Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Saccharothrix espanaensis, Saccharopolyspora erythraea und Kitasatospora sp. 152608
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von Diplom-Pharmazeutin und Apothekerin Yvonne-Isolde Schmidt-Bohli aus Temeschburg
2016 II
Dekan: Prof. Dr. Manfred Jung
Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Stefan Weber
Referent: Prof. Dr. Andreas Bechthold
Korreferent: Prof. Dr. Oliver Einsle
Drittprüfer: Prof. Dr. Rolf Schubert
Tag der Promotion: 30.06.2016 III
Teile dieser Arbeit wurden in den folgenden Publikationen und Konferenzbeiträgen veröffentlicht:
Wissenschaftliche Publikationen
Strobel T, Schmidt Y, Linnenbrink A, Luzhetskyy A, Luzhetska M, Taguchi T, Brötz E, Paululat T, Sta- sevych M, Stanko O, Novikov V, Bechthold A. Tracking down biotransformation to the genetic level: identification of a highly flexible glycosyltransferase from Saccharothrix espanaensis. Appl Environ Microbiol. 2013 Sep;79(17):5224–32.
Schmidt-Bohli YI, Schäffer M, Strobel T, Paululat T, Bechthold A. Identification of a novel N- glycosyltransferase from Saccharopolyspora erythraea. (in Bearbeitung)
Samra S, Tokovenko B, Kaszubowska M, Makitrynskyy R, Welle E, Schmidt-Bohli Y, Gross S, Paululat T, Luzhetskyy A, Bechthold A. Insight into Saccharothrix espanaensis grown in different media: Tran- scriptome and natural product analysis. (Eingereicht)
Poster
Samra S, Schmidt Y, Kaszubowska M, Strobel T, Paululat T, Bechthold A. Saccharothrix espanaensis – a promising strain for production and biotransformation of natural products. DPhG Annual Meeting, Freiburg, 09. – 11. Oktober 2013
IV
Meiner Familie gewidmet.
V
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ...... 11
2 Einleitung ...... 13
2.1 Aktinomyceten – bemerkenswerte Bodenbakterien ...... 13
2.1.1 Aktinomyceten als wichtige Naturstoffproduzenten ...... 13
2.1.2 Der Saccharomicin-Produzent Saccharothrix espanaensis ...... 14
2.1.3 Der Erythromycin-Produzent Saccharopolyspora erythraea ...... 16
2.1.4 Der Simocyclinon-Produzent Kitasatospora sp. 152608 ...... 18
2.2 Glykosylierte Naturstoffe ...... 20
2.2.1 Bedeutung glykosylierter Naturstoffe ...... 20
2.2.2 Glykosyltransferasen als enzymatische Werkzeuge ...... 21
2.2.3 Prinzip der kombinatorischen Biosynthese ...... 23
2.3 Resveratrol als vielseitiges Polyphenol ...... 26
2.4 Zielsetzung der Arbeit ...... 27
3 Material und Methoden ...... 29
3.1 Labor- und Analysengeräte ...... 29
3.2 Software, Datenbanken und Internetservices ...... 30
3.3 Chemikalien und Verbrauchsmittel ...... 30
3.3.1 Chemikalien, Medienbestandteile und Antibiotika ...... 30
3.3.2 Organische Lösungsmittel ...... 33
3.3.3 Enzyme und Kits ...... 33
3.3.4 Sonstige Materialien ...... 34
3.4 Puffer und Lösungen ...... 35
3.4.1 Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen und Dauerkulturen ...... 35
3.4.2 Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion in Escherichia coli...... 35
3.4.3 Lösungen und Puffer zur Isolierung von Plasmid-DNA mittels Alkalischer Lyse ...... 35
3.4.4 Lösungen und Puffer zur Isolierung genomischer DNA aus Aktinomyceten-Stämmen . 36
3.4.5 Lösungen zur Isolierung der Gesamt-DNA aus Aktinomyceten-Stämmen ...... 36 VI
3.4.6 Lösungen und Puffer zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese ...... 36
3.4.7 Lösungen und Puffer für die Proteinaufreinigung ...... 37
3.4.8 Lösungen und Puffer zur Herstellung von SDS-PAGE-Gelen sowie für die Durchführung der diskontinuierlichen SDS-PAGE ...... 38
3.4.9 Lösungen und Puffer für die Durchführung des in vitro Aktivitätsassays zur Saccharomicin-Biosynthese...... 39
3.4.10 Lösungen und Puffer für die Durchführung des in vitro Aktivitätsassays SACE_3599 ... 40
3.4.11 Lösungen und Puffer für die Durchführung des in vitro Aktivitätsassays zur Bestätigung der Konformation von U3-7 ...... 40
3.4.12 Lösungen für in vivo Biotransformationsexperimente...... 40
3.4.13 Lösungen für die Aufreinigung niedermolekularer Biotransformationsprodukte ...... 41
3.5 Nährmedien...... 41
3.6 Antibiotika ...... 42
3.7 Stämme ...... 43
3.7.1 Escherichia coli-Stämme ...... 43
3.7.2 Aktinomyceten-Stämme ...... 43
3.7.3 Sonstige verwendeten Stämme ...... 44
3.8 Vektoren und Plasmide ...... 44
3.8.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide ...... 44
3.8.2 In dieser Arbeit erstellte Plasmide ...... 46
3.9 Mikrobiologische Methoden ...... 47
3.9.1 Kultivierung von Escherichia coli ...... 47
3.9.2 Herstellung von Escherichia coli-Dauerkulturen ...... 48
3.9.3 Kultivierung von Aktinomyceten-Stämmen ...... 48
3.9.4 Erstellung von Aktinomyceten-Dauerkulturen ...... 48
3.9.5 Übertragung von DNA auf Escherichia coli mittels Transformation ...... 49
3.9.6 Blau-Weiß-Selektion in Escherichia coli ...... 51
3.9.7 Intergenerische Konjugation ...... 51
3.9.8 Markerfreie Integration ...... 53 VII
3.9.9 Bestimmung der Trockenmasse ...... 54
3.10 Molekularbiologische Methoden ...... 54
3.10.1 Plasmidisolierung ...... 54
3.10.2 Isolierung genomischer DNA aus Aktinomyceten-Stämmen ...... 55
3.10.3 Isolierung der Gesamt-DNA aus Aktinomyceten-Stämmen ...... 56
3.10.4 Polymerase-Kettenreaktion ...... 56
3.10.5 Restriktion von DNA durch Restriktionsendonukleasen ...... 58
3.10.6 Dephosphorylierung mit Hilfe der Antarktischen Phosphatase ...... 58
3.10.7 Auffüllreaktion mit Hilfe der T4-DNA-Polymerase ...... 59
3.10.8 Ligation ...... 59
3.10.9 Agarose-Gelelektrophorese ...... 59
3.10.10 Sequenzierung von Plasmid-DNA ...... 60
3.11 Klonierung von Plasmiden ...... 60
3.11.1 Klonierung von Saccharomicin-Biosynthese-Genen ...... 60
3.11.2 Klonierung von Plasmiden zur heterologen Proteinproduktion ...... 61
3.11.3 Klonierung des Inaktivierungskonstruktes pKCΔsace_3599 ...... 63
3.11.4 Klonierung des Komplementierungskonstruktes pTOSz-sace_3599 ...... 63
3.11.5 Klonierung von pTOS-ermE* und pTOS-Talose ...... 63
3.11.6 Verwendete Primer und PCR-Bedingungen ...... 64
3.12 Geninaktivierung mittels Doppelcrossover ...... 66
3.12.1 Erstellung des Inaktivierungskonstruktes pKCΔsace_3599 ...... 66
3.12.2 Gewinnung und Nachweis einer Singlecrossover-Mutante ...... 66
3.12.3 Gewinnung und Nachweis einer Doppelcrossover-Mutante ...... 67
3.13 Präparation, Aufreinigung und Analytik von Proteinen ...... 68
3.13.1 Heterologe Proteinsynthese in Escherichia coli ...... 68
3.13.2 Zellaufschluss ...... 69
3.13.3 Affinitätschromatographie ...... 69
3.13.4 Gelfiltration ...... 73 VIII
3.13.5 Spaltung von Proteinen mittels TEV-Protease ...... 74
3.13.6 Aufkonzentrierung von Proteinlösungen durch Zentrifugation ...... 74
3.13.7 Diskontinuierliche Sodiumdodecyl-Polyacrylamidgelelektrophorese ...... 75
3.13.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen ...... 75
3.13.9 In vitro Aktivitätsassays zur Saccharomicin-Biosynthese ...... 76
3.13.10 In vitro Aktivitätsassays SACE_3599 ...... 77
3.14 Kristallographische Methoden ...... 79
3.14.1 Allgemein ...... 79
3.14.2 Initial Screens ...... 79
3.15 Isolierung und Analytik niedermolekularer Naturstoffe ...... 79
3.15.1 Biotransformationsstudien und Naturstoffextraktion aus Bakterienkulturen ...... 79
3.15.2 Festphasenextraktion ...... 81
3.15.3 Dünnschichtchromatographie ...... 82
3.15.4 Säulenchromatographie mittels Sephadex LH-20 ...... 82
3.15.5 Analytische HPLC-MS ...... 83
3.15.6 Semi-präparative HPLC zur Aufreinigung der Resveratrol-Derivate ...... 85
3.15.7 In vitro Aktivitätsassays zur Bestätigung der Konformation von U3-7...... 85
3.15.8 NMR-Spektroskopie ...... 86
3.15.9 Untersuchung der antibiotischen Aktivität/Agardiffusionstest ...... 86
4 Ergebnisse ...... 89
4.1 Untersuchungen zur Saccharomicin-Biosynthese ...... 89
4.1.1 Heterologe Expression von Biosynthese-Genen des Saccharomicin-Aglykons...... 89
4.1.2 Biochemische Untersuchungen von Sam7 und Sam36 ...... 91
4.2 Proteinpräparation der Glykosyltransferase Ses60310 aus Saccharothrix espanaensis 94
4.2.1 Präparation und Aufreinigung von Ses60310 mit N-terminalem His6-tag ...... 94
4.2.2 Proteinspaltung mittels TEV-Protease ...... 96
4.2.3 Präparation und Aufreinigung von Ses60310 mit Streptavidin-Affinitäts-tag ...... 97
4.3 Biotransformation von trans-Resveratrol ...... 99 IX
4.3.1 Untersuchungen der Biotransformationsaktivität von trans-Resveratrol mit der flexiblen Glykosyltransferase Ses60310 aus Saccharothrix espanaensis ...... 99
4.3.2 Aufreinigung der Biotransformationsprodukte ...... 101
4.3.3 Untersuchung der antibiotischen Aktivität der Biotransformationsprodukte ...... 102
4.4 Identifizierung des N-Glykosyltransferase-Gens aus Saccharopolyspora erythraea ... 102
4.4.1 Genom-Analyse zur Identifizierung möglicher Kandidaten-Gene ...... 103
4.4.2 Verwendung der heterologen Testsysteme Streptomyces albus Rham und Streptomyces albus Gluc zur Identifizierung des N-Glykosyltransferase-Gens...... 107
4.4.3 Überprüfung der Aktivität von SACE_3599 in Saccharopolyspora erythraea ...... 110
4.4.4 In silico Analyse des Genomabschnitts in unmittelbarer Nähe des N- Glykosyltransferase-Gens sace_3599 ...... 113
4.5 Biochemische Untersuchungen der N-Glykosyltransferase SACE_3599 ...... 115
4.5.1 Präparation und Aufreinigung von SACE_3599 ...... 115
4.5.2 In vitro Aktivitätsassays von SACE_3599 ...... 118
4.5.3 Untersuchung der Antibiotika-Resistenz...... 120
4.6 Untersuchungen zur Talose-Glykosyltransferase aus Kitasatospora sp. 152608 ...... 120
4.6.1 in silico Analyse zur Biosynthese von Talose ...... 121
4.6.2 Heterologes Testsystem zur Produktion von Talose ...... 122
4.6.3 Genom-Analyse zur Identifizierung möglicher Talose-Glykosyltransferase-Kandidaten- Gene in Kitasatospora sp. 152608 ...... 124
5 Diskussion und Ausblick ...... 131
5.1 Saccharomicin-Biosynthese...... 131
5.2 Proteinpräparation der flexiblen Glykosyltransferase Ses60310 ...... 133
5.3 Biotransformation von trans-Resveratrol ...... 135
5.4 Identifizierung und Charakterisierung der N-Glykosyltransferase SACE_3599 aus Saccharopolyspora erythraea ...... 136
5.5 Identifizierung der Talose-Glykosyltransferase aus Kitasatospora sp. 152608 ...... 141
6 Literaturverzeichnis ...... 145
7 Anhang ...... CLXI X
7.1 Plasmidkarten ...... CLXI
7.1.1 pET21a-7665-STN ...... CLXI
7.1.2 pET21a-7665-TSC ...... CLXI
7.1.3 pET21a-sam7-C-his-TEV ...... CLXII
7.1.4 pET21a-sam36-C-his-TEV ...... CLXII
7.1.5 pET28a-sace_3599-N-his ...... CLXIII
7.1.6 pET28a-sam7-N-his ...... CLXIII
7.1.7 pET28a-sam36-N-his ...... CLXIV
7.1.8 pKCΔsace_3599 ...... CLXIV
7.1.9 pTOS-ermE*...... CLXV
7.1.10 pTOS-Talose ...... CLXV
7.1.11 pTOSz-sace_3599 ...... CLXVI
7.1.12 pUWL-A-sam36 ...... CLXVI
7.1.13 pUWL-A-sam36+7 ...... CLXVII
7.1.14 pUWL-A-sam7 ...... CLXVII
7.2 NMR-Daten ...... CLXVIII
7.2.1 U3-7 ...... CLXVIII
7.3 Abkürzungsverzeichnis ...... CLXIX
7.4 Abbildungsverzeichnis ...... CLXXIII
7.5 Tabellenverzeichnis ...... CLXXVI
8 Danksagung ...... CLXXIX
9 Bildungsgang ...... CLXXXI
11 Zusammenfassung
1 Zusammenfassung Diese Arbeit befasst sich mit den drei Aktinomyceten Saccharothrix espanaensis DSM 44229, Sac- charopolyspora erythraea NRRL 23338 und Kitasatospora sp. 152608.
Saccharothrix espanaensis ist dazu in der Lage, die antibiotisch aktiven Saccharomicine A und B zu produzieren. Dabei handelt es sich um vielversprechende Substanzen mit Aktivität gegen multi- resistente Keime. Darüber hinaus ist Saccharothrix espanaensis für seine Biotransformationsaktivität bekannt. Der Stamm kann während der Kultivierung zugegebene Xenobiotika aufnehmen und diese Substanzen beispielsweise durch die Aktivität seiner flexiblen Glykosyltransferase Ses60310 mit Rhamnose konjugieren, bevor sie in biotransformierter Form wieder in das Kulturmedium abgegeben werden. Das Wissen über die Substratflexibilität von Ses60310 wurde im Rahmen dieser Arbeit durch Fütterungsexperimente mit dem vielfältig biologisch aktiven Polyphenol trans-Resveratrol erweitert. Des Weiteren wurden Versuche zur Optimierung der Proteinaufreinigung von Ses60310 durchge- führt. Ebenso wurden Experimente zur Bestätigung des postulierten Biosyntheseweges des Sac- charomicin-Aglykons durchgeführt.
Saccharopolyspora erythraea produziert das klinisch relevante Antibiotikum Erythromycin A. Weiter- hin ist Saccharopolyspora erythraea dazu in der Lage, das gefütterte Xenobiotikum 1,4- Diaminoanthrachinon N-glykosidisch mit Glucose zu verknüpfen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde durch Geninaktivierungs- und Komplementierungsversuche SACE_3599 als verantwort- liche N-Glykosyltransferase identifiziert. Das Enzym SACE_3599 wurde außerdem heterolog in E- scherichia coli produziert, aufgereinigt und für in vitro Aktivitätsassays verwendet. Das Protein kata- lysiert in vitro die Reaktion von 1,4-Diaminoanthrachinon und TDP-Glucose zu dem glucosylierten 1,4-Diaminoanthrachinon-Derivat und TDP.
Kitasatospora sp. 152608 produziert die zytostatisch wirksamen Simocyclinon D-Antibiotika. Auch Kitasatospora sp. 152608 kann Xenobiotika transformieren, indem gefüttertes Alizarin mit dem sel- tenen Zucker 6-deoxy-Talose verknüpfen wird. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Genomse- quenz von Kitasatospora sp. 152608 analysiert um Kandidaten-Gene für die Talose-übertragende Glykosyltransferase zu identifizieren. In Vorbereitung der experimentellen Identifizierung der Talose- Glykosyltransferase wurde ein heterologes Testsystem etabliert.
Bei den Glykosyltransferasen aus Saccharothrix espanaensis, Saccharopolyspora erythraea und Kitasatospora sp. 152608 handelt es sich jeweils um wertvolle Enzyme, die als Werkzeuge in der en- zymatischen Katalyse zur Generierung neuer glykosylierter Sekundärmetaboliten eingesetzt werden können. Aus diesem Grund stellen die Glykosyltransferasen, die im Rahmen dieser Arbeit identifi-
12 Zusammenfassung ziert, aufgereinigt beziehungsweise charakterisiert wurden, einen großen Gewinn unter anderem für die Freiburger Glykosyltransferase-Toolbox dar.
13 Einleitung 2 Einleitung
2.1 Aktinomyceten – bemerkenswerte Bodenbakterien Vertreter der Gattungen Saccharothrix, Saccharopolyspora, Streptomyces und Kitasatospora gehören zu der Ordnung der Actinomycetales (Aktinomyceten). Bei den Aktinomyceten handelt es sich um Gram-positive, obligat aerobe, ubiquitär im Boden sowie dem Meer vorkommende und zumeist apa- thogene Bakterien mit einem hohen GC-Gehalt von 61-80 % (1).
Aktinomyceten weisen einige bemerkenswerte Eigenschaften auf. Als Bodenbakterien sind sie an dem Abbau komplexer biologischer Polymere pflanzlichen und tierischen Ursprungs beteiligt (2–4). In ihrem Lebenszyklus durchlaufen sie unterschiedliche morphologische Differenzierungsstufen. So wird unter guten Wachstumsbedingungen ein fädiges Substratmycel ausgebildet. Bei Nährstoffmangel oder anderen Stressbedingungen wird ein Luftmycel ausgebildet. Durch Abschnürung werden daraus Sporen als Überdauerungsform freigesetzt (5). In Form von Sporen ist ein Überleben im Boden von bis zu 70 Jahren möglich (6). Durch Auskeimen der Sporen zu Substratmycel schließt sich der Lebens- zyklus. Das Genom von Aktinomyceten ist meist linear (7) und mit 8 Mb bis 10 Mb von besonderer Größe (8–11). Die hier untersuchten Vertreter Saccharothrix espanaensis und Saccharopolyspora erythraea stellen insofern eine Ausnahme dar, da sie ein zirkuläres Genom besitzen (12,13). Strepto- myces albus hat hingegen mit 6,8 Mb für einen Aktinomyceten ein vergleichsweise kleines Genom (14).
2.1.1 Aktinomyceten als wichtige Naturstoffproduzenten Aktinomyceten sind bekannt für ihr Potenzial, bioaktive Naturstoffe zu produzieren. Dies lässt sich eindrucksvoll dadurch belegen, dass mehr als 60 % aller bekannten aktiven Sekundärmetaboliten von Aktinomyceten gebildet werden (15). Die bioaktiven Metaboliten gehören dem Sekundärstoffwech- sel an und sind im Gegensatz zu den Produkten des Primärstoffwechsels nicht essenziell für das Wachstum der Bakterienzellen, können jedoch unter gewissen Bedingungen einen Selektionsvorteil darstellen. Es ist anzumerken, dass Gene, die dem selben Biosyntheseweg angehören, häufig inner- halb des Genoms in einem Bereich konzentriert vorliegen, dem sogenannten Biosynthese-Gen- Cluster (16). Dies erleichtert die Erforschung dieser Biosynthesewege. Die gebildeten Sekundärstoffe weisen eine große Diversität auf und fungieren in Bakterien beispielsweise als Kommunikationsmit- tel, Ionophore, Antibiotika, Antimykotika, Insektizide sowie Effektoren der Differenzierung (17). Bei- spiele für klinisch relevante Antibiotika sind Erythromycin (Saccharopolyspora erythraea), Kanamycin (Streptomyces kanamyceticus), Streptomycin (Streptomyces griseus) und Vancomycin (Amycolotopsis orientalis) (18,19). Über die antibiotische Aktivität hinaus finden die produzierten Naturstoffe vielsei- tige klinische Anwendung als potente Arzneistoffe. Als Antimykotika eingesetzt werden unter ande-
14 Einleitung rem Amphotericin B (Streptomyces nodosum) und Nystatin (Streptomyces noursei). In der Krebsthe- rapie finden beispielsweise die Zytostatika Daunorubicin (Streptomyces peucetius) und Bleomycin (Streptomyces verticillus) Verwendung (18,19). Als Immunsuppressiva eingesetzt werden neben an- deren Rapamycin (Streptomyces hygroscopicus) und Tacrolimus (Streptomyces tsukubaensis) (18,19). Aufgrund seiner vielfältigen Talente wählte die Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikro- biologie (VAAM) Streptomyces zu der Mikrobe des Jahres 2016 (20). Die produzierten Sekundärme- taboliten werden dabei besonders hervorgehoben. So erhielt Streptomyces zwei Nobelpreise. Den ersten Nobelpreis 1952 erhielt Selman A. Waksman für die Entdeckung des Antibiotikums Strepto- mycin und den zweiten Nobelpreis 2015 erhielten Satoshi Omura und William C. Campbell für die Entdeckung des gegen die Infektionskrankheiten Flussblindheit und Elephantiasis eingesetzten Avermectins (Streptomyces avermitilis) (21–23).
2.1.2 Der Saccharomicin-Produzent Saccharothrix espanaensis Bei Saccharothrix espanaensis (S. espanaensis) handelt es sich um einen Aktinomyceten aus der Fa- milie der Pseudonocardiaceae. Der Stamm S. espanaensis wurde aus einer Bodenprobe im spani- schen Puerto Llano isoliert. Das Genom von S. espanaensis DSM 44229 wurde 2012 sequenziert (13).
Der Stamm produziert das antibiotisch aktive LL-C19004 (24). Es wurde gezeigt, dass es sich bei LL- C19004 nicht um eine einzelne Substanz, sondern um eine Mischung handelt, die Saccharomicin A und B enthält (25). Die einzigartige Struktur der Saccharomicine besteht aus einem N-(m,p- Dihydroxycinnamoyl)-taurin-Aglykon, welches mit einer Zuckerkette, bestehend aus 17 Desoxyein- heiten, verknüpft ist. Die Strukturformel ist in Abbildung 2.1 dargestellt. Das Aglykon wird aus dem Phenylpropanoid trans-Kaffeesäure aufgebaut, welches über eine Amidbindung mit der Aminosul- fonsäure Taurin verknüpft ist. Bei den Desoxyhexose-Einheiten handelt es sich um fünf Fucose- Einheiten, vier Saccharosamin-Einheiten, eine Rhamnose-Einheit, vier 4-epi-Vancosamin-Einheiten und zwei Digitoxose-Einheiten. Saccharomicin A und B unterscheiden sich nur durch das Zuckermole- kül an Position 10 der verzweigten Zuckerkette. Während Saccharomicin A an dieser Position eine Rhamnose trägt, besitz Saccharomicin B an der Stelle eine Digitoxose. Die beiden 4-epi-Vancosamin- Einheiten an Position 9 und 17 der Zuckerkette liegen protoniert vor, während die Sulfonsäuregruppe des Aglykons sowie die Sulfatgruppe der Fucose-Einheit an Position 1 der Zuckerkette deprotoniert vorliegen.
15 Einleitung
Abbildung 2.1: Strukturformeln der Saccharomicine A und B Saccharomicin A besitzt an Position 10 der Zuckerkette eine Rhamnose-Einheit (R1 = R3 = OH, R2 = H), während Sac- charomicin B an dieser Stelle eine Digitoxose-Einheit trägt (R1 = R3 = H, R2 = OH). Fuc, D-Fucose; Sac, D-Saccharosamin; Rha, L-Rhamnose; Eva, L-4-epi-Vancosamin; Dig, L-Digitoxose.
Es wurde postuliert, dass das Vorliegen als vierfach geladenes Zwitterion zu der Ausbildung zweier makromolekularer Schleifen führt (25). Als Wirkmechanismus beschrieben ist die Integration dieser Schleifen in die bakterielle Zellmembran, das die Zelllyse zur Folge hat (26). Darüber hinaus werden DNA-, RNA- und Proteinbiosynthese unspezifisch gehemmt. Eine antibiotische Aktivität ist gegen multi-resistente Staphylococcus aureus-Stämme sowie Vancomycin-resistente Enterokokken be- schrieben (25,26), weshalb die Saccharomicine in einer Zeit ständig zunehmender Antibiotika- Resistenzen einen wertvollen Arzneistoff darstellen könnten. Problematisch für eine systemische Anwendung sind jedoch die geringe Hydrolyse-Stabilität im Sauren sowie eine geringe therapeutische Breite. Aufgrund der guten Wasserlöslichkeit, bedingt durch die Zuckerreste, wurde die topische Anwendung vorgeschlagen (26). Ein klinisch angewendetes Arzneimittel ist bislang nicht zugelassen.
Dr. M. Berner gelang die Identifizierung des Saccharomicin-Clusters sowie der Nachweis der Funktio- nalitäten von Sam8 und Sam5 (27). Durch Expression von sam8 und sam5 in dem heterologen Wirt Streptomyces fradiae XKS konnte die Produktion von trans-Kaffeesäure nachgewiesen werden. Das Gen sam8 codiert demnach für eine Tyrosin-Ammoniak-Lyase und sam5 für eine 4-Coumarat-3- Hydroxylase. Dr. T. Strobel und N. Gehring konnten die Kaffeesäureproduktion in S. albus reproduzie- ren (28,29). Die weiteren Schritte der Synthese des Saccharomicin-Aglykons wurden von Dr. M. Ber- ner und Dr. T. Strobel wie folgt postuliert: Sam7, eine Acetyl-CoA-Ligase, aktiviert trans-Kaffeesäure mit Acetyl-CoA zu Kaffeoyl-CoA, welches wiederum durch Sam36, eine Penicillin-Acylase, mit Taurin zu dem Saccharomicin-Aglykon verknüpft wird (27,29).
Es konnte gezeigt werden, dass S. espanaensis nicht nur der Produzent einer neuartigen Antibiotika- Klasse ist, sondern auch eine besondere Biotransformationsaktivität besitzt. Durch in vivo Fütte-
16 Einleitung rungsexperimente mit Xenobiotika wurde die Biotransformationsaktivität untersucht. Xenobiotika sind definiert als chemische Verbindungen, die dem Organismus fremd sind. Zur Untersuchung der Biotransformationsaktivität von S. espanaensis wurden Anthrachinone und Aminoanthrachinone wie beispielsweise Alizarin, Emodin, 1,4-Diaminoanthrachinon (U3) oder 2-Aminoanthrachinon (U8) aber auch andere niedermolekulare Metaboliten wie dem Flavonoid Quercetin oder dem Aminocoumarin Novobiocinsäure verwendet (29,30). Es wurde nachgewiesen, dass der Stamm die gefütterten Xeno- biotika O-glykosidisch mit Rhamnose verknüpft. Bei den Fütterungen mit Alizarin und Emodin konn- ten auch zweifache Rhamnosylierungen der Substrate nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde bei einigen Substraten wie Alizarin, 1-Amino-4-chloranthrachinon, Novobiocinsäure, U3 und U8 eine Hydroxylierung, teilweise mit anschließender Rhamnosylierung, beobachtet. Die Biotransformations- aktivität von S. espanaensis beruht somit nicht nur auf der Rhamnosylierung sondern auch auf der Hydroxylierung der gefütterten Xenobiotika.
Die beobachtete Glykosylierungsaktivität ist außergewöhnlich, da bislang für keinen anderen Akti- nomyceten solch eine große Substrat-Flexibilität beschrieben wurde. Dr. T. Strobel konnte nachwei- sen, dass die Glykosyltransferase (GT) Ses60310 für die Glykosylierungsaktivität in S. espanaensis verantwortlich ist (29).
Bei der GT Ses60310 handelt es sich um eine GT der CAZy-Familie 1. Somit gehört sie der Strukturfa- milie GT-B an und der Reaktionsmechanismus der Zuckerübertragung ist invertierend (vergleiche 2.2.2). Neben der Substrat-Flexibilität weist Ses60310 auch eine gewisse Zucker-Donor-Flexibilität auf. So wird neben dem Desoxyzucker L-Rhamnose auch der Didesoxyzucker L-Olivose übertragen (29).
Aus ihrer großen Substrat-Flexibilität leitet sich die Einsatzmöglichkeit in der kombinatorischen Bio- synthese (vergleiche 2.2.3) und somit ihr möglicher Nutzen für die Synthese neuer glykosylierter Na- turstoff-Derivate ab.
2.1.3 Der Erythromycin-Produzent Saccharopolyspora erythraea Bei Saccharopolyspora erythraea (S. erythraea) handelt es sich um einen Aktinomyceten aus der Fa- milie der Pseudonocardiaceae. Die Art S. erythraea wurde 1987 aufgrund der Zellwandzusammenset- zung der Gattung Saccharopolyspora zugeordnet, nachdem sie vormals unter dem Artnamen Strep- tomyces erythraeus der Gattung Streptomyces zugeordnet war (31). Das Genom des ursprünglichen Stammes S. erythraea NRRL 23338 wurde 2007 sequenziert (12).
S. erythraea ist dazu in der Lage, das antibiotisch aktive Erythromycin A zu produzieren. Bei Erythro- mycin A handelt es sich um ein 14-gliedriges Makrolid mit den Desoxyzuckern L-Cladinose an C4- Position und D-Desosamin an C6-Position. Die Strukturformel ist in Abbildung 2.2 dargestellt. Eryth-
17 Einleitung romycin stellt ein Breitbandantibiotikum dar, welches therapeutisch gegen Infektionen mit Gram- positiven Bakterien (Staphylokokken, Streptokokken), Gram-negativen Bakterien (Neisserien), Zell- wandlosen (Chlamydien, Mykoplasmen) und Schraubenförmigen (Borrelien) bei Infektionen im Hals-, Nasen- und Ohrenbereich, Infektionen der unteren Atemwege, Infektionen der Haut sowie Infektio- nen der Geschlechtsorgane eingesetzt wird (32).
Abbildung 2.2: Strukturformel des Makrolid-Antibiotikums Erythromycin A
Neuere semisynthetische Erythromycin A-Derivate wie Clarithromycin, Azithromycin und Roxithro- mycin besitzen ein erweitertes Wirkspektrum sowie verbesserte pharmakologische Eigenschaften. Unter anderem besitzen sie eine bessere Säurestabilität und eine konstantere gastrointestinale Ab- sorption (33–35).
Makrolidantibiotika greifen an der 50S-Untereinheit der bakteriellen 70S-Ribosomen an. Durch Hemmung der Translokation der Peptidyl-t-RNA von der Akzeptorstelle zu der Donorstelle wird die Proteinbiosynthese behindert. Durch diese Arretierung der Proteinbiosynthese kommt es zu einem bakteriostatischen Effekt der Makrolide (36). Durch Methylierung der Makrolid-Bindungsstelle der ribosomalen RNA kommt es zu der Ausbildung einer Resistenz gegen Makrolide sowie den ebenfalls antibiotisch wirksamen Lincosamiden und Streptograminen (32). Zum Selbstschutz der Makrolid- produzierenden Bakterien ist ein weiterer Mechanismus der Resistenzvermittlung bekannt. Mittels Glykosylierung der Makrolid-Antibiotika durch sogenannte Makrolid-GTs kommt es zu einer Inaktivie- rung des produzierten, antibiotisch aktiven Sekundärmetaboliten und somit zur Verhinderung einer Selbst-Vergiftung (37–40). Durch die Aktivität einer Glykosidase kann es zu der Wiederherstellung der antibiotischen Aktivität kommen (40).
Im Rahmen ihrer Promotion konnte Dr. T. Strobel nachweisen, dass S. erythraea ebenfalls Biotrans- formationsaktivität besitzt, da der Stamm supplementierte Xenobiotika mit einem Zucker-Molekül verknüpfen kann (29). Bei der Fütterung mit Alizarin konnte das aus S. espanaensis bekannte Bio-
18 Einleitung transformationsprodukt 2-O-α-L-Rhamnosylalizarin nachgewiesen werden. Anders jedoch als S. espanaensis besitzt S. erythraea keine Hydroxylierungsaktivität. Bei Fütterung mit dem Amino- anthrachinon-Derivat U3 kam es aus diesem Grund nicht zu einer Hydroxylierung mit anschließender Rhamnosylierung. Wie erhofft konnte bei der Fütterung von U3 ein N-glukosyliertes Produkt (U3-8) nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde das N-acetylierte U3-Derivat U3-21 entdeckt. Somit besitzt S. erythraea Rhamnosylierungs-, Glucosylierungs- sowie Acetylierungsaktivität.
2.1.4 Der Simocyclinon-Produzent Kitasatospora sp. 152608 Bei der Art Kitasatospora sp. 152608 handelt es sich um einen Aktinomyceten der Familie Streptomy- cetaceae. Der Stamm ist dazu in der Lage, Simocyclinone zu produzieren (41). Simocyclinone gehören zu den Angucyclinen und wurden ursprünglich in Streptomyces antibioticus Tü6040 entdeckt (42). Die Angucycline stellen Antibiotika mit unsymmetrischem Tetrazyklin-Ring dar. Simocyclinon D8 (SD8; siehe Abbildung 2.3) ist ein potenter Vertreter der Simocyclinone mit antibakterieller sowie zytostati- scher Aktivität (43,44).
Abbildung 2.3: Strukturformel von Simocyclinon D8
Die biologische Aktivität der Simocyclinone beruht auf der Inhibierung der DNA-Gyrase durch die Verhinderung der Bindung der DNA an das Enzym (45–47).
Das Biosynthese-Gen-Cluster zur Produktion von SD8 in S. antibioticus Tü6040 konnte bereits im Jahr 2002 kloniert und annotiert werden (48,49). Die von Kitasatospora sp. 152608 produzierten Simocyc- linone SD9, SD10 und SD11 weisen große strukturelle Ähnlichkeiten zu SD8 auf. Die Simocyclinone SD8, SD9, SD10 sowie SD11 unterscheiden sich lediglich geringfügig in den Substituenten an Position 1 und 3 des Tetrazyklin-Rings.
Anhand der Genomsequenz von Kitasatospora sp. 152608 konnte dessen Simocyclinon-Biosynthese- Cluster identifiziert werden (41). Die Amycomycine C und D (siehe Abbildung 2.4) entstehen in Kitasatospora sp. 152608 als Shunt-Produkte der Simocyclinon-Synthese (50). Aus den Strukturfor- meln wird ersichtlich, dass der seltene Zucker 6-deoxy-L-Talose enthalten ist.
19 Einleitung
Abbildung 2.4: Strukturformeln der Amycomycine C und D
Die 6-deoxy-L-Talose stellt ein Epimer der L-Rhamnose dar. Die beiden Zucker unterscheiden sich lediglich in ihrer Konfiguration an der C4-Position. Mögliche Biosynthesewege von dTDP-6-deoxy-L- Talose ausgehend von Glucose-1-phosphat sind aus Kitasatospora kifunensis (51), Actinobacillus acti- nomycetecomitans (52) und Burkholderia thailandensis (53) bekannt und zusammenfassend in Abbil- dung 2.5 dargestellt.
Abbildung 2.5: Bekannter Biosyntheseweg von dTDP-6-deoxy-L-Talose und dessen Epimer dTDP-L-Rhamnose. dTDP-GS, dTDP-Glucosesynthase; 4,6-DH, dTDP-Glucose-4,6-dehydratase; 3,5-E, 3,5-Epimerase; 4-KR, 4-Ketoreduktase; 4- E, 4-Epimerase
Durch die Aktivität einer dTDP-Glucosesynthase ensteht aus D-Glucose-1-phosphat dTDP-D-Glucose, welche mittels einer dTDP-Glucose-4,6-dehydratase zu dTDP-4-keto-6-deoxy-D-Glucose umgesetzt
20 Einleitung wird. Diese wird durch eine 3,5-Epimerase zu dTDP-4-keto-6-deoxy-L-Glucose epimerisiert. Von die- sem Zwischenprodukt aus, sind zwei unterschiedliche Wege beschrieben. Mittels einer 4- Ketoreduktase kann direkt die Umsetzung zu dTDP-6-deoxy-L-Talose erfolgen. Ebenso kann durch eine 4-Ketoreduktase zuerst dTDP-L-Rhamnose gebildet werden, welche durch die Aktivität einer 4- Epimerase zu dTDP-6-deoxy-L-Talose epimerisieren kann. Das Gleichgewicht liegt hierbei auf der Seite der dTDP-L-Rhamnose.
Als Bestandteil der Lipopolysaccharide und Polysaccharide ist 6-deoxy-L-Talose in der äußeren Zell- membran Gram-negativer Bakterien zu finden (54–56). Bakterielle Sekundärstoffe, die Talose enthal- ten, sind rar. Bekannte Beispiele sind Talosin A und B, Phenazoviridin sowie Acyl- und Aryl-α- Glykoside aus Streptomyces sp. GöM1. Bei den Talosinen A und B aus Kitasatospora kifunensis MJM341 handelt es sich um glykosylierte Isoflavone mit starker antimykotischer Aktivität gegen Candida albicans, Aspergillus niger und Cryptococcus neoformans (57). Phenazoviridin aus Strepto- myces sp. HR04 zeigt als Radikalfänger eine starke inhibitorische Aktivität gegen Lipidperoxidation (58). Das Acyl-Glykosid Pyrrol-2-yl-carbonyl-6-deoxy-α-L-talopyranosid aus S. sp. GöM1 zeigt antipa- rasitäre Aktivität gegen Plasmodium falciparum und Trypanosoma brucei rhodesiens (59).
Durch Fütterung von Kitasatospora sp. 152608 mit Alizarin konnte ein mit Talose verknüpftes Aliza- rin-Derivat gewonnen werden (50). Somit zeigt der Stamm Biotransformationsaktivität, hervorgeru- fen durch mindestens eine Talose-übertragende GT.
Mit Talose verknüpfte Naturstoffe können wie bereits beschrieben vielfältige biologische Aktivitäten aufweisen. Die Talose-GT(s) aus Kitasatospora sp. 152608 könnte(n) durch ihren Einsatz in der kom- binatorischen Biosynthese als wertvolles Werkzeug zur Generierung neuer glykosylierter Naturstoff- Derivate dienen und stellen somit ein interessantes Forschungsobjekt dar.
2.2 Glykosylierte Naturstoffe
2.2.1 Bedeutung glykosylierter Naturstoffe Viele der klinisch relevanten Substanzen aus Aktinomyceten besitzen Zuckerstrukturen. Hierzu zählen Antibiotika, Vitamine, Alkaloide, Steroide sowie Polyphenole (18,60,61). Die Strukturformeln des antimykotisch aktiven Nystatins, des zytostatisch wirsamen Daunorubicins sowie des antibiotisch wirksamen Streptomycins sind in Abbildung 2.6 dargestellt. Unter den glykosylierten Naturstoffen aus Aktinomyceten gibt es Substanzen, die wie das abgebildete Streptomycin nur aus Zucker- und Cyclohexan-Bausteinen bestehen. Glykosylierte Naturstoffe bestehen jedoch zum überwiegenden Teil aus einem Aglykon, welches mit einer oder mehreren Zuckereinheiten verknüpft ist. So besteht Erythromycin (vergleiche Abbildung 2.2) beispielsweise aus einem Polyketid-Aglykon des Polyketid-
21 Einleitung Stoffwechsels vom Typ I und ist mit dem Desoxyzucker L-Mycarose und dem Aminozucker D- Desosamin verknüpft (62–64).
Abbildung 2.6: Strukturformeln der glykosylierten Naturstoffe Nystatin (Streptomyces noursei), Daunorubicin (Strepto- myces peucetius) sowie Streptomycin (Streptomyces griseus).
Die Zuckerstrukturen spielen sowohl für die pharmakokinetischen als auch für die pharmakodynami- schen Eigenschaften der Substanzen eine essenzielle Rolle (18,61). So steigern Zuckerreste beispiels- weise die Hydrophilie und Löslichkeit von Naturstoffen oder ermöglichen, wie im Fall des Makrolid- antibiotikums Erythromycin, erst eine in vivo Aktivität. Unglykosylierte Vorstufen des Erythromycins zeigen keine oder nur eine geringe antibiotische Aktivität (18). Ebenso nimmt die biologische Aktivi- tät der antimykotisch aktiven Polyene Amphotericin B und Nystatin bei Fehlen des Zuckerrestes ab (65,66).
Dies verdeutlicht, warum glykosylierten Naturstoffen sowie der Erforschung ihrer Biosynthesewege ein besonderer Stellenwert innerhalb der Naturstoffforschung zukommt.
2.2.2 Glykosyltransferasen als enzymatische Werkzeuge Für die stereo- und regiospezifische Übertragung von Zuckereinheiten auf Aglyka sind Glykosyltrans- ferasen (GTs; EC 2.4.-.-) verantwortlich. GTs sind definiert als Enzyme, welche aktivierte Zucker- Donatoren unter Abspaltung einer Phosphat-Abgangsgruppe auf ein Akzeptor-Substrat übertragen. Sogenannte Leloir-GTs nutzen Nukleosid-Phosphat-Zucker, meist Nukleosid-Diphosphat-Zucker (NDP-
22 Einleitung Zucker) als Donatoren, wohingegen Nicht-Leloir-GTs Zucker übertragen, welche direkt mit Phosphat aktiviert sind (67). Beispiele für NDP-Zucker-Donatoren sind UDP-Galaktose, GDP-Mannose oder TDP- Rhamnose (68). Als Akzeptoren können unter anderem Oligosaccharide, Proteine, Nukleinsäuren, Lipide oder andere niedermolekulare Moleküle fungieren (69). Zuckermoleküle werden am häufigs- ten auf den nukleophilen Sauerstoff einer Hydroxylgruppe des Akzeptor-Substrates übertragen. Ebenso kann aber auch eine Verknüpfung des Zuckermoleküls mit einem C-, N- oder S-Nukleophil stattfinden (69).
GTs kommen in allen Organismen vor und übernehmen wichtige Funktionen in Primär- sowie in Se- kundärstoffwechsel. Unter anderem sind hierbei der Aufbau von Glykogen und Stärke zur Speiche- rung von Energie in Eukaryoten (68), die Synthese von Peptidoglykan als Bestandteil bakterieller Zellwände (68), die Synthese polymerer Gerüstsubstanzen wie Cellulose und Chitin (68), die Regula- tion der Transkription zahlreicher Gene (70,71) sowie die Glykosylierung von Sekundärmetaboliten in Bakterien und Pflanzen (18,61) zu nennen. Beim Menschen erfolgt außerdem die Bildung membran- gebundener Oligosaccharide, welche der Zell-Zell-Kommunikation dienen und Rezeptorfunktionen für Hormone, Viren und Toxine besitzen (72). Diese Auswahl an Beispielen verdeutlicht, dass GTs an einer Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen beteiligt sind. So verwundert es nicht, dass GTs nur eine geringe Sequenzhomologie untereinander aufweisen (68).
In der CAZy-Datenbank [Carbohydrate Active enZymes] (73) werden katalytische Einheiten, welche in der Lage sind glykosidische Bindungen zu knüpfen, zu modifizieren oder zu spalten, zusammengefasst (74). Trotz der geringen Sequenzhomologie teilen Campbell et al. die NDP•Hexose•Glykosyltransferasen basierend auf Aminosäure-Sequenz-Homologien ein (75) und lis- ten sie in der CAZy-Datenbank auf. Aus anfänglich 26 NDP-Hexose-Glykosyltransferase-Familien sind inzwischen 98 geworden (Stand April 2016). GTs einer Familie besitzen neben einer gewissen Se- quenzhomologie dieselbe Proteinfaltung und den gleichen molekularen Reaktionsmechanismus.
Bezüglich des Reaktionsmechanismus unterteilt man GTs in solche, die die Stereochemie an dem anomeren Kohlenstoffatom des Zucker-Donors invertieren (invertierende GTs) und solche, die die Konformation beibehalten (beibehaltende GTs) (76).
Trotz sehr starker Unterschiede in der Primärstruktur können alle GTs anhand ihrer Proteinfaltung und ihrer räumlichen Struktur den vier Strukturfamilien GT-A, GT-B, GT-C und GT-D zugeordnet wer- den (77,78). Leloir-GTs kommen dabei in den Strukturfamilien GT-A und GT-B vor, während Nicht- Leloir-GTs in den Strukturfamilien GT-C und GT-D zu finden sind (77–80).
Alle bislang bekannten GTs des bakteriellen Sekundärstoffwechsels gehören der CAZy-Familie 1 an, wonach es sich um invertierende NDP-Hexose-Transferasen mit GT-B-Faltung handelt. Die GTs der
23 Einleitung Strukturfamilie GT-B bestehen aus zwei Domänen, welche eine sehr große Ähnlichkeit in Größe und Aufbau miteinander aufweisen. Die beiden Domänen, über ein Linker-Peptid miteinander verbunden, stehen sich so gegenüber, dass sich das aktive Zentrum in der dazwischenliegenden Kluft befindet (81). Jede Domäne besteht aus mehreren, zumeist sechs, parallelen ß-Faltblatt-Strukturen, welche durch α-Helices verbunden sind. Diese Anordnung wird als Rossmann-Faltung bezeichnet (82,83). Die N-terminale Domäne ist für die Bindung der Akzeptor-Moleküle zuständig, während an der C- terminalen Domäne die Stabilisierung des Nukleosid-Diphosphat des Zucker-Donors erfolgt.
Die N-Glykosylierung von Asparagin-Resten ist eine häufig bei pro- und eukaryotischen Proteinen auftretende post-translationale Modifikation (84). Der Prozess beinhaltet die Übertragung eines vor- ab zusammengesetzten Oligosaccharids von einem Lipid-Donor an eine Asparagin-Seitenkette eines Polypeptids und wird durch membrangebundene Oligosaccharyl-Transferasen (OST) katalysiert. Ob- wohl N-Glykoside im Hinblick auf Hydrolyse stabiler sind als O-Glykoside ist die N-Glykosylierung nie- dermolekularer Naturstoffe seltener anzutreffen. Zu den wenigen bekannten N-GTs, die Nukleotid- aktivierte Monosaccharide als Donatoren verwenden um diese auf niedermolekulare Naturstoffe zu übertragen, zählen beispielsweise AtmG, NokL, PrlH, RebG, SpcG und StaG. Bei AtmG handelt es sich um die Indolocarbazol-N-GT aus Actinomadura melliaura (85). NokL ist die Indolocarbazol-N-GT aus Nonomuraea longicatena (86). PrlH ist an der Biosynthese der antibiotisch wirksamen Pyralomicine aus Nonomuraea spiralis IMC A-0156 beteiligt (87), während RebG aus Lechevalieria aerocolonigenes als N-GT an der Biosynthese des zytostatisch aktiven Topoisomerase I-Inhibitors Rebeccamycins mit- wirkt (88). In dem marinen Aktinomyceten-Stamm Streptomyces sanyensis ist die Indolocarbazol-N- GT SpcG entdeckt und charakterisiert worden (89). StaG stellt die N-GT der Staurosporin-Biosynthese in Streptomyces clavuligerus dar (90). Wie bei anderen Indolocarbazolen auch handelt es sich bei Staurosporin um einen potenten Proteinkinase-Inhibitor mit vielversprechenden klinischen Ergebnis- sen im Einsatz gegen multi-resistente Krebserkrankungen (91). Weitere bekannte Beispiele für N-GTs in der Naturstoffbiosynthese sind Asm25 und StnG. Asm25 ist eine N-GT aus der Ansamitocin- Biosynthese in Actinosynnema pretiosum (92). Die Ansamitocine sind Maytansinoide bakteriellen Ursprungs mit zytostatischer Aktivität (93). Die N-GT StnG glykosyliert das Iminstickstoffatom des Guanidins während der Biosynthese des antimikrobiell aktiven Streptothricins in Streptomyces sp. TP-A0356 (94).
2.2.3 Prinzip der kombinatorischen Biosynthese Bei der kombinatorischen Biosynthese handelt es sich um ein molekularbiologisches Verfahren zur Veränderung und Kombination unterschiedlicher Biosynthese-Gen-Cluster, was zu der Synthese neu- er, unnatürlicher Naturstoffe führt (95). In einem ersten Schritt muss das Biosynthese-Gen-Cluster lokalisiert werden. Die einzelnen Gene müssen anschließend funktionell charakterisiert werden um
24 Einleitung Gene mit bekannter Funktion ausschalten beziehungsweise durch Gene aus anderen Stämmen erset- zen zu können.
Erfolgreiche Beispiele für die in vivo Synthese neuer Sekundärstoffmetaboliten sind vielfach be- schrieben. So konnte bereits durch Inaktivierung des Hydroxylase-Gens eryF in dem Erythromycin- Produzenten Saccharopolyspora erythraea das säure-stabile Erythromycin-Derivat 6- Deoxyerythromycin A erhalten werden (96). Einen echten kombinatorischen Ansatz stellt die hetero- loge Expression verschiedener Gene dar. So konnten durch Kombination unterschiedlicher Erythro- mycin-Rapamycin-Hybrid-Module eine Vielzahl neuer Derivate in Streptomyces lividans generiert werden (97). Darüber hinaus konnte mittels Austausch des Ketoreduktase-Gens dnmV der Zuckerbio- synthese in Streptomyces peucetius durch die homologen Gene eryBIV aus Saccharopolyspora eryth- raea beziehungsweise avrE aus Streptomyces avermitilis das klinisch angewandte Zytostatikum Epi- rubicin erhalten werden (98). Die Produktion in dem genetisch veränderten S. peucetius-Stamm war somit einfacher und mit einer größeren Ausbeute möglich als in der Partialsynthese aus Daunorubi- cin-Derivaten.
Da Zuckersubstituenten für die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften von Arzneistoffen eine essentielle Rolle einnehmen (vergleiche 2.2.1), ist ein wichtiges Forschungsziel, mit Hilfe der kombinatorischen Biosynthese das Glykosylierungsmuster aktiver Sekundärstoffe zu verändern um neue klinisch relevante Substanzen zu erhalten. Hierfür werden unter anderem GTs mit bekanntem Substratspektrum benötigt. Glykosyltransferasen stellen aufgrund der Vielzahl mögli- cher Akzeptoren und Donatoren eine facettenreiche Enzymgruppe dar, welche an der Biosynthese vieler Sekundärmetaboliten beteiligt ist. Einige Glykosyltransferasen besitzen eine hohe Zucker- Donor-Flexibilität (99). Problematisch ist jedoch meist ihre geringe Akzeptor-Substrat-Flexibilität (100). Zu den Vorteilen der enzymatischen Synthese gegenüber der chemischen Synthese zählen die Regio- und Stereoselektivität. Durch diese werden die aufwendige Schutzgruppenchemie sowie die Enantiomerentrennung überflüssig (101,102). Dies führt zu geringeren Kosten bei einer gleichzeitig gesteigerten Ausbeute. Des Weiteren kann die enzymatische Glykosylierungsreaktion im wässrigen Milieu bei Raumtemperatur stattfinden, da der hydrolyseempfindliche Zuckerdonor in der Bindeta- sche des Enzyms abgeschirmt und somit vor Hydrolyse geschützt ist.
Beispiele für die erfolgreiche Veränderung des Glykosylierungsmusters mit Hilfe der kombinatori- schen Biosynthese sind unter anderem für die GTs AknS (103), DesVII (104,105) sowie Plm12 (106) beschrieben. Die GT AknS aus dem Aclacinomycin A-Cluster von Streptomyces galilaeus ist dazu in der Lage, während der Biosynthese des zytostatisch wirksamen Anthracyclins den Zuckerrest L- Rhodosamin auf das Aglykon zu übertragen (107). Hierbei wird ein Komplex mit dem Protein AknT gebildet, wodurch die Umsetzung beschleunigt wird. Durch gemeinsame heterologe Expression von
25 Einleitung aknS/aknT sowie avrE, dem TDP-4-Ketohexulosereduktase-Gen aus Streptomyces avermitilis, mit verschiedenen Kombinationen weiterer Zuckerbiosynthese-Gene konnten in Streptomyces vene- zuelae unterschiedliche Doxorubicin-Derivate, darunter auch Epirubicin, produziert werden (103). Epirubicin weist im Vergleich zu Doxorubicin eine verringerte Kardiotoxizität bei gleichbleibender zytostatischer Aktivität auf (108).
Bei DesVII handelt es sich um eine substrat-flexible GT aus Streptomyces venezuelae, die innerhalb der Biosynthese der Makrolidantibiotika Methymycin und Pikromycin D-Desosamin auf den 12- be- ziehungsweise 14-gliedrigen Makrolakton-Ring überträgt (109). Durch Inaktivierung der Biosynthe- secluster des Makrolakton-Grundgerüsts sowie des Desosamin-Zuckers in Streptomyces venezuelae, anschließende Komplementierung der erhaltenen Mutante mit Genen für die Biosynthese der Des- oxyzucker TDP-D-Quinovose beziehungsweise TDP-D-Olivose und dem GT-Gen desVII sowie desVIII, dem Gen für dessen Hilfsprotein, sowie Fütterung verschiedener 12-, 14- und 16-gliedriger Makrolak- tone konnten neue glykosylierte Makrolakton-Derivate generiert werden (104). In weiteren Versu- chen wurden Gene für die Biosynthese unterschiedlicher Desoxyzucker gemeinsam mit dem GT-Gen desVII in eine TDP-D-Desosamin-defiziente Streptomyces venezuelae-Mutante eingebracht. Der re- kombinante Stamm war dazu in der Lage, neue Derivate des Makrolidantibiotikums Narbomycin mit unnatürlichen Zuckerresten zu produzieren (105). Narbomycin-Derivate, welche mit L-Rhamnose oder 3‘-O-Demethyl-D-Chalcose verknüpft sind, zeigten in vitro gegen Erythromycin-sensitive sowie Erythromycin-resistente Stämme von Enterococcus faecium und Staphylococcus aureus eine größere antibiotische Aktivität als Narbomycin oder Erythromycin (105).
Streptomyces albus J1074 ist unter bestimmten Bedingungen dazu in der Lage, die antibiotisch akti- ven Paulomycine zu produzieren (110). An der Biosynthese dieser glykosylierten Sekundärmetaboli- ten sind unter anderem auch die zwei GTs Plm12 und Plm23 beteiligt (106). Bei Plm23 handelt es sich um eine C-GT, die D-Allose auf das Aglykon überträgt, während Plm12 die Zuckerkette durch Über- tragung von L-Paulomycose verlängert. Durch Inaktivierung dreier Gene der Paulomycose- Biosynthese und Komplementierung mit den benötigten Genen der Biosynthese der Desoxyhexosen L-Amicetose und L-Olivose konnten fünf neue Derivate der Paulomycine A und B generiert werden, welche sich in dem Glykosylierungsmuster unterscheiden (106). Während die Paulomycine A und B eine gute antibiotische Aktivität gegen Gram-positive Bakterien aufweisen (111,112), ist die antibioti- sche Aktivität der Derivate mit Modifikationen an dem Paulomycose-Rest reduziert (106). Dies ver- deutlicht nochmals den Einfluss der Zuckersubstituenten auf die biologische Aktivität glykosylierter Sekundärmetaboliten.
An Hand der gewählten Beispiele wurde der Stellenwert der kombinatorischen Biosynthese zur Mo- difikation des Glykosylierungsmusters biologisch aktiver Sekundärmetaboliten dargelegt. Auffällig ist
26 Einleitung jedoch, dass sich das Substratspektrum jeweils auf artverwandte Akzeptor-Substrate beschränkt. Von weitaus größerem Nutzen für die Anwendung in der kombinatorischen Biosynthese können GTs sein, die in der Wahl ihrer Akzeptor-Substrate flexibel sind. Der hierzu zusammengefassten Auswahl an flexiblen GTs (vergleiche (113)) ist Ses60310 aus Saccharothrix espanaensis (114) als wichtiger Vertre- ter der flexiblen GTs hinzuzufügen.
2.3 Resveratrol als vielseitiges Polyphenol Bei Resveratrol (3,5,4'-Trihydroxystilben) handelt es sich um ein Polyphenol, welches in vielen Pflan- zen gebildet wird. Resveratrol kommt unter anderem in Vitis vinifera (Weintraube), Arachis spp. (Erdnuss), Vaccinium sp. (Blaubeere) und Humulus lupulus (Hopfen) vor (115–118). Als Phytoalexin wird Resveratrol als Abwehrmechanismus gegen mikrobiellen Befall mit Botrytis cinerea in Wein- trauben gebildet (119). Auch andere Stressfaktoren wie freie Radikale, Ozon oder UV-Einstrahlung können die Produktion anregen (120). Resveratrol kann in den isomeren Formen cis- und trans- Resveratrol vorkommen, wobei das trans-Isomer unter UV-Einfluss in das cis-Isomer umgewandelt wird. Da es sich bei dem trans-Isomer um die aktive Form des Resveratrols handelt, sollte die Sub- stanz vor UV-Strahlung geschützt werden (121–123).
Es sind verschiedene Derivate des Resveratrols bekannt. Zu diesen zählen unter anderem Glukoside wie Piceid, Dimere wie Pallidol, Trimere wie Grandiphenol C oder α-Viniferin und weitere Polymere wie γ-Viniferin (124–126). Von den Resveratrol-Glykosiden ist bekannt, dass sie eine höhere Stabilität aufweisen als Resveratrol (127–129). Zudem steigt die Wasserlöslichkeit durch Glykosylierung und erhöht somit die Bioverfügbarkeit des sonst nach oraler Applikation trotz hoher Absorptionsraten nur zu einem sehr geringen Bruchteil bioverfügbaren Resveratrols (130).
Resveratrol und seinen Derivaten wird eine Vielzahl pharmakologischer Wirkungen zugeschrieben. Dazu zählen beispielsweise die Wirksamkeit gegen Typ II Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, Alz- heimer, kardiovaskuläre Erkrankungen, Ischämie sowie Krebserkrankungen (131–145). Resveratrol wird durch seine kardioprotektive Wirkung auch für das sogenannte Französische Paradoxon verant- wortlich gemacht. Dieses besagt, dass es in Frankreich trotz eines hohen Konsums gesättigter Fett- säuren eine niedrigere Sterblichkeit in Folge von Koronaren Herzkrankheiten gibt als in anderen ver- gleichbar entwickelten Ländern. Dieses Phänomen wird auf den hohen Konsum von Rotwein und dem darin enthaltenen Resveratrol zurückgeführt (146).
Als Wirkmechanismus werden die Neutralisation freier Radikale sowie die Inhibierung der Produktion von Stickstoffmonoxid und Zytokinen, wie TNFα oder Interleukin-6 beschrieben (147–150). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass durch Aktivierung von SIRT1, eine Hydrolase die durch Deacetylierung in die Signaltransduktion eingreift, einerseits die Lebensspanne von Hefen, Würmern, Fliegen, Fischen
27 Einleitung und Mäusen verlängert werden konnte und andererseits, dass Mäuse trotz hochkalorischer Ernäh- rung in Kombination mit SIRT1-Aktivierung durch Resveratrol schlank und gesund blieben (151–154).
In vitro Glykosylierungsexperimente mit der GT YjiC aus Bacillus licheniformis und unterschiedlichen Zucker-Donatoren erbrachten eine Vielzahl neuer mono-, di- und triglykosidischer Resveratrol- Derivate mit potentiell positiven Eigenschaften für die Entwicklung neuer Therapeutika (155). Dr. A. Linnenbrink konnte zeigen, dass der Biotransformationswirt S. espanaensis ebenfalls dazu in der Lage ist, Resveratrol umzusetzen (30). Ein- beziehungsweise zweifach rhamnosylierte Derivate wurden lediglich auf Grundlage der massenspektroskopischen Daten vermutet. Eine Strukturaufklärung der Biotransformationsprodukte fand nicht statt.
Im April 2016 sind 108 klinische Studien zu Resveratrol in der Datenbank des U.S. Amerikanischen National Institute of Health registriert (156). Nur wenige der aufgeführten und bereits abgeschlosse- nen Studien haben ihre Ergebnisse veröffentlicht. Gleichzeitig steigt die Zahl der Publikationen zu dem Thema Resveratrol in PubMed jährlich an. Aktuell sind 8.425 Artikel veröffentlicht, davon alleine 1.044 in dem Jahr 2015. Doch es gibt auch kritische Stimmen, die in Resveratrol und seinen Derivaten keine neuen klinisch relevanten Arzneistoffe sondern nur überbewertete Substanzen sehen, welche unspezifisch mit einer Vielzahl von Strukturen interagieren (157). Resveratrol ist bislang nur als Nah- rungsergänzungsmittel und nicht als Arzneimittel zugelassen. Eine abschließende Beurteilung der pharmakologischen Eigenschaften steht noch aus.
2.4 Zielsetzung der Arbeit Ziel der hier vorliegenden Arbeit war die Identifizierung, Aufreinigung und Charakterisierung ver- schiedener Glykosyltransferasen aus Aktinomyceten.
Die Aufreinigung der flexiblen Glykosyltransferase Ses60310 aus Saccharothrix espanaensis sollte für Kristallisationsversuche optimiert werden. Die Kenntnis ihrer Kristallstruktur stellt einen wichtigen Schritt zu dem Verständnis ihrer großen Flexibilität dar. Darüber hinaus sollte die Substratflexibilität in weiteren Fütterungsexperimenten mit trans-Resveratrol untersucht werden.
Die N-Glykosyltransferase aus Saccharopolyspora erythraea sollte mittels Inaktivierungs- und Kom- plementierungsversuchen identifiziert werden. Um die N-Glykosyltransferase in vitro charakterisie- ren zu können, sollte die Glykosyltransferase heterolog in E. coli produziert, aufgereinigt und in Akti- vitätsassays eingesetzt werden.
Die Genomsequenz von Kitasatospora sp. 152608 sollte auf Gene untersucht werden, die möglicher- weise für Glykosyltransferasen codieren. Unter diesen Genen sollten mittels in silico Sequenzanaly- sen die Kandidaten-Gene identifiziert werden, welche mit der höchsten Wahrscheinlichkeit für eine
28 Einleitung Talose-übertragende Glykosyltransferase codieren. Ein heterologes Testsystem sollte in Vorbereitung auf die experimentelle Identifizierung der Talose-Glykosyltransferase etabliert werden.
Darüber hinaus sollte die letzten beiden Schritte der postulierten Biosynthese des Saccharomicin- Aglykons nachgewiesen werden.
Die Kentnisse der Eigenschaften der beschriebenen Glykosyltransferasen sowie der Biosynthesewege stellt einen wichtigen Schritt zu deren Einsatz in der kombinatorischen Biosynthese und somit zur Generierung neuer Sekundärmetaboliten dar.
29 Material und Methoden 3 Material und Methoden Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten chemischen Substanzen und Geräte sind im Folgenden in Listen zusammengefasst. Firmenstandorte der Hersteller sind jeweils bei der Erstnennung angege- ben.
3.1 Labor- und Analysengeräte
Tabelle 3.1: Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller mit Standort Bezeichnung Hersteller Agarosegel-Elektrophoresekammer und Zubehör GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg) ÄKTA-FPLC GE Healthcare Europe GmbH Autoklav Systec 5075 ELV Tuttnauer Europe B.V. (Breda, NL) Binokular Carl Zeiss (Jena) Brutschränke Binder GmbH (Tuttlingen) CCD-Kamera Eagle Eye, Stratagene (Heidelberg) E. coli Pulser™ Bio-Rad Laboratories GmbH (München) E-Box VX5 Vilber Lourmat (Eberhardzell) French Pressure Cell Press Thermo Scientific (Bremen) Holten LaminAir Thermo Scientific HPLC-ESI-MS Agilent 1100 Serie: Agilent Technologies (Waldbronn) Degasser G1322A, Autosampler G1313A, Säulen- ofen G1316A, quaternäre Pumpe G1311A, DAD G1315B, Quadrupol-Massendetektor G1946D, ESI- Quelle NanoDrop 2000 Thermo Scientific OryxNano Protein Crystallization Robot Douglas Instruments (East Garston, UK) PCR-Geräte: Gene Amp® PCR System 9700 Thermo Scientific Mastercycler Epigradient Eppendorf (Hamburg) pH-Meter SI Analytics GmbH (Mainz) Pipetten Gilson International (Limburg) Protein-Elektrophorese-Kammer Mini-PROTEAN 3 Bio-Rad Laboratories GmbH mit Zubehör und Spannungsgeber Power Pac 300 Rotationsverdampfer: CVC2´´ Vacuubrand GmbH + Co. KG (Wertheim) Waterbath B-480 Büchi Labortechnik GmbH (Essen) Hei-VAP Value Digital Heidolph Instruments GmbH & Co. KG Laborota 4000 efficient (Schwabach) SC 920 KNF Neuberger GmbH (Freiburg) Rührer MR 3002 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG Schüttelinkubator Multitron Infors (Bottmingen, CH) Spektralphotometer: Spektrometer Ultrospec 2100 pro GE Healthcare Europe GmbH UviLine 9400 SI Analytics GmbH
30 Material und Methoden
Tabelle 3.1: Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller mit Standort UV-Transilluminator Image Master VDS zur Geldo- Amersham Pharmacia (Freiburg) kumentation (312 nm) Vacuum-Concentrator BA-VC-300 H Helmut Saur Laborbedarf (Reutlingen) Vortex Reax top Heidolph Instruments GmbH & Co. KG Wasser-Filteranlage Millipore (Billerica, USA) Zentrifugen: 5415R und 5417R für 1,5/2 ml-Reaktionsgefäße Eppendorf Avanti J-20XP für 500 ml-Gefäße Beckman Coulter (Krefeld) Rotina 35 R für 15/50 ml-Zentrifugenröhrchen Andreas Hettich GmbH & Co.KG (Tuttlingen)
3.2 Software, Datenbanken und Internetservices
Tabelle 3.2: Verwendete Software, Datenbanken und Internetservices sowie deren Hersteller mit Standort Bezeichnung Hersteller/Anbieter antiSMASH http://antismash.secondarymetabolites.org/ (158,159) BLAST National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, USA http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (160,161) CAZy http://www.cazy.org/ (74) ChemStation Rev. B.09.03 Agilent Technologies Clone Manager Suite 7 Scientific and Educational Software (Cary, USA) ClustalX 2.1 http://www.clustal.org/clustal2/ (162) ExPASy http://www.expasy.ch/ (163) galaxy Uni Freiburg http://galaxy.uni-freiburg.de; Lehrstuhl für Bioinformatik, Uni Freiburg (164,165) MS Office Paket Microsoft (Redmond, USA) NEBiocalculator http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligatio; NEB NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ TreeView http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html (166) Unicorn GE Healthcare Europe GmbH UniProt http://www.uniprot.org/ (167)
3.3 Chemikalien und Verbrauchsmittel
3.3.1 Chemikalien, Medienbestandteile und Antibiotika Tabelle 3.3: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller mit Standort Substanz Hersteller 1 kb Leiter New England BioLabs (Ipswich, GB) 1,4-Dithiothreitol (DTT) Carl Roth (Karlsruhe) 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA) Sigma-Aldrich (München) 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) Carl Roth 4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (PNPG) Carl Roth 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) Carl Roth
31 Material und Methoden
Tabelle 3.3: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller mit Standort 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure (X-Gluc) X-Gluc Direct (GB) Acrylamid/Bisacrylamid Carl Roth Adenosintriphosphat (ATP) Carl Roth Agar-Agar Carl Roth Agarose Carl Roth Ammoniumpersulfat (APS) Carl Roth Ammoniumsulfat Merck (Darmstadt) Ampicillin, Natriumsalz Sigma-Aldrich Apramycinsulfat AppliChem GmbH(Darmstadt) Azithromycin Sigma-Aldrich Bäckerhefe Lucullus Backen & Genießen GmbH & Co. KG (Darmstadt) Bovines Serumalbumin (BSA) Promega (Mannheim) Bromphenolblau Carl Roth Calciumcarbonat Carl Roth Carbenicillin, Dinatriumsalz Carl Roth CASO Bouillon Carl Roth Coenzym A Natriumsalz (CoA) Sigma-Aldrich Coomassie Brilliant Blue G-250 Carl Roth Coomassie Brilliant Blue R-250 Carl Roth d-Desthiobiotin Sigma-Aldrich Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) Peqlab (Erlangen) Dextrin Carl Roth D-Glucose-Monohydrat Carl Roth di-Kaliumhydrogenphosphat Trihydrat Carl Roth di-Natriumhydrogenphosphat Carl Roth D-Mannitol Carl Roth dTDP-Rhamnose Prof. Dr. Jürgen Rohr (University of Kentucky, USA) Erythromycin Carl Roth Essigsäure Carl Roth Ethidiumbromid Carl Roth Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl Roth Fosfomycin, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, 10.000 x in water Biotium (Hayward, USA) β-Glucosidase Carl Roth Glycerin Carl Roth Hefeextrakt Carl Roth Hygromycin B Carl Roth Imidazol Carl Roth Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth Kaliumacetat Carl Roth Kaliumdihydrogenphosphat Merck Kanamycinsulfat Carl Roth Kartoffel-Extrakt-Glucose Bouillon Carl Roth
32 Material und Methoden
Tabelle 3.3: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller mit Standort Lab Lemco Fleischextrakt Oxoid (Basingstoke, GB) LB Medium (Lennox) Carl Roth Magnesiumchlorid Carl Roth Magnesiumsulfat Heptahydrat Carl Roth Maismehl Huber-Mühle GmbH (Hohberg) Maltose Carl Roth Malzextrakt Carl Roth 2-Mercaptoethanol Merck Natriumchlorid Carl Roth Natriumdihydrogenphosphat Carl Roth Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth Natriumhydroxid Plätzchen Carl Roth Natriumhydroxid-Lösung 1 M Merck Natriumphosphat Carl Roth Ni2+-NTA Agarose Qiagen GmbH (Hilden) Nickelsulfat Hexahydrat Carl Roth
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dinatriumsalz (Na2-NADH) Carl Roth Nystatin Dihydrat Carl Roth Pepton aus Soja Carl Roth Pharmamedia Southern Cotton Oil Company (Mem- phis, USA) Phosphoenolpyruvat (PEP) Sigma-Aldrich Roti®Phenol/C/J Carl Roth Saccharose Carl Roth Salzsäure 25 % Carl Roth Sojamehl, vollfett W. Schoenenberger GmbH (Magstadt) Soytone Bectors, Dickinson and Company (Sparks, USA) Spectinomycin Dihydrochlorid Pentahydrat Sigma-Aldrich Stärke Carl Roth TDP-α-D-Glucose Sigma-Aldrich N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Carl Roth Thymidin-5‘-diphospho-α-D-Glucose Dinatriumsalz (TDP- Sigma-Aldrich Glucose) Trichloressigsäure (TCA) Carl Roth Tris(2-chlorethyl)phosphat (TCEP) Carl Roth Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Carl Roth TRIS-HCl Carl Roth Tryptic Soy Broth (TSB) Carl Roth Trypton Becton-Dickinson (Heidelberg)
33 Material und Methoden 3.3.2 Organische Lösungsmittel Tabelle 3.4: Verwendete organische Lösungsmittel sowie deren Hersteller mit Standort Substanz Hersteller Aceton Carl Roth Acetonitril (HPLC grade) Carl Roth Dichlormethan Carl Roth Dimethylformamid (DMF) Carl Roth Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth Essigsäureethylester (Ethylacetat, EE) Carl Roth Ethanol (EtOH) Carl Roth Isopropanol Carl Roth Methanol (MeOH) Carl Roth Phenol/Chloroform (Roti®-Phenol pH 8) Carl Roth
3.3.3 Enzyme und Kits
Tabelle 3.5: Verwendete Enzyme mit Hersteller und Standort Name Hersteller Antarktische Phosphatase New England BioLabs DNase New England BioLabs Gibson Assembly® Master Mix New England BioLabs Pyruvatkinase (PK)/ Laktatdehydrogenase (LDH) Sigma-Aldrich Lysozym aus Hühnereiweiß Carl Roth Pfu-Polymerase Am Institut hergestellt Phusion-Polymerase Am Institut hergestellt Proteinase K Promega Restriktionsendonukleasen New England BioLabs RNase A Qiagen T4-DNA-Ligase Promega, New England BioLabs Taq-Polymerase Am Institut hergestellt TEV-Protease AG Prof. Einsle, Universität Freiburg Velocity DNA Polymerase Bioline GmbH (Luckenwalde)
Tabelle 3.6: Verwendete Kits sowie deren Hersteller mit Standort Bezeichnung Hersteller innuPrep Plasmid Mini Kit Analytik Jena (Jena) PureYield™ Plasmid Midiprep System Promega Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega
34 Material und Methoden
Tabelle 3.7: Für Kristallisationsversuche verwendete Screens mit Hersteller und Standort Screen Hersteller/ Referenz Footprint I-III (168–170) Index I/II Hampton Research (Aliso Viejo, USA) MemGold Molecular Dimensions Limited (Suffolk, UK)
3.3.4 Sonstige Materialien Tabelle 3.8: Sonstige verwendete Materialien sowie deren Hersteller mit Standort Bezeichnung Hersteller 1,5 ml- und 2 ml-Reaktionsgefäße Carl Roth 15 ml- und 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit Deckel Carl Roth Bördelkappen N11 Macherey-Nagel (Düren) Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research (Aliso Viejo, USA) Dünnschichtchromatographie-Alufolien 20 x 20 cm Merck
Kieselgel 60 F254 und RP-18 F254s Dünnschichtchromatographie-Fertigplatten ADAMANT Macherey-Nagel
UV254 0,25 mm Kieselgel 60 mit Fluoreszenzindikator Festphasenextraktions-Säule Oasis HLB 35cc (6 g) LP Waters GmbH (Eschborn) Extraction Cartridge Filter: Carl Roth Rotilabo®-Spritzenfilter 13 mm; 0,45 μm, PVDF Rotilabo®-Spritzenfilter steril 13 mm; 0,22 μm, PVDF Filterrondelle MN 827 ATD, Ø = 6 mm Macherey-Nagel Gene Pulser Küvette 0,1 cm – 165-2089 Bio-Rad Laboratories GmbH HisTrap™ FF Säule 5 ml GE Healthcare Europe GmbH HPLC Vials Inserts 9 mm, 0.15 ml Macherey-Nagel Mikrotiterplatte Intelli Plate Art Robbins Instruments (Sunnyvale, USA) PD-10 Sephadex G25 GE Healthcare Europe GmbH Rotilabo®-Petrischalen, Durchmesser 10 mm Carl Roth Save-Lock Tubes 2 ml Eppendorf Sephadex LH-20 Säule Amersham Biosciences Spritzen Injekt-Einmalspritzen 2/10 ml, steril B. Braun Melsungen AG (Melsungen) StrepTrap™ HP, 5 ml Säule GE Healthcare Europe GmbH Superdex™ 200 10/300 GL GE Healthcare Europe GmbH Vivaspin 20 Konzentrator Sartorius Stedim Biotech GmbH (Göttin- gen) XBridge™ C18 (20 mm × 4,6 mm; 3,5 μm) Waters GmbH XBridge™ C18 (100 mm × 4,6 mm; 3,5 μm) Waters GmbH Zorbax C18 (50 mm x 9,4 mm; 5 μm) Agilent Technologies Zorbax C18 (150 mm x 9,4 mm; 7 μm) Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C8 (12,5 mm x 4,6 mm; 5 μm) Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 μm) Agilent Technologies
35 Material und Methoden 3.4 Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden, soweit nicht anders beschrieben, mit bidestilliertem Wasser
(H2Obidest) hergestellt. Zur pH-Wert-Einstellung wurden falls nötig NaOH (1 M) oder HCl (1 M) ver- wendet. In der Regel wurden die Lösungen bei Raumtemperatur (RT) gelagert. Ausnahmen sind in den entsprechenden Tabellen vermerkt.
3.4.1 Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen und Dauerkulturen
Tabelle 3.9: Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen und Dauerkulturen Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkungen
0,1 M MgCl2-Lösung MgCl2 9,53 g autoklavieren; bei 4 °C lagern
H2Obidest ad 1.000 ml
0,1 M CaCl2-Lösung CaCl2 11,11 g autoklavieren; bei 4 °C lagern
H2Obidest ad 1.000 ml
0,1 M CaCl2-Lösung mit 15 % Glycerol CaCl2 11,11 g autoklavieren; bei 4 °C lagern Glycerol 150 g
H2Obidest ad 1.000 ml Glycerol-Lösung 10 % Glycerol 100 g autoklavieren; bei 4 °C lagern
H2Obidest ad 1.000 ml Glycerol-Lösung 15 % Glycerol 150 g autoklavieren; bei 4 °C lagern
H2Obidest ad 1.000 ml Saccharose-Lösung 25 % Saccharose 250 g autoklavieren; bei 4 °C lagern
H2Obidest ad 1.000 ml
3.4.2 Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion in Escherichia coli Tabelle 3.10: Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion in E. coli Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkungen 1 M IPTG- IPTG partikelfrei filtrieren; vor Licht geschützt lagern; 20 µl Lösung pro Platte; bei -20 °C lagern X-Gal-Lösung X-Gal 100 mg/ml in DMF lösen; autosteril; vor Licht geschützt lagern; 20 µl pro Platte; bei -20 °C lagern
3.4.3 Lösungen und Puffer zur Isolierung von Plasmid-DNA mittels Alkalischer Lyse
Tabelle 3.11: Lösungen und Puffer zur Isolierung von Plasmid-DNA mittels Alkalischer Lyse Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkungen P1-Lösung TE-Puffer 50 x 6 ml 10 ml P1 + 100 µg/ml RNase A
H2Obidest 94 ml pH 8,0; bei 4 °C lagern P2-Lösung NaOH 0,8 g bei RT lagern SDS 1,0 g
H2Obidest 100 ml P3-Lösung Kaliumacetat (wasserfrei) 147,2 g mit Eisessig auf pH 5,2 einstellen; bei
H2Obidest ad 500 ml 4 °C lagern
36 Material und Methoden
Tabelle 3.11: Lösungen und Puffer zur Isolierung von Plasmid-DNA mittels Alkalischer Lyse TE-Puffer TRIS-HCl 500 mM mit HCl auf pH 7,6 einstellen; bei 4 °C 50 x EDTA 50 mM lagern
3.4.4 Lösungen und Puffer zur Isolierung genomischer DNA aus Aktinomyceten-Stämmen Tabelle 3.12: Lösungen und Puffer zur Isolierung genomischer DNA aus Aktinomyceten-Stämmen Bezeichnung Bestandteile Menge/Konzentration Anmerkungen SET-Puffer NaCl 75 mM EDTA-Lösung auf pH 8,0 einstel- EDTA 25 mM len; Tris-HCl-Lösung auf pH 7,5 TRIS-HCl 20 mM einstellen Lysozym-Lösung Lysozym 50 mg/ml Proteinase K-Lösung Proteinase K 20 mg/ml SDS-Lösung SDS 10 % (m/V) nicht autoklavieren NaCl-Lösung NaCl 5 M
3.4.5 Lösungen zur Isolierung der Gesamt-DNA aus Aktinomyceten-Stämmen Tabelle 3.13: Lösungen zur Isolierung der Gesamt-DNA aus Aktinomyceten-Stämmen Bezeichnung Bestandteile Menge/ Anmerkungen Konzentration Lösung L1 Lysozym 4 mg/ml In Lösung P1 der alkalischen Lyse lösen; bei 4 °C la- RNase 200 µg/ml gern Lösung L2 SDS 10 % (m/V) Lösung L3 Kaliumacetat 3 M mit Eisessig auf pH 5,2 einstellen; bei 4 °C lagern
3.4.6 Lösungen und Puffer zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Tabelle 3.14: Lösungen und Puffer zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese Bezeichnung Bestandteile Menge/ Anmerkungen Konzentration 1 kb DNA Leiter 10 kb; 8 kb; 6 kb; 5 kb; 4 kb; 0,1 μg/μl für analytische Gele 4 μl und (NEB) 3 kb; 2 kb; 1,5 kb; 1 kb; 0,5 kb für präparative Gele 8 μL auf- DNA-Fragmente tragen Agarose-Lösung Agarose 7 g in der Mikrowelle aufkochen; 0,7 % TAE-Puffer 1 x ad 1.000 ml bei 60 °C lagern Ethidiumbromid- Ethidiumbromid 10 μg/ml vor Licht geschützt lagern Färbebad GelRed™- GelRed™ 303 µl vor Licht geschützt lagern
Färbebad H2Obidest ad 1.000 ml Ladepuffer Gel Loading Dye, Purple, 6 x (NEB) TAE-Puffer 50 x TRIS 2 M mit Eisessig auf pH 8,0 einstel- EDTA 50 mM len
37 Material und Methoden 3.4.7 Lösungen und Puffer für die Proteinaufreinigung
Alle verwendeten Puffer wurden mit 1 M HCl beziehungsweise 1 M NaOH auf pH 8,0 eingestellt. Puf- fer und Lösungen, die bei der präparativen Aufreinigung an der ÄKTA FPLC eingesetzt wurden, wur- den unter Vakuum filtriert.
Tabelle 3.15: Lösungen und Puffer zu dem Entfernen und Beladen der HisTrap™ FF Säule mit Ni2+-Ionen (171) Bezeichnung Bestandteile Konzentration 2+ Puffer zu dem Entfernen der Ni -Ionen Na3PO4 20 mM NaCl 0,5 M EDTA 50 mM Bindungs-Puffer entspricht Puffer A (siehe Tabelle 3.16) 2+ Lösung zu dem Beladen mit Ni -Ionen NiSO4 0,1 M
Tabelle 3.16: Verwendete Puffer für die Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie Bezeichnung Bestandteile Konzentration Puffer A TRIS-HCl 50 mM His-trap SACE_3599 NaCl 300 mM Imidazol 10 mM
MgCl2 10 mM Puffer B TRIS-HCl 50 mM His-trap SACE_3599 NaCl 300 mM Imidazol 500 mM
MgCl2 10 mM Puffer A TRIS-HCl 40 mM His-trap Ses60310 NaCl 100 mM
MgCl2 5 mM TCEP 1 mM Glycerin 10 % (m/V) Puffer B TRIS-HCl 40 mM His-trap Ses60310 NaCl 100 mM
MgCl2 5 mM TCEP 1 mM Glycerin 10 % (m/V) Imidazol 500 mM Bindungs-Puffer Tris-HCl 100 mM Strep-tag NaCl 150 mM EDTA 1 mM Elutions-Puffer Tris-HCl 100 mM Strep-tag NaCl 150 mM EDTA 1 mM d-Desthiobiotin 2,5 mM
38 Material und Methoden
Tabelle 3.16: Verwendete Puffer für die Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie Regenerations-Puffer Tris-HCl 100 mM Strep-tag NaCl 150 mM EDTA 1 mM HABA 1 mM
Tabelle 3.17: Verwendete Puffer für die Proteinaufreinigung mittels Gelfiltration Bezeichnung Bestandteile Konzentration Anmerkungen Gelfiltrations-Puffer TRIS-HCl 25 mM pH 8,0 SACE_3599 NaCl 150 mM
MgCl2 5 mM Gelfiltrations-Puffer TRIS-HCl 40 mM pH 8,0 Ses60310 NaCl 100 mM TCEP 1 mM Glycerin 10 % (m/V)
3.4.8 Lösungen und Puffer zur Herstellung von SDS-PAGE-Gelen sowie für die Durchführung der diskontinuierlichen SDS-PAGE
Tabelle 3.18: Zusammensetzung des 12 % Trenngels, pH 8,8 Komponenten 2 Gele 3 Gele 4 Gele
H2Obidest 2,68 ml 4,02 ml 5,36 ml 1,5 M TRIS-HCl 2 ml 3 ml 4 ml 10 % SDS 80 µl 120 µl 160 µl Acrylamid/Bisacrylamid 3,2 ml 4,8 ml 6,4 ml 10 % APS 40 µl 60 µl 80 µl Temed 4 µl 6 µl 8 µl
Tabelle 3.19: Zusammensetzung des 4 % Sammelgels, pH 6,8 Komponenten 2 Gele 3 Gele 4 Gele
H2Obidest 3,66 ml 5,49 ml 7,32 ml 1,5 M TRIS-HCl 1,5 ml 2,25 ml 3 ml 10 % SDS 60 µl 90 µl 120 µl Acrylamid/Bisacrylamid 0,798 ml 1,197 ml 1,596 ml 10 % APS 30 µl 45 µl 60 µl Temed 6 µl 9 µl 12 µl
39 Material und Methoden
Tabelle 3.20: Lösungen und Puffer für die diskontinuierliche SDS-PAGE Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkungen Ladepuffer 2 x TRIS-HCl-Lösung pH 6,8; 0,5 M 1,8 ml Glycerol 2,0 g SDS 10 % 2,0 ml Bromphenolblau 1 % 200 μl DTT 0,154 g
H2Obidest ad 10 ml Laufpuffer 10 x TRIS-HCl 30,3 g pH 8,3 Glycin 144,2 g SDS 10 g
H2Obidest ad 1.000 ml Coomassieblau- Coomassie Brilliant Blau 2,5 g Färbelösung Ethanol 450 ml Essigsäure (100 %) 100 ml VE-Wasser ad 1.000 ml Entfärber Ethanol 450 ml Essigsäure (100 %) 100 ml VE-Wasser ad 1.000 ml Proteinstandard 1 170 kDa; 130 kDa; 100 kDa; 70 kDa (rot); PageRuler™ Prestained Pro- SDS-PAGE (PP) 55 kDa; 40 kDa; 35 kDa; 25 kDa; 15 kDa; tein Ladder, Thermo Scien- 10 kDa (grün) tific; 5 µl pro Gel Proteinstandard 2 245 kDa; 180 kDa; 135 kDa; 100 kDa; 75 kDa Protein Marker VI, AppliChem SDS-PAGE (PA) (rot); 63 kDa; 48 kDa; 35 kDa; 25 kDa( grün); GmbH; 5 µl pro Gel 20 kDa; 17 kDa; 11 kDa Proteinstandard 3 212 kDa; 158 kDa; 116 kDa; 97,2 kDa; Protein Marker, Broad Range, SDS-PAGE (PN) 66,4 kDa; 55,6 kDa; 42,7 kDa; 34,6 kDa; NEB; 7 µl pro Gel 27,0 kDa; 20,0 kDa; 14,3 kDa; 6,5 kDa
3.4.9 Lösungen und Puffer für die Durchführung des in vitro Aktivitätsassays zur Saccharomicin- Biosynthese Tabelle 3.21: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays zur Saccharomicin-Biosynthese Bezeichnung Bestandteile Menge/Konzentration Anmerkungen 10 x MOPS Puffer MOPS 20,9 g mit NaOH-
Natriumacetat, H2O-frei 2,1 g Plätzchen auf
Na2-EDTA 1,9 g pH 7,5 einstellen
H2Obidest ad 500 ml Resuspensions-Puffer 10 x MOPS-Puffer 100 ml NaCl 30 ml
MgCl2 20 ml DTT 2 ml
H2Obidest ad 1 l CoA-Lösung CoA 2 mM Taurin-Lösung Taurin 20 mM
40 Material und Methoden
Tabelle 3.21: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays zur Saccharomicin-Biosynthese ATP-Lösung ATP 25 mM Kaffeesäure-Lösungen Kaffeesäure 2/5/10/20/40 mM DMSO Trichloressigsäure-Lösung TCA 240 mg/ml
3.4.10 Lösungen und Puffer für die Durchführung des in vitro Aktivitätsassays SACE_3599 Tabelle 3.22: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays mit SACE_3599 Bezeichnung Bestandteile Menge/Konzentration Anmerkungen der Stammlösung TRIS-Puffer Tris-HCl 500 mM pH 7,5/8,0/8,8 BSA-Lösung BSA 10 mg/ml Promega; bei -20 °C lagern
MgCl2-Lösung MgCl2 1 M Anthrachinon-Lösung U3 2 mM bei -20 °C lagern TDP-Glucose-Lösung TDP-Glucose 10 mM bei -20 °C lagern PEP-Lösung PEP 70 mM bei -20 °C lagern PK-/LDH-Lösung Glycerin 50 % Sigma-Aldrich; bei HEPES pH 7,0 10 mM -20 °C lagern KCl 100 mM EDTA 0,1 mM NADH-Lösung NADH 15 mM bei -20 °C lagern
3.4.11 Lösungen und Puffer für die Durchführung des in vitro Aktivitätsassays zur Bestätigung der Konformation von U3-7 Tabelle 3.23: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays zur Konformation von U3-7 Bezeichnung Bestandteile Menge/Konzentration Anmerkungen
0,1 M Na-Phosphat- 0,2 M NaH2PO4 39,0 ml pH 7,0
Puffer 0,2 M Na2HPO4 61,0 ml
H2Obidest. ad 200 ml 0,1 M Na-Acetat- 0,2 M Essigsäure 29,6 ml pH 5,0 Puffer 0,2 M Na-Acetat 70,4 ml
H2Obidest. ad 200 ml β-Glucosidase-Lösung β-Glucosidase 10 mg/ml PNPG-Lösung PNPG 0,1 M
3.4.12 Lösungen für in vivo Biotransformationsexperimente
Alle Substanzen die für in vivo Biotransformationsexperimente verwendet wurden, sind mit Herstel- ler und dessen Standort in Tabelle 3.24 aufgelistet. Die entsprechenden Lösungen hatten jeweils eine Konzentration von 25 mg/ml in DMSO. Nach der Filtration wurden die Lösungen bis zu ihrer Verwen- dung bei -20 °C gelagert.
41 Material und Methoden
Tabelle 3.24: Substanzen für Biotransformationsexperimente Substanz Hersteller 1,4-Diaminoanthrachinon (U3) Prof. Dr. V. Novikov (Lemberg, UA) 1,4-Dihydroxyantrachinon (U2) Prof. Dr. V. Novikov Alizarin Sigma-Aldrich Kaffeesäure (KS) Sigma-Aldrich trans-Resveratrol Carl Roth Taurin Sigma-Aldrich
3.4.13 Lösungen für die Aufreinigung niedermolekularer Biotransformationsprodukte
Tabelle 3.25: Lösungen für die Festphasenextraktion Bezeichnung Bestandteile Menge/Konzentration Elutions-Lösungen Methanol 30 – 100 % (V/V) VE-Wasser Wasch-Lösung Dichlormethan 15 ml Methanol 35 ml Essigsäure 1 ml
Tabelle 3.26: Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie Bezeichnung Bestandteile Konzentration Laufmittel für Resveratrol-Derivate Ethylacetat 67,6 % Wasser 17,6 % Ameisensäure 7,4 % Essigsäure 7,4 % Laufmittel für U3-7 Acetonitril 89,5 % Wasser 10,5 % Essigsäure + 0,1 %
3.5 Nährmedien
Alle Nährmedien wurden nach Herstellung und pH-Einstellung autoklaviert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 M HCl- beziehungsweise 1 M NaOH-Lösung oder NaOH-Plätzchen eingestellt. Gegebenenfalls wurden dem autoklavierten Medium nach der Herstellung sterilfiltrierte Antibiotika- lösungen (siehe 3.6) zugesetzt.
In Platten gegossene Festmedien enthielten, zusätzlich zu den aufgeführten Bestandteilen, Agar-Agar in einer Konzentration von 21 g/l.
42 Material und Methoden
Tabelle 3.27: Nährmedien Medium Bestandteile Menge Anmerkungen LB LB-Trockenpulver 20 g Zur Kultivierung von E. coli-Stämmen; Leitungswasser ad 1.000 ml auf pH 7,3 einstellen TSB CASO Bouillon 30 g Zur Kultivierung von Aktinomyceten- Leitungswasser ad 1.000 ml Stämmen; auf pH 7,2 einstellen PDA Kartoffel-Extrakt-Glucose Bouillon 26,5 g Zur Kultivierung von Fusarium verticil- Leitungswasser ad 1.000 ml lioides YM Hefeextrakt 3 g Zur Kultivierung von Candida parapsi- Malzextrakt 3 g losis Pepton aus Soja 5 g Glucose 10 g Leitungswasser ad 1.000 ml MS D-Mannitol 20 g Zur Intergenerische Konjugation; auf Sojamehl, vollfett 20 g pH 7,2 einstellen; sterile Zugabe von
Leitungswasser ad 1.000 ml 10 ml einer 1 M MgCl2- oder CaCl2- Lösung nach dem Autoklavieren NL111 Lab Lemco Fleischextrakt 20 g Für in vivo Biotransformations- Malzextrakt 100 g experimente; auf pH 7,2 einstellen
CaCO3 10 g Leitungswasser ad 1.000 ml HA Hefeextrakt 4 g Zur Produktion von Kaffeesäure in Malzextrakt 10 g S. albus; auf pH 7,2 einstellen Glucose 4 g Leitungswasser ad 1.000 ml
3.6 Antibiotika
Alle Stammlösungen wurden entweder mit H2Obidest. oder EtOH 100 % hergestellt und anschließend sterilfiltriert (Porengröße 0,22 μm). Die Lagerung erfolgte bei -20 °C.
Tabelle 3.28: Verwendete Antibiotika mit entsprechenden Lösungsmitteln sowie Konzentrationen Antibiotikum Abkürzung Lösungsmittel Konzentration der Endkonzentration im Stammlösung [mg/ml] Medium [µg/ml]
Ampicillin Amp H2Obidest 50 50
Apramycin Apra H2Obidest 100 100 Azithromycin Azi EtOH 100 % 2,5
Carbenicillin Carb H2Obidest 50 50 Chloramphenicol Cam EtOH 100 % 34 34 Erythromycin Ery EtOH 100 % 2,5
Fosfomycin Phos H2Obidest 200 400
Hygromycin B Hyg H2Obidest 50 50
Kanamycin Kana H2Obidest 30 30
Spectinomycin Spec H2Obidest 100 100
43 Material und Methoden 3.7 Stämme
3.7.1 Escherichia coli-Stämme
Tabelle 3.29: Verwendete E. coli-Stämme und deren Beschreibung Stamm Verwendung Beschreibung Referenz - - - E. coli BL21 (DE3) x Proteinsynthese F ompT hsdSB(rB mB ) gal dcm (DE3) Invitrogen™ pLysS pLysS (CamR) (Carlsbad, USA) - - - + R E. coli BL21 Codon Proteinsynthese F ompT hsdS(rB mB ) dcm Tet gal endA (172,173) Plus RP x pL1SL2 Hte [argU proL CamR] pL1SL2 (AmpR) - - - E. coli BL21 Star Proteinsynthese F ompT hsdSB(rB mB ) gal dcm rne131 Invitrogen™ (DE3) (DE3) E. coli DH5α Klonierung F-, ϕ80/lacZΔM15, Δ(lacZYA- Invitrogen™ - argF)U169, recA1, endA1, hsdR17(rk + - ,mk ), phoA, supE44, λ , thi-1, gyrA96, relA1 E. coli ET12567 x Intergenerische F-, dam-13 ::Tn9, dcm-6, hsdM, hsdR, (174) pUZ8002 Konjugation zij-202::Tn10, recF143, galK2, GalT22, ara-14, lacY1, xyl-5, leuB6, thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4, tsx-78, mtl-1, glnV44 E. coli Intergenerische F-, dam-13 ::Tn9, dcm-6, hsdM, hsdR, (175–177) ET12567 x pUB307 Konjugation zij-202::Tn10, recF143, galK2, GalT22, ara-14, lacY1, xyl-5, leuB6, thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4, tsx-78, mtl-1, glnV44 - - - 3 E. coli Rosetta 2 Proteinsynthese F ompT hsdSB(rB mB ) gal dcm pRARE2 Novagen (CamR) (Darmstadt) E. coli Turbo Klonierung F´ proA+B+ lacIq ΔlacZ M15/fhuA2 New England Δ(lacproAB) glnV gal R(zgb- BioLabs 210::Tn10,)TetS endA1 thi-1 Δ(hsdS- mcrB)5 E. coli XL1-Blue Klonierung recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, Stratagene supE44, relA1, lac [F´ proAB la- cIqZΔM15 Tn10 (TetR)]
3.7.2 Aktinomyceten-Stämme
Tabelle 3.30: Verwendete Aktinomyceten-Stämme und deren Beschreibung Stamm Beschreibung Referenz Kitasatospora sp. 152608 Produziert Simocyclinone und dTDP-6-deoxy-L-Talose (41,50) Saccharopolyspora eryth- Erythromycinproduzent (31) raea NRRL 23338
44 Material und Methoden
Tabelle 3.30: Verwendete Aktinomyceten-Stämme und deren Beschreibung Saccharopolyspora eryth- Mutante von Saccharopolyspora erythraea NRRL 23338; diese raea Δsace_3599 sace_3599- (Inaktivierung des GT-Gens sace_3599) Arbeit Saccharothrix espanaensis Saccharomicinproduzent, metabolisiert lipophile Molekü- (24) DSM 44229 le durch Rhamnosylierung und Hydroxylierung Streptomyces albus J1074 Wirt zur heterologen Expression (178) Streptomyces albus Gluc Heterologer Wirt, produziert dTDP-Glucose (179) Streptomyces albus Rham Wirt zur heterologen Expression, produziert dTDP- (29) Rhamnose
3.7.3 Sonstige verwendeten Stämme
Tabelle 3.31: Sonstige verwendete Stämme und deren Beschreibung Stamm Verwendung Beschreibung Referenz Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn Agardiffusionstest Marburger Stamm ATCC 6051 (180) Candida parapsilosis DSM 5784 Agardiffusionstest (181) Fusarium verticillioides DSM 62264 Agardiffusionstest (182)
3.8 Vektoren und Plasmide
3.8.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide Die Plasmide pET-STN-ttha0948 sowie pET-CST-gene wurden von dem Arbeitskreis von Herrn Prof. Einsle, Universität Freiburg, zur Verfügung gestellt.
Die Bezeichnung 7665 für die Glykosyltransferase Ses60310 geht auf eine frühere Nummerierung der Gene während der Sequenzierungsarbeiten an dem Genom von Saccharothrix espanaensis (29) zu- rück und wird synonym verwendet.
Tabelle 3.32: In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide Plasmid Ausgangsplasmid Insert bzw. Beschreibung Resistenz Referenz cos17 pOJ436 Cosmid, trägt die Gene sam9 bis aac(3)IV (27) sam38 des Saccharomicin-Clusters cos35 pOJ436 Cosmid, trägt die Gene sam1 bis aac(3)IV (27) sam8 des Saccharomicin-Clusters pBluescript II Klonierungsvektor bla Invitrogen SK(-) (pBSK-) pET21a(+) Expressionsplasmid zur Protein- bla Novagen
produktion mit C-terminalem His6- tag pET28a(+) Expressionsplasmid zur Protein- aphII Novagen produktion mit N- und C-
terminalem His6-tag
45 Material und Methoden
Tabelle 3.32: In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide pET28a- pET28a(+) Expressionsplasmid zur Produktion aphII (183) 7665-N-his- von Ses60310 mit N-terminalem
TEV His6-tag und TEV-Schnittstelle pET-STN- pET21a(+) Expressionsplasmid zur Protein- bla AG Prof. Eins- ttha0948 produktion mit N-terminalem le Strep-tag und TEV-Schnittstelle pET-TSC- pET21a(+) Expressionsplasmid zur Protein- bla AG Prof. Eins- gene produktion mit C-terminalem le Strep-tag und TEV-Schnittstelle pLERE-Spec- Klonierungsvektor, trägt aadA und aadA, bla Kobylyanskyy, oriT oriT flankiert von zwei loxRE Er- unpubliziert kennungssequenzen pSET*sam7 pTAJA Expressionsplasmid, trägt sam7 zur aac(3)IV (29) heterologen Expression des Acetyl- CoA-Ligasegens pTESa pSET152 Expressionsplasmid mit attP und aac(3)IV (184) loxP Sequenzen für die markerfreie Integration; ermEp1-Promotor pTOS-Rham pTOS Expressionsplasmid zur markerfrei- aac(3)IV (29) en Integration von oleL, oleS, oleE und oleU; ermE*-Promotor pTOS*sam7+ pTOS Plasmid zur markerfreien Integrati- aac(3)IV (29) 5+8+36 on von sam7, sam5, sam8 und sam36 pTOSz pTOS Vektor zur markerfreien Integrati- aac(3)IV (185) on mit lacZ-Reportergen pUWL-A replikatives Multicopy-Plasmid mit aac(3)IV, (186) ermE-Promotor bla pUWL-A- pUWL-A Expressionsplasmid zur heterolo- aac(3)IV (29) 7665 gen Expression des Glykosyltrans- ferasegens ses60310 pUWL-A- pUWL-A Expressionsplasmid zur heterolo- aac(3)IV (179) sace_1884 gen Expression des Glykosyltrans- ferasegens sace_1884 pUWL-A- pUWL-A Expressionsplasmid zur heterolo- aac(3)IV (179) sace_3599 gen Expression des Glykosyltrans- ferasegens sace_3599 pUWL-A- pUWL-A Expressionsplasmid zur heterolo- aac(3)IV (179) sace_4470 gen Expression des Glykosyltrans- ferasegens sace_4470 pUWL-Dre Expressionsplasmid, trägt das Dre- bla, tsr (184) Rekombinasegen
46 Material und Methoden 3.8.2 In dieser Arbeit erstellte Plasmide Die folgenden Plasmidkonstrukte wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit hergestellt.
Tabelle 3.33: In dieser Arbeit neu erstellte Plasmide Plasmid Vektor/Ausgangs- Insert bzw. Beschreibung Länge des kloniert plasmid Inserts über pET21a-7665- pET-STN-ttha0948 Expressionsplasmid zur Produktion 1,2 kb HindIII/ STN von Ses60310 mit N-terminalem XhoI Strep-tag und TEV-Schnittstelle pET21a-7665- pET-TSC-gene Expressionsplasmid zur Produktion 1,2 kb NdeI/ TSC von Ses60310 mit C-terminalem Strep- HindIII tag und TEV-Schnittstelle pET21a-sam7- pET21a(+) Expressionsplasmid zur Produktion der 1,1 kb NdeI/ C-his-TEV putativen Acetyl-CoA-Ligase Sam7 mit XhoI
C-terminalem His6-tag und TEV- Schnittstelle pET21a- pET21a(+) Expressionsplasmid zur Produktion der 2,4 kb NdeI/ sam36-C-his- putativen Penicillin-Acylase Sam36 mit XhoI
TEV C-terminalem His6-tag und TEV- Schnittstelle pET28a- pET28a(+) Expressionsplasmid zur Produktion 1,2 kb HindIII/ sace_3599-N- von SACE_3599 mit N-terminalem NdeI his His6-tag pET28a-sam7- pET28a(+) Expressionsplasmid zur Produktion der 1,1 kb NdeI/ N-his putativen Acetyl-CoA-Ligase Sam7 mit XhoI
N-terminalem His6-tag pET28a- pET28a(+) Expressionsplasmid zur Produktion der 2,4 kb NdeI/ sam36-N-his putativen Penicillin-Acylase Sam36 mit XhoI
N-terminalem His6-tag pKC1132- pKC1132 Plasmid enthält DNA-Bereiche up- 1,7 kb NotI/ sace_3599-NX stream von sace_3599 aus XbaI S. erythraea pKC1132- pKC1132- Plasmid enthält DNA-Bereiche up- und 1,7 kb XbaI/ sace_3599- sace_3599-NX downstream von sace_3599 aus PstI NX-XP S. erythraea pKCΔsace_35 pKC1132- Plasmid zur Inaktivierung von 0,9 kb SphI/ 99 sace_3599-NX-XP sace_3599 in S. erythraea XbaI pTOS-ermE* pTOS-Rham Plasmid zur markerfreien Integration; NotI ermE*-Promotor pTOS-03123 pTOS Expressionsplasmid mit KSS_03123, 1,0 kb ClaI/ ein putatives dTDP-Glucose-4,6- NdeI dehydratase-Gen aus K. sp. 152608 pTOS- pTOS-03123 Expressionsplasmid mit KSS_03123, 1,5 kb NdeI/ 03123_24_25 KSS_03124, ein putatives dTDP-D- NotI Glucosesynthase-Gen, und KSS_03125, ein putatives dTDP-4-Keto-6-
47 Material und Methoden
Tabelle 3.33: In dieser Arbeit neu erstellte Plasmide deoxyglucose-3,5-epimerase-Gen aus K. sp. 152608 pTOS-Talose pTOS-03123_24_25 Expressionsplasmid zur markerfreien 1,0 kb NotI/ Integration von KSS_03123, SpeI KSS_03124, KSS_03125 und KSS_03127, ein putatives dTDP-6- deoxy-L-Talose-4-dehydrogenase-Gen, zur heterologen Produktion von dTDP- 6-deoxy-L-Talose pTOSz- pTOSz Plasmid zur Komplementierung von 1,5 kb SpeI/ sace_3599 sace_3599 in EcoRI S. erythraeaΔsace_3599 pUWL-A- pUWL-A Expressionsplasmid zur heterologen 2,6 kb HindIII/ sam36 Expression des putatives Penicillin- EcoRV Acylase-Gens Sam36 pUWL-A- pUWL-A-sam36 Expressionsplasmid zur heterologen 1,3 kb EcoRI/ sam36+sam7 Expression des putatives Acetyl-CoA- EcoRV Ligase-Gens Sam7 gemeinsam mit Sam36 pUWL-A-sam7 pUWL-A-sam36+7 Expressionsplasmid zur heterologen 1,3 kb HindIII/ Expression des putatives Acetyl-CoA- EcoRV Ligase-Gens Sam7
3.9 Mikrobiologische Methoden
3.9.1 Kultivierung von Escherichia coli
Zur Kultivierung von E. coli-Kulturen (siehe Tabelle 3.29) wurden entweder einzelne Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher beziehungsweise einer autoklavierten Pipettenspitze gepickt oder ein Teil einer Glycerol-Dauerkultur in flüssiges LB-Medium (siehe Tabelle 3.27) angeimpft. Flüssigkulturen mit einem Volumen von bis zu 10 ml wurden als Vorkulturen in Reagenzgläsern mit Aluminiumkappen für 16 h bei 37 °C auf dem Schüttler (180 rpm) kultiviert. Volumina von 100 ml wurden in 300 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane als Hauptkulturen mit 2 ml Vorkultur inokuliert und bei 37 °C auf dem Schüttler (180 rpm) bis zu einer OD600 von 0,5-0,7 kultiviert.
Bei der Anzucht von E. coli-Kulturen auf LB-Agarplatten wurden die Einzelkolonien mit einem sterilen Zahnstocher gepickt und großflächig ausgestrichen oder mit Drigalskispatel ausplattiert. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank.
Den Flüssig- sowie Festmedien wurden entsprechend den in den E. coli-Stämmen enthaltenen Resistenzgenen Selektionsantibiotika (siehe 3.6) zugesetzt.
48 Material und Methoden 3.9.2 Herstellung von Escherichia coli-Dauerkulturen
Von Klonen, welche nachweislich gewünschte Plasmide enthielten, wurden zur Konservierung Dau- erkulturen hergestellt. Dazu wurden 100 ml LB-Flüssigmedium mit entsprechenden Antibiotika mit dem gewünschten Klon von einer Platte inokuliert und für 16 h bei 37 °C auf dem Schüttler inkubiert (180 rpm). Die Kultur wurde auf zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und zentrifugiert (RT, 5.000 rpm, 5 min). Die Pellets wurden zum Waschen in 30 ml steriler Glycerol-Lösung (15 % m/V) (siehe Tabelle 3.9) resuspendiert und erneut zentrifugiert (RT, 5.000 rpm, 5 min). Im Anschluss daran wurden die Pellets in insgesamt 3-5 ml steriler Glycerol-Lösung (15 % m/V) resuspendiert. Die Lage- rung erfolgte bei -20 °C.
3.9.3 Kultivierung von Aktinomyceten-Stämmen
Zur Kultivierung der Aktinomyceten-Stämme und ihrer Mutanten wurden 500 µl einer Saccharose- Dauerkultur oder ein 1 cm2-großes, dicht bewachsenes Agarstück verwendet um TSB-Flüssigmedium zu inokulieren. Für Vorkulturen wurden 50 ml TSB-Medium (siehe Tabelle 3.27) in 100 ml- Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen für 1-2 Tage bei 28 °C auf dem Schüttler (180 rpm) kultiviert.
Jeweils 2 ml dieser Vorkultur wurden dazu verwendet, 100 ml Hauptkultur für Biotransformations- versuche in einem 300 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen und einer Spirale zu inokulieren. Die Durchführung der Biotransformationsstudien ist unter 3.15.1 beschrieben.
Die Kultivierung der Stämme auf Festmedium erfolgte auf TSB-Agarplatten, welche die entsprechen- den Selektionsantibiotika enthielten. Einzelne Kolonien wurden hierfür mit einem sterilen Zahnsto- cher gepickt, ausgestrichen und in einem Brutschrank bei 28 °C für 3-5 Tage inkubiert.
3.9.4 Erstellung von Aktinomyceten-Dauerkulturen
Zur Konservierung von Aktinomyceten-Stämmen sowie derer Mutanten wurden Dauerkulturen her- gestellt.
Dazu wurden 50 ml TSB-Flüssigmedium mit entsprechenden Antibiotika mit der gewünschten Kolonie von einer Platte inokuliert und für 16 h bei 28 °C auf dem Schüttler inkubiert (180 rpm). Die Kultur wurde in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert (RT, 5.000 rpm, 10 min). Das Pellet wurde zum Waschen in 30 ml steriler Saccharose-Lösung (25 % m/V) (siehe Tabelle 3.9) resus- pendiert und erneut zentrifugiert (RT, 5.000 rpm, 10 min). Im Anschluss daran wurde das Pellet in insgesamt 10 ml steriler Saccharose-Lösung (25 % m/V) resuspendiert. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C.
49 Material und Methoden 3.9.5 Übertragung von DNA auf Escherichia coli mittels Transformation Bei der Transformation handelt es sich um die Aufnahme freier DNA aus dem Medium in kompetente
Bakterienzellen. Man unterscheidet zwischen der CaCl2-vermittelten Hitzeschocktransformation so- wie der Transformation mittels Elektroporation. Standardmäßig wurde die CaCl2-vermittelte Hitze- schocktransformation angewendet. Ab einer Größe der Plasmid-DNA von mehr als 10 kb wurden E. coli-Zellen mittels Elektroporation transformiert.
3.9.5.1 CaCl2-vermittelte Hitzeschocktransformation
3.9.5.1.1 Herstellung CaCl2-kompetenter Escherichia coli-Zellen
CaCl2-kompetente E. coli-Zellen wurden in Anlehnung an die Methode von Sambrook et al. (187) hergestellt. Die hierfür verwendeten Lösungen sind unter 3.4.1 in Tabelle 3.9 beschrieben.
Zwischen 5 ml und 10 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika wurden mit einer Bakterienko- lonie von einer Platte beziehungsweise von einer Dauerkultur angeimpft und bei 37 °C für 16 h auf dem Schüttler (180 rpm) inkubiert. Von dieser Vorkultur wurden jeweils 1-2 ml entnommen um
100 ml LB•Flüssigmedium mit Antibiotika anzuimpfen. Die Hauptkulturen wurden bis zu einer OD600 von 0,5•0,7 angezogen und anschließend durch Zentrifugation geerntet. Hierfür wurden die Kulturen auf Zentrifugenröhrchen verteilt und zentrifugiert (4 °C, 5.000 rpm 10 min). Die folgenden Schritte wurden alle auf Eis, mit eisgekühlten Lösungen und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die
Zellpellets wurden jeweils in 30 ml 0,1 M MgCl2-Lösung resuspendiert und erneut abzentrifugiert
(4 °C, 3.000 rpm, 10 min). Nach der anschließenden Resuspension in 30 ml 0,1 M CaCl2-Lösung erfolg- te eine 20-minütige Inkubation auf Eis. Nach erneuter Zentrifugation (4 °C, 3.000 rpm, 10 min) wurde das Pellet abhängig von seiner Größe in 3 bis 10 ml 0,1 M CaCl2-Lösung mit 15 % Glycerol (m/V) re- suspendiert und in Aliquots von 150 μl bei -80 °C gelagert oder direkt weiter verwendet.
3.9.5.1.2 Hitzeschocktransformation von Escherichia coli und Überpicken von Transformanden Nach dem Auftauen der kompetenten Zellen auf Eis (ca. 10 min), wurde für die Hitzeschocktransfor- mation eines Ligationsansatzes der gesamte Ligationsansatz von 10 μl den 150 μl CaCl2-kompetenter Zellen zugesetzt. Bei der Transformation mit isoliertem Plasmid erfolgte die Zugabe von 2 μl DNA- Lösung.
Der Transformationsansatz wurde für 30 min auf Eis inkubiert. Um die Aufnahme der Plasmid-DNA in die Zelle zu ermöglichen, wurde eine eineinhalb-minütige Hitzeschock-Behandlung bei 42 °C durchge- führt. Es folgte eine fünf-minütige Inkubation auf Eis. Dem Ansatz wurde anschließend 1 ml LB•Flüssigmedium steril zugegeben und bei 37 °C für 1 h inkubiert. Die Zellen wurden auf einer LB- Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert.
50 Material und Methoden An dem darauffolgenden Tag wurden die angewachsenen Kolonien von der Platte gepickt und auf einer neuen LB-Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika großflächig ausgestrichen. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank.
3.9.5.2 Transformation mittels Elektroporation
3.9.5.2.1 Herstellung elektrokompetenter Escherichia coli-Zellen Elektrokompetente E. coli-Zellen wurden in Anlehnung an die Methode von Sambrook et al. (187) hergestellt. Die verwendete Lösung ist unter 3.4.1 in Tabelle 3.9 beschrieben.
Zwischen 5 ml und 10 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika wurden mit einer Bakterienko- lonie von Platte beziehungsweise mit einem Teil einer Dauerkultur angeimpft und bei 37 °C für 16 h auf dem Schüttler (180 rpm) inkubiert. Von dieser Vorkultur wurden jeweils 1-2 ml entnommen um
100 ml LB•Flüssigmedium mit Antibiotika anzuimpfen. Die Hauptkulturen wurden bis zu einer OD600 von 0,5•0,7 angezogen und anschließend durch Zentrifugation geerntet. Hierfür wurden die Kulturen auf Zentrifugenröhrchen verteilt und zentrifugiert (4 °C, 5.000 rpm, 10 min). Die folgenden Schritte wurden alle auf Eis, mit eisgekühlten Lösungen und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Zellpellets wurden zum Waschen jeweils in 30 ml Glycerol-Lösung (10 % m/V) resuspendiert und er- neut abzentrifugiert (4 °C, 3.000 rpm, 10 min). Nach wiederholter Resuspension in Glycerol-Lösung wurde abermals zentrifugiert (4 °C, 3.000 rpm, 10 min). Das erhaltene Pellet wurde abhängig von der Größe in 3 bis 10 ml Glycerol-Lösung (10 % m/V) resuspendiert und in Aliquots von 150 μl bei -80 °C gelagert oder direkt weiter verwendet.
3.9.5.2.2 Transformation von Escherichia coli mittels Elektroporation und Überpicken von Trans- formanden Der Transformationsansatz wurde in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette vereinigt. Um die Aufnahme der Plasmid-DNA in die Zelle zu ermöglichen, wurde mittels E. coli Pulser™ der Firma Bio- Rad ein Puls von 4-5 ms abgegeben (25 μF, 1,8 kV, 200 Ω). Dem Ansatz wurde innerhalb der nächsten 10 s 1 ml LB•Flüssigmedium zugegeben und nach Suspension und Überführung in ein 1,5 ml- Reaktionsgefäß erfolgte eine einstündige Inkubation bei 37 °C. Im Anschluss daran wurde der Trans- formationsansatz auf einer LB-Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert. Die Agarplatte wurde für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert.
An dem darauffolgenden Tag wurden die angewachsenen Kolonien von der Platte gepickt und auf einer neuen LB-Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika großflächig ausgestrichen. Die Inkubation erfolgt für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank.
51 Material und Methoden 3.9.6 Blau-Weiß-Selektion in Escherichia coli
Im Anschluss an die Transformation lässt sich mit Hilfe der Blau-Weiß-Selektion der Erfolg von Klonie- rungsexperimenten anhand der Kolonie-Färbung feststellen. Es werden Klonierungsvektoren ver- wendet, die ein lacZ-Gen zur α-Komplementierung der deletierten β-Galactosidase-Untereinheit des Bakterienstamms enthalten. Wird ein E. coli-Stamm mit deletiertem β-Galactosidase-Gen mit einem Vektor transformiert, kann mit Hilfe einer Farbreaktion festgestellt werden, ob das Bakterium ein religiertes oder rekombiniertes Plasmid aufgenommen hat. Die E. coli-Kolonien mit religiertem Plas- mid erscheinen blau, da das intakte lacZ-Gen die β-Galactosidase komplementiert, welche wiederum X-Gal zu einen blauen Farbstoff umsetzt. Enthalten E. coli-Zellen hingegen ein rekombinantes Plas- mid, wurde das lacZ-Gen durch Insertion der DNA unterbrochen. Dadurch findet keine Umsetzung des X-Gal statt und die Kolonien bleiben weiß.
Für die Durchführung der Blau-Weiß-Selektion wurde eine LB-Agarplatte mit entsprechenden Selek- tionsantibiotika zusätzlich mit 20 μl IPTG-Lösung und 20 μl X-Gal-Lösung (siehe Tabelle 3.10) über- schichtet. Nach Durchführung der Transformation, wurde der Transformationsansatz auf der über- schichteten LB-Agarplatte ausplattiert und für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert.
3.9.7 Intergenerische Konjugation Um Plasmid-DNA auf Aktinomyceten-Stämme zu übertragen, wurde die intergenerische Konjugation nach Kieser et al. (188) verwendet. Dabei dient der methylierungsdefiziente Stamm E. coli ET12567 als Donor, um einen Abbau artfremder DNA in dem Rezipienten-Stamm zu umgehen. E. coli ET12567 enthält zusätzlich ein sich selbst nicht transferierendes Fertilitätsplasmid (pUZ8002 oder pUB307). Diese Plasmide besitzen das RP4 Konjugationssystem mit geringer Rezipientenspezifität. Die Mobili- tätsfaktoren ermöglichen hierdurch die Übertragung von DNA in artfremde Organismen in Anwesen- heit des RP4 origin of Transfer (oriT) (189).
3.9.7.1 Vorbereitung des Donor-Stammes Zur Vorbereitung des Donor-Stammes wurden E. coli ET12567 x pUZ8002- oder E. coli ET12567 x pUB307-Zellen mit dem gewünschten Plasmid beziehungsweise Cosmid transfor- miert (siehe 3.9.5). Der Transformationsansatz wurde auf LB-Platten mit den entsprechenden Antibi- otika ausplattiert und für 16 h bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert.
An dem darauffolgenden Tag wurden alle erhaltenen Transformanden mit einer Impföse aufgenom- men, jeweils auf eine neue LB-Platte mit den entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und für 24 h bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert.
52 Material und Methoden Von den dicht bewachsenen Platten wurden mit der Impföse wenige Transformanden aufgenom- men, auf jeweils zwei neue LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und für 24 h bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert.
3.9.7.2 Vorbereitung des Rezipienten-Stammes Parallel zu der Vorbereitung des Donor-Stammes wurde der Aktinomyceten-Stamm als Rezipient vorbereitet. Hierzu wurden 50 ml TSB-Flüssigmedium, falls erforderlich unter Antibiotika-Zugabe, frisch mit einer Saccharose-Dauerkultur angeimpft und für 24 h auf dem Schüttler (180 rpm) bei 28 °C inkubiert.
3.9.7.3 Durchführung der intergenerischen Konjugation Für den Schritt der Konjugation wurde jeweils 1 ml der Aktinomyceten-Kultur abgenommen und zentrifugiert (RT, 7.000 rpm, 4 min). Der Überstand wurde verworfen. Die transformierten E. coli- Zellen wurden mit einer Impföse vollständig von den LB-Platten abgenommen und die Zellen einer Platte jeweils in einem 2 ml-Reaktionsgefäß mit der zentrifugierten Aktinomyceten-Kultur vermischt.
Die Zell-Suspensionen wurden auf MS-Platten ausplattiert und bei 28 °C in einem Brutschrank inku- biert.
Zusätzlich wurden zweimal nur der Aktinomyceten-Stamm ohne E. coli-Zellen ausplattiert. Diese dienten als Negativ- beziehungsweise Positivkontrolle.
Nach 8-16-stündiger Inkubation wurden die MS-Platten mit Antibiotika-Lösungen überschichtet. Zu- sätzlich zu dem entsprechenden Antibiotikum des Plasmids beziehungsweise Cosmids kam Fosfomy- cin gegen die E. coli-Zellen zum Einsatz. Die Positivkontrolle wurde ebenfalls mit Fosfomycin sowie gegebenenfalls mit weiteren Antibiotika überschichtet um das Wachstum des Aktinomyceten- Stammes anzuzeigen. Die Negativkontrolle wurde mit dem Selektionsantibiotikum des zu übertra- genden Plasmids überschichtet um ein Wachstum des Aktinomyceten-Stammes zu verhindern.
Die MS-Platten wurden für mindestens zwei Tage bei 28 °C in einem Brutschrank inkubiert. Waren Exkonjuganten sichtbar, wurden diese mit einem sterilen Zahnstocher gepickt und auf TSB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum und Fosfomycin ausgestrichen. Diese Platten wurden für mindestens zwei weitere Tage bei 28 °C in einem Brutschrank inkubiert.
Gut angewachsene Exkonjuganten wurden in 50 ml TSB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Antibiotika und Fosfomycin mit einem etwa 1 cm2 großen Mycel-Rechteck aus der TSB-Platte inoku- liert. Der Ansatz wurde für mindestens zwei Tage bei 28 °C auf dem Schüttler (180 rpm) inkubiert.
53 Material und Methoden Mit dieser Kultur wurde eine Verdünnungsreihe erstellt um einzelne, saubere Exkonjuganten ohne E. coli-Verunreinigungen zu erhalten. Hierfür wurden 900 µl Wasser mit 100 µl Kultur gemischt (Ver- dünnung 1). Von der Verdünnung 1 wurden 100 µl mit 900 µl Wasser gemischt (Verdünnung 2). Die- ser Vorgang wurde bis zu Verdünnung 8 wiederholt. Die Verdünnungen 5 bis 8 wurden auf TSB- Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum und Fosfomycin ausplattiert und für mindestens zwei Tage bei 28 °C in einem Brutschrank inkubiert.
Die angewachsenen Einzelkolonien wurden mit einem sterilen Zahnstocher gepickt und auf TSB- Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum und Fosfomycin ausgestrichen. Diese Platten wurden für mindestens zwei Tage bei 28 °C in einem Brutschrank inkubiert.
Waren die Exkonjuganten gut angewachsen wurden 50 ml TSB-Flüssigmedium mit den entsprechen- den Antibiotika und Fosfomycin mit einem etwa 1 cm2 großen Mycel-Rechteck aus der TSB-Platte inokuliert. Der Ansatz wurde für mindestens zwei Tage bei 28 °C auf dem Schüttler (180 rpm) inku- biert. Aus dieser Kultur wurde eine Saccharose-Dauerkultur hergestellt (siehe 3.9.4).
Um zu überprüfen ob die Konjugation erfolgreich war, wurde die genomische DNA beziehungsweise die Gesamt-DNA isoliert (siehe 3.10.2 beziehungsweise 3.10.3). Auf der genomischen DNA wurden die gewünschten DNA-Abschnitte mittels PCR und Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen. Mit der isolierten Gesamt-DNA erfolgte eine Retransformation des enthaltenen Plasmids in E. coli Turbo- Zellen. Die Plasmid-DNA wurde mittels Mini-Präparation (siehe 3.10.1.2) aufgereinigt und mittels Restriktionsverdau (siehe 3.10.5) und Sequenzierung (siehe 3.10.10) kontrolliert.
3.9.8 Markerfreie Integration
Um Gene stabil und dauerhaft in ein Genom zu integrieren, wurde die Methode der markerfreien Integration verwendet (184).
Die zu integrierenden Gene wurden in den Vektor pTOS kloniert und das erhaltene Plasmid mittels Konjugation in den heterologen Wirt S. albus eingebracht. Das verwendete Plasmid pTOS besitz zwei Erkennungssequenzen für die Dre-Rekombinase, sogenannte rox-sites. Im Anschluss an die erste erfolgreiche Konjugation wurde das Plasmid pUWL-Dre ebenfalls mittels Konjugation in den hetero- logen Wirt eingebracht. Durch Expression des Dre-Rekombinasegens innerhalb der Zellen wurde Dre- Rekombinase synthetisiert, welche die rox-sites erkennt und den von ihnen flankierten DNA- Abschnitt aus dem Genom entfernt. Somit wurde das Plasmidbackbone entfernt und nur die ge- wünschten Gene unter Kontrolle des ermE*-Promotors blieben zurück. Der Erfolg der markerfreien Integration wurde durch Amplifizierung des Apramycinresistenzgens sowie eines in das Genom inte- grierten Gens mittels PCR nachgewiesen.
54 Material und Methoden 3.9.9 Bestimmung der Trockenmasse
Um das Wachstum beziehungsweise die Produktion von Sekundärstoffen vergleichen zu können, wurde die Trockenmasse von Zell-Pellets bestimmt. Hierfür wurden 5 ml Kultur in einem vorher be- reits gewogenen 15 ml-Zentrifugenröhrchen abzentrifugiert (RT, 5.000 rpm, 20 min). Der Überstand wurde verworfen und das erhaltene Pellet für 72 Stunden bei 60 °C getrocknet. Nach dem Abkühlen der Zentrifugenröhrchen wurden sie erneut auf derselben Waage gewogen. Die Differenz beider Messungen ergibt die Trockenmasse.
3.10 Molekularbiologische Methoden
3.10.1 Plasmidisolierung
Abhängig von dem gewünschten Reinheitsgrad und der benötigten DNA-Menge kamen verschiedene Methoden für die Plasmidisolierung zum Einsatz. Alle hier beschriebenen Methoden der Plasmidiso- lierung beruhen auf dem Prinzip der Alkalischen Lyse nach Birnboim et al. (190).
3.10.1.1 Plasmidisolierung nach dem Prinzip der Alkalischen Lyse Die Alkalische Lyse ohne Kit ist eine kostengünstige, aber vergleichsweise unsaubere Methode der Plasmidisolierung und wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet um Plasmide für den Kontrollver- dau mittels Restriktionsendonukleasen (siehe 3.10.5) zu gewinnen. Alle verwendeten Lösungen sind unter 3.4.3 in Tabelle 3.11 beschrieben.
Mindestens 2 ml einer Vorkultur in LB-Flüssigmedium mit entsprechenden Antibiotika wurden zentri- fugiert (RT, 14.000 rpm, 5 min) und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 200 μl P1- Lösung resuspendiert, anschließend wurden 200 μl P2-Lösung zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Des Weiteren wurden 200 μl P3-Lösung zupipettiert und für 5 min auf Eis inkubiert.
Nach Zentrifugation (4 °C, 14.000 rpm, 15 min) wurde der Überstand in ein neues 1,5 ml- Reaktionsgefäß überführt und mit 400 μl eiskaltem Isopropanol eine alkoholische Fällung der Plas- mid•DNA durchgeführt. Nach erneuter Zentrifugation (4 °C, 14.000 rpm, 15 min) wurde der Über- stand verworfen und das Plasmid-DNA-Pellet mit 200 μl eiskaltem Ethanol 70 % gewaschen. Nach anschließender Zentrifugation (4 °C, 14.000 rpm, 5 min) wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde für etwa 10 min bei 60 °C in einem Trockenschrank getrocknet. Abschließend wurde die Plas- mid-DNA in 30 μl H2Obidest. gelöst und für den Kontrollverdau mittels Restriktionsendonukleasen ver- wendet.
55 Material und Methoden 3.10.1.2 Plasmidminipräparation mittels Kit Die Methode der Plasmidminipräparation mittels Kit eignet sich zu der quantitativen Aufreinigung von Plasmid- und Cosmid-DNA eines höheren Reinheitsgrades, wurde jedoch nur für die Aufreinigung von DNA zur Sequenzierung oder zur längerfristigen Aufbewahrung verwendet.
Bei Plasmid-DNA kam das Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System zum Einsatz. Für die Aufreinigung von Cosmiden wurde das innuPrep Plasmid Mini Kit (siehe Tabelle 3.6) verwendet. Die Aufreinigung erfolgte entsprechend den Herstellerangaben. Abschließend wurde die erhaltene DNA in 60 μl H2Obidest. gelöst und bei -20 °C gelagert.
3.10.1.3 Plasmidmidipräparation mittels Kit Eine Plasmidmidipräparation mittels Kit führt zu einer größeren Plasmidmengen als bei einer Plas- midminipräparation. Dafür verwendet wurde das PureYield™ Plasmid Midiprep System (siehe Tabelle 3.6). Die DNA-Isolierung erfolgte entsprechend den Angaben des Herstellers. Die erhaltene DNA wurde in bis zu 600 μL H2Obidest. gelöst. Die auf diese Weise gewonnene DNA wurde für Klonierungs- experimente und zur längerfristigen Aufbewahrung verwendet.
3.10.2 Isolierung genomischer DNA aus Aktinomyceten-Stämmen Zur Überprüfung ob integrative Plasmide beziehungsweise Cosmide bei der intergenerischen Konju- gation von dem Aktinomyceten-Rezipienten aufgenommen und in das Genom integriert wurden, wurde genomische DNA isoliert. Hierfür wurde ein Protokoll nach Kieser et al. verwendet (188). Alle benötigten Puffer und Lösungen sind in Tabelle 3.12 aufgeführt.
Die Aktinomyceten-Stämme wurden in 50 ml TSB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika für 16 h bei 28 °C und 180 rpm auf dem Rundschüttler inkubiert. Von dieser Übernachtkultur wurden 1- 2 ml zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 10 min) und der Überstand wurde verworfen. Das Mycel wurde in 500 µl SET-Puffer resuspendiert und mit 10 µl Lysozym-Lösung versetzt. Anschließend wurde der Ansatz für 30 min bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Nach Zugabe von 14 µl Proteinase K- Lösung sowie 50 µl SDS-Lösung erfolgte eine Inkubation von bis zu 60 min bei 55 °C in einem Heiz- block. Der Ansatz wurde mit 200 µl 5 M NaCl-Lösung sowie mit 500 µl Phenol-Chloroform-Mischung versetzt. Nach mindestens zwei-minütigem Schütteln und Zentrifugation (RT, 14.000 rpm, 10 min) wurde die obere Phase abgenommen und mit 500 µl Isopropanol versetzt. Nach erneuter Zentrifuga- tion (RT, 14.000 rpm, 10 min) wurde das erhaltene Pellet mit 500 µl eiskaltem 70 %igem (V/V) Etha- nol gewaschen und erneut zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 10 min). Dieser Waschschritt wurde einmal wiederholt. Das DNA-Pellet wurde bei 65 °C getrocknet und abschließend in 30 µl H2Obidest gelöst. Die Lagerung erfolgt bei 4 °C in einem Kühlschrank.
56 Material und Methoden 3.10.3 Isolierung der Gesamt-DNA aus Aktinomyceten-Stämmen Zur Überprüfung ob ein replikatives Plasmid bei der intergenerischen Konjugation von dem Rezipien- ten aufgenommen wurde, wurde die Gesamt-DNA der Mutanten isoliert. Alle verwendeten Puffer und Lösungen sind in Tabelle 3.13 aufgeführt.
Die Aktinomyceten-Stämme wurden in 50 ml TSB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika für 16 h bei 28 °C und 180 rpm auf dem Rundschüttler inkubiert. Von dieser Übernachtkultur wurden 2 ml zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 10 min) und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in 500 µl Lösung L1 resuspendiert und für 40-60 min bei 37 °C unter gelegentlichem Invertieren inku- biert. Nach Zugabe von 120 µl Lösung L2 wurde der Ansatz für 20 min bei 65 °C erhitzt. Die nun klare Lösung wurde mit 400 µl Lösung L3 versetzt, 20 min auf Eis inkubiert und anschließend abzentrifu- giert (4 °C, 14.000 rpm, 10 min). Der klare Überstand wurde abgenommen und die DNA durch Zuga- be von einem Volumenteil 70 %igem (V/V) Isopropanol und zehn-minütiger Inkubation bei RT gefällt. Nach erneuter Zentrifugation (4 °C, 14.000 rpm, 10 min) wurde das erhaltene Pellet mit 500 µl eiskal- tem 70 %igem (V/V) Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert (4 °C, 14.000 rpm, 10 min). Dieser Waschschritt wurde einmal wiederholt. Das erhaltene Pellet wurde bei 65 °C getrocknet und ab- schließend in 30 µl H2Obidest gelöst. Die Lagerung erfolgt bei 4 °C in einem Kühlschrank.
3.10.4 Polymerase-Kettenreaktion
3.10.4.1 Allgemein Bei der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) handelt es sich um eine selekti- ve und schnelle in vitro Methode zur Amplifizierung eines DNA-Fragments (191). Dabei werden die Schritte Denaturierung, Hybridisierung und Elongation zyklisch 25- bis 35-mal wiederholt.
In Anlehnung an ein vorhandenes Standard-Temperaturprogramm (siehe Tabelle 3.34) wird jedes Mal ein individuelles Programm entworfen. Hybridisierungstemperatur (x) sowie Elongationsdauer (y) sind die variablen Parameter. Die Hybridisierungstemperatur richtet sich nach der Schmelztempe- ratur der Primer. Zur Ermittlung der Hybridisierungstemperatur wurde eine Gradienten-PCR durchge- führt (siehe 3.10.4.2). Die Elongationsdauer ist abhängig von der Länge des zu amplifizierenden DNA- Abschnitts sowie von der verwendeten Polymerase.
Als Polymerasen wurden die Pfu-Polymerase aus dem hyperthermophilen marinen Archaeon Py- rococcus furiosus (192), die Taq-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus (193) sowie die künstlich hergestellte Pfu-ähnliche Polymerase Phusion (Thermo Scientific®) verwen- det. Die Pfu-Polymerase besitzt eine Korrekturlesefunktion aufgrund ihrer 3‘-5‘ Exonukleaseaktivität, sie ist deshalb im Vergleich zu der Taq-Polymerase langsamer und synthetisiert nur 500 bp pro min. Die Taq-Polymerase ist in der Lage circa 1.000 bp pro min zu synthetisieren. Die Phusion DNA-
57 Material und Methoden Polymerase ist ein künstlich hergestelltes, chimäres Protein aus einer Pyrococcus-ähnlichen DNA- Polymerase und einer dsDNA-bindenden Proteindomäne. Die dsDNA-bindende Proteindomäne er- höht die Verweildauer der DNA an dem Enzym pro Bindeereignis, was zu einer hohen Synthesege- schwindigkeit von 2.000-4.000 bp pro min führt. Gleichzeitig weist die Phusion mit ihrer 3‘-5‘ Exonuk- leaseaktivität und der daraus resultierenden Korrekturlesefunktion eine vielfach größere Genauigkeit auf als die Pfu-Polymerase.
Parallel zu jeder PCR wurde eine Negativkontrolle durchgeführt. Dabei wurde die DNA-Matrize durch Wasser ersetzt. In Tabelle 3.35 findet sich das verwendete Standard-Pipettierschema.
Tabelle 3.34: Verwendetes Standard-Temperaturprogramm für die PCR Initialisierung Denaturierung Hybridisierung Elongation Termination Temperatur 94 °C 94 °C x 72 °C 72 °C 4 °C Dauer 5 min 30 s 30 s y 7 min ∞ Wiederholungen 25-35
Tabelle 3.35: Verwendetes Standard-Pipettierschema für die PCR Komponente Volumen Stoffmenge/Units Polymerase-Puffer, 10 x 10 μl DMSO 10 μl forward-Primer, 10 µM 2 μl 20 pmol reverse-Primer, 10 µM 2 μl 20 pmol dNTP-Mix, 10 mM 2 μl je Nukleotid 20 nmol DNA-Matrize 1 μl DNA-Polymerase 1 μl ca. 5 units
H2Obidest ad 100 μl
3.10.4.2 Gradienten-PCR Die Gradienten-PCR wurde verwendet um die Hybridisierungstemperatur zu ermitteln. Unter Einsatz des Mastercycler Epigradient wurden in verschiedenen Reaktionsansätzen unterschiedliche Hybridi- sierungstemperaturen ausprobiert. Für die folgenden Amplifikationen wurde die Hybridisierungs- temperatur verwendet, bei der eine hohe Ausbeute an gewünschtem Produkt bei gleichzeitig ge- ringstem Anteil an unspezifischen Amplifikationen synthetisiert wurde.
3.10.4.3 Stepdown-PCR Abweichend von dem Standard-PCR-Programm wurde das Stepdown-PCR-Programm verwendet, wenn durch die Gradienten-PCR keine Hybridisierungstemperatur für die Synthese des gewünschten DNA-Abschnitts gefunden werden konnte. Bei einer Stepdown-PCR wurde in den ersten zehn Zyklen
58 Material und Methoden die Hybridisierungstemperatur jeweils um 1 °C abgesenkt. In weiteren 20 Zyklen wurde die durch- schnittliche Hybridisierungstemperatur der ersten zehn Zyklen verwendet.
3.10.4.4 Kolonie-PCR Zum Nachweis, dass das gewünschte DNA-Fragment nach Transformation in E. coli enthalten war, wurde eine Kolonie-PCR ohne vorherige DNA-Isolierung durchgeführt. Dazu wurden jeweils Einzelko- lonien von einer Transformationsplatte mit einem sterilen Zahnstocher gepickt, zur Kolonieerhaltung auf eine neue LB-Agarplatte mit Antibiotika ausgestrichen und in 50 µl PCR-Ansatz (siehe Tabelle 3.35) suspendiert. Durch die initiale Denaturierung von 5 min bei 94 °C wurden die Zellen zerstört und die DNA lag frei im PCR-Ansatz vor, in welchem sie als DNA-Matrize diente.
3.10.5 Restriktion von DNA durch Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme bakteriellen Ursprungs, welche in der Lage sind DNA an be- stimmen, meist palindromischen Erkennungssequenzen von 4-8 bp Länge zu erkennen und innerhalb oder in der Nähe dieser Erkennungssequenzen DNA zu spalten.
Die Restriktionsendonukleasen wurden gemäß den Bestimmungen des Herstellers bei den enzym- spezifischen Inkubationstemperaturen und mit den jeweils mitgelieferten Puffern verwendet. Bei einem analytischen Ansatz betrug das Gesamtvolumen 10 µl und bei einem präparativen 70 µl. In der Regel betrug die optimale Inkubationstemperatur 37 °C und die Dauer 1,5 h.
3.10.6 Dephosphorylierung mit Hilfe der Antarktischen Phosphatase Die Dephosphorylierung ist die enzymatisch katalysierte Abspaltung der Phosphat-Gruppe an dem 5‘- Ende eines DNA-Fragmentes. Diese Methode wird eingesetzt um einen Vektor zu desphosphorylieren und eine Religation zu verhindern. Dadurch wird die Effizienz von Ligation und Klonierung, insbeson- dere bei blunt-end Klonierungen, gesteigert.
Tabelle 3.36: Pipettierschema der Dephosphorylierung mit Hilfe der Antarktischen Phosphatase Komponente Volumen Präparativer Restriktionsverdau 70 µl Puffer 8 µl Antarktische Phosphatase 2 µl
Die Dephosphorylierung des Vektors mit Hilfe der Antarktischen Phosphatase wurde direkt im An- schluss an den präparativen Restriktionsverdau durchgeführt. Das Pipettierschema ist in Tabelle 3.36 dargestellt. Die Inkubationsdauer betrug 15 min bei 37 °C.
Nach Hitze-Inaktivierung der Antarktischen Phosphatase bei 70 °C für 5 min wurde die erhaltene DNA direkt zur Ligation (siehe 3.10.8) verwendet oder bei -20 °C gelagert.
59 Material und Methoden 3.10.7 Auffüllreaktion mit Hilfe der T4-DNA-Polymerase Die T4-DNA-Polymerase kann ähnlich wie das Klenow-Fragment dazu verwendet werden um 5‘- Überhänge aufzufüllen und somit blunt ends für die Ligation zu erhalten. Da die T4-DNA-Polymerase zusätzlich zu der Polymeraseaktivität eine 3‘-5‘-Exonukleaseaktivität besitzt, werden 3‘-Überhänge ebenfalls geglättet. In Tabelle 3.37 ist das Pipettierschema der Auffüllreaktion dargestellt. Zur Vorbe- reitung wurde die DNA mittels Restriktionsenzymen verdaut und mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (siehe Tabelle 3.6) aufgereinigt.
Tabelle 3.37: Pipettierschema der Auffüllreaktion mit T4-DNA-Polymerase Komponente Volumen DNA 12 µl dNTPs 2 µl Puffer 2 µl BSA 2 µl T4-DNA-Polymerase 2 µl
Nach 15-minütiger Inkubation des DNA-Fragments bei 12 °C, erfolgte eine erneute Aufreinigung mit- tels Kit. Die so behandelte Vektor-DNA wurde für die Ligation (siehe 3.10.8) verwendet.
3.10.8 Ligation
DNA-Ligationen wurden durch die T4-DNA-Ligase (siehe Tabelle 3.5) katalysiert, welche unter ATP- Verbrauch Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3‘-OH- und dem 5‘-Phosphat-Ende doppelsträn- giger DNA knüpft (194). Entsprechend den Herstellerangaben wurden das zu ligierende DNA-Insert und der Vektor, nach vorhergegangener Restriktion (siehe 3.10.5), in Gegenwart des Hersteller- Puffers in einem Verhältnis von 7:1 bis 3:1 gemischt. Die DNA-Fragmente müssen dabei entweder mit jeweils denselben Restriktionsenzymen geschnitten worden sein oder kompatible Enden aufweisen. Nach Inkubation für 16 h bei 4 °C, für 4 h bei 16 °C beziehungsweise für 1 h bei RT erfolgte die Trans- formation des Ligationsansatzes (siehe 3.9.5).
3.10.9 Agarose-Gelelektrophorese
Für die Aufreinigung von DNA nach ihrer Größe wurde die Gelelektrophorese mit Agarose-Gelen ei- ner Konzentration von 0,7 % (m/V) nach Sambrook et al. (187) verwendet. Die verwendeten Lösun- gen sind unter 3.4.6 in Tabelle 3.14 beschrieben.
Alle Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit der entsprechenden Menge an 6 x Ladepuffer versetzt. Als Längenstandard dienten jeweils 4 μl einer 1 kb DNA Leiter. Die Elektrophorese zu analy- tischen Zwecken erfolgte für 35 min bei 110 V in 1 x TAE-Puffer bei RT, für präparative Zwecke wur- den 80 V und 50 min gewählt.
60 Material und Methoden Die DNA-Banden wurden durch 15- bis 30-minütige Inkubation mit dem Phenanthridin-Farbstoff Ethidiumbromid beziehungsweise dem Ethidiumbromid-Derivat GelRed™ markiert, im UV- Transilluminator sichtbar gemacht und die Gele mit einer CCD-Kamera fotografiert beziehungsweise in der E-Box VX5 visualisiert und dokumentiert.
Bei präparativen Gelen wurde die Inkubationszeit kürzer gewählt und die gewünschten Banden wur- den mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde mit Hilfe des Wizard® SV Gel and
PCR Clean-Up System nach den Herstellerangaben aus dem Agarosegel aufgereinigt, in 30 μl H2Obidest. gelöst und bei -20 °C gelagert oder sofort weiterverwendet.
3.10.10 Sequenzierung von Plasmid-DNA
Zur Überprüfung neu konstruierter Plasmide wurden Sequenzierungen bei der Firma GATC in Kon- stanz beziehungsweise bei der Firma Eurofins Genomics in Ebersberg in Auftrag gegeben. Ausgehend von mindestens 600 ng Plasmid-DNA wurden mit Hilfe von vektorspezifischen Standardprimern oder genspezifischen Primern automatisch prozessierte Sequenzdaten erhalten.
3.11 Klonierung von Plasmiden Alle Vektoren und Plasmide, die im Rahmen dieser Arbeit zur Klonierung neuer Plasmide verwendet wurden, sind in Tabelle 3.32 aufgelistet. Die neu hergestellten Plasmide sind in Tabelle 3.33 aufgelis- tet, ihre Plasmidkarten sind im Anhang unter 7.1 zu finden. Die Primer, welche zur Amplifikation der zu klonierenden Gene verwendet wurden, sind in Tabelle 3.38 und die PCR-Bedingungen in Tabelle 3.39 aufgeführt. Alle neu hergestellten Plasmide wurden mittels Restriktionsverdau (siehe 3.10.5) sowie Sequenzierung (siehe 3.10.10) verifiziert.
3.11.1 Klonierung von Saccharomicin-Biosynthese-Genen
3.11.1.1 pUWL-A-sam36 Das Gen sam36 aus dem Saccharomicin-Cluster wurde in den replikativen Vektor pUWL-A kloniert, um sam36 heterolog in S. albus zu exprimieren.
Dazu wurde sam36 über HindIII und EcoRV aus dem Plasmid pTOS*sam7+5+8+36 ausgeschnitten und in den linearisierten (siehe 3.10.5) und dephosphorylierten (siehe 3.10.6) Vektor pUWL-A kloniert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pUWL-A-sam36.
3.11.1.2 pUWL-A-sam36+7 Die Gene sam36 und sam7 aus dem Saccharomicin-Cluster wurden in den replikativen Vektor pUWL- A kloniert, um sam36 und sam7 heterolog in S. albus zu exprimieren.
61 Material und Methoden Das Gen sam7 wurde über EcoRI und EcoRV aus dem Plasmid pSET*sam7 ausgeschnitten und in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pUWL-A-sam36 kloniert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pUWL-A-sam36+7.
3.11.1.3 pUWL-A-sam7 Das Gen sam7 aus dem Saccharomicin-Cluster wurde in den replikativen Vektor pUWL-A kloniert, um sam7 heterolog in S. albus zu exprimieren.
Über EcoRV und HindIII wurde sam36 aus dem Plasmidkonstrukt pUWL-A-sam36+7 ausgeschnitten. Mittels T4-DNA-Polymerase wurden blunt ends generiert (siehe 3.10.7). Abschließend erfolgte die Ligation zu dem resultierenden Plasmid pUWL-A-sam7.
3.11.2 Klonierung von Plasmiden zur heterologen Proteinproduktion
3.11.2.1 pET21a-sam7-C-his-TEV
Zur Expression des Gens sam7 zusammen mit einem C-His6-tag und einer TEV-Schnittstelle in E. coli wurde das Expressionskonstrukt pET21a-sam7-C-his-TEV erstellt.
Das Gen sam7 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars sam7-prot-f/ sam7-C-his-r und dem Template pSET*sam7 amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pET21a(+) kloniert. Das resultie- rende Plasmid trägt den Namen pET21a-sam7-C-his-TEV.
3.11.2.2 pET28a-sam7-N-his
Zur Expression des Gens sam7 zusammen mit einem N-His6-tag in E. coli wurde das Expressionskon- strukt pET28a-sam7-N-his erstellt.
Das Gen sam7 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars sam7-prot-f/ sam7-N-his-r und dem Template pSET*sam7 amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pET28a(+) kloniert. Das resultie- rende Plasmid trägt den Namen pET28a-sam7-N-his.
3.11.2.3 pET21a-sam36-C-his-TEV
Zur Expression des Gens sam36 zusammen mit einem C-His6-tag und einer TEV-Schnittstelle in E. coli wurde das Expressionskonstrukt pET21a-sam36-C-his-TEV erstellt.
Das Gen sam36 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars sam36-prot-f/ sam36-C-his-r und dem Template pTOS*sam7+5+8+36 amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pET21a(+) kloniert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pET21a-sam36-C-his-TEV.
62 Material und Methoden 3.11.2.4 pET28a-sam36-N-his
Zur Expression des Gens sam36 zusammen mit einem N-His6-tag in E. coli wurde das Expressionskon- strukt pET28a-sam36-N-his erstellt.
Das Gen sam36 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars sam36-prot-f/ sam36-N-his-r und dem Template pTOS*sam7+5+8+36 amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen NdeI und XhoI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pET28a(+) kloniert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pET28a-sam36-N-his.
3.11.2.5 pET21a-7665-STN Zur Expression des Glykosyltransferase-Gens Ses60310 zusammen mit einem N-terminalen Strep-tag und einer TEV-Schnittstelle in E. coli wurde das Expressionskonstrukt pET21a-7665-STN erstellt.
Das Gen Ses60310 wurde mit dem Primerpaar 7665-STN-f/ -r und dem Template pET28a-7665-N-his- TEV amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen HindIII und XhoI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pET-STN-ttha0948 kloniert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pET21a-7665-STN.
3.11.2.6 pET21a-7665-TSC Zur Expression des Glykosyltransferase-Gens Ses60310 zusammen mit einem C-terminalen Strep-tag und einer TEV-Schnittstelle in E. coli wurde das Expressionskonstrukt pET21a-7665-TSC erstellt.
Das Gen Ses60310 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars 7665-TSC-f/ -r und dem Template pET28a-7665-N-his-TEV amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen NdeI und HindIII wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pET-TSC-gene kloniert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pET21a-7665-TSC.
3.11.2.7 pET28a-sace_3599-N-his
Zur Expression des N-GT-Gens sace_3599 mit N-terminalem His6-tag wurde das Expressionskonstrukt pET28a-sace_3599-N-his erstellt.
Das Gen sace_3599 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars pET-3599-f/ pET28a- 3599-r und genomischer DNA von S. erythraea als Template amplifiziert. Über die Primer wurden in das PCR-Produkt eine NdeI-, eine HindIII-Schnittstelle sowie ein Stoppcodon eingeführt.
Das PCR-Produkt wurde blunt in den EcoRV-geöffneten und dephosphorylierten Vektor pBSK(-) sub- kloniert. Das Gen sace_3599 wurde anschließend mittels der Restriktionsendonukleasen HindIII und NdeI aus dem resultierenden Plasmid pBSK(-)-3599 für pET28a(+) ausgeschnitten und in den lineari-
63 Material und Methoden sierten und dephosphorylierten Vektor pET28a(+) ligiert. Das resultierende Plasmid trägt den Namen pET28a-sace_3599-N-his.
3.11.3 Klonierung des Inaktivierungskonstruktes pKCΔsace_3599 Zur Erstellung des Inaktivierungskonstrukts pKCΔsace_3599 wurden zwei DNA-Abschnitte amplifi- ziert. Der Abschnitt 3599-NX ist homolog zu dem DNA-Bereich upstream, der Abschnitt 3599-XP ist homolog zu dem DNA Bereich downstream von sace_3599.
3599-NX wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars 3599-NX-f/ -r amplifiziert. 3599-XP wurde unter Verwendung der Primer 3599-XP-f/ -r amplifiziert. Als Template diente dabei jeweils genomische DNA von S. erythraea.
Über die Restriktionsschnittstellen NotI und XbaI wurde das PCR-Produkt 3599-NX in den linearisier- ten und dephosphorylierten Vektor pKC1132 kloniert. Mittels Blau-Weiß-Selektion konnte auf den E. coli-Klon mit dem resultierenden Plasmid pKC1132-sace_3599-NX selektiert werden.
Das Plasmid pKC1132-sace_3599-NX wurde linearisiert, dephosphoryliert und mit dem XbaI- und PstI-verdauten PCR-Produkt 3599-XP zu dem Plasmid pKC1132-sace_3599-NX-XP ligiert.
Das Spectinomycinresistenzgen wurde mit dem Primerpaar Spec-f/ -r und dem Template pLERE-Spec- oriT amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen SphI und XbaI wurde das PCR-Produkt in das linearisierte und dephosphorylierte Plasmid pKC1132-sace_3599-NX-XP kloniert. Das resultierende Inaktivierungskonstrukt trägt den Namen pKCΔsace_3599.
3.11.4 Klonierung des Komplementierungskonstruktes pTOSz-sace_3599 Um den Einfluss von SACE_3599 auf die Biotransformation von 1,4-Diaminoanthrachinon weiter zu untersuchen beziehungsweise etwaige polare Effekte zu identifizieren, sollte die Doppelcrossover- Mutante S. erythraea Δsace_3599 komplementiert werden. Dafür sollte das intakte Gen sace_3599 in den Vektor pTOSz eingebracht werden.
Das Gen sace_3599 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars 3599k-f/ -r und genomi- scher DNA von S. erythraea als Template amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen SpeI und EcoRI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pTOSz ligiert. Das resultierende Komplementierungskonstrukt trägt den Namen pTOSz-sace_3599.
3.11.5 Klonierung von pTOS-ermE* und pTOS-Talose Aufgrund des starken Promoters ermE* wurde das Plasmid pTOS-Rham als Backbone für die Klonie- rung von pTOS-Talose ausgewählt.
64 Material und Methoden Unter Verwendung des Primerpaars pTOS-f/ -r wurde das Backbone von pTOS-Rham mittels PCR amplifiziert. Über die Primer wurden in das PCR-Produkt zwei NotI- sowie jeweils eine NdeI- und eine SpeI-Schnittstelle eingebracht.
Nach der Amplifizierung wurde das PCR-Produkt mit NotI geschnitten und mit sich selbst ligiert. Durch diese Ligation wurde das Plasmid pTOS-ermE* mit neu eingefügten SpeI- und NdeI- Schnittstellen erhalten.
Das Gen KSS_03123 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars 03123ClaI-f/ 03123NdeI-r und genomischer DNA von Kitasatospora sp. 152608 amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen ClaI und NdeI wurde das PCR-Produkt in den linearisierten und dephosphorylierten Vektor pTOS- ermE* zu pTOS-03123 ligiert.
Die Gene KSS_03124 und KSS_03125 wurden gemeinsam mittels PCR unter Verwendung des Primer- paars 03124_25NdeI-f/ 03124_25NotI-r und genomischer DNA von Kitasatospora sp. 152608 amplifi- ziert. Über die Restriktionsschnittstellen NdeI und NotI wurde das PCR-Produkt in das linearisierte und dephosphorylierte Plasmid pTOS-03123 zu pTOS-03123_24_25 ligiert.
Das Gen KSS_03127 wurde mittels PCR unter Verwendung des Primerpaars 03127NotI-f/ 03127SpeI-r und genomischer DNA von Kitasatospora sp. 152608 amplifiziert. Über die Restriktionsschnittstellen NotI und SpeI wurde das PCR-Produkt in das linearisierte und dephosphorylierte Plasmid pTOS- 03123_24_25 zu pTOS-Talose ligiert.
3.11.6 Verwendete Primer und PCR-Bedingungen In Tabelle 3.38 sind alle Primer, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden, nach Projekten geordnet aufgeführt. Tabelle 3.39 zeigt die exakten PCR-Bedingungen. Die spezifischen PCR- Bedingungen für die Primer zum Nachweis einer Single- und einer Doppelcrossover-Mutante sind in Tabelle 3.40 aufgelistet.
Tabelle 3.38: Zur Klonierung verwendete Primer Die eingeführten Restriktionsschnittstellen sind fett markiert. Die Primer wurden von Eurofins Genomics bezogen. Restriktions- Primername Primersequenz (5´ 3´) schnittstellen
Primer zur Synthese von Sam7 und Sam36 mit His6-tag sam7-prot-f TATACATATGGTGGGCTATGCAGAACTGAGTCCG NdeI sam7-N-his-r TATACTCGAGTCACCTTGTCCCAACCTCCG XhoI sam7-C-his-r TATACTCGAGCCTTGTCCCAACCTCCG XhoI sam36-prot-f TATACATATGCGCCGCACAACACGCGT NdeI sam36-N-his-r TATACTCGAGCTACTTCGGCAGCAGCACG XhoI sam36-C-his-r TATACTCGAGCTTCGGCAGCAGCAC XhoI
65 Material und Methoden
Tabelle 3.38: Zur Klonierung verwendete Primer Die eingeführten Restriktionsschnittstellen sind fett markiert. Die Primer wurden von Eurofins Genomics bezogen. Primer zur Synthese von Ses60310 mit Strep-tag 7665-TSC-f TATACATATGGGTACGATCGAGCCGGTGAAG NdeI 7665-TSC-r TATAAAGCTTGCGGGCGTACTCGGACAG HindIII 7665-STN-f TTAAAGCTTATGGGTACGATCGAGCCGGTGAAG HindIII 7665-STN-r TATACTCGAGCTAGCGGGCGTACTCGGACAG XhoI
Primer zur Synthese von SACE_3599 mit His6-tag pET-3599-f TACGCATATGACCAAGCACTTCGCGTTCGTCTCCC NdeI/Start pET28-3599-r TAGCAAGCTTTCAGGCCAGGTAGGACTCCAG HindIII/Stopp Primer zur Inaktivierung von sace_3599 3599-NX-f TATAGCGGCCGCGTGGCCCACCTCAAGCAG NotI 3599-NX-r GCGCTCTAGAGTCGGTCATGGGTGGGACGTC XbaI 3599-XP-f GCGCTCTAGAGCACCGCGTTCAACAAGC XbaI 3599-XP-r TATACTGCAGCGTGTCGGAGCGGCGGACC PstI Spec-f (185) TCGCCCATGGCATGCTTGGTCACCACCGACTATTTG XcmI/SphI Spec-r (185) CGGCCTCGAGTCTAGAACAATTGCTTATTTGCCGACTACC XhoI/XbaI Primer zur Komplementierung von sace_3599 3599k-f GCGCACTAGTAACACATGTTCAACAGCGTCGG SpeI 3599k-r GCTAGAATTCCAGGAGGAACACGACCATGACCC EcoRI Primer zur Erstellung von pTOS-Talose pTOS-f TCGCGGCCGCCATATGCGCATGCATCGATAGATCTC NotI/NdeI pTOS-r TATAGCGGCCGCACTAGTGAGCACGGACTGAAGCG NotI/SpeI 03123ClaI-f AGGCCTCGAGATCTATATCGATAGGGCGGGTCTTCGAAC ClaI 03123NdeI-r GTCGTGGGGCCATATGTCAGCCACGCAG NdeI 03124_25NdeI-f GCGTGGCTGACATATGGCCCCACGACCCCGC NdeI 03124_25NotI-r CGGGAGCGGCCGCTCAGACCGAGCGGAG NotI 03127NotI-f TCGGTCTGAGCGGCCGCTCCCGCGGTAC NotI 03127SpeI-r CGCTTCAGTCCGTGCTCAACTAGTTCAGCCGTTCAGACG SpeI
Tabelle 3.39: Zur Klonierung verwendete PCR-Bedingungen erwartete Primerpaar Polymerase Annealingtemperatur Elongationsdauer Fragmentlänge
Primer zur Synthese von Sam7 und Sam36 mit His6-tag sam7-prot-f Pfu 63,3 °C 2:30 min 1,1 kb sam7-N-his-r sam7-prot-f Pfu 58,3 °C 2:30 min 1,1 kb sam7-C-his-r sam36-prot-f Pfu 71,0 °C 5:00 min 2,4 kb sam36-N-his-r sam36-prot-f Pfu 60,7 °C 5:00 min 2,4 kb sam36-C-his-r Primer zur Synthese von Ses60310 mit Strep-tag 7665-TSC-f/ -r Pfu 60,7 °C 2:30 min 1,2 kb 7665-STN-f/ -r Pfu 60,7 °C 2:30 min 1,2 kb
66 Material und Methoden
Tabelle 3.39: Zur Klonierung verwendete PCR-Bedingungen
Primer zur Synthese von SACE_3599 mit His6-tag pET-3599-f Pfu 63,3 °C 3:10 min 1,2 kb pET28-3599-r Primer zur Inaktivierung von sace_3599 3599-NX-f/ -r Taq 66,0 °C 1:50 min 1,7 kb 3599-XP-f/ -r Taq 66,0 °C 1:50 min 1,7 kb Spec-f/ -r (185) Pfu 68,2 °C 1:45 min 0,9 kb Primer zur Komplementierung von sace_3599 3599k-f/ -r Pfu 63,3 °C 1:40 min 1,5 kb Primer zur Erstellung von pTOS-Talose 03123ClaI-f Pfu 43,8 °C 2:10 min 1,0 kb 03123NdeI-r 03124_25NdeI-f Stepdown-PCR Pfu 3:10 min 1,5 kb 03124_25NotI-r 55,4 °C – 45,4 °C 03127NotI-f Pfu 41,5 °C 2:10 min 1,0 kb 03127SpeI-r pTOS-f/ -r Pfu 63,7 °C 11:35 min 5,7 kb
3.12 Geninaktivierung mittels Doppelcrossover Die Inaktivierung von sace_3599 in dem Genom von S. erythraea wurde nach der von Kieser et al. beschriebenen Methode durchgeführt (188). Hierbei wurde das Zielgen durch Insertion von Fremd- DNA in Form einer Spectinomycinresistenz-Kassette inaktiviert und mit Hilfe eines Doppelcrossovers durch das mutierte Gen ersetzt.
3.12.1 Erstellung des Inaktivierungskonstruktes pKCΔsace_3599
Zur Erstellung des Inaktivierungskonstruktes pKCΔsace_3599 wurden jeweils zwei 1,7 kb lange Re- kombinationsabschnitte amplifiziert. Der Abschnitt 3599-NX, homolog zu dem DNA-Bereich up- stream des Zielgens, trägt einen Teil des Genstarts. Der DNA-Abschnitt 3599-XP, homolog zu dem DNA-Bereich downstream, trägt einen Teil vom Ende des Gens. Beide homologen Bereiche wurden so in das Suizidplasmid pKC1132 kloniert, dass Start und Ende des Gens direkt aneinander ligiert wurden. Zwischen die homologen Bereiche wurde anschließend das Gen für die Spectinomycinresis- tenz kloniert, wodurch das Zielgen unterbrochen wird. Die Klonierung des Inaktivierungskonstruktes pKCΔsace_3599 ist unter 3.11.3 beschrieben.
3.12.2 Gewinnung und Nachweis einer Singlecrossover-Mutante Das fertige Inaktivierungskonstrukt pKCΔsace_3599 wurde mittels intergenerischer Konjugation (sie- he 3.9.7) in S. erythraea eingebracht. Dabei wurden sowohl auf das Apramycinresistenzgen in dem Vektoranteil des Inaktivierungskonstruktes als auch auf das Spectinomycinresistenzgen selektiert. Bei
67 Material und Methoden den angewachsenen Exkonjuganten hat eine Rekombination von einem der beiden homologen Be- reiche des Plasmids mit dem Genom von S. erythraea stattgefunden.
Zum Nachweis, dass es sich bei den erhaltenen Exkonjuganten um Singlecrossover-Mutanten han- delt, wurde eine PCR durchgeführt. Es wurden Primer abgeleitet, die kurz vor dem Start und kurz nach dem Ende des Zielgens binden. Singlecrossover-Mutanten tragen sowohl das native als auch das mutierte Gen in ihrem Genom. Aufgrund des eingebrachten Spectinomycinresistenzgens unterschei- det sich das mutierte Gen in der Größe von dem nativen Gen. Die PCR zeigt für eine Singlecrossover- Mutante je zwei unterschiedlich lange Fragmente. Die PCR-Bedingungen und die erwarteten Frag- mentlängen für den Nachweis der Integration sind in Tabelle 3.40 aufgelistet.
Tabelle 3.40: PCR-Bedingungen zum Nachweis von Single- und Doppelcrossover-Mutanten Aufgelistet sind die verwendeten Primer mit Annealingtemperatur und Elongationsdauer. Es ist angegeben, welche Fragmentlängen für ein natives und für ein mutiertes Gen erhalten wurden. Primer- verwendete Annealing- Elongations- Länge nati- Länge mutier- Zielgen paar Polymerase temperatur dauer ves Gen tes Gen sace_3599 3599k-f/ -r Phusion 63,3 °C 50 sek 1,5 kb 1,8 kb
3.12.3 Gewinnung und Nachweis einer Doppelcrossover-Mutante Zur Generierung des zweiten Rekombinationsereignisses wurde eine Singlecrossover-Mutante mehr- fach passagiert. Dazu wurde eine einzelne Kolonie in 50 ml spectinomycinhaltiges TSB-Flüssigmedium gegeben und 48 h bei 28 °C in einem Schüttelturm bei 180 rpm inkubiert. Von dieser ersten Passage wurde 1 ml in frisches Medium überimpft und erneut inkubiert. Nach 10 Passagen wurde mit der Flüssigkultur eine Verdünnung in TSB-Medium hergestellt (1:10 bis 1:107) und ausplattiert. Von den Platten, auf denen Einzelkolonien gewachsen waren, wurden insgesamt etwa 250 bis 350 Klone auf Verlust der Apramycinresistenz durch das zweite Crossover-Ereignis getestet. Dies gelang durch Überimpfen der Klone auf apramycin- und spectinomycinhaltiges TSB-Festmedium. Eine Rastervorla- ge, welche auf die Platten angelegt wurde, erlaubte später die Zuordnung identischer Klone. Nach 3 bis 4 Tagen Inkubation der Selektionsplatten konnten Apramycin-sensitive und Spectinomycin- resistente Klone identifiziert werden.
Mittels PCR wurde nachgewiesen, dass es sich bei den erhaltenen Apramycin-sensitiven und Specti- nomycin-resistenten Klonen um Doppelcrossover-Mutanten handelt. Die PCR wurde analog zum Nachweis der Singlecrossover-Mutanten durchgeführt (siehe Tabelle 3.40).
68 Material und Methoden 3.13 Präparation, Aufreinigung und Analytik von Proteinen
In einem ersten Schritt wurden mittels Testexpressionen die Synthesebedingungen für die heterolo- ge Produktion von Proteinen in E. coli optimiert (siehe 3.13.1.1), welche dann in der Überproduktion entsprechend zur Anwendung kamen (siehe 3.13.1.2). Nach Aufschluss der Zellen (siehe 3.13.2) er- folgte eine mehrstufige Aufreinigung der Proteine mittels Affinitätschromatographie (siehe 3.13.3) sowie Größenausschlusschromatographie (siehe 3.13.4). Auf diese Weise aufgereinigte Proteine wurden in Aktivitätsassays (siehe 3.13.10) sowie für Kristallisationsversuche (siehe 3.14) verwendet.
3.13.1 Heterologe Proteinsynthese in Escherichia coli
3.13.1.1 Testexpression Um das Zellwachstum und die heterologe Biosynthese des jeweiligen Proteins in E. coli zu optimie- ren, wurden Testungen der Synthesebedingungen in verschiedenen E. coli-Produktionsstämmen, bei verschiedenen Temperaturen sowie unterschiedlichen Konzentrationen des Induktors IPTG durchge- führt.
Der E. coli-Stamm mit dem entsprechenden Expressionskonstrukt wurde von Platte oder als Dauer- kultur in 10 ml LB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Antibiotika angeimpft. Diese Vorkulturen wurden für 16 h bei 37 °C auf dem Schüttler inkubiert (180 rpm). Anschließend wurden 100 ml LB- Medium mit den entsprechenden Antibiotika und 2 ml dieser Vorkultur inokuliert und bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte OD600 von 0,5-0,7 kultiviert. Bei Erreichen der gewünschten optischen Dichte erfolgte die Induktion mit IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 1 mM. Die Kulturen wurden für weitere 3 h bis 16 h bei unterschiedlichen Temperaturen (20 °C, 28 °C oder 37 °C) auf dem Schütt- ler inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (siehe Tabelle 3.41) wurde jeweils die OD600 gemessen und 1 ml Probe entnommen. Parallel wurde als Kontrolle mit dem leeren Vektor identisch verfahren.
Tabelle 3.41: Zeitplan der Probenentnahme 20 °C 28 °C 37 °C
t0 t0 t0
- - t1
- t2 t2
- t3 t3
- t4 -
t16 - -
Die Proben wurden zentrifugiert (4 °C, 14.000 rpm, 2 min), der Überstand verworfen und das Pellet bis zu seiner weiteren Analyse bei -20 °C gelagert. Um einen quantitativen Vergleich zwischen den verschiedenen Proben zu ermöglichen, wurden die Pellets entsprechend ihrer OD600 in Wasser resus-
69 Material und Methoden pendiert, wobei pro 0,1 optischen Einheiten eine Wassermenge von 20 µl gewählt wurde. Jeweils 10 µl wurden mit 10 µl SDS-Ladepuffer versetzt und per SDS-PAGE (siehe 3.13.7) analysiert. Damit konnten jeweils der beste Stamm sowie die geeignetsten Bedingungen ermittelt werden.
3.13.1.2 Protein-Überproduktion Entsprechend der Ergebnisse der Testexpressionen (siehe 3.13.1.1) wurden Großproduktionen von 2- 5 l Kultur durchgeführt.
Hierfür wurde jeweils eine Vorkultur von 10 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika mit ei- nem Klon von einer LB-Platte oder von einer Dauerkultur eines Klons inokuliert und für 16 h bei 37 °C unter Schütteln (180 rpm) kultiviert. Mit je 2 ml dieser Vorkultur wurden je 100 ml einer Hauptkultur angeimpft. Die Hauptkultur wurde bei 37 °C unter Schütteln (180 rpm) bis zu einer OD600 von 0,5-0,7 kultiviert, anschließend mit IPTG induziert (Endkonzentration gemäß Testexpression) und entspre- chend der Ergebnisse der Testung der Synthesebedingungen (siehe 3.13.1.1) kultiviert.
Durch Zentrifugation (RT, 5.000 rpm, 10 min) wurden die Zellen geerntet, der Überstand wurde ver- worfen und das Zellpellet bis zu der weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
3.13.2 Zellaufschluss
In der vorliegenden Arbeit wurden für den Zellaufschluss von E. coli-Zellen sowohl die biologische Methode mittels Lysozym als auch die mechanische Methode der French Pressure Cell Press verwen- det.
Tiefgefrorene Zellpellets wurden, auf Eis aufgetaut und dabei in 10 bis 20 ml Puffer A resuspendiert, mit Lysozym und 10 μl DNase versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Die verwendete French-Press- Zelle (40 K) mit einem Volumen von 35 ml wurde vor Benutzung gekühlt. Die Zellsuspension wurde nach der Inkubation mit Lysozym zwei- bis dreimal bei einem Druck von maximal 900 psi bis zu einer homogenen Konsistenz aufgeschlossen. Abschließend wurden unlöslichen Zellbestandteile durch Zentrifugation (4 °C, 11.000 rpm, 2 x 30 min) abgetrennt.
3.13.3 Affinitätschromatographie
3.13.3.1 Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie Ein mögliches System der Affinitätschromatographie besteht aus Ni2+-Nitrilotriessigsäure (Ni2+-NTA) und Polyhistidinen.
NTA, welches an Agarose fixiert ist, bildet mit mehrwertigen Metallionen wie beispielsweise Ni2+ ei- nen stabilen Komplex und dient als stationäre Phase der Affinitätschromatographie (195). Ein Protein mit C- oder N-terminal angehängten Histidinen bindet an die Ni2+-Ionen und wird so auf der Säule
70 Material und Methoden zurückgehalten (196,197). Hierdurch findet eine Abtrennung unerwünschter Proteine statt. Durch Zugabe von Imidazol in niedriger Konzentration zu dem Lysepuffer sowie mehrstufige Erhöhung der Imidazolkonzentration in den Waschpuffern können schwächer gebundene Verunreinigungen ent- fernt werden. Abschließend wird das mit großer Affinität gebundene Protein durch eine hohe Imida- zolkonzentration von 150-300 mM eluiert. Die verwendeten Puffer sind unter 3.4.7 in Tabelle 3.16 beschrieben.
3.13.3.2 Analytische Aufreinigung mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis mit vorgekühlten Lösungen und Geräten durchgeführt. Das tiefge- frorene Zellpellet von 100-300 ml Kultur (siehe 3.13.1) wurde in 8 ml Puffer A (10 mM Imidazol) re- suspendiert, auf vier 2 ml-Reaktionsgefäße verteilt und zentrifugiert (4 °C, 14.000 rpm, 10 min). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet erneut in Puffer A resuspendiert. Die Zellsuspension wur- de vereinigt, zur Zelllyse mit Lysozym versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurde das Zelllysat wieder auf vier Reaktionsgefäße verteilt und zentrifugiert (4 °C, 14.000 rpm, 15 min). Der Überstand wurde mit 1 ml Ni2+-NTA-Harz versetzt und für 60 min auf Eis gerührt. Nach der Inku- bation wurde die Suspension in eine PD-10-Leersäule mit Fritte gegeben und nach dem Absetzten des Säulenmaterials der Durchfluss (DF) gesammelt. Es wurde zweimal mit je 4 ml Waschpuffer (40 mM Imidazol) gewaschen (W1 und W2) und das Protein abschließend viermal mit je 0,5 ml Eluti- onspuffer (250 mM Imidazol) eluiert (E1 - E4). Alle Fraktionen wurden separat gesammelt. Jeweils 8 μl wurden mit derselben Menge an SDS-Ladepuffer gemischt und per SDS-PAGE (siehe 3.13.7) ana- lysiert. Das Ni2+-NTA-Harz wurde im Anschluss für 30 min mit 0,5 M NaOH-Lösung gewaschen, in 1 ml Ethanol 30 % aufgenommen und bei 4 °C gelagert.
3.13.3.3 Präparative Aufreinigung mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie Die präparative Aufreinigung erfolgte stets in einem größeren Maßstab mittels ÄKTA-FPLC System. Für die hier vorliegende Arbeit wurde das System mit einer 5 ml HisTrap-Säule betrieben. Als mobile Phase dienen Puffer, welche dem System über Schläuche aus bis zu zwei Vorratsgefäßen zugeführt werden können. Durch die zwei vorhandenen Pumpen werden einerseits ein regulierbarer und kon- stanter Fluss und andererseits die Einstellung eines beliebigen Mischungsverhältnisses ermöglicht. Im Vergleich zu einer HPLC wird jedoch ein weitaus geringerer Druck aufgebaut. Der maximal tolerierte Druck richtet sich dabei nach der stationären Phase. Das Auftragen der Probe auf die Säule erfolgt abhängig von dem Probenvolumen über verschieden große Sample-Loops. Für das Auftragen großer Volumina auf die HisTrap-Säule wurde der 150 ml Superloop verwendet. Für Volumina von bis zu 1,0 ml fand der 2 ml•Sample•Loop Anwendung. Das Sammeln von Proben ist vollautomatisch über einen Probensammler möglich. Das System wird permanent auf 4 °C gekühlt und wird bei Nichtbe- nutzung in Ethanol 20 % gelagert.
71 Material und Methoden Da das System in Ethanol 20 % gelagert wurde, mussten das Gerät sowie die Säule vor der Protein- aufreinigung gespült und äquilibriert werden. Dies geschah mit jeweils mindestens 5-6 Säulenvolu- mina (SV) Milli-Q-Wasser und Puffer A. Nach erfolgtem Zellaufschluss des Pellets von 1 l Kultur und Zentrifugation (siehe 3.13.2) wurde der 150 ml-Superloop mit der Probe befüllt und anschließend die Probe auf die HisTrap-Säule geladen. Währenddessen konnte der Durchfluss gesammelt werden. Dieser enthält alle nicht gebundenen Proteine. Bis zu dem Erreichen einer Basislinie wurde erneut mit Puffer A gespült. Zum Waschen und Entfernen schwach gebundener Verunreinigungen wurde dem Puffer A ein geringer Anteil Puffer B zugemischt. Zum Eluieren des aufzureinigenden Proteins wurde der Anteil an Puffer B und somit die Imidazolkonzentration weiter erhöht. Abschließend wur- de die Säule mit 100 % Puffer B, Milli-Q-Wasser und für die Lagerung mit Ethanol 20 % gespült. Eine tabellarische Beschreibung der Säule sowie der Methode sind in Tabelle 3.42 zu finden.
Tabelle 3.42: Beschreibung der Säule sowie der His-trap-Methode Säule HisTrap FF 5 ml Säulenmaterial und Partikelgröße Ni Sepharose™ (Agarose) 6 Fast Flow/90 µm Säulenvolumen 5 ml System und Säule spülen I 6 SV Milli-Q-Wasser; Flussrate 1,0 ml/min Äquilibrierung I 6 SV Puffer A (10-40 mM Imidazol); Flussrate 1,0 ml/min Probeninjektion 20-30 ml Probe; Flussrate 0,5 ml/min Äquilibrierung II Puffer A bis die Absorption wieder das Niveau der Basislinie erreicht; Flussrate 1 ml/min Säule waschen Gradient mit Puffer B (500 mM Imidazol) Elution Gradient mit Puffer B (500 mM Imidazol) System und Säule spülen II je 6 SV Puffer B, Milli-Q-Wasser und Ethanol 20 %; Flussrate 1,0 ml/min Fraktionsvolumen 1,0-1,7 ml Wellenlänge der Absorptionsmessung 280 nm
Die HisTrap-Säule wurde gemäß Herstellerangaben jeweils nach viermaliger Benutzung von dem rest- lichen Nickel befreit und anschließend wieder mit Ni2+-Ionen beladen. Die hierfür verwendeten Puffer und Lösungen sind unter 3.4.7 in Tabelle 3.15 aufgeführt. Die Durchführung ist in Tabelle 3.43 be- schrieben.
Tabelle 3.43: Vorgehen bei dem Entfernen der Ni2+-Ionen und Neubeladen der HisTrap™ FF Säule Vorgang Abfolge und Volumen der genutzten Puffer und Lösungen Entfernen der Ni2+-Ionen 5-10 SV Puffer zu dem Entfernen der Ni2+-Ionen 5-10 SV Puffer A
5-10 SV H2Obidest Beladen mit Ni2+-Ionen 2,5 ml Lösung zu dem Beladen mit Ni2+-Ionen
5 SV H2Obidest 5 SV Puffer A
72 Material und Methoden 3.13.3.4 Streptavidin-Affinitätschromatographie Ein weiteres mögliches System der Affinitätschromatographie besteht aus Strep-Tactin, einem Strep- tavidin-Derivat, und dem Strep-tag, einem Oligopeptide mit der Aminosäure-Sequenz WSHPQFEK (198).
Bei Streptavidin handelt es sich um ein 19 kDa großes Protein, isoliert aus Streptomyces avidinii. Als Homo-Tetramer besitzt es eine sehr große Affinität für Biotin und dient, in Agarose eingebettet, als stationäre Phase der Affinitätschromatographie. Das speziell entwickelte Streptavidin-Derivat Strep- Tactin besitzt eine annähernd 100-fach höhere Affinität zu dem Strep-tag als das ursprüngliche Strep- tavidin. Ein Protein mit C- oder N-terminal angehängtem Strep-tag kann an die Biotin-Bindungstasche des Strep-Tactin binden und so auf der Säule zurückgehalten werden. Hierdurch findet eine Abtren- nung unerwünschter Proteine statt. Aufgrund der hohen Affinität und Spezifität ist kein separater Waschschritt erforderlich. Die Elution des aufzureinigenden Proteins erfolgt durch 2,5 mM d- Desthiobiotin im Puffer. Hierbei handelt es sich um milde, physiologische Bedingungen. Die verwen- deten Puffer sind unter 3.4.7 in Tabelle 3.16 beschrieben.
3.13.3.5 Präparative Aufreinigung mittels Streptavidin-Affinitätschromatographie Die präparative Aufreinigung erfolgte analog zu der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie mittels ÄKTA-FPLC System (siehe 3.13.3.3). Für die hier vorliegende Arbeit wurde das System mit einer 5 ml StrepTrap™ HP-Säule betrieben. Der maximal tolerierte Druck beträgt hierbei 0,3 MPa.
Das System wurde vor der Proteinaufreinigung zuerst mit Milli-Q-Wasser gespült und anschließend mit Bindungs-Puffer äquilibriert. Nach Zellaufschluss des Pellets von 1 l Kultur und Zentrifugation wurde der 150 ml-Superloop mit der Probe befüllt und anschließend die Probe auf die Säule geladen. Währenddessen konnte der Durchfluss gesammelt werden. Bis zu dem Erreichen einer Basislinie wurde erneut mit Bindungs-Puffer gespült. Zum Eluieren des aufzureinigenden Proteins wurden dem Puffer 2,5 mM d-Desthiobiotin zugegeben. Abschließend wurde die Säule mit Milli-Q-Wasser und für die Lagerung mit Ethanol 20 % gespült. Eine tabellarische Beschreibung der Säule sowie der Methode ist in Tabelle 3.44 zu finden.
Tabelle 3.44: Beschreibung der Säule sowie der Strep-tag-Methode Säule StrepTrap HP Säulenmaterial und Partikelgröße Highly cross-linked 6 % Agarose/34 µm Säulenvolumen 5 ml System und Säule spülen I 6 SV Milli-Q-Wasser; Flussrate 1,0 ml/min Äquilibrierung I 6 SV Bindungs-Puffer; Flussrate 1,0 ml/min Probeninjektion 30-40 ml Probe; Flussrate 0,5 ml/min Äquilibrierung II Mindestens 6 SV Bindungs-Puffer bis die Absorption wieder das Niveau der Basislinie erreicht; Flussrate 1 ml/min
73 Material und Methoden
Tabelle 3.44: Beschreibung der Säule sowie der Strep-tag-Methode Elution 6 SV Elutions-Puffer System und Säule spülen II je 6 SV Milli-Q-Wasser und Ethanol 20 %; Flussrate 1,0 ml/min Fraktionsvolumen 1,0-1,7 ml Wellenlänge der Absorptionsmessung 280 nm
3.13.4 Gelfiltration
3.13.4.1 Allgemein Bei der Gelfiltration, auch Größenausschlusschromatographie oder Gelpermeationschromatographie genannt, handelt es sich um ein flüssigchromatographisches Verfahren zur Trennung von Proteinen aufgrund ihrer Größe, welche bei globulären Proteinen proportional zu der Molekülmasse ist. Das Trägermaterial besteht aus einer porösen Gelmatrix definierter Porengrößen. In diese Poren diffun- dieren kleinere Moleküle stärker als größere, weshalb kleinere Proteine länger auf der Säule verblei- ben als größere. Daraus ergibt sich, dass Proteine nach absteigender Molekülmasse eluiert werden. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen dem Elutionsvolumen und dem Logarithmus der Molekülmasse.
3.13.4.2 Präparative Aufreinigung Die Aufreinigung des Proteins mittels Gelfiltration fand nur in einem präparativen Maßstab statt. Hierfür wurde das ÄKTA-FPLC System benutzt. Die Auftrennung der Probe erfolgte entweder mittels einer 24 ml• oder einer 120 ml-Gelfiltrationssäule.
Das System wurde mit Milli•Q•Wasser gespült und mit Gelfiltrations-Puffer äquilibriert. Die vereinig- ten Protein-Fraktionen der Affinitätschromatographie wurden mit Hilfe eines Vivaspin 20 Konzentra- tors auf ein Volumen < 0,5 ml eingeengt, zentrifugiert (4 °C, 14.000 rpm, 10 min) und mit Hilfe des 2 ml-Sample-Loops auf die Gelfiltrationssäule aufgetragen. Die Elution erfolgte mit Gelfiltrations- Puffer. Abschließend wurde die Säule mit Milli-Q-Wasser und für die Lagerung mit Ethanol 20 % ge- spült. Eine tabellarische Beschreibung der Säulen sowie der Methode findet sich in Tabelle 3.45.
Tabelle 3.45: Beschreibung der Säule sowie der Gelfiltrations-Methode kleine Säule Superdex 200 10/300 GL Säulenmaterial und Partikelgröße Agarose/Dextran/13 µm Säulenvolumen 24 ml große Säule HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade Säulenmaterial und Partikelgröße Agarose/Dextran/34 µm Säulenvolumen 120 - 124 ml System und Säule spülen I 1 SV Milli-Q-Wasser; Flussrate 0,2-0,5 ml/min Äquilibrierung I 1 SV Gelfiltrations-Puffer; Flussrate 0,2-0,5 ml/min
74 Material und Methoden
Tabelle 3.45: Beschreibung der Säule sowie der Gelfiltrations-Methode Probeninjektion max. 0,5 ml Probe; Flussrate 0,5 ml/min Elution 1 SV Gelfiltrations-Puffer; Flussrate 0,5 ml/min System und Säule spülen II je 1 SV Milli-Q-Wasser und Ethanol 20 %; Flussrate 0,2-0,5 ml/min Fraktionsvolumen 1,0-1,7 ml Wellenlänge der Absorptionsmessung 280 nm
3.13.5 Spaltung von Proteinen mittels TEV-Protease
Bei Proteasen handelt es sich um Enzyme, welche in der Lage sind, Proteine zu spalten. Man unter- scheidet Exo- und Endopeptidasen, die das Protein von den Enden her abbauen oder es innerhalb der Polypeptidkette spalten. Jede Endoprotease erkennt eine definierte Aminosäure•Sequenz, auch Pro- teaseschnittstelle genannt. Die verschiedenen Proteasen unterscheiden sich in Spezifität, Geschwin- digkeit und Temperaturspektrum. Anhand der hier aufgeführten Gesichtspunkte wurde für die vor- liegende Arbeit die TEV-Endoprotease ausgewählt. Hierfür mussten Konstrukte verwendet werden, welche in ihrer Proteinstruktur die TEV-Erkennungssequenz ENLYFQG tragen (199).
Die TEV-Protease kann dazu verwendet werden, Affinitäts-tags von heterolog produzierten Proteinen zu entfernen. Dies kann nötig sein, wenn die Proteinfaltung beeinträchtigt ist oder sich der Affinitäts- tag bei Kristallisationsversuchen als hinderlich erweist.
Zur Abspaltung des N-terminalen His6-tags an Ses60310 wurde mit der Protein-Probe zuerst, wie in 3.13.3.3 beschrieben, eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Anschließend wurden die ge- sammelten Protein-Fraktionen, wie in 3.13.6 beschrieben, auf ein Endvolumen von 0,5 ml aufkon- zentriert. Die Inkubation des Proteins mit 50 µl TEV-Protease erfolgte bei 4 °C über 16 h. Die hier
2+ verwendete TEV-Protease besitzt ihrerseits einen His6-tag und kann somit mittels Ni - Affinitätschromatographie entfernt werden. Demzufolge wurde eine weitere Ni2+- Affinitätschroma- tographie durchgeführt, bei der sich das aufzureinigende Protein im Durchfluss befand, da es nun ohne His6-tag vorlag. Der gesamte Durchfluss wurde gesammelt, aufkonzentriert und auf die Gelfilt- rationssäule aufgegeben (siehe 3.13.4).
3.13.6 Aufkonzentrierung von Proteinlösungen durch Zentrifugation
Das Einengen des Volumens einer Proteinlösung wurde sowohl nach der Affinitätschromatographie als auch nach der Gelfiltration durchgeführt. Dies geschah mittels Ultrafiltration bei 4 °C, wobei sich die Drehzahl nach den Herstellerangaben der Konzentratoren richtete. Verwendet wurden Vivaspin 20 Konzentratoren mit einem Ausschlussvolumen (MWCO) von 10 kDa. Die Dauer der Zentrifugation richtet sich nach dem zu zentrifugierenden Volumen, der Proteinkonzentration und dem Zustand des
75 Material und Methoden Konzentrators. Konzentratoren wurden ebenfalls dazu verwendet um das Milieu, in welchem das Protein vorlag, zu verändern. Hierfür wurde nach dem Einengen des Volumens der Konzentrator mit dem neuen Puffer aufgefüllt und erneut abzentrifugiert.
3.13.7 Diskontinuierliche Sodiumdodecyl-Polyacrylamidgelelektrophorese Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen und zur Beurteilung der Proteinreinheit nach den Aufreinigungsschritten wurde die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE) verwendet. Hierbei handelt es sich um die Standardmethode zur Auftrennung von Proteinen in einem elektrischen Feld nach ihrer Molekülgröße unabhängig von der Ladung des Moleküls.
Bei der Herstellung wurde zunächst das Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Auspolymerisieren des Trenngels wurde das Isopropanol entfernt und das Sammelgel gegossen. Als Platzhalter für die Probenkammern wurde vor dem Auspolymerisieren ein Kamm in das Sammel- gel gesteckt. Die Zusammensetzungen der verschiedenen Gele sind unter 3.4.8 in Tabelle 3.18 sowie Tabelle 3.19 aufgeführt. Alle weiteren benötigten Lösungen und Puffer sind in Tabelle 3.20 beschrie- ben. Nicht sofort benötigte Gele wurden bis zu einer Woche bei 4 °C in nasse Tücher eingewickelt gelagert.
Die Proben wurden vor dem Auftragen in die Kammern im Verhältnis 1:1 mit SDS-haltigem Ladepuf- fer versetzt und 5 min bei 100 °C gekocht. Es wurden 16 μl der Proben in die Probenkammern der SDS-Gele aufgetragen, zusätzlich in einer Spur 8 μl eines Protein-Größenstandards.
Die Laufkammer sowie das obere Reservoir der Gelhalterung wurden mit Laufpuffer gefüllt. Der Spannungsgeber wurde mit 150 V betrieben, bis das Bromphenolblau aus dem SDS-Ladepuffer den unteren Rand des Gels erreicht hatte.
Die Färbung des Trenngels erfolgte mit Coomassie Brilliant Blue-haltiger Färbelösung, nachdem das Sammelgel abgetrennt und verworfen wurde. Hierfür wurden die Gele zweimal für jeweils etwa 30 s in der Mikrowelle gekocht und zusätzlich 1 h auf dem Tischschüttler (RT, 50 rpm) inkubiert. Mit Hilfe der Entfärberlösung wurde anschließend der Farbstoff aus den Gelen entfernt, nicht jedoch der an die Proteine gebundene. Dadurch wurden die Proteinbanden sichtbar. Das Entfärben der Gele fand unter häufigem Wechsel des Entfärbers über etwa 3 h statt. Nach dem Entfärben wurden die Gele mit einem Scanner digitalisiert und gespeichert.
3.13.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen
Für die Durchführung der Aktivitätsassays (siehe 3.13.10) war es erforderlich, die Konzentration des Proteins in Lösung zu bestimmen. Hierfür wurde der NanoDrop 2000 verwendet. Durch Messung der Absorption bei 280 nm wird unter Zuhilfenahme des Lambert-Beerschen Gesetzes die Konzentration
76 Material und Methoden berechnet, sofern der molare dekadische Extinktionskoeffizient sowie die Molekülmasse des Proteins bekannt sind (200). Ein Wert für den molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten kann mit Hilfe der „ProtParam“-Funktion von Expasy (163) bestimmt werden und beträgt für SACE_3599 21.430 l/mol*cm. Die Molekülmasse beträgt 45.316,4 g/mol.
Vor Vermessung der aufkonzentrierten Proteinlösung wurde jeweils ein Nullabgleich gegen den Gel- filtrations-Puffer durchgeführt.
3.13.9 In vitro Aktivitätsassays zur Saccharomicin-Biosynthese
Zum Nachweis sowie zur Charakterisierung der Proteinaktivität wurden verschiedene Aktivitätsassays mit Sam7 und Sam36 durchgeführt. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze findet sich in Tabel- le 3.46. Zusätzlich wurden jeweils Negativkontrollen mitgeführt. Diese enthielten an Stelle des En- zyms H2Obidest. sowie alle weiteren aufgeführten Substanzen in angegebener Konzentration. Proben und Negativkontrollen wurden auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert.
3.13.9.1 Aktivitätsassay aus dem Rohextrakt Die wie unter 3.13.1.2 beschrieben gewonnenen Zellpellets von E. coli Rosetta 2 und den Rosetta 2- Mutanten, Rosetta 2 x pET21a-sam7-C-his-TEV und Rosetta 2 x pET21a-sam36-C-his-TEV, wurden in Resuspensions-Puffer (siehe Tabelle 3.21) resuspendiert und anschließend mittels Lysozym und French Press (siehe 3.13.2) aufgeschlossen. Des Weiteren wurden, wie unter 3.9.3 beschrieben, Vor- und Hauptkulturen von S. espanaensis angezogen. Die Hauptkultur wurde für 48 h bei 28 °C unter Schütteln (180 rpm) kultiviert und durch Zentrifugation (RT, 5000 rpm, 10 min) geerntet. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde mittels French Press (siehe 3.13.2) aufge- schlossen.
Rosetta 2-Zellen ohne Sam7 und Sam36 dienten als Negativkontrolle. Aufgeschlossene S. espanaensis-Zellen dienten als Positivkontrolle und wurden sowohl als interne als auch als externe Kontrolle verwendet.
Tabelle 3.46: Zusammensetzung der Reaktionsansätze für Aktivitätsassays aus einem Rohextrakt Substanz Konzentration bzw. Volumen Zelllysat jeweils 100 µl Kaffeesäure 0,2-4,0 mM ATP 2,5 mM CoA 0,2 mM Taurin 0,2 mM Resuspensions-Puffer, pH 7,5 ad 1 ml
77 Material und Methoden Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze ist in Tabelle 3.46 angegeben. Die verschiedenen Vari- anten der Behandlung dieser Reaktionsansätze sind unter 3.13.9.2, 3.13.9.3 und 3.13.9.4 beschrie- ben.
3.13.9.2 Lösen in Methanol Die verschiedenen Reaktionsansätze wurden für 3 Stunden bei 28 °C inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden anschließend mittels SpeedVac zur Trockene eingedampft, in 500 µl Methanol aufgenom- men, partikelfrei filtriert und mittels HPLC-MS (Methode sam1, siehe 3.15.5.3) analysiert.
3.13.9.3 Extraktion mit Ethylacetat Im Anschluss an die dreistündige Inkubation wurde der pH-Wert der Reaktionsansätze mit 2,5 %iger HCl auf pH 4,5 eingestellt. Es folgte eine zweimalige Extraktion der wässrigen Reaktionsansätze mit jeweils 750 µl Ethylacetat (EE). Die EE-Phasen wurden mittels SpeedVac zur Trockene eingedampft, in 100 µl Methanol aufgenommen und mittels HPLC-MS (Methode sam1, siehe 3.15.5.3) analysiert.
3.13.9.4 Aufbereitung mittels PD-10 Sephadex G25-Säule und Trichloressigsäure Im Anschluss an den Zellaufschluss erfolgte eine Entsalzung des Rohextrakts mittels PD-10 Sephadex G25-Säule, bevor die Zelllysate den jeweiligen Reaktionsansätzen zugegeben wurden.
Nach Inkubation (3 h, 28 °C beziehungsweise 37 °C) wurden die Proteine mittels TCA gefällt und durch Zentrifugation (RT, 14.000 rpm, 10 min) abgetrennt. Von der resultierenden wässrigen Phase wurden 100 µl für die HPLC-MS-Analyse (Methode sam1, siehe 3.15.5.3) genutzt.
3.13.10 In vitro Aktivitätsassays SACE_3599
Zum Nachweis sowie zur Charakterisierung der Proteinaktivität wurden, wie unter 3.13.10.1 und 3.13.10.2 beschrieben, Aktivitätsassays mit SACE_3599 durchgeführt. Die verwendeten Lösungen sind unter 3.4.10 in Tabelle 3.22 dargestellt. Die Zusammensetzungen der Reaktionsansätze sind in Tabelle 3.47 beziehungsweise Tabelle 3.48 aufgeführt. Parallel wurden Negativkontrollen mitgeführt.
Diese enthielten an Stelle des Enzyms H2Obidest. sowie alle weiteren aufgeführten Substanzen in ange- gebener Konzentration. Proben und Negativkontrollen wurden auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert.
3.13.10.1 Bestimmung mittels HPLC-MS Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 28 °C beziehungsweise 37 °C wurde die Reaktion durch Überschichten und Ausschütteln mit 200 µl EE gestoppt. Jeder Reaktionsansatz wurde insgesamt drei Mal mit EE extrahiert. Die zusammengehörenden EE-Phasen wurden in einem neuen Reaktionsgefäß vereinigt und mittels SpeedVac zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 μl Methanol aufgenommen und zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 10 min). Von dem partikelfreien Überstand wurden
78 Material und Methoden 80 μl in ein Vial mit Inlay abgefüllt und mittels der Methode tina3 per HPLC-MS (siehe 3.15.5.1) ana- lysiert (Injektionsvolumen 60 μl).
Tabelle 3.47: Zusammensetzung Aktivitätsassay SACE_3599 mittels HPLC-MS Substanz Endkonzentration bzw. Volumen TRIS-Puffer 25 mM BSA 0,5 mg/ml
MgCl2 2,5 mM 1,4-Diaminoanthrachinon 0,2 mM TDP-Glucose 0,2 mM Enzym 5 µM
H2Obidest ad 200 µl
3.13.10.2 Photometrische Bestimmung Entsprechend der Methode von Gosselin et al. (201) sollte ein photometrischer Assay zum Nachweis der Aktivität der Glykosyltransferase SACE_3599 implementiert werden.
Tabelle 3.48: Zusammensetzung des photometrischen Aktivitätsassays SACE_3599 Substanz Konzentration bzw. Volumen TRIS-Puffer 25 mM BSA 0,5 mg/ml
MgCl2 2,5 mM 1,4-Diaminoanthrachinon 0,2 mM TDP-Glucose 0,2 mM PEP 0,7 mM PK und LDH je 3,6 U NADH 0,15 mM Enzym 5 µM
H2Obidest ad 200 µl
Die Durchführung fand bei 340 nm und RT in einer Küvette der Schichtdicke 1 cm statt. Der Nullab- gleich wurde vor Zugabe von NADH und SACE_3599 vorgenommen. Nach Zugabe von NADH, aber vor Zugabe des Enzyms, erfolgte eine Inkubation von 10 min bei RT. Nach Zupipettieren des Enzyms wur- de über die Dauer von 20 min in einem Intervall von 10 sek die Absorption gemessen. Im Anschluss daran wurde die Probe wie bereits unter 3.13.10.1 beschrieben für die Vermessung an der HPLC-MS vorbereitet und mittels der Methode tina3 per HPLC-MS analysiert (Injektionsvolumen 60 μl).
79 Material und Methoden 3.14 Kristallographische Methoden
3.14.1 Allgemein Zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur eines Proteins werden Röntgenbeugungsexperimente an Proteinkristallen durchgeführt. Eine weit verbreitete Methode zum Erhalt der Proteinkristalle ist die „sitting drop“ Gasphasendiffusion. Hierbei wird die Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit dem Fällungsmittel gefüllt und eine geringe Menge des Proteins in einer Vertiefung im Kopfraum der Mikrotiterplatte in Fällungsmittel eingebracht. Durch den anschließenden luftdichten Verschluss der Mikrotiterplatte entsteht in diesem Kopfraum eine gesättigte Fällungsmittel-Atmosphäre, wodurch das Wasser langsam aus dem proteinhaltigen Tropfen diffundiert. Durch diese Diffusion steigt die Fällungsmittel- und Proteinkonzentration stetig an, was entweder zu dem Ausfallen des Proteins oder zu der spontanen Bildung von Kristallisationskeimen führt.
3.14.2 Initial Screens Alle im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Kristallisierungsexperimente wurden zusammen mit Dr. H. K. Tam an dem Institut für Organische Chemie und Biochemie der Universität Freiburg durch- geführt.
Für die Kristallisationsversuche wurden mit dem OryxNano Roboter je 0,3-0,5 μl Proteinlösung und je 0,3-0,5 μl Reservoirlösung pipettiert. Die Kristallisationsansätze wurden bei 20 °C oder 4 °C inkubiert.
Da eine Vorhersage der Kristallisationsbedingungen nicht möglich ist, müssen die geeigneten Bedin- gungen empirisch ermittelt werden. Hierfür verwendet man sogenannte Screens. In dieser Arbeit verwendete Screens sind in Tabelle 3.7 aufgeführt.
3.15 Isolierung und Analytik niedermolekularer Naturstoffe
3.15.1 Biotransformationsstudien und Naturstoffextraktion aus Bakterienkulturen
Für Biotransformationsstudien wurden verschiedene Aktinomyceten-Stämme sowie Mutanten ver- wendet. Die Bakterien wurden, wie in Tabelle 3.49 dargestellt, mit Kaffeesäure sowie Taurin, trans- Resveratrol beziehungsweise verschiedenen Anthrachinon-Derivaten gefüttert. Die gefütterten Lö- sungen (siehe 3.4.12) hatten alle eine Konzentration von 25 mg/ml in DMSO und wurden nach dem Lösen der Substanz sterilfiltriert.
80 Material und Methoden
Tabelle 3.49: Übersicht über die verwendeten Stämme, Medien und gefütterten Substanzen Stamm Medium gefütterte Substanzen Saccharomicin-Biosynthese S. albus WT HA Kaffeesäure ± Taurin S. albus x cos17 HA Kaffeesäure ± Taurin S. albus x cos35 HA Kaffeesäure S. albus x pTOS*sam7+5+8+36 HA Kaffeesäure ± Taurin S. albus x pUWL-A-sam36+7 HA Kaffeesäure ± Taurin S. albus x pUWL-A-sam7 HA Kaffeesäure Biotransformation von trans-Resveratrol S. albus WT NL111 trans-Resveratrol S. espanaensis WT NL111 trans-Resveratrol S. albus Rham NL111 trans-Resveratrol S. albus Rham x pUWL-A-7665 NL111 trans-Resveratrol heterologe Expression von Glykosyltransferase-Genen S. albus x pUWL-A-sace_1884 NL111 Alizarin, U3 S. albus x pUWL-A-sace_3599 NL111 Alizarin, U2, U3 S. albus x pUWL-A-sace_4470 NL111 Alizarin, U3 S. albus Gluc x pUWL-A-sace_1884 NL111 Alizarin, U3 S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 NL111 Alizarin, U2, U3 S. albus Gluc x pUWL-A-sace_4470 NL111 Alizarin, U3 S. albus WT NL111 Alizarin, U2, U3 S. albus Gluc NL111 Alizarin, U2, U3 S. erythraea WT NL111 Alizarin, U2, U3 Inaktivierung und Komplementierung von sace_3599 S. erythraea WT NL111 U3 S. erythraea x pKCΔsace_3599 NL111 U3 S. erythraeaΔsace_3599 NL111 U3 S. erythraeaΔsace_3599 x pTOSz NL111 U3 S. erythraeaΔsace_3599 x pTOSz-sace_3599 NL111 U3
Der zeitliche Ablauf der Versuche ist in Tabelle 3.50 dargestellt. Die Vorkulturen wurden, wie in 3.9.3 beschrieben, hergestellt. Jeweils 2 ml dieser Vorkulturen wurden dazu verwendet 100 ml Hauptkul- turen in einem 300 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen und einer Spirale zu inokulieren. Diese wurden für insgesamt 7 Tage bei 28 °C auf dem Schüttler (180 rpm) inkubiert. Zum ersten Mal erfolg- te die Fütterung der Hauptkultur 32 h nach dem Animpfen. Pro Fütterung und Kolben wurden 20 μl Substanz-Lösung zugegeben. Die Hauptkultur wurde die zwei darauffolgenden Tage jeweils zweimal täglich, einmal morgens und einmal nachmittags, gefüttert. Insgesamt wurde jeder Kolben somit fünfmal gefüttert, was einer Substanzmenge von 2,5 mg entspricht. Parallel hierzu erfolgte jeweils die Kultivierung einer ungefütterten Kultur als Kontrolle. Bei Fütterungsexperimenten mit der UV- labilen Substanz trans-Resveratrol erfolgte die Kultivierung unter Lichtausschluss. Hierfür wurden die
81 Material und Methoden Scheiben der Inkubatoren beziehungsweise die Erlenmeyerkolben mit Aluminiumfolie vor Lichteinfall abgeschirmt.
Tabelle 3.50: Zeitlicher Ablauf der in vivo Biotransformationsstudien Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 8 Vorkultur Hauptkultur Fütterung x 1 Fütterung x 2 Fütterung x 2 Extraktion
Am siebten Tag nach dem Animpfen der Hauptkultur wurden die niedermolekularen Biotransforma- tionsprodukte aus dem Medium extrahiert. Hierfür wurden die identisch behandelten Kulturen ver- einigt und es wurde, soweit nicht anders angegeben, ein pH-Wert von 7,0 eingestellt. Anschließend wurden die Kulturen zentrifugiert (RT, 5.000 rpm, 10 min) um Myzel und Fermentationsüberstand zu trennen. Der Überstand wurde im Verhältnis 1:1 mit Ethylacetat in einem Scheidetrichter extrahiert und dabei für mindestens 10 min geschüttelt.
Die wässrige Phase wurde verworfen und die Ethylacetat-Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert, um das restliche Wasser vollständig zu entfernen. Das Ethylacetat wurde abschließend in einem Rotationsverdampfer bei 42 °C entfernt.
Die Probe wurde in Methanol aufgenommen, partikelfrei filtriert und 70 μl in ein Vial mit Inlay abge- füllt und mittels HPLC-MS (siehe 3.15.5) analysiert (Injektionsvolumen 60 μl). Die restliche Probe wurde mittels Festphasenextraktion (3.15.2), Dünnschichtchromatographie (3.15.3) sowie Säulen- chromatographie (3.15.4) weiter aufgereinigt.
3.15.2 Festphasenextraktion
Die Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) erlaubt die Anreicherung von Substanzen mit definierten chemischen oder physikalischen Eigenschaften aus einer komplexen Matrix. In der vorlie- genden Arbeit wurde die Festphasenextraktion für die Fraktionierung von Methanol-Rohextrakten zur präparativen Isolierung von Biotransformationsprodukten eingesetzt. Vor dem Auftragen des in Methanol und Wasser suspendierten und zentrifugierten (RT, 5.000 rpm, 5 min) Rohextrakts wurde die Kartusche, ausgehend von 100 % Methanol, stufenweise auf 30 % Methanol in Wasser konditio- niert. Eluiert wurde mit Methanol aufsteigender Konzentrationen von 30 % bis 100 % (siehe 3.4.13 Tabelle 3.25). Der Probenrückstand wurde jeweils stufenweise in 6 ml konzentrierter werdendem Methanol in Wasser suspendiert, zentrifugiert und auf die Säule aufgegeben bevor mit dem entspre- chenden Methanol in Wasser eluiert wurde. Elution und Konditionierung erfolgten mit Unterdruck bei ca. 800 mbar. Die Eluate wurden bei 42 °C zur Trockene einrotiert.
Für die Untersuchung der Proben mittels HPLC-MS (siehe 3.15.5) wurden die Rückstände jeweils in 800 μl bis 2,4 ml Methanol aufgenommen, partikelfrei filtriert und 70 μl pro Vial abgefüllt.
82 Material und Methoden 3.15.3 Dünnschichtchromatographie
Die Methode der Dünnschichtchromatographie wurde zur weiteren Aufreinigung der Biotransforma- tionsprodukte im Anschluss an die Festphasenextraktion (siehe 3.15.2) angewandt. Hierfür wurden die Fraktionen der Festphasenextraktion mit dem größten Gehalt des gewünschten Biotransformati- onsproduktes ausgewählt.
3.15.3.1 Analytische Dünnschichtchromatographie Zur Optimierung der Laufmittelzusammensetzung wurde die Dünnschichtchromatographie in einem analytischen Maßstab durchgeführt. Es wurden Kieselgel-Dünnschichtchromatographie-Alufolien mit verschiedenen Laufmittelgemischen verwendet. Abhängig von der Konzentration der Probe wurden pro Substanz und Platte wenige μl aufgebracht. Die Visualisierung der Analyten erfolgte durch Fluo- reszenzlöschung (254 nm) beziehungsweise Fluoreszenz (366 nm).
3.15.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie Nach Optimierung der Laufmittelzusammensetzung (siehe 3.4.13 Tabelle 3.26) wurden für die präpa- rative Dünnschichtchromatographie Kieselgel•Glasplatten verwendet. Abhängig von der Konzentrati- on der Probe wurden pro Platte 150•300 μl aufgebracht. Die Visualisierung der Analyten erfolgte wiederum durch Fluoreszenzlöschung (254 nm) beziehungsweise Fluoreszenz (366 nm). Die Analyse der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung erfolgte mittels HPLC-MS. Hierfür wurden die zu analysierenden Banden aus den Platten ausgekratzt, in jeweils einem Zentrifugenröhrchen mit Methanol versetzt, 5 min geschüttelt und zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 5 min). Der Überstand wurde partikelfrei filtriert und der Rückstand wurde zwei weitere Male auf dieselbe Weise extrahiert. Für eine HPLC-MS-Analyse wurden jeweils 70 μl in ein Vial abgefüllt. Das Extraktionsmittel wurde mit Hilfe der SpeedVac oder durch Abrotieren bei 42 °C vollständig aus der restlichen Probe entfernt.
3.15.4 Säulenchromatographie mittels Sephadex LH-20
Die weitere Aufreinigung der mit SPE und DC vorgereinigten Biotransformationsprodukte erfolgte mit Hilfe der Säulenchromatographie. Als Sorbens wurde Sephadex LH-20 und als Elutionsmittel Metha- nol verwendet. Das Sorbens wurde in Methanol gequollen in einer Glassäule gelagert. Der aufzurein- igende Extrakt wurde in dem Elutionsmittel Methanol gelöst und möglichst konzentriert auf die Säule aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte ohne Überdruck und die erhaltenen Fraktionen wurden nach Volumen gesammelt.
Die Absorption der einzelnen Fraktionen wurde bei der Wellenlänge des Absorptionsmaximums der aufzureinigenden Substanz bestimmt. Zusätzlich wurde als Referenz die Absorption bei einer Wellenlänge gemessen, an der die aufzureinigende Substanz nicht absorbiert. Fraktionen mit
83 Material und Methoden möglichst hohen Absorptionswerten bei der Wellenlänge des Absorptionsmaximums und gleich- zeitig möglichst kleinen Werten bei der Referenzwellenlänge wurden per HPLC-MS auf vorhan- dene Sekundärstoffe überprüft und nach der Analyse gegebenenfalls vereint.
3.15.5 Analytische HPLC-MS
Die Flüssigchromatographie mit massenspektrometrischer Kopplung verbindet Auftrennung und Identifikation von Substanzen miteinander. HPLC-MS-Messungen wurden mit einem Agilent 1100 System durchgeführt, welches über eine LC-DAD-MSD-Kopplung verfügt (siehe Tabelle 3.1). Die Tem- peratur des Säulenofens betrug 30 °C. Zur Auftrennung glykosylierter Biotransformationsprodukte wurde eine Zorbax Eclipse XDB-C8 (12,5 mm x 4,6 mm; 5 μm Partikeldurchmesser) als Vorsäule zu- sammen mit einer Zorbax Eclipse XDB-C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 μm Partikeldurchmesser) als Hauptsäule eingesetzt. Zur Auftrennung von Kaffeesäure wurde eine XBridge™ C18 (20 mm × 4,6 mm; 3,5 μm Partikeldurchmesser) als Vorsäule in Kombination mit einer XBridge™ C18 (100 mm × 4,6 mm; 3,5 μm Partikeldurchmesser) als Hauptsäule verwendet. Die Detektion erfolgte UV-metrisch und mit einem direkt dahinter geschalteten Quadrupol-Massendetektor in einem Mas- senbereich von 100•1100 Da. Der MSD war mit einer APCI-Quelle (siehe Tabelle 3.51) bestückt. Es wurde sowohl im positiven als auch im negativen Modus gemessen.
Tabelle 3.51: Parameter der APCI-Ionisierungsquelle Parameter Einstellungen MSD Scan 100-1100 Da MSD (+), MSD (-) Modus Drying gas flow 12 l/min Drying gas temperature 350 °C Nebulizer pressure 35 psig Capillary voltage (Vcap positive) 3.000 V Capillary voltage (Vcap negative) 3.000 V
3.15.5.1 Methode tina3 Tabelle 3.52: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methode tina3 Zeit [min] Laufmittel C [%] Laufmittel D [%] 0 80 20 9 67 33 16 50 50 20 30 70 24 5 95 29 5 95 30 80 20 35 80 20 Mess- und Referenzwellenlängen: 254 nm (Ref. 360 nm), 480 nm (Ref. 800 nm), 360 nm (Ref. 580 nm), 430 nm (Ref. 600 nm), 310 nm (Ref. 440 nm)
84 Material und Methoden Für die Analyse der in vitro Aktivitätsassays sowie der Biotransformationsexperimente mit Anthrachi- nonen wurde der Gradient tina3 (siehe Tabelle 3.52) verwendet (29). Laufmittel C war dabei H2O mit 0,5 % Essigsäure (V/V) und Laufmittel D Acetonitril. Der Fluss lag bei 0,5 ml/min.
3.15.5.2 Methode antqui03
Für die Analyse der Resveratrol-Derivate wurde der Gradient antqui03 (C8-Säule) verwendet (siehe
Tabelle 3.53)(30). Laufmittel C war dabei H2O mit 0,5 % Essigsäure (V/V) und Laufmittel D Acetonitril. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min.
Tabelle 3.53: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methoden antqui03 Zeit [min] Laufmittel C [%] Laufmittel D [%] 0 80 20 9 67 33 16 50 50 20 30 70 24 5 95 29 5 95 30 80 20 35 80 20 Mess- und Referenzwellenlängen: 254 nm (Ref. 360 nm), 300 nm (Ref. 580 nm), 330 nm (Ref. 580 nm), 430 nm (Ref. 600 nm), 400 nm (Ref. 600 nm)
3.15.5.3 Methode sam1 Für die Analyse der Kaffeesäure-Fütterungen und der in vitro Aktivitätsassays aus dem Rohextrakt wurde der Gradient sam1 (C18-Säule) verwendet (siehe Tabelle 3.54)(29). Laufmittel B war dabei Ace- tonitril mit 0,5 % Essigsäure (V/V) und Laufmittel C H2O mit 0,5 % Essigsäure (V/V). Die Flussrate be- trug 0,5 ml/min.
Tabelle 3.54: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methode sam1 Zeit [min] Laufmittel B [%] Laufmittel C [%] 0 10 90 3 10 90 9 30 70 12 50 50 18 95 5 20 95 5 22 10 90 32 10 90 Mess- und Referenzwellenlängen: 250 nm (Ref. 400 nm), 279 nm (Ref. 500 nm), 310 nm (Ref. 500 nm), 345 nm (Ref. 500 nm)
85 Material und Methoden 3.15.6 Semi-präparative HPLC zur Aufreinigung der Resveratrol-Derivate
Für die semi-präparative Aufreinigung der Resveratrol-Derivate wurde das Agilent 1100 System mit dem Gradienten yvo02 (semipräparative C18-Säule) verwendet (siehe Tabelle 3.55). Als Vorsäule kam eine Zorbax C18 (50 mm x 9,4 mm; 5 μm Partikeldurchmesser) zusammen mit einer Zorbax C18
(150 mm x 9,4 mm; 7 μm Partikeldurchmesser) als Hauptsäule zum Einsatz. Laufmittel C war H2O mit 0,5 % Essigsäure (V/V) und Laufmittel D Acetonitril. Die Flussrate betrug 2 ml/min.
Tabelle 3.55: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methode yvo02 Zeit [min] Laufmittel C [%] Laufmittel D [%] 0 75 25 19 75 25 19,1 5 95 22 5 95 22,1 75 25 28 75 25 Mess- und Referenzwellenlängen: 254 nm (Ref. 360 nm), 300 nm (Ref. 580 nm), 330 nm (Ref. 580 nm), 360 nm (Ref. 600 nm), 400 nm (Ref. 600 nm)
3.15.7 In vitro Aktivitätsassays zur Bestätigung der Konformation von U3-7
Zum Bestätigung der β-Konformation des 1,4-Diaminoanthrachinon-Derivats U3-7 wurden verschie- dene Aktivitätsassays mit der β-Glucosidase aus Mandeln [E.C. 3.2.1.21] durchgeführt. Alle verwen- deten Lösungen und Puffer sind in Tabelle 3.23 aufgelistet. Die Aktivitätsassays in dem Na-Phosphat- Puffer bei pH 7,0 sind unter 3.15.7.1 beschrieben. Unter 3.15.7.2 sind die Aktivitätsassays in Na- Acetat-Puffer bei pH 5,0 aufgeführt. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze findet sich in Tabel- le 3.56 beziehungsweise Tabelle 3.57. Zusätzlich wurden jeweils Positiv- und Negativkontrollen durchgeführt. Die Positivkontrollen enthielten PNPG als Glucosid. Die Negativkontrollen enthielten an Stelle des Glucosides Puffer sowie alle weiteren aufgeführten Substanzen in angegebener Kon- zentration. Proben und Kontrollen wurden auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert.
3.15.7.1 Na-Phosphat-Puffer pH 7,0 Der Aktivitätsassay wurde angelehnt an die von Kim et al. beschriebene Methode durchgeführt (202). Die Inkubationsdauer betrug 30 min bei 37 °C in einem Wasserbad. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 750 µl EE gestoppt. Nach Zentrifugation (RT, 14.000 rpm, 5 min) wurde der organische Überstand abpipettiert und die wässrige Reaktionslösung wurde ein zweites Mal auf dieselbe Art mit 750 µl EE extrahiert. Die zusammengehörigen organischen Phasen wurden vereint und mittels SpeedVac zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 μl Methanol aufgenommen und zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 10 min). Von dem partikelfreien Überstand wurden 80 μl in ein Vial mit Inlay abge-
86 Material und Methoden füllt und mittels der Methode tina3 per HPLC-MS (siehe 3.15.5.1) analysiert (Injektionsvolumen 60 μl).
Tabelle 3.56: Zusammensetzung Aktivitätsassay β-Glucosidase in Na-Phosphat-Puffer Substanz Endkonzentration bzw. Volumen Glucosid 1 µmol β-Glucosidase 50 u Na-Phosphat-Puffer ad 1 ml
3.15.7.2 Na-Acetat-Puffer pH 5,0 Der Aktivitätsassay wurde angelehnt an die von Bechthold et al. beschrieben Methode durchgeführt (203). Die Inkubation erfolgt bei 37 °C in einem Wasserbad. Zu den Zeitpunkten 0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min und 240 min wurden Proben von jeweils 100 µl entnommen. Die entnom- menen Proben wurden mit jeweils 10 µl TCA-Lösung (240 mg/ml) versetzt um das Protein auszufäl- len, geschüttelt und zentrifugiert (RT, 14.000 rpm, 5 min). Von dem klaren Überstand wurden 80 µl in ein Vial mit Inlay überführt und 60 µl hiervon zur Analyse mittels HPLC-MS verwendet (Methode ti- na3, siehe 3.15.5.1).
Tabelle 3.57: Zusammensetzung Aktivitätsassay β-Glucosidase in Na-Acetat-Puffer Substanz Endkonzentration bzw. Volumen Glucosid 0,1 µmol β-Glucosidase 4 u Na-Acetat-Puffer ad 1 ml
3.15.8 NMR-Spektroskopie
Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Strukturaufklärung von U3-7 mittels NMR-Spektroskopie (nu- clear magnetic resonance). Die Struktur wurde durch Dr. T. Paululat an der Universität Siegen aufge- klärt. Durch Aufnahmen von 1H- und 13C-Spektren konnten die entsprechenden Atome detektiert werden und über Kopplungen zwischen den verschiedenen Atomgruppen deren Position im Mole- külgerüst bestimmt werden. Alle Spektren wurden auf einer Varian VNMR-S 600-Apparatur aufge- nommen. Neben 1D-NMR-Experimenten wurden auch 1H/1H-COSY (correlation spectroscopy), 1H/13C- und 1H/15N-HMBC (heteronuclear multiple bond correlation) 2D-NMR-Experimente durchge- führt. Die chemischen Verschiebungen wurden auf das verwendete Lösungsmittel DMSO-d6 bezogen.
3.15.9 Untersuchung der antibiotischen Aktivität/Agardiffusionstest
Zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität von Biotransformationsprodukten wurden Hemm- hoftests mit dem Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis (siehe Tabelle 3.31), dem Gram- negativen Bakterium Escherichia coli (siehe Tabelle 3.29), dem Hefepilz Candida parapsilosis sowie
87 Material und Methoden dem Schimmelpilz Fusarium verticillioides (siehe Tabelle 3.31) durchgeführt. Zur Kultivierung von B. subtilis wurde DM-Medium verwendet, bei E. coli LB-Medium, bei C. parapsilosis YM-Medium und bei F. verticillioides PDA-Medium.
Es wurden 50 ml Übernachtkulturen der jeweiligen Stämme angefertigt (vergleiche 3.9.1 und 3.9.3). Je 1 ml Kultur wurde für das Überschichten einer Agarplatte verwendet. Die zu untersuchenden DC- Banden wurden aus Dünnschichtchromatographie-Alufolien ausgeschnitten oder die methanolischen Sephadex-Fraktionen der Testsubstanzen wurden auf Filterrondelle pipettiert. Die ausgeschnittenen DC-Banden beziehungsweise die getrockneten Filter wurden mit einer sterilisierten Pinzette auf die getrocknete Agaroberflächen gesetzt und die Platten in einem Brutschrank für 16 h bei 28 °C bezie- hungsweise 37 °C inkubiert. Als Positivkontrollen dienten Apramycin beziehungsweise Nystatin und als Negativkontrolle Methanol.
Die Größe der um die Filter beziehungsweise DC-Platte von dem Wachstum ausgesparten Hemmhöfe erlaubt eine Beurteilung der antimikrobiellen Aktivität der Substanzen gegen die eingesetzten Stäm- me.
88 Material und Methoden
89 Ergebnisse 4 Ergebnisse
4.1 Untersuchungen zur Saccharomicin-Biosynthese Die Saccharomicine A und B bestehen aus N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin als Aglykon sowie ei- ner Seitenkette aus 17 O-glykosidisch verknüpften Desoxyhexoseeinheiten (25). Dr. M. Berner konnte in S. fradiae XKS durch die heterologe Expression von sam8, dessen Genprodukt eine Tyrosin- Ammoniak-Lyase darstellt, die Synthese von trans-p-Cumarsäure nachweisen. Die gemeinsame Ex- pression von sam8 mit sam5, dessen Genprodukt eine 4-Cumarat-3-Hydroxylase ist, führte zu der Synthese von trans-Kaffeesäure (27). Diese Ergebnisse wurden in den Arbeiten von N. Gehring und Dr. T. Strobel bestätigt (28,29). Darüber hinaus wurde postuliert, dass es sich bei dem Genprodukt von sam7 um eine Kaffeoyl-CoA-Ligase handelt, welche trans-Kaffeesäure zu Kaffeoyl-CoA umsetzt, welches wiederum durch das Genprodukt von sam36, eine Penicillin-Amidase, unter Verknüpfung von Taurin zu N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin umgesetzt wird (27,29). In Abbildung 4.1 ist der postulierte Biosyntheseweg des Saccharomicin-Aglykons dargestellt. Im Rahmen der hier vorliegen- den Arbeit sollten weitere Experimente zur Aufklärung der beiden abschließenden Schritte in der Biosynthese des Saccharomicin-Aglykons durchgeführt werden.
Abbildung 4.1: Postulierter Biosyntheseweg des Saccharomicin-Aglykons N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin (27,29).
4.1.1 Heterologe Expression von Biosynthese-Genen des Saccharomicin-Aglykons Zur Bestätigung des von Dr. M. Berner und Dr. T. Strobel postulierten Syntheseweges des Saccharo- micin-Aglykons wurden die Cosmide cos17 (welches die Gene sam9 bis sam38 des Saccharomicin- Clusters enthält) sowie cos35 (welches die Gene sam1 bis sam8 des Saccharomicin-Clusters enthält) mittels Konjugation in S. albus eingebracht (siehe 3.9.7). Mittels PCR wurden einige der sam-Gene in dem Genom der erhaltenen Exkonjuganten S. albus x cos17 und S. albus x cos35 nachgewiesen, um den Erfolg der Konjugation zu bestätigen. Die Mutanten wurden, wie unter 3.9.3 beschrieben, unter
90 Ergebnisse Zugabe von Kaffeesäure beziehungsweise Kaffeesäure und Taurin kultiviert, nach pH-Wert- Einstellung auf 3,2 mit Ethylacetat extrahiert (siehe 3.15.1) und mittels HPLC-MS auf Biotransforma- tionsprodukte untersucht (Methode sam1, siehe 3.15.5.3). S. albus WT wurde parallel dazu als Kon- trolle kultiviert und auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert.
Da keine neue Peaks detektiert werden konnten und auch die Massen von Kaffeoyl-CoA (Mr =
929 g/mol) beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin (Mr = 287 g/mol) nicht nachweisbar waren, konnte weder die Produktion von Kaffeoyl-CoA noch von N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin nachgewiesen werden.
Um Kaffeesäure innerhalb der Zellen des heterologen Wirts zu produzieren, wurde das von Dr. T. Strobel im Rahmen ihrer Arbeit klonierte integrative Plasmid pTOS*sam7+5+8+36 für weitere Expe- rimente verwendet (29). Das Plasmid enthält mit sam7, sam5, sam8 und sam36, die putativen Gene für die Biosynthese des Saccharomicin-Aglykons. Das Plasmid pTOS*sam7+5+8+36 wurde mittels Konjugation in S. albus eingebracht. Die Gene konnten in dem Genom des erhaltenen Exkonjuganten S. albus x pTOS*sam7+5+8+36 mittels PCR nachgewiesen werden. Die Mutante wurde kultiviert, nach pH-Wert-Einstellung auf 3,2 mit Ethylacetat extrahiert und mittels HPLC-MS (Methode sam1) auf die Synthese von Kaffeoyl-CoA beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin untersucht. Parallel dazu wurde der S. albus WT als Kontrolle kultiviert und auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert.
Auch hier konnten die erwarteten Peaks der Massen von Kaffeesäure (Mr = 180 g/mol), Kaffeoyl-CoA
(Mr = 929 g/mol) beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin (Mr = 287 g/mol) nicht nach- gewiesen werden. Auch nach Supplementierung von Kaffeesäure oder Kaffeesäure und Taurin zur Steigerung der Biosyntheserate konnten die gewünschten Produkte Kaffeoyl-CoA beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin in den Extrakten nicht detektiert werden.
Für weitere Experimente wurden die Gene sam7 und sam36 in den replikativen Vektor pUWL-A klo- niert (siehe 3.11.1). Die resultierenden Plasmide pUWL-A-sam7 und pUWL-A-sam36+7 wurden mit- tels Konjugation in S. albus eingebracht. Die entsprechenden Gene konnten in der extrahierten Ge- samt-DNA (siehe 3.10.3) der erhaltenen Exkonjuganten S. albus x pUWL-A-sam7 und S. albus x pUWL-A-sam36+7 mittels PCR nachgewiesen werden. Die Mutanten wurden unter Zugabe von Kaf- feesäure beziehungsweise Kaffeesäure und Taurin kultiviert, nach pH-Wert-Einstellung auf 3,2 mit Ethylacetat extrahiert und mittels HPLC-MS (Methode sam1) auf Biotransformationsprodukte unter- sucht. Parallel dazu auf dieselbe Art und Weise kultivierter, behandelter und analysierter S. albus WT diente als Kontrolle.
91 Ergebnisse Für keine der Mutanten konnten neue Peaks detektiert werden. Auch die Massen von Kaffeoyl-CoA
(Mr = 929 g/mol) beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin (Mr = 287 g/mol) waren nicht nachweisbar. Somit konnte weder die Produktion von Kaffeoyl-CoA noch von N-(m,p- Dihydroxycinnamoyl)-taurin nachgewiesen werden.
Kaffeesäure besitzt einen pks-Wert von 4,6 und liegt somit in HA-Medium mit einem pH-Wert von 7,4 überwiegend in der deprotonierten, d.h. negativ geladenen Form vor (Verhältnis ca. 1:630). Dies führt möglicherweise bei in vivo Fütterungsexperimenten mit Kaffeesäure (siehe 3.15.1) zu einer verminderten Aufnahme wodurch das Substrat in unzureichender Menge zur Verfügung steht. Um die Kaffeesäure-Aufnahme zu verbessern, sollten Fütterungsexperimente bei niedrigeren pH-Werten durchgeführt werden. Bei einem pH-Wert von 4,6 liegen die protonierte, d.h. ungeladene Form und die deprotonierte Form in einem Verhältnis von 1:1 vor. Bei einer weiteren pH-Wert-Absenkung auf pH 2,6 verschiebt sich das Verhältnis auf 100:1 für die protonierte Form. Aus diesem Grund sollte in einem ersten Versuch überprüft werden, ob S. albus dazu in der Lage ist, bei einem pH-Wert von 4,6 beziehungsweise 2,6 zu wachsen. Hierfür wurden TSB- und HA-Flüssigmedium vor dem Autoklavieren mit Essigsäure/Na-Acetat-Puffer auf pH 4,6, beziehungsweise mit Natriumcitrat auf pH 2,6 einge- stellt. Je dreimal 50 ml dieser Medien wurden mit je 1 ml einer S. albus Vorkultur (siehe 3.9.3) ange- impft. Dabei fiel auf, dass die Bakterienzellen bei pH 2,6 sofort ihre feste Form verloren. Nach 72 h wurde, wie unter 3.9.9 beschrieben, die Trockenmasse bestimmt. Die Zellpellets der Kultivierung bei pH 4,6 und pH 2,6 wiesen nach dem Trocknen eine untypische schwarze Farbe auf. Im Vergleich hier- zu waren die Pellets der Vergleichs-Kultivierung bei pH 7,2 (TSB-Medium) beziehungsweise 7,4 (HA- Medium) beige gefärbt. Eine Auswertung der Trockenmasse ergab für TSB-Medium bei pH 7,2 einen Zugewinn an Masse von 3,9 mg, bei pH 4,6 betrug der Zugewinn 1,2 mg und bei pH 2,6 0,9 mg. Für HA-Medium betrug der Zugewinn an Masse 4,7 mg bei pH 7,4, 0,4 mg bei pH 4,6 und 0,3 mg bei pH 2,6. Diese Werte zeigen, dass S. albus bei niedrigeren pH-Werten nur schwach bis gar nicht wach- sen kann. Fütterungsversuche bei niedrigeren pH-Werten wurden aus diesem Grund nicht durchge- führt.
4.1.2 Biochemische Untersuchungen von Sam7 und Sam36 Zur biochemischen Charakterisierung der putativen Kaffeoyl-CoA-Ligase Sam7 sowie der putativen Penicillin-Amidase Sam36 sollten die entsprechenden Gene sam7 und sam36 heterolog in E. coli ex- primiert, die Proteine anschließend mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt und für in vitro Aktivitätsassays verwendet werden.
4.1.2.1 Proteinpräparation von Sam7
Für die Biosynthese von Sam7 mit C-terminalem His6-tag sowie TEV-Schnittstelle wurde das Expressi- onskonstrukt pET21a-sam7-C-his-TEV kloniert (siehe 3.11.2.1). Entsprechend wurde für die Biosyn-
92 Ergebnisse these von Sam7 mit N-terminalem His6-tag das Expressionskonstrukt pET28a-sam7-N-his kloniert (siehe 3.11.2.2). Zur Überprüfung der Synthesebedingungen wurden die Expressionsplasmide zuerst in verschiedene E. coli-Stämme transformiert, um anschließend, wie unter 3.13.1.1 beschrieben, die Bedingungen zur heterologen Synthese zu optimieren. Für das Expressionsplasmid pET21a-sam7-C- his-TEV kamen die E. coli-Stämme E. coli BL21 Star (DE3) und E. coli Rosetta 2 zum Einsatz und für das Expressionsplasmid pET28a-sam7-N-his wurden die E. coli-Stämme E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2, E. coli BL21 Star (DE3) und E. coli Rosetta 2 verwendet.
Die Auswertung aller durchgeführten Testexpressionen mittels SDS-PAGE (siehe 3.13.7) ergab Pro- teinbanden der gewünschten Größe von 42,1 kDa für C-terminal His6-tag-fusioniertes Protein und
42,5 kDa für N-terminal His6-tag-fusioniertes Protein. Die besten Bedingungen zur Produktion von Sam7 waren in dem E. coli-Stamm BL21 Codon Plus RP x pL1SL2 x pET28a-sam7-N-his, induziert mit 0,5 mM IPTG und für 4 h bei 28 °C kultiviert. Unter diesen Bedingungen war eine analytische Aufrei- nigung mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie (siehe 3.13.3.2) möglich. Eine präparative Aufrei- nigung desselben Proteins mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie (siehe 3.13.3.3) nach vorheri- gem Zellaufschluss (siehe 3.13.2) ergab eine unzureichende Proteinmenge zur Durchführung von in vitro Aktivitätsassays, da das Protein in den Fraktionen des Durchflusses und nicht in den Elutions- fraktionen vorhanden war. Auch nach Variation verschiedener Parameter war eine präparative Auf- reinigung von Sam7 nicht möglich.
4.1.2.2 Proteinpräparation von Sam36
Für die Biosynthese von Sam36 mit C-terminalem His6-tag sowie TEV-Schnittstelle wurde das Expres- sionskonstrukt pET21a-sam36-C-his-TEV kloniert (siehe 3.11.2.3). Entsprechend wurde für die Biosyn- these von Sam36 mit N-terminalem His6-tag das Expressionskonstrukt pET28a-sam36-N-his kloniert (siehe 3.11.2.4). Zur Testung der Synthesebedingungen wurden die Expressionsplasmide zuerst in verschiedene E. coli-Stämme transformiert, um anschließend, wie unter 3.13.1.1 beschrieben, die Bedingungen zur heterologen Synthese zu optimieren. Für das Expressionsplasmid pET21a-sam36-C- his-TEV kamen die E. coli-Stämme E. coli BL21 Star (DE3) und E. coli Rosetta 2 zum Einsatz und für das Expressionsplasmid pET28a-sam36-N-his wurden die E. coli-Stämme E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2, E. coli BL21 Star (DE3) und E. coli Rosetta 2 verwendet.
Die Auswertung der durchgeführten Testexpressionen mit dem Expressionsplasmid pET28a-sam36- N-his mittels SDS-PAGE (siehe 3.13.7) ergab Proteinbanden der gewünschten Größe von 89,8 kDa, wohingegen bei Testexpressionen mit dem Expressionsplasmid pET21a-sam36-C-his-TEV keine Pro- teinbanden der gewünschten Größe vorhanden waren. Die besten Bedingungen zur Produktion von Sam36 waren in dem E. coli-Stamm BL21 Star (DE3) x pET28a-sam36-N-his, induziert mit 0,7 mM IPTG und für 4 h bei 28 °C kultiviert. Die analytische Aufreinigung mittels Ni2+-NTA-
93 Ergebnisse Affinitätschromatographie (siehe 3.13.3.2) ergab keine Proteinbande der gewünschten Größe in den Elutionsfraktionen, wodurch die Durchführung einer präparativen Aufreinigung mittels Ni2+-NTA- Affinitätschromatographie sowie die Durchführung von in vitro Aktivitätsassays nicht möglich war. Auch durch Variation verschiedener Parameter war eine Aufreinigung von Sam36 nicht möglich.
4.1.2.3 In vitro Aktivitätsassays mit Sam7 und Sam36 aus dem Rohextrakt Da für die Durchführung von in vitro Aktivitätsassays keine ausreichende Menge der aufgereinigten Proteine Sam7 und Sam36 erhalten werden konnten, sollten zum Nachweis der Proteinaktivitäten von Sam7 und Sam36 Aktivitätsassays aus den Rohextrakten der Zelllysate durchgeführt werden. Die Durchführung erfolgte wie unter 3.13.9 beschrieben. Als Substrat wurde trans-Kaffeesäure einge- setzt, welche von Sam7 unter ATP-Verbrauch mit Coenzym A zu Kaffeoyl-CoA verknüpft werden soll- te. Kaffeoyl-CoA, welches als Zwischenprodukt entstehen würde, sollte katalysiert durch Sam36 in Anwesenheit von Taurin zu N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin reagieren. Nach Lösen der zur Tro- ckene eingeengten Reaktionsansätze in Methanol (siehe 3.13.9.2) und anschließende Analyse mittels HPLC-MS (siehe 3.15.5.3, Methode sam1) war kein Unterschied zwischen den verschiedenen Reakti- ons- und Kontrollansätzen sichtbar. In weiteren Versuchen wurden nach Inkubation der Reaktionsan- sätze die pH-Werte auf pH 4,5 eingestellt und anschließend erfolgte die Extraktion mit Ethylacetat (siehe 3.13.9.3). Abhängig von der jeweiligen Zusammensetzung des Reaktionsansatzes waren nur Peaks in den HPLC-Chromatogrammen sichtbar, welche allesamt den Komponenten des Reaktions- ansatzes zugeordnet werden konnten. In weiteren Versuchen wurden die Zelllysate vor Zugabe zu dem Reaktionsansatz mittels PD-10 Sephadex G25-Säulen entsalzt und die Proteine nach Inkubation des Reaktionsansatzes mit TCA gefällt. Diese Versuche wurden mit verschiedenen Kaffeesäure- Konzentrationen von 0,2 mM bis zu 4,0 mM wiederholt. Beispielhaft ist in Abbildung 4.2 ein Aktivi- tätsassay mit einer Kaffeesäure-Konzentration von 4,0 mM dargestellt. Da alle sichtbaren Peaks den Komponenten des Reaktionsansatzes zugeordnet werden konnten, wurde keine Umsetzung zu den gewünschten Produkten detektiert. Der Peak bei 10,7 min kann der zugesetzten trans-Kaffeesäure
(Mr = 180,16 g/mol) zugeordnet werden. Unter dem Einfluss von Licht fand eine cis-trans- Isomerisierung der Kaffeesäure statt. Der Peak von cis-Kaffeesäure besitzt eine Retentionszeit von 5,2 min. Die UV-Absorptionsspektren von trans- und cis-Kaffeesäure sind sich sehr ähnlich. Ein Ver- gleich ist in Abbildung 4.2 dargestellt. Der Peak bei 3,2 min ist auf CoA zurückzuführen. Die Peaks bei den Retentionszeiten von 2,5 min, ca. 8 min, 19,7 min sowie 23,4 min entsprechen alle dem verwen- deten Resuspensionspuffer. Eine Umsetzung der Produkte zu den gewünschten Edukten war mittels
HPLC-MS-Analyse nicht detektierbar, da weder neue Peaks noch die Massen von Kaffeoyl-CoA (Mr =
929 g/mol) beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin (Mr = 287 g/mol) detektiert werden konnten.
94 Ergebnisse
Abbildung 4.2: HPLC-Chromatogramm (λ = 279 nm) des Aktivitätsassays aus dem Rohextrakt bei 28 °C. Der Aktivitätsassay wurde mit entsalzten Zelllysaten, welche Sam7 und Sam36 enthielten, durchgeführt. Zusätzlich wa- ren CoA (tR = 3,2 min), ATP, Taurin und 4,0 mM Kaffeesäure in dem Reaktionsansatz (Puffer tR = 2,5 min, 8 min, 19,7 min, 23,4 min) vorhanden. Ein Vergleich der UV-Absorptionsspektren von trans-Kaffeesäure (rot) und cis-Kaffeesäure (blau) sowie die Strukturformeln sind abgebildet. 4.2 Proteinpräparation der Glykosyltransferase Ses60310 aus Saccharothrix espa- naensis Dr. T. Strobel konnte nachweisen, dass es sich bei dem Enzym Ses60310 aus Saccharothrix espanaen- sis um eine GT mit sehr hoher Substratflexibilität handelt (29). Im Rahmen meiner Diplomarbeit so- wie der Promotion von Dr. T. Strobel wurde das GT-Gen ses60310 in verschiedenen E. coli-Stämmen exprimiert, das Protein in unterschiedlichen Reinheitsstufen aufgereinigt und zur biochemischen Charakterisierung in in vitro Aktivitätsassays verwendet (29,183).
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollte die Aufreinigung des Proteins Ses60310 für die Kristal- lisation optimiert werden.
4.2.1 Präparation und Aufreinigung von Ses60310 mit N-terminalem His6-tag In einem ersten Versuch erfolgten Proteinsynthese und Aufreinigung, wie von Dr. T. Strobel be- schrieben (29). Mit Hilfe des Expressionsplasmids pET28a-7665-N-his-TEV wurde Ses60310 in dem Stamm E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2 synthetisiert.
Der erste Aufreinigungsschritt erfolgte mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie (siehe Abbildung 4.3). Das Protein wurde bei einer Imidazolkonzentration von 250 mM von der Säule eluiert. Die ver- einigten Proteinfraktionen wurden aufkonzentriert und in einem weiteren Schritt mittels Gelfiltration (siehe Abbildung 4.4) aufgereinigt.
95 Ergebnisse
Abbildung 4.3: Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von Ses60310. Die gemessene Absorption (blau) sowie die verwendete Imidazolkonzentration (rot) sind dargestellt. Die Hauptfraktion des Proteins Ses60310 eluiert bei einer Imidazolkonzentration von 250 mM (türkis hinterlegt).
Abbildung 4.4: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von Ses60310. Das Ausschlussvolumen entspricht 42-53 ml. Das unaggregierte Protein Ses60310 eluiert bei einem Volumen von 77- 84 ml (türkis hinterlegt). Das Gelbild zeigt eine SDS-PAGE der Gefi-Fraktion des Proteins Ses60310 bei 79 ml (1). PP, Pro- teinstandard PageRuler™ Thermo Scientific.
96 Ergebnisse Bei einem Ausschlussvolumen von 42 bis 52 ml eluieren Verunreinigungen sowie aggregiertes Pro- tein. Das nicht-aggregiert Protein Ses60310 eluiert bei einem Volumen von 77 bis 84 ml. In Abbildung 4.4 ist ein SDS-PAGE der Gefi-Fraktion bei 79 ml dargestellt.
Das auf diese Weise gewonnene nicht-aggregierte Protein wurde in Zusammenarbeit mit Dr. H. K. Tam von dem Institut für Organische Chemie und Biochemie, Universität Freiburg, für Kristallisati- onsversuche (siehe 3.14) verwendet. Durch zu schnelle Aggregation des Proteins kam es zu der Bil- dung ungeordneter Proteinpräzipitate an Stelle von geordneten Kristallen, wie zur Strukturaufklärung benötigt.
4.2.2 Proteinspaltung mittels TEV-Protease In weiteren Versuchen wurde statt eines Stufengradienten ein linearer Gradient in der Ni2+-NTA- Affinitätschromatographie verwendet oder die Proteinfraktionen wurden im Anschluss an die Ni2+- NTA-Affinitätschromatographie weniger stark aufkonzentriert und in mehreren Teilmengen auf die Gelfiltrationssäule aufgetragen. Da beides zu einer stark reduzierten Proteinausbeute führte, erfolgte in einem nächsten Versuch die Abspaltung des His6-tag mittels TEV-Protease im Anschluss an eine erste, wie unter 4.2.1 beschrieben durchgeführte, Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie.
Abbildung 4.5: Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von Ses60310 im An- schluss an die His6-tag-Abspaltung mittels TEV-Protease. Die gemessene Absorption (blau) sowie die verwendete Imidazolkonzentration (rot) sind dargestellt. Die Hauptfraktion des Proteins Ses60310 eluiert ohne Imidazol (türkis hinterlegt), die TEV-Protease bei einer Imidazolkonzentration von 50 mM.
97 Ergebnisse Das Vorgehen zur Spaltung von Proteinen mittels TEV-Protease ist unter 3.13.5 beschrieben. Nach der Inkubation mit TEV-Protease folgte eine zweite Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie (siehe Abbil- dung 4.5). Da der His6-tag des Proteins entfernt wurde, eluierte das Protein Ses60310 ohne Imidazol bei einem Volumen von 1 bis 12 ml. Bei einer Imidazolkonzentration von 50 mM eluierte die TEV-
Protease, die ihrerseits einen His6-tag besitzt.
Die vereinten Proteinfraktionen wurden aufkonzentriert und in einem weiteren Schritt mittels Gelfilt- ration aufgereinigt (siehe Abbildung 4.6). Die Elution des Proteins erfolgte während der Gelfiltration größtenteils im Ausschlussvolumen ab 42 ml und zum anderen in dem sich direkt anschließenden, nicht klar strukturierten, Peak bis 93 ml. Das auf diese Weise gewonnene Protein konnte nicht für Kristallisationsversuche verwendet werden.
Abbildung 4.6: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von Ses60310 im Anschluss an die Spaltung mittels TEV-Protease. Das Protein Ses60310 eluiert in einem nicht klar strukturierten Peak.
4.2.3 Präparation und Aufreinigung von Ses60310 mit Streptavidin-Affinitäts-tag Zur Überproduktion der Glykosyltransferase Ses60310 mit C-terminalem Streptavidin-Affinitäts-tag sowie TEV-Schnittstelle wurde das Expressionsplasmid pET21a-7665-TSC, wie unter 3.11.2.6 be- schrieben, kloniert. Entsprechend wurde für die Biosynthese von Ses60310 mit N-terminalem Strep- tag und TEV-Schnittstelle das Expressionsplasmid pET21a-7665-STN kloniert (siehe 3.11.2.5). Zur Testung der Synthesebedingungen wurden die Expressionsplasmide zuerst in verschiedene E. coli- Stämme transformiert, um anschließend, wie unter 3.13.1.1 beschrieben, die Bedingungen zur hete-
98 Ergebnisse rologen Synthese zu optimieren. Es kamen jeweils die E. coli-Stämme E. coli BL21 (DE3) x pLysS, E. coli BL21 Star (DE3) und E. coli Rosetta 2 zum Einsatz.
Die Auswertung aller durchgeführten Testexpressionen mittels SDS-PAGE (siehe 3.13.7) ergab Pro- teinbanden der gewünschten Größe von 42,9 kDa für das C-terminal Strep-tag-fusionierte Protein und 43,0 kDa für das N-terminal Strep-tag-fusionierte Protein. Nach dem Zellaufschluss (siehe 3.13.2) war eine Aufreinigung mittels Streptavidin-Affinitätschromatographie (siehe 3.13.3.5) für Ses60310 aus dem Stamm E. coli Rosetta 2, induziert mit 0,3 mM IPTG und für 4 h bei 28 °C inkubiert, mit bei- den Expressionsplasmiden in geringer Ausbeute möglich. Exemplarisch ist das Elutionschromato- gramm der Streptavidin-Affinitätschromatographie des N-terminal Strep-tag-fusionierten Proteins aus insgesamt 2,5 l Kultur in Abbildung 4.7 dargestellt.
Abbildung 4.7: Elutionschromatogramm der Streptavidin-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von N-terminal Strep-tag-fusioniertem Ses60310. Die gemessene Absorption (blau) sowie der Anteil an verwendeten Elutionspuffer (rot) sind dargestellt. Die Hauptfrakti- on des Proteins Ses60310 eluiert bei 75-78 ml. Der türkis hinterlegte Proteinpeak ist zusätzlich vergrößert dargestellt.
Die aufkonzentrierten Elutionsfraktionen (73-80 ml) des Proteins wurden jeweils auf die Gelfiltrati- onssäule aufgetragen (siehe 3.13.4.2). Als Ergebnis der Gelfiltration des C-terminal Strep-tag- fusionierten Proteins war das gewünschte Protein ausschließlich im Ausschlussvolumen vorhanden. Als Ergebnis der Gelfiltration des N-terminal Strep-tag-fusionierten Proteins war das gewünschte Protein sowohl in dem Ausschlussvolumen, bei 7 bis 10 ml, als auch in zwei weiteren Peaks, bei 14 bis 19 ml sowie 19 bis 22 ml, vorhanden (siehe Abbildung 4.8). Menge und Reinheit waren für Kristallisa- tionsversuche nicht ausreichend.
99 Ergebnisse
Abbildung 4.8: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von N-terminal Strep-tag-fusioniertem Ses60310 im Anschluss an die Stretavidin-Affinitätschromatographie. Das Protein Ses60310 eluiert im Ausschlussvolumen bei 7-10 ml sowie in zwei weiteren Peaks (14-19 ml und 19-22 ml). 4.3 Biotransformation von trans-Resveratrol Dr. A. Linnenbrink konnte im Rahmen seiner Dissertation zeigen, dass der Stamm S. espanaensis dazu in der Lage ist trans-Resveratrol zu biotransformieren (30). An Hand der massenspektrometrischen Auswertung wurden ein- und zweifach rhamnosylierte Resveratrol-Derivate vermutet. Aufgabe der hier vorliegenden Arbeit war eine Untersuchung der Biotransformationsaktivität sowie eine Aufreini- gung der Biotransformationsprodukte.
4.3.1 Untersuchungen der Biotransformationsaktivität von trans-Resveratrol mit der flexiblen Glykosyltransferase Ses60310 aus Saccharothrix espanaensis Zur Untersuchung der Biotransformationsaktivität wurde eine Kultur des Stamms S. espanaensis, wie unter 3.15.1 beschrieben, mit trans-Resveratrol supplementiert und nach siebentägiger Kultivierung unter Lichtausschluss mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Rohextrakte wurden mittels HPLC- ESI-MS (Methode antqui03) analysiert. In Abbildung 4.9 ist ein Vergleich der Kultur mit (I) und ohne (II) Zusatz von trans-Resveratrol dargestellt. In dem HPLC-Chromatogramm der gefütterten Kultur ist neben dem gefütterten trans-Resveratrol bei einer Retentionszeit von 10,7 min die Bildung von Bio- transformationsprodukten zu erkennen. Bei einer Retentionszeit von 6,94 min wurde die Substanz YS1 detektiert, bei 8,45 min folgt die Substanz YS2. Die UV-Absorptionsspektren von YS1 und YS2 sind dem von trans-Resveratrol sehr ähnlich (siehe Abbildung 4.9). In den Massenspektren von YS1 sowie YS2, die im negativen Modus gemessen wurden, liegt das höchste Signal jeweils bei m/z = 747 [2 M-
100 Ergebnisse H]-. Darüber hinaus findet man Signale mit m/z = 373 [M-H]- und m/z = 409 [M+Cl]-. Die Massendiffe- renz von 146 u deutet auf eine Rhamnosylierung hin. Eine Masse von 748 g/mol entspricht zwei Res- veratrol-Molekülen (je 228 g/mol) in Verbindung mit einer zweifachen Rhamnosylierung.
Abbildung 4.9: HPLC-Chromatogramme (λ = 330 nm) der Kulturen von S. espanaensis mit (I) und ohne (II) Fütterung von trans-Resveratrol. Die UV-Absorptionsspektren von trans-Resveratrol (rot), YS1 (blau), YS2 (grün) sowie die Strukturformel von trans- Resveratrol sind abgebildet.
In weiteren Versuchen wurde die Biotransformationsstudien durch Fütterung der Mutante S. albus Rham x pUWL-A-7665 (29) mit trans-Resveratrol wiederholt. Die Ethylacetat-Rohextrakte wurden mittels HPLC-ESI-MS (Methode antqui03) analysiert. S. albus WT sowie S. albus Rham wurden parallel dazu als Kontrolle kultiviert und auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert. In Abbildung 4.10 ist ein Vergleich der Kultur S. albus Rham x pUWL-A-7665 (I) mit S. albus Rham (II) nach Fütte- rung mit trans-Resveratrol dargestellt. In dem HPLC-Chromatogramm der S. albus Rham x pUWL-A- 7665-Kultur ist neben trans-Resveratrol bei einer Retentionszeit von 10,7 min die Bildung von Bio- transformationsprodukten zu erkennen. Bei einer Retentionszeit von 7,02 min wurde die Substanz YS4 detektiert, bei 8,66 min folgt die Substanz YS5. Die UV-Absorptionsspektren von YS4 sowie YS5 sind dem von trans-Resveratrol sehr ähnlich (siehe Abbildung 4.10). Im negativen Modus gemessen, liegt das höchste Signal in den Massenspektren von YS4 sowie YS5 jeweils bei m/z = 409 [M+Cl]-. Dar- über hinaus findet man Signale mit m/z = 373 [M-H]-. Der Massengewinn von 146 u deutet auf eine Rhamnosylierung hin.
Bei einer Retentionszeit von 5,70 min wurde die Substanz YS3 detektiert. Die UV- Absorptionsspektren von YS3 sind ebenfalls dem von trans-Resveratrol sehr ähnlich (siehe Abbildung 4.10). In dem im negativen Modus gemessenen Massenspektrum, liegt das Signal bei m/z = 315 [M+Cl]-. Der Massengewinn von 88 u entspricht rechnerisch einer Alkylierung mit 1,3-Butadien mit Cl-
101 Ergebnisse als Ladungsträger. Da YS3 ebenfalls bei der Fütterung von S. albus WT und S. albus Rham mit trans- Resveratrol detektiert werden konnte, kann eine Beteiligung der Glykosyltransferase Ses60310 an der Entstehung von YS3 ausgeschlossen werden.
Abbildung 4.10: HPLC-Chromatogramme (λ = 330 nm) der Kulturen von S. albus Rham x pUWL-A-7665 (I) und S. albus Rham (II) nach Fütterung von trans-Resveratrol. Die UV-Absorptionsspektren von trans-Resveratrol (rot), YS3 (blau), YS4 (grün) sowie YS5 (lila) sind abgebildet.
Um die gebildeten Biotransformationsprodukte zu identifizieren, sollten sie aufgereinigt und ihre Struktur mittels NMR aufgeklärt werden.
4.3.2 Aufreinigung der Biotransformationsprodukte Aus 5 l Kultur von S. espanaensis, supplementiert mit insgesamt 125 mg trans-Resveratrol, wurden die gebildeten Biotransformationsprodukte extrahiert (siehe 3.15.1). Die folgenden Aufreinigungs- schritte wurden soweit möglich unter Lichtausschluss durchgeführt. Der erhaltene Rohextrakt wurde mittels Festphasenextraktion fraktioniert (siehe 3.15.2) und über präparative Dünnschichtchromato- graphie (DC; siehe 3.15.3.2) sowie eine Sephadex LH-20 Säule (siehe 3.15.4) aufgereinigt. Da die Aus- beute der Biotransformationsprodukte nach den hier beschriebenen Schritten sehr gering war, sollte die Dünnschichtchromatographie durch die semi-präparative HPLC (siehe 3.15.6) ersetzt werden. Während der Durchführung der semi-präparativen HPLC (Methode yvo02) kam es zu einer stetigen Abnahme der Biotransformationsprodukte, was auf eine Instabilität dieser hindeutet.
Die Arbeiten zur Aufreinigung der Biotransformationsprodukte wurden im Rahmen der Diplomarbeit von N. Gummerlich weitergeführt (204). N. Gummerlich konnte das Substanzgemisch NG1, welches der Masse und dem UV-Spektrum nach YS4 und YS5 entspricht, aus der Kultur von S. albus Rham x pUWL-A-7665 isolieren. Mit Hilfe von Dr. T. Paululat konnten NMR-Daten gewonnen und ausgewer- tet werden. Laut seinem Strukturvorschlag handelt es sich bei NG1 um eine 1:1 Mischung aus rham-
102 Ergebnisse nosyliertem trans- und cis-Resveratrol. Die Rhamnosylierung hat an dem zweifach hydroxylierten Ring stattgefunden.
4.3.3 Untersuchung der antibiotischen Aktivität der Biotransformationsprodukte Zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität der Biotransformationsprodukte wurden die Banden der analytischen DCs (siehe 3.15.3.1), wie unter 3.15.9 beschrieben, genutzt. Gegen die getesteten Stämme B. subtilis, E. coli, C. parapsilosis und F. verticillioides ließ sich jeweils in der eingesetzten Menge weder eine antibiotische noch eine antimykotische Aktivität nachweisen.
4.4 Identifizierung des N-Glykosyltransferase-Gens aus Saccharopolyspora eryth- raea Dr. T. Strobel konnte zeigen, dass auch der Aktinomycet S. erythraea Biotransformationsaktivität besitzt (29). Für die beobachtete Glykosylierung ist eine GT verantwortlich, die Glucose auf ein Stick- stoff-Atom von 1,4-Diaminoanthrachinon überträgt, sodass 1-N-α-Glucosyldiaminoanthrachinon (U3- 8) entsteht. Ein Chromatogramm einer S. erythraea-Kultur nach U3-Fütterung ist in Abbildung 4.11 dargestellt.
Abbildung 4.11: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der Kultur von S. erythraea nach Fütterung von U3. Die Biotransformationsprodukte U3-8 (blau) sowie U3-21 (grün) sind markiert. Zusätzlich sind die von Dr. T. Strobel und Dr. T. Paululat ermittelten Strukturformeln angegeben.
Es gibt viele GTs, die in der Lage sind O-glykosidische Bindungen zu knüpfen. Jedoch sind bislang nur wenige GTs bekannt, welche die Übertragung eines Zuckermoleküls auf einen Stickstoff-Akzeptor katalysieren. Darum sollte in dieser Arbeit das Gen, welches für die N-GT codiert, identifiziert und weiter charakterisiert werden.
103 Ergebnisse 4.4.1 Genom-Analyse zur Identifizierung möglicher Kandidaten-Gene Das Genom von S. erythraea wurde 2007 sequenziert (12). Mittels BLASTp-Analyse wurde diese Ge- nomsequenz auf GT-Gene untersucht, wobei 56 potentielle GT-Gene identifiziert werden konnten (siehe Tabelle 4.1). Des Weiteren sind in der Tabelle die mögliche Funktion der entsprechenden En- zyme sowie die Zuordnung zu einer CAZy-Familie angegeben. Bei Homologie einer GT aus S. erythraea zu GTs einer bestimmten CAZy-Familie, wurde diese GT der Familie zugeordnet. War eine eindeutige Zuordnung nicht möglich, ist in Tabelle 4.1 keine Zugehörigkeit angegeben.
Tabelle 4.1: GT-Gene aus dem Genom von S. erythraea Die mögliche Funktion der Proteine ist angegeben. Die GTs wurden in CAZy-Familien eingeteilt. CAZy- Gen-ID Name Funktion Familie sace_0046 Peptidoglycan GT, Zellteilungsprotein FtsI, Penicillin-bindendes Pro- - tein 2 sace_0104 GT 2 sace_0166 Galactofuranosyltransferase - sace_0180 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese 2 sace_0199 GT 2 sace_0652 iroB GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen 1 sace_0679 GT 1 sace_0682 GT 1 sace_0719 eryBV Mycarosyltransferase - sace_0726 eryCIII Desosaminyltransferase - sace_0791 Mannosyltransferase 39 sace_1223 GT 39 sace_1412 dmt Mannosyltransferase beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_1884 GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen und beteiligt an der 1 Resistenzvermittlung gegenüber Makrolid-Antibiotika sace_2010 GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen 1 sace_2289 Mannosyltransferase beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_2346 GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen - sace_2393 Membran-Zucker-Transferase beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_3177 cps2I GT 1 sace_3180 GT 1 sace_3341 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese 2 sace_3439 GT 39 sace_3463 Aminosäuretransporter, verwandt mit UDP- - Glucuronosyltransferasen sace_3599 GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen und beteiligt an der 1 Resistenzvermittlung gegenüber Makrolid-Antibiotika sace_3665 GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen 1 sace_3911 Mannosyltransferase 1 sace_3913 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_3916 GT 1
104 Ergebnisse
Tabelle 4.1: GT-Gene aus dem Genom von S. erythraea Die mögliche Funktion der Proteine ist angegeben. Die GTs wurden in CAZy-Familien eingeteilt. sace_4321 GT 39 sace_4470 Makrolid-GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen 1 sace_4644 GT verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen - sace_5174 iroB GT verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen 1 sace_5225 csbB Stress response-Protein, beteiligt an der Zellwand-Biosynthese 2 sace_5571 GT 1 sace_5572 GT 1 sace_5573 ADP-Heptose-LPS-Heptosyltransferase 9 sace_5578 GT 2 sace_5580 GT 2 sace_5692 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_5733 GT - sace_5734 Galactofuranosyltransferase - sace_6097 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_6109 GT 39 sace_6193 iroB GT verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen - sace_6200 GT - sace_6463 Integrales Membran-Regulator-Protein - sace_6472 wbbL dTDP-Rhamnosyltransferase - sace_6473 GT 1 sace_6474 GT 1 sace_6475 GT 2 sace_6476 GT - sace_6477 GT 1 sace_6554 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - sace_6675 GT verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen - sace_6905 GT 1 sace_6971 GT -
Zu der CAZy-Familie 1 gehören alle GTs, die im bakteriellen Sekundärstoffwechsel an der Glykosylie- rung niedermolekularer Substanzen beteiligt sind. Da der gesuchten N-GT eine ähnliche Funktion zugeschrieben wird, ist sie mit hoher Wahrscheinlichkeit auch Mitglied dieser CAZy-Familie. In dem Genom von S. erythraea wurden 19 GT-Gene identifiziert, die wahrscheinlich für GTs der CAZy- Familie 1 codieren. Unter diesen 19 GT-Genen liegen zwölf innerhalb eines Sekundärstoff-Clusters. Da jedoch unwahrscheinlich ist, dass sich die gesuchte N-GT innerhalb eines Sekundärstoff-Clusters befindet, könnte die gesuchte GT eine der folgenden sein: sace_0652, sace_1884, sace_2010, sace_3599, sace_3665, sace_4470 sowie sace_5174. Dr. A. Linnenbrink konnte zeigen, dass bei der Fütterung von S. coelicolor mit dem Anthrachinon Emodin eine Biotransformation stattfindet. Bei dem Biotransformationsprodukt könnte es sich auf- grund der Masse um ein hydroxyliertes und mit einer Hexopyranose, wie beispielsweise Glucose, konjugiertes Derivat handeln (30). Dr. T. Strobel stellte die Theorie auf, dass in den beiden Aktinomy-
105 Ergebnisse ceten-Stämmen S. erythraea und S. coelicolor ähnliche GTs für die Glucosylierung niedermolekularer Substanzen verantwortlich sind (29). Basierend auf dieser Annahme führte sie einen Vergleich der einzigen beiden GTs der CAZy-Familie 1 aus S. coelicolor (sco0040 und sco6090) gegen S. erythraea durch. Die größten Ähnlichkeiten mit den GTs aus S. coelicolor wiesen die Genprodukte von sace_1884, sace_3599 sowie sace_4470 auf. Darüber hinaus konnte Dr. T. Strobel experimentell nachweisen, dass es sich bei dem Genprodukt von sace_2010 nicht um die gesuchte GT handelt. Die putativen GTs der CAZy-Familie 1 aus S. erythraea wurden mit bekannten N-GTs aus Actinobacte- ria, den Makrolidresistenz-vermittelnden GTs OleD und OleI aus Streptomyces antibioticus sowie den putativen Glykosyltransferasen SCO0040 und SCO6090 aus S. coelicolor in ein verwandtschaftliches Verhältnis zueinander gesetzt. Anhand der erhaltenen Daten, wurde der in Abbildung 4.12 darge- stellten phylogenetischen Baum erstellt. Dieser phylogenetische Baum zeigt, dass SACE_1884, SACE_3599 sowie SACE_4470 die größten Ähnlichkeiten zu OleI und OleD, zu SCO0040 und SCO6090 sowie zu den bekannten N-GTs NokL, SpcG, StaG, AtmG, PrlH und RebG aufweisen.
106 Ergebnisse
Abbildung 4.12: Phylogenetischer Baum der zu CAZy-Familie 1 gehörenden GTs aus S. erythraea, bekannter N-GTs aus Actinobacteria sowie der Makrolidresistenz-vermittelnden GTs OleD und OleI aus Streptomyces antibioticus. Glucosyltransferasen sind umrandet. Der Baum wurde durch Bootstrapping (205) und den Neighbour-joining (206) Algo- rithmus mit dem Programm ClustalX 2.1 (162) und die TreeView Software (166) generiert. Die Zahlenwerte an den Kno- tenpunkten geben an, wie sich die GTs in dem Bootstrap-Test bei 1.000 Wiederholungen verhalten haben. Die Kanten- länge gibt die verwandtschaftliche Nähe zwischen verschiedenen Enzymen wieder.
Aufgrund der durchgeführten Analysen kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei sace_1884, sace_3599 sowie sace_4470 um die Kandidaten-Gene mit der höchsten Wahrscheinlichkeit die ge- suchte N-GT zu sein handelt. Aus diesen Gründen werden folgende Versuche vorrangig mit diesen drei GT-Genen durchgeführt. Sollte keines dieser drei Gene dem gesuchten N-GT-Gen entsprechen, kommen mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit noch weitere drei Kandidaten-Gene in Betracht (sace_0652, sace_3665 und sace_5174).
107 Ergebnisse 4.4.2 Verwendung der heterologen Testsysteme Streptomyces albus Rham und Streptomyces albus Gluc zur Identifizierung des N-Glykosyltransferase-Gens Geninaktivierungsexperimente sind eine spezifische, jedoch in Aktinomyceten sehr zeitaufwendige Methode, um die Funktion eines bestimmten Genes zu ermitteln. Aus diesem Grund sollten die ein- zelnen Gene heterolog exprimiert werden. Nach dem Vorbild von Dr. T. Strobel (29) sollte ein hetero- loges Testsystem zur schnelleren Untersuchung der heterolog exprimierten Kandidaten-Gene sace_1884, sace_3599 sowie sace_4470 verwendet werden.
Die Gruppe um Prof. Dr. J. Salas konnte den heterologen Wirt S. albus bereits mehrfach zur Charakte- risierung von Glykosyltransferasen nutzen (99,207,208). Dabei zeichnet sich der Stamm S. albus durch schnelles Wachstum sowie gute Konjugierbarkeit aus. Darüber hinaus ist der S. albus WT dazu in der Lage Glucose-1-phosphat zu synthetisieren. Lediglich die zur Aktivierung zu dTDP-D-Glucose benötigte dTDP-Glucosesynthase ist in dem WT nicht enthalten. Um die potentiellen N-GT-Gene wei- ter zu untersuchen sollte das dTDP-Glucosesynthase-Gen oleS in S. albus eingebracht werden. Vorab sollten die Kandidaten-Gene im Rahmen der Diplomarbeit von M. Schäffer in dem bereits etablierten heterologen Testsystem S. albus Rham getestet werden. S. albus Rham besitzt zusätzlich zu dem dTDP-Glucosesynthase-Gen oleS das dTDP-Glucose-4,6-dehydratase-Gen oleE, das dTDP-4-Keto-6- deoxyglucose-3,5-epimerase-Gen oleL und das dTDP-4-Ketohexulosereduktase-Gen oleU, mit deren Hilfe der Stamm dazu in der Lage ist, dTDP-Rhamnose zu produzieren.
4.4.2.1 Expression der N-Glykosyltransferase-Kandidaten-Gene in Streptomyces albus Rham S. albus Rham hat die dTDP-Rhamnose-Biosynthese-Gene markerfrei unter Kontrolle des ermE*- Promotors in seinem Genom integriert (29). Im Rahmen ihrer Diplomarbeit konnte M. Schäffer die Kandidaten-Gene sace_1884, sace_3599 und sace_4470 heterolog in S. albus Rham exprimieren (31). Die erhaltenen Mutanten wurden in in vivo Fütterungsexperimenten mit dem Anthrachinon-Derivat U3 gefüttert. Die Mutante S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 konnte das Aminoanthrachinon U3 in vivo biotransformieren. Das UV-Absorptionsspektrum des erhaltenen Biotransformationsprodukts U3-7 ähnelt dem von U3 sehr stark und ist nahezu identisch zu dem UV-Absorptionsspektrum von U3-8. Jedoch ist die Retentionszeit von U3-7 im Vergleich zu der Retentionszeit von U3-8 leicht ver- kürzt. Im negativen Modus gemessen liegt das höchste Signal von U3-7 in dem Massenspektrum bei m/z = 435 [M+Cl]-. Im positiven Modus gemessen liegt das höchste Signal bei m/z = 401 [M+H]+. Die Massendifferenz von 162 u deutet, wie bei dem Biotransformationsprodukt U3-8 aus dem S. erythraea WT, auf eine Glucosylierung hin.
108 Ergebnisse 4.4.2.2 Erstellung von Streptomyces albus Gluc M. Schäffer konnte des Weiteren das heterologe Testsystem S. albus Gluc etablieren (179). Zur Er- stellung der Mutante S. albus Gluc wurde das dTDP-Glucosesynthase-Gen oleS markerfrei unter Kon- trolle des ermE*-Promotors ins Genom von S. albus integriert.
4.4.2.3 Expression der N-GT-Kandidaten-Gene in Streptomyces albus Gluc Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde die heterologe Expression der Kandidaten-Gene sace_1884, sace_3599 und sace_4470 in dem heterologen Testsystem S. albus Gluc durchgeführt. Die replikativen Plasmide pUWL-A-sace_1884, pUWL-A-sace_3599 sowie pUWL-A-sace_4470 wurden jeweils mittels Konjugation in S. albus Gluc eingebracht (siehe 3.9.7). Die erhaltenen Mutanten S. albus Gluc x pUWL-A-sace_1884, S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 und S. albus Gluc x pUWL-A- sace_4470 wurden, wie unter 3.15.1 beschrieben, durch Fütterung mit Alizarin, 1,4- Dihydroxyanthrachinon oder 1,4-Diaminoanthrachinon auf ihre Glucosylierungsaktivität untersucht (vergleiche Tabelle 3.49). Die erhaltenen Ethylacetat-Rohextrakte wurden mittels HPLC-ESI-MS (Me- thode tina3) analysiert. Parallel wurden S. albus WT, S. albus Gluc, S. erythraea WT, S. albus x pUWL- A-sace_1884, S. albus x pUWL-A-sace_3599 und S. albus x pUWL-A-sace_4470 als Kontrollen kulti- viert und auf dieselbe Art und Weise behandelt und analysiert.
Abbildung 4.13: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der Kulturen von S. albus Gluc x pUWL-A-sace_1884 (I), S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 (II), S. albus Gluc x pUWL-A-sace_4470 (III) und S. albus Gluc (VI) nach Fütterung von U3.
In Abbildung 4.13 sind die Fütterungen der Mutanten S. albus Gluc x pUWL-A-sace_1884, S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 und S. albus Gluc x pUWL-A-sace_4470 sowie von S. albus Gluc als Kon- trolle dargestellt. Bei der Fütterung von S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 lässt sich bei einer Re- tentionszeit von 10,6 min ein zusätzlicher Peak neben dem gefütterten U3 mit einer Retentionszeit von 21,5 min erkennen. Der Peak entspricht hinsichtlich Retentionszeit, UV-Spektrum und Masse
109 Ergebnisse dem von M. Schäffer in S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 detektierten U3-7 (179). In Abbildung 4.14 sind Vergleiche der UV-Absorptionsspektren von U3 und U3-7 (A) sowie U3-7 und U3-8 (B) mit- einander abgebildet. Das UV-Absorptionsspektrum von U3-7 ist dem von U3 sehr ähnlich und nahezu identisch mit dem von U3-8.
Abbildung 4.14: Vergleich der UV-Absorptionsspektren (A) von U3 (rot) mit U3-7 (lila) und (B) von U3 mit U3-8 (blau).
In dem Massenspektrum von U3-7, gemessen im negativen Modus, liegt das höchste Signal bei m/z = 435 [M+Cl]-. Im positiven Modus gemessen liegt das höchste Signal bei m/z = 401 [M+H]+. Der Mas- sengewinn von 162 u deutet auf eine Glucosylierung hin.
Der als Kontrolle verwendete Stamm S. albus x pUWL-A-sace_3599 wurde ebenfalls durch Fütterung von U3 auf seine Glucosylierungsaktivität untersucht. Trotz Expression des GT-Gens sace_3599 war der Stamm nicht dazu in der Lage U3 umzusetzen. Dies bestätigt, dass der S. albus WT selber keine dTDP-D-Glucosesynthase besitzt und somit nicht in der Lage ist, Glucose zu dTDP-D-Glucose umzu- setzen und zu aktivieren.
4.4.2.4 Isolierung und Strukturanalyse von U3-7 Vergleicht man U3-7 aus den heterologen Testsystemen S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 und S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 mit U3-8 aus dem S. erythraea WT, stellt man fest, dass die beiden Biotransformationsprodukte U3-7 und U3-8 ein nahezu identisches UV-Absorptionsspektrum sowie die identische Masse besitzen. Lediglich die Retentionszeit von U3-7 ist im Vergleich zu U3-8 von 11,4 min auf 10,6 min verkürzt. Um die Ursache für diesen Unterscheid zwischen U3-7 und U3-8 auf- zuklären, sollte U3-7 isoliert und die Struktur mittels NMR aufgeklärt werden.
Zur Extraktion des Biotransformationsprodukts U3-7 wurde aufgrund der größeren Biotransformati- onsrate das heterologe Testsystem S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 gewählt. 5 l Kultur von S. albus
110 Ergebnisse Gluc x pUWL-A-sace_3599, gefüttert mit insgesamt 125 mg U3, wurden wie unter 3.15.1 beschrieben mit Ethylacetat extrahiert. Mittels Festphasenextraktion wurde der erhaltene Rohextrakt fraktioniert (siehe 3.15.2). Das zu isolierende Biotransformationsprodukt U3-7 war sowohl in der 50 %- als auch in der 60 %-Fraktion vertreten. In einem weiteren Schritt erfolgte die präparative Dünnschichtchro- matographie (Rf-Wert 0,6), wie unter 3.15.3.2 beschrieben. Abschließend erfolgte eine Säulenchro- matographie mittels Sephadex LH-20 (siehe 3.15.4). Es konnten insgesamt 4,5 mg U3-7 als violettfar- benes Pulver isoliert werden.
O NH2
OH O O HN OH HO OH Abbildung 4.15: Mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärte Strukturformel von U3-7. Bei U3-7 handelt es sich um 1-N-β-Glucosyldiaminoanthrachinon (Mr = 400,39 g/mol).
Die NMR-Spektroskopie zur Strukturaufklärung von U3-7 wurde von Dr. T. Paululat an der Universität
1 13 Siegen durchgeführt. Die Probe wurde bei 35 °C, in DMSO-d6 gelöst, vermessen. Es wurden H-, C- sowie 2D-NMR-Experimente (1H,1H-COSY und 1H,13C-HMBC) durchgeführt. Bei U3-7 handelt es sich 1-
N-β-Glucosyldiaminoanthrachinon (siehe Abbildung 4.15). Die tabellarische Zusammenfassung der NMR-Daten ist im Anhang unter 7.2.1 in Tabelle 7.1 aufgeführt.
Durch die Strukturaufklärung des glucosylierten U3-7 konnte gezeigt werden, dass es sich bei SACE_3599 um die gesuchte N-GT handelt.
4.4.3 Überprüfung der Aktivität von SACE_3599 in Saccharopolyspora erythraea Zur Überprüfung, ob SACE_3599 die einzige gesuchte N-GT in dem Genom von S. erythraea ist, sollte das GT-Gen sace_3599 mittels Doppelcrossover in dem Genom von S. erythraea inaktiviert werden. Die erhaltene Mutante sollte die Testsubstanz 1,4-Diaminoanthrachinon nicht mehr glucosylieren können.
4.4.3.1 Inaktivierung von sace_3599 Zur Inaktivierung des Gens sace_3599 in dem Genom von S. erythraea wurde mittels Doppelcrosso- ver, wie unter 3.12 beschrieben, eine Spectinomycinresistenz-Kassette eingebracht. In Abbildung 4.16 ist die Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung des nativen und des mutierten Gens sace_3599 zum Nachweis der Singlecrossover-Mutante S. erythraea x pKCΔsace_3599 sowie der Doppelcrossover-Mutante S. erythraea Δsace_3599 dargestellt. Das Bild zeigt den erfolgreichen Aus- tausch der Spectinomycinresistenz-Kassette gegen sace_3599.
111 Ergebnisse
1 2 3 4 5
1,8 kb 1,5 kb
Abbildung 4.16: Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung des nativen und des mutierten Gens sace_3599. 1: Chromosomale DNA der Doppelcrossover-Mutante S. erythraea Δsace_3599. Enthält das mutierte Gen sace_3599 (erwartete Größe 1,8 kb). 2: 1 kb DNA Leiter der Firma NEB. 3: Chromosomale DNA der Singlecrossover-Mutante S. erythraea x pKCΔsace_3599. Trägt das native und das mutierte Gen sace_3599 (erwartete Größen 1,5 und 1,8 kb). 4: Chromosomale DNA des S. erythraea WT. Trägt das native Gen sace_3599 (erwartete Größe 1,5 kb). 5: H2O als Negativkontrolle.
4.4.3.2 In vivo Glucosylierungsexperimente mit Saccharopolyspora erythraea Δsace_3599 Wie unter 3.15.1 beschrieben, wurde die Doppelcrossover-Mutante S. erythraea Δsace_3599 für in vivo Glucosylierungsexperimente verwendet, wobei 1,4-Diaminoanthrachinon als Testsubstanz dien- te. Nach Extraktion der Kulturen erfolgte die Analyse mittels HPLC-ESI-MS (Methode tina3). In Abbil- dung 4.17 ist das HPLC-Chromatogramm des Ethylacetat-Extraktes dieser Kultur (II) im Vergleich zu einer gleich behandelten Kultur des S. erythraea WT (I) dargestellt. Aus dieser Abbildung wird ersicht- lich, dass die Mutante kein U3-8 mehr bildet und somit nicht mehr in der Lage ist das Anthrachinon- Derivat zu glucosylieren. Der U3-21-Peak ist jedoch immer noch vorhanden.
Abbildung 4.17: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der Kulturen von S. erythraea WT (I), S. erythraea Δsace_3599 (II) und S. erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599 (III) nach Fütterung von U3.
112 Ergebnisse 4.4.3.3 Komplementierung von Saccharopolyspora erythraea Δsace_3599 mit sace_3599 Durch in vivo Glucosylierungsexperimente mit 1,4-Diaminoanthrachinon konnte gezeigt werden, dass die Mutante S. erythraea Δsace_3599 ihre Glucosylierungsaktivität verloren hat. Um nachzuweisen, dass die Inaktivierung von sace_3599 Ursache dieser Veränderung in der Biotransformationsaktivität ist, sollte die Doppelcrossover-Mutante S. erythraea Δsace_3599 mit einer intakten Kopie des Gens sace_3599 komplementiert werden. Führt die Expression des GT-Gens sace_3599 in der Dop- pelcrossover-Mutante zu einer mit dem WT vergleichbaren Glucosylierungsaktivität, ist nachgewie- sen, dass es sich bei sace_3599 um das für die N-Glucosylierungsaktivität verantwortliche Gen han- delt.
Zur Expression von sace_3599 in S. erythraea Δsace_3599 wurde, wie unter 3.11.4 beschrieben, das Komplementierungs-Plasmid pTOSz-sace_3599 konstruiert und, wie unter 3.9.7 beschrieben, mittels Konjugation in S. erythraea Δsace_3599 eingebracht. In Abbildung 4.18 ist die Agarose- Gelelektrophorese der Amplifizierung des nativen und des mutierten Gens sace_3599 zum Nachweis der Komplementierungs-Mutante S. erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599 dargestellt.
1 2 3 4
1,8 kb 1,5 kb
Abbildung 4.18: Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung des nativen und des mutierten Gens sace_3599 mit ver- schiedenen Templates. 1: Chromosomale DNA der Komplementierungs-Mutante S. erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599. Enthält das native und das mutierte Gen sace_3599 (1,5 und 1,8 kb). 2: Amplifizierung von sace_3599 als Positivkontrolle. pTOSz-sace_3599 diente als Template. Das Gen sace_3599 ist detek- tierbar (1,5 kb). 3: H2O als Negativkontrolle. 4: 1 kb DNA Leiter der Firma NEB.
4.4.3.4 In vivo Glucosylierungsexperimente mit Saccharopolyspora erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599 Wie unter 3.15.1 beschrieben, wurde mit der Mutante S. erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599 ein in vivo Glucosylierungsexperiment mit 1,4-Diaminoanthrachinon als Testsubstanz durchgeführt. Nach Extraktion der Kultur erfolgte die Analyse mittels HPLC-ESI-MS (Methode tina3). In Abbildung 4.17 ist das HPLC-Chromatogramm des Ethylacetat-Extraktes dieser Kultur (III) im Vergleich zu einer gleich behandelten Kultur des S. erythraea WT (I) dargestellt. Aus dieser Abbildung wird ersichtlich,
113 Ergebnisse dass die Komplementierung von S. erythraea Δsace_3599 mit pTOSz-sace_3599 wieder zu der Bio- transformation von U3 durch Glucosylierung führt. Dies bestätigt die Versuche in den heterologen Testsystemen und beweist, dass sace_3599 für die gesuchte N-GT codiert.
4.4.4 In silico Analyse des Genomabschnitts in unmittelbarer Nähe des N-Glykosyltransferase- Gens sace_3599 Das GT-Gen sace_3599 codiert für die N-GT, welche für die Glucosylierung von 1,4- Diaminoanthrachinon in S. erythraea verantwortlich ist. Zur weiteren Charakterisierung wurde eine in silico Analyse des Gens sace_3599 sowie der Gene in näherer Umgebung durchgeführt.
In Tabelle 4.2 sind die GTs aus S. erythraea mit der größten Ähnlichkeit zu SACE_3599 angegeben. Darüber hinaus sind Vergleiche mit den Makrolid-GTs OleD und OleI aus Streptomyces antibioticus sowie mit bekannten N-GTs aus Actinobacteria aufgeführt. Die größte Ähnlichkeit zu einer anderen GT aus S. erythraea weißt SACE_3599 mit 47 % identischen und 61 % ähnlichen Aminosäuren zu SACE_1884, einer GT mit unbekannter Funktion, auf. Mit der Makrolid-GT OleI teilt SACE_3599 36 % identische und 50 % ähnliche Aminosäuren. Und im Vergleich zu den N-GTs zeigt SACE_3599 mit 29 % identischen und 43 % ähnlichen Aminosäuren die größte Ähnlichkeit zu SpcG, einer N-GT aus der Indolocarbazol-Biosynthese in Streptomyces sanyensis.
Tabelle 4.2: Vergleich von SACE_3599 mit anderen GTs Angegeben sind Namen der GTs, Stamm, Anteil identischer/ähnlicher AS sowie GenBank-Zugangsnummer. Anteil identischer/ähnlicher GenBank-Zugangsnummer, Name Stamm AS [%] Referenz GT aus S. erythraea SACE_1884 S. erythraea 47/61 CAM01196 (12) SACE_4470 S. erythraea 34/48 CAM03739 (12) Makrolid-GTs aus Streptomyces antibioticus OleD S. antibioticus 33/48 ABA42119 (39) OleI S. antibioticus 36/50 ABA42118 (209) N-GTs aus Actinobacteria AtmG Actinomadura melliaura 26/41 ABC02800 (85) NokL Nonomuraea longicate- 27/40 ACN29718 (86) na PrlH Nonomuraea spiralis IMC 27/43 AGC24262 (87) A-0156 RebG Lechevalieria aerocolo- 27/40 BAC10673 (88) nigenes SpcG Streptomyces sanyensis 29/43 AGL96572 (89) StaG Streptomyces 25/35 EFG04604 (90) clavuligerus
114 Ergebnisse In Abbildung 4.19 ist der Genomabschnitt um das N-GT-Gen sace_3599 dargestellt. Das N-GT-Gen ist umgeben von Genen, welche für hypothetische Proteine, einen Transkriptionsregulator der XRE- Familie (Xenobiotic Response Element), ein PE-PGRS-Familien-Protein (polymorphic GC-repetitive sequence), eine Methionin-Aminopeptidase, zwei Aminoglykosid-N3’-Acetyltransferasen, eine Oxi- dase, eine Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase sowie eine Enolase-Phosphatase codieren.
Abbildung 4.19: Genomabschnitt um das N-GT-Gen sace_3599. at, Aminoglykosid-N3’-Acetyltransferase-Gen; enoph, Enolase-Phosphatase-Gen; hp, für ein hypothetisches Protein co- dierendes Gen; metap, Methionin-Aminopeptidase-Gen; ox, Oxidase-Gen; pe-pgrs, für ein PE-PGRS-Familien-Protein codierendes Gen; reg, Gen codiert für einen Transkriptionsregulator der XRE-Familie; rpe, Ribulose-5-Phosphat-4- Epimerase-Gen; sace_3599, N-Glykosyltransferase-Gen.
Die Genprodukte des Genomabschnitts um das N-GT-Gen sace_3599 sind unter Angabe der jeweili- gen Funktion und der Aminosäure-Sequenz-Ähnlichkeit in Tabelle 4.3 aufgelistet.
Tabelle 4.3: Genprodukte des Genomabschnitts um das N-GT-Gen sace_3599 Neben der Funktion sind die Proteine mit größter Ähnlichkeit mit Stamm, Anteil identischer/ähnlicher AS sowie Gen- Bank-Zugangsnummer angegeben. Anteil identi- GenBank- Proteinsequenz ähn- Genprodukt Funktion scher/ ähnlicher Zugangsnummer, lich zu AS [%] Referenz SACE_3595 PE-PGRS-Familien- N599_26790, Saccha- 99/100 EQD83160 Protein ropolyspora ery- thraea D SACE_3597 XRE-Transkriptions- HipB, Saccharopoly- 73/84 WP_010692851 regulator spora spinosa SACE_3598 Methionin- MetAP1, Saccha- 53/66 WP_029722975 Aminopeptidase ropolyspora recti- virgula SACE_3603 Aminoglykosid-N3’- Antibiotic_NAT, 78/84 WP_012377682 Acetyltransferase Streptomyces griseus SACE_3604 Aminoglykosid-N3’- Antibiotic_NAT, 74/82 WP_039939167 Acetyltransferase Streptomyces himas- tatinicus SACE_3605 Oxidase Cupin, Saccharopoly- 81/87 WP_010692862 spora spinosa SACE_3606 Ribulose-5-Phosphat- Aldolase_II, Amycola- 75/82 WP_005157185 4-Epimerase topsis azurea SACE_3607 Enolase-Phosphatase HAD_2, Saccha- 78/84 WP_010692864 ropolyspora spinosa
115 Ergebnisse SACE_3595 stellt ein PE-PGRS-Familien-Protein dar. Es handelt sich hierbei um eine polymorphe GC- reiche Sequenz (PGRS) mit sich wiederholendem Prolin-Glutaminsäure-Motiv (PE).
Bei SACE_3597 handelt es sich um einen Transkriptionsregulator der XRE-Familie, welche typischer- weise ein Helix-Turn-Helix-Motiv aufweisen. Einer der bekanntesten Vertreter dieser Transkriptions- regulatoren ist Xre aus Bacillus subtilis (210).
Methionin-Aminopeptidasen wie SACE_3598 (EC 3.4.11.18) dienen dazu N-terminale Aminosäure, vorzugsweise Methionin, von wachsenden Peptiden und Arylamiden abzuspalten.
Aminoglykosid-N3’-Acetyltransferasen, hier durch SACE_3603 und SACE_3604 (EC 2.3.1.81) vertre- ten, acetylieren typischerweise den 2-Desoxystreptamin-Ring, Grundbaustein vieler Aminoglykosid- Antibiotika.
Ein Vergleich mit der UniProt-Datenbank (167) ergab, dass die Enzyme SACE_3605, SACE_3606 und SACE_3607 gemeinsam vier von sechs Schritten des Methionin-Salvage-Stoffwechselweges katalysie- ren und somit an der Methionin-Biosynthese beteiligt sind (211). SACE_3606 wandelt 5’- Methylthioribose-1-phosphat in 5’-Methylthioribulose-1-phosphat um (212), welches von SACE_3607 erst in das Intermediat 2,3-Diketo-5’-methylthiopentan-1-phosphat (213) und anschließend in 1,2- Dihydroxy-3-keto-5’-methylthiopenten umgesetzt wird (214). Abschließend erfolgt durch SACE_3605, abhängig vom Cofaktor, die Umwandlung zu 3-Methylthiopropianat oder 4-Methylthio-2- ketobutanoat (215,216). Enzyme für den ersten sowie den letzten Schritt des Methionin-Salvage- Stoffwechselweges konnten in dem Genom von S. erythraea bislang nicht identifiziert werden.
4.5 Biochemische Untersuchungen der N-Glykosyltransferase SACE_3599 Anhand der Biotransformationsexperimente sowie der Inaktivierung mit anschließender Komple- mentierung von sace_3599 in S. erythraea konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei dem Enzym SACE_3599 aus Saccharopolyspora erythraea um die gesucht GT handelt, die Glucose auf ein aroma- tisches Amin des 1,4-Diaminoanthrachinon überträgt.
In Folgendem sollte sace_3599 weiter biochemisch charakterisiert werden. Hierzu sollte das GT-Gen heterolog in E. coli exprimiert werden, um das Protein aufzureinigen und für in vitro Aktivitätsassays nutzbar zu machen.
4.5.1 Präparation und Aufreinigung von SACE_3599
Zur Biosynthese der Glukosyltransferase SACE_3599 mit N-terminalem His6-tag wurde das Expressi- onsplasmid pET28a-sace_3599-N-his kloniert (siehe 3.11.2.7). Zur Testung der Synthesebedingungen wurde das Expressionsplasmid zuerst in verschiedene E. coli-Stämme transformiert, um anschlie- ßend, wie unter 3.13.1.1 beschrieben, die Bedingungen zur heterologen Synthese zu optimieren. Es
116 Ergebnisse kamen die E. coli-Stämme E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2, E. coli BL21 (DE3) x pLysS, E. coli BL21 Star (DE3) und E. coli Rosetta 2 zum Einsatz.
Die Auswertung aller durchgeführten Testexpressionen mittels SDS-PAGE (siehe 3.13.7) ergab Pro- teinbanden der gewünschten Größe von 45,3 kDa. Aufgrund der vergleichsweise großen Protein- menge bei gleichzeitig geringer Menge anderer Proteine wurden E. coli Rosetta 2-Zellen zur Durch- führung weiterer Versuche genutzt. Abbildung 4.20 zeigt die Testexpression in E. coli Rosetta 2-Zellen bei 20 °C, zu den Zeitpunkten t0 sowie 20 h nach Induktion mit unterschiedlichen IPTG- Konzentrationen.
1 2 3 4 PA 5 6
45,3 kDa
Abbildung 4.20: SDS-PAGE der Testexpression von sace_3599 in E. coli Rosetta 2 x pET28a-sace_3599-N-his (45,3 kDa). Durchgeführt bei 20 °C. Zu dem Zeitpunkt der Induktion (1) sowie 20 h nach Induktion mit 0,1 mM IPTG (2), 0,5 mM IPTG (3) sowie 1,0 mM IPTG (4) wurden Proben genommen. Im Vergleich ist die Testexpression mit dem leeren Vektor pET28a zu dem Zeitpunkt der Induktion (5) sowie 20 h nach Induktion mit 1,0 mM IPTG (6) aufgetragen. PA, Proteinstandard AppliChem.
Ein weiterer Grund für die Wahl der E. coli Rosetta 2-Zellen besteht darin, dass sie Gene enthalten, welche für sieben in E. coli selten vorkommende tRNAs codieren. Dies kann die Translation GC- reicher Proteine ohne vorherige Codon-Optimierung verbessern. Die deutlichste Proteinbande war nach Induktion mit 0,1 mM IPTG und 20-stündiger Inkubation bei 20 °C auf dem SDS-PAGE-Gel zu sehen. Diese Konditionen wurden für weitere Kultivierungen zur Gewinnung von SACE_3599 für die Proteinaufreinigung in einem präparativen Maßstab gewählt.
Nach dem Zellaufschluss (siehe 3.13.2) wurde SACE_3599 mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie (siehe 3.13.3.1) aufgereinigt. In Abbildung 4.21 ist das Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA- Affinitätschromatographie des Proteins aus 800 ml Kultur dargestellt. Bei einer Imidazolkonzentrati- on von 255 mM und einem Elutionsvolumen von 93 bis 104 ml eluiert die Hauptfraktion des Proteins. In der SDS-PAGE sind zusätzlich zu dem gewünschten Protein mehrere schwache Banden von Verun- reinigungen sichtbar (vergleiche Abbildung 4.22). Um diese Verunreinigungen, sowie die aggregierten Proteinfraktionen abzutrennen, wurde im Anschluss an die Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie mit den aufkonzentrierten Elutionsfraktionen eine präparative Aufreinigung mittels Gelfiltration durchge- führt (siehe 3.13.4.2).
117 Ergebnisse
Abbildung 4.21: Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von SACE_3599. Die gemessene Absorption (blau) sowie die verwendete Imidazolkonzentration (rot) sind dargestellt. Die Hauptfraktion des Proteins SACE_3599 eluiert bei einer Imidazolkonzentration von 255 mM.
1 2 3 4 PN 5 6 7
45,3 kDa
Abbildung 4.22: SDS-PAGE der Aufreinigung von SACE_3599 mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration. Von der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie (1-4) wurden Proben des Durchflusses (1), des Waschschritts mit 83,5 mM Imidazol (2) sowie der Elutionsfraktion des Proteins SACE_3599 bei 96 ml (3) beziehungsweise 98 ml (4) aufgetragen. Zudem wurde die vereinigte und aufkonzentrierte Proteinfraktion vor der Gelfiltration aufgetragen (5). Von der Gelfiltra- tion wurden Ausschlussvolumen (6) sowie bei 15-18 ml eluiertes Protein (7) aufgetragen. PN, Proteinstandard NEB
Abbildung 4.23 zeigt das Elutionschromatogramm der Gelfiltration. Bei einem Elutionsvolumen von 7 bis 12 ml wurde der Peak des Ausschlussvolumens detektiert. In dem Ausschlussvolumen eluieren Verunreinigungen sowie aggregiertes Protein. Bei einem Volumen von 15 bis 18 ml eluiert das nicht- aggregierte Protein SACE_3599. Dieses Protein wurde gesammelt, vereint und konzentriert. Bande 7 der SDS-Page in Abbildung 4.22 zeigt das reine nicht-aggregierten Protein nach der Gelfiltration. Aus einem Liter Kultur konnten durchschnittlich 5-6 mg des Proteins SACE_3599 produziert werden.
118 Ergebnisse
Abbildung 4.23: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von SACE_3599. Das Protein SACE_3599 eluiert bei einem Volumen von 15-18 ml.
4.5.2 In vitro Aktivitätsassays von SACE_3599 Zum Nachweis der Proteinaktivität sowie zur Charakterisierung des Enzyms wurden mit dem aufge- reinigten Protein SACE_3599 in vitro Aktivitätsassays durchgeführt. Hierfür wurden 1,4- Diaminoanthrachinon als Akzeptor-Substrat und TDP-α-Glucose als Zucker-Donor verwendet. Das
Enzym sollte, wie in Abbildung 4.24 dargestellt, die Reaktion zu 1-N-β-Glucosyldiaminoanthrachinon und TDP katalysieren.
Abbildung 4.24: Reaktionsgleichung der Glucose-Übertragung von TDP-α-D-Glucose auf 1,4-Diaminoanthrachinon.
4.5.2.1 Photometrische Bestimmung Der photometrische in vitro Aktivitätsassay wurde, wie unter 3.13.10.2 beschrieben, bei 340 nm und RT in einer Küvette der Schichtdicke 1 cm durchgeführt. Es handelt sich hierbei um eine gekoppelte enzymatische Reaktion, bei welcher TDP als Produkt aus der Zuckerübertragungsreaktion [1] in dem zweiten Schritt als eines der Edukte dient: TDP und Phosphoenolpyruvat (PEP) reagieren in Gegen- wart der Pyruvatkinase (PK) zu Pyruvat und TTP [2]. Pyruvat seinerseits reagiert mit NADH unter An-
119 Ergebnisse wesenheit von Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat und NAD+ [3]. Photometrisch wird die Abnahme der Absorption bei 340 nm verfolgt, da NADH für diese Wellenlänge im Gegensatz zu NAD+ ein zwei- tes Absorptionsmaximum besitzt.
Abbildung 4.25: Photometrischer Aktivitätsassay von SACE_3599 (links) und Negativkontrolle (rechts). Gemessen wurde die Abnahme der Absorption bei 340 nm, welche in dem gekoppelten Assay durch die Umsetzung von NADH zu NAD+ zustande kommt. Im Vergleich ist eine identisch behandelte Negativkontrolle ohne Zusatz von SACE_3599 dargestellt.
In Abbildung 4.25 ist die Abnahme der Absorption über die Zeit in einem photometrisch durchgeführ- ten Aktivitätsassay mit SACE_3599 (grün) im Vergleich zu einer ohne SACE_3599 durchgeführten Negativkontrolle (rot) dargestellt.
Durch die Abnahme der Absorption konnte gezeigt werde, dass SACE_3599 unter den vorliegenden Reaktionsbedingungen die Glucosylierung von 1,4-Diaminoanthrachinon katalysiert.
4.5.2.2 Bestimmung mittels HPLC-MS Wie unter 3.13.10.1 beschrieben, wurden zusätzlich zu den photometrischen Aktivitätsassays Best- immungen mittels HPLC-MS vorgenommen. Zur Bestimmung von pH- und Temperaturoptimum der Glucosylierungs-Reaktion wurden Assays bei verschiedenen pH-Werten sowie verschiedenen Tempe- raturen durchgeführt. Zur Einstellung der pH-Werte wurden TRIS-Puffer mit pH 7,5, pH 8,0 und pH 8,8 verwendet. Für eine konstante Temperatur während der Reaktion erfolgte die 30-minütige Inkubation bei 28 °C beziehungsweise 37 °C in einem Brutschrank. Parallel wurden jeweils identisch behandelte Negativkontrollen ohne Enzym durchgeführt. Die Analyse erfolgte mit der Methode ti- na3. In Abbildung 4.26 ist das HPLC-Chromatogramm der Ethylacetat-Extrakte des Aktivitätsassays bei 28 °C und pH 8,8 im Vergleich zu der Negativkontrolle abgebildet. Daraus wird ersichtlich, dass SACE_3599 1,4-Diaminoanthrachinon unter diesen Reaktionsbedingungen innerhalb von 30 min voll- ständig zu dem glucosylierten Derivat umsetzt.
120 Ergebnisse
Abbildung 4.26: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der in vitro Aktivitätsassays bei 28 °C und pH 8,8. Negativkontrolle ohne Zugabe von SACE_3599 (I) und Assay unter Zugabe von SACE_3599 (II).
Für andere Reaktionsbedingungen konnte die Glucosylierung von 1,4-Diaminoanthrachinon nicht nachgewiesen werden. SACE_3599 konnte somit hinsichtlich pH- und Temperaturoptimum charakte- risiert werden. Das pH-Optimum beträgt 8,8 und das Temperaturoptimum 28 °C.
4.5.3 Untersuchung der Antibiotika-Resistenz Es sollte untersucht werden, ob die Inaktivierung der als Makrolid-GT annotierten N-GT SACE_3599 zu einem Verlust der Resistenz gegenüber Makrolid-Antibiotika führt. Hierzu wurde, ähnlich wie un- ter 3.15.9 beschrieben, der Agardiffusionstest verwendet. Es wurden TSB-Platten mit S. erythraea WT beziehungsweise S. erythraea Δsace_3599 überschichtet. Jeweils 7,5 µg, 15 µg beziehungsweise 30 µg der Testsubstanzen Erythromycin oder Azithromycin wurden auf Filterrondelle pipettiert. Als Positivkontrolle diente Apramycin und als Negativkontrolle Ethanol. Die getesteten Stämme S. erythraea WT und S. erythraea Δsace_3599 waren jeweils in den eingesetzten Mengen nicht sensi- tiv gegen Erythromycin oder Azithromycin.
4.6 Untersuchungen zur Talose-Glykosyltransferase aus Kitasatospora sp. 152608 Die Gruppe um Prof. Dr. A. Luzhetskyy konnte aus Kulturen des Simocyclinon-Produzenten Kitasato- spora sp. 152608 die zwei neuen Angucycline Amycomycin C und D isolieren (41,50). Der Zuckeranteil besteht hierbei aus der seltenen 6-deoxy-α-Talose. Des Weiteren konnte die Gruppe zeigen, dass bei Fütterungsexperimenten in DNPM-Medium eine Verknüpfung des gefütterten Alizarins mit 6-deoxy- α-Talose stattfindet, wohingegen bei Fütterung in NL5-Medium keine Glykosylierung dieser Art zu beobachten ist. Die Daten der Genom-Sequenzierung sowie der RNA-Sequenzierung aus der Kultivie-
121 Ergebnisse rung in den beiden unterschiedlichen Medien wurden von Prof. Dr. A. Luzhetskyy zur Verfügung ge- stellt. Mit Hilfe dieser Daten sollte die Talose-GT aus Kitasatospora sp. 152608 identifiziert werden.
4.6.1 in silico Analyse zur Biosynthese von Talose Ähnlich wie bereits unter 4.4.2 beschrieben, sollte ein heterologes Testsystem zur schnelleren Unter- suchung der Kandidaten-Gene aus Kitasatospora sp. 152608 hergestellt werden.
Dabei sollte der heterologe Wirt S. albus zur Charakterisierung der Talose-GT genutzt werden. Wie bereits bekannt, ist der S. albus WT dazu in der Lage Glucose-1-phosphat zu synthetisieren. Ausge- hend von D-Glucose-1-phosphat erfolgt die Synthese von dTDP-D-Glucose mit Hilfe einer dTDP- Glucosesynthase. In dem nächsten Schritt erfolgt, katalysiert durch eine dTDP-Glucose-4,6- dehydratase, die Umwandlung zu dTDP-4-keto-6-deoxy-D-Glucose, welche durch die Aktivität einer 3,5-Epimerase zu dTDP-4-keto-6-deoxy-L-Glucose isomerisiert. Ausgehend von dTDP-4-keto-6-deoxy- L-Glucose ergeben sich zwei unterschiedliche Reaktionswege. Es besteht erstens die Möglichkeit in einem Reaktionsschritt mit Hilfe einer 4-Ketoreduktase zu dTDP-6-deoxy-L-Talose zu gelangen. Zwei- tens besteht die Möglichkeit wiederum mittels einer 4-Ketoreduktase zu dTDP-L-Rhamnose zu gelan- gen, welche durch eine 4-Epimerase zu dTDP-6-deoxy-L-Talose umgesetzt wird. Das Gleichgewicht der Epimerisierungsreaktion liegt dabei auf der Seite der dTDP-L-Rhamnose (vergleiche Abbildung 2.5).
Die BLASTp-Analyse der übersetzten Genomsequenz von Kitasatospora sp. 152608 im Vergleich zu den bekannten Enzymen RmlA (dTDP-Glucosesynthase), RmlB (dTDP-Glucose-4,6-dehydratase), RmlC (dTDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase) und Tal (dTDP-6-deoxy-L-Talose-4-dehydrogenase) der dTDP-6-deoxy-Talose-Biosynthese aus Kitasatospora kifunensis ergab für jedes Enzym mindestens einen Treffer. Die Genprodukte mit der höchsten Übereinstimmung sind in einem Gen-Cluster lokali- siert. Eine grafische Darstellung des entsprechenden Gen-Clusters ist in Abbildung 4.27 zu sehen.
Abbildung 4.27: Talose-Biosynthese-Gen-Cluster in Kitasatospora sp. 152608. Gene der Zuckersynthese (blau), Gene der Zuckerübertragung (lila), andere Gene (grün) und hypothetische Gene (grau)
122 Ergebnisse Die Genprodukte des Clusters sind in Tabelle 4.4 unter Angabe der jeweiligen Funktion und der Ami- nosäure-Sequenz-Ähnlichkeit aufgelistet.
Tabelle 4.4: Genprodukte des Talose-Biosynthese-Gen-Clusters Neben der Funktion sind die Proteine mit größter Ähnlichkeit mit Stamm, Anteil identischer/ähnlicher AS sowie Gen- Bank-Zugangsnummer angegeben. Anteil identi- GenBank- Proteinsequenz ähn- Genprodukt Funktion scher/ ähnlicher Zugangsnummer, lich zu AS [%] Referenz KSS_03123 dTDP-Glucose-4,6- RmlB, K. kifunensis 92/95 ADO32598 (51) dehydratase KSS_03124 dTDP-Glucose- RmlA, K. kifunensis 89/93 ADO32599 (51) synthase KSS_03125 dTDP-4-Keto-6- RmlC, K. kifunensis 83/89 ADO32600 (51) deoxyglucose-3,5- epimerase KSS_03126 GT CAZy-Familie 2 Streptomyces sp. 96/97 WP_030263542 NRRL B-24484 KSS_03127 dTDP-6-deoxy-L- Tal, K. kifunensis 68/80 ADO32602 (51) Talose-4-dehydro- genase KSS_03128 O-Acetyl-transferase OafA, K. kifunensis 52/65 ADO32603 (51) KSS_03129 hypothetisches Pro- tein KSS_03130 translationaler PRK00049, Strepto- 99/100 WP_030263551 Elongationsfaktor Tu myces sp. NRRL B- 24484
4.6.2 Heterologes Testsystem zur Produktion von Talose Die wie unter 4.6.1 beschrieben, identifizierten Gene KSS_03123, KSS_03124, KSS_03125 und KSS_03127 der Talose-Biosynthese sollten in den S. albus WT eingebracht werden, um die Mutante S. albus Tal herzustellen. Die Mutante sollte im Anschluss an die Genom-Analyse (vergleiche 4.6.3) für die experimentelle Untersuchung der potentiellen Talose-GT-Gene verwendet werden. Hierfür sollten jeweils die entsprechenden codierenden Bereiche einzeln in das Expressionsplasmid pUWL-A kloniert und in das heterologe Testsystem S. albus Tal konjugiert werden. Durch Fütterung der erhal- tenen Mutanten mit Alizarin und HPLC-ESI-MS-Analyse der Ethylacetat-Rohextrakte sollte untersucht werden, ob der entsprechende codierende Bereich an der Glykosylierung von Alizarin beteiligt ist.
123 Ergebnisse 4.6.2.1 Erstellung von Streptomyces albus Tal Zur Erstellung der Mutante S. albus Tal wurden die dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthese-Gene in das Genom von S. albus eingebracht. Hierfür wurde, wie unter 3.11.5 beschrieben, das Plasmid pTOS- Talose mit den Genen KSS_03123, KSS_03124, KSS_03125 und KSS_03127 kloniert. Mittels Konjuga- tion (siehe 3.9.7) wurden die dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthese-Gene in das Genom von S. albus integriert.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1,0 kb 0,9 kb
Abbildung 4.28: Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung von KSS_03123 (1 kb) und aac(3)IV (0,9 kb) zum Nachweis der markerfreien Integration der dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthesegene in das Genom von S. albus. 1: Amplifizierung von KSS_03123. Chromosomale DNA von S. albus WT diente als Template. Das Gen KSS_03123 ist nicht detektierbar. 2: Amplifizierung von KSS_03123. pTOS-Talose diente bei der Positivkontrolle als Template. Das Gen KSS_03123 ist de- tektierbar. 3: 1 kb DNA Leiter der Firma NEB. 4: Amplifizierung von KSS_03123. Chromosomale DNA von S. albus x pTOS-Talose diente als Template. Das Gen KSS_03123 ist detektierbar. 5: Amplifizierung von KSS_03123. Chromosomale DNA von S. albus Tal diente als Template. Das Gen KSS_03123 ist detek- tierbar. 6: Amplifizierung von aac(3)IV. pTOS-Talose diente bei der Positivkontrolle als Template. Das Gen aac(3)IV ist detektier- bar. 7: 1 kb DNA Leiter der Firma NEB. 8: Amplifizierung von aac(3)IV. Chromosomale DNA von S. albus x pTOS-Talose diente als Template. Das Gen aac(3)IV ist detektierbar. 9: Amplifizierung von aac(3)IV. Chromosomale DNA von S. albus Tal diente als Template. Das Gen aac(3)IV ist nicht de- tektierbar.
Um eine markerfreie Integration der dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthese-Gene unter Kontrolle des ermE*-Promotors zu erreichen wurde das Plasmidbackbone anschließend mittels Dre-Rekombinase vom Plasmid pUWL-Dre aus dem Genom entfernt. Nach Entfernen dieser Plasmid-DNA aus dem Ge- nom bleiben nur die dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthese-Gene KSS_03123, KSS_03124, KSS_03125 und KSS_03127 unter Kontrolle des ermE*-Promotors zurück. Mittels PCR wurde nachgewiesen, dass S. albus x pTOS-Talose sowohl aac(3)IV als auch KSS_03123 in seinem Genom integriert hat, wohin- gegen bei S. albus Tal nur KSS_03123, aber nicht mehr aac(3)IV nachweisbar war (siehe Abbildung 4.28). Das heterologe Testsystem S. albus Tal steht somit zur Untersuchung potentieller Talose-GT- Gene zur Verfügung.
124 Ergebnisse 4.6.3 Genom-Analyse zur Identifizierung möglicher Talose-Glykosyltransferase-Kandidaten-Gene in Kitasatospora sp. 152608 Das Genom von Kitasatospora sp. 152608 wurde von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. A. Luzhetskyy sequenziert (41,50). Mittels BLASTp-Analyse wurde die Genomsequenz auf GT-Gene untersucht, wo- bei 50 potentielle GT-Gene identifiziert werden konnten (siehe Tabelle 4.5). Des Weiteren sind in der Tabelle, falls bekannt, die mögliche Funktion der entsprechenden Enzyme sowie die Zuordnung zu einer CAZy-Familie angegeben.
Tabelle 4.5: GT-Gene aus Kitasatospora sp. 152608 Die mögliche Funktion der Proteine ist angegeben. Die GTs wurden in CAZy-Familien eingeteilt. Gen-ID Funktion CAZy-Familie KSS_00015 GT 1 KSS_00157 GT 1 KSS_00160 GT 1 KSS_00162 GT 1 KSS_00191 GT beteiligt an der Zellwand-Biosynthese - KSS_00193 GT 1 KSS_00202 GT 1 KSS_00208 Polyprenol-Monophosphomannose-Synthase 2 KSS_00294 GT 1 KSS_00939 GT, verwandt mit UDP-Glucuronosyltransferasen 1 KSS_00940 GT 1 KSS_01148 GT 1 KSS_01612 Galactosyltransferase 1 KSS_01618 GT 2 KSS_01620 GT 1 KSS_01626 GT 1 KSS_01628 GT 1 KSS_01739 GT 2 KSS_01898 GT 39 KSS_02167 Mannosyltransferase 1 KSS_02309 GT 1 KSS_02359 GT 1 KSS_02373 Membranprotein - KSS_02907 GT 2 KSS_02918 GT 2 KSS_03008 GT 2 KSS_03009 GT 2 KSS_03010 GT - KSS_03012 GT 2 KSS_03119 GT 2 KSS_03126 Polyprenol-Monophosphomannose-Synthase 2 KSS_03219 GT 1 KSS_03366 D-Inositol-3-phosphate-GT 1
125 Ergebnisse
Tabelle 4.5: GT-Gene aus Kitasatospora sp. 152608 Die mögliche Funktion der Proteine ist angegeben. Die GTs wurden in CAZy-Familien eingeteilt. KSS_03491 Penicillin-bindendes Protein - KSS_03816 GT 2 KSS_03836 Polyprenol-Monophosphomannose-Synthase 2 KSS_04094 Glucosyl-3-phosphoglycerate-Synthase 2 KSS_04265 Peptidoglycan-GT - KSS_04269 Membranprotein - KSS_05128 GT 2 KSS_05173 GT 1 KSS_05178 GT 1 KSS_05239 GT 1 KSS_05654 GT - KSS_05771 GT 2 KSS_05772 Hypothetisches Protein 2 KSS_06175 Polyprenol-Monophosphomannose-Synthase 2 KSS_06468 Polyprenol-Monophosphomannose-Synthase 2 KSS_06706 GT 2 KSS_07033 GT -
Die Abbildung 4.29 zeigt in einem phylogenetischen Baum die evolutionären Beziehungen dieser 50 GTs zueinander. Bei den 42 GTs, die einer Familie nach CAZy zugeordnet werden konnten, handelt es sich vermutlich um NDP-Hexose-Transferasen. Davon gehört eine GT der CAZy-Familie 39 an (KSS_01898). Bei GTs dieser Familie handelt es sich um invertierende Enzyme der Strukturfamilie GT- C, welche Dolichol-Phosphat-Mannose als Zucker-Donor verwenden. Die 19 GTs der CAZy-Familie 2 sind vermutlich an dem Primärstoffwechsel beteiligt, wozu beispielsweise der Aufbau von DNA zählt. Die weiteren 22 GTs gehören der CAZy-Familie 1 an, welche alle bekannten GTs beinhaltet, die im Sekundärstoffwechsel an der Glykosylierung niedermolekularer Substanzen beteiligt sind.
126 Ergebnisse
Abbildung 4.29: Phylogenetischer Baum aller GTs aus Kitasatospora sp. 152608. Zu der CAZy-Familie 1 gehörende GTs sind rot geschrieben, GTs der CAZy-Familie 2 grün und die GT der CAZy-Familie 39 blau. Nicht zugeordnete GTs sind schwarz geschrieben. Der Baum wurde durch Bootstrapping (205) und den Neighbour- joining (206) Algorithmus mit dem Programm ClustalX 2.1 (162) und die TreeView Software (166) generiert. Die Zahlen- werte an den Knotenpunkten geben an, wie sich die GTs in dem Bootstrap-Test bei 1.000 Wiederholungen verhalten haben. Die Kantenlänge gibt die verwandtschaftliche Nähe zwischen verschiedenen Enzymen wieder.
Da der gesuchten Talose-GT eine ähnliche Funktion zugeschrieben wird, ist sie mit hoher Wahr- scheinlichkeit Mitglied der CAZy-Familie 1. In dem Genom von Kitasatospora sp. 152608 wurden 22 solcher GT-Gene identifiziert. Unter diesen 22, befinden sich elf GT-Gene innerhalb eines Sekundär- stoff-Clusters, eine davon in dem Simocyclinon-Cluster. Da die Glykosylierung von Alizarin im Gegen- satz zu der Produktion der Simocyclinone und Angucycline nur in DNPM-Medium und nicht auch in NL5-Medium stattfindet, kann davon ausgegangen werden, dass das gesuchte Talose-GT-Gen in NL5- Medium im Vergleich zu DNPM-Medium herrunterreguliert ist. In Abbildung 4.30 sind die Transkriptionsraten aller GT-1-Gene in DNPM-Medium (blau) im Vergleich zu NL5-Medium (rot) dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass zehn GT-Gene in DNPM-Medium herr- unterreguliert sind (KSS_00193, KSS_00202, KSS_00294, KSS_01628, KSS_02167, KSS_02309,
127 Ergebnisse KSS_02359, KSS_03219, KSS_03366 und KSS_05173), während zwölf GT-Gene hochreguliert sind (KSS_00015, KSS_00157, KSS_00160, KSS_00162, KSS_00939, KSS_00940, KSS_01148, KSS_01612, KSS_01620, KSS_01626, KSS_05178 und KSS_05239). Unter diesen zwölf Genen befindet sich wahr- scheinlich die gesuchte Talose-GT.
Abbildung 4.30: Transkriptionsraten aller GTs der CAZy-Familie 1 in DNPM-Medium (blau) im Vergleich zu NL5-Medium (rot)
Ein evolutionärer Vergleich der Genprodukte dieser 12 Kandidaten-Gene mit bekannten Rhamnose- GTs (ElmGT (99), CalG1 (217), AraGT (218) und OleG2 (219)), Rhamnose- und Olivose-GTs (SACE_2010 (12) und Ses60310 (13)) sowie einer Talose-GT (TlmK (220,221)) ist in dem phylogeneti- schen Baum der Abbildung 4.31 dargestellt.
128 Ergebnisse
Abbildung 4.31: Phylogenetischer Baum der in DNPM-Medium hochregulierten GTs der CAZy-Familie 1 aus Kitasatospo- ra sp. 152608 im Vergleich zu bekannten Rhamnose-GTs, Rhamnose- und Olivose-GTs und einer Talose-GT. Der Baum wurde durch Bootstrapping (205) und den Neighbour-joining (206) Algorithmus mit dem Programm ClustalX 2.1 (162) und die TreeView Software (166) generiert. Die Zahlenwerte an den Knotenpunkten geben an, wie sich die GTs in dem Bootstrap-Test bei 1.000 Wiederholungen verhalten haben. Die Kantenlänge gibt die verwandtschaftliche Nähe zwischen verschiedenen Enzymen wieder.
Die größte Ähnlichkeit zu der Talose-GT TlmK aus Streptoalloteichus hindustanus E465-94 ATCC 31158 (220,221) weist KSS_00162 auf. TlmK überträgt jedoch im Gegensatz zu der gesuchten Talose- GT NDP-4-amino-4,6-dideoxy-L-Talose an Stelle von dTDP-6-deoxy-L-Talose. Diese besitzt im Ver- gleich zu dTDP-6-deoxy-L-Talose eine Aminogruppe an Position 4. Der Austausch einer Aminogruppe gegen eine Hydroxy-Gruppe könnte jedoch einen größeren Einfluss auf die Zucker-Donor-Akzeptanz ausüben, als eine Änderung der Konformation an einem nicht anomeren C-Atom. Aus diesem Grund wird davon ausgegangen, dass die gesuchte Talose-GT eine größere Ähnlichkeit zu den Rhamnose- GTs sowie Rhamnose- und Olivose-GTs aufweist als zu TlmK. Die GT aus Kitasatospora sp. 152608, welche die größte Ähnlichkeit zu den Rhamnose-GTs sowie zu den Rhamnose- und Olivose-GTs auf- weist, ist KSS_00939. Sie teilt 35 % identische sowie 43 % ähnliche Aminosäuren mit AraGT aus Strep- tomyces echinatus (218). Aufgrund der durchgeführten in silico Analysen der Genomsequenz sowie der Transkriptom-Daten wurde KSS_00939 als Kandidaten-Gen mit der höchsten Wahrscheinlichkeit, für die gesuchte Talose- GT zu kodieren, identifiziert. Die durch in silico Analysen erbrachten Ergebnisse sollten zukünftig, wie
129 Ergebnisse unter 4.6.2 beschrieben, in dem heterologen Testsystem S. albus Tal durch Einbringen des Kandida- ten-Gens KSS_00939 mittels Konjugation und Fütterung der erhaltenen Mutante mit Alizarin bestä- tigt werden.
130 Ergebnisse
131 Diskussion und Ausblick 5 Diskussion und Ausblick
5.1 Saccharomicin-Biosynthese In dem Aktinomyceten Saccharothrix espanaensis wurden die antibiotisch aktiven Substanzen Sac- charomicin A und B entdeckt (24,25). Sie bestehen aus dem Aglykon N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)- taurin sowie einer Seitenkette aus 17 O-glykosidisch verknüpften Zuckereinheiten. Dr. M. Berner konnte in seiner Arbeit die Synthese von trans-Kaffeesäure aus L-Tyrosin über das Zwischenprodukt trans-Cumarsäure sowie die Funktionalität der Enzyme Sam8 und Sam5 nachweisen (27). Dieses Er- gebnis wurde in den Arbeiten von N. Gehring und Dr. T. Strobel bestätigt (28,29). Darüber hinaus wurde von Dr. M. Berner postuliert, dass es sich bei dem Genprodukt von sam7 um eine Kaffeoyl- CoA-Ligase handelt, welche trans-Kaffeesäure zu Kaffeoyl-CoA umsetzt, welches wiederum durch eine Penicillin-Amidase, unter Verknüpfung von Taurin zu dem Saccharomicin-Aglykon N-(m,p- Dihydroxycinnamoyl)-taurin umgesetzt wird. Dr. T. Strobel postulierte, dass es sich bei Sam36 um die gesuchte Penicillin-Amidase handelt. Der gesamte putative Syntheseweg ist unter 4.1 in Abbildung 4.1 dargestellt.
In weiteren Versuchen wollte Dr. M. Berner die Funktionalität von Sam7 nachweisen. Dazu sollten die Gene sam8, sam5 und sam7 in dem heterologen Wirt S. fradiae XKS exprimiert werden. Jedoch konnte das Produkt Kaffeoyl-CoA nicht nachgewiesen werden. Bei den Arbeiten von Dr. T. Strobel zu der Sequenzierung des Genoms von S. espanaensis kam es zu Änderungen der Annotation, wodurch die Genstarts einiger Gene verschoben wurden. Unter anderem besteht das Genprodukt von sam7 nicht mehr nur aus 363 Aminosäuren. Da das Startcodon upstream verschoben wurde, besteht Sam7 derzeit aus 374 Aminosäuren. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche wurde sam7 nach der neuen Annotation von Dr. T. Strobel verwendet, um sicher zu stellen, dass ein voll- ständiges Protein gebildet werden kann.
Die Verwendung des integrativen Vektors pTOS in Form des Plasmids pTOS*sam7+5+8+36 brachte zwei Vorteile mit sich. Zum einen war das vollständige Gen sam7 enthalten und zum anderen waren alle postulierten, zur Kaffeesäureproduktion benötigten Gene intrazellulär vorhanden. Dadurch sollte das Problem der Kaffeesäureaufnahme aus dem Medium umgangen werden. In diesem Stamm konn- ten weder Kaffeoyl-CoA noch das Saccharomicin-Aglykon detektiert werden. Da es sich jedoch um ein integratives Plasmid mit nur einer Kopie pro Zelle handelt, besteht die Möglichkeit, dass die Um- setzungsrate für eine Detektion der Produkte zu gering ist.
Um das Problem der geringen Kopienzahl innerhalb der Zelle zu lösen, wurde der replikative Vektor pUWL-A verwendet. Die zwei erstellten Plasmide pUWL-A-sam36+7 sowie pUWL-A-sam7 wurden mittels Konjugation in S. albus eingebracht und in Fütterungsexperimenten mit trans-Kaffeesäure
132 Diskussion und Ausblick und Taurin supplementiert. Eine Detektion der gewünschten Produkte Kaffeoyl-CoA beziehungsweise N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-taurin war nicht möglich. Dies kann auf mehrere Ursachen zurückzufüh- ren sein. Zum einen ist nicht bekannt, wie groß die aufgenommene Kaffeesäure-Menge bei pH 7,4, dem pH-Wert von HA-Flüssigmedium ist, da Kaffeesäure bei diesem pH-Wert nur ca. im Verhältnis 1:630 in der protonierten, d.h. neutralen Form vorliegt und zum anderen handelt es sich bei Kaffeoyl- CoA um eine reaktive Verbindung, die auf anderen Wegen weiter metabolisiert werden kann.
Es gab die Überlegung, die Kaffeesäure-Aufnahme durch pH-Wert-Absenkung zu verbessern. Da Kaf- feesäure einen pks-Wert von 4,6 besitzt, liegen bei pH 4,6 die deprotonierte und die protonierte Form in einem Verhältnis von 1:1 vor. Bei einer weiteren Absenkung auf pH 2,6 verschiebt sich das Verhältnis auf 100:1 für die protonierte Form. In einem Vorversuch wurde getestet, ob eine Kultivie- rung von S. albus bei pH 4,6 beziehungsweise pH 2,6 in HA-Medium möglich ist. Jedoch war S. albus unter den gegebenen Bedingungen nicht dazu in der Lage zu wachsen, sodass Fütterungsversuche bei diesen niedrigen pH-Werten nicht durchgeführt wurden.
Da eine heterologe Expression in S. albus nicht erfolgreich war und um das Problem der Kaffeesäu- reaufnahme zu umgehen, sollten Sam7 sowie Sam36 heterolog in E. coli produziert, aufgereinigt und für in vitro Aktivitätsassays verwendet werden. Da nach der Aufreinigung mittels Ni2+-NTA- Affinitätschromatographie die Proteinausbeute zu gering war, wurde im weiteren Verlauf auf eine Aufreinigung weitestgehend verzichtet. Lediglich die Aufbereitung der Zelllysate mittels PD-10 Se- phadex G25-Säule wurde durchgeführt. Aufgrund der komplexen Zusammensetzung der Zelllysate war eine Aussage über die Proteinausbeute nicht möglich. Bei den durchgeführten Aktivitätsassays aus dem Rohextrakt konnte keine Umsetzung der Substrate beobachtet werden. Zum einen kann dies an einer geringen Proteinausbeute und in Folge dessen an einer sehr niedrigen Produktkonzent- ration liegen. Zum anderen kann in den komplexen Reaktionsansätzen eine inhibierende Komponen- te enthalten sein, welche durch Verwendung der PD-10 Sephadex G25-Säule nicht entfernt wurde. Genauso ist jedoch eine Entfernung der als Kofaktoren benötigten Metallionen durch Verwendung der PD-10 Sephadex G25-Säule denkbar.
Ein interessanter Ansatz für weitergehende Versuche wurde von Rodrigues et al. beschrieben (222). Die Gruppe veröffentlichte die heterologe Produktion von Kaffeesäure aus Tyrosin in E. coli unter Verwendung der codonoptimierten Tyrosin-Ammoniak-Lyase TAL aus Rhodotorula glutinis sowie der codonoptimierten 4-Coumarat-3-hydroxylase Sam5 aus Saccharothrix espanaensis. Sie fanden her- aus, dass die Produktausbeute bei Fütterungsversuchen in E. coli durch Verwendung unterschiedli- cher Kombinationen verschiedener Plasmide, welche entweder das für TAL-codierende Gen oder sam5 tragen, erhöht werden kann. Darüber hinaus wurden in den E. coli-Kulturen Edukte supplemen- tiert, da die endogene Tyrosinproduktion nicht für die Synthese großer Mengen an trans-Cumarsäure
133 Diskussion und Ausblick ausreicht. Um die toxischen Effekte durch hohe Konzentration an trans-Cumarsäure zu reduzieren, wurde die Supplementierung von Tyrosin der von trans-Cumarsäure vorgezogen. Darüber hinaus erfolgte die Zugabe auf mehrere Einzelgaben verteilt. Eine weitere Steigerung der Umsetzung von Tyrosin zu trans-Cumarsäure wurde beobachtet, wenn die entstandene trans-Cumarsäure weiter umgesetzt wurde und nicht akkumulieren konnte. Dies wurde zum Teil ebenfalls auf die toxischen Effekte zurückgeführt. Weiter wirkte sich ein spezielles Kultivierungsschema der E. coli-Kulturen posi- tiv auf die Produktion aus. Nach Inkubation der E. coli-Zellen bei 37 °C in LB-Medium bis zu einer
OD600 von 0,4 erfolgte eine fünfstündigen Inkubation bei 26 °C. Nach Zentrifugation wurden die Zel- len in M9 Minimalmedium unter Zusatz von Spurenelementen und Vitaminen resuspendiert. Die Expression wurde induziert und die Kultivierung für 63 h bei 26 °C weitergeführt, wobei Tyrosin auf mehrere Einzelgaben verteilt zugesetzt wurde. Übertragen auf die Versuche zu der Synthese des Saccharomicin-Aglykons könnte dies wie folgt aussehen: Die codonoptimierten Gene sam8, sam5, sam7 und sam36 werden auf mehrere replikative Vektoren mit starken, induzierbaren Promotoren verteilt und in E. coli eingebracht. Es folgt eine wie bereits beschriebene Kultivierung über eine Ge- samtdauer von mehr als 68 h mit Supplementierung von Spurenelementen, Vitaminen, Tyrosin sowie Taurin. Wenn es sich bei Sam8, Sam5, Sam7 und Sam36 um alle benötigten Enzyme handelt, könnte durch diese Maßnahmen eine Erhöhung der Umsetzungsrate zu einer Detektierbarkeit der ge- wünschten Produkte führen und die postulierten Funktionen bestätigen.
5.2 Proteinpräparation der flexiblen Glykosyltransferase Ses60310 Bei Ses60310 handelt es sich um eine substratflexible GT aus S. espanaensis. Diese ist dazu in der Lage, Rhamnose oder Olivose auf unterschiedliche Sekundärstoffe wie Alizarin, Emodin, Novobiocin- säure oder Quercetin zu übertragen (29,183). Um ein Verständnis für die außergewöhnliche Substrat- flexibilität zu erhalten, sollte das Protein aufgereinigt und kristallisiert werden.
Im Rahmen meiner Diplomarbeit konnte trotz vielfältiger Änderungen der Synthese- und Aufreini- gungsbedingungen stets zwar lösliches, aber aggregiertes Protein erhalten werden (183). Unter an- derem kam das Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) zum Einsatz. DTT kann durch Verhinderung der Oxidation von Sulfanylgruppen zu Disulfidbrücken durch Luftsauerstoff zu der Stabilisierung der Kon- formation des Proteins führen.
Dr. T. Strobel konnte durch Coexpression mit den Genen, welche für die Chaperone GroES, GroEL1 und GroEL2 aus S. coelicolor codieren (172), sowie der gleichzeitigen Verwendung des Reduktions- mittels Tris(2-chlorethyl)phosphat (TCEP) lösliches, unaggregiertes Protein erhalten (29). Bei Chape- ronen handelt es sich um Heat Shock Proteine, welche unter sogenannten Stressbedingungen, wie beispielsweise unphysiologisch hohen Temperaturen, oxidativem Stress oder dem Vorhandensein toxischer Substanzen (z.B. IPTG), vermehrt synthetisiert werden (223). Über hydrophobe Wechsel-
134 Diskussion und Ausblick wirkungen findet eine Bindung der Chaperone an neu synthetisierte Proteine statt, wodurch diese vor unerwünschter Aggregation geschützt werden bis sie ihre native Konformation erhalten haben (224,225). Ist der Prozess der Proteinfaltung abgeschlossen, werden die Chaperone nicht mehr benö- tigt und ihre Bindung zu dem Protein wird gelöst. Ohne das Vorhandensein von Chaperonen gestaltet sich die Proteinsynthese von Aktinomyceten-Proteinen in E. coli oft schwierig, da es nicht zu einer korrekten Faltung der Proteine kommt. Ein Vergleich der Reduktionsmittel zeigt, dass es sich bei TCEP um ein stabileres und stärkeres Reduktionsmittel handelt als bei DTT (226–228). Da die Chape- rone und TCEP nur in Kombination miteinander verwendet wurden, konnte keine Aussage darüber getroffen werden, welche Komponente für die Gewinnung unaggregierten Proteins essentiell war. Mit dem auf diese Weise gewonnenen Protein konnte Dr. T. Strobel Näherungswerte für die enzym- kinetischen Parameter vmax und Km bestimmen.
Ziel der hier vorliegenden Arbeit war die Verwendung von aufgereinigtem Protein in Kristallisations- versuchen, um Informationen über die räumliche Beschaffenheit und Besonderheiten der Bindungs- tasche sowie des aktiven Zentrums zu erhalten und anhand dieser Informationen Rückschlüsse über die Substratflexibilität der GT ziehen zu können.
Für einen ersten Kristallisationsversuch wurde Protein verwendet, welches auf die von Dr. T. Strobel beschriebene Art aufgereinigt wurde. Eine schnelle Aggregation führte zu der Bildung ungeordneter Präzipitate an Stelle von geordneten Kristallen. Mögliche Ursachen hierfür sind unter anderem Stö- rungen durch das Reduktionsmittel TCEP oder durch den His6-tag. Der His6-tag kann beispielsweise aufgrund der negativen Ladung der Histidine die Faltung des Proteins negativ beeinflussen oder es kann in Kombination mit mehrfach geladenen Metallkationen zu einer Komplexbildung mehrerer
Proteinmoleküle über deren His6-tags kommen.
In weiteren Versuchen sollte die Aufreinigung optimiert werden, um die Störfaktoren in den Kristalli- sationsversuchen zu beseitigen. Unter anderem wurde ein linearer Gradient an Stelle eines Stufen- Gradienten für die Affinitätschromatographie mittels Ni2+-NTA verwendet und das Protein wurde im Anschluss an die Affinitätschromatographie weniger stark aufkonzentriert, um in mehreren Teilmen- gen auf die Gelfiltrationssäule aufgetragen zu werden. Beides führte zu einer stark reduzierten Pro- teinmenge.
Ein anderer Ansatz war die enzymatische Abspaltung des His6-tag mittels Proteasen im Anschluss an eine erste Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie, um eine Aggregation des Proteins über Wechselwir- kungen des His6-tags mit mehrwertigen Metallkationen zu verhindern. Im Bereich der Proteinaufrei- nigung kommen vor allem die Endopeptidasen Thrombin und die TEV-Protease zum Einsatz (229). Da die TEV-Protease eine höhere Spezifität als Thrombin aufweist, wurde sie für die hier durchgeführten
135 Diskussion und Ausblick Arbeiten verwendet. Ein weiterer Vorteil der TEV-Protease neben ihrer Spezifität ist ihre Robustheit gegenüber äußeren Einflüssen (230). Im Zuge der hier durchgeführten Aufreinigung mit Entfernung des N-terminalen His6-tags kam es zu einer starken Abnahme der Proteinausbeute. Eine mögliche Ursache stellt der zusätzliche Aufreinigungsschritt in Form der zweiten Ni2+-NTA- Affinitätschromatographie dar.
Da eine Optimierung der Aufreinigung mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie nicht möglich war, wurde eine andere Variante der Affinitätschromatographie getestet. Hierbei handelt es sich um die Streptavidin-Affinitätschromatographie. Bei der Säulenmatrix handelt es sich um das Streptavidin- Derivat Strep-Tactin, welches eine sehr hohe Affinität zu dem Strep-tag, einem Oligopeptid mit der Aminosäure-Sequenz WSHPQFEK, aufweist (198). Ein Protein mit C- oder N-terminal fusioniertem Strep-tag bindet an die Biotin-Bindungstasche des Strep-Tactin und wird auf der Säule zurückgehal- ten. Hierdurch findet eine sehr spezifische Abtrennung unerwünschter Proteine statt. Aufgrund der hohen Affinität und Spezifität ist kein separater Waschschritt erforderlich. Die Elution des aufzureini- genden Proteins erfolgt unter milden, physiologischen Bedingungen durch 2,5 mM d-Desthiobiotin im Puffer. Damit weist die Verwendung eines Strep-tags im Vergleich zu der Verwendung eines His6- tags viele Vorteile auf. Von Nachteil ist jedoch, dass von Seiten des Herstellers der StrepTrap HP Säu- le keine Angaben zu der Stabilität des Säulenmaterials bei Verwendung von TCEP gemacht werden. Aus diesem Grund wurde TCEP in den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Aufreinigungen mit- tels Streptavidin-Affinitätschromatographie nicht verwendet. Das Resultat war eine minimale Pro- teinausbeute nach der Affinitätschromatographie und die Elution des Proteins in allen auftretenden Peaks der Gelfiltration. Menge und Reinheit des Strep-tag-fusionierten Proteins waren für Kristallisa- tionsversuche nicht ausreichend.
Das Ziel zukünftiger Arbeiten ist weiterhin eine Optimierung der Aufreinigung und Kristallisation des Proteins, um die Kristallstruktur der flexiblen GT Ses60310 zu erhalten. Die Kristallstruktur kann In- formationen über die beobachtete Substratflexibilität liefern. Auch eine Kokristallisierung mit dem Zucker-Donor erscheint vorteilhaft, da dies einerseits zu einer Erhöhung der Stabilität und anderer- seits zu der Gewinnung zusätzlicher Daten führen kann. Ebenso sollte das aufgereinigte Protein zur
Präzisierung der bislang erhobenen enzymkinetischen Parameter vmax und Km genutzt werden.
5.3 Biotransformation von trans-Resveratrol Bei Resveratrol (3,5,4'-Trihydroxystilben) handelt es sich um ein Phenylpropan, welches in vielen, darunter auch traditionell angewandten, Pflanzen vorhanden ist. So wird Resveratrol unter anderem in Weintrauben, Erdnüssen, Blaubeeren und Hopfen produziert (115–118). Resveratrol werden eine Vielzahl pharmakologischer Wirkungen zugeschrieben. Dazu zählen beispielsweise die Wirksamkeit gegen Typ II Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, Alzheimer, kardiovaskuläre Erkrankungen sowie
136 Diskussion und Ausblick Tumorerkrankungen (131,133,135,136,139,145). Von anderen klinisch relevanten Sekundärmetaboli- ten ist bekannt, dass Zuckerreste sowohl für die pharmakokinetischen als auch für die pharmakody- namischen Eigenschaften der Substanzen eine essentielle Rolle spielen (18,61). Da die Bioverfügbar- keit von oral appliziertem Resveratrol gering ist (130) besteht die Hoffnung, diese durch Generierung geeignete Resveratrol-Derivate zu verbessern.
Dr. A. Linnenbrink konnte zeigen, dass der Biotransformationswirt S. espanaensis dazu in der Lage ist Resveratrol umzusetzen (30). Aufgrund der detektierten Massen in der HPLC-ESI-MS-Analyse kann dabei von unterschiedlichen Verknüpfungen des Resveratrols mit Rhamnose-Einheiten ausgegangen werden. Da inzwischen bekannt ist, dass Ses60310 in S. espanaensis eine Rhamnose-übertragende GT mit großer Substratflexibilität ist, lag die Vermutung nahe, dass Ses60310 auch an den Rhamnosy- lierungen des Resveratrol beteiligt ist. Aus diesem Grund wurden in der hier vorliegenden Arbeit zusätzlich zu den Fütterungen des S. espanaensis WT Fütterungen des heterologen Testsystems S. albus Rham x pUWL-A-7665 vorgenommen. Durch diese Fütterungen konnte nachgewiesen wer- den, dass es sich bei Ses60310 um die GT handelt, welche in S. espanaensis für die Glykosylierung von Resveratrol verantwortlich ist. Mittels HPLC-ESI-MS wurden in dem heterologen Testsystems unterschiedliche Derivate mit einem Massenzugewinn von 146 u detektiert. Dies deutet auf rhamno- sylierte Derivate hin.
Weiterführend sollte in der Diplomarbeit von N. Gummerlich die Biotransformationsrate optimiert werden, um die Biotransformationsprodukte aufzureinigen und deren Strukturen mittels NMR aufzu- klären. Für NG1, ein Gemisch aus Biotransformationsprodukten, konnten NMR-Daten gewonnen werden, welche die Schlussfolgerung zulassen, dass es sich um eine 1:1-Mischung von rhamnosylier- ten cis- und trans-Resveratrol handelt. Für das aufgereinigte Biotransformationsprodukt NG2 konn- ten keine NMR-Daten gewonnen werden.
Ein vielversprechendes Thema zukünftiger Arbeiten auf diesem Gebiet stellt die Strukturaufklärung weiterer Biotransformationsprodukte sowie die Charakterisierung derer pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften dar.
5.4 Identifizierung und Charakterisierung der N-Glykosyltransferase SACE_3599 aus Saccharopolyspora erythraea Im Rahmen ihrer Dissertation konnte Dr. T. Strobel in Fütterungsexperimenten zeigen, dass der Erythromycin-Produzent S. erythraea dazu in der Lage ist, das Anthrachinon-Derivat U3 (1,4- Diaminoanthrachinon) umzusetzen (29). Die Strukturaufklärung des isolierten Derivats U3-8 ergab, dass es sich um 1-N-α-Glucosyldiaminoanthrachinon handelt. Daraus ließ sich folgern, dass der
137 Diskussion und Ausblick Stamm eine GT besitzt, die Glucose auf ein aromatisches Amin übertragen kann. Ziel war es diese seltene GT zu identifizieren.
M. Schäffer konnte in ihrer Diplomarbeit durch Fütterungsexperimente des heterologen Testsystems S. albus Rham, in welches jeweils die Gene, welche für die Kandidaten-Gene kodieren, eingebracht waren, nachweisen, dass die GT SACE_3599 für die N-Glucosylierung verantwortlich ist (179). Bei Fütterung der Mutante S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 mit U3 konnte das Biotransformations- produkt U3-7 detektiert werden. Die U3-Fütterungen der Mutanten S. albus Rham x pUWL-A- sace_1884 und S. albus Rham x pUWL-A-sace_4470 ergaben jeweils keine Biotransformation. Das Biotransformationsprodukt U3-7 besitzt die identische Masse und ein sehr ähnliches UV- Absorptionsspektrum wie U3-8. Beide unterscheiden sich jedoch in der Retentionszeit in der HPLC- MS-Analyse. Während U3-8 eine Retentionszeit von 11,4 min aufweist, ist diejenige von U3-7 auf 10,6 min verkürzt.
Das von M. Schäffer bei in vivo Fütterungsexperimenten des heterologen Testsystems S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 mit U3 detektierte Biotransformationsprodukt U3-7 wurde im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit nach U3-Fütterung ebenfalls in dem heterologen Testsystem S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 detektiert. Aufgrund der Tatsache, dass U3-7 aus den beiden heterologen Test- systemen hinsichtlich Retentionszeit, UV-Spektrum sowie Masse identisch ist, wurde davon ausge- gangen, dass es sich um ein und dasselbe Biotransformationsprodukt handelt. Da die Biotransforma- tionsrate in S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 höher war, wurde U3-7 aus diesem heterologen Test- system isoliert und dessen Struktur mittels NMR aufgeklärt. Dabei wurde festgestellt, dass es sich bei
U3-7 um 1-N-β-Glucosyldiaminoanthrachinon handelt. Die beiden Biotransformationsprodukte U3-7 und U3-8 unterscheiden sich somit in der Konformation an dem anomeren Kohlenstoffatom. Laut Schätzung von Dr. T. Paululat lagen in der Probe aus dem S. erythraea WT 75 % des biotransformier- ten U3 als U3-8 und 25 % als U3-7 vor. In der Probe aus S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 lagen hin- gegen 84 % als U3-7 und nur 16 % als U3-8 vor.
Bei U3-7 aus S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 und S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 handelt es sich um dasselbe Biotransformationsprodukt. Dies lässt sich dadurch begründen, dass dTDP-D- Glucose ein Zwischenprodukt in der Biosynthese von dTDP-L-Rhamnose darstellt und dem heterolo- gen Testsystem S. albus Rham damit sowohl Rhamnose als auch Glucose zur Verfügung stehen.
Eine mögliche Ursache für die unterschiedlichen Konformationen von U3-8 aus S. erythraea und U3-7 aus S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 an den anomeren Kohlenstoffatomen stellt die Mutarotation dar. In Abbildung 5.1 ist die Änderung der Konformation an dem anomeren Kohlenstoff durch Muta- rotation am Beispiel der Glucose gezeigt.
138 Diskussion und Ausblick
Abbildung 5.1: Mutarotation am Beispiel von D-Glucose
Da Mutarotation nicht an deoxy-Nukleotidzuckern, wie beispielsweise dTDP-D-Glucose, stattfinden kann, besteht die einzige Möglichkeit einer Mutarotation im vorliegenden Fall an den Produkten U3- 8 beziehungsweise U3-7. Mutarotationen an sekundären Aminen sind aus der Literatur bereits be- kannt (231). Da jedoch weder im Verlauf der Arbeiten von Dr. T. Strobel noch in der vorliegenden Arbeit eine Änderung der Konformation über die Dauer der Lagerung beobachtet werden konnte, wird davon ausgegangen, dass die Produkte U3-8 und U3-7 stabil sind. Darüber hinaus wäre im Fall einer Mutarotation die Einstellung eines Gleichgewichtsverhältnisses zwischen den beiden isomeren Formen zu erwarten. Den Angaben von Dr. T. Paululat über die Mengenverhältnisse von U3-7 und U3-8 in den unterschiedlichen Proben zu Folge, hat keine Einstellung eines Epimerenverhältnisses stattgefunden.
Eine weitere mögliche Erklärung für das Vorkommen der unterschiedlich konformierten Strukturen stellt die Biosynthese von dTDP-D-Glucose dar. Für die Biosynthese von dTDP-D-Glucose aus Glucose werden eine Glucokinase, eine Phosphoglucomutase (PGM) sowie eine dTDP-Glucosesynthase benö- tigt (vergleiche Abbildung 5.2).
Abbildung 5.2: Aktivierung von D-Glucose zu dTDP-D-Glucose GK Glucokinase; PGM Phosphoglucomutase; dTDP-GS dTDP-Glucosesynthase
Im Gegensatz zu S. albus J1074 (GenBank-Zugangsnummer NC_020990.1), welcher nur ein annotier- tes α-PGM-Gen (XNR_RS27690; WP_015508239; EC 5.4.2.2) aber kein annotiertes β-PGM-Gen be- sitzt, enthält S. erythraea NRRL 2338 (GenBank-Zugangsnummer AM420293.1) mindestens ein anno- tiertes β-PGM-Gen (SACE_3173; CAM02873; EC 5.4.2.6), aber kein annotiertes α-PGM-Gen. β-PGMs katalysieren die Umsetzung von β-Glucose-6-phosphat zu β-Glucose-1-phosphat während α-PGMs die Umsetzung von α-Glucose-6-phosphat zu α-Glucose-1-phosphat katalysieren. Zusätzlich muss S. erythraea eine α-PGM besitzen, da die Biosynthese sowohl von dTDP-β-L-Mycarose als auch von dTDP-α-D-Desosamin, beides Zuckereinheiten des Makrolid-Antibiotikums Erythromycin, von α-D- Glucose-1-phosphat ausgeht (63,64,232,233). Die Analyse beider Genome mittels BLAST und Galaxy Uni Freiburg ergab, dass jeweils viele Enzyme vorhanden sind, die Ähnlichkeit zu PGMs aufweisen. Diese Enzyme sind mit ihrer jeweiligen Funktion in Tabelle 5.1 und Tabelle 5.2 aufgelistet.
139 Diskussion und Ausblick
Tabelle 5.1: Vergleich von Enzymen aus S. erythraea NRRL2338 mit bekannten PGMs Neben der Funktion sind die Proteine mit größter Ähnlichkeit mit Stamm, Funktion sowie Anteil identischer/ähnlicher AS angegeben. Anteil identi- Proteinsequenz ähn- Genprodukt postulierte Funktion Funktion scher/ähnlicher AS lich zu [%] SACE_2235 Haloacid Dehalogenase YcjU, E. coli K12 β-PGM 30/44 SACE_2447 Trehalose-6-phosphat- YvdM, Bacillus subtilis β-PGM 33/47 Phosphatase SACE_5220 Haloacid Dehalogenase PgmB, Lactococcus β-PGM 27/51 lactis SACE_6460 Phosphomannomutase PgcA, Staphylococcus α-PGM 22/40 aureus Mu50 SACE_6548 Phosphomannomutase AlgC, Pseudomonas α-PGM 37/54 putida KT 2440 SACE_6779 Phosphomannomutase AlgC, Pseudomonas α-PGM 31/47 putida KT 2440
Tabelle 5.2: Vergleich von Enzymen aus S. albus J1074 mit bekannten PGMs Neben der Funktion sind die Proteine mit größter Ähnlichkeit mit Stamm, Funktion sowie Anteil identischer/ähnlicher AS angegeben. Anteil identi- Proteinsequenz ähn- Genprodukt postulierte Funktion Funktion scher/ähnlicher AS lich zu [%] XNR_RS00640 Hydrolase PgmB, Lactococcus β-PGM 32/52 lactis XNR_RS09485 Phosphomannomutase AlgC, Pseudomonas α-PGM 34/49 putida KT 2440 XNR_RS17440 Hydrolase YcjU, E. coli K12 β-PGM 28/43 XNR_RS18640 Phosphoglucosamin- Pgm, E. coli K12 α-PGM 33/45 mutase XNR_RS19865 Phosphomannomutase PgcA, Staphylococcus α-PGM 33/49 aureus Mu50 XNR_RS25635 Hydrolase YvdM, Bacillus sub- β-PGM 27/46 tilis
Um zu überprüfen, ob die Konformations-Unterschiede durch die Verwendung unterschiedlicher Stämme oder durch Mutarotation zu Stande kommen, sollten U3-8 aus S. erythraea sowie U3-7 aus S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 zur Wiederholung der NMR-Analysen nochmals aufgereinigt wer- den. Darüber hinaus sollten Untersuchungen der Stabilität in wässrigem Medium erfolgen.
Die hauptsächliche Verwendung von dTDP-β-D-Glucose statt dTDP-α-D-Glucose in Anwesenheit bei- der Diastereomere wie in dem S. erythraea WT zeigt die Präferenz der N-GT SACE_3599 für den β- konformierten Zucker.
140 Diskussion und Ausblick Durch Fütterungsexperimente des S. erythraea WT sowie der heterologen Testsysteme S. albus Rham x pUWL-A-sace_3599 und S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 mit verschiedenen Anthrachinon- Derivaten im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sowie der beiden vorangegangenen Arbeiten von Dr. T. Strobel und M. Schäffer, konnte die Spezifität der GT SACE_3599 nachgewiesen werden. So können unter anderem weder 1,4-Dihydroxyanthrachinon noch 1,5-Diaminoanthrachinon von SACE_3599 umgesetzt werden. Dies lässt zum einen darauf schließen, dass SACE_3599 nur das aro- matische Amin, nicht aber das Phenol als Substrat akzeptiert und zum anderen, dass die Reaktion regiospezifisch verläuft. Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass 1,4-Dihydroxyanthrachinon und 1,5-Diaminoanthrachinon nicht beziehungsweise nicht in demselben Maße in die Zelle aufgenommen werden wie 1,4-Diaminoanthrachinon. Um dies zu überprüfen, sollten weitere in vitro Aktivitätsas- says mit verschiedenen Anthrachinon-Derivaten durchgeführt werden.
Um Nachzuweisen, dass es sich bei SACE_3599 um die einzige GT aus S. erythraea handelt, die für die N-Glucosylierung von U3 verantwortlich ist, wurden in dieser Arbeit Gen-Inaktivierungs-Experimente durchgeführt. Hierfür wurde die Doppelcrossover-Mutante S. erythraea Δsace_3599 generiert und mit U3 gefüttert. Dass die Doppelcrossover-Mutante nicht dazu in der Lage war U3 umzusetzen zeigt, dass SACE_3599 die einzige gesuchte N-GT aus S. erythraea ist, welche U3 glucosylieren kann.
Die Komplementierung der Doppelcrossover-Mutante mit einer intakten Kopie des Gens sace_3599 führte zu der Komplementierungsmutante S. erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599. Diese war in Fütterungsexperimenten wieder dazu in der Lage U3-8 zu produzieren.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem das Gen sace_3599 heterolog in E. coli Rosetta2-Zellen ex- primiert werden und das lösliche, unaggregierte Protein mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie sowie Gelfiltration aufgereinigt werden. Das auf diese Weise behandelte Enzym SACE_3599 konnte in unterschiedlichen in vitro Aktivitätsassays innerhalb von 30 min bei pH 8,8 und 28 °C das Anthrachi- non-Derivat U3 vollständig zu dem 1-N-β-glucosylierten Derivat U3-7 umsetzen.
Das Gen sace_3599 gehört keinem der 25 Sekundärstoff-Cluster in dem Genom von S. erythraea an. Darüber hinaus ist SACE_3599 als GT, welche an der Resistenzvermittlung gegenüber Makrolid- Antibiotika beteiligt ist, annotiert. Sie teilt 33 % identische und 48 % ähnliche Aminosäuren mit OleD, einer GT aus S. antibioticus von der bekannt ist, dass sie durch Glykosylierung von Makrolid- Antibiotika zu der Antibiotika-Resistenz der Wirtszelle beiträgt (12,37–40,209,234). Dies zeigt, warum es sehr wahrscheinlich ist, dass SACE_3599 nicht an der Biosynthese eines Sekundärstoffes beteiligt ist, sondern Teil eines Schutzmechanismus des Stammes gegen Selbst-Vergiftung darstellt. Anhand der Stämme S. erythraea WT und S. erythraea Δsace_3599 wurde überprüft, ob durch Inaktivierung der N-GT SACE_3599 die Resistenz gegenüber den Makrolid-Antibiotika Erythromycin und Azithro-
141 Diskussion und Ausblick mycin verloren geht. Handelt es sich bei SACE_3599 um die einzige GT zur Resistenzvermittlung ge- genüber Makrolid-Antibiotika in dem Stamm S. erythraea, ist ein Verlust der natürlichen Resistenz zu erwarten. In den durchgeführten Untersuchungen zu der Antibiotika-Resistenz wurde keine Ände- rung der Sensitivität beobachtet. Dies lässt darauf schließen, dass SACE_3599 nicht die einzige Mak- rolid-GT in S. erythraea ist. Im Zuge der Genom-Analyse zur Identifizierung möglicher N-GT- Kandidaten-Gene wurden zwei weiteren GTs die Funktion putativer Makrolid-GTs zugeordnet. Bei diesen zwei GTs handelt es sich um SACE_1884 und SACE_4470. Beide zeigen in einem Sequenzver- gleich große Ähnlichkeiten zu SACE_3599. So teilen SACE_3599 und SACE_1884 47 % identische und 61 % ähnliche Aminosäuren, während SACE_3599 und SACE_4470 34 % identische und 48 % ähnliche Aminosäuren teilen. Um zu Überprüfen, welche dieser drei GTs für die Resistenzvermittlung gegen- über Makrolid-Antibiotika essentiell ist, könnten weitere Inaktivierungsversuche mit den beiden ver- bleibenden GT-Genen durchgeführt werden. Ebenso ist es denkbar, dass es erst durch gleichzeitige Inaktivierung aller drei GT-Gene zu einem Resistenz-Verlust kommt, da die Funktion des inaktivierten Gens von den anderen beiden kompensiert werden kann.
Aminoanthrachinone und ihre Derivate haben eine Vielzahl physiologischer und pharmakologischer Eigenschaften wie beispielsweise antibiotische, antimykotische (235) und zytostatische Aktivität (236). Zuckerreste sind in vielen Fällen essentiell für die biologische Aktivität der glykosylierten Se- kundärmetaboliten. So führt die Verknüpfung mit einem Zucker meist zu einer besseren Löslichkeit, gesteigerter Polarität und verbesserter chemischer Stabilität (128). GTs, welche die Konjugation einer Zuckereinheit mit einem Aglykon katalysieren, sind wichtige Enzyme zur Erzeugung neuer Verbin- dungen mit verändertem Glykosylierungsmuster. Bislang sind die meisten bekannten Naturstoff-GTs an der Entstehung O-glykosidischer Bindungen beteiligt. Im Gegensatz dazu sind N-GTs selten, ob- wohl bekannt ist, dass N-glykosidische Bindungen gegenüber Hydrolyse stabiler sind als O- glykosidische Bindungen.
Es konnte gezeigt werden, dass mit SACE_3599 ein wertvolles Enzym, welches als Werkzeug in der kombinatorischen Biosynthese dienen kann, gefunden und charakterisiert wurde. Da die N-GT dazu in der Lage ist ein Arzneistoff-verwandtes Aminoanthrachinon zu glucosylieren, stellt sie des Weite- ren ein lohnenswertes Forschungsobjekt für zukünftige Arbeiten dar.
5.5 Identifizierung der Talose-Glykosyltransferase aus Kitasatospora sp. 152608 Die Gruppe von Prof. Dr. A. Luzhetskyy konnte aus Kulturen des Simocyclinon-Produzenten Kitasato- spora sp. 152608 die Angucycline Amycomycin C und D isolieren, deren Zuckerrest die seltene 6- deoxy-α-Talose darstellt (41,50). Darüber hinaus fand in Fütterungsexperimenten in DNPM-Medium die Verknüpfung des gefütterten Alizarins mit 6-deoxy-α-Talose statt, wohingegen in NL5-Medium
142 Diskussion und Ausblick keine Glykosylierung zu beobachten war. Es wurde eine Transkriptomanalyse der Kultivierungen in den beiden unterschiedlichen Medien durchgeführt.
Ziel der hier vorliegenden Arbeit war die Identifizierung der Talose-GT aus Kitasatospora sp. 152608. Hierfür sollte ein heterologes Testsystem zur schnelleren Untersuchung der Kandidaten-Gene herge- stellt werden. Als heterologer Wirt wurde S. albus gewählt. Mittels Sequenzvergleich wurden in dem Genom von Kitasatospora sp. 152608 die Gene für die dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthese identifi- ziert, anschließend in das integrative Plasmid pTOS kloniert und mittels Konjugation in S. albus ein- gebracht. Durch Konjugation der erhaltenen Mutante mit dem Plasmid pUWL-Dre und der damit verbundenen Synthese der Dre-Rekombinase, erfolgte die Entfernung des Plasmidbackbones. Es re- sultierte eine markerfreie Integration der Talose-Biosynthese-Gene in das Genom des heterologen Testsystems S. albus Tal.
Bevor das heterologe Testsystems S. albus Tal jedoch zukünftig zur Untersuchung der potentiellen Talose-GT-Gene verwendet wird, empfiehlt es sich das heterologe Testsystem selbst noch auf dessen Funktionsfähigkeit zu testen. Dies könnte durch Einbringen des GT-Gens ses60310 aus S. espanaensis geschehen. Durch Fütterung der Mutante S. albus Tal x pUWL-A-7665 mit Alizarin sowie Isolierung und Strukturaufklärung möglicher Biotransformationsprodukte kann die Funktionsfähigkeit getestet werden. Die GT Ses60310 (synonym 7665) bietet sich für diesen Test an, da sie dazu in der Lage ist Rhamnose sowie Olivose zu übertragen, beides Zucker mit einer großen Ähnlichkeit zu 6-deoxy-α- Talose (vergleiche Abbildung 5.3).
Abbildung 5.3: Strukturformeln von dTDP-6-deoxy-L-Talose, dTDP-L-Rhamnose und dTDP-L-Olivose Die Unterschiede von dTDP-6-deoxy-L-Talose beziehungsweise dTDP-L-Olivose im Vergleich zu dTDP-L-Rhamnose sind blau unterlegt.
Des Weiteren ist bekannt, dass sowohl Ses60310 aus S. espanaensis als auch die gesuchte Talose-GT aus Kitasatospora sp. 152608 Alizarin als Substrat akzeptieren. Dies führt zu einer guten Vergleich- barkeit beider Biotransformationsreaktionen.
Nachdem die Funktionsfähigkeit des heterologen Testsystems in zukünftigen Versuchen bestätigt ist, können die entsprechenden codierenden Bereiche der mittels in silico Analyse ermittelten Kandida- ten-GTs jeweils einzeln in das Expressionsplasmid pUWL-A kloniert und mittels Konjugation in das heterologe Testsystem S. albus Tal eingebracht werden.
143 Diskussion und Ausblick Zur Identifizierung der Kandidaten-Gene wurde das Genom von Kitasatospora sp. 152608 mittels BLASTp-Analyse auf GT-Gene untersucht. Von den 50 potentiellen GTs gehören 22 der CAZy-Familie 1 an, welche alle bekannten GTs beinhaltet, die im Sekundärstoffwechsel an der Glykosylierung nie- dermolekularer Substanzen beteiligt sind.
Der gesuchten Talose-GT wird eine ähnliche Funktion zugeschrieben, wodurch sie mit hoher Wahr- scheinlichkeit Mitglied dieser CAZy-Familie ist. Da die Glykosylierung von Alizarin im Gegensatz zu der Produktion der Simocyclinone und Angucycline nur in DNPM-Medium und nicht auch in NL5-Medium stattfindet, kann davon ausgegangen werden, dass das gesuchte Talose-GT-Gen bei der Transkrip- tomanalyse in DNPM-Medium im Vergleich zu NL5-Medium hochreguliert ist. Es gibt zwölf GT-Gene deren Genprodukte der CAZy-Familie 1 zugeordnet werden und die in DNPM- Medium hochreguliert sind: KSS_00015, KSS_00157, KSS_00160, KSS_00162, KSS_00939, KSS_00940, KSS_01148, KSS_01612, KSS_01620, KSS_01626, KSS_05178 und KSS_05239. Ein evolutionärer Ver- gleich der Genprodukte dieser zwölf Kandidaten-Gene mit den bekannten Rhamnose-GTs ElmGT (99), CalG1 (217), AraGT (218) und OleG2 (219) sowie den Rhamnose- und Olivose-GTs SACE_2010 (12) und Ses60310 (13) sowie der Talose-GT TlmK (220,221) ergibt, dass KSS_00939 die größte Ähn- lichkeit zu den Rhamnose-GTs sowie zu den Rhamnose- und Olivose-GTs aufweist. Aufgrund der durchgeführten in silico Analysen der Genomsequenz sowie der Transkriptom-Daten, wurde KSS_00939 als Kandidaten-Gen mit der höchsten Wahrscheinlichkeit für die gesuchte Talose- GT zu kodieren, identifiziert. Obwohl eine restliche Wahrscheinlichkeit besteht, dass auch eine der andern elf GTs die gesucht Talose-GT sein könnte, sollte zukünftig das GT-Gen KSS_00939 vorrangig in dem heterologen Testsystem untersucht werden. Darauf folgend kann durch Fütterung der erhal- tenen Mutanten des heterologen Testsystems mit Alizarin und HPLC-ESI-MS-Analyse der Ethylacetat- Rohextrakte untersucht werden, ob der entsprechende codierende Bereich an der Glykosylierung von Alizarin beteiligt ist.
Nach zukünftiger Identifizierung der Talose-GT in dem heterologen Testsystem S. albus Tal bedarf es noch einer abschließenden Bestätigung, dass es sich bei der identifizierten GT um die einzige Talose- GT in Kitasatospora sp. 152608 handelt. Dieser Nachweis kann mittels Inaktivierung des entspre- chenden Gens in dem WT-Stamm und Fütterung der erhaltenen Inaktivierungs-Mutante mit Alizarin erfolgen. Abschließend sollte noch die Komplementierung der Inaktivierungsmutante mit einer intak- ten Kopie des GT-Gens erfolgen, wobei eine Rückkehr der Biotransformationsaktivität zu erwarten ist.
Bei der Talose-GT aus Kitasatospora sp. 152608 handelt es sich um ein wertvolles Enzym, welches einerseits dazu in der Lage ist mit 6-deoxy-α-Talose einen seltenen Zucker zu übertragen und ande- rerseits mit Alizarin ein Arzneistoff-ähnliches Substrat aus der Gruppe der Anthraquinone akzeptiert.
144 Diskussion und Ausblick Aus diesen Gründen stellt sie ein lohnenswertes Forschungsobjekt dar und könnte zukünftig auch als Werkzeug in der kombinatorischen Biosynthese dienen.
145 Literaturverzeichnis
6 Literaturverzeichnis 1. Wright F, Bibb MJ. Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome. Gene. 1992 Apr;113:55– 65.
2. McCarthy A. Lignocellulose-degrading actinomycetes. FEMS Microbiol Lett. 1987 Jun;46(2):145– 63.
3. Crawford DL. Biodegradation of Agricultural and Urban Wastes. In: Actinomycetes in Biotechno- logy. Elsevier; 1988. p. 433–59.
4. Wang Z, Crawford DL, Pometto III AL, Rafii F. Survival and effects of wild-type, mutant, and recombinant Streptomyces in a soil ecosystem. Can J Microbiol. 1989 May;35(5):535–43.
5. Kieser T. Practical streptomyces genetics. John Innes Foundation., editor. Norwich: John Innes Foundation; 2000.
6. Fletcher M. Bacteria in their natural environments. Society for General Microbiology.;Society for General Microbiology., editor. London; Orlando: Published for the Society for General Microbiology by Academic Press; 1985.
7. Volff JN, Altenbuchner J. A new beginning with new ends: linearisation of circular chromosomes during bacterial evolution. FEMS Microbiol Lett. 2000 May 15;186(2):143–50.
8. Leblond P, Demuyter P, Simonet JM, Decaris B. Genetic instability and associated genome plas- ticity in Streptomyces ambofaciens: pulsed-field gel electrophoresis evidence for large DNA alterations in a limited genomic region. J Bacteriol. 1991 Jul;173(13):4229–33.
9. Kieser HM, Kieser T, Hopwood DA. A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. J Bacteriol. 1992 Sep;174(17):5496–507.
10. Leblond P, Redenbach M, Cullum J. Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3(2). J Bacteriol. 1993 Jun;175(11):3422–9.
11. Lezhava A, Mizukami T, Kajitani T, Kameoka D, Redenbach M, Shinkawa H, et al. Physical map of the linear chromosome of Streptomyces griseus. J Bacteriol. 1995 Nov;177(22):6492–8.
12. Oliynyk M, Samborskyy M, Lester JB, Mironenko T, Scott N, Dickens S, et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat Biotechnol. 2007 Apr;25(4):447–53.
13. Strobel T, Al-Dilaimi A, Blom J, Gessner A, Kalinowski J, Luzhetska M, et al. Complete genome sequence of Saccharothrix espanaensis DSM 44229(T) and comparison to the other completely sequenced Pseudonocardiaceae. BMC Genomics. 2012;13:465.
14. Zaburannyi N, Rabyk M, Ostash B, Fedorenko V, Luzhetskyy A. Insights into naturally minimised Streptomyces albus J1074 genome. BMC Genomics. 2014;15:97.
15. Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. J Nat Prod. 2007 Mar;70(3):461–77.
146 Literaturverzeichnis 16. Martín MF, Liras P. Organization and expression of genes involved in the biosynthesis of antibi- otics and other secondary metabolites. Annu Rev Microbiol. 1989;43:173–206.
17. Demain AL, Adrio JL. Contributions of microorganisms to industrial biology. Mol Biotechnol. 2008 Jan;38(1):41–55.
18. Weymouth-Wilson AC. The role of carbohydrates in biologically active natural products. Nat Prod Rep. 1997 Apr;14(2):99–110.
19. Demain AL. Pharmaceutically active secondary metabolites of microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol. 1999 Oct;52(4):455–63.
20. Mikrobe des Jahres [Internet]. Available from: http://mikrobe-des-jahres.de/index.html
21. Schatz A, Bugle E, Waksman SA. Streptomycin, a Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Exp Biol Med. 1944 Jan 1;55(1):66–9.
22. Burg RW, Miller BM, Baker EE, Birnbaum J, Currie SA, Hartman R, et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob Agents Chemother. 1979 Mar;15(3):361–7.
23. Blair LS, Campbell WC. Trial of avermectin B1a, mebendazole and melarsoprol against pre- cardiac Dirofilaria immitis in the ferret (Mustela putorius furo). J Parasitol. 1978 Dec;64(6):1032–4.
24. Labeda DP, Lechevalier MP. Amendment of the Genus Saccharothrix Labeda et al. 1984 and Descriptions of Saccharothrix espanaensis sp. nov., Saccharothrix cryophilis sp. nov., and Sac- charothrix mutabilis comb. nov. Int J Syst Bacteriol. 1989 Oct 1;39:420–3.
25. Kong F, Zhao N, Siegel MM, Janota K, Ashcroft JS, Koehn FE, et al. Saccharomicins, Novel Hep- tadecaglycoside Antibiotics Effective against Multidrug-Resistant Bacteria. J Am Chem Soc. 1998 Dec;120(51):13301–11.
26. Singh MP, Petersen PJ, Weiss WJ, Kong F, Greenstein M. Saccharomicins, novel heptadecagly- coside antibiotics produced by Saccharothrix espanaensis: antibacterial and mechanistic activi- ties. Antimicrob Agents Chemother. 2000 Aug;44(8):2154–9.
27. Berner, Martin. Molekularbiologische Untersuchungen zur Biosynthese der Oligosaccharid- Antibiotika Saccharomicin A und B in Saccharothrix espanaensis [Dissertation]. Albert-Ludwigs- Universität Freiburg; 2006.
28. Gehring N. Untersuchungen zur Saccharomicin Biosynthese [Bachelorarbeit]. Albert-Ludwigs- Universität Freiburg; 2012.
29. Strobel T. Genomische und molekularbiologische Untersuchungen zum Biotransformationswirt Saccharothrix espanaensis [Dissertation]. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg; 2013.
30. Linnenbrink A. Gewinnung glykosylierter Naturstoffe durch Biotransformation in Saccharothrix espanaensis sowie funktionelle Charakterisierung dreier Polyketidbiosynthesegencluster aus dem Mensacarcinproduzenten Streptomyces sp. Gö C4/4 [Dissertation]. Albert-Ludwigs- Universität Freiburg; 2009.
31. Labeda DP. Transfer of the Type Strain of Streptomyces erythraeus (Waksman 1923) Waksman and Henrici 1948 to the Genus Saccharopolyspora Lacey and Goodfellow 1975 as Saccharopoly-
147 Literaturverzeichnis spora erythraea sp. nov., and Designation of a Neotype Strain for Streptomyces erythraeus. Int J Syst Bacteriol. 1987 Jan;37(1):19–22.
32. Aktories K, Förstermann U, Hofmann F, Starke K, Forth W, Aktories-Förstermann-Hofmann- Starke, editors. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie: für Studenten der Medizin, Veterinärmedizin, Pharmazie, Chemie und Biologie sowie für Ärzte, Tierärzte und Apo- theker. 9., völlig überarb. Aufl., [Nachdr.]. München: Elsevier, Urban & Fischer; 2008. 1189 p.
33. Neu HC. The development of macrolides: clarithromycin in perspective. J Antimicrob Chemother. 1991 Feb;27 Suppl A:1–9.
34. Bahal N, Nahata MC. The new macrolide antibiotics: azithromycin, clarithromycin, dirithromy- cin, and roxithromycin. Ann Pharmacother. 1992 Jan;26(1):46–55.
35. Butler MS. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Nat Prod Rep. 2008 Jun;25(3):475–516.
36. Champney WS, Tober CL. Inhibition of translation and 50S ribosomal subunit formation in Staphylococcus aureus cells by 11 different ketolide antibiotics. Curr Microbiol. 1998 Dec;37(6):418–25.
37. Cundliffe E. How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annu Rev Microbiol. 1989;43:207–33.
38. Vilches C, Hernandez C, Mendez C, Salas JA. Role of glycosylation and deglycosylation in biosyn- thesis of and resistance to oleandomycin in the producer organism, Streptomyces antibioticus. J Bacteriol. 1992 Jan;174(1):161–5.
39. Hernández C, Olano C, Méndez C, Salas JA. Characterization of a Streptomyces antibioticus ge- ne cluster encoding a glycosyltransferase involved in oleandomycin inactivation. Gene. 1993 Nov 30;134(1):139–40.
40. Quirós LM, Carbajo RJ, Braña AF, Salas JA. Glycosylation of macrolide antibiotics. Purification and kinetic studies of a macrolide glycosyltransferase from Streptomyces antibioticus. J Biol Chem. 2000 Apr 21;275(16):11713–20.
41. Bilyk O, Brötz E, Tokovenko B, Bechthold A, Paululat T, Luzhetskyy A. New Simocyclinones: Sur- prising Evolutionary and Biosynthetic Insights. ACS Chem Biol. 2016 Jan 15;11(1):241–50.
42. Theobald U, Schimana J, Fiedler HP. Microbial growth and production kinetics of Streptomyces antibioticus Tü 6040. Antonie Van Leeuwenhoek. 2000 Dec;78(3–4):307–13.
43. Schimana J, Fiedler HP, Groth I, Süssmuth R, Beil W, Walker M, et al. Simocyclinones, novel cytostatic angucyclinone antibiotics produced by Streptomyces antibioticus Tü 6040. I. Taxo- nomy, fermentation, isolation and biological activities. J Antibiot (Tokyo). 2000 Aug;53(8):779– 87.
44. Richter SN, Frasson I, Palumbo M, Sissi C, Palù G. Simocyclinone D8 turns on against Gram- negative bacteria in a clinical setting. Bioorg Med Chem Lett. 2010 Feb 1;20(3):1202–4.
45. Edwards MJ, Flatman RH, Mitchenall LA, Stevenson CEM, Le TBK, Clarke TA, et al. A Crystal Structure of the Bifunctional Antibiotic Simocyclinone D8, Bound to DNA Gyrase. Science. 2009 Dec 4;326(5958):1415–8.
148 Literaturverzeichnis 46. Sissi C, Vazquez E, Chemello A, Mitchenall LA, Maxwell A, Palumbo M. Mapping Simocyclinone D8 Interaction with DNA Gyrase: Evidence for a New Binding Site on GyrB. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Jan 1;54(1):213–20.
47. Hearnshaw SJ, Edwards MJ, Stevenson CE, Lawson DM, Maxwell A. A New Crystal Structure of the Bifunctional Antibiotic Simocyclinone D8 Bound to DNA Gyrase Gives Fresh Insight into the Mechanism of Inhibition. J Mol Biol. 2014 May;426(10):2023–33.
48. Trefzer A, Pelzer S, Schimana J, Stockert S, Bihlmaier C, Fiedler H-P, et al. Biosynthetic gene cluster of simocyclinone, a natural multihybrid antibiotic. Antimicrob Agents Chemother. 2002 May;46(5):1174–82.
49. Galm U, Schimana J, Fiedler H-P, Schmidt J, Li S-M, Heide L. Cloning and analysis of the simocyc- linone biosynthetic gene cluster of Streptomyces antibioticus Tü 6040. Arch Microbiol. 2002 Aug;178(2):102–14.
50. Brötz E, Bilyk O, Kröger S, Paululat T, Bechthold A, Luzhetskyy A. Amycomycins C and D, new angucyclines from Kitasatospora sp. Tetrahedron Lett. 2014 Oct;55(42):5771–3.
51. Karki S, Yoo H-G, Kwon S-Y, Suh J-W, Kwon H-J. Cloning and in vitro characterization of dTDP-6- deoxy-l-talose biosynthetic genes from Kitasatospora kifunensis featuring the dTDP-6-deoxy-l- lyxo-4-hexulose reductase that synthesizes dTDP-6-deoxy-l-talose. Carbohydr Res. 2010 Sep;345(13):1958–62.
52. Nakano Y, Suzuki N, Yoshida Y, Nezu T, Yamashita Y, Koga T. Thymidine diphosphate-6-deoxy-L- lyxo-4-hexulose reductase synthesizing dTDP-6-deoxy-L-talose from Actinobacillus actinomyce- temcomitans. J Biol Chem. 2000 Mar 10;275(10):6806–12.
53. Yoo H-G, Kwon S-Y, Karki S, Kwon H-J. A new route to dTDP-6-deoxy-l-talose and dTDP-l- rhamnose: dTDP-l-rhamnose 4-epimerase in Burkholderia thailandensis. Bioorg Med Chem Lett. 2011 Jul;21(13):3914–7.
54. Zähringer U, Rettenmaier H, Moll H, Senchenkova SN, Knirel YA. Structure of a new 6-deoxy- alpha-D-talan from Burkholderia (Pseudomonas) plantarii strain DSM 6535, which is different from the O-chain of the lipopolysaccharide. Carbohydr Res. 1997 May 12;300(2):143–51.
55. Knirel YA, Shashkov AS, Senchenkova SN, Merino S, Tomás JM. Structure of the O- polysaccharide of Aeromonas hydrophila O:34; a case of random O-acetylation of 6-deoxy-L- talose. Carbohydr Res. 2002 Sep 3;337(15):1381–6.
56. Muldoon J, Perepelov AV, Shashkov AS, Nazarenko EL, Zubkov VA, Gorshkova RP, et al. Struc- ture of an acidic polysaccharide from the marine bacterium Pseudoalteromonas flavipulchra NCIMB 2033(T). Carbohydr Res. 2003 Feb 14;338(5):459–62.
57. Kim W-G, Yoon TM, Kwon HJ, Suh JW. Talosins A and B: new isoflavonol glycosides with potent antifungal activity from Kitasatospora kifunensis MJM341. II. Physicochemical properties and structure determination. J Antibiot (Tokyo). 2006 Oct;59(10):640–5.
58. Kato S, Shindo K, Yamagishi Y, Matsuoka M, Kawai H, Mochizuki J. Phenazoviridin, a novel free radical scavenger from Streptomyces sp. Taxonomy, fermentation, isolation, structure elucida- tion and biological properties. J Antibiot (Tokyo). 1993 Oct;46(10):1485–93.
59. Bitzer J, Zeeck A. 6-Deoxy-α-L-talopyranosides fromStreptomyces sp. Eur J Org Chem. 2006 Aug;2006(16):3661–6.
149 Literaturverzeichnis 60. Vogt T, Jones P. Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: characterization of a supergene family. Trends Plant Sci. 2000 Sep;5(9):380–6.
61. Kren V, Martínková L. Glycosides in medicine: “The role of glycosidic residue in biological activi- ty.” Curr Med Chem. 2001 Sep;8(11):1303–28.
62. Donadio S, Katz L. Organization of the enzymatic domains in the multifunctional polyketide synthase involved in erythromycin formation in Saccharopolyspora erythraea. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51–60.
63. Summers RG, Donadio S, Staver MJ, Wendt-Pienkowski E, Hutchinson CR, Katz L. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspo- ra erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiol Read Engl. 1997 Oct;143 ( Pt 10):3251–62.
64. Zhang H, Wang Y, Wu J, Skalina K, Pfeifer BA. Complete Biosynthesis of Erythromycin A and Designed Analogs Using E. coli as a Heterologous Host. Chem Biol. 2010 Nov;17(11):1232–40.
65. Byrne B, Carmody M, Gibson E, Rawlings B, Caffrey P. Biosynthesis of deoxyamphotericins and deoxyamphoteronolides by engineered strains of Streptomyces nodosus. Chem Biol. 2003 Dec;10(12):1215–24.
66. Nedal A, Sletta H, Brautaset T, Borgos SEF, Sekurova ON, Ellingsen TE, et al. Analysis of the mycosamine biosynthesis and attachment genes in the nystatin biosynthetic gene cluster of Streptomyces noursei ATCC 11455. Appl Environ Microbiol. 2007 Nov;73(22):7400–7.
67. Leloir LF. Two decades of research on the biosynthesis of saccharides. Science. 1971 Jun 25;172(3990):1299–303.
68. Hu Y, Walker S. Remarkable structural similarities between diverse glycosyltransferases. Chem Biol. 2002 Dec;9(12):1287–96.
69. Lairson LL, Henrissat B, Davies GJ, Withers SG. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annu Rev Biochem. 2008;77:521–55.
70. Monsigny M, Midoux P, Mayer R, Roche AC. Glycotargeting: influence of the sugar moiety on both the uptake and the intracellular trafficking of nucleic acid carried by glycosylated poly- mers. Biosci Rep. 1999 Apr;19(2):125–32.
71. Zachara NE, Hart GW. The emerging significance of O-GlcNAc in cellular regulation. Chem Rev. 2002 Feb;102(2):431–8.
72. Gagneux P, Varki A. Evolutionary considerations in relating oligosaccharide diversity to biologi- cal function. Glycobiology. 1999 Aug;9(8):747–55.
73. CAZy - Home [Internet]. Available from: http://www.cazy.org/
74. Lombard V, Golaconda Ramulu H, Drula E, Coutinho PM, Henrissat B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 2014 Jan 1;42(D1):D490–5.
75. Campbell JA, Davies GJ, Bulone V, Henrissat B. A classification of nucleotide-diphospho-sugar glycosyltransferases based on amino acid sequence similarities. Biochem J. 1997 Sep 15;326 ( Pt 3):929–39.
150 Literaturverzeichnis 76. Sinnott ML. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem Rev. 1990 Nov;90(7):1171– 202.
77. Ünligil UM, Rini JM. Glycosyltransferase structure and mechanism. Curr Opin Struct Biol. 2000 Oct;10(5):510–7.
78. Kikuchi N, Kwon Y-D, Gotoh M, Narimatsu H. Comparison of glycosyltransferase families using the profile hidden Markov model. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Oct 17;310(2):574–9.
79. Bourne Y, Henrissat B. Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules. Curr Opin Struct Biol. 2001 Oct;11(5):593–600.
80. Liu J, Mushegian A. Three monophyletic superfamilies account for the majority of the known glycosyltransferases. Protein Sci Publ Protein Soc. 2003 Jul;12(7):1418–31.
81. Vrielink A, Rüger W, Driessen HP, Freemont PS. Crystal structure of the DNA modifying enzyme beta-glucosyltransferase in the presence and absence of the substrate uridine diphosphogluco- se. EMBO J. 1994 Aug 1;13(15):3413–22.
82. Rossmann MG, Moras D, Olsen KW. Chemical and biological evolution of nucleotide-binding protein. Nature. 1974 Jul 19;250(463):194–9.
83. Lesk AM. Systematic representation of protein folding patterns. J Mol Graph. 1995 Jun;13(3):159–64.
84. Schwarz F, Aebi M. Mechanisms and principles of N-linked protein glycosylation. Curr Opin Struct Biol. 2011 Oct;21(5):576–82.
85. Gao Q, Zhang C, Blanchard S, Thorson JS. Deciphering indolocarbazole and enediyne ami- nodideoxypentose biosynthesis through comparative genomics: insights from the AT2433 bio- synthetic locus. Chem Biol. 2006 Jul;13(7):733–43.
86. Chiu H-T, Chen Y-L, Chen C-Y, Jin C, Lee M-N, Lin Y-C. Molecular cloning, sequence analysis and functional characterization of the gene cluster for biosynthesis of K-252a and its analogs. Mol Biosyst. 2009 Oct;5(10):1180–91.
87. Flatt PM, Wu X, Perry S, Mahmud T. Genetic Insights into Pyralomicin Biosynthesis in Nonomuraea spiralis IMC A-0156. J Nat Prod. 2013 May 24;76(5):939–46.
88. Sánchez C, Butovich IA, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin: characterization and generation of indolocarbazole derivatives. Chem Biol. 2002 Apr;9(4):519–31.
89. Li T, Du Y, Cui Q, Zhang J, Zhu W, Hong K, et al. Cloning, characterization and heterologous ex- pression of the indolocarbazole biosynthetic gene cluster from marine-derived Streptomyces sanyensis FMA. Mar Drugs. 2013 Feb;11(2):466–88.
90. Medema MH, Trefzer A, Kovalchuk A, van den Berg M, Müller U, Heijne W, et al. The sequence of a 1.8-mb bacterial linear plasmid reveals a rich evolutionary reservoir of secondary metabolic pathways. Genome Biol Evol. 2010;2:212–24.
91. Tang W-L, Chen WC, Roy A, Undzys E, Li S-D. A Simple and Improved Active Loading Method to Efficiently Encapsulate Staurosporine into Lipid-Based Nanoparticles for Enhanced Therapy of Multidrug Resistant Cancer. Pharm Res. 2016 May;33(5):1104–14.
151 Literaturverzeichnis 92. Zhao P, Bai L, Ma J, Zeng Y, Li L, Zhang Y, et al. Amide N-glycosylation by Asm25, an N- glycosyltransferase of ansamitocins. Chem Biol. 2008 Aug 25;15(8):863–74.
93. Yu T-W, Bai L, Clade D, Hoffmann D, Toelzer S, Trinh KQ, et al. The biosynthetic gene cluster of the maytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnema pretiosum. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jun 11;99(12):7968–73.
94. Guo Z, Li J, Qin H, Wang M, Lv X, Li X, et al. Biosynthesis of the carbamoylated D-gulosamine moiety of streptothricins: involvement of a guanidino-N-glycosyltransferase and an N-acetyl-D- gulosamine deacetylase. Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Apr 20;54(17):5175–8.
95. Katz L, Hutchinson CR. Chapter 14. Genetic Engineering of Antibiotic Producing Organisms. In: Annual Reports in Medicinal Chemistry. Elsevier; 1992. p. 129–38.
96. Weber JM, Leung JO, Swanson SJ, Idler KB, McAlpine JB. An erythromycin derivative produced by targeted gene disruption in Saccharopolyspora erythraea. Science. 1991 Apr 5;252(5002):114–7.
97. Xue Q, Ashley G, Hutchinson CR, Santi DV. A multiplasmid approach to preparing large libraries of polyketides. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Oct 12;96(21):11740–5.
98. Madduri K, Kennedy J, Rivola G, Inventi-Solari A, Filippini S, Zanuso G, et al. Production of the antitumor drug epirubicin (4’-epidoxorubicin) and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius. Nat Biotechnol. 1998 Jan;16(1):69–74.
99. Blanco G, Patallo EP, Braña AF, Trefzer A, Bechthold A, Rohr J, et al. Identification of a sugar flexible glycosyltransferase from Streptomyces olivaceus, the producer of the antitumor po- lyketide elloramycin. Chem Biol. 2001 Mar;8(3):253–63.
100. Salas JA, Méndez C. Engineering the glycosylation of natural products in actinomycetes. Trends Microbiol. 2007 May;15(5):219–32.
101. Boons G-J. Strategies in Oligosaccharide Synthesis. Tetrahedron. 1996 Jan;52(4):1095–121.
102. Suzuki K. Lessons from total synthesis of hybrid natural products. Chem Rec N Y N. 2010 Oct;10(5):291–307.
103. Han AR, Park JW, Lee MK, Ban YH, Yoo YJ, Kim EJ, et al. Development of a Streptomyces vene- zuelae-based combinatorial biosynthetic system for the production of glycosylated derivatives of doxorubicin and its biosynthetic intermediates. Appl Environ Microbiol. 2011 Jul;77(14):4912–23.
104. Jung WS, Han AR, Hong JSJ, Park SR, Choi CY, Park JW, et al. Bioconversion of 12-, 14-, and 16- membered ring aglycones to glycosylated macrolides in an engineered strain of Streptomyces venezuelae. Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Oct;76(6):1373–81.
105. Han AR, Shinde PB, Park JW, Cho J, Lee SR, Ban YH, et al. Engineered biosynthesis of glycosyla- ted derivatives of narbomycin and evaluation of their antibacterial activities. Appl Microbiol Bi- otechnol. 2012 Feb;93(3):1147–56.
106. González A, Rodríguez M, Braña AF, Méndez C, Salas JA, Olano C. New insights into paulomycin biosynthesis pathway in Streptomyces albus J1074 and generation of novel derivatives by com- binatorial biosynthesis. Microb Cell Factories. 2016;15(1):56.
152 Literaturverzeichnis 107. Leimkuhler C, Fridman M, Lupoli T, Walker S, Walsh CT, Kahne D. Characterization of Rhodosa- minyl Transfer by the AknS/AknT Glycosylation Complex and Its Use in Reconstituting the Bio- synthetic Pathway of Aclacinomycin A. J Am Chem Soc. 2007 Aug;129(34):10546–50.
108. Hurteloup P, Ganzina F. Clinical studies with new anthracyclines: epirubicin, idarubicin, esorubi- cin. Drugs Exp Clin Res. 1986;12(1–3):233–46.
109. Borisova SA, Zhao L, Melançon III CE, Kao C-L, Liu H-W. Characterization of the glycosyltrans- ferase activity of desVII: analysis of and implications for the biosynthesis of macrolide antibio- tics. J Am Chem Soc. 2004 Jun 2;126(21):6534–5.
110. Olano C, García I, González A, Rodriguez M, Rozas D, Rubio J, et al. Activation and identification of five clusters for secondary metabolites in Streptomyces albus J1074. Microb Biotechnol. 2014 May;7(3):242–56.
111. Wiley PF. A new antibiotic, U-43,120 (NSC-163500). J Antibiot (Tokyo). 1976 May;29(5):587–9.
112. Argoudelis AD, Brinkley TA, Brodasky TF, Buege JA, Meyer HF, Mizsak SA. Paulomycins A and B. Isolation and characterization. J Antibiot (Tokyo). 1982 Mar;35(3):285–94.
113. Härle J, Bechthold A. Chapter 12 The Power of Glycosyltransferases to Generate Bioactive Natu- ral Compounds. In: Methods in Enzymology. Elsevier; 2009. p. 309–33.
114. Strobel T, Schmidt Y, Linnenbrink A, Luzhetskyy A, Luzhetska M, Taguchi T, et al. Tracking down biotransformation to the genetic level: identification of a highly flexible glycosyltransferase from Saccharothrix espanaensis. Appl Environ Microbiol. 2013 Sep;79(17):5224–32.
115. Roldán A, Palacios V, Caro I, Pérez L. Resveratrol content of Palomino fino grapes: influence of vintage and fungal infection. J Agric Food Chem. 2003 Feb 26;51(5):1464–8.
116. Sanders TH, McMichael RW, Hendrix KW. Occurrence of resveratrol in edible peanuts. J Agric Food Chem. 2000 Apr;48(4):1243–6.
117. Lyons MM, Yu C, Toma RB, Cho SY, Reiboldt W, Lee J, et al. Resveratrol in raw and baked blueberries and bilberries. J Agric Food Chem. 2003 Sep 24;51(20):5867–70.
118. Jerkovic V, Collin S. Occurrence of resveratrol and piceid in American and European hop cones. J Agric Food Chem. 2007 Oct 17;55(21):8754–8.
119. Langcake P, Pryce RJ. The production of resveratrol by Vitis vinifera and other members of the Vitaceae as a response to infection or injury. Physiol Plant Pathol. 1976 Jul;9(1):77–86.
120. Roggero JP, Garcia Parrilla C. Effects of ultraviolet irradiation on resveratrol and changes in res- veratrol and various of its derivatives in the skins of ripening grapes. Sci Aliments. 1995;15:411– 22.
121. Orallo F. Biological Effects of Cis- Versus Trans-Resveratrol. In: Aggarwal B, Shishodia S, editors. Resveratrol in Health and Disease. CRC Press; 2005. p. 577–600.
122. Orallo F. Comparative studies of the antioxidant effects of cis- and trans-resveratrol. Curr Med Chem. 2006;13(1):87–98.
123. Anisimova NY, Kiselevsky MV, Sosnov AV, Sadovnikov SV, Stankov IN, Gakh AA. Trans-, cis-, and dihydro-resveratrol: a comparative study. Chem Cent J. 2011;5:88.
153 Literaturverzeichnis 124. He S, Jiang L, Wu B, Pan Y, Sun C. Pallidol, a resveratrol dimer from red wine, is a selective sing- let oxygen quencher. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Feb 6;379(2):283–7.
125. Ito T, Abe N, Oyama M, Tanaka T, Murata J, Darnaedi D, et al. Two Novel Resveratrol Trimers from Dipterocarpus grandiflorus. Helv Chim Acta. 2009 Jun;92(6):1203–16.
126. Soleas GJ, Diamandis EP, Goldberg DM. Resveratrol: a molecule whose time has come? And gone? Clin Biochem. 1997 Mar;30(2):91–113.
127. Jones P, Vogt T. Glycosyltransferases in secondary plant metabolism: tranquilizers and stimu- lant controllers. Planta. 2001 Jun;213(2):164–74.
128. Gachon CMM, Langlois-Meurinne M, Saindrenan P. Plant secondary metabolism glycosyltrans- ferases: the emerging functional analysis. Trends Plant Sci. 2005 Nov;10(11):542–9.
129. Bowles D, Lim E-K, Poppenberger B, Vaistij FE. Glycosyltransferases of lipophilic small molecules. Annu Rev Plant Biol. 2006;57:567–97.
130. Walle T, Hsieh F, DeLegge MH, Oatis JE, Walle UK. High absorption but very low bioavailability of oral resveratrol in humans. Drug Metab Dispos Biol Fate Chem. 2004 Dec;32(12):1377–82.
131. Szkudelski T, Szkudelska K. Anti-diabetic effects of resveratrol. Ann N Y Acad Sci. 2011 Jan;1215:34–9.
132. Sun C, Zhang F, Ge X, Yan T, Chen X, Shi X, et al. SIRT1 improves insulin sensitivity under insulin- resistant conditions by repressing PTP1B. Cell Metab. 2007 Oct;6(4):307–19.
133. Baur JA, Sinclair DA. Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence. Nat Rev Drug Discov. 2006 Jun;5(6):493–506.
134. Wang MJ, Huang HM, Hsieh SJ, Jeng KC, Kuo JS. Resveratrol inhibits interleukin-6 production in cortical mixed glial cells under hypoxia/hypoglycemia followed by reoxygenation. J Neuroim- munol. 2001 Jan 1;112(1–2):28–34.
135. Frémont L, Belguendouz L, Delpal S. Antioxidant activity of resveratrol and alcohol-free wine polyphenols related to LDL oxidation and polyunsaturated fatty acids. Life Sci. 1999;64(26):2511–21.
136. Marambaud P, Zhao H, Davies P. Resveratrol promotes clearance of Alzheimer’s disease amy- loid-beta peptides. J Biol Chem. 2005 Nov 11;280(45):37377–82.
137. Pezzuto JM. Grapes and human health: a perspective. J Agric Food Chem. 2008 Aug 27;56(16):6777–84.
138. Mizutani K, Ikeda K, Kawai Y, Yamori Y. Resveratrol Attenuates Ovariectomy-Induced Hyperten- sion and Bone Loss in Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats. J Nutr Sci Vitaminol (To- kyo). 2000;46(2):78–83.
139. Hung LM, Chen JK, Huang SS, Lee RS, Su MJ. Cardioprotective effect of resveratrol, a natural antioxidant derived from grapes. Cardiovasc Res. 2000 Aug 18;47(3):549–55.
140. Bhatt SR, Lokhandwala MF, Banday AA. Resveratrol prevents endothelial nitric oxide synthase uncoupling and attenuates development of hypertension in spontaneously hypertensive rats. Eur J Pharmacol. 2011 Sep 30;667(1–3):258–64.
154 Literaturverzeichnis 141. Petrovski G, Gurusamy N, Das DK. Resveratrol in cardiovascular health and disease. Ann N Y Acad Sci. 2011 Jan;1215:22–33.
142. Sato M, Ray PS, Maulik G, Maulik N, Engelman RM, Bertelli AA, et al. Myocardial protection with red wine extract. J Cardiovasc Pharmacol. 2000 Feb;35(2):263–8.
143. Gorbunov N, Petrovski G, Gurusamy N, Ray D, Kim DH, Das DK. Regeneration of infarcted myo- cardium with resveratrol-modified cardiac stem cells. J Cell Mol Med. 2012 Jan;16(1):174–84.
144. Jang M, Cai L, Udeani GO, Slowing KV, Thomas CF, Beecher CW, et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes. Science. 1997 Jan 10;275(5297):218–20.
145. Aggarwal BB, Bhardwaj A, Aggarwal RS, Seeram NP, Shishodia S, Takada Y. Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies. Anticancer Res. 2004 Oct;24(5A):2783–840.
146. Renaud S, de Lorgeril M. Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for coronary heart disease. Lancet Lond Engl. 1992 Jun 20;339(8808):1523–6.
147. Pangeni R, Sahni JK, Ali J, Sharma S, Baboota S. Resveratrol: review on therapeutic potential and recent advances in drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 2014 Aug;11(8):1285–98.
148. Tsai SH, Lin-Shiau SY, Lin JK. Suppression of nitric oxide synthase and the down-regulation of the activation of NFkappaB in macrophages by resveratrol. Br J Pharmacol. 1999 Feb;126(3):673–80.
149. Wadsworth TL, Koop DR. Effects of the wine polyphenolics quercetin and resveratrol on pro- inflammatory cytokine expression in RAW 264.7 macrophages. Biochem Pharmacol. 1999 Apr 15;57(8):941–9.
150. Feng Y-H, Zhou W-L, Wu Q-L, Li X-Y, Zhao W-M, Zou J-P. Low dose of resveratrol enhanced im- mune response of mice. Acta Pharmacol Sin. 2002 Oct;23(10):893–7.
151. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, et al. Small molecule acti- vators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature. 2003 Sep 11;425(6954):191–6.
152. Knutson MD, Leeuwenburgh C. Resveratrol and novel potent activators of SIRT1: effects on aging and age-related diseases. Nutr Rev. 2008 Oct;66(10):591–6.
153. Quideau S, Deffieux D, Pouységu L. Resveratrol still has something to say about aging! Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Jul 9;51(28):6824–6.
154. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, et al. Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature. 2006 Nov 16;444(7117):337–42.
155. Pandey RP, Parajuli P, Shin JY, Lee J, Lee S, Hong Y-S, et al. Enzymatic Biosynthesis of Novel Res- veratrol Glucoside and Glycoside Derivatives. Appl Environ Microbiol. 2014 Dec;80(23):7235– 43.
156. ClinicalTrials.gov [Internet]. Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/home
155 Literaturverzeichnis 157. Baell J, Walters MA. Chemistry: Chemical con artists foil drug discovery. Nature. 2014 Sep 24;513(7519):481–3.
158. Blin K, Medema MH, Kazempour D, Fischbach MA, Breitling R, Takano E, et al. antiSMASH 2.0--a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers. Nucleic Acids Res. 2013 Jul 1;41(W1):W204–12.
159. Medema MH, Blin K, Cimermancic P, de Jager V, Zakrzewski P, Fischbach MA, et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acids Res. 2011 Jul 1;39(suppl):W339–46.
160. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403–10.
161. Gish W, States DJ. Identification of protein coding regions by database similarity search. Nat Genet. 1993 Mar;3(3):266–72.
162. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinforma Oxf Engl. 2007 Nov 1;23(21):2947–8.
163. Artimo P, Jonnalagedda M, Arnold K, Baratin D, Csardi G, de Castro E, et al. ExPASy: SIB bioin- formatics resource portal. Nucleic Acids Res. 2012 Jul;40(Web Server issue):W597-603.
164. Camacho C, Coulouris G, Avagyan V, Ma N, Papadopoulos J, Bealer K, et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 2009;10:421.
165. Cock PJA, Chilton JM, Grüning B, Johnson JE, Soranzo N. NCBI BLAST+ integrated into Galaxy. GigaScience. 2015 Dec;4(1).
166. Page RD. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Com- put Appl Biosci CABIOS. 1996 Aug;12(4):357–8.
167. UniProt Consortium. UniProt: a hub for protein information. Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D204-212.
168. Stura EA, Nemerow GR, Wilson IA. Strategies in the crystallization of glycoproteins and protein complexes. J Cryst Growth. 1992 Aug;122(1–4):273–85.
169. Stura EA, Satterthwait AC, Calvo JC, Kaslow DC, Wilson IA. Reverse screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1994 Jul 1;50(Pt 4):448–55.
170. Bergfors, TM. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. 1999. 306 p.
171. GE Healthcare. Instructions 11-0008-88 AH HisTrapTM FF, 1 ml and 5 ml [Internet]. Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/13147359884 70/litdoc11000888_20150304212650.pdf
172. Betancor L, Fernández M-J, Weissman KJ, Leadlay PF. Improved catalytic activity of a purified multienzyme from a modular polyketide synthase after coexpression with Streptomyces chape- ronins in Escherichia coli. Chembiochem Eur J Chem Biol. 2008 Dec 15;9(18):2962–6.
156 Literaturverzeichnis 173. Moncrieffe MC, Fernandez M-J, Spiteller D, Matsumura H, Gay NJ, Luisi BF, et al. Structure of the glycosyltransferase EryCIII in complex with its activating P450 homologue EryCII. J Mol Biol. 2012 Jan 6;415(1):92–101.
174. MacNeil DJ, Gewain KM, Ruby CL, Dezeny G, Gibbons PH, MacNeil T. Analysis of Streptomyces avermitilis genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector. Ge- ne. 1992 Feb 1;111(1):61–8.
175. Bennett PM, Grinsted J, Richmond MH. Transposition of TnA does not generate deletions. Mol Gen Genet MGG. 1977 Jul 20;154(2):205–11.
176. Grinsted J, Bennett PM, Higginson S, Richmond MH. Regional preference of insertion of Tn501 and Tn802 into RP1 and its derivatives. Mol Gen Genet MGG. 1978 Nov 9;166(3):313–20.
177. Flett F, Mersinias V, Smith CP. High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl DNA-restricting streptomycetes. FEMS Microbiol Lett. 2006 Jan 17;155(2):223–9.
178. Chater KF, Wilde LC. Streptomyces albus G mutants defective in the SalGI restriction- modification system. J Gen Microbiol. 1980 Feb;116(2):323–34.
179. Schäffer M. Heterologe Expression von Glycosyltransferasegenen in Steptomyces albus [Diplo- marbeit]. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg; 2013.
180. Skerman VBD, McGowan V, Sneath PHA, editors. Approved Lists of Bacterial Names (Amended). Washington (DC): ASM Press; 1989.
181. van Berkel WJ, Eppink MH, Middelhoven WJ, Vervoort J, Rietjens IM. Catabolism of 4- hydroxybenzoate in Candida parapsilosis proceeds through initial oxidative decarboxylation by a FAD-dependent 4-hydroxybenzoate 1-hydroxylase. FEMS Microbiol Lett. 1994 Aug 15;121(2):207–15.
182. Nirenberg H. Untersuchungen über die morphologische und biologische Differenzierung in der Fusarium-Sektion Liseola. [Berlin & Hamburg]: Parey in Komm.; 1976.
183. Schmidt, Yvonne-Isolde. Biochemische Charakterisierung der Glykosyltransferase Ses60310 aus Saccharothrix espanaensis [Diplomarbeit]. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg; 2011.
184. Herrmann S, Siegl T, Luzhetska M, Petzke L, Jilg C, Welle E, et al. Site-specific recombination strategies for engineering actinomycete genomes. Appl Environ Microbiol. 2012 Mar;78(6):1804–12.
185. Heitzler, Tanja. Sekundärstoffe aus Aktinomyceten: Untersuchungen zur Biosynthese und Regu- lation sowie Verifizierung eines Clustom-Sequencing-Verfahrens [Dissertation]. Albert-Ludwigs- Universität Freiburg; 2015.
186. Hardter, Uwe. Heterologe Expression der Glykosyltransferasen SaqGT1 und SaqGT2 des Saqua- yamycin Z-Produzenten Micromonospora sp. TÜ 6368. [Diplomarbeit]. Albert-Ludwigs- Universität Freiburg; 2007.
187. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. 3 p.
157 Literaturverzeichnis 188. Kieser T, John Innes Foundation. Practical streptomyces genetics. Norwich: John Innes Founda- tion; 2000.
189. Mazodier P, Petter R, Thompson C. Intergeneric conjugation between Escherichia coli and Streptomyces species. J Bacteriol. 1989 Jun;171(6):3583–5.
190. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24;7(6):1513–23.
191. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263–73.
192. Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short JM, Sorge JA, Mathur EJ. High-fidelity amplifi- cation using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene. 1991 Dec 1;108(1):1–6.
193. Chien A, Edgar DB, Trela JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol. 1976 Sep;127(3):1550–7.
194. Weiss B, Richardson CC. Enzymatic breadage and joining of deoxyribonucleic acid. 3. An enzy- me-adenylate intermediate in the polynucleotide ligase reaction. J Biol Chem. 1967 Sep 25;242(18):4270–2.
195. Hochuli E, Döbeli H, Schacher A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and pepti- des containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr. 1987 Dec 18;411:177–84.
196. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new ap- proach to protein fractionation. Nature. 1975 Dec 18;258(5536):598–9.
197. Hochuli E, Bannwarth W, Döbeli H, Gentz R, Stüber D. Genetic Approach to Facilitate Purificati- on of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Bio/Technology. 1988 Nov;6:1321–5.
198. Skerra A, Schmidt TG. Use of the Strep-Tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins. Methods Enzymol. 2000;326:271–304.
199. Carrington JC, Dougherty WG. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid se- quences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 May;85(10):3391–5.
200. Gill SC, von Hippel PH. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 1989 Nov 1;182(2):319–26.
201. Gosselin S, Alhussaini M, Streiff MB, Takabayashi K, Palcic MM. A continuous spectrophotomet- ric assay for glycosyltransferases. Anal Biochem. 1994 Jul;220(1):92–7.
202. Kim HK, Pack MY. Cloning and expression of Cellulomonas fimi β-glucosidase genes in E- scherichia coli. Enzyme Microb Technol. 1989 May;11(5):313–6.
203. Bechthold A, Berger U, Heide L. Partial purification, properties, and kinetic studies of UDP- glucose:p-hydroxybenzoate glucosyltransferase from cell cultures of Lithospermum erythrorhi- zon. Arch Biochem Biophys. 1991 Jul;288(1):39–47.
158 Literaturverzeichnis 204. Gummerlich N. Gewinnung neuer Naturstoffe durch Glykosylierung [Diplomarbeit]. Albert- Ludwigs-Universität Freiburg; 2015.
205. Efron B. Bootstrap Methods: Another Look at the Jackknife. Ann Stat. 1979 Jan;7(1):1–26.
206. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 1987 Jul;4(4):406–25.
207. Aguirrezabalaga I, Olano C, Allende N, Rodriguez L, Braña AF, Méndez C, et al. Identification and expression of genes involved in biosynthesis of L-oleandrose and its intermediate L-olivose in the oleandomycin producer Streptomyces antibioticus. Antimicrob Agents Chemother. 2000 May;44(5):1266–75.
208. Rodriguez L, Oelkers C, Aguirrezabalaga I, Braña AF, Rohr J, Méndez C, et al. Generation of hyb- rid elloramycin analogs by combinatorial biosynthesis using genes from anthracycline-type and macrolide biosynthetic pathways. J Mol Microbiol Biotechnol. 2000 Jul;2(3):271–6.
209. Quirós LM, Aguirrezabalaga I, Olano C, Méndez C, Salas JA. Two glycosyltransferases and a gly- cosidase are involved in oleandomycin modification during its biosynthesis by Streptomyces an- tibioticus. Mol Microbiol. 1998 Jun;28(6):1177–85.
210. Wood HE, Devine KM, McConnell DJ. Characterisation of a repressor gene (xre) and a tempera- ture-sensitive allele from the Bacillus subtilis prophage, PBSX. Gene. 1990 Nov 30;96(1):83–8.
211. Furfine ES, Abeles RH. Intermediates in the conversion of 5’-S-methylthioadenosine to methio- nine in Klebsiella pneumoniae. J Biol Chem. 1988 Jul 15;263(20):9598–606.
212. Kabuyama Y, Litman ES, Templeton PD, Metzner SI, Witze ES, Argast GM, et al. A mediator of Rho-dependent invasion moonlights as a methionine salvage enzyme. Mol Cell Proteomics MCP. 2009 Oct;8(10):2308–20.
213. Pirkov I, Norbeck J, Gustafsson L, Albers E. A complete inventory of all enzymes in the eukaryo- tic methionine salvage pathway. FEBS J. 2008 Aug;275(16):4111–20.
214. Wang H, Pang H, Bartlam M, Rao Z. Crystal structure of human E1 enzyme and its complex with a substrate analog reveals the mechanism of its phosphatase/enolase activity. J Mol Biol. 2005 May 13;348(4):917–26.
215. Ju T, Goldsmith RB, Chai SC, Maroney MJ, Pochapsky SS, Pochapsky TC. One protein, two enzy- mes revisited: a structural entropy switch interconverts the two isoforms of acireductone dio- xygenase. J Mol Biol. 2006 Nov 3;363(4):823–34.
216. Oram SW, Ai J, Pagani GM, Hitchens MR, Stern JA, Eggener S, et al. Expression and function of the human androgen-responsive gene ADI1 in prostate cancer. Neoplasia N Y N. 2007 Aug;9(8):643–51.
217. Ahlert J, Shepard E, Lomovskaya N, Zazopoulos E, Staffa A, Bachmann BO, et al. The calicheami- cin gene cluster and its iterative type I enediyne PKS. Science. 2002 Aug 16;297(5584):1173–6.
218. Luzhetskyy A, Mayer A, Hoffmann J, Pelzer S, Holzenkämper M, Schmitt B, et al. Cloning and heterologous expression of the aranciamycin biosynthetic gene cluster revealed a new flexible glycosyltransferase. Chembiochem Eur J Chem Biol. 2007 Apr 16;8(6):599–602.
159 Literaturverzeichnis 219. Olano C, Rodriguez AM, Michel JM, Méndez C, Raynal MC, Salas JA. Analysis of a Streptomyces antibioticus chromosomal region involved in oleandomycin biosynthesis, which encodes two glycosyltransferases responsible for glycosylation of the macrolactone ring. Mol Gen Genet MGG. 1998 Aug;259(3):299–308.
220. Tao M, Wang L, Wendt-Pienkowski E, George NP, Galm U, Zhang G, et al. The tallysomycin bio- synthetic gene cluster from Streptoalloteichus hindustanus E465-94 ATCC 31158 unveiling new insights into the biosynthesis of the bleomycin family of antitumor antibiotics. Mol BioSyst. 2007;3(1):60–74.
221. Wang L, Tao M, Wendt-Pienkoski E, Galm U, Coughlin JM, Shen B. Functional characterization of tlmK unveiling unstable carbinolamide intermediates in the tallysomycin biosynthetic pathway. J Biol Chem. 2009 Mar 27;284(13):8256–64.
222. Rodrigues JL, Araújo RG, Prather KLJ, Kluskens LD, Rodrigues LR. Heterologous production of caffeic acid from tyrosine in Escherichia coli. Enzyme Microb Technol. 2015 Apr;71:36–44.
223. Lindquist S, Craig EA. The heat-shock proteins. Annu Rev Genet. 1988;22:631–77.
224. Schmid D, Baici A, Gehring H, Christen P. Kinetics of molecular chaperone action. Science. 1994 Feb 18;263(5149):971–3.
225. Zhu X, Zhao X, Burkholder WF, Gragerov A, Ogata CM, Gottesman ME, et al. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science. 1996 Jun 14;272(5268):1606– 14.
226. Burns JA, Butler JC, Moran J, Whitesides GM. Selective reduction of disulfides by tris(2- carboxyethyl)phosphine. J Org Chem. 1991 Apr;56(8):2648–50.
227. Han JC, Han GY. A procedure for quantitative determination of tris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable and effective than dithiothreitol. Anal Biochem. 1994 Jul;220(1):5–10.
228. Getz EB, Xiao M, Chakrabarty T, Cooke R, Selvin PR. A comparison between the sulfhydryl re- ductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Anal Biochem. 1999 Aug 15;273(1):73–80.
229. Rehm H. Proteinbiochemie Proteomics. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag; 2010.
230. Nallamsetty S, Kapust RB, Tözsér J, Cherry S, Tropea JE, Copeland TD, et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Pro- tein Expr Purif. 2004 Nov;38(1):108–15.
231. Isbell HS, Frush HL. Mutarotation, Hydrolysis, and Rearrangement Reactions of Glycosylamines 1. J Org Chem. 1958 Sep;23(9):1309–19.
232. Lee HY, Chung HS, Hang C, Khosla C, Walsh CT, Kahne D, et al. Reconstitution and characteriza- tion of a new desosaminyl transferase, EryCIII, from the erythromycin biosynthetic pathway. J Am Chem Soc. 2004 Aug 18;126(32):9924–5.
233. Zhang C, Fu Q, Albermann C, Li L, Thorson JS. The in vitro characterization of the erythronolide mycarosyltransferase EryBV and its utility in macrolide diversification. Chembiochem Eur J Chem Biol. 2007 Mar 5;8(4):385–90.
160 Literaturverzeichnis 234. Quirós LM, Salas JA. Biosynthesis of the macrolide oleandomycin by Streptomyces antibioticus. Purification and kinetic characterization of an oleandomycin glucosyltransferase. J Biol Chem. 1995 Aug 4;270(31):18234–9.
235. Berghot MA, Hanna MA, Girges MM. Synthesis and biological activity of some heterocyclic sys- tems containing anthraquinone. Pharm. 1992 May;47(5):340–3.
236. Huang H-S, Chiu H-F, Lu W-C, Yuan C-L. Synthesis and antitumor activity of 1,8- diaminoanthraquinone derivatives. Chem Pharm Bull (Tokyo). 2005 Sep;53(9):1136–9.
CLXI Anhang
7 Anhang
7.1 Plasmidkarten
7.1.1 pET21a-7665-STN
XhoI
f1 origin ses60310
HindIII
lac operator TEV-site 6000 Strep-tag bla T7 promoter 1000 pET21a-7665-STN 5000 6588 bps 2000 ori pBR322
4000 lacI 3000
Abbildung 7.1: Plasmidkarte von pET21a-7665-STN
Verwendet zur Proteinproduktion von Ses60310 mit N-terminalem Strep-tag.
7.1.2 pET21a-7665-TSC
HindIII
f1 origin Strep-tag TEV-site
ses60310
bla 6000 NdeI 1000 lac operator T7 promoter pET21a-7665-TSC 5000 ori pBR322 6585 bps 2000
4000 3000 lacI
Abbildung 7.2: Plasmidkarte von pET21a-7665-TSC
Verwendet zur Proteinproduktion von Ses60310 mit C-terminalem Strep-tag.
CLXII Anhang 7.1.3 pET21a-sam7-C-his-TEV
XhoI
f1 origin His-tag TEV-site sam7 NdeI
lac operator 6000 T7 promoter bla 1000 pET21a-sam7-C-his-TEV 5000 6510 bps 2000 ori pBR322
4000 lacI 3000
Abbildung 7.3: Plasmidkarte von pET21a-sam7-C-his-TEV
Verwendet zur Proteinproduktion von Sam7 mit C-terminalem His6-tag und TEV-Schnittstelle.
7.1.4 pET21a-sam36-C-his-TEV
XhoI
f1 origin His-tag TEV-site
sam36 bla 7000 1000 pET21a-sam36-C-his-TEV 6000 2000 ori pBR322 7779 bps
5000 lac operator 3000 NdeI T7 promoter 4000
lacI
Abbildung 7.4: Plasmidkarte von pET21a-sam36-C-his-TEV
Verwendet zur Proteinproduktion von Sam36 mit C-terminalem His6-tag und TEV-Schnittstelle.
CLXIII Anhang 7.1.5 pET28a-sace_3599-N-his
HindIII
f1 origin
sace_3599 aphII 6000 NdeI 1000 His-tag pET28a-sace_3599-N-his lac operator 5000 T7 promoter 6487 bps 2000
4000 ori pBR322 3000
lacI
Abbildung 7.5: Plasmidkarte von pET28a-sace_3599-N-his
Verwendet zur Proteinproduktion von SACE_3599 mit N-terminalem His6-tag.
7.1.6 pET28a-sam7-N-his
XhoI
f1 origin
sam7
aphII 6000 NdeI
1000 His-tag lac operator T7 promoter pET28a-sam7-N-his5000 6421 bps 2000
4000
ori pBR322 3000 lacI
Abbildung 7.6: Plasmidkarte von pET28a-sam7-N-his
Verwendet zur Proteinproduktion von Sam7 mit N-terminalem His6-tag.
CLXIV Anhang 7.1.7 pET28a-sam36-N-his
XhoI
f1 origin
aphII
7000 sam36 1000
pET28a-sam36-N-his6000 2000 ori pBR322 7690 bps
5000 3000
4000 His-tag T7 promoter NdeI lac operator lacI
Abbildung 7.7: Plasmidkarte von pET28a-sam36-N-his
Verwendet zur Proteinproduktion von Sam36 mit N-terminalem His6-tag.
7.1.8 pKCΔsace_3599
oriT PstI aac(3)IV
'LacZa
7000
1000
pKC(delta)sace_35996000 2000 homolog down 7569 bps
LacZa' 5000 3000 NotI 4000 'Sace_3599
homolog up aadA Sace_3599' XbaI
SphI Abbildung 7.8: Plasmidkarte von pKCΔsace_3599
Verwendet zur Inaktivierung von sace_3599 in dem Genom von Saccharopolyspora erythraea.
CLXV Anhang 7.1.9 pTOS-ermE*
SpeI NotI NdeI ClaI
oriT rox ermE* attP rox
5000
1000 pTOS-ermE* Int aac(3)IV 4000 5725 bps
2000
3000
pInt
ori ColE1
Abbildung 7.9: Plasmidkarte pTOS-ermE*
Integrativer Vektor mit ermE* Promotor.
7.1.10 pTOS-Talose
SpeI
ori Trox NotI
KSS_03127
KSS_03125 aac(3)IV
8000
pTOS-Talose2000KSS_03124 ori ColE1 9239 bps
6000 NdeI 4000 KSS_03123
pInt ermE* Int attP rox ClaI
Abbildung 7.10: Plasmidkarte pTOS-Talose
Integratives Plasmid zur heterologen Produktion von dTDP-6-deoxy-L-Talose.
CLXVI Anhang 7.1.11 pTOSz-sace_3599
SpeI
ori T rox ErmE*LacZ'
Sace_3599
7000
1000 aac(3)IV pTOSz-sace_35996000 EcoRI
2000 'LacZ 7477 bps 5000 attP rox 3000 ori ColE1 4000
Int pInt
Abbildung 7.11: Plasmidkarte von pTOSz-sace_3599
Integratives Plasmid zur Komplementierung von S. erythraeaΔsace_3599.
7.1.12 pUWL-A-sam36
HindIII
ermE up rep
ori 10000
sam36 2000 8000pUWL-A-sam36 10252 bps aac(3)IV
4000 6000
EcoRV
oriT bla ori ColE1
Abbildung 7.12: Plasmidkarte von pUWL-A-sam36
Replikatives Plasmid zur heterologen Expression von sam36 in S. albus.
CLXVII Anhang 7.1.13 pUWL-A-sam36+7
HindIII
ermE up rep ori
sam36 10000
2000 pUWL-A-sam36+7 aac(3)IV 11504 bps 8000
4000 EcoRV
sam7 6000
ori ColE1 bla oriT EcoRI
Abbildung 7.13: Plasmidkarte von pUWL-A-sam36+7
Replikatives Plasmid zur heterologen Expression von sam36 und sam7 in S. albus.
7.1.14 pUWL-A-sam7
HindIII EcoRV
ermE up rep
sam7 ori 8000 EcoRI
pUWL-A-sam72000 8949 bps 6000
oriT 4000 aac(3)IV
bla
ori ColE1
Abbildung 7.14: Plasmidkarte von pUWL-A-sam7
Replikatives Plasmid zur heterologen Expression von sam7 in S. albus.
CLXVIII Anhang 7.2 NMR-Daten
7.2.1 U3-7
Das Lösungsmittel DMSO-d6 wurde als interner Standard verwendet (δH = 2,50 ppm, δC = 39,5 ppm).
O NH2 5 10 4
10a 4a 8a 9a
8 9 1 1’ OH O 6’ O N OH H HO OH Abbildung 7.15: Strukturvorschlag für U3-7 Es handelt sich dabei um 1-N-β-Glucosyldiaminoanthrachinon (Mr: 400,39 g/mol).
ESI-MS (pos. Modus): m/z = 401,2 [M+H]+, m/z = 423,1 [M+Na]+, m/z = 823,3 [2M+Na]+
Tabelle 7.1: NMR-Daten für U3-7 Die Daten wurden aus 1H- und 13C-1D-Spektren und 1H,1H-COSY- sowie 1H,13C-HMBC-2D-Spektren abgelesen. 1 1 1 13 Position C [ppm] H (J Hz) [ppm] H, H-COSY H, C-HMBC 1 144,9 3-H, 1’-H 1-NH - 10,82 d (6,4) 2 125,1 7,42 d (9,6) 3-H 1-NH, 1J, 3-H 3 129,0 7,30 d (9,6) 2-H 2-H, 1J 4 146,7 2-H 4a 108,0 3-H 5 125,9 8,25 m 6-H 6-H, 7-H 6 132,7 7,82 m 5-H 5-H, 7-H, 8-H 7 132,6 7,81 m 8-H 5-H, 6-H, 8-H 8 125,7 8,24 m 7-H 6-H, 7-H 8a 133,8 5-H, 7-H, 8-H 9 181,5 (2-H), 8-H 9a 109,4 1-NH, 2-H 10 182,3 (3-H), 5-H 10a 133,9 5-H, 6-H, 8-H 1’ 83,2 4,72 d (8,4) 2’-H 1-NH, 2’-H 2’ 73,6 3,23 dd (8,8; 8,4) 1’-H, 3’-H 1-NH, 1’-H, 3’-H 3’ 77,6 3,32 dd (9,0; 8,8) 2’-H, 4’-H 1’-H, 2’-H
4’ 70,1 3,20 dd (9,2; 9,0) 3’-H, 5’-H 3’-H, 6’-Ha, 6’-Hb
CLXIX Anhang
Tabelle 7.1: NMR-Daten für U3-7 Die Daten wurden aus 1H- und 13C-1D-Spektren und 1H,1H-COSY- sowie 1H,13C-HMBC-2D-Spektren abgelesen.
5’ 77,9 3,36 ddd (9,2; 6,0; 2,0) 4’-H, 6’-Ha, 6’-Hb 4’-H, 6’-Hb
6’ 60,9 Ha: 3,69 dd (12,0; 2,0) 5’-H, 6’-Hb 4’-H, 5’-H
Hb: 3,48 dd (12,0; 6,0) 5’-H, 6’-Ha
7.3 Abkürzungsverzeichnis a) Physikalische Größen und Einheiten
% Prozent ∞ unendlich δ chemische Verschiebung λ Wellenlänge Ω Ohm °C Grad Celsius A Absorption Au Absorption units, Absorptionseinheiten bp Base pairs, Basenpaare Da Dalton g Gramm h Hour(s), Stunde(n) Hz Hertz J Kopplungskonstante kb Kilobase pairs, Kilobasenpaare l Liter m Meter M molare Masse [g/mol], molar [mol/L] min Minute(n) mol Einheit der Stoffmenge m/V Verhältnis Masse zu Volumen [g/l] m/z Masse/Ladung-Verhältnis
OD600 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm ppm parts per million psig pound-force per square inch gauge, relativer Druck
Rf Retentionsfaktor
CLXX Anhang rpm Rotations per minute, Umdrehungen die Minute sek Second(s), Sekunde(n) t Zeit tR retention time, Retentionszeit U Unit(s), Maß für die Enzymaktivität (entspricht der Menge an Enzym welches 1 μmol Substrat pro Minute umsetzt) V Volt bzw. Volumen [l] V/V Verhältnis Volumen zu Volumen
b) Vorsilben k kilo 103 c zenti 10-2 m milli 10-3 μ micro 10-6 n nano 10-9 p pico 10-12
c) Nukleotide
A Adenin T Thymin C Cytosin G Guanin
d) Aminosäuren
A Alanin C Cystein D Asparaginsäure E Glutaminsäure F Phenylalanin G Glycin H Histidin I Isoleucin K Lysin L Leucin M Methionin N Asparagin P Prolin Q Glutamin R Arginin S Serin T Threonin V Valin W Tryptophan Y Tyrosin
CLXXI Anhang
e) Sonstiges
Δ in einer Mutante inaktiviertes Gen 1D eindimensional 2D zweidimensional aac(3)IV Apramycinresistenzgen aadA Spectinomycinresistenzgen ADP Adenosindiphosphat APCI atmospheric pressure chemical ionization, Chemische Ionisation bei Atmosphären- druck aphII Kanamycinresistenzgen APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäuren ATP Adenosintriphosphat AUC Area under the curve, Fläche unter der Kurve bidest. bidestilliert bla β-Lactamresistenz BLASTp basic local alignment search tool BSA Bovine serum albumin, Rinderserumalbumin CAZy Carbohydrate Active enZymes CoA Coenzym A COSY correlation spectroscopy: homonukleare Korrelationsspektroskopie für 1H/1H d Schichtdicke DAD Dioden-Array-Detektor DF Durchfluss DMSO Dimethylsulfoxid
DMSO-d6 deuteriertes DMSO DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleosidtriphosphat, Nukleotide, DNA-Bausteine dTDP Desoxythymidindiphoshat DTT Dithiothreithol ε molarer Absorptionskoeffizient E. coli Escherichia coli
CLXXII Anhang EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EE Essigsäureethylester, Ethylacetat ESI Elektronenspray-Ionisation et al. et aliae, und andere EtOH Ethanol FPLC Fast Protein Liquid Chromatography GC-Gehalt Gehalt an Guanin und Cytosin GDP Guanidindiphosphat GT(s) Glykosyltransferase(n)
His6 Polypeptid mit sechs N- oder C-terminalen Histidinen HPLC High performance liquid chromatography, Hochleistungsflüssigkeitschromatogra- phie int Integrasegen IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid LB Lysogeny Broth LC liquid chromatography, Flüssigchromatographie LDH Laktatdehydrogenase MeOH Methanol MS Massenspektrometrie MSD Massenspektrometrie-Detektor NADH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (reduzierte Form) NaOH Natriumhydroxid NCBI National Center for Biotechnology Information Ni2+-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure NMR nuclear magnetic resonance, Kernspinresonanzspektroskopie oriT origin of transfer PCR Polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PEP Phosphoenolpyruvat PK Pyruvatkinase RP reversed phase, Umkehrphase RT Raumtemperatur SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sp. species SPE Solid Phase Extraction, Festphasenextraktion SV Säulenvolumen
CLXXIII Anhang TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin TRIS 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol tRNA transfer-RNA tsr Thiostreptonresistenzgen U2 1,4-Dihydroxyanthrachinon U3 1,4-Diaminoanthrachinon UDP Uridindiphosphat UV Ultraviolettes Licht VIS sichtbares Licht (Wellenlängenbereich 400 nm – 800 nm) X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid X-Gluc 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure
7.4 Abbildungsverzeichnis Abbildung 2.1: Strukturformeln der Saccharomicine A und B ...... 15 Abbildung 2.2: Strukturformel des Makrolid-Antibiotikums Erythromycin A ...... 17 Abbildung 2.3: Strukturformel von Simocyclinon D8 ...... 18 Abbildung 2.4: Strukturformeln der Amycomycine C und D ...... 19 Abbildung 2.5: Bekannter Biosyntheseweg von dTDP-6-deoxy-L-Talose und dessen Epimer dTDP-L- Rhamnose...... 19 Abbildung 2.6: Strukturformeln der glykosylierten Naturstoffe Nystatin (Streptomyces noursei), Daunorubicin (Streptomyces peucetius) sowie Streptomycin (Streptomyces griseus)...... 21 Abbildung 4.1: Postulierter Biosyntheseweg des Saccharomicin-Aglykons N-(m,p- Dihydroxycinnamoyl)-taurin (27,29)...... 89 Abbildung 4.2: HPLC-Chromatogramm (λ = 279 nm) des Aktivitätsassays aus dem Rohextrakt bei 28 °C...... 94 Abbildung 4.3: Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von Ses60310...... 95 Abbildung 4.4: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von Ses60310...... 95 Abbildung 4.5: Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von Ses60310 im Anschluss an die His6-tag-Abspaltung mittels TEV-Protease...... 96 Abbildung 4.6: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von Ses60310 im Anschluss an die Spaltung mittels TEV-Protease...... 97 Abbildung 4.7: Elutionschromatogramm der Streptavidin-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von N-terminal Strep-tag-fusioniertem Ses60310...... 98
CLXXIV Anhang Abbildung 4.8: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von N-terminal Strep-tag- fusioniertem Ses60310 im Anschluss an die Stretavidin-Affinitätschromatographie...... 99 Abbildung 4.9: HPLC-Chromatogramme (λ = 330 nm) der Kulturen von S. espanaensis mit (I) und ohne (II) Fütterung von trans-Resveratrol...... 100 Abbildung 4.10: HPLC-Chromatogramme (λ = 330 nm) der Kulturen von S. albus Rham x pUWL-A- 7665 (I) und S. albus Rham (II) nach Fütterung von trans-Resveratrol...... 101 Abbildung 4.11: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der Kultur von S. erythraea nach Fütterung von U3...... 102 Abbildung 4.12: Phylogenetischer Baum der zu CAZy-Familie 1 gehörenden GTs aus S. erythraea, bekannter N-GTs aus Actinobacteria sowie der Makrolidresistenz-vermittelnden GTs OleD und OleI aus Streptomyces antibioticus...... 106 Abbildung 4.13: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der Kulturen von S. albus Gluc x pUWL-A- sace_1884 (I), S. albus Gluc x pUWL-A-sace_3599 (II), S. albus Gluc x pUWL-A-sace_4470 (III) und S. albus Gluc (VI) nach Fütterung von U3...... 108 Abbildung 4.14: Vergleich der UV-Absorptionsspektren (A) von U3 (rot) mit U3-7 (lila) und (B) von U3 mit U3-8 (blau)...... 109 Abbildung 4.15: Mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärte Strukturformel von U3-7...... 110 Abbildung 4.16: Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung des nativen und des mutierten Gens sace_3599...... 111 Abbildung 4.17: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der Kulturen von S. erythraea WT (I), S. erythraea Δsace_3599 (II) und S. erythraea Δsace_3599 x pTOSz-sace_3599 (III) nach Fütterung von U3...... 111 Abbildung 4.18: Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung des nativen und des mutierten Gens sace_3599 mit verschiedenen Templates...... 112 Abbildung 4.19: Genomabschnitt um das N-GT-Gen sace_3599...... 114 Abbildung 4.20: SDS-PAGE der Testexpression von sace_3599 in E. coli Rosetta 2 x pET28a- sace_3599-N-his (45,3 kDa)...... 116 Abbildung 4.21: Elutionschromatogramm der Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie zur Aufreinigung von SACE_3599...... 117 Abbildung 4.22: SDS-PAGE der Aufreinigung von SACE_3599 mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration...... 117 Abbildung 4.23: Elutionschromatogramm der Gelfiltration zur Aufreinigung von SACE_3599...... 118 Abbildung 4.24: Reaktionsgleichung der Glucose-Übertragung von TDP-α-D-Glucose auf 1,4- Diaminoanthrachinon...... 118
CLXXV Anhang Abbildung 4.25: Photometrischer Aktivitätsassay von SACE_3599 (links) und Negativkontrolle (rechts)...... 119 Abbildung 4.26: HPLC-Chromatogramm (λ = 550 nm) der in vitro Aktivitätsassays bei 28 °C und pH 8,8. Negativkontrolle ohne Zugabe von SACE_3599 (I) und Assay unter Zugabe von SACE_3599 (II)...... 120 Abbildung 4.27: Talose-Biosynthese-Gen-Cluster in Kitasatospora sp. 152608...... 121 Abbildung 4.28: Agarose-Gelelektrophorese der Amplifizierung von KSS_03123 (1 kb) und aac(3)IV (0,9 kb) zum Nachweis der markerfreien Integration der dTDP-6-deoxy-L-Talose-Biosynthesegene in das Genom von S. albus...... 123 Abbildung 4.29: Phylogenetischer Baum aller GTs aus Kitasatospora sp. 152608...... 126 Abbildung 4.30: Transkriptionsraten aller GTs der CAZy-Familie 1 in DNPM-Medium (blau) im Vergleich zu NL5-Medium (rot) ...... 127 Abbildung 4.31: Phylogenetischer Baum der in DNPM-Medium hochregulierten GTs der CAZy-Familie 1 aus Kitasatospora sp. 152608 im Vergleich zu bekannten Rhamnose-GTs, Rhamnose- und Olivose- GTs und einer Talose-GT...... 128 Abbildung 5.1: Mutarotation am Beispiel von D-Glucose ...... 138 Abbildung 5.2: Aktivierung von D-Glucose zu dTDP-D-Glucose ...... 138 Abbildung 5.3: Strukturformeln von dTDP-6-deoxy-L-Talose, dTDP-L-Rhamnose und dTDP-L-Olivose ...... 142 Abbildung 7.1: Plasmidkarte von pET21a-7665-STN ...... CLXI Abbildung 7.2: Plasmidkarte von pET21a-7665-TSC ...... CLXI Abbildung 7.3: Plasmidkarte von pET21a-sam7-C-his-TEV ...... CLXII Abbildung 7.4: Plasmidkarte von pET21a-sam36-C-his-TEV ...... CLXII Abbildung 7.5: Plasmidkarte von pET28a-sace_3599-N-his ...... CLXIII Abbildung 7.6: Plasmidkarte von pET28a-sam7-N-his ...... CLXIII Abbildung 7.7: Plasmidkarte von pET28a-sam36-N-his ...... CLXIV Abbildung 7.8: Plasmidkarte von pKCΔsace_3599 ...... CLXIV Abbildung 7.9: Plasmidkarte pTOS-ermE* ...... CLXV Abbildung 7.10: Plasmidkarte pTOS-Talose ...... CLXV Abbildung 7.11: Plasmidkarte von pTOSz-sace_3599 ...... CLXVI Abbildung 7.12: Plasmidkarte von pUWL-A-sam36 ...... CLXVI Abbildung 7.13: Plasmidkarte von pUWL-A-sam36+7 ...... CLXVII Abbildung 7.14: Plasmidkarte von pUWL-A-sam7 ...... CLXVII Abbildung 7.15: Strukturvorschlag für U3-7...... CLXVIII
CLXXVI Anhang 7.5 Tabellenverzeichnis Tabelle 3.1: Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller mit Standort ...... 29 Tabelle 3.2: Verwendete Software, Datenbanken und Internetservices sowie deren Hersteller mit Standort ...... 30 Tabelle 3.3: Verwendete Chemikalien und Medienbestandteile sowie deren Hersteller mit Standort30 Tabelle 3.4: Verwendete organische Lösungsmittel sowie deren Hersteller mit Standort ...... 33 Tabelle 3.5: Verwendete Enzyme mit Hersteller und Standort ...... 33 Tabelle 3.6: Verwendete Kits sowie deren Hersteller mit Standort ...... 33 Tabelle 3.7: Für Kristallisationsversuche verwendete Screens mit Hersteller und Standort ...... 34 Tabelle 3.8: Sonstige verwendete Materialien sowie deren Hersteller mit Standort ...... 34 Tabelle 3.9: Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen und Dauerkulturen ...... 35 Tabelle 3.10: Lösungen für die Blau-Weiß-Selektion in E. coli ...... 35 Tabelle 3.11: Lösungen und Puffer zur Isolierung von Plasmid-DNA mittels Alkalischer Lyse ...... 35 Tabelle 3.12: Lösungen und Puffer zur Isolierung genomischer DNA aus Aktinomyceten-Stämmen .. 36 Tabelle 3.13: Lösungen zur Isolierung der Gesamt-DNA aus Aktinomyceten-Stämmen ...... 36 Tabelle 3.14: Lösungen und Puffer zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese ...... 36 Tabelle 3.15: Lösungen und Puffer zu dem Entfernen und Beladen der HisTrap™ FF Säule mit Ni2+- Ionen (171) ...... 37 Tabelle 3.16: Verwendete Puffer für die Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie ...... 37 Tabelle 3.17: Verwendete Puffer für die Proteinaufreinigung mittels Gelfiltration ...... 38 Tabelle 3.18: Zusammensetzung des 12 % Trenngels, pH 8,8 ...... 38 Tabelle 3.19: Zusammensetzung des 4 % Sammelgels, pH 6,8 ...... 38 Tabelle 3.20: Lösungen und Puffer für die diskontinuierliche SDS-PAGE ...... 39 Tabelle 3.21: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays zur Saccharomicin-Biosynthese ...... 39 Tabelle 3.22: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays mit SACE_3599 ...... 40 Tabelle 3.23: Verwendete Lösungen und Puffer zur Durchführung des Aktivitätsassays zur Konformation von U3-7 ...... 40 Tabelle 3.24: Substanzen für Biotransformationsexperimente ...... 41 Tabelle 3.25: Lösungen für die Festphasenextraktion ...... 41 Tabelle 3.26: Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie ...... 41 Tabelle 3.27: Nährmedien ...... 42 Tabelle 3.28: Verwendete Antibiotika mit entsprechenden Lösungsmitteln sowie Konzentrationen . 42 Tabelle 3.29: Verwendete E. coli-Stämme und deren Beschreibung ...... 43
CLXXVII Anhang Tabelle 3.30: Verwendete Aktinomyceten-Stämme und deren Beschreibung ...... 43 Tabelle 3.31: Sonstige verwendete Stämme und deren Beschreibung ...... 44 Tabelle 3.32: In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide ...... 44 Tabelle 3.33: In dieser Arbeit neu erstellte Plasmide ...... 46 Tabelle 3.34: Verwendetes Standard-Temperaturprogramm für die PCR ...... 57 Tabelle 3.35: Verwendetes Standard-Pipettierschema für die PCR ...... 57 Tabelle 3.36: Pipettierschema der Dephosphorylierung mit Hilfe der Antarktischen Phosphatase .... 58 Tabelle 3.37: Pipettierschema der Auffüllreaktion mit T4-DNA-Polymerase ...... 59 Tabelle 3.38: Zur Klonierung verwendete Primer ...... 64 Tabelle 3.39: Zur Klonierung verwendete PCR-Bedingungen ...... 65 Tabelle 3.40: PCR-Bedingungen zum Nachweis von Single- und Doppelcrossover-Mutanten ...... 67 Tabelle 3.41: Zeitplan der Probenentnahme ...... 68 Tabelle 3.42: Beschreibung der Säule sowie der His-trap-Methode ...... 71 Tabelle 3.43: Vorgehen bei dem Entfernen der Ni2+-Ionen und Neubeladen der HisTrap™ FF Säule .. 71 Tabelle 3.44: Beschreibung der Säule sowie der Strep-tag-Methode ...... 72 Tabelle 3.45: Beschreibung der Säule sowie der Gelfiltrations-Methode ...... 73 Tabelle 3.46: Zusammensetzung der Reaktionsansätze für Aktivitätsassays aus einem Rohextrakt ... 76 Tabelle 3.47: Zusammensetzung Aktivitätsassay SACE_3599 mittels HPLC-MS ...... 78 Tabelle 3.48: Zusammensetzung des photometrischen Aktivitätsassays SACE_3599 ...... 78 Tabelle 3.49: Übersicht über die verwendeten Stämme, Medien und gefütterten Substanzen ...... 80 Tabelle 3.50: Zeitlicher Ablauf der in vivo Biotransformationsstudien ...... 81 Tabelle 3.51: Parameter der APCI-Ionisierungsquelle...... 83 Tabelle 3.52: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methode tina3 ...... 83 Tabelle 3.53: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methoden antqui03 .... 84 Tabelle 3.54: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methode sam1 ...... 84 Tabelle 3.55: Laufmittelgradient sowie Messwellenlängen der HPLC-ESI-MS Methode yvo02 ...... 85 Tabelle 3.56: Zusammensetzung Aktivitätsassay β-Glucosidase in Na-Phosphat-Puffer ...... 86 Tabelle 3.57: Zusammensetzung Aktivitätsassay β-Glucosidase in Na-Acetat-Puffer ...... 86 Tabelle 4.1: GT-Gene aus dem Genom von S. erythraea ...... 103 Tabelle 4.2: Vergleich von SACE_3599 mit anderen GTs ...... 113 Tabelle 4.3: Genprodukte des Genomabschnitts um das N-GT-Gen sace_3599 ...... 114 Tabelle 4.4: Genprodukte des Talose-Biosynthese-Gen-Clusters ...... 122 Tabelle 4.5: GT-Gene aus Kitasatospora sp. 152608 ...... 124 Tabelle 5.1: Vergleich von Enzymen aus S. erythraea NRRL2338 mit bekannten PGMs ...... 139 Tabelle 5.2: Vergleich von Enzymen aus S. albus J1074 mit bekannten PGMs ...... 139
CLXXVIII Anhang Tabelle 7.1: NMR-Daten für U3-7 ...... CLXVIII
CLXXIX Danksagung 8 Danksagung Ich bedanke mich herzlich bei allen, die mich während meiner Promotion unterstützt haben und da- mit maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben:
Prof. Dr. Andreas Bechthold, unter dessen Leitung diese Arbeit durchgeführt wurde, danke ich für die Bereitstellung der interessanten Themen, die wissenschaftliche Betreuung meiner Arbeit und seinem Interesse daran.
Prof. Dr. Oliver Einsle, der sich freundlicherweise dazu bereit erklärt hat das Amt des Korreferenten zu übernehmen, danke für die Hilfe in Fragen der Proteinaufreinigung und Kristallisation.
Prof. Dr. Rolf Schubert danke für die freundliche Zusage als Drittprüfer an der Disputation teilzuneh- men.
Dr. Thomas Paululat von der Universität Siegen danke ich für die Durchführung der NMR-Messungen und die Strukturaufklärung. Vielen Dank für die große Hilfsbereitschaft und die gute Kooperation.
Dr. Heng Keat Tam von dem Institut für Organische Chemie und Biochemie danke ich für die Hilfe bei der Durchführung der Kristallisationsversuche und seine Ratschläge zur Proteinaufreinigung.
Prof. Dr. Andriy Luzhetskyy und Dr. Bogdan Tokovenko von der Universität des Saarlandes danke ich für die Bereitstellung der Genomsequenz von Kitasatospora sp. 152608 sowie der Transkriptomda- ten.
Dr. Björn Grüning von dem Institut für Informatik danke ich für die Hilfestellungen im Umgang mit Galaxy und die schönen Mittagspausen bei einer Schüssel Milchreis.
Dr. Gabriele Weitnauer danke ich für Ihre Hilfe in allen Lebenslagen, Ihr offenes Ohr und die guten Gespräche die wir immer führen konnten.
Meinen fleißigen Korrekturlesern Anja Greule, Denise Deubel und Johannes Bohli danke ich für ihre unermüdliche Jagd nach Fehlern und Unklarheiten aller Art.
Meinen lieben Kolleginnen und Kollegen mit denen ich die Denkzelle teilen durfte: Suzan Samra, Dr. Tina Strobel, Dr. Tanja Heitzler, Nils Gummerlich und Philipp Schwarzer. Auch wenn es häufig eng war – ich hätte mit niemandem anderen die Denkzelle teilen wollen. Vielen Dank für die tatkräftige Un- terstützung, eure guten Ratschläge sowie die schöne gemeinsame Zeit.
Meinen Diplomanden Milena Schäffer und Nils Gummerlich danke ich dafür, dass sie mir eine große Hilfe waren und dass es darüber hinaus viel Spaß gemacht hat gemeinsam mit ihnen im Labor zu stehen.
CLXXX Danksagung Meinen Praktikanten Marcel Rommel und Nardine Soliman danke ich für ihr Interesse an meiner Arbeit und die große Motivation die sie an den Tag gelegt haben.
Den Assistenten des PB0/1-Praktikums Judith Trefzger, Dr. Tanja Heitzler, Philipp Werner, Marcus Essing, Dr. Bettina Siedle und Katharina Heßelbach danke ich für die gute Zusammenarbeit bei der Betreuung der Studenten und die tolle Stimmung im Praktikum.
Unseren „Guten Feen“ Elisabeth Welle, Sandra Groß, Marcus Essing, Monika Weber, Sandra Cabrera, Tanja Herbstritt und Dr. Susanne Elfert danke ich dafür, dass sie in Labor und Sekretariat immer alles am Laufen halten.
Dr. Arne Gessner, Stefanie Hackl, Elisabeth Welle und SongYa Zhang danke ich für die Betreuung der LC-MS-Anlage und die Lösung aller damit verbundenen Probleme zu jeder Tages- und Nachtzeit.
Anja Greule, Dr. Irene Santillana, Denise Deubel, Stefanie Hackl, Dr. Tina Wardecki und Regina Dorn- hof danke ich für die stete Hilfsbereitschaft. Suzan Samra danke ich darüber hinaus für ihre geradezu übermenschliche Hilfsbereitschaft die sie jedem von uns Tag für Tag zuteil kommen lässt.
Elisabeth Welle, Dr. Jasmin Kroeger, Anja Greule, Dr. Irene Santillana und Stefanie Hackl danke ich für die vielen angenehmen (wenn auch nicht immer fachlichen) Gespräche.
Meinen ehemaligen und jetzigen Kollegen Denise Deubel, Astrid Erber, Anja Greule, Sandra Gross, Nils Gummerlich, Stefanie Hackl, Dr. Uwe Hardter, Dr. Tanja Heitzler, Katharina Heßelbach, Monika Kaszubowska, Dr. Jasmin Kroeger, Dr. Sarah Maier, Suzan Samra, Dr. Irene Santillana, Milena Schäf- fer, Philipp Schwarzer, Dr. Theresa Siegl, Dr. Tina Strobel, Elisabeth Welle, Dr. Julia Wunsch-Palasis, Jing Zhu und ChiJian Zuo danke ich für die gute Zusammenarbeit im Labor.
Dem kleinen Ward Leo danke ich für seine beruhigende Art, seine Gitarren-Solos und seine einzigar- tige Darbietung deutscher Kinderlieder. Er wusste von Anfang an wie er seiner „Tante“ ein Lächeln ins Gesicht zaubern kann.
Meiner Familie danke ich für ihre grenzenlose Liebe und Unterstützung. All denjenigen die viel zu früh von uns gehen mussten danke ich für die bleibenden Spuren, die sie in meinem Leben hinterlas- sen haben.
Meinem Mann Johannes danke ich dafür, dass er in all den Jahren gemeinsam mit mir die Höhen und Tiefen durchgestanden hat.
CLXXXI Bildungsgang 9 Bildungsgang
Diese Seite enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung.