Comunicado 134 ISSN 9192-0099 Brasília, DF Técnico Outubro, 2005

POLIMORFISMO LISINA-232/ALANINA NO GENE DGAT1 EM RAÇAS BOVINAS CRIADAS NO BRASIL

Andréa A. Egito1 Maria do Socorro M. Albuquerque2 Marília C. R Pappas3 Samuel R.Paiva4 Dário Grattapaglia5 Concepta McManus6 Silvia Ribeiro Castro7 Leonardo Daniel de Almeida8 Paloma André Cunha9 Arthur da Silva Mariante10

Resumo

Está se realizando a caracterização genética de raças bovinas criadas no Brasil para genes candidatos conhecidos e associados a fenótipos de interesse econômico. A substituição K232A (AAG→GCG) no gene DGAT1 foi relacionada à variação na porcentagem de gordura no leite e com o grau de marmoreio na avaliação da qualidade da carne. A freqüência, para duas variantes alélicas conhecidas, do loco DGAT1 por PCR-Cfr1RFLP foi estimada pela genotipagem de um total de 332 animais, Bos taurus e B. indicus, não aparentados, das seguintes raças brasileiras naturalizadas:

1 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF 2 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF 3 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF 4 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF 5 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF 6 Universidade de Brasília, Brasília, DF 7 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF 8 Bolsista iniciação Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 9 Bolsista iniciação Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 10 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

(CA), (CL), Curraleiro known allelic variants at the DGAT1 (CU), (MN), Pantaneiro locus by PCR-Cfr1RFLP genotyping a (P), Guzerá (GU), Gir (GI), e (N), total of 332 unrelated animals of Bos assim como para as raças Holandesa taurus and B. indicus of the following (Hol) e Jersey (J). O alelo selvagem, naturalized Brazilian breeds Caracu associado ao alto teor de gordura no (CA), Crioulo Lageano (CL), Curraleiro leite e que codifica a lisina (DGAT1K), (CU), Mocho nacional (MN), Pantaneiro teve uma freqüência de 100% nas raças (P), Guzerá (GU), Gir (GI), and Nelore Bos indicus N e GU e de 92% na GI, (N) as well as the common breeds com o alelo DGAT1A aparecendo Frisian (F) and Jersey (J). The wild-type somente em heterozigose. Nas raças high milk fat content associated lysine taurinas, por outro lado, a freqüência do encoding allele (DGAT1K) had 100% alelo DGAT1K foi de 67% no MN, 55% frequency in Bos indicus N and GU no J, 50% no CL, P e CU e de 30% no breeds, 92% in GI with the DGAT1A CA e Hol. A alta freqüência para o allele appearing only in heterozygosity. DGAT1K em B. indicus, quando In B. taurus breeds, on the other hand, comparado com B. taurus, está de the DGAT1K frequency was 67% in MN, acordo com as expectativas em relação 55% in J, 50% in CL, P and CU and ao conteúdo de gordura no leite. 30% in CA and F. The results of higher Entretanto, este resultado não dá allele frequency for (DGAT1K) in B. respaldos à hipótese que este mesmo indicus as compared to B. taurus alelo esteja associado ao alto grau de comply with expectations in relation to marmoreio da carne nesta espécie. milk fat content. However they do not Estes resultados também sugerem que support the hypothesis that this same o baixo teor de marmoreio observado allele is associated with higher marbling em raças zebuínas é controlado scores in this species. These results provavelmente por outros genes e não also suggest that the very limited pelo DGAT1. variation for marbling score observed in B. indicus is most likely controlled by Palavras chave: conteúdo de gordura genes other than DGAT. no leite, marmoreio, raças naturalizadas, PCR-RFLP. Key words: Milk fat content, Marbling, native breeds, PCR-RFLP

LYSINE-232/ALANINE INTRODUÇÃO POLYMORPHISM AT THE DGAT1 GENE A manutenção das raças IN BOVINE BREEDS RAISED IN naturalizadas depende de sua inserção BRAZIL nos sistemas de produção existentes. Animais das raças naturalizadas ABSTRACT apresentam uma carne macia, com Genetic characterization of a number of sabor diferenciado, e, embora isto bovine breeds raised in Brazil for known nunca tenha sido cientificamente candidate genes associated with provado, pode estar relacionado ao fato economically interesting phenotypes are destes animais serem oriundos de raças carrying out. The K232A substitution taurinas. Vários fatores estão (AAG→GCG) in the gene DGAT1 has envolvidos nas características been fully described as involved both in relacionadas à qualidade da carcaça. milk fat content variation and marbling score in meat quality assessment. We A gordura intramuscular analisada estimated the frequency of the two subjetivamente como marmoreio da

carne, varia entre indivíduos e raças Pantaneiro (35), raças naturalizadas de com herdabilidade de até 0,65 e está origem taurina; Holandês (25) e Jersey correlacionado com características (29), raças taurinas e; Gir (30), Guzerá como a suculência, sabor e maciez da (35) e Nelore (32), raças zebuínas. carne (MARSCHALL, 1999). Diversos estudos demonstraram menor maciez O DNA genômico foi obtido a da carne em raças zebuínas partir de amostras sanguíneas (SHACKELFORD et al., 1991; FRIES e previamente extraídas e armazenadas RUVINSKY, 1999) e sabe-se que raças no Banco de DNA do Laboratório de desta origem possuem um menor teor Genética Animal (LGA) da Embrapa de marmoreio (FRIES e RUVINSKY, Recursos Genéticos e Biotecnologia. 1999; MARSCHALL, 1999). A genotipagem foi feita pela A substituição de uma lisina por técnica PCR-RFLP (Polymerase Chain uma alanina (K232A) no gene DGAT1 Reaction - Restriction Fragment Length que codifica a enzima diacilglicerol O - Polymorphism). Um fragmento de aciltransferase, que catalisa a última 411pb do gene DGAT1, onde se etapa da síntese de triglicérides localiza a substituição K232A, foi (CASES et al., 1998), foi associada ao amplificado com o primer descrito por conteúdo de gordura de leite (GRISART Winter et al. (2002). As reações de PCR et al., 2004; WINTER et al. 2002). O foram feitas com um volume final de alelo considerado ancestral, 13µl, utilizando-se 9 ng de DNA denominado DGATk (lisina) leva a um genômico; tampão 1x; 1,0 mM de aumento da quantidade de gordura e a MgCl2, 200uM de cada dNTP, 0,12µM diminuição do conteúdo protéico e de primer, 8% de BSA e 1,0UI de Taq volume do leite (SPELMAN et al., 2002). DNA polimerase. Thaller et al. (2003) sugere que este polimorfismo também possa estar Para a detecção das variantes associado ao marmoreio da carne em alélicas, 5µl do DNA amplificado foram animais da raça Holandesa e digeridos com 1,5 UI da enzima de Charolesa. restrição CfrI por 1h a 37oC, seguido de inativação a 65o C por 20 minutos. A Como parte do programa de separação dos produtos digeridos foi caracterização genética de raças feita em gel de agarose 2% corado com bovinas criadas no Brasil, além das brometo de etídeo (fig.1). análises da estrutura populacional realizadas com diferentes marcadores Amostras de três indivíduos de moleculares, estão sendo genotipadas genótipos distintos foram seqüenciadas diferentes raças quanto à variação (fig.2) visando auxiliar a identificação alélica para genes candidatos de dos fragmentos digeridos observados importância econômica. Neste estudo, no gel de agarose. foi estimada a freqüência do polimorfismo lisina/alanina do gene RESULTADOS E DISCUSSÕES DGAT1. Pela digestão enzimática do MATERIAL E MÉTODOS fragmento de 411bp com a enzima de restrição CfrI, que caracteriza o alelo Foram genotipados 332 DGATA, foi possível identificar os indivíduos das seguintes raças bovinas: homozigotos para a variante lisina (não Caracu (41), Crioulo Lageano (36), há digestão), homozigotos para a Curraleiro (35), Mocho Nacional (33), variante alanina (fragmentos de 203 e

208 pb) e os indivíduos heterozigotos Nas raças taurinas (fig. 1). A digestão enzimática parcial especializadas, a diferença observada observada nos indivíduos homozigotos entre as raças Jersey e Holandesa para a variante alanina (DGATA) foi (45% e 70%, respectivamente, para o confirmada pelo sequenciamento de alelo DGATA) também dão o respaldo alelos de diferentes indivíduos com necessário para a comprovação da genótipos distintos (fig. 2). relação destes alelos com a produção leiteira. A maior freqüência para o alelo O gráfico da figura 4 apresenta a DGAT1A na raça Holandesa quando freqüência alélica observada nas 10 comparada com a raça Jersey condiz raças analisadas. O alelo selvagem, com os níveis de produção leiteira associado ao alto teor de gordura no destas duas raças, uma vez que a raça leite e que codifica a lisina (DGAT1K), Holandesa tem uma maior produção teve uma freqüência de 100% nas raças leiteira, mas com um menor teor de Bos indicus Nelore e Guzerá e de 92% gordura (ao redor de 3,5%) quando na raça Gir, com o alelo DGAT1A comparada com a raça Jersey, que aparecendo somente em heterozigose. possui uma aptidão manteigueira com Nas raças taurinas, por outro lado, a teores de gordura no leite alcançando freqüência do alelo DGAT1K foi de 67% uma média de 5,3% e uma produção na raça Mocho Nacional, 55% na raça leiteira mediana. Jersey, 50% no Crioulo Lageano, Pantaneiro e Curraleiro e de 30% na Sabidamente, raças zebuínas raça Caracu e Holandesa. Os índices possuem um grau de marmoreio médio de heterozigosidade observados podem menor que raças taurinas (FRIES e ser visualizados na Tabela 1 sendo que RUVINSKY, 1999; MARSCHALL, 1999). o maior nível foi observado na raça Desta forma, os resultados observados Crioulo Lageano (0,57). Na raça Caracu neste trabalho não dão respaldos à a freqüência elevada do alelo DGATA hipótese que o alelo DGATK esteja pode ser explicada pela inclusão, na associado ao alto grau de marmoreio da amostra analisada, de um rebanho carne, nesta espécie, conforme sugere selecionado para produção leiteira. Thaller et al. (2003). Este alelo está praticamente fixado nas raças Nelore e A alta freqüência para o DGAT1K Guzerá e ocorre em alta freqüência na em B. indicus, quando comparado com raça Gir, onde o alelo DGATA aparece B. taurus, está de acordo com as em apenas 8% dos animais e em expectativas em relação ao conteúdo de heterozigose (figura 4). Estes resultados gordura no leite nestas populações. sugerem que o teor de marmoreio da Raças zebuínas embora produzam carne na espécie bovina é controlado pouco leite quando comparadas às provavelmente por outros genes e não raças taurinas, possuem teor de pelo DGAT1. gordura superior (JARDIM, 1973). Desta forma, os dados aqui observados Kaupe et al. (2004), ao estudar condizem com estas informações, uma diferentes raças bovinas observaram vez que o alelo selvagem (DGATk) está resultados semelhantes aos obtidos em associado com uma menor produção nosso estudo. O alelo DGATA está leiteira e uma maior porcentagem de fixado em algumas raças taurinas gordura no leite (SPELMAN et al., 2002) enquanto que o DGATK parece estar como pode ser observado nas raças fixado em determinadas raças zebuínas como a raça Nelore. zebuínas, o que levou o autor a sugerir que a substituição K232A no alelo DGATk tenha ocorrido, provavelmente,

após a divergência das subespécies que outros genes devem, taurina e zebuína. provavelmente, controlar esta característica. CONCLUSÕES As raças naturalizadas, como a Embora a enzima DGAT1 exerça raça Pantaneira, possuem quando uma função fisiológica, ao catalisar a comparadas com as raças reação final da síntese de triglicérides, especializadas uma grande que pudesse ser compatível com a variabilidade genética o que evidência o deposição de gordura intramuscular, os potencial enorme para o melhoramento resultados observados sugerem que o genético. A partir da utilização de alelo DGAT1K, relacionado com o animais que possuam o alelo DGATA aumento de gordura, diminuição do em sistemas de cruzamento volume e conteúdo protéico no leite; preferencial, por exemplo, seria possível não está relacionado ao alto teor de incrementar a produção leiteira desta marmoreio na espécie bovina, sendo raça.

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 1. Digestão enzimática do fragmento de 411 bp do gene DGAT1 com a enzima de restrição CfrI. L – Ladder 1Kb plus; pistas 1 e 7 – homozigotos DGATA/DGATA; pistas 2, 3 e 4 – heterozigoto; 5, 6 e 8 – homozigoto DGATKDGATK ; 9 – controle de fragmento não digerido

Figura 2. Sequenciamento de genótipos distintos do gene DGAT1. Homozigoto GC – DGATADGATA; Homozigoto AA – DGATK/DGATK e Heterozigoto GC/AA - DGATA/ DGATk .

100 DGATK K 90 DGAT A 80 DGATADGAT 70

% 60 50

40

30

20

10

0 l r r z l a t L r i o n u e N u e C C G H a C J M G N P Raças

Figura 3. Distribuição de freqüências alélicas ao gene DGAT1 em 10 raças bovinas analisadas. (Hol – Holandesa; Ca – Caracu; Pant – Pantaneiro; CL – Crioulo Lageano; Cur – Curraleiro; Jer – Jersey; MN – Mocho Nacional; Gir – Gir; Guz – Guzerá; Nel – Nelore)

100% 90% 80% 70% 60% 50% DGATA/DGATA 40% DGATK/DGATA 30% K K 20% DGAT /DGAT

genotípica Frequência 10% 0% CA CL CU MN PAN HOL JER NEL GIR GU RAÇAS

Figura 4. Distribuição de freqüências genotípicas do gene DGAT1 nas 10 raças bovinas analisadas. (Hol – Holandesa; Ca – Caracu; Pant – Pantaneiro; CL – Crioulo Lageano; Cur – Curraleiro; Jer – Jersey; MN – Mocho Nacional; Gir – Gir; Guz – Guzerá; Nel – Nelore)

Tabela 1. Heterozigosidade observada nas raças estudadas. (N – número de indivíduos analisados)

Heterozigosidade Raça N observada Desvio Padrão Caracu 41 0,37 0,07 Crioulo Lageano 36 0,55 0,08 Curraleiro 35 0,26 0,07 Gir 30 0,17 0,07 Guzerá 35 0,00 0,00 Holandês 25 0,44 0,09 Jersey 29 0,28 0,08 Mocho Nacional 33 0,36 0,08 Nelore 32 0,00 0,00 Pantaneiro 35 0,49 0,08

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Comunicado Exemplares desta edição podem ser Comitê de Presidente: Maria Isabel de Oliveira Técnico, 134 adquiridos na Publicações Penteado Embrapa Recursos Genéticos e Secretário-Executivo: Maria da Graça Biotecnologia Simões Pires Negrão Serviço de Atendimento ao Cidadão Membros: Arthur da Silva Mariante Parque Estação Biológica, Av. W/5 Maria Alice Bianchi Norte (Final) – Maria da Graça S. P. Brasília, DF CEP 70770-900 – Caixa Negrão Ministério da Postal 02372 PABX: (61) 448-4600 Expediente Maria de Fátima Batista Agricultura, Fax: (61) 340-3624 Maria Isabel de O. Pecuária e http://www.cenargen.embrapa.br Penteado Abastecimento e.mail:[email protected] Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi 1ª edição Carneiro 1ª impressão (2005): Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça Simões Pires Negrão