UNIVERSIDADE FEDERAL DE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE EXTRATOS ORGÂNICOS E

CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE UMA LECTINA DE RUFULA

JOSÉ HELTON DE VASCONCELOS ARCOVERDE

Recife Fevereiro de 2015 ______

JOSÉ HELTON DE VASCONCELOS ARCOVERDE

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE EXTRATOS ORGÂNICOS E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE UMA LECTINA DE MANILKARA RUFULA

Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito final exigido para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Biotecnologia.

ORIENTADORA:Prof a. Dra. Maria das Graças Carneiro da Cunha.

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Recife, Fevereiro de 2015

Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788

Acorverde, José Helton de Vasconcelos Avaliação da atividade biológica de extratos orgânicos e caracterização parcial de lectina de Manilkara Rufula / José Helton de Vasconcelos Arcoverde. – Recife: O Autor, 2016. 179 f.: il. . Orientadora: Maria das Graças Carneiro da Cunha Tese(doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2016.

Inclui referências e anexos

1. 2. Plantas da Caatinga3. Lectinas I. Cunha, Maria das Graças Carneiro II. Título.

634.909811 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2010-268

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

JOSÉ HELTON DE VASCONCELOS ARCOVERDE

"Avaliação da atividade biológica de extratos orgânicos e caracterização parcial de uma lectina de Manilkara rufula"

Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito final exigido para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Biotecnologia.

Data de Aprovação:_23_/_02_/_2015

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Maria das Graças Carneiro da Cunha- (Orientadora) Departamento de Bioquímica (LIKA/UFPE)

Prof. Dr. Thiago Henrique Napoleão - (UFPE) Departamento de Bioquímica

______Prof. Dr. Rafael Matos Ximenes - (UFPE) Departamento de Antibióticos

______Prof. Dr. Romero Marcos Pedrosa Brandão Costa- (UFRPE)

______Profa. Dra. Marthyna Pessoa de Souza - (UFPE)

SUPLENTES

______Profa. Dra. Maria Terezados Santos Correia - (UFPE) Departamento de Bioquímica

______Profa. Dra. Márcia Vanuza da Silva - (UFPE) Departamento de Bioquímica ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

DEDICATÓRIA

“Dedico este trabalho a todos que me deram apoio, principalmente a minha família que esteve sempre ao meu lado, e nos mementos difíceis me incentivaram para que essa conquista pudesse ser alcançada”.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me abençoado, iluminado e estar sempre presente diante das dificuldades, me concedendo força e fé todos os dias para que pudesse ter concluído mais esse objetivo em minha vida;

A meus pais, José Hiran e Maria Ideane, meu eterno agradecimento, por acreditaram em meu potencial, e estarem sempre me apoiando e incentivando, isso me fez mais forte para dar sempre o melhor de mim;

A minha esposa Suzana, pelo seu companheirismo, amizade, compreensão, apoio e amor. A Hemilly Susan da qual nos últimos anos não pude estar muito próximo, mas que esteve sempre em meu pensamento. Vocês foram grande parte da minha inspiração para o desenvolvimento e conclusão desse trabalho;

A meus irmãos Hiran e Jemima e a meus avós, agradeço por sempre se orgulharem de mim e confiarem em meu trabalho;

Às minhas orientadoras Professoras Dra. Graça Cunha, Dra. Tereza Correia e Dra. Oliane Magalhães, por acreditarem em mim. Agradeço por me mostrarem o caminho da ciência e dividirem os vossos conhecimento, e principalmente por fazerem parte da minha vida por alguns anos, pois vocês serão sempre exemplos de profissionalismo e dedicação;

A Professora Dra. Marcia Vanusa, pois foi uma das pessoas que mais contribuiu para que esse trabalho rendesse bons frutos;

A meus amigos da Pós-Graduação, pelos momentos divididos juntos, especialmente aos colegas do Laboratório de Biotecnologia, Paulo, Pricila, Fernando, Isabel, Carlos, Carol e Rita, que além de companheiros de trabalho se tornaram verdadeiros amigos. Aos colegas do Laboratório de Enzimologia nas pessoas de Douglas, Janilson, Guto e Robinson; do Laboratório de Glicoproteínas Raiana, Michele e Aline; do Laboratório de Produtos Naturais Barbara, Cecília, Alexandre e Seu João, e demais amigos do Departamento de Bioquímica. Obrigado por tornarem meu trabalho mais leve e divertido, por dividirem comigo as angústias e alegrias. Foi bom poder contar com vocês! ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pelo título de Doutor que me foi concedido;

A Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE) pelo apoio financeiro para o desenvolvimento deste projeto;

Ao Departamento de Bioquímica na pessoa de Miron, e todos desse departamento, que de uma forma ou de outra contribuíram para a conclusão deste trabalho;

Muito obrigado...

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Tudo o que somos nasce com nossos pensamentos e, em nossos pensamentos, fazemos o nosso mundo.

“Buda”

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RESUMO

Este trabalho teve como objetivos realizar um screening com diversas espécies da Caatinga, isolar, caracterizar e testar quimicamente moléculas bioativas presentes nas folhas de Manilkararufula (Maçaranduba), visando agregar valor biotecnológico às plantas desse bioma. Foram avaliadas 28 espécies vegetais quanto à presença de lectinas, a partir do teste de atividade hemaglutinante (AH), e inibição de tripsina. Utilizando aparelho soxhlet deferentes extratos orgânicos foram preparados, em ordem eluotropica, com folhas de M. rufula, utilizando os solventes clorofórmio, acetato de etila e metanol, e o perfil fitoquímico dos extratos obtidos traçado por cromatografia em camada delgada (CCD). Testes de atividade antioxidante,invitro, com os extratos foram realizados pelos métodos de DPPH e Fosfomolibidênio, e os mesmos tiveram ainda seus conteúdos de flavonoides determinados. A ação protetora de DNA também foi avaliada para os extratos e a lectina obtida.A atividade antimicrobiana foi realizada por diluição seriada em microplaca contra seis espécies de bactérias.Neste estudo foi avaliada ainda a atividade termiticida para cada um dos extratos obtidos.Uma lectina foi obtida a partir do extrato salino das folhas de M.rufula, aprengando-se métodos tradicionais de purificação, como fracionamento salino e cromatografia de afinidade. Dentre as espécies analisadas, 20 apresentaram AH, onde as concentrações proteicas nos extratos salinos variaram de 0,95 a 20,88 mg/mL, e 21 foram capazes de inibir, em seus extratos, a atividade de tripsina em algum nível. O ensaio em CCD revelou pouca diversidade de compostos secundários nas folhas de M. rufula, sendo encontrados heterosídeos cianogênicos, flavonoides, triterpenos, esteroides e taninos. Os melhores resultados de atividade antioxidante foram obtidos com os extratos preparados com metanol e acetato de etila, os quais apresentaram excelente sequestro de radicais livres a uma concentração de 200 µg/mL. Nestes extratos também foram encontradas uma alta concentração de compostos fenólicos e flavonódies, os mesmos também apresentaram atividade protetora de DNA e mostraram-se eficazes como agentes antimicrobianos, atuando contra algumas cepas de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Os três extratos obtidos apresentaram atividade termiticida com eliminação de 100% dos insetos em até 48 horas. A lectina foi obtida por ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

cromatografia em suporte de quitina e mostrou-se altamente termoestável, mantendo sua AH mesmo quando submetida a estresses de calor e resistente a variações de pH. A lectina não teve sua AH alterada pela presença de íons, e em SDS-PAGE observou-se a presença de duas bandas com 42,3 e 36,2 kDa. Esta proteína também apresentou atividade protetora de DNA e antibacteriana contra M. luteus. Este é o primeiro relato que apresenta M. rufula como uma espécie vegetal com potencial biotecnológico, tornando-a uma promissora fonte de novos compostos bioativos.

Palavras chave: Caatinga; Manilkararufula; Compostos bioativos; Atividade biológica.

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ABSTRACT

This work had as objectives to perform a screening with several species from Caatinga, isolate, characterize and test chemically bioactive molecules present in the leaves of Manilkara rufula (maçaranduba), aiming to add value to this biome biotechnology. Twenty eight plant species were evaluated for the presence of lectins, from the hemagglutinating activity (AH) and inhibition of trypsin. Using soxhlet apparatus different organic extracts were prepared, in order eluotropic, with leaves of M. rufula, using solvents chloroform, ethyl acetate and methanol. The phytochemical profile of extracts obtained charted by thin-layer chromatography (TLC). Testing of antioxidant activity in vitro with extracts were carried out by methods of DPPH and phosphomolybdeno and they even had their content of flavonoids determined. The protective action of DNA has also been evaluated for lectin and extracts. The antimicrobial activity was performed by serial dilution in microplate against six species of bacteria. In this study was to evaluate the termiticide activity for each of the extracts obtained. A lectin was obtained from the saline extract of leaves of M. rufula, utility traditional methods of purification, as salt fractionation and affinity chromatography. Among the species analyzed, 20 presented AH, where protein concentrations in saline extracts ranged from 0.95 to 20.88 mg/mL, 21 were able to inhibit, in their statements, the activity of trypsin on some level. The test in TLC revealed little diversity of secondary compounds in this tissue, and found cyanogenic glycosides, flavonoids, triterpenes, steroids and tannins. The best results were obtained with antioxidant activity of the extracts prepared from methanol and ethyl acetate, which showed excellent scavenging free radicals at a concentration of 200/mL. In these extracts were also found a high concentration of phenolic compounds and flavonods, the same also presented protective activity of DNA and proved effective as antimicrobial agents, acting against a few strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria. The three extracts obtained showed termiticide activity with 100% elimination of insects within 48 hours. The lectin was obtain by chromatography on chitin support and was highly thermostable, maintaining its HA even when subjected to heat and resistant to pH changes. The lectin did not have its HA amended by presence of ions, and SDS-PAGE showed the presence of two bands with 42.3 and 36.2 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

kDa. This protein also presented DNA and antibacterial protective activity against m. luteus. This is the first report that presents M. rufula as a species with biotechnological potential, making it a promising source of new bioactive compounds.

Keywords: Caatinga; Manilkara rufula; Bioactive compounds; Biologic activity.

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LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1: Área de Caatinga no PARNA do Catimbau. FONTE: (ARCOVERDE, 2015)... 20

Figura 2: Localização geográfica do PARNA do Catimbau (municípios de Buíque, Tupanatinga e Ibimirim), estado de Pernambuco, Brasil. FONTE: (ARCOVERDE, 2015 22

Figura 3: Arvore (A), folhas (B) e frutos (C) de Manilkara rufula. FONTE: 30 (ARCOVERDE, 2015)......

Figura 4: Estrutura química geral dos flavonoides e suas diferentes classes. FONTE: (RAVISHANKAR et al., 2013)...... 42

Figura 5: Dímeros comuns de taninos condensados, (proantocianidinas) encontrados em plantas. Variação estrutural, devido aos tipos de ligações. FONTE: (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011)...... 45

Figura 6: Estrutura básica dos esteróides com a respectiva numeração dos seus carbonos...... 48

Figura 7: Estrutura do núcleo de espirostano. FONTE: (THAKUR et al., 2011)...... 49

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À JOURNAL OF CHEMICAL ECOLOGY Figura 1: Protective effects of different extracts in DNA nicking assay. (A) Lane 1: negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s reagent),

(C) Lane 3-5: AcOEt (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (D) Lane 6-8: CHCl3 (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (E) Lane 9-11: MeOH (125 µg/mL) + Fenton’s reagent……………... 114 Figura 2: Termiticide activity of the chloroform (A), ethyl acetate (B) and methanol (C) extracts prepared from the leaves of M. rufula...... 117

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À PROCESSBIOCHEMISTRY Fig. 1: Profile of quitin affinity chromatographic column eluted with acetic acid 1mol/L… 152

Fig. 2: Molecular Characterisation. SDS-PAGE gel (12,5%) obtained through lectin purification on quieten chromatography, stained with bright blue Coomassie. Band molecular weights were 43,2 (A) e 36,3 (B) KDa, respectively...... 153

Fig. 3: Chromatography of MkaLL on Superdex-75 10/300GL column accepted to a ÄKTA purifying system, equilibrated and eluted with NaCl 0,15 mol/L……………………. 154 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

Fig. 4: Effect of pH at hemagglutinating activity after incubation with different pH (4,5- 11) buffers...... 155

Fig. 5: Effect of temperature at MkaLL HA in rabbit erythrocytes. The initial activity was 512 and each point over the line represents the average of three repetitions...... 156

Fig. 6: Protective effects of lectin of M. rufula in DNA nicking assay. (A) Lane 1: negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s reagent), (3) Lane 3-5: MkaLL (5o µg/mL) + Fenton’s reagent……...... 157

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LISTA DE TABELAS

ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO PELA NATURAL PRODUCT RESEACH:

FORMERLY NATURAL PRODUCT LETTERS.

Table 1: Studied species and their tissues examined for lectin and trypsin inhibitor activity with therespective titres of HA, protein concentration (mg/mL) and trypsin inhibitory effect of the saline extracts………………………………………………………….. 94

Table S1. Species collected in the Vale do Catimbau National Park (Caatinga of Pernambuco)……………………………………………………………………………………… 102

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À JOURNAL OF CHEMICAL ECOLOGY

Table 1: Phytochemical profile obtained by thin layer chromatography (TLC) of chloroform, ethyl acetate and methanol extracts prepared from the leaves of M. rufula...... 112

Table 2: Concentrations (µg/ml) of the MeOH, AcOEt and CHCl3 extracts, from the leaves of M. rufula, able to scavenge 50% of the free radicals of DPPH………………….. 113 Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) obtained with the organic extracts from the leaves of M. rufula…... 116

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À PROCESSBIOCHEMISTRY

Table 1: Inhibition of hemagglutinating activity of 40-80% saline fraction of leaves from M. ruful. using rabbit red blood erythrocytes.…………………………………………………. 149

Table 2: Purification summary of leaf lectins from Manilkararufula...... 150

Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (CBM) of MkaLL against bacterias……………………………………………. 151

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AAT: Atividade Antioxidante Total

AH: Atividade Hemaglutinante

BSA: albumina sérica bovina (Bovine Serum Albumine)

CBM: Concentração Bactericida Mínima

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

DMSO: Dimetilsulfóxido

DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo

EAG: Equivalente ao Ácido Gálico

EROs: Espécies Reativas de Oxigênio ha: hectare

MIC: Concentração Inibitória Mínima

MkaLL: lectina das folhas de Manilkararufula

PARNA: Parque Nacional

SDS-PAGE: eletroforese em gel de proliacrilamida (Sodium Dodecyl Sulphat-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

SUMÁRIO Pag 1.INTRODUÇÃO...... 17 2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...... 19 2.1 Bioma Caatinga...... 19 2.2 Parque Nacional do Catimbal...... 21 2.3 Plantas:Fontes de Novos Compostos Bioativos...... 22 2.4 Família ...... 26 2.4.1 Gênero Manilkara...... 26 2.5 Compostos Bioativos...... 30 2.5.1 Metabólitos Primários...... 31 2.5.1.1 Lectinas...... 32 2.5.1.1.2 Inibidores de tripisina...... 35 2.5.2 Metabolitos Secundários...... 36 2.5.2.1 Classificação...... 38 2.5.2.1.1 Compostos Fenólicos...... 38 2.5.2.1.1.1 Fenóis...... 39 2.5.2.1.1.2 Flavonóides...... 41 2.5.2.1.1.3 Taninos...... 43 2.5.2.1.2 Terpenóides...... 46 2.5.2.1.2.1 Esteroides...... 47 2.5.2.1.3 Saponinas...... 48 2.5.2.1.4 Compostos Nitrogenados...... 51 2.5.2.1.4.1 Alcalóides...... 51 2.5.4 Atividades Biológicas de de Metabólitos Secundários...... 52 2.5.4.1 Atividade Antioxidante...... 52 2.5.4.2 Atividade Antimicrobiana...... 53 2.5.4.3 Atividade termiticida...... 54 3. OBJETIVOS...... 56 3.1 Geral...... 56 3.2 Específicos...... 56 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 58 5. CAPITULO I - ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO PELA NATURAL PRODUCT RESEACH: FORMERLY NATURAL PRODUCT LETTERS ……… 89 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...

6. CAPITULO II - MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À JOURNAL OF CHEMICAL ECOLOGY...... 104 7. CAPITULO III - MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À PROCESS BIOCHEMISTRY...... 127 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 158 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 17

1. INTRODUÇÃO

As plantas com propriedades medicinais constituem a base dos sistemas de cuidados a saúde em muitas sociedades. Ouso dos conhecimentos e práticas associadas a esses recursos vegetais fazem parte de uma importante estratégia ligada à conservação da biodiversidade, à descoberta de novos medicamentos, e melhoria na qualidade de vida em comunidades rurais (BALAKRISHNANet al., 2014). A partir do metabolismo primário das plantas, dentre vários outros compostos, são produzidos ácidos nucleicos, proteínas e carboidratos e, juntamente com as reações bioquímicas básicas da mesma, como a respiração e fotossíntese, as plantas evoluíram na produção de uma ampla variedade de substâncias secundárias. Essas substâncias foram denominadas de compostos ou metabólitos secundários (TAIZ eZEIGER, 2004). As lectinas são um grupo de proteínas ou glicoproteínas de origem não imune,altamente diversas, ubiquamente distribuídas em plantas, animais e micro-organismos (LEI-LEI et al., 2011).Apresentam a capacidade de reconhecer e ligar-se especificamente a mono ou oligossacarídeos sem induzir alterações na estrutura dos mesmos (SOUZA et al., 2011). Estudos mostram que um grande número de lectinas têm sido isoladas e caracterizadas em diversas plantas, e estas proteínas estão emergindo como moléculas promissoras, principalmente por conterem sítios de ligação específicos, pois esta habilidade especial de reconhecimento pode ser utilizada como importante ferramenta biotecnológica (COSTA et al., 2010; CHARUNGCHITRAK et al., 2011). A família Sapotaceae, presente no bioma da Caatinga, possui distribuição tropical e subtropical, incluindo cerca de 50 gêneros contendo 1000 espécies de hábito arbóreo e arbustivo. No Brasil, ocorrem 14 gêneros e cerca de 200 espécies, com destaque para Chrysophyllum, Manilkara, Micropholis, Pouteria, Pradosiaos e Sideroxylon (ALMEIDA-JUNIOR, 2010). Quimicamente, as espécies desta família são caracterizadas por apresentarem uma variedade de classes de substâncias, sendo os compostos mais conhecidos as saponinas, flavonoides, polifenois, triterpenos, carotenoides, esteroides, ácidos ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 18

graxos e taninos, com diversas atividades biológicas já comprovadas (KUSHIMA, 2005; MONTENEGROet al., 2006; BARBOSA-FILHOet at., 2008). No gênero Manilkara são encontradas algumas espécies que têm sido utilizadas popularmente como plantas medicinais no tratamento de várias enfermidades, como inflamações, febre, hemorragias, dores de estômago e comocicatrizantes. Alguns estudos já realizados com espécies deste gênero mostraram que, as mesmas são possuidoras de compostos com diversas propriedades biológicas, como antimicrobiana, antiparasitária, antitumoral e antioxidante (CHANDA e NAGANI, 2010; KANERIA e CHANDA, 2012). Na literatura não há relatos com M. rufula que tratem do seu potencial como fonte de compostos bioativos, sendo este o primeiro trabalho que mostra a presença de tais componentes na espécie. Estudos mostram que compostos naturais oferecem inúmeras oportunidades para o desenvolvimento de novas drogas com potencial terapêutico. Logo, explorar as potencialidades oferecidas pelas plantas da Caatinga, é uma forma de não só contribuir para a obtenção de novos princípios bioativos, mas também uma maneira de agregar valor à região e contribuir para sua preservação.Diante do exposto, este trabalho teve como objetivos, determinar o potencial biotecnológico de espécies deste bioma, identificar e avaliarquímica e biologicamentecompostos secundários oriundos do metabolismo celular, e obter uma lectina das folhas de Manilkararufula, visando novas e futuras aplicaçõesde biomoléculas desta espécie como antioxidantes e antimicrobianas.

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Bioma Caatinga

A Caatinga é um bioma de clima semiárido com florestas arbustivas e espinhosas, de folhas decíduas, encontradas no Nordeste brasileiro(SILVA et al., 2014).A mesma responde por aproximadamente 10% do território nacional e 60% da região Nordeste. Caatinga, que em Tupi significa “matabranca”, aparência que quase sempre tem no período mais seco, é um dos tipos de vegetação mais heterogêneo presentes no Brasil. Devido às variações de relevo e microclima, são encontrados nesse bioma ecotopos formados por espécies de de campos rupestres, de mata atlântica e de restinga (RODRIGUES, 2006; PORDEUS, 2007). Suas faixas de precipitação média anual estão entre 240-1500 mm (LEALet al., 2005).A estação seca dura entorno de sete meses e o inverno é a estação das chuvas, onde as temperaturas não são tão elevadas. Estas características fazem da Caatinga um tipo peculiar de vegetação adaptada às condições climáticas locais encontradas nesta região (TRENTIN et al., 2011). No bioma Caatinga, já foi comprovada a existência de 510 gêneros e 5.344 espécies de plantas vasculares, dentre os quais 18 gêneros e 318 espécies são endêmicas (GIULIETTIet al., 2002), o que caracteriza essa região como uma das grandes áreas de maior biodiversidade no Brasil. Na Caatinga predomina a vegetação xerófita (figura 1) que carrega um grande número de espécies vegetais. Este bioma é uma matriz de matagais espinhosos e florestas sazonalmente secas, com bolsões de florestas tropicais de altitude e cerrado, que abrange a maior parte dos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, , e parte do nordeste de Minas Gerais, no Vale do Jequitinhonha, ocupando uma área de aproximadamente 735.000 km2(BASSO et al., 2005), representando a quarta maior área coberta por uma única forma de vegetação no Brasil (CARTAXO et al., 2010), onde estão presentes espécies que não podem ser encontradas em nenhum outro lugar do mundo.

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Figura 1: Área de Caatinga no PARNA do Catimbau (ARCOVERDE, 2015).

Áreas desse bioma têm sofrido forte influência humana ao longo dos anoslevando à perda de paisagens e trazendo consequências graves para a manutenção da biodiversidade local(ALBUQUERQUE et al., 2005). A fragmentação de toda Caatinga pode levar ao desaparecimento de espécies e organismos únicos da região (NETO, 2009). Silva et al. (2014) afirmam que a pressão antrópica associada a aridez local levou a uma extrema degradação de grandes extensões desse bioma, dando origem aos chamados núcleos de desertificação,o que enfatiza a importância e urgência do desenvolvimento de estratégias sustentáveis para preservação da biodiversidade nesta área. Neste ambiente, encontram-se espécies de ocorrência endêmica, bem como plantas com atividades farmacológicas reconhecidas pela população local, muitas delas ainda desconhecidas pela ciência, tanto do ponto de vista botânico como químico e farmacológico (RODRIGUES, 2006; NETO, 2009). Nos últimos anos tem havido um crescente interesse em adquirir conhecimentos sobre as plantas dentro desta área (ALBUQUERQUE et al., 2007a), e algumas publicações já descreveram a rica flora da região como promissora fonte de compostos bioativos(ALMEIDA et al., 2005; AGRA et al., 2007a; ALBUQUERQUE et al., 2007b; ALBUQUERQUE e OLIVEIRA, 2007; AGRA et al., 2008). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 21

Em termos de utilizações medicinais, alguns compostos obtidos de plantas da Caatinga já demonstraram propriedades interessantes como anti- inflamatória, antimicrobiana, cicatrizante e antioxidante. E estes compostos aparecem essencialmente em algumasfamilias de plantas desta região (ALMEIDA et al., 2005). Além disso, esses coonstituintes aparecem em concentrações elevadas em algumas espécies que são intensamente utilizadas para fins terapêuticos (MONTEIRO et al., 2006).Segundo Agra et al. (2007) no nordeste do Brasil as práticas medicinais tradicionais têm sido usadas para tratar uma imensa variedade de doenças, incluindo enfermidades da pele, distúrbios gastrointestinais, tuberculose, infecções do trato urinário, e outras. No entanto, algumas destas plantas utilizadas necessitam de estudos científicos para confirmarem sua eficácia (CARTAXO et al., 2010).

2.2 Parque Nacional do Catimbau

Criado em 2002 elocalizado a 278 Km da cidade do Recife, Capital do Estado de Pernambuco, o Parque Nacional da Serra do Catimbau (PARNA do Catimbau), está inserido na zona de transição entre o Agreste e Sertão do Estado, entre as coordenadas geográficas: 8°24’00” e 8°36’35” S e 37°09’30” e 37°14’40” W(figura2). Sua área é de 62.300 ha, na forma de uma poligonal e encontra-se distribuída entre os municípios de Buíque (12.438 ha.); Tupanatinga (23.540 ha) na Microrregião do Vale do Ipanema, e Ibimirim (24.809 ha) na Microrregião do Moxotó Semiárido Pernambucano (RODRIGUES, 2006). A região em estudo é considerada o segundo maior parque arqueológico do Brasil, com aproximadamente trinta sítios arqueológicos (PORDEUS, 2007). Em sua vegetação predomina a Caatinga característica marcante da flora do parque, (RODRIGUES, 2006; PORDEUS, 2007), sendo uma das poucas áreas onde ainda podem ser encontradas matas desse bioma não alteradas pela ação do homem. O PARNA do Catimbau é constituído de paisagens com grandes riquezas e biodiversidade impar em seu Estado. Em pesquisa realizada pela Sociedade Nordestina de Ecologia (S.N.E), a região do Catimbau por suas características, foi considera Área de Extrema Importância Biológica (RODRIGUES, 2006). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 22

Figura2: Localização geográfica do PARNA do Catimbau (municípios de Buíque, Tupanatinga e Ibimirim), estado de Pernambuco, Brasil (ARCOVERDE, 2015).

A vegetação de Caatinga presente nas áreas do Catimbau mostra grande diversidade de espécies e estruturas, em função das variações de relevo e do topoclima. Por essa razão, podem ser encontradas no parque,além da quelas típicas da Caatinga,outras espécies presentes em áreas de cerrado, campos rupestres, e mata Atlântica. Nos planaltos e chapadas dessa região, ainda são encontradas vegetações residuais pouco conhecidas e estudadas, como os encraves de mata úmida nos brejos de altitude e a vegetação arbustiva perenifólia das chapadas (RODRIGUES, 2006).

2.3Plantas:Fontes de Novos Compostos Bioativos

Há milhares de anos a natureza tem sido fonte de agentes medicinais, uma vez que dispõe de compostos altamente diversificados que muitas vezes apresentam atividades biológicas específicas (CHANDA ePAREKH, 2010). Tradicionalmente, as plantas, oferecem um vasto campo de estudos para a descoberta de novos agentes com potencial terapêutico (MOOTOOSAMY e MAHOMOODALLY, 2014), onde as informações obtidas a partir de efeitos ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 23

biológicos dos fitoterápicos tornam-se um valioso contributo para a descoberta de novos compostos bioativos alem de permitir o desenvolvimento de novas linhas terapêuticas (EISSA et al., 2014). A ampliação do conhecimento etnobotânico sobre o uso de plantas com propriedades medicinais e o desenvolvimento de pesquisas nessa área, ganhou substancial consideração entre as comunidades científicas aolongo do tempo. Ainda, o aumento no custo dos tratamentos convencionais para algumas doenças, os custos crescentes das drogas de origem sintéticas e a resistência antimicrobiana frente a vários antibióticos, tem incentivado a busca por novos medicamentos derivados das plantas (AREEJ et al., 2013; KAYANI et al., 2014). Mesmo com os avanços da indústria farmacêutica na produção de medicamentos sintéticos, diversos agentes quimioterapêuticos ainda têm sido desenvolvidos como resultado de estudos de plantas com propriedades medicinais (OSMAN et al., 2011). Estas têm sido usadas em várias partes domundo para tratar diferentes enfermidades, pricipalmente em regiões com difícil acesso a programas de saúde, onde a utilização de plantas na medicina tradicional é muito comum por grande parte da população local (AREEJ et al.,2013). Várias pesquisas etnofarmacológicas têm sido publicadas nos últimos anos com base na medicina tradicional em várias culturas da África (KARUNAMOORTHI e TSEHAYE, 2012; SEMENYA et al., 2012), Ásia (DEY eKUHAD, 2014), Austrália (PACKER et al., 2012), China (GHORBANI et al., 2011), América do Sul (REHECHO et al., 2011) e em regiões específicas de países ocidentais (CALVO et al., 2011; CAVERO et al., 2011) com o objetivo de preservar o uso de ervas como remédios, e encontrar uma abordagem baseada em evidências, para seu uso como medicamentos (EISSA et al., 2014). Estudos etnobotânicos realizados nas regiões tropicais demonstraram que as populações locais possuem um amplo conhecimento a cerca das espécies de plantas farmacologicamente úteis (TACHER et al., 2002; TORRE- CUADROS e ISLEBE, 2003; ALBUQUERQUE e OLIVEIRA, 2007). Ainda, essas informações sobre o uso dos recursos naturais também podem contribuir para a conservação da biodiversidade local. A importância global de plantas ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 24

com propriedades medicinais pode ser atribuída pelos numerosos medicamentos convencionais que foram derivados a partir destas, e que são atualmente utilizados na prática clínica (HÜBSCH et al., 2014). Muitas espécies têm sido reconhecidas por suas propriedades curativas e exercerem um impacto benéfico sobre a saúde, apresentando diversas atividades biológicas como, por exemplo, anti-inflamatória, antimicrobiana, antioxidante, hipolipemiantes,antimutagênicos e outros(BALAKRISHNAN et. al., 2014). Estudos mostram que compostos naturais puros e extratos vegetais padronizados oferecem inúmeras oportunidades para o desenvolvimento de novas drogas com potencial biotecnológico, devido a suadiversidade química inigualável (ASWATHANARAYAN eVITTAL, 2013).Viegas-Jr et al. (2006) afirmam que nos países ocidentais, onde a base da indústria farmacêutica é a química sintética, 25% dos fármacos foram originalmente isolados de plantas. De acorco com Almeida et al. (2005), vários estudos têm chamado a atenção para o uso de plantas com propriedades medicinais, discutindo diferentes hipóteses na tentativa de explicar os padrões de uso encontrados. Stepp (2004), em seu trabalho, observou uma alta frequência de ervas daninhassendo utilizadas para fins terapêuticos em várias partes do mundo, sugerindo que esta preferência possa estar relacionada a aspectos químicos das mesmas. No entanto, fatores culturais, influenciam fortemente a seleção e uso de plantas para tais fins (AMOROZO, 2004; VANDEBROEK et al., 2004). A eficácia dos fitoterápicos está geralmente influenciada por vários fatores, incluindo diferenças genéticas, condições ambientais, tais como temperatura, exposição ao sol, disponibilidade hidrica, variação nutricional e presença de microorganismos, que afetam os processos celulares nas plantas e as suas respostas a estímulos (GUO et al., 2008; LI et al., 2012).A variabilidade de compostos químicos entre as populações também tem sido atribuída a efeitos abióticos do meio ambiente, tais como a salinidade (BOURGOU et al., 2010;TAARIT et al., 2011) e umidade (BETTAIEB et al., 2011) além dos anteriormente citados. Neste sentido, as composições dos compostos ativos e as potências terapêuticas das plantas são alterados, portanto, torna-se essencial diferenciar os locais de cultivo e as condições das ervas para entender suas propriedades e otimizar seus usos (LEE et al., 2013). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 25

O número de estudos sobre plantas com propriedades medicinais na região semiárida do Nordeste brasileiro tem crescido progressivamente. No entanto, a maioria destes são descritivos, se concentrando em apenas listar plantas, bem como suas indicações terapêuticas, as partes utilizadas e seu modo de uso (SILVA eANDRADE, 2002;MOREIRA et al., 2002;ALBUQUERQUE eANDRADE, 2002;ALMEIDA et al., 2006). O uso de plantas medicinais da Caatinga está geralmente associado à remoção de partes destas e sua utilização como remédio. Algumas espécies são altamente exploradas devido à extensa colheita para abastecer o setor farmacêutico (ALBUQUERQUE eANDRADE, 2002). Numerosas espécies de árvores do semiárido brasileirotêm sua casca retirada e usada para fins medicinais, sendo esta uma prática extremamente comum na região. Contudo, muitas destas árvores crescem lentamente, e em alguns casos as práticas de coleta destrutiva podem reduzir o tamanho de uma população aumentando a probabilidade de sua extinção local (MONTEIROet al., 2006). Muitas destas espécies têm outras utilizações não farmacêuticas, especialmente como madeira (ALBUQUERQUE et al., 2005; MONTEIRO et al., 2006). Desse modo, a sustentabilidade da colheita de plantas medicinais depende de uma série de fatores que operam em diferentes níveis. Logo as ameaças às populações de plantas locais podem surgir a partir de outras atividades de uso das mesmas (BOTHA et al., 2004). A utilização e manejo de plantas é uma prática cotidiana em muitas comunidades do Brasil que residem próximos a fragmentos de matas ou reservas florestais. O uso frequente de recursos vegetais indica que estas populações têm um amplo conhecimento a cerca das espécies nativas. A importância desta informação para melhoria de vida cotidiana das populações rurais, bem como o uso sustentável desses recursos vegetais tem sido frequentemente apontada para a tomada de decisões sobre preservação (CAMPOS eEHRINGHAUS, 2003; ALBUQUERQUE, 2004; MONTEIROet al., 2006). O problema relacionado à diminuição da biodiversidade envolve um conjunto de alterações, como reduções da heterogeneidade biológica em uma determinada região, por exemplo. Para se reverter o problema, é necessária uma melhor compreensão das relações entre a biodiversidade local e o ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 26

ecossistema. Logo, as ligações entre a diversidade total de espécies quimicamente úteis em determinada área esua disponibilidadepara as populações locais devem ser examinadas, para que tais recursos sejam preservados (ALBUQUERQUE eOLIVEIRA, 2007).

2.4 Família Sapotaceae

A família Sapotaceae possui distribuição tropical e subtropical, incluindo cerca de 60 gêneros contendo 1.343 espécies de hábito arbóreo e arbustivo. No Brasil ocorrem 14 gêneros e cerca de 200 espécies, com destaque para Chrysophyllum, Manilkara, Micropholis, Pouteria, Pradosia e Sideroxylon (ALMEIDA-JÚNIOR, 2010; THE-PLANT-LIST, 2013). As plantas pertencentes à família Sapotaceae são lenhosas, arbustivas ou arbóreas, com folhas alternas, raramente opostas ou verticiladas (Pradosia), simples, geralmente sem estípulas e com margem geralmente inteira. A Inflorescência é cimosa, frequentemente em panículas ou reduzidas a fascículos axilares; as flores são pouco vistosas, unissexuadas ou bissexuadas, actinomorfas, com estipes geralmente em número igual ou duplo ao das pétalas (SOUZA e LORENZI, 2005). Quimicamente, as espécies desta família são caracterizadas por apresentarem uma variedade de classes de substâncias, sendo os compostos mais conhecidos as saponinas, flavonoides, polifenois, triterpenos e politerpenos, naftol, benzoquinonas, carotenoides, esteroides, ácidos graxos, taninos e óleos essenciais, com diversas atividades biológicas, dentre elas, antiulcerogênica, antimicrobiana e antiviral (BERROUGUI et al., 2004; KUSHIMA, 2005; STEVENS, 2005, MONTENEGRO et al., 2006; BARBOSA- FILHO et al., 2008).

2.4.1 Gênero Manilkara

O gênero Manilkara é constituído por cerca de 35 espécies de hábitos arbóreos e arbustivos,sendo 19 destas espécies encontradas no Brasil, das ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 27

quais, 12 estão presentes na região Nordeste, sendo a Bahia o estado mais diverso (GOMES et al., 2010). No Brasil, os estudos floristicos que contemplaram a família Sapotaceae compreendem áreas pontuais e restritas de diferentes regiões do país. Ducke (1950) listou oito espécies amazônicas, três com ocorrência no Nordeste e três no Sudeste; segundo o autor, as espécies de Manilkara ocorrentes na floresta Amazônica, popularmente conhecidas como maçaranduba, maçaranduba- vermelha, maçaranduba verdadeira ou maparajuba (CORRÊA, 1978), tem importância não só pelo número, mas também pelo valor dos seus produtos (madeira e látex).Ducke (1957) revisou a listagem e reconheceu 16 espécies de Manilkara para o território nacional. No Nordeste, algumas listagens florísticas contemplaram a ocorrência de espécies de Manilkara, com destaque para os estudos desenvolvidos por Sales et al. (1998), que apresentaram um checklist da flora ameaçada dos brejos de altitude em Pernambuco; Barbosa et al. (2006) que também produziram umchecklist das plantas do Nordeste brasileiro; e Amorim et al. (2008) que inventariaram a flora da Reserva Biologica de Una, Bahia. Na região Norte, Ribeiro et al. (1999) e Pennington (2006) registraram as espécies de Manilkara ocorrentes na Reserva Ducke. Apesar da representatividade das espécies de Manilkara nos diferentes biomas (Amazônico, Atlântico, Caatinga e Cerrado), a floresta Atlântica possui a maior diversidade do gênero quando se considera apenas a região Nordeste do país (CALVENTE et al., 2005). Aplicações no tratamento de algumas enfermidades como,inflamação, dores no estômago e cicatrização de feridas, foram encontradas para algumas espécies do gênero Manilkara,que têm sido utilizadas popularmente como plantas medicinais. Estudos já realizados com espécies deste gênero mostraram diversas propriedades invitro (FERNANDES, 2011).Em seu trabalho Chanda e Parekh (2012) mostraram que extratos de Manilkarahexandra possuem atividade antibacteriana contra diversas espécies de interesse clínico,enfatizando assim a importância biotecnológica do gênero. Um ensaio de atividade antibacteriana in vitro contra 14 importantes bactérias patogênicas a humanos foi realizado com extrato aquoso das folhas deManilkara zapota, e revelou uma maior atividade inibitória contra ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 28

Staphylococcus aureus, Citrobacter sp., e Proteusmirabilis. (SATISH et al., 2008).Vários estudos já desenvolvidos com esta espécie mostraram que alguns tecidos da mesma apresentam propriedades biológicas diversas. As folhas e casca são utilizadas para tratar a tosse, resfriado, disenteria e diarreia. As atividades antimicrobianas e antioxidantes são também relatadas a partir de suas folhas (NAIR e CHANDA, 2008; KANERIA et. al., 2009). Os resultados do estudo desenvolvido por Osman et al. (2011) demonstraram claramente a atividade anti-cancerígena (carcinoma ascítico de Ehrlich)invivode extratos preparados com a casca e o caule de Manilkara zapota. Neste estudo eles obtiveram um prolongamento do tempo de vida dos animais avaliados, alem de uma diminuição na contagem de glóbulos brancos do sangue. Estes dois fatores são os critérios confiáveis para avaliar uma droga anticâncer segundo os autores. A casca da M. zapota também é utilizada tradicionalmente para o tratamento da febre e dor. O extrato etanólico preparado com a casca desta espécie mostrou uma inibição significativa em ensaios de edema da pata com ratos, induzido por injeção da carragenina. A atividade anti-inflamatória, observada pode ser devido a um efeito inibidor do extrato sobre a liberação de histamina e/ou serotonina (GANGULY et al., 2013). Ganguly et al. (2013) segerem que a presença de flavonóides, saponinas, taninos e glicosídeos no extrato bruto das folhas de M. zapota, sugerindo quea presença destes compostos pode ser responsável por sua atividade anti-inflamatória. Outros estudos também atribuem à atividade anti- inflamatória encontradas em extratos de plantas, a presença de fitoconstituintes como terpenóides eesteroides, alémdeoutros já citados (MULLA et al., 2010; ADJENE et al., 2012). M.rufula (Miq.) é uma árvore que mede de 5 a 10 metros de altura (figura 3-A); com ramo acinzentado, indumento tomentoso a puberulento, ferrugíneo a esbranquiçado. Suas folhas (figura 3-B)são alternas, distribuídas ao longo do ramo, raras no ápice do mesmo. O fruto (figura 3-C)apresenta-se oblongo- elipsóide, glabro, vermelho, alaranjado ou marrom. A M. rufula compartilha caracteres com M. dardanoi, diferindo por apresentar inflorescência de 5 a 8 flores, enquanto M. dardanoi possui flor solitária (LAM, 1941). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 29

M.rufula floresce entre os meses de outubro e janeiro, com maior intensidade de floração registrada em outubro; frutifica entre janeiro e maio, com pico de frutificação no mês de março (LAM, 1941). Está distribuída na região Nordeste (Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco, Piauí e Sergipe), em áreas de caatinga, cerrado e na transição caatinga-cerrado. Apresenta ocorrência na Paraíba e Rio Grande do Norte, além do registro na divisa entre os estados de Tocantins e Bahia em vegetação de cerrado (LAM, 1941). O último estudo relacionado à presença dessa espécie mostrou que M. rufula apresentava-se na categoria de baixo risco de extinção (IUCN, 2001), mas problemas com a destruição acelerada e perda das áreas de Caatinga e Cerrado, podem em um futuramente levar a mesma a ser incluída entre as espécies ameaçadas de extinção. Logo, faz-se necessária a tomada de medidas e projetos para conservação das populações de M. rufula para manutenção desses espécimes in situ.

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A

C

B C

Figura 3: Arvore (A), folhas (B) e frutos (C) de Manilkara rufula (ARCOVERDE, 2015).

2.5Compostos Bioativos

O metabolismo da planta é frequentemente dividido em duas classes principais: a) metabolismo primário, considerado aquele que permite uma planta utilizar água, dióxido de carbono e sais minerais para sintetizar os metabolitos primários essenciais (açúcares, ácidos graxos, aminoácidos e ácidos nucleicos), necessários para produzir e manter as células,estes compostos têm uma origem muito antiga e como tal, os genes requeridos para ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 31

a sua síntese são largamente conservados entre todas as plantas conhecidas; b) metabolitos secundários (também referidos como os produtos naturais, ou metabolitos especializados fitoquímicos), considerados como sendo os produtos químicos necessários para as interações de plantas com o meio ambiente (p.ex., compostos de defesa contra pragas e agentes patogênicos) (HURTADO-FERNÁNDEZ et al., 2011; KLIEBENSTEIN eOSBOURN, 2012). O nível de diversidade química de uma população vegetal pode ser associadoà intensidade com que a planta é estimulada a produzir novos compostos. Por exemplo, o ataque de patógenos pode estimular a produção de metabólitos como mecanismo autodefesa(BRAVO‑MONZÓN et al., 2014).Segue-se que a capacidade de evoluir e desenvolver novas vias metabólicas seja benéfica para adaptação a novos nichos ambientais, um aspecto essencial de especiação da planta. Isso levanta questões importantes sobre os mecanismos subjacentes à evoluçãometabólica em plantas (YONEKURA-SAKAKIBARA e SAITO, 2009; GOODSTEIN et al., 2012). A composição dos metabólitos individuais e as suas concentrações não são constantes, mas diferem de órgão para órgão, dentro do ciclo de desenvolvimento de uma planta e, além disso, inter e intra populações. Essa variação leva a formação de misturas complexas de metabólitos secundários, o que é, provavelmente, uma estratégia desenvolvida pelos vegetais contra a seleção de herbívoros ou patógenos especializados (WINK, 2008).

2.5.1 Metabólitos Primários

Os principais compostos produzidos pelas plantas são chamados metabólitos primários e se encontram em todas as células vegetais (PUENTES, 2009). Estes têm sido amplamente estudados na busca por novos fármacos e/ou por moléculas de interesse biotecnológico. Estresses bióticos e abióticos podem influenciar o metabolismo primário das plantas, afetando a produção de alguns metabólitos importantes como carboidratos, por exemplo (LAWO et al., 2011; SCHOEDL et al., 2013). Para os metabólitos primários, observou-se que o estresse hídrico leva a um aumento de mio-inositol e sacarose em algumas plantas, o que pode refletir seus respectivos papéis como osmoprotetores (GRIMPLET et al., 2009). Também foi ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 32

observado um aumento significativo de prolina em folhas de videira (DOUPIS et al., 2011) e bagas (DELUC et al., 2009), sob condições de déficit hídrico, assumindo que este aminoácido possa participar da proteção contra a formação de espécies reativas de oxigênio em excesso nos vegetais. Os metabólitos primários estão intimamente relacionados com o fenótipo de um organismo, podendo inclusive fornecer características nutricionais importantes ao mesmo (HOEKENGA, 2008). Sabe-se que as plantas se protegem contra organismos patogênicos por diversas respostas de defesa, que incluem a produção de peptídeos antimicrobianos a partir do seu metabolismo primário. Alguns destes produtos, tais como lectinas (LEI-LEI et al., 2011)e inibidores de proteases (LINGARAJU e GOWDA, 2008), são importantes componentes do sistema protetordos vegetais, podendo haver variações entre espécies quanto a sua produção (HOSSAIN et al., 2012).

2.5.1.1 Lectinas

As lectinas foram relatadas pela primeira vez em 1888, por Stillmark.Ao estudar a toxicidadede extratos deRicinuscommunis (mamona), ele observou a capacidade em aglutinar eritrócitos, devido à presença da “ricina”,proteína extraída desta planta (KENNEDY et al., 1995). Algum tempo depois, outra proteína com capacidade hemaglutinante, chamada “abrina”, foi encontrada em sementes deAbrusprecatorius (Jequiriti). Mesmo com estas descobertas, o estudo sobre lectinas só começou a ganhar força em 1960, abrindo uma ampla área de aplicação para estas proteínas (GABOR et al., 2004). O termo lectina (do latim lectus, que significa escolher) refere-se à destreza dessas proteínas em ligarem-se específica e reversivelmente a carboidratos (HE et al., 2013). As lectinas contêm pelo menos um domínio não catalítico que lhes permite reconhecer e ligar-se seletiva e reversivelmente a açúcares livres ou glicanos específicos, presentes em glicoproteínas e glicolipidios, sem alterar a estrutura dos mesmos (LEI-LEI et al., 2011). As lectinas interagem com carboidratos livres ou glicoconjugados através de um sítio de ligação específico e por ligações não covalentes. A diversidade estrutural das lectinas e a elevada especificidade de ligação ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 33

permitem a estas várias aplicações biotecnológicas, tais como reconhecimento de células e glicoproteínas (SOUZA, 2011) e monitoramento dos carboidratos na superfície celular (FAIS et al., 2009). Os procedimentos de isolamento e caracterização para estas proteínas geralmente envolvem rastreio pela sua capacidade de aglutinar células e precipitar glicoconjugadose o isolamento em colunas de afinidade com ligantes específicos (VILLANUEVA, 2002). As lectinas, quando imobilizados em suportes inertes, podem atuar como matrizes de afinidade para isolamento de outras moléculas (PAIVA et al., 2003; SILVA et al., 2011). Lectinas podem ser encontradas em animais (ALPUCHE et al., 2005;YANG et al., 2007), micro-organismos (BHOWAL et al.,2005;KHAN et al., 2007), e plantas,nestas elas são isoladas principalmente a partir de sementes, mas a sua ocorrência em outros tecidos vegetais, como folhas (COELHO eSILVA, 2000), rizomas (KAUR et al., 2005), tubérculos (KAUR et al., 2006), casca (SÁ et al., 2009a), cerne (SÁ et al., 2008) e raízes (WONG eNG, 2006),também foi relatada. As Lectinas vegetais estão distribuídas nas seguintes famílias: Leguminosae, Ligadoras de quitina, Ligadoras de manose de monocotiledôneas, Cucurbitaceae, Amaranthaceae, Jacalina e RIP Tipo 2 (PEUMANS e VANDAMME et al., 1998). A maioria das lectinas de origem vegetal apresenta especificidade por carboidratos simples (monossacarídeos) ou complexos (oligossacarídeos e glicanas), os quais podem ser de origem vegetal ou não, como N- acetilglicosamina e ácidos N-glucurônico, galacturônico, xilurônico, L-idurônico, siálico e N-acetilmurâmico (VANDAMME et al., 2008). Lectinas ligadoras de quitina têm sido estudadas do ponto de vista estrutural. As mais conhecidas são aquelas pertencentes à família das heveínas, assim chamadas por possuírem em comum o dominío heveínico como motivo estrutural de reconhecimento da quitina. Sendo especialmente rica em resíduos de glicina e cisteína, a estrutura da haveína é mantida por quatro pontes dissulfeto, o que lhe confere uma notável estabilidade, característica que se estende às demais lectinas da família das heveínas. Mesmo depois de aquecida a 90ºC por 10 minutos, a heveína ainda inibe o crescimento de fungos (NEUMANN et al., 2004). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 34

Lectinas tem uma importante participação nos processos fisiológicos das plantas. Segundo Charungchitrak et al., (2011) o papel das lectinas no sistema de defesas das plantas pode ter evoluído a partir da capacidade destas moléculas em aglutinar e imobilizar micro-organismos. As evidências para este papel são: a presença de lectinas em locais com potencial de invasão por agentes infecciosos, como sementes, e a ligação dessasproteínas a vários microrganismos e sua capacidade de inibir o crescimento destes. As lectinas, por terem a habilidade de se ligar especificamente a carboidratos, apresentam uma variedade de efeitos biológicos, alguns dos quais servindo como base para a aplicação das mesmas na investigação de atividades químicas e biotecnológicas. Estas proteínas têm sido sugeridas como compostos naturais para controle de insetos e fungos.Souza et al. (2011), isolaram lectina de raízes secundárias de B. monandra edemonstraram que essa proteína possui atividade antifúngica e termiticida, ratificando o potencial biotecnológico de lectinas para aplicações no controle de pragas agrícolas. A toxicidade das lectinas tem sido estudada com o objetivo de garantir segurança ao meio ambiente e a saúde humana. Vaz et al. (2010) avaliaram aLectina com atividade antifúngica obtida da casca de Sebstiania jacobinensis, aqual não apresentou efeito deletério sobre náuplias de Artemia salina e embriões de Biomphalaria glabrata, o que indica a baixa toxicidade dessas proteínas. Lam e Ng (2011) realizaram uma extensa revisão bibliográfica e concluíram Lectinas podem ser expressas com sucesso heterologamente para uma produção em larga escala. Podendo serem aplicadas em uma variedade de culturas para uso como estratégias de manejo integrado de pragas; provando que o uso dessas proteínas pode reduzir a carga de pesticidas químicos atualmente usados. Lei-Lei et al. (2011) relatam que lectinas de leguminosas são bem conhecidas por possuirem deversas funções biológicas tais como anti-tumoral, antiviral e anti-fúngicas. O crescimento de fungos é considerado um fator importante na biodeterioração de diversos materiais, como grãos armazenados, madeira, pinturas, esculturas, couro e óleo (STERFLINGER, 2010). Espécies de ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 35

Fusarium podem causar várias doenças no trigo (WAGACHA eMUTHOMI, 2007), tomate (AGRIOS, 2005), amendoim (ROJO et al., 2007), e de outras culturas. Efeito antifúngico sobre Fusarium foi relatado a partir de lectinas isoladas de raízes de Astragalusmongholicus (YAN et al., 2005), cerne em Myracrodruonurundeuva (SÁ et al., 2009b), e cascade Sebastianiajacobinensis (VAZ et al., 2010) e raízes de B. monandra (SOUZA et al., 2011).Lei-Lei et al. (2011) também afirmam quelectinas de leguminosas são bem conhecidas por possuirem deversas funções biológicas tais como anti-tumoral, antiviral e antimicrobiana.

2.5.1.1.2 Inibidores de tripisina

Os inibidores de protease estão amplamente distribuídos na natureza, podendo ser encontrados em diversas espécies vegetais, variando desdepequenas moléculas até peptídeos e proteínas de alto peso molecular (IBRAHIM e PATTABHI, 2005).Geralmente são proteínas que interagem específica e reversivelmente com enzimas proteolíticas, podendo promovendo sua inibição por meio da competição com o substrato pelo sítio ativo da enzima (LASKOWSKI-Jr. e QASIM, 2000; LINGARAJU e GOWDA, 2008). Desta forma, essas proteínas são classificadas de acordo com a sua especificidade de interação e podem afetar a atividade de serinoproteinases, cisteínoproteinases, proteinases aspárticas e metaloproteinases (TREMACOLDI e PASCHOLATI, 2004). Diversas atividades biológicas têm sido relatadas envolvendo inibidores de protease, por exemplo, como agentes farmacológicos no combate a nematóides (SAMAC e SMIGOCKI, 2003),na agriculturacontra insetos causadores de pragas (TELANG et al., 2003), para avaliação da lipodistrofia associada ao HIV em humanos (DIEHL et al., 2008), também quanto a sua ação inseticida e antimicrobiana (MARINHO et al., 2008). Essa duas classes de proteínas vegetais, lectinas e inibidores de proteases, têm sido investigadas pelas suas aplicações em diversos processos biológicos e em futuro próximo essas podem vir a se tornar importantes ferramentas biotecnológicas.

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2.5.2 Metabolitos Secundários

Metabólitos secundários, também referidos como compostos naturais, são os produtos oriundos do metabolismo celular, não sendo essenciais para o crescimento normal, desenvolvimento ou a reprodução de um organismo, sendo utilizados para satisfazer as exigências secundárias do mesmo, por exemplo, na competição para sobrevivência interespécies, fornecendo mecanismos de defesa (VAISHNAV e DEMAIN, 2011). Plantas, bactérias, fungos e organismos marinhos, como esponjas, tunicados e corais são fontes bem conhecidas de metabólitos secundários. Muitos destes compostos provaram valor inestimável como agentes antibacterianos ou antifúngicos, drogas anticâncer, agentes de redução de colesterol, imunossupressores, antiparasitários, herbicidas e ferramentas para diagnósticos e pesquisa (VAISHNAV e DEMAIN, 2011). Os metabólitos secundários foram considerados durante muito tempo, produtos de excreção do vegetal, sem função definida sendo apenas produtos uriundos do metabolismo celular (SANTOS, 2004; ALMEIDA-CORTEZ, 2005). De acordo com Macel e Klinkhamer (2010), os metabolitos secundários de plantaspodem variar dentro e entre as populações,podendopermitir que os indivíduos sejam agrupados em função da proporção relativa de cada composto que se é encontrado. A variabilidade química destes metabólitos desempenha um importante papel, por exemplo, nas relações planta-inseto, determinando a fragilidade da planta ou resistência da mesma a predadores. A coevolução entre plantas, insetos, microrganismos e mamíferos conduz à síntese desses metabólitos como forma de defesa ou atração. Estima-se que o número desses compostos ultrapasse 400 mil, sendo em sua maioria nitrogenados, terpenóides e fenólicos, podendo ser encontrados em várias partes da planta e suas concentrações variando com a idade (LARA, 1991;SIMAS et al., 2004). Nas plantas, os metabólitos secundários têm um papel importante no processo de adaptação ao seu ambiente, contribuindo para que as mesmas possam ter uma boa interação com os diferentes ecossistemas. Os produtos secundários também aumentam a expectativa de sobrevivência de uma dada espécie, por estarem envolvidos em diversas atividades biológicas com este ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 37

fim, atuando, por exemplo, como antimicrobiano, protegendo a planta de patógenos, podendo apresentar ainda atividades antigerminativas ou tóxicas para outros vegetais como as fitoalexinas (FUMAGALI et al., 2008). A produção de metabólitos deve estar relacionada, ao menos parcialmente, com a imobilidade das plantas, em vista de não poderem escapar das pressões ambientais pelo movimento, restando suas defesas estruturais e a produção e/ou acumulação de substâncias químicas (ALMEIDA-CORTEZ, 2005). Esta relação de metabolitos secundários com o ambiente biótico transmite uma pressão evolutiva sobre plantas para criar novos compostos e como tal, a maioria dos metabolitos secundários são de linhagem específica (KLIEBENSTEIN e OSBOURN, 2012). A importância ecológica do metabolismo secundário é ilustrada pela observação de que mutantes vegetais que lhes faltam alguns metabólitos específicos comumente não conseguem sobreviver no ambiente, de forma que esses genótipos seriam rapidamente extintos em competição com plantas do tipo selvagem (ZUEST et al., 2011). Assim, metabólitos secundários são passíveis de serem tão essenciais para o sucesso de uma planta no ambiente natural quanto um metabolito primário (KLIEBENSTEIN eOSBOURN, 2012). Acredita-se que estruturas celulares reforcem a síntese de metabólitos secundários para se protegerem contra efeitos oxidativos sob condições estressantes. Dentre estes compostos incluem-se algumas vitaminas, terpenóides, carotenóides, óleos essenciais e compostos fenólicos, que são importantes em plantas para o seu desenvolvimento, crescimento normal e defesa contra infecções (MAZID et al., 2011). Em muitas plantas, esses metabólitos podem reduzir a disponibilidade de proteínas para herbívoros. Estes compostos se ligam às proteínas e inibem a sua digestão. Insetos que se alimentam de plantas ricas em taninos podem reduzir os efeitos inibitórios deste, pela produção de surfactantes que se assemelham a detergentes, em seus fluidos intestinais (SIMAS et al., 2004). Estudos mostram que a presença desses metabólitos pode conferir resistência a planta frente a alguns predadores, por exemplo, os alcaloides pirrolizidina em Seneciojacobaea e a traça especializada Tyriajacobaeae (MACEL e KLINKHAMER, 2010); alguns glucosinolatos em Brassicaoleracea e larvas dos herbívoros Pierisrapae e Mamestrabrassicae (POELMAN et al., 2009.); ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 38

glicosídeos fenólicos em Populustremuloides e larvas da mariposa Lymantriadispar (DONALDSON e LINDROTH, 2007); terpenoides em Perseaamericana e aTriozapsyllid formadores de galhas (TORRES-GURROLA et al., 2011). A avaliação da variabilidade de metabólitos químicos é importante para o entendimento das interações da planta com o ambiente, principalmente na compreensão da estrutura química em nível de população, o que pode facilitar a busca por agentes biologicamente ativos, concentrando-se em áreas selecionadas, em vez de toda a distribuição de espécies (BRAVO‑MONZÓN et al., 2014). Devido às inúmeras atividades biológicas dos metabólitos secundários de plantas, estes vêm sendo utilizados há séculos na medicina popular e nos dias atuais, como medicamentos, cosméticos, matéria-prima para a química fina e outros fins diversos (BIAVATTI et al., 2007; SAÚDE-GUIMARÃES e FARIA, 2007; BARBOSA-FILHO et al., 2008). As plantas podem apresentar importante atividade antioxidante devido a produção de compostos polifenólicos. Os flavonoides e terpenóides, principalmente, apresentam-se como corantes e pigmentos de plantas, funcionando também como antioxidantes potentes (HOSSAIN et. al. 2012). A riqueza em metabólitos secundários garante vantagens às plantas para a sua sobrevivência (SANTOS, 2004). Estes metabólitos podem ser classificados quanto à sua estrutura química: nitrogenados (alcalóides, aminoácidos não-protéicos e glicosídeos cianogênicos), terpenóides (triterpenos, saponinas e glicosídeos cardioativos) e fenólicos (ligninas, flavonóides e taninos) (SANTOS, 2004; CARVALHO et al., 2004).

2.5.2.1 Classificação

2.5.2.1.1 Compostos Fenólicos

Os compostos fenólicos são um grupo diverso de substâncias, podendo ser constituídas por moléculas simples de baixo peso molecular até moléculas altamente complexas de peso molecular elevado. Devido a grande diversidade em sua estrutura, eles possuem diferentes propriedades, tais como solubilidade ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 39

e polaridade que lhes permite ter diferentes interações com outras moléculas (JAKOBEK, 2015). Compostos fenólicos podem interagir uns com os outros e com outras moléculas que os rodeiam. Moléculas maiores têm um maior número de grupos hidroxila, o que as torna mais susceptíveis a um grande número de interações com outros compostos. Mesmo aqueles com uma estrutura mais simples estão frequentemente associados com unidades de açúcar, que por sua vez aumentam o número de grupos hidroxila da molécula, elevando a capacidade de interação da mesma(JAKOBEK, 2015). Shishikura et al. (2006) estudaram o processo de emulsificação in vitro e a influência de polifenóis no mesmo. Um modelo de emulsão de azeite, fosfatidilcolina e sais biliares foi criado para simular pequenas condições intestinais. Verificou-se que os polifenóis do chá verde e preto afetaram as emulsões, aumentando o tamanho das gotas e diminuindo a área superficial específica. Os altores sugeriram que as interações entre os polifenóis do chá e fosfatidilcolina foram razões para tal acontecimento. Estes com estes compostos revelaram que os mesmos possuem algumas atividades biológicas importantes, como por exemplo, propriedades anticancerígenas (BELLION et al., 2010) e prevenção contra doenças cardiovasculares (HOLLMAN et al., 2011).

2.5.2.1.1.1Fenóis

Os fenóis, simples e ácidos fenólicos,constituem um grupo de compostos fitoquímicos bastante diversificado, oriundos do metabolismo secundário das plantas (DEY eKUHAD,2014).Galotaninos (taninos hidrolisáveis) e proantocianidinos (taninos condensados) são compostos que contem várias unidades básicas de polifenóis interligados numa estrutura maior e mais complexa (CROZIER et al., 2009; LANDETE, 2011). Por outro lado, os ácidos fenólicos são um grupo de fenóis das plantas que têm estruturas relativamente simples, mas também podem ser ligados a unidades de açúcar. Eles são um grande grupo de fenóis hidrofílicos (JAKOBEK, 2015). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 40

Estruturalmente, o grupo dos fenóis apresenta um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxila; que variam desde moléculas simples a compostos altamente polimerizados (KSOURIet al., 2009). Ao longo das últimas décadas, estes compostos tornaram-se populares por sua aplicação potencial na prevenção de várias doenças crônicas(onde os mesmos agem protegendo as células por suas propriedades antioxidantes), onde podem ser citados os problemas cardiovasculares, câncer, osteoporose, diabetes melitus e doenças neurodegenerativas(MARTINSet al., 2011). A capacidade antioxidante de extratos de polifenóis depende não só da qualidade da biomassa de partida (origem geográfica, condições climáticas, data de colheita e das condições de armazenamento), mas também dos processos tecnológicos envolvidos na sua produção (NKHILI et al., 2009).Diferentes estratégias de extração (líquido-líquido/sólido-líquido) utilizando solventes convencionais têm sido empregadas para a obtenção de compostos fenólicos oriundosde vegetais, como por exemplo, a extração em Soxhlet, maceração, extração assistida por microondas, extração por alta pressão hidrostática e extração com fluido supercrítico (IGNAT et al., 2011). De acordo com Ksouriet al.(2009) os compostos fenólicos agemcomo mediadores em reações oxidativas, podendo portanto ser usados na prevençãodo envelhecimento precoce, além de outras doenças associadas a ação de radicais livres.Segundo Jaramillo et al. (2010), legumes e frutas são boas fontes destes fenóis. Por este motivo acredita-se que a ingestão de frutas e vegetais frescos esteja relacionada com a redução de doenças cardiovasculares e câncer. Experimentos com modelos animais têm demonstrado que polifenóis do chá verde reduziram os danos oxidativos causados por radicais aniônicos superóxido e aumentaram a expectativa de vida no organismo modelo Caenorhabditiselegans. Ainda, estes polifenóis também se mostraram capazes de reduzir a formação de oligômeros ß-amiloide envolvidos na doença de Alzheimer(ABBAS e WINK, 2009). Os produtos da oxidação de fenóis recebem o nome de quinonas, sendo as antraquinonas as mais conhecidas, devido a seu alto número presente na natureza. As antraquinonas possuem um papel na defesa das plantas, apresentando toxicidade para diversos insetos herbívoros, proteção contra o ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 41

ataque de fungos e alelopatia, onde a planta libera substâncias no ambiente,as quais são capazes de inibir o crescimento de espécies competidoras (FALKENBERG, 2003). Cumarinas também são constituintes fenólicos derivados do metabolismo da fenilalanina e estão amplamente distribuídas nos vegetais, podendo ser encontradas em todas as partes de uma planta (KUSTER e ROCHA, 2003).

2.5.2.1.1.2Flavonóides

Flavonóides constituem uma classe de numerosos compostos quimicamente diversos que ocorrem em muitas frutas, legumes e especiarias (CARLSEN et al., 2010). Estudos sobre estes compostos vêm sendo realizados há muito tempo e suas propriedades quimiopreventivas estão bem estabelecidas e documentadas na literatura (KNASMÜLLER et al.,2009). São eles, dentre outras coisas, os responsáveis pela cor, sabor e aroma de frutas e flores, desempenhando assim o importante papel de atraentes ou repelentes de insetos e herbívoros (WOJAKOWSKA et al., 2013). Flavonóides e seus derivados constituem um expressivo grupo, diferenciado, de metabólitos secundários em plantas. Estes compostos desempenham importantes papeis fisiológicos e bioquímicos, em muitos processos celulares (ANDERSEN eMARKHAM, 2006). Representam um dos maiores grupos de compostos fenólicos, podendo ser classificados em várias subcategorias como antocianidinas, flavonóis, flavonol (catequinas e proantocianidinas), flavanonas, flavonas e isoflavonas (CROZIER et al., 2009). Os flavonoides possuem uma estrutura básica semelhante, consistindo de dois grupos fenil ligados entre si por uma ponte com três carbonos comumente ciclizados com oxigênio. São diferenciados de acordo com o grau de insaturação e oxidação do segmento de três carbonos. Além disso, várias moléculas de açúcar podem ser ligadas à estrutura dos flavonoides, sobre os seus grupos hidroxila, que tornam o arranjo destas moléculas mais complexo (figura 4). Geralmente eles são encontrados em formas glicosídicas eessa glicosilação os torna mais solúveis em água (JAKOBEK, 2015).

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Flavanols

Flavona Flavanonol

Estrutura Geral dos Flavonoides

Flavonol Isoflavona Flavonona

Figura 4: Estrutura química geral dos flavonoides e suas diferentes classes. FONTE: (RAVISHANKAR et al., 2013).

Os flavonóides, bem como outros compostos fenólicos, apresentam importantes funções nas plantas (ARAÚJO et al., 2008), inclusive em taxonomia, utilizados especialmente para distinguir espécies estreitamente relacionadas (JUDD et al., 2007). Flavonóides podem afetar também as funções das células ligadas a processos inflamatórios no corpo humano, agindo sobre as enzimas e vias envolvidas neste processo, como, por exemplo, interferindo na produção de prostaglandina E2 e Ciclooxigenases-2 (TALHOUK et al., 2007). O interesse neste grupo de compostos é crescente, devido às suas inúmeras funções em plantas, bem como os seus efeitos benéficos sobre a ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 43

saúde humana. A Identificação de metabólitos derivados fenólicos presentes em extratos de plantas é uma tarefa importante em estudos nas muitas áreas de pesquisas biológicas ou médicas (WOJAKOWSKA et al., 2013).Nos últimos anos, os flavonóides e os seus análogos sintéticos têm sido intensamente investigados no tratamento de alguns tipos de câncer (ovário, mama, cervical, pâncreas, próstata) (LIN et al., 2009; LAZAREVIC et al., 2011).

2.5.2.1.1.3Taninos

Inicialmente os taninos foram identificados pelo seu sabor adstringente e por sua capacidade de precipitar proteínas. Esses compostos podem ser encontrados em muitas plantas que são utilizadas pelo homem como ervas medicinais, na alimentação e na fabricação de bebidas. Nos vegetais, os taninos podem ser encontrados em suas raízes, flores, frutos, folhas, cascas e na madeira (QUEIROZ et al.,2002). Estes compostos apresentam solubilidade em água e peso molecular compreendido entre 500 e 3000 Dalton, possuindo a habilidade de formar complexos om proteínas e alcalóides (MELLO e SANTOS 2001). Existem duas classes principais de taninos: hidrolizáveis e condensados (também conhecidos como proantocianidinas, assim denominados provavelmente pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas) (QUEIROZ et al., 2002; SCIONEAUX et al., 2011). Os taninos hidrolisáveis consistem de ésteres de ácidos gálicos e seus dímeros (ácido digálico ou hexaidroxidifênico e elágico) ligados a monossacarídeos, principalmente a glicose, sendoos taninos elágicos bem mais frequentes que os gálicos. Dentro dos taninos condensados, existem vários subtipos que diferem na estereoquímica e padrão de hidroxilação dos flavonoides, sendo denominados grupos constitutivos (SCIONEAUX et al., 2011). Taninos condensados são oligômeros ou polímeros de dois ou mais flavonoides, geralmente catequinas e epicatequinas, e frequentemente as correspondentes galocatequinas tri-hidroxiladas. Dois dos taninos condensados mais comuns são: as procianidinas e as prodelpinidinas, cadeias lineares de flavanol com ligações via C4-C8 (Figura5) (SCIONEAUX et al., 2011). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 44

No entanto, as diferenças de ligações e composição de subunidades também contribuem para a diversidade da estrutura do tanino condensado(figura 6). Por fim, outros tipos de compostos fenólicos podem ser conjugados com taninos oligoméricos, tais como o ácido gálico. É importante notar que detalhes estruturais nos taninos podem influenciar diretamente seus efeitos biológicos (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011). Os taninos condensados perfazem, aproximadamente, a metade da matéria seca da casca de muitas árvores. Eles constituem a segunda fonte de polifenóis do reino vegetal, perdendo apenas para a lignina (QUEIROZ et al., 2002). Os mesmos podem se acumular nos vacúolos, frequentemente nas camadas epidérmicas ou subepidérmicas de folhas e frutos (McMAHON et al., 2000). As plantas lenhosas tendem a sintetizar taninos mais do que as herbáceas, mas há muitas exceções. As gramíneas são desprovidas destes compostos, e algumas famílias de plantas, que incluem membros produtores de lenhas, não sintetizam taninos. Eles são encontrados em coníferas e espécies caducifólias, bem como em árvores tropicais.A concentração de taninos é uma característica altamente plástica, que varia com o genótipo da planta, tecido, estágio de desenvolvimento e condições ambientais (McMAHON et al., 2000; OSIER eLINDROTH, 2001). Alguns grupos de taninos podem agir sobre o metabolismo do ácido araquidônico desempenhando importante função no processo inflamatório (OKUDA, 2005).Araújo et al. (2008) diz que as atividades anti-inflamatória, analgésica e anti-úlcerogênica da casca de Myracrodruonurundeuva (aroeira), observadas em ratos, estão relacionadas a um aumento na concentração de compostos secundários produzidos por esta planta, especialmente taninos. Na literatura são encontrados diversos relatos que demonstram os efeitos benéficos, principalmente antioxidantes, de uma dieta com níveis moderados de taninos condensados (PRIOR e GU, 2005; RASMUSSEN et al., 2005). Devido a sua capacidade de eliminar os radicais livres, ou reduzir outros compostos oxidados, e formar radicais semiquinonas relativamente estáveis, estes compostos podem atuar como antioxidantes no organismo (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

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Figura 5: Dímeros comuns de taninos condensados, (proantocianidinas) encontrados em plantas. Variação estrutural, devido aos tipos de ligações. FONTE: (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

Assim como em insetos herbívoros, os taninos também podem ser prejudiciais para animais vertebrados. Diversos efeitos tóxicos do ácido tânico, por exemplo, já foram relatados para diversos animais domésticos, incluindo bovinos e suínos (MUELLER-HARVEY, 2006). A toxicologia de taninos em herbívoros e mamíferos tem recebido pouca atenção. A questão chave é o nível que os taninos são degradados ou absorvidos durante a digestão, visto que as moléculas menores são as que exercem maiores efeitos farmacológicos ou tóxicos, quando comparados aos taninos com maior peso molecular (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011). Segundo Prior e Gu (2005) e Rasmussen et al. (2005) apenas taninos condensados com um baixo grau de polimerização, tais como os dímeros, são eficientemente absorvidos pelos herbívoros. Nos animais vertebrados, como os humanos, acredita-se que estes compostos permanecem intactos em suas vísceras. Há inúmeras questões que ainda estão pendentes sobre taninos. Por exemplo, as razões pelas quais as plantas produzem muitas estruturas diferentes destes compostos permanecem um mistério. A questão maior é ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 46

quais são as diferenças funcionais entre as distintas estruturas de taninos em papéis como antimicrobianos e toxinas.Apesar de várias pesquisas realizadas sob diferentes abordagens com teores de taninos, a associação dessas informações com o aproveitamento de plantas medicinais ainda deve ser mais bem explorada (MONTEIRO et al., 2006; BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

2.5.2.1.2Terpenóides

Dentre os metabólitos produzidos pelas plantasos terpenóides aparecem como a maior classe, com cerca de 50.000 estruturasjá identificadas (NIOGRET et al., 2013). São bastante diversificados quimicamente, e quando associados a outras moléculas, podem formar outros compostos secundários (COLEY e BARONE, 2001). Os terpenos podem alterar o ambiente abiótico local, através da qualidade do ar e, portanto, do clima local; por exemplo, florestas de eucaliptos australianas são conhecidas por liberarem terpenos, principalmente durante o dia, mudando a composição iônica do ar, resultando em altas temperaturas locais e baixa umidade local e chuvas (SUNI et al., 2008; VICKERS et al., 2009). Uma planta pode sintetizar vários terpenóides. As diferenças qualitativas e quantitativas podem ser observadas em diferentes estágios do desenvolvimento e os perfis químicos podem variar em seus diferentes tecidos e órgãos (WINK et al., 2003; BRENES-ARGUEDAS e COLEY 2005). Essas mudanças na proporção de terpenóides em diferentes locais são resultantes da acumulação, transformação e/ou emissão desses compostos (NIOGRET et al., 2013).

Terpenóides, principalmente os monoterpenos C10 e C15-sesquiterpenos, são conhecidos por desempenhar um papel importante na biologia e ecologia de plantas, direta ou indiretamente, e influenciar suas interações com o meio ambiente(CHENG et al., 2007). Eles foram identificados como sendo tóxicos podendo repelir os ataques de herbívoros (BYERS et al., 2004). Além da ação contra herbívoros, os terpenos desempenham outras funções de grande importância nas interações entre plantas, animais e micro-organismos. Os ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 47

terpenos também podem ser considerados como “feromônios”, aleloquímicos, hormônios vegetais e agentes de atração polínica (TAIZ e ZEIGER, 2004). As plantas geralmente produzem misturas complexas de terpenóides que podem diferir significativamente entre as espécies. Para os indivíduos da mesma espécie, estas misturas frequentemente diferemna proporção e quantidade de cada composto químico, proporcionando fenótipos químicos distintos (CHENG et al., 2007). Padrões e variações fenotípicas em metabólitos secundários de plantas têm forte importância ecológica,sendoum fator relevante para a compreensão da história evolutiva de populações naturais (ANDREW et al., 2007). Estes compostos são detentores de um metabolismo e bioquímica especial, sendo responsáveis por caracterizarem cada espécie vegetal, e funcionando como um elemento de diferenciação e especiação, que possibilita a garantia de sobrevivência e propagação em seus ecossistemas (SANTOS, 2003). Os triterpenóides compreendem um grupo de substâncias de origem natural derivadas predominantemente do esqualeno, um precursor acíclico com 30 átomos de carbono. Este grande grupo de produtos naturais reúne cerca de 100 esqueletos químicos distintos. Durante o processo bioquímico de formação dessas substâncias podem ocorrer diversas ciclizações, gerando moléculas complexas como os triterpenos tetracíclicos e pentacíclicos (XU et al., 2004). Dentre as diversas atividades biológicas relatadas para triterpenos, podemos citar os efeitos antiinflamatórios, hepatoprotetores, analgésicos, antimicrobianos, antimicóticos, imunomodulatórios e tônicos (MUFFLER et al., 2011).

2.5.2.1.2.1 Esteróides

Os terpenóides compõem uma grande e estruturalmente diversificada família de compostos naturais, derivada de unidades isoprênicas. Os compostos terpênicos podem ser classificados de acordo com a quantidade de unidades isoprênicas em: monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 48

Segundo Dewick (2002) os esteróides são triterpenóides modificados. A união de duas moléculas de farnesildifosfato (C15) irá formar os triterpenos e esteróides, elas se ligam cauda-cauda para formar o esqualeno que sofrerá uma epoxidação catalisada por enzima gerando o esqualeno-2,3-óxido. Os esteróides de fungos, plantas e algas podem ter um ou dois carbonos extras ligados ao C24 da cadeia lateral em sua molécula (figura 6). Estes metabólitos são encontrados como glicosídeos ou como álcool livre (3-OH), esterificados a ácidos graxos, sendo constituintes das membranas dos organismos citados anteriormente, podendo afetar a sua permeabilidade (DEWICK, 2002; GROS, 1985).

Figura 6: Estrutura básica dos esteróides com a respectiva numeração dos seus carbonos.

2.5.2.1.3 Saponinas

Saponinas são uma das muitas classes de metabólitos secundários encontrados em fontes naturais, particularmente abundantes em várias espécies de plantas, mas também presentes em alguns organismos marinhos e insetos (THAKUR et al., 2011). Devido às suas propriedades químicas, as saponinas são capazes de interagir com as membranas celulares e de diminuir a tensão superficial de uma solução aquosa. Esta atividade é a razão para o nome "saponina", ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 49

derivado da palavra latina "sapo", que se refere à formação de uma espuma estável como espuma de sabão em solução aquosa (MELZIG et al., 2001). De acordo com o carácter químico da aglicona (conhecido como sapogenina), elas podem ser classificadas em dois grupos com base na natureza do seu esqueleto: um grupo de saponinas esteroidais e um grupo de saponinas triterpenóides (HOSTETTMANN e MARSTON, 2005). Saponinas esteroidais de plantas são principalmente os compostos contendo 27 átomos de carbono que formam as estruturas do núcleo espirostano (figura 7) e furostano. Na natureza, as saponinas consistem principalmente de derivados espirostano chamadas de saponinas "reais", ou neosaponinas, sendo raros os relatos de derivados de furostano. Alguns autores também levam em consideração os glicosídeos de alcalóides esteroidais e cucurbitacinas para a classificação química de saponinas (THAKUR et al., 2011). O amplo espectro de saponinas é resultado principalmente de um grau variável de hidroxilação na aglicona. Grupos metila em posições epecíficas também podem ser oxidados dando origem a outros radicais. Este arranjo estruturalde um elemento é especialmente interessante nestes compostos, com efeitos específicos sobre suas atividades farmacológicas (THAKUR et al., 2011).

Figura 7: Estrutura do núcleo de espirostano. FONTE: (THAKUR et al., 2011).

As saponinas mais conhecidas são metabólitos secundários produzidos em Magnoliophyta, abrangendo tanto dicotiledôneas quanto monocotiledôneas. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 50

Sendo as saponinas esteroidais produzidas especialmente em algumas famílias de monocotiledôneas, e as saponinas triterpenóides encontradas principalmente em dicotiledôneas. Cerca de 60 famílias deste taxon produzem este tipo de saponina, dentre elas a Sapotaceae (THAKUR et al., 2011). Estas saponinas são compostos possuidores de diferentes propriedades farmacológicas, como: atividade antimicrobiana, insecticida, moluscicida (ODA et al, 2000; SPARG et al, 2004; MAZZA e GUCLU, 2007), e, recentemente, foram avaliadas quanto à sua atividade antitumoralinvitro (ESKANDER et al., 2013). Existem saponinas presentes em inúmeras espécies vegetais que apresentam toxicidade para diversos artrópodes, incluindo insetos herbívoros (COLEY e BARONE, 2001). A toxicidade destas saponinas está associada à capacidade desta substância em formar complexos com esteróis, dando origem a compostos importantes que podem interferirna muda de muitos insetos, por exemplo. Estes complexos interferem na absorção dos esteróis pelo sistema digestivo dos animais, promovendo uma desorganização das membranas celulares depois que entram na corrente sanguínea. Desta forma, a ação das saponinas acaba por interferir no desenvolvimento dos insetos (GUREVITCH et al., 2009). Saponinas isoladas a partir de plantas mostraram, invitro,a capacidade de inibição de crescimento celulare indução a apoptose em linhagens tumorais (PARK et al., 2010). Sua atividade citotóxica foi descrita para uma gama destes compostos, e novos relatos continuam a aparecer na literatura (WENG et al., 2008; PODOLAK et al., 2010). Um dos problemas associados com o uso destes metabólitoscomo agentes antitumorais é a sua elevada toxicidade singular, a qual é acompanhada de uma correlação enganosa entre dados in vitro e in vivo, este fato complica o possível uso das saponinas como agentes citotóxicos no cenário clínico (GAUTHIER et al., 2009). Segundo Thakur et al. (2011) estudos desenvolvidos até o momento, mostram que as saponinas seguramente apresentam um grande potencial terapêutico, e com o avanço da nanotecnologia, é correto afirmar que saponinas em forma de nanopartículas futuramente poderão mostrar diversas aplicações biotecnológicas. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 51

2.5.2.1.4 Compostos Nitrogenados

2.5.2.1.4.1Alcaloides

Os alcalóides, segundo Coley e Barone (2001), são os metabólitos secundários estrutural e bioquimicamente mais diversificados. Hoje, cerca de 10.000 alcalóides já foram identificados, sendo os mais conhecidos a cocaína, a nicotina, a morfina e a cafeína (RAVEN et al., 2001). Alcaloides são compostos nitrogenados farmacologicamente ativos, encontrados predominantemente nas angiospermas. Em sua grande maioria, possuem caráter alcalino, com exceções tal como colchicina, piperina, oximas e alguns sais quaternários como o cloridrato de larifolina (SIMÕES et al., 2004). Alcalóides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal, podendo haver acúmulo preferencial dessas substâncias em um ou mais órgãos. Estes metabólitos se subdividem em inúmeras subclasses, de acordo com o seu aminoácido precursor: triptofano (alcaloides indólicos e quinolínicos), ornitina e lisina (alcaloides pirrolidínicos, tropânicos, pirrolizidínicos, piperidínicos e quimolizidínicos), fenilalanina e tirosina (protoalcaloide, alcaloides isoquinolínicos e benzilisoquinolínicos). Os alcaloides pirrolizidínicos apresentam ação protetora na planta contra predadores, sendo substâncias muito tóxicas, agindo de maneira deletéria principalmente sobre hepatócitos (COSTA, 2008). Muitos podem atuar sobre componentes do sistema nervoso de predadores, afetando o transporte nas membranas, à síntese e atividade proteica. A planta contendo alcalóides pode aumentar a quantidade deste composto, após uma agressão, como resposta ao dano inicial provocado por herbívoros, fortalecendo dessa forma o vegetal contra futuros ataques (TAIZ e ZEIGER, 2004; DEL-CLARO e TOREZAN- SILINGARDI, 2012).

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2.5.4 Atividdades Biológicas deMetabólitos Secundários

2.5.4.1Atividade Antioxidante

O conhecimento acerca das espécies reativas de oxigênio (EROs), um subproduto do metabolismo normal, tem despertado grande interesse nas últimas décadas, devido a sua participação em várias situações clínicas.EROs podem ser produzidos em células como uma resposta a diversos fatores, como por exemplo, tensões térmicas, agentes químicos e radiação UV e ionizante. Dentre outras causas o estresse oxidativo pode promover danos ao DNA, inibição das funções celulares e a peroxidação dos lipídios e proteínas. Ademais, os EROs contribuem para o desenvolvimento do câncer, diabetes, arteriosclerose, doenças inflamatórias, e envelhecimento (DAKAH et al., 2014). Alguns benefícios trazidos à saúde pelas plantas são, em parte, atribuídos aos componentes antioxidantes, incluindo vitamina C, vitamina E, glutationa, carotenóides, ácidos fenólicos e flavonóides (XIA et al., 2012). Os polifenóis presentes em vários vegetais são relatados como possuidores de boas propriedades antioxidantes e protegem contra os danos celulares causados pelos EROs. O dano ao DNA induzido pelos radicais livres é um evento comum em todas as células vivas, sendo uma das principais formas de agressão, podendo levar ao aparecimento de várias doenças. Nos últimos anos, houve um crescente interesse na identificação de captadores de radicais livres ou antioxidantes que inibissem a ação dos EROs sobre o DNA (GIRISH et al., 2012). Acredita-se que geralmente as plantas com maior conteúdo de compostos fenólicos apresentam boa atividade antioxidante, pois sabe-se que há uma correlação direta entre o teor de fenóis totais e atividade antioxidante (BARAVALIA et al., 2009; GHOLIVAND et al., 2010). Kaneria et al. (2009), mostraram que o extrato metanólico de M. zapota é rico em conteúdo fenólico e mostraram ter uma boa atividade sequestradora de radicais livres DPPH.

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 53

2.5.4.2 Atividade Antimicrobiana

O aumento da resistência a múltiplas drogas em microrganismos patogênicos associado a efeitos colaterais indesejáveis de determinados antibióticos tem promovido um grande interesse pela busca de novos compostos de origem vegetal com potencial antimicrobiano (KRISHNAIAH et al., 2007; KANERIA e CHAND, 2012). Nos últimos 20 anos, tem se intensificado o interesse por produtos naturais como fontes de novos agentes com potencial terapêutico (CHANDA e PAREKH, 2010; TRENTIN et al., 2011). Bactérias e fungos são agentes causadores de importantes doenças, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Apesar da existência de vários antibacterianos e anti-fúngicos potentes, nas últimas décadas nota-se um exorbitante aumento da resistência aos medicamentos convencionais (CHANDA e PAREKH, 2010), oque tornou-se um importante problema de saúde pública (HÜBSCH et al., 20014). O interesse em pesquisar plantas com propriedades medicinais tem aumentado, sobretudo, com o objetivo de identificar alternativas para superar essa resistência desenvolvida (AIYEGORO e OKOH, 2009). Há, no entanto, consenso entre diversos estudos, que compostos antimicrobianos derivados de plantas apresentam uma potência inferior aos sintéticos (VAN-VUUREN e VILJOEN, 2011).Esse fato tem impulsionado a pesquisa no sentido de se descobrir terapias combinadas para uma maior eficácia.Vários trabalhos já vêm investigando os resultados das interações entre produtos antimicrobianos naturais e sintéticos (VAN-VUUREN eVILJOEN, 2006; SULIMAN et al., 2010). Embora os antibióticos diminuam a propagação e gravidade de uma ampla variedade de doenças infecciosas, devido ao seu uso descontrolado destes medicamentos, as bactérias e fungos têm desenvolvido inúmeros mecanismos para escapar dos agentes antimicrobianos (AREEJ et al., 2013). Logo, o uso indiscriminado de antibióticos e os problemas com doenças infecciosas emergentes tornaram inevitável à busca por novos agentes antimicrobianos de origem vegetal (ASWATHANARAYAN e VITTAL, 2013). Muitos compostos bioativos têm sido isolados a partir de extratos de algas e relatados como possuidores de excelente atividade antibacteriana ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 54

(LAKSHMI, et al., 2006; OSMAN, et al., 2010) e antifúngica (ERTÜRK e TAS, 2011; STEIN et al., 2011). Suffredini et al (2004) prepararam 705 extratos orgânicos e aquosos utilizando plantas da Floresta Amazônica e Mata Atlântica, e observaram que muitos foram ativos contra Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Escherichiacoli. Um estudo desenvolvido por Ramos et al. (2009) com espécies utilizadas na medicina tradicional na região Nordeste, mostrou, in vitro, que a maioria dos extratos de plantas dos gêneros Croton, Protium e Muntingia calabura, apresentaram atividade contra S. aureus e B. subtilis. Atividade antibacteriana de quatro espécies pertencentes ao gênero Cnidoscoluspresentes na Caatinga foi avaliada por Sobrinho et al. (2012), os resultados mostraram que cepas resistentes de S. aureus e S. epidermidisforam sensíveis aos extratos metanólicos da casca de C. quercifolius. Brustein et al., (2012) em se estudo isolaram e testaram, frente a diferentes bactérias, uma lectina (EmaL) das sementes de Eugenia malaccensis. Os resultados mostraram que EmaL tinha uma potente atividade antibacteriana invitro com a inibição do crescimento de algumas bactérias patogênicas importantes. A lectina mostrou ser mais eficaz contra S. aureus e Streptococcus sp. Segundo Paiva et al. (2010) os tecidos vegetais contêm metabólitos secundários e lectinas possuidores de atividade antibacteriana e antifúngica, sendo, portanto, fontes de moléculas bioativas naturais para controlar agentes patogénicos que causam doenças em plantas e humanos.

2.5.4.3Atividade termiticida

Cupins são pragas de insetos altamente destrutivas, que podem danificar diversos tipos de materiais, como por exemplo a madeira de casas, plantas e culturas agrícolas, como cana de açúcar, milho, cevada e arroz. As colônias de cupins também causam a biodegradação da madeira, sendo estes reconhecidos como causadores de um dos mais sérios problemas para utilização da madeira. Sabe-se também que as térmitas podem danificar uma variedade de outros materiais que variam desde tecidos, papel e até mesmo ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 55

aqueles não celulósicos como o amianto, betume de asfalto e folhas de metal (BULTMAN et al., 1979). A Natureza produziu uma grande variedade de plantas com uma variedade de estratégias químicas defensivas. A partir da diversidade química encontrada nas plantas, é possível se obter compostos bioativos com ação contra diversos tipos de insetos. Pesticidas seguros, com novos mecanismos de ação são necessárias tanto para retardar o desenvolvimento de resistência como para ajudar a atender as regulamentações de saúde e ambientais cada vez mais rigorosas (ANONYMO, 2000). O uso de compostos termiticidas sintéticos vem sendo realizado há muito tempo para tratamento do solo, bem como de culturas agrícolas diversas. Mas atualmente existe grande interesse em se descobrir novos compostos eficazes, que possam reduzir os danos causados por térmitas, e ao mesmo tempo não tragam prejuízos ao meio ambientalmente e a saúde humana (ELANGO et al., 2012). Para se evitar a poluição ambiental e problemas à saúde, causados pelo uso de pesticidas sintéticos, frequentemente são estudadas substâncias tóxicas aos cupins, que possam ser isoladas naturalmente a partir de plantas (CHANG et al., 2001). Muitos extratos vegetais e óleos essenciais (ARIHARA et al., 2004a,b; CHANG et al., 2001; CHENG et al., 2004), podem ser as fontes alternativas destes agentes de controle para térmitas, pois os mesmos representam fontes ricas de produtos químicos bioativos. Materiais lenhocelulósicos são degradados pelos térmitas, uma vez que estes insetos produzem enzimas como as celulases e hemicelulases. As celulases são normalmente classificadas como endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases. Endoglucanases clivam as ligações de glicosídeo aleatoriamente dentro da molécula de celulose. As exoglucanase clivam ligações nas extremidades da cadeia de celulose e as β-glucosidases, também conhecidas como cellobiases, catalisam a hidrólise da celobiose (FISCHER et al., 2013).Compostos naturais anti-cupim podem apresentar diferentes atividades contra diferentes espécies de térmitas (OSBRINK et al., 2001) e os produtos naturais são uma fonte promissora de compostos que exibem atividades pesticidas (IBRAHIM et al., 2004;. LAX e OSBRINK, 2003;. ZHU et al., 2003). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 56

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Realizar um screening de diversas plantas da Caatinga avaliando o seu potencial biotecnológico, e identificar e purificar moléculas bioativas a partir de folhas de Manilkararufula.

3.2 Específicos

3.2.1 Realizar um screening de diversas plantas da Caatinga buscando a presença de lectinas e inibidores de tripsina; 3.2.2 Selecionar uma espécie vegetal para ser estudada; 3.2.3 Realizar um screening fitoquímico para determinação dos compostos secundários presentes nos extratos clorofórmico, acetato de etila e metanólico das folhas de M. rufula; 3.2.4Avaliar a atividade antioxidante dos extratos clorofórmico, acetato de etila e metanólico das folhas de M. rufula utilizando deferentes métodos: sequestro do radical 2,2-diphenil-2-picrilhidrazil (RSA-DPPH) e capacidade antioxidante total utilizando o fosfomolibdenium (P-Mo); 3.2.5Determinar o conteúdo de fenois totais presentes nos extratos clorofórmico, acetato de etila e metanólico das folhas de M. rufula; 3.2.6Efetuar estudos para determinar as melhores condições de isolamento de lectina das folhas de M. rufula através de variações dos parâmetros de temperatura, pH e tempo de extração, bem como presença ou ausência de NaCl; 3.2.7Purificar uma lectina de M. rufula através de precipitação com sulfato ecromatografia por afinidade; 3.2.8 Determinar a estabilidade da lectina frente a variações de temperatura e pH; 3.2.9 Avaliar a atividade da lectina quanto à necessidade de íons; 3.2.10 Avaliar a atividade protetora de DNA dos extratos obtidos com clorofórmio, acetato de etila e metanol, bem como da lectina obtidos das folhas de M. rufula.

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3.2.11Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos clorofórmico, acetato de etila, metanólicoe da lectina obtidosdas folhas de M. rufula frentea diferentes espécies de bactérias e fungos. 3.2.12 Avaliar a atividade anti-temitas dos extratos clorofórmico, acetato de etila, metanólico e da lectina obtidos das folhas de M. rufula. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 58

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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5. CAPITULO I

ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO

REVISTA: Natural Product Reseach: Formerly Natural Product Letters

TÍTULO: Screening of Caatinga Plants as Sources of Lectins and Trypsin Inhibitors

Publishednonline: 26, Mar, 2014.

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SUPPLEMENTARY MATERIAL

Screening of Caatinga plants as sources of lectins and trypsin inhibitors

José Hélton Vasconcelos Arcoverdea, Aline de Souza Carvalhoa, Fernanda Pacífico de Almeida Nevesa, Bianca Paiva Dionízioa, Emmanuel Viana Pontuala, Patrícia Maria Guedes Paivaa, Thiago Henrique Napoleãoa,*, Maria Tereza dos Santos Correia, Márcia Vanusa da Silva, and Maria das Graças Carneiro-da-Cunha aDepartamento de Bioquímica, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil.

Abstract

Although it is one of the most threatened areas in the Earth, there are few studies on the biotechnological potential of the Caatinga. This work evaluated 36 extracts from 27 Caatinga plants for lectin and trypsin inhibitor activities. The presence of lectin was detected in 77.7% of samples by haemagglutinating assay. The highest values of specific haemagglutinating activity were found to extracts of leaves from Mimosa lewesii, Bauhinia acuruana and Manilkara rufula and of branches from Myracrodruon urundeuva. Trypsin inhibitor activity was detected in 63.9% of the tested extracts being strong inhibitory effect (> 70%) found in 11 samples. This work demonstrates that Caatinga is a potential source of bioactive plant proteins that can be isolated and studied for several applications. The biochemical prospecting of Caatinga is essential for collection of bioactive principles so as to add conservation value to the region.

Keywords: biochemical prospecting; Caatinga; lectin; plant proteins; protease inhibitor.

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1. Experimental

Plant material The plants were collected at several sites in the Vale do Catimbau National Park (PARNA do Catimbau) in Pernambuco, Brazil. Botanical specimens were identified at the Herbarium of the Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), where a voucher for each species was deposited. The species studied are listed in Table S1 with their respective scientific names, common names in Portuguese, voucher numbers and uses.

Extracts and protein concentration The aerial parts of plants (leaves, fruit), the bark of the stems and the roots were dried in an oven at 45 °C for 2-3 days. The dry material was ground into powder using a bench grinder. The powders were added to a 0.15 M NaCl solution at a ratio of 10% (w/v), under constant and gentle agitation for 4 h, at 4 °C or 28 °C. The mixtures were passed through filter paper and centrifuged (9,000 g, 4 °C, 10 min) and the supernatant corresponded to extracts. The extracts were then assessed for protein concentration and haemagglutinating and trypsin inhibitor activities. The estimation of protein concentration was carried out according to Lowry et al. (1951), using a standard curve of bovine serum albumin (BSA), with values between 31.25 and 500 g/ml.

Haemagglutinating activity The presence of lectins was determined in microtiter plates (Paiva & Coelho 1992) using a 2.5% (v/v) suspension of rabbit erythrocytes treated with glutaraldehyde (Bing et al. 1967). The haemagglutinating activity (HA) was determined by adding 50 L of 0.15 M NaCl in all wells and 50 L of the sample to be evaluated in the second well of the horizontal row, with successive dilutions until 1:2048 and disregarding the final 50 L. Then 50 L of the erythrocyte suspension were added to each well and the plate left to stand for 45 min at 28 ºC. One haemagglutinating unit (titer-1) was defined as the reciprocal of the highest dilution of the sample promoting full agglutination of erythrocytes. The specific HA corresponds to the ratio between titer and protein concentration in mg/mL.

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Trypsin inhibitor activity The inhibition of trypsin activity was evaluated according to Pontual et al. (2012) in microplates of 96 wells using 0.1 mg/mL of bovine trypsin in 0.1 M Tris-HCl

(pH 8.0), containing 0.02 M CaCl2. The bovine trypsin (5 μl) was incubated (5 min, 37°C) with the extract (50 μl) in Tris-HCl pH 8.0 (150 μl). Subsequently, the synthetic substrate BApNA (N-benzoyl-arginine-ρ-nitroanilide), dissolved in dimethyl sulfoxide, was added (5 μl) and the mixture was incubated (30 min, 37 °C). The hydrolysis of the substrate was tracked by the measurement of absorbance at 405 nm. The inhibitory activity was determined by remaining hydrolytic activity and inhibition percentages were calculated as follows: % inhibition = 100 - [100 x (residual activity /activity in control)]. Assays were performed in triplicate. Inhibition effect was ranked as low (<30%), moderate (30-70%) and strong (>70%). Reaction blanks containing only substrate and/or extract were also performed.

2. References

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Table S1. Species collected in the Vale do Catimbau National Park (Caatinga of Pernambuco). Scientific name Common name (in Voucher Ethnobotanical uses Brazil) Abarema cochliacapos ------Anadenanthera colubrina var. cebil Angico IPA 84.039 Timber, fuel, animal feed, human food, construction, veterinary and technological use Apuleia leiocarpa Garapa, grápia IPA 84.886 Timber, fuel, animal feed, ornamental use, reforestation Bauhinia acuruana Mororó IPA 84.042 Timber, forrage, fuel Buchenavia capitata Tanimbuca Landscaping Byrsonima gardneriana Murici IPA 84.882 Fuel, veterinary use Chamaecrista desvauxii Camponesa IPA 84.064 Fuel Commiphora leptophloeos Amburana IPA 84.037 Timber Dioclea grandiflora Mucunã-de-caroço IPA 84.057 Timber, animal feed, veterinary and medicinal use Eugenia brejoensis Cutia IPA 84.033 ---- Harpochilus neesianus ----- IPA 84.879 ----- Hymenaea courbaril var. courbaril Jatobá IPA 84.888 Fuel Ipomea brasiliana ---- IPA 84.883 ---- Jacaranda rugosa Jacarandá IPA 84.881 Landscaping Manilkara rufula Maçaranduba IPA 84.889 Fuel, animal feed, veterinary use Mimosa lewesii ---- IPA 84.053 ---- ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 103

Myracrodruon urundeuva Aroeira preta IPA 84.059 Timber, fuel, animal feed, landscaping, veterinary & apicultural use Myroxylum peruiferum Cabreúva IPA 84.110 Timber, fuel, construction, perfume, ornamental use Ouratea blanchetiana ----- IPA 84.044 ----- Parkinsonia aculeata Acácia, turco, junco IPA 84.113 Fuel, reforestation, landscaping, apicultual & ornamental use Piptadenia viridiflora Espinheiro, icarapé IPA 84.058 Fuel, animal feed Pityrocarpa moniliformis Canzenzo, quipembe IPA 84.048 Timber, forrage, animal feed, human food, apicultural & medicinal use Poincianella microphylla Catingueira IPA 84.880 Forrage, fuel, animal feed, human food, construction, medicinal & technological use Senna splendida Fedegoso grande IPA 84.040 Fuel Sida galheirensis Malva branca IPA 84.078 Medicinal use Sideroxylum obtusifolium Umbuzeiro, quixaba IPA 84.076 Timber, fuel, veterinary use Stigmaphyllon paralias Amarelinho IPA 84.090 ----- References: Agra et al. 2007a,b; Ducke 1953; Braga 1976; Tokarnia et al. 1994; Queiroz et al. 2002; Leal et al. 2003; Pereira et al. 2003; Milano et al. 2004; Silva et al. 2004; Foroughbakhch et al. 2005; Ferraz et al. 2006; Ramírez et al. 2006; Silva et al. 2006; Pinos-Rodríguez et al. 2007; Moreira & Guarim-Neto 2009; Alves & Nascimento 2010; Loiola et al. 2010; Salin 2010; Moraes et al. 2011; Souza 2011. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 104

6. CAPITULO II

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO

REVISTA: Journal of Chemical Ecology

TÍTULO: EVALUATION OF ANTIOXIDANT, ANTIBACTERIAL, DNA-PROTECTIVE AND ANTI-TERMITE ACTIVITIES OF MANILKARARUFULA (MIQ.) H. J. LAM. (SAPOTACEAE)

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EVALUATION OF ANTIOXIDANT, ANTIBACTERIAL, DNA-PROTECTIVE AND ANTI-TERMITE ACTIVITIES OF MANILKARA RUFULA (MIQ.) H. J. LAM. (SAPOTACEAE)

1JOSÉ HELTON VASCONCELOS ARCOVERDE, 1RAIANA APOLINÁRIO DE PAULA, 1MYCHELY SHEILA MELO, 1BARBARA DE AZEVEDO RAMOS, 1DANIEL RODRIGO DE ARAUJO, 2RAFAEL MATOS XIMENES, 1ALEXANDRE GOMES DA SILVA, , 1THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO, 1MÁRCIA VANUZA DA SILVA, 1MARIA TEREZA DOS SANTOS CORREIA, 1,2MARIA DAS GRAÇAS CARNEIRO-DA-CUNHA*

1Departamento de Bioquímica, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420 Recife, Pernambuco, Brazil. 2Laboratório de Biotecnologia, LIKA, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-901 Recife, Pernambuco, Brazil. 3Departamento de Antibióticos, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50740-520 Recife, Pernambuco, Brazil.

(*) Corresponding author: Phone: +55.81.21268547; Fax: +55.81.21268576 E-mail address: [email protected] (M.G. Carneiro-da-Cunha)

Abstract - Bioactive compounds are found in many plants and are known to possess biological properties. Manilkara, which belongs to the family Sapotaceae, contains species that are popularly used to treat various diseases. The objective of this work was to evaluate the antioxidant, antibacterial, DNA- protective and anti-termite activities of organic extracts prepared from the leaves of M. rufula, which were extracted in an eluotropic series with the solvents chloroform, ethyl acetate and methanol. The phytochemical profile obtained from the extracts was traced using thin-layer chromatography and some compounds were observed, which were mostly phenolic derivatives, such as tannins and flavonoids. The extracts prepared with ethyl acetate and methanol showed significant antioxidant activity, in vitro, which was detected using DPPH and phosphomolybdenum methods. These extracts also ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 106

contained high concentrations of phenolic compounds and flavonoids, had DNA-protective activity, and were shown to be effective antimicrobial agents that acted against some strains of Gram-negative and Gram-positive bacteria. The three extracts also exhibited termiticide activity and eliminated 100% of the insects within 48 hours. This is the first study that shows M. rufula is a valuable plant species with biotechnological potential, making it a promising source of new biological compounds.

Keywords- bioactive compounds – antioxidant – DNA nicking - termiticide.

INTRODUCTION

Plants are a focus in many fields of study, mainly because they present diverse pharmacological activities and have been used for therapeutic purposes by many traditional societies for a long period of time (Sittiwet and Puangpronpitag 2009). Actually, studies have shown that pure natural compounds and standardized plant extracts offer numerous opportunities to develop new drugs with biotechnological potential (Aswathanarayan and Vittal 2013; Mendez et al. 2012). Reactive oxygen species (ROS), a subproduct of the normal metabolism, have aroused great interest over the last few decades due to their involvement in pathologies. ROS can be produced in cells as a response to various factors, for example, chemical agents and radiation. Oxidative stress can promote DNA damage, inhibiting cellular functions and the peroxidation of lipids and proteins, contributing to the development of sicknesses, such as cancer, diabetes, arteriosclerosis, inflammation problems and premature aging (Dakah et al. 2014). Polyphenols found in many plants are reported to have good antioxidant properties and protect against cell damage caused by ROS. In recent years, there has been a growing interest in identifying scavengers of free radicals and antioxidants that specifically inhibit ROS actions in cellular genetic material (Girish et al. 2012). The rising prevalence of multidrug resistance in pathogenic microorganisms and the undesirable side effects of certain antibiotics have ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 107

further increased an interest in searching for new antimicrobial drugs that originate from plants. This is because one of the various ways plants defend themselves against pathogenic microorganisms is the production of bioactive molecules (Hossain et al. 2011). The family Sapotaceae has a tropical and subtropical distribution and includes approximately 50 genera and 1000 species of trees and shrubs. In Brazil there are 200 species within 14 genera of Sapotaceae, such as Chrysophyllum, Manilkara, Micropholis, Pouteria, Pradosiaos and Sideroxylon (Almeida-Junior 2010). Chemically, species of this family are characterized by having various classes of substances, for example, saponins, flavonoids, polyphenols, triterpenes, carotenoids, steroids, fatty acids and tannins; scientifically, these compounds have already been shown to have diverse biological activities (Barbosa-Filho et al. 2008; Kushima 2005; Montenegro et al. 2006). Some species of Manilkara, have been popularly used as medicinal plants to heal wounds and to treat various illnesses, such as inflammation, fever, postpartum hemorrhages and, upset stomachs. In vitro, species of this genus have shown antimicrobial, anti-parasitic, anti-tumor and antioxidant activity (Fernandes et al. 2011). Manilkara rufula, also known as maçaranduba, is used by some traditional communities to treat stomach problems, as an antipyretic, to heal wounds and to control worm infestations. There is a continuous necessity to search for new species of plants that have biotechnological potential. The objective of this work was to evaluate the antioxidant, antimicrobial, DNA-protective and anti-termite activities of organic extracts prepared from the leaves of Manilkara rufula, which were extracted in an eluotropic series with the solvents chloroform, ethyl acetate and methanol.

METHODS AND MATERIALS

Collection of Plant Material. Leaves of M. rufula, free of diseases, were collected in an area of Parque Nacional do Catimbau (PARNA do Catimbau), northeastern Brazil, in January (dry season) and June (rainy season) of 2012. Voucher specimens were identified and deposited in the herbarium at the Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) under the numbers 86769 and ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 108

86770. The collected leaves were dried in a dryer at 37ºC for 72h. The dried material was ground and stored at 4°C until use. Organic Extracts. The extracts, from the powder of the leaves of M. rufula, were made in a Soxhlet apparatus using organic solvents, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (AcOEt) and methanol (MeOH), in an eluotropic series. One hundred grams of the sample was packed in muslin cloth and used for the extraction at a temperature below the boiling point of each solvent. All of the samples were submitted to reflux until saturation (24 h). After this period, the extracts were filtered through Whatman filter paper (nº 1). In all cases, the solvents were removed until the organic extracts were dry, separately concentrated using a rotary evaporator at 45°C under reduced pressure, and stored at -10 ºC. The concentrated residue was dissolved in sterilized dimethyl sulfoxide (DMSO- 1:9), methanol (PA) or NaCl (0.15 M) when necessary. The extracts were filtered with a 0.22µm filter (type GV Millipore) and used for the study Phytochemical Screening. To determine the phytochemical compounds present in the extracts, standard reference assays were developed. The identification of flavonoid aglycone, flavonoid heterosides, cinnamic derivatives and alkaloids was made according to Wagner and Bladt (1996); mono and sesquiterpenes, triterpenes and steroids according to Harborne (1998); and condensed proanthocyanidins and leucoanthocyanidins according to Roberts et al. (1957). Assays of Antioxidant Activity Scavenging activity of the radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Antioxidant activity was determined from the reactions of scavenging the stable radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) by the molecular components present in the extracts of M. rufula; the methodology was based on Blois (1958). A methanol solution of DPPH (20 mg/ml) was prepared and its concentration adjusted for an absorbance between 0.6 and 0.7 at 517nm. A 250μl aliquot of this solution was mixed with 40μl of different concentrations of the extracts (10, 25, 50, 100, 200, 300 and 400 µg /ml dissolved in methanol) and the absorbance was read after thirty minutes. Quercetin and ascorbic acid were used as reference compounds for the assay. The tests were performed in triplicate. The radical scavenging of DPPH was calculated by the following formula: Scavenged [DPPH](%) = (Abs sample Abs control)Abs control x 100 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 109

Total Antioxidant Activity. The total antioxidant activity (TAA) was evaluated based on the method used by Pietro et al. (1999). An aliquot (100 µL) of the sample in methanol (1mg/mL) was added to 1000 µL of phosphomolybdenum (600 mM of sulfuric acid, 28 mM of sodium phosphate and 4 mM of ammonium molybdate) and incubated in a water bath (bain-marie) at 95°C for 90 minutes. The same procedure was used to prepare the control, which was a methanol and phosphomolybdenum solution. After cooling to 25°C, the absorbance of the samples was measured at 695 nm. The test was performed in triplicate and the total antioxidant activity was expressed in relation to the ascorbic acid and calculated by the following formula:

TAA%=(Aa – Ac)(Aaa – Ac) x 100

Where: Ac=Absorbance of the control, Aa=Absorbance of the sample, Aaa=Absorbance of the ascorbic acid.

Dosage of Phenolic Compounds. The total phenolic content was determined by the Folin-Ciocalteu method according to McDonald et al. (2001). The extracts were adjusted to a concentration of 1 mg/ml in methanol, and 900 µL of distilled water, 100 µL of the sample and 500 µL of the Folin-Ciocalteu reagent (1:10) were added to each sample tube. After 10 minutes in the dark, 2.5 ml of 7.5% sodium carbonate was added and left for 20 more minutes in the dark at room temperature (25 ± 2°C). After this period the absorbance of the samples, at 765nm, was read against white. A curve of the calibration pattern was prepared using gallic acid dissolved in methanol and the following linear equation was found: y=0.023x + 0.62, r²= 0.995. The concentration of total phenol in the sample was determined from this curve. The total phenol in the extract was expressed in terms of the equivalent of gallic acid (GAE mg/g of extract).

Dosage of Flavonoids. Determining the flavonoids was based on the methodology described by Woisky and Salatino (1998), with modifications. The results were expressed as quercetin equivalents (EQ) per milligram of sample. The extracts were prepared at 1mg/mL.

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DNA Nicking Assay. The DNA nicking assay was performed using pBR 322 plasmid DNA. The reaction mixture contained 0.3 µL of plasmid DNA, 10 µL of

Fenton’s reagent (30 mM H2O2, 50 mM ascorbic acid, and 80 mM FeCl3) followed by the addition of extracts. The final volume of the mixture was brought up to 25 µL using distilled water. The mixture was then incubated for 30 min at 37 °C and the DNA was analyzed on 1% agarose gel (prepared by dissolving 1 g of agarose in 100 mL of 0.5 x TBE Buffer) (Kaur et al. 2008). The measurement of DNA damage protection was analyzed by Total Lab Quant.

Antibacterial activity Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC). The bacteria was provided in nutrient agar (DifcoTM) by the Departamento de Antibióticos (DA) at the Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Brazil, and stored at 4°C. The Gram-positive strains were Staphylococcus aureus (UFPEDA-02), Micrococcus luteus (UFPEDA-100) and Bacillus subtilis (UFPEDA-86), and the Gram-negative strains were Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA-416), Escherichia coli (UFPEDA-224) and Klebsiella pneumoniae (UFPEDA-396). The bacteria were cultivated in nutrient broth (DifcoTM) in 250 ml, shaken bottles, and incubated overnight in an orbital agitator at 100 rpm and 37°C. The cellular concentration was determined by measuring the turbidity of the suspension using calibration curves (turbidity equivalent to 0.5 on the MacFarland scale). The susceptibility tests for determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were performed using CLSI (2011). The bacteria were cultivated for 24 hours at 37oC. The extracts were dissolved in 10% DMSO and the dilutions were prepared in microtiter plates with 96 wells containing culture medium; final concentrations varied from 0.190 to 50 mg/ml. Posteriorly, 20 µl of the bacterial suspension was inoculated in the microplate and the tests were carried out using a final volume of 200 µl. The plates were incubated at 37°C for 24 hours. Chloramphenicol was used as a positive control. Cell viability was observed using Resazurin solution (0.01%) and was indicated by a change in color. Changes from pink to purple were considered to have bacterial growth. For each extract corresponding to the lowest concentrations tested, which did not ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 111

change color after macroscopic evaluation, the MIC was determined and expressed in mg/mL. Using the results of the MIC test, the concentrations that were shown to be completely absent of bacterial growth were identified and 10 µl of each culture was transferred to Petri plates containing Mueller-Hinton agar and incubated for 24 h at 37°C to determine the MBC. The lowest sample concentration, where there was no growth on the agar surface, was defined as the MBC.

Anti-termite Activity Insects. A colony of Nasutitermes corniger was collected from an area of Atlantic Forest located on the campus of the Universidade Federal Rural de Pernambuco, Brazil. The termite colony was selected according to overall integrity criteria. The nest was carefully removed from the trunk of a tree using a machete and then transferred to the laboratory. The colony was maintained at 28 ± 2°C (70 ± 5% relative humidity) in the dark for 6 h and subsequently used in the bioassays. Termiticidal Assay. Termiticidal activity was evaluated by a no-choice bioassay based on the method described by Kang et al. (1990). Each experimental unit consisted of a Petri dish (90 x 15 mm, TPP-Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland) with the bottom covered with filter paper. A filter paper disk (4 cm in diameter) impregnated with 200ml of sample in 0.15 M NaCl was put in each dish. Termiticidal activity was evaluated for the organic extracts made from the leaves M. rufula with chloroform, ethyl acetate and methanol (2.5, 5 and 10 mg/ml of extract). For the negative controls, the filter paper was impregnated with 0.15 M NaCl. A total of 20 active termites (at a worker-to- soldier ratio of 4:1) were transferred to each dish; these were maintained at 28°C in the dark. Insect survival was evaluated daily until all insects were dead. Bioassays were carried out in four replicates for each concentration and survival rates (as percentages) were obtained for each treatment. Statistical Analysis. Each experiment was performed at least three times and results are presented as the mean ± SD. The statistical analysis was performed using the Student’s t-test. Differences were considered significant at p< 0.05.

The concentration needed for 50% inhibition (IC50) was estimated graphically by a linear regression analysis. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 112

RESULTS

Extracts and Phytochemical Screening. The extracts obtained with the chloroform, ethyl acetate and methanol solvents yielded 3.71%, 2.35% and15.71% (p/p respectively) of dry weight in relation to the powder of the leaves (100g) used to prepare the extracts. The phytochemical analyses using M. rufula revealed the presence of cyanogenic heterosides, phenolic compounds (flavonoids and tannins), triterpenes and steroids; alkaloids, cinnamic derivatives and saponins were not observed (Table 1).

Table 1: Phytochemical profile obtained by thin layer chromatography (TLC) of chloroform, ethyl acetate and methanol extracts prepared from the leaves of M. rufula. Class of secondary metabolites Manilkara rufula Leaves Cyanogenic heterosides +

CHCl3 AcOEt MeOH Flavonoids (aglycones) - + + Flavonoids ( heterosides) - ++ ++ Cinnamic derivatives - - - Triterpenes +++ ++ - Steroids +++ ++ - Monoterpenes and Sesquiterpenes - - - Alkaloids - - - Condensed proanthocyanidins and - + (monomers) ++ (condensates) leucoanthocyanidins Presence (+) or absence (-) of compound. Visualization of a band with low color intensity (+), intermediate intensity (++) and high intensity (+++) using TLC.

Scavenging of the DPPH Radical. The molecule DPPH (2,2-diphenyl- picrilidrazil) is characterized as a free radical that possesses the ability to donate a free electron to an antioxidant molecule, making it stable. This transfer causes the reagent to lose its purple color (Md, et al., 2013) and the degree of discoloration indicates the antioxidant potential of the sample. In this study, the extracts of Manilkara rufula exhibited a high degree of scavenging of the DPPH radical compared to the controls used (quercetin and ascorbic acid). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 113

Of the three organic extracts tested, two (AcOEt and MeOH) decolorized the DPPH reagent at concentrations of 84.15 µg/ml and 42.93 µg/ml, respectively, and the potential to eliminate free radicals was in the following order: extract MeOH > AcOEt > CHCl3 (Table 2). These results show that Manilkara rufula is an important source of bioactive compounds with antioxidant potential.

Table 2: Concentrations (µg/ml) of the MeOH, AcOEt and CHCl3 extracts, from the leaves of M. rufula, able to scavenge 50% of the free radicals of DPPH.

IC50 Values Confidence interval CONTROLS Quercetin >10 Ascorbic Acid 26.93 26.14 - 27.75 EXTRACTS Chloroform <400 Ethyl acetate 84.15 71.26 - 99.37 Methanol 42.93 38.61 - 47.72

The extract CHCl3 did not present satisfactory activity. The highest concentration only scavenged 6.637% of the free radical. This low antioxidant action could be related to the absence of phenolic compounds in this fraction. The AcOEt and MeOH extracts showed better results, at concentrations of 200 µg/ml, and scavenged 84.37% and 84.01% of the DPPH, respectively. For the highest concentration tested (400 µg/ml) the free radical scavenging activity was 86.358% and 84.145%, respectively. As seen in figure 1, at 200 µg/ml and above there was little variation in the antioxidant power of the extracts from M. rufula, and the scavenging power was as high as the controls used.

Total Antioxidant Activity. The results show that the total antioxidant activities of the CHCl3, AcOEt and MeOH fractions were 35.78% (± 2.15), 40.80% (± 1.84) and 76.25% (± 1.08), respectively, when compared to the ascorbic acid compound that was considered to have 100% antioxidant capacity. Even though the fraction obtained from the chloroform did not present satisfactory ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 114

antioxidant activity for the DPPH assay, it did show 35.78% (± 2.15) anti-radical activity for the same method of analysis. Total Phenols and Flavonoids. Among the three extracts, MeOH showed the highest quantity of phenolic compounds (79.913 ± 0.86 mg EAG / g), followed by AcOEt (73.493 ± 1.19 mg EAG / g). The high quantity of phenolic compounds could be related to the high antioxidant activity that was demonstrated in this study. The fraction obtained with CHCl3 did not reveal the presence of phenolic compounds, which could be related to its low antioxidant activity. The amount of flavonoids found in this study showed that the highest concentration of this metabolite was present in the AcOEt extract (56.03 ± 0.03 mg EQ/mg), followed by MeOH (72.23 ± 0.04 mg EQ/mg). In the CHCl3 extract, a low concentration of flavonoids was found (5.30 ± 0.02 mg EQ/mg), which justifies the failure to detect these compounds in the TLC assay for that fraction. DNA Nicking Assay. In the DNA protection assay, with exception to the methanol fraction, it was possible to observe that the extracts prepared from the leaves of M. rufula offered protection against damage to the supercoiled plasmid pBR322 DNA, induced by the hydroxyl radical present in Fenton’s reagent (Figure 1). In this test the activity of the fractions obtained from CHCl3, AcOEt and MeOH was evaluated by the degree of protection to prevent the degradation of the DNA. Figure 3 shows the protective activity of the extracts evaluated. Different concentrations were analyzed and the CHCl3 and AcOEt extracts at 125 µ/mL reduced the damage caused to the DNA by the hydroxyl radical from the reagent. The MeOH fraction showed no protective activity, even at a concentration of 250 µ/mL, because all of the DNA was degraded.

Figurea 1: Protective effects of different extracts in the DNA nicking assay. (A) Lane 1: negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s reagent), (C) Lane 3-5: AcOEt (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (D) Lane 6-8: CHCl3 (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (E) Lane 9-11: MeOH (125 µg/mL) + Fenton’s reagent. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 115

Antibacterial Activity. The three extracts prepared from the leaves of M. rufula were evaluated for their antimicrobial activity against different strains of bacteria. The best results obtained were with the methanol and ethyl acetate extracts. The extract prepared with ethyl acetate showed inhibitory activity against one of the strains tested, Micrococus luteus (MIC 0.78 mg/mL). However, the methanol extract stood out for showing inhibitory activity against four of the six strains analyzed (Table 3). The chloroform extract did not promote growth inhibition for the pathogens tested.

Termiticide Activity. In the present study, the organic extracts from the leaves of M. rufula, prepared with chloroform, ethyl acetate and methanol, were evaluated for their termiticide potential against workers and soldiers of N. corniger. All of the extracts, at concentrations of 2.5, 5 and 10 mg/mL, exhibited significant (p < 0.05) termiticide activity against the workers compared with the negative control (Figure 2-A,B,C), and all of the termites were dead after 48 hours of exposure to the extracts. However, the extracts did not exhibit activity against the soldiers.

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 116

Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) obtained with the organic extracts from the leaves of M. rufula.

Extracts Bacteria MIC (mg/ml) MBC (mg/ml) Chloramphenicol CLO ACE MET CLO ACE MET (µg/mL) S. aureus – UFPEDA-02 3.125 ND 25 3.125 - > 25 ND

M. luteus - UFPEDA-100 0.781 ND 0.78 0.78 - 3.12 3.12 B. subtillis- UFPEDA-86 1.562 ND 12.5 12.5 - ND 25.0 E. coli – UFPEDA-224 0.781 ND 25.0 3.125 - > 25 >12.5

K. pneumonieae – UFPEDA-396 1.562 ND 12.5 3.125 - 12.5 6.25

P. aeruginosa – UFPEDA-416 6.250 ND 25.0 - - 25.0 -

CLO: chloroform extract; ACE: ethyl acetate extract; MET: methanol extract. ND: not detected.

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 117

Figure 2: Termiticide activity of the chloroform (A), ethyl acetate (B) and methanol (C) extracts prepared from the leaves of M. rufula.

DISCUSSION

In this study the highest yielding extract, in relation to the leaf, was produced with the methanol solvent. These data corroborate a study by Hossain et al. (2011), which reported that yields of an extracted compound are higher when using methanol compared to other solvents, such as chloroform, ethyl acetate and hexane. The results of this work show that the leaves of M. rufula possess metabolites with high antioxidant activity, compared to the controls, which might be the result of elevated levels of phenolic and flavonoid compounds present in the extracts prepared with ethyl acetate and methanol. Studies that evaluated the chemical composition of some representative of the genus Manilkara showed the presence of triterpenes, saponins and flavonoids in leaves and roots (Oliveira et al. 2014). Works have conclusively shown a direct relation between the content of phenolic compounds and antioxidant activity of some ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 118

plants. Thus, the chemical composition found in an active extract is an important factor governing the efficacy of natural antioxidants (Hossain et al. 2011; Shah and Hossain 2014). For some plants, the presence of phytoconstituents (such as, terpenoids, steroids, flavonoids, tannins and glycosides) has been reported to be responsible for anti-inflammatory and antipyretic properties (Adjene et al. 2012; Mulla et al. 2010). The antioxidant activity of the extracts made with ethyl acetate and methanol could be related to the extraction power these solvents have on phenolic compounds, as well as to the number of hydroxyl groups and the structural conformation that these phenols might have in the sample (Alves et al. 2010). According to Medini et al. (2014), extracts prepared with nonpolar solvents, such as hexane, have lower anti-free radical activity, whereas those prepared with more polar solvents, such as methanol, have higher activity against these radicals. According to Medini et al. (2014), plants contain a high variation of compounds with antioxidant capacity, but this is difficult to measure separately for each compound. This study shows for the first time the anti-free radical action, in vitro, of organic extracts prepared from the leaves of M. rufula. This finding corroborates a study by Kaneria et al. (2009) that focused on a species in the same genus (M. zapota) and found that the methanol extract from the leaves was also rich in phenolic content and had good scavenging activity of DPPH free radicals. The highest antioxidant activity evaluated by the phosphomolybdenum method, among the extracts prepared with the leaves of M. rufula, was obtained from the MeOH fraction. Likewise, Uma et al. (2011) observed that methanol extracts exhibited a higher potential for all antioxidant trials when compared to an ethanol extract and acetone for the green microalgae Desmococcus olivaceous and Chiorococcum humicola. In our work it was observed that the chloroform extract also presented antioxidant activity for this method; this activity was not detected by the DPPH method. Chanda and Nagani (2010) showed there was no relation between the extracts of leaves of Manilkara zapota, prepared with different solvents, and their antioxidant activity. These results agree with those of Baravalia et al. (2009) and Gholivand et al. (2010), which affirmed that, in general, plants with a higher content of phenolic compounds exhibit good antioxidant activity, since it is known that there is a ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 119

direct correlation between the amount of total phenols and such activity. According to the present results it is possible to conclude that the extracts from the same plant, prepared with different solvents, show distinct levels of antioxidant activity. It is essential to perform more than one test to evaluate the antioxidant potential of a plant species since each solvent is capable of extracting different phytoconstituents. As with the phenolic compounds, the presence of high concentrations of flavonoids in the AcOEt and MeOH extracts, as well as the low quantity in the

CHCl3 fraction, can influence their antioxidant potential. According to Sousa et al. (2007), phenolic compounds are stable mainly because of the resonance of the aromatic rings present in these structures and, thus, antioxidant activity is related to the reducing properties and chemical structure of these compounds, and plays an important role in the neutralization or scavenging of free radicals and chelation of transition metals acting on the oxidation process. Flavonoides, present in the extracts analyzed here, are considered one of the most common groups of natural components encountered in plants and are involved in various biological actions (Suhartono et al. 2012). Already, it is known that flavonoids and phenolic acids, such as rutin, quercetin, luteolin, gallic acid and caffeic acid, can produce significant antioxidant activity (Li et al. 2012).

The results of this study showed that the CHCl3 and AcOEt fractions were capable of impeding the degradation of the supercoiled plasmid pBR322 DNA. Hydroxyl radicals are highly reactive, can form in all biological systems, have been characterized has highly harmful, are involved in some pathologies, and can cause damage to almost all types of molecules found in living cells (Hochestein and Atallah 1988). ROS have the ability to break DNA molecules, which can contribute to carcinogenesis and mutagenesis (Babu et al. 2001), and in the human body there is no specific enzyme defense against these agents. For this reason, the discovery of compounds capable of eliminating hydroxyl radicals is of critical importance for the prevention of some diseases induced by oxidative stress (Zhou et al. 2010). Polyphenols are compounds capable of chelating active ions of iron and make them inert, and, consequently, they are not involved in Fenton’s reaction (Walia et al. 2009); in this case, the presence of these metabolites in the extracts is involved in inhibiting DNA damage. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 120

Previous studies have demonstrated that triterpenoids and flavonoid compounds exhibit significant antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, such as S. aureus (Li et al. 2012). These data reinforce our results since flavonoids were also present in the methanol extract, which had inhibitory action against S. aureus. Patel and Rao (2012) studied various plant species belonging to the family Sapotaceae. They showed that methanol extracts, among various others tested, had the best antibacterial activity because this solvent is capable of extracting compounds that exhibit antibacterial action as some phenolic derivatives. The same authors also pointed out that extracts from the fruits of Manilkara hexandra, prepared with acetone and methanol, presented significant antibacterial activity against Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Escherichia coli and Salmonella paratyphi. In the same way, Chanda and Parekh (2012) showed in a study with extracts prepared from the leaves M. hexandra that there was high antimicrobial activity against different species of bacteria. Another study conducted with M. zapota, in vitro, showed its leaves and bark possess antimicrobial and antioxidant activity (Kaneria et al. 2009). Antimicrobial activity assays of aqueous and ethanol extracts from the stem of M. zapota used against different strains bacteria revealed that the ethanol fraction showed activity against various species of bacteria, such as S. aureus, S. epidermides, B. subtilis, P. aeruginosa, P. vulgeris, K. pneumoniae, E. coli, Salmonela typhimurium, Proteus vulgaris, P. mirabilis and Micrococcus flavus (Nair and Chanda 2008). Natural products derived from extracts of plants have been tested in programs to discover new insecticide agents that control termites but do not damage the environment. Some of the natural products tested are vulgarone B (isolated from Artemisia douglasiana), apiol (from Ligusticum hultenii) and cnicin (from Centaurea maculosa), which killed species of the termite Coptotermes formosanus (Meepagala et al. 2006). Cantrell et al. (2007) showed that compounds isolated from plants present significant termiticide activity, which was observed by the reduction in the consumption of filter paper used in the trials and by the death of the insects. In our study, the presence of flavonoids was detected ethyl acetate and methanol extracts and triterpenos were detected in the chloroform extract ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 121

(among others), and all of the termiticide agents were effective, killing 100% of the termites within 48h. Alkaloids, monoterpenoids, toxic hydrocarbons (Cornelius et al. 1997), flavonoids and related compounds obtained from plants are toxic against ants and termites (Boue and Raina 2003; Ohmura et al., 2000). A methanol extract from the leaves of Detarium microcarpum possessed strong anti-termite activity (Lajide et al. 1995). Fractions made with hexane, diethyl ether and ethanol, from the leaves of Flourensia cernua, exhibited high termiticide activity; the majority of the hexane fraction was monoterpenoids and the majority of the ethanol fraction was sesquiterpenoids (Tellez et al. 2001). Verma and Verma (2006) reported that extracts of 5% chloroform, from the leaves of Lantana camara, presented significant termiticide activity. It is worth mentioning that this is the first study developed with M. rufula, where organic extracts prepared from the leaves of this species were evaluated for there antimicrobial and anti-termite potential. The organic extracts from the leaves of M. rufula, prepared with the ethyl acetate and methanol solvents, showed antioxidant activity and were effective antimicrobial agents that acted against Gram-positive and Gram-negative bacteria. The three organic extracts prepared from the leaves of M. rufula presented termiticide activity against Nasutitermes corniger workers. This is the first study that demonstrates the biological potential of Manilkara rufula, and revealed that the leaves of this plant can be a good source of bioactive compounds. Future studies are necessary to isolate and identify the compounds responsible for the activities detected

ACKNOWLEDGMENTS

The author José Helton V. Arcoverde is recipient of a scholarship from Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE). The authors express their gratitude to the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and fellowship (MTSC and MGCC) and by financial support. Rede NanoBiotec, Núcleo de Bioprospecção da Caatinga/ INSA, as well as IcmBio for the authorization to collect in Parque Nacional do Catimbau (16.888 Sisbio).

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ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 127

7. CAPITULO III

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO

REVISTA: Process Biochemistry

TÍTULO: PARCIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Manilkararufula (Miq.) H. J. LAM. (Sapotaceae) LEAF LECTIN AND ITS DNA PROTECTION CAPACITIES AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 128

1 PARCIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Manilkara rufula

2 (Miq.) H. J. LAM. (Sapotaceae) LEAF LECTIN AND ITS DNA PROTECTION

3 CAPACITIES AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY

4 1José H. V. Arcoverde, 1Raiana A. de Paula; 1Douglas H. O. Andrade; 3Kilma C,

5 Paz; 1Márcia V. da Silva, 1Maria T. S. Correia, 2Oliane M. C. Magalhães,*1,3

6 Maria G. Carneiro-da-Cunha

7

8 1Departamento de Bioquímica, CCB, Universidade Federal de

9 Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420 Recife, Pernambuco, Brasil.

10 2Departamento de Micologia, CCB, Universidade Federal de

11 Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420 Recife, Pernambuco, Brasil.

12 3Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA, Universidade

13 Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-901 Recife, Pernambuco,

14 Brasil.

15

16 * Corresponding author at: Departamento de Bioquímica, Centro de

17 Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof.

18 Moraes Rego s/n, CEP 50.670-420 Recife, PE, Brazil. Tel.: +55 81 2126 8540;

19 fax: +55 81 21268576. E-mail address: [email protected] (M.G. Carneiro-da-

20 Cunha).

21

22

23

24

25 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 129

26 Abstract

27 Manilkara rufula leaf lectin was obtained from different seasons collected

28 material through ammonium sulfate saturation. The crude extract precipitated

29 termed 40-80% fraction, which was applied into a chitin chromatographic

30 column,capable to bind lectin. The column was eluted with 1,0 M acetic acid for

31 6 hours, and the adsorbed colect, lyophilised and named MkaLL. DNA

32 protective activity was performed using pBR322 plasmid and Fenton reagent.

33 Antibacterial activity was determined by micro dilution in titer plate. High

34 resolution chromatography through AKTA presented two distinct peaks, and

35 SDS-PAGE of the lectin under reducing conditions in the presence of 2-

36 mercaptoethanol, showed two bands with molecular weight of 46,2 and 36,3

37 kDa. Seasonality was not a determinant factor for lectin obtention, MkaLL was

38 not dependant on mono or divalent cations. It was stable up to 80°C and

39 exhibited maximum hemagglutination at basic pH (8,5-9,5). MkaLL revealed an

40 antimicrobial activity against M. luteus and DNA protective activity. This was the

41 first report of a lectin obtained from a specimen of Manilcara genus, due to this

42 these data could be significant for better determine its biotecnology potential.

43

44 Keywords: Lectin, Manilkara rufula; DNA protection ; antibacterial activity.

45

46

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49

50 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 130

51 Introduction

52 The plant kingdom presents as a valuable source of biomolecules among these,

53 lectins shows to have unique specifications [1]. These proteins have the ability

54 to specifically and reversibly bind different mono and polysaccharides without

55 changing their structures.

56 Lectins are naturally found in different plant tissues, with various

57 functions, also occurring in other organisms such as animals [2].

58 Plant lectins carbohydrates specificity make them a valuable

59 biotechnology tool with multiple applications. Some lectins were used as

60 vaccine additives due to there ability to bind glycosylated molecules present on

61 cell surfaces [3].

62 Previous studies demonstrated its anti tumoral activity, and importance

63 for diagnostic through cell type differentiation [4,5,6]. It has been proved to have

64 a wide potential for insect control [7], antibacterial activity [8] and applications

65 against diverse microorganisms infections [9].

66 Oxygen reactive species (OREs) are produced by all aerobic cells. Their

67 defence against free radicals is accomplished through antioxidant molecules,

68 like enzymes [10]. However, when OREs levels exceeds the defence capacity,

69 the result could be a DNA oxidative damage, which promotes breaks in the

70 molecules chain inducing a mutation, that can develop a cancer [11].

71 Despite the growing interest on isolation,structural and functional

72 characterisation of bioactive compounds, still have a lot to be studied at

73 Caatinga region [12].

74 This biome represents the fifth larger area covered with a single type of

75 vegetation in Brazil, distributed among 60% of Northeast region [13]. In past ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 131

76 years, plants containing medicinal properties of this area have drawn attention

77 to be researched more about them [14], as some publications already described

78 therapeutic actions of Caatinga´s flora [14,15,16].

79 Included in this environment is the Sapotaceae family, encompassing 50

80 genus with 1000 species,approximately. In Brazil occurs 14 different genrera,

81 like Manilkara [17]. In this genera has many species used as medicinal plants

82 for treatment of fever, haemorrhage, cicatrising, antimicrobials,antiparasitc,

83 antitumoral and antioxidants activity [18]. Studies carried with M. zapota

84 demonstrated that various tissues presents biological properties. From its

85 leaves were related antimicrobial,antioxidant and pesticide activities [19,20].

86 The work showed Manilkara hexandra extracts possess antimicrobial activity

87 against many clinical interest species.

88 The aim of this study was to purify and partially characterise lectins from

89 M. rufula leaves, well as evaluating its DNA protective and antibacterial activity.

90 Until the moment there is no studies leading to information about presence and

91 biotechnology potential of this genus lectins, this being the first report.

92

93 Materials and Metods

94 Chemicals

95 Sugars (D-glucose, D-xylose, D-arabinose, D-galactose, Sacarose, N-acetyl-D-

96 glucosamine), sodium chloride, ammonium sulfate, acetic acid and

97 chromatographic matrices (Chitin, Superdex-75 10/300GL) were purchased

98 from Sigma-Aldrich Chemical Company (USA). All reagents were of analytical

99 grade.

100 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 132

101 Plant Specimen

102 M. rufula leaves were collected from Catimbau National Park (PARNA do

103 Catimbau), located in Pernambuco, Brazil, between January and June ( dry and

104 raining season,respectively). A specimen was identified and deposited in

105 Pernambuco Agronomic Institute (IPA) herbarium, through vouchers numbered

106 86769 e 86770, dry and raining season specimen, respectively.

107

108 Lectin Extraction

109 Green leaves from the top of the host plant were washed with distilled water,

110 dried in a hothouse at 37°C for 3 days. Dried leaves were then powdered and

111 stored at 4°C until utilisation. The powder was homogenised in 10% (w/v) 0.15

�1 112 mol L NaCl and maintained under constant agitation at 25°C for 8 h [22].

113 The mixture was filtered through Whatman (nº: 1) filter paper and centrifuged at

114 4°C for 10 minutes at 8.000rpm. All the supernatants obtained were designated

115 crude extract.

116

117 Hemagglutinating activity and hemagglutinating activity inhibition

118 Hemagglutinating activity (HA) of lectins was evaluated in microtiter plates

119 utilising glutaraldehyde treated rabbit erythrocytes. Lectin aliquots (50uL) were

�1 120 2-fold serially diluted with 0.15 mol L NaCl forward the addition of 2.5% (v/v)

121 erythrocytes. Succeeding 45 min of incubation,HA was determined as the

122 contrary of the titer; this matching to the lowest sample dilution exhibiting

123 complete hemagglutination , visually validated through the absence of

124 erythrocyte precipitation. The specific HA was determined by the relation of HA

125 to protein concentration [22]. ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 133

126 Protein Determination

127 According to Smith [23], the protein concentration was analysed using a

128 standard curve of bovine seric albumin (BSA), with values among 20 and 2.000

129 μg/ml.

130

131 Purification of M. rufula (MkaLL) leaf lectin

132 CE was 20%-saturated with ammonium sulfate for 4h at room temperature and

133 centrifuged at 12.000 µ g for 15 min at 4°C. The precipitate was stored and

134 corresponded to the 0-20% fraction, and the supernatant was adjusted to 20–

135 40% saturation. This procedure continued until 100% saturation. The

-1 136 precipitates were resuspended in 0.15 mol L NaCl and dialysed against

-1 137 distilled water and 0.15 mol L NaCl for 6 hours and the highest saline fraction

138 (40-80%) was used for chromatographic procedures. Affinity chromatography

139 was done by applying 25 ml of 40-80% fraction (51,4 mg/mL of protein) onto a

-1 140 chitin column (100ml) previously packed and equilibrated 0.15 mol L NaCl at

141 a flow rate of 20 mL h-1 after collecting unabsorbed samples of 6 mL (more

-1 142 than 0.03 absorbance at 280 nm), the column was eluted with 1,0 mol L

143 acetic acid. Fractions with absorbance higher than 0,1 were pooled, dialysed

144 against NaCl 5 mM at 25ºC, lyophilised, suspended in distilled water and

145 denominated MkaLL. To analyse the purification protocol efficiency, MkaLL was

-1 146 suspended in 0.15 mol L NaCl (1 mg mL-1 ) was loaded onto a Superdex-75

147 10/300GL column coupled to an A KTA purifier system and eluted with 0.3 mol

148 c NaCl at 0.5 mL min-1.

149 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 134

150 Gel Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)

151 Polyacrylamide electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulphate

152 (SDS–PAGE) was performed on a 12,5% (w/v) gel following the method

153 described by Laemmli [24]. MkaLL lectin, samples were submitted to reducing

154 and non-reducing conditions in the presence or absence of 2-mercaptoethanol

155 reducing agent, respectively. Standard marker proteins ( Broad Range Protein

156 Molecular Weight Markers with proteins sizes 10, 15, 25, 35, 50, 75, 100, 150

157 and 225 kDa), purchased from Promega. Protein bands were stained with Coomassie

158 Brilliant Blue (CBB) 0,02% (w/v) for 16 hours at room temperature.

159 Discolouration was proceeded of consecutive washes on 10% (v/v) acetic acid.

160

161 Effect of mono and divalent ions, pH and temperature

162 Samples of MkaLL (500 µg/mL and HA=512) were used to evaluate the effect of

+ 163 metal ions, pH and temperature on MkaLL HA. The result of mono (Na and

+ 2+ 2+ 2+ 164 K ) and divalent metal ions (Ca , Mg and Mn ) on HA was accomplished

165 according to Pajic et al. [25].

166 The purified lectin solution was previously dialysed against 0.025 mol

-1 167 L EDTA for 16 h at 4°C and then dialysed against deionised water (8 h at

168 4°C). Subsequently, the HA was carried out in microtiter plates with dialysed

169 lectin preparation (50 mL) serially 2-fold diluted 0.02 mol L-1 of the different ions

170 (50 mL) prepared in 0.15 mol L-1 NaCl. The microtiter plate was standing at

171 25°C for 45 min before the inclusion of a 2.5% (v/v) erythrocyte suspension (50

172 µ L). ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 135

173 The effect of pH on the HA of purified lectin was carried out in 0.01 mol

-1 174 L buffers that differed in terms of their pKa value (citrate phosphate pH 3,0-

175 6,5; Tris-HCl pH 7.0- 9,5; glycine-NaOH pH 10-12), where lectin samples were

176 incubated for 30 min and HA posteriorly determined. The effect of temperature

177 on HA of MkaLL was evaluated by incubating 1 mL of purified lectin at 30, 40,

178 50, 60, 70, 80, 90 and 100°C for 30 min [26], followed by a HA assay.

179

180 DNA Nicking Assay

181 The DNA nicking assay was performed using pBR322 plasmid DNA. The

182 reaction mixture contained 0.3 µL of plasmid DNA, 10 µL of Fenton’s reagent

183 (30 mM H2O2, 50 mM ascorbic acid, and 80 mM FeCl3) followed by the addition

184 of extracts. The final volume of the mixture was brought up to 25 µL using

185 distilled water. The mixture was then incubated for 30 min at 37 °C and the DNA

186 was analysed on 1% agarose gel (prepared by dissolving 1 g of agarose in 100

187 mL of 0,5 x TBE Buffer) [27]. The measurement of DNA damage protection was

188 analysed by Total Lab Quant.

189

190 Antibacterial Activity

191 Bacteria were provided by the Department of Antibiotics (DA), Universidade

TM 192 Federal de Pernambuco (UFPE), Brazil in Difco Nutrient Agar (NA) and

193 stored at 4°C. Gram-positive strains were Staphylococcus aureus (UFPEDA-

194 02), Micrococcus luteus (UFPEDA-100),Bacillus subtilis (UFPEDA-86), and

195 Gram-negative strains were Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA-416) and

196 Klebsiella pneumoniae (UFPEDA-396). Bacteria were grown in shaker flasks ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 136

TM 197 (250 mL) containing Difco Nutrient Broth (NB) and incubated overnight in a

198 orbital shaker at 100 rpm and 37°C. The cell concentration was determined by

199 measuring the suspension turbidity at 600 nm and then converted to colony

5 6 -1 200 forming units (10 to 10 CFU mL ) using appropriate calibration curves

201 (turbidity equivalent to 0.5 in the McFarland scale). One CFU represents a

202 viable cell capable of promoting bacterial growth.

203 The susceptibility assay for determination of minimum inhibition

204 concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) was

205 executed by micro dilution through CSLI [28]. Bacteria were grown for 24

206 hours at 37oC. MkaLL samples were adjusted for 1mg/mL and serial diluted in

207 titer plates, with final concentrations ranging from 0,09 to 500 µg/ml. Afterwards,

208 20 µl of bacterial suspension (106–10-7 CFU/ml) were inoculated,tests realised

209 in a final volume of 200 µl and incubated at 30°C for 24 hours. Cloranfenicol

210 was applied as a positive standard and Resazurin (0,01%) as an indicator

211 through color changing, a bacterial growth is indicated by changing from purple

212 to pink. The minimum inhibitory concentration (MIC) corresponded to the

213 minimum lectin concentration that inhibited visible bacterial growth, expressed

214 in µg/mL. 10 µl of each concentration without growth were inoculated in petri

215 plates with Agar Mueller-Hinton and incubated as described above for further

216 identification. The minimum bactericidal concentration corresponded to the

217 minimum concentration of lectin that inhibited 100% growth in the Agar surface.

218 All experiments were done in triplicates.

219

220 Results and discussion

221 Lectin obtention ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 137

222 By Schwob et al. [29] the season were a sample is collected is one of most

223 important factors, as quantity and some active components are not constant

224 during the year, since season variation could interfere in diverse metabolic

225 contents, such as lectins.

226 Total content variation likewise relative proportion of plant metabolic

227 occurs in different seasons [30]. Seasonality is a factor that acts directly on

228 photosynthesis in plants. Plants use a variety of ways to regulate foliar light

229 absorption, thereby preventing light energy absorption in excess, which may

230 cause modifications to the synthesis of biomolecules [31].

231 Considering that plant lectins are part of this products, our investigation

232 of seasonal dynamics on M. rufula extracts by HA analysis revealed a non

233 variation between heavy rain and drought periods extracts. We suggest that M.

234 rufula leaf lectin is not sensible for seasonal alterations

235

236 Purification and parcial characterisation of M. rufula leaf lectin.

237 Among the fractions saturated with ammonium sulfate from CE, F40-48%

238 showed the most SHA (39,8) and was, therefore, chosen for lectin purification

239 protocol.

240 AH inhibition test of saline fraction showed that it can occur in the

241 presence of some sugars (table 1). The affinity chromatography method is

242 based on the specific bind capacity of a protein, also reversible for some

243 carbohydrates. This way quieten column was chosen to purify MkaLL.

244 The chitin chromatographic step revealed a single active peak eluted

245 with 1 M/L acetic acid, suggesting isolation of the lectin (fig. 1). This MkaLL

246 active peak presented a yield of 0,9% and a 4,5-fold purification factor (table ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 138

247 2),yielding a total of 11,28mg of MkaLL from 10 g of M. rufula leaves [31].

248 Bauhinia forficata yielded 13 mg of purified lectin from 10g of seeds [32].

249 SDS-PAGE of eluted material showed two polypeptide bands between 42,3 and

250 36,2 kDa (fig. 2). By Oliveira et al. [33], plant lectins are isolated front their

251 natural source, even though isoforms presence decreases the sample

252 heterogeneity. Upon non reduction with 2-mercaptoethanol, this lectin

253 consistently dissociated into two bands. Stoeva et al. [34] also reported lectins

254 isoforms which binds chitin in Viscum album mistletoe. Similar results were

255 reported by Agrawal et al. [35] for presence of six isoforms of SL-I lectin.

256 In addition, MkaLL was submitted for a second purification, ÄKTA system

257 of liquid chromatography with high capacity of purification, using Superdex-75

258 10/300GL. The Superdex-75 10/300GL step revealed two peaks (fig. 3).

259 Associating to SDS-PAGE result, it suggests isolation of two lectins or one

260 isoform of MkaLL.

261 Oliveira et al. [36] reported that different lectins could present

262 agglutination differences according to the nature of glycoproteins on celular

263 surfaces. MkaLL presented agglutination on rabbit erythrocytes in relation to HA

264 to human erythrocytes (A+ and O+). B. variegata candida lectin (BVL) was not

265 able to agglutinate rabbit erythrocytes [37], the B. monandra [38], showed a HA

266 on rabbit and human erythrocytes. This variations confirms that each lectin is

267 particular for it specificity for carbohydrates or glycoproteins.

268 MkaLL showed a high affinity for D-glucose and N-Acetyl-D-

269 Glycosamine, where these sugars inhibited HA in 5 unities at a minimum

270 concentration of 62,5 µg/mL. Other lectins have HA inhibited by low

271 concentration of these sugars [39, 40]. Silva, et al. [32] related even though BfL ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 139

272 lectin was little inhibited by N-Acetyl-D-Glucosamine,it was adsorbed in chitin

273 support. In regard of F40-80% been inhibited by glucose , the support with this

274 carbohydrate was not sufficient for MkaLL isolation. It is noteworthy, this is the

275 first work which shows a Manilkara lectin isolation.

276 MkaLL HA was not affected by mono or divalent ions. MkaLL HA was

277 stable at different pH values(4,5-11), and the highest HA was obtained at

278 alkaline pH (8,5 – 9,5) (fig.4), in acid pH the lectins tends to decrease activity.

279 MkaLL was heat-stable up to 80°C, with a progressive loss until 100°C

280 (fig. 5), this lectin was high thermostable as it HA only diminished at 80°C, and

281 when heated for three hours at 100°C still presenting HA. MkaLL was resistant

282 to chemical or physical stress, such as pH and temperature.

283 A Medeiros et al. [41] study on the effect of temperature and pH

284 demonstrated that the lectin acquired was stable for heat and pH, however it HA

285 was lost with temperatures over 60°C, also the HA of CaL was not disturbed by

286 divalent cations (Ca2+, Mg2+ ou M2+). In same way, the lectin isolated from

287 Haliclona cratera [25] showed a low stability, maintaining the HA until 56°C and

288 pH ranging from 4,6 to 10,2.

289

290 DNA Nicking

291 The inhibitory action of MkaLL over the attack of hydroxyl radicals to the DNA

292 was evaluated through in vitro cleavage of pBR322 plasmid. According to Jung

293 and Surh [42] DNA damage is associated to the conversion form of the plasmid

294 from the supercoiled to a linear and round. The figure 6 shows the MkaLL

295 inhibition effect on a 50 µg/mL, which blocked the cleavage of DNA plasmid, ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 140

296 consequently changing format and total degradation of the molecule in a lack of

297 lectin.

298 Mutations or breaks in the double-stranded chain may contribute to

299 formation of chromosomal aberrations leading to cancer. Therefore, oxidative

300 injuries seems to be relevant to the carcinogenic process [43, 44]. Hence, it is

301 thought that MkaLL could be a future tool to inhibit these injuries and previne

302 cancer development through ORE´s. This is the first report on a Manilkara

303 lectin, MkaLL, able to protect plasmodia DNA against oxidative injuries caused

304 by hydroxyl radicals.

305

306 Antibacterial activity

307 Several studies have been performed to evaluate interactions involving plant

308 lectins with bacteria [45, 46]. Others done to evaluate this interaction focused in

309 obtain new bioactive molecules [26, 47, 48].

310 Bacterial resistant microorganism are increasing, emerging the interest

311 to research new antibiotics derived from plants.

312 In vitro antibacterial assays demonstrated that the MkaLL exhibited antibacterial

313 activity against only one tested pathogenic bacteria (M. luteus) (table 3).

314 A lectin isolated from Araucaria angustifolia seeds led to the formation of

315 pores and disruption of the Gram-positive bacteria membrane, being more

316 active against Gram positive bacteria than Gram-negative bacteria [49].

317 Lectin concentrations over 500 µg/ml were not used for this assay, since

318 according to Costa et al. [31] becomes unfeasible the use of high

319 concentrations of proteins, by virtue of these biomolecules may interfere with

320 the growth of microorganisms, not per its direct action as an antimicrobial but by ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 141

321 increasing the osmolarity killing microorganisms and thereby leading false-

322 positive results.

323 This is the first report of a lectin (MkaLL) for Manilkara genera obtained from the

324 leaves of Manilkara rufula (Maçaranduba). The purification protocol using chitin

325 allowed obtaining a lectin, which appeared as two polypeptide bands in SDS-

326 PAGE. The purification on AKTA system suggests the isolation of two lectins or

327 MkaLL isoforms in chitin column. This showed to be highly thermostable and

328 resistant to pH variations. MkaLL revealed to possess DNA protective activity

329 against hydroxyl radicals and antimicrobial activity against M. luteus.

330

331 Acknowledgments

332 The author José Helton V. Arcoverde is recipient of a scholarship 333 from Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco 334 (FACEPE). The authors express their gratitude to the Conselho Nacional de 335 Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and 336 fellowship (MTSC and MGCC) and by financial support. Rede NanoBiotec, 337 Núcleo de Bioprospecção da Caatinga/ INSA, as well as IcmBio for the 338 authorization to collect in Parque Nacional do Catimbau (16.888 Sisbio). 339 340 Bibliographic References

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494

495 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 148

496 Superscription of figures

497

498 Fig. 1: Profile of quitin affinity chromatographic column eluted with acetic acid

499 1mol/L.

500 Chromatogram: Sample abs at 280nm (▲); Sample Log of HA(●); (↓)

501 beginning of elution, MkaLL was obtained between intervals of fractions 110-

502 132.

503

504 Fig. 2: Molecular Characterisation. SDS-PAGE gel (12,5%) obtained through

505 lectin purification on quieten chromatography, stained with bright blue

506 Coomassie. Band molecular weights were 43,2 (A) e 36,3 (B) KDa,

507 respectively.

508

509 Fig. 3: Chromatography of MkaLL on Superdex-75 10/300GL column accepted

510 to a ÄKTA purifying system, equilibrated and eluted with NaCl 0,15 mol/L.

511

512 Fig. 4: Effect of pH at hemagglutinating activity after incubation with different pH

513 (4,5-11) buffers.

514

515 Fig. 5: Effect of temperature at MkaLL HA in rabbit erythrocytes. The initial

516 activity was 512 and each point over the line represents the average of three

517 repetitions.

518

519 Fig. 6: Protective effects of lectin of M. rufula in DNA nicking assay. (A) Lane 1:

520 negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s

521 reagent), (3) Lane 3-5: MkaLL (5o µg/mL) + Fenton’s reagent.

522

523

524 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 149

525 Table 1: Inhibition of hemagglutinating activity of 40-80% saline fraction of

526 leaves from M. ruful. using rabbit red blood erythrocytes.

527

Carbohydrates 500 250 125 62.50 31.25 (µg/mL)

D-glucose + + + + -

D-fructose - - - - -

D-xylose - - - - -

D-arabinose - - - - -

D-galactose + + - - -

Sucrose - - - - -

N-acetyl-D- + + + + - glucosamine

528

529 Lectin concentration: 500 µg/mL

530 Initial HAtiter corresponded: 2048.

531 Assay achieved at room temperature (25°C) using a 2.5% suspension of

532 erythrocytes.

533

534

535 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 150

536 Tabela 2: Purification summary of leaf lectins from Manilkara rufula.

537

Activity aAHE Lectin Vol. Protein bfold total (AH/mg c Yield (%) Fraction (ml) (mg) Purific. (AH) )

Ext.Crud 100 5.360 204.800 38.2 1.00 100

e

F: 40- 45 2.313 92.160 39.8 1.04 45.0

80%

MakaLL 240 11.28 1.920 170.2 4.45 0.9

538

539 MkaLL: lectin obtained from M. rufula leaves by quitin chromatography..

540 a Specific Hemagglutinating Activity; agglutinating against rabbit erythrocytes.

541 b Purification fold: relation between SHA of lectin and SHA of crude extract.

542 c Yield: relation between HA of crude extract and lectin.

543

544 ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 151

545 Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal

546 Concentration(CBM) of MkaLL against bacterias.

547

Bactérias MIC (µg/mL) CMB (µg/mL)

S. aureus – UFPEDA-02 ND ND

M. luteus - UFPEDA-100 250 > 250

B. subtillis- UFPEDA-86 ND ND

E. coli – UFPEDA-224 ND ND

K. pneumonieae – UFPEDA-396 ND ND

P. Aeruginosa – UFPEDA-416 ND ND

548

549 Mkal: M. rufula lectin.

550 ND: Not detected.

551 MIC: Minimum Inhibitory Concentration corresponded to the minimal lectin

552 concentration that inhibited bacterial growth, in titer plates.

553 CBM: Minimun Bactericidal Concentration was determined as the highest

554 dilution (lowest concentration) without growth on Agar plates.

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8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

1. Na Caatinga há uma grande vareidade de espéceis vegetais ricas em compostos bioquímicos que devem ser melhor explorados.

2. Os solventes clorofórmio, acetato de etila e metanol mostraram-se eficientes para extração de metabólitos secundários das folhas de M. rufula.

3. Nas folhas de M. rufula estão presentesuma expressiva quantidade de flavonoides, esteroides e taninos.

4. Os extratos orgânicos das folhas de M. rufula mostraram atividade antioxidante, protetora de DNA, anti-bacteriana e termiticida.

5. Uma lectina (MkaLL) com atividade protetora de DNA e anti-bacteriana foi isolada das folhas de M. rufula.

7. M. rufula apresenta-se como uma promissora fonte de compostos bioativos.