Aspectos Epigenéticos Del Gen BTBD3 En Niños Diagnosticados Con TDAH En Una Muestra De Pacientes Colombianos

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos.

Óscar Gerardo Rodríguez Angarita

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina, instituto de genética, Colombia 2018

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos.

Óscar Gerardo Rodríguez Angarita

Tesis o trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al tíıtulo de Magister en Neurociencias

Director MD, MSc. Humberto Arboleda Granados

Grupo de Investigación: Grupo de Neurociencias – Universidad Nacional de Colombia

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina, instituto de genética, Colombia 2018

Los teóricos realizan los experimentos en sus cerebros. Los experimentadores utilizan, además, las manos. Aquéllos son pensadores y éstos artesanos. El teórico actúa en un lugar prístino, limpio de ruido, vibraciones y suciedad. El experimentador desarrolla intimidad con la materia, como el escultor con la arcilla. El teórico inventa sus compañeros, como ingenuo Romeo que sueña su Julieta ideal. Los amores del experimentador son sudor, quejas y esperanza.

James Gleick

Agradecimientos

Las investigaciones para éste trabajo no habrían sido posibles sin el apoyo económico de Colciencias. El Instituto de Genética también contribuyó al desarrollo de éste trabajo, abriéndome las puertas y permitiendo tener la experiencia de formarme como investigador, también agradezco a la línea de investigación en Neurodesarrollo, en el marco de la cual se desarrolló mi trabajo. Diferentes personas han contribuído con ésta tesis de manera directa e indirecta. El profesor Humberto Arboleda, mi director de tesis, por sus invaluables consejos y su ejemplo de disciplina y amor por la ciencia. Xiomara Rodríguez quien comparte su vida conmigo y me ha apoyado en momentos difíciles y potencia mi momentos felices. Mi familia, que se ha convertido en mi estandarte y son un cimiento fundamental en todo mi proceso de desarrollo académico. Varios colegas me han ayudado. Quiero mencionar especialmente a Diana Cifuentes, Angie Alvarado y Gabriela Concha, quienes aparte de ser buenas amigas, con paciencia me ayudaron, sobretodo en el proceso de aprendizaje de los procedimientos de laboratorio. A María Fernanda Mahecha, por sus asesorías y en general a todo mis profesores, compañeros de aula y de laboratorio con quienes sostuve conversaciones inspiradoras que me motivaron a seguir adelante. También quisiera agradecer a la evolución, por la selección natural que hizo de coffea y Camellia sinensis, que gracias a su contenido de cafeína me ayudaron a mantener mi sistema nerviosos estimulado, además de que varias ideas para la tesis fueron en un inicio bosquejos en las servilletas de cafetería.

Resumen y Abstract IX

Resumen El TDAH es un trastorno comportamental altamente heredable, persistente y frecuente. La etiología del trastorno no está clara. Sin embargo, se han descrito similitudes neuroanatómicas entre trastorno de déficit de atención e hiperactividad (TDAH), trastorno obsesivo compulsivo (TOC) y espectro autista (EA). Por otra parte, se encontrado asociación significativa entre variantes genómicas en el gen BTBD3 y TOC y áreas diferencialmente metiladas en este mismo gen asociadas a TDAH. Este trabajo se propuso determinar el patrón de metilación de un área del gen BTBD3 en una muestra de pacientes Colombianos diagnosticados con TDAH. Adicionalmente se generaron comparaciones en los niveles de metilación en función de diversas variables clínicas. De manera complementaria, se desarrollaron análisis no considerados en los objetivos del trabajo, se generó un análisis de interacción proteína-proteína (PPi) alrededor del gen BTBD3 y un análisis de expresión y co-expresipon del gen en cerebro prenatal y adulto. Esto con el fin de tener un entendimiento más profundo de la función de BTBD3 en el neurodesarrollo y la conducta El diagnósticos de TDAH no se asocia con cambios en la metilación. Se observa relación de la metilación con estrés prenatal, el tipo de parto, estrés durante el embarazo, si fue o no un embarazo deseado, si hubo algún riesgo para el embarazo durante el tercer trimestre, tipo de parto enfermedades al nacer,tipo de alimentación, región de nacimiento edad del padre y de la madre. La red de interacciones entre proteínas está dominado por procesos asociados al metabolismo mediado por ubiquitinación. La desestabilización topológica mostró cambios significativos en topológica y enriquecimiento funcional. El análisis de expresión mostró que el gen BTBD3 tiende a estar más expresado en cerebro prenatal que en adulto pero con co-expresiones más débiles. Palabras clave: TDAH, metilación, PPi, BTBD3, desestabilización topológica, BSP PCR, análisis de expresión.

X Resumen y Abstract

Abstract

Introduction: ADHD is a behavioral disorder highly heritable, persistent and frequent. The etiology of the disorder is not clear. Nevertheless, neuroanatomical similarities has been described between attention deficit hyperactivity disorder ADHD, obsessive compulsive disorder (OCD) and autistic spectrum (AS). Moreover, there is significant association between genomic variants in BTBD3 and OCD and differentially methylated areas in the before mentioned gene associated to ADHD. This work attempt to determine the methylation pattern in a region of BTBD3 in a sample of Colombian patients diagnosed with ADHD. Additional, methylation was compared as function of clinical variables. in a complementary way, it was performed several not before considered analysis in the goals of the investigation, it was developed a protein-protein (PPi) interaction analysis surrounding the BTBD3 gene and an expression and coexpression analysis of the gene in the prenatal and adult brain. This with the goal get a more profound understanding of the BTBD3 function in the neurodevelopment and in the behavior The diagnosis of ADHD is not associated with changes in methylation. Relations are observed when diagnosis interact with prenatal stress, type of delivery, stress during pregnancy, if it was a desired pregnant, risks in the third trimester of pregnancy, type of delivery, diseases at birth, type of feeding, region of birth, age of father and mother. The network of interactions between proteins is dominated by metabolism mediated by ubiquitination. Topological destabilization showed significant changes in topological and functional enrichment. The expression analysis show than the BTBD3 gene tend to be more expressed in the prenatal brain than in the adult brain but with lower coexpression. Key words: ADHD, methylation, PPi, BTBD3, topological destabilization, BSP PCR, expression analysis.

Contenido

1. Introducción. 18 2. Justificación. 21 3. Trastorno de déficit de atención e hiperactividad. 22 3.1 TDAH y Sistema excitador. 22 4. Epigenética 24 4.1. Señalización y factores epigenéticos. 25 4.2 Metilación de ADN. 27 4.3. Dinámica epigenética. 30 5. BTBD3. 33 5.1. BTBD3 y Neurodesarrollo. 34 5.2. BTBD3 y TDAH. 35 6. Objetivos. 37 6.1 General. 37 6.2 Específicos. 37 7. Metodología. 38 7.1. Metilación 38 7.1.1. Muestra. 38 7.1.2. Criterios de inclusión y exclusión. 39 7.1.3. Extracción de ADN. 39 7.1.4. Conversión con bisulfito. 40 7.1.5. BSP PCR. 41 7.1.6. Purificación y reacción de secuencia. 42 7.1.7. Análisis de metilación. 43 7.2. Análisis de redes. 43 7.3. Análisis de expresión y co-expresión. 45 7.4. Análisis estadístico. 46 7.5. Enriquecimiento funcional. 47 8. Resultados 49 8.1. Patrón de metilación en BTBD3. 49 8.1.1. Factores ambientales asociados a la elevación de la metilación. 51 8.1.2. Factores in utero asociados a la elevación de la metilación. 53 8.1.3. Factores postparto asociados a la elevación de la metilación. 55 8.2. Red de Interacción Proteína Proteína (PPi) del gen BTBD3. 59 8.3. Patrón de expresión del gen BTBD3 en el cerebro prenatal y adulto. 68

8.3.1. co-expresión del gen BTBD3 70 9. Discusión. 77 9.1. Patrón de metilación. 77 9.2. Red PPi 82 9.2.1. Detección de comunidades. 84 9.2.2. Análisis topológico 86 9.3. Expresión y co-expresión de BTBD3. 89 9.3.1. Expresión por área. 89 9.3.2. co-expresión. 94 10. Conclusiones. 97 11. Perspectivas 100 12. Anexos. 102 12.1. Mediciones topológicas de la red. 102 12.2. Enriquecimiento funcional de la red completa y desestabilizada. 116 12.3. Enriquecimiento funcional de la red con los nodos que poseen mayor coeficiente topológico 124 12.4. Protocolo general de electroforesis. 128 12.5. Protocolo de conversión con bisulfito. 129 12.6. Protocolo de purificación de ADN y preparación de reacción de secuencia. 131 13. Referencias. 134

Contenido 13

Término Abreviaturas

AIBS Allen institute for brain science

CBC Corteza cerebelosa

EA Espectro autista

EdgeB Centralidad de intermediación de arista

GD Giro dentado

PageR Centralidad de rango de page

TDAH/ADHD Trastorno de déficit de atención e hiperactividad

PK Proteínas kinasas

TOC/OCD Trastorno obsesivo compulsivo

GWAS Estudios de asociación de genoma completo

SNP Polimorfismo de un solo nucleótido

5meC 5 metilcitosina

K Lisina

ADN Ácido desoxiribonucleico

ARN Ácido ribonucleico

snoARN ARN nucleolar pequeño

miARN Micro ARN

lncARN ARN largo no codificante

HDAC Deacetilasas de histonas

HAT Acetiltransferasa de histonas

DNMT DNA metiltransferasas

TET Metilcitosina dioxigenasa tet

5hmC 5-hidroximetilcitosina

5caC 5-carboxilmetilcitosina

Abreviatura Término

5fC 5-formilcitosina

R Arginina

H3K4me metilación en la lisina 4 de la histona 3

H3K9me Metilación en la lisina 9 de la histona 3

H3K27me3 Trimetilación de la lisina 27 en la histona 3

HMT Metiltransferasa de histonas

S Serina

HDM Demetilasa de histonas

PP Fosfatasas

BTB complejo bric-a-brac–tramtrack–broad / pox virus and zinc finger

BTBD3 BTB/POZ domain containing 3

KD knockdown

KO Knockout

NMDA Receptor N-methyl-D-aspartate

PCR Reacción en cadena de polimerasa

PTR Pretectum

MTc Tectum mesencefálico

THM Tálamo

MTg Tegmento mesencefálico

HTM Hipotálamo

PnTg Tegmento pontino

NEDD8 neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 8

NR3C1 Receptor de glucocorticoides

HiF Formación hipocampal

Contenido 15

Abreviatura Término

CbCx Corteza cerebelosa adulta

VT Tálamo ventral

WM Materia blanca

Betw Centralidad de intermediación

Eigen Centralidad de autovector

Closs Centralidad de cercanía

Degree Centralidad de grado

HPA eje hipotálamo pituitaria suprarrenal

CRH Hormona liberadora de corticotropina

ACTH Hormona adrenocorticotropa

CS Síndrome de Cushing

Ppi Interacción proteína-proteína

BSP Bisulfite Sequencing PCR

ESME Epigenetic Sequencing Methylation analysis software

Sf sufrimiento fetal

SfC sufrimiento fetal y cianosis

DieVF disqueratosis intraepitelial benigno familiar

BpE Bajo de peso y estatura

PS pobre succión

GO gene ontology

ML Machine Learning

1. Introducción.

El TDAH es una patología caracterizada por la incapacidad para sostener y controlar la atención así como por la emisión de conductas impulsivas (American Psychiatric Association, 2009a) acompañado por déficit en funciones ejecutivas. El TDAH es altamente frecuente (Bell, 2011a), persistente (de Zwaan, Gruß, et al., 2011) y heredable (Thapar, Cooper, Eyre, & Langley, 2013a). Sin embargo, las bases genéticas de la patología no se han establecido (Johnson, 2015a; Zhou et al., 2008). Al ser un fenómeno con repercusiones sociales; fracaso escolar, laboral y dificultades de socialización, se asocia con elevación en niveles de estrés psicosocial (Hirvikoski, Lindholm, Nordenström, Nordström, & Lajic, 2009). Se ha hipotetizado que una incorrecta corticogenesis juega un papel predominante en la emergencia del fenotipo TDAH, debido a que se ha observado un retraso en la maduración del encéfalo de quienes la padecen (Shaw et al., 2007). En éste sentido el gen BTBD3 resulta un marcador importante en desarrollo y mantenimiento de la patología, ya que este participa en los procesos de orientación de dendritas hacia axones activos e incluso orienta las dendritas cuando la expresión de los axones es ectópica (Matsui et al., 2013). Se ha asociado específicamente a ls columnas corticales que inician en la capa 4 de la corteza (L4) y la arborización de las conexiones tálamocorticales (Wang et al., 2017). La actividad de este gen se encuentra conservada desde D. melanogaster hasta H. sapiens (“RefSeq: NCBI Reference Sequence Database,” n.d.). Lo que sugiere la importancia de la función de este en la correcta organización del sistema nervioso. Por otra parte estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han mostrado que el SNP rs6131295, el cual está corriente abajo del gen BTBD3 se asocia significativamente con patologías como trastorno obsesivo compulsivo (TOC) (Browne, Gair, Scharf, & Grice, 2014; Stewart et al., 2013). Un estudio encontró similitud estructural entre los encéfalos de pacientes con TOC, TDAH y espectro autista (EA) (Ameis et al., 2016). Lo que sugiere marcas genéticas similares en las tres patologías. Sin embargo, los estudios GWAS de TDAH no muestran resultados consistentes (Romanos et al., 2008; Zhou et al., 2008). Lo anterior indicaría la participación de procesos tanto genéticos como epigenéticos en el desarrollo y mantenimiento de la patología.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 19 muestra de pacientes colombianos

Los estudios de genética facilita establecer relaciones entre estructura genotípica y un fenotipo, esto es especialmente claro en los modelos de herencia mendelianos, en los cuales la presencia de un alelo dominante (heterocigoto), o dos recesivos o dominantes (homocigoto), lleva a la expresión de un fenotipo particular, en patrones de segregación generacional vertical (alelo dominante) u horizontal (alelos recesivos), en los cuales hay que considerar los porcentajes de penetrancia y expresividad del fenotipo (Nussbaum, McInnes, & Willard, 2007). Sin embargo, el genotipo y el fenotipo no siempre guardan relación, la mayoría de los fenotipos patológicos o ventajosos son producto de interacciones bioquímicas complejas, es decir, que pueden intervenir más de un gen y factores ambientales. El efecto del ambiente sobre la conducta y el organismo, además de la diferencia en los tejidos de un mismo organismo abrieron las puertas a la conceptualización sobre la epigenética. Esta hace referencia al estudio de los cambios en la expresión genética en los que no se altera la secuencia de nucleótidos del ADN (LaSalle, Powell, & Yasui, 2013a). La metilación del ADN es un proceso en el cual un grupo metilo (CH3) se agrega al carbono 5 de la Citosina (5meC), generalmente en áreas donde estos nucleótidos están seguidos de guaninas. La metilación se presenta en zonas promotoras, intragénicas e intergénicas y dependiendo de dónde se presente la metilación la consecuencia para el funcionamiento del genoma será diferente. Las área de mayor influencia de la metilación se denominadas islas CpG; sitios en el genoma enriquecidos en Guaninas y Citosinas, de aproximadamente 200 pb en donde el porcentaje de CG es superior al 50% y donde la tasa de CpG observadas / CpG esperadas es superior al 0.6 y generalmente asociadas a promotores (Gardiner-Garden & Frommer, 1987a; Hackett & Surani, 2013a; Ku, Jeon, & Park, 2011a). Debido a que los cambios epigenéticos regulan la expresión de los genes, han emergido en campo de la investigación psiquiátrica. BTBD3 es un gen poco estudiado, no existen aún estudios cristalográficos y tampoco se conoce su panorama exacto de expresión así como su desarrollo ontológico. En este escenario resulta importante determinar el panorama epigenético del gen en su región reguladora en una muestra de pacientes con diagnóstico de trastornos comportamentales. Se seleccionó la técnica BSP PCR para obtener los porcentajes de metilación individuales de cada CpG del amplicón

20 1. Introducción.

estudiado. Aun así la técnica de conversión con bisulfito no es capaz de diferenciar entre las distintas marcas epigenéticas del ADN, algunas asociadas a demetilación. Debido al escaso conocimiento del funcionamiento del gen

2. Justificación.

Las etapas del neurodesarrollo, pre y postnatal, son periodos sensibles en los que el organismo se encuentra en medio de procesos de cambio que pueden ser alterados fácilmente. Dichas alteraciones pueden ser constitutivas, es decir, que son producto del genotipo y/o debido a factores ambientales que generan cambios en la manera como se expresa el ADN. Cualquiera de estos pueden llevar a trastornos del neurodesarrollo, que generalmente se asocian con déficit en las capacidades intelectuales (Millan, 2013a). Entre estos trastornos el TDAH sobresale por su frecuencia y por la afectación que puede tener en la vida de quienes lo padecen. Establecer los componentes moleculares de este trastorno permitiría generar estrategias de diagnóstico y tratamiento más eficaces. Debido a la similitud neuroanatómica entre diferentes trastornos del desarrollo con TDAH y a la emergencia de BTBD3 como un gen asociado a estas patologías (Ameis et al., 2016; Stewart et al., 2013; Yue et al., 2016)). Se propone indagar la relación entre este gen y el TDAH en una muestra de pacientes Colombianos.

3. Trastorno de déficit de atención e hiperactividad.

El trastorno de déficit de atención e hiperactividad (TDAH) se constituyó como una entidad patológica en los años sesentas cuando era denominada como “reacción hiperquinética infantil” (Russell A. Barkley, 2005), el TDAH es uno de los trastornos del comportamiento más frecuentes, se presenta en un 3% a 7% de la población infantil (Bell, 2011b), con predominancia en varones (Thapar & Cooper, 2016). Se caracteriza por la incapacidad para sostener la atención y un patrón persistente de conductas impulsivas e hiperactivas (American Psychiatric Association, 2009b). Además presenta un alto grado de persistencia; se ha descrito que entre un 30% a 60% de las personas que padecieron TDAH en la niñez lo mantiene en la adultez (de Zwaan, Barbara, et al., 2011). Es un trastorno altamente heredable, se estima en un 78% (Thapar, Cooper, Eyre, & Langley, 2013b). Los factores genéticos del TDAH se han estudiado ampliamente, sin embargo, la etiología del trastorno no ha sido establecida (Johnson, 2015b; Zhou et al., 2008).

3.1 TDAH y Sistema excitador.

El TDAH, debido a sus características, se ha asociado al incremento de eventos socialmente estresantes como el fracaso escolar y dificultades en la socialización (Hirvikoski, Tatja, et al., 2009). Aunque estos eventos estresores no son traumáticos, si ponen al sujeto en situaciones de estrés crónico, y aunque dicho estrés no es alto, es perjudicial. Se ha asociado, el estrés crónico en la niñez y la adolescencia, con una menor capacidad de control neurohormonal debido a incremento de la metilación de la región 1f del gen NR3C1 (L. J. van der Knaap et al., 2014). Se ha postulado que uno de los elementos más importantes que influyen en el desarrollo del TDAH es un patrón de baja excitabilidad general, es decir, déficit

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 23 muestra de pacientes colombianos

en la capacidad para activar las áreas del cerebro asociadas a la regulación comportamental (Nigg, Hill Goldsmith, & Jennifer, 2004). Este elemento no solo lleva a una baja capacidad para activar el sistema motivacional, sino que también implica un sistema inhibidor comportamental hipoactivo, (R. A. Barkley, 1997), esto es, las redes neuronales asociadas a la inhibición del sistema límbico no generan suficiente actividad debido a la baja cantidad de neurotransmisores excitadores, de modo que el sistema límbico no es modulado adecuadamente. En general se ha observado que el patrón de respuesta ante estrés de los sujetos diagnosticados con TDAH difiere de los sujetos que no (Johnson, 2015b). Un estudio encontró que la cantidad de cortisol basal (hormona producida durante evento estresantes) de niños con TDAH es menor que los controles (Ma et al., 2011). Diferencias en la respuesta del cortisol también son observables en la adultez; se encontró, en adultos con TDAH, que el nivel basal de cortisol es similar a los controles. Sin embargo, este presenta un patrón de elevación significativo frente al estrés, es decir, que el aumento de cortisol frente a un estímulo estresante es significativamente mayor en sujetos con TDAH con respecto a controles (Raz & Leykin, 2015). La desregularización del sistema excitador y del sistema emocional y de inhibición comportamental puede asociarse al retraso en el desarrollo de la corteza prefrontal que se ha observado en niños con TDAH. Un estudio que comparó imágenes de resonancia magnética de pacientes TDAH versus controles, encontró un retraso en el engrosamiento cortical en los pacientes con respecto a los controles, especialmente las áreas frontales (Shaw et al., 2007). Mientras los controles alcanzaron el grosor máximo a los 7.5 años, los niños TDAH lo alcanzaron a lo 10.5 años (Shaw et al., 2007). Dicho retraso puede asociarse a la incorrecta organización cortical producto de cambios en la metilación de genes reguladores de la organización dendrítica y axonal como BTBD3 (Kazuhiko Igarashi, Kurosaki, & Roychoudhuri, 2017). Esto puede llevar a que neurotransmisores asociados al aprendizaje (glutamato), emociones (5-HT) y motivación (dopamina), no estén presentes de manera suficiente o necesaria en el sistema nerviosos, esto guarda relación con el fenotipo inatento de los niños TDAH.

24 3. Trastorno de déficit de atención e hiperactividad.

Estos datos en conjunto apuntan a una desregularización de la actividad encefálica general, que al menos en niños con TDAH, implicaría una incorrecta organización cortical, lo que sugiere cambios en los patrones de metilación que alteran la expresión de genes asociados a la maduración encefálica. Esto podría estar indicando que existen procesos de maduración y ambientales que están generando variaciones en las firmas epigenéticas ya establecidas en los niños. Con esta base, se hipotetiza que los patrones epigenéticos alterados (hipermetilación o hipometilación) se asocian a los eventos estresantes producto de las condiciones sociales propias del TDAH, y estos a su vez contribuyen al desarrollo y mantenimiento de la patología.

4. Epigenética

Los estudios de genética facilitan establecer relaciones entre estructura genotípica y un fenotipo particular, esto es especialmente claro en los modelos de herencia mendelianos, en los cuales la presencia de un alelo dominante (heterocigoto), o dos recesivos o dominantes (homocigoto), lleva una alta probabilidad de expresar de un fenotipo, en patrones de segregación generacional vertical (alelo dominante) u horizontal (alelos recesivos) (Nussbaum, McInnes, & Willard, 2015). Sin embargo, el genotipo y el fenotipo no siempre guardan relación directa, la mayoría de los fenotipos patológicos (o ventajosos) son producto de interacciones bioquímica complejas, es decir, que pueden intervenir más de un gen y factores ambientales. Esta baja correlación entre genotipo y fenotipo abrió la puerta a las ideas que permitieron la aparición del concepto de epigenética. La epigenética estudia las modificaciones postraduccionales en la cromatina heredables y su efecto sobre la transcripción que estas pueden tener (LaSalle, Powell, & Yasui, 2013b). Aunque los estudios de epigenética han cobrado relevancia, en tiempos recientes, no son nuevos. El término “epigenética” fue acuñado por Conrad Waddington, quien cuestionó el paradigma imperante de su época, según el cual, existía una relación directa entre genotipo y fenotipo; en su lugar hipotetizó que debía existir una relación entre genes, ambiente y la expresión del fenotipo (Millan, 2013b; Waddington, 1956). El efecto de la epigenética sobre el fenotipo es apreciable cuando se observan un par de células, cada una de un tejido diferente pero de un mismo organismo, estas comparten la misma secuencia de ADN, sin embargo, se diferencian en la manera como expresan el ADN, esto le confiere su identidad a cada célula. Estas diferencias en las células de un mismo organismo se deben al control en la expresión debido a las modificaciones en la cromatina que generan variaciones en la cantidad de transcritos y en consecuencia afecta la producción de proteínas. Estos cambios son impulsados por factores como tiempo, espacio y las circunstancias en las que se encuentra el organismo. Los procesos epigenéticos permiten que la célula, y por ende el tejido, el órgano y el sistema, tengan identidad propia, esto es, los procesos epigenéticos participan en

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos 25

la diferenciación celular, establecimiento de patrones de expresión (Maunakea, Chepelev, Cui, & Zhao, 2013) y mantenimiento de su identidad, a través de procesos como la impronta genética, procesos activos y pasivos de demetilación del ADN, modificaciones postraduccionales de las histonas y acción de ARNs no codificantes (Bartolomei & Ferguson-Smith, 2011; Hackett & Surani, 2013b).

4.1. Señalización y factores epigenéticos.

Los procesos epigenéticos dependen de cascadas de señalización que regulan su función. En general se proponen 3 elementos fundamentales en esta cascada: epigeneradores, iniciador epigenético y mantenedores epigenéticos (Berger, Kouzarides, Shiekhattar, & Shilatifard, 2009). Los epigeneradores son las señales ambientales o madurativas que activan los iniciadores. El iniciador epigenético hace referencias a proteínas que actúan como factores de transcripción y que reclutan a los mantenedores. Los mantenedores epigenéticos actúa sobre las histonas o modificando el patrón de metilación del ADN (figura 1) (Berger et al., 2009; Stankiewicz, Swiergiel, & Lisowski, 2013).

figura 1. esquema de la cascada de señalización que lleva a generar cambios epigenéticos. tomado de (Berger et al., 2009; Stankiewicz et al., 2013).

A diferencia del código genético, en el cual la información de interés está contenida en la secuencia de nucleótidos, el patrón epigenético está determinado

26 4. Epigenética

por la acción de diferentes componentes moleculares que interactúan de manera dinámica (figura 2); metilación del ADN (Berger et al., 2009; Stankiewicz et al., 2013); modificaciones en proteínas histonas, que tienen áreas con residuos de aminoácidos sensibles a cambios postraduccionales, adicionalmente, los nucleosomas enteros pueden ser modificados (eyectados, cambiados, desplazados) (LaSalle et al., 2013b; Millan, 2013b); ARNs no codificantes que van intervenir de manera directa en la formación, maduración y función del ARN mensajero (mARN); ARN nucleolar pequeño (snoARN) interviene en le proceso de splicing del ADN; micro ARN (miARN) y ARN largo no codificante (lncARN) se unen al mARN evitando que este sea transcrito y participa en formación de heterocromatina (Millan, 2013b; Siprashvili et al., 2012). Estos diferentes componentes actúan en una dinámica de sistema, es decir, que son interdependientes, multicausales y con respuestas no lineales. Así, por ejemplo, la metilación del ADN es capaz de reclutar HDAC (deacetilasas de histonas), asociadas a formación de heterocromatina (Kim, J.-M., To, & Seki, 2012; Kouzarides & Tony, 2007) o HAT (acetiltransferasas de histonas), la cuales pueden ejercen un efecto opuesto a HDAC (Du, Johnson, Jacobsen, & Patel, 2015; LaSalle et al., 2013b), es decir, los cambios en la metilación de los nucleótidos afectan de manera directa a la condensación de la cromatina y por ende la manera como se expresan poblaciones de genes. Del mismo modo, cambios en las histonas o en la metilación del ADN pueden llevar a una mayor o menor expresión de los ARN no codificantes, lo que impactaría el proceso de traducción a proteínas y/o la condensación de la cromatina (Hackett & Surani, 2013b; Millan, 2013b). Los estudios en epigenética han abierto la discusión sobre la posible existencia de un código epigenético; similar a lo que ocurre con el código de ADN. Referente a la metilación en el ADN se ha observado que durante los proceso de replicación del ADN existen mecanismos que permiten que las hebras nuevas mantengan el patrón de las hebras paternas, es decir, que durante la replicación celular se hereda el patrón de metilación (Feng et al., 2010), esto lleva a suponer que una vez establecido un patrón de metilación este será relativamente estable y se transmitirá en los procesos de división celular. Con respecto a las histonas, el código epigenético se refiere a la posible relación que existe entre la secuencia de aminoácidos de la cola de las histonas y sus modificaciones postraduccionales. Se

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos 27

sugiere que estas secuencias tienen una mayor importancia como puntos activadores de otras proteínas que como puntos de anclaje para dichas proteínas (Rando, 2012). Adicionalmente, el patrón de modificaciones postraduccionales de las histonas también son transmitidos durante la mitosis y la meiosis. Lo anterior sugiere cierta estabilidad en los patrones epigenéticos que ya se han establecido. Una vez se forma el cigoto, las diferente vías de diferenciación, como wnt o notch (Fiuza & Arias, 2007; Komiya & Habas, 2008) permiten la reorganización del epigenoma para generar los diferentes tejidos. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos del ADN es mucho más estable y permanece prácticamente inalterada durante todo el periodo de vida del organismo, por su parte el patrón epigenético se modifica ante señales madurativas y ambientales de manera más dinámica que el ADN.

Figura 2. muestra los diferentes niveles de actividad epigenética: ADN, histonas, nucleosomas y ARN no codificantes. Tomado de (Griffiths & Hunter, 2014).

4.2 Metilación de ADN.

Es un proceso en el cual un grupo metilo (CH3) se agrega al carbono 5 de la Citosina (5meC), generalmente en áreas donde estos nucleótidos están seguidos de guaninas, denominados dinucleótidos CpGs (figura 3). La metilación se presenta tanto en zonas promotoras, intragénicas e intergénicas y dependiendo de dónde se presente la metilación la consecuencia para el funcionamiento del genoma será diferente. Las área de mayor influencia de la metilación se denominadas islas CpG; sitios en el genoma enriquecidos en Guaninas y Citosinas de aproximadamente 200 pb en donde el porcentaje de CG es superior al 50% y donde la tasa de CpG observadas / CpG esperadas es superior al 0.6 y

28 4. Epigenética

generalmente asociadas a promotores (Gardiner-Garden & Frommer, 1987b; Hackett & Surani, 2013b; Ku, Jeon, & Park, 2011b). En el genoma de los mamíferos el 80% de los CpGs no asociados a islas se encuentran metilados, mientras que los CpG asociados a islas están demetilados (Baylin & Jones, 2016). Las islas CpG son puntos de anclaje para los factores de transcripción, lo que implica que estas zonas deben permanecer demetiladas, de modo que las proteínas puedan interactuar con el ADN (Li & Zhang, 2014). Pero otra familia de proteínas, denominadas proteínas con dominio de unión a CpG metilada, utiliza las CpG metiladas como punto de anclaje y de ese modo puede interactuar con otros complejos proteicos. Así los procesos de metilación del ADN alteran la expresión del ADN impidiendo que ciertas proteínas interactúen con el ADN y al mismo tiempo sirviendo de punto de anclaje para otras. Los procesos de metilación están a cargo de enzimas denominadas DNA metiltransferasas (DNMT). Existen dos tipos: de mantenimiento y de novo. Las de mantenimiento permiten que durante el proceso de replicación del ADN las hebras nuevas mantengan el patrón de metilación de las dos hebras paternas, la enzima de mantenimiento se denomina DNA metiltransferasa 1 (DNMT1) (Bestor, 1998; Provençal & Binder, 2015; Wu & Zhang, 2010). Las enzimas de novo, por su parte, actúan en función de las condiciones ambientales o internas de la célula y genera nuevas metilaciones. Estas enzimas son DNA metiltransferasa 3a y 3b (DNMT3a y 3b) son fundamentales en los procesos de establecimiento de la identidad de las líneas celulares durante el desarrollo (LaSalle et al., 2013b; Okano, 1998). Estos dos procesos están interrelacionados, y se asocian al desarrollo de enfermedades en función de las condiciones ambientales. Esto es, si un evento particular genera un patrón de metilación adverso en un momento determinado de la vida, dicho patrón de metilaciones serán producto de la acción de DNMT3a y 3b, si estas células afectadas continúan reproduciéndose, ya sea por mitosis o meiosis, los cambios en la metilación se extenderá por la acción de los mecanismo de replicación de ADN y de las enzimas de mantenimiento (DNMT1). Así un evento ambiental puede tener consecuencias tiempo después de ocurrido y en un área mayor a la afectada originalmente. Ahora bien, las células neuronales postmitóticas no entran en mitosis ni en meiosis una vez diferenciadas, lo que lleva a pensar que, algunos de los patrones de metilación adversos en el sistema nervioso central se pueden establecer tanto en periodos de diferenciación celular

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos 29

(prenatales) como en periodos posteriores del desarrollo. Fenómeno que se observa en procesos de estrés postnatal (L. Eiland & Romeo, 2013; McEwen, Gray, & Nasca, 2015; Provençal & Binder, 2015; Lisette J. van der Knaap, Oldehinkel, Verhulst, van Oort, & Riese, 2015; Vukojevic et al., 2014; Yehuda et al., 2015).

Figura 3. Arriba muestra la unión de la citosina y la guanina con los puentes de hidrógeno. Abajo igual que arriba, pero con la citosina metilada.

Cuando la metilación se da en las regiones promotoras de los genes se asocia con silenciamiento de estos (LaSalle et al., 2013b; Millan, 2013b), Este fenómeno es debido a que la metilación impide que los factores de transcripción interactúen con el ADN (Stankiewicz et al., 2013), adicionalmente la metilación del ADN recluta proteínas que metilan o deacetilan las histonas, así, el silenciamiento de una región del ADN puede llevar a la represión en la transcripción de muchos otros genes (Mifsud et al., 2011). Es importante tener en cuenta que los procesos de metilación no son lineales, es decir, mientras que la metilación en el promotor puede silenciar un gen y sirve como punto de anclaje para otras proteínas, este mismo proceso en el cuerpo del gen puede asociarse a procesos como aumento de la transcripción o inclusión aberrante de exones en el splicing (Du et al., 2015; LaSalle et al., 2013b; Maunakea et al., 2013). Es de resaltar que procesos de hipometilación del promotor también pueden implicar una baja en la transcripción (Franklin et al., 2010a). Lo que indica que la influencia de la metilación en la expresión no solo se da por el silenciamiento de los genes, sino que también es capaz de alterar el producto de transcripción.

30 4. Epigenética

Sin embargo, el proceso de metilación de ADN no es estático, existen mecanismos asociados a la eliminación de la metilación en las citosinas. Se ha observado la participación de la familia de enzimas metilcitosina dioxigenasa Ten- Eleven Translocation (TETs) en la transformación del ADN metilado (5meC) a 5- hidroximetilcitosina (5hmC), 5-carboxilmetilcitosina (5caC) o 5-formilcitosina (5fC) (Hackett & Surani, 2013b; Mifsud et al., 2011; Tahiliani et al., 2009). Estos diversos derivados de la 5meC se han asociados a procesos dinámicos de demetilación del ADN. Es importante señalar que estas marcas epigenéticas producidas por las enzimas TET representan dificultades a nivel de investigación, sobretodo al usar la técnica de cuantificación de metilación de ADN más frecuente, la conversión con bisulfito. Esta técnica permite comparar la metilación de una región de interés del ADN (o de todo el genoma) transformando las Citosinas no metiladas en Uracilos, mientras las Citosinas metiladas permanecen inalteradas; la dificultad que representa esta técnica está en que el bisulfito tampoco cambia los demás derivados de las TETs (figura 4), es decir, que al tratar el ADN con bisulfito, la lectura de la secuenciación no es capaz de diferenciar entre 5meC, 5hmC, 5caC o 5fC (Hackett & Surani, 2013b). Esto implica que lo que puede, en un momento dado, ser interpretado como un proceso de hipermetilación de un gen, podría ser una marca asociada a la demetilación y por ende a cambios en la expresión.

Figura 4. representación de la estructura de la citosina metilada y los diferentes derivados de las enzimas TET. 5mC, 5-metilcitosina; 5hmC, 5-hidroximetilcitosina; 5fC, 5-formilcitosina; 5caC, 5- caboxilcitosina. Adaptado de (Booth et al., 2013a; Li & Zhang, 2014).

4.3. Dinámica epigenética.

Mientras que la estructura genética se considera altamente estable, la epigenética es muy dinámica, se modifica en función señales madurativas y estímulos ambientales. Los patrones epigenéticos, además, pueden ser heredados transgeneracionalmente sin seguir las leyes de segregación

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una muestra de pacientes colombianos 31

mendeliana (Soloway, 2006) a través de tres procesos principales: 1) cambios comportamentales de los padres o cuidadores, esto es, si una marca epigenética particular genera un fenotipo comportamental en los cuidadores, las conducta asociadas pueden generar las mismas marcas epigenéticas en las crías; un estudio encontró que madres ansiosas, en monos rhesus, lleva al desarrollo de crías con conductas de ansiedad crónica (McEwen et al., 2015), en este mismo sentido se ha descrito, en ratas hembras, que la calidad del cuidado materno influye en la expresión del receptor de estrógenos 1b en el área preóptica medial, las variaciones en este receptor modifica la calidad del comportamiento materno, lo que a su vez genera una expresión similar de dicho receptor en las crías por efecto de la crianza (Champagne et al., 2006). 2) procesos prenatales adversos. Cambios en la permeabilidad del útero por glucocorticoides (GC) y sobre exposición del feto a estrés genera daños en diversas estructuras del sistema nervioso central (Lucassen et al., 2009; Provençal & Binder, 2015). 3) patrones epigenéticos en las células germinales que se transfieren en la formación del zigoto; se han observado, en roedores, que la alteración artificial de de microRNA en células germinales del padre tiene un efecto en el desarrollo de la cría (Grandjean et al., 2009a). Otro estudio en roedores encontró que, protocolos de condicionamiento de miedo con olor en la generación F0 generan un patrón de hipometilación en el gen Olfr1 que persiste en la generación F1, incluso con cría cruzada (Dias & Ressler, 2014a). y 4) la dieta, debido al efecto directo de la dieta sobre el metabolismo es un elemento fundamental en la alteración del epigenoma. Un estudio encontró que la restricción calórica en monos rhesus, se asociaba con un mejor estado de salud general y una vida más longeva (Messaoudi et al., 2010). Debido a que el TDAH es altamente heredable (Thapar, Cooper, Eyre, & Langley, 2013c), pero sus bases genéticas no son claras, es posible que uno o varios de estos procesos de transmisión epigenética estén interviniendo en el desarrollo y mantenimiento del trastorno. La dinámica de las marcas epigenéticas implican que existen mecanismos que permiten cambiar los patrones que se han establecido. Los procesos epigenéticos más descritos en las histonas se dan en los residuos de aminoácidos que se encuentran en las colas de estas: la metilación se produce en argininas (R) o lisinas (K), se han asociado con condensación de la cromatina. Sin embargo,

32 4. Epigenética

una marca epigenética como metilación en la lisina 4 de la histona 3 (H3K4me) se asocia con facilitación de la transcripción, mientras que una marca como H3K9me o H3K27me3 es represiva (Kouzarides & Tony, 2007; Mifsud et al., 2011; Rice & Allis, 2001; Yung, Stuetzer, Fischle, Martinez, & Cavalli, 2015). Este proceso depende de las enzimas metiltransferasas de histonas (HMT). La fosforilación se ha observado asociados tanto a potenciación como represión de la transcripción, aquí participan las proteínas kinasas (PK) (Stankiewicz et al., 2013; Yung et al., 2015). En la fosforilación un grupo fosfato se une a una serina (S), en este caso se ha detectado que S sirve como punto de anclaje para proteínas metiladoras como PRC2 (Yung et al., 2015). La acetilación se ha relacionado con facilitación en la transcripción, en este caso actúa la acetiltransferasa de histonas (HAT). En este proceso grupo acetilo (COCH3) se una a K. El grupo acetilo neutraliza la carga de K. Por lo que K pierde su capacidad para interactuar electrostáticamente con zonas cargadas negativamente en otras histonas o con el ADN, lo cual facilita la descondensación de la cromatina (Kim et al., 2012; Kouzarides & Tony, 2007; Mifsud et al., 2011; Rice & Allis, 2001). Adicionalmente en las histonas existen proteínas que se encargan de eliminar las modificaciones postraduccionales: la actividad contraria de HAT está a cargo de las de HDAC, que elimina las acetilaciones; el proceso opuesto de HMT lo desempeñan las demetilasa de histonas (HDM), encargada de suprimir las metilaciones y mientras las PK se encarga de fosforilar son las fosfatasas (PP) son las encargadas de eliminar dichas fosforilaciones (Stankiewicz et al., 2013; Yung et al., 2015)

5. BTBD3.

La proteína BTB (complejo bric-a-brac–tramtrack–broad) también denominado como POZ (pox virus and zinc finger) es un dominio que suele hacer parte de las proteínas con función de factor de transcripción en las que se presenta un dominio de dedos de zinc (Kazuhiko Igarashi et al., 2017; Siggs & Beutler, 2012). Produce un motif de interacción proteína proteína (Bardwell & Treisman, 1994). Este dominio se encuentra cerca del área N-terminal de la fracción de dedos de zinc y hace parte de los receptores citosólicos que reclutan co-represores como N-CoR o SMRT, así como deacetilasas de histonas en regiones promotoras (Huynh & Bardwell, 1998; Kazuhiko Igarashi et al., 2017; Siggs & Beutler, 2012). Sin embargo, un estudio de cristalografía mostró que, los diferentes dominios BTB tienen diferentes afinidades, así por ejemplo, el dominio BTB de la proteína LRF no interacciona con SMRT mientras el dominio BTB en BCL6 si lo hace (Stogios, Chen, & Privé, 2007). Sugiriendo la capacidad del dominio BTB para generar cambios en la transcripción de manera especializada. El genoma humano codifica 44 proteínas BTB (Stogios, Downs, Jauhal, Nandra, & Privé, 2005). Las proteínas con dominio BTB permanecen en el citosol y en función de una señal forman dímeros y posteriormente se traslocan al núcleo donde reconoce secuencias y recluta otras proteínas (figura 5) (Stogios et al., 2007) La familia de proteínas BTB participan en embriogénesis, desarrollo de linfocitos, oncogénesis y desarrollo encefálico. Entre estas se encuentran: BCL6, PLZF, Kaiso, HIC1, FAZF y LRF/ZBTB7, BTBD3 (Kelly & Daniel, 2006; Matsui et al., 2013; Siggs & Beutler, 2012). En una proteína como BACH el dominio BTB media los procesos de dimerización (homodímeros y heterodímeros) y de interacción con correpresores (Kazuhiko Igarashi et al., 2017; K. Igarashi et al., 1998; Yoshida et al., 1999). Por su parte la proteína BTBD3 (BTB/POZ domain containing 3) es codificada por un gen que se ubica en el cromosoma 20p12.2 (“BTBD3 BTB domain containing 3 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI,” n.d.). Y se asocia a procesos de desarrollo cortical (Matsui et al., 2013).

34 5. BTBD3.

5.1. BTBD3 y Neurodesarrollo.

Se ha descrito que durante la primera semana postnatal, en ratones, este gen participa en la organización de la corteza somatosensorial primaria, elicitando la formación de las conexiones tálamo-corticales con la capa 4 (L4), orientando las dendritas de las neuronas espinosas estrelladas (corteza granular) hacia axones activos. Cuando el gen BTBD3 es transfectado, en zonas donde regularmente no se expresa, elicita patrones de orientación dendrítica similares a los que genera en las zonas donde su expresión es canónica (Matsui et al., 2013). En modelos knockdown (KD) para BTBD3 se ha observado que las dendritas se ramifican anormalmente con respecto a los animales con la función inalterada, así como una reducción en la poda sináptica (Matsui et al., 2013). Modelos Knockout (KO) para el gen NMDA (receptor N-methyl-D-aspartate) muestran que BTBD3 permanece en el citosol y genera patrones de ramificación dendrítica anormal (Matsui et al., 2013). Lo que sugiere que señales despolarizantes de la neurona activan el proceso de translocación de BTBD3 hacia el núcleo (Matsui et al., 2013). La eliminación, en ratones, de la función de BTBD3 a través KO del gen Lhx2, el cual es un factor de transcripción que induce la transcripción de BTBD3, genera cambios en la respuesta electrofisiológica, expresión de c-fos, incapacidad para formar las barreras corticales de L4 así como patrones de ramificación anormal, indicando que la hipofunción de BTBD3 se asocia a déficits en procesamiento sensorial (Wang et al., 2017). Las proteínas represoras de la transcripción como BACH (figura 5), que contienen BTB, suelen tener sitios de reconocimiento de secuencia similares a los que tienen factores de transcripción positivos con dominios bZIP, como NRF2. Esto permite que entre ambos grupos de proteínas, represoras y activadoras, se generen intercambios rápidos que facilitan establecer patrones de transcripción específicos de acuerdo a tiempo y espacio (Kazuhiko Igarashi et al., 2017). Esta capacidad para cambiar rápidamente de activación a inhibición de la transcripción es esencial para los procesos de neurodesarrollo durante el periodo postnatal.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 35 muestra de pacientes colombianos

Figura 5. A: dominios de la proteína BACH1. Las líneas verdes indican residuos de cisteína- prolina. El dominio BTB en rojo; CLS, señal de localización citoplasmática y dominio bZIP. Tomado de (Kazuhiko Igarashi et al., 2017). B: estructura cristalográfica del dominio BTB de la proteína LRF. Los recuadro punteados muestran la interfaz de dimerización cerrada; el recuadro sólido muestra la interfaz de dimerización abierta Tomado de (Stogios et al., 2007). C: esquema general de señalización de las proteína con dominio BTB; una señal despolarizante induce la dimerización de las proteínas con dominio BTB, el cual se transloca al núcleo donde recluta correpresores y/o modificadores post traduccionales de histonas.

5.2. BTBD3 y TDAH.

Aunque no se han realizado estudios del grado de expresión del gen en encéfalos humanos, al comparar el nivel de expresión del gen en la corteza visual de ratones y hurones se encontró que este gen solo estaba expresado en la corteza visual de hurones, los cuales dependen más de la información visual que los ratones (Matsui et al., 2013). Lo que sugiere que la función de reorientación y poda que induce el gen BTBD3 es esencial para controlar grandes flujos de información que requieren un procesamiento intenso. Esto queda reflejado en el desarrollo del cuerpo calloso, que tiene periodos críticos en el periodo postnatal (Lebel, Walker, Leemans, Phillips, & Beaulieu, 2008), mismo periodo en que genes asociados a la organización encefálica, como BTBD3 o Lhx2, se encuentran en su pico máximo de expresión en ratones (Matsui et al., 2013; Wang et al., 2017).

36 5. BTBD3.

Estudios de neuroimagen en niños y adolescentes diagnosticados con TDAH muestran que existen alteraciones estructurales en la materia blanca con respecto a controles. Un estudio de asociación de imágenes de difusión y mediciones comportamentales, en niños y adolescentes con desórdenes del neurodesarrollo, encontró que, los pacientes TDAH, EA, TOC comparten similitudes en la disrupción de la materia blanca en el esplenio del cuerpo calloso comparado con controles. Adicionalmente, TDAH y EA presenta similitudes en las alteraciones de la materia blanca en tracto corticoespinal, rodilla del cuerpo calloso, y el fascículo fronto occipital inferior (Ameis et al., 2016). Lo que sugiere alteraciones tempranas de la organización de la materia blanca. Por otra parte estudios GWAS han mostrado que el SNP rs6131295, el cual está en una región cercana del gen BTBD3, se asocia significativamente con patologías como TOC (Browne et al., 2014; Stewart et al., 2013). Lo cual indica que las alteraciones en el gen BTBD3 pueden estar asociadas al desarrollo de patologías del neurodesarrollo y que dichas patologías comparten marcadores biológicos. Sin embargo, los estudios GWAS de TDAH no muestran resultados consistentes (Romanos et al., 2008; Zhou et al., 2008). La inconsistencia en la asociación entre genotipos y la patología sugieren la participación de procesos epigenéticos en el desarrollo y mantenimiento de la patología. Los estudios en epigenética del gen BTBD3 son escasos. Sin embargo un estudio de metilación de DNA del genoma completo (EWA) encontró tres regiones del gen BTBD3 diferencialmente metiladas en muestras de sangre de pacientes TOC al compararlos con controles (Yue et al., 2016). En conjunto, los datos asociados a las similitudes entre los trastornos del neurodesarrollo referentes a la estructura encefálica, la participación del gen BTBD3 en la correcta organización encefálica junto con la significacia del SNP rs6131295 en TOC, convierten el gen BTBD3 en un candidato para el estudio de patología del neurodesarrollo

6. Objetivos.

6.1 General.

Determinar el/los perfiles de metilación del gen BTBD3 en niños con diagnóstico de TDAH en una muestra de la población de Bogotá.

6.2 Específicos.

● Comparar los niveles de metilación del gen BTBD3 en niños con diagnóstico de TDAH y un grupo control ● Analizar los niveles de metilación del gen BTBD3 y su relación con características clínicas de TDAH (inatención o hiperactividad). ● Evaluar, mediante bases de datos, las proteínas que interactúan con BTBD3 así como su enriquecimiento funcional (este objetivo no hace parte de objetivos planteados originalmente, se desarrolló con el fin de establecer de manera más clara la función de éste gen en el desarrollo y la conducta) ● Evaluar, mediante bases de datos, el patrón de expresión del gen BTBD3 en cerebro prenatal y adulto (este objetivo no hace parte de objetivos planteados originalmente, se desarrolló con el fin de establecer de manera más clara la función de éste gen en el desarrollo y la conducta)

7. Metodología.

De modo general, a una muestra de niños y adolescentes colombianos, con y sin TDAH se les tomó una muestra de sangre e historia clínica, se extrajo el ADN, está pasó por un proceso de conversión con bisulfito, la muestra bisulfitada se amplificó mediante PCR, se secuenció y se extrajeron los porcentajes de metilación en cada CpG. Adicionalmente y aunque no estaba contemplado en los objetivos de este trabajo se desarrolló un análisis PPi, en el que se obtuvieron las proteínas que interactúan con BTBD3 y se analizaron mediante teoría de grafos y finalmente se utilizaron datos de microarreglos para determinar el patrón de expresión del gen en el encéfalo prenatal y auto, junto con los genes coexpresados en ambos periodos del desarrollo. A continuación se describe con más detalle cada uno de los procedimientos.

7.1. Metilación 7.1.1. Muestra.

Las muestras para el análisis fueron escogidas del banco de sangre del Instituto de Genética de la universidad Nacional de Colombia. El material de análisis fue obtenido de diferentes instituciones, incluyendo colegios distritales e instituciones hospitalarias. Se seleccionaron 50 casos y 50 controles. Edades entre 5 a 17 años media = 10.4; 휎= 3.2. 48 mujeres 52 hombres. Tanto los casos como los controles venían previamente diagnosticados, sin embargo, se les practicaron pruebas Psiquiátricas y Neuropsicológicas que derivaron en diagnósticos secundarios. Se entrevistó a cada paciente y familiar, con presencia de uno de los psiquiatras del servicio y un profesional en psicología para realizar el diagnóstico basado en los criterios del DSM-V (American Psychiatric Association, 2009a). Se aplicará tanto a pacientes y controles escalas de tamizaje y severidad para corroborar los diagnósticos de psiquiatría.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 39 muestra de pacientes colombianos

7.1.2. Criterios de inclusión y exclusión.

Cincuenta (50) pacientes entre 5 a 17 años con diagnóstico de TDAH. Se seleccionaron 50 participantes entre 5 a 17 años que compartan características sociodemográficas con los seleccionados en el grupo de pacientes. Los participantes no deben tener condiciones neurológicas que afecten el desarrollo, como haber sufrido traumas craneoencefálicos, epilepsia, consumo de sustancias psicoactivas directas, entre otros. No disposición a participación en el estudio pese a cumplir las condiciones. Tanto para el grupo de casos como el control, se excluirán los participantes que obtengan un puntaje de Cociente Intelectual menor a 70, en la Escala Wechsler de Inteligencia para niños WISC IV. En el caso de los participantes del grupo control: por medio de historia clínica y escalas diagnósticas, se corroboró que no existen indicadores de dificultades del desarrollo, del aprendizaje o trastornos de conducta.

7.1.3. Extracción de ADN.

El protocolo de extracción de ADN se realiza de acuerdo a las recomendaciones de promega (Oktafiani, n.d.). La muestra de sangre son obtenidas del banco de muestras del Instituto de Genética de la Universidad Nacional. La muestra debe ser mezclada durante 10 minutos. Se agrega 20µl de solución de proteinasa K (PK) en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Posteriormente se añaden 200μl de sangre al tubo que contiene la solución de proteinasa K (PK), y se mezcla brevemente. Se añaden 200μl de buffer de Lisis Celular (CLD) al tubo. Tapar y mezclar por vortex durante al menos 10 segundos. A continuación se incuba a 56°C durante 10 minutos. Se retira el tubo del área de incubamiento. Luego se añaden 250μl de buffer de unión (BBA), tapar el tubo, y se mezcla mediante agitación con vórtex durante 10 segundos. En un tubo colector con un tubo de unión ReliaPrep™, se adiciona el contenido del tubo con la sangre y el buffer de unión. Se centrifuga por un minuto a máxima velocidad.

40 7. Metodología.

Posteriormente se debe descartar el tubo colector y se usa un nuevo tubo colector adicionando 500μl de solución de lavado de columna (CWD) a la columna y se centrifuga durante 3 minutos a velocidad máxima. Desechar el flujo que se produce. Este último paso se repite dos veces, de modo que se completen tres lavados. La columna se pone en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A continuación añadir 50-200μl de agua libre de nucleasa a la columna. Centrifugar durante 1 minuto a velocidad máxima. Finalmente Desechar la columna ReliaPrep ™, y guardar la solución obtenida.

7.1.4. Conversión con bisulfito.

En el proceso de conversión con bisulfito cada Citosina no metilada se convertirá en Uracilos y posteriormente en la amplificación pasan a ser Timinas (Patterson, Molloy, Qu, & Clark, 2011). Debido a que la extracción de ADN se realiza de sangre, el ADN amplificado proviene de un lisado de diferentes tipos de células, en el proceso de secuenciamiento se obtiene el porcentaje de metilación de cada CpG. En la figura 6 se puede observar la secuencia de referencia regular y bisulfitada. La muestra de sangre de pacientes y controles es tomada con previo consentimiento informado junto con las historias clínicas de los pacientes, controles y familiares. Estas permanecen de manera confidencial en las instalaciones del Instituto de Genética de la Universidad Nacional. El ADN será extraído usando el kit ReliaPrepminiprep (Promega) y será sometido a tratamiento con bisulfito usando EZ DNA Methylation kit (Zymo-Research), posteriormente será normalizado a una concentración de 15 ng/ul usando mediciones espectrométricas en Nanodrop 2000. Para la técnica BSP PCR, se usarán primers diseñados para las diferentes regiones de interés (tabla 1) siguiendo las recomendaciones para esta técnica (“MethPrimer-Design MSP/BSP primers and predict CpG islands - Li Lab, PUMCH,” n.d.). Se debe adicionar 20 μl de ADN purificado a 130 μl de reactivo de conversión (CT) en un tubo de PCR, se mezcla la muestra y se centrifuga brevemente. Posteriormente se ponen el/los tubos de PCR en un termociclador con el siguiente protocolo: 98°C por 8 minutos; 64°C por 3.5 horas y

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almacenamiento de 4°C durante un máximo de 20 horas. Posteriormente se adicionaron 600 μl de buffer de unión M en una columna Zymo-Spin™ IC y poner la columna en un tubo colector. Poner el contenido de la PCR en la columna Zymo-Spin™ IC, tapar el tubo y mezclar varias veces. A continuación se centrifuga a máxima velocidad por 30 segundos, descartar el fluido del tubo colector. Agregar 100 µl de buffer de lavado M a la columna y centrifugar por 30 segundos. Después se añaden 200 µl de buffer de desulphonation M a la columna y dejar reposar en la sala a temperatura ambiente (20-30 °C) entre 15-20 minutos. Después de la incubación, centrifugar a máxima velocidad durante 30 segundos. A continuación se añaden 200 µl de buffer de lavado M a la columna y se centrifuga por 30s a máxima velocidad, este proceso se repite una vez más. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Adicionar 10 µl de buffer de elución directo en la matrix de la columna. Finalmente centrifugar a máxima velocidad por 30s para eluir el ADN.

7.1.5. BSP PCR.

Este método permite amplificar productos de ADN bisulfitados,. Para el proceso de amplificación de los productos de conversión con bisulfito se diseñaron primers con los siguientes criterios: de entre 25 a 30 pb, primers forward y reverse con TM similar, debían contener múltiples T que provengan de C convertidas, los primers no deben contener CpGs y el amplicón debe ser de entre 100 a 200 pb (Clark, Statham, Stirzaker, Molloy, & Frommer, 2006). Los primers fueron probados in silico para comprobar su especificidad, se utilizó la herramienta online BiSearch (Tusnády, Simon, Váradi, & Arányi, 2005). Por cada muestra en un tubo de PCR se ponen 2µl del la ADN eluido en la conversión con bisulfito, 8.7 µl de agua, 1.5 µl NaCl, 2 µl Buffer, 1.6 µl de dNTPs, 2 µl primer forward y reverse y 0.2 µl Taq polimerasa Maxima Hot Start (Thermo Scientific). Durante el proceso de estandarización se estableció que para cada sujeto se debían hacer dos tubos de PCR, de modo que el ADN de ambos se mezcle y se fortaleciera la señal al secuenciar. Se aplicó el siguiente programa térmico

42 7. Metodología.

1. 5 minutos a 95 °C. Hot start activation, activación de la Taq polimerasa. 2. 30 segundos a 95 °C. Denaturación del ADN. 3. 30 segundos a 58 °C. Anillaje con los primers. 4. 45 segundos a 72 °C. Extensión o polimerización del ADN 5. se repite desde el paso 2 al paso 4 cuarenta veces. 6. 4 minutos a 72 °C. Extensión final del ADN. 7. Infinite hold a 12 °C Posteriormente se comprueba la PCR usando 3 µl de producto amplificado en un gel de agarosa al 1.5% (Patterson et al., 2011). Protocolo completo en anexos.

7.1.6. Purificación y reacción de secuencia.

El resultado de la amplificación de la PCR debe ser mezclado en un tubo de eppendorf de 1.5 Ml con acetato de amonio (NH4Ac) y etanol al 100%, luego de centrifugar esta mezcla se deben realizar varios lavados con etanol al 75%. Después de descartar el sobrenadante se debe dejar evaporar por completo el etanol y el ADN se debe resuspender en agua. Protocolo completo en anexos. Durante el proceso de estandarización, al purificar los amplificados estos no generaban una señal con la suficiente calidad para ser leídos por el Epigenetic sequencing methylation analysis (ESME) (Lewin, Schmitt, Adorján, Hildmann, & Piepenbrock, 2004). Posterior al secuenciamiento. De modo que por cada sujeto se generaron dos amplificaciones que al ser mezclados en la purificación conseguían la señal adecuada. Se comprueba la concentración del ADN resuspendido en el Nanodrop 2000, la concentración ideal de ADN para evitar errores de secuenciamiento es de 1 ng/µl. Si la concentración era mayor la mezcla se diluía con agua. Posteriormente se hace la reacción de secuencia, para esto se ponen, en un tubo de eppendorf de 1.5, 4.5 µl de producto de PCR con 0.5 de primer, para cada muestra se debe mandar a secuenciar por separado el primer forward y el reverse. Protocolo completo en anexos

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7.1.7. Análisis de metilación.

Los productos purificados de ADN son enviados a secuenciar mediante el método Sanger. Los resultados de secuenciamientos son leídos por el software ESME (Lewin et al., 2004), este software presenta varios niveles de control de calidad que permiten estimar el porcentaje de metilación en cada CpG (figura S4). De manera breve ESME recibe el archivo .abi y un archivo con la secuencia de referencia, se realiza un control de entropía, se alinea la secuencia de referencia y la secuencia a medir, se genera una normalización de la señal del electroferograma y se calcula el porcentaje de metilación en cada CpG.

7.2. Análisis de redes.

Con el el fin de determinar los elementos moleculares y funcionales con los que interactúa BTBD3 se desarrollará un análisis de interacción proteína-proteína (PPi). Para esto se obtendrán datos predictivos y experimentales de las proteínas que interactúan con BTBD3 de la base de datos STRING (Szklarczyk et al., 2017). Posteriormente, se utilizarán estas interacciones para generar un grafo en el cual los nodos representan las proteínas y en aristas las interacciones entre estas. Sobre dicho grafo se aplicarán seis diferentes criterios matemáticos para detectar los nodos más centrales; criterios topológicos y finalmente la red se desestabiliza y se comparara su enriquecimiento funcional. Se determinarán seis criterios de centralidad. Betweenness centrality

(Betw): en donde para un vértice 휈푖 en un grafo conectado, Betw es dado

1 휎휈푠 휈 (휈푖) por 푡 donde 휎 es el número de rutas cortas (shortest 훴휈푠 ≠ 휈푖훴휈푡 ≠ 휈푖 휈푠 휈푡 2 휎휈푠 휈푡 path) de 휈푠 a 휈푡, y 휎휈푠휈푡(휈푖)es el número de rutas cortas de de 휈푠 a 휈푡que pasan por 휈푖 . Eigenvector centrality (Eigen): para un grafo no dirigido y conectado se aplica 퐴. 푐 = 휆1푐, donde 휆1es el Eigen más grande de la matriz adyacente del grafo 퐴. Closeness centrality (Closs): si 푑 es la matriz de distancia (la matriz

44 7. Metodología.

cuadrada(푑푖,푗)consiste en todas las distancias del grafo desde el vértice 휈푖 al vértice 휈푗 ) entonces el promedio de distancia 푙푖 desde el vértice 휈푖 a todos los

훴 푑 demás vértices conectados es dado por 푗 푖,푗 donde la suma es tomada sobre 푘 todos los (푑푖,푗)finitos y 푘es el número de vértices conectados a 휈푖. Pagerank centrality (PageR): requiere especificar los pesos 훼satisfactorio para 0 ≤ 훼 ≤ 1 y de manera opcional tomar una lista de centralidades iniciales 훽cuyo valor suma 1. Degree Centrality (Degree): se define como el número de aristas que conducen desde o hacia un nodo, Degree se encuentra entre 0y 푛 − 1, donde 푛es el número de vértices en un grafo. Edgebetweenness centrality (EdgeB): es definido 휎 (푒) 휈푖휈푗 por퐸푑푔푒퐵(푒) = 훴 훴 , donde 휎 denota el número de rutas cortas 휈푖 휈푗 휎 휈푖휈푗 휈푖휈푗 entre los vértices 휈푖 y 휈푗 y deja que 휎휈푖휈푗(푒) denote el número de rutas cortas entre los vértices 휈푖 y 휈푗que van a través de la arista 푒. Cada una de estas ecuaciones da un índice numérico a cada nodo (vértice) y arista, estos índices se organizarán en un histograma de modo que se pueda visualizar la distribución de las centralidades. Posteriormente, la red pasará por desestabilización topológica (DT). En éste análisis se toman todos los nodos que interactúan de modo directo con BTBD3 y se eliminan de la red principal, de este modo se obtienen dos redes, la red principal y la red sin los nodos que interactúan con BTBD3, en esta nueva red, la red sin los nodos que interactúan con BTBD3, se vuelven a aplicar los análisis topológicos y se obtienen las distribuciones. Las distribuciones de la red principal y la subred sin BTBD3 se comparan usando el test Kruskal Wallis para distribuciones no paramétricas. De modo que se pueda comprobar si las centralidades de la red sufren cambios significativos al eliminar BTBD3. La red pasará por dos tipos de análisis de enriquecimiento funcional. En el primero se generarán comunidades al interior de la red, esto es, los nodos que tengan mayor correlación se agrupan en subcomunidades. Se extraerá el enriquecimiento funcional de la red al suman cuántas proteínas están dedicadas a cada una de las funciones ontológicas: procesos biológicos, subunidades proteicas PFAM, subunidades proteicas INTERPRO, vías de señalización KEGG,

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funciones moleculares y componentes celulares. Posteriormente se comparan los enriquecimientos funcionales en la red principal y la red desestabilizada, de modo que se pueda establecer qué funciones se pierden o reducen al eliminar BTBD3 de la red principal.

7.3. Análisis de expresión y co-expresión.

De modo que se pueda establecer los principales sitios (hubs) de expresión del gen BTBD3 en el encéfalo humano y de este modo establecer relaciones anatomo funcionales y anatomo patológicas, se utilizará la base de datos del AIBS (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014) de donde se extraerán datos de experimentos de microarreglos que se desarrollaron en encéfalos humanos, tanto en estado prenatal como adulto, y de este modo determinar el patrón de expresión temporoespacial del gen. Los datos del AIBS se obtendrán de microarreglos desarrollados en de 4 cerebros en estado prenatal que van desde las 15 semanas postnatal hasta las 21 semanas postnatal. Por su parte las mediciones para el cerebro adulto se desarrollaron en 12 encéfalos, que iban de los 24 años a los 57 años. De estos, 8 cerebros eran de hombres y 4 de mujeres; 4 afroamericanos, 6 caucásicos y 2 hispanos. El nivel de expresión del gen fue medida usando dos sondas (id. A_23_P102759, id. A_24_P134356). En el encéfalo prenatal se tomaron medidas para 23 núcleos encefálicos y en el caso del adulto fueron 27, que cubren áreas corticales y subcorticales. Los datos de las áreas en cerebro prenatal y cerebro adulto se compararán usando el test estadístico K-sample T, esto permitirá establecer si la variación de expresión del gen en ambos periodos del desarrollo es significativa. Adicionalmente se se obtendrán datos de genes co-expresados con BTBD3 en ambos periodos del desarrollo, los datos se correlacionarán usando el Spearman test, esto permitirá establecer la manera cómo se relacionan los diferentes genes. Finalmente a ambos grupos de genes se les hará un análisis de enriquecimiento funcional, de modo que se pueda establecer en su contexto qué funciones son más importantes en cada periodo del desarrollo.

46 7. Metodología.

7.4. Análisis estadístico.

Se utilizará el software ESME para obtener los porcentajes de metilación de las CpGs individuales (Lewin et al., 2004). Para comparar los vectores de acuerdo a cada una de las variables clínicas se utilizará el test Kruskal Wallis para distribuciones no paramétricas. Este test permite determinar si la distribución de dos o más grupos es igual. Kruskal Wallis es la versión no paramétrica del test ANOVA (Kruskal & Wallis, 1952). Posteriormente se desarrollarán modelos de los datos utilizando un clasificador lineal basado en Machine Learning (ML) para determinar el patrón de selección y el modelo más apropiado. ML se refiere a una metodología utilizada para modelar datos, similar al modelado que se realiza en la estadística convencional, pero a diferencia de esta, en ML existen algoritmos que generan los modelos de manera automática (Flach, 2012) En el caso de las PPi se obtienen datos topológicos de la red de interacciones, la red es desestabilizada y la distribución de ambas redes, original y desestabilizada, es comparada usando el test de Kruskal Wallis. Adicionalmente se utilizará ML para detectar correlaciones internas en la red y generar un esquema de las comunidades al interior de la misma. Los datos obtenidos de AIBS, se organizarán de acuerdo a si son prenatales o adultos, los niveles de expresión de las áreas del cerebro prenatal suficientemente desarrolladas como para compararlas con cerebro adulto se testearán usando el test K-Sample T para vectores con distribución paramétrica. Adicionalmente los datos de co-expresión se correlacionarán con el test Spearman para distribuciones no paramétricas. El análisis de topológico, las estimaciones de distribución de los vectores, las correlaciones, los test estadísticos inferenciales y los algoritmos de Machine Learning vienen incluídos como funciones en el Software Mathematica 11.2.

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7.5. Enriquecimiento funcional.

Se extraerán los enriquecimientos funcionales de las redes completa y desestabilizada: componentes celulares, funciones moleculares, subunidades proteicas INTERPRO, vías de señalización KEGG, subunidades proteicas PFAM y procesos biológicos. Y se comparará la cantidad de proteínas dedicadas a cada función en las dos redes, con el fin de determinar qué procesos se veían afectados por la desestabilización topológica. FInalmente se determinan qué funciones se pierden al generar la desestabilización topológica.

Figura 6. Características de la región amplificada. La tabla muestra las coordenadas y características del gen BTBD3. La gráfica muestra la posición relativa del gen en el cromosoma. Los rectángulos rojos representan los exones del gen BTBD3 con la zona de inicio de la transcripción (TSS) señalada. El recuadro azul representa al área amplificada, la cual se encuentra a 307 pares de bases corriente arriba del TSS. Abajo se muestran las secuencias regular y convertida con bisulfito con los dinucleótidos CpG señalados en negrilla y con un superíndice. La secuencia de interés (en azul), se encuentra en la coordenada cromosómica 11.871.010 - 11.871.190.

48 7. Metodología.

Tabla 1. Primers y secuencias

Primer Coordenada Secuencia de Coordenadas de las referencia CpGs

Fw : 5’- chr20:11871010 CCAGATCACTGAAG TAGATTATTGAAGAG AGTGTAGTCGTTAG CpG1: 11.871.033 TGTAGT -3’ GTATTACGAGACCT CTATTTATGCACCCT CpG2: 11.871.045 CCTTATCTGTTAGAG Rv: 5’- AGAGGGCTGGCATC ACTTACACTAACAAA CpG3: 11.871.132 AGTGCCTAAAAAGG ATAAATATA -3’ AGCCCCAAAGCCAA CpG4: 11.871.146 ATGCAATCGGCCCT CTATTACCGGAGGA TGCCCTGTATCCCG CpG5: 11.871.165 CACATCCACTCTGC CAGTGCAAGT

Reporte de los primers utilizados para amplificar la región de interés, la coordenada amplificada en el genoma, la secuencia amplificada y las coordenadas de cada CpG en el cromosoma 20.

8. Resultados

8.1. Patrón de metilación en BTBD3.

A una muestra de pacientes (diagnosticados con TDAH) y controles con edades entre 5 y 17 años se les tomó muestra de sangre e historia clínica. Posteriormente fueron pareados por edad y sexo. Se extrajo el ADN de las muestras de sangre, este ADN fue bisulfitado y se amplifico la región (“Human hg19 chr20:11,870,949-11,871,848 UCSC Genome Browser v362,” n.d.). Posteriormente se secuenció y se extrajeron los porcentajes de metilación en cada CpG con el software ESME (Lewin et al., 2004). Las diferencias en porcentajes de metilación se analizaron utilizando test no paramétricos multivariados. En general todos los dinucleótidos CpGs del amplicón muestran valores de porcentaje de metilación cercanos a 0% (figura 7), lo que es concordante con diferentes estudios de metiloma (figura S3). Los valores descriptivos de los porcentajes de metilación fueron, CpG1: Min = 0, Max = 0.06, 휒= 0.0028, Mediana = 0; CpG2: Min = 0, Max

= 0.11, 휒= 0.0074, Mediana = 0; CpG3: Min = 0, Max = 0.255 , 휒= 0.0083, Mediana

= 0; CpG4: Min = 0, Max = 1, 휒= 0.039, Mediana = 0; CpG5: Min = 0, Max = 0.1, 휒= 0.0053, Mediana = 0. Los porcentajes de metilación de acuerdo al diagnóstico inicial (caso, control) no mostraron diferencia (figura 7). Dichos porcentajes de metilación mostraron distribuciones mixtas: CpG1, 2 y 5 Uniform distribution; CpG3: Weibull Distribution; CpG4: Student T Distribution. Los valores de metilación se compararon en función de las diferentes variables clínicas. Las variables que arrojaron valores significativos en al menos una CpG se agruparon en tres categorías: ambientales (figura 8 a la 10), durante el embarazo (figura 11 a la 13) y postparto (figura 14 E a la 16). Ninguna de las demás variables de la historia clínica se asoció a cambios significativos en los porcentajes de metilación (tabla 2). Sin embargo, las interacciones entre variables si arrojaron significancia.

50 8. Resultados

Usando métodos de modelamiento de datos basados en machine Learning, se desarrollaron clasificadores lineales para cada variable. Posteriormente se evaluó la eficacia de cada clasificador y se trazaron las probabilidades de cada en variable en función del porcentaje de metilación de cada CpG. Las variables Región de nacimiento y enfermedad al nacer fueron las que mejor se ajustaron al modelo, es decir, con un Accuracy de clasificación >69% (figura 17 y 18). Los participantes que no tuvieron ninguna enfermedad al nacer muestran mayor probabilidad de clasificación en cualquier nivel de metilación, esto es, el no padecer enfermedades al momento de nacer (N/A) es un factor que facilita que se generen porcentajes de metilación a la alta o a la baja (figura 17). La CpG2 muestra que el bajo peso y estatura al nacer se asocia con elevación en los porcentajes de metilación. En la CpG3 el sufrimiento fetal muestra tendencia a tener una mayor relación con niveles más elevados de metilación. En el caso de la CpG4 la relación es con la Cianosis. En la CpG5 solo la variable N/A mantiene relación con bajos y altos niveles, es decir que esta CpG no parece ser influenciada por enfermedades al nacer (figura 24). Por su parte en la variable Región de nacimiento la CpG 1, 2 y 4 mostró que Bogotá tiene mayor relación con niveles elevados de metilación. Las CpG 3 y 5 muestran con proceso inverso, esto es, los niveles más bajos de metilación se asocian más con las personas nacidas en Bogotá y a medida que el porcentaje de metilación aumenta su asociación con Otras regiones aumenta (figura 18). Mostrando una influencia diferencial en función de la región de nacimiento, con mayor influencia en los niveles elevados de metilación de parte de los nacidos en Bogotá.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 51 muestra de pacientes colombianos

Figura 7. Distribución del porcentaje general de metilación en cada CpG de acuerdo a si es caso o un control. La mayoría de los valores son cercanos a 0 %. Sin embargo, parece existir una tendencia en las CpG 3 y 4 a la hipermetilación. Cada CpG tiene el p-value en la parte superior.

8.1.1. Factores ambientales asociados a la elevación de la metilación.

Figura 8. Porcentaje de metilación en función de la región de nacimiento. Los sujetos se agruparon de acuerdo a si habían nacido en Bogotá o en otras regiones del país. El p-value se muestra en la parte superior, basado en el test kruskal wallis. Se observa una diferencia significativa en la CpG2; figura B, en donde se ve una tendencia a la hipermetilación de las personas que nacieron en Bogotá.

52 8. Resultados

Figura 9. Porcentaje de metilación en función de la edad del padre al momento de la toma de muestra de sangre. Las edades de los padres fueron agrupadas en rangos de 10 años. La CpG3 muestra diferencia significativa hacia la hipermetilación en participantes cuyos padres están entre los 40 a 49 años. La CpG5, figura C, muestra tendencia hacia la hipermetilación en los participantes con padres entre 20 a 29 años de edad. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

Figura 10. Porcentaje de metilación en función de la edad de la madre al momento de la toma de muestra de sangre. Las edades de las madres fueron agrupadas en rangos de 10 años. La CpG3, figura C, muestra diferencia significativa hacia la hipermetilación en participantes cuyas madres están entre 30 a 39 años, aunque por la forma de la distribución pareciera que quien tiene mayor influencia son las madres de rangos entre 20 a 29 los test posteriores mostraron que son las madres del rango posterior. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

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8.1.2. Factores in utero asociados a la elevación de la metilación.

Figura 11. Porcentaje de metilación en función de la percepción de estrés durante el embarazo (estrés prenatal). Se agruparon de acuerdo a si la madre del participante afirma o no haber tenido estrés durante el embarazo. La CpG4, figura D, muestra diferencia significativa hacia la hipermetilación cuando la mamá del participante reporta haber sufrido de estrés durante el periodo de embarazo. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

Figura 12. Porcentaje de metilación en función del reporte de la madre respecto a si había sido o no un embarazo deseado. Las CpG 1 y 2, figura A y B respectivamente, muestra una diferencia significativa hacia la hipermetilación cuando la madre reporta que sí fue un embarazo deseado. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

54 8. Resultados

Figura 13. Porcentaje de metilación en función de los riesgos para el embarazo durante el tercer trimestre. La CpGs 4, figura D, muestra hipermetilación significativamente más alta cuando el reporte de riesgo en el tercer trimestre es negativo. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

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8.1.3. Factores postparto asociados a la elevación de la metilación.

Figura 14. Porcentaje de metilación de acuerdo al tipo de parto. La CpG5, figura E, muestra una metilación significativamente más elevada como efecto de un parto vaginal. La CpG4, figura D, muestra una tendencia hacia la hipermetilación cuando se reporta un parto vaginal. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

Figura 15. Porcentaje de metilación en función de si el participante tuvo o no alguna enfermedad al nacer. Los participantes fueron agrupados en las categorías Sí (si padeció alguna enfermedad al nacer) o No. La CpG4, figura D, muestra un patrón de hipermetilación en los participantes que padecieron alguna enfermedad al nacer. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

56 8. Resultados

Figura 16. Porcentaje de metilación en función del tipo de alimentación durante los primeros meses de vida. La CpG1, figura A, muestra que los participantes alimentados únicamente con leche materna tienen un porcentaje de metilación significativamente más elevado que los demás. Se utilizó el test Kruskal Wallis.

Tabla 2. Resumen de las variables clínicas que no mostraron significancia.

CpG1 CpG2 CpG3 CpG4 CpG5

p-value

Semanas de gestación 0.76 0.74 0.77 0.49 0.82

riesgos primer trimestre 0.54 0.81 0.66 0.43 0.6

riesgos segundo trimes 0.16 0.31 0.2 0.26 0.7

estado de ánimo prenatal 0.91 0.67 0.44 0.13 0.48

orden gestación 0.88 0.92 0.29 0.95 0.71

tipo de vivienda 0.12 0.18 0.14 0.27 0.11

Estrato 0.76 0.32 0.09 0.93 0.44

Estado civil padres 0.1 0.2 0.61 0.23 0.34

Antecedentes psiquia 0.21 0.34 0.72 0.96 0.24

Asma 0.64 0.42 0.82 0.16 0.6

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 57 muestra de pacientes colombianos

Lateralidad 0.2 0.4 0.42 0.9 0.08

rinitis 0.53 0.56 0.58 0.23 0.8

dermatitis 0.64 0.68 0.51 0.43 0.71

otitis 0.88 0.52 0.16 0.73 0.1

Amigdalitis 0.72 0.56 0.23 0.38 0.72

Varicela 0.80 0.85 0.76 0.38 0.24

Adenoide 0.44 0.39 0.62 0.43 0.28

gastritis 0.85 0.75 0.19 0.18 0.41

febriles 0.44 0.39 0.62 0.43 0.81

enf. respiratorias 0.88 0.95 0.86 0.63 0.6

medicamento 0.48 0.43 0.9 0.95 0.14

edad niños 0.65 0.54 0.6 0.16 0.19

diagnóstico inicial: Caso o 0.34 0.69 0.59 0.8 0.7 control

Diagnóstico secundario 0.9 0.5 0.6 0.7 0.1

Sexo 0.61 0.96 0.33 0.3 0.57

Peso al nacer 0.99 0.93 0.53 0.36 0.93

Talla al nacer 0.73 0.89 0.09 0.4 0.45

Parto x estrés prenatal 0.5 0.6 0.3 0.01 0.1

Parto x estrés prenatal x 0.2 0.4 0.6 0.04 0.4 diagnóstico inicial La primera columna muestra la variable, las demás columnas representan cada una de las CpGs, y los valores p de cada comparación se listan debajo.

58 8. Resultados

Figura 17. Distribución de porcentaje modelamiento basado en machine learning de cada una de las enfermedades de los participantes al nacer como función del porcentaje de metilación. En la parte superior de cada figura se ve el porcentaje de precisión con la que pueden ser clasificadas cada una de las características modeladas. Las CpGs 1, 2, 3 y 4 fueron modeladas usando Logistic Regression, la CpG5 se modeló utilizando Nearest Neighbors. Sf = sufrimiento fetal, SfC = sufrimiento fetal y cianosis, DieVF = disqueratosis intraepitelial benigno familiar, BpE = Bajo de peso y estatura, PS = pobre succión

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 59 muestra de pacientes colombianos

Figura 18. Distribución de porcentajes modelamiento basado en machine learning de acuerdo a la región de nacimiento de los participantes. En la parte superior de cada figura se ve el porcentaje de precisión con la que pueden ser clasificadas cada una de las características modeladas. La CpG 1 y 4 se modeló utilizando un algoritmo de Random Forest. Para la CpG2 se utilizó el algoritmo Decision Tree. En la CpG 3 y 5 se utilizó Logistic Regression.

8.2. Red de Interacción Proteína Proteína (PPi) del gen BTBD3.

El análisis de interacciones del gen BTBD3 muestra una red extendida de 305 nodos y 12497 interacciones (figura 19). Esta red se generó utilizando datos procedentes de minería de texto, bases de datos, co-expresión, co-ocurrencia y datos experimentales obtenidos en la base de datos STRING (Szklarczyk et al., 2017). De los 305 nodos 44 interactúan de manera directa con BTBD3 formando una subred (figura 21E). Las proteínas que interactúan de manera directa con BTBD3 se encuentran asociados a: transición G2/M del ciclo celular mitótico, proceso catabólico de proteasa dependiente de la ubiquitina dependiente de SCF, procesos catabólico de proteína dependiente de ubiquitina, ritmo circadiano, desestabilización de proteínas, ruta de señalización Notch, nedilación de proteínas, meiosis ovocitaria, ruta de señalización Wnt, procesamiento de proteínas en retículo endoplásmico (figura 19 y tabla suplementaria S1).

60 8. Resultados

El análisis topológico de red sugieren que al tener un alto coeficiente de agrupamiento (0.818), se trata de una red robusta (tabla 3). Adicionalmente se tuvieron en cuenta las medidas topológicas referentes a: Betweenness centrality (Betw) se define como la centralidad de un nodo en función del número de rutas más cortas (Shortest path) que lo atraviesan (Durant & Wagner, 2017). La distribución muestra que la mayoría de los nodos tienen un bajo Betw (figura 20). Closeness centrality (Closs) se refiere a la centralidad basada en la media de longitudes de todos los Shortest Path desde el nodo medido hasta cualquier otro nodo que pueda ser alcanzado en la red (Estrada, 2012). Closs tiene su pico de frecuencia más alto entre 0.55 y 0.6 (figura 20), las proteínas o nodos que muestran los valores más elevados en este índice son: RPS27A, UBA52, RBX1, UBC, UBB, CUL1, SKP1, BTRC. SKP2, RNF7, BTBD1, BTBD6, FBXW5, ANAPC10, FBXW7, CUL3, CDC34, FBXW11, CDC20, UBE2D1, implicadas en Proceso catabólico de proteína celular, proceso catabólico de proteína dependiente de ubiquitina mediado por proteasoma, ubiquitinación de proteína ⼀ Las reacciones químicas y las vías que resultan en la descomposición de una proteína o péptido por hidrólisis de sus enlaces peptídicos, iniciadas por la unión covalente de ubiquitina y mediadas por el proteasoma.(Gene Ontology Consortium, n.d.)⼀, proceso del ciclo celular mitótico, respuesta al estímulo. Eigenvector centrality (Eigen) es una medida de centralidad que se basa en la suma de la centralidades de sus vecinos, a mayor de centralidad de estos, mayor Eigen tiene el nodo, lo que implica elevada interconectividad (Estrada, 2012). Los puntos mejor interconectados en esta red son las proteínas: SKP1, CUL1, RBX1, RPS27A, UBA52, UBC, UBB, SKP2, BTRC, relacionado a proceso catabólico de la proteína celular, regulación del proceso metabólico de la macromolécula ⼀ regulación de la descomposición de moléculas grandes⼀, regulación de la respuesta al estímulo, comunicación celular, vía de señal del receptor de la superficie celular, regulación del ciclo celular. Page rank (PageR) centrality es una medida que permite identificar qué nodos en una red son fundamentales para el funcionamiento de la misma, los nodos que mejor puntúan en este análisis son: RPS27A, CUL1, SKP1, UBA52, RBX1, UBC, UBB, BTRC, responsables de procesos como comunicación celular, proceso viral, regulación del proceso metabólico celular, respuesta al estrés, vía estimulante de la señal del receptor de

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 61 muestra de pacientes colombianos

lectina de tipo C. Degree centrality (Degree) este criterio de centralidad que está definido por la cantidad de aristas que llevan al nodo y/o salen de este. los nodos con mayor Degree son: RPS27A, UBA52, CUL1, SKP1, RBX1, UBC, UBB, BTRC, SKP2, que se han asociado a regulación del proceso metabólico celular, comunicación celular, vía de señal del receptor de la superficie celular, respuesta inmune innata, respuesta al estrés, regulación negativa de la transcripción. Edge betweenness centrality (EdgeB) es una medida de centralidad para aristas (interacciones). La medida de esta centralidad se da en función de la cantidad de Shortest path que pasan por la arista medida. Este criterio de centralidad tiene una distribución tipo Poisson (figura 20). En este caso las interacciones más importantes son: RHOBTB3 <-> CUL3, BTBD6 <-> RHOBTB3, BTBD6 <-> IMP4, RHOBTB2 <-> CUL3, BTBD3 <-> IMP4, RHOBTB2 <-> BTBD1, RHOBTB2 <-> BTBD6. El listado completo de las medidas topológicas de la red se encuentran en la tablasuplementaria S1. Con el fin de identificar el total de los nodos más influyentes en la red, los puntajes de todos los criterios topológicos fueron normalizados a Z y se tomaron todos los nodos que se encontraban por encima de la primera desviación estándar: 16 de Betw, 27 de Closs, 110 de Eigen, 31 de PageR, 44 de Degree. Al ser combinados en una sola lista, y al eliminar los nombres repetidos, se obtuvieron 116 genes. Los procesos biológicos más enriquecidos a este subgrupo son la ubiquitinación y metabolismo de proteínas. El resto de elementos enriquecidos en la red pueden ser encontrados en la figura suplementaria S2, las características de la red y el listado de genes pertenecientes a esta están en la tabla suplementaria S2. El análisis de desestabilización topológica permite determinar si los procesos biológicos asociados a un sistema se ven afectados al eliminar determinados componentes de este. Se identificaron todos los nodos que interactúan de manera directa con BTBD3 (figura 21 A y E) y se eliminaron de la red principal. Posteriormente se compararon las distribuciones topológicas de la red original con los de la red desestabilizada. Se observaron diferencias significativas en Eigen, PageR, Degree y EdgeB (figura 21 G, H, I, J, K y L). Una de las características más importante de las redes son las emergencias de comunidades al interior de estas, es decir, grupos de nodos que se encuentran altamente interconectados, lo que los lleva a formar subgrupos en

62 8. Resultados

una red. Usando algoritmos incorporados en el software Mathematica 11, se detectaron 3 diferentes comunidades en la red principal (figura 21B) las cuales representan unidades funcionales dentro de la red. Los procesos biológicos, así como las vías de señalización y el conjunto de genes pertenecientes a cada grupo están resumidos en la tabla 4.

Figura 19. Red PPi del gen BTBD3. Red de interacción predicha basada en minería de texto, bases de datos, co-expresión y co-ocurrencia. Se incluyen datos de interacción encontrados experimentalmente. El patrón de colores en nodo y vértices se refieren al análisis topológico de los mismos. Red analizada en cytoscape utilizando datos de la base de datos STRING (Szklarczyk et al., 2017).

Tabla 3. resumen de las características de la red Clustering coefficient 0.818 Connected components 1

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 63 muestra de pacientes colombianos

Network diameter 4 Network radius 2 Network Centralization 0.441 Shortest paths 92720 (100%) Characteristic path length 1.9226 avg. number of neighbors 81948 Number of nodes 305 Number of edges 12497 Network density 0.27 Isolated nodes 0 Number of self-loops 0

Figura 20. Análisis de frecuencia de los componentes topológicos de la red. Betweenness centrality: centralidad de intermediación; Closeness centrality: centralidad de cercanía; Eigenvector centrality: centralidad de auto vector; Pagerank centrality: centralidad de rango de página; Degree centrality: centralidad de grado; Edge betweenness centrality: centralidad de intermediación de arista. El eje Y representa la frecuencia y el eje X muestra el valor centralidad de acuerdo a cada criterio de centralidad.

64 8. Resultados

Figura 21. Análisis topológico y de desestabilización topológica. A. grafo simplificado de la red de la figura 19. Se resalta la subred BTBD3 en rojo, es decir, los nodos que interactúan de manera directa con BTBD3. B. grafo de comunidades emergentes de la red de la sección A. C. grafo resultante al eliminar la subred BTBD3. D. grafo de la subred BTBD3 con este gen señalado en rojo. E. comparación de distribución de Betweenness centrality (Betw) de la red completa y la red

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 65 muestra de pacientes colombianos

en la que se elimina la subred de BTBD3. F. distribución Eigenvector centrality (Eigen) en red completa y red sin la subred BTBD3. G. Closeness centrality (Closs) entre la red completa y la red desestabilizada (sin la subred BTBD3). H. distribución de centralidad de Pagerank (PageR) en la red original versus la red desestabilizada. I. Degree centrality (Degree) en las dos redes. J. Edge betweenness centrality (EdgeB) en la red original comparada con la red desestabilizada. KW: test Kruskal Wallis.

Tabla 4. resumen de procesos biológicos, las vías de señalización KEGG y el conjunto de proteínas enriquecidos en cada una de las comunidades de la figura 21B. Procesos biológicos GO Rutas KEGG Proteínas pertenecientes al grupo

Grupo Modificación de proteínas Proteólisis mediada por ANAPC7, ANAPC5, 1 por conjugación de proteínas ubiquitina (62), Meiosis SOCS3,TCEB1,COPS pequeñas (97), ovocitaria (15), Ciclo celular 6, ANAPC2, CDC23, Ubiquitinación de proteínas (15), Procesamiento de CDC27, CDC16, (93), Proceso catabólico de proteínas en retículo SKP1, RBX1, la proteína dependiente de endoplásmico (13), ANAPC1, ANAPC10, modificación (80), Proteólisis Maduración de ovocitos ANAPC4, CDC20, implicada en el proceso mediada por progesterona FZR1, ANAPC11, catabólico de la proteína (10), Ritmo circadiano (6), CUL1, NEDD8, celular (81), Proceso Enfermedad de parkinson (8), CUL4A, UBE2C, catabólico de proteínas Infección por HTLV-I (10), SKP2, IMP4, FBXL19, celulares (81), Proteólisis Carcinoma de células renales TCEB2, FBXW7, VHL, (85), Proceso catabólico (5), Infección por herpes UBA3, UBE2M, proteosomal de las proteínas simple (6) UBA52, CUL2, CUL5, (60), Proceso de CUL4B, UBE2D2, modificación de proteínas BTRC, UBE2B, celulares (99), UBE2F, HACE1, Poliubiquitinación de CUL3, RNF7, CDC34, proteínas (44), Proceso FBXL3, UBE2K, UBB, metabólico de la proteína UBE2A, UBC, celular (98), Regulación UBE2D1, UBA1, positiva del proceso FBXL4, UBA6, catabólico de la proteína UBE2E3, UBE2S, celular (26), Regulación de la FBXW11, TRAF7, transición de fase del ciclo UBE2N, UBE2L3, celular (29), Proceso UBE2I, NEDD4, metabólico de la UBE2R2, CCNF, macromolécula celular (100), UBE2L6, UBE2D3, Regulación de la separación FBXO2, UBE2E2, de la cromátida hermana RAB9A, PLIN3, UBA7, mitótica (15), Regulación UBE2G1, UBE2E1, negativa de la ubiquitinación UBE2D4, UBE2U, de proteínas (20), FBXO32, TRIM63, Regulación de la SPOP, KDM2A, transcripción del promotor de KEAP1, RHOBTB3, ARN polimerasa II en TRIP12, FBXO44, respuesta al estrés (12), FBXO6, CUL7, Reparación post-replicación FBXW8, DET1, (11), Regulación del proceso FBXO9, KDM2B, de modificación de proteínas FBXO18, FBXL2, (39), Regulación negativa de FBXO4, CAND1, la organización de organelos SPOPL, FBXL20, (18), Fisión de organelos USP47, FBXL5, (21), Respuesta celular al UBE2G2, ASB2,

66 8. Resultados

estrés (37), Regulación de la FBXW5, FBXL13, proteólisis (25), SPSB4, SPSB1, Ubiquitinación de histonas FBXL8, FBXW12, (8), Respuesta celular a FBXO21, FBXO10, hipoxia (11), Proceso FBXO17, FBXL12, metabólico de DNA (22), FBXW2, FBXL7, Respuesta de daño en el FBXO22, FBXO27, ADN, detección de daño en FBXO41, PARK2, el ADN (7), Simbiosis, que FBXL6, FBXO31, abarca el mutualismo a FBXO30, CACUL1, través del parasitismo (21), FBXO45, FBXL17, Organización de organelos VPRBP, FBXO7, de un solo organismo (33), FBXW4, RHOBTB2, Ritmo circadiano (8), ARHGDIA, ARHGDIB, Regulación positiva de la FBXW9, FBXL15, morfogénesis de la dendrita ASB1, SPSB2, (4), Vía de señalización FBXL16, ASB6, Notch (), Regulación del ARHGDIG, FBXL14, desarrollo de dendritas (6), FBXL18, BTBD1, regulación de la FBXO25, BTBD6, morfogénesis de dendritas ABTB1, BTBD2, (5), Regulación de la FBXO39, MARCH2, respuesta al estrés (21), ABTB2, BTBD9, Transducción de la señal BTBD11, BTBD3, intracelular (24) MARCH3

Grupo Biogénesis del ribosoma Biogénesis ribosómica en WDR36, RRP9, 2 (63), Proceso metabólico del eucariotas (32), Degradación EXOSC9, EXOSC1, rRNA (53), Procesamiento de ARN (8) DCAF13, NOP58, de rRNA (52), UTP6, NOP56, Procesamiento de ncRNA PDCD11, BMS1, (53), Biogénesis de PWP2, UTP20, componentes celulares (66), NOP14, KRR1, Biogénesis de la subunidad EXOSC2, EXOSC3, pequeña ribosómica (17), MPHOSPH10, RRP7A, Proceso metabólico del ARN NOL6, EXOSC5, (60), Expresión génica (58), UTP14A, NOB1, BYSL, proceso metabólico de la BOP1, EXOSC6, macromolécula celular (61), EXOSC7, RPF2, Hidrólisis del enlace RRS1, DDX52, UTP15, fosfodiéster de RNA (11), UTP18, EBNA1BP2, Proceso metabólico (65), TBL3, HEATR1, Metilación del rARN (3). WDR43, CIRH1A, EXOSC4, WDR12, PES1, WDR3, RPP38, FBL, RPS9, WDR75, UTP3, NHP2L1, WDR46, RCL1, IMP3, TSR1, BRIX1, PNO1, NOP2, RBM28, NHP2, NOC4L, GNL3, MKI67IP, UTP14C, DHX37, RIOK2, LTV1, ENSG00000204775, NOC2L, MRTO4, NIP7, DDX56, ENSG00000248354, RRP15, GRWD1,

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 67 muestra de pacientes colombianos

KIAA0020, NOL10, UTP11L, DDX49, DIEXF, NAT10, DDX47, RPF1, GNL3L, WDR74, RRP36, DIMT1, NSUN6, MAK16, POLR1E, TFB2M, NGDN, FCF1, RTCA, NOP16

Grupo Transición de fase del ciclo Vías asociadas a cáncer (27), CDK2, CDKN1A, 3 celular mitótico (25), Hepatitis B (18), Ciclo celular CCNE1, COPS5, Regulación de la vía de (16), Ruta de señalización COPS2, COPS4, señalización canónica Wnt PI3K-Akt (14), Ruta de COPS7A, PSMD11, (21), Regulación negativa de señalización (p53) (), Vía de PSMA6, CDK4, la vía de señalización Wnt señalización de la hormona CCND1, CCNE2, (17), Transición G1/S del tiroidea (9), Vía de GPS1, PSMD7, ciclo celular mitótico (19), señalización FoxO (9), Vía de SEC24A, SEC23A, Regulación del ciclo celular señalización Hedgehog (7), PSMA4, SEC31A, (30), Proceso metabólico Ritmo circadiano (6), Vía de SEC13, RPS27A, proteico (48), Proceso de señalización de neurotrofinas DDB1, CRY2, ARNTL, modificación de proteínas (7), Procesamiento de COPS8, PSMD14, celulares (40), Recubrimiento proteínas en el retículo SEC24D, CDKN1B, de vesículas COP-II (8), endoplasmático (7), Ruta de CRY1, CCNA2, IKBKB, Regulación negativa de la señalización AMPK (5), Ruta NFKB1, RB1, respuesta al estímulo (28), de señalización NF-Kappa B CTNNB1, APC, PER2, Regulación negativa de la (4), Meiosis ovocitaria (4). AXIN1, CKS1B, CDK6, transcripción del promotor de CSNK1E, PLK1, ARN polimerasa II (22), CCNA1, SUFU, GLI1 Regulación de la SEC24B, HIF1A, transducción de señales DDB2, TP53, NFKBIA, (34), Proceso metabólico de CSNK1D, GSK3B, la macromolécula celular SEC24C, RBL2, DTL, (53), Regulación negativa del FBXO5, NFKB2, MYC, proceso apoptótico (22), CRBN, GLI2, Regulación positiva de la BHLHE41, EP300, proteólisis (16), Regulación CKS2, SEC16A, negativa de la comunicación CSNK1A1, NOTCH1, celular (24), Respuesta ckshs1, FAM123B, celular al estrés (27), GLI3, FOXO3, FOXO1, Regulación del proceso LMAN1, NFKBIE metabólico del compuesto nitrogenado (40), Ruta de señalización Notch (8), regulación del ritmo circadiano (7), Formación de patrón proximal / distal (5), respuesta a droga (11), Respuesta a lípidos (14), Vía de señalización del receptor intracelular (8), Desarrollo del epitelio (15), Vía de señalización del receptor TRK de la neurotrofina (9), Morfogénesis de órganos embrionarios (9), Regulación positiva de la proliferación neuroblástica (4), Respuesta

68 8. Resultados

a hormonas esteroideas (10), Regresión de notocordio (2), Desarrollo de tejidos (18), Desarrollo del cerebro (12), Senescencia prematura inducida por estrés (3), Vía de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (6), Suavizado de la vía de señalización que participa en la regulación de la proliferación de las células precursoras de las células granulares cerebelosas (2) El número entre paréntesis representa la cantidad de genes involucrados en el proceso. La columna genes muestra una lista de todos los genes en el grupo.

8.3. Patrón de expresión del gen BTBD3 en el

cerebro prenatal y adulto.

Usando la base de datos de microarreglos del Allen institute for brain science (AIBS), sobre el perfil transcripcional del cerebro, se obtuvo el patrón de expresión del gen BTBD3 en fase prenatal y adulta. Los datos muestran que el gen tiene una alta expresión en corteza cerebelosa (CBC), pretectum (PTR), tectum mesencefálico (MTc), tálamo (THM), tegmento mesencefálico (MTg), hipotálamo (HTM) y tegmento pontino (PnTg) durante el periodo prenatal (figura 22A). No obstante, las demás áreas permanecen dentro de la primera desviación estándar lo que sugiere la importancia de este gen durante periodos de neurodesarrollo temprano. En el periodo adulto se ve una alta expresión en formación hipocampal (HiF), corteza cerebelosa adulta (CbCx), tálamo ventral (VT) y materia blanca (WM) (figura 22B). Las demás áreas permanecen dentro de la primera desviación estándar a excepción del núcleo pontino y el estriado, en lo cuales el gen se observa hipo expresión. Se compararon áreas del cerebro prenatal lo suficientemente desarrolladas como para encontrarlas en el cerebro adulto. Al comparar el nivel de expresión de cerebros prenatales con adultos se observa que, con excepción del subtálamo, donde no existe diferencia y el claustro (CL) en donde BTBD3 está hiper

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 69 muestra de pacientes colombianos

expresado en adulto, todas las demás áreas muestran una reducción significativa de la expresión del gen en la adultez (figura 22C).

Figura 22. A: nivel de expresión del gen BTBD3 en el cerebro prenatal humano, organizado de menor a mayor expresión. Las mediciones fueron tomadas en cerebros de fetos en las semana 15, 16 y 21 post concepción. Se utilizaron 4 cerebros uno 15 semanas; uno de 16 semanas y dos de 21 semanas. B: nivel expresión del gen BTBD3 en el cerebro adulto humano organizado de menor a mayor nivel. Las mediciones se realizaron en cerebros de 24, 31, 39, 49, 55 y 57 años. Los cerebros donantes fueron 4 afroamericanos, 6 caucásicos y 2 hispanos. Ocho de estos cerebros pertenecían a hombres y 4 a mujeres. C: comparación del nivel de expresión del gen en las estructuras encefálicas que se encuentran presentes tanto en adultos como en prenatales. Se compararon usando el test k-Sample T para distribuciones paramétricas, se muestran tanto el valor del estadístico como el valor p. Las líneas punteadas en A, B y C representan las desviaciones estándar. Cla: claustro; BFp: prosencéfalo basal; THM: tálamo; SubTH: subtálamo; HTM: hipotálamo; CBC: corteza cerebelosa; MTg: tegmento mesencefálico. Los datos fueron procesados a partir de los datos de expresión de microarreglo del AIBS (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014).

70 8. Resultados

8.3.1. co-expresión del gen BTBD3

Con datos obtenidos del AIBS se determinaron los genes que presentan el mayor nivel de co-expresión con BTBD3 tanto en cerebro prenatal como en cerebro adulto. Las correlaciones muestran que, el cerebro prenatal está dominado por correlaciones modestas que no superan el 0.5 de coeficiente de correlación. Al buscar entre los genes que muestran co-expresión con BTBD3 tanto en el cerebro prenatal como en el cerebro adulto se encontró que los genes A_24_P471121 y CCNE1, asociados al proceso de división celular, se encuentran co-expresados con BTBD3 tanto en periodo prenatal como adulto (figura 23 y 24). El gen CCNE1 (ciclina E1) tiene funciones como cofactor de transcripción y receptor de andrógenos, adicionalmente participa en el desarrollo del hígado, regeneración de órganos, respuesta a nitrógeno orgánico, respuesta a estímulo de citoquinas y crecimiento antral del folículo ovárico. A diferencia del cerebro prenatal, en el cerebro adulto se observaron correlaciones con valores más significativos entre el gen BTBD3 y otros genes. El gen que mostró una covariación más significativa con BTBD3 fue DHX29, el cual tiene funciones de unión a ATP, de helicasa y participa en el proceso de traducción de proteínas. Los genes fueron correlacionados usando el coeficiente de correlación de Spearman (Figura 24). Las gráficas tienen en la parte superior el valor de coeficiente y p-value asociado al test de hipótesis. Se analizaron los enriquecimientos en procesos biológicos, funciones moleculares, componentes celulares y los elementos compartidos de los genes co-expresados en ambos estados del desarrollo (Figura 25).

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 71 muestra de pacientes colombianos

Figura 23. Genes co expresados con BTBD3 en cerebros prenatales. Los genes muestran niveles moderados de correlación, siendo el gen PDLIM5 el que muestra el nivel coeficiente de correlación más elevado. Dos genes, A_24_P471121 y CCNE1, muestran co-expresión tanto en cerebros

72 8. Resultados

prenatales como adultos. Los niveles de expresión se correlacionaron usando el Test de Spearman. Los datos se obtuvieron del instituto allen (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014)

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 73 muestra de pacientes colombianos

Figura 24. Genes co-expresados con BTBD3 en cerebro adulto. Se seleccionaron los genes que mostraron niveles de correlación de al menos 0.7. Se utilizó el test Spearman. Los datos se obtuvieron del instituto allen (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014).

74 8. Resultados

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 75 muestra de pacientes colombianos

figura 25. Nube de palabras que representa el enriquecimiento funcional en los genes co- expresados con BTBD3 en estado prenatal y adulto. A. enriquecimiento en procesos biológicos en estado prenatal y adulto. B. procesos biológicos compartidos entre los genes co-expresados en estado prenatal y adulto. C. Componentes celulares enriquecidos en ambos estadios de desarrollo. D. componentes celulares compartidos en los genes co-expresados en ambos estadios. E.

76 8. Resultados

funciones moleculares enriquecidas en los genes co-expresados. F. funciones moleculares compartidas.

9. Discusión.

Este trabajo analizó el patrón de metilación en una región del gen BTBD3 en una muestra de niños y adolescentes con diagnóstico de trastornos del neurodesarrollo Colombianos. En diferentes estudios la región amplificada muestra un patrón de hipometilación, a excepción de condiciones patológicas asociadas a cáncer (figura S3). Los resultados obtenidos están en concordancia con los trabajos reportados en el (“Human hg19 chr20:11,870,949-11,871,848 UCSC Genome Browser v362,” n.d.) (figura S3), es decir, que la mayoría de los sujetos mostraron porcentajes de metilación cercanos a cero. En este mismo sentido queda claro que los patrones de metilación en diferentes tejidos son similares, incluyendo sangre y cerebro (figura S3), lo que valida el trabajo actual que fue desarrollado en sangre. Adicionalmente se estableció el interactoma de BTBD3, esto es, el conjunto de proteínas con las que este gen interactúa, de modo que, al realizar una simulación de desestabilización topológica, se pudiera establecer qué funciones ontológicas desaparecen, lo que podría explicar por qué experimentos de knockout (KO) o knock down (KD) que afectan a este gen muestran que las dendritas dejan de polarizarse como en condiciones regulares. Finalmente se utilizaron bases de datos de expresión genética que permitieron determinar el patrón temporoespacial de expresión de BTBD3, esto facilita hacer relaciones anatomo-funcionales y anatomo-patológicas en eventos de fallas en la expresión del gen. A continuación se discuten cada una las secciones de resultados.

9.1. Patrón de metilación.

Se utilizaron las técnicas de conversión con bisulfito y amplificación por BSP PCR para determinar el porcentaje de metilación de una región corriente arriba del gen primer exón de BTBD3, en la región reguladora. Los porcentajes de metilación fueron calculados y posteriormente se hicieron comparaciones basadas en métodos factoriales entre los porcentajes de metilación y cada una de las variables de la historia clínica. Adicionalmente se modelaron diferentes variables

78 9. Discusión.

utilizando Machine Learning que, permiten visualizar los patrones de asociación entre la metilación y los componentes individuales de las variables. Al comparar los porcentajes de metilación de todos los participantes se observó que estos tienden a estar cerca de 0% (figura 7). Estos valores en los porcentajes de metilación coinciden con los reportados en estudios de metiloma, en los que la región estudiada permanece hipometilada a excepción de condiciones asociadas a cáncer, en los que esta zona tiende a la hipermetilación (figura S3). Sin embargo, los dinucleótidos CpG 3 y 4 parecen mostrar una tendencia a la hipermetilación con picos máximos de metilación de 25% y 100% respectivamente (figura 7). Debido a la cercanía de esta región con la isla CpG del gen BTBD3 (figura S3), y que solo el 20% de las CpGs no pertenecientes a islas CpG están demetiladas (Baylin & Jones, 2016), y ya que el promotor tiende a estar entre 100 y 1000 pb corriente arriba, es plausible asumir que la secuencia amplificada hace parte de la región reguladora del gen BTBD3 y por ende los cambios en la metilación de esta pueden tener un efecto en la transcripción del gen. Sin embargo, se requieren estudios de expresión de la proteína para corroborarlo. Nuestros resultados sugieren que existen factores ambientales, in utero y postparto que afectan la metilación del gen BTBD3. La variable factor ambiental que mostró asociación con el incremento en la metilación es la región de nacimiento del participante. En esta variable el dinucleótido CpG2 mostró una variación significativa en el porcentaje de metilación entre los que nacieron en Bogotá versus otras regiones (figura 8 B). Un posible evento asociado a la variación en la metilación en esta variable es el clima; temperatura y humedad. Un estudio encontró que el descenso en la temperatura estaba asociada con hipometilación en los genes ICAM-1, asociado a respuesta inmune, e hipermetilación del gen CRAT, asociado al metabolismo de lípidos, mientras el incremento de la temperatura tiene mayor relación con hipometilación de TLR-2, participa en la inducción de la apoptosis, por su parte el incremento en la humedad se asocia con hipometilación de ICAM-1 y F3 (Bind et al., 2014). La temperatura media en Bogotá los últimos 18 años fue de 14°C con humedad media del 78% (“Wolfram|Alpha: Making the world’s knowledge computable,” n.d.). Lo que implica temperaturas bajas y alta humedad, aunque el estudio no determinó el efecto en el

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 79 muestra de pacientes colombianos

gen BTBD3, es posible que el clima tenga efectos diferenciales en el metiloma que también están influenciando el gen BTBD3. La edad de la madre y del padre al momento de recoger la muestra también muestran influencia sobre la metilación, ambas en la CpG3 (figura 9C y 10C). En este sentido un estudio que interrogó 27578 CpGs en recién nacidos, encontró correlación entre 144 de estas CpGs (pertenecientes a 142 genes) y la edad de los padres. La tendencia fue que a medida que aumenta la edad de los padres tiende a disminuir la metilación global del recién nacido y dicha relación es más fuerte entre la edad materna y la metilación del hijo. Entre el grupo de genes a los que pertenecen las CpGs diferencialmente metiladas, se encuentran genes asociados a la regulación del desarrollo neurológico (Adkins, Thomas, Tylavsky, & Krushkal, 2011). Este factor resulta interesante, ya que existen diferentes formas en las que una marca epigenética puede ser transmitida, vía células germinales, estrés in utero o pautas de crianza (McEwen et al., 2015). Debido al momento de la recolección de las muestras de sangre es posible que las variaciones en la metilación estén más asociadas a las pautas de crianza. Nuestros resultados muestran que entre menos es la edad de la madre mayor es el porcentaje de metilación, lo que concuerda con el estudio antes reportado. Las variables que influenciaron la elevación en la metilación durante el embarazo o in utero pueden relacionarse con el estrés percibido o fáctico (figura 11 D, 12 A y B y 13 D). Es decir, si las madres de los participantes creían haber tenido estrés o si por condiciones de enfermedad o traumatismo lo recibieron. El estrés tiene un efecto significativo en el panorama epigenético; un patrón epigenético establecido puede ser transferido a la siguiente generación si dichas firmas epigenéticas se establecen en las células germinales (óvulos o espermatozoides). Sin embargo, se ha observado que el patrón epigenético impreso en las células germinales es “reiniciado” cuando se forma el zigoto y la mayoría de las metilaciones son borradas, vía métodos pasivos y activos de demetilación (Bohacek & Mansuy, 2015a; Booth et al., 2013b; Hackett & Surani, 2013c). Este proceso parece ser una estrategia de protección contra posibles firmas epigenéticas aberrantes y para devolverle a las células sus características pluripotentes (Hackett & Surani, 2013d). No obstante, existen reportes de firmas epigenéticas que pasan de una generación a otra sin que intervenga la crianza (Dias & Ressler, 2014b; Grandjean et al., 2009b). Un estudio, en ratones C57Bl6/J

80 9. Discusión.

encontró que el estrés por separación materna, en la generación F0, generaba un patrón de hipermetilación de las células germinales masculinas de la generación F1 en los genes MeCP2 y CB1, dicho patrón persiste en el cerebro de las hembras F2, mientras que el gen CRFR2 se hipometiló con el mismo patrón de herencia (Franklin et al., 2010b). Este estudio también mostró que, aunque CRFR2 estaba hipomelitado su transcrito estaba regulado a la baja, indicando una relación no lineal entre los patrones de metilación del promotor y expresión (Franklin et al., 2010c). Lo anterior sugiere que una marca epigenética que se estableció por crianza o ambiente puede después, ser transmitida vía células germinales. No es claro qué factores moleculares y ambientales determinan que una marca epigenética se genere y posteriormente se transmita a la siguiente generación. Estos procesos de pérdida de marcas epigenéticas también involucran las histonas. Se ha descrito que durante la espermatogénesis la mayoría de las histonas son reemplazadas por protaminas, lo que lleva a una pérdida global de las modificaciones generadas en estas proteínas (Bohacek & Mansuy, 2015b). Por su parte las variables postparto que contribuyen al aumento en la metilación se asocian al tipo de parto, la presencia o no de enfermedades al nacer y el tipo de alimentación durante el desarrollo temprano. Los participantes nacidos por parto vaginal presentan un incremento significativo de la metilación en en la CpGs 5 (figura 14 E). El parto vaginal se ha asociado con un incremento en catecolaminas y cortisol durante el alumbramiento, este fenómeno facilita la activación del sistema inmunitario inflamatorio (Yektaei-Karin et al., 2007) y la respiración postparto (Olver, Walters, & Wilson, 2004). Adicionalmente se ha asociado el parto por cesárea con el posterior desarrollo de asma (Metsälä et al., 2008) y leucemia (Cnattingius et al., 1995). En un estudio se observó que el porcentaje de metilación global en sangre de niños recién nacidos por cesárea era mayor a los que nacieron por parto vaiginal. Sin embargo, cinco días después los niveles de metilación global entre los dos grupos no difería (Schlinzig, Johansson, Gunnar, Ekström, & Norman, 2009). Este desfase temporal en el porcentaje global metilación durante el alumbramiento podría tener consecuencias a la salud y en teoría podría llevar a alterar el patrón epigenético posteriormente. Sin embargo, nuestros resultados muestran un cambio de metilación a la alta en niños nacidos por parto vaginal y debido a que esta es una región hipometilada (figura S3) es posible suponer un efecto diferencial por el tipo de parto en regiones específicas

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 81 muestra de pacientes colombianos

del genoma no reportadas aún. Adicionalmente al comparar en conjunto el tipo de parto y el estrés preconcepción se observa una interacción entre estos dos factores asociados a la elevación de la metilación en la CpG4, KW: 9.75, p = 0.01. Ésta misma CpG mostró significancia al considerar juntos tipo de parto, estrés prenatal y diagnóstico inicial CpG4, KW: 14.1, p = 0.04 (Tabla 2). Esto indica que al parecer el tipo de parto es un factor sumatorio que interactúa con otras variables y contribuye a la elevación en la metilación en la CpG4. El efecto sobre el epigenoma de enfermedades y traumatismos en los periodos del desarrollo temprano pueden tener consecuencias tiempo después de que el evento epigenerador ha tenido lugar, ya que un evento ambiental que establezca una marca epigenética puede propagarse gracias a las enzimas de mantenimiento (DNMT) y propagarse por un tejido hasta que se manifieste el efecto. Eventos adversos pueden alterar el funcionamiento del eje HPA cambiando la firma epigenética en los genes NR3C1 (Weaver et al., 2004), Avp (Murgatroyd & Spengler, 2014) y Crh (Elliott, Ezra-Nevo, Regev, Neufeld-Cohen, & Chen, 2010). El desarrollo neuronal se ve truncado ya que se afectan las firmas epigenéticas de las neurotrofinas BDNF (Roth, Lubin, Funk, & Sweatt, 2009) y Gad1 (T.-Y. Zhang et al., 2010). Esta variable mostró significancia en la CpG4 entre los que habían tenido algún tipo de enfermedad al nacer y los que no, mostrando el efecto sobre esta región en función de las adversidades en periodos del desarrollo temprano. Usando métodos de análisis basados en machine learning se modelaron las variables enfermedad al nacer y lugar de nacimiento en función del patrón de metilación de cada CpG. El modelo sugiere que haber padecido enfermedades asociadas a diarrea o la ictericia se relacionan con mayores niveles de metilación en la CpG1. En la CpG2 hasta el 10% de metilación se tiene una mayor asociación con condiciones saludables, sin embargo, bajo peso y estatura (BpE) tiene mayores probabilidades de generar niveles altos de metilación en esta CpG. La CpG3 tiene mayor nivel de asociación con condiciones saludables hasta el 27% de metilación, niveles más elevados se asocian con SF. Los porcentajes altos y bajos de metilación en la CpG4 y 5 se ven más influenciados por condiciones saludables (figura 17). Por su parte el modelado en función de la región de nacimiento mostró una mayor asociación entre los bajos niveles de metilación y haber nacido en un lugar distinto a Bogotá en la CpG1. En los dinucleótidos CpG 2 y 4 la variable Bogotá puede influenciar la aparición de niveles bajos y altos de metilación,

82 9. Discusión.

poniendolo como un factor sumatorio, que puede ser influenciado por otras variables. En las CpGs 3 y 5 hasta alrededor del 17% de metilación existe una mayor relación con la variable Bogotá, los niveles más elevados se asocian con personas nacidas en otras regiones (figura 18).

9.2. Red PPi

El análisis PPi permite revelar el panorama de interacción de una o más proteínas y usando teoría de grafos se pueden establecer los elementos más centrales en dichas interacciones. En este grupo de observaciones se determinaron los procesos biológicos más importantes asociados a BTBD3, gene ontology (GO), se desarrolló una distinción de comunidades emergentes en la red de interacciones y un estudio topológico o de centralidades. La PPi alrededor del gen BTBD3 generó una red extendida de 305 nodos (proteínas) y 12497 aristas (interacciones), con alto grado de robustez, es decir, un alto coeficiente de agrupamiento (0.812). Lo que implica que la red de procesos en los que se encuentra inmerso el gen BTBD3 tiene un alto grado de estabilidad, gracias a elementos redundantes, por ejemplo el proceso metabólico tiene 219 proteínas ejecutando dicha función (figura S1), lo que queda de manifiesto en la figura suplementaria S1, donde se observa que por ejemplo más de 200 proteínas tienen funciones metabólicas en esta red y que gran número de proteínas tienen funciones de ubiquitinación. De estos 305 nodos, 44 interactúan directamente con BTBD3. La red directa de BTBD3 está enriquecida en procesos asociados a la transformación de proteínas vía ubiquitinación y neddylation de proteínas, proceso en el que NEDD8 (neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 8) es conjugado con su proteína diana, la cual tiene una subunidad de Cullina. Un estudio de inmunohistoquímica encontró la presencia de NEDD8 en cuerpos de Lewy, ovillos neurofibrilares en Alzheimer y enfermedad de neuronas motoras (Mori et al., 2005). Con lo cual es posible hipotetizar que trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo comparten mecanismos y etiologías comunes. Uno de los procesos más abundantes de esta red de interacciones son las transformaciones de proteínas vía ubiquitinación (figura S1), esta es fundamental

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durante la sinaptogénesis, ya que el proceso de cambio dinámico de las neuronas está mediado por constantes modificaciones de la arquitectura celular, las cuales se posibilitan por la constante degradación y renovación del panorama proteico en función de la ubiquitinación y posterior degradación en el proteosoma. En este sentido se ha descrito que la perturbación de la homeostasis del sistema de ubiquitinación en roedores, al knockear la deubiquitinasa Usp14, genera defectos en el desarrollo de las conexiones neuromusculares (Chen et al., 2011), el mismo estudio encontró que, en las primeras semanas del periodo postnatal se genera un pico de expresión del sistema de ubiquitina, lo que sugiere la importancia de este en la organización del sistema nervioso durante dicho periodo (Chen et al., 2011). Este pico de expresión coincide con los de BTBD3 y Lhx2 asociados a organización cortical (Matsui et al., 2013; Wang et al., 2017). Otro proceso asociado a esta red es la reproducción celular tanto en mitosis como meiosis ovocitaria, lo que sugiere la participación de BTBD3 no solo en la maduración de la corteza sino también en su génesis. Los genes de esta subred también participan en proceso de diferenciación y mantenimiento del destino celular a través de la vía Notch, esta permite la diferenciación de las células en función de su posición con respecto a las otras, ya sea inhibiendo la diferenciación de estas; inhibición lateral o promoviendo la diferenciación de sus vecinas; activación lateral (Fiuza & Arias, 2007; Yoon & Gaiano, 2005). El papel de la vía Notch en el desarrollo sistema nervioso va más allá de establecimiento y mantenimiento de la identidad de las células, se ha encontrado expresado en el cono de crecimiento axonal en la mosca de la fruta (Giniger, 1998). En concordancia con lo anterior, un estudio describe que, al generar una cepa de ratones knockout para Notch1, estos presentan dificultades en la capacidad de memoria, sugiriendo la participación de este gen, y por ende de la red, en el desarrollo de las habilidades cognitivas (Costa, Honjo, & Silva, 2003). BTBD3 permite que las dendritas se reorienten en función de diversas señales y el knockout de Notch genera dificultades en memoria, indicando complementariedad de estos genes en el proceso de plasticidad sináptica. Bloquear la señal de Notch, activando Numb o Dx, promueve la expansión de las neuritas. Otros estudios encontraron que la deleción de Numb perturba la maduración neuronal en el cerebelo. La deleción de Numb interrumpe la arborización axonal en los ganglios sensoriales (Huang et al., 2005; Klein, Zilian, Suter, & Taylor, 2004). En esta red

84 9. Discusión.

también se encuentran genes de la vía Wnt, la cual se asocia a destino celular, gastrulación, control de la polarización celular, migración neuronal y sinaptogénesis vía modulación del citoesqueleto (Komiya & Habas, 2008; Salinas, 2007). Estudios en roedores muestran que afectar la vía Wnt, a través de de knockout del gen Gpr177, lleva a malformaciones en el cerebro y el cráneo; ausencia de mesencéfalo. También se ven afectadas la palatogenesis, morfogénesis dental y la formación de las glándulas salivales y serosas (Fu, Ivy Yu, Maruyama, Mirando, & Hsu, 2011; Fu, Jiang, Mirando, Yu, & Hsu, 2009).

9.2.1. Detección de comunidades.

La detección de comunidades en una red permite identificar subgrupos con altos grados de interconección (Reichardt & Bornholdt, 2006). Estas representan unidades funcionales dentro de un sistema. En la red descrita en este trabajo emergieron 3 diferentes comunidades (figura 21B). Cada uno de estos grupos cuenta con procesos y vías enriquecidas. El subgrupo 1 es el más grande de los tres, con 144 proteínas, entre las que se incluye BTBD3. Este grupo está enriquecido en procesos biológicos asociados a transformación de proteínas, reparación de ADN, respuesta a estrés, desarrollo de dendritas entre otras. Es de resaltar, con respecto al estrés y la morfogénesis del tejido nervioso que, este fenómeno afecta la formación dendrítica tanto en humanos como en roedores. Se ha observado, en roedores, que el estrés agudo es capaz de causar retraso en la formación de las espinas dendríticas en la amígdala basolateral, lo que puede llevar a la aparición de fenotipos de ansiedad, mientras que el estrés crónico genera hipertrofia de esta misma zona (McEwen et al., 2015). Adicionalmente diferentes estudios han encontrado que el estrés durante la adolescencia puede generar atrofia en las neuronas piramidales prefrontales e hipocampales, así como hipertrofia del los núcleos basolaterales de la amígdala (Lisa Eiland, Ramroop, Hill, Manley, & McEwen, 2012; L. Eiland & Romeo, 2013). Debido a que el estrés es un epigenerador (Stankiewicz et al., 2013), la exposición crónica a este genera perturbaciones aberrantes en el metiloma, esto es corroborado por un estudio que interrogó 450000 CpGs en niños retirados de sus hogares por los servicios sociales a causa de maltrato versus controles, se

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observó que las proporciones de metilación en los niños que fueron maltratados se habían invertido, es decir, la zonas hipermetiladas en controles se habían hipometilado en casos y las áreas hipometiladas en controles se encontraban hipermetiladas en casos (Yang et al., 2013). En esta misma dirección un estudio describió, en el cerebro postmortem de adolescentes suicidas, una expresión disminuida del receptor de glucocorticoides NR3C1 (Pandey, Rizavi, Ren, Dwivedi, & Palkovits, 2013). De este modo el estrés se ha convertido en un importante factor remodelador del panorama epigenético y que además tiene un impacto en el funcionamiento de la red descrita en este trabajo. El grupo 2 (figura 21B) consta de noventa proteínas, principalmente asociadas al procesamiento de ARN; ARN ribosomal (rARN) y ARN no codificante (ncARN). El intrincado proceso de interacciones del sistema de ARNs que incluyen mARN y ncARN controlan en gran medida el desarrollo del sistema nervioso central a través de la modificación de la cromatina, control del splicing, imprinting, transcripción y traducción (Mattick, 2004). Debido a los procesos en los que participa el ARN es de esperar que la expresión y funcionamiento del ARN sea seminal en cualquier periodo del desarrollo y que la alteración en cualquiera de sus componentes lleve al desarrollo de patologías. Un ejemplo es el síndrome X frágil causado por la pérdida de la función de la proteínas FMRP, la cual transporta mARN e interactúa con ARNi (Jin, Alisch, & Warren, 2004). Otro estudio encontró que, al transcribirse el mARN del gen CEBPA se transcribe un ARN que se asocia con la enzima DNMT1 y previene la metilación del gen CEBPA (Di Ruscio et al., 2013), es decir, que la transcripción de un gen puede modular su futuro patrón de expresión vía modificación de la metilación de ADN por ARN. En el último grupo hay 71 nodos o proteínas (figura 21B), principalmente relacionadas a ciclo celular, regulación de la transcripción, transformación de proteínas, recubrimiento vesicular, transducción de señal, ciclo circadiano, respuesta a hormonas esteroideas, desarrollo de tejidos (vías Notch y Wnt), respuesta a drogas, proliferación celular y desarrollo de cerebelo (tabla 4). El recubrimiento vesicular se refiere al proceso en el que la membrana de las vesículas se enriquece con proteínas, estas van a permitir tráfico intracelular; transporte de lípidos, proteínas etc., los sistemas de tráfico más conocidos implican las proteínas de recubrimiento Clathrin; que actúa en una vía de endocitosis, COP-II; exporta proteínas desde el retículo endoplasmático y COP-I;

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transporte al interior del cuerpo de Golgi y de Golgi hacia el retículo endoplasmático. Estas interactúan con proteínas SEC para formar sistemas de transporte cerrados (Faini, Beck, Wieland, & Briggs, 2013). Ambos grupos de proteínas se encuentran presentes en el interactoma de BTBD3 (tabla suplementaria S1). Alterar el sistema de tráfico impediría a una célula desempeñar cualquier tipo de función, desde el metabolismo hasta la acomodación de proteínas en el espacio intracelular. El otro aspecto llamativo de este grupo es el ciclo circadiano, este se refiere al control periódico de los ritmos biológicos que se presentan en ciclos de 24 horas. Es notable que el ciclo circadiano es uno de los elementos alterados con más frecuencia en diversas enfermedades mentales; depresión, esquizofrenia, trastorno bipolar entre otras (Jagannath, Peirson, & Foster, 2013). El control del ciclo circadiano está a cargo de un sistema de retroalimentación negativa, en el que los genes CLOCK y BMAL1 elicitan la transcripción de genes asociados al metabolismo. Adicionalmente transcriben los genes Per y Cry (presentes en el interactoma de BTBD3 tabla S1), los que a su vez reprimen la acción de CLOCK y BMAL1. Este proceso de transcripción y represión se da en ciclo de aproximadamente 24 horas (Wulff, Gatti, Wettstein, & Foster, 2010). De los aspectos explorados en la red, uno de los que mayor relación tienen con las capacidades cognitivas es el sueño. Perturbaciones de este impiden la ocurrencia del sueño REM, fase en la se consolida la memoria, adicionalmente la regulación de los los estados emocionales se ven altamente afectados. En este sentido un estudio encontró que cuando un grupo de sujetos tratan de consolidar memoria emocional, esta se ve perjudicada cuando se evita que los participantes pasen por ciclos de sueño REM (Nishida, Pearsall, Buckner, & Walker, 2009).

9.2.2. Análisis topológico

El análisis topológico permite identificar que elementos en una red son los más centrales de acuerdo a diversos criterios matemáticos. Estas centralidades son fundamentales para determinar qué nodos e interacciones son fundamentales para el funcionamiento de la red. Con el fin de determinar la importancia de los

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nodos asociados a BTBD3 en la red principal, se eliminaron todos los nodos que interactúan de manera directa con BTBD3 (desestabilización topológica), posteriormente se compararon la distribución de las características topológicas de la red original con la red desestabilizada: Betweenness centrality (Betw) o centralidad de intermediación identifica nodos en la red que son cruciales para el flujo de información. Al desestabilizar la red, Betw no presenta cambios (figura 21G), indicando que la subred BTBD3 no participa en los procesos de centralidad de nodos individuales. Por su parte Eigenvector centrality (Eigen) o centralidad de autovector identifica nodos en la red que están conectados a muchos otros nodos con altas interconecciones; con alto coeficiente topológico. La distribución de esta medida topológica presenta cambios significativos en la red desestabilizada, lo que implica que los subgrupos altamente interconectados se redistribuyen en la red, si algún proceso biológico dependía de estas redes podría haberse visto afectado de modo negativo (figura 21H). Closeness centrality (Closs) o centralidad de cercanía identifica nodos en la red que son importantes para la rápida difusión de la información en una red. Esta medida no se encuentra alterada al desestabilizar la red, lo que sugiere que, a pesar de la pérdida de los 44 nodos asociados a BTBD3, la velocidad con la que la red propaga sus procesos no se ve afectada. Pagerank centrality (PageR) o centralidad de rango de Page es una medida que permite identificar qué nodos en una red son fundamentales para el funcionamiento de la misma, al desestabilizar la red se observa un cambio altamente significativo (figura 21J), la gráfica sugiere que algunos nodos con alto puntaje en este criterio fueron eliminados, pero lo que el sistema redistribuye los nodos con alto nivel de PageR, de modo que, al perder algunos elementos de la red, se pierden ciertas funciones pero el sistema en general sigue funcionando, esto se denomina robustez del sistema. Degree centrality (Degree) o centralidad de grado identifican nodos en la red por su influencia sobre otros nodos en su vecindario inmediato, es decir, centralidades locales. La red desestabilizada, en este criterio, es significativamente diferente, la red original muestra que este elemento estaba más distribuído en la red, al eliminar la subred BTBD3, la cantidad de nodos con altos puntajes en Degree disminuyeron y desarrollaron una distribución leptocúrtica (figura 21K). Lo que sugiere que los puntos centrales de flujo de información locales se vieron altamente perturbados, es posible que localidades con funciones bien establecidas hayan visto perturbada su función.

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Edge betweenness centrality (EdgeB) o centralidad de intermediación de arista identifica las aristas que son cruciales para los flujos de información, a diferencia de las medidas anteriores que definen la centralidad de los nodos, este índice identifica las interacciones más centrales. Al desestabilizar al red este criterio cambia significativamente. Este cambio podría implicar, como algunos casos anteriores, la redistribución de las centralidades, pero debido a la redundancia del sistema es difícil determinar si los procesos biológicos se han afectado de modo que impida a la red continuar funcionando. Una comprobación de lo descrito en el proceso de desestabilización topológica exigiría desarrollar experimentos de laboratorio en el que se eliminen de manera selectiva, vía knockout o knockdown, genes con alto grado de centralidad de esta red. Al analizar la topología y el enriquecimiento de los nodos con mayor centralidad de la red principal (figura S2). Las funciones observadas en esta subred no distan mucho de los de la red principal o de la subred de BTBD3 o de la red desestabilizada. Esto indica que la red tiene un alto grado de cohesión debido a la homogeneidad en las funciones, dominios proteicos, procesos biológicos y componentes a lo largo y ancho de la red. Es decir, que casi sin importar las subdivisiones funcionales o topológicas que se le realicen a esta red los mismos enriquecimientos de la red principal van a persistir. Estos datos en conjunto apuntan a que la función de polarización dendrítica que ejerce el gen BTBD3 (Matsui et al., 2013), está mediada por el efecto que tiene este gen en la transcripción de genes reguladores del citoesqueleto, la degradación de proteínas, el control de los ciclos circadianos y el procesamiento de ncARN. Esto es, el control en la transcripción que ejerce BTBD3 permitiría que los genes reguladores de la sinaptogénesis, morfogénesis dendrítica, degradación proteica y procesamiento de ncARN aumentarán o disminuirán en función de la señales despolarizantes de los axones vecinos. Debido a que BTBD3 interactúa con genes asociados al desarrollo, pero que también parecen participar en procesos neurodegenerativos (Mori et al., 2005) se fortalece la hipótesis que la neurodegeneración puede rastrearse en patologías del neurodesarrollo.

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9.3. Expresión y co-expresión de BTBD3.

Con el fin de establecer el papel del gen BTBD3 en la conducta, se utilizaron datos del AIBS para establecer el patrón de expresión encefálico (dónde y cuánto se expresa el gen) de BTBD3. De esta manera se pueden establecer relaciones anatomofuncionales y anatomopatológicas. Adicionalmente se estableció el panorama de co-expresión en ambos momentos del desarrollo, así es posible conocer el panorama de interacción del gen. Los datos del AIBS se obtuvieron utilizando microarreglos en 4 cerebros prenatales de 15 a 21 semanas postconcepción y en 6 cerebros adultos de 24 a 57 años (Hawrylycz et al., 2012; J. A. Miller et al., 2014). En el cerebro prenatal las zonas de hiperexpresión del gen BTBD3 corresponden a la corteza cerebelosa (CBC), mesencéfalo (pretectum (PTR), tegmento mesencefálico (MTg), tectum mesencefálico (MTc)), tálamo (THM), hipotálamo (HTM), y tegmento pontino (PnTg). No se encontraron regiones de hipoexpresión, es decir, con expresión por debajo de la primera desviación estandar (figura 22A). Por su parte el cerebro adulto muestra hipoexpresión en el estriado (Str) y en el núcleo pontino (Bpons). Las zonas hiper expresadas corresponden a formación hipocampal (HiF), corteza cerebelosa adulta (CbCx), tálamo ventral (VT), materia blanca (WM) y claustro (CL) (figura 22B)

9.3.1. Expresión por área.

Los datos de expresión sugieren que el cerebelo mantiene un patrón de hiperexpresión tanto en estado prenatal como en adulto, con una diferencia significativa entre estos dos periodos, mostrando reducción en la expresión en la adultez (figura 22A, B y C). Esto indica la importancia de BTBD3 en el desarrollo y mantenimiento de esta estructura encefálica. El cerebelo humano se encuentra en la zona posterior del encéfalo y se conecta al resto del encéfalo a través del tallo cerebral vía pedúnculos cerebelosos; Pedúnculo superior: lleva información del cerebelo a la corteza cerebral; pedúnculo medio: conecta la corteza cerebral al cerebelo y el pedúnculo inferior: transmite información del cerebelo al sistema

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vestibular y la médula espinal y de la oliva inferior al cerebelo (Stoodley & Limperopoulos, 2016). Es de señalar que tanto el lóbulo anterior como lóbulo VIII del cerebelo contienen representaciones senriomotoras (Grodd, Hülsmann, Lotze, Wildgruber, & Erb, 2001), mientras el lóbulo posterior se conecta con áreas de control cognitivo y emocional (Stoodley & Schmahmann, 2010). La red entre el cerebelo y el cerebro, ponen a esta estructura como un punto clave en el desarrollo del cerebro. El cerebelo se ha asociado con mayor frecuencia al aprendizaje de secuencias motoras implícitas. Sin embargo, existen reportes que indican que daños en esta estructura afectan a largo plazo el volumen de materia gris y blanca en el área prefrontal dorsolateral, área premotora, cortezas sensoriomotoras, y regiones occipitales inferiores (Limperopoulos, Chilingaryan, Guizard, Robertson, & Du Plessis, 2010). Lo que implica que tanto áreas asociadas al control motor como las de control ejecutivo dependen del funcionamiento cerebeloso. En este sentido se ha determinado que el hemisferio lateral posterior del cerebelo (Crus I y Crus II) se relacionan con el desarrollo de funciones cognitivas. Bebés prematuros, con reducción del volumen en regiones laterales del cerebelo, muestran déficits en funciones ejecutivas y visoespaciales (Allin et al., 2005). Sujetos con TDAH han mostrado hipoactividad en el cerebelo anterior, Crus I bilateral (Massat et al., 2012; Mattfeld et al., 2016). En suma, daños en los hemisferios posteriores laterales y en el vermis del cerebelo se asocian con los síntomas de TDAH, autismo y dislexia, esto es debido a las relaciones frontoparietales y límbicas con las que dichas áreas hacen conexión. De este modo, alteraciones en la función de BTBD3, que impidan la correcta organización cortical del cerebelo podría afectar el desempeño de funciones motoras, cognitivas y emocionales. Durante el desarrollo prenatal PTR es la segunda área con mayor expresión del gen BTBD3 (figura 22), ésta área hace parte del mesencéfalo, PTR participa en el procesamiento visual subcortical (Benevento, Rezak, & Santos-Anderson, 1977; Collewijn, 1975). Adicional al procesamiento visual, ésta área se ha asociado con la regulación del ciclo circadiano. En un estudio se lesionó químicamente el PTR en ratas albinas, se observó una reducción significativa del sueño REM inducido (A. M. Miller, Miller, Obermeyer, Behan, & Benca, 1999). Resultados similares se encontraron en un estudio que analizó PnTg, en este estudio se describe que existen diferencias significativas en la medición de N-

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acetil aspartato, entre los sujetos control y los que presentan desórdenes del sueño REM (L. Zhang et al., 2016). Lo anterior es congruente con los datos de análisis de interactoma, en el que se encontraron vías KEGG y proteínas asociadas al ciclo circadiano (figura S1). Como tercera área en nivel de expresión se encuentra MTc, ésta también forma parte del mesencéfalo. MTc contiene los colículos superiores, asociados a reflejos visuales, y los colículos inferiores, que son áreas de procesamiento auditivo (Angeles Fernández-Gil, Palacios-Bote, Leo-Barahona, & Mora-Encinas, 2010). Por su parte MTg corresponde a la zona intermedia entre el MTc y la base del tallo cerebral, esta estructura contiene núcleos somatosensoriales, la sustancia negra, el núcleo rojo, el núcleo de la oliva inferior y la formación reticular. Esta última se extiende desde el cordón espinal hasta tálamo y el hipotálamo, adicionalmente se conecta con el cerebelo, el núcleo rojo y la sustancia negra, entre sus funciones se encuentran la coordinación de movimientos finos, conciencia, arousal, vigilia y reflejo de postura (Angeles Fernández-Gil et al., 2010). La concentración de estas funciones en dicha área la hace fundamental para la iniciación de los estados atencionales. En el modelo neuropsicológico de Mesulam, el sistema atencional inicia en el zona reticular, generando los fenómenos atencionales básicos, como la orientación y la alerta, paulatinamente va ascendiendo hacia la corteza, que permite capacidades atencionales más sofisticadas (Mesulam, 2000). Debido al nivel de expresión de BTBD3 en estas zonas mesencefálicas y a la importancia de estas en los procesos de control motor y atencionales, fallos en la expresión del gen, ya sea por eventos genéticos o epigenéticos podrían llevar a un detrimento en las capacidades cognitivas que utilizan los procesos atenciones como base, adicionalmente, en estas zonas se encuentran regiones asociadas a trastornos neurodegenerativos como el Parkinson, el cual también se encuentra en los análisis de enriquecimiento del interactoma de BTBD3 (Tabla 4). El THM es una estructura situada lateral al tercer ventrículo, se ha descrito como un nodo importante en el procesamiento y relevo de información sensorial hacia la corteza cerebral, el cerebelo y el Str. Cada uno de los subnúcleo talámicos es esencial para el flujo de información hacia distintas áreas de corteza, y cada núcleo puede ser categorizado en función de sus proyecciones. Se ha descrito que los núcleos mediodorsal y pulvinar son necesarios para los procesos

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de integración de información fronto-parietal, dicha red está relacionada con procesos cognitivos complejos (Dorph-Petersen & Lewis, 2017). Un estudio reciente encontró que alteraciones en el tálamo izquierdo, menor cantidad de N- metil aspartato, en gemelos monocigotos y dicigotos se ha vinculado con síntomas de espectro autista (EA), mostrando una relación entre la función del tálamo, la lateralización y la severidad de los síntomas de EA (Hegarty et al., 2018). Otros núcleos talámicos afectan la flexibilidad cognitiva. Se ha observado que lesiones del núcleo reuniens, en el tálamo ventral medial de ratas, les impide desempeñar el paradigma set shifting, en el que se requiere que el animal seleccione un estímulo que previamente no generaba recompensa para esta vez la obtenga (Linley, Gallo, & Vertes, 2016). Por su parte VT, estructura que mostró hiperexpresión de BTBD3 en adultos. Se ha asociado a las conductas de búsqueda y recompensa, un estudio que registró los potenciales de acción en el globo pálido y VT durante la ejecución de una tarea de aprendizaje estímulo-respuesta basada en recompensa, encontró que VT muestra una importante activación durante el desempeño de estas tareas (Schroll et al., 2015). Debido al papel como nodo esencial, que ejerce THM, en la comunicación entre la periferia y áreas subcorticales con la corteza cerebral, su funcionamiento es seminal en los procesos atencionales. Si la reorganización dendrítica se ve alterada en función de la falla en BTBD3, no solo el procesamiento sensorial, sino también la integración de estímulos que facilitan los procesos cognitivos superiores experimentarían un detrimento. En el cerebro adulto HiF sobresale por ser el área con mayor expresión del gen BTBD3. Esta zona, localizada en lo profundo del lóbulo temporal, se ha asociado con la formación de memoria y control del eje HPA (O’Mara, 2006). Esta región se compone de giro dentado (GD), regiones de la 1 a la 4 del cuerno de amón (CA 1, 2, 3 y 4), subiculum, presubiculum, para subiculum, fimbria, células granulares del giro dentado, fisura hipocampal y capa molecular (Whelan et al., 2016). Debido a las funciones asociada a HiF, memoria explícita episódica, memoria espacial e inhibición tónica hipotalámica (Burgess, Maguire, & O’Keefe, 2002; McEwen et al., 2015), es lógico pensar que la arquitectura de las poblaciones celulares contenidas en ésta área deben modificarse constantemente, de modo que faciliten los procesos mnésicos a corto plazo, que durante la fase de sueño REM se consolidaran en la memoria a largo plazo. Se ha observado, en

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 93 muestra de pacientes colombianos

roedores, que las vías de señalización Semaforinas-plexinas, en el hipocampo modulan la dinámica de microtúbulos, permitiendo que se desarrollen las neuritas y la arborización las dendritas (Laht, Otsus, Remm, & Veske, 2014). El análisis PPi mostró que existen al menos 19 genes que interactúan con BTBD3 (APC, CCNE1, CCNF, CDC16, CDC20, CDC27, CDK2, CDK6, CSNK1A1, CSNK1D, CTNNB1, CUL7, DTL, FBXL7, FBXO31, FBXW11, GSK3B, KEAP1, PLK1) y que tienen función de microtubule organizing center, dicha función se pierde al desestabilizar la red PPi (figura S1), lo anterior es consonante con estudios que muestran que al eliminar la función de BTBD3, se pierde la capacidad para generar columnas corticales y polarizar dendritas (Matsui et al., 2013; Wang et al., 2017). La desregularización de diversas regiones hipocampales se han asociados con TDAH. Un estudio encontró baja densidad del receptor D5 en el hipocampo de modelos animales para TDAH (Medin et al., 2013). Por otra parte un estudio basado en modelos de machine learning encontró que cambios en el volumen hipocampal pueden ser usado de manera efectiva para distinguir entre casos y controles (Rangarajan, Suresh, & Mahanand, 2014). Lo anterior apunta a que la desregularización de HiF puede asociarse a un descontrol del eje HPA, incapacidad para generar memoria nueva y dificultades en la conexión con la corteza frontal, fenómenos relacionados a diferentes patologías neuropsicológicas y neuropsiquiátricas. El eje HPA es como se denomina a una cadena de reacciones neurohormonales que dan inicio en el núcleo paraventricular de HTM. Cuando este núcleo hipotalámico es estimulado produce hormona liberadora de corticotropina (CRH), ésta hormona actúa sobre sus receptores en la adenohipófisis, lo que lleva a la liberación de hormona adrenocorticotropa (ACTH) (Harkness, Stewart, & Wynne-Edwards, 2011). la cual viaja a través de la vena porta hasta la glándulas suprarrenales, una vez allí, ACTH estimula la corteza suprarrenal para que libere glucocorticoides (Wolf, 2003). El cortisol permite que el organismo disponga de más energía para enfrentar la amenaza suprimiendo el sistema inmune y acelerando el metabolismo, detiene otros ejes neurohormonales, para la liberación de interleuquinas (Tsigos, Constantine, & Chrousos, 2002) y genera feedback negativo en el eje HPA. La exposición crónica a glucocorticoides se ha asociado a detrimento en los sistemas cognitivos. Un modelo interesante de estudio sobre los efectos del

94 9. Discusión.

cortisol crónico sobre el organismo es el síndrome de Cushing (CS). Esta patología es causada por mutaciones que generan tumores en glándulas suprarrenales o pituitaria y en consecuencia hiperactividad de las glándulas suprarrenales (Lerario, Moraitis, & Hammer, 2014). Esta condición genera una sobreproducción de cortisol, este elicitar mayor actividad de la vía cAMP/PKA (Lerario et al., 2014). Las personas expuestas a estos altos niveles de cortisol presentan déficits en funciones cognitivas como atención, funciones ejecutivas y memoria no verbal. En un estudio realizado en pacientes CS, se encontró que después de ser tratados (remover quirúrgicamente el tumor ya sea de la pituitaria o de las glándulas suprarrenales) no se generaba mejoría significativa en funciones ejecutivas y atención (Forget, Hélène, André, Isabelle, & Henri, 2016). Esto indica, que los daños producidos por la exposición a glucocorticoides son de mediano y largo plazo en el sistema cognitivo y se asocian con los síntomas de TDAH. El CL es una estructura subcortical la cual ha cobrado importancia recientemente por su papel en la integración global de los procesos cognitivos. En un estudio se aplicó un estímulo eléctrico a ésta área lo que tuvo como efectos comportamentales la detención de lectura, inicio de mirada fija, ausencia de respuesta ante comandos verbales, auditivos o visuales, movimientos respiratorios reducidos. Adicionalmente el paciente reportó que no recordaba nada de lo sucedido durante el procedimiento (Koubeissi, Bartolomei, Beltagy, & Picard, 2014). Al estimular CL se detectó un aumento en la actividad sincrónica del lóbulo parietal y frontal posterior, esto sugiere que el encéfalo, ante dichas condiciones, es incapaz de organizar en integra todos los procesos y estímulos necesarios para generar la conciencia. Al ser un nodo tan importante de integración sensorial, CL debe mantener un patrón de interconexiones muy bien afinado, posibilitado, entre otros por la alta expresión de BTBD3. No se conoce una relación directa entre esta estructura y los trastornos de neurodesarrollo, sin embargo, su papel como integrador puede afectar las funciones cognitivas básica.

9.3.2. co-expresión.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 95 muestra de pacientes colombianos

Aunque el nivel de expresión del gen BTBD3 tiende a ser más elevado en estado prenatal (figura 22C) su correlación con otros genes es más bajas (figura 23), lo que podría estar indicando un patrón dinámico de expresión genómica durante el desarrollo prenatal, esto es, el genoma empiezan a establecer patrones de expresión que determinarán la identidad celular, por tal razón los patrones de expresión no son tan fijos. Mientras que en el cerebro adulto, se observa una correlación más fuerte entre los diferentes genes y BTBD3 (figura 24), asociada a un patrón de expresión ya establecido. También es de resaltar que solo 2 genes muestran co-expresión en estado prenatal y adulto. Esto sugiere un cambio brusco en el panorama de interacciones entre este gen y los demás. La ontología de genes permite determinar los procesos y funciones enriquecidas en un grupo de genes. Este tipo de análisis se realizó en el grupo de genes co-expresados en estado prenatal y estado adulto (figura 25). La nube de palabras muestra el enriquecimiento de acuerdo a la categoría ontológica y un inserto que muestra las funciones compartidas. Los procesos biológicos más abundantes en los genes co-expresado en estado prenatal son desarrollo de sistema nervioso, procesos metabólicos, regulación de la transcripción dependiente de ADN, regulación de la presión sanguínea, transporte de iones de sodio, desarrollo organismico multicelular, transporte de iones de potasio y reducción de oxidación (figura 25A). Esto es, aparte de las funciones de desarrollo los genes co-expresados en este periodo se asocian al control iónico y control vascular. Por su parte, en el estado adulto los proceso biológicos más enriquecidos son: iniciación de la transcripción del promotor de la ARN polimerasa II, splicing de mARN nuclear vía espliceosoma, regulación de la transcripción, fosforilación de aminoácidos en proteínas, regulación positiva de la transcripción del promotor de ARN polimerasa II, elongación del ARN del promotor de la ARN polimerasa II, respuesta al daño del ADN (figura 25A). Lo que indica que en la adultez el panorama de co-expresión está dominado por procesos de regulación de la transcripción y activación de proteínas vía fosforilación, esto es concordante con los enriquecimientos encontrados en el grupo dos del interactoma de BTBD3 (figura 21B tabla 4). Sin embargo, funciones como ciclo celular, división celular, regulación positiva de la transcripción dependiente de ADN, transporte de iones de potasio y fosforilación de aminoácidos, se conservan tanto en estado prenatal como adulto

96 9. Discusión.

(figura 25B). Los datos anteriores sugieren que el panorama de co-expresión de BTBD3 participa tanto en el desarrollo del sistema nerviosos como en control de la expresión. A pesar de esto el grupo de genes con los que co-expresa es radicalmente distinto, sugiriendo que la función de BTBD3 es dependiente de tiempo y espacio en el organismo.

10. Conclusiones.

Se determinaron los perfiles de metilación de una región reguladora gen BTBD3 en niños con diagnóstico de TDAH en una muestra de la población Colombiana. Los resultados sugieren que los porcentajes de metilación del área estudiada no se asocian con el diagnóstico. A pesar de esto, existen interacciones significativas con las variables tipo de parto y el estrés prenatal. La metilación en la región estudiada es susceptible a cambios en las primeras fases del desarrollo, posteriormente se fija y permanece más estable. De manera más general, se observa una relación entre el estrés y el momento de desarrollo sobre la metilación de esta región; a mayor estrés y menor edad, más elevado es el porcentaje de metilación, sobretodo en las CpG 3 y 4. Dichos porcentajes son concordantes con los que reporta el USCS, en donde se muestra que los niveles de metilación de esta zona son similares en diferentes tejidos, incluyendo sangre y cerebro. La comparación de los niveles de metilación en función de las variables clínicas sugiere que, diferentes factores ambientales inciden en los porcentajes de metilación. Estos factores pueden ser de tipo estresor, como las condiciones a las que se estuvo sometido durante el periodo preparto, el tipo de alimentación o el haber padecido enfermedades durante periodos tempranos de desarrollo. Sin embargo, factores que pueden ser considerados previos y externos al individuo también podrían generan cambios en la metilación, esto es, la edad de los padres o la región de nacimiento. Estos factores pueden constituir blancos de intervención para evitar el desarrollo de procesos de metilación aberrantes. El análisis PPi, a partir de datos obtenidos de la base de datos STRING, permitió establecer que la red de interacciones en las que estaría inmerso BTBD3 se encuentra dominada por procesos metabólicos vía ubiquitinación de proteínas. Esto explicaría porque los estudios de knockdown, del gen BTBD3, encuentren que las neuronas pierden su capacidad de polarización dendrítica, es decir, que al eliminar BTBD3 la célula ve afectada su capacidad para degradar proteínas, modificar su entramado de microtúbulos y en general renovar el panorama proteico. La desestabilización topológica sugiere que, al eliminar BTBD3 se

98 10. Conclusiones.

generaría pérdida de funciones metabólicas y de transducción de señal, lo que al parecer desembocaría en incapacidad de la célula para reaccionar y adaptarse a las señales externas. Las proteínas y las interacciones observadas en esta red no solo ofrecen un marco de entendimiento sobre el fenómeno de la polarización dendrítica, sino que pueden ser blancos de investigación o terapéuticos desde el punto de vista farmacológico. Aunque en este estudio no se determinó la cantidad de proteína BTBD3, y los estudios previos que han disminuído la función de BTBD3, tampoco han medido el aumento o disminución de otras proteínas, podría ser relevante establecer si, al disminuir la función de BTBD3 disminuye la función de otros sistemas, como el sistema de procesamiento de ARN o el de ubiquitinación, los cuales emergieron en el análisis PPi. Los análisis de redes permiten pasar del estudio de asociación de variables genéticas a examinar uno o varios genes en su contexto funcional, de manera que se puedan establecer nuevos blancos terapéuticos o investigativos. Aunque la metilación del área estudiada no mostró relación directa con el diagnóstico inicial de TDAH, los patrones expresión de BTBD3 en el encéfalo humano tanto en periodo prenatal como adulto y su función biológica de orientación dendrítica, mediada por las proteínas con las que interactúa BTBD3, sugieren la importancia de este gen para buen funcionamiento y desarrollo del sistema nervioso central. Usando datos del AIBS se determinó que los niveles más elevados de expresión del gen se localizan en áreas asociadas al control motor fino y grueso, formación de memoria, inhibición de ejes neurohormonales, control del ritmo circadiano, arousal, conciencia y control ejecutivo. Adicionalmente, la expresión de BTBD3 tiende a ser mayor en estado prenatal que en estado adulto. Quizá debido a los procesos de sinaptogénesis y en general establecimiento estructural del encéfalo durante el periodo prenatal. Sumado a lo anterior, se observa que el patrón de co-expresión es más débil durante el periodo prenatal que durante la adultez. Posiblemente por la misma razón, durante el periodo prenatal las células nerviosas aún se encuentran en fases de diferenciación, establecimiento de identidad y de patrones de expresión, lo que hace que haya mayor variabilidad en los niveles de expresión. Por su parte, en la adultez se observan patrones más fijos, los que explicaría que la menor expresión de BTBD3 pero una correlación mayor con los genes con los que se co-expresa. También se observa que durante el periodo prenatal el patrón de expresión se asocia a

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 99 muestra de pacientes colombianos

desarrollo del sistema nervioso mientras que en la adultez los genes están enfocados a regulación de la transcripción. A nuestro entender este es el primer estudio que indaga la relación entre la metilación del gen BTBD3 y el TDAH, en el que adicionalmente se tuvieron en cuenta un gran número de variables clínicas, y el uso de bases de datos para generar relaciones anatomofuncionales asociadas a los lugares de mayor expresión del gen y la determinación del entramado de interacciones proteicos y sus enriquecimientos funcionales

11. Perspectivas

Para dar mayor robustez a los resultados, se debe incrementar la muestra, adicionalmente es importante indagar otras regiones del gen, como la isla CpG o zonas intergénicas y la relación de la metilación de dichas áreas con polimorfismos. Aunque los resultados sugieren que la metilación en el área estudiada es susceptible a cambios durante periodos tempranos y posteriormente se fija y es más estable, deberían hacerse estudios longitudinales que abarquen la adultez y la vejez, en los que se pueda establecer la evolución de la patología con los cambios en la metilación. Aunque existen estudios de pérdida de función del gen, estos solo han evaluado los efectos en áreas específicas del cerebro de ratones. Estudios de reducción de la función del gen y sus consecuencias comportamentales ayudarían a dilucidar los efectos que dicha reducción de función podría tener en la coordinación motora, formación de memoria, control ejecutivo y neurohormonal. En este mismo sentido y basándonos en la PPi, se debería evaluar el efecto que la disfunción de BTBD3 tiene sobre los sistemas de ubiquitinación, procesamiento de ncARN, transporte intracelular, recubrimiento vesicular etc. Debido a su centralidad (alto coeficiente topológico) los genes RPS27A, UBA52, CSNK1D, IMP4, DCAF13, RBX1, RHOBTB2, UBC, UBB, CUL3, CUL1, BTBD6, CSNK1E, SKP1, BTRC, TP53, SKP2, RNF7, BTBD1, FBXW5, ANAPC10, FBXW7, CDC34, FBXW11, CDC20, UBE2D1, CDC23, CDC16, TRIP12, FBXW2, UBE2R2, UBE2C, ANAPC11, CCNF, CDC27, CUL2, ANAPC1, FZR1, ANAPC5, UBE2N, ANAPC4, ANAPC2, UBE2E1, UBE2D2, ANAPC7, FBXO17, CUL5 y UBA1 son importantes blancos de estudio desde el punto de vista genético y epigenético. El patrón de expresión del gen sugiere que áreas como el cerebelo, la formación hipocampal, tálamo, claustro y tallo cerebral deberían ser blancos de observación en estudios de neuroimagen, tanto en procesos de desarrollo como degenerativos, ya que son importantes hubs de expresión para BTBD3.

12. Anexos.

12.1. Mediciones topológicas de la red.

EdgeBetween Betweenness ClosenessCen EigenvectorC DegreeCentral PageRankCen nessCentrality Centrality trality entrality ity trality

RHOBTB 3 <-> 0.008378 0.007899 CUL3 663.24 RPS27A 8363.11 RPS27A 0.763819 SKP1 15 RPS27A 215 RPS27A 6 BTBD6 <-> RHOBTB 0.008357 0.007013 3 602.817 UBA52 2738.66 UBA52 0.698851 CUL1 12 UBA52 183 CUL1 5 BTBD6 0.008304 0.006902 <-> IMP4 581.415 CSNK1D 1805.3 RBX1 0.689342 RBX1 00 CUL1 183 SKP1 63 RHOBTB 2 <-> 0.008259 0.006811 CUL3 570.296 IMP4 1093.95 UBC 0.683146 RPS27A 49 SKP1 181 UBA52 17 BTBD3 0.008188 0.006704 <-> IMP4 549.169 DCAF13 931.699 UBB 0.683146 UBA52 53 RBX1 177 RBX1 37 RHOBTB 2 <-> 0.008172 0.006498 BTBD1 519.406 RBX1 846.469 CUL1 0.672566 UBC 44 UBC 173 UBC 12 RHOBTB 2 <-> RHOBTB 0.008172 0.006498 BTBD6 498.854 2 838.915 SKP1 0.669604 UBB 44 UBB 173 UBB 12 BTBD1 0.008140 0.006199 <-> IMP4 444.34 UBC 822.254 BTRC 0.649573 SKP2 06 BTRC 164 BTRC 75 SEC24A <-> 0.008094 0.005854 CSNK1D 424.865 UBB 822.254 SKP2 0.638655 BTRC 62 SKP2 160 SKP2 66 SEC31A <-> 0.007872 0.005554 TCEB2 421.124 CUL3 811.628 RNF7 0.637317 FBXW7 08 FBXW7 144 CUL3 77 SEC23A <-> 0.007794 0.005210 UBE2B 421.103 CUL1 794.112 BTBD1 0.6294 UBE2D1 25 CUL3 143 FBXW11 84 CSNK1D <-> 0.007791 0.005210 SEC24D 420.835 BTBD6 759.941 BTBD6 0.626804 RNF7 79 FBXW11 142 FBXW7 8 CSNK1D <-> 0.007767 0.005121 SEC24B 420.835 CSNK1E 748.978 FBXW5 0.625514 CUL3 79 RNF7 141 RNF7 12 CSNK1D <-> ANAPC1 0.007741 0.004917 LMAN1 420.835 SKP1 739.258 0 0.62423 FBXW11 80 UBE2D1 136 BTBD6 07 CSNK1D <-> ANAPC1 0.007735 0.004912 SEC24C 420.835 BTRC 727.724 FBXW7 0.614141 1 06 CCNF 136 CDC20 02 DCAF13 <-> 0.007725 0.004884 RBX1 418.889 TP53 600.514 CUL3 0.614141 CDC16 14 CDC20 135 CCNF 54 RHOBTB 2 <-> 0.007694 0.004856 KEAP1 418.873 PSMD14 497.468 CDC34 0.614141 CCNF 01 CDC16 135 UBE2D1 1 UBA52 0.007688 0.004814 <-> 412.369 BTBD1 491.689 FBXW11 0.612903 CDC27 83 CDC23 134 CDC16 07

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 103 muestra de pacientes colombianos

MRTO4 UBA52 <-> RHOBTB 0.007678 0.004804 BOP1 400.508 3 488.479 CDC20 0.610442 CDC23 90 CUL2 133 BTBD1 57 UBA52 <-> 0.007678 0.004792 PES1 384.457 BTBD3 470.889 UBE2D1 0.605578 CDC20 67 CDC27 133 CUL2 06 RHOBTB 2 <-> ARHGDI ANAPC1 0.007671 ANAPC1 0.004779 A 380.453 FBXW11 414.284 CDC23 0.604374 0 75 1 133 CDC23 47 RHOBTB 2 <-> ARHGDI 0.007638 G 380.453 SKP2 407.468 CDC16 0.603175 CUL2 12 FBXW5 132 CDC27 0.004731 RHOBTB 2 <-> ARHGDI 0.007632 ANAPC1 0.004727 B 380.453 UBE2B 375.154 TRIP12 0.60198 FBXW5 97 0 132 FBXW5 15 NOP56 <-> 0.007628 ANAPC1 0.004713 RPS27A 377.306 NHP2L1 335.761 FBXW2 0.600791 ANAPC1 76 UBE2C 129 1 09 RAB9A <-> 0.007617 0.004679 SEC24A 374.636 NHP2 332.781 UBE2R2 0.599606 FZR1 72 FZR1 129 UBE2C 97 RPS27A <-> 0.007617 ANAPC1 0.004672 NOB1 370.487 RNF7 325.213 UBE2C 0.599606 UBE2C 54 BTBD1 129 0 53 UTP11L <-> ANAPC1 0.007614 0.004634 RPS27A 369.813 IMP3 278.365 1 0.599606 ANAPC5 42 FBXL3 128 FBXL3 54 UBA52 <-> 0.007606 0.004565 EXOSC2 369.085 SEC24A 278.026 CDC27 0.598425 UBE2N 84 ANAPC1 128 FZR1 24 RPS27A <-> 0.007600 0.004546 UTP6 368.939 CUL4A 276.77 CCNF 0.598425 ANAPC4 18 UBE2N 127 CUL5 82 NOP14 <-> 0.007597 0.004519 RPS27A 368.939 FBXL3 259.984 FZR1 0.594912 ANAPC2 01 CUL5 127 FBXL15 04 WDR46 <-> 0.007583 0.004515 RPS27A 368.939 CDC20 251.009 CUL2 0.594912 UBE2E1 89 CDC34 127 CDC34 57 TBL3 <-> 0.007583 0.004509 RPS27A 368.939 UBE2C 247.138 UBE2N 0.59375 UBE2D2 69 BTBD6 127 ANAPC1 96 RPS27A <-> MPHOS 0.007579 0.004477 PH10 368.939 FBXW7 236.298 FBXL3 0.59375 CDC34 22 ANAPC5 127 UBE2N 9 RPS27A <-> 0.007568 0.004469 KRR1 368.939 FBXW5 234.155 ANAPC5 0.592593 ANAPC7 24 FBXO17 126 ANAPC5 71 RPS27A <-> 0.007546 0.004467 DDX52 368.939 KEAP1 225.652 ANAPC1 0.592593 BTBD1 48 FBXL15 126 CSNK1D 7 RPS27A <-> 0.007544 0.004455 DDX49 368.939 TCEB2 216.176 UBE2D2 0.590291 FBXO17 14 ANAPC4 126 FBXO17 16 DDX47 <-> 0.007542 0.004435 RPS27A 368.939 NOL6 213.31 ANAPC4 0.590291 CUL5 18 ANAPC2 126 FBXO32 29 RPS27A <-> 0.007542 0.004431 UTP18 368.939 WDR12 206.528 ANAPC2 0.590291 UBA1 04 UBE2D2 125 UBE2B 44

104 12. Anexos.

CIRH1A <-> 0.007524 0.004429 RPS27A 368.939 CDC23 193.999 HACE1 0.589147 FBXO4 23 FBXO32 125 ANAPC2 43 WDR3 <- > ANAPC1 0.007520 0.004427 RPS27A 368.939 0 192.896 UBE2B 0.588008 UBE2S 97 UBE2E1 124 ANAPC4 45 WDR43 <-> 0.007519 0.004397 RPS27A 368.939 CCNF 177.89 CUL5 0.588008 FBXL19 37 FBXO44 124 FBXO2 23 DIEXF <- > 0.007519 0.004397 RPS27A 368.939 CDC34 177.689 ANAPC7 0.588008 FBXO9 37 FBXO4 124 FBXO44 13 BMS1 <- > 0.007514 0.004396 RPS27A 368.939 NEDD8 175.817 UBE2S 0.586873 FBXL3 40 FBXO2 124 UBE2D2 48 WDR75 <-> 0.007513 0.004367 RPS27A 366.42 RPP38 174.214 UBE2E1 0.586873 FBXL15 00 ANAPC7 124 FBXO4 71 PWP2 <- > 0.007511 0.004347 RPS27A 365.909 FBXW2 173.649 DCAF13 0.586873 FBXO32 99 VHL 123 ANAPC7 93 RPS27A <-> 0.007509 0.004340 UTP3 365.775 TRIP12 172.732 VHL 0.585742 VHL 85 UBE2S 123 UBA1 6 RHOBTB 2 <-> CSNK1A 0.007508 PLIN3 365.533 1 168.671 UBE2K 0.585742 UBE2K 53 UBA1 123 UBE2E1 0.00434 RCL1 <- > 0.007507 0.004335 RPS27A 365.425 CDK2 163.086 FBXO4 0.585742 FBXO44 48 FBXO9 123 VHL 64 NOC4L <-> 0.007506 0.004333 RPS27A 365.135 HACE1 154.375 UBA1 0.584615 FBXO2 19 FBXO31 123 HACE1 92 UTP14C <-> 0.007500 0.004332 RPS27A 364.157 CUL4B 152.992 FBXO32 0.584615 FBXO31 50 FBXL19 123 UBE2S 36 RPS27A <-> 0.007497 0.004330 BYSL 362.76 CUL2 150.916 FBXO17 0.584615 BTBD6 99 FBXO6 122 FBXO31 31 RRP7A <-> 0.007496 0.004324 RPS27A 358.611 NOP58 147.28 FBXL15 0.584615 UBA3 24 FBXO27 122 FBXO9 4 FCF1 <- > 0.007484 0.004324 RPS27A 357.381 PNO1 147.144 UBA3 0.582375 HACE1 94 FBXL7 122 FBXL19 4 TSR1 <- > 0.007482 0.004290 RPS27A 356.353 PSMA6 144.675 FBXO44 0.582375 FBXL5 57 FBXL5 122 FBXO6 51 HEATR1 <-> 0.007482 0.004290 RPS27A 355.015 UTP15 142.619 FBXO2 0.582375 FBXO6 57 UBA3 121 FBXO27 51 RIOK2 <- > 0.007482 0.004290 RPS27A 354.301 UBE2D1 139.793 UBE2M 0.581262 FBXO27 57 HACE1 121 FBXL7 51 SEC24A <-> 0.007482 0.004290 UBE2C 352.928 SEC13 138.122 KEAP1 0.581262 FBXL7 57 UBE2M 120 FBXL5 51 LTV1 <-> 0.007481 0.004245 RPS27A 351.813 CDKN1A 132.322 FBXO9 0.581262 UBA7 91 UBE2K 120 UBA3 96 UBA52 <-> 0.007463 0.004219 EXOSC3 351.616 PLK1 131.628 FBXO31 0.581262 UBA6 98 UBE2B 120 UBE2M 64 RPS27A 350.486 DDB1 130.392 FBXL19 0.581262 UBE2D3 0.007460 VPRBP 119 TRIP12 0.004193

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 105 muestra de pacientes colombianos

<-> 19 9 RRP36 RPS27A <-> 0.007456 0.004185 PNO1 349.817 CDC16 127.9 VPRBP 0.580153 UBE2A 30 UBE2D3 119 VPRBP 84 UBA52 <-> 0.007456 0.004185 EXOSC1 346.975 DHX37 125.803 UBE2A 0.580153 UBE2M 08 UBA7 119 UBE2K 64 BTBD3 <-> 0.007441 0.004183 SEC16A 345.066 FBXL15 124.793 UBA7 0.580153 UBE2B 85 TRAF7 119 TRAF7 27 UBA52 <-> 0.007433 0.004181 EXOSC7 343.995 RPS9 123.815 FBXO6 0.580153 TCEB1 10 UBE2A 118 KEAP1 24 RPS27A <-> 0.007430 0.004160 UTP20 338.165 EP300 121.585 FBXO27 0.580153 TRAF7 15 UBA6 118 UBE2D3 98 DCAF13 <-> 0.007409 0.004148 RNF7 336.443 FBXO32 119.91 FBXL7 0.580153 CUL7 61 TRIP12 118 UBA7 75 PDCD11 <-> 0.007408 0.004137 RPS27A 331.849 PDCD11 118.368 FBXL5 0.580153 VPRBP 86 TCEB1 117 DET1 26 CUL4A <-> 0.007397 0.004124 GRWD1 320.491 RRP9 116.798 UBA6 0.579048 TRIP12 83 FBXW8 117 TCEB2 31 WDR36 <-> 0.007388 0.004116 RPS27A 318.081 PSMA4 112.679 TRAF7 0.579048 FBXW8 75 DET1 117 UBE2A 28 UTP14A <-> 0.007367 0.004108 RPS27A 312.527 CDC27 110.749 IMP4 0.579048 UBE2E3 22 UBE2R2 116 UBA6 95 ANAPC1 0 <-> 0.007365 0.004091 UTP15 308.915 CUL5 106.992 FBXW8 0.579048 UBE2L3 88 CUL7 116 FBXW8 38 FBXW5 <-> 0.007364 0.004078 DCAF13 307.846 FBL 102.385 TCEB2 0.577947 UBE2R2 41 UBE2L3 115 TCEB1 92 NOP2 <- 0.007363 0.004058 > CDK2 300.112 BRIX1 101.126 TCEB1 0.577947 UBE2F 26 TCEB2 115 UBE2R2 61 EXOSC6 <-> ANAPC1 0.007363 0.004043 UBA52 295.936 1 100.847 UBE2D3 0.57685 TCEB2 12 KEAP1 115 FBXO41 38 IMP4 <-> 0.007350 0.004039 BTBD2 294.09 CCNE1 99.8211 CUL7 0.57685 DET1 10 UBE2G1 114 IMP4 04 CSNK1E <-> 0.007341 0.004038 SEC16A 293.803 GSK3B 96.3489 UBE2L3 0.575758 KEAP1 09 UBE2F 114 CUL7 03 SEC24A <-> 0.007337 0.004035 UBE2B 289.932 POLR1E 96.1974 DET1 0.574669 UBE2G1 18 UBE2E3 114 DCAF13 87 RPS27A <-> 0.007328 0.004007 NOP58 289.9 UBE2R2 94.9734 TP53 0.573585 FBXL4 25 SOCS3 114 UBE2L3 29 UBA52 <-> 0.007322 0.003984 EXOSC5 283.886 CDKN1B 93.9408 SOCS3 0.573585 FBXL20 35 FBXO41 114 UBE2G1 63 DHX37 <-> 0.007320 0.003977 TRIP12 283.022 PSMD11 90.0378 UBE2F 0.571429 SOCS3 54 FBXL4 113 SOCS3 41 RHOBTB 3 <-> 0.007313 0.003965 BTBD3 281.559 WDR36 87.9048 UBE2E3 0.571429 UBE2U 69 UBE2U 112 UBE2F 52

106 12. Anexos.

BTRC <- > 0.007307 0.003960 CSNK1D 279.281 FZR1 87.8773 FBXO41 0.571429 UBE2E2 46 UBE2E2 112 UBE2E3 63 UBA52 <-> 0.007293 0.003953 EXOSC9 271.144 EXOSC4 86.623 UBE2G1 0.570356 UBE2D4 75 NEDD4 112 FBXL4 25 SEC13 <-> 0.007283 0.003939 CDC20 266.614 BTBD2 86.2021 FBXL4 0.570356 NEDD4 86 FBXW2 112 UBE2G2 93 RPS27A <-> 0.007282 0.003904 RRP9 261.38 NOC2L 83.3801 PSMD14 0.569288 UBE2L6 55 FBXL20 112 FBXW12 71 PSMD14 <-> 0.007278 0.003899 RPF1 260.7 BYSL 81.8453 FBXL20 0.569288 FBXO41 56 UBE2L6 111 NEDD4 47 NOL6 <- 0.007265 0.003890 > CDC34 258.576 UTP14A 81.0914 UBE2U 0.568224 FBXO22 90 UBE2G2 111 FBXW2 27 EBNA1B P2 <-> 0.007263 0.003890 CCNE1 257.343 FBXO2 78.6006 UBE2E2 0.568224 FBXL13 98 UBE2D4 111 UBE2E2 22 GNL3 <- 0.007260 0.003886 > TP53 252.191 FBXO17 78.1211 PARK2 0.568224 FBXO7 40 TRIM63 111 UBE2U 57 UTP15 <-> 0.007260 0.003886 RPS27A 251.571 CACUL1 77.9642 NEDD4 0.568224 PARK2 36 PARK2 111 TRIM63 26 NOL6 <- > 0.007256 0.003885 UBE2R2 248.309 FBXO44 77.0429 UBE2L6 0.567164 FBXL18 08 FBXW12 111 FBXL20 63 DHX37 <-> 0.007248 0.003884 RPS27A 247.71 PSMD7 76.6695 UBE2G2 0.567164 FBXW2 61 FBXO7 111 FBXL18 44 SEC13 <-> 0.007246 0.003860 HACE1 246.994 CTNNB1 75.4344 UBE2D4 0.567164 FBXW9 19 FBXO22 111 FBXO7 61 CSNK1D <-> 0.007246 0.003860 FBXW11 246.097 PES1 74.6638 TRIM63 0.567164 FBXL12 19 FBXL18 111 PARK2 09 UBA52 0.007241 0.003857 <-> FBL 244.67 NFKB1 71.4697 IMP3 0.567164 ASB1 37 FBXW9 110 FBXO22 34 UBA52 <-> 0.007240 0.003856 WDR12 243.879 UBE2N 68.9872 FBXW12 0.567164 FBXW12 54 FBXW4 110 IMP3 17 RHOBTB 2 <-> 0.007236 0.003851 BTBD3 242.977 ANAPC1 68.9126 FBXO7 0.567164 TRIM63 13 FBXL14 110 UBE2L6 48 TP53 <-> 0.007235 0.003848 NAT10 241.988 NOP56 67.3862 FBXO22 0.567164 FBXW4 59 FBXL13 110 UBE2D4 52 SEC31A <-> 0.007234 0.003847 CSNK1D 241.984 FBXO4 65.3857 FBXL18 0.567164 UBE2G2 26 FBXL12 110 FBXL14 77 FBXW2 <-> 0.007233 0.003829 RRP9 239.884 NOP2 65.0181 FBXW9 0.566108 FBXL14 07 ASB1 110 FBXW4 35 CSNK1D <-> 0.007227 0.003821 SEC23A 237.323 ANAPC5 63.9509 FBXW4 0.566108 ASB2 18 SPSB4 109 ASB1 64 RPS27A <-> 0.007227 0.003819 CUL3 233.623 UBA1 63.7845 FBXL14 0.566108 SPSB4 18 SPSB2 109 FBXW9 1 RPS27A 0.007227 0.003819 <-> FBL 231.338 GRWD1 63.5234 FBXL13 0.566108 SPSB2 18 SPSB1 109 FBXL12 1 FBXW2 0.007227 0.003814 <-> 231.017 UBE2S 63.3874 FBXL12 0.566108 SPSB1 18 FBXO30 109 FBXL13 04

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 107 muestra de pacientes colombianos

WDR12 FBXL3 <-> 0.007227 0.003780 CSNK1D 229.356 TSR1 63.3126 ASB1 0.566108 FBXO30 18 FBXO21 109 SPSB4 14 RB1 <-> EBNA1B 0.007227 0.003780 PNO1 227.885 P2 62.1841 SPSB4 0.565056 FBXO21 18 FBXO10 109 SPSB2 14 PSMD14 <-> 0.007227 0.003780 TFB2M 226.916 VHL 61.8697 SPSB2 0.565056 FBXO10 18 FBXL8 109 SPSB1 14 RHOBTB 3 <-> ARHGDI 0.007227 0.003780 A 223.547 ANAPC2 61.1161 SPSB1 0.565056 FBXL8 18 FBXL16 109 FBXO30 14 RHOBTB 3 <-> ARHGDI 0.007227 0.003780 B 223.547 UTP11L 59.6704 NHP2L1 0.565056 FBXL16 18 ASB6 109 FBXO21 14 RHOBTB 3 <-> ARHGDI 0.007227 0.003780 G 223.547 LTV1 59.405 FBXO30 0.565056 ASB6 18 ASB2 109 FBXO10 14 PSMD14 <-> 0.004206 0.003780 BRIX1 223.236 EXOSC5 58.8609 FBXO21 0.565056 CACUL1 65 DCAF13 101 FBXL8 14 NOC2L <-> 0.003610 0.003780 CDKN1A 217.019 RIOK2 58.645 FBXO10 0.565056 CUL4A 60 IMP4 99 FBXL16 14 CSNK1D <-> 0.003409 0.003780 RPS27A 216.544 CCNA1 58.3907 FBXL8 0.565056 PSMD14 07 IMP3 97 ASB6 14 POLR1E <-> 0.003403 0.003780 EP300 216.285 DET1 58.2861 FBXL16 0.565056 NEDD8 31 NOP58 94 ASB2 14 CDC23 <-> 0.003061 0.003753 EXOSC4 214.163 UBE2D2 57.9494 ASB6 0.565056 CUL4B 38 WDR36 93 NOP58 3 RHOBTB 3 <-> 0.002978 0.003741 PLIN3 212.822 CDK4 57.7077 ASB2 0.565056 SPOP 67 UTP15 93 TP53 16 UBC <-> 0.002926 0.003725 IMP3 210.381 FBXO31 57.5878 CUL4A 0.561922 PSMD11 48 RRP9 93 NOP56 94 IMP3 <-> 0.002923 0.003716 UBB 210.381 CCND1 57.4 CSNK1D 0.561922 PSMD7 02 PDCD11 93 PDCD11 73 RPS27A 0.002806 0.003715 <-> IMP4 210.348 ANAPC4 57.3609 WDR36 0.560886 CDK2 44 NOP56 93 WDR36 97 NHP2 <- 0.002749 0.003708 > CDK4 208.282 WDR46 57.199 UTP15 0.559853 SPOPL 90 WDR46 92 UTP15 71 NOL6 <- > 0.002712 0.003708 RPS27A 205.715 WDR43 57.199 NOP58 0.559853 TP53 25 WDR43 92 RRP9 16 RHOBTB 2 <-> 0.002629 0.003687 RAB9A 203.082 WDR3 57.199 PDCD11 0.558824 FBXL2 80 WDR3 92 FBL 92 UBB <-> 0.002545 0.003678 NHP2 201.299 UTP6 57.199 UTP14A 0.557798 CDKN1B 21 WDR12 92 WDR46 54 UBC <-> 0.002449 0.003678 NHP2 201.299 UTP18 57.199 NOL6 0.557798 CCNA2 71 UTP6 92 WDR43 54 BRIX1 <- 0.002429 0.003678 > FBXO5 199.99 TBL3 57.199 RRP9 0.556777 PLK1 35 UTP18 92 WDR3 54 NOC2L 0.002417 0.003678 <-> TP53 196.514 NOP14 57.199 PNO1 0.556777 NFKB1 32 TBL3 92 UTP6 54 MARCH 196.111 MPHOS 57.199 NOP56 0.556777 PSMA4 0.002411 NOP14 92 UTP18 0.003678

108 12. Anexos.

3 <-> PH10 35 54 IMP4 IMP4 <-> MARCH 0.002388 MPHOS 0.003678 2 194.968 KRR1 57.199 FBL 0.556777 PSMA6 87 PH10 92 TBL3 54 DCAF13 <-> 0.002339 0.003678 CRBN 180.342 DIEXF 57.199 WDR46 0.555759 CDKN1A 75 KRR1 92 NOP14 54 BTBD6 <-> 0.002279 MPHOS 0.003678 RPS27A 180.054 DDX52 57.199 WDR43 0.555759 FBXO18 09 FBL 92 PH10 54 UBA52 <-> 0.002252 0.003678 EXOSC4 177.253 DDX49 57.199 WDR3 0.555759 COPS5 74 DIEXF 92 KRR1 54 PDCD11 <-> 0.002202 0.003678 NFKB1 174.866 DDX47 57.199 UTP6 0.555759 BTBD2 14 DDX52 92 DDX52 54 UBA52 0.002173 0.003678 <-> IMP3 167.204 CIRH1A 57.199 UTP18 0.555759 COPS6 63 DDX49 92 CIRH1A 54 UBA52 <-> 0.002132 0.003678 NHP2 165.741 BMS1 57.199 TBL3 0.555759 ABTB1 74 DDX47 92 BMS1 54 RPP38 0.002120 0.003678 <-> UBB 165.44 TFB2M 56.1956 NOP14 0.555759 CCNE1 33 CIRH1A 92 DIEXF 54 RPP38 0.002096 0.003678 <-> UBC 165.44 FBXO5 55.6517 NEDD8 0.555759 USP47 71 BMS1 92 DDX49 54 RPS27A <-> MPHOS 0.002090 0.003678 KEAP1 165.208 UBE2G2 55.433 PH10 0.555759 CCNA1 10 UTP3 91 DDX47 54 CSNK1E <-> 0.002074 0.003676 FOXO3 164.971 PWP2 55.0514 KRR1 0.555759 ABTB2 37 RCL1 91 WDR12 09 POLR1E <-> 0.002049 0.003662 GSK3B 162.451 UTP3 54.7496 DIEXF 0.555759 CCND1 96 PWP2 91 BYSL 73 CUL4A <-> 0.002025 0.003657 DCAF13 162.274 RCL1 54.5668 DDX52 0.555759 UBE2I 85 NOC4L 91 NHP2L1 65 NFKBIE <-> 0.002022 0.003644 RPS27A 161.56 NOC4L 54.382 DDX49 0.555759 BTBD3 08 NHP2L1 91 PWP2 08 UBB <-> 0.002012 0.003643 NHP2L1 159.744 FBXO9 54.2965 DDX47 0.555759 FBXO5 41 BYSL 91 UTP3 56 UBC <-> 0.002006 0.003643 NHP2L1 159.744 FBXL19 54.2965 CSNK1E 0.555759 BTBD11 41 WDR75 90 NOC4L 56 BTRC <- > BHLHE4 0.002006 0.003643 1 158.899 WDR75 53.9644 CIRH1A 0.555759 BTBD9 41 UTP14A 90 RCL1 39 RPS27A <-> 0.002006 0.003612 COPS7A 156.669 MRTO4 52.9454 BMS1 0.555759 FBXO25 41 RPF1 90 UTP14A 22 RPS27A <-> 0.002006 0.003608 RBL2 156.268 FBXO6 52.4792 UTP3 0.554745 FBXO39 41 NOL6 90 WDR75 96 NHP2 <- > 0.001807 0.003606 RPS27A 155.977 FBXO27 52.4792 RCL1 0.554745 DDB1 95 UTP14C 89 RPF1 77 IMP3 <-> 0.001794 0.003603 RPS27A 154.96 FBXL7 52.4792 PWP2 0.554745 CCNE2 90 UTP11L 89 PSMD14 46 DCAF13 <-> 0.001673 0.003599 CDKN1B 154.193 FBXL5 52.4792 NOC4L 0.554745 CTNNB1 03 PNO1 88 NOL6 35

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 109 muestra de pacientes colombianos

UBE2I <- 0.001642 0.003587 > NOP58 153.431 UTP14C 52.3294 BYSL 0.554745 CDK4 60 HEATR1 88 UTP11L 17 CUL4B <-> 0.001627 0.003574 DCAF13 151.191 FBXO41 50.9147 DHX37 0.553734 EP300 99 DHX37 88 UTP14C 79 RPS27A <-> 0.001624 0.003574 FBXO44 149.99 SPOP 50.8737 WDR75 0.552727 CDK6 24 RRS1 86 CSNK1E 74 DTL <-> 0.001622 0.003541 DCAF13 149.672 UBE2M 49.9133 UTP11L 0.552727 NFKBIA 08 PSMD14 86 PNO1 95 FBXO2 <-> 0.001579 0.003538 RPS27A 148.655 TRIM63 49.023 UTP14C 0.551724 MYC 75 NIP7 86 HEATR1 54 NOTCH1 <-> 0.001566 0.003535 WDR12 148.041 SEC16A 48.932 HEATR1 0.551724 DTL 62 MRTO4 86 DHX37 37 RPS27A <-> 0.001389 0.003470 FBXL15 146.349 RRP7A 48.6063 FCF1 0.549729 COPS8 93 FCF1 86 FCF1 76 GPS1 <- > 0.001363 0.003468 RPS27A 146.202 ANAPC7 48.0297 TSR1 0.548736 DDB2 70 TSR1 85 NIP7 53 CCNF <- > 0.001357 0.003461 RPS27A 145.682 FCF1 46.9318 RPS9 0.548736 CKS1B 79 TP53 85 RRS1 15 SPOPL <-> 0.001339 0.003460 RPS27A 145.524 SEC31A 46.931 RPP38 0.548736 COPS4 50 BRIX1 85 MRTO4 91 RPS27A <-> 0.001287 0.003434 COPS4 144.286 HEATR1 46.7921 PSMD11 0.548736 KDM2A 21 PES1 83 TSR1 78 UBC <-> 0.001272 0.003429 RPS9 143.361 VPRBP 46.5289 WDR12 0.546763 CAND1 19 LTV1 83 BRIX1 54 UBB <-> 0.001272 0.003365 RPS9 143.361 SPOPL 46.297 LTV1 0.546763 GSK3B 18 BOP1 83 LTV1 34 NFKB2 <-> 0.001271 0.003344 RPS27A 143.179 DTL 45.888 CUL4B 0.546763 COPS2 63 TFB2M 82 RRP7A 28 RPS27A <-> 0.001250 0.003343 SPOP 143.076 NOB1 45.7706 RRP7A 0.544803 IKBKB 28 RRP7A 82 PES1 11 FBXL7 <-> 0.001182 0.003338 RPS27A 142.535 TRAF7 45.5729 NOB1 0.544803 HIF1A 48 NOB1 82 BOP1 71 FBXO6 <-> 0.001173 0.003336 RPS27A 142.535 RB1 44.8504 RIOK2 0.543828 GPS1 86 NHP2 82 TFB2M 18 FBXO27 <-> 0.001139 0.003318 RPS27A 142.535 SEC23A 44.1706 RRP36 0.542857 GLI3 77 MKI67IP 82 NOB1 68 FBXL5 <-> 0.001132 0.003316 RPS27A 142.535 UBA3 43.4128 CDK2 0.541889 GLI1 69 DDX56 82 NHP2 97 RPS27A <-> 0.001126 0.003315 FBXO9 142.416 UBE2E1 42.7636 NHP2 0.540925 ckshs1 18 RPF2 81 MKI67IP 84 FBXL19 <-> 0.001068 0.003307 RPS27A 142.416 RPF1 42.393 CACUL1 0.539964 GLI2 38 RIOK2 81 DDX56 54 DCAF13 <-> 0.001049 KIAA002 0.003296 RPS27A 142.267 BOP1 41.9575 UTP20 0.539007 NOTCH1 99 0 81 RIOK2 86 FBXO31 142.162 RRP36 39.0583 CDKN1B 0.539007 KDM2B 0.001046 EBNA1B 81 EBNA1B 0.003284

110 12. Anexos.

<-> 12 P2 P2 78 RPS27A FBXO45 <-> 0.001026 0.003282 RBX1 142.068 EXOSC9 38.7045 CDKN1A 0.539007 NFKB2 16 RRP36 80 CUL4A 66 FBXO41 <-> 0.001020 KIAA002 0.003272 RPS27A 141.623 DDB2 38.1549 BTBD3 0.539007 CKS2 95 RBM28 80 0 48 FBXO17 <-> 0.001001 0.003268 RPS27A 141.619 MYC 35.533 PSMD7 0.537102 RB1 13 NAT10 80 RPF2 76 HIF1A <- ENSG00 > CSNK1A 0.000973 0002483 0.003265 RPS27A 141.365 UBE2I 34.7065 MRTO4 0.537102 1 66 54 80 DIMT1 46 RPS27A <-> 0.000962 0.003263 SKP1 141.176 GNL3 34.6623 DDB1 0.537102 SUFU 19 DIMT1 80 RRP36 13 FAM123 ENSG00 B <-> FAM123 0.000954 0002483 0.003238 RPS27A 141.074 FBXW8 33.4512 PSMA6 0.535211 B 70 CACUL1 80 54 34 CUL1 <- > 0.000874 0.003236 RPS27A 141.028 UBE2D3 32.5888 PSMA4 0.535211 AXIN1 45 RPS9 79 NAT10 81 FBXO32 <-> 0.000863 0.003233 RPS27A 140.697 COPS5 32.4365 PES1 0.534271 RBL2 04 RPP38 79 RBM28 74 FBXW11 <-> BHLHE4 0.000856 0.003219 1 138.856 NOTCH1 32.0784 BOP1 0.534271 PER2 09 NOL10 79 RPS9 91 BTRC <- > 0.000853 0.003219 CSNK1E 138.848 UBE2K 31.7866 NFKB1 0.532399 FBXL6 33 GRWD1 79 RPP38 01 FBXW12 <-> 0.000851 0.003214 RPS27A 138.359 RAB9A 31.7297 CCNE1 0.529617 COPS7A 82 GNL3 79 GNL3 46 FBXW7 ENSG00 <-> 0.000821 0002047 0.003209 RPS27A 138.031 UTP20 29.6024 BTBD2 0.528696 APC 44 75 79 PSMD11 48 CACUL1 ENSG00 <-> 0.000756 0002047 0.003203 RPS27A 136.92 FBXW12 29.2324 EP300 0.525952 NFKBIE 74 CUL4A 79 75 09 CUL4B <-> 0.000674 0.003200 NHP2L1 136.812 NAT10 28.7527 PLK1 0.525043 FBXO45 22 CSNK1D 79 GRWD1 06 UBA52 <-> 0.000664 0.003199 RPP38 136.436 HIF1A 28.4957 GSK3B 0.525043 DCAF13 73 POLR1E 78 NOL10 52 RPS27A 0.000633 0.003189 <-> GLI1 136.015 UBE2A 28.417 UBE2I 0.522337 CRY2 54 NOP2 77 CACUL1 43 SUFU <- > 0.000631 0.003183 RPS27A 135.766 DIMT1 27.9902 CTNNB1 0.521441 NHP2L1 88 NOC2L 77 POLR1E 77 FBXL18 <-> 0.000626 0.003176 RPS27A 135.705 COPS6 26.9176 EXOSC2 0.520548 CRY1 24 NGDN 77 PSMD7 19 FBXO4 <-> 0.000622 0.003143 RPS27A 135.357 CCNA2 26.2743 DTL 0.520548 CSNK1E 10 UTP20 76 NGDN 04 WDR36 0.000611 0.003136 <-> TP53 134.679 UBA7 24.8603 CCND1 0.520548 CSNK1D 28 NSUN6 76 NOC2L 81 FBXL14 0.000598 0.003132 <-> 134.245 EXOSC6 23.8058 SPOP 0.519658 FBXL17 33 GNL3L 76 NOP2 53

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 111 muestra de pacientes colombianos

RPS27A COPS8 <-> 0.000581 0.003125 RPS27A 134.018 FBXL4 22.9476 EXOSC4 0.517888 IMP3 05 WDR74 75 UTP20 6 IKBKB <- > 0.000566 0.003095 RPS27A 132.619 TCEB1 22.5163 FBXO5 0.517007 FOXO3 01 CSNK1E 75 NSUN6 67 UTP14A 0.000546 0.003094 <-> TP53 132.021 SOCS3 22.152 EXOSC5 0.517007 RPS9 06 PSMD11 74 GNL3L 89 RPS27A <-> 0.000544 0.003074 FBXL4 131.323 EXOSC2 22.0852 COPS5 0.517007 NHP2 96 PSMD7 73 WDR74 88 COPS2 <-> 0.000542 0.002992 RPS27A 131.197 UBE2G1 21.9114 SPOPL 0.516129 RPP38 16 RTCA 72 CDK2 36 CSNK1E <-> CSNK1A 0.000512 0.002972 FBXW11 130.916 GLI2 21.618 1 0.516129 IMP4 30 RRP15 72 RRP15 87 PSMD11 <-> MARCH 0.000505 0.002958 NHP2L1 130.904 UBE2L3 21.0071 CCNA1 0.514382 2 99 MAK16 72 MAK16 98 SKP2 <- > 0.000458 0.002958 RPS27A 130.7 UBA6 20.826 CDK4 0.512648 NOL6 70 NEDD8 71 RTCA 86 UBE2G1 <-> 0.000457 0.002945 RPS27A 130.454 FBXL18 20.5861 CCNA2 0.512648 FOXO1 28 EXOSC2 69 CUL4B 4 COPS6 <-> 0.000431 0.002910 RPS27A 129.997 CUL7 18.4582 EXOSC6 0.511785 CRBN 12 CUL4B 69 CDKN1A 59 CSNK1E <-> 0.000422 0.002882 FBXL3 129.656 NFKBIA 17.9065 EXOSC9 0.510924 WDR12 37 CDK2 69 CDKN1B 47 PSMD14 <-> 0.000404 0.002880 NOP58 129.574 IKBKB 17.5433 EXOSC3 0.510924 FBL 67 EXOSC5 65 NEDD8 26 CUL5 <- > 0.000403 0.002863 RPS27A 128.469 FBXL14 17.145 NOTCH1 0.510067 UTP15 15 CDKN1B 65 EXOSC2 51 CCNA2 <-> 0.000399 0.002858 RPS27A 128.258 GLI1 16.6475 EXOSC1 0.509213 RRP9 44 PSMA6 64 PSMA4 01 RPS27A <-> 0.000390 0.002857 CCND1 128.253 FOXO1 15.7306 DDB2 0.509213 DHX37 34 PSMA4 64 PSMA6 99 UBE2G2 <-> 0.000383 0.002767 RPS27A 127.865 CDK6 15.5237 EXOSC7 0.507513 NOP58 58 CDKN1A 64 PLK1 46 GLI3 <-> 0.000361 0.002733 RPS27A 127.69 NEDD4 14.1285 COPS6 0.507513 EXOSC4 65 EXOSC4 62 EXOSC5 06 RAB9A <-> RHOBTB 0.000359 0.002671 3 127.555 UBE2F 13.1053 RB1 0.503311 WDR36 76 SPOP 61 CCND1 49 RPS27A <-> 0.000357 0.002624 FBXO7 127.147 AXIN1 12.3368 GLI2 0.502479 PDCD11 18 PLK1 60 EXOSC4 44 CCNE2 <-> 0.000351 0.002588 RPS27A 126.665 EXOSC3 12.3056 NFKBIA 0.498361 UTP14A 06 EXOSC6 59 SPOP 95 SPSB4 <-> 0.000338 0.002588 RPS27A 126.591 NIP7 10.795 CCNE2 0.498361 BYSL 18 EXOSC9 58 EP300 48

112 12. Anexos.

RPS27A <-> 0.000336 RHOBTB 0.002583 FBXL8 126.591 GLI3 10.7677 IKBKB 0.497545 NOP56 64 EXOSC3 58 2 61 ASB2 <- > 0.000336 0.002560 RPS27A 126.591 UBE2E3 10.2207 COPS2 0.497545 UTP6 03 SPOPL 57 NFKB1 16 SPSB1 <-> MPHOS 0.000336 0.002541 RPS27A 126.591 PER2 9.78068 GLI3 0.495922 PH10 03 NFKB1 57 BTBD3 75 FBXO10 <-> 0.000336 0.002521 RPS27A 126.591 COPS2 9.36373 GLI1 0.495922 UTP18 03 CCND1 57 EXOSC6 19 FBXL16 <-> 0.000336 0.002496 RPS27A 126.591 FOXO3 9.00775 COPS8 0.494309 TBL3 03 EXOSC7 55 EXOSC3 01 SPSB2 <-> 0.000336 0.002490 RPS27A 126.591 FBXW4 8.98911 AXIN1 0.493506 NOP14 03 EXOSC1 55 EXOSC9 66 RPS27A <-> 0.000336 RHOBTB 0.002485 FBXO30 126.591 PARK2 8.92309 APC 0.491115 KRR1 03 CCNA2 55 3 91 ASB6 <- > 0.000336 0.002483 RPS27A 126.591 RRS1 8.63564 COPS4 0.489533 DDX52 03 COPS5 53 CTNNB1 2 FBXO21 <-> 0.000336 0.002464 RPS27A 126.591 FBXO7 8.62592 TFB2M 0.488746 BMS1 03 EP300 52 SPOPL 03 FBXL13 <-> 0.000336 0.002441 RPS27A 126.462 APC 8.56083 SUFU 0.488746 CIRH1A 03 CTNNB1 51 CCNA2 88 FBXW9 <-> 0.000336 0.002385 RPS27A 126.382 CCNE2 8.39556 CRBN 0.488746 WDR43 03 FBXL2 49 COPS5 91 RPS27A <-> 0.000336 0.002380 FBXL12 126.382 CKS1B 7.71257 HIF1A 0.487961 WDR3 03 DDB1 49 EXOSC1 25 UBE2U <-> 0.000336 0.002379 RPS27A 126.294 FBXL2 7.70197 PER2 0.487179 WDR46 03 CCNE1 49 EXOSC7 84 RPS27A <-> 0.000336 0.002352 ASB1 126.241 COPS8 7.66159 GPS1 0.4864 DDX49 03 CCNA1 49 MYC 51 FBXW4 <-> FAM123 0.000336 0.002350 RPS27A 126.224 UBE2E2 7.15151 B 0.484848 DDX47 03 MYC 48 DDB1 43 TRIM63 <-> 0.000336 0.002268 RPS27A 126.142 UBE2U 6.49708 NFKB2 0.48254 DIEXF 03 COPS6 47 CDK4 96 FBXO22 <-> 0.000334 0.002245 RPS27A 126.11 CRY2 6.3182 CRY2 0.481775 NOC4L 29 CDK4 47 CCNA1 22 RPP38 <-> 0.000334 0.002239 RPS27A 126.013 COPS4 6.31023 CRY1 0.481775 RCL1 27 BTBD2 46 GSK3B 86 UBA52 <-> 0.000334 0.002227 NHP2L1 125.912 EXOSC1 6.27662 RPF1 0.479495 UTP3 21 BTBD3 44 CCNE1 54 PSMD14 <-> 0.000334 0.002197 WDR12 125.77 CRY1 6.03366 BRIX1 0.479495 PWP2 06 GSK3B 43 SEC24A 85 TRAF7 <-> 0.000332 CSNK1A 0.002191 RPS27A 125.565 FBXO22 6.031 RBL2 0.47874 PNO1 00 FBXO18 43 1 29

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 113 muestra de pacientes colombianos

RPS27A <-> 0.000329 0.002155 TCEB2 124.754 ARNTL 5.87974 COPS7A 0.475743 WDR75 50 UBE2I 41 COPS6 97 RPS27A <-> 0.000328 0.002141 UBE2D4 124.491 MKI67IP 5.26529 FOXO1 0.475 HEATR1 90 CDK6 41 BTBD2 85 CSNK1D <-> 0.000328 0.002114 DDB1 124.439 FBXO18 5.13155 NFKBIE 0.474259 UTP11L 56 CCNE2 41 FBXL2 96 PARK2 <-> 0.000327 0.002004 RPS27A 124.258 ASB1 4.98782 NOC2L 0.47352 UTP14C 33 ABTB1 41 CDK6 65 CUL2 <- > 0.000325 0.001997 RPS27A 124.098 FBXL20 4.66431 FOXO3 0.471318 TSR1 06 USP47 40 SEC13 8 UBE2E2 <-> MARCH 0.000323 0.001954 RPS27A 123.843 EXOSC7 4.60515 2 0.469136 FCF1 40 NFKBIA 40 NFKBIA 98 UBE2L6 <-> 0.000321 0.001942 RPS27A 123.834 RRP15 4.31473 CDK6 0.467692 LTV1 04 FBXO5 40 CCNE2 98 RPS27A <-> 0.000317 CSNK1A 0.001926 FBXL20 123.669 WDR74 4.26862 MYC 0.466974 PES1 06 1 40 FBXO18 26 UBE2F <-> 0.000313 0.001885 RPS27A 123.653 NGDN 4.23098 GRWD1 0.466974 RIOK2 40 ABTB2 39 UBE2I 81 DET1 <- > 0.000311 0.001869 RPS27A 123.39 DDX56 3.79532 NAT10 0.466258 MRTO4 74 FBXO39 38 SEC16A 93 CSNK1D 0.000311 0.001868 <-> TP53 123.07 UBE2L6 3.6701 GNL3 0.465544 RRP7A 51 FBXO25 38 ABTB1 22 NEDD4 <-> 0.000310 0.001866 RPS27A 122.331 NFKB2 3.41809 ARNTL 0.464122 NOB1 02 DTL 38 DTL 65 UBE2E3 <-> 0.000308 0.001860 RPS27A 121.377 ABTB1 3.32556 FBXL2 0.462006 BOP1 33 BTBD9 38 SEC23A 57 RPS27A ENSG00 <-> 0002483 0.000308 0.001859 NFKBIA 121.15 54 3.2465 NOP2 0.459909 RRP36 20 BTBD11 38 SEC31A 74 RPS27A ENSG00 <-> 0002047 MARCH 0.000303 0.001847 BTBD1 120.923 75 3.19412 POLR1E 0.457143 3 73 DDB2 36 FBXO5 28 RPS27A <-> KIAA002 0.000303 0.001834 UBE2B 120.862 0 3.16811 FBXO18 0.457143 EXOSC5 09 RB1 34 NOTCH1 72 UBE2C <-> 0.000299 0.001830 RPS27A 120.829 GPS1 3.09256 ABTB1 0.455772 UTP20 85 NOTCH1 34 USP47 62 UBE2D3 <-> 0.000289 0.001819 RPS27A 120.751 FBXW9 2.98121 USP47 0.45441 ARNTL 47 IKBKB 33 DDB2 63 CSNK1E <-> RHOBTB 0.000285 0.001815 SEC13 120.422 FBXL12 2.98121 DIMT1 0.45441 2 54 COPS8 33 SEC24D 83 COPS5 <-> BHLHE4 BHLHE4 0.000285 0.001815 RPS27A 119.908 1 2.60998 1 0.45441 EXOSC9 28 COPS2 33 SEC24C 83 RPS27A <-> 0.000281 0.001815 UBE2S 119.759 March2 2.50741 CKS1B 0.453055 BRIX1 20 CKS1B 33 SEC24B 83 CSNK1D 119.758 UBE2D4 2.32915 ABTB2 0.453055 RPF1 0.000280 GLI3 32 LMAN1 0.001815

114 12. Anexos.

<-> 79 83 CCNA1 RPS27A <-> 0.000273 0.001798 UBE2M 119.507 USP47 2.30786 FBXO39 0.452381 TFB2M 47 GLI1 32 RB1 44 SOCS3 <-> 0.000273 0.001796 RPS27A 117.803 CAND1 2.303 FBXO25 0.452381 EXOSC2 30 COPS4 32 ABTB2 2 CDC27 <-> EBNA1B 0.000269 0.001762 RPS27A 117.502 RPF2 2.15973 P2 0.452381 EXOSC6 34 HIF1A 31 FBXO39 89 FBXW8 <-> 0.000254 0.001762 RPS27A 117.472 ckshs1 2.0253 BTBD9 0.452381 GRWD1 73 GLI2 31 FBXO25 89 UBA3 <- > 0.000254 0.001762 RPS27A 117.008 RBL2 1.94349 BTBD11 0.452381 NOC2L 48 GPS1 28 BTBD9 89 CSNK1D <-> 0.000252 0.001762 PLK1 116.886 CRBN 1.789 CAND1 0.449704 NAT10 35 ckshs1 26 BTBD11 89 FOXO1 <-> MARCH 0.000248 0.001760 CSNK1D 116.748 RBM28 1.7685 3 0.44904 EXOSC3 54 AXIN1 26 IKBKB 58 UBA1 <- > EBNA1B 0.000245 0.001733 RPS27A 116.076 NOL10 1.71965 SEC13 0.447059 P2 25 CAND1 25 GLI1 52 TCEB1 <-> FAM123 0.000244 0.001718 RPS27A 116.054 B 1.67563 ckshs1 0.444444 GNL3 91 NFKB2 24 HIF1A 39 UBE2L3 <-> 0.000244 0.001710 RPS27A 116.054 SUFU 1.57322 SEC24A 0.44186 RRS1 17 FOXO3 24 GLI3 24 RPS27A <-> 0.000242 0.001699 NHP2L1 115.987 NSUN6 1.43958 KDM2A 0.438672 EXOSC1 99 SUFU 23 COPS2 48 UBA6 <- > 0.000242 0.001686 RPS27A 115.607 CKS2 1.39859 CKS2 0.438672 NOP2 93 NOP16 23 COPS8 17 UBA7 <- > 0.000242 0.001678 RPS27A 115.31 RTCA 1.35274 RRS1 0.43741 EXOSC7 56 CKS2 23 CKS1B 29 UBE2A <-> 0.000241 0.001677 RPS27A 115.262 KDM2A 1.31706 NIP7 0.436782 NIP7 61 APC 23 GLI2 12 VPRBP <-> 0.000241 0.001648 RPS27A 114.832 GNL3L 1.06706 DDX56 0.434907 DIMT1 61 COPS7A 22 COPS4 29 CDC16 <-> 0.000237 ARHGDI 0.001610 RPS27A 114.8 March3 0.959246 KDM2B 0.434286 POLR1E 40 RBL2 21 G 83 ANAPC1 1 <-> 0.000234 ARHGDI 0.001610 RPS27A 114.622 FBXL13 0.922987 MKI67IP 0.433048 MKI67IP 10 FOXO1 21 B 83 CUL7 <- > KIAA002 0.000233 FAM123 ARHGDI 0.001610 RPS27A 114.176 MAK16 0.892923 0 0.433048 RPF2 26 B 21 A 83 CDC20 ENSG00 <-> 0002047 0.000231 0.001501 RPS27A 113.784 COPS7A 0.740612 75 0.433048 DDX56 91 PER2 20 GPS1 32 SEC13 <-> 0.000228 0.001498 PLK1 113.779 FBXL17 0.613655 RPF2 0.432432 RBM28 72 KDM2A 20 AXIN1 44 RPS27A 113.735 KDM2B 0.447851 ENSG00 0.432432 KIAA002 0.000225 NFKBIE 17 FOXO3 0.001464

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 115 muestra de pacientes colombianos

<-> 0002483 0 98 22 HACE1 54 UBA52 ENSG00 <-> 0002047 0.000225 0.001430 RPS9 113.104 FBXL6 0.406528 RBM28 0.431818 75 77 KDM2B 17 RAB9A 46 ENSG00 RPS27A 0002483 0.000225 0.001422 <-> VHL 112.414 NFKBIE 0.370779 NOL10 0.430595 54 14 CRY2 16 ckshs1 07 ANAPC7 <-> 0.000223 0.001375 RPS27A 111.978 NOP16 0.360112 WDR74 0.429379 NOL10 22 CRY1 16 APC 87 ANAPC1 <-> 0.000218 0.001364 RPS27A 111.871 ABTB2 0.232127 NGDN 0.429379 NSUN6 16 FBXL6 14 NFKB2 27 UBE2E1 <-> 0.000217 0.001347 RPS27A 111.457 SEC24D 0.111111 GNL3L 0.429379 GNL3L 84 SEC13 13 FOXO1 47 CSNK1D <-> BHLHE4 0.000212 0.001338 1 111.331 SEC24C 0.111111 FBXL6 0.429379 NGDN 89 CRBN 13 CAND1 04 ANAPC4 <-> 0.000207 0.001334 RPS27A 111.254 SEC24B 0.111111 NSUN6 0.428773 WDR74 95 ARNTL 13 PER2 98 ARNTL <-> 0.000207 0.001334 BTRC 111.167 LMAN1 0.111111 SEC23A 0.427567 RTCA 58 SEC24A 12 SUFU 37 ARNTL <-> BHLHE4 0.000202 RHOBTB 0.001309 CSNK1D 111.131 SPSB4 0 FBXL17 0.427567 1 15 2 11 CKS2 23 FZR1 <- > 0.000200 0.001296 RPS27A 110.804 SPSB2 0 SEC31A 0.426966 RRP15 52 FBXL17 11 COPS7A 73 ANAPC2 <-> 0.000199 BHLHE4 0.001284 RPS27A 110.781 SPSB1 0 RRP15 0.426966 MAK16 05 1 11 NOP16 39 CSNK1D <-> 0.000169 FAM123 0.001257 SEC13 110.293 PLIN3 0 RTCA 0.42577 SEC13 33 SEC31A 10 B 83 RPS27A <-> RHOBTB 0.000155 0.001255 ANAPC5 110.075 FBXO45 0 MAK16 0.424581 3 29 SEC23A 10 RBL2 99 IMP3 <-> 0.000141 0.001230 NEDD8 109.755 FBXO39 0 FBXO45 0.42047 SEC24A 77 SEC16A 10 PLIN3 2 RPS27A <-> RHOBTB 0.000075 MARCH 0.001196 PSMD7 108.266 FBXO30 0 2 0.412483 SEC23A 08 2 10 CRY1 85 RPS27A <-> RHOBTB 0.000074 0.001191 UBE2K 108.035 FBXO25 0 3 0.409152 SEC31A 39 FBXO45 10 CRY2 35 UBE2D1 <-> 0.000069 0.001127 RPS27A 107.187 FBXO21 0 SEC16A 0.392765 NOP16 80 SEC24D 9 KDM2A 65 UBE2D2 <-> 0.000027 0.001112 RPS27A 106.849 FBXO10 0 NOP16 0.389245 SEC16A 75 SEC24C 9 ARNTL 25 UBE2N <-> 9.96917* 0.001105 RPS27A 105.082 FBXL8 0. SEC24D 0.36983 SEC24D 10^-6 SEC24B 9 NFKBIE 61 RPS9 <- > 9.96917* RHOBTB BHLHE4 RPS27A 104.75 FBXL16 0 SEC24C 0.36983 LMAN1 10^-6 3 9 1 0.001038 CTNNB1 104.457 BTBD9 0 SEC24B 0.36983 SEC24C 9.96917* LMAN1 9 KDM2B 0.001034

116 12. Anexos.

<-> 10^-6 7 CSNK1D NHP2 <- > 9.96917* MARCH 0.000969 NEDD8 100.34 BTBD11 0 LMAN1 0.36983 SEC24B 10^-6 3 7 CRBN 677 CSNK1A 1 <-> 5.17681* 0.000940 DIMT1 98.9046 ASB6 0 RAB9A 0.321693 RAB9A 10^-6 RAB9A 4 FBXL6 677 CUL1 <- > ARHGDI 3.96072* ARHGDI 0.000865 FBXO45 97.8851 ASB2 0 PLIN3 0.295432 G 10^-6 G 4 FBXL17 477 PES1 <- ARHGDI ARHGDI ARHGDI 3.96072* ARHGDI MARCH 0.000830 > DDB2 97.5163 G 0 G 0.293153 A 10^-6 B 4 2 679 EXOSC6 <-> ARHGDI ARHGDI ARHGDI 3.96072* ARHGDI 0.000798 PSMA6 96.9103 B 0 B 0.293153 B 10^-6 A 4 FBXO45 54 CSNK1E <-> BHLHE4 ARHGDI ARHGDI 3.9365*1 MARCH 0.000740 1 96.1884 A 0 A 0.293153 PLIN3 0^-6 PLIN3 3 3 11 tabla S1. Medidas topológicas

12.2. Enriquecimiento funcional de la red completa y desestabilizada.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 117 muestra de pacientes colombianos

118 12. Anexos.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 119 muestra de pacientes colombianos

120 12. Anexos.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 121 muestra de pacientes colombianos

122 12. Anexos.

Figura S1. enriquecimiento en cada una de las categorías ontológicas de las proteínas pertenecientes a la red completa (figura 19) y la red desestabilizada (figura 21C). Cada diagrama de barras muestra el conteo de cuántas proteínas en la red se asocian a cada función. Cada uno de los conteos está junto al conteo de la red desestabilizada (red sin subred BTBD3). Cada figura tiene un inserto donde se listan las funciones que desaparecen en la red desestabilizada.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 123 muestra de pacientes colombianos

124 12. Anexos.

12.3. Enriquecimiento funcional de la red con los nodos que poseen mayor coeficiente topológico

Figura S2. Red PPi de los nodos más significativos de la red principal. A grafo de la red con los 116 nodos más importantes en los criterios de análisis topológico. B nube de palabras con los procesos más enriquecidos en la subred con los nodos más importantes. C nube de palabras que resume los componentes celulares más enriquecidos en la red. D

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 125 muestra de pacientes colombianos

enriquecimiento de las funciones moleculares de la red. E rutas de señalización KEGG presentes en la red. F enriquecimiento de dominios proteicos Pfam. Entre más grande sea la palabra mayor cantidad de proteínas dedicadas a la función.

Genes

RPS27A, UBA52, CSNK1D, IMP4, DCAF13, RBX1, RHOBTB2, UBC, UBB, CUL3, CUL1, BTBD6, CSNK1E, SKP1, BTRC, TP53, SKP2, RNF7, BTBD1, FBXW5, ANAPC10, FBXW7, CDC34, FBXW11, CDC20, UBE2D1, CDC23, CDC16, TRIP12, FBXW2, UBE2R2, UBE2C, ANAPC11, CCNF, CDC27, CUL2, ANAPC1, FZR1, ANAPC5, UBE2N, ANAPC4, ANAPC2, UBE2E1, UBE2D2, ANAPC7, FBXO17, CUL5, UBA1, FBXO4, UBE2S, FBXL19, FBXO9, FBXL3, FBXL15, FBXO32, VHL, UBE2K, FBXO44, FBXO2, FBXO31, UBA3, HACE1, FBXL5, FBXO6, FBXO27, FBXL7, UBA7, UBA6, UBE2D3, UBE2A, UBE2M, UBE2B, TCEB1, TRAF7, CUL7, VPRBP, FBXW8, UBE2E3, UBE2L3, UBE2F, TCEB2, DET1, KEAP1, UBE2G1, FBXL4, FBXL20, SOCS3, UBE2U, UBE2E2, UBE2D4, NEDD4, UBE2L6, FBXO41, FBXO22, FBXL13, FBXO7, PARK2, FBXL18, FBXW9, FBXL12, ASB1, FBXW12, TRIM63, FBXW4, UBE2G2, FBXL14, ASB2, SPSB4, SPSB2, SPSB1, FBXO30, FBXO21, FBXO10, FBXL8, FBXL16, ASB6 Tabla S2. Genes pertenecientes a la subred de los genes con mayor coeficiente topológico

126 12. Anexos.

figura S3. Representación del patrón de metilación de la región de interés (sombreado azul claro) en diferentes condiciones y tejidos obtenidos en diferentes estudios de metiloma (lista de la izquierda). Las líneas azules oscuras representan regiones hipometiladas, se puede observar que en leucemia y otros tipos de cáncer el área hipometilada disminuye. La línea verde en la parte superior representa la isla CpG y la línea azul inmediatamente superior es el primer exón de BTBD3 (“Human hg19 chr20:11,870,949-11,871,848 UCSC Genome Browser v362,” n.d.).

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 127 muestra de pacientes colombianos

figura S4. Representación esquemática de los controles de calidad del software ESME. Tomado de (Lewin et al., 2004)

128 12. Anexos.

12.4. Protocolo general de electroforesis. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales - Cámara de electroforesis - Fuente de poder - Beakers de diferentes volúmenes - Balanza - Plancha de agitación - Plancha de calentamiento - Tubos Eppendorf

Reactivos -Agarosa -Buffer de corrido TBE (Mezcla lista para preparar, diluyendo en agua destilada en una proporción de 17g por litro) -Marcador de tamaño (Ladder) -Hydragreen

Protocolo

A. Preparación del Buffer de Corrido TBE Mezclar el TBE en polvo (listo para preparar) con agua destilada en una proporción de 17g por litro. Se debe preparar suficiente Buffer para preparar el gel y para el corrido, aproximadamente 500 ml

B. Preparación del buffer de carga (Blue Loading BufferPack de Biolabs) De acuerdo a las indicaciones de la ficha técnica en un tubo Eppendorf se debe tomar 1 volumen del agente reductor (Reducing Agent) que está a una concentración de 30x y mezclar con nueve volúmenes del Blue loading buffer.

Procedimiento 1. Preparación del gel de agarosa (Preparación de un gel al 1.5%) 1.1. Pesar 1.5 g de agarosa 1.2. Añadir la agarosa a 100 ml de buffer TBE en un matraz. 1.3. Calentar la mezcla en un horno de microondas o plancha de calentamiento hasta que se observe que toda la agarosa se ha fundido (50 seg en microondas) 1.4. Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50 °C y añadir 2 µl de HydraGreen 1.5. Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a hacer el gel sellando los bordes con cinta de enmascarar, o colocándolo en el dispositivo previsto para ello, y colocando el peine en la posición deseada. 1.6. Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado, evitando la formación de burbujas. Dejar que solidifique durante al menos 30 min.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 129 muestra de pacientes colombianos

Nota: Si el objetivo del gel es evaluar los productos de la PCR, entonces el gel debe estar más concentrado (2%)

2. Preparación de las muestras 2.1. Mezclar las muestras de ADN (4 µl de muestra) con 2 µl del Buffer de carga.

Nota: En este caso el gel tiene como finalidad evaluar la calidad del ADN, si el gel se va a realizar para evaluar los productos de la PCR, se debe incluir el marcador de tamaño (2 µl) que también debe estar mezclado con Buffer de carga. En este caso a las muestras de ADN no se les agrega Buffer de carga, ya que la master mix para PCR ya la tiene.

3. Carga de las muestras y corrida del gel 3.1. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar el molde con el gel en la cámara de electroforesis. 3.2. Añadir buffer TBE hasta que cubra el gel unos 3-5 mm. 3.3. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos para las muestras. 3.4. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon en el punto 2.1

Nota: De acuerdo a las recomendaciones de la ficha técnica para el Buffer de carga; se recomienda calentar las muestras a 95°C durante 3-5 min y luego centrifugarlas durante 15 -20 segundos antes de cargarlas.

3.5. Conectar los cables a la fuente de poder y aplicar un voltaje de 80 V durante 30- 40 minutos.

Nota: Siempre se deben ubicar las muestras desde el ánodo (conexión negra) y verificar la formación de burbujas para garantizar que si está funcionando correctamente la cámara y los conectores

12.5. Protocolo de conversión con bisulfito. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales y equipos - Micropipetas de diferentes volúmenes - Tubos Eppendorf de 1.5 ml - Columnas (Zymo-Spin IC Column) - Puntas para micropipetas - Gradilla - Microcentrífuga - Baño seco - Termociclador - Vortex

Reactivos

130 12. Anexos.

- Reactivo de conversion CT (CT conversion reagent) - Buffer de dilución (M- Dilution Buffer) - Buffer de disolución (M-Dissolving Buffer) - Buffer de lavado (M-Wash Buffer) - Buffer de unión (M-Binding Buffer) - Buffer de desulfonación (M- Desulphonation Buffer) - Buffer de elución (M-Elution Buffer) - Agua destilada - Etanol

Protocolo A. Preparación del Reactivo de Conversión CT Agregar 900 µl de agua, 300 µl de Buffer de dilución (M- Dilution Buffer) y 50 µl de Buffer de disolución (M-Dissolving Buffer) a un tubo de Reactivo de Conversión CT (CT conversión reagent).Mezclar a temperatura ambiente con agitador vortex por 10 minutos. Nota: Es normal ver restos del reactivo de conversión no disueltos. Cada tubo del reactivo de conversión (CT conversión reagent) está diseñado para la conversión de 10 muestras de ADN. Almacenamiento: El reactivo de conversión CT (CT conversión reagent) es sensible a la luz. Para mejores resultados, el reactivo de conversión CT (CT conversión reagent) debe ser usado inmediatamente después de la preparación. Si el reactivo no va a ser usado inmediatamente, puede almacenarse hasta una semana a 4°C o hasta un mes a -20 °C. Si se ha guardado el reactivo en solución, debe calentarse hasta 37°C y agitar con vortex antes de usar.

B. Preparación del Buffer de Lavado: Añadir 24 ml de Etanol al 100% a 24 ml de Buffer de lavado antes de usar.

Procedimiento:

1. Añadir 130 µl del reactivo de conversión CT (CT conversión reagent) a 20 µl de una muestra de ADN en un tubo de PCR. Si el volumen de la muestra de ADN es menos de 20 µl, completar la diferencia con agua. Mezclar la muestra, dando suaves golpes al tubo o pipeteando varias veces, luego centrifugar para que el líquido vaya al fondo. 2. Colocar el tubo con la muestra en un termociclador y realizar los siguientes pasos: - 98°C por 10 minutos - 64°C por 2.5 horas - 4°C almacenar hasta por 20 horas Nota: El almacenamiento a 4°C es un paso opcional. 3. Añadir 600 µl de Buffer de unión (M-Binding Buffer) a una columna (Zymo-Spin IC Column) y ubicar la columna en un tubo colector. 4. Cargar la muestra del paso dos al interior de la columna que contiene el Buffer de unión (M-Binding Buffer). Cerrar la tapa y mezclar invirtiendo la columna varias veces. 5. Centrifugar a 10000 g por 30 segundos .Descartar el fluido del tubo colector. 6. Añadir 100 µl de Buffer de lavado (M-Wash Buffer) a la columna. Centrifugar a la mayor velocidad por 30 segundos.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 131 muestra de pacientes colombianos

7. Añadir 200 µl de Buffer de desulfonación (M- Desulphonation Buffer) a la columna y dejar a temperatura ambiente entre 15 y 20 minutos. Después de la incubación, centrifugar a la mayor velocidad por 30 segundos. 8. Añadir 200 µl de Buffer de lavado (M-Wash Buffer) a la columna. Centrifugar a la mayor velocidad por 30 segundos.Añadir otros 200 µl de Buffer de lavado (M-Wash Buffer) y centrifugar por 30 segundos adicionales. 9. Colocar la columna en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Añadir 10 µl de Buffer de elución (M-Elution Buffer) directamente a la matriz de la columna.Centrifugar por 30 segundos a la máxima velocidad para la elución del ADN.

Nota: El ADN está listo para el análisis inmediato o puede ser almacenado en o por debajo de -20°C para usar después. Para almacenamiento a largo plazo, guardar a -70°C. Se recomienda utilizar 1-4 µl del ADN eluido por cada PCR, sin embargo, pueden ser utilizados hasta 10 µl dependiendo de los requerimientos del experimento, pero pequeños volúmenes de elución tendrán un ADN más concentrado. Alternativamente, agua o TE (pH 6.0) pueden ser utilizados para elución si es requerido en los experimentos.

12.6. Protocolo de purificación de ADN y preparación de reacción de secuencia.

Nota: Todos los reactivos utilizados para la purificación deben estar fríos. Se recomienda ponerlo en hielo. Las cantidades de NH4Ac y de etanol al 100% están hechos para 34 µl de producto de PCR, es decir, dos tubos de PCR.

1. En un tubo de eppendorf de 1.5 ml adicione 3.4 µl de acetato de amonio (NH4Ac) a 34 µl de producto de PCR. 2. Adicionar 68 µl de etanol al 100% 3. Centrifugar por 30 minutos a 15000 rpm en una centrífuga refrigerada a 4°C. 4. Descartar el sobrenadante cuidadosamente. 5. Adicionar 200 µl de etanol frío al 75% 6. Centrifugar por 20 minutos a 15000 rpm en una centrífuga refrigerada a 4°C. 7. Descartar el sobrenadante cuidadosamente. 8. Repetir los pasos del 5 al 7. 9. LLeve los tubos a SpeedVac por 5 minutos o dejar los tubos abiertos hasta que el etanol se evapore por completo. 10. Resuspender en 15 µl de agua y guardar las muestras a 4°C. 11. Medir la concentración de ADN y diluir en agua si es necesario.

Para enviar las muestras al servicio de secuenciamiento del instituto de Genética (SSigMol)

132 12. Anexos.

1. Poner 4.5 µl de producto de PCR purificado en un tubo de eppendorf de 1.5 ml. 2. Añadir 0.5 µl de primer a una concentración de 10 µM.

Aspectos epigenéticos del gen BTBD3 en niños diagnosticados con TDAH en una 133 muestra de pacientes colombianos

figura S5. A Electroferograma representativo del proceso de secuenciamiento. B Gel de electroforesis, los pacientes se representan con A y los controles con B, C- se refiere al control negativo, MP es el marcador de peso molecular 50 pb DNA ladder..

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