Sistemática E Modelagem De Distribuição Potencial De Espécies De Spondias L

Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biologia Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva

Sistemática e modelagem de distribuição potencial de espécies de Spondias L. (Anacardiaceae) no Brasil

Bárbara Mendes Ferreira Noleto

Orientadora: Cassia Mônica Sakuragui

2019.1

Sistemática e modelagem de distribuição potencial de espécies de Spondias L (Anacardiaceae) no Brasil

Bárbara Mendes Ferreira Noleto

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutora.

Orientadora: Cassia Mônica Sakuragui

Rio de Janeiro 2019.1

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Sistemática e modelagem de distribuição potencial de espécies de Spondias L. (Anacardiaceae) no Brasil.

Bárbara Mendes Fereira Noleto

Orientadora: Cassia Mônica Sakuragui

Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título Doutora. Aprovada por:

______Prof. Dr. Marcelo Trovó (UFRJ)

______Prof. Dr. Davyson Lima (FIOCRUZ)

______Prof. Dr. Marco Rocha (FIOCRUZ)

______Prof. Dr. José Ricardo Mermudes (UFRJ)

______Profa. Dra. Adriana Lobão (UFF)

______Profa. Dra. Rosana Conrado Lopes (UFRJ) – Suplente

______Prof. Dr. Paulo Paiva (UFRJ) – Suplente

Rio de Janeiro 2019.1

NOLETO, Bárbara Mendes Ferreira

Quimiotaxonomia, filogenia, delimitação de espécies e modelagem de nicho ecológico no gênero Spondias L./ Bárbara Mendes Ferreira Noleto. Rio de Janeiro: UFRJ, Instituto de Biologia, 2019. xi, 117f., il. Orientadora: Cassia Mônica Sakuragui. Tese (Doutorado) – UFRJ – Instituto de Biologia – Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva, 2019. Referências Bibliográficas: f. 109f. 1. Sistemática 2. Delimitação de espécies. 3. Modelagem distribuição geográfica potencial. 4. Spondias. 5. Anacardiaceae. I. Sakuragui, C.M. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biologia Evolutiva. III. Título.

"Você nunca sabe a força que tem, até que a sua única alternativa é ser forte.” Johnny Depp.

“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” José de Alencar.

Dedico os esforços deste trabalho ao meu melhor amigo e parceiro de vida, Daniel Vitor Ferreira Noleto, o mais belo presente que a vida e a biologia me conferiram. Obrigada pelo apoio e incentivo incansáveis e por ser este ser humano excepcional.

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Agradecimentos

Foram quatro anos e alguns meses de muita resiliência, esforços, dedicação e determinação para chegar até aqui, enfrentando com coragem moral todos os desafios e imprevistos impostos, nem sempre fáceis, mas que foram vencidos com a imprescindível ajuda e o incansável apoio de amigos, familiares e profissionais da saúde. Gostaria de agradecer, inicialmente, à minha orientadora Dra Cássia Sakuragui pelo convite para ingressar nesta jornada, pela confiança depositada, pela paciência, pela compreensão e por todo o incentivo a este doutorado. À Dra Maria Auxiliadora Coelho Kaplan (MÁ), por ter me acolhido e orientado em minha iniciação científica e durante todo o meu mestrado com tanta generosidade, apoio e incentivo, sendo exemplo de competência, dedicação, força, garra e determinação, contribuindo com inúmeros ensinamentos ao longo da minha trajetória acadêmica, ensinamentos dos quais levo comigo para além da academia; minha profunda gratidão e reconhecimento. À Letícia Loss por toda a atenção, ajuda e ensinamentos, os quais foram cruciais para a realização de parte desta tese. Aos que contribuíram nas inúmeras coletas pelo Brasil, sendo fundamentais para a realização deste trabalho: Daniel Vitor, Michel, Amanda e Nerivaldo. Aos meus amigos queridos, Juliana, Amanda, Michel, Janaína, Ana Clarissa e Cíntia que, mesmo com o distanciamento natural da vida, estiveram presentes, sempre que possível, para partilhar das alegrias, angústias e desafios desta jornada. À minha família que sempre esteve ao meu lado com seu apoio, incentivo e carinho. Em especial a minha mãe Fátima Cristina, exemplo de força, determinação e competência que me ensinou o valor do estudo e nunca duvidou da minha capacidade de enfrentamento das adversidades. Aos meus irmãos João Paulo e Paloma que compartilharam das angústias e dos percalços desta jornada, emanando amor fraternal. Em especial ao meu marido Daniel Vitor pela amizade, pelo companheirismo, pelo apoio financeiro oportuno, pelo incentivo e carinho inabaláveis e por ter me escolhido como parceira de vida, o meu eterno obrigada. Aos órgãos de fomento CAPES, pela bolsa concedida, e CNPq, pelo auxílio à pesquisa.

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Sistemática e modelagem de distribuição geográfica potencial de espécies de Spondias L (Anacardiaceae) no Brasil

Bárbara Mendes Ferreira Noleto

Orientadora: Cassia Mônica Sakuragui

Resumo:

Neste estudo, analisamos a filogenia, a delimitação micromolecular entre espécies, padrões quimiotaxonômicos e padrões de distribuição geográfica no gênero Spondias L. (Anacardiaceae). Os objetivos principais foram identificar as entidades taxonômicas das Spondias brasileiras que ocorrem na Mata Atlântica, determinar as relações filogenéticas entre elas e reconhecer os limites entre as espécies, avaliar padrões quimiotaxonômicos e contribuir para a ampliação do conhecimento sobre a distribuição geográfica e ecologia deste gênero através da modelagem de nicho ecológico das espécies que ocorrem no Brasil. Os resultados das análises de filogenia, juntamente com a análise de delimitação de espécies reconheceram quatro unidades taxonômicas para o domínio Mata Atlântica em detrimento das cinco unidades taxonômicas propostas por estudos baseados em dados morfológicos, além de reconhecer a espécie Spondias expeditionaria J. D. Mitch. & Daly como uma entidade de Spondias macrocarpa Engl. A análise dos metabólitos especiais identificados para o gênero indicou que os flavonóides e os taninos condensados de cadeia longa são importantes marcadores taxonômico para o grupo em virtude da abundância e variabilidade estrutural apresentada. A análise de modelagem ecológica indicou um predomínio de distribuição pelo domínio da Mata Atlântica, ampliou a área de ocorrência conhecida em literatura da maioria das espécies e indicou áreas potenciais de ocorrência, as quais poderão auxiliar em trabalhos de levantamentos florísticos, na eleição de áreas com condições ideais para o cultivo, uma vez que trata-se de espécies de potencial alimentício e medicinal, além de auxiliar no estabelecimento de áreas prioritárias para a conservação das espécies analisadas.

Systematics and modeling of potential geographic distribution of Spondias L (Anacardiaceae) species in Brazil

Bárbara Mendes Ferreira Noleto

Advisor: Cassia Mônica Sakuragui

Abstract: In this study, we analyzed the phylogeny, the micromolecular delimitation between species, chemotaxonomic patterns and patterns of geographic distribution in the genus Spondias L. (Anacardiaceae). The main objectives were to identify the taxonomic entities of the Brazilian Spondias that occur in the Atlantic Forest, to determine the phylogenetic relationships between them and to recognize the boundaries between species, to evaluate chemotaxonomic patterns and to contribute to the expansion of knowledge about the geographic distribution and ecology of this genus through of the ecological niche modeling of the species that occur in Brazil. The results of the phylogenetic analysis with the species delimitation analysis, recognized four taxa for the Atlantic Forest domain, in detriment of the five taxonomic units proposed by studies based on morphological data, besides recognizing the species Spondias expeditionaria J. D. Mitch. & Daly as an entity of Spondias macrocarpa Engl. The analysis of the special metabolites identified for the genus indicated that flavonoids and condensed long chain tannins are important taxonomic markers for the group due to their abundance and structural variability presented. The ecological modeling analysis indicated a predominance of distribution for the Atlantic Forest domain, expanded the known area of occurrence of most species and indicated potential areas of occurrence, which may assist in floristic surveys, in the selection of areas with ideal conditions for the cultivation, since they are species of food and medicinal potential and to contribute to the establishment of priority areas for the conservation of the species.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 16

2. OBJETIVOS ...... 19

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 25

4. CAPÍTULO 1 – Parte I

ABSTRACT ...... 28

RESUMO ...... 28

INTRODUÇÃO ...... 29

MATERIAL E MÉTODOS ...... 30

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 34

CONCLUSÃO ...... 36

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 52

5. CAPÍTULO 1 – Parte II

ABSTRACT ...... 57

RESUMO ...... 57

INTRODUÇÃO ...... 58

MATERIAL E MÉTODOS ...... 58

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 58

CONCLUSÃO ...... 60

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 64

6. CAPÍTULO 2

ABSTRACT ...... 66

RESUMO ...... 66

INTRODUÇÃO ...... 67

MATERIAL E MÉTODOS ...... 68

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 71 xi

CONCLUSÃO ...... 74

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 79

7. CAPÍTULO 3

ABSTRACT ...... 86

RESUMO ...... 86

INTRODUÇÃO ...... 87

MATERIAL E MÉTODOS ...... 89

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 93

CONCLUSÃO ...... 96

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 102

8. CAPÍTULO 4

ABSTRACT ...... 108

RESUMO ...... 108

INTRODUÇÃO ...... 109

MATERIAL E MÉTODOS ...... 110

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 110

CONCLUSÃO ...... 112

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 115

9. CONCLUSÕES GERAIS FINAIS ...... 116

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ÍNDICE DE TABELAS

INTRODUÇÃO GERAL

Tabela 1. Nomes aceitos, nomes vulgares e características morfológicas diagnósticas das espécies de Spondias tratadas neste trabalho ...... 20

Tabela 2. Nomes aceitos e ocorrência de acordo com Mitchel & Daly (2015) e BFG 2015 (S. bahiensis) e as abordagens para cada espécies neste trabalho...... 21

CAPÍTULO 1 – Parte I

Tabela 1. Acessoss, nomes das espécies, locais de coleta, voucher, e número de acesso no GenBanck das amostras utilizadas neste estudo...... 37

Tabela 2: Resultados do modelo misto Yule-Coelescente (GMYC) and o bayesian Poisson Tree Processes (bPTP). Análises com intervalo de Confiança (IC) em parêntesis...... 49

Tabela 03: Número de entidades para cada grupo taxonômico estimado nas analises do GMYC e bPTP, baseadas em diferentes modelos evolutivos...... 49

CAPÍTULO 1 – Parte II

Tabela 1. Lista de reagentes e protocolos de PCR para amplificar as regiões cloroplastídicas trnL-F e psbA-trnH...... 59

Tabela 2. Lista dos Iniciadores (sentido 5’−3’)...... 59

Tabela 3: Qualidade e quantitade de DNA obtido de espécies de Spondias...... 60

Tabela 4: Avaliação das regiões genômicas para identificação molecular de espécies de Spondias...... 60

CAPÍTULO 2 Tabela 1: Perfil químico de espécies de Spondias baseados no quantitativo de metbólitos identificados por classe química, descritos em literatura...... 75

CAPÍTULO 3

Tabela 1. Valores dos parâmetros ambientais WorldClim registrados para o conjunto de pontos de ocorrência para 5 espécies de Spondias...... 98

Tabela 2. Registro de Spondias no Brasil, encontrados nos bancos de dados (SpeciesLink e Biogeo) e utilizados para a elaboração dos modelos de distribuição das espécies no país...... 98

Tabela 3. Nomes e sinônimos das espécies brasileiras de Spondias L. (Anacardiaceae)...... 99

Tabela 4. Indicadores de qualidade dos modelos aplicados a cinco espécies de Spondias de ocorrência no Brasil...... 99 xiii

Tabela 5. Distribuição geográfica das espécies de Spondias do Brasil...... 100

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ÍNDICE DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1: Ilustrações da morfologia de folíolos de espécies de Spondias. Fonte: Mitchell & Daly (2015)...... 22

Figura 2: Ilustrações da morfologia de flores de espécies de Spondias. Fonte: Mitchell & Daly (2015)...... 23

Figura 3: Ilustrações da morfologia de frutos de espécies de Spondias. Fonte: Mitchell & Daly (2015)...... 24

Figura 4: Fotos de espécies de Spondias...... 25

CAPÍTULO 1 – Parte I

Figura 1: Mapa indicando a localização das amostras utilizada neste estudo. …...... … 36

Figura 2: Filograma inferido da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Yule...... 43

Figura 3: Filograma inferido da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Coalescência...... 44

Figura 4: Filograma inferido da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo Coelescente de Multi-espécies...... ; 45

Figura 5: Árvore ultramétrica obtida da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Yule...... 46

Figura 6: Árvore ultramétrica obtida análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Coalescência...... 47

Figura 7: Árvore ultramétrica obtida análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Coalescência de Multi-espécies.... 48

CAPÍTULO 1 – Parte II

Figura 1: Eletroforese (gel de agarose a 1%) do material genômico extraído de espécies de Spondias (números 2 a 13). Número 1 corresponde a Ladder (1Kb)...... 60

Figura 2: Produtos de amplificação da região genômica trnH-psbA de espécies de Spondias (números 2 a 15 e 17 a 28)...... 60

Figura 3: Produtos de amplificação da região genômica trnL-trnF de espécies de Spondias (números 2 a 12). Número 1 corresponde a ladder (1 Kb.)...... 61

CAPÍTULO 2

Figura 1. Percentagens dos números de ocorrência (NO%) de metabólitos especiais encontrados em Spondias...... 76

Figura 2.: Gráfico dos Loadings correspondentes aos 07 parâmetros estudados...... 76

Figura 3: Estrutura química de compostos fenólicos isolados de Spondias...... 77

Figura 4: Estrutura química de esteróides e terpenóides isolados de Spondias...... 78

CAPÍTULO 3

Figura 1. Distribuição potencial das espécies de Spondias com 20 ou mais pixels. .... 101

Figura 2. Distribuição potencial de espécie de Spondias com 5 a 9 pixels...... 101

CAPÍTULO 4

Figura 1: Fotos da morfologia de Spondias venulosa. (Engl.) Engl...... 113

Figura. 2. Mapa dos estados brasileiros e a distribuição geográfica atualizada de S. venulosa pelo Brasil segundo Forzza et al (2012) e CRIA (2018)...... 114

1. INTRODUÇÃO GERAL

A família Anacardiaceae R. Br. abarca mais de 850 espécies de árvores e arbustos, mais raramente de lianas e ervas perenes, distribuídas majoritariamente em áreas tropicais e subtropicais de todo o mundo (Pell et al. 2011). Dentro desta família, existem muitas espécies que são cultivadas por apresentarem frutos e sementes comestíveis como a manga (Mangifera indica L.), o caju (Anacardium occidentale L.), o pistache (Pistacia vera L.) e a pimenta-rosa (Schinus terebinthifolius Raddi) (Pell et al. 2011). Por exemplo, a manga está entre as cinco culturas de frutas mais importantes do mundo (Janick 2005). Muitas outras Anacardiaceae são comestíveis e utilizadas como fontes de alimentos em escala regional (Pell et al. 2011). Outras espécies também são exploradas por seu valor madeireiro, horticultural e farmacológico (Pell et al. 2011). Nesta família, o gênero Spondias L. também se destaca por sua importância alimentícia e farmacológica. Espécies como cajá (S. mombin), umbu (S. tuberosa) e cajá-umbu (S. mombin x S. tuberosa) que possuem seus frutos comercializados in natura ou processados na forma de polpas, sucos e outros produtos alimentícios. Devido à utilização comercial destes frutos, inúmeras pesquisas vêm sendo realizadas abordando as suas características de cultivo, assim como as características físico-químicas, tais como a maturação e a estabilidade, além da identificação dos seus constituintes químicos (Almeida, Albuquerque e Castro 2011; Assis, et al. 2006; Bora, et al. 1991; Borges et al., 2007; Jorge et al., 2007; Lima et al., 2002; Lira Júnior et al., 2005; Martins et al., 2003; Santos et al. 2010). Ademais, há também registros em literatura especializada quanto à exploração do potencial farmacológico de algumas espécies através do uso popular deste gênero na medicina tradicional de diversas regiões do Brasil, sendo utilizados como abortivos, tônicos e no tratamento contra doenças infecciosas.(Agra, et al. 2007; Almeida, et al. 2010; Caraballo, Caraballo & Rodríguez- Acosta, 2004; Fenner et al., 2006; Hajdu e Hohmann, 2012; Lucena et al. 2012; Offiah & Anyanwu, 1989). Na atual circunscrição (Mitchell & Daly 2015; Machado et al. 2015), Spondias compreende 19 espécies, todas com frutos comestíveis, e, por isso, algumas destas espécies são amplamente cultivadas. As espécies que ocorrem no Brasil perfazem um total de nove indivíduos, sendo sete nativas e duas cultivadas (Michell & Daly 2015; Machado et al. 2015). As espécies de Spondias ocorrentes no bioma Mata Atlântica particularmente exibem ramos vegetativos muitos similares. Ao longo deste trabalho, procuramos reconhecê-las em campo, utilizando algumas características particulares, mas que só foram efetivas na identificação em campo, quando aliadas principalmente aos caracteres dos frutos. A fim de tornar mais claras

as diferenças entre elas, sumarizamos estas características na tabela 1. Nesta tabela acrescentamos ainda duas espécies cultivadas, S. purpurea L. e S. pinnata (Koenig ex L.f.) Kurz, por terem ocorrência no Brasil e serem abordadas em alguns dos capítulos deste trabalho. Além disso, para ilustrar as características morfológicas destas espécies são apresentadas pranchas e figuras que ilustram alguns dos seus principais representantes (Fgs. 1 a 4) Nesse contexto, constata-se que muitos indivíduos de Spondias partilham similaridades morfológicas entre si, gerando dificuldades na identificação e classificação e delimitação dos limites entre as espécies deste grupo. Embora pouco estudado do ponto de vista filogenético, existem alguns trabalhos descritos em literatura abordando a filogenia e biogeografia com enfoque em espécies pertencentes a mata seca da Floresta Atlântica (Machado et al, 2015, Silva et al, 2015, Pereira et al, 2015 e Santos et al, 2008). Vale frisar que a delimitação dos limites entre espécies segue como um problema central e controverso em estudos evolutivos e embora a maioria dos conceitos de espécies compartilhem a ideia central de De Queiroz (2007), o critério para reconhecimento de unidades evolutivas, as vezes podem ser mutualmente exclusivos, dificultando as tomadas de decisão. Contudo, atualmente, modelos bayesianos filogenéticos e de coalescência estão sendo utilizados com sucesso para estimar limites de espécies e relações filogenéticas em grupos de difícil identificação morfológica (Goldstein & DeSalle, 2011, Zhang et al., 2013 Pons et al., 2006), como é o caso do gênero Spondias. O referido gênero corresponde ao de distribuição geográfica mais ampla dentro da subfamília Spondioideae, com espécies ocorrendo nas ecorregiões Neotropical, Afrotropical, Indo-Malaia, Australásia e Oceania. Como a distribuição geográfica de espécies resulta da atuação de fatores históricos (vicariância, dispersão) (Morrone & Crisci 1995) e ecológicos (distribuição de habitats, interações biológicas) (Soberón & Peterson 2005), o entendimento dos padrões de distribuição geográfica depende de ambos fatores. A distribuição geográfica das espécies é uma questão de grande importância para o entndimento da história evolutiva, bem como a ecologia das mesmas, porque reflete o efeito de processos históricos e ecológicos (Brown et al. 1996). Os padrões globais de diversidade são produto, em grande escala, de processos históricos dentro e entre os clados e, em escala menor, das relações ecológicas (Wiens & Donoghue 2004). As variáveis ecológicas que influenciam uma espécie descrevem o nicho dessa espécie e as relações históricas entre os grupos podem ser refletidas em suas relações filogenéticas (Soberón & Peterson 2005).

Dessa forma, as espécies de Spondias se apresentam como um excelente modelo de estudo, por apresentarem ampla distribuição geográfica, serem espécies de grande importância econômica e alimentícia e por abarcar espécies que estão inseridas num bioma ameaçado como a Mata Atlântica.

Tabela 01: Nomes aceitos, nomes vulgares e características morfológicas diagnósticas das espécies de Spondias (Mitchell & Daly, 2015) tratadas neste trabalho. Táxon Nomes vulgares Características morfológicas diagnósticas S. admirabilis J. D. Mitch. cajá-açú, cajá-do- Árvore, folíolos com base simétrica, margem & Daly mato, cajá-redondo, esparsamente serreada, nervação secundária irregular. cajazeiro-redondo Fruto globoso longo depresso; 1.8–2.8 (3.2) × 1.8–2.2 cm. S. bahiensis Carvalho, Van Umbu-cajá da Bahia Arvoreta, base dos pecíolos com pulvino, nervação den Berg & Machado secundária levemente curvada. Fruto piforme ou obovóide, (4)4.8–5.5 × 2.5–3.2 cm, presença de protuberâncias cônica próxima parte distal. S. dulcis Parkinson cajá, cajaíba, Árvore, folíolos com base sub simétrica, margem cajazeira, cajaseiro, inteira, nervuras secundárias perpendiculares à cajazeira-miúda, principal. Fruto elipsoide, obovoide ou oblongo; 4–10 cajazeira-mirim × 3–8 cm. S. expeditionaria J. D. cajá-mirim Árvore, tronco com a casca fissurada; folíolos com Mitch. & Daly base simétrica, margem serreada, nervação secundária irregular. Fruto globoso depresso; 3–3.3 × 3–3.8 cm. S. globosa J. D. Mitch. & cajá, taperebá Árvore, inserção decorrente dos folíolos no pecíolo; Daly nervuras secundárias retas ou curvas. Fruto 1.6–3 × 2.2–3 cm. S. macrocarpa Engl. cajá-mirim, acajá Árvore, folíolos sub simétricos, nervação intersecundária presente. Fruto oblongo a levemente obovoide; 3.5–4.2 × 2.3–2.5 cm. S. mombin L. taperebá, cajá Árvore, inserção do folíolo no pecíolo excurrente, nervuras secundárias sempre retas. Fruto oblongo, menos frequentemente elipsóide, 2–4 × 1.8–2.7 cm. S. pinnata (Koenig ex L.f.) ameixa-de-porco Árvore decídua, folíolos verde-escuros, nervuras Kurz secundárias pronunciadas. Fruto ovóide, 3.8-5 cm compr. S. purpurea L. ciriguela Árvore, folíolos com ápice acuminado, acúmem 0,5 mm. Fruto oblongo a ovóide 2.5–5 × 0.5–3 cm. S. testudinis J. D. Mitch. & cajá-de-jaboti, Árvore, folíolos assimétricos, nervuras Daly cajarana, cajarana- intersecundárias presentes. Fruto oblongo com ápice da-mata truncado, 4.9–6.3 × 2.3–2.7 cm. S. tuberosa Arruda imbu, imbuzeiro, Arvoreta, folíolos largamente elípticos, nervação fina ambu, ambuzeiro, ausente. Fruto subglobosos, 2.6–3.3 × 1.5–2.2 cm. ombu S. venulosa (Mart. ex Engl.) cajá, cajazeira, cajá- Árvore, folíolos subsimétricos ou simétricos, base do Engl. graúdo, cajá-de- folíolo sempre revoluta, com tricomas, venação pescoço, cajá-brava, secundária irregular. Fruto oblongo, 3.6–6 × 1.9–3.6 cajá-pau cm.

Tabela 02: Nomes aceitos e ocorrência de acordo com Mitchel & Daly (2015) e BFG 2015 (S. bahiensis) e as abordagens para cada espécies neste trabalho. Táxon Distribuição Neste estudo S. acida Blume Malásia Nenhuma abordagem S. acuminata Roxb. India, Miamar e Tailândia Nenhuma abordagem S. admirabilis J. D. Mitch. Floresta Atlântica, Rio de Capítulos 1 e 3 (abordagens molecular e & Daly Janeiro, Brasil distribuição geográfica real e potencial) S. bahiensis Carvalho, Van Sudeste do Brasil, Capítulo 3 (distribuição geográfica real e den Berg & Machado Caatinga potencial) S. dulcis Parkinson Pacífico; amplamente Capítulo 3 (distribuição geográfica real e cultivada nos trópicos potencial) S. expeditionaria J. D. Floresta Atlântica, do Capítulos 1 e 3 (abordagens molecular e Mitch. & Daly Espírito Santo e Minas distribuição geográfica real e potencial) Gerais, Brasil S. globosa J. D. Mitch. & Oeste da Amazônia; Capítulo 3 (distribuição geográfica real e Daly Brasil e Venezuela potencial) S. macrocarpa Engl. Sudeste do Brasil Capítulos 1 e 3 (abordagens molecular e distribuição geográfica real e potencial) S. malayana Kosterm. Malásia nenhuma S. mombin L. Mexico, Bolivia e sudeste Capítulos 1, 2, 3 (abordagens molecular, do Brasil; cultivada nos quimiotaxonômica e distribuição geográfica real trópicos e potencial) S. novoguineensis Kosterm. Sudeste da Malásia Nenhuma abordagem S. pinnata (Koenig ex L.f.) Indochina e Sul da China Capítulo 2 (abordagem quimiotaxonômica) Kurz S. purpurea L. Mexico ao Panamá; Capítulos 2 e 3 (abordagens quimiotaxonômica cultivada nos trópicos e distribuição geográfica real e potencial) S. radlkoferi Donn.-Sm. México à America Nenhuma abordagem Central ao noroeste da Venezuela e Colômbia S. tefyi J. D. Mitch., Daly, Madagascar Nenhuma abordagem & Randrian. S. testudinis J. D. Mitch. & Sudoeste da Amazonia Capítulo 3 (distribuição geográfica real e Daly potencial) S. tuberosa Arruda Nordeste do Brasil; Capítulos 2 e 3 (abordagens quimiotaxonômica cultivada no Brasil e distribuição geográfica real e potencial) S. venulosa (Mart. ex Engl.) Sudeste do Brasil Capítulos 1, 2, 3, e 4 (abordagens molecular, Engl. quimiotaxonômica e distribuição geográfica real e potencial) S. xerophila Kosterm. Sri Lanka Nenhuma abordagem

Figura 1: Ilustrações da morfologia de folíolos de espécies de Spondias. Fonte: Mitchell & Daly (2015).

Figura 2: Ilustrações de morfologia de flores de espécies de Spondias. Fonte (Mitchell & Dayle, 2015).

Figura 3: Ilustrações de morfologia de frutos de espécies de Spondias.Fonte (Mitchell & Dayle, 2015).

Figura 04: Fotos de espécies de Spondias: A: Frutos imaturos de S. dulcis (modificado Daly, D, C in press) , B: Ramo com folhas e frutos imaturos de S. purpurea (modificado Daly, D, C in press), C: Frutos imaturos de S. monbin, D: Folíolos e fruto imaturo de S. macrocarpa, E: Frutos maduros de S. venulosa, F: Ramo com folíolos e frutos imaturos de S. venulosa, G: Frutos imaturos de S. admirabilis, H: Folíolos de S. expeditionária, I: Ramos e inflorescências de S. venulosa.

2. OBJETIVOS

O presente trabalho buscou evidenciar caracteres micromoleculares potencialmente utilizáveis em estudos sistemáticos para Spondias, além de apresentar informações sobre a distribuição real e potencial de espécies nativas brasileiras e espécies introduzidas de ocorrência no Brasil. Durante a execução do projeto, optamos por apresentar diferentes abordagens para conjuntos particulares de espécies, aproveitando o universo de dados presentes em literatura especializada. Estas abordagens estão resumidas na tabela 2, que traz também uma sinopse de todos os nomes aceitos para o gênero e sua ocorrência no mundo. Assim, esta tese está dividida em quatro capítulos, a saber: Capítulo 1 – Filogenia e delimitação de espécies de Spondias da Mata Atlântica (Anacardiaceae), o qual apresenta o que chamamos parte 2, que se constitui em um manuscrito com informações sobre o aperfeiçoamento dos protocolos de extração e amplificações de marcadores para amostras do gênero. Capítulo 2 - Quimiotaxonomia no gênero Spondias L. (Anacardiaceae), o qual se baseou em estudos químicos prévios para o gênero. Capítulo 3 – Modelagem de distribuição real e potencial das espécies de Spondias L. no Brasil que utilizou registros para todas as espécies de ocorrência no Brasil, abordando todas as espécies nativas e duas cultivadas. Capítulo 4 – Nova ocorrência de Spondias venulosa Engl. (Engl.) para o estado do Tocantins- TO, Brasil, o qual trata-se de artigo publicado no Scientific Multidisciplinary Journal informando a expansão de distribuição geográfica desta espécie da Mata Atlântica para o domínio do Cerrado.

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4. CAPÍTULO 1. Parte I: Filogenia e delimitação de espécies de Spondias da Mata Atlântica (Anacardiaceae)

Manuscrito que será submetido ao periódico BioOne Journal

Abstract

Spondias L. genus belongs to Anacardiaceae, a family of over 850 species of trees and shrubs distributed in tropical and subtropical zones worldwide. It presents 19 species that occur in the Neotropic, Afrotropic, Indo-Malaya, Australasia and Oceania ecozones. The economic importance of several species is focused on the fruits which are extremely appreciated and commercialized in natura or in the form of pulp fruit and sweets. The popular identification (“Cajá” or “Cajá-mirim”) as well as morphological similarities among the species have led to considerable taxonomic confusions in the genus. The use of DNA analyses can be a useful tool for this group, allowing species identification at the molecular level and in determining the phylogenetic relationships within the group. The aim of this study was to identify the Atlantic Forest lineages of Brazilian species of Spondias, to determine the phylogenetic relationships within the taxa and to recognize the limits among the species. To this end DNA from specimens of all five-species distributed in the Atlantic Forest was extracted and amplified by PCR using sequences from the trnH-psbA spacer gene, and ETS gene sequences followed by sequencing using the Sanger method; some additional sequences of the same markers were obtained from the GenBanK. Species delimitations were conducted using GMYC (Generalized Mixed Yule Coalescent) and Poisson-Tree-Processes (PTP) methods. The DNA-based circumscriptions were generally congruent with morphological species delimitations. Nonetheless, GMYC and bPTP exposed incongruences between morphological delineations and inferences from molecular phylogenetic reconstructions, leading to a propose of four Spondias lineages for the Atlantic Forest and the recognition of S. expeditionaria within S. macrocarpa taxa.

Keywords: Anacardiaceae, DNA-based taxonomy, species boundaries, cajá-mirim.

Resumo

O gênero Spondias L. pertence a Anacardiaceae, uma família de mais de 850 espécies de árvores e arbustos distribuídos em zonas tropicais e subtropicais em todo o mundo. Apresenta 18 espécies que ocorrem nas ecozonas Neotrópica, Afrotrópica, Indo-Malaia, Australásia e Oceania. A importância econômica de várias espécies está nos frutos que são extremamente apreciados e comercializados in natura ou na forma de frutas e doces de polpa. A identificação popular (“Cajá” ou “Cajá-mirim”), bem como as semelhanças morfológicas entre as espécies, levaram a consideráveis confusões taxonômicas no gênero. O uso de análises de DNA pode ser uma ferramenta útil para este grupo, permitindo a identificação de espécies no nível molecular e na determinação das relações filogenéticas dentro do grupo. O objetivo deste estudo foi identificar unidades taxonômicas das espécies brasileiras de Spondias da Mata Atlântica, determinar as relações filogenéticas dentro dos táxons e reconhecer os limites entre as espécies. Para este fim, o DNA de espécimes de todas as cinco espécies distribuídas na Mata Atlântica foi extraído e amplificado por PCR usando sequências do gene espaçador trnH-psbA, e seqüências do gene ETS seguido de sequenciamento usando o método de Sanger; algumas seqüências adicionais dos mesmos marcadores foram obtidas do GenBanK. As delimitações de espécies foram realizadas utilizando os métodos GMYC (Generalized Mixed Yule Coalescent) e Poisson-Tree- Processes (PTP). As circuncisões baseadas em DNA eram geralmente congruentes com as delimitações das espécies morfológicas. No entanto, GMYC e bPTP expuseram incongruências entre os delineamentos morfológicos e as inferências de reconstruções filogenéticas moleculares, levando à proposição de quatro unidades taxonômicas de Spondias para a Mata Atlântica e ao reconhecimento de S. expeditionaria como uma entidade de S. macrocarpa.

Palavras-chave: Anacardiaceae, taxonomia baseada em DNA, limites de espécies, cajá.

Introdução Tentar definir uma linhagem de espécie pode ser problemático quando as barreiras ao fluxo gênico não existem ou se tornaram obsoletas. Dentro das populações naturais, as linhagens são moldadas por forças evolutivas, tais como seleção e deriva, mas o fluxo gênico persistente entre linhagens divergentes pode impedir esse processo (Ellstrand et al., 1999). Este problema é mais evidente em clados com espécies morfologicamente semelhantes, ou seja, populações que exibem alta diversidade e baixa variação morfológica, e que são difíceis de distinguir além do escopo da análise molecular (Goldstein e DeSalle, 2011). No presente estudo, empregamos modelos coalescentes e filogenéticos em uma análise bayesiana para estimar as relações e os limites entre cinco espécies pertencentes ao gênero Spondias L e de ocorrência na Mata Atlântica. Este gênero pertence a família Anacardiaceae R. Br., uma família de mais de 850 espécies de árvores, arbustos e arbustos. mais raramente videiras ou ervas perenes distribuídas majoritariamente em zonas tropicais e subtropicais em todo o mundo (Pell et al. 2011). Anacardiaceae possui muitas espécies cultivadas por seus frutos ou sementes comestíveis, sendo algumas fontes alimentares importantes, como manga (Mangifera indica L.), caju (Anacardium occidentale L.), pistache (Pistacia vera L.) e pimenta rosa (Schinus terebinthifolius Raddi) (Pell et al. 2011). Muitas outras Anacardiaceae são comestíveis e utilizadas como fontes alimentares em escala regional (Pell et al. 2011), como é o caso de várias espécies de Spondias (S. dulcis Parkinson, S. mombin L. e S. tuberosa Arruda). Outras espécies também são exploradas por seus valores madeireiros, medicinais e hortícolas (Pell et al. 2011). A delimitação morfológica das espécies de Spondias é baseada principalmente em caracteres vegetativos, especialmente nas folhas e folíolos. Além disso, a maioria dos táxons apresenta semelhanças na sua morfologia, incluindo as dimensões das plantas, tamanho da folha, número e morfologia dos folíolos, além de similaridades na morfologia da inflorescência e dos frutos. Tais similaridades são mais freqüentes em espécies simpátricas, ou seja, S. expedicionaria J. D. Mitch & Daly, S. macrocarpa Engl., S. venulosa (Engl.) Engl., S. admiribilis J. D. Mitch & Daly e S. monbin L. (Mitchell & Daly 2015, Silva-Luz & Pirani 2015) que podem dificultar a identificação da espécie. Devido a este último fato e ao potencial uso econômico de diversas espécies como frutos utilizados in natura ou produtos processados, uma série de trabalhos utilizando ferramentas genéticas foi publicada recentemente. Ao consultar a literatura especializada, constata-se que para o grupo, estudos de variabilidade genética foram conduzidos para as espécies S. tuberosa Arruda, o umbu do

semi-árido brasileiro (Santos et al. 2008) e S. purpurea L. (Miller & Schall 2005), a siriguela, buscando informações genéticas entre diferentes populações. Ainda neste contexto, as relações filogenéticas e os estudos biogeográficos de Spondias foram conduzidos por Machado et al. (2015), bem como estudos sobre um grupo específico de espécies nordestinas. Pereira et al. (2015) utilizaram dados fitoquímicos de flavonóides de folhas de cinco espécies representativas de Spondias com uma abordagem filogenética. Recentemente, uma nova espécie domesticada foi descrita, Spondias bahiensis P. Carvalho, Van Den Berg e Machado (umbu-cajá), com base nos resultados das investigações moleculares, morfométricas, morfológicas e de divergência temporal realizadas por Machado et al. (2015). Embora um código de barras tenha sido proposto por Silva et al. (2015) para espécies de Spondias, a delimitação das unidades taxonômicas que ocorrem na Mata Atlântica ainda permanece problemática, considerando os resultados deste último trabalho e as novas espécies descritas recentemente (Mitchell & Daly 2015). Portanto, propomos um estudo filogenético utilizando ferramentas específicas para a delimitação de unidades taxonômicas para esclarecer as seguintes identidades: S. venulosa (Engl.) Engl., S. admiribilis JD Mitch & Daly, S. macrocarpa Engl., S. monbin L. e S. expeditionaria JD Mitch & Daly, todos da Mata Atlântica e comparar os resultados de diferentes modelos genealógicos na geração da hipótese de filogenias e espécies.

Material e Métodos

AMOSTRAS E ANÁLISES EM LABORATÓRIO

A fim de obter amostras de indivíduos com diferentes variabilidades morfológicas, nossa seleção de amostras foi realizada cobrindo a maioria dos estados brasileiros onde suas ocorrências foram registradas (Silva-Luz & Pirani 2015; BFG 2015; Mitchell e Daly 2015). Portanto, este estudo selecionou cinco espécies bem distribuídas na Mata Atlântica, no Brasil (indivíduos dos estados do Rio de Janeiro-RJ, São Paulo-SP, Espírito Santo-ES, Minas Gerais- MG e Bahia-Ba) (BFG 2015). Um total de 124 amostras de S. macrocarpa, S. venulosa e S. admirabilis foram selecionadas para este estudo. 50 foram coletados pelo autor Noleto, B. M. F. e os demais 74 foram obtidos de estudo anterior (Machado et al, 2015). Todas as amostras de S. expeditionaria

e S. monbim analisadas por este foram obtidas a partir de estudo anterior (Machado et al, 2015). Veja informação suplementar (Fig 1 e Tab.1). Amostras de S. admirabilis foram coletadas no estado do Rio de Janeiro-RJ, incluindo o tipo de localidade (Brasil, Rio de Janeiro, Ponta da Jararaca). As amostras de Spondias venulosa e S. macrocarpa foram coletadas nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Minas Gerais, incluindo a localidade do tipo S. macrocarpa no estado do Espírito Santo (município de Aracruz, Barra do Riacho). Os indivíduos de Spondias expeditionaria foram coletados nos estados de Minas Gerais e Espírito Santo e S. monbin foi coletada nos estados do Espírito Santo, São Paulo, Minas Gerais e Bahia (Machado et al, 2015). Para mais detalhes, consulte informações suplementares. (Tab. 1). Todos os espécimes, sua origem geográfica e o número correspondente de sequências das sequências obtidas no GenBank são listados em uma tabela suplementar (Tab. 1). A escolha do grupo externo e o enraizamento foram baseados em Fine et al. (2014). O material coletado foi corretamente identificado, com base em literatura especializada e consulta aos herbários, e armazenado em sacos de papel em local fresco e depois separado para análises moleculares. A extração de DNA foi baseada nos protocolos de Permingeat et al. 1998 e Healey et al. 2014, com modificações. Regiões de cpDNA (trnH-psbA) (Sang et al. 1997) e nrDNA (ETS) foram analisadas (Pell 2004; Weeks & Simpson 2004). As reacções foram realizadas num volume de 50 ml contendo 5 ml de tampão de reacção; MgCl2 1,5 mM; DNTP 0,2 mM; 1,25 U Taq DNA polymerase; 0,5 mM de cada iniciador e 200 ng de ADN. A amplificação foi realizada com temperatura de desnaturação inicial de 94Cº por 3 min, seguida de 40 ciclos a 94 Cº por 30 s, anelamento a 55Cº e 60 Cº por 30 se extensão final a 72 Cº por 10 min. As reações de PCR foram realizadas em um BioCycler Thermal Cycler e os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% para confirmar a amplificação. Os produtos de PCR foram sequenciados utilizando o Kit de Sequenciação de Ciclo BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems®) com eletroforese em 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA). Utilizou-se as sequências de Spondias de 2 marcadores: sequências do gene cloroplastídico espaçador trnH-psbA e seqüências do gene nuclear ETS (34 seqüências) e 94 seqüências adicionais para ambos os marcadores obtidos do GenBank;. As sequências foram editadas e reconciliadas usando o BIOEDIT e alinhadas usando o MAFFT 7. com configurações de opção padrão. O Mesquite v3.0 foi usado para verificar o quadro de codificação quanto a possíveis erros.

RECONSTRUÇÃO FILOGENÉTICA E ANÁLISE DE DELIMITAÇÃO DE EPECIES

Estimamos árvores ultramétricas no programa BEAST 2 (Bouckaert et al., 2014) empregando três modelos evolutivos diferentes para as árvores: Tamanho da População Constante (Kingman, 1982), modelo Pure Birth Yule (Yule, 1925), modelo coalescente BEAST de múltiplas espécies (Heled & Drummond, 2010). Para a análise de Coalescência de Multi-Espécies, definimos as delimitações de espécies com base no modelo coalescente de múltiplas espécies. Análises filogenéticas foram realizadas nos servidores do CIPRES Science Gateway (Miller et al., 2010). Os modelos de substituição foram selecionados usando o software Bayesian Information Notepad ++ (https://notepad-plus-plus.org/download/v7.4. Criterion (BIC), como estimado pelo PAUP 4.0a146 (Swoord, 2002) e escolhemos o GTR + I + G como modelo de evolução. A extensão da cadeia MCMC foi de 60.000.000 com amostragem de cada geração. Na árvore do Modelo Misto e na árvore do modelo Multi-Espécies Coalescentes, foram geradas 60.000 gerações; três cadeias MCMC independentes para cada análise. As árvores os enraizamentos desses trechos independentes foram combinados em um único arquivo usando o LogCombiner (Bouckaert et al., 2014) com burn-in de 10%. A árvore máxima de credibilidade de clado de cada uma das 3 análises (Yule, Coalescent e Multi Species Coalescent) foi calculada usando o Tree Anotator 2 (Bouckaert et al., 2014). A credibilidade máxima do clado foi importada para o TreeGraph 2 (Stöver e Müller, 2010) para gerar um arquivo de formato newick que foi importado para o R. (R Development Core Team, 2015). O Tracer v1.6 (Drummond e Rambaut, 2007) foi usado para analisar os arquivos de log e os valores dos parâmetros do ESS gerados pelo BEAST. Todos os valores de ESS foram maiores que 200. Análises de GMYC foram executadas com o pacote SPLITS (Ezard et al., 2009) em R. O limiar de especiação-coalescente foi estimado para vários intervalos de tempo de espera em cada árvore filogenética, e o intervalo de tempo de espera que tem a máxima verossimilhança foi escolhido como sendo o ponto de transição entre os processos de especiação e coalescente (Pons et al., 2006). Finalmente, contrastamos nossos limites de espécies como estimados por GMYC com aqueles de bPTP (Zhang et al., 2013), um método que não requer árvores ultramétricas. Usamos MrBayes (Ronquist et al., 2012) para reconstruir uma árvore de relógio relaxado como entrada para o bPTP. A árvore MrBayes foi reconstruída com comprimento de cadeia MCMC de 8.000.000 e amostragem em cada

8.000 gerações de corridas de 4 cadeias cada; Análises de bPTP foram realizadas no servidor bPTP (http://species.h-its.org/) com valores padrão.

Resultados e discussão

RECONSTRUÇÕES FILOGENÉTICAS

Análises Bayesianas empregando diferentes prévias de árvores (Yule, Coalescent e Multiespecies coalescent) e as árvores geradas a partir da análise dos dados concatenados entre partições nucleares e de cloroplastos mostram árvores de credibilidade máximas similares. Os clados S. admirabilis, S. macrocarpa, S. monbin e S. venulosa foram fortemente apoiados (> 0,80 pp) Quatro espécies foram molecularmente distinguíveis de outras espécies intimamente relacionadas, apesar dos indivíduos de S. expeditionaria que foram recuperados no clado S. macrocarpa (Figs. 2, 3 e 4). Todas as análises fornecem resultados semelhantes, tanto em termos de relações filogenéticas como de delimitação de espécies e indicaram quatro grandes clados com considerável probabilidade posterior (> 0,80 pp), S. admirabilis (clado I), S. monbin (clado II), S. macrocarpa (clado III) e S. venulosa (clado IV). Os clados I e II foram recuperados com alta probabilidade posterior (> 0,95 pp) na árvore Multi Espécies Coalescente, mas as árvores Yule e Coalescent apresentam baixas probabilidades posteriores. No entanto, os clados III e IV foram recuperados com alta probabilidade posterior (> 0,95 pp) nas árvores Yule e Coalescente enquanto na árvore Coalescente Multi Espécies apresentaram baixa probabilidade posterior (<0,95 pp) (Figs 2, 3 e 4). As árvores gênicas recuperadas pelo BEAST e usadas como entrada para GMYC, (Figs 5, 6 e 7) e a árvore de relógio relaxado reconstruída no Mr. Bayes e usada como entrada para o bPTP, recuperaram os mesmos quatro clades principais recuperados pelo BEAST análises (Fig. 8), também recuperaram os mesmos quatro clados com altas probabilidades posteriores. Veja informações suplementares. Em todas as análises, Spondias expeditionaria foram recuperadas no clado III (S. macrocarpa indicando que S. expeditionaria e S. macrocarpa pertencem ao mesmo táxon.

DELIMITAÇÃO DE EPECIES

O modelo GMYC foi preferido em relação a hipótese nula para todos os modelos de árvore (consulte a tabela 3 para resultados de probabilidade). Os tempos de divergência para

as árvores concatenadas dos modelos evolutivos Yule, Coalescent e de Multi espécies coalescente foram 0,25 MYA, 0,24 MYA e 0,22 MYA, respectivamente. A abordagem realizada pelo GMYC identificou número similar de clusters (linhagens ramificadas) e entidades (clusters mais linhagens não ramificadas) para os três modelos de árvores: Árvores coalescentes Yule, Coalescente e de Multi espécies delimitaram 4 clusters e 12 entidades (Tabelas 2 e 3). Análises de GMYC separaram em mais de uma entidade as seguintes espécies (Tab. 3): S. admirabilis (2), S. mombin (3), S. macrocarpa (5) e S. venulosa (3). O bPTP analisa a recuperação de um número mais elevado de entidades (13) do GMYC (Tab. 3) e produz resultados diferentes do GMYC em relação às seguintes delimitações de espécies: bPTP delimitou 3 entidades para S. macrocarpa e 2 entidades em GMYC e delimitou 5 entidades para S. mombin contra 4 em GMYC. A delimitação de espécies é uma abordagem difícil e tem sido considerada uma questão importante e contenciosa em estudos evolutivos (de Queiroz, 1998; Hausdorf, 2011; Wheeler e Meier, 2002; Wiley, 1981). Embora a maioria dos conceitos de espécies compartilhe a idéia central de Queiroz (2007) e define no conceito de linhagens de espécies- que tais espécies estão desenvolvendo, separadamente (meta) linhagens de população - os critérios para reconhecer as unidades básicas de evolução podem ser mutuamente exclusivos. O presente estudo corresponde à primeira abordagem de delimitação de espécies baseada em DNA para o gênero Spondias. As espécies de Spondias são encontradas em diferentes regiões do Brasil, algumas em áreas de florestais e outras em cultivos domésticos. Sua importância econômica é restrita aos frutos que são extremamente apreciados e comercializados (Silva et al, 2015). Os nomes vernaculares de várias espécies pode variar de acordo com a região devido a contribuição do conhecimento popular, por exemplo, S. macrocarpa, S. admirabilis e S. venulosa são constantemente identificados como “Cajá” ou “Cajá-mirim”, causando muitas confusões em classificações de espécies. Além disso, semelhanças morfológicas entre as espécies também causam consideráveis confusões taxonômicas no gênero, ou seja, semelhanças no tamanho da folha, número, morfologia de folíolos e morfologia da inflorescência e dimensões das plantas podem causar dúvidas na identificação das mesmas. (Mitchell & Daly, 2015). Spondias admirabilis e S. venulosa são frequentemente confundidas e muitas vezes identificadas como mesma entidade taxonômica, porque compartilham semelhanças entre suas folhas e folíolos, o que dificulta a identificação correta no campo e compromete os estudos taxsonômicos no grupo. (Mitchell & Daly, 2015). No entanto, nosso estudo reconhece S.

admirabilis como uma diferente de S. venulosa, portanto, corrobora com os estudos de Michell e Daly (2015) e traz novas informações moleculares que contribuirão para estabelecer as diferenças e limites entre as espécies analisadas por este estudo. Nossas análises recuperaram 4 clados para as linhagens de Spondias da Mata Atlântica: (I) S. admirabilis, (II) S. monbin, (III) S. macrocarpa e (IV) S. venulosa. Todas as análises recuperaram altas probabilidades posteriores para esses clados. Silva et al (2015) e Pereira et al (2015) também recuperaram os clados I e IV. Os clados II e III foram recuperados por Machado et al (2015). As análises filogenéticas mostraram que os espécimes identificados como S. expeditionaria foram recuperados dentro do clado de S. macrocarpa, indicando que ambas as espécies representam a mesma entidade, fato suportado pelos métodos GMYC e bPTP, como indicado anteriormente. Outros estudos também reconstruíram filogenias de Spondias com base em marcadores moleculares (Miller e Schall 2005, Santos et al, 2008, Machado et al, 2015, Pereira et al, 2015 e Silva et al, 2015), mas até agora pouquíssimos clados interespecíficos com indivíduos de linhagens da Mata Atlântica foram recuperados com forte apoio (Miller & Schall 2005, Miller, 2008 e Pereira et al, 2015). Nossos resultados apresentam uma nova hipótese para as linhagens da Mata Atlântica deste gênero, com quatro clados fortemente apoiados em vez de cinco clados propostos por estudos anteriores baseados apenas em dados morfológicos (Mitchell e Daly, 2015, Silva-Luz & Pirani, 2015). Assim, o uso de marcadores moleculares de DNA e métodos de delimitação de espécies pode determinar padrões genéticos que contribuiriam para a resolução de questões taxonômicas relevantes nas linhagens de Spondias presentes na Mata Atlântica. As relações filogenéticas das espécies de Spondias reconstruídas sob diferentes modelos genealógicos resultaram em topologias semelhantes e apontam para incongruências na sistemática de algumas espécies de Spondias. No entanto, não foi objetivo do presente estudo reorganizar a taxonomia do grupo, visto que nenhum dos autores é especialista em Spondias e a decisão de sinonimizar os nomes depende além dos resultados moleculares, da análise dos tipos nomenclaturais e da compreensão do conceito geral da espécie, o que não realizamos neste trabalho.

Conclusão

A identificação das espécies de Spondias baseia-se principalmente em caracteres morfológicos, muitas vezes muito sutis e de difícil aplicação, ou dispostos em plasticidade induzida por condições ambientais. As delimitações de espécies filogenéticas, por outro

lado, também dependem de um certo grau de subjetividade. Métodos como GMYC e bPTP podem fornecer uma abordagem mais objetiva para o delineamento de espécies moleculares com base em inferências bayesianas, embora os limites inferidos sejam apenas putativos. De acordo com nossos resultados, as circuncisões baseadas em DNA foram geralmente congruentes com as delimitações das espécies morfológicas. No entanto, GMYC e bPTP expuseram incongruências entre delineamentos morfológicos e inferências de reconstruções filogenéticas moleculares, levando à proposição de quatro linhagens de Spondias para a Mata Atlântica, apesar de cinco linhagens propostas por estudos anteriores e do reconhecimento de S. expeditionaria como S. macrocarpa como discutimos acima. Essas incongruências podem decorrer de processos evolutivos, mas também demonstram a necessidade de um trabalho taxonômico integrativo, envolvendo mais marcadores genéticos e dados morfológicos e ecológicos para corroborar ou contradizer estes resultados de delimitação de espécies por análises bayesianas para o gênero Spondias.

Figura 1: Mapa indicando os locais onde foram coletadas as amostras de espécies de Spondias utilizadas neste estudo. Os locais de coleta estão indicados pelo símbolo (+).

Tabela 1. Acessos, nomes das espécies, locais de coleta, voucher, e número de acesso no GenBanck das amostras utilizadas neste estudo.

ETS trnH-psbA Coordenadas Data de Genbank Acessos Espécies País Estado Município Voucher Genbank Geográficas coleta Número de Número de acesso acesso 19°09'06"S, Sma_01 Spondias Brazil Espírito Santo Linhares M. C. Machado 1549 04/04/2013 KJ026868 KJ026801 macrocarpa 40°04'17"W Aracruz, Bairro do 19°09'06"S, Sma_02 Spondias Brazil Espírito Santo M. C. Machado 1550 04/04/2013 KJ026869 KJ026802 macrocarpa Riacho 40º07’23"W 22°18'28"S, Sma_03 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1578 17/05/2015 Esse estudo this study macrocarpa 41°04'17"W 22°21'18"S, Sma_04 Spondias Brazil São Paulo Araras M. C. Machado 1546 20/04/2013 KJ026870 KJ026803 macrocarpa 40°13'26"W

Sma_05 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 03°52'21"S, B.M., Vieira 1578 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo macrocarpa 41°25'20"W 03°53'00"S, Se_01 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro M. C. Machado & N. G. 1549 20/08/2004 KJ026872 KJ026805 expeditionaria 32°25'20"W 22°57'55"S, Se_02 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro M. C. Machado & N. G. 1549 20/08/2004 KJ026874 KJ026807 expeditionaria 41°19'22"W 22°57'55"S, Sa_01 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo admirabilis 41°25'20"W 03°51'00"S, Sa_02 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro A .M. Miranda 4462 20/08/2004 KJ026875 KJ026808 admirabilis 41°25'20"W Sa_03 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 03°50'12"S, B.M., Vieira 1580 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo admirabilis 41°25'20"W 12°15'13"S, E. Melo, M. C. Machado Sa_04 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 26/01/2013 KJ026877 KJ026810 admirabilis 41°25'19"W &1560 22°5'52"S, Sa_05 Spondias Brazil Rio de Janeiro Araruama M. C. Machado & N. G. 1549 18/09/2013 KJ026878 KJ026811 admirabilis 41°26'24"W Spondias 22°57'55"S, Sa_06 admirabilis Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 41°25'20"W M. C. Machado & N. G. 1549 18/09/2013 KJ026879 KJ026811 22°56'88"S, Sa_10 Spondias Brazil Rio de Janeiro Arraial do Cabo B.M., Vieira 1580 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo admirabilis 40°01'60"W 22°57'55"S, Sa_11 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo admirabilis 41°22'19"W 22°57'55"S, Sa_12 Spondias Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo admirabilis 32°27'24"W Rio de Janeiro. Ponta 22°57'55"S, Sa_13 Spondias Brazil Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo admirabilis da Jararaca 41°26'22"W 39

22°48'39"S, Sv_01 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Armação dos Búzios 41°58'41"W B.M., Vieira 1579 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo 22°57'55"S, Sv_02 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W B.M., Vieira 1579 17/05/2015 Esse estudo Esse estudo 22°57'55"S, Sv_03 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo 22°57'55"S, Sv_04 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, Sv_05 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo 22°57'55"S, Sv_06 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, Sv_07 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo 22°57'55"S, Sv_08 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, Sv_09 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo 22°57'55"S, Sv_10 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, Sv_11 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W A .M. Miranda 4462 20/08/2004 KJ026873 KJ026806 22°57'55"S, Sv_12 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, Sv_13 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W A .M. Miranda 4462 20/08/2004 KJ026876 KJ026809 22°57'55"S, Sv_14 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, M. C. Machado & N. G. Sv_15 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 19/09/2013 KJ026883 KJ026816 Spondias 32°25'20"W Antas 1566 22°57'55"S, Sv_16 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 43°13'30"W 22°57'55"S, D. Cardoso & M. C. Machado Sv_17 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 14/10/2012 KJ026884 KJ026817 Spondias 32°25'20"W 3259 22°57'55"S, D. Cardoso & M. C. Machado Sv_18 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 14/10/2012 KJ026887 KJ026822 Spondias venulosa 43°13'30"W 3259 22°57'55"S, Sv_19 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°25'20"W M. C. Machado 1571 11/11/2013 KJ026885 KJ026818 22°57'55"S, Sv_20 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 43°13'30"W M. C. Machado 1572 11/11/2013 KJ026886 KJ026819 21°54'51"S, Sv_21 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 38°58'09"W 16°44'38"S, Sv_22 venulosa Brazil Minas Gerais Montes Claros M. C. Machado, A. R.1332 02/01/2013 KJ026887 KJ026820 Spondias 43°52'10"W 22°58'54"S, Barbosa & M. R. Santos 1465 Sv_23 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 32°24'18"W 03/02/2012 KJ026863 KJ026754

22°54'55"S, Sv_24 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 32°25'20"W 22°56'51"S, Sv_25 Spondias venulosa Brazil Minas Gerais Minas Gerais 43°16'30"W M. C. Machado, A. R.1522 03/01/2013 KJ026888 KJ026821 40°13'05"W, Sv_26 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro Barbosa & M. R. Santos 1299 11/05/2004 KJ026840 KJ026771 Spondias venulosa 13°15'25"S, 40°13'05"W, M. C. Machado, C. van den Sv_27 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 12/08/2012 KJ026842 KJ026775 Spondias 13°17'25"S, Berg 1432 40°13'05"W, Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 Sv_28 Spondias venulosa Brazil Rio de Janeiro 13°12'23"S, 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo 40°13'05"W, Sv_29 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 13°11'24"S, 40°13'05"W, D. Cardoso & M. C. Machado Sv_30 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 12/10/2012 KJ026844 KJ026777 Spondias 13°11'26"S, 3250 40°13'05"W, D. Cardoso & M. C. Machado Sv_31 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 12/10/2012 KJ026849 KJ026782 Spondias venulosa 14°11'29"S, 3250 40°13'05"W, . Cardoso & M. C. Machado Sv_32 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 14/10/2012 KJ026845 KJ026778 Spondias 14°10'30"S, 3257 40°13'05"W, . Cardoso & M. C. Machado Sv_33 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 12/10/2012 KJ026850 KJ026783 Spondias venulosa 14°18'26"S, 3250 40°13'05"W, D. Cardoso & M. C. Machado Sv_34 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 14/10/2012 KJ026846 KJ026779 Spondias 13°11'25"S, 3257 40°13'05"W, D. Cardoso & M. C. Machado Sv_35 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 15/10/2012 KJ0268455 KJ026782 Spondias venulosa 14°16'24"S, 3258 40°13'05"W, M. C. Machado & D. Cardoso Sv_36 venulosa Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 15/10/2012 KJ026847 KJ026780 Spondias 14°11'25"S, 1289 40°13'05"W, M. C. Machado & D. Cardoso Sv_37 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 15/10/2012 KJ026850 KJ026783 Spondias venulosa 13°11'25"S, 1289 12°12'60"S, Sv_38 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'33"W 12°13'60"S, Sv_39 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°05'33"W 12°15'60"S, Sv_40 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'32"W 12°16'60"S, Sv_41 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'30"W 12°17'60"S, Sv_42 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'35"W 12°13'60"S, Sv_43 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'36"W 12°17'60"S, Sv_44 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'38"W 12°18'60"S, Sv_45 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'35"W 12°13'60"S, Sv_46 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'31"W

12°15'60"S, Sv_47 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'36"W 12°16'60"S, Sv_48 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'38"W 12°17'60"S, Sv_47 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro B.M., Vieira 1579 18/09/2015 Esse estudo Esse estudo Spondias venulosa 39°04'40"W 12°13'60"S, Smo_01 Spondias monbin Brazil Bahia Feira de Santana 39°04'35"W E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02687 KJ026783 12°14'60"S, Smo_02 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02689 KJ026784 Spondias monbin 39°04'33"W 12°13'62"S, Smo_03 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02690 KJ026785 Spondias monbin 39°04'31"W 12°13'65"S, Smo_04 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02691 KJ026786 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'610"S, Smo_05 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02693 KJ026787 Spondias monbin 39°04'32"W 12°13'60"S, Smo_06 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02694 KJ026788 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_07 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02695 KJ026789 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'62"S, Smo_08 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02696 KJ026790 Spondias monbin 39°04'32"W 12°13'61"S, Smo_09 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02697 KJ026791 Spondias monbin 39°04'32"W 22°57'55"S, M. C. Machado & N. G. Smo_10 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 18/09/2013 KJ026879 KJ026812 Spondias monbin 43°13'30"W Antas 1565 22°57'52"S, M. C. Machado & N. G. Smo_11 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 18/09/2013 KJ026880 KJ026813 Spondias monbin 43°13'30"W Antas 1565 22°57'52"S, M. C. Machado & N. G. Smo_12 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 18/09/2013 KJ026881 KJ026814 Spondias monbin 43°13'33"W Antas 1565 22°57'47"S, M. C. Machado & N. G. Smo_13 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 18/09/2013 KJ0268782 KJ026815 Spondias monbin 43°13'31"W Antas 1565 22°57'51"S, M. C. Machado & N. G. Smo_14 Brazil Rio de Janeiro Rio de Janeiro 18/09/2013 KJ026883 KJ026816 Spondias monbin 43°13'29"W Antas 1565 12°13'60"S, Smo_15 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02696 KJ026792 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_16 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02697 KJ026793 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_17 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02698 KJ026795 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_18 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02699 KJ026796 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_19 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02670 KJ026792 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_20 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02671 KJ026793 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_21 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02672 KJ026795 Spondias monbin 39°04'37"W

12°13'63"S, Smo_22 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02673 KJ026796 Spondias monbin 39°04'34"W 12°26'22"S, D. Cardoso&M.C, Machado Smo_23 Brazil Bahia Lajedinho 02/12/2013 KJ02674 KJ026792 Spondias monbin 40°50'04"W, 600m 3258 13°11'25"S, Smo_24 Brazil Bahia Planaltino E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02675 KJ026793 Spondias monbin 40°17'57"W, 784m Smo_25 Spondias monbin Brazil Bahia Feira de Santana 12°13'63"S, 39°04'34"W E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02676 KJ026795 12°13'63"S, Smo_26 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02677 KJ026796 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_27 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02678 KJ026792 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_28 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02679 KJ026793 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_29 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02690 KJ026795 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_30 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02691 KJ026796 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_31 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02692 KJ026792 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_32 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02697 KJ026793 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_33 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02693 KJ026795 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_34 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02695 KJ026796 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_35 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02699 KJ026792 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_36 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02684 KJ026793 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_37 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02687 KJ026795 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_38 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02690 KJ026797 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_39 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02681 KJ026790 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_40 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02686 KJ0267100 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_41 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02665 KJ0267101 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_42 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02666 KJ0267102 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_43 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02667 KJ0267103 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_44 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02668 KJ0267104 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_45 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ026969 KJ0267105 Spondias monbin 39°04'37"W

12°13'63"S, Smo_46 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02673 KJ0267106 Spondias monbin 39°04'34"W 13°11'25"S, Smo_47 Brazil Bahia Itapeting E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02682 KJ0267107 Spondias monbin 40°17'57"W, 784m 12°13'60"S, Smo_48 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02695 KJ02679108 Spondias monbin 39°04638"W 12°13'60"S, Smo_49 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ0268 KJ02679109 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_50 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ0262 KJ0267110 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_51 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02692 KJ0267111 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_52 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02663 KJ02679121 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_53 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02664 KJ0267127 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_54 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02673 KJ0267123 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_55 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02682 KJ0267126 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_56 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02695 KJ0267124 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_57 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ0268 KJ02679129 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_58 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ0262 KJ02679122 Spondias monbin 39°04'34"W 12°13'60"S, Smo_59 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02692 KJ02679128 Spondias monbin 39°04'37"W 12°13'63"S, Smo_60 Brazil Bahia Feira de Santana E. Melo 11938 02/12/2013 KJ02663 KJ02679120 Spondias monbin 39°04'34"W

Figura 2: Filograma inferido da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Yule. Números abaixo dos clados representam valores de probabilidades posteriores. Quatro clados majoritários estão representados: I. Spondias admirabilis; II. Spondias mombin; III. Spondias macrocarpa; IV. Spondias venulosa.

Figura 3: Filograma inferido da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Coalescência. Números abaixo dos clados representam valores de probabilidades posteriores. Quatro clados majoritários estão representados: I. Spondias admirabilis; II. Spondias mombin; III. Spondias macrocarpa; IV. Spondias venulosa.

Figura 4: Filograma inferido da análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo Coelescente de Multi- espécies. Números abaixo dos clados representam valores de probabilidades posteriores. Quatro clados majoritários estão representados: I. Spondias admirabilis; II. Spondias mombin; III. Spondias macrocarpa; IV. Spondias venulosa.

Figura 5: Árvore ultramétrica obtida na análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Yule. Números abaixo dos clados representam valores de probabilidades posteriores. Quatro clados majoritários estão representados: I. Spondias admirabilis; II. Spondias mombin; III. Spondias macrocarpa; IV. Spondias venulosa. Grupo externo foi excluído desta árvore.

Figura 6: Árvore ultramétrica obtida na análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Coalescência. Números abaixo dos clados representam valores de probabilidades posteriores. Quatro clados majoritários estão representados: I. Spondias admirabilis; II. Spondias mombin; III. Spondias macrocarpa; IV. Spondias venulosa. Grupo externo foi excluído desta árvore.

Figura 7: Árvore ultramétrica obtida na análise de dados concatenados (marcadores ETS e trnH-psbA), usando o modelo evolutivo de Coalescência de Multi-espécies. Números abaixo dos clados representam valores de probabilidades posteriores. Quatro clados majoritários estão representados: I. Spondias admirabilis; II. Spondias mombin; III. Spondias macrocarpa; IV. Spondias venulosa. Grupo externo foi excluído desta árvore.

Tabela 2: Resultados do modelo misto Yule-Coelescente (GMYC) and o bayesian Poisson Tree Processes (bPTP). Análises com intervalo de Confiança (IC) em parêntesis. Multispecies Método Yule Coalescente bPTP coalescente Clusters (IC) 4 (3-6) 4 (3-7) 4 (3-5) 4 (3-6) Entidades (IC) 12 (11-13) 12 (11-13) 12 (11-12) 13 (11-13) Linhagens distintas 4 4 4 4 Probabilidade nula 506.543 514.568 510.342 1238.426 Probabilidade GMYC/bPTP 521.236 526.514 524.329 1245.759 Razão de verossimilhança 25.321 21.192 20.053 40.362 Teste de razão de 5.4 x 10-6 9.2 x 10-6 1.3 x 10-5 19 x 10-6 verossimilhança Tempo de divergência 0.25 MYA 0.24 MYA 0.22 MYA -

Tabela 03: Número de entidades para cada grupo taxonômico estimado nas analyses do GMYC e bPTP, baseadas em diferentes modelos evolutivos.

GMYC GMYC GMYC yule multiespecies bPTP Espécies coalescente coalescente S. admirabilis 1 2 1 2 S. expeditionaria 1 1 1 1 S. macrocarpa 2 3 2 3 S. mombin 5 4 5 4 S. venulosa 3 3 3 3 Total 12 12 12 13

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5. CAPÍTULO 1. Parte II: Otimização metodológica e marcadores genéticos úteis ao nível de espécie para o gênero Spondias L. (Anacardiaceae)

Manuscrito submetido ao periódico Rodriguésia

Abstract

This work provides an optimized DNA isolation method for the genus Spondias (Anacardiaceae) and PCR protocols for DNA amplification of two useful markers, chloroplast DNA fragments of genes trnL- F and trnH-psbA, to solve problems at the species level. The methodology presented here can be applied routinely on molecular studies of Spondias to clarify taxonomy and phylogeny questions.

Keywords: Anacardiaceae; cajá; DNA extraction protocol optimization; molecular markers.

Resumo

O presente trabalho fornece uma metodologia otimizada de isolamento de DNA para o gênero Spondias (Anacardiaceae), bem como protocolos de PCR para amplificação de DNA de dois marcadores úteis para resolução de questões no nível de espécie, a partir de fragmentos cloroplastídicos de trnL-F e trnH- psbA. A metodologia apresentada aqui pode ser aplicada rotineiramente para estudos moleculares de Spondias visando esclarecer questões taxonômicas e filogenéticas.

Palavras-chaves: Anacardiaceae, cajá; otimização de extração de DNA; marcadores moleculares.

Introdução

O gênero Spondias L. pertence à família Anacardiaceae e inclui cerca de 19 espécies de Cajás com significativa importância econômica e social; algumas delas também são exploradas pelo setor agrícola, como é o caso das espécies Spondias monbin L. (cajazeiro) e Spondias purpurea L. (ciriguela) (Mitchell & Daly, 2015 e Machado et al. 2015). Apesar de sua relevância econômica, poucos estudos moleculares (Machado et al. 2015) e filogenéticos (Pell 2004; Nie et al. 2009; Xie et al. 2014; Weeks et al. 2014; Machado et al. 2015) foram conduzidos até o momento. Um fator importante para a escassez de dados moleculares é a elevada concentração de certos metabólitos especiais (p. ex. compostos fenólicos) que estão presentes em quase todos os tecidos de várias espécies e podem interferir na purificação e amplificação do DNA (Pell, 2004 e Mitchell & Daly, 2015). Contudo, os marcadores genéticos cloroplastídicos matK, rbcL, trnL-F, trnH-psbA e trnG-trnS (Silva et al., 2015, Machado et al, 2015; Miller et al., 2005) e o marcador nuclear ETS (Pereira et al., 2015, Machado et al., 2015) têm sido utilizados com algum sucesso em estudos filogenéticos do gênero. Neste sentido, testamos os fragmentos de genes de ETS, trnL-trnF e trnH-psbA para espécies de Spondias de ocorrência na Mata Atlântica. O presente trabalho apresenta um protocolo otimizado para o isolamento de DNA de cinco espécies de Spondias, protocolos de PCR que foram adaptados para os marcadores genéticos cloroplastídicos utilizados e indicamos quais marcadores de DNA foram os mais informativos em nível de espécie.

Material e métodos

O material vegetal utilizado neste estudo compreendeu fragmentos de folhas de cinco espécies de Spondias da Mata Atlântica (Spondias admirabilis, J.D. Mitch. & Daly, Spondias expedicionaria J.D. Mitch. & Daly, Spondias macrocarpa Engl., Spondias monbin L. e Spondias venulosa (Engl.)Engl.. Esses materiais foram selecionados abrangendo populações naturais dos estados do Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais e São Paulo, no sudeste do Brasil. A metodologia utilizada baseou-se nos autores Permingeat (et al. 1998) e Healey (et al. 2014) com modificações, as quais se encontram detalhadas nos resultados deste trabalho.

Resultados e Discussão PROTOCOLO ADAPTADO (baseado em Permingeat et al. 1998 e Healey et al. 2014) PARA ISOLAMENTO DE DNA E PROTOCOLOS DE PCRs OTIMIZADOS.

Extração de dna: Folhas secas em sílica em gel de cada uma das espécies de Spondias foram usadas para o isolamento de DNA. O protocolo de extração de DNA foi baseado em protocolos anteriores (Permingeat et al. 1998 e Healey et al. 2014) com modificações listadas abaixo. Etapas preparatórias: nenhuma modificação (Healey et al. 2014).

Trituração e ruptura de tecido: nenhuma modificação (Permingeat et al. 1998). Extração de proteínas e tratamento com RNase-A: Haeley et al. (2014) com modificações em negrito. Adicione 1 volume de clorofórmio: álcool isoamílico à solução e misture por inversão por 10 min. Centrifugue a amostra por 10 min a 10.000 rpm e recupere 500 µL do sobrenadante em um novo tubo Falcon (15 mL), tomando cuidado para evitar a interface camada aquosa / orgânica. Adicionar 5 µl de RNase-A (10 mg / mL) à solução e incubar a 37° C por 60 min com agitação periódica (a cada 20 min) e suave para digerir o RNA. Após a incubação, adicionar 1 volume de clorofórmio: álcool isoamílico à solução e misturar por inversão por 5 min. Centrifugar a solução por 10 min a 10.000 rpm e pipetar a fase aquosa em um novo tubo Falcon, tomando cuidado para evitar a camada orgânica. Precipitação: Haeley et al. (2014) com modificações em negrito. Adicione ½ do volume de NaCl 5M à amostra e misture suavemente por inversão. Em seguida, adicione três volumes de etanol a 100% frio e misture suavemente por inversão. Coloque os tubos em um freezer a temperatura de -20°C e incube por 1 h. Após a incubação, centrifugar o tubo Falcon por 15 min a 10.000 rpm para sedimentar o DNA. Decantar o sobrenadante e lavar o sedimento de DNA com 3 mL de etanol frio a 75%. Agite a solução e centrifugue novamente por 20 min a 10.000 rpm. Faça uma segunda lavagem com 3 mL de etanol frio a 75%. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, secar ao ar o pellet de DNA por 20 min em temperatura ambiente. Uma vez secos, suspender o DNA em 200 µl de tampão TE: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) e 0,1 mM EDTA. Reações de amplificação de PCR: De acordo com os protocolos de PCR descritos por Pell (2004) com modificações (ver Tabela 1). Para amplificar as regiões dos primers trnL-F, seguimos as recomendações de Taberlet et al. (1991). Para amplificação dos primers trnH-psbA, nos baseamos em Sang et al. (1997) e Tate & Simpson (2003) (ver detalhes dos primers na Tabela 2). As amplificações por PCR foram realizadas em reações de volume final de 50 µL, utilizando apenas as amostras de DNA obtidas através do protocolo de extração modificado aqui apresentado, diluídas a 1/10 para reduzir a concentração de inibidores (Savolainen et al. 1995). Os passos de PCR adaptados, para cada reação, estão resumidos na Tabela 2.

AVALIAÇÃO DA QUALIDADE E QUANTIDADE DO DNA

A quantidade de DNA genômico total isolado foi determinada utilizando o espectrofotômetro NanoDrop (Nano 2000, Thermoscientific). A qualidade das amostras foi avaliada com as leituras de 260/280 e 260/230 dadas pelo espectrofotômetro NanoDrop e ainda verificada usando eletroforese em gel de agarose a 1%. Leituras de NanoDrop e eletroforese em gel de agarose confirmaram a presença de um alto rendimento de DNA em todas as amostras (Tabela 3 e Figura 1).

AS REGIÕES GENÔMICAS ANALIZADAS

As regiões genômicas analisadas apresentaram altas taxas de amplificação (Figuras 2 e 3) e todas as regiões produziram matrizes acima de 500 pb. A região trnH-psbA apresentou 42 sítios informativos e a região trnL-trnF apresentou 25 sítios informativos (Tabela 4), enquanto o ETS apresentou 13 sítios informativos. Portanto, dentre os marcadores genéticos analisados, os mais informativos foram os de origem cloroplastídica, trnH-psbA seguidos pela região trnL- trnF e o ETS foi a região mais conservadora.

A otimização metodológica e os marcadores de DNA apresentados neste trabalho apresentam um uso promissor para estudos moleculares de espécies de Anacardiaceae, especialmente as do gênero Spondias, que possuem altas concentrações de inibidores de origem fenólica e ainda são pouco estudados quanto à filogenia (Pereira et al., 2015, Mitchell & Daly, 2015 e Machado et al., 2015).

Conclusão

Este novo protocolo otimizado é acessível e traz uma solução prática para as notáveis dificuldades de purificação e amplificação do DNA de algumas espécies de Anacardiaceae, como é o caso das espécies de Spondias abarcadas pelo presente estudo (Pell 2004; Mitchell e Daly, 2015).

Tabela 1. Lista de reagentes e protocolos de PCR para amplificar as regiões cloroplastídicas trnL-F e psbA-trnH.

Reagentes da PCR Concentrações finais

trnL-trnF trnH-psbA

H2O Buffer 5x (Promega) 1x 1x DMSO 1 M (Sigma-Aldrich) - 15% BSA 400ng/µL (Promega) 1/1000 1/1000

Cl2Mg (Promega) 5 mM 5 mM Pimer F 1 µM 1 µM Primer R 1 µM 1 µM dNTP's 1mM (Promega) 200 µM 200 µM DNA dil 1/10 25 ng 25 ng

Taq pol 5u/µL (Promega) 1.5-2 U 1.5-2 U

Etapas da PCR trnL-F psbA-trnH

1-Desnaturação Inicial 2 min -97°C 1 min-98°C 2-Desnaturação 1 min -94°C 20s-98°C 3-Anelamento 2 min-48/55°C 30s-64°C/ 40s-72°C 4-Extenção 3 min-72°C 2 min-72°C 5-Alongamento 17 min-72°C 20 min-72°C [etapas2-3-4] x 35 [etapas2-3-4] x 35

Table 2. Lista dos Iniciadores (sentido 5’−3’)

A TRNL-F= e-F GGTTCAAGTCCCTCTATCCC; f-R ATTTGAACTGGTGACACGAG

B psbA3-trnHf_05= psbA3- GTTATGCATGAACGTAATGCTC; trnHf_05- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

Tabela 3: Qualidade e quantitade de DNA obtido de espécies de Spondias.

Espécies Concentração de DNA 260/280 260/230 (ng/µL)

Spondias venulosa 1180 1.68 0.90

b Spondias. admirabilis 857 1.75 1.10

a Spondias macrocarpa 1360 1.65 0.80 b Spondias expeditionaria 674 1.78 0.93

a Spondias monbin 1152 1.52 0.89

Tabela 4: Avaliação das regiões genômicas para identificação molecular de espécies de Spondias.

Região trnH-psbA trnL-trnF Tamanho sequência alinhada (bp) 667 826 Número de sítios variáveis 58 46 Número de sítos informativos 42 25 12% (0.5– 1.5% (0– Média variabilidade intraespecífica (%) 17.5%) 3.8%) 0.4% (0– 0.1% (0– Média variabilidade interespecífica (%) 3.8%) 0.6%)

Figura 1: Eletroforese (gel de agarose a 1%) do material genômico extraído de espécies de Spondias (números 2 a 13). Número 1 corresponde a Ladder (1Kb).

Figura 2: Produtos de amplificação da região genômica trnH-psbA de espécies de Spondias (números 2 a 15 e 17 a 28). Números 1 a 16 correspondem a Ladder (1 Kb).

Figura 3: Produtos de amplificação da região genômica trnL-trnF de espécies de Spondias (números 2 a 12). Número 1 corresponde a ladder (1 Kb.)

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6. CAPÍTULO 2. Quimiotaxonomia no gênero Spondias L. (Anacardiaceae)

Manuscrito a ser submetido ao periódico Química Nova

Abstract

The genus Spondias L (Anacardiaceae) comprises 19 species, many of which especially important due to their use in folk medicine as weel as food source. A database of the micromolecular composition of Spondias was generated for a chemotaxonomic analysis. Clustering and Principal Components Analysis (PCA) were performed, as well the calculation of evolutive parameters used in chemotaxonomy. The chemical profile and the statistical multivariate analysis demonstrated that flavonols, terpenes and tanines are the most important chemical markers in this genus. The SH/(AC+IPP) and FV/FL ratios are compatible with the positioning of Spondias in the Anacardiaceae family.

Key-words: Spondias, Anacardiaceae, chemotaxonomy, principal component analysis (PCA).

Resumo

O gênero Spondias L. (Anacardiaceae) apresenta aproximadamente 19 espécies, muitas delas especialmente importantes por seu uso em medicina popular e ou como fonte de alimento. Para a análise quimiotaxonômica, um banco de dados acerca da composição micromolecular de espécies deste gênero foi criado. Foram elaboradas análises de agrupamento e de componentes principais, bem como o cálculo de parâmetros evolutivos usados em quimiotaxonomia. O perfil químico e a análise estatística multivariada demonstraram que alcalóides, terpenóides e taninos são os marcadores químicos mais importantes para este gênero. As relações SH/(AC+IPP) e FV/FL foram compatíveis com o posicionamento de Spondias na família Anacardiaceae.

Palavras-chave: Spondias, Anacardiaceae, quimiotaxonomia, análise de componente principal.

Introdução

A análise do padrão de ocorrência de metabólitos especiais contribui para o estabelecimento de marcadores químicos que em conjuto com outros caracteres, favorecem a robustez dos estudos taxonômicos de linhagens vegetais. Os caracteres químicos micromoleculares são de grande valia para a robustez consolidação de filogenias já estabelecidas (Wink 2003, Liscombe et al. 2005) que favorecem, muitas vezes, a visualização do desenvolvimento evolutivo desses caracteres químicos, tão importantes sob o ponto de vista de utilização humana. O uso de dados químicos micromoleculares para estudos com grandes grupos vegetais, evidenciam a existência de gradientes químicos de afinidade entre esses grupos (Gottlieb 1982, Gottlieb et al. 1996), e vem sendo sendo aplicado com relativo sucesso em muitos casos e contribuído para a taxonomia de diferentes grupos de Angiospermas (Nascimento et al 2015, Cipriani et al. 2012, Castilho & Kaplan 2006, Emerenciano et al. 2001, Soares & Kaplan 2001, Figueiredo et al. 1995). As técnicas atuais de análise multivariada aliadas ao uso de computadores, surgem como uma alternativa moderna de abordagem para os estudos quimiotaxonômicos (Nascimento et al 2015, Cipriani et al. 2012Emerenciano 2007, Da Costa 2005, Correia 2008, Cruz 2008, Ferreira 2005, Ferreira 2004, Alvarenga 2001). O gênero Spondias L. corresponde a um dos gêneros da família Anacardiaceae de grande importância alimentícia e medicinal, cuja circunscrição variou consideravelmente desde que este gênero foi criado, com muitas espécies que foram originalmente descritas como Spondias sendo atualmente posicionadas em outros gêneros (Mitchell & Daly 2015, Machado et al 2015). Atualmente Spondias compreende 19 espécies sendo nove encontradas no Brasil: quatro são introduzidas e cultivadas e cinco são nativas do país (Mitchell & Daly 2015). Muitos indivíduos de Spondias partilham similaridades morfológicas entre si, o que pode gerar dificuldades na identificação e delimitação dos limites entre as espécies deste grupo. Embora ainda pouco estudado do ponto de vista químico e filogenético, existem alguns trabalhos descritos em literatura abordando a filogenia e análise de seus metabólitos especiais principais (Machado et al, 2015, Silva et al, 2015, Pereira et al, 2015 e Santos et al, 2008). As espécies de Anacardiaceae mais estudadas do ponto de vista químico têm sido a Mangueira (Mangifera indica) e o Cajueiro (Anacardium occidentalle) e algumas espécies do gênero Rhus, principalmente em virtude da importância econômica e toxicidade demonstrada pelas espécies desta família. Contudo, vale frisar que esta família ainda é pouco explorada do ponto de vista químico, tendo cerca de menos de 10% de suas espécies estudadas sob esta ótica até o momento (Correia et al. 2006).

Dentre os metabólitos secundários, destacam-se duas classes de substâncias que são características na família: flavonóides, especialmente biflavonóides, e lipídios fenólicos, encontrados em espécies que normalmente apresentam propriedades tóxicas ou alergênicas (Umadevi et al. 1988 e Correia at al. 2006). A diversidade de metabólitos e atividades biológicas vêm justificado o grande interesse no estudo de espécies desta família. Além disso, a atividade antioxidante ampla e elevada apresentada pelo Vimang® está entre os resultados mais promissores até o momento. Os lipídeos fenólicos, derivados da rota policetídica, são metabólitos freqüentes em espécies desta família e muitas atividades biológicas relatadas e comprovadas destas espécies são atribuídas a esta classe de substâncias (Correia at al. 2006). Quanto à diversidade química apresentada pelo gênero Spondias, dentre os componentes químicos identificados, destacam-se a presença de alcalóides, flavonóides, taninos e saponinas (Njoku & Akumefula, 2007, Bürger, 2008, Engles, 2009, Tian, 2009 a, b, Silva, 2012, Silva, 2011, Omoregie & Oikeh, 2015, Shittu, 2014, Bayoka et al., 2006; Corthout et al., 1991 e 1992; SILVA et al., 2011, Pereira et al., 2015). Os estudos acerca deste gênero se concentram principalmente em nível de caule e frutos (Njoku e Akumefula, 2007). Espécies como o cajá (S. mombin L.), umbu (S. tuberosa Arruda) e cajá-umbu (S. mombin x S. tuberosa) são as mais estudadada e destacam-se por sua importância alimentícia e farmacológica, possuindo seus frutos comercializados in natura ou processados na forma de polpas, sucos e outros produtos alimentícios. Devido à utilização comercial destes frutos, inúmeras pesquisas vêm sendo realizadas abordando as suas características de cultivo, assim como as características físico- químicas, tais como a maturação e a estabilidade, além da identificação dos seus inúmeros constituintes químicos (Almeida, Albuquerque e Castro 2011; Assis, et al. 2006; Bora, et al. 1991; Borges et al., 2007; Jorge et al., 2007; Lima et al., 2002; Lira Júnior et al., 2005; Martins et al., 2003; Santos et al. 2010). Ademais, há também registros em literatura especializada quanto à exploração do potencial farmacológico de algumas espécies através do uso popular deste gênero na medicina tradicional de diversas regiões do Brasil, sendo utilizados como abortivos, tônicos e no tratamento contra doenças infecciosas.(Agra, et al. 2007; Almeida, et al. 2010; Caraballo, Caraballo & Rodríguez-Acosta, 2004; Fenner et al., 2006; Hajdu e Hohmann, 2012; Lucena et al. 2012; Offiah & Anyanwu, 1989). Em virtude de ainda não possuir uma taxonomia bem resolvida, de apresentar algumas espécies que partilham similaridades morfológicas, as quais tornam difícil a identificação baseada apenas em dados morfológicos e por se tratar de um gênero de importância alimentícia e medicinal, o presente trabalho visou elaborar um amplo banco de dados contendo informações quanto aos componentes químicos principais identificados e/ou isolados e discutir possíveis padrões quimiotaxonômicos no gênero Spondias L. Para tal, utilizou-se de

uma abordagem metodológica de caráter interdisciplinar, a qual faz uso de técnicas estatísticas e computacionais para analisar os padrões de ocorrência de possíveis marcadores químicos.

Material e métodos

CONSTITUIÇÃO DO BANCO DE DADOS

Foi realizado um levantamento amplo de ocorrências de micromoléculas em espécies pertencentes ao gênero Spondias obtidas por meio de pesquisa sistemática e exaustiva em bases científicas especializadas e reconhecidamente confiáveis para pesquisa científica (ISI Web of Science, Scopus, Scirus, Scielo e Chemical Abstracts). O referido levantamento não obedeceu à recorte de período, sendo incluídos quaisquer trabalhos sobre química de espécies de Spondias publicados até a presente data. O perfil quimiotaxonômico do gênero Spondias foi elaborado a partir do tabulamento das informações de ocorrência de metabólitos especiais. Esse tabulamento foi empregado na elaboração de uma matriz de ocorrência, a qual foi submetida à análise de componentes principais.

INFORMAÇÕES TAXONÔMICAS

Informações taxonômicas referentes às espécies de Spondias foram obtidas de trabalhos publicados sobre o gênero (Mitchell & Daly 2015 e Machado et al 2015), no banco de dados presentes no sistema SpeciesLink do Centro de Referência de Informações Ambientais (CRIA, 2018), bem como, aravés da utilização de bancos de dados internacionais especializados em botânica taxonômica (International Plant Name Index (IPNI) e Tropicos).

NÚMERO DE OCORRÊNCIAS (NO)

Calcula-se esta variável levando em conta a soma do número de diferentes metabólitos secundários isolados para cada táxon pertencentes a uma determinada classe de substâncias ou rota metabólica (Gottlieb et al. 1996, Soares & Kaplan 1995, Gottlieb 1982). O número de ocorrências é a base para o cálculo de relações biossintéticas já utilizadas para a análise da evolução de rotas metabólicas em diversos grupos vegetais (Gottlieb et al. 1996).

A RELAÇÃO CHIQUIMATO/ACETATO + ISOPENTENIL-PIROFOSFATO [CH/(AC+IPP)]

A relação CH/(AC+IPP) corresponde a um parâmetro quimiotaxonômico que visa fornecer uma informação quantitativa acerca da utilização das principais rotas metabólicas vegetais, verificando a diversidade químico-estrutural final dos produtos de biossíntese de cada uma das rotas de forma comparativa, o que permite uma interpretação sobre as tendências evolutivas metabólicas globais dos táxons em análise. Tal parâmetro é calculado através do quociente entre o NO de metabólitos derivados da rota biossintética do acetato ou do IPP e o NO de metabólitos derivados da via do chiquimato. Substâncias sintetizadas a partir de precursores de ambas as rotas de biossíntese, como os flavonóides, foram considerados ocorrência para cada uma delas (Gottlieb & Borin 1998).

A RELAÇÃO FLAVONA/FLAVONOL (FN/FL)

De modo análogo à relação CH/(AC+IPP), a relação FN/FL também tem como característica fornecer informações sobre tendências evolutivas biossintéticas globais em táxons vegetais. No entanto, esse parâmetro restringe-se à ocorrência de flavonóides, para os quais algumas tendências evolutivas importantes já estão estabelecidas (Soares & Kaplan 2001). A relação FN/FL é estabelecida pela razão entre o NO de flavonas e o NO de flavonóis. A ocorrência de um mesmo composto em duas ou mais espécies distintas foi contada cumulativamente para o gênero.

SELEÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUIMIOTAXONÔMICOS

Os marcadores micromoleculares foram determinados e escolhidos de acordo com a amplitude de sua ocorrência e em virtude de sua diversidade estrutural nos táxons analisados. Essa seleção foi direcionada primordialmente às classes de metabólitos mais comumente elencados como marcadores para o gênero. Os marcadores selecionados foram agrupados de acordo com seus tipos estruturais químicos em subcategorias mais específicas quando apropriado.

ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA)

A PCA é uma técnica estatística multivariada que possui como uma de suas principais vantagens comprimir o espaço amostral com uma perda mínima de informação. Como

conseqüência, a interpretação dessa análise pode nos levar à delimitação de agrupamentos definidos pelas variáveis que mais contribuem com a maximização da variância. Portanto, a referida análise é capaz de extrair do conjunto de dados originais as informações mais relevantes para o melhor entendimento de um determinado problema. Um detalhamento mais profundo acerca da utilização, vantagens, limitações e aspectos matemáticos deste tipo de abordagem pode ser encontrado na literatura especializada (Wold 1987). A matriz de entrada para essa análise é a própria matriz baseada em NOs. A análise foi realizada novamente pelo programa PAST®.

Resultados e Discussão

O número de ocorrências de metabólitos secundários para Spondias foi de 73. O perfil químico deste gênero é caracterizado pela presença principalmente de flavonóides (NO = 15), taninos (NO = 6), terpenóides, (NO = 11), ácidos fenólicos (NO = 4), saponinas (NO = 8), alcalóides (NO = 5), cumarinas (NO = 2 ), esteróis (NO = 9), aminoácidos (NO=5),carboidratos (NO=8) e chalconas (NO= 2). (Tab. 1 e Fig 1). A química de espécies deste gênero indica um valor da relação chiquimato/acetato igual a 1.85. Neste gênero, o maior percentual de metabólitos especiais são os derivados de biossíntese mista como os flavonóides (NO = 15) que representam 20% do total de metabólitos encontrado. Os flavonóides identificados compreendem flavonas (NO = 7), flavonóis (NO =5 ), di- hidroflavonas (NO = 3) e chalconas (NO = 2), sendo a razão FN/FL igual a 2,4. A análise de componentes principais confirmou o potencial dos flavonóides, terpenóides e taninos como potenciais marcadores quimiotaxonômicos para o gênero (Fig.2). Os flavonóides e os derivados de cadeia longa da via do ácido acético, como os terpenóides e principalmente os taninos condensados, correspondem as substâncias mais representativas do gênero Spondias. Com destaque para a relativa abundância da presença de derivados de cadeia longa da via do acetato (terpenóides e taninos hidrolizáveis) que indicam o potencial destes como marcadores taxonômicos para o grupo. As estruturas químicas de alguns representantes destas classes de compostos se encontram ilustrados na figura 3. Apesar da circunscrição da superordem Roseflorae (DALGHREN 1980) e o clado das Rosideas (APG IV), onde o gênero Spondias se encontra inserido, apresentarem diferenças, ressaltamos aqui o trabalho de Castilho e Kaplan (2008). As autoras apresentaram um estudo quimiotaxonômico para a superordem e discutiram os tipos flavonoídicos produzidos em Rosiflorae, onde encontraram uma maior produção de flavonóis em relação às flavonas. Além disso, sugeriram que a proteção das hidroxilas flavonoídicas mostrou uma nítida preferência na proteção por glicosilação em detrimento à proteção por metilação.

Estudos realizados por Stevens (2001) para a ordem Sapindales (APG IV), indicaram a presença de diversos metabólitos especiais, dentres os quais destacam-se: Flavonóis (kaempferol, quercetina, miricetina), flavonas, biflavonas, flavona metílicas, biflavonil, 5- desoxiflavonóides, cianidina, delfinidina, monoterpenos, triterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanos, ácido elágico, taninos hidrolisáveis e não hidrolisáveis, fenóis com cadeias laterais insaturadas, acridinas, alcalóides β-carbalinas, alcalóides imidazólicos, alcaloides quinolínicos, alcalóides benzilisoquinolínicos, alcalóides derivados do antranílico, saponinas pentacíclicas terpênicas, compostos cianogênicos derivados de leucina ou fenilalanina, artrocinonas derivadas de ácido poliacetato ou chiquímico, piranócronas, cumarinas, furanocumarinas, quebrachitol (ciclitol), carboidratos alifáticos, poliacetilenos, álcoois polivalentes cíclicos, amidas, ácidos graxos tipo C18:3, aminoácidos ciclopropanos e poligalitol. Nesta ordem, diferente do que se observa no estudo realizado por Castilho e Kaplan (2008) para a superordem Roseflorae, dentre os tipos flavonídicos produzidos, existe uma preferência pela produção de flavonas em relação aos flavonóis. Além disso, também de maneira análoga ao que foi observado na superordem Roseflorae, os flavonóides produzidos apresentam preferência por proteção das hidroxilas flavonoídicas através de metilação em detrimento à proteção por glicosilação (Stevens, 2001). A análise do perfil químico de espécies do gênero Spondias presente em literatura especializada indicou que este gênero apresenta um perfil heterogênio, com destaque para a presença de flavonóides, taninos, terpenóides, alcaloides e saponinas (Figura 01) (Bürger, 2008, Engles, 2009, Tian, 2009 a, b, Silva, 2012, Silva, 2011, Omoregie & Oikeh, 2015, Shittu, 2014, Bayoka et al., 2006; Corthout et al., 1991 e 1992; Silva et al., 2011, Pereira et al., 2015). Assim como observado para a ordem Sapindales (Stevens, 2001) com relação aos compostos flavonídicos, neste gênero, até o momento, existe uma abudância de flavonas identificadas em relação aos flavonóis registrados e a proteção das hidroxilas flavoníticas ocorre por glocosilação e metiliação, não havendo ainda em literatura, estudos químicos expressivos que indiquem uma predileção por proteção ou desproteção das hidroxilas. Além disso, foram registrados para o gênero Spondias, os flavonóides, kaempferol, quercetina, miricetina, registrados também para a ordem Sapindales. Ademais, um estudo fitoquímico realizado com folhas de S. venulosa, espécie endêmica da Mata Atlântica, indicou a presença de Flavonol 3-O-glicosídeo que também foi detectado em folhas de quatro outrras espécies de Spondias (Pereira et al 2015). A presença de tais flavonóides pode ser considerada um caráter sinapomórfico do clado de Spondias brasileiras. Além disso, a ocorrência de ramnetina 3-O-rutinosídeo em combinação com dados filogenéticos forneceu evidências para a separação das duas espécies de Mata Atlântica (S.

venulosa (Engl) Engl. e S. expeditionaria J. D. Mitch. & Daly) em um clado distinto (Pereira et al 2015), o que é importante para estudos quimiossistemáticos e filogenéticos adicionais deste gênero. Quanto aos estudos farmacológicos, a partir da revisão realizada sobre o gênero Spondias foi possível verificar que a maioria dos trabalhos se concentram em três espécies principais: Spondias tuberosa, Spondias mombin e Spondias pinnata, as quais compreendem aproximadamente 80% das publicações no gênero. As duas primeiras são nativas do Brasil, já a última raramente é encontrada no país, no entanto, já é bem estudada na literatura, uma vez que a mesma é bem distribuída por países asiáticos os quais são conhecidos por fazer uso na medicina tradicional (Bürger, 2008, Engles, 2009, Tian, 2009 a, b, Silva, 2012, Silva, 2011, Omoregie & Oikeh, 2015, Shittu, 2014, Bayoka et al., 2006; Corthout et al., 1991 e 1992; Silva et al., 2011, Pereira et al., 2015) Os relatos para o uso tradicional de S. mombin são principalmente para processos infecciosos, inflamatórios e como abortivo (ou estimulante de parto), adicionalmente, nos estudos já realizados na literatura dá-se destaque para a atividade antimicrobiana in vitro e o massivo número de estudos de atividade antifertilidade ou abortiva da espécie. Em contrapartida, S. pinnata é conhecida por uma utilização na medicina popular mais diversificada, que vai desde tratamento de diarreia e disenteria a uso como antituberculoso; nos estudos in vitro onde a maioria investiga o potencial antimicrobiano da espécie, a maior atenção é voltada para um estudo anticancerígeno onde a planta apresentou boa atividade contra as células malignas e não afetou as células saudáveis. O vasto uso de S. dulcis na medicina tradicional para tratar infecções de pele, que é visto na maioria das literaturas investigadas sobre etnofarmacologia, o que aumenta a importância desse uso popular e atenta para a necessidade de comprovação de estudos para a espécie, que pode ser promissora em tratamentos de infecções de pele (Ghosal & thakur, 1981, Gupta et al., 2010; Chalise, et al. 2010; Maisuthisakul, Suttajit & Pongsawatmanit, 2007; Samee et al., 2006; Sulaiman et al., 2011, Maisuthisakul, Suttaji. & Pongsawatmanit, 2008; Mondal & Dash, 2009; Das et al., 2011, Satpathy et al., 2011; Manik et al., 2013). Apesar do expressivo uso popular das espécies do gênero Spondias para processos inflamatórios, poucos estudos são voltados para esse potencial, havendo relatos apenas para as espécies S. pinnata e S. mombin, e nenhum para S. tuberosa. Esta espécie também apresenta um uso popular diversificado, dentre os quais se destacam os tratamentos inflamatórios e infecciosos com diversas partes da planta. Das três principais espécies, S. tuberosa é a que mais carece de estudos farmacológicos pré- clínicos para comprovação das suas propriedades ditas medicinais, tornando a espécie uma planta em potencial para estudos posteriores (Almeida et al., 2005, Araújo et al. 2008, Rufino et al., 2010, Engles, 2009, Tian,

2009 a, b, Silva, 2012, Silva, 2011, Omoregie & Oikeh, 2015, Shittu, 2014, Bayoka et al., 2006; Corthout et al., 1991 e 1992; Silva et al., 2011).

Conclusão

Através da análise dos diferentes parâmetros quimiossistemáticos para o gênero Spondias foi possível constatar que o perfil químico do gênero se caracteriza pela ocorrência de taninos terpenoides, flavonóides, alcalóides e saponinas, sendo que a biossíntese dos seus metabólitos especiais se baseia, principalmente, na via do ácido acético, fato que corrobora com o posicionamento deste gênero entre as angiospermas mais derivadas. Os flavonóides, terpenóides e taninos em virtude da grande variação estrutural encontrada, se apresentam como importantes marcadores taxonômicos para o grupo. Dentre as espécies que foram investigadas do ponto de vista químico, a espécie S. mombin é a mais estudada, sendo seu perfil químico caracterizado principalmente por taninos, alcalóides e flavonóides.

Tabela 1. Perfil químico de espécies de Spondias baseados nos metabólitos identificados por classe química descritos em literatura. Classes químicas Espécies Referências Esteróis Terpenóides Saponinas Alcalóides Ac.Fe. Flavonóides Cumarinas Chalconas Tanninos Aminoácidos Carboidratos ENGLES, 2009, TIAN, 2009 a, b, SILVA, 2012, SILVA, 2011, OMOREGIE & OIKEH, 2015, Spondias 2 2 1 1 1 4 1 1 2 -- -- SHITTU, 2014, BAYOKA et al., monbin 2006; CORTHOUT et al., 1991 e 1992; SILVA et al., 2011, PEREIRA et al., 2015 ALMEIDA et al., 2005, ARAÚJO et Spondias 1 1 2 2 2 5 -- -- 1 -- -- . 2008, RUFINO ., 2010, SILVA tuberosa al et al et al., 2011 GHOSAL & THAKUR, 1981, GUPTA et al., 2010; CHALISE, et al. 2010; MAISUTHISAKUL, SUTTAJIT & PONGSAWATMANIT, 2007; SAMEE et al., 2006; SULAIMAN ET AL., Spondias 3 4 4 1 -- 3 -- 1 1 5 8 2011 MAISUTHISAKUL, SUTTAJIT pinnata & PONGSAWATMANIT, 2008; MONDAL; DASH, 2009; DAS et al., 2011, SATPATHY et al., 2011; MANIK et al., 2013 Spondias 2 3 2 -- 1 2 1 -- 1 -- -- ENGELS, 2012 e LIMA , 2016 purpurea et al JIROVETZ, BUCHBAUER & NGASSOUM, 1999, ISAK ET AL., Spondias 1 2 1 2 1 3 -- 3 -- -- 2005; LUXIMON-RAMMA, dulcis BAHORUN & CROZIER, 2003, SANT’ANNA-SANTOS et al., 2006, Spondias ------1 ------PEREIRA ., 2015 venulosa et al

NO %

CHA CUM ALC AFE AMI TAN CAR SAP EST TER FLA

0 5 10 15 20 25

Figura 1. Percentagens dos números de ocorrência (NO%) de metabólitos especiais encontrados em Spondias. CHA, chalconas (NO =3), CUM, cumarina (NO=3), ALC (NO=6), alcalóides, AFE, ácidos fenólicos (NO=6), AMI, aminoácidos (NO = 7), TAN (NO = 8), AcFEN, (NO = 4), CAR, carboidratos (NO=9), SAP, saponinas (NO = 10), EST, esteróis (NO = 12), TER, terpenóide (NO=15) e Flavonóides (NO= 20).

Figura 2: Gráfico dos Loadings correspondentes aos parâmetros estudados: Flavonóides, Terpenóides, Cumarinas, Saponinas, Alcalóides, Taninos condensados e Taninos hidrolisáveis.

Figura 3. Principais compostos fenólicos isolados em Spondias. Fonte: Adaptado de Sameh et al. 2018.

Figura 4: Estrutura química dos principais esteróis e terpenóides isolados de Spondias. Fonte: Adaptado de Sameh et al. 2018.

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7. CAPÍTULO 3. Modelagem de distribuição geográfica potencial no gênero Spondias L.

Manscrito a ser submetido no periódico Scientific Reports

Abstract

The present study aims to provide a biogeographic review and the distribution (real and potential) of Spondias species (Anacardiaceae.) in Brazil. The data were collected from the SpeciesLink, a Network that integrates primary data from scientific collections and is linked to the system of Biogeography of Flora and Fungi of Brazil (Biogeo). The real distribution and potential distribution models for each Brazilian species of Spondias, based on a consensus model ande generated by up to five algorithms, were calculated. A total of 2877records were found for 8 species of Spondias in Brazil. In the selection of records for this study, the percentage of total exclusion was relatively high (49.8%), mainly due to the lack of georeference, and determinator. In the evaluation of the consensus models, satisfactory results were considered only for species with 20 or more pixels. The others data showed erros and their models will serve only to guide new areas for collection. The potencial geographical distribution shows a predominant pattern for the Atlantic Rain Forest.

Key-words: distribution models, biogeography, Spondias, Tropics, Atlantic Rain Forest.

Resumo

O presente estudo visou apresentar uma revisão biogeográfica da distribuição (real e potencial) das espécies de Spondias L. (Anacardiaceae) nativas do Brasil. Os dados foram obtidos através de registros presentes na rede SpeciesLink que integra dados primários de coleções científicas e está interligada ao sistema Biogeografia da Flora e Fungos do Brasil (Biogeo). Foram definidos a distribuição real e os modelos de distribuição potencial para cada espécie brasileira de Spondias, baseando-se em um modelo de consenso, os quais foram gerados por até cinco algoritmos. Um total de 2.877 registros foram encontrados para 8 espécies de Spondias de ocorrência no Brasil. Ao selecionar os registros para a realização deste estudo, observou-se que percentual de perda total foi elevado (49,8%), devido principalmente à falta de georreferenciamento e de determinador. Na avaliação dos modelos de consenso, foram considerados resultados satisfatórios apenas aqueles para as espécies que apresentaram 20 ou mais pixels. Os demais registros apresentaram muitos erros e, por isso, seus modelos contribuem apenas para orientar possíveis novas áreas para coletas. A predição das potenciais distribuições geográficas indicou um padrão predominante para a Floresta Atlântica.

Palavras-chave: modelos de distribuição, biogeografia, Spondias, Trópicos, Floresta

Atlântica.

Introdução

A circunscrição do gênero Spondias Lindley sofreu várias alterações desde a sua criação, com muitas espécies sendo originalmente descritas como Spondias passando a serem atualmente posicionadas em outros gêneros da família Anacardiaceae (Mitchell & Daly 2015, Machado et al 2015). Na atual circunscrição, o gênero Spondias se encontra inserido na subfamília Spondioideae e abarca 19 espécies de grande potencial alimentício, pois seus frutos são comestíveis. Nove espécies de Spondias são encontradas no Brasil: três são introduzidas e cultivadas e seis são nativas do país, onde ocorrem também táxons que possivelmente representam espécies que ainda não foram descritas e alguns táxons que apresentam uma morfologia intermediária, provavelmente de origem híbrida (Mitchell & Daly 2015). Segundo estudos biogeográficos realizados por Machado (2014), a análise dos tempos de divergência indicou que Spondias surgiu no final do Eoceno, com a divergência entre Spondias e demais Spondioideae datada de 35,3 Ma atrás. Spondias começou a se diversificar no Oligoceno, com a divergência mais antiga, datada de 26,7 Ma atrás, ocorre entre um clado Neotropical e um clado contendo espécies das ecorregiões Indo-Malaia e Australásia; a ocorrência dos gêneros mais próximos de Spondias também nessas regiões sugere que o gênero provavelmente se originou na Eurásia e depois se dispersou para a região Neotropical. Isso indica que a migração de Spondias da Ásia para as Américas deve ter ocorrido entre o final do Oligoceno e início do Mioceno, possivelmente através da ponte de terra de Bering ou do arco das ilhas Aleutas, que estavam disponíveis para migração de táxons adaptados a climas quentes e semi-áridos desde o início do Mioceno (Machado, 2014). No caso das Spondias neotropicais, as linhagens mais antigas estão na região Mesoamericana, e os clados Sul-Americanos formam duas linhagens aninhadas entre as linhagens Mesoamericanas, o que indica que pelo menos dois eventos de dispersão para América do Sul antes do fechamento do istmo do Panamá (3 Ma atrás) (Machado, 2014). A subfamília Spondioideae apresenta uma distribuição principalmente pantropical, com dez gêneros e ca. 65 espécies ocorrendo na ecozona Afrotrópica, onze gêneros e ca. 55 espécies em áreas tropicais das ecozonas Indo-Malaya e Australásia, e cinco gêneros e ca. 23 espécies ocorrendo na ecozona neotrópica. Além de três gêneros compartilhados entre as ecozonas Indo- Malaya e Australásia, existem apenas outros três gêneros de Spondioideae cujas distribuições abrangem dois ou mais ecozones: Antrocaryon Pierre (três espécies Afrotropical e uma Neotropical), Lannea A. Rich. (principalmente Afrotrópica, uma espécie na ecozona indo-

malaia) e Spondias, o qual possui uma distribuição pantropical, com espécies que ocorrem nas ecorregiões Neotropical, Afrotropical, Indo-Malaia, Australásia e Oceania, correspondendo ao gênero desta subfamília que possui a distribuição geográfica mais ampla dentro da subfamília Spondioideae (Pell et al. 2011 e Mitchell & Daly, 2015). Tal gênero compreende árvores de porte grande, médio e pequeno porte, adaptadas a áreas úmidas, sazonalmente secas e semiáridas (Mitchell & Daly 2015 e Forzza et al, 2012). No Brasil, espécies de Spondias apresentam distribuição nas regiões, Sudeste, Centro-Oeste, Norte e Nordeste (Silva-Luz & Pirani, 2014), podendo ser encontradas em diversos tipos de vegetação nos domínios da Amazônia, Mata Atlântica e Caatinga (Mitchell & Daly, 1998 e Mitchell & Daly, 2015).Os nomes populares mais utilizados para as espécies do referido gênero são: Cajá, Cajazeira, Cajá de pescoço, Cajá-manga, Cajarana, Umbu, Umbuzeira, Umbu-cajá e Ciriguela (Mitchell & Daly e Machado et al 2015). A importância alimentícia e na medicina popular do gênero vem despertando o interesse quanto as suas características de cultivo, bem como as suas características físico-químicas, tais como maturação e estabilidade, além da identificação dos seus constituintes químicos. Neste contexto, destacam as espécies como o umbu (Spondias tuberosa), o cajá (Spondias mombin) e o cajá-umbu (S. mombin x S. tuberosa), os quais possuem seus frutos comercializados in natura ou processados na forma de polpas, sucos e demais produtos alimentícios (Almeida, Albuquerque e Castro 2011; Assis, et al. 2006; Bora, et al. 1991; Borges et al., 2007; Jorge et al., 2007; Lima et al., 2002; Lira Júnior et al., 2005; Martins et al., 2003; Santos et al. 2010). No âmbito da medicina popular, muitas espécies de Spondias são utilizadas como abortivo, como tônico e no tratamento de desordens infecciosas, com destaque para as espécies S. monbin, S. tuberosa e S. dulcis (Agra, et al. 2007; Almeida, et al. 2010; Caraballo, Caraballo & Rodríguez-Acosta, 2004; Fenner et al., 2006; Hajdu e Hohmann, 2012; Lucena, et al. 2012; Offiah & Anyanwu, 1989). Embora corresponda a um gênero de importância econômica e de ampla distribuição geográfica pelo Brasil, estudos sobre Spondias L., abarcando sua ecologia e biogeografia, ainda são escassos, evidenciando a necessidade da realização de maiores esforços para o fortalecimento da compreensão sobre a evolução, a migração e a distribuição espacial deste gênero no Brasil (Mitchell & Daly 2015). Diante do exposto, o presente estudo visou apresentar uma revisão da distribuição geográfica real de espécies de Spondias, além de mapear suas distribuições potenciais, no

intuito de contribuir para a ampliação do conhecimento sobre a ecologia e biogeografia deste gênero de grande potencial alimentício e medicinal.

Material e Métodos

LEVANTAMENTO DAS ESPÉCIES E SINÔNIMOS

Os nomes e os sinônimos das espécies de Spondias no Brasil foram compilados a partir da última versão da Lista das Espécies da Flora do Brasil (LEFB) (JBRJ, s. d.) e do The International Plant Names Index (IPNI, s. d.), que compõem os principais dicionários e indexadores de nomes científicos de Angiospermas. Portanto, para este estudo, foram considerados o total de registros dos nomes válidos das espécies analisadas (S. venulosa, S. macrocarpa, S. monbin, S. tuberosa e S. testudinis).

DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DAS ESPÉCIES

No estudo da distribuição geográfica das espécies analizadas, inicialmente, foi analisada a distribuição real das espécies de Spondias. Para tal, considerou-se o total de registros dos nomes válidos existentes no banco de dados da rede SpeciesLink (s. d.), os quais foram georrefenciados pelas coleções (herbários) de origem ou através do auxílio do aplicativo dataCleaning (DC), desenvolvido pelo Centro de Referência em Informação Ambiental (CRIA, 2018). O referido aplicativo identifica possíveis erros ortográficos nos nomes das espécies e facilita a padronização dos dados, não interferindo na informação, pois nenhum elemento é modificado, ou seja, o aplicativo apenas indica os registros suspeitos, os quais foram todos descartados da análise realizada neste estudo. Posteriormente, os dados selecionados foram inseridos em outra ferramenta, também desenvolvida pelo CRIA, denominada por geoLoc (CRIA, 2007), a qual tem por objetivo auxiliar o trabalho de coleções biológicas no georreferenciamento de seus acervos, atribuindo as coordenadas geográficas para a sede do município da coleta, quando os rótulos das exsicatas não apresentam dados exatos de longitude e de latitude. Além do total de registros (Rt) disponíveis no banco de dados do SpeciesLink, também foram examinados todos os rótulos e as imagens digitalizadas das exsicatas de herbários virtuais participantes ou não das redes de integração de dados de coleções, bem como as publicações

nas áreas de conhecimento relacionadas ao nosso estudo, como ecologia de plantas, inventários florestais e florísticos, os quais trazem listas de espécies e de floras de diferentes localidades. Todavia, esse material só foi considerado quando citado o registro do exemplar-testemunho (Voucher) em herbário cadastrado no Index Herbariorum (Thiers, s. d.) ou no próprio banco de dados do SpeciesLink. A distribuição potencial de cada espécie de Spondias foi modelada por meio do sistema Biogeo (CRIA, s. d.), que está diretamente interligado à base de dados do SpeciesLink, onde são realizadas as buscas dos dados. A interação entre ambos é dinâmica, de tal forma que todas as modificações e inclusões são detectadas e atualizadas periodicamente pelo próprio sistema. O Biogeo utiliza o programa openModeller (CRIA, openModeller, s. d.) para produção dos modelos de distribuição potencial. Também desenvolvida pelo CRIA, esta ferramenta constitui um programa aberto, de arquitetura modular, com código aberto, multialgoritmo e suporta vários formatos de dados. Corrsponde a um programa específico para geração de modelos de distribuição potencial de espécies a partir das variáveis ambientais atribuídas a cada ponto de treino ou pixel (Muñoz et al., 2011). Portanto, para executar a modelagem da distribuição potencial das espécies de Spondias, foram necessárias a relização de três ações prévias, a saber: (1) a aplicação de filtros para seleção dos registros a serem utilizados; (2) a seleção das variáveis ambientais; e (3) a seleção dos modelos.

FILTROS PARA SELEÇÃO DOS REGISTROS

A partir do total de registros (Rt) de cada espécie de Spondias encontrado no SpeciesLink, foram revisadas, individualmente, todas as informações das amostras encontradas. Nesse sentido, foram aplicados dois filtros para selecionar os registros com melhor qualidade, a saber: no primeiro filtro (F1), apenas os registros com nomes válidos (Rv) passaram. Tais registros foram, então, considerados pelo Biogeo, onde foram submetidos ao segundo filtro (F2), que considerou apenas os registros que apresentavam coordenadas geográficas distintas e cujos identificadores eram os especialistas no grupo taxonômico em estudo (Rgi). Cada registro que apresentava coordenada distinta foi considerado um ponto de treino ou pixel (Px). Como a maioria das coletas apresentam as mesmas coordenadas ou foram realizadas muito próximas umas das outras, os registros foram agregados em um único pixel, para geração dos modelos. No caso de registros duplicados na mesma coleção ou com 90

identificação conflitante entre duas ou mais coleções, foram considerados apenas aqueles com determinação mais recente. Contudo, as amostras que não possuiam o nome do determinador ou eram identificadas como provenientes de cultivos não foram consideradas.

VARIÁVEIS AMBIENTAIS

Para a realização do presente estudo, foram utilizadas oito variáveis ambientais, uma topográfica (altitude) e sete bioclimáticas que se aplicam às características do clima tropical brasileiro, a saber: (1) variação média de temperatura no dia; (2) temperatura máxima no mês mais quente; (3) temperatura mínima no mês mais frio e precipitação no trimestre mais úmido; (5) precipitação no trimestre mais seco; (6) precipitação no trimestre mais quente e (7) precipitação no trimestre mais frio. A altitude foi obtida diretamente do banco de dados do Global Climate Data WorldClim (s. d.), para abarcar, indiretamente outros fatores, como incidência de radiação solar e pressão atmosférica, que normalmente influenciam grande parte da distribuição das espécies de plantas. As variáveis bioclimáticas também foram extraídas do WorldClim (Bioclimatic variables, s. d.), na resolução espacial aproximada de 1 km² (Tabela 1). O WorldClim é um banco de dados que disponibiliza as variáveis bioclimáticas derivadas dos valores mensais de precipitação e de temperatura, os quais podem ser selecionados e aplicados a qualquer região do planeta, sendo amplamente usados em modelagem de distribuição de espécies (Giannini et al., 2012; Peterson & Soberón, 2012; Yanga et al., 2013).

MODELOS UTILIZADOS NA DISTRIBUIÇÃO POTENCIAL

Os modelos de distribuição potencial utilizados foram baseados em dados de presença a partir das variáveis ambientais atribuídas a cada pixel (Muñoz et al., 2011). O número de pixels disponíveis é o fator determinante de qual ou quais algoritmos são possíveis de serem processados e, dependendo deste número, pode-se utilizar até cinco algoritmos, gerando, assim, até cinco modelos, além de um modelo de consenso. Para dados com número de pixels disponíveis que apresentem valores menor do que cinco, recomenda-se a geração do modelo da dissimilaridade ambiental (DA), usando-se a de distância euclidiana em relação ao ponto de ocorrência mais próximo (Carpenter et al., 1993); entre cinco e nove pixels, utilizou-se o Maximum Entropy (MaxEnt) (Phillips et al., 2006); 91

entre dez e 19 pixels, foram usados três modelos: 1) MaxEnt; 2) Genetic Algorithm for Ruleset Prediction – Best Subsets (GARP BS) (Anderson et al., 2003); e 3) o modelo de consenso entre esses dois primeiros, de acordo com o proposto pelo Biogeo. Com o número de pixels maior ou igual a vinte, foi possível gerar seis modelos: 1) MaxEnt; 2) GARP BS; 3) distância Mahalanobis (DM) (Farber & Kadmon, 2003); 4) Ecological-Niche Factor Analysis (ENFA) (Hirzel et al., 2002); 5) Support Vector Machines (SVM) (Schölkopf et al., 2001); e 6) o modelo de consenso entre os cinco primeiros modelos. Os modelos gerados são transformados em modelos binários, por meio de um corte baseado no limiar de presença mínima (LPT), também denominado por limite da menor presença (lowest presence threshold). Tal técnica é capaz de identificar e selecionar o menor valor de adequabilidade ambiental atribuído pelo modelo a um ponto de presença do conjunto de pixels, ou seja, os pixels que apresentam valores acima do limite de corte são considerados como possíveis áreas de presença (Phillips et al., 2006; Pearson, 2007). O modelo de consenso foi baseado no valor médio dos diferentes algoritmos, como recomendado por Marmion et al. (2009), o qual indica, quais são as áreas onde há sobreposição de ocorrência de pelo menos dois outros modelos. Este modelo apresenta os níveis de concordância entre os algoritmos descritos em cores diferentes, a saber: vermelha (para cinco algoritmos), laranja (para quatro), amarelo (para três) e azul (para menos do que três). Tal modelo vem se mostrando muito útil para apoiar inúmeras tomadas de decisões sobre a distribuição de várias espécies atualmente (Chen, 2009; Hassemer et al., 2016).

AVALIAÇÃO DOS MODELOS

A avaliação da qualidade dos modelos foi realizada de acordo com o Biogeo, ou seja: modelos com menos de 5 pixels de ocorrência não foram testados, servem apenas para indicar áreas relativamente próximas, com variáveis ambientais semelhantes, onde deveriam ser realizadas novas coletas botânicas; modelos com 5 a 19 pixels de ocorrência foram avaliados com a omissão interna e testados com o procedimento de leave-one-out, seguido do cálculo da probabilidade associada ao número de acertos, ou seja, para cada ponto, um novo modelo é gerado com todos os outros pontos, sendo, em seguida, testado com o ponto em questão. Depois de relizar esses dois procedimentos para todos os pontos considerados, calcula-se a probabilidade de se obter o número de sucessos usando um teste de Poisson-binomial unicaudal.

Para os modelos com 20 ou mais pixels, além da omissão interna, também foram consideradas a omissão externa e a área sob a curva (area under the curve – AUC). A omissão corresponde a um tipo de erro que ocorre quando o modelo não prevê áreas com variáveis ambientais adequadas para a espécie. Nesse sentido, a omissão interna é calculada com os mesmos pontos utilizados na geração do modelo, enquanto que a externa é calculada com pontos que não foram utilizados na geração do modelo. A omissão externa não é calculada para o modelo MaxEnt. A omissão interna não deve ultrapassar 5% e a externa não dever ultrapassar 20% (Peterson et al., 2008). A AUC é a relação entre a área do modelo e a área de estudo para cada limiar da curva; seus valores foram calculados com validação cruzada do tipo 5-fold, recomendado para as espécies que apresentem entre 20 e 199 pixels (Phillips et al., 2006). Os valores de AUC foram considerados extremamente satisfatórios (> 0,9), satisfatórios (> 0,8) e razoáveis (> 0,7), conforme recomendado por Swets (1988).

Resultados e Discussão

A relação de espécies da BFG (2019) apresenta 9 espécies do gênero ocorrendo no Brasil, sendo encontrado para 4 destas espécies 11 sinônimos válidos (Tab. 1). Inicialmente, foram encontrados 2.877 registros de Spondias no Brasil, porém 224 destes foram pré-excluídos, 78 correspondem a Spondias dulcis Parkinson, espécie que não é nativa do Brasil e cujos registros são orindos de áreas de cultivo e os demais (166) foram excluídos por serem identificados apenas ao nível de gênero. Assim, o número total de registros considerados foi de 2.653; destes, 108 foram excluídos por não apresentarem nomes válidos, 876 foram excluídos por não apresentarem georreferenciamento e 234 por não apresentarem identificador especialista no grupo. Ao final, foram considerados 1.435 registros, agrupados em 166 pixels (Tab. 2). Considerando as 9 espécies, o percentual de perda total de registros de algumas espécies foi consideravelmente elevado, como foi o caso de S. testudinis (74,7%) e S. mombin (42%), cujas perdas ocorreram especialmente devido à falta de dados de georreferenciamento e de identificadores especializados (Tab. 2). A falta de georreferenciamento e de identificadores especializados correspondem a um problema recorrente nas exsicatas dos herbários. O georreferenciamento das amostras já é (ou deveria ser) um item obrigatório para incorporação de exsicatas nos herbários; porém ainda 93

existem grandes quantidades de material não identificado por especialistas, fato já destacado por outros autores (Ferreira & Hopkins 2004; Hopkins 2007). Outra explicação se deve ao fato de existir uma quantidade considerável de material oriundo de vários projetos de cunho ambiental, os quais não possuem em seu corpo técnico de trabalho, especialistas para a identificação do material ou em virtude do pequeno quantitativo de especialista existente no mercado (Franciscon & Miranda 2017). A existência de diminutos registros nas coleções pode evidenciar uma estreita distribuição geográfica das espécies; ou porque possuem populações muito escassas; ou porque são pouco coletadas, o que levaria a uma falsa raridade da espécie (Siqueira et al. 2009), além de limitações na identificação de áreas de endemismo (Murray-Smith et al. 2009). Quando se evidenciam concentrações de coletas botânicas restritas a poucas áreas (Hopkins 2007; Schulman et al. 2007), tais concentrações, às vezes são confundidas como áreas de alto endemismo, fato que é muito comum ao domínio da Mata Atlântica (Nelson et al. 1990).

DISTRIBUIÇÃO CONHECIDA

A distribuição geográfica conhecida das espécies de Spondias no Brasil apontam para um predomínio de distribuição no domínio da Mata Alântica (Tab. 3), com exceção para as espécies S. bahiensis, S. mombin, S. testudinis e S. globosa que apresentaram distribuição em outros domínios, tais como: Caatinga, Cerrado e Amazônia. S. mombin é a espécies com maior distribuição geográfica conhecida, apresentando registros nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste. Diferente de S. testudinis cuja distribuição conhecida apresenta registros apenas para a região Norte do Brasil, no estado do Acre (AC). Já S. tuberosa possui distribuição nas regiões Nordeste e Sudeste enquanto que S. bahiensis apresenta distribuição conhecida apenas para a região Nordeste. A espécies S. macrocarpa e S. venulosa apresentam distribuição conhecida nas regiões Nordeste e Sudeste do Brasil, enquanto que S. expeditionaria e S. admirabilis apresentam distribuição apenas pela região sudeste (Tab.3).

DISTRIBUIÇÃO POTENCIAL

Os modelos consensos, aplicados nas espécies com mais de 20 pixels (S. monbin e S. venulosa), apresentaram resultados satisfatórios através de valores de omissão interna abaixo

de 5%, omissão externa média abaixo de 20% e AUC maior que 0,9. Da mesma forma, o modelo consenso para S. macrocarpa (com 18 pixels) e S. tuberosa (com 13 pixels) apresentou baixa omissão interna e probabilidade menor que 0,01 (Tab. 4). Esses resultados estão relacionados ao número de pixels, que por sua vez depende do número de registros; o que eleva a acurácia e números de acertos dos modelos (Siqueira et al. 2009). A espécie S. testudinis que apresentou número de pixels entre 5 e 9 a omissão interna foi maior que 5% e a probabilidade maior que 0,01 (Tab. 4); por isso, o modelo MaxEnt proposto para este espécie devem ser realizados em uma escala mais acurada, de forma a se obter mais pixels, garantindo assim maior qualidade nos modelos (Tab. 3). A distribuição potencial de S. tuberosa ampliou a ocorrência conhecida (RJ, ES, SP e MG) para o Nordeste área de distribuição para (TO, GO, BA, SE, AL, PE, PB, RN, CE e PI), como indicam a figura 1a e a tabela 3, regiões com condições ambientais adequadas, podendo serconsideradas como áreas passíveis de plantios, uma vez que tarta-se de espécie de potencial alimentício. S. macrocarpa também apresentou ampliação da área de ocorrência nos locais de coletas já conhecidos (RJ, ES e MG), e apontou um potencial de ocorrência em outros estados na região nordeste (TO, GO, BA, SE, AL, PE, PB, RN, CE e PI), além de algumas áreas com condições ambientais adequadas nos estados da BA, SE, AL, PE, PB (Fig. 1b). O modelo consenso ampliou a área de distribuição da espécie S. venulosa para AC, AM, RO, TO, GO, MT, MS, BA, SE, AL, PE, PB, RN, CE, PI e MA, além de ampliar a sua a área de ocorrência nos locais de coletas já conhecidos (RJ, ES, SP, MG e BA) (Fig. 1c), enquanto que o modelo consenso gerado para S. mombin não extrapolou a sua distribuição real (Fig 1 D). O modelo MaxEnt aplicado à S. testudines, espécie que apresentou o menor número de pixels (n=8), ampliou a área de distribuição conhecida (AC) para AM, RO e MS (Fig. 2 A). Esta espécie apresentou poucos pixels devido à proximidade geográfica apresentada pelos registros analizados apresentando omissão interna maior que 5%, (Tab. 3). S. globosa também apresentou um número diminuto de pixels (n=5) e o modelo MaxEnt aplicado ampliou sua área de distribuição conhecida (AC e AM) para RO, RR, MT, PA, AM, MA e PI (Fig. 2 B). Esta espécie apresentou poucos pixels em virtude do número reduzido de registros encontrados e em virtude da proximidade geaográfica apresentada pela maioria deles, apresentando assim como S. testudinis, uma omissão interna maior que 5%, (Tab. 3). Portanto, para estas espécies, o modelo proposto deve ser utilizado como ferramenta para identificar áreas com condições

ambientais favoráveis à espécie; onde novas coletas possam ser realizadas e suas populações possam ser avaliadas, como recomenda Pearson et al. (2007). Como os modelos modelo de S. testudinis e S. globosa foram elaborados, respectivamente, com apenas 8 e 5 pixels, um estudo mais detalhado, em uma escala menor é recomendado para que se confirme sua distribuição potencial. A modelagem estatística não é eficaz quando poucos pontos de dados estão disponíveis, pois os modelos não conseguem produzir previsões confiáveis (Cayuela et al. 2009). Ademais, vale frisar que não foram gerados modelos para as espécies S. admirabilis, S. bahiensis e S. expeditionaria ou em virtude do número reduzido de registros encontrados, como é caso de S. bahiensis, ou pela proximidade geográfica dos registros analisados, como ocorre com S. admirabilis e S. expeditionaria. A diferenciação observada nos nichos das espécies desse gênero mostrou uma correlação com a temperatura média anual e a sazonalidade da temperatura (especialmente durante os meses mais frios), seguida pela precipitação (especialmente nos meses mais quentes), sendo que a variação dentro destes aspectos climáticos foi um dos fatores que definiu geograficamente a ocorrência de algumas espécies. Ainda que essas variações ambientais constituem fatores de restrição de ocupação de nicho para algumas espécies, essas variações podem estar relacionadas com as adaptações fisiológicas das espécies em estudo (Crawley 1997), ocorrendo muitas vezes em diferentes regiões fitogeográficas e apresentando ampla distribuição geográfica (Fiaschi & Pirani 2009). Num âmbito da Biologia da Conservação, estudos sobre modelagem ecológica são excelentes preditores de como as espécies se comportarão sob o cenário atual de mudanças globais, onde espécies que apresentam distribuição geográfica mais restrita estarão mais suscetíveis a extinções, enquanto que outras, de distribuição mais ampla, tenderão a se adaptar às novas mudanças.

Conclusão

A distribuição espacial de espécies de Spondias pelo Brasil indicam uma distribuição com predomínio da maioria das espécies no domínio da Mata Atlântica, com exceção de S. bahiensis, S. monbin e S. testudines, que apresentam registros para Caatinga, Cerrado e Amazônia, respectivamente.

Os modelos de distribuição potencial expandiram as áreas de ocorrência de S. macrocarpa, S. venulosa, S. testudinis e S. tuberosa, enquanto que a distribuição potencial de S. monbin foi correspondente a sua distribuição real.

Tabela 1. Valores dos parâmetros ambientais WorldClim registrados para o conjunto de pontos de ocorrência para 5 espécies de Spondias: Pu+ = precipitação no trimestre mais úmido do ano; Ps+ = precipitação no trimestre mais seco do ano; Pq+ = precipitação no trimestre mais quente do ano; Pf+ = precipitação no trimestre mais frio do ano; Vt/dia = variação média de temperatura ao longo do dia; Tq+ = temperatura máxima no mês mais quente do ano; Tf- = temperatura mínima no mês mais frio do ano; At = altitude (variável indireta); * = valores médios referentes ao único pixel para a espécie. Precipitação/trimestre (mm) Temperatura (°C) At (m)

Espécie Pu+ Ps+ Pq+ Pf+ Vt/dia Tq+ Tf

Mín Máx Mín Máx Mín Máx Mín Máx Mín Máx Mín Máx Mín Máx Mín Máx

Spondias macrocarpa 862 864 130 137 462 451 208 373 10,4 10,8 31,4 32,7 18,1 18,3 151 176 Spondias venulosa. 781 861 140 360 223 384 105 347 8 12,5 32,1 31,3 14,8 16,8 689 860 Spondias testudinis 407 1080 72 352 275 639 98 903 8,4 11,4 28,5 32,9 13 22,4 100 874 Spondias monbin 790 1020 101 378 396 482 592 793 8,4 13,5 32,7 36,4 22,3 21,3 100 643 Spondias tuberosa 394 975 98 273 278 614 109 880 7 12,6 28 32,9 11,8 22,8 127 456 Spondias globosa 745 1249 114 286 254 463 132 451 21 34 27,8 39 25,6 32,4 114 431 Spondias admirabilis 652 924 123 285 260 472 326 658 9 13 31 33.2 10 21,5 136 547 Spondias bahiensis 621 863 118 259 243 384 284 571 8 12,1 27 32,8 9 22,4 141 482 Spondias expeditionaria 584 726 120 248 271 452 238 446 8,4 13 24 31,8 8 23 127 356

Tabela 2. Registro de Spondias no Brasil, encontrados nos bancos de dados (SpeciesLink e Biogeo) e utilizados para a elaboração dos modelos de distribuição das espécies no país. Legendas: Rt = número total de registros; Rv = registros com nomes válidos; Rgi = registros georreferenciados e com determinador; Px = número de pixels para Rgi; F1 = porcentagem de perda no filtro 1; F2 = porcentagem de perda no filtro 2; % = porcentagem de perda total. Espécies Rt Rv Rgi Px Perda F1(%) Perda F2(%) Perda total (%)

Spondias macrocarpa 57 45 39 18 21 13,33 34,33

Spondias venulosa. 254 193 174 65 24 9,84 33,84

Spondias testudinis 46 30 12 8 34,7 40 74,7

Spondias monbin 842 624 521 62 26 16,5 42,5 13 Spondias tuberosa 975 815 638 13 16,4 22 38,4 Spondias globosa 22 17 15 5 22,72 11,75 34,47 Spondias bahiensis 4 4 4 1 0 0 0 Spondias admirabilis 38 38 38 1 0 0 0 Spondias expeditionaria 9 9 9 1 0 0 0

Tabela 3. Nomes e sinônimos das espécies brasileiras de Spondias L. (Anacardiaceae).

1. Spondias tuberosa Arruda

= Opuntia inamoena K. Schum. = Psittacanthus bicalyculatus Mart.

2. Spondias venulosa (Engl.) Engl.

= Spondias purpurea venulosa (Mart.) Engl

3. Spondias testudinis J. D. Mitchell & D. C. Daly

não foram encontrados sinônimos

4. Spondias monbin L.

= Spondias cf. mombins L. = Spondias Spondias mombin L. = Spondias mombin mombin L. =Sponndias mombins L. = Sponndias mombin globosa L. = Spondias mombin var. globosa L. = Spondias mombin var. mombin L.

5. Spondias macrocarpa Engl.

= Melothria fluminensis Gardner. 6. Spondias admirabilis J. D. Mitchell & D. C. Daly não foram encontrados sinônimos 7. Spondias expeditionaria J. D. Mitchell & D. C. Daly não foram encontrados sinônimos 8- Spondias bahiensis P.Carvalho, Van den Berg & M.Machado não foram encontrados sinônimos 9- Spondias mombin globosa J. D. Mitchell & D. C. Daly não foram encontrados sinônimos

Tabela 4. Indicadores de qualidade dos modelos aplicados a cinco espécies de Spondias de ocorrência no Brasil - porcentagem da omissão interna (Oi) e omissão externa média (Om) e área sob a curva (AUC). Para as espécies com menos de 20 pixels, é apresentado o valor da probabilidade oriundo do teste de Poisson-binomial unicaudal. Legendas: DM = distância Mahalanobis; ENFA = Ecological-Niche Factor Analysis; GARP = Genetic Algorithm for Ruleset Prediction; MaxEnt = Maximum Entropy; SVM = Support Vector Machines. Modelos (algoritmos)

Espécies Oi Consenso DM ENFA GARP MaxEnt SVM

(%) AUC Om AUC Om AUC Om AUC Om AUC Om AUC Om

Espécies com 20 ou mais pixels

S. monbin 1,4 0,92 1,9 0,83 1,8 0,94 1,4 0,90 8,4 0,86 5,7 0,81 34,6

S. venulosa 1,6 0,96 3,1 0,88 6,7 0,92 4,6 0,94 3,0 0,94 3,1 0,87 21,5

Espécies com 10 a 19 pixels

S. macrocarpa 2,5 0,92 - - - - - < 0,01 - < 0,01

S. tuberosa 1,0 0,70 - - - - - = 0,74 - = 0,21

Espécies com 5 a 9 pixels

S. testudinis 13,5 ------< 0,01 S. globosa 17,2 < 0,01

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Espécies com zero pixel

S. expeditionaria Sem modelo S. bahiensis Sem modelo S. admirabilis Sem modelo

Tabela 5. Distribuição geográfica das espécies de Spondias do Brasil. Legendas: MaxEnt = Maximum Entropy. Distribuição real Espécies Distribuição potencial Habitat Domínio Estados

Área Antrópica, Floresta Ciliar ou Galeria, Amazônia, O modelo cosenso de dois Floresta de Igapó, Cerrado, Todos os algoritmos não extrapolou a Floresta de Terra Firme, S. mombin Mata Estados Floresta de Várzea, Atlântica distribuição real Floresta Estacional Semidecidual O modelo consenso ampliou a Mata RJ, ES e área de distribuição para TO, GO, S. macrocarpa Floresta Ombrófila Atlântica MG BA, SE, AL, PE, PB, RN, CE, PI e MA. O modelo consenso ampliou a área de distribuição para AC, Mata RJ, SP, ES e S. venulosa AM, RO, TO, GO, MT, MS, BA, Floresta Ombrófila Atlântica MG SE, AL, PE, PB, RN, CE, PI e MA.

O modelo consenso ampliou a RJ, SP, ES e área de distribuição para TO, GO, S. tuberosa Caatinga e Caatinga (stricto sensu) Cerrado MG BA, SE, AL, PE, PB, RN, CE e PI O modelo MaxEnt ampliou a área S. testudinis Amazônia AC de distribuição para AM, RO e Floresta de Terra firma MS Caatinga (Floresta AL, BA, PE e S. bahiensis Caatinga Nenhum modelo foi gerado Estacional SE Semidecidual) Floresta estacional semidecidual, Floresta Mata RJ Nenhum modelo foi gerado Ombrófila e Vegetação S. admirabilis Atlântica sob afloramentos rochosos Floresta Ombrófila e Mata ES e MG Nenhum modelo foi gerado Vegetação sob S. expeditionaria Atlântica afloramentos rochosos Área Antrópica, Floresta O modelo MaxEnt ampliou a área de Igapó, Floresta de S. globosai Amazônia AC e AM de distribuição para RR, RO, MT, Terra Firme, Floresta de PA, AM, MAe PI. Várzea

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Figura 1. Distribuição potencial das espécies de Spondias com 20 ou mais pixels: A) S. tuberosa (n = 13 pixels); B) S. macrocarpa (n = 18 pixels), C) S. venulosa (n = 65 pixels) e D) S. monbin. (n = 62 pixels). As cores representam áreas de concordância entre os algoritmos: vermelho = 5 algoritmos; laranja = 4 algoritmos; amarelo = 3 algoritmos; azul = menos de 3 algoritmos.

Figura 2. Distribuição potencial de espécie de Spondias com 5 a 9 pixels: A) S. testudinis (n = 8 pixels) e B) S. globosa (n= 5 pixels). As cores representam áreas de concordância entre os algoritmos: vermelho = 2 algoritmos; azul = menos de 2 algoritmos. 101

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8. CAPÍTULO 4. Novos registros de Spondias venulosa (Engl.) Engl. para o estado do Tocantins – TO, Brasil.

Artigo publicado no periódico Multidisciplinary Scientific Journal DOI: 10.32749

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Abstract

Spondias venulosa (Engl.) Engl. is known to be widely distributed in the Atlantic Forest domain, occurring in the Southeast and Northeast regions of Brazil. The present study extends its distribution area to the northern region of Brazil by finding new records for Tocantins state, in to the Cerrado domain and provides new geographical data that may contribute to the expansion of knowledge on the geography and conservation of the species.

Key-words: Anacardiaceae, Spondias, distribution extension and Cerrado.

Resumo

Spondias venulosa (Engl.) Engl. é conhecida por estar amplamente distribuída pelo domínio da Mata Atlântica, ocorrendo nas regiões Sudeste e Nordeste do Brasil. O presente estudo amplia a sua área de distribuição para a região Norte do Brasil ao encontrar registros de ocorrência inéditos para o estado do Tocantins, dentro do domínio do Cerrado, fornecendo assim, novos dados que poderão contribuir para ampliação do conhecimento sobre a geografia e a conservação da espécie.

Palavras-chaves: Anacardiaceae, Spondias, ampliação de distribuição e Cerrado.

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Introdução

Spondias L. pertence à Anacardiaceae R. Br., uma família que abarca mais de 850 espécies de árvores, arbustos e lianas ou ervas perenes, distribuídas majoritariamente em zonas tropicais e subtropicais em todo o mundo (Pell et al., 2011). Inúmeras espécies de Anacardiaceae são exploradas em virtude dos seus potenciais, madeireiros, medicinais e alimentares (Pell et al. 2011). Dentre as espécies com frutos comestíveis e utilizadas como fontes de alimento em escala regional, destacam-se o cajá (Spondias monbin L.) e a ciriguela (Spondias purpurea L.), espécies pertencentes ao gênero Spondias (Pell et al., 2011 e Mitchell & daly, 2015). O referido gênero possui uma distribuição pantropical, com espécies que ocorrem nas ecorregiões Neotropical, Afrotropical, Indo-Malaia, Australásia e Oceania, sendo o gênero que possui a distribuição geográfica mais ampla dentro da subfamília Spondioideae (Pell et al. 2011). Este gênero compreende árvores de grande, médio e pequeno porte, adaptadas a áreas úmidas, sazonalmente secas e semiáridas (Mitchell & DALY, 2015 e Forzza et al, 2012). No Brasil, espécies de Spondias se distribuem nas regiões, Sudeste, Centro-Oeste, Norte e Nordeste (Silva-luz & Pirani, 2014), sendo encontradas em diversos tipos de vegetação nos domínios da Amazônia, Mata Atlântica e Caatinga (Mitchell & Daly, 1998 e Mitchell & Daly, 2015). Embora corresponda a um gênero de ampla distribuição geográfica pelo Brasil, estudos sobre a geografia de Spondias L. ainda são escassos, evidenciando a necessidade da realização maiores esforços para o fortalecimento da compreensão sobre a evolução, a migração e a distribuição espacial deste gênero no Brasil (Mitchell & Daly, 2015). Durante trabalhos de campo realizados no estado do Tocantins, foram identificados, pela primeira vez neste estado, quatro registros de Spondias venulosa (Engl.) Engl. Tais registros evidenciam a ampliação de sua distribuição do domínio da Mata Atlântica para o domínio do Cerrado e fornecem novas informações que poderão contribuir para a ampliação do conhecimento sobre a biogeografia e conservação desta espécie. O presente estudo tem como objetivo fornecer dados atualizados de distribuição geográfica, mapa com as novas ocorrências para o estado do Tocantins, descrições morfológicas e informações sobre o hábito e fenologia da espécie analisada.

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Material e métodos

Dados sobre a morfologia, distribuição geográfica, informações sobre o hábito e informações sobre fenologia da espécie foram baseadas em estudos de Mitchell & Daly (2015), nas análises das coleções de Anacardiaceae dos herbários da Universidade Federal do Rio de Janeiro (RB) e do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro (RFA) e informações do Centro de Registros de Informações Ambientais (CRIA, 2018). As formações vegetais foram classificadas de acordo com Veloso et al. (1991) e, apenas os novos registros de ocorrências para o estado do Tocantins são tratados neste estudo. O mapa de distribuição geográfica foi elaborado com o programa DIVA-GIS 7.5 (Hijmans et al., 2012) e baseado nos registros presentes no Centro de Registros de Informações Ambientais (CRIA, 2018). Os registros considerados neste estudo e utilizados na elaboração do mapa de distribuição geográfica apresentado são aqueles cujos táxons foram reconhecidos pelos autores como exemplares de S. venulosa e os registros realizados pelos especialistas no grupo, os pesquisadores John D. Mitchell e Douglas Daly.

Resultados e Discussão

Durante coletas botânicas realizadas em 2016 na região Norte do Brasil, foram identificados, pela primeira vez, registros de quatro ocorrências de Spondias venulosa para o estado do Tocantins -TO. Até o momento a espécie havia sido registrada apenas para o domínio da Mata Atlântica, sendo considerada por diversos autores como restrita a este domínio (Mitchell & Daly, 2015; Silva-Luz & Pirani, 2014 e Forzza et al., 2012). Os novos registros aqui apresentados ampliam a distribuição desta espécie do domínio da Mata Atlântica para o domínio do Cerrado. Spondias venulosa (Engl.) Engl. é conhecida pelos nomes populares: cajá, cajazeira, cajá-pau, cajá-de-pescoço, cajá-brava e cajá-graúdo (Mitchell & Daly, 2015), possui porte elevado, podendo atingir 10–20 m de altura (Figura 1A), e ramifica quando se encontra a vários metros do chão. As folhas possuem 15–30 cm de comprimento com 3–6 pares de folíolos (Figura 1B). As folhas são glabras e a raque apresenta coloração avermelhada (Figura 1B). Os folíolos são elípticos, com o ápice acuminado e a base simétrica, truncada (Figura 1B). A margem na base do folíolo é revoluta e apresenta tricomas hirsutos restritos à área revoluta, configurando-se em uma domácia. Os frutos são drupas ovóides ou oblongas, de coloração

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amarelada quando maduros, podendo apresentar lenticelas em sua superfície e coloração verde quando imaturos (Figura 1C), que se desenvolvem isolados ou em pequenos cachos de 2–6 frutos. As inflorescências são do tipo panículas terminais, de formato piramidal, com 20–30 cm de comprimento (Figura 1D). O cajá-de-pescoço é uma árvore frutífera nativa da Mata Atlântica, que se distribui pelos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Espírito Santo, Bahia, Sergipe, Alagoas, Ceará, e Maranhão, sendo encontrada em florestas mais secas, semideciduais a deciduais (Lorenzi et al., 2006; Santos et al., 2008; Silva-Luz & Pirani, 2014 e CRIA, 2018). Trata-se de uma planta muito pouco cultivada (Lorenzi et al., 2006). A referida espécie não é amplamente cultivada em hortas caseiras, mas é encontrada em alguns parques brasileiros, jardins botânicos e arboretos (Lorenzi et al. 2006 e Mitchell & Daly, 2015). Não há dados em literatura ou informações presentes nas coleções em herbário que estabeleçam um período de polinização ou dispersão dessa espécie. Contudo, existem registros de que a espécie entra em floração entre os meses de agosto-fevereiro e frutificação entre os meses de janeiro-setembro. Os frutos são comestíveis e ocasionalmente usados para fazer sucos; sendo a maioria dos frutos coletada na natureza (Lorenzi et al., 2006). A maioria dos indivíduos de S. venulosa foi coletada, no município de Taquaraçu (cerca de 32 km do centro da cidade de Palmas, capital do estado do Tocantins), em áreas de Cerrado úmido (florestas de galeria) - conhecidas como Cerradão - (Veloso et al, 1991) e apenas uma ocorrência foi registrada para a região metropolitana de Palmas, dentro do Parque Municipal Cesamar (Figura 2). A cobertura vegetal das áreas de Cerradão é formada principalmente por savanas e vegetações de campo, compostas por gramíneas, distribuídas em um solo bem drenado de uma planície aluvial. Há uma extensa área pantanosa coberta por campos úmidos, intercalados por florestas de galeria ou florestas paludais associadas a cursos de água perenes. Os tipos predominantes de solo na região são os Concrecionários, Latossolos e Neossolos Quartzarênicos (Veloso et al., 1991). Embora as citações quanto à distribuição geográfica desta espécie apontem para uma distribuição restrita ao domínio Mata Atlântica (Mitchell & Daly, 2015; Silva-Luz & Pirani, 2014 e Forzza et al., 2012), os novos registros de S. venulosa apresentados por este estudo, ampliam a sua distribuição geográfica e demostram que este táxon também possui distribuição pelo domínio do Cerrado, mas especificamente pelas áreas de Cerradão (florestas de galeria), indicando que o conhecimento sobre a geografia desta espécie ainda se encontra incipiente. 111

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Conclusão

Os registros aqui apresentados ampliam a ocorrência de S. venulosa entre os domínios vegetais brasileiros, com a adição de sua distribuição geográfica para o domínio do Cerrado. Até então, esta espécie era registrada apenas para o domínio da Mata Atlântica. Tais registros apontam para a existência de lacunas quanto ao conhecimento sobre a biogeografia da espécie e evidenciam a necessidade de maiores estudos com enfoques biogeográficos para o grupo.

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Figura 1: Spondias venulosa. A: Hábito. B: Ramo mostrando folha, folíolos e frutos imaturos. C: Frutos imaturos. D: Ramo com inflorescências. Fonte: autor

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Figura. 2. Mapa dos estados brasileiros. Os estados marcados representam a distribuição geográfica atualizada de S. venulosa pelo Brasil segundo Forzza et al (2012) e CRIA (2018). Os novos registros para o estado do Tocantins estão representados pelo símbolo (+). Os nomes dos estados estão abreviados de acordo com o IBGE. AC – Acre, AL – Alagoas, AM – Amazonas, AP – Amapá, BA – Bahia, CE – Ceará, DF – Distrito Federal, ES Espírito Santo, FN – Arquipélago Fernando de Noronha, GO – Goiás, MA – Maranhão, MG – Minas Gerais, MS – Mato Grosso do Sul, MT – Mato Grosso, PA – Pará, PB – Paraíba, PE – Pernambuco, PI – Piauí, PR– Paraná, RJ – Rio de Janeiro, RN – Rio Grande do Norte, RO– Rondônia, RR – Roraima, RS – Rio Grande do Sul, TO –Tocantins, SE – Sergipe, SC – Santa Catarina, SP – São Paulo. Fonte: autor

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Referências Bibliográficas

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9. CONCLUSÕES GERAIS FINAIS

De acordo com nossos resultados, as circuncisões baseadas em DNA realizadas foram, de maneira geral, congruentes com as delimitações das espécies morfológicas. No entanto, GMYC e bPTP expuseram incongruências entre delineamentos morfológicos e inferências de reconstruções filogenéticas moleculares, levando à proposição de quatro linhagens de Spondias para a Mata Atlântica, apesar de cinco linhagens propostas por estudos anteriores e do reconhecimento de S. expeditionaria como S. macrocarpa. Essas incongruências podem decorrer de processos evolutivos, mas também demonstram a necessidade de um trabalho taxonômico integrativo, envolvendo mais marcadores genéticos e dados morfológicos, químicos e ecológicos para corroborar ou contradizer estes resultados de delimitação de espécies bayesianas para o gênero Spondias. Através da análise dos diferentes parâmetros quimiossistemáticos para o gênero Spondias foi possível constatar que o perfil químico do gênero se caracteriza pela ocorrência de taninos terpenoides, flavonóides, alcalóides e saponinas, sendo que a biossíntese dos seus metabólitos especiais se baseia, principalmente, na via do ácido acético, fato que corrobora com o posicionamento deste gênero entre as angiospermas mais derivadas. Os taninos, principalmente os taninos condensados de cadeia longa, em virtude da grande variação estrutural encontrada, se apresentam como importantes marcadores taxonômicos para o grupo. A distribuição espacial de espécies de Spondias pelo Brasil indicam uma distribuição com predomínio da maioria das espécies no domínio da Mata Atlântica, com exceção de S. bahiensis, S. monbin e S. testudines, que apresentam registros para Caatinga, Cerrado e Amazônia, respectivamente, corroborando com os dados presentes em literatura especializada. Os modelos de distribuição potencial expandiram as áreas de ocorrência de S. macrocarpa, S. venulosa, S. testudinis e S. tuberosa, enquanto que a distribuição potencial de S. monbin foi correspondente a sua distribuição real, além de indicar áreas com condições ideais para o cultivo destas espécies. A diferenciação observada na modelagem ecológica das espécies desse gênero mostrou uma correlação com a temperatura média anual e a sazonalidade da temperatura (especialmente durante os meses mais frios), seguida pela precipitação (especialmente nos meses mais quentes), sendo que a variação dentro destes aspectos climáticos foi um dos fatores que definiu

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geograficamente a ocorrência de algumas espécies. Ainda que essas variações ambientais constituem fatores de restrição de ocupação de nicho para algumas espécies, essas variações podem estar relacionadas com as adaptações fisiológicas das espécies em estudo, ocorrendo muitas vezes em diferentes regiões fitogeográficas e apresentando ampla distribuição geográfica.

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