Instituto Politécnico Nacional Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Sinaloa
DEPARTAMENTO DE ACUACULTURA
Caracterización y Filogenia de la Región Control del Genoma Mitocondrial de Especies del Género Ictalurus (Pisces: Ictaluridae) en el Noroeste de México
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRIA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA:
Sarahí Vega Heredia
Guasave, Sinaloa, Diciembre del 2007
Contenido
Resumen xiii Introducción 1 Antecedentes 4 Caracteristicas de la familia Ictaluridae 4 Caracteristicas y problemática del género Ictalurus 6 Hibridación y diversidad génetica 9 Caracteristicas del genoma mitocondrial 11 Región control o del asa de desplazamiento 13 Replicación del mtDNA 14 Replicación y transcripción del mtDNA de mamíferos 15 Genes mitocondriales más utilizados en la filogenia de peces 16 La filogenia 18 Filogenia del género Ictalurus 20 Hipótesis 23 Objetivo general 23 Objetivos especificos 23 Materiales y métodos 24 Muestreos de campo e identificación de las especies 24 Extracción y análisis del DNA 24 Diseño de oligonucleótidos 26 Amplificación por PCR y PCR gradiente 27 Purificación y secuenciación 28 Analisis de secuencias y filogenia 28 Resultados 30 Análisis del DNA total y las secuencias de la región control 30 Secuenciación y composición de bases nucleotídicas de la región control 30 Estructura de la región control 31 Inferencia filogenética 40 Discusión 44
ii Longitud y composición de bases nucleotidicas de la region control de 44 Ictalurus Estrutura de la región control 45 Inferencia filogenética 48 Conclusiones 50 Literatura citada 51
iii Lista de tablas
Tabla Página
I Clasificación taxonómica del género Ictalurus de acuerdo a 5 Lundberg (1992)
II Lista de localidades de recolecta de los bágres nativos y 25 exóticos utilizados en este estudio
III Características de los oligonucleótidos diseñados para la 27 amplificación por PCR de la región control
IV Composición de nucleótidos en la región control del género 31 Ictalurus y su comparación con otros Siluriformes seleccionados
V Longitud y composición de los dominios derecho, central e 37 izquierdo de la región control de las especies estudiadas
iv Lista de figuras
Figura Página
1 Fotografía del bagre Yaqui, Ictalurus pricei (foto A. Varela 7 Romero).
2 Mapa del genoma mitocondrial de vertebrados modificado de 13 Waldbieser et al., (2003).
3 Relaciones filogenéticas de los bagres del género Ictalurus, 20 modificado de Lundberg (1992).
4 Relaciones filogenéticas del género Ictalurus por medio del gen cyt- 22 b del mtDNA de acuerdo a los método de máxima parsimonia y máxima verosimilitud (Varela-Romero, 2007).
5 Localización de los oligonucleótidos utilizados en este estudio. 26
6 Amplicónes de la región control de I. pricei 43 y 45, I. cf. pricei 30 (Batopilas), I. cf. pricei (Tutuaca) e I. furcatus.
7 Alineamiento de las secuencias de la región control de I. pricei 43 y 33 45, I. cf. pricei (Tutuaca), I. cf. pricei (Batopilas) e I. furcatus
8 Alineamiento de las secuencias asociadas a la terminación (TAS) de 34 la síntesis de la cadena pesada en el dominio izquierdo de la región control de las especies estudiadas.
9 Alineamiento de las secuencias conservadas en el dominio central de 38 la región control de las especies estudiadas.
10 Alineamiento de los bloques de secuencias conservadas (CSB) en la 39 región control de las especies estudiadas.
v 11 Topología del árbol de la región control de Ictalurus obtenida de 41 acuerdo al criterio Neighbor-Joining.
12 Topología del árbol de la región control de Ictalurus obtenida de 42 acuerdo al análisis de máxima parsimonia.
13 Topología del árbol de la región control de Ictalurus obtenida de 43 acuerdo al análisis de máxima verosimilitud.
vi DEDICATORIA
A mis padres Margarita Heredia Q. y Sergio Vega C. por creer en mí y darme su apoyo incondicional. Los amo.
A mis hermanos Sergio, Paúl, Tania y Tania por apoyarme en mis decisiones por muy descabelladas que sean.
A mi tía Martha Heredia Q. que ha sido una segunda mamá para mí.
A mi perrita la Pulga, que me llena de felicidad.
A mis mejores amigos Carmen, Carlos de cariño Yiyo y Yetzabel gracias por los bellos momentos que me han hecho y hacen pasar a su lado. Por siempre amigos.
A la Dra. Gloria Yepiz Plascencia, Perduraran siempre en mi todas sus enseñanzas, logro transmitirme el amor que siente por la ciencia, es por eso que ningún obstáculo logro vencerme. La quiero mucho mucho!, mi más grande admiración para usted.
vii AGRADECIMIENTOS Y RECONOCIMIENTOS
Al laboratorio de Biología molecular de Organismos Acuáticos (LBMOA) por dejarme tener el inmenso orgullo de haber pertenecido a su grupo de investigación.
A mi asesor Dr. Alejandro Varela por su asesoria, cariño, paciencia, por formarme no solo profesionalmente si no también mi parte humana, ya que eres un excelente ser humano a quien yo aprecio y admiro profundamente. Siempre estare agradecida con la vida por haberte cruzado en mi camino, me siento muy orgullosa de haber sido tu alumna Jefe.
A mi asesor Dr. Juan Carlos Sainz ya que creyó en mi en uno de los momentos más dificiles de mi vida, ayudándome a realizar el trabajo de investigación que yo quería en el laboratorio de LBMOA del CIAD. Gracias por la energía positiva que siempre me transmitiste para que no decayera mi ánimo.
A CIAD Hermosillo, porque siempre me recibe con los brazos abiertos y por contribuir en mi formación profesional.
Al Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora (DICTUS) por darme tanta paz y apoyo cuando trabaje en sus instalaciones.
Al Instituto Politécnico Nacional por la beca que me otorgó.
Al CIIDIR Sinaloa por mostrarme que yo puedo vencer cualquier obstáculo que se me presente en la vida. Sin viento el papalote no puede volar.
A mis amigos del LBMOA Oliviert Martínez, Carmen Contreras, Antonio García, José Gpe. Soñanez, Mariana Rodríguez, Aldo Arvízu, Martín Bustillos, Emmanuel Aispuro y Alejandro Varela, todo fue más fácil teniendolos a mi lado, sus palabras de apoyo fueron claves para que yo culminara esta meta.
viii A la Dra. Adriana Muhlia por sus acertados consejos en todo momento.
A la M. C. Alma B. Peregrino que fue quien me enseño las bases para trabajar y ser eficiente en el laboratorio.
A los miembros de mi comité de tesis, Dra. Gloria Yepiz Plascencia, Dr. Antonio Luna González, Dr. Héctor Abelardo González Ocampo por su apoyo y su contribución a este trabajo.
Al Departamento de Acuacultura del CIIDIR por aceptarme como su alumna.
A la Dirección de Tecnologías de Alimentos de Origen Animal (DTAOA) del CIAD.
A mis amigos de generación de la maestría Manuel, Xochitl y Malú Omar por creer en mi a un en los malos momentos.
Al M. C. Santiago Jaime Reyes Herrera por su apoyo y su sabiduria en la toma de decisiónes en momentos dificiles.
A Don Roberto Urías, Dorin Ortíz, Celestino Várgas, Ricardo Baez, Dra. Teresa L. Espinosa, M. C. Diana Escobedo, Dr. Miguel A. Apodaca todos ellos son muy valiosos para el desarrollo del CIIDIR-Sinaloa. Y a Doña Ofe por su bondad.
A Ana Victoria Moran Bustamante quien se atrevio a rentar con migo en este año que vivi aqui en Hermosillo, por tolerarme, quererme, preocuparse por mi porque no avisaba cuando llegaba tarde o no llegaba a casa ups!!!!!, por compartir conmigo su forma tan positiva de ver la vida.
A la familia Mena Caro en especial a María del Carmen Caro Villaseñor y Omar Mena Caro quienes me permitieron formar parte de su familia.
A la familia Spinola Quezada en especial a mi tía querida Josefina Quezada Luque.
ix
Y por su puesto a ti mi músico querido Juan Carrillo, que no te das por vencido ante los obstáculos que te a puesto la vida.
A todas aquellas personas que me han apoyado y porque no también, a aquellas personas que han puesto obstáculos en mi camino y en mi superación.
Agradezco también a mi perseverancia ya que en un largo viaje lo realmente interesante está en las experiencias del trayecto.
x
Este trabajo de Maestría fue realizado en el laboratorio de Biología
Molecular de Organismos Acuáticos dentro de la Dirección de Tecnologías
de Alimentos de Origen Animal en el Centro de Investigación en
Alimentación y Desarrollo (CIAD, AC) y en el Departamento de
Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora
(DICTUS)
xi Resumen
El género Ictalurus es el único miembro de la familia Ictaluridae registrado en México, cuenta con especies muy utilizadas en la acuacultura, pesca deportiva y comercial (I. furcatus e I. punctatus) y con especies enlistadas dentro la Norma Oficial Mexicana (NOM-059-SEMARNAT-2001). El bagre Yaqui (I. pricei) se encuentra en la categoría de protección especial debido al impacto de las actividades productivas de la región. La introducción de bagres exóticos como I. punctatus e I. furcatus a las cuencas hidrólogicas donde el bagre Yaqui habita, ha ocasionado la reducción de su abundancia y distribución, ademas de promover su hibridación. La región control es la más variable del genoma mitocondrial, ya que presenta secuencias muy conservadas entre los vertebrados como las secuencias asociadas a la terminación de su replicación (TAS) y bloques de secuencias conservadas (CSB), además de secuencias hipervariables, que están involucradas en la replicación y transcripción mitocondrial. Debido a la heterogeneidad de sus secuencias, esta región ha sido utilizada para estudiar problemas filogenéticos diferenciando genéticamente a grupos estrechamente relacionados a nivel de especie e individuos. El objetivo de esta investigación es caracterizar la estructura de la región control y utilizarla para evaluar las relaciones filogenéticas de los bagres Ictalurus pricei, I. cf. pricei (río Batopilas), I. cf. pricei (río Tutuaca) e I. furcatus. El DNA fue obtenido de tejido de la aleta pélvica y para la amplificación de la región control se diseñaron oligonucleotidos de regiones que la flanquean. La construcción y análisis de secuencias de la región control se realizó utilizando los programas de cómputo DNAStar y BIOEDIT. El análisis filogenético se desarrolló con el programa PAUP utilizando los criterios de distancias, máxima parsimonia y máxima verosimilitud con un bootstrap de 1000 replicas. Se logró obtener y caracterizar la región control completa de dos ejemplares de I. pricei, un ejemplar de I. cf. pricei (Batopilas), I. cf. pricei (Tutuaca) e I. furcatus. Se identificaron tres repeticiones TACAT y 2 repeticiones de ATGTA identificándose como secuencias asociadas a la terminación de la síntesis de la cadena pesada llamadas TAS. Se localizaron tres CSB y un dominio central. Los CSB2 y CSB3 fueron los más conservados entre los Ictalurus y el más variable fue el CSB1. Las bases más abundantes fueron la adenina (A) y la timina (T) y la menos abundante fue la guanina (G). La inferencia filogenética basada en distancias genéticas,
xii máxima parsimonia y máxima verosimilitud permitió identificar un grupo monofilético de bagres nativos para el Noroeste de México (I. pricei, I. cf. pricei del río Tutuaca, e I. cf. pricei del río Batopilas) definiendo la identidad especifica del bagre Yaqui y del género Ictalurus. La región control proporcionó una inferencia filogenética congruente con la información existente sobre la evolución del género y elevó el nivel de confidencia en el análisis de máxima verosimilitud.
xiii Introducción
Los bagres constituyen un grupo diverso y abundante de peces que ocupan un lugar importante en la biodiversidad de vetebrados. La familia Ictaluridae es el único grupo de bagres dulceacuícolas de Norteamerica y America Central (Burgess, 1989). Este grupo incluye siete géneros con casi 50 especies (Lundberg, 2003). El género Ictalurus es el único nativo registrado en México (Rutter, 1896), con un potencial económico importante ya que cuenta con especies muy utilizadas en la acuacultura, pesca deportiva y comercial. Este género comprende ocho especies descritas que son: el bagre azul Ictalurus furcatus, el bagre de Balsas I. balsanus, el bagre de canal I. punctatus, el bagre Mexicano I. mexicanus, el bagre tropical I. meridionales, el bagre del Lerma I. dugessi, el bagre lobo I. lupus y el bagre Yaqui I. pricei (Miller et al., 2005).
Actualmente I. mexicanus, I. lupus e I. pricei se encuentran enlistados dentro de la NOM-059-SEMARNAT-2001 en la categoria de protección especial (Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales, 2002) debido al impacto de las actividades productivas involucradas en el desarrollo económico de la región Norte y Noroeste de México. La construcción de presas y la introducción de peces exóticos a las cuencas hidrólogicas donde habitan estas especies han alterado su hábitat natural remplazando a los peces nativos y promoviendo su hibridación (Juarez-Romero et al., 1989; Meffe et al., 1988; Varela-Romero, 1995).
El bagre Yaqui I. pricei se distribuye desde la cuenca del río Yaqui en Sonora y Chihuahua hasta el río Fuerte en Sinaloa incluyendo localidades en el río Mayo. Dentro de su distribución natural en los cauces de los ríos Yaqui y Mayo se ha observado que su distribución y abundancia ha sido reducida en varias localidades, especialmente en las regiones de baja a mediana elevación en Sonora, encontrándose restringida a las cabeceras más remotas de las cuencas, condición que amenaza su permanencia en habitats naturales (Varela-Romero, 2007). Adicionalmente, la introducción de bagres exóticos con potencial económico provenientes de los Estados Unidos de Norteamérica como los bagres de canal y azul dentro de su habitat natural, es considerado un impacto que amenaza su conservación y aprovechamiento debido a que se han detectado
1 híbridos entre los bagres Yaqui y de canal en recolectas provenientes de la región serrana de Sonora y Chihuahua (Campoy-Favela et al., 1989).
La hibridación ocurre cuando dos especies distintas se reproducen entre si trayendo como consecuencia que el descendiente del híbrido borre los limites entre subespecies o especies que antes podian diferenciarse (Dobzansky et al., 1977). Las herramientas moleculares a nivel de genoma mitocondrial (mtDNA) han sido muy utilizadas en muchos organismos para investigar la variabilidad genética, hibridación y filogenia debido a que no presenta recombinación y al diferente nivel de conservación de sus genes (Rokas et al., 2003; Waldbieser et al., 2003; Hardman, 2005; Sullivan et al., 2006) . En el caso del bagre Yaqui existe poca información disponible sobre genes mitocondriales, su estructura y relaciones filogenéticas con las especies dentro de su mismo género (Varela-Romero, 2007). La información existente está enfocada a comprender los cambios genéticos que afectan la supervivencia de especies amenazadas y algunas veces los problemas por hibridación existentes.
La región control o de desplazamiento (D-loop) es reconocida como la región con mayor variación del genoma mitocondrial (Avise, 2000; Ferris et al., 1987; Meyer, 1993) y ha sido muy útil para estudiar variaciones a nivel intraespecífico e interespecífico (Lin et al., 2006; Kirschning et al., 2007). El conocimiento de esta región es muy importante debido a que en ella se encuentran los elementos de control para la replicación y transcripción del genoma mitocondrial. Además esta región se reconoce por tener una rápida tasa evolutiva que la hace hipervariable, mostrando secuencias muy variables y secuencias conservadas como los CSB, TAS y un dominio central, este último es el más conservado entre los vertebrados (Saccone et al., 1991; Sbisa et al., 1997; Shadel et al., 1993; Walberg et al., 1981). Debido a su hipervariabilidad y a su conservación, esta región ha sido muy utilizada para estudiar el dinamismo de la evolución resolviendo problemas filogenéticos diferenciando genéticamente a grupos estrechamiento relacionados, principalmente por debajo del nivel de especie (Saccone et al., 1987; Shadel et al., 1993; Wolstenholme, 1992).
2 Hasta el momento sólo existe un estudio publicado sobre la secuenciación del genoma mitocodrial completo del bagre de canal (Waldbieser et al., 2003). La región control de esta especie es la única reportada en el GenBank para los bagres de la familia Ictaluridae. Por todo lo anterior, en este trabajo se propuso amplificar y secuenciar la región control del genoma mitocondrial de los bagres I. pricei (2 individuos), I. cf. pricei del río Tutuaca, I. cf. pricei del río Batopilas e I. furcatus, con el objetivo de caracterizarla y evaluar las relaciones filogenéticas del género Ictalurus.
La región control del genoma mitocondrial del género Ictalurus no ha sido estudiada y encierra información relacionada con el inicio de la replicación y transcripción del genoma mitocondrial con secuencias altamente conservadas y otras hipervariables. Por lo anterior, este trabajo determinó la secuencia nucleotídica de la región control para conocer su estructura y su papel en la inferencia de las relaciones filogenéticas de algunas especies del género Ictalurus y de grupos cercanos a la familia Ictaluridae. Para contribuir y reforzar la hipótesis filogenética del origen y evolución de las especies del género en el Noroeste de México y apoyar en el conocimiento de la biodiversidad, historia natural y la problemática que amenaza a estas especies y su manejo.
3
Antecedentes
Los peces son organismos de sangre fría, caracterizados por poseer vértebras, branquias y aletas. Son el grupo de vertebrados más numeroso, estimando que existen cerca de 20,000 especies vivientes, aunque se piensa que podrían incrementarse a 40,000 (Lagler et al., 1984). Debido a su capacidad de adaptación a los cambios ecológicos, pueden vivir casi en cualquier ambiente donde exista agua, desde las aguas del antártico, hasta los manantiales termales; desde el agua dulce y blanda hasta en depósitos hipersalinos, y en aguas profundas y oscuras (Lagler et al., 1984). De las 20,000 especies vivientes, la mitad son marinas y las restantes estuarínas, y aproximadamente la tercera parte son dulceacuícolas (Lagler et al., 1984). Uno de los grupos de peces dulceacuícolas más diversificados en Norteamérica es la familia Ictaluridae, su clasificación taxonómica se presenta en la Tabla I. (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy).
Características de la familia Ictaluridae
La familia Ictaluridae es una de las 31 familias del orden Siluriformes y es la única familia de bagres dulceacuícolas del Norte de América. Habita desde la Bahía de Hudson en Canadá, hasta América Central en el río Usumacinta en Guatemala a lo largo del litoral oriental y en la vertiente Pacífico de México. Esta familia está integrada por siete géneros que incluyen casi 50 especies (Hardman, 2005; Lundberg, 1992; Miller et al., 2005). En México la familia Ictaluridae es la de mayor importancia comercial, ya que la conforman los bagres azul, I. furcatus y de canal, I. punctatus que son de interés para la acuacultura y pesca por la excelente calidad de su carne (Burgess, 1989).
Las especies de la familia Ictaluridae tienen un cuerpo moderadamente alargado, piel lisa o desnuda (carente de escamas), gruesa y generalmente de color oscura. Su característica principal es que presentan 4 pares de barbillas largas alrededor de la boca (2 nasales, 2 maxilares y 4 en la parte inferior de la mandíbula), las mandíbulas están compuestas por dientes viliformes y presentan una espina en el borde anterior de las aletas dorsal y pectorales (Burgess, 1989; Lundberg, 1992). Todas las especies de la
4 familia tienen un ancestro común (es monofilética) y aparentemente tienen afinidad muy cercana con la familia Cranoglanidae del continente Asiático (Hardman, 2005; Miller et al., 2005).
Tabla I. Clasificación taxonómica del género Ictalurus de acuerdo a Lundberg (1992).
Taxón Nombre Reino Metazoa Phylum Chordata Clase Actinopterygii Orden Siluriformes Familia Ictaluridae Genero Ictalurus Especie Ictalurus punctatus Ictalurus australis Ictalurus lupus Ictalurus dugesii Ictalurus mexicanus Ictalurus pricei Ictalurus furcatus Ictalurus balsanus
La mayoría de los bagres de esta familia tienen hábitos nocturnos y viven la totalidad del tiempo en aguas turbias donde el agua es quieta. Su alimentación se basa en artrópodos, algas, larvas, otros peces, renacuajos y material muerto (Burgess, 1989). El entorno acuático ofrecido por el ciclo hidrológico en los ríos que conforman la cuenca donde habita favorece una diversidad de recursos nutritivos y provee un ambiente propicio para la reproducción de las presas de los bagres. Son peces de crecimiento lento y su reproducción es estacional adaptándose a los cambios de nivel de agua de los afluentes de la cuenca y al régimen de lluvias. Realizan migraciones durante periodos determinados en busca de lugares apropiados para desovar. El desove se produce en
5 primavera y los primeros meses de verano para lo cual construyen un nido en la arena para depositar los huevos (Burgess, 1989).
Características y problemática del género Ictalurus
El genero Ictalurus es el único género nativo registrado para el Noroeste de México (Rutter, 1896). Las características más significativas de este género son las siguientes: tienen una aleta caudal furcada, la mandíbula superior se proyecta sobre la inferior y la parte posterior de la espina dorsal presenta dientes a manera de sierra (Miller et al., 2005). México tiene por lo menos ocho especies descritas, el bagre azul I. furcatus, el bagre del Balsas I. balsanus, el bagre tropical I. meridionales, el bagre de canal I. punctatus, el bagre lobo I. lupus, el bagre del Lerma I. dugesii, el bagre mexicano I. mexicanus y el bagre Yaqui I. pricei (Lundberg, 1992). El conocimiento del número de especies y sus relaciones es aún muy pobre, sin embargo, el registro fósil incluye al menos cuatro especies extintas (Miller et al., 2005; Smith, 1987). Actualmente siete Ictalúridos se encuentran enlistados por el gobierno Mexicano como endémicos del territorio Nacional, como Prietella lundbergi y Prietella phreatophila, que son considerados en peligro de extinción. Además de cinco del género Ictalurus, I. australis e I. dugesii que son considerados en peligro de extinción; y tres que se encuentran enlistados bajo la categoría de protección especial I. pricei, I. mexicanus e I. lupus (Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, 2002).
El desarrollo económico ha traído como consecuencia la utilización inadecuada de los recursos hidrológicos destinados para las actividades productivas como la agropecuaria, minera, industrial y doméstica; alteraciones físicas de los hábitats naturales por la construcción de presas e incremento en el uso de agentes contaminantes (Meffe et al., 1988; Varela-Romero, 1995). Esto ha provocado la reducción de los hábitats disponibles para peces nativos y sus migraciones naturales al interior de los sistemas hidrológicos, además de la introducción de especies de peces exóticos (Salmonidae, Cyprinidae, Catostomidae e Ictaluridae) en las cuencas hidrológicas de Sonora que se encuentran compartidas con los vecinos estados de Baja California, Chihuahua, Sinaloa, Arizona y Nuevo México. Estos peces exóticos están remplazando a los peces nativos
6 de este estado debido a la competencia por alimento, espacio y otros recursos, generando, impactos negativos a las poblaciones de peces nativos (Juarez-Romero et al., 1989, Varela-Romero, 1995).
El bagre Yaqui, Ictalurus pricei (Figura 1), se distribuye desde la cuenca del río Yaqui y Mayo en Sonora, Chihuahua y el sur de Arizona, hasta el río Fuerte en Sinaloa. Habita en corrientes moderadas con sustrato lodoso, arenoso y rocoso. Los adultos ocupan aguas profundas durante el día, moviéndose hacia las corrientes y aguas quietas en la noche para alimentarse (Burgess, 1989). Debido a la similitud morfológica del bagre Yaqui con el de canal, se puede esperar una similitud en su ecología y conducta (Minckley, 1973). Los caracteres diagnósticos más empleados para separar al bagre Yaqui del resto de sus congéneres y principalmente del bagre de canal han sido el número de radios en la aleta pectoral, el número de branquiespínas (de 16 a 24), el grado de unión entre los huesos supraoccipital y supraneural (no hay unión), la longitud del hueso cleitra (menor en bagre Yaqui), la longitud de la base de la aleta anal (menor en esta especie) y el número de radios en la aleta anal que es de 23 a 25 (Minckley, 1973).
Figura 1. Fotografía del bagre Yaqui, Ictalurus pricei (foto A. Varela Romero).
El bagre Yaqui esta siendo impactado por la construcción de presas (Bojorquez et al., 1985) y por la competencia e hibridación con la especie no-nativa I. punctatus, (Miller et al., 2005), se ha registrado la reducción de su distribución y abundancia, encontrándose restringida a las cabeceras más remotas y de difícil acceso de las cuencas, además, ha sido extirpado de las cuencas de los ríos Sonora y Casas Grandes, por lo que se considera una especie en riesgo (Varela-Romero, 1995; Varela-Romero, 2007). Por su importancia comercial y deportiva, los bagres de canal I. punctatus y azul
7 I. furcatus, han sido introducidos en diferentes embalses de la región de Sonora, Sinaloa y Chihuahua (Varela-Romero, 1995; Varela-Romero, 2007).
Se han detectado individuos híbridos en recolectas provenientes de la región serrana de la distribución natural del bagre Yaqui, lo que representa una amenaza para su conservación y aprovechamiento de este bagre (Campoy-Favela et al., 1989; Hendrickson y Varela-Romero, 2002; Miller et al., 2005). Se ha encontrado evidencia de introgresión (propagación de genes de una especie en la reserva de genes de otra especie por hibridación y entrecruzamiento) entre el bagre Yaqui y de canal en la segunda generación de 184 individuos del bagre Yaqui mantenidos en cautiverio, evidenciados por marcadores bioquímicos como las isoenzimas y por características morfológicas como el número de radios de la aleta anal, número de vértebras y rasgos osteológicos (Donald et al., 1999).
El bagre de canal, I. punctatus, habita en la vertiente del Atlántico desde el sur de Canadá, centro de los Estados Unidos y en el río Bravo hasta el norte de Veracruz en la vertiente del Atlántico de México. Habitan en arroyos grandes, los adultos viven en agua profunda y los juveniles viven en aguas poco profundas, se desplazan y alimentan durante la noche o en días nublados, desovan generalmente en abril y los primeros días de junio, los huevos son colocados en agujeros para ser protegidos por el macho, su tamaño máximo es de 1.3 metros y su peso es de 13.6 kilos. Durante la reproducción los machos adquieren un color más oscuro que las hembras. Se alimentan principalmente de presas del fondo como peces, insectos, langosta de agua dulce, moluscos y algunas plantas (Burgess, 1989; Miller et al., 2005). Su dispersión y contacto con poblaciones de bagres nativos debido a su utilización por los piscicultores en todo el país, generando problemas de hibridación reportados recientemente por varios autores (Hendrickson, 1983; Hendrickson et al., 2002; Miller et al., 2005).
El bagre azul, I. furcatus, habita en la vertiente Atlántico desde el valle del río Mississippi del este de los Estados Unidos al sur y hacia el oeste en ríos de la cuenca del Golfo de México incluyendo la cuenca del Río Bravo y sus tributarios los ríos Conchos y Pecos. El desove es en primavera y su dieta se basa en peces, insectos acuáticos y
8 mejillones que se encuentran cerca del fondo, los adultos varían en tamaño de hasta de 1.5 metros y pesan de 36.3 a 68 kilos (Burgess, 1989; Miller et al., 2005). Debido a su alta demanda por su enorme tamaño y su deliciosa carne, esta especie ha sido introducida dentro del río Yaqui en Sonora (Hendrickson et al., 1981).
Hibridación y diversidad genética
La hibridación ocurre cuando dos especies distintas se reproducen entre si, y cuando las condiciones genéticas y ecológicas resultan favorables para que esto suceda. Con la hibridación puede suceder el enriquecimiento del acervo génico de una especie, donde el descendiente híbrido parcialmente fértil puede dar lugar a una población en la que sea posible el intercambio génico, y que cuando se presenta una producción de abundantes híbridos se pueden borrar los límites entre subespecies o especies que antes podían diferenciarse claramente (Dobzansky et al., 1977).
Existen básicamente dos mecanismos o barreras naturales de aislamiento reproductor para que no se de la hibridación y pérdida de la variabilidad genética. Las barreras prezigóticas que incluyen el aislamiento ecológico del hábitat, los tiempos diferenciales de madurez sexual, debilitación de la atracción sexual, diferencias morfológicas de los genitales; y las barreras postzigóticas (antes de su madurez sexual), que incluye esterilidad de los híbridos, gametos disfuncionales y la reducción de la viabilidad de los descendientes híbridos. La perturbación y modificación del hábitat por prácticas de manejo del agua y la introducción de especies emparentadas exóticas permiten el rompimiento de estas barreras reproductivas, por lo que las especies exóticas compiten por recursos con las especies nativas que ambas especies requieren. En estas condiciones una de las especies, ya sea exótica o nativa con variantes genotípicas y fenotípicas ventajosas tendrá mayor probabilidad de sobrevivir, reproducirse y de desplazar a la otra especie (Dobzansky et al., 1977).
La diversidad de especies ha sido el componente de la diversidad biológica que más atención ha recibido, por la importancia de la especie como unidad biológica y a la relativa facilidad con que puede medirse. Sin embargo, hay muchos aspectos de la
9 biodiversidad para los que se desconocen los mecanismos causales que demandan explicaciones del nivel genético y ecológico (Gaston, 2000). Los marcadores genéticos que se han empleado son los marcadores morfológicos, tipos sanguíneos, inversiones cromosómicas, aloenzimas y, a partir de los ochentas, los marcadores con base a las secuencias de nucleótidos (DNA). La genética de poblaciones determina que tanta diversidad genética existe en las poblaciones naturales y los cambios que ocurren a nivel genético dentro y entre poblaciones como la adaptación, la especiación y el origen, abordando las causas de la evolución teniendo una posición dentro de la biología evolutiva (Futuyma, 1998). Como unidad básica de análisis usan al gen y sus variantes (alelos) sobre los patrones de variación de genes en poblaciones y su asociación con factores del medio ambiente (Futuyma, 1998).
Los marcadores moleculares han permitido conocer las diferencias genéticas de la población, familias e individuos y el análisis de la introgresión e hibridación entre ellos (Gutierrez-Millán, 2003; Saccone et al., 1991; Sbisa et al., 1997; Sullivan et al., 2006; Varela-Romero, 2007). El desarrollo y dominio de las técnicas moleculares han fortalecido el estudio de la sistemática de peces, que complementan los estudios morfológicos. La información molecular ha sido muy útil para evaluar las relaciones filogenéticas y zoogeográficas entre las poblaciones de peces (Stepien et al., 1997).
Los marcadores con base en DNA evalúan la variación que ocurre a nivel de secuencias de nucleótidos, por esto se consideran más precisos que las aloenzimas. Otros marcadores que son muy utilizados son los polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLPs por sus siglas en ingles), DNA polimórfico amplificado al azar (RAPDs), polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs), la secuencias internas simples repetidas (ISSR) y los microsatélites (Schlotterer, 2004). Para la obtención de información extremadamente precisa y completa sobre la variación en regiones específicas del genoma de cualquier organismo se utiliza la técnica de secuenciación directa del DNA nuclear y genoma mitocondrial (mtDNA), que proporcionan información directa del genoma en estudio (Schlotterer, 2004).
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Características del genoma mitocondrial
El mtDNA es una molécula circular de doble hélice, excepto en algunas algas como Chlamydomonas (alga verde), protozoos como Paramecium (Alberts et al., 2002) y las clases Scyphozoa y Hydrozoa (Bridge et al., 1992) que contienen una molécula lineal. Este genoma es muy utilizado para análisis de la variabilidad genética y estudios de evolución y filogenia ya que tiene un alto poder resolutivo (diferente nivel de conservación de sus genes) y no presenta recombinación debido a que su herencia es uniparental (Rand, 2001), en la mayoría de los eucariotes excepto en la secoya roja de California, Sequoia sempervirens; plátano malayo, Musa acuminata y el mejillón mediterráneo, Mytilus galloprovincialis (Fauré et al., 1994; Ladoukakis et al., 2001; Neale et al., 1989). Debido a que el espermatozoide no aporta citoplasma a la célula huevo (Paniagua et al., 1999) y el óvulo aporta siempre al zigoto el citoplasma donde están contenidas las mitocondrias, por consiguiente cabe esperar que en los animales superiores la herencia sea uniparental impidiendo la recombinación, más exactamente materna (Stepien et al., 1997; Rokas et al., 2003).
El mtDNA en vertebrados presenta usualmente entre 103 a 104 copias por célula, su tamaño es de 16 a 18 kb y puede aislarse como una molécula circular (Shadel et al., 1993). En él se expresan 13 genes polipeptídicos de la cadena respiratoria, sus productos se encuentran localizados en la membrana mitocondrial y son esenciales para la producción del ATP. También presenta dos RNAs ribosomales (rRNA) y 22 RNAs de transferencia (tRNA) (Figura 2) (Shadel et al., 1993; Waldbieser et al., 2003; Wang et al., 2007). La composición del genoma mitocondrial de vertebrados es conservado dentro de un patrón general entre sus especies (Boore, 1999); sin embargo, las secuencias nucleotídicas y la organización de los elementos reguladores en la transcripción y replicación del genoma tienen una variación considerable (Shadel et al., 1997). El mtDNA se compone de una cadena pesada (H-strand), donde se encuentra la mayor parte de las secuencias que codifican para 12 polipéptidos, 14 tRNAs y dos rRNAs. En la cadena ligera (L-strand) sólo codifica para un polipéptido y ocho tRNAs. Una cadena se diferencia de la otra en función de su contenido en G+T (Shadel et al., 1997).
11 El mtDNA ha sido muy utilizado para evaluar la filogenia para gran variedad de especies por la elevada frecuencia de mutaciones que presenta, de 5 a 10 veces superior al DNA nuclear (Hoelzel et al., 1991). Esta dinámica mutacional está asociada al escape eventual de radicales libres asociados al daño oxidativo generado durante el transporte de electrones durante la respiración celular (Bielawski et al., 2002; Reyes et al., 1998) también debido en parte a la carencia de histonas y de mecanismos de reparación del DNA, estas mutaciones son una fuente rica de variabilidad de los genes del mtDNA (Garesse et al., 1997).
La variabilidad en la longitud del mtDNA, ahora reconocida como una característica común de esta molécula, ha sido observada en numerosas especies de peces (Billington et al., 1991). En cada caso, está variabilidad en la longitud se debe a la presencia de variación en el número de repeticiones en tanda (VNTRs por sus siglas en ingles) en la principal región no codificante (Faber et al., 1998). Otra fuente de variabilidad es el arreglo genético del mtDNA observado en el análisis del arreglo del mtDNA completo de 58 especies de cordados y 29 especies de no cordados (Boore, 1999). En los cordados y hemicordados, 44 especies comparten el arreglo genético idéntico en los 37 genes. Después de los cordados los artrópodos son el phyla más estudiado en el rearreglo de sus genes mitocondriales. El mtDNA de la mosca Drosophila fue el primero en ser determinado entre los invertebrados y su arreglo genético difiere del cangrejo herradura, Limulus polyphemus (Staton et al., 1997), en la translocación de un sólo tRNA. Esta translocación ocurre en el clado “insectos-crustaceos” y es un fuerte indicador de la cercana relación de estos dos grupos. Se ha visto que los cambio más comunes de los artrópodos son en los genes cercanos a la región control (Boore, 1999).
En los vertebrados el rearreglo de los genes de la rana toro (Rana catesbeiana), fue cyt- b - D-loop - tRNALeu- tRNAThr - tRNAPro - tRNAPhe – 12SrRNA, este arreglo genético difiere del arreglo de rana catana, Xenopus laevis y la rana de arrozal, Rana limnocharis. El arreglo de X. laevis es idéntico al del humano y el ratón (Roe et al., 1985). Además estos autores encontraron secuencias repetidas de 16 y 17 pb en la región control a una distancia de 0.6 a 1.2 kb de longitud entre ellas y mencionan que estas secuencias son las causantes de la variación de tamaño del mtDNA. En la región
12 control de estas ranas se encontraron elementos TAS, y los CSB1 y CSB2 que fueron muy conservados en R. catesbiana, X. laevis y humano. Las secuencias del segmento del 3’ de la región control fue el más variable excepto los tRNAs y el 12SrRNA que resultaron muy conservados (Sumida et al., 2000).
Figura 2. Mapa del genoma mitocondrial de vertebrados. Modificado de Waldbieser et al. (2003). rRNA genes ribosomales, CO citocromo oxidasa, ND subunidades de la NADH deshidrogenada, ATP subunidades de la ATP sintasa, cyt-b citocromo b, tRNAs genes de RNA de transferencia.
Región control o del asa de desplazamiento (D-loop)
Muchos de los estudios moleculares se han enfocado a la región control también conocida como D-loop y se llama así por que aquí se encuentra el origen de la replicación y transcripción de la molécula de DNA mitocondrial (Hoelzel et al., 1991). Por esto, esta región es rica en adenina y timina (A-T) y se encuentran todos los elementos de control conocidos de la replicación y transcripción (Wolstenholme, 1992). En vertebrados esta región ha sido bien caracterizada y puede dividirse en tres dominios, el izquierdo (L) con un alto porcentaje de G,
13 y el derecho (R) con un bajo porcentaje de G y alto porcentaje de A, además de secuencias repetidas en las terminaciones 5’ y 3’ que son relativamente divergentes o hipervariables en longitud (Saccone et al., 1987; Shadel et al., 1993). Sin embargo la región control también contiene bloques de secuencias conservadas llamadas CSB y secuencias TAS que están asociadas con el inicio y terminación de la síntesis de la cadena mitocondrial. Además la región control contiene un dominio central que en mamíferos es de 200 pb y es muy conservado (Saccone et al., 1991; Sbisa et al., 1997; Shadel et al., 1993). A pesar de que contiene marcos de lectura abiertos de 32 a 72 bases con codones de terminación AGG, no se conocen polipéptidos provenientes de su traducción. Además, tiene una abundancia de G del 20 % y un bajo contenido de A (Saccone et al., 1987). En vertebrados la región control contiene el origen de replicación del genoma mitocondrial. Por su hipervariabilidad y por sus secuencias conservadas esta región se ha tenido particular interés para su estudio por su importancia funcional y su papel en la evolución (Saccone et al., 1987).
Replicación del mtDNA
La replicación del mtDNA es asimétrica ya que cuenta con dos orígenes de replicación, uno para la cadena pesada (OH) y otro para la cadena ligera (OL) (Shadel et al., 1993). La replicación de la cadena H inicia en la región control desde el origen de replicación de la cadena pesada (OH) hacia el gen citocromo b (cyt-b) y comienza a desplazarse a lo largo del genoma circular. Durante este proceso, existe un periodo de tiempo en el que una porción de la cadena pesada (H) se encuentra en forma sencilla y no en forma de doble cadena como la cadena ligera (L). Cuando la horquilla de replicación alcanza el origen de replicación de la cadena ligera (OL), representada por una estructura en forma de tallo, la replicación de la cadena L complementaria se inicia en dirección opuesta a la cadena pesada, de regreso hacia el gen citocromo c oxidasa I (COI). Después de que la horquilla de replicación de la cadena H complementaria ha pasado por OL, la cadena H parental permanece aún en forma de cadena sencilla hasta que la horquilla de replicación de la cadena L complementaria la convierte en una hebra doble. El tiempo en el que la cadena H permanece como cadena sencilla queda expuesta a un ambiente oxidativo producido por los radicales libres generados durante el transporte de
14 electrones en el proceso de respiración celular (Frederico et al., 1990; Tanaka et al., 1994; Francino et al., 1997; Bielawsky et al., 2002; Reyes et al., 1998).
Replicación y transcripción del mtDNA de mamíferos
Los mecanismos de replicación y transcripción han sido caracterizados principalmente en mamíferos ya que no existe información para otros phyla. En mamíferos los elementos cis responsables para la regulación de estos dos procesos se localizan en la región control. Por otra parte todos los factores trans son codificados por el DNA nuclear, incluyendo la polimerasa mitocondrial (mtRNA pol.), la polimerasa gama (mtDNA pol γ) y todos los demás factores que regulan la transcripción y replicación (Garesse et al., 2001).
La replicación del mtDNA de mamíferos inicia con la construcción de un RNA cebador sintetizado por la mtRNA pol (Montoya, 2005; Shadel et al., 1993). Para que la polimerasa acceda al DNA molde e inicie la replicación del mtDNA, se requiere un cambio conformacional (desenrollado) del mtDNA inducido por el factor de transcripción (mtTFA). La topoisomerasa de tipo I relaja al DNA superenrrollado y la helicasa mitocondrial desenrolla la doble hebra rompiendo los puentes de hidrógeno para producir moldes de hebra única y las proteinas estabilizadoras de cadena sencilla (mtSSB por sus siglas en ingles) previenen la renaturalización y aceleran la síntesis de DNA. La síntesis de DNA la lleva a cabo la holoenzima DNA pol γ, que es un heterodimero que consta de dos subunidades la catalíticas, pol γ-α de 125 a 140 kda con actividades de polimerización 5’-3’ y una subunidad pequeña, pol γ-β de 35 a 55 kda con actividad exonucleotídica, además de promover el reconocimiento de los primers y aumento de la afinidad de la enzima por el DNA, así confiriéndole mayor procesividad a la subunidad catalítica 3’-5’ (Garesse et al., 2001; Montoya, 2005; Shadel et al., 1993).
La transcripción del mtDNA se inicia a partir de tres promotores diferentes uno para la cadena ligera (L) y dos para la cadena pesada (H1 y H2) localizados en su dominio derecho (Garesse et al., 2001; Shadel et al., 1993; Shadel et al., 1997). De forma
15 general, la cadena ligera se transcribe como un sólo mRNA policistrónico con ocho tRNAs, además de un oligonucleótido de RNA que es utilizado tanto en la transcripción como en la replicación del genoma mitocondrial (Sbisa et al., 1990). En la cadena H se originan dos mRNA policistrónicos. El primer policistrón inicia en el punto de transcripción H1, en el extremo 3’ del gen 16SrRNA y es responsable de la síntesis de los genes 12S y 16SrRNAs, del tRNAPhe y del tRNAVal. El segundo policistron, es menos frecuente y comienza en el punto de iniciación H2, cerca del extremo 5’ del gen 12SrRNA, se extiende al extremo 3’ del gen 16SrRNA, produciendo un RNA que corresponde a casi la totalidad de la cadena pesada que codifica los mRNAs de los 12 péptidos y 14 tRNAs. El mecanismo por el cual se originan los dos RNAs policistrónicos no está claro y se hipotetiza la existencia de una señal de finalización especifica del gen 16SrRNA, donde estaría implicado un factor de terminación (mTERF), o también que los genes que codifican para los tRNAs se intercalan entre los genes que codifican para proteínas y rRNAs actuando como señales de corte (Montoya, 2005; Sbisa et al., 1997).
El proceso de transcripción lo lleva a cabo una RNA polimerasa específica y dos factores de transcripción (mtTFA y mtTFB). El análisis estructural de los rRNAs se caracterizan por estar metilados, aunque su grado de metilación es más bajo que el de los rRNAs citoplásmicos y por estar oligoadenilados en su extremo 3’ con 1 a 10 adeninas no codificadas en el DNA. Los tRNAs son también más pequeños que los citoplasmáticos, carecen de nucleótidos constantes y se estabilizan con menos interacciones terciarias. Los mRNAs contienen una cola de unas 55 adenosinas en el extremo 3’ e inician por el codón de iniciación AUG, AUA o AUU careciendo de la presencia de un tramo no codificante y capucha en el extremo 5’(Garesse et al., 2001; Montoya, 2005; Shadel et al., 1993; Shadel et al., 1997).
Genes mitocondriales más utilizados en filogenética de peces
Los genes mitocondriales con distintos niveles de conservación han sido utilizados para estudiar las relaciones filogenéticas entre especies de peces y así también para los bagres de Norteamérica (Hardman et al., 2003; Hardman, 2002). Los genes
16 mitocondriales más utilizados son algunos genes codificantes para proteínas como el citocromo b (cyt-b) que permiten reconocer variaciones a nivel de especies, y genes conservados como los del RNA ribosomal 12SrRNA y 16SrRNA que ofrecen información a niveles taxonómicos superiores (Stepien et al., 1997; Varela-Romero, 2007). Los distintos niveles de conservación de estos genes han permitido caracterizar patrones de variación desde niveles específicos hasta el de familia, así como construir inferencias filogenéticas a estos niveles de organización taxonómica (Hardman et al., 2003; Hardman, 2002; Hardman, 2005).
La región control del genoma mitocondrial incluye los más altos niveles de variación en sus secuencias y en su longitud (Avise, 2000; Ferris et al., 1987; Meyer, 1993). En la región control del mtDNA de las células L y células KB en humano y ratón se identificaron 3 CSB y encontraron que la región control está limitada corriente arriba por el tRNAPhe, que es codificado por la cadena pesada, y corriente abajo por el tRNAPro, que es codificado por la cadena ligera, esta estructura del mtDNA es muy conservada en humanos y ratas (Walberg et al., 1981).
El CSB1 se ubica corriente arriba en el 5’ de la cadena pesada, esta posición sugiere que quizás este bloque está implicado en la terminación y síntesis de la cadena pesada durante la replicación. El CSB2 de un tamaño de 16-19 nucleótidos con 75 % de citosina (C) se ubica corriente abajo del final 5’. La posición de esta región y el contenido ribonucleótido sugiere que quizás es el producto primario del inicio de la replicación de la cadena pesada. El CSB3 tiene un tamaño de 18 nucleótidos y se localiza corriente arriba de la cadena 5’ y por su posición quizás también juega algún rol en el inicio de la cadena pesada. También se encontraron secuencias TAS en el 3’ de la cadena pesada que representan secuencias repetidas asociadas con la terminación de la síntesis de la cadena pesada (Walberg et al., 1981).
Sbiza y colaboradores (1997) realizaron un análisis comparativo de la región control completa de 26 especies de diez diferentes órdenes de mamíferos. Este análisis comparativo permitió identificar nuevos bloques de secuencias conservadas presentes en todas las especies. Se encontraron 2 bloques de 60 pb de secuencias conservadas
17 asociadas a la terminación de la síntesis de la cadena pesada TAS1 y TAS2 en todos los organismos estudiados. El análisis de los CSB y TASs indican que el CSB1 es el único bloque esencial y común en el mtDNA de todos los mamíferos con diferente grado de similitud. Los CSB2 y CSB3 son más conservados pero no están presentes en todas las especies y podrían estar relacionados en funciones específicas de cada especie, estando así ligados al proceso coevolutívo “núcleo-mitocondria” pudiéndose así explicar las diferencias en la conservación de estos elementos a lo largo de la evolución. Las distancias entre los CSBs son muy variables, así la distancia entre el CSB1 y el CSB2 es de 20 a 270 pb, y entre el CSB2 y CSB3 de 5 a 57 pb, la distancia entre el CSB3 y el final del 5’ es muy variable entre 60 a 342 pb. El dominio central es muy conservado, tiene un tamaño de 304 a 328 pb, de los cuales 50 sitios de las secuencias son invariables en todas las especies (Sbisa et al., 1997). Este alto grado de similitud hace a este dominio apropiado para propósitos filogenéticos (Saccone et al., 1991).
Waldbieser et al. (2003) secuenciaron el genoma mitocondrial completo del bagre de canal resultando con un tamaño de 16,497pb. La región control representó el 5.3% de la totalidad del genoma con 885 pb. El alineamiento de la región control de varias especies de peces óseos como: carpa (Cyprinus Carpio), pez dorado (Carassius auratus), salmón (Salmo salar), trucha (Oncorhynchus mykiss), pez cebra (Danio rerio), botete (Takifugu rubripes) y anguila japonesa (Anguilla japonica) mostraron secuencias conservadas muy similares entre ellas. La estructura de la región control consta de tres CSBs. El CSB 1 se encontró entre las bases 630 a 691, el CSB 2 entre las bases 740 a 763 y el CSB 3 entre las bases 786 a 808. Se encontraron además secuencias también conservadas entre estos peces y muy similares a las secuencias asociadas a la síntesis de la cadena pesada de los mamíferos entre las bases 45 a 92 y en las secuencias de la región central de la región control entre las bases 322 a 555 (Sbisa et al., 1997; Doda et al., 1981).
La filogenia
La diversidad de la vida es extraordinaria. Se han descrito aproximadamente 1,500,000 especies de animales, no obstante a pesar de esa prodigiosa diversidad, todos los
18 organismos están formados por el oxígeno, hidrógeno y carbono; proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos; los procesos de transcripción y traducción, así como el código genético. Estas y otras similitudes han sido utilizadas para clasificar o caracterizar a los grupos de organismos y distinguirlos de otros para agruparlos de forma jerárquica de acuerdo a su origen. La información genética ha sido utilizada como la base primaria de unidades evolutivas para especies amenazadas, siendo este uno de los retos que enfrenta la biología de la conservación. (Dobzansky et al., 1977). La filogenia es la forma más simple de mostrar la clasificación de los organismos de una forma conveniente para conocer la historia evolutiva de un grupo o linaje (Dobzansky et al., 1977). A pesar del progreso en el conocimiento de la filogenia de los bagres, sus relaciones a nivel de familias, géneros y de especie, no es suficientemente claro. Para conocer las relaciones filogenéticas entre las familias de bagres se han utilizado datos morfológicos y moleculares (Hardman, 2005; Lundberg, 2003; Lundberg, 1992; Sullivan et al., 2006).
El mtDNA ha sido utilizado para resolver un gran número de problemas filogenéticos por ser casi exclusivamente uniparental y materno sin recombinación (Pesole et al., 1991). Utilizando secuencias del genoma mitocondrial completo, Zuogang et al., (2006) construyeron la filogenia del orden Otophysi (Cipriniformes, Caraciformes, Siluriformes y Gymnotiformes). Los árboles resultantes mostraron a los Caraciformes y Gymnotiformes como clados hermanos de los Siluriformes. La filogenia basada en el análisis del gen mitocondrial Citocromo b (cyt-b) y los genes nucleares rag1 y rag 2 identifican dentro de los Siluriformes a los Cranoglánidos del Noreste Asiático como el taxón hermano de los Ictalúridos (Hardman, 2005). Además Hardman (2005) complementó sus datos moleculares con datos biogeográficos, paleontológicos y geológicos, y sugiere que un ancestro de los Ictaluridos y Cranoglánidos encontró una ruta al Noroeste de Norteamérica proveniente del Noroeste Asiático en el Cretáceo tardío (98 a 66 millones de años).
19
La filogenia del género Ictalurus
Durante los pasados 20 años las relaciones filogenéticas de la familia Ictaluridae han sido estudiadas empleando datos comparativos morfológicos y paleontológicos (Lundberg, 1970; Taylor, 1969). Se encontró que la familia Ictaluridae contiene cerca de 60 especies vivientes y al menos cuatro extintas, además es un taxón monofilético (grupo que comparte el mismo antepasado común). El género Astephus comparte sinapomorfias (posesión en común de un carácter) con el género Ictalurus y es considerado como su taxón plesiomórfico (caracteres ancestrales similares). La información reciente publicada sobre la evolución de la familia indica una mayor complejidad que las relaciones sustentadas por la información anatómica. Para el conocimiento más completo sobre la familia, es necesario construir la filogenia del grupo considerando información molecular, morfológica, biogeográfica y paleontológica (Lundberg, 1992). Son escasos los estudios filogenéticos del género Ictalurus, la única propuesta disponible es la de Lundberg (1992) que propone un árbol filogenético que fue construido utilizando rasgos morfológicos (características merísticas y morfométricas), en el que se definen dos grupos principales, el clado punctatus con las especies I. punctatus, I. lupus, I. dugesii, I. mexicanus e I. pricei y el clado furcatus formado por las especies I. furcatus e I. balsanus (Figura 3).
Figura 3: Relaciones filogenéticas de los bagres del género Ictalurus, modificado de Lundberg (1992).
20 Debido a que la información del género Ictalurus, sobre todo las especies mexicanas, es muy escasa, Varela-Romero (2007) estudió las relaciones filogenéticas de un grupo de bagres nativos del clado punctatus en el Noroeste de México, con el propósito de esclarecer la insuficiente información genética disponible. Por medio del análisis de las secuencias de los genes mitocondriales 12SrRNA y cyt-b, estimo las relaciones filogenéticas de 40 individuos de bagres nativos del genero Ictalurus de localidades de México (de las cuencas de los ríos Yaqui, Fuerte, Culiacán, San Lorenzo, San Pedro Mezquital, Conchos y Tuxpan). También observó una gran variación individual para el cyt-b encontrando seis haplotipos en 15 individuos del río Yaqui, cuatro haplotipos en 10 individuos del río Fuerte; dos haplotipos en dos especímenes de I. australis, dos haplotipos de 3 secuencias analizadas en los ríos Tamazula y Rodeo; 1 haplotipo de 3 especímenes del río San Lorenzo; y finalmente un haplotipo de dos especímenes de la cuenca del Conchos. Los resultados de la inferencia filogenética basada en los métodos de distancias genéticas, máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana, fueron la alta variación intraespecífica entre los individuos del género Ictalurus. La inferencia filogenética derivada del cyt-b agrupa al clado pricei de las cuencas de los ríos Yaqui y Fuerte, con el clado hermano de los bagres nativos de los ríos Sinaloa, Culiacán y San Lorenzo, y sugiere que estos son clados hermanos de Ictalurus lupus y del bagre del río Conchos del noreste de México (Figura 4), reconociendo al complejo pricei como un taxón nuevo de bagres nativos de los ríos de Sinaloa y que es muy similar al bagre Yaqui, pero con diferentes características diagnósticas a nivel morfológico y moleculares (Varela-Romero, 2007).
Por lo anterior, en la filogenia ha sido común la utilización de los genes de las subunidades proteicas preferentemente cyt-b para niveles categóricos inferiores y los genes ribosomales han sido usados en niveles categóricos superiores (Gilles et al., 2001; Hardman, 2005; Hardman et al., 2003; Varela-Romero et al., 2007; Waldbieser et al., 2003). La región control ha sido muy utilizada para resolver problemas filogenéticos diferenciando genéticamente a grupos estrechamente relacionados, especialmente por debajo del nivel de especie debido a que es la región más divergente del genoma mitocondrial (Sbisa et al., 1990). Estas características sugieren a la región control como un potencial candidato para el análisis de las relaciones filogenéticas entre especies e
21 individuos. Existen estudios que indican que los árboles filogenéticos realizados con la región control y combinaciones con los genes 16SrRNA y el cyt-b en 35 Cyprínidos y en ratones del género Apodemos, fueron más robustos y precisos comparándolos con otros árboles realizados con otros genes del mtDNA (Bellinvia, 2004; Gilles et al., 2001).
Figura 4. Relaciones filogenéticas del género Ictalurus por medio del gen cyt-b del mtDNA de acuerdo a los métodos de máxima parsimonia y máxima verosimilitud (Varela-Romero, 2007).
22 Hipótesis
Las características de la estructura de la región control de los bagres nativos del Noroeste de México identifican sus relaciones específicas y filogenéticas.
Objetivo general
Caracterizar y evaluar las relaciones filogenéticas utilizando la región control de los bagres Ictalurus pricei, I. cf. pricei (Batopilas), I. cf. pricei (Tutuaca) e I. furcatus.
Objetivos específicos
1.-Extraer el DNA total para la amplificación de la región control por PCR y determinar la secuencia nucleotídica por secuenciación para las especies de interés.
2.-Determinar la estructura y las diferencias a nivel nucleótido de la región control para las especies de interés.
3.-Evaluar las relaciones filogenéticas entre las especies analizadas del género Ictalurus por los métodos de máxima parsimonia y máxima verosimilitud.
23 Materiales y métodos
Muestreos de campo e identificación de las especies
Los ejemplares fueron recolectados dentro del estudio de la variabilidad genética de los bagres nativos del Noroeste de México (Varela Romero, 2007) y se utilizaron las recolectas de bagres de los ríos Sirupa y Tutuaca, y de la Presa El Novillo de la cuenca del río Yaqui en Sonora y Chihuahua, además de bagres del río Batopilas de la cuenca del río Fuerte en Chihuahua. La descripción de las localidades se incluye en la Tabla II. Se utilizaron los especimenes I. pricei 43 e I. pricei 45, y solo un espécimen de cada una de las demás especies para la caracterización de la región control del genoma mitocondrial y la filogenia. De estos especimenes se obtuvo una muestra de 5 g de la porción interior de la aleta pélvica derecha que se fijó con etanol al 95 % y etiquetó para depositarse en el laboratorio de Biología Molecular de Organismos Acuáticos del CIAD (LBMOA). Los ejemplares de referencia fueron fijados con formol al 10 % y transferidos a alcohol etílico al 70 % para su conservación y fueron depositados en la Colección Ictiológica del Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora (DICTUS).
Extracción y análisis del DNA
Para la extracción del DNA se utilizó el método propuesto por Peregrino-Uriarte et al. (2006). Cada extracción se inició con 100 a 150 mg de tejido de la aleta pélvica derecha homogenizada con un homogenizador Kontes utilizando 500 µl de buffer de homogenización (NaCl 0.4 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA, 2 mM, pH 8.0) previa incubación por 15 min a 55 °C. Posteriormente se añadieron 3 µl de RNAsa A (10 mg/ml) y se incubó durante una hora a 37 °C, para después agregar 10 µl de Proteinasa K (20 mg/ml) junto con 50 µl de SDS al 20% para incubar una hora a 60°C. Pasado el tiempo de incubación, se centrifugó la muestra a 10,000 x g por 10 min a 4°C. Se descartó el precipitado y al sobrenadante se le agregaron 300 µl de NaCl 6 M y 88 µl de CTAB (bromuro de hexadecil trimetil amonio) al 10 % lo cual resultó en una
24 concentración final de 1 % y fue incubada por 1 h a 55 °C. Después se añadió 1 volumen (aproximadamente 850 µl) de cloroformo:alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló manualmente. Esta solución fue centrifugada a 14,000 x g durante 5 min. Posteriormente se repitió la extracción con cloroformo:alcohol isoamílico para volver a centrifugar bajo las condiciones ya descritas. Se tomó después la fase acuosa, se añadió 1 volumen igual de isopropanol para precipitar el DNA y se incubó durante toda la noche a -20 °C y posteriormente se centrifugó a 10,000 x g por 40 min a 4 °C. El DNA precipitado (pellet) fue lavado dos veces con 300 µl de etanol al 70 % frío y se centifugó a 10,000 x g por 10 minutos a 4 °C. Finalmente el pellet fue secado por centrifugación en una secadora de vacío (Speed-Vac, Savant, Modelo DNA 110) por tiempos de 10 a 30 min y se resuspendió en 50 a 100 µl de buffer TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) para su utilización en la reacción en cadena de la polimeraza (PCR) (Sambrook et al., 1989).
Tabla II. Lista de localidades de recolecta de los bágres nativos y exóticos utilizados en este estudio. Las localidades fueron tomadas de Varela-Romero (2007)
Localidad 2. Mexico: Chihuahua, Cuenca del Yaqui, Río Sirupa en Rancho Huápoca, 29º08.616´N, 108º18.266´W; 1,380 m, 05-IV-1990. Recolectores: Personal del USFWS/AZDGF personnel. Especie recolectada: Ictalurus pricei.
Localidad 9. Mexico: Sonora, Cuenca del Yaqui, Presa El Novillo en Tepupa, 29º9.143´N, 109º41.781´W; 330 m, 14-V-2004. Recolectores: A. Varela-Romero, J.G. Soñanis-Organis, I. Anduro-Corona. Especie recolecteda: Ictalurus furcatus.
Localidad 10. Mexico: Chihuahua, Cuenca del Yaqui, Río Tutuaca en Rancho El Nogal, 28º34.196´N, 108º22.337´W; 1,622 m, 4-I-2005. Recolectores: J. Brooks, N. Smith, M. Kirkeminde, T. Bale, W. Brandenburg, C. Tole. Especie recolectada: Ictalurus cf. pricei.
Localidad 23. México: Chihuahua, Cuenca del Fuerte, Río Batopilas 15 km al Este del poblado de Batopilas, 27º05.923´N, 107º40.773´W; 658 m, 20-II-2005. Recolectores: J. Brooks, A. Varela-Romero, N. Smith, R. Rosas-Valdez. Especies recolectadas: Ictalurus cf. pricei.
25 Se determinó la calidad y pureza del templado por espectrofotometría de luz ultravioleta utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 a una absorbancia de de 260 y 280 nm de longitude de onda. La calidad del templado se analizó en geles de agarosa al 1 % en 30 µl de Syber-safe concentrado (10,000 X en DMSO) en 400 µl de TAE 1X (solución concentrada 50X: 242g Tris-Base, 57.1 ml ácido acético glacial, 100 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0 en un litro). El gel se colocó en una cámara de electroforesis horizontal sub-Cell GT (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). A las muestras de DNA se les agregó buffer carga 6X (0.25% azul de bromofenol, 0.25% xileno cianol FF, 30% glicerol en agua) en una relación 5:1. La electroforesis del gel se corrió a 60 v y una vez concluida, el gel se fotografió con un sistema digital Kodak GL 200 Imaging System (Rochester NY, EUA).
Diseño de oligonucleótidos
Se diseñaron dos oligonucleótidos a partir de los genes mitocondriales cyt-b con número de acceso en el GenBank EF590206 y para el gen 12SrRNA con número de acceso EF590202 de acuerdo a Varela-Romero (2007). El oligonucleótido forward H15149 que corresponde a la posición 401 bases en el cyt-b con su pareja reverse B12Sri que corresponde a la posición 432 bases en el 12srRNA. Los oligonucleótidos internos de la región control se diseñaron en base a las secuencias reportadas del mtDNA del bagre de canal por (Waldbieser et al., 2003) y se utilizaron para secuenciar la totalidad de la región (Figura 5).
Figura 5. Localización de los oligonucleótidos utilizados en este estudio.
En el diseño de estos oligonucleótidos se tuvo especial cuidado en evitar características indeseables como la formación de estructuras secundarias y primers-dimers disponible en http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html. En la tabla III se muestran las secuencias de los iniciadores utilizados.
26 Tabla III. Características de los oligonucleótidos diseñados para la amplificación por PCR de la región control. H15149 y B12Sri tomados de Varela-Romero (2007)
Oligonucleótidos Tm °C % GC Secuencias FwIprDl 59.9 47.62 GCCCTCTCTCCCAACTATTAT RvIprDl 61.3 47.62 GCAATCAGGCACACTTTCTAC fiprDl 64.8 47.62 TCCTGACATCGCTTATTGGTG riprDl 64.8 47.62 CACCAATAAGCGATGTCAGGA H15149 61.4 40.91 GAGGACAAATRTCATTCTGAGG B12Sri 57.7 50.00 GCTAAGCATAGTGGGGTATC
Amplificación por PCR y PCR gradiente
El DNA total fue utilizado como templado (100 ng) para la amplificación de la región control mediante PCR. Las concentraciones finales de los componentes de cada reacción fueron de 45 µl de la enzima Platinum PCR supermix que contiene (22 U/ml de la enzima Platinum PCR supermix Recombinant Taq DNA polimerasa con un anticuerpo, 22mM Tris-HCl, pH 8.4, 55 mM KCl, 1.65 mM MgCl, 220 µM, dGTP, 220 µM dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 20 µM de cada uno de los primers. Las amplificaciones del DNA fueron realizadas en un termociclador PTC-200 DNA Engine (MJ Research, Inc., Waltham, MA) con las temperaturas y tiempos de amplificación que se muestran a continuación: 94 °C de desnaturalización por 1 min, 55 °C de alineación por 1 min, 72 °C de extensión por 3 min (32 ciclos) y finalmente, una extensión de 72 °C por 10 min. El DNA amplificado fue posteriormente analizado en geles de agarosa al 1 % en TAE.
Se realizó un PCR gradiente con las mismas condiciones del PCR anterior, a diferentes temperaturas, para buscar la temperatura de alineación que permitiera obtener un amplicon con mayor pureza. Las temperaturas del gradiente fueron las siguientes: 55.0 °C, 57.8 °C, 61.0 °C, 63.5 °C, 65.0 °C, con los tiempos de amplificación como anteriormente se describe variando las temperatura de alineación de acuerdo a las
27 temperaturas del gradiente explicado. El DNA amplificado se analizó como anteriormente se describe.
Purificación y Secuenciación
La purificación de DNA para su secuenciación fue realizada usando una columna MicroSpin con matriz de fibra de vidrio (GFX PCR DNA and gel band purification, Amersham Biosciences) de acuerdo a las siguientes especificaciones: a la columna GFX se le adicionaron 500 µl de buffer de captura (acetato y chaotrope) y posteriormente se adicionó la muestra de DNA (máximo 100 µl/filtro) para la captura del DNA. Se mezcló con la pipeta y posteriormente se centrifugó a 10,000 x g por 1 minuto para pasar la solución a través de la matriz de fibra de vidrio de la columna. La columna se pasó a un tubo de colecta limpio para ser lavada 1 vez con 500 µl de buffer de lavado (Tris-EDTA 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA y etanol absoluto al 80 %) y centrifugado a 10,000 x g por 1 minuto, nuevamente la columna se pasó a un microtubo de 1.5 ml y se le agregaron 100 µl de agua calidad Milli-Q estéril directamente a la matriz de fibra de vidrio para eluir el DNA. Se incubó a temperatura ambiente por 1 minuto y se centrifugó a 10,000 x g por 2 minutos. Se repitieron una vez más los pasos de retención del DNA reutilizando el buffer de captura y se volvió a eluir para recuperar la totalidad del DNA de la muestra. La solución fue secada al vacío en el Speed-Vac hasta concentrarlo a 50 µl y se midió su concentración en el Nanodrop. El DNA purificado se secuenció con el método de terminación de cadenas con dideóxidos en un secuenciador automático en el Laboratorio of Genomic analysis and Technology. University of Arizona, Tucson, Arizona.
Análisis de las secuencias y filogenia
Las secuencias nucleotídicas de la región control fueron editadas y alineadas formando un conjunto (contig) con los programas EditSeq y MegAlign (DNASTAR, Madison, WI) y el programa BIOEDIT versión 7.0.9 disponible en http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html. Las secuencias obtenidas de la región control de las especies de interés fueron alineadas con otras secuencias disponibles en el
28 GenBank (por los números de acceso del GenBank) utilizando el programa ClustalW disponible en (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html).
Para la construcción de los árboles filogenéticos se utilizó el programa PAUP version 4.0b10 (Swoford, 2002). Se utilizaron los criterios de distancias genéticas, máxima parsimonia y máxima probabilidad. Se utilizó al bagre Cranoglanis bouderius como grupo externo. En el criterio de distancias se utilizaron las distancias genéticas para construir un árbol del vecino más cercano (neighbor joining) de acuerdo a los criterios estándar del programa. Para máxima parsimonia se realizó una búsqueda heurística para evaluar todas las topologías posibles de los árboles y se escogió el árbol con el menor número de cambios por medio del consenso estricto. Se utilizó el método de Jackknife con búsqueda heurística para la formación de los clados. Para la inferencia por máxima verosimilitud se calculó la probabilidad en base al modelo de evolución de las secuencias produciendo el árbol más probable utilizando el criterio de información Akaike AIC (Posada et al., 2004) en la versión modificada ModelTest (Posada et al., 1998) que nos guió para determinar el modelo óptimo sobre la substitución nucleotídica en el análisis de ML. El modelo resultante se incluyó en los comandos del archivo PAUP y con el se construyó el árbol más probable realizando un consenso estricto. En los tres criterios, los árboles fueron construidos utilizando 1000 réplicas aleatorias mediante la modalidad de bootstraping para seleccionar el árbol de cada uno de los criterios utilizados.
29 Resultados
Análisis del DNA total y las secuencias de la región control
Se obtuvo DNA no degradado en calidad y cantidad suficiente para lograr amplificar la región control completa de manera consistente de las especies Ictalurus pricei (2 individuos), un individuo de I. cf. pricei (Batopilas), un individuo de I. cf. pricei (Tutuaca) y un individuo de I. furcatus. Los productos de PCR obtenidos fueron únicos y no presentaron bandas adicionales inespecíficas (Figura 6). El tamaño del amplicon fue de aproximadamente de 2140 pb.
Figura 6. (A) Amplicones de la región control de I. pricei 43 (carril 2), I. pricei 45 (carril 3), 12SrRNA control positivo (carril 4) (B) 12SrRNA control positivo (carril 2), amplicones de I. furcatus (caril 3), I. lupus (carril 4), I. cf. pricei (Tutuaca) (carril 5), (C) amplicones de I. balsanus (carril 2), I. sp. (Rodeo) (carril 3), I. cf. pricei (Batopilas) (carril 4). En los carriles 1 de los tres geles se presenta el estándar 1 Kb Ladder Plus.
Secuenciación y composición de bases nucleotídicas de la región control
Se observó variación interespecífica en la longitud y composición de bases de la región control para los Ictalurus y sus taxas hermanos Cranoglanis y Pangasionodon. Las bases nucleotídicas más abundantes fueron adenina y timina que mostraron un promedio
30 del 63%, en comparación al par de bases guanina y citosina (36.5%) y la base menos abundante fue la guanina con un promedio del 13.45% (Tabla IV).
Tabla IV. Composición de nucleótidos en la región control de algunas especies del género Ictalurus y su comparación con otros Siluriformes seleccionados. Longitud % % % % % % Especies (pb) GC AT A T C G I. pricei 43 888 35.96 64.04 32.58 31.46 23.03 12.92 I. pricei 45 888 36.28 63.27 32.14 31.13 23.07 13.21 I. cf.(Batopilas) 889 35.97 63.33 32.69 31.33 22.62 13.35 I. cf. (Tutuaca) 888 36.49 63.51 32.55 30.97 23.54 12.95 I. punctatus 885 36.72 63.20 31.86 31.41 23.28 13.45 I. furcatus 886 37.58 62.19 31.72 30.47 23.70 13.88 C. bouderius 878 36.67 63.33 32.57 30.75 23.01 13.67 P. gigas 899 36.37 63.63 32.70 30.92 22.25 14.13
Al realizar el alineamiento y producir el contig utilizando como guía la secuencia del bagre de canal Ictalurus punctatus reportado en el GenBank (NC_003489), se obtuvo la secuencia completa de la región no codificante “región control”, además de 3 RNA de transferencia (tRNAPhe,tRNAPro y tRNAThr). Las secuencias completas de la región control obtenidas para las 4 especies, I. pricei, I. cf. pricei (Tutuaca), I. cf. pricei (Batopilas) e I. furcatus se muestran en el alineamiento de la figura 7 en donde se utilizo el programa ClustalW disponible en http://www.igs.cnrsmrs.fr/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi?stage1=1&daction=TCOFFEE: :Regular y el programa BoxShade disponible en http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html. La longitud de cada secuencia nucleotídica fue de 888 bases para I. pricei 43, I. pricei 45 y I. cf. pricei (Tutuaca); 889 para I. cf. pricei (Batopilas), y 886 para I. furcatus.
Estructura de la Región Control
La región control en los Ictalurus secuenciados en este trabajo mostró una estructura de tres regiones o dominios, izquierdo, central y derecho. El dominio izquierdo no varió
31 mucho en longitud en I. pricei, I. cf. pricei (Tutuaca), I. cf. pricei (Batopilas), I. punctatus e I. furcatus resultó ser de 311 pb. I. cf. pricei (Batopilas) difiere de los demás Ictalurus con una longitud de 312 pb. En la composición de nucleótidos este dominio mostró un porcentaje de adenina de 38.46 %, timina de 34.12 %, citosina de 19.81 % y el porcentaje más bajo fue para guanina de 7.60 % (Tabla V).
I. pricei 43 1 TATAACCAATATTCCCCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAACTCAACATCATGGTTTAAGT I. pricei 45 1 TATAACCAATATTCCCCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAACTCAACATCATGGTTTAAGT I. cf. (Batopilas) 1 TATAACCAATATTTACCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAACTCAACATCATGGTTTAAGT I. cf. (Tutuaca) 1 TATAACCAATATTCCCCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAACTCAACATCATGGTTTAAGT I. punctatus 1 TATAACCAACATTCCCCGACACATGCAATTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAACTCAACATCATGGTTTAAGT I. furcatus 1 TA-AACCAATATTTCCCGACATGCACAACCTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAACTTAACATCATGGTTTAAGT
I. pricei 43 81 ACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATCATTATATGGTATATCCCCATAGTACCTATATTAAACATTTTTGT I. pricei 45 81 ACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATCATTATATGGTATATCCCCATAGTACCTATATTAAACATTTTTGT I. cf. (Batopilas) 81 ACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATAATTACATGGTATATCCCCATAACACCTATATTAAACATTTTTGT I. cf. (Tutuaca) 81 ACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATCATTATATGGTATATCCCCATAGTACCTATATTAAACATTTTTGT I. punctatus 81 ACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAATTCATTACATGGTATATCAACATACAACCTACATTAAACATTTTTGT I. furcatus 80 ACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAATCCATTACATGATATATCAACATATACCCTACATGAAACATTTTTGT
I. pricei 43 161 TTAAAACATTAAAATAAGCCGTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGC----GCAT I. pricei 45 161 TTAAAACATTAAAATAAGCCGTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCAACTGCAT I. cf. (Batopilas) 161 TTAAAACATTAAAATAAGCCGTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCGATTGCAT I. cf. (Tutuaca) 161 TTAAAACATTAAAATAAGCCGTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCAACTGCAT I. punctatus 161 TTACAATATCAAAATAAGCCGTACATAAACCATATTAATTCAAACTCATAAATAATATATCTTAAAATGGGCTATTGCAT I. furcatus 160 CTACAACATTATAAGAAACCGTACATAAACCATATTAATTCAAACTCATAAATAAAATATCTTAAAATGAGTAACTTCAT
I. pricei 43 237 AATTCCTAATA-CCTCCATATAACCATTTTCTATGCATTACCCAACTAATATT-GCTAACCAACATCCTATGTAGTAAGA I. pricei 45 241 AATTCCTAATA-CCTCCATATAACCATTTTCTATGCATTACCCAACTAATATT-GCTAACCAACATCCTATGTAGTAAGA I. cf. (Batopilas) 241 AATTCCTAATA-CCCCCATAAAACCATTTTCTATGCGTTACCCAACTAATATTCGCTAACCAATATCCTATGTAGTAAGA I. cf. (Tutuaca) 241 AATTCCTAATA-CCTCCATATAACCATTTTCTATGCATTACCCAACTAATATT-GCTAACCAACATCCTATGTAGTAAGA I. punctatus 241 AATTCCTAATA-CCTTCATAAAACCATTTTCTATGCTCTTCCCAACTATTATC-GCTAATCAACATTCGATGCAGTAAGA I. furcatus 240 GACTCCCAATAACCTCCATACAACCATTTTCTATGCGTTCCCCAACTATAATT-GCTAAACAACATTCTATGTAGTAAGA ♦♦♦♦♦♦♦ DC
I. pricei 43 315 GACCACCATCCCCGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGAACGATCAGGGACAAAATTTGTGGGGGTGACACAACTTGCA I. pricei 45 319 GACCACCATCCCCGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGAACGATCAGGGACAAAATTTGTGGGGGTCACACAACTTGCA I. cf. (Batopilas) 320 GACCACCATCCCTGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGAACGATCAGGGACAAAATTTGTGGGGGTTACACAACTTGCA I. cf. (Tutuaca) 319 GACCACCATCCCCGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGAACGATCAGGGACAAAATTTGTGGGGGTCACACAACTTGCA I. punctatus 319 GACCACCATCCTTGTATACCTTAAGATACACGGTCCTTGAACGATCAGGGACAAAACTTGTGAGGGTCACACAACTTGCA I. furcatus 319 GACCACCATCCCTGTATACCTTAAGATACACAGTCCTTGAACGATCAGGGACAAAACTTGTGGGGGTCACACAACTCACA ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦ ♦♦♦♦ DC DC DC
I. pricei 43 395 CTATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCATACATTTATAATTCCTCATAATATGAACTTTCCTGACATC----AT I. pricei 45 399 CTATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCATACATCTATAATCCTTCATAATATGAACTTTCCTGACATCGGTTAT I. cf. (Batopilas) 400 CTATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCATACATCTATAATCCCTCATAATATGAAATTTCCTGACATCGGTTAT I. cf. (Tutuaca) 399 CTATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCATACATCTATAATCCCTCATAATATGAACTTTCCTGACATCGCTTAT I. punctatus 399 CTATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGTCCATACATTTA-AACTCCTCATAATATGAATTTTCCTGACATCGCTTAT I. furcatus 399 CTATTACTGGCATCTGGTTCCTATTTCAGGGCCATACAT-TA-AGCCCCSCATGATATGAATTTTCCTGGCATCGCTTAT ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦ DC
I. pricei 43 471 TGGTGTAACTTCGCTGTAGCAAACAC-CCCCCAAGCCAAGGCATTCTTTTATAGGCATGGGGTTCTTTTTTTTTAGGATC I. pricei 45 479 TGGTGTAACTTCGCTGTAGCAAACAC-CCCCCAAGCCAAGGCATTCTTTTATAGGCATGGGGTTCTTTTTTTTTAGGATC I. cf. (Batopilas) 480 TGGTGTAACTTCGCTGTAGCAAAGCC-CCCCCAAGCCAAGGCATTCTTTTATAGGCATGGGGTTCTTTTTTTTTAGGATC I. cf. (Tutuaca) 479 TGGTGTAACTTCGCCGTAGCAAACAC-CCCCCAAGCCAAGGCATTCTTTTATAGGCATGGGGTTCTTTTTTTTTAGGATC I. punctatus 478 TGGTGTAACTACGCCGTAGCAAGCAC-CCCCCAAGCCAAGGCGTTCTTTTATAGGCATGGGGTTTTTCTTTTTTAGGGTC I. furcatus 477 TGGTGTA--CTCGCCGTAGCTAGCACSCCCCCAAGCCAAGGCGTTCTTTTATAGGCATGGGGGTTTTTATTTTTAAGGTC ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦ DC
I. pricei 43 550 ACTTTCATCTGGCATACTTCATGCAGGCAATCAACAAACATTCAAGGTTGCACTAATTTTTATTCAAACCAACCAAAAAT I. pricei 45 558 ACTTTCATCTGGCATACTTCATGCAGGCAATCAACAAACATTCAAGGTTGCACTAATTTTTATTCAAACCAACCAAAAAT I. cf. (Batopilas) 559 ACTTTCATCTGGCATACTTCATGCAGGCAATCAACAAACATTCAAGGTTGCACTAATTTTTATTTAAACCAACCAAAAAT I. cf. (Tutuaca) 558 ACTTTCATCTGGCATACTTCATGCAGGCAATCAACAAACATTCAAGGTTGCACTAATTTTTATTCAAACCAACCAAAAAT I. punctatus 557 ACTTTCATTTGGCATACTTCATGCAGGCAATCAACAAACATTCAAGGTCGCACTA-TTTTTATTCAAGCCAACCAAAAAT I. furcatus 555 ACTTTCATTTGGCATACTTCATGCAGGCAATCAACAGATACTCAAGGTTGCTCTA-TTTTTATTCAAGCCAAACGAATAT <---- CSB1
32
I. pricei 43 630 GTAATGCTTTAATGACATACCTGAAATAATTACATAACTCTCTATCAAGTACATAACTGATATTGCCGTTTCC------A I. pricei 45 638 GTAGTGCTTTAATGACATACCTGAGATAATTACATAACTCTCTATCAAGTACATAACTGATATTGCCGTTTCCA--CATA I. cf. (Batopilas) 639 GTAATGCTTTAATGACATACTTGAAATAATTACATAACTCTCTATCAAGTACATAACTGATATTGCCGCTTCCA--CATA I. cf. (Tutuaca) 638 GTAATGCTTTAATGACATACCTGAGATAATTACATAACTCTCTATCAAGTACATAACTGATATTGCCGTTTCCA--CATA I. punctatus 636 GTAATGCTTTAATGACATACTTGAAATAATTACATAACTCTCTCTCAAGTACATAACTGATATTGCCGT-TCCA--CATA I. furcatus 634 GTAATGCTCTAATGACATACCTTGAATAATTACATGAATCTCTATCAAGTACATAACCTATATTGTCACTTCCAGGCATA ------> CSB1
I. pricei 43 704 CCTCCCTAAGATCCCCCTGGGCTTCGCGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCATGCCGTACAAGTCCTAATTAATCCTGTT I. pricei 45 716 CCTCCCTAAGATCCCCCTGGGCTTCGCGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCATGCCGTACAAGTCCTAATTAATCCTGTT I. cf. (Batopilas) 717 CCTCCCTAAGATCCCCCTGGGCTTCGCGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCATGCCGTACAAGTCCTAATTAATCCTGTT I. cf. (Tutuaca) 716 CCTCCCTAAGATCCCCCTGGGCTTCGCGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCATGCCGTACAAGTCCTAATTAATCCTGTT I. punctatus 713 CCTCCCTAAGATCCCCCCGGGCTTCGCGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCATGCCGTACGAGTCCTAATTAATCCTGTT I. furcatus 714 CCTCCCTAATATCCCCCCGGGTCTCACGCGCGGTAAACCCCCCTACCCCCCA-CCCGTACAAATCCTAATTAATCCTGTT ▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲ ♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠ CSB2 CSB3
I. pricei 43 784 AAACCCCTAAACCAGGTAAGGCCCGATTGGCGTATTCAACAAGCTATGATATGTGTTGATATATAGTGTTATAAATTCGC I. pricei 45 796 AAACCCCTAAACCAGGTAAGGCCCGATTGGCGTATTCAACAAGCTATGATATGTGTTGATATATAGTGTTATAAATTCGC I. cf. (Batopilas) 797 AAACCCCTAAACCAGGTAAGGCCCGATTGGCGTATTCAACAAGCTATGATATGTGTTGATATATAGTGTTATAAATTCGC I. cf. (Tutuaca) 796 AAACCCCTAAACCAGGTAAGGCCCGATTGGCGTATTCAACAAGCTATGATATGTGTTGATATATAGTGTTATAAATTCGC I. punctatus 793 AAACCCCTAAACCAGGTAAGGCCCGATTGACATATTCAACAAGTAGTGATGTGTGTTGATATATAGTGTTATAAATTCAC I. furcatus 793 AAACCCCTAAACCAGGCAAGGCTCGGTTGGCGTATTCAACAAGTAGTGATATGTGTTGATATATAGTGTTATAAATTCGC ♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠♠ CSB3
I. pricei 43 864 ATCATATTGTATA I. pricei 45 876 ATCATA---TATA I. cf. (Batopilas) 877 ATTAT----TATA I. cf. (Tutuaca) 876 ATCATA---TATA I. punctatus 873 ATCATATTGTATA I. furcatus 873 ATTATATTGTATA
Figura 7. Alineamiento de las secuencias de la región control de I. pricei 43 y 45, I. cf. pricei (Tutuaca), I. cf. pricei (Batopilas) e I. furcatus. (♦) representa al dominio central (DC), (<---->) representa al bloque de secuencias conservadas 1 (CSB1), (▲) representa al bloque de secuencias conservadas 2, (♠) representa al bloque de secuencias conservadas 3 (CSB3).
Además en el dominio izquierdo, el alineamiento de estas secuencias nucleotídicas mostró tres repeticiones de las secuencias palindrómicas TACAT también llamadas TASs (Figura 8). Estas secuencias se encontraron entre las bases 45 a 49, 80 a 85 en todas las especies analizadas y entre las bases 182 a 186 en todas las especies excepto en Cranoglanis bouderius. Se identificaron dos repeticiones de las secuencias palindrómicas ATGTA entre las bases 89 a 93 en todas las especies excepto en Pangasionodon gigas, que varió la segunda T por C y entre las bases 308 a 312 incluye la primera A del dominio central (Figura 8).
En el dominio central la longitud de esta región varió en todas las especies. Ictalurus pricei fue el que mostró mayor longitud con 234 pb y el que presento menor longitud fue I. furcatus con 227 pb. Este dominio mostró un mayor porcentaje de adeninas con
33 un promedio de 27.24 %, muy similar al promedio de timinas de 27.74 %, el porcentaje de citosinas fue de 25.22 % y de igual manera que en el dominio izquierdo el más bajo fue para la base guanina con un promedio de 19.64 % pero mayor porcentaje que en el dominio izquierdo y derecho (Tabla V). Las regiones más conservadas en este dominio entre los Ictalurus secuenciados en este trabajo y sus taxas hermanos C. bouderius y P. gigas fueron las secuencias nucleotídicas 312 a 328, 355 a 371, 395 a 428, 502 a 539 (Figura 9). En este trabajo también se encontró otra región muy conservada entre las bases 463 a 482 en los Ictalurus y sus taxas hermanos Cranoglanis bouderius y Pangasionodon gigas. Estas secuencias fueron menos conservadas para los peces C. carpio, C. auratus, S. salar, O. mykiss T. rubripes, A. japonica y D. rerio.
I. pricei 45 TATAACCAATATTCCCCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAA 60 I. cf. (Tutuaca) TATAACCAATATTCCCCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAA 60 I. pricei 43 TATAACCAATATTCCCCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAA 60 I. cf. (Batopilas) TATAACCAATATTTACCGACACACACAACTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAA 60 I. punctatus TATAACCAACATTCCCCGACACATGCAATTTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAA 60 I. furcatus TA-AACCAATATTTCCCGACATGCACAACCTCACTATGGTTTAGTACATAATATGTATAA 59 ♥♥♥♥♥ TAS I. pricei 45 CTCAACATCATGGTTTAAGTACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATCATTA 120 I. cf. (Tutuaca)_ CTCAACATCATGGTTTAAGTACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATCATTA 120 I. pricei 43 CTCAACATCATGGTTTAAGTACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATCATTA 120 I. cf. (Batopilas)_ CTCAACATCATGGTTTAAGTACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAAATAATTA 120 I. punctatus CTCAACATCATGGTTTAAGTACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAATTCATTA 120 I. furcatus CTTAACATCATGGTTTAAGTACATATTATGTATAATATTACATCATGGTTTAATCCATTA 119 ♥♥♥♥♥ ♥♥♥♥♥ TAS TAS I. pricei 45 GTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCAACTGCAT 240 I. cf. (Tutuaca)_ GTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCAACTGCAT 240 I. pricei 43 GTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCAACTGCAT 240 I. cf. (Batopilas) GTACATAAACCATAATAATTTAAACTCATAAATAATTTATCTTAAAATGAGCGATTGCAT 240 I. punctatus GTACATAAACCATATTAATTCAAACTCATAAATAATATATCTTAAAATGGGCTATTGCAT 240 I. furcatus GTACATAAACCATATTAATTCAAACTCATAAATAAAATATCTTAAAAT-AGTAACTTCAT 238 ♥♥♥♥♥ TAS I. pricei 45 CAACATCCTATGTAGTAAGAGACCACCATCCCCGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGA 358 I. cf. (Tutuaca) CAACATCCTATGTAGTAAGAGACCACCATCCCCGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGA 358 I. pricei 43 CAACATCCTATGTAGTAAGAGACCACCATCCCCGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGA 358 I. cf. (Batopilas) CAATATCCTATGTAGTAAGAGACCACCATCCCTGAATACCTTAAGATACACGGTCCTTGA 359 I. punctatus CAACATTCGATGCAGTAAGAGACCACCATCCTTGTATACCTTAAGATACACGGTCCTTGA 358 I. punctatus CAACATTCTATGTAGTAAGAGACCACCATCCCTGTATACCTTAAGATACACAGTCCTTGA 357 ♥♥♥♥♥ TAS
Figura 8. Alineamiento de las secuencias asociadas a la terminación (TAS) de la síntesis de la cadena pesada en el dominio izquierdo de la región control de las especies estudiadas por medio del programa ClustalW. Representadas con el símbolo corazon (♥).
En el dominio derecho la longitud de la región control varió menos que en el dominio central. Ictalurus pricei 45, I. cf. pricei (Tutuaca) e I. furcatus presentaron la misma
34 longitud de 348 pb, I. pricei 43 e I. cf. pricei (Batopilas) mostraron la misma longitud de 349 pb y la especie que varió más fue I. punctatus con 346 pb. En este dominio las bases más abundantes fueron la timina con un porcentaje de 30.84 %, la adenina con 29.86 %, la citosina que mostró un porcentaje de 24.95 % y la base menos abundante fue la guanina con un porcentaje de 14.17 %. Comparando en longitud y porcentaje de nucleótidos de los Ictalurus con C. bouderius y P. gigas son muy similares, sólo P. gigas mostró en este dominio una mayor longitud que en los Ictalurus (Tabla V).
Con el propósito de evidenciar las diferencias entre estas secuencias, se calculó su identidad genética utilizando el algoritmo SeqMan del programa DNAStar. El género Ictalurus fue totalmente conservado entre las bases 312 a 371 con un porcentaje de identidad del 100 %. Entre las secuencias 395 a 428 sólo el clado punctatus de este género mostró un porcentaje de identidad del 100 %, y con respecto al clado furcatus (I. furcatus) su identidad disminuyó a 94 %. Los bagres nativos estudiados presentaron un porcentaje de identidad del 100 % entre las secuencias 502 a 539 I. pricei 45, I. pricei 43 e I. cf. pricei (Tutuaca), y con respecto a I. punctatus esta disminuyó al 97 %; nuevamente la especie más variable entre los Ictalurus fue I. furcatus con un porcentaje del 93 %. Comparando a los Ictalurus con los otros nueve peces incluidos en este estudio, su porcentaje de identidad con respecto a estas secuencias fue menor al 80 % (Figura 9).
El dominio derecho mostró tres bloques de secuencias conservadas (CSB1, CSB2 y CSB3) en todas las especies analizadas como resultado del alineamiento por ClustalW. El grado de similitud entre los CSBs fue variable. El CSB1 se identificó entre las secuencias 630 a 691 y 663 a 691. El cálculo de identidad para I. pricei 45, I. pricei 43 e I. punctatus mostró un porcentaje de identidad del 94 % y con respecto a I. cf. pricei (Batopilas) y de 90 % de éste comparado con I. cf. pricei (Tutuaca) y de (97 %) comparado con éste último. En la comparación de los bagres nativos del género Ictalurus con I. furcatus se obtuvo un porcentaje del 76 al 88 %. Entre las secuencias 663 a 691 para I. pricei 45, I. pricei 43, I. cf. pricei (Tutuaca) e I. cf. pricei (Batopilas) mostraron un porcentaje de identidad del 100 % y con respecto a I. punctatus un 97 % e I. furcatus un 93 % (Figura 10), de los tres CSB éste fue el más variable. El CSB2 se
35 localizó entre las bases 736 a 762. Este bloque fue el más conservado entre los Ictalurus nativos. El clado punctatus presentó un porcentaje de identidad del 100 % con respecto al clado furcatus (I. furcatus) su porcentaje fue del 96 %. El CSB3 se observó entre las bases 775 a 808, fue el más conservado de los tres bloques y entre los Ictalurus mostró un porcentaje de identidad del 100 %. Se detectaron otras regiones conservadas entre los Ictalurus, C. bouderius y P. gigas entre las bases 816 a 827 y 842 a 868. Las longitudes de las secuencias entre los CSBs fueron variables (Figura 7). La longitud de la secuencia entre los CSB1 y CSB2 fue de 43 bases y entre el CSB2 y CSB3 fue de 23 bases. La distancia entre el CSB3 y el 3’ corriente arriba al tRNAPhe fue el más variable para los Ictalurus.
36
Tabla V. Longitud y composición nucleotídica de los dominios derecho, central e izquierdo de la región control de las especies estudiadas
DOMINIO IZQUIERDO DOMINIO CENTRAL DOMINIO DERECHO
Especie L A C G T L A C G T L A C G T
I. pricei 43 311 38.59 19.61 7.40 34.41 230 27.83 24.35 19.13 28.70 349 30.37 25.21 13.75 30.66
I. pricei 45 311 38.59 19.61 7.40 34.41 234 27.35 25.21 19.23 28.21 348 28.89 25.00 14.37 30.75
I. cf. pricei 312 39.10 19.23 7.69 33.97 232 27.16 24.14 20.26 28.45 349 30.37 24.64 13.75 31.23 (Batopilas) I. cf. pricei p 311 38.59 19.61 7.40 34.41 229 27.95 26.20 18.78 27.07 348 30.17 25.29 14.08 30.46 (Ttutuaca) I. punctatus 311 37.30 19.94 8.04 34.73 228 27.63 25.00 19.30 28.07 346 29.77 25.14 14.45 30.64
I. furcatus 311 38.59 20.90 7.72 32.80 227 25.55 26.43 21.15 25.99 348 29.60 24.43 14.66 31.32
C. bouderius 304 38.49 18.42 8.55 34.54 229 28.38 25.76 18.34 27.51 345 30.14 25.22 15.07 29.57
P. gigas 308 36.04 19.81 9.42 34.74 232 32.76 23.71 18.53 25.00 359 29.81 23.40 15.32 31.48
37 I. pricei45 I. Batopilas I. pricei43 I. Tutuaca I. punctatus I. furcatus C. bouderius P. gigas C. carpio C. auratus D. rerio S. salar O. mykiss T. rubripes A. japonica
DC DC I. pricei45 I. Batopilas I. pricei43 I. Tutuaca I. punctatus I. furcatus C. bouderius s P. gigas C. carpio C. auratus D. rerio S. salar O. mykiss T. rubripes A. japonica Figura 9. Alineamiento de las secuencias conservadas en el dominio central de la región control de las especies estudiadas.
38 663CSB1 691
I. pricei45 I. Batopilas I. pricei43 I. Tutuaca I. punctatus I. furcatus C. bouderius P. gigas C. carpio C. auratus D. rerio S. salar O. mykiss T. rubripes A. japonica
I. pricei45 I. pricei45 I. Batopilas I. Batopilas I. pricei43 I. pricei43 I. Tutuaca I. Tutuaca I. punctatus I. punctatus I. furcatus I. furcatus C. bouderius C. bouderius P. gigas P. gigas C. carpio C. carpio C. auratus C. auratus D. rerio D. rerio S. salar S. salar O. mykiss O. mykiss T. rubripes T. rubripes A. japonica A. japonica
Figura 10. Alineamiento de los bloques de secuencias conservadas (CSB) en la región control de las especies estudiadas.
39 Inferencia filogenética
La inferencia filogenética basada en distancias genéticas, máxima parsimonia y máxima verosimilitud resulto útil para identificar a los Ictalurus estudiados en este trabajo. De un total de 928 pares de bases alineadas, 134 caracteres aportaron información de acuerdo al criterio de parsimona. En máxima parsimonia del árbol fue de 344 pasos y el índice de consistencia (c.i.) fue de 0.910 y el índice de retención (r. i.) fue de 0.693. Para máxima verosimilitud, la longitud del árbol se conserva y el valor de verosimilitud fue de Ln = 2690.02370. Los criterios de distancias genéticas, máxima parsimonia y máxima verosimilitud mostraron a los bagres del río Yaqui I. pricei 43 y 45 e I. cf. pricei (Tutuaca) en un sólo clado restringido a la cuenca del río Yaqui, y muestran a los bagres del río Batopilas, I. sp, como un grupo de bagres nativos específicamente relacionado a los bagres Yaqui (Figuras 11, 12 y 13). Este grupo de bagres nativos del género Ictalurus resultó como un grupo monofilético de acuerdo a todos los criterios evolutivos empleados, es decir, con un ancestro común que origina a todos los bagres nativos de las cuencas de los ríos Yaqui y Fuerte en el Noroeste de México.
Este grupo de bagres nativos diagnosticado en base a la región control, se sitúa como un clado hermano mayor al bagre de canal I. punctatus. El clado punctatus en este estudio incluye a los bagres Yaquis de lo ríos Yaqui (I. pricei 43 y 45), del río Tutuaca (Ictalurus cf. pricei), y del río Batopilas (Ictalurus cf. pricei), y al propio bagre de canal I. puntatus. Este clado se logró diferenciar del clado furcatus que incluye a I. furcatus en nuestro estudio. Nuestra inferencia basada en la región control nos permitió obtener un nivel de bootstrap alto entre 96 al 100 % en todas las relaciones de los bagres nativos y del clado punctatus sujetos a estudios. Con respecto a la distribución geográfica de estos bagres en la vertiente Pacífico de la Sierra Madre Occidental, los bagres nativos del Noroeste de México tienen una correspondencia geográfica con la distribución del bagre Yaqui en las cuencas del río Yaqui, Mayo e incluye a los bagres nativos del río Fuerte I. cf. pricei (Batopilas) dentro de la especie descrita hasta el momento como Ictalurus pricei.
40
Figura 11. Topología del árbol de la región control de Ictalurus obtenida de acuerdo al criterio de Neighbor-Joining. Los números sobre los nodos corresponden a los valores de bootstrap (después de 1000 replicas).
41
Figura 12. Topología del árbol de la región control de Ictalurus obtenida de acuerdo al análisis de máxima parsimonia. Los números sobre los nodos corresponden a los valores de bootstrap (después de 1000 replicas).
42
Figura 13. Topología del árbol de la región control de Ictalurus obtenida de acuerdo al análisis de máxima verosimilitud. Los números sobre los nodos corresponden a los valores de bootstrap (después de 1000 replicas).
43 Discusión
Longitud y composición nucleotídicas de la región control de Ictalurus
La región control resultó ser variable en longitud comparando a los Ictalurus estudiados en este trabajo con otros peces como carpas (Cyprinus carpio 928 bases; Carassius auratus, 921 bases), salmones y truchas (Salmo salar, 1006 bases; Oncorhynchus mykiss, 1003 bases), Danio rerio (950 bases), Anguilas (Anguilla japonica, 967 bases) y botetes (Takifugu rubripes, 821 bases), que además ha sido observado también en anfibios y mamíferos (Saccone et al., 1991; Sumida et al., 2000; Waldbieser et al., 2003). Esta variabilidad esta relacionada con la heterogeneidad promovida por la divergencia de secuencias que existe corriente abajo al CSB3 del dominio derecho y entre los CSBs (1, 2 y 3). Aquí es donde se encuentran los VNTRs que varía en el número de copias entre especies e individuos, además incluye la recombinación, transposición o replicación intra e intermolecular del mtDNA. Esta variabilidad se ha observado a nivel interespecífico e intraespecífico otorgándole estabilidad a la estructura secundaria de hoja de del asa de desplazamiento del D-loop (Mignotte et al., 1990; Saccone et al., 1991).
Con respecto a la composición de bases nucleotídicas, en mamíferos y anfibios la característica principal de la región control es la baja abundancia de guanina y citosina, además de la alta abundancia de adenina y timina (Reyes et al., 1998; Sumida et al., 2000). Esta característica ha sido observada en diferentes órdenes de mamíferos como primates, roedores, cetáceos, insectívoros, carnívoros, marsupiales, lagomorfos, artiodáctilos, perisodáctilos y monotremas mostrando que en todos los organismos las bases más abundantes son la adenina y timina y las bases menos abundantes son la guanina y citosina (Sbisa et al., 1997). Los peces C. carpio, S. salar, D. rerio, O. mykiss, C. auratus, T. rubripes y A. japonica también mostraron un promedio más alto para la adenina y timina (65.7 %), en comparación al par de bases guanina y citosina (34.22 %). En crustáceos, principalmente los peneidos del pacífico, también las bases más abundantes fueron también adenina y timina (Gutierrez-Millán, 2003). Estos resultados coincidieron con la alta abundancia en la adenina y timina de los Ictalurus
44 analizados en este trabajo, ya que es una característica del mtDNA y más aún de la región control debido al doble puente de hidrogeno que presentan la AT, donde se requiere menor energía para romper este doble enlace que el triple formado por el par GC para separar las cadenas para que se mantenga la apertura del asa de desplazamiento, proceso necesario para que se inicie la síntesis de la cadena pesada hija y se desplace la cadena pesada (Lewin, 2001).
Estructura de la región control
La región control del mtDNA de los Ictalurus secuenciados en este trabajo se encuentra flanqueada por el tRNAaPro y el tRNAPhe, y esta estructura es conservada en todos los vertebrados (Saccone et al., 1991; Shadel et al., 1997). Este arreglo de la estructura de la región control resultó ser el mismo para la rana X. laevis (Roe et al., 1985), pero diferente en la Rana nigromaculata, R. porosa porosa, R. porosa brevipoda ( raza de Okayama), R. porosa brevipoda (raza de Nagoya) ya que la región control se encuentra limitada por el cyt-b y el tRNALeu (Sumida et al., 2000). Esto muestra entonces la evidencia de que el arreglo de los tRNAs cambian en el proceso de la evolución y existe un variado patrón de la estructura y de la presencia/ausencia de tRNAs a lo largo de la escala evolutiva (Sumida et al., 2000).
A diferencia del grado de conservación de algunas secuencias estructurales del resto del genoma, la región control muestra una gran variabilidad en longitud y en la composición de sus nucleótidos. En base a esto, la región control se dividió en tres dominios, el dominio derecho que se encuentra adyacente al gen tRNAPhe que es donde se encuentran los elementos cis llamados CSBs asociados con el inicio de la sínteis de la replicación de la cadena pesada (OH) y que se localiza corriente abajo a los promotores LSP y HSP (Saccone et al., 1991; Shadel et al., 1997; Walberg et al., 1981). El dominio central y el dominio izquierdo que contiene los elementos cis (secuencias) asociados a la terminación de la síntesis de la cadena pesada llamadas (TAS). Estos elementos cis (CSBs y TASs) son los responsables de la regulación de la transcripción y replicación del genoma mitocondrial (Garesse et al., 2001; Saccone et al., 1991; Shadel et al., 1993).
45
En el dominio izquierdo se identificaron las secuencias palindrómicas repetidas TACAT, ATGTA que forman parte de algunas secuencias TAS en los vertebrados en general. Estas secuencias proporcionan estabilidad al lazo u horquilla, que es una estructura secundaria involucrada en la regulación del número de copias del mtDNA en la replicación (Saccone et al., 1991; Sbisa et al., 1997; Shadel et al., 1997). Debido a esto, resultó predecible su encuentro en los Ictalurus analizados dada la conservación en la escala evolutiva que tienen por la función tan importante de la regulación de la replicación y transcripción del genoma mitocondrial (Saccone et al., 1991; Sbisa et al., 1997; Shadel et al., 1997).
Waldbieser et al., (2003) identificaron en el bagre de canal I. punctatus, dos repeticiones de las secuencias TACAT, además una secuencia muy similar también fue reportada en la rana Xenopus laevis como TACA (Roe et al., 1985). En este trabajo, al utilizar al bagre de canal en análisis comparativo con los Ictalurus nativos secuenciados, se encontró que eran un total de tres repeticiones de esta secuencia, y no dos. Adicionalmente también se encontraron dos repeticiones de las secuencias palindrómicas ATGTA que Waldbieser et al., (2003) no reportaron debido a que no compararon al bagre de canal con otras especies de su mismos género. Los experimentos sobre el análisis transcripcional realizados por Sbisa et al., (1990) en la mitocondria de rata, demuestran que la síntesis de las dos cadenas ligera (L) y pesada (H) terminan en estas secuencias cis. En mamíferos en este mismo dominio se observó que las bases más abundantes son AT, y está relacionado con la posibilidad de que se pueda formar una estructura secundaria que permita la terminación de la síntesis de la cadena H (Shadel et al., 1997).
El dominio central es uno de los más conservados en la evolución del genoma mitocondrial en vertebrados (Sbisa et al., 1997, Saccone et al., 1991). En mamíferos su característica principal es que contiene un mayor porcentaje de guaninas y un menor porcentaje de adeninas a diferencia de los dominios izquierdo y derecho que contienen mayores porcentajes de adeninas y donde la base menos abundante es la guanina. Estas características también fueron observadas en X. laevis, y aparentemente indican una
46 limitación funcional de este domino en la regulación de la replicación y transcripción (Saccone et al., 1987; Saccone et al., 1991). El alto grado de conservación observado en las especies del género Ictalurus y en el resto de peces estudiados en este trabajo, permite que este dominio sea conveniente para el estudio y comparación de las relaciones filogenéticas de estos peces con vertebrados de taxas superiores como mamíferos, aves, reptiles y anfibios (Sbisa et al., 1997). La función de este dominio aún no se conoce, sin embargo Sbisa et al., (1997) y Saccone et al., (1987) mencionan que existen posibles marcos de lectura abiertos en todas las secuencias de mamíferos, a pesar de que la longitud de sus secuencias son muy variables y de que en las secuencias de aminoácidos su similitud es muy baja, por lo tanto su función sigue siendo incierta.
El dominio derecho, por contener los VNTRs, es el dominio más variable en longitud (Sbisa et al., 1997), sin embargo, esto no fue evidente entre los Ictalurus analizados en este trabajo, ya que su longitud varió menos que la del propio dominio central. Corriente abajo al dominio central se encuentra el CSB1, y está presente en todos los mamíferos estudiados por Sbisa et al., (1997), por lo que es muy conservado y no muestra muchos cambios en su evolución. Los BSC2 y BSC3 son más conservados que el CSB1, sin embargo no se presentan en todos las especies de vertebrados. El CSB2 sólo se presentó en orangutanes, ballena, vacas, ovejas y en el ornitorrinco. El CSB3 no se encontró en ninguno de los anteriores, pero si se encontró en el gorila, orangután y los roedores (Saccone et al., 1991; Sbisa et al., 1997).
La razon por la cual el CSB1 esta siempre presente en los mamíferos es porque inicia la formación del híbrido RNA/DNA que es reconocido por la endoribonucleasa RNase MRP cuya función es para la formación del proceso de los primers mitocondriales para que se de el inicio de la replicación de la cadena pesada, aunque esta endoribonucleasa también reconoce al CSB 2 y 3 estos bloques son especie específicos, lo cual explica la ausencia de estos bloques en algunas especies de vertebrados. Además que podrían estar involucrados en la asociación coevolutiva de los procesos mitocondria núcleo y al empaquetamiento de la estructura de replicación de la región control (Sbisa et al., 1997; Shadel et al., 1997; Tullo et al., 1995).
47 La posición en la que se encuentran los CSB son muy variables, principalmente entre el BSC1 y BSC2, varían de 20 a 270 nucleótidos entre cada bloque. Esta distancia ente el BSC2 y el BSC3 resultó de 5 a 57 bases y la distancia entre el BSC3 y el terminal 5’ de la región control hacia el tRNAPhe fue extremadamente variable, de entre 60 a 342 pb (Sbisa et al., 1997). En el cerdo existen de 14 a 29 repeticiones de secuencias de 10 pares de bases entre el CSB2 y el CSB1 que no interfiere en el inicio de la síntesis de la cadena pesada y se piensa que estas repeticiones son parte del híbrido RNA-DNA. Además, se ha sugerido que la formación del hibrido es tolerante a la variación de la longitud y secuencias de la región control (Longley et al., 1991; Shadel et al., 1997).
Inferencia filogenética
La inferencia filogenética de este estudio basada en distancias genéticas, máxima parsimonia y máxima verosimilitud mostró a los bagres nativos de las cuencas de los ríos Yaqui, Tutuaca y Fuerte formando un grupo monofilético que pertenecen a la especie Ictalurus pricei. Para este bagre nativo resultó que, al igual que el análisis de Varela-Romero (2007) basado en los genes cyt-b y 12SrRNA, provienen de un ancestro común para todos los bagres nativos del Noroeste de México. De igual forma, existió una correspondencia geográfica de la distribución de I. pricei recabada de la literatura (Eschmeyer, 1998) con los datos moleculares provenientes de este estudio y de los proporcionados por Varela-Romero (2007). Esta agrupación esta suficientemente soportada por los valores de bootstraping (Figuras 11 a la 13) y coincidieron con los de Varela-Romero (2007), donde la inferencia filogenética utilizada fue máxima parsimonia, verosimilitud e inferencia Bayesiana derivada de los genes cyt-b y 12SrRNA. Adicionalmente, estos bagres nativos resultaron hermanos del bagre de canal I. punctatus definiendo el clado punctatus de entre las especies de bagres incluidas en este estudio y además, hermanos éstos del representante de clado furcatus, I. furcatus, con valores de bootstraping elevados en cada uno de los criterios de inferencia filogenética utilizada, al igual que Varela-Romero (2007). Estos datos moleculares refuerzan la hipótesis basada en datos morfológicos y propuesta por Lundberg (1970), de la existencia de dos clados al interior del género Ictalurus.
48 En la inferencia filogenética se incluyó como grupo externo al taxa hermano de los Ictaluridae, Cranoglanis bouderius (Cranoglanidae) recientemente definido por Hardman (2005). Esta evidencia está apoyada por análisis filogenéticos basados en genes mitocondriales (cyt-b) y genes nucleares (rag1, rag2), caracteres morfológicos, evidencia del registro fósil, datos biogeográficos, paleontológicos y geológicos (Hardman, 2005; Sullivan et al., 2006). Los Ictaluridos y Cranoglánidos son dos grupos de bagres nativos que enlaza a los bagres endémicos dulceacuícolas de Norteamérica y el este de Asia debido a la unión que hubo de las placas tectónicas de Norte América y el Nororiental Asiática aproximadamente hace 60 millones de años (Barron et al., 1981; Smith et al., 1981).
México es actualmente reconocido como el centro de especiación del género Ictalurus (Lundberg, 1982). Los análisis filogenéticos nos ayudan a conocer la biodiversidad de este grupo de peces nativos (orden Siluriformes) que es uno de los más diversos ya que viven en todos los habitats marinos y dulceacuícolas alrededor del mundo formando una parte muy importante de la comunidad acuática. Este trabajo enfocó sus esfuerzos al conocimiento de la variabilidad genética de los bagres nativos del Noroeste de México, específicamente I. pricei. I. pricei es endémico de los ríos Yaqui y Fuerte y se encuentra en riesgo de extinción (Varela-Romero, 2007), razón por la cual los esfuerzos en resolver sus relaciones filogenéticas resultan en un desafío para la ictiología además de contribuir así con su conservación y uso apropiado .
49 Conclusiones
La estructura de la región control del mtDNA de Ictalurus pricei, I. cf. pricei del río Tutuaca, I. cf. pricei del río Fuerte e I. furcatus fue similar a la de su congénere I. punctatus.
La región control presenta un dominio central, tres bloques de secuencias conservadas (CSB1, SCB2, CSB3) y dos secuencias palindrómicas llamadas TASs.
El dominio central resultó ser muy conservado para el género Ictalurus y también para el resto de especies de peces estudiadas.
La región control define la identidad específica del género Ictalurus y de sus dos clados.
La inferencia filogenética indica la existencia de un grupo de bagres nativos para el Noroeste de México y concuerda con la inferencia filogenética disponible utilizando el cyt-b.
50 Literatura citada
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