Ofício Nº 018/2021 Crato/CE, 16 De Fevereiro De 2021. Thiago Marques Vieira Titular Da 6ª Promotoria De Justiça Do Crato/CE

Ofício nº 018/2021 Crato/CE, 16 de fevereiro de 2021.

Ao Exmo. Sr. Dr. Promotor de Justiça Thiago Marques Vieira Titular da 6ª Promotoria de Justiça do Crato/CE

Assunto: Resposta ao Of. 113/2021 (Inquérito Civil nº 06.2016.00001725-3 – Zonas Especiais Ambientais). Cooperação Técnica-Científica da Universidade Regional do Cariri – URCA.

A Ordem dos Advogados do Brasil – OAB, pela Subsecção da OAB/Crato, cumprimenta Vossa Excelência, ao tempo em que apresenta em anexo a este, o apoio científico e técnico do Corpo Docente da Universidade Regional do Cariri – URCA, no sentido de nos fornecer subsídios Técnico-Científicos que relatem o Impacto Ambiental que a Lei Municipal 3730/2021 trará para as Zonas Especiais Ambientais desta municipalidade do Crato, para a eventual impetração de Ação Cível em Juízo. Nesse sentido, os Professores da URCA colecionaram (em anexo), Artigos e Relatórios Acadêmicos, nos fartos trabalhos técnico-científicos realizados ao longo do tempo em face desse caso concreto (Lei Municipal 3730/2021) e de casos anteriores semelhantes. Ademais, ao final, ofertaram as urgentíssimas Recomendações Técnicas-Científicas referentes ao pedido de Desafetação da Zona Especial Ambiental do Rio Batateiras – ZEA 04.

Certos do acolhimento, aproveitamos o ensejo para reiterar a Vossa Excelência, os protestos de elevada estima e distinta consideração.

Atenciosamente,

Avenida Perimetral Dom Francisco de Assis, 380, São Miguel, Crato-CE – Fone: (88) 3523-1802 Email: [email protected]

fls. 603 Este documento é cópia do original assinado digitalmente por THIAGO MARQUES VIEIRA. Para conferir o original, acesse o site http://www.mpce.mp.br, informe o processo 06.2016.00001725-3informeo processo código e o http://www.mpce.mp.br, site o conferiroacesse Para original, VIEIRA. MARQUES originaldocópia porTHIAGO documento digitalmente assinado é Este 4BD8CA. fls. 604 Este documento é cópia do original assinado digitalmente por THIAGO MARQUES VIEIRA. Para conferir o original, acesse o site http://www.mpce.mp.br, informe o processo 06.2016.00001725-3informeo processo código e o http://www.mpce.mp.br, site o conferiroacesse Para original, VIEIRA. MARQUES originaldocópia porTHIAGO documento digitalmente assinado é Este 4BD8CA.

Ofício nº 017/2021 Crato/CE, 10 de fevereiro de 2021.

Ao Ilmo. Sr. Prof. Francisco Edmar de Sousa Silva Pinheiro Chefe de Gabinete da Reitoria da URCA

Assunto: Cooperação Científica e Técnica

A Ordem dos Advogados do Brasil – OAB, pela Subsecção da OAB/Crato, cumprimenta Vossa Senhoria, ao tempo em que solicita o apoio científico e técnico desta Instituição de Ensino Superior, no sentido de nos fornecer subsídios que relatem o impacto ambiental que a lei municipal 3730/2021 (documentos em anexo) trará para as Zonas Especiais Ambientais desta municipalidade do Crato, para a eventual impetração de Ação Declaratória de Inconstitucionalidade da lei municipal. Nesse sentido, é do nosso conhecimento um farto trabalho científico produzido pelo Prof. Dr. Waltecio Almeida em face desse caso concreto.

Certos do atendimento, aproveitamos o ensejo para reiterar à Vossa Senhoria, os protestos de elevada estima e distinta consideração.

Atenciosamente,

Avenida Perimetral Dom Francisco de Assis, 380, São Miguel, Crato-CE – Fone: (88) 3523-1802 Email: [email protected]

O fls. 441 I A D P O C O fls. 442 I A D P O C O fls. 443 I A D P O C O fls. 444 I A D P O C O fls. 445 I A D P O C O fls. 446 I A D P O C O fls. 447 I A D P O C O fls. 448 I A D P O C O fls. 449 I A D P O C O fls. 450 I A D P O C O fls. 451 I A D P O C O fls. 452 I A D P O C O fls. 453 I A D P O C O fls. 454 I A D P O C O fls. 455 I A D P O C O fls. 456 I A D P O C O fls. 457 I A D P O C O fls. 458 I A D P O C O fls. 459 I A D P O C O fls. 460 I A D P O C O fls. 461 I A D P O C O fls. 462 I A D P O C O fls. 463 I A D P O C O fls. 464 I A D P O C O fls. 465 I A D P O C O fls. 466 I A D P O C O fls. 467 I A D P O C O fls. 468 I A D P O C O fls. 469 I A D P O C O fls. 470 I A D P O C O fls. 471 I A D P O C O fls. 472 I A D P O C O fls. 473 I A D P O C

GOVERNO DO ESTADO DO CEARÁ SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E EDUCAÇÃO SUPERIOR – SECITECE UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI – URCA GABINETE DA REITORIA

Ofício Nº 087/2021- GR Crato-CE, 15 de fevereiro de 2021

Ao Senhor Reno Feitosa Gondim Presidente Ordem dos Advogados do Brasil (OAB) – Subsecção Crato Avenida Perimetral Dom Francisco de Assis, 380 São Miguel, Crato-CE

Assunto: resposta ao Ofício

Cumprimentamos Vossa Senhoria ao tempo em que destacamos a participação efetiva da Universidade Regional do Cariri (URCA) nos debates técnicos e políticos que foram realizados em torno da temática da desafetação das Zonas Especiais Ambientais (ZEAs) desde o ano de 2018, notadamente através dos posicionamentos emanados pelos Departamentos de Geociências, Ciências Biológicas, Construção Civil e Geopark Araripe, especialmente no âmbito do Processo Civil nº 35/2016 – PJJECC/Crato/CE, que questionava a Construção do Loteamento Brisa do Seminário na Zona Especial Ambiental do Rio Batateiras – ZEA 04. No caso em tela (lei municipal 3730/2021), a URCA, através do Departamento de Geociências (DEGEO), foi convidada a se manifestar sobre esse novo processo de desafetação. Este Chefe de Gabinete, na condição de professor do DEGEO, participou ativamente dos debates e marcou posição enfática no sentido de não se autorizar a transformação da ZEA em área residencial. Considerando o exposto, esta Chefia de Gabinete se acosta ao trabalho desenvolvido pelo professor e pesquisador desta IES, professor Dr. Waltécio de Oliveira Almeida, que arrolou farta documentação que coaduna com os posicionamentos anteriormente destacados e torna patente os gravíssimos prejuízos causados pelo processo de desafetação das ZEAs tanto para a biodiversidade como para a sociedade em geral. Em tempo, aproveitamos o ensejo para informar que o Observatório Ambiental tem aglutinado uma série de pesquisadores, líderes políticos e ativistas ambientais no sentido

Campus do Pimenta Rua Cel. Antonio Luiz - 1161, Pimenta, 63.105-000 - Crato - CE Fone (88) 3102.1218

GOVERNO DO ESTADO DO CEARÁ SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E EDUCAÇÃO SUPERIOR – SECITECE UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI – URCA GABINETE DA REITORIA

de promover uma maior integração da luta pelo desenvolvimento urbano sustentável. O referido Observatório tem realizado uma série de levantamentos que podem subsidiar, também, essa douta subsecção da OAB Crato no sentido de pleitear juridicamente a Ação Declaratória de Inconstitucionalidade.

Atenciosamente,

Prof. Dr. FRANCISCO EDMAR DE SOUSA SILVA PINHEIRO Chefe de Gabinete

Campus do Pimenta Rua Cel. Antonio Luiz - 1161, Pimenta, 63.105-000 - Crato - CE Fone (88) 3102.1218

Prof. Dr. Waltécio de Oliveira Almeida (Pós-Doutorado)

CV-Lattes: http://lattes.cnpq.br/9344468891467823 Universidade Regional do Cariri, Departamento de Química Biológica/ CCBS, R. Cel. Antônio Luiz, 1161, 63100-000, Crato, CE, Brasil. E-mail: [email protected] Tel.(88) 98839-0037

RELATÓRIO DESCRITIVO DOS DANOS AMBIENTAIS DECORRENTES DA URBANIZAÇÃO PREVISTA NA Lei No 3.730/2021

Prof. DrWaltécio de Oliveira Almeida (ALMEIDA, W.O.)

Líder do Grupo de Pesquisa em Biologia Comparada CNPq/ URCA

Programa de Pós-Graduação em Diversidade Biológica e Recursos Naturais PPGDR/ URCA

Programa de Pós-Graduação em Etnobiologia e Conservação da Natureza PPGEtno/ UFRPE-URCA-UEPB

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Zoologia)/ UFPB

Universidade Regional do Cariri – URCA/ Ceará

Crato - CE

2021 Introdução

A porção de encosta da Capada do Araripe compõe a Área de Proteção Ambiental (APA), em conjunto com a Floresta Nacional do Araripe forma um sistema integrado entre flora, fauna e hidrografia. É a encosta, coração da APA, uma área de amortecimento hídrico, onde se encontram 130 nascentes de água na região (Aquasis, 2006). Devidoa disponibilidade de água é nessa área que a maioria das espécies de animais até então estudadas, 25 espécies de morcegos, duas espécies de anfisbenas, 82 espécies de répteis e 33 espécies de anfíbios. Estes totalmente dependentes das fontes de água para sobreviver (Ávila et al., 2016). Todas essas espécies ou foram apenas registradas, ou poucos trabalhos sobre biologia e parasitologia foram realizadas. Morcegos de conhecimento geral são portadores de uma variedade de coronavírus, e nada ainda foi estudado sobre os morcegos da APA. A Lei No 3.730/2021 propõe a modificação de parte da APA com um novo zoneamento para urbanização. Além do exposto sobre a diversidade de fontes hídricas da APA, flora e fauna associadas a elas destaco aqui dois pontos gravíssimos contra a aplicação dessa lei: (1) a presença das palmeiras babaçu (Attaleaspeciosa), buriti (Mauritia flexuosa), carnaúba (Coperniciaprunifera), catolé (Syagrusoleracea) e macaúba-barriguda (Acrocomiaintumescens), as quais são habitats naturais de espécies de insetos triatomídeos conhecidos como barbeiros (Rhodniusnasutus) portadores dos protozoários Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli, causadores de epidemias da doença de Chagas (ver estudos da Fundação Oswaldo Cruz anexos); (2) as nascentes, cuja espécie extremamente ameaçadas de extinção só vivem em associação a elas, o soldadinho do Araripe (Antilophiabokermanni) (ver anexo documentos da “TheInternational Union for ConservationofNature - IUCN RedListofThreatenedSpecies”.

(1) Desmatamento florestal e aumento de casos de Doenças de Chagas As Palmeiras (exemplo Figura 1) são o habitat naturas de espécies de triatomídeos, muitos destes infectados com T. cruzi e T. rangeli (Tabela 1, Figura 2 e3). Estes alimentam-se do sangue de morcegos, gambás, pássaros, cobras, anfíbios e até de insetos. Segundo os dados levantados pela FioCruz: ”Nossos resultados sugerem a existência de uma enorme área de transmissão enzoótica de T. cruzi e T. rangeli mantida pelo R. nasutuscom capacidade de infestação em ambientes artificiais, o que pode acarretar risco para a população local” (Dias, 2007; Dias et al., 2007). Além da necessidade das autoridades lidarem com esse problema, evitar desmatamento e a eliminação das presas naturais dos triatomídeos é uma das melhores formas para combater uma epidemia de doença de Chagas.

Figura 1 - Catolé (Syagrusolearacea), palmeira com distribuição em regiões da APA. Municíio de Crato – CE (Fonte: Dias, 2007).

Tabela – Número de palmeiras infestadas, triatomídeos capturados, examinados, infectados, e percentual de infecção por espécie de palmeira.

Fonte: Dias (2007).

Figura 2 - Fêmeas de R.nasutus proveniente da geração parental coletados nas cinco espécies de palmeiras da APA: a) babaçu, b) buriti, c) carnaúba, d) catolé e e) macaúba-barriguda. (Fonte: Dias, 2007).

Figura 3 – Tripanosomas encontrados: A´) T. rangeli; A``) T. cruzi; B) isolado da cepa San Agustin (controle positivo de T. rangeli; C) cepa Y (controle positivo de T. cruzigrupo II); D) cepa YuYu (controle positivo de T. cruzi grupo I) (Fonte: Dias, 2007).

Ressalto com ênfase: as árvores e animais presentes na APA nos protegem dos triatomídeos que preferem seus habitats e presas naturais. A urbanização prevista na Lei No 3.730/2021 pode causar um aumento de pessoas infectadas, por si só, Lei torna-se origem de uma calamidade sanitária.

(2) Desmatamento florestal, destruição de fontes naturais e extinção de espécies Extinção é para sempre e representa um crime contra a humanidade. Segundo Gaiotti (2016): “O soldadinho do Araripe (Antilophiabokermanni) (Fig. 4) é uma espécie Passeriforme da família Pipridae e uma das recentes descobertas da ornitologia brasileira, descrita há apenas 18 anos. Encontra-se criticamente ameaçada, com população estimada em 800 indivíduos”. Esses pássaros só vivem em associação às nascentes presentes na APA (Rego et al., 2010). Se a aplicação da urbanização prevista na Lei No 3.730/2021 pode gerar uma emergência sanitária com epidemia de doença de Chagas, ela também é por si só um crime ao contribuir com a redução de áreas onde a Antilophiabokermannivive, acelerando sua extinção.

Figura 4 - MachoAntilophiabokermanni banhando-se em uma das nascentes presentes na APA, Crato – CE. de Foto: Weber A. G. Silva

Ao ressaltar esses dois pontos, sou em absoluto contra a Lei No 3.730/2021 e seu plano de “urbanização”. Só existe uma forma de descrever isso: DESTRUÇÃO DE VIDAS POR ESPECULAÇÃO IMOBILIÁRIA. Somos maiores do que isso seres humanos não devem se tornar agentes de devastação, peste e dor.

Referências bibliográficas Aquasis. 2006. Plano de conservação do soldadinho-do-araripe (Antilophiabokermanni). Pp1–36. Ávila et al., 2016. Herpetologia do sul do Ceará e sertão de Pernambuco. Fortaleza, 93p. Dias, F. B. S., 2007a.Ecologia de RhodniusnasutusStal, 1859 (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) em palmeiras da Chapada do Araripe, Ceará, Brasil. Dissertação de Mestrado, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 121p. Dias et al., 2007.First report on the occurrence of TrypanosomarangeliTejera, 1920in the state of Ceará, Brazil, in naturally infected triatomineRhodniusnasutusStal, 1859 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae).Memórias do InstitutoOswaldo Cruz, 102(5): 643-645. Gaiotti, M. G., 2016. Antilophiabokermanni(Aves: Pipridae): Parâmetros reprodutivos, sistema de acasalamento social e genético e o papelda seleção sexual. Tese de Doutorado, Universidade Federal de Brasília, 206p. Rego, et al., 2010. Population Genetic Studies of Mitochondrial Pseudo-Control Region in the EndangeredAraripeManakin (Antilophiabokermanni). The Auk,127(2):335-342. Volume 54(22):315‑328, 2014

Morcegos da Chapada do Araripe, Nordeste do Brasil

Roberto Leonan Morim Novaes1 Rafael de Souza Laurindo2

ABSTRACT

Chapada do Araripe is a plateau located within the Caatinga biome in northeastern Brazil between the states of Ceará, Pernambuco and Piauí. Altimetry has great variation, giving a variety of vegetation and environmental dynamics distinct from other Caatinga areas. With the aim of increasing the meager information on biodiversity of the Caatinga, between 2010 and 2012 we conducted a survey of bats in five locations in the Chapada do Araripe, in counties of Barbalha and Jardim, Ceará, and Serrita in Pernambuco. Our survey recorded 25 species in six families resulting in the capture of 201 individuals. Sampling recorded three new records for Ceará State, Sturnira tildae, Pteronotus gymnonotus, Cynomops planirostris and Pro- mops nasutus. A compilation of the literature revealed that in the Chapado do Araripe occur 49 bat species distributed in eight families, representing 64% of bat species in the Caatinga.

Key-Words: Chiroptera; Caatinga; Assemblage; Species survey.

INTRODUÇÃO 2002). A maior parte da Caatinga é composta por ambientes semiáridos, embora também possa apresentar Na região neotropical a fauna de morcegos pode hábitats mésicos em menor proporção, como na Cha- representar até 50% da comunidade de mamíferos pada do Araripe (Costa et al., 2004). de uma região (Timm, 1994), tendo um importante A Chapada do Araripe é um planalto localiza- papel na manutenção de áreas naturais devido a uma do dentro do domínio da Caatinga no nordeste bra- série de serviços ecológicos prestados, como a disper- sileiro, mais precisamente entre os estados do Ceará, são de sementes e o controle de populações de inverte- Pernambuco e Piauí. Possui variação altimétrica entre brados (Kalka et al., 2008; Mello et al., 2011). Ainda 700 e 1.000 m (DNPM, 1996), o que confere uma assim, o conhecimento sobre a distribuição geográfica grande variedade de fitofisionomias e uma dinâmica e biologia de muitas espécies de morcegos de algumas ambiental distinta das demais áreas de Caatinga de sub-regiões da América do Sul, como a Caatinga, ain- baixada (Castro, 1996). A Chapada do Araripe é pro- da é incipiente (Bernard et al., 2011). tegida por uma Área de Proteção Ambiental (APA da A Caatinga brasileira é um dos biomas menos Chapada do Araripe) e parte de seu território também conhecidos da América do Sul quanto a sua biodiver- é protegido pela Floresta Nacional do Araripe e pelo sidade. Possui uma área de 740.000 km², ocupando Parque Geológico do Araripe (Silva et al., 2004a). To- cerca de 10% do território do Brasil (Aguiar et al., davia, assim como boa parte da Caatinga, a Chapada

1. Fundação Oswaldo Cruz, Campus Fiocruz da Mata Atlântica. Estrada Rodrigues Caldas, 3.400, CEP 22713‑375, Rio de Janeiro, RJ. Brasil. E‑mail: [email protected] 2. Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia. Campus Universitário, CEP 37200‑000, Lavras, MG, Brasil. http://dx.doi.org/10.1590/0031-1049.2014.54.22 316 Novaes, R.L.M. & Laurindo, R.S.: Morcegos da Chapada do Araripe

do Araripe sofre uma intensa pressão antrópica devido Willig et al., 1993). Esses estudos foram os pioneiros à expansão de áreas agrícolas, ocupação de moradia e ainda hoje são de extrema relevância para a compre- desordenada e caça (Novaes et al., 2013). ensão da fauna de mamíferos da Caatinga brasileira, e Por possuir uma rica biodiversidade, incluindo indivíduos coletados durante esses trabalhos ainda ser- endemismos e descrição de novas espécies, apresen- vem como material para descrições de novas espécies tar diversos tipos de hábitats, sítios fossilíferos e áreas (e.g., Moratelli et al., 2011). Contudo, com exceção cársticas, a Chapada do Araripe é considerada Área dos trabalhos com revisão de espécimes de coleção, ne- Prioritária para Conservação da Biodiversidade da Ca- nhum estudo de campo sobre mamíferos na Chapada atinga, sendo classificada como região de extrema im- do Araripe foi realizado desde então. portância biológica (Silva et al., 2004a). Além disso, Apresentamos aqui os resultados de um levan- esses mesmos autores indicam que em decorrência do tamento da quiropterofauna realizado em uma par- crescente processo de ocupação humana e expansão te da Chapada do Araripe. Adicionalmente, ao final agrícola, a Chapada do Araripe possui necessidades do trabalho, apresentamos a lista total de espécies de urgentes para a pesquisa científica de diversos grupos morcegos registradas na Chapada do Araripe através taxonômicos, incluindo mamíferos, contribuindo de compilação feita na literatura. para o acúmulo de conhecimento e aumento da pro- teção para a conservação da biodiversidade da região. Pesquisas com mamíferos na Chapada do Araripe MATERIAL E MÉTODOS foram iniciadas na década de 1970 com pesquisadores do Carnegie Museum of Natural History (EUA), re- Área de estudo sultando em uma série de trabalhos sobre zoogeografia e história natural de mamíferos, incluindo morcegos A Chapada do Araripe possui cerca 180 km de (e.g., Mares et al., 1981, 1985; Willig, 1983, 1985a, b; extensão abrangendo parte dos estados de Pernam-

Figura 1: Localização da Chapada do Araripe, na Caatinga brasileira (em verde), nordeste do Brasil. Papéis Avulsos de Zoologia, 54(22), 2014 317

buco, Piauí e Ceará (Fig. 1), estando a maior parte e distróficos, sendo caracterizado por apresentar neste último (Nascimento, 1996). Essa Chapada está uma densa vegetação de nível arbóreo e que, em inserida dentro do domínio da Caatinga, e nela ocor- média, não ultrapassa 8 m de altura. Simmons rem distintos padrões de vegetação, descritos a seguir (1996) também denomina essa fisionomia de conforme Figueira (1989): cerrado edáfico. (4) Carrasco, vegetação xerófila com características (1) Floresta subperenifólia tropical plúvio-nebular bem particulares, que consiste de uma comuni- (mata úmida), caracterizando uma fitofisiono- dade arbustiva densa, baixa e quase totalmente mia úmida, com dossel superior a 12 m de altura domina por elementos da Caatinga, como plan- semelhante a Floresta Atlântica Ombrófila, com tas de caules finos e cespitosos, e cactáceas em presença destacada de palmeiras e bromélias epí- abundância, embora também possam ser encon- fitas. Esta fisionomia é encontrada nas vertentes tradas espécies arbóreas. Na Chapada do Arari- mais altas da chapada (entre 900 e 1.000 m) e pe ocorre desde as áreas mais baixas, tendo seu nas encostas que possuem acúmulo de água. limite altitudinal em torno dos 850 m. Essa fito- (2) Floresta subcauducifólia tropical pluvial (mata fisionomia pode abrigar um microhábitat deno- seca), fisionomia que recobre a retaguarda da minado localmente de “Serrote”, uma pequena mata úmida, nos níveis inferiores das altas ver- elevação arenítica na paisagem de planície que tentes da chapada (entre 800 e 950 m), sendo pode formar cavidades naturais frequentemente caracterizada por apresentar um dossel de média utilizados como abrigos por morcegos (Willig, altura (até 12 m) e uma vegetação que combina 1983). elementos das matas úmidas, cerrado arbóreo e do carrasco, com ausência de bromeliáceas ou outras plantas epífitas. Amostragem (3) Floresta subcaducifólia tropical xeromorfa (cerrado arbóreo), está presente entre as altitudes de A amostragem foi realizada em duas campanhas 800 e 900 m, principalmente em solos arenosos anuais, uma em período chuvoso (fevereiro e março) e

Figura 2: Fitofisionomias da Chapada do Araripe, sendo: Mata Úmida (A), Mata Seca (B), Cerrado Arbóreo (C), Carrasco (D). Fotos por Roberto Leonan Morim Novaes. 318 Novaes, R.L.M. & Laurindo, R.S.: Morcegos da Chapada do Araripe

Tabela 1: Localidades de amostragem de morcegos na Chapada do Araripe, incluindo coordenada geográfica; altitude; hábitat, sendo: Mata Úmida (MU), Mata Seca (MS), Cerrado Arbóreo (CE) e Carrasco (CA); e esforço amostral.

Localidade Coordenada Altitude Hábitat Esforço* Caldas, Barbalha, CE 07°22’45”S/39°20’38”O 923 m MU 8.100 m².h Vale da Lua, Jardim, CE 07°32’58”S/39°18’45”O 808 m MS 8.100 m².h Mata das Torres, Serrita, PE 07°38’45”S/39°19’34”O 940 m MS 8.100 m².h Sítio São Raimundo, Jardim, CE 07°29’28”S/39°20’28”O 898 m CE 8.100 m².h Sítio Seriema, Jardim, CE 07°32’18”S/39°19’16”O 820 m CE 8.100 m².h Sítio Pitomba, Serrita, PE 07°39’23”S/39°20’03”O 837 m CA 8.100 m².h

* Esforço amostral total de 48.600 m².h outra em período seco (outubro), nos anos de 2010 e Lista compilada 2011, e uma campanha apenas entre os períodos chuvoso e seco, em abril de 2012. Em cada campanha fo- Nós realizamos uma compilação das espécies ram realizadas seis noites consecutivas, totalizando 30 de morcegos com ocorrência na Chapada do Araripe noites de amostragem. As capturas foram realizadas através de revisão na literatura, sendo considerados nas quatro fitofisionomias mencionadas por Figuei- apenas artigos científicos publicados em periódicos e ra (1989) (Fig. 2), contudo, não houve padronização capítulos de livro de circulação livre. A busca foi re- do esforço amostral para as diferentes fisionomias. A alizada através de bases de dados disponíveis na web, amostragem foi realizada em cinco localidades nos como Scientific Electronic Library Online – SciE- municípios de Barbalha, Jardim e Serrita (Tabela 1) LO (www.scielo.org/php/index.php), Web of Scien- e fez parte do monitoramento da quiropterofauna da ce – WoS (http://portal.isiknowledge.com) e Google Linha de Transmissão Iracema 500 kV São João do Scholar (http://scholar.google.com.br). A busca foi Piauí-Milagres. realizada com a combinação de palavras-chave como A amostragem de morcegos foi feita através “Chiroptera”, “morcego”, “Brasil”, “Caatinga” e “Ara- de capturas usando 10 redes de neblina (Zootech® ripe”, nos idiomas inglês e português. 9 × 3 m, 20 mm), armadas em trilhas, clareiras na Adotamos a ordem de citação de famílias e vegetação, em frente a abrigos, pontos de alimenta- subfamílias proposta por Simmons (2005) e a nomen- ção ou sobre açudes artificiais cercados por vegetação clatura adotada seguiu Peracchi et al. (2011). Gêneros natural, conforme métodos de Kunz & Kurta (1988). e espécies são apresentados em ordem alfabética. As redes foram abertas imediatamente após o por do sol e fechadas seis horas após, totalizando 6h de amostragem por noite, concentrando as capturas no maior RESULTADOS horário de atividade dos morcegos (Brown, 1968; La- Val, 1970). O esforço amostral foi calculado confor- Foi realizado um esforço amostral total de me Straube & Bianconi (2002), e a eficiência de cap- 48.600 m².h, sendo 8.100 m².h para cada uma das tura (EC) foi calculada através da divisão do número seis localidades amostradas. O esforço amostral foi total de capturas pelo esforço amostral empregado. As diferente para as fisionomias, sendo de 8.100 m².h espécies foram classificadas em guildas tróficas seguin- para a mata úmida, 16.200 m².h para mata seca, do Kalko et al. (1996). 16.200 m².h para o cerrado arbóreo e 8.100 m².h Os morcegos capturados foram identificados para o carrasco. A eficiência de captura na Chapada previamente em campo usando os caracteres propos- do Araripe foi de 0,0041 morcego/m².h. A amos- tos por Vizotto & Taddei (1973), Simmons & Voss tragem permitiu a captura de 200 morcegos de 24 (1998) e Reis et al. (2007), marcados com anilhas espécies distribuídas em seis famílias. Contudo, em- metálicas no antebraço e soltos no mesmo local de bora não tenha sido capturado em rede de neblina, captura. Alguns exemplares foram eutanasiados para um exemplar de Eumops auripendulus (Shaw, 1800) confirmação taxonômica, seguindo as normas propos- foi encontrado atropelado em outubro de 2011 na ro- tas por Sikes et al. (2011), e depositados na Coleção dovia CE‑060, que corta um trecho da Chapada de de Mamíferos do Museu Nacional do Rio de Janeiro Araripe entre Barbalha e Jardim. Os resultados estão e Coleção de Morcegos da Universidade Federal de sumarizados na Tabela 2 e uma prancha com as foto- Lavras (Apêndice). O presente estudo possui licença grafias dos morcegos na Fig. 3. do IBAMA, processo no. 02001.001113/2008‑11, A família Phyllostomidae foi a mais abundante, autorização no. 192/2010. tanto em número de espécies quanto em capturas, Papéis Avulsos de Zoologia, 54(22), 2014 319

Tabela 2: Morcegos amostrados na Chapada do Araripe, incluindo guilda trófica (IAE = Insetívoro aéreo, HEM = Hematófago, NEC = Nectarívoro, ICA = Insetívoro catador, ONI = Onívoro, FRU = Frugívoro, PIS = Piscívoro), hábitats (CA = Carrasco, CE = Cerrado arbóreo, UM = Mata Úmida, MS = Mata Seca), número de capturas (N), frequência (%).

Espécies Guilda Trófica Hábitat N % Emballonuridae Peropteryx macrotis IAE CA 4 1,99 Phyllostomidae Desmodus rotundus HEM CE 2 0,99 Anoura geoffroyi NEC MU, CE 5 2,48 Lonchophylla mordax NEC CE 1 0,49 Glossophaga soricina NEC MU, MS, CE, CA 26 12,9 Micronycteris sanborni ICA CE 1 0,49 Phyllostomus discolor ONI MU, CE 3 1,49 Phyllostomus hastatus ONI MU, MS, CE 5 2,48 Carollia pespicillata FRU MU, MS, CE, CA 50 24,8 Artibeus lituratus FRU MU, MS, CE, CA 11 5,57 Artibeus planirostris FRU MU, MS, CE, CA 19 9,45 Platyrrhinus lineatus FRU MU, MS, CE 33 16,4 Sturnira lilium FRU MU, MS, CE 11 5,57 Sturnira tildae FRU MU 2 0,99 Mormoopidae Pteronotus gymnonotus IAE CA 4 1,99 Pteronotus parnelli IAE CA 1 0,49 Noctilionidae Noctilio leporinus PIS CA 1 0,49 Molossidae Cynomops planirostris IAE MS 1 0,49 Eumops auripendulus* IAE CE 1 0,49 Molossus molossus IAE MS, CA 11 5,57 Neoplatymops mattogrossensis IAE CA 1 0,49 Promops nasutus IAE CE 1 0,49 Vespertilionidae Lasiurus blossevilli IAE MU, MS, CE 3 1,49 Lasiurus ega IAE CE 1 0,49 Myotis lavali IAE CE 3 1,49 Total 201 100

* Espécie registrada por atropelamento. sendo Carollia perspicillata (Linnaeus, 1758) a espé- Tabela 3: Número de captura de morcegos por guilda trófica cie mais frequente com 24,8% de todas as capturas, em diferentes hábitats amostrados, sendo Carrasco (CA), Cerrado seguido por Platyrrhinus lineatus (É. Geoffroy, 1810) Arbóreo (CE), Mata Seca (MS), Mata Úmida (MU), além de número total de captura (N) e abundância relativa (%) na Chapada e Glossophaga soricina (Pallas, 1766) com 16,4% e do Araripe. 12,9%, respectivamente. Embora todos os indivídu- Hábitats amostrados N % os capturados e soltos tivessem sidos marcados, não Guilda trófica houve recaptura de nenhum morcego. Quatro espé- CA CE MS MU Total Total cies são consideradas novos registros para o Estado Insetívoros aéreos 19 7 4 1 31 15,4 do Ceará, são elas Sturnira tildae de la Torre, 1959, Insetívoros catadores 0 1 0 0 1 0,49 Pteronotus gymnonotus Natterer, 1843, Cynomops Hematófagos 0 2 0 0 2 0,99 planirostris (Peters, 1865) e Promops nasutus (Spix, Nectarívoros 1 7 18 6 32 15,8 1823). Onívoros 0 3 3 2 8 3,97 A guilda dos insetívoros aéreos foi a que apre- Frugívoros 6 39 48 33 126 62,7 sentou a maior riqueza de espécies (11 spp.), contudo, Piscívoros 1 0 0 0 1 0,49 os morcegos frugívoros foram os mais abundantes, re- Total 27 59 73 42 201 100 320 Novaes, R.L.M. & Laurindo, R.S.: Morcegos da Chapada do Araripe

presentando 62,7% de todas as capturas (Tabela 3). É Lista compilada e atualizações taxonômicas importante ressaltar que grande parte dos morcegos insetívoros aéreos (83,8%) foi capturada em ambien- A busca nas bases de dados disponíveis na web tes xerófitos (Carrasco e Cerrado), enquanto a maior encontrou 77 trabalhos, destes, apenas nove estavam parte dos morcegos fitófagos (frugívoros e nectarívo- relacionados com o tema buscado (Mares et al., 1981, ros = 66,4%) foi capturada nos hábitats mais úmidos 1985; Willig, 1983, 1985a, b; Willig et al., 1993; (Mata Seca e Mata Úmida). Simmons, 1996; Oliveira et al., 2003; Moratelli et al., A colocação de redes de neblina no entorno de 2011). Todavia, devido à sobreposição de resultados coleções d’água se mostrou essencial para a amostra- obtidos por diferentes trabalhos publicados oriundos gem, sobretudo para o registro das espécies insetívoras do mesmo projeto, apenas cinco artigos foram utiliza- e piscívora. A amostragem realizada no entorno de dos como fontes de dados para compilação das espé- açudes e riachos permitiu a captura de oito espécies cies com ocorrência na Chapada do Araripe (sendo: e significou 70,9% de todas as capturas de morcegos Mares et al., 1981; Willig, 1983; Simmons, 1996; insetívoros. Oliveira et al., 2003; Moratelli et al., 2011).

Figura 3A: Espécies de morcegos capturadas na Chapada do Araripe, sendo: Peropteryx macrotis (A), Desmodus rotundus (B), Anoura geoffroyi (C), Lonchophylla mordax (D), Glossophaga soricina (E), Micronycteris sanborni (F), Phyllostomus discolor (G), Phyllostomus hastatus (H), Carollia perspicillata (I). Fotos por Roberto Leonan Morim Novaes. Papéis Avulsos de Zoologia, 54(22), 2014 321

A compilação feita a partir da literatura permitiu do em substituição a Artibeus jamaicensis Leach, 1821 registrar a ocorrência de 44 espécies, e a ocorrência de mencionado por Willig (1983) com ocorrência na outras cinco espécies foram adicionadas pelo presen- Chapada do Araripe. te estudo. Portanto, a Chapada do Araripe possui 49 Seguindo a proposta de Garbino & Tejedor espécies de morcegos registradas, distribuídas em oito (2013), a combinação Natalus macrourus (Gervais, famílias (Tabela 4). Os registros foram provenientes 1856) é usada em substituição à Natalus stramineus de seis municípios nos Estados do Ceará e Pernam- Gray, 1838, citado para a Chapada do Araripe por buco. É importante ressaltar que nenhum estudo com Willig (1983). morcegos foi realizado na Chapada do Araripe na ver- Consideramos Molossus rufus É. Geoffroy, 1805 tente do Piauí. Atualizações taxonômicas e nomencla- como sinônimo sênior para Molossus ater (menciona- turais seguem abaixo. do por Willig, 1983), conforme proposto por Dolan Conforme indicado por revisões recentes (ver (1989). Lim, 1997; Marques-Aguiar, 2007; Hoofer et al., A revisão feita por Eger (2007) menciona a ocor- 2008), o nome Artibeus planirostris Spix, 1823 é usa- rência de Promops nasutus no município de Exu ba-

Figura 3B: Espécies de morcegos capturadas na Chapada do Araripe, sendo: Artibeus lituratus (A), Artibeus planirostris (B), Platyrrhinus lineatus (C), Sturnira lilium (D), Sturnira tildae (E), Pteronotus gymnonotus (F), Pteronotus parnelli (G), Noctilio leporinus (H), Cynomops planirostris (I). Fotos por Roberto Leonan Morim Novaes. 322 Novaes, R.L.M. & Laurindo, R.S.: Morcegos da Chapada do Araripe

seado no trabalho de Mares et al. (1981), que relata DISCUSSÃO a captura de um indivíduo de Promops sp. para essa localidade. Contudo, um estudo posterior utilizando A amostragem realizada por nós registrou ape- o mesmo material coletado por Mares et al. (op cit.) nas 51% das espécies de morcegos com ocorrência não menciona a ocorrência de qualquer espécie de na Chapada do Araripe, contudo, foi capaz de regis- Promops nessa região (Willig, 1983). Sendo assim, de- trar cinco espécies que não haviam sido reportadas vido a poucas evidências fornecidas por Eger (2007) no levantamento realizado anteriormente por Willig que confirmem a ocorrência de P. nasutus na Chapa- (1983), sendo Sturnira tildae, Pteronotus gymnonotus, da do Araripe, nós não consideramos esse registro em Pteronotus parnelli (Gray, 1843), Eumops auripendu- nosso trabalho. lus e Promops nasutus. Isso pode ser um indicativo A combinação Lasiurus blossevilli (Lesson, 1826) da possibilidade de novas ocorrências de espécies de é usada em substituição a Lasiurus borealis (Müller, morcegos que ainda não foram registradas por ambos 1776), mencionado por Willig (1983). os levantamentos nessa região, especialmente nas lo-

Figura 3C: Espécies de morcegos capturadas na Chapada do Araripe, sendo: Eumops auripendulus (A), Molossus molossus (B), Neoplaty- mops mattogrossensis (C), Promops nasutus (D), Lasiurus blossevilli (E), Lasiurus ega (F), Myotis lavali (G). Fotos por Roberto Leonan Morim Novaes. Papéis Avulsos de Zoologia, 54(22), 2014 323

Tabela 4: Morcegos com ocorrência nos diferentes municípios inseridos na Chapada do Araripe, nordeste do Brasil. Registros obtidos em [1] Mares et al. (1981), [2] Willig (1983), [3] Simmons (1996), [4] Oliveira et al. (2003), [5] Moratelli et al. (2011) e [6] presente estudo.

Espécies Barbalha Crato Jardim Nova Olinda Exu Serrita Emballonuridae Peropteryx macrotis — — — — [1] [6] Saccopteryx bilineata — [1] — — — — Saccopteryx leptura — [1] — — — — Phyllostomidae Desmodontinae Desmodus rotundus — [1] [6] [1] [1] — Diphylla ecaudata — — — — [1] — Glossophaginae Anoura geoffroyi [6] [1] [6] [1] [1] — Glossophaga soricina [6] [1] [6] — [1] [6] Lonchophylla mordax — — [6] [1] [1] — Phyllostominae Lophostoma brasiliense — — — — [1] — Lophostoma silvicolum — — — — [2] — Micronycteris minuta — [1] — — [1] — Micronycteris megalotis — [2] — — [2] — Micronycteris sanborni — [3] [6] [4] [4] — Micronycteris schmidtorum — — — — [4] — Mimon crenulatum — — — — [1] — Phyllostomus discolor [6] [1] [6] — [1] — Phyllostomus hastatus [6] [1] [6] — [1] [6] Tonatia bidens — — — — [1] — Trachops cirrhosus — — — — [1] — Carolliinae Carollia brevicauda — [4] — — — — Carollia perspicillata [6] [1] [6] [1] [1] [6] Stenodermatinae Artibeus concolor — [1] — — — — Artibeus lituratus [6] [1] [6] [1] [1] [6] Artibeus planirostris [6] [1] [6] [1] [1] [6] Platyrrhinus lineatus [6] [1] [6] [1] [1] [6] Sturnira lilium [6] [1] [6] — [1] — Sturnira tildae [6] — — — — — Uroderma magnirostrum — [2] — — [2] — Mormoopidae Pteronotus davyi — [1] — — [1] — Pteronotus gymnonotus — [6] — — — [6] Pteronotus parnelli — — — — — [6] Noctilionidae Noctilio leporinus — [1] — — [1] [6] Furipteridae Furipterus horrens — — — — [1] — Natalidae Natalus macrourus — [1] — — — — Molossidae Cynomops planirostris — — [6] — [1] — Eumops auripendulus — [6] — — — Eumops sp. — [2] — — — Molossops temminckii — [1] — [1] — Molossus molossus — [1] [6] — [1] [6] 324 Novaes, R.L.M. & Laurindo, R.S.: Morcegos da Chapada do Araripe

Espécies Barbalha Crato Jardim Nova Olinda Exu Serrita Molossus rufus — — — [1] [1] — Neoplatymops mattogrossensis — — — — [1] [6] Nyctinomops laticaudatus³ — [2] — — [1] — Promops nasutus — — [6] — — — Vespertilionidae Eptesicus furinalis — [1] — — — — Lasiurus blossevilli [6] [1] [6] — — — Lasiurus ega — [1] [6] — [1] — Myotinae Myotis nigricans — [1] — — [1] — Myotis lavali — [5] [6] — [5] — Myotis riparius — [4] — — [4] — calidades ainda não amostradas. Sendo assim, enco- foi fotografado, marcado e solto no mesmo local de rajamos a continuidade da amostragem de morcegos captura. nessa chapada, especialmente na vertente mais próxi- Eumops auripendulus foi registrado somente ma ao Piauí, para o qual nunca houve nenhum levan- através de um indivíduo atropelado coletado na ro- tamento de quirópteros. dovia CE‑060. A área onde o indivíduo foi encontra- As capturas de S. tildae foram realizadas exclu- do apresentava dois grandes açudes nas margens da sivamente na mata úmida, figurando o primeiro re- rodovia, além de uma extensa vegetação de cerrado gistro dessa espécie para o Estado do Ceará e para o arbóreo. Considerando o comportamento de voo em bioma Caatinga. Embora esteja inserida dentro do grandes alturas de E. auripendulus e o local do atrope- domínio da Caatinga, a localidade de captura de S. til- lamento, é provável que a colisão com algum veículo dae é caracterizada como Floresta subperenifólia tro- tenha ocorrido enquanto o animal usava um dos açu- pical plúvio-nebular, uma fitofisionomias semelhante des do entorno da rodovia para beber água, ou captu- à Mata Atlântica, tanto nos elementos da paisagem rar insetos sobre o espelho d’água. quanto em fatores abióticos, como a maior umidade Um indivíduo de P. nasutus foi capturado em e menor incidência de radiação solar no interior da rede de neblina armada em torno de um açude artifi- floresta (Figueira, 1989). Considerando a distribui- cial circundado por vegetação de Cerrado arbóreo. É ção dessa espécie, é provável que sua ocorrência esteja digno de nota que este é o segundo registro documen- associada à hábitats florestais mais úmidos. A mata tado de P. nasutus para a Caatinga e o primeiro para úmida foi uma fisionomia pouco explorada no levan- o Ceará. tamento realizado por Willig (1983), o que deve ter O levantamento feito por nós registrou um nú- dificultado o registro dessa espécie. mero de espécies dentro do esperado para áreas de Ca- As outras quatro novas ocorrência para a Cha- atinga e Cerrado, que normalmente reportam entre pada do Araripe são de morcegos insetívoros aéreos, 15 e 25 espécies (Willig, 1983; Pedro & Taddei, 1997; que são mais difíceis de serem registrados através de Silva et al., 2004b; Tomáz & Zoréa, 2008; Gregorin capturas com redes de neblina, já que possuem uma et al., 2011). Contudo, estudos de longo prazo que ecolocação mais eficiente na detecção das redes de ne- empreguem um esforço amostral superior tendem a blina e costumam forragear em grandes alturas, aci- apresentar uma riqueza de espécies consideravelmen- ma da vegetação (Freeman, 1981; Adams, 1989; Best te maior (e.g., Esbérard, 2003; Sampaio et al., 2003; et al., 2002). Faria et al., 2006; Sá-Neto & Marinho-Filho, 2013). Quatro indivíduos de P. gymnonotus foram cap- Bergallo et al. (2003), sugerem que para amostrar a turados em rede de neblina em Serrita e uma colônia maior parte das espécies de Phyllostomidae seja neces- com cerca de 800 indivíduos dessa espécie foi encon- sário o mínimo de 1.000 capturas de morcegos, que só trada se abrigando em uma cavidade natural em rocha é possível de ser alcançado com estudos de longo pra- arenítica (Gruta do Farias) no Arajara Park, uma Re- zo ou com elevado esforço amostral, podendo assim serva Particular do Patrimônio Natural localizada em gerar uma lista de espécies mais próxima da realidade. Crato (veja Novaes, 2012), sendo o primeiro registro A eficiência de captura na Chapada do Araripe dessa espécie para o Ceará. Já P. parnelli foi registrado apresenta valores semelhantes aos encontrados para por apenas um indivíduo capturado em rede de nebli- outras áreas de Caatinga no Brasil. Silva (2007) ob- na. Por ser tratar de uma fêmea grávida, o indivíduo teve uma eficiência de 0,0038 morcegos/m².h em Papéis Avulsos de Zoologia, 54(22), 2014 325

Brejo de Madre de Deus, no Pernambuco, e Sá-Neto Pteronotus gymnonotus, Cynomops planirostris e & Marinho-Filho (2013) de 0,0025 para a região do Promops nasutus. Uma compilação da literatura reve- médio São Francisco na Bahia. Em uma área de Ca- lou que na Chapada do Araripe ocorrem 49 espécies de atinga na Floresta Nacional Contendas do Sincorá, morcegos distribuídas em oito famílias, o que representa na Bahia, Rios et al. (2008) capturaram apenas 41 64% das espécies de morcegos da Caatinga. morcegos com um esforço amostral de 45.360 m².h (EC = 0,0009). Quando comparado com inventários Palavras-Chave: Chiroptera; Caatinga; Comunida- na Floresta Atlântica e no Cerrado (e.g., Ferreira et al., de; Levantamento de espécies. 2010, EC = 0,0132; Cunha et al., 2011, EC = 0,0119; Luz et al., 2013, EC = 0,0201), a Caatinga apresenta uma capturabilidade consideravelmente menor. Sá- AGRADECIMENTOS -Neto & Marinho-Filho (2013) indicam que a baixa densidade de morcegos é um padrão comum na Somos gratos à Ana Cláudia Delciellos, Carlos Caatinga devido à baixa produtividade primária e ao Cândido, Igor Catharino de Souza, Eduardo Felberg, regime de chuvas irregular (Prado, 2003; Brown et al., William de Paula, Thiago Marques e Mara Silva pela 2004), incluindo longos períodos de seca (Novaes ajuda no trabalho de campo; à Renato Gregorin pela et al., 2013). ajuda na identificação de alguns espécimes; à Dossel Os morcegos fitófagos foram os mais abun- Ambiental Consultoria e Projetos Ltda. pela oportu- dantes nesse levantamento, sobretudo nas áreas mais nidade de trabalhar nessa região; aos revisores anôni- úmidas. A maior amostragem de morcegos fitófagos mos pelas valiosas sugestões. R.L.M. Novaes agradece é esperada, considerando que Phyllostomidae é a fa- a bolsa PIBIC CNPq/Fiocruz. mília mais diversa da região Neotropical (Simmons, 2005), uma das mais abundantes e com maior sucesso de captura utilizando redes de neblina, possivelmente REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS devido a sua ecolocação menos sensível e sua altura de forrageio mais baixa que o de morcegos insetívoros, Adams, J.K. 1989. Pteronotus davyi. Mammalian Species, 346: 1‑5. (Portfors et al., 2000; Sampaio et al., 2003). Aguiar, J.; Lacher Jr., T.E. & Silva, J.M.C. 2002. The Caatinga. In: Mittermeier, R.A.; Mittermeier, C.G.; Robles-Gil, P.; Somando nossos resultados aos dados obtidos Pilgrim, J.; Fonseca, G.A.B.; Brooks, T. & Konstant, W.R. por Willig (1983), foram registradas 49 espécies de (Eds.). Wildmess: earth’s last wild places. 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Aceito em: 06/07/2014 Publicado em: 30/09/2014 328 Novaes, R.L.M. & Laurindo, R.S.: Morcegos da Chapada do Araripe

APÊNDICE

Morcegos da Chapada do Araripe depositados na Coleção de Mamíferos do Museu Nacional do Rio de Janeiro (MN) e Coleção de Morcegos da Universidade Federal de Lavras (CMUFLA).

Anoura geoffrouyi (MN79952), Artibeus lituratus (MN75220), Artibeus planirostris (MN79951), Carollia perspicillata (MN79924, MN79940, MN79948), Eumops auripendulus (MN75224), Glossophaga soricina (MN75221, MN75223, MN79931, MN79937, MN79928), Lonchophylla mordax (MN79927), Lasiurus blos- sevili (MN78413, MN79941), Micronycteris sanborni (MN79945), Myotis lavali (MN79946, MN79925), Mo- lossus molossus (MN75201), Neoplatymops mattogrossensis (MN79944), Peropteryx macrotis (MN79947), Phyllos- tomus discolor (MN75222), Platyrrhinus lineatus (MN75203, MN79923), Promops nasutus (CMUFLA1070), Pteronotus gymnonotus (MN75202, MN79949), Sturnira lilium (MN79942), Sturnira tildae (MN79939). The IUCN Red List of Threatened Species™ ISSN 2307-8235 (online) IUCN 2008: T29620A22154584

Mazama gouazoubira, Gray Brocket

Assessment by: Black-Decima, P.A. & Vogliotti, A.

View on www.iucnredlist.org

Citation: Black-Decima, P.A. & Vogliotti, A. 2016. Mazama gouazoubira. The IUCN Red List of Threatened Species 2016: e.T29620A22154584. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016- 2.RLTS.T29620A22154584.en

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The IUCN Red List of Threatened Species™ is produced and managed by the IUCN Global Species Programme, the IUCN Species Survival Commission (SSC) and The IUCN Red List Partnership. The IUCN Red List Partners are: Arizona State University; BirdLife International; Botanic Gardens Conservation International; Conservation International; NatureServe; Royal Botanic Gardens, Kew; Sapienza University of Rome; Texas A&M University; and Zoological Society of London.

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THE IUCN RED LIST OF THREATENED SPECIES™ Taxonomy

Kingdom Phylum Class Order Family

Animalia Chordata Mammalia Cetartiodactyla Cervidae

Taxon Name: Mazama gouazoubira (G. Fischer [von Waldheim], 1814)

Synonym(s): • Mazama gouazipira (G. Fischer, 1814) [orth. error]

Common Name(s): • English: Gray Brocket, Brown Brocket • Spanish: Cabra Silvestre, Corzuela Común, Corzuela Parda, Guazu, Guazu Virá Taxonomic Notes: Six morphological forms pertaining to the concept of Brown Brocket adopted here have been described as subspecies of Mazama simplicicornis (= M. gouazoubira) or M. gouazoubira ( Pinder and Leeuwenberg 1997). They are argentina Lönnberg, auritus Gray, kozeritzi Miranda-Ribeiro, mexianae Hagmann, namby Fitzinger, and superciliaris Gray. In his review of Brazilian species of Mazama, Rossi (2000) interpreted the morphological differences that led authors to describe auritus Gray, kozeritzi Miranda-Ribeiro, mexianae Hagmann, namby Fitzinger, and superciliaris Gray as individual variation among specimens of Mazama gouazoubira. We follow this author in not recognizing any subspecies from Brazil. The form argentina Lönnberg , not analyzed by Rossi (2000), remains the only one that could merit subspecific status. Nevertheless, a thorough analysis of the original description of Mazama simplicicornis argentina shows there are no characters in the type that cannot be explained by individual or geographical variation. Therefore, at the present time we see no reason to recognize either argentina Lönnberg or any other form cited above as subspecies of Mazama gouazoubira. Assessment Information

Red List Category & Criteria: Least Concern ver 3.1

Year Published: 2016

Date Assessed: June 15, 2015

Justification: This species is confirmed to be Least Concern in view of its relatively large distribution, occurrence in a number of protected areas, presumed large populations which do not appear to be declining at a rate sufficient for a threat category at this time. Recent studies indicate that the distribution and abundance of the species do not warrant a threatened status at this time although populations are declining where they come in contact with human populations.

Previously Published Red List Assessments 2008 – Least Concern (LC) – http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2008.RLTS.T29620A9506233.en

2000 – Data Deficient (DD)

Geographic Range

Range Description: The Brown Brocket deer is found east of the dry, pre-Andean regions in Argentina and Bolivia, extending to the Atlantic coast on the west, its northern limit is south of the Amazon region and its southern limit includes all of Uruguay and up to the province of Entre Rios in Argentina. Although some authors report its distribution throughout all of Brazil, more recent evidence indicates its substitution by M. nemorivaga in the region of the Amazon (Duarte 1996, Duarte and Jorge 1998, Rossi 2000, Weber and Gonzalez 2003).

Country Occurrence: Native: Argentina; Bolivia, Plurinational States of; Brazil; Paraguay; Uruguay

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 3 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en Population Populations seem to be decreasing due to the advance of human populations. There is no evidence of fragmented populations and the species continues to be abundant in most of its range, decreasing or disappearing when close to human populations. Densities vary greatly. In Brazil densities of 0.35 – 1 individual/km² have been found (Pinder 1997), in Bolivia densities of 5-12 individuals/km² have been found (Rivero et al. 2004). Current Population Trend: Decreasing

Habitat and Ecology (see Appendix for additional information) This species occurs in moderately humid to dry regions where there are areas of woody or brush cover. It is not found in the Amazon region and it avoids dense forests in other regions as well, although it occupies the edges of forests. It does not live in open areas but will feed in these areas, including many types of agricultural plantations, if cover is available nearby. It is found in both dry and moist Chaco regions (Cartes 1998, Chiarello 1999, Gonzalez 2004, Pinder 1997, Pinder and Leeuwenberg 1997, Rivero et al. 2005).

It eats a wide variety of plant species and is a selective feeder. It has pulses of frugivory depending on the area, season and availability of frutis, but is not essentially frugiverous in many areas, its habitat is not consistent with a frugivorous diet since it avoids forests where most of the fruit is found (Caballero 2001, Cartes 1998, Julia 2002, Pinder 1997, Stallings 1984).

Breeding occurs almost all year around with births in all months except May, June and July in Argentina and Bolivia and correlated with the rainy season in Brazil (Chavez 1999, Julia 2002). There is a post partum estrus and a gestation period of 7 months.

Mazama gouazoubira is a small to medium sized deer, with head and body length 882-1060 mm, tail length 83-190 mm, and ear length 95-121 mm (Rossi 2000), shoulder height 500-650 mm and weight 11-25 kg (Duarte and Jorge 1998). In Brazil, regional, ecological and individual variations in coloration of M. gouazoubira have frequently been reported (Duarte 1996, Pinder and Leeuwenberg 1997, Rossi 2000). Light and brownish colors prevail in individuals living in grasslands, while forest populations tend to be darker and grayer, significant individual variation exists within a single population. M. gouazoubira can be readily distinguished from the most similar species, the Amazonian Brown Brocket Mazama nemorivaga, by its orange rump and dorsal side of the tail, larger rounded ears, smaller eyes and orbital cavities, and wider auditory bulla rather than chocolate brown rump and dorsal side of the tail, small pointed ears, large eyes, large orbital cavities, and narrow auditory bulla of the latter species (Duarte 1996, Rossi 2000).

Systems: Terrestrial

Use and Trade Trade of this species is probably increasing (Julia 2002 pers. comm.).

Threats (see Appendix for additional information)

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 4 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en In Argentina populations are generally declining due to hunting pressure and habitat loss. International hunting expeditions are organized in Argentina (Julia 2002). In Bolivia the populations seem to be staying constant in spite of great hunting pressure. In Brazil this is the most abundant deer species in the country, but populations are declining in certain areas (Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro). In Paraguay, the populations in general are remaining constant, but the species has disappeared from recently urbanized areas and areas of high human density. In general there is heaving hunting pressure and loss of animals due to kills by dogs as well as habitat loss.

Conservation Actions (see Appendix for additional information) The species occurs in a number of protected areas throughout its distribution: 5 national parks and 9 provincial reserves in Argentina; in almost all national parks and private reserves in Paraguay; in 7 national protected areas in Bolivia and in numerous protected areas in Brazil. Hunting is illegal in many places (several Argentine provinces, for example) but the bans are not enforced. Recommended actions would be to implement and enforce controls on hunting, control stray dogs and to educate rural and village populations to conserve the deer rather than immediately trying to kill any individual that they see in the area. Credits

Assessor(s): Black-Decima, P.A. & Vogliotti, A.

Reviewer(s): Zanetti, E.S.Z. & González, S.

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 5 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en Bibliography Caballero, M. 2001. Comparación de la dieta de la urina (Mazama gouazoupira) durante las épocas lluviosa y seca en la zona del Izozoz, Santa Cruz – Bolivia. Bachelor Thesis, Universidad Autonoma Gabriel Rene Moreno.

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Citation

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Habitats (http://www.iucnredlist.org/technical-documents/classification-schemes)

Major Season Suitability Habitat Importance? 1. Forest -> 1.5. Forest - Subtropical/Tropical Dry - Marginal -

1. Forest -> 1.6. Forest - Subtropical/Tropical Moist Lowland - Marginal -

2. Savanna -> 2.1. Savanna - Dry - Marginal -

2. Savanna -> 2.2. Savanna - Moist - Marginal -

3. Shrubland -> 3.5. Shrubland - Subtropical/Tropical Dry - Suitable Yes

3. Shrubland -> 3.6. Shrubland - Subtropical/Tropical Moist - Suitable Yes

5. Wetlands (inland) -> 5.5. Wetlands (inland) - Permanent Freshwater - Marginal - Lakes (over 8ha)

14. Artificial/Terrestrial -> 14.2. Artificial/Terrestrial - Pastureland - Marginal -

14. Artificial/Terrestrial -> 14.3. Artificial/Terrestrial - Plantations - Marginal -

14. Artificial/Terrestrial -> 14.6. Artificial/Terrestrial - Subtropical/Tropical - Marginal - Heavily Degraded Former Forest

Threats (http://www.iucnredlist.org/technical-documents/classification-schemes)

Threat Timing Scope Severity Impact Score 11. Climate change & severe weather -> 11.2. Ongoing - - - Droughts Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 2. Agriculture & aquaculture -> 2.3. Livestock farming Ongoing - - - & ranching -> 2.3.2. Small-holder grazing, ranching or farming Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.1. Ecosystem conversion 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 2. Agriculture & aquaculture -> 2.3. Livestock farming Ongoing - - - & ranching -> 2.3.3. Agro-industry grazing, ranching or farming Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.1. Ecosystem conversion 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 4. Transportation & service corridors -> 4.1. Roads & Ongoing - - - railroads Stresses: 2. Species Stresses -> 2.1. Species mortality

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 8 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en 5. Biological resource use -> 5.1. Hunting & trapping Ongoing - - - terrestrial animals -> 5.1.1. Intentional use (species is the target) Stresses: 2. Species Stresses -> 2.1. Species mortality 5. Biological resource use -> 5.1. Hunting & trapping Future - - - terrestrial animals -> 5.1.3. Persecution/control Stresses: 2. Species Stresses -> 2.1. Species mortality 7. Natural system modifications -> 7.1. Fire & fire Ongoing - - - suppression -> 7.1.3. Trend Unknown/Unrecorded Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 8. Invasive and other problematic species, genes & Ongoing - - - diseases -> 8.1. Invasive non-native/alien species/diseases -> 8.1.1. Unspecified species Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 8. Invasive and other problematic species, genes & Ongoing - - - diseases -> 8.1. Invasive non-native/alien species/diseases -> 8.1.2. Named species (Canis familiaris) Stresses: 2. Species Stresses -> 2.1. Species mortality 8. Invasive and other problematic species, genes & Ongoing - - - diseases -> 8.2. Problematic native species/diseases -> 8.2.1. Unspecified species Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 9. Pollution -> 9.1. Domestic & urban waste water -> Future - - - 9.1.3. Type Unknown/Unrecorded Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 9. Pollution -> 9.2. Industrial & military effluents -> Ongoing - - - 9.2.3. Type Unknown/Unrecorded Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation 9. Pollution -> 9.3. Agricultural & forestry effluents -> Ongoing - - - 9.3.4. Type Unknown/Unrecorded Stresses: 1. Ecosystem stresses -> 1.2. Ecosystem degradation

Conservation Actions in Place (http://www.iucnredlist.org/technical-documents/classification-schemes)

Conservation Actions in Place In-Place Land/Water Protection and Management

Conservation sites identified: Yes, over entire range

In-Place Species Management

Subject to ex-situ conservation: Yes

Conservation Actions Needed (http://www.iucnredlist.org/technical-documents/classification-schemes)

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 9 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en Conservation Actions Needed 2. Land/water management -> 2.1. Site/area management

2. Land/water management -> 2.2. Invasive/problematic species control

4. Education & awareness -> 4.1. Formal education

4. Education & awareness -> 4.3. Awareness & communications

5. Law & policy -> 5.4. Compliance and enforcement -> 5.4.3. Sub-national level

Research Needed (http://www.iucnredlist.org/technical-documents/classification-schemes)

Research Needed 1. Research -> 1.1. Taxonomy

1. Research -> 1.2. Population size, distribution & trends

1. Research -> 1.3. Life history & ecology

1. Research -> 1.5. Threats

3. Monitoring -> 3.1. Population trends

Additional Data Fields

Distribution Lower elevation limit (m): 0

Upper elevation limit (m): 1500

Population Extreme fluctuations: No

Population severely fragmented: No

Habitats and Ecology Continuing decline in area, extent and/or quality of habitat: No

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 10 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en The IUCN Red List of Threatened Species™ ISSN 2307-8235 (online) IUCN 2008: T29620A22154584

The IUCN Red List Partnership

The IUCN Red List of Threatened Species™ is produced and managed by the IUCN Global Species Programme, the IUCN Species Survival Commission (SSC) and The IUCN Red List Partnership.

The IUCN Red List Partners are: Arizona State University; BirdLife International; Botanic Gardens Conservation International; Conservation International; NatureServe; Royal Botanic Gardens, Kew; Sapienza University of Rome; Texas A&M University; and Zoological Society of London.

THE IUCN RED LIST OF THREATENED SPECIES™

© The IUCN Red List of Threatened Species: Mazama gouazoubira – published in 2016. 11 http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2016-2.RLTS.T29620A22154584.en Population Genetic Studies of Mitochondrial Pseudo-Control Region in the Endangered Araripe Manakin (Antilophia bokermanni) Author(s): Péricles S. Rêgo, Juliana Araripe, Weber A. G. Silva, Ciro Albano, Thieres Pinto, Alberto Campos, Marcelo Vallinoto, Iracilda Sampaio, and Horacio Schneider Source: The Auk, 127(2):335-342. Published By: The American Ornithologists' Union URL: http://www.bioone.org/doi/full/10.1525/auk.2009.09052

BioOne (www.bioone.org) is a nonprofit, online aggregation of core research in the biological, ecological, and environmental sciences. BioOne provides a sustainable online platform for over 170 journals and books published by nonprofit societies, associations, museums, institutions, and presses. Your use of this PDF, the BioOne Web site, and all posted and associated content indicates your acceptance of BioOne’s Terms of Use, available at www.bioone.org/page/terms_of_use. Usage of BioOne content is strictly limited to personal, educational, and non-commercial use. Commercial inquiries or rights and permissions requests should be directed to the individual publisher as copyright holder.

BioOne sees sustainable scholarly publishing as an inherently collaborative enterprise connecting authors, nonprofit publishers, academic institutions, research libraries, and research funders in the common goal of maximizing access to critical research. Te Auk 127(2):335 342, 2010 Te American Ornithologists’ Union, 2010. Printed in USA.

POPULATION GENETIC STUDIES OF MITOCHONDRIAL PSEUDO-CONTROL REGION IN THE ENDANGERED ARARIPE MANAKIN (ANTILOPHIA BOKERMANNI)

PÉRICLES S. RÊGO,1,2,5 JULIANA ARARIPE,1 WEBER A. G. SILVA,3 CIRO ALBANO,3 THIERES PINTO,3 ALBERTO CAMPOS,3 MARCELO VALLINOTO,1,4 IRACILDA SAMPAIO,1 AND HORACIO SCHNEIDER1

1Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Bragança, Pará, Brazil; 2Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Estadual do Maranhão, São Luís, Brazil; 3Associação de Pesquisa e Preservação de Ecossistemas Aquáticos, Fortaleza, Brazil; and 4Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, Campus Agrário de Vairão, Universidade do Porto, Vairão, Portugal

ABSTRACT.—Te Araripe Manakin (Passeriformes: Pipridae: Antilophia bokermanni) is the most threatened passeriform species and is classified as critically endangered. With an estimated population of only  individuals, this species is endemic to a small area (^ km) of forest on the slopes of the Araripe Plateau in northeastern Brazil. Te urgent need to implement an effective conservation program for the Araripe Manakin has stimulated intensive research into various aspects of its biology. We sequenced a segment of the mtDNA between the genes ND and S rDNA, which includes a pseudo-control region. Tis region was analyzed in  specimens of A. bokermanni with the aim of measuring intraspecific genetic diversity and population structure. Although the segment’s position is the same as described in other bird species, A. bokermanni differs in some aspects, such as its length of  base pairs and the absence of indels or tandem repeats. Our analysis provides no evidence of population substructuring or a history of population expansion. Te species’ genetic variability is slightly reduced in comparison with its sister species A. galeata, but their similarity indicates a relatively recent process of separation. Received  December , accepted  August .

Key words: Antilophia bokermanni, Araripe Manakin, conservation, population genetics, pseudo-control region.

Estudios de Genética Poblacional sobre la Falsa Región de Control en la Especie Amenazada Antilophia bokermanni

RESUMEN.—Antilophia bokermanni (Passeriformes: Pipridae) es la especie de paseriforme más amenazada y está clasificada como en peligro crítico. Con una población estimada de sólo  individuos, esta especie es endémica de un área pequeña (^ km) de bosque en las faldas de la meseta de Araripe en el noreste de Brasil. La necesidad de implementar de forma urgente un programa de conservación efectivo para A. bokermanni ha estimulado intensas investigaciones sobre varios aspectos de su biología. Secuenciamos un segmento del ADNmt ubicado entre los genes ND y S ADNr, el cual incluye una falsa región de control. Esta región fue analizada en  especímenes de A. bokermanni con el objeto de medir la diversidad genética intraespecífica y la estructura poblacional. Aunque la posición del segmento es la misma que ha sido descrita en otras especies de aves, A. bokermanni difiere en algunos aspectos, como su longitud de  pares de bases y la ausencia de inserciones o deleciones y de repeticiones en tándem. Nuestros análisis no brindan evidencia de subestructura poblacional ni de una historia de expansión poblacional. La variabilidad genética de la especie es ligeramente reducida en comparación con su especie hermana A. galeata, pero su similitud indica un proceso de separación relativamente reciente.

THE ARARIPE MANAKIN (Passeriformes: Pipridae: Antilophia Lichtenstein, ), which is found in the gallery forests of the bokermanni) was described in  by Galileu Coelho and Weber central Brazilian Cerrado biome, the Araripe Manakin differs Silva in what has been considered one of the most important or- principally in its vocalizations and the predominantly whitish col- nithological finds of the past few decades. Although very similar oration of the adult males (Coelho and Silva ). Although most to its sister species the Helmeted Manakin (Antilophia galeata other piprids have lek mating systems, these two species differ in

5Present address: Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Campus Universitário de Bragança, Universidade Federal do Pará, Bragança-PA, 68600-000, Brazil. E-mail: [email protected]

Te Auk, Vol. , Number , pages  . ISSN -, electronic ISSN -.  by Te American Ornithologists’ Union. All rights reserved. Please direct all requests for permission to photocopy or reproduce article content through the University of California Press’s Rights and Permissions website, http://www.ucpressjournals. com/reprintInfo.asp. DOI: ./auk..

— 335 — 336 — RÊGO ET AL. — AUK,VOL. 127

FIG. 1. (A) Collecting localities for Antilophia bokermanni (rectangle) and A. galeata (stars). (B) Distribution of A. bokermanni on the Araripe Plateau (Cha- pada do Araripe), Brazil. (C) Location of the collecting sites for A. bokermanni (numbers) and the lacuna (dotted circle) within its geographic range. having a socially monogamous mating system that lacks elaborate Studies of the viability of endangered species have increas- courtship rituals (Prum , ). ingly included the application of genetic tools to aid in identify- Te Araripe Manakin, which is endemic to the Brazilian state ing and understanding the factors that influence their survival of Ceará, has been classified as being in critical danger of extinc- (Frankham et al. ). Phenomena such as loss of genetic vari- tion by both Brazilian and international organizations (Ministério ability, inbreeding, and subpopulation structuring are problematic do Meio Ambiente , Hirschfeld ) because of its restricted for species with highly reduced ranges or population size (Saccheri distribution, the reduced size of its population, and habitat loss. et al. , Westemeier et al. , Primack and Rodrigues ). Te most recent study of the species indicated that its current geo- Mitochondrial DNA (mtDNA) has been widely used as a molecu- graphic distribution covers no more than  km of the forests lar marker because of its usefulness in analyzing genetic diversity, on the slopes of the Araripe Plateau (Hirschfeld ). Tis area, population structure, and demographic history (Avise ). In which contains the best-conserved tracts of habitat, consists of a the present study, we sequenced the segment of mtDNA between narrow strip of forest  m wide that stretches  km between the genes ND and S rRNA in  specimens of A. bokermanni. In the extremes of the species’ range on the plateau’s northeastern many species of birds, this segment is known as the pseudo-control slope (Fig. A). Te Araripe Manakin is found only in the plateau’s region (YCR; Mindell et al. , Haring et al. , Bensch and humid forests, including the less well-preserved areas, which indi- Härlid ). For comparison, we also analyzed samples from the cates a degree of tolerance of anthropogenic habitat disturbance. sister species, A. galeata, which is distributed in the Cerrado and Te presence of running water from mountain springs and the mi- Pantanal of Brazil, northeastern Paraguay, and northeastern Bo- croclimate of the slope have been identified as the primary factors livia (del Hoyo et al. ). Although both species occur in the Cer- that influence habitat selection. rado biome, there is no evidence of sympatry or contact between Field data from  through  indicate that the species is the species. As part of a baseline effort to develop effective conser- absent from the center of its distribution (dotted circle in Fig. C), vation strategies, we used our genetic data to evaluate the demo- which means that the population is divided into a western subpop- graphic history of A. bokermanni and to evaluate the hypothesis ulation and an eastern subpopulation. Preliminary surveys indi- that the eastern and western subpopulations differ genetically. cated a population of  to  individuals (BirdLife International ). More recently, population size was assessed more system- METHODS atically by determining the number of adult males per spring and extrapolating this value according to the number and quality of Sampling.—Samples were collected between May  and Feb- springs within the known distribution. Tis resulted in a probably ruary  in the northeastern portion of the Araripe Plateau more realistic estimation of total population size (including adults (Chapada do Araripe) in the Brazilian state of Ceará (n```S, and juveniles) of ^ individuals, which is still low enough to be n```W). Te locations of collecting sites were determined by of considerable concern for conservation (Hirschfeld ). confirming the presence of the species through observations or APRIL 2010 — POPULATION GENETICS OF ARARIPE MANAKIN — 337

records of vocalizations (Fig. C). Our analysis did not include sex- was converted into the FASTA format and transferred to the BIO- ing of samples, but the sex ratio for A. bokermanni appears to be EDIT sequence editor (Hall ) for visual inspection of the : (P. S. Rêgo unpubl. data). Te specimens were captured in mist alignment and possible correction of the coding of any observed in- nets set up adjacent to the springs, and samples of blood or feather sertions or deletions. Nucleotide composition, the number of hap- bulbs were collected and stored in % ethanol. Once each bird lotypes and polymorphic sites, and the rates of divergence between was processed, a wing feather was clipped in a unique manner to the sequences of the two species were computed using MEGA, prevent resampling. Tissue samples of A. galeata from São Carlos version . (Kumar et al. ). Phylogenetic arrangements of the in the Brazilian state of São Paulo (n```S, n```W) and haplotypes of the two species were obtained through the PAUP* from Brasília (n```S, n```W) (see stars in Fig. A) were program, version . (Swofford ), using the neighbor-joining provided by researchers from the Federal University of São Carlos (NJ), maximum-parsimony (MP), and maximum-likelihood (ML) and the University of Brasília, respectively. methods. Te significance and robustness of the arrangements ob- Extraction, amplification, and sequencing of DNA.—Te tained were estimated on the basis of bootstrap values with , samples were registered according to the regulations of the Ge- pseudoreplications. Te possible presence of the hypothesized bar- netics and Molecular Biology Laboratory of the Federal Univer- rier to gene flow across the center of the distribution was tested sity of Pará and were stored in freezers until analysis. DNA was using Monmonier’s Maximum Differentiation Algorithm, run in extracted by ribonuclease digestion for  h at nC, and then pro- ALLELES IN SPACE, version . (Miller ). teinase K was added for – h (or overnight) at nC. Te product Te programs DNASP, version . (Rozas et al. ), and AR- was washed liberally in phenol-chloroform and precipitated with LEQUIN, version . (Excoffier et al. ), were used to calculate isopropanol (Sambrook et al. ). the following parameters of genetic diversity and population struc- Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the con- turing in A. bokermanni: haplotype (h; Nei ) and nucleotide (P; trol region (D-loop) of the mitochondrial genome, including the Nei ) diversity; the fixation index, FST (Weir and Hill ); hi- flanking segments of the genes ND and S rRNA. Te primers erarchical analysis of molecular variance (AMOVA; Excoffier et al. used in the present study were those described by Sorenson et al. ) and the number of migrants per generation (M Nm). NET- (): ND L- (`–ACA AAC ACC ACT AAC ATT CCA WORK, version . (Bandelt et al. ), was used to produce a hap- CC–`) and S rRNA H- (`–TCG ATT ACA GAA CAG GCT lotype network through the method of median vectors. Tis allows CCT CTA G–`). Each reaction was conducted in a final volume a comparison between the observed distribution of haplotypes and of  ML containing  ML of the mixture of deoxynucleotides (. that generated by the analysis of population structuring. M r M M mM),  L of the  Taq buffer,  L of MgCl ( mM),  L of Population growth, stability, or decline was evaluated by ana- each primer ( ng ML−), ^ ng of the total DNA, . ML of the lyzing the distribution of the number of observed pairwise hap- Taq polymerase enzyme ( U ML−; Invitrogen, Carlsbad, Califor- lotype differences, known as the mismatch distribution (Rogers nia), and sterile distilled water to complete the final reaction vol- and Harpending ), for the population as a whole and for the ume. Amplification conditions consisted of an initial -min step for two hypothesized subpopulations, using DNASP. Values expected denaturation at nC, followed by  cycles of  min at nC,  min according to the sudden-population-expansion model were com- at nC, and  min at nC. Final extension took  min at nC. puted and plotted together with the observed values, and the sig- Te products of the amplification were purified using the nificance of the sum of the squared deviations (SSD) was used to ExoSAP-IT kit (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, test the hypothesis of expansion. Tree parameters of the sudden- United Kingdom), for which  ML of the enzymatic solution was expansion model were also tested using ARLEQUIN: Harpend- added to each  ML aliquot of the PCR reaction, and then incu- ing’s raggedness (r), the values of θ before and after the expansion n n bated at  C for  min and then a further  min at  C. Te process (θ and θ), and the estimate of the time of expansion products of this purification were submitted to a new PCR reac- measured in mutational units (Tau – T). Te last is a statistical pa- tion, this time by the dideoxyterminal method (Sanger et al. ), rameter applied to the mismatch plot to assess robustness and sig- with reagents of the Big Dye kit (ABI Prism Dye Terminator Cycle nificance, as well as the time course of population expansion (t). Sequencing Ready Reaction, Applied Biosystems, Foster City, Cal- Deviations from the model of neutral evolution of infinite ifornia). Sequencing reactions were conducted in a final volume of sites were tested using Tajima’s D (Tajima ) and Fu’s Fs (Fu  ML, containing  ML of the purified samples, . ML of one of the ), run in ARLEQUIN. Tese neutrality tests are designed to primers (concentration of  ng ML−),  ML of buffer (Tris . M assess whether the population is evolving under the influence of M M pH ./MgCl  mM),  L of Big Dye mix, and . L of sterile some selective pressure or experiencing demographic events (ex- distilled water to complete the final volume. Tis volume was sub- pansion or reduction), if the null hypothesis of neutrality is re- mitted to a program of different temperatures:  cycles of  s at jected (P .). nC,  s at nC, and  min at nC. Reagents not incorporated during the reaction were eliminated by washing with isopropanol. RESULTS Te nucleotide sequences of the gene fragments produced by this reaction were determined in an ABI  (PerkinElmer, Waltham, A total of  samples of A. bokermanni were collected from  Massachusetts) automated sequencer. sites and analyzed together with  samples of A. galeata from Sequence alignment and population analyses.—Te sequences Brasília (n ) and São Carlos (n ) (Table ). In contrast to re- obtained were subjected to automatic multiple alignment with the sults in most other birds, the segments obtained by amplification CLUSTAL-W application (Tompson et al. ), using the penalty and sequencing were much smaller than expected for the control parameters suggested by Schneider (). Te file thus generated region (D-loop). By comparing sequences deposited in GenBank, 338 — RÊGO ET AL. — AUK,VOL. 127

TABLE 1. Sample information and collecting sites in Ceará (Antilophia bokermanni) and in São Paulo and Brasilia (A. galeata), Brazil.

Number of Species Collecting site a samples Sample codes

A. bokermanni (1) Sítio Vale Verde 2 CLU_01, CLU_02 (2) Fazenda Bebida Nova 2 CVV_01, CVV_02 (3) Nascente da AABEC 2 CAA_01, CAA_02 (4) Nascente do Grangeiro 2 CPI_01, CPI_02 (5) Sítio Melo 2 BME_01, BME_02 (6) Nascente do Céu 2 BCE_01, BCE_02 (7) Nascente do Farias 2 BFA_01, BFA_02 (8) Nascente dos Guaribas 1 BGA_01 (9) Nascente Riacho do Meio 2 BRM_01, BRM_02 (10) Nascente Santa Rita 2 BSR_01, BSR_02 (11) Nascente do Silvério 2 BSI_01, BSI_02 (12) Fazenda Serra do Mato 2 MHE_01, MHE_02 (13) Nascente do Furtado 3 MFU_01, MFU_02, MFU_03 (14) Nascente do Cafundó 1 MCA_01 (15) Sítio Valentim 3 MVA_01, MVA_02, MVA_03 A. galeata São Carlos–SP 5 AGA_39, AGA_40, AGA_41, AGA_42, AGA_43 Brasília–DF 15 AGA_75, AGA_78, AGA_131, AGA_134, AGA_410 AGA_454, AGA_519, AGA_545, AGA_612, AGA_639 AGA_761, AGA_795, AGA_822, AGA_906, AGA_1010

a Numbers refer to the sites marked in Figure 1C. we were able to confirm that the fragment obtained here did not and Marshall , Haring et al. , Ruokonen and Kvist ). correspond to the control region but rather to a pseudo-control re- In all samples from both species, all changes at the variable sites gion (9CR; Haring et al. ). Te genus Antilophia is therefore were transitions. consistent with the arrangement of the mitochondrial genome al- Te observed rates of nucleotide divergence in the haplotypes ready described in the Passeriformes and other bird orders (Min- of the two species were very similar (.%, mean . o . [SD]). dell et al. , Bensch and Härlid , Haring et al. ), in Te consensus phylogenetic arrangement produced by the three which a 9CR, rather than the D-loop, is found between the genes methods (NJ, MP, and ML) revealed a star-like tree with no node ND and S rRNA. resolution (data not shown). Tis similarity between the two sis- Once the sequences were edited, the segment comprised  ter species is even more evident in the haplotype network (Fig. ), base pairs (bp), of which  correspond to the pseudo-control re- which reveals two principal and divergent mitochondrial lineages gion. Te rest of the amplified segment corresponded to parts of (H_ and H_), which represent % of the specimens analyzed. the S rDNA (^ bp) and ND genes (^ bp), in addition to Te remaining specimens have haplotypes that diverge by only a tRNAGLU and tRNAPHE. No indels (insertions or deletions) were few mutations, probably derived from the more abundant lineages. observed, with the exception of a sequence found in A. galeata Te presence of most of the different haplotypes in each of the two (specimen Aga_), in which three bases had been deleted. No evi- hypothesized subpopulations (east and west) is a further indication dence was found (e.g., no stop codons in the S rDNA and ND of the overall homogeneity within the species and the absence of any genes, no double bands in the PCR, and no double peaks in the differentiation. Te most common haplotype in the population of chromatogram) to suggest that the segment is a nuclear copy of A. bokermanni (H_) was also recorded in A. galeata (Fig.  and a segment of the avian mitochondrial genome (NUMT; Quinn Table ), albeit at a lower frequency. Te second-most-common ). Te sequences that we obtained were deposited in GenBank haplotype in A. bokermanni (H_) was absent in A. galeata. (accession numbers GQ–GQ for A. bokermanni Te indices of intraspecific genetic diversity were slightly and GQ–GQ for A. galeata). lower in A. bokermanni (Table ) than in A. galeata, even though Seven variable sites (^% of the total) were identified in the the latter was represented by a smaller sample. Both haplotype (h) A. bokermanni sequences, resulting in  distinct haplotypes dis- and nucleotide (P) diversity in A. bokermanni were moderate in tributed among the collecting sites (Table ). Of these  polymor- comparison with results of other avian studies, although the val- phic sites, one was located in the ND segment,  in the region of ues were higher than those recorded for some endangered species the 9CR, and the remaining  in the S rDNA, with no variation (Questiau et al. , Asai et al. , Lopes et al. ). No dif- found in the tRNAs. Seven haplotypes were identified in the  ferences in diversity indices were found between the eastern and specimens of the sister species (A. galeata), resulting from  vari- western subpopulations. able sites and the deletion in Aga_. Te nucleotide composition A negative, nonsignificant value was obtained for the fixa- of the sequences of both species was highly similar, with a pre- tion index (FST −.) between “east” and “west” samples of dominance of adenine and cytosine (.% and .% of bases, re- A. bokermanni, corroborating the lack of differentiation between spectively) and a deficiency of guanine (.%), which corresponds the eastern and western subpopulations. Te AMOVA analysis in- to the known pattern of mitochondrial sequences in birds (Baker dicated that all the molecular variability occurred at the level of APRIL 2010 — POPULATION GENETICS OF ARARIPE MANAKIN — 339

TABLE 2. Haplotypes identiﬁed in Antilophia bokermanni (and its subpopulations; see text) and A. galeata. The columns marked in gray refer to the variable sites within the pseudo-control region (9CR)

Position of variable sites (vertical)

001112223555677 Identiﬁcation of the specimens

485565681289322 A. bokermanni Number of Haplotype specimens 278909238762257 Western subpopulation Eastern subpopulation A. galeata H_1 7 CGCAACTTATAATAC CLU_01, CVV_01, BGA_01, MFU_01 — CPI_01, BME_02, BCE_01 H_2 3 –––––T–CG–––––– CLU_02 MFU_02, MVA_02 — H_3 18 T––––T–CG––GC–T CVV_02, CAA_01, BRM_02, BSR_01, AGA_39, AGA_40; CAA_02, CPI_02, BSR_02, MHE_01, AGA_41, AGA_43 BME_01, BCE_02, MHE_02, MCA_01, BFA_01 MVA_01 H_4 1 –––––T–CG––GC–T BFA_02 – — H_5 4 T––––T–CG–––––– — BRM_01, BSI_01, — BSI_02, MFU_03 H_6 1 T–––––––––––––– —MVA_03— H_7 3 –––––T––G–––––– — — AGA_42, AGA_545, AGA_795 H_8 1 ––XXXT––G–––––– ——AGA_75 H_9 3 TA–––TCCG––GC–T — — AGA78, AGA_131, AGA_134 H_10 4 TA–––T–CG–––C–T — — AGA_410, AGA_454, AGA_519, AGA_822 H_11 3 TA–––T–CGA–GCGT — — AGA_612, AGA_639, AGA_761 H_12 2 –––––T––G–T–TA– ——AGA_906, AGA_1010

FIG. 2. The haplotype network found for Antilophia bokermanni and A. galeata. Haplotypes are represented by circles, the sizes of which are propor- tional to their frequencies. Numbers on the lines that join the circles correspond to the positions of the divergent nucleotides in the region studied. Samples of A. galeata are in black and those of A. bokermanni are in white. 340 — RÊGO ET AL. — AUK,VOL. 127

TABLE 3. Indices of genetic diversity for Antilophia bokermanni and A.galeata obtained from 788 base pairs of mtDNA between the ND6 and 12S rRNA genes (n number of individuals, Nh number of haplotypes, h haplotype diversity, and P nucleotide diversity).

Species Population nNhh o SD Po SD

A. bokermanni Western subpopulation 14 4 0.659 o 0.090 0.0046 o 0.0006 Eastern subpopulation 16 5 0.758 o 0.080 0.0037 o 0.0006 Whole population 30 6 0.722 o 0.062 0.0041 o 0.0004 A. galeata Whole population 20 7 0.884 o 0.031 0.0049 o 0.0005

the whole population (%) rather than among subpopulations, which further contradicts the hypothesis of differentiation between the eastern and western subpopulations. Monmonier’s algorithm was consistent with the hypothesis that the east–west gap serves as a potential barrier to gene flow (data not shown). Te mismatch plots were multimodally distributed (Fig. ), confirming the results of the haplotype network, which indicated two common but divergent haplotypes. Graphs with a multimodal distribution contradict the hypothesis of a process of expansion in panmictic populations and instead suggest other processes, such as hitchhiking effects or retention of ancestral polymorphisms (Rogers and Harpending ). Te P value for the comparison of observed and expected values (SSD) did not differ for any analyzed group (Table ).

Te values of θ and θ for both the total population and the two subpopulations overlapped (Table ), which indicates no expansion. Tis conclusion is further corroborated by the lack of differences in the raggedness index (Table ). Similarly, although the values of both Tajima’s D and Fu’s Fs were positive for all group- ings (Table ), none was signiﬁcant (P .).

DISCUSSION

Because little more than a decade has passed since the discovery of A. bokermanni, data on population structure and dynamics are still scarce. Te principal, integrated study of the characteristics of this bird was conducted by the nongovernmental organization Associação de Pesquisa e Preservação de Ecossistemas Aquáti- cos (Association for Research and Preservation of Aquatic Eco- systems). Te project was supported by prominent Brazilian and international institutions and resulted in the Araripe Manakin Conservation Plan (Associação de Pesquisa e Preservação de Ecos- sistemas Aquáticos ), which presents information on home range, population size, reproduction, and dispersal. In the present study, we sequenced the YCR, a small segment of ^ bp with no repetitions or indels in either A. bokermanni or A. galeata. Te utility of the YCR for both inter- and intraspecific studies of birds remains to be determined because of () the limited number of species in which it has been described, () the lack of reliable estimates of its rate of evolution, and () the difficul- ties of sequence alignment between distinct species (Riesing et al. , Kruckenhauser et al. , Nittinger et al. ). Te indices of genetic diversity in A. bokermanni (P . FIG. 3. Mismatch distribution of the sequences of the pseudo-control and h .) were moderate and differed little from those in region of Antilophia bokermanni, based on the sudden-population- A. galeata (Table ). Given the differences between the two spe- expansion model. Frequency is expressed as a fraction of all compar- cies in sample size and geographic distribution, the relative lack of isons. Expected and observed values are marked “Exp” and “Obs,” differentiation found between them is intriguing. Considering the respectively. APRIL 2010 — POPULATION GENETICS OF ARARIPE MANAKIN — 341

TABLE 4. Statistics for mismatch distribution and neutrality tests in Antilophia bokermanni and A. galeata (n number of haplotypes; T estimate of the time of expansion in mutational units; Q0 and Q1 estimate of population size before and after the expansion, respectively; r raggedness index).

Statistical parameter of the mismatch distribution Neutrality tests

Species n TQ0 Q1 r SSD Tajima’s D Fu’s Fs

A. bokermanni Western subpopulation 14 7.975 0.000–4.986 1.495–56.841 0.3455 a 0.159 a 2.35233 a 2.95544 a Eastern subpopulation 16 4.702 0.000–4.399 0.991–28.922 0.1924 a 0.077 a 1.40378 a 1.37835 a Whole population 30 7.080 0.000–6.281 1.047–109.775 0.2018 a 0.080 a 2.4732 a 2.05445 a A. galeata Whole population 20 2.013 0.000–13.893 5.042–705.962 0.1020 a 0.035 a 1.2370 a 0.98955 a aNot significant (P 0.05). combination of factors that have led A. bokermanni to the brink of LITERATURE CITED extinction, these levels of diversity might be considered relatively high in comparison with other endangered bird species (Moum ASAI, S., Y. YAMAMOTO, AND S. YAMAGISHI. . Genetic diversity and Árnason , Van Den Bussche et al. , Martínez-Cruz et and extent of gene flow in the endangered Japanese population of al. , Asai et al. ). Te results of the mismatch distribution Hodgson’s Hawk-eagle, Spizaetus nipalensis. Bird Conservation (multimodal) and the haplotype network (small number of unique International :–. haplotypes) argue against a hypothesis of demographic expansion ASSOCIAÇÃO DE PESQUISA E PRESERVAÇÃO DE ECOSSISTEMAS and for a hypothesis of retention of ancestral polymorphisms that AQUÁTICOS. . Plano de Conservação do Soldadinho-do- predate the separation of the two species. Similarly, the results of araripe (Antilophia bokermanni). [Online.] Available at www. the tests for deviations from neutrality (D and Fs) were positive, aquasis.org/. although not significant, providing further evidence against pop- AVISE, J. C. . Phylogeography: Te History and Formation of ulation expansion. Tis could also indicate a recent bottleneck. It Species. Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts. will be necessary to use other, more sensitive markers (e.g., micro- BAKER, A. J., AND H. D. MARSHALL. . Mitochondrial control satellites) to test this hypothesis. region sequences as tools for understanding evolution. Pages – We also found basically the same haplotypes in both species in Avian Molecular Evolution and Systematics (D. P. Mindell, Ed.). of Antilophia (Fig. ), which suggests incomplete lineage sorting. Academic Press, San Diego, California. Our results therefore indicate a surprising degree of similarity BANDELT, H.-J., P. FORSTER, AND A. RÖHL. . Median-joining between the species, given their disjunct ranges and pronounced networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biol- morphological (plumage color) divergence. ogy and Evolution :–. We found no evidence of population differentiation within BENSCH, S., AND A. HÄRLID. . Mitochondrial genomic rearrange- A. bokermanni, despite the fairly large gap in its distribution. Te ments in songbirds. Molecular Biology and Evolution :–.

AMOVA and FST tests indicated that the gap has not yet resulted in BIRDLIFE INTERNATIONAL. . Treatened Birds of the World. any significant substructuring of the population, at least in the mi- Lynx Edicions, Barcelona, Spain, and BirdLife International, tochondrial sequence analyzed here. Given that the present study Cambridge, United Kingdom. is the first to use the pseudo-control region as a population marker COELHO, A. G. M., AND W. A. G. SILVA. . A new species of Anti- in Passeriformes, our results should be interpreted with caution, lophia (Passeriformes: Pipridae) from Chapada do Araripe, Ceará, and we advise against making comparisons between this marker Brasil. Ararajuba :–. and other mitochondrial markers commonly used in the literature. DEL HOYO, J., A. ELLIOTT, AND J. SARGATAL,EDS. . Handbook Additional mitochondrial or nuclear markers may help reveal addi- of the Birds of the World, vol. : Cotingas to Pipits and Wagtails. tional patterns of variation within A. bokermanni and A. galeata. Lynx Edicions, Barcelona, Spain. EXCOFFIER, L., G. LAVAL, AND S. SCHNEIDER. . ARLEQUIN ACKNOWLEDGMENTS (version .): An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online : Tis study was supported by Conselho Nacional de Desenvolvi- –. mento Científico e Tecnológico (CNPq)/Museu Paraense Emílio EXCOFFIER, L., P. E. SMOUSE, AND J. M. QUATTRO. . Analysis of Goeldi (MPEG)/Universidade Federal do Pará (UFPA) through a molecular variance inferred from metric distances among DNA Ph.D. scholarship. We are very grateful to M. R. Francisco (Uni- haplotypes: Application to human mitochondrial DNA restric- versidade Federal de São Carlos, São Carlos), A. Aleixo (Museu tion data. Genetics :–. Paraense Emílio Goeldi, Belém), and A. A. Ferreira (Universidade FRANKHAM, R., J. D. BALLOU, AND D. A. BRISCOE. . Intro- de Brasília, Brasília), for providing tissue samples. We also thank duction to Conservation Genetics. Cambridge University Press, S. Ferrari for revision of the manuscript and D. McDonald for his Cambridge, United Kingdom. editing. Samples were collected with the approval of the Instituto FU, Y. X. . Statistical tests of neutrality of mutations against pop- Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ulation growth, hitchhiking and backgroud selection. Genetics (license no. /). :–. 342 — RÊGO ET AL. — AUK,VOL. 127

HALL, T. A. . BIOEDIT: A user-friendly biological sequence QUESTIAU, S., M.-C. EYBERT, A. R. GAGINSKAYA, L. GIELLY, AND alignment editor and analysis program for Windows //NT. P. TABERLET. . Recent divergence between two morphologi- Nucleic Acids Symposium Series :–. cally differentiated subspecies of bluethroat (Aves: Muscicapidae: HARING, E., L. KRUCKENHAUSER, A. GAMAUF, M. J. RIESING, AND Luscinia svecica) inferred from mitochondrial DNA sequence W. PINSKER. . Te complete sequence of the mitochondrial variation. Molecular Ecology :–. genome of Buteo buteo (Aves, Accipitridae) indicates an early split QUINN, T. W. . Molecular evolution of the mitochondrial in the phylogeny of raptors. Molecular Biology and Evolution genome. Pages – in Avian Molecular Evolution and Systemat- :–. ics (D. P. Mindell, Ed.). Academic Press, San Diego, California. HARING, E., M. J. RIESING, W. PINSKER, AND A. GAMAUF. . Evo- RIESING, M. J., L. KRUCKENHAUSER, A. GAMAUF, AND E. HARING. lution of a pseudo-control region in the mitochondrial genome of . Molecular phylogeny of the genus Buteo (Aves: Accipitridae) Palearctic buzzards (genus Buteo). Journal of Zoological System- based on mitochondrial marker sequences. Molecular Phyloge- atics and Evolutionary Research :–. netics and Evolution :–. HIRSCHFELD, E.,ED. . Rare Birds Yearbook : Te World’s ROGERS, A. R., AND H. HARPENDING. . Population growth  Most Treatened Birds. BirdLife International, Cambridge, makes waves in the distribution of pairwise genetic differences. United Kingdom. Molecular Biology and Evolution :–. KRUCKENHAUSER, L., E. HARING, W. PINSKER, M. J. RIESING, H. ROZAS, J., J. C. SÁNCHEZ-DELBARRIO, X. MESSEGUER, AND R. WINKLER, M. WINK, AND A. GAMAUF. . Genetic vs. mor- ROZAS. . DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coales- phological differentiation of Old World buzzards (genus Buteo, cent and other methods. Bioinformatics :–. Accipitridae). Zoologica Scripta :–. RUOKONEN, M., AND L. KVIST. . Structure and evolution of the KUMAR, S., K. TAMURA, AND M. NEI. . MEGA: Integrated avian mitochondrial control region. Molecular Phylogenetics and software for molecular evolutionary genetics analysis and Evolution :–. sequence alignment. Briefings in Bioinformatics :–. SACCHERI, I., M. KUUSSAARI, M. KANKARE, P. VIKMAN, W. LOPES, I. F., C. I. MIÑO, AND S. N. DEL LAMA. . Genetic diver- FORTELIUS, AND I. HANSKI. . Inbreeding and extinction in sity and evidence of recent demographic expansion in waterbird a butterfly metapopulation. Nature :–. populations from the Brazilian Pantanal. Brazilian Journal of SAMBROOK, J., E. F. FRITSCH, AND T. MANIATIS. . Molecular Biology  (Supplement):–. Cloning. A Laboratory Manual, nd ed. Cold Spring Harbor Lab- MARTÍNEZ-CRUZ, B., J. A. GODOY, AND J. J. NEGRO. . Popu- oratory Press, Cold Spring Harbor, New York. lation genetics after fragmentation: Te case of the endangered SANGER, F., S. NICHLEN, AND A. R. COULSON. . DNA Sequenc- Spanish Imperial Eagle (Aquila adalberti). Molecular Ecology ing with chain-termination inhibitors. Proceedings of the National :–. Academy of Sciences USA :–. MILLER, M. P. . Alleles in space (AIS): Computer software for SCHNEIDER, H. . Método de Análise Filogenética: Um Guia the joint analysis of interindividual spatial and genetic informa- Prático. Editora Holos–Sociedade Brasileira de Genética Press, tion. Journal of Heredity :–. Ribeirão Preto. MINDELL, D. P., M. D. SORENSON, AND D. E. DIMCHEFF. . SORENSON, M. D., J. C. AST, D. E. DIMCHEFF, T. YURI, AND D. P. Multiple independent origins of mitochondrial gene order in MINDELL. . Primers for a PCR-based approach to mitochon- birds. Proceedings of the National Academy of Sciences USA drial genome sequencing in birds and other vertebrates. Molecu- :–. lar Phylogenetics and Evolution :–. MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE. . Lista Nacional das Espé- SWOFFORD, D. L. . PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsi- cies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção. [Online.] mony (*and Other Methods), version V.b. Sinauer Associates, Available at www.meioambiente.es.gov.br/download/NovaLista Sunderland, Massachusetts. FaunaAmeacaMMA.pdf. TAJIMA, F. . Statistical method for testing the neutral mutation MOUM, T., AND E. ÁRNASON. . Genetic diversity and population hypothesis by DNA polymorphism. Genetics :–. history of two related seabird species based on mitochondrial DNA THOMPSON, J. D., D. G. HIGGINS, AND T. J. GIBSON. . CLUSTAL control region sequences. Molecular Ecology :–. W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence align- NEI, M. . Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University ment through sequence weighting, position-specific gap penalties Press, New York. and weight matrix choice. Nucleic Acids Research :–. NITTINGER, F., E. HARING, W. PINSKER, M. WINK, AND A. GAMAUF. VAN DEN BUSSCHE, R. A., S. R. HOOFER, D. A. WIEDENFELD, D. H. . Out of Africa? Phylogenetic relationships between Falco WOLFE, AND S. K. SHERROD. . Genetic variation within biarmicus and the other hierofalcons (Aves: Falconidae). Journal and among fragmented populations of Lesser Prairie-Chickens of Zoological Systematics & Evolutionary Research :–. (Tympanuchus pallidicinctus). Molecular Ecology :–. PRIMACK, R. B., AND E. RODRIGUES. . Biologia da conservação. WEIR, B. S., AND W. G. HILL. . Estimating F-statistics. Annual Midiograf Press, Londrina. Review of Genetics :–. PRUM, R. O. . A test of the monophyly of the manakins (Pipridae) WESTEMEIER, R. L., J. D. BRAWN, S. A. SIMPSON, T. L. ESKER, R. W. and of the cotingas (Cotingidae) based on morphology. Occasional JANSEN, J. W. WALK, E. L. KERSHNER, J. L. BOUZAT, AND K. N. Papers of the Museum of Zoology of the University of Michigan, PAIGE. . Tracking the long-term decline and recovery of an no. . isolated population. Science :–. PRUM, R. O. . Syringeal morphology, phylogeny, and evolution of the Neotropical manakins (Aves: Pipridae). American Museum of Natural History Novitates :–. Associate Editor: D. B. McDonald

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

Antilophia bokermanni (Aves: Pipridae): Parâmetros reprodutivos, sistema de acasalamento social e genético e o papel

da seleção sexual

Milene Garbim Gaiotti

Orientadora: Regina H. F. Macedo

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ecologia da Universidade de Brasília, como requisito para a obtenção do grau de Doutora em Ecologia.

Brasília, DF

2016 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente aos meus pais que sempre me apoiaram e me incentivaram a lutar pelos meus objetivos, e que me deram força em todos os momentos difíceis durante esses anos. Longe ou perto, me ajudando a procurar ninhos ou apenas através do telefone, vocês sempre estiveram comigo quando mais precisei e por isso sou muito grata.

À Regina, que foi muito mais que uma orientadora acadêmica, você é uma inspiração de mulher, pesquisadora e mãe. Obrigada por acreditar em mim, por me proporcionar tantas oportunidades que farão diferença eternamente na minha vida pessoal e profissional.

Agradeço imensamente aos meus alunos e companheiros de campo: Wilmara, João,

Verônica, Eveny e Tatyane. Sem vocês esse trabalho provavelmente teria sido muito difícil de realizar. Eu aprendi muito com vocês, a experiência de ensinar essa profissão que tanto amo, principalmente em campo foi incrível. Obrigada por enfrentarem tanto morros, chuvas e dificuldades que só nós sabemos que encontramos nesses quatro anos no campo.

Também gostaria de agradecer toda minha família que mesmo de forma indireta também passou por todas as fases junto comigo, todos os Natais ausentes (ou corridos), obrigada por compreenderem meu trabalho, ou pelo menos aceitarem. Ao meu irmão e cunhada que foram passar Natal comigo quando os ninhos não me deixaram viajar. Agradeço também ao Robson Ávila que de certa forma foi o responsável por eu morar no Crato, e ter a oportunidade de estudar o soladinho do Araripe, obrigada por todo o apoio.

Aos meus amigos antigos e recentes, em especial ao Drausio Honório que é quase um irmão e sempre me deu tanta força em todos os momentos. Aos meus amigos do norte, que tornaram a minha estadia fora do Brasil tão fácil que nem queria voltar mais, em especial ao

Brian Wiese, que tem sido um grande parceiro, sempre me incentivando e me colocando pra cima e até me ajudando em campo, sem você essa reta final seria muito mais difícil. Também quero agradecer aos meus colegas da UNB pelas risadas e suporte: Pedro Moraes, Guilherme,

2 Desireé, Ingrid e especialmente ao Pedro Diniz e à Lilian (ainda conto como UNB), que me socorreram todas as dúvidas e que me ajudaram tanto, sem vocês acho que eu não conseguiria!!

Agradeço todo o pessoal do Laboratório de Ornitologia de Cornell, em especial ao

Prof. Mike Webster, Prof. Irby Lovette e à Dra. Bronwyn Butcher, pela oportunidade, paciência, tempo e imensurável aprendizado que me proporcionaram. Também quero agradecer ao Matt Medler pela tão atenciosa recepção durante minha estadia em Ithaca.

Ao CEMAVE/ICMBio pelo fornecimento das anilhas metálicas. Ao IBAMA pela concessão das licenças. À Aquasis pelo apoio inicial no campo.

Agradeço ao Programa de Pós-graduação em Ecologia da Universidade de Brasília, à

Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e CNPq (Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelas bolsas concedidas no Brasil e no exterior. Agradeço às fontes de financiamento deste projeto: Universidade de Brasília,

FAP-DF (Fundação de Apoio à Pesuisa), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico), ABS (Animal Behavior Society), AFO (Association of Field

Ornithologists), OC (Ornithological Council), The Rufford Foundation e Idea Wild.

Agradeço aos membros da banca, professores doutores Marina Anciães, Miguel

Marini, Eduardo Bessa, Carlos Bianchi e Ricardo Machado, pela atenção e contribuições ao meu trabalho.

3 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL...... 14 ESPÉCIE DE ESTUDO ...... 17 ÁREA DE ESTUDO ...... 19 REFERÊNCIAS ...... 23

CAPÍTULO 1 - Biologia reprodutiva de Antilophia bokermanni (Aves: Pipridae) ...... 29 INTRODUÇÃO ...... 30 MÉTODOS ...... 33 Captura e marcação dos indivíduos ...... 33 Sexagem ...... 34 Determinação da estação reprodutiva e volume de chuvas ...... 34 Cuidado parental ...... 35 Parâmetros de nidificação ...... 36 Territórios reprodutivos ...... 38 Análises estatísticas ...... 39 RESULTADOS ...... 43 Captura, marcação e definição do período reprodutivo ...... 43 Construção e descrição dos ninhos ...... 46 Descrição dos ovos e incubação ...... 48 Período de ninhego, análises de sobrevivência e modelos ...... 50 Cuidado parental ...... 60 Territórios reprodutivos ...... 63 DISCUSSÃO ...... 65 REFERÊNCIAS ...... 74 ANEXO 1. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 47 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1)...... 86 ANEXO 2. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 74 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis:

4 diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Sem co-variável altura do ninho em relação ao solo...... 87 ANEXO 3. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 55 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Sem co-variável diâmetro externo...... 88 ANEXO 4. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para período de ninhego (N= 28 ninhos), de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1)...... 89

CAPÍTULO 2 - Intersexual differences in the diet of the critically endangered and endemic Araripe manakin (Aves: Pipridae) ...... 91 ABSTRACT ...... 92 RESUMO ...... 93 INTRODUCTION...... 94 METHODS ...... 97 RESULTS ...... 99 DISCUSSION ...... 105 ACKNOWLEDGMENTS ...... 108 LITERATURE CITED ...... 109

CAPÍTULO 3 - Variação nos caracteres secundários de machos de Antilophia bokermanni, e sua relação com sucesso reprodutivo ...... 116 INTRODUÇÃO ...... 117 MÉTODOS ...... 121 Índice de Condição corporal ...... 121 Coleta e análise da plumagem ...... 122 Gravação e análise do canto ...... 124 Coleta de sangue e imunologia ...... 125 Extração de DNA e análises moleculares de paternidade ...... 125 Sucesso reprodutivo ...... 129 Análises estatísticas ...... 130 RESULTADOS ...... 133

5 Condição corporal e imunologia ...... 133 Plumagem ...... 133 Canto ...... 134 Paternidade ...... 137 Hipótese 1: O índice de condição corporal está associado à condição imunológica? ...... 137 Hipótese 2: A qualidade do macho (ICC e condição imunológica) está refletida nos caracteres sexuais secundários?...... 139 Hipótese 3: Machos de maior qualidade (na condição corporal, caracteres sexuais secundários ou territorialidade) tem maior sucesso reprodutivo? ...... 141 DISCUSSÃO ...... 146 CONCLUSÕES ...... 152 REFERÊNCIAS ...... 153 ANEXO 1- Frequência (em %) de células do sistema imune nos esfregaços sanguíneos de machos de Antilophia bokermanni...... 166 ANEXO 2- Valores médios (a partir das 3 medidas de conjuntos de penas), para cada macho de Antilophia bokermanni por parte do corpo de onde a pena foi coletada e as variáveis: brilho (B2), croma (S1.UV para penas brancas e S1.Red para as vermelhas), contraste (S6) e matiz (H2)...... 167

CAPÍTULO 4 - Sistema de acasalamento social e genético de Antilophia bokermanni (Aves: Pipridae) ...... 171 INTRODUÇÃO ...... 172 MÉTODOS ...... 178 Índice de Condição corporal (ICC) das fêmeas e ninhegos...... 178 Sucesso de Pareamento ...... 178 Determinação da paternidade genética ...... 179 Similaridade genética (parentesco) e heterozigosidade ...... 181 Análises estatísticas ...... 181 RESULTADOS ...... 182 DISCUSSÃO ...... 187 REFERÊNCIAS ...... 194

6 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – A- Macho adulto de A. bokermanni B- Fêmea adulta de A. bokermanni... 19

Figura 2 – A imagem superior indica os limites da APA da Chapada do Araripe entre os estados do Piauí, Ceará e Pernambuco. O retângulo vermelho destaca a FLONA do Araripe. A imagem inferior é uma ampliação da região que correspondente ao estado do Ceará, e em verde está indicada a área de ocorrência de A. bokermanni (imagem: Aquasis, 2006)...... 21

Figura 3 – Localização das seis áreas amostradas no presente estudo na Chapada do Araripe entre os anos de 2013 a 2016...... 21

Figura 4 – Distribuição das cinco áreas amostradas no município de Crato-CE, na Chapada do Araripe...... 22

CAPÍTULO 1

Figura 1- Câmera Multilaser DC115 camuflada e posicionada a 2m do ninho para a coleta de dados de cuidado parental de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe-CE..36

Figura 2- Número de ninhos de Antilophia bokermanni encontrados e número de ninhos com ninhegos em relação ao volume de chuvas durante as três estações reprodutivas amostradas na Chapada do Araripe-CE...... 46

Figura 3- Ninho de Antilophia bokermanni em fase inicial de construção, na Chapada do Araripe-CE...... 47

Figura 4- Ninho de Antilophia bokermanni finalizado, na Chapada do Araripe-CE. . 47

Figura 5- Ovos de Antilophia bokermanni no ninho, na Chapada do Araripe- CE. .... 49

Figura 6- Atividades de cuidado parental realizadas pelas fêmeas de Antilophia bokermanni na Chapada do Araripe- CE. A: vigiando o ninho; B: Alimentando ninhego; C: sentada no ninho...... 61

Figura 7- Distribuição de 16 territórios reprodutivos estabelecidos por machos de Antilophia bokermanni em uma das áreas amostradas, na Chapada do Araripe-CE. ... 64

Figura 8- Tamanhos de territórios reprodutivos (m2) de machos de A. bokermanni e a presença (1) ou ausência (0) de água no seu interior, na Chapada do Araripe- CE...... 65

7 CAPÍTULO 2

Figure 1. Percentage of each gathering method performed by male and female Araripe manakins during focal observations (n = 15 females and 11 males)...... 103

Figure 2. Percentage of each gathering method performed by male and female Araripe manakins during the morning (0900 to 10:30 hr; n = 10 females and 7 males) and afternoon (1500 to 1600 hr; n = 11 females and 9 males) observation sessions...... 104

Figure 3. Percentage of time spent by male and female Araripe manakins in each strata during the morning (0900 to 10:30 hr; n = 10 females and 7 males) and afternoon (1500 to 1600 hr; n = 11 females and 9 males) observation sessions...... 104

CAPÍTULO 3

Figura 1- Penas coletadas de um macho de Antilophia bokermanni preparadas para medição no espectrofotômetro...... 123

Figura 2- Curvas de reflectância das cores de plumagem de cada parte do corpo (ventre, dorso, topete, manto) dos machos de Antilophia bokermanni amostrados durante duas estações reprodutivas (2013/2014 e 2014/2015) na Chapada do Araripe-CE...... 134

Figura 3- Espectrograma do canto completo de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni...... 135

Figura 4- Espectrograma do assobio de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni...... 135

Figura 5- Espectrograma do canto parcial de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni...... 136

Figura 6- Espectrograma do chamado de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni...... 136

Figura 7- Espectrograma do assobio dobrado de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni...... 136

Figura 8- Espectrograma do canto dobrado de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni...... 137

Figura 9- Correlação entre o índice de condição corporal e a frequência de linfócitos em machos de Antilophia bokermanni...... 138

8 Figura 10- Correlação entre o índice de condição corporal e a frequência de heterófilos em machos de Antilophia bokermanni...... 139

Figura 11- Correlação entre o índice de condição corporal e a reflectância de ultravioleta (UV) na plumagem branca do dorso dos machos de Antilophia bokermanni...... 140

Figura 12- Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e o índice de condição corporal dos machos de Antilophia bokermanni que defenderam território. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples...... 142

Figura 13- Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e o tamanho do território defendido por machos de Antilophia bokermanni. A reta em vermelho representa o modelo previsto por regressão linear simples...... 142

Figura 14- Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e a condição corporal dos machos (com e sem território) de Antilophia bokermanni. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples...... 143

Figura 15- Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e a complexidade do canto (tamanho do repertório) dos machos de Antilophia bokermanni. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples...... 144

Figura 16- Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e as propriedades acústicas do canto dos machos de Antilophia bokermanni. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples...... 145

CAPÍTULO 4

Figura 1- Número de alelos incompatíveis (Trio mismatches) entre pais sociais e seus filhotes e a possibilidade dos machos sociais serem os pais biológicos dos filhotes, levando em consideração as características genéticas das mães (Trio LOD score)...... 180

Figura 2- Número de alelos incompatíveis (Trio mismatches) entre pais confirmados (genetic father) e seus filhotes e a possibilidade destes machos serem os pais biológicos

9 dos filhotes, levando em consideração as características genéticas das mães (Trio LOD score)...... 180

Figura 3- Distribuição dos territórios de cinco machos que perderam a paternidade em seus ninhos, mas foram pais extra-par em outros ninhos (indicados pelas setas), na área Grangeiro...... 184

10 LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Tabela 1. Espécies de plantas utilizadas como suporte de ninho de Antilophia bokermanni e o número de ninhos registrados em cada uma delas, na Chapada do Araripe, CE, nas estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016...... 48 Tabela 2. Sobrevivência diária (DSR) geral (ovos e ninhegos juntos) por área amostrada e por período reprodutivo amostrado (Ano), com tempo constante, de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, nas estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016...... 51 Tabela 3. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para sobrevivência diária geral (fase de ovos e ninhegos, N= 47 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1)...... 51 Tabela 4. Sobrevivência diária (DSR) para período de incubação (fase de ovos), por área amostrada e período reprodutivo amostrado (Ano), com tempo constante, de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016...... 52 Tabela 5. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 47 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1). Sem co- variável área amostrada...... 53 Tabela 6. Sobrevivência diária (DSR) para período de ninhego, por área amostrada e por período reprodutivo (Ano) amostrado com tempo constante para de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016...... 54 Tabela 7. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para período de ninhego (N= 28 ninhos), de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1). Sem co- variável área amostrada...... 56 Tabela 8. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para período de ninhego (N= 50

11 ninhos), de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Sem co-variável altura do ninho em relação ao solo (height)...... 57 Tabela 9. Importância relativa, beta estimate (B) e erro padrão (±EP) das variáveis dos modelos da taxa de sobrevivência diárias de ninhos de Antilophia bokermanni nos períodos de incubação, ninhego e geral (incubação e ninhego), na Chapada do Araripe, Ceará, durante as três estações reprodutivas amostradas (2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016). As colunas numéricas (1, 2, 3 e 4) são referentes a cada resultado da seleção de modelos com tempo constante (Tc), tempo Linear (Tl) e tempo quadrático (Tq): 1- todas as variáveis inclusas; 2- sem a co-variável área; 3- sem a co-variável altura do ninho em relação ao solo (Altura) e 4- sem a co-variável diâmetro externo (Diamextern.). Tempo constante (Tc), Tempo Linear (Tl), Tempo quadrático (Tq)...... 58 Tabela 10. Tempo despendido pela fêmea de Antilophia bokermanni (em horas) para cada comportamento de cuidado relativo aos ninhegos (N=20 ninhos), na Chapada do Araripe- CE...... 62 CAPÍTULO 2 Table 1. Occurrence frequency (OF) and numerical frequency (NF) for all food items consumed by Araripe manakins (N=94)...... 100 Table 2. Dietary Importance Index (DIi) of each food item consumed by female (N=57) and male (N=37) Araripe manakins (N=94)...... 100 Table 3. Occurrence frequency (OF) and numerical frequency (NF) for food items consumed by female (N=57) and male (N=37) Araripe manakins...... 101 CAPÍTULO 3 Tabela 1. Descrição dos 15 pares de primers utilizados nas análises de microsatélite, suas respectivas temperaturas de anelamento (TA) e referências bibliográficas...... 128 Tabela 2. Características dos 15 microssatélites amplificados em Antilophia bokermanni para os 359 indivíduos amostrados, utilizados nas análises de paternidade e maternidade no programa Cervus 3.0.3 (Kalinowski et al. 2007). Hobs: Heterozigosidade observada; Hexp: Heterozigosidade esperada; NE-1P: probabilidade de exclusão para um pai ou mãe candidatos; NE-2P: probabilidade de exclusão para um candidato dado o genótipo da mãe (para filhotes com a maternidade confirmada); P(HW): probabilidade do equilíbrio de Hardy-Weinberg e FN: frequência de alelos nulos...... 129 Tabela 3. Tamanhos amostrais para as variáveis analisadas para machos de Antilophia bokermanni, com referência às hipóteses testadas...... 131 Tabela 4. Valores dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2) resultantes das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis de complexidade do canto de machos de Antilophia bokermanni...... 132

12 Tabela 5. Valores dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2) resultantes das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis dos componentes acústicos do canto de machos de Antilophia bokermanni...... 132 Tabela 6. Valores dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2) resultantes das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis de coloração da plumaegm de machos de Antilophia bokermanni...... 132 Tabela 7. Resultados dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2), das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis da plumagem do ventre de machos de Antilophia bokermanni que defenderam território...... 146

13 INTRODUÇÃO GERAL

A seleção sexual segundo Darwin (1859, 1871) é a seleção que surge a partir da variância no sucesso de acasalamento dos indivíduos, através da competição entre membros de um sexo por membros do sexo oposto (intra-sexual) e escolha diferencial de membros de um sexo pelo sexo oposto (inter-sexual). Até o advento de técnicas moleculares nos estudos de sistema de acasalamento de aves, era considerado que a seleção sexual desempenhava um papel menor nas espécies monogâmicas (Danchin et al. 2005). A fraca variação aparente do sucesso reprodutivo dos machos parecia indicar esse baixo potencial da seleção sexual.

Assim, não parecia necessário utilizar esse tipo de abordagem para explicar a evolução da monogamia nessas espécies (Danchin et al. 2005).

As aves foram, por muitos anos, erroneamente consideradas um grupo quase inteiramente monogâmico (93% das espécies), uma vez que o estudo do sistema de acasalamento se restringia a observação comportamental (Lack 1968). No entanto, no fim da década de 80, a abordagem molecular nas análises de paternidade de alguns estudos, mostraram que em muitas espécies consideradas até então monogâmicas, ocorriam fertilizações extra-par (FEP) (Griffith et al. 2002). Houve uma transformação na forma de interpretar os comportamentos reprodutivos desse grupo. Foi revelado que apenas 14% das espécies seriam geneticamente monogâmicas e que 86% das espécies antes consideradas monogâmicas são na verdade poligínicas, sendo que em média 11,1% dos ninhegos e 18,7% das ninhadas são provenientes de fertilização extra-par (Griffith et al. 2002).

As análises genéticas de paternidade indicaram a existência de variação no sucesso reprodutivo entre machos, o que permitiu explicar a existência de características e comportamentos exagerados nessas espécies. Tornou-se necessário separar os tipos de sistemas de acasalamento em social e genético (ou sexual) ( Bennett & Owens 2002, Griffith et al. 2002, Danchin et al. 2005). O sistema de acasalamento social é aquele onde os machos

14 podem auxiliar nos cuidados com a prole, porém não necessariamente serem os pais biológicos desta (Bennett & Owens 2002). Enquanto que o sistema genético permite a identificação dos pais biológicos da prole, que podem ser parceiros extra-pares, e não obrigatoriamente auxiliar no cuidado parental nem conviver socialmente com a fêmea

(Winckler & Seibt 1983, Gotway 1996).

Essa nova abordagem levou pesquisadores a acreditar que a seleção sexual em aves monogâmicas poderia ser forte o suficiente para explicar a evolução de caracteres sexuais secundários (Prum 1998, Danchin et al. 2005). Tradicionalmente, o dimorfismo sexual seria uma consequência da variação entre espécies no sistema de acasalamento e no padrão de cuidado parental (Darwin 1871, Wallace 1889). A poligamia levaria o sexo competitivo a ser maior ou mais ornamentado que o sexo que escolhe o parceiro, enquanto que a ampla diferença entre os sexos no cuidado parental levaria o sexo que efetua o cuidado da prole a possuir uma plumagem mais críptica (Owens & Hartley 1998). Como o potencial sucesso reprodutivo esperado para os machos deve ser maior em espécies poligínicas que monogâmicas, é comumente assumido que o dicromatismo sexual deva ser maior em espécies com sistemas de acasalamento poligínicos (Bennett & Owens 2002).

A proporção de fertilizações resultantes de cópulas fora do par social é chamada de taxa de fertilização extra-par (FEP) (Westneat et al. 1990), sendo essa bastante variável entre espécies e mesmo dentro de populações (Griffith et al. 2002). Pode ainda, ser bastante alta em algumas espécies socialmente monogâmicas, ultrapassando 25%, e em alguns casos excede

55% (Griffith et al. 2002). Alguns fatores têm sido considerados fundamentais para essa variação, sendo que explicações baseadas sobre a mortalidade dos adultos (Mauck et al. 1999,

Wink & Dyrcz 1999), o cuidado parental (Mulder et al. 1994), a diversidade genética (Petrie

& Lipsitch 1994) e a densidade de ninhos (Stutchbury & Morton 1995, Stutchbury et al.

1998) são as que possuem maior suporte empírico para explicar as variações de FEP em aves.

15 No entanto, Griffith et al. (2002) chamam a atenção para a possibilidade de diversos fatores estarem envolvidos ao mesmo tempo.

Além disso, em muitas espécies de aves, existe o controle por parte das fêmeas sobre as cópulas e transferência de esperma usado na fertilização, o que pode também influenciar na variação das taxas de FEP, através da proporção de fêmeas numa população que buscam por cópulas extra-par (Birkhead & Møller 1993, Petrie & Kempenaers 1998). Portanto, para compreender essa variação de FEP entre espécies ou populações, deve-se avaliar os fatores que levam fêmeas a buscar parceiros extra-par (Petrie & Kempenaers 1998). Muitas abordagens foram feitas nesse sentido, procurando entender quais os benefícios desse comportamento para as fêmeas (Fisher 1915, Zahavi 1975, Double & Cockburn 2000, Eshel et al. 2000, Griffith et al. 2003, Kokko & Jennions 2008).

Esses benefícios podem ser indiretos, onde fêmeas podem escolher machos com melhores genes e assim produzir uma prole mais saudável e/ou atraente (Zahavi 1975, Møller

& Alatalo 1999, Eshel et al. 2000, Pryke & Andersson 2005) ou devido à compatibilidade genética dos indivíduos envolvidos (Zeh & Zeh 1988). Ainda, os benefícios podem ser diretos, em termos de fecundidade acrescida (Andersson 1994), acesso a recursos na forma de presentes nupciais e/ou melhor qualidade do território (Thornhill & Alcock 1983, Alatalo et al. 1986). A fêmea pode também se beneficiar diretamente quanto à qualidade do cuidado parental (Hoelzer 1989, Norris 1990, Keyser e Hill 2000) ou ainda proteção contra predadores e outros machos (Danchin et al. 2005). No entanto, existem custos para fêmeas que buscam FEP, como a perda do parceiro social e seu investimento na prole (Petrie &

Kempenaers 1998), assim como a maior exposição a doenças sexualmente transmissíveis e parasitas (Sheldon 1993, Höglund & Sheldon 1998).

A preferência da fêmea por determinados machos ao invés de outros, parece indicar a boa qualidade (genética ou morfológica) destes escolhidos (Dvorak 1984, Griffith & Immler

16 2009). No entanto, dado o custo associado a essa preferência, tal escolha também pode variar

em função da qualidade das fêmeas (Riebel et al. 2010). Alguns estudos demonstram que

fêmeas de baixa qualidade copulam com machos de baixa qualidade, enquanto fêmeas de alta

qualidade copulam com machos de alta qualidade (Poulin & Vickery 1996, Rolff 1998,

Burley & Foster 2006, Holveck & Riebel 2010). Isso implica na existência de um mecanismo

que permita às fêmeas avaliar sua própria condição (Burley & Foster 2006).

A seleção sexual pode ser considerada, em alguns casos, um processo co-evolutivo

entre machos e fêmeas (Lande 1981, Kirkpatrick 1982, Kirkpatrick & Hall 2004, Andersson

& Simmons 2006). A variação na preferência da fêmea pode, então, tanto aumentar ou

diminuir consideravelmente a força e/ou direção da seleção sexual, e por isso tem um grande

impacto na evolução dos traços secundários nos machos (Poulin & Vickery 1996, Rolff 1998,

Cotton et al. 2006). Assim, entender como, e se, machos expressam informações sobre sua

qualidade genética no seu fenótipo ou através de determinados comportamentos, como um

sinal honesto ou não (Petrie et al. 1998, Forstmeier et al. 2002, Cotton et al. 2006, Taylor &

McGraw 2013), e como a preferência e a avaliação das fêmeas variam (Beehler & Foster

1988, Pfennig & Tinsley 2002, Cotton et al. 2006, Caro et al. 2010), é fundamental para

compreendermos o papel da seleção sexual no sistema de acasalamento das espécies.

ESPÉCIE DE ESTUDO

O soldadinho do Araripe (Antilophia bokermanni) é uma espécie Passeriforme da

família Pipridae e uma das recentes descobertas da ornitologia brasileira, descrita há apenas

18 anos. Encontra-se criticamente ameaçada, com população estimada em 800 indivíduos e

área de ocorrência de apenas 31 Km² (Rêgo et al. 2010, IUCN 2015). A espécie é endêmica

das matas de encosta da Chapada do Araripe localizada na divisa dos estados do Ceará,

Pernambuco e Piauí, porém sua ocorrência é restrita à porção do Ceará. Possui dimorfismo

17 sexual evidente, sendo os machos brancos, com rêmiges e retrizes negras, além de possuírem um manto vermelho (grená) que se estende desde a cabeça até o meio do dorso, enquanto que as fêmeas são verdes, mais escuro no dorso e mais claro no ventre (Coelho & Silva 1998)

(Figura 1). Os indivíduos jovens apresentam a mesma coloração da fêmea. Machos sub- adultos fazem a muda para a plumagem de machos adultos iniciando pela coloração do topete e manto e depois pelo branco do corpo e negro da cauda e asa (dados não publicados). Na sua descrição original consta que os machos são maiores e possuem as asas e cauda mais longas que as fêmeas (Coelho & Silva 1998).

Nesses 18 anos desde sua descoberta os esforços para a conservação e aumento populacional da espécie têm sido direcionados quase que exclusivamente para a educação ambiental e preservação das áreas de ocorrência (Silva & Rêgo 2004). No entanto, quase nada se sabe a respeito de sua biologia, ecologia ou comportamentos. Existem apenas quatro estudos empíricos sobre a espécie, sendo estes sobre: a descrição da espécie (Coelho & Silva

1998), determinação do período reprodutivo através da vocalização dos machos (Girão &

Souto 2005), plantas utilizadas como suporte para nidificação (Linhares et al. 2010), e variabilidade genética da população (Rêgo et al. 2010). Porém, os indivíduos nunca foram anilhados em nenhum desses estudos, dificultando, por exemplo, a determinação com maior precisão do tamanho e dinâmica da população, fatores fundamentais para adequação do status de ameaça da espécie.

Nenhum estudo empírico sobre o sistema de acasalamento social ou genético, nem sobre a existência de cópulas extra-par e comportamentos reprodutivos do soldadinho do

Araripe foi realizado até o momento. Assume-se que a espécie seja socialmente monogâmica devido ao estudo realizado por Marini e Cavalcanti (1992) sobre o sistema de acasalamento da espécie irmã, Antilophia galeata, no Brasil Central. Tais informações, assim como outros

18 dados de sua história natural e comportamento são cruciais, principalmente devido a seu

status de ameaça, para proposição de planos de manejo mais efetivos.

A B

Figura 1 – A- Macho adulto de A. bokermanni B- Fêmea adulta de A. bokermanni

ÁREA DE ESTUDO

O estudo foi realizado na Chapada do Araripe localizada no domínio da Caatinga,

porém a área destoa da região semiárida que a circunda, pelo volume de chuvas (média anual:

934 mm) e altitude (acima de 800m em relação ao nível do mar). A Chapada estende-se pelos

estados do Ceará, Pernambuco e Piauí e possui uma área de aproximadamente 4.500Km².

Apresenta uma vegetação bastante diversificada dominada por quatro tipos de fitofisionamias

principais: Mata seca, Carrasco, Cerrado e Mata úmida (mata de encosta) (Figueira 1989). A

permeabilidade da formação rochosa da camada superior da Chapada do Araripe em conjunto

com a chuva permite a origem de diversas nascentes na porção norte-oriental, correspondente

ao estado do Ceará (Inesp 2009), onde são encontradas as matas úmidas que são o habitat do

soldadinho do Araripe.

19 A porção da Chapada onde é encontrada a espécie está sob regime de proteção da

Área de Proteção Ambiental (APA) do Araripe, uma área de uso sustentável. Mais recentemente a espécie foi registrada em áreas de grotas que correspondem a Floresta

Nacional (FLONA) do Araripe no topo da Chapada, que por ser uma unidade de proteção integral é fundamental para a permanência da espécie, além de servir como zona de amortecimento da encosta, onde se concentra mais de 95% da população do soldadinho do

Araripe (Figura 2) (Aquasis 2006).

A distribuição da espécie não é uniforme nessa faixa de mata úmida, e sim concentrada junto às nascentes e córregos, fazendo com que a área de ocorrência seja de apenas 31 km² no terreno sinuoso da encosta da Chapada do Araripe. Na região se encontram

130 nascentes, sendo que em 91 dessas foi registrada a presença do soldadinho do Araripe e em 74 nascentes foram registrados machos vocalizando, comportamento utilizado como indicativo de sítios de nidificação (Aquasis 2006). Este estudo foi realizado em dois munícipios no estado do Ceará: Barbalha e Crato (Figura 3), em seis áreas distintas (1 em

Barbalha e 5 em Crato), sendo a de Barbalha denominada Riacho do Meio, e as de Crato:

Grangeiro, Nascente, Caianas, Advogados e Serrano (Figura 3 e 4).

Figura 2- A imagem superior indica os limites da APA da Chapada do Araripe entre os estados do Piauí, Ceará e Pernambuco. O retângulo vermelho destaca a FLONA do Araripe. A imagem inferior é uma ampliação da região que correspondente ao estado do Ceará, e em verde está indicada a área de ocorrência de A. bokermanni (imagem: Aquasis, 2006).

Figura 3- Localização das seis áreas amostradas no presente estudo na Chapada do Araripe entre os anos de 2013 a 2016.

Figura 4- Distribuição das cinco áreas amostradas no município de Crato-CE, na Chapada do Araripe.

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Capítulo 1

Biologia reprodutiva de Antilophia bokermanni (Aves: Pipridae)

29 INTRODUÇÃO

O conhecimento dos parâmetros reprodutivos de uma espécie é a base para a

formulação de questões sobre sua ecologia, evolução e comportamento (Bartholomew 1986,

Rotenberry & Wiens 1989). Apesar da importância do conhecimento de tais parâmetros para

muitas aves, principalmente neotropicais, dados básicos são escassos e muitas vezes

inexistentes para grande número de espécies (Martin 1996, Stutchbury & Morton 2001,

Ricklefs 2012, Marini et al. 2012).

Sabe- se que as diferentes estratégias reprodutivas são moldadas por pressões seletivas

(Pianka 1976) e envolvem inúmeras “escolhas” evolutivas, que determinam quando

indivíduos devem começar a reproduzir, quantos ninhegos produzir por estação reprodutiva,

o tempo de incubação e quanto cuidado dedicar aos ninhegos, entre outros aspectos da

reprodução (Ricklefs 2003). Embora essas informações sejam essenciais para o

desenvolvimento de estratégias de conservação e planos de manejo, estudos que

disponibilizam informações coletadas por longos períodos são praticamente inexistentes em

algumas regiões do Brasil, especialmente para espécies de aves endêmicas (Duca & Marini

2011). O número de estudos sobre parâmetros reprodutivos de aves brasileiras cresceu

consideravelmente nos últimos anos, mas a maioria deles são para espécies do Cerrado

(Macedo 1992, Bianchi 1998, Amaral & Macedo 2003, Carvalho et al. 2007, Dias et al.

2009, Marini et al. 2012).

Apesar das informações ainda escassas, alguns padrões têm sido observados nos

estudos existentes, principalmente quanto às divergências nos tamanhos de ninhadas, taxas de

predação, sucesso reprodutivo e cuidado parental entre espécies, populações e regiões

biogeográficas (temperada vs. neotropical) (Snow 1976). Existem diversos fatores

ecológicos, evolutivos e fisiológicos envolvidos nessas diferenças (Stutchbury & Morton

2001). Alguns estudos foram realizados com objetivo de encontrar padrões que expliquem

30 tais variações (Robinson et al. 1963, Rotenberry & Wiens 1989, Ogden & Stutchbury 1996,

Robinson et al. 2000, Formica & Tuttle 2009, Keyel et al. 2013). De forma geral, é assumido que aves neotropicais possuem períodos reprodutivos mais longos, menores ninhadas, maiores taxas de predação de ninho e consequentemente menor sucesso reprodutivo que aves de regiões temperadas (Cody 1966, Ricklefs 1966, Murray 1985, Purcell et al. 1997). No entanto, existe uma grande variação quanto à duração do período reprodutivo entre regiões, mesmo quando consideramos apenas o Brasil, onde algumas espécies amazônicas reproduzem ao longo do ano (Johnson et al. 2012), enquanto que para a maioria das espécies do Cerrado, por exemplo, o período reprodutivo é restrito aos meses de setembro e outubro

(Marini et al. 2012).

Em zonas temperadas hipóteses com bases empíricas possibilitam entender melhor os fatores que determinam o período reprodutivo das aves (Stutchbury & Morton 2001). A hipótese da disponibilidade de alimento, que sugere que as aves se reproduzem quando o recurso alimentar é mais abundante, é a mais aceita (Lack 1954). Para os Trópicos, existem muitos resultados controversos e poucas evidências que apoiam essa hipótese (Stutchbury &

Morton 2001). Muitos estudos encontraram que o período reprodutivo das aves neotropicais está relacionado com o início das chuvas, que de maneira geral, é o período de maior abundância de alimento (Marini 1992, Lopes & Marini 2005, Medeiros & Marini 2007,

Rubio & Pinho 2008, Nóbrega & Pinho 2010). No entanto, a maioria desses estudos se concentra nas regiões centro-oeste e sudeste do país.

Outros fatores devem ser considerados para explicar a estação reprodutiva de outras regiões, como a predação de ninhos, o período de muda e seleção sexual (Wunderle Jr 1982,

Stutchbury & Morton 2001). Para Antilophia bokermanni, por exemplo, a determinação do período reprodutivo foi feita através do registro da frequência de vocalizações dos machos, tendo seu pico nos meses de setembro e outubro, que na região nordeste geralmente

31 corresponde o pico da seca (especialmente o mês de setembro), sendo a frequência de vocalização negativamente correlacionada com a estação chuvosa (Girão & Souto 2005).

Variações no tamanho da prole podem também influenciar a dinâmica populacional e diferença no sucesso reprodutivo dos indivíduos (Rotenberry & Wiens 1989). A alta taxa de predação tem sido relacionada ao menor tamanho de ninhada nos trópicos e é normalmente atribuída à grande diversidade de predadores, sendo as serpentes os predadores primários de ninhos (Skutch 1985). Porém, nem todos os estudos corroboram essa hipótese (Roper &

Goldstein 1997). De fato, vários estudos demonstraram que proles de aves tropicais sofrem altas taxas de predação, podendo ultrapassar 70% (Aguilar et al. 2008, Noske et al. 2008,

Marini et al. 2009, Nóbrega & Pinho 2010, Marini et al. 2012), sendo esta a causa principal de perda da ninhada e baixo sucesso reprodutivo (Ricklefs 1969). Para aves que possuem ninhos em forma de cesto abertos, a predação é tão alta que apenas 29% dos ninhegos chegam à fase de emplumar-se (Robinson et al. 2012).

Ainda, a predação é um dos fatores capazes de moldar as táticas de cuidado parental das espécies (Martin et al. 2000). Skutch (1985) sugeriu que predadores usam a atividade dos pais para localizar os ninhos, gerando um custo da predação que limitaria a frequência na qual os pais podem alimentar os ninhegos, afetando assim, o tamanho da ninhada (quanto menor a prole menor a atividade dos pais no ninho). Este custo favoreceria a evolução da redução das visitas dos pais em regiões onde a taxa de predação é alta (Martin et al. 2000).

Os benefícios do cuidado parental variam entre espécies, e muitos fatores aumentam o valor desse cuidado, sendo o aumento da sobrevivência dos ninhegos o benefício primário desse comportamento (Slater & Halliday 1994). Em piprídeos o cuidado parental é geralmente realizado apenas pela fêmea, assim como a construção dos ninhos (Prum 1997,

Doucet 2006). Esse fator, provavelmente, é resultado de uma forte pressão de predação sobre a prole, uma vez que machos possuem uma coloração extravagante, enquanto a plumagem

32 das fêmeas é críptica, geralmente em tons de verde (Martin & Badyaev 1996). Outro

fenômeno indicador dessa pressão seria o atraso na mudança de plumagem dos machos, que

pode levar até três anos, diminuindo seu risco de predação (Selander 1965, Procter-Gray &

Holmes 1981, McDonald 1993). Assim, o conhecimento de parâmetros reprodutivos das

diferentes espécies auxilia no esclarecimento de diversas questões evolutivas e fornece uma

base para a compreensão do seu comportamento de acasalamento. Além disso, é fundamental

para elaboração de ações de conservação, principalmente para espécies criticamente

ameaçadas.

Este capítulo tem o objetivo principal de entender quais são os padrões da biologia

reprodutiva do soldadinho do Araripe (Antilophia bokermanni), uma vez que tais informações

são inexistentes e ao mesmo tempo cruciais na geração de hipóteses sobre comportamentos

de corte e acasalamento da espécie. Informações detalhadas da espécie encontram-se na seção

“Espécie de Estudo”, no início da tese.

Neste capítulo procuramos descrever os parâmetros básicos da biologia reprodutiva de

Antilophia bokermanni, fornecendo informações acerca do período reprodutivo e

territorialidade da espécie, descrição do ninho e detalhes sobre sua construção, sobre a

postura de ovos e taxas de sobrevivência de ovos e ninhegos. Também fornecemos

informações sobre o comportamento de cuidado com os filhotes.

MÉTODOS

O estudo foi realizado na Chapada do Araripe, área descrita anteriormente (ver Área

de Estudo), tendo duração de três estações reprodutivas: 2013/2014 (primeira estação),

2014/2015 (segunda estação) e 2015/2016 (terceira estação).

CAPTURA E MARCAÇÃO DOS INDIVÍDUOS

Os indivíduos de A. bokermanni foram capturados com redes de neblina (12m x

2,5m), dispostas próximas aos corpos d`água e trilhas onde a espécie foi observada com

33 maior frequência. As capturas foram realizadas ao longo dos três anos do estudo, totalizando

18.600 horas/rede. Ainda, sempre que encontrado um ninho que os pais não estavam anilhados, foi montada uma ou duas redes de neblina próximo ao ninho na tentativa de marcar todos os indivíduos da família. Todos os indivíduos capturados foram anilhados com anilhas metálicas fornecidas pelo CEMAVE (IBAMA N°40116-1/CEMAVE N°3731/2) e receberam uma combinação única de três anilhas plásticas coloridas.

Os indivíduos capturados foram pesados com balança de mola (100g) e suas medidas morfológicas da asa direita, tarso esquerdo, narina e cauda foram tomadas com paquímetro de precisão. No caso de machos adultos ainda foram medidos a altura do topete e o comprimento do manto. Ainda, foi realizada a coleta de sangue (0,2ml) de todos os indíviduos capturados, através de punção da veia ulnar. O sangue foi armazenado em álcool 99% para subsequentes análises genéticas de paternidade (ver Cap. 3 e 4) e para sexagem. Os ninhegos foram anilhados e tiveram seu sangue coletado ainda nos ninhos, sempre que possível.

SEXAGEM

Como dito anteriormente, A. bokermanni possui forte dimorfismo sexual, no entanto, machos jovens possuem a plumagem verde como a das fêmeas (eg. Coelho & Silva 1998).

Assim, a determinação do sexo dos indivíduos com plumagens verdes (inclusive os ninhegos) só pode ser realizada com confiança através de sexagem genética. Utilizamos as amostras de sangue de todos os indivíduos verdes e dos ninhegos para sexagem. A sexagem foi feita pelo método proposto por Griffith et al. (1998) utilizando dois genes CHD (chromo- helicase-dna) que possuem cromossomos sexuais W (CHD-W) e Z (CHD-Z), onde fêmeas possuem ZW e machos possuem ZZ. Para amplificação do DNA foi utilizado o método de

PCR (Polymerase Chain Reaction) por meio dos iniciadores 2550/2718 descritos por

Fridolfsson & Ellegren (1999).

DETERMINAÇÃO DA ESTAÇÃO REPRODUTIVA E VOLUME DE CHUVAS

34 O início da estação reprodutiva foi considerado a partir do momento em que a primeira atividade de nidificação foi registrada (construção do ninho, ninho pronto ou ninho ativo). A partir desse ponto inicial foram determinados os períodos de nidificação, incubação, ninhego e revoada (quando os filhotes deixam o ninho). A reprodução foi considerada encerrada quando não foi registrada mais nenhuma dessas atividades.

O volume de chuva foi determinado utilizando os dados da FUNCEME (2016)

(Fundação Cearense de Meteorologia e Recursos Hídricos), que possui dois postos de coleta de dados na área de estudo. Foram utilizados os dados de volume de chuva mensal (mm) referentes ao mês e ano de cada uma das estações reprodutivas (2013/2014, 2014/2015 e

2015/2016).

CUIDADO PARENTAL

O comportamento parental foi monitorado através de filmagens dos ninhos durante

1:30h a cada três dias, no período de ninhego com 1 a 2 dias de idade, utilizando duas mini- câmeras digitais (Kodak Zx1 e Multilaser DC115, zoom 10x) posicionadas a 2m do ninho.

Através das filmagens foram identificadas cinco categorias de comportamento parental, e para cada filmagem foi registrado o número de horas de cada categoria de comportamento.

Foi determinada se a distribuição de alimento para os ninhegos, em ninhos com dois ninhegos, foi feita de forma equivalente, e ainda, se a entrega de alimento era realizada de forma direcional (direita e esquerda).

As câmera foram camufladas para evitar alteração no comportamento dos indivíduos no ninho e para evitar atrair a atenção de predadores (Figura 1). As filmagens permitiram determinar qual dos pais efetua o cuidado parental e quais os tipos de comportamento efetuados por este. Além disso, foi observado (quando possível) se o tipo de alimento entregue aos ninhegos é semelhante ao consumido pelos adultos, informação obtida através das fezes destes durante a captura (ver capítulo 2 para dieta). Adicionalmente, foi registrado

35 qualquer comportamento de abandono do ninho, e em qual fase do desenvolvimento dos ninhegos o evento ocorreu, e se possível, qual a causa do comportamento, bem como outros comportamentos relevantes (e.g. encontros agonísticos).

Figura 1- Câmera Multilaser DC115 camuflada e posicionada a 2m do ninho para a coleta de dados de cuidado parental de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe-CE.

PARÂMETROS DE NIDIFICAÇÃO

A busca por ninhos foi realizada seguindo metodologia proposta por Martin e Geupel

(1992), que consiste em vasculhar toda a vegetação onde há potencial para a espécie construir os ninhos, nesse caso próximo aos corpos d`água e locais úmidos na encosta da Chapada do

Araripe. A metodologia inclui também o acompanhamento dos pais (ou apenas de um deles), principalmente quando estes (ou este) estiverem carregando algum material vegetal (para confecção do ninho) ou alimento (para alimentar os ninhegos). Além disso, através do estudo realizado por Linhares et al. (2010) foi possível direcionar as buscas nas plantas já conhecidas por servirem de suporte para os ninhos de A. bokermanni.

36 Uma vez encontrados, os ninhos foram monitorados a cada dois dias, tendo seu status registrado: ativo (com ovos ou ninhego), pronto (quando o ninho estava pronto mas ainda não se tornara ativo) e em construção (quando o ninho foi encontrado na fase de construção).

Quando perto do dia de eclosão (para os ninhos que foram acompanhados desde a construção), as visitas foram realizadas diariamente, no intuito de saber o dia exato da eclosão. Também foram tomadas as medidas do ninho, após este ter seu ciclo de reprodução concluído ou ser abandonado, evitando assim qualquer interferência. Com auxílio de uma trena foi medida a altura do ninho em relação ao solo (m) e com paquímetro foram medidas a profundidade do ninho (mm), o diâmetro externo e interno (mm) e a altura do ninho (mm), além de também ter sido registrado o tipo de material utilizado para a confecção do ninho e quando possível a espécie de planta suporte utilizada.

Os ovos tiveram sua largura e comprimento medidos com paquímetro (mm), foram pesados com balança de mola (Pesola® 100g) e descritos quanto à sua coloração e formato.

Foram determinados os principais parâmetros reprodutivos, descritos abaixo, que incluíram: tamanho da ninhada, taxa de predação, taxa de sobrevivência da prole, o tempo de incubação e eclosão, a duração da fase de ninhego e o sucesso ou insucesso do ninho.

Um ninho foi considerado bem sucedido quando a reprodução foi concluída, com a saída de pelo menos um ninhego do ninho (revoada). O ninho foi considerado abandonado quando não teve sua construção concluída, não se tornou ativo ou houve abandono na fase de ovos ou ninhego e foi considerado predado quando houve indícios de tal evento, como ovos ou ninhegos danificados ou removidos. Quando houve predação, foi registrado em qual fase do desenvolvimento ocorreu (ovo ou ninhego).

A definição das fases de incubação e ninhego seguiu o proposto por Mayfield (1975), sendo a fase de incubação referente ao tempo decorrido entre a postura do primeiro ovo até

37 sua eclosão, e a fase de ninhego referente ao período entre a eclosão do primeiro ovo até a partida do último ninhego.

TERRITÓRIOS REPRODUTIVOS

Utilizamos o termo território reprodutivo para nomear as áreas defendidas pelos machos através de constante vocalização durante o período de reprodução da espécie, mas que não são áreas necessariamente utilizadas com exclusividade por estes machos para outros comportamentos tais como se alimentar ou dormir, podendo estes machos utilizar outras

áreas (sem ser as que estes defendem) para estes fins. Os territórios foram determinados por meio dos pontos utilizados para emissão de vocalizações dos machos adultos. Sempre que avistado um macho vocalizando em um determinado ponto durante o período reprodutivo ou próximo a um ninho, o local foi marcado com o uso de GPS (GPS Garmin eTrex 10). Esse processo foi repetido quantas vezes foram necessárias, para um mesmo macho, em diferentes pontos de uma determinada área defendida, até que se obteve pontos suficientes para delimitação de seu território (no mínimo seis pontos). Cada macho foi observado por pelo menos três dias, para que fosse confirmada a sua área territorial.

A área do território foi obtida através da união dos pontos mais externos demarcados no GPS (poleiros onde machos vocalizaram): as coordenadas de cada ponto foram inseridas no Google Maps© e utilizando a ferramenta “desenhar polígono”, tais pontos foram unidos formando o polígono do território. Uma vez criado o polígono, sua área foi medida utilizando-se o EarthPoint© (Clark 2016), um plugin para o Google Maps que permite medir

áreas do mapa em metros quadrados.

A presença ou ausência de córregos ou nascentes dentro da área de cada território foi registrada no intuito de avaliar se esta medida influencia no tamanho do território do macho, pois a presença de água é importante para a reprodução de inúmeras espécies de aves. A presença de água pode permitir uma melhor termoregulação de ovos e ninhegos e resultar na

38 frutificação de plantas (Grant 1982, Westmoreland et al. 2007), e acreditamos que possa ser uma importante medida da qualidade do território para A. bokermanni. A proximidade aos corpos de água permanentes poderia ser um fator chave para a reprodução da espécie na região, devido à escassez e imprevisibilidade de chuvas na região nordeste (Marengo 2010).

ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Sobrevivência e predação na fase de ovos e ninhegos

O cálculo da taxa de sucesso reprodutivo foi realizado utilizando o programa MARK

(White & Burnham 1999, Dinsmore & Disnmore 2007), que além de fornecer a taxa de sobrevivência diária (TSD) dos ninhos, permite ainda gerar e selecionar modelos que incluem co-variáveis que podem influenciar essas taxas e ainda uma avaliação se a TSD varia ao longo da estação reprodutiva de forma linear ou quadrática, sendo possível também o cálculo da TSD constante, como utilizada no método de Mayfield (Mayfield 1975).

Os modelos foram selecionados pelo Critério de Informação de Akaike (AIC –

Akaike´s Information Criterion, Burnham & Anderson 2002), onde os valores de AIC são corrigidos para amostras pequenas (AICc). Um modelo foi considerado bom o suficiente para explicar os dados quando ΔAICc < 2 (Burnham & Anderson 2002). Os pesos normalizados de

Akaike (pesos de AIC) são calculados para cada modelo, e permitem avaliar suas respectivas importâncias na modelagem dos dados, considerando todos os modelos comparados

(Burnham & Anderson 2002). A importância relativa de cada variável (soma dos pesos de

AIC de todos os modelos que a incluem) foi considerada no intuito de verificar a evidência da sua importância na predição da TSD.

O programa Mark exige que se cumpram cinco premissas, para melhor confiança de suas análises, as quais procuramos preencher: 1) identificação da idade do ninho no dia do encontro (ver procura e monitoramento de ninhos); 2) determinação do destino do ninho (ver procura e monitoramento de ninhos); 3) ausência de influência antropogênica sobre a

39 sobrevivência; 4) independência entre os destinos dos ninhos; e 5) homogeneidade nas TSDs

(Dinsmore & Disnmore 2007). Consideramos que o encontro do ninho e as checagens subseqüentes não influenciaram a TSD (premissa 3), pois os ninhos não foram marcados com nenhum material e foram feitas apenas breves aproximações nos ninhos, evitando chamar a atenção de predadores. A premissa 4, não foi completamente cumprida, uma vez que alguns ninhos pertenciam a uma mesma fêmea, no entanto como os locais e períodos que estes ninhos foram encontrados eram diferentes dos iniciais, consideramos suficientemente independentes. Com relação à premissa 5 (homogeneidade nas TSDs), foi considerado que todos os ninhos possuíam as mesmas condições ecológicas, uma vez que ocorreram no mesmo tipo de vegetação (mata úmida). No entanto, como os ninhos estavam distribuídos em seis áreas diferentes e cada uma pode sofrer diferentes influências (e.g. atividades humanas) além de possuírem diferentes tamanhos, foi criada a variável “Área” para ser incluída nos modelos. O mesmo vale para os períodos reprodutivos, por serem estes três anos distintos, foi criada a variável “Ano”, para que fosse possível considerar o seu efeito na TSD, portanto devido à inclusão das variáveis área e ano, considerou-se que todos os ninhos sofreram o mesmo risco de insucesso (premissa 5).

Nos modelos foram incluídas as co-variáveis das medidas do ninho diâmetro externo

(mm) e altura do ninho em relação ao solo (m). As outras medidas tomadas do ninho

(diâmetro interno, profundidade e altura) foram excluídas dos modelos por estarem correlacionadas entre si, sendo selecionada apenas a variável diâmetro externo por ter aparentemente uma relevância maior sobre a sobrevivência dos ninhegos, como avaliado a priori nos modelos. Ainda foram incluídas as outras duas co-variáveis mencionadas anteriormente: a área amostrada (Área) e as três estações reprodutivas (Ano).

Como para muitas espécies (Lopes e Marini 2005, Duca & Marini 2005, Carvalho et al. 2007) a TSD na fase de ovos difere da TSD na fase de ninhegos devido a fatores como

40 tempo de exposição e atividade dos pais no ninho, as análises dos modelos foram feitas em três etapas: (1) TSD geral para a espécie, onde não se fez distinção entre fases (ovos ou ninhegos); (2) TSD apenas para o período de incubação (fase de ovos); e (3) TSD apenas para o período de ninhego. Em cada uma delas, foi avaliada a TSD por período reprodutivo, TSD por área amostrada e os modelos incluindo as co-variáveis de medidas do ninho. Devido ao tamanho amostral distinto para medidas do ninho, optou-se por fazer modelos apenas com o diâmetro externo (incluindo período reprodutivo e área), modelos apenas com a altura do ninho em relação ao solo (incluindo período reprodutivo e área) e finalmente com essas duas co-variáveis inclusas.

A “história de encontro” de cada ninho foi construída utilizando os cinco parâmetros exigidos para a modelagem no programa MARK: 1) dia em que o ninho foi encontrado; 2) ultimo dia em que o ninho foi encontrado ativo; 3) último dia de checagem do ninho; 4) destino do ninho: sucesso ou insucesso; e 5) número de ninhos com aquela história de encontro. Além desses cinco parâmetros foram incluídas as quatro co-variáveis mencionadas anteriormente: diâmetro externo do ninho, altura do ninho em relação ao solo, área amostrada e estação reprodutiva (ou ano).

Os períodos reprodutivos foram transformados em dias corridos para a análise no programa MARK, e utilizou-se então a duração da estação mais longa para a análise da sobrevivência geral da espécie (onde a fase de ovos e ninhegos não foi distinta) e das fases de ovos e ninhegos. O primeiro dia de uma estação foi considerado o dia em que foi encontrado o primeiro ninho ativo (com ovos), sendo este o dia 1, e o último dia aquele em que foi observado um ninho ativo (com ovos ou ninhego). A estação mais longa foi a primeira

(2013/2014) com 138 dias de ninhos ativos. Para as análises de sobrevivência apenas da fase de ovos o número de dias corridos utilizado foi 131, uma vez que após esse período decorrido não foram observados ninhos com ovos, e para as análises de sobrevivência da fase de

41 ninhego foram utilizados 138 dias já que o último dia da estação corresponde ao último dia de ninho ativo.

Cuidado Parental

Os vídeos de cuidado parental foram analisados no programa JWatcher Video®

(Blumstein & Daniel 2007) que permite a quantificação de um determinado comportamento, bem como registra a quantidade de tempo que um determinado comportamento foi realizado.

Nos ninhos com dois ninhegos, para avaliar se o adulto entrega alimento mais frequentemente em uma determinada direção (direita ou esquerda em relação à câmera) ou se a taxa de entrega de alimento é propositalmente direcionada para um dos ninhegos, foram realizados testes t-Student para cada ninho, uma vez que a unidade amostral nesse caso foi o número de entregas de alimentos para cada ninho, e o intuito dessa análise foi analisar a diferença em cada ninho e não um padrão geral para a espécie. No entanto, também foi realizado um teste t-Student com o número de vezes em que cada ninhego (1 e 2) foi alimentado para os ninhos com dois ninhegos. O ninhego 1 foi sempre marcado com tinta preta, sendo sempre re-marcado quando necessário e sua posição no ninho (direita ou esquerda) registrada sempre antes do início das gravações.

Foi testado ainda se houve diferença no tempo gasto em cada comportamento de cuidado parental, entre ninhos com um e dois ninhegos, e para isso foi realizado test t-Student para cada comportamento observado. Todos os testes estatistícos dessa parte do estudo foram realizados no programa PAST 3.13 (Hammer et al. 2001).

Territórios reprodutivos

Com o intuito de analisar se os tamanhos dos territórios diferem quanto a presença/ausência de córregos e nascentes, como os dados não apresentaram uma distribuição

42 normal, foi utilizada uma análise de Mann-Whitney (U-test ) no pacote estatístico PAST 3.13

(Hammer et al. 2001).

RESULTADOS

CAPTURA, MARCAÇÃO E DEFINIÇÃO DO PERÍODO REPRODUTIVO

Foram anilhados e coletadas amostras de sangue de 350 indivíduos (231 adultos e 119

ninhegos). Destes foram sexados 181 machos e 169 fêmeas, sendo que entre os 119 ninhegos,

foi possível a sexagem de 113, sendo a razão sexual destes bastante equilibrada: 55 fêmeas e

58 machos. O peso médio dos machos adultos foi de 20.65 ± 0.10g e das fêmeas 20.69 ±

0.16g, não havendo diferença estatística (U = 4118.5, P = 0.86). Durante as três estações

reprodutivas amostradas foram encontrados 190 ninhos (79 em 2013/2014, 81 em 2014/2015

e 30 em 2015/2016), e destes 124 se tornaram ativos e 75 chegaram a fase de ninhego. Dentre

os ninhos ativos, 53 não obtiveram sucesso por diferentes motivos: 10 foram abandonados,

32 predados, cinco foram perdidos por outras razões (chuvas derrubaram ninho, árvore caiu

sobre o ninho) e nove filhotes, pertencentes a seis ninhos, morreram no ninho em duas áreas.

Ainda, 16 fêmeas ejetaram um dos ovos para fora do ninho. Para todos os ninhos que se

tornaram ativos e foram abandonados, o abandono ocorreu durante a fase de incubação.

O período de nidificação foi considerado a partir do primeiro ninho a ser encontrado e

terminando no dia de atividade do último ninho mais tardio encontrado, durante as três

estações. Sendo assim foi determinado que o período de nidificação inicia-se no dia 30 de

outubro (referente ao ninho encontrado mais cedo, pertencente a segunda estação) e termina

no dia 4 de abril (referente ao ninho mais tardio, pertencente a terceira estação). O período de

incubação variou entre as estações sendo estes: entre 08 de novembro de 2013 a 15 de

fevereiro de 2014 (primeira estação), 03 de novembro de 2014 a 27 de fevereiro de 2015

43 (segunda estação) e 28 de novembro de 2015 a 01 de abril de 2016 (terceira estação). O mesmo ocorreu para o período de ninhego sendo este de 05 de dezembro de 2013 a 26 de março de 2014 (primeira estação), 24 de novembro de 2014 a 14 de março de 2015 (segunda estação) e 29 de janeiro de 2016 a 24 de março de 2016 (terceira estação). Portanto, de modo geral definimos os período de incubação entre 03 novembro a 26 de março, e o período de ninhego de 24 de novembro a 26 de março.

Pode-se observar que o período de incubação terminou após o período de ninhego para a terceira estação (último ninho com ovos foi observado no dia 01 de abril de 2016). No entanto, essa observação foi referente a apenas um ninho que foi predado, não chegando a fase de ninhego. Assim, decidimos não utilizar essa observação para a definição do período de incubação, uma vez que acreditamos ser uma excessão, não representando o período de incubação de toda a espécie.

O período de revoada (primeiro dia em que um ninhego deixa o ninho) iniciou-se em

25 de dezembro de 2013 para a primeira estação (2013/2014), 05 de dezembro de 2014 para a segunda estação (2014/2015) e 15 de fevereiro de 2016 para a terceira estação (2015/2016).

O último dia em que um filhote voou para cada estação foi 27 de março de 2014 (primeira estação), 15 de março de 2015 (segunda estação) e 25 de março de 2016 (terceira estação).

Dessa forma, o período de revoada pode ser definido como sendo entre 05 de dezembro a 27 de março.

Os dados pluviométricos obtidos no site da FUNCEME (Fundação Cearense de

Metereologia e recursos hídricos), para cada mês/ano de coleta de dados reprodutivos podem ser visualizados na figura 2. Na primeira estação (2013/2014) o volume de chuva foi maior

(1.589mm3, 푋̅: 197,87 ±65,5), no entanto as chuvas iniciaram apenas em novembro. Já na segunda estação (2014/2015), ainda que em menor volume total para a estação (976mm3,

푋̅:122,7±54,9), as chuvas parecem ter sido mais bem distribuídas ao longo do período

44 reprodutivo, sendo que as primeiras chuvas, mesmo sendo em menor volume (6mm), ocorreram no mês de setembro. A terceira estação (2015/2016) foi a que apresentou o menor volume de chuvas (767mm3, 푋̅: 95,8±53,8) (Figura 2).

A relação entre o início da construção dos ninhos e o volume de chuvas para a região não foi analisada estatisticamente devido à necessidade de uma amostragem de um número maior de anos para que isso fosse possível. No entanto, observando o gráfico pluviométrico

(Figura 2) pode-se notar que a espécie só começou a nidificar após a ocorrência de certa quantidade de chuva. Ainda na figura 2, é possível verificar que o número de ninhos encontrados por mês, bem como o número de ninhegos presentes durante cada mês/ano parece ser bastante dependente da chuva. Isso fica mais claro principalmente para o final de

2015, onde o atraso nas atividades reprodutivas foi de quase três meses, quando comparado com os outros dois anos de amostragem, provavelmente devido ao menor volume de chuvas registrado anterior à nidificação (anterior à janeiro). Ainda no período de 2014/2015 (segunda estação), mesmo a pouca chuva em setembro parece ter influenciado o início precoce da construção de ninhos (1° ninho em construção encontrado em 30 de outubro de 2014), quando comparado com os outros anos amostrados.

CONSTRUÇÃO E DESCRIÇÃO DOS NINHOS

Foram observados 54 ninhos durante a fase de construção nos três períodos de coleta

(Figura 4), sendo três destes filmados durante 2h cada, no intuito de verificar se os dois pais contribuem com alimentação dos ninhegos. Em todos os ninhos observados durante essa fase e nos três que foram filmados apenas a fêmea efetuou a construção de ninhos.

Os ninhos são abertos no formato de cestas, construídos em forquilhas de plantas de inúmeras espécies. A fêmea utiliza teias de aranha e folhas secas nas fases iniciais de

46 construção (Figura 3) e finaliza com gravetos muito finos no interior do ninho (Figura 4). O tempo de construção dos ninhos é em média 4 dias (N=54). As medidas dos ninhos (N=63) são: altura= 55,87 ± 1,38mm; diâmetro interno= 46,05 ± 0,87mm; diâmetro externo= 72,62 ±

1,10mm; profundidade= 27,18 ± 0,73mm; e altura em relação ao solo= 1,89 ± 0,37m.

Figura 3- Ninho de Antilophia bokermanni em fase inicial de construção, na Chapada do Araripe-CE.

Figura 4- Ninho de Antilophia bokermanni finalizado, na Chapada do Araripe-CE.

47 Para 87 ninhos, foram identificadas 14 espécies de plantas suportes, pertencentes a 10

famílias (tabela 1). Três espécies identificadas neste estudo, não haviam sido registradas por

Linhares et al. (2010), sendo elas: Cyathea microdonta, Inga spp. e Mangifera indica.

Psychotria colorata foi a espécie mais utilizada (N=13) dentre os ninhos observados (N=87),

seguida por Hirtella glandulosa (N=10). Dentre as plantas identificadas as samambaias

(Cyathea spp.) tiveram o maior número relativo de ninhos perdidos por falta de sustenção

(queda do ninho): 10 dos 16 ninhos encontrados caíram.

Tabela 1. Espécies de plantas utilizadas como suporte de ninho de Antilophia bokermanni e o número de ninhos registrados em cada uma delas, na Chapada do Araripe, CE, nas estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Família Espécie N ninhos Anacardiaceae Mangifera indica L. 1 Burseraceae Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand 5 Chrysobalanaceae Hirtella glandulosa Spreng 10 Cyatheaceae Cyathea pungens (Willd.) Domin 7 Cyatheaceae Cyathea microdonta (Desv.) Domin. 9 Fabaceae Inga spp. 3 Melastomataceae Henriettea succosa (Aubl.) DC 8 Melastomataceae Miconia ibaguensis (Bonpl.) Triana 9 Nyctaginaceae Guapira opposita (Vell.) Reitz 5 Picramniaceae Picramnia sellowii Planch 7 Psychotria colorata (Willd. ex Roem. & Schult.) Müll. 13 Rubiaceae Arg. Cordiera myrciifolia (Spruce ex K. Schum) C. Persson & 5 Rubiaceae Delprete Piperaceae Piper arboreum var. arboreum Aubl. 3 Piperaceae Piper arboreum var. hirtellum Yunck. 2

DESCRIÇÃO DOS OVOS E INCUBAÇÃO

Foram acompanhados 117 ninhos durante a fase de ovos. Os ovos possuem formato

piriforme com coloração bege e manchas basais mais escuras (Figura 5). As medidas dos

ovos são (N=147): comprimento= 23,91 ± 0,07mm; largura= 16,49 ± 0,05mm; e peso= 3,19

± 0,03g. O número de ovos por ninho pode variar de 1 a 2, sendo a maioria dos ninhos

amostrados com dois ovos (N= 97). A diferença no tempo de postura entre o primeiro e o

48 segundo ovo é de dois dias em média (N= 39 ninhos). Apenas a fêmea efetua a incubação dos ovos, sendo essa iniciada somente após a postura do segundo ovo (para ninhos com 2 ovos) e o tempo médio de incubação é de 19 dias (N=125 ninhos).

Ainda, com relação a postura de ovos, algumas fêmeas (N= 16) que possuíram seus ninhos predados na fase de ovo ou ninhego efetuaram mais de uma postura ou ao menos começaram a construção de outro ninho. Na primeira estação (2013/2014), 11 fêmeas efetuaram mais de uma tentativa de postura; na segunda estação (2014/2015), apenas uma fêmea foi registrada fazendo uma segunda tentativa; e na terceira estação (2015/2016), quatro fêmeas efetuaram mais de uma postura. O maior número de tentativas observado para uma mesma fêmea em uma única estação reprodutiva foi de seis vezes, durante a primeira estação.

Dentre as 16 fêmeas que foram observadas nidificando mais de uma vez, apenas cinco obtiveram sucesso, ou seja, os ninhegos voaram, sendo o sucesso obtido na segunda tentativa para quatro fêmeas e na terceira tentativa para uma delas.

Figura 5- Ovos de Antilophia bokermanni no ninho, na Chapada do Araripe- CE.

49 PERÍODO DE NINHEGO, ANÁLISES DE SOBREVIVÊNCIA E MODELOS

Dentre os 124 ninhos que se tornaram ativos, 75 (60%) chegaram à fase de ninhego

(N=119 ninhegos), sendo que destes, 56 (74,6%) ninhos tiveram sucesso, ou seja os ninhegos voaram. O período de ninhego tem uma duração média de 16 dias, a partir do dia que eclodem até o dia que deixam os ninhos. As medidas dos ninhegos (referente a última medição com 10 dias de vida) são: peso= 15,01 ± 0,19 g; asas= 20,81 ± 0,29 mm; tarso=

18,79 ± 0,19mm (N= 51 ninhegos).

A probabilidade dos ovos eclodirem é de 56%, enquanto a taxa de predação dos ovos

é de 30%, calculados com o método de Mayfield (Mayfield 1975). Já para os ninhegos a probabilidade de deixarem o ninho é de 72%, e a taxa de predação sobre estes é de 20%.

Esses dados são referentes apenas às duas primeiras estações reprodutivas (2013/2014 e

2014/2015). Os dados das três estações juntas (2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016) foram tratados por meio de modelagens no programa MARK, dada a maior relevância desse método.

Como dito anteriormente, os modelos foram avaliados em três etapas (ver métodos) no programa MARK, para as três estações reprodutivas. Para a primeira etapa (sem distinção de períodos de ovos e ninhego) a taxa de sobrevivência diária (TSD) variou entre áreas amostradas e entre períodos reprodutivos (tabela 2), considerando o tempo constante, ou seja, quando a sobrevivência dos ninhos não varia ao longo da estação reprodutiva. A área

“Advogados” apresentou maior sobrevivência (63,3%) e a área “Serrano” a menor (1,3%); no entanto, é preciso atentar-se para o número de ninhos encontrados em cada área, sendo o tamanho amostral (N ninhos) para a área “Grangeiro” consideravelmente maior que as demais. Já em relação aos períodos reprodutivos, o segundo ano de amostragem (2014/2015) apresentou uma sobrevivência maior (47%) e o terceiro ano (2015/2016) a menor sobrevivência, apenas 37% (tabela 2).

50 Tabela 2. Sobrevivência diária (DSR) geral (ovos e ninhegos juntos) por área amostrada e por período reprodutivo amostrado (Ano), com tempo constante, de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, nas estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Variável DSR DSR^35 Sobrevivência % N ninhos Área Grangeiro 0,97 0,386 38,6 62 Nascente 0,97 0,404 40,5 17 Caiana 0,96 0,314 31,5 16 Riacho do 0,97 0,438 43,8 14 meio Advogados 0,98 0,632 63,3 12 Serrano 0,88 0,013 1,3 3 Ano

2013/2014 0,96 0,33 33,2 54 2014/2015 0,97 0,47 47 39 2015/2016 0,97 0,37 37 31

Em relação aos modelos para essa primeira etapa das análises de sobrevivência, o modelo com menor valor de AIC que ajustou a TSD foi o que incluiu: o tempo constante

(Tc), diâmetro externo (externdiam) e área amostrada (area1), e este modelo possui 26% de evidência de ser o melhor modelo (tabela 4). Outros modelos também tiveram baixos valores de AIC, no entanto as evidências de que estes seriam modelos relevantes, são inferiores a

14% (tabela 3).

Tabela 3. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para sobrevivência diária geral (fase de ovos e ninhegos, N= 47 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc peso Likelihood Par {Tc + externdiam + area1} 182,557 0 0,264 1 4 174,51 {Tc + externdiam} 183,871 1,314 0,136 0,51 2 179,85 {Tc + area1} 184,115 1,558 0,121 0,45 3 178,09 {Tc + externdiam + height 184,440 1,883 0,103 0,39 5 174,38 + area1} {T constante} 184,953 2,396 0,079 0,30 1 182,94 {Tl + externdiam} 185,784 3,226 0,052 0,19 3 179,76

51 {Tl + area1} 185,824 3,267 0,051 0,19 4 177,78 {Tc + externdiam + height} 185,875 3,318 0,050 0,19 3 179,85 {Tc + height+ area1} 185,983 3,426 0,047 0,18 4 177,94 {T linear} 186,928 4,371 0,029 0,11 2 182,91 {Tc + height} 186,940 4,383 0,029 0,11 2 182,92 {Tc + ano1} 188,758 6,201 0,011 0,04 3 182,73 {Tl + height} 188,924 6,366 0,010 0,04 3 182,90 {Tq} 188,940 6,382 0,010 0,04 3 182,91 deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados.

Para a fase de incubação (período de ovos), também foram observadas diferentes

TSDs entre as áreas amostradas e os períodos reprodutivos (tabela 4). Novamente, a área

“Advogados” foi a que apresentou a maior sobrevivência (90%) e a área “Serrano” a menor

(3%). A área “Grangeiro” apresentou uma sobrevivência também alta (63%), para os 57 ninhos analisados na fase de ovos. Em relação ao período reprodutivo, o segundo ano

(2014/2015) apresentou a maior sobrevivência (72%) para a fase de ovos e o primeiro ano a menor (54%).

Tabela 4. Sobrevivência diária (DSR) para período de incubação (fase de ovos), por área amostrada e período reprodutivo amostrado (Ano), com tempo constante, de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Variável DSR DSR^19 Sobrevivência % N ninhos Área Grangeiro 0,97 0,63 63 57 Nascente 0,96 0,52 52 17 Caianas 0,96 0,46 46 15 Riacho do Meio 0,97 0,56 56 13 Advogados 0,99 0,9 90 12 Serrano 0,88 0,09 9 3 Ano

2013/2014 0,96 0,54 54 50 2014/2015 0,98 0,72 72 36 2015/2016 0,97 0,57 57 31

Em relação aos modelos analisados para a fase de ovos, quando utilizadas todas as co- variáveis juntas (diâmetro externo, altura, área e estação reprodutiva), o modelo com menor

ΔAICc foi o que incluiu o tempo constante (Tc) e a área amostrada (area1), tendo este 32%

52 de evidência de ser o melhor modelo. No entanto o modelo que incluiu Tc, área e diâmetro externo (externdiam) também apresentou um valor de ΔAICc baixo e 25% de evidência de ser o melhor modelo (ANEXO 1).

Como o tamanho amostral variou muito entre áreas (tabela 4), essa co-variável pode ter tido uma influência maior do que teria se os tamanhos amostrais fossem mais similares, uma vez que em algumas áreas a TSD é muito alta ou muito baixa, devido simplesmente ao baixo número de ninhos encontrados. Sendo assim, decidimos avaliar os modelos excluindo a co-variável área. E como pode ser observado na tabela 5, o modelo que incluiu o tempo constante (Tc) foi o que melhor ajustou a TSD para o período de incubação, com valor de

ΔAIC menor e 23% de evidência de ser o melhor modelo.

O modelo incluindo Tc e diâmetro externo também apresentou valor de AIC baixo, porém, possui apenas 13% de evidência de ser o melhor modelo. No entanto, quando avaliados os modelos com um tamanho amostral maior (devido à exclusão da co-variável altura do ninho em relação ao solo), o modelo com o tempo linear (Tl) foi o que melhor ajustou a TSD (ΔAIC: 0) para a fase de ovos, indicando que a taxa de sobrevivência diária diminui ao longo da estação reprodutiva, para esta fase (ANEXO 2). Quando analisadas todas as co-variáveis, exceto o diâmetro externo, o modelo que incluiu tempo constante (Tc) e área e o modelo com tempo constante, altura do ninho (height) e área foram os que melhor ajustaram a TSD na fase de ovos, apresentando 50% e 25% de evidência de serem os melhores modelos, respectivamente (ANEXO 3).

Tabela 5. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 47 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1). Sem co-variável área amostrada. Delta AICc Model Num. Model AICc Deviance AICc Weights Likelihood Par

53 {T constante} 135,075 0 0,230 1 1 133,06 {Tc + externdiam} 136,076 1,001 0,139 0,606 2 132,05 {T linear} 136,153 1,078 0,134 0,583 2 132,13 {Tc + height} 137,005 1,930 0,087 0,380 2 132,98 {Tl + externdiam} 137,212 2,137 0,079 0,343 3 131,17 {Tc + externdiam + 138,059 2,983 0,051 0,225 3 132,02 height} {Tl + height} 138,138 3,063 0,049 0,216 3 132,10 {T quadratico} 138,161 3,086 0,049 0,213 3 132,12 {Tc + ano1} 138,334 3,259 0,045 0,196 3 132,29 {Tq + externdiam} 139,191 4,115 0,029 0,127 4 131,13 {Tl + externdiam + 139,233 4,157 0,028 0,125 4 131,17 height} {Tc + ano1 + 139,372 4,296 0,026 0,116 4 131,31 externdiam} {Tc + ano1 + 139,993 4,918 0,019 0,085 4 131,93 height} {Tq + height} 140,157 5,081 0,018 0,078 4 132,09 {Tq + externdiam + 141,213 6,137 0,010 0,046 5 131,12 height} deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

Considerando apenas a fase de ninhego (terceira etapa das análises de sobrevivência), também observou-se variações nas TSDs entre áreas amostradas e períodos reprodutivos

(tabela 6). Sendo a área “Nascente” a que apresentou maior sobrevivência (100%), onde todos os ninhos que chegaram até a fase de ninhego (N=9) tiveram sucesso. A área com menor sobrevivência foi “Advogados” (sobrevivência: 59%). Em relação aos períodos reprodutivos o primeiro ano (2013/2014), apresentou maior sobrevivência (71%), quando comparado com o segundo (62%) e terceiro (67%) períodos reprodutivos (tabela 6).

Tabela 6. Sobrevivência diária (DSR) para período de ninhego, por área amostrada e por período reprodutivo (Ano) amostrado com tempo constante para de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Variável DSR DSR^16 Sobrevivência % N ninhos Área Grangeiro 0,97 0,65 65 39 Nascente 1,00 1,00 100 9 Caiana 0,96 0,55 55 11

54 Variável DSR DSR^16 Sobrevivência % N ninhos Riacho do Meio 0,97 0,61 61 5 Advogados 0,96 0,59 59 11 Ano

2013/2014 0,98 0,71 71 31 2014/2015 0,97 0,62 62 28 2015/2016 0,97 0,67 67 16

Em relação ás análises de seleção de modelos para a fase de ninhego, quando utilizadas todas as co-variáveis (diâmetro externo, altura, área e estação reprodutiva), o modelo que melhor ajustou a TSD foi o que inclui tempo linear (Tl), período reprodutivo

(ano1), área amostrada (área 1), diâmetro externo (externdiam) e altura do ninho em relação ao solo (height), apresentando 17% de evidência de ser o melhor modelo (ANEXO 4). No entanto, assim como realizado para a fase de ovos, devido a grande diferença nos tamanhos amostrais entre áreas amostradas, optou-se novamente por verificar a seleção de modelos sem essa co-variável. E foi observado que o modelo com o tempo constante e período reprodutivo

(ano1) foi o que melhor ajustou a TSD para a fase de ninhego, com 26% de evidência de ser o melhor modelo, seguido pelo modelo que incluiu tempo linear, período reprodutivo (ano1), diâmetro externo (externdiam) e altura do ninho em relação ao solo (height) com evidência de que este é um bom modelo de 18% (tabela 7). O modelo que inclui tempo linear e ano, apresentou taxa de sobrevivência constante ao longo do primeiro ano (2013/2014), no entanto para o segundo e terceiro anos de amostragem, a sobrevivência foi menor no início da estação reprodutiva, aumentando ao longo desta.

No caso dos dados para fase de ninhego, todos os ninhos que possuíam dados de altura do ninho possuíram dados de diâmetro externo, mas o oposto não é verdade, sendo então analisados os dados sem a altura do ninho apenas, na intenção de se utilizar um maior tamanho amostral. Para a análise incluindo todas as co-variáveis exceto altura do ninho em relação ao solo, o modelo que melhor ajustou a TSD para a fase de ninhego foi o que inclui o tempo quadrático e área amostrada (area1) com 20% de evidência de que é o melhor modelo

55 (tabela 8). Isso indica que a sobrevivência dos ninhegos oscila ao longo da estação, sendo

menor no início e no final e tendo seu pico no meio da estação reprodutiva (Tabela 9).

Tabela 7. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para período de ninhego (N= 28 ninhos), de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1). Sem co-variável área amostrada. Delta Model Num. Modelo AICc AICc peso Desvio AICc Likelihood Par {Tc + ano1} 39,461 0 0,263 1 2 35,42 {Tl + ano1+ externdiam 40,154 0,693 0,186 0,706 5 29,95 + height} {Tl + ano1+ externdiam 40,656 1,195 0,145 0,55 4 32,52 } {Tl + ano1} 40,867 1,406 0,130 0,495 3 34,78 {Tl + ano1+ height} 40,977 1,516 0,123 0,468 4 32,84 {Tc + externdiam} 43,887 4,426 0,028 0,109 2 39,84 {T linear} 43,987 4,526 0,027 0,104 2 39,94 {T constante} 44,342 4,881 0,022 0,087 1 42,32 {Tl + externdiam} 44,712 5,251 0,019 0,072 3 38,63 {Tc + externdiam + 45,919 6,458 0,010 0,039 3 39,83 height} {Tl + height} 46,006 6,545 0,01 0,037 3 39,92 {Tc + height} 46,355 6,894 0,008 0,031 2 42,31 {Tq + externdiam} 46,563 7,102 0,007 0,028 4 38,43 {Tl + height + 46,76 7,299 0,006 0,026 4 38,62 externdiam} {Tq + height} 47,028 7,567 0,006 0,022 4 38,89 {Tq + height + 48,570 9,109 0,002 0,010 5 38,37 externdiam} deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

56 Tabela 8. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para período de ninhego (N= 50 ninhos), de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Sem co-variável altura do ninho em relação ao solo (height). Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc peso Likelihood Par {Tq + area1} 86,990 0 0,204 1 5 76,88 {Tc + area1} 88,339 1,348 0,104 0,509 3 82,29 {T quadratico} 88,422 1,432 0,100 0,488 3 82,38 {Tq + area1 + 88,904 1,913 0,078 0,384 6 76,75 externdiam} {Tq + area1 + ano1} 89,024 2,034 0,074 0,361 7 74,82 {Tc + area1 89,114 2,124 0,070 0,345 4 81,04 +externdiam} {Tl + area1} 89,151 2,160 0,069 0,339 4 81,08 {T constante} 89,724 2,733 0,052 0,254 1 87,71 {Tc + area1 + ano1} 89,981 2,991 0,045 0,224 5 79,87 {Tc + externdiam} 90,377 3,387 0,037 0,183 2 86,35 {Tq + externdiam} 90,391 3,401 0,037 0,182 4 82,32 {Tq + ano1} 90,767 3,777 0,030 0,151 5 80,66 {T linear} 90,802 3,812 0,030 0,148 2 86,78 {Tl + externdiam} 91,855 4,864 0,017 0,087 3 85,81 {Tc + externdiam + 92,394 5,404 0,013 0,067 4 84,32 ano1} {Tq + ano1 + 92,582 5,592 0,012 0,061 6 80,43 externdiam-} {Tc + ano1} 92,590 5,600 0,012 0,060 3 86,54 {Tl + ano1} 93,900 6,909 0,006 0,031 4 85,82 deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

57 Tabela 9. Importância relativa, beta estimate (B) e erro padrão (±EP) das variáveis dos modelos da taxa de sobrevivência diárias de ninhos de Antilophia bokermanni nos períodos de incubação, ninhego e geral (incubação e ninhego), na Chapada do Araripe, Ceará, durante as três estações reprodutivas amostradas (2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016). As colunas numéricas (1, 2, 3 e 4) são referentes a cada resultado da seleção de modelos com tempo constante (Tc), tempo Linear (Tl) e tempo quadrático (Tq): 1- todas as variáveis inclusas; 2- sem a co-variável área; 3- sem a co-variável altura do ninho em relação ao solo (Altura) e 4- sem a co-variável diâmetro externo (Diamextern.). Tempo constante (Tc), Tempo Linear (Tl), Tempo quadrático (Tq).

Período/ Importância Relativa B ± EP variável 1 2 3 4 1 2 3 4 Incubação B ± EP B ± EP B ± EP B ± EP Tc 0,89 0,60 0,31 0,90 5,54817 1,46 2,1003 1,375 0,810 1,11 5,079 1,21 Tl 0,07 0,29 0,48 0,06 -0,00057 0,006 -0,002 0,026 -0,005 0,041 -0,0004 0,005 Tq 0,02 0,10 0,19 0,03 2,036E-07 0,0004 7,7E-07 0,001 -2,2E-05 0,003 -4,5E-06 0,0004 Área 0,73 - - - 0,16 0,76 -1,29201 0,434 ------0,1675 3,319 -1,908 0,457 Ano 0,02 0,09 0,10 0,02 -0,00903 0,017 -0,0464 0,083 0,0137 0,07 -0,012 0,022 Diamextern 0,35 0,36 0,23 - - - -0,0141 0,066 -0,011 0,064 -0,0017 0,03 ------Altura 0,22 0,26 - - - 0,35 0,07915 0,188 0,032 0,195 ------0,03 0,10

Ninhegos Tc 0,18 0,33 0,33 - - - 1,08549 0,907 1,5083 1,069 6,381 4,88 ------Tl 0,79 0,64 0,12 - - - 0,00871 0,135 0,0037 0,106 0,00150 0,01 ------Tq 0,01 0,01 0,53 - - - -6,936E-06 0,0003 -6,05E-06 0,0003 -0,00040 0,01 ------Área 0,47 - - - 0,64 - - - -12,771 6,984 ------17,735 7,25 ------Ano 0,85 0,84 0,19 - - - 19,305 31,53 18,376 14,01 0,2389 0,27 ------Diamextern 0,44 0,40 0,26 - - - -0,0485 0,130 -0,0428 0,117 -0,00852 0,057 ------Altura 0,52 0,35 ------1,2119 0,863 -0,55261 0,543 ------

Geral

Período/ Importância Relativa B ± EP variável 1 2 3 4 1 2 3 4 Tc 0,84 ------5,940 2,329 ------Tl 0,14 ------0,0003 0,0117 ------Tq 0,01 ------4,05E-08 0,0001 ------Área 0,58 ------0,85663 0,0001 ------Ano 0,01 ------0,0009 0,0086 ------Diamextern 0,60 ------0,0308 0,1018 ------Altura 0,24 ------0,0335 0,1722 ------

59 CUIDADO PARENTAL

Foram analisadas 195h de filmagens em 20 ninhos (12 com dois ninhegos e oito com um ninhego), durante os dois primeiros períodos reprodutivos (2013/2014 e

2014/2015). Em todos os ninhos analisados apenas a fêmea efetuou as atividades de cuidado dos ninhegos.

Os comportamentos observados foram classificados nas seguintes categorias: sentada no ninho (sobre os ninhegos) (Figura 6C), alimentando o ninhego 1, alimentando o ninhego 2 (no caso de dois ninhegos) (Figura 6B), limpando o ninho, vigiando

(empoleirada ao lado do ninho) (Figura 6A), limpando os ninhegos, e ausente (quando a fêmea se ausentava do ninho). Dentre estes, o comportamento que a fêmea realizou por mais tempo é o de “sentar no ninho” (33,87 horas), ainda que na maior parte do tempo observado a fêmea estava ausente do ninho (92,21 horas) (tabela 10). Foi observado apenas um encontro agonístico entre uma fêmea de A. bokermanni e um indivíduo de Myiobius atricaudus. Acreditamos que este encontro seja resultado de disputa por recursos, uma vez que as espécies nidificam muito próximas espacialmente e temporalmente (no mesmo período) uma da outra e durante o mesmo período (observação pessoal).

60 A B

Figura 6- Atividades de cuidado parental realizadas pelas fêmeas de Antilophia bokermanni na Chapada do Araripe- CE. A: vigiando o ninho; B: Alimentando ninhego; C: sentada no ninho. Dos itens alimentares que foram entregues pela fêmea aos ninhegos, nenhum diferiu dos que foram encontrados nas fezes dos indivíduos adultos. Ainda, foram analisadas as fezes de 12 ninhegos e também nenhuma diferença quanto ao tipo de item alimentar foi encontrada quando comparadas as dietas destes com a dieta dos adultos (para descrição da dieta dos adultos, ver capítulo 2).

61 Foi ainda averiguado se fêmeas com 1 ou 2 ninhegos apresentam diferentes comportamentos ou gastam mais tempo em determinadas atividades. Não foi encontrada diferença entre ninhos com diferentes números de ninhegos para nenhum dos comportamentos (limpando o ninho: t=-0,69, p=0,49; limpando ninhegos: t=-0,21, p=0,82; vigiando: t=-0,63, p=0,53; sentada no ninho: t=0,17, p=0,86; tempo ausente: t=-1,5, p=0,13). Para o comportamento alimentando os filhotes não foi testada a diferença entre ninhos com 1 ou 2 ninhegos, uma vez que os dados para ninhos com dois ninhegos foram coletados separadamente, com o intuito de testar a diferença nesse comportamento dentro de um mesmo ninho.

Para ninhos com dois ninhegos foi analisado se fêmeas dariam preferência para um dos ninhegos (1 ou 2) na entrega de alimento, mas também não foi encontrada diferença significativa (t= 0,43; p=0,66), sendo o número de vezes e o tempo gasto na distribuição de alimento entre filhotes igual ou muito similar. Em relação à posição de entrega (direita ou esquerda), a fêmea deu maior preferência para o ninhego da direita em apenas um dos ninhos (t= 5,14; p<0,001), sendo que este ninho foi filmado por mais horas do que os demais (16h de filmagem).

Tabela 10. Tempo despendido pela fêmea de Antilophia bokermanni (em horas) para cada comportamento de cuidado relativo aos ninhegos (N=20 ninhos), na Chapada do Araripe- CE. Comportamento N Horas efetuada Limpando o ninho 0,45 Limpando ninhegos 0,53 Alimentando ninhego 2 0,56 Alimentando ninhego 1 1,32 Vigiando 17,46 Sentada no ninho 33,87 Ausente do ninho 92,21

62 TERRITÓRIOS REPRODUTIVOS

Foram mensurados 29 territórios reprodutivos na primeira (2013/2014), segunda

(2014/2015) e terceira (2015/2016) estações reprodutivas. Os territórios foram demarcados por meio de registro da atividade de defesa dos machos em cada área, com canto frequente e perseguições aéreas de machos vizinhos e/ou invasores. Os territórios possuíram em média 1.209 m2 ± 122. Onze territórios foram estabelecidos em áreas sem a presença de córregos ou nascentes.

Durante a segunda estação reprodutiva (2014/2015), 10 machos permaneceram nos mesmos territórios estabelecidos previamente durante a campanha de 2013/2014 (dos que já estavam anilhados na primeira estação reprodutiva). Na terceira estação (2015/2016) apenas um macho permaneceu no mesmo território estabelecido na segunda estação

(2014/2015). No entanto, dois machos permaneceram na mesma área, com novos territórios entre a estação de 2014/2015 e 2015/2016, sendo que dois machos que haviam estabelecido território em uma das áreas na primeira e segunda estação, migraram para uma outra área durante a terceira estação. Ainda, três machos permaneceram no mesmo território durante as três estações reprodutivas. Observou-se também que mesmo quando um novo macho ocupou um território que pertenceu a outro indivíduo em uma estação prévia, estes ocupavam os mesmo poleiros, sendo a área defendida do território, a mesma.

Muitos territórios encontram-se bastante próximos uns dos outros (Figura 7). Em algumas ocasiões foram observados encontros entre machos vizinhos, onde machos executaram perseguições aéreas, emitindo um som mecânico com as asas e cauda. Ainda, em quatro ocasiões foram observados encontros agonísticos com disputa física, onde machos lutaram no solo.

Figura 7- Distribuição de 16 territórios reprodutivos estabelecidos por machos de Antilophia bokermanni em uma das áreas amostradas, na Chapada do Araripe-CE.

Em relação à presença ou ausência de água dentro dos territórios defendidos pelos machos, foi encontrado que territórios com a presença de água são menores que os territórios sem água no seu interior (Mann-Whitney MANN-WHITNEY U= 21, p= 0,01)

(Figura 8).

Figura 8- Tamanhos de territórios reprodutivos (m2) de machos de A. bokermanni e a presença (1) ou ausência (0) de água no seu interior, na Chapada do Araripe- CE.

DISCUSSÃO

Considerando que a população de Antilophia bokermanni é estimada em 800

indivíduos apenas (IUCN 2015), neste estudo foi amostrado 43,75% da população total,

sendo que 51,72% foram machos e 48,28% fêmeas. O conhecimento do tamanho efetivo de

uma população, é fundamental para a predição da taxa de endogamia e perda da

variabilidade genética (Frankham 1995). Ainda, conhecer a razão sexual de populações,

principalmente para espécies ameaçadas de extinção, é fundamental para análises de

viabilidade populacional, uma vez que populações com razão sexual enviesada para um dos

sexos, necessitam diferentes estratégias de conservação e tendem a decrescer mais

rapidamente (Steifetten & Dale 2006).

O presente estudo é o primeiro a ser realizado efetuando o anilhamento de A.

bokermanni, sendo os resultados sobre captura e número de indivíduos de cada sexo

65 essencial para futuros estudos populacionais e comportamentais. Ao contrário do que se espera para populações pequenas e isoladas (Steifetten & Dale 2006), a razão sexual de A. bokermanni parece ser equilibrada. No entanto, é necessário um acompanhamento a longo prazo de populações da espécie para que se observe a permanência do equilíbrio da razão sexual, principalmente por ser uma espécie relativamente recente, do ponto de vista evolutivo (Luna et al. in prep.), estar sob grande pressão antrópica e pela inexistência de dados anteriores a este estudo para avaliar se a razão sexual caminha para um enviesamento, pelo menos na população estudada.

O período reprodutivo de A. bokermanni pode ser considerado longo, quando comparado com outras espécies de piprídeos e aves neotropicais (Foster 1976, McDonald

1989, Marini 1992, Aleixo & Galetti 1997, Prum et al. 1996, Diniz et al. 2013), tendo uma duração total de pelo menos seis meses (Outubro a Março), considerando a nidificação. A duração do período de nidificação é também maior do que o esperado quando comparamos com outras espécies que possuem ninhos abertos e em formato de cesta (Ricklefs & Brawn

2013, Marques-Santos et al. 2015, Repenning & Fontana 2016). Algumas outras espécies

Neotropicais também apresentam longos períodos de nidificação (Skutch 1976, Ricklefs

1993, Martin 2002), sendo essa uma estratégia difícil de explicar, uma vez que devido às maiores taxas de predação nos trópicos, espera-se que a fase de nidificação seja mais curta

(Martin 2002, Tieleman et al. 2004, Ricklefs & Brawn 2013). Uma das hipóteses mais usadas para explicar essas diferenças reprodutivas entre aves tropicais e de regiões temperadas é a de que espécies com períodos mais longos, tenham menor taxa de visitação pelos pais. Isso resultaria em um decréscimo na temperatura média dos ovos para a fase de incubação e menor taxa de entrega de alimento na fase de ninhegos, atrasando a eclosão

66 dos ovos e revoada dos filhotes; no entanto, Ricklefs e Brawn (2013) não encontraram essa relação para as seis espécies de Passerine analisadas.

O fato de não serem encontradas muitas espécies de predadores de ninhos na

Chapada do Araripe, e destas espécies não serem muito abundantes (Ribeiro et al. 2012 ,

Gaiotti observação pessoal), pode contribuir para a longa duração do período de incubação e ninhegos de A. bokermanni, pois como se sabe a pressão de predação é um dos principais fatores que moldam a duração da estação reprodutiva das espécies, bem como outros aspectos comportamentais (Ricklefs 1969, Skutch 1985). Dentre os 124 ninhos que se tornaram ativos, apenas 25,8% foram perdidos devido à predação, enquanto que a porcentagem de ninhos predados para outras espécies de aves neotropicais varia de 65% a

70% (Aguilar et al. 2000, Noske et al. 2008, Nóbrega & Pinho 2010). Ainda, outro indicativo da baixa predação é a alta taxa de sobrevivência de A. bokermanni, sendo que em geral, para espécies com ninhos abertos, apenas 29% dos ninhegos deixam os ninhos

(Robinson et al 2012), enquanto que neste estudo 74,6% dos ninhos ativos, obtiveram sucesso.

No estudo de Girão e Souto (2005), onde determinaram o período reprodutivo de A. bokermanni através da frequência de canto de alguns machos, foi sugerido que a estação reprodutiva seria de agosto a fevereiro, tendo seu pico em setembro e outubro e período de incubação e ninhego de setembro a dezembro. No entanto, no presente estudo encontramos que o período de nidificação vai de novembro à março, tendo seu pico em janeiro, podendo ter mais de um pico ao longo da estação como foi o caso da segunda estação (2014/2015).

Os nossos resultados demonstram a importância da coleta de dados de nidificação, através do monitoramento dos ninhos, para uma maior precisão da determinação de cada etapa da

67 reprodução. Durante a coleta de dados nas três estações reprodutivas, em especial na terceira (2015/2016), o canto iniciou-se por algumas semanas mas cessou por longo período (aparentemente devido a falta de chuvas), não significando que tivesse iniciado o período de nidificação, uma vez que ninhos não foram iniciados.

Dentre as 14 espécies de plantas identificadas, utilizadas como suporte de ninho de

A. bokermanni, quatro são também utilizadas para a alimentação da espécie (Linhares et al.

2010). Espécies de Psychotria foram também utilizadas como plantas suporte em estudos realizados com Chiroxiphia linearis, que utilizou apenas seis espécies de planta suporte

(Foster 1976), e na dieta de Manacus manacus e Pipra erythrocefala (Morales-Betancourt

2012). As espécies Climedia spp., Miconia spp. e Piper spp., aqui registradas como espécies suporte de ninho, foram também utilizadas na dieta de Chiroxiphia boliviana, M. manacus e P. erythrocephala (Montaño-Centellas 2012, Morales-Betancourt 2012), o que sugere a possibilidade de que A. bokermanni poderia também utilizar tais espécies para sua alimentação.

Alguns fatores relativos às plantas utilizadas merecem atenção especial, como o caso da fêmea que nidificou em uma mangueira (Magnifica indica), espécie invasora e bastante comum em áreas urbanas. A área onde esse registro ocorreu (Nascente), é uma das

áreas que mais sofre com a presença constante de humanos e extração ilegal e irregular de

água, causando grande alteração na vegetação. Os ninhos construídos em samambaias

(Cyathea spp.) também chamam a atenção pelo insucesso (68% foram perdidos), sendo que na maioria das vezes o ninho foi derrubado por intempéries climáticas. Samambaias são bastante abundantes no interior da mata, no entanto, a maioria das áreas são pequenos fragmentos de vegetação ao longo da encosta da Chapada do Araripe (Brito et al. 2013),

68 que possivelmente sofrem efeito de borda, o que pode explicar a perda dos ninhos (Silva

Neto 2013). Se A. bokermanni possuía uma preferência por samambaias, devido ao difícil acesso de predadores (por ser uma planta frágil) e a sua proximidade à áreas úmidas, a perda de ninhos nessas plantas devido a uma maior exposição à intempéries climáticas, pode ocasionar um efeito negativo relevante para o sucesso da espécie.

As áreas amostradas apresentam diferentes graus de fragmentação, sendo a área

“Grangeiro” a maior e aparentemente mais bem conservada dentre todas, o que explica o maior número de ninhos encontrados nesta área (N= 67 ninhos). Apesar de a área

“Advogados” ter apresentado a maior taxa de sobrevivência diária geral e no período de incubação, foram encontrados apenas 12 ninhos nessa área. No segundo semestre de 2015 a

área “Advogados” foi quase que completamente perdida por um incêndio criminoso, logo no início do período de nidificação, o que ocasionou o pequeno tamanho amostral de ninhos para esta área. O incêndio também afetou boa parte da área “Grangeiro”, e estimamos que foram perdidos pelo menos 10 territórios reprodutivos (e sítios de nidificação), devido a esse episódio.

Neste estudo encontramos resultados divergentes para a taxa de sobrevivência em relação a área e ano de amostragem. Variações no sucesso reprodutivo em diferentes anos e

áreas é um padrão comum para aves (Moynahan et al. 2006, Manica 2008, Newmark &

Stanley 2011). Os principais fatores ligados a diferentes TSDs entre estações seriam o volume de chuva, oferta de alimento, competição, mudanças de temperatura, bem como catástrofes ecológicas (Rotenberry & Wiens 1989, Donovan et al. 1997, Stutchbury &

Morton 2001, Moynahan et al. 2006). Em geral, áreas mais abertas ou degradadas possuem

TSD menor quando comparadas com áreas de mata contínua e mais densa (Wilcove 1985,

69 Martin 1993, Paton 1994).

Encontramos que o diâmetro externo do ninho e altura em relação ao solo podem ser fatores determinantes para o sucesso de A. bokermanni nas fases de ovos e ninhegos.

Poucos trabalhos avaliaram o efeito do tamanho do ninho sobre o seu sucesso (Caccamise

1977, Alabrudzinska et al. 2003, Hudson & Bollinger 2013). No entanto, alguns estudos também encontraram que as dimensões, formato e altura de um ninho podem ser fatores importantes para o sucesso destes (Møller 1989, Martin 1993, Söderström & Rydén 1998,

Hansell 2000, Aguilar et al. 2008, Newmark & Stanley 2011).

Assim como demonstrado para outros estudos (Martin et al. 2000, Lloyd & Martin

2005, Repenning & Fontana 2016), foi encontrada uma menor sobrevivência ao longo da estação reprodutiva durante a fase de ovos (quando excluída a co-variável altura do ninho), que pode estar relacionada a fatores como: maior visitação dos pais ao ninho dada a proximidade da eclosão dos ovos e maior tempo de exposição do ninho, ambos facilitando a detecção por predadores (Hochachka 1990, Grant et al. 2005, Di Giacomo et al. 2011).

Além disso, o aumento das chuvas no final do período de reprodutivo, pode também causar maior perda de ninhos de A. bokermanni.

O fato de que a sobrevivência dos ninhegos oscila ao longo da estação (tempo quadrático), pode ser explicada pela maior oferta de alimento e volume de chuvas

(Linhares et al. 2010, Funceme 2016), uma vez que a disponibilidade de alimento só passa a ser importante nesta fase. Ainda, a baixa sobrevivência dos ninhegos no início da estação, pode estar associada ao menor número de ninhos em uma determinada área neste período, resultando em uma menor diluição do risco de predação dos ninhegos (Kruuk 1964, Lack

1968, Ricklefs 1969). Outro fator que pode causar essa variação quadrática, é o grau de

70 experiência da fêmea. Fêmeas mais experientes tendem a por ovos em períodos onde a taxa de perda de ninho é menor, bem como quando a disponibilidade de alimento durante a fase de ninhego é maior (Skutch 1976, Curio 1983). Dependendo da espécie este período pode ser no início, meio ou fim da estação reprodutiva, enquanto fêmeas reproduzindo pela primeira vez não possuem tal discernimento (Bryant 1979, Nol & Smith 1987).

Assim como para outras espécies de piprideos (Marini 1992, Doucet 2006, DuVal

& Goymann 2011), o cuidado parental é realizado apenas pela fêmea em A. bokermanni.

Não foi encontrada diferença na taxa de entrega de alimento entre ninhegos ou entre os comportamentos efetuados em ninhos com um ou dois ninhegos. Assim, a variação no número de filhotes entre ninhos não parece estar ligada a diferenças no cuidado efetuado pela fêmea. A comprovação de que machos não auxiliam em nenhuma etapa do cuidado parental, incita um questionamento sobre a atual classificação do sistema de acasalamento de A. bokermanni, considerada socialmente monogâmica. Em espécies socialmente monogâmicas é comum que a fêmea receba auxílio do macho, seja no cuidado com a prole ou com alimentação trazida pelo macho para a fêmea durante a incubação, por exemplo

(Trivers 1972, Chutter et al. 2016).

A única atividade realizada pelo macho, relacionada à reprodução, é a defesa de território. Os territórios dos machos de A. bokermanni são relativamente pequenos quando comparados com outros passeriformes (Gorrel et al. 2005, Duca & Marini 2005, Faria et al.

2007). Uma explicação ecológica seria a pequena área de ocorrência da espécie adicionada

à fragmentação do habitat, além da sinuosidade do relevo (ICMBIO 2011, Pinhero et al.

2014). O fato de termos encontrado uma relação negativa entre o tamanho do território e a presença de água, pode ser explicada pelo fato de que áreas próximas a água tendem a ser

71 de melhor qualidade, devido à maior umidade e oferta de alimento bem como locais de nidificação (Grant 1982, Smith & Shugart 1987). Isso tornaria desnecessária a defesa de uma grande área, uma vez que a quantidade de alimento presente em uma pequena porção seria suficiente (Schoener 1968). Ainda, estas áreas seriam mais disputadas por machos, gerando maior competição e pressão entre vizinhos, resultando em menores territórios

(Korpimäki 1988, Adams 2001).

Ao contrário do que se acreditava (BirdLife International 2010, ICMBIO 2011), inúmeros ninhos e territórios reprodutivos foram encontrados relativamente distantes de corpos d’água e em altas altitudes na encosta da Chapada do Araripe. Essa constatação é de fundamental importância para a conservação da espécie, uma vez que o fato de sítios de nidificação não estarem necessariamente sobre nascentes e corpos d’água pode ampliar a

área de vida da espécie bem como modificar as estratégias de conservação. Vale ressaltar que uma certa umidade e a presença de determinadas plantas, em especial as utilizadas como suporte de ninhos, parecem ser necessárias para o estabelecimento destes territórios pelos machos e a nidificação da fêmea (observação pessoal).

Os resultados encontrados neste estudo sobre a história natural e em especial, a biologia reprodutiva de A. bokermanni, fornecem base para estudos mais elaborados sobre a espécie, além de colaborar com ações de conservação para a mesma. O fato de terem sido encontrados ninhos em áreas com grande influência antrópica, não significa que a espécie tenha sucesso em tais locais, pois é preciso atentar-se para o número de ninhos encontrados e o número de ninhos bem sucedidos nessas áreas. O menor número de ninhos encontrados, o elevado número destes abandonados, e a utilização de espécies de plantas invasoras para nidificação em áreas com maior interferência humana indicam ser essa uma das principais

72 ameaças para A. bokermanni. Por outro lado, a persistência da espécie e o relativo alto sucesso reprodutivo também demonstram a resiliência de A. bokermanni, gerando otimismo quanto à sua sobrevivência como espécie, desde que as devidas providências sejam implementadas.

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85 ANEXO 1. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 47 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc peso Likelihood Par {Tc + area1} 131,724 0 0,323 1 3 125,68 {Tc + area1 + externdiam} 132,170 0,445 0,259 0,800 4 124,11 {Tc + area1 + height} 133,211 1,487 0,153 0,475 4 125,15 {T constante} 135,075 3,350 0,060 0,187 1 133,06 {Tc + externdiam} 136,076 4,352 0,036 0,113 2 132,05 {T linear} 136,153 4,429 0,035 0,109 2 132,13 {Tc + height} 137,005 5,281 0,023 0,071 2 132,98 {Tl + externdiam} 137,212 5,488 0,020 0,064 3 131,17 {Tc + externdiam + height} 138,059 6,334 0,013 0,042 3 132,02 {Tl + height} 138,138 6,413 0,013 0,040 3 132,10 {T quadratico} 138,161 6,436 0,012 0,04 3 132,12 {Tc + ano1} 138,334 6,610 0,011 0,036 3 132,29 {Tq + externdiam} 139,191 7,466 0,007 0,023 4 131,13 {Tl + externdiam + height} 139,233 7,508 0,007 0,023 4 131,17 {Tc + ano1 + externdiam} 139,372 7,647 0,007 0,021 4 131,31 {Tc + ano1 + height} 139,993 8,269 0,005 0,016 4 131,93 {Tq + height} 140,157 8,432 0,004 0,014 4 132,09 {Tq + externdiam + height} 141,213 9,488 0,002 0,008 5 131,12 deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

86 ANEXO 2. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 74 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Sem co-variável altura do ninho em relação ao solo. Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc peso Likelihood Par {T linear} 190,062 0 0,260 1 2 186,05 {T constant} 191,002 0,94 0,162 0,625 1 188,99 {T quadratico} 191,866 1,804 0,105 0,405 3 185,84 {Tl + externdiam} 191,919 1,857 0,103 0,395 3 185,89 {Tl + area1} 192,350 2,288 0,083 0,318 6 180,27 {Tc + externdiam} 192,975 2,913 0,060 0,232 2 188,96 {Tq + externdiam} 193,781 3,719 0,040 0,155 4 185,74 {Tl + ano1} 193,997 3,935 0,036 0,139 4 185,96 {Tq + area1} 194,033 3,971 0,035 0,137 7 179,93 {Tc + ano1} 194,047 3,985 0,035 0,136 3 188,02 {Tc + area1} 194,187 4,125 0,033 0,127 5 184,13 {Tq + ano1} 195,719 5,657 0,015 0,059 5 185,66 {Tc + externdiam + 195,963 5,901 0,013 0,052 6 183,88 area} {Tc + externdiam + 195,991 5,929 0,013 0,051 4 187,95 ano1} deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

87 ANEXO 3. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) no período de incubação (fase de ovos, N= 55 ninhos) de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadratic (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Sem co-variável diâmetro externo. Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc peso Likelihood Par {Tc + area1} 171,908 0 0,504 1 3 165,87 {Tc + height + area1} 173,273 1,364 0,255 0,505 4 165,22 {T constante} 176,060 4,151 0,063 0,125 1 174,05 {Tc + height} 176,451 4,541 0,052 0,103 2 172,43 {Tl+ height} 177,264 5,355 0,034 0,068 3 171,23 {T linear} 177,373 5,464 0,032 0,065 2 173,35 {Tq + height} 178,801 6,893 0,016 0,031 4 170,74 {Tc + ano1} 178,864 6,955 0,015 0,030 3 172,83 {T quadratico} 178,927 7,018 0,015 0,029 3 172,89 {Tc + height+ ano1} 179,747 7,838 0,010 0,019 4 171,69 deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

88 ANEXO 4. Resultados da seleção de modelos, utilizando o Critério de Informação de Akaike para pequenos tamanhos amostrais (AICc) para período de ninhego (N= 28 ninhos), de ninhos de Antilophia bokermanni, na Chapada do Araripe, CE, entre as estações reprodutivas de 2013/2014, 2014/2015 e 2015/2016. Modelos analisados com tempo constante (Tc), linear (Tl) e quadrático (Tq). Modelos incluindo co-variáveis: altura do ninho (height), diâmetro externo (externdiam), estação reprodutiva (ano1) e área amostrada (area1). Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc Pesos Likelihood Par {Tl + ano1 + area1 + externdiam + 38,939 0 0,175 1 6 26,65 height} {Tl + ano1 + area1 + 39,183 0,243 0,155 0,8852 5 28,98 height} {Tc + ano1} 39,461 0,521 0,135 0,7706 2 35,42 {Tl + ano1+ externdiam + 40,154 1,214 0,095 0,5448 5 29,95 height} {Tl + ano1+ 40,656 1,716 0,074 0,4239 4 32,52 externdiam } {Tl + ano1} 40,867 1,927 0,066 0,3815 3 34,78 {Tl + ano1+ height} 40,977 2,037 0,063 0,361 4 32,84 {Tl + ano1 + area1 + 41,549 2,609 0,04 0,2713 5 31,34 externdiam} {Tl + ano1 + area1} 41,982 3,042 0,038 0,2184 4 33,84 {Tl + area1} 43,259 4,319 0,020 0,1154 3 37,17 {Tc + area1} 43,729 4,789 0,016 0,0912 2 39,68 {Tc + externdiam} 43,887 4,947 0,014 0,0843 2 39,84 {T linear} 43,987 5,047 0,014 0,0801 2 39,94 {Tl + area + 44,277 5,337 0,012 0,0693 4 36,14 externdiam} {T constante} 44,342 5,403 0,011 0,0671 1 42,32 {Tl + externdiam} 44,712 5,773 0,009 0,0558 3 38,63 {Tl + area + height} 44,923 5,984 0,008 0,0502 4 36,79 {T quadratico} 45,120 6,180 0,007 0,0455 3 39,04 {Tc + externdiam + 45,919 6,979 0,005 0,0305 3 39,83 height} {Tl + height} 46,006 7,066 0,005 0,0292 3 39,92 {Tl + area1 + 46,025 7,085 0,005 0,0289 5 35,82 externdiam +

89 Delta AICc Model Num. Modelo AICc Desvio AICc Pesos Likelihood Par height} {Tc + height} 46,355 7,415 0,004 0,0246 2 42,31 {Tq + externdiam} 46,563 7,623 0,003 0,0221 4 38,43 {Tl + height + 46,76 7,820 0,003 0,0201 4 38,62 externdiam} {Tq + height} 47,028 8,088 0,003 0,0175 4 38,89 {Tq + height + 48,570 9,630 0,001 0,0081 5 38,37 externdiam} deltaAICc = Diferença entre o AICc e o AICc mínimo encontrado para os modelos comparados

Capítulo 2

Intersexual differences in the diet of the critically endangered

and endemic Araripe manakin (Aves: Pipridae)

91 ABSTRACT

Diet studies provide information about a species’ ecology, evolution and behavior. The

Araripe manakin (Antilophia bokermanni) is a critically endangered, endemic and sexually

dichromatic species from northeastern Brazil. Similarly to other manakins, females have

cryptic plumage while males exhibit typically conspicuous coloration, in this case a red

helmet and black wings and tail. Little is known about its natural history, and as an

endangered bird, information about diet may be crucial for conservation plans. We

analyzed the Araripe manakin diet and tested if male and female food items and foraging

behavior differ. We caught and banded birds, and analyzed feces samples. Using focal

observations we collected foraging behavioral data, including vegetation strata used,

foraging bout duration and gathering method. Food items were identified to the lowest

taxonomic level possible. Unidentified seeds were classified as morphotypes. Based on

data gathered from 57 females and 37 males, we found that the Araripe manakin diet

contains both plant and animal items including 10 different types of fruits and three Orders

of invertebrates. Climedia biserrata was the most important plant item consumed,

representing 80% of the diet. There was a substantial overlap of 68% of food items in the

diets between sexes, which did not differ statistically. However male and female diets were

unique in some aspects: females consumed two extra items (Morphotypes VIII and IX) and

also had a more diverse diet when compared to males. Males, however, consumed more

Coleoptera and these were the second most important item in their diets. Since male and

female foraging behavior does not differ, this result suggests that males choose to consume

more beetles perhaps to maintain plumage color, since beetles are rich in carotenoids.

92 Results also provide important data about which plants can be used in the management or

recovery of Araripe manakin habitats.

Keywords: Araripe manakin, diet, foraging, frugivory, Pipridae

RESUMO

Estudos sobre dieta fornecem informações sobre ecologia, evolução e comportamento das

espécies. Antilophia bokermanni é uma espécie criticamente ameaçada, sexualmente

dicromática e endêmica do nordeste do Brasil. Assim como outros piprídeos, fêmeas

possuem coloração críptica enquanto machos exibem uma coloração conspícua, nesse caso

um manto vermelho, cauda e asas pretas. Pouco se sabe sobre a história natural da espécie e

como uma ave ameaçada, informações sobre sua dieta são cruciais para sua conservação.

Nós analisamos a dieta de A. bokermanni e testamos se os itens consumidos e o

comportamento de forrageamento diferem entre machos e fêmeas. Nós capturamos os

indivíduos, e analisamos suas amostras de fezes. Usando observações focais coletamos

dados sobre forrageamento incluindo: extrato da vegetação e técnica utilizadas e duração

do forrageamento. Os itens alimentares foram identificados ao menor nível taxonômico

possível. Sementes não identificadas foram agrupadas em morfotipos. Utilizando dados de

57 fêmeas e 37 machos, nós encontramos que a dieta de A. bokermanni contêm itens

vegetais e animais, incluindo 10 tipos de frutos e três Ordens de invertebrados. Climedia

biserrata foi o item mais importante, representando 80% da dieta. A sobreposição

intersexual da dieta foi de 68%, a qual não diferiu estatisticamente. No entanto, a dieta de

machos e fêmeas foram únicas em alguns aspectos: fêmeas consumiram dois itens extra

(Morfotipo VIII e IX) e apresentando uma dieta mais diversa. Machos consumiram mais

93 Coleoptera, sendo este o segundo item mais importante na sua dieta. Uma vez que o

comportamento de forrageamento entre sexos não diferiu, nossos resultados sugerem que

machos escolhem consumir mais besouros, talvez com a finalidade de manutenção da

coloração da plumagem, uma vez que besouros são ricos em carotenóides. Os resultados

ainda fornecem importantes informações sobre quais plantas usar no manejo ou

recuperação do habitat da espécie.

Palavras-chave: Antilophia bokermanni, dieta, forrageamento, frugivoria, Pipridae

INTRODUCTION

Diet is one of the strongest selection pressures influencing a bird’s life, affecting

both the fecundity and survival of adults (Charnov and Krebs 1974, Murphy and Haukioja

1986, Nur 1990). Regrettably, for most tropical species, even general information about

foraging habits and diet are still missing (Harris et al. 2005, Alho 2008). Because habitat

degradation in the Tropics is in many cases severe and ongoing, threatening the continued

existence of many bird populations, data relative to diets are important for appropriate

conservation, especially for endangered species (Sample and Whitmore 1993, Lopes et al.

2005).

Our study focused on the diet of the Araripe manakin, Antilophia bokermanni, a

critically endangered and endemic bird species of the tropical bird family Pipridae. Species

in this family typically exhibit a striking dichromatism, with males presenting colorful

plumage and complex displays, and mating systems are based upon lek formation and

promiscuous mating (Prum 1994). Nevertheless, one single genus in the family, Antilophia,

appears to have a socially monogamous system, no lek formation, and parental investment

by both sexes (Prum 1994). The genus has two species: A. galeata and A. bokermanni. The

94 latter species, subject of the current study, was described in 1998 (Coelho & Silva 1998), is critically endangered, and is the only passerine species endemic to Ceará state, Brazil

(IUCN 2015). Its population size is currently estimated at only 800 individuals (Aquasis

2006, Rêgo et al. 2010, IUCN 2015, BirdLife International 2016). Similarly to the rest of the species in the family, the Araripe manakin is sexually dichromatic: females are olive green while adult males are white, with a red helmet and black wings and tail (Coelho and

Silva 1998). Despite some limited information about its conservation status and endemism, data on the species´ natural history, ecology, and behavior are totally lacking, imposing serious obstacles to the development and implementation of conservation plans.

Species with strong sexual dimorphism can differ in their feeding ecology (Selander

1966, Hedrick and Temeles 1989, Shine 1989), especially if males and females have a large difference in body size, different coloration, and need to forage in different ways to avoid predation or to ingest different types of food given their plumage coloration requirements

(Fox and Vevers 1961, Brush 1978). Recent studies with some manakins have found that males and females differ in their behavior and diet and do not have the same role and significance as fruit dispersers (Loiselle et al. 2007, Montaño-Centellas 2012).

Consequently, information relative to the diet requirements of each sex and their particular impact and importance for the ecosystem is crucial for conservation purposes (Selander

1966, Hedrick and Temeles 1989, Shine 1989).

Habitat fragmentation is one of the main causes of species´ populational decline

(Wilcove et al. 1998, Venter et al. 2006), and implementing recovery plans is in some cases the best solution for increasing population size (Kerr and Deguise 2004, Taylor et al. 2005).

Conservation plans for endangered species usually identify which habitat conditions are

95 essential components for the preservation and growth of populations (Cassaza et al. 2016).

Hence, data about which plants are critical (e.g. as food sources, for nesting and protection) for the survival of a given species is a crucial step for establishing successful conservation plans.

The plateau where our studied population occurs is a disturbed area that suffers from human occupation and inappropriate resource exploitation by the local community.

Also, the multiple fresh water springs on the slopes of the plateau constitute the most important water source for nearby cities. Thus, the loss of the forest vegetation will result in a large and very negative impact on surrounding cities (Brasil 1996, Lins, 2009).

Maintenance of the forest is strongly dependent upon seed dispersal of local plants and trees. The manakins are represented by many frugivorous species that are important seed dispersers (Snow 1970, Foster 1977, Marini 1992, Blake and Loiselle 2002, Silva e Melo

2011, Montaño-Centellas 2012, Morales-Betancourt et al. 2012), often having a substantial role in maintaining forests (Marini 1992, Loiselle and Blake 1999, Silva and Melo 2011).

The Araripe manakin is the only representative of the Pipridae family on the Araripe plateau, and despite its critically endangered status, it remains one of the most abundant species in many areas along the plateau (Gaiotti in prep.).

For the above described reasons, information about the Araripe manakin diet should be important not only for the species´ conservation but can also be relevant to human populations in the cities that obtain their water supplies from the plateau. In the present study we describe the diet of the critically endangered Araripe manakin and assess whether males and females have different dietary habits. Given the strong sexual dimorphism of the species, we expected to find divergences in male and female foraging habits and diets.

METHODS

We conducted this study in four areas along the slopes of the Araripe plateau, Ceará state,

Brazil (-7.2810694°S, -39.44205°W). The diet data were collected over the course of two

years, from April 2013 to April 2015. We caught the birds using five mist nets (12m x 3m)

for 6hr each day, during 620 days totaling 18,600 net-hours.

Once caught we kept individuals for five minutes in a cloth bag lined with a paper

towel to collect the feces deposited in the bag, which were stored in 70% ethanol and

subsequently analyzed with a stereomicroscope (Bel Photonics® WF10X). Despite some

level of sample degradation, fecal data analysis was the chosen method because of its less

invasive nature, given the conservation status of the species, while still providing relatively

good information about diet, especially fruit consumption (Remsen et al. 1993).

Additionally, a previous study with the sister species (Helmeted Manakin Antilophia

galeata) using forced regurgitation, a method that yields more complete diet data,

presented a high mortality rate (Gaiotti 2011).

The body measurements were taken to determine the degree of sexual size

dimorphism, as this can be relevant for foraging behavior. Individuals were measured with

a hand- held dynamometer (mm) and weighted with a spring balance (Pesola® 100g). Body

measurements included tarsus length, tail length (from uropygial gland to the tip of the

longest feather), wing length (from the shoulder to the tip of the longest feather), and bill

length (from the nostril to the tip of the bill). As young males have the same olive green

plumage as females, we collected ~60 μL of blood from all individuals using brachial

venipuncture for molecular determination of sex. Samples were kept in ethanol until

97 analyses were performed. We used PCR analyses to determine the sex of each individual using the sexing primer 2550/2718.

Food items in the fecal samples were identified to the lowest taxonomic level possible. Seeds that could not be identified were classified as morphotypes. To determine the most important food items in the diet we calculated the occurrence frequency (OC) and numerical frequency (NF) for each individual food item as:

푁푣 OC = × 100 푁푖푛푑.

Where Nv is the number of individuals who consumed a given food item and Nind. is the total number of individuals sampled.

푁푖 NF = × 100 푁푡

Where Ni is the number of food item for a given category and Nt is the sum of all food items for all categories.

With these values we used a modified version of the Kawakami-Vazzoler (1980)

Dietary Importance Index (DIi):

DI푖 = (OC푖 × AF̅̅̅̅푖)/ ∑(OC푖 × AF̅̅̅̅푖) × 100.

Where OCi is the Occurrence Frequency for a given food item and AF̅̅̅̅푖 is the average of the numerical frequency for the food item.

We calculated the diversity of food items for male and female diets using the

Shannon Diversity Index (H) (Shannon 1948) and the amount of food item overlap between sexes using the Bray-Curtis Dissimillarity Index (Bray and Curtis 1957). We tested whether consumption of each food item by males and females differed with a Student t-Test when the data had a normal distribution and a Mann-Whitney U-test for non-parametric data. All

98 statistical analyses were performed with the statistics package PAST 3.0 (Hammer et al.

2001) with the α-level set at <0.05. All values are presented as mean ± standard deviation,

unless noted otherwise.

In addition we also collect foraging behavior data using focal observations of color-

banded individuals foraging for 90 min in the morning (0900 to 1030 hr; n = 10 females

and 7 males) and 60 min during the afternoon (1500 to 1600 hr; n = 11 females and 9

males) for one week. We recorded the vegetation strata where individuals foraged, the

foraging behavior employed (gathering methods), the duration of feeding bouts and

whether males and females were together. The strata were classified according to height as:

canopy (>7 m), understory (2-7 m) and ground (0-2 m). We followed Remsen and

Robinson´s (1990) classification scheme for foraging behavior for four categories: hang,

hang up, hang down, hang upside-down. We added an extra category named fly-catch

based on previous observations of Araripe manakin foraging behavior.

RESULTS

We caught 183 Araripe manakins from which we obtained 94 individual fecal samples. Of

these, 28 male samples and 44 female samples contained identifiable food materials of both

plant and animal origin. We found 10 different types of fruits and two Orders (Coleoptera

and Aracnidae) and one Family (Formicidae) of invertebrates (Table 1). We identified

fruits from three plant genera/species: Byrsonima sericea (Malpighiaceae), Clidemia

biserrata (Melastomataceae) and Cecropia sp (Urticaceae) while the other seven were

classified as morphotypes.

Clidemia biserrata was the most consumed item with an occurrence frequency

(OC) of 22.34% (Table 1). It also was the most important food item representing 80.92% of

99 the Araripe manakin diet, followed by fruit Morphotype VI (DIi= 11.82%) and

Morphotype I (DIi= 4.32%) (Table 2). The most consumed animal item was Coleoptera

(OC= 12.76%), followed by Aracnidae (OC= 6.38%) (Table 1).

Table 1. Occurrence frequency (OF) and numerical frequency (NF) for all food items consumed by Araripe manakins (N=94). Item OF (%) NF (%) Byrsonima sericea 3.19 0.26 Cecropia sp. 5.32 0.89 Clidemia biserrata 22.34 65.96 Morphotype I 10.64 7.53 Morphotype III 12.76 2.04 Morphotype VI 11.70 18.79 Morphotype VII 6.38 0.62 Morphotype VIII 6.38 1.33 Morphotype IX 2.13 0.18 Morphotype X 4.25 0.35 Formicidae 4.25 0.44 Aracnidae 6.38 0.53 Coleoptera 12.76 1.06

Table 2. Dietary Importance Index (DIi) of each food item consumed by female (N=57) and male (N=37) Araripe manakins (N=94). Item Females Males All

Byrsonima sericea 0.01 0.09 0.05 Cecropia sp. 0.09 0.49 0.24 Clidemia biserrata 64.16 94.36 80.62 Morphotype I 6.45 1.92 4.32

100 Item Females Males All

Morphotype III 1.74 0.96 1.42 Morphotype VI 25.34 1.44 11.82 Morphotype VII 0.33 0.09 0.23 Morphotype VIII 1.49 0 0.23 Morphotype IX 0.06 0 0.02 Morphotype X 0.06 0.09 0.09 Formicidae 0.03 0.21 0.1 Aracnidae 0.06 0.38 0.16 Coleoptera 0.14 1.93 0.8

Males and females presented differences in their diets: females ingested two extra fruit species not ingested by males: Morphotypes VIII and IX (Table 3). Females also had a more diverse diet (H= 1.89, e^=0.27, D=0.36) when compared to males (H= 0.72, e^=0.18,

D=0.72). However, the overall diet of males and females had a substantial overlap of 68% of food items (BrayCurtis Index= 0.68), and did not differ statistically (U = 30.5, P = 0.53).

Perusing the data allowed us to verify that males ingested animal items more frequently

(Table 3), and that these items were also twice as important in their diets (Table 2).

Additionally, males consumed significantly more Coleoptera than did females (t = 2.78, P

= 0.006).

Table 3. Occurrence frequency (OF) and numerical frequency (NF) for food items consumed by female (N=57) and male (N=37) Araripe manakins. Females Males Food item OF (%) NF (%) OF (%) NF (%) Byrsonima sericea 1.75 0.16 5.4 0.39 Cecropia sp. 3.51 0.47 8.11 1.38

101 Females Males Food item OF (%) NF (%) OF (%) NF (%)

Clidemia biserrata 21.05 51.35 24.32 84.81 Morphotype I 10.53 10.3 10.81 3.94 Morphotype III 12.28 2.38 13.51 1.58 Morphotype VI 14.03 30.43 8.11 3.94 Morphotype VII 7.02 0.8 5.4 0.39 Morphotype VIII 10.53 2.38 0 0 Morphotype IX 3.51 0.32 0 0 Morphotype X 3.51 0.32 5.4 0.39 Formicidae 1.75 0.32 8.11 0.59 Aracnidae 3.51 0.32 10.81 0.8 Coleoptera 5.26 0.5 24.32 1.8

During focal observations, we recorded 29 adult males and 32 females foraging and using five different gathering behaviors (see Methods). The most frequently used method was “hang”, performed 83.09% by females and 80.49% by males, followed by “hang down” (Figure 1). The behaviors “hang upside down” and “fly catch” were only performed in the morning (Figure 2). We did not find differences between male and female duration of foraging behavior (t = -0.7, p = 0.46), strata used (U = 4.0, p = 1.0) or gathering methods

(t = -3.93E-16, p = 1.0). Both sexes spent a higher percentage of time on the ground and never visited the canopy during the afternoon (Figure 3).

We found no difference between male (mean = 20.65 ± 0.10) and female mass

(mean = 20.69 ± 0.16) (U = 4118.5, P = 0.86). And while males have longer wings (U =

102 3994.5, P < 0.001), tails (t = 5.13; P < 0.001) and tarsi (U = 3260.5, P < 0.001), females have longer bills (U = 4694.5, P = 0.003).

90 80 Male 70 60 Female 50 40 30 20 Amount Amount of time (%) 10 0

Gathering methods

Figure 1. Percentage of each gathering method performed by male and female Araripe manakins during focal observations (n = 15 females and 11 males).

103 60

50 male_morning 40 female_morning 30 male_afternoon 20 female_afternoon Amount (%) Amount time of 10

Gathering methods

60.0

50.0 Canopy

40.0 Understory

30.0 Ground

20.0

10.0 Percentage Percentage of time spent per strata

0.0 Male Female Male Female

Morning Afternoon

104 DISCUSSION

Despite some expected fecal sample degradation, we were able to document the

Araripe manakin’s diet and show the existence of some divergences between the male and

female diets. Similarly to several other studied manakins (Marini 1992, Loiselle and Blake

1999, Lopes et al. 2005, Gaiotti 2011, Silva e Melo 2011, Montaño-Centellas 2012),

Araripe manakins consume both fruits and arthropods, although fruits were more

representative and seem to be the primary item of their diet. The amount of fruit species

ingested by Araripe manakins was similar to that found for other manakin species (Foster

1976, Silva and Melo 2011, Morales-Betancourt 2012).

In this study, Clidemia bisserata was the most consumed item for both sexes, and

also had the highest Dietary Importance Index (DIi), demonstrating the importance of this

plant for this critically endangered bird. Two other manakin species, Manacus manacus

and Pipra erythrocephala, have also been shown to consume high levels of plants of the

Clidemia genus (Morales-Betancourt et al. 2012). The phenology of C. bisserata may

contribute to our findings, since it is one of the few plants in the Araripe plateau that

provides fruit year-round (Linhares 2010), allowing Araripe manakins continuous easy

access. Quite possibly, individuals learn the location of plants that are providing fruits,

allowing them to return repeatedly to the same sites (Foster 1977, Wheelwright and Janson

1985).

Males and females did not differ in their foraging behavior. For all focal

observations both sexes were feeding close to each other or even on the same plant. Thus,

foraging behavior does not justify the differences between male and female diets. We

found that females have a more diverse diet than males. One possible explanation is that

105 the more cryptic olive-green plumage of females provides them with a greater degree of camouflage in forested areas, thus allowing them to seek food over a broader area with less risk of predation (Pratt and Stiles 1983). Males, on the other hand, have a very bright white body coloration, with conspicuous red helmets, and may be more vulnerable to predation

(Wallace 1889, Götmark 1993).

Furthermore, we found that females have a longer bill, which probably allows them to manipulate more types of fruits (e.g. larger fruits) that males may be unable to handle and ingest (Doucet 2006). Another possible explanation for the higher diversity in the female diet is their more frequent movement between territories, allowing them to forage more widely, when compared to the territorial males, which are limited to small areas.

Evidence of this higher locomotion is that only females or young males (with green feathers) were recaptured in areas as far apart as 4.65 km during this study (n = 4) but no adult males were recaptured at any substantial distance from their first place of capture.

This is also the case for other manakins, wherein adult males are committed to lek sites, and thus cover smaller feeding areas when compared to females and young males (Snow

1962, Lill 1974, Graves et al. 1983, Théry 1992).

Males consumed significantly more Coleoptera beetles when compared to females.

Many studies have shown that beetles and other arthropods are rich in carotenoids (Karrer and Jucker 1948, Czeczuga 1971, Goodwin 1986, Isaksson 2009, Eeva et al. 2010).

Animals cannot produce carotenoids and rely on their diets to obtain this pigment

(Thommen 1971, Brush 1976, Gray 1996), which is responsible for the red, yellow and orange colors found in bird plumages (Fox and Vevers 1961, Brush 1978, McGraw 2004).

Several studies have shown that the level of carotenoid ornamentation in birds is associated

106 with differences in their diets (Slagsvold and Lifjeld 1985, Partali et al. 1987, Hill and

Montgomerie 1994, Hill et al. 1994, Ryan et al. 1994), and that carotenoid ingestion is positively correlated to the intensity of feather coloration (Hill et al. 2002). Because the majority of red feathers result from carotenoid ingestion (Brush 1976, Hill 2006), it is very likely that adult male Araripe manakins need to ingest food items that will result in the bright red plumage of their helmets. The consumption of beetles may be a good option when fruits rich in carotenoids are unavailable or insufficient.

The higher importance of arthropods (i.e. protein) in the male diet can also be associated to the male’s overall larger size, including longer wings, tail and tarsi. Because arthropods have high levels of protein, the growth rate of birds on a more insectivorous diet is faster than that of frugivorous ones (Savory 1977, Johnston 1993). Since males have a less diverse diet than females, as mentioned above, they may need a more protein-rich diet.

In addition, as the vast majority of plants do not have fruit year-round, males may depend upon invertebrates as a complementary item in their diet, more frequently than females.

Our results provide key information about the Araripe manakin diet, which may be important for improving the conservations status of this endemic and critically endangered species (BirdLife International 2016). Additionally, we show that males and females differ in several aspects of their diets, indicating sex-specific requirements relative to habitat food resources. These results also contribute with basic data about Araripe manakin feeding ecology, which can be helpful for future conservation plans applied to recover heavily degraded areas; in such cases, for example, reforestation can use plants that we now know are important for the Araripe manakin diet. Finally, the differences in the male and female diets raise new questions about the evident dimorphism of the Araripe manakin and how

107 male foraging behavior may be used to maintain their conspicuous coloration.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) and the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) for scholarships provided to Milene Gaiotti. CNPQ also provided a fellowship for

Regina H. Macedo. For financial support we thank the Association of Field Ornithology,

Ornithological Council, Geopark Araripe, Rufford Foundation and the Fundação de Apoio

a Pesquisa do DF (FAP-DF). Prof. Robson Ávila graciously provided lab space for the food

item analyses. We are grateful for logistic support from Universidade de Brasília and

Cornell University and for field assistance provided by João H. de Oliveira, Verônica

Lima, Eveny L. Cavalcante Maia and Tatyane Oliveira. Brian D. Wiese reviewed a

preliminary version of this manuscript. We thank NGO Aquasis for help with access to our

field study sites.

Ethics statement: This research was conducted under the licenses provided by CEMAVE

(no. 3731/2) and IBAMA (no. 40116-4).

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115

Capítulo 3

Variação nos caracteres secundários de machos de Antilophia

bokermanni, e sua relação com sucesso reprodutivo

116 INTRODUÇÃO

No século XIX a função e a evolução de características extravagantes, geralmente

dos machos, foram tema de famosas discussões entre Charles Darwin e Alfred Wallace,

que diferiam quanto às ideias de como tais características teriam surgido (Darwin 1871,

Wallace 1895). Foi Ronald Fisher (1915, 1930) que, com a teoria de potencialização

(runaway selection hypothesis), forneceu novas explicações para a origem de tais

características e reconciliou os pontos de vista desses grandes naturalistas. A proposta de

Fisher era, resumidamente, que existiam duas etapas no processo de evolução de

características extravagantes: primeiro existiria uma variação genética embasando os traços

dos machos, e que aqueles com um traço ligeiramente mais extravagante (e.g., uma cauda

um pouco maior), teriam uma pequena vantagem em termos de sobrevivência. A segunda

etapa diz respeito à preferência das fêmeas, que por sua vez, possuiriam uma variação

genética na propensão de acasalarem-se com machos com traços de extravagância variados.

Assim, fêmeas que preferissem machos mais extravagantes produziriam uma prole com

uma sobrevida ligeiramente maior. Então, os alelos codificando traços mais extravagantes

tornariam se mais frequentes na população, tal qual os alelos codificando a preferência das

fêmeas por esses traços, potenciando o processo.

Muitos autores mostraram através de modelos teóricos que o processo runaway

proposto por Fisher (1915) realmente pode ocorrer (Donald 1973, Lande 1981, Kirkpatrick

1982, Bailey & Moore 2012, Chandler et al. 2013). No entanto, alguns pesquisadores não

estavam satisfeitos com o efeito disgênico da escolha da fêmea e buscaram explicações em

um contexto onde a escolha poderia levar as fêmeas a copularem com machos de maior

aptidão (Smith 1976). Desta forma surgiram hipóteses alternativas para a origem dos

117 caracteres sexuais secundários dos machos. O princípio do handicap (ou desvantagem), defendido por Zahavi (1975), é o mais discutido. Esse princípio propõe que as preferências das fêmeas evoluem para permitir que estas se acasalem com machos de maior qualidade, e a escolha de machos com traços mais extravagantes, no entanto desvantajosos (em termos de sobrevivência) para os machos, ocorreria porque funcionariam como indicadores de boa saúde e vigor, também chamado por Andersson (1994) de mecanismos indicadores. Isso alude à existência de genes associados à boa qualidade dos indivíduos, ou “bons genes”.

Assim, apenas machos de melhor qualidade (e.g., mais saudáveis), seriam capazes de exibir traços energeticamente custosos, que parecem não ser adaptativos no contexto da seleção natural. Tal qual o processo runaway, o princípio do handicap tanto tem sido criticado quanto elogiado (Smith 1976; 1985, Kirkpatrick 1986, Pomiankowski 1987, Grafen 1990,

Yang et al. 2013, Hodges-Simeon et al. 2014, Moore et al. 2015).

Hamilton e Zuk (1982) propuseram algumas modificações na teoria de Zahavi

(1975). Eles sugeriram que adaptações em populações animais evoluem de forma cíclica em resposta aos parasitas, e que a variação na extravagância das características dos machos seria mediada por tais parasitas ou patógenos. Assim, machos livres de infecções ou infestações exibiriam características comportamentais mais vigorosas (e.g., display, canto, vôo) ou possuiriam plumagens mais brilhantes, por exemplo. Sugeriram ainda, que se a resistência a parasitas fosse hereditária, fêmeas que optassem por tais machos teriam uma prole com maior aptidão. Esse modelo assume que: (1) a expressão de características sexuais secundárias nos machos depende da sua saúde e vigor; (2) hospedeiros co-evoluem com seus parasitas gerando uma hereditariedade da resistência a esses parasitas; e (3) existe

118 um efeito negativo da presença do parasita sobre a viabilidade do hospedeiro (Møller

1990).

Inúmeros estudos têm sido realizados no intuito de explicar se, de fato, esses traços dos machos estão relacionados com sua qualidade e saúde, e muitas divergências tem sido encontradas (Borgia & Collis 1989, Endler & Lyles 1989, Møller 1990, Clayton 1991,

Weatherhead et al. 1991, Poulin & Vickery 1996, von Schantz et al. 1996, Hamilton &

Poulin 1997, Costa & Macedo 2005, Vas et al. 2011, Pölkki et al. 2012, Marzal et al. 2013,

Molnár et al. 2013). Tal princípio não parece funcionar de maneira igual para todos os traços, nem para todas as espécies (Kirkpatrick 1986, Clayton 1991, Pröhl et al. 2013). Por isso é necessário primeiramente encontrar quais traços, caso existam, estariam relacionados com a saúde e vigor do macho, assim como quais parâmetros de saúde ou boa qualidade poderiam estar associados a esses traços (Drury 2010).

É reconhecido que doenças parasitárias afetam negativamente o desenvolvimento e a qualidade dos caracteres sexuais secundários. Sabe-se também que altos níveis de testosterona, necessários para a produção e manutenção de traços exagerados, suprimem o sistema imune (Folstad & Karter 1992), permitindo apenas aos machos livres (ou com menores taxas) de parasitas e infecções possuírem tais características extravagantes. A convergência das propostas de Folstad & Karter (1992) e de Hamilton e Zuk (1982) com a teoria do handicap de Zahavi (1975) sugere que a exuberância de características sexuais secundárias seja uma boa indicadora da saúde do macho que as exibe (Drury 2010). Para as aves, a coloração das penas, a complexidade do canto, o investimento no cuidado parental e a condição corporal são caracteres reconhecidamente associados à qualidade da saúde dos

119 machos (Shutler & Weatherhead 1990, Garamszegi 2004, Carvalho et al. 2007, Gil et al.

2007, Marzal et al. 2013).

Aves da Família Pipridae são excelentes modelos para testar tais teorias, devido ao grande dimorfismo sexual, e à exuberância e complexidade na coloração e nos displays exibidos pelos machos (Prum 1998, Anciães & Prum 2008). A Família Pipridae destaca-se não só pela exuberância das características sexuais secundárias como também pelo fato de ter um sistema de acasalamento poligâmico, na forma de leks. O presente trabalho focou uma das espécies dessa família, Antilophia bokermanni, com o intuito de examinar sua biologia reprodutiva e comportamento. Na Introdução Geral à tese apresento informações mais detalhadas acerca da espécie de estudo.

O gênero Antilophia é o único entre os piprideos que não exibe displays elaborados de corte, sendo que as duas espécies do gênero são classificadas como monogâmicas, diferentemente das outras espécies da família (Prum 1994, 1998, Marini & Cavalcanti

1992). Contudo, machos de A. bokermanni possuem uma plumagem de coloração extravagante para uma espécie tida como monogâmica e que habita a mata úmida: branca, grená e preta, diferente das fêmeas que são verde oliva (Coelho & Silva 1998). Ainda, os machos possuem uma vocalização bastante chamativa e frequente, especialmente durante o período reprodutivo, além de um repertório variado (Girão & Souto 2005, Gaiotti observação pessoal).

Tais caracteres sexuais secundários, na sua vasta maioria, não são produzidos através de seleção natural (Lande 1981, Kirkpatrick 1982, Frazee & Masly 2015, Gordon et al. 2015). Assim, esse estudo teve por objetivo avaliar se a variação nos caracteres sexuais secundários em machos de A. bokermanni está relacionada com uma melhor condição

120 física destes, ou seja, se as características são sinais honestos de qualidade e se os machos

com características mais acentuadas/complexas, por sua vez, são favorecidos pelas fêmeas,

tendo assim um maior sucesso reprodutivo. Esperamos, também, que machos com

melhores condições corporais possuam maiores territórios reprodutivos.

No contexto do exposto acima, testamos nesse trabalho as seguintes hipóteses: (1)

machos com melhor condição corporal (maior índice da relação peso e comprimento do

tarso) apresentam melhor condição imunológica; (2) machos com melhor condição

corporal (maior índice da relação peso e comprimento do tarso) e/ou melhor condição

imunológica exibem caracteres sexuais secundários mais extravagantes (plumagem e

vocalização) e possuem territórios reprodutivos maiores; e (3) a qualidade do macho, seja

através de condição corporal, extravagância dos caracteres sexuais secundários ou maior

território, está relacionada com seu sucesso reprodutivo.

MÉTODOS

O Capítulo 1 traz parte da descrição metodológica que foi utilizada também no

estudo descrito no presente capítulo, e portanto não repetida aqui. Tais metodologias se

referem à:

Captura e marcação dos indivíduos

Territórios reprodutivos

ÍNDICE DE CONDIÇÃO CORPORAL

Todos os machos adultos capturados tiveram as medidas morfométricas tomadas

com paquímetro bem como seu peso mensurado com balança de mola, como descrito nos

métodos no capítulo 1. A idade dos machos foi determinada através da coloração da

plumagem, onde machos com plumagem adulta completa (sem a presença de penas verdes)

121 foram considerados adultos, machos que apresentaram partes da plumagem verde foram considerados sub-adultos e machos totalmente verdes (que tiveram o sexo determinado através de sexagem genética) foram considerados jovens. Usando a razão entre o peso e o comprimento do tarso, foi calculado o índice de condição corporal dos indivíduos (ICC = peso/tarso) onde altos valores indicam indivíduos mais pesados com relação ao tamanho, ou seja, com melhores condições corporais no que se refere à reservas energéticas lipídicas.

Esse método é considerado uma boa medida de saúde e tamanho do macho, quando as duas medidas, peso e tarso, não estão correlacionadas, como no caso do presente estudo

(coeficiente da correlação de Pearson: r = 0,27; p = 0,10), uma vez que reflete de forma independente peso e comprimento (Peig & Green 2009).

COLETA E ANÁLISE DA PLUMAGEM

Para todos os machos adultos, foram registradas (com paquímetro 0,01mm de precisão) as medidas do comprimento do manto (da extremidade do topete até a extremidade do manto), e do comprimento do topete (da base da pena frontal até a ponta do topete). Foram coletadas 4 a 7 penas do topete (vermelhas), 4 a 7 do manto (vermelhas), 3 a 6 penas do dorso (brancas) e 3 a 6 penas do ventre (brancas). As penas foram fixadas com fita crepe em papel cartão (Figura 1), embaladas em envelopes de papel alumínio com identificação do indivíduo, os quais foram mantidos longe da umidade e da luz para posterior espectrofotometria das penas. A medição da coloração das penas foi realizada com espectrofotômetro Ocean Optics® USB4000 com uma fonte de luz de xenônio pulsante PX-2 (Ocean Optics, Dunedin, Florida), que permite a iluminação no espectro ultra-violeta e no espectro visível para humanos (250-750nm).

Para cada grupo de penas (topete, manto, dorso e ventre), foi avaliado o total de luz refletido pelas penas através da medida de brilho (reflectância média, B2), a cor através da

122 matiz (comprimento de onda com máxima reflectância, H2), o contraste (diferença entre as reflectâncias máxima e mínima, S6), e a pureza da cor (croma) através da saturação (razão entre a soma da reflectância em um determinado espectro de cor e a reflectância total: UV-

Croma para as penas brancas e S1.vermelho para penas vermelhas). Para essas análises, foi utilizado o programa SpectraSuite®. As leituras das medidas de reflectância das penas foram obtidas posicionando a fibra óptica apenas no ângulo de 90° em relação à pena, por não se tratarem de penas com coloração iridescente. Para cada conjunto de penas foram feitas três medidas em locais aleatórios nas penas, e computada a média para cada conjunto de medições. As medidas de coloração das penas do topete dos machos foram desconsideradas nas análises das hipóteses 2 e 3, devido ao pequeno tamanho amostral para machos que defenderam território (Hipótese 2) e/ou produziram prole (Hipótese 3). Essas medidas foram utilizadas apenas para fins descritivos das curvas de reflectância.

Figura 1- Penas coletadas de um macho de Antilophia bokermanni preparadas para medição no espectrofotômetro.

123 GRAVAÇÃO E ANÁLISE DO CANTO

As gravações dos cantos dos indivíduos foram realizadas entre as 1100h e 1300h, horário de maior atividade vocal de A. bokermanni (Girão & Souto 2005, Gaiotti observação pessoal). Sempre que avistado um indivíduo macho adulto anilhado, vocalizando, foi iniciada a gravação a partir do início do próximo canto, com um gravador digital Marantz PMD 661® e microfone unidirecional Sennheiser K6®. Todas as amostras de canto tiveram duração mínima de cinco minutos. As gravações foram analisadas no programa RavenPro 1.4® (Bioacustics Research Program 2011).

Para as análises acústicas do canto foram utilizadas cinco amostras de cantos completos (ver descrição abaixo), sendo selecionados os cantos mais limpos (com menos ruído) e de melhor qualidade (gravados mais próximos aos indivíduos). Para os cantos completos foram medidos os seguintes parâmetros acústicos (Smith et al. 2013): duração do canto (segundos), banda de frequência 90% (Hz), frequência 5% (Hz), frequência 95%

(Hz), pico de frequência (Hz), delta time (s) e entropia média (Hz). A complexidade do canto também foi avaliada, uma vez que foi observado que machos podem realizar mais de um tipo de som. A complexidade foi quantificada com base no número total de cada tipo de canto emitido pelo macho durante o intervalo de 5 minutos de gravação. Os tipos de cantos existentes foram determinados após serem escutadas todas as gravações realizadas em campo, em conjunto com os registros observados enquanto em campo (quando não era possível gravar, mas foi registrado um novo tipo de canto). Para caracterizar diferentes categorias de canto, consideramos o número e tipo (aspecto) de sílabas presentes, e para classificar como um novo tipo de canto, deveria soar diferente. Por exemplo, cantos incompletos apresentam sílabas similares às de cantos completos, porém em números

124 diferentes e o final do canto incompleto é diferente do canto completo, faltando sílabas de finalização, por isso denominamos tal vocalização de canto incompleto. Os sonogramas, gráficos representativos que mostram a distribuição de frequências dos cantos registrados para A. bokermanni, encontram-se nos resultados.

COLETA DE SANGUE E IMUNOLOGIA

As amostras de sangue dos indivíduos foram coletadas por meio de uma punção com agulha na veia ulnar como descrito no capítulo 1. Parte do sangue coletado foi utilizado para produzir um esfregaço sanguíneo no intuito de gerar um perfil imunológico dos machos, com a quantificação de células do sistema imune (i.e., bastonetes, heterofilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos). Os esfregaços foram feitos em lâminas de microscopia, fixados com metanol 10% e corados com Giemsa para posterior análise laboratorial com o método de contagem diferencial de leucócitos através de coloração pelo panócito.

As análises laboratoriais foram realizadas pelo Laboratório Veterinário Santé, em

Brasília, DF, Brasil (http://www.santelaboratorio.com.br/). Uma análise de correlação foi efetuada entre frequências das células do sistema imune e as medidas de condição corporal dos machos para verificar se esses dois parâmetros estariam associados.

EXTRAÇÃO DE DNA E ANÁLISES MOLECULARES DE PATERNIDADE

Para a obtenção do DNA das amostras de sangue foi utilizado o protocolo de extração QIAGEN® para tecidos, uma vez que o armazenamento do sangue ocorreu em etanol 99%, coagulando-o rapidamente e tornando-o sólido como um tecido. Foram utilizados 15 pares de microsatélites polimórficos para as análises de paternidade. Todos os primers utilizados foram previamente desenvolvidos a partir de dados da literatura (tabela

1). Dez dos primers utilizados foram desenvolvidos para outras espécies de piprídeos, no entanto, se mostraram eficazes (polimórficos) para A. bokermanni no presente estudo

125 (tabela 2). Cinco destes primers foram desenvolvidos especificamente para Antilophia spp.

(Souza et al. in prep.) (tabela 1). Os microsatélites foram rearranjados em grupos de quatro para possibilitar múltiplas PCR (Polymerase Chain Reaction). As PCR’s foram realizadas com o kit QIAGEN® Multiplex PCR, e as condições de cada reação foram adaptadas para cada conjunto de microssatélites, de acordo com o tamanho dos marcadores e temperatura de anelamento necessárias para a eficácia da PCR. Todas as extrações de DNA e reações de

PCR foram realizadas no Fuller Lab de biologia molecular do Cornell Lab of Ornithology,

Cornell University, EUA.

Cada reação de PCR conteve 5 μl de QIAGEN® Type it master mix kit, 1 μl do mix de primers, 1,4 μl de água e 2 μl de DNA. Para cada mix de primers foram preparadas soluções de 500 μl da seguinte maneira: foram adicionados 10 μl de cada primer (5’-3’e

3’- 5’) (quando haviam quatro primers no mix) e 420 μl de solução tampão TE. Quando havia menos primers no mix (para casos de primers que tiveram temperatura de anelamento diferentes), a solução teve o volume de TE ajustado para que o produto final fosse 500 μl.

O DNA foi amplificado nas reações de PCR através de ciclos termais de acordo com o protocolo para o Type it microssatélite PCR Kit da QIAGEN®, modificando-se apenas as temperaturas de anelamento (TA) de acordo com a característica (sequência) de cada primer (tabela 1). Para os pares de primers que possuíram TA de 58 °C o tempo final de extensão foi prolongado para 3 minutos (ao invés dos 30 segundos do protocolo) para maior eficácia da reação. Os produtos da PCR foram genotipados na Cornell University

Biotechnology Resource Center (BRC) utilizando 3730xl DNA analyzer (Applied

Biosystems) e GeneScan-500 LIZ (Applied Biosystems) como padronizador de tamanho molecular.

126 Foi utilizado o programa Geneious 8.1.5 (Kearse et al. 2012) para determinar os picos de cada microsatélite, através do tamanho do fragmento de cada alelo para cada locus, onde cada pico corresponde a um alelo de determinado tamanho. Os resultados gerados no Geneious foram então utilizados para as análises de paternidade no programa

Cervus 3.0.0 (Kalinowski et al. 2007). Utilizamos a verossimilhança entre os alelos (LOD score) dos indivíduos, com o nível de confiança de 95% (restrita) e 90% (relaxada) sendo utilizados apenas os valores acima da confiança restrita (exceto para um caso onde o macho com maior LOD era o macho do par social, onde foi então aceita a confiança de 80%). A maior verossimilhança é calculada através da probabilidade de um pai candidato ser o verdadeiro pai, dividido pela probabilidade de que ele não o seja. Os valores de LOD no

Cervus foram gerados com base nos seguintes parâmetros: 1) 10000 simulações de genótipos de ninhegos, 2) número de machos (pais candidatos), 3) proporção de alelos assinados, 4) proporção de machos amostrados na população (85%), e 5) mínimo desejado de alelos compatíveis entre pais e filhotes (modificado para 7). Primeiramente foram feitas análises de frequência de alelos, onde se identificou a presença e proporção de alelos nulos e heterozigosidade (tabela 2).

As simulações de paternidade foram feitas para filhotes onde se sabia quem era a mãe, através de observações no campo, e para filhotes onde não se conhecia a mãe, com o intuito de verificar se nesse último caso ela teria sido amostrada, mesmo não tendo sido identificada no campo. Para as análises de parentesco foram utilizadas as opções “all parents” e “joint LOD score”. A maternidade também foi confirmada para os ninhegos onde se conhecia a mãe, utilizando-se o mesmo processo usado para confirmar a paternidade, porém para maternidade, sendo que utilizamos o parâmetro de 70% como a

127 proporção de fêmeas amostradas na população. Quando a maternidade foi confirmada as mães foram incluídas nas análises de paternidade.

Tabela 1. Descrição dos 15 pares de primers utilizados nas análises de microsatélite, suas respectivas temperaturas de anelamento (TA) e referências bibliográficas.

128 Tabela 2. Características dos 15 microssatélites amplificados em Antilophia bokermanni para os 359 indivíduos amostrados, utilizados nas análises de paternidade e maternidade no programa Cervus 3.0.3 (Kalinowski et al. 2007). Hobs: Heterozigosidade observada; Hexp: Heterozigosidade esperada; NE-1P: probabilidade de exclusão para um pai ou mãe candidatos; NE-2P: probabilidade de exclusão para um candidato dado o genótipo da mãe (para filhotes com a maternidade confirmada); P(HW): probabilidade do equilíbrio de Hardy-Weinberg e FN: frequência de alelos nulos. Locus N alelos Hobs Hexp NE-1P NE-2P P (HW) FN Chiro5 4 0.621 0.564 0.833 0.677 0.002 -0.0550 Chiro4 8 0.710 0.726 0.673 0.492 0.410 0.0153 Chiro10 5 0.474 0.447 0.895 0.754 0.340 -0.0290 Chiro8 4 0.630 0.532 0.851 0.697 0.000 -0.1039 Chiro12 5 0.643 0.635 0.780 0.623 0.5901 -0.0089 Chiro11 3 0.599 0.570 0.838 0.725 0.6339 -0.0239 Man4 6 0.691 0.702 0.709 0.532 0.7368 0.0066 Man1 6 0.727 0.710 0.699 0.521 0.3197 -0.0160 Chr3-22 3 0.284 0.295 0.956 0.864 0.8266 0.0128 Chiro7 7 0.730 0.728 0.675 0.497 0.006 -0.0023 M7 2 0.485 0.497 0.877 0.813 0.6966 0.0118 M9 5 0.752 0.731 0.685 0.512 0.5319 -0.0152 M10 2 0.382 0.404 0.919 0.839 0.3497 0.0274 M12 2 0.474 0.461 0.894 0.823 0.6702 -0.0140 M14 5 0.747 0.732 0.684 0.510 0.6940 -0.0107

SUCESSO REPRODUTIVO

O sucesso reprodutivo dos machos de A. bokermanni foi quantificado a partir do número de ninhegos com paternidade genética confirmada para cada macho. No entanto, para as análises estatísticas não foi possível utilizar o número de ninhegos atribuídos a cada macho diretamente como um parâmetro, devido a essa distribuição numérica ser muito variável (apenas 2 machos geraram 2 ninhegos, 1 gerou 5 ninhegos e 57 apenas 1 ninhego).

Desta forma, optou-se por utilizar o sucesso reprodutivo como uma variável binária: 0

129 (quando o macho não foi pai biológico de nenhum ninhego) ou 1 (quando o macho foi pai biológico de pelo menos um ninhego).

ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Utilizamos análises de Pearson para avaliar a correlação entre o índice de condição corporal dos machos e a contagem de células do sistema imune (hipótese 1). Na avaliação da hipótese 2, realizamos uma análise de correlação entre os caracteres sexuais secundários dos machos (variáveis explicativas) e o índice de condição corporal (variável resposta).

Para os machos que defenderam território, verificamos também se o tamanho dos territórios está relacionado com o índice de condição corporal.

Para avaliar a hipótese 3, onde testamos se os caracteres sexuais secundários de machos de A. bokermanni estão relacionados com seu sucesso reprodutivo, foi utilizada um modelo linear generalizado (distribuição do erro do tipo binomial) no programa R (R

Development Core Team 2011). As análises foram separadas em dois grupos: machos com territórios reprodutivos e todos os machos, uma vez que machos que não foram observados defendendo territórios também tiveram a paternidade confirmada para alguns filhotes.

Dentro de cada um desses grupos foi analisada a relação do sucesso reprodutivo com cada variável ou conjunto de variáveis, separadamente: (1) índice de condição corporal, e tamanho do território para o grupo dos machos com território, (2) coloração da plumagem branca do dorso, (3) coloração da plumagem vermelha do manto, (4) coloração da plumagem branca do ventre, (5) complexidade do canto, e (6) características acústicas do canto.

As análises foram realizadas separadamente (na forma de correlações) para cada conjunto de variáveis devido à grande diferença nos tamanhos amostrais de machos e características sexuais secundárias amostradas, não sendo possível a realização de um

130 modelo único incluindo todas as variáveis ao mesmo tempo. Por exemplo, para alguns machos foram coletadas amostras do canto mas não das penas, sendo que todas as variáveis foram amostradas em apenas seis machos (tabela 3). A idade dos machos foi incluída em todos os modelos como um valor fixo, exceto para modelos que incluíram a coloração da plumagem. O índice de condição corporal dos machos foi incluído como uma variável preditora contínua nos modelos que incluíram as variáveis de (2) a (6), listadas acima.

Tabela 3. Tamanhos amostrais para as variáveis analisadas para machos de Antilophia bokermanni, com referência às hipóteses testadas. Tamanho amostral (N de machos) Variáveis Hipóteses 1 e 2 Hipótese 3 Índice de condição corporal 118 60 Coloração plumagem ventre 33 23 Coloração plumagem dorso 34 20 Coloração plumagem manto 32 25 Perfil imunológico 42 14 Tamanho território 32 32 Canto (complexidade e acústica) 21 21

Foram aplicadas análises dos componentes principais (PCA), separadamente, para as medidas de complexidade do canto (tabela 4), características acústicas do canto (tabela

5) e coloração da plumagem (tabela 6). As análises de PCA foram realizadas com o intuito de reduzir o número de variáveis preditoras e evitar colinearidade entre preditores nos modelos. Os componentes com auto-valores (eigenvalues) maiores que 1 (critério de Kaiser

1960), foram retidos para as demais análises. Em todos os casos, apenas os dois primeiros componentes foram utilizados e explicaram em média 76,88% da variação no conjunto original dos dados. Ainda, realizou-se testes de verossimilhança para a comparação entre modelos e avaliação da significância de cada variável preditora. Para comparações múltiplas, foi utilizado o comando glht do pacote multcomp no programa R (R

Development CoreTeam 2011).

131 Tabela 4. Valores dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2) resultantes das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis de complexidade do canto de machos de Antilophia bokermanni. Variável Comp.1 Comp.2 Número de assobios 0.603 -0.137 Número de cantos completos 0.536 Número de cantos incompletos 0.238 0.531 Número de duplos assobios 0.487 -0.430 Número de cantos dobrados -0.233 -0.717

Tabela 5. Valores dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2) resultantes das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis dos componentes acústicos do canto de machos de Antilophia bokermanni. Variáveis Comp.1 Comp.2 Largura de Banda 90% -0.461 0.374 Delta time (s) -0.309 0.157 Pico de frequência -0.479 Entropia média -0.759 Frequência 5% -0.405 -0.489 Frequência 95% -0.544 0.110

Tabela 6. Valores dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2) resultantes das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis de coloração da plumaegm de machos de Antilophia bokermanni. Variáveis Comp.1 Comp.2 dorso.B2 0.563 -0.382 dorso.s1uv -0.466 -0.467 dorso.S6 0.681 dorso.H2 0.796 manto.B2 0.680 0.128 manto.s1red -0.429 -0.712 manto.S6 0.534 -0.506 manto.H2 -0.260 0.470 ventre.B2 0.632 0.406 ventre.s1red -0.260 0.733 ventre.S6 0.703 ventre.H2 -0.198 0.543

132 RESULTADOS

Foram capturados e anilhados 123 machos (85 adultos, 27 sub-adultos e 11 jovens),

para os quais também foram coletadas amostras de sangue. Destes, 118 tiveram medidas

morfométricas coletadas. Foram feitas gravações de cantos de 21 machos anilhados

(identificados), dentre os 32 que também defenderam território. As penas foram analisadas

para 53 machos (adultos apenas) e esfregaços de sangue de boa qualidade foram feitos para

42 machos.

CONDIÇÃO CORPORAL E IMUNOLOGIA

A média do índice de condição corporal dos machos (ICC = peso/tarso) foi de 0,91

± 0,006, sendo que o macho com maior índice possuiu 1,08 e o menor 0,77. Foram

analisadas lâminas com esfregaço de sangue de 42 machos adultos. A presença e a

quantidade de cada categoria celular do sistema imune variou entre indivíduos, no entanto,

em nenhum macho adulto foram encontrados bastonetes e eosinófilos, apenas heterófilos,

linfócitos e monócitos (Anexo 1).

PLUMAGEM

Foram analisadas penas de 53 machos adultos. No Anexo 2, estão listados,

individualmente, os valores médios (a partir das 3 medidas de conjuntos de penas) por parte

do corpo de onde a pena foi coletada para as variáveis: brilho (B2), croma (S1.UV para

penas brancas e S1.Red para as vermelhas), contraste (S6) e matiz (H2). As curvas de

reflectância foram produzidas para as plumagens de diferentes partes do corpo para a

população de machos amostrados (Figura 2).

133

CANTO

Foram gravados os cantos de 21 machos que estabelecram territórios reprodutivos em uma ou mais estações reprodutivas. Foram registrados seis tipos diferentes de sons sendo estes classificados em: cantos completos (Figura 3), assobios (Figura 4), cantos parciais (Figura 5), chamados (Figura 6), duplo assobios (Figura 7) e canto dobrado (Figura

8). Em relação às características acústicas dos cantos completos (Figura 3), as medidas médias para os 21 indivíduos analisados foram: duração do canto 90% (segundos): 0,76 ±

0,02, banda de frequência 90% (Hz): 1131,7 ± 37,0; frequência 5% (Hz): 2357,2 ± 18,23; frequência 95% (Hz): 3488,9 ± 42,82; pico de frequência (Hz): 3068,75 ± 53,90; delta time

(s): 0,947 ± 0,02 e entropia média (Hz): 2805,8 ± 115,90.

134

Figura 3- Espectrograma do canto completo de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni.

Figura 4- Espectrograma do assobio de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni.

135

Figura 5- Espectrograma do canto parcial de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni.

Figura 6- Espectrograma do chamado de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni.

Figura 7- Espectrograma do assobio dobrado de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni.

136

Figura 8- Espectrograma do canto dobrado de um indivíduo macho adulto de Antilophia bokermanni.

PATERNIDADE

Realizamos análises de paternidade para 60 machos adultos (machos que produziram filhotes, tendo ou não defendido território). Os resultados mostraram que 43 machos produziram um total de 57 ninhegos. Destes 43 machos, 28 não defenderam territórios reprodutivos e seus filhotes se encontravam em ninhos de outros machos, enquanto que 14 defenderam territórios reprodutivos e produziram filhotes, porém, não necessariamente dentro dos seus próprios territórios. Tivemos ainda 17 machos que possuíam territórios e ninhos, mas não produziram nenhum filhote. Ou seja, estes foram pais sociais mas perderam a paternidade genética nos seus próprios ninhos e não tiveram filhotes em ninhos alheios.

HIPÓTESE 1: O ÍNDICE DE CONDIÇÃO CORPORAL ESTÁ ASSOCIADO À CONDIÇÃO IMUNOLÓGICA?

Imunologia

Foi realizada uma análise de correlação entre os diferentes tipos de células do sistema imune com o índice de condição corporal (ICC) dos machos. Foi encontrada uma correlação positiva entre a quantidade de linfócitos e o ICC (r = 0,465; p = 0,01) (Figura 9)

137 e uma correlação negativa entre a quantidade de heterófilos e o ICC (r = -0,47; p = 0,01)

(Figura 10). A quantidade de monócitos não está conrrelacionada com o ICC (r = -0,03; p =

0,85). Estes resultados indicam a existência de uma relação entre a condição corporal do macho, ou seja, peso proporcional ao tamanho esquelético do indivíduo, e seu perfil imunológico.

Figura 9 - Correlação entre o índice de condição corporal e a frequência de linfócitos em machos de Antilophia bokermanni.

138

Figura 10 - Correlação entre o índice de condição corporal e a frequência de heterófilos em machos de Antilophia bokermanni.

HIPÓTESE 2: A QUALIDADE DO MACHO (ICC E CONDIÇÃO IMUNOLÓGICA) ESTÁ REFLETIDA NOS CARACTERES SEXUAIS SECUNDÁRIOS?

PLUMAGEM

Foi encontrada uma correlação positiva entre a reflectância de UV das penas brancas do dorso dos machos de A. bokermanni e o índice de condição corporal (r = 0,71; p<0,05), indicando que machos com maiores reservas lipídicas para seus tamanhos refletem mais UV nas penas do dorso (Figura 11). Não foi encontrada correlação entre as outras medidas de coloração da plumagem e o índice de condição corporal dos machos. Nenhuma correlação foi encontrada entre as medidas de coloração das penas de machos adultos de A. bokermanni e o tamanho do território (para machos que estabeleceram território).

Igualmente, nenhuma correlação foi encontrada entre plumagem e os diferentes tipos de células do sistema imune.

139

Figura 11 - Correlação entre o índice de condição corporal e a reflectância de ultravioleta (UV) na plumagem branca do dorso dos machos de Antilophia bokermanni.

CANTO (COMPLEXIDADE E MEDIDAS ACÚSTICAS)

Nenhuma correlação foi encontrada entre as medidas acústicas e de complexidade do canto de A. bokermanni com índices de condição corporal. Curiosamente, foi encontrada uma correlação negativa entre uma característica do canto, o delta time, e o tamanho do território, para machos que estabeleceram território (r = -0,62; p = 0,01). Ou seja, machos com cantos mais longos possuíram menores territórios. Também foi encontrado que o número de assobios duplos está positivamente correlacionado com a quantidade de heterófilos (r = 0,9; p = 0,04) e negativamente correlacionado com a quantidade de linfócitos (r = -0,92; p = 0,03). No entanto, devido ao baixo tamanho amostral (N=5) de machos que possuíram dados de canto e quantificação do sistema imune, estes resultados devem ser avaliados com cautela.

TAMANHO DO TERRITÓRIO

140 O tamanho do território não está correlacionado com o índice de condição corporal dos machos de A. bokermanni (r = -0,1; p = 0,58), nem com nenhum dos tipos de células do sistema imune.

HIPÓTESE 3: MACHOS DE MAIOR QUALIDADE (NA CONDIÇÃO CORPORAL, CARACTERES SEXUAIS SECUNDÁRIOS OU TERRITORIALIDADE) TEM MAIOR SUCESSO REPRODUTIVO?

Índice de Condição Corporal

Para os machos que foram observados defendendo território e que produziram filhotes, foi encontrada uma correlação positiva entre o sucesso reprodutivo e o índice de condição coporal, indicando que machos com melhores condições corporais apresentaram uma maior probabilidade de produzir filhotes (χ² = 5,38, p = 0,02; β = 1,08 ± 0,54) (Figura

12). Ainda para estes machos, o sucesso reprodutivo tendeu a ser positivamente correlacionado com o tamanho do território defendido (χ² = 3,12, p = 0,08; β = 0,72 ±

0,44), ou seja, machos com território maiores tendem a ter uma maior probabilidade de deixar descendentes (Figura 13).

141

Figura 12 - Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e o índice de condição corporal dos machos de Antilophia bokermanni que defenderam território. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples.

Figura 13 - Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e o tamanho do território defendido por machos de Antilophia bokermanni. A reta em vermelho representa o modelo previsto por regressão linear simples.

142 Quando analisados todos os machos (com e sem territórios) também foi encontrada uma correlação positiva entre o sucesso reprodutivo e o índice de condição corporal (χ² =

7,03, p = 0,008; β = 0,88 ± 0,37) (Figura 14), mais uma vez demonstrando que o índice de condição coporal pode ser uma medida de qualidade dos machos de A. bokermanni.

Figura 14 - Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e a condição corporal dos machos (com e sem território) de Antilophia bokermanni. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples.

Canto: Complexidade e Acústica

A probabilidade de um macho produzir filhotes também variou com a complexidade do canto (PC1, p > 0,30; PC2, χ² = 5,89, p = 0,015; β = -1,93 ± 1,05) (Figura 15). Note que na figura, os escores negativos se relacionam com um maior número de assobios, assobios duplos e cantos dobrados, enquanto os escores positivos se relacionam com número de cantos incompletos (ver tabela 4 nos métodos para scores da PCA). Desta forma, o número de assobios, o número de assobios duplos e o número de cantos dobrados foram

143 positivamente relacionados com o sucesso reprodutivo, enquanto que o número de cantos incompletos foi negativamente relacionado com o sucesso reprodutivo dos machos (tabela

4). As propriedades acústicas dos cantos completos dos machos não estão relacionadas com a probabilidade de um macho produzir filhotes (PC1, χ² = 2,24, p = 0,13; PC2, χ² = 0,78, p

= 0,38). No entanto, após a seleção de modelos regressiva passo-a-passo, resultados mostram que a probabilidade de um macho possuir um filhote genético tende a ser positivamente relacionada com o primeiro componente (PC1, χ² = 3,60, p = 0,058; β=1,23

± 0.83) (Figura 16). Isso sugere que possivelmente o sucesso reprodutivo é maior em machos com cantos completos mais curtos (ou mais rápidos) e de baixa frequência

(considerando a banda de frequência, frequência dominante, mínima e máxima) (tabela 5).

Figura 15 - Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e a complexidade do canto (tamanho do repertório) dos machos de Antilophia bokermanni. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples.

144

Figura 16 - Correlação entre o sucesso reprodutivo (probabilidade de um macho em produzir prole biológica) e as propriedades acústicas do canto dos machos de Antilophia bokermanni. A curva em vermelho representa o modelo previsto por regressão logística simples.

Coloração da Plumagem

O sucesso reprodutivo dos machos não variou com as medidas de coloração da plumagem do dorso: tanto para machos com território (PC1, χ² = 1,52, p = 0,22; PC2, χ² =

1,22, p = 0,27) quanto para todos os machos (PC1, χ² = 1,93, p = 0,16; PC2, χ² = 2,37, p =

0,12). O sucesso reprodutivo também não variou em relação à coloração do manto dos machos com território (PC1, χ² = 0,36, p = 0,55; PC2, χ² = 1,05, p = 0,30) ou quando analisados todos os machos (PC1, χ² = 0,04, p = 0,85; PC2, χ² = 0,16, p = 0,69). Quando analisados todos os machos, o sucesso reprodutivo não foi relacionado com a plumagem do ventre (PC1, χ² = 0,007, p = 0,93; PC2, χ² = 0,48, p = 0,49) (tabela 6). No entanto, quando analisados apenas os machos que defenderam território, pode-se observar uma tendência dos machos com plumagens do ventre menos brilhantes e menos saturadas no UV obterem

145 maior sucesso reprodutivo (PC1, χ² = 0,62, p = 0,43; PC2, χ² = 3,83, p = 0,0502. β= -1,83 ±

1,28) (tabela 7).

Tabela 7. Resultados dos dois primeiros componentes (Comp.1 e Comp.2), das análises de compomentes principais (PCA), para as variáveis da plumagem do ventre de machos de Antilophia bokermanni que defenderam território. Variáveis Comp.1 Comp.2 ventre.B2 0.556 0.466 ventre.Uvchroma -0.435 0.528 ventre.S6 0.672 0.183 ventre.H2 -0.223 0.686

DISCUSSÃO

Segundo o princípio de handicap, apenas machos mais vigorosos e saudáveis

seriam capazes de exibir ornamentos mais extravagantes, devido ao custo energético da

produção e manutenção desses ornamentos, sendo estes então, indicadores honestos da

qualidade dos machos (Zahavi 1975, Hamilton & Zuk 1982, Andersson 1994).

Possivelmente, fêmeas teriam maior interesse por machos de maior qualidade, tanto pela

possibilidade da herança genética de bons genes para seus filhotes quanto no que se refere

ao investimento possível na defesa de recursos e cuidado parental (Lande 1981, Kirkpatrick

1982, Bailey & Moore 2012). Os resultados do presente estudo subsidiam tais

possibilidades de forma bastante clara em vários aspectos.

Nossa primeira hipótese foi de que machos com melhores condições corporais,

representadas aqui através de um índice que reflete o peso relativo ao tamanho esquelético,

teriam um perfil imunológico melhor. Nossos resultados apontam que machos com maiores

índices corporais tem uma quantidade maior de linfócitos e uma quantidade menor de

heterófilos. Ou seja, existe uma relação entre condição corporal e perfil imunológico de

146 machos de A. bokermanni. Como se sabe, linfócitos são importantes células de defesa presentes em aves e possuem uma alta frequência em condições normais de saúde (20-

50%) (Miesle 2011). Já a baixa frequência de linfócitos no sangue de aves está associada a infecções virais (Gross & Siegel 1983, VanCampen et al. 1989, Miesle 2011). Assim, a correlação positiva de abundância de linfócitos com o ICC dos machos de A. bokermanni sugere que este índice pode ser utilizado como uma medida indicativa de saúde imunológica dos machos. Além disso, a correlação negativa entre heterófilos e o ICC reforça a confiabilidade desse índice, visto que um dos primeiros sinais de doenças severas em aves é o grande aumento na frequência de heterófilos, podendo inclusive levar indivíduos à morte devido ao aumento da toxicidade no sangue que este tipo de célula ocasiona (Harmon 1998, Miesle 2011). A falta de correlação entre monócitos e ICC pode ser explicada pela baixa frequência dessa célula de defesa no sangue das aves (0-3%). No entanto, uma frequência maior que 10%, como apresentaram alguns indivíduos, pode ser um forte indicativo de doenças crônicas (Miesle 2011), podendo explicar o baixo ICC

(valores abaixo da média) para a maioria desses indivíduos.

As predições intrínsecas à nossa segunda hipótese eram de que machos com melhores condições corporais e/ou de saúde imunológica exibiriam caracteres sexuais secundários de plumagem e vocalização mais extravagantes. Também consideramos a possibilidade destes machos terem maiores territórios. Os dados indicam que alguns caracteres sexuais secundários dos machos de A. bokermanni estão relacionados com o

índice de condição corporal (ICC) e condição imunológica dos mesmos. Encontramos que a saturação de UV na plumagem branca do dorso tem relação positiva com o ICC dos machos, indicando que essa medida corporal pode estar associada positivamente tanto com

147 alguns ornamentos quanto com a saúde imunológica. Outros estudos com aves também mostram que a condição corporal de machos reflete aspectos de saúde, por exemplo, presença de parasitas, e pode refletir a qualidade de ornamentos tais como tamanho do repertório de canto, displays e plumagem (Nowicki et al. 2000, Doucet & Montgomerie

2003, Macedo et al 2012, Magalhães et al. 2014, Manica et al. 2016). Nossos resultados, portanto, também sustentam a premissa de que a condição corporal, aqui estimada pelo

ICC, pode ser utilizada como um indicador da qualidade de alguns ornamentos e saúde dos machos da espécie estudada.

Enfatizamos o achado referente à reflectância de ultravioleta (UV) da plumagem do dorso de A. bokermanni estar positivamente correlacionada com o ICC. O ultravioleta é amplamente conhecido por ser um importante espectro de cor para aves, tanto na busca por alimentos (Burkhardt 1982, Probst et al. 2002, Rajchard 2009) quanto no contexto da seleção sexual (Bennett et al. 1996; 1997, Andersson & Amundsen 1997, Andersson et al.

1998, Johnsen et al. 1998, Hunt et al. 1998, 1999, Cuthill et al. 2000, Pearn et al. 2001,

Arnold et al. 2002, Doucet et al. 2005). Inúmeros estudos com aves têm demonstrado a relação da reflexão de UV com a qualidade dos indivíduos (Keyser & Hill 1999, Siitari &

Huhta 2002, Alonso-Alvarez et al. 2004, Doucet et al. 2005). Além disso, a presença de

UV na plumagem pode ser custosa, com consequências negativas na sobrevivência dos indivíduos, uma vez que muitos predadores também podem visualizar tal espectro de luz

(Andersson 1999). Assim, nossos resultados sugerem que machos em melhores condições podem produzir e manter plumagem com maiores graus de UV. Ou seja, o UV da plumagem do dorso pode ser um sinal honesto da qualidade de machos de A. bokermanni.

148 Os resultados discutidos acima mostram, portanto, que existe uma relação integrada entre condição corporal, saúde imunológica e produção de caracteres sexuais secundários, dessa forma em grande parte apoiando as propostas teóricas de vários pesquisadores

(Hamilton & Zuk 1982, Møller & Pomiankowski 1993, Andersson 1994). No entanto, a teoria da seleção sexual e runway, predizem que para que tais caracteres sexuais se fixem na população, estes devem ser favorecidos pelas fêmeas no acasalamento, ou seja, machos com diferentes variações nos seus ornamentos, tamanho ou comportamento devem apresentar diferenças no sucesso reprodutivo (Fisher 1915, 1930, Donald 1973, Lande

1981, Kirkpatrick 1982). Nossa terceira hipótese reflete exatamente tais premissas, e prevê que machos em melhores condições corporais ou com caracteres sexuais secundários mais extravagantes, ou ainda que defendem maiores territórios, efetivamente teriam maior sucesso reprodutivo. Nossos dados subsidiam essa hipótese, pois encontramos que para A. bokermanni o maior sucesso reprodutivo dos machos pode ser predito pelo seu índice de condição corporal, tamanho de território e alguns elementos do canto, particularmente sua complexidade. E ainda, que tal sucesso reprodutivo está negativamente relacionado com a produção de cantos incompletos.

Existe uma relação entre complexidade do canto de algumas espécies de aves e a capacidade de aprendizado dos indivíduos, portanto de alta qualidade (McGregor et al.

1981, Baker et al. 1986, Boogert et al. 2008). Tal relação talvez seja um fator importante no processo seletivo de fêmeas de A. bokermanni, que favoreceriam machos com cantos mais complexos (maior número de assobios, maior número de assobios duplos e cantos dobrados). Para algumas espécies cantos mais complexos são mais atrativos para fêmeas do que a qualidade do território dos machos, devido possivelmente à sua relação com a

149 capacidade de aprendizado dos machos (Potvin et al. 2015). Adicionalmente, a complexidade do canto pode ser reduzida com a presença de parasitas, como demonstrado para canários (Spencer et al. 2005).

Outro indicativo da importância da complexidade e qualidade do repetório acústico para o sucesso dos machos de A. bokermanni é a relação negativa entre o sucesso reprodutivo dos machos e o número de cantos incompletos, que poderia resultar de uma aprendizagem deficiente. Para algumas espécies de aves existem evidências de que a aprendizagem deficiente do canto pode resultar de uma baixa diversidade genética produzida por endogamia, por exemplo. Tais machos não seriam atrativos para fêmeas, que usariam cantos deficientes como indicativos de genótipos de baixa qualidade (Brown 1997,

Boer et al. 2016). Por se tratar de uma população pequena, isolada e com baixa diversidade genética (Rêgo et al. 2010, IUCN 2015), a perda de heterozigosidade ocorre mais rapidamente (Ellstrand & Elam 1993). Assim, evitar endocruzamento pode ser crucial para a produção de uma prole saudável e tem como consequência a manutenção da diversidade genética da espécie.

Além da complexidade, cantos completos com frequência acústica mais baixa e de menor duração, também se relacionaram com um maior sucesso reprodutivo. Cantos com baixa frequência podem transpor mais obstáculos em ambientes de mata densa ou de relevo montanhoso e alcançar maiores distâncias (Wiley & Richards 1982, Wiley 1991,

Slabbekoorn & Smith 2002). A população de A. bokermanni estudada ocorre justamente em tal contexto ambiental de mata fechada e paisagem acidentada. Podemos supor, portanto, que machos com cantos com frequências mais baixas podem atrair um maior número de fêmeas, uma vez que estes podem ser escutados a maiores distâncias. Como

150 consequência, machos com cantos de menor frequência possuem maior chance de acasalamento (por atrair mais fêmeas), resultando em um maior sucesso reprodutivo.

Ainda, o tamanho do território também refletiu um maior sucesso reprodutivo dos machos de A. bokermanni. Para muitas espécies de aves o tamanho do território defendido por machos está ligado à qualidade tanto do território quanto do macho que o defende, uma vez que para defender uma grande área um maior gasto de energia é demandado

(Andersson 1994, Candolin & Voigt 2001). Em alguns casos, o tamanho do território pode indicar a qualidade genética do macho residente, como no caso de Monias benchi, para a qual demonstrou-se uma relação positiva entre tamanho do território e heterozigozidade genética (Seddon et al. 2004). Assim, machos com maiores territórios podem ser melhores parceiros reprodutivos, consequentemente terem maior sucesso reprodutivo (Brooker &

Rowley 1995). No caso de A. bokermanni, a relação entre tamanho territorial e sucesso reprodutivo pode também estar associada a uma outra variável, que seria o isolamento do território. Na população de estudo, territórios maiores foram os mais isolados (ver figura de distribuição dos territórios no capítulo 1), ou seja, seus donos não disputaeam bordas, como no caso de territórios menores. Assim, o isolamento dessas áreas pode resultar em um maior sucesso dos machos simplesmente pela falta de competição intrassexual, devido a ausência de outros machos nos arredores do território. Porém, vale ressaltar que devido ao tamanho das áreas amostradas, fêmeas tem a possibilidade de visitar todos os territórios em uma determinada área, durante uma mesma estação, sendo tal capacidade confirmada pelos dados de recaptura e observações.

151 CONCLUSÕES

Antilophia bokermanni é atualmente descrita como uma espécie de Pipridae que não

executa displays ou se acasala em leks, além de ser descrita como monogâmica, diferente

das demais espécies da família Pipridae No entanto, nossos dados indicam que A.

bokermanni está sujeita a uma forte pressão de seleção sexual. Os dados de paternidade

indicam grande variabilidade na produção de filhotes, com alguns machos sendo excluídos

do cenário reprodutivo. Além disso, ficou evidenciado o fato de diferentes elementos

acústicos predizerem o sucesso reprodutivo dos machos. Apesar de não terem sido

encontradas relações diretas entre características da plumagem e o sucesso reprodutivo dos

machos, a relação entre o ICC e a reflectância de UV da plumagem e produção de células

de defesa, sugerem fortemente que a plumagem pode desempenhar um papel importante na

escolha das fêmeas, explicando o acentuado dimorfismo sexual da espécie.

Por se tratar de uma espécie criticamente ameaçada e inserida em um ambiente com

pouca proteção onde em muitos fragmentos existe a constante presença de poluição sonora,

a importância do canto para o sucesso reprodutivo dos machos, aqui demonstrada, reforça a

urgência de ações de manejo, uma vez que cantos com baixa frequência tendem a perder

sua potência na presença de poluição sonora (Halfwerk et al. 2011). Os resultados obtidos

neste estudo, corroboram com importantes teorias que tentam explicar a evolução de

caracteres sexuais secundários em machos, sendo uma importante adição à literatura, uma

vez que apesar de bastante discutido, poucos estudos demonstraram tais corroborações

quando estudados em condições naturais.

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165 ANEXO 1- Frequência (em %) de células do sistema imune nos esfregaços sanguíneos de

machos de Antilophia bokermanni.

ID macho Heterófilo Linfócitos Monócitos E127477 4 92 4 E150489 6 82 12 E127439 14 76 10 E123439 12 86 2 E150111 8 88 4 E150481 45 55 0 E150123 16 82 2 E150500 12 80 8 E127427 4 96 0 E127453 4 94 2 E150470 20 72 8 E127446 52 40 8 E127485 12 80 8 E150473 24 72 4 E150481 32 56 12 E150497 6 90 4 E127441 52 44 4 E127431 24 72 4 E150141 8 92 0 E150494 24 76 0 E127431 20 80 0 E127485 12 88 0 E150191 32 64 4 E127434 16 68 16 E150489 20 76 4 E150491 36 64 0 E150487 28 48 24 E150159 68 32 0 E127444 32 68 0 E150159 52 44 4 E127446 44 55 1 E127494 32 65 3 E127453 28 67 5 E150487 47 48 5 E150483 36 56 8 E127462 28 60 12

166 ANEXO 2- Valores médios (a partir das 3 medidas de conjuntos de penas), para cada macho de Antilophia bokermanni por parte do corpo de onde a pena foi coletada e as variáveis: brilho (B2), croma (S1.UV para penas brancas e S1.Red para as vermelhas), contraste (S6) e matiz (H2).

Macho ID Parte do corpo B2 S1.UV S1.violet S1.red S6 H2 E127427 dorso 39,1947 0,2456 0,2842 0,2386 16,5593 352 E127427 manto 5,3711 0,0424 0,0565 0,7622 24,0136 353 E127427 ventre 47,5730 0,2281 0,2670 0,2444 26,7610 477 E127427 topete 7,6833 0,0910 0,1076 0,6820 27,3419 319 E127430 dorso 57,7670 0,2173 0,2561 0,2492 36,7321 668 E127430 manto 5,8076 0,0782 0,0967 0,6549 20,4506 323 E127430 ventre 40,7432 0,2336 0,2722 0,2425 20,4972 549 E127430 topete 3,1868 0,0059 0,0122 0,8470 16,5468 548 E127431 dorso 23,9847 0,2372 0,2763 0,2389 12,1001 611 E127431 manto 4,5097 0,0624 0,0817 0,6553 16,7332 343 E127431 topete 3,6525 0,0242 0,0372 0,7685 16,4291 498 E127432 dorso 45,8342 0,2120 0,2509 0,2511 33,5455 665 E127432 manto 12,3630 0,1511 0,1738 0,5392 28,3684 316 E127432 ventre 44,6961 0,2152 0,2540 0,2497 31,6444 490 E127432 topete 7,0970 0,1321 0,1564 0,5287 17,1278 316 E127434 dorso 55,3210 0,2135 0,2519 0,2525 37,6301 658 E127434 manto 5,2199 0,0589 0,0755 0,6945 19,9124 315 E127434 ventre 51,7262 0,2337 0,2718 0,2453 27,1733 667 E127439 dorso 41,1962 0,2186 0,2576 0,2487 27,4682 477 E127439 manto 6,3426 0,0351 0,0469 0,7945 29,6138 348 E127439 ventre 44,6482 0,2327 0,2713 0,2448 23,7138 477 E127444 manto 3,3317 0,0530 0,0766 0,6087 11,8947 498 E127446 dorso 35,7923 0,2330 0,2713 0,2453 19,2212 693 E127446 manto 3,5718 0,1190 0,1190 0,8804 19,4284 328 E127446 ventre 59,8409 0,2285 0,2663 0,2499 33,1692 477 E127447 dorso 42,0859 0,2063 0,2452 0,2524 30,8085 687 E127447 ventre 57,6530 0,2194 0,2581 0,2492 37,0900 666 E127447 topete 3,7088 0,0265 0,0383 0,8002 17,0642 494 E127450 dorso 40,2748 0,2161 0,2554 0,2464 28,2506 665 E127450 manto 7,8979 0,1054 0,1261 0,6075 23,9254 317 E127450 topete 3,6461 0,0613 0,0830 0,6285 12,6878 498 E127457 topete 3,3558 0,0209 0,0362 0,7168 13,8949 498

167 Macho ID Parte do corpo B2 S1.UV S1.violet S1.red S6 H2 E127459 dorso 35,9372 0,2258 0,2638 0,2492 18,6597 666 E127459 manto 6,7395 0,0567 0,0720 0,7175 27,7904 315 E127459 topete 3,6130 0,0444 0,0624 0,6649 13,1734 498 E127460 dorso 23,0022 0,2097 0,2486 0,2506 16,6872 665 E127460 manto 5,8851 0,1094 0,1360 0,4890 14,0104 318 E127460 ventre 31,2512 0,2280 0,2672 0,2434 18,0901 689 E127460 topete 9,1655 0,0777 0,0931 0,6865 31,8535 315 E127464 dorso 51,4721 0,1847 0,2218 0,2697 44,0532 617 E127464 manto 6,1107 0,0260 0,0388 0,7635 25,9900 548 E127464 topete 3,1939 0,0064 0,0154 0,7899 14,4374 548 E127466 manto 5,3303 0,0560 0,0749 0,6437 18,3136 548 E127467 dorso 30,2901 0,2107 0,2500 0,2487 22,6924 548 E127467 topete 5,1091 0,0372 0,0505 0,7377 20,1558 466 E127471 dorso 52,5995 0,2080 0,2469 0,2535 39,0145 477 E127471 manto 9,3814 0,1201 0,1433 0,5501 24,2919 316 E127471 ventre 40,3876 0,2267 0,2658 0,2449 25,1045 689 E127471 topete 2,6937 0,0044 0,0102 0,8355 13,3792 548 E127475 dorso 32,9117 0,2010 0,2389 0,2594 24,8433 548 E127475 manto 5,5676 0,0363 0,0494 0,7541 23,0937 368 E127475 topete 6,5915 0,1136 0,1372 0,5231 15,7698 317 E127480 dorso 38,1772 0,2081 0,2460 0,2557 26,2809 665 E127480 manto 5,9145 0,0529 0,0700 0,6922 22,7315 303 E127480 ventre 21,3834 0,2067 0,2467 0,2465 16,9730 639 E127480 topete 5,5868 0,0575 0,0732 0,7000 19,7917 312 E127485 manto 9,9032 0,1478 0,1724 0,5173 23,3430 318 E127485 ventre 28,6262 0,1890 0,2245 0,2639 23,8370 400 E127486 manto 9,2805 0,1069 0,1273 0,6069 28,4472 316 E127486 ventre 50,7398 0,2065 0,2449 0,2553 36,3524 476 E127488 dorso 23,7547 0,2157 0,2552 0,2469 15,9993 663 E127488 manto 7,9616 0,0828 0,1011 0,6577 28,0460 316 E127488 ventre 42,3771 0,2175 0,2558 0,2516 27,9176 610 E127488 topete 3,0636 0,0774 0,1055 0,5269 9,0705 498 E127491 dorso 43,4822 0,2174 0,2554 0,2527 27,2202 666 E127491 manto 6,9523 0,0328 0,0447 0,7843 31,7897 368 E127491 topete 2,2457 0,0110 0,0206 0,7874 10,5125 498 E127493 dorso 35,2014 0,2084 0,2473 0,2520 24,6366 657 E127493 manto 7,4853 0,1029 0,1168 0,6942 25,6906 315 E127493 topete 8,6098 0,1810 0,2000 0,5646 22,5508 337 E127494 dorso 45,1875 0,2038 0,2431 0,2548 31,8007 446

168 Macho ID Parte do corpo B2 S1.UV S1.violet S1.red S6 H2 E127494 manto 5,8033 0,0467 0,0612 0,7366 23,9008 467 E127494 ventre 29,6408 0,2404 0,2792 0,2406 12,1775 665 E127494 topete 3,4613 0,0513 0,0737 0,6139 11,8440 498 E127496 manto 5,5222 0,0307 0,0443 0,7492 24,2802 497 E127496 ventre 45,1249 0,2123 0,2512 0,2493 31,0989 665 E127496 topete 4,8089 0,0476 0,0639 0,7021 17,8983 548 E127498 dorso 41,2617 0,2063 0,2449 0,2535 30,2747 686 E127498 manto 8,5532 0,1006 0,1205 0,6185 27,0801 317 E127498 ventre 45,0661 0,2234 0,2622 0,2461 29,5072 549 E127498 topete 4,6512 0,0654 0,0841 0,6563 15,8073 498 E127499 manto 7,7499 0,0686 0,0863 0,6643 27,6514 318 E127499 ventre 25,5297 0,2083 0,2478 0,2474 18,3141 548 E127500 ventre 34,1449 0,2288 0,2677 0,2426 20,1280 693 E150101 topete 2,4134 0,0258 0,0431 0,6682 9,1018 498 E150106 dorso 30,6487 0,2251 0,2641 0,2444 17,3779 665 E150106 manto 10,3456 0,1466 0,1671 0,5782 26,1657 317 E150106 topete 3,6464 0,1083 0,1257 0,6580 12,3245 317 E150109 topete 6,7769 0,0857 0,1059 0,5880 19,5977 318 E150114 dorso 41,3634 0,2057 0,2446 0,2522 30,8985 644 E150114 manto 9,3816 0,0692 0,0871 0,6713 32,8994 316 E150114 ventre 42,0922 0,1978 0,2365 0,2561 33,4679 687 E150114 topete 2,5052 0,0000 0,0007 0,8500 11,5950 548 E150115 manto 5,8051 0,0352 0,0470 0,7883 26,2009 343 E150115 ventre 34,1159 0,2156 0,2547 0,2487 22,6423 686 E150116 dorso 36,2009 0,2234 0,2626 0,2446 20,9948 666 E150116 manto 3,9834 0,0496 0,0666 0,7061 16,0796 548 E150116 ventre 48,1876 0,2061 0,2449 0,2531 36,6194 666 E150116 topete 6,2052 0,0408 0,0525 0,7772 26,7396 350 E150120 topete 3,6531 0,0174 0,0288 0,7467 14,7082 549 E150123 manto 7,6026 0,1120 0,1283 0,6634 25,7210 314 E150123 ventre 44,7366 0,2299 0,2686 0,2440 25,6761 581 E150123 topete 2,5789 0,0118 0,0189 0,8452 12,9856 498 E150125 dorso 50,1642 0,2168 0,2554 0,2500 32,4880 665 E150125 manto 7,4242 0,0724 0,0886 0,6819 27,0978 316 E150126 manto 5,4969 0,1102 0,1360 0,5314 14,7226 316 E150126 ventre 33,2351 0,2151 0,2543 0,2485 23,5003 687 E150130 dorso 37,9644 0,2214 0,2601 0,2469 24,3596 665 E150130 manto 8,0560 0,0621 0,0780 0,6996 31,6801 316 E150145 dorso 32,1079 0,2149 0,2545 0,2473 21,7815 667

169 Macho ID Parte do corpo B2 S1.UV S1.violet S1.red S6 H2 E150145 manto 6,8862 0,1185 0,1431 0,5369 17,8741 318 E150145 ventre 46,4585 0,2295 0,2685 0,2436 26,0707 671 E150145 topete 6,6424 0,0814 0,1016 0,6387 23,0313 316 E150150 ventre 28,9962 0,2110 0,2503 0,2481 21,0044 610 E150150 topete 4,8223 0,0544 0,0717 0,6939 17,8427 666 E150151 dorso 43,0359 0,2062 0,2453 0,2524 31,2535 687 E150151 manto 5,4771 0,0859 0,1058 0,6366 18,1325 304 E150159 dorso 32,3722 0,2119 0,2500 0,2520 22,1189 547 E150159 manto 15,1362 0,1661 0,1899 0,5169 33,3245 547 E150159 ventre 25,7709 0,2310 0,2702 0,2419 13,9505 547 E150159 topete 6,6559 0,1863 0,2094 0,5316 16,4954 322 E150161 dorso 46,5380 0,2067 0,2459 0,2517 34,7785 686 E150161 manto 15,0343 0,1487 0,1723 0,5263 34,0889 318 E150161 ventre 43,9536 0,2112 0,2501 0,2510 31,7308 477 E150161 topete 8,0654 0,0459 0,0587 0,7610 33,6268 498 E150162 dorso 2,8262 0,0764 0,1070 0,3377 4,7715 548 E150162 topete 5,0126 0,0814 0,1038 0,5644 14,3874 315 E150162 manto 5,3199 0,0556 0,0730 0,6898 20,4230 498 E150162 ventre 30,6392 0,2101 0,2499 0,2460 22,0253 666 E150163 manto 7,7880 0,0795 0,0979 0,6669 28,7800 317 E150163 ventre 39,7840 0,2108 0,2499 0,2508 28,3291 667 E150165 manto 4,0895 0,0317 0,0435 0,7944 18,5398 498 E150165 ventre 41,9256 0,2213 0,2602 0,2485 26,7672 476 E150168 dorso 38,9065 0,2235 0,2625 0,2453 24,3568 667 E150168 manto 8,7564 0,1386 0,1631 0,5181 19,5459 317 E150168 topete 2,6468 0,0039 0,0100 0,8407 13,2075 548 E150191 dorso 38,0778 0,2064 0,2447 0,2573 29,0603 605 E150191 manto 5,0788 0,0397 0,0546 0,7266 20,4317 549 E150191 ventre 44,2834 0,2325 0,2711 0,2443 22,9889 477 E150453 dorso 45,2432 0,1834 0,2220 0,2607 40,6293 665 E150453 manto 6,5620 0,0608 0,0789 0,6762 24,1531 333 E150453 ventre 48,1316 0,2055 0,2443 0,2534 36,4971 647 E150453 topete 2,0658 0,0241 0,0408 0,6919 7,7802 665 E150491 dorso 42,8692 0,2233 0,2615 0,2491 23,7286 666 E150491 manto 5,5382 0,0264 0,0376 0,7977 25,7561 368 E150491 ventre 51,5856 0,2228 0,2611 0,2486 30,0528 665

170

Capítulo 4

Sistema de acasalamento social e genético de Antilophia

bokermanni (Aves: Pipridae)

171 INTRODUÇÃO

Darwin (1871) foi o primeiro a discutir sistemas de acasalamento em termos

evolutivos. No entanto, apenas no início do século XX estudos focados em sistemas de

acasalamento sociais, formação de casais e comportamentos de acasalamento, ganharam

maior atenção (Hingston 1933, Nice 1938, Skutch 1940). Lack, em 1940, ainda

argumentava a persistente ignorância a respeito de sistemas de acasalamento sociais, mais

especificamente em aves, sendo que por muitos anos acreditou-se que a monogâmia

prevalecia em 93% das espécies de aves (Lack 1968). Ao mesmo tempo, espécies que

apresentavam sistemas poligâmicos intrigavam pesquisadores, que começaram a questionar

também o efeito da seleção sexual em espécies monogâmicas que apresentam acentuado

dimorfismo sexual (Verner 1963, Wilson & Pianka 1963, Selander 1965). Desta forma

iniciou-se, na década de 60, a busca por explicações não apenas comportamentais, mas

também genéticas, para o esclarecimento das ambiguidades encontradas em tais espécies.

Desde então, além de estudos ecológicos e comportamentais, os avanços

tecnológicos embasados em ferramentas moleculares, principalmente no campo da

genética, permitiram um melhor entendimento sobre como evoluíram e como funcionam os

diferentes sistemas de acasalamento (Freeman-Gallant et al. 2006, Kleven et al. 2008,

Griffith & Immler 2009, Wan et al. 2013). Sistemas de acasalamento são determinados pela

capacidade de um sexo (geralmente os machos) em monopolizar parceiros do sexo oposto

(Emlen & Oring 1977, Danchin et al. 2005, Alcock 2009). Além disso, o conceito de

sistema de acasalamento define a forma como os indivíduos de uma espécie acessam seus

parceiros, com quantos parceiros irão interagir durante um determinado período, a duração

dessa interação e o envolvimento de cada sexo no cuidado parental (Reynolds 1996).

172 As divergências entre as estratégias reprodutivas de cada sexo, ou conflito sexual, ocorrem a partir da anisogamia (produção de gametas diferenciados), onde fêmeas investem mais do que machos na produção de gametas (Trivers 1972). Como consequência, machos conseguem aumentar o seu sucesso reprodutivo ao aumentarem o número de parceiras reprodutivas, enquanto fêmeas obtém maior sucesso buscando parceiros que aumentem a chance de sobrevivência dos seus ninhegos (Trivers 1972,

Emlen & Oring 1977). Assim, o conflito sexual tem um papel fundamental na evolução de estratégias reprodutivas de diferentes espécies, sendo cópulas extra-par (CEP) uma estratégia bastante comum (Westneat & Stewart 2003). Tais cópulas extra-par definem-se pelo acesso reprodutivo a um parceiro outro que o parceiro com o qual o indivíduo encontra-se socialmente vinculado (parceiro social ou intra-par) (Emlen & Oring 1977,

Westneat & Stewart 2003).

Para machos, é clara a razão pela qual buscariam o maior número de parceiras férteis (Trivers 1972). Mas, para as fêmeas os benefícios não são tão óbvios, principalmente porque o sucesso reprodutivo das fêmeas não aumenta linearmente com o número de parceiros com os quais copulam (Bateman 1948, Trivers 1972). Além disso, para as fêmeas as cópulas extra-par resultam em um alto risco de contágio de doenças sexualmente transmissíveis (Zuk 1990, Sheldon 1993), maior exposição à predação

(Pomiankowski 1987) e retaliação por parte do parceiro social, arriscando assim a perda do cuidado parental (Cezilly & Nager 1995). Apesar disso, fêmeas de muitas espécies em grupos taxonômicos diversos buscam parceiros extra-par (PEP), e os estudos de paternidade confirmam altas taxas de fertilização extra-par (FEP), mesmo em espécies

173 socialmente monogâmicas (Owens & Hartley 1998, Griffith et al. 2002, Macedo et al.

2008, Wan et al. 2013, Manica et al. 2016).

Devido a essa aparente falta de vantagens para as fêmeas, foram levantadas hipóteses sobre os benefícios diretos e indiretos possivelmente gerados por tal comportamento, como por exemplo, aumento da sobrevivência e/ou fecundidade da fêmea

(Zahavi 1975) e melhor qualidade da prole (Alatalo et al. 1986, Andersson 1994). Desde então, muitos estudos tentam confirmar os benefícios de FEP para as fêmeas (Cezilly &

Nager 1995, Jennions & Petrie 2000, Griffith et al. 2002; 2003, Westneat & Stewart 2003,

Cohas et al. 2007, Forsman et al. 2008, Rosivall et al. 2009, Griffith & Immler 2009), na tentativa de explicar os altos valores de FEP encontrados em muitas espécies (Gelter &

Tegelström 1992, Barber et al. 1996, Bjørnstad & Lifjeld 1997, Rowe et al. 2001, Hoffman et al. 2010). A frequência média de paternidade extra-par em aves é de 11,1% da prole e pelo menos 25% das espécies de passeriformes possuem taxas de FEP acima de 25%

(revisão em Griffth et al. 2002). Esses valores sugerem que fêmeas buscam por CEP, e essa iniciativa seria um forte indício de que haja algum tipo de benefício para a fêmea e/ou para sua prole (Birkhead & Møller 1993).

Assim, resumidamente, os benefícios que as CEP trariam para as fêmeas são agrupados em três categorias: materiais (Burke et al. 1989, Bensch & Hasselquist 1991,

Gibson 1992, Gray 1997, Forstmeier et al. 2002, Westneat & Stewart 2003), fisiológicos

(Sheldon 1994, Krokene et al. 1998) e genéticos (Petrie et al. 1998, Eshel et al. 2000,

Brommer et al. 2002, Griffith et al. 2002, Tarvin et al. 2005, Freeman-Gallant et al. 2006,

Kokko & Jennions 2008, Griffith & Immler 2009, Wetzel & Westneat 2009). No entanto,

174 ainda é muito discutido se esses fatores justificam tal comportamento (Westneat 1990,

Birkhead & Møller 1993).

De acordo com vários estudos, a principal evidência de que fêmeas buscam benefícios genéticos (seja por maior compatibilidade genética ou maior aptidão para os ninhegos), seria estabelecer que machos extra-par tem uma melhor qualidade do que machos intra-par (Kempenaers et al. 1992, Dyrcz et al. 2005, Tarvin et al. 2005, Gerlach et al. 2012). Os caracteres sexuais secundários dos machos, originados através da seleção sexual, são muitas vezes sinais honestos de sua saúde e vigor (e.g. Andersson 1994), permitindo que fêmeas tenham como julgar a qualidade dos machos e avaliar qual parceiro seria o mais adequado. Além das características dos machos (como plumagem brilhante, cantos complexos, exibições elaboradas), a qualidade da fêmea na sua escolha por parceiros também tem sido discutida (Cotton et al. 2006). Assim, a preferência da fêmea deve refletir também a sua condição, por razões similares às dos ornamentos dos machos. E se isso de fato ocorre, a ornamentação dos machos será favorecida pela seleção sexual não apenas por atrair as fêmeas, mas também porque um traço mais extravagante do macho poderá atrair uma fêmea de melhor qualidade, principalmente se a condição da fêmea estiver ligada à sua fertilidade (Cotton et al. 2006). Desta forma, vislumbra-se um processo de retroalimentação que envolve as características ornamentais exuberantes dos machos, a capacidade de escolha e qualidade das fêmeas.

Muitos trabalhos tem demonstrado relação entre a qualidade da fêmea e sua preferência, onde fêmeas em melhores condições são mais exigentes quanto ao parceiro do que fêmeas em condições inferiores (Holveck & Riebel 2010, Riebel et al. 2010). Esses autores destacam a importância de levar em conta a capacidade de discriminação da fêmea

175 quanto à sua própria qualidade e a qualidade do macho. Discute-se ainda que nem sempre a maior qualidade de um indivíduo significaria que este seja mais atrativo para o indivíduo do sexo oposto, sendo também necessária uma investigação a respeito do que é atrativo e se estes caracteres indicam qualidade (Basolo 2004, Bel-Venner et al. 2008).

Uma das principais evidências da seleção sexual nas aves é o dimorfismo sexual e extravagância na ornamentação dos machos de várias espécies (e.g. Darwin 1871, Fisher

1915, Zahavi 1975). A família Pipridae é conhecida por possuir espécies sexualmente dicromáticas e polígamas, com complexos displays por parte dos machos e formação de lek

(McDonald 1989, McDonald & Potts 1994, Prum 1994; 1997). No entanto, piprídeos das

únicas duas espécies do gênero Antilophia (A. galeata e A. bokermanni) são conhecidos por não possuirem um sistema de acasalamento de poligamia com lek, ou seja, e sim por serem monogâmicas, apesar de seu acentuado dicromatismo sexual (Marini & Cavalcanti 1992,

Prum 1994). Para A. galeata, espécie que ocorre no Cerrado, o sistema de acasalamento verificado foi de monogamia social, onde machos defendem territórios reprodutivos nos quais as parceiras sociais nidificam e aparentemente, é encontrado apenas um casal por território (Marini & Cavalcante 1992). Com relação a A. bokermanni, espécie endêmica das matas de encostas da Chapada do Araripe no Ceará e criticamente ameaçada, pouco se sabe sobre seus hábitos e comportamentos. No entanto, devido à classificação da espécie irmã

(A. galeata) como socialmente monogâmica, assumiu-se e divulga-se que A. bokermanni também apresente um sistema de acasalamento com formação de casais do tipo monogâmico (Coelho & Silva 1998, Aquasis 2006, Rêgo et al. 2010). Um maior detalhamento sobre a espécie é dado na seção “espécie de estudo” no ínicio desta tese.

176 Em um estudo realizado por Prum (1994), é sugerido que Antilophia possa ter perdido o comportamento de lek devido a características ambientais, como a sua restrição a zonas ripárias do Cerrado. No entanto, espécies filogeneticamente próximas, como

Chiroxiphia caudata, também são restritas a essas mesmas áreas, portanto sofreriam as mesmas pressões seletivas, mas ainda assim exibem complexos displays e sistema de acasalamento promíscuo (Foster 1981). Para ambas as espécies de Antilophia não existem, na literatura, dados de paternidade genética, registros sobre a realização de display do macho ou mesmo indícios de cuidado paternal, ou ainda da relação entre a distinta coloração do macho e sua biologia reprodutiva.

Além das questões teóricas que surgem sobre as diferenças do gênero Antilophia no contexto evolutivo da Família Pipridae, informações sobre o sistema de acasalamento de A. bokermanni, assim como outros dados de sua biologia e comportamento, são cruciais para a elaboração de planos de manejo mais efetivos. Desta forma, o presente trabalho visa primariamente descrever o sistema de acasalamento social e genético de A. bokermanni, constatando se estes são compatíveis. Para isso, o estudo averiguou a existência de cópulas extra-par, estimando taxas de FEP e fertilização intra-par (FIP). Além desses dados descritivos, testamos as seguintes hipóteses: (1) o acasalamento na espécie é assortativo, ou seja, existe uma correlação positiva entre machos e fêmeas acasalados, bem como entre ninhegos e seus pais (pai e mãe), no que se refere à condição corporal (estimada através de um índice de condição corporal, ICC); (2) machos com maiores territórios apresentam maior sucesso de pareamento (i.e, com fêmeas nidificando em seu território) e maior índice de condição corporal (ICC) e o sucesso de pareamento está relacionado ao ICC; (3) machos extra-par possuem maiores índices de condição corporal (ICC), são geneticamente mais

177 dissimilares com relação às fêmeas e possuem maior heterozigosidade do que os machos

socialmente acasalados; e (4) ninhegos oriundos de cópulas extra-par exibem melhores

condições corporais e maior heterozigosidade do que ninhegos intra-par.

MÉTODOS

O capítulo 1 descreve as seguintes metodologias, utilizadas também neste capítulo:

Captura e marcação dos indivíduos

Coleta de sangue dos ninhegos

Procura e monitoramento dos ninhos

Territórios reprodutivos

O capítulo 3 descreve as seguintes metodologias, utilizadas também neste capítulo:

Morfometria

Coleta e análise da plumagem

Gravação e análise do canto

Extração de DNA e análises moleculares de paternidade

Sucesso reprodutivo

ÍNDICE DE CONDIÇÃO CORPORAL (ICC) DAS FÊMEAS E NINHEGOS

A condição corporal das fêmeas e ninhegos foi determinada da mesma forma que para

os machos (métodos Capítulo 3), através da razão entre medidas do peso e tarso. Para os

ninhegos foi calculado o índice de condição corporal após a eclosão (1 a 2 dias), sendo

ninhos que foram encontrados já com ninhegos com mais de dois dias desconsiderados nas

análises.

SUCESSO DE PAREAMENTO

178 O sucesso de pareamento foi calculado através do número de vezes em que um macho foi registrado nidificando com uma fêmea em pelo menos uma tentativa reprodutiva, ou seja, quando pelo menos um ninho ativo daquele macho foi encontrado dentro do seu território.

DETERMINAÇÃO DA PATERNIDADE GENÉTICA

Em adição ao descrito no capítulo 3 sobre as análises genéticas de paternidade, trago aqui um melhor esclarecimento sobre o protocolo de determinação de paternidade biológica dos filhotes de A. bokermanni. Um macho só foi confirmado como pai biológico de um filhote quando: (1) o valor do LOD score (chance de um determinado indivíduo ser aparentado) para o trio (mãe, filhote e pai) fosse maior que 6,45 (acima dos 95% de confiança determinado pelo programa Cervus, Kalinowski et al. 2007), quando a mãe não era conhecida e o valor do LOD score fosse maior que 4,32 quando a mãe foi confirmada;

(2) O número de alelos incompatíveis (mismatches) entre o filhote e o pai fosse menor que

2; e (3) foi levado em consideração o local de anilhamento ou recaptura do macho em questão e a área onde o ninho foi encontrado. Ainda, geramos figuras utilizando valor do trio LOD score para os machos sociais (figura 1) e para os pais biológicos (figura 2), para melhor visualizar a comparação dos valores (score) e mismatches entre estes machos, facilitando a tomada de decisões sobre a paternidade biológica dos machos, levando em consideração as características genéticas das mães.

179

Figura 2- Número de alelos incompatíveis (Trio mismatches) entre pais confirmados (genetic father) e seus filhotes e a possibilidade destes machos serem os pais biológicos dos filhotes, levando em consideração as características genéticas das mães (Trio LOD score).

180 SIMILARIDADE GENÉTICA (PARENTESCO) E HETEROZIGOSIDADE

Foi calculada a relação de parentesco entre fêmeas e seus parceiros sociais e extra-par, utilizando-se o coeficiente de parentesco “r” de Queller e Goodnight (1989) no programa

SPAGEDI v. 1.5 (Hardy & Vekemans 2002). O método utiliza a proporção de alelos compartilhados entre dois indivíduos levando em conta a frequência de cada alelo na população amostrada. Foi utilizada toda a população amostrada nas análises de parentesco, e então identificadas as fêmeas (mães) e seus respectivos parceiros sociais e extra-par.

Subsequentemente utilizamos o teste t de Student no programa PAST 3.13 (Hammer et al.

2001) para averiguar se pais sociais são mais aparentados com as fêmeas do que seus parceiros extra-par.

A heterozigosidade, ou nível de endogamia, foi calculada por meio do método proposto por Aparicio et al. (2006), que leva em consideração a variabilidade alélica de um locus em comparação à heterozigosidade esperada para este locus e a presença ou ausência de heterozigose deste locus, em um determinado indivíduo. O índice de homozigosidade

(HL) varia de 0 a 1, sendo que valores mais próximos de 1 indicam indivíduos com menor diversidade genética (HL=1 corresponde a um indivíduo com todos os loci homozigóticos).

ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Para analisar se existe correlação entre o índice de condição corporal (ICC) das fêmeas e o ICC dos seus respectivos machos sociais e filhotes utilizamos uma análise de correlação de Spearman, assim como para avaliar se existe correlação entre o ICC dos filhotes e o de seus pais biológicos. Utilizamos correlações de Spearman também para verificar se o sucesso de pareamento dos machos é associado ao tamanho territorial, seu ICC e ainda se o

ICC dos machos que defenderam territórios reprodutivos, está relacionado com o tamanho destas áreas.

181 Para testar se existe diferença entre o ICC e heterozigosidade de machos sociais em

comparação a machos extra-par utilizamos testes t pareados e para avaliar se machos

sociais são mais aparentados geneticamente às fêmeas que machos extra-par, utilizamos o

teste U de Mann-Whitney. Finalmente, para averiguar se filhotes intra-par diferem de

filhotes extra-par quanto a seus ICCs e sua heterozigosidade, utilizamos testes t pareados e

o teste U de Mann-Whitney, respectivamente. Ainda, utilizamos correlação de Pearson para

verificar se o ICC dos filhotes está relacionado com o nível de heterozigosidade destes.

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico PAST 3.13

(Hammer et al. 2001).

RESULTADOS

Foram monitorados 101 ninhos durante as três estações reprodutivas (2013/2014,

2014/2015, 2015/2016). Destes, foi possível a identificação das mães em 41 ninhos (N= 37

fêmeas) e de pais sociais (macho defendendo território) de 63 ninhos (N= 28 machos),

sendo que para 30 ninhos tanto a mãe quanto o pai social foram identificados. Dentre os

casais identificados, 25 produziram pelo menos um ninhego. Ainda, durante as observações

de campo foram registradas múltiplas fêmeas (2 a 3) nidificando simultaneamente no

território de um único macho, em pelo menos quatro ocasiões (quatro territórios, de quatro

machos distintos), indicando que nestes casos um único macho possuiu mais de uma

parceira social.

Através das análises genéticas de paternidade identificamos pais biológicos para 57

ninhegos (N= 43 pais) e a maternidade foi confirmada para 76 ninhegos (N= 37 fêmeas).

Encontramos que dentre os ninhegos analisados, 53 foram provenientes de cópulas extra-

par (de um macho diferente do que defendia o território onde o ninho se encontrava) e

182 apenas 4 ninhegos (N= 4 ninhos) foram derivados de cópulas intra-par, ou seja, o pai biológico defendia o território onde o ninho se encontrava. Desta forma, a taxa de fertilização extra-par (FEP) é de 94,21% para ninhegos (90,91% por ninho) e a taxa de fertilização intra-par (FIP) é de 5,79% (9,09% por ninho) apenas, para A. bokermanni. No entanto, alguns ninhegos (N= 10) tiveram a paternidade biológica confirmada para um dos machos amostrados, porém o macho social não foi identificado, não sendo possível afirmar portanto se esses ninhegos foram provenientes de cópulas intra ou extra-par, sendo então desconsiderados nos cálculos das taxas de FEP e FIP. Ainda, para outros cinco ninhos, com dois filhotes cada, os irmãos tiveram um mesmo pai, porém em quatro destes ninhos o pai social não era o pai biológico dos ninhegos, e no quinto ninho o pai social não foi amostrado.

Entre os machos que tiveram a paternidade biológica confirmada para pelo menos um filhote (intra ou extra-par), apenas 52% eram adultos (plumagem sem penas verdes) enquanto que 48% (N=21) se encontravam com a plumagem sub-adulta (presença de penas verdes pelo corpo). Estes sub-adultos não foram observados defendendo territórios reprodutivos ou mesmo vocalizando, durante a estação reprodutiva em que produziram filhotes. Entretanto, 45% dos machos (N=14) que defenderam algum território reprodutivo, ou seja, que foram pais sociais de algum ninho, tiveram a paternidade confirmada para algum filhote, mesmo que este tenha sido extra-par. A figura 3 ilustra a localização dos territórios que alguns desses machos defenderam e os territórios onde estes produziram filhotes extra-par, indicados pelas setas. Ainda, quatro dentre os 14 machos territorialistas mencionados, tiveram a paternidade biológica confirmada para filhotes em ninhos de outras

áreas amostradas (diferentes da área onde defendia território). Porém, em todos os quatro

183 casos, se tratavam de áreas vizinhas, próximas umas das outras, indicando que as fêmeas copularam com tais machos em uma determinada área amostrada (e.g. Grangeiro), porém nidificaram em outra área (e.g. Advogados).

Figura 3- Distribuição dos territórios de cinco machos que perderam a paternidade em seus ninhos, mas foram pais extra-par em outros ninhos (indicados pelas setas), na área Grangeiro.

O PAREAMENTO NA ESPÉCIE É ASSORTATIVO? OU SEJA, FÊMEAS COM MELHORES CONDIÇÕES

CORPORAIS PAREAM-SE SOCIALMENTE COM MACHOS EQUIVALENTES? E O ICC DOS FILHOTES ESTÁ

RELACIONADO COM O ICC DE SEUS PAIS? (H1)

O índice de condição corporal (ICC) médio das fêmeas e machos foi bastante similar:

0,92 ± 0,01 (N=110) e 0,91 ± 0,006 (N=119), respectivamente. Para os ninhegos com até dois dias de idade a média do ICC foi de 0,45 ± 0,01 (N=120). Não foi encontrada correlação do ICC das fêmeas com ninhos com o ICC de seus respectivos machos sociais

(machos que foram observados defendendo o território onde a fêmea nidificou; r= 0,31; p=

0,09, N= 30). Também não foi encontrada correlação entre o ICC das mães e seus

184 respectivos filhotes (N=44; r= -0,08; p=0,60), nem entre o ICC dos pais biológicos e seus filhotes (N=54; r= -0,22; p=0,10).

MACHOS COM MAIORES TERRITÓRIOS APRESENTAM MAIOR SUCESSO DE PAREAMENTO E ICC ? E

SEU SUCESSO DE PAREAMENTO ESTÁ RELACIONADO COM O ICC? (H2)

Dentre os machos que foram capturados e anilhados, 28 foram observados defendendo territórios reprodutivos e se parearam com pelo menos uma fêmea em pelo menos uma das estações reprodutivas amostradas. Todos os 28 machos chegaram a ter ninho nos seus territórios em algum momento durante a estação reprodutiva, mas apenas 25 possuíram ninhos com ninhegos em seus territórios (foram pais sociais). O macho que obteve o maior sucesso de pareamento foi o indivíduo E150116, que pareou-se sete vezes durante as três estações reprodutivas amostradas, seguido pelos indivíduos E150150 e E150163 que parearam-se cinco vezes cada. Onze machos parearam-se apenas uma vez, sete machos parearam-se duas vezes e sete machos parearam-se três vezes durante os períodos amostrados.

O território reprodutivo foi mensurado para 26 machos que tiveram sucesso em parear- se com pelo menos uma fêmea. O tamanho do território dos machos não se correlacionou com o sucesso de pareamento (r= -0,15; p= 0,43), nem com seu índice de condição corporal

(r= -0,05; p=0,7). O sucesso de pareamento destes machos também não esteve correlacionado com seu ICC (r= -0,31; p=0,50).

MACHOS EXTRA-PAR POSSUEM MAIORES ÍNDICES DE CONDIÇÃO CORPORAL (ICC), SÃO MENOS

RELACIONADOS GENETICAMENTE COM AS FÊMEAS E POSSUEM MAIOR HETEROSIGOSIDADE (HL) DO

QUE MACHOS SOCIAIS? (H3)

185 Quando comparado o ICC de machos sociais que perderam a paternidade dos seus filhotes com o ICC dos machos extra-par (pais biológicos), houve uma tendência do ICC dos machos extra-par ser ligeiramente maior (t= -1,79; p=0,07), não chegando porém a ser significativa estatisticamente. Com relação à semelhança genética entre machos e fêmeas que acasalaram, não foi encontrada diferença no coeficiente de parentesco “r” das fêmeas com machos sociais (rsocial= -0,01 ± 0,03) e com pais biológicos (rgenético= -0,08 ± 0,03)

(Mann-Whitney U= 378; p= 0,29). Ou seja, machos extra-par não são menos aparentados geneticamente às fêmeas quando comparados com os machos sociais das mesmas. A heterosigosidade média de machos socias (HL= 0,384 ± 0,013) e machos extra-par (HL=

0,380 ± 0,016) foi quase idêntica, não havendo diferença estatística entre os dois índices (t=

0,87; p=0,38).

NINHEGOS DE CÓPULAS EXTRA-PAR POSSUEM MELHORES CONDIÇÕES CORPORAIS E SÃO MAIS

HETEROZIGÓTICOS (HL) QUE NINHEGOS INTRA-PAR? (H4)

O índice de condição corporal (ICC) médio para os filhotes de A. bokermanni analisados foi de 0,46 ± 0,02 e a média do nível de heterozigosidade (HL) foi de 0,36 ±

0,01 (N= 98 filhotes). A média de heterozigosidade para a espécie em geral (considerando todos os indivíduos amostrados: machos, fêmeas e ninhegos) foi de 0,37 ± 0,007. Não foi encontrada correlação entre o HL e o ICC dos filhotes em geral (r=0,01; p=0,91).

Como dito anteriormente, apenas quatro ninhegos foram produzidos por machos que defendiam os territórios onde os ninhos foram encontrados. Todos os quatro ninhos possuíam dois filhotes, mas a paternidade intra-par foi encontrada apenas para um dos filhotes em cada um dos ninhos (N= 4), ou seja, os machos sociais perderam a paternidade de um dos filhotes em todos os quatro casos. Comparamos os filhotes destes ninhos e não

186 encontramos diferenças no ICC (t= -0,05; p=0,95) ou nível de endogamia ou

heterosigosidade (Mann-Whitney U= 6; p= 0,66) entre os filhotes intra-par e extra-par.

DISCUSSÃO

O conceito de sistema de acasalamento refere-se às estratégias comportamentais de

uma espécie para o acesso a parceiros reprodutivos, incorporando diferentes parâmetros

que incluem: o número de parceiros adquiridos, a forma de aquisição de parceiros, a

presença e características de formação de casais, e os padrões do cuidado parental

fornecido por cada sexo (Emlen & Oring 1977). Assim, sistemas socialmente

monogâmicos, na sua vasta maioria, apresentam defesa territorial tipicamente realizada por

machos ou ambos os sexos, formação de um vínculo social entre os parceiros (um macho e

uma fêmea) e cuidado parental realizado por ambos os sexos (Lack 1968, Emlen & Oring

1977).

Até o presente momento, o sistema de acasalamento de Antilophia tem sido definido

como monogâmico (Marini & Cavalcanti 1992, Prum 1994). Tal definição baseia-se sobre

a aparente defesa territorial realizada pelos machos e a presença de ninhos nessas áreas.

Além disso, prevaleceu a ausência de conhecimento sobre a realização de displays pelo

macho assim como a falta de informações sobre paternidade de prole. No presente estudo,

encontramos que para A. bokermanni, não ocorreu cuidado parental do macho em nenhuma

fase reprodutiva (construção do ninho, incubação dos ovos) ou de desenvolvimento dos

filhotes pós-eclosão (ver resultados capítulo 1). Além desse fato, registramos outras

evidências que fogem à definição clássica da monogamia social: mais de uma fêmea

nidificando em território de um mesmo macho em algumas ocasiões; ausência de defesa de

parceiros reprodutivos; e principalmente, uma elevadíssima taxa de paternidade “extra-

187 par”. Tais observações indicam que o sistema social de A. bokermanni não se encaixa na definição de uma monogamia clássica.

Como constatado até o momento, a média de cópulas extra-par para aves consideradas socialmente monogâmicas é de 11% (Griffith et al. 2002). No entanto, alguns estudos encontraram que espécies socialmente monogâmicas podem possuir taxas de cópula extra- par que alcançam valores maiores que a média, podendo ultrapassar 50% (Yezerinac et al.

1995, Barber et al. 1996, Carvalho et al. 2006, Manica et al. 2016). Porém, para tais espécies, o sistema social se encaixa na definição de monogamia no que tange ao vínculo social e cuidado parental realizado por ambos os sexos (Dunn & Hannon 1992, Lozano &

Lemon 1995, Diniz et al. 2015), características ausentes em A. bokermanni. Além disso, nenhum estudo onde espécies socialmente monogâmicas tiveram seu sistema de acasalamento genético analisado, registrou valores superiores a 90% na taxa de FEP, como encontramos no presente estudo. Desta forma, propomos que o sistema de acasalamento social de A. bokermanni não possa ser classificado como monogâmico.

Sugerimos que a aparente defesa territorial dos machos possa ser considerada como uma forma de display, onde o canto possui a principal função de atrair as fêmeas e não tenha funcionalidade quanto à defesa de uma área, no sentido de excluir outros machos.

Podemos encontrar suporte para essa proposta nos resultados encontrados no capítulo 3, onde elementos do canto mostraram-se importantes para o sucesso reprodutivo dos machos, sendo um forte indicativo de qualidade dos mesmos e possivelmente a principal forma da fêmea avaliar a qualidade do macho. Ainda, o fato de fêmeas nidificarem dentro das áreas defendidas por machos pode ser resultado da baixa disponibilidade de áreas adequadas para

188 a nidificação, não estando associada à formação de pares, o que explicaria a presença de mais de um ninho em um mesmo território.

Também foram observados em algumas ocasiões, machos em vôos circulares onde perseguiam sem agressividade um ao outro, emitindo sons mecânicos, produzidos provavelmente pelas asas durante o vôo, e encerravam pousando um ao lado do outro.

Infelizmente tal comportamento não foi quantificado, porém em todas as ocasiões observadas (mais de 6 vezes), foi registrada a presença de pelo menos uma fêmea aparentente observando os machos. Ainda, tal comportamento não ocorreu dentro das áreas defendidas pelos machos, mas sim em áreas neutras (onde não havia machos defendendo território), e frequentemente em uma mesma área. Tais características se assemelham às arenas utilizadas por machos para exibições de lek, como descrito para a grande maioria dos piprídeos (Lill 1974, Anciães & Prum 2008, Durães et al. 2008, Cestari & Pizo 2012).

Este comportamento de vôos circulares também foi observado por Marini (1992), para a espécie irmã A. galeata, no entanto tal comportamento nunca foi detalhado ou teve sua função investigada.

Constatamos ainda que muitos machos sub-adultos ou jovens, e que não defenderam territórios reprodutivos, produziram filhotes biológicos. Em diversas espécies de Pipridae os machos apresentam um grande atraso na mudança para a plumagem adulta completa

(Foster 1987, DuVal 2005, McDonald 2009), mesmo tendo maturidade sexual, ou seja, capazes de produzir filhotes (Foster 1987, Marini 1992). Aparentemente, a mudança da plumagem juvenil para adulta em piprídeos não é dependente da quantidade de hormônios como a testosterona (Day et al. 2006, Fusani et al. 2014). É possível que o atraso na muda seja uma estratégia de machos para acesso às fêmeas sem competirem ou serem agredidos

189 por outros machos, pois a presença de grande quantidade de penas verdes torna tais machos parecidos com fêmeas, possivelmente não sendo identificados por outros machos como competidores intra-sexuais (Rohwer et al. 1980, Flood 1984). É plausível, portanto, que tais machos forcem a cópula com as fêmeas, uma vez que estas também não os identificariam como machos, o que explicaria a produção de filhotes por estes machos. No entanto, é necessário averiguar se machos de A. bokermanni seriam menos agressivos em relação a indivíduos verdes do que com machos que possuem plumagem adulta. Além disso, a vantagem e a função do atraso da mudança da plumagem de aves podem variar entre espécies (Lyon & Montgomerie 1986).

Nossos resultados não corroboraram a hipótese de que fêmeas com melhores condições corporais paream-se com machos equivalentes, além de não ter sido encontrada correlação entre o ICC dos filhotes e mães ou seus respectivos pais biológicos. Também não encontramos suporte para a hipótese de que o sucesso de pareamento dos machos estaria relacionado ao tamanho do seu território, indicando assim que fêmeas não se beneficiam diretamente em parear-se com determinados machos. No entanto, a disponibilidade de alimento em cada território não foi medida. Apesar disso, diferente de outras áreas, a encosta da Chapada do Araripe apresenta uma vegetação bastante homogênea (Silva-Neto

2013), sendo bastante provável que a variação na distribuição de plantas e frutos entre os territórios seja baixa.

Encontramos que em comparação com filhotes intra-par, filhotes provenientes de cópulas extra-par não possuem maiores ICC, ou maior heterozigosidade. Também verificamos que machos extra-par não possuem maior diversidade genética e ICC, quando comparados com machos sociais. Assim, não encontramos suporte para a teoria de que

190 fêmeas recebem benefícios indiretos em cópulas com parceiros extra-par. Outros estudos também não tem encontrado evidências que apoiam tal contexto teórico (Hill et al. 2011,

Manica et al. 2016). De modo geral, estudos tem indicado que a presença de benefício indireto para fêmeas que buscam cópulas extra-par diverge bastante entre diferentes espécies (Forsman et al. 2008, Schmoll et al. 2009, Forstmeier et al. 2014, Hsu et al. 2015,

Whittingham & Dunn 2016). No caso de A. bokermanni isso pode ser um indicativo de que a endogamia possui baixa influência para a escolha de parceiros pelas fêmeas, pouco afetando a qualidade genética dos filhotes.

Os nossos resultados ainda sugerem que os níveis de endogamia são altos quando comparados com outras espécies de aves (Bates 2000, Ortego et al. 2007, Manica et al.

2016) ou mesmo outras espécies da família Pipridae (Ryder et al. 2009). Enquanto que para aves, de modo geral, o coeficiente de endogamia varia de 0 a 14% (Bates 2000, Shad et al.

2013), para A. bokermanni o valor médio foi de 37%, lembrando que valores mais altos indicam menor heterozigosidade. A baixa variação entre indivíduos (ou seja, baixa heterozigose) e a baixa influência da endogamia na escolha de parceiros e consequentemente entre filhotes, podem ser resultado de altos níveis de endogamia, uma vez que para ocorrer seleção de machos mais heterozigóticos, a diferença entre os indivíduos deve ser mais evidente. Altos níveis de endogamia são esperados para espécies com pequenas populações isoladas (Frankham 1996), como é o caso de A. bokermanni.

Esse cenário é bastante preocupante uma vez que a perda de alelos ocasiona diversas consequências negativas para a espécie como: baixa resistência a doenças, alelos deletérios, alta mortalidade, baixo sucesso de eclosão e sobrevivência de ninhegos, podendo ocasionalmente levar à extinção da espécie (Ralls et al. 1979, Milss & Smouse 1994,

191 Frankham 1995, Hendrick & Kalinowski 2000, Brekke et al. 2010). Deste modo, os resultados encontrados no presente estudo servem de alerta para a urgência de tomada de decisões sobre a conservação da área de ocorrência da espécie.

Vale ainda ressaltar, que as hipóteses testadas no presente estudo foram baseadas no conceito de que existem machos intra-par, ou seja, parceiros sociais, uma vez que o sistema social da espécie era considerado até o momento como monogâmico. No entanto, nossos resultados, inclusive a ausência de benefícios para a fêmea e filhotes na busca de parceiros

“extra-par”, sugerem que o sistema social de A. bokermanni não inclui o conceito de machos sociais, assemelhando-se assim com todas as outras espécies da familia Pipridae nesse quesito (Foster 1987, McDonald & Potts 1994, Prum 1994, Shorey 2002, DuVal

2007, Anciães & Prum 2008, Durães et al. 2008). Portanto, a alta taxa de paternidade extra- par pode ser um indicativo de que de fato a definição de intra e extra-par não cabe para a espécie, tornando a comparação entre sistema social e genético pouco coerente, principalmente considerando-se o sistema social monogâmico. Acreditamos que seja necessária uma re-definição, buscando um enquadramento mais adequado para o sistema de acasalamento de A. bokermanni dentro do vasto e complexo espectro de diferentes tipos de sistemas sociais.

Assim, propomos que o sistema de acasalamento social e genético que melhor se encaixa com os dados obtidos para A. bokermanni seria o de lek solitário poligínico. De acordo com alguns pesquisadores, tal sistema pode evoluir tanto por razões demográficas, devido à baixa densidade de indivíduos (Olsen & McDowell 1983), quanto sociais, devido

à baixa tolerância de machos quanto a presença de outros machos (Prum et al. 1996). O sistema de lek solitário poligínico é encontrado em outros membros da família, como

192 algumas espécies do gênero Heterocercus, Xenopipo e Machaeropterus (Sick 1959; 1967,

Prum et al. 1996). A definição deste sistema prediz que: (1) o lek solitário é possivelmente derivado do lek tradicional, com classes agregadas de territorialidade; e (2) compartilha a característica mais importante do lek tradicional ou lek agregado: machos defendem territórios, não baseados na defesa de recursos, mas para efetuarem “display” poligínico

(polyginous advertisement) (Prum 1994, Prum et al. 1996). Tais características descrevem de forma adequada o encontrado para A. bokermanni no presente estudo, explicando assim a função da defesa de territórios pelos machos, apesar das altas taxas de FEP.

A divergência entre as espécies dos gêneros acima citados e Antilophia bokermanni em relação fato de que os ninhos de tais espécies não se encontrarem necessariamente dentro dos territórios defendidos pelos machos, pode ser uma consequência da redução da área de vida e restrição das fêmeas quanto à locais de nidificação. No entanto, as populações da espécie irmã A. galeata, não se encontram reduzidas, além de possuírem uma distribuição abrangente (Sick 1997) mas fêmeas parecem também nidificar dentro dos territórios dos machos. Porém, para quase todas as espécies mencionadas, poucos estudos foram realizados no que diz respeito aos locais de nidificação em relação aos territórios defendidos pelos machos, para Heterocercus flavivertex por exemplo, apenas um ninho foi encontrado durante o estudo de Prum et al. (1996) e A. galeata apenas dois ninhos (Marini

1992). Assim, é preciso ter cautela quanto a conclusões em relação à inserção dos ninhos dentro dos territórios dos machos ou não, bem como acerca das razões ecológicas e comportamentais para o que observamos no presente estudo quando comparado com outras espécies de lek solitário.

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206 DIAS FBS Agradecimentos

Ministério da Saúde

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

CENTRO DE PESQUISA RENÉ RACHOU Mestrado em Ciências da Saúde Doenças Infecciosas e Parasitárias

ECOLOGIA DE Rhodnius nasutus STÅL, 1859 (HEMIPTERA: REDUVIIDAE: TRIATOMINAE) EM PALMEIRAS DA CHAPADA DO ARARIPE, CEARÁ, BRASIL.

por

Fernando Braga Stehling Dias

Belo Horizonte Fevereiro/2007 ECOLOGIA DE Rhodnius nasutus STÅL, 1859 (HEMIPTERA: REDUVIIDAE: TRIATOMINAE) EM PALMEIRAS DA CHAPADA DO ARARIPE, CEARÁ, BRASIL.

por

Fernando Braga Stehling Dias

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação do Centro de Pesquisa René Rachou como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências na área de concentração

Doenças Infecciosas e Parasitárias

Orientadora: Dra. Liléia Diotaiuti

Belo Horizonte Fevereiro/2007

Catalogação-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do IRR Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975

D541e Dias, Fernando Braga Stehling. 2007 Ecologia de Rhodnius nasutus Stål 1859 (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) em palmeiras da Chapada do Araripe, Ceará, Brasil / Fernando Braga Stehling Dias. – Belo Horizonte, 2007.

xix, 101 f.: il.; 210 x 297 mm.

Bibliografia: f. 94 – 105 Dissertação (mestrado) – Dissertação para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde pelo Programa de Pós - Graduação em Ciências da Saúde do Instituto René Rachou. Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.

1. Rhodnius 2. Ecologia 3. Doença de Chagas I. Título. II. Diotaiuti, Liléia (Orientação).

CDD – 22. ed. – 616.936 3

iii

A presente dissertação foi desenvolvida no laboratório da 20ª Regional da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará, no Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas do Centro de Pesquisa René Rachou/FIOCRUZ, sob a orientação da Dra. Liléia Diotaiuti, e no Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular do Centro de Pesquisa René Rachou/FIOCRUZ, com as colaborações do Dr. Alvaro José Romanha e Dr. Evandro Marques de Menezes Machado, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências junto ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Pesquisa René Rachou/FIOCRUZ.

“Faça da interrupção um novo caminho, da queda um passo de dança, do medo uma escada, do sonho uma ponte, da procura um encontro...Não paute sua vida nem sua carreira pelo dinheiro. Ame seu ofício com todo o coração. Persiga fazer o melhor. Seja fascinado pelo realizar, que o dinheiro virá como conseqüência. Pense no seu país, porque principalmente hoje pensar em todos é a melhor maneira de pensar em si...Fomos criados para construir pirâmides e versos, descobrir continentes e mundos e caminhar sempre com um saco de interrogações na mão e uma caixa de possibilidades na outra... Trabalhe em algo que você realmente goste e você nunca precisará trabalhar na vida”. Nilzan Guanaes

Aos meus pais, Marco Aurélio e Maria Helena.

vi DIAS FBS Agradecimentos

AGRADECIMENTOS DIAS FBS Agradecimentos

À Dra. Liléia Diotaiuti, a grande idealizadora deste projeto, pela orientação, amizade, confiança e constantes ensinamentos. Uma guerreira nos trabalhos de campo e acima de tudo, pela paciência comigo!

Ao Dr. Evandro Marques de Menezes Machado pelos ensinamentos em todas as etapas em que trabalhamos com Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli, e principalmente, pelo exemplo de profissionalismo.

À Cláudia Mendonça Bezerra pelos bons momentos que passamos juntos no Ceará e por todo o apoio e esforço conseguido para mim junto a Secretaria de Saúde do Ceará.

Ao Dr. Alvaro José Romanha por ter aberto as portas do Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular do CPqRR, permitindo a caracterização das cepas de tripanosomatídeos, e por nos ceder às cepas padrões.

Ao Dr. João Carlos Pinto Dias pelo exemplo de vida e dedicação a doença de Chagas. Pelas boas conversas, conselhos, agradável convívio e sugestões na revisão desta dissertação.

Ao Dr. Fernando Abad-Franch pela belíssima discussão, sugestões e críticas, o que enriqueceu muito esta dissertação.

Ao Dr. Marcos Horácio Pereira e Dr. Edelberto dos Santos Dias, pelas valiosas críticas e sugestões em minha qualificação.

Ao Dr. Nicolás Jaramillo pelas ajudas nas análises morfométricas.

À SUCEN-SP e ao Cláudio Casanova pela colaboração nos estudos de precipitina.

DIAS FBS Agradecimentos

A todos os moradores das localidades trabalhadas que permitiram a execução deste trabalho em suas propriedades. Pela gentileza, receptividade, simplicidade e pelos almoços diários.

Aos senhores Bonifácio, Bosco, Galego e José que mostraram ser fortes e guerreiros no manuseio da moto-serra e dissecção das palmeiras.

Ao Azevedo Quirino de Souza e Antônio Pereira. Dois grandes amigos que estiveram junto a mim durante quase todos os dias no campo. Por me socorrer nos momentos difíceis e pela agradável companhia nos finais de semana, sempre acompanhada de uma “Brahma” gelada.

Ao “grande” Antônio Lemos e ao Francisco Chagas pela ajuda árdua e diária nas coletas dos “procotós”.

A todos os funcionários da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará dos municípios de Crato e Juazeiro do Norte, pela agradável convivência durante três semanas que estive morando no alojamento da Secretaria.

Aos motoristas da Secretaria da Saúde do Ceará que estiveram longe de suas famílias permitindo a realização deste trabalho.

Ao IBAMA-ARARIPE em nome do prof. Jackson Antero, pelo apoio, dicas dos locais de coletas e constantes ajudas.

À Maria Inês Mascarenhas pela eficiência nas infinitas ajudas dos serviços de secretaria e formatação deste trabalho.

À Grasi e Thessa pela amizade e por ceder espaço do seu valioso tempo cuidando das minhas colônias nos períodos em que estive ausente.

Aos amigos do Laboratório de Triatomíneos: Ademilson, Alessandra, Alexandre Silva, Ana Vitta, Angélica, Auffy, Carlota, Denise, Diogo, Gina, Ivan, JP, Kelly,

ix DIAS FBS Agradecimentos

Letícia, Marcelo, Marcos, D. Maria, Raquel, Rita, Sílvia Basques, Sílvia Ermelinda, Theo e Violeta pelo convívio diário, amizade.

Aos amigos do Laboratório de Entomologia Médica: Ana Bahia, Carol’s, Bruno, Gustavo, Lili, Lú, Nágila, Paulo, Rafa e Tati pela amizade e pela companhia nas “cervejadas” durante a semana.

À Pós-Graduação do CPqRR, especialmente à Cris, Neyde, Andréa, Dra. Virgínia Schall e Dra. Cristiana Brito

À Ana Carolina Lustosa pelas ajudas nas análises estatísticas.

Aos meus pais, Marco Aurélio e Maria Helena, e irmãos, Maurício, Rodrigo e Cristiane, por tudo!

À vovó Inhá, pelas constantes orações.

À FAPEMIG, CNPq e CPqRR, pelo apoio financeiro.

E a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para a concretização deste trabalho.

Muito obrigado!!

FERNANDO BRAGA

x DIAS FBS Agradecimentos

RESUMO

xi DIAS FBS Resumo

Considera-se que Rhodnius nasutus Stål, 1859 seja um triatomíneo restrito ao domínio da caatinga. Entretanto, seus limites não estão bem reconhecidos. O objetivo do presente trabalho foi identificar qual espécie de triatomíneo ocorre ao sul do estado do Ceará, nas palmeiras da Chapada do Araripe, Brasil e sua importância na transmissão local pelo Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. Embora esteja incluída no contexto da caatinga, esta região é considerada uma área com vegetação mista de cerrado e Mata Atlântica. Sendo as diversas espécies de palmeiras relatadas como ecótopo para triatomíneos do gênero Rhodnius, foram trabalhadas cinco espécies de palmeiras, num total de 10 exemplares para cada espécie, a saber: babaçu (Attalea speciosa), buriti (Mauritia flexuosa), carnaúba (Copernicia prunifera), catolé (Syagrus oleracea) e macaúba-barriguda (Acrocomia intumescens). A única espécie de triatomíneo encontrada foi R. nasutus, e o índice de infestação global foi de 86%. No Ceará, esta espécie tem sido encontrada freqüentemente no peridomicílio e intradomicílio, demonstrando significativa importância na DC. O índice de infecção encontrado pelo Trypanosoma cruzi foi de 16,8% e, pela primeira vez na literatura, relatamos a ocorrência do Trypanosoma rangeli no estado do Ceará, com índice de infecção natural de 7,7%, nos insetos analisados. Os tripanosomatídeos foram caracterizados molecularmente, confirmando os achados microscópicos, sendo as cepas de T. cruzi pertencentes ao grupo I, característico de cepas circulantes do ambiente silvestre. Estudos da reação de precipitina sugerem que as principais fontes alimentares do R. nasutus são ave e gambá. As árvores UPGMA geradas pela análise morfométrica apontam o grupo de insetos dos buritis como o mais distante geneticamente, o que pode estar relacionado ao isolamento geográfico deste grupo de insetos aos demais. Nossos resultados associados aos enormes palmeirais encontrados na região da Chapada do Araripe fazem desta uma importante região endêmica da tripanosomíase americana silvestre.

xii DIAS FBS Agradecimentos

ABSTRACT DIAS FBS Abstract

Rhodnius nasutus Stål, 1859 is considered a triatomine restricted to “caatinga” regions. However, their occurrence restrictions are still unknown. The purpose of this work was to identify which triatomine species occurs in the south of Ceará state, in palm trees of Chapada do Araripe, Brazil and its importance in the local transmission of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. In spite of being included in the “caatinga” environment, this region is considered an area with a mixed vegetation of “cerrado” and “Mata Atlântica” (Atlantic Forest). As the most diverse species of palm trees are reported as ecotopes for triatomines from the genus Rhodnius, were studied five species of palm trees, with a total of 10 specimens of each species, as follows: “babaçu” (Attalea speciosa), “buriti” (Mauritia flexuosa), “carnaúba” (Copernicia prunifera), “catolé” (Syagrus oleracea) and “macaúba-barriguda” (Acrocomia intumescens). The only triatomine species found was R. nasutus, and a global infestation rate was 86%. In Ceará, this species has often been found in the peridomicile and intradomicile, playing a significant role in Chagas disease. Trypanosoma cruzi’s infection rate was 16.8% and, for the first time in the literature, Trypanosoma rangeli was reported to occur in the state of Ceará, with a natural infection rate of 7.7%, in the insects analyzed. Trypanosomatids were molecularly characterized, corroborating microscopic findings, with T. cruzi strains belonging to group I, characteristic of circulating strains from a sylvatic environment. Studies on precipitin reaction suggest that the most important food resources of R. nasutus are birds and opossums. UPGMA trees generated by morphometric analysis point to a group of insects of “buritis” as the most distant ones, which may be related to the geographic isolation of this group of insects compared to the other ones. Our results associated with large areas of palm trees found in the region of Chapada do Araripe make this an important endemic region of sylvatic American trypanosomiasis.

xiv

LISTA DE ABREVEATURAS

APA – Área de Preservação Ambiental ºC – Grau Celsius cm - centímetro DC – doença de Chagas DNA – Ácido desoxiribonucleico dNTP – Deoxinucleotídeos trifosfatos FLONA – Floresta Nacional g – força da gravidade M – moles mM - milimolar µl – microlitro GPS – Global Positioning System IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Nacionais Renováveis KCl – Cloreto de Potássio LIT – Liver infusion tryptose

MgCl2 – Cloreto de Magnésio min - minuto NaOH – Hidróxido de Sódio nm - nanômetro pb – pares de bases PCDCh – Programa de Controle da Doença de Chagas PCR – Reação em Cadeia da Polimerase RAPD - Random amplified polymorphic DNA seg - segundo Taq – Thermus aquaticus Tris – Tris (hidroximetil) amino metano U - unidade UR – umidade relativa V – volt v/v – volume por volume

LISTA DE FIGURAS

1. Distribuição geográfica dos países endêmicos para a doença de Chagas 22

2. Mapas com a distribuição de triatomíneos no Brasil 28

3. Localização das bacias hidrográficas brasileiras 32

4. Mapas de distribuição de espécies de palmeiras 33

5. Carnaúba (Copernicia prunifera) 34

6. Macaúba-barriguda (Acrocomia intumescens) 35

7. Babaçu (Attalea speciosa) 35

8. Buriti (Mauritia flexuosa) 36

9. Catolé (Syagrus oleracea) 36

10. Mapa político do estado do Ceará 42

11. Mapa esquemático da região da Chapada do Araripe 43

Vista dorsal da asa de um triatomíneo adulto mostrando os pontos de 12. 53 referência utilizados na morfometria

13. Fêmeas de R. nasutus procedentes das palmeiras da Chapada do Araripe 58

Gráfico da densidade populacional de triatomíneos por estádio evolutivo e 14. 60 espécie de palmeira

15. Gráfico da densidade populacional de triatomíneos por espécie de palmeira 60

16. Amplificação via PCR para caracterização das cepas de T. cruzi e T. rangeli 64

17. Formas evolutivas de Trypanosoma. cruzi e T. rangeli em meio de cultura LIT 65

Gráfico representativo da temperatura na axila foliar das cinco espécies de 18. 70 palmeiras e temperatura do ambiente

19. Fauna associada as palmeiras da Chapada do Araripe, Brasil 72

20. Distribuição dos R. nasutus analisados em relação ao Tamanho Centróide 73

21. Mapa fatorial da análise discriminante 75

22. Árvore UPGMA obtida a partir das distâncias de Mahalanobis 76

23. Árvore UPGMA obtida a partir das distâncias Euclidianas 76

xvi

LISTA DE TABELAS

Condições estabelecidas para a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) nos 1. 49 estudos da variabilidade do gene de mini-exon do Trypanosoma cruzi Condições estabelecidas para a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) nos 2. 50 estudos da variabilidade do gene de mini-exon do Trypanosoma rangeli

3. Dados de infestação de triatomíneos por espécie de palmeira 57

Quantidade de triatomíneos coletados de acordo com estádio evolutivo e 4. 59 espécie de palmeira

Diferenças estatísticas encontradas entre as cinco espécies de palmeiras 5. 61 pesquisadas com relação à densidade triatomínica

Número de palmeiras infestadas, triatomíneos capturados, examinados, 6. infectados com tripanosomatídeos, e percentual de infecção, por espécie de 62 palmeira

Origem e caracterização molecular das cepas isoladas de T. cruzi e de T. 7. 66 rangeli

8. Fonte alimentar identificada pela reação de precipitina em Rhodnius nasutus 68

9. Dados microclimáticos das palmeiras da Chapada do Araripe e do ambiente 69

Freqüência das fontes alimentares observadas nas diferentes espécies de 10. 73 palmeiras

Diferenças estatísticas encontradas em relação ao tamanho centróide nas 11. 78 análises morfométricas.

xvii

ÍNDICE

Lista de Abreveaturas xv

Lista de Figuras xvi

Lista de Tabelas xviii

1-Introdução 21

1.1 – Doença de Chagas 22

1.2 – Vetores da doença de Chagas 24

1.2.1 – Sistemática e Evolução 24

1.2.2 – Ecótopos de Rhodnius 25

1.2.3 – Trypanosoma rangeli e linhagens de Trypanosoma cruzi 25

1.2.4 – Taxonomia de Rhodnius 26

1.2.5 – Ecologia de Rhodnius nasutus e Rhodnius neglectus 27

1.3 – Área de estudo 31

2-Objetivos 38

2.1 – Objetivo geral 39

2.2 – Objetivos específicos 39

3-Metodologia 40

3.1 – Procedência e coleta dos triatomíneos 41

3.2 – Manutenção das colônias 45

3.3 – Exame dos triatomíneos 46

3.4 – Cultivo de tripanosomatídeos 47

3.5 – Caracterização molecular das cepas de tripanosomatídeos 48

3.6 – Reação de Precipitina 51

3.7 – Caracterização microclimática das palmeiras 52

3.8 – Morfometria geométrica 53

3.9 – Análises estatísticas 55

4 – Resultados 56

xviii

4.1 – Infestação das Palmeiras 57 4.2 – Densidade Populacional 58 4.3 – Exame de triatomíneos / índice de infecção por tripanosomatídeos 62 4.4 – Caracterização molecular das cepas de tripanosomatídeos 63 4.5 – Reação de precipitina 67 4.6 – Microclima 69 4.7 – Fauna associada aos triatomíneos nas palmeiras 71 4.8 – Morfometria geométrica das asas 73

5 – Discussão 77 Doença de Chagas no Ceará 78 Métodos de coleta dos triatomíneos 79 Variação cromática em R. nasutus 80 Palmeiras como ecótopos para R. nasutus 81 Preferências alimentares dos triatomíneos 86 T. cruzi e T. rangeli 87 Morfometria 89 Consideração Epidemiológica 90

6 – Conclusões 91

7 – Referências Bibliográficas 94

9 – Anexos 107

9.1 – Autorização do IBAMA para derrubada das palmeiras 108

9.2 – Autorização do IBAMA para coleta e transporte de triatomíneos 109

9.3 – Ficha de campo utilizada na coleta dos triatomíneos 110

9.4 – Protocolo utilizado para a extração do DNA genômico dos 111 tripanosomatídeos pela técnica de fenol-clorofórmio álcool-isoamílico

9.5 – Soluções utilizadas em géis de poliacrilamida 112

9.6 –Dados do PCDCh dos municípios trabalhados da Chapada do Araripe,Ceará. 113

9.7 – Manuscrito aceito para publicação 119

xix DIAS FBS Agradecimentos

1. INTRODUÇÃO DIAS FBS Introdução

1.1. DOENÇA DE CHAGAS

A doença de Chagas (DC), também conhecida como Tripanossomíase Americana, é considerada a mais importante infecção parasitária na América Latina em termos de impacto econômico e social (World Bank, 1993), e um dos principais problemas de saúde pública no continente Americano (WHO, 2003). Primitivamente, a DC era considerada uma enzootia, e a medida em que o homem entrou em contato com os focos naturais da doença e modificou o ambiente, passou a ser considerada uma zoonose (Barretto, 1979). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (2003), trata-se de uma doença tropical infecciosa que acomete cerca de 11 milhões de pessoas, e aproximadamente 100 milhões de pessoas vivem em área de risco, podendo se infectar com o agente etiológico da DC, o Trypanosoma cruzi Chagas, 1909, um protozoário flagelado pertencente à ordem Kinetoplastidae e família Trypanosomatidae. No Brasil, estima-se que aproximadamente quatro milhões de pessoas estejam infectadas pelo protozoário (Dias, 2000). Esta doença possui uma ampla distribuição geográfica, sendo encontrados os seus vetores desde os Estados Unidos até o sul da Argentina (Lent & Wygodzinsky, 1979) (figura 1).

Figura 1: Distribuição geográfica dos países endêmicos para a doença de Chagas. Fonte: OMS, 1996.

22 DIAS FBS Introdução

A DC é caracterizada por um quadro clínico agudo sintomático ou assintomático que tende a evoluir ao quadro crônico. Na fase crônica da doença, indivíduos infectados podem continuar a apresentar a forma indeterminada (assintomática), ou desenvolver sintomas, caracterizando as formas cardíacas, digestivas (megacólon e/ou megaesôfago) ou até mesmo a forma nervosa. Dois ou mais tipos destas formas podem ocorrer em um mesmo indivíduo (Ferreira et al, 1997). Vários são os mecanismos de transmissão da DC. A principal forma de transmissão é a vetorial, sendo responsável aproximadamente por 80% dos casos da doença de humanos (Dias, 1987; Schofield, 1994). Entretanto, outras vias de infecção são relatadas, como a transfusional, congênita, transplantes de órgãos, ingestão de substância infectada e acidentes laboratoriais (Moncayo, 1992; Schofield, 1994; Dias, 1987). Ainda não há vacina nem tratamento específico e eficaz para a DC. Atualmente, o Benzonidazol (Rochagan®) e o Nifurtimox (Lampit®) são as drogas de escolha no tratamento da doença. Nos casos agudos da doença, estas drogas levam à cura parasitológica de mais de 80% dos pacientes tratados, entretanto, sua eficácia varia de acordo com a área geográfica, provavelmente, devido às diferenças de suscetibilidade das diferentes cepas de T. cruzi às drogas. Nos estágios crônicos da doença, no entanto, há uma limitação da eficácia destes medicamentos por possuírem elevados efeitos tóxicos ao paciente, o que pode acarretar a interrupção do tratamento. A suscetibilidade das diferentes cepas de T. cruzi a estas drogas também é apontada como um fator limitante para a cura da DC nos estágios crônicos (Urbina & Docampo, 2003).

23 DIAS FBS Introdução

1.2. VETORES DA DOENÇA DE CHAGAS

1.2.1 Sistemática / Evolução Triatominae

Os vetores da DC são insetos pertencentes à família Reduviidae, subfamília Triatominae. Até o momento, seis tribos e 138 espécies de triatomíneos foram catalogadas (Galvão et al, 2003; Forero et al, 2004; Poinar, 2005; Galvão & Angulo, 2006; Costa, Argolo, Felix, 2006; Costa & Felix, 2007). A grande maioria destas espécies ocorre nas Américas. Os triatomíneos diferem dos demais insetos da família Reduviidae pelo seu hábito hematofágico obrigatório em todas as fases evolutivas, embora já tenha sido observado o exercício do canibalismo, do predatismo e do coprofagismo (Sherlock, 1979; Lent & Wygodzinsky, 1979; Salvatella et al, 1994). Evolutivamente, acredita-se que a hematofagia dos triatomíneos seja um evento recente e tenha se derivado a partir de diferentes reduviídeos predadores, através de uma série de mudanças morfológicas, fisiológicas, comportamentais e demográficas, sendo assim, um grupo polifilético. (Schofield, 1994). Lent & Wygodzinsky (1979) a partir de dados morfológicos comparados a outros hemípteros, propõem como monofilética a subfamília Triatominae. Estudo utilizando análise cladística de triatomíneos, Paula et al. (2005), analisando os fragmentos 16S de rDNA, concluem como polifilética a subfamília Triatominae, mas os autores chamam a atenção para a importância do grupo externo, que poderá definir e alterar o resultado da análise. Assim sendo, a sistemática filogenética da subfamília Triatominae ainda não foi totalmente esclarecida.

24 DIAS FBS Introdução

1.2.2. Ecótopos de Rhodnius

Três são os principais gêneros de triatomíneos de importância epidemiológica: Triatoma Laporte, 1832, Panstrongylus Berg, 1879 e Rhodnius Stål, 1859. Os triatomíneos abrigam os mais diversos ecótopos, como palmeiras, tocas de animais, ocos de árvores, fendas sob rochas, locas de pedras, ninhos de aves, bromélias epífitas, dentre outros (Lent & Wygodzinsky, 1979). No caso de Rhodnius, diversos autores (Gamboa, 1961; Pifano, 1973; Barretto, 1979; Lent & Wygodzinsky, 1979; Diotaiuti & Dias, 1984; Romaña et al., 1999; Teixeira et al., 2001; Abad-Franch et al., 2001; Gurgel-Gonçalves et al., 2004a; Gurgel-Gonçalves et al., 2004b) têm relatado as palmeiras como ecótopo natural destes triatomíneos. Estima-se que o microclima tenha papel importante para o estabelecimento de uma estável relação Rhodnius / palmeira (Lorenzo et al., 2003), talvez com relevante impacto no processo de adaptação das espécies deste gênero às diferentes palmeiras (Diotaiuti et al., 2005).

1.2.3. Trypanosoma rangeli e linhagens de Trypanosoma cruzi

Os triatomíneos também são vetores de um outro tripanosomatídeo, o Trypanosoma rangeli Tejera, 1920, principalmente espécies pertencentes ao gênero Rhodnius (D’Alessandro & Hincapie, 1986). O único relato de infecção natural por T. rangeli, inclusive em glândulas salivares, por triatomíneos de outros gêneros foi em Triatoma dimidiata Latreille, 1811 (D’Alessandro & Saraiva, 1992). Relatos sobre infecção natural de Rhodnius por T. rangeli já foram descritas em várias regiões do Brasil e outros países da América Latina (Barrett & Oliveira, 1977; D’Alessandro & Hincapie, 1986; Diotaiuti et al., 1992; Ramirez et al., 1998; Feliciangeli et al., 2002; Urrea et al., 2005; Calzada et al., 2006). No Brasil, T. rangeli foi descrito pela primeira vez por Deane (1958) em Didelphis marsupialis, no Estado do Pará. Sua ocorrência também já foi assinalada no Estado da Bahia, em R. domesticus Neiva & Pinto (1923); no Estado do Amazonas, Santa Catarina e Minas Gerais (Barrett & Oliveira, 1977; Miles et al., 1983; Steindel et al., 1991; Ramirez et al., 1998). O T. rangeli é

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transmitido ao hospedeiro vertebrado através da saliva dos triatomíneos infectados, no momento do repasto sangüíneo. Nestes animais, o T. rangeli não é patogênico, apresentando parasitemia baixa e de curta duração. A distribuição do T. rangeli muitas vezes sobrepõe-se geograficamente com T. cruzi, permitindo a ocorrência de infecções simples ou mistas tanto em hospedeiros vertebrados, quanto nos triatomíneos (D’Alessandro, 1976). Em ensaios sorológicos, devido às semelhanças antigênicas entre T. cruzi e T. rangeli, podem apresentar reação cruzada (Grisard et al., 1999). Como diagnóstico diferencial, a técnica da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é recomendada devido a sua especificidade e sensibilidade (Grisard et al., 1999). Utilizando a técnica da PCR a partir da análise do gene do mini-exon, Souto et al (1996) conseguiram separar duas principais linhagens filogenéticas de T. cruzi que posteriormente foram denominadas T cruzi I, associada ao ciclo silvestre e T. cruzi II, associada ao ciclo doméstico (Anonymous, 1999).

1.2.4. Taxonomia de Rhodnius

Devido às grandes semelhanças morfológicas existentes entre espécies do gênero Rhodnius, a taxonomia deste gênero é bastante discutida por diversos autores, principalmente entre R. prolixus e R. robustus Larrousse, 1927, devido ao fato de ocorrer em áreas de simpatria e semelhança no padrão cromático. Este fato levou Barrett (1988) a agrupá-las, juntamente com R. nasutus e R. neglectus, em um complexo de espécies denominado “Complexo R. prolixus”. No entanto, várias ferramentas têm sido empregadas com êxito na diferenciação das espécies deste complexo, como morfologia geral (Lent & Wygodizinsky, 1979), morfometria (Harry, 1994) morfologia da genitália masculina (Lent & Jurberg, 1969; Harry, 1993), estudo bioquímico de isoenzimas (Solano et al., 1996), estudo protéico da saliva (Soares et al., 2000), estudos citogenéticos (Schereiber et al., 1972; Perez et al., 1992; Panzera et al., 1996) e moleculares, como RAPD (Garcia et al., 1998). No entanto, a grande dificuldade taxonômica do grupo refere-se à diferenciação

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entre R. robustus e R. prolixus. Isto é devido às grandes semelhanças cromáticas e sobreposição de áreas de distribuição geográfica, coincidentes com florestas tropicais e subtropicais úmidas, apesar de R. prolixus ocorrer nos limites mais ao norte e R. robustus estender-se para áreas amazônicas mais ao sul (Schofield & Dujardin, 1999). Monteiro et al. (2003) analisaram seqüências de DNA mitocondrial (mtDNA) de 12 populações de R. prolixus e 14 populações de R. robustus, inclusive espécimes de R. robustus procedentes das localidades muito próxima às localidades tipo (local de descrição da espécie por Larousse, na Amazônia brasileira, próximo a foz do rio Tefé, e na região de Cayenne, Guiana Francesa). Apesar da grande controvérsia taxonômica entre estas duas espécies, foi possível verificar que R. prolixus e R. robustus são espécies distintas. R. prolixus mostrou ser uma espécie monofilética enquanto os espécimes de R. robustus analisados da região Amazônica formaram três clados na árvore filogenética devido às diferenças nas seqüências do mDNA, constituindo um grupo parafilético (Monteiro et al, 2003).

1.2.5. Ecologia de R. nasutus e R. neglectus

Muitas espécies de aves que habitam palmeiras concomitantemente com os triatomíneos atuam como agentes dispersores de ovos, ninfas, e até mesmo o inseto adulto (Lent & Wygodzinsky, 1979). Espécies do gênero Rhodnius também podem ser capazes de colonizar o ambiente artificial. Rhodnius prolixus Stål, 1859 é o principal vetor da doença de Chagas na Colômbia, Venezuela e alguns países da América Central (Schofield, 1994). Outras espécies de importância epidemiológica secundária (Silveira & Rezende, 1994), como o Rhodnius nasutus Stål, 1859 e R. neglectus têm sua presença constante no ambiente artificial, especialmente no peridomicílio (Alencar, 1987). Segundo Carcavallo et al (1998), Lent & Wygodzinsky (1979) e Schofield (1994), o R. neglectus é uma espécie com distribuição geográfica coincidente à área de cerrado no Brasil, e o R. nasutus à caatinga (figura 2).

27 DIAS FBS Introdução

Figura 2: Mapas mostrando a distribuição de triatomíneos no Brasil. (A) R. nasutus; (B) R. neglectus, segundo Carcavallo et al., 1998.

R. neglectus é uma espécie de triatomíneo com ampla distribuição geográfica, abrangendo no Brasil os Estados da Bahia, Goiás, Mato Grosso, Maranhão, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco e São Paulo (Galvão et al, 2003). Geralmente são encontrados em babaçus (Attalea speciosa Mart. ex. Spreng.), macaubeiras (Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart.), buritis (Mauritia flexuosa L.f.) e ariruris (Attalea butyracea Mutis ex L.f.) (Diotaiuti & Dias, 1984; Diotaiuti et al, dados não publicados). Às vezes estão associados a ninhos de aves (Barretto, 1979). É um importante vetor do T. cruzi, pois tem sido encontrado naturalmente infectado no ambiente silvestre, no peridomicílio e no intradomicílio (Lent & Wygodzinsky, 1979; Barretto, 1979; Diotaiuti & Dias, 1984; Teixeira et al., 2001; Gurgel-Gonçalves et al., 2004b). No Estado do Maranhão, Teixeira et al. (2001) admitem a hipótese de R. neglectus deixarem as palmeiras à noite, atraídos pelas luzes dos domicílios, para exercerem a hematofagia e em seguida retornarem às palmeiras. Segundo estes mesmos autores, entretanto, esta observação necessita maiores investigações. Este comportamento dos triatomíneos já foi confirmado para R. brethesi Matta, 1919 na região amazônica por Coura et al (1994) e

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parece também ser usual de R. robustus na Amazônia Equatoriana (Aguilar et al., 1999) e de R. nasutus no Ceará (Sarquis et al, 2004) A infestação de palmeiras do cerrado por R. neglectus foi extensamente estudada por Barretto (1979) nos estados de Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais e São Paulo, estando associada, principalmente, à palmeira babaçu, buriti, macaúba (Acrocomia sclerocarpa Mart.) e aricuris. Sua distribuição atinge limites ao norte de Tocantins (Diotaiuti, Silveira, Elias, 1984), alcançando Paço do Lumiar, situada na Ilha de São Luis, Maranhão (Teixeira et al., 2001), provavelmente seguindo a rota dos grandes palmeirais originados na região do Bico de Papagaio, Tocantins (Diotaiuti et al.,1985). Recentemente, inserido no contexto da caatinga, mas a uma altitude de 500-800 metros, foi observada a infestação de R. nasutus em babaçus que ocorrem na Serra de Meruoca, norte do Ceará, região de maior umidade, considerada como remanescentes da Mata Atlântica do período que havia continuidade entre a mesma e a Amazônia (Cavalcante, 2005). Muito proximamente, e separada quase que apenas pela altitude, encontram-se a 90 metros de altitude grandes carnaubais da caatinga, também infestados pelo R. nasutus. Neste estudo, o impacto das características de cada palmeira sobre a população de triatomíneo ficou muito evidenciado pela diferença de tamanho dos insetos, muito maiores nos que procediam de babaçus (Diotaiuti et al., 2005). O cruzamento entre R. nasutus das carnaúbas e babaçus produziu indivíduos de tamanho intermediário, o que parece descartar que estas características tenham origem genética, mas sim, sejam influenciadas pelas condições ambientais (Dias et al., 2005). Em estudo realizado no estado do Ceará, Alencar (1987) encontrou seis principais espécies de triatomíneos, estando o R. nasutus incluído nesta lista, com constante presença no peridomicílio, associados a galinhas (Gallus gallus) e gato (Felis catus), como revelam os resultados da reação de precipitina aplicada para identificação das fontes alimentares utilizadas pelo triatomíneo. Segundo este mesmo autor, R. nasutus foi considerada a quarta espécie mais capturada no Ceará, presente em 35,5% dos municípios pesquisados, totalizando sua ocorrência em 50 municípios cearenses, incluindo Crato e Barbalha, cidades inseridas na região da Chapada do Araripe, objeto de estudo

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deste trabalho. Também foram encontrados espécimes naturalmente infectados pelo T. cruzi, demonstrando sua participação no ciclo de transmissão do parasito no ambiente artificial no Estado do Ceará. Ademais, não houve relato sobre a ocorrência de R. neglectus neste estudo. Estudo realizado em Jaguaruana, Ceará, município situado em áreas planas, pertencente ao domínio da caatinga, a única espécie de triatomíneo encontrada por Sarquis et al (2004), associada à carnaúba (Copernicia purnifera (Mill.) H.E. Moore)), a única espécie de palmeira da região, foi o R. nasutus, com índice de infecção pelo T. cruzi de 25%. Esta espécie também relatada habitando o peri e intradomicílio com índices de infecção de 30,6% (n = 62) e 100% (n = 2), respectivamente. Esses dados reforçam ainda mais a associação entre o R. nasutus e a palmeira carnaúba, e importância deste vetor na transmissão da tripanosomíase americana.

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1.3. ÁREA DE ESTUDO

A caatinga é um dos biomas brasileiros de que menos se dispõe de informações sobre os seus componentes e das relações entre eles (Nascimento & Nascimento, 1998). A Chapada do Araripe localiza-se entre os Estados do Ceará, Pernambuco e Piauí, região Nordeste brasileira. Trata-se de uma região morfogeográfica de aproximadamente 1.063.000 hectares, em continuidade com o Planalto Sertanejo e a Depressão Sertaneja. Grande parte de sua extensão é composta por área de preservação ambiental (APA), denominada APA-Araripe. É considerada uma região de transição cerrado/caatinga com vegetação arbórea aberta, apresentando elementos típicos de cerrado, Amazônia e Mata Atlântica. O uso das terras baseia-se na agricultura de subsistência, principalmente feijão, mandioca, milho e cana-de- açúcar. A Chapada do Araripe está localiza-se na Bacia Sedimentar do Araripe, um importante sítio paleontológico por apresentar registros fossilíferos do período Cretáceo (Bagnoli, 1998) A Chapada do Araripe é um divisor de águas das três grandes bacias hidrográficas do nordeste: bacia Jaguaribe, bacia do Rio São Francisco e do Rio Parnaíba (figura 3). Em sua porção leste e separada da APA Araripe, encontra-se a Floresta Nacional do Araripe (FLONA Araripe) com 38.262 hectares de mata basicamente secundária, altitudes variando entre 840 e 920m e classificada em cinco diferentes fisionomias: transição floresta úmida/cerrado, cerrado, floresta úmida degradada pelo fogo, floresta úmida semi-perenifólia e carrasco. Possui cerca de 307 fontes ou nascentes de águas, o que justifica elevada umidade e diversidade vegetacional na região (Bagnoli, 1998). O índice pluviométrico anual é aproximadamente de 920mm e a temperatura oscila entre 24ºC e 26ºC, com mínima no inverno (julho) entre 21ºC e 23ºC e máxima no verão (janeiro) entre 25ºC e 27ºC. A amplitude térmica anual é relativamente baixa na região. No município de Barbalha, a amplitude térmica anual é em torno de 3ºC (Costa et al, 1998).

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Figura 3: Localização das bacias hidrográficas brasileiras. Fonte: IBGE.

De acordo com Henderson, Galeano, Bernal (1995) e Lorenzi et al. (1996 e 2004) (figura 4) é provável encontrar na região da Chapada do Araripe as palmeiras macaúba, macaúba-barriguda (Acrocomia intumescens Drude), carnaúba, catolé ((Syagrus oleracea (Mart.) Becc.), buriti e babaçu, sendo a macaúba-barriguda desprovidas de qualquer informação referente a infestação por triatomíneos, na literatura. A região da Chapada do Araripe é formada por grandes palmeirais. Nas planícies aluviais, aliadas às altas temperaturas, encontra-se o habitat de preferência da carnaúba (figura 5). Entretanto, em altitudes mais elevadas (cerca de 700m) é constante a presença da macaúba- barriguda (figura 6), babaçu (figura 7), buriti (figura 8) e catolé (figura 9) sendo o catolé, uma palmeira indicadora de áreas mais secas, quando comparada às demais (Figueiredo et al, 1998).

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A B C

D E

Figura 4: Mapas de distribuição de espécies de palmeiras, segundo Lorenzi et al. (2004). A) babaçu; B) buriti; C) carnaúba; D) catolé e E) macaúba-barriguda.

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Figura 5: A) Grande concentração de carnaúbas (Copernicia prunifera) em regiões mais planas (aproximadamente 350m de altitude), município de Missão Velha-CE (foto do autor). B) Detalhe da axila foliar e das fibras da carnaúba mostrando a coloração avermelhada, semelhante à coloração do R. nasutus. No círculo, presença de ovos de triatomíneos. (foto: Francisco Cialdine Frota Carneiro).

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Figura 6: Macaúba-barriguda (Acrocomia intumescens), palmeira com distribuição em áreas mais serranas e sem dados sobre infestação por triatomíneos, município de Barbalha-CE (foto do autor).

Figura 7: Babaçu (Attalea speciosa), palmeira encontrada em regiões com altitude mais elevada, município de Barbalha-CE (foto do autor).

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Figura 8: Buriti (Mauritia flexuosa), palmeira de regiões com elevadas altitudes e solos pantanosos no município de Santana do Cariri-CE (foto do autor).

Figura 9: Catolé (Syagrus oleracea), palmeira com distribuição em regiões com altitudes mais elevadas. Município de Crato-CE (foto do autor).

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Os mapas de distribuição de R. neglectus e R. nasutus confeccionados por Carcavallo et al (1998), parecem ser complementares, cujos limites entre o sul do Ceará e Pernambuco, coincidem com a Chapada do Araripe. Muito pouco se conhece sobre os triatomíneos presentes na região, exceto pelas informações do Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh), que relatam o encontro de Rhodnius nas casas, identificado como R. nasutus. Seria realmente esta espécie presente na região, ou, devido às condições biogeográficas, existiria condições para a ocorrência de R. neglectus?

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2. OBJETIVOS

38 DIAS FBS Objetivos

2.1. OBJETIVO GERAL

Determinar as espécies de Rhodnius presentes em palmeiras na Chapada do Araripe, Brasil, e sua importância na transmissão silvestre do Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.2.1 Identificar as espécies de triatomíneos existentes em cinco espécies palmeiras na região da Chapada do Araripe, Brasil;

2.2.2 Determinar a taxa de infestação por Rhodnius em cinco espécies de palmeiras;

2.2.3 Determinar a densidade populacional de Rhodnius, em cinco espécies de palmeira, na referida região;

2.2.4 Determinar a taxa de infecção natural dos triatomíneos capturados pelo T. cruzi e T. rangeli;

2.2.5 Caracterizar molecularmente as cepas de tripanosomatídeos isoladas dos triatomíneos infectados;

2.2.6 Determinar as fontes de alimentação dos triatomíneos e suas possíveis fontes de infecção pelo T. cruzi;

2.2.7 Determinar o microclima na axila foliar das palmeiras;

2.2.8 Determinar a variabilidade genética entre as diferentes populações de Rhodnius através da morfometria geométrica das asas.

39 DIAS FBS Objetivos

3. METODOLOGIA

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3.1. PROCEDÊNCIA E COLETA DOS TRIATOMÍNEOS

Os triatomíneos estudados neste projeto foram procedentes de regiões inseridas na Chapada do Araripe, que se localiza geograficamente a sul do Estado do Ceará, noroeste de Pernambuco, e englobando também uma pequena porção leste do estado do Piauí. (figura 11). As coletas localizaram-se no Estado do Ceará, abrangendo os municípios de Barbalha (φ7°18’S λ38º55'W), Crato (φ7º 14'S λ39º24'W), Juazeiro do Norte (φ7°12’S λ39°18’W), Missão Velha (φ7°15’S λ39°08’W) e Santana do Cariri (φ7°11’S λ39°44W) (figura 10) fazendo parte da micro-região do Cariri.

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Figura 10: Mapa político do estado do Ceará. Ao sul do estado e em cinza, os municípios onde foram realizadas as coletas dos triatomíneos.

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Figura 11: Mapa esquemático da região da Chapada do Araripe (área verde). Fonte: IBAMA-CE.

As coletas dos triatomíneos foram realizadas no período de 14 de março a 06 de abril de 2006 com a participação de agentes da Secretaria da Saúde do Estado do Ceará (SESA-CE). A seleção das áreas trabalhadas foi determinada junto ao IBAMA- Araripe, de acordo com a ocorrência das espécies de palmeiras existentes nos municípios da região da Chapada do Araripe. As palmeiras foram identificadas de acordo com Lorenzi et al (1996, 2004) e Henderson, Galeano, Bernal (1995). O critério para a escolha dos exemplares de palmeiras trabalhados foi aleatório, mas evitou-se dissecar palmeiras que estavam muito próximas uma das outras. O critério do tamanho amostral (n = 50) foi baseado na disponibilidade de tempo e dos recursos financeiros. Os triatomíneos foram coletados através da derrubada das palmeiras, de acordo com Diotaiuti & Dias (1984), após autorização do IBAMA (anexos I e II). Cada palmeira foi identificada com um código e preenchida uma ficha de campo (anexo III), com data e horário da derrubada, condição climática local, espécie e tamanho da palmeira, fauna associada à palmeira, temperatura na axila foliar. Logo após a derrubada, as palmeiras eram dissecadas cortando-se na base da bainha foliar.

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Cada folha era retirada cuidadosamente e procurada minuciosamente a presença dos triatomíneos. Foram também realizadas buscas nas brácteas, cachos de cocos e caule. Todas as palmeiras foram referenciadas geograficamente com auxílio de um GPS (Global Positioning System). No campo, os insetos coletados foram acondicionados em potes de plástico e identificados com o código da palmeira, contendo em seu interior um suporte de papel em forma de sanfona para facilitar a movimentação dos insetos. No laboratório, todos os triatomíneos foram contabilizados por estádio evolutivo e sexo, por palmeira, para cálculo da densidade, taxas de infestação e colonização. A identificação das espécies capturadas foi realizada através das chaves de classificação propostas por Lent & Wygodzinsky (1979). Os triatomíneos capturados em cada espécie de palmeira constituíram uma colônia de estudo com um determinado código, totalizando cinco grupos. Definiu-se como palmeira positiva àquela que tivesse no mínimo um exemplar de triatomíneo, presença de exúvia, ou mesmo somente ovos.

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3.2. MANUTENÇÃO DE COLÔNIAS

A partir das coletas, foram estabelecidas cinco colônias de acordo com a espécie de palmeira, no Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas do Centro de Pesquisa René Rachou / FIOCRUZ (LATEC), em condições de temperatura e umidade semi-controladas (25ºC ± 1ºC; 60%± 10%UR). Os barbeiros foram acondicionados em frasco de polietileno devidamente identificado (aproximadamente 15cm de diâmetro e 20cm de altura), tendo ao fundo duas folhas de papel de filtro para a absorção das fezes e da urina produzidas pelos insetos. Um papel cartolina foi dobrado em forma de sanfona até a altura do frasco a fim de facilitar a movimentação e alimentação dos mesmos. A superfície do frasco foi vedada com pano de malha fina envolvida por esparadrapo e elásticos (gominhas). Cada colônia foi mantida separadamente por geração, e semanalmente, os triatomíneos eram alimentados em galinhas (Gallus gallus) imobilizadas. Da mesma forma, semanalmente, as colônias eram limpas para a retirada de exúvias e ovos, e separação das gerações. Os insetos de campo que morreram foram montados em alfinetes entomológicos, identificados e guardados como insetos de referência para coleção de triatomíneos do LATEC.

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3.3. EXAME DOS TRIATOMÍNEOS

Todos os triatomíneos coletados no campo e que chegaram vivos (n=26) no laboratório foram examinados quanto a presença de tripanosomatídeos. Este procedimento foi realizado através de exame parasitológico das fezes a fresco, através da técnica de compressão abdominal. As fezes dos triatomíneos foram diluídas em uma gota de solução salina 0,15M, colocadas sobre lâmina e lamínula e observadas em microscópio óptico de acordo com as objetivas disponíveis, sendo aumento de 400x, no laboratório da SESA-CE, e 160x, no LATEC. Esse procedimento foi realizado no laboratório da 20ª Regional da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará, no município de Crato, e no LATEC. Pelas limitações na estrutura do laboratório no Ceará, o exame da presença de T. rangeli na hemolinfa foi realizado somente no LATEC, pois o procedimento exige o isolamento imediato dos parasitos em meio de cultura e condições estéreis. Assim, somente os triatomíneos positivos ao exame do tubo digestivo e sobreviventes ao chegarem no LATEC, tiveram uma perna seccionada, e uma micro gota de hemolinfa (aproximadamente 10μl) foi colocada sobre lâmina e lamínula. O material foi visualizado em microscópio óptico, utilizando aumento de 160x. Os insetos com resultado negativo no tubo digestivo foram destinados à criação.

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3.4. CULTIVO DE TRIPANOSOMATÍDEOS

Os tripanosomatídeos foram isolados retirando-se o tubo digestivo e cultivados em meio de cultura. Para isso, 26 insetos que foram positivos para Trypanosoma, no exame das fezes ou na hemolinfa, tiveram a superfície externa desinfetadas com álcool 70% (v/v), e em seguida dissecados em capela de fluxo laminar, removendo-se o tubo digestivo e as glândulas salivares com auxílio de pinças e tesoura de dissecção estéreis. O material proveniente de cada inseto foi adicionado, individualmente, a 1ml de meio de cultura LIT (Liver Infusion Tryptose) (Camargo, 1964), em tubos de vidro com tampa de rosca. Posteriormente, o tubo digestivo foi macerado e transferido para tubos contendo meio ágar-sangue+LIT. Os tubos foram mantidos em estufa incubadora a 27,5ºC para multiplicação dos parasitos. Semanalmente, alíquotas das culturas foram examinadas em microscópio óptico (aumento 160x) e repicadas quando necessário. As amostras que apresentavam aproximadamente 109 parasitos/ml foram submetidas à centrifugação (1500x g por 10 minutos a 4ºC). O sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspendido em solução salina 0,15M. Este processo foi repetido três vezes, sendo o sedimento obtido após a última centrifugação criopreservado a –70ºC até a sua utilização para extração do DNA (Romanha, 1982). Alíquotas das cepas isoladas foram criopreservadas em nitrogênio líquido (-196ºC), de acordo com a técnica padronizada por Filardi & Brener (1975), utilizando como agente crioprotetor, o glicerol 10%, fazendo parte do banco de cepas do LATEC.

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3.5. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS CEPAS DE TRIPANOSOMATÍDEOS

A tipagem molecular foi baseada na amplificação de parte da região intergênica do gene de mini-exon do T. cruzi (Souto et al, 1996) e do T. rangeli (Grisard et al 1999), por meio da técnica da PCR, realizada em Termociclador modelo PTC-100™ (MJ Research, Inc. – Watertown, USA). O DNA dos parasitos foi extraído utilizando a técnica de fenol- clorofórmio-álcool isoamílico, de acordo com Steindel et al (1993) (anexo IV). A concentração de DNA foi determinada por meio de espectrofotômetro (Eppendorf Biophotometer– Hamburg, Germany), a 260nm de comprimento de onda, sendo o grau de pureza das amostras determinado pela relação da absorbância 260/280nm. Os produtos da PCR esperados apresentam 300pb para T. cruzi I, 350pb para T. cruzi II. Foram utilizados os iniciadores TCI - 5’-CCT GCA GGC ACA CGT GTG TGT G-3’ (específico para T. cruzi I), TCII - 5’-GTG TCC GCC ACC TCC TCC GGC CC-3’ (específico para T. cruzi II), TC - 5’-CCC CCC TCC CAG GCC ACA CTG-3’ (comum aos dois grupos) (Souto et al, 1996). Para T. rangeli o produto esperado apresenta 360pb, com os seguintes iniciadores: TrINT-1 - 5’-CGC CCA TTC GTT TGT CC-3’, TrINT-2 - 5’-TCC AGC GCC ATC ACT GAT C-3’ e TrINT-3 - 5’-AAG ATG AGG CGT GGC TCT G-3’ (Grisard et al, 1999). Todos iniciadores foram sintetizados pelo laboratório Alpha DNA (Montreal, Quebec, Canadá). Os reagentes usados na PCR foram: tampão de PCR (20mM Tris-HCl pH 8,4; 50mM KCl; 0,75mM MgCl2), 200µM dNTP, 2pmoles de cada iniciador e 0,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Carisbad, CA, USA) e 1µl de DNA molde, perfazendo volume total de 10µl/reação. As condições da PCR estão descritas nas tabelas I e II. Para a visualização dos produtos amplificados, 3µL da amostra amplificada foram diluídos em igual volume de tampão de amostra 6x (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% de xilenocianol e 15% de ficol) e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 8% em sistema de minigel (BIO-RAD), sendo posteriormente corados com nitrato de prata 0,2% (Souto et al., 1996).

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Como padrão de peso molecular, foi utilizado o DNA do bacteriófago ΦX174 digerido pela enzima de restrição Haell. Em todas as etapas, foram usadas cepas padrões como controles positivos. Para T. cruzi grupo II utilizou-se a cepa Y, isolada de uma paciente na fase aguda da doença de Chagas, via xenodiagnóstico (Pereira da Silva & Nussenzweig, 1953), e para T. cruzi grupo I, a cepa YuYu, isolada a partir de um exemplar de Triatoma infestans Klug, 1834 capturado na área rural do Vale do YuYu, município de Carinhanha, Bahia (Filard & Brener, 1975). Como controle positivo para T. rangeli, utilizou-se a cepa San Agustin isolada de um paciente chagásico colombiano (Tibayrenc et al, 1993). As amostras padrões encontram-se disponíveis no banco de cepas do Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular, FIOCRUZ/MG. Em todas as reações foi feito controle negativo sem adição do DNA molde.

Tabela I: Condições estabelecidas para a Reação em Cadeia da Polimerase nos estudos da variabilidade do gene de mini-exon do Trypanosoma cruzi (Souto et al, 1996) Temperatura de Temperatura de Temperatura de Ciclo anelamento dos desnaturação/tempo Extensão do DNA/tempo iniciadores/tempo 94ºC 5 min Primeiro 55ºC 30 seg 72ºC 30 seg 27 ciclos 94ºC 1 min 55ºC 30 seg 72ºC 30 seg seguintes 94ºC 1 min último ciclo 55ºC 30 seg 72ºC 10 min

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Tabela II: Condições estabelecidas para a Reação em Cadeia da Polimerase nos estudos da variabilidade do gene de mini-exon do Trypanosoma rangeli (Grisard, 1999). Temperatura de Temperatura de Temperatura de Ciclo anelamento dos desnaturação/tempo Extensão do DNA/tempo iniciadores/tempo 94ºC 10 min Primeiro 6 ciclos 94ºC 30 s 45ºC 2 min 72ºC 30 seg seguintes 26 ciclos 94ºC 30 s 50ºC 1 min 72ºC 30 seg seguintes Último Ciclo 50ºC 1 min 72ºC 5 min

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3.6. REAÇÃO DE PRECIPITINA

A fim de determinar o tipo de fonte alimentar dos triatomíneos, realizou- se a reação de precipitina em colaboração com a SUCEN-SP (Superintendência de Controle de Endemias do Estado de São Paulo). Os triatomíneos que morreram antes da realização do exame para constatação de tripanosomatídeos no tubo digestivo tiveram o conteúdo intestinal retirado e transferido para lâminas de papel de filtro. Para cada inseto foram anotados o estádio evolutivo e o código da palmeira de origem. Para os triatomíneos que já haviam sido examinados, o procedimento foi semelhante, porém sendo anotado também o resultado do exame parasitológico (positivo ou negativo). Os conteúdos intestinais, depois de secos, foram acondicionados dentro de sacos plásticos, individualmente, e mantidos em temperatura ambiente. Os testes de Reação de Precipitação em Tubo Capilar foram realizados segundo a técnica descrita por Siqueira (1960). Cada material foi testado com anti-soros de ave, cão, gambá, gato, humano, porco e roedor, produzidos em coelhos.

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3.7. CARACTERIZAÇÃO MICROCLIMÁTICA DAS PALMEIRAS

Em cada palmeira trabalhada, foram coletados dados instantâneos de temperatura. Para isto, logo após a derrubada, era introduzido um termômetro na axila da folha. Após cinco minutos, o termômetro era retirado e anotado seus valores na ficha de campo.

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3.8. MORFOMETRIA GEOMÉTRICA DAS ASAS

Para o estudo morfométrico, utilizaram-se 30 asas direitas de fêmeas e de machos provenientes de triatomíneos da geração F1, oriundas das cinco colônias estabelecidas a partir das coletas. As imagens das asas foram obtidas utilizando máquina fotográfica digital marca Sony, modelo FD Mavica Interpolated 1.6 megapixel Images, acoplada a ocular de um microscópio estereoscópio Zeiss, modelo Stemi SV 6 (Germany), aumento 8x. Para cada asa, foram utilizados oito pontos de referências (landmarks) na região membranosa do hemiélitro, todas realizadas pelo mesmo investigador (figura 12). As coordenadas foram geradas a partir do programa COO, versão 36 (Dujardin & Slice, 2006)

Figura 12: Vista dorsal de uma asa direita de R. nasutus. Os círculos e os números indicam os pontos de referências utilizados.

A comparação de tamanho entre os grupos foi obtida através do tamanho centróide, que é o estimador de tamanho isométrico e representa o ponto central do polígono formado pela junção dos pontos de referências. A análise do tamanho isométrico foi realizada através do programa MOG, versão 75 (Dujardin & Slice, 2006). A Análise Generalizada de Procrustes (AGP) é um algoritmo matemático que elimina os efeitos de escala, de orientação e de posição dos objetos, conseguindo quantificar as variações entre os pontos de referências correspondentes e busca o ajuste para a melhor sobreposição das

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configurações geométricas (Jaramillo & Dujardin, 2006). Esta análise foi realizada pelo programa MOG, versão 75 (Dujardin & Slice, 2006). É na AGP que são gerados os valores das variáveis de conformação (Partial Warps) e o tamanho centróide de cada indivíduo. A Análise dos Componentes Principais foi realizada através do programa COV, versão 46 (Dujardin & Slice, 2006), utilizando os dois primeiros componentes principais. Esta análise foi baseada na matriz das variáveis de conformação e onde se obteve as distâncias Euclidianas entre os grupos analisados. A partir destes resultados, verificou-se através da análise de variância multivariada (MANCOVA) se o resíduo alométrico foi igual entre os grupos e obtida uma árvore UPGMA dos grupos. A Análise Discriminante foi realizada com a utilização do programa PAD, versão 82 (Dujardin & Slice, 2006), tendo sido calculadas as distâncias de Mahalanobis entre as amostras, a partir das variáveis de conformação. A análise discriminante verificou também a reclassificação dos indivíduos entre os grupos. Uma árvore UPGMA foi gerada a partir das distâncias de Mahalanobis. Todos os programas utilizados nas análises morfométricas estão disponíveis em http://www.mpl.ird.fr/morphometrics.

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3.9. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

A densidade triatomínica foi testada estatisticamente através do teste não-paramétrico Kruskal-Wallis e Comparações Múltiplas de Dunn’s. As análises estatísticas foram realizadas através dos programas Minitab (versão 13) e/ou Graph Pad Prism (versão 3). Nos estudos morfométricos, a análise do tamanho centróide entre os grupos foi testada através do teste não paramétrico Mann-Whitney. Na análise discriminante, foi testada a significância estatística entre os grupos através de teste não paramétrico de permutação e correção de Bonferroni. Um teste de regressão linear múltipla foi realizado a fim de verificar a significância do resíduo alométrico na discriminação entre os grupos, utilizando os valores do primeiro fator canônico e o tamanho centróide (Jaramillo et al, 2002).

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4. RESULTADOS

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4.1. INFESTAÇÃO DAS PALMEIRAS

No período de 14/03/2006 a 06/04/2006 foram dissecadas cinco espécies de palmeiras, num total de 10 exemplares para cada espécie de palmeira, a saber: babaçu (Attalea speciosa), buriti (Mauritia flexuosa), carnaúba (Copernicia prunifera), catolé (Syagrus oleracea) e macaúba- barriguda (Acrocomia intumescens). A palmeira babaçu obteve um índice de infestação por triatomíneos de 100%, enquanto a macaúba-barriguda obteve índice de 70%. Buriti, carnaúba e catolé tiveram índice de infestação de 90%, 80% e 90%, respectivamente. A tabela III resume os dados de infestação das diferentes espécies de palmeiras. O tempo médio para a dissecção completa da copa das palmeiras variou de 35 minutos para as carnaúbas a 120 minutos para os babaçus. O tamanho das palmeiras foi mensurado, sendo a carnaúba a palmeira mais baixa, com 5 metros, enquanto as maiores palmeiras foram encontradas nos buritis, alcançando até 20 metros.

Tabela III: Valores absolutos e relativos de infestação de triatomíneos por espécie de palmeira. Infestação Palmeira / Espécie Valor absoluto Valor relativo babaçu (A. speciosa) 10/10 100% buriti (M. flexuosa) 09/10 90% carnaúba (C. prunifera) 08/10 80% catolé (S.oleracea) 09/10 90% macaúba-barriguda (A. intumescens) 07/10 70% Total 43/50 86%

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4.2. DENSIDADE POPULACIONAL

Foram coletados 521 triatomíneos, sendo 71 adultos e 450 ninfas, identificados morfologicamente como R. nasutus de acordo com Lent & Wygodzinsky (1979), com mediana de 4,0 triatomíneos/palmeira e 5,0 triatomíneos/palmeira infestada. Entretanto, os espécimes coletados nas carnaúbas apresentaram coloração típica de acordo com a descrição da espécie, enquanto os triatomíneos provenientes das outras espécies de palmeiras foram morfologicamente muito similares, apresentando coloração castanha por todo o corpo, porém diferente aos insetos das carnaúbas que apresentaram coloração avermelhada (figura 13).

Figura 13: Fêmeas de R. nasutus provenientes da geração parental coletados nas cinco espécies de palmeiras na região da Chapada do Araripe, Ceará, Brasil. a) babaçu; b) buriti; c) carnaúba; d) catolé e e) macaúba-barriguda.

Para cálculo da densidade populacional, os triatomíneos coletados no campo foram contabilizados por estádio evolutivo (tabela IV) (figuras 14 e 15). Babaçu foi a palmeira que apresentou maior densidade populacional, totalizando 224 triatomíneos e mediana de 19,0 barbeiros/palmeira positiva,

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enquanto buriti foi a palmeira com a menor densidade, totalizando 19 triatomíneos, e média aproximada de um barbeiro/palmeira positiva. Catolé foi a segunda palmeira com a maior densidade populacional, contabilizando 191 triatomíneos coletados (mediana de 11,5 triatomíneos/palmeira positiva), seguido da macaúba e carnaúba com 63 e 24 barbeiros, e mediana de 2,5 barbeiros/palmeira positiva (tabela IV). Do ponto de vista global, os estádios evolutivos mais freqüentes foram o quarto e o quinto estádios, com 161 e 146 triatomíneos, respectivamente. Em nenhuma palmeira estudada foram encontrados ovos viáveis, nem cascas de ovos de triatomíneos. Duas palmeiras (um exemplar de babaçu e outro catolé) apresentaram grande densidade triatomínica com 73 e 77 R. nasutus, respectivamente, o que aumentou consideravelmente os valores das medianas. Este fato pode ser explicado pela presença de um marsupial na palmeira de babaçu e pela existência de um ninho de bem-te-vi na palmeira catolé, ambos os animais habitando as palmeiras.

Tabela IV: Número de triatomíneos coletados de acordo com estádio evolutivo e espécie de palmeira Estádio Quantidade de triatomíneos / espécie de palmeira Total babaçu buriti carnaúba catolé macaúba evolutivo 1º estádio 03 zero 05 05 03 16 2º estádio 27 zero 02 01 02 32 3º estádio 50 03 01 15 26 95 4º estádio 63 08 01 68 21 161 5º estádio 51 06 04 82 03 146 fêmea 12 01 05 11 02 31 macho 18 01 06 09 06 40 Total (%) 224 (43,0) 19 (3,6) 24 (4,6) 191 (36,7) 63 (12,1) 521 (100,0) * med/Q1; Q3 19 (7; 28) 1 (1; 2,25) 2,5 (0,75; 4,25) 11,5 (6,25; 26,5) 2,5 (0,0; 9,5) 4 (0,0; 9,5) *Mediana / 1º quartil; 3º quartil.

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180

160 babaçu buriti 140 carnaúba catolé 120 macaúba todos os grupos* 100

20 Número de triatomíneos coletados coletados triatomíneos de Número

1st 2st 3st 4st 5st fêmea macho Estádios evolutivos Figura14: Gráfico representativo da densidade populacional de triatomíneos por estádio evolutivo e espécie de palmeira (st = estádio). *todos os grupos = triatomíneos coletados nas cinco espécies de palmeiras.

100

b, c 75

50 d coletados

Nº triatomíneos de 25

0 babaçu (a) buriti (b) carnaúba (c) catolé (d) macaúba (e) Espécie de palmeira

Figura 15: Gráfico representativo da densidade populacional de triatomíneos por espécie de palmeira. A linha horizontal em cada espécie de palmeira refere-se à mediana. As letras correspondem às diferenças estatísticas significativas (p< 0,05).

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Tabela V: Diferenças estatísticas encontradas entre as cinco espécies de palmeiras pesquisadas com relação à densidade triatomínica. Palmeira babaçu buriti carnaúba Catolé Macaúba babaçu

buriti p<0,01 carnaúba p<0,05 p>0,05 catolé p>0,05 p<0,05 p>0,05 macaúba p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 Teste estatístico utilizado: Kruskal-Wallis e comparações múltiplas de Dunns.

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4.3. EXAME DOS TRIATOMÍNEOS / ÍNDICE DE INFECÇÃO POR TRIPANOSOMATÍDEOS.

De 521 triatomíneos capturados, 382 barbeiros (77,3%) foram submetidos a exame de compressão abdominal para constatação de infecção quanto a presença de tripanosomatídeos. Destes 382 triatomíneos examinados, 64 estavam infectados, o que representa um índice de infecção de 16,8%. Os dados globais de captura, exame de triatomíneos, número de triatomíneos infectados e valor percentual de barbeiros infectados estão demonstrados na tabela VI. Apesar da baixa quantidade de triatomíneos examinados nas carnaúbas (n = 16) e nos buritis (n = 15), a única espécie de palmeira que não apresentou insetos infectados foi a carnaúba, enquanto babaçu apresentou o maior índice de triatomíneos infectados (21,5%). Parece, portanto, com relação à infecção por tripanosomatídeos, que as palmeiras analisadas neste estudo, estejam divididas em dois grupos: o primeiro constituído pelas palmeiras de babaçu e catolé com índices de infecção próximos a 20%, e outro grupo, pertencente às palmeiras de buriti, carnaúba e macaúba com índices de infecção variando de zero a 7%.

Tabela VI: Número de palmeiras infestadas, triatomíneos capturados, examinados, infectados com tripanosomatídeos, e percentual de infecção, por espécie de palmeira. Número palmeiras Triatomíneos Triatomíneos Triatomíneos Palmeira infestadas (%) capturados (%) examinados (%) infectados (%) Babaçu 10 (23,3) 224 (43,0) 144 (64,4) 31 (21,5) Buriti 9 (20,9) 19 (3,6) 15 (79,0) 1 (6,8) Carnaúba 8 (18,6) 24 (4,6) 16 (66,7) zero Catolé 9 (20,9) 191 (36,7) 148 (77,5) 29 (19,6) Macaúba 7 (16,3) 63 (12,1) 59 (93,7) 3 (5,0) Total 43 (100) 521 (100) 382 (73,3) 64 (16,8)

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4.4. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS CEPAS DE TRIPANOSOMATÍDEOS

Foram isoladas 26 cepas de tripanosomatídeos. Destas, 19 cepas foram caracterizadas molecularmente. Não foi possível a caracterização das cepas restantes (sete cepas) devido à contaminação por bactérias e/ou fungos. A tipagem molecular de todos os isolados foi compatível com T. cruzi pertencente ao grupo I (relativo ao ciclo silvestre da doença de Chagas), apresentando uma banda de 300pb. (figura 16a). Em dois isolados, um procedente de inseto capturado em palmeira buriti (cepa RN01) e outro proveniente de outro inseto capturado em catolé (cepa RN04), apresentaram uma banda com aproximadamente 203pb e duas outras bandas de menor intensidade com 244 e 265 pb, respectivamente (figura 16b), ratificando os achados morfológicos (figura 17), demonstrando, pela primeira vez, ocorrência de infecção mista pelo T.cruzi e T.rangeli neste vetor e nesta região (tabela VII). A denominação dos isolados foi baseada nos critérios estabelecidos em Reunião Satélite realizada em 1999 em ocasião da comemoração do 90o aniversário da descoberta da doença de Chagas (Anonymous, 1999). As cepas foram criopreservadas para estudos futuros.

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B PM CN 1 2 3 4 5 6 pb

A T. cruzi I 330pb T. cruzi II 300pb

PM CN 1 2 3 4 5 pb T. rangeli

310 - B 265pb 234 - 244pb

194 - 203pb

Figura 16: A) Amplificação via PCR, utilizando os iniciadores TC, TC I e TC II para caracterização de T. cruzi. PM – Padrão de peso molecular, CN – controle negativo da reação (sem adição de DNA), canaletas: 1 – cepa RN01; 2 – RN02; 3 – RN03; 4 – RN04; 5 – cepa YuYu (controle positivo, pertencente ao grupo T. cruzi I); 6 – cepa Y (controle positivo pertencente ao grupo T. cruzi II). B) Amplificação via PCR, utilizando os iniciadores TrINT 1, TrINT 2 e TrINT 3 para a caracterização de T. rangeli. PM – padrão de peso molecular, CN – Controle negativo da reação (sem adição de DNA), canaletas: 1 – cepa RN01; 2 – RN02; 3 – RN03; 4 – RN04; 5 –controle positivo da reação (cepa San Agustin). Géis de poliacrilamida a 8% corados pela prata.

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A’ 10μm A’’ 10μm

10μm B 10μm C D 10μm Figura 17: Tripanosomas de meio de cultura LIT, corados pela Giemsa, aumento 1000x. A) cepa RN01 isolada a partir de R. nasutus com infecção mista; A’) T. rangeli isolado da cepa RN01; A’’) T. cruzi isolado da cepa RN01; B) cepa San Agustin (controle positivo de T. rangeli); C) cepa Y (controle positivo de T. cuzi grupo II) e D) cepa YuYu (controle positivo de T. cruzi grupo I).

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Tabela VII: Origem e caracterização molecular das 19 amostras de Trypanosoma cruzi, das 2 amostras de T. rangeli isoladas e das amostras padrões utilizadas como controles positivos nas reações de PCR. Ciclo de Amostra Ecótopo Hospedeiro Mini exon Transmissão RNAS/BR/2006/RN01* buriti Silvestre Rhodnius nasutus 1 RNAS/BR/2006/RN02 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN03 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN04* catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN05 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN06 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN07 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN08 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN10 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN12 babaçu “ “ “ RNAS/BR/2006/RN15 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN17 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN18 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN20 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN21 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN22 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN23 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN24 catolé “ “ “ RNAS/BR/2006/RN25 catolé “ “ “ Homem, Y Domiciliar 2 fase aguda YuYu Silvestre Triatoma infestans 1 San Agustin (T. rangeli) Domiciliar Homem - *triatomíneos com infecção mista (presença de T. cruzi e T. rangeli).

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4.5. REAÇÃO DE PRECIPITINA

Foram testadas no total, 152 amostras do conteúdo do trato digestivo dos triatomíneos coletados em campo (106 triatomíneos procedentes dos babaçus; dois dos buritis; nove das carnaúbas; 25 dos catolés e 10 das macaúbas). As amostras foram testadas contra anti-soros de ave, cão, gambá, gato, humano, porco e roedor, os únicos disponíveis para este estudo na SUCEN-SP. A reação de precipitina foi reagente em 70 insetos (46,1%), sendo 20 R. nasutus reagentes para sangue de ave (13,2%) e 53 para sangue de gambá (34,9%) (tabela VIII). Apenas três exemplares alimentaram-se das duas fontes de alimentação reagentes. Dos triatomíneos procedentes das palmeiras babaçus, 26 insetos estavam infectados, sendo 18 destes reagentes para gambás, dois exemplares com material insuficiente para a reação e seis amostras não reagiram contra os anti-soros testados. Em relação aos triatomíneos oriundos dos catolés, quatro exemplares estavam infectados, sendo dois insetos com material insuficiente e dois não reagiram contra os anti-soros testados. Trinta triatomíneos não tinham conteúdo suficiente para avaliar a fonte alimentar e 52 insetos não reagiram a nenhum dos anti-soros testados. Sob o ponto de vista epidemiológico, o fato mais importante foi a ausência de reação das amostras testadas contra anti- soro humano.

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Tabela VIII: Fonte alimentar identificada pela reação de precipitina em R. nasutus, por espécie de palmeira e estádio evolutivo, coletados na região da Chapada do Araripe, Ceará. Palmeira Estádio Resultado Ave + Material Não Examinados/ Ave Gambá Gambá insuficiente reagente Reagente (%)

babaçu ninfas 2 1 14 5 5 106/53 (56,2%) adultos 3 zero 33 13 30 buriti ninfas zero zero zero zero zero 2/0 (0%) adultos zero zero zero zero 2 ninfas zero 1 3 zero zero carnaúba 9/5 (45%) adultos 1 zero zero 3 1

catolé ninfas 2 zero zero 1 1 25/9 (36%) adultos 7 zero zero 4 10 macaúba ninfas zero zero zero 3 1 10/3 (30%) adultos 2 1 zero 1 2 Total ninfas 4 2 17 9 7 152/70 (46,1%) adultos 13 1 33 21 45 Observação: Total de triatomíneos reagentes para: ave = 20 (6 ninfas e 14 adultos) e gambá = 53 (19 ninfas e 34 adultos).

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4.6. MICROCLIMA

O período das coletas (março e abril/2006) está incluído no período chuvoso da região. Dente as cidades trabalhadas, Missão Velha e Juazeiro do Norte correspondem aos únicos municípios com altitude de região de caatinga (Fernandes, 1994), sendo encontrada apenas a palmeira carnaúba. Os demais municípios estão inseridos em região serrana, com altitudes acima de 700 metros. Carnaúba foi a palmeira que apresentou temperatura média mais elevada na axila foliar com 30,1ºC (tabela IX). A temperatura da axila foliar dos babaçus e buritis apresentou microclima mais estável, com menor variação de temperatura, enquanto carnaúba e macaúba apresentaram a maior variação térmica (figura 18). A figura 18 apresenta os dados de temperatura das palmeiras. Todas as espécies foram capazes de amenizar a temperatura na axila foliar em relação à temperatura ambiente, favorecendo a colonização triatomínica nas palmeiras.

Tabela IX: Temperatura (ºC) medida em cada palmeira na axila foliar, após a derrubada e do ambiente. Temperatura Palmeira Axila foliar (X / DP)* Ambiente (X / DP)* babaçu 23,3 ± 0,5 27,4 ± 2,4 buriti 25,1 ± 0,9 26,9 ± 1,1 carnaúba 26,2 ± 1,5 30,1 ± 1,4 catolé 23,3 ± 1,1 25,4 ± 1,8 Macaúba-barriguda 24,2 ± 1,6 27,7 ± 2,8 Média geral 24,4 ± 1,6 27,5 ± 2,5 *X / DP = média e desvio padrão

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Ambiente (°C) Ambiente 25 Temperatura Axila foliar e 20 babaçu (a) buriti (b) carnaúba (c) catolé (d) macaúba (e) ambiente (f) Espécie de palmeira e Ambiente

Figura 18: Gráfico representativo da temperatura da axila foliar das cinco espécies de palmeiras e temperatura ambiente. A linha horizontal em cada espécie de palmeira refere-se a mediana das temperaturas.

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4.7. FAUNA ASSOCIADA AOS TRIATOMÍNEOS NAS PALMEIRAS

A tabela X apresenta os dados de ocorrência referente aos animais observados nas palmeiras durante a dissecção das mesmas, considerados como possíveis fontes de alimentação para os triatomíneos (figura 19). Foram observadas várias espécies de artrópodes (insetos e aracnídeos), como formigas, cupins, baratas, besouros, gafanhotos, outros Heteroptera, pseudoescopiões, centopéias, aranhas que não puderam ser identificadas Chamou a atenção a freqüência com que foram observadas aranhas caranguejeiras, e centopéias medindo cerca de 20 centímetros.

Tabela X: Freqüência absoluta das possíveis fontes de alimentação para os triatomíneos, observadas nas diferentes espécies de palmeiras*. ave ou palmeira anfíbio cobra gambá lagarto morcego Total indícios** babaçu 2 7 zero 1 5 2 17 buriti 2 4 1 zero 1 3 11 carnaúba zero 2 zero zero 3 1 6 catolé 1 3 zero zero 6 zero 10 macaúba 1 2 zero zero 3 1 7 Total 6 18 1 1 18 7 51 *10 palmeiras de cada espécie ** Presença de ninhos não habitados e/ou somente penas de aves.

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A B C

D E F

G H I Figura 19: Fauna associada aos triatomíneos nas diferentes espécies de palmeiras da Chapada do Araripe, Brasil.

A) Morcego capturado em um babaçu. B) Gambá (Didelphis albiventris) habitando um babaçu. Na seta, presença de um lagarto. C) Detalhe do gambá capturado com sua prole. D) Ninho com cinco filhotes de bem-te-vi (Pitangus sulphuratus) em uma carnaúba. E) Cobra-cipó que habitava um buriti. F) Aranha caranguejeira na folha de um buriti. G) Urubu em uma folha do babaçu H) Gafanhoto (Tropidacris cristata) que habitava uma palmeira carnaúba I) Perereca que habitava um buriti entre o pecíolo e a bainha foliar.

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4.8. MORFOMETRIA GEOMÉTRICA DAS ASAS

Embora tenha sido observado dimorfismo sexual em todas as populações (dados não mostrados), a análise morfométrica foi realizada utilizando juntamente, os machos e as fêmeas de cada grupo (figura 20). A análise do tamanho centróide demonstrou diferença estatística entre as populações (Kruskal-Wallis, p<0,01), sendo os insetos provenientes dos buritis maiores aos demais grupos, e os insetos procedentes dos babaçus menores (p< 0,05) (tabela XI).

macaúba

catolé

carnaúba

buriti

babaçu

Figura 20: Distribuição dos indivíduos analisados em relação ao Tamanho Centróide (CS). Os nomes das palmeiras indicam a origem dos R. nasutus analisados. Cada traço azul representa a asa direita de cada indivíduo. A linha central em cada box plot refere-se a mediana do tamanho centróide de cada grupo.

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Tabela XI: Diferenças estatísticas encontradas entre as cinco espécies de palmeiras pesquisadas em relação ao tamanho centróide. Os valores em negrito apontam as diferenças estatísticas significativas.

Palmeira babaçu buriti carnaúba catolé Macaúba babaçu

buriti p<0,01 carnaúba p<0,01 p<0,01 catolé p<0,01 p<0,01 p>0,05 macaúba p<0,05 p<0,01 p>0,05 p>0,05 Teste estatístico utilizado: Teste não paramétrico Mann-Whitney.

A análise discriminante (AD) das variáveis de conformação mostrou que a primeira variável canônica contribuiu com 55% da variação entre os grupos, e a segunda variável contribuiu com 29%, no entanto, não foi possível observar separação entre os grupos. Esta análise não conseguiu discriminar os grupos estudados (figura 21), demonstrando grande semelhança os grupos em relação à conformação, o que geralmente é esperado para estudos intrapopulacionais. A reclassificação baseada nas distâncias de Mahalanobis foi maior para os triatomíneos procedentes dos buritis (85%) e menor para os insetos da macaúba (38%).

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Figura 21: Mapa fatorial da análise discriminante. Os eixos CV1 e CV2 representam a primeira e a segunda variável de conformação (variável canônica), respectivamente. O nome das palmeiras refere-se aos grupos estudados. Cada ponto do gráfico representa um indivíduo.

Apesar da grande semelhança entre os grupos apontada pelo mapa fatorial da análise discriminante, tanto a árvore UPGMA criada a partir das distâncias de Mahalanobis (AD), quanto a árvore UPGMA das distâncias Euclidianas demonstram que os insetos procedentes dos buritis formaram o grupo mais isolado. Porém, estudos complementares, com a utilização de marcadores moleculares, serão necessários para a verificação e determinação das distâncias genéticas e das diferenças intrapopulacionais. Houve a formação de dois agrupamentos: um composto entre os insetos de babaçus com macaubeiras, e outro entre carnaúba e catolé. (figuras 22 e 23). As permutações múltiplas das distâncias de Mahalanobis demonstraram diferenças significativas entre todas as distâncias dos grupos (p< 0,005). Da mesma forma, as diferenças foram significativas entre as distâncias Euclidianas.

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Figura 22: Árvore UPGMA obtida a partir das distâncias de Mahalanobis das variáveis de conformação, derivadas da análise discriminante. Os nomes das palmeiras indicam a procedência das populações de R. nasutus estudadas.

Figura 23: Árvore UPGMA obtida a partir das distâncias Euclidianas das variáveis de conformação, derivadas da análise dos componentes principais comuns. Os nomes das palmeiras indicam a procedência das populações de R. nasutus estudadas.

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5. DISCUSSÃO

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DOENÇA DE CHAGAS NO CEARÁ

Durante algumas décadas, o Estado do Ceará foi muito estudado, abrangendo diferentes contextos que envolvem a doença de Chagas: infestação triatomínica no ambiente silvestre, peri e intra-domiciliar, infecção de mamíferos hospedeiros, inquéritos sorológicos da população e características sócio-ambientais (Alencar, 1987). Este autor encontrou seis espécies de triatomíneos nos municípios pesquisados: Triatoma brasiliensis Neiva, 1911, T. pseudomaculata Corrêa & Espínola, 1964, Panstrongylus megistus Burmeister, 1835, P. lutzi Neiva & Pinto, 1923, R. nasutus e Psammolestes tertius Lent & Jurberg, 1965. No município de Crato, Alencar (1987) estudando um pouco sobre a ecologia do R. nasutus, em babaçus e macaubeiras, encontrou este triatomíneo naturalmente infectado (índice de infecção 77,8%, n = 9) e associado com gambás e morcegos. Para este autor, apesar de R. nasutus não exercer papel na transmissão do T. cruzi ao homem, esta espécie está estritamente associado ao ambiente silvestre com os gambás e morcegos. A condição sócio-econômica de grande parte da população rural e as informações sobre a doença de Chagas e seus vetores eram precárias. As características das casas também eram muito precárias, que segundo Alencar (1987): “as características das casas são típicas de região pobre, sendo o piso e as paredes de barro batido ou ‘taipa’”. Esses fatores favoreceram a domiciliação triatomínica, com elevados índices de colonização no ambiente artificial (peri e intradomicílio). Inquéritos sorológicos realizados no período de 1942 a 1967 no Ceará demonstram que a taxa de positividade média dos municípios pesquisados era de 14,8%. Neste período, os dois municípios cearenses que apresentavam as mais elevadas taxas foram Crato, com 40,7%, seguido de Juazeiro do Norte, com 37,5% (Alencar, 1987). Embora o controle da transmissão vetorial da DC tenha sido institucionalizado em 1950 pelo Serviço Nacional de Malária, a sistematização e estruturação do controle ao nível nacional foram implantadas somente em 1975, com o criação do Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh) pela SUCAM (Superintendência de Campanhas em Saúde Pública). Nessa época, a área de risco vetorial englobava 36% do território nacional, em 18

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estados. Dentre as espécies de triatomíneos catalogadas no Brasil, cinco foram apontadas como tendo participação direta na transmissão domiciliar, sendo o T. brasiliensis, espécie autóctone da região Nordeste, considerado o principal vetor na região (Vinhaes & Dias, 2000). O PCDCh preconiza a borrifação das unidades domiciliares (UD’s) infestadas com inseticidas, tendo a infestação domiciliar diminuída gradativamente. A partir dos dados do PCDCh, Silveira, Feitosa, Borges (1984) catalogaram as espécies de triatomíneos capturadas no ambiente domiciliar de 1942 municípios brasileiros. Nesse período foram encontradas cinco espécies de triatomíneos no estado do Ceará, P. lutzi, P. megistus, R. nasutus, T. brasiliensis e T. pseudomaculata. Com exceção de Santana do Cariri, todos os outros municípios trabalhados no presente estudo foram notificadas quanto à presença do R. nasutus no intradomicílio, sendo esta espécie considerada por Alencar (1987) a quarta mais capturada no Ceará. Em todas as áreas trabalhadas neste projeto, após a coleta dos triatomíneos nas palmeiras, os insetos eram apresentados ao proprietário da localidade e grande parte da população local. Quase a totalidade desses moradores não reconheceu o R. nasutus, e não sabiam que esta espécie trata- se de um vetor da doença de Chagas, embora os dados do PCDCh demonstrem sua ocorrência no peridomicílio (entre 2003 e 2005). Nos últimos anos, na região da Chapada do Araripe, R. nasutus é considerada a segunda espécie mais capturada no peridomicílio, com presença também no intradomicílio, perdendo apenas para o T. pseudomaculata. Nas localidades trabalhadas, muitos moradores fizeram referência sobre o encontro dentro das casas de um único “procotó”, de coloração preta e de porte maior que, possivelmente, de acordo com as espécies de ocorrência no Ceará parece ser P.megistus.

MÉTODOS DE COLETA DOS TRIATOMÍNEOS

Recentemente, Sarquis et al (2004) trabalhando no município de Jaguaruana, região de caatinga no nordeste do Ceará, encontraram T.

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brasiliensis, T. pseudomaculata, R. nasutus e P. lutzi nos ambientes artificiais (peri e intradomicílio). Destas, somente o P. lutzi não foi notificado dentro das casas. A coleta dos triatomíneos no ambiente silvestre foi realizada com a utilização de armadilhas (Noireau et al, 2002), apenas na palmeira carnaúba, a única presente na região. Foram investigadas 523 palmeiras em quatro localidades (infestação de 24,9%) e a única espécie de triatomíneo encontrada nas carnaúbas foi o R. nasutus, com índice de infecção de 25%, entretanto o índice global de infecção do R. nasutus, incluindo todos os ecótopos analisados, foi de 27,2%. A presença constante do R. nasutus no peri e intradomicílio, juntamente com os dados do PCDCh, reforçam a possibilidade desta espécie ser considerada uma potencial vetora da doença de Chagas humana e entre os reservatórios silvestres.

VARIAÇÃO CROMÁTICA EM R. NASUTUS

A distribuição geográfica do R. nasutus é restrita à região Nordeste brasileira, englobando os Estados do Ceará, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte. (Lucena & Lima-Borba, 1977; Carcavallo et al, 1998; Galvão et al, 2003) Embora R. nasutus esteja incluído em um complexo de espécies, os espécimes coletados foram facilmente identificados através da morfologia, embora tenha sido observada ligeira variação cromática. Os triatomíneos coletados nas carnaúbas apresentaram coloração padrão de acordo com a descrição da espécie (avermelhada) (Lent & Wygodzinsky, 1979) enquanto os insetos das demais espécies de palmeiras apresentaram coloração castanha. Gaunt & Miles (2000) suspeitam que a variação no padrão de coloração dos triatomíneos, principalmente de algumas espécies do gênero Rhodnius, pode ser um indicativo da influência do habitat (espécie de palmeira) em relação aos triatomíneos. Nossas observações em campo corroboram com essa teoria, pois principalmente nas carnaúbas a coloração avermelhada dos R. nasutus (ninfas e adultos) é extremamente semelhante às fibras existentes na copa das palmeiras, ao caule e à base das folhas, possibilitando que R. nasutus se camufle nessas estruturas da palmeira (figura 5, página 34). Para

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as demais palmeiras de tronco e axilas foliares mais escuras, R. nasutus também apresentaram padrão mais escuro. R. nasutus é apontada por Abad-Franch et al (2005) como uma espécie especialista, associada apenas à palmeira carnaúba e ninhos de pássaros. No entanto, a partir do presente estudo, podemos incluir o R. nasutus juntamente com outras espécies do gênero (e.g. R. neglectus, R. pictipes Stål, 1872, R. prolixus, R. robustus), no grupo das espécies generalistas, pois foi encontrada nas cinco espécies de palmeiras pesquisadas na região da Chapada do Araripe, sendo a macaúba-barriguda sem nenhuma informação na literatura, até então, sobre infestação triatomínica.

PALMEIRAS COMO ECÓTOPO PARA R. NASUTUS

Cada espécie de palmeira apresenta uma arquitetura própria e representa um ecossistema muito peculiar. Entretanto, em todas as cinco espécies de palmeiras, a grande maioria dos triatomíneos foi capturada entre a bainha foliar e, às vezes, no início do pecíolo. Como um dos objetivos do presente trabalho foi determinar a densidade populacional entre as espécies de palmeiras, a metodologia utilizada através da dissecção das palmeiras e coleta manual dos triatomíneos foi a mais adequada, pois outras metodologias (coleta manual, sem dissecção, na copa das palmeiras ou utilização de armadilhas) podem não garantir a captura total da fauna triatomínica. Uma vez que os barbeiros encontram-se em locais de difícil acesso para a captura sem dissecção, utilizada por Gurgel-Gonçalves et al (2004a), e devido ao grande porte de algumas espécies de palmeiras, a utilização de armadilhas, como feito por Sarquis et al (2004), pode não atrair todos os triatomíneos. Somente recentemente algumas espécies de palmeiras em outras regiões do Ceará (Serra da Meruoca) estão sendo estudadas em relação à sua associação com triatomíneos do gênero Rhodnius onde destacam-se o babaçu em regiões serranas e a carnaúba na caatinga (Diotaiuti et al., 2005).

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Palmeiras do gênero Attalea já vêm sendo estudadas em várias regiões brasileiras e em outros países das Américas Central e do Sul, servindo como ecótopo para várias espécies de triatomíneos, principalmente do gênero Rhodnius (Barretto, 1979; Romana et al., 1999; Teixeira et al., 2001; Diotaiuti et al., 2005; Sanchez-Martin et al., 2006). Romaña et al (1999) investigando possíveis ecótopos silvestres de Rhodnius pallescens Barber, 1932 no Panamá, representados por cinco espécies de palmeiras, apontam a Attalea butyracea como o principal ecótopo deste triatomíneo na região, principalmente devido à alta densidade triatomínica encontrada nesta palmeira. No presente trabalho, babaçu foi a palmeira que obteve a maior infestação por R. nasutus, maior densidade triatomínica na região da Chapada do Araripe, bem como uma grande diversidade de possíveis fontes alimentares (aves e mamíferos). Dados semelhantes já foram descritos por Barreto (1979) em Uberaba, Minas Gerais em babaçus infestados por R. neglectus. Os triatomíneos foram capturados no tronco das palmeiras, debaixo das bainhas das folhas, mas parece que entre as espécies de palmeiras estudadas, babaçu apresentou o maior número de barbeiros nos cachos dos cocos e brácteas. A forma de inserção das folhas do babaçu no caule, constituindo um ambiente aparentemente bastante protegido, provavelmente permite maior estabilidade microclimática, servindo de abrigo para animais hospedeiros da doença de Chagas e refúgios para os triatomíneos. Lorenzo et al., (2003) trabalhando com várias espécies de palmeiras no estado do Tocantins, e utilizando sensores programáveis de temperatura e umidade, demonstram que as palmeiras do gênero Attalea possuem menor variação climática, mantendo um microclima muito estável e favorável para os triatomíneos. Por outro lado, a macaúba-barriguda foi a espécie de palmeira com o menor índice de infestação. Diotaiuti & Dias (1984) estudando outra espécie de macaubeira (Acrocomia sclerocarpa, hoje A. aculeata) em municípios da periferia de Belo Horizonte, Minas Gerais, encontraram um índice de infestação de 60,5% por R. neglectus, estando algumas palmeiras co-habitadas por P. megistus. Embora tenham sido encontradas várias possíveis fontes de alimentação para R. nasutus nas macaubeiras da região da Chapada do Araripe, talvez o que justifica sua menor taxa de infestação em relação às

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demais palmeiras seja a presença de enormes espinhos, distribuídos por toda a palmeira, desde o início do caule até a bainha foliar, pecíolos e folhas, o que pode dificultar a instalação de um número maior de animais que sirvam de fontes de alimentação para os barbeiros. Nesta espécie de palmeira, a variação microclimática na axila foliar foi ampla, fato já demonstrado para A. aculeata por Lorenzo et al (2003) em Tocantins, o que possivelmente pode estar relacionado a uma arquitetura da planta que constitua um ambiente menos estável. Embora a infestação encontrada nos buritis tenha sido alta (90%), a densidade triatomínica foi a mais baixa entre as espécies de palmeiras pesquisadas (19 triatomíneos). Esta palmeira é mais difícil para a coleta dos triatomíneos, por dois motivos: i) devido ao seu grande porte, tendo as bases foliares muito grandes, exigindo a movimentação da palmeira durante todo o trabalho de dissecção da mesma, e ii) local de ocorrência: os buritis ocorrem em solos alagados (brejos) e pantanosos, sendo popularmente conhecida como palmeira-do-brejo. Em algumas localidades, muitas famílias em Santana do Cariri-CE vivem da extração da polpa do fruto do buriti para a venda ou da fabricação do doce. Assim, somente era permitida a derrubada dos espécimes machos, que não produzem os cachos dos cocos, limitando o estudo às palmeiras com menor número de esconderijos para os triatomíneo, ocasionando uma sub-avaliação da infestação. Além disso, também podem influenciar nos resultados: i) o formato das folhas do buriti é em forma de leque e os pecíolos formam uma espécie de “calha”, onde acumula água no interior da palmeira, local onde os barbeiros ficam alojados ii) por ocorrer em solos pantanosos, e por apresentar a copa aberta, no momento da queda da palmeira a região interna de alguns dos pecíolos, bem próximos à axila foliar fica preenchida de lama, impossibilitando a procura dos triatomíneos. Todas as palmeiras estudadas foram capazes de amenizar a temperatura na axila das folhas, em relação ao ambiente externo, reduzindo claramente as amplitudes, principalmente a amplitude máxima, favorecendo a infestação triatomínica. Em relação às medianas, não foram estatisticamente diferentes do ambiente externo as temperaturas das axilas das folhas do buriti e carnaúba.

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Assim como o buriti, as folhas da carnaúba são em formato de leque (palmatipartida), no entanto, com bainhas bem menores e estreitas, inseridas alternadamente ao longo do caule, permitindo maior entrada de radiação solar por toda a copa. As temperaturas na axila foliar foram as maiores registradas entre todas as palmeiras investigadas e com elevada amplitude, variando a temperatura de acordo com o meio externo, mas, ainda assim, mantendo maior umidade em relação ao ambiente. Provavelmente, um fator determinante para a ocorrência de R. nasutus nas carnaúbas seja a umidade do ar, já que os artrópodes perdem mais água em ambientes mais secos, utilizando o fechamento dos espiráculos para o seu equilíbrio hídrico (Edney, 1967). A palmeira carnaúba é incriminada como ecótopo natural de R. nasutus. Silva & Silva (1989) verificando a influência da temperatura na biologia deste triatomíneo, demonstrou uma significativa redução no ciclo evolutivo quando os insetos eram mantidos a 30ºC (comparados com 25ºC). Nesta temperatura, além da diminuição no ciclo, os insetos ingeriam maior quantidade de sangue e havia maior fecundidade. Considerando que na carnaúba as condições sejam semelhantes a este experimento no laboratório, pode-se concluir pela grande adaptação do R. nasutus a esta palmeira, permitindo-lhe sobreviver em condições inviáveis para outras espécies de triatomíneos. Provavelmente, um fator importante determinação da densidade triatomínica nas palmeiras seja a disponibilidade de fontes alimentares e refúgios para os insetos. A carnaúba foi a única espécie de palmeira que não apresentou triatomíneos infectados. Dentre as cinco espécies de palmeiras pesquisadas, a arquitetura da carnaúba configura menor número de esconderijos para os triatomíneos, o que também pode estar relacionado à população de vertebrados que buscam abrigo na copa desta palmeira, interferindo negativamente na infecção dos triatomíneos. A distribuição desta palmeira foi restrita às menores altitudes (cerca de 360 metros), em solos arenosos, muitas vezes em locais alagados no período chuvoso, ensolarados e com elevadas temperaturas. Trata-se de uma palmeira que, na região da Chapada do Araripe, é preservada por muitos moradores que vivem do artesanato realizado a partir das folhas jovens, confeccionando chapéus e outros objetos. É interessante assinalar que a coleta destas folhas é realizada subindo-se na palmeira e apoiando o abdômen na copa da mesma

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para equilibrar-se. Considerando a hiperatividade de R. nasutus, pode ser que neste momento haja possibilidade do inseto picar o indivíduo. Este fato pode ser interessante e merece investigação. O índice de infestação dos catolés foi igual ao do buriti (90%), mas diferiu significativamente em relação à densidade populacional, sendo a segunda palmeira com maior número de R. nasutus coletados. O índice de infecção dos triatomíneos foi de 19,6%. Pelas limitações da bateria de anti- soros utilizadas para o processamento da reação de precipitina, não foi possível comprovar a importância de alguns animais encontrados nas copas das palmeiras como fonte de alimentação para os triatomíneos, conforme os resultados obtidos por Diotaiuti & Dias (1984) em Minas Gerais. Em um ninho de bem-te-vi (Pitangus sulphuratus) presente em um catolé foram encontrados 32 espécimes de R. nasutus, quase todos ingurgitados. Na mesma palmeira, alguns triatomíneos estavam infectados. Este fato demonstra que hospedeiros da DC freqüentam as palmeiras. Neste caso, vários moradores das localidades trabalhadas no município de Crato, relataram a existência de marsupiais (gambás) nas localidades, que provavelmente possam atuar como agentes dispersores da DC e até mesmo, dos triatomíneos no ambiente silvestre. Catolé foi a segunda espécie de palmeira com maior número de triatomíneos e apresentou em quase todos os espécimes répteis e anfíbios. Abad-Franch et al (2005) trabalhando com Phytelephas aequatorialis infestadas por R. ecuadoriensis Lent & León, 1958, região oeste do Equador, correlacionaram a quantidade de matéria orgânica em decomposição nas palmeiras (folhas mortas, fibras) e a densidade triatomínica. Estes autores encontraram maior densidade em palmeiras com maior quantidade de matéria orgânica. Apesar desta correlação não ter sido observada neste estudo em campo, nossas observações parecem estar de acordo com estes dados, considerando-se que quanto maior a palmeira, maior é a quantidade de matéria orgânica disponível. R. nasutus é considerada uma espécie de triatomíneo em vias de adaptação ao ambiente artificial. Na região estudada, esta espécie tem sido freqüentemente coletada em ambientes artificiais conforme demonstram os dados do PCDCh, inclusive de exemplares infectados pelo T. cruzi. Sarquis et

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al (2004) apontam que a presença do R. nasutus no intradomicílio seja devido à proximidade das palmeiras às residências. Desta forma, os insetos possivelmente invadem o intradomicílio a procura de alimento, atraídos à noite pela luz, conforme já descrito na região amazônica para o R. brethesi (Coura et al., 1994).

PREFERÊNCIAS ALIMENTARES DOS TRIATOMÍNEOS

Apesar do hábito hematófago obrigatório dos triatomíneos, Brumpt (1914) e Lent & Wygodzinsky (1979) relatam a possibilidade de cleptofagia, e até mesmo o canibalismo, entre estes insetos. Vários estudos têm demonstrado a preferência alimentar dos triatomíneos no ambiente silvestre e ambientes artificiais, assim a avaliação do comportamento alimentar dos triatomíneos torna-se uma ferramenta de pesquisa importante para o esclarecimento da epidemiologia da DC. Algumas espécies de triatomíneos geralmente estão associadas a poucas fontes de alimentação, enquanto outras espécies são bastante ecléticas. Diotaiuti & Dias (1984) verificando as fontes alimentares dos R. neglectus capturados em macaubeiras nas proximidades de Belo Horizonte-MG, demonstram que esta espécie de triatomíneo é bem eclética. O estudo da reação de precipitina reagiu com animais de sangue frio, aves e mamíferos, incluindo o homem. Entretanto, o sangue de ave foi o alimento mais constante para R. neglectus. Barretto (1979) avaliando as fontes alimentares de triatomíneos em diversas espécies de palmeiras encontraram maior freqüência em sangue de gambá, morcegos e roedor, conforme indicam os resultados da precipitina, sendo estes animais importantes veiculadores de tripanosomatídeos. Em nossos estudos, utilizando a metodologia da reação de precipitina e testando as amostras contra anti-soros de ave, cão, gambá, gato, humano, porco e roedor, somente foi possível a identificação de duas fontes alimentares (ave e gambá) nas cinco espécies de palmeiras estudadas. Todos os anti-soros testados reagiram ao respectivo soro homólogo diluído, a pelo menos, 1:10.000 e não reagiram aos soros heterólogos diluídos a 1:10, demonstrando alta sensibilidade da técnica. Cinqüenta e dois espécimes não

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reagiram aos anti-soros testados, dados que, provavelmente, podem sugerir a alimentação destes triatomíneos em outros vertebrados que não constam da bateria de anti-soros utilizada. Não deve ser completamente descartada a possibilidade de que os triatomíneos exerçam o predatismo, se alimentando da hemolinfa de outros artrópodes que fazem parte da biocenose da palmeira, como observado para outras espécies de triatomíneos (Salvatella et al., 1994; Sandoval et al., 2000; Lent & Wygodzinsky, 1979). Um fator importante observado a partir desses resultados foi o elevado número de insetos com material insuficiente, o que pode estar relacionado ao período de dispersão das aves e escassez de hospedeiros vertebrados nas palmeiras. Talvez uma possível fonte de alimentação dos triatomíneos nas diferentes palmeiras da Chapada do Araripe sejam os morcegos. Somente nos catolés não foi observada a presença deste animal e nos buritis, era constante sua presença, sendo contabilizados mais de 30 morcegos em uma única palmeira dissecada.

TRYPANOSOMA CRUZI e TRYPANOSOMA RANGELI

O T. rangeli foi anteriormente descrito no Nordeste brasileiro por Lucena & Vergetti (1973) em fezes de P. megistus, no estado de Alagoas, e por Barrett & Oliveira (1977) em R. domesticus, na Bahia, com base em características morfológicas. Possivelmente, a transmissão do T. cruzi e do T. rangeli aos triatomíneos na região da Chapada do Araripe está associada fortemente ao gambá, conforme demonstram os dados de precipitina. O índice de infecção por tripanosomatídeos encontrado no tubo digestivo dos triatomíneos foi de 16,8% (n=64). O T. rangeli é um parasito patogênico para os triatomíneos e o único capaz de se instalar na hemolinfa e glândulas salivares dos triatomíneo (D’Alessandro & Saraiva, 1992). Optamos em fazer o exame da hemolinfa somente no LATEC, pois o isolamento destes necessita ser imediato e em condições estéreis. Desta forma, foi possível examinar apenas os insetos sobreviventes (n=26). O índice de infecção pelo T. rangeli encontrado na hemolinfa foi de 7,7%. Devido à grande variabilidade morfológica que T. rangeli

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apresenta nas diferentes formas evolutivas, o diagnóstico específico é difícil por meio da morfologia. Além disso, também dificulta o diagnóstico na possibilidade de infecções mistas com o T. cruzi, tanto no hospedeiro vertebrado quanto no inseto vetor. Pelas facilidades oferecidas pela técnica da biologia molecular via PCR, a caracterização dos parasitos isolados neste trabalho foi realizada utilizando como marcador molecular, uma região intergênica do gene do mini- exon (Souto et al, 1996; Grisard et al, 1999). Esta metodologia mostrou-se específica tanto para a caracterização das cepas de T. cruzi, quanto para T. rangeli, não apresentando reações cruzadas, nem resultados duvidosos. Dois espécimes de R. nasutus estavam com infecção mista, porém em nenhum destes exemplares o T. rangeli chegou a invadir as glândulas salivares. Cepas de tripanosomatídeos podem apresentar diferentes comportamentos nos insetos vetores. Machado et al (2001), testando a suscetibilidade de R. prolixus, R. neglectus, R. nasutus e R. domesticus com três diferentes cepas de T. rangeli, demonstraram maior infectividade nas espécies cuja distribuição geográfica se sobrepõe ao local de descrição das cepas. Sessenta dias após o repasto sangüíneo infectante em camundongos, 100% dos R. domesticus apresentaram nas glândulas salivares formas de T. rangeli de uma cepa isolada de um roedor em Santa Catarina; no mesmo período pós-repasto, esta mesma espécie de triatomíneo não apresentou nenhum inseto com infecção nas glândulas salivares com as cepas Macias, isolada de paciente chagásico, via xenodiagnóstico e Choachi, isolada de R. prolixus (Steindel et al, 1994). Guhl et al (2002) observaram que cepas de T. rangeli isoladas de R. colombiensis Mejia, Galvão & Jurberg, 1999 e de R. pallescens foram incapazes de invadir e se desenvolverem dentro das glândulas salivares de R. prolixus, o que reforça a existência de um relacionamento complexo entre parasito-vetor. Vallejo et al (2003) divide T. rangeli em dois grupos filogenéticos associados com vetores específicos, na Colômbia e em outros países Latino Americanos. As espécies de Rhodnius são mais suscetíveis à infecção pelo T. rangeli (D’Alessandro & Hincapie, 1986), já sendo relatada infecção experimental de 12 entre 14 espécies testadas ou encontradas naturalmente infectadas (Guhl et al., 2002). No presente estudo, o fato de T. rangeli não ter sido detectado nas glândulas salivares de R. nasutus

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pode estar relacionado à suscetibilidade da espécie de triatomíneo à cepa ou relacionado com o tempo de infecção.

MORFOMETRIA

A morfometria geométrica pode ser considerada uma ferramenta útil na detecção da variação fenotípica resultante de causas genéticas ou ambientais. Esta técnica possui a vantagem sobre a morfometria tradicional, pois a morfometria geométrica é fundamentada em uma estatística denominada Análise de Procrustes. Nesta análise, a partir das coordenadas dos pontos de referência, pode-se construir uma configuração geométrica da estrutura analisada (Jaramillo & Dujardin, 2006). A partir de nossas análises, o tamanho centróide foi estatisticamente diferente entre os grupos. Os triatomíneos procedentes dos buritis foram nitidamente maiores aos demais grupos e os insetos do grupo babaçu, menores aos demais. Jaramillo & Dujardin (2006) admitem que as causas mais freqüentes de tamanho entre indivíduos da mesma espécie sejam fisiológicas. Na análise discriminante, a primeira variável de conformação é responsável pela maior parte da variabilidade. Em nosso estudo, esta variável contribuiu com 55% e foi possível observar uma ligeira separação dos insetos procedentes de babaçus e macaúbas. A segunda variável de conformação contribuiu com 29% da variabilidade dos grupos, mas não foi possível observar separação entre os mesmos. Na análise discriminante, a árvore UPGMA, obtida pelas distâncias de Mahananobis, apontou o grupo de R. nasutus procedentes dos buritis como sendo o mais externo, demonstrando, possivelmente, ser este o grupo mais distante geneticamente. No entanto, os demais grupos formaram agrupamentos, sendo o babaçu mais próximo geneticamente de macaúba, e carnaúba mais próximo do catolé. Possivelmente, este fato pode ser explicado pela distribuição geográfica das espécies de palmeiras entre os grupos estudados. Na região da Chapada do Araripe, babaçu e macaúba são palmeiras que ocorrem em simpatria. Alguns dos triatomíneos coletados nessas duas espécies de palmeiras foram

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procedentes da mesma localidade. Assim, o fato destes grupos de insetos serem muito próximos geneticamente pode ser devido ao fluxo gênico de R. nasutus entre babaçu e macaúba, o que merece ser investigado com maior cautela utilizando marcadores moleculares. Diotaiuti et al (2005) sugerem que as características ambientais de cada espécie de palmeira possam ser um fator relevante para o tamanho dos insetos. Estes autores, utilizando a morfometria tradicional da cabeça e comparando R. nasutus procedentes de babaçus e de carnaúbas, verificaram diferenças no tamanho dos insetos, sendo os triatomíneos dos babaçus muito maiores que os das carnaúbas. Neste estudo, nossos dados apontam como maiores os insetos dos buritis. Esta espécie de palmeira ocorre em grande quantidade no município de Santana do Cariri, aproximadamente 100km de distância das demais espécies de palmeiras, e muito próxima à Floresta Nacional do Araripe, local com grande diversidade de animais, incluindo mastofauna. Possivelmente, o isolamento geográfico e a diversidade de fontes alimentares para os triatomíneos ao redor das localidades trabalhadas possam ter influenciado no tamanho dos barbeiros.

CONSIDERAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA

Os dados aqui apresentados mostram a existência de uma grande população de R. nasutus nos palmeirais da Chapada do Araripe. Considerando a extensão destes palmeirais, a densidade triatomínica deve ser, provavelmente, surpreendente, principalmente nos babaçus e catolés. Estes fatores associados aos dados do PCDCh, faz da Chapada do Araripe uma importante área de transmissão da doença de Chagas silvestre. Fora o processo já bem descrito de colonização das casas e transmissão vetorial do T. cruzi, os achados de formas alternativas de transmissão na Amazônia (Coura et al., 1994) e no Equador (Aguilar et al., 1999) devem ser investigados, na perspectiva da vigilância epidemiológica da DC na Chapada do Araripe, conforme já sugerido por Sarquis et al. (2004).

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6. CONCLUSÕES

91 DIAS FBS Conclusões

• A única espécie de triatomíneo encontrada em 50 palmeiras da região da Chapada do Araripe foi R. nasutus. • Foi observada diferença cromática nos R. nasutus das diferentes espécies de palmeiras. Os triatomíneos coletados nas carnaúbas foi o único grupo que apresentou coloração avermelhada, típica da descrição da espécie. • A infestação das palmeiras pelos triatomíneos na amostra estudada foi elevada (86%). • As maiores densidades triatomínicas estão relacionadas às palmeiras babaçu e catolé (mediana de 19 e 11,5 triatomíneos/palmeira positiva, respectivamente). • Neste estudo, em todas as espécies de palmeiras, exceto na carnaúba foram encontrados R. nasutus naturalmente infectados pelo T. cruzi. • As cepas de T. cruzi isoladas dos triatomíneos pertenciam ao grupo I, típica de cepas circulantes no ambiente silvestre. • Relatamos pela primeira vez a ocorrência de T. rangeli no estado do Ceará, parasitando R. nasutus, ampliando ainda mais a área de ocorrência deste tripanosomatídeo. • Neste estudo a reação de precipitina foi reagente em 70 (46,1%) insetos, sobre um total de 152 examinados, sendo 13,2% reagentes para ave e 34,9% reagentes para gambá. Outras possíveis fontes de alimentação como anfíbios, aves, cobra, lagartos e morcegos foram detectadas em 29 das 50 palmeiras estudadas. • Os dados de precipitina sugerem que os gambás foram potenciais reservatórios do T. cruzi e T. rangeli no ambiente silvestre. • Todas as espécies de palmeiras foram capazes de amenizar a temperatura da axila das folhas, local principalmente colonizado por triatomíneos em relação ao ambiente externo, tendo os babaçus apresentado menores amplitudes. • Na análise morfométrica, os triatomíneos procedentes dos buritis foram maiores que os demais grupos de insetos.

92 DIAS FBS Conclusões

• R. nasutus é um triatomíneo não somente adaptado à caatinga, mas também ocorre em regiões serranas, consideradas como remanescentes de matas úmidas e infestando as mais diversas espécies de palmeiras. • Nossos resultados sugerem a existência de uma enorme área de transmissão enzoótica de T. cruzi e T. rangeli mantida pelo R. nasutus com capacidade de infestação em ambientes artificiais, o que pode acarretar risco para a população local. • Sugerimos às autoridades locais a instalação de vigilância entomológica na região, com treinamento das comunidades e da equipe de saúde para identificação, notificação e combate de focos triatomínicos.

93 DIAS FBS Conclusões

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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105 DIAS FBS Referências Bibliográficas

8. ANEXOS

106 DIAS FBS Anexos

Anexo I: Autorização do IBAMA para derrubada das palmeiras.

107 DIAS FBS Anexos

Anexo II: Autorização do IBAMA para coleta e transporte de triatomíneos.

108 DIAS FBS Anexos

Anexo III: Modelo da ficha de coleta de triatomíneos utilizada neste projeto.

Ministério da Saúde

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisa René Rachou Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas FICHA DE COLETA DE TRIATOMÍNEOS EM CAMPO

Data: ______/______/______Horário Início: ______Término: ______Condição Climática: Sol Parcial. Nublado Nublado Chuvoso Localidade (município): ______Número Palmeira: ______Espécie de Palmeira: ______Tamanho da Palmeira: ______Espécie de Palmeira mais próxima: ______Altitude: ______Referência Geográfica: ______Fauna Associada à palmeira: ______Palmeira: Positiva Negativa Ovos: ______1º estádio: ______2º estádio: ______3º estádio: ______4º estádio: ______5º estádio: ______Fêmeas: ______Machos: ______Espécies de Triatomíneos Capturadas: ______Temp. à sombra: ______Umidade à sombra: ______Temp. na copa após derrubada: ______Umidade: ______Temp. axila foliar: ______Observações: ______Av. Augusto de Lima, 1715, 30190-002 Belo Horizonte - MG - Brasil Tel: (31) 3349-7700 (ramal 7761) - Fax: (31) 3295-3115 e-mail: [email protected]

109 DIAS FBS Anexos

Anexo IV: Protocolo utilizado para a extração do DNA genômico dos tripanosomatídeos pela técnica de fenol-clorofórmio álcool-isoamílico.

EXTRAÇÃO DE DNA – MÉTODO DE FENOL-CLOROFÓRMIO

1. Adicionar ao material (pellet de T. cruzi ou sangue) volume igual de tampão de extração com SDS e 5µL de proteinase K (50 a 100µg/mL), misturando suavemente por inversão do tubo, para homogeneizar. 2. Deixar incubando a 37ºC overnight ou a 52ºC por 1 hora, agitando periodicamente. 3. Adicionar volume igual de fenol (pH 8,0) neutralizado e misturar suavemente por 10 minutos. 4. Centrifugar a 14000RPM por 10 minutos, à temperatura ambiente. 5. Retirar o sobrenadante e transferir para um novo tubo contendo ½ volume de fenol e ½ volume de clorofórmio-álcool-isoamílico (24:1) e misturar por 10 minutos. 6. Centrifugar a 14000RPM por 10 minutos, à temperatura ambiente. 7. Retirar o sobrenadante e transferir para um novo tubo contendo 1/10 do volume de acetato de sódio 3M, pH 5,2. 8. Adicionar 2,5x o volume de etanol 100% gelado (o etanol deverá estar a - 70ºC por 1 hora ou a -20ºC overnight) e misturar delicadamente, por inversão do tubo, para homogeneizar. 9. Centrifugar a 14000RPM, 4ºC, por 10 minutos. 10. Lavar o pellet por 2x com etanol 70% gelado (cerca de 1mL), misturando delicadamente por inversão do tubo e centrifugando a 14000RPM por 10 minutos a 4ºC 11. Após a última lavagem, retirar o sobrenadante com a pipeta e deixar secar no multi-block por alguns minutos. 12. Acrescentar 50µL de TE ou DDW e deixar ressuspendendo a 37ºC por 30 minutos, agitando periodicamente. 13. Estocar a -20ºC se for estocar ou a 4ºC, se for utilizar em breve.

110 DIAS FBS Anexos

Anexo V: Soluções utilizadas em géis de poliacrilamida

SOLUÇÕES UTILIZADAS EM GÉIS DE POLIACRILAMIDA

1. “Sopas Primitivas” Bis-acrilamida 30% 13,32 ml 4% TBE 5X 20,00 ml

H20 MQ 65,88 ml Bis-acrilamida 30% 20,00 ml 6% TBE 5X 20,00 ml APS

H20 MQ 60,00 ml Bis-acrilamida 30% 27,00 ml 1g Persulfato 8% TBE 5X 20,00 ml 100ml DDW H20 MQ 53,00 ml Bis-acrilamida 30% 33,20 ml 10% TBE 5X 20,00 ml

H20 MQ 46,70 ml

2. Bis-acrilamida 30%

Acrilamida (C3H5NO) 29g PM 71,08 Bis (N,N’-methylene-bis-acrylamide) 1g PM 154,17

H2O MQ qsp 100ml

3. Solução Fixadora (1 a 3 géis) Etanol PA 15ml Ácido Acético 750ml Água MQ 150ml

4. Solução Fixadora Glicerinada (500ml)

10% 20% Glicerina 50ml Glicerina 100ml Solução Fixadora 450ml Solução Fixadora 400ml

5. Solução Corante AgNO3 0,3g 2g Água MQ 150ml 1000ml

6. Solução de Revelação NAOH 0,75M 4,5g 30g Água MQ 150ml 1000ml

Não esquecer de acrescentar 450µl de formaldeído 0,1M antes

de colocar os géis em contato com a solução (senão não revela)

111 DIAS FBS Anexos

Anexo VI: Dados do PCDCh dos cinco municípios trabalhados da Chapada do Araripe, Ceará.

Dados do Programa de Controle da Doença de Chagas dos cinco municípios estudados da Chapada do Araripe, Ceará, Brasil.

112 DIAS FBS Anexos

Ano: 2003 capturado examinado positivo índice de infecção (%) Espécie intra peri intra peri intra peri intra peri global R.nasutus 4 113 0 106 0 1 0% 0,9% 0,9% P. lutzi 0 0 0 0 0 0 0% 0% 0% P.megistus 0 18 0 18 0 2 0% 11,1% 11,1% T.brasiliensis 9 23 8 20 0 0 0% 0% 0% T.pseudomaculata 82 657 70 625 0 6 0% 1,0% 0,9% Total 95 811 78 769 0 9 0% 1,2% 1,1%

Ano: 2004 capturado examinado positivo índice de infecção (%) Espécie intra peri intra peri intra peri intra peri global R.nasutus 15 147 14 146 0 3 0% 2,1% 1,9% P. lutzi 1 0 1 0 0 0 0% 0% 0% P.megistus 2 12 2 11 0 0 0% 0% 0% T.brasiliensis 25 48 24 48 0 0 0% 0% 0% T.pseudomaculata 64 646 62 628 3 4 4,8% 0,6% 1,0% Total 107 853 103 833 3 7 2,9% 0,9% 1,1%

Ano: 2005 capturado examinado positivo índice de infecção (%) Espécie intra peri intra peri intra peri intra peri global R.nasutus 3 199 3 193 0 4 0% 2,1% 2,0% P. lutzi 5 41 3 31 1 0 33,3% 0% 2,9% P.megistus 0 1 0 1 0 0 0% 0% 0% T.brasiliensis 33 32 25 32 2 0 8,0% 0% 3,6% T.pseudomaculata 51 738 38 657 0 11 0% 1,7% 1,7% Total 92 1011 69 914 3 15 4,3% 1,6% 1,8% intra = intradomicílio; peri = peridomicílio

113 DIAS FBS Anexos

114 DIAS FBS Anexos

115 DIAS FBS Anexos

116 DIAS FBS Anexos

117 DIAS FBS Anexos

Anexo VII: Artigo aceito para publicação.

118 wem2snst2yswldo2gruzD2io2de2tneiroD2olF2IHP@SAX2HHHEHHHD2eugust2PHHU I pirst2report2on2the2ourrene2of2rypnosom2rngeli2ejerD2IWPH in2the2stte2of2geráD2frzilD2in2nturlly2infeted2tritomine hodnius2nsutus2@remipterD2eduviideA pernndo2frg2tehling2hisD2viléi2hiotiutiGCD2elvro2tosé2omnhBD2gláudi wendonç2fezerrBBD2ivndro2wrques2de2wenezes2whdo

Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas *Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou-Fiocruz, Av. Augusto de Lima 1715, 30190-002 Belo Horizonte, MG, Brasil ** Secretaria do Estado da Saúde do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil The aim of this work was to identify and report the occurrence of Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi in naturally infected Rhodnius nasutus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) in the state of Ceará, Brazil. Triatomines feces, salivary glands, and hemolymph were collected for fresh examination, and specific detection of T. rangeli and T. cruzi DNA by polymerase chain reaction was carried out. The specific characterization of these two parasites showed the simultaneous presence of both parasites in two (7.7%) of the 26 positive insects. Our results provide further knowledge on the geographical distribution of T. rangeli in Brazil.

Key words: Trypanosoma rangeli - Rhodnius nasutus - Ceará

Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 and Trypano- inside or outside hemocytes and, then, they actively pen- soma cruzi Chagas, 1909, are hemoflagellate protozoa etrate through salivary glands, especially in Rhodnius of the Family Trypanosomatidae, belonging to the Order species, where metacyclogenesis occurs (D’Alessandro Kinetoplastida (D’Alessandro 1976). Both parasites are & Hincapie 1986). In vertebrate hosts, T. rangeli has sympatric in Americas with a wide geographic distribu- been reported to infect more than 20 genera in five differ- tion. T. cruzi is the etiological agent of Chagas disease, ent animal orders (D’Alessandro & Saraiva 1992). The and T. rangeli is responsible for a non-pathogenic invertebrate host infection occurs during the triatomine fection in mammals (D’Alessandro & Saraiva 1992). blood feeding, through which infective trypomastigotes Both parasites can be found in the same triatomine vec- are released together with the vector saliva (Vallejo et tor species, and in the same vertebrate hosts, which are al. 1988). mammals belonging to different orders and genera, in- In Brazil, the first report on the occurrence of T. cluding man (D’Alessandro & Saraiva 1992). Although rangeli was issued by Deane (1958) in Didelphis mar- T. rangeli is not pathogenic for the vertebrate host, its supialis, in the state of Pará. Steindel et al. (1991) re- occurrence should be recorded as it frequently presents ported the presence of T. rangeli in the rodent Echimys an overlapping distribution with T. cruzi (D’Alessandro dasythrix in Southern Brazil. Several other reports on 1976). T. rangeli bears similarities with T. cruzi regard- T. rangeli occurrence in Brazil have been given by some ing surface antigens, impairing the diagnosis of Chagas investigators such as those by Diotaiuti et al. (1992) who disease when serological assays are carried out. More- reported the occurrence of that flagellate, based on its over, considering the fact that T. rangeli is highly pleo- morphology, in R. neglectus in the state of Tocantins; morphic, its morphological identification may be rather Lucena and Verguetti (1973) reported Panstrongylus difficult, being misidentified as T. cruzi (Urdaneta-Mo- megistus infections with the flagellate, also based on its rales & Tejero 1992). morphological traits, in the state of Alagoas; in Bahia, Interactions between T. rangeli and its invertebrate Barrett and Oliveira (1977) reported natural infection host starts after ingestion of trypomastigote forms dur- of a R. domesticus nymph with T. rangeli; Ramirez et al. ing the triatomine blood feeding. Following ingestion, (2002) demonstrated D. albiventris infection with T. trypomastigotes undergo differentiation to epimasti- rangeli in the Southeast. A single report on human in- gotes that multiply in the insect vector intestine. After fection with T. rangeli was made by Coura et al. (1996) reaching the intestine lumen, the epimatigote forms in- in the Amazon region, and R. brethesi may be consid- vade hemocelle, in which they remain to multiply either ered the most likely vector in the region. The current investigation was aimed at verifying the occurrence of T. rangeli in R. nasutus specimens collected on different palm tree species, namely: babaçu palm (Attalea speciosa); buriti (Mauritia flexuosa); carnaúba palm (Copernicia prunifera); catolé palm Financial support: Fapemig, CNPq, CPqRR-Fiocruz (Syagrus oleracea); and macaúba-barriguda (Acrocomia + Corresponding author: [email protected] intumescens), in rural areas from five municipalities of Received 20 December 2006 Chapada do Araripe, in the southern region of Ceará, Accepted 26 April 2007 Brazil, between 14 March and 06 April, 2006. P pirst2report2on2the2ourrene2of2F2rngeli2in2gerá22pernndo2frg2tehling2his2et2lF

The insects were evaluated regarding the presence the samples in which T. rangeli was isolated, which con- of trypanosome in their intestinal content through ana- firmed the presence of mixed infection. lyzing their fresh feces obtained by abdominal compres- In the present study, identification of Trypanoso- sion; hemolymph analysis on glass slides was also car- matidae found in the insect intestine tract by means of ried out after sectioning one of the insect legs. Salivary morphological analysis was not possible, requiring a di- glands from positive hemolymph were dissected in or- agnosis confirmation through PCR. An overlapping der to verify the presence of parasites. All biological geographic distribution of both T. cruzi and T. rangeli, material obtained was analyzed under light microscopy occurrence of mixed infection in vertebrate and inver- (magnification 160 x). The trypanosomes were isolated tebrate hosts and, T. rangeli pleomorphism account for from insects in LIT medium added to blood agar main- the need for molecular techniques for identification of tained at 27.5ºC, keeping weekly passages. Trypanosomatidae species. By using PCR, that enabled Polymerase chain reaction (PCR) has been known to amplification of the intergenic region of the mini-exon be more sensitive than optical microscopy for detec- gene, we were able to identify the Trypanosomatidae tion and specific characterization of these trypanosomes species in R. nasutus collected in the state of Ceará, in insect vectors, mainly concerning the possibility of Brazil. The present communication is the first to report mixed infection (Machado et al. 2000). Hence, we have the occurrence of T. rangeli in the state of Ceará, Bra- used PCR for specific detection of T. rangeli and T. cruzi zil, identified in naturally infected triatomines of the in samples of isolated parasites; DNA was obtained from species R. nasutus. parasite cultures using standard phenol/chloroform/ Chapada do Araripe is comprised in the mountain re- isoamyl alcohol extraction (Steindel et al. 1993). De- gions of the Brazilian semi-arid, regarded as remaining tection of T. rangeli was based on amplification of an areas of humid forests in the caatinga vegetation. It pre- intergenic region of T. rangeli mini-exon with the fol- sents typical elements of the Brazilian Amazon, Mata lowing primers: TrINT-1 – 5'-CGC CCA TTC GTT TGT Atlântica and cerrado (Bagnoli 1998), what is validated CC-3'; TrINT-2 - 5'-TCC AGC GCC ATC ACT GAT C-3'; through geologics, floristics, and faunistics evidences and TrINT-3 - 5'-AAG ATG AGG CGT GGC TCT G-3' (Monteiro & Kaz 1994). In regions with an overlapping (Grisard et al. 1999). For T. cruzi detection, specific of the geographic distribution of T. cruzi and T. rangeli, primers were designed to amplify an intergenic region co-infections in vectors and vertebrates are common of the mini-exon gene (Souto et al. 1996). As positive (D’Alessandro & Saraiva 1992). The presence of mar- control, the T. rangeli San Agustin strain, isolated from supials in the palms, being this important reservoir of a Colombian chagasic patient, was used. The products both parasites, may favour the occurrence of co-infec- were submitted to electrophoresis in polyacrylamide gel tion in the same insect, as suggested for other authors and then revealed after being silver stained. (Cuba-Cuba 1998, Ramirez et al. 2002), specially con- Out of the 26 insects positive for trypanosome in sidering that blood of these animals in the stomachal their intestines, two (7.7%) showed to be positive for content of infected triatomines was identified through trypanosome in hemolymph without showing parasites the precipitin technique (data not shown). in their salivary glands though. Molecular typing of iso- The occurrence of T. rangeli in naturally infected R. lated samples using TrINT primers showed to be spe- nasutus from palm trees in Ceará provides further know- cific for T. rangeli, amplifying a band of approximately ledge on the geographical distribution of this parasite in 203 bp and two other bands of less intensity, 244 and Brazil. Considering that in the Brazilian caatinga there 265 bp, respectively, which provided corroborating evi- are areas similar to the Chapada do Araripe (Ca-valcante dence to our microscopic findings (Fig. 1). In all iso- 2005), it is very likely that the occurrence of T. rangeli lates, T. cruzi was identified (data not shown), including in triatomines colonizing palm trees in the Northeast,

MW CN 1 2 3 4 5 bp

310 265bp 234 244bp 194 203bp

Polymerase chain reaction amplification products of the mini-exon gene generated by Trypanosoma samples isolated from naturally infected Rhodnius nasutus using the primers TrINT 1, TrINT 2, and TrINT 3. MW: molecular weight, the numbers on the left are the size markers (φX174 digested by the restriction enzyme Haell); NC: negative control (no DNA add). Lanes - 1: strain RN01; 2: RN02; 3: RN03; 4: RN04; 5: strain San Agustin (positive control), visualized on 8% polyacrilamide gel, silver stained. wem2snst2yswldo2gruzD2io2de2tneiroD2olF2IHP@SAD22eugust2PHHU Q as well as associated with vertebrate hosts, may be even Diotaiuti L, Silveira AC, Elias M, Steindel M 1992. The possibil- higher. As is known, there was a link among the Brazilian ity of occurrence of Trypanosoma rangeli in the state of caatinga, Amazon, and Mata Atlântica regions that rein- Tocantins, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 87: 451. forces this hypothesis (Cavalcante 2005). Studies about Grisard EC, Campbell DA, Romanha AJ 1999. Mini-exon gene genetic proximity among T. rangeli strains from sev- sequence polymorphism among Trypanosoma rangeli strains eral geographic regions may collaborate to clarify a pos- isolated from distinct geographical regions. Parasitology sible migratory route that culminated in the establish- 118: 375-382. ment of this parasite in Brazilian Northeast. This obser- Gurgel-Gonçalves R, Ramalho ED, Duarte MA, Palma ART, vation also reinforces the idea that false-positive results Abad-Franch F, Carranza JC, Cuba-Cuba CA 2004. Enzootic of diagnostic tests for T. cruzi infection are possible, as transmission of Trypanosoma cruzi and T. rangeli in the mentionated by Gurgel-Gonçalves et al. (2004). Federal District of Brazil. Rev Inst Med Trop São Paulo 46: 323-330. ACKNOWLEDGMENTS Lucena DT, Vergetti JG 1973. Infecção natural de Panstrongylus To the Secretaria de Estado da Saúde do Ceará for helping megistus (Burmeister, 1835) por Trypanosoma rangeli us to collect the insects. (Tejera, 1920), no interior do Estado de Alagoas. Rev Inst REFERENCES Med Trop S Paulo 15: 171-178. Bagnoli E 1998. Projeto Araripe – 1ª parte: Conhecendo o Araripe: Machado EMM, Alvarenga NJ, Romanha AJ, Grisard EC 2000. Atividades produtivas da população. Turismo, Ecoturismo, A simplified method for sample collection and DNA isolation Turismo Cultural e Científico. In Projeto Araripe. [s.i]: [s.n.], for polymerase chain reaction detection of Trypanosoma p. 292-318. rangeli and Trypanosoma cruzi in triatomine vectors. Mem Inst Oswaldo Cruz 95: 836-866. Barrett TV, Oliveira TS 1977. A Trypanosoma indistinguishable from Trypanosoma rangeli in the haemolymph of Rhodni- Monteiro S, Kaz L 1994. Caatinga – Sertão Sertanejos, Alum- us domesticus from Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 71: bramentos Livroarte, Rio de Janeiro, 255 pp. 445-446. Ramirez LE, Lages-Silva E, Alvarenga-Franco F, Matos A, Vargas Cavalcante A 2005. Jardins Suspensos no Sertão, Scientific N, Fernandes O, Zingales B 2002. Abstract high prevalence American Brasil, Duetto Editorial, São Paulo, n. 32, janeiro. of Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi in opossums and triatomids in a formerly-endemic area of Chagas Coura JR, Fernandes O, Arboleda M, Barrett TV, Carrara N, disease in Southeast Brazil. Acta Trop 84: 189-198. Degrave W, Campbell DA 1996. Human infection by Trypa- nosoma rangeli in the Brazilian Amazon. Trans R Soc Trop Souto R, Fernandes O, Macedo A, Campbell D, Zingales B 1996. Med Hyg 90: 278-279. DNA markers define two major phylogenetics linageages of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 83: 141-152. Cuba-Cuba CA 1998. Revisión de los aspectos biológicos y diagnósticos del Trypanosoma (Herpetosoma) rangeli. Rev Steindel M, Carvalho Pinto JC, Toma HK, Mangia HR, Ribeiro- Soc Bras Med Trop 31: 207-220. Rodrigues R, Romanha, AJ 1991. Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920) isolated from a sylvatic rodent (Echimys D’Alessandro A 1976. Biology of Trypanosoma (Herpetosoma) dasythrix) in Santa Catarina island, Santa Caratina state: rangeli Tejera, 1920. In WHR Lumsden, DA Evans (eds), first report of this trypanosome in Southern Brazil. Mem Biology of Kinetoplastida, vol. 1, Academic Press, Lon- Inst Oswaldo Cruz 86: 73-79. don, p. 327-403. Steindel M, Dias-Neto E, Carvalho CJ, Grisard E, Menezes C, Murta D’Alessandro A , Saraiva NG 1992. Trypanosoma rangeli. In SM, Simpson AJ, Romanha AJ 1993. Randomly amplified Parasitic Protozoa, 2nd ed., Vol. 2, Academic Press, San polymorphic DNA (RAPD) and isoenzyme analysis of Trypa- Diego, p. 1-54. nosoma rangeli strains. J Euk Microbiol 4: 261-267. D’Alessandro A, Hincapie O 1986. Rhodnius neivai: a new Urdaneta-Morales S, Tejero F 1992. Trypanosoma rangeli experimental vector of Trypanosoma rangeli. Am J Trop (Tejera, 1920): observations upon pleomorphism. Mem Inst Med Hyg 35:512-514. Oswaldo Cruz 87: 511-516. Deane LM 1958. Novo hospedeiro de tripanosomas dos tipos Vallejo GA, Marinkelle CJ, Guhl F, Sánchez N 1988. cruzi e rangeli no Estado do Pará. O marsupial Metachirops Comportamiento de la infección y diferenciación morfoló- opossum opossum. Rev Bras Malar Doenças Trop 10: gica entre Trypanosoma cruzi y T rangeli em el intestino 531-541. del vector Rhodnius prolixus. Rev Bras Biol 48: 577-587. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 102(5): 643-645, August 2007 643 First report on the occurrence of Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 in the state of Ceará, Brazil, in naturally infected triatomine Rhodnius nasutus Stal,° 1859 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) Fernando Braga Stehling Dias, Liléia Diotaiuti/+, Alvaro José Romanha*, Cláudia Mendonça Bezerra**, Evandro Marques de Menezes Machado

Key words: Trypanosoma rangeli - Rhodnius nasutus - Ceará

Trypanosoma rangeli Tejera, 1920 and Trypano- inside or outside hemocytes and, then, they actively pen- soma cruzi Chagas, 1909, are hemoflagellate protozoa etrate through salivary glands, especially in Rhodnius of the Family Trypanosomatidae, belonging to the Order species, where metacyclogenesis occurs (D’Alessandro Kinetoplastida (D’Alessandro 1976). Both parasites are & Hincapie 1986). In vertebrate hosts, T. rangeli has sympatric in Americas with a wide geographic distribu- been reported to infect more than 20 genera in five differ- tion. T. cruzi is the etiological agent of Chagas disease, ent animal orders (D’Alessandro & Saraiva 1992). The and T. rangeli is responsible for a non-pathogenic invertebrate host infection occurs during the triatomine fection in mammals (D’Alessandro & Saraiva 1992). blood feeding, through which infective trypomastigotes Both parasites can be found in the same triatomine vec- are released together with the vector saliva (Vallejo et tor species, and in the same vertebrate hosts, which are al. 1988). mammals belonging to different orders and genera, in- In Brazil, the first report on the occurrence of T. cluding humans (D’Alessandro & Saraiva 1992). Al- rangeli was issued by Deane (1958) in Didelphis mar- though T. rangeli is not pathogenic for the vertebrate supialis, in the state of Pará. Steindel et al. (1991) re- host, its occurrence should be recorded as it frequently ported the presence of T. rangeli in the rodent Echimys presents an overlapping distribution with T. cruzi dasythrix in Southern Brazil. Several other reports on (D’Alessandro 1976). T. rangeli bears similarities with T. rangeli occurrence in Brazil have been given by some T. cruzi regarding surface antigens, impairing the diag- investigators such as those by Diotaiuti et al. (1992) who nosis of Chagas disease when serological assays are car- reported the occurrence of that flagellate, based on its ried out. Moreover, considering the fact that T. rangeli morphology, in R. neglectus in the state of Tocantins; is highly pleomorphic, its morphological identification Lucena and Verguetti (1973) reported Panstrongylus may be rather difficult, being misidentified as T. cruzi megistus infections with the flagellate, also based on its (Urdaneta-Morales & Tejero 1992). morphological traits, in the state of Alagoas; in Bahia, Interactions between T. rangeli and its invertebrate Barrett and Oliveira (1977) reported natural infection host starts after ingestion of trypomastigote forms dur- of a R. domesticus nymph with T. rangeli; Ramirez et al. ing the triatomine blood feeding. Following ingestion, (2002) demonstrated D. albiventris infection with T. trypomastigotes undergo differentiation to epimasti- rangeli in the Southeast. A single report on human in- gotes that multiply in the insect vector intestine. After fection with T. rangeli was made by Coura et al. (1996) reaching the intestine lumen, the epimatigote forms in- in the Amazon region, and R. brethesi may be consid- vade hemocelle, in which they remain to multiply either ered the most likely vector in the region. The current investigation was aimed at verifying the occurrence of T. rangeli in R. nasutus specimens collected on different palm tree species, namely: babaçu palm (Attalea speciosa); buriti (Mauritia flexuosa); carnaúba palm (Copernicia prunifera); catolé palm Financial support: Fapemig, CNPq, CPqRR-Fiocruz (Syagrus oleracea); and macaúba-barriguda (Acrocomia + Corresponding author: [email protected] intumescens), in rural areas from five municipalities of Received 20 December 2006 Chapada do Araripe, in the southern region of Ceará, Accepted 26 April 2007 Brazil, between 14 March and 06 April, 2006. 644 First report on the occurrence of T. rangeli in Ceará • Fernando Braga Stehling Dias et al.

The insects were evaluated regarding the presence the samples in which T. rangeli was isolated, which con- of trypanosome in their intestinal content through ana- firmed the presence of mixed infection. lyzing their fresh feces obtained by abdominal compres- In the present study, identification of Trypanoso- sion; hemolymph analysis on glass slides was also car- matidae found in the insect intestine tract by means of ried out after sectioning one of the insect legs. Salivary morphological analysis was not possible, requiring a di- glands from positive hemolymph were dissected in or- agnosis confirmation through PCR. An overlapping der to verify the presence of parasites. All biological geographic distribution of both T. cruzi and T. rangeli, material obtained was analyzed under light microscopy occurrence of mixed infection in vertebrate and inver- (magnification 160 x). The trypanosomes were isolated tebrate hosts and, T. rangeli pleomorphism account for from insects in LIT medium added to blood agar main- the need for molecular techniques for identification of tained at 27.5ºC, keeping weekly passages. Trypanosomatidae species. By using PCR, that enabled Polymerase chain reaction (PCR) has been known to amplification of the intergenic region of the mini-exon be more sensitive than optical microscopy for detec- gene, we were able to identify the Trypanosomatidae tion and specific characterization of these trypanosomes species in R. nasutus collected in the state of Ceará, in insect vectors, mainly concerning the possibility of Brazil. The present communication is the first to report mixed infection (Machado et al. 2000). Hence, we have the occurrence of T. rangeli in the state of Ceará, Bra- used PCR for specific detection of T. rangeli and T. cruzi zil, identified in naturally infected triatomines of the in samples of isolated parasites; DNA was obtained from species R. nasutus. parasite cultures using standard phenol/chloroform/ Chapada do Araripe is comprised in the mountain re- isoamyl alcohol extraction (Steindel et al. 1993). De- gions of the Brazilian semi-arid, regarded as remaining tection of T. rangeli was based on amplification of an areas of humid forests in the caatinga vegetation. It pre- intergenic region of T. rangeli mini-exon with the fol- sents typical elements of the Brazilian Amazon, Mata lowing primers: TrINT-1 – 5'-CGC CCA TTC GTT TGT Atlântica and cerrado (Bagnoli 1998), what is validated CC-3'; TrINT-2 - 5'-TCC AGC GCC ATC ACT GAT C-3'; through geologics, floristics, and faunistics evidences and TrINT-3 - 5'-AAG ATG AGG CGT GGC TCT G-3' (Monteiro & Kaz 1994). In regions with an overlapping (Grisard et al. 1999). For T. cruzi detection, specific of the geographic distribution of T. cruzi and T. rangeli, primers were designed to amplify an intergenic region co-infections in vectors and vertebrates are common of the mini-exon gene (Souto et al. 1996). As positive (D’Alessandro & Saraiva 1992). The presence of mar- control, the T. rangeli San Agustin strain, isolated from supials in the palms, being this important reservoir of a Colombian chagasic patient, was used. The products both parasites, may favour the occurrence of co-infec- were submitted to electrophoresis in polyacrylamide gel tion in the same insect, as suggested for other authors and then revealed after being silver stained. (Cuba-Cuba 1998, Ramirez et al. 2002), specially con- Out of the 26 insects positive for trypanosome in sidering that blood of these animals in the stomachal their intestines, two (7.7%) showed to be positive for content of infected triatomines was identified through trypanosome in hemolymph without showing parasites the precipitin technique (data not shown). in their salivary glands though. Molecular typing of iso- The occurrence of T. rangeli in naturally infected R. lated samples using TrINT primers showed to be spe- nasutus from palm trees in Ceará provides further know- cific for T. rangeli, amplifying a band of approximately ledge on the geographical distribution of this parasite in 203 bp and two other bands of less intensity, 244 and Brazil. Considering that in the Brazilian caatinga there 265 bp, respectively, which provided corroborating evi- are areas similar to the Chapada do Araripe (Cavalcante dence to our microscopic findings (Figure). In all iso- 2005), it is very likely that the occurrence of T. rangeli lates, T. cruzi was identified (data not shown), including in triatomines colonizing palm trees in the Northeast,

MW NC 1 2 3 4 5 bp

310 265bp 234 244bp 194 203bp

Polymerase chain reaction amplification products of the mini-exon gene generated by Trypanosoma samples isolated from naturally infected Rhodnius nasutus using the primers TrINT 1, TrINT 2, and TrINT 3. MW: molecular weight, the numbers on the left are the size markers (φX174 digested by the restriction enzyme Haell); NC: negative control (no DNA add). Lanes - 1: strain RN01; 2: RN02; 3: RN03; 4: RN04; 5: strain San Agustin (positive control), visualized on 8% polyacrilamide gel, silver stained. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 102(5), August 2007 645 as well as associated with vertebrate hosts, may be even Diotaiuti L, Silveira AC, Elias M, Steindel M 1992. The possibil- higher. As is known, there was a link among the Brazilian ity of occurrence of Trypanosoma rangeli in the state of caatinga, Amazon, and Mata Atlântica regions that rein- Tocantins, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 87: 451. forces this hypothesis (Cavalcante 2005). Studies about Grisard EC, Campbell DA, Romanha AJ 1999. Mini-exon gene genetic proximity among T. rangeli strains from sev- sequence polymorphism among Trypanosoma rangeli strains eral geographic regions may collaborate to clarify a pos- isolated from distinct geographical regions. Parasitology sible migratory route that culminated in the establish- 118: 375-382. ment of this parasite in Brazilian Northeast. This obser- Gurgel-Gonçalves R, Ramalho ED, Duarte MA, Palma ART, vation also reinforces the idea that false-positive results Abad-Franch F, Carranza JC, Cuba-Cuba CA 2004. Enzootic of diagnostic tests for T. cruzi infection are possible, as transmission of Trypanosoma cruzi and T. rangeli in the mentionated by Gurgel-Gonçalves et al. (2004). Federal District of Brazil. Rev Inst Med Trop São Paulo 46: 323-330. ACKNOWLEDGMENTS Lucena DT, Vergetti JG 1973. Infecção natural de Panstrongylus To the Secretaria de Estado da Saúde do Ceará for helping megistus (Burmeister, 1835) por Trypanosoma rangeli us to collect the insects. (Tejera, 1920), no interior do Estado de Alagoas. Rev Inst REFERENCES Med Trop S Paulo 15: 171-178. Bagnoli E 1998. Projeto Araripe – 1ª parte: Conhecendo o Araripe: Machado EMM, Alvarenga NJ, Romanha AJ, Grisard EC 2000. Atividades produtivas da população. Turismo, Ecoturismo, A simplified method for sample collection and DNA isolation Turismo Cultural e Científico. In Projeto Araripe. [s.i]: [s.n.], for polymerase chain reaction detection of Trypanosoma p. 292-318. rangeli and Trypanosoma cruzi in triatomine vectors. Mem Inst Oswaldo Cruz 95: 836-866. Barrett TV, Oliveira TS 1977. A Trypanosoma indistinguishable from Trypanosoma rangeli in the haemolymph of Rhodni- Monteiro S, Kaz L 1994. Caatinga – Sertão Sertanejos, Alum- us domesticus from Brazil. 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UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI - URCA DEPARTAMENTO DE GEOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CONSTRUÇÃO CIVIL INSTITUTO TECNOLÓGICO DO CARIRI - ITEC GEOPARK ARARIPE

RECOMENDAÇÕES TÉCNICAS-CIENTÍFICAS REFERENTES AO PEDIDO DE DESAFETAÇÃO DA ZONA ESPECIAL AMBIENTAL DO RIO BATATEIRAS – ZEA 04

1. IDENTIFICAÇÃO:

SOLICITANTE: Ministério Público do Estado do Ceará - Promotoria de Justiça do Juizado Especial Cível e Criminal da Comarca de Crato-CE. REFERÊNCIA: Processo Civil nº 35/2016 – PJJECC/Crato/CE. ASSUNTO: Construção do Loteamento Brisa do Seminário na Zona Especial Ambiental do Rio Batateiras – ZEA 04 LOCAL: Zona Especial Ambiental – ZEA 04 – Rio Batateiras, Crato-CE.

2. PRELIMINARES

Antes da exposição de recomendações técnicas-científicas, é salutar realizar um breve histórico do processo de desafetação da ZEA 04. O Promotor de Justiça do DECON da Cidade do Crato, Doutor Thiago Marques Vieira, no âmbito da instrução do Processo Civil nº 35/2016 PJJEC/CRATO/CE (processo de desafetação de uma Zona Especial Ambiental – ZEA 04 – Rio Batateiras), convocou uma Audiência Pública tendo como fito colher os mais diversificados pontos de vista acerca da temática em tela de uma gama variada de entidades envolvidas com a questão ambiental no Crato. Segundo consta nos documentos apensados pela Secretaria de Meio Ambiente e Desenvolvimento Territorial do Crato (SEMADT), a Procuradoria

Geral do Munícipio opinou favoravelmente pela desafetação da ZEA (parecer nº 010512/2017). A Câmara de Vereadores também aprovou a desafetação da referida ZEA. Entretanto, após a aprovação pela Câmara de Vereadores, o Ministério Público foi provocado e, ao analisar todo o conjunto de documentos encaminhados, recomendou a suspensão da sanção por parte do Poder Executivo. A recomendação foi acatada e o processo de desafetação encontra- se atualmente em debate no âmbito do Ministério Público. Considerando o contexto exposto, Doutor Thiago Marques Vieira solicitou que a Universidade Regional do Cariri (URCA) constituísse uma equipe multidisciplinar para analisar os pareceres existentes e pontuar a sua posição acadêmica referente ao pedido de desafetação. É nesse macrocontexto que o presente parecer se insere. Salienta-se que o tempo foi curto e tudo ficou circunscrito a “breves recomendações”, uma vez que caberá ao Poder Público efetuar, eventualmente, estudos mais detalhados da área. Após vistoria ao local realizada em 13 de dezembro de 2018 pela equipe multidisciplinar da URCA, formada por professores do Departamento de Geografia, do Departamento de Biologia, do Departamento da Construção Civil, do Instituto Tecnológico do Cariri – ITEC e do Geopark Araripe, além de alguns acadêmicos do curso de Tecnologia da Construção Civil, foi possível constatar que grande parte da área territorial do loteamento está localizada dentro de uma Zona Especial Ambiental (ZEA 04 – Rio Batateiras), preconizada pela lei municipal nº 2590/2005 (Plano Diretor de Desenvolvimento Urbano - PDDU). Cabe destacar que quando da concepção das Zonas Especiais Ambientais foi contratada uma empresa de consultoria para fins de formulação do Plano Diretor da Cidade do Crato. Para conformar essas ZEAs foram realizados levantamentos e estudos pertinentes e essa definição não foi realizada à revelia da ciência ambiental, mas seguiu critérios técnicos e científicos. Entretanto, essa comissão informa que não teve acessos aos memorandos técnicos utilizados na definição dessas ZEAs. A Lei Municipal nº 2590/2005 (Plano Diretor de Desenvolvimento Urbano - PDDU), em seu artigo 65, conceitua ZEA como sendo “áreas sensíveis e de interesse ambiental, conformadas pelos parques urbanos, pelas áreas de preservação ecológica, em suas várias modalidades, pelas faixas de

2 preservação e proteção de todos os recursos hídricos no território da cidade do Crato”. O artigo 70 da mesma lei, por seu turno, estabelece as restrições de uso, a saber: “as atividades permitidas nas Zonas Especiais Ambientais são unicamente aquelas que tenham vínculo funcional direto com o objeto de sua criação”. A ZEA 04 foi assim definida, de modo geral, ao que tudo parece, tendo como fundamento a proteção dos recursos hídricos de superfície e subsuperfície, bem como a proteção de encostas íngremes, com inclinação superior a 45º, revestidas por vegetação e que ajuda na contenção de possíveis processos erosivos. Essa inclinação coloca parte da área do loteamento dentro da concepção de APP (Área de Preservação Permanente) insculpida no artigo 30 da Lei 12.651/2012 (Código Florestal), concebida como sendo “área protegida, coberta ou não por vegetação nativa, com a função ambiental de preservar os recursos hídricos, a paisagem, a estabilidade geológica e a biodiversidade, facilitar o fluxo gênico de fauna e flora, proteger o solo e assegurar o bem-estar das populações humanas”. A partir da visita in locu da equipe e das ponderações legais elencadas, conclui-se que é temerário, do ponto de vista ambiental e legal, a liberação total da área para fins de expansão urbana, especialmente de empreendimentos e edificações que tendam a proporcionar um adensamento populacional que promovam remoção de vegetação e ocupação de áreas íngremes mediante cortes e remoção do solo. Nesse sentido, partindo da premissa que boa parte da área não comporta uso e ocupação que comprometa severamente a dinâmica ambiental, propugna-se que sejam realizados estudos mais detalhados a fim de determinar quais áreas poderão ser efetivamente ocupadas para fins de loteamento e parte seja reservada para a preservação.

3. DESCRIÇÃO DO EMPREENDIMENTO

O empreendimento em tela projeta a construção de 1.367 lotes, para uma população estimada de 4.511 habitantes. Entretanto, análises mais específicas da dinâmica demográfica, direciona para uma ocupação muito maior do que a que está estimada. Ademais, o empreendimento propõe ser

3 implementado entre duas zonas francamente povoadas o que, por si só, indica a uma sinergia de ocupação tendo em vista o processo de interligação que será realizado pelo empreendimento. No que tange ao loteamento esclarece-se que ele recebeu parecer favorável dos técnicos da SEMADT (parecer técnico nº 106003791701, de 23/01/2017) e dos técnicos da Secretaria Estadual de Meio Ambiente (através da Coordenadoria de Biodiversidade – COBIO – parecer técnico nº 84, de 16/11/2016), uma vez que o empreendimento fica localizado a um raio de 1km da Unidade de Conservação Parque Estadual Sítio Fundão. Entretanto, os referidos pareceres não consideraram a fragilidade ambiental da área, especialmente no que se refere aos aspectos topográficos, vegetacionais e de recursos hídricos o que induziu o proprietário a fazer uso total da área.

4. DA VISTORIA E ANÁLISE DOS DOCUMENTOS DO LOTEAMENTO

Na sequência serão enumeradas algumas RECOMENDAÇÕES DE NATUREZA TÉCNICA E CIENTÍFICA no que concerne ao processo em tela.

4.1. Análise da documentação apresentada:

Após exaustiva análise da documentação do processo de Licenciamento Ambiental, referente à fase de Licença Previa do Loteamento Residencial denominado Brisa do Seminário, tecemos as seguintes considerações:

I) Há incongruência no que diz respeito à extensão da área do empreendimento, vejamos: o Requerimento de Licença (fl. 02) refere-se a uma área de 567.414,57 m2; o Parecer Técnico nº 84/2016 PARES Sitio Fundão (fl. 39) e o Memorial Descritivo (fl. 44) fazem alusão a uma área de 50,65ha; Já o Estudo de Viabilidade Ambiental cita uma área de 70.65ha. Consideramos de extrema necessidade a padronização dessas informações para melhor compreensão da área em análise.

II) O memorial descritivo (fl. 40) relata a existência de uma Área de Preservação Permanente que corresponde a 45.047,74m2, sendo esta, localizada às margens do Rio Batateira, conforme plantas apresentadas no processo. Em visita ao local foi possível constatar a existência de outras áreas nitidamente consideradas de preservação permanente. Quando considerada a Lei 12.651/2012, que define em seu Art 4º, inciso V, que as encostas ou partes destas com declividade superior a 45°, equivalente a 100% (cem por cento) na linha de maior declive, são áreas de preservação permanente, percebemos que tanto a documentação apresentada na fase de requerimento de licença prévia, quanto os estudos ambientais não identificaram a existência dessas áreas. Sendo que as mesmas são perceptíveis a “olho nu”, desse modo, sugerimos que seja realizado um apurado levantamento planialtimétrico nas áreas de acentuado declive para identificação de áreas com tais características, uma vez que essas não devem ser objeto de ocupação humana, dada a sua fragilidade ambiental no que diz respeito aos aspectos geológicos, a presença de representativa vegetação nativa e o risco de erosões em decorrência de futuras supressões vegetais, tanto para a área com declividade, quanto para as áreas circunvizinhas que poderão receber sedimentos destas, acarretando em uma série de problemas para a gestão pública;

III) Em petição apresentada pelo empreendedor (fl. 148) o mesmo alega que o projeto está encravado em área pouco sensível ambientalmente, fazendo referência ao parecer do Sr. José Arlindo Sampaio Siebra Junior, porém não aponta em que parte do Parecer Técnico essa informação encontra-se inserida. Não há como indicar que esta área seja pouco sensível sob o ponto de vista ambiental sem a profunda análise através do um instrumento adequado para tal, nessa perspectiva o empreendedor apresentou um Estudo de Viabilidade Ambiental (EVA) sobre o qual tecemos alguns comentários mais adiante;

IV) No que se refere ao Estudo de Viabilidade Ambiental (EVA), foi emitido um Termo de Referência para elaboração do mencionado documento, sendo este o conteúdo mínimo a ser abordado pelo profissional responsável por sua elaboração. Em relação ao EVA tecemos os seguintes comentários:

a) Na folha 195, ao tratar de Movimentação de Terra, o responsável pelo estudo afirma que “Não haverá movimentação de solo nas áreas de preservação permanente(APP) e áreas verdes presentes no terreno”, sendo importante ressaltar que existem lotes alocados em áreas nitidamente caracterizadas como APP, as quais não devem ser ocupadas por edificações, e mesmo que irregularmente possa vir a ocorrer, consequentemente haverá movimentação de terra;

b) No que tange ao item 5 (identifica análise e/ou avaliação dos impactos ambientais) o responsável pelo estudo optou pelo uso de uma Metodologia de Avaliação de Impactos Ambientais amplamente conhecida na literatura especializada, a Matriz de Interação, cuja principal característica desse método é buscar apresentar uma relação entre causa (ação do empreendimento) e efeito (impacto ambiental gerado). Uma vez que foi definida essa metodologia, seria de fundamental importância a apresentação da referida matriz contendo as ações do empreendimento e os referidos impactos por ela gerados. No entanto, o estudo não apresenta nenhuma matriz, embora faça referência a uma tabela em anexo (fl. 205), a mesma não se encontra na documentação disponibilizada, sendo impossível identificar quais são os 31 impactos ambientais avaliados no estudo. Não havendo, portanto, como essa equipe avaliar se os 31 impactos condizem com a realidade encontrada na visita em campo.

c) No item 5.1.2 (fl. 217) o EVA apresenta 10 ações impactantes do empreendimento, sendo necessária a apresentação dos impactos a elas relacionados, uma vez que essa é a proposta da matriz de Interação utilizada na avaliação de impactos ambientais. A simples

indicação de ações impactantes não é suficiente para representar a dinâmica da possível ocorrência de impactos ambientais em uma determinada área; d) No item 6 (fl. 219) o EVA apresenta 8 medidas mitigadoras para os impactos ambientais do empreendimento, no entanto, não faz referência a quais impactos estas estão relacionadas, sendo razoável a apresentação de, no mínimo, uma medida mitigadora para cada impacto ambiental identificado, sendo assim, faz-se necessária a indicação de pelo menos 31 medidas, relacionando-as aos seus respectivos impactos; e) No item considerações e recomendações (fl. 221) o estudo sugere que os resíduos sólidos orgânicos e não orgânicos sejam recolhidos sistematicamente pela “Prefeitura de Sobral”, consideramos não ser aplicável tal recomendação, uma vez que o empreendimento se encontra no município de Crato, localizado a cerca de 580 km daquele município. Esse fato, ainda, levanta dúvidas sobre a pertinência, em todos os termos técnicos e científicos disponibilizados no documento, dos estudos realizados e da área do empreendimento. Esse fato não é de menor importância, mas caberá ao responsável pela elaboração do EVA posteriores esclarecimentos. f) Quando da caracterização dos dados demográficos do município do Crato são utilizadas informações provenientes do site Wikipedia. É de consenso, no meio acadêmico, que essa referência não é plenamente confiável para embasar estudos de natureza técnica ou científica, uma vez que é um sítio eletrônico que é coletivamente construído, muitas vezes à revelia de dados confiáveis e que tenham passado pelo crivo dos pares no campo acadêmico. Salienta-se que os dados demográficos não são, no conjunto do estudo, de menor importância, haja vista que o projeto em tela se refere a um loteamento de cunho residencial/comercial que irá, certamente, elevar os indicadores de adensamento humano no local.

g) Os levantamentos atinentes à biodiversidade são vagos e insuficientes para que fosse realizada uma análise mais acurada do empreendimento na dinâmica da vida das espécies da fauna e flora que ali habitam. Nesse mesmo sentido, os dados referentes às alterações da dinâmica das águas superficiais, mormente no que tange à remoção de sedimentos e posterior acúmulo na calha do rio Batateiras, os dados são precários ou inexistentes. Nesse sentido, não é possível compreender o real impacto da remoção desses sedimentos, o que inviabiliza a possibilidade de mensurar o presumível assoreamento do referido curso d’água.

4.2. Análise sobre os levantamentos topográficos apresentados:

Após conferências de coordenadas, sobreposição de levantamentos e análise da poligonal foram feitas as seguintes considerações sobre a área em comento baseada nos mapas topográficos anexados ao processo:

I) Inicialmente foi feito uma conferência das coordenadas apresentadas em quadros de memoriais descritivos dos dois mapas anexos ao processo. Chegamos à seguinte conclusão:

a) Referente ao mapa anexo (fl. 17) processo n.º 201702021053, apresenta uma área de 204.645,61m², diante da conferência a partir das coordenadas do memorial descritivo, foi encontrada uma área de 204.692,43m² sendo um valor maior do que exposto no mapa, apresentando uma divergência de 46,82m². No referido mapa não constam informações relevantes sobre o levantamento, tais como:

✓ Tipo de equipamento topográfico utilizado; ✓ Tipo de software topográfico utilizado; ✓ Mapa de localização.

Figura 1 – Desenho obtido através das coordenadas contidas no mapa através do software AutoCad Gratuito Educacional

b) Referente ao mapa anexo (fl. 29) processo n.º 20160608103, apresenta uma área de 506.500,00m², diante da conferência a partir das coordenadas do memorial descritivo, foi encontrada uma área de 506.815,57m² sendo um valor maior do que exposto no mapa, apresentando uma divergência de 315,57m². No referido mapa não constam informações relevantes sobre o levantamento, tais como: ✓ Tipo de equipamento topográfico utilizado; ✓ Tipo de software topográfico utilizado; ✓ Mapa de localização; ✓ Inexistência do sistema de referência utilizado nas coordenadas; ✓ Divergência na coordenada de n.º 101 onde apresentou uma variação de localização para fora da área mapeada o que resultou na diferença da área total, conforme figura 2.

Figura 2 – Desenho obtido através das coordenadas contidas no mapa através do software AutoCad Gratuito Educacional Coordenada n.º 101

c) Após a junção dos arquivos foi observado que o lado Leste do mapa anexo (fl. 17) processo n.º 201702021053 está sobrepondo em vários trechos com o lado Oeste do mapa anexo (fl. 29) processo n.º 20160608103. Após análise das coordenadas apresentadas em ambos os mapas se conclui que há uma invasão e sobreposição de confrontantes nos lados Leste/Oeste, conforme figura 3.

Figura 3 – Junção das áreas 1 e 2

II) Do ponto de vista de implantação do loteamento chamamos atenção para o fato da grande possibilidade da ocorrência de problemas de ordem geológico-geotécnica, com produção de áreas de risco devido a erosão, assoreamento, acidentes associados a deslizamentos de taludes e encostas, pois grande parte da área é de encosta e não atende ao limite máximo de declividade compatível com a ocupação urbana, conforme preconizado na lei de uso e parcelamento do solo (Lei 6.766/1979, conhecida como Lei Lehmann), mais precisamente em seu artigo 3°, item III, que proíbe a ocupação urbana de encostas com declividade igual ou superior a 30% (~16,5º). III) Outro problema é a existência de mananciais de água que abastecem grande parte da cidade, além do rio Batateiras que passa nas proximidades, que com a ocupação da área loteada poderá causar a poluição desses mananciais em virtude da inexistência de sistema público de esgotamento sanitário o que obriga a solução a ser do tipo individual, ou seja, através do sistema de fossa séptica e sumidouro.

5. CONCLUSÃO

Com base nas informações descritas acima, pode-se concluir que existem falhas e inconsistências na documentação e na concepção da liberação da área total proposta para o loteamento. Assim, da forma que se encontra, representa sérios riscos ambientais. Desta forma, a equipe multidisciplinar sugere as seguintes recomendações:

a) Realizar estudos ambientais mais detalhados a cerca do processo de desafetação da ZEA 4, inclusive fazendo uso dos dados e levantamentos realizados quando da formulação do Plano Diretor; b) Preservar as áreas com inclinação superior a 30º e o respectivo componente vegetacional; c) Compatibilização das áreas territoriais do empreendimento nos diversos documentos que compõe o processo; d) Apresentar levantamento plano-altimétrico nas áreas de acentuado declive visando a identificação das áreas de encosta, declividade superior a 45°, nos termos do art. 4°, inciso V, da Lei 12.651/2002; e) Correções/Complementações ao Estudo de Viabilidade Ambiental – EVA, conforme detalhado no item 4.1, incisco IV, deste parecer; f) Informar qual o tipo de equipamento e softwares utilizados nos levantamento topográficos apresentados, assim como apresentar mapa de localização georreferenciado; g) Se manifestar sobre medidas a serem adotadas para atendimento ao art. 3°, inciso III da lei 6.766/1979; h) Se manifestar sobre solução para o tipo de esgotamento sanitário a ser utilizado nos lotes haja vista a existência de mananciais de água nas proximidades.

6. ENCERRAMENTO O presente parecer técnico possui 13 (treze) laudas de formato A4, digitadas de um só lado.

Crato/CE, 11 de janeiro de 2019.

______FRANCISCO EDMAR DE SOUSA SILVA

______JANEIDE FERREIRA ALENCAR DE OLIVEIRA

______JEFFERSON LUIZ ALVES MARINHO

______JOSÉ LAÉCIO DE MORAES

______NIVALDO SOARES DE ALMEIDA