Présenté Par : M Sakina ZEROUAL Thème CARACTÉRISATION CHIMIQUE ET ACTIVITÉ ANTIOXYDANTE DES HUILES ESSENTIELLES D'une P

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE ABOU BEKR BELKAÏD DE TLEMCEN Faculté des Sciences Département de Chimie Laboratoire des substances naturelles et bioactives (LASNABIO) MEMOIRE Présenté pour obtenir le diplôme de : MASTER EN CHIMIE

Option : Molécules Bioactives : Synthèses et Applications

Présenté Par : Melle Sakina ZEROUAL

Thème CARACTÉRISATION CHIMIQUE ET ACTIVITÉ ANTIOXYDANTE DES HUILES ESSENTIELLES D’UNE PLANTE DE LA FAMILLE DES FABACÉES : Psoralea bituminosa L.

Soutenu le : 05/06/2016 Devant le jury

Président Boufeldja TABTI Pr. Université de Tlemcen Examinateurs Meriem BENYAROU Pr. Université de Tlemcen Nassim DJABOU MC(A) Université de Tlemcen Promoteur Chaouki SELLES MC(A) Université de Tlemcen

Année-universitaire: 2015-2016

Dédicaces

Avec un énorme plaisir, un cœur ouvert et une immense joie, que je dédie ce travail A mes très chers parents qui m’ont guidé durant les moments les plus pénibles de ce long chemin, ma mère qui a été à mes côtés et m’a soutenu durant toute ma vie, et mon père qui a sacrifié toute sa vie afin de me voir devenir ce que je suis. Merci mes parents A mes chers frères : Mohammed Riad, Oussama, Farid. A mes grands-mères. A mon fiancé et toute sa famille. A mes très chères amies : Asmaa, Nassima, Farah, Khamsa. A toute la famille ZEROUAL et KEBBATI. A la mémoire de notre chère amie « AGHA-MIR ASMA ». Veuillez tous, accepter mes hautes salutations et considérations. Que Dieu puisse vous protéger. SAKINA Remerciements

J’aimerais en premier lieu remercier mon dieu Allah qui m’a donné la volonté et le courage pour la réalisation de ce travail, qui a été effectué dans le Laboratoire des Substances Naturelles et Bioactives (LASNABIO), pour cela je tiens à remercier son directeur Pr. Saïd GHALEM ainsi que le chef de l’équipe des huiles essentielles le Pr. Boufeldja TABTI pour toute l’aide et les conseils qui nous ont apportés. Ma reconnaissance, et mes sincères remerciements vont à mon encadreur Monsieur Chaouki SELLES pour m'avoir dirigé tout au long de la réalisation de ce travail. Ses orientations, ses encouragements, sa compréhension, sa disponibilité constante m'ont été d'une précieuse aide. J’exprime ma profonde reconnaissance au Pr. Mohamed el Amine DIB de m’avoir aidé et pour ses conseils, ses commentaires et sa bienveillance. Qu’il soit assuré de ma profonde gratitude pour m’avoir guidé tout au long du cursus de Master. Je remercie également, Mr Nassim DJABOU pour ses conseils éclairés, et pour son soutien et son aide. Je voudrais également remercier tous les membres du jury pour avoir accepté d’évaluer ce travail et pour toutes leurs remarques et critiques sans oublier le Pr. Meriem BENYAROU. Mes remerciements vont également à tous les enseignants du département de chimie. Je ne peux oublier de remercier chaleureusement mes très chères amies, pour l’ambiance cordiale et leur aide permanente qui a fait preuve d’une grande patience suite à mes plaintes et mes satisfactions : Asma, Nassima, Imene, Radia. Un grand merci à tous mes amis de la promotion du Master MBSA. Je vous remercie tout simplement d’être vous-même et pour les moments inoubliables que nous avons partagés ensemble, ainsi que l’ambiance particulière qui nous a aidés à bien mener le cheminement de notre travail. Merci infiniment. Mes plus profonds remerciements vont à mes parents. Tout au long de mon cursus, ils m’ont toujours soutenu, encouragé et aidé. Ils ont su me donner toutes les chances pour réussir. Qu’ils trouvent, dans la réalisation de ce travail, l’aboutissement de leurs efforts ainsi que l’expression de ma plus affectueuse gratitude. Je ne peux oublier mon entourage, famille et amis pour leur travail invisible dans cette longue tache ainsi qu’à tous les gens que j’aime et qui m’aiment.

Abréviations utiles

AA : Acide ascorbique.

Abs : Absorbance.

BHA : Hydroxy anisol butylé.

BHT : Hydroxy toluène butylé.

CPG : Chromatographie en phase gazeuse.

CPG/SM : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.

D.O : Densité optique.

DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl.

FRAP : Ferric Reducing Ability of Plasma.

H.E : Huiles essentielles. HY : Hydrolat.

IC50 : Concentration d’inhibition de 50% des radicaux libres. IR : Indice de rétention. m : masse.

Min : minute.

P.bituminosa L. : Psoralea bituminosa L.

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire.

T : Température.

UV-VIS : Ultrat Violet/Visible.

V : Volume.

% HE : Rendement en huile essentielle.

%HY : Rendement en hydrolat.

%I : Pourcentage d’inhibition. Sommaire

Remerciements Abréviations utiles Liste des figures Liste des tableaux Introduction générale ...... 1

Chapitre I : Partie bibliographique I.1. Présentation de la plante étudiée Psoralea bituminosa L...... 4 I.1.1. Présentation des Fabacées : ...... 4 I.1.2. Caractéristiques des Fabacées : ...... 4 I.1.3. Importance économique : ...... 5 I.2. Présentation du genre Psoralea :...... 5 I.3. Caractérisation et présentation de Psoralea bituminosa L...... 5 I.3.1 Description botanique de la plante : ...... 6 I.3.2. Classification : ...... 7 I.3.3.Autres utilisations : ...... 8 I.3.4. Effets secondaires et contre-indications : ...... 8 I.4. Travaux scientifiques réalisés sur Psoralea bituminosa L...... 8

Chapitre II : Partie expérimentale II.1. Introduction : ...... 13 II.2. Matériel et méthodes : ...... 13 II.2.1.Provenance du matériel végétal et identification : ...... 13 II.2.2.Séchage et Conservation : ...... 14 II.2.3.Criblage phytochimique : ...... 14 II.2.4- Extraction des huiles essentielles et de l’hydrolat de la partie aérienne de Psoralea bituminosa L.: ...... 17 II.2.4.1.Introduction : ...... 17 II.2.4.2.Technique d’extraction : L’hydrodistillation ...... 18 II.2.4.3.Obtention de l’hydrolat : ...... 19 II.2.5. Méthodes d’identification chimique des huiles essentielles de Psoralea bituminosa L...... 20 II.2.6.Activité antioxydante des huiles essentielles et de l’hydrolat : ...... 20 II.2.6.1.Test de piégeage du radical libre DPPH : ...... 20 II.2.6.2.Test de la réduction du fer FRAP : ...... 21 II.2.6.3. Inhibition de blanchiment du β-carotène : ...... 22 II.3. Résultats et discussion ...... 23 II.3.1.Criblage phytochimique : ...... 23 II.3.2.Huiles essentielles et hydrolat : extraction et analyses : ...... 24 II.3.3.Activité antioxydante des huiles essentielles et de l’hydrolat de la partie aérienne de Psoralea bituminosa L. : ...... 27 II.3.3.1.Test de piégeage du radical libre DPPH : ...... 27 II.3.3.2.Méthode de réduction des ions ferriques FRAP : ...... 28 II.3.3.3.Test de blanchissement de β-carotène : ...... 29 Conclusion : ...... 32 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 34 ANNEXE ...... 38

LISTE DES FIGURES

Figure I.1 Feuilles de Psoralea bituminosa L. 7 Figure I. 2 Fleur de Psoralea bituminosa L 7 Figure II.1 Carte géographique de la wilaya de Tlemcen 13 Figure II.2 Montage de l’extracteur Soxhlet 14 Figure II.3 Montage d’hydrodistillation type Clevenger. 19 Figure II.4 Récupération de l’hydrolat 19 Figure II. 5 Ampoule à décanter 19 Figure II.6 Réaction du DPPH avec un antioxydant. 21 Figure II.7 Structure du β-carotène 22

Figure II.8 Composés majoritaires de l’H.E de P.bituminosa L. 26

Figure II.9 Composés majoritaires de l’H.Y de P.bituminosa L. 26

Figure II.10 Réduction du radical du violet au jaune par l’H.E de P. 27 bituminosa L. Figure II.11 Pourcentage d’inhibition de : HE, HY, AA 28

Figure II.12 Absorbance de : HE, HY et AA en fonction de la 29 concentration Figure II.13 Pourcentage d’inhibition de : HE, HY, BHT 30

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I.1 Composés majoritaires des HE des feuilles, fleurs et graines. 9

Tableau I.2 Composés majoritaires des HE des feuilles et des fleurs. 10

Tableau II.1 Résultats du criblage phytochimique. 23

Tableau II.2 Composition chimique de l’H.E et de l’H.Y de la partie aérienne de P. bituminosa L. 24

Tableau II.3 % d’inhibition du DPPH par H.E, HY et AA 27

Tableau II.4 Pouvoir antioxydant par la méthode de FRAP. 28

Tableau II.5 Activité antioxydante de H.E et de HY par la méthode de β- carotène 29

Tableau II.6 Activité antioxydante de BHT par la méthode de β-carotène 29

Introduction générale

A travers les siècles, les traditions humaines ont su développer la connaissance et l’utilisation des plantes médicinales dans le but de vaincre la souffrance et d’améliorer la santé des hommes. Ni le hasard, ni la religion et ni la superstition n’a guidé la médecine traditionnelle à employer une plante plutôt qu'une autre. Certainement, c’est l’expérience où les gens apprécient les vertus apaisantes et analgésiques des plantes [1]. En effet, les plantes possèdent des milliers de substances actives à l'intérieur de leurs organes (feuilles, fleurs, racines,...) et peuvent, selon des techniques chimiques (extraction, distillation,....), permettre l'isolation du principe actif pour l’utiliser en pharmacie. Ces remèdes naturels sont bien souvent très efficaces avec moins d'effets secondaires reconnus que beaucoup de médicaments de synthèse, mais peuvent néanmoins être mortels ou toxiques pour l'organisme lorsqu'ils sont mal utilisés [2]. Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêts multiples mis à profit dans l’industrie : en alimentation, en cosmétologie et en dermopharmacie. Parmi ces composés on retrouve dans une grande mesure les métabolites secondaires qui se sont surtout illustrés en thérapeutique [3]. Dans le cadre de la recherche de molécules ou activités biologiques nouvelles d’origine végétale, il est donc préférable de ne pas baser le choix des plantes à étudier sur le seul hasard, mais de le circonscrire selon divers critères. Le plus utilisé est celui de leur emploi en médecine traditionnelle ou populaire qui valorise l’expérience accumulée par les autochtones dans le monde entier, y compris dans les pays occidentaux. Parmi ces constituants d’origine végétale, les huiles essentielles (H.E), riches en terpénoïdes et en composés non-terpénoïdiques, possèdent des propriétés biologiques diverses et intéressantes. Elles constituent donc une source attirante de nouveaux composés dans la recherche de molécules bioactives. La médecine moderne utilise les vertus thérapeutiques des H.E et de leurs constituants. En effet, de nombreux composés volatils sont aujourd'hui des ingrédients courants des préparations pharmaceutiques. Les H.E ont été considérées comme les agents antimicrobiens et antioxydants les plus efficaces présents dans ces plantes. Les qualités antimicrobiennes et antioxydantes des plantes aromatiques et médicinales sont connues depuis longtemps. Toutefois, il aura fallu attendre le début du 20ème siècle pour que les scientifiques commencent à s’y intéresser. Ces propriétés antimicrobiennes et antioxydantes sont dues à la fraction des H.E contenue dans les plantes. Il existe aujourd’hui approximativement 3000 huiles, dont environ 300 sont réellement commercialisées, destinées principalement à l’industrie des arômes et des parfums. Mais la tendance actuelle des consommateurs à rechercher une alimentation plus naturelle, a entraîné un regain d’intérêt des scientifiques pour ces substances. Depuis l’antiquité, les plantes aromatiques furent utilisées le plus souvent par les parfumeries. Cependant, durant ces dernières décennies, elles sont devenues sources d’antioxydants naturels et d’agents antimicrobiens. Les H.E quant à elles, ainsi que les extraits aromatiques ont été utilisés pour

1 leurs propriétés antiseptiques. Dans l’Egypte ancienne, les techniques de l’embaumement utilisant les résines aromatiques, ainsi que l’H.E, produisaient une inhibition puis une destruction de tous les microorganismes présents, en assurant une conservation pratiquement infinie du corps. Dans les vieux ouvrages de médecine, les résines aromatiques ou l’H.E étaient les principes actifs qu’on peut retrouver dans les différentes drogues végétales ayant des propriétés antiseptiques significatives. Dans les ouvrages les plus récents, l’utilisation des H.E dans l’aromathérapie laisse entrevoir une perspective d’alternative aux médicaments de synthèse. Les plantes aromatiques possèdent plusieurs activités biologiques, parmi lesquelles on peut citer les activités suivantes : fongistatique, insecticide, nématicide, herbicide, bactériostatique, antioxydante [4]. Nombreuses sont les espèces aromatiques et médicinales non exploitées. Pour notre part, nous avons choisi d’étudier une plante de la famille des fabacées : Psoralea bituminosa L. Pour mener à bien cette étude, un certain nombre d’objectifs a été fixé :  Réaliser un criblage phytochimique à partir de la partie aérienne de la plante pour déceler la présence de différents groupes de familles chimiques ;  Extraire les huiles essentielles (HE) et de récupérer l’hydrolat (HY) par hydrodistillation ;  Effectuer les analyses chromatographiques : CPG et CPG/SM ;  Déterminer l’activité antioxydante par trois méthodes différentes.

Chapitre I :

Partie bibliographique

CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.

I.1. Présentation de la plante étudiée Psoralea bituminosa L.

I.1.1. Présentation des Fabacées :

La famille des Fabaceae ou légumineuses est une très grande famille des plantes Magnoliophytiques qui comprendrait 12000 espèces reparties en plus de 650 genres.

Ce sont des plantes herbacées, des arbustes, des arbres ou des lianes. La famille est cosmopolite des zones froides à tropicales. La fonction chlorophyllienne est parfois transférée aux tiges [5].

De nombreuses plantes de cette famille ont une grande importance économique pour les humains qui ont appris très tôt à les cultiver et à en exploiter les ressources [6].

I.1.2. Caractéristiques des Fabacées :

Elles peuvent être : herbacées, ligneuses (Ulex, Robinia, Cytisus, Genista…) et il en existe même sous forme de lianes.

Les feuilles sont à phyllotaxie alterne le plus souvent et revêtissent différentes formes : simples, composées, épineuses.

Les feuilles sont généralement stipulées, quelques fois les stipules se sont transformées en épine.

 Fleurs des Fabacées :

Les nombreuses représentantes des Fabacées montrent diverses types d’inflorescences : en grappe le plus souvent, en corymbe, en ombelle (Anthyllis Coronilla) ou encore en fleurs solitaires. Les fleurs sont hermaphrodites et régulières. L’architecture des fleurs est caractéristique de la Famille. La structure des fleurs est semblable à toutes les espèces, on dit qu’elles sont Papilionacées. Les pièces florales sont toujours disposées de la même façon mais peuvent avoir des dimensions différentes.

La corolle possède cinq pétales plus ou moins libres et colorés par différentes teintes.

 Fruits des Fabacées

Fruit en gousse, caractéristique de la famille [7].

4 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.

I.1.3. Importance économique :

La famille des Fabaceae a une grande importance économique. Les graines de ces espèces constituent une source protéique végétale pour l'alimentation animale et humaine ; leur culture ne nécessite pas d'engrais azotés.

Cette famille produit également des essences d'exploitation, des plantes ornementales, médicinales. Certaines espèces constituent les hôtes des chenilles alimentaires [5].

I.2. Présentation du genre Psoralea

D'un point de vue systématique, le genre Psoralea, appartient à la famille des Légumineuses, sous- famille des Papilionacées et tribu des psorazejae. Le genre comprend approximativement 120 espèces principalement réparties en Afrique du Sud, 45 espèces; en Amérique du Nord, 30 espèces et en Australie, 15 espèces. Cependant, les Psoralées sont également représentées en Asie, Amérique du Sud et dans tout le bassin méditerranéen. En France, on ne trouve qu'une seule espèce: Psoralea bituminosa L., très courante dans tout le midi méditerranéen et qui tient son nom de la forte odeur de bitume qu'elle dégage lorsqu'on triture ses feuilles.

D'une manière générale, les Psoralées peuvent être considérées comme des plantes de milieux difficiles. Les Psoralées australiennes se distribuent principalement dans les savanes boisées à Eucalyptus et à Acacias qui recouvrent la majorité du continent. Ce sont des zones semi-arides recevant 250 à 500 mm d'eau par an. Les précipitations se répartissent presque exclusivement durant le printemps austral. La période de végétation active des Psoralées correspond donc à cette saison où les températures sont élevées [8].

I.3. Caractérisation et présentation de Psoralea bituminosa L.

La Bituminaria bituminosa L. (Psoralée à odeur de bitume) est une espèce végétale appartenant à la famille des Fabacées (sous-famille des Faboïdées, tribu des Psoralées), et c’est une légumineuse éternelle de sécheresse de pâturage et une source des composés pharmaceutiques, largement distribuée dans le bassin méditerranéen et Macaronesia. Une grande diversité existe en Îles Canaries avec trois variétés botaniques décrites et d'autres écotypes à l'étude [9].

C'est une plante herbacée vivace à feuillage caduc haute de 20 centimètres à près d'un mètre. Ses tiges grêles, coriaces à la base, portent des feuilles caulinaires espacées disposées de façon alterne. Le pied de la plante, parfois très ramifié, à l'instar de ses feuilles qui le sont très peu, présente souvent une

5 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE. rosette de feuilles radicales dressées. Pubescentes comme le reste de la plante, ses feuilles sont pétiolées. Elles présentent trois folioles elliptiques acuminées au contour entier et à nervation pennée.

Il s’agit d’une plante sauvage des zones chaudes et sèches et des sols calcaires pauvres même pierreux. En outre, elle est très bien adaptée à la sécheresse et aux expositions ensoleillées.

La Psoralée à odeur de bitume est une plante hermaphrodite qui fleurit en été (de juin à septembre environ).

Ses fleurs zygomorphes papilionacées sont réunies en inflorescences axillaires longuement pédonculées. Contrairement aux apparences, ces inflorescences ne sont pas des capitules mais des racèmes dressés très compacts.

Ses fleurs caractéristiques des Faboïdées présentent un calice velu, un étendard et deux ailes bleus ainsi qu'une carène blanche. Ses fruits sont des gousses lancéolées et pointues portées par les calices persistants [10].

Nom scientifique : Psoralea bituminosa L.

Autre noms scientifiques : Butiminaria bituminosa, Aspaltium bituminosum, Aspaltium frutescens, Bipontinia bituminosa, Dorychnium angustifolium, Dorychnium rotundifolium, Lotodes bituminosa, Psoralea foetida, Psoralea palaestina, Psoralea plumosa, Rhyncodium bituminosum, Rhyncodium palaestinum.

Autres noms communs : Herbe au bitume, Trèfle bitumineux, Trèfle puant, Psoralée à odeur de goudron, pois arabe [11].

Appellations locales : Mentina , Adna [12].

I.3.1 Description botanique de la plante :

Plante vivace de 50 cm à 1 mètre, herbacée, pubescente-glanduleuse, dressée, à forte odeur de bitume; feuilles trifoliolées (Figure I.1), à folioles elliptiques ou lancéolées, entières, ponctuées- glanduleuses ; stipules libres, linéaires acuminées ; fleurs bleuâtres (Figure I.2), 10-15 en têtes subglobuleuses, involucrées, serrées, sur des pédoncules axillaires 2-4 fois plus longs que la feuille ; calice velu, en cloche, à 5 dents inégales, lancéolées-linéaires, égalant le tube ; étendard oblong,

6 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE. dépassant les ailes et la carène obtuse ; étamines diadelphes ; stigmate en tête ; gousse incluse, ovale- comprimée, à bec ensiforme 2 fois plus long quelle, non stipitée, velue, indéhiscente, à une seule graine[13].

Figure I.1 : Feuilles de Psoralea bituminosa L. Figure I. 2 : Fleur de Psoralea bituminosa L.

I.3.2. Classification :

- Règne : plantae.

- Sous-règne : tracheobionta.

- Division : magnoliophyta.

- Classe : magnoliopsida.

- Sous-classe : rosidae.

- Ordre : fabales.

- Famille : fabaceae.

- Genre : bituminaria [14].

7 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.

I.3.3.Autres utilisations :

La psoralée fait partie des plantes médicinales impliquées dans de nombreuses médecines traditionnelles, la médecine ayurvédique et la médecine traditionnelle chinoise et de la médecine Siddha (médecine du sud de l'Inde et des plus anciennes datant d'au moins dix mille ans) :

Dans la médecine ayurvédique, la psoralée caractérisée par un parfum particulier est utilisée en tant qu'élément aromatique.

Elle était et l'est encore préconisé pour traiter toutes sortes de bactéries et d'infections fongiques de l'organisme, de plus elle stimule l'urination et la perspiration (transpiration sans sudation apparente), elle traite également les troubles de la constipation. Elle est un traitement de tous les problèmes de la peau, comme la lèpre, le psoriasis et le leucoderme (dépigmentation de la peau se traduisant par des taches blanches), par une application renouvelée, elle finit par estomper les taches blanches.

De plus, elle calme et remédie les morsures de reptiles venimeux et les piqures d'insectes.

Pour la médecine traditionnelle chinoise, le bu gu zhi (nom chinois du psoralea) est de nature très chaude et de saveur amère et piquante, il cible les organes des reins et de la rate. Pour ce faire dans leur pharmacopée, elle est utilisée pour tonifier les reins et fortifier le yang, elle préserve l'essence et elle réchauffe la rate et freine les diarrhées. Cela se traduit par une tonification du système rénal ainsi que de l'organisme en général, elle est d'une grande efficacité pour aider à la guérison des fractures des os et elle permet de soulager les douleurs de la carie dentaire.

Cette plante aux mille vertus fait également l'objet d'étude et de recherches pharmacologiques, principalement sur ses capacités chimioprotectrices, antimicrobiennes et anti-inflammatoires [15].

I.3.4. Effets secondaires et contre-indications :

La psoralée est déconseillée durant la grossesse et l'allaitement. Cette plante pourrait entrainer une sensibilité accrue de la peau poussant à éviter les bains de soleil durant le traitement [15].

I.4. Travaux scientifiques réalisés sur Psoralea bituminosa L.

Les travaux antérieurs sur cette plante et qui seront exposés, sont le résultat d’une recherche bibliographique basée surtout sur la banque de données SNDL. En 1995 [16] , il a été démontré que P. bituminosa L. est une plante xérophile ayant le potentiel de protéger le sol contre l'érosion côtière.

8 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.

En plus, elle contient des composés antibactériens non caractérisés et elle est utilisée comme complément capillaire pour les cheveux [17]. Jusqu’à 1997 [18], aucune recherche chimique n’avait été faite sur cette plante, sauf le traitement des échantillons de P.bituminosa L. par hydrolyse, qui a démontré la présence de furanocoumarine. Les travaux qui ont suivi, ont montré que le genre cosmopolite et polymorphe, Psoralea L. avec plus de 120 espèces est connu en phytochimie comme source de furanocoumarines, dont le composé archétype (furo[3,2-g][1]benzopyran-7-one) a été appelé plus tard le psoralène. D’autre part, l'apparition de furanocoumarines n’est pas une caractéristique principale du genre, qui est caractérisé par d'autres métabolites secondaires , en particulier les isoflavonoïdes shikimates et les monoterpenoides [19]. En Italie [20], Pistelli et son équipe ont porté leurs études sur les parties aériennes de P. bituminosa L.,qui a révélé en plus des composés phénoliques connus, les pterocarpanes prénylés : bitucarpine A et B, dont les structures ont été élucidées par des techniques spectroscopiques. Un isoflavonoïde connu (8- prenyldaidzein) a également été obtenu pour la première fois. L’année qui suit [21], Les huiles essentielles obtenues par microextraction en phase solide (SPME), de la partie aérienne ( feuilles, fleurs et graines ) de Psoralea bituminosa L. ont été analysées par GC et GC-MS. La présence de monoterpènes ou d’alcools aliphatiques a été également étudiée. Les huiles essentielles ont montré des différences qualitatives et quantitatives.

Composés Feuilles Fleurs Graines majoritaires Caryophyllene 23% 18% / β-farnesene 15% 6% / Germacrène 24% 18% / Tricyclène / / 11% α-pinene / / 50%

Tableau I.1 : Composés majoritaires des HE des feuilles, fleurs et graines.

Par ailleurs , il a été démontré que P.bituminosa L. possède des propriétés antifongiques, antivirales et antibactériennes [22].

En 2006, Walker et al [23] ont découvert dans P.bituminosa L. une plante ornementale ayant la capacité de phytostabilisation des métaux lourds dans les sols contaminés ou dégradés.

En 2007 [24], une investigation a été faite sur la fraction volatile de la partie aérienne fraiche (feuille et fleur) de P.bituminosa L. qui a été isolée par entrainement à la vapeur et analysée par GC et

9 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.

GC-MS. Le rendement en huile essentielle des feuilles et des fleurs était de 0,1-0,3% et 0,2% de la matière fraîche, respectivement. Une relation possible entre la composition chimique et l’odeur forte caractéristique de cette espèce, a été discutée.

Composés majoritaires Feuilles Fleurs Alcools 36.6-62.3% 53% Sesquiterpènes 18.1-31.5% 13.7% Hydrocarbures 4.3-9.1% 7.6% Composés phénoliques 4.3-7.8% 2.6% Furanocoumarines 3.0-4.7% 4.9% Monoterpènes 1.4-2.9% 1.9%

Tableau I.2 : Composés majoritaires des HE des feuilles et des fleurs.

Par la suite, les travaux ont montré que P.bituminosa L. est une source de furanocoumarines et pterocarpanes pouvant être utilisée pour le traitement du psoriasis et du vitiligo [25] et la protection contre les infections et les herbivores [26].

En plus, la composition phytochimique de la partie aérienne de P.bituminosa L. ainsi que les activités anti oxydantes et antibactériennes ont été investiguées. Le résultat a donné lieu à deux composés dont les structures ont été déterminées par UV, RMN H et RMN C13. L'étude a révélé pour la première fois la présence dans cette espèce d'isoflavone (daidzéine) et du flavone (isoorientine). Les activités antibactériennes des extraits au (Dichlorométhane, Acétate d'éthyle et n-BuOH) ont été déterminées en utilisant la méthode de diffusion sur disque. Le potentiel antioxydant de l'extrait au n-BuOH a été évalué par deux méthodes. L'activité antibactérienne de la plante P.bituminosa L. est certainement liée à sa composition chimique. L'extrait de n-BuOH a montré une activité anti-oxydante importante [27].

En 2015, Eulogio J. Llorent-Martínez et al. [28] ont présenté pour la première fois la composition chimique des feuilles et des fleurs de P.bituminosa L. Le criblage des composés phytochimiques été effectué en utilisant la chromatographie liquide à haute performance à ionisation par électropulvérisation couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-ESI-MS). Plus de 40 composés ont été identifiés provisoirement ou caractérisés. Un pourcentage élevé de composés détectés correspond aux flavonoïdes glycosylés, en particulier de l'apigénine, bien que les acides phénoliques, les lignanes, les saponines ont également été identifiés.

10 CHAPITRE І : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.

Finalement, une nouvelle étude a évalué l'effet antihyperglycémiant de l'extrait aqueux des feuilles. Des rats Wistar ont été utilisés dans l'étude qui a montré que l’extrait est dépourvu de toxicité et possède une bonne activité contre le diabète [29]. A la lecture de ces travaux, P.bituminosa L. reste insuffisamment étudiée.

CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE

CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

II.1. Introduction

L’analyse d’une plante à potentialités thérapeutiques passe inévitablement par deux méthodes différentes. Dans la première approche, l’étude est basée sur des enquêtes ethnobotaniques préalables pour cibler une activité biologique quelconque. La deuxième approche qui est plus classique, consiste à réaliser un criblage des principales familles chimiques présentes dans la plante. Parmi les très nombreuses substances que les plantes élaborent, plusieurs constituants sont doués d'activité pharmacologique et par conséquent responsables de l'emploi en thérapeutique. Ils font partie de groupes chimiques très divers; il peut s'agir de principes définis (Alcaloïdes, composés phénoliques, hétérosides.), ou de mélanges complexes comme les huiles essentielles. Ces constituants appartiennent généralement aux métabolites secondaires. Dans ce qui suit, nous présentons plusieurs méthodes et techniques utilisées dont la description est succincte.

II.2. Matériel et méthodes

II.2.1.Provenance du matériel végétal et identification :

La récolte de la partie aérienne de Psoralea bituminosa L. a été effectuée en période de janvier- Février 2016 dans la région de Ghazaouet [33m, 35°04’N 1°51’O] dans la wilaya de Tlemcen. (Figure II.1)

Ghazaouet

Figure II.1 : Carte géographique de la wilaya de Tlemcen

L’espèce récoltée a été formellement identifiée par un botaniste enseignant à la faculté des sciences de la nature et de la vie (SNV) de l’université de Tlemcen.

13 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

II.2.2.Séchage et Conservation :

Comme toute plante n’est généralement pas utilisée immédiatement après la cueillette, il est nécessaire de connaitre les meilleures méthodes pour en conserver ses principes actifs et par conséquent ses propriétés thérapeutiques. Après sa récolte, le matériel végétal a été nettoyé (débarrassé des débris) puis étalé sur du carton étendu par terre ensuite laissé sécher à l’ombre, à l’abri de la poussière et dans des endroits bien aérés. Le matériel végétal a été disposé par fines couches et remué de temps à autre. La matière végétale sèche a été placée dans des sacs en papier.

II.2.3.Criblage phytochimique :

Une fois le matériel végétal prétraité, la partie aérienne de la plante est soumise à une batterie de tests pour détecter de façon qualitative les principales familles de produits naturels qui peuvent se trouver dans l'échantillon : La détection de ces familles constitue le screening ou criblage phytochimique. La caractérisation qualitative des différentes familles que contient notre plante a été réalisée sur deux extraits de solvants de polarités différentes (Ethanol et Eau) comme suivant : L’épuisement de la matière végétale a été réalisé à chaud par un montage type Soxhlet (Figure II.2), ou 50 g de la matière végétale est placée dans une cartouche poreuse à l’intérieur du Soxhlet, et cela en présence de 300ml d’éthanol pour l’extrait étahnolique, et le même volume d’eau dans le cas de l’extrait aqueux.

Figure II.2 : Montage de l’extracteur Soxhlet

14 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

Les extraits éthanoliques et aqueux ont été soumis à divers tests phytochimiques en vue de mettre en évidence les métabolites secondaires responsables de la plupart des activités biologiques de chaque espèce végétale.

1. Tests de caractérisation : 1.1 Épuisement par l’éthanol  Alcaloïdes sels On évapore 20 mL de la solution éthanolique à sec. On ajoute 5 mL de HCl 2N au résidu et on chauffe dans un bain-marie. On filtre le mélange, puis on divise le filtrat en deux parties égales. En fin, on traite la première avec quelques gouttes du réactif de Mayer et la seconde avec le réactif de Wagner. Observation : présence de turbidité ou précipitation (+) Est enregistré si le réactif produit une légère opacité (++) Est enregistré si le réactif produit une turbidité et non une floculation (+++) Est enregistré si le réactif produit une floculation ou un précipité lourd[4].  Flavonoïdes On traite 5 mL d’extrait alcoolique avec quelques gouttes de HCl concentré et 0,5 g de tournures de magnésium. La présence des flavonoïdes est mise en évidence si une couleur rose ou rouge se développe en l’espace de 3min[30].  Tanins

A 1 mL de solution alcoolique, on ajoute 2mL d’eau et 2 à 3 gouttes de solution de FeCl3 diluée. Un test positif est révélé par l’apparition d’une coloration bleue-noire (tanins cathéchiques), bleu-verte (tanins galliques) [30].  Composés réducteurs On traite 1 mL de l’extrait éthanolique avec 2 mL d’eau distillée et 20 gouttes de la liqueur de Fehling puis on chauffe. Un test positif est révélé par la formation d’un précipité rouge-brique[30].  Coumarines On évapore 5 mL de la solution extractive éthérique. On dissout le résidu dans 1 à 2 mL d’eau chaude. On divise le volume en deux parties puis on prend la moitié du volume comme témoin et on ajoute à l’autre moitié 0,5 mL de NH4OH (10%). En fin on met deux taches sur un papier filtre et on les examine sous la lumière U.V., une fluorescence intense indique la présence des coumarines[30].  Stérols & stéroïdes On évapore 10 mL d’extrait alcoolique puis le résidu obtenu est traité avec 10 mL de chloroforme anhydre. Après filtration, on mélange 5 mL de la solution chloroformique avec 5 mL d’anhydre acétique puis on ajoute quelques gouttes d’acide sulfurique concentré. On agite et on laisse reposer. Un test positif

15 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE. est révélé par l’apparition d’une coloration violacée fugace virant au vert (maximum d’intensité en 30 min à 21C°)[4]. 1.2 Epuisement par l’eau  Amidon Le test effectué consiste à traiter 5 mL de l’extrait aqueux avec le réactif d’amidon. Un test positif est révélé par l’apparition d’une coloration bleue violacée[4].  Composés réducteurs Le teste consiste à ajouter 2 mL de la solution aqueuse 5 à 8 gouttes de liqueur de Fehling, chauffer ensuite la solution résultante. Un précipité rouge brique marque la présence des hydrates de carbones[4].  Saponosides Les saponosides sont caractérisés par un indice de mousse. Leur détection est réalisée en ajoutant un peu d’eau à 2 mL de l’extrait aqueux, après l’agitation, le mélange est abandonné pendant 20 minutes et la teneur en saponosides est évaluée: Pas de mousse = test négatif (-) Mousse moins de 1cm = test faiblement positif (+) Mousse de 1-2cm = test positif (++) Mousse plus de 2cm = test très positif (+++) [30].  Les tanins La présence des tanins est mise en évidence en ajoutant, à 1 mL de l’extrait aqueux, 1 mL d’eau et 1

à 2 gouttes de solution de FeCl3. L’apparition d’une coloration verte foncée ou bleue verte indique la présence des tanins[30]. 2. Réactifs de caractérisation :  Réactif de Mayer :

On dissout 1.358 g de HgCl2 dans 60 mL d’eau et 5 g de KI dans 10 mL d’eau. On mélange, ensuite, les deux solutions et on ajuste le volume total à 100 mL d’eau. Les alcaloïdes donnent avec ce réactif une trouble plus un précipité blanc.  Réactif de Wagner :

On dissout 2 g de KI et 1.27 g de I2 dans 75 mL d’eau, la solution ainsi obtenue est ajoutée à 100 mL d’eau. Les alcaloïdes donnent avec ce réactif un précipité brun.  Liqueur de Fehling La liqueur de Fehling est un mélange de deux solutions Fehling A et le Fehling B, les composés réducteurs donnent avec le réactif de Fehling un précipité rouge brique.  Réactif d’Amidon Une solution de 1.2 g d’iode dans 50 mL d’eau distillée contenant 2.5 g d’iodure de potassium est chauffée pendant 5 min, puis diluée jusqu’à 500 mL. On chauffe 5 mL de la solution à tester avec 10 mL

16 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE. d’une solution de NaCl saturée dans un bain-marie jusqu’à ébullition et on ajoute le réactif d’amidon. Un test positif est révélé par l’apparition d’une coloration bleue violacée.

II.2.4 .Extraction des huiles essentielles et de l’hydrolat de la partie aérienne de Psoralea bituminosa L.:

II.2.4.1.Introduction :

Depuis des millénaires, les huiles essentielles ont été élaborées à partir de plantes aromatiques pour se soigner, pour conjurer le mauvais sort, aromatiser les aliments et les conserver. Elles ont été recommandées également pour le plaisir et la détente que procure leur pratique régulière. [31] Une huile essentielle peut être un ensemble de molécules pour un chimiste, un arome pour un parfumeur ou encore la quintessence ou l’esprit d’un végétal pour alchimiste. Dans la réalité, une huile essentielle est l’ensemble de tout cela, car il s’agit d’un produit parfumé et volatil, composé de molécules sécrétées par certains arbres et certaines plantes qui lui confèrent un parfum spécifique. Le terme « volatil »s’explique par le fait que les huiles essentielles s’évaporent très rapidement. C’est pourquoi il est nécessaire de les conserver correctement afin qu’elles gardent intacts leurs principes actifs. [32] Les essences ou huiles essentielles, connues également sous le nom d’huiles volatiles, de parfums, etc., sont des substances odorantes huileuses, volatiles, peu solubles dans l’eau, plus ou moins solubles dans l’alcool et dans l’éther, incolores ou jaunâtres, inflammables qui s’altèrent facilement à l’air en se résinifiant. Elles sont liquides à température ordinaire ; quelques-unes sont solides ou en partie cristallisées ; elles n’ont pas le toucher gras et onctueux des huiles fixes dont elles se distinguent par leur volatilité. Leur odeur plus ou moins forte, suave, piquante ou désagréable. Elles ont la propriété de ne pas laisser de tache durable sur le papier.[33] Les huiles essentielles sont contenues dans les plantes aromatiques et sont responsables des différentes senteurs qu’elles dégagent. L’hydrodistillation reste le moyen le plus employé pour produire les huiles essentielles, en particulier à des fins commerciales et médicinales. Les métabolites secondaires sont extraits des plantes par un entraînement à la vapeur d’eau. Le volume d’huile essentielle récupéré dépend du rendement de distillation, qui est variable, chez une même plante, en fonction de la saison. Les huiles essentielles peuvent aussi être obtenues par expression à froid, comme pour les agrumes. De nouvelles techniques, permettant d’augmenter le rendement de production, ont été développées, comme l’extraction au moyen de dioxyde de carbone liquide à basse température et sous haute pression ou l’extraction assistée par ultrasons ou micro-ondes.[34] Les huiles essentielles se rencontrent dans tout le règne végétal. Cependant, elles sont particulièrement abondantes chez certaines familles telles que : les Conifères, les Rutacées, les Ombellifères, les Myrtacées, les Lamiacées, les Poacées.

17 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

Elles sont présentes dans différents organes végétaux producteurs, variant en fonction de la zone productrice du végétal : les sommités fleuries (ex: lavande, menthe...), dans les racines ou rhizomes (ex: vétiver, gingembre), dans les écorces (ex: cannelles), le bois (ex: camphrier), les fruits (ex: citron), les graines (ex: Muscade) et sont contenues dans des structures spécialisées à savoir : les poils, les canaux sécréteurs et les poches.[35] Des études ont été menées sur le développement de nouvelles applications et l’exploitation des propriétés naturelles des huiles essentielles dans le domaine alimentaire. Les huiles essentielles et leurs composants sont connus pour posséder des activités antioxydantes et pourraient donc servir d’agents de conservation alimentaire, ou approuvés comme additifs alimentaires.Ainsi, les huiles essentielles commencent à avoir beaucoup d’intérêt comme source potentielle de molécules naturelles bioactives. Elles font l’objet d’étude pour leur éventuelle utilisation comme alternative pour la protection des aliments contre l’oxydation[36].

II.2.4.2.Technique d’extraction : L’hydrodistillation

Le matériel végétal (partie aérienne) de P. bituminosa L. a été mis dans un montage à hydrodistillation de type Clevenger selon la méthode préconisée dans la Pharmacopée européenne (Figure II.3).Une quantité de 400 g du matériel végétal est déposée dans un ballon de 6 L rempli à demi d'eau, relié à un réfrigérant. Le mélange eau/plante est porté à ébullition par un chauffe-ballon pour générer une vapeur d’eau saturée en composés volatils. Le réfrigérant sert à condenser la vapeur en distillat et l'extraction débute lorsque les premières gouttes tombent dans le collecteur et se poursuit pendant 5 heures. L’huile essentielle (phase organique) se sépare de l’hydrolat (phase aqueuse) après condensation dans le réfrigérant. Afin d'éliminer le peu d'eau susceptible d'avoir été retenue dans la phase organique, on fait agir un déshydratant (sulfate de magnésium anhydre) ; c'est l'opération de séchage. L’huile essentielle est par la suite récupérée et conservée à 4°C dans des flacons en verre brun avant d’être analysées. Le rendement en huile essentielle est défini comme étant le rapport entre la masse de l’huile essentielle obtenue et la masse du matériel végétal sec.

%HE = (m1/m0)*100 %HE : rendement en huile essentielle

m1 : masse en gramme d’huile essentielle

m0 : masse en gramme de la matière végétale

18 RT: 0.00 - 60.01 27.91 NL: 100 9.40E8 TIC MS 90 PB3TALEB 2015 80 32.02

40 41.53

RelativeAbundance 12.72 30 55.97 20 37.44 3.96 51.84 10 21.91 6.78 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Time (min)

CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

Figure II.3: Montage d’hydrodistillation type Clevenger.

II.2.4.3.Obtention de l’hydrolat :

Pour chaque extraction 400 mL d’hydrolat a été récupéré (Figure II.4) dans des bouteilles en verre ambré et conservé à l’abri de la chaleur. Le volume total a été soumis à une extraction séquentielle liquide-liquide par un solvant apolaire en utilisant une ampoule à décanter (Figure II.5). Chaque 400 mL de l’hydrolat a été traité par 3 fois 50 mL d’éther diéthylique. Le résidu ainsi récupéré a été mis dans des flacons opaques préalablement pesés. Le calcul de rendement est défini comme suit :

%H.Y = [V/V0] x 100 %H.Y : rendement en huile essentielle V : volume d’hydrolat après traitement en millilitre V0: volume total de l’hydrolat en millilitre.

Figure II.4 : Récupération de l’hydrolat Figure II. 5 : Ampoule à décanter

19 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

II.2.5. Méthodes d’identification chimique des huiles essentielles de Psoralea bituminosa L.

Les méthodes les plus appliquées pour l’analyse des huiles essentielles sont des méthodes chromatographiques qui permettent la séparation et l’identification des constituants. Parfois, d’autres techniques spectroscopiques s’avèrent complémentaires. Les conditions opératoires ainsi que les chromatogrammes de l’HE et de l’HY se trouvent en annexe.

II.2.6.Activité antioxydante des huiles essentielles et de l’hydrolat :

L’oxygène est un élément essentiel pour les organismes multicellulaires parce qu’il permet de produire de l’énergie en oxydant de la matière organique. Mais, nos cellules convertissent une partie de cet oxygène en métabolites toxiques : les radicaux libres organiques[3].

Parmi les activités biologiques des plantes médicinales, ces dernières années l'attention s'est portée sur l'activité antioxydante en raison du rôle qu'elle joue dans la prévention des maladies chroniques telles que les pathologies du cœur, le cancer, le diabète, l'hypertension, et la maladie d'Alzheimer en combattant le stress oxydant[37]. Plusieurs méthodes sont utilisées pour évaluer, in vitro et in vivo, l’activité antioxydante. Ces méthodes diffèrent entre elles en termes de mécanismes de réaction, substrat et antioxydant, états des réactions et la forme dont sont exprimés les résultats. Une meilleure compréhension de ces méthodes contribue à l’interprétation correcte des résultats.[38]

L’objectif de la présente étude est de déterminer le pouvoir antioxydant de l’huile essentielle de la partie aérienne de P.bituminosa L. ainsi que de celui de l’hydrolat en utilisant les méthodes suivantes : la méthode de détermination de l’oxydation du radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl dite DPPH, méthode de FRAP et la méthode de blanchissement de la β-carotène.

II.2.6.1.Test de piégeage du radical libre DPPH :

Le DPPH˙ est généralement le substrat le plus utilisé pour l’évaluation rapide et directe de l’activité antioxydante en raison de sa stabilité sous forme d’un radical libre et la simplicité de l’analyse. A température ambiante, le radical DPPH˙ présente, en solution alcoolique, une intense coloration violette qui disparaît au contact d’une substance donneuse de protons (figure II.6). Cette décoloration met en évidence le pouvoir antioxydant d’un échantillon par sa capacité à piéger le radical libre et se traduit par une diminution de l’absorbance à 517 nm.[39]

20 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

Figure II.6 : Réaction du DPPH avec un antioxydant.

Mode opératoire : 50μl de chaque solution éthanolique des extraits à différentes concentrations (de 1 à 10 µl/ml) sont ajoutés à 1,95 mL de la solution méthanolique du DPPH (0,025 g/). Parallèlement, un contrôle négatif est préparé en mélangeant 50 μl de méthanol avec 1,95 mL de la solution méthanolique de DPPH. La lecture de l’absorbance est faite contre un blanc préparé pour chaque concentration à 517 nm après 30 min d’incubation à l’obscurité et à la température ambiante. Le contrôle positif est représenté par une solution d’un antioxydant standard ; l’acide ascorbique dont l’absorbance a été mesuré dans les mêmes conditions que les échantillons. Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition (I%)[40].

%I= [(Abs contrôle – Abs test)/ Abs contrôle] x 100

Les valeurs d’IC50 ont été déterminées graphiquement par la régression linéaire.

II.2.6.2.Test de la réduction du fer FRAP :

Le pouvoir réducteur d’un extrait est associé à son pouvoir antioxydant. Cette technique a été développée pour mesurer la capacité des extraits testés à réduire le fer ferrique (Fe3+) présent dans le 2+ 3+ complexe K3Fe(CN) 6 en fer ferreux (Fe ). En effet le Fe participe à la formation du radical hydroxyle par la réaction de Fenton. L’absorbance du milieu réactionnel est déterminée à 700 nm. Une augmentation de l’absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur des extraits testés.[3] Mode opératoire : 1 mL de l’extrait à différentes concentrations (de 1 à 9 µl/ml) est mélangé avec 2,5 mL d’une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6) et 2,5 mL d’une solution de ferricyanure de potassium

K3Fe(CN)6 à 1%. L’ensemble est incubé au bain-marie à 50°C pendant 20 min ensuite, 2.5 mL d’acide trichloroacétique à 10% sont ajoutés pour stopper la réaction et les tubes sont centrifugés à 3000 rpm pendant 10 min. Un aliquote (2,5 mL) de surnageant est combinée avec 2,5 mL d’eau distillée et 0,5 mL

21 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE. d’une solution aqueuse de FeCl3 à 0,1%. La lecture de l’absorbance du milieu réactionnel se fait à 700 nm contre un blanc semblablement préparé, en remplaçant l’extrait par de l’eau distillée qui permet de calibrer l’appareil (UV-VIS spectrophotomètre). Le contrôle positif est représenté par une solution d’un antioxydant standard ; l’acide ascorbique dont l’absorbance a été mesuré dans les mêmes conditions que les échantillons. Une augmentation de l’absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur des extraits testés [40].

II.2.6.3. Inhibition de blanchiment du β-carotène :

Dans ce test la capacité antioxydante des extraits est déterminée en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydatif du β-carotène (figure II.7), par les produits d’oxydation de l’acide linoléique.

Figure II.7: Structure du β-carotène

Mode opératoire :

Une quantité de 2 mg de β-carotène est dissous dans 20 mL de chloroforme (CHCl3), puis 4 mL de cette solution sont mises dans un ballon à fond plat avec 40 mg d’acide linoléique et 400 mg de Tween 40. Après évaporation sous vide du chloroforme, le mélange est repris dans l’eau distillée aérée. Dans une microplaque à 96 puits, 150 μl de cette émulsion sont additionnés de 10 μl d’extrait végétal de concentration connue. Les microplaques sont alors mises en incubation à 50°C pendant 120 min (pour catalyser l’oxydation de l’acide linoléique) et la D.O est mesurée (à T = 0 et T = 120 mn) à 470 nm grâce à un lecteur de microplaques. L’activité de l’extrait est calculée par rapport à celles du témoin négatif (sans extrait). Les résultats sont comparés à ceux des antioxydants de synthèse (BHT, BHA). Le pourcentage d’inhibition (PI) est obtenu comme suit :

% I = [(D.O E120 – D.O T120) / (D.O T0 – D.O T120)] × 100

D.O E120 : absorbance de l’extrait à T = 120 min

D.O T120 : absorbance du témoin négatif à T = 120 min

D.O T0 : absorbance du témoin négatif à T = 0 min.[39]

22 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

II.3. Résultats et discussion

II.3.1.Criblage phytochimique :

Le but final de l'étude des plantes médicinales est souvent d'isoler un ou plusieurs constituants responsables de l'activité particulière de la plante. De ce point de vue, les techniques générales de screening phytochimique permettent de détecter, dans la plante, la présence des produits appartenant à des classes de composés physiologiquement actifs.

Les tests de caractérisation sont basés sur des réactions de précipitation et de complexation avec formation de complexes insolubles et colorés. La coloration observée et provoquée par l’utilisation d'un réactif approprié, est due généralement à la formation d'une conjugaison ou d'une insaturation dans une molécule. Et le screening phytochimique de Psoralea bituminosa L. a été effectué sur différents extraits en utilisant des solvants à polarités différentes (Ethanol, Eau) et cela a pour but d’extraire la totalité des métabolites secondaires dans une plante. L’extraction a été réalisée à l’aide d’un montage de Soxhlet jusqu’à épuisement de la matière végétale. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant :

SOLVANTS Eau Ethanol FAMILLES Alcaloïdes sels / + Flavonoïdes / + Composés réducteurs + + Tanins + + Coumarines / + Amidon - / Stéroïdes / + Saponosides + / / : Non testé - : absence + : présence

Tableau II.1 : Résultats du criblage phytochimique.

Le screening phytochimique effectué sur Psoralea bituminosa L. a permis d’obtenir les résultats suivants reportés sur le Tableau.  Un test positif pour les flavonoïdes, les tanins, les alcaloïdes, les coumarines et les stéroides.  Les composés réducteurs ont aussi marqué leur présence dans les deux extraits testés (éthanolique et aqueux).  Pour les saponosides, la couche de mousse a été estimée à hauteur de 1,5cm.  Le test d’amidon produit une inférence négative.

23 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

Les résultats montrent que la plante est d’une grande importance, elle est riche en composés phénoliques tel que les flavonoïdes et les tanins qui sont reconnus pour leur propriétés antioxydantes.

II.3.2.Huiles essentielles et hydrolat : extraction et analyses :

Pour extraire les huiles essentielles et l’hydrolat à partir de la plante, nous avons utilisé une hydrodistillation au moyen d’un essencier de type Clevenger (Figure II.3). L’huile essentielle de la partie aérienne de la plante est plus légère que l'eau. Elle est liquide à température ambiante. Elle possède une odeur caractéristique forte et sa couleur est jaune. Pour les HE, le rendement d’extraction calculé par rapport à la masse sèche du végétal et déterminé après cinq heures d’hydrodistillation est de 0.02%. Pour l’HY, le rendement calculé par rapport au volume total de l’hydrolat traité est lui aussi de 0.02%.

Les résultats obtenus par analyse chromatographique en phase gazeuse (CPG) puis par chromatographique en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM) sont consignés dans le Tableau II.2 et illustrés par les chromatogrammes en annexe. Les composés majoritaires sont indiqués en gras. L’analyse du chromatogramme et des spectres de masses a permis d’identifier et de caractériser 36 composés représentant 90.6 % des constituants totaux de l’huile essentielle. Leurs indices de rétention et leurs pourcentages relatifs sont présentés dans le Tableau II.2.

N°a Composés IR HE HY 01 α-Cubebene 1358 0,1 02 α-copaene 1379 0,5 03 β-Bourbonene 1385 1,5 04 (E)-β-Caryophyllene 1419 19,8 05 β-Copaene 1429 9,2 06 (E)-β-Farnesene 1439 0,9 07 α-Himachalene 1449 3,8 08 Allooromadendrene 1452 1,6 09 γ-muurolene 1469 0,6 10 γ-curcumene 1471 0,8 11 Germacrene D 1473 0,6 12 Zingiberene 1479 0,5 13 Bicyclogermacrène 1488 0,2 14 E,E-α-farnesene 1492 0,5 15 γ-cadinene 1501 0,4 16 β-curcumene 1505 0,4 17 β-Sesquiphellandrène 1512 0,7 18 E-α-bisabolene 1529 Tr 19 epi-globulol 1548 0,3 22 Caryophyllene oxide 1471 14,1 35,5 21 Globulol 1589 1,3

24 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

22 Guaiol 1591 0,9 23 Hexadecane 1599 1,7 24 τ-Cadinol 1632 0,8 9,9 25 τ-Muurolol 1642 0,2 3,2 26 α-Cadinol 1654 0,4 8,5 27 (Z,Z)-Farnesol 1665 1,3 5,6 28 α-bisabolol 1682 1,1 29 Heptadécane 1700 0,5 30 α-Oxobisabolene 1735 Tr 31 (Z)-Phytol 2068 13,1 2,5 32 (E)-Phytol 2135 10,5 25,6 33 Eicosane 2200 0,8 34 C23 2300 0,5 35 C24 2400 0,6 36 C25 2500 0,2 Taux d’identification % 90,6 90,8 Monoterpènes hydrocarbonés 0 0 Monoterpènes oxygénés 0 0 Sesquiterpènes hydrocarbonés 47,82% 0 Sesquiterpènes oxygénés 22,65% 64,85% Diterpènes hydrocarbonés 2.51% 25,94% Diterpènes oxygénés 5.03% 0 Composés non-terpéniques 12,58% 0

Tableau II.2: Composition chimique de l’H.E et de l’H.Y de la partie aérienne de P. bituminosa L.

De l’analyse de ce tableau, il ressort que, l’H.E de P.bituminosa L.de la région de Ghazaouet est proportionnellement constituée de sesquiterpènes hydrocarbonés et de sesquiterpènes oxygénés. Les composés identifiés se répartissent en 19 sesquiterpènes hydrocarbonés (47.82%), 9 sesquiterpènes oxygénés (22.65%), 2 diterpènes oxygénés (5.03%), 1 diterpène hydrocarboné (2.51 %) et 5 composés non terpéniques (12.58 %). Les trois composés majoritaires sont le (E)-β-Caryophyllene (19.8%), le Caryophyllene oxide (14.1 %), et le β-Copaene (9.2 %).Ils sont suivis de deux diterpènes oxygénés : (Z)-Phytol (13.1 %), (E)-Phytol (10.5 %). Cependant, les monoterpènes oxygénés ou hydrocarbonés sont quasiment absents.

25 Chapitre II : partie expérimentale.

(E)-β-Caryophyllene β-Copaene Caryophyllene oxide

(E)-Phytol (Z)-Phytol

Figure II.8: Composés majoritaires de l’H.E de P.bituminosa L.

L’analyse chromatographique de l’HY a permis d’identifier 7 composés représentant 90.8% de la composition chimique de l’HY. Les constituants identifiés sont formés de 5 Sesquiterpènes oxygénés, 2 composés de type diterpènes hydrocarbonés. Les trois composés majoritaires sont : Caryophyllene oxide (35.5%), τ-Cadinol (9.9%), α-Cadinol (8.5%).

Caryophyllene oxide τ-Cadinol α-Cadinol

Figure II.9: Composés majoritaires de l’H.Y de P.bituminosa L.

26 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

II.3.3.Activité antioxydante des huiles essentielles et de l’hydrolat de la partie aérienne de Psoralea bituminosa L. :

II.3.3.1.Test de piégeage du radical libre DPPH :

Le test DPPH (diphenylpicrylhydrazyl) est une méthode largement utilisée dans l’analyse de l’activité antioxydante. Cette méthode est basée sur la réduction d’une solution alcoolique de DPPH en présence d'un antioxydant qui donne un hydrogène ou un électron, la forme non radicalaire DPPH-H est formée.

L’activité antioxydante de H.E de P.bituminosa L. a été évaluée spectrophotométriquement suivant la réduction de ce radical qui s’accompagne par son passage de la couleur violette à la couleur jaune, mesurable à 517nm.

Les valeurs des IC ont été calculées, en vue de déterminer les concentrations qui réduisent 50% 50 des radicaux libres. Une valeur faible d’IC50 indique une activité antioxydante forte.

Figure II.10 : Réduction du radical du violet au jaune par l’H.E de P. bituminosa L.

Concentrations (µl/ml) 10 9 7 5 4 2 1

HE 87.23 76.65 69.36 61.32 52.58 45.57 38.52 IC50=3.13

% d’inhibition HY 92.82 84.25 78.09 63.12 54.46 48.68 40.59 IC50=2.61

AA 98.88 96.75 86.18 71.35 68.15 55.25 45.07 IC50=1.41

Tableau II.3 : % d’inhibition du DPPH par H.E, HY et AA

27 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

120 R² = 0,9862 100 R² = 0,9866 R² = 0,9901 80

hydrolat % 60 huile A.ascorbique 40

0 0 2 4 6 8 10 12 C(µl/ml)

Figure II.11 : Pourcentage d’inhibition de : HE, HY, AA

Le tableau II.4 illustre l’activité de piégeage du radical DPPH, exprimée en pourcentage, en fonction de la concentration des différents extraits utilisés et de l’antioxydant de référence (acide ascorbique). L’huile essentielle et l’hydrolat de P.bituminosa L. ainsi que l’acide ascorbique ont pu réduire le radical DPPH• avec des valeurs de IC respectives de 3.13 ; 2.61 et 1.41 µl/mL. La figure 50 II.11 montre bien un grand rapprochement entre les activités antioxydantes des extraits de la plante et celle du témoin.

II.3.3.2.Méthode de réduction des ions ferriques FRAP :

Concentrations 9 5 4 2 1 (µl/ml)

HE 1.354 0.965 0.813 0.589 0.486 Absorbance HY 1.749 1.155 0.966 0.689 0.502 AA 2,577 2,521 2,498 2,475 2,461

Tableau II.4 : Pouvoir antioxydant par la méthode de FRAP.

28 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

3 R² = 0,9988 2,5 R² = 0,9965 2 R² = 0,9951

1,5 huile A 1 hydrolat A.ascorbique 0,5

0 0 2 4 6 8 10 C(µl/ml)

Figure II.12 : Absorbance de : HE, HY et AA en fonction de la concentration

A partir des résultats du pouvoir antioxydant de réduction ferrique (FRAP) appliqué aux volatils de la plante, il a été constaté que les deux extraits ont des capacités à réduire le fer semblables avec une légère supériorité pour l’hydrolat. Par comparaison à l’acide ascorbique, ce dernier présente une capacité plus importante que celles de l’hydrolat et des huiles essentielles. Le pouvoir antioxydant que possède ces dernières surtout l’hydrolat, serait du aux composés oxygénés qui y sont présents en proportions importantes et qui possèdent un caractère réducteur remarquable vis-à-vis des ions ferriques Fe3+.

II.3.3.3.Test de blanchissement de β-carotène :

Concentrations 10 8 4 2 1 (µl/ml)

HE 65.64 55.89 39.48 33.84 27.69 IC50=6.35µl/ml % d’inhibition

HY 90.76 90.25 66.66 58.97 52.82 IC50=0.13µl/ml

Tableau II.5: Activité antioxydante de H.E et de HY par la méthode de β-carotène

Concentrations (µl/ml) 2 1 0.2 0.1

% d’inhibition BHT 98.4 75.36 55.59 49.55 IC50=0.034 µl/ml

Tableau II.6: Activité antioxydante de BHT par la méthode de β-carotène

29 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTALE.

350 R² = 0,969 300 R² = 0,9951 250 R² = 0,994

200 % 150 hydrolat 100 huile 50 BHT 0 0 2 4 6 8 10 12 C(µl/ml)

Figure II.13: Pourcentage d’inhibition de : HE, HY, BHT

Les résultats obtenus montrent que le BHT (antioxydant de référence) et les deux extraits (HE et HY) testés inhibent d’une manière significative l’oxydation couplée de l’acide linoléique et du β- carotène. L’huile essentielle révèle une activité inhibitrice modérée avec une IC estimé à 6.35μl/ml, 50 mais cette valeur d’activité reste significativement inférieure à celle du contrôle positif (BHT). D’autre part, ce test confirme encore une fois le pouvoir antioxydant très important de l’hydrolat avec une valeur d’IC50 égal à 0.13 μl/ml et qui est une valeur très significative par rapport au témoin de référence qui est le BHT.

Conclusion

L’ouest algérien est une région qui possède une flore riche et peu valorisée. Beaucoup de plantes médicinales qui s’y trouvent représentent une source inépuisable de substances bioactives. Ces plantes sont caractérisées par la biosynthèse de molécules odorantes appelées huiles essentielles (HE) et connues depuis longtemps pour leurs activités thérapeutiques. La présente étude s’inscrit dans le cadre général des travaux de recherche de l’équipe des huiles essentielles du laboratoire des substances naturelles et bioactives (LASNABIO) de l’université de Tlemcen visant la valorisation des ressources naturelles d’origine végétale de l’ouest algérien. Aujourd’hui, la recherche se concentre sur l'extraction d'antioxydants naturels qui seraient moins toxiques et plus efficaces que les antioxydants synthétiques Le présent travail a consisté en premier lieu, à effectuer un criblage phytochimique d’une plante de la famille des fabacées; Psoralea bituminosa L. il s’agit d’une analyse qualitative basée sur des réactions de coloration et/ou de précipitation. Celle-ci est effectuée sur la drogue végétale sèche et sur des extraits selon la méthodologie usuelle. Elle a permis la mise en évidence de composés appartenant aux différents groupes chimiques à savoir les alcaloïdes, les flavonoïdes, les coumarines, les tanins, les saponines, les composés réducteurs et les stéroïdes et qui possèderaient une activité antioxydante. L’huile essentielle et l’hydrolat de la partie aérienne (tiges et feuilles) de l’espèce Psoralea bituminosa L, obtenus par hydrodistillation à l’aide d’un dispositif de type Clevenger ont été caractérisés pour la première fois. L’analyse des volatiles a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse (CPG) et par CPG couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM) en utilisant deux colonnes, l’une polaire et l’autre apolaire. L’analyse du chromatogramme et des spectres de masses a permis d’identifier et de caractériser 36 composés représentant 90.6 % des constituants totaux de l’huile essentielle qui est proportionnellement constituée de sesquiterpènes. Les composés majoritaires sont le (E)-β-Caryophyllene (19.8%), le Caryophyllene oxide (14.1 %), et le suivis de deux diterpènes oxygénés : (Z)-Phytol (13.1 %) et le (E)-Phytol (10.5 %). D’autre part, l’analyse chromatographique de l’hydrolat a permis d’identifier 7 composés dont 5 Sesquiterpènes oxygénés, représentant 90.8% de la composition chimique de l’HY. Trois composés présentent des proportions élevées : Caryophyllene oxide (35.5%), τ-Cadinol (9.9%), et α-Cadinol (8.5%).

Pour l’évaluation du pouvoir antioxydant des volatiles de Psoralea bituminosa L, l’utilisation de plusieurs approches méthodologiques différentes reste préconisé afin d’avoir une meilleure lecture de l’activité antioxydante de nos extraits. Pour notre part, nous avons opté pour trois méthodes, à savoir : l’activité de piégeage du radical DPPH, la méthode de blanchiment du β-carotène et la réduction du fer (FRAP). Les résultats obtenus montrent une activité antioxydante non négligeable des volatiles de Psoralea bituminosa L. alors qu’aucune étude n’en a fait état jusqu’à présent dans la littérature. Par ailleurs,

32 l’hydrolat présente un pouvoir antioxydant plus important que celui des huiles essentielles. Les composés majoritaires surtout oxygénés et par la présence d’un groupe hydroxyle seraient responsables de l’activité antioxydante de Psoralea bituminosa L. L’huile essentielle étant un complexe mixte de composés naturels volatils, des investigations approfondies sont nécessaires afin d’identifier, isoler et purifier les composés actifs dans cette huile. Au vu de l’étape actuelle des résultats de notre étude, les produits naturels tels que les volatils de Psoralea bituminosa L pourraient être une alternative aux antioxydants synthétiques.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES [1] N. Benhammou, “Activité antioxydante des extraits des composés phénoliques de dix plantes médicinales de l’Ouest et du Sud-Ouest Algérien,” thèse, université ABOUBEKR BELKAID, Tlemcen, 2012. [2] N. Bougandoura, “Pouvoir antioxydant et antimicrobien des extraits d’espèces végétales Saturejacalaminthasspnepta (nabta) et Ajugaiva L. (chendgoura) de l’ouest d’Algérie,” memoire, université ABOUBEKR BELKAID, Tlemcen, 2011. [3] K. Kanoun, “Contribution à l’étude phytochimique et activité antioxydante des extraits de Myrtus communis L. (Rayhane) de la région de Tlemcen (Honaine),” mémoire, université ABOUBEKR BELKAID, Tlemcen, 2011. [4] R. Belabbes, “Enquête ethnobotanique, caractérisation chimique et activités biologiques des volatils de deux plantes médicinales de l’ouest Algérien : Calendula arvensis L et Carthamus sp L,” mémoire, université ABOUBEKR BELKAID, Tlemcen, 2014. [5] D. K. K. Belesi Katula, “Inventaire et description des fabaceae arbres (momosoidae et faboidae ) de Kinshasa et ses environs,” thèse, université Kinshasa RDC, Graduat, 2009. [6] https://www.google.dz/#q=Fabaceae+%E2%80%94+Wikip%C3%A9dia.html [7]https://www.google.dz/#q=%E2%80%9CLes+Fabac%C3%A9es%2C+L%C3%A9 gumineuses+ou+Papilionac%C3%A9es.+Une+Famille+de+Plantes+du+Massif+du+Jura+ Franc-comtois+et+Suisse+par+Nocueill..html. [8] F. Bourgaud, A. Guckert, and Institut national polytechnique de Lorraine., “Etude de la biologie de plantes du genre Psoralea (légumineuses), productrices de furocoumarines interet pharmaceutique : essais de cultures in-vitro,” 1990. . [9] C. Gisbert, M. Dabauza, E. Correal, R. Swennen, and B. Panis, “Cryopreservation of Bituminaria bituminosa varieties and hybrids.,” Cryobiology, vol. 71, no. 2, pp. 279–285, Oct. 2015. [10] https://www.google.dz/#q=%E2%80%9CBituminaria+bituminosa+- +Psoral%C3%A9e+bitumineuse.html. [11] https://www.google.dz/#q=%E2%80%9CBituminaria+bituminosa.html. [12] F. Baba Aissa, Encyclopédie des plantes utiles-flore d’Algérie et du Maghreb, Libraire moderne. Rouïba, 1999. [13] https://www.google.dz/#q=%E2%80%9CHerbe+au+bitume+- +Bituminaria+bituminosa+-+quelle-est-cette-fleur.com.html [14]https://www.google.dz/#q=%E2%80%9CPsoral%C3%A9e+bitumineuse+%E2% 80%94+Wikip%C3%A9dia.html. [15]https://www.google.dz/#q=%E2%80%9CPsoralea%2C+Bu+gu+zhi%2C+bakuch i%2C+psoralea+laxatives%2C+psoralea+psoriasis%2C+psoralea+stimulant.html. [16] V. Andreu, J. L. Rubio, and R. Cerní, “Effect of Mediterranean shrub on water erosion control,” Environ. Monit. Assess., vol. 37, no. 1–3, pp. 5–15, Jan. 1995. [17] D. Rivera and C. Obon, “The ethnopharmacology of Madeira and Porto Santo Islands, a review.,” J. Ethnopharmacol., vol. 46, no. 2, pp. 73–93, May 1995.

[18] G. Innocenti, A. Piovan, R. Filippini, R. Caniato, and E. M. Cappelletti, “Quantitative Recovery of Furanocoumarins from Psoralea bituminosa,” Phytochem. Anal., vol. 8, no. 2, pp. 84–86, 1997. [19] M. Gordaliza, J. M. M. del Corral, C. Gorritti, and A. San Feliciano, “Composition and biological activities of the genus Psoralea,” Curr. Top. Phytochem., vol. 2, pp. 151 – 161, 1999. [20] L. Pistelli, C. Noccioli, G. Appendino, F. Bianchi, O. Sterner, and M. Ballero, “Pterocarpans from Bituminaria morisiana and Bituminaria bituminosa,” Spec. Issue Mem. Profr. Jeffrey B Harb., vol. 64, no. 2, pp. 595–598, Sep. 2003. [21] A. Bertoli, F. Menichini, C. Noccioli, I. Morelli, and L. Pistelli, “Volatile constituents of different organs of Psoralea bituminosa L.,” Flavour Fragr. J., vol. 19, no. 2, pp. 166–171, 2004. [22] T. Maurich, M. Iorio, D. Chimenti, and G. Turchi, “Erybraedin C and bitucarpin A, two structurally related pterocarpans purified from Bituminaria bituminosa, induced apoptosis in human colon adenocarcinoma cell lines MMR- and p53-proficient and -deficient in a dose-, time-, and structure-dependent fashion,” Chem. Biol. Interact., vol. 159, no. 2, pp. 104–116, Feb. 2006. [23] D. J. Walker, I. Moñino, and E. Correal, “Genome size in Bituminaria bituminosa (L.) C.H. Stirton (Fabaceae) populations: separation of ‘true’ differences from environmental effects on DNA determination,” Environ. Exp. Bot., vol. 55, no. 3, pp. 258– 265, Mar. 2006. [24] A. Tava, L. Pecetti, M. Ricci, M. A. Pagnotta, and L. Russi, “Volatile compounds from leaves and flowers of Bituminaria bituminosa (L.) Stirt. (Fabaceae) from Italy,” Flavour Fragr. J., vol. 22, no. 5, pp. 363–370, 2007. [25] S. Martínez, E. Correal, D. Real, A. Ortuño, and J. A. de. Río, “Bituminaria bituminosa: a source of furanocoumarins of pharmaceutical interest,” vol. 27, pp. 307– 322, 2010. [26] D. J. Walker, D. Martínez-Fernández, E. Correal, P. Romero-Espinar, and J. Antonio del Río, “Accumulation of furanocoumarins by Bituminaria bituminosa in relation to plant development and environmental stress,” Plant Physiol. Biochem., vol. 54, pp. 133–139, May 2012. [27] S. Azzouzi, N. Zaabat, K. Medjroubi, S. Akkal, K. Benlabed, F. Smati, and M.-G. Dijoux-Franca, “Phytochemical and biological activities of Bituminaria bituminosa L. (Fabaceae),” Asian Pac. J. Trop. Med., vol. 7, Supplement 1, pp. S481–S484, Sep. 2014. [28] E. J. Llorent-Martínez, V. Spínola, S. Gouveia, and P. C. Castilho, “HPLC- ESI-MSn characterization of phenolic compounds, terpenoid saponins, and other minor compounds in Bituminaria bituminosa,” Ind. Crops Prod., vol. 69, pp. 80–90, Jul. 2015. [29] R. Lemouchi, C. Selles, H. Medjdoub, and B. Tabti, “Assessment of possible efficacy of aqueous leaves extract of Psoralea bituminosa L. for anti-hyperglycaemic activity,” Asian Pac. J. Trop. Dis., vol. 5, no. 7, pp. 575–578, Jul. 2015. [30] Z. Aguieb, M. Messai Belgacem, “Valorisation des arachides (Arachis hypogea L.) cultivées à la Wilaya D’El-Oued,” mémoire, UNIVERSITE ECHAHID HAMMA LAKHDAR D’EL-OUED, EL-OUED, 2015. [31] C. Selles, “Valorisation d’une plante médicinale à activité antidiabétique de la région de Tlemcen : Anacyclus pyrethrum L. Application de l’extrait aqueux à l’inhibition

35 de corrosion d’un acier doux dans H2SO4 0.5M,” doctorat, ABOU BEKR BELKAID, Tlemcen, 2012. [32] N. Fekih, “Proprietes chimiques et biologiques des huiles essentielles de trois especes du genre pinus poussant en Algérie,” doctorat, ABOU BEKR BELKAID, Tlemcen, 2014. [33] N. Bousbia, “Extraction des huiles essentielles riches en anti-oxydants à partir de produits naturels et de co-produits agroalimentaires,” doctorat, Ecole Nationale Supérieure Agronomique, Alger, 2011. [34] B. Bayala, “Etude des propriétés anti-oxydantes, anti-inflammatoires, anti- prolifératives et anti-migratoires des huiles essentielles de quelques plantes médicinales du Burkina Faso sur des lignées cellulaires du cancer de la prostate et de glioblastomes,” doctorat, BLAISE PASCAL, 2014. [35] L. Lakhdar, “Evaluation de l’activite antibacterienne d’huiles essentielles marocaines sur aggregatibacter actinomycetemcomitans : étude in vitro,” doctorat, FACULTE DE MEDECINE DENTAIRE, Rabat, 2015. [36] M. Barkat and I. Laib, “Composition chimique et activité antioxydante de l’huile essentielle des fleurs seches de lavandula officinalis,” Rev. Génie Ind., vol. 6, no. 2, pp. 46–54, 2011. [37] A. Meddour, M. Yahia1, N. Benkiki1, and A. Ayachi2, “Etude de l’activité antioxydante et antibactérienne des extraits d’un ensemble des parties de la fleur du capparis spinosa l.,” Leban. Sci. J., vol. 14, no. 1, 2013. [38] I. Chikhi, “Composition chimique et activites biologiques des extraits de cinq plantes aromatiques et medicinales de l’ouest d’algerie,” doctorat, ABOU BEKR BELKAID, Tlemcen, 2013. [39] T. M. Chaouche, “Contribution à l’étude des activités antioxydantes et antimicrobiennes des extraits de quelques plantes médicinales,” doctorat, ABOU BEKR BELKAID, Tlemcen, 2014. [40] N. Bougandoura ,N.Bendimerad , “Evaluation de l’activité antioxydante des extraits aqueux et méthanolique de Satureja calamintha ssp.Nepeta (L.) Briq.,” Nat. Technol., vol. 9, p. 14 à 19, Juin 2013.

ANNEXE

RT: 0.00 - 60.01 27.91 NL: 100 9.40E8 TIC MS 90 PB3TALEB

80 32.02

60 Relative Abundance

40 41.53 12.72 30 55.97 20 37.44 3.96 51.84 10 21.91 6.78 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Time (min)

Chromatogramme de l’huile essentielle de la partie aérienne de Psoralea bituminosa L.

Chromatogramme de l’hydrolat de Psoralea bituminosa L.

Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique مركز البحث العلمي و التقني في التحليل الفيزيائي و الكيميائي Centre de Recherche Scientifique et Technique en Analyse physico-Chimiques BP 248 Alger RP 16004 Alger Tel/Fax : 021247406 www.crapc-dz.org

Conditions Opératoires de l’analyse par CPG/SM

Injecteur Température : 250°C Mode d’injection : Split 1/50 Volume injecté : 0.2 µl

Colonne Type : DN-5MS Dimensions : long 30 m * D int 0.25 mm * épaisseur film 0.25 µm Phase stationnaire : 5% Phenyl 95% dimethylpolysiloxane. (Autre : Spécifier) Température du four :60°C pendant 8 min, 2°C/min jusqu’à 250°C, isotherme pendant 15 min Durée d’analyse : 118 min Gaz vecteur : Hélium pureté : N 6 Débit GV : 0.5 ml/min Détecteur de masse Mode d’analyse : Scan TIC (de 35 à 350) Délai du solvant : 4 min Température de l’interface : 280 °c Type d’ionisation : Impact électronique Intensité du filament : 70 ev Type de l’analyseur de masse : Master TOF Mass Température de la source : 200 °c

Chromatographe : DANI GC Master Spectrometre de masse :Master Dani TOF