Nghiên Cứu Đa Dạng Của Họ Bọ Cánh Cứng Ăn Lá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

------

NGUYỄN THỊ ĐỊNH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG CỦA HỌ BỌ CÁNH CỨNG ĂN LÁ (CHRYSOMELIDAE) VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG VỚI THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG CỦA VƯỜN QUỐC GIA NÚI CHÚA, TỈNH NINH THUẬN, VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI -2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

------

NGUYỄN THỊ ĐỊNH

Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 9 42 01 20 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN VĂN SINH 2. TS. JESÚS GÓMEZ-ZURITA

HÀ NỘI - 2018 i

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả nghiên cứu đã được tôi công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Định

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng của họ Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của Vườn quốc gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử”, Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ, chuyên viên của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu de Biologia Evolutiva (IBE) ở Tây Ban Nha; Ban Giám hiệu Học viện Khoa học và Công nghệ. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó. Tôi xin chân thành cảm ơn chương trình hợp tác khoa học giữa Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam và Hội đồng nghiên cứu Quốc Gia Tây Ban Nha, giai đoạn 2011-2014 đã tài trợ học bổng và kinh phí cho tôi trong quá trình học tập ở Tây Ban Nha. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Tổng cục Lâm nghiệp Việt Nam đã cho phép tôi được làm việc trong VQG Núi Chúa. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban Quản lý VQG Núi Chúa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thu mẫu ở VQG Núi Chúa. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu trong phòng Sinh thái môi trường đất (IEBR), Annabela Cardoso và các bạn bè sinh viên trong phòng thí nghiệm Đa dạng và Tiến hóa côn trùng ăn lá (IBE) đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Sinh (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật), Tiến sĩ Jesús Gómez-Zurita (de Biologia Evolutiva, Tây Ban Nha) – những người thầy trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận án này. Cuối cùng tôi chân thành cảm ơn tới chồng tôi là Trịnh Đình Cường, con gái Trịnh Nguyễn Thu Thủy, con trai Trịnh Bình Minh và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này.

NCS: Nguyễn Thị Định iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...... i LỜI CẢM ƠN ...... ii MỤC LỤC ...... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...... vi DANH LỤC CÁC BẢNG ...... viii DANH LỤC CÁC HÌNH ...... ix MỞ ĐẦU...... 1 1.1. Lý do chọn đề tài ...... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ...... 1 1.3. Nội dung nghiên cứu ...... 2 1.4. Đối tượng nghiên cứu...... 2 1.5. Phạm vi nghiên cứu ...... 2 1.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...... 2 1.6.1. Ý nghĩa khoa học...... 2 1.6.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ...... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...... 3 1.1. Các vấn đề liên quan đến luận án ...... 3 1.1.1. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học ...... 3 1.1.1.1. Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan ...... 3 1.1.1.2. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để tăng tốc độ đánh giá đa dạng sinh học ...... 6 1.1.2. Sự không đồng nhất của môi trường và ảnh hưởng của nó đến đa dạng sinh học ...... 11 1.1.3. Chrysomelidae là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng sinh học và nghiên cứu sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái...... 12 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae ở Việt Nam ...... 14 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới ...... 15 1.2. Khái quát về điều kiện tự nhiên – kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu ...... 16 1.2.1. Vị trí địa lý ...... 17 1.2.2. Địa hình ...... 17 1.2.3. Khí hậu, thủy văn ...... 18 1.2.4. Đặc điểm sinh thái thảm thực vật ...... 20 iv

1.2.5. Hệ động, thực vật ...... 21 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 23 2.1. Phương pháp thu mẫu và phân chia sinh cảnh ở VQG Núi Chúa ...... 23 2.1.1. Thiết kế và thu thập mẫu vật ...... 23 2.1.2. Phân chia sinh cảnh trong khu vực thu mẫu ở VQG Núi Chúa ...... 27 2.2. Phương pháp sinh học phân tử: ...... 27 2.3. Phương pháp xác định loài Chrysomelidae ...... 29 2.4. Phương pháp xác định thức ăn của các loài Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ...... 31 2.5. Đánh giá độ giàu loài tiềm năng của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ...... 31 2.6. Nhóm các phương pháp xác định mối liên quan của Chrysomelidae với điều kiện môi trường ...... 31 2.6.1. Phân tích biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian ...... 31 2.6.2.Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA) để tìm ra nhân tố tác động tới mối liên hệ giữa Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng ...... 31 2.6.3. Đánh giá đa dạng beta của mối tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng theo độ cao (sinh cảnh) ...... 32 2.6.4. . Phân tích mô hình của mạng lưới tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng ...... 33 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...... 34 3.1. Phân định vùng chuyển tiếp sinh thái ...... 34 3.2. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa ...... 35 3.2.1. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên đặc điểm hình thái ...35 3.2.2. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên dữ liệu ADN ...... 43 3.2.3. Tiềm năng đa dạng loài Chrysomelidae đạt được ở VQG Núi Chúa ...... 49 3.2.4. Đánh giá độ giàu loài của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ...... 50 3.3. Thực vật chủ của Chrysomelidae ...... 52 3.4. Sự biến đổi của quần xã Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa ...... 62 3.4.1. Cấu trúc của quần xã Chrysomelidae xuyên qua không gian và độ cao ở VQG Núi Chúa ...... 62 3.4.1.1. Ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” (sự chiếm cứ giữa lãnh thổ) tới Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ...... 62 3.4.1.2. Sự biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian ...... 64 3.4.2. Sự thay đổi của tương tác giữa Chrysomelidae và thực vật chủ theo sự thay đổi của độ cao ...... 71 3.4.2.1 Sự sắp xếp phù hợp với quy chuẩn ...... 71 v

3.4.2.2. Đa dạng beta của tương tác Galerucinae và thực vật chủ theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa ...... 73 3.4.3. Hoạt động bảo tồn ở VQG Núi Chúa cần chú ý đến sự mất môi trường sống của quần xã Chrysomelidae ...... 79 KẾT LUẬN ...... 80 KIẾN NGHỊ ...... 81 DANH SÁCH TÀI LIỆU TRÍCH DẪN ...... 82 DANH SÁCH CÁC CÔNG BỐ ...... 103 PHỤ LỤC ...... 104

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADN: Acid deoxyribonucleic AFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt khuếch đại ARN: Acid Ribonucleic bPTP: Mô hình Poisson Tree Processes Cây “ultrametric”: Cây quan hệ họ hàng mà tất cả chiều dài từ rễ tới đỉnh là bằng nhau Cây ML: Cây quan hệ họ hàng có khả năng xảy ra nhất CCA: Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn Chi-sq: Giá trị phân phối khi bình phương COI: Gen Cytochrome c oxidase subunit I cpDNA: ADN lục lạp GenBank: Ngân hàng gen GMYC: Mô hình Generalized Mixed Yule-Coalescent Haplotype: Dạng đơn bội ITS: Vùng sao chép bên trong Ribosome nhân Loài singleton: Loài chỉ thu được một cá thể Mmid-domain: Sự chiếm cứ giữa lãnh thổ p- distance: Khoảng cách cặp so sánh PCR: Phản ứng khuếch đại gen RFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn RAPD: Đa hình khuếch đại ngẫu nhiên SC: Mô hình tiến hóa đồng hồ nghiêm ngặt (Strict clock) SSR: Lặp lại trình tự đơn giản ULN: Mô hình tiến hóa đồng hồ tự do thông thường (Unstrict lognomal clock) VIF: Yếu tố làm tăng sự khác nhau VQG: Vườn Quốc Gia

βOS: Sự không giống nhau của tương tác hình thành giữa các loài chia sẻ

βrepl: Đa dạng beta của các loài thay thế vii

βrich: Đa dạng beta của các loài mất đi/tăng lên

βS: Sự không giống nhau trong thành phần loài của quần xã βsim: Đa dạng beta của thành phần các loài thay thế βsne: Đa dạng beta của thành phần các loài tạo ổ

βST: Sự không giống nhau của các tương tác do các loài thay thế

βtotal: Đa dạng beta tổng phản ánh cả loài thay thế và loài mất đi/tăng thêm

βWN: Sự không giống nhau của các tương tác trong hai sinh cảnh

GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ Loài thay thế: Là những loài xuất hiện ở vị trí mới và thay thế loài mất đi ở vị trí cũ (số loài thay thế bằng số loài mất đi). Loài tạo ổ: Là những loài là tập hợp con của những loài thu được ở vị trí có nhiều loài hơn. Loài mất đi: Là loài xuất hiện ở vị trí cũ nhưng lại không xuất hiện ở vị trí mới Loài tăng thêm: Là loài xuất hiện ở vị trí mới mà vị trí khác không có. Loài chia sẻ: Là loài giống nhau giữa các vị trí so sánh. Loài bPTP: Là loài xác định được bằng phương pháp Mô hình Poisson Tree Processes (bPTP). Bộ ba mã vạch: Là một phương pháp phân loại sử dụng một đoạn gen ngắn trong ADN của sinh vật để xác định sinh vật đó là thuộc về một loài riêng biệt.

viii

DANH LỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Tọa độ các vị trí thu mẫu ở VQG Núi Chúa……………………………….25 Bảng 3.1: Đa dạng loài Chrysomelidae trong các tuyến điều tra và theo độ cao ở VQG Núi Chúa………………………………………………………………………………43 Bảng 3.2: Kết quả phân định loài dựa trên trình tự ADN gen cox1 của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa theo các thuật toán và mô hình khác nhau …………………………..44 Bảng 3.3: Sự không đồng thuận giữa loài hình thái và loài bPTP của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ………………………………………………………………………..45 Bảng 3.4: Dự đoán đa dạng loài Chryromelidae đạt được trong các tuyến thu mẫu, trong các sinh cảnh và trong toàn bộ khu vực nghiên cứu ở VQG Núi Chúa ……...... 50 Bảng 3.5: Nhận dạng phân loại học của các trình tự ADN lục lạp psbA-TrnH của thực vật chủ của các cá thể thuộc phân họ Galerucinae đạt được từ chương trình BAGpipe...... 54 Bảng 3.6: Số cá thể, số trình tự ADN vùng psbA-trnH và số họ thực vật chủ của các loài thuộc phân họ Galerucinae ở khu vực nghiên cứu …………………………...... 59 Bảng 3.7: So sánh cấu trúc của quần xã Chrysomelidae giữa các tuyến thu mẫu ở VQG Núi Chúa……………………………………………………………………………....65 Bảng 3.8: Kết quả phân tích CCA của riêng từng biến số đến tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ ở khu vực nghiên cứu…………………………………...73 Bảng 3.9: Sự không giống nhau của quần xã Galerucinae và quần xã thực vật chủ giữa rừng khô và rừng ẩm ở khu vực nghiên cứu…………………………………………..73 Bảng 3.10: So sánh đặc điểm cấu trúc của mạng lưới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh khô và ẩm ở khu vực nghiên cứu…..78

DANH LỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí của gen COXI trong gen ty thể………………………………………..8 Hình 1.2: Sơ đồ VQG Núi Chúa………………………………………………………19 Hình 2.1: Thu mẫu ở khu vực nghiên cứu…………………………………………….24 Hình 2.2: Sơ đồ thu mẫu Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ………………………….26 Hình 3.1: Mô hình phân bố nhiệt trung bình/năm theo độ cao ở khu vực Núi Chúa….34 Hình 3.2: Mô hình phân bố loài giống nhau và loài đơn nhất dọc theo độ cao ở khu vực nghiên cứu …………………………………………………………………………….35 Hình 3. 3: Xác định loài dựa trên cây mtADN của Chrysomelidae (loài từ 001 đến 069) ở VQG Núi Chúa………………………………………………………………………47 Hình 3.4: Xác định loài dựa trên mtADN của Chrysomelidae (các loài từ 070-155) ở VQG Núi Chúa………………………………………………………………………...49 Hình 3.5: Sự sắp xếp phân loại học của trình tự ADN thức ăn của Galerucinae (loài số 87) theo chương trình BAGpipe……………………………………………………….53 Hình 3.6: Tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ của chúng ở khu vực nghiên cứu …………………………………………………………………………………………60 Hình 3.7: Mạng lưới tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ ở khu vực nghiên cứu …………………………………………………………………………………...... 62 Hình 3.8: Sự thay đổi đa dạng loài alpha của Chrysomelidae dọc theo độ cao ở VQG Núi Chúa ………………………………………………………………...... 64 Hình 3.9: So sánh đa dạng beta của Chrysomelidae theo không gian ở VQG Núi Chúa ...... 69 Hình 3.10: Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn của các biến số tới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ ở trong khu vực nghiên cứu………………………...72 Hình 3.11a: Mạng lưới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh ở VQG Núi Chúa …………………………………………………………..76 Hình 3.11b: Đồ thị tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh ở VQG Núi Chúa…………………………………………………………………...... 77

MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài Các quần xã sinh vật không phải là các đơn vị độc lập, mà là những mảnh ghép của bức tranh môi trường tự nhiên, và có sự phụ thuộc lẫn nhau. Trong đó, quần xã thực vật có liên quan chặt chẽ đến tính chất vật lý của môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, bức xạ mặt trời…Các nhân tố vật lý này thay đổi theo độ cao, sẽ kéo theo sự thay đổi trong cấu trúc của quần xã thực vật. Về phần mình, thực vật là thức ăn của nhiều loại côn trùng, có vai trò quyết định trong sự đa dạng cũng như sự phân bố của chúng. Nghiên cứu về phản ứng của côn trùng ăn thực vật với sự thay đổi của quần xã thực vật theo độ cao sẽ giúp chúng ta hiểu biết rõ hơn về mối quan hệ phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái. Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) là một họ lớn nhất trong bộ cánh cứng (Coleoptera). Thức ăn của Chrysomelidae là thực vật, vì vậy chúng có liên kết chặt chẽ với thực vật trong toàn bộ đời sống và việc thu bắt mẫu của chúng tương đối đơn giản. Do đó, Chrysomelidae là nhóm côn trùng phù hợp làm đối tượng cho việc nghiên cứu sự phụ thuộc của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái. Vườn Quốc Gia (VQG) Núi Chúa bao gồm diện tích rừng bán khô hạn độc đáo nhất Việt Nam và quần xã thực vật ở đây có sự thay đổi rõ rệt theo độ cao từ rừng khô trên đất thấp, qua rừng chuyển tiếp (rừng bán ẩm) tới rừng ẩm thường xanh trên núi cao. Vì vậy, VQG Núi Chúa là địa điểm lý tưởng để thực hiện nghiên cứu của luận án Vì tất cả các lý do trên tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của vườn quốc gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử” 1.2. Mục tiêu của đề tài Đánh giá sự đa dạng loài và sự biến động theo không gian của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae và đánh giá sự thay đổi thức ăn của chúng theo không gian.

1.3. Nội dung nghiên cứu Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để đánh giá sự đa dạng loài của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Xác định sự biến đổi thành phần của họ Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo không gian ở VQG Núi Chúa. 1.4. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các loài trong họ Chrysomelidae thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera) và thức ăn của chúng. 1.5. Phạm vi nghiên cứu Đề tài đánh giá đa dạng loài và tương tác loài của Chrysomelidae theo không gian thay đổi từ rừng khô trên đất thấp tới rừng ẩm ở độ cao trên 300 m so với mức nước biển, trong khu vực khoảng 10 km2 của Vườn Quốc Gia Núi Chúa, nằm trên địa bàn 02 huyện Ninh Hải và Thuận Bắc, tỉnh Ninh Thuận, phía Nam Việt Nam. 1.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.6.1. Ý nghĩa khoa học Đây là nghiên cứu đầu tiên về quần xã Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Kết quả của nghiên cứu cho phép đánh giá sự đa dạng quần xã Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa, khám phá một số loài mới cho khoa học và ghi nhận thực vật chủ của một số nhóm loài của họ Chrysomelidae. 1.6.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả của luận án cung cấp thông tin để hiểu rõ hơn về cấu trúc của đa dạng sinh học và nguy cơ làm mất đa dạng sinh học ở vùng nhiệt đới, từ đó có thể rút ra những nhận thức có liên quan đến bảo tồn.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các vấn đề liên quan đến luận án 1.1.1. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học 1.1.1.1. Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan Định nghĩa đa dạng sinh học: Theo Luật Đa dạng sinh học (2008) thì “Đa dạng sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong tự nhiên”. Ba cấp độ này làm việc cùng nhau để tạo ra sự phức tạp của sự sống trên Trái đất [1]. Sự đa dạng di truyền ở cấp độ cơ bản nhất của nó được thể hiện bởi sự khác biệt trong trình tự của các nucleotide (adenine: A, cytosine: C, guanine: G, thymine: T…) hình thành nên ADN trong các tế bào của sinh vật. ADN được chứa trong các nhiễm sắc thể có mặt trong tế bào; một số nhiễm sắc thể được chứa trong các bào quan của tế bào (ví dụ, các nhiễm sắc thể của ty thể và lục lạp). Mỗi một gen là một đoạn của ADN nằm trên nhiễm sắc thể và quy định một đặc tính cụ thể của một sinh vật. Whittaker (1972) đưa ra 3 khái niệm đa dạng trong sinh thái học: đa dạng alpha, đa dạng bê ta và đa dạng gamma. Đa dạng alpha đánh giá đa dạng cho tập hợp mẫu từ một quần xã nhất định. Đa dạng beta đánh giá sự thay thế loài hay sự thay đổi thành phần sinh vật khi chuyển từ quần xã này sang quần xã khác. Đa dạng gamma đánh giá sự phong phú loài của một loạt sinh cảnh (một cảnh quan, một khu vực địa lý hoặc một hòn đảo), nó là hệ quả của đa dạng alpha của các quần xã thành phần và của đa dạng beta giữa chúng [2]. Mora et al. (2011) dự đoán có khoảng 8,7 triệu (± 1,3 triệu) loài có nhân trên toàn cầu; trong đó có khoảng 2,2 triệu (± 0,18 triệu) là sống dưới biển. Họ cho rằng khoảng 86% các loài đang tồn tại trên trái đất và 91% các loài trong đại dương vẫn đang chờ đợi mô tả [3]. Đến nay, tổng số loài mô tả được chấp nhận trên thế giới được ước tính là gần 1.900.000 loài và có khoảng 18.000 loài mới được miêu tả mỗi năm (năm 2007) (Chapman 2009) [4]. Nhiều loài đã tuyệt chủng trong lịch sử địa chất của trái đất. Lý do chính cho những sự tuyệt chủng là sự thay đổi môi trường hoặc sự cạnh tranh sinh học. Tỷ lệ tuyệt chủng gây ra bởi con người lớn hơn tỷ lệ tuyệt chủng tự nhiên của chúng khoảng từ 1.000 đến 10.000 lần. Hiện nay, sự tác động của con người

4 gây ra sự tuyệt chủng của các loài sinh vật trên trái đất là một trong những vấn đề môi trường lớn nhất đối với nhân loại (Pidwirny, 2015) [5]. Đánh giá đa dạng sinh học: Trong ba cấp độ đa dạng sinh học, cấp độ đa dạng loài gần như được áp dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh thái và bảo tồn sinh học, mặc dù các mức độ đa dạng của bậc phân loại cao hơn (chi, họ, bộ) hoặc mô hình đa dạng tiến hóa đôi khi cũng được coi là đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu cổ sinh vật học (Foote 1997; Roy et al. 1996; Raup và Sepkoski 1984) [6, 7, 8]. Do đó, các nhà sinh vật học thường đánh giá đa dạng sinh học thông qua đánh giá độ giàu loài. Có hai phương pháp chính để đánh giá độ giàu loài: (1) phương pháp đánh giá mang tính định tính bao gồm đa dạng loài alpha là tổng số loài trong một quần xã có trong một hệ sinh thái cụ thể. Tính đa dạng beta mô tả mức độ dao động thành phần loài khi các yếu tố môi trường thay đổi. Tính đa dạng gamma áp dụng cho những khu vực rộng lớn hơn về mặt địa lý. Trong thực tế, ba chỉ số đa dạng này thường liên quan chặt chẽ với nhau. (2) Phương pháp đánh giá mang tính định lượng bao gồm đánh giá số lượng cá thể hay sinh khối của một loài, hay mật độ loài, đó là số lượng mỗi loài trong khu vực hay đơn vị thu mẫu, ví dụ như số lượng các loài trên một mét vuông (Magurran 2013) [9] và các chỉ số sinh thái. Độ giàu loài (số lượng các loài trong một khu nghiên cứu) đại diện cho một thước đo duy nhất nhưng quan trọng, nó có giá trị như sự phổ biến chung của đa dạng sự sống nhưng nó phải được tích hợp với các số liệu khác để nắm bắt đầy đủ các mặt của đa dạng sinh học. Chỉ số sinh thái sử dụng số liệu định lượng để đo lường các khía cạnh của đa dạng sinh học, điều kiện sinh thái, sự có lợi, hoặc sự điều khiển các thay đổi, nhưng không có chỉ số sinh thái đơn lẻ để nắm bắt tất cả các mặt của đa dạng sinh học. Lý tưởng nhất, để đánh giá các điều kiện và xu hướng của đa dạng sinh học trên toàn cầu hoặc phần nhỏ hơn là đo lường sự phong phú của tất cả các sinh vật theo không gian và thời gian, sử dụng phân loại (chẳng hạn như số lượng các loài), đặc điểm chức năng (ví dụ cây cố định nitơ như đậu so với cây không cố định nitơ), và sự tương tác giữa các loài có ảnh hưởng đến động lực và chức năng của chúng (ví dụ ăn thịt, ký sinh, cạnh tranh, giúp thụ phấn, và ảnh hưởng của những tương tác này đến hệ sinh thái như thế nào). Thậm chí quan trọng hơn sẽ là đánh giá sự dịch chuyển của đa

5 dạng sinh học trong không gian hoặc thời gian. Hiện nay, chúng ta không thể làm được điều này với độ chính xác cao bởi vì các số liệu còn thiếu. Khủng hoảng đa dạng sinh học: là sự mất đi của gen, các loài và các hệ sinh thái. Mooney (2010) cho thấy ví dụ về các tổn thất to lớn về sự mất đa dạng sinh học ở tất cả các cấp của sinh vật từ gen, các loài đến hệ sinh thái và toàn bộ cảnh quan [10]. Từ thế kỷ 17, có ít nhất 717 loài động vật và 87 loài thực vật đã mất đi. Ngày nay, hơn 17.000 loài thực vật và động vật có nguy cơ cùng số phận (Danh sách đỏ IUCN). Vos et al. (2015) ước tính rằng sự mất đi trong tự nhiên có thể gần với tỷ lệ 0,1 loài trên một triệu loài trên một năm và do đó tỷ lệ tuyệt chủng hiện nay là cao hơn 1000 lần so với tỷ lệ tự nhiên và trong tương lai có thể sẽ cao hơn 10.000 lần [11]. Levin (2002) cho thấy rằng trung bình cứ 20 phút có một loài trên trái đất bị mất đi. Sinh thái học ước tính rằng một nửa của tất cả các loài chim đang sống và động vật có vú sẽ biến mất trong vòng 200 hoặc 300 năm [12]. Nhân tố chính cho sự thay đổi đa dạng sinh học trong tương lai bao gồm sự thay đổi trong sử dụng đất, biến đổi khí hậu, lắng đọng Ni tơ, trao đổi sinh học và hấp thụ khí CO2 (Sala et al., 1997) [13]. Hậu quả của sự tuyệt chủng có thể phá vỡ quá trình sinh thái quan trọng như thụ phấn và phát tán hạt giống, dẫn đến sự mất mắt xích trong lưới và chuỗi thức ăn dẫn đến sự sụp đổ của hệ sinh thái và làm cho tăng tỷ lệ tuyệt chủng tổng thể (Sodhi et al. 2009) [14]. Sau khi hiện tượng tuyệt chủng bùng phát này kết thúc, số lượng loài cũng có thể trở lại như mức trước nhưng chắc chắn sẽ có ít hơn nhóm phân loại bậc cao hơn so với hiện tại. Một sự thay đổi quy mô như vậy trong hệ sinh vật của trái đất sẽ làm nghèo đa dạng sinh học trên hành tinh trong nhiều triệu năm tới (Levin 2002) [12]. Trở ngại phân loại trong nghiên cứu đa dạng sinh học: Phân loại thường được nhắc đến là sự mô tả lý thuyết và thực hành, đặt tên và sắp xếp có hệ thống các sinh vật sống. Công việc này là cần thiết cho sự hiểu biết cơ bản về đa dạng sinh học và bảo tồn. Việc thiếu tên khoa học và những khó khăn trong việc xác định loài trong nghiên cứu sinh thái là "trở ngại phân loại" (New, 1984) [15]. Điều này đang có ảnh hưởng rất lớn cho khoa học bảo tồn. Nhiều loài sẽ bị tuyệt chủng trước khi chúng được mô tả và chúng ta vẫn tiếp tục không biết chính xác có bao nhiêu loài trên hành tinh của chúng

6 ta. Các "trở ngại phân loại" đã dẫn tới sự hiểu biết không đầy đủ về phần lớn đa dạng sinh học toàn cầu.

Như vậy, với sự đa dạng loài rất cao trên hành tinh của chúng ta, có rất nhiều loài đang chờ được mô tả trong khi có nhiều trở ngại trong việc định danh loài, nhiều loài có nguy cơ bị tuyệt chủng trước khi được mô tả. Điều này dẫn đến chúng ta sẽ đánh giá đa dạng sinh học không được chính xác và các nhà khoa học đã tìm ra công cụ hữu dụng giúp đánh giá đa dạng sinh học nhanh và chính xác, đó là công cụ sinh học phân tử. 1.1.1.2. Sử dụng công cụ sinh học phân tử để tăng tốc độ đánh giá đa dạng sinh học Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng loài Như đã đề cập ở trên, có ba cấp độ đa dạng sinh học: Đa dạng loài, đa dạng di truyền và đa dạng hệ sinh thái. Sinh học phân tử là một lĩnh vực của sinh học liên quan đến quá trình phiên mã gen cho sản phẩm acid Ribonucleic (ARN), sự dịch mã của ARN thành protein và vai trò của những protein thể hiện trong chức năng tế bào (https://www.news-medical.net/life-sciences/Molecular-Biology-Techniques.aspx#). Mục đích chính của những kỹ thuật sinh học phân tử là có được trình tự ADN của gen mục tiêu. Những bước chính là: (1) tách triết ADN mục tiêu, (2) khuếch đại đoạn ADN mục tiêu (PCR) và (3) giải trình tự ADN: là việc xác định thứ tự của các nucleotide A, G, C và T có trong một phân đoạn của ADN mục tiêu. Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự nhuộm màu là phương pháp chuẩn trong phân tích trình tự ADN. Đến nay, kỹ thuật giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đã được áp dụng trong một loạt các trường hợp, bao gồm cả trình tự cả hệ gen, các trình tự mục tiêu, phát hiện vị trí ràng buộc của các yếu tố phiên mã và sự biểu hiện sao chép đa hình của ARN không mã hóa. Tùy thuộc vào mục tiêu của nhà khoa học nhưng mục đích cuối cùng là nhận được trình tự của ADN để so sánh giữa chúng với nhau. Mã vạch ADN dựa trên gen ty thể (thường xuyên nhất gen Cytochrome oxidase subunit I: COI) đã nổi lên như một công cụ hữu ích để xác định các loài động vật. Mã vạch ADN được sử dụng như một công cụ hiệu quả cho cả việc xác định các loài đã biết và phát hiện ra những loài mới (Hebert et al. 2003, 2010, Savolainen et al. 2005) [16, 17, 18]. Ban đầu, mã vạch ADN đã được đề xuất cho giới động vật vào năm 2003,

7 khi Hebert và các đồng nghiệp đã thử nghiệm một mã vạch gen đơn để xác định loài và đặt ra thuật ngữ "mã vạch ADN" (Hebert et al. 2003) [16]. Kể từ thời điểm đó trình tự gen COI đã được sử dụng như là tác nhân định danh trong phần lớn các ngành động vật bao gồm động vật có xương sống (Hebert et al. 2004, Ward et al. 2005, Kerr et al. 2007, Smith et al. 2005, Nijman và Aliabadian 2010) [19, 20, 21, 22, 23] và động vật không xương (Hajibabaei et al. 2006, Bucklin et al. 2011, Hausmann et al. 2011) [24, 25, 26]. Trong những năm gần đây, các tiện ích thiết thực của mã vạch ADN chứng tỏ là một công cụ hấp dẫn để giúp giải quyết sự mơ hồ trong phân loại (Hebert et al. 2004, 2010) [17, 19], đánh giá đa dạng sinh học (Plaisance et al. 2009, Naro-Maciel et al. 2009, Grant et al. 2011) [27, 28, 29], và trong nghiên cứu sinh học bảo tồn (Neigel et al. 2007, Rubinoff 2006, Dalton và Kotze 2011) [30, 31, 32]. Mã vạch ADN có thể cung cấp thêm cơ sở dữ liệu giúp phân loại loài được chính xác hơn (Thompson et al. 2012) [33]. Thứ hai, mã vạch ADN có thể giúp xác định loài trong những trường hợp việc định loại chỉ được thực hiện tới mức chi hoặc họ. Thứ ba, dữ liệu di truyền thu thập cho mã vạch ADN thường bao gồm các biến đổi trong một loài, chúng cho phép phân tích theo hướng mức độ thấp của quần thể bao gồm cả việc phát hiện các cấu trúc di truyền, và trong một số trường hợp là theo dõi biến động quần thể (Nagy et al. 2013) [34]. Mã vạch ADN cũng có thể được áp dụng như là công cụ để giải quyết các câu hỏi cơ bản về sinh thái, tiến hóa và sinh học bảo tồn (Kress et al. 2014) [35]. Mã vạch ADN là một hoặc vài chuỗi gen tương đối ngắn lấy từ một phần của bộ gen tiêu chuẩn và được sử dụng để xác định loài. Một gen được sử dụng làm gen mã vạch ADN phải thỏa mãn ba tiêu chuẩn: (1) Có sự khác nhau và sự biến đổi gen có ý nghĩa ở cấp độ loài; (2) có vị trí sườn (flanking) bảo tồn để phát triển mồi PCR chung áp dụng cho số lượng phân loại học lớn; (3) có độ dài tương đối ngắn để dễ dàng tách chiết và khuếch đại ADN (Kress và Erickson 2008) [36]. Một trình tự ADN ngắn của 600 cặp bazơ trong gen mã hóa ty thể COI đã được chấp nhận như là chuẩn, mã vạch ADN cấp độ loài thiết thực cho nhiều nhóm động vật (Hebert et al. 2003) [16].

Hình 1.1: Vị trí của gen COXI trong gen ty thể (nguồn www.slideshare.net/GullFatima/dna-barcoding-in-animals-71007134) Mã vạch ADN trên nhiễm sắc thể hiện nay thường được sử dụng nhiều nhất cho thực vật. Hai vùng ADN được định nghĩa là 'mã vạch lõi' gồm rbcLa và matK đã được chuẩn hóa như mã vạch ADN cho thực vật trên cạn (CBOL Plant Working Group 2009). Ngoài các mã vạch lõi, hai khu vực khác, trnH-psbA và nrITS đã được đề xuất như mã vạch ADN bổ sung cho thực vật (Hollingsworth et al. 2011, Li et al. 2011) [37, 38]. Lý do cho việc áp dụng hai vùng này (rbcLa và matK) là mức độ cao của khả năng thu được các trình tự có chất lượng cao và mức độ cho phép phân biệt loài (Burgess et al. 2011) [39]. Gere et al. (2013) kết hợp trnH-psbA với mã vạch ADN nhân đã cải thiện đáng kể phân biệt loài trong họ Bàng (Combretaceae) ở miền nam châu Phi, kết quả của họ cũng cho thấy sự thành công của mã vạch ADN trong phân biệt các loài có quan hệ gần [40]. Ballardini et al. (2013) đề nghị các gen ADN ở lục lạp psbZ-trnfM như một dấu hiệu mã vạch tiềm năng ở chi Phoenix [41]. Gen 16S rRNA, COI, và

9 cpn60 bình thường có thể được sử dụng như là dấu hiệu cho việc phát triển mã vạch ADN của vi khuẩn (Purty và Chatterjee 2016) [42]. ITS có thể đưa ra một sự khác biệt quan trọng trong sự hoàn thành của nó như là một mã vạch cho nấm (Dentinger et.al., 2011) [43]. Mã vạch ADN sẽ có nhiều ứng dụng cho sự sống ở biển: nhận dạng các ấu trùng, các loài xâm lấn, loài bí ẩn, các loài mới, sự buôn bán trái phép của loài được bảo vệ, quản lý vật nuôi, đánh giá đa dạng sinh học, giám sát hệ sinh thái, tu chỉnh lại các loài đã biết, suy luận của các mối quan hệ phát sinh loài, phát sinh địa lý và mô hình hình thành loài (Radulovici, Archambault và Dufresne 2010) [44]. Smith et al. (2005) chứng minh mã vạch ADN giúp giải quyết sự thất bại của phương pháp kiểm kê hiện tại để nhanh chóng đáp ứng nhu cầu cấp bách đánh giá đa dạng sinh học, đặc biệt trong việc đánh giá sự phong phú và sự thay thế khi chuyển đổi cảnh quan với đơn vị phân loại đa dạng cao và sử dụng mã vạch ADN trong sự hợp tác với các nhà phân loại sẽ cung cấp các bản đồ quy mô thiết yếu để đánh giá đa dạng sinh học ở quy mô mà quyết định bảo tồn được thực hiện [22]. Đối với các mẫu trong bộ sưu tập lịch sử tự nhiên, mã vạch ADN có một vai trò quan trọng, nó cung cấp một cách đơn giản để xác minh, một phương pháp để định danh mẫu vật và phát hiện các mục cơ sở dữ liệu không chính xác. Ngoài ra, mã vạch ADN cung cấp một phương pháp đơn giản ở thực địa, trong đó một miếng gạc hoặc mẫu sinh thiết, kết hợp với dữ liệu địa phương và những hình ảnh chính xác, sẽ là đủ để nhận dạng sơ bộ các loài (Chambers và Hebert 2016) [45]. Mã vạch ADN có thể sử dụng như một công cụ phân tử quan trọng để đánh giá đa dạng sinh học và bảo tồn các loài bò sát (Trivedi et al.2016) [46]. Do đó, các cơ sở dữ liệu trình tự của axit Nucleotide quốc tế (như GenBank…) đã thông qua từ khóa nhận dạng duy nhất (Barcode) để nhận ra các chuỗi mã vạch tiêu chuẩn theo quy định của cộng đồng khoa học (ví dụ Consortium for the Barcode of Life (CBOL)). Sự ra đời của mã vạch ADN là một sự bổ sung tự nhiên với thời kỳ hậu di truyền, trong đó trình tự của toàn bộ gen đã cung cấp một số lượng lớn các thông tin trình tự từ một số lượng loài hạn chế. Mã vạch ADN có thể giúp mở rộng kiến thức của chúng ta bằng cách khám phá nhanh chóng nhiều loài hơn và không tốn kém. Các kết

10 quả thu được từ các nghiên cứu mã vạch ADN sau đó có thể giúp chúng ta xác định loài là những mục tiêu tốt cho phân tích di truyền chi tiết hơn (Hajibabaei et al. 2007) [47]. Sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nghiên cứu tương tác sinh thái

Các phương pháp phổ biến nhất xác định thức ăn của côn trùng bao gồm: 1) quan sát trực tiếp côn trùng ăn thực vật tại thực địa; 2) thử nghiệm cho ăn (Barone 1998) [48]; 3) phân tích thành phần thức ăn trong ruột; và 4) kỹ thuật đồng vị ổn định (Joern và Parker, 1978; Otte và Joern, 1976) [49, 50]. Tuy nhiên, việc xác định thức ăn của các loài côn trùng bằng việc sử dụng các phương pháp này gặp nhiều khó khăn. Quan sát hiện trường sẽ khó thực hiện nếu khu vực nghiên cứu hiểm trở, chẳng hạn như rừng ở núi dốc và cao. Quan sát trực tiếp cũng bị giới hạn bởi khả năng của nhà nghiên cứu để xác định chính xác các loài liên quan đến các tương tác (Hebert et al. 2004) [19]. Trong các thử nghiệm cho ăn, côn trùng thường ăn các loại thức ăn khác với thức ăn khi chúng sống trong tự nhiên, và do đó mức độ tiêu thụ của côn trùng có thể bị đánh giá quá cao (Barone, 1998) [48]. Đối với các phương pháp phân tích thành phần thức ăn trong ruột và đồng vị ổn định, việc xác định thông tin về phân loại và / hoặc sinh thái thường rất hạn chế. Gần đây nhiều nhà khoa học đã sử dụng phương pháp khác để xác định thức ăn của côn trùng, đó là sử dụng trình tự ADN thực vật trong ruột của côn trùng (Jurado- Rivera et al., 2009; Navarro et al., 2010) [51, 52]. Phương pháp này tách chiết ADN từ mô của thực vật bị tiêu hóa bởi côn trùng ăn thực vật. Một phần của ADN này sẽ được khuếch đại và giải trình tự, sau đó các trình tự gen này được dùng để xác định tên ở các bậc phân loại bằng cách so sánh với cơ sở dữ liệu tham khảo hiện tại như GenBank hoặc thư viện mã vạch ADN. Kỹ thuật dựa trên ADN này cho phép chúng ta xác định thức ăn của côn trùng ăn cỏ mà không quan sát trực tiếp. Hơn nữa, bởi vì kỹ thuật này nhắm vào ít mục tiêu, nó làm giảm khả năng bỏ qua mối quan hệ dinh dưỡng của côn trùng ăn thực vật. Có nhiều nghiên cứu đã áp dụng phương pháp này để xác định thực vật chủ của những côn trùng ăn thực vật khi mà thực vật chủ của chúng hoàn toàn không được biết như García-Robledo et al. 2013; Kishimoto-Yamada et al., 2013; Liu J et al. 2014..[53, 54, 55].

Như vậy sinh học phân tử là một công cụ hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng sinh học, đặc biệt trong đánh giá đa dạng loài – cấp độ đa dạng được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu sinh học, và tương tác loài (sinh thái học). Nó giúp đánh giá nhanh được đa dạng của một nhóm quần xã sinh vật trước khi chúng được mô tả dựa vào đặc điểm hình thái, giúp giải quyết sự thất bại của phương pháp kiểm kê hiện tại để nhanh chóng đáp ứng nhu cầu cấp bách đánh giá đa dạng sinh học. Những điều này giúp cho dự đoán số loài trong tự nhiên nhanh và chính xác hơn. 1.1.2. Sự không đồng nhất của môi trường và ảnh hưởng của nó đến đa dạng sinh học Haller et al. (2013) cho rằng, có hai loại mô hình không gian trên hành tinh của chúng ta: mô hình siêu quần thể, trong đó các cá thể sinh sống ở hai hoặc nhiều mảnh rời rạc khác nhau và mô hình không gian liên tục của dải biến đổi môi trường. Theo tác giả, sự không đồng nhất về môi trường xuất phát từ hai yếu tố: đầu tiên là sự thay đổi của môi trường, tiếp đến là sự phân mảnh liên tục trong không gian, được mô tả bởi biên độ và quy mô không gian của nó. Cùng với nhau, các thành phần này tạo lên một loạt các cảnh quan với mô hình không đồng nhất. Họ kết luận rằng tính không đồng nhất không gian, bằng cách tạo ra các chế độ lựa chọn khác nhau đã thúc đẩy sự đa dạng, là một động lực quan trọng của sự hình thành loài [56]. Pausas và Austin (2001) xem xét lại mô hình giàu loài dọc theo dải biến đổi môi trường bằng các nghiên cứu trước đây. Họ kết luận rằng hầu hết các nghiên cứu cho thấy một xu hướng tăng sự phong phú loài với nhiệt độ và nguồn nước, cũng như với sự gia tăng không đồng nhất về môi trường. Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu cho thấy sự làm giàu dinh dưỡng dẫn đến giảm sự phong phú các loài. Tuy nhiên, phản ứng khác nhau có thể quan sát được do sự tương tác giữa các tham số, bao gồm cả các yếu tố nhiễu loạn và dao động quanh sự giới hạn nguồn tài nguyên dọc theo dải biến đổi môi trường [57]. Jill et al. (2009) điều tra mô hình phân bố của các loài chim ở vùng núi Tilaran của Costa Rica ở độ cao giữa 1.000 m và 1.700 m, nơi có một sự thay đổi độ ẩm rõ nét. Đa dạng beta cao đã được tìm thấy cho thấy sự thay đổi gần như hoàn toàn trong thành phần của quần xã sinh vật trong vài km trên sườn hướng về Thái Bình Dương. Và sự thay đổi trong thành phần loài có liên quan với sự thay đổi về độ ẩm (và

12 liên quan tới sự bao phủ của thực vật bì sinh) ở những khoảng cách khác nhau trên sườn Thái Bình Dương [58]. Yang et al, (2015) đã chứng minh rằng tác động của sự không đồng nhất môi trường lên sự phong phú các loài phụ thuộc vào vị trí của quần xã dọc theo dải biến đổi môi trường: ở hai đầu của dải biến đổi môi trường có một mối tương quan dương giữa tính đa dạng với sự không đồng nhất của môi trường, trong khi đó ở giữa của dải biến đổi môi trường, không tồn tại một mối quan hệ như vậy [59]. Arnan et al. (2015) nhận thấy cả biến môi trường và biến không gian đóng góp đáng kể vào sự thay đổi tính đa dạng ở các bậc phân loại, phát sinh loài và chức năng ở cả quy mô alpha và beta; trong đó cấu trúc không gian có ảnh hưởng rộng hơn [60]. Phân mảnh môi trường sống thường được định nghĩa như một quá trình ở quy mô cảnh quan bao gồm cả môi trường sống bị mất đi và môi trường sống bị chia cắt. Nghiên cứu thực nghiệm ngày nay cho thấy mất môi trường sống có ảnh hưởng xấu rộng và liên tục tới đa dạng sinh học. Còn bản thân phân mảnh môi trường sống có ảnh hưởng ít hơn tới đa dạng sinh học (Fahrig 2003) [61]. Có nhiều nghiên cứu về sự thay đổi loài theo độ cao, nhưng hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trong khu vực Nam và Trung Mỹ. Các nghiên cứu này tập trung vào nhóm chân khớp giàu loài, cụ thể là côn trùng (24,5%), hầu hết là những nghiên cứu về cánh cứng và bướm (Brehm G & Fiedluk, 2004; Novotny et al. 2005, Escobar et al. 2006, García-López et al. 2012..) [62, 63, 64, 65], chỉ có một vài nghiên cứu về Chrysomelidae dọc theo độ cao (Sánchez-Reyes et al. 2016, Bouzan et al. 2015) [66, 67]. Hầu hết các nghiên cứu đều cho kết quả rằng đa dạng loài thay đổi với độ cao. 1.1.3. Chrysomelidae là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng sinh học và nghiên cứu sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái. Trong lĩnh vực sinh học người ta dựa vào các sinh vật chỉ thị để đánh giá chất lượng của môi trường (Noss 1990, Caro và O'Doherty 1999) [68, 69]. Nhóm sinh vật được sử dụng như sinh vật chỉ thị môi trường đòi hỏi phải có sự đa dạng loài cao và có sự đa dạng tương tác sinh thái. Thông qua đánh giá đa dạng sinh học của nhóm sinh vật này (bao gồm đánh giá đa dạng loài và tương tác loài) sẽ giúp chúng ta mô tả được sự phụ thuộc lẫn nhau của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái. Về đặc điểm này, đối

13 với các hệ sinh thái cạn, các loài côn trùng ăn cỏ là một nhóm thích hợp để tiến hành cuộc điều tra quy mô lớn về đa dạng sinh học và tương tác sinh thái (Stork and Habel 2014) [70]. Trong đó Chrysomelidae là đối tượng thích hợp nhất trong bộ cánh cứng Coleoptera khi đánh giá đa dạng sinh học và chứng minh sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái. Bởi vì, chúng đại diện cho một số lượng loài lớn, dễ thấy và rất đa dạng trong hoạt động ăn thực vật trong hệ sinh thái nhiệt đới và ôn đới. Chrysomelidae là họ đa dạng nhất trong bộ cánh cứng với hơn 37.000 loài được mô tả, hầu hết các mô tả này là của các loài ở vùng Trung và Nam Mỹ (Bouchard et al. 2009) [71]. Nghiên cứu ở quy mô nhỏ trong rừng nhiệt đới cho thấy Chrysomelidae có tính đa dạng cao, ví dụ: Thormann et al. (2016) sử dụng mã vạch ADN khám phá 266 loài Chrysomelidae trong núi rừng của Vườn Quốc gia Podocarpus và khu dự trữ Reserva Biologica San Francisco liền kề ở phía nam Ecuador [72]; 157 loài Chrysomelidae được khám phá trong rừng rụng lá nhiệt đới ở Peregrina Canyon của bang Tamaulipas ở đông bắc Mexico (Sancher- Reyes et al., 2014) [73]; 60 loài thuộc phân họ Alticinae được ghi nhận ở Antalya và 57 loài thuộc phân họ Alticinae được ghi nhận ở Isparta của Thổ Nhĩ Kỳ (Aslan, 2010; Aslan và Ayvaz, 2009) [74, 75]; 253 loài Chrysomelidae được ghi nhận trong 0,8 ha rừng nhiệt đới ở Panama (Charles và Bassett, 2005) [76] hoặc 1.073 loài trên toàn bộ lãnh thổ của Malaysia (Mohamedsaid 2004) [77]... Thêm vào đó, chúng cho thấy một sự đa dạng đáng chú ý của việc ăn thực vật (từ lá đến gốc) cũng như mức độ chuyên môn hóa khác nhau, từ loài ăn một loại thức ăn đến loài ăn nhiều loại thức ăn khác nhau, và khả năng phát tán (từ loài không thể bay xa đến có thể bay xa). Sự đa dạng phân loại và thức ăn của chúng có thể gây kinh ngạc trong bất kỳ môi trường nhiệt đới cụ thể nào (Erwin 1982; Wagner 1999; Novotny và Miller 2014) [78, 79, 80], chúng có mối quan hệ sinh thái chặt chẽ với thực vật ở tất cả các giai đoạn của chu kỳ sống và có tỷ lệ đặc hữu cao, cả hai yếu tố đó cho thấy chúng có mối quan hệ chặt chẽ với môi trường. Do vậy chúng là đối tượng thích hợp trong nghiên cứu các phương diện của đa dạng sinh học: nghiên cứu đa dạng loài và tương tác sinh thái (Price 2002) [81].

1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae ở Việt Nam Từ năm 1975 đến năm 2008, côn trùng cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) ở Việt Nam đã được tập trung nghiên cứu nhiều về đa dạng loài và đặc điểm phân bố. Đặc biệt khu hệ Chrysomelidae ở khu vực phía Bắc Việt Nam (Tam Đảo, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình..), khu vực ba tỉnh miền trung (Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế) và một số tỉnh Tây Nguyên đã được nghiên cứu kỹ (Đặng Thị Đáp và Medvedev, 1982, 1983, 1989 [82, 83, 84] và Trần Thiếu Dư và cs 2005, 2006, 2007, 2008 [85-89]. Và các kết quả nghiên cứu này cho thấy Chrysomelidae có sự đa dạng loài cao và một số nhóm (Monolepties) có sự phân bố theo vùng miền (chúng được ghi nhận nhiều ở các tỉnh miền trung và Tây Nguyên, trong khi chúng ít xuất hiện ở các tỉnh phía Bắc) Phân loại học của Chrysomelidae ở Việt Nam được một số tác giả trong nước quan tâm như Đặng Thị Đáp và Trần Thiếu Dư (2005) [90, 91, 92] và nhiều tác giả nước ngoài quan tâm nghiên cứu và công bố như Medvedev (1985, 1987, 1988, 1992, 2001, 2004, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015) [93-109], Delobel et al. (2011) [110], Shu-Yong et al. (2010) [111], Warchalowski (2010) [112], Lopatin (2003, 2008) [113, 114], Moseyko (2005, 2006) [115, 116], Bezdek (2005) [117] và Kimoto (1997, 1998, 2000) [118, 119, 120]. Theo ghi nhận của các tác giả này, có khoảng 700 loài Chrysomelidae ở Việt Nam đã được mô tả và công bố trên các tạp chí khoa học, và ước tính số loài Chrysomelidae ở Việt Nam có thể vượt 1.000 loài. Điều này cho thấy sự đa dạng rất cao của quần xã Chrysomelidae ở Việt Nam và nhiều loài đang chờ phát hiện và mô tả mới cho khoa học. Những ghi nhận về thực vật chủ của các loài Chrysomelidae ở Việt Nam còn rất hạn chế. Medvedev và Đặng Thị Đáp (1982, 1983) [82, 83] đã đưa ra danh sách thực vật chủ của 212 loài Chrysomelidae, tuy nhiên danh sách này chưa đầy đủ và theo tác giả phương pháp nghiên cứu của các tác giả còn nhiều hạn chế. Tác giả ghi nhận thực vật chủ của Chrysomelidae dựa vào quan sát trực tiếp ngoài thực địa, khi bắt gặp chúng trên thực vật nào thì kết luận thực vật đó là thức ăn của chúng. Kết luận này nhiều khi không chính xác, bởi vì Chrysomelidae là côn trùng biết bay và chúng có thể bay xa, nhiều loài ăn trên nhiều loại thức vật khác nhau.

Năm 1993. Đặng Thị Đáp đã có nghiên cứu và kết luận ban đầu về ảnh hưởng của cảnh quan tới sự phân bố của phân họ Cassidinae. Trong họ Chryrsomelidae, hai phân họ Galerucinae và Eumophinae có số loài hơn các phân họ khác, Cassidinae là phân họ nhỏ, có số loài ít, do vậy nếu sử dụng phân họ Cassidinae cho nghiên cứu sinh thái học sẽ cho kết quả thiếu chính xác. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu sâu về sinh thái học và đặc biệt nghiên cứu về ảnh hưởng của dải biến động môi trường tới quần xã Chrysomelidae [121]. Dữ liệu về đa dạng côn trùng ở VQG Núi Chúa đã được Tạ Huy Thịnh và cộng sự nghiên cứu trong năm 2005, tuy nhiên nhóm tác giả không nghiên cứu về quần xã Chrysomelidae ở khu vực này [122]. Kết quả của nhóm tác giả chỉ thống kê sự đa dạng của một số họ côn trùng ở VQG Núi Chúa (có bộ Coleoptera, nhưng không có họ Chrysomelidae). Do vậy, kết quả nghiên cứu của luận án là kết quả nghiên cứu đầu tiên về quần xã Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Tóm lại, các nghiên cứu trước đây về Chrysomelidae ở Việt Nam chủ yếu về phân loại học hình thái và những điều tra đa dạng loài ở một số Vườn quốc gia, chưa có nghiên cứu về sinh thái học của quần xã Chrysomelidae trong điều kiện môi trường cụ thể và đặc biệt chưa có ghi nhận dữ liệu về sinh học phân tử của Chrysomelidae ở Việt Nam. 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới Chrysomelidae là một nhóm cánh cứng lớn nhất trong bộ cánh cứng, có khoảng 37.000 loài Chrysomelidae đã được mô tả, thuộc hơn 2000 giống (Jolivet, Petitpierre, và Hsiao (1988) [123]. Chúng được nghiên cứu khá đầy đủ về thực vật chủ (Jolivet và Hawkeswood 1995) [124], về sinh học: nhận dạng, phát sinh loài, di truyền, sinh thái ….(Jolivet và Cox , 1996) [125]. Các nhà khoa học ngày nay đã sử dụng sinh học phân tử để nghiên cứu sâu hơn về phát sinh loài của Chrysomelidae (Nadein, 2015; Matsumura et al. 2014; Montelongo và Gómez-Zurita, 2014; …) [126, 127, 128] cũng như đánh giá đa dạng của Chrysomelidae (Thormann et al., 2016; Papadopoulou, Cardoso và Gómez-Zurita, 2013) [72, 129] và tìm kiếm thực vật chủ của chúng (Jurado-Rivera et al. 2009, Kishimoto-Yamada et al. 2013; De la Cadena et al. 2017; ) [51, 54, 130].

Cùng với xu hướng nghiên cứu trên thế giới đang áp dụng, luận án sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá đa dạng loài và thức ăn của Chrysomelidae trong điều kiện môi trường ở VQG Núi Chúa: sự thay đổi môi trường ở phạm vi nhỏ nhưng liên tục, thay đổi từ rừng khô ở độ cao thấp tới rừng ẩm ở độ cao cao hơn. Độ cao trong nghiên cứu này chưa tới 1.000 m, trong khi các nghiên cứu trước đây đa số ở độ cao trên 1.000 m và được nghiên cứu ở khu vực Nam và Trung Mỹ. Do đó, nghiên cứu của đề tài là không trùng lặp với các nghiên cứu trước đây. Như vậy, sinh vật có sự đa dạng lớn trong mọi bậc phân loại, sự thiếu hụt nghiêm trọng các chuyên gia trong nghiên cứu phân loại học các loài, cùng với tốc độ sự tuyệt chủng của các loài trong tự nhiên cao là trở ngại trong nghiên cứu đa dạng sinh học, sinh thái học và sự phát sinh loài. Sinh học phân tử có thể được sử dụng như là công cụ hỗ trợ đắc lực để giải quyết vấn đề trở ngại trong nghiên cứu đa dạng sinh học, là công cụ giúp đánh giá nhanh đa dạng sinh học (đa dạng loài và tương tác sinh thái của các loài). Chrysomelidae với số lượng loài lớn trên thế giới, nhiều loài chưa được khám phá, phân bố rộng và có tương tác sinh thái loài phức tạp, chúng ít được nghiên cứu ở trong rừng nhiệt đới nên là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng của chúng (đa dạng và tương tác loài) trong sự biến động môi trường ở Vườn Quốc Gia Núi Chúa để chứng minh sự phụ thuộc lẫn nhau của các quần xã trong hệ sinh thái. 1.2. Khái quát về điều kiện tự nhiên – kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu VQG Núi Chúa được thành lập trên cơ sở: . Quyết định số 194/QĐ - HĐBT ngày 9 tháng 8 năm 1986 của Hội đồng Bộ trưởng (nay là Chính phủ) về việc thành lập Khu Bảo tồn Thiên nhiên Núi Chúa. . Công văn số 200/NN và PTNT ngày 17 tháng 1 năm 1997 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn gửi Uỷ ban nhân dân Tỉnh Ninh Thuận đồng ý với chủ trương về quy hoạch ổn định đối với các loại rừng, đồng thời xây dựng các dự án trong đó có rừng đặc dụng khô hạn Núi Chúa. . Quyết định số 134/2003/QĐ - TTg ngày 7 tháng 9 năm 2003 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập VQG Núi Chúa.

1.2.1. Vị trí địa lý VQG Núi Chúa thuộc huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh Thuận, giáp với tỉnh Khánh Hòa. Ở vị trí cực đông của Nam Trung Bộ, nơi tiếp giáp giữa vùng Đông Nam Bộ và Nam Trung Bộ, có toạ độ từ 11°35'25" đến 11°48'38" vĩ bắc và 109°4'5" đến 109°14'15" kinh đông, diện tích: 29.865 ha trong đó phần đất liền là 22.513ha và phần biển là 7.352 ha, vùng đệm có diện tích 7.350 ha. Giới hạn phía bắc là ranh giới giáp tỉnh Khánh Hòa. Khu vực Núi Chúa có ba mặt giáp biển. Ngay phía bắc là phần dưới của vịnh Cam Ranh thuộc xã Cam Lập thành phố Cam Ranh tỉnh Khánh Hòa, Phía đông và nam là biển Đông với các xã Vĩnh Hải và Nhơn Hải thuộc huyện Ninh Hải. Phía nam là đầm Nại, phía tây giới hạn bằng chính quốc lộ 1A. 1.2.2. Địa hình Khu vực Núi Chúa là một khối núi khá liền nhau, nhìn từ ảnh vệ tinh thì Núi Chúa có hình dạng như một con rùa có đầu quay về phía Nam, đuôi là phần nhô ra mũi Xốp. Khối núi này có nhiều đỉnh ở các độ cao khác nhau, mà đỉnh cao nhất là đỉnh núi Cô Tuy có độ cao 1.039 m. Địa hình thấp dần từ trung tâm ra, phần phía bắc và tây có độ dốc lớn hơn phía Nam và phía Đông. Phía Tây và Tây nam địa hình bị chia cắt do có các khối núi nhỏ tạo thành các thung lũng sườn núi theo hướng Đông Bắc-Tây Nam; còn phía Bắc, Đông và Đông nam địa hình ít bị chia cắt, thấp dần từ đỉnh núi ra biển Địa hình có độ cao dưới 300 m: phân bố phía Đông và Nam và các khu vực ở phía Bắc giáp biển, địa hình ít bị chia cắt, độ dốc dưới 200. Địa hình có độ cao từ 300-700 m: phân bố phía Tây và Tây Nam, địa hình bị chia cắt mạnh, hình thành các thung lũng và sườn vách dốc trên 200, cho đến 350. Địa hình có độ cao trên 700 m: phân bố ở phần trung tâm, có nhiều đỉnh núi ở các độ cao khác nhau, bị ngăn cắt bởi các thung lũng, có độ dốc từ 200 đến 400. Xa hơn về phía Tây Nam là đồng bằng nhỏ Phan Rang, bao bọc xung quanh bởi các khối núi cao. Cả khu vực Núi Chúa-Phan Rang gần như hình thành dạng địa hình lòng chảo, ngăn cách ở phía Bắc, Tây và Nam là các khối núi có địa hình cao trên 500 m cho đến trên 1.000 m. Ở hai đầu phía Bắc và Nam bị chặn lại bởi các khối núi ăn lan ra biển có cao độ trung bình 500-700 m.

1.2.3. Khí hậu, thủy văn Khu vực VQG Núi Chúa nằm lọt hoàn toàn trong khu vực khí hậu ven biển miền trung thuộc vùng khí hậu Nam Trung Bộ với đặc điểm là khô hạn, đặc điểm này liên quan đến vị trí bị che khuất của vùng này bởi các núi vòng cung bao bọc phía Bắc, Tây và Nam với hai luồng gió mùa chính. Trong vùng khí hậu khô hạn này thì khu vực Phan Rang được coi là trung tâm khô hạn nhất nước, với lượng mưa trung bình năm dưới 700 mm, có những năm dưới 500 mm. Mùa mưa ở khu vực này đến muộn so với các vùng khác và kết thúc cũng sớm hơn, bắt đầu khoảng tháng 9 - 10 và kết thúc khoảng tháng 12. Gió mùa Đông Bắc không ảnh hưởng nhiều đến khu vực nên không cung cấp thêm lượng ẩm vào mùa gió mùa Đông Bắc, còn gió mùa Tây Nam vào mùa mưa thì lại bị các khối địa hình cao hơn ở vị trí bên trong hứng gần hết lượng ẩm mà gió mùa Tây Nam mang lại. Do vị trí tiếp giáp như vậy lượng mưa tại khu vực Núi Chúa có thể đạt xấp xỉ 1000 mm hoặc hơn so với trung tâm khô hạn Phan Rang-Mũi Dinh chỉ đạt 650-750 mm/năm. Chế độ nhiệt của khu vực mang những nét đặc trưng của chế độ nhiệt miền Nam, không có mùa đông lạnh, nhiệt độ trung bình năm xấp xỉ 260 C, nhiệt độ tháng lạnh nhất không xuống thấp hơn 230 C (cho địa hình thấp, đồng bằng), nền nhiệt độ các tháng trong năm khá ổn định theo kiểu chuyển tiếp khí hậu xích đạo – nhiệt đới. Các yếu tố cực trị về nhiệt có thể thấy qua các trị số cực tiểu như nhiệt độ tối thấp tuyệt đối có thể đạt 14-150 C ở đồng bằng và giảm thêm theo độ cao. Độ ẩm không khí liên quan đến chế độ nhiệt và mưa như trên nên độ ẩm trung bình chỉ khoảng 80%, trong các tháng mùa mưa cũng chỉ đạt khoảng 85%, trong các tháng mùa khô độ ẩm tối thấp tuyệt đối có thể xuống dưới 20-25%. Theo Luận chứng Khoa học của VQG Núi Chúa, tính toán các chỉ số nhiệt và mưa hàng tháng thì khu vực này có 9 tháng khô, 4 tháng hạn và 2 tháng kiệt và được xếp vào loại khô hạn nhất ở Việt Nam. Chỉ số khô hạn X = 9. 4. 2 Hệ thống dòng chảy – thủy văn: Với địa hình là một khối núi nhỏ độc lập như vậy nên hệ thống thủy văn sông suối trong khu vực này có đặc trưng là dòng chảy ngắn, nhỏ và lưu lượng thay đổi theo mùa, diện tích lưu vực cho từng dòng chảy không lớn.

Nhìn chung khu vực VQG Núi Chúa không có suối lớn, chỉ có một số suối nhỏ, ngắn đến mùa khô gần như không có nước. Các suối có dòng chảy đáng kể như suối Nước ngọt, Suối Nước giếng, Suối Kiền Kiền, suối Đông Nha, suối Lồ ồ, suối Đá. Các suối trên đều bắt nguồn từ trên núi cao chảy ra biển đông [131].

Hình 1.2: Sơ đồ VQG Núi Chúa (nguồn: Sinh vật rừng Việt Nam: http://www.vncreatures.net/all_vqg/mapnc.php)

1.2.4. Đặc điểm sinh thái thảm thực vật Theo ghi nhận ban đầu của Phân Viện Điều Tra Quy Hoạch Rừng II, VQG Núi Chúa có 3 dạng sinh cảnh chính là: - Rừng thường xanh trên núi cao trung bình và thấp - Rừng bán khô hạn - Vùng ven bờ biển (bao gồm cả rừng khô hạn trên núi thấp ven bờ biển và khu dân cư) VQG Núi Chúa có 6 kiểu thảm thực vật chính là: - Kiểu Trảng cỏ thứ sinh trên đất cát ven biển - Kiểu Trảng cây bụi thường xanh trên đất cát ven biển - Kiểu Rừng thưa cây lá rộng hơi khô nhiệt đới - Kiểu Trảng cây bụi gai chịu hạn rụng lá nhiệt đới - Kiểu Trảng cây bụi thường xanh hơi khô nhiệt đới - Kiểu Rừng kín thường xanh hơi ẩm nhiệt đới núi thấp Cũng theo tác giả trên, ở VQG Núi Chúa có các sinh cảnh thực vật như: - Thực vật trên đồi cát ven biển - Thực vật khô hạn trên vùng núi đá lộ đầu - Thực vật truông bụi gai thưa cây rụng lá trên nền đất pha cát - Thực vật cây lá rộng thường xanh từ khô hạn tới hơi ẩm - Thực vật lá rộng xen lá kim hơi ẩm vùng núi - Một số sinh cảnh hẹp như thực vật hồ nước trên núi, thực vật trên thác nước, thực vật ven khe nước trên núi. Khu vực VQG Núi Chúa có kiểu hệ sinh thái bán khô hạn được biết đến như là kiểu hệ sinh thái tiêu biểu cho khu vực nhưng ngoài ra còn có kiểu hệ sinh thái khác làm cho khu vực khác với các vùng khác, đó là hệ sinh thái rừng thường xanh với hệ thực vật và thành phần loài khác với hệ thực vật của hệ sinh thái bán khô hạn. Hệ thực vật trong khu vực này còn có cả thành phần loài thuộc vùng khí hậu không phải là nóng và khô hạn tiêu biểu thường gặp, đó là các loài thực vật thuộc vùng khí hậu á nhiệt đới và ôn đới với các loài cây lá kim đặc trưng như Kim Giao (Podocarpus spp.) và Thanh tùng (Taxus baccata). Sự xuất hiện các loài thực vật á nhiệt đới và ôn đới này đã tạo

nên những nét đặc trưng riêng và tính đa dạng về sinh thái, cảnh quan và sinh học nói chung cho cả khu vực Núi Chúa [132]. 1.2.5. Hệ động, thực vật Đã ghi nhận 350 loài san hô, trong đó có 307 loài san hô cứng tạo rạn thuộc 59 giống, 15 họ, trong đó đặc biệt có 46 loài san hô được ghi nhận là phân loại mới tại Việt Nam. VQG Núi Chúa còn được ghi nhận là nơi có một số quần thể rùa biển đến sinh sản gồm 03 loài là Đồi mồi (Eretmochelys imbricata), Rùa xanh (Chelonia mydas), Đồi mồi dứa (Lepidochelys Olivacea). Trong sáu kiểu thảm thực vật nêu trên các nhà khoa học nghiên cứu, điều tra đã ghi nhận được 1.504 loài thực vật bậc cao có mạch trên cạn nằm trong 85 bộ, 147 họ và 596 chi thuộc 7 ngành thực vật khác nhau ở Việt Nam có 08 ngành thực vật bậc cao có mạch hiện đang sống thì ở VQG Núi Chúa đã có đại diện của 07 ngành chiếm 87%, chỉ thiếu ngành Cỏ tháp bút. Những loài thực vật đã được ghi nhận có những giá trị khác nhau. Trong đó có 30 loài quý hiếm có tên trong Sách đỏ Thế giới. Đã ghi nhận 330 loài động vật có xương sống trên cạn với 84 loài thú, 163 loài chim và 83 loài bò sát – lưỡng cư, trong số đó có 46 loài là loài nguy cấp quý hiếm có tên trong Sách đỏ Việt Nam, Sách đỏ thế giới và các phụ lục của Nghị định 32/2006/NĐ-CP [133]. Trong đợt điều tra khảo sát 6/2004, từ 3 tuyến điều tra đã thu thập được 10 bộ, 95 họ Côn trùng gồm 361 loài và dạng loài. Số loài đã định tên khoa học chiếm 53,7% trong số đó (Tạ Huy Thịnh et al., 2005) [122]. Khu hệ động vật ở VQG Núi Chúa chưa được điều tra, nghiên cứu đầy đủ nhưng theo một số nhà khoa học nơi đây vẫn tồn tại nhiều loài động vật quý hiếm như: Chà và chân đen (Pygathrix nigripes), Gấu ngựa (Ursus thibetanus), Rùa da (Dermochelys coriacea), Đồi mồi dứa (Chelonia mydas), Vích (Caretta caretta)... Nhiều loài chim quý hiếm vẫn còn hiện diện như: Cốc biển bụng trắng (Fregata andrewsi), Gà lôi (Lophura nythemera), Phướn đất (Carpococcyx renauldi), công (Pavo muticus)... chứng tỏ mức độ đa dạng nơi đây vẫn còn khá cao [133]. Như vậy, VQG Núi Chúa bao gồm diện tích rừng bán khô hạn độc đáo nhất Việt Nam và quần xã thực vật ở đây có sự thay đổi rõ rệt theo độ cao từ rừng khô trên đất

22 thấp, qua rừng chuyển tiếp (rừng bán ẩm) tới rừng ẩm thường xanh trên núi cao. Vì vậy, VQG Núi Chúa là địa điểm lý tưởng để thực hiện nghiên cứu của luận án

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương pháp thu mẫu và phân chia sinh cảnh ở VQG Núi Chúa 2.1.1. Thiết kế và thu thập mẫu vật

Để xác định được các tuyến đường thu mẫu, nghiên cứu sinh đã giành 1 tuần khảo sát khu vực nghiên cứu ở VQG Núi Chúa trong lần thu mẫu đầu tiên (5/2012), sau đó trong các đợt thu mẫu tiếp theo, nghiên cứu sinh chọn được các tuyến đường thu mẫu lan tỏa theo các hướng khác nhau của VQG Núi Chúa, đảm bảo thu được mẫu vật đại diện cho toàn bộ VQG Núi Chúa. Năm con đường rừng ở Vườn Quốc Gia Núi Chúa được chọn để tiến hành thu mẫu trong các đợt điều tra có tên là Mái Nhà, Đá Đỏ, Ao Hồ, Núi Ông và Suối Trục (tên các con đường theo người dân địa phương đặt). Trong mỗi đợt thu mẫu, mỗi tuyến được thu mẫu từ độ cao ở mức nước biển (tương ứng với vùng sinh thái khô) theo độ cao tăng dần lên đến 449m (tương ứng với vùng sinh thái chuyển tiếp và một phần của vùng sinh thái ẩm) (Bảng 2.1, Hình 2.2), Mỗi con đường rừng cố định được thu mẫu 10 lần: thu mẫu một lần/tháng trong các tháng 6, tháng 7 và tháng 9 (năm 2012) và tháng 1 (năm 2013) và hai lần/tháng trong các tháng 2 đến 4 (năm 2013). Tuyến Đá Hang chỉ được thu mẫu một lần tháng 5 năm 2012 trong lần khảo sát đầu tiên. Các mẫu vật họ Chrysomelidae được thu thập quanh những điểm cố định dọc theo các tuyến đường rừng trong mỗi lần thu mẫu. Do luận án nghiên cứu về sinh thái học của quần xã Chrysomelidae (sự biến đổi theo độ cao), do vậy cần có phương pháp thu mẫu nhất quán để đảm bảo sự phân tích được chính xác nhất. Do vậy, chúng tôi chỉ thu mẫu bằng phương pháp đập (thời gian và chiều cao tán đập là nhất quán tại mỗi điểm thu mẫu). Cụ thể, tại mỗi điểm thu mẫu việc thu thập mẫu vật được thực hiện trong 10 phút bằng cách đập từ thảm cỏ, cây bụi và các cành cây thấp tới cao đến khi nào không thể với được thì dừng (khoảng 2,5 m) (hình 2.1). Các mẫu vật thu được được lưu trữ ngay lập tức trong các lọ có chứa ethanol tuyệt đối (96%) cho bảo quản ADN, các lọ được đánh nhãn thời gian vị trí địa lý và tuyến đường thu mẫu.

Hình 2.1: Thu mẫu ở khu vực nghiên cứu

Bảng 2.1: Tọa độ các vị trí thu mẫu ở VQG Núi Chúa

TĐ Vĩ độ Kinh độ E. N. TĐ Vĩ độ Kinh độ E. N. DH1 11,6956389 109,162736 109 11 NO1 11,7334444 109,184389 122 15 DH2 11,7021667 109,148444 233 15 NO2 11,7341111 109,182472 174 7 DH3 11,7096528 109,141736 506 2 NO3 11,7345556 109,181222 204 5 DH4 11,7156111 109,136944 661 13 NO4 11,7349583 109,180056 238 8 DH5 11,7221667 109,136111 714 9 NO5 11,7353889 109,179111 271 3 NO6 11,7356667 109,177750 340 9 AH1 11,7279722 109,202944 50 3 NO7 11,7355000 109,176889 382 11 AH2 11,7266389 109,20475 82 6 NO8 11,7362778 109,175861 411 11 AH3 11,7310278 109,209889 142 2 NO9 11,7371667 109,175958 418 6 AH4 11,7322222 109,211278 173 2 NO10 11,7379861 109,175972 428 6 AH5 11,7352778 109,212972 200 4 NO11 11,7385556 109,175861 441 9 AH6 11,7363889 109,215111 208 6 NO12 11,7402639 109,175389 486 7 AH7 11,7358333 109,21625 236 4 NO13 11,7424444 109,175250 484 4 AH8 11,7354444 109,217264 258 7 NO14 11,7456944 109,175028 474 1 AH9 11,7349167 109,218861 260 2 AH10 11,7352222 109,2195 265 2 MN1 11,7279830 109,189704 38 2 MN2 11,7265833 109,185528 67 10 DD1 11,7226667 109,181306 111 3 MN3 11,7246806 109,182014 107 10 DD2 11,7193889 109,179361 158 3 MN4 11,7245556 109,180417 140 4 DD3 11,7177778 109,178333 188 4 MN5 11,7246944 109,179403 166 12 DD4 11,7165556 109,174611 243 3 MN6 11,7226944 109,179417 162 2 DD5 11,7145278 109,175083 230 2 MN7 11,7251667 109,177236 180 9 DD6 11,7150556 109,181528 212 4 MN8 11,7251806 109,175125 224 15 DD1' 11,7205833 109,182944 157 2 MN9 11,7238611 109,174472 244 14 DD2' 11,7165694 109,180903 211 2 MN10 11,7216528 109,174681 258 9 DD3' 11,7151944 109,179236 230 4 MN11 11,7207500 109,173917 269 3 DD4' 11,7152222 109,176625 224 2 MN12 11,7192361 109,174944 284 15 DD5' 11,7164167 109,177278 219 3 MN13 11,7182222 109,172222 324 3 MN14 11,7196667 109,171222 358 3 ST1 11,7346667 109,190583 101 4 MN15 11,7192500 109,170222 364 4 ST2 11,7368333 109,190222 171 11 ST3 11,7391667 109,190653 251 11 ST4 11,7411250 109,191597 287 1 ST5 11,7436528 109,192681 326 21 ST6 11,7446806 109,1925 351 18 ST7 11,7461667 109,192167 378 13 ST8 11,7485000 109,192833 405 15 ST9 11,7511528 109,192319 392 18 ST10 11,7534444 109,192875 376 21 Chú thích: (TĐ) tuyến đường thu mẫu; (E) độ cao: m; (N.) số lần thu mẫu; (DH) tuyến Đá Hang; (AH) tuyến Ao Hồ; (NO) tuyến Núi Ông; (DD) tuyến Đá Đỏ; (MN) tuyến Mái Nhà; (ST) tuyến Suối Trục

Hình 2.2: Sơ đồ thu mẫu Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa (a) Vị trí VQG Núi Chúa trong bản đồ Việt Nam (b) Phác họa hình dáng VQG Núi Chúa và các tuyến thu mẫu (c) Các vị trí thu mẫu trong các tuyến thu mẫu ở VQG Núi Chúa, với vùng màu xám là vùng chuyển tiếp được giả định.

2.1.2. Phân chia sinh cảnh trong khu vực thu mẫu ở VQG Núi Chúa Sự phân chia sinh cảnh trong khu vực nghiên cứu dựa trên kết quả nghiên cứu trước đây về VQG Núi Chúa [132] kết hợp với việc phân tích một số tham số của quần xã Chrysomelidae như chỉ số tương đồng (chỉ số SØrensen – Dice) bằng việc sử dụng phương pháp cửa sổ trượt (sliding window) (Barton et al. 2013) [134]. Mẫu vật đã được xác định loài được phân chia cho các khoảng 40 m độ cao liền kề và tính toán số loài giống nhau giữa các khoảng độ cao liền kề đó và loài chỉ có ở trên/dưới mỗi khoảng độ cao đó. Cơ sở của phương pháp này là vùng thu mẫu của chúng tôi sẽ bao trùm một khu vực là môi trường sống chung của những loài ưa thích môi trường khô nhưng có thể mở rộng phạm vi sống đến môi trường ẩm hơn và những loài ưa thích môi trường ẩm nhưng có thể mở rộng phạm vi sống tới môi trường khô hơn. Vùng này là vùng chuyển tiếp sinh thái và có sự đa dạng cao hơn hai vùng sinh thái khô và ẩm (ảnh hưởng của sự chiếm cứ giữa lãnh thổ như Colwell và Lees 2000) [135]. 2.2. Phương pháp sinh học phân tử: Toàn bộ phần mềm của mỗi mẫu vật bọ cánh cứng ăn lá được dùng làm đối tượng để tách chiết ADN tiêu chuẩn, sử dụng bộ công cụ DNeasy Blood và Tissue (Qiagen Iberia, Madrid, Spain) để tách triết ADN theo protocol trong phòng thí nghiệm. Toàn bộ cơ thể mẫu vật đã được sử dụng cho tách triết ADN, phần xác còn lại của những mẫu vật này sau khi tách triết ADN được giữ lại, làm khô, gắn lại làm tiêu bản với các thông tin thời gian, địa điểm và người thu thập mẫu vật để làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sau này. Để xác định loài họ Chrysomelidae, các ADN của từng cá thể được dùng làm khuôn cho sự khuếch đại PCR của gen ty thể cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) có chiều dài 830bp, sử dụng cặp mồi TL-N-3014 (Simon et al. 1994) [136] C1-J-2183 được sửa đổi (Gómez-zurita et al. 2012) [137]. Khi các mồi này kết hợp lỗi, locus tương tự trong hai mảnh ngắn hơn không chồng nhau được khuếch đại, sử dụng mồi ở trong phù hợp hay bổ sung ngược lại với nó (Gómez-zurita et al. 2012) [137]. Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR gen cox1 gồm: 1µl AND, 2.5µl của Buffer 10X, 1.5 µl

MgCl2 50mM, 0.25µl dNTPs 20mM, 0.5µl primers (cả hai chiều) 10µM, 0.1µl Taq

28 polymerase và 18.65µl nước tinh khiết. Điều kiện tiêu chuẩn của phản ứng PCR là 30 giây biến tính ở 94° C, 30 giây ủ ở 50° C và kéo dài 1 phút tại 72° C. Các sản phẩm PCR được làm sạch bằng cách sử dụng ammonium acetate và isopropanol lạnh, kiểm tra gel điện di agarose 1.5% và được giải trình tự theo cả hai chiều bằng cách sử dụng cùng mồi PCR và bộ giải trình tự theo chu kỳ BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). Các trình tự bổ sung được lắp ráp thành các chuỗi ADN được nhân bản nằm liền kề nhau và chỉnh sửa bằng phần mềm Geneious Pro 5.3.6 (Biomatters Ltd, Auckland, New Zealand) và những trình tự không rõ ràng được sắp xếp lại bằng tay. Các trình tự tạo ra trong nghiên cứu này đã được lưu giữ trong cơ sở dữ liệu lưu trữ Nucleotide Châu Âu (EMBL-EBI, Hinxton) với số gia nhập LT160095-LT160588. Để nghiên cứu thức ăn trong ruột của Chrysomelidae, chúng tôi khuếch đại vùng Intergenic spacer của locus cpADN PsbA-TrnH. Chúng tôi sử dụng cặp mồi Psba (5’GTTATGCATGAACGTAATGCTC3’) và TrnH (5’CCTAACACTTAGGTGGTACGCGC3 ’) để có được những đoạn gen dài, phản ứng PCR sử dụng là: 1.5µl ADN, 0.1µl Taq polymerase, 0.5 µM của mỗi mồi và 1.5 mM MgCl2, 2.5µl Buffer 10X, 0.25 µl dNTP, và nước tinh khiết sao cho tổng dung tích bằng 25µl. Điều kiện của phản ứng là: biến tính ADN ở 94o trong 30 giây, giảm nhiệt độ từ 60o đến 43o trong 60 giây với 16 chu trình, 27 chu trình ở 42o trong 30 giây và kéo dài trong 1 phút ở 70o. Với những đoạn gen ngắn chúng tôi sử dụng cặp mồi PsbAinT2 (5’CTCATAACTTCCCTCTAGAYYTAGC3’) và TrnHinT1 (5’CAYCGGTTCACCTAGTTCCG3’) với điều kiện phản ứng là 20 chu trình trong 30 giây biến tính ở 94o, ủ trong 30 giây ở 60o và kéo dài ở 72o trong một phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra trong gel điện di agarose 1.5 %. Các sản phẩm PCR cho thấy nhiều dải sẽ được cắt và được đánh nhãn và cất trữ trong các lọ riêng biệt, chúng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lại. Các sản phẩm PCR được làm sạch bằng ammonium acetate và isopropanol. Các DNA được giải trình tự cả hai chiều sử dụng cùng mồi PCR và bộ kit giải trình tự BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). Sử dụng phần mềm Geneious Pro 5.3.6

để nhóm các cặp ADN có trình tự bổ sung với nhau, chỉnh sửa chúng và sắp xếp chúng trong một ma trận trình tự đơn. 2.3. Phương pháp xác định loài Chrysomelidae Xác định loài Chrysomelidae theo dữ liệu sinh học phân tử

Việc xác định các loài đã sử dụng một số phương pháp dựa trên cây phát sinh loài, hiệu quả của từng phương pháp được đánh giá bằng cách so sánh sự phù hợp của chúng với các loài hình thái. Chúng tôi sử dụng hai phương pháp tiếp cận loài dựa trên cây: mô hình Generalized Mixed Yule-Coalescent (GMYC) xem xét cả đơn và đa ngưỡng (Pons et al. 2006, Fujisawa and Barraclough 2013) [138, 139], và mô hình Poisson Tree Processes (bPTP) (Zhang j-J et al. 2013) [140]. Trước khi phân tích phát sinh loài, tất cả dữ liệu được xếp lại thành loại đơn (không có các trình tự ADN của các cá thể giống nhau cùng tồn tại). Phương pháp GMYC yêu cầu cây ultrametric (là cây phát sinh loài mà các chiều dài từ gốc tới đỉnh bằng nhau). Để có được cây “ultrametric” đầu tiên xác định mô hình tiến hoá phù hợp nhất với biến thể quan sát thấy trong ma trận dữ liệu gen cox1 được đánh giá dựa trên một số thông tin tiêu chuẩn được thực hiện trong jModelTest 2.1.5 (Darriba et al. 2012) [141]. Mô hình được chọn là GTR + I + G trong mọi trường hợp. Sau đó sử dụng một vài cách để thu được cây “ultrametric”: Cách đầu tiên là thiết lập cài đặt mô hình tiến hóa phù hợp cho ma trận gen cox1 trong RAxML 7.2.6 (Stamatakis 2006) [142] để thu được cây có khả năng xảy ra nhất (cây ML). Các cây ML tối ưu đã thu được với bước đầu khám phá cài đặt sắp xếp lại ban đầu tốt nhất từ bộ sưu tập của 100 cây bắt đầu ngẫu nhiên, và bước thứ hai sử dụng những cài đặt tối ưu trong tìm kiếm suy luận phức tạp cho cây có khả năng xảy ra được biết tốt nhất sử dụng 500 bản sao. Cây ML thu được, được tạo rễ từ giữa điểm của con đường nhánh dài nhất giữa hai điểm đầu cuối và đã được thực hiện chuyển thành cây ultrametric với (1) các thuật toán PATHd8, mà chuyển đổi chiều dài nhánh bằng cách làm nhẵn tỷ lệ cục bộ để thích ứng độ lệch với đồng hồ phân tử (Britton et al. 2007) [143]; hoặc (2) phương pháp làm nhẵn tỷ lệ tham số được thực hiện trong r8s 1.8 (Sanderson 2003) [144]. Theo đó, chúng tôi đã thu được thông số làm nhẵn tối ưu bằng

30 cách sử dụng việc kiểm tra chéo một dải các giá trị giữa 0,01 và 1000, và ấn định độ tuổi gốc tùy ý đến 100 đơn vị thời gian. Cách thứ 2 chúng tôi sử dụng suy luận Bayesian (BI) sử dụng BEAST 1.8.1 (Drummond 2012) [145]. BI đã được sử dụng để sản xuất cây gen, sử dụng bốn chuỗi Markov Monte Carlo với 50 triệu thế hệ, mô hình tiến hóa GTR + I + G với các thông số đánh giá từ mẫu vật và ưu tiên cây kết hợp thành một khối, lấy mẫu cây và các thông số liên quan mỗi 5000 thế hệ. Cây tin cậy có nhóm tổ tiên chung là cây lớn nhất và các thông số liên quan đạt được sau khi loại bỏ 10% đầu tiên của mẫu cây bằng cách sử dụng TreeAnnotator 1.6.2 (Drummond et al. 2012) [145] và Tracer 1.6 (Rambaut et al. 2014) [146]. Sau đó sử sử dụng gói "splits " (Ezard et al. 2009) [147] trong phần mềm R 3.1.1 (R . Development Core Team) [148] để xác định loài theo mô hình GMYC với cả đơn ngưỡng và đa ngưỡng. Phương pháp bPTP, không yêu cầu cây phân cực và xác định loài được tối ưu hóa trên độ dài nhánh (Zhang j-J et al. 2013) [140]. BPTP chạy trực tuyến trên trang web "bPTP server" (http://species.h-its.org) và sử dụng cùng một cây đầu vào gốc RAxML giống như trong sử dụng mô hình GMYC. Phương pháp nhận dạng loài dựa vào đặc điểm hình thái: Do luận án nghiên cứu về sinh thái học quần xã và sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng loài của Chrysomelidae, vì vậy nghiên cứu sinh không đi sâu vào phân loại học hình thái, mà chỉ phân chia các mẫu vật đến các dạng hình thái khác nhau. Đầu tiên, các mẫu vật được quan sát dưới kính lúp soi nổi và phân chia sơ bộ đến mức độ phân họ theo Paul (2009) [149] và trực tuyến qua trang web https://sites.google.com/site/mikesinsectkeys/Home/keys-to-coleoptera/chrysomelidae, sau đó các mẫu vật trong các phân họ được nhận dạng tới bậc phân loại thấp nhất theo khóa định loại của Kimoto (2000, 1989, 1982, 1981) [120, 150, 151, 152]. Kết quả được so sánh với kết quả từ phương pháp xác định loài dựa trên dữ liệu ADN. Nếu các dạng hình thái có sự đa màu sắc sẽ tiến hành kiểm tra đặc điểm của cơ quan sinh dục.

2.4. Phương pháp xác định thức ăn của các loài Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa Trình tự ADN của gen lục lạp trong thức ăn từ ruột Chrysomelidae được sử dụng thông qua chương trình BAGpipe (Papadopoulou et al. 2015) [153] để tìm ra trình tự ADN từ dữ liệu GenBank phù hợp nhất, với đầy đủ thông tin về phân loại học. Từ đó thức ăn của các loài Chrysomelidae được xác định ở cấp độ họ của bậc phân loại thực vật.

2.5. Đánh giá tiềm năng đa dạng loài của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa Phương pháp đường cong tích lũy đã được sử dụng để khám phá tiềm năng đa dạng loài của Chrysomelidae trong các tuyến thu mẫu và các sinh cảnh khác nhau (Hortal et al. 2006) [154]. Đường cong tích lũy loài được xây dựng dựa trên kết quả của các phương pháp xác định loài khác nhau. Các tính toán được thực hiện trong phần mềm EstimateS 9.1 (Colwell 2013) [155]. 2.6. Nhóm các phương pháp xác định mối liên quan của Chrysomelidae với điều kiện môi trường 2.6.1. Phân tích biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian Phần mềm EstimateS 9.1 (Colwell 2013) [155] được sử dụng để tính toán các chỉ số Jacard và Sorensen để so sánh sự đa dạng loài giữa các tuyến đường thu mẫu theo Chao et al. (2005) [156]. Để phân tích sự thay đổi trong thành phần cấu tạo của quần xã, đề tài định lượng sự khác nhau trong thành phần loài giữa các vị trí so sánh. Dữ liệu được phân chia theo các tuyến đường thu mẫu và theo sinh cảnh thu mẫu. Trong mọi trường hợp chúng tôi mô tả thành phần không giống nhau giữa các vị trí trên cơ sở thành phần loài thay thế (đánh giá qua βsim) và thành phần loài tạo ổ (đánh giá qua βsne) như đề xuất bởi Baselga (2010) [157]. Đánh giá sự không giống nhau được tính toán bằng gói “betapart” (Baselga và Orme 2012) [158] trong phần mềm R 3.1.1 (R Development Core team) [148]. 2.6.2. Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA) để tìm ra nhân tố tác động tới mối liên hệ giữa Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng Chúng tôi đã thực hiện sự sắp xếp hợp với quy tắc tiêu chuẩn của dữ liệu liên kết thực vật chủ cho mỗi cá thể (ma trận phản ứng) bằng phép phân tích sự phù hợp với quy tắc tiêu chuẩn (CCA) (Oksanen, 2011) [159], sử dụng gói “vegan”2.0-10. Sự sắp

32 xếp được thử theo 4 biến số giải thích có tên là: Sinh cảnh – phân biệt giữa các mẫu vật thu thập được dưới và trên độ cao 300m so với mực nước biển, hay tương ứng là sinh cảnh khô và sinh cảnh ẩm; Loài- ghi nhận bằng phương pháp ADN; Tuyến thu mẫu- theo các tuyến đường thu mẫu và thời gian - phân chia mẫu vật thu mẫu từ tháng một đến tháng năm (sau mùa mưa) và tháng sáu đến tháng 9 (trước mùa mưa mới). Giả thuyết sai là không có nhân tố nào ảnh hưởng tới liên kết của cánh cứng và thực vật, và ý nghĩa của kết quả được giải thích như ảnh hưởng tới cấu trúc của tương tác thực vật và Chrysomelidae. 2.6.3. Đánh giá đa dạng beta của mối tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng theo độ cao (sinh cảnh) Để tính toán đa dạng beta của quần xã cánh cứng ăn lá và quần xã thực vật, chúng tôi xây dựng ma trận với dữ liệu có/không để tính toán các chỉ số đa dạng trong hai loại sinh cảnh (khô và ẩm), sử dụng gói “BAT” 1.3.1 (Cardoso et al. 2014; Carvalho 2012; Podani và Schmera 2011) [160, 161, 162], các chỉ số đa dạng beta được tính toán cho từng quần xã Chrysomelidae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh khô và ẩm bao gồm: βtotal là đa dạng beta tổng phản ánh cả loài thay thế và loài mất

đi/tăng thêm; βrepl là đa dạng beta của các loài thay thế; βrich là đa dạng beta của các loài mất đi/tăng lên, βtotal = βrepl + βrich. Để đánh giá đa dạng beta của tương tác thực vật chủ và cánh cứng ăn lá, trong mỗi một sinh cảnh chúng tôi xây dựng một ma trận tương tác với hàng là các loài cánh cứng ăn lá và cột là các thực vật chủ. Chúng tôi đã sử dụng ma trận có/không cho tính toán đa dạng beta của các tương tác dịch chuyển dọc độ cao (từ sinh cảnh khô tới sinh cảnh ẩm). Chúng tôi áp dụng khung làm việc được đề xuất bởi Poisot et al (2012) [163] cho tính toán sự không giống nhau của các tương tác trong hai sinh cảnh (βWN), sự không giống nhau trong thành phần loài của quần xã (βS), sự không giống nhau của tương tác hình thành giữa các loài chia sẻ (βOS) và sự không giống nhau của các tương tác do các loài thay thế (βST) giữa hai ma trận trong sinh cảnh khô và sinh cảnh ẩm, trong đó βWN = βOS + βST. Tất cả việc tính toán các chỉ số được thực hiện trên gói “betalink” 2.1.0 trong phần mềm R 3.2.1 (R Development Core Team) [148].

2.6.4. Phân tích mô hình của mạng lưới tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng Có hai ma trận mạng lưới được xây dựng, một cho sinh cảnh khô và một cho sinh cảnh ẩm. Trong mỗi ma trận, các hàng là các thực vật chủ (bậc dinh dưỡng thấp hơn) và các cột là các loài cánh cứng ăn lá (bậc dinh dưỡng cao hơn). Tất cả các tính toán được thực hiện trong gói “Bipartite” 2.05 (Dormann et al. 2008) [164] được viết trong phần mềm R 3.2.2 (R Development Core Team) [148]. Chức năng visweb và plotweb của gói đã được sử dụng để có được sự sắp xếp mạng lưới theo các kiểu lồng nhau, theo khối và theo dải biến động (Lewinsohn et al., 2006) [165]; chức năng networklevel để tính toán một số chỉ số để so sánh giữa hai mạng lưới trong hai sinh cảnh. Trong mạng lưới có thể tồn tại những liên kết chưa được quan sát (Olesen et al. 2011) [166], do đó 1000 ma trận giả định được tạo ra từ ma trận quan sát được thông qua chức năng nullmodel và tính toán các chỉ số định lượng và định tính như trong ma trận quan sát và so sánh kết quả với ma trận quan sát được (Dormann et al 2009) [167].

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân định vùng chuyển tiếp sinh thái Dựa theo kết quả nghiên cứu về VQG Núi Chúa [132] nhiệt độ ở khu vực VQG Núi Chúa có sự thay đổi theo độ cao (nhiệt độ giảm theo độ cao tăng) (hình 3.1). Trong năm tuyến đường được thu mẫu Mái Nhà, Ao Hồ, Đá Đỏ, Núi Ông và Suối Trục chỉ có 3 tuyến Mái Nhà, Núi Ông và Suối Trục (thu mẫu đạt tới độ cao gần 500m) là các tuyến có quần xã thực vật thay đổi rõ rệt theo độ cao, ở độ cao < 300m (tương ứng vùng sinh thái khô) và ở độ cao > 300m (tương ứng vùng sinh thái ẩm).

Hình 3.1: Mô hình phân bố nhiệt trung bình/ năm theo độ cao khu vực Núi Chúa (theo Đoàn Dương [132])

Dựa trên kết quả từ phương pháp “cửa sổ trượt”. Chúng tôi sử dụng kết quả xác định loài dựa trên dữ liệu ADN có sự phù hợp tốt nhất với loài hình thái – phương pháp bPTP (chúng tôi gọi tắt là loài bPTP) (sẽ được trình bày ở mục 3.2.2) để tính toán. Phương pháp “cửa sổ trượt” đã sinh ra những giá trị ổn định tương đối (0,25 - 0,37) cho chỉ số tương đồng của loài giống nhau trong hầu hết so sánh song song giữa độ cao dưới 160 m và trên 320 m (hình 3.2). Chúng tôi đề xuất đoạn độ cao từ 160 m đến 320 m như là vùng dịch chuyển giữa vùng sinh thái khô (chúng tôi gọi là sinh cảnh khô) và vùng sinh thái ẩm (chúng tôi gọi là sinh cảnh ẩm) ở khu vực thu mẫu. Ngoài ra trong vùng rộng từ 160 m đến 320 m đã có sự dịch chuyển dần dần của thành phần quần xã theo xu hướng khác biệt của loài. Đặc biệt, ở điểm giữa (300 m) được xem xét như là ranh giới mạnh mẽ của vùng chuyển tiếp sinh thái và được sử dụng để phân tích xa hơn về sự thay đổi của quần xã Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo độ cao (hình 3.2).

(Chú thích: Mỗi một điểm là sự so sánh giữa các khỏng độ cao liên tiếp 40 m. Vùng màu xám ở giữa là sự tăng đa dạng các loài giống nhau. Đường đứt đoạn là sự dịch chuyển loài đơn nhất được đặt ở độ cao 300 m).

Hình 3.2: Mô hình phân bố loài giống nhau và loài đơn nhất dọc theo độ cao ở khu vực nghiên cứu

3.2. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa 3.2.1. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên đặc điểm hình thái Chúng tôi thu được tổng số 520 mẫu vật Chrysomelidae ở khu vực nghiên cứu của Vườn Quốc gia Núi Chúa sử dụng khóa định loại của Kimoto [120, 150, 151, 152] chúng tôi xác định được toàn bộ số mẫu vật này thuộc về 141 dạng loài hình thái (như trong danh sách dưới đây). Phần lớn mẫu vật được xác định đến mức độ giống, một số mẫu vật chỉ xác định được ở mức độ phân họ, chỉ có số ít mẫu vật được xác định đến loài. Trong các mẫu vật được xác định đến mức độ loài, có 13 loài được mô tả là mới cho khoa học, bao gồm 11 loài trong giống Monolepta Chevrolat: M. decreta, M. demimuta, M. densopunctata, M. dubia, M. fluctuans, M. fuscicorne, M. interruptomarginata, M. ochracea, M. quotidiana, M. semicostata, M. thomaswagneri và 2 loài trong giống Paleosepharia Laboissiere: P. frontis và P. nuichua. Danh sách

36 các dạng loài hình thái của Chrysomelidae thu được ở khu vực nghiên cứu của VQG Núi Chúa gồm: Phân họ Alticinae Spinola, 1844 Giống Hyphasis Harold, 1887 1. Hyphasis sp.1 (89) 2. Hyphasis sp.2 (90) 3. Hyphasis tonkinensis (91) Giống Trachyaphthona Heikertinger, 1924 4. Trachyaphthona sp. (93) Giống Hermaeophaga Foudras, 1859 5. Hermaeophaga sp.1 (95, 96) 6. Hermaeophaga sp.3 (98) 7. Hermaeophaga sp.4 (130) Giống Manobidia Chen, 1934 8. Manobidia sp. (110) Giống Asiophrida Medvedev, 1999 9. Asiophrida sp. (111) Giống Podontia Dalman 1824 10. Podontia sp. (112) 11. Alticinae sp.1 (86) 12. Alticinae sp.2 (88) 13. Alticinae sp.3 (92) 14. Alticinae sp.4 (94) 15. Alticinae sp.5 (97) 16. Alticinae sp.6 (106, 107) 17. Alticinae sp.8 (108) 18. Alticinae sp.9 (109) 19. Alticinae sp.10 (122) 20. Alticinae sp.11 (123) 21. Alticinae sp.12 (124)

22. Alticinae sp.13 (125) 23. Alticinae sp.14 (136) Phân họ Bruchinae Latreille, 1802 24. Bruchinae sp.1 (81) 25. Bruchinae sp.2 (82) 26. Bruchinae sp.3 (83) Phân họ Chlamisinae Gressitt, 1946 Giống Chlamisus Rafinesque, 1815 27. Chlamisus sp.1 (1) 28. Chlamisus sp.2 (2) Phân họ Chrysomelinae Latreille, 1802 Giống Plagiodera Dejean, 1837 29. Plagiodera sp. (84) Giống Asiparopsis Chen, 1934 30. Asiparopsis sp. (85) Phân họ Clytrinae Lacordaire, 1848 Giống Clytra Laicharting, 1781 31. Clytra sp. (12) Giống Aetheomorpha Lacordaire, 1848 32. Aetheomorpha sp.1 (13) 33. Aetheomorpha sp.2 (16) Giống Smaragdina Chevrolat , 1837 34. Smaragdina sp.1 (14) 35. Smaragdina sp.2 (18) Giống Aspidolopha Lacordaire, 1848 36. Aspidolopha melanophthalma Lac, 1848 (15) 37. Clytrinae sp. (17) Phân họ Criocerinae Latreille, 1804 Giống Lilioceris Reitter, 1912 38. Lilioceris sp.1 (79)

39. Lilioceris sp.2 (80) Phân họ Cryptocephalinae Gyllenhal, 1813 Giống Adiscus Gistl, 1857, 40. Adiscus sp.1 (3) 41. Adiscus sp.2 (8) Giống Cryptocephalus Muller, 1764 42. Cryptocephalus sp.1 (4) 43. Cryptocephalus sp.2 (5) 44. Cryptocephalus inhumeralis Pic, 1922 (6) Giống Coenobius Suffrian, 1857 45. Coenobius sp.1 (7) 46. Coenobius sp.2 (9) 47. Coenobius sp.3 (10) 48. Coenobius sp.4 (11) Phân họ Eumolpinae Hope, 1840 Giống Aulexis Baly, 1863 49. Aulexis sp.1 (33) 50. Aulexis sp.2 (34) Giống Basilepta Baly, 1860 51. Basilepta sp.1 (45) 52. Basilepta sp.2 (57) 53. Basilepta sp.3 (59) 54. Basilepta sp.4 (60) 55. Basilepta sp.5 (65) 56. Basilepta sp.6 (66) 57. Basilepta sp.7 (67) 58. Basilepta sp.8 (68, 69) Giống Cleoporus Lefèvre, 1884 59. Cleoporus sp. (51) Giống Cleorina Lefèvre, 1885

60. Cleorina sp.1 (56) 61. Cleorina sp.2 (61) Giống Colaspoides Castelnau, 1883, 62. Colaspoides sp.1 (25, 26) 63. Colaspoides sp.3 (27) 64. Colaspoides sp.4 (28, 29) Giống Colasposoma Castelnau, 1833 65. Colasposoma sp.1 (44) 66. Colasposoma sp.1 (48) 67. Colasposoma sp.2 (49) Giống Heterotrichus Chapuis, 1874 68. Heterotrichus sp.1 (46, 47) Giống Hyperaxis Gemminger & Harold, 1874 69. Hyperaxis sp. 1 (40) 70. Hyperaxis sp.2 (41, 42) Giống Iphimoides Jacoby, 1883 71. Iphimoides sp. (20) Giống Nodina Motschulsky, 1853 72. Nodina sp.1 (52) 73. Nodina sp.2 (54, 55) Giống Pagria Lefèvre, 1884 74. Pagria sp.1 (53) 75. Pagria sp.2 (62) Giống Piomera Baly, 1863 76. Piomera sp.1 (36) Giống Platycorynus Chevrolat, 1937 77. Platycorynus sp. 1 (19) 78. Platycorynus sp.2 (21) 79. Platycorynus sp.3 (22) 80. Platycorynus sp.4 (23, 24)

Giống Scelodonta Westwood, 1837 81. Scelodonta sp.1 (37, 38, 39) 82. Scelodonta sp.2 (43) Giống Trichochrysea Baly, 1861 83. Trichochrysea sp.1 (63) 84. Trichochrysea sp.2 (64) Giống Tricliona Lefèvre, 1885 85. Tricliona sp. (50) Giống Xanthonia Baly, 1863 86. Xanthonia sp.1 (30, 31) 87. Eumopinae sp.1 (32) 88. Eumopinae sp.2 (35) 89. Eumopinae sp.4 (58 Phân họ Galeruciniae Latreille, 1802 Giống Cassenoides Kimoto, 1989 90. Cassenoides sp.1 (103) 91. Cassenoides sp.2 (133, 134) Giống Desbordesius Laboissike, 1933 92. Desbordesius sp.1 (105) 93. Desbordesius sp.2 (137) Giống Euluperus Weise, 1886 94. Euluperus sp. (99) Giống Gallerucida Motschulsky, 1860 95. Gallerucida sp.1 (131) 96. Gallerucida sp.2 (132) Giống Hyphaenia Baly, 1865 97. Hyphaenia sp.1 (120) 98. Hyphaenia sp.2 (121) Giống Issikia Chūjö, 1961 99. Issikia sp. (114)

Giống Liroetiella Kimoto, 1989 100. Liroetiella sp. (127) Giống Macrima Baly, 1878 101. Macrima sp. (119) Giống Monolepta Chevrolat, 1836 102. M. dalatica (141) 103. M. decreta (152) 104. M. demimuta (155) 105. M. densopunctata (138) 106. M. dubia (150) 107. M. flustuans (146) 108. M. fuscicorne (143) 109. M. interruptomarginata (145) 110. M. ochracea (153) 111. M. quotidiana (144) 112. M. semicostata (148, 149) 113. M. thomaswagneri (142) 114. Monolepta sp.1 (147) 115. Monolepta sp.2 (151) 116. Monolepta sp.3 (154) Giống Paleosepharia Laboissière, 1936 117. Paleosepharia nuichua (139) 118. Paleosepharia frontis (140) Giống Pseudoides Jacoby, 1892 119. Pseudoides sp. (101) Giống Pyrrhalta Joannis, 1865 120. Pyrrhalta sp.1 (115) 121. Pyrrhalta sp.2 (116) 122. Pyrrhalta sp.3 (129) Giống TaumaceraThunberg, 1814

123. Taumacera sp. (117) Giống Theopea Baly, 1864 124. Theopea sp. (87) 125. Galerucinae sp.1 (100) 126. Galerucinae sp.2 (102) 127. Galerucinae sp.3 (104) 128. Galerucinae sp.4 (113) 129. Galerucinae sp.6 (118) 130. Galerucinae sp.7 (126) 131. Galerucinae sp.8 (128) 132. Galerucinae sp.9 (135) Phân họ Hispinae Gyllenhal, 1813 Giống Aspidomorpha Hope, 1840 133. Aspidomorpha sp.1 (71) 134. Aspidomorpha sp.2 (72) 135. Aspidomorpha sp.3 (73) Giống Cassida Linnaeus, 1758 136. Cassida sp.1 (75) 137. Cassida sp.2 (76) 138. Cassida sp.3 (77) Giống Vietocassis Medvedev & Eroshkina, 1988 139. Vietocassis sp. (78) 140. Hispinae sp.1 (70) 141. Hispinae sp.2 (74)

(Các số trong dấu ngoặc đơn là số loài bPTP sẽ được trình bày trong mục 3.2.2) 141 loài hình thái thuộc 10 phân họ (bảng 3.2), phần lớn các mẫu vật nằm trong phân họ Eumolpinae (với 221 mẫu vật, thuộc 41 loài hình thái) và nhóm Galerucinae (146 mẫu vật và 43 loài hình thái), nhóm Alticinae có 49 mẫu vật thuộc 23 loài hình thái. Bảy phân họ còn lại thu được rất ít mẫu vật trong đó hai phân họ Cryptocephaninae và

Hispinae không thu được mẫu vật trong một số tuyến điều tra. Đa dạng loài hình thái trên một tuyến điều tra dao động từ 22 đến 58 loài, trong những tuyến điều tra ở địa bàn thấp hơn (Ao Hồ và Đá Đỏ) có số lượng loài thấp. Đa dạng loài ở trên và dưới 300 m dao động từ 85 đến 95 loài (bảng 3.1). Bảng 3.1: Đa dạng loài Chrysomelidae trong các tuyến điều tra và theo độ cao ở VQG Núi Chúa Phân họ Số lượng Số Tuyến điều tra Quần xã mẫu vật loài Ao Đá Mái Núi Suối Đá <300m >300m Hồ Đỏ Nhà Ông Trục Hang Alticinae 49 23/25 4/4 5/5 6/6 8/8 6/7 6/6 17/18 12/12 Bruchinae 7 3/3 - - 2/2 2/2 - - 3/3 - Chlamysinae 3 2/2 - - - 1/1 1/1 - - 2/2 Chrysomelinae 2 2/2 1/1 - - - - 1/1 1/1 1/1 Clytrinae 12 7/7 1/1 - 3/3 - 4/4 3/3 5/5 4/4 Criocerinae 2 2/2 - - - - 2/2 - - 2/2 Cryptocephalinae 14 9/9 4/4 1/1 1/1 1/1 5/5 1/1 7/7 4/4 Eumolpinae 221 41/51 12/13 7/8 20/22 18/21 19/20 18/19 26/32 30/33 Galerucinae 146 43/45 8/8 6/6 17/17 17/17 19/20 9/9 28/29 28/29 Hispinae 38 9/9 1/1 3/3 8/8 2/2 2/2 1/1 8/8 3/3 Tổng số 494 141/1 31/32 22/23 57/59 49/52 58/61 39/40 95/103 86/90 55 Ghi chú: Loài dựa trên đặc điểm hình thái ở trên dấu “/” và loài dựa theo kết quả bPTP ở dưới dấu “/” 3.2.2. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên dữ liệu ADN Chúng tôi thu được tổng số 520 mẫu vật Chrysomelidae ở khu vực nghiên cứu của Vườn Quốc gia Núi Chúa và toàn bộ số mẫu vật này được tách triết ADN, nhưng chỉ có 494 mẫu vật cho trình tự ADN có chất lượng tốt được dùng cho việc xác định loài. Trong 494 trình tự này có 150 trình tự lặp lại do vậy chỉ có 344 trình tự ADN khác nhau được dùng để phân tích xác định loài. Các trình tự Cox1 của các mẫu vật được dùng để xác định loài theo một số phương pháp khác nhau. Số lượng loài được đánh giá dao động từ 155 loài (theo phương pháp bPTP dựa trên cây ML) đến 186 loài (theo phương pháp GMYC với đa ngưỡng trên cây ML sử dụng r8s). Ngoại trừ kết quả xác định loài theo phương pháp GMYC với đa ngưỡng (từ PATHd8 và từ BEAST 1.8) cho kết quả khác biệt lớn với loài hình thái, tất cả các kết quả còn lại cho thấy sự phù hợp cao với loài hình thái (xấp xỉ 90 %) và có sự đồng thuận với nhau cao. Chỉ 8 loài theo phương pháp bPTP cho thấy sự chia tách xa hơn với một hay hầu hết phương pháp đơn ngưỡng khác, và 2 được kết hợp trong một đơn vị (khi so sánh với loài hình

44 thái). Trong các kết quả xác định loài dựa trên ADN, kết quả bằng phương pháp bPTP là phù hợp tốt nhất với loài hình thái. Xem xét những loài được xác định theo phương pháp bPTP không phù hợp với loài hình thái cho thấy, có 13 loài hình thái bị phân chia thành 2 loài bPTP và 1 loài hình thái bị phân chia thành 3 loài bPTP (bảng 3.3). Kết quả của đề tài có độ tin cậy cao bởi vì các phương pháp được sử dụng là độc lập với nhau. Một phần lớn các loài suy ra từ bộ dữ liệu đơn 344 trình tự ADN cox1 (dạng haplotype) chỉ có 1 trình tự ADN: 60% theo phương pháp xác định loài bPTP và từ 58,6 - 64,6% theo phương pháp GMYC. Khi xác định loài cho toàn bộ 494 trình tự ADN cox1, số lượng loài chỉ thu được một cá thể chiếm 49,7% (loài theo phương pháp bPTP). Mười bốn loài hình thái được phân tách xa hơn bởi phương pháp bPTP và các phương pháp khác, ngoại lệ là các loài số 046 và 047 chúng được giữ lại như là dạng đơn trong hầu hết các kết quả xác định bằng phương pháp GMYC. Và 14 loài này đại đa số trong cùng tuyến thu mẫu (9/14 loài) và cùng sinh cảnh (11/14 loài) (bảng 3.3). Sự hình thành loài thông thường được tách ra từ một mẫu haplotype trong nhóm cùng tổ tiên có khoảng cách p trung bình 0,096 ± 0,080. Bảng 3.3 cho thấy các nhóm loài bPTP 028-029, 037-039, 041-042, 095-096 và 139-140 có khoảng cách gen > 0,096. Bảng 3.2: Kết quả phân định loài dựa trên trình tự ADN gen cox1 của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa theo các thuật toán và mô hình khác nhau Cây Sự Ngưỡng Số loài Số bó Xác xuất Số loài Số loài Số loài tuyến trong đồng chia kết hợp tính GMYC thuận tách so lại so với với loài với loài loài hình hình thái hình thái thái ML R8s Đơn 178 [175-181] 63 [62-65] 500,063 122 18 0 Đa 186 [183-186] 62 [61-62] 505,887 119 21 0 Pd8 Đơn 160 [155-163] 65 [64-66] 522,670 124 16 0 Đa 161 [152-166] 76 [73-76] 527,336 39 20 81 BI SC Đơn 162 [157-166] 67 [65-67] 2480,504 124 16 0 Đa 165 [153-165] 94 [91-96] 2491,387 39 21 80 ULN Đơn 164 [158-166] 66 [66-68] 2463,070 122 18 0 Đa 173 [170-174] 67 [66-67] 2466,495 119 21 0 ML - bPTP 155 - - 126 14 0

Bảng 3.3: Sự không đồng thuận giữa loài hình thái và loài bPTP của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa (Loài bPTP như trong hình 3.3 và hình 3.4) Loài Số cá thể Số vị trí Cùng Cùng Khoảng cách Đặc điểm hình thái bPTP thu được tuyến sinh cảnh ADN và sai số khác nhau thu mẫu 023-024 (1-5) 5 có có 0.058±0.005 Màu sắc 025-026 (1-2) 3 không có 0.043±0.006 không 028-029 (1-23) 18 có có 0.125±0.005 không 030-031 (1-18) 17 có có 0.046±0.004 Kích thước và lớp lông 037-039 (2-2-2) 19 có có 0.304±0.007 không 041-042 (1-13) 12 Có có 0.228±0.006 không 046-047 (1-1) 2 không không 0.019±0.005 không 054-055 (1-6) 7 có có 0.059±0.004 không 068-069 (7-5) 12 có có 0.070±0.006 không 095-096 (1-3) 4 có có 0.107±0.007 không 106-107 (2-1) 3 không không 0.031±0.006 không 133-134 (2-1) 3 không có 0.071±0.008 Màu sắc ở trên đầu 139-140 (1-2) 3 không không 0.109±0.011 Bộ phận sinh dục của con đực 148-149 (5-10) 13 Có có 0.067±0.005 không

(Chú thích: Số ở đỉnh là số cá thể dạng haplotype và phù hợp với số loài tiêu bản của mẫu vật. Khi một vài mẫu vật có trình tự ADN giống nhau, số lượng tổng của các cá thể được đưa ra. Số ở điểm nút miêu tả sự hỗ trợ của thuật toán bootstrap. Những ô màu đen được đánh số là các đơn vị loài được xác định theo bPTP và những ô màu trắng là các loài hình thái cho thấy sự không đồng thuận với loài bPTP.) Hình 3.3: Xác định loài dựa trên cây mtADN của Chrysomelidae (loài từ 001 đến 069) ở VQG Núi Chúa. Bao gồm các phân họ Cryptocephalinae và Eumolpinae (nhóm chị em được chỉ ra ở hình 3.3).

(Chú thích: Số ở đỉnh là số cá thể dạng haplotype và phù hợp với số loài tiêu bản của mẫu vật. Khi một vài mẫu vật có trình tự ADN giống nhau, số lượng tổng của các cá thể được đưa ra. Số ở điểm nút miêu tả sự hỗ trợ của thuật toán bootstrap. Những ô màu đen được đánh số là các đơn vị loài được xác định theo bPTP và những ô màu trắng là các loài hình thái cho thấy sự không đồng thuận với loài bPTP.) Hình 3.4: Xác định loài dựa trên mtADN của Chrysomelidae (các loài từ 070-155) ở VQG Núi Chúa. Bao gồm các phân họ Hispinae, Criocerinae, Bruchinae, Chrysomelinae, Galerucinae và Alticinae (nhóm chị em được chỉ ra ở hình 3.2).

3.2.3. Tiềm năng đa dạng loài Chrysomelidae đạt được ở VQG Núi Chúa Bảng 3.4 cho thấy sự khác nhau của sự đánh giá không tham số của độ giàu loài dựa trên mẫu vật thu được và sự phân chia mẫu vật theo các tuyến thu mẫu và vị trí thu mẫu ở khu vực nghiên cứu. Các tuyến thu mẫu Ao Hồ và Suối Trục xuất hiện như là những tuyến đường đã thu mẫu tốt hơn các tuyến còn lại vì kết quả đánh giá của độ giàu loài thông thường gấp đôi sự đa dạng đã thu được. Tuyến Đá Đỏ, Mái Nhà và Núi Ông có số lượng mẫu vật thu được ít hơn và độ giàu loài được đánh giá nhiều hơn 2 lần (loại trừ Jack 1) và lên đến 4,3 lần (đánh giá Chao 2 cho tuyến Mái Nhà), cao hơn rất nhiều so với số lượng loài đã thu được. Tuyến đường Đá Hang thu mẫu đạt tới độ cao cao hơn các tuyến còn lại, có sự đa dạng loài cao nhưng do tuyến đường này chỉ được thu mẫu một lần trong khi các tuyến đường khác có số lần thu mẫu nhiều hơn, do vậy kết quả đánh giá độ giàu loài của tuyến đường này sẽ là thiếu chính xác. Khi phân chia dữ liệu theo độ cao, kết quả đánh giá sự đa dạng cho thấy cả phần sinh cảnh khô (<300 m) và sinh cảnh ẩm (>300 m) mẫu vật thu được bằng khoảng 50- 75% đa dạng được dự đoán của chúng, mặc dù thu mẫu ở độ cao trên 300 m đạt được hiệu quả thấp. Xét trên tổng thể cả khu vực thu mẫu, số lượng mẫu thu được của chúng tôi vượt trên 60% sự đa dạng dự đoán có thể đạt được trong khu vực nghiên cứu.

Bảng 3.4: Dự đoán đa dạng loài Chryromelidae đạt được trong các tuyến thu mẫu, trong các sinh cảnh và trong toàn bộ khu vực nghiên cứu ở VQG Núi Chúa (loài dùng cho đánh giá là loài bPTP) Tuyến N Số loài dự ICE Chao2 Jack1 Jack2 thu mẫu đoán tạo đường cong (S) AH 27a 48,7±10,09 72 51,47±14,94 45,0±4,44 56,73 DD 23 51,2±11,72 76,48 96,6±63,16b 39,4±3,63 52,61 DH 40 99,9±16,98 329,83 173,20±73,69 69,60±5,60 90,45 MN 57a 120,4±17,61 170,85 213,9±86,49b 95,3±7,9 126,77 NO 52 102,1±15,64 146,52 142,8±46,47b 86,4±6,33 112,53 ST 58a 101,8±14,37 150,84 120,2±28,48b 93,1±6,63 116,47 <300mc 94 147,4±15,18 201,59 156,2±22,29 141,2±14,44 167,15 >300mc 74 121,5±13,99 220,64 129,0±20,92 110,07±13,87 126,16 Tổngc 133a 197,3±16,31 260,18 250,8±22,44 195,4±13,30 227,80 Tổngd 155 226,3±17,08 301,09 234,46±22,58 230,00±12,24 268,13 Tổnge 151a 225,3±18,43 280,94 241,8±27,62b 227,8±12,40 271,91 Giải thích: a Một số ít mẫu vật và loài không thế được chia tới vị trí thu mẫu cụ thể. b Tính toán với đánh giá cổ điển (Colwell 2013) [152]. c Tổng số mẫu không bao gồm mẫu vật thu được từ tuyến Đá Hang. d Tổng số mẫu vật phân chia bới tuyến thu mẫu. e Tổng số mẫu vật phân chia bới vị trí thu mẫu. ICE, Chao2, Jack1, Jack2: Các phương pháp đánh giá độ giàu loài tiềm năng. 3.2.4. Đánh giá độ giàu loài của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa Nghiên cứu về nhóm côn trùng có sự đa dạng cao luôn luôn cho thấy sự thay đổi trong cấu trúc quần xã trong hệ sinh thái (Gotelli et al. 2010) [168]. Do có số lượng loài cao cho nên sẽ là khó khăn để thu được toàn bộ mẫu vật, những nhóm này thông thường thiếu sự cập nhật, sự tu chỉnh lại danh lục loài, nhiều loài vẫn còn chưa được nhận dạng và đợi mô tả và khó khăn để các chuyên gia đưa ra sự phân loại loài (ít nhất là tên của loài). Vì vậy, nhiều nghiên cứu đặc điểm các quần xã côn trùng nhiệt đới thường sử dụng các đặc điểm hình thái của con cái để đánh giá đa dạng loài (Basset et al. 2000) [169]. Ngày nay, sự khó khăn này có thể được giải quyết bằng phương pháp xác định loài dựa trên ADN. Hơn nữa, phương pháp này là đặc biệt phù hợp cho

51 nghiên cứu quần thể. Ở phạm vị nghiên cứu nhỏ, việc xác định các loài sử dụng phương pháp dựa trên ADN mang lại kết quả rất chính xác (Bergsten et al. 2012) [170]. Các mẫu vật thu được ở phạm vi nhỏ so với khu vực nghiên cứu thường đại diện cho một phần trong tổng số biến thể di truyền của loài và có sự khác biệt di truyền với những loài gần gũi nhất cùng khu vực phân bố (Bergsten et al. 2012; Meyer và Paulay 2005) [170, 171]. Ưu điểm của các phương pháp xác định loài dựa trên ADN cho nghiên cứu sinh thái quần xã là khả năng đánh giá được sự đa dạng tiềm năng (Hebert et al. 2004) [19], mà nếu không được chú ý sẽ đánh giá sai về đa dạng (Vodă et al. 2014) [172]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kết hợp giữa phương pháp nhận dạng loài dựa vào đặc điểm hình thái với các phương pháp xác định loài dựa trên ADN, kết quả cho thấy có 155 loài theo phương pháp bPTP phù hợp cao nhất với 141 loài hình thái thu được ở VQG Núi Chúa. Kết quả của chúng tôi là trong phạm vi của các kết quả trong các nghiên cứu tương tự về quần xã Chrysomelidae ở Việt Nam trước đây ở VQG Tam Đảo, khu Bảo tồn Thiên Nhiên Đăkrong (Quảng Trị) và khu vực Trung Bộ (Trần Thiếu Dư và cộng sự 2005, 2006, 2007, 2008) [85-89] và trong vùng nhiệt đới, thậm trí trong các nghiên cứu sử dụng nhiều kỹ thuật thu mẫu thay đổi có hệ thống hơn (Thormann et al. 2016; Charles và Basset 2005; Flowers và Hanson 2003; Sánchez- Reyes et al. 2014; ) [72, 76, 173, 174]. Với 155 loài Chrysomelidae thu được và kết quả đánh giá sự giàu loài tiềm năng từ 225-300 loài trong khu vực thu mẫu, và xét đến ảnh hưởng của quy mô và tính chất nhỏ của khu vực nghiên cứu (Rahbek 2005) [175], chúng tôi nhận thấy rằng đa dạng alpha địa phương ở Núi Chúa là rất cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có thể so sánh với kết quả thu được trong phạm vi và hệ thống khác. Ví dụ số loài cánh cứng ăn lá ở phạm vị nhỏ trong rừng nhiệt đới là 200 loài trong 11,6 km chiều dài của tuyến đường thu mẫu với phạm vi độ cao 760 m ở Peregrina Canyon Tamaulipas, Mexico; (Sánchez – Reyes et al. 2014) [174]; trên 400 loài được đánh giá ở khoảng độ cao giữa 1.000 m và 3.000 m trên mực nước biển ở rừng núi của Ecuador trong khu vực khoảng 140 km2 (Thormann et al. 2016) [72]; hay 510 loài cánh cứng ăn lá của tán lá từ 10-40 m độ cao trong rừng khô và rừng ẩm thường xanh ở Panama trên diện tích 55 km2 (Ødegaard 2006) [176].

Kết quả đánh giá tiềm năng đa dạng loài Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa cho thấy rằng trong trường hợp phân loại học dựa trên ADN không phù hợp cao với các loài hình thái chúng tôi cũng có sự thu mẫu thành công đạt 51,5% của tổng sự đa dạng tiềm năng của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa, và trên 68% trong hầu hết trường hợp xác định loài dựa trên ADN phù hợp cao với các loài hình thái. 3.3. Thực vật chủ của Chrysomelidae Trong quần xã Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa, do kinh phí hạn hẹp cho nên chỉ các mẫu vật trong phân họ Galerucinae được khuếch đại vùng gen cpADN PsbA-TrnH. Tất cả ADN của 146 mẫu vật trong phân họ Galerucinae được khuếch đại vùng gen cpADN PsbA-TrnH, tuy nhiên chỉ có 84 trong số 146 mẫu vật khuếch đại thành công, 84 mẫu vật này thuộc 32 loài. Trong đó, có 12 mẫu vật thu được 2 trình tự gen PsbA-TrnH, do đó tổng số thu được 96 trình tự gen PsbA-TrnH, và được sắp xếp trong 35 họ thực vật (bảng 3.6). Các mẫu vật không khuếch đại ADN vùng PsbA-TrnH thành công là do chất lượng ADN thấp (do lỗi kỹ thuật trong bảo quản mẫu vật của lần thu mẫu đầu tiên). Từ 96 trình tự ADN của vùng gen PsbA-TrnH thu được, chúng tôi có được thông tin phân loại thực vật chủ của Galerucinae thông qua chương trình BAGpipe. Thông qua chương trình này chúng tôi có được dữ liệu ADN của vùng gen PsbA-TrnH của các họ thực vật đã được gửi tới genbank, sau đó chương trình sẽ tự động so sánh sự tương tự nhau giữa trình tự ADN thức ăn của Chrysomelidae với trình tự ADN từ genbank và cuối cùng sẽ cho ra bảng kết quả được tóm tắt lại như bảng 3.5.

Ngoài Trong nhóm nhóm

Hình 3.5: Sự sắp xếp phân loại học của trình tự ADN thức ăn của Galerucinae (loài số 87) theo chương trình BAGpipe

Bảng 3.5. Nhận dạng phân loại học của các trình tự ADN lục lạp psbA-TrnH của thực vật chủ của các cá thể thuộc phân họ Galerucinae đạt được từ chương trình BAGpipe Chú thích: Bốn phương pháp suy luận được kiểm tra bao gồm: sự phù hợp tốt nhất với các trình tự thu được từ genBank (với khoảng cách p được đưa ra tương ứng), và phân loại học chung chung của các trình tự từ genBank với sự giống nhau ở 96% với các trình tự ADN lục lạp psbA-TrnH, và các giá trị hỗ trợ bên ngoài nhóm và bên trong nhóm. (Nhóm bên trong và nhóm bên ngoài minh họa như trong hình 3.5)

Sự Sự Taxon của ủng ủng Sự phù hợp tốt nhất với các ADN từ hộ hộ Loài trình tự thu được từ genBank genbank giống bên Tên của taxon bên Tên của taxon Mẫu vật (khoảng cách p) 0.96 ngoài bên ngoài trong bên trong Họ thực vật (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Theopea sp. (87) 2949 Morus indica (0,05084) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR)

3010 Morus indica (0,04609) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3179 Morus alba (0,05333) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3280 Morus indica (0,04609) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3283 Morus indica (0,04609) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3225 Morus indica (0,04609) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3273 Morus alba (0,04504) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3276 Morus indica (0,04609) - 1 Moraceae 0,92 Milicia MORACEAE (MOR) 3191 Holoptelea integrifolia (0) Rosales ULMACEAE (ULM) Hydrocotyle umbellata 3275 (0,00323) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) 3276 Hydrocotyle umbellata (0) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) 3284 Mangifera indica (0) Mangifera indica 0,93 Anacardiaceae 1 Mangifera indica ANACARDIACEAE (ANA) Polyalthia 3301 Polyalthia suberosa (0,00597) Annonaceae 0,98 Annonaceae 0,86 suberosa ANNONACEAE (ANN) Polyalthia 3301 Polyalthia suberosa (0,00597) Annonaceae 0,98 Annonaceae 0,86 suberosa ANNONACEAE (ANN)

(2) (1) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)

3345 Coffea mauritiana (0,01639) Rubiaceae - Rubiaceae 1 Rubiaceae RUBIACEAE (RUB) Morinda 3351 Morinda citrifolia (0,03343) citrifolia 0,71 Morindeae 1 Morinda citrifolia RUBIACEAE (RUB) Theopea sp. (87) Morinda 3351 Morinda citrifolia (0,03492) citrifolia 0,71 Morindeae 1 Morinda citrifolia RUBIACEAE (RUB) Albizia 3284 Albizia corniculata (0,01114) Fabaceae - Fabaceae 0,88 corniculata FABACEAE (FAB) Macrolobium angustifolium 3376 (0,04143) - - Detarieae - Detarieae FABACEAE (FAB) Galerucinae sp.1 (100) Chrysophyllum cuneifolium 2986 (0,00452) Sapotaceae 1 Sapotaceae 0,9 Sapotaceae SAPOTACEAE (SAP) 3049 Xantolis siamensis (0,00535) Sapotaceae 0,98 Sapotaceae 0,83 Sapotaceae SAPOTACEAE (SAP) Elaeagnus 3250 Elaeagnus gonyanthes (0) Elaeagnus 0,92 Elaeagnus 0,97 gonyanthes ELAEAGNACEAE (ELA) unclassified unclassified 3324 Bursera simaruba (0,00455) Burseraceae 0,99 Burseraceae 0,85 Burseraceae BURSERACEAE (BUR) unclassified unclassified 3324 Bursera simaruba (0,00455) Burseraceae 0,99 Burseraceae 0,85 Burseraceae BURSERACEAE (BUR) Galerucinae sp.2 (102) Psychotria berteroana 2892 (0,08648) - - Rubioideae - Rubioideae RUBIACEAE (RUB) Cassenoides sp.1 (103) 2957 Eurya ryukyuensis (0) Pentaphylacaceae 0,98 Pentaphylacaceae 0,7 Eurya PENTAPHYLACACEAE (PEN) Galerucinae sp. 3 (104) 3347 Rytidostylis gracilis (0,00966) Sicyoeae 0,91 Cucurbitaceae 1 Sicyoeae CUCURBITACEAE (CUC) Pyrrhalta sp.2 (116) Strychnos nux Strychnos nux Strychnos nux 3017 Strychnos nux vomica (0) vomica 1 vomica 1 vomica LOGANIACEAE (LOG) Handroanthus impetiginosus Stereospermum 3017 (0,06037) - 1 Pentapetalae 0,81 colais BIGNONIACEAE (BIG) 3163 Meiogyne bidwillii (0,01706) Annonaceae 0,93 Annonaceae 0,98 Annonaceae ANNONACEAE (ANN) Polyalthia 3295 Polyalthia suberosa (0,00597) Annonaceae 0,98 Annonaceae 0,86 suberosa ANNONACEAE (ANN) 3177 Celtis paniculata (0,04273) - - Celtis 1 Celtis CANNABACEAE (CAN) Secamone Secamone 3290 Secamone elliptica (0,00623) elliptica 0,94 Apocynaceae 1 elliptica APOCYNACEAE (APO) Taumacera sp (117) Garcinia 2890 Garcinia conrauana (0,05389) - 1 Clusiaceae 0,95 multiflora CLUSIACEAE (CLU) Galerucinae sp.6 (118) 2948 Croton megalobotrys (0,01492) Croton - Croton - Croton EUPHORBIACEAE (EUP)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)

3189 Croton megalobotrys (0,01481) Croton - Croton - Croton EUPHORBIACEAE (EUP) Hyphaenia sp.2 (121) 3157 Meiogyne bidwillii (0,01497) Annonaceae 0,93 Annonaceae 0,98 Annonaceae ANNONACEAE (ANN) Galerucinae sp.6 (126) 3235 Clematis grossa (0,00338) Anemoneae 0,94 Anemoneae 0,89 Anemoneae RANUNCULACEAE (RAN) 3244 Syzygium cumini (0,00928) Syzygium 0,91 Syzygium 0,82 Syzygium MYRTACEAE (MYR) Pyrrhalta sp.3 (129) 2989 Ficus tinctoria (0,01319) Ficus 1 Ficus 0,79 Ficus tinctoria MORACEAE (MOR) Psydrax lamprophylla 2989 (0,01639) Ixoroideae 0,74 Ixoroideae 1 Ixoroideae RUBIACEAE (RUB) 3170 Derris reticulata (0,01152) Fabaceae - Fabaceae 0,83 Derris reticulata FABACEAE (FAB) 3198 Hydrocotyle umbellata (0) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) Gallerucida sp.1 (131) Tetrastigma jinghongense Tetrastigma 3165 (0,00759) Vitaceae 0,92 Vitaceae 0,79 tonkinense VITACEAE (VIT) Gallerucida sp.2 (132) Ailanthus 3178 Ailanthus triphysa (0,04) triphysa 0,75 Ailanthus 0,77 Ailanthus triphysa SIMAROUBACEAE (SIM) Cassenoides sp.2 (133) 2907 Ilex zygophylla (0,01461) Ilex - Ilex - Ilex AQUIFOLIACEAE (AQU) Cassenoides sp.2 (134) Lithocarpus litseifolius 2872 (0,01113) Fagaceae 0,8 Fagaceae 0,75 Lithocarpus FAGACEAE (FAG) Galerucinae sp.9 (135) 2993 Maesa perlaria (0,00692) Maesa - asterids 0,81 Ericales PRIMULACEAE (PRI) 3185 Maesa perlaria (0,00694) Maesa - asterids 0,81 Ericales PRIMULACEAE (PRI) Antidesma vogelianum 3018 (0,06170) - - Antidesma - Antidesma PHYLLANTHACEAE (PHY) 3160 Pterygota alata (0,00824) Malvaceae 1 Malvaceae 0,92 Pterygota alata MALVACEAE (MAL) Monolepta densopunctata Averrhoa Averrhoa 3378 (138) Averrhoa carambola (0) carambola - Oxalidaceae 0,98 carambola OXALIDACEAE (OXA)

3378 Meiogyne bidwillii (0,01718) Annonaceae 0,93 Annonaceae 0,98 Annonaceae ANNONACEAE (ANN) Paleosepharia frontis (140) Glyptopetalum rhytidophyllum 2850 (0,02597) Celastraceae 1 Celastraceae 0,74 Glyptopetalum CELASTRACEAE (CEL) Hydrocotyle umbellata 3199 (0,00323) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA)

Hydrocotyle umbellata 3199 (0,00323) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA)

Monolepta dalatica (141) 2959 Eurya ryukyuensis (0) Pentaphylacaceae 0,98 Pentaphylacaceae 0,7 Eurya PENTAPHYLACACEAE (PEN)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 3188 Croton megalobotrys (0,01923) Croton - Croton - Croton EUPHORBIACEAE (EUP) Acronychia pedunculata Acronychia 3192 (0,00804) Acronychia 1 Acronychia 0,98 pedunculata RUTACEAE (RUT) 3195 Myrsine seguinii (0,01207) Primulaceae - Pentapetalae 1 Pentapetalae PRIMULACEAE (PRI) unclassified 3379 Anno- holosericea (0) Annonaceae 0,9 Annonaceae 0,81 Annonaceae ANNONACEAE (ANN) Monolepta thomaswagneri Rhodomyrtus tomentosa Rhodomyrtus 2974 (142) (0,00651) Myrtaceae - Myrtaceae 1 tomentosa MYRTACEAE (MYR) Rhodomyrtus tomentosa Rhodomyrtus 3320 (0,00651) Myrtaceae - Myrtaceae 1 tomentosa MYRTACEAE (MYR) 3061 Dacryodes edulis (0,02919) Dacryodes edulis - Anacardiaceae 1 Anacardiaceae ANACARDIACEAE (ANA) 3073 Castanea pumila (0,00808) Fagaceae - Fagaceae 0,8 Fagaceae FAGACEAE (FAG) Dodonaea 3166 Dodo-ea viscosa (0) viscosa 1 Sapindaceae 1 Dodonaea viscosa SAPINDACEAE (SAP) 3194 Myrsine seguinii (0,01207) Primulaceae - Pentapetalae 1 Pentapetalae PRIMULACEAE (PRI) Monolepta fuscicorne 3274 (143) Bridelia leichhardtii (0) Bridelia 1 Bridelieae 1 Bridelia PHYLLANTHACEAE (PHY) Monolepta quotidiana (144) Talipariti macrophyllum 2947 (0,01286) Malvoideae - Malvaceae 0,78 Malvaceae MALVACEAE (MAL) Talipariti macrophyllum 2950 (0,01333) Malvoideae - Malvaceae 0,78 Malvaceae MALVACEAE (MAL) Monolepta 2862 Buxus balearica (0,02352) Buxus 1 Buxus 0,87 Buxus BUXACEAE (BUX) interruptomarginata 3050 (145) Schefflera hypoleuca (0,01146) Araliaceae - asterids - asterids ARALIACEAE (ARA) Monolepta flustuans (146) Hydrocotyle umbellata 3202 (0,00323) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) Hydrocotyle umbellata 3202 (0,00323) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) Monolepta semicostata 2982 Celtis sinensis (0,00925) Celtis 1 Celtis 0,94 Celtis CANNABACEAE (CAN) (148) 3277 Hydrocotyle umbellata (0) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) 3354 Buxus balearica (0,02325) Buxus 1 Buxus 0,87 Buxus BUXACEAE (BUX) Monolepta semicostata (149) 2958 Eurya muricata (0,00238) Pentaphylacaceae 0,98 Pentaphylacaceae 0,7 Eurya PENTAPHYLACACEAE (PEN)

Symplocos urceolaris 3042 (0,01658) Symplocos 0,99 Ericales 1 Symplocos SYMPLOCACEAE (SYM)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) unclassified unclassified 3042 Urera corallina (0,00396) Urticaceae - Urticaceae 1 Urticaceae URTICACEAE (URT) Monolepta semicostata (149) 3120 Castanea pumila (0,00840) Fagaceae - Fagaceae 0,8 Fagaceae FAGACEAE (FAG)

3196 Myrsine seguinii (0,01207) Primulaceae - Pentapetalae 1 Pentapetalae PRIMULACEAE (PRI) 3291 Dacryodes edulis (0,02919) Dacryodes edulis - Anacardiaceae 1 Anacardiaceae ANACARDIACEAE (ANA) unclassified 3350 Anno- holosericea (0) Annonaceae 0,9 Annonaceae 0,81 Annonaceae ANNONACEAE (ANN) 3285 Hydrocotyle umbellata (0) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) 3363 Hydrocotyle umbellata (0) Hydrocotyle - asterids 1 Hydrocotyle ARALIACEAE (ARA) Monolepta dubia Harpephyllum caffrum Harpephyllum 3219 (150) (0,04360) - - Anacardiaceae 1 caffrum ANACARDIACEAE (ANA) Monolepta sp. 2953 (151 Croton megalobotrys (0,01470) Croton - Croton - Croton EUPHORBIACEAE (EUP) Monolepta decreta 3261 (152) Syzygium cumini (0,01149) Syzygium 0,91 Syzygium 0,82 Syzygium MYRTACEAE (MYR) Monolepta ochracea 2938 (153) Salacia chinensis (0,00540) Celastraceae 0,82 Celastraceae 1 Salacia chinensis CELASTRACEAE (CEL) Monolepta deminuta 3187 Vernicia fordii (0,03095) Vernicia fordii 1 Euphorbiaceae 1 Vernicia EUPHORBIACEAE (EUP) (155) 3367 Teramnus uncinatus (0) Phaseoleae FABACEAE (FAB) Brassavola 3369 Brassavola cucullata (0) Orchidaceae 0,75 Laeliinae 1 cucullata ORCHIDACEAE (ORC) 3369 Bridelia micrantha (0,04674) - 1 Bridelieae 1 Savia sessiliflora PHYLLANTHACEAE (PHY) Morinda 3370 Morinda citrifolia (0,03067) citrifolia 0,71 Morindeae 1 Morinda citrifolia RUBIACEAE (RUB) X X 3084 Cayaponia jenmanii (0,03703) Cucurbitaceae 0,91 Cucurbitaceae 0,88 Cucurbitaceae CUCURBITACEAE (CUC)

Bảng 3.6. Số cá thể, số trình tự ADN vùng psbA-trnH và số họ thực vật chủ của các loài thuộc phân họ Galerucinae ở khu vực nghiên cứu Loài Số cá thể Số trình tự ADN Số họ thực vật chủ Theopea sp. (87) 15 19 7 Galerucinae sp.1 (100) 4 5 3 Galerucinae sp.2 (102) 1 1 1 Cassenoides sp.1 (103) 1 1 1 Galerucinae sp.3 (104) 1 1 1 Pyrrhalta sp.2 (116) 5 6 5 Taumacera sp. (117) 1 1 1 Galerucinae sp.6 (118) 2 2 1 Hyphaenia sp.2 (121) 1 1 1 Galerucinae sp.7 (126) 2 2 2 Pyrrhalta sp.3 (129) 3 4 4 Gallerucida sp.1 (131) 1 1 1 Gallerucida sp.2 (132) 1 1 1 Cassenoides sp.2 (133) 1 1 1 Cassenoides sp.2 (134) 1 1 1 Galerucinae sp.9 (135) 4 4 3 Monolepta densopunctata (138) 1 2 2 Paleosepharia frontis (140) 2 3 2 M. dalatica (141) 5 5 5 M. thomaswagneri (142) 6 6 5 M. fuscicorne (143) 1 1 1 M. quotidian (144) 2 2 1 M. interruptomarginata (145) 2 2 2 M. flustuans (146) 1 2 1 M. semicostata (148) 3 3 3 10 M. semicostata (149) 8 9 8 M. dubia (150) 1 1 1 Monolepta sp.(151) 1 1 1 M. decreta (152) 1 1 1 M. ochracea (153) 1 1 1 M. deminuta (155) 4 5 5 Galerucinae sp.3 1 1 1 Tổng số 32 loài 84 cá thể 96 trình tự DNA 35 họ thực vật chủ

Theo bảng 3.6, số thực vật chủ của các loài trong phân họ Galerucinae dao động từ 1-10 họ phụ thuộc vào số lượng cá thể của từng loài (thường những loài có số lượng cá thể lớn thì liên kết với nhiều họ thực vật chủ hơn và ngược lại). Kết quả này cho

thấy rằng có 13 loài trong phân họ Galerucinae là những loài polyphagous (loài ăn tạp). Loài M. semicostata (gồm hai loài xác định theo phương pháp bPTP là loài 148 và loài 149) ăn trên nhiều thực vật chủ nhất (10 họ thực vật chủ), loài số 87 ăn trên 7 họ thực vật chủ, có 4 loài ăn trên 5 họ thực vật chủ (loài 116, loài M. dalatica, M. thomaswagneri và loài M. deminuta), loài 129 ăn trên 4 họ thực vật chủ, có 2 loài ăn trên 3 họ thực vật chủ (loài 100 và loài 135), có 4 loài ăn trên 2 họ thực vật chủ (loài 126, loài M. densopunctata, P. frontis và M. interruptomarginata), 18 loài còn lại được ghi nhận chỉ ăn trên một họ thực vật chủ, những loài này chỉ có một cá thể trên loài. Các họ thực vật chủ của phân họ Galerucinae chủ yếu thuộc thực vật hạt kín.

Hình 3.6: Tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ của chúng ở khu vực nghiên cứu (bên dưới là các họ thực vật chủ, bên trên là các loài Galerucinae theo phương pháp xác định loài bPTP)

Hình 3.7: Mạng lưới tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ ở khu vực nghiên cứu

Tổng số có 74 liên kết hình thành giữa 32 loài Galerucinae và 35 họ thực vật chủ, như vậy trung bình có 1,1 liên kết/loài. Quan sát hình 3.6 và hình 3.7, chúng tôi thấy tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng thu được ở VQG Núi Chúa là phức tạp, được xây dựng từ 7 mạng lưới nhỏ (các loài trong các mạng lưới nhỏ khác nhau thì không tương tác với nhau): 4 mạng lưới chỉ có 1 liên kết, 1 mạng lưới có 2 liên kết, 1 mạng lưới có 3 liên kết, và 65 liên kết trong mạng lưới còn lại.

Sử dụng bộ ba mã vạch ADN chúng tôi có được 35 họ thực vật chủ của 32 loài Galerucinae thu được ở khu vực nghiên cứu. Kết quả cho thấy các họ thực vật chủ của Galerucinae thuộc ngành thực vật hạt kín, phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu trước đây (Barone 1998, Kishimoto-Yamadat et al. 2013; Ødegaard 2000, Novotny et al. 2002; Aslan và Alkan 2015, Eben và Monteros, 2015) [48, 54, 177, 178, 179, 180]. Có 14 loài Chrysomelidae ăn trên 2 họ thực vật chủ và 18 loài Chrysomelidae chỉ ăn trên 1 loài thực vật chủ. Điều này cho thấy nhiều loài Galerucinae ở khu vực nghiên cứu thiên về ăn chuyên biệt trên một họ thực vật chủ, điều này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu trước đây về thực vật chủ của côn trùng vùng nhiệt đới (Erwin 1982; Novotny và Basset 2005; Lewinsohn và Roslin 2008) [78, 181, 182] sự ăn tạp của nhiều loài Galerucinae là tương tự như trong kết quả nghiên cứu của Kishimoto- Yamadat et al. (2013) [54].

3.4. Sự biến đổi của quần xã Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa 3.4.1. Cấu trúc của quần xã Chrysomelidae xuyên qua không gian và độ cao ở VQG Núi Chúa 3.4.1.1. Ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” (sự chiếm cứ giữa lãnh thổ) tới Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa Trong phương pháp của chúng tôi, xác định độ rộng của vùng chuyển tiếp là vùng ở giữa độ cao 280 m và 320 m, ở vùng này cho thấy sự giảm đa dạng loài rõ rệt. Đa dạng loài cao nhất đạt được ở hai đỉnh, một đỉnh đạt được ở độ cao thấp (< 280 m) và một đỉnh ở độ cao cao hơn (> 320 m), và điều này cho thấy đường cong hình chữ U (Hình 3.8). Kết quả này có thể là do ảnh hưởng của chiến lược thu mẫu (chỉ có 2 điểm trong các tuyến thu mẫu của chúng tôi là bao phủ khoảng cách 40 m này). Trong phạm vi nghiên cứu của chúng tôi, sự giảm nhẹ độ giàu loài đã quan sát được ở độ cao hơn > 500 m. Những mẫu vật từ Đá Hang, tuyến thu mẫu có độ cao lớn hơn 700 m, cho thấy số loài đơn nhất thu được nhiều ở độ cao cao hơn (14 trong 19 loài tìm thấy ở độ cao trên 500 m) nhưng còn quá sớm để kết luận sự thay đổi của độ giàu loài liên quan đến sự thay đổi độ cao bởi vì tuyến đường này chỉ được thu mẫu một lần.

Trong các nghiên cứu trước đây, có hai mô hình chính được tìm thấy trong nghiên cứu ảnh hưởng của độ cao tới độ giàu loài. Một là đa dạng loài giảm với độ cao hay đa dạng loài đạt đỉnh ở độ cao của điểm giữa khu vực cư trú của sinh vật (Rahbek 2005) [175]. Kết quả của chúng tôi gợi ý cho mô hình sau ít biết đến hơn đó là ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” (sự chiếm cứ giữa lãnh thổ) (Dunn et al.2007) [183]. Theo mô hình này, sự giàu loài giảm đều đều theo độ cao ở phạm vi tuyến đường ngắn trong khi độ giàu loài có dạng hình nón đối với tuyến đường dài hơn (Rahbek 2005, Dunn et al. 2007) [175, 183]. Nhiều chân khớp ở phạm vi không gian nhỏ hơn hiếm khi phù hợp với những dự đoán của mô hình “mid-domain” (Dunn et al. 2007) [183]. Tuy nhiên không có nhiều tài liệu nghiên cứu ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” ở phạm vi nhỏ. Chỉ có một vài dữ liệu cho thấy có sự ảnh hưởng của độ cao tới quần xã sinh vật (Kotze và SamWays 2001) [184]. Nghiên cứu của chúng tôi đang hướng vào độ cao trong tuyến đường ngắn, với sự thay đổi nhỏ của quần xã thực vật. Kết quả của chúng tôi cho thấy ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” là nhỏ và chúng tôi giải thích kết quả này là do các loài thích nghi khác nhau ở vùng chuyển tiếp (Jankowski et al. 2009) [185]. Và sự phá rừng ở vùng đất thấp, hay sự khôi phục rừng không đầy đủ đã dẫn tới sự thay đổi độ giàu loài và thành phần quần xã. Sự xáo trộn môi trường có thể gây ảnh hưởng làm giảm độ giàu loài như mô tả cho bướm sâu đo trong núi Kilimanjaro (Axmacher et al. 2004, Christensen và Heilmann – Clausen 2009) [186, 187]. Ngoài ra, sự ít phù hợpvới mô hình “mid-domain” của dữ liệu của chúng tôi có thể do hiệu quả thu mẫu không bằng nhau trong chiến lược thu mẫu của chúng tôi.

(Chú thích: các tuyến thu mẫu Ao Hồ, Đá Đỏ, Mái Nhà, Núi Ông và Suối Trục) được xem xét ở các đoạn độ cao liên tục khác nhau. Đa dạng rơi ở giữa độ cao (đường liền mảnh) như là sự phù hợp thông qua sự khác nhau nhỏ của phân tích và nó cho thấy như sự làm phẳng của đường cong phù hợp (đường liền đậm)) Hình 3.8: Sự thay đổi đa dạng loài alpha của Chrysomelidae dọc theo độ cao ở VQG Núi Chúa 3.4.1.2. Sự biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian Chúng tôi phân tích cấu trúc quần xã Chrysomelidae theo tuyến đường thu mẫu và theo độ cao. Tỷ lệ loài giống nhau giữa các cặp tuyến đường thu mẫu trong khoảng từ 6,3% đến 46,0% (với chỉ số Sørensen cổ điển) và từ 3,2% đến 29,8% (với chỉ số Jaccard), và giá trị đạt thấp nhất khi so sánh giữa tuyến Đá Hang và các tuyến đường khác (Bảng 3.7). Dựa trên kết quả này và những kết quả trước đây cho thấy Đá Hang như nằm ngoài chiến lược thu mẫu, và chúng tôi không sử dụng kết quả của Đá Hang cho phân tích sự biến động của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa. Sau khi loại bỏ số loài thu được trong tuyến Đá Hang còn lại 129 loài bPTP trong tổng số 155 loài bPTP được dùng cho phân tích cấu trúc của Chrysomelidae theo không gian ở khu vực nghiên cứu.

Bảng 3.7. So sánh cấu trúc của quần xã Chrysomelidae giữa các tuyến thu mẫu ở VQG Núi Chúa ( Chú thích: đánh giá sử dụng chỉ số Sørensen cổ điển (bên dưới đường chéo) và chỉ số Jaccard (bên trên đường chéo)). Ao Hồ Đá Đỏ Đá Hang Mái Nhà Núi Ông Suối Trục Ao Hồ - 0.170 0.074 0.197 0.183 0.192 Đá Đỏ 0.290 - 0.032 0.171 0.136 0.135 Đá Hang 0.138 0.063 - 0.112 0.108 0.147 Mái Nhà 0.329 0.292 0.202 - 0.233 0.224 Núi Ông 0.309 0.240 0.195 0.378 - 0.298 Suối Trục 0.322 0.238 0.257 0.366 0.460 -

Từ bảng 3 cho thấy, Hai tuyến Núi Ông và Suối Trục được thu mẫu ở độ cao cao hơn và có vị trí không gian gần nhau, đã cho thấy số loài giống nhau cao nhất. Sự khác nhau của các loài trong các tuyến thu mẫu chủ yếu được gây ra bởi các loài thay thế (turnover) trong hầu hết các trường hợp, ngoại trừ trường hợp của Núi Ông và Suối Trục có sự đóng góp 10% của các loài tạo ổ (nestedness) (Hình 3.9a). Khi so sánh cấu trúc quần xã theo sinh cảnh (độ cao) trong mỗi tuyến đường thu mẫu cho thấy các quần xã từ sinh cảnh khô hơn của mỗi tuyến đường thu mẫu (ở độ cao dưới 300 m) có sự giống nhau nhiều hơn (sự khác nhau xấp xỉ 28-34%), tạo thành cụm với nhau (Hình 3.9b). So sánh cấu trúc quần xã Chrysomelidae trong các sinh cảnh khô (độ cao < 300 m) giữa các tuyến đường thu mẫu với nhau cho thấy cấu trúc quần xã Chrysomelidae trong tuyến Ao Hồ và Mái Nhà là giống nhau cao và tuyến Suối Trục khác xa với các tuyến còn lại (Hình 3.9c). Trong các sinh cảnh ẩm (độ cao > 300 m), cấu trúc quần xã Chrysomelidae trong tuyến Núi Ông và Suối Trục là giống nhau cao và khác xa với tuyến Mái Nhà (Hình 3.9d). Sử dụng kết quả phân định vùng chuyển tiếp như trên để

phân chia quần xã bọ cánh cứng ăn lá trong số mẫu thu được, quần xã trong vùng chuyển tiếp cho thấy sự giống nhau toàn thể cao nhất so với sinh cảnh ẩm (Hình 3.9e). Như vậy quần xã Chrysomelidae phân bố không đồng đều trong không gian. Chúng tôi chỉ sử dụng 129 loài Chrysomelidae đại diện cho sự lấy mẫu xuyên tâm từ vịnh Vĩnh Hy (loại trừ mẫu vật thu được từ tuyến Đá Hang). Tỷ lệ của các loài Chrysomelidae giống nhau giữa các tuyến thu mẫu và loại rừng được thu mẫu ở Núi Chúa là thấp (Bảng 3.7), do đó cho giá trị không giống nhau cao, điển hình trên 0,6 và sự chiếm ưu thế của thành phần các loài thay thế (tỷ lệ 0,68 - 0,77) xuyên qua phạm vi không gian nhỏ của khu vực nghiên cứu ở VQG Núi Chúa (Hình 3.9). Đa dạng beta có đóng góp lớn tới đa dạng của toàn quần xã. Mẫu vật thu được trong sinh cảnh khô theo hướng tạo thành cụm với nhau. Chúng tôi nhận thấy số loài ở vùng đất thấp (< 300 m) cao hơn số loài ở độ cao cao hơn (> 300 m) theo thứ tự 89 loài và 74 loài. Số loài chỉ thu được một cá thể ở hai độ cao là tương tự (38,2% và 35,1%, theo thứ tự < 300 m và > 300 m). Kết quả này cho thấy rằng, loài hiếm gặp và sự thu mẫu là khá cân bằng nhau trong các sinh cảnh. Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy, ở độ cao > 300 m có độ giàu loài cao hơn so với quần xã cánh cứng ở độ cao < 300 m, và đa dạng beta cao ở độ cao > 300 m phần lớn do thành phần các loài thay thế (Hình 3.9c và d). Chúng tôi đánh giá đa dạng beta của Chrysomelidae trong các tuyến đường và sinh cảnh thu mẫu của 60% đa dạng loài dự đoán đạt được ở Núi Chúa. Số liệu này có thể ảnh hưởng tới kết quả đánh giá đa dạng beta và khó để dự đoán tác nhân nào ảnh hưởng đến kết quả của chúng tôi. Có thể đa dạng beta được đánh giá quá cao bởi vì trong tất cả các điểm thu mẫu của chúng tôi không có điểm nào thu được chính xác số loài như dự đoán, cũng có thể bị đánh giá thấp bởi vì sự hạn chế trong thu mẫu những loài hiếm ở mỗi vị trí. Sự đánh giá sẽ là chính xác hơn nếu chúng tôi thu được số loài gần với dự đoán hơn. Số lượng mẫu vật có thể ảnh hưởng quan trọng tới đánh giá đa dạng beta. Số lượng mẫu vật nhỏ so với tổng khu vực được thu mẫu có thể làm tăng sự khác nhau bởi tính biến đổi trong sự xuất hiện loài. Ngược lại, số lượng mẫu vật lớn có thể có ảnh hưởng ngược lại bởi vì các loài đã di chuyển tới môi trường tối ưu của chúng. Trong trường hợp nghiên cứu của chúng tôi, số lượng mẫu vật nhỏ, ảnh hưởng

này có thể làm tăng đa dạng beta của mẫu vật ở phạm vi nhỏ (Barton el al. 2013; da Silva và Hernandez 2014) [134, 188]. Dù thế nào, sự xem xét trong khu vực nghiên cứu của chúng tôi còn cục bộ, và chúng tôi thu mẫu nhiều lần và khoảng cách giữa các điểm thu mẫu trong các tuyến đường là ngắn và thực vật khác nhau ít, điều này dường như không giống với xu hướng là số lượng mẫu vật tác động nghiêm trọng tới kết quả của chúng tôi. Ngoài ra, sự nghiên cứu trong một vài tuyến đường ở phạm vị nhỏ cung cấp một tiêu chuẩn lý tưởng để đánh giá ảnh hưởng của số lượng mẫu vật trong phạm vi nhỏ bằng khảo sát các nhóm loài giống nhau. Đa dạng beta có thể là độc lập với khoảng cách hay ít nhất không cao hơn nhiều ở khoảng cách ngắn nhất. Xem xét sự khác nhau giữa cấu trúc quần xã Chrysomelidae trong các tuyến thu mẫu, sự khác nhau tổng thể cao nhất đã đạt được không chỉ sau khi ảnh hưởng kết hợp của sự chia tách không gian mà còn của sự đa dạng sinh thái. Sự phân bố khác nhau của quần xã Chrysomelidae theo không gian đề nghị rằng sự đa dạng không những phụ thuộc mạnh mẽ vào các nhân tố phân loại học, sinh thái học và nhân tố lịch sử, mà còn vào sự phân chia của phạm vị độ cao, nhưng hiện tại chúng tôi không thể loại bỏ những sai lệch trong chiến lược thu mẫu (Rahbek, 2005; Oliver, 2015 và Tello et al., 2015) [175, 189, 190].

Sự khác nhau của các loài Sự khác nhau của các loài Sự khác nhau tổng thể thay thế tạo ổ

Hình 3.9: So sánh đa dạng beta của Chrysomelidae theo không gian ở VQG Núi Chúa (a) giữa các tuyến thu mẫu (b) giữa các sinh cảnh trong các tuyến đường thu mẫu (c) giữa các sinh cảnh khô trong các tuyến thu mẫu (d) giữa các sinh cảnh ẩm trong các tuyến thu mẫu (e) giữa 3 sinh cảnh (dry: sinh cảnh khô, ecotone: vùng chuyển tiếp và moist: sinh cảnh ẩm) trong toàn bộ khu vực nghiên cứu. Nguyên nhân sự phân bố không đồng đều của quần xã Chrysomelidae theo không gian.

Làm sáng tỏ nguyên nhân của sự phân bố không đều này là một trong những mục tiêu quan trọng nhất trong sinh thái học quần xã, và đặc biệt là cho mục tiêu bảo tồn. Sự xem xét trong phạm vi nghiên cứu nhỏ của chúng tôi, liên quan đến sự thay đổi độ cao, sự khác nhau được biểu hiện bằng sự khác nhau trong cấu trúc quần xã và hầu hết bởi các loài thay thế có thể là do sự chuyên môn hóa của các loài, thêm vào đó là sự liên quan giữa sự chuyên biệt vật chủ và đa dạng beta khi so sánh các vị trí dọc theo sự dịch chuyển sinh thái. Nhân tố tạo ổ (nestedness) của đa dạng beta có thể phản ánh sự thay đổi quần xã liên quan rõ ràng đến sự mất loài do sự phá hoại môi trường sống (nếu chúng ta quan sát sự đa dạng từ môi trường ở độ cao cao hơn tới vùng đất thấp được canh tác) hay các loài tăng thêm trong môi trường chuyển tiếp. Nghiên cứu của chúng tôi thiếu dữ liệu về những nhân tố khác – sinh vật và vô sinh và các yếu tố chưa biết, đã cản trở kiểm tra những giả thuyết trên. Độ cao là nhân tố đại diện cho một vài nhân tố liên quan đến sự thay đổi môi trường, nhưng nhân tố nào hay sự kết hợp của một vài nhân tố là điều kiện cho sự hợp lại của quần xã vẫn còn được tranh luận (Rahbek 2005) [175]. Trong những nhân tố tiềm năng, nhiệt độ được coi như một nhân tố ảnh hưởng chính đến sinh vật (Körner 2007) [191]. Nhiệt độ, và các nhân tố khác có ảnh hưởng khác nhau lên sự nhóm họp của quần xã, nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp lên sức chịu đựng vật lý của sinh vật hay gián tiếp ảnh hưởng lên các sinh vật (McCain 2007; Sundqvist et al. 2013) [192, 193]. Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình quang hợp, quá trình đường phân và sự cung cấp chất dinh dưỡng từ đất, từ đó chọn lọc các loài thực vật có các đặc điểm và chức năng phù hợp với nó, do đó nhiệt độ điều khiển quần xã thực vật (Sundqvist et al.

2013) [193]. Nhiệt độ kết hợp với độ ẩm (mặc dù độ ẩm không được xem như thực thể độ cao, Körner 2007) [191] và được công nhận như là yếu tố điều khiển mạnh mẽ cấu trúc quần xã động vật. Trong trường hợp của côn trùng ăn thực vật, các loài khác nhau và độ chuyên môn hóa khác nhau, thì quần xã thực vật được sử dụng làm thức ăn là điều kiện tất yếu cho sự phân bố của chúng. Theo chúng tôi chắc chắn đây là sự kết hợp trực tiếp và gián tiếp của sự thay đổi môi trường (độ cao) với cấu trúc của quần xã thực vật dọc theo sự dịch chuyển kiểu rừng, và sự thay đổi của cấu trúc quần xã thực vật này là yếu tố điều chỉnh sự đa dạng của cánh cứng ăn lá ở phạm vi nhỏ ở VQG Núi Chúa. Sự đa dạng này được giải thích thông thường bởi sự thay thế các loài thực vật, do đó thực vật chủ có khả năng xuất hiện như là điều kiện nhân tố chính của sự phân bố của động vật ăn chúng (Brehm et al. 2003; Novotny và Weibler 2005) [194, 195]. Mặc dù vậy, chúng tôi vẫn xem nhân tố này là ít quan trọng trong vai trò điều khiển cấu trúc của quần xã, hay là một giả thuyết để kiểm tra trong hệ thống này. Sự giới hạn trong thức ăn có thể là đúng cho các loài riêng lẻ và đó là những loài chuyên biệt cao. Tuy nhiên, các quần xã Chrysomelidae cho thấy tính chuyên biệt khác nhau, nhiều loài ăn nhiều loài thực vật khác nhau. Do đó, khi sự thay thế loài được thực hiện ở mức độ quần xã, nhân tố điều kiện không phải là thực vật chủ mà là các yếu tố xác định môi trường của quần xã thực vật. Hơn nữa, trong khi sự giàu có loài có thể cho thấy sự biến đổi vùng mạnh mẽ trong rừng nhiệt đới, sự chuyên biệt của côn trùng ăn thực vật dường như có liên quan với bậc phân loại học thực vật cao hơn, do đó thực vật chủ ảnh hưởng ít tới sự phân tán của chúng (Novotny và Weiblen 2005) [195]. Tóm lại, xem xét ở phạm vi địa lý nhỏ và sự thay đổi sinh thái dần dần trong khu vực nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi giải thích đa dạng beta cao là do điều kiện môi trường tiểu khí hậu (tác động trực tiếp lên chức năng sinh lý của côn trùng và gián tiếp lên quần xã thực vật).

3.4.2. Sự thay đổi của tương tác giữa Chrysomelidae và thực vật chủ theo sự thay đổi của độ cao 3.4.2.1 Sự sắp xếp phù hợp với quy chuẩn Phân tích sự phù hợp với quy chuẩn (CCA) sử dụng bốn biến số giải thích (Sinh cảnh – phân biệt giữa các mẫu vật thu thập được dưới và trên độ cao 300 m so với mực nước biển, hay tương ứng là sinh cảnh khô và sinh cảnh ẩm; Loài- ghi nhận bằng phương pháp ADN; Tuyến thu mẫu- theo các tuyến đường thu mẫu và thời gian - phân chia mẫu vật thu mẫu từ tháng một đến tháng năm (sau mưa gió mùa) và tháng sáu đến tháng 9 (trước mùa mưa mới) và thực vật chủ ở mức độ họ. Kết quả phân tích CCA đã đạt được giá trị VIF (Yếu tố làm tăng sự khác nhau) là thấp (1,06-1,58), đề nghị cho sự độc lập của các biến số bởi vì giá trị VIF bằng 1 đề nghị cho sự biến đổi độc lập hoàn toàn và giá trị lớn hơn 10 hoặc 20 đề nghị cho sự phụ thuộc nhau của các biến số và một mô hình có ý nghĩa cao (FCCA=1,452, Chi-sq=2,095, d.f.=4; P=0,001) cho ra sự tác động của 4 biến số này tới tương tác giữa cánh cứng ăn lá và thực vật chủ là thấp (6,93%), nó được đóng góp khá đồng nhất qua 4 trục hợp với quy chuẩn

(VARCCA1=0,322, VARCCA2=0,256, VARCCA3=0,245 và VARCCA4=0,177), trong đó trục đầu tiên là có ý nghĩa cao (FCCA1=1,872, Chi-sq=0,676, d.f.=1; P=0,001), và trục thứ 2 và thứ 3 có ý nghĩa vừa phải (FCCA2=1,487, Chi-sq=0,537, d.f.=1, P=0,030;

FCCA3=1,421, Chi-sq=0,513, d.f.=1, P=0,029) (hình 3.10). Khi kiểm tra sự phù hợp độc lập của từng biến số chúng tôi có kết quả như trong bảng 3.8.

Thời gian

Tuyến thu mẫu

Sinh cảnh

Loài

Hình 3.10: Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn của các biến số tới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ ở trong khu vực nghiên cứu.

Bảng 3.8: Kết quả phân tích CCA của riêng từng biến số đến tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ ở khu vực nghiên cứu. Stt Biến số Tỷ lệ của df Chisquare F P sự hạn chế (%) 1 Loài 1,668 1 0,5044 1,3737 0,036 2 Sinh cảnh 1,945 1 0,5883 1,6067 0,001 3 Tuyến thu mẫu 1,952 1 0,5902 1,6122 0,004 4 Thời gian 1,729 1 0,5229 1,4249 0,045

Bảng 3.8 cho thấy cả 4 biến số cùng ảnh hưởng tới tương tác giữa cánh cứng ăn lá và thực vật chủ (p = 0,01- 0,045 < 0,05) trong đó hai biến số sinh cảnh và tuyến thu mẫu có ảnh hưởng lớn hơn hai biến số còn lại vì có giá trị chisquare và F lớn hơn hai biến số còn lại (0,05883, 0,05902 và 1,6067 và 1,6122, theo thứ tự sinh cảnh và tuyến thu mẫu) 3.4.2.2. Đa dạng beta của tương tác Galerucinae và thực vật chủ theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa Đa dạng beta của cả quần xã Galerucinae và quần xã thực vật chủ trong khu vực nghiên cứu là cao (> 0.7) (bảng 3.9). Trong đó, đa dạng beta tổng và đa dạng beta của các loài mất đi/tăng lên của quần xã Galerucinae là nhỏ hơn quần xã thực vật chủ, tuy nhiên đa dạng beta của sự thay thế thì ngược lại. Bảng 3.9: Sự không giống nhau của quần xã Galerucinae và quần xã thực vật chủ giữa rừng khô và rừng ẩm ở khu vực nghiên cứu Chỉ số Quần xã Quần xã thực vật Tương tác giữa Galerucinae chủ Galerucinae và xã thực vật chủ

βtotal 0.72 0.77 0.96

Βrepl 0.69 0.57 0.85

Βrich 0.03 0.2 0.11

Kết quả tính toán đa dạng beta của tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ bằng gói “betalink” trong R cho kết quả sự khác nhau của mạng lưới trong hai sinh cảnh là cao ΒWN = 0, 92, trong đó 83,7% là do bởi các loài chia sẻ (βOS = 0,77) và

16,3% là do bởi các loài thay thế (βST = 0,15) và sự khác nhau của hỗn hợp loài của mạng lưới là cao (βS = 0, 57). Đa dạng beta cao là do sự khác nhau trong cấu trúc của mạng lưới trong hai sinh cảnh. Điều này sẽ trở nên rõ ràng hơn khi mô hình mạng lưới trong hai sinh cảnh được phân tích trong mục sau. Thực vật là quan trọng trong xác định ranh giới sinh cảnh xuyên qua không gian (Danz et al., 2011) [196]. Kết quả của chúng tôi cho thấy ảnh hưởng khẳng định của sinh cảnh và các tuyến thu mẫu đến liên kết giữa Galerucinae và thực vật chủ. Trong nghiên cứu của Menke et al (2012) [197] đã chỉ ra rằng thay đổi của đất rừng canh tác đã ảnh hưởng đến cấu trúc của mạng lưới thực vật và động vật ăn quả. Đa dạng beta cao của quần xã cánh cứng ăn lá và quần xã thực vật chủ là nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau cao của tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ. Đa dạng beta cao của các tương tác chủ yếu được đóng góp bởi các loài chia sẻ giữa hai mạng lưới trong sinh cảnh khô và sinh cảnh ẩm (βO S= 0,77) trong khi các loài thay thể đóng góp ít hơn (βST = 0,15). Mặc dù đa dạng beta của Galerucinae và thực vật chủ là cao, hay các loài chung thấp (9/32 loài cho Galerucinae và 8/34 họ thực vật chủ), tuy nhiên 9 loài chung này là loài ăn tạp, chúng có phổ thức ăn rộng, chúng hình thành 43 tương tác với thực vật chủ (chiếm 59% tổng tương tác trong mạng lưới). Những tương tác này đóng góp chính cho sự khác nhau cao của các tương tác giữa hai sinh cảnh. Giá trị đa dạng beta của quần xã thực vật chủ là cao hơn quần xã Galerucinae. Kết quả của chúng tôi là tương tự với kết quả của Novotny (2009) [198] khi nghiên cứu tương tác giữa động vật ăn thực vật và thực vật. Đa dạng beta của động vật ăn thực vật phụ thuộc vào sự chuyên biệt thực vật chủ của chúng. Sự dịch chuyển của các loài thực vật chủ trong không gian, thời gian và xuyên qua các môi trường khác nhau là nguyên nhân của sự thay đổi trong thành phần của quần xã động vật ăn thực vật. Novotny et al. (2006) [199] đã phát hiện rằng trong rừng mưa nguyên sinh đa dạng beta của động vật ăn thực vật thấp do sự chuyên biệt thực vật chủ thấp và sự phân tán cao. Hui Zhu et al. (2015)

đã chỉ ra rằng khi không có mặt gia súc, sự giàu loài của côn trùng liên quan với sự giàu loài của thực vật [200]. 3.4.2.3. Cấu trúc của mạng lưới tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ theo sinh cảnh (độ cao) So sánh cấu trúc của mạng lưới trong hai sinh cảnh khô và ẩm, sinh cảnh khô có 45 tương tác được xây dựng bởi 21 loài Galerucinae và 25 họ thực vật chủ, sinh cảnh ẩm có 38 tương tác được xây dựng bởi 20 loài Galerucinae và 18 họ thực vật chủ. Sự khác nhau này được thể hiện rõ qua sơ đồ phác họa mạng lưới và đồ thị tương tác trong hình 3.11a, b và các đặc điểm cấu trúc của mạng lưới được liệt kê trong bảng 3.10. Một số đặc điểm cấu trúc trong mạng lưới tương tác được liệt kê trong Bảng 3.10, trong đó: Chỉ số connectance là tỷ lệ liên kết thực (bằng số loài Galerucinae nhân với số loài thực vật chủ) chia cho số lượng các tế bào trong mạng lưới; Số lượng compartments là các mạng lưới nhỏ cấu trúc nên mạng lưới tổng thể và chúng không kết nối với nhau; Tính đối xứng của mạng lưới là sự cân bằng giữa số lượng của cả 2 mức độ dinh dưỡng, giá trị >0 cho thấy số loài ở mức độ dinh dưỡng cao cao hơn số loài ở mức độ dinh dưỡng thấp và ngược lại; Hệ số bó: Là hệ số bó trung bình của các thành viên của nó, đơn giản là số lượng liên kết quan sát được chia cho số lượng liên kết tiềm năng.

B Hình 3.11a: Mạng lưới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh ở VQG Núi Chúa (A) là trong sinh cảnh khô; (B) trong sinh cảnh ẩm

Hình 3.11b: Đồ thị tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh ở VQG Núi Chúa (C) sinh cảnh khô và (D) sinh cảnh ẩm

Bảng 3.10: So sánh đặc điểm cấu trúc của mạng lưới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh khô và ẩm ở khu vực nghiên cứu

Đặc điểm so sánh Sinh cảnh khô Sinh cảnh ẩm Số loài Galerucinae 21 20 Số họ thực vật chủ 25 18 Tổng số loài trong mạng lưới 46 38 Số tương tác trong mạng lưới 45 32 Số liên kết trên một loài 0.98 0.84 Chỉ số connectance 0.086 0.089 Số lượng của compartments 6 7 Tính đối xứng của mạng lưới -0.087 0.52 Hệ số bó 0.04 0.055 Đa dạng shannon 3.8 3.465

Từ bảng 3.10 ta thấy, số loài Galerucinae, họ thực vật chủ và số tương tác giữa Galerucinae và các họ thực vật chủ ở sinh cảnh khô là cao hơn sinh cảnh ẩm (tương ứng 45 và 32) nhưng số mạng lưới nhỏ cấu tạo nên toàn bộ mạng lưới ở sinh cảnh ẩm lại nhiều hơn sinh cảnh khô (tương ứng 7 và 6). Trong sinh cảnh khô, 5 trong số 6 tiểu mạng lưới chỉ có 1 tương tác, các tương tác còn lại tạo thành tiểu mạng lưới cùng nhau (40 tương tác), trong khi ở sinh cảnh ẩm có 4/7 tiểu mạng có 1 tương tác, 1/7 tiểu mạng lưới có 3 tương tác, 1/7 có tiểu mạng lưới có 4 tương tác, 1/7 tiểu mạng lưới có 21 tương tác. Tính đối xứng của mạng lưới ở sinh cảnh khô < 0 còn ở sinh cảnh ẩm lại >0. Điều này cho thấy, tương tác giữa các loài Galerucinae và các họ thực vật chủ ở sinh và cảnh khô là phức tạp hơn trong sinh cảnh ẩm, và sinh cảnh khô có nhiều loài Galerucinae thiên về ăn tạp (ăn nhiều vật chủ) hơn so với các loài Galerucinae ở trong sinh cảnh ẩm, hay nói cách khác các loài Galerucinae trong sinh cảnh ẩm thiên về sự chuyên biệt thức ăn hơn. Điều này có thể được giải thích, do trong sinh cảnh khô với điều kiện thức ăn nghèo nàn các loài Galerucinae muốn tồn tại được phải ăn đa dạng

các loại thực vật khác nhau, còn trong sinh cảnh ẩm với điều kiện thức ăn dồi dào các thực vật chủ cung cấp đủ lượng thức ăn cho các loài cánh cứng. Điều này cho thấy sự thích nghi của Galerucinae trong các điều kiện sống khác nhau. Số lượng tiểu mạng lưới trong hai mạng lưới trong hai sinh cảnh ở khu vực nghiên cứu là cao hơn trong kết quả nghiên cứu của một vài nghiên cứu trước đây, mặc dù số loài trong mạng lưới là nhỏ hơn (Krause et al., 2003; Prado và Lewinshon, 2004) [201, 202]. Giá trị kết nối trong hai mạng lưới trong hai sinh cảnh ở khu vực nghiên cứu là thấp hơn trong một vài nghiên cứu trước đây (Eben và Monteros, 2015; Meskens et al., 2011) [180, 203] nhưng kết quả của nghiên cứu lại phù hợp với kết quả trong nghiên cứu của Dunne et al (2002) [204, 205]. 3.4.3. Hoạt động bảo tồn ở VQG Núi Chúa cần chú ý đến sự mất môi trường sống của quần xã Chrysomelidae Động cơ đầu tiên của chúng tôi để nghiên cứu tính đa dạng cánh cứng ăn lá và sự thay thế tiềm năng trong diễn thế sinh thái từ rừng khô đất thấp đến rừng ẩm hơn ở Núi Chúa là sự cấp thiết làm tăng sự hiểu biết về đa dạng sinh học của VQG Núi Chúa. Trong vùng nhiệt đới, nhóm côn trùng đa dạng cao như Chrysomelidae có thể đóng góp lớn vào sự khác biệt to lớn cho sinh thái quần xã. Kết quả từ nghiên cứu của chúng tôi với sự liên quan rõ ràng cho bảo tồn là đa dạng Chrysomeliar ở Núi Chúa rất cao, và đặc biệt sự sự thay thế loài cao trong các tuyến thu mẫu ở độ cao khác nhau và sự khác nhau của quần xã Chrysomelidae có liên quan đến quần xã thực vật. Sự hiểu biết về đa dạng beta liên quan với phạm vi không gian là quan trọng để hiểu những rủi ro tuyệt chủng và để có những thể chế bảo tồn hiệu quả. Do vậy, những biện pháp bảo vệ ở VQG Núi Chúa cần tính đến sự không đồng nhất cao của tính đa dạng này. Đặc biệt với tình trạng chặt phá rừng ở vùng đất thấp ở Núi Chúa là tăng nhanh trong những năm gần đây sẽ làm mất đi môi trường sống của quần xã Chrysomelidae gây ra sự sụt giảm đa dạng của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa.

KẾT LUẬN 1. Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa Chúng tôi khám phá 155 loài Chrysomelidae theo phương pháp xác định loài dựa vào dữ liệu ADN (gen cox1) tương ứng với 141 dạng loài hình thái ở khu vực nghiên cứu trong VQG Núi Chúa. Mô tả 13 loài mới cho khoa học, bao gồm 11 loài trong giống Monolepta Chevrolat: M. decreta, M. demimuta, M. densopunctata, M. dubia, M. fluctuans, M. fuscicorne, M. interruptomarginata, M. ochracea, M. quotidiana, M. semicostata, M. thomaswagneri và 2 loài trong giống Paleosepharia Laboissiere: P. frontis và P. nuichua. Tiềm năng đa dạng loài của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa được đánh giá cao hơn từ 1,5 -2,0 lần đa dạng thu được. 2. Thực vật chủ của Chrysomelidae Bằng phương pháp sinh học phân tử, chúng tôi ghi nhận được 35 họ thực vật thuộc ngành thực vật hạt kín là thức ăn của 32 loài Chrysomelidae thuộc phân họ Galerucinae thu được ở VQG Núi Chúa. Trong 32 loài ghi nhận được thực vật chủ có 18 loài chỉ ăn trên một họ thực vật (loài chuyên biệt) và 14 loài ăn trên nhiều hơn hai họ thực vật (loài ăn tạp). 3. Sự biến đổi của quần xã Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa Đa dạng loài Chrysomelidae là tương tự trong hai loại sinh cảnh (độ cao < 300 m và >300 m), đa dạng alpha thay đổi dọc theo độ cao và cho thấy sự đa dạng tăng trong vùng chuyển tiếp (khoảng độ cao từ 160 m - 320 m). Đa dạng beta của Chrysomelidae là cao giữa các tuyến thu mẫu và giữa các sinh cảnh. Sinh cảnh và tuyến đường thu mẫu có ảnh hưởng tới liên kết giữa các loài Chrysomelidae và các họ thực vật chủ. Đa dạng beta của quần xã Chrysomelidae và thực vật chủ giữa hai sinh cảnh là cao (> 0,7), dẫn đến đa dạng beta của tương tác giữa chúng cao (0,96). Mạng lưới trong sinh cảnh ẩm có nhiều tiểu mạng lưới hơn sinh cảnh khô và các loài Chrysomelidae trong sinh cảnh ẩm là thiên về chuyên biệt thức ăn hơn trong sinh cảnh khô.

KIẾN NGHỊ Đề tài sử dụng phương pháp sinh học phân tử để xác định loài cánh cứng ăn lá thu được ở khu vực nghiên cứu, chưa nghiên cứu sâu về phân loại học hình thái. Chúng tôi mới chỉ tập trung phân loại một phân họ Galeruciae trong các mẫu vật thu được ở khu vực nghiên cứu nhưng đã mô tả được 13 loài mới cho khoa học. Do vậy trong các mẫu vật Chrysomelidae thu được ở khu vực nghiên cứu chắc chắn có nhiều loài là mới cho khu hệ Chrysomelidae ở Việt Nam cũng như mới cho khoa học. Do vậy cần có nghiên cứu về phân loại cho khu hệ Chrysomelidae ở khu vực nghiên cứu cũng như trong toàn lãnh thổ Việt Nam. Do giới hạn về kinh phí nghiên cứu, chúng tôi chỉ áp dụng phương pháp sinh học phân tử để khám phá ra thực vật chủ của các loài trong phân họ Galerucinae và kết quả cho thấy có sự thích nghi về thức ăn của các loài Chrysomelidae với điều kiện sống, tuy nhiên để kết quả chuẩn xác hơn cần nghiên cứu cho tất cả các mẫu vật Chrysomelidae thu được trong khu vực nghiên cứu cũng như thể mở rộng trong các khu vực nghiên cứu khác.

DANH SÁCH TÀI LIỆU TRÍCH DẪN 1. Quốc hội nước Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam khoá XII, 2008: Luật Đa dạng sinh học. Luật số: 20/2008/QH12, Hà Nội, ngày 13 tháng 11 năm 2008. 2. R.H. Whittaker, R. H., Evolution and Measurement of Species Diversity. Taxon, 1972, 21, 213-251 3. Camilo Mora, Derek P. Tittensor, SiNA Adl, Alastair G. B. Simpson, Boris Worm, How many species are there on Earth and in the Ocean? PloS Biol, 2011, 9(8): e1001127.doi: 10.1371/JourNAl.pbio.1001127. 4. A.D. Chapman, Numbers of living species in Australia and the world. Canberra: Australian Biological Resources Study, 2009: page 80. 5. M. Pidwirny, Understanding Physical Geography. Our planet Earth Publishing, 2015: 1- 209. 6. M. Foote. The Evolution of Morphological diversity. Ann. Rev.Ecol. Syst. 1997. 28:129-152 7. K. Roy, D. Jablonski. and J.W. Valentine, Higher taxo in biodiversity studies: patterns from Eastern Pacific marine mollusas. Phl. Trans. R. Soc. Lond. B. 1996. 351: 1605-1613. 8. D. M. Raup and J. Sepkoski. Periodicity of Extinction in geologic past. Pro. Natl. Acad. Sci., 1984. Vol 81: 801-805. 9. A.E. Magurran, Measuring Biological Diversity. John Wiley & Sons, 2013: 1- 264. 10. H.A. Mooney, The ecosystem – service chain and the biological diversity crisis. Phil. Trans. R. Soc. B., 2010, 365: 31 – 39. Doi:10.1098/rstb.2009.0223 11. J.M. De Vos, L.N. Joppa, Gittleman JL, Stephens PR, Pimm SL, Estimating the normal background rate of species extinction. Conserv Biol., 2015; 29(2):452- 62. Doi: 10.1111/cobi.12380. 12. P.S. Levin and D.A. Levin, The real Biodiversity Crisis. Macroscope. American Scientist, 2002, volume 90: 6-8 13. O.E. Sala et al., Global biodiversity scenarios for the year 2100. Science, 2000. 287(5459):1770-4.

14. N. S. Sodhi, B. W. Brook, and J.A. Corey, Chapter V.1: Causes and Consequences of species Extinctions. In Princeton guide to Ecology, 2009: 514 – 520. 15. T.R. New, Insect conservation. Junk, The Hague, 1984. 184pp. 16. P.D.N. Hebert, A. Cywinska, S.L. Ball, J.R. DeWaard, Biological identifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 2003, 270: 313-321. 17. P.D.N. Hebert, J.R. deWaard, Jean-François Landry, DNA barcodes for 1/1000 of the animal kingdom. Biol. Lett., 2010, 6, 359–362. doi:10.1098/rsbl.2009.0848 18. V. Savolainen, R.S. Cowan, A.P. Vogler, G.K. Roderick, R. Lane, Towards writing the encyclopaedia of life: an introduction to DNA barcoding. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 2005, 360(1462): 1805–1811. 19. P.D.N. Hebert, E.H. Penton, J.M. Burns, D.H. Janzen, W. Hallwachs, Ten species in one: AND barcoding reveals cryptics species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 14812–14817. PMID: 15465915. 20. R.D. Ward, T.S. Zemlak, B.H. Innes, P.R. Last, P.D.N Hebert, DNA barcoding Australia’s fish species. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 2005; 360(1462): 1847–1857. 21. K.C.R. Kerr, M. Y. Stoeckle, C.J. Dove, L.A. Weigt, C.M. Francis, P.D.N. Hebert, Comprehensive DNA barcode coverage of North American birds. Mol Ecol Notes. 2007 Jul; 7(4): 535–543. Doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01670.x 22. M.A. Smith, B.L. Fisher, and P.D.N. Hebert, DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthropod group: the ants of Madagascar. Phil. Trans. R. Soc. B., 2005, 360, 1825–1834. Doi:10.1098/rstb.2005.1714. 23. V. Nijman, M. Aliabadian, Performance of distance-based DNA barcoding in the molecular identification of Primates. Comptes Rendus Biologies, 2010, 33: 11- 16

24. M. Hajibabaei, D. H. Janzen, J.M. Burns, Winnie Hallwachs, and P.D.N. Hebert, DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS, 2006. 103 (4) 968-971; doi:10.1073/pnas.0510466103 25. A. Bucklin, D. Steinke, and L. Blanco-Bercial, DNA barcoding of marine metazoa. Ann. Rev. Mar. Sci. 2011, 3, 471–508. doi: 10.1146/annurev-marine- 120308-080950. 26. A. Hausmann, G. Haszprunar, P.D.N. Hebert, DNA Barcoding the Geometrid Fauna of Bavaria (Lepidoptera): Successes, Surprises, and Questions. PloS ONE, 2011, 6(2): e17134. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017134. 27. L. Plaisance, N. Knowlton, G. Paulay, C. Meyer, Reef-associated crustacean fauna: biodiversity estimates using semi-quantitative sampling and DNA barcoding. Coral Reefs (2009) 28: 977-986. Doi: 10.1007/s00338-009-0543-3. 28. E. Naro-Maciel, B. Reid, N.N. Fitzsimmons, DNA barcodes for globally threatened marine turtles: a registry approach to documenting biodiversity. Mol. Ecol. Resour. 2009; 10:252–263. 29. CE. Grant, T.L. Bailey, W.S. Noble, FIMO: scanning for occurrences of a given motif. Bioinformatics, 2011. 27(7):1017-8. Doi: 10.1093/bioinformatics/btr064. 30. J. Neigel, A. Domingo & J. Stake, DNA barcoding as a tool for coral reef conservation. Coral Reefs (2007) 26: 487. Doi:10.1007/s00338-007-0248-4. 31. D. Rubinoff, Utility of Mitochondrial DNA Barcodes in Species Conservation. Conservation Biology, 2006; 20: 1026–1033. Doi:10.1111/j.1523- 1739.2006.00372.x 32. DL. Dalton And A. Kotze, DNA barcoding as a tool for species identification in three forensic wildlife cases in South Africa. Forensic Sci Int., 2011. ;207(1-3):e51- 4. Doi: 10.1016/j.forsciint.2010.12.017. 33. K. Thompson, C.S. Baker, A. Van Helden, S. Patel, C. Millar, R. Constantine, The world’s rarest whale. Current Biology, 2012, 22, R905–R906. Doi: 10.1016/j.cub.2012.08.055

34. Z. T Nagy, T. Backeljau, M.D. Meyer, K. Jordaens, DNA barcoding: a practical tool for fundamental and applied biodiversity research. ZooKeys, 2013, 365 Special Issue. 1-677. 35. W. J. Kress, C. Garcı´a-Robledo, M. Uriarte, and D.L. Erickson, DNA barcodes for ecology, evolution, and conservation. Trends in Ecology & Evolution xx (2014) 1–11. 36. W.J. Kress, D.L. Erickson. DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 26; 105(8): 2761– 2762. Published online 2008 Feb 19. Doi: 10.1073/pnas.0800476105. 37. P.M. Hollingsworth, S.W. Graham, D.P. Little, Choosing ADN Using a Plant DNA Barcode. PloS ONE, 2011, 6(5): e19254. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019254. 38. D. Z. Li, L. M. Gao, H. T. Li, H. Wang, X. J. Ge, J. Q. Liu, Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108, 19641–19646. 10.1073/pnas.1104551108. 39. K.S. Burgess, A.J. Fazekas, P.R. Kesanakurti, S.W. Graham, B.C. Husband, Steven G. Newmaster, Diana M. Percy, Mehrdad Hajibabaei4ADN Spencer C. H. Barrett, Discriminating plant species in a local temperate ﬂora using the rbcL+matK DNA barcode. Methods in Ecology ADN Evolution, 2011, 2, 333–34. Doi: 10.1111/j.2041-210X.2011.00092.x 40. J. Gere, K. Yessoufou, B.H. Daru, L.T. Mankga, O. Maurin, M. van der Bank, Incorporating trnH-psbA to the core DNA barcodes improves significantly species discrimination within southern African Combretaceae. ZooKeys, 2013, 365: 127– 147. Doi: 10.3897/zookeys.365.5728. 41. M. Ballardini, A. Mercuri, C. Littardi, S. Abbas, M. Couderc, B. Ludeña, J-C Pintaud, The chloroplast DNA locus psbZ-trnfM as a potential barcode marker in Phoenix L. (Arecaceae). Zookeys. 2013; (365): 71- 82. Doi: 10.3897/zookeys.365.5725

42. R.S. Purty and S. Chatterjee, DNA Barcoding: An Effective Technique in Molecular Taxonomy. Austin J Biotechnol Bioeng., 2016; 3(1): 1059. 43. B. T. Dentinger, M. Y. Didukh, J. M. Moncalvo, Comparing COI and ITS as DNA barcode markers for mushrooms ADN allies (Agaricomycotina). PloS One. ,2011; 6: e25081. 44. A.E. Radulovici , P. Archambault and F. Dufresne, DNA Barcodes for Marine Biodiversity: Moving Fast Forward? Diversity, 2010, 2, 450-472; doi:10.3390/d2040450. 45. E.A. Chambers, P.D.N. Hebert, Assessing DNA Barcodes for Species Identification in North American Reptiles ADN Amphibians in Natural History Collections. PloS ONE, 2016 11(4): e0154363. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0154363. 46. S. Trivedi, A.A. Aloufi, H. Rehman, S. Saggu, S.K. Ghosh, DNA barcoding: Tool for assessing species identification in Reptilia. Journal of Entomology ADN Zoology Studies, 2016; 4(1): 332-337. 47. M. Hajibabaei, G.A.C. Singer, P.D.N. Hebert and D.A. Hickey, DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics ADN population genetics. Trends in Genetics, 2007. Vol.23 No.4: 167-172. Doi:10.1016/j.tig.2007.02.001. 48. J.A. Barone, Host-specificity of folivorous insects in a moist tropical forest. J Anim Ecol., 1998, 67: 400-409. Doi:10.1046/j.1365-2656.1998.00197.x. 49. B. Fry, A. Joern, P.L. Parker, Grasshopper food web analysis: Use of carbon isotope ratios to examine feeding relationships among terrestrial herbivores. Ecology, 1978, 59: 498–506. 50. D. Otte, A. Joern, On feeding patterns in desert grasshoppers ADN the evolution of specialized diets. Proc Acad Nat Sci Phila., 1976, 128: 89–126. 51. J.A. Jurado-Rivera, A.P. Vogler, C.A.M. Reid, E. Petitpierre, and J. Gómez- Zurita, DNA barcoding insect–host plant associations. Proc Biol Sci., 2009, 276(1657): 639–648.

52. S.P. Navarro, J.A. Jurado-Rivera, J. Gomez-Zurita, C.H.C. Lyal, A.P. Vogler, DNA profiling of host-herbivore interactions in tropical forests. Ecol Entomol., 2010. 35: 18-32. Doi:10.1111/j.1365-2311.2009.01145.x. 53. C. García-Robledo, David L. Erickson, Charles L. Staines, Terry L. Erwin, ADN W. John Kress, Tropical Plant–Herbivore Networks: Reconstructing Species Interactions Using DNA Barcodes. PloS One, 2013. 8(1): e52967. 54. K. Kishimoto-Yamada, K. Kamiya, P. Meleng, B. Diway, H. Kaliang, L. Chong et al., Wide Host Ranges of Herbivorous Beetles? Insights from DNA Bar Coding. PloS ONE, 2013. 8(9): e74426. Doi:10.1371/journal.pone.0074426. 55. J. Liu, L. Shi, J. Han, G. Li, H. Lu, J. Hou, X. Zhou, F. Meng, S.R. Downie, Identification of species in the angiosperm family Apiaceae using DNAbarcodes. Mol Ecol Resour. 2014 Nov; 14(6):12318. Doi: 10.1111/1755-0998.12262. 56. Benjamin C. Haller, Rupert Mazzucco, Ulf Dieckmann. Evolutionary Branching in Complex LADNscapes. The American Naturalist, 2013; E000 DOI: 10.1086/671907. 57. J. G. Pausas and M. P. Austin, Patterns of Plant Species Richness in Relation to Different Environments: An Appraisal. Journal of Vegetation Science, 2001, 12: 153 – 166. https://doi.org/10.2307/3236601. 58. Jill E. Jankowski, Anna L. Ciecka, Nola Y. Meyer and Kerry N. Rabenold, Beta diversity along environmental gradients: implications of habitat specialization in tropical montane lADNscapes. Journal of Animal Ecology, 2009, 78, 315-327. 59. Z. Yang, X. Liu, M. Zhou, D. Ai, G. Wang, Y. Wang, C. Chu & J. Lundholm, The effect of environmental heterogeneity on species richness depends on community position along the environmental gradient. Scientific Reports, 2015, 5:15723. 60. Xavier Arnan, Xim Cerda and Javier Retana , Partitioning the impact of environment ADN spatial structure on alpha ADN beta components of taxonomic, functional ADN phylogenetic diversity in European ants. PeerJ. 2015 Sep 29;3:e1241. doi: 10.7717/peerj.1241. eCollection 2015.

61. Lenore Fahrig, Effects of habitat fragmentation on Biodiversity. Annu. Rev. Ecol. Syst., 2003, 34: 487-515. 62. G. Brehm and K. Fiedler, Ordinating tropical moth ensembles from an elevational gradient: a comparison of common methods. J Trop Ecol. 2004; 20: 165–172. 63. V. Novotny, SE. Miller, Y. Basset, L. Cizek, K. Darrow, B. Kaupa, An altitudinal comparison of caterpillar (Lepidoptera) assemblages on Ficus trees in Papua New Guinea. J Biogeogr., 2005, 32: 1303–1314. 64. F. Escobar, J.M. Lobo, G. Halffter, Assessing the origin of Neotropical mountain dung beetle assemblages (Scarabaeidae: Scarabaeinae): the comparative influence of vertical ADN horizontal colonization. J Biogeogr., 2006; 33: 1793– 1803. 65. A. García-López, E. Micó, E. Galante, From lowlADN to highlADNs: searching for elevational patterns of species richness ADN distribution of scarab beetles in Costa Rica. Div Distr., 2012; 18: 543–553. 66. U.J. Sánchez-Reyes, S. Niño–Maldonado, L. Barrientos-Lozano, Shawn M. Clark, Robert W. Jones, Faunistic patterns of leaf beetles (Coleoptera, Chrysomelidae) within elevational ADN temporal gradients in Sierra de San Carlos, Mexico. ZooKeys, 2016, 611: 11-56. https://doi.org/10.3897/zookeys.611.9608. 67. A. M. Bouzan, V. Flinte, M. V. Macedo, R. F. Monteiro, Elevation ADN temporal distributions of Chrysomelidae in southeast Brazil with emphasis on the Galerucinae. ZooKeys, 2015. (547):103-117. Doi:10.3897/zookeys.547.9723. 68. R. F. Noss, Indicators for monitoring Biodiversity- A hierarchical approach. Conservation Biology, 1990, 4: 355–364. Doi: 10.1111/j.1523-1739.1990.tb00309.x 69. T. M. Caro, G. O’Doherty, On the use of surrogate species in conservation biology. Conservation Biology, 1999, 13: 805–814. Doi: 10.1046/j.1523- 1739.1999.98338.x.

70. N. E. Stork, J. C. Habel, Can biodiversity hotspots protect more than tropical forest plants ADN vertebrates? Journal of Biogeography, 2014, 41: 421–428. Doi: 10.1111/jbi.12223. 71. P. Bouchard, V. V. Grebennikov, A. B. T. Smith & H. Douglas, Biodiversity of Coleoptera. In Insect biodiversity: science ADN society (R.G. Foottit & P.H. Adler, eds.). Blackwell Publishing, Oxford, 2009, p.265- 301.http://dx.doi.org/10.1002/9781444308211.ch11. 72. B. Thormann, D. Ahrens, D.M. Armijos, M.K. Peters, T. Wagner, J.W. Wägele, Exploring the leaf beetle fauna (Coleoptera: Chrysomelidae) of an Ecuadorian mountain forest with ADN barcoding. PloS ONE. 2016; 11: e0148268. Doi: 10.1371/journal.pone.0148268 PMID: 26849826. 73. J.U. Sanchez-Reyes, UrielNino-Maldo-do Santiago; J. Robert W., Diversity ADN altitudinal distribution of Chrysomelidae (Coleoptera) in Peregrina Canyon, Tamaulipas, Mexico. ZooKeys, 2014. Volume:417, Pages:103-132 74. Ebru G. Aslan, Comparative diversity of Alticinae (Coleoptera: Chrysomelidae) between Ciglikara ADN Dibek Nature reserves in Antalya, Turkey. Biologia, 2010: 65 (2): 316-324. 75. Ebru. G. Aslan and Yusuf Ayvaz, Diversity of Alticinae (Coleoptera, Chrysomelidae) in Kasnak Oak Forest Nature Reserve, Isparta, Turkey. Turkish Journal of Zoology, 2009: 33(3): 251-262 76. E. Charles, Y. Basset, Vertical stratification of leaf-beetle assemblages (Coleoptera: Chrysomelidae) in two forest types in Panama. J Trop Ecol. 2005; 21: 329–336. 77. M. S. Mohameddsaid, Catalogue of the Malaysian Chrysomelidae (Insecta: Coleoptera). Pensoft, Sofia-Moscow, 2004, 239 pp. 78. T.L. Erwin, Tropical forests: their richness in Coleoptera ADN other arthropod species. Coleopts. Bulletin, 1982, 36: 74-75.

79. T. Wagner, Arboreal chrysomelid community structure ADN faunal overlap between different types of forests in Central Africa. In: Cox ML (Ed.) Advances in Chrysomelidae Biology 1. Backhuys Publishers, Leiden, 1999, 247–270. 80. V. Novotny, S.E. Miller, Mapping ADN understADNing the diversity of insects in the tropics: past achievements ADN future directions. Austral Entomology, 2014, 53: 259–267. Doi: 10.1111/aen.12111 . 81. P.W. Price, Species interactions ADN the evolution of biodiversity. In: Herrera CM, Pellmyr O (Eds) Plant-Animal Interactions: An Evolutionary Approach. Blackwell Science, Oxford, 2002: 3–25. 82. Dang Thi Dap and L.N Medvedev, Trophical connections of Chrysomelidae in Vietnam. In: “Animal world of Vietnam”, M., “Nauka”, 1982, 84-97 (in Russian). 83. Dang Thi Dap and L.N Medvedev, Zoogeographical review of Chrysomelidae from Vietnam ADN Indochina. In: “Fauna ADN ecology of animals in Vietnam, 1983, M., “Nauka”, 83-94 (in Russian). 84. Đặng Thị Đáp, Sinh thái học và các mối quan hệ dinh dưỡng của côn trùng cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) ở Việt Nam. Tạp Chí Sinh học ,1989 11(4): 23-27. 85. Trần Thiếu Dư, Đặng Thị Đáp, Côn trùng cánh cứng ăn lá (Coleoptera: Chrysomelidae) ở Vườn quốc gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và những bổ sung mới cho khu hệ Việt Nam. Báo cáo khoa học, Hội nghị côn trùng toàn quốc lần thứ 5. NXB Nông nghiệp, 2005: 38-45. 86. Trần Thiếu Dư, Đặng Thị Đáp, Danh sách các loài côn trùng Cánh cứng ăn lá (Coleoptera, Chrysomelidae) tại khu bảo tồn thiên nhiên Đakrông (Quảng Trị). Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2005: 109-111. 87. Trần Thiếu Dư, Tạ Huy Thịnh, Đặng Thị Đáp, Kết quả điều tra côn trùng cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae, Coleoptera) dọc theo nhánh phía Tây đường Hồ Chí Minh đoạn từ Quảng Trị tới Quảng Nam. Báo cáo khoa học, Hội thảo KHCN quản lý nông nghiệp và phát triển bền vững ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp, 2006: 414- 420.

88. Trần Thiếu Dư, Tạ Huy Thịnh, Đặng Thị Đáp, Danh sách các loài cánh cứng ăn lá thuộc các phân họ Galerucinae, Hispinae và Cassidinae (Coleoptera: Chrysomelidae) thu được trên dãy Trường Sơn thuộc khu vực Trung Bộ. Báo cáo khoa học về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật. Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2. Phần Khu hệ Động vật – Thực vật; Sinh thái học và Môi trường. NXB Nông nghiệp, 2007: 62-72. 89. Trần Thiếu Dư, Tạ Huy Thịnh, Đặng Thị Đáp, Kết quả điều tra các phân họ Bọ đầu thụt Eumolpinae và Bọ nhảy Alticinae (Col.: Chrysomelidae) ở khu vực Trung Trường Sơn. Báo cáo Khoa học, Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ 6, Nxb Nông nghiệp, 2008: 60-67. 90. Đặng Thị Đáp, Trần Thiếu Dư, Côn trùng cánh cứng ăn lá thuộc tộc Galerucini (Chrysomelidae, Galerucinae) ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, Hội thảo quốc gia về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ nhất, NXB Nông nghiệp, 2005: 79-85. 91. Đặng Thị Đáp, Trần Thiếu Dư, Giống Arthrotus Motsch. Và Dercetina Gress. & Kim. (Coleoptera, Chrysomelidae, Galerucinae) ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, Hội nghị côn trùng toàn quốc lần thứ 5. NXB Nông nghiệp, 2005: 50-56. 92. Trần Thiếu Dư, Đặng Thị Đáp, Giống Podontia Dalman (Coleoptera, Chrysomelidae, Alticinae) ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, Hội nghị côn trùng toàn quốc lần thứ 5. NXB Nông nghiệp, 2005: 46-49. 93. L.N Medvedev, Criocerinae (Coleoptera, Chrysomelidae) of Vietnam. In: "Insects of Vietnam", In: "Insects of Vietnam", M., "Nauka", 1985, 64-79 (in Russian). 94. L.N Medvedev, Clytrinae (Coleoptera, Chrysomelidae) of field station Buon Loi. In: "Insects of Vietnam", M., "Nauka", 1985, 94-101 (in Russian). 95. L.N Medvedev and E. Samoderzhenkov, Cryptocephalinae fauna of Vietnam. In: "Entomological fauna of Vietnam", 1987, M., "Nauka", 1987, 20-40 (in Russian). 96. L.N Medvedev, Chrysomelinae fauna of Vietnam. In: "Entomological fauna of Vietnam", M., "Nauka", 1987, 69-80 (in Russian).

97. L.N Medvedev and G. Eroshkina, Revision of Cassidinae of Vietnam fauna. In: "Fauna and ecology of Vietnam insects", M., "Nauka", 1988, 105-143 (in Russian). 98. L.N Medvedev, Leaf beetles of the subfamily Clytrinae of Vietnam fauna. In: "Fauna and ecology of Vietnam insects", M., "Nauka", 1988, 21-46 (in Russian). 99. L.N Medvedev, Revision of subfamily Hispinae (Coleoptera, Chrysomelidae) of Vietnam fauna, part I. In: "Systematics and ecology of insects from Vietnam", "Nauka", M., 1992, 127-156 (in Russian). 100. L.N. Medvedev, Chrysomelidae of southern Asia (Coleoptera). Entomologica Basiliensia, 2001, 23: 159-191. 101. L.N. Medvedev, New genera and species of Oriental Chrysomelidae (Coleoptera). Entomologica Basiliensia, 2004, 26: 325-338. 102. L.N. Medvedev, Chrysomelidae (Coleoptera) of high mountain regions of North-West Vietnam. Russian Entomological Journal, 2009, 18(3): 201-208 103. L.N. Medvedev, New taxa of Chrysomelidae (Coleoptera) collected in canopy trees of South Vietnam. Russian Entomological Journal, 2010, 19(3): 241-244. 104. L.N Medvedev, New and poorly known Oriental species of leaf beetles (Coleoptera: Chrysomelidae). Russian Entomological Journal, 2011: 20(2): 193-196 105. L.N Medvedev, New species of Luperus Geoffroi, 1762 (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae) from China and Vietnam. Kavkazskii Entomologicheskii Byulleten, 2012: 8(2): 252-253 106. L.N Medvedev, New species of Chrysomelidae (Coleoptera) from Indochina. Evraziatskii Entomologicheskii Zhurnal, 2012, 11(1): 63-69 107. L.N Medvedev, New species of Calomicrus Stephens, 1834 (Chrysomelidae: Galerucinae) from China and Indochina. Russian Entomological J., 2013. 22(1): 37- 42. 108. L.N Medvedev, Revision of the genus Paleosepharia Laboissiere, 1936 (Coleoptera: Chrysomelidae) from Indochina. Russian Entomological J., 2014, 23 (1):45-51.

109. L.N Medvedev, New taxa of Chrysomelidae (Coleoptera) from Vietnam.

Russian Entomological J., 2015, Volume: 24 Issue: 1 Pages: 67-72. 110. Delobel Alex, Anton Klaus-Werner, New data on Spermophagus from Vietnam, with the description of a new species (Coleoptera:Chrysomelidae: Bruchinae: Amblycerini). Genus (Wroclaw), 2011 : 22(2): 261-270.

111. Wang Shu-Yong, Cui Jun-Zhi, LI Wen-Zhu, Ge Si-Qin,Yanv Xing-Ke, Three new species of Sphaeroderma apicale species group from China and Vietnam (Coleoptera,Chrysomelidae). Acta Zootaxonomica Sinica, 2010, 35(4): 905-910. 112. Andrzej Warchalowski, Lema victoris, a new species from vietnam (chrysomelidae: criocerinae). Annales Zoologici (Warsaw), 2010, 60(2): 221-223. 113. Igor K. Lopatin, A new genus and its two new species of leaf-beetles from Vietnam (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae). Genus (Wroclaw), 2003, 14(1): 103-107. 114. Igor K. Lopatin, Sinoluperus vietnamicus sp. n. - the first representative of the Chinese genera in Vietnam (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae). Zoosystematica Rossica, 2008, 17(1): 150 115. A.G. Moseyko, A new species of genus Demotina Baly (Chrysomelidae: Eumolpinae) from Vietnam with notes on synonymi of related species. Russian Entomological Journal, 2005, 14 (1): 55-57. 116. A.G. Moseyko, A new species of the leaf-beetle genus Demotina Baly (Coleoptera: Chrysomelidae: Eumolpinae) from Vietnam. Trudy Russkogo Entomologicheskogo Obshchestva, 2006, 77: 241-244. 117. J. Bezdek, New and interesting Apophylia species from South-East Asia (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae). Raffles Bulletin of Zoology, 2005, 53(1): 35-45 118. S. Kimoto, Description of a new species of Cassidinae from Vietnam (Coleoptera: Chrysomelidae). Serangga, 1997, 2(1): 143-145.

119. S. Kimoto, Descriptions of three new species of hispid beetles (Coleoptera: Chrysomelidae) from Thailand, Cambodia and Vietnam. Serangga, 1998, 3(1): 1-6. 120. S. Kimoto, Chrysomelidae (Coleoptera) of Thailand, Cambodia, Laos and Vietnam. VII. Alticinae. Bulletin of the Institute of Comparative Studies of International Cultures and Societies, 2000, Volume: 26: 103-299 121. Dang Thi Dap, The role of landscape ecological factors on distribution of leaf- beetles in Vietnam (ColeopteraChrysomelidae). Entomologiste (Paris), 1993, 49(3): 135-138. 122. Tạ Huy Thịnh, Phạm Hồng Thái, Hoàng Vũ Trụ. Kết quả bước đầu điều tra côn trùng ở Vườn Quốc gia Núi Chúa tỉnh Ninh Thuận. Báo cáo khoa học, Hội nghị Côn trùng học toàn quốc. Nxb Nông nghiệp, 2005, Hà Nội, 225-231 123. P. Jolivet, E. Petitpierre, and T.H. Hsiao, Biology of Chrysomelidae. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988, 615 p.

124. P. Jolivet, T.J. Hawkeswood, Host-Plants of Chrysomelidae of the World. Publisher : Backhuys, 1995. Pages : 281 125. P. Jolivet, M.L. Cox, Chrysomelidae Biology: 1: The Classification, Phylogeny and Genetics; 2: Ecological Studies; 3: General Studies. Publisher, 1996 : SPB. 3 vol 1: 444p 126. Konstantin S. Nadein, Phylogeny of Diboliina inferred from a morphologically based cladistic analysis (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae). J. Arthropod Systematics & Phylogeny, 2015. 73(1): 65-83 127. Yoko Matsumura, Izumi Yao, Rolf G. Beutel & Kazunori Yoshizawa, Molecular phylogeny of the leaf beetle subfamily Criocerinae (Coleoptera: Chrysomelidae) and the correlated evolution of reproductive organs. J. Arthropod Systematics & Phylogeny, 2014. 72(2): 95-110. 128. T. Montelongo & J. Gómez-Zurita, Multilocus molecular systematics and evolution in time and space of Calligrapha (Coleoptera: Chrysomelidae, Chrysomelinae). Zool. Scr. 2014. 43: 605-628.

129. A. Papadopoulou, A. Cardoso & J. Gómez-Zurita, Diversity and diversification of Eumolpinae (Coleoptera: Chrysomelidae) in New Caledonia. Zool. J. Linn. Soc., 2013, 168: 473-495. 130. G. De la Cadena, A. Papadopoulou, J-M. Maes & J. Gómez-Zurita, Evaluation of bias on the assessment of diet breadth of herbivorous insects using molecular

methods. Insect Sci., 2017 Apr;24(2):194-209. doi: 10.1111/1744-7917.12303. Epub 2016 Apr 7. 131. https://vi.wikipedia.org/wiki/Vườn_quốc_gia_Núi_Chúa 132. Đoàn Cảnh, Báo cáo chính thức về Đa dạng sinh học ở VQG Núi Chúa, 2006. 133. Sinh vật rừng việt nam: http://www.vncreatures.net/all_vqg/mapnc.php 134. P.S. Barton, S.A. Cunningham, A.D. Manning, H. Gibb, D.B. Lindenmayer, R.K. Didham, The spatial scaling of beta diversity. Global Ecol Biogeogr. 2013; 22: 639–647 135. R.K. Colwell and D. C. Lees, The mid-domain effect: geometric constraints on the geographyofspecies richness. Trends in Ecology & Evolution, 2000a, 15:70–76. 136. C. Simon, F. Frati, A. Beckenbach, B. Crespi, H. Liu, P. Flook, Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann Entomol Soc Am. 1994; 87: 651–701. 137. J. Gómez-Zurita, D. Sassi, A. Cardoso, M. Balke, Evolution of Cryptocephalus leaf beetles related to C. sericeus (Coleoptera: Chrysomelidae) and the role of hybridization in generating species mtDNA paraphyly. Zool Scr. 2012; 41: 47–67. 138. C.J. Pons, T.G. Barraclough, J. Gomez-Zurita, A. Cardoso, D.P. Duran, S. Hazell, S. Kamoun, W.D. Sumlin , A.P. Vogler, Sequence-based species delimitation for the DNA taxonomy of undescribed insects. Syst Biol. 2006; 55: 595–609. 139. T. Fujisawa, T.G. Barraclough, Delimiting species using single-locus data and the Generalized Mixed Yule Coalescent approach: a revised method and evaluation

on simulated data sets. Syst Biol. 2013; 62: 707–724. doi: 10.1093/sysbio/syt033 PMID: 23681854 140. J-j Zhang, P. Kapli, P. Pavlidis, A. Stamatakis, A general species delimitation method with applications to phylogenetic placements. Bioinformatics, 2013; 29: 2869–2876. doi: 10.1093/bioinformatics/btt499 PMID: 23990417 141. D. Darriba, G.L. Taboada, R. Doallo, D. Posada, jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing. Nat Methods. 2012; 9: 772. 142. A. Stamatakis, RAxML-VI-HPC: Maximum Likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics. 2006; 22: 2688– 2690. PMID: 16928733 143. T. Britton, C.L. Anderson, D. Jacquet, S. Lundqvist, K. Bremer, Estimating divergence times in large phylogenetic trees. Syst Biol. 2007; 56: 741–752. PMID: 17886144 144. M.J. Sanderson, r8s: inferring absolute rates of molecular evolution and divergence times in the absence of a molecular clock. Bioinformatics. 2003; 19: 301–302. PMID: 12538260 145. A.J. Drummond, M.A. Suchard, D. Xie, A. Rambaut, Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7. Mol Biol Evol. 2012; 29: 1969–1973. doi: 10.1093/molbev/mss075 PMID: 22367748 146. A. Rambaut, M.A. Suchard, D. Xie, A.J. Drummond, Tracer v1.6. 2014. Available: http://beast.bio.ed.ac.uk/ Tracer. 147. T. Ezard, T. Fujisawa, T.G. Barraclough, SPLITS: SPecies’ LImits by Threshold Statistics. R package version 1.0-18/r45. 2009. Available: http://R-Forge.R- project.org/projects/splits/. 148. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing. 149. Paul Aston, Chrysomelidae of Hong Kong part I: Introduction and key to subfamilies. Journal of Hong Kong Entomological Bulletin, 1(2), 2009: 2-5.

150. S. Kimoto, Chrysomelidae (Coleoptera) of Thailand, Cambodia, Laos and Vietnam. IV. Galerucinae. Esakia, 27, 1989: 1-241. 151. S. Kimoto and J.L. Gressitt, Chrysomelidae (Coleoptera) of of Thailand, Cambodia, Laos and Vietnam. III. Eumophinae. Esakia, 18, 1982: 1-141. 152. S. Kimoto and J.L. Gressitt, Chrysomelidae (Coleoptera) of of Thailand, Cambodia, Laos and Vietnam. II. Clytrinae, Cryptocephalinae, Chlamisinae, Lamprosomatinae and Chrysomelinae. Pacific Insect. 23 (3-4), 1981: 286 -391. 153. A. Papadopoulou, D. Chesters, I. Coronado, G. De la Cadena, A. Cardoso, J.C. Reyes, J-M. Maes, R.M. Rueda, J. Gómez-Zurita, Automated DNA-based plant identification for large-scale biodiversity assessment. Molecular Ecology Resources, 2015, 15: 136–152. doi: 10.1111/1755-0998.12256 154. J. Hortal, P.A.V. Borges and C. Gaspar, Evaluating the performance of species richness estimators: sensitivity to sample grain size. Journal of Animal Ecology, 2006, 75: 274–287. doi:10.1111/j.1365-2656.2006.01048.x 155. R.K. Colwell, 2013. EstimateS, Version 9.1: Statistical Estimation of Species Richness and Shared Species from Samples (Software and User's Guide). 156. A. Chao, R.L. Chazdon, R.K. Colwell and T.J. Shen, A new statistical approach for assessing similarity of species composition with incidence and abundance data. Ecology Letters, 2005, 8: 148–159. doi:10.1111/j.1461-0248.2004.00707.x 157. A. Baselga, Partitioning the turnover and nestedness components of beta diversity. Global Ecol. Biogeogr. 2010, 19: 134-143. 158. A. Baselga, C.D.L. Orme, Betapart: an R package for the study of beta diversity. Methods in Ecology and Evolution , 2012, 3: 808-812 159. J. Oksanen, Multivariate analysis of ecological communities in R: vegan tutorial, 2011. 160. P. Cardoso, F. Rigal, J.C. Carvalho, M. Fortelius, P.A.V. Borges, J. Podani & D. Schmera, Partitioning taxon, phylogenetic and functional beta diversity into replacement and richness difference components. Journal of Biogeography, 2014, 41, 749-761.

161. J.C. Carvalho, P. Cardoso & P. Gomes, Determining the relative roles of species replacement and species richness differences in generating beta-diversity patterns. Global Ecology and Biogeography, 2012, 21, 760-771 162. J. Podani & D. Schmera, A new conceptual and methodological framework for exploring and explaining pattern in presence-absence data. Oikos, 2011, 120, 1625- 1638. 163. T. Poisot, E. Canard, D. Mouillot, N. Mouquet, D. Gravel, The dissimilarity of species interaction networks. Ecology Letters, 2012, 15: 1353-1361. 164. C.F. Dormann, O. Purschke, J.R.G. Márquez, S. Lautenbach and B. Schröder, Components of uncertainty in species distribution analysis: a case study of the great grey shrike. Ecology, 2008, 89: 3371–3386. doi:10.1890/07-1772.1 165. Thomas M. Lewinsohn, Paulo I. Prado, Pedro Jordano and Jordi Bascompte and Jens M. Olesen, FORUM: Structure in plant-animal interaction assemblages. Oikos, 2006, 11.3.1:174-184 166. Jens M. Olesen, Jordi Bascompte, Yoko L. Dupont, Heidi Elberling, Claus Rasmussen and Pedro Jordano, Missing and forbidden links in mutualistic networks. Proceeding of the Royal Society B: Biological Sciences, 2011, 278: 752-732. 167. Carsten F. Dormann, Jochen Fründ, Nico Blüthgen and Bernd Gruber, Indices, Grapphs and Null Models: Analysing Bipartite Ecological Networks. The Open Ecology, 2009, 2: 7-24. 168. N.J. Gotelli, R.K. Colwell, Estimating species richness. In: Magurran AE, McGill BJ, editors. Biological Diversity: Frontiers In Measurement And Assessment. Oxford: Oxford University Press; 2010. pp. 39–54 169. Y. Basset, V. Novotny, S.E. Miller, R. Pyle, Quantifying Biodiversity: Experience with parataxonomists and digital photography in Papua New Guinea and Guyana. BioScience. 2000; 50: 899–908 170. J. Bergsten, D.T. Bilton, T. Fujisawa, M. Elliott, M.T. Monaghan, M. Balke, et al., The effect of geographical scale of sampling on ADN barcoding. Syst Biol. 2012; 61: 851–869. PMID: 22398121

171. C. Meyer, G. Paulay, ADN barcoding: error rates based on comprehensive sampling. PLoS Biol., 2005; 3: e422. PMID: 16336051 172. R. Vodă, L. Dapporto, V. Dincă, R. Vila, Cryptic matters: overlooked species generate most butterfly betadiversity. Ecography. 2014; 38: 405–409. 173. R.W. Flowers, P.E. Hanson, Leaf beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) diversity in eight Costa Rican habitats. In: Furth DG, editor. Special Topics in Leaf Beetle Biology. Sofia: Pensoft Publishers; 2003. pp. 25–51 174. U.J. Sánchez-Reyes, S. Niño-Maldonado, R.W. Jones, Diversity and altitudinal distribution of Chrysomelidae (Coleoptera) in Peregrina Canyon, Tamaulipas, Mexico. ZooKeys. 2014; 417: 103–132. doi: 10. 3897/zookeys.417.7551 PMID: 25061357 175. C. Rahbek, The role of spatial scale and the perception of large-scale species- richness patterns. Ecol Lett. 2005; 8: 224–239 176. F. Ødegaard, Host specificity, alpha- and beta-diversity of phytophagous beetles in two tropical forests in Panama. Biodiv Cons. 2006; 15: 69–91 177. F. Ødegaard, The relative importance of trees versus lianas as hosts phytophagous beetles (Coleoptera) in tropical forests. J Biogeogr., 2000, 27: 283- 296. Doi:10.1046/j.1365-2699.2000.00404.x. 178. V. Novotny, Y. Basset, S.E. Miller, P. Drozd, L. Cizek, Host specialization of leaf-chewing insects in a New Guinea rainforest. J Anim Ecol., 2002. 71: 400-412. Doi:10.1046/j.1365-2656.2002.00608.x. 179. Ebru Gül Aslan and Kübra Alkan, The Alticini (Coleoptera: Chrysomelidae: Galerucinae) fauna of Davraz Mountain (Isparta): comments on host plant and altitude preferences with two new records for Turkish fauna. Turk J Zool, 2015, 39: 488-493. 180. Eben & A. Espinosa de los Monteros, Trophic interaction network and the evolutionary history of Diabroticina beetles (Chrysomelidae: Galerucinae). J. Appl. Entomol. 2015, 139: 468-477.

100

181. V. Novotny, Y. Basset, Host specificity of insect herbivores in tropical forests. Pros Biol Sci., 2005. 272: 1083-1090. Doi:10.1098/rspb.2004.3023.PubMed: 16024368. 182. Thomas M. Lewinsohn and Tomas Roslin, Four ways towards tropical herbivore megadiversity. Ecology Letters, 2008, 11: 398-416. Doi: 10.1111/j.1461NA0248.2008.01155.x 183. R.R. Dunn, C.M. McCain, N.J. Sanders, When does diversity fit null model predictions? Scale and range size mediate the mid-domain effect. Global Ecol Biogeogr. 2007; 16: 305–312. 184. D. Kotze & M. Samways, No general edge effects for invertebrates at Afromontane forest/grassland ecotones. Biodiversity and Conservation, 2001, 10: 443. doi:10.1023/A:1016606209906 185. J.E. Jankowski, A.L. Ciecka, N.Y. Meyer, K.N. Rabenold, Beta diversity along environmental gradients: implications of habitat specialization in tropical montane landscapes. J Anim Ecol. 2009; 78: 315–327. doi: 10.1111/j.1365- 2656.2008.01487.x PMID: 19040686 186. J.C. Axmacher, G. Holtmann, L. Scheuermann, G. Brehm, K. Müller- Hohenstein, K. Fiedler, Diversity of geometrid moths (Lepidoptera: Geometridae) along an Afrotropical elevational rainforest transect. Div Distr. 2004; 10: 293–302. 187. M. Christensen, J. Heilmann-Clausen, Two new boreal species of Tricholoma from Fennoscandia. Mycotaxon. 2009. 107:431-440 188. P.G. da Silva, M.I.M. Hernández, Local and regional effects on community structure of dung beetles in a mainland-island scenario. PLoS ONE. 2014; 9: e111883. doi: 10.1371/journal.pone.0111883 PMID: 25356729 189. C. C. Oliver, Taxonomy in times of the taxonomic impediment -Examples from the Community of Experts on Amphipod Crustaceans. Journal of Crustacean Biology, 2015, 35(6): 729-740 190. J.S. Tello, J.A. Myers, M.J. Macía, A.F. Fuentes, L. Cayola, G. Arellano, et al. Elevational gradients in β- diversity reflect variationin the strength of local

101

community assembly mechanisms across patial scales. PLoSONE.2015;10:e0121458.doi:10.1371/journal.pone.0121458PMID:25803846 191. C. Körner, The use of 'altitude' in ecological research. Trends Ecol Evol., 2007; 22: 569–574. PMID: 17988759 192. C.M. McCain, Could temperature and water availability drive elevational species richness patterns? A global case study for bats. Global Ecol Biogeogr., 2007; 16: 1–13. 193. M.K. Sundqvist, N.J. Sanders, D.A. Wardle, Community and ecosystem responses to elevational gradients: processes, mechanisms, and insights for global change. Ann Rev Ecol Evol Syst. 2013; 44: 261– 280 194. G. Brehm, J. Homeier, K. Fiedler, Beta diversity of geometrid moths (Lepidoptera: Geometridae) in an Andean montane rainforest. Div Distr. 2003; 9: 351–366 . 195. V. Novotny & G.D. Weiblen, From communities to continents: beta diversity of herbivorous insects. Ann. Zool. Fenn., 2005, 42, 463–475. 196. N.P. Danz, P.B. Reich, L.E. Frelich and G.J. Niemi, Vegetation controls vary across space and spatial scale in a historic grassland-forest biome boundary. Ecography, 2011, 34: 402–414. doi: 10.1111/j. 1600-0587.2010. 06561. X 197. S. Menke, K. Bo¨hning-Gaese, and M. Schleuning, Plant– frugivore networks are less specialized and more robust at forest–farmland edges than in the interior of a tropical forest. Oikos, 2012. 121:1553–1566. 198. V. Novotny, Beta diversity of plant-insect food webs in tropical forests: a conceptual framework. Insect Conservation and Diversity, 2009, 2: 5-9. 199. V. Novotny, P. Drozd, S.E. Miller, M. Kulfan, M. Janda, Y. Basset, G.D. Weiblen, Why are there so many species of herbivorous insects in tropical rainforests? Science. 2006 Aug 25; 313(5790):1115-8.. 200. Hui Zhu, Deli Wang, Qinfeng Guo, Jun Liu, Ling Wang, Interactive effects of large herbivores and plant diversity on insect abundance in meadow steppe in China. Agriculture, Ecosystems and Environment, 2015, 212: 245-252.

102

201. Anna E. Krause, Kenneth A. Frank, Doran M. Mason, Robert E. Ulanowicz & William W. Taylor, Compartments revealed in food-web structure. Nature, 2003, 426: 282-285. 202. I.P. Prado and T.M. Lewinshon, Compartments in insect-plant associations and their consequences for community structure. Journal of Animal Ecology, 2004, 73: 1168-1178. 203. C. Meskens, D. Mckenna, T. Hance, D. Windsor, Host plant taxonomy and phynotype influence the structure of a Neotropical host plant-Hispine beetle food web. Ecol. Entomol., 2011. 36: 480-489 204. Jenifer A. Dunne, Richard J. Williams, and Neo D. MartinezNetwork structure and biodiversity loss in food webs: robustness increases with connectance. Ecology Letters, 2002, 5: 558–567. doi:10.1046/j.1461-0248.2002.00354.x 205. Jenifer A. Dunne, Richard J. Williams, and Neo D. Martinez, Food-web structure and network theory: The role of connectance and size. PNAS, 2002, 99(20): 12917-12922

103

DANH SÁCH CÁC CÔNG BỐ 1. Gómez-Zurita J, Cardoso A, Coronado I, De la Cadena G, Jurado-Rivera JA, Maes J-M, Montelongo T, Nguyen DT, Papadopoulou A (2016) High throughput biodiversity analysis: Rapid assessment of species richness and ecological interactions of Chrysomelidae (Coleoptera) in the tropics. In: Jolivet P, Santiago-Blay J, Schmitt M (Eds) Research on Chrysomelidae 6. ZooKeys 597: 3–26. doi: 10.3897/zookeys.597.7065 2. Nguyen DT, Gómez-Zurita J (2016) Subtle Ecological Gradient in the Tropics Triggers High Species-Turnover in a Local Geographical Scale. PLoS ONE 11(6): e0156840. doi:10.1371/journal.pone.0156840 3. Dinh T. Nguyen, Jesús Gómez-Zurita (2017) Diversity and trophic ecology of the Monoleptites group (Chrysomelidae: Galerucinae, Luperini) in the Núi Chúa National Park (S Vietnam) with description of new species of Monolepta Chevrolat and Paleosepharia Laboissière. Journal of Asia-Pacific Entomology 20 65– 87

PHỤ LỤC I. Một số hình ảnh mẫu vật Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa 1. Phân họ Alticinae

2. Phân họ Bruchinae

3. Phân họ Chlamysinae

4. Phân họ Chrysomelinae

5. Phân họ Clytrinae

6. Phân họ Criocerinae

7. Phân họ Cryptocaphalinae

8. Phân họ Eumophinae

9. Phân họ Galerucinae

10. Phân họ Hispinae

II. Một số hình ảnh về khu vực nghiên cứu và thu mẫu ngoài thực địa 1. Sinh cảnh rừng khô

2. Sinh cảnh rừng chuyển tiếp

3. Rừng ẩm