en el ET, el tamizaje fitoquímico reveló la presencia de metabolitos en abundancia como esteroides, lactonas, flavonoides, taninos, catequinas y cumarinas fijas.

En nuestros resultados observamos, un mayor número de extractos etanólicos con actividad antiplasmodial, lo que indicaría que los metabolitos secundarios de tipo no alcaloidal presentes principalmente esteroides, lactonas, flavonoides y taninos, de acuerdo al tamizaje fitoquímico, podrían ser los responsables de la actividad antiplasmodial de estos extractos. Cabe mencionar que los extractos alcaloidales que

74 fueron activos reportaron valores de IC50 más efectivo en relación a sus respectivos extractos etanólicos, en este caso que asumiría es probable que exista un efecto antagonista entre los compuestos presentes en el ET.

La artemisinina, compuesto natural del tipo sesquiterpeno lactona endoperóxido, aislado de la especie Artemisia annua (Asteraceae), originaria de China y Vietnam, que es un potente antimalárico utilizado para tratar la malaria grave multidroga- resistente 49. En este trabajo se han identificado mediante tamizaje fitoquímico que todos los ET con actividad antiplasmodial tienen presencia de metabolitos secundarios del tipo lactonas y terpenos.

Se han aislado y caracterizado flavonoides de muchas plantas medicinales usadas en áreas endémicas de malaria, los cuales tienen una variabilidad de actividad dependiendo de la estructura, entre estos compuestos, las chalconas sintéticas y naturales han demostrado un potencial prometedor.

Dos chalconas asiladas del género Crotalaria (Fabaceae), la medicagenina, demostró efecto in vitro (IC100 = 2 μg/mL) como inhibidor de la maduración de esquizontes de P. falciparum 50, mientras que crotaorixina inhibió la maduración de los parásitos a una concentración de 10 μg/mL 50. Una serie de auronas sintéticas se probó su capacidad para inhibir in vitro los estadios eritrocitarios de varias cepas de P. falciparum, resultando el compuesto más activo el 4, 6, 4’-triacetil- 3’,5’-dimetoxi-2- aurona (IC50= 0,007 y 0,18 μM) contra las cepas K1 (cepa resistente a drogas) y NF54 (cepa sensible), respectivamente 50. También, nueve flavonoides aislados de Artocarpus champeden (Moraceae) se encontraron que poseen actividad contra P. 50 falciparum con valores de IC50 entre 0,001 y 1,3 μM . Además, se ha reportado buena actividad antiplasmodial con algunos biflavonoides como lanaroflavona (IC50 50 50 = 0,48 μM) y biflavanona (IC50 = 80 ng/mL) .

La síntesis de nuevos derivados de isoflavonas [3 – estirilcarbonil – 2 metil – 5 – metoxi] – isoflavona (1) y [3 – estirilcarbonil – 2 – metil – 7 – metoxi] – isoflavona

(2) (IC50 = 2,89 y 3,23 µM), respectivamente, mostraron tener muy buena actividad in vitro frente a la cepa W2 de P. falciparum; y en modelos murinos consistentes en

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51 ratones NIH infectados por P. berghei (IC50 = 24,85 y 7,30 µM), respectivamente . En base a estos datos reportados en la bibliografía se ve la importancia de los flavonoides en la actividad antiplasmodial tanto in vitro como in vivo, que al ser comparados con nuestros resultados obtenidos en el tamizaje fitoquímico, donde se identifica la presencia de este metabolito secundario en todos los ET activos.

En nuestros resultados se observó presencia de metabolitos del tipo esteroides en todos los ET, excepto en el de Marsdenia rubrofusca (tallo), esto sugiere que parte de la actividad antiplasmodial mostrada por los ET, puede ser por la presencia de este tipo de compuestos. El extracto de Solanum nudum (Solanaceae), empleado tradicionalmente para el tratamiento de la fiebre asociadas a la malaria en Nariño,

Colombia, se han aislado compuestos del tipo esteroidal SN1, SN2 y SN4 (IC50 = 28,3; 175,1 y 41,8 µM respectivamente), con actividad antiplasmodial en promedio frente a las cepas FCB2 (CQ-R) y NF54 (CQ-S), además de presentar baja toxicidad 52.

En el presente estudio se empleó como sustancia patrón al extracto hidroalcohólico y alcaloidal de corteza de R. peruviana Standl, especie quimiotaxonómicamente relacionada con las Cinchonas, por la similitud de los compuestos presentes en las especies de donde también se aislaron alcaloides indólicos y quinolínicos (Cinchonina, quinina, quinidina, quinamina, conquinamina, etc). Algunas especies del género Remijia son fuente de alcaloides tipo quinina y cinchona, considerando que la quinina es el segundo alcaloide más potente frente a las cepas de Plasmodium encontradas en el hombre, después de la quinidina 4, 39.

La actividad antiplasmodial mostrada frente a las cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-

S) de P. falciparum del Ext. H2O/OH de R. peruviana (IC50 = 1,53 y 6,16 µg/mL, respectivamente), se puede comparar con estudios similares donde se utilizó el ET frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) con una IC50 = 2,40 µg/mL, a pesar de la diferencia del tipo de extracto se puede decir que la actividad antiplasmodial es semejante 10. También en otro estudio frente a la cepa F32 - Tanzania (CQ-S) de P. falciparum, el

Ext. H2O/OH de R. peruviana (IC50 = 4,40 µg/mL) presentó buena actividad, si bien no es el mismo tipo de cepa, ambas son sensibles a la cloroquina 21. Además de que

76 esta especie es reconocida por tener actividad sobre P. falciparum, debido a la presencia de alcaloides.

Se analizó a través de una prueba “t” para muestras independientes y con p- valor unilateral el IC50 de los extractos etanólicos y alcaloidales con actividad antiplasmodial significativa de acuerdo al protocolo, es decir IC50< 10ug/mL, y así contrastar que estos posean una IC50 menor o mayor que el extracto utilizado de referencia (control positivo);así mismo se obtuvo en la tabla 7, de los extractos etanólicos frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) de P. falciparum, con un error menor al 0,05 % podemos decir que el extracto que obtuvo un valor inferior a T (2,132), fue el extracto etanólico de Odontadenia geminata (hojas), por lo que este muestra mejor actividad que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana (control positivo); en la tabla 8, de los extractos alcaloidales activos frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) de P. falciparum, el extracto alcaloidal de Marsdenia rubrofusca (hojas) presenta una IC50 cercana al extracto alcaloidal de la corteza de Remijia peruviana, sin embargo a pesar de presentar un valor T inferior (<2,132), tiene un error mayor al 5% (p=0,41) lo que no nos asegura que la actividad del extracto alcaloidal en estudio sea mayor al extracto alcaloidal utilizado como referencia.

En la tabla 9, de los extractos etanólicos activos frente a la cepa 3D7 (CQ-S) de P. falciparum, el extracto que mostró un valor T inferior, fue el extracto etanólico de Malouetia tamaquarina (corteza), por lo tanto este extracto muestran mejor actividad que el extracto hidroalcohólico de la corteza de Remijia peruviana; en la tabla 10, de los extractos alcaloidales activos frente a la cepa 3D7 (CQ-S) de P. falciparum, todos sobrepasaron el valor T (2,132), es decir no presentaron mejor actividad que el extracto alcaloidal de Remijia peruviana.

Con la interpretación se sostiene que existe evidencia estadística de que los extractos que presentaron actividad de acuerdo al protocolo, fueron estadísticamente significativos al ser contrastados con el extracto empleado como control positivo, corroborándose estadísticamente los resultados, lo cual hace evidenciar que la actividad antiplasmodial es exclusiva de cada especie y que varía de acuerdo a la cantidad de los productos naturales presentes en su composición.

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4.3. CONCLUSIONES

 De las ocho especies vegetales de la familia Apocynaceae estudiadas, se obtuvieron 32 extractos (17 ET y 15 EAB).  10 ET y 5 EAB, resultaron activos inhibiendo el crecimiento de P. falciparum. 9 ET y 4 EAB frente a la cepa FCR-3 (CQ-R) y 6 ET y 2 EAB frente a la cepa 3D7 (CQ-S). Se destaca la importante actividad antiplasmodial mostrada del ET de Odontadenia geminata frente a P. falciparum cepa FCR-3 (CQ-R), 15 veces superior que el control positivo de Remijia peruviana y 3 veces más eficaz que la droga patrón cloroquina frente a esta misma cepa.  De acuerdo con el tamizaje fitoquímico, los ET que presentaron actividad antiplasmodial, revelaron la presencia de metabolitos secundarios como alcaloides, seguido de los lactonas, flavonoides, esteroides y taninos los cuales podrían ser responsables de la actividad antiplasmodial.  Estos resultados ameritan estudios fitoquímicos biodirigidos, con la finalidad de validar la acción antiplasmodial y la caracterización de sus componentes químicos, en especial la búsqueda de los compuestos responsables de la actividad.

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4.4. RECOMENDACIONES

 Continuar con estudios relacionados a la evaluación antiplasmodial de especies vegetales de la Familia Apocynaceae, pues en base a los antecedentes y reportes sobre el uso tradicional de estas especies, con respecto a los resultados obtenidos, catalogan a estos estudios como un instrumento útil para corroborar y además dar indicios del posible contenido químico en las especies o familias, como responsables de la actividad biológica y así el descubrimiento de nuevos blancos de investigación para la obtención de nuevos principios activos y el desarrollo de nuevos antimaláricos  Desarrollar estudios de fraccionamiento químico biodirigido de los extractos que mostraron muy buena actividad antiplasmodial, haciendo uso de técnicas cromatográficas (cromatografía de líquida al vacío, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de columna, cromatografía circular, HPLC, etc), determinar las estructuras químicas utilizando técnicas de espectroscópicas (IR, 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC y NOESY) y espectrométricas (masas baja y alta resolución) y realizar ensayos de actividad antiplasmodial de los compuestos aislados con la finalidad de comprobar la actividad.  Ampliar nuevas estrategias e identificar procesos metabólicos del parásito, por medio de estudios moleculares, que establezcan a nuevas dianas terapéuticas de acción, en las que los metabolitos secundarios presentes en los extractos vegetales pudieran ejercer acción.  Realizar estudios de evaluación antiplasmodial in vivo y de toxicidad de las especies vegetales que presentaron actividad antiplasmodial.

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4.5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4.6. ANEXOS

Anexo 1: Mapa epidemiológico de incidencia de casos de malaria por P. falciparum en el departamento de Loreto.

Fuente: Red Nacional de Epidemiología (RENACE) – DGE – MINSA, Hasta la SE 39 del 2015.

Anexo 2: Casos de malaria por P. falciparum por semana. Loreto 2012 – 2015.

Fuente: Red Nacional de Epidemiología (RENACE) – DGE – MINSA, Hasta la SE 39 del 2015.

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Anexo 3: Flujograma de recolección de datos

Recolección de la muestra

Descongelamiento de las Secado y molienda de la muestra cepas FCR3 (CQ-R) y 3D7 (CQ-S) Maceración, filtración y concentración de la muestra Cultivo in vitro de cepas

Obtención de los ET y EAB

Evaluación antiplasmodial de extractos

Incubación por 48 horas

Tinción de células (Bromuro de etidio)

Lectura por citometría de flujo

Determinación de IC50

Tamizaje fitoquímico

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Anexo 4: Definiciones operacionales

Variable independiente: Extractos de las especies vegetales de la familia Apocynaceae.

Variable Definición conceptual Definición operacional Indicador Índices Escala independiente

Extracción etanólica Productos obtenidos de la obtenida por la * En función del peso separación de sustancias extracción de sustancias final del extracto biológicamente activas de los * Porcentaje de Extractos de biológicamente activas obtenido del peso materiales inertes o inactivos rendimiento de especies de una planta, realizado inicial del material de una especie vegetal, a partir los extractos. vegetales de la cada 48 horas vegetal. Tipo de de la utilización de un familia obteniéndose dos * (+) = Positivo: variable: disolvente seleccionado (etanol * Presencia de Apocynaceae componentes: la solución (+) = Poco Cualitativo 96°) y de un proceso de metabolitos de la región extraída en su disolvente (++) = Medianamente extracción para la eliminación secundarios Loreto (el extracto) y el residuo (+++) = Abundante total o parcial del mismo (el bagazo), con posterior * ( - ) = Negativo (concentración al vacío en un filtrado, concentrado y rotavapor). conservado.

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Variable dependiente: Actividad antimalárica in vitro.

Variable Definición conceptual Definición operacional Indicador Índices Escala dependiente Capacidad de un Determinación de la extracto o control * Activo: Actividad parasitemia por positivo de inhibir el IC =  10 g/ml Tipo de Variable: antimalárica in citometría de flujo de Valor IC 50 crecimiento de cepas 50 * No activo Cuantitativa vitro los extractos y controles de P. falciparum de (positivo y negativo). IC50 =  10 g/ml cultivos in vitro

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Anexo 5: Exicata de las especies vegetales

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Anexo 6: Lugar de ubicación de las 08 especies vegetales

Código de Nombre Lugar de Coordenadas N° Género Especies exicata común recolección (G.P.S) sprucei Carretera 03°57´0.9´´ S Loro 1 035171 Macoubea (Müll. Arg.) Iquitos – 73°24´34.1´´ micuna Markgr Nauta Km 25 N Carretera 03°57´0.9´´ S killipi Cuchara 2 040770 Malouetia Iquitos – 73°24´34.1´´ Woodson caspi Nauta Km 25 N tamaquarina 03°42´51.0´´ S Cuchara 3 037478 Malouetia (Aubl.) A. Manacamiri 73°17´16.3´´ caspi DC N pavonii (A. Carretera 03°58´58.6´´ S 4 037476 Mandevilla DC.) - Iquitos – 73°25´2.6´´ N Woodson Nauta Km 25 03°43´16.5´´ S rubrofusca 5 035894 Marsdenia - Manacamiri 73°16´58.8´´ E. Fourn N geminata (Hoffmanns. 03°42´58.6´´ S 6 035436 Odontadenia ex Roem.  - Manacamiri 73°16´54.7´´ Schult.) N Müll. Arg macrantha Carretera 03°57´8.3´´ S (Roem.  Sapo 7 024164 Odontadenia Iquitos – 73°24´41.6´´ Schult.) huasca Nauta Km 25 N Markgr kamaensis 03°43´16.5´´ S 8 015941 Tassadia (Morillo) Morillo Manacamiri 73°16´58.8´´ Morillo N

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Anexo 7: Obtención de extractos etanólicos.

Anexo 8: Extracción de alcaloides (Marcha alcaloidal)

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Anexo 9: Flujograma de evaluación de la actividad antiplasmodial in vitro

Preparación del medio RPMI (Roswell Park Memorial

Institute) – 1640 para Preparación de cultivo. (RPMII). medio completo

(RMPIC): 2.5 mL Evaluación de la de solución stock

actividad antiplasmodial de albumax II en Preparación de la solución 50 mL de RPMI

stock de albumax II. incompleto. Descongelamiento de las cepas FCR-3 (CQ-R) y 3D7 Baño maría a 37° durante 3 minutos. (CQ-S) de P. falciparum.

Adición de soluciones de Adaptación al cultivo in vitro descongelamiento (NaCl 12%; 1.6% y de las cepas de P. 0.9%); 500L con eritrocitos no falciparum; siguiendo la parasitados, 9.5 mL de RPMIC; mezcla de metodología de Trager y gases durante 1 minuto e incubar a 37°C Jansen. por 48 horas.

Cambiar medio de cultivo y adicionar mezcla de gases al cultivo diariamente. Control de la parasitemia

 Realizar un frotis con < 5 L, teñido con Giemsa al 10%

Evaluación de la susceptibilidad in vitro de los extractos obtenidos

frente a las cepas de P. falciparum.

A diferentes concentraciones del extracto (10 g/mL; 1g/mL; y 0.1g/mL (c), se incuba por 48 horas.

} Medición de la parasitemia por citometría de flujo, porcentaje de Inhibición e IC50 de cada extracto.

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Anexo 10: Preparación de medios para cultivo in vitro.

Anexo 11: Descongelamiento de las cepas de P. falciparum

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Anexo 12: Mantenimiento de cultivos in vitro de P. falciparum.

Anexo 13: Sincronización de cepas de P. falciparum.

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Anexo 14: Evaluación de la actividad antiplasmodial in vitro

Anexo 15: Diluciones seriales de los extractos a ensayar

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Anexo 16: Configuración de la placa de 96 alvéolos.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A H2O

B CN CN CN 2a 2a 2a 4b 4b 4b T

C 1c 1c 1c 3c 3c 3c 4a 4a 4a T

D H2O 1b 1b 1b 3b 3b 3b 5c 5c 5c T H2 O E 1a 1a 1a CN CN CN 5b 5b 5b 6b Rf

F 2c 2c 2c 3a 3a 3a 5a 5a 5a 6b Rf

G 2b 2b 2b 4c 4c 4c 6c 6c 6c 6b Rf

H H2O

Donde: Extractos: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 CN: Control negativo (DMSO 0,2%)

T: Testigo (RPMII) Concentraciones: c (10µg/mL); d (1µg/mL); e (0,1µg/mL) R: Ruido de fondo

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Anexo 17: Medición de la parasitemia por citometría de flujo.

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Anexo 18: Porcentaje de rendimiento de los extractos etanólicos y extractos alcaloidales básicos. Peso de Parte Peso de la Especies extracto ET % Rend. utilizada muestra (g) (g) Hojas 333.00 g. 82.86 g. 24.88 % Macoubea sprucei Corteza 766.70 g. 49.64 g. 6.48 % Hojas 332.20 g. 65.48 g. 19.71 % Malouetia killipii Tallo 657.00 g. 48.87 g. 7.44 % Corteza 228.20 g. 19.03 g. 8.34 % Hojas 275.90 g. 204.59 g. 26.92 % Malouetia tamaquarina Tallo 267.60 g. 31.21 g. 11.66 %

Corteza 98.20 g. 8.62 g. 8.77 % Mandevilla pavonii Toda la planta 413.00 g. 74.66 g. 18.08 % Hojas 108.00 g. 30.28 g. 28.04 % Marsdenia rubrofusca Tallo 168.60 g. 22.36 g. 13.26 % Hojas 122.40 g. 50.85 g. 41.54 % Odontadenia geminata Tallo 227.40 g. 29.24 g. 12.86 % Raíz 40.40 g. 4.11 g. 10.18 % Hojas 194.80 g. 42.54 g. 21.84% Odontadenia macrantha Tallo 500.70 g. 57.14 g. 11.41 % Tassadia kamaensis Toda la planta 342.00 g. 64.96 g. 18.99 % Parte Peso del ET Peso del EAB Especies % Rend. utilizada (g) (g) Hojas 41.43 g. 0.02 g. 0.05 % Macoubea sprucei Corteza 24.82 g. 0.45 g. 1.83 % Hojas 32.74 g. 0.01 g. 0.04 % Malouetia killipii Tallo 24.44 g. 0.02 g. 0.09 %

Corteza 9.51 g. 4.35 g. 43.50 % Hojas 102.30 g 0.02 g. 0.06 % Malouetia tamaquarina Tallo 15.61 g. 0.01 g. 0.06 %

Corteza 4.31 g. 2.56 58.36 % Hojas 15.14 0.18 g. 1.19 % Marsdenia rubrofusca Tallo 11.18 g. 0.07 g. 0.63 % Hojas 25.42 g. 0.02 g. 0.08 % Odontadenia geminata Tallo 14.62 g. 0.05 g. 0.37 % Hojas 21.27 g. 0.10 g. 0.35 % Odontadenia macrantha Tallo 28.57 g. 0.20 g. 0.70 % Tassadia kamaensis Toda la planta 32.48 g. 0.21 g. 0.65 %

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Anexo 19: Procedimiento de tamizaje fitoquímico.

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Anexo 20: Tamizaje fitoquímico de los extractos etanólicos con actividad antiplasmodial.

Metabolitos secundarios Parte Especies C utilizada Alc. Q Tr E L Fl F T S R A/aa C F D (++) Macoubea Hojas CCF - - ++ ++ ++ - ++ - - - + + sprucei (+++) D (++) Malouetia Hojas CCF - - + ++ ++ - +++ - - - - - killipii (+++) D (++) Hojas CCF - - +++ ++ +++ - ++ + - - - - Malouetia (+++) tamaquarina D (++) Corteza CCF - + ++ +++ ++ - ++ - +++ - + + (+++) Mandevilla Toda la D (-) - - +++ ++ +++ - ++ + - - + + pavonii planta CCF(-) D (++) Hojas CCF - - +++ + +++ - ++ + ++ - + + Marsdenia (+++) rubrofusca D (++) Tallo CCF - ++ - + +++ - + - - +++ + + (+++) D (++) Odontadenia Hojas CCF - - +++ +++ +++ - +++ ++ - - + + geminata (+++) D (++) Odontadenia Hojas CCF - - +++ ++ ++ - +++ - - - + + macrantha (+++) D (++) Tassadia Toda la CCF - - ++ ++ +++ - ++ - + - + + kamaensis planta (+++)

LEYENDA: Alc: Alcaloides (D: Dragendorff, CCF: Cromatografía en capa fina); Q: Quinonas; Tr: Triterpenos; E: Esteroides; L: Lactonas; Fl: Flavonoides; F: Fenoles; T: Taninos; S: Saponinas; R: Resinas; Am/aa: Aminas y aminoácidos; C: Catequinas; CF; Cumarinas Fijas.

(+) = Positivo: (+) = Poco, (++) = Medianamente, (+++) = Abundante; (-) = Negativo

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Anexo 21: Normas de bioseguridad

 Está terminantemente prohibido comer, bebe, fumar, manipular lentes de contacto, y/o aplicarse cosméticos dentro del laboratorio.  Las personas con cabello largo deben tenerlo recogido hasta atrás para evitar el contacto con los reactivos químicos, muestras clínicas o el fuego.  Todos los alimentos deben ser almacenados fuera del área de trabajo en los gabinetes o refrigerador designado para tal uso.  Todo personal que trabaje o manipule muestras biológicas (sangre completa, suero, plasma, secreciones, etc) debe contar con su respectiva cartilla de vacunación, principalmente contra la hepatitis B. De no contar con esta vacuna es mejor no ingresar a realizar cualquier manipulación, debido a que se corre el riesgo de infección y el centro de investigación no se hará responsable de tal hecho.  Todo el personal debe usar mandil de manga larga resistente, además deberá usar otras prendas que le cubran, piernas, torso y pies. Las sandalias, pantalones cortos, faldas, etc. No son aceptados en el laboratorio. El ingreso será negado a las personas que no vistan en forma apropiada como para trabajar en el laboratorio.  El uso de guantes de látex es obligatorio durante la manipulación del material biológico, de materiales o reactivos peligrosos (Ej., bromuro de etidio, acrilamida, etc).  Deberán usar un sistema de protección ocular además de mascarillas para los procedimientos en los que se pueden producir salpicaduras de muestras, microrganismos u otros materiales peligrosos.  Deben lavarse las manos después de manipular material infeccioso, quitarse los guantes antes de abandonar el laboratorio.  Es obligatorio retirarse el mandil antes de abandonar el laboratorio.  El pipeteo de cualquier sustancia o muestra en el laboratorio (incluido el agua destilada) se debe realizar empleando la propipetas manuales o automáticas. Nunca utilizar la boca para succionar las pipetas.

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 Evitar inhalar y nunca probar el sabor de cualquier sustancia o solución química o biológica en el laboratorio.  Si un reactivo químico u algún otro líquido le salpican sobre los ojos lave los ojos inmediatamente con abundante agua.  En caso de accidentes (cortes, quemaduras, etc) notifique inmediatamente y acuda a un centro de salud inmediatamente.  Nunca trabaje en el laboratorio sin supervisión de un instructor  Si usted no tiene seguridad de lo que debe hacer, preguntar a la persona supervisora.  Nunca realice un experimento o prueba de laboratorio no autorizada, cualquier actividad hágalo en un laboratorio acondicionado para ese tipo de prueba.  Lea cuidadosamente los manuales de seguridad, los manuales de operación de equipos, la hoja de datos de seguridad para cada producto químico antes de usarlo.  Al descartar productos químicos asegurarse de neutralizarlo según las normas internacionales.  El personal debe lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio.  Cada área del laboratorio cuenta con normas y procedimientos de trabajo, los cuales deben ser leídos y seguidos por todo el personal, a fin de evitar accidentes y reducir el riesgo de posibles contaminaciones.  Es importante rotular todos los materiales a usarse.

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