MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta DISERTAČNÍ PRÁCE Mgr. Jan Mendel Brno, 2007
MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i.
Mgr. Jan Mendel Využití mtDNA pro charakterizaci populačních struktur druhů rodů Gobio a Romanogobio Disertační práce Školitel: RNDr. Věra Lusková, Ph.D. Brno, 2007
1 Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Mgr. Jan Mendel Název disertační práce: Využití mtDNA pro charakterizaci populačních struktur druhů rodů Gobio a Romanogobio . Název disertační práce anglicky: The using of mtDNA for characteristics of population structures of species from the genera Gobio and Romanogobio . Studijní program: Biologie Studijní obor (směr), kombinace oborů: Obecná a molekulární genetika Školitel: RNDr. Věra Lusková, Ph.D. Rok obhajoby: 2007 Klíčová slova v češtině: Gobio , Romanogobio , taxonomie, systematika, fylogeneze, fylogeografie, RAPD, sekvencování, mtDNA, nDNA, control region, cytochrom b, S7 r protein, intron, S7indel diagnostika, hybridizace, vnitrodruhová a mezidruhová diverzita Klíčová slova v angličtině: Gobio , Romanogobio , taxonomy, systematics, phylogeny, phylogeography, RAPD, sequencing, mtDNA, nDNA, control region, cytochrome b, S7 r protein, intron, S7indel diagnostics, hybridization, intraspecific and interspecific diversity
2 © Jan Mendel, Masarykova univerzita v Brně, 2007
3 PODĚKOVÁNÍ Tuto disertační práci věnuji své ženě Denisce jako dík za vždy teplou večeři, hřejivé obětí a za oporu, kterou pro mě v mém životě trvale představuje. Malému ještě nenarozenému Samuelovi, který byl v závěru mým největším hnacím motorem. A také celé své rodině, která mě neustále podporovala a podporuje. Rád bych poděkoval Věře Luskové, Stanislavu Luskovi a ostatním kolegům z ichtyologického oddělení Ústavu biologie obratlovců, v.v.i., Lukáši Vetešníkovi, Karlu Halačkovi, Ivu Papouškovi a Janu Kociánovi, bez nichž by tato práce nemohla vzniknout. Rád bych také poděkoval domácím i zahraničním kolegům Jánu Koščovi, Ekaterine D. Vasil’eve, Johnu Taggartovi, Alexandru Ruchinovi, Guler Ekmekci, Füsun Erk’akan, Cevher S. Özeren, Radku Šandovi, Andrei N. Pashkovovi, Sergei I. Reshetnikovovi a mnohým dalším, kteří mi poskytli své vzorky a přispěli svými podněty k řešení této problematiky. Tato dizertační práce byla řešena v rámci výzkumných projektů: IAA6045005 „Charakteristiky a genetické rozdílnosti populací a druhů „hrouzka“ rodů Gobio a Romanogobio – příspěvek k poznání biodiverzity“ Grantové agentury AV ČR, IPS5045111 „Molecular and other genetic markers applied in the conservation of populations of endangered, rare and vanishing fish species in the Czech Republic“ Grantové agentury AV ČR a VaV/SM/6/3/05 „Genetická diverzita ohrožených druhů ryb – nezbytný základ efektivní ochrany biodiverzity“ Ministerstva životního prostředí ČR.
4 Prohlašuji, že tuto práci jsem vypracoval samostatně. Veškerou literaturu a ostatní prameny, z nichž jsem při přípravě práce čerpal, řádně cituji a uvádím v seznamu použité literatury.
5 Abstrakt Využití mtDNA pro charakterizaci populačních struktur druhů rodů Gobio a Romanogobio Taxonomie a systematika druhů rodů Gobio a Romanogobio je v současné době velmi nepřehledná. O validitě řady druhů, poddruhů a forem, jež byly popsány v minulosti, se vedou diskuse. Současná systematika obou rodů je založena především na morfologických charakteristikách a nebyla dosud potvrzena molekulárními analýzami. Tato studie se zabývá fylogenetickými vztahy 28 druhů obou rodů v euroasijském kontextu. Genetická diverzita hrouzků byla zkoumána technikami RAPD a přímým sekvencováním control regionu, cytochromu b a intronu S7 r proteinu. Molekulární analýzy potvrdily rodovou diferenciaci původního rodu Gobio na dva rody Gobio a Romanogobio . Bylo prokázáno, že území ČR osídlují druhy Gobio gobio , Gobio obtusirostris , Gobio carpathicus (ojediněle), Romanogobio banaticus , Romanogobio vladykovi , Romanogobio belingi a druh označený termínem „species in waiting“ Romanogobio carpathorossicus . Na území SR se vyskytuje vedle tří výše jmenovaných druhů rodu Gobio i čtvrtý druh pracovně označený Gobio sp. 1. Rod Romanogobio má obdobnou druhovou skladbu jako v ČR vyjma druhu Romanogobio belingi . Na slovenském území byl navíc potvrzen výskyt druhu Romanogobio friči . Výsledky ukázaly, že řeky Černého moře vykazují větší druhovou pestrost rodu Gobio než řeky tekoucí do Severního a Baltského moře. Celkem bylo zachyceno 16 hybridních událostí, které se týkaly obou rodů. Na území SR byla vymezena hybridní zóna v oblasti severních přítoků řeky Tisy. Byla posouzena genetická odlišnost populací na území ČR a SR, především u kriticky ohrožených druhů rodu Romanogobio . U šesti populací druhu Gobio gobio a dvou populací Gobio obtusirostris byla zjištěna statisticky významná mezipopulační diverzita. Bylo odhaleno celkem 40 populačně diagnostických RAPD markerů. Byla nalezena jednoduchá rozlišovací metoda nazvaná „S7indel diagnostika“, která se osvědčila jako nástroj rychlé identifikace druhů rodu Gobio . Bylo navrženo rozšíření subjektu ochrany o „ochranu genetické diverzity“ jako v současnosti nejsnáze uplatnitelný postup při ochraně biodiverzity v ČR.
6 Dissertation Abstract
The using of mtDNA for characteristics of population structures of species from the genera Gobio and Romanogobio Taxonomy and systematics of species of the genera Gobio and Romanogobio is rather confused at present. Validity of a number of species, subspecies and forms described in the past is under discussion. The present systematics of both the genera is based especially on morphological characteristics and has not been confirmed by molecular analyses yet. The study deals with phylogenetic relationships of 28 species of both the genera in the Euro Asian context. Genetic diversity of gudgeons was investigated using the RAPD technique and direct sequencing of the control region, cytochrome b and the intron of the S7 r protein. Molecular analyses have confirmed generic differentiation of the original genus Gobio into two genera Gobio and Romanogobio . It has been demonstrated that the territory of the Czech Republic is inhabited by the species Gobio gobio , Gobio obtusirostris , Gobio carpathicus (only one specimen found), Romanogobio banaticus , Romanogobio vladykovi , Romanogobio belingi and by the species Romanogobio carpathorossicus which is denoted as a “species in waiting”. Concerning the territory of the Slovak Republic, in addition to the three above mentioned species of the genus Gobio also a fourth one occurs there which is provisionally called Gobio sp. 1. The genus Romanogobio has a similar species composition as in CR except for Romanogobio belingi . In addition, the presence of Romanogobio friči was confirmed in the territory of Slovakia. The results have pointed out, that the rivers of the Black Sea show greater species diversity of the genus Gobio than the rivers flowing into the North and Baltic Seas. Altogether 16 hybridization events concerning both the genera were recorded. In the territory of the Slovak Republic, a hybrid zone was delineated in the area of nothern tributaries of the Tisa River. Genetic difference of the populations in the territories of CR and SR was examined, especially in the critically endangered species of the genus Romanogobio . Statistically significant inter population diversity was found in six populations of Gobio gobio and two populations of Gobio obtusirostris . Altogether 40 population diagnostic RAPD markes were identified. A simple differentiation method called “S7indel diagnostics” was found; it proved to be a useful tool for quick identification of the species of the genus Gobio . Broadening of the subject of conservation with “genetic diversity conservation” was suggested as the easiest procedure in biodiversity conservation in CR at present.
7 OBSAH 1 Úvod ...... 10 2 Přehled současného stavu řešené problematiky ...... 14 2.1 Diverzita druhová a vnitrodruhová – obecný pohled ...... 14 2.2 Taxonomie zkoumaného objektu ...... 17 2.3 Použité názvosloví...... 19 2.4 Hrouzek obecný ( Gobio gobio Linnaeus, 1758) ...... 20 2.4.1 Rozšíření v ČR a SR...... 21 2.4.2 Stupeň ohrožení a ochrana...... 21 2.5 Hrouzek Kesslerův ( Romanogobio kesslerii Dybowski, 1862) ...... 22 2.5.1 Rozšíření v ČR a SR...... 23 2.5.2 Stupeň ohrožení a ochrana...... 24 2.6 Hrouzek běloploutvý ( Romanogobio albipinnatus Lukasch, 1933)...... 26 2.6.1 Rozšíření v ČR a SR...... 27 2.6.2 Stupeň ohrožení a ochrana...... 30 2.7 Hrouzek dlouhovousý ( Romanogobio uranoscopus Agassiz, 1828) ...... 32 2.7.1 Rozšíření v ČR a SR...... 32 2.7.2 Stupeň ohrožení a ochrana...... 33 2.8 Hybridizace a introgrese...... 35 3 Cíle disertační práce ...... 38 4 Materiál a metody ...... 39 4.1 Sběr vzorků a DNA extrakce...... 39 4.2 Volba molekulárních technik a výběr molekulárních markerů ...... 42 4.2.1 Metoda RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)...... 42 4.2.2 Metoda přímého sekvencování...... 42 4.2.2.1 Využití mitochondriálního markeru ...... 43 4.2.2.2 Control region a cytochrom b...... 44 4.2.2.2.1 Control region...... 44 4.2.2.2.2 Cytochrom b ...... 45 4.2.2.3 Využití jaderného markeru ...... 46 4.2.2.4 První intron S7 r proteinu...... 47 4.3 Statistické vyhodnocení...... 49 5 Komentář k dosaženým výsledkům ...... 51 5.1 Příloha A: Genetic diversity of Gobio gobio populations in the Czech Republic and Slovakia, based on RAPD markers ...... 51 5.2 Příloha B: Molekulárně biologické analýzy hrouzka Kesslerova ve vodách České republiky a Slovenska...... 53 5.3 Příloha C: Rybí osídlení a genetická diverzita populace hrouzka obecného z Divoké Orlice u Kostelce nad Orlicí ...... 55 5.4 Příloha D: Molecular phylogeny of the genus Romanogobio (Cyprinidae, Pisces) and its contribution to taxonomy...... 56 5.5 Příloha E: Molecular phylogeny of the genus Gobio (Cyprinidae, Pisces) and its contribution to taxonomy ...... 59 6 Diskuse ...... 62 6.1 Posouzení vhodnosti použitých technik a markerů ...... 62 6.2 Zástupci rodů Gobio a Romanogobio ...... 63 6.2.1 Zástupci rodu Gobio ...... 63 6.2.2 Zástupci rodu Romanogobio...... 68
8 6.2.2.1 Hrouzek Kesslerův ...... 68 6.2.2.2 Hrouzek dlouhovousý...... 70 6.2.2.3 Hrouzek běloploutvý ...... 71 6.3 Ochranářské aspekty...... 73 7 Shrnutí ...... 75 8 Seznam použité literatury ...... 77 9 Seznam použitých zkratek ...... 93 10 Soubor publikací ...... 94
9 „I řekl Bůh Noemu: S tebou však učiním smlouvu. Vejdeš do archy a s tebou tvoji synové, tvá žena i ženy tvých synů. A ze všeho, co je živé, ze všeho tvorstva, uvedeš vždy po páru do archy, aby s tebou zůstali naživu; samec a samice to budou. Z rozmanitých druhů ptactva a z rozmanitých druhů zvířat a ze všech zeměplazů rozmanitých druhů, z každého po páru, vejdou k tobě, aby se zachovali při životě.“ (Bible Gn 6,18 20; Český ekumenický překlad)
1 Úvod
Česká republika (ČR) leží ve středu Evropy a svým územím náleží z hlediska hydrologické příslušnosti ke třem úmořím. Největší část území ČR (65,2%) patří k úmoří Severního moře (povodí Labe), do úmoří Černého moře náleží část území Moravy spadající převážně do povodí řeky Moravy (Dyje) a malá část území při státní hranici na Šumavě (25,4%). Do úmoří Baltského moře (povodí Odry) patří pouze Slezsko a území na severu Moravy (9,4%). Tato skutečnost má významný vliv na bohatou druhovou pestrost ichtyofauny ČR. Řada druhů je svým výskytem specificky vázána na jednotlivá úmoří. Především v úmoří Černého moře se vyskytuje mnoho taxonů, které nejsou původní v úmoří Severního a Baltského moře. Na území ČR byl historicky potvrzen výskyt 94 druhů mihulí a ryb 13 řádů a 23 čeledí ve volné přírodě nebo v akvakulturním chovu. Z toho, podle současných přehledů (Lusk et al., 2002b; Lusk et al., 2004a), původní druhovou skladbu ichtyofauny ČR tvoří 4 druhy mihulí a 55 druhů ryb. Z nich však jsou pro vody ČR vymizelé dva druhy mihulí (mihule mořská, mihule říční) a šest druhů ryb (vyza velká, jeseter velký, placka pomořanská, síh severní, plotice lesklá a platýz bradavičnatý). Dalších 24 druhů je v různém stupni ohrožení (Lusk et al., 2004a). Zbývající druhy ryb (okolo 35 druhů) jsou nepůvodní a byly do ČR záměrně či neúmyslně introdukovány člověkem nebo pronikly z vod sousedních států, avšak jen u 12 druhů se podařila částečná či úplná aklimatizace (Lusk et al., 1998; Lusk et al., 2002a). Karas stříbřitý, střevlička východní, sumeček americký a koljuška tříostná patří k druhům plně aklimatizovaným a vytvářejícím trvalé populace ve volné přírodě. Podstatu hydrologického
10 systému na území ČR tvoří pramenné části povodí hlavních řek (Labe, Vltava, Ohře, Morava, Dyje, Odra) a proto možnost přirozené imigrace nepůvodních druhů je výrazně nižší oproti územím, kudy protékají větší toky, např. Slovensko (Lusk et al., 2004b). S výjimkou druhu Carassius auratus , je výskyt ostatních nepůvodních druhů výsledkem lidské introdukce. Poslední skupinou nepůvodních ryb jsou druhy vyskytující se pouze v důsledku jejich umělé reprodukce či experimentálního chovu. Při procesu ochrany biodiverzity jsou uvažovány pouze nativní druhy daného státu. Nezbytnou součástí celoevropského úsilí o ochranu původní ichtyofauny by měl však být i přehled o situaci (výskyt, význam a vliv) nepůvodních druhů v jednotlivých zemích. V ČR dosud neexistuje centrální registr introdukovaných druhů ryb. První přehled nepůvodních druhů, které jsou dovezeny či pokusně chovány, zpracovali až autoři Lusk et al. (2005b). Ochrana biodiverzity je významným tématem současnosti jak na celosvětové, tak i na regionální úrovni v rámci jednotlivých států. Symbolem ochrany všeho živého na naší planetě se stala biblická archa Noemova (viz úvodní citát). Bylo přijato mnoho dokumentů a zákonů, jako např.: Úmluva o biologické rozmanitosti (UNCED, „Summit o zemi“, 1992), mezinárodní legislativní ochranářské normy (Bernská úmluva, Směrnice Rady č. 92/43/EEC), národní normy (zákon č. 114/1992 Sb. O ochraně přírody a krajiny, vyhláška č. 395/1992 Sb., atd.), které napomáhají k ochraně živočichů, tedy i ichtyofauny. V květnu 2006 přijala evropská komise klíčový dokument COM (2006) 216 – „Halting the Loss of Biodiversity by 2010“. Dokument se zabývá mimo jiné tématy eutrofizace, acidifikace, homogenitou a fragmentací prostředí, nutností redukce invazivních druhů a alienů, adaptacemi na klimatické změny a také nezbytností pokračovat v kompletaci sítě Natura 2000. Většina badatelů však chápe, že datum 2010 je jen symbolické, neboť není v lidských silách v tak krátké době vyřešit problémy, které se na Zemi kumulovaly po dlouhý čas. Jedno je ale zřejmé, že se spojují vědci, národy i kontinenty v úsilí zastavit nezodpovědné a bezohledné jednání lidí vůči přírodě a přírodním zdrojům. Toto rostoucí úsilí po změně bylo demonstrováno na 1 st European Congress of Conservation Biology v Maďarsku (Eger, 2006), kterého se zúčastnilo přes 1000 účastníků z 53 zemí všech kontinentů. Na kongresu byly prezentovány projekty a zkušenosti z různých oblastí ochrany biodiverzity živočichů, rostlin a přírodních habitatů. V rámci sekce „Učení se od jiných kontinentů“ byly demonstrovány jednotlivé body plánování ochranářského projektu, monitorování dlouhodobých změn a hrozeb a vyhodnocování dosažených výsledků. Byly představeny komplexní projekty zabývající se ochranou a managementem různých živočichů. Např. finský projekt na ochranu vlků ( Canis lupus ), švýcarský projekt na ochranu alpského tetřeva ( Tetrao urogallus), švédský projekt na
11 ochranů evropských raků ( Astacus astacus ) či arktických lišek ( Alopex lagopus ), projekt na ochranu hnědých medvědů v Britské Kolumbii ( Ursus arctos) , projekt na ochranu ryb v povodí Upper Mississippi nebo švédský program na reintrodukci čápa bílého ( Ciconia ciconia ), atd. Realizace evropské záchranné sítě Natura 2000 v zemích EU je celkově ve velmi pokročilé fázi. V rámci 15 nejstarších členských států (EU15) byla již skončena 1. fáze (s výjimkou mořských habitatů). Tzn., byly stanoveny základní cíle, byl sestaven design ochranářských projektů a vytipovány habitaty zájmu. Celkem bylo stanoveno více jak 20 000 míst ochrany, které tvoří oblast větší než je území Německa. V některých státech byla již spuštěna i 2. fáze, tj. management, monitoring a zpravodajství. Česká republika, jako člen EU, rovněž poskytuje určité finanční prostředky na projekty spojené s mapováním a ochranou biodiverzity. V současné době bylo na území ČR vymezeno 104 evropsky významných lokalit (EVL) pro 15 tzv. „naturových druhů“ ryb (Tab. 4; Hanel & Lusk, 2005). Tab. 4. Přehled „naturových druhů“ a počtu evidovaných a vybraných území v ČR (EVL) Evidované Vybrané Druh lokality lokality (EVL) Mihule potoční ( Lampetra planeri ) 446 23 Mihule ukrajinská* ( Eudontomyzon mariae ) 1 0 Losos obecný ( Salmo salar ) 9 8 Bolen dravý ( Aspius aspius ) 147 6 Hrouzek Kesslerův ( Romanogobio kesslerii ) 2 2 Hrouzek běloploutvý ( Romanogobio albipinnatus ) 7 3 Ostrucha křivočará ( Pelecus cultratus ) 1 1 Hořavka duhová ( Rhodeus amarus) 66 15 rod Sekavec ( Cobitis sp.) 8 8 Sekavčík horský ( Sabanejewia balcanica ) 1 1 Piskoř pruhovaný ( Misgurnus fossilis ) 69 10 Ježdík žlutý ( Gymnocephalus schraetser ) 1 1 Ježdík dunajský ( Gymnocephalus baloni ) 1 1 Drsek větší ( Zingel zingel ) 1 1 Drsek menší ( Zingel streber ) 1 1 Vranka obecná ( Cottus gobio ) 231 23 * Nebyla navržena EVL v důsledku kritického stavu jediné populace
12 V SR bylo navrženo 332 území evropského významu (UEV) pro 25 „naturových druhů“ ryb, mezi kterými se vedle dvou již zmiňovaných druhů hrouzků nachází i hrouzek dlouhovousý ( Romanogobio uranoscopus , Tab. 5). Pro větší podrobnosti odkazuji na Králiková & Gojdičová (2004) a na slovenské stránky Natura 2000 (http://www.sopsr.sk/natura/index.php?p=4&lang=sk&sec=12). Tab. 5. Přehled „naturových druhů“ a počtu navržených území v SR (UEV) Bioregión Vybrané Druh alpínsky panónsky lokality (UEV) Boleň dravý ( Aspius aspius) x x 13 Mrena stredomorská ( Barbus meridionalis (peloponesius) x x 7 Mrena (Barbus spp. (Barbus barbus ) Pĺž severný ( Cobitis taenia (elongatoides ) x x 17 Hlaváč bieloplutvý ( Cottus gobio ) x x 33 Mihuľa potiská (Eudontomyzon danfordi )* x x Mihuľa ukrajinská (Vladykovova) Eudontomyzon mariae (vladykovi)* x x Hrúz bieloplutvý (Gobio albipinnatus ) x x 39 Hrúz Kesslerov ( Gobio kessleri ) x x 16 Hrúz fúzatý ( Gobio uranoscopus ) x x 8 Hrebenačka vysoká (Gymnocephalus baloni ) x 25 Hrebenačka pásavá (Gymnocephalus schraetzer ) x x 11 Hlavátka podunajská (Hucho hucho ) x x 8 Mihuľa potočná (Lampetra planeri) x 3 Čík európsky (Misgurnus fossilis ) x x 23 Šabľa krivočiara (Pelecus cultratus ) x 9 Lopatka dúhová (Rhodeus sericeus amarus ) x x 48 Plotica čiernomorská (perleťová) ( Rutilus frisii meidingeri )** x Plotica lesklá (Rutilus pigus ) x x 8 Pĺž zlatistý (Sabanejewia aurata (balcanica) x x 16 Losos atlantický ( Salmo salar ) Extinct Lipeň tymianový (Thymallus thymallus ) Blatniak tmavý (Umbra krameri ) x 7 Kolok vretenovitý (Zingel streber ) x x 22 Kolok veľký ( Zingel zingel ) x 8 * navrhnute ako Eudontomyzon spp. – 11 UEV ** v r. 1979, jeden splavený exemplár v rieke Dunaj v Radvani nad Dunajom (okr. Komárno)
13 Ichtyologické oddělení ÚBO AV ČR, v.v.i., kterého jsem členem, se od roku 2000 podílelo a podílí na některých projektech, jejichž podstatu tvoří problematika biodiverzity různých druhů ryb. Jmenovitě: • „Characteristics and genetic differences of populations and species of genus Gobio and Romanogobio : contribution to description of their biodiversity“ (2000 2003; IAA6045005). • „Molecular and other genetic markers applied in the conservation of populations of endangered, rare, and vanishing fish species in the Czech Republic“ (2001 2005; IPS5045111). • „Intraspecific diversity in selected fish species (family: cyprinidae, cobitidae) in the conditions of Central Europe“. Tento projekt byl podporován Evropskou unií (Improving Human Potential Programme – Access to Research Infrastructures, 2005; HPRI CT 2001 00180). • „Genetická diverzita ohrožených druhů ryb – nezbytný základ efektivní ochrany biodiverzity“ (2005 2007; MŽP ČR VaV/SM/6/3/05). • „Biodiverzita ryb v oblasti soutoku Moravy a Dyje – podpora a stabilizace populací vzácných a ohrožených druhů (2007 2009; MŽP ČR VaV/SP/2d4/55/07). Cílem této disertační práce je přispět k inventarizaci biodiverzity rodů Gobio a Romanogobio vzhledem k ohrožení některých druhů hrouzků. Přinést nové poznatky v oblasti taxonomie, systematiky a fylogeografie obou rodů, především na území ČR. Státoprávní uspořádání a hydrologické souvislosti však vedly k tomu, že ichtyofauna České republiky a ichtyofauna Slovenska byly v minulosti zkoumány jako souvislý komplet. Proto, jako většina dřívějších studií věnovaných problematice „hrouzka“, i předkládaná studie řeší jednotlivé tématické aspekty v návaznosti na skutečnosti zjištěné v rámci obou států.
14 2 Přehled současného stavu řešené problematiky
2.1 Diverzita druhová a vnitrodruhová – obecný pohled
Taxonomické systémy ryb jako základní jednotku uvažují „druh“ a proto i následné aplikační aktivity (rybářství) a opatření (ochrana) užívají druhový princip jako výchozí pro řídící a vymezující předpisy a legislativní normy. Současné znalosti o druhové skladbě ichtyofauny ČR i SR vznikly klasickými postupy, využívajícími především morfologické a ekologické charakteristiky. Při hodnocení a ochraně biodiverzity ichtyofauny v současném pojetí je však nezbytné zohlednit vedle druhového pohledu i aspekt vnitrodruhový (genetický). Proto ichtyologický výzkum v ČR v 90. letech minulého století se věnoval i této tématice. Postupně byly publikovány studie o vnitrodruhové diverzitě některých druhů ryb ČR a SR. Většina studií byla založena na metodě biochemické genetiky (alozymová analýza) a až v poslední době začaly být používány metody molekulární genetiky. První studie vnitrodruhové diverzity byly věnovány říčním druhům „parmového pásma“: Barbus barbus (Šlechtová et al., 1993, 1998), Chondrostoma nasus (Lusková et al., 1995, 1997), Vimba vimba (Lusk et al., 2005a). Několik studií vzniklo v souvislosti s celosvětovým výzkumem rodu Cobitis : Šlechtová et al. (2000, 2003), Lusk et al. (2003), Lusková et al. (2004). Problematiku vnitrodruhové diverzity v ČR ve vztahu k její ochraně analyzovali ve svých studiích např. Lusk et al. (1995, 2002b, 2002c) a Šlechta et al. (1996). Ztráta či oslabení geneticky jedinečných populací se v minulém století zvýšily v důsledku např. destrukce biotopů, znečištění, vodohospodářského a rybářského managementu, blokování migračních cest nebo v důsledku interbrídingu či vlivem konkurence s vysazovanými nepůvodními druhy, případně zavlečením nemocí a parazitů. Výsledkem těchto vlivů bylo snížení účinné velikosti populace a ztráta genetické variability. Tato vnitrodruhová variabilita je důležitou charakteristikou populací pro krátkodobé fitness jedince i pro dlouhodobé přežívání populace, protože umožňuje adaptaci k měnícím se environmentálním podmínkám. Na genetickou variabilitu lze pohlížet dvěma způsoby: jako na alelovou a nukleotidovou varianci a také jako na alelovou heterozygozitu. U malých izolovaných populací může být genetická variabilita podstatně snížena genetickým driftem a inbrídingem , což může vést ke ztrátě alely a tedy ke snižování heterozygozity. Takové redukce mohou mít za následek snížení fitness až eventuální vyhynutí. Dalším problémem je vysazování nenativních ryb do přirozených populací, buď neuváženě – doplňkovým vysazováním nebo náhodně, např úniky z chovů. Ztráta specifických lokálních adaptací má za
15 následek homogenizaci populací a snížení genetické variance. Vysazování je často považováno za univerzální lék pro všechny problémy spojené se snižováním početnosti populace. A přitom se učiní málo kroků pro zjištění základní příčiny tohoto poklesu. V mnoha případech jsou vysazováni jedinci bez genotypizace a z geograficky vzdálených populací, což může vést k hybridizaci či introgresivní hybridizaci cizích ůseků DNA do nativních genofondů, což může mít škodlivý dopad na lokální adaptaci a charakter populace. Z praktického hlediska není v lidských silách chránit všechny populace jednotlivých druhů, ale je možné na základě seriózního sběru dat vytipovat ty, u kterých je nezbytný lidský zásah a následná ochrana. Jak správně chránit vnitrodruhovou (genetickou) diverzitu či jaké kroky jsou nezbytné v současné době činit na tomto poli uvádějí Lusk et al. (2002a) a Hanel & Lusk (2005): 1) vědecky stanovit rozsah a úroveň vnitrodruhové diverzity u nativních taxonů naší ichtyofauny, zejména u druhů zvláště chráněných. 2) na základě získaných znalostí vymezit dílčí hydrologické regiony pro možnou manipulaci s násadami ryb za účelem posilování místních populací. 3) speciální pozornost věnovat druhům, u kterých je potřebné aplikovat záchranný program včetně záchranného chovu. Je zřejmé, že při uskutečňování těchto cílů bude potřeba značných finančních prostředků a zejména času. Ale již nyní jsou zavedeny určité prozatímní principy (Lusk et al., 2002c): a) v případě posílení populace intervenčním vysazováním, preferovat násady (matečné ryby, jikry) pocházející z dané populace. b) nepřesouvat násady mimo hydrologický systém příslušného úmoří. V případě dlouhodobě chovaných druhů (kapr obecný, lín obecný, candát obecný a štika obecná) nemusí být tento princip striktně dodržen. c) u druhů s intervenčním vysazováním nepřesouvat násady mimo dílčí hydrologické regiony, které byly navrženy s ohledem na jejich stávající migrační separaci (Obr. 3). Týká se to všech uměle rozmnožovaných říčních druhů ryb.
16 Obr. 3. Základní hydrologické celky České republiky (převzato z Hanel & Lusk, 2005). A. Ohře, B. Dolní tok Labe (včetně povodí Odry v Čechách), C. Střední tok Labe, D. Horní tok Labe (včetně povodí Odry v Čechách), E. Berounka (včetně povodí Dunaje v Čechách), F. Dolní tok Vltavy, G. Sázava, H. Otava (včetně povodí Dunaje v Čechách), I. Horní tok Vltavy (včetně povodí Dunaje v Čechách), J. Lužnice, K. Horní tok Moravy, L. Povodí horní Dyje a Svratky, M. Dolní tok Dyje a Moravy, N. Střední tok Moravy, O. Bečva, P. Povodí Odry
2.2 Taxonomie zkoumaného objektu
Taxonomie zůstává důležitou oblastí biologického výzkumu od vzniku Linnéova klasifikačního systému v 18. století. Taxonomie je věda, která nám umožňuje kvantifikovat biodiverzitu. Popis a pojmenování rozdílných taxonů jsou nezbytné pro mnoho disciplín v biologii. Např. v ochranářské biologii (conservation biology) jsou správná identifikace taxonů (taxonomie) a zhodnocení jejich evolučních vzájemných vztahů (systematika) klíčové pro design účinných strategií v ochranářském managementu. Nedostatečné rozpoznání odlišného a ohroženého taxonu může vést k nedostatečné ochraně a následnému vyhynutí. Naopak identifikace příliš mnoha taxonů na podkladě nekomplexního přístupu může vést k plýtvání limitovaných ochranářských zdrojů. Špatná identifikace sesterského taxonu by mohla vést k nesprávné volbě zdrojové populace pro doplnění ohrožené populace. Na konci 20. století došlo k významnému posunu v ichtyologickém výzkumu. Stále více vědců se zaměřuje na oblast taxonomie s využitím poznatků fylogeneze a fylogeografie. Příčinami tohoto posunu jsou především stupňující důraz na poznání a ochranu biodiverzity a extrémní nárůst aplikace nových zejména molekulárních metod. Výsledné poznatky vedou ke změně dosavadních taxonomických kategorií. Přehledná revize skladby evropských ryb, kterou provedl Kottelat (1997), vedla k postupnému opouštění kategorie „subspecie“ a otevřela cestu k povyšování stávajících
17 subspecií na kategorii species a dále i k ustanovování nových druhů. Přes zdůrazňování nutnosti maximálně komplexního vyhodnocování souboru údajů, jako základu pro seriózní taxonomickou studii (Kottelat, 1998) je doposud obvykle využíván pouze dílčí okruh údajů (morfologie, osteologie) k taxonomickým závěrům. Navíc používání rozdílných druhových konceptů, či naopak vlastního subjektivního kritéria, mělo za následek vystavění „the Tower of Babel“ v evropské ichthyologické taxonomii. Výsledkem tohoto chaosu je 1933 rozdílných jmen, která byla navržena pro 358 nativních sladkovodních druhů ryb v Evropě, tzn. 5,4 jmen/druh (Kottelat, 1998). Nastíněná problematika taxonomie ryb odráží stav taxonomického vývoje rodu Gobio v původním klasickém rozsahu. Přehlednou revidovanou skladbu rodu Gobio v kontextu s časovými znalostmi podal Berg (1948 1949). Další výrazné změny do taxonomie rodu Gobio vnesl Bănărescu (1961, 1962), který v rámci rodu Gobio (Cuvier, 1816) vyčlenil dva další podrody, Rheogobio (Bănărescu, 1961; typ uranoscopus) a Romanogobio (Bănărescu, 1961; typ kesslerii). Později Naseka (1996) podrod Romanogobio povýšil na samostatný rod. V dalším vývoji jsou do tohoto rodu zařazováni hrouzci skupiny „albipinnatus “ a „kesslerii “. Ne zcela jednoznačný je náhled na status podrodu Rheogobio , když se ojediněle objevuje jeho aplikace jako samostatného rodu u druhu Rheogobio /Gobio uranoscopus (Nalbant et al., 2004). V posledních letech se objevuje řada studií věnovaných taxonomii „gudgeons“, kdy jsou využívána data morfologická, karyologická včetně genetických k objevování nových druhů či povyšování dosavadních poddruhů na druhovou úroveň (Doadrio & Madeira, 2004; Freyhof
& Naseka, 2005; Naseka et al., 2006; Naseka & Freyhof, 2004; Vasileva et al., 2004). Některé z nich však identifikují a stanovují nový druh bez komplexního přístupu. Mapování biodiverzity ryb a její rychlá ochrana by měla být založena na vědecké zodpovědnosti a preciznosti. Proto pracovní termín „species in waiting“ navrhovaný skupinou kolem profesora Heberta (Hebert et al., 2004) pro případy vyhlašování nových druhů bez komplexity přístupů je vhodným řešením, které nebrzdí proces rychlého mapování biodiverzity a zároveň poskytuje dostatečný čas pro jeho komplexní revizi. Systematické zařazení hrouzků dle Taxonomicon & Systema Naturae 2000 (Brands, 2005) Kmen: Chordata – Strunatci Podčeleď: Vertebrata – Obratlovci Třída: Osteichthyes – Ryby Podtřída: Actinopterygii – Paprskoploutví
18 Nadoddělení: Neopterigii Pododdělení: Teleostei – Kostnatí Řád: Cypriniformes – Máloostní Čeleď: Cyprinidae – Kaprovití Podčeleď: Gobioninae 1. Rod: Gobio 2. Rod: Romanogobio Hrouzci rodu Gobio jsou velmi rozšířeni a obývají oblast od povodí Duero ve Španělsku až po severní Čínu. Celkem bylo popsáno a v literatuře se uvádí asi 149 vědeckých názvů druhů/poddruhů tohoto rodu, z toho 21 je považováno v současné době za platných (Froese & Pauly, 2007 – FishBase 7/2007). Hrouzci rodu Romanogobio obývají jednu z devíti definovaných ekozón, konkrétně západní část Palearktické zóny. Celkem bylo popsáno a v literatuře se uvádí asi 19 vědeckých názvů druhů/poddruhů tohoto rodu, z toho 17 je považováno v současné době za platných (Froese & Pauly, 2007 – FishBase 7/2007). Doktorská práce pojednává o 15 druzích/poddruzích rodu Gobio a o 13 druzích/poddruzích rodu Romanogobio v Evropě. Z toho v České republice se vyskytuje podle původní nomenklatury 1 druh rodu Gobio (Gobio gobio ) a 2 druhy rodu Romanogobio (Romanogobio albipinnatus a Romanogobio kesslerii ). Na Slovensku je situace podobná s tím, že rod Romanogobio je zastoupen 3 druhy ( Romanogobio albipinnatus , Romanogobio kesslerii a Romanogobio uranoscopus ).
2.3 Použité názvosloví
Považuji za vhodné v úvodu komentovat a vysvětlit používání názvosloví ryb, které jsou předmětem této práce. V dřívější i současné literatuře je uváděno různé pojmenování pro druhy hrouzka obou analyzovaných rodů, což přináší nemalé obtíže při interpretaci. Taxonomický problém má několik rovin, které svým způsobem přispěly k nepřehlednosti v užívaném názvosloví.
1. Zachovávání dřívější nomenklatury, která řadila všechny hrouzky do jednoho rodu Gobio . Z toho vzniká pojmenování Gobio gobio , Gobio albipinnatus , Gobio uranoscopus a Gobio kesslerii .
19 2. Užívání taxonomického názvosloví plynoucího z uznání validity podrodů Romanogobio a Rheogobio (Bănărescu, 1961) a s následným povýšením na rodovou úroveň. Odpovídající pojmenování Romanogobio albipinnatus , Rheogobio uranoscopus , Romanogobio kesslerii . 3. Užívání taxonomického názvosloví plynoucího z uznání validity rodu Romanogobio vedle již existujícího rodu Gobio (Naseka, 1996). Z toho plyne pojmenování Romanogobio albipinnatus , Romanogobio uranoscopus , Romanogobio kesslerii . 4. Uznávání kategorie poddruh, geografické variety dostávaly poddruhový název uvnitř polytypického druhu. Např. Romanogobio (albipinnatus) belingi , Gobio (uranoscopus) friči , zkrácená forma G. u. friči . Podruhová kategorie je označena závorkou ve vědeckém názvu. 5. Pojmenovávání na základě fylogenetického druhového konceptu (Phylogenetic Species Concept, PSC) nebo evolučního druhového konceptu (ESC), které ruší kategorii poddruh a v případě prokázání validity některého z poddruhů jej povyšují na druhovou úroveň. Např. Romanogobio (albipinnatus) vladykovi = Romanogobio vladykovi , Romanogobio (uranoscopus) friči = Romanogobio friči . V úvodní části dizertační práce užívám pro orientaci poddruhové názvosloví a při citování prací jiných autorů původní pojmenování. V případě vlastních výsledků či závěrů, v souladu s novými vědeckými skutečnostmi a přístupy, užívám pojmenování podle druhového konceptu ESC (Kottelat 1997, 1998; Kullander, 1999).
20
2.4 Hrouzek obecný ( Gobio gobio Linnaeus, 1758) Obr. 4. Nápadná pigmentace hřbetní a ocasní ploutve u hrouzka obecného (Foto: K. Halačka). Podrobnější charakteristiky hrouzka obecného – popis druhu, ekologické nároky a biologie jsou uvedeny v souhrnných přehledech: Oliva et al. (1968); Baruš & Oliva (1995); Bănărescu (1999) a Hanel & Lusk (2005).
2.4.1 Rozšíření v ČR a SR Hrouzek obecný je všeobecně rozšířený druh, viz lokality výskytu na území ČR (Obr. 5).
21 Obr. 5. Evidovaný výskyt hrouzka obecného ( Gobio gobio ) na úzení ČR za období 1958 2005 (převzato z Hanel & Lusk, 2005). Na Slovensku je Gobio gobio rovněž hojně rozšířen (mapa není uvedena), vyskytuje se v malých potocích i velkých řekách a lze jej nalézt i vysoko v horních úsecích řek Laborec a Topľa (Weisz & Kux, 1959). Absentuje pouze v horských peřejnatých a pramenitých vodách. Nejhojněji se objevuje ve střední části toku s charakterem parmového pásma, jeho současný výskyt na území SR je oproti minulosti v podstatě nezměněn (Koščo et al., 2005). Konkrétní lokality výskytu přináší Oliva et al. (1968) a Baruš & Oliva (1995).
2.4.2 Stupeň ohrožení a ochrana Není objektem národní ani evropské ochrany.
22
2.5 Hrouzek Kesslerův ( Romanogobio kesslerii Dybowski, 1862) Obr. 6. Hrouzek Kesslerův (Foto: K. Halačka). Podrobnější charakteristiky hrouzka Kesslerova – popis druhu, ekologické nároky a biologie jsou popsány v souhrnných přehledech: Baruš & Oliva (1995); Bănărescu (1999); Hanel & Lusk (2005).
2.5.1 Rozšíření v ČR a SR Hrouzek Kesslerův je nejvzácnější ze tří druhů hrouzka na území ČR (Obr. 7). Do roku 1949 nebyl identifikován na našem území ani na území Slovenska. V roce 1950 byl poprvé objeven v Bečvě u Lipníka (říční km 25; Oliva 1950, 1951). V roce 1951 byly získány dva exempláře tohoto druhu v Bečvě nad obcí Lhotka u Valašského Meziříčí (říční km 56; Bănărescu & Oliva, 1966). Další nález v Bečvě následoval až po 45 letech, kdy byl uloven jeden exemplář u Přerova (říční km 10; Jurajda et al., 1996). V letech 1997 1998 byl proveden komplexní ichtyologický průzkum řeky Bečvy, který prokázal, že tento druh se vyskytuje v úseku řeky od jejího ústí do Moravy (říční km 0,1) až po Hustopeče nad Bečvou (říční km 50,5). Nejpočetnější populace hrouzka Kesslerova byla objevena na říčním km 35,5 u obce Rybáře (až 650 ryb/ha; Lusk et al., 2005a). Ojedinělý výskyt tohoto druhu z lokality Grimov uvádí Spurný et al. (2000). Na podzim roku 2003 byl proveden ichtyologický výzkum řeky Moravy do které se vlévá řeka Bečva. Byl vymezen nový areál výskytu v řece Moravě od ústí řeky Bečvy (říční km 210,7) směrem proti proudu až po jez v Bolelouci (říční km 221,04; Merta & Lusk, 2004). Na území Slovenska je známý z východoslovenských řek Ipel’, Hornád, Laborec, Ondava, Slaná, Tisa, Topl’a, Torysa, Uh, Ulička, atd., kde v dřívějších dobách patřil k hojným druhům tamní ichtyofauny (Kux & Weisz, 1958, 1962, 1964; Weisz & Kux, 1959; Holčík et al., 1965; Žitňan, 1965b; Dorko, 1966b; dále viz Oliva
23 et al., 1968). Na základě intenzivnějšího mapování tohoto druhu po roce 2000 i v souvislosti s projektem Natura 2000 byl potvrzen jeho výskyt v málopočetných populacích v povodí Dunaje (Dunaj, Hron, Rimava, Kysuca, Krupina, Štiavnička, Čierna Orava, Jelešná, Ipeľ, Blh). V povodí Tisy pak v tocích Bodva, Slaná, Hornád, Torysa, Topľa, Ondava, Laborec, Uh, Tisa (Koščo 2007, pers. com.). Obr. 7. Evidovaný výskyt hrouzka Kesslerova na území ČR za období 1950 2005 (převzato z Hanel & Lusk, 2005).
24 Obr. 8. Výskyt hrouzka Kesslerova na území SR v povodí řeky Tisy (převzato z Koščo et al., 2005). před rokem 1980 období 1995 2003 (čísla lokalit 1 13) Koščo et al. (2005) uvádí výskyt např. v řece Topl’a proti proudu od ústí do Ondavy, lokalita Božčice a v horní části toku na lokalitách Giraltovce, Brezov, Nemcovce a Poliakovce. Další lokality výskytu v povodí řeky Tisy ukazuje Obr. 8, převzato z článku Koščo et al. (2005), kde je patrný nepříznivý trend snižování počtu lokalit jeho výskytu.
2.5.2 Stupeň ohrožení a ochrana V průběhu posledních padesáti let došlo k dramatickému omezení původního rozšíření druhu R. kesslerii , je objektem národní i evropské ochrany a patří mezi tzv. „naturové druhy“. V ČR: podle národní legislativy (vyhl. č. 395/1992 Sb.) je hodnocen jako kriticky ohrožený. v Červeném seznamu IUCN (2004) je řazen do kategorie DD. v naší legislativě (vyhl. č. 166/2005 Sb.) je řazen do přílohy A. v rámci Červeného seznamu ČR je hodnocen jako kriticky ohrožený (Lusk et al., 2004a). V SR: v Červeném seznamu SR je řazen jako kriticky ohrožený. dle národní a mezinárodní legislativy je řazen mezi druhy evropského významu, pro něž se vyhlašují zvláště chráněná území (SCI) a proto je součástí přílohy 6b (24/2003 Z. z.), HD2, Be3. Pro účely záchranářského projektu Natura 2000 byl upřesněn jeho výskyt a byla navržena na území ČR a SR pro něj zvláště chráněná území (EVL a UEV). Jmenovitě na území ČR: 1) hrouzek Kesslerův ( Romanogobio kesslerii ) – 2 EVL: a) úsek se štěrkovými náplavami od Lipníka nad Bečvou po Hranice (CZ0714082 – Bečva Žebračka) b) úsek se štěrkovými lavicemi od soutoku Moravy s Bečvou až po jez v Bolelouci (CZ0714085 – Morava – Chropyňský luh) Obě populace jsou prostorově vymezené a tvoří současně jediná dvě území výskytu tohoto druhu v ČR. Jmenovitě na území SR:
25 1) hrúz Kesslerov ( Gobio kesslerii ) – 16 UEV území: SKUEV0006 Rieka Latorica , SKUEV0063 Ublianka , SKUEV0064 Bratislavské luhy , SKUEV0090 Dunajské luhy , SKUEV0183 Veľkolélsky ostrov , SKUEV0234 Ulička , SKUEV0235 Kanál Stretavka , SKUEV0257 Poiplie , SKUEV0269 Ostrovné lúčky , SKUEV0270 Hrušovská zdrž , SKUEV0293 Kľúčovské rameno , SKUEV0295 Biskupické luhy , SKUEV0312 Devínske alúvium Moravy , SKUEV0313Devínske jazero , SKUEV0314 Rieka Morava , SKUEV0393 Dunaj Konkrétnější a podrobnější popis slovenských UEV území, včetně map, lze nalézt na stránce: http://www.sopsr.sk/natura/index.php?p=4&sec=12
26 2.6 Hrouzek běloploutvý (Romanogobio albipinnatus Lukasch, 1933 ) Obr. 9. Hrouzek běloploutvý (Foto: K. Halačka). Podrobnější charakteristiky hrouzka běloploutvého – popis druhu, ekologické nároky a biologie jsou popsány v souhrnných přehledech: Baruš & Oliva (1995); Bănărescu (1999); Hanel & Lusk (2005).
2.6.1 Rozšíření v ČR a SR Výskyt hrouzka běloploutvého na území ČR je znám jen z oblasti Jižní Moravy, zejména z řek Moravy a Dyje. Mahen (1929 1931) nalezl v Jihlavě hrouzky odlišné od známých druhů G. gobio a G. uranoscopus . Nicméně tyto jedince přiřadil ke vzorkům druhu G. uranoscopus . Toto chybné zařazení bylo dáno skutečností, že druh G. albipinnatus nebyl rozpoznáván, neboť byl popsán poprvé až v roce 1933 (Lukasch 1933). Později Lusk (1977) potvrdil výskyt G. albipinnatus na této lokalitě. Kux (1957) poznamenává, že G. albipinnatus výrazně převládá nad G. gobio v dolních úsecích řek Moravy a Dyje. Oblast řeky Moravy: nedávná data (Peňáz & Jurajda, 1993; Jurajda & Peňáz, 1994; Jurajda et al., 1998) potvrzují výskyt tohoto druhu v řece Moravě. Novější data uvádějí výskyt hrouzka běloploutvého v ústí potoka Velička do řeky Moravy (říční km 128,8; Lusk et al., 2000). V roce 2003 byl zaznamenán výskyt v řece Moravě v blízkosti ústí s říčkou Olšava (říční km 154,7), nedaleko Kroměříže (říční km 195,3) a v přítocích Moštěnka, Dřevnice a Březnice. Oblast řeky Dyje: Lelek and Libosvárský (1960) ohlásili objevení tohoto druhu v dolní části řeky Dyje v Břeclavi. V současnosti je znám hojný výskyt v přítoku řeky Dyje v říčce Kyjovce. Bănărescu & Oliva (1966) oznámili výskyt v řece Bečvě nedaleko Kamence. Tento výskyt ale nebyl potvrzen při detailním výzkumu řeky Bečvy v letech 1997 2000.
27 Podle dat vyhodnocených v roce 2005 (Lusk et al., 2005a) se hrouzek běloploutvý vyskytuje v řece Moravě od soutoku s řekou Dyje (říční km 70) až po ř. km 195,3 a současně v dolní části řeky Dyje po Novomlýnskou nádrž (říční km 46,0). Dále byl zaznamenán příležitostný výskyt v dolní části řeky Jihlava až po Ivančice, v dolní a střední části řeky Rokytná (přítok Jihlavy). Byl potvrzen i výskyt v krátkém úseku řeky Dyje nad Vranovskou přehradou (říční km 206 208). Současně byl potvrzen v řece Dyji blízko hranic s Rakouskem (tzv. Moravská Dyje, říční km 253). Při porovnání s údaji o distribuci tohoto druhu v minulosti je patrný pokles přibližně o 30 %. V roce 2003 byl oznámen záchyt hrouzka běloploutvého v Čechách v řece Labi, oblast soutoku Labe s Vltavou. Jedinci byli popsáni jako G. albipinnatus , později byl název změněn na Romanogobio belingi (Šlechta 2004, pers. com.). Lusk et al. (2005c) potvrdili nález tohoto druhu v řece Labi blízko jezu ve Střekově (69 km po proudu od soutoku Labe s Vltavou) a dále blízko jezu v Neratovicích (13,1 km proti proudu od tohoto soutoku). Lokality výskytu hrouzka běloploutvého zobrazuje Obr. 10. Na Slovensku byl v minulosti zjištěn na těchto lokalitách: Malý Dunaj u Prievozu u Bratislavy (Oliva 1950, 1953), Dunaj – hlavní tok a ramena, v Petržalce, Karlovej Vsi, Jarovciach, Čilistove, Obide, Štúrove (Brtek, 1953). Dále Laborec, Michalovce a ústí; Čierna voda; Topl’a, Brezov (Weis et Kux 1959); Laborec u Oborína (Žitňan, 1961 1962); jižní svahy Vihorlatu, Kusínský potok pod obcí Kusín (Holčík & Mišík, 1962); průtočná ramena Dunaje, Čilistov; Dunaj, Velké Kosihy, Malý Dunaj, Komárno; Nitra, Lándor, Bánovce; Žitava, Dvory nad Žitavou; Dunaj, Štúrovo; soutok Hronu s Dunajem; Hron, Kamenica nad Hronom, Levice (Kux & Weisz, 1962); Blatská nížina, Jovsanský potok; Okna, Bunkovce, Sobranecký potok, Senné; Čierna Voda, Stretava; Uh, Pavlovce; Latorica, most mezi Kr. Chlumcem a V. Kapušany; Tisa, Čierna n. Tisou; Torysa, Ploské; Ipel’, silnice Lučenec – Filakovo, Slovenské Ďarmoty; Krupina, Dolné Rykynčie, Šahy; Štiavnička, Šahy; Slatina nad Viglašem, nad Zvolenem (Kux & Weisz, 1964); dolní tok Latorice, Ból (Žitňan, 1964); slovenský úsek Tisy (Žitňan, 1965a); Dunaj, Palkovičovo, Medveďov, Kravany, inundační jezírka u Medveďova (Balon, 1967). Další slovenské lokality do roku 1964 uvádí Oliva et al. (1968). V současnosti se hrouzek běloploutvý vyskytuje (Koščo 2007, pers. com.) v povodí Dunaje (Dunaj, Malý Dunaj, Morava, Váh, Vlára, Dudváh, Blava, Hron, Nitra, Žitava, Krupina, Štiavnička, Slatina, Ipeľ) a v povodí Tisy (Čierna voda, Bodrog, Tisa). Dále pak v jižních regionech východního Slovenska, jak ukazuje Obr. 11. Jmenovitě byl jeho výskyt potvrzen v potoku Ida a jeho kanálech. V povodí řeky Slané zatím nebyl zaznamenán.
28 Obr. 10. Evidovaný výskyt hrouzka běloploutvého na území ČR za období 1965 2005 (Hanel & Lusk, 2005). Obr. 11. Výskyt hrouzka běloploutvého na území SR v povodí řeky Tisy (převzato z Koščo et al., 2005). před rokem 1980 období 1995 2003
29 V povodí řeky Bodvy byl potvrzen jeho výskyt v Hornádu, Toryse a Olšavě. Byl potvrzen v řece Topl’é (říční km 0 80), od soutoku Ondavy s Latoricou proti proudu (říční km 97, Domaša nádrž), v Laborci od jeho ústí do Latorice proti proudu (říční km 63), v řece Uh a jeho přítocích a v Latorici na území SR. Na východním Slovensku v povodí řeky Tisy nebyl zaznamenán pokles početnosti lokalit ve srovnání s literárními údaji (Koščo et al., 2005).
2.6.2 Stupeň ohrožení a ochrana Hrouzek běloploutvý nemá přímý hospodářský význam. V průběhu posledních padesáti let došlo ke snížení původního rozšíření tohoto druhu. Je objektem národní i evropské ochrany a patří mezi tzv. „naturové druhy“. V ČR: v naší legislativě (vyhl. č. 166/2005 Sb.) je řazen do přílohy A. v rámci Červeného seznamu ČR je hodnocen jako zranitelný (vulnerable; Lusk et al., 2004a). V SR: status ohroženosti druhu: – zařazení do národní a mezinárodní legislativy: je řazen do seznamu druhů národního významu do přílohy 4b (24/2003 Z. z.), HD2, Be3. Pro účely záchranářského projektu Natura 2000 byl upřesněn jejich výskyt a byla navržena na území ČR a SR pro ně zvlášť chráněná území (EVL a UEV). Jmenovitě na území ČR: 2) hrouzek běloploutvý ( Romanogobio albipinnatus ) – 3 EVL: a) území zahrnuje řeku Moravu od soutoku s Dyjí v délce 30 km směrem proti proudu, řeku Dyji od soutoku s Moravou až po jez v Břeclavi a také dolní část Kyjovky. Území je rozšířeno o vodní biotopy (ramena, zemníky, kanály, tůně) v aktivním a místy i pasivním aluviu uvedených toků (CZ0624119 – Soutok – Podluží) b) neupravený úsek řeky Dyje od jezu v Podhradí ke státní hranici (CZ0624095 – Údolí Dyje) c) dolní tok Rokytné od ústí do Jihlavy po silniční most v obci Rokytná (CZ0623819 – Řeka Rokytná)
30 Původní rozšíření hrouzka běloploutvého v povodí Moravy a Dyje bylo výrazně větší, než je současný stav. Znečištění, výstavba jezových objektů a regulace se ztrátou členitosti toků, byly hlavní příčiny zániku mnoha populací tohoto druhu. Jmenovitě na území SR: 2) hrúz bieloplutvý ( Gobio albipinnatus ) – 39 UEV území: SKUEV0006 Rieka Latorica , SKUEV0063 Ublianka , SKUEV0064 Bratislavské luhy , SKUEV0075 Klátovské rameno , SKUEV0090 Dunajské luhy , SKUEV0092 Dolnovážske luhy , SKUEV0116 Pri Jakubovských rybníkoch , SKUEV0121 Marhecké rybníky , SKUEV0124 Bogdalický vrch , SKUEV0125 Gajarské alúvium Moravy , SKUEV0148 Rieka Vlára , SKUEV0155 Alúvium Starej Nitry , SKUEV0159 Alúvium Žitavy , SKUEV0161 Alúvium Moravy pri Suchohrade , SKUEV0163 Rudava , SKUEV0165 Kútsky les , SKUEV0168 Horný les , SKUEV0177 Šmolzie , SKUEV0178 V studienkach , SKUEV0182 Číčovské luhy , SKUEV0183 Veľkolélsky ostrov , SKUEV0227 Čiližské močiare , SKUEV0234 Ulička , SKUEV0235 Kanál Stretavka , SKUEV0236 Rieka Bodrog , SKUEV0257 Poiplie , SKUEV0269 Ostrovné lúčky , SKUEV0270 Hrušovská zdrž , SKUEV0272 Vozokánsky luh , SKUEV0293 Kľúčovské rameno , SKUEV0311 Kačenky , SKUEV0312 Devínske alúvium Moravy , SKUEV0313 Devínske jazero , SKUEV0314 Rieka Morava , SKUEV0315 Skalické alúvium Moravy , SKUEV0317 Rozporec , SKUEV0393 Dunaj , SKUEV0396 Devínske lúky , SKUEV0397 Tok Váhu pri Zamarovciach Konkrétnější a podrobnější popis slovenských UEV území, včetně map, lze nalézt na stránce: http://www.sopsr.sk/natura/index.php?p=4&sec=12
31 2.7 Hrouzek dlouhovousý ( Romanogobio uranoscopus Agassiz, 1828) Obr. 12. Hrouzek dlouhovousý (Foto: J. Koščo). Podrobnější charakteristiky hrouzka dlouhovousého – popis druhu, ekologické nároky a biologie jsou popsány v souhrnných přehledech: Oliva et al, 1968; Baruš & Oliva (1995); Bănărescu (1999).
2.7.1 Rozšíření v ČR a SR Na území České republiky se tento druh patrně nikdy nevyskytoval a ani v současné době nebyl zaznamenán jeho výskyt. První doložené nálezy na Slovensku jsou z Dunaje pod Bratislavou (Podhradský & Brtek, 1955), v průtočných ramenech Dunaje u Čilistova (Weisz & Kux, 1962), ve Váhu (Kirka, 1964), ve Vláře (Černý, 1980) a ve Vláře při ústí do Váhu (Blahák, 1981). Na východním Slovensku v povodí Tisy byly doloženy nálezy v řece Topl’a (Kux & Weisz, 1958, Weisz & Kux, 1959), v Ondavě (Weisz & Kux, 1962; Dorko, 1963), v Laborci (Weisz & Kux, 1959), v Toryse (Kux & Weisz, 1964), v Hornádu v okolí Košic (Weisz & Kux, 1962). Často se hrouzek dlouhovousý vyskytuje společně s hrouzkem Kesslerovým, ale v případě řek Ipel’ a povodí řeky Slané tomu tak není. V západněji ležících povodích Hronu a Nitry nebyl prokázán výskyt ani jednoho z těchto zmiňovaných druhů hrouzka. Při ichtyologickém výzkumu v letech 1995 2003 byl zaznamenán jeho výskyt na sedmi lokalitách, jak demonstruje Obr. 13. Jmenovitě: v řece Bodvě (Hosťovce, č. 1), při soutoku Torysy a Hornádu (č. 2), v Hornádu (Košice, č. 3), v Toryse (Ploská, č. 4), v Topl’e (Božčice, č. 5), v Laborci (Kochánovce, č. 6) a v Uličce (Ulič, č. 7). Poměrně silná populace byla zjištěna v Laborci, slabší populace žijí v povodí Bodvy, Torysy, Hornádu, ojediněle se
32 vyskytují v Topl’e a Ondave. V dunajském povodí je současný výskyt tohoto druhu nejasný (Koščo 2007, pers. com.). Podobně jako v případě hrouzka Kesslerova je patrné mizení hrouzka dlouhovousého z jeho původních lokalit především v horních úsecích řek. Hlavním důvodem bylo znečištění v minulosti, budování kanálů a devastace přirozených habitatů (Koščo et al., 2005). V porovnání se zbývajícími druhy hrouzka rodu Romanogobio je situace tohoto druhu nejméně příznivá (Koščo 2007, pers. com.). Obr. 13. Výskyt hrouzka dlouhovousého na území SR v povodí řeky Tisy (převzato z Koščo et al., 2005). před rokem 1980 období 1995 2003 (čísla lokalit 1 7)
2.7.2 Stupeň ohrožení a ochrana Hrouzek dlouhovousý je považován za endemit některých řek dunajského povodí. V průběhu posledních padesáti let došlo k dramatickému omezení původního rozšíření tohoto druhu a proto je objektem národní i evropské ochrany. V ČR: nevyskytuje se V SR: status ohroženosti druhu: v rámci Červeného seznamu SR je hodnocen jako kriticky ohrožený.
33 zařazení do národní a mezinárodní legislativy: je řazen do příloh 4b, 6b (24/2003 Z. z.), Be3, HD2. Pro účely záchranářského projektu Natura 2000 byl upřesněn jeho výskyt a byla navržena na území SR pro něj zvlášť chráněná území (UEV). Jmenovitě na území SR: 3) hrúz fúzatý ( Gobio uranoscopus ) – 8 UEV území SKUEV0006 Rieka Latorica , SKUEV0090 Dunajské luhy , SKUEV0183 Veľkolélsky ostrov , SKUEV0229 Beskýd , SKUEV0234 Ulička , SKUEV0238 Veľká Fatra , SKUEV0243 Rieka Orava , SKUEV0253 Rieka Váh Konkrétnější a podrobnější popis slovenských území (UEV), včetně map, lze nalézt na stránce: http://www.sopsr.sk/natura/index.php?p=4&sec=12
34 2.8 Hybridizace a introgrese Hybridizace je běžným a dobře dokumentovaným fenoménem v rostlinné říši a současně široce akceptovaným vysvětlením původu mnoha rostlinných druhů. V současné době se objevuje stále více studií, které odhalují fenomén hybridizace i v živočišné říši a hovoří o její důležité roli v evoluci zvířat (Arnold, 1997; Grant & Grant, 1998). Některé přehledné studie zdůrazňují tvůrčí roli, kterou hybridizace může sehrávat v adaptivní evoluci a v procesu speciace (Rieseberg, 1997; Grant & Grant, 1998; Seehausen, 2004). Dřívější ochranářské strategie a postupy obecně nepřipouštěly ochranu hybridů. Avšak současné uznávání historické role hybridizace, jako evolučního procesu, způsobuje přehodnocení těchto pravidel. Přirozená hybridizace je obecněji rozšířená u ryb než u jiných obratlovců. Často se objevuje mezi blízce příbuznými druhy buď v geograficky definovaných hybridních zónách nebo po úmyslné či neúmyslné introdukci způsobené člověkem (Avise, 1994; Arnold, 1997; Goodman et al., 1999). Hybridizační události lze třídit do šesti typů (Obr. 14). Určení zda hybridizace je v přírodě přirozeným jevem u druhu nebo se objevila na základě antropogenní činnosti je klíčové pro jeho ochranu. Obr. 14. Přehled hybridních typů (převzato z Allendorf et al., 2001).
35 Determinace hybridizace vzniklé lidským zapříčiněním je mnohdy velmi obtížná, ale potřebná pro nebezpečí zániku mnoha taxonů (druhů, poddruhů, lokálně adaptovaných populací). Typy 1 3 reprezentují hybridizační události, které jsou přirozenou součástí dědictví evoluce taxonů. Tato taxa by měla být chráněna. Typy 4 6 dělí antropogenní hybridizaci do tří kategorií s rozdílnými důsledky pro ochranářské perspektivy. Hybridní taxa vzniklá antropogenní činností by měla být chráněna jen ve vyjímečných případech (Allendorf et al., 2001). Hybridní jedinci byli do poloviny 60. let minulého století detekováni pouze morfologickými charakteristikami a předpokládalo se, že by měli vykazovat intermediátní fenotyp svých rodičů. Avšak ne vždy tomu tak bylo, neboť hybridní jedinci občas vykazují mozaiku parentálních fenotypů. Navíc jedinci z tzv. „hybrid swarms“, s více geny od jednoho rodiče se často morfologicky od tohoto rodiče neliší. Morfologické znaky navíc nedovolují určit, zda se jedná o jedince první generace (F1), jedince vzniklého zpětným křížením (backcross) nebo zda se jedná o jedince pozdější generace. Postupné zavádění molekulárně genetických markerů velmi zjednodušilo identifikaci a popis hybridních populací. Tato procedura souvisí s vývojem proteinové elektroforézy (alozymová analýza) v polovině 60. let 20. století (Lewontin & Hubby, 1966; Ayala & Powell, 1972) a dominovala až do ranných 90. let. Poté rychlé pokroky ve vývoji molekulárních technik, speciálně PCR, vedly k narůstajícímu počtu lokusů, které můžeme použít pro detekci hybridizace. Navíc tyto techniky (analýza mikrosatelitů, sekvencování mtDNA nebo nDNA lokusů) jsou vhodnější pro malé populace ohrožené zánikem, protože sběr vzorků může být neinvazivní. Nejčastějším příkladem hybridizace u živočichů je „interspecific mtDNA transfer“. Tento fenomén je známý u Mus domesticus (Gyllensten & Wilson, 1987). Bernatchez et al. (1995) oznámil pradávnou introgresi mtDNA druhu Salvelinus alpinus do alopatrické populace Salvelinus fontinalis . Podobně i Takahashi & Takata (2000) odhalil introgresi mnoha mtDNA linií druhu Pungitius pungitius do Pungitius tymensis . Velká pozornost je soustředěna na informace o nahodilých hybridizačních událostech, méně je však zjišťována možnost vzniku nových dlouho žijících entit, které vznikly hybridizací (Dowling & Secor, 1997). Jako příklad lze uvést dávnou hybridizaci mezi kojotem ( Canis latrans ) a vlkem americkým ( Canis lupus ), která dala vznik ohroženému druhu Canis rufus (Wayne & Jenks, 1991; Roy et al., 1994). U ryb jsou také známy stabilní hybridní formy, které vznikly z blízce příbuzných druhů. Jako příklad lze uvést druh Gila seminuda , říční cyprinid z jihozápadu USA, který vznikl introgresivní hybridizací mezi Gila robusta a Gila elegans (DeMarais et al., 1992; Dowling & DeMarais, 1993). V Evropě byly odhaleny a hlouběji popsány tři
36 hybridní komplexy. Nejlépe prostudovaný je komplex kaprovité ryby Squalius ( Rutilus , Leuciscus ) alburnoides (Teleostei, Cyprinidae) z Pyrenejského poloostrova. Tento asexuální komplex diploidní a polyploidní formy je výsledkem hybridizace mezi samicemi S. pyrenaicus a samci neznámého původu (Collares Pereira, 1989; Alves et al., 2001). Do skupiny hybridních komplexů se také řadí některé evropské populace sekavců rodu Cobitis , u nichž bylo pomocí experimentálního křížení zkoumáno jejich asexuální rozmnožování (Bohlen and Ráb, 2001; Janko et al., 2003; Lusková et al., 2004). Nejméně prostudovaný je komplex tzv. karasa stříbřitého Carassius auratus ( gibelio ). Kalous et al. (2004) pod pojmem „gibelio “ rozumí hybridní víceploidní komplex rodu Carassius , který vznikl ve východní Asii, kde se stýkaly areály ferálního Carassius auratus a neznámého druhu rodu Carassius („ Carassius incognitus “). Evidenci hybridů rodu Gobio a Romanogobio je možné najít ve starších, ale i současných literárních údajích. Na křížence hrouzka obecného a hrouzka běloploutvého v dolním toku řek Moravy a Dyje a v řece Jihlavě poukázali Romanovský (1952) a Kux (1957). V Rokytné (přítoku Jihlavy) výskyt hybridů zaznamenal Lusk (1973), v rameni Dunaje v Čilistovu Kux and Weisz (1962) a v Ipel’u (Slov. Darmoty) Kux and Weisz (1964). Na východním Slovensku v povodí Tisy byli zjištěni kříženci v Laborci (Weisz & Kux, 1959). Podle Kuxe (1957) se hybridní jedinci obou druhů vyznačují středními hodnotami znaků: průměr oka, délka vousků, skvrnění ploutví a lemování postranní čáry. Nález hybridů hrouzka obecného a hrouzka Kesslerova popsal Kux and Weisz (1962) v řece Ondavě (Duplin a Slovenská Krajna), v říčce Blh (přítok řeky Slaná; Kux & Weisz, 1964) a v Toryse na lokalitě Ploská (Kux, 1964). Šlechtová et al. 2005 pomocí alozymové analýzy odhalili mezidruhovou hybridní introgresi na některých českých a slovenských lokalitách.
37 3 Cíle dizertační práce
1. Ověřit taxonomický status druhů/poddruhů rodů Gobio a Romanogobio na území ČR a SR. 2. Na základě analýz mtDNA posoudit vnitrodruhovou (genetickou) variabilitu druhů rodu Gobio a Romanogobio s přihlédnutím k areálu jejich rozšíření a hydrogeografickým oblastem. 3. Vyhodnotit odlišnost populací na území ČR a SR z hlediska posilování místních populací. 4. Vyhodnotit výskyt přírodních mezidruhových hybridních forem druhů Gobio gobio x Romanogobio albipinnatus a Gobio gobio x Romanogobio kesslerii . 5. Uplatnit výsledky pro ochranářský management na druhové a vnitrodruhové (genetické) úrovni. Najít odpovědi na konkrétní otázky: A. Žije v ČR a SR pouze nominotypická forma Gobio (gobio) gobio ? B. Je možné rozlišit na našem území literaturou zmiňované subspecie Gobio (gobio) gobio a Gobio (gobio) obtusirostris ? C. Která populace hrouzka Kesslerova na území SR je fylogeneticky nejblíže k jediným dvěma českým populacím? D. Je možné jednoznačně identifikovat tři poddruhy hrouzka běloploutvého? Nejedná se pouze o synonyma poddruhu Romanogobio (albipinnatus) albipinnatus ? E. Je validní existence subspecie Romanogobio (uranoscopus) friči na území SR?
38 4 Materiál a metody
4.1 Sběr vzorků a DNA extrakce
Sběry vzorků pro molekulárně genetické analýzy byly provedeny v letech 2000 2006.
Obr. 15. Skupina ichtyologického oddělení Ústavu biologie obratlovců, v.v.i. při terénních pracech (Foto: K. Halačka). Výběr lokalit sběru pokrývá hlavní distribuční oblasti zkoumaných taxonů v České a Slovenské republice. Druh Gobio gobio byl zastoupen 11 lokalitami v ČR i na Slovensku s celkovým počtem analyzovaných jedinců 142. Druh Romanogobio albipinnatus byl zastoupen na území ČR 3 lokalitami a na území SR 7 lokalitami. Celkem bylo analyzováno 63 jedinců. Druh Romanogobio kesslerii se vyskytuje pouze na dvou českých lokalitách a celkem 17 zástupců bylo analyzováno. Na území Slovenska bylo odchyceno celkem 12 jedinců z 3 lokalit. Navíc na území SR se vyskytuje ještě další druh rodu Romanogobio , tj. Romanogobio uranoscopus , který byl zastoupen 3 lokalitami s celkovým počtem analyzovaných jedinců 14. Souhrnně bylo analyzováno 248 zástupců 4 druhů rodu Gobio a Romanogobio , kteří se nacházejí na 40 lokalitách v ČR a SR (Tab. 6 a 7). Odlov adultních jedinců byl prováděn elektrolovem (stejnosměrný pulzní proud s parametry 160 200 V; 2,0 3,1 A). V počátečním období analýz (do roku 2003) byly ryby transportovány živé do laboratoře, kde byly usmrceny nadměrnou dávkou narkotizačního roztoku (2 phenoxy ethanol). Poté byly jednotlivě označeny a bylo jim odebráno cca 100 mg vzorku svalové tkáně.
39 Tab. 6. Lokality sběru vzorků s původním druhovým označením a počty odchycených jedinců rodu Gobio na lokalitách ČR a SR Lokalita (řeka/místo/povodí/úmoří) Počet Druh jedinců Lokality na území ČR 83 G. gobio Bečva – Rybáře, Dunaj, Černé moře 5 G. gobio Blanice_I – Vlašim a Blanice_II – Vodňany, Labe, Severní moře 5+5 G. gobio Divoká Orlice – Kostelec n. Orlicí, Labe, Severní moře 10 G. gobio Dyje – Soutok, Dunaj, Černé moře 6 G. gobio Haná – Vyškov, Dunaj, Černé moře 5 G. gobio Jevišovka – Božice, Dunaj, Černé moře 2 G. gobio Labe – Neratovice, Srnojedy, Střekov, Severní moře 9 G. gobio Odra – Odry, Baltské moře 10 G. gobio Olše – Louky, Odra, Baltské moře 10 G. gobio Rož. Bečva – Luhy, Dunaj, Černé moře 6 G. gobio Stěnava – Broumov, Odra, Baltské moře 10 G. gobio Lokality na území SR 59 G. gobio Belžanský potok, Tisa, Černé moře 5 G. gobio Bystrička – Martin, Dunaj, Černé moře 10 G. gobio Ipel' – stát. hranice, Dunaj, Černé moře 5 G. gobio Ida – Buzica, Tisa, Černé moře 3 G. gobio Hron – Čata, Dunaj, Černé moře 10 G. gobio Laborec – Kochánovce, Tisza, Černé moře 4 G. gobio Revištia kanál, Tisa, Černé moře 6 G. gobio Top'la – Poliakovce, Tisa, Černé moře 6 G. gobio Ublianka – Ubl'a, Tisa, Černé moře 3 G. gobio Ulička – Ulič, Tisa, Černé moře 2 G. gobio Váh – Hlohovec, Dunaj, Černé moře 5 G. gobio Celkem 22 lokalit 142 Tkáň byla uchovávána v TNES U pufru (10 mM Tris HCl pH 8.0, 125 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5 % SDS, 4 M Urea). Od roku 2004 byla odchyceným jedincům odebrána pouze
40 část prsní ploutve, která byla uchovávána v 96% alkoholu. Někteří jedinci byli vzati pro uchování, ostatní byli vráceni zpět. Celková genomová DNA byla extrahována pomocí štěpící aktivity proteinázy K (20mg/ml v 50% glycerol), následné phenol chloroform isoamylalcohol purifikace a etanol precipitace (Sambrook et al., 1989). Tab. 7. Lokality sběru vzorků s původním druhovým označením a počty odchycených jedinců rodu Romanogobio na lokalitách ČR a SR Lokalita (řeka/místo/povodí/úmoří) Počet Druh jedinců Lokality na území ČR 34 R. albipinnatus Dyje – Břeclav a Podhradí, Dunaj, Černé moře 19 R. albipinnatus Labe – Neratovice a Střekov, Severní moře 6 R. albipinnatus Morava – Blata a NPR Zástudánčí, Dunaj, Černé moře 9 R. albipinnatus Lokality na území ČR 17 R. kesslerii Bečva – Rybáře, Dunaj, Černé moře 11 R. kesslerii Morava – Tovačov, Dunaj, Černé moře 6 R. kesslerii Lokality na území SR 29 R. albipinnatus Ida – Buzica, Tisa, Černé moře 3 R. albipinnatus Ipel' – státní hranice, Dunaj, Černé moře 1 R. albipinnatus Revištia kanál, Tisa, Černé moře 8 R. albipinnatus Top'lá – Nemcovce a Poliakovce, Tisa, Černé moře 3 R. albipinnatus Ublianka – Ubl'a, Tisa, Černé moře 8 R. albipinnatus Uh – Lehárovce, Tisa, Černé moře 1 R. albipinnatus Váh – Hlohovec, Dunaj, Černé moře 5 R. albipinnatus Lokality na území SR 12 R. kesslerii Ipel' – státní hranice, Dunaj, Černé moře 3 R. kesslerii Laborec – Kochánovce, Tisza, Černé moře 5 R. kesslerii Top'la – Nemcovce a Poliakovce, Tisa, Černé moře 4 R. kesslerii Lokality na území SR 14 R. uranoscopus Laborec – Kochánovce, Tisza, Černé moře 5 R. uranoscopus Hornád – Košice, Tisa, Černé moře 5 R. uranoscopus Ulička – Ulič, Tisa, Černé moře 4 R. uranoscopus Celkem 18 lokalit, 3 druhy 106
41 Vyizolovaná DNA byla resuspendována v TE pufru (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). Pokusili jsme se také o molekulární analýzu vzorků přechovávaných v muzeu, avšak bez zjevného výsledku. Vzorky byly většinou uchovávány ve formaldehydu a u vzorků v alkoholu se později ukázalo, že byly nejdříve fixovány ve formaldehydu a později převedeny do alkoholu.
4.2 Volba molekulárních technik a výběr molekulárních markerů
V dizertační práci bylo použito dvou molekulárně biologických technik: 1) metoda RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) 2) metoda přímého sekvencování: a) úseku mtDNA b) intronu nDNA
4.2.1 Metoda RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)
RAPD technika byla poprvé popsána v roce 1990 dvěma nezávislými týmy (Welsh & McClelland, 1990; Williams et al., 1990). Tato metoda patří k fingerprintové technice zahrnující PCR amplifikaci využívající libovolnou primerovou sekvenci. PCR směs obsahuje pouze jeden oligonukleotid 10 bp délky zastupující „forward“ i „reverse“ primery. Každý takový primer hybridizuje ke stovkám míst v genomu. Amplifikace se však vizualizuje pouze mezi místy, která jsou od sebe vzdálena méně než 2 kb (tj. maximální velikost PCR produktu). PCR podmínky (např. annealing temperature) jsou obvykle voleny tak, že 10 20 fragmentů je amplifikováno per primer. Tak relativně málo primerů může produkovat mnoho fragmentů a skrínovat mnoho lokusů v celém genomu. Výhodou je komerční dostupnost RAPD kitů. Metoda je výhodná pro nalezení polymorfních míst u druhů, u kterých zatím není dostupná žádná sekvence. Hlavní nevýhodou je vysoká citlivost na změny podmínek a nízká reprodukovatelnost výsledků. Více viz příloha A.
4.2.2 Metoda přímého sekvencování
Dvě odlišné sekvenční metody byly vyvinuty nezávisle ve stejném roce W. Gilbertem (Maxam & Gilbert, 1977) a F. Sangerem (Sanger et al., 1977). S vývojem DNA sekvenčních metod v posledních 20 30 letech a díky bouřlivému rozvoji sekvenčních experimentů u široké škály organismů začaly být odhalovány jednotlivé sekvence mitochondriálních i jaderných genů a dokonce i celých genomů. Byly odvozovány fylogenetické vztahy jednotlivých druhů na základě předem vytipovaných genových sekvencí,
42 a začaly se množit i studie, kde fylogenie byla odvozována od uspořádání genů uvnitř mitochondriálního genomu (Bibb et al., 1981; Roe et al., 1985; Johansen et al., 1990).
4.2.2.1 Využití mitochondriálního markeru
První studie mapující DNA variaci v přírodních populacích zkoumaly živočišnou mitochondriální DNA (mtDNA), protože je relativně malou kruhovou molekulou (přibližně 16 500 bazí u obratlovců) a snadno izolovatelnou z genomické DNA. Navíc se vyskytuje v tisících kopiích na buňku. Časté využívání mtDNA sekvencí ve fylogenetických studiích je dáno několika charakteristikami: a) je haploidní a maternálně děděná u většiny druhů (Kondo et al., 1990; Gyllestein et al., 1991); b) chybí rekombinace (Clayton 1982, 1992; Hayashi et al., 1985), ale výjimky se objevují (Rokas et al., 2003; Guo et al., 2006) c) 5x 10x vyšší evoluční rychlost při srovnání s jadernými sekvencemi (Brown et al., 1979). Především proto, že mitochondrie nemají opravné enzymy pro chyby v replikaci ani pro poškození DNA (Clayton, 1982); d) snadnější hodnocení díky přítomnosti mutací v podobě substitucí a vzácněji v podobě inzercí/delecí (Avise, 1994). Mitochondriální DNA u ryb obsahuje 13 protein kódujících genů, dva ribosomální geny (rRNA) a 22 transferových RNA (tRNA) genů (Meyer, 1993). Uvnitř mitochondriálního genomu se různé regiony vyvíjejí různou evoluční rychlostí, a proto lze zvážit, který použijeme, pro určitou studii. Velká (16S) a malá (12S) podjednotka ribozomální DNA jsou mírně konzervativní regiony u ryb a jsou používány především pro analýzy vyšší systematické úrovně (podčeleď, čeleď, nadřád, řád; Hillis & Dixon, 1991; Wiley et al., 1998). Control region, který zahrnuje displacement (D) loop, má vysoce variabilní nekódující místa mezi velmi konzervativními funkčními oblastmi. Control region je používán pro analýzu blízce příbuzných taxonů, kde vzrůstající variace může reflektovat nedávné evoluční události (Lockhart et al., 1995). Jiné mtDNA geny jako ATPase6, ATPase8, cytochrom b nebo NADH( n) mohou být vhodnější pro fylogenezi taxonů intermediátní divergence (úroveň čeledi a rodu), protože tyto geny jsou variabilnější než rRNAs nebo COI, ale jsou méně variabilní než D loop. Neplatí to ale všeobecně. Z mtDNA protein kódujících genů se jeví být cytochrom b robustním evolučním markerem odhalujícím fylogenetické vztahy na různých taxonomických úrovních u ryb (Schmidt et al., 1998; Cantatore et al. 1994; Finnerty & Block, 1995). Cytochrom c oxidáza podjednotka I ( CO I) se aktuálně nejhojněji používá jako „DNA barcode“ v rostlinné i živočišné říši (Hebert et al., 2004; Kress et al., 2005; Ward et al., 2005).
43 4.2.2.2 Control region a cytochrom b
V předkládané dizertační práci byly zvoleny pro fylogenetické analýzy dva mitochondriální markery, control region jako hlavní marker a vedlejší marker cytochrom b. Lokace obou zvolených mtDNA markerů ukazuje Obr. 16. Oba patří k nejvyužívanějším v těchto typech studií a současně u obou existují universální primery pro určení fylogenetických vztahů ryb (Hillis et al., 1996). Navíc podle mnohých studií poskytují dostatečnou variabilitu mezi taxony řádu Cypriniformes, případně čeledi Cyprinidae (Tang et al., 2006; Liu & Chen, 2003; Cunha et al., 2002). V rámci rodů Gobio a Romanogobio bylo dosud publikováno několik dílčích prací využívajících zmiňované markery (Madeira et al., 2005; Bianco & Ketmaier, 2005; Yang et al., 2006). Obr. 16. Lokace mitochondriálních markerů.
4.2.2.2.1 Control region
Control region (CR) je hlavní nekódující oblastí v mtDNA. Reguluje replikaci H řetězce a transkripci všech mtDNA genů. Tento region, s výjimkou jeho centrální části, je pravděpodobně vystaven velmi slabým selekčním tlakům, a proto se vyvíjí velmi rychle (Ward et al., 1991). Obvykle je považován za nejvariabilnější část mtDNA díky výskytu četných nukleotidových substitucí, krátkých indelů a dynamice měnícího se počtu tandemových repetic. Nicméně současné studie indikují, že poloha mutací a strukturálních přestaveb není distribuována náhodně napříč celým regionem, ale postihuje jen určitá hypervariabilní místa a domény. Struktura control regionu byla studována u mnoha vertebrat, včetně ryb, u kterých však zůstávala donedávna nejasná. V současnosti se rozlišují tři domény: Centrální doména, ETAS doména a CSB doména. Centrální doména byla identifikována poprvé u savců (Southern et al., 1988) a měla podobu
44 několika konzervativních sekvenčních bloků (B F). Lee et al. (1995) definovali u Teleostei pouze blok CSB D. Liu et al. (2002) u Cypriniformes identifikovali tři bloky CSB D, CSB E a CSB F. Sbisa et al. (1997) prezentoval dva nové konzervativní bloky a nazval je ETAS1 a ETAS2 (extended termination associated sequences). Pouze blok ETAS1 identifikovali Liu et al. (2002) u Cypriniformes. CSB doména byla nalezena u savců, ptáků i ryb a rozlišují se její tři větší bloky: CSB1, CSB2 a CSB3 (Sbisa et al., 1997; Randi & Lucchini, 1998; Liu et al., 2002). V systematice a taxonomii byla ETAS doména navržena pro studie inter a introdruhovou evoluci. O centrální doméně se uvažuje také v důsledku vysokého stupně podobnosti jako o vhodném regionu pro fylogenezi. Funkčnost této domény prozatím zůstává neznámá a její využitelnost v systematice je potřeba dále prověřit (Liu et al., 2002). CSB doména byla prověřována u ptáků (Randi & Lucchini, 1998), kde autoři nalezli vysokou rychlost změn a proto ji považovali za nevhodnou pro fylogenetickou studii. V rozporu s touto prací prokázali při výzkumu druhů ryb řádu Cypriniformes Liu et al. (2002), že tato doména je naopak velmi konzervativní a vhodná pro studie tohoto typu. V této dizertační práci jsem prověřoval variabilitu/konzervativnost všech tří domén – ETAS, centrální i CSB domény, které byly součástí sekvence o velikosti 713 bp (Obr. 17). 713 bp PCR produkt ETAS Centrální doména CSB doména .. .. .. ETAS1 CSB F CSB E CSB D CSB 1 CSB 2 CSB 3 Obr. 17. Pozice jednotlivých domén v CR markeru.
4.2.2.2.2 Cytochrom b
Gen cytochrom b, jako vedlejší marker, byl využit pouze pro porovnání s několika sekvencemi druhů rodu Romanogobio , které byly dostupné v databázi GenBank. Control region i cytochrom b byly amplifikovány pomocí dvojic primerů, viz Tab. 8.
45 Tab. 8. Seznam primerů používaných v této dizertační práci. Gen/region Primer Sekvence (5´ 3´) Reference CR CR159 CCC AAA GCA AGT ACT AAC GTC Tato studie CR439 AAC TGT TTT TCC CAC ACT TA Tato studie CR493 TTG GGT AAC GAG GAG TAT GTA Tato studie CR851 TGC GAT GGC TAA CTC ATA C Tato studie STIR_CR Carp Pro AAC TCT CAC CCC TGG CTA CCA AAG Thai et al., 2004 Carp Phe CTA GGA CTC ATC TTA GCA TCT TCA GTG Thai et al., 2004 CYT B GluDG.L TGA CTT GAA RAA CCA YCG TTG Palumbi, 1996 H16460 CGA YCT TCG GAT TAA CAA GAC CG Bermingham pers. com. S7 r protein S7univL ACA ATT GTA AGT CGG AGA TG Tato studie S7univP CCC ACA AAA TAA GAT ATT AGG Tato studie
4.2.2.3 Využití jaderného markeru
Pro komplexnější pochopení vztahů mezi druhy rodu Gobio a Romanogobio byla využita i fylogenetická informace, kterou poskytoval single copy nuclear locus 1. intronu S7 r proteinu (S7). Jaderná DNA je alternativou k mtDNA jako zdroj genů, ze kterých lze dovozovat nezávislé fylogenie. Mnoho jaderných genů bývá zasaženo rekombinací, inzercemi/delecemi (indely) a introny. Indely často komplikují obnovu celého genu během PCR amplifikace. Inzertovaná DNA a introny mohou přerušit kódující region genu a navíc inzerce a introny mohou zvětšit velikost amplifikovaného produktu. Indely mohou také inhibovat amplifikaci genu, jestliže naruší primerové vazebné místo. Nízký počet kopií jaderných genů, ve srovnání s vysokým počtem kopií genů v mitochondriální a chloroplastové DNA také přispívá k redukci množství PCR produktu (Hillis et al., 1996). Pro fylogenetické analýzy vzdálenějších taxonů u Teleostei jsou používány kódující geny, které jsou silně konzervativní (růstový hormon, aktin, 5S, 18S, 28S, kreatin kináza). U několika jaderných genů bylo zjištěno, že se velmi rychle vyvíjejí, např. RAG1, RAG2 (recombination activating gene), a byly tak shledány jako potenciálně užitečné pro zjištění vztahů mezi druhy ryb čeledi Myrmoridae (Sullivan, pers. com.) a Beloniformes (Lovejoy et al., 2004). Streelman & Karl (1997) úspěšně amplifikovali jaderný lokus Tmo 4C4 u 17 druhů čeledi Labroidae. Lavoue et al. (2003) publikovali práci, která svědčila o fylogenetické užitečnosti prvních dvou intronů genu kódujícího S7 ribosomální protein u afrických „electric fishes“ (Mormyroidea). Některé ribozomální proteiny jsou považovány primárně za architektonické komponenty, které řídí správné sestavování ribozomální RNA a udržují její funkční
46 trojrozměrnou strukturu. S7 r protein je jeden ze dvou proteinů (vedle S4), který iniciuje sestavení 30S ribozomální podjednotky u prokaryot (Wimberly et al., 1997). Toto je nezbytné pro správné složení velké 3’ domény 16S ribozomální RNA. S7 r protein je také jeden z proteinů (vedle S3/S3a, S6, S14/S15), který hraje důležitou roli v interakci templátu 40S podjednotky u eukaryot (Mundus et al., 1993). Lidský S7 r protein je lokalizován pomocí FISH techniky na 2. chromozómu v pozici p25 (Annilo et al., 1995). Obsahuje 7 exonů, 6 intronů a jeho velikost je kolem 6 kb. V případě srovnání cDNA S7 sekvencí u člověka s jinými živočichy, pak z 89% je totožná se sekvencí Rattus rattus (Suzuki et al., 1990), z 81% se sekvencí Xenopus leavis (Mariottini et al., 1988) a z 66% se sekvencí Anopheles gambiae (Salazar et al., 1993).
4.2.2.4 První intron S7 r proteinu
Relativně málo systematických studií nadřádu Teleostei bylo prováděno za využití intronové sekvence (Oakley & Phillips, 1999; Quattro et al., 2001), ačkoliv u jiných skupin obratlovců je hojněji využívána (Kupfermann et al., 1999; Prychitko & Moore, 1997; Walton et al., 2000; Mundy & Kelly, 2001; Weibel & Moore, 2002). Je to patrně dáno tím, že se obecně věří, že introny se vyvíjejí příliš rychle a nevyzpytatelně. S rostoucím počtem studií jaderných intronových sekvencí však začínáme více chápat a odborněji vyhodnocovat její užitečnost. To platí i pro posouzení síly fylogenetického signálu v tomto jaderném genetickém materiálu. Chow & Hazama (1998) detekovali významné vnitrodruhové rozdíly v 1. a 2. intronu genu S7 v populacích Thunnus albacares a navrhli využívat tento marker pro studium genetické struktury uvnitř druhů a také pro zkoumání fylogenetických vztahů u blízce příbuzných druhů. Jiné studie (Lavoué et al., 2000; Sullivan et al., 2002) naopak poukazovaly na malou nebo žádnou variabilitu mezi zkoumanými blízce příbuznými druhy.
655 859 bp Obr. 18. Struktura S7 r protein genu.
47 Studie zabývající se molekulární evolucí afrických ryb nadčeledi Mormyroidea (Lavoué et al., 2003) naopak demonstruje fylogenetickou užitečnost prvních dvou intronů genu S7. V této dizertační práci jsem prověřoval užitečnost fylogenetického signálu, který poskytuje 1. intron genu kódující S7 r protein (Obr. 18). Sekvence 1. intronu je zhruba 5x delší než v případě sekvence 2. intronu a jeho relativní nukleotidová variabilita je poměrně rovnoměrně rozdělena podél celé intronové sekvence (Obr. 19; Lavoué et al., 2003). Obr. 19. Relativní nukleotidová variabilita ve třech úsecích genu kodující S7 r protein. Tento jaderný marker začíná být v současnosti více používán v systematických a taxonomických studiích Cyprinidů a jiných čeledí ryb (Wang et al., 2002; Lavoue et al., 2003; Bernardi & Lape, 2005). Konzervativní exonové regiony obklopující intronové oblasti umožnily design univerzálních S7 primerů u ryb (Chow & Hazama, 1998). Avšak v předkládané dizertační práci jsem využil vlastní design primerů získaný porovnáním sekvencí u druhů rodu Gobio a Romanogobio z různých geografických oblastí (Tab. 8). V závěrečné části této podkapitoly uvádím krátký nástin laboratorních kroků, které následovaly. Podrobněji jsou postupy uvedeny v přiložených publikacích (přílohy A E). Pomocí vhodně navržených primerů byly amplifikovány sekvence jaderného (S7) i dvou mitochondriálních markerů (CR a Cyt b). Produkty PCR reakce byly přečištěny precipitací
PEG/Mg/NaAc (26% Polyethylene glycol, 6.5 mM MgCl 2 . 6H 2O, 0.6 M NaAc.3H 2O) a TM následně použity pro sekvenační reakci s kitem BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit
48 v. 1.1 (Applied Biosystems) podle návodu výrobce. Produkty sekvenační reakce byly opět přečištěny etanolovou precipitací. Pro sekvenaci byl použit přístroj ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Analyzovaný fragment mitochondriální DNA každého vzorku byl sekvencován z obou 3’ a 5’ konců. Chromatogramy byly upraveny a sesazeny pomocí počítačového modulu SeqManII (součást programového balíku Lasergene v 6.0 (DNASTAR Inc.). Sesazené sekvence byly vizuálně zkontrolovány pro odstranění případného výskytu chyb a následně porovnány algoritmem ClustalW. Správná taxonomická příslušnost prvních sekvencí byla potvrzena srovnáním s databází GenBank.
4.3 Statistické vyhodnocení
Haplotypová (Hd) a nukleotidová diverzita (p) (Nei, 1987) byla vyhodnocena počítačovým programem DNA SP 4.0 (Rozas et al., 2003). Pomocí programu Modeltest 3.8 (Posada, 2006) byly vybrány parametry evolučního modelu, který nejlépe odpovídá danému souboru dat. Fylogenetické vztahy mezi haplotypy a nukleotypy byly rekonstruovány metodami Neighbour joining (NJ), maximální úspornosti (maximum parsimony, MP) a maximální pravděpodobnosti (Maximum Likelihood, ML) pomocí programu PAUP* ver. 4.0b10 (Swofford, 2002). Bayesova analýza (BI) byla aplikována pomocí programu MrBayes 3.1.2 (Ronquist et al., 2005). Jako outgroupy pro zakořenění stromů byly použity dostupné sekvence druhů z čeledi Cyprinidae a podčeledi Gobioninae z národního centra pro molekulárně biologické informace (NCBI). Během procesu fylogenetického odvozování z jaderného markeru (S7) byly otestovány tři způsoby zacházení s mezerami (gaps): 1) jako chybějící (missing) data, 2) jako pátý znak (fifth state, Barriel, 1994) a 3) jako separátní binární znak (separate character, Simmons & Ochoterena, 2000). Nejlépe propracované zacházení s indely (inzerce/delece) spolu s jejich zapracováním do fylogenetických analýz popsali Simmons & Ochoterena (2000). Stanovili dva způsoby: a) procedura „simple indel coding“ (SIC) – nejvíce využívaná v současných studiích pro svoji jednoduchost a b) procedura „complex indel coding“ (CIC), která se objevuje rovněž ve vědecké literatuře (Simmons et al., 2001; Löhne & Borsch, 2005). Müller (2006) popsal třetí přístup k ošetření indelů, tzv. „modified complex indel coding” (MCIC). Kódování indelů bylo prováděno pomocí programu SeqState (Müller, 2005), ve kterém je implementován program IndelCoder. Všechny uvedené přístupy a metody byly otestovány v předkládané dizertační práci.
49 Kongruence mezi stromovou topologií založenou na kombinovaných datech (CR, CYT B a S7 sekvence) byla testována ILD testem (incongruence length difference test), který je součástí programu PAUP* (Farris et al., 1994; Mickevich & Farris, 1981). Pro odhadnutí genealogických vnitrodruhových vztahů byla konstruována haplotypová i nukleotypová síť (network) pomocí programu TCS 1.21 program (Clement et al., 2000), který využívá přístup „statistical parsimony“ (Templeton et al., 1992) Indely byly kódovány jako pátý stav znaků.
50 5 Komentář k dosaženým výsledkům
Dosažené výsledky jsou přiloženy ve formě publikací (viz příloha A E).
5.1 Příloha A: Genetic diversity of Gobio gobio populations in the Czech Republic and Slovakia, based on RAPD markers
Hrouzek obecný ( Gobio gobio ) je značně rozšířen v Evropě a Asii (Bănărescu, 1999) a znalosti o jeho diverzitě byly donedávna zakládány pouze na externích morfologických znacích. Byla popsána řada subspecií nebo morf napříč velkou geografickou oblastí výskytu tohoto druhu. V ČR i SR je hojný a obývá především úseky řek a toků parmového pásma. Morfologická proměnlivost hrouzků v různých povodích byla v minulosti studována českými a slovenskými ichtyology a jejich studenty (Albertová & Suchomelová 1953; Krupka, 1969; Dorko, 1966a; Toušková, 1978; Závěta, 1990). Podle Bănărescu (1961) poddruh Gobio (gobio) gobio obývá toky úmoří Severního moře a poddruh Gobio (gobio) obtusirostris obývá toky povodí Dunaje (Černé moře). Podle autora, je tehdejší ČSSR a Německo oblastí přechodu mezi nominotypickou formou a spp. obtusirostris (= carpathicus , Vladykov), podobně jak uvádí Hrabě et al. (1973). Nicméně převládal názor (Krupka, 1969; Dorko, 1966a; Toušková, 1978), že území ČR a SR jsou obývána pouze nominotypickou subspecií. Callejas et al. (2004) použili metody RAPD k diagnostikování tří druhů hrouzka – obecného, Kesslerova a dlouhovousého, taxonomií a systematikou tohoto taxonu se však nezabývali. Cílem této studie bylo získat genetické markery pro identifikaci populací tohoto druhu a odpovědět na výše položenou otázku možné existence poddruhů a současně zmapovat inter a intrapopulační diverzitu hrouzka obecného v tocích všech tří úmoří. Byly zkoumány dvě populace z úmoří Severního moře a po třech populacích z úmoří Černého a Baltského moře. Bylo připraveno 7 RAPD primerů vhodných ke studiu celého genomu jednotlivých populací. Bylo zviditelněno 212 rozdílných a dobře separovaných DNA oblastí. U každé z populací byl vytvořen a analyzován vlastní fingerprintový vzor (pattern) s charakteristickými diagnostickými fragmenty. Bylo odhaleno 40 populačně diagnostických markerů. Největší intrapopulační diverzita byla nalezena u populací z řek Odra a Bystrička (průměrně 38% a 37%). Nejmenší byla nalezena u populací z řek Olše a obou Blanic (průměrně 28% a 26%). U ostatních zkoumaných populací byly zjištěny hodnoty pohybující se ve vymezeném rozmezí. Ve srovnání se studiemi zabývajícími se úrovní variability různých druhů ryb, se populace hrouzka zjištěnými hodnotami řadily do středu spektra a nenaznačovaly žádné alarmující události vzhledem k fitness. Bylo potvrzeno pravidlo o větší podobnosti populací v souvislosti
51 s geografickou příslušností ke svému úmoří, vyjma populace z řeky Odry. Tato populace z úmoří Baltu vykazovala větší blízkost k populaci z řeky Rožnovská Bečva z úmoří Černého moře, což podporuje pravděpodobnou hypotézu o spojení těchto dvou toků během období Pleistocenu (Czudek, 1997). Největší mezipopulační rozdílnost v rámci úmoří vykazovaly populace z úmoří Severního moře a nejmenší mezipopulační rozdílnost obecně náležela populacím z řek tekoucích do Černého moře. Fylogram sestrojený metodou Neighbour joining poukázal na jednoznačnou odlišnost populací z úmoří Černého moře od populací z úmoří Severního a Baltského moře, což podporuje domněnku existence obou poddruhů G. g. gobio a G. g. obtusirostris na vyšetřovaném území (Obr. 20).
Obr. 20. Neighbour joining (NJ) konsensuální strom analyzovaný softwarem FreeTree. Bootstrap hodnoty jsou uváděny v uzlech stromu (založeno na 1000 replikacích).
52 5.2 Příloha B: Molekulárně biologické analýzy hrouzka Kesslerova ve vodách České republiky a Slovenska
Území ČR a SR obývají čtyři druhy hrouzka. Hrouzek Kesslerův patří k nejohroženějším. Na území ČR se vyskytuje jen na dvou lokalitách. Do roku 2003 byl evidován pouze v řece Bečvě, později byl zjištěn i v řece Moravě (Merta & Lusk, 2004; Lusk et al., 2005b). Vnitropopulační a mezipopulační diverzita tohoto druhu nebyla doposud zkoumána. V této studii jsme se zaměřili na výzkum vnitrodruhové diverzity hrouzka Kesslerova na čtyřech českých a čtyřech slovenských lokalitách v rámci dvou českých a tří slovenských řek. Celkem jsme odhalili 9 rozdílných haplotypů. Nejvyšší genetickou variabilitou se vyznačovala populace z Bečvy (3 haplotypy), po dvou haplotypech vykazovaly populace z řek Morava, Topl’a a Ipel’ a jeden haplotyp byl nalezen ve východoslovenské řece Laborec. Vnitropopulační diverzita nepřevyšovala hodnotu 0,7%. Mezipopulační diverzita uvnitř první skupiny (populace z Bečvy a Ipel’u) činila 0,4% a druhé skupiny (populace z Moravy, Topl’e a Ipel’u) 0,5 1,0%. Analýza mtDNA control regionu rozdělila populace hrouzka Kesslerova do dvou odlišných skupin a přinesla překvapivá zjištění z pohledu možného posílení především českých populací násadami z početnějších slovenských populací (Obr. 21). Genetické analýzy nepotvrdily logickou úvahu o rozšíření hrouzka Kesslerova z řeky Bečvy do řeky Moravy při červencových povodních roku 1997. Jedná se o dvě odlišné populace, které lze najít i na území Slovenska. Obě skupiny se od sebe výrazně odlišují na základě mtDNA markeru (6,2%). Pro komplexnější pochopení vztahů mezi jednotlivými druhy hrouzka ( G. gobio, R. kesslerii a R. albipinnatus ), zejména na lokalitách společného výskytu, jsme přistoupili i k otestování jaderného markeru (intron genu kódující S7 r protein). Přístup kombinující analýzu obou genomů (mtDNA i nDNA) přinesl další významná zjištění. Především potvrzení hybridizační události mezi dvěma druhy Gobio gobio a Romanogobio kesslerii na dvou lokalitách – v řece Moravě a Ipel’. Pomocí molekulárních markerů bylo dosaženo jednoznačné determinace mezi hrouzkem Kesslerovým a hrouzkem běloploutvým, kteří na lokalitách společného výskytu jsou v některých případech morfometricky obtížně rozpoznatelní (Obr. 22). Hybridizace mezi těmito sympatrickými druhy však nebyla zjištěna.
53 R.KessBecva3831 R.KessIpel5546
51 R.KessIpel5545 R.Kess I. skupina 100 R.KessBecva3833
98 R.KessBecva3834 R.KessMoravaTovacov4080 R.KessMoravaTovacov4081 100 R.KessLaborec4049 R. Kess II. skupina 61 99 R.KessTopla4036 80 R.KessTopla4039 R.albToplaNemcovce4041
58 R.kessMoravaBlata4428 96 R.KessMoravaNPR4343 R. alb 100 R.KessToplaPoliakovce4038 R.KessIpel5543 56 R.KessMoravaBlata4426
100 R.KessTovacov4111 hybridi G.gobBecva2341 G.gob 100 G.gobTopla4023 G.gob
87 R.KessIpel5550 hybridi AF529882 Vimba vimba
0.02
Obr. 21. Neighbour joining bootstrap konsensuální strom analyzovaný na základě sekvence control regionu (610 bp). Čísla v uzlech stromu reprezentují procenta z 1000 bootstrap pseudoreplikací; pouze hodnoty nad 50% jsou zobrazeny.
1111111111 1111222222 2222222222 4566777788 8889000123 4444455578 5589012403 4561147000 5678901330 R.KessIpel5546 CTTTGTTGTT TAGCTCGGCC TAACAAGTTG R.KessMoravaTovacov4080 ...... R.albToplaNemcovce4041 ...... AT...... A.T .TTT....AC R.KessToplaPoliakovce4038 ...... A...... A.T .TTT....AC R.KessIpel5543 ...... A...... A.T .TTA....AC R.KessMoravaBlata4426 ...... A...... A.T .TTA....AC Chybná identifikace R.KessMoravaBlata4428 ...... A...... A.T .TTA....AC R.KessMoravaNPR4343 ...... A... A...... A.T .TTA....AC G.gobBecva2341 ACACTAG.CA .TATCAAAGT CTTATCAAAA R.KessMoravaTovacov4111 ACACTAG.CA .TATCAAAGT CTTATCAAAA hybridi R.KessIpel5550 ACACTAG.CA .TATCAAA.T CTTATCAAAA G.gobToplaPoliakovce4023 ACACTAG.CA .TATCAAA.T CTTATCAAAA Obr. 22. Výběr variabilních pozic control regionu u hybridů a chybně identifikovaných jedinců R. kesslerii na území ČR a SR. Identické = symbol “.“
54 5.3 Příloha C: Rybí osídlení a genetická diverzita populace hrouzka obecného z Divoké Orlice u Kostelce nad Orlicí
V rámci mapování biodiverzity se donedávna shromažďovaly informace o druhové pestrosti a početnosti druhu v rámci místního rybího společenstva. Byly vyhodnocovány vlivy extrémních povodní, antropogenní zásahy v korytech řek, míra znečištění, atd. Zejména na konci minulého století a v prvních letech 21. století byla v rámci Společenství Orlice vyvíjena aktivita po poznání biologické rozmanitosti osídlení ryb v řece Divoká Orlice v co nejširším rozsahu. Tato studie je příkladem malého aplikovaného výzkumu jedné oblasti na území České republiky. Vedle již v úvodu zmiňovaných parametrů jsme přistoupili i k zapojení molekulárních metod a technik biochemické genetiky do poznání vnitrodruhové variability značně rozšířeného druhu G. gobio na tomto území. Pomocí elektrolovu byla nalezena velmi pestrá druhová skladba (18 druhů z 9 čeledí). Mimo jiné byl zaznamenán i výskyt larev mihule potoční, ohroženého druhu se zvláštní územní ochranou. Pro zmapování genetické diverzity hrouzka obecného, který je obecně rozšířeným druhem v části „spojené Orlice“ i v navazujících částech obou zdrojnic, tj. Tiché a Divoké Orlice, bylo využito alozymové analýzy, multilokusové RAPD techniky a metody přímého sekvencování. Alelická variabilita i průměrná heterozygozita nevykazovala alarmující hodnoty, které by poukazovaly na stav ohrožení těchto populací, zjištěné hodnoty se pohybovaly v rámci rozmezí hrouzka obecného v ČR (Šlechtová et al., 2005). Metoda RAPD poskytla populační identifikační markery odlišující jedince z řeky Divoká Orlice od zkoumaných populací úmoří Baltského a Černého (Mendel et al., 2005). Byla zjištěna dostatečná vnitropopulační variabilita, jejíž hodnota byla výrazně odlišná od parametrů charakterizujících ohrožené uniformní populace. Analýza mtDNA markeru jednoznačně potvrdila (podobně jako RAPD metoda) geografickou příslušnost populace z Divoké Orlice k populacím z úmoří Severního moře, avšak nevyčlenila je vůči populacím z úmoří Baltského moře. Naproti tomu potvrdila významnou odlišnost od populací hrouzka obecného z úmoří Černého moře (Mendel et al., 2005).
55 5.4 Příloha D: Molecular phylogeny of the genus Romanogobio (Cyprinidae, Pisces) and its contribution to taxonomy
V posledních dvou desetiletích prochází oblast taxonomie a systematiky rychlým vývojem. Výraznou úlohu sehrálo zavedení nových metodických postupů, zejména molekulárně biologických a sílící snaha poznat a chránit biodiverzitu na zemi. Proto i u ryb narůstá počet revizí čeledí, rodů a druhů. Mezi hrouzky rodu Romanogobio se nachází mnoho taxonů, kteří jsou endemity v různých oblastech Evropy a Asie a současně mnoho druhů v různých stupních ohrožení. Jejich taxonomie je v současné době velmi nepřehledná. Je to způsobeno existencí řady druhů, poddruhů a forem, jež byly popsány v dřívějších dobách a o jejichž validitě se vedou diskuse. Navíc v současnosti lze nalézt popis nových druhů hrouzka často bez komplexního přístupu, tzn. pouze podle morfologických znaků, bez genotypizování na obou markerech (mtDNA a nDNA), což může být zavádějící. K nepřehlednosti přispívá i nejednotnost tří desítek používaných konceptů („species concepts”). Tento přetrvávající taxonomický chaos může vyvolávat velké problémy v oblasti ochranářské legislativy, což může následně znemožnit stanovení vhodné strategie pro ochranářský management (Kottelat, 1998; Lusk & Šlechta, 2005). Předkládaná studie se zabývá fylogenetickými vztahy 13 evropských druhů a poddruhů rodu Romanogobio . Na území ČR a SR se vyskytují tři druhy tohoto rodu všeobecně označované Romanogobio albipinnatus , Romanogobio kesslerii a Romanogobio uranoscopus . Pro správné pochopení taxonomie těchto druhů bylo nezbytné zasadit je do evropského kontextu. V tomto krátkém hodnocení se zaměřím pouze na českou a slovenskou otázku a na obecné závěry plynoucí pro naši faunu. Ichtyologický výzkum hrouzka z obou území začal kolem roku 2000 a trvá dodnes. Pro orientaci ve velmi složité otázce systematiky hrouzka bylo nezbytné vycházet z geografických informací v literatuře, z analýz založených na morfologických charakteristikách a především, z molekulárně biologických analýz obou genomů. Jako hlavní hodnotící genetické markery byly zvoleny mitochondriální control region a 1. intron jaderného genu kódující S7 r protein. Vedlejší marker cytochrom b byl vybrán pro porovnání s dostupnými sekvencemi v databázi GenBank. Molekulární analýzy potvrdily názor o samostatném validním statusu rodu Romanogobio vedle existujícího rodu Gobio (Obr. 23). Podrod Rheogobio je označen jako „junior synonym“ rodu Romanogobio . Při bližším pohledu na jednotlivé druhy vyskytující se na území ČR a SR bylo prokázáno a podle evolučního druhového konceptu (ESC) přijato pojmenování: 1) v rámci skupiny „ kesslerii “
56 Byla povrzena monofílie této skupiny na obou mitochondriálních markerech (CR i CYT B). Bylo prokázáno, že na území ČR i SR se nevyskytuje nominotypický druh Romanogobio kesslerii (dříve s poddruhovým názvem Romanogobio (kesslerii) kesslerii ). Byl potvrzen výskyt druhu Romanogobio banaticus (dříve s poddruhovým názvem Romanogobio (kesslerii) banaticus ) v tocích Bečva a Ipel’. Dále byl navržen ke komplexní revizi možný výskyt druhu Romanogobio carpathorossicus (dříve s poddruhovým názvem Romanogobio (kesslerii) carpathorossicus ) na obou územích v tocích Morava, Laborec a Topl’a. Prozatím byl navržen pro tento druh termín – „species in waiting“. 2) v rámci skupiny „ uranoscopus “ Molekulární analýzy jednoznačně potvrdily příslušnost druhů či poddruhů této skupiny do rodu Romanogobio . Na území SR byl prokázán výskyt Romanogobio friči (dříve s poddruhovým názvem Gobio/Rheogobio (uranoscopus) friči ) v tocích Hornád, Laborec a Ulička. Tento výsledek je navržen v souladu s literárními údaji o geografickém výskytu tohoto druhu. Pro úplnost by bylo ještě nutné prokázat odlišný druhový status od nominotypického druhu Romanogobio uranoscopus (dříve s poddruhovým názvem Gobio/Rheogobio (uranoscopus) uranoscopus ) popsaného v horní části Dunaje. 3) v rámci skupiny „ albipinnatus “ Bylo prokázáno, že se na území ČR a SR nenachází nominotypický druh Romanogobio albipinnatus (dříve s poddruhovým názvem Romanogobio (albipinnatus) albipinnatus ). Na území ČR byl potvrzen výskyt druhu Romanogobio belingi (dříve s poddruhovým názvem Romanogobio (albipinnatus) belingi ) v řece Labi. Jeho původnost pro tento tok však není jednoznačná. Současně na území ČR i SR byl potvrzen výskyt druhu Romanogobio vladykovi (dříve s poddruhovým názvem Romanogobio (albipinnatus) vladykovi ) v českých tocích Dyje, Morava a v slovenských tocích Ipel’, Revištia, Topl’a, Ublianka, Uh, Váh. Byla potvrzena monofílie této skupiny a současně větší podobnost druhů Romanogobio belingi a Romanogobio vladykovi .
57 Obr. 23. Bayesovský konsensuální strom vyplývající z analýzy kombinovaných dat (S7, Cyt b, CR) studovaných hrouzků rodu Romanogobio . Bayesian posteriorní probability/NJ/MP/ML boostrap hodnoty jsou uvedeny blízko uzlů. Pouze hodnoty ≥ 50% jsou ukázány. Zvýrazněno je sedm linií roztříděných do dvou skupin. Druhové jméno je následováno názvem lokality.
58 5.5 Příloha E: Molecular phylogeny of the genus Gobio (Cyprinidae, Pisces) and its contribution to taxonomy
Taxonomie a systematika rodu Gobio je v novém vymezení i po vyčlenění rodu Romanogobio značně komplikovaná a nepřehledná. Bylo popsáno a v literatuře se uvádí asi 149 vědeckých názvů druhů/poddruhů tohoto rodu, z nichž většina byla postupně přehodnocena jako synonyma. V současnosti je považováno v rámci tohoto rodu za platné 21 druhových názvů (Froese & Pauly, 2007 – FishBase 7/2007). Areál rozšíření tohoto rodu je od Španělska a Britských ostrovů až po severní Čínu a jeho zástupci obývají všechny typy vod – stojatých i tekoucích, sladkovodních a brakických. Palearktický druh Gobio gobio (Linnaeus, 1758) vykazuje mimořádnou fenotypickou diverzitu a je považován za jeden z nejvíce variabilních druhů ryb v Evropě (Bănărescu, 1999). Zahrnuje mnoho poddruhů a lokálních forem, popsaných v minulosti, o validitě mnohých z nich se vedou rozsáhlé diskuse. Cílem této studie bylo posoudit validitu některých druhů či poddruhů rodu Gobio a odhadnout fylogenetické vztahy mezi nimi. Zpřehlednit taxonomii hrouzka, identifikovat “species in waiting“, popřípadě některé již existující druhy/poddruhy navrhnout pro komplexní revizi. V neposlední řadě přinést nové poznatky z oblasti genetiky tohoto rodu, včetně identifikačních diagnostických markerů. V tomto komentáři se omezím pouze na zástupce rodu Gobio obývající ČR a SR. Na obou územích je tento taxon považován za hojný a není předmětem ochrany žádného stupně. Zajímavost těchto dvou území, především českého je v jeho poloze vzhledem k hydrologickému systému. Příslušnost ke třem úmořím (Severní moře, Baltské moře a Černé moře) zvyšuje možnost výskytu více poddruhů či druhů rodu Gobio . Podle Bănărescu (1961) nominátní poddruh Gobio (gobio) gobio (Linnaeus, 1758) obývá toky úmoří Severního moře a poddruh Gobio (gobio) obtusirostris Valenciennes, 1842 obývá toky povodí Dunaje (Černé moře). Vedle těchto dvou taxonů je popisován na slovenském území výskyt poddruhu Gobio (gobio) carpathicus Vladykov, 1925 v oblasti horní Tisy. V minulosti Albertová & Suchomelová (1953), Dorko (1966a), Krupka (1969), Toušková (1978) a Závěta (1990) studovali morfologickou proměnlivost hrouzků různých povodí a došli k názoru, že území ČR a SR obývá pouze nominotypická subspecie Gobio (gobio) gobio . Na základě molekulárních analýz jaderného i mitochondriálního genomu (Obr. 24) a na pozadí fylogenetických analýz hrouzka v Evropě jsme však došli k závěrům, že na území ČR se nacházejí tři čisté monofyletické linie tohoto rodu, popisovány jako Gobio gobio (L_I), Gobio obtusirostris (L_II) a Gobio carpathicus (L_IV). Na území Slovenska se nacházejí
59 stejné tři linie jako v ČR a navíc čtvrtá čistá monofyletická linie s dočasným pojmenováním „species in waiting” (L_III). U všech byly identifikovány typické haplotypy a nukleotypy, které byly zaslány do mezinárodní databáze GenBank. Byla vyhodnocena linijní sekvenční variabilita na základě DNA distance. Dále byli odhaleni jedinci hybridního původu s výše uvedenými třemi druhy (vyjma Gobio obtusirostris ) a navíc také s linií L_V pocházející z oblasti Turecka. Byla vymezena hybridní zóna v oblasti severních přítoků horní Tisy. Byla nalezena nadějná identifikační metoda „S7indel diagnostika“, která na principu délkové diference PCR produktů umožní rychlé a levné rozlišení jednotlivých zástupců rodu Gobio . Více v příloze E. Při bližším pohledu na jednotlivé zástupce rodu Gobio na území ČR a SR byl prokázán výskyt čistých linií: • Gobio gobio (L_I) Lokality ČR: v povodí Labe (řeky Blanice, D. Orlice, Labe; úmoří Severního moře), v povodí Odry (řeky Odra, Stěnava; úmoří Baltského moře) a v povodí Dunaje (řeky Bečva, Haná; úmoří Černého moře). Lokality SR: v povodí Tisy (řeka Ida, Revištia kanál; úmoří Černého moře). • Gobio obtusirostris (L_II) Lokality ČR: v povodí Odry (řeka Odra; úmoří Baltského moře) a v povodí Dunaje (řeky Bečva, Dyje, Haná, Jevišovka; úmoří Černého moře). Lokality SR: v povodí Dunaje (řeky Bystrička, Ipel’, Váh; úmoří Černého moře). • Gobio carpathicus (L_IV) Lokality ČR: v povodí Dunaje (řeka Dyje; úmoří Černého moře). Lokality SR: v povodí Tisy (řeky Laborec, Ublianka a Revištia kanál; úmoří Černého moře). • „Species-in-waiting“ (L_III) Lokality SR: v povodí Tisy (řeky Laborec, Topľa a Belžanský potok; úmoří Černého moře). Byli identifikováni jedinci hybridního původu a jejich lokality výskytu: • Hybrid L_I ×V Lokality ČR: v povodí Odry (řeka Odra; úmoří Baltského moře). Lokality SR: v povodí Tisy (řeka Ida; úmoří Černého moře). • Hybrid L_I ×IV Lokality SR: v povodí Tisy (Revištia kanál; úmoří Černého moře). • Hybrid L_I ×III Lokality SR: v povodí Tisy (Revištia kanál; úmoří Černého moře). • Hybrid L_III ×V
60 Lokality SR: v povodí Tisy (Belžanský potok; úmoří Černého moře). • Hybrid L_IV×V Lokality SR: v povodí Tisy (řeka Ulička; úmoří Černého moře). Obr. 24. Bayesovský konsensuální strom vyplývající z analýzy dat control regionu studovaných hrouzků rodu Gobio . Bayesian posteriorní probability/NJ/MP/ML boostrap hodnoty jsou uvedeny blízko uzlů. Pouze hodnoty ≥ 50% jsou ukázány. Zvýrazněno je čtrnáct linií roztříděných do čtyř podskupin a dvou hlavních skupin. Druhové jméno je následováno názvem lokality (popř. identifikačním číslem jedince).
61 6 Diskuse
Taxonomie a systematika hrouzka rodů Gobio a Romanogobio je v současné době předmětem výzkumného zájmu mnoha vědeckých týmů. Mezinárodní konference „Distribution, taxonomic and genetic status of the European species of the genus Gobio “ pořádaná Ústavem biologie obratlovců AV ČR v Brně v roce 2003 přinesla první dílčí poznatky z různých částí Evropy a byla impulsem k dalšímu intenzivnímu výzkumu. Předkládaná dizertační práce přináší vědecké poznatky shromážděné v letech 2001 2007 a je první souhrnnou fylogenetickou studií zabývající se 28 druhy/poddruhy obou rodů v euroasijském kontextu. Diskutovaná data se týkají především situace na území ČR a SR. V příloze D a E je tato problematika hodnocena v širším evropském kontextu.
6.1 Posouzení vhodnosti použitých technik a markerů
Pro pochopení taxonomických a systematických souvislostí jsme v první fázi výzkumu využili techniky RAPD a v druhé fázi metody sekvencování vybraných částí mitochondriálního a jaderného genomu. Metoda RAPD byla zvolena pro první vhled do problematiky hrouzků z důvodu absence molekulárně genetických informací při zahájení dizertační práce a z důvodu univerzality a robustnosti této techniky a rychlé detekce mnoha vzorků současně. K metodě sekvencování jsme přistoupili poté, kdy byl nezbytný hlubší pohled do nukleotidové struktury genetického materiálu zkoumaných populací. Zjištění primární struktury DNA nám poskytlo nesrovnatelně větší množství informací než v případě techniky RAPD a navíc otevřelo širší možnosti využití: od porovnání s databázovými sekvencemi (GenBank) hrouzků z odlišných geografických lokalit až po pestřejší spektrum nástrojů statistického zpracování. Metoda sekvenace mitochondriální i jaderné DNA je považována za velmi účinnou metodu při studiu taxonomie a systematiky (Allendorf & Luikart, 2007; Freeland, 2005). Při volbě vhodných markerů jsme vybrali nejuniverzálnější a nejvíce používané úseky mitochondriální DNA v rámci řádu Cypriniformes control region a cytochrom b. Jako hlavní marker byl zvolen control region z důvodu různé variabilnosti jeho částí. Prověřovali jsme variabilnost/konzervativnost všech tří domén: ETAS, centrální i CSB. Ve škále od nejvíce variabilní po nejvíce konzervativní se jevily rozpoznávané domény control regionu takto: ETAS>Centrální>CSB. Domény CSB2 a CSB3 byly téměř shodné napříč všemi zkoumanými taxony. Úsek jaderné DNA – první intron genu pro S7 r protein jsme zvolili z důvodu četnosti různě dlouhých indelů (Lavoué et al., 2003). Potvrdilo se to i
62 v této studii a k dalšímu zkoumání byla předložena nová identifikační metoda, kterou jsme nazvali „S7indel diagnostika“. Tato technika na principu délkové diference PCR produktů umožní rychlé a levné rozlišení jednotlivých zástupců rodu Gobio . Předpokládáme, že po doplnění o prozatím neanalyzované druhy a po následném vyprecizování této techniky, především na základě RFLP metody či stanovení pozice primerů, bude možné snadno rozlišit všechny nebo alespoň velkou většinu druhů tohoto rodu. Pro správné a komplexní pochopení genetiky rodů Gobio a Romanogobio se osvědčila kombinace analýz markerů obou genomů. Postupem času se ukázalo, že fylogenetická analýza hrouzků postavená na jediném markeru je neúplným a často zavádějícím přístupem k vyřešení taxonomicko systematické otázky. Na základě druhových konceptů PSC (Cracraft, 1989; Kottelat, 1997) nebo ESC (Wiley & Mayden, 2000; Mayden, 2002) nebudeme již v této části používat poddruhový název při vyvozování taxonomických závěrů, avšak validní poddruhy již povyšujeme na druhovou úroveň.
6.2 Zástupci rodů Gobio a Romanogobio
V úvodu jednotlivých následujících podkapitol jsem provedl literární rešerši dostupných pramenů s tématy taxonomie a systematiky analyzovaných druhů rodů Gobio a Romanogobio . Poté v jednotlivých odstavcích jsem se snažil najít odpovědi na kladené cíle a otázky, které byly sumarizovány v kapitole 3.
6.2.1 Zástupci rodu Gobio
Z literární rešerše článků zabývajících se taxonomickým statusem hrouzků na území ČR a SR vyplývá, že v minulosti byl rod Gobio předmětem vědeckého zájmu z hlediska posouzení jeho ekologické a geografické variability na základě morfometrických a morfologických charakteristik. Na variabilitu v některých proporcionálních znacích poukázal už Berg (1914). Rozlišoval na základě délky vousků formu: morpha brevicirris z horního toku Donu a morpha longicirris z dolního toku Amuru. Dle umístění řitního otvoru na morphu prosopyga (otvor je blíže k bázi ploutví břišních) vyskytující se v řekách Don, Ural, Volchova, Volha, Kama, Emba a Dunaj a na morphu katapyga (anus je nápadně blízko u báze řitní ploutve), která je typická pro Bajkal, horní Don, řeku Bělaja v povodí Kamy. Dalším typem variability, na kterou Berg upozornil, byla délka rypce. Formu s krátkým rypcem (délka rypce menší než délka zaočního prostoru) nazval morpha obtusirostris a s dlouhým rypcem (délka rypce větší než délka zaočního prostoru) morpha longirostris . Obě morphy se vyskytují společně. Krátkonosí byli poprvé popsáni ze systému Dunaje (jezero Pejpus), ze
63 systému Kaspického moře (řeky Vetluga, Emba) a z povodí Amuru (Argun). Obecně, morpha obtusirostris se nejčastěji vyskytuje v systému Černého moře, vzácněji v systému Kaspického moře a ještě vzácněji za Uralem a tvoří zvláštní subspecii obtusirostris , vzhledem k častému výskytu určitého znaku omezeného na geografickou oblast. Naproti tomu v systému Atlantického oceánu a Severního moře převládají exempláře s dlouhým rypcem (morpha longirostris ). Dlouhonosá forma ze systému Amuru byla nazvána jako var. cynocephalus Dybowski, 1869. Vladykov (1925) se zabýval studiem rodu Gobio na slovenském území a popsal novou subspecii G. g. carpathicus z povodí horní Tisy, Oravy a Nitry. Vladykov (1931) vyjádřil názor, že subspecifické rozdíly (výška těla k délce, minimální výška k délce ocasního násadce a délka vousků) mezi tímto novým poddruhem a G. g. obtusirostris z oblasti horního Dunaje existují. Berg (1948 1949) pokládal novou subspecii za málo známou a patrně totožnou s G. g. sarmaticus Berg, 1949 z Dněstru a Jižního Bugu. Albertová & Suchomelová (1953) sledovaly na 697 jedincích hrouzků variabilitu „Bergových znaků“ a počty šupin v postranní čáře. Došly k závěrům, že u rybničních exemplářů (Blatná, Mšec) se jednalo o morphu prosopyga , u říčních exemplářů (Ohře, Vltava) o morphu katapyga. V délce vousků zaznamenaly určité rozdíly. Formou longicirris nazvaly jedince z řeky Vltava (Praha) a formou brevicirris jedince z lokality Ohře (Karlovy Vary). Na základě délky rypce rozhodly, že se populace v ČR řadí k morfě obtusirostris (vyjma exemplářů z Blatné). Konstatovaly tendenci zmenšování počtu šupin u rybničních exemplářů směrem k říčním. Oliva (1961) uvádí výskyt G. gobio (Linnaeus, 1758) ze středního Polabí. Lohninský (1962) sledoval ekologickou variabilitu některých meristických a plastických znaků a srovnával 745 ryb z 24 lokalit povodí Labe a Odry. Došel k závěrům, že samci mají většinou vyšší počet šupin v postranní čáře než samice. Počet šupin postranní čáry nezávisí na ekologických podmínkách. Délka rypce se relativně zvětšuje v období před pohlavní dospělostí hrouzků. Samci se od samic délkou rypce neliší. V tekoucích vodách systému Labe a Odry převažuje G. gobio morpha longirostris , podobně jako ve stojatých vodách povodí Labe. Krátkorypá forma ( G. gobio morpha obtusirostris ) se však vyskytovala i ve dvou potocích a pěti stojatých vodách systému Labe, což znamená, že tato morpha není omezena jen na povodí Černého moře, jak uvedly Albertová & Suchomelová (1953). Poměrná délka vousků pohlavně nedospělých ryb se liší od délky vousků pohlavně dospělých. Ve vodách labského systému převládá G. gobio morpha l ongicirris , avšak v malém množství se na většině lokalit vyskytuje i morpha brevicirris . Výslovně limnofilní populace mají nejdelší vousy. V povodí Odry zjistil pouze dlouhovousou formu G. gobio morpha longicirris . Samci se délkou vousků nelišili od
64 samic. Během růstu do pohlavní dospělosti ryby se zvětšuje relativní vzdálenost mezi břišními ploutvemi a řitním otvorem. V dospělosti je tato vzdálenost menší u samců než u samic. Hrouzci ve stojatých vodách povodí Labe se shodují v postavení řitního otvoru s typickou formou (morpha prosopyga ). V tekoucích vodách labského a oderského systému se vyskytuje společně s typickou formou též G. gobio morpha katapyga (50:50). Posledně jmenovaná forma byla ojediněle zjištěna i v rybnících (okolí Blatné a Vykáň) a v polabských tůních. Na rozlišení anglických hrouzků G. g. gobio na dvě ekologické rasy – reofilní a limnofilní poukazoval Bănărescu (1962). Rolik (1965a) poznamenává, že jedinci z horní Odry jsou přechodnou formou mezi G. g. gobio a G. g. obtusirostris . A v rámci ekologické variability patří k reofilním populacím G. gobio s menší výškou těla a výškou ocasního násadce, delší hlavou a ocasním násadcem, delšími párovými ploutvemi. Krupka (1969) popírá validitu poddruhu G. g. obtusirostris na českém a slovenském území a tvrdí, že toto území obývá pouze nominotypická forma. Hrabě et al. (1973) považuje rozlišení dunajské a nominotypické subspecie na našem území za nemožné, neboť se jedná o oblast s přechodnými tvary. Toušková (1978) vyhodnocovala 28 morfometrických a 3 meristické znaky u 180 jedinců G. gobio z povodí Dunaje a 78 jedinců z povodí Labe a porovnávala je s daty hrouzků z Anglie (nomin. G. g. gobio ), Polska ( G. g. sarmaticus ), Rumunska (G. g. obtusirostris ) a Kazachstánu ( G. g. lepidolaemus ). Podle jejího závěru na území ČR a SR žije hrouzek totožný s nominotypickou subspecií G. g. gobio . Ze získaných molekulárních dat jednoznačně vyplývá, že na území ČR lze rozlišit (se silnou statistickou podporou) tři čisté monofyletické linie rodu Gobio , které představují druhy Gobio gobio , Gobio obtusirostris a Gobio carpathicus (Příloha E). Výsledky molekulárních analýz poukazují na relativně vysokou procentuální divergenci sekvencí obou markerů (CR a S7) mezi zmiňovanými taxony. Zvláště je to patrné na jaderném markeru, který umožňuje, jednoduše rozlišit nominotypický druh od zbylých dvou druhů. Při porovnání příbuznosti jednotlivých zjištěných druhů je zřejmé, že náležejí ke společnému severo evropskému kládu. Při jemnějším rozlišení nominotypický druh Gobio gobio náleží k podkládu severo západnímu a zbylé dva druhy Gobio obtusirostris a Gobio carpathicus k severo východnímu podkládu (podobně i později uváděná slovenská Linie_III s obecným označením Gobio sp. 1). Nominotypický druh je široce distribuován po celém našem území a majoritně se vyskytuje v řekách dvou úmoří Severního a Baltského, minoritně v úmoří Černého moře. Druh G. obtusirostris se nachází majoritně v řekách úmoří Černého a minoritně v řekách úmoří Baltského moře. V úmoří Severního moře nebyl zaznamenán. Při analýzách 22 jedinců z řeky Dyje byl nalezen v lokalitě Soutok jediný exemplář druhu G. carpathicus na českém území.
65 Na území České republiky byly identifikovány lokality společného výskytu více druhů. K lokalitám společného výskytu nominotypického druhu a G. obtusirostris patří potok Haná a řeky Bečva, Dyje, Odra. U dvou posledně uváděných lokalit je situace komplikovanější vzhledem k nálezu třetího druhu na této lokalitě. V Dyji jde o již zmiňovaný G. carpathicus a v řece Odře byl navíc zaznamenán výskyt dvou mezidruhových hybridů mezi G. gobio a Gobio sp. 2 (Linie_V). Zástupci Linie_V, kteří jako čistá populace byli zaznamenáni v Turecku, byli předběžně nazváni „species in waiting“ a v současnosti u nich probíhá proces komplexní revize. Na území Slovenska byly rozlišeny čtyři čisté monofyletické linie s významnou statistickou podporou (Příloha E), představující druhy: Gobio gobio , Gobio obtusirostris , Gobio carpathicus and Gobio sp. 1 (Linie_III, „species in waiting“). Metoda RAPD studující menší počet populací než v případě sekvenční analýzy, rozlišila nominotypický druh od G. obtusirostris z povodí Váhu (řeka Bystrička) a z Hronu. Čistý nominotypický druh byl nalezen pouze v kanálu Revištia (přítok Latorice, povodí Tisy). Distribuční oblast jednoho ze tří dunajských druhů G. obtusirostris byla nalezena na západním Slovensku. Gobio sp. 1 a G. carpathicus představují východoslovenské druhy povodí Tisy. Situace kolem východoslovenských hrouzků je však komplikovaná v důsledku nálezu více druhů na stejné lokalitě a záchytu jedinců hybridního původu. K lokalitám společného výskytu dvou čistých druhů patří řeka Laborec ( Gobio sp. 1 a G. carpathicus ) a kanál Revištia ( G. gobio a G. carpathicus ). Na dvou lokalitách byli identifikováni hybridi mezi nominotypickým druhem a Gobio sp. 2 (Linie_V, řeka Ida), mezi nominotypickým druhem a Gobio sp. 1(Linie_III, kanál Revištia) a na stejné lokalitě i mezi nominotypickým druhem a G. carpathicus . Hybridi mezi tureckou Linií_V a Gobio sp. 1 (Linie_III), Linií_V a druhem G. carpathicus byli nalezeni na lokalitách Belžanský potok, resp. řeka Ulička. Na základě těchto zjištění jsme vymezili hybridní zónu v oblasti severních přítoků řeky Tisy (Příloha E, Obr. 7) shodně s tvrzením autorů Rolik (1965a) a Hrabě et al. (1973) o existenci oblasti s přechodnými tvary. Z hlediska identifikace zmiňovaných druhů metoda RAPD poskytla charakteristické fingerprinty šesti a dvou populací druhů G. gobio , resp. G. obtusirostris . Rozlišené sekvenční haplotypy a nukleotypy čtyř čistých druhů a hybridních jedinců osídlujících toky ČR a SR spolu s ostatními analyzovanými druhy (podobně i u druhů rodu Romanogobio ), byly zaslány do mezinárodní databáze GenBank. Druhý cíl této dizertační práce, týkající se posouzení vnitrodruhové diverzity, byl řešen v termínech haplotypové a nukleotypové variability a průměrné vnitrodruhové diverzity (v procentech), zjištěných metodami RAPD i sekvencováním (Příloha A a E). Bylo
66 identifikováno pět haplotypů a čtyři nukleotypy druhu G. gobio . Vnitrodruhová sekvenční diverzita u obou markerů nepřesáhla 0,37%, což znamená, že populace je tvořena pouze jedním čistým druhem (Hebert et al., 2004; Ward et al., 2005). Podobné hodnoty vnitrodruhové variability byly nalezeny i u ostatních hodnocených druhů. Diverzita zjišťovaná RAPD metodou se pohybovala v rozmezí 26 38%, v souladu s rozmezím uváděným autory Foo et al. (1995) a Yoon & Kim (2001) a nevykazovaly alarmující skutečnosti spojené se sníženou fitness analyzovaných populací. Pozdější sekvenční analýzy populací z řek Odra a patrně i Rožnovská Bečva poukázaly na komplikovanost situace v důsledku společného výskytu více druhů či hybridů. Na hodnoty populační diverzity těchto populací, zjištěné metodou RAPD, je proto nutné pohlížet jako na variabilitu lokality s více druhy nikoliv na vnitrodruhovou variabilitu jednoho druhu (Příloha E). Vysvětlením středové pozice obou populací ve fylogramu (Příloha A, Obr. 3) je záchyt a existence obou druhů G. gobio a G. obtusirostris na těchto lokalitách. U druhu G. obtusirostris bylo rozlišeno pět haplotypů a jeden nukleotyp. Vnitrodruhová sekvenční diverzita nepřesáhla 0,31% a diverzita zjištěná RAPD metodou se pohybovala v rozmezí 33 37%. U druhu Gobio carpathicus byly rozlišeny tři haplotypy a tři nukleotypy. Vnitrodruhová sekvenční diverzita nepřesáhla 0,30% a diverzita zjištěná metodou RAPD nebyla u ostatních druhů studována. U monofyletické linie_III, prozatím obecně nazvané Gobio sp. 1 byly rozlišeny čtyři haplotypy a jeden nukleotyp. Vnitrodruhová sekvenční diverzita nepřesáhla 0,30%. Mezidruhové sekvenční diverzity jednotlivých druhů vyskytující se na českém a slovenském území jsou uvedeny v příloze E (Tab. 5). Nejvíc divergentním druhem byl nominotypický druh G. gobio . Na základě vyhodnocených dat lze obecně říci, že řeky tekoucí do Černého moře vykazují větší druhovou pestrost hrouzka než řeky tekoucí do úmoří Severního a Baltského. Tyto výsledky podporují tvrzení (Reyjol et al., 2007) o Ponto Kaspickém regionu (Ponto Caspian Europe) jako „Biodiversity hotspots“ pro evropské říční ryby. V oblasti úmoří Černého moře byl zaznamenán výskyt čtyř čistých linií rodu Gobio a záchyt šesti hybridních událostí. Bylo prokázáno, že úmoří Severního moře osídluje výhradně nominotypický druh G. gobio . V řekách tekoucích do Baltského moře byl zjištěn výskyt dvou čistých linií a záchyt jedné hybridní události. Pravidlo o větší podobnosti populací téhož druhu v souvislosti s geografickou příslušností nebylo potvrzeno metodou přímého sekvencování. U fylogenetické studie hrouzků se toto pravidlo jeví jako velmi hrubé a při používání konceptu rozlišování monofyletických linií, které zde uplatňujeme, i bez obsahu. Metoda přímého sekvencování rozdělila hrouzky do jednotlivých linií, které se vyskytují v daném úmoří a
67 pokud se vyskytují napříč úmořím, nebyla shledána významnější odlišnost. O existenci dalších druhů rodu Gobio , kteří se nevyskytují na území ČR a SR, je pojednáváno v Příloze E.
6.2.2 Zástupci rodu Romanogobio Taxony skupin „kesslerii “, „albipinnatus “ a „uranoscopus “ v současnosti zahrnované do rodu Romanogobio byly v minulosti řazeny do souhrnného rodu Gobio , případně podrodu Rheogobio , a tak u starších studií lze nalézt i pojmenování s tímto rodovým/podrodovým označením.
6.2.2.1 Hrouzek Kesslerův
V rámci hrouzka Kesslerova je rozlišováno šest poddruhů z různých geografických oblastí (viz příloha D). Z hlediska literárních údajů a geografické lokace našeho území i území Slovenska jsou pravděpodobní pouze dva – Gobio (kessleri) kessleri Dybowski, 1862 a Gobio (kesslerii) carpathorossicus Vladykov, 1925 z horního toku Tisy (Zakarpatská Ukrajina). Oliva (1950, 1951) hrouzka Kesslerova poprvé objevil v Bečvě a uvedl, že je identický s nominátním poddruhem Gobio (kessleri) kessleri z Dniestru (správné současné pojmenování – kesslerii , Kottelat, 1997). Vladykov (1925) popsal a pojmenoval jedince z povodí horní Tisy nejprve jako Gobio (uranoscopus) carpathorossicus , později jako Gobio (persa) carpathorossicus a vyjádřil názor, že je konspecifický s G. kesslerii z Dniestru (Vladykov, 1931). Bănărescu & Oliva (1966) považují tyto jedince z horní Tisy za blízké hrouzkům z Dněstru a exemplářům, z Moravy a dalších slovenských řek, avšak polemizují, zda tito jedinci, kteří jsou v některých znacích intermediátní mezi poddruhy Gobio (kessleri) kessleri a Gobio (kessleri) banaticus , by měli být přiřazeni k nominátnímu poddruhu z Dniestru a nebo vyčleněni jako odlišný poddruh Gobio (kessleri) carpathorossicus . Dodávají, že pro nedostatečné diference jsou jedinci synonymizováni s poddruhem z Dniestru. Rolik (1965b) pojednává o geografické a ekologické variabilitě hrouzka Kesslerova v řece San (přítok Visly, pramenící nedaleko severovýchodní polsko slovenské hranice) v porovnání se vzorky z řeky Dniester. Podle autorky pozorovaná odlišnost na základě morfologických dat nedosahuje poddruhové úrovně a analyzovaní jedinci patří k nominátní formě G. k. kessleri z Dniestru. Libosvárský & Kux (1982) ve statistické studii pomocí pěti morfometrických charakteristik vzájemně rozlišují tři druhy rodu Gobio ( G. uranoscopus , G. kessleri , G. albipinnatus ) z oblasti ČR a SR. Avšak k bližšímu taxonomickému zařazení se nevyjadřují.
68 Na základě našich molekulárních analýz (Příloha B, D) jsme rozlišili na území ČR i SR dvě signifikantně odlišné monofyletické linie hrouzka Kesslerova. Při vzájemném porovnání s jedinci z řeky Dniester je zcela zřejmé, že české a slovenské území neosídluje druh R. kesslerii , jak uváděly výše zmiňované literární prameny. Analyzované sběry jedinců z povodí středního Dunaje se rozdělily na dvě skupiny, z nichž první tvořili jedinci z řek Bečva a Ipel’. Druhou skupinu tvořili jedinci z řek Laborec a Topl’a (povodí Tisy) a překvapivě také jedinci z řeky Moravy. Do Moravy se vlévá řeka Bečva, proto byl logicky předpokládán společný původ. Porovnáním výše zmiňovaných jedinců z dunajského systému se sekvencemi rumunských jedinců z řeky Nera (oblast Banat), uloženými v mezinárodní databázi GenBank, se ozřejmil taxonomický původ první skupiny. Se silnou statistickou podporou osídluje řeku Bečvu a Ipel’ druh R. banaticus (Obr. 4, Příloha D). Druhá skupina jedinců převážně z povodí Tisy, je v současnosti intenzivně studována (Obr. 2, Příloha D). Je zvažována platnost v současnosti neuznaného taxonu Gobio (kesslerii) carpathorossicus (Bănărescu & Oliva, 1966). Pokud se prokáže jeho validita bude pojmenován jako Romanogobio carpathorossicus , avšak do ukončení procesu komplexní revize nese obecné označení „species in waiting“. Výsledky molekulárních analýz poukazují na relativně vysokou procentickou divergenci sekvencí mitochondriálního markeru (CR) mezi zmiňovanými dvěma liniemi (5,6 6,2%). Bylo rozlišeno pět haplotypů a pět nukleotypů druhu R. banaticus a osm haplotypů se třemi nukleotypy potenciálního druhu R. carpathorossicus . Nejvyšší haplotypová diverzita byla zjištěna v řekách Bečva, Morava a Topl’a, nejvyšší nukleotypová variabilita především v řece Bečvě. Intraspecifická diverzita nepřesáhla 0,7%. Mezipopulační variabilita uvnitř první a druhé skupiny byla 0,4%, resp. 0,5 1,0%. Obě rozlišené linie jsou považovány za bazální ve fylogenetickém stromu a spolu s druhem R. pentatrichus za nejvíce divergentní druhy rodu Romanogobio . Při hodnocení otázky výskytu přírodních mezirodových a současně mezidruhových hybridů hrouzka obecného a Kesslerova jsme na dvou lokalitách v řece Moravě a Ipel’u zaznamenali hybridní událost ve formě cytonukleární nerovnováhy. Rozšiřujeme tak seznam lokalit evidence hybridizace mezi těmito druhy vedle již zmiňovaných slovenských lokalit (Kux, 1964; Kux & Weisz 1962, 1964). Při posouzení odlišností populací vyskytujících se na obou územích je evidentní, že každá linie má stejnou nebo velmi podobnou alternativu a při případném procesu posilování místních populací je po genotypizaci zřejmé, které zdrojové populace jsou pro určitou linii nejvhodnější.
69 6.2.2.2 Hrouzek dlouhovousý
Hrouzek dlouhovousý nebyl na území ČR zjištěn. Na území SR jsou literární údaje o jeho výskytu z východoslovenské oblasti (Koščo et al., 2005). V literatuře jsou rozpoznávány tři validní subspecie hrouzka dlouhovousého (viz příloha D; Bănărescu, 1999). Z hlediska geografické lokace území Slovenska jsou pravděpodobné pouze dvě – R. u. uranoscopus Agassiz, 1828 a R. u. friči Vladykov, 1925. Vladykov (1925) popsal nový druh z horní Tisy Gobio friči. Později dospěl k jinému názoru, že tento druh je jen geografickou rasou druhého řádu („natio“) druhu Gobio uranoscopus , od kterého se odlišuje menšíma a vzdálenějšíma očima a kratšími vousky (Vladykov, 1931). Bănărescu (1953) uvedl, že k subspecii friči náleží také populace z oblasti Banatu a z povodí dolního Dunaje (jižní a východní Rumunsko, severní Bulharsko), a proto se nejedná o endemismus pro povodí Tisy. Libosvárský & Kux (1982) považovali populace z řek Topľa, Ondava, Torysa za druh G. uranoscopus a pomocí morfometrických znaků: délka vousků, průměr oka, max. a min. výška těla a délka ocasního násadce jej odlišovali analýzami PCA (Principal coordinates analysis) a DFA (Discriminant function analysis) od ostatních porovnávaných druhů. U populace hrouzků z Dunaje a z povodí Váhu je nevyjasněná otázka poddruhové příslušnosti, vzhledem k větší blízkosti k areálu výskytu nominotypického poddruhu Romanogobio (uranoscopus) uranoscopus z povodí horního toku Dunaje. Od východoslovenských populací druhů Romanogobio (uranoscopus) friči je výraznější územní vzdálenost. Dosud provedené dílčí rozbory nasvědčovaly tomu, že zaznamenaný plynulý pokles hodnot znaků (poměr průměru oka a délky vousků k délce hlavy) byl pokládán Bănărescem (1953) ze systematického hlediska za nejdůležitější. Tzn., že u východních populací jsou oči menší než u nominotypické formy, vousky se též zkracují. Vladykov (1925, 1931) uvádí rozmezí hodnot diagnostických znaků pro populace ze Zakarpatské Ukrajiny. Bănărescu (1970) udává rozmezí hodnot těchto znaků pro populace poddruhů friči a nominotypického uranoscopus . Srovnáme li biometrické údaje Podhradského & Brtka (1955), Bănăresca (1970) a Černého (1980), týkající se nominotypického poddruhu z Isaru a subspecie friči z Rumunska, Dunaje u Bratislavy a z Vláry, bylo zjištěno, že subspecie friči má vyšší tělo, kratší vousky k délce těla a menší oči. Bănărescu (1970) dále uvádí, že o poddruhu G. u. friči je získáno mnoho údajů, ovšem málo je známo o rozšíření nominotypického poddruhu G. u. uranoscopus a doporučuje jej proto pozornosti ichtyologů v Rakousku a jižní části Německa. Na základě molekulárních analýz jsme rozlišili na území SR jednu monofyletickou linii se silnou statistickou podporou (Příloha D). Jelikož se nepodařilo získat vzorek z řeky Isar,
70 nebylo možné provést srovnání s nominotypickým druhem R. uranoscopus . Srovnáním získaných sekvencí jedinců z povodí Tisy a databázových sekvencí jedinců z povodí středního Dunaje (řeka Nera, oblast Banat, Rumunsko) spolu s geografickou lokací areálu výskytu uváděnou v literatuře, bylo zřejmé, že se jedná o druh Romanogobio friči. Ve východoslovenských řekách Hornádu, Laborci a Uličce bylo rozlišeno po dvou a u posledně jmenovaných dvou lokalit po jednom haplotypu. Jeden totožný nukleotyp byl zjištěn u všech zmiňovaných populací. Tzn., že jedinci z řeky Laborec a Ulička nevykazovali žádnou variabilitu. Celková vnitrodruhová variabilita nepřesáhla 0,24%. Ze systematického hlediska byli jedinci tohoto druhu řazeni do společného kládu s druhy R. albipinnatus , R. belingi a R. vladykovi podle mitochondriálního i jaderného markeru. Nebyl odhalen žádný mezirodový ani mezidruhový hybrid. Pro konečné a jednoznačné prokázání validity tohoto druhu na uvedeném území bude nutné provést srovnání s nominotypickým druhem R. uranoscopus . Zůstává nevyjasněná otázka původu populací z povodí Váhu, neboť se nepodařilo získat materiál z této oblasti.
6.2.2.3 Hrouzek běloploutvý
U hrouzka běloploutvého byly v minulosti rozlišovány tři poddruhy (Bănărescu, 1946, 1960, 1961; Bănărescu & Nalbant, 1973): Gobio (albipinnatus) albipinnatus Lukasch, 1933 z povodí Volhy, Gobio (albipinnatus) belingi Slatenenko, 1934 popsaný z Dněpru a Gobio (albipinnatus) vladykovi Fang, 1943 z delty Dunaje. Komplikovanou historii těchto subspecií uvádím v článku o druzích Romanogobio (viz příloha D). Čtvrtou subspecii tanaiticus popsal nedávno Naseka (2001) z povodí řeky Donu. Z hlediska geografické lokace našeho území a území Slovenska je možný výskyt pouze dvou poddruhů Romanogobio (albipinnatus) vladykovi a Romanogobio (albipinnatus) belingi . Podle Bănărescu (1961) se poddruh belingi liší od subspecie vladykovi kratší hlavou, rypcem a větším okem. G. a. albipinnatus se liší menším okem a větší mezioční vzdáleností (Bănărescu, 1952). Historie nálezu poddruhu vladykovi v ČR a SR je šířeji popsána v Příloze D. Oliva (1950, 1951, 1953) prokázal po srovnání Vladykova „křížence“, vzorků jedinců z Malého Dunaje určených jako G. belingi a na základě Bergovy studie (1948 49), která synonymizovala subspecii belingi s poddruhem G. a. albipinnatus , že se jedná o jeden druh G. albipinnatus . Oliva (1952) eviduje poddruh vladykovi v řece Moravě (blízko Hodonína), Kux (1957) na třech lokalitách: Břeclav, Tvrdonice a Holásky u Brna. Podotýká, že je hojný v dolní části Moravy a Dyje. Bănărescu & Oliva (1966) popisuje tuto subspecii i z řeky Bečvy blízko ústí řeky Bystřice. Bănărescu (1972 73) poznamenává, že hrouzek běloploutvý je
71 skutečně jeden druh, který obývá široký areál od povodí dolního Dunaje až k Volze a rozpadá se na tři subspecie. Libosvárský & Kux (1982) našel rozdílné charakteristiky mezi druhy kesslerii , uranoscopus a albipinnatus , v případě posledně jmenovaného se jednalo o lokality Lanžhot, Hodonín (řeka Morava) a Bánov (řeka Nitra). V roce 2003 byla nalezena na českém území v Labi v ústí do Liběchovky druhá subspecie (původem z Dněpru) a byla označena novým druhovým pojmenováním Romanogobio belingi (Šlechta, pers. com.). V roce 2005 byla evidována i na dalších dvou labských lokalitách Neratovice a Střekov (Lusk et al., 2005a). Výsledky molekulárních analýz prokázaly osídlení českého území dvěma monofyletickými liniemi se silnou statistickou podporou (Obr. 3 6, Příloha D). Bylo jednoznačně prokázáno, že druh Romanogobio albipinnatus z povodí Volhy se nevyskytuje na území ČR ani SR. Na dvou lokalitách řeky Labe byl identifikován druh Romanogobio belingi , jeho sekvenční vzory se shodovaly nebo byly velmi podobné se vzory z typových lokalit Dniepru a Dniestru. O původu tohoto druhu v Labi jsou vedeny diskuse (Freyhof et al., 2000; Scholten, 2000). Tito autoři označují hrouzka běloploutvého z řek Rýn, Odra a Labe jako G. albipinnatus , avšak po molekulárním testování jedinců těchto řek je zřejmé, že toto označení je nesprávné. Nicméně uvádějí tři možná vysvětlení jeho původu: (1) neúmyslná introdukce s jinými druhy z různých povodí jako násada nebo jako návnada; (2) invaze přes umělý systém kanálů (mezi Labe Odra, Labe Rýn, Rýn Dunaj); (3) nerozpoznaný původní obyvatel této oblasti. Díky široké distribuci a početnému výskytu tohoto druhu se nejeví pravděpodobná nedávná invaze. Spíše se jeví vhodnějším vysvětlení založené na chybných identifikacích a přehlížení možného výskytu. Toto vysvětlení je podporováno i vlastními studiemi, kde uvádíme příklad snadnosti jeho záměny v důsledku hybridizačních událostí a objevy nových areálů výskytu (příloha B a D). V povodí Dunaje v řece Dyji byl potvrzen nález druhu Romanogobio vladykovi . Při porovnání rozlišených sekvencí hrouzka z povodí Volhy s poddruhy belingi a vladykovi bylo identifikováno divergenční rozmezí 1,10 7,57% na základě analýz jaderného i mitochondriálního genomu. Obě linie se vzájemně odlišovaly na testovaných markerech v rozmezí 1,53 2,25%. Byla zjištěna větší vzájemná podobnost druhů Romanogobio belingi a Romanogobio vladykovi oproti druhu z Volhy. Na území Slovenska byl potvrzen pouze výskyt druhu Romanogobio vladykovi na dvou lokalitách povodí Dunaje (Ipel’ a Váh) a na čtyřech lokalitách povodí Tisy (Revištia, Topl’a, Ublianka a Uh). U druhu R. belingi byly identifikovány dva a u druhu R. vladykovi šest holotypů, nejčastěji u jedinců z řeky Dyje.
72 Situace kolem zjištěných nukleotypů (jaderných haplotypů) je složitější v důsledku hybridizace. Vnitrodruhové variability nepřesáhly 0,34 a 0,14% u druhů R. belingi , resp. R. vladykovi . V rámci vyhodnocování výskytu přírodních mezirodových a mezidruhových hybridních forem hrouzka běloploutvého byly i v minulosti v literatuře zaznamenáni především kříženci s hrouzkem obecným na Moravě (řeky Dyje, Jihlava, Morava Rokytná; Romanovský, 1952; Kux, 1957; Lusk, 1973). Na Slovensku byli tito hybridi zaznamenáni v rameni Dunaje (Kux & Weisz, 1962), v Ipel’u (Kux & Weisz, 1964) a v Laborci (Weisz & Kux, 1959). Molekulárními technikami jsme odhalili četnější výskyt hybridů tohoto druhu než v případě hrouzka Kesslerova. Zaznamenali jsme čtyři mezirodové a čtyři mezidruhové hybridy ( R. belingi x R. vladykovi ) v Labi a jeho povodí. V analyzovaných lokalitách povodí Dunaje (dle literatury distribuční oblast R. vladykovi ), nebyl evidován žádný mezidruhový hybrid a byl zde zaznamenán pouze výskyt čistých populací R. vladykovi . Situace kolem hybridizace druhů rodu Gobio a Romanogobio je velmi komplikovaná v důsledku evidence introgresivní hybridizace, i cytonukleární nerovnováhy, popř. mitochondriálního transferu. Hybridní problematika hrouzků se v současné době vyhodnocuje a bude podrobně rozebrána v připravovaném samostatném článku.
6.3 Ochranářské aspekty Základní součástí ochranářského managementu je zajištění optimálních podmínek pro trvalou existenci zdravé populace chráněného subjektu. Pokud jsou tyto podmínky nevyhovující, je nezbytným krokem jejich zlepšení a obnovu příznivého stavu provést formou restauračních zásahů. Mohou následovat další postupy k obnově narušené, oslabené či vymizelé populace. V případě, že populace je silně oslabena, lze k obnově její životaschopnosti realizovat podpůrné vysazování matečných ryb nebo násad. V případě, že populace vymizela, je možno uvažovat o její restauraci pomocí jedinců z existujících populací. Při všech těchto zásazích je nezbytné provést genetické analýzy, vyhodnotit blízkost či podobnost populací a zvolit postup, který minimalizuje rizika destrukce genetické identity původní populace (Allendorf & Luikart, 2007). Výsledky, které jsme získali při výzkumu genetické diverzity příslušníků rodu Gobio v původním chápání, prokázaly, že na území České republiky i na Slovensku je úroveň jejich genetické diverzity zásadně odlišná od původních předpokladů. Konkrétně je nutno vnímat ve vztahu k ochraně biodiverzity následující zjištění:
73 Byla potvrzena rodová diferenciace původního rodu Gobio na dva rody Gobio a Romanogobio , jak je to postupně prosazováno i na mezinárodní úrovni.
Původně chápána jednotná druhová struktura druhu Gobio gobio se na základě genetických analýz průkazně rozdělila na struktury, kterým lze přisuzovat druhovou úroveň ( Gobio gobio , Gobio obtusirostris , Gobio carpathicus a Gobio sp. 1).
V rámci druhu Gobio gobio byla zjištěna průkazná mezipopulační diverzita (RAPD analýza).
U druhů rodu Romanogobio dochází ke změnám jejich odborného označení: původní Romanogobio albipinnatus lze rozčlenit na druhy Romanogobio vladykovi a Romanogobio belingi . Avšak původnost posledně zmiňovaného taxonu na území ČR je v současnosti nejednoznačná. Původní druh Romanogobio kesslerii lze rozčlenit na Romanogobio banaticus a možná i Romanogobio carpathorossicus (probíhá revize). Pro definitivní potvrzení validity druhu Romanogobio friči na území SR je nezbytné prokázat odlišný druhový status od nominotypického druhu z horní části Dunaje.
Specifický význam pro posouzení taxonomického statusu mají hybridizační procesy, které byly zjištěny u druhů Gobio gobio , Gobio carpathicus , Gobio sp. 1 (Linie_III), Gobio sp. 2 (Linie_V), Romanogobio banaticus , Romanogobio belingi a Romanogobio vladykovi . S ohledem na uvedené nové poznatky o taxonomické a genetické struktuře rodu Gobio v původním chápání, vyvstává problém efektivní ochrany zjištěné biodiverzity u této části ichtyofauny ČR a SR. Jsme si vědomi komplikovanosti vytváření, aktualizace i uplatňování ochranářského managementu, který potřebuje jednoduché a efektivní nástroje. Za nejefektivnější a nejsnáze uplatnitelný postup je možno považovat rozšíření subjektu ochrany, kdy vedle „ochrany druhu“ bude zavedena plnohodnotně i „ochrana genetické diverzity“, jak pro naše podmínky uvádějí např. Lusk et al. (2002a, 2002b), Hanel & Lusk (2005). Tento přístup by zajistil ochranu zavedených druhů i druhů ustanovených na základě genetických analýz, při současné ochraně vnitrodruhové diverzity (na populační úrovni).
74 7 Shrnutí Výsledky dizertační práce lze shrnout do několika bodů: Genetické analýzy prokázaly, že území ČR osídlují tři druhy rodu Gobio : Gobio gobio , Gobio obtusirostris a na jediné lokalitě (Soutok) byl zaznamenán ojedinělý výskyt druhu Gobio carpathicus . Ze zástupců rodu Romanogobio se na českém území vyskytují tři, popř. čtyři druhy: ze skupiny „albipinnatus“ – Romanogobio vladykovi a Romanogobio belingi . Ze skupiny „kesslerii“ – Romanogobio banaticus a prozatím označený termínem „species in waiting“ Romanogobio carpathorossicus . Prokázali jsme, že území SR osídlují čtyři druhy rodu Gobio : Gobio gobio (minoritně), Gobio obtusirostris , Gobio carpathicus a Gobio sp. 1 – druh označený pracovním termínem „species in waiting“ (Linie_III). Ze zástupců rodu Romanogobio se na tomto území vyskytují tři (čtyři) druhy: ze skupiny „ albipinnatus “ – Romanogobio vladykovi . Ze skupiny „ kesslerii “ – Romanogobio banaticus a pracovním termínem označený „species in waiting“ Romanogobio carpathorossicus . Ze skupiny „ uranoscopus “ Romanogobio friči. Celkem bylo identifikováno a do mezinárodní databáze GenBank zasláno 47 haplotypů a 38 nukleotypů rodu Gobio a 32 haplotypů a 33 nukleotypů rodu Romanogobio , přičemž z území ČR a SR 17 haplotypů a 9 nukleotypů rodu Gobio a 25 haplotypů a 14 nukleotypů rodu Romanogobio . Řeky úmoří Černého moře vykazují větší druhovou pestrost rodu Gobio než řeky příslušející do úmoří Severního a Baltského. Byl zaznamenán v této oblasti výskyt čtyř geneticky rozlišitelných druhů rodu Gobio . Bylo prokázáno, že úmoří Severního moře osídluje výhradně nominotypický druh Gobio gobio . V řekách úmoří Baltského moře byl zjištěn výskyt dvou druhů tohoto rodu. Byli identifikování kříženci mezi oběma rody i mezi druhy uvnitř těchto rodů. Celkem bylo zachyceno na území ČR (v řece Labi, Moravě, Odře) devět a na území SR (Belžanský potok, Ida, Ipel’, Revištia, Ulička) sedm hybridních událostí. Na území SR byla vymezena hybridní zóna v oblasti severních přítoků řeky Tisy. Hybridizace mezi druhy rodu Gobio je častá a komplikovaná, vyžaduje více pozornosti. Pro zodpovězení otázky, zda hybridní jedinci tvoří početnou, viabilní a rozmnožující se populaci, bude nutné další zkoumání.
75 Byla nalezena jednoduchá rozlišovací metoda nazvaná „S7indel diagnostika“, která byla předložena, jako nadějný nástroj k rychlé identifikaci druhů rodu Gobio . Byly identifikovány zdrojové populace pro případ posilování populací kriticky ohrožených druhů rodu Romanogobio . Na základě získaných výsledků je nezbytné do ochranářského managementu zařadit vedle druhové i genetickou úroveň ochrany taxonů. Odpovědi na konkrétní otázky kladené v Kapitole 3: Druh Gobio gobio není jediným druhem rodu Gobio vyskytujícím se na území ČR a SR. Druhy Gobio gobio a Gobio obtusirostris jsou rozlišitelné pomocí „S7indel diagnostiky“. Možnost rozlišení na základě morfologických a morfometrických znaků nebyla zkoumána. Byl prokázán překvapivě odlišný původ hrouzka skupiny „ kesslerii “ na území ČR. Pro druh Romanogobio banaticus , reprezentovaný populací z Bečvy, je fylogeneticky nejblíže populace z řeky Ipel’. Pro „species in waiting“ Romanogobio carpathorossicus , reprezentovaný populací z řeky Moravy, jsou geneticky nejpodobnější slovenské populace z řek Laborec a Topl’a. Ze skupiny „ albipinnatus “ se na území ČR a SR jednoznačně nevyskytuje druh Romanogobio albipinnatus . Jedná se o druhy Romanogobio belingi a Romanogobio vladykovi , kteří jsou si poměrně podobné a jejichž rozlišení zůstává prozatím na úrovni nukleotidových substitucí. Jisté indelovské odlišnosti byly již zaznamenány a jsou vyhodnocovány. Definitivní potvrzení validity druhu Romanogobio friči na území SR bude možné až po srovnání genetického vzoru s druhem Romanogobio uranoscopus z horního Dunaje.
76 8 Seznam použité literatury
Albertová, O., & Suchomelová, K. (1953). K ekologické variabilitě hrouzka ( Gobio gobio (Linnaeus) 1758). Acta Soc. Zool. Bohemoslovenicae 17 (1): 1 7 (in Czech with German summary). Allendorf, F. W., Leary, R. F., Spruell, P., & Wenburg, J. K. (2001). The problems with hybrids: setting conservation guidelines. Trends in Ecology and Evolution 16: 613 622. Allendorf, F. W., & Luikart, G. (2007). Conservation and the genetics of populations . Blackwell Publishing. Oxford. Alves, M. J., Coelho, M. M., & Collares Pereira, M. J. (2001). Evolution in action through hybridisation and polyploidy in an Iberian freshwater fish: a genetic review. Genetica 111: 375 385. Annilo, T., Laan, M., Stahl, J., & Metspalu, A. (1995). The human ribosomal protein S7 encoding gene: isolation, structure and localization in 2p25. Gene 165 (2): 297 302. Arnold, M. L. (1997). Natural hybridization and evolution . Oxford University Press, New York. Avise, J. C. (1994). Molecular Markers, Natural history, and Evolution , 2 end. Chapman & Hall, New York. Ayala, F. J., & Powell, J. R. (1972). Allozymes as diagnostic characters of sibling species of Drosophila . Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69: 1094 1096. Balon, E. (1967). Ichtyofauna pozdl´žneho a priečneho profilu československého úseku Dunaja, druhové a početné zmeny rybích populácií a ich ochrana. Čs. Ochrana prírody 3: 203 229. Bănărescu, P. (1946). Les poissons des environs de Timi ora. Notationes Biologicae , Bucure t. 4: 135 165. Bănărescu, P. (1952). Studiu biometric si sistematic al Cyprinidului Gobio albipinnatus Lukas (inclusiv G. belingi Slast.) din bazinul Dunarii. St. cerc. stiint. (Cluj) 3 (1 2): 1 18. Bănărescu, P. (1953). Zur Kenntnis der Systematik, Verbreitung und Ökologie von Gobio uranoscopus (Agassiz) aus Rumänien. Věst. čs. Společ. zool . 17 (2): 178 198. Bănărescu, P. (1961). Weitere systematische Studien uber die Gattung Gobio (Pisces, Cyprinidae), insbesondere im Donaubecken. Věst. čs. Společ. zool. 25 (4): 318 346. Bănărescu, P. (1962). Phylletische Beziehungen der Arten und Artbildung bei der Gattung Gobio (Pisces, Cyprinidae). Věst. čs. Společ. zool. 36 (1): 38 64.
77 Bănărescu, P. (1970). Données sur la forme nominale de Gobio uranoscopus (Pisces, Cyprinidae). Bull. Mus. natl. His. Nat., Paris (2) 42 (1): 165 169. Bănărescu, P. (1972 73). Zur Kenntnis der Fischfauna des Theisbeckens. Tiscia (Szeged) 7: 69 77. Bănărescu, P. (1999). Genus Gobio . In: Bănărescu P. (Ed.) The freshwater fishes of Europe . Vol.5/I. Aula Verlag, Wiebelsheim, pp. 33 202. Bănărescu, P., & Nalbant, T. T. (1973). Pisces, Teleostei. Cyprinidae (Gobioninae). Das Tierreich. Lief. 93 . – W. de Gruyter, Berlin, pp. 304. Bănărescu, P., & Oliva, O. (1966). A note on Gobio kessleri Dybowski, 1862, and Gobio albipinnatus Lukasch, 1933 (Cyprinidae, Osteichthyes) from the river Bečva. Věst. čs. Společ. zool ., 30 (1):1 4. Barriel, V. (1994). Molecular phylogenies and how to code insertion/deletion events. C.R. Acad. Sci. III 317: 693 701. Baruš, V., & Oliva, O. (1995). Mihulovci a Ryby . Academia, 698 pp, ISBN 80 200 0218 9. Berg, L. S. (1914). Pыбы (Marsipobranchii i Pisces), вып. 2, том 3. (Фауна Pоссии и сопpeдeльных стpан), Пeтpогpад, пп. 337 704 (in Russian). Berg, L. S. (1948 49). Ryby presnych vod SSSR i sopredel’nych stran. (Freshwater fishes of the USSR and adjacent countries). 4th ed. IZD. Akad. Nauk., Moskow Leningrad (in Russian).
.Bernardi, G., & Lape, J. (2005). Tempo and mode of speciation in the Baja California disjunct fish species Anisotremus davidsonii. Molecular Ecology 14: 4085 4096. Bernatchez, L., Glmet, H., Wilson, C. C., & Danzmann, R. G. (1995). Introgression and fixation of Arctic char ( Salvelinus alpinus ) mitochondrial genome in an allopatric population of brook trout ( Salvelinus fontinalis ). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences , 52: 179 185. Bianco, P. G., & Ketmaier, V. (2005). Will the Italian endemic gudgeon, Gobio benacensis , survive the interaction with the invasive introduced Gobio gobio ? Folia Zool . 54 (1): 42 49. Bibb, M. J., Van Etten, R. A., Wright, C. T., Walberg, M. W., & Calyton, D. A. (1981). Sequence and organization of mouse mitochondrial DNA. Cell 26: 167 180. Blahák, P. (1981). Příspěvek k poznání ichtyofauny dolního toku Vláry. Ac. Rer. Natur. Mus. Nat. Slov., Bratislava 27: 123 139.
78 Bohlen, J., & Ráb, P. (2001). Species and hybrid richness in spined loaches of genus Cobitis (Teleostei: Cobitidae ), with a checklist of European forms and suggestions for conservation. Journal of Fish Biology 59 (Suppl. A): 79 85. Brands, S. J. (comp.). (1989 2005). Systema Naturae 2000. The Taxonomicon . Universal Taxonomic Services, Amsterdam, The Netherlands. http://sn2000.taxonomy.nl/Taxonomicon/ . Access date: 5/2007. Brown, W. M., George, M., & Wilson, A. C. (1979). Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1967 1971. Brtek, J. (1953). Príspevok k poznaniu rozšírenia niektorých pre faunu ČSR nových alebo málo známých pontokaspických druhov živočichov v Dunaji. Biológia, Bratislava 8 (4): 297 309. Callejas, C., Lusková, V., & Ochando, M. D. (2004). A contribution to the genetic characterisation of some species of the genus Gobio (Cyprinidae). Folia zoologica, 53 (4): 433 436. Cantarore, P., Robertim, M., Pesole, G., Ludovico, A., Milella, F., Gadaleta, M. N., & Saccone, C. (1994). Evolutionary analysis of cytochrome b sequences in some Perciformes: evidence for a slower rate of evolution than in mammals. Journal of Molecular Evolution. 1994 (39): 589 597. Clayton, D. A. (1982). Replication of animal mitochondrial DNA. Cell 28: 693 705. Clayton, D. A. (1992). Structure and function of the mitochondrial genome. J. Inherited Metab. Dis. 15: 439 447. Clement, M., Posada, D., & Crandall, K. (2000). TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Mol. Ecol . 9(10): 1657 1660. Collares Pereira, M. J. (1989). Hybridization in European cyprinids: evolutionary potential of unisexual populations. In: Evolution and ecology of unisexual vertebrates , Bulletin 466, New York State Museum, Albany, New York, USA: 281 288. Cracraft, J. (1989). Speciation and its ontology: The empirical consequences of alternative species concepts for understanding patterns and processes of differentiation. In. Speciation and its Consequences (Otte D. & J. A. Endler, eds.), pp. 28 59. Sinauer Associates, Sunderland. Cunha, C., Mesquita, N., Dowling, T. E., Gilles, A., & Coelho, M. M. (2002). Phylogenetic relationships of Eurasian and American cyprinids using cytochrome b sequences. J. Fish Biol. 61: 929 944.
79 Czudek, T. (1997). Reliéf Moravy a Slezska v kvartéru (Relief of Moravian and Slesien in Quatemary). Sursum Tišnov, 213 pp. (in Czech with German summary). Černý, J. (1980). Správa o náleze Gobio uranoscopus v rieke Vlára. Biologia , Bratislava 35 (2): 141 144. DeMarais, B. D., Dowling, T. E., Douglas, M. E., Minckley, W. L, & Marsh, P. C. (1992). Origin of Gila seminuda (Teleostei: Cyprinidae) through introgressive hybridization: Implications for evolution and conservation . Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89: 2747 2751. Doadrio, I., & Madeira, M. J. (2004). A new species of the genus Gobio Cuvier, 1816 (Actynopterigii, Cyprinidae) from the Iberian Peninsula and southwestern France. Graellsia 60 (1): 107 116. Dorko, J. (1963). Príspevok k ichtyofauně Ondavy. Sbor. pedag. inšt. v Prešove, prír. vedy, zv. 1: 45 67. Dorko, J. (1966a). Morfologicko systematická charakteristika hrúza obyčajného ( Gobio gobio L.) z Ondavy a jej prítokov. Sb. biol. a geol. věd Pedagogických fakult, 2: 137 147. Dorko, J. (1966b). Morfologicko systematická charakteristika hrúza Kesslerovho (Gobio kessleri Dybowski, 1862) z povodia Ondavy. Zb. Ped. Fak. Univ. J. Šafárika Prešov, Prír. vedy , 1: 125 131. Dowling, T. E., & DeMarais, B. D. (1993). Evolutionary significance of introgressive hybridization in cyprinid fishes. Nature 362: 444 446. Dowling, T. E., & Secor, C. L. (1997). The role of hybridization and introgression in the diversification of animals. Annual Reviews in Ecology and Systematics 28: 593 619. Farris, J. S., Källerjö, M., Kluge, A. G., & Butt, C. (1994). Testing significance of incongruence. Cladistics 10: 315 319. Finnerty, J. R., & Block, B. A. (1995). Evolution of cytochrome b in the Scombroidei (Teleostei): molecular insights into billfish (Istiophoridae and Xiphiidae) relationships. Fisheries Bulletin . 93(1): 78 96. Foo, C. L., Dinesh, K. R., Lim, T. M., Chan, W. K., & Phang, V. P. (1995). Inheritance of RAPD markers in the guppy fish, Poecilia reticulata. Zoolog. Sci. 12 (5): 535 541. Freeland, J. R. (2005). Molecular Ecology . John Wiley & Sons. Chichester, England. Freyhof, J., & Naseka, A. M. (2005). Gobio delyamurei , a new gudgeon from Crimea, Ukraine (Teleostei: Cyprinidae). Ichthyol. Explor. Freshwaters 16 (4): 331 338.
80 Freyhof, J., Scholten, M., Bischoff, A., Wanzenböck, J., Staas, S., & Wolter, C. (2000). Extensions to the known range of the whitefin gudgeon in Europe and biogeographical implications. J. Fish Biol. 57: 1339 1342. Froese, R., & Pauly, D. (eds.) (2007). FishBase. World Wide Web electronic publication. www.fishbase.org . Goodman, S. J., Barton, N. H., Swanson, G., Abernethy, K., & Pemberton, J. (1999). Introgression trough rare hybridization: a genetic study of a hybrid zone between Red and Sika Deer (Genus Cervus ) in Argyll, Scotland. Genetics 152: 355 371. Grant, B. R., & Grant, P. R. (1998). Hybridization and speciation in Darwin’s finches – the role of sexual imprinting on a culturally transmitted trait. Pp. 404 422 in Howard D.J. and S. H. Berlocher, eds. Endless Forms. Oxford University Press, New York. Guo, X., Liu, S., & Liu, Y. (2006). Evidence for recombination of mitochondrial DNA in triploid crucian carp. Genetics 172: 1745 1749. Gyllensten, U., Wharton, D., Josefsson, A., & Wilson, A. C. (1991). Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice. Nature 352: 255 257. Gyllensten, U. B., Wilson, A. C. (1987). Interspecific mitochondrial DNA transfer and the colonization of Scandinavia by mice. Genetical Research, Cambridge 49: 25 29. Hanel, L., & Lusk, S. (2005). Fishes and Lampreys of the Czech Republic: Distribution and Conservation. ČSOP Vlašim, 447 pp, ISBN 80 86327 49 3. Hayashi, J. I., Tagashira, Y., & Yoshida, M. C. (1985). Absence of extensive recombination between interspecies and intraspecies mitochondrial DNA in mammalian cells. Exp. Cell Res . 160: 387 395. Hebert, P. D. N., Stoeckle, M. Y., Zemlak, T. S., & Francis, C. M. (2004). Identification of birds through DNA barcodes. PLOS Biology 2: 1657 1663. Hillis, D. M., & Dixon, M. T. (1991). Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly Review of Biology 66 (4): 411 453. Hillis, D. M., Moritz, C., & Mable, B. K., (1996). Molecular Systematics . Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. 655 pp. Holčík, J., Bastl, I., Kirka, A., & Mišík, V. (1965). Ichtyofauna povodia Oravskej priehrady a jej prítokov. Acta ret. nat. Mus. nat. Slov. Bratislava 11 (1): 93 139. Holčík, J., & Mišík, V. (1962). Ichtyologický výzkum Karpatského oblúka. I. Ichtyofauna tokov južných svahov Vihorlatu a Blatskej nížiny. Biológia, Bratislava 17 (6): 422 439. Hrabě, S., Oliva, O., & Opatrný, E. (1973). Klíč našich ryb, obojživelníků a plazů . SPN, Praha
81 Chow, S., & Hazama, K. (1998). Universal PCR primers for S7 ribosomal protein gene introns in fish. Molecular Ecology 7: 1247 1263. Janko, K., Kotlík, P., & Ráb, P. (2003). Evolutionary history of asexual hybrid loaches (Cobitis : Teleostei) inferred from phylogenetic analysis of mitochondrial DNA variation. Journal of Evolutionary Biology 16: 1280 1287. Johansen, S., Gudddal, P. H., & Johansen, T. (1990). Organization of the mitochondrial genome of Atlantic cod, Gadus morhua. Nucleic Acids Res . 18: 411 419. Jurajda, P., Hohausová, E., & Gelnar, M. (1998). Seasonal dynamics of fish abundance below a migration barrier in the lower regulated River Morava. Folia Zool. 47: 215 223. Jurajda, P., & Peňáz, M. (1994). Fish community of the lower regulated stretch of the River Morava, Czech Republic. Folia Zool . 43: 57 64. Jurajda, P., Ráb, P., Šlechta, V., & Šlechtová, V. (1996): Occurrence and identification of Kessler’s gudgeon ( Gobio kessleri ) in the river Bečva (Czech Republic). Folia Zool . 45: 253 257. Kalous, L., Šlechtová, V., Bohlen, J., & Doadrio, I. (2004). Původ a identifikace ryb rodu Carassius v Evropě pomocí molekulárně genetických dat. Sb. referátů z VII. České ichtyologické konference : 69 73. Kirka, A. (1964). Správa o náleze Gobio uranoscopus v rieke Orave. Zool. listy 13 (1): 86 87. Kondo, R., Satta, Y., Matsuura, E. T., Ishiwa, H., Takahata, N., & Chigusa, S. I. (1990). Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophila . Genetics 126: 657 663. Koščo, J., Lusk, S., Halačka, K., Lusková, V., & Košuth, P. (2005). Distribution of species of the genus Gobio in the Tisza River drainage area, Slovakia. Folia Zool. 54 (Suppl. 1): 65 72. Kottelat, M. (1997). European freshwater fishes. Biologia, Bratislava 52/Supplement 5: 1 271. Kottelat, M. (1998). Systematics, species concepts and the conservation of freshwater fish diversity in Europe. Ital. J. Zool . 65 Suppl.: 65 72. Králiková, K, & Gojdičová, E. (2004). Európska únia a ochrana prírody . Štátna ochrana prírody Slovenskej republiky, Banská Bystrica, ISBN 80 89035 56 6. Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., & Janzen, D. H. (2005). Use of DNA barcodes to identify flowering plants. PNAS 102 (23): 8369 8374.
82 Krupka, I. (1969). A contribution to the variability of meristic features and ecology of some species of cyprinoid fish in the River Turiec. Práce Lab. Rybárstva, Bratislava 2: 121 158. Kullander, S. (1999). Fish species – how and why. Reviews in Fish Biology and Fisheries 9: 325 352. Kupfermann, H., Satta, Y., Takahata, N., Tichy, H., & Klein, J. (1999). Evolution of Mhc DRB introns: implications for the origin of primates. Journal of Molecular Evolution 48: 663 674. Kux, Z. (1957). Příspěvek k poznání ichtyofauny dunajského povodí ČSR. Acta Mus. Moraviae, Brno 42: 67 84. Kux, Z. (1964). Ichtyofauna západní části karpatského oblouku a přilehlých nížin. Bionomie mihule karpatské (Lampetra danfordi Regan). Kand. dis. práce , ÚVO ČSAV Brno, 1. a 2. část 233 pp. (nepubl.). Kux, Z., & Weisz, T. (1958). Příspěvek k poznání ichtyofauny řeky Toplé v Bardějovském okrese. Čas. Mor. Musea , Brno 45: 145 174. Kux, Z., & Weisz, T. (1962). Ichtyofauna hlavního toku Dunaje a jeho některých přítoků v jihoslovenské nížině. Čas. Mor. Musea , Brno 47: 151 180. Kux, Z., & Weisz, T. (1964). Příspěvek k poznání ichtyofauny slovenských řek. Čas. Mor. Musea , Brno 49: 191 246. Lavoué, S., Bigorne, R., Lecointre, G., & Agnèse, J. F. (2000). Phylogenetic relationships of mormyrid electric fishes (Mormyridae, Teleostei) inferred from cytochrome b sequences. Molecular Phylogenetic and Evolution 14: 1 10. Lavoué, S., Sullivan, J. P., & Hopkins, C. D. (2003). Phylogenetic utility of the first two introns of the S7 ribosomal protein gene in African electric fishes (Mormyroidea: Teleostei) and congruence with other molecular markers. Biol. J. Linnean Soc. 78: 273 292. Lee, W., Conroy, J., Howell, W. H., & Kocher, T. D. (1995). Structure and evolution of teleost mitochondrial control regions. J. Mol. Evol. 41: 54 66. Lelek, A., & Libosvárský, J. (1960). Výskyt ryb v rybím přechodu v Břeclavi. Zool. listy 9: 293 308. Lewontin, R. C., Hubby, J. L. (1966). A molecular approach to the study of genic heterozygosity in natural populations. II. Amount of variation and degree of heterozygosity in natural populations of Drosophila pseudoobscura . Genetics 54: 595 609.
83 Libosvárský, J., & Kux, Z. (1982). Multivariate analysis of five morphometric characters in the genus Gobio . Folia Zoologica 31 (1): 83 92. Liu, H., & Chen, Y. (2003). Phylogeny of the East Asian cyprinids inferred from sequences of the mitochondrial DNA control region. Can. J. Zool. 81: 1938 1946. Liu, H., Tzeng, Ch., & Teng, H. (2002). Sequence variations in the mitochondrial DNA control region and their implications for the phylogeny of the Cypriniformes. Can. J. Zool. 80: 569 581. Lockhart, P. J., Penny, D., & Meyer, A. (1995). Testing the phylogeny of swordtail fishes using split decomposition and spectral analysis. Journal of Molecular Evolution 41(5): 666 674. Lohninský, K. (1962). Ökologische variabilität des Gründlings [Gobio gobio (Linnaeus), 1768] in böhmischen Gewässern. Acta societatis zoologicae bohemoslovenicae XXVI (2): 160 173. Löhne, C., & Borsch, T. (2005). Phylogenetic utility and molecular evolution of the petD group II intron in basal angiosperms. Mol. Biol. Evol. 22: 317 332. Lovejoy, N. R, Iranpour, M., & Collette, B. B. (2004). Phylogeny and Jaw Ontogeny of Beloniform Fishes. Integr. comp. biol. 44: 366 377. Lusk, S. (1973). The ichthyofauna of the Rokytná River. I. Species composition, abundance and biomass. Folia Zool. Brno 22 (2): 165 180. Lusk, S. (1977). The ichthyofauna of the middle course of the Jihlava River in relation to the water reservoir at Dalešice. Folia Zool. 26: 255 269. Lusk, S., Halačka, K., & Lusková, V. (1998). Introdukované druhy ryb v ichtyofauně České republiky. Bull. Lampetra III , ČSOP Vlašim: 119 133. Lusk, S., Hanel, L., & Lusková, V. (2004a). Red list of the ichthyofauna of the Czech Republic: Development and present status. Folia Zool. 53: 215 226. Lusk S., Koščo J., Halačka K., Lusková V., & Flajšhans M. 2003: Identification of Cobitis from the Slovakian part of the Tisza basin. Folia biologica (Kraków), 21 (Suppl.): 61 65. Lusk, S., Koščo, J., Lusková, V., Halačka, K., & Košuth, P. (2004b). Alien fish species in the floodplains of the Dyje and the Bodrog rivers. Ecohydrology & Hydrobiology 4: 199 205. Lusk, S., Lusková, V., & Dušek, M. (2002a). Biodiverzita ichtyofauny České republiky a problematika její ochrany. Biodiverzita ichtyofauny ČR (IV): 5 22. Lusk, S., Lusková, V., & Halačka, K. (2000). Rybí osídlení říčky Veličky (povodi Moravy). Bulletin Lampetra IV , ZO ČSOP Vlašim: 168 174.
84 Lusk, S., Lusková, V., & Halačka, K. (2002b). Umělý chov a vysazování násad – významné riziko pro vnitrodruhovou diverzitu divoce žijících ryb v České republice. Sb. Produkce násadového materiálu ryb a raků. VÚRH Vodňany: 23 27. Lusk, S., Lusková, V., Halačka, K., & Horák, V. (2005c). Distribution of Gobio species in the Czech Republic. Folia Zool. 54 (Suppl. 1): 56 64. Lusk, S., Lusková, V., Halačka, K., Šlechta, V., & Šlechtová, V. (2002c). Status and protection of species and intraspecific diversity of the ichthyofauna in the Czech Republic. In: Collares Pereira, M. J., Coelho, M. M., Cowx, I. G. (Eds.), Conservation of freshwater fishes: Options for the future : 21 33. Blackwell Science, Oxford. Lusk S., Lusková V., Halačka K., Šlechtová V., & Šlechta V. (2005d). Characteristics of the remnant Vimba vimba population in the upper part of the Dyje River. Folia Zool., 54: 389 404. Lusk, S., Lusková, V. Hanel, L., & Halačka, K. (2005b). Alien species in the ichthyofauna of the Czech Republic: their impact and meaning. [Nepůvodní druhy v ichtyofauně České republiky: jejich vliv a význam]. Rybinsk: Rossijskaja Akademija nauk : 203 204. Lusk S., Lusková V., Šlechta V., & Šlechtová V. (1995). Násady a populační genetika divoce žijících druhů ryb. Sb. produkce násad perspektivních druhů ryb, MZLU Brno: 20 25. Lusk, S., & Šlechta, V. (2005a). Changes in the taxonomy of gudgeons from European waters. Folia Zool. 54 (Suppl. 1): 2 4. Lusková, V., Koščo, J., Halačka, K., Stráňai, I., Lusk, S., & Flajšhans, M. (2004). Status of populations of the genus Cobitis in Slovakia. Biologia (Bratislava) 59 (5): 621 626. Lusková V., Šlechtová V., Povž M., Šlechta V., & Lusk S. (1997). Genetic variability of Chondrostoma nasus populations in rivers of the Blafl Sea and Baltic Sea drainage systems. Folia Zool. 46 (Suppl. 1): 27 36. Lusková V., Šlechtová V., Šlechta V., & Lusk S. (1995). The population genetic diversity of Chondrostoma nasus from Moravan and Slovak rivers. Folia Zool. 44 (Suppl. 1): 89 98. Lynch, M., Conery, J., & Burger, R. (1995). Mutation meltdowns in sexual populations. Evolution 49: 1067 1088. Madeira, M. J., Gómez Moliner, B. J., & Doadrio, I. (2005). Genetic characterization of Gobio gobio of the Iberian Peninsula based on cytochrome b sequences. Folia Zool. 54 (Suppl. 1): 5 12. Mahen, J. (1929 1931). Příspěvek k systematice ryb kaprovitých I . a II. Sb. klubu přírodověd. v Brně 12, 33 46, II, 13 a 14 (1930, 1931): 3 18.
85 Mariottini, P., Bagni, C., Annesi, F., & Amaldi, F. (1988). Isolation and nucleotide sequences of cDNAs for Xenopus laevis ribosomal protein S8: similarities in the 5' and 3' untranslated regions of mRNAs for various r proteins. Gene 67: 69 74. Maxam, A. M., & Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 564.
Mayden, R. L. (2002). On biological species, species concepts and individuation in the natural world. Fish Fish. 3: 171 196.
Mendel, J., Lusková, V., Halačka, K., Lusk, S., & Vetešník, L. (2005). Genetic diversity of Gobio gobio populations in the Czech Reopublic and Slovakia, based on RAPD markers. Folia Zool . 54 (Suppl. 1): 13 24.
Merta, L., & Lusk, S. (2004): Výskyt hrouzka Kesslerova ( Gobio kesslerii Dybowski, 1862) v řece Moravě. Biodiverzita ichtyofauny ČR (V) : 65 70.
Meyer, A. (1993). Evolution of mitochondrial DNA in fishes. In : Biochemistry and Molecular Biology of Fishes vol 2., Elsevier, Amsterdamn. pp 1 38. Mickevich, M. F., & Farris, J. S. (1981). The implications of congruence in Menidia. Syst. Biol. 30: 351 370. Müller, K. (2005). SeqState primer design and sequence statistics for phylogenetic DNA data sets. Applied Bioinformatics 4, 65 69. Müller, K. (2006). Incorporating information from length mutational events into phylogenetic analysis. Molecular Phylogenetics and Evolution 38: 667 676. Mundus, D. A., Bulygin, K. N., Ven'yaminova, A. G., Vladimirov, S. N., Vratskikh, L. V., Repkova, M. N., Yamkovoi, V. S., & Karpova, G. G. (1993). Human placenta 40S ribosomal subunit affinity modification by oligoribonucleotide derivatives containing the AUG codon. In: Ribosomal proteins composing the codon anticodon interaction site. Mol. Biol. 27: pp. 91 95. Mundy, N. I., & Kelly, J. (2001). Phylogeny of lion tamarins ( Leontopithecus spp ) based on interphotoreceptor retinol binding protein intron sequences. American Journal of Primatology 54: 33 40. Nalbant, T. T., Battes, K. W., Pricope, F., & Ureche, W. (2004). First record of the Amur sleeper Perccottus glenii (Pisces: Perciformes: Odobtobutidae) in Romania. Travaux du Museum National d´Histoire Naturelle „Grigore Antipa 47: 279 284.
86 Naseka, A. M. (1996). Comparative study on the vertebral column in the Gobioninae (Cyprinidae, Pisces) with special reference to its systematics. Publ. Espec. Inst. Espan. Oceanogr. 21: 149 167. Naseka, A. M. (2001). Contributions to the knowledge of infraspecific structure of whitefin gudgeon, Romanogobio albipinnatus (Lukasch, 1933) Cyprinidae: Gobioninae), with a description of a new subspecies, R. albipinnatus tanaiticus , from the Don drainage. Proceedings of the Zological Institute St. Peterburg 287: 99 119. Naseka, A. M., & Freyhof, J. (2004). Romanogobio parvus , a new gudgeon from River Kuban, southern Russia (Cyprinidae, Gobioninnae). Ichthyol. Explor. Freshwaters 15 (1): 17 23. Naseka, A. M., Erk’akan, F., & Kücük, F. (2006). A description of two new species of the genus Gobio from Central Anatolia (Turkey) (Teleostei: Cyprinidae). Zoosyst. Rossica 15: 185 194. Nei, M. (1987). Molecular Evolutionary Genetics . Columbia University Press, New York. Oakley, T., & Phillips, R. B. (1999). Phylogeny of salmonine fishes based on Growth Hormone introns: Atlantic ( Salmo ) and Pacific ( Oncorhynchus ) salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetic and Evolution. 11: 381 393. Oliva, O. (1950). K nálezu řízka Gobio belingi Slastenenko 1934 a Gobio kessleri Dybowski 1862 (Cyprinidae Gobiini) v Československu. Akv. listy, Praha 22 (7): 124 125. Oliva, O. (1951). Gobio belingi Slastenenko = Gobio albipinnatus Lukaš 1933. Akv. listy, Praha 22 (2): 20 21. Oliva, O. (1952). Příspěvek k poznání ryb řeky Moravy. Zool. a entomol. listy 15 (2): 128 132. Oliva, O. (1953). Gobio albipinnatus Lukasch, 1933, nová ryba v československých vodách. Čas. Nár. Musea, Praha , odd. přír. 122: 94 96. Oliva, O. (1961). Seznam ryb středního Polabí. Acta societatis zoologicae bohemoslovenicae XXV (4): 366 368. Oliva, O., Hrabě, S., & Lác, J. (1968). Stavovce Slovenska I. Ryby, obojživelníky a plazy . Ryby pp. 18 227. Vyd. SAV, Bratislava, 389 pp. Palumbi, S. R. (1996). Nucleic acids. II. The polymerase chain reaction. In Molecular systematics , 2nd (D. M. Hillis, C. Moritz, C. & B. K. Mable, Eds.), pp. 205 247. Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc. Peňáz, M., & Jurajda, P. (1993). Fish assemblages of the Morava river: longitudinal zonation and protection. Folia Zool. 42: 317 328.
87 Podhradský, V., & Brtek, J. (1955). Zpráva o náleze Gobio uranoscopus (Agassiz) v Dunaji při Bratislave. Biológia, Bratislava 10 (3): 373 375. Posada, D. (2006). ModelTest Server: a web based tool for the statistical selection of models of nucleotide substitution online. Nucleic Acids Research 34, Web Server issue. Available from: http://darwin.uvigo.es/software/modeltest_server.html . Prychitko, T. M., & Moore, W. S. (1997). The utility of DNA sequences of an intron from the beta fibrinogen gene in phylogenetic analysis of woodpeckers (Aves: Picidae). Molecular Phylogenetic and Evolution 8: 193 204. Quattro, J. M., Jones, W. J., & Oswald, K. J. (2001). PCR primers for an aldolase B intron in acanthopterygian fishes. BMC Evolutionary Biology 1: 9. Randi, E., & Lucchini, V. (1998). Organization and evolution of the mitochondrial DNA control regio in the avian genus Alectoris . J. Mol. Evol. 47: 149 162. Reyjol, Y., Hugueny, B., Pont, D., Bianco, P. G., Beier, U., Caiola, N., Casals, F., Cowx, I., Economou, A., Ferreira, T., Haidvogl, G., Noble, R., De Sostoa, A., Vigneron, T., & Virbickas, T. (2007). Patterns in species richness and endemism of European freshwater fish. Global Ecol. Biogeogr . 16: 65 75. Rieseberg, L. H. (1997). Hybrid origins of plant species. Annual Review of Ecology and Systematics 28: 359 389. Roe, B. A., Ma, D. P., Wilson, R. K., & Wong, F. H. (1985). The complete nucleotide sequence of the Xenopus laevis mitochondrial genome. J. Biol. Chem. 260: 9759 9774. Rokas, A., Ladoukakis, E., & Zouros, E. (2003). Animal mitochondrial DNA recombination revisited. Trends Ecol. Evol. 18: 411 417. Rolik, H. (1965a). Contribution to the knowledge of the geographical and ecological variability of Gobio gobio (L.) in Poland. Fragmenta faunistica , XII (2): 15 29. Rolik, H. (1965b). Remarks on the systematic position of the Gobio kessleri DYB. from River San. Fragmenta faunistica , XI (28): 455 465. Romanovský, A. (1952). Užitkové a plevelné ryby řeky Dyje. Zool. a entomol. listy 1 (4): 245 252. Ronquist, F., & Huelsenbeck, J. P. (2005). Bayesian analysis of molecular evolution using MrBayes. In: Nielsen, R. (Ed.), Statistical Methods in Molecular Evolution . Springer, New York. Roy, S. M., Geffen, E., Smith, D., Ostrander, E. A., Wayne, R. K. (1994) Patterns of differentiation and hybridization in North American wolflike canids, revealed by analysis of microsatellite loci. Molecular Biology and Evolution 11: 553 570.
88 Rozas, J., Sánches Delbarrio, J. C., Messeguer, X., & Rozas, R. (2003). DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19: 2496 2497. Salazar, C. E., Mills Hamm, D., Kumar, V., & Collins, F. H. (1993). Sequence of a cDNA from the mosquito Anopheles gambiae encoding a homologue of human ribosomal protein S7. Nucleic Acids Res. 21: 4147. Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning a Laboratory Manual . Second 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 74: 5463 5467. Sbisa, E., Tanzariello, F., Reyes, A., Pesole, G., & Saccone C. (1997). Mammalian mitochondrial D loop region structural analysis: identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications. Gene 205: 125 140. Seehausen, O. (2004). Hybridizace and adaptive radiation. Trends in Ecology and Evolution 19: 198 207. Schmidt, T. R., Bielawski, J. P., & Gold, J. R. (1998). Molecular phylogenetics and evolution of the cytochrome b gene in the cyprinid genus Lythrurus (Actinopterygii: Cypriniformes). Copiea . 1998 (1): 14 22. Scholten, M. (2000). First record of the whitefin gudgeon, Gobio albipinnatus Lukasch 1933, in the River Elbe. J. Appl. Ichthyol. 16: 131 133. Simmons, M. P., Ochoterena, H. (2000). Gaps as characters in sequencebased phylogenetic analyses. Syst. Biol. 49: 369 381. Simmons, M. P., Ochoterena, H., & Carr, T. G. (2001). Incorporation, relative homoplasy, and effect of gap characters in sequence based phylogenetic analyses. Syst. Biol. 50: 454 462. Southern, S. O., Southern, P. J., & Dizon, A. E. (1988). Molecular characterization of a cloned dolphin mitochondrial genome. J. Mol. Evol. 28: 32 42. Spurný, P., Mareš, J., & Fiala, J. (2000). Druhová diverzita ichtyocenózy dolního toku řeky Bečvy. Biodiverzita ichtyofauny ČR (III): 149 154. Streelman, J. T., & Karl, S. (1997). Reconstructing labroid evolution with single copy nuclear DNA. Proceedings of the Royal Society of London, B . 264: 1011 1020. Sullivan, J. P., Lavoué, S., & Hopkins, C. D. (2002). Discovery and phylogenetic analysis of a riverine species flock of African electric fishes (Mormyridae: Teleostei). Evolution 56: 597 616.
89 Suzuki, K., Olvera, J., & Wool, I. G. (1990). The primary structure of rat ribosomal protein S7. FEBS Lett. 271: 51 53. Swofford, D. L. (2002). PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and other methods). Sinauer Associates, Sunderland, MA. Šlechta V., Lusková V., Šlechtová V., & Lusk S. (1996). Vnitrodruhová diverzita ryb a možnosti její ochrany. Biodiverzita ichtyofauny ČR (I): 26 33. Šlechtová V., Šlechta V., & Berrebi P. (1993). Genetic diversity of Barbus in Czech and Slovak revers: preliminary results. Cahiers d´Ethologie, 13: 207 210. Šlechtová V., Lusková V., Šlechta V., Lusk S., & Pivoňková J. (2003). Potential species identification by allozyme/protein markers in European spined loach. Folia biologica (Kraków), 21 (Suppl.): 43 47. Šlechtová, V., Lusková, V., Šlechta, V., Halačka, K., Lusk, S., & Koščo, J. (2005). Intraspecific allozyme diversity of Gobio gobio in Czech and Slovak rivers. Folia Zool. 54 (Suppl. 1): 25 32. Šlechtová, V., Lusková, V., Šlechta, V., Lusk, S., Halačka, K., & Bohlen, J. (2000). Genetic differentiation of two diploid polyploid complexes of spined loach, genus Cobitis (Cobitidae), in Czech Republic, involving C. taenia, C. elongatoides and C. spp.: Allozyme interpopulation and interspecific differences. Folia Zool. 49 (Suppl. 1): 67 78. Šlechtová V., Šlechta V., Lusková V., Lusk S., & Berrebi P. (1998). Genetic variability of common barbel, Barbus barbus populations in the Czech Republic. Folia Zool. (Suppl. 1): 21 33. Takahashi, H., & Takata, K. (2000). Multiple lineages of the mitochondrial DNA introgression from Pungitus pungitus (L.) to Pungitus tymensis (Nikolsky). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 57: 1814 1833. Tang, Q., Liu, H., Mayden, R., & Xiong, B. (2006). Comparison of evolutionary rates in the mitochondrial DNA cytochrome b gene and control region and their implications for phylogeny of the Cobitoidea (Teleostei: Cypriniformes). Mol. Phylogenet. Evol. 39: 347 357. Templeton, A. R., Crandall, K. A., Sing, C. F. (1992). A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. III. Cladogram estimation. Genetics 132: 619 633. Thai, B. T., Burridge, C. P., Pham, T. A., & Austin, C. M. (2004). Using mitochondrial nucleotide sequences to investigate diversity and genealogical relationships within common carp ( Cyprinus carpio L.). Animal Genetics 36: 23 28.
90 Toušková, E. (1978). Contribution to the morphological variability of gudgeon Gobio gobio (Osteichthyes, Cyprinidae). Věst. Čs. Společ. zool. 42 (4): 289 302. Vasil’eva, E. D., Vasil’ev, V. P., Kuga, T. I. (2004). On taxonomy of gudgeons of the genus Gobio (Gobioninae, Cyprinidae) of Europe: a new gudgeon species Gobio kubanicus from the Basin of the Kuban River. Voprosy Ikhtiol. 44 (6): 766 782 (in Russian). Vladykov, V. (1925). Ueber einige neue Fishe aus der Tschechoslowakei (Karpathorussland). Zool. Anz. Jena , 64 (11/12): 248 252. Vladykov, V. (1931). Poissons de la Russie Sous Carpathique (Tchécoslovaquie). Mém. Soc. Zool. France 29 (4): 217 374. Walton, A. H., Nedbal, M. A., & Honeycutt, R. L. (2000). Evidence from intron 1 of the nuclear transthyretin (Prealbumin) gene for the phylogeny of African mole rats (Bathyergidae). Molecular Phylogenetic and Evolution 16: 467 474. Wang, X., He, S., & Chen, Y. (2002). Sequence variations of the S7 ribosomal protein gene in primitive cyprinid fishes: Implication on phylogenetic analysis. Chinese Science Bulletin 47 (19): 1638 1643. Ward, R. H., Frazier, B. L., Dew Jager, K., & Pääbo, S. (1991). Extensive mitochondrial diversity within a single American tribe. Proc Natl Acad Sci USA 88: 8720 8724. Ward, R. D., Zemlak, T. S., Innes, B. H., Last, P. R., & Hebert, P. D. N. (2005). DNA barcoding Australia’s fish species. Philos. Trans. R. Soc. London B 360: 1847 1857. Wayne, R. K., Jenks, S. M. (1991). Mitochondrial DNA analysis implying extensive hybridization of the endangered red wolf Canis rufus . Nature 351: 565 568. Weibel, A. C., Moore, W. S. (2002). A test of a mitochondrial genebased phylogeny of woodpeckers (genus Picoides ) using an independent nuclear gene, beta fibrinogen intron 7. Molecular Phylogenetic and Evolution 22: 247 257. Weisz, T., & Kux, Z. (1959). Příspěvek k poznání ichtyofauny řek Laborce, Toplé, a Popradu. Acta Musei Moraviae 44: 119 138. Weisz, T., & Kux, Z. (1962). Ichtyofauna Ondavy a Hornádu. Čas. Mor. Musea, vědy přír., Brno 47: 181 200. Welsh, J., & McClelland, M. (1990). Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research 18: 7213 7218. Wiley, E. O., Johnson G. D., & Dimmick, W.W. (1998). The phylogenetic relationships of Lampridiform fishes (Teleosteoi: Acanthomorpha), based on a total evidence analysis of morphological and molecular data. Molecular Phylogenetics and Evolution 10 (3): 417 425.
91 Wiley, E. O., & Mayden, R. L. (2000). The evolutionary species concept. In : Species concepts and phylogenetic theory: A debate (Wheeler Q. D. & R. Meier, eds.), pp. 70 89. New York: Columbia Univ. Press. Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, J., Rafalski, J. A., & Tingey, S. V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18: 6531 6535. Wimberly, B. T., White, S. W., & Ramakrishnan, V. (1997). The structure of ribosomal protein S7 at 1.9 A resolution reveals a b hairpin motif that binds double stranded nucleic acids. Structure 5 (9): 1187 1198. Yang, J., He, S., Freyhof, J., Witte, K., & Liu, H. (2006). The phylogenetic relationships of the Gobioninae (Teleostei: Cyprinidae) inferred from mitochondrial cytochrome b gene sequences. Hydrobiologia 553: 255 266. Yoon, J. M., & Kim, G. W. (2001). Randomly amplified polymorphic DNA polymerase Chain reaction analysis of two different populations of cultured Korean catfish Silurus asotus . Journal of Biosciences 26 (5): 641 647. Závěta, J. (1990). Morphologishe Variabilität von Gründling Gobio gobio (Cyprinidae, Osteichthyes). Acta Universitatis Carolinae Biologica 34: 275 311. Žitňan, R. (1961 62). Príspevok k poznání ichtyofauny vod východného Slovenska. Zb. Východoslov. múzea v Košiciach , sér. A, 2 3: 270 274. Žitňan, R. (1964). Príspevok k poznání ichtyofauny dolného toku Latorice. Zb. Východoslov. múzea v Košiciach , sér. A 5: 117 119. Žitňan, R. (1965a). Monogenoidea der Fische des Flusses Hron (Gran). Helmintológia 6: 29 48. Žitňan, R. (1965b). Ichtyofauna československého úseku Tisy. Zb. Východoslov. můzea v Košiciach, zool. bot. B , 6: 61 67.
92 9 Seznam použitých zkratek
ATPase6 ATP synthase subunit 6 Be Bernská úmluva, příloha III BI Bayesian inference cDNA complementary DNA CIC Complex indel coding COI Cytochrom c oxidáza podjednotka I CR Control region CR kriticky ohrožený (critically endangered) CSB conserved sequence block Cyt b cytochrom b EN ohrožený (endangered) ESC evoluční druhový koncept (Evolutionary Species Concept) ETAS extended termination associated sequences EU Evropská Unie EVL evropsky významné lokality FISH Fluorescent in situ hybridization Gn Genesis (1. kniha Mojžíšova) Hd haplotypová diverzita HD Habitat Directive, příloha II, (Annex (II, IV and V) to the Council Directive No. 92/43/EEC ) ILD Incongruence length difference test IUCN International Union for Conservation of Nature and Natural Resources kb tisíc bazí (kilo basis) km kilometr MCIC Modified complex indel coding ML Maximum likelihood MP Maximum parsimony mtDNA mitochondriální DNA (mitochondrial DNA) NADH NADH dehydrogenase NCBI National Center for Biotechnology Information nDNA jaderná DNA (nuclear DNA) NJ Neighbour joining p nukleotidová diverzita p25 vymezená oblast na krátkém raménku chromozómu PCR polymerase chain reaction pers. com. osobní komunikace (personal communication) PSC fylogenetický druhový koncept (Phylogenetic Species Concept) SCI sites of community interest RAPD Randomly amplified polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism r protein ribosomal protein rRNA ribozomální RNA S7 jaderný lokus 1. intronu S7 r proteinu SIC Simple indel coding tRNA transferová RNA UEV území evropského významu UNCED United Nations Conference on Environment and Development VU zranitelný (vulnerable)
93 10 Soubor publikací
10.1 Příloha A Mendel, J., Lusková, V., Halačka, K., Lusk S., & Vetešník, L. (2005). Genetic diversity of Gobio gobio populations in the Czech Republic and Slovakia, based on RAPD markers. Folia Zoologica 54 (1): 13 24.
10.2 Příloha B Mendel, J., Lusk, S., Lusková, Koščo, J., V., Papoušek, I., Halačka, K., & Vetešník, L. (2006). Molekulárně biologické analýzy hrouzka Kesslerova ve vodách České republiky a Slovenska. (Molecular biological analyses of Sand gudgeon (Romanogobio kesslerii ) in the waters of the Czech Republic and Slovakia). Biodiverzita ichtyofauny ČR (VI): 95 101.
10.3 Příloha C Mendel, J., Lusková, V., Lusk, S., & Halačka, K. (2006). Rybí osídlení a genetická diverzita populace hrouzka obecného z Divoké Orlice u Kostelce nad Orlicí. (The fish community in the Divoká orlice River near Kostelec nad Orlicí, and the genetic diversity of the local common gudgeon population). Sborník konference Orlicko – Kladsko 2006 . Jablonné nad Orlicí : Sdružení obcí Orlicko: 175 178.
10.4 Příloha D Mendel, J., Lusk, S., Lusková, V., Vasil’eva, E. D., Erk’akan, F., Ruchin, A., Koščo, J., Vetešník, L., Halačka, K., Papoušek, I., Pashkov, A. N., & Reshetnikov, S. I. (2007). Molecular phylogeny of the genus Romanogobio (Cyprinidae, Pisces) and its contribution to taxonomy. Mol. Phylogenet. Evol. (submitted 5/2007).
10.5 Příloha E Mendel, J., Lusk, S., Vasil’eva, E. D., Vasil’ev, V. P., Lusková, V., Erk’akan, F., Ruchin, A., Koščo, J., Vetešník L., Halačka, K., Šanda, R., Pashkov, A. N., & Reshetnikov, S. I. (2007). Molecular phylogeny of the genus Gobio (Cyprinidae, Pisces) and its contribution to taxonomy. Mol. Phylogenet. Evol. (submitted 8/2007).
94