ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------
Lê Thị Quỳnh
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------
Lê Thị Quỳnh
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN
Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Đinh Thị Phòng PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên
Lê Thị Quỳnh
LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Đinh Thị Phòng đã tận tình, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng cũng nhƣ thực hiện nghiên cứu để thoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, toàn thể cán bộ Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Tiến Hiệp đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học. Luận văn này là một phần kết quả của đề tài TN3/T15 thuộc Chƣơng trình Tây Nguyên 3. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Chƣơng trình. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên khích lệ của gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên
Lê Thị Quỳnh
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ...... 3 DANH MỤC HÌNH ...... 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...... 5 MỞ ĐẦU ...... 7 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...... 9 1.1. Giới thiệu tổng quát về loài Bách xanh ...... 9 1.1.1. Vị trí phân loại Bách xanh ...... 9 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Bách xanh ...... 9 1.1.3. Tình hình phân bố Bách xanh ở Việt Nam ...... 11 1.2. Tính đa dạng di truyền giữa các quần thể thực vật ...... 12 1.2.1. Khái niệm về quần thể thực vật ...... 12 1.2.2. Tính đa dạng di truyền của quần thể thực vật ...... 13 1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thƣờng đƣợc dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật ...... 13 1.3.1. Kỹ thuật isozyme ...... 13 1.3.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ...... 14 1.3.3. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ...... 15 1.3.4. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ...... 15 1.3.5. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) ...... 16 1.3.6. Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) ...... 17 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về đa dạng di truyền ở thực vật ..... 17 1.4.1. Thế giới ...... 17 1.4.2. Trong nƣớc ...... 18 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu ...... 22 2.2. Nội dung nghiên cứu ...... 26 2.3. Địa điểm nghiên cứu ...... 26 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...... 26
1 2.4.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Bách xanh ...... 26 2.4.2. Phƣơng pháp nhân bản PCR ...... 27 2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu ...... 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...... 29 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số loài Bách xanh ...... 29 3.2. Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị ISSR ...... 29 3.2.1. Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị ISSR ...... 29 3.2.2. Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR ...... 34 3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR ... 36 3.2.4. Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ thị ISSR ...... 39 3.3. Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị SSR...... 39 3.3.1. Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị SSR ...... 39 3.3.2. Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR ...... 43 3.3.3. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR ...... 48 3.3.4. Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ thị SSR ...... 50 3.4. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR ... 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...... 58 1. KẾT LUẬN ...... 58 2. KIẾN NGHỊ ...... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...... 59
2 DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin của các mẫu thu nghiên cứu phân tử ...... 22 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 30 mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu ...... 23 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của 17 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ...... 24 Bảng 3.1. Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích với 30 mồi ISSR ...... 30 Bảng 3.2. Thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR ...... 34 Bảng 3.3. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR ...... 36 Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng di truyền (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa các quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR...... 36 Bảng 3.5. Giá trị PIC, đa dạng gen trong một locus và tỷ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR ...... 42 Bảng 3.6. Một số thông số đa dạng di truyền của từng quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR ...... 44 Bảng 3.7. Một số thông số di truyền chính của quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR ...... 46 Bảng 3.8. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR ...... 47 Bảng 3.9. Hệ số tƣơng đồng (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR ...... 48 Bảng 3.10. Một số thông số di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR+SSR ...... 52 Bảng 3.11. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR+SSR ...... 53 Bảng 3.12. Hệ số tƣơng đồng (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR vàSSR ...... 53
3 DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Bách xanh ở Vƣờn quốc gia Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk ...... 10 Hình 2.1. Vị trí thu mẫu các quần thể Bách xanh trong nghiên cứu ...... 22 Hình 3.1. DNA tổng số tách từ lá đại diện của một số mẫu Bách xanh điện di trên gel agarose 0,9% ...... 29 Hình 3.2. Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR3 trên gel agarose 1,5% ...... 32 Hình 3.3. Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR62 trên gel agarose 1,5% ...... 33 Hình 3.4. Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA ...... 37 Hình 3.5. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR ...... 38 Hình 3.6. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm3 trên gel polyacrylamide 5% ...... 40 Hình 3.7. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm7 trên gel poly acrylamide 5% ...... 41 Hình 3.8. Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA ...... 49 Hình 3.9. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR...... 50 Hình 3.10. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR tính theo phƣơng pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA...... 54 Hình 3.11. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR và SSR ...... 55
4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Đa hình chiều dài phân đoạn DNA nhân bản (Amplified Fragment AFLP Length Polymorphism)
AOO Phạm vi cƣ trú (Area of Occupancy) bp Cặp bazơ (Base pair)
BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam
Trình tự lặp lại đơn giản của vùng gen lục lạp (Chloroplasts Simple cpSSR Sequence Repeat) dNTP Deoxyribonucleoside 5‟ Triphosphate kb 1000 cặp bazơ (Kilobase pair)
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EOO Phạm vi khu phân bố (Estimating Extent of Occurrence)
Genbank Ngân hàng gen quốc tế
CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide
DNA Axit Deoxyribo Nucleic (deoxyribonucleic acid)
Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (International Union for IUCN Conservation of Nature)
Vùng giữa các đoạn trình tự lặp lại đơn giản (Inter Simple Sequence ISSR Repeat)
ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal Transcribed Spacer) mtDNA ADN ty thể (mitochondrion Deoxyribo Nucleoic Axit)
NJ Phƣơng pháp tạo cây phân loại Neighbor Joining (Neighbor Joining)
OD Mật độ quang học (Optical Density)
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)
Đa hình các đoạn ADN đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên (Random RAPD Amplified Polymorphic DNA)
5 Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
SSR Trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat)
TAE Tris Acetate EDTA
TE Tris EDTA
Tm Nhiệt độ biến tính (Melting temperature)
Phƣơng pháp phân cặp nhóm không có trọng số dùng trung bình số học UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)
VQG Vƣờn Quốc gia
VU Sẽ nguy cấp (Vulnerable)
6 MỞ ĐẦU Tây Nguyên là một trong những vùng giàu loài lá kim nhất Việt Nam. Hầu hết những loài lá kim ở Tây Nguyên đều là những loài có giá trị khoa học và kinh tế cao trong đó có loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz). Bách xanh có khu phân bố rộng với số lƣợng cá thể lớn, nhƣng gần đây đã bị khai thác nhiều để lấy gỗ và làm bột hƣơng, nên môi trƣờng sống của loài đang bị thu hẹp dần. Theo số liệu điều tra gần đây nhất của Nguyễn Tiến Hiệp năm 2013, hiện ở vùng suối Đatanla (Đà Lạt) chỉ còn những cây nhỏ, đƣờng kính dƣới 10cm, ven thác Darơcao (Đà Lạt) chỉ còn hơn 50 cây có đƣờng kính trên 5cm (số liệu chƣa công bố). Ƣớc tính cả nƣớc ta hiện tại không còn quá 500 cây Bách xanh có đƣờng kính trên 10cm [6]. Môi trƣờng sống của Bách xanh cũng đang bị thu hẹp dần do nạn phá rừng và nạn nƣơng rẫy. Theo tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2014, Bách xanh đƣợc xếp vào bậc bị đe dọa (VU A2cd). Vì vậy, việc bảo tồn hữu hiệu nguồn gen Bách xanh là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu trƣớc đây mới chỉ tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và nơi phân bố, còn các nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen vẫn rất hạn chế và mới chỉ tập trung cho một số loài [6], [8]. Đặc biệt các dẫn liệu về đa dạng nguồn gen di truyền của loài Bách xanh ở Tây Nguyên hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, nhiều loại chỉ thị phân tử đã đƣợc sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen làm cơ sở cho nghiên cứu bảo tồn và tái tạo nguồn gen ở đối tƣợng sinh vật nói chung và ở các loài cây lá kim nói riêng. Trong các loại chỉ thị thì chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) và SSR (Simple Sequence Repeat) đang đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở cả mức độ quần thể và loài cả trên giới và Việt Nam. Chẳng hạn nhƣ Wang và cộng sự (2004) đã sử dụng chỉ thị ISSR phân tích đa dạng di truyền của 5 quần thể Bách xanh ở Tây Nam Trung Quốc [56] và đã chỉ ra tỉ lệ locus đa hình P = 26,9%. Hay năm 2010, Wang và Hao cũng đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 13 quần thể thông
7 tự nhiên ở Trung Quốc (Pinus tabulaeformis Carr.) [55]. Kết quả chỉ ra rằng mức độ biến đổi di truyền trong quần thể Thông ở Trung Quốc chủ yếu duy trì bên trong quần thể. Sự đa dạng di truyền có xu hƣớng giảm từ quần thể trung tâm đến quần thể trung gian và quần thể biên. Cả hai yếu tố phân bố tự nhiên và hoạt động của con ngƣời đều ảnh hƣởng đến sự hình thành cấu trúc di truyền của loài này. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay mới chỉ có nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền và cộng sự (2009) đã sử dụng chỉ thi RAPD và cpDNA để nghiên cứu đa dạng di truyền của 20 mẫu Bách xanh thu đƣợc Hà Nội, Lâm Đồng, Quảng Bình. Kết quả phân tích đã chỉ ra các mẫu phân tích có hệ số di truyền dao động từ 0,75 đến 1, kết quả thu đƣợc còn cho thấy tính bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở loài Bách xanh [5]. Xuất phát từ các cơ sở khoa học trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể Bách xanh tự nhiên (Calocedrus macrolepis Kurz) ở Tây Nguyên” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau: - Xác định mức độ đa dạng nguồn gen di truyền cho 3 quần thể Bách xanh tự nhiên thu tại 3 tỉnh Lâm Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai ở Tây Nguyên bằng chỉ thị ISSR và SSR làm cơ sở cho nghiên cứu giải pháp khai thác, bảo tồn và tái tạo nguồn gen. - Xây dựng cây phát sinh chủng loại quần thể loài Bách xanh trên cơ sở phân tích chỉ thị ISSR và SSR.
8 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu tổng quát về loài Bách xanh 1.1.1. Vị trí phân loại Bách xanh Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) là loài cây thân gỗ, thân thẳng, phân cành sớm và phân tán rộng. Bách xanh phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc và vùng núi đất phía Nam, trong các cánh rừng nguyên sinh rậm thƣờng xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp và ở độ cao 800 - 1500m trên mặt biển. Theo phân loại khoa học, Bách xanh thuộc: Giới (regnum): Plantae Ngành (phylum): Pinophyta Lớp (class): Pinopsida Bộ (order): Pinales Họ (familia): Cupressaceae Chi (genus): Calocedrus Loài (species): macrolepis 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Bách xanh Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) là loài cây gỗ lớn, thƣờng xanh, chiều cao từ 20 – 25m có khi trên 30m, đƣờng kính 0,6 – 0,8m [8]. Vỏ màu nâu sẫm, nứt dọc sau bong mảng, vết vỏ đẽo màu hồng dày 4 – 10mm có nhiều sợi dài. Cành lớn xoè rộng, cành non dẹt, mọc cách, xếp thành mặt phẳng. Lá hình vảy mọc đôi, từng đôi xếp lợp lên nhau, đôi ở giữa lớn hơn, dài 5mm, đôi ở mép gấp nếp, dài 2mm. Mặt trên màu xanh thẫm mặt dƣới có nhiều phấn trắng. Nón đơn tính cùng gốc, mọc lẻ đầu cành. Nón đực hình trứng dài, mang 6 – 8 đôi nhị. Nón cái hình trứng trái xoan, dài 12 – 15mm, rộng 4mm mang 3 đôi vảy nón. Thƣờng chỉ đôi vảy ở giữa mang 2 noãn. Khi chín vảy nón hoá gỗ, hạt có 2 cánh, cánh lớn hình trứng, cánh nhỏ hình dải. Hạt rụng tháng 10 – 12 (hình 1.1). Tái sinh bằng hạt tốt, đặc biệt ở nơi có nhiều ánh sáng. Cây con mọc nhiều nhƣ mạ nhƣng chỉ một số rất ít phát triển thành cây trƣởng thành. Ở Việt Nam, Bách xanh đƣợc phân bố tự nhiên ở nhiều tỉnh thành trên cả nƣớc, thƣờng mọc thành đám nhỏ hoặc rải rác trên độ cao
9 900 – 1100m vùng Ba Vì (Hà Tây) và Đà Lạt (Lâm Đồng). Trên thế giới, loài Bách xanh đƣợc phân bố ở nhiều quốc gia nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ và Thái Lan. Bách xanh là loài có giá trị kinh tế cao, gỗ thƣờng dùng trong xây dựng nhà cửa, đóng đồ gỗ cao cấp, tiện đồ mỹ nghệ và làm đồ dùng văn phòng. Hơn nữa gỗ Bách xanh có mùi thơm dịu nên còn đƣợc dùng làm bột hƣơng. Ngoài ra cây có dáng đẹp, có thể trồng làm cảnh.
B A
Hình 1.1. Cây Bách xanh ở Vƣờn quốc gia Chƣ Yang Sin, Đắk Lắk (A: Cây trƣởng thành, B: tiêu bản của loài) (Ảnh: Nguyễn Tiến Hiệp, 2013) Hiện nay, môi trƣờng sống của Bách xanh đang bị thu hẹp dần do nạn phá rừng và nạn nƣơng rẫy. Bách xanh tái sinh bằng hạt tốt nhƣng tỷ lệ cây con sống sót rất thấp. Những cá thể Bách xanh hiện nay nếu còn trong tự nhiên với độ tuổi rất cổ, hơn 400 năm tuổi. Vì thế số lƣợng cây con không đủ thay thế cho lớp cây trƣởng
10 thành già cỗi và những cây bị khai thác vì mục đích thƣơng mại. Bách xanh đang có nguy cơ tuyệt chủng trên phạm vi toàn cầu. Vùng suối Đatanla (Đà Lạt) chỉ còn những cây nhỏ đƣờng kính dƣới 10cm, ven thác Darơcao (Đà Lạt) chỉ còn hơn 50 cây có đƣờng kính trên 5cm, ƣớc tính cả nƣớc ta hiện tại không còn quá 500 cây Bách xanh có đƣờng kính trên 10cm. Cần gấp rút khoanh vùng bảo vệ và đƣa vào gieo trồng ở một số nơi quanh Đà Lạt và trên đỉnh núi Ba Vì [2]. Theo Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2014, Bách xanh đƣợc xếp vào bậc bị đe dọa (VU A2cd) [6]. Vì vậy, việc bảo tồn hiệu quả nguồn gen Bách xanh là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu. 1.1.3. Tình hình phân bố Bách xanh ở Việt Nam Ở Việt Nam, Bách xanh đƣợc ghi nhận có cả ở các vùng núi đá vôi phía Bắc và các núi đất phía Nam. Các quần thể phía Nam Việt Nam phân bố ở Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa và Ninh Thuận). Những cây trên các vùng núi đá vôi ở phía Bắc (Sơn La, Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Kạn, Hòa Bình và Nghệ An) cho thấy sự khác nhau về hình thái của các bộ phận sinh dƣỡng. Đó có thể là điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt hơn hoặc là một loài khác. Trên thế giới Bách xanh (C. macrolepis) gặp ở Đông Bắc Myanma, Thái Lan, Lào và Đông Nam Trung Quốc [6]. Bách xanh gặp thành từng đám nhỏ trong các rừng nguyên sinh rậm thƣờng xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp (nhiệt độ trung bình năm 15 - 200C, lƣợng mƣa trên 1500mm) ở độ cao 800 – 1500m trên mặt biển, ở các loại đất sét. Mối đe dọa chính đối với loài Bách xanh là việc khai thác quá mức để lấy gỗ trên toàn bộ vùng phân bố của loài. Ở phía Nam Việt Nam, đặc biệt là ở Tây Nguyên, Bách xanh còn bị đe dọa tuyệt chủng do các khu rừng bị chia cắt, lửa rừng và do chuyển đổi nơi sống của cây thành đất nông nghiệp. Bách xanh đã đƣợc xếp vào nhóm IIA của Danh mục các loài động vật và thực vật quí hiếm [6] nên việc khai thác bị luật pháp hạn chế. Để bảo tồn loài Bách xanh, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Lâm Đồng đã giao cho xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng Tây Nguyên và Dự án giống Lâm nghiệp Việt Nam có nhiệm vụ nhân giống một số loài cây lâm
11 nghiệp trong đó có Bách xanh để cung cấp cây con phục vụ cho việc trồng bổ sung cho rừng nguyên sinh. Các quần thể Bách xanh chính đƣợc xác định nằm ngoài các khu bảo tồn nhƣng vẫn thuộc diện rừng phòng hộ nhƣ ở khu vực Thƣợng Đa Nhim (Lâm Đồng), Tân Tiến (Ninh Thuận), Khánh Sơn (Khánh Hòa). Vì việc khai thác loài cây này bị luật pháp hạn chế nên cần nâng cao nhận thức về bảo tồn tại các khu vực này [6], [8]. 1.2. Tính đa dạng di truyền giữa các quần thể thực vật 1.2.1. Khái niệm về quần thể thực vật Quần thể là tập hợp các cá thể trong cùng một loài, cùng sinh sống trong một khoảng không gian xác định, vào một thời gian nhất định, có khả năng sinh sản và tạo thành những thế hệ mới [1]. Quần thể là một tổ chức sinh học ở mức cao, đƣợc đặc trƣng bởi những tính chất mà cá thể không bao giờ có nhƣ cấu trúc về giới tính, về tuổi, mức sinh sản, mức tử vong – sống sót và sự dao động số lƣợng cá thể của quần thể. Do là một nhóm cá thể của loài nên những loài nào có vùng phân bố hẹp, điều kiện môi trƣờng khá đồng nhất thƣờng hình thành một quần thể. Những quần thể nội phối điển hình là các quần thể thực vật tự thụ phấn, động vật tự thụ tinh. Các quần thể thực vật tự thụ phấn gồm những dòng có kiểu gen khác nhau. Tự phối hay giao phối gần gọi chung là nội phối làm cho quần thể dần dần bị phân thành những dòng thuần có kiểu gen khác nhau. Trải qua nhiều thế hệ nội phối, các gen ở trạng thái dị hợp chuyển sang trạng thái đồng hợp. Số thể dị hợp giảm dần, số thể đồng hợp tăng dần. Quần thể thực vật sinh sản bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến sự khác nhau về di truyền giữa các quần thể là lớn, mất tính đa dạng di truyền và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ. Giao phối ngẫu nhiên (ngẫu phối) giữa các cá thể trong quần thể là nét đặc trƣng của quần thể giao phối. Trong quần thể ngẫu phối nổi lên mối quan hệ phụ thuộc lẫn nhau giữa các cá thể về mặt sinh sản. Vì vậy quần thể giao phối đƣợc xem là đơn vị sinh sản, đơn vị tồn tại của loài trong tự nhiên. Chính mối quan hệ về sinh sản là cơ sở đảm bảo cho quần thể tồn tại trong không gian và qua thời gian. Quần thể giao phối nổi bật ở đặc điểm đa hình. Quá trình giao phối là nguyên nhân làm
12 cho quần thể đa hình về kiểu gen, do đó đa hình về kiểu hình. Thụ phấn chéo có thể sản sinh những cá thể lai đa dạng. Cấu trúc di truyền của những cá thể này có nhiều cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao trong hoàn cảnh môi trƣờng sống. Tác động của con ngƣời đến môi trƣờng sống làm phá vỡ cấu trúc quần thể, mất tính đa dạng, số cá thể còn lại ít sẽ không đủ sức hỗ trợ cho sự tồn tại của một quần thể, quần thể dễ bị tiêu diệt, tuyệt chủng vì những thay đổi bất thƣờng. Tính đa dạng di truyền của những quần thể này thấp nên khó thích nghi với các biến động khí hậu. 1.2.2. Tính đa dạng di truyền của quần thể thực vật Đa dạng sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong tự nhiên. Đa dạng loài là số lƣợng và sự đa dạng của các loài đƣợc tìm thấy tại một khu vực nhất định của một vùng nào đó. Đa dạng loài là tất cả sự khác biệt trong một hay nhiều quần thể của một loài cũng nhƣ đối với quần thể của các loài khác nhau. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài xử lý những biến đổi bất lợi của môi trƣờng sống và có khả năng tự phục hồi trong môi trƣờng sống của chúng [1]. Nhƣ vậy, đa dạng di truyền đƣợc đề cập đến nhƣ là mức độ đa hình của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc đƣợc phản ánh bởi số alen của quần thể tại một nơi và thời gian cụ thể hoặc số alen của một loài trong phạm vi phân bố địa lý và lịch sử tồn tại của nó. 1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thƣờng đƣợc dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật 1.3.1. Kỹ thuật isozyme Kỹ thuật Isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme. Phƣơng pháp
13 này đƣợc Hunter và Market đƣa ra từ năm 1957, đƣợc Harris hoàn thiện vào năm 1966 và bắt đầu đƣợc sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay. Di truyền quần thể cần thiết phải nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền trong/giữa các quần thể. Kỹ thuật isozyme đƣợc sử dụng nhƣ dấu phân tử cho mục tiêu này. Mặc dù hiện nay đã có nhiều kỹ thuật DNA phát triển nhƣng kỹ thuật isozyme vẫn đƣợc sử dụng vì cách thức thực hiện tƣơng đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp. Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trƣờng [11].
1.3.2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA - Đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991. Phƣơng pháp này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 nucleotide) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc trƣng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu đƣợc gồm các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thƣớc và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân đƣợc các đoạn khác biệt nhau [4], [11].
Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gen của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp. Trong nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [12].
14 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp). Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao [11], [12]. 1.3.3. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt đƣợc bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các “dấu vân tay” đặc trƣng cho từng phân tử DNA. Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [4], [11]. Kỹ thuật này đƣợc dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay. Kỹ thuật RFLP đƣợc sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật... Kỹ thuật RFLP đƣợc thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn. DNA của mẫu nghiên cứu sau khi đƣợc tách chiết và tinh sạch sẽ đƣợc cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lƣợng và kích thƣớc các đoạn cắt DNA khác nhau, những bộ gen giống nhau thì sẽ cho ra số lƣợng, kích thƣớc các đoạn cắt giống nhau, kích thƣớc và số lƣợng các đoạn cắt này sẽ quan sát đƣợc trên điện di đồ. 1.3.4. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), đƣợc hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA đƣợc nhân lên có định hƣớng sau khi bị cắt bởi 2 RE, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR). Kỹ thuật này đƣợc Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành 1 công cụ hữu ích để nhận biết nhiều locus trong sự đa hình DNA mà không cần biết
15 trƣớc thông tin về trình tự DNA của chúng. Phƣơng pháp này có thể đƣa ra nhanh chóng một ƣớc lƣợng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau. 1.3.5. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat), còn đƣợc gọi là microsaterlite (vi vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp bazơ) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ 2 đến 40 đơn vị. Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn. Chúng đƣợc phân bố trong hệ gen và có tính đặc trƣng cho từng loài [11]. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này đƣợc nhận dạng, bƣớc tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Chỉ thị SSR sau đó đƣợc sử dụng tƣơng tự nhƣ các mồi RAPD. Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt đƣợc sự sai khác mà không xác định đƣợc bằng các mồi khác nhƣ RAPD và RFLP. Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm đƣợc thời gian và hoá chất. Mồi sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trƣng và vì thế đáng tin cậy khi phát hiện cùng một locus và thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen. Chỉ thị SSR là các locus đặc trƣng, nên cung cấp nhiều thông tin rất có ích cho việc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm. SSR là loại chỉ thị đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại chỉ thị chỉ đặc trƣng cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lƣợng lớn các đoạn DNA của genome có chứa SSR. Hiện nay, số lƣợng mồi thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR trong việc lập bản đồ gen. Một vấn đề khác cũng thƣờng gặp phải trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các alen với các chỉ thị phân tử là rất khó. SSR có
16 thể đƣợc phân bố ngẫu nhiên trong genome nhƣng cũng có khi tập trung lại ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể. Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều locus trong phân tích liên kết di truyền và nghiên cứu quần thể [11]. 1.3.6. Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật do Zietkiewicz và cộng sự phát hiện năm 1994 [60]. Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân thật tồn tại một loại các trình tự nucleotide lặp lại, chúng thƣờng đặc trƣng cho loài. Trình tự này gồm từ 2 đến 5 nucleotide lặp lại nhiều lần, ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n và nằm rải rác trong hệ genome của thực vật bậc cao. Kỹ thuật ISSR dựa trên kỹ thuật PCR và dùng một mồi đơn có độ dài từ 20 đến 30 nucleotide để nhân bản các trình tự đơn giản ở giữa các trình tự lặp lại cho loài. Đoạn mồi đƣợc thiết kế là đoạn oligonucletide có trình tự bổ sung với trình tự lặp. Khoảng cách giữa các trình tự lặp khác nhau làm cho các phân đoạn DNA đƣợc nhân có độ dài ngắn khác nhau và đặc trƣng cho mỗi cá thể. Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra chỉ thị ISSR phản ánh mức độ phân nhóm di truyền của quy luật Mendel [51]. Mồi này cũng đƣợc sử dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng DNA ở một số đối tƣợng cây trồng [25], [31], [38], [41]. 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về đa dạng di truyền ở thực vật 1.4.1. Thế giới Do có giá trị kinh tế và dƣợc liệu cao, nên các loài lá kim nói chung trên thế giới đã bị khai thác và tàn phá nhiều. Vì thế tính đa dạng của chúng đã và đang bị đe dọa cả ở mức độ loài và quần thể. Việc nghiên cứu di truyền quần thể phục vụ cho công tác bảo tồn và phục hồi các loài Thông trên thế giới đang là “điểm nóng” và đƣợc nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm [25]. Chẳng hạn, năm 2004, Wang và cộng sự đã sử dụng chỉ thị ISSR phân tích đa dạng di truyền của 5 quần thể Bách xanh ở Tây Nam Trung Quốc. Kết quả chỉ ra tỉ lệ locus đa hình P = 26,9% và giá trị dị hợp tử mong đợi của các quần thể Bách xanh nghiên cứu là 0,114, không có sự tƣơng quan giữa khoảng cách di truyền và số lƣợng cá thể trong quần thể, sự đa dạng di truyền của các quần thể Bách xanh là thấp [56].
17 Năm 2010, Xiliao và cộng sự [54] đã sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 9 quần thể Bách xanh ở Trung Quốc. Kết quả phân tích 34 mẫu Bách xanh từ 9 quần thể sử dụng 13 chỉ thị SSR cho thấy số alen trên một locus dao động từ 2 đến 9 với giá trị trung bình là 6,08. Giá trị của hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể trung bình 0,668 dao động từ 0 đến 1,000. Giá trị tần số gen dị hợp tử mong đợi dao động từ 0,154 đến 0,891 với mức trung bình 0,681. Những chỉ thị SSR đa hình sẽ là công cụ hữu ích trong việc xác định đa dạng di truyền để xây dựng chiến lƣợc bảo tồn các loài Bách xanh này. Ngoài ra còn có nhiều nhóm tác giả khác trên thế giới cũng đã quan tâm và nghiên cứu về vấn đề này nhƣ năm 2010, Wang và Hao đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 13 quần thể thông tự nhiên ở Trung Quốc (Pinus tabulaeformis Carr.) [55]. Kết quả chỉ ra rằng tổng số biến đổi di truyền trong quần thể Thông ở Trung Quốc chủ yếu duy trì bên trong quần thể. Sự đa dạng di tuyền có xu hƣớng giảm từ quần thể trung tâm đến quần thể trung gian và quần thể biên. Cả hai yếu tố phân bố tự nhiên và hoạt động của con ngƣời đều ảnh hƣởng đến sự hình thành cấu trúc di truyền của loài này. Madhav và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của 13 quần thể của loài Thuja occidentalis (Cupressaceae) ở Canada, Scotia và Island [34], Chung và cộng sự (2004) nghiên cứu trên loài Cunninghamia konishii – một loài đặc hữu ở Đài Loan [20], Man và cộng sự (2000) nghiên cứu đa dạng di truyền trên loài Juniperus rigida (Cupressaceae) và Juniperus coreana [35]. Đặc biệt thông qua việc phân tích cấu trúc di truyền sử dụng chỉ thị ISSR, AFLP, của một số loài lá kim bị đe doạ tuyệt chủng cho thấy mức độ đa dạng di truyền bị suy giảm rất cao liên quan đến khả năng tăng hệ số đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ và hẹp. Những nghiên cứu đó cũng chỉ ra mức độ đa dạng giữa các quần thể là rất lớn và đồng thời đƣa ra một số biện pháp hiệu quả để phục hồi nguồn gen một số loài lá kim bị đe dọa tuyệt chủng [57]. 1.4.2. Trong nƣớc Việt Nam hiện đƣợc xếp vào một trong 10 điểm nóng nhất trên thế giới về
18 bảo tồn Thông, vì thế việc nghiên cứu bảo tồn các loài lá kim cần đƣợc coi trọng [6], [8]. Đến nay, ở Việt nam hầu hết các loài mới chỉ tập trung vào việc nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và nơi phân bố, trong khi đó các nghiên cứu về phân tử cũng nhƣ thành hóa học còn ít đƣợc chú ý. Công ƣớc quốc tế về Đa dạng sinh học (1994) đã xác định Đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp: (i) đa dạng trong loài (đa dạng di truyền hay đa dạng nguồn gen), (ii) đa dạng giữa các loài (đa dạng về thành phần loài hay đa dạng loài) và (iii) đa dạng hệ sinh thái. Vì những lý do trên, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài có giá trị khoa học, kinh tế, các loài đặc hữu, quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam nói chung, đặc biệt các loài lá kim là hết sức cần thiết. Hiện nay ở Việt Nam có nhóm nghiên cứu của Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (BTTNVN) là một trong những đơn vị đã và đang có những nghiên cứu sâu về đa dạng di truyền nguồn gen một số loài lá kim trên cơ sở phân tích phân tử. Chẳng hạn nhƣ Vũ Đình Duy và cộng sự (2010) đã đánh giá đa dạng di truyền của 4 loài thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae) là Pơ mu (Fokienia hodginsii), Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var. konishii), Hoàng đàn Hữu liên (Cupressus tonkinesis) và Thủy tùng (Glytostrobus pensilis) bằng sử dụng chỉ thị ISSR, SSR và giải mã vùng gen 18S đã chỉ ra hai loài Pơ mu và Sa mộc dầu có mức độ suy giảm cao hơn Thủy tùng và Hoàng đàn Hữu liên [3]. Sự suy giảm đều liên quan đến hoạt động của con ngƣời, đặc biệt nơi sống bị phân cắt. Kết quả giải mã trình tự gen 18S còn cho phép giải quyết vấn đề tồn tại về taxon của Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var. konishii); hay Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2010) đã giải mã vùng gen rpoC, gen rbcL và gen matK để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 15 loài lá kim thuộc lớp Thông (Thủy tùng, Thông đỏ bắc, Bách xanh núi đá, Bách xanh núi đất, Hồng tùng, Thông Pà cò, Thông tre lá dài, Thông đà lạt, Thông nàng, Thông tre lá ngắn, Thông ba lá, Kim giao nam, Kim giao bắc, Dẻ tùng vân nam và Thông đỏ nam) và đã chỉ ra mối quan hệ gần gũi của các loài [13]. Để nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các taxon trong thực vật, Tam và Trang (2012) đã sử dụng vùng gen 18S để xác định mối quan hệ tiến hoá của 6 chi
19 thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae) ở Việt Nam [50]. Kết quả chỉ ra 2 nhánh tiến hoá có quan hệ mật thiết với nhau, Xanthocyparis vietnamesis/Cupressus tonkinensis và Fokienia hodginsii/Cupressus rupestris/C. formasana. Xanthocyparis noothatensis có quan hệ gần gũi với loài thuộc chi Cupressus. Fokienia hodginsii cùng nhánh tiến hoá với chi Calocedrus. Tƣơng tự, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009), Vũ Thi Thu Hiền và cộng sự (2009) cũng đã sử dụng chỉ thị RAPD, và cpSSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền quần thể tự nhiên loài Pơ mu và Bách xanh phục vụ cho cho công tác bảo tồn. Kết quả phân tích đã chỉ ra: đối với loài Pơ mu khi phân tích 25 mẫu từ các xuất xứ Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai và Hòa Bình phân làm 2 nhánh chính có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động từ 0,876 đến 1, tính đa dạng di truyền giữa các xuất xứ Pơ mu rất thấp và có thể đe dọa sự tồn vong của loài này [9]. Đối với loài Bách xanh, hệ số tƣơng đồng di truyền của 20 mẫu Bách xanh thu đƣợc ở 3 địa phƣơng Hà Tây, Lâm Đồng, Quảng Bình dao động từ 0,75 đến 1. Kết quả phân tích với 15 mồi RAPD và 6 mồi cpSSR cho thấy có sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ genome lục lạp của cây Bách xanh [5]. Mới đây nhất, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2015) cũng đã sử dụng chỉ thị ISSR và SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể tự nhiên loài Thông lá dẹt (Pinus krempfij Lecomte) và Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferre‟) và đã chỉ ra rằng tính đa dạng di truyền trong quần thể loài Thông lá dẹt là tƣơng đối thấp. Cụ thể, khi sử dụng 17 cặp mồi SSR để phân tích 70 cá thể cho thấy mức độ tƣơng đồng di truyền của loài Thông lá dẹt ở Tây Nguyên dao động từ 59 đến 100% [10]. Tƣơng tự, khi sử dụng 26 mồi ISSR để phân tích tính đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể Thông lá dẹt ở Tây Nguyên cho thấy mức độ tƣơng đồng di truyền của loài dao động trong khoảng từ 65,7 đến 79,82% [7]. Với các kết quả này cho thấy cần phải bảo tồn cả ở mức cá thể và quần thể. Với loài Thông đà lạt (Pinus datatenis Ferre‟), nhóm nghiên cứu đã sử dụng 26 mồi ISSR để phân tích đa dạng di truyền 6 quần thể tự nhiên loài này thu ở: Xa Hiếu, Dak Glei, Ngọc Linh (Kon Tum), Đa Chais (Lâm Đồng), Hòa Sơn (Đắk Lắk), A Yun (Gia Lai) kết quả đã nhân bản đƣợc 95 phân đoạn DNA trong đó có 48 phân đoạn DNA đa hình (chiếm 50,52%). Tính
20 đa dạng di truyền thể hiện cao nhất ở quần thể Đa Chais, tinh Lâm Đồng (I = 0,130; h = 0,077; PPB = 25,26%) và thấp nhất ở quần thể Xa Hiếu, tỉnh Kon Tum (I = 0,06; h = 0,037; PPB = 11,58%). Tổng mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các cá thể trong quần thể là 58,01% và giữa các quần thể là 41,09% [22]. Đến nay có thể nói, các dẫn liệu về đa dạng di truyền, các trình tự nucleotide đặc trƣng cho một số loài lá kim đặc hữu, có giá trị kinh tế cao và có nguy cơ tuyệt chủng hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu hoặc rất hạn chế nên cần đƣợc quan tâm nghiên cứu để có kế hoạch bảo tồn cũng nhƣ khai thác nguồn tài nguyên quý giá này.
21 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Là các mẫu lá hoặc gỗ của bảy mƣơi cá thể (mỗi cá thể là một mẫu) thuộc 3 quần thể tự nhiên loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) thu tại 3 tỉnh: Lâm Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai. Các mẫu do TS. Nguyễn Tiến Hiệp, cộng tác viên của Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp. Mẫu đƣợc bảo quản trong sillicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho tới khi sử dụng. Thông tin chi tiết các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 2.1 và hình 2.2. Bảng 2.1. Thông tin của các mẫu thu nghiên cứu phân tử Tên Số Vị trí địa lí Độ cao so Địa điểm quần lƣợng Kí kiệu mẫu Vĩ độ bắc Kinh độ đông mặt nƣớc thu mẫu thể mẫu (◦N) (◦E) biển (m) Đatanla Đà Lạt, 32 Cm1-Cm32 11o54‟2.5” 108o26‟56.8” 1315 Lâm Đồng Krông Hòa Bông, 34 Cm33- Cm66 12o25‟05” 108o22‟17” 1200 Sơn Đắk Lắk Kon K‟ Bang, Chƣ 4 Cm67- Cm70 14o30‟52” 108o33‟21” 1040 –1057 Gia Lai Răng
Hình 2.1. Vị trí thu mẫu các quần thể Bách xanh trong nghiên cứu
22 Các mồi và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu: Ba mƣơi mồi ISSR và 17 cặp mồi SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền quần thể Bách xanh thu đƣợc ở Tây Nguyên. Các mồi và cặp mồi đƣợc tổng hợp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technology, Mỹ), có ký hiệu và trình tự nucleotide nhƣ trong bảng 2.2 và bảng 2.3. Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 30 mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu
Nhiệt độ bắt STT Tên mồi Tình tự Tài liệu tham khảo cặp (oC)
1 UBC811 (GA)8C 50 [30]
2 UBC828 (TG)8A 51 [18]
3 UBC835 (AG)8CC 50 [30]
4 UBC836 (AG)8CA 49 [30]
5 UBC841 (GA)8CC 48 [55]
6 UBC846 (CA)8GT 50 [55]
7 UBC848 (CA)8GG 49 [55]
8 A17899 (GT)6CA 52 [42]
9 A17901 (CA)6AG 52 [42]
10 HB12 (CAC)3GC 51 [42]
11 HB15 (GTG)3GC 51 [42]
12 (CAG)5 (CAG)5 51 [16]
13 (CAA)5 (CAA)5 50 [16]
14 (GACA)4 (GACA)4 50 [16]
15 UBC865 (CCG)6 50 [18]
16 ISSR09 (CCA)5 49 [36]
17 UBC817 (CA)8A 50 [18]
18 UBC844 (CT)8AC 51 [18]
23 19 P-46 (AG)8T 48 [14]
20 P-49 (GA)8T 49 [14]
21 P-51 (GA)8A 50 [14]
22 P-52 (CT)8G 50 [14]
23 P-54 (TC)8G 48 [14]
24 P-55 (AC)8T 51 [14]
25 P-56 (AC)8G 49 [14]
26 P-59 (GA)8CT 50 [14]
27 P-61 (AC)8TG 51 [14]
28 P-62 CTC(AG)7 51 [14]
29 P-65 CAC(TG)7 50 [14]
30 P-69 (GGGTG)3 50 [14]
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của 17 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
Tham STT Tên mồi Trình tự lặp Trình tự nucleotide khảo
5‟ TTTGGGTTTTCTTCGTTTTC 3‟ 1 Cm1 (AAG)4 [32] 3‟ ACATTCCAAAAGTTCCCTATCT 5‟
5‟ TGGGTTGACCAGTGCTTCT 3‟ 2 Cm3 (AG)23 [32] 3‟ ATGCCCAACACCTCATTAGA 5‟
5‟ AAAACTTCTAAGACCTCAACCT 3‟ 3 Cm4 (TG)17 [32] 3‟ CAAGGAAGGTAGTTTGTAGAGA 5‟
5‟ GAAGTTTACCATTTGTCGAA 3‟ 4 Cm5 (TG)17 [32] 3‟ GTGTCTTCCAATATGAATCG 5‟
5‟ AAAAGAATCCAAAACACACA 3‟ 5 Cm6 (AC)17 [32] 3‟ CCCACCTGTACATTTCTCTA 5‟
24 5‟ CCTAACACAAACTCCAAGAAGA 3‟ 6 Cm7 (CA)9 [32] 3‟ TTGGACACTCAAAAGCAATAAT 5‟
5‟ TCCCTACTTTTTGGTTTTTTATT 3‟ 7 Cm12 (TG)9 [32] 3‟ ACATTGGGCTCATTGATTTC 5‟
5‟ AAATCGGGTCAACATCAAGC 3‟ 8 Pinus07 (TC)6(AC)7 [29] 3‟ TCTCTCTCTCTCACACACACAC 5‟
5‟ CGGGCTGGTATCTCAAGAGT 3‟
9 Pinus10 (AC)6(AG)14 3‟ ACACACACACACAGAGAGAGAG [29] 5‟
5‟ GAGACCAGACAAAGATGAAGA 3‟ 10 PeC19BGT [36] (AG)21 3‟ GAGTAAGAGCAAGACACCAAA 5‟
5‟ACTCATTTCCGGATGGTGG3‟ 11 Pnh038 (ATAGA)5 [19] 3‟ TGGGGCTTGGACTTCAAGA5‟
5‟ CTTTTGTTTTTCAACAATTGCA 3‟ 12 Pt79951 [52] (T)9 3‟ ACATCTATCTCCCATATCGGC 5‟
5‟TTCATTGGAAAT ACACTAGCCC3‟ 13 Pt71936 (T)22 [53] 3‟AAAACCGTACATGAGATTCCC 5‟
(A) GG(A) 5‟ CCCGTATCCAGATATACTTCCA 3‟ 14 Pt26081 18 3 [53] G(A)3 5‟ TGGTTTGATTCATTCGTTCAT 3‟
5‟ GTTTTTTAAATTGGGAAGGCG 3‟
15 PRE24 3‟ CGTGGGGGAGATAGTGATAGAGT [17] (AG) 29 5‟
5‟ GCCCACTATTCAAGATGTCA 3‟ 16 RPS1b [24] (AC)10 3‟ GATGTTAGCAGAAACATGAGG 5‟
5‟ TCCATCAGTGAGCAGTGG 3‟ 17 RPS150 [24] (GAG)4 3‟ CACTTGGGCTTCCTCTTC 5‟
25 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu:
Hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch genomic, Kit tinh sạch sản phẩm PCR, đệm TAE, agarose, poly acrylamide, TE,...Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Đệm PCR, MgCl2, dNTP, Taq polymerase; hóa chất tinh sạch cản phẩm PCR và xác định trình tự nucleotide: Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Dye Teminator Cycle Sequencing Kit,…Các hóa chất sử dụng đều là của các hãng Fermentas, Biobasis, QIAGEN, ...
t t v ụng cụ: Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức) máy ổn nhiệt (Memmert, Đức)… Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf, đầu côn các loại,…của các hãng Canada, Mỹ, Trung Quốc và Việt Nam. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Xác định mức độ đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh thu ở 3 tỉnh Lâm Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai. - Xây dựng cây phát sinh chủng loại quần thể loài Bách xanh trên cơ sở phân tích chỉ thị ISSR và SSR. 2.3. Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen – Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Bách xanh DNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá hoặc vỏ cây bằng phƣơng pháp của Porebski và cộng sự (1997) [44]. Kiểm tra độ sạch trên gel agarose 0,9% và đo nồng độ DNA tổng số trên máy UVS 2700, Labomed, Hoa Kỳ.
26 2.4.2. Phƣơng pháp nhân bản PCR Phản ứng PCR-ISSR: Phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện trên máy PCR system 9700, trong thể tích là 25µl với các thành phần: 1X dung dịch đệm PCR, 2,5 mM
MgCl2, 2mM dNTPs, 100nM mồi, 50ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bƣớc: biến tính 94oC trong 1 phút, gắn mồi 45 - 50oC (tùy từng mồi) trong 1 phút, kéo dài mồi 72oC trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC. Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR sẽ đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% cùng với thang DNA chuẩn 1 kb. Gel agarose đƣợc nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dƣới tia UV. Phản ứng PCR-SSR: Phản ứng nhân gen đƣợc thực hiện trong thể tích 25µl gồm các thành phần: 1X dung dịch đệm PCR, 2,5 mM MgCl2, 2mM dNTPs, 100nM mỗi mồi xuôi và ngƣợc, 50 ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase. Các phản ứng đƣợc thực hiện trên máy PCR system 9700 với chu trình nhiệt: biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bƣớc: biến tính 94oC trong 1 phút, gắn mồi 50 - 55oC (tùy từng mồi) trong 1 phút, kéo dài mồi 72oC trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 5% cùng với thang marker DNA chuẩn 100 bp sau đó nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dƣới tia UV. 2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu Số liệu PCR-ISSR: Phân tích số liệu theo quy ƣớc: 1 - phân đoạn DNA xuất hiện và 0 - phân đoạn DNA không xuất hiện khi phân tích sản phẩm PCR-ISSR với phần mềm NTSYS 2.0 [45]. Các thông số đa dạng di truyền của mỗi quần thể nhƣ giá trị alen tổng số (Na), alen hiệu quả (Ne), phần trăm phân đoạn đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) [47], hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) và mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các cá thể trong quần thể và giữa các quần thể đƣợc tính toán sử dụng phần mền GENALEX 6.3 [43]. Chỉ số đa dạng di truyền tính theo Nei (h) (1973) của mỗi quần thể đƣợc tính theo công thức h = ∑pi2 (trong đó pi là tần số của alen thứ i tại locus đó) [39]. Hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC) của mỗi chỉ
27 2 thị ISSR đƣợc xác định theo công thức: PICi = 1 - ∑Pij . Trong đó Pij là tần số alen thứ j của kiểu gen i đƣợc kiểm tra. Thiết lập ma trận khoảng cách di truyền để phân tích thành phần tọa độ (PCA) giữa các cá thể. Lập biểu đồ hình cây theo phƣơng pháp của Nei và Li (1972) trong phần mền NTSYS 2.0 [45] và giá trị bootstrap đƣợc hỗ trợ bởi phần mền Win-Boot [59] với 1000 lần lặp lại. Số liệu PCR-SSR: Số lƣợng alen tổng số và thành phần alen đƣợc xác định cho mỗi locus. Các thông số đa dạng di truyền của mỗi quần thể nhƣ phần trăm số phân đoạn đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon (I) (Shannon và Weaver, 1949) [47] và theo Nei (h) (1973) [39], hệ số gen di hợp tử mong đợi (He), hệ số gen di hợp tử quan sát (Ho), hệ số tự thụ phấn (Fis) đƣợc tính toán sử dụng phần mền GENALEX 6.3 [43] và FSTAT [28]. Hệ số khác biệt di truyền (Fst) và sự trôi dạt gen (Nm) cho mỗi locus đƣợc tính theo công thức: Fst = (Ht - mean He)/ Ht và Nm = [(1/Fst)-1]/ 4, trong đó He = 1-∑(pi)2, Ht (tổng dị hợp tử mong đợi) = 1-∑(tpi)2 (pi là tần số của alen thứ i, tpi là tần số của alen thứ i trong tổng số alen. Khoảng cách di truyền và hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp quần thể đƣợc tính toán dựa trên phần mềm GENALEX 6.3. Phân tích mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) cũng đƣợc tiến hành để tính toán mức độ khác biệt đáng kể giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể sử dụng phần mềm GENALEX 6.3. Ma trận khoảng cách di truyền đƣợc thiết lập để phân tích thành phần tọa độ (PCA) giữa các quần thể. Lập biểu đồ hình cây và biểu đồ tọa độ (PCA) theo phƣơng pháp của Nei và Li (1972) trong phần mền NTSYS 2.0 [45], giá trị bootstrap đƣợc hỗ trợ bởi phần mền Win-Boot với số lần lặp lại 1000 lần [59].
28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số loài Bách xanh DNA tổng số của 70 cá thể từ 3 quần thể Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Porebski và cộng sự (1997) có cải tiến một số bƣớc cho phù hợp với phòng thí nghiệm [23]. Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,9% (hình 3.1) cho thấy mỗi giếng chỉ cho một băng vạch duy nhất, các băng đều đậm, sắc nét, thể hiện DNA tách chiết đƣợc có độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng và độ sạch DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm cho thấy, nồng độ DNA của 70 mẫu Bách xanh dao động từ 640 đến 1000 ng/µl. Tỷ lệ OD260/OD280 thể hiện độ tinh sạch của các mẫu DNA dao động từ 1,732 đến 2 (số liệu không chỉ ra ở đây). Kết quả trên khẳng định các mẫu DNA tách chiết đƣợc hoàn toàn đủ tiêu chuẩn cho những phân tích tiếp theo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
Hình 3.1. DNA tổng số tách từ lá đại diện của một số mẫu Bách xanh điện di trên gel agarose 0,9% . 3.2. Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị ISSR 3.2.1. Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị ISSR Ba mƣơi mồi ISSR đã đƣợc sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của 70 mẫu Bách xanh thuộc 3 quần thể thu ở Đatanla (Lâm Đồng), Hòa Sơn (Đắk Lắk) và
29 Kon Chƣ Răng (Gia Lai). Trong đó 25/30 mồi chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu. Tổng số nhân bản đƣợc 129 phân đoạn DNA với kích thƣớc dao động trong khoảng 250 – 2000 bp, trong đó có 65 phân đoạn đa hình (chiếm 50,39%), giá trị đa dạng gen trung bình trong một locus (Hj) là 0,112. Hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC) của các mồi dao động từ 0 (mồi UBC841, A17899, ISSR1, ISSR5 và ISSR61) đến 0,326 (mồi ISSR49). Các chỉ thị ISSR cho tỷ lệ đa hình thấp giữa các mẫu nghiên cứu, chỉ có 18 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50%, trong đó có duy nhất mồi ISSR3 có 100% số phân đoạn đa hình (bảng 3.1). So sánh với kết quả nghiên cứu của Vũ Thị Thu Hiền và cộng sự (2009) khi phân tích mồi RAPD cho thấy, loài Bách xanh thu ở Tây Nguyên có hàm lƣợng thông tin đa hình thấp hơn (PIC = 0,101) so với loài Bách xanh thu ở Hà Nội, Quảng Bình và Lâm Đồng (PIC = 0,109) nhƣng lại có tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình (PPB) lại cao hơn (50,39% so với 39,29%, tƣơng ứng) [5]. Bảng 3.1. Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích với 30 mồi ISSR
Kích Phân Phân Đa dạng Tổng % Phân thƣớc đoạn đoạn gen trong STT Mồi PIC phân đoạn đa phân đoạn đa đồng một locus đoạn hình (bp) hình hình (Hj)
1 UBC811 400 – 950 0,094 5 3 2 60,00 0,238
2 UBC828 300 – 750 0,066 4 2 2 50,00 0,148
3 UBC835 450 – 1400 0,027 3 1 2 33,33 0,088
4 UBC836 250 – 1100 0,168 7 5 2 71,43 0,118
5 UBC841 375 – 800 0,000 4 0 4 0,00 0,000
6 UBC846 300 – 850 0,089 6 4 2 66,67 0,176
7 UBC848 300 – 800 0,155 4 3 1 75,00 0,310
8 A17899 300-500 0,000 2 0 2 0,00 0,000
9 A17901 250 – 1100 0,093 7 5 2 71,43 0,099
30 10 HB12 400 – 1100 0,199 4 3 1 75,00 0,061
11 HB15 450 – 1550 0,147 6 3 3 50,00 0,071
12 ISSR1 450 – 1150 0,000 4 0 4 0,00 0,000
13 ISSR2 350 – 1100 0,001 5 1 4 20,00 0,006
14 ISSR3 500 – 1200 0,018 4 4 0 100 0,069
15 ISSR5 600 – 800 0,000 2 0 2 0,00 0,000
16 ISSR11 600 – 2000 0,271 5 4 1 80,00 0,150
17 ISSR15 350 – 600 0,119 3 1 2 33,33 0,162
18 ISSR16 650 – 750 0,261 2 1 1 50,00 0,176
19 ISSR46 350 – 750 0,028 4 2 2 50,00 0,093
22 ISSR49 450 – 700 0,326 4 3 1 75,00 0,158
20 ISSR51 450 – 650 0,151 3 2 1 66,67 0,240
21 ISSR54 550 – 750 0,117 2 1 1 50,00 0,243
23 ISSR55 400 – 750 0,013 5 2 3 40,00 0,047
24 ISSR55.1 450 – 1400 0,215 6 4 2 66,67 0,126
25 ISSR56 550 – 700 0,025 3 1 2 33,33 0,082
26 ISSR59 350 – 900 0,325 8 6 2 75,00 0,271
27 ISSR61 400 – 950 0,000 6 0 6 0,00 0,000
28 ISSR62 400 – 650 0,022 3 2 1 66,67 0,080
29 ISSR65 400 – 650 0,007 4 1 3 25,00 0,027
30 ISSR69 700 – 1300 0,104 4 1 3 25,00 0,113
Tổng 250 – 2000 3,041 129 65 64 - 3,352
Trung - 0,101 4,3 2,167 2,133 50,39 0,112 bình
31 Phân tích kết quả điện di sản phẩm PCR của 70 mẫu Bách xanh với mồi ISSR3 và mồi ISSR62 đại diện cho 30 mồi ISSR đƣợc thể hiện trong hình 3.2 và hình 3.3
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp
1000 bp 750 bp 500 bp
250 bp
Hình 3.2. Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR3 trên gel agarose 1,5% (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Bách xanh nhƣ trong hình 2.1, M: marker phân tử 1kb). Mồi ISSR3: Kết quả điện di sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh với mồi ISSR3 trong hình 3.2 cho thấy, tổng số có 4 phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với kích thƣớc dao động trong khoảng 500 – 1200 bp, thì cả 4 phân đoạn đều thể hiện tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu. Đây là mồi duy nhất có 100% số phân đoạn đa hình. Cụ thể tại vị trí 1200 bp (hình →) có 67 mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA (trừ 3 mẫu Cm12, Cm15 và Cm57, tƣơng ứng với các giếng số 12, 15 và 57). Tại vị trí 750bp (hình ←), cũng có 67 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA trừ 3 mẫu Cm67, Cm69
32 và Cm70 (tƣơng ứng với các giếng số 67, 69 và 70) lại không xuất hiện phân đoạn DNA. Tại vị trí 640bp (hình ←), chỉ riêng 1 mẫu Cm57 (tƣơng ứng với giếng 57) không xuất hiện phân đoạn DNA, còn lại tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA. Tại vị trí 500bp (hình ←), tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA trừ mẫu Cm49 (tƣơng ứng với giếng 49) không xuất hiện phân đoạn DNA. Nhƣ vậy rõ ràng đã có sự đa hình DNA giữa các mẫu nghiên cứu khi phân tích với mồi ISSR3
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
1000 bp
750 bp 500 bp
250 bp
M 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
1000 bp 750 bp 500 bp
250 bp
Hình 3.3. Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR62 trên gel agarose 1,5% (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Bách xanh nhƣ trong hình 2.1, M: marker phân tử 1kb).
Mồi ISSR62: Tính đa hình giữa các mẫu Bách xanh đƣợc thể hiện rất rõ khi phân tích với mồi ISSR62. Có tất cả 3 phân đoạn DNA đƣợc nhân bản thì có đến 2 phân đoạn đa hình (chiếm 66,67%) (hình 3.3). Sự đa hình DNA giữa 70 mẫu Bách xanh đƣợc thể hiện khác nhau ở những vị trí phân đoạn DNA khác nhau. Chẳng hạn ở vị trí phân đoạn 550 bp (hình ←) chỉ có các mẫu Cm6, Cm7 và Cm67 – Cm70 (tƣơng ứng các giếng số 6, 7 và 67 – 70) không xuất hiện phân đoạn DNA, các mẫu còn lại đều xuất hiện phân đoạn DNA. Hay nhƣ tại vị trí 650 bp (hình →) tất cả các
33 mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA mới trừ các mẫu Cm6, Cm7, Cm42, Cm49, Cm51 – Cm56 và Cm70 (tƣơng ứng với các giếng số 6, 7, 42, 49, 51 – 56 và 70) không xuất hiện phân đoạn DNA. 3.2.2. Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR Các thông số di truyền của quần thể Bách xanh đƣợc đánh giá ở cả mức độ quần thể và loài. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.2 cho thấy theo cả ba cách tính đa dạng di truyền của Nei (h), chỉ số đa dạng Shannon (I) và phần trăm phân đoạn đa hình (PPB) của ba quần thể đã chỉ ra quần thể Bách xanh ở Đatanla có tính đa dạng di truyền cao nhất (h = 0,102; I = 0,192 và PPB = 35,66%), xếp thứ hai là quần thể Hòa Sơn (h = 0,084; I = 0,175 và PPB = 34,88%), và thấp nhất là quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,015; I = 0,022 và PPB = 3,88%). Kết quả này cho thấy, dù tính theo phƣơng pháp nào cũng vẫn phản ánh đúng thực trạng về tính đa dạng nguồn gen di truyền của mỗi quần thể. Bảng 3.2. Thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR Mức độ quần thể Thông số Mức độ Trung di truyền Đatanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng loài bình N 32 34 4 23,3 70 Na 1,326 1,302 0,814 1,147 1,512 Ne 1,227 1,198 1,027 1,150 1,277 He 0,130 0,117 0,015 0,087 0,168 PPB (%) 35,66 34,88 3,88 24,81 51,16 h 0,102 0,084 0,015 0,067 0,116 I 0,192 0,175 0,022 0,130 0,254
Ghi chú: N: kích thước quần thể, Na: số alen quan sát trung bình, Ne: số alen hiệu quả, He: Hệ số gen dị hợp tử mong đợi, PPB: Phần trăm phân đoạn đa hình, h: Chỉ số đa dạng Nei, I: Chỉ số đa dạng Shannon. Kết quả phân tích trong bảng 3.2 đã chỉ ra các thông số đa dạng di truyền thể hiện mức độ loài ( h = 0,116; I = 0,254 và PPB = 51,16%) cao hơn so với quần thể
34 Bách xanh ở Đatanla (h = 0,102; I = 0,192 và PPB = 35,66% ). Khi so sánh mức độ đa dạng nguồn gen di truyền của loài Bách xanh với một số loài Thông khác trên thế giới và Việt Nam cho thấy loài Bách xanh ở Tây Nguyên, Việt Nam có mức độ đa dạng di truyền (PPB = 51,16% và I = 0,254), tƣơng đƣơng với loài Pinus nigra của Trung Quốc (PPB = 51,04 % và I = 0,262), nhƣng thấp hơn so với loài Pinus sylvestris ở Đức và Tây Ban Nha (PPB = 99,76 % và I = 0,690) [37], [21], loài Pinus krempfii của Việt Nam (PPB = 76,19 % và I = 0,414) [10], và cao hơn loài Pinus dalatensis của Việt Nam (PPB = 50,53 % và I = 0,259) [22]. Kết quả phân tích số alen hiệu quả (Ne), số alen quan sát trung bình (Na) và hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) đƣợc tìm thấy ở quần thể Đatanla đạt cao nhất (Ne = 1,227; Na = 1,326 và He = 0,130), tiếp đến là quần thể Hoà Sơn (Ne = 1,198; Na = 1,302 và He = 0,117) và cuối cùng là quần thể Kon Chƣ Răng (Ne = 1,027; Na = 0,814 và He = 0,015). Mức độ đa dạng di truyền trong quần thể loài Bách xanh trong nghiên cứu này thể hiện ở mức thấp (He = 0,168) khi so sánh với một số quần thể Pinus tabulaeformis (He = 0,415), Pinus koraiensis (He = 0,348), Pinus sibirica (He = 0,267), Pinus sylvestris (He = 0,262) [55], [27], [58], [21], nhƣng lại cao hơn so với loài Calocedrus macrolepis ở Trung Quốc (He = 0,1114) [56], loài Pinus krempfii ở Việt Nam (He = 0,151) [7]. Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy loài Bách xanh ở Tây Nguyên, Việt Nam có nguy cơ suy giảm đa dạng di truyền khá cao. Bên cạnh đó, kết quả phân tích mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể Bách xanh ở bảng 3.3 cho thấy, tổng mức độ thay đổi phân tử thấp giữa các quần thể (36,33%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (63,67%) với giá trị p < 0,001. Trong nghiên cứu của Vũ Thị Thu Hiền và cộng sự (2009) mới chỉ ra tính đa dạng di truyền cho quần thể Bách xanh ở Hà Tây, Lâm Đồng, Quảng Bình (Việt Nam) [5] nhƣng chƣa đánh giá đƣợc mức độ thay đổi phân tử ở mức quần thể. Tuy nhiên, khi so sánh với loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis) ở Trung Quốc trong nghiên cứu của Wang và cộng sự (2004) [56] nhận thấy, mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể của loài Bách xanh ở Tây Nguyên cao hơn (36,33% so với 4,1%, tƣơng ứng) và thấp hơn giữa các cá thể trong quần thể (63,67% so với 95,9%, tƣơng ứng).
35 Bảng 3.3. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR Bậc tự Tổng bình Thành phần Tổng sự biến Nguồn biến thiên Giá trị p do phƣơng biến đổi đổi (%) Giữa các quần thể 2 137,793 3,270 36,33 Giữa các cá thể < 0,001 67 384,007 5,731 63,67 trong quần thể
Hệ số tƣơng đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa 3 quần thể Bách xanh nhận đƣợc khi so sánh các cặp quần thể với nhau và đƣợc ghi nhận ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng di truyền (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa các quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR
Đatanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng Trung bình Đatanla 0,046 0,150
Hòa Sơn 0,955 0,105 0,102 Kon Chƣ Răng 0,861 0,900 Trung bình 0,9
Kết quả trong bảng 3.4 chỉ ra các quần thể Bách xanh nghiên cứu có hệ số tƣơng đồng di truyền tƣơng đối cao ( > 0,861), trung bình đạt 0,9. Trong đó, quần thể Bách xanh ở Đatanla và Hòa Sơn có hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất (0,955) và thấp nhất là giữa quần thể ở Đatanla và Kon Chƣ Răng (0,861). Khoảng cách di truyền giữa các quần thể dao động từ 0,046 (giữa quần thể Đatanla và Hòa Sơn) đến 0,150 (giữa quần thể Đatanla và Kon Chƣ Răng). Khoảng cách di truyền trung bình giữa ba quần thể là 0,102. 3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR Phân tích UPGMA trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Nei (1972) sử dụng phần mềm NTSYS 2.0 đã chỉ ra mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu của 3 quần thể Bách xanh thể hiện trong hình 3.4 và hình 3.5.
36
89.1
c 53.3
II.2 77.6
72.1 II 57.3 60.0
II.1 b
51.1
59.1
I 57.3 99.5 53.5 a
Hình 3.4. Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA (a: mẫu thu ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai); b: mẫu thu ở Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu thu ở Đatanla (Lâm Đồng)
37
Hình 3.5. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR (hình 3.4) chia thành hai nhánh chính I và II và có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng từ 81,4% (Cm16 và Cm57) đến 99,1% (Cm62 và Cm65). Nhánh chính I gồm 4 mẫu Cm67, Cm68, Cm69 và Cm70 đều có nguồn gốc ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai), có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 96,5 đến 98%. Nhánh chính II gồm 66 mẫu còn lại và chia thành 2 phân nhóm II.1 và II.2 có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 85,5 đến 99,1%. Trong đó phân nhóm II.1 gồm 34 mẫu (Cm33 – Cm66) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 87 đến 99,1%, đều có nguồn gốc ở Hòa Sơn (Đắk Lắk). Phân nhóm II.2 gồm 32 mẫu (Cm1 – Cm32) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 86 đến 98%, có nguồn gốc ở Đatanla (Lâm Đồng). Kết quả phân nhóm theo biểu đồ tọa độ (hình 3.5) cũng phản ánh kết quả tƣơng tự nhƣ biểu đồ hình cây. Các mẫu có khoảng cách di truyền càng gần nhau thì trên biểu đồ tọa độ chúng sẽ nằm co cụm lại với nhau.
38 3.2.4. Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ thị ISSR Thông qua các thông số di truyền nhận đƣợc cho thấy loài Bách xanh ở Tây Nguyên có mức độ đa dạng di truyền tƣơng đối thấp (I = 0,254; He = 0,168; h = 0,116 và PPB = 51,16%). So sánh giữa các tiểu quần thể, thì quần thể Bách xanh ở Kon Chƣ Răng có mức độ đa dạng di truyền thấp nhất (I = 0,022; He = 0,015; h = 0,015 và PPB = 0,388). Điều này đồng nghĩa với sự suy giảm đa dạng di truyền ở cả mức độ loài và quần thể đều liên quan đến hoạt động của con ngƣời, đặc biệt nơi sống của chúng bị phá hủy hoặc bị suy giảm nghiêm trọng. Tổng mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể là 36,33% và giữa các cá thể trong cùng quần thể là 63,67%. Mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với 30 mồi ISSR chia thành hai nhánh chính có mức độ tƣơng đồng di truyền dao động từ 81,4% đến 99,1%. Các cá thể trong cùng quần thể có quan hệ gần gũi nhau về mặt di truyền và đều nằm co cụm vào từng nhóm riêng biệt trên biểu đồ hình cây. Kết quả phân nhóm trên biểu đồ tọa độ (PCA) cũng phản ánh kết quả tƣơng tự. 3.3. Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị SSR 3.3.1. Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị SSR Mƣời bảy cặp mồi SSR đã đƣợc sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho 70 mẫu Bách xanh thuộc 3 quần thể ở Tây Nguyên (Đatanla, tỉnh Lâm Đồng; Hòa Sơn, tỉnh Đắk Lắk và Kon Chƣ Răng, tỉnh Gia Lai), trong đó có 15/17 cặp mồi chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu với số phân đoạn DNA nhân bản đƣợc dao động từ 1 (cặp mồi Pinus10 và Pt26081) đến 4 (cặp mồi Cm12 và Pt79951). Tổng số đã nhân bản đƣợc 42 phân đoạn, trung bình 2,47 phân đoạn/mồi, trong đó có 40 phân đoạn đa hình (chiếm 95,2%). Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh với cặp mồi Cm3 (hình 3.6) và cặp mồi Cm7 (hình 3.7) đại diện cho 17 cặp mồi SSR nghiên cứu.
39 Cặp mồi Cm3: Kết quả phân tích sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh với cặp mồi Cm3 đƣợc thể hiện trong hình 3.6. Tính đa hình giữa các mẫu Bách xanh đƣợc thể hiện rất rõ khi phân tích với mồi này. Trong số 3 phân đoạn DNA đƣợc nhân bản thì cả 3 phân đoạn đều thể hiện tính đa hình (chiếm 100%). Sự đa hình giữa các mẫu đƣợc thể hiện tại những vị trí nhân bản các phân đoạn DNA khác nhau. Chẳng hạn ở vị trí 350 bp (hình →) tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA trừ 6 mẫu Cm8, Cm18 và Cm67 – Cm70 (tƣơng ứng các giếng số 8, 18 và 67, 68, 69 và 70) đã không xuất hiện phân đoạn DNA. Hay nhƣ tại vị trí 415 bp (hình←) chỉ có 6 mẫu Cm13, Cm21 và Cm67 – Cm70 (tƣơng ứng các giếng số 13, 21 và 67, 68, 69 và 70) đã xuất hiện phân đoạn DNA, trong khi đó các mẫu còn lại đều không xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí này.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 30 31 32 33 34 35 3637 3839 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
500 bp 400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
Hình 3.6. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm3 trên gel polyacrylamide 5% (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Bách xanh nhƣ trong hình 2.1, M: marker phân tử 100bp Cặp mồi Cm7: Đây cũng là một trong những mồi thể hiện rõ nét sự đa hình giữa các mẫu Bách xanh nghiên cứu. Kết quả phân tích sản phẩm PCR-SSR với cặp mồi Cm7 cho thấy có 3 phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với kích thƣớc từ 195 bp
40 đến 220 bp, thì cả 3 phân đoạn đều thể hiện tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu (hình 3.7). Tại vị trí phân đoạn 195 bp (hình →) tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA trừ 13 mẫu Cm43 – Cm49, Cm51, Cm55, Cm56, Cm58, Cm62 và Cm69 (tƣơng ứng các giếng số 43 – 49, 51, 55, 56, 58, 62 và 69) không xuất hiện phân đoạn DNA. Tại vị trí 200 bp (hình ←) có 19 mẫu Cm33 – Cm35, Cm43 – Cm52, Cm55 – Cm59 và Cm62 (tƣơng ứng các giếng số 33 – 35, 43 – 52, 55 – 59 và 62) xuất hiện phân đoạn DNA, các mẫu còn lại đều không xuất hiện phân đoạn DNA.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 30 31 32 33 34 35 3637 3839 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
500 bp 400 bp 300 bp
200 bp
100 bp
Hình 3.7. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm7 trên gel poly acrylamide 5% (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Bách xanh nhƣ trong hình 2.1, M: marker phân tử 100bp) Các phân đoạn nhân bản đƣợc có kích thƣớc dao đông trong khoảng từ 100 đến 430 bp. Hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC) và giá trị đa dạng gen trong một locus (Hj) của các cặp mồi dao động từ 0 (Pinus10 và Pt26081) đến 0,526 (Cm12) và từ 0 (Pinus10 và Pt26081) đến 0,446 (Pinus07) tƣơng ứng (bảng 3.5).
41 Bảng 3.5. Giá trị PIC, đa dạng gen trong một locus và tỷ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR
Phân Phân Đa dạng Kích thƣớc Tổng % phân đoạn đoạn gen trong STT Tên mồi phân đoạn PIC phân đoạn đa đa đồng một locus (bp) đoạn hình hình hình (Hj)
1 Cm1 215 - 225 0,437 3 0 3 100 0,316
2 Cm3 350 - 415 0,384 3 0 3 100 0,238
3 Cm4 125 - 150 0,233 2 0 2 100 0,238
4 Cm5 150 - 175 0,117 2 0 2 100 0,296
5 Cm6 305 - 350 0,422 3 0 3 100 0,179
6 Cm7 195 - 220 0,296 3 0 3 100 0,402
7 Cm12 100 - 120 0,526 4 0 4 100 0,279
8 Pinus10 145 - 145 0,000 0 1 1 0 0,000
9 Pinus07 350 - 410 0,341 3 0 3 100 0,446
10 PeC19BGT 200 - 210 0,374 3 0 3 100 0,227
11 Pnh038 150 - 160 0,067 2 0 2 100 0,220
12 Pt79951 165 - 180 0,482 4 0 4 100 0,318
13 Pt71936 410 - 430 0,141 2 0 2 100 0,356
14 Pt26081 255 - 255 0,000 0 1 1 0 0,000
15 PRE24 375 - 400 0,361 2 0 2 100 0,106
42 16 RPS1b 310 - 320 0,074 2 0 2 100 0,241
17 RPS150 195 - 200 0,377 2 0 2 100 0,107
Tổng 100 - 430 4,632 40 2 42 - 3,969
Trung bình 100 - 430 0,272 2,35 0,12 2,47 95,24 0,234
3.3.2. Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR Các thông số di truyền của quần thể Bách xanh đƣợc đánh giá ở cả mức độ quần thể và loài. Giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) dao động từ 0,211 ở quần thể Kon Chƣ Răng đến 0,321 ở quần thể Đatanla. Giá trị Ho và He đƣợc tìm thấy ở mức độ loài tƣơng ứng với giá trị 0,339 và 0,367 đƣợc chỉ ra ở bảng 3.6. Mức độ đa dạng di truyền trong quần thể loài Bách xanh trong nghiên cứu này thể hiện ở mức thấp (He = 0,367) khi so sánh với một số quần thể lá kim khác trên thế giới, chẳng hạn loài Pinus tabulaeformis (He = 0,415) nhƣng lại cao hơn loài Pinus koraiensis (He = 0,348), Pinus sibirica (He = 0,267), Pinus sylvestris (He = 0,262) [55], [27], [58], [21]. Giá trị alen quan sát trung bình (Na) thay đổi từ 1,529 (quần thể Kon Chƣ Răng) đến 2,118 (quần thể Đatanla) với giá trị trung bình của 3 quần thể là 1,824.. Số alen hiệu quả (Ne) dao động từ 1,428 (quần thể Kon Chƣ Răng) đến 1,589 (quần thể Hòa Sơn) với giá trị trung bình là 1,531. Ở mức độ loài các thông số di truyền của quần thể Bách xanh thể hiện cao hơn ở mức độ quần thể, với giá trị Na, Ne tƣơng ứng là 2,471 và 1,773. Số alen hiếm trên một locus (Ap) tìm thấy ở cả 3 quần thể Đatanla (0,294), Hòa Sơn (0,235) và Kon Chƣ Răng (0,059). Giá trị hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể, dao động từ 0,309 ở quần thể Kon Chƣ Răng đến 0,348 ở quần thể Hòa Sơn, trung bình ba quần thể là 0,330.
43 Bảng 3.6. Một số thông số đa dạng di truyền của từng quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR
Quần Mức độ quần thể Mức độ thể Đatanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng Trung bình loài
Na 2,118 1,824 1,529 1,824 2,471
Ne 1,575 1,589 1,428 1,531 1,733
Ap 0,294 0,235 0,059 0,196 -
Ho 0,335 0,348 0,309 0,330 0,339
He 0,321 0,320 0,211 0,284 0,367
I 0,496 0,466 0,313 0,425 0,602
PPB(%) 88,24 76,47 47,06 70,59 88,24
h 0,251 0,25 0,167 0,222 0,279
Ap 0,294 0,235 0,059 0,196 -
Fis -0,025 -0,071 -0,340 -0,145 -
Ghi chú: N: Số mẫu; Na: Số alen quan sát trung bình; Ne: Số alen hiệu quả; I: Chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon; Ho và He: Hệ số gen di hợp tử quan sát và mong đợi; UHe: Unbiased expected heterozygosity; h: Chỉ số đa dạng di truyền theo Nei; PPB: phần trăm phân đoạn đa hình; Ap: Số alen hiếm trên một locus; Fis: Hệ số giao phấn cận noãn với p < 0,05. Chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) đƣợc tính toán cao nhất ở quần thể Đatanla (I = 0,496), sau đó đến quần thể Hòa Sơn (I = 0,466) và thấp nhất là quần thể Kon Chƣ Răng (I = 0,313). Xét về khía cạnh đa hình của các phân đoạn DNA cho thấy tính đa dạng di truyền quần thể cũng khác biệt nhau nhiều ở cả ba quần thể Đatanla (PPB = 88,24%), Hòa Sơn (PPB = 76,47%) và thấp hơn cả vẫn là quần thể Kon Chƣ Răng (PPB = 47,06%). So sánh với một số loài lá kim khác trên thế giới và Việt Nam thì loài Bách xanh ở Tây Nguyên có mức độ đa dạng di truyền (PPB =
44 88,24% và I = 0,602) cao hơn so với loài Pinus nigra ở phía nam Tây Ban Nha và phía bắc Morocco (PPB = 51,04% và I = 0,262) [37], hoặc loài Pinus krempfii của Việt Nam (PPB = 76,19% và I = 0,414) [7]; và cao hơn loài Pinus dalatensis của Việt Nam (PPB = 50,53% và I = 0,259) [22] nhƣng lại thấp hơn loài Pinus sylvestris ở các khu vực khác nhau của Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Thụy Điển và Đức (PPB = 99,76 % và I = 0,690) [21]. Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy tính đa dạng di truyền thấp đối với quần thể Kon Chƣ Răng và cao ở quần thể Đatanla. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả khi phân tích với chỉ thị ISSR. Theo kết quả khảo sát thực địa cho thấy số lƣợng cá thể là nhỏ và khác nhau đáng kể giữa các quần thể. Quần thể Bách xanh ở Đatanla có số lƣợng cá thể trƣởng thành nhiều nhất (khoảng hơn 10 cá thể có chiều cao trên 10m), trong khi đó quần thể ở Hòa Sơn chủ yếu là cây tái sinh có chiều cao dƣới 1m, chỉ có khoảng 10 cá thể có chiều cao 1 – 10m, quần thể ở Kon Chƣ Răng mới tìm thấy 4 cá thể trƣởng thành có chiều cao 15 – 20m). Kết quả này cho phép nhận định việc giao phấn (pollilation) ở Đatanla cao hơn ở quần thể Hòa Sơn và Kon Chƣ Răng. Để có thêm cơ sở về tính đa dạng di truyền loài Bách xanh, chúng tôi cũng đã phân tích thêm một số thông số di truyền của quần thể Bách xanh với mỗi cặp mồi SSR và đƣợc thể hiện trong bảng 3.7 cho thấy 15 trong số 17 cặp mồi SSR phân tích chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu, chỉ có 2 cặp mồi không chỉ ra tính đa hình là Pinus10 và Pt26081. Trong đó, giá trị alen trung bình (Na) cao nhất đƣợc tìm thấy ở cặp mồi Cm12 (2,667) và thấp nhất ở cặp mồi Pinus10, Pt26081 (1,000). Kết quả phân tích SSR cũng cho thấy mức độ di nhập gen (Nm) của quần thể Bách xanh cao nhất khi phân tích với cặp mồi RPS1b (Nm = 22,007 và Fst = 0,011) và thấp nhất là cặp mồi Cm3 (Nm = 0,152 và Fst = 0,622). Khả năng giao phấn chéo (Fis) đã tìm thấy ở 10/17 cặp mồi SSR phân tích đó là Cm3 (-0,237), Cm4 (-0,150), Cm5 (-0,560), Cm6 (- 0,084), PeC19BGT (-0,430), Pnh038 (-0,628), Pt71936 (-0,319), PRE24 (- 0,055), RPS1b (-0,771) và RPS150 (-0,279) (bảng 3.7).
45 Bảng 3.7. Một số thông số di truyền chính của quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR
Tên mồi N Na Ne I Ho He Fis Fst Nm
Cm1 23,3 1,667 1,396 0,370 0,052 0,246 0,789 0,574 0,185
Cm3 23,3 2,000 1,332 0,368 0,273 0,221 -0,237 0,622 0,152
Cm4 23,3 1,667 1,281 0,269 0,198 0,172 -0,150 0,177 1,165
Cm5 23,3 1,667 1,547 0,427 0,467 0,299 -0,560 0,164 1,274
Cm6 23,3 1,667 1,360 0,295 0,188 0,173 -0,084 0,204 0,975
Cm7 23,3 2,000 1,956 0,681 0,474 0,488 0,029 0,159 1,324
Cm12 23,3 2,667 2,073 0,742 0,349 0,466 0,252 0,215 0,911
Pinus07 23,3 2,000 1,576 0,471 0,239 0,308 0,223 0,395 0,383
Pinus10 23,3 1,000 1,000 0,000 0,000 0,000 - - -
PeC19BGT 23,3 2,333 1,846 0,682 0,652 0,456 -0,430 0,048 4,947
Pnh038 23,3 2,000 1,831 0,640 0,731 0,449 -0,628 0,032 7,606
Pt79951 23,3 2,000 1,661 0,558 0,244 0,377 0,354 0,450 0,305
Pt71936 23,3 2,000 1,924 0,673 0,633 0,480 -0,319 0,015 16,976
Pt26081 23,3 1,000 1,000 0,000 0,000 0,000 - - -
PRE24 23,3 1,667 1,064 0,122 0,061 0,058 -0,055 0,022 11,141
RPS1b 23,3 2,000 1,941 0,677 0,858 0,484 -0,771 0,011 22,007
RPS150 23,3 1,667 1,233 0,251 0,198 0,155 -0,279 0,132 1,643
Trung bình 23,3 1,824 1,531 0,425 0,330 0,284 -0,124 0,215 4,176
Ghi chú: N: số mẫu; Na: số alen trung bình trên một locus; Ne: số alen hiệu quả trên một locus; I: chỉ số đa dạng Shannon; Ho và He: hệ số gen dị hợp tử quan sát và mong đợi; F: Chỉ số Fixation; Fis: hệ số giao phấn cận noãn với p < 0.05; Fst: hệ số khác biệt di truyền; Nm: hệ số di nhập gen.
46 Phân tích mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (36,46%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (63,54%) với giá trị p < 0,001. Khi so sánh với loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) của Trần Thị Liễu và cộng sự (2014) phân tích với 17 cặp mồi SSR nhận thấy mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể của loài Bách xanh cao hơn (36,46% so với 11,94%, tƣơng ứng) và thấp hơn giữa các cá thể trong quần thể (64,31% so với 88,06%, tƣơng ứng) [10]. Mức độ thay đổi phân tử này cũng phù hợp với mức độ thay đổi phân tử khi phân tích với chỉ thị ISSR (bảng 3.8). Bảng 3.8. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR
Bậc Tổng bình Thành phần Tổng sự biến Giá trị Nguồn biến thiên tự do phƣơng biến đổi đổi (%) p
Giữa các quần thể 2 124,241 2,950 36,46
Giữa các cá thể < 0,001 67 344,430 5,141 63,54 trong quần thể
Hệ số tương đồng truyền v k oảng truyền g ữa 3 quần t ể B xan Hệ số tƣơng đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa 3 quần thể Bách xanh đƣợc xác định sau khi so sánh các cặp quần thể với nhau. Kết quả chỉ ra các quần thể Bách xanh nghiên cứu đều có hệ số tƣơng đồng di truyền khá cao (> 0,7), trung bình 0,824. Trong đó quần thể Đatanla và Hòa Sơn có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất (0,891), kết quả này cũng phù hợp khi phân tích với chỉ thị ISSR. Hệ số tƣơng đồng di truyền thấp nhất đƣợc xác định giữa quần thể Đatanla và quần thể Kon Chƣ Răng (0,750). Tƣơng tự, khoảng cách di truyền cao nhất đƣợc xác định giữa cặp quần thể Kon Chƣ Răng/Đatanla (0,288) và thấp nhất giữa cặp quần thể Hòa Sơn/Đatanla (0,115) (bảng 3.9).
47 Bảng 3.9. Hệ số tƣơng đồng (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR Đatanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng Trung bình Đatanla 0,115 0,288
Hòa Sơn 0,891 0,270 0,236
Kon Chƣ Răng 0,750 0,763 Trung bình 0,824
3.3.3. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu của 3 quần thể Bách xanh với chỉ thị SSR đƣợc thể hiện trong hình 3.8. Kết quả chỉ ra 3 quần thể Bách xanh nghiên cứu đã chia thành 2 nhánh chính riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng từ 71% (Cm41 và Cm63) đến 98% (Cm52 và Cm53, Cm56 và Cm58). Trong đó, quần thể Kon Chƣ Răng (Gia Lai) lập thành một nhóm, quần thể Hòa Sơn (Đắk Lắk) và Đatanla (Lâm Đồng) lập thành một nhóm riêng biệt.
48 53.6
54.8 II.2
76.7 c
51.3 II
53.0 66.5
52.5
II.1
b
I 70.9 86.6 62.8 a
Hình 3.8. Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA (a: mẫu thu ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai); b: mẫu thu ở Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu thu ở Đatanla (Lâm Đồng).
49 Kết quả phân tích trong hình 3.8 cho thấy, nhánh chính I gồm 4 mẫu Cm67, Cm68, Cm69 và Cm70 đều có nguồn gốc ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai), có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 88,8 đến 97%. Nhánh chính II gồm 66 mẫu còn lại và chia thành 2 phân nhóm II.1 và II.2 có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 73,8 đến 98%. Trong đó phân nhóm II.1 gồm 34 mẫu (Cm33 – Cm66) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 77,9 đến 98%, đều có nguồn gốc ở Hòa Sơn (Đắk Lắk). Phân nhóm II.2 gồm 32 mẫu (Cm1 – Cm32) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 78,4 đến 98%, có nguồn gốc ở Đatanla (Lâm Đồng). Biểu đồ tọa độ (hình 3.9) cũng thể hiện việc phân nhóm tƣơng tự nhƣ biểu đồ hình cây.
Datanla Hòa Sơn
Kon Chƣ Răng Tọa độ 2(21.92%) độ Tọa
Tọa độ 1 (29.42%)
Hình 3.9. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 3.3.4. Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ thị SSR Mƣời bảy cặp mồi SSR đã đƣợc sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho 70 mẫu Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) thuộc 3 quần thể ở Tây Nguyên (Đatanla, tỉnh Lâm Đồng; Hòa Sơn, tỉnh Đắk Lắk và Kon Chƣ Răng, tỉnh Gia Lai). Tổng số đã phát hiện đƣợc 42 alen, trung bình 2,47 alen/mồi, trong đó có 40 alen đa
50 hình (chiếm 95,2%). Các alen phát hiện đƣợc có kích thƣớc trong khoảng 100 – 430 bp. Kết quả phân tích SSR đã chỉ ra quần thể Bách xanh ở Đatanla có tính đa dạng di truyền cao nhất (h = 0,251; I = 0,496 và PPB = 88,24%), xếp thứ hai là quần thể Hòa Sơn (h = 0,250; I = 0,466 và PPB = 76,47%), và thấp nhất là quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,167; I = 0,313 và PPB = 47,06%). Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (36,46%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (63,54%). Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị SSR chia thành hai nhánh chính I và II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng từ 71 đến 98%. Nhánh chính I gồm 4 mẫu Cm67, Cm68, Cm69 và Cm70 đều có nguồn gốc ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai), có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 88,8 đến 97%. Nhánh chính II gồm 66 mẫu còn lại và chia thành 2 phân nhóm II.1 và II.2 có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 73,8 đến 98%. Trong đó phân nhóm II.1 gồm 34 mẫu (Cm33 – Cm66) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 77,9 đến 98%, đều có nguồn gốc ở Hòa Sơn (Đắk Lắk). Phân nhóm II.2 gồm 32 mẫu (Cm1 – Cm32) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 78,4 đến 98%, có nguồn gốc ở Đatanla (Lâm Đồng). 3.4. Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR Để có cái nhìn tổng quát hơn về mức độ đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể Bách xanh nghiên cứu, chúng tôi đã tổng hợp kết quả phân tích với chỉ thị ISSR và chỉ thị SSR. Kết quả đã chỉ ra quần thể Bách xanh ở Đatanla có tính đa dạng di truyền cao nhất (h = 0,123; I = 0,194 và PPB = 36.61%), xếp thứ hai là quần thể Hòa Sơn (h = 0,107; I = 0,188 và PPB = 345.52%), và thấp nhất là quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,031; I = 0,034 và PPB = 6.01%) (bảng 3.10). Kết quả phân tích về các thông số này này cũng phù hợp với kết quả khi phân tích độc lập hai chỉ thị ISSR và SSR.
51 Bảng 3.10. Một số thông số di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR
Thông số Mức độ quần thể Mức độ di truyền loài Đatanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng Trung bình N 32 34 4 23,3 70 Na 1,317 1,284 0,825 1,142 1,512 Ne 1,229 1,221 1,041 1,164 1,277 He 0,131 0,127 0,023 0,094 0,168 PPB (%) 36,61 35,52 6,01 26,05 51,16 h 0,123 0,107 0,031 0,102 0,146 I 0,194 0,188 0,034 0,139 0,254
Ghi chú: N: số mẫu; Na: số alen trung bình trên một locus; Ne: số alen hiệu quả trên một locus; I: chỉ số đa dạng Shannon; He: hệ số gen dị hợp tử mong đợi; UHe: Unbiased expected heterozygosity; h: chỉ số đa dạng theo Nei; PPB: phần trăm phân đoạn đa hình. Kết quả phân tích mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể cũng cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (37,87%) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (62,13%) (bảng 3.11). Khi so sánh với loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis) ở Trung Quốc trong nghiên cứu của Wang và cộng sự (2004) [56] nhận thấy, mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể của loài Bách xanh ở Tây Nguyên cao hơn (37,87% so với 4,1%) và thấp hơn giữa các cá thể trong quần thể (62,13% so với 95,9%) và khi so sánh với loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) của Trần Thị Liễu và cộng sự (2014) phân tích với 17 cặp mồi SSR cũng nhận thấy mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể của loài Bách xanh cao hơn (37,87% so với 11,94%) và thấp hơn giữa các cá thể trong quần thể (62,13% so với 88,06%) [10]. Mức độ thay đổi phân tử này cũng phù hợp với mức độ thay đổi phân tử khi phân tích với chỉ thị ISSR và chỉ thị SSR.
52 Bảng 3.11. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR
Bậc Tổng bình Thành phần Tổng sự biến Giá trị Nguồn biến thiên tự do phƣơng biến đổi đổi (%) p
Giữa các quần thể 2 237,886 5,676 37,87 < 0,001 Trong các quần thể 67 623,928 9,312 62,13
Hệ số tương đồng truyền v k oảng truyền g ữa 3 quần t ể B xanh Kết quả trong bảng 3.12 chỉ ra các quần thể Bách xanh nghiên cứu có hệ số tƣơng đồng di truyền tƣơng đối cao ( > 0,853), trung bình đạt 0,897. Trong đó quần thể Đatanla và Hòa Sơn có hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất (0,952) và thấp nhất là giữa quần thể Đatanla và quần thể Kon Chƣ Răng (0,853). Khoảng cách di truyền giữa các quần thể dao động từ 0,049 (giữa quần thể Đatanla và Hòa Sơn) đến 0,159 (giữa quần thể Đatanla và Kon Chƣ Răng). Khoảng cách di truyền trung bình giữa ba quần thể là 0,109. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả khi phân tích độc lập hai chỉ thị ISSR và chỉ thị SSR. Bảng 3.12. Hệ số tƣơng đồng (dƣới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR
Đatanla Hòa Sơn Kon Chƣ Răng Trung bình
Đatanla 0,049 0,159
Hòa Sơn 0,952 0,114 0,109
Kon Chƣ Răng 0,853 0,892
Trung bình 0,897
Phân tích UPGMA trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Nei (1972) sử dụng phần mềm NTSYS 2.0 đã tìm thấy mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu của 3 quần thể Bách xanh thể hiện trong hình 3.10 và hình 3.11.
53 75.3 58.1 52.7 54.9
II.2 49.8 c 65.1 62.8
51.1 57.0 68.1
II
77.5
52.6 50.5 II.1 b 63.1 60.4
I 99.9 64.8 a 86.6
Hình 3.10. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR tính theo phƣơng pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Ghi chú: a: mẫu ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai); b: mẫu ở Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu ở Đatanla (Lâm Đồng).
54 Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị ISSR và SSR (hình 3.10) chia thành hai nhóm chính I và II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng từ 78,5% (Cm41 và Cm50) đến 98,1% (Cm64 và Cm65). Nhóm chính I gồm 4 mẫu Cm67, Cm68, Cm69 và Cm70 đều có nguồn gốc ở Kon Chƣ Răng (Gia Lai), có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 94,8 đến 97,9%. Nhóm chính II gồm 66 mẫu còn lại và chia thành 2 phân nhóm II.1 và II.2 có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 82,2 đến 98,1%. Trong đó phân nhóm II.1 gồm 34 mẫu (Cm33 – Cm66) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 86,5 đến 98,1%, đều có nguồn gốc ở Hòa Sơn (Đắc Lắc). Phân nhóm II.2 gồm 32 mẫu (Cm1 – Cm32) có hệ số tƣơng đồng di truyền trong khoảng từ 84,7 đến 97,3%, có nguồn gốc ở Đatanla (Lâm Đồng). Biểu đồ tọa độ (hình 3.11) cũng thể hiện việc phân nhóm tƣơng tự nhƣ biểu đồ hình cây. Các mẫu có khoảng cách di truyền càng gần nhau thì trên biểu đồ tọa độ chúng sẽ nằm co cụm lại với nhau.
Datanla Hòa Sơn
Kon Chƣ Răng Tọa dộ 2 (18.81%) 2 dộ Tọa
Tọa độ 1 (39.42%)
Hình 3.11. Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR và SSR
55 So sánh hiệu quả p ân tí đa ạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ th ISSR và SSR: Ba mƣơi mồi ISSR và mƣời bảy cặp mồi SSR đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng di truyền của 70 các thể thuộc 3 quần thể Bách xanh thu đƣợc ở Lâm Đồng, Đắk Lắk, Gia Lai thì có 25/30 mồi ISSR và 15/17 cặp mồi SSR đã chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu. Các mồi ISSR cho tỷ lệ đa hình thấp giữa các mẫu nghiên cứu, chỉ có 18 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50%, trong đó có duy nhất mồi ISSR3 có 100% số phân đoạn đa hình. Trong khi đó khi phân tích với 17 cặp mồi SSR lại cho thấy tỉ lệ đa hình tƣơng đối cao giữa các mẫu nghiên cứu (nhân bản đƣợc tổng số 42 phân đoạn, trung bình 2,47 phân đoạn/mồi, trong đó có 40 phân đoạn đa hình (chiếm 95,2%)). Hàm lƣợng thông tin đa hình ( PIC) khi phân tích với chỉ thị ISSR cũng thấp hơn khi phân tích với chỉ thị SSR (1,01 và 0,272, tƣơng ứng). Thông số đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh với 30 mồi ISSR đã chỉ ra quần thể Đatanla có tính đa dạng di truyền cao nhất (I = 0,192; h = 0,102; PPB = 35,66%; Ne =1,227 và He = 0,130) và thấp nhất là quần thể Kon Chƣ Răng (I = 0,022; h = 0,015; PPB = 3,88%; Ne = 1,027 và He = 0,015). Kết quả phân tích với chỉ thị SSR cũng cho kết quả giống với kết quả phân tích bởi chỉ thị ISSR thể hiện ở quần thể Đatanla có tính đa dạng di truyền cao nhất (h = 0,251; I = 0,496 và PPB = 88,24%) và thấp nhất vẫn là quần thể Kon Chƣ Răng (h = 0,167; I = 0,313 và PPB = 47,06%). Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể khi phân tích với chỉ thị ISSR và SSR đều cho thấy tổng mức độ thay đổi phân tử là thấp giữa các quần thể (36,63% và 36,46%, tƣơng ứng) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (63,67% và 63,54%, tƣơng ứng) với giá trị p < 0,001. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR và SSR đều chia thành hai nhánh chính I và II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng từ 81,4% đến 99,1% và từ 71% đến 98%, tƣơng ứng. Các cá thể trong cùng quần thể có quan hệ gần gũi nhau về mặt di truyền và đều nằm co cụm vào từng nhóm riêng biệt trên biểu đồ
56 hình cây. Kết quả phân nhóm trên biểu đồ tọa độ (PCA) phân tích với chỉ thị ISSR và SSR đều phản ánh tƣơng tự nhƣ biểu đồ hình cây. Các mẫu có khoảng cách di truyền càng gần nhau thì trên biểu đồ tọa độ chúng sẽ nằm co cụm lại với nhau. Dựa vào kết quả trên ta có thể thấy kết quả phân tích đa dạng di truyền 3 quần thể Bách xanh ở Tây Nguyên khi phân tích với chỉ thị ISSR và SSR là tƣơng đối giống nhau, chỉ có một khác biệt nhỏ đó là khi phân tích với chỉ thị ISSR cho thấy tỉ lệ đa hình và hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC) là tƣơng đối thấp còn khi phân tích với chỉ thị SSR lại cho kết quả tƣơng đối cao. Khi sử dụng nhiều mồi để phân tích đa dạng di truyền thì kết quả sẽ chính xác và khách quan hơn, đó cũng là lí do trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng đồng thời cả 2 loại chỉ thị ISSR và SSR để đánh giá đa dạng di quyền quần thể Bách xanh ở Tây Nguyên.
57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1. Ba mƣơi mồi ISSR và 17 cặp mồi SSR sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền cho 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) ở Tây Nguyên (Đatanla, Lâm Đồng; Hòa Sơn, Đắk Lắk và Kon Chƣ Răng, Gia Lai). Trong đó 25/30 mồi ISSR và 15/17 cặp mồi SSR chỉ ra tính đa hình . 2. Tính đa dạng di truyền của loài Bách xanh ở Tây Nguyên khi phân tích với cả hai chỉ thị ISSR và SSR đều bộc lộ cao nhất ở quần thể Đatanla và thấp nhất ở quần thể Kon Chƣ Răng, tỉnh Gia Lai. 3. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể khi phân tích với chỉ thị ISSR và SSR đều thấp giữa các quần thể và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể. 4. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR và SSR đều chia thành hai nhánh chính I và II riêng biệt có hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng từ 81,4% đến 99,1% và từ 71% đến 98%, tƣơng ứng. Các cá thể trong cùng quần thể có quan hệ gần gũi nhau về mặt di truyền và đều nằm co cụm vào từng nhóm riêng biệt trên biểu đồ hình cây. Kết quả phân nhóm trên biểu đồ tọa độ (PCA) phân tích với chỉ thị ISSR và SSR đều phản ánh tƣơng nhƣ biểu đồ hình cây. Các mẫu có khoảng cách di truyền càng gần nhau thì trên biểu đồ tọa độ chúng sẽ nằm co cụm lại với nhau. 5. Thông qua các giá trị nhƣ hệ số di nhập gen (Nm), giá trị tạo giống (Fis), số alen hiếm (Ap) và mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) cho thấy tính đa dạng di truyền loài Bách xanh ở Tây Nguyên không đáng lo ngại, mặc dù có sự trôi dạt nguồn gen tƣơng đối cao ở một số locus nên việc bảo tồn đa dạng nguồn gen cũng cần đƣợc quan tâm sớm. 2. KIẾN NGHỊ Từ các kết quả nghiên cứu trên đây chúng tôi có đề xuất: 1. Cần có chiến lƣợc thu thập hạt giống loài Bách xanh để bảo tồn nguồn tài nguyên tự nhiên ở Tây Nguyên. 2. Xây dựng khu bảo tồn tại chỗ để chăm sóc sự phát triển của cây mạ và quản lý sự phát triển nguồn gen tại tất cả các quần thể. 3. Xây dựng một nguồn gen lõi để duy trì và bảo tồn sự phát triển các nguồn gen tại tất cả các quần thể để làm tăng tính đa dạng di truyền trong mỗi vùng.
58 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trọng Cúc (2002), Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Bộ KH & CN, Viện KH và CNVN (2007), Sách Đỏ Việt Nam - Phần II- Thực vật, NXB KHTN & CN, tr. 389. 3. Vũ Đình Duy, Bùi Thị Tuyết Xuân, Trần Vinh, Nguyễn Minh Tâm (2010), “Phân tích đa dạng và quan hệ di truyền quần thể Thủy tùng (Glyptostrobus pensilis) ở Đắk Lắk bằng chỉ thị SSR”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(3), tr. 331-336. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội. 5. Vũ Thị Thu Hiền, Lê Anh Tuấn, Trần Thị Việt Thanh, Phí Hồng Hải, Đinh Thị Phòng (2009), Phân tích mối quan hệ di truyền tập đoàn giống cây bách xanh (Calocedrus macrolepis) bằng mồi RAPD và DNA lục lạp, Proceeding Hội nghị khoa học lần thứ 3 về Sinh thái và tài nguyên sinh vật, tr. 120-128. 6. Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc, Nguyễn Đức Tố Lƣu, Philip Ian Thomas, Aljos Farjon, Leonid Averyanov, Jacinto Regalado (2004), Thông Việt Nam: Nghiên cứu hiện trạng bảo tồn 2004, Fauna & Flora International, Chƣơng trình Việt Nam, Hà Nội. 7. Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Tiến Hiệp, Đinh Thị Phòng (2015), “ Tính đa dạng nguồn gen di truyền và cấu trúc quần thể loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)- loài đặc hữu ở Tây Nguyên, Việt Nam bằng chỉ thị ISSR”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 53(2), tr. 179. 8. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004), Các loài cây lá kim ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Đinh Thị Phòng, Vũ Thị Thu Hiền, Phí Hồng Hải, La Ánh Dƣơng (2009), “Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Pơ Mu (Fokienia hodginsii) bằng mồi RAPD và ADN lục lạp”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 12(2), tr. 195-201.
59 10. Đinh Thị Phòng, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Nguyễn Tiến Hiệp (2014), “ Đánh giá tính đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) ở Tây Nguyên, Việt Nam bằng chỉ thị SSR”, Tạp chí sinh học, 36(2), tr. 210-219. 11. Khuất Hữu Thanh (2005), Kỹ thuật gen – Nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 12. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 13. Nguyễn Minh Tâm, Vũ Đình Duy, Phạm Văn Lực, Nguyễn T. Phƣơng Trang, Nguyễn Tiến Hiệp (2010), Bảo tồn tính đa dạng di truyền một số loài Thông đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, Proceeding Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tr. 13-21. TIẾNG ANH 14. Arif M., Zaidi N. M., Singh Y. P., Haq Q. M. R., Singh U. S. (2009), “A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in Shisham (Dalbergia sissoo)”, Plant. Mol. Biol. Rep., 27, pp. 488– 495. 15. Averyanov L.V., Nguyen Tien Hiep, Pham Van The, Phan Ke Loc. (2004), “ Calocedrus rupestris sp.nov (Cuppressaceae) new relict coniferous species from limestone areas of northern Vietnam, Proceeding of the National Conference on Life Science, Thai Nguyen University, pp. 40-44. 16. Bornet B., Branchard M. (2001), “Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: Reproducible and specific tools for genome fingerprinting”. Plant. Mol. Biol. Rep., 19, pp. 209-215. 17. Boys J., Cherry M., Dayanandan S. (2005), „„Microsatellite analysis reveals genetically distinct populations on red pine (Pinus resinosa, pinaceae)“, Amer. J. Bot., 92(5), pp. 833-841. 18. Carrasco B., Retamales J. B., Quiroz K., Garriga M., Caligari P. D. S., Gonzales R. G. (2013), “Inter simple sequence repeat markers associated with flowering
60 time duration in the Chilean strawberry (Fragaria chiloensis)”, J. Agr. Sci. Tech., 15, pp. 1195-1207. 19. Chiang Y. C., Shih H. C., Chang L. W., Li W. R., Lin H. Y., Ju L. P. (2011), “Isolation of 16 polymorphic microsatellite markers from an endangered and endemic species Podocarpus nakaii (Podocarpaceae)”, Amer. J. Bot., pp. 306- 309. 20. Chung JD, Lin TP, Lin MY, Hwang SY. (2004), “ Genetic diversity and biogeography of Cunninghamia konishii with Cunninghamia lanceolate, a mainland special in China”, Mol. Phylogene. Evol., 33(3), pp. 791-801. 21. Cipriano J., Carvalho A., Fernandes C., Gaspar M. J., Pires J., Bento J., Roxo L., Louzada J., Lima-Brito J. (2013), “Evaluation of genetic diversity of Portuguese Pinus sylvestris L. populations based on molecular data and inferences about the future use of this germplasm”, J. Genet., 92, e41-e48. 22. Dinh Thi Phong, Vu Thi Thu Hien, Tran Thi Lieu (2015), “ Genetic variation of Pinus dalatensis Ferre‟ (Pinaceae) populations- endemic species in Vietnam revealed by ISSR markers”, J. Chem. Bio. Phy. Sci. Sec. B., Feb.2015- Apr.2015, Vol 5, No.2, pp. 1415-1425. 23. Doyle J. J., Doyle D. J. (1990), “Isolation of plant DNA from fresh tissue”, Pocus 12, pp. 13-15. 24. Echt C. S., Vendramin G. G., Neison C. D., Marquardt P. (1999) „Microsatellite DNA as shared genetic markers among conifer species”, Canada J. For. Res., 29, pp. 365-371. 25. Fang D. Q., Roose M. L., Federici C. T. (1997), “Fingerprinting trifoliate orange germ plasm accessions with isozymes, RFLPs and inter-simple sequence repeat markers”, Theo. App. Genet., 95, pp. 211-219. 26. Farjon A., Page C. N. (1999), Conifer : status survey and conservation action plan, Conifer Specialist Group, IUCN, Gland, Switzerland &Cambrige, UK.
61 27. Feng F. J., Han S. J. and Wang H. M. (2006), “Genetic diversity and genetic differentiation of natural Pinus koraiensis populations”, J. For. Res., 17, pp. 21– 24. 28. Goudet J., 1995. FSTAT version 1.2: a computer program to calculate F- statistics. J. Hered., 86, pp. 485-486. 29. Hung K. H., Lin C. Y., Huang C. C., Hwang C. C., Hsu T. W., Ku Y. L., Wang W.K., Hung C.Y.,Chiang T.Y. (2012), “Isolation and characterization of microsatellite loci from Pinus massoniana (Pinaceae)”, Botanical Studies, 53, pp. 191-196. 30. Isshiki S., Iwata N., Khan M. M. R. (2008), “ISSR variations in eggplant (Solanum melongena L.) and related Solanum species”, J. Amer. Soci. Hort. Sci., 117, pp. 186–190. 31. Levi A., Rowland L. J. (1997), “Identifying blueberry cultivars and evaluating their genetic relationships using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) anchored primer”, J. Amer. Soci. Hort. Sci., 122, pp. 74-78. 32. Liao S. X., Mi X. J., Liu A. Z., Li K., Yang Z. Y., Tian B. (2010), “Isolation and Characterization of polymorphic microsatellite markers in Calocedrus macrolepis Kurz (Cupressaceae)”., J. Amer. Soci. Hort. Sci., 45(1), pp.169–171. 33. Liu G. F., Dong J. X., Jiang Y., Lu Y. F., Jiang J. and Zhao G. Y. (2005), “Analysis of genetic relationship in 12 species of Section Strobus with ISSR markers”, J. For. Res., 16, pp. 213–215. 34. Madhav P. (2011), “ Genetic diversity and differentiation of core vs. peripheral populations of eastern white cedar, Thuja occidentalis (Cupressaceae)”, Am. J. Bot., 99(4); pp. 690-699. 35. Man K. H., Hong W. H. (2000), “Genetic diversity and population structure of Juniperus rigida (Cupressaceae) and Juniperus coreana”, Evol. Ecol., 2000, Vol.14.Issue 2, pp. 87.
62 36. Mellick R., Porter C., Rossetto M. (2009), “Isolation and characterisation of polymorphic microsatellite loci from Podocarpus elatus (Podocarpaceae)”, Mol. Ecol. Res., 9(6), pp. 1460-1466. 37. Moraga A. R., Perez D. C., Lucas-Borja M. E., Tiscar P. A., Viñegla B., Linares J. C., Gómez-Gómez L., Ahrazem O. (2013), “Genetic Diversity of Pinus nigra Arn. Populations in Southern Spain and Northern Morocco Revealed By Inter- Simple Sequence Repeat Profiles”, Int. Jour. Mol. Scien., 13, pp. 5645-5658. 38. Nagaoka T., Ogihara Y. (1997), “Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers”, Theo. App. Genet., 94, pp. 597-602. 39. Nei M. (1973), “Analysis of genetic diversity in subdivided populations”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 70, pp. 3321-3323 40. Nguyen Minh Tam, Nguyen T. Phuong Trang, Nguyen Thi Hoa (2011), “Genetic diversity of an endangered species Fokienia hodginsii (Cupressaceae)”, Afri. J. Biot., 10(71), pp. 15838-15844. 41. Nkongolo K. K., Gervais S., Michael P., Zhou Y. (2014), “Comparative analysis of Inter Simple Sequence Repeats and Simple Sequence Repeats markers: Genetic analysis of Deschampsia cespitosa populations growing in metal contaminated regions in Canada”, Amer. J. Bioc. Biot., 10 (1); pp. 69-80. 42. Parasharami V. A., Thengane S. R.. (2012), “Inter population genetic diversity analysis using ISSR markers in Pinus roxburghii (Sarg.) from Indian provenances”, Int. J. Biodivers. Conserv., 4 (5), pp. 219-227. 43. Peakall R., Smouse P. E. (2006), GenAlEx V5: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research, Australian National University, Canberra, Australia (http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/). 44. Porebski S., Bailey L. G., Baum B. R.. (1997), “Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components”, Plan. Mol. Biol. Rep., 15(1), pp. 8-15.
63 45. Rohlf F. J. (1992), NTSYS-PC: Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.0, State University of New York (Stony Brook, New York). 46. Semagn K., Bjornstad A. and Ndjiondjop M. N. (2006), “An overview of molecular marker methods for plants”, Afri. J. Biot., 5 (25), pp. 2540-2568. 47. Shannon C., Weaver W. (1949), The mathematical theory of communication, University of Illinois Press, Urbana, USA. 48. Shaw J. E., Small R. L. (2005), “Chloroplast DNA phylogeny and phylogeography of the North American plums (Prunus subgenus Prunus section Prunocerasus, Rosaceae)”, Amer. J. Bot., 92, pp. 2011-2030. 49. Tam N. M., Hoa N. T., Trang N. T. P. (2009), “Genetic variation in threatened conifer Cunninghamia lanceolata var. konishii using ISSR markers: Implications for conservation”, J. Biol., 31(2), pp. 66-72. 50. Tam N. M., Trang N. T. P. (2012),” Molecular identification of Cupressaceae (Coniferales) in Vietnam based on 18S-rRNA sequence”, Afri. J. Biot., 11 (18), pp. 4158-4162. 51. Tsumura Y., Ohba K., Strauss S. H. (1996), “Diversity and inheritance of inter- simple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica)”, Theo. App. Genet., 92, pp. 40-45. 52. Vekemans X., Beauwens T., Lemaire M., Roldan-Ruiz I.(2002), “ Data from amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers show indication of size homoplasy and of a relationship between degree of homoplasy and fragment size”, Mol. Ecol., 11, pp.139-151. 53. Vendramin G. G., Lelli L., Rossi P., Morgante M. (1996), “A set of primers for the amplification of 20 chloplast microsatellites in Pinaceae” Mol. Ecol., 5, pp. 595-598. 54. Xiliao S, Jie X, Yin Y. Z. (2010), “Isolation and characterization of polymorphic microsatellite markers in Calocedrus macrolepis Kurz”, Hort. Sci., 45 (1), pp. 169-171.
64 55. Wang M. B., Hao Z. Z. (2010), “Rangewide genetic diversity in natural populations of Chinese pine (Pinus tabulaeformis)”, Bio. Gene., 48, pp. 590– 602. 56. Wang D.L, Li, Z.C. (2004), “Genetic diversity of Calocedrus macrolepis (Cupressaceae) in Southwestern China”, Bio. Chem. Sys. Ecol., v.32, no.9. 57. Wu Z. Y., Liu J. F., Hong W., Pan D. M., Zheng S. Q. (2011), “Genetic diversity of natural and planted Glyptostrobus pensilis populations: a comparative study”, Chin. J. App. Ecol., 22(4), pp. 873. 58. Yang C. P., Wei L., Jiang J., Liu G. F., Zhao G. Y. (2005), “Analysis of genetic diversity for nineteen populations of Pinus sibirica Du Tour with technique of ISSR”, J. Nor. For. Univ., 33, pp. 1–3. 59. Yap I. V., Nelson R. J. (1996). Winboot: a program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence of UPGMA- based dendrograms, IRRI, Manila 60. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. (1994), “Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR) anchored PCR amplification”, Genome, 20, pp. 176-183.
65