Mixosporídeos Em Oligoquetas (Actinosporos) E Em Peixes (Mixosporos) De Pisciculturas Dos Estados De São Paulo E Mato Grosso Do Sul, Brasil

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA TIAGO MILANIN

Mixosporídeos em oligoquetas (actinosporos) e em peixes (mixosporos) de pisciculturas dos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil

CAMPINAS

2015

CAMPINAS

2015

DEDICATÓRIA

Ofereço a Deus, que move todas as coisas...

Dedico aos meus pais, Laurindo e

Milza (exemplos de superação em

que procuro me espelhar sempre),

pelo amor, confiança e pelos

esforços imensuráveis para que eu

chegasse até aqui. AGRADECIMENTOS

Escrever uma tese é sempre um grande desafio, mas desafio maior será utilizar poucas linhas para agradecer a todas as pessoas que fizeram parte da minha trajetória de seis anos no laboratório de parasitologia, do Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP de Pirassununga e o Departamento de Biologia Animal da UNICAMP. Ao meu orientador Prof. Dr. Edson Aparecido Adriano pela orientação, apoio e incentivo, sem o qual este trabalho não seria possível. Ao Prof. Dr. Antônio Augusto Mendes Maia do Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP, que atuou extra oficialmente como meu co-orientador, agradeço pelo espaço fornecido no laboratório de parasitologia, apoio material, acompanhamento nos procedimentos laboratoriais, orientações, incentivo, cumplicidade e amizade. À Dra. Márcia Ramos Monteiro Silva, pelo incentivo e principalmente pela ajuda nos procedimentos laboratoriais, sem a qual este trabalho não seria possível. Deixando de lado as formalidades, obrigado por todas as risadas, por todas as caronas, por todas as broncas, por todas as festas de aniversário, por todos os conselhos, por todas as orações, por toda a cumplicidade, por todas as mensagens, por todos os passeios, mas, sobretudo obrigado pela sólida amizade que construímos. À Dra. Jerri Bartholomew, professora do Departament of Microbiology da Oregon State University, EUA, pela oportunidade de estágio, e pelos valiosos ensinamentos. Ao Dr. Stephen Douglas Atkinson, pesquisador do Departament of Microbiology da Oregon State University, EUA, pela ajuda e sugestões a respeito dos desenhos presentes nessa tese. Às minhas irmãs Flávia e Vânia, pelo incentivo e por toda a ajuda necessária. À minha irmã do coração e companheira de pesquisa Juliana Naldoni, que sempre esteve ao meu lado, e que muitas vezes abriu mão dos seus compromissos profissionais para se dedicar aos meus. Aos professores e funcionários do departamento de Biologia Animal da UNICAMP, pelo incentivo, apoio material e por todo o conhecimento que compartilharam durante as disciplinas administradas. À Professora Daniele de Oliveira do departamento de Ciências Biológicas das Faculdades Adamantinenses Integradas - FAI, pelos primeiros ensinamentos na área de Parasitologia, exemplo de docência e amizade. Aos colegas do departamento de Biologia Animal da Unicamp, em especial a Letícia Aparecida Duart Bastos e Suellen Aparecida Zatti pela amizade e apoio durante o curso de doutorado. Aos companheiros de pesquisa do laboratório de parasitologia do Departamento de Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP de Pirassununga, Mateus Maldonado Carriero, Gabriel Sassarão Alves Moreira, Elayna Maciel, Kassia Roberta Higino Kapodifoglio, João Lucon, Júlio César Cenci Aguiar e Josi Ponzetto, pela amizade, companherismo, ajuda material, e por suportar as minhas alterações de humor. Aos meus amigos de Pirassununga, Daniel Gonçalves, Kelly Cristine Santos Roballo, Aline Fernanda de Souza, Keliane Bordin, Phelipe Favaron, Rodrigo Barreto, Fernanda Cavalari e Vitor Augusto Garcia, obrigado por deixarem os meus dias mais leves. À Dra Silmara Marques Alegretti, coordenadora do curso de Biologia Animal da Unicamp, pelo incentivo e pelos convites para participação em eventos ligados a minha linha de pesquisa. Ao analista ambiental do ICMbio (Pirassununga), Dr. Paulo Sérgio Ceccarelli que muito colaborou na indicação dos locais de coleta para o desenvolvimento dos trabalhos de campo. Ao Senhor Yassuo Kasai, proprietário da piscicultura Piraí, pela recepção e pelo fornecimento de parte do material de pesquisa. À minha prima Roseli Azevedo, pelo incentivo, ajuda nas coletas, paciência e amizade sincera. À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela bolsa de doutorado, processo nº 2011/08549-6.

“Antes do compromisso, há hesitação, a oportunidade de recuar, uma ineficácia permanente. Em todo ato de iniciativa (e de criação), há uma verdade elementar cujo desconhecimento destrói muitas idéias e planos esplêndidos.

No momento em que nos comprometemos de fato, a providência também age. Ocorre toda espécie de coisas para nos ajudar, coisas que de outro modo nunca ocorreriam. Toda uma cadeia de eventos emana da decisão, fazendo vir em nosso favor todo tipo de encontros, de incidentes e de apoio material imprevistos, que ninguém poderia sonhar que surgiriam em seu caminho. Começa tudo o que possa fazer, ou que sonhas poder fazer. “A ousadia traz em si o gênio, o poder e a magia”.

J. W. Goethe RESUMO

Dentre os parasitos de peixes, destacam-se aqueles do filo Myxozoa (= mixozoários). A maioria das espécies de mixosporídeos apresenta um ciclo biológico que envolve dois estágios de desenvolvimento, sendo que em invertebrados, principalmente anelídeos, ocorre o estágio actinosporo e em vertebrados, principalmente peixes, mas também em anfíbios, répteis, aves e mamíferos, o estágio mixosporo. Neste estudo foram realizadas análises morfológicas e moleculares de estágios actinosporo e mixosporo encontrados em oligoquetas e peixes oriundos de pisciculturas dos estados de São Paulo (SP) e Mato Grosso do Sul (MS), Brasil. Para o estudo do estágio actinosporo foram realizadas coletas de oligoquetas em duas pisciculturas, sendo uma localizada no município de Porto Ferreira, SP e outra no município de Terenos, MS. Em

Porto Ferreira foram coletados 333 oligoquetas, sendo que desse total, 13 (3,9 %) exemplares de Pristina americana foram observados liberando quatro tipos de actinosporos, sendo Aurantiactinomyxon tipos 1, 2 e 3 e Helioactinomyxon tipo 1. A análise ultraestrutural realizada em um exemplar de P. americana mostrou a presença de pansporocisto de Aurantiactinomyxon tipo 2 em diferentes estágios de desenvolvimento na parede do intestino. No município de Terenos foram coletados 86 exemplares de oligoquetas, sendo que um (0,9 %) espécime identificado como Slavina evelinae estava liberando actinosporos de Seisactinomyxon tipo 1 nov., o qual pertence a um grupo coletivo ainda não relatado na literatura. A idenficação dos oligoquetas foi realizada com base em dados morfológicos e no sequenciamento do 18S rDNA.

Também foram realizados o sequenciamentos do 18S rDNA dos actinosporos

Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov., resultando em sequências parciais contendo 1200, 902 e 1877 pb, respectivamente. A análise filogenética mostrou que Aurantiactinomyxon tipo 1, 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. agruparam em um clado juntamente com uma espécie de Thelohanellus parasito de Siluriformes e outras seis espécies de Myxobolus parasitos de Characiformes. No estudo do estágio mixosporo de mixosporídeos, exemplares de patinga (híbrido resultante do cruzamento entre Piaractus mesopotamicus e P. brachypomus) e de pintado híbrido (resultante do cruzamento entre Pseudoplatystoma corruscans e P. reticulatum) foram obtidos em duas pisciculturas do estado de São Paulo. Dos 15 exemplares de patinga coletados no município de Porto Ferreira, 11 (73,3 %) apresentaram infecção por Myxobolus cf. cuneus e dos 20 exemplares de pintado híbrido oriundos de uma piscicultura do município de Mogi Mirim, oito (40 %) apresentaram infecção por Henneguya pseudoplatystoma. O sequenciamento do 18S rDNA de esporos de M. cf. cuneus e H. pseudoplatystoma resultou em sequências de 1855 e 1946 pb, respectivamente. A análise ultra-estrutural de M. cf. cuneus revelou que os plasmódios apresentaram desenvolvimento assincrônico, com presença de pansporoblastos dispóricos em diferentes fases de desenvolvimento, e esporos imaturos e maduros por todo o plasmódio. A análise filogenética mostrou M. cf. cuneus como uma espécie irmã de

Henneguya pellucida, em um subclado composto principalmente por mixosporídeos parasitos de characiformes e H. pseudoplatystoma agrupou em um subclado composto de Henneguya spp. parasitos de peixes do gênero Pseudoplatystoma.

Palavras-chave: Myxozoa, Actinosporo, Mixosporo, Oligoquetas, 18S rDNA,

Filogenia, Myxobolus, Henneguya, Piscicultura ABSTRACT

Among the fish parasites, those of the Myxozoa phylum are highlighted as the most important. Most species of myxozoans show life cycle that involves two development stages, being that in vertebrates, mainly in annelids, occurs the actinospore stage and in vertebrates, mainly in fishes, but also in amphibians, reptiles, birds and mammals, the myxospore stage. In this study, morphological and molecular analysis were performed in actinospore and myxospore stages found in oligochaetes and fishes from fish farms from São Paulo and Mato Grosso do Sul states. For the actinosporo study, were performed two oligochaetes gatherings in two fish farms, one located in municipality of

Porto Ferreira, São Paulo state and other in municipality of Terenos, Mato Grosso do

Sul state. Of the 333 oligochaetes collected in Porto Ferreira, 13 (3.9 %) specimen of

Pristina americana were observed releasing four actinospore types, being

Aurantiactinomyxon types 1, 2 and 3, and Helioactinomyxon type 1. The ultrastructural analysis performed in one specimen of P. americana showed two different developmental stages of pansporocysts of Aurantiactinomyxon type 2 in the gut wall. In

Terenos, 86 specimens of oligochaetes were collected, being that one specimen (0.9 %) identified as Slavina evelinae was releasing actinospore of Seisactinomyxon type 1 nov., which belongs to collective group still not reported in the literature. The oligochaetes identification was performed based on morphological data and on the 18S rDNA sequencing. The sequencing of the 18S rDNA of Aurantiactinomyxon types 1 and 2, and Seisactinomyxon type 1 nov. were also performed, resulting in partial sequences containing 1,200, 902 and 1,877 pb, respectively. The phylogenetic analysis showed that Aurantiactinomyxon type 1 and 2, and Seisactinomyxon type 1 nov. have grouped in a clade with a Thelohanellus species parasite of Siluriformes and other six species of Myxobolus parasites of Characiforms fishes. In the mixospore study, specimens of patinga (hybrid resulted from a cross between Piaractus mesopotamicus and P. brachypomus) and pintado (hybrid resulted from a cross between

Pseudoplatystoma corruscans and P. reticulatum), were gathered from two fish cultures in São Paulo state. From 15 specimens of patinga collected in Porto Ferreira, 11 (73.3

%) presented Myxobolus cf. cuneus infection, and from the 20 specimens of hybrid pintado collected in Mogi Mirim, eight (40 %) showed Henneguya pseudoplatystoma infection. The 18S rDNA sequencing of M. cf. cuneus and H. pseudoplatystoma spores resulted in sequences containing 1,855 and 1,946 bp, respectively. The M. cf. cuneus ultrastructural analysis revealed that the plasmodium presented an asynchronous development, with the presence of disporic pansporoblasts in two different development phase, and immature and mature spores in the whole plasmodium. The phylogenetic analysis showed M. cf cuneus as a sister specie of H. pellucida, in a subclade mainly composed of myxozoans parasites of Characiforms and H. pseudoplatystoma grouped in a subclade composed of Henneguya spp. parasites of fish of Pseudoplatystoma genus.

Keywords: Myxozoa, Actinospore, Myxospore, Oligochaetes, 18S rDNA, Phylogeny,

Myxobolus, Henneguya, Fish Culture LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Diagrama resumido do ciclo de vida dos mixosporídeos alternando entre hospedeiros vertebrados e invertebrados...... 25

Figura 2. Diagrama hipotético do ciclo de vida de Enteromyxum scophthalmi traduzido a partir de Redondo et al. (2004) ...... 27

Figura 3. Esporos da ordem Bivalvulida ...... 31

Figura 4. Esporos do estágio actinosporo ...... 32

Capítulo 1: Actinosporos de mixosporídeos em oligoquetas de sistemas de criação de peixes nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil

Figura 1. Placa utilizada para manutenção dos oligoquetas isolados ...... 46

Figura 2. Detalhes dos parâmetros utilizados nas medidas dos esporos de

Seisactinomyxon tipo 1 nov ...... 47

Figura 3. Fotomicrografia em contraste de fase de Pristina americana ...... 52

Figura 4. Fotomicrografia de oligoqueta da espécie Slavina evelinae...... 53

Figura 5. Aurantiactinomyxon tipo 1 liberado por Pristina americana ...... 55

Figura 6. Aurantiactinomyxon tipo 2 liberado por Pristina americana ...... 57

Figura 7. Eletromicrografia de corte transversal do intestino de Pristina americana infectado por Aurantiactinomyxon tipo 2...... 58

Figura 8. Eletromicrografia de pansporocisto de Aurantiactinomyxon tipo 2 do intestino de Pristina americana ...... 59

Figura 9. Aurantiactinomyxon tipo 3 liberado por Pristina americana ...... 61

Figura 10. Helioactinomyxon tipo 1 liberado por Pristina americana ...... 63

Figura 11. Seisactinomyxon tipo 1 nov. liberado por Slavina evelinae ...... 65

Figura 12. Árvore de máxima verossimilhança mostrando a relação entre

Aurantiactinomyxon tipo 1, 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. com outras espécies de mixosporídeos parasitos de peixes de água doce da América do Sul, baseada na sequência parcial do 18S rDNA ...... 67

Capítulo 2: Filogenia molecular e ultraestrutura de Myxobolus cf. cuneus, parasito do hibrido patinga e Henneguya pseudoplatystoma, parasito do hibrido pintado

Figura 1. Fotomicrografia de esporos maduros de Myxobolus cf. cuneus, parasito do baço de patinga (A) e de Henneguya pseudoplatystoma, parasito do filamento branquial de pintado híbrido (B) ...... 84

Figura 2. Eletromicrografia do baço de patinga infectado por Myxobolus cf. cuneus ...... 86

Figura 3. Eletromicrografia de estágios de desenvolvimento de Myxobolus cf. cuneus parasito de patinga ...... 87

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1: Actinosporos de mixosporídeos em oligoquetas de sistemas de criação de peixes nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil

Tabela 1: Primers usados para a Reação em Cadeia da Polimerase e sequenciamento dos actinosporos...... 50

Tabela 2: Primers usados para a PCR e sequenciamento dos oligoquetas...... 50

Capítulo 2: Filogenia molecular e ultraestrutura de Myxobolus cf. cuneus, parasito do hibrido patinga e Henneguya pseudoplatystoma, parasito do hibrido pintado

Tabela 1: Lista de primers usados na amplificação e no sequenciamento do 18S rDNA de Myxobolus cf. cuneus e Henneguya pseudoplatystoma...... 83

Tabela 2: Dados comparativos das dimensões dos esporos, sítios de infecção, hospedeiros e regiões geográfiacas de Henneguya pseudoplatystoma e Myxobolus cf. cuneus obtidos neste estudo em relação às descrições originais...... 85

Tabela 3. Similaridade, baseada no 18S rDNA, indicando as distâncias genéticas entre as species de Henneguya e Myxobolus que agruparam juntas com as espécies alvo deste estudo...... 90

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 18

1.1. Ciclo de vida dos Myxozoa ...... 22

1.1.1. Transmissão indireta: envolvendo 2 hospedeiros (invertebrados e

vertebrados) ...... 22

1.1.1.1. Desenvolvimento no hospedeiro invertebrado ...... 23

1.1.1.2. Desenvolvimento no hospedeiro vertebrado...... 24

1.1.2. Transmissão horizontal: peixe-peixe...... 26

1.1.3. Transmissão vertical (oligoqueta-oligoqueta) ...... 27

1.2. Potencial de hospedeiros invertebrados ...... 28

1.3. Diversidade dos estágios de actinosporos ...... 29

2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 30

2.1. Métodos morfológicos ...... 30

2.2. Métodos moleculares ...... 32

3. JUSTIFICATIVA ...... 33

4. OBJETIVOS ...... 34

4.1. Objetivo Geral ...... 34

4.2. Objetivos Específicos ...... 355

5. REFERÊNCIAS ...... 36

6. RESULTADOS ...... 42

Capítulo 1: Actinosporos de mixosporídeos em oligoquetas de sistemas de criação de peixes nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil

1. INTRODUÇÃO ...... 44

2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 45

2.1. Coleta de amostras e análise morfológica ...... 45 2.2. Análises Moleculares ...... 47

2.3. Análise de Ultraestrutura dos actinosporos em oligoquetas ...... 51

3. RESULTADOS ...... 51

3.1. Aurantiactinomyxon tipo 1 (Fig. 5) ...... 53

3.2. Aurantiactinomyxon tipo 2 (Figs. 6-8) ...... 55

3.3. Aurantiactinomyxon tipo 3 (Fig. 9) ...... 60

3.4. Helioactinomyxon tipo 1 (Fig. 10) ...... 62

3.5. Seisactinomyxon tipo 1 nov. (Fig. 11) ...... 64

4. DISCUSSÃO ...... 68

5. REFERÊNCIAS ...... 72

Capítulo 2: Filogenia molecular e ultraestrutura de Myxobolus cf. cuneus, parasito do hibrido patinga e Henneguya pseudoplatystoma, parasito do hibrido pintado

1. INTRODUÇÃO ...... 78

2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 80

3. RESULTADOS ...... 83

4. DISCUSSÃO ...... 91

5. REFERÊNCIAS ...... 93

7. CONCLUSÕES GERAIS ...... 97

8. ANEXOS ...... 98

8.1. Certificado da Comissão de Ética no uso de Animais (CEP FZEA/USP) ...... 98

8.2. Declaração de que a tese não infringe os dispositivos da lei nº 9610/98 ...... 99 18

1. INTRODUÇÃO

Os estudos envolvendo parasitos de peixes têm sido intensificados nos últimos anos, devido à mortalidade e a morbidade que esses patógenos podem causar, tanto em peixes de ambiente natural quanto de explorações piscícolas (WOO, 2006). Em sistemas de cultivo, os peixes estão geralmente em condições de alta densidade, onde surtos de doenças são mais prováveis de ocorrer. Assim, a produção em massa de peixes cultivados é sempre acompanhada por agentes patogênicos (RÜCKERT et al., 2008).

Entre os parasitos de peixes, aqueles do filo Myxozoa Grassé, 1970 (= mixozoários), se destacam entre os mais importantes (FEIST e LONGSHAW, 2006) e têm sido alvo de muitos estudos nos últimos anos.

Os mixozoários são parasitos microscópicos, multicelulares e formadores de esporos, podendo ser encontrados tanto em ambiente marinho quanto em água doce. Eles têm como caráter morfológico diferencial, a presença de cápsulas polares, que são estruturas análogas aos nematocistos dos cnidários (ATKINSON, 2011).

Dentre os mixozoários, a espécie mais conhecida é Myxobolus cerebralis Hofer, 1903, que é o agente etiológico da “doença do rodopio”, uma patologia geralmente fatal que acomete salmonídeos em várias partes do mundo. A doença manifesta-se nos exemplares jovens, e o parasito se aloja nas cartilagens, causando deformações na cabeça e coluna vertebral, e quando não é letal, torna os peixes inviáveis para o comércio (FEIST e

LONGSHAW, 2006). Contudo, além de M. cerebralis, várias outras espécies de mixozoários foram registradas causando importantes danos a diversas espécies de peixes em todo o mundo. Parvicapsula sp. infecta as brânquias, fígado e rins de salmão do atlântico (Salmo salar Linnaeus, 1758), sendo que em 2012 esse parasito foi responsável por altas taxas de mortalidades em pisciculturas do norte da Noruega (STERUD et al., 2003). Henneguya ictaluri Pote, Hanson e Shivaji, 2000, causa a doença proliferativa das brânquias em Ictalurus

punctatus Rafinesque, 1818, e é considerada a mais importante doença para o catfish, resultando em altas taxas de mortalidade em exemplares jovens em sistemas de criação

(FEIST e LONGSHAW, 2006). Enteromyxum scophthalmi Palenzuela, Redondo e Alvarez-

Pellitero, 2002, infecta o trato digestivo, estômago e reto de Psetta maxima Linnaeus, 1758, em pisciculturas do noroeste da Espanha, induzindo a alta resposta inflamatória e causando necrose tecidual, com elevada mortandade (BERMÚDEZ et al., 2010).

No Brasil, são conhecidas cerca de 90 espécies de mixozoários (NALDONI et al., 2011) e algumas foram descritas infectando peixes nativos amplamente cultivados em pisciculturas

(MARTINS e SOUZA, 1997; MARTINS et al., 1997; ADRIANO et al., 2005a, b; 2006;

2009; 2012; EIRAS et al., 2009; MILANIN et al., 2010; NALDONI et al., 2009; 2011).

Henneguya pseudoplatystoma Naldoni, Arana, Maia, Ceccarelli, Tavares, Borges, Pozo e

Adriano, 2009 causou importante redução da área funcional do epitélio respiratório de exemplares de pintado híbrido, procedente de pisciculturas dos estados de São Paulo e Mato

Grosso do Sul (NALDONI et al., 2009). Em exemplares de pacu de pisciculturas do estado de

São Paulo, Henneguya piaractus Martins e Souza, 1997, foi encontrado causando compressão dos capilares, hemorragia e focos inflamatórios nas brânquias (MARTINS et al., 1997;

ADRIANO et al., 2005a) e Myxobolus cuneus Adriano, Arana e Cordeiro, 2006, causando obstrução do fluxo sanguíneo nas brânquias (ADRIANO et al., 2006).

Até 1983, os parasitos do filo Myxozoa eram divididos em duas classes: a classe

Myxosporea, composta por parasitos de vertebrados, principalmente peixes e raramente anfíbios, répteis, aves e mamíferos (LOM e NOBLE, 1984; KENT et al., 2001;

BARTHOLOMEW et al., 2008), e a classe Actinosporea, constituída por parasitos de invertebrados, principalmente anelídeos (KENT et al., 2001). Esta classificação passou a ser questionada quando Wolf e Markiw (1984) reconstruíram, em laboratório, o ciclo de vida de

M. cerebralis, e mostraram que o parasito alternava entre o hospedeiro peixe e um hospedeiro

invertebrado, o oligoqueta Tubifex tubifex Müller, 1774. A partir destes resultados, e de outros estudos realizados posteriormente foi constatado que os parasitos das classes Myxosporea e

Actinosporea representavam, na realidade, estágios distintos do ciclo de vida de parasitos do filo Myxozoa.

Assim, a classe Actinosporea foi extinta e seus representantes migraram para a classe

Myxosporea. Atualmente, o filo Myxozoa conta com cerca de 2400 espécies conhecidas

(ZHANG, 2011), divididas em duas classes: a classe Malacosporea Canning, Curry, Feist,

Longshaw e Okamura, 2000, (= malacosporídeos) formada por três espécies nominadas:

Tetracapsuloides bryosalmonae Canning, Curry, Feist, Longshaw e Okamura, 2000, parasito de salmonídeos e que tem briozoários como hospedeiros invertebrados, Buddenbrockia plumatellae Schröder, 1910, parasito de briozoários de água doce e Buddenbrockia allmani

Canning, Curry, Hill e Okamura, 2007, parasito da cavidade corporal de briozoários da espécie Lophopus crystallinus Pallas, 1768 (CANNING et al., 2007); e a classe Myxosporea

Butschli, 1881, (= mixosporídeos) que engloba a grande maioria das espécies de mixozoários, sendo que o ciclo de vida é alternado pelo estágio mixosporo em hospedeiros vertebrados

(principalmente peixes) e estágio actinosporo em invertebrados do filo Annelida (LOM e

DYKOVÁ, 2006; BARTHOLOMEW et al., 2008).

A seguir está a classificação do filo Myxozoa conforme a proposta de Grassé (1970) e

Canning et al. (1996) e (2000):

Filo Myxozoa

Classe Myxosporea Buetschli, 1881

Ordem Bivalvulida Schulman, 1959

Subordem Platysporina Kudo, 1919

Família Myxobolidae Thélohan, 1892

Subordem Sphaeromyxina Lom e Noble, 1984

Família Sphaeromyxidae Lom e Noble, 1984

Subordem Variisporina Lom e Noble, 1984

Família Alatosporidae Shulman et al., 1979

Família Auerbachiidae Evdokimova, 1973

Família Ceratomyxidae Doflein, 1899

Família Chloromyxidae Thélohan, 1892

Família Fabesporidae Naidenova e Zaika, 1969

Família Myxidiidae Thélohan, 1892

Família Ortholineidae Lom e Noble, 1984

Família Parvicapsulidae Shulman, 1953

Família Sinuolineidae Shulman, 1959

Família Sphaerosporidae Davis, 1917

Ordem Multivalvulida Shulman, 1959

Família Kudoidae Meglitsch, 1947

Família Trilosporidae Shulman, 1959

Classe Malacosporea Canninget al., 2000

Ordem Malacovalvulida Canning et al., 2000.

Família Saccosporidae Canning, Okamura e Curry, 1996

A posição dos mixozoários dentre os metazoários é ainda causa de intensos debates, sendo que dados morfológicos e moleculares sugerem que eles sejam membros altamente degenerados do filo Cnidaria (JIMÉNEZ-GURI et al., 2007), e possivelmente, um táxon irmão para Polypodium hydriforme Ussov, 1885, um parasito cnidário enigmático dos oócitos de peixes Acipenseriformes (SIDDALL et al., 1995; ZRZAVÝ e HYPŠA, 2003; EVANS et al., 2008).

Com a extinção da classe Actinosporea e com o intuito de facilitar a comunicação entre aqueles que estudam mixozoários, convencionou-se usar os termos “estágio actinosporo” para as formas encontradas nos hospedeiros invertebrados e “estágio mixosporo” para as formas encontradas no hospedeiro vertebrado (FEIST e LONGSHAW, 2006).

1.1. Ciclo de vida dos Myxozoa

De acordo com Atkinson (2011), os estágios do ciclo biológico têm sido demonstrados em apenas 52 espécies de mixozoários, pouco menos de 3 % de todas as espécies conhecidas.

Desse total, 47 ciclos são indiretos, com esporos morfologicamente distintos alternando entre hospedeiros vertebrados (mixosporos) e invertebrados (actinosporos) (Figura 1), e nos outros

5 ocorrem à transmissão horizontal ou vertical direta.

A seguir segue um resumo dos modos de transmissão dos mixosporídeos:

1.1.1. Transmissão indireta: envolvendo 2 hospedeiros (invertebrados e vertebrados)

O processo sexual (gametogonia) no ciclo biológico dos mixozoários tem sido observado somente no estágio de actinosporo, por essa razão os invertebrados são considerados os hospedeiros definitivos, e vertebrados os hospedeiros intermediários (FEIST e LONGSHAW, 2006).

Em Feist e Longshaw (2006) encontra-se uma descrição genérica do ciclo biológico dos mixosporídeos, que é apresentado de forma resumida a seguir:

1.1.1.1. Desenvolvimento no hospedeiro invertebrado

O desenvolvimento no invertebrado, normalmente um anelídeo oligoqueta, envolve três fazes – esquizogonia, ou estágio proliferativo, gametogonia e esporogonia. Nas espécies em que já se conhece o ciclo biológico, a fase no anelídeo se inicia pela infecção destes por mixosporos (esporos oriundos da fase mixosporo em vertebrados). Os mixosporos são então ingeridos pelos oligoquetas e, quando em contato com o epitélio, os filamentos polares são liberados para ancorar o parasito ao novo hospedeiro. Neste momento, as valvas dos mixosporos se abrem e o esporoplasma amebóide é liberado, penetrando entre as células epiteliais do intestino. Em M. cerebralis (cujo ciclo é o mais conhecido), o esporoplasma binucleado sofre várias divisões nucleares originando uma célula multinucleada. Em seguida ocorre o processo de plasmotomia (clivagem de uma célula multinucleada para formar duas ou mais células), formando numerosas células uninucleadas que invadem outros espaços intercelulares. Em alguns casos, este processo de reprodução assexuada pode se repetir.

Nestas células uninucleadas ocorre a formação de quatro núcleos e, por plasmotomia, cada uma origina quatro outras, sendo duas células somáticas e duas germinativas, as quais são designadas como células  e ß. As células somáticas envolvem (como um envelope) as células germinativas, e então passam por duas divisões mitóticas, resultando em um envelope formado por oito células.

As células  e ß passam por três divisões mitóticas, originando 16 gametócitos diplóides (oito  e oito ß). Cada uma destas células sofre uma divisão meiótica, produzindo

16 gametas haplóides e 16 corpos polares. Cada uma das oito células  resultantes, se funde

com uma das oito células ß, produzindo assim oito zigotos que originarão cada um, um esporo

(esporogonia). A fusão das células  com as células ß é considerada a fase sexual, o que mostra que os invertebrados são os hospedeiros definitivos. Este processo resulta na formação de actinosporos (esporos resultantes da fase actinosporo que ocorre nos anelídeos), que quando liberados das células do epitélio intestinal dos anelídeos, ganham o ambiente aquático juntamente com as fezes, e servem de fonte de infecção para os peixes.

1.1.1.2. Desenvolvimento no hospedeiro vertebrado

Nas espécies cujo ciclo de vida é conhecido, os actinosporos (oriundos dos anelídeos) são infectantes para o hospedeiro peixe. Em contato com o hospedeiro vertebrado, os filamentos polares dos esporos são liberados e atuam para ancorar o esporo. O esporoplasma é então liberado do actinosporo e penetra no peixe via pele, brânquias, cavidade bucal e até intestinal. Após a penetração, a parede do esporoplasma se dissolve e as células infectantes invadem os tecidos adjacentes. Neste ponto, o desenvolvimento depende da espécie de parasito envolvida, e pode seguir vários caminhos, mas é aceito que há no mínimo um estágio proliferativo antes da esporogonia, o que maximiza o potencial de produção de esporos. Pela circulação ou migrando intercelularmente, o parasito atinge o tecido alvo, onde ocorrerá o seu desenvolvimento, com a formação de plasmódios onde são observados os processos de esporogonia, característicos para cada espécie, onde geram os mixosporos, os quais apresentam morfologia distinta dos actinosporos.

Figura 1. Diagrama resumido do ciclo de vida dos mixosporídeos alternando entre hospedeiros vertebrados e invertebrados. A. Ocorre à extrusão do filamento polar ancorando o mixosporo no epitélio intestinal do anelídeo, em seguida ocorre a abertura das valvas do esporo; B. Gametogonia; C. Esporogonia do estágio actinosporo; D. Actinosporo maduro sendo liberado na água, oriundo de um pansporocisto maduro; E. O actinosporo em contato com a superfície da pele ou brânquias do peixe hospedeiro libera o filamento polar, facilitando a invasão do esporoplasma no novo hospedeiro; F. Multiplicação do parasito antes da esporogonia; G. Esporogonia dos mixosporos. (Traduzido a partir de Yokoyama et al., 2012).

1.1.2. Transmissão horizontal: peixe-peixe

A transmissão direta de peixe para peixe sem a exigência de um hospedeiro invertebrado foi observada em espécies de mixosporídeos do gênero Enteromyxon. Neste caso, não há até aqui o registro da presença de actinosporos, sendo os estágios vegetativos os responsáveis pela transmissão das enteromyxosis (DIAMANT, 1997; REDONDO et al.,

2002). No entanto, existe a hipótese de que um ciclo de vida heteroxeno envolvendo um estágio de actinosporo possa existir para a espécie Enteromyxum scophthalmi (Figura 2).

Em algumas espécies foi demonstrado que o desenvolvimento extrasporogonico pode ocorrer paralelo ao estágio esporogonico (FEIST e LONGSHAW 2006) e de acordo com

Atkinson (2011), a injeção artificial de formas do estágio extrasporogonico de mixosporídeos em peixes sadios pode dar início a uma nova infecção. McGeoge et al. (1996) realizaram um experimento injetando estágios extrasporogonicos de Sphaerospora sp. na região intraperitoneal de salmão do Atlântico (S. salar) e truta marrom (Salmo trutta Linnaeus,

1758) saudáveis. Para esse experimento os estágios extrasporogonicos foram obtidos dos rins de salmão do Atlântico infectados por Sphaerospora sp. Os parasitos foram vistos nos túbulos renais dos peixes entre 14 e 28 dias após a infecção experimental e evoluiu para estágios esporogonicos e formação de esporos maduros. A infecção por mixozoários através da injeção artificial intraperitoneal de estágios extrasporogonicos têm sido demonstrada por outros autores em estudos envolvendo T. bryosalmonae (KENT e HEDRICK, 1985), Ceratomyxa shasta Noble, 1950 (IBARRA et al., 1991), Sphaerospora renicola Dyková e Lom, 1982

(MOLNÁR e KOVÁCS-GAYER, 1986) e Kudoa thyrsites Gilchrist, 1924 (MORAN et al.,

1999).

Figura 2. Diagrama hipotético do ciclo de vida de Enteromyxum scophthalmi traduzido a partir de Redondo et al. (2004). A. Os ciclos de proliferação e esporogonia incluem as etapas (ST) acima definidas como ST1 à ST5. Nas etapas de ST1 para ST3 ocorrem à invasão e a dispersão do parasito dentro do peixe. Nas etapas ST2 para ST3 são os principais estágios infectantes na transmissão peixe para peixe, quando liberados juntamente com tiras epiteliais através das fezes. As etapas ST4 e ST5 seguem os padrões usuais de esporogonia observados nos Myxozoa. Eventualmente alguns esporos (ST5) podem se desenvolver no peixe ou iniciarem um ciclo de vida alternativo, envolvendo um hospedeiro invertebrado B. que atualmente é desconhecido.

1.1.3. Transmissão vertical (oligoqueta-oligoqueta)

Morris e Adams (2006) realizaram um experimento com oligoquetas Lumbriculus variegatus Müller, 1774, infectados com actinosporos. Nesse experimento dois oligoquetas foram individualizados, e após um período de três semanas esses dois oligoquetas resultaram em mais dois novos indivíduos. Exames subsequentes dos oligoquetas demonstraram que

todos estavam positivos para actinosporos. Os oligoquetas se mantiveram infectados ao longo das 2 semanas em que as análises foram realizadas. Os autores também verificaram desenvolvimento do parasito dentro desses anelídeos, com grande número de pansporoblastos, observados no tecido epitelial do intestino desses vermes. Os quatro oligoquetas foram então colocados dentro de uma bandeja, e após um período de dois meses, a partir dessa cultura, foram recolhidos treze exemplares. Esse aumento no número de oligoquetas sugere que eles se reproduziram através da fragmentação natural de seus corpos, mais de uma vez. Quando examinados, todos os anelídeos possuíam cabeça e cauda, indicando que houve uma regeneração completa após a fragmentação. Os treze exemplares se mostraram positivos quanto à presença de actinosporos. Nesse mesmo experimento, visando testar a transmissão horizontal entre os anelídeos, alguns oligoquetas negativos foram colocados para coabitarem aqueles que estavam liberando actinosporos, e após esse contato foi realizada a análise molecular com primers específicos para mixosporídeos. Não foi detectado DNA de mixosporídeos em nenhum dos anelídeos negativos introduzidos, sendo com isso possível sugerir que a transmissão horizontal do parasito não ocorre de oligoqueta para oligoqueta.

Segundo Anderson e May (1981), a transmissão vertical é um importante mecanismo pelo qual os parasitos são mantidos no ambiente quando as populações de hospedeiros são baixas.

1.2. Potencial de hospedeiros invertebrados

Atualmente existem cerca de 5 mil espécies de oligoquetas descritos no mundo, dos quais 1.700 vivem em ambiente aquático (MARTIN et al., 2008). Os oligoquetas atuam como decompositores da matéria orgânica e são uma importante fonte de alimento para vários animais, incluindo peixes, crustáceos e insetos (GILBERT e GRANATH, 2003). Na América

do Sul são encontradas oito famílias de oligoquetas aquáticas: Alluroidea, Capilloventridae,

Haplotaxidae, Naididae, Narapidae, Opistocystidae, Phreodrilidae e Tiguassuidae

(CHRISTOFFERSEN, 2007). Dentre estas famílias de oligoquetas aquáticas que ocorrem na

América do Sul, Naididae é a única que tem espécies que já foram, em alguma parte do mundo, registradas atuando como hospedeiros invertebrados de mixosporídeos (Atkinson

2011). No Brasil, o estudo de oligoquetas envolvidos como hospedeiros de mixosporídeos está restrito ao trabalho de Békési et al. (2002), que identificaram oligoquetas da família

Ocnerodrilidae, espécie que alterna entre ambiente aquático e terrestre, liberando actinosporos em uma piscicultura localizada no estado do Ceará. No entanto, os autores não identificaram estes anelídeos além do nível de família.

1.3. Diversidade dos estágios de actinosporos

Desde que a classe Actinosporea tornou-se sinônima da classe Myxosporea, as descrições dos actinosporos são feitas de forma a conjugar aqueles que guardam semelhanças entre si em agrupamentos denominados "grupos coletivos", um termo usado para substituir o táxon “gênero” da extinta classe Actinosporea (LOM e DYKOVÁ, 2006). Dentro do grupo coletivo, o termo “tipo” vem substituir o táxon “espécie”, sendo assim, um novo achado deve ser nomeado em linguagem vernacular, como por exemplo: actinosporo Triactinomyxon, tipo

2 de Smith 1999 (LOM e DYKOVÁ 2006). Até 2011 existiam 18 grupos coletivos, com quase 200 tipos de actinosporos descritos (ÖZER et al., 2002; CANNING e OKAMURA;

2004; LOM e DYKOVÁ, 2006), sendo que mais recentemente foram criados mais dois novos grupos: Unicapsulactinomyxon (RANGEL et al., 2011) e Triactinospomyxon (ZHAI et al.,

2012).

Borkhanuddin (2013) listou os seguintes nomes dos grupos coletivos existentes e suas respectivas quantidades de esporos descritos: Triactinomyxon Štolc, 1899 (53),

Hexactinomyxon Štolc, 1899 (8), Synactinomyxon Štolc, 1899 (8), Sphaeractinomyxon

Caullery e Mesnil, 1904 (8), Tetractinomyxon Ikeda, 1912 (6), Neoactinomyxum Granata,

1922 (18), Guyenotia Naville, 1930 (1), Aurantiactinomyxon Janiszewska, 1952 (34),

Siedleckiella Janiszewska, 1953 (3), Raabeia Janiszewska, 1955 (25), Antonactinomyxon

Janiszewska, 1957 (3), Echinactinomyxon Janiszewska, 1957 (19), Ormieractinomyxon

Marques, 1984 (1), Heliactinomyxon Bellerud, 1993 (2) (BORKHANUDDIN, 2013;

ROSSER et al., 2014), Endocapsa Hallett, Erséus e Lester, 1999 (2), Tetraspora Hallett e

Lester, 1999 (2), Pseudotriactinomyxon Hallett, Atkinson, Schöl e El-Matbouli, 2003 (3),

Hungactinomyxon Rácz, Eszterbauer e Molnár, 2005 (1), Unicapsulactinomyxon Rangel,

Cech, Székely e Santos, 2011 (1), Triactinospomyxon Zhai, Zhou e Gui, 2012 (1). Ainda de acordo com Borkhanuddin (2013), os grupos coletivos Endocapsa e Unicapsulactinomyxon possuem esporos encontrados em ambiente marinho. Já os grupos coletivos

Sphaeractinomyxon, Triactinomyxon e Tetractinomyxon possuem representantes que circulam entre os dois ambientes (marinho e água doce), e o restante dos outros grupos apresenta esporos encontrados somente em água doce.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Métodos morfológicos

O método tradicional para a classificação taxonômica dos mixosporídeos é baseado em dados morfológicos, principalmente nas características dos esporos, mas também dos plasmódios, bem como na especificidade de hospedeiro e tropismo por órgãos e/ou tecidos infectados (LOM e ARTHUR, 1989; FERGUSON et al., 2008; CARRIERO et al., 2013). No entanto, a morfologia dos esporos é a base principal da classificação e identificação dos

mixosporídeos (ANDREE et al., 1999; FERGUSON et al., 2008). Sendo assim a descrição morfológica no nível de espécie é baseada nas dimensões das estruturas dos esporos. Para os estágios mixosporos, as dimensões devem seguir as orientações (Figura 3) descritas em Lom e

Arthur (1989) e para os estágios de actinosporos, os pesquisadores devem seguir as orientações (Figura 4) descritas em Lom et al. (1997) (YOKOYAMA et al., 2012). Nos

últimos anos entretanto, vários outros autores contribuíram com novos métodos na descrição morfológica dos estágios actinosporos (HALLET et al., 2003; LOM e DYKOVÁ, 2006;

SZÉKELY et al., 2007).

Figura 3. Esporos da ordem Bivalvulida (A. vista frontal, B. vista lateral) e multivalvulida (C-E. visto de cima, D. vista lateral) esporos mixosporídeos. PC: cápsula polar, SP: esporoplasma, SV: Valvas, SL: linha de sutura, L: comprimento de esporos, W: largura de esporos, T: espessura de esporos, PCL: comprimento cápsula polar, PCW: largura cápsula polar (Traduzido a partir de Yokoyama et al., 2012).

Figura 4. Esporos do estágio actinosporo. A. Triactinomyxon; B e C. Aurantiactinomyxon; D e E. Neoactinomyxum; F e G. Tetractinomyxon; B, D e F: vistos de cima; C, E e G: vista lateral. SB: corpo do esporo, LSB: comprimento do corpo do esporo; WSB: largura do corpo do esporo; S: estilo; LS: comprimento do estilo; WS: largura do estilo; CP: processo caudal; LCP: comprimento do processo caudal (independentemente da curvatura). LSCP: maior distância entre as pontas dos processos caudais; PC: cápsula polar; DSB: diâmetro do corpo do esporo, quando o mesmo for esférico (Traduzido a partir de Yokoyama et al., 2012).

2.2. Métodos moleculares

O 18S rDNA é um dos genes mais utilizados em estudos filogenéticos e é um importante marcador na triagem molecular da biodiversidade (CHENUIL, 2006). Em geral, as sequências do 18S rDNA são de fácil acesso, devido às regiões altamente conservadas que permitem a utilização de primers universais (HILLIS e DIXON, 1991). Métodos de biologia molecular utilizando o 18S rDNA têm sido amplamente utilizados em investigações de parasitos do filo Myxozoa em diferentes abordagens, tais como a diferenciação de espécies morfologicamente semelhantes (CARRIERO et al., 2013; MÜLLER et al., 2013; MOREIRA

et al., 2014; NALDONI et al., 2014), estudo da especificidade de hospedeiro e de tecido

(MOLNÁR et al., 2002), elucidação do ciclo biológico (ATKINSON et al., 2007; SZÉKELY et al., 2009; ATKINSON e BARTHOLOMEW, 2009) e nos estudos das relações filogenéticas (MOLNÁR et al., 2008; FIALA e BARTOŠOVÁ, 2010; NALDONI et al.,

2011; 2014; ADRIANO et al., 2012; CARRIERO et al., 2013; MOREIRA et al., 2014).

3. JUSTIFICATIVA

Parasitos do filo Myxozoa são metazoários ainda pouco conhecidos e nos últimos anos vêm sendo alvo de estudos de pesquisadores de diferentes áreas, como parasitologia, sistemática, patologia, fisiologia, biologia celular e molecular, ecologia, evolução, entre outras, os quais têm possibilitado descobertas que vêm alterando profundamente nosso conhecimento sobre este grupo. Em 1984, foi descoberto que M. cerebralis (a espécie mundialmente mais estudada) apresentava ciclo biológico que envolvia um hospedeiro invertebrado (oligoqueta). Isso foi mais tarde também observado em outras espécies e teve um grande impacto na classificação do grupo, com a extinção da classe Actinosporea. A descoberta da existência de hospedeiros invertebrados no ciclo de vida dos mixosporídeos foi importante também no desenvolvimento de técnicas e métodos de controle destes parasitos, principalmente em sistemas de criação de peixes, visto que alterou completamente o entendimento sobre os mecanismos de transmissão.

Além da descoberta relacionada com a biologia e sistemática dos mixosporídeos, avanços importantes têm sido feitos com relação ao conhecimento da diversidade. Atualmente são conhecidas mais de 2.400 espécies, com centenas de novas descrições anualmente em todo o mundo. Contudo, a América do Sul, que é o continente com maior ictiofauna de água doce, o número de espécies descritas até o momento não ultrapassa a marca de 9 dezenas, sendo que

mais de 50 % foram descritas apenas nos últimos 10 anos, sendo que algumas têm sido reconhecidas como importantes patógenos para seus hospedeiros em pisciculturas.

Das espécies de mixozoários conhecidas em todo o mundo, apenas 47 (1,9 %) tiveram o ciclo biológico elucidados. Desta forma, o estudo destes metazoários se impõe como um importante desafio para várias áreas do conhecimento, e pode ser de grande valia para melhorar as condições de cultivo de peixes. Em nosso meio, devido à crescente importância que peixes nativos vêm assumindo na piscicultura, além de ampliar o conhecimento sobre a diversidade de mixozoários que infectam nossa ictiofauna, torna-se imprescindível ainda identificar os hospedeiros invertebrados envolvidos no ciclo biológico destes parasitos, visando entender os mecanismos de manutenção e disseminação dos mesmos nos ambientes de criação. O conhecimento dos mecanismos de transmissão destes parasitos será um forte aliado no controle das espécies com potencial patogênico, visto que para estes parasitos o foco não deve estar no tratamento (que ainda é muito difícil ou inviável), mas no manejo do ambiente visando condições sanitárias que minimizem a transmissão e, por conseguinte, os impactos sobre a produção.

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo Geral:

Identificar estágios mixosporo e actinosporo de mixosporídeos encontrados respectivamente em peixes e anelídeos oriundos de sistemas de criação de pintado (incluindo híbridos) e pacu (incluindo híbridos) nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, e avaliar aspectos da interação parasito-hospedeiro em peixes e oligoquetas infectados.

4.2. Objetivos Específicos

1) Avaliar a ocorrência de estágios actinoporos de Myxosporea em oligoquetas nos

viveiros de criação.

2) Identificar os estágios actinosporos (baseado em características morfológicas e

moleculares – sequenciamento do 18S rDNA).

3) Comparar as sequências do 18S rDNA obtidas dos estágios actinoporos com as

sequências dos estágios mixosporos disponíveis no Genbank, e sequenciar estágios

mixosporos de espécies que infectam os peixes alvo deste estudo, mas que ainda não

estão disponíveis no GenBank.

4) Identificar (baseado em análises morfológicas e moleculares) os hospedeiros

invertebrados envolvidos na transmissão dos Myxozoa.

5) Avaliar aspectos da interação parasito-hospedeiro com base em análises

ultraestruturais em peixes e oligoquetas infectados.

5. REFERÊNCIAS

ADRIANO, E. A.; ARANA, S.; CORDEIRO, N. S. Histology, ultrastructure and prevalence of Henneguya piaractus (Myxosporea) infecting the gills of Piaractus mesopotamicus (Characidae) cultivated in Brazil. Diseases of Aquatic Organisms, v. 64, p. 229-235, 2005a.

ADRIANO E. A.; ARANA S.; CORDEIRO N. S. An ultrastructural and histopathological study of Henneguya pellucida n. sp. (Myxosporea: Myxobolidae) infecting Piaractus mesopotamicus (Characidae) cultivated in Brazil. Parasite, v. 12, p. 221-227, 2005b.

ADRIANO, E. A.; ARANA, S.; CORDEIRO, N. S. Histopathology and ultrastructure of Myxobolus cuneus n. sp. infecting the connective tissue of Piaractus mesopotamicus (Pisces: Characidae) cultivated in Brazil. Parasite, v. 13, p. 137-42, 2006.

ADRIANO, E. A.; ARANA, S.; ALVES, A. L.; SILVA, M. R. M.; CECCARELLI, P. S.; HENRIQUE–SILVA, F.; MAIA, A. A. M. Myxobolus cordeiroi n. sp., a parasite of Zungaro jahu (Siluriformes: Pimelodiade) from Brazilian Pantanal: morphology, phylogeny and histopathology. Veterinary Parasitology, v. 162, p. 221–229, 2009.

ADRIANO, E. A.; CARRIERO, M. M.; MAIA, A. A. M.; SILVA, M. R. M.; NALDONI, J.; CECCARELLI, P. S.; ARANA, S. Phylogenetic and host parasite relationship analysis of Henneguya multiplasmodialis n. sp. infecting Pseudoplatystoma spp. in Brazilian Pantanal wetland. Veterinary Parasitology, v. 185, p. 110-120, 2012.

ANDERSON, R. M. e MAY, R. M. The population dynamics of micro-parasites and their invertebrate hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. v. 291, p. 451- 524. 1981.

ANDREE, K. B.; SZÉKELY, C.; MOLNÁR, K.; GRESOVIAC, S. J.; HEDRICK, R. P. Relationships among members of the genus Myxobolus (Myxozoa : Bilvalvidae) based on small subunit ribosomal DNA sequences. Journal of Parasitology, v. 85, p. 68–74, 1999.

ATKINSON, S. D.; HALLETT, S. L.; BARTHOLOMEW, J. L. The life cycle of Chloromyxum auratum (Myxozoa) from goldfish, Carassius auratus (L.), involves an antonactinomyxon actinospore. Journal of Fish Diseases, v. 30 p. 149–156, 2007.

ATKINSON, S. D. e BARTHOLOMEW, J. L. Alternate spore stages of Myxobilatus gasterostei, a myxosporean parasite of three-spined sticklebacks (Gasterosteus aculeatus) and oligochaetes (Nais communis). Journal of Parasitology, v. 104, p. 1173–1181, 2009.

ATKINSON, S. D. Diversity, life cycles and population genetics of freshwater Myxozoa from the Pacific Northwest of North America. PhD Thesis, School of Chemistry & Molecular Bioscience, The University of Queensland, Australia, 220 p., 2011.

BARTHOLOMEW, J. L.; ATKINSON, S. D.; HALLETT, S. L.; LOWENSTINE, L. J.; GARNER, M. M.; GARDINER, C. H.; RIDEOUT, B. A.; KEEL, M. K.; BROWN, J. D. Myxozoan parasitism in waterfowl. International Journal for Parasitology, v. 38, p. 1199-1207, 2008

BÉKÉSI, L.; SZÉKELY, C.; MOLNÁR, K. Atuais conhecimentos sobre Myxosporea (Myxozoa), parasitas de peixes. Um estágio alternativo dos parasitas no Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 39, p.271-276, 2002.

BERMÚDEZ, R.; LOSADA, A. P.; VÁZQUEZ, S.; REDONDO, M. J.; ALVAREZ, P. P.; QUIROGA, M. I. Light and electron microscopic studies on turbot Psetta maxima infected with

Enteromyxum scophthalmi: histopathology of turbot enteromyxosis. Diseases of Aquatic Organisms, v. 89, p. 209–221, 2010.

BORKHANUDDIN M. H. Studies on fish parasitic myxozoans in lake balaton, hungary and in freshwater and marine biotopes in malaysia. PhD Thesis, Doctoral School of Animal and Agricultural Environmental Sciences. University of Pannonia Georgikon Faculty, Hungria, 107 p., 2013.

CANNING, E. U.; OKAMURA, B.; CURRY, A. Development of a myxozoan parasite Tetracapsula bryozoides gen. n. et sp. n. in Cristatella mucedo (Bryozoa: Phylactolaemata). Folia Parasitologica, v. 43, p. 249-261, 1996.

CANNING, E. U.; CURRY, A.; FEIST, S. W.; LONGSHAW, M.; OKAMURA, B. A new class and order of myxozoans to accommodate parasites of bryozoans with ultrastructural observations on Tetracapsula bryosalmonae (PKX organism). Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 47, p. 456-468, 2000.

CANNING, E. U. e OKAMURA, B. Biodiversity and Evolution of the Myxozoa. Advances in Parasitology, v. 56, p. 43-131, 2004

CANNING, E. U.; CURRY, A.; HILL, S. L.; OKAMURA, B. Ultrastructure of Buddenbrockia allmani n. sp. (Myxozoa, Malacosporea), a parasite of Lophopus crystallinus (Bryozoa, Phylactolaemata). Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 54, p. 247-262, 2007.

CARRIERO, M. M.; ADRIANO, E. A.; SILVA, M. R. M.; CECCARELLI, P. S.; MAIA, A. M. Molecular Phylogeny of the Myxobolus and Henneguya Genera with Several New South American Species. PLoS ONE, v. 8 e 73713, 2013.

CHENUIL, A. Choosing the right molecular genetic markers for studying biodiversity: from molecular evolution to practical aspects. Genetica, v. 127, p. 101-201, 2006.

CHRISTOFFERSEN, M. L. A catalogue of aquatic microdrile oligochaetes (Annelida: Clitellata) from South America. Acta Hydrobiologica Sinica, v. 31, p. 59-86, 2007.

DIAMANT, A. Fish-to-fish transmission of a marine myxosporean. Diseases of Aquatic Organisms, v. 30, p. 99-105, 1997.

EIRAS, J. C.; TAKEMOTO, R. M.; PAVANELLI, G. C. Henneguya corruscans n. sp. (Myxozoa, Myxosporea, Myxobolidae), a parasite of Pseudoplatystoma corruscans (Osteichthyes, Pimelodidae) from the Paraná River, Brazil: a morphological and morphometric study. Veterinary Parasitology, v. 159 p. 154-158, 2009.

EVANS, N. M.; LINDNER, A.; RAIKOVA, E. V.; COLLINS, A. G.; CARTWRIGHT, P. Phylogenetic placement of the enigmatic parasite, Polypodium hydriforme, within the Phylum Cnidaria. BMC Evolutionary Biology, v. 8, p. 1-12, 2008

FEIST, S. W. e LONGSHAW, M. Phylum Myxozoa. In: WOO, P. T. K. Fish diseases and disorders: Protozoan and Metazoan infections, 2a ed., CAB International, Reino Unido, p. 230–296, 2006.

FERGUSON, J. A.; ATKINSON, S. D.; WHIPPS, C. M.; KENT, M. L. Molecular and morphological analysis of Myxobolus spp. of salmonid fishes with the description of a new Myxobolus species. Journal of Parasitology, v. 4, p. 1322–1334, 2008.

FIALA I. e BARTOŠOVÁ, P. History of myxozoan character evolution on the basis of rDNA and EF- 2 data. BMC Evolutionary Biology, v. 10, p. 1-13, 2010.

GILBERT, M. A.; GRANATH, W.O. Whirling disease of salmonid fish: life cycle, biology, and disease. Journal of Parasitology, v. 89, p. 658–667, 2003.

GRASSÉ, P.P. Embranchement des Myxozoaires. In: P. P. Grassé, R.A. Poisson and O. Tuzet (Eds.), Précis de Zoologie 1, Invertébrés. Second Edition. Mason et Cie, Paris, p. 107–112, 1970.

HALLETT, S. L.; ATKINSON, S. D.; SCHÖL, H.; EL-MATBOULI, M. Characterisation of two novel types of hexactinomyxon spores (Myxozoa) with subsidiary protrusions on their caudal processes using scanning electron microscopy and 18S rDNA sequence data. Diseases of Aquatic Organisms, v. 55, p. 45–57, 2003.

HILLIS, D. M. E DIXON, M. T. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly Review of Biology, v. 66, p. 411-446. 1991.

IBARRA, A. M.; GALL, G. A. E.; HEDRICK, R. P. Susceptibility of two strains of rainbow trout Oncorhynchus mykiss to experimentally induced infections with the myxosporean Ceratomyxa shasta. Diseases of Aquatic Organisms, v. 10, p. 191–194. 1991

JIMÉNEZ-GURI, E.; PHILIPPE, H.; OKAMURA, B.; HOLLAND, P. W. H. Buddenbrockia is a cnidarian worm. Science, v. 317, p. 116–118, 2007.

KENT, M. L. e HEDRICK, R. P. Transmission of the causative agent of proliferative kidney disease (PKD) with the blood and spleen of infected fish: further evidence that the PKX parasite belongs to the phylum Myxozoa. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, v. 5, p. 39–42, 1985.

KENT, M. L; ANDREE, K. B.; BARTHOLOMEW, J. L.; EL-MATBOULI, M.; DESSER, S. S.; DEVLIN, R. H.; FEIST, S. W.; HEDRICK, R. P.; HOFFMANN, R. W.; KHATTRA, J.; HALLETT, S. L.; LESTER, R. J. G.; LONGSHAW, M.; PALENZEULA, O.; SIDDALL, M. E.; XIAO, C. X. Recent advances in our knowledge of the Myxozoa. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 48, p. 395–413, 2001.

LOM, J. e NOBLE, E. R. Revised classification of the class Myxosporea Bütschli, 1881. Folia Parasitologica, v. 31, p. 193-205, 1984.

LOM, J e ARTHUR J. R. A Guideline for the preparation of species descriptions in Myxosporea. Journal of Fish Diseases, v. 12, p. 151–156, 1989.

LOM, J.; MCGEORGE, J.; FEIST, S. W.; MORRIS, D.; ADAMS, A. Guidelines for the uniform characterisation of the actinosporean stages of the phylum Myxozoa. Diseases of Aquatic Organisms, v. 30, p. 1–9. 1997.

LOM, J. e DYKOVÁ, I. Myxozoan genera: definition and notes on taxonomy, life-cycle terminology and pathogenic species. Folia Parasitologica, v. 53, p. 1-36, 2006.

MARTIN, P.; MARTÍNEZ-ANSEMIL, E.; PINDER, A.; TIMM, T.; WETZEL, M. J. Global diversity of oligochaetous clitellates (¨Oligochaeta¨; Clitellata) in freshwater. Hydrobiologia, v. 595, p. 117-127, 2008.

MARTINS M. L.; SOUZA V. N.; MORAES J. R. E.; MORAES F. R.; COSTA A. J. Pathology and behavioural efects associated with Henneguya sp. (Myxozoa: Myxobolidae) infections of captive pacu Piaractus mesopotamicus in Brazil. Journal of the World Aquaculture Society, v. 28, p. 297-300, 1997.

MARTINS, M. L. e SOUZA, V. N. Henneguya piaractus n. sp. (Myxozoa: Myxobolidae), a gill parasite of Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Osteichthyes: Characidae), in Brazil. Revista Brasileira de Biologia, v. 57, p. 239-245, 1997.

MCGEORGE, J; SOMMERVILLE, C; WOOTTEN, R. Transmission experiments to determine the relationship between Sphaerospora sp. from Atlantic salmon, Salmo salar, and Sphaerospora truttae: a revised species description for S. truttae. Folia Parasitologica, v. 43, p. 107-116, 1996.

MILANIN T.; EIRAS J. C.; ARANA S.; MAIA A. A. M.; ALVES A. L.; SILVA M. R. M., CARRIERO M.M.; CECCARELLI P.S.; ADRIANO E. A. Phylogeny, ultrastructure, histopathology and prevalence of Myxobolus oliveirai sp. nov., a parasite of Brycon hilarii (Characidae) in the Pantanal wetland, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 105, p. 762–769, 2010.

MOLNÁR, K. e KOVÁCS-GAYER, E. Observations on the intracellular and coelozoic developmental stages of Hoferellus cyprini (Doflein, 1898) (Myxosporea, Myxozoa). Parasitologia Hungarica, v. 19 p. 27–30, 1986.

MOLNÁR, K.; ESZTERBAUER, E.; SZÉKELY, C.; DÁN, Á.; HARRACH, B. Morphological and molecular biological studies on intramuscular Myxobolus spp. of cyprinid fish. Journal of Fish Diseases, v. 25, p. 643–652, 2002.

MOLNÁR, K.; CECH, G.; SZÉKELY, C. Infection of the heart of the common bream, Abramis brama (L.) with Myxobolus s.l. dogieli (Myxozoa, Myxobolidae). Journal of Fish Diseases, v. 31, p. 613–620, 2008.

MORAN, J. D. W.; WHITAKER, D. J.; KENT, M. L. Natural and laboratory transmission of the marinemyxozoan parasite Kudoa thyrsites to Atlantic salmon. Journal of Aquatic Animal Health, v. 11, p. 110–115, 1999.

MOREIRA, G. S. A.; ADRIANO, E.; SILVA, M. R. M.; CECCARELLI, P. S.; MAIA, A. A. M. The morphological and molecular characterization of Henneguya rotunda n. sp., a parasite of the gill arch and fins of Salminus brasiliensis from the Mogi Guaçu River, Brazil. Parasitology Research, v. 113, p. 1703-1711, 2014.

MORRIS, D. J. e ADAMS, A. Transmission of freshwater myxozoans during the asexual propagation of invertebrate hosts. International Journal for Parasitology, v. 36, p. 371–377, 2006.

MÜLLER, M. I.; ADRIANO, E. A.; CECCARELLI, P. S.; SILVA, M. R. M.; MAIA, A. A. M.; UETA, M. T. Prevalence, intensity and morphologic and molecular analysis of Henneguya piaractus and Myxobolus cf. colossomatis from farmed Piaractus mesopotamicus in Brazil. Diseases of Aquatic Organisms, v. 107, p. 129-139, 2013.

NALDONI J.; ARANA S.; MAIA A. A. M.; CECCARELLI P. S.; TAVARES L. E. R.; BORGES F. A.; POZO C. F.; ADRIANO E. A. Henneguya pseudoplatystoma n. sp. causing reduction in epithelial area of gills in the farmed pintado, a South American catfish: Histopathology and ultrastructure. Veterinary Parasitology, v. 166, p. 52–59. 2009.

NALDONI, J.; ARANA, S.; MAIA, A.A.M.; SILVA, M.R.M.; CARRIERO, M.M.; CECCARELLI, P.S.; TAVARES, L.E.R.; ADRIANO, E.A. Host-parasite-environment relationship, morphology and molecular analyses of Henneguya eirasi n. sp. parasite of two wild Pseudoplatystoma spp. in Pantanal Wetland, Brazil. Veterinary Parasitology, v.177, p. 247-255, 2011.

NALDONI J.; MAIA, A. A. M.; SILVA, M. R. M.; ADRIANO E. Henneguya cuniculator sp. nov., a parasite of spotted sorubim Pseudoplatystoma corruscans in the São Francisco Basin, Brazil. Diseases of Aquatic Organisms, v. 107 p. 211–221, 2014.

ÖZER, A.; WOOTTEN, R.; SHINN, A. P. Survey of actinosporean types (Myxozoa) belonging to seven collective groups found in a freshwater salmon farm in Northern Scotland. Folia Parasitologica, v. 49, p. 189–210, 2002.

RANGEL, L. F.; CECH, G.; SZÉKELY, C.; SANTOS, M. J. A new actinospore type Unicapsulactinomyxon (Myxozoa), infecting the marine polychaete, Diopatra neapolitana (Polychaeta: Onuphidae) in the Aveiro Estuary (Portugal). Parasitology, v. 138, p. 698-712, 2011.

REDONDO, M. J.; PALENZUELA, O.; RIAZA, A.; MACÍAS, A.; ALVAREZ-PELLITERO, P. Experimental transmission of Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa), an enteric parasite of turbot Scophthalmus maximus. Journal of Parasitology, v. 88, p. 482-488, 2002.

REDONDO, M. J.; PALENZUELA, O.; ALVAREZ-PELLITERO, P. Studies on transmission and life cycle of Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa), an enteric parasite of turbot Scophthalmus maximus. Folia Parasitologica, v. 51, p. 188-98, 2004.

ROSSER, T. G.; GRIFFIN, M. J.; QUINIOU, S. M.; GREENWAY, T. E.; KHOO, L. H.; WISE, D. J.; POTE, L. M. Molecular and morphological characterization of myxozoan actinospore types from a commercial catfish pond in the Mississippi Delta. Journal of Parasitology, v. 100, p. 828–839, 2014.

RÜCKERT, S.; PALM, H. W.; KLIMPEL, S. Parasite fauna of seabass (Lates calcarifer) under mariculture conditions in Lampung Bay, Indonesia. Journal of Applied Ichthyology, v. 24:3, p. 321-327, 2008.

SIDDALL, M. E.; MARTIN, D. S.; BRIDGE, D.; DESSER, S. S.; CONE, D. K. The demise of a phylum of protists: phylogeny of Myxozoa and other parasitic Cnidaria. Journal of Parasitology, v. 81, p. 961–967, 1995.

STERUD, E.; POPPE. T.; BORNO, G. Intracellular infection with Spironucleus barkhanus (Diplomonadida: Hexamitidae) in farmed Arctic char Salvelinus alpinus. Diseases of Aquatic Organisms, v. 56, p. 155–161, 2003.

SZÉKELY, C.; HALLETT, S. L.; AL-SAMMAN, A.; DAYOUB, A. First description of myxozoans from Syria: novel records of hexactinomyxon, triactinomyxon and endocapsa actinospore types. Diseases of Aquatic Organisms, v. 74, p. 127–137, 2007.

SZÉKELY, C.; HALLETT, S. L.; ATKINSON, S. D.; MOLNÁR, K. Complete life cycle of Myxobolus rotundus (Myxosporea: Myxobolidae), a gill myxozoan of common bream Abramis brama. Diseases of Aquatic Organisms, v. 85 p. 147–155, 2009.

WOLF, K. e MARKIW, M. E. Biology contravenes taxonomy in the Myxozoa: new discoveries show alternation of invertebrate and vertebrate hosts. Science, v. 225, p. 1449–1452, 1984.

WOO, P. T. K. Fish Diseases and Disorders: Protozoan and Metazoan Infections, vol. 1, 2ª ed., CAB International, Reino Unido, 791 p., 2006.

YOKOYAMA, H.; GRABNER, D.; SHIRAKASHI, S. Transmission Biology of the Myxozoa, In: CARVALHO, E. Health and Environment in Aquaculture, ISBN: 978- 953-51-0497-1, InTech,

Disponível em: , 2012.

ZHAI, Y. H.; ZHOU, L.; GUI, J. F. Identification and characterization of one novel type of Triactinospomyxon with short spore axis. Parasitology Research, v. 110, p. 2385–2393, 2012.

ZHANG, Z. Q. Animal biodiversity: an introduction to higher-level classification and taxonomic richness. Zootaxa, v. 3148, p. 7–12, 2011.

ZRZAVÝ, J. e HYPŠA, V. Myxozoa, Polypodium, and the origin of the Bilateria: the phylogenetic position of “Endocnidozoa” in light of the rediscovery of Buddenbrockia. Cladistics, v. 19, p. 164–169, 2003.

6. RESULTADOS

Os resultados da tese estão divididos em dois capítulos. O capítulo 1 versa sobre o estudo do estágio actinosporo e o capítulo 2 sobre o estágio mixosporo de parasitos da classe

Myxosporea encontrados em pisciculturas dos estados de São Paulo e do Mato Grosso do Sul.

Capítulo 1:

Actinosporos de mixosporídeos em oligoquetas de sistemas de criação de peixes nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil

RESUMO: Neste estudo foi investigado o envolvimento de oligoquetas no ciclo biológico de mixosporídeos em pisciculturas de água doce nos estados de São Paulo e Mato

Grosso do Sul, Brasil. Dos 333 exemplares de oligoquetas coletados em uma piscicultura no estado de São Paulo, três (0,9 %) liberaram esporos de Aurantiactinomyxon tipo 1, oito (2,4

%) liberaram esporos de Aurantiactinomyxon tipo 2, um (0,3 %) liberou esporos de

Aurantiactinomyxon tipo 3 e um (0,3 %) liberou esporos de Helioactinomyxon tipo 1. Dos 86 exemplares de oligoquetas coletados em uma piscicultura do estado do Mato Grosso do Sul, um (0,9 %) foi observado liberando actinosporos de um tipo pertencente a um grupo coletivo ainda não descrito, e foi nomeado como Seisactinomyxon tipo 1 nov. Os oligoquetas infectados foram identificados com base em dados morfológicos e no sequenciamento do 18S rDNA, e em ambas as pisciculturas, os oligoquetas pertenciam à família Naididae, sendo a espécie Pristina americana, em São Paulo e Slavina evelinae, em Mato Grosso do Sul. Este é o primeiro relato do envolvimento destas duas espécies no ciclo de vida dos mixosporídeos. O sequenciamento do 18S rDNA de Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. gerou sequências de 1.200, 902 e 1.877pb, respectivamente. A análise ultraestrutural revelou vários pansporocistos de Aurantiactinomyxon tipo 2 na parede intestinal de P.

americana. Na análise filogenética, Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov., agruparam em um clado formado por seis espécies de Myxobolus parasitos de peixes

Characiformes e uma espécie do gênero Thelohanellus parasito de peixes Siluriformes.

Palavras-chave: Actinosporo, Myxozoa, Oligoqueta Naididae, 18S rDNA,

Ultraestrutura, Piscicultura

1. INTRODUÇÃO

O filo Myxozoa é composto por parasitos metazoários que apresentam uma ampla variedade de hospedeiros aquáticos (FEIST e LONGSHAW, 2006). Wolf e Markiw (1984), em um estudo que mudou o entendimento da biologia dos mixosporídeos, demonstraram que o parasito Myxobolus cerebralis Hofer, 1903, apresentava um ciclo de vida indireto, que envolvia um estágio mixosporo que se desenvolvia em hospedeiros vertebrados e um estágio actinosporo que se desenvolvia em hospedeiros invertebrados. Após esse trabalho, muitos outros estudos sobre o envolvimento dos estágios actinosporos no ciclo biológico de mixosporídeos foram publicados em várias partes do mundo, como os de YOKOYAMA et al.

(1993; 1995); NEGREDO e MULCAHY (2001); ÖZER et al. (2002); OUMOUNA et al.

(2003); MARCUCCI et al. (2009); SZÉKELY et al. (2009); RANGEL et al. (2012);

ROSSER et al. (2014).

Atualmente, são conhecidos mais de 180 tipos de actinosporos infectando hospedeiros invertebrados, principalmente oligoquetas, mas também briozoários em água doce e poliquetas em ambiente marinho (MARCUCCI et al., 2009). A América do Sul é a região que apresenta a maior diversidade de peixes de água doce do mundo (SCHAEFER, 1998) e até o momento foram descritas apenas cerca de 90 espécies de mixosporídeos infectando peixes dessa região (NALDONI et al., 2011; EIRAS et al., 2011). No entanto, neste continente, o

único estudo que relata a ocorrência de estágios actinosporos em oligoquetas é o de Békési et al. (2002), onde os autores encontraram actinosporos pertencentes ao grupo coletivo Raabeia sendo liberados por oligoquetas da família Ocnerodrilidae.

Neste estudo, são apresentados dados morfológicos, moleculares e ultraestruturais de cinco tipos de actinosporos encontrados infectando exemplares de oligoquetas da família

Naididae, capturados em pisciculturas nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, Brasil.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Coleta de amostras e análise morfológica

Amostras de sedimento contendo oligoquetas foram coletadas das partes rasas de viveiros de duas pisciculturas, sendo uma localizada no município de Porto Ferreira, SP e outra localizada no município de Terenos, MS, durante o verão de 2012 e 2014.

As amostras foram armazenadas dentro de sacos plásticos, recobertas com água do próprio viveiro e conduzidas para o laboratório. No laboratório, os oligoquetas foram identificados morfologicamente segundo os critérios taxonômicos estabelecidos por

Brinkhurst e Jamieson (1971), Righi (1984) e Brinkhurst e Marchese (1989).

O sedimento contendo os oligoquetas foi então dividido em recepientes menores

(Béquer de 250 ml), recobertos com água de torneira, acomodados em uma incubadora com temperatura ajustada para 27ºC e a oxigenação foi controlada por um sistema de aeração.

Após uma semana, a água de cada recipiente foi filtrada (em malha de 20 µm). O material obtido foi examinado em microscópio Axioplan 2 (ZEISS) equipado com contraste de fase e acoplado em uma câmera MC 80 DX (ZEISS) utilizando objetiva de 20x, para a pesquisa de actinosporos. Nos recipientes cuja água se mostrou positiva quanto a presença de actinosporos, os oligoquetas foram cuidadosamente recolhidos e armazenados individualmente em placas com pequenos poços contendo água (Figura1).

Figura 1. Placa utilizada para manutenção dos oligoquetas isolados (A). Oligogueta isolado dentro de um dos poços da placa (B).

Ao todo foram coletados 333 oligoquetas do sedimento oriundo da piscicultura de Porto

Ferreira e 86 oligoquetas do sedimento obitido na piscicultura de Terenos. A água dos poços em que os oligoquetas estavam isolados foi analisada a cada dois dias. Os actinosporos encontrados foram examinados ao microscópio Axioplan 2 (ZEISS) equipado com contraste de fase e acoplado em uma câmera MC 80 DX (ZEISS) utilizando objetivas de 20x e 40x. Os dados morfométricos dos esporos foram obtidos de acordo com Lom et al. (1997) e as medidas foram expressas em micrometros (μm). Os parâmetros utilizados nas medidas de um novo grupo coletivo de actinosporos (Seisactinomyxon tipo 1 nov.) descrito neste estudo são detalhados na Figura 2.

Figura 2. Detalhes dos parâmetros utilizados nas medidas dos esporos de Seisactinomyxon tipo 1 nov. 1: comprimento das cápsulas polares; 2: largura das cápsulas polares; 3: comprimento do estilo; 4: largura do estilo e corpo; 5: comprimento do corpo; 6: comprimento do processo caudal antes da bifurcação; 7: comprimento do processo caudal após a bifurcação; 8: largura do processo caudal antes da bifurcação; 9: largura do processo caudal após a bifurcação.

2.2. Análises Moleculares

Para a extração de DNA, a água contendo os actinosporos foi colocada em microtubos de 1,5 μl. A concentração dos actinoporos foi feita através da evaporação da água em um concentrador 5301 eppendorf, possibilitando assim a aderência dos actinosporos na parede do microtubo. Para a extração de DNA dos oligoquetas, os exemplares foram seccionados em pequenas partes e colocados em um microtubo de 1,5 mL. As amostras de DNA dos actinosporos e anelídeos foram extraídas utilizando o kit de extração DNeasy Blood e Tissue

Kit (QIAGEN), seguindo as instruções do fabricante. O conteúdo de DNA foi determinado utilizando o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) a 260 nm.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) do 18S rDNA foi realizada com um volume final de 25 μl, sendo10-50 ng de DNA extraído, 1x tampão de taq DNA polimerase

(Invitrogen), 0,2 mmol de dNTP (Invitrogen), 1,5 mmol de MgCl2, 0,2 pmol de cada primer

(Invitrogen), 0,25 μl (1,25 U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e água ultrapura (MilliQ).

As reações de amplificação foram realizadas num termociclador Hamburg AG

22331(Eppendorf). Para os actinosporos a etapa de desnaturação inicial foi a 95 ºC durante 5 min., seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 60 s, o anelamento foi a 62 ºC durante

60 s) e extensão a 72 ºC durante 120 s, finalizando com uma etapa de alongamento a 72 ºC estendida para 5 min. Inicialmente foram utilizados os pares de primers ERIB1(s) - ACT1R(r) e TED(s) - ERIB10(r). No entanto, para algumas amostras, primers mais específicos foram construídos utilizando o software MacVector, como é o caso do primer MATF(s), substituindo o primer ERIB1(s). De acordo com a necessidade, alguns produtos de PCR foram clonados em um vetor de PCR®4-TOPO® do kit TOPO-TA Cloning® Kit (Invitrogen) inseridos em cepas Top 10 de Escherichia coli segundo as instruções do fabricante. Os primers utilizados para PCR e sequenciamento dos actinosporos estão descritos na Tabela 1.

Para os oligoquetas, a desnaturação inicial foi a 95 ºC durante 5 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95 ºC durante 30 s, anelamento a 60 °C durante 30 s e extensão a 72

ºC por 90 s, terminando com uma etapa final de alongamento à 72 ºC por 8 min. (SJÖLIN et al., 2005). Para a primeira reação de PCR foram utilizados os primers TIMA(s) e TIMB(r), seguida por um nested de PCR utilizando os primers TIMA-1100(r) TIMB-660(f). Os primers utilizados na PCR e no sequenciamento do DNA dos oligoquetas estão descritos na Tabela 2.

Os produtos de PCR dos actinosporos e oligoquetas foram visualizados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 % em tampão TAE (Tris-acetato de EDTA), corados com Sybr Safe

DNA (Invitrogen, Life Technologies, CA, EUA) e analisados em um transilluminador

Stratagene 2020E. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram comparados com o 1Kb

plus DNA Ladder (Invitrogen life Technologies, CA, EUA). O sequenciamento foi realizado utilizando o kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied BiosystemsTM Inc.,

CA, EUA) e um sequenciador ABI 3730 DNA (Applied BiosystemsTM).

As sequências dos actinosporos foram alinhadas usando o software BioEdit 7.1.3.0

(HALL, 1999). O padrão de nucleotídeos BLASTn (ALTSCHUL et al., 1997) foi usado para verificar a similaridade entre as sequências analisadas no presente estudo com outras disponíveis no site do GenBank.

Para avaliar a posição filogenética de Aurantiactinomyxon tipo 1, 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. em relação a outras espécies de mixosporídeos da América do Sul cujas sequências do 18S rDNA estão disponíveis no GenBank, uma análise filogenética foi realizada utilizando o programa PhyML 3.0 (GUINDON et al., 2010), empregando o método de máxima verossimilhança. O modelo evolutivo de substituição de nucleotídeos GTR+I+G foi selecionado usando as informações contidas no Akaike Information Criterion (AIC), e que foi determinado pelo programa jModeltest 0.1 (POSADA, 2008). As frequências de nucleotídeos foram: A= 0,2375, C = 0,2011, G = 0,2818 e T = 0,2796, e as taxas de seis tipos diferentes de substituição de nucleótidos foram [AC] = 1,1864, [AG] = 3.3383, [AT] =

1,8528, [CG] = 0,6677, [CT] = 4.5961, [GT] = 1,0000. O parâmetro de distribuição do gama foi de 0,3900. A análise de Bootstrap (500 réplicas) foi empregada para avaliar a robustez relativa dos ramos da árvore. As sequências das espécies de Myxozoa

Buddenbrockia plumatellae Schröder, 1910 e Buddenbrockia allmani Canning, Curry, Hill e

Okamura, 2007 foram usadas como grupo externo.

Tabela 1: Primers usados para a Reação em Cadeia da Polimerase e sequenciamento dos actinosporos.

Primer Actinosporo tipo Aplicação Sequência Referência ERIB1 (senso) Seis/Auranti 2 PCR/Sequenciamento 5’-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’ Barta et al. (1997) ACT1R (reverso) Seis/Auranti 1-2 PCR/Sequenciamento 5’-AATTTCACCTCTCGCTGCCA-3’ Hallett e Diamant (2001) MATF (senso) Aurantiactinomyxon 1 PCR/Sequenciamento 5’GTGTCAACCCATTGGATAACCG-3’ Neste estudo MC5 (senso) Seis/Auranti 1-2 Sequenciamento 5’-CCTGAGAAACGGCTACCACATCCA-3’ Molnár et al. (2002) MC3 (reverso) Aurantiactinomyxon 1 Sequenciamento 5’-GATTAGCCTGACAGATCACTCCACGA-3’ Molnár et al. (2002) TEDF (senso) Seisactinomyxon PCR/Sequenciamento 5’-AATTACCCAATCCAGACAAT-3 Capodifoglio et al. (2015) MX3 (reverso) Seisactinomyxon Sequenciamento 5’-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3’ Andree et al. (1999) ERIB10 (reverso) Seisactinomyxon PCR/Sequenciamento 5’-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3’ Barta et al. (1997)

Tabela 2: Primers usados para a PCR e sequenciamento dos oligoquetas.

Primer Aplicação Sequência Referência Tim A (senso) PCR/Seq. 5’-AMCTGGTTGATCCTGCCAG-3’ Sjölin et al. (2005) Tim B (reverso) PCR/Seq. 5’-TGATCCATCTGCAGGTTCACCT-3’ Sjölin et al. (2005) 660F (senso) Nested PCR/Seq. 5’-GATCTCGGGTCCAGGCT-3’ Norén e Jondelius (1999) 1100R (reverso) Nested PCR/Seq. 5’-GATCGTCTTCGAACCTCTG-3’ Norén e Jondelius (1999) 4FB (senso) Sequenciamento 5’-CCAGCAGCCGCGGTAATTCCAG-3’ Norén e Jondelius (1999) 4FBK (reverso) Sequenciamento 5’-CTGGAATTACCGCGGCTGCTGG-3’ Norén e Jondelius (1999) 7F (senso) Sequenciamento 5’-GCAATAACAGGTCTGTGATGC-3’ Norén e Jondelius (1999) 7FK (reverso) Sequenciamento 5’-GCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ Norén e Jondelius (1999)

2.3. Análise de Ultraestrutura dos actinosporos em oligoquetas

Para a análise de ultraestrutura, os oligoquetas foram divididos em três partes

(anterior, média e posterior) e fixados em glutaraldeído a 2,5 % em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2) durante 12 h, lavados em uma solução de glicose- salina durante 2 h e pós-fixados em OsO4. Após a desidratação usando uma série de passagens por acetonas, a amostra foi incorporada em resina 812 EMbed (Electron

Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA). Cortes ultrafinos foram duplamente corados com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinados em um microscópio eletrônico

LEO 906 a 60 kV (NALDONI et al., 2009).

3. RESULTADOS

Dos 333 espécimes de oligoquetas examinados a partir do material obtido nos viveiros da piscicultura de Porto Ferreira, treze (3,9 %) foram observados liberando actinosporos. Dos 86 oligoquetas obtidos nos viveiros da piscicultura de Terenos, um

(0,9 %) foi observado liberando actinosporos.

Os espécimes de oligoquetas da piscicultura de Porto Ferreira que se encontravam positivos para actinosporos foram identificados morfologicamente como sendo da família Naididae, espécie Pristina americana Cernosvitov, 1937 (Figura 3), e os espécimes da piscicultura de Terenos foram identificadas como sendo da família

Naididae, espécie Slavina evelinae Marcus, 1942 (Figura 4). O sequenciamento do 18S rDNA dos oligoquetas resultou em sequências de 1789 pb para aqueles de Porto

Ferreira e 1330 pb para aqueles de Terenos. Esta foi a primeira sequência do 18S rDNA obtida de P. americana e S. evelinae e de acordo com a pesquisa BLASTn, as sequências que mais se assemelham a de P. americana foram as de Pristina

proboscidea Beddard, 1896 (DQ459960.1), Pristina jenkinae Stephenson, 1932

(DQ459959), Pristina leidyi Smith, 1896 (GQ355433) e Pristina aequiseta Bourne,

1891 (GQ355432), com 99 % de similaridade. Dentre as sequências de espécies do gênero Slavina presentes no GenBank a que apresentou maior similaridade foi a da espécie Slavina appendiculata Udekem, 1855 (AF411876) encontrada na Suécia

(ERSÉUS et al., 2002), com 99 % de similaridade

Os actinosporos encontrados na piscicultura de Porto Ferreira foram pertencentes a dois grupos coletivos distintos: Aurantiactinomyxon, Janiszewska, 1955; e

Helioactinomyxon Bellerud, 1993. Três oligoquetas (0,9 %) liberaram esporos

Aurantiactinomyxon tipo 1, oito (2,4 %) liberaram esporos Aurantiactynomyxon tipo 2, um (0,3 %) liberou esporos Aurantiactinomyxon tipo 3 e um (0,3 %) liberou esporos de

Helioactinomyxon tipo 1 (Figuras 5 - 10). Os actinosporos encontrados na piscicultura de Terenos foram pertencentes a um novo grupo coletivo que foi denominado

Seisactinomyxon tipo 1 nov. (Figura 11), criado a partir deste estudo.

Figura 3. Fotomicrografia em contraste de fase de Pristina americana. A: note a presença de um pansporocisto de Aurantiactinomyxon tipo 2 (seta larga). B: região posterior do oligoqueta e actinosporos (setas finas) liberados para o meio externo. C: ampliação de B, mostrando os actinosporos liberados. Escala das barras: 100 μm.

Figura 4. Fotomicrografia de oligoqueta da espécie Slavina evelinae.

Além da caracterização morfológica dos cinco tipos de actinosporos, também são apresentados abaixo dados do sequenciamento parcial do 18S rDNA dos tipos

Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov., com sequências de 1200 pb, 902 pb e 1877 pb, respectivamente, e a análise ultraestrutural da forma

Aurantiactinomyxon tipo 2.

3.1. Aurantiactinomyxon tipo 1 (Fig. 5)

Corpo dos esporos esférico a elipsóide, medindo 10,9 μm (8,7-11,5) de diâmetro.

Processos caudais alongados e de tamanhos iguais, com extremidades posteriores ligeiramente curvadas para baixo e formato coniforme, medindo 18,6 μm (18,1-20,1) de comprimento e 9 μm (8,5-9,4) de largura na base (ponto mais largo do processo caudal).

A maior distância entre as pontas dos processos caudais foi de 39,0 μm (32,8-44,13).

Processos caudais com um núcleo móvel no interior de cada um. Três cápsulas polares projetadas para fora do corpo do esporo na superfície apical e medindo 2,1 μm (1,6-2,4)

(Figura 3). Não foi possível determinar a quantidade de células germinativas no interior do esporoplasma. As medidas foram obtidas a partir de 12 esporos.

Hospedeiro: Pristina americana Cernosvitov, 1937 (Annelida: Naididae).

Prevalência: 3/333 (0,9 %).

Sequência do 18S rDNA: 1200 pb.

Observações: Os esporos foram observados na superfície da água dois dias após a coleta e isolamento dos oligoquetas. De acordo com a pesquisa BLASTn, as sequências mais semelhantes a Aurantiactinomyxon tipo 1 foram aquelas das espécies Myxobolus aureus Carriero, Adriano, Silva, Ceccarelli e Maia, 2013 (KF296348) e Myxobolus macroplasmodialis Molnar, Ranzani-Paiva, Eiras e Rodrigues, 1998 (KF296357) , com apenas 89 % e 87 % de semelhança respectivamente. Os dados morfométricos concentrados no corpo dos esporos e no comprimento dos processos caudais de

Aurantiactinomyxon tipo 1 se assemelham às do Aurantiactinomyxon encontrado nos estudos de Marcucci et al. (2009). No entanto, o corpo dos esporos de

Aurantiactinomyxon tipo 1 é mais robusto e o processo caudal é maior. Em relação aos aspectos morfológicos, Aurantiactinomyxon tipo 1 deste estudo assemelha-se ao

Aurantiactinomyxon tipo 1 descrito por Hallett et al. (2006), no entanto eles se diferenciam no que diz respeito aos dados morfométricos.

Figura 5. Aurantiactinomyxon tipo 1 liberado por Pristina americana (A-C). A: desenho esquemático; B e C: fotomicrografias em contraste de fase. Corpo do esporo (seta branca), cápsulas polares (seta preta), processos caudais (seta larga). Escala das barras: 25 μm.

3.2. Aurantiactinomyxon tipo 2 (Figs. 6-8)

Corpo dos esporos arredondado em vista apical, e em forma de barril em vista lateral, medindo 8,0 μm (7,0-9,0) de diâmetro. Processos caudais iguais em tamanho e levemente curvados para baixo, porção posterior em formato coniforme, medindo 16,2

μm (13,7-19,3) de comprimento e 6 μm (4,7-6,9) de largura na base (ponto mais largo do processo caudal). A maior distância observada entre as pontas dos processos caudais foi de 30,2 μm (25,3-31,6). Cada processo caudal apresentou em seu interior um núcleo

móvel. Esporos com três cápsulas polares localizadas, em vista apical, na periferia do corpo do esporo e quando em visão lateral, projetadas para fora do corpo dos esporos, medindo 1,5 μm (1,0-1,9) (Figura 4). Não foi possível determinar a quantidade de células germinativas no interior do esporoplasma. As medidas foram obtidas a partir de

15 esporos.

Hospedeiro: Pristina americana Cernosvitov, 1937 (Annelida: Naididae).

Prevalência: 8/333 (2,4 %).

Sequência do 18S rDNA: 902 pb.

Observações: Os esporos foram observados na superfície da água um dia após a captura e o isolamento dos oligoquetas. De acordo com a pesquisa BLASTn, as sequências mais semelhantes a Aurantiactinomyxon tipo 2 foram as das epécies

Unicauda pelteobagrus Ma, 1998 (KC193254) e Myxobolus aureus (KF296348) com respectivamente 86 % e 85 % de similaridade. O alinhamento da sequência parcial do

18S rDNA de Aurantiactinomyxon tipo 1 com a do Aurantiactinomyxon tipo 2 mostrou

76,1 % de similaridade.

Com relação ao diâmetro do corpo dos esporos e das cápsulas polares de

Aurantiactinomyxon tipo 2, as medidas se assemelham àquelas de Aurantiactinomyxon pavinsis Ormières, 1968, descrito infectando o epitélio intestinal de Stylodrilus heringianus Marques, 1984 e de Tubifex ignotus Negredo e Mulcahy, 2001. No entanto, os processos caudais de Aurantiactinomyxon tipo 2 obtidos neste estudo são mais estreitos e as pontas mais afiladas.

Figura 6. Aurantiactinomyxon tipo 2 liberado por Pristina americana (A-C); A: desenho esquemático; B e C: fotomicrografias em contraste de fase. Corpo do esporo (seta preta), cápsulas polares (seta branca), processos caudais (seta larga). Escala das barras: 25 μm.

A análise ultraestrutural de um exemplar de P. americana infectado mostrou a presença de vários pansporocistos de Aurantiactinomyxon tipo 2 na parede do intestino.

O desenvolvimento dos actinosporos era sincrônico dentro de cada pansporocisto, no entanto era assincrônico entre os diferentes pansporocistos. Em algumas etapas de desenvolvimento foi possível observar pansporocistos se desenvolvendo muito próximos uns dos outros (Figura 7). Em estágios avançados de desenvolvimento e/ou amadurecimento dos actinosporos foi possível observar a presença das cápsulas polares, dobras dos processos caudais, e células germinativas no interior do esporoplasma

(Figura 8).

Figura 7. Eletromicrografia de corte transversal do intestino de Pristina americana infectado por Aurantiactinomyxon tipo 2. A: pansporocistos (P) na parede do intestino (wg). IL: lumen intestinal. Escala da barra = 10 μm. B: pansporocistos (P) formados por 2 células envelope (ec) conectadas por junções desmossômicas (setas brancas finas). Note vários esporos (sp) em estágios avançados de desenvolvimento, com o dobramento dos processos caudais (setas pretas finas), primórdio da cápsula polar (seta branca) e cápsula polar (seta preta). Alguns pansporocistos foram intimamente relacionados com outros (asteriscos). Escala da barra = 5 μm. C: ampliação de B, mostrando detalhes da junção desmossômica entre as células envelope. Escala da barra = 0.5 μm.

Figura 8. Eletromicrografia de pansporocisto de Aurantiactinomyxon tipo 2 do intestino de Pristina americana. A: observe actinosporo em avançado estágio de desenvolvimento mostrando a presença de duas cápsulas polares (pc), dobras dos processos caudais (setas pretas largas) e parede das valvas (v). Esporoplasmossomos presentes no interior do esporoplasma (setas pretas finas), gotículas lipídicas (setas brancas finas), mitocôndria (m) e quatro células germinativas (g). Escala da barra = 2 μm. B: ampliação de A, mostrando detalhes da célula germinativa. Note o núcleo (n) ocupando quase a metade da célula, mitocôndria (m) e grânulos do citoplasma (c). Escala da barra = 0.2 μm.

3.3. Aurantiactinomyxon tipo 3 (Fig. 9)

Corpo dos esporos arredondado medindo 9,5 μm (8,4-10,9) de diâmetro.

Processos caudais alongados de tamanhos iguais, extremidades afiladas, medindo 11,1

μm (9,1-13,5) de comprimento, 10,3 μm (9,9-11,6) de largura na base e 10,7 μm (9,7-

11,5) no ponto mais largo. Cada processo caudal apresentou em seu interior um núcleo móvel. Três cápsulas polares esféricas medindo 1,4 μm (1,0-1,6) de diâmetro posicionadas, em vista apical, na periferia do corpo do esporo (Figura 7). Não foi possível determinar a quantidade de células germinativas no interior do esporoplasma.

As medidas foram obtidas a partir de 10 esporos.

Hospedeiro: Pristina americana Cernosvitov, 1937 (Annelida: Naididae).

Prevalência: 1/333 (0,3 %).

Observações: Os esporos foram observados na superfície da água 3 dias após a captura e isolamento dos oligoquetas. O espécime de P. americana infectado com esse tipo de esporo liberou poucos esporos, inviabilizando a realização da PCR. Os dados morfométricos relativos ao comprimento dos processos caudais da forma aqui estudada estão próximos àqueles dos Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 descritos por Székely et al.

(2004), mas em relação à largura dos processos caudais, entretanto, assemelham-se as de Aurantiactinomyxon tipo 4 e 6 descrito por El-Mansy (1998a) e Aurantiactinomyxon tipo 2 de El-Mansy (1998b). Por outro lado, as cápsulas polares apresentaram dimensões semelhantes às dos Aurantiactinomyxon tipo 5 e 8 de El-Mansy (1998a) e tipo 3 de El-Mansy (1998b). Considerando o contexto morfológico geral do esporo, as maiores semelhanças são com os Aurantiactinomyxon tipo 1, 3 e 4 de El-Mansy

(1998b), porém, exitem diferenças mofométricas importantes em relação às várias estruturas dos esporos.

Figura 9. Aurantiactinomyxon tipo 3 liberado por Pristina americana (A-C); A: desenho esquemático; B e C: fotomicrografias em contraste de fase. Corpo do esporo (seta preta), cápsulas polares (seta branca), processos caudais (seta larga). Escala das barras: 25 μm.

3.4. Helioactinomyxon tipo 1 (Fig. 10)

Corpo dos esporos com formato triangular em vista apical, medindo 8,4 μm (7,3-

9,7) de diâmetro. Processos caudais com tamanhos iguais, formato triangular, medindo

10,1 μm (8,7-11,9) de comprimento, 8,3 μm (7,3-9,37) de largura na base e 23,1 μm

(21,58-24,28) na extremidade (ponto mais largo). A maior distância entre as pontas dos processos caudais foi de 10,9 μm (8,35-12,16). Cada processo caudal apresentou um núcleo móvel em seu interior. Três cápsulas polares projetadas para fora do corpo dos esporos, medindo 1,7 μm de diâmetro (1,6-2,3) (Figura 8). Esporoplama com várias células germinativas ocupando quase todo o corpo do esporo. As medições foram obtidas a partir de 9 esporos.

Hospedeiro: Pristina americana Cernosvitov, 1937 (Annelida: Naididae).

Prevalência: 1/333 (0,3 %).

Observações: A análise molecular não pôde ser realizada devido ao baixo número de esporos liberados pelo espécime de P. americana infectado, o que impossibilitou a obtenção de quantidade adequada de DNA durante a PCR.

Segundo Rosser et al. (2014), um actinosporo denominado Helioactinomyxon minutus Bellerud, 1993, foi descrito em uma tese de doutorado defendida na Mississippi

State University, a partir do exame de Dero digitata Mueller, 1773 coletados em um sistema de criação de catfish também no Mississippi. No entanto, Lom e Dykova (2006) não reconheceram como válido esse tipo de actinosporo porque o trabalho não foi publicado em um periódico, argumentando que não estaria acessível. Rosser et al.

(2014), realizando exames em D. digitata também no Mississipi, descreveram dois tipos de actinosporos que foram considerados como sendo do grupo coletivo descrito nos

estudos de Bellerud (1993). Estes autores sugeriram então, a validação do nome

Helioactinomyxon como um grupo coletivo. O Helioactinomyxon tipo 1 encontrado infectando o exemplar de P. americana examinado neste estudo assemelha-se ao

Helioactinomyxon tipo 2 encontrado em D. digitata coletados no Mississipi (ROSSER et al., 2014). O esporo presente neste estudo apresenta as medidas do diâmetro da cápsula polar similar as medidas de Helioactinomyxon tipo 2 de Rosser et al., 2014, porém o presente esporo apresentou diferenças significativas nas medidas do comprimento dos processos caudais e na distância entre os processos caudais, que permite diferenciá-lo dos outros tipos de Heliactinomyxon até agora descritos.

Figura 10. Helioactinomyxon tipo 1 liberado por Pristina americana (A-B). A: desenho esquemático; B: fotomicrografia em contrate de fase. Corpo do esporo (seta preta), cápsulas polares (seta branca), processos caudais (seta larga). Escala das barras: 25 μm.

3.5. Seisactinomyxon tipo 1 nov. (Fig. 11)

Esporo composto de corpo, estilo e 6 processos caudais. Corpo do esporo ocupando quase toda extensão do estilo, medindo 88 μm (57,3-104,5) de comprimento e estilo medindo 100 μm (60,3-115,7) de comprimento e 6,1 μm (4,3-8,7) de largura para o corpo do esporo e para o estilo. Processos caudais com 22,5 μm (13,8-26,8) de comprimento até a bifurcação, 9,5 μm (6,9-10,8) de largura antes da bifurcação, 81,9

μm (76,4-87) de comprimento e 6,7 μm (3,47-8,9) de largura após a bifurcação. Três cápsulas polares projetadas para o exterior do corpo no ápice do esporo, medindo 5,7

μm (4,5-7,5) de comprimento e 2,4 μm (1,8-2,8) de largura. Esporoplama, com várias células germinativas, ocupando toda a extensão do corpo dos esporos (Figuras 9 e 10).

As medições foram obtidas a partir de 11 esporos.

Hospedeiro: Slavina evelinae Marcus, 1942 (Annelida: Naididae).

Prevalência: 1/86 (0,9 %).

Sequência do 18S rDNA: 1877 pb.

Observações: Seisactinomyxon tipo 1 nov. apresenta estilo longo e fino, característica compartilhada por tipos de esporos encontrados dentro de

Triactinomyxon, Pseudotriactinomyxon e Hexactinomyxon (HALLET et al., 2003).

Assim como no tipo Hexactinomyxon, o novo tipo aqui descrito compartilha ainda a presença de seis processos caudais. Contudo, em relação ao estilo, Seisactinomyxon tipo 1 nov. difere da maioria dos Triactinomyxon, Pseudotriactinomyxon e

Hexactinomyxon pelo fato do corpo dos esporos ocuparem quase toda a extensão do estilo. A maioria dos tipos de actinosporos (incluindo Hexactinomyxon) apresentam 3

células valvais bem definidas (HALLET et al., 2003; SZÉKELY et al., 2007), sendo que em Triactinomyxon, Pseudotriactinomyxon e Hexactinomyxon, a junção das células valvais resultam em linhas de suturas bem definidas (HALLET et al., 2003). Em

Hexactinomyxon, cada célula valval apresenta bifurcação a partir da base do esporo, sendo que cada uma das duas metades se funde com a célula valval vizinha (HALLET et al., 2003; SZÉKELY et al., 2007). Em Seisactinomyxon tipo 1 nov., no entanto, a junção das células valvais que forma o estilo, não resultam em linhas de suturas nítidas e a bifurcação das células valvais se dá quase na região mediana dos processos caudais.

Figura 11. Seisactinomyxon tipo 1 nov. liberado por Slavina evelinae (A-C). A: desenho esquemático; B e C: fotomicrografias em contraste de fase. Corpo e estilo do esporo (seta preta), cápsulas polares (seta branca), processos caudais (seta larga). Escala das barras: 50μm.

Na análise filogenética, a árvore produzida a partir das sequências do 18S rDNA de esporos de Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov., incluindo todas as espécies de mixosporídeos parasitos de peixes de água doce da América do Sul, mostrou que Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. agruparam em um clado composto ainda por uma espécie do gênero Thelohanellus parasito de peixes Siluriformes e seis espécies de Myxobolus parasitos de peixes Characiformes

(Figura 12).

Figura 12. Árvore de máxima verossimilhança mostrando a relação entre Aurantiactinomyxon tipo 1, 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. com outras espécies de mixosporídeos parasitos de peixes de água doce da América do Sul, baseada na sequência parcial do 18S rDNA. Os números acima dos nós indicam os níveis de confiança do bootstrap. Traços (-) indicam valores abaixo de 50 %.

4. DISCUSSÃO

Até o momento são conhecidos aproximadamente 200 tipos diferentes de actinosporos em todo o mundo (MARCUCCI et al., 2009, BORKHANUDDIN, 2013;

ROSSER et al., 2014). Apesar da América do Sul ser o continente com maior diversidade de peixes de água doce, e nesse local serem conhecidas quase uma centena de espécies de mixosporídeos (EIRAS et al., 2011, ADRIANO et al., 2012), até o presente, Békési et al. (2002), foram os únicos pesquisadores que se dedicaram ao estudo de estágios actinosporo de mixosporídoes nessa região. Naquele estudo, os autores descreveram morfologicamente os esporos de um tipo de actinosporo pertencente ao grupo coletivo Raabeia, que foi liberado por oligoquetas da família

Ocnerodrilidae.

No presente estudo, exemplares de oligoquetas da espécie P. americana coletados em uma piscicultura no estado de São Paulo, Brasil foram encontrados infectados por quatro tipos de actinosporos pertencentes a dois grupos coletivos. A descoberta de uma espécie de oligoqueta albergando diferentes tipos de actinosporos têm sido comum em outras regiões do mundo. Özer et al. (2002), estudando a especificidade de hospedeiros para vários tipos de actinosporos em sistemas de criação de salmão do Atlântico, na

Escócia, descobriram que oligoquetas das espécies T. tubifex e Lumbriculus variegatus

Müller, 1774, albergavam respectivamente 13 e 6 tipos diferentes de actinosporos. Xi et al. (2013) verificaram que Branchiura sowerbyi Beddard, 1892, coletados em uma lagoa da China habitada por carpa cruciana (Carassius auratus gibelio Bloch, 1782), liberou três tipos de actinosporos e Rosser et al. (2014) encontraram seis diferentes tipos actinosporos sendo liberados por oligoquetas da espécie D. digitata capturados em sistemas de criação de catfish no Mississippi, EUA.

Um exemplar de S. evelinae liberou em suas fezes um tipo de actinosporo que apresentou morfologia marcante, que não permitiu sua classificação em nenhun dos grupos coletivos descritos. Como no tipo Hexactinomyxon (HALLET et al., 2003), os esporos do novo tipo liberado por S. evelinae apresentaram bifurcação das células valvais, formando por fim, seis processos caudais. Porém, no tipo decritos por Hallet et al. (2003), a bifurcação se dá a partir da base do esporo, equanto em Seisactinomyxon tipo 1 nov., a bifurcação ocorre quase no meio dos processos caudais (Fig. 11). Desta forma, é aqui sugerido a criação do grupo coletivo Seisactinomyxon para albergar

Seisactinomyxon tipo 1 nov. aqui descrito.

Nesse estudo, a prevalência de infecção foi baixa, variando de 0,3 %

(Aurantiactinomyxon tipo 3, Helioactinomyxon tipo 1 e Seisactinomyxon tipo 1 nov.) a

2,4 % (Aurantiactinomyxon tipo 2). Estes valores baixos estão de acordo com os padrões de prevalência observados em vários outros estudos relativos ao estágio actinosporo (MCGEORGE et al., 1997; XIAO e DESSER 1998a, b; ÖZER et al., 2002;

OUMOUNA et al., 2003; HALLETT et al., 2003; ESTERBAUER et al., 2006;

MARCUCCI et al., 2009; ROSSER et al., 2014). No entanto, é importante ressaltar que, neste estudo, os exemplares de P. americana e S. evelinae foram examinados apenas no verão, e isso pode não refletir a real prevalência ao longo do ano.

Os espécimes de P. americana aqui estudados foram coletados em sistemas de criação de peixes conhecidos popularmente como pacu (Piaractus mesopotamicus

Holmberg, 1887) e patinga (híbrido entre P. mesopotamicus e Piaractus brachypomus

Cuvier, 1818), ambos Characiformes cultivados em pisciculturas de várias regiões do

Brasil (MPA, 2013). Na América do Sul são conhecidas até o presente, 20 espécies de mixosporídeos parasitos de peixes de água doce cujas sequências do 18S rDNA estão disponíveis no GenBank. De todas essas sequências, nove são de mixosporídeos

parasitos de peixes Characiformes (CARRIERO et al., 2013; MOREIRA et al., 2014;

NALDONI et al., 2015), sendo que os parasitos das espécies Myxobolus colossomatis

Molnár e Békési, 1993, Henneguya piaractus, Martins e Souza 1997, Henneguya pellucida Adriano, Arana e Cordeiro, 2005, e Myxobolus cuneus Adriano, Arana e

Cordeiro, 2006, infectam P. mesopotamicus e/ou peixes híbridos resultantes do cruzamento desta espécies com outros peixes Sul Americanos (CARRIERO et al., 2013;

MÜLLER et al., 2013, MILANIN et al., 2015). Neste trabalho, foram realizados sequenciamento do 18S rDNA Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. No entanto, as sequências desses três tipos de actinosporos não apresentaram correspondência com nenhuma sequência do 18S rDNA de mixosporídeos disponíveis no GenBank, mostrando que as fases actinosporos aqui estudadas não são parte do ciclo biológico de nenhuma das espécies de mixosporídeos cujo 18S rDNA foi sequenciado.

A árvore filogenética mostrou os mixosporídeos sul americanos divididos em dois clados. Mixidium ceccarellii Adriano, Silva, Atkinson, Bartholomew e Maia, 2014, aparece como uma linhagem distinta daquela que compõe o grande clado formado por espécies de Myxobolus, Henneguya e Thelohanellus. Este grande clado está dividido, com bom suporte de bootstrap, originando dois subclados, e Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov., juntamente com seis outras espécies de Myxobolus parasitos de peixes Characiformes e uma espécies do gênero Thelohanellus parasito de

Siluriformes, compõem o subclado menor. Aurantiactinomyxon tipo 2 aparece como espécie basal no subclado, e Seisactinomyxon tipo 1 nov., com bom valor de bootstrap, agrupou como espécie irmã de Myxobolus macroplasmodialis Molnár, Ranzani-Paiva,

Eiras e Rodrigues, 1998, um parasito de Salminus brasiliensis Cuvier, 1816. Em um detalhado estudo filogenético de espécies de Myxobolus e Henneguya, Carriero et al.

(2013) mostraram a importância do papel das interações filogenéticas dos hospedeiros

na evolução destes parasitos. Estes dados podem, diante do quadro observado, sugerir que as três espécies de actinosporos cujos sequenciamentos foram aqui produzidos, podem ser parte do ciclo biológico de espécies de Myxobolidae que infectam

Characiformes ou Siluriformes.

Até o momento, não há nenhuma sequência do 18S rDNA de P. americana depositada no GenBank, e a pesquisa BLASTn mostrou que as sequências que apresentaram maior similaridade com a sequência da espécie de anelídeo aqui estudada foram as das espécies P. proboscidea, P. jenkinae, P. leidyi e P. aequiseta, com 99 % de similaridade. Assim como para P. americana, não foi encontrada nenhuma sequência de

S. evelinae depositada no GenBank e BLASTn mostrou 99 % de similaridade com a sequência de S. appendiculata.

Oligoquetas da família Naididae são bons nadadores, permitindo que estes anelídeos explorem uma ampla variedade de habitats (VERDONSCHOT et al., 1982).

No Brasil, oligoquetas da família Naididae tem sido observados em diferentes ambientes (PAMPLIN et al., 2005, ALVES e GORNI, 2007; GORNI e ALVES, 2007), sendo que segundo Pamplin et al. (2005), espécies pertencentes à essa família são os que apresentaram maior riqueza dentre os oligoquetas encontrados em represas do rio

Tietê. O trabalho aqui desenvolvido mostra duas espécies da família Naididae envolvidas no ciclo biológico de mixosporídeos em viveiros de pisciculturas no Brasil, apontando para a importância do monitoramento da densidade desses oligoquetas na estratégia de controle destes parasitos em sistemas de criação de peixes.

5. REFERÊNCIAS

ADRIANO, E. A.; CARRIERO, M. M.; MAIA A. A. M.; SILVA, M. R. M.; NALDONI, J.; CECCARELLI, S. P.; ARANA, S. Phylogenetic and host-parasite relationship analysis of Henneguya multiplasmodialis n. sp. Infecting Pseudoplatystoma spp. in Brazilian Pantanal wetland. Veterinary Parasitology, v. 185, p. 110−120, 2012. ALTSCHUL, S.F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFER, A. A.; ZHANG, J. H.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, p. 3389−3402, 1997. ALVES, R. G. e GORNI, G. R. Naididae species (Oligochaeta) associated with submersed aquatic macrophytes in two reservoirs (São Paulo, Brazil). Acta Limnologica Brasiliensia, v.19, p, 407-413, 2007. ANDREE K. B.; SZÉKELY C.; MOLNÁR K.; GRESOVIAC S. J.; HEDRICK R. P. Relationships among members of the genus Myxobolus (Myxozoa: Bilvalvidae) based on small subunit ribosomal DNA sequences. Journal of Parasitology, v. 85, p. 68-74, 1999 BARTA, J. R.; MARTIN, E. D.; LIBERATOR, P. A.; DASHKEVICZ, M.; ANDERSON, J. W.; FEIGHNER, S. D.; ELBRECHT, A.; PERKINS-BAROW, A.; JENKINS, M. C.; DANFORTH, H. D.; RUFF, M. D.; PROFOUS-JUCHELKA, H. Phylogenetic relationships among eight Eimeria species infecting domestic fowl inferred using complete small subunit ribosomal DNA sequences. Journal of Parasitology, v. 83, p. 262- 271. 1997 BÉKÉSI, L.; SZÉKELY, C.; MOLNÁR, K. Atuais conhecimentos sobre Myxosporea (Myxozoa), parasitas de peixes. Um estágio alternativo dos parasitas no Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 39, p.271-276, 2002. BELLERUD, B. L. Etiological and epidemiological factors effecting outbreaks of proliferative gill disease on Mississippi channel catfish farms. Ph.D. Dissertation. College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, Mississippi State, Mississippi, 164 p., 1993. BORKHANUDDIN M. H. Studies on fish parasitic myxozoans in lake balaton, hungary and in freshwater and marine biotopes in malaysia. PhD Thesis, Doctoral School of Animal and Agricultural Environmental Sciences. University of Pannonia Georgikon Faculty, Hungary, 107 p., 2013. BRINKHURST, R. O. e B.G.M. JAMIESON. Aquatic Oligochaeta of the world. Toronto, University of Toronto Press, 860 p., 1971. BRINKHURST, R. O. e MARCHESE, M. R. Guía para la identificación de oligoquetos acuáticos continentales de Sud y Centroamérica. Santa Fe: Asociacíon de Ciências Naturales del Litoral, 207 p., 1989. CAPODIFOGLIO, K. R. H.; ADRIANO, E. A.; SILVA, M. R. M.; MAIA, A. A. M. Supplementary data of Henneguya leporinicola (Myxozoa, Myxosporea) a parasiteof Leporinus macrocephalus from fish farms in the state of Sao Paulo, Brazil. Acta Parasitologica. No prelo 2015. CARRIERO, M. M.; ADRIANO, E. A.; SILVA, M. R. M.; CECCARELLI, P. S.; MAIA, A. A. M. Molecular Phylogeny of the Myxobolus and Henneguya Genera with Several New South American Species. PLoS ONE, v. 8 e 73713, 2013. EIRAS, J. C.; TAKEMOTO, R. M.; PAVANELLI, G. C.; ADRIANO, E. A. About the biodiversity of parasites of freshwater fish from Brazil. Bulletin of European Association of Fish Pathologists, v. 31, p. 161-168, 2011.

EL-MANSY, A.; SZÉKELY, C.; MOLNÁR, K. Studies on the occurrece of actinosporean stages of myxosporeans in Lake Balaton, Hungary, with the description of triactinomyxon, raabeia and aurantiactinomyxon types. Acta Veterinaria Hungarica, v. 46, p. 437-450, 1998a. EL-MANSY, A.; SZÉKELY, C.; MOLNÁR, K. Studies on the occurrence of actinosporean stages of fish myxosporeans in a fish farm of Hungary, with the description of triactinomyxon, raabeia, aurantiactinomyxon and neoactinomyxon types. Acta Veterinaria Hungarica, v. 46, p. 259-284, 1998b. ERSÉUS, C.; KÄLLERSJÖ, M.; EKMAN, M.; HOVMÖLLER, R. 18S rDNA phylogeny of the Tubificidae (Clitellata) and its constituent taxa: dismissal of the Naididae. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 22, p. 414–422, 2002. ESZTERBAUER, E.; MARTON, S.; RÁCZ, O. Z.; LETENYEI, M.; MOLNÁR, K. Morphological and genetic differences among actinosporean stages of fish-parasitic myxosporeans (Myxozoa): difficulties of species identification. Systematic Parasitology, v. 65, p. 97–114, 2006. FEIST, S. W e LONGSHAW, M. Phylum myxozoa. In WOO, P. T. K. Fish diseases and disorders. Protozoan and metazoan infections, v. 1, 2ª ed., CAB International, Oxfordshire, Estados Unidos da América, p. 230-296, 2006. GUINDON, S.; DUFAYARD, J. F.; LEFORT, V.; ANISIMOVA, M.; HORDIJK, W.; GASCUEL, O. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Systematic Biology, v. 59, p. 307– 321. 2010. GORNI, G. R. e ALVES, R. G. Naididae (Annelida, Oligochaeta) associated with briophytes in Brotas, State of São Paulo, Brazil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 24, p. 518-519, 2007. HALL, T. A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, v. 41, p. 95–98, 1999. HALLETT, S. L. e DIAMANT, A. Ultrastructure and small-subunit ribosomal DNA sequence of Henneguya lesteri n. sp (Myxosporea), a parasite of sand whiting Sillago analis (Sillaginidae) from the coast of Queensland, Australia. Diseases of Aquatic Organisms, v. 46, p. 197–212, 2001. HALLETT, S. L.; ATKINSON, S. D.; SCHÖL, H.; EL-MATBOULI, M. Characterisation of two novel types of hexactinomyxon spores (Myxozoa) with subsidiary protrusions on their caudal processes using scanning electron microscopy and 18S rDNA sequence data. Diseases of Aquatic Organisms, v. 55, p. 45–57, 2003. HALLETT, S. L.; ATKINSON, S. D.; HOLT, R. A.; BANNER, C. R.; BARTHOLOMEW, J. L. A new myxozoan from feral goldfish (Carassius auratus). Journal of Parasitology, v. 92, p. 357-363, 2006. LOM, J.; MCGEORGE, J.; FEIST, S. W.; MORRIS, D.; ADAMS, A. Guidelines for the uniform characterisation of the actinosporean stages of parasites of the phylum Myxozoa. Diseases of Aquatic Organisms, v. 30, p. 1–9, 1997. LOM, J. e DYKOVÁ, I. Myxozoan genera: definition and notes on taxonomy, life-cycle terminology and pathogenic species. Folia Parasitologica, v. 53, p. 1–36, 2006. MARCUCCI, C.; CAFFARA, M.; GORETTI, E. Occurrence of actinosporean stages (Myxozoa) in the Nera River system (Umbria, central Italy). Parasitology Research, v. 105, p. 1517–1530, 2009.

MCGEORGE, J.; SOMMERVILLE, C.; WOOTTEN, R. Studies of actinosporean myxozoan stages parasitic in oligochaetes from sediments of a hatchery where Atlantic salmon harbour Sphaerospora truttae infection. Diseases of Aquatic Organisms, v. 30, p. 107- 119, 1997. MILANIN, T.; MAIA, A. A. M.; SILVA, M. R. M.; ADRIANO, E. A. Molecular phylogeny and ultrastructure of Myxobolus cf. cuneus, a parasite of patinga hybrid and Henneguya pseudoplatystoma, a parasite of pintado hybrid. Acta Parasitologica. No prelo 2015. MOLNÁR, K.; ESZTERBAUER, E.; SZÉKELY, C.; DÁN, Á.; HARRACH, B. Morphological and molecular biological studies on intramuscular Myxobolus spp. of cyprinid fish. Journal of Fish Diseases, v. 25, p. 643–652, 2002. MOREIRA, G. S. A.; ADRIANO, E.; SILVA, M. R. M.; CECCARELLI, P. S.; MAIA, A. A. M. The morphological and molecular characterization of Henneguya rotunda n. sp., a parasite of the gill arch and fins of Salminus brasiliensis from the Mogi Guaçu River, Brazil. Parasitology Research, v. 113, p. 1703-1711, 2014. MPA, Minitério da Pesca e Aquicultura. Disponível em: http://www.mpa.gov.br/index.php/imprensa/noticias/2156-brasil-conhece-o-seu-primeiro- censo-aquicola. Acesso em 15/02/2013. MÜLLER, M. I.; ADRIANO, E. A.; CECCARELLI, P. S.; MAIA, A. A. M.; UETA, M. T. Prevalence, intensity, and phylogenetic analysis of Henneguya piaractus and Myxobolus cf. colossomatis from farmed Piaractus mesopotamicus in Brazil. Diseases of Aquatic Organisms, v. 107, p. 129-139, 2013. NALDONI J.; ARANA S.; MAIA A. A. M.; CECCARELLI P. S.; TAVARES L. E. R.; BORGES F. A.; POZO C. F.; ADRIANO E. A. Henneguya pseudoplatystoma n. sp. causing reduction in epithelial area of gills in the farmed pintado, a South American catfish: Histopathology and ultrastructure. Veterinary Parasitology, v. 166, p. 52–59. 2009. NALDONI, J.; ARANA, S.; MAIA, A.A.M.; SILVA, M.R.M.; CARRIERO, M.M.; CECCARELLI, P.S.; TAVARES, L.E.R.; ADRIANO, E.A. Host-parasite-environment relationship, morphology and molecular analyses of Henneguya eirasi n. sp. parasite of two wild Pseudoplatystoma spp. in Pantanal Wetland, Brazil. Veterinary Parasitology, v.177, p. 247-255, 2011. NALDONI, J.; ZATTI, S. A.; CAPODIFOGLIO, K. R. H.; MILANIN, T.; MAIA A. A. M.; SILVA, M. R. M.; ADRIANO, E. A. Host-parasite and phylogenetic relationships of Myxobolus filamentum sp. n. (Myxozoa: Myxosporea), a parasite of Brycon orthotaenia (Characiformes: Bryconidae) in Brazil. Folia Parasitologica. No prelo 2015. NEGREDO, C. e MULCAHY, M. F. Actinosporean infections in oligochaetes in a river system in southwest Ireland with descriptions of three new forms. Diseases of Aquatic Organisms, v. 46, p. 67-77, 2001. NORÉN, M. e JONDELIUS, U. Phylogeny of the Prolecithophora (Platy-helminthes) inferred from 18S rDNA sequences. Cladistics, v. 15, p. 103–112, 1999. OUMOUNA, M.; HALLETT, S. L.; HOFFMANN, R. W.; EL-MATBOULI, M. Seasonal occurrence of actinosporeans (Myxozoa) and oligochaetes (Annelida) at a trout hatchery in Bavaria, Germany. Parasitology Research, v. 89, p. 170–184, 2003. ÖZER, A.; WOOTTEN, R.; SHINN, A. P. Survey of actinosporean types (Myxozoa) belonging to seven collective groups found in a freshwater salmon farm in northern Scotland. Folia Parasitologica, v. 49, p. 189–210, 2002.

PAMPLIN, P. A. Z.; ROCHA, O.; MARCHESE, M. Riqueza de espécies de Oligochaeta (Annelida, Clitellata) em duas represas do rio Tietê. Biota Neotropica (Ed. Portuguesa), Campinas, v. 5, p. 1-8, 2005. POSADA, D. jModelTest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology and Evolution, v. 25 p. 253–1256, 2008. RANGEL, L. F.; AZEVEDO, C.; CASAL, G.; SANTOS, M. J. Ultrastructural aspects of Ellipsomyxa mugilis (Myxozoa: Ceratomyxidae) spores and developmental stages in Nereis diversicolor (Polychaeta: Nereidae). Journal of Parasitology, v. 98, p. 513–519, 2012. RIGHI, G. Manual de identificação de invertebrados límnicos do Brasil. Brasília: CNPq/Coordenação Editorial, 48 p, 1984. ROSSER, T. G.; GRIFFIN, M. J.; QUINIOU, S. M.; GREENWAY, T. E.; KHOO, L. H.; WISE, D. J.; POTE, L. M. Molecular and morphological characterization of myxozoan actinospore types from a commercial catfish pond in the Mississippi Delta. Journal of Parasitology, v. 100, p. 828–839, 2014. SCHAEFER, S. A. Conflict and resolution: impact of new taxa on phylogenetic studies of the neotropical cascudinhos (Siluroidea: Loricariidae). In Malabarba, L. R.; Reis, R. E.; Vari, R. P.; Lucena, Z. M. S.; Lucena, C. A. S. (eds): Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes, EDIPUCRS, Porto Alegre, p. 375-400, 1998. SJÖLIN, E.; ERSÉUS, C.; KÄLLERSJÖ, M. Phylogeny of Tubificidae (Annelida, Clitellata) based on mitochondrial and nuclear sequence data. Molecular Biology and Evolution, v. 35, p. 431–441, 2005. SZÉKELY, C.; AVENANT-OLDEWAGE, A.; MOLNÁR, K. Description of a new actinosporean type from South African freshwaters. Diseases of Aquatic Organisms, v. 61, p. 95–102, 2004. SZÉKELY, C.; HALLETT, S. L.; AL-SAMMAN, A.; DAYOUB, A. First description of myxozoans from Syria: novel records of hexactinomyxon, triactinomyxon and endocapsa actinospore types. Diseases of Aquatic Organisms, v. 74, p. 127–137, 2007. SZÉKELY, C.; HALLETT, S. L.; ATKINSON, S. D.; MOLNÁR, K. Complete life cycle of Myxobolus rotundus (Myxosporea: Myxobolidae), a gill myxozoan of common bream Abramis brama. Diseases of Aquatic Organisms, v. 85, p. 147–155, 2009. VERDONSCHOT, P. F. M.; SMIES, M.; SEPERS, A. B. J. The distribution of aquatic oligochaetes in brackish inland waters in the SW Netherlands. Hydrobiologia, v. 89, p. 29-38, 1982. WOLF, K. e MARKIW, M. E. Biology contravenes taxonomy in the Myxozoa: new discoveries show alternation of invertebrate and vertebrate hosts. Science, v. 225, p. 1449–1452, 1984. XI, B. W.; ZHANG J. Y., XIE, J.; PAN, L. K.; GE, X. P.. Three actinosporean types (Myxozoa) from the oligochaete Branchiura sowerbyi in China. Parasitology Research, v. 112, p. 1575–1582, 2013.

XIAO, C. e DESSER, S. S. Actinosporean stages of myxozoan parasites of oligochaetes from Lake Sasajewun, Algonquin Park, Ontario: new forms of triactinomyxon and raabeia. Journal of Parasitology, v. 84, p. 998-1009, 1998a. XIAO, C. e DESSER S. S. Actinosporean stages of myxozoan parasites of oligochaetes from Lake Sasajewun, Algonquin Park, Ontario: new forms of echinoactinomyxon,

neoactinomyxon, aurantiactinomyxon, guyenotia, synactinomyxon and antonactinomyxon. Journal of Parasitology, v. 84, p. 1010-1019, 1998b. YOKOYAMA, H.; OGAWA, K.; WAKABAYASHI, H. Some biological characteristics of actinosporeans from the oligochaete Branchiura sowerbyi. Diseases of Aquatic Organisms, v. 17, p. 223–228, 1993. YOKOYAMA, H.; OGAWA, K.; WAKABAYASHI, H. Myxobolus cultus n. sp. (Myxosporea: Myxobolidae) in the goldfish Carassius auratus transformed from the actinosporean stage in the oligocheate Branchiura sowerbyi. Journal of Parasitology, v. 81, p. 446-451, 1995.

Capítulo 2:

Filogenia molecular e ultraestrutura de Myxobolus cf. cuneus, parasito do hibrido patinga e Henneguya pseudoplatystoma, parasito do hibrido pintado

Artigo publicado no periódico Acta Parasitologica, v. 60(3), p. 442-450, 2015.

RESUMO: Myxobolus cuneus e Henneguya pseudoplatystoma infectam respectivamente pacu (Piaractus mesopotamicus) e pintado híbrido (Pseudoplatystoma corruscans x Pseudoplatystoma reticulatum) em pisciculturas brasileiras. No presente estudo foram realizadas análises do 18S rDNA de Myxobolus cf. cuneus encontrado no baço de patinga, um peixe híbrido resultante do cruzamento de Piaractus mesopotamicus x Piaractus brachypomus, e de H. pseudoplatystoma encontrado infectando brâquias de pintado híbrido, ambos os peixes oriundos de pisciculturas do estado de São Paulo, Brasil. O estudo também fornece novos detalhes da interface parasito-hospedeiro de M. cf. cuneus, revelando que a parede do plasmódio é composta por uma única membrana, a qual apresenta numerosos canais de pinocitose ligando o meio externo ao ectoplasma do plasmódio. O desenvolvimento dos esporos é assincrônico, com pansporoblastos dispóricos em diferentes estágios de desenvolvimento e esporos imaturos e maduros encontrados em diferentes regiões do plasmódio. A análise filogenética mostrou M. cf. cuneus como uma espécie irmã de

Henneguya pellucida, em um subclado composto principalmente por mixosporídeos parasitos de Characiformes e H. pseudoplatystoma agrupou em um subclado composto de Henneguya spp. parasitos de peixes do gênero Pseudoplatystoma.

Palavras-chave: Myxobolus, Henneguya, Filogenia, 18S rDNA, Ultraestrutura.

1. INTRODUÇÃO

Os peixes são uma importante fonte de proteínas, vitaminas, minerais, ácidos graxos e ômega-3, e representa 16,6 % da produção mundial de proteína animal e 6,5 % do consumo humano (FAO, 2012). O peixe conhecido popularmente como patinga é um híbrido resultante do cruzamento da fêmea de Piaractus mesopotamicus Holmberg,

1887, original da Bacia do Prata, com o macho de Piaractus brachypomus Cuvier,

1818, original das bacias Amazônica e do Orinoco (FRANCESCHINI, 2012; FROESE e PAULY, 2011). Essas duas espécies de peixes são conhecidas popularmente no Brasil como pacu e pirapitinga, respectivamente. Os peixes do gênero Piaractus bem como os seus híbridos, são amplamente cultivados em diferentes regiões do Brasil, com a produção atingindo 95.692,4 toneladas em 2010 (MPA, 2011).

No Brasil, outro peixe importante na piscicultura é o híbrido conhecido como pintado (IBAMA, 2008). Esse peixe é resultante do cruzamento da fêmea de

Pseudoplatystoma corruscans Spix Agassiz, 1829, com o macho de Pseudoplatystoma reticulatum Eigenmann e Eigenmann, 1889, respectivamente conhecidos como pintado e cachara (Carvalho et al., 2008). Em 2011, a produção de pintado híbrido atingiu

8.824,3 toneladas. Os híbridos Patinga e Pintado estão entre os peixes com maior valor comercial na aquicultura brasileira (URBINATI et al., 2010).

Os mixosporídeos estão entre os mais abundantes parasitos de peixes, podendo ser encontradas infecções tanto de ambiente natural quanto em sistemas de criação (FEIST e LONGSHAW, 2006, GÓMEZ et al., 2014). Dentre os mixospórídeos, aqueles dos gêneros Myxobolus Bütschli, 1882 e Henneguya Thelohan, 1892 são os mais comuns em peixes (EIRAS, 2002; EIRAS et al., 2005; 2014; EIRAS e ADRIANO, 2012,

ADRIANO et al., 2012). No Brasil, devido à importância econômica na pesca e na aquicultura, peixes dos gêneros Piaractus e Pseudoplatystoma Bleeker, 1862, têm

recebido atenção dos ictioparasitologistas, o que tem permitido rápido aumento no conhecimento da fauna de mixosporídeos que infectam esses peixes (MARTINS et al.,

1997; ADRIANO et al., 2005a, b; 2006; 2012; NALDONI et al., 2009; 2011; 2014;

CARRIERO et al., 2013; MÜLLER et al., 2013).

Myxobolus cuneus Adriano, Arana e Cordeiro, 2006 e Henneguya pseudoplatystoma Naldoni, Arana, Maia, Ceccarelli, Tavares, Borges, Pozo e Adriano,

2009, foram originalmente descritos infectando respectivamente pacu (P. mesopotamicus) e pintado híbrido (P. corruscans x P. reticulatum) em pisciculturas

Brasileiras (ADRIANO et al., 2006; NALDONI et al., 2009). Os autores realizaram as identificações baseadas em análises morfológica, histopatológica e ultraestrutural, e mostraram que estes parasitos são importantes patógenos para essas espécies de peixes em sistemas de criação.

Myxobolus cuneus foi encontrado infectando a vesícula biliar, bexiga urinária, brânquias, baço, fígado, coração, nadadeiras e superfície da cabeça de pacu cultivado no estado de São Paulo, Brasil. Nos filamentos branquiais, o desenvolvimento do parasito causou deformações na parede e, em alguns casos, a obstrução do lúmen das arteríolas

(ADRIANO et al., 2006). H. pseudoplatystoma causou deformações na estrutura do filamento branquial de pintado de cultivado nos estados de São Paulo e Mato Grosso do

Sul, levando à redução da área funcional do epitélio (NALDONI et al., 2009).

O presente trabalho é parte de um contínuo estudo de mixosporídeos parasitos de peixes de água doce da América do Sul, e fornece dados do sequenciamento do 18S rDNA de Myxobolus cf. cuneus encontrado no baço de exemplares de patinga e H. pseudoplatystoma parasito dos filamentos branquiais de pintado híbrido coletados em pisciculturas do estado de São Paulo, Brasil. O presente estudo também apresenta a análise filogenética destas espécies de mixosporídeos, bem como a incorporação de

novos dados ultraestruturais relacionados com a interação parasito-hospedeiro de M. cf. cuneus.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Quinze exemplares de patinga e vinte de pintado híbrido foram obtidos respectivamente em pisciculturas localizadas nos municípios de Porto Ferreira e Mogi

Mirim, São Paulo, Brasil. As coletas foram realizadas durante o verão de 2013. Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Departamento de

Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo-USP/FZEA (número do processo:

14.1.391.74.9).

Os peixes foram necropsiados e o exame parasitológico feito com o auxilio de um microscópio de luz 2 Zeiss, acoplado à um computador equipado com um software de captura de imagem Axivision 4.1. A morfometria dos esporos foi feita de acordo com os critérios estabelecidos por Lom e Arthur (1989), e as medidas foram expressas em micrômetros (μm) como média ± desvio padrão (SD).

Para a microscopia eletrônica de transmissão, tecidos do hospedeiro contendo plasmódios foram fixados em glutaraldeído a 2,5 % diluído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) durante 12 h, lavados no mesmo tãmpão durante 2 h e pós-fixados em OsO4. Após a desidratação em séries de passagens por acetonas, o material foi incluído em resina 812 EMbed. Cortes ultrafinos foram duplamente corados com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinados em um microscópio eletrônico

LEO 906 a 60 kV.

Para a análise molecular, os plasmódios foram fixados em álcool absoluto (PA). O

DNA dos parasitos foi extraído usando o DNeasy® Blood e Tissue Kit (QIAGEN,

EUA) seguindo as instruções do fabricante. A concentração de DNA foi determinada

usando o espectofotômetro NanoDrop 2000, a 260 nm. A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi realizada com um volume final de 25 μL, contendo 10-50 ng de

DNA extraído, Tampão da Taq Polimerase 1x (Invitrogen), 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP (Invitrogen), 1,25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 0,2 pmol de cada primer, e água ultrapura (MilliQ), em um termociclador AG 22331 Hamburg

(Eppendorf).

A amplificão foi realizada de acordo com as seguintes etapas: uma desnaturação inicial à 95 ºC por 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 60 s, anelamento a 65 ºC por 60 s, extensão a 72 ºC por 60 s, e finalizada com uma etapa de alongamento à 72 ºC por 5 min. Os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 % em tampão TAE (Tris-acetato de EDTA), corados com Sybr Safe DNA (Invitrogen, Life Technologies, CA, EUA) e analisados em um transiluminador Stratagene 2020E. Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram comparados com o marcador de peso molecular 1 Kb plus DNA Ladder (Invitrogen Life

Technologies, CA, EUA). O sequenciamento foi realizado utilizando o kit BigDye®

Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied BiosystemsTM Inc., CA, EUA) e um sequenciador ABI 3730 DNA (Applied BiosystemsTM). As amostras foram amplificadas utilizando os pares de primers ERIB1 - ACT1R e MYXGEN4f - ERIB10

(Tabela 1), que amplificaram dois fragmentos do 18S rDNA de aproximadamente

1000pb e 1200pb, respectivamente. Outros primers utilizados nas reações de sequenciamento estão listados na Tabela 1.

O padrão de nucleotídeos BLAST (blastn) (ALTSCHUL et al., 1997) foi usado para verificar a similaridade entre as sequências analisadas no presente estudo com outras disponíveis no site do GenBank. As sequências de M. cf. cuneus e H.

pseudoplatystoma foram alinhadas com várias outras sequências obtidas no GenBank usando o software BioEdit 7.1.3.0 (HALL, 1999).

O modelo evolutivo de substituição de nucleotídeos (GTR + G) foi selecionado usando as informações contidas no Akaike Information Criterion (AIC), utilizando o programa jModeltest 0.1 (POSADA, 2008). As frequências de nucleotídeos foram de

A= 0,2397, C = 0,1952, G = 0,2800 e T = 0,2851, e as taxas de substituição de nucleotídos foram [AC] = 1,1360, [AG] = 3,0788, [AT] = 1,4607, [CG] = 0,6899, [CT]

= 3,9902, [GT] = 1,0000. O parâmetro de distribuição gama foi de 0,3620.

Para avaliar a posição de M. cf. cuneus e H. pseudoplatystoma em relação a outras de Myxobolus/Henneguya spp., foi realizada análise filogenética envolvendo as sequências destas espécies mais sequências de espécies representativas dos gêneros

Myxobolus e Henneguya disponíveis no GenBank. O programa utilizado foi o PhyML

3.0 (GUINDON et al., 2010), empregando o método de máxima verossimilhança com

500 réplicas. Kudoa thyrsites Gilchrist, 1924 e Kudoa alliaria Kovaleva, Shulman e

Yakovlev, 1979 foram utilizados como grupo externo. Com base na árvore resultante, as sequências que se agruparam mais próximas às sequências produzidas por esse estudo foram alinhadas e comparadas para produzir uma tabela de similaridade (Tabela 2), utilizando o programa MEGA 5.0 (TAMURA et al., 2011).

Tabela 1: Lista de primers usados na amplificação e no sequenciamento do 18S rDNA de Myxobolus cf. cuneus e Henneguya pseudoplatystoma.

Primers Aplicação Ssequência dos primers Referência ERIB1 PCR/Sequenciamento 5’-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’ Barta et al. (1997) (senso) MC5 Sequenciamento 5’-CCTGAGAAACGGCTACCACATCCA-3’ Molnár et al. (2002) (senso) MYXGEN4f PCR/Sequenciamento 5’GTGCCTTGAATAAATCAGAG-3’ Diamant et al. (2004) (senso) ERIB10 PCR/Sequenciamento 5’CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3’ Barta et al. (1997) (reverso) MC3 Sequenciamento 5’-GATTAGCCTGACAGATCACTCCACGA-3’ Molnár et al. (2002) (reverso) ACT1R PCR/Sequenciamento 5’-AATTTCACCTCTCGCTGCCA-3’ Hallett e Diamant (2001) (reverso)

3. RESULTADOS

Plasmódios brancos, esféricos e medindo aproximadamente 200 μm de diâmetro

foram encontrados na cápsula do baço de onze exemplares de patinga, totalizando 73,3

% do total de peixes examinados. Esporos piriformes e válvas simétricas e convexas em

vista lateral. Cápsulas polares alongadas e iguais em tamanho, ocupando pouco mais da

metade do corpo dos esporos (Figura 1A). Filamentos polares dispostos

perpendicularmente ao eixo longitudinal da cápsula polar. Com base nos dados

morfométrico/mofológicos o parasito foi identificado como M. cf. cuneus (Tabela 2).

Plasmódios brancos de H. pseudoplatystoma, medindo até 0,6 mm de

comprimento foram encontrados parasitando a porção média do filamento branquial de

oito exemplares de pintado híbrido, totalizando 40 % do total de peixes examinados.

Esporos elipsóides em vista frontal, válvas simétricas e convexas em vista lateral.

Cápsulas polares alongadas e iguais em tamanho ocupando pouco menos da metade do

corpo dos esporos (Figura 1B). Os dados comparativos das dimensões dos esporos,

sítios de infecção, hospedeiros e regiões geográficas de H. pseudoplatystoma e M. cf.

cuneus obtidos nesse estudo em relação às descrições originais são apresentados na

Tabela 3.

A análise ultraestrutural de M. cf. cuneus revelou que o plasmódio apresentou desenvolvimento assincrônico, sendo possível observar pansporoblastos dispóricos em diferentes fases de desenvolvimento, e esporos imaturos e maduros presentes em diferentes regiões do plasmódio (Figuras 2A e 3A, 3D). Uma cápsula de tecido conjuntivo composta por fina camada de fibroblastos e fibras de colágeno foi observada envolvendo os plasmódios (Figura 2A). A parede do plasmódio foi composta de membrana única, a qual apresentou numerosos canais de pinocitose interligando o meio externo ao ectoplasma dos plasmódios (Figura 2B). Numerosas mitocôndrias foram observadas no interior do plasmódio (Figura 3B).

Tabela 2: Dados comparativos das dimensões dos esporos (em μm), sítios de infecção, hospedeiros e regiões geográfiacas de Henneguya pseudoplatystoma e Myxobolus cf. cuneus obtidos neste estudo em relação às descrições originais. CCP: comprimento das cápsulas polares; LCP: largura das cápsulas polares; NFP: número de voltas do filamento polar.

Comprimento Largura do Comprimento Sítio de Espécies Espessura CCP LCP NFP Localização total do esporo esporo da cauda infecção/hospedeiro Piscicultura, Mogi H. pseudoplatystoma 32,1±2 3,6±0,3 2,6±0,2 3,7±0,2 1,2±0,2 22,7±2,0 Brânquias/Pintado Mirim, São Paulo, -- (Neste estudo) (27,06-36,89) (2,99-4,14) (2,18-2,87) (3,28-4,34) (1-1,94) (19,32-26,21) híbrido Brasil

Mogi Mirim, São Paulo, Brasil e H. pseudplatystoma Brânquias/Pintado Bandeirantes, Mato Naldoni et al., 2009 33,2 ±1,9 3,4 ±0,4 -- 3,3 ±0,4 1,0 ±0,4 22,7±1,7 6-7 híbrido Grosso do Sul, Brasil

Piscicultura, Porto M. cf. cuneus 10,5±0,35 5,4±0,27 4,3±0,32 6,01±0,38 2,01±0,31 Ferreira, São Paulo, -- 9-10 Baço/Patinga (este estudo) (9,96-11,24) (4,95-6,01) (4-4,9) (5,19-6,82) (1,28-2,55) Brasil

M. cuneus Tecido conjuntivo/P. Pirassununga, São 10 ± 0,6 5,1 ± 0,3 -- 5,7±0,3 1,7±0,2 -- 8-9 (Adriano et al., 2006) mesopotamicus Paulo, Brasil

Figura 2. Eletromicrografia do baço de patinga infectado por Myxobolus cf. cuneus: A. Interface parasito-hospedeiro mostrando a parede do plasmódio (seta) circundada por cápsula de tecido conjuntivo (cc). Observe no interior do plasmódio (P), pansporoblastos jovens (yp), esporos imaturos (ims) e maduros (ms). H: hospedeiro; er: eritrócitos; fn: núcleos do fibroblasto. Escala da barra: 10µm; B. Ampliação da interface parasito-hospedeiro mostrando a cápsula de tecido conjuntivo (linha pontilhada), com núcleos de fibroblastos (nf) e fibras de colágeno (cf), parede plasmodial composta por uma única membrana (seta), ectoplasma (ec) do plasmódio (P) com numerosos canais de pinocitose (pc) e parte de um esporo maduro (ms). Escala da barra: 2,5µm.

Figura 3. Eletromicrografia de estágios de desenvolvimento de Myxobolus cf. cuneus parasito de patinga: A. Pansporoblasto em estágio de desenvolvimento. Note esporos jovens (ys) e vários núcleos (n) nas células que estão em processo de diferenciação. Escala da barra: 2µm; B. Corte de um esporo imaturo mostrando as células capsulogênicas (cc) com os seus núcleos (cn), cápsula polar (pc), esporoplasma (sp) com um núcleo visível (n), inúmeras mitocôndrias (m) e esporoplasmossomos (seta branca). Note a presença do material formador das valvas (vm), e externamente, várias mitocôndrias. Escala da barra: 1 µm; C. Corte longitudinal de esporo imaturo apresentando células capsulogênicas com seus núcleos (cn) e a cápsula polar (pc) com filamento polar internalizado (seta preta), esporoplasma (sp) com um núcleo visivel (n), mitocôndria (m) e esporoplasmosomos (seta branca); ms: esporo maduro; im: esporo imaturo. Escala da barra: 2µm. D. Corte transversal de esporo imaturo mostrando esporoplasma (sp) binucleado (n). Escala da barra: 1µm.

O sequenciamento do 18S rDNA de esporos de M. cf. cuneus e H. pseudoplatystoma resultou em sequências contendo 1855 e 1946 pb, respectivamente. A partir dessas sequências, pesquisas no BLASTn foram realizadas, o que permitiu que estas espécies fossem diferenciadas de outras sequências do 18S rDNA de mixosporídeos disponíveis no GenBank. De acordo com o BLASTn, a espécie com maior identidade com M. cf. cuneus foi Henneguya pellucida Adriano, Arana e

Cordeiro, 2005 (KF296352), e a que apresentou maior identidade com H. pseudoplatystoma foi Henneguya maculosus Carriero, Adriano, Silva, Ceccarelli e

Maia, 2013 (KF296344).

A análise filogenética, utilizando o método de máxima verossimilhança mostrou que M. cf. cuneus aparece como uma espécie irmã de H. pellucida em um subclado composto principalmente por mixosporídeos parasitos de caraciformes e H. pseudoplatystoma agrupou em um subclado composto de Henneguya spp. parasitos de peixes de Pseudoplatystoma (Figura 4).

Figura 4. Árvore de máxima verossimilhança mostrando a relação de Myxobolus cf. cuneus e Henneguya pseudoplatystoma com outras espécies de mixosporídoes com base na sequência parcial do 18S rDNA. Os números acima dos nós indicam os níveis de confiança do bootstrap. Traços (-) são mostrados para valores abaixo de 50 %.

A análise de similaridade, usando as sequências de espécies que se agruparam próximas às espécies alvo desse estudo, mostrou que as espécies com maior similaridade genética em relação a M. cf. cuneus foi H. pellucida, com 85,8 %, e em relação a H. pseudoplatystoma foi H. maculosus, com 90,6 % (Tabela 3).

Tabela 3. Similaridade, baseada no 18S rDNA, indicando as distâncias genéticas entre as species de Henneguya e Myxobolus que agruparam juntas com as espécies alvo deste estudo.

Myxobolus cf. cuneus Henneguya pseudoplatystoma Espécies N. de diferenças Porcentagem N. de diferenças Porcentagem M. cf. cuneus 301 83,6 H. pseudoplatystoma 301 83,6 H. maculosus 287 84,3 180 90,6 H. eirasi 227 81,1 143 88,1 H. corruscans 280 84,5 249 86,9 H. cuniculator 179 85,1 161 86,7 H. multiplasmodialis 273 82,4 246 84,2 M. flavus 261 82,8 230 84,8 M. hakyi 264 83,6 299 84,2 M. pangasii 259 83,6 278 82,3 H. sutherlandi 272 85,2 311 84,0 H. pellis 277 85,0 285 85,3 H. exilis 274 85,1 282 85,4 H. adiposa 276 85,0 287 85,2 M. oliveirai 177 84,3 260 82,6 H. pellucida 222 85,8 289 81,3 H. psorospermica 259 83,7 305 80,8 H. lobosa 268 83,1 284 82,0 H. piaractus 269 85,4 307 83,7 H. visibilis 258 84,8 304 82,0 M. pantanalis 264 85,5 303 83,9 H. rotunda 286 84,4 287 84,4 H. pseudorhinogobii 344 81,3 330 82,4 H. rhinogobii 340 81,5 316 83,1 H. shaharin 185 81,5 171 82,7

4. DISCUSSÃO

Myxobolus cuneus foi descrito por Adriano et al. (2006) infectando as brânquias, vesícula biliar, bexiga urinária, baço, nadadeiras, superfície da cabeça, fígado e coração de exemplares de P. mesopotamicus oriundos de uma piscicultura do estado de São

Paulo, Brasil. Sua descrição foi baseada em dados morfológicos, histológicos e ultraestruturais. Os dados morfométricos dos esporos do parasito encontrados no baço de patinga correspondem a M. cuneus (Tabela 3). Esse trabalho fornece o sequenciamento do 18S rDNA desses esporos. No entanto, como a sequência foi obtida a partir de esporos encontrados em um hospedeiro híbrido, mesmo sendo resultante do cruzamento entre espécies do mesmo gênero, P. mesopotamicus (hospedeiro original) e P. brachypomus), foi decido referir-se aqui como Myxobolus cf. cuneus, e esperar um futuro sequenciamento de M. cuneus a partir de P. mesopotamicus. Isso evita futuras confusões taxonômicas.

O presente estudo fornece dados ultraestruturais mais detalhadas sobre a interface parasito-hospedeiro e esporogonia de M. cf. cuneus, os quais mostram os plasmódios envolvidos por uma cápsula de tecido conjuntivo fina composta por fibras de colágeno e fibroblastos, uma característica que tem sido comumente relatada em outros estudos envolvendo mixosporídeos (SITJA-BOBADILLA e ALVAREZ-PELLITERO, 1993;

HOLZER e SCHACHNER, 2002; SITJA-BOBADILLA, 2008). Os plasmódios foram delimitados por uma única membrana, a qual apresentou numerosos canais de pinocitose ligando o meio externo à zona do ectoplasma, característica descrita também por outros autores (CURRENT e JANOVY, 1976; 1978; CURRENT. 1979; ROCHA et al., 1992; EL-MANSY e BASHTAR, 2002; MILANIN et al., 2010). Estes dados complementam a descrição original de Adriano et al. (2006), em que estas informações não foram fornecidas

A prevalência de M. cf. cuneus no híbrido patinga foi de 73,3 %, similar à prevalência de 73 % relatado por Adriano et al. (2006) em P. mesopotamicus, considerando, porém, todos os órgãos infectados. No entanto, no híbrido, a infecção por

M. cf. cuneus foi observada apenas no baço, e a prevalência de 73,3 % era muito mais elevada quando comparada aos 14,1 % observados no baço de P. mesopotamicus

(ADRIANO et al., 2006).

Os exemplares de pintado híbrido examinados neste estudo foram obtidos a partir de um sistema de criação localizado no município de Mogi Mirim e a prevalência de H. pseudoplatystoma foi de 40 %. Na mesma piscicultura, Naldoni et al. (2009), encontraram prevalência de 100 %. Apesar da menor prevalência, a nova descoberta de

H. pseudoplatystoma neste sistema de criação indica que este parasito tem um ciclo de vida bem estabelecido naquele local, ao mesmo tempo, como mostrado por Naldoni et al. (2009), está ausente em outras pisciculturas do Estado de São Paulo.

Em relação à descrição original de H. pseudoplatystoma feita por Naldoni et al.

(2009), o presente estudo acrescenta dados referentes à sequência do 18S rDNA, que, juntamente com a sequência de M. cuneus, permitiu aqui avaliar a posição filogenética destas duas espécies de mixosporídeos, que infectam duas espécies de peixes de água doce comercialmente muito importantes na América do Sul.

A análise filogenética mostrou que M. cf. cuneus, um parasito do tecido conjuntivo do híbrido patinga aparece como uma espécie irmã de H. pellucida, um parasito que também infecta tecido conjuntivo de P. mesopotamicus (ADRIANO et al.,

2005a). H. pseudoplatystoma agrupou em um subclado composto exclusivamente por

Henneguya spp. parasitos de brânquias de peixes do gênero Pseudoplatystoma, que aparece em um clado maior composto apenas por mixosporídeos parasitos de peixes siluriformes. Estes agrupamentos, de acordo com hospedeiro e afinidade de

órgãos/tecidos, são consistentes com os relatos de outros pesquisadores

(ESZTERBAUER, 2004; FIALA, 2006; CARRIERO et al., 2013).

Além da análise filogenética, o sequenciamento do 18S rDNA destes

mixosporídeos, que apresentam potencial patogênicos para duas espécies de peixes

importantes para a piscicultura da América do Sul (ADRIANO et al., 2006; NALDONI

et al., 2009), também serão importantes para futuros estudos, permitindo a identificação

e desenvolvimento de métodos de diagnósticos mais precisos com base em técnicas

moleculares.

5. REFERÊNCIAS

ADRIANO, E. A.; ARANA, S.; CORDEIRO, N. S. An ultrastructural and histopathological study of Henneguya pellucida n.sp. (Myxosporea: Myxobolidae) infecting Piaractus mesopotamicus (Characidae) cultivated in Brazil. Parasite, v. 12, p. 221-227, 2005a. ADRIANO, E. A.; ARANA, S.; CORDEIRO, N. S. Histology, ultrastructure and prevalence of Henneguya piaractus (Myxosporea) infecting the gills of Piaractus mesopotamicus (Characidae) cultivated in Brazil. Diseases Aquatic Organisms, v. 64, p. 229-35, 2005b. ADRIANO, E. A.; ARANA S.; CORDEIRO, N. S. Histopathology and ultrastructure of Myxobolus cuneus n. sp. infecting the connective tissue of Piaractus mesopotamicus (Pisces: Characidae) cultivated in Brazil. Parasite, v. 13, 137-42, 2006. ADRIANO, E. A.; CARRIERO, M. M.; MAIA, A. A. M.; SILVA, M. R. M.; NALDONI, J.; CECCARELLI, S. P.; ARANA S. Phylogenetic and host-parasite relationship analysis of Henneguya multiplasmodialis n. sp. Infecting Pseudoplatystoma spp. in Brazilian Pantanal wetland. Veterinary Parasitology, v. 185, p. 110−120, 2012. ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFER, A. A.; ZHANG, J. H.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, p. 3389−3402, 1997. BARTA, J. R.; MARTIN, D. S.; LIBERATOR, P. A.; DASHKEVICZ, M.; ANDERSON, J. W.; FEIGHNER, S. D.; ELBRECHT, A.; PERKINS-BARROW, A.; JENKINS, M. C.; DANFORTH, H. D.; RUﬀ, M. D.; PROFOUS-JUCHELKA, H. Phylogenetic relationships among eight Eimeria species infecting domestic fowl inferred using complete small subunit ribosomal DNA sequences. Journal of Parasitology, v. 83, p. 262–271, 1997. CARRIERO, M. M.; ADRIANO, E. A.; SILVA, M. R. M.; CECCARELLI, P. S.; MAIA, A. A. M. Molecular phylogeny of the Myxobolus and Henneguya genera with several new South American species. PLoS One, v. 8 (9), e73713, p. 1 – 12, 2013. CARVALHO, D. C.; SEERIG, A.; MELO D. C.; SOUSA, A. B.; PIMENTA, D.; OLIVEIRA, D. A. A. Identificação molecular de peixes: o caso do Surubim (Pseudoplatystoma spp.). Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 32, p. 215-219, 2008.

CURRENT, W. L. e JANOVY, J. Jr. Ultrastructure of interlamellar Henneguya exilis in the channel catfish. Journal of Parasitology, 62, 975–981, 1976. CURRENT, W. L. e JANOVY, J. Jr. Comparative study of ultrastructure of interlamellar and intralamellar types of Henneguya exilis Kudo from channel catfish. Journal of Protozoology, v. 25, p. 56–65, 1978. CURRENT, W. L. Henneguya adiposa Minchew (Myxosporida) in the channel catfish: ultrastructure of the plasmodium wall and sporogenesis. Journal of Protozoology, v. 26, p. 209–217, 1979. DIAMANT, A.; WHIPPS, C. M.; KENT, M. L. A new species of Sphaeromyxa (Myxosporea: Sphaeromyxina: Sphaeromyxidae) in devil ﬁreﬁsh, Pterois miles (Scorpaenidae), from the northern Red Sea: Morphology, ultrastructure, and phylogeny. Journal of parasitology, v. 90, p. 1434–1442, 2004. EIRAS, J. C. Synopsis of the species of the genus Henneguya Thélohan, 1892 (Myxozoa: Myxosporea: Myxobolidae). Systematic Parasitology, v. 52, p. 43-54., 2002. EIRAS, J. C.; MOLNÁR, K.; LU, Y. S. Synopsis of the species of Myxobolus Butschli, 1882 (Myxozoa : Myxosporea : Myxobolidae). Systematic Parasitology, 61, 1–46, 2005. EIRAS, J. C.; ADRIANO, E. A. A checklist of new species of Henneguya Thélohan, 1892 (Myxozoa: Myxosporea, Myxobolidae) described between 2002 and 2012. Systematic Parasitology, 83, 95– 104, 2012. EIRAS, J. C.; ZHANG, J.; MOLNÁR. K. Synopsis of the species of Myxobolus Bütschli, 1882 (Myxozoa: Myxosporea, Myxobolidae) described between 2005 and 2013. Systematic Parasitology, v. 88, p. 11–36, 2014. EL-MANSY, A. e BASHTAR, A. R. Histopathological and ultrastructural studies of Henneguya suprabranchiae Landsberg, 1987 (Myxosporea: Myxobolidae) parasitizing the suprabranchial organ of the freshwater catfish Clarias gariepinus Burchell, 1822 in Egypt. Parasitology Research, v. 88, p. 617–626, 2002. ESZTERBAUER E. Genetic relationship among gill-infecting Myxobolus species (Myxosporea) of cyprinids: molecular evidence of importance of tissue-specificity. Diseases of Aquatic Organisms, 58, 35-40, 2004. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), 2012. The state of world fisheries and aquaculture. Disponível em: http://www.fao.org/docrep/016/i2727e/i2727e.pdf. Acesso em 04 de fevereito de 2014. FEIST, S. W.; LONGSHAW, M.: Phylum myxozoa. In: WOO, P. T. K. (ed.): Fish diseases and disorders. Protozoan and metazoan infections. 2ª ed. CAB International, Oxfordshire, Estados Unidos da América, p. 1:230-296, 2006. FIALA, I. The phylogeny of Myxosporea (Myxozoa) based on small subunit ribosomal RNA gene analysis. International Journal for Parasitology, v. 36, p. 1521-1534, 2006. FRANCESCHINI, L. Infecções parasitárias e microbianas na produção do pacu Piaractus mesopotamicus e do híbrido patinga procedentes da região Noroeste do Estado de São Paulo. Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biosciências de Botucatu, São Paulo, Brazil, 2012. FROESE, R.; PAULY, D. 2011. FishBase. World Wide Web electronic publication. Disponível em: www.fishbase.org. Acesso em 04 de fevereiro de 2014. GÓMEZ, D.; BARTHOLOMEW, J.; SUNYER, J. O. Biology and mucosal immunity to myxozoans. Developmental e Comparative Immunology, v. 43, p. 243–256, 2014.

GUINDON, S.; DUFAYARD, J. F.; LEFORT, V.; ANISIMOVA. M.; HORDIJK. W.; GASCUEL. O. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Systematic Biology, v. 59, p. 307-321, 2010. HALL, T. A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41, 95–98, 1999. HALLETT, S. L. e DIAMANT, A. Ultrastructure and small-subunit ribosomal DNA sequence of Henneguya lesteri n.sp. (Myxosporea), a parasite of sand whiting Sillago analis (Sillaginidae) from the coast of Queensland, Australia. Diseases Aquatic of Organisms, 46, 197–212, 2001. HOLZER, A. S. e SCHACHNER, O. Myxobolus cycloides on the swimbladder of chub Leuciscus cephalus: a controlled, host-specific localization. Diseases Aquatic of Organisms, 49, 179–183, 2002. IBAMA, Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis. Estatística da pesca 2006 Brasil: grandes regiões e unidades da federação, IBAMA, Brasília, 181 p., 2008. LOM, J e ARTHUR J. R. A Guideline for the preparation of species descriptions in Myxosporea. Journal of Fish Diseases, v. 12, p. 151–156, 1989. MARTINS, M. L.; SOUZA, V. N.; MORAES, F. R.; MORAES, J. R. E.; COSTA, A. J.; ROCHA, U. F. Pathology and behavioral effects associated with Henneguya sp. (Myxozoa: Myxobolidae) infections of captive pacu Piaractus mesopotamicus in Brazil. Journal World Aquaculture Society, 28, 297-300, 1997. MILANIN, T.; EIRAS, J. C.; ARANA, S.; MAIA, A. A. M.; ALVES, A. L.; SILVA, M. R. M.; CARRIERO, M. M.; CECCARELLI, P. S.; ADRIANO, E. A. Phylogeny, Ultrastructure, histopathology and prevalence of Myxobolus oliveirai sp. nov., a parasite of Brycon Hilarii (Characidade) in the Pantanal wetland, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 105, 762- 769, 2010. MOLNÁR, K.; ESZTERBAUER, E.; SZÉKELY, C.; DÁN, A.; HARRACH, B. Morphological and molecular biological studies on intramuscular Myxobolus spp. of cyprinid ﬁsh. Journal of Fish Diseases, v. 25, p. 643–652, 2002. MPA, Ministério da Pesca e Aquicultura. Boletim estatístico da pesca e aqüicultura, Brasília, Brasil, 60p, 2011. MÜLLER, I. M.; ADRIANO, A. E.; CECCARELLI, S. P.; SILVA, M. R. M.; MAIA, M. A. A.; UETA, T. M. Prevalence, intensity, and phylogenetic analysis of Henneguya piaractus and Myxobolus cf. colossomatis from farmed Piaractus mesopotamicus in Brazil. Diseases Aquatic of Organisms, v. 107, p. 129-139, 2013. NALDONI, J.; ARANA, S.; MAIA, A. A. M.; CECCARELLI, P. S.; TAVARES, L. E. R.; BORGES, F. A.; POZO, C. F.; ADRIANO, E. A. Henneguya pseudoplatystoma n. sp. causing reduction in epithelial area of gills in the farmed pintado, a South American catfish: Histopathology and ultrastructure. Veterinary Parasitology, v. 166, p. 52-59, 2009. NALDONI, J.; ARANA, S.; MAIA, A. A. M.; SILVA, M. R. M.; CARRIERO, M. M.; CECCARELLI, P. S.; TAVARES, L. E. R.; ADRIANO, E. A. Host-parasite-environment relationship, morphology and molecular analyses of Henneguya eirasi n. sp. parasite of two wild Pseudoplatystoma spp. in Pantanal Wetland, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 177, p. 247-255, 2011. NALDONI, J.; MAIA, A. A. M.; SILVA, M. R. M.; ADRIANO, E. A. Henneguya cuniculator sp. nov., a parasite of spotted sorumbim Pseudoplatystoma corruscans in the Sao Francisco Basin, Brasil. Diseases Aquatic of Organisms, v. 107, p. 211-221, 2014. POSADA, D. jModelTest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology and Evolution, v. 25, p. 1253–1256, 2008.

ROCHA, E.; MATOS, E.; AZEVEDO, C. Henneguya amazônica n. sp. (Myxozoa, Myxobolidae), parasitizing the gills of Crenicichla lepidota Heckel, 1840 (Teleostei, Cichlidae) from the Amazon river. European Journal of Protistology, v. 28, p. 273–278, 1992. SITJÀ-BOBADILLA, A. e ALVAREZ-PELLITERO, P. Pathologic effects of Sphaerospora dicentrarchi Sitj/t-Bobadilla and Alvarez-Pellitero, 1992 and S. testicularis Sitjà-Bobadilla and Alvarez-Pellitero, 1990 (Myxosporea: Bivalvulida) parasitic in the Mediterranean sea bass Dicentrarchus labrax L. (Teleostei: Serranidae) and the cell-mediated immune reaction: a light and electron microscopy study. Parasitology Research, v. 79, p. 119-129, 1993. SITJÀ-BOBADILLA, A. Fish immune response to myxozoan parasites. Parasite, v. 15, p. 420-425, 2008. TAMURA, K.; PETERSON, D.; PETERSON, N.; STECHER, G.; NEI, M.; KUMAR, S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, v. 28, p. 2731–2739, 2011. URBINATI, E. C.; GONÇALVES, F. D.; TAKAHASHI, L. S.: Pacu (Piaractus mesopotamicus). In: BALDISSEROTTO, B.; GOMES, L. C.: Espécies nativas para piscicultura no Brasil. UFSM, Santa Maria, p. 205-244, 2010.

7. CONCLUSÕES GERAIS

Os resultados obtidos durante os estudos realizados para o desenvolvimento desta tese permitiram concluir que, em sistemas de criação, os oligoquetas Pristina americana e Slavina evelinae estão envolvidos como hospedeiros definitivos, no ciclo biológico de mixosporídeos. Em P. americana ocorrem o desenvolvimento de quatro diferentes tipos de actinosporos (Aurantiactinomyxon tipos 1, 2 e 3 e Helioactinomyxon tipo 1) e em S. evelinae ocorreu o desenvolvimento de Seisactinomyxon tipo 1 nov., um actinosporo cujo grupo coletivo ainda não estava registrado na literatura. Através da análise ultraestrutural foi possível concluir que o desenvolvimento dos pansporocistos de

Aurantiactinomyxon tipo 2 ocorreu na parede do intestino de P. americana. A análise filogenética mostrou que Aurantiactinomyxon tipo 1 e 2 e Seisactinomyxon tipo 1 nov. agruparam em um clado composto por espécies de Myxobolus parasitos de

Characiformes e Thelohanellus sp. parasito de Siluriformes. A análise filogenética de

Myxobolus cf. cuneus e Henneguya pseudoplatystoma mostrou que estas espécies agruparam de acordo com a afinidade de hospedeiro e de sítios de infecção.

8. ANEXOS

8.1. Certificado da Comissão de Ética no uso de Animais (CEP FZEA/USP)

8.2. Declaração de que a tese não infringe os dispositivos da lei nº 9610/98