UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA VICERRECTORÍA ACADÉMICA ESCUELA DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES MAESTRÍA EN MANEJO DE RECURSOS NATURALES CON ENFÁSIS EN BIODIVERSIDAD

Respuestas morfogenéticas de plántulas in vitro y esquejes de Vanilla planifolia Andrews provenientes de poblaciones silvestres, caracterizadas molecularmente y cultivadas en invernadero y en Sistemas Agroforestales, Guápiles, Costa Rica

Tesis presentada al Tribunal Examinador del Programa de Maestría de Manejo de Recursos Naturales de la Escuela de Ciencias Exactas y Naturales para optar por el grado de Magister Scientiae con énfasis en gestión de la biodiversidad

José Bernal Azofeifa Bolaños

Director de tesis: Germán Rivera Coto [email protected] Lector de tesis: Roberto Cordero Solórzano [email protected] Lector de tesis: Amelia Paniagua Vásquez [email protected]

San José, Costa Rica

Junio, 2017

TRIBUNAL EXAMINADOR

Este proyecto de Graduación ha sido aceptado y aprobado en su forma presente por el Tribunal Examinador del Programa de Maestría en Manejo y Protección de los Recursos Naturales del Sistema de Estudios de Postgrado de la Universidad Estatal a Distancia, como requisito parcial para optar por el grado de Magister Scientiae en Manejo y Protección de los Recursos Naturales con énfasis en Gestión de la Biodiversidad.

______XXXXXXXXXX Representante Director del Sistema de Estudios de Postgrado

______XXXXXXXXXXX Representante Director de la Escuela de Ciencias Exactas y Naturales

______Zaidett Barrientos Llosa, Ph.D. Coordinadora Programa de Maestría en Manejo de los Recursos Naturales

______Germán Rivera Coto, M. Sc. Director de Tesis

______Roberto Cordero Solórzano, Ph.D Lector de tesis

______Amelia Paniagua Vásquez, M. Sc. Lector de tesis

Dedicatoria

A mis padres Bernal Azofeifa Sandí y Ana Margarita Bolaños Esquivel

Agradecimientos

Al Instituto de Investigación y Servicios Forestales de la Universidad Nacional de Costa Rica por ser parte de su personal académico durante el periodo 2008-2016. A la UNED, porque el programa de enseñanza andragógica me hizo ordenado en el estudio y potenció mi capacidad productiva. A mi director de tesis, Germán Rivera Coto, por su gran profesionalismo, conocimiento y gran ayuda durante la investigación y escritura de la tesis. A mi jefa inmediata y compañera de trabajo Amelia Paniagua Vásquez por permitirme trabajar junto a ella durante los últimos siete años. A Roberto Cordero Solórzano por aceptar ser parte de mi tribunal examinador y por sus valiosos aportes para mejorar la calidad del manuscrito. A José Antonio García García por sus consejos profesionales y apoyo en momentos claves del proceso. A Michel Grisoni del CIRAD-Francia por confiar en mi trabajo como profesional y por apoyarme incondicionalmente en los estudios de vainilla de Costa Rica. A todas las personas comprometidas con el manejo de esta maravillosa especie.

INDICE

RESUMEN GENERAL ...... 9 ABSTRACT ...... 10 INTRODUCCIÓN GENERAL ...... 11 CAPITULO I ...... 20 A new vanilla species from Costa Rica closely related to V. planifolia (Orchidaceae) ...... 20 Abstract ...... 20 Introduction ...... 20 Material and methods ...... 21 Plant and DNA samples ...... 21 Morphological traits ...... 22 DNA extraction and sequencing ...... 27 Data analysis ...... 28 Results ...... 28 Field observations ...... 28 Phylogenetic analysis ...... 34 Morphology of vegetative and reproductive organs of VanL ...... 34 Aromatic content of mature fruits ...... 39 Taxonomy ...... 41 Diagnosis ...... 41 Etymology ...... 41 Type material ...... 41 Holotype ...... 42 Paratypes ...... 42 Description ...... 42 Phenology ...... 43 IUCN status –Vulnerable ...... 43 Discussion ...... 45 Acknowledgements ...... 46 References...... 47 CAPITULO II ...... 52 Efecto de la desinfección de segmentos nodales sobre el rendimiento morfogenético de vitroplantas de Vanilla planifolia Andrews ...... 52 RESUMEN ...... 52 ABSTRACT ...... 53 INTRODUCCIÓN ...... 53 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 55 Fase de establecimiento ...... 55 Fase de multiplicación ...... 57 Ensayo fitopatológico ...... 57 Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) ...... 58 RESULTADOS ...... 58 DISCUSIÓN ...... 68 CONCLUSIONES ...... 73 AGRADECIMIENTOS ...... 74

LITERATURA CITADA ...... 74 CAPITULO III ...... 78 Respuestas morfogenéticas de plantas in vitro y esquejes de Vanilla planifolia Andrews (Orchidaceae) durante el desarrollo inicial del cultivo en vivero y en sistemas agroforestales ...... 78 ABSTRACT ...... 78 RESUMEN ...... 79 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 80 RESULTADOS ...... 83 DISCUSIÓN ...... 85 AGRADECIMIENTOS ...... 88 REFERENCIAS...... 88 CAPITULO IV ...... 91 Efecto de la selección cualitativa del esqueje sobre la sobrevivencia y desarrollo morfogenético en invernadero de Vanilla planifolia Andrews procedente de poblaciones silvestres ...... 91 RESUMEN ...... 91 ABSTRACT ...... 92 INTRODUCCIÓN ...... 92 CONCLUSIONES ...... 99 AGRADECIMIENTOS ...... 99 LITERATURA CITADA ...... 99 CAPÍTULO V ...... 101 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 101 CONCLUSIONES ...... 101 RECOMENDACIONES ...... 102 ANEXOS ...... 104 ANEXO 1: Datos crudos del efecto de la selección cualitativa del esqueje sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante el desarrollo inicial del cultivo en vivero ...... 104 ANEXO 2: Características morfológicas, culturales, bioquímicas y fisiológicas de los aislados fúngicos y bacterianos del ensayo de desinfección de dos fases ...106 ANEXO 3: Codificación binaria para el análisis de regresión logística de la contaminación presente en los aislados totales, fúngicos y bacterianos del ensayo de desinfección de dos fases ...... 107 ANEXO 4. Datos crudos del efecto de la desinfección de doble fase sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante el establecimiento in vitro...... 110 ANEXO 5: Datos crudos del efecto de la desinfección de doble fase sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante la multiplicación in vitro...... 112 ANEXO 6: Datos crudos del efecto de la condición y el tipo de explante sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante el desarrollo inicial del cultivo en vivero y en sistemas agroforestales ...... 117

Respuestas morfogenéticas de plántulas in vitro y esquejes de Vanilla planifolia Andrews provenientes de poblaciones silvestres, caracterizadas molecularmente y cultivadas en invernadero y en Sistemas Agroforestales, Guápiles, Costa Rica

José Bernal Azofeifa Bolaños Maestría en Manejo de Recursos Naturales, UNED. Instituto de Investigación y Servicios Forestales, Universidad Nacional de Costa Rica; [email protected]

RESUMEN GENERAL Comercialmente Vanilla planifolia es la especie de orquídea más importante del mundo y la segunda especia más cara después del azafrán, motivo por el cual las poblaciones silvestres y cultivadas se han reducido en términos de cantidad y calidad genética. Costa Rica está dentro del ámbito de distribución natural de la especie, presenta poblaciones silvestres con contenidos de compuestos aromáticos que exceden las normas internacionales y es el país con la mayor diversidad de vainillas en Mesoamérica. Sin embargo, no existe suficiente soporte tecnológico para su cultivo. Por lo tanto, este trabajo generó datos de forma sistemática para conocer aspectos morfogenéticos en laboratorio, invernadero y campo, con individuos procedentes de poblaciones silvestres a través de una investigación en cuatro fases. La primera consistió en la caracterización del material silvestre mediante descriptores morfológicos y moleculares para asegurar homogeneidad genética y verificar que se trató de la especie correcta. Gracias a ello, se descubrió una especie cercana pero distinta de V. planifolia (V. sotoarenasii) que crece en simpatría en el caribe costarricense. Este nuevo genotipo se distinguió de otras especies del grupo planifolia por una reducción de 30% en el tamaño de las flores y frutos, una divergencia en las secuencias nucleares del espaciador transcrito interno (ITS) en al menos dos nucleótidos, por la presencia de compuestos anisílicos y por bajos contenidos de compuestos fenólicos en los frutos (incluido vainillina). Además, se confirmó la extensión del área de distribución de V. planifolia hacia el sur de Costa Rica. En la segunda fase, se evaluó la capacidad de adaptación y la calidad fitosanitaria de los individuos silvestres en condiciones de vivero. El objetivo de este procedimiento fue la obtención de plantas homogéneas en cuanto a peso y longitud para los ensayos subsecuentes. Las plantas que fueron seleccionadas por su buena condición fitosanitaria, vigorosidad y ausencia de daño mecánico sobrevivieron mejor y mostraron las respuestas morfogenéticas más altas para las variables peso, longitud y número de entrenudos del brote nuevo; peso y número de raíces totales y el número de entrenudos del explante inicial. En la tercera fase, se evaluó el efecto de la doble desinfección (invernadero y laboratorio) sobre la respuesta morfogenética de segmentos nodales durante el establecimiento y multiplicación in vitro. Se concluyó que un pre tratamiento con kilol y la aplicación de HgCl2 en laboratorio fue el método de esterilización más eficiente para reducir la carga microbiológica en su totalidad y aumentar de forma significativa la respuesta morfogenética de plantas silvestres durante el establecimiento y multiplicación en laboratorio. En la cuarta fase de la investigación, se comparó el efecto de la procedencia del explante (esqueje y plántula in vitro) sobre la respuesta morfogenética durante el desarrollo inicial en condiciones de vivero y en un sistema agroforestal. Se determinó, por vez primera, que las vitroplantas procedentes de la fase tres y cultivadas en un sistema agroforestal, desarrollan características agronómicas superiores para las variables longitud del brote, número de entrenudos y

número de raíces en relación con los esquejes cultivados y procedentes de la fase dos en ambas condiciones, así como, las vitroplantas cultivadas en vivero; mientras los esquejes cultivados en vivero presentaron los valores más altos para las variables longitud y peso de las raíces. Los resultados pioneros de esta investigación en Costa Rica reflejan la necesidad de promover investigaciones relacionadas con el tipo y tamaño adecuado del explante, la nutrición óptima en vivero y las condiciones microambientales idóneas para el establecimiento de plantaciones comerciales de calidad.

ABSTRACT Vanilla planifolia is the most economically important orchid species in the world, and the second most profitable after saffron, that is the reason why wild and cultivated populations have been reduced in terms of quantity and genetic quality. Costa Rica is within the natural distribution area of the species, and has wild populations with contents of aromatic compounds exceeding the international standards and is the country with the greatest diversity of Vanilla in Mesoamerica. However, there is not enough technical background for its cultivation. Therefore, this research has generated data in a systematic way to know morphogenetic responses in laboratory, greenhouse and field of individuals from wild populations by working in four phases. In the first one, a characterization of wild material was done by morphological and molecular descriptors to ensure genetic homogeneity and total certainty that the correct species was used. We discovered a new species closely related but significantly distinct from V. planifolia (V. sotoarenasii) growing in sympatry in the Caribbean coast of Costa Rica. It is especially distinguished from V. planifolia by a reduction of about 30% of the size of the fruits and flowers, by a divergence of the nuclear nucleotide sequences of the Internal Transcribed Spacer (ITS) for at least two species- conserved nucleotides compared to seven other species of the V. planifolia group, and by the presence of anisic compounds and low content of phenolic compounds (including vanillin) in the fruits. In addition, the extension of the area of distribution of V. planifolia southward to Costa Rica, where a recent speciation process occurred, was confirmed. In the second phase, the adaptative capacity and phytosanitary quality of wild individuals, were evaluated under nursery conditions. The objective of this procedure was to obtain homogeneous plants in terms of weight and length for subsequent assays. The selected plants for their good phytosanitary condition, vigorousness and no mechanical damage survived better and showed the highest morphogenetic responses for the variables weight, length and number of internodes of the new shoot; weight and number of total roots and the number of internodes of the initial cutting. In the third phase, the effect of a double‒ disinfection process (greenhouse and laboratory) on the morphogenetic response of nodal segments of Vanilla planifolia during the establishment and multiplication in the culture medium Murashige and Skoog (MS) was evaluated. The best disinfection treatment was obtained with the use of kilol in the nursery and HgCl2 in the laboratory, where 100% pathogen‒free explants and the best morphogenetic responses of wild plants during the establishment and multiplication in laboratory were obtained. In the fourth phase of the research the effect of the plant type (cutting and micro cutting) on the morphogenetic response during the initial development in nursery conditions and in an agroforestry system was compared. It was determined, for the first time, that micro cuttings from stage three and cultivated in an agroforestry system, presented superior agronomic characteristics for the variables shoot length, number of internodes and number of roots in relation to the cuttings cultivated and coming from the phase two in both conditions, as well as micro cuttings growing in nursery; while the cuttings in nursery had the highest values for the variables length and weight of the roots. The pioneering results of this investigation in Costa Rica reflect the need of research related to the type and size of the

explant, optimum nutrition in the nursery and microenvironmental conditions suitable for the establishment of quality commercial plantations.

INTRODUCCIÓN GENERAL El género Vanilla Mill. pertenece a la familia Orchidaceae, subfamilia Vanilloideae, tribu Vanilleae y subtribu Vanillinae (Cameron, 2010). El género se divide en los subgéneros Vanilla y Xanata y, este último, en las secciones Xanata y Tethya (Soto-Arenas y Cribb, 2010). El primero incluye las vainillas americanas y el segundo las del viejo mundo y del caribe (Bouetard et al., 2010). La cantidad de especies descritas dentro del género no está clara aún. Soto y Dressler (2010) y Arditti et al. (2009) reportan 107 especies; Soto y Cribb (2010), 106 especies; Cameron y Chase (1999), 90 especies; The International Plant Names Index, 188 especies (Bory, Grisoni, Duval, y Besse, 2008). No obstante, a pesar de estas inconsistencias la clasificación más estudiada es la de 110 especies propuesta por Portères en 1954 (Besse et al., 2004; Bory, Brown, Duval, y Besse, 2010; Bory et al., 2008a; Gigant, Bory, Grisoni, y Besse, 2011; Pignal, 2010). El género se distribuye naturalmente en las regiones tropicales de todos los continentes, excepto en Australia (Bory et al., 2008). Costa Rica posee la mayor diversidad de especies de vainilla en Mesoamérica al registrar 11 de las 18 que existen en México y Centroamérica. El acervo genético está conformado por V. costaricensis Soto Arenas, V. dressleri Soto Arenas, V. hartii Rolfe, V. helleri A.D. Hawkes, V. inodora Schiede, V. odorata C. Presl, V. planifolia Andrews, V. pompona Schiede, V. sarapiquensis Soto Arenas, V. sotoarenasii M. Pignal, Azof.-Bolaños & Grisoni y V. trigonocarpa Hoehne. (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). Las especies V. planifolia, V. × tahitensis y V. pompona son las únicas fuentes de vainilla natural en el mundo, sin embargo el 95% de la producción mundial se obtiene de los frutos procesados de la especie V. planifolia (Bory et al., 2008; Divakaran, Babu, y Peter, 2006; Lubinsky, Bory, Hernández-Hernández, Seung-Chul, y Gómez-Pompa, 2008; Sujatha y Bhat, 2010), lo cual la convierte, en términos económicos, en la orquídea más importante del mundo y la segunda especia más cara después del azafrán (Havkin- Frenkel y Belanger, 2007). V. × tahitensis y V. pompona son cultivadas en menor escala (Soto 2006, Soto y Dressler 2010). El cultivo comercial de V. planifolia tiene como objetivo la obtención de los frutos (cápsulas) como materia prima para la extracción de la vainillina, compuesto fenólico que brinda el aroma y sabor más popular en el mundo (Chandran y Puthur, 2009; Geetha y Shetty, 2000; George y Ravishankar, 1997; Giridhar y Ravishankar, 2004; Gonzalez- Arnao et al., 2009; Hailemichael, Tilahun, Kifelw, y Mitiku, 2012; Havkin-Frenkel y Belanger, 2007; Janarthanam y Seshadri, 2008; Kalimuthu, Senthilkumar, y Murugalatha, 2006; Pak, Gropper, Dai, Havkin-Frenkel, y Belanger, 2004; Tan, Chin, y Alderson, 2010). Éste, es el componente principal de las cápsulas fermentadas de los más de 250 compuestos diferentes hallados durante el proceso de beneficiado (Havkin-Frenkel y Belanger, 2007; Pak et al., 2004; Sharp, Kocaoglu-Vurma, Langford, Rodriguez-Saona, y Harper, 2012; Sinha, Sharma, y Sharma, 2008). La vainillina se utiliza en la industria alimenticia para dar sabor a muchas bebidas, platos dulces, galletas, pasteles, salsas dulces y helados (Chandran y Puthur 2009), chocolates, condimentos, oleorresinas e industrias de perfumería (Malabadi y Nataraja 2007). También, se le atribuye efectos antibacterianos, antioxidantes, antimutagénicos, anticlastogénicos, anticarcinogénicos, hipolipemiantes, insecticidas, entre muchos otros (Korthou y Verpoorte, 2007; Sinha et al., 2008). Aunque V. planifolia es sin duda, la especie de mayor importancia económica, es relevante puntualizar su rol en los campos ecológico y social dentro de las regiones productoras. En primer lugar, ecológico, dado que sus parientes silvestres reflejan el

estado de salud de los bosques (Osorio, 2012), además, las plantaciones de vainilla comparadas con cultivos anuales y zonas de pastoreo, son agrosistemas forestales con presencia de especies arbóreas perennes y una estructura de vegetación compleja que permite mantener la biodiversidad original, incluyendo hábitats especializados para animales arbóreos (Soto-Arenas y Solano-Gómez, 2007); también los mismos autores, sugieren que las extensiones de los vainillales pueden tener efectos en el mantenimiento de los ciclos biogeoquímicos. En segundo lugar, desde el punto de vista social, el cultivo puede utilizar mano de obra familiar, pues no se requiere grandes extensiones de terreno para obtener altos ingresos económicos (Ramírez, Rapidel, y Mattey, 1999). Si la experiencia de manejo es exitosa, la incorporación del componente turístico podría ser una opción más para la diversificación de las actividades de la finca, por lo cual la viabilidad de desarrollo del cultivo por parte de familias pequeñas y de escasos recursos convierte a esta especie en una alternativa de agricultura sustentable. La distribución natural de V. planifolia comprende países como México, Guatemala, Belice, Honduras, Costa Rica y Panamá (Gigant et al., 2011; Havkin-Frenkel y Belanger, 2007; Homma, Amorim de Menezes, y Bandeira de Matos, 2006; Soto y Cribb, 2010; Soto y Dressler, 2010). Lo anterior, muestra la importancia de la región como fuente natural de variación genética. A pesar de ello, las poblaciones naturales se encuentran en peligro crítico de extinción, porque el número de individuos encontrados es mucho menor que la cantidad mínima recomendada para el mantenimiento de poblaciones viables (Soto- Arenas, 1999; Soto, 2006). Esta situación, es ocasionada por la deforestación, colectas excesivas para el establecimiento de nuevas plantaciones, inadecuados manejos del cultivo (Bory et al., 2008), cambios climáticos, enfermedades en monocultivos que ocasionan la pérdida total de las plantaciones (Divakaran et al., 2006) y la falta de esfuerzos de conservación (Verma et al., 2009). La vainilla es una orquídea de crecimiento epífito conformada por un tallo cilíndrico dispuesto por entrenudos que son las zonas de crecimiento meristemático axilar, de donde surgen las hojas, las inflorescencias en forma de racimo y las raíces adventicias o laterales, que dan soporte y ayudan en la absorción de nutrientes (Tapia 2011, Kelso- Bucio et al. 2012). En los trópicos crece desde los 0 hasta los 1500 m.s.n.m. (Anilkumar, 2004). En Costa Rica, la altitud mayor para una especie de vainilla (V. pompona) se localizó a 1064 m en la Zona Protectora El Rodeo. La temperatura óptima de crecimiento varía entre 20 a 32°C (Osorio, 2012). La precipitación ideal para un adecuado crecimiento es de 1500-3000 mm anuales (Correia, Janes, Rola-Rubzen, Freitas, y Gomes, 2009) con una estación seca para favorecer la floración y la cosecha. La planta requiere suelos sueltos, friables y bien drenados (Anilkumar 2004, León 2005, Medina et al. 2009), ricos en materia orgánica (Anilkumar, 2004; Medina et al., 2009), valores de pH entre 5,5 y 7 (León 2005, Medina et al. 2009), buenos contenidos de Calcio (Ca) y Potasio (K) (León, 2005), no resiste anegamientos y necesita sombra parcial para un adecuado crecimiento. Tales características hacen posible su introducción en otros sistemas de cultivo de los trópicos cálidos y húmedos (Anilkumar, 2004). Los requerimientos generales para el cultivo de vainilla permiten su implementación en diversas regiones agroclimáticas del país. Además, este cultivo representa una alternativa económica y ecológicamente adecuada para el modelo de desarrollo de conservación del patrimonio natural y de crecimiento económico impulsado por el gobierno de Costa Rica (MIDEPLAN, 2014). A pesar del incremento mundial en área cosechada y producción (toneladas) durante el periodo 1961-2014, el rendimiento por hectárea muestra una tendencia a la baja (FAO STAT, 2017). Al respecto, Soto (2006), argumenta que en México, las plantaciones son rústicas y con producciones por plantación muy bajas, si se compara con los altos rendimientos que se obtendrían con plantaciones modernas y tecnificadas.

En Costa Rica, la situación fue muy similar, las tecnologías utilizadas para el crecimiento de V. planifolia fueron de carácter tradicional, con rendimientos bajos y altos costos de producción. Las principales causas de tal problema fueron: cosechas pobres, carencia de cultivares mejorados, irregularidad en la siembra, problemas fitosanitarios, sitios de siembra no adecuados, así como carencia de capacitación oportuna y de calidad (Acuña, 2009). Las pequeñas plantaciones comerciales existentes en la actualidad, son de un híbrido entre V. planifolia y V. pompona, el cual cuenta con facilidades de manejo agronómico y mayor resistencia a Fusarium oxysporum. Pero, con la desventaja de no poder exportarse a Estados Unidos, el principal consumidor mundial. La razón de esta limitante se debe al código de regulación federal (21 CFR169) que impuso un estándar de identidad para V. planifolia y V. × tahitensis (FDA, 2016), lo que impide el trasiego de otras especies, incluso con importancia comercial (ejm: V. pompona, híbridos, otras). Ante la necesidad de conciliar aspectos productivos con la conservación y conocimiento de los recursos genéticos de vainilla, en el 2012 se inició un proyecto de conservación en todo el país a cargo de la Universidad Nacional de Costa Rica (Azofeifa-Bolaños, Paniagua-Vásquez, y García-García, 2014). Antes de esta iniciativa, la propuesta más importante relacionada con la conservación de germoplasma se desarrolló en el CATIE durante la década de los ochenta y noventa. Sin embargo, la falta de recursos económicos para el mantenimiento y el cambio hacia la investigación en otros cultivos acabó con esos materiales, en especial, por problemas fitosanitarios (Astorga, comunicación personal, 2013). En la actualidad, la colección ex situ de vainilla recolectada en Costa Rica está constituida por aproximadamente 150 accesiones con escasa documentación morfológica y molecular; de esta colección inicial, varias han muerto por causas bióticas (enfermedades) o por la pobre adaptación a las nuevas condiciones ambientales de luz, temperatura, humedad y suelo, entre otras. La crítica situación de los recursos fitogenéticos de vainilla en Mesoamérica, motivó al botánico mexicano Miguel Ángel Soto Arenas a buscar por más de 20 años parientes silvestres de V. planifolia. En sus exploraciones, solo halló alrededor de 30 especímenes silvestres genuinos en México, que se encontraban en peligro de desaparecer por los incendios de 1998, la colecta excesiva de plantas silvestres, el abandono de plantaciones establecidas con plantas silvestres, la fragmentación del hábitat y por el asocio a zonas de alta población (Bory et al., 2008; Soto-Arenas y Solano-Gómez, 2007; Soto-Arenas, 1999). Los esfuerzos subsecuentes por encontrar nuevos parientes silvestres se detallan en este trabajo. Como consecuencia de la búsqueda de poblaciones naturales de V. planifolia en Costa Rica, una nueva especie endémica en la región caribe, fue colectada e identificada, para su conservación. La nueva especie es poseedora de muchos caracteres deseables para programas de mejora genética en el ámbito mundial: contenido aromático único que combina vainillina y anís, resitencia a Fusarium oxysporum f. sp. radicis-vanillae (principal enfermedad del cultivo en todos los continentes), indehiscencia de la cápsula en la madurez, floración temprana y mayor éxito reproductivo (alta producción de frutos), entre otros (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). Para poder incorporar este germoplasma nativo en futuras plantaciones comerciales, es prioritario, conservar el material y después, conocer el potencial agronómico a través de ensayos de laboratorio, vivero y campo. Este material encontrado en Costa Rica, es fundamental para el desarrollo de programas de mejoramiento que permitan incrementar la base genética del cultivo. Varias investigaciones sugieren que la reducida diversidad de genes en las plantaciones es la causa principal de la baja tolerancia a factores bióticos y abióticos adversos, lo cual ha ocasionado pérdidas significativas del rendimiento en todas las regiones productoras. Además, los problemas de manejo cultural como el estricto régimen de propagación

asexual de unos pocos clones y la autofecundación sucesiva que ocasiona depresión consanguínea, agravan la problemática. Para mejorar la tolerancia de los cultivares comerciales y reducir las pérdidas en la producción, las especies silvestres y los parientes cercanos deben caracterizarse de forma genética para el uso futuro de ese germoplasma en programas de mejora (Iglesias-Andreu et al., 2014; Ramos-Castellá et al., 2016).

Los primeros resultados sobre la domesticación inicial indicaron que una selección de forma cualitativa de los esquejes es necesaria para aumentar la sobrevivencia del explante y las respuestas morfogenéticas en condiciones de vivero. Ante la extrema rareza de hallar parientes silvestres de vainilla, este trabajo representa el primer eslabón y la línea base para el manejo morfoagronómico inicial de este tipo de germoplasma. Durante los últimos años, la biotecnología se ha convertido en una herramienta complementaria para la conservación de vainilla, en contraposición a los elevados costos de los sistemas tradicionales de conservación que limitan el número de accesiones, con posibilidades reales para preservarse (Divakaran et al., 2006). Además, a través de técnicas biotecnológicas que utilizan enfoques moleculares, la taxonomía de las plantas se mejoró al permitir clasificaciones confiables basadas en la genealogía (Besse, 2014). En particular, en la última década, la secuenciación de ADN nuclear, mitocondrial y cloroplástico permitió estudiar la diversidad genética de las plantas y definir con exactitud posiciones taxonómicas en todas las familias de plantas, incluido el difícil grupo de las orquídeas vainilloides (Soto y Dressler, 2010). Para una estrategia integral de conservación en Costa Rica, caracterizar los recursos genéticos y salvaguardarlos en un banco de germoplasma in vitro es esencial; en primer lugar, para perpetuar genotipos valiosos de V. planifolia y, en segundo, para multiplicar de forma masiva dicho material para su posterior uso en unidades productivas. Las técnicas de cultivo de tejidos permiten propagar la especie mediante explantes: brotes apicales, segmentos nodales, yemas axilares (Hailemichael et al., 2012), masas de callo, protocormos, segmentos radiculares (George y Ravishankar 1997, Giridhar y Ravishankar 2004), segmentos de hojas (Tan et al., 2010). Sin embargo, para lograr el establecimiento inicial, es necesario optimizar un protocolo de desinfección que garantice la supervivencia de accesiones únicas, escasas o difíciles de establecer de forma vegetativa en vivero, como es el caso de poblaciones silvestres en peligro de extinción (Azofeifa-Bolaños et al., 2014). Al respecto, es importante señalar que en Costa Rica los protocolos de desinfección clásicos que utilizan diversas concentraciones de hipoclorito de calcio [Ca(ClO)2], hipoclorito de sodio (NaClO), alcohol y otros no han logrado la asepsia adecuada para el establecimiento in vitro de vainilla (datos no mostrados), lo cual implica una pérdida constante de material genético promisorio, además de comprometer la supervivencia y calidad fitosanitaria de las plantas madre en vivero. En esta investigación se demostró la eficacia de un protocolo de doble desinfección (vivero y laboratorio) para generar explantes libres de contaminantes y respuestas morfogenéticas superiores durante el establecimiento y multiplicación en contraste con otros protocolos similares. Por su parte, la propagación tradicional a partir de esquejes obtenidos de plantas maduras (Geetha y Shetty 2000, Tan et al. 2010, Hailemichael et al. 2012), es un método ineficiente (Giridhar y Ravishankar 2004), lento, con alta demanda de mano de obra y tiempo; y además, antieconómico, pues la obtención de los esquejes para la propagación limita el crecimiento y desarrollo de la planta madre (Geetha y Shetty 2000, Kalimuthu et al. 2006, Janarthanam y Seshadri 2008, Acuña 2009, Palama et al. 2010, Tan et al. 2010, Hailemichael et al. 2012). Por otro lado, la demanda mundial de propágulos difícilmente puede ser abastecida mediante esquejes provenientes de plantas maduras (Hailemichael et al. 2012, Geetha y Shetty 2000). Lo anterior, hace que las técnicas biotecnológicas de

cultivo de tejidos se conviertan en una herramienta adecuada para multiplicar eficazmente y suministrar las cantidades requeridas de materiales sanos y vigorosos para la plantación a gran escala (Hailemichael et al., 2012; Iglesias-Andreu et al., 2014). Además de la ventaja que este tipo de material ofrece, al posibilitar el intercambio seguro de muestras, aún con países poseedores de regulaciones fitosanitarias muy exigentes (Sánchez- Chiang y Jiménez 2010). En particular, facilita el suministro y certificación de plantas libres de virus, por lo que es más factible cumplir con las obligaciones de la Convención Internacional de Protección Fitosanitaria (CIPF) (https://www.ippc.int/es/) para cualquier transferencia de material vegetal entre países (Richard et al., 2009; Roux-Cuvelier y Grisoni, 2010). Sin embargo, las bondades de los protocolos del cultivo de tejidos que menciona la literatura no evalúan el desempeño de las plantas en invernadero y mucho menos en campo. Es común encontrar trabajos científicos que indican la vigorosidad en las plantas, como medida de la calidad de la investigación, sin embargo, se suelen mencionar variantes cualitativas que omiten la mención y el establecimiento de ensayos que muestren las diferencias cuantitativas. El punto débil del cultivo de tejidos vegetales consiste, precisamente, en el paso de las plantas de un ambiente autotrófico (in vitro) a uno heterotrófico (ex vitro). Los porcentajes de mortalidad en este paso son elevados y la mayoría de las publicaciones científicas quedan a nivel de laboratorio. El logro de protocolos completos para plantas procedentes de cultivo in vitro, que cuantifiquen los porcentajes de supervivencia y vigorosidad, tanto en invernadero como en campo, es un reto para la biotecnología agrícola. Esta investigación es pionera en este campo y pretende aportar elementos fundamentales para el logro de un cultivo tecnificado de V. planifolia en Costa Rica, por varias razones. En primer lugar, porque se conoce de forma previa el contenido de vainillina (en frutos fermentados) del material que será objeto de estudio. En segundo, porque se establecerán poblaciones ex situ en laboratorio, invernadero y campo de la población silvestre donante. Y tercero, porque hasta la fecha no hay trabajos concluyentes que determinen si las plantas provenientes del cultivo in vitro presentan características agronómicas superiores (rasgos anatómicos, fisiológicos, fitopatológicos, entre otros) con respecto a las plantas procedentes de esquejes de plantas maduras durante el establecimiento inicial.

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CAPITULO I

A new vanilla species from Costa Rica closely related to V. planifolia (Orchidaceae)

José Bernal Azofeifa Bolaños Maestría en Manejo de Recursos Naturales, UNED. Instituto de Investigación y Servicios Forestales, Universidad Nacional de Costa Rica, Heredia, Costa Rica; [email protected] (Este artículo fue publicado y debe ser citado como: Azofeifa-Bolaños J.B., Gigant L.R., Nicolás-García M., Pignal M., Tavares-González F.B., Hágsater E., SalazarChávez G.A., Reyes-López D., Archila-Morales F.L., García-García J.A., da Silva D., Allibert A., Solano-Campos F., Rodríguez-Jimenes G.d.C., Paniagua- Vásquez A., Besse P., Pérez-Silva A. & Grisoni M. 2017. A new vanilla species from Costa Rica closely related to V. planifolia (Orchidaceae). European Journal of Taxonomy 284: 1– 26. http://dx.doi.org/10.5852/ejt.2017.284)

Abstract We describe a new vanilla species growing in sympatry with Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews (Orchidaceae) in the province of Limón, Caribbean coast of Costa Rica. The morphology of the reproductive and vegetative organs observed on vines cultivated under shade-house, the nuclear (Internal Transcribed Spacer) and plastid (matK) nucleotide sequences, as well as the contents of aromatic compounds measured in ripe fruits, show that this species is close to but distinct from V. planifolia. The name V. sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. is proposed for this new Vanilla species endemic in Costa Rica. It is especially distinguished from V. planifolia by a reduction of about 30% of the size of the fruits and flowers, by a divergence of ITS sequences for at least two species-conserved nucleotides compared to seven other species of the V. planifolia group, and by the presence of anisic compounds and low content of phenolic compounds (including vanillin) in the fruits. These results confirmed the extension of the area of distribution of V. planifolia southward to Costa Rica, where a recent speciation process occurred. Because of its particular agronomic and aromatic properties, V. sotoarenasii sp. nov. could represent a valuable biological resource for the vanilla industry.

Keywords. Barcoding, Costa Rica, Limón, radiation, Vanilla planifolia, V. sotoarenasii.

Azofeifa-Bolaños J.B., Gigant L.R., Nicolás-García M., Pignal M., Tavares-González F.B., Hágsater E., Salazar- Chávez G.A., Reyes-López D., Archila-Morales F.L., García-García J.A., da Silva D., Allibert A., Solano-Campos F., Rodríguez-Jimenes G.d.C., Paniagua- Vásquez A., Besse P., Pérez-Silva A. & Grisoni M. 2017. A new vanilla species from Costa Rica closely related to V. planifolia (Orchidaceae). European Journal of Taxonomy 284: 1– 26. http://dx.doi.org/10.5852/ejt.2017.284

Introduction

The Vanilla genus, Vanilla Plum. ex Miller (Miller 1754), belongs to the subfamily Vanilloideae, tribe Vanillinae (Cameron 2010). It is an ancient group of tropical orchids that originated in America about 70 million years ago and differentiated in America, Africa and Asia (Ramírez et al. 2007; Bouétard et al. 2010). The classification of the species of Vanilla was recently reviewed by Soto Arenas & Cribb (2010), who divided the genus into two subgenera, Vanilla and Xanata Soto Arenas & P.J.Cribb, and further split the subgenus Xanata into two sections Xanata and Tethya Soto Arenas & P.J.Cribb. Currently, about 110 Vanilla species are reported and clustered into 20 groups (Portères 1954; Soto Arenas & Cribb 2010; Cameron 2011; Pansarin et al. 2012). The V. planifolia group is the most important by the number of species (16) and, economically, because it contains the commercial species V. planifolia Jacks. ex Andrews (Andrews 1808) and V. × tahitensis J.W.Moore (Moore 1933), the aromatic fruits of which provide the vanilla flavor used by the food and perfumes industries. The taxonomy of the species from Mexico and Central America was reviewed by Soto Arenas & Dressler (2010) based on their morphology and Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA sequences. Recently, two new species have been described in the region, V. esquipulensis Archila & Chiron (Archila & Chiron 2012) in Guatemala and V. rivasii Molineros, Rob.González, Flanagan & J.T.Otero (Molineros-Hurtado et al. 2014) in Chocó, northern Colombia, plus two more in French Guiana, V. inornata Sambin & Chiron (Sambin & Chiron 2015) and V. aspericaulis Sambin & Chiron (Sambin & Chiron 2015). Ten out of the 17 species recorded in Mexico and Central America have been reported in Costa Rica (Soto Arenas & Dressler 2010), namely: V. costaricensis Soto Arenas (Soto Arenas & Dressler 2010), V. dressleri Soto Arenas (Soto Arenas & Dressler 2010), V. hartii Rolfe (Rolfe 1899), V. helleri A.D.Hawkes (Heller & Hawkes 1966), V. inodora Schiede (Schiede 1829), V. odorata C.Presl (Presl 1827), V. planifolia, V. pompona Schiede (Schiede 1829), V. sarapiquensis Soto Arenas (Soto Arenas & Dressler 2010) and V. trigonocarpa Hoehne (Hoehne 1944). During surveys carried out in Costa Rica since 2012 (Azofeifa-Bolaños et al. 2014) abundant populations of vanilla which did not fit any species previously described in the country were observed in Limón Province (Caribbean coast of Costa Rica). This vanilla, called “vanilla Limón” (VanL), had strong morphological similarities with a vanilla accession collected in Cahuita (Limón, Costa Rica) in 1993, referenced Pignal 396b (P00075132) in the herbarium of the Muséum national d’Histoire naturelle in Paris, P (herbarium acronym following Thiers continuously updated). Living specimens of this accession were preserved in the Emmanuel Liais Park (Cherbourg-en-Cotentin, France) under accession number CH554, and subsequently in the Biological Resources Centre (BRC) Vatel (Saint Pierre, La Réunion) under accession number CR0068, and were tentatively classified as V. aff. planifolia. Molecular approaches have enhanced plant taxonomy by allowing reliable genealogy- based classifications (Besse 2014). In the last decade, nuclear, mitochondrial and chloroplastic DNA sequencing has been used to study plant diversity and resolve taxonomic positions in all plant families, including the puzzling group of vanilloid orchids (Cameron 2009, 2010; Soto Arenas & Dressler 2010). The aim of this study was to investigate the taxonomic status of VanL by using complementary approaches involving morphology of reproductive and vegetative organs, molecular barcoding and secondary metabolite accumulation in fruits.

Material and methods

Plant and DNA samples

The plant samples used in this study were obtained from field surveys carried out in Costa Rica, Mexico and Guatemala, supplemented with lyophilized plant materials preserved in the Mexican National Collection (Reyes-López et al. 2014), the BRC Vatel (Roux-Cuvelier & Grisoni 2010), and DNA from the herbarium of the Instituto Chinoin, AMO (Thiers continuously updated). The survey in Costa Rica was conducted between November 2012 and March 2016 in the entire country. Prospections were targeted on areas where vanilla were recorded based on herbarium specimen information and consulting orchid experts, local guides, and earlier project experiences, among others. The material was collected according to permit number 061-2013 issued on 12 Jun. 2013 by National System of Conservation Areas (SINAC) of the Ministry of Environment and Energy (MINAE). All plant and DNA samples analyzed in this study are listed in Table 1.

Morphological traits

To compare the morphology of vegetative and reproductive organs of VanL to those of V. planifolia, the following traits were measured on plants cultivated in controlled conditions in BRC Vatel in La Réunion: length and greater width of the third and fourth leaves, diameter and length of the third inter-node, length and width of the tube, length of the ovary, length and width of the dorsal sepal. Measurements were carried out on two to six plants per accession grown under shade-house in November, which is the optimum vegetative growth and flowering period in La Réunion. From 14 to 30 fresh organs were measured per accession according to the availability of material. Length and weight of fruits were also measured at maturity (in July). We used the experimental tool “collaboratoire” of the national French infrastructure e-ReColNat (ANR-11-INBS-0004) for specimen comparisons.

Table 1. Identification and origin of the accessions of species of Vanilla Plum. ex Miller used in this study. [continued on next 3 pages] Code Species Country of origin Depository Locus Code in collection / voucher bahi0071 V. bahiana Brazil VATEL matK CR0071 bahi0086 V. bahiana Brazil VATEL ITS & matK CR0086 bahi0098 V. bahiana Brazil VATEL ITS CR0098 bahi0099 V. bahiana Brazil VATEL ITS & matK CR0099 bahi0668 V. bahiana Brazil VATEL matK CR0668 caly-01 V. calyculata Honduras UNAM ITS Linares_3386 cham0666 V. chamissonis Brazil VATEL ITS & matK CR0666 crib0109 V. cribbiana French Guyana VATEL ITS & matK CR0109 crib0122 V. cribbiana French Guyana VATEL matK CR0122 cribb-01 V. cribbiana Mexico UNAM ITS Soto_7940 cribb-02 V. cribbiana Mexico UNAM ITS Soto8439(nueva) cribb-03 V. cribbiana Mexico UNAM ITS Soto_8370 dres-01 V. dressleri Costa Rica UNAM ITS ByrdIA6(azul) dres-02 V. dressleri Costa Rica UNAM ITS Byrd_IIC3 dres-03 V. dressleri Costa Rica UNAM ITS Byrd_ID3 dres-04 V. dressleri Costa Rica UNAM ITS Byrd_IIC2 hart-01 V. hartii Costa Rica UNAM ITS Byrd_IIF1 hart-03 V. hartii ? UNAM ITS MAS7956 hart-04 V. hartii Costa Rica UNAM ITS Salas_1 hell-0 V. helleri Mexico UNAM ITS Soto8818 hell-01 V. helleri Costa Rica UNAM ITS Byrd_IID5 hell-02 V. helleri Costa Rica UNAM ITS Byrd_IIF4 insi-02 V. insignis Mexico UNAM ITS Soto_7668 insi-03 V. insignis Honduras UNAM ITS Linares7 insi-04 V. insignis Guatemala UNAM ITS Soto_8611 insi2507 V. cf. insignis Mexico ITT matK muestra-13 insi2519 V. cf. insignis Mexico ITT ITS muestra-25 insi2520 V. cf. insignis Mexico ITT ITS muestra-26 insi2521 V. cf. insignis Mexico ITT ITS & matK muestra-27 insi2542 V. cf. insignis Mexico ITT ITS & matK muestra-20 insi2545 V. cf. insignis Mexico ITT ITS muestra-23 insi2583 V. insignis Mexico ITT ITS muestra-33 insi2584 V. cf. insignis Mexico ITT ITS muestra-34 insi2594 V. cf. insignis Mexico BUAP ITS #005 insi2618 V. insignis Mexico BUAP matK CR2618 insi2672 V. insignis Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-002 insig2548 V. cf. insignis Mexico ITT matK muestra-26 lind0682 V. lindmaniana French Guyana VATEL ITS & matK CR0682 odor-01 V. odorata ? UNAM ITS Soto_8822 odor0116 V. odorata French Guyana VATEL ITS & matK CR0116 odor0117 V. odorata French Guyana VATEL matK CR0117 odor-02 V. odorata ? UNAM ITS Soto_8797 odor-04 V. odorata ? UNAM ITS Soto_8365 odor-05 V. odorata ? UNAM ITS Soto_8356 odor-06 V. odorata ? UNAM ITS Soto_7955

odor2154 V. odorata Mexico CITRO ITS V. odorata odor2671 V. planifolia Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-001 odor686 V. odorata ? VATEL matK CR0686 odor-sn V. odorata Surinam UNAM ITS Hagsater11881 phae-01 V. phaeantha Mexico UNAM ITS Carnevali_4825 phae-02 V. phaeantha ? UNAM ITS Kew phae-03 V. phaeantha Panama UNAM ITS Soto_9920 phae1522 V. phaeantha Madagascar VATEL matK CR1522 phae1524 V. phaeantha Madagascar VATEL matK CR1524 phae1525 V. phaeantha Madagascar VATEL matK CR1525 phae1526 V. phaeantha Madagascar VATEL matK CR1526 pla2506 V. planifolia Mexico ITT matK CR2506 plan_KJ566306 V. planifolia ? Genbank matK KJ566306 plan0001 V. planifolia La Réunion VATEL ITS & matK CR0001 plan0020 V. planifolia La Réunion VATEL ITS & matK CR0020 plan0024 V. planifolia La Réunion VATEL ITS & matK CR0024 plan0027 V. planifolia La Réunion VATEL ITS CR0027 plan0038 V. planifolia La Réunion VATEL ITS & matK CR0038 plan0043 V. planifolia La Réunion VATEL ITS CR0043 plan0196 V. planifolia La Réunion VATEL ITS & matK CR0196 plan-02 V. cf. planifolia Costa Rica UNAM ITS Byrd_IIA1 plan-03 V. cf. planifolia Honduras UNAM ITS Linares8BF plan-05 V. planifolia Mexico UNAM ITS Soto8355(nueva) plan-06 V. planifolia Costa Rica UNAM ITS Pupulin_1966 plan0628 V. planifolia La Réunion VATEL ITS CR0628 plan-08 V. planifolia Mexico UNAM ITS MAS_8526 plan0802 V. planifolia La Réunion VATEL ITS & matK CR0802 plan0831 V. planifolia Mayotte VATEL ITS CR0831 plan0836 V. planifolia Mayotte VATEL ITS CR0836 plan0852 V. planifolia Comores VATEL ITS CR0852 plan0862 V. planifolia Comores VATEL ITS CR0862 plan0876 V. planifolia Comores VATEL ITS CR0876 plan0883 V. planifolia Comores VATEL ITS CR0883 plan-14 V. planifolia ? UNAM ITS KewPWC plan1563 V. planifolia Madagascar VATEL ITS CR1563 plan1570 V. planifolia Madagascar VATEL ITS CR1570 plan-18 V. planifolia Mexico UNAM ITS Soto8808 plan-22 V. planifolia ? UNAM ITS clon1324 plan2497 V. planifolia Mexico ITT matK muestra-03 plan2499 V. cf. planifolia Mexico ITT matK muestra-05 plan2500 V. cf. planifolia Mexico ITT matK muestra-06 plan2518 V. planifolia Mexico ITT ITS & matK muestra-24 plan2523 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-29 plan2530 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-01 plan2531 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-02 plan2533 V. planifolia Mexico ITT ITS & matK muestra-09 plan2534 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-10 plan2535 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-11 plan2540 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-18

plan2541 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-19 plan2544 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-22 plan2549 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-28 plan2551 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-30 plan2552 V. planifolia Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-126 plan2555 V. planifolia Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-198 plan2559 V. planifolia Costa Rica UNA ITS none plan2582 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-32 plan2586 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-36 plan2587 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-37 plan2588 V. planifolia Mexico ITT ITS & matK muestra-38 plan2589 V. planifolia Mexico ITT matK muestra-39 plan2590 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-40 plan2591 V. planifolia Mexico ITT ITS muestra-41 plan2592 V. planifolia Mexico BUAP ITS #001 plan2599 V. planifolia Mexico BUAP ITS #027 plan2605 V. planifolia Mexico BUAP ITS #044 plan2608 V. planifolia Mexico BUAP ITS #056 plan2616 V. planifolia Mexico BUAP ITS #081 plan2625 V. planifolia Mexico BUAP ITS #111 plan2632 V. planifolia Mexico BUAP ITS #128 plan2645 V. planifolia Mexico BUAP ITS #180 plan2650 V. planifolia Mexico BUAP ITS #mut plan2678 V. planifolia Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-008 plan2679 V. planifolia Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-009 plan2680 V. planifolia Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-010 plan2681 V. planifolia Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-011 plan2682 V. planifolia Guatemala Orquideario_Archila ITS VG-012 pomp0018 V. pompona French VATEL matK CR0018 Polynesia pomp0052 V. pompona La Réunion VATEL matK CR0052 pomp0064 V. pompona ? VATEL matK CR0064 pomp0070 V. pompona Brazil VATEL matK CR0070 pomp0079 V. pompona Guadelupe VATEL matK CR0079 pomp0096 V. pompona French Guyana VATEL matK CR0096 pomp-02 V. pompona ? UNAM ITS Soto_7632 pomp0691 V. pompona ? VATEL matK CR0691 pomp1529 V. cf. pompona Madagascar VATEL matK CR1529 pomp1923 V. pompona Mexico VATEL matK CR1923 pomp2581 V. pompona Mexico VATEL ITS CR2581 sp.0068 V. sp. Costa Rica VATEL ITS & matK CR0068 sp.2180 V. sp. Costa Rica VATEL ITS & matK CR2180 sp.2543 V. cf. planifolia Mexico ITT ITS muestra-21 sp.2552 V. sp. Costa Rica VATEL matK CR2552 sp.2553 V. sp. Costa Rica UNA ITS & matK UNA-VAN-002 sp.2554 V. sp. Costa Rica UNA ITS & matK UNA-VAN-047 sp.2557 V. sp. Costa Rica UNA ITS & matK UNA-VAN-002 sp.2719 V. sp. Costa Rica VATEL ITS & matK CR2719 sp.2720 V. sp. Costa Rica VATEL ITS CR2720

sp.2721 V. sp. Costa Rica VATEL ITS CR2721 sp.2722 V. sp. Costa Rica VATEL ITS & matK CR2722 sp.UNA022 V. sp. Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-022 sp.UNA049 V. sp. Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-049 sp.UNA059 V. sp. Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-059 sp.UNA228 V. sp. Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-228 sp.UNA229 V. sp. Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-229 sp.UNA230 V. sp. Costa Rica UNA ITS UNA-VAN-230 xtah0017 V. × tahitensis French VATEL ITS & matK CR0017 Polynesia xtah0163 V. × tahitensis French polynesia VATEL matK CR0163 xtah0164 V. × tahitensis French VATEL ITS & matK CR0164 Polynesia xtahi-02 V. × tahitensis French UNAM ITS Colin_sn Polynesia

DNA extraction and sequencing

Total DNA was extracted from lyophilized leaf samples using the Qiagen DNA plant minikit (Dusseldorf, Germany) according to manufacturer protocols. Quantity and quality of the DNA were estimated using a Nanodrop spectrophotometer (Wilmington, USA), and DNA extracts were adjusted to 20 ng μl-1 for polymerase chain reaction (PCR) amplification. The Internal Transcribed Spacer (ITS) of nuclear ribosomal DNA and part of the plastid maturase K (matK) gene were chosen for molecular characterization because they are among the most discriminant loci for orchids (Cameron 2009; Hollingsworth et al. 2009; Xu et al. 2015) and have distinct inheritances, biparental for ITS and maternal for matK. The DNA samples were PCR amplified using GoTaq kit (Promega, USA) with the two primer pairs AB101/AB102 (Sun et al. 1994) for the ITS sequence, and matK-743F (5’- CTTCTGGAGTCTTTCTTGAGC-3’) / matK-1520R (5’- CGGATAATGTCCAAATACCAAATA-3’) for matK. The 25 μl PCR reaction mixture contained: PCR reaction buffer, 50 nmol MgCl2, 1 U Taq polymerase (GoTaq, Promega, USA), 5 nmol dNTPs, 10 nmol of each forward and reverse primer and 40 ng of genomic DNA. Amplification reactions were performed using a 96-well GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, USA). The annealing temperatures for primers were 60°C for ITS and 56°C for matK. Samples from Costa Rica were also amplified using the Multiplex PCR kit (Qiagen) with the same primers, and the PCR Mix and cycling conditions defined by the provider. Amplicons were sequenced in both directions as part of the Bibliothèque du Vivant project (Paris, France), and by Genwiz (Takeley, UK) and Genoscreen (Lille, France). Nucleotide sequences were aligned using the ClustalW package included in Bioedit software (Hall 1999) and cleaned manually to generate consensus sequences. The data set was complemented with reference sequences obtained previously (Soto Arenas & Dressler 2010).

Identification and quantification of aromatic precursors in mature fruits

Hand-pollinated fruits of VanL (CR0068) and three V. planifolia accessions (CR0196, CR0040 and CR0038), cultivated under shade-house in La Réunion, were harvested at 8 months after pollination, in 2013 and 2014, then freeze-dried to minimize possible enzyme degradation. The fruits were ground to a fine powder with a mortar and pestle and stored at minus 20°C until extraction. Extraction of volatile compounds was performed using a protocol adapted from Palama et al. (2009) and Pérez Silva et al. (2011). Fifty milligrams of the ground material were suspended in 10 ml of phosphate buffer (0.1 M; pH 5). The mixture was ultra-sonicated (frequency 35 kHz; AXTOR Model CD-4820) for 10 min at ambient temperature. The mixture was rapidly heated to 80°C for 10 min to inactivate endogenous enzymes and, after cooling at 25°C, was centrifuged at 5000 rpm for 3 min and then filtrated on a Whatman no.1 paper (Sigma-Aldrich, USA). The filtrate was complemented with 0.4 ml of a glycosidase rich enzyme preparation (AR2000®, Sigma–Aldrich, Mexico; 70 mg∙ml-1 in phosphate buffer mentioned above) and adjusted to a volume of 10 ml with the pH 5 buffer solution. The extract was vortexed and incubated for 4 h at 40°C for enzymatic hydrolysis of the glycosylated precursors. One milliliter of hydrolyzed extract was filtered at 0.45 μm prior to HPLC analysis. The samples were analyzed on an Agilent 1100 series equipped with a UV–VIS detector (G1314A), degasser (G1379A), column oven (G1316A), quaternary pump unit (G1311A) and autosampler (G1313A) controlled by OpenLAB CDS EZChrom Edition (Agilent Technologies, Inc. 2013). The column used was Zorbax Eclipse plus XDB C18 (150 mm long and 4.6 mm in diameter; 5 μm, Agilent Technologies, Mexico) and the mobile phase

was a mixture of two solvents: A (0.1 M KH2PO4, pH 3.2) and B (MeOH, HPLC grade). Elution was achieved at 30°C with a gradient of 3−7% B for 2 min (0.8 ml∙min-1), 7% B for 10 min (0.8 ml∙min-1), 7% B for 11 min (1.5 ml∙min-1), followed by isocratic elution in 19% B for 25 min (1.5 ml∙min-1) and 19% B for 40 min (2.0 ml∙min-1). The compounds were monitored at 230 nm, and the injection volume was 10 μl. The compounds were quantified using the external standard technique. Solutions at concentrations ranging from 10 to 100 mg∙ml-1 in the mobile phase were injected into the HPLC system to build the calibration curve. All chemicals used were of analytical grade. The standard compounds for HPLC analyses, i.e., vanillin, vanillic acid, p-hydroxybenzaldehyde, p-hydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzyl alcohol, vanillyl alcohol, anisyl alcohol and anisic acid, were from Sigma–Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Anisaldehyde was obtained from Chromadex (Irvine, CA, USA) and methanol (HPLC-grade) from J.T. Baker® (Saint Quentin Fallavier, France). The water used was Milli-Q-purified. For each sample, extraction and HPLC were run in duplicate.

Data analysis

All statistical analyses were performed with the R statistical software (R Core Team 2013). Multiple comparisons of means of morphological and aromatic traits were performed using the Multcomp package in R (Hothorn et al. 2008). Phylogenetic trees were inferred using the maximum likelihood method implemented in MEGA7 (Kumar et al. 2016) after determining the best substitution model using the online version of JModelTest2 (Guindon et al. 2003; Darriba et al. 2012). Branch robustness was assessed by bootstrapping 1000 datasets and branches with less than 65% bootstrap support were collapsed.

Results

Field observations

A total of 131 vanilla plants were collected in the survey carried out throughout Costa Rica in the time period 2013−2016. Among them, 17 were tentatively classified as V. planifolia (12) or VanL (5) according to the morphology of the leaves, stem or flower. The geographic origin and code numbers of these plants are provided in Fig. 1 and Table 2. Morphologically, the VanL plants showed most similarity with V. planifolia and V. ×tahitensis, a species having a hybrid origin involving V. planifolia and V. odorata (Lubinsky et al. 2008). However, compared to these two species VanL plants had much smaller leaves, flowers and fruits (Fig. 2) and a distinct shape of leaves; elliptic-obovate in the case of VanL, oblong for V. planifolia and lanceolate for V. × tahitensis. On the other hand, VanL plants differed markedly from the 12 other species of the V. planifolia group (namely V. appendiculata Rolfe (Rolfe 1895), V. bahiana Hoehne (Hoehne 1950), V. cristagalli Hoehne (Hoehne 1944), V. dubia Hoehne (Hoehne 1944), V. dungsii Pabst (Pabst 1975), V. fimbriata Rolfe (Rolfe 1899), V. helleri, V. insignis Ames (Ames 1934), V. odorata, V. phaeantha Rchb.f. (Reichenbach 1865), V. ribeiroi Hoehne (Hoehne 1910) and V. schwackeana Hoehne (Hoehne 1944)) by color of sepal, color of petal, size and shape of tube, label ornamentation, and shape, thickness and texture of leaves.

Fig. 1. Localization of Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. (VanL) and V. planifolia Jacks. ex Andrews samples collected in Costa Rica.

Table 2: Geographic origin of the samples collected in Costa Rica Ex situ Collection Municipality Latitude Longitude Elevation Code in DNA Genotyp Site Collectors Conser Status date (Province) (°N) (°W) (m) collection code e vation Cahuita 21 Jan. 1993 B. Gosselin MNHN CH588 CR0068 VanL (Limón) Siquirres B. Azofeifa, JA UNA-VAN- planifoli 8 Feb.2013 Barra de Parismina 10.294 83.338 14 UNA CR2552 wild (Limón) Garcia, A. Paniagua 00126 a Siquirres B. Azofeifa, JA UNA-VAN- 8 Feb.2013 Barra de Parismina 10.281 83.329 18 UNA CR2553 VanL wild (Limón) Garcia, A. Paniagua 00002 Refugio Nacional 14 Nov. Talamanca Mixto de Vida M. Grisoni, B. BRC 9.594 82.602 14 CR2180 CR2180 VanL wild 2013 (Limón) Silvestre Gandoca- Azofeifa VATEL Manzanillo Refugio Nacional 14 Nov. Talamanca Mixto de Vida B. Azofeifa, JA UNA-VAN- planifoli 9.594 82.601 17 UNA FSC-22 wild 2013 (Limón) Silvestre Gandoca- Garcia 00022 a Manzanillo Refugio Nacional 14 Nov. Talamanca Mixto de Vida B. Azofeifa & JA UNA-VAN- 9.595 82.603 16 UNA CR2554 VanL wild 2013 (Limón) Silvestre Gandoca- Garcia 00047 Manzanillo Refugio Nacional 14 Nov. Talamanca Mixto de Vida B. Azofeifa, JA UNA-VAN- 9.5895 82.595 19 UNA FSC-08 VanL wild 2013 (Limón) Silvestre Gandoca- Garcia 00049 Manzanillo Parque Nacional 10 Sep. Talamanca B. Azofeifa, J.A. UNA-VAN- planifoli Cahuita-Puerto 9.747 82.812 27 UNA FSC-07 wild 2014 (Limón) Garcia 00059 a Vargas Parque Nacional 10 Sep. Talamanca B. Azofeifa, J.A. UNA-VAN- planifoli Cahuita-Puerto 9.747 82.812 27 UNA CR2555 wild 2014 (Limón) Garcia 00198 a Vargas Finca 11 Nov. San Isidro A. Barquero, B. planifoli 9.496 84.012 847 Santiag CR2559 cultivated 2014 (Dota) Azofeifa a o Parra 11 Nov. Guápiles A. Barquero, B. UNA-VAN- 10.353 83.804 79 UNA CR2557 VanL cultivated 2014 (Limón) Azofeifa 00216 18 Nov. Siquirres B. Azofeifa, J.A. UNA-VAN- planifoli Barra de Parismina 10.295 83.338 15 UNA FSC-01 wild 2014 (Limón) Garcia 00228 a

Mora (San A. Paniagua, J.A. UNA-VAN- planifoli No data Guayabo (Colón) 9.859 84.265 962 UNA FSC-02 cultivated José) Garcia 00230 a 23 May. Siquirres UNA-VAN- planifoli Barra de Parismina 10.287 83.333 6 B. Azofeifa UNA FSC-06 wild 2015 (Limón) 00229 a M. Grisoni, B. 12 Mar. Siquirres Azofeifa, A. BRC planifoli Barra de Parismina 10.279 83.327 6 CR2719 CR2719 wild 2016 (Limón) Paniagua, M. Vieira VATEL a Nascimiento M. Grisoni, B. 12 Mar. Siquirres Azofeifa, A. BRC planifoli Barra de Parismina 10.279 83.327 8 CR2720 CR2720 wild 2016 (Limón) Paniagua, M. Vieira VATEL a Nascimiento M. Grisoni, B. 12 Mar. Siquirres Azofeifa, A. BRC planifoli Barra de Parismina 10.279 83.327 8 CR2721 CR2721 wild 2016 (Limón) Paniagua, M. Vieira VATEL a Nascimiento M. Grisoni, B. 12 Mar. Siquirres Azofeifa, A. BRC planifoli Barra de Parismina 10.279 83.327 8 CR2722 CR2722 wild 2016 (Limón) Paniagua, M. Vieira VATEL a Nascimiento

Five out of the six VanL samples, CR0068, CR2180, CR2553, CR2554 and UNA-049, were collected in natural forests at three localities of the Caribbean province of Limón (Costa Rica), indicated in Table 2. The sixth VanL accession (CR2557) was cultivated in a farm with no information on its origin. During the survey, ten V. planifolia plants were found growing wild at two localities of the Limón province. Five of these accessions were collected in Barra Parismina, a human settlement established about 50 years ago that is still not connected by road to the rest of the country and where, according to one of the first settlers, vanilla was present prior to human occupation and no vanilla was ever introduced by man (Gabriel Taylor, Vanilla grower, Parismina, Costa Rica). They are therefore considered to be occurring naturally in this area and not having escaped from local cultivation. They were morphologically indistinguishable from cultivated V. planifolia collected at farms in San Isidro (CR2559) and Mora (UNA-0230) or the three V. planifolia from Talamanca (UNA-0022, UNA-0059, CR2555).

Fig. 2. Natural biotope of Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. (VanL) at Refugio Nacional Mixto de Vida Silvestre, Gandonca Manzanillo, Costa

Rica. A. View of the littoral region of Limón Province harboring VanL populations. B. Important development of VanL in the humid littoral forests of Limón. C. Flower of VanL. D. Naturally pollinated fruits of VanL at maturity.

To date, the wild populations of VanL and V. planifolia were both sampled in tropical humid forests of the southern coastal lowlands of Limón Province (Fig. 3). This biotope is characterized by plant species adapted to sandy soils such as Terminalia catappa L. (Combretaceae), Coccoloba uvifera (L.) L. (Polygonaceae), Cocos nucifera L. (Arecaceae), Costus spicatus (Jacq.) Sw. (Costaceae), Hibiscus pernambucensis Arruda (Malvaceae), Acrostichum aureum L. (Pteridaceae), Chrysobalanus icaco L. (Chrysobalanaceae), Amphitecna latifolia (Mill.) A.H. Gentry (Bignoniaceae), Rhizophora mangle L. (Rhizophoraceae) and Pterocarpus officinalis Jacq. (Fabaceae). The VanL plant from Guápiles (CR2557) was sampled in a vanilla plot where vanilla was associated with pepper and cinnamon.

Fig. 3. Comparison of morphological traits between Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. (accession CR0068) and V. planifolia Jacks. ex Andrews (CR0196) cultivated under shade house in La Réunion. A. Front view of entire flowers. B. Separated flower parts. C. Mature fruits. D. Leaves.

In Gandoca-Manzanillo, Parismina and Cahuita the flowering happened from October to January, as deduced from the many racemes found in mid-November bearing flowers and young fruits. Mature vanilla beans were harvested in December 2015 from the VanL population of Guápiles (CR2557), which indicated a flowering time probably ending in March.

Phylogenetic analysis

To elucidate the taxonomic position of VanL plants, the nuclear ITS DNA and the matK plastid gene were sequenced for 125 and 55 vanilla accessions, respectively. The sample set included VanL specimens, accession representatives of the diversity of the V. planifolia group, as well as outgroup species (Table 1). The phylogenetic tree inferred from the 506 positions of the 125 aligned ITS sequences (465 to 500 nt) revealed a clade separated with 93% bootstrap support, containing the five VanL accessions (CR2180, CR2553, CR2554, CR2557 and UNA049) along with CR0068 from BRC Vatel and two accessions from the AMO, collected in Costa Rica and Honduras respectively, identified as V. planifolia cf. plan-02 and plan-03 (Fig. 4). This clade was within the V. planifolia accessions and close to the V. bahiana / V. phaeantha clade. It was more distantly related to the V. insignis and the V. helleri – V. odorata – V. × tahitensis clades. The eight partial ITS sequences in the VanL clade differed from all the accessions of the V. planifolia clade by two conserved nucleotides at positions 390 and 479 of the alignment (Table 3). Similarly, V. bahiana differed from V. phaeantha by only two conserved nucleotides (nt 172 and 420). In contrast, the V. planifolia clade differed from the V. bahiana and V. phaeantha group by 13 conserved nucleotides, and from V. insignis by 15 conserved nucleotides. The phylogenetic tree inferred from the 741 positions of the 55 aligned matK sequences (699 to 734 nt) separated V. planifolia with high bootstrap support from its most closely related species, including V. odorata, V. insignis, V. bahiana and V. phaeantha (Fig. 5). The eight VanL accessions sequenced felt within the V. planifolia clade, confirming their very close relationship with this species. Phylogenetic trees inferred using the Neighbor Joining, Parsimony and Bayesian methods were congruent with the ML trees (data not shown).

Morphology of vegetative and reproductive organs of VanL

The morphology of the leaf, stem, and flower of VanL is very similar to that of V. planifolia (Fig. 2). However, the former differs from the latter by a highly significant reduction in size of the vegetative and reproductive organs (Table 4). In average, leaf and stem dimensions are 29 to 41% smaller in VanL compared to V. planifolia. The size reduction in VanL is less important in the flower, with tube length only 7% and sepal length 12% lesser than for V. planifolia. However, in VanL, the dorsal sepal is 29% narrower and the ovary 19% shorter than in V. planifolia. The blooming period of VanL cultivated in La Réunion was approximately two weeks earlier than that of V. planifolia accessions, but they overlapped from October to November. Mature fruits of VanL were 45% shorter and 55% lighter than those of V. planifolia (Fig. 2; Table 4). They were also indehiscent and more cylindrical, contrary to most V. planifolia fruits, which dehisce at maturity and have a more triangular section.

Fig. 4. Phylogenetic tree derived from the partial ITS sequences (506 positions) of the 125 accessions listed in Table 1, showing the differentiation of the Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. clade from V. planifolia Jacks. ex Andrews and all other related species. The tree was inferred using the Maximum Likelihood method based on the Tamura-Nei model with invariant sites and Gamma distribution of evolutionary rates. The figures indicate the percentage of bootstrap support. Branches with less than 65% support were collapsed. Countries of origin: Bra = Brazil; Com = Comoros: CR = Costa Rica; FGu = French Guiana; FPo = French Polynesia; Gua = Guatemala; Hon = Honduras; Mad = Madagascar; May = Mayotte; Mex = Mexico; Run = La Réunion; na = geographic origin not available. Numbers in brackets indicate the number of similar accessions merged in one branch for outgroup species.

Table 3. Inter-clade polymorphisms of within-clade-conserved nucleotides along the partial ITS sequence of Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews, V. sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. and their most closely related species. The triangular matrix on the right indicates the number of polymorphic sites between species. Nucleotides diverging from the V. planifolia sequence are in bold. Y = C or T, K = G or T.

Position

12 25 33 34 54 58 80 93 112 127 172 178 188 192 204 390 399 420 422 423 424 444 473 479 480 493 494 V. planifolia V. planifolia C T G C T T Y A - A T A C Y C C C T C G G C G A Y C K

vanL

VanL C T G C T T T A - A T A C C C G C T C G G C G G C C T 2 V. bahiana V. bahiana C T A T C C C C T T C A C T C C T T T G G T A A T T G 13 19 V. phaeantha V. 13 18 2 phaeantha C T A T C C C C T T T A C T C C T C T G G T A A T T G

V. V. insignis V. insignis T C G C T C T A - A T G T T A C T Y T T C C A A T T G 11 17 16 15

Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

Table 4. Means of different measurements on vegetative and reproductive organs of two accessions of Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. (CR0068 and CR2180) and two accessions of V. planifolia Jacks. ex Andrews (CR0040 and CR0196). Measurements are in mm unless otherwise indicated. In each line, means with different letters are significantly different (p < 0.05, Tukey’s test). StE = standard error. V. sotoarenasii sp.nov. V. planifolia

CR0068 CR2180 CR0040 CR0196 Measurements (mm) mean StE mean StE mean StE mean StE length of leaf 76.0 2.28 a 105.8 3.85 b 149.4 2.58 c 146.5 3.65 C width of leaf 32.7 0.58 a 27.4 1.29 a 50.0 0.96 b 47.9 1.08 B diametre of stem 5.8 0.09 a 6.1 0.12 a 10.3 0.25 b 9.9 0.26 B length of internode 71.4 3.00 a 91.0 3.03 a 117.7 3.65 b 122.2 4.66 B Number of ítems 30 14 24 30 length of sepal sup 50.3 0.45 a 50.6 0.64 a 57.9 0.43 b 56.8 0.53 b width of sepal sup 9.5 0.22 a 8.9 0.33 a 13.5 0.29 b 12.6 0.33 b length of tuve 42.6 0.32 a 43.2 0.67 a 47.0 0.40 b 45.7 0.48 b width of tuve 10.8 0.12 a 11.3 0.18 a 13.6 0.19 b 13.0 0.22 b length of ovary 37.8 0.53 a 45.9 0.93 b 53.1 0.61 c 49.9 0.72 c Number of items 30 19 22 30 weight of mature 6.6 0.17 a - - 18.1 0.84 b 18.3 0.65 b fruit (g) length of mature fruit 114 2.20 a - - 201 3.66 b 203 2.26 b Number of items 16 - - 17 22

Aromatic content of mature fruits

Strongly contrasted aromatic profiles were observed between VanL and V. planifolia by comparing the contents of nine volatile precursors detected in mature fruits by HPLC (Table 5). The fruits of VanL had a much lower content of vanillyl compounds, particularly vanillin which did not exceed 0.26% of dry matter, while it was over 2.28% in V. planifolia beans. Conversely, VanL fruits had significant amounts of anisyl compounds which were not detected by HPLC in V. planifolia fruits, and p- hydroxybenzyl (PHB) alcohol was present at a much higher titer in VanL compared to V. planifolia. The contents of the two other p-hydroxyl compounds were not significantly different between VanL and V. planifolia.

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Fig. 5. Phylogenetic tree derived from the partial matK sequences (725 positions) of the 55 accessions listed in Table 1, showing the Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. accessions (red dots) within the V. planifolia clade but distinct from other related species. The tree was inferred using the Maximum Likelihood method based on the Hasegawa-Kishino-Yano model and Gamma distribution of evolutionary rates. The figures indicate the percentage of bootstrap support. Countries of origin: Bra = Brazil; CR = Costa Rica; FGu = French Guiana; FPo = French Polynesia; Mad = Madagascar; Mex = Mexico; Run = La Réunion; na = geographic origin not available. Numbers in brackets indicate the number of similar accessions merged in one branch for outgroup species.

As a whole, the VanL fruit had a significantly lower (about 30%) level of total aromatic content (all nine molecules) and a very distinct aromatic profile compared to V. planifolia. Indeed, the volatiles of V. planifolia fruits were strongly dominated by vanillyl compounds (83.1% of all volatiles, particularly vanillin which represented 68%). By contrast, the VanL fruits contained a more equilibrated profile with a slight dominance of vanillyl compounds (41.9% of all volatiles, in which vanillyl-alcohol represented 31%), p-hydroxybenzyl and anisyl compounds (35.9% and 22.2%, respectively). The above results indicate than VanL and V. planifolia are very closely related but significantly distinct in morphological and biochemical traits, as well as in nuclear nucleotide sequences. We therefore propose to place VanL in a specific taxon distinct from V. planifolia, and to name it Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov.

Taxonomy

Class Equisetopsida C.Agardh (Agardh et al. 1825) Subclass Magnoliidae Novák ex Takht. (Takhtajan 1967) Superorder Lilianae Takht. (Takhtajan 1967) Order: Asparagales Link (Link 1829) Family Orchidaceae Juss. (de Jussieu 1789) Subfamily Vanilloideae (Lindl.) Szlach. (Szlachetko 1995) Tribe Vanilleae (Blume 1835) Genus Vanilla Plum. ex Mill. (Miller 1754) Subgenus Xanata Soto Arenas & Cribb (Soto Arenas & Cribb 2010) Section Xanata Soto Arenas & Cribb (Soto Arenas & Cribb 2010) Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. LSID Figs 2, 3, 6

Diagnosis

A Vanilla planifolia similis, sed folia caulesque breviores (folium: 7.6−10.6 × 2.7−3.3 cm versus 14.7−14.9 × 4.8−5 cm), laminae breviores, ellipticae-oblongaeque, flores albiores, tubus floris, sepala petalaque breviores, sepalum dorsale angustius, labellum angustiius cum papillis salientioribus, ovarium brevitius (3.8−4.6 cm versus 5−5.3 cm), fructus brevitior (11.4 cm versus 20.1−20.3 cm) indehiscensque, sectio fructi cylindrica (versus trigona). Moleculae aromaticae fructi absimilis.

Etymology

This species is dedicated to Dr. Miguel Angel Soto Arenas (1963−2009), authority in orchid floristics and ecology, particularly in the Vanilla genus.

Type material

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Holotype

COSTA RICA: Cahuita (ex hort. parc E. Liais, from plants collected by B. Gosselin in 1993), 8 Oct. 1996, Pignal 396 b (holo-: P: P00075132).

Paratypes

COSTA RICA: Limón Province: Talamanca, Refugio Nacional Mixto de Vida Silvestre Gandoca- Manzanillo, 9.594° N, 82.602° W, altitude 2 m, 14 Nov. 2013 (originally collected) and cultivated in BRC Vatel, Saint Pierre, La Réunion, France CRV2180, 28 Feb. 2016, M. Grisoni & J.B. Azofeifa-Bolaños JJMM01 (REU: REU13363). Costa Rica, Limon: Canton of Talamanca. Refugio Nacional Mixto de Vida Silvestre Gandoca-Manzanillo, 14 Nov. 2013, M. Grisoni, B. Azofeifa and J. García 2180 (CR 281507), B. Azofeifa and J. García 0047 (CR 281508); Canton of Siquirres, Barra de Parismina, 8 Feb. 2013, B. Azofeifa, J. García and A. Paniagua 0002 (CR 281509) (originally collected) and cultivated in INISEFOR, Heredia, Costa Rica.

Table 5. Means of volatile compounds quantified by HPLC in mature beans of V. sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. (CR0068; 3 samples) and V. planifolia Jacks. ex Andrews (CR0196, CR0038, CR0040; 9 samples). Contents are expressed as grams of compound per 100 g dry matter. nd = compound not detected. Averages with different letters within rows are significantly different (p < 0.05). V. sotoarenasii sp.nov. V. planifolia Compounds g/100g dw % g/100g dw % Vanillin 0.26 a 10.9 2.28 b 68.0 Vanillic acid nd a 0.0 0.19 b 5.5 Vanillyl alcohol 0.73 a 31.0 0.32 b 9.6 Total vanillyl compounds 0.99 a 41.9 2.79 b p-hydroxybelzaldehyde 0.20 a 8.5 0.18 a 5.4 p-hydroxybenzoic acid 0.37 a 15.8 0.37 a 11.2 p-hydroxybenzyl alcohol 0.27 a 11.6 0.01 b 0.3 Total p-hydroxybenzyl compounds 0.85 a 35.9 0.56 b Anisyl alcohol 0.24 a 10.2 nd b - Anisaldehyde 0.03 b 1.4 nd b - Anisic acid 0.25 a 10.6 nd b - Total anisyl compounds 0.52 a 22.2 nd b Total 2.36 a 100 3.35 b 100

Description

Hemiepiphytic vine up to 15 m high. Stems flexuous, terete, smooth, green, 5−6 mm thick; internodes, sometimes slightly curved apically, ca 10 cm long. Terrestrial roots pubescent, ramified, ca 2 mm thick; both attaching and free aerial roots terete, pubescent, ca 2 mm thick at base, ca 3.5 mm at middle. Leaves regularly alternate. Blade elliptic to obovate, slightly fleshy (ca 27 veins visible on dry specimens); base rounded to cuneate, shortly pseudopetiolate; apex shortly acuminate (acumen sharp, 12 mm long, 5 mm at base), slightly recurved; margin thinned; pseudopetiole canaliculate, 16 × 5 mm. Inflorescence: raceme, ca 10−20-flowered, 7−13 cm, sometimes located on short axillary branches, sometimes lying on leafy stems. 3−4 inflorescence bracts, foliaceous, basal bract pseudopetiolate (40 × 20 mm), upper bract sessile and shorter (20 × 8 mm and 12 × 3 mm). Flowers at anthesis successively, ephemeral, 1−2 simultaneously, white green, sepals forming an angle of approximately 45° with axis of column, petals more or less parallel to this axis. Ovary terete, smooth,

42 slightly arcuate, white at base and green on upper ⅔, 30 mm long and 4 mm in diameter. Parts of perianth with whitish inclusions (visible on dry specimens), longitudinally oriented, ca 0.1−2 mm long, more numerous on petals, dorsal sepal narrow elliptic to oblanceolate, ca 11-veined, 40 × 10 mm, apex acute, rounded, base attenuate-clawed, slightly concave, canaliculate. Lateral sepals, elliptic asymmetric, slightly falciform, ca 11-veined, 38 × 10.5 mm, apex acute, slightly cupuliform, base attenuate, canaliculate, 4 mm wide. Petals elliptic asymmetric, slightly falciform, ca 12- veined, carinate dorsally (carena 1.2 mm wide), 38 × 9 mm, apex rounded, base attenuate, 3 mm wide (Fig. 6). Labellum attached to column along margins of 5/7 (ca 20 mm), funnel-shaped, spread apically (opening about 10 mm), trilobed, ca 30-veined ramified in distal third, margin crenulate. With 5−6 fimbriated scales, ca 1.5 × 1.5 mm, at about middle of labellum. Lateral lobes, obliquely triangular, ca 11-veined, 10 mm high and 7 mm wide, margins widely undulate. Midlobe quadrate, 20 mm wide and 6 mm high, about 12-veined, converging at apex. Papillae on four central veins, on apical half. Column trigonous-semicylindrical, 28 mm long, 2.5 mm wide, apically with 2 lateral auricles, crenulate, 2.5 mm high and 4 mm wide. Rostellum quadrangular, ca 3 × 3 mm. Stigma bilobed. Anther articulated, connective keel-shape, 2 × 2 mm, bicarinate on top. Operculum helmet-shaped, 2 × 3 mm. Pollinarium, 2. Fruit arcuate, banana- shaped, green, turning yellowish and then brown, 11−16 × 1.5 cm, with cylindrical section.

Phenology

The flowering period occurs from October to March in Costa Rica.

IUCN status –Vulnerable

The populations of V. sotoarenasii sp. nov. observed in the province of Limón showed strong vegetative development of vines and natural seed set was frequently observed. However, a small number of populations have so far been observed and only over a very limited area of Limón Province (10 populations over a coastal strip of about 50 km²), and its habitat is periodically submerged by the ocean. This makes us inclined to tentatively classify V. sotoarenasii sp. nov. as vulnerable D2 (IUCN 2012) until further data on distribution and population dynamics have been obtained.

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Fig. 6. Croquis drawing of a flower of Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov.

Table 6. Characters differentiating Vanilla sotoarenasii M.Pignal, Azofeifa-Bolaños & Grisoni sp. nov. from related species. V. planifolia V. × tahitensis V. sotoarenasii sp. nov. Leaf shape elliptic to oblong narrowly oblong to elliptic to obovate lanceolate Leaf length more than 14 cm more than 14 cm less than 12 cm long long long Leaf length/width less than 4 times more than 4 times about 3 times as long as ratio as long as wide as long as wide wide Sepals size more than 55 × 10 more than 55 × 10 no more than 53 × 8 mm (length × width) mm mm Fruit section triangular, triangular, rounded, indehiscent generally generally dehiscent indehiscent 44

Discussion

Using complementary approaches involving morphology of the reproductive and vegetative systems, molecular barcoding and secondary metabolite accumulation in fruits, we highlighted specific traits for the vanilla populations sampled on the Caribbean coast of Costa Rica which revealed a new taxon, V. sotoarenasii sp. nov. The morphology of the flowers and leaves clearly assigned V. sotoarenasii sp. nov. within the V. planifolia group (Soto Arenas & Dressler 2010). Based on flower morphology, V. sotoarenasii sp. nov. was more similar to V. planifolia and V. × tahitensis than to any other vanilla species of this group. However, V. sotoarenasii sp. nov. differs from the other two species by several characteristics. Firstly, our data and previous data by Costantin & Bois (1915) and Portères (1953) showed that V. sotoarenasii sp. nov. has a significantly smaller size for all organs measured (stem, leaf, flower and fruit) compared to V. planifolia and V. × tahitensis, and had a distinct shape of the leaves: elliptic to obovate in the case of V. sotoarenasii sp. nov., elliptic to oblong for V. planifolia and narrowly oblong to lanceolate for V. × tahitensis. In addition, the flowers of V. sotoarenasii sp. nov. are more whitish, with a narrower label showing marked papillae, compared to those of V. planifolia, which are more greenish, with a wider label and smooth papillae. On the basis of HPLC quantification of hydrolyzed volatile compounds in mature fruits, the aromatic precursors of V. sotoarenasii sp. nov. are very distinct from those of V. planifolia. In particular, fruits of V. sotoarenasii sp. nov. were characterized by less predominant vanillin content and the presence of anisyl compounds. They should develop, after over-maturation or curing, flavors extremely different from those of V. planifolia and more similar to those of V. pompona or V. × tahitensis (Pérez-Silva et al. 2006; Brunschwig et al. 2009; Maruenda et al. 2013). On the other hand, molecular analysis of nuclear DNA sequences (ITS) unambiguously separated the V. sotoarenasii sp. nov. group of plants from the V. planifolia group including 68 accessions originating from seven countries (Comoros, Costa Rica, Guatemala, Madagascar, Mayotte, Mexico, and La Réunion). This result is corroborated by amplified fragment length polymorphism (AFLP) analyses by Bory et al. (2008) that clearly separated V. sotoarenasii sp. nov. CR0068 from 303 V. planifolia genotypes of diverse origins with an average distance comparable to the distance between V. planifolia and V. × tahitensis. The facts that i) at the plastid DNA level (partial matK sequence) V. sotoarenasii sp. nov. and V. planifolia share the same clade, and ii) in the ITS phylogeny V. sotoarenasii sp. nov. is in an internal position within the V. planifolia clade (like V. helleri within the V. odorata cluster), suggest the recent radiation of V. sotoarenasii sp. nov. from V. planifolia populations. So far, V. sotoarenasii sp. nov. has only been observed in Limón Province of Costa Rica where it is sympatric with V. planifolia, which has been reported as native to Costa Rica (Soto Arenas & Dressler 2010). However, recent introductions in the country of V. planifolia cultivars and hybrids has also been documented (Soto Arenas & Dressler 2010; Belanger & Havkin-Frenkel 2011; Varela Quirós 2011). Historical, genetic and phylogenetic data are insufficient to decide whether V. sotoarenasii sp. nov. derived from natural or introduced populations of V. planifolia, nor how and when the radiation occurred. Orchid species are often interfertile, which allows them to create interspecific and even intergeneric fertile hybrids. Many interspecific hybrids between species of Vanilla have been produced in the last decades by botanists and agronomists (Knudson 1950; Theis & Jiménez 1957; Divakaran et al. 2006). In nature, however, interspecific hybrids are prevented by reproductive barriers that result primarily from the inability of pollinators to transfer pollen from one species to another. Within the limits of our sampling, we have never observed intermediary types, at the genetic or morphological level, in the Limón area, which suggests that a reproductive barrier may exist between V. planifolia and V.

45 sotoarenasii sp. nov. Indeed, in the case of sympatric populations of the two very closely related species V. barbellata Rchb.f. and V. dilloniana Correll, having synchronous flowering and the same pollinator in western Puerto Rico, intermediary types were observed, demonstrating natural interspecific hybridizations (Nielsen 2000). We hypothesize that the differences in flower morphology observed between V. planifolia and V. sotoarenasii sp. nov. impede gene flow from one species to another, which enhanced the radiation of the population in Limón. Vanilla pollination is bee- dependent (Ackerman 1986; Gigant et al. 2011) and flower size difference is likely to constitute a reproductive barrier between species by selecting compatible pollinators. This has been observed for instance in Peru where, due to their small size, the Mellipona bees did not remove pollen when visiting V. grandiflora Lindl. flowers, and therefore did not contribute to its pollination (Lubinsky et al. 2006). Given the significant size reduction of the flowers of V. sotoarenasii sp. nov. compared to those of V. planifolia, it is unlikely that a bee capable of pollinating one of the two species would be able to pollinate the other. In addition to size compatibility, the probability of pollinator visits is frequently increased by the aromatic metabolites emitted by orchid flowers, which act as bee attractants (Ackerman 1986; Pansarin & Pansarin 2014). This is particularly important for vanilla flowers that are open a single day, which reduces the chances of pollen-pollinator encounter. Analysis of the volatile compounds emitted by flowers from various Vanilla species (unpublished data) has shown in particular that in V. planifolia (n = 4) the major compounds are a hydrocarbon monoterpene, (E)-β- ocimene (representing 17.10 ± 14.08% of all detected compounds), and an aromatic compound, 2,6-bis (1,1-dimethylethyl)- 4-(1-oxopropyl) phenol (11.59 ± 8, 04%), while in V. sotoarenasii sp. nov. (n = 1), only (E)-β-ocimene was predominantly found (63.26%). This difference in the nature of volatile emissions between the two species could also contribute to the specificity of the pollinators visiting the flowers. Furthermore, the earlier flowering of V. sotoarenasii sp. nov. compared to V. planifolia may also contribute to favor self or geitonogamous pollination as well as provide greater reproductive success to V. sotoarenasii sp. nov., as pointed out for non- rewarding orchids (Jersáková et al. 2006; Sun et al. 2009). All these factors hindering gene flow between populations of V. sotoarenasii sp. nov. and V. planifolia may account for the radiation that led to the emergence of V. sotoarenasii sp. nov., a species that is genetically, morphologically, and biochemically distinct from V. planifolia. Finally, given its original aromatic content combining vanilyl and anisic notes, its high level of resistance (at least for CR0068) to the Fusarium root rot of vanilla (Koyyappurath et al. 2015), and its early and abundant flowering in culture, V. sotoarenasii sp. nov. could be a promising genitor for breeding programs aiming to produce new vanilla varieties for the agroindustry.

Acknowledgements

The authors are grateful to the National Council for Scientific and Technological Research of Costa Rica (CONICIT) for the financial support to conduct the collecting missions in Costa Rica, and to the Natural Resources Management Master Program of the Open University of Costa Rica (UNED) for supporting the MSc work of the first author. The molecular genotyping and phylogenetic analyses were partly funded by the Vanitax (ANR Bibliothèque du Vivant) and the VaBiome (EraNet-NetBiome) projects. The authors would like to warmly thank M. Alain Rongier, Pierre Poulain, Jean-Paul Brixtel and the municipality of Cherbourg-en-Cotentin (France) for allowing access to the material conserved in the Parc Emmanuel Liais, Ana Barquero of INISEFOR-UNA for providing plant material, Pr. Thomas Petit and colleagues from the University Institute of Technology of Saint Pierre (La Réunion) for facilitating HPLC analyses in their lab, and Marc Jeanson from P, Muséum national d’Histoire naturelle (Paris).

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Manuscript received: 18 March 2016 Manuscript accepted: 2 September 2016 Published on: 22 February 2017 Guest editors: Line Le Gall, Frédéric Delsuc, Stéphane Hourdez, Guillaume Lecointre and Jean-Yves Rasplus,

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Desk editor: Danny Eibye-Jacobsen

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

CAPITULO II

Artículo Efecto de la desinfección de segmentos nodales sobre el rendimiento morfogenético de vitroplantas de Vanilla planifolia Andrews1

José Bernal Azofeifa Bolaños Maestría en Manejo de Recursos Naturales, UNED. Instituto de Investigación y Servicios Forestales, Universidad Nacional de Costa Rica, Heredia, Costa Rica; [email protected]

(Este artículo será publicado con las siguientes coautorías: José Bernal Azofeifa-Bolaños, Germán Rivera-Coto, Amelia Paniagua-Vásquez, Roberto Cordero-Solorzano, Eduardo Salas-Alvarado. Agronomía Mesoamericana

RESUMEN El establecimiento aséptico en condiciones de laboratorio de parientes silvestres de Vanilla planifolia no ha sido documentado en los diferentes protocolos de esterilización y regeneración disponibles en la literarura, así como tampoco se ha evaluado la importancia de la desinfección en el aumento del vigor. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto que ocasiona un proceso de doble desinfección (invernadero y laboratorio) sobre la respuesta morfogenética de segmentos nodales de vainilla durante el establecimiento y multiplicación en el medio de cultivo Murashige y Skoog (MS). Se evaluaron seis tratamientos: 1) alcohol 70%/NaClO 0,35%; 2) kilol/NaClO 0,35%; 3) testigo/NaClO 0,35%; 4) alcohol 70%/HgCl2 0,2%; 5) kilol/HgCl2 0,2% y 6) testigo/HgCl2 0,2%. Los géneros de bacterias y hongos más dominantes fueron Pantoea sp. (33%) y Fusarium sp. (12%), respectivamente. El mejor tratamiento de desinfección se obtuvo con el uso de kilol en vivero y HgCl2 en laboratorio, donde se logró un 100% de explantes libres de contaminantes. Este mismo tratamiento presentó los mayores valores de longitud y peso del brote, número, longitud y peso de las raíces durante el establecimiento, mientras que el tratamiento kilol/NaClO presentó los valores más altos para la variable diámetro del brote. En la etapa de multiplicación, la condición aséptica de los grupos experimentales presentó los mayores valores para las variables longitud y peso comparado con la respuesta morfogénica presentada en la condición de contaminación. Se concluyó que un pre tratamiento con kilol y la aplicación de HgCl2 en laboratorio es el método de esterilización más eficiente para reducir la carga microbiológica y aumentar la respuesta morfogenética de plantas silvestres de V. planifolia. La omisión de una estrategia adecuada para el desarrollo de cultivos asépticos, induce la pérdida de materiales únicos, compromete el desarrollo de la planta madre y genera adaptaciones atípicas durante la aclimatización. Palabras claves: vainilla, calidad fitosanitaria, Costa Rica, especies silvestres de vainilla, desinfección in vitro.

1 Este trabajo es parte de los resultados de la tesis del Programa de Maestría Académica en Manejo de Recursos Naturales de la Universidad Estatal a Distancia con énfasis en gestión de la Biodiversidad. El trabajo fue realizado en el Instituto de Investigación y Servicios Forestales de la Universidad Nacional de Costa Rica. Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

ABSTRACT Disinfection effect of nodal segments from Vanilla planifolia Andrews on the morphogenetic response of in vitro plants. The aseptic establishment in laboratory conditions of wild type Vanilla planifolia has not been documented in any sterilization and regeneration protocols available in the literature, nor has been evaluated the importance of disinfection to enhance the vigorosity. The aim of this experiment was to evaluate the effect of a double disinfection process (greenhouse and laboratory) on the morphogenetic response of nodal segments of vanilla during the establishment and multiplication in the culture medium Murashige and Skoog (MS). Six treatments were evaluated: 1) alcohol 70%/NaClO 0.35%; 2) kilol/NaClO 0.35%; 3) control/NaClO 0.35%; 4) alcohol 70%/HgCl2 0.2%; 5) kilol/HgCl2 0.2% and 6) control/HgCl2 0.2%. The main genera of bacteria and fungi were Pantoea sp. (33%) and Fusarium sp. (12%), respectively. The best disinfection treatment was obtained with the use of kilol in the nursery and HgCl2 in the laboratory, where 100% pathogen‒free explants were obtained. This treatment also showed the highest values of length and weight of the shoot, number, length and weight of the roots for the establishment, while the kilol/NaClO treatment had the highest value for the variable width of the shoot. In the multiplication stage, the experimental groups in aseptic condition showed the highest values for the variables length and weight compared to the morphogenic response obtained in the condition of contamination. It was concluded that a pre‒treatment with kilol in the greenhouse and an application of HgCl2 in the laboratory were the most efficient sterilization method to reduce the microbial load and increase morphogenetic response in wild V. planifolia plants. The omission of an adequate strategy for the development of aseptic cultures, induce losses of unique materials, compromises the development of the donor plants and generates atypical adaptations in the acclimatization process. Key words: vanilla, phytosanitary status, Costa Rica, wild species, in vitro disinfection.

INTRODUCCIÓN El género Vanilla tiene una distribución pantropical y está compuesto por aproximadamente 110 especies (Gigant et al., 2011). De éstas, solo V. planifolia, V. pompona y V. × tahitensis producen vainillina, el compuesto aromatizante y saborizante más popular en el mundo (Havkin-Frenkel y Belanger, 2007; Ranadive, 2011; Anuradha et al., 2013; Maruenda et al., 2013). El 95% de la producción global se obtiene de los frutos fermentados de V. planifolia, lo cual la posiciona como la orquídea con mayor importancia económica y la segunda especia más cara seguida por el azafrán (Havkin-Frenkel y Belanger, 2007). En los últimos años, el mercado mundial de la vainilla natural ha experimentado una demanda constante y creciente, ocasionando un cambio en las estrategias de comercialización, y por consiguiente, un reordenamiento de las unidades productoras para suplir con rapidez la poca oferta. Para solventar esta situación deficitaria, es necesario aumentar el área de cultivo y optimizar la siembra a través de cultivos intensivos. En ambos casos, se requiere la generación rápida y masiva de semilla de calidad.

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

Para el logro de ese objetivo, es indispensable contar con protocolos que permitan obtener suficientes plantas con características genéticas idóneas, provenientes de bancos de germoplasma o programas de mejoramiento, mediante el uso de técnicas eficientes para la producción masiva de esos materiales y que todo esté inmerso en una estrategia global de manejo y aprovechamiento de los recursos fitogenéticos (Soto-Arenas y Solano-Gómez, 2007). En la actualidad la Universidad Nacional de Costa Rica, lidera un programa en ese sentido, para lo cual ya se ha establecido un banco de germoplasma (con más de 150 accesiones), se han caracterizado especies colectadas en diversas partes del país (incluida una especie nueva) y se ha recurrido a la multiplicación de material in vitro para reproducir materiales valiosos (Azofeifa- Bolaños et al., 2014, 2017). Como parte de la estrategia integral para la conservación de vainilla en Costa Rica, es indispensable salvaguardar los recursos genéticos en un banco de germoplasma in vitro con la intención de perpetuar genotipos valiosos de V. planifolia y, multiplicar de forma masiva dicho material para su posterior uso en unidades productivas. Sin embargo, para lograr esto, es necesario optimizar un protocolo de desinfección que garantice la supervivencia de material vegetal de accesiones únicas, escasas o difíciles de establecer de forma vegetativa en vivero (Azofeifa-Bolaños et al., 2014). El éxito o fracaso de la asepsia en los protocolos de desinfección para el cultivo in vitro de plantas tropicales, ha sido documentado de forma limitada, a pesar de que esta estrategia es un factor clave para lograr el establecimiento y multiplicación óptimo de estas especies (Mng’omba et al., 2012). En el caso particular de la vainilla, la literatura indica diversidad de protocolos de micropropagación donde se mencionan procedimientos de desinfección (Tan et al., 2010; Zuraida et al., 2013; Mujar et al., 2014). No obstante, se obvia la información sobre la efectividad de tales procesos, con excepción del trabajo de Abebe et al. (2009), quienes lograron un 90% de explantes libres de contaminación al utilizar 0,1% HgCl2, de los cuales, solo el 60% sobrevivió a la esterilización. La experiencia en el manejo de los recursos genéticos de vainilla sugiere la necesidad de una estandarización de las desinfecciones, pues el establecimiento aséptico no es fácil. La causa de esto obedece a tres factores: el primero, es la presencia de los microorganismos endófitos que indica la literatura (Khoyratty et al., 2015). El segundo, la sobrevivencia de microorganismos fitopatógenos externos y, el tercero, es el tipo de estrategia llevada a cabo, cuyo diseño, requiere conocer aspectos genéticos y fisiológicos del material (Trigiano y Gray, 2005) Ante la falta de información relacionada con estos métodos y la importancia de la calidad fitosanitaria, como un requisito fundamental en el trasiego de germoplasma y

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla en el óptimo desempeño de las plantas; el objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de un proceso de desinfección de dos fases (vivero y laboratorio), sobre la respuesta morfogenética de vitroplantas de V. planifolia, durante el establecimiento y multiplicación in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Fase de establecimiento Los explantes usados para el establecimiento en laboratorio fueron obtenidos de plantas de V. planifolia correspondientes a la accesión UNA‒VAN‒00229, del banco de germoplasma de vainilla INISEFOR‒ECA, ubicado en la Finca Experimental Santa Lucía, de la UNA, Santa Lucía, Barva, Heredia, Costa Rica (10° 01' 22,188'' N ‒ 84° 06' 46,235'' O, 1278 msnm). Con la finalidad de seleccionar las mejores soluciones desinfectantes para el establecimiento in vitro, se realizó un experimento donde se evaluaron dos condiciones. En vivero se aplicó la desinfección a porciones de plantas de vainilla con dos productos: solución de alcohol 70%, kilol (2,5 ml/l) y agua como testigo. En el laboratorio se hizo la desinfección con: hipoclorito de sodio (NaClO) al 0,35% y el cloruro de mercurio (HgCl2) al 0,20%. La combinación de ambas condiciones resultó en seis tratamientos. En el vivero se seleccionaron seis plantas con al menos 15 entrenudos, a las cuales se les realizó el proceso de desinfección una vez por semana durante cinco semanas consecutivas. Las porciones de planta desinfectadas se cortaron y trasladaron al laboratorio en bolsas de polipropileno, etiquetadas según el tratamiento de desinfección. En el laboratorio, los 30 entrenudos de cada tratamiento de vivero (alcohol, kilol y agua) se colocaron de forma independiente en un frasco de 1000 ml durante una hora con flujo constante de agua. Luego, se colocaron en 500 ml de agua con 20 ml de jabón líquido antibacterial (Protex ®), en agitación constante durante 15 min. El excedente de jabón se eliminó con tres lavados con agua destilada estéril. Posteriormente, los explantes se colocaron en frascos de 100 ml con una solución de alcohol 70% por un minuto.

Se procedió a aplicar los dos tratamientos de desinfección (NaClO y HgCl2) en el laboratorio de la siguiente forma: 15 explantes de cada tratamiento de desinfección en vivero, se colocaron en agitación constante en una solución de NaClO al 0,35% durante 20 minutos y los otros 15 en una solución con HgCl2 al 0,2% por 15 minutos.

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

En todos los tratamientos de desinfección, se realizaron cuatro lavados con agua destilada estéril dentro de la cámara de flujo laminar y previo al establecimiento en el medio de cultivo. Se utilizó un diseño completamente al azar con 15 repeticiones por tratamiento. La unidad experimental consistió de un entrenudo que en promedio presentó una longitud de 4,48 cm, un peso de 1,07 g y un diámetro de 0,51 cm. En total se utilizaron 90 entrenudos de vainilla. Los entrenudos se sembraron en el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS) al 100% complementado con 30,00 g de sacarosa (3% p/v) y 2,70 gL-1 de agente gelificante (Phytagel ®). El pH de la solución del medio de cultivo se ajustó a 5,70 antes de su esterilización. Se utilizaron frascos cilíndricos de vidrio con un diámetro de 4,00 cm, una altura de 13,00 cm y con un volumen de 163,36 ml, en los cuales se dispensaron 20,00 ml del medio de cultivo. La esterilización del medio se realizó a una presión de 1,03 kg/cm2 y 121°C, durante 25 minutos. Para propiciar el crecimiento de los explantes, los cultivos se colocaron en un cuarto de crecimiento a 28°C, 30 μmol m-2 s-1 de intensidad lumínica y un fotoperiodo de 16 horas, por un periodo de dos meses. Se evaluó el porcentaje de contaminación total, fúngica y bacteriana; longitud, peso y diámetro de los brotes nuevos; longitud, peso y número de las raíces adventicias por planta y vigorosidad. Para la obtención de los valores de peso, cada unidad experimental se colocó sobre una balanza electrónica, mientras que para la medición del diámetro y las longitudes se tomaron fotografías graduadas a cada unidad experimental. Los valores absolutos se obtuvieron con un analizador de imágenes. Se analizó la proporción de explantes contaminados, mediante una regresión logística debido a que el número de explantes contaminados es una variable del tipo binomial. A las otras variables de crecimiento de los explantes (longitud, peso y diámetro de los brotes nuevos; longitud, peso y número de raíces) se les aplicó un análisis de varianza (ANDEVA), por ser variables del tipo normal. En todos los casos el modelo consideró dos factores: desinfección en vivero y desinfección en laboratorio; y su interacción. Cuando se obtuvo diferencias significativas entre los niveles de un factor, se efectuó la separación de las medias de mínimos cuadrados mediante la prueba DMS protegida ("protected LSD" en inglés). El primer análisis se hizo con el Proc Genmod y el segundo con el Proc GLM, ambos del paquete estadístico SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Cuando la interacción entre factores resultó significativa se representó mediante un gráfico. Los porcentajes de contaminación total, por hongos y bacterias se obtuvieron mediante tablas de frecuencias.

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

Al finalizar el periodo de evaluación y bajo condiciones asépticas, los brotes vivos y verdes emergidos de los entrenudos sometidos al proceso de desinfección, se cortaron y separaron para la fase de multiplicación.

Fase de multiplicación Para evaluar el efecto de la desinfección sobre la capacidad de multiplicación in vitro de los segmentos nodales obtenidos de la fase anterior, el modelo consideró tres factores: desinfección en vivero, desinfección en laboratorio y contaminación (explantes provenientes de brotes limpios originados de estacas asociadas con contaminación y asépticas). La combinación de los tres factores resultó en 12 tratamientos. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 82 repeticiones para el tratamiento asociado con contaminación y 164 repeticiones para el tratamiento aséptico. La unidad experimental consistió de un segmento nodal de aproximadamente 2,00 cm. En total se utilizaron 246 entrenudos. Los brotes se cultivaron bajo las mismas condiciones de crecimiento anteriormente descritas, excepto en las dimensiones de los frascos cilíndricos de crecimiento: 2,50 cm de diámetro, 15,00 cm de altura y una capacidad de 73,63 ml. Tres meses después de la siembra, se evaluó la longitud y peso del brote. La obtención de los valores de peso y longitud se realizó de la misma forma que durante el establecimiento. Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA). Cuando se obtuvo diferencias significativas entre los niveles de un factor, se efectuó la separación de las medias de mínimos cuadrados mediante la prueba DMS protegida ("protected LSD" en inglés). El análisis se realizó con el Proc GLM del paquete estadístico SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Cuando la interacción entre factores resultó significativa se representó mediante un gráfico. Las estacas infectadas con hongos fueron desechadas, mientras que las contaminadas con bacterias se desinfectaron y subcultivaron para aumentar la cantidad de plantas para ensayos subsecuentes.

Ensayo fitopatológico Una vez evaluado y extraído el explante, los frascos con el medio de crecimiento que presentaron contaminación asociada a los segmentos nodales fueron sellados y trasladados al Laboratorio de Fitopatología de la Escuela de Ciencias Agrarias de la UNA para su respectiva identificación. Las muestras de medio MS con presencia de contaminación fueron subcultivadas en el medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) contenido en placas de petri de 9,00 cm de diámetro y complementado con dos gotas de ácido láctico (25%) para estimular el

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla crecimiento de los hongos y evitar la proliferación de bacterias. Cada muestra se cultivó por duplicado, para incubarlas en la oscuridad y a temperatura ambiente. A partir del cuarto día de incubación, las cajas se observaron diariamente en busca de estructuras morfológicas para la identificación taxonómica de hongos. Las bacterias contaminantes se purificaron en el medio PDA sin acidificar, mediante un estriado sobre el medio endurecido. La caracterización de las colonias de bacterias se realizó utilizando los siguientes criterios: forma, color, elevación, olor y consistencia sobre los medios PDA, YDC (extracto de levadura, dextrosa y carbonato de calcio) y KB (B de King). La morfología se determinó por observación al microscopio de un frotis sometido a la tinción de Gram (Bartholomew y Mittwer, 1952). Las propiedades fisiológicas y bioquímicas se analizaron mediante la aplicación de las pruebas de crecimiento anaeróbico en medio líquido PD (papa‒dextrosa), actividad pectolítica en papa y crecimiento a 37 y 40°C (Schaad et al., 2001).

Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) Con el objetivo de garantizar la calidad fitosanitaria del establecimiento in vitro de las plantas silvestres de V. planifolia, se tomaron 10 muestras de hojas de las plantas utilizadas en los tratamientos de desinfección en invernadero para realizar la prueba serológica conocida como ELISA, para los siguientes virus: potexvirus del mosaico del Cymbidium (CymMV), tobamovirus de la mancha anillada del Odontoglossum (ORSV), cucumovirus del mosaico del pepino (CMV) y potyvirus (Poty). Para cada muestra, se evaluó por duplicado el ensayo de captura de anticuerpos monoclonales conocido como inmunoensayo de triple anticuerpo (TAS‒ELISA) para la detección temprana de antígenos específicos para cada virus. Los reactivos y las condiciones específicas de la prueba serológica fueron proporcionados según las recomendaciones de la casa comercial Agdia®. Los análisis fueron realizados en el Laboratorio del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular de la Universidad de Costa Rica (CIBCM‒UCR).

RESULTADOS A pesar de las consideraciones técnicas implementadas para reducir la carga patogénica de los segmentos nodales durante el establecimiento, algunos géneros comunes de bacterias y hongos persistieron luego del proceso desinfectante. Del total de aislamientos bacterianos encontrados, los géneros predominantes fueron Pantoea (64%), seguido de Erwinia (26%), Acidovorax (4%), Pseudomonas (4%) y Xanthomonas (2%). La predominancia de Pantoea en los medios de cultivo no afectó el crecimiento de la planta en forma cualitativa, pues todas las que presentaron

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla contaminación, crecieron verdes, vigorosas y sin lesiones necróticas. La especie identificada que predominó fue P. citrea y constituye la primera vez que se informa sobre la presencia de la especie en vainilla. Sin embargo, para garantizar la fidelidad genética de los aislados, se necesitan estudios futuros de biología molecular. Para los efectos de este experimento no fue posible establecer una asociación patogénica de Erwinia con vainilla. De la misma forma, en las colonias del género Acidovorax que persistieron después de la desinfección, no fue posible determinar la especie, así como tampoco, su efecto patógeno con vainilla. Por su parte, solo dos aislados de Pseudomonas fluorescens resistieron la desinfección y no mostraron evidencia de afectar los explantes. Por otra parte, en los aislamientos fúngicos, el más frecuente fue Fusarium oxysporum (28%), seguido de hongos con micelio estéril, F. solani, F. semitectum, Fusarium sp. Phoma sp. Alternaria sp. y Cladosporium sp. La supervivencia de F. oxysporum y F. solani en el experimento ocasionó la muerte de las plántulas in vitro, motivo por el cual, la presencia de estas especies, se consideró nociva. De forma opuesta, la persistencia en los aislamientos de Phoma sp. no causó lesiones a la planta, a pesar de ser evidente su manifestación (Figura 1).

A B C D

Figura 1. Contaminación asociada a segmentos nodales de V. planifolia luego del proceso de doble desinfección durante el establecimiento en laboratorio. (A) F. oxysporum, (B) F. solani, (C) Phoma sp. y (D) Erwinia sp. Figure 1. Microorganism contamination of nodal segments of V. planifolia after a double-disinfection process during the establisment in laboratory. (A) F. oxysporum, (B) F. solani, (C) Phoma sp. y (D) Erwinia sp.

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

No hubo diferencias significativas en la interacción entre los factores (desinfección en vivero por desinfección en laboratorio) para las variables contaminación por bacterias (χ2=5,85; n=90; p=0,0538) y debida a hongos (χ2=2,17; n=90; p=0,3375). Sin embargo, la contaminación total (ocasionada por cualquier microorganismo) resultó con diferencias significativas (χ2=6,68; n=90; p=0,0354) en la interacción entre los factores. La contaminación bacteriana fue mayor que la fungosa (Figuras 2 y 3). Independientemente de la solución desinfectante utilizada en el laboratorio, el kilol resultó la solución desinfectante aplicada en el vivero que condujo a la menor contaminación (total, hongos y bacterias) durante el establecimiento de los explantes en el laboratorio (Figura 2). El kilol redujo 2,9, 3,3 y 2,6 veces la contaminación total, por bacterias y hongos respecto al alcohol y 2,5, 2,4 y 2,3 veces la contaminación de estos grupos de microorganismos respecto al testigo. El efecto del alcohol sobre el desarrollo de microorganismos fue similar (p>0,05) al testigo en el vivero (Figura 2).

90 90 30 b p≤,0001 b p≤,0001 b p=0,0687 80 80 b 25 b 70 70 b 60 60 20 50 50 15 40 40 a a 30 30 a 10 20 20 5

Contaminación total (%) total Contaminación 10 10 Contaminación fúngica (%)fúngica Contaminación

0 (%) bacteriana Contaminación 0 0 Alcohol Kilol Testigo Alcohol Kilol Testigo Alcohol Kilol Testigo

Figura 2. Porcentaje de contaminación total, por bacterias y hongos (n=30) en explantes de V. planifolia de acuerdo al tratamiento de desinfección en vivero. En cada gráfico, letras diferentes sobre las barras significan que hay diferencias entre tratamientos de desinfección (p<0,05) según el método de medias de mínimos cuadrados. Valores p asociados al factor desinfección en vivero del ANDEVA. Figure 2. Percentage of total, bacterial and fungal contamination (n=30) in explants of V. planifolia according to the greenhouse disinfection treatments. In each graphic, different lowercase letters above solid bars denote significant differences among treatments (p<0,05), according to least squares means procedures. ANOVA p-values associated to the greenhouse disinfection factor.

Independientemente del desinfectante usado en el vivero, la solución desinfectante utilizada en el laboratorio que redujo en mayor grado la contaminación por

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

microorganismos fue HgCl2 respecto a NaClO (p≤0,0093). Las reducciones fueron 1,8, 1,8 y 2,6 veces la contaminación total, por bacterias y hongos (Figura 3).

80 b p=0,0001 80 p=0,0005 35 p=0,0093 b b 30 60 60 25 a a 20 40 40 15 a 20 20 10

5

Contaminación total (%) total Contaminación Contaminación fúngica (%)fúngica Contaminación

0 (%) bacteriana Contaminación 0 0 NaClO HgCl₂ NaClO HgCl₂ NaClO HgCl₂

Figura 3. Porcentaje de contaminación total, por bacterias y hongos (n=45) en explantes de V. planifolia según tratamientos de desinfección en laboratorio. En cada gráfico, letras diferentes sobre las barras significan que hay diferencias entre tratamientos de desinfección (p<0,05) con el método de medias de mínimos cuadrados. Valores p asociados al factor desinfección en laboratorio del ANDEVA. Figure 3. Percentage of total, bacterial and fungal contamination (n=45) in explants of V. planifolia according to the greenhouse disinfection treatments. In each graphic, different lowercase letters above solid bars denote significant differences among treatments (p<0,05), according to least squares means procedures. ANOVA p-values associated to the greenhouse disinfection factor.

Para contaminación total no hubo diferencias significativas (p≥0,0586) entre los desinfectantes usados en vivero seguido por la desinfección con NaClO en el laboratorio. Por el contrario, cuando el desinfectante en el laboratorio fue el HgCl2 posterior a la desinfección en vivero, se presentó diferencias entre el kilol respecto al alcohol y el testigo (p<0,0001), mientras que entre estos dos últimos tratamientos no hubo diferencias (p=0,1422). Los explantes obtenidos de material vegetal previamente desinfectado con alcohol en el vivero, presentaron una menor contaminación total que alcanzó solo 7% (p=0,6668) con el uso del HgCl2, respecto al NaClO. Por el contrario, los explantes que provenían de material vegetal desinfectados con kilol en el vivero, presentaron una reducción del

53% en contaminación total (p<0,0001) cuando se utilizó HgCl2 en vez de NaClO como desinfectantes en el laboratorio. La combinación kilol y HgCl2 fue altamente efectiva pues evitó por completo la contaminación por cualquier microorganismo. Los explantes provenientes de material vegetal de vivero sin desinfectante (testigo), redujeron su contaminación en un 40% (p=0,0291) al emplear HgCl2 en el laboratorio respecto a

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

NaClO. La eficacia del HgCl2 para reducir la contaminación total en el laboratorio después de usar kilol o agua en el vivero y su poca eficacia después de usar alcohol en el vivero, explica la interacción significativa entre factores (χ2=6,68; n=90; p=0,0354) (Figura 4).

NaClO HgCl₂ p=0,0354 100 a a 80 B a 60 B 40 20 A 0 Contaminación total (%) total Contaminación Alcohol Kilol Testigo

Figura 4. Porcentaje de contaminación total (n=15) de explantes de plantas silvestres de V. planifolia según tratamiento de desinfección en vivero (Alcohol, Kilol, Testigo) y desinfección en laboratorio (NaClO y HgCl2). Letras minúsculas iguales sobre las barras pertenecientes a NaClO significan que no hay diferencias (p>0,05), mientras letras mayúsculas diferentes sobre las barras con HgCl2 significan que hay diferencias entre tratamientos de desinfección en vivero (p<0,05), según el método de medias de mínimos cuadrados. Valor p asociado a la interacción entre los factores desinfección en vivero y desinfección en laboratorio del ANDEVA. Figure 4. Percentage of total contamination (n=15) in explants of V. planifolia according to the greenhouse disinfection (Alcohol, Kilol, Control) and laboratory

(NaClO y HgCl2) treatments. Same lowercase letters above NaClO dark bars denote non-significant (P>0.05) differences, while different capital letters above HgCl2 light bars denote significant (P< 0.05) differences among greenhouse treatments, according to least squares means procedures. ANOVA p-values associated to the interaction between factors.

En cuanto al desarrollo de los explantes, tanto el diámetro del brote como la longitud de raíces presentaron diferencias entre los tratamientos de desinfección en vivero y entre desinfectantes utilizados en el laboratorio, las otras variables no presentaron diferencias significativas excepto el peso de raíces para el factor vivero (Cuadros 1 y 2). El diámetro del brote presentó una diferencia de 7 a 11% mayor cuando provenía de material vegetal de vivero desinfectado con alcohol o kilol respecto al testigo (Cuadro 1). Mientras los explantes desinfectados en el laboratorio con NaClO presentaron mayor diámetro que con HgCl2 (Cuadro 2), por lo cual su uso también

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

puede ser una opción en vainilla cuando se carezca de las instalaciones o mecanismos de eliminación adecuados para los productos de desecho que contienen mercurio. La longitud de las raíces fue de 29 a 33% mayor cuando provenía de material vegetal de vivero con los tratamientos testigo o kilol al compararse con el alcohol. Los

explantes desinfectados en laboratorio con HgCl2 presentaron una longitud de las raíces 21% mayor en contraste con la desinfección con NaClO (Cuadro 2). El peso de las raíces fue de 40 a 45% mayor cuando el material vegetal provenía de vivero sometido a los tratamientos testigo o kilol respecto al alcohol (Cuadro 1).

Cuadro 1. Medias de algunas variables de crecimiento (± error estándar) de los brotes emergentes de V. planifolia durante el establecimiento in vitro según el tratamiento de desinfección en vivero. Table 1. Mean number of some growth parameters (± standard error) from emerging V. planifolia shoots during the in vitro establishment according to the greenhouse disinfection treatment. Brote Raíces Tratamiento Longitud Peso Diámetro Longitud Peso Numero (cm) (g) (cm) (cm) (g) Kilol (n=30) 8,64(0,63) 1,99(0.15) 0,31(0.01)a 4,14(0.32) 5,05(0.46)a 0,11(0.01)a Alcohol (n=30) 9,05(0,64) 1,56(0.16) 0,30(0.01)a 4,44(0.32) 3,40(0.46)b 0,06(0.01)b Testigo (n=30) 8,74(0.60) 1,67(0.15) 0,28(0.01)b 4,51(0.30) 4,78(0.43)a 0,10(0.01)a F* (p)** F (p) F (p) F (p) F (p) F (p) 0,11(0,8953) 2,18(0,1215) 3,81(0,0279) 0,38(0,6867) 3,57(0,0343) 4,43(0,0161) *Estadístico F. **Probabilidad asociada al ANDEVA, en negrita los valores significativos. Tratamientos cuyas medias tienen letras iguales en una misma columna no difieren (p>0,05) según el método de medias de mínimos cuadrados. *F statistic. ** ANOVA p-values. Significant values are shown in bold. Different letters in the same column denote significant differences among treatments (p<0,05), according to least squares means procedures.

Cuadro 2. Medias de algunas variables de crecimiento (± error estándar) de los brotes emergentes de V. planifolia durante el establecimiento in vitro según el tratamiento de desinfección en laboratorio.

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

Table 2. Mean number of some growth parameters (± standard error) from emerging V. planifolia shoots during the in vitro establishment according to the laboratory disinfection treatment. Brote Raíces Tratamiento Longitud Peso Diámetro Longitud Peso Numero (cm) (g) (cm) (cm) (g) NaClO (n=45) 8,36(0,52) 1,66(0,13) 0,31(0,01)a 4,06(0,27) 3,86(0,38)b 0,08(0,01)

HgCl2 (n=45) 9,26(0,50) 1,82(0,12) 0,28(0,01)b 4,68(0,25) 4,90(0,36)a 0,09(0,01) F* (p)** F (p) F (p) F (p) F (p) F (p) 1,53(0,2203) 0,87(0,3546) 7,69(0,0074) 2,81(0,0988) 4,03(0,0493) 0,56(0,4553) *Estadístico F. **Probabilidad asociada al ANDEVA, en negrita los valores significativos. Tratamientos cuyas medias tienen letras iguales en una misma columna no difieren (p>0,05) según el método de medias de mínimos cuadrados. *F statistic. ** ANOVA p-values. Significant values are shown in bold. Different letters in the same column denote significant differences among treatments (p<0,05), according to least squares means procedures.

Para el factor de variación correspondiente a la interacción entre factores, se presentaron diferencias significativas para las variables largo del brote (F=4,43; n=90), peso del brote (F=4,68; n=90), número de raíces (F=4,02; n=90) y peso de raíces (F=3,33; n=90) (Figura 5). Los valores más altos de estas cuatro variables se

obtuvieron con la combinación kilol‒HgCl2, y las mayores diferencias se presentaron

entre la combinación kilol‒HgCl2 respecto a kilol–NaClO (Figura 5). Por su parte, las interacciones para las variables diámetro del brote (F=0,22; n=90; p=0,8019) y longitud de las raíces (F=2,01; n=90; p=0,1433) no fueron significativas.

NaClO HgCl₂ NaClO HgCl₂

15 p=0,0160 3 A p=0,0130 A 2,5 a B a a B a a B 10 a 2 B 1,5 5 1

0,5 Peso (g) del Peso brote

Longitud del brote (cm) brote del Longitud 0 0 Alcohol Kilol Testigo Alcohol Kilol Testigo

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

NaClO HgCl₂ NaClO HgCl₂ p=0,0230 p=0,0424 6 a A A 0,2 A 5 A ab 0,15 4 b a B a 3 0,1 a C 2 0,05

1 Número raíces de Número 0 (g) las raíces de Peso 0 Alcohol Kilol Testigo Alcohol Kilol Testigo

Figura 5. Respuesta morfogenética de algunas variables de crecimiento de plantas silvestres de V. planifolia según tratamiento de desinfección en vivero (Alcohol, Kilol,

Testigo) y desinfección en laboratorio (NaClO y HgCl2). Letras minúsculas iguales sobre las barras pertenecientes a NaClO significan que no hay diferencias (P>0,05), mientras letras mayúsculas diferentes sobre las barras con HgCl2 significa que no hay diferencias entre tratamientos de desinfección en vivero (p>0,05), según el método de medias de mínimos cuadrados. Probabilidad (valor p) asociada a la interacción entre factores del ANDEVA. Figure 5. Morphogenetic responses of some growth parameters of wild V. planifolia plants according to the greenhouse disinfection (Alcohol, Kilol, Control) and laboratory

(NaClO y HgCl2) treatments. Same lowercase letters above NaClO dark bars denote non-significant (P>0.05) differences, while different capital letters above HgCl2 light bars denote significant (P<0.05) differences among greenhouse treatments, according to least squares means procedures. ANOVA p-values associated to the interaction between factors.

La combinación kilol‒HgCl2 obtuvo un incremento de un 36% para la variable longitud del brote en comparación con la combinación kilol‒NaClO (p=0,040), pero, con el resto de combinaciones, el aumento no fue significativo.

Es importante destacar que el efecto del tratamiento combinado kilol‒HgCl2 en el análisis de la variable peso del brote, aumentó un 43% en comparación con la secuencia alcohol‒HgCl2 (p=0,014) y 38% respecto a la combinación kilol‒NaClO (p=0,040). En ninguno de los tratamientos restantes las diferencias fueron significativas.

Para el caso de la variable número de raíces, la combinación kilol‒HgCl2 obtuvo un 37% más raíces que kilol‒NaClO, aunque la diferencia significativa calculada fue marginal (p=0,054).

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

La interacción entre tratamientos no fue significativa para la longitud radical, sin embargo, la mejor combinación indicada de forma previa, incrementó hasta un 47% más el tamaño de las raíces en comparación con el tratamiento alcohol‒HgCl2. Para la variable peso de las raíces, se presentó un 71% de aumento entre el tratamiento kilol‒HgCl2 y entre alcohol‒HgCl2 (p=0,004). En el resto de las combinaciones no hubo diferencias significativas. En lo que se refiere al desarrollo de los explantes en el ensayo de multiplicación se obtuvo diversas respuestas en el análisis de los factores Condición (Cond), Vivero (Viv), Laboratorio (Lab) y las respectivas interacciones.

Cuadro 3. Resultados del ANDEVA de tres vías de los efectos de una desinfección de doble fase en vivero y laboratorio sobre la respuesta de crecimiento de las variables peso y longitud del brote de V. planifolia durante la multiplicación in vitro. Table 3. Three-way ANOVA results of a double-disinfection process in greenhouse and laboratory on the growth response of the variables weight and length of V. planifolia shoots during the in vitro multiplication. Peso Longitud Fuente de variación gl* F** p*** gl F P Condición 1 42,34 <,0001 1 22,63 <,0001 Vivero 2 4,97 0,0077 2 2,73 0,0673 Condición x Vivero 2 2,75 0,066 2 0,94 0,3922 Laboratorio 1 0,89 0,3468 1 0,15 0,6953 Condición x Laboratorio 1 1,51 0,2209 1 2,54 0,1123 Vivero x Laboratorio 2 2,9 0,0568 2 0,27 0,7607 Condición x Vivero x Laboratorio 2 4,17 0,0167 2 1,65 0,1947 *gl=grados de libertad. **Estadístico F. ***Probabilidad asociada al ANDEVA, en negrita los valores significativos (p<0,05). n=246. *df=degrees of freedom. **F statistic. *** ANOVA p-values. Significant values are shown in bold (p<0,05). n=246.

Las variables peso y longitud del brote presentaron diferencias significativas para el factor condición, las otras variables no presentaron diferencias significativas excepto la variable longitud del brote para los factores Viv y la interacción Cond*Viv*Lab (Cuadro 3, Figuras 6‒8). Los brotes sanos generados de la condición que no presentó contaminación (Asp) durante el establecimiento fueron 24% más pesados y largos comparados con los brotes sanos generados de la condición contaminada (Cont) (p≤,0001) (Figura 6). 66

Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

a 20 p≤,0001 4 p≤,0001 a b 15 3 b 10 2

5 1 Peso del brote(g)

0 0 Longitud Longitud brotedel (cm) Contaminación Asepsia Contaminación Asepsia Condición Condición Figura 6. Peso y longitud del brote durante la multiplicación in vitro de V. planifolia según la condición de procedencia del material vegetal (contaminado y aséptico). Letras minúsculas diferentes sobre las barras significan que hay diferencias entre las condiciones (p< 0,05). Valor p asociado al factor condición del ANDEVA. Figure 6. Shoot weight and length of V. planifolia during the in vitro multiplication according to the provenance of the plant material (contaminated and aseptic). Different lowercase letters above light bars denote significant differences among conditions. ANOVA p-values associated to the condition factor.

En vivero, la longitud promedio del material vegetal desinfectado con alcohol fue 9 y 13% mayor respecto al kilol y testigo, respectivamente (p=0,0077) (Figura 7).

20 a p=0,0077 ab b 15

10

5

0 Longitud del brote (cm) brote del Longitud Alcohol Kilol Testigo Condición

Figura 7. Longitud del brote durante la multiplicación in vitro de V. planifolia según el tratamiento de desinfección en vivero del material vegetal. Letras minúsculas diferentes sobre las barras significan que hay diferencias entre las condiciones (p< 0,05). Valor p asociado al factor desinfección en vivero del ANDEVA. Figure 7. Shoot length of V. planifolia during the in vitro multiplication according to the greenhouse disinfection treatment of the plant material. Different lowercase letters above light bars denote significant differences among conditions. ANOVA p-values associated to the greenhouse disinfection factor.

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

La longitud del brote presentó interacción significativa entre los tres factores (p=0,0167). Los valores más altos se obtuvieron a partir de los explantes desarrollados en la condición Asp durante el establecimiento (Figura 8). La mayor diferencia (55%) se presentó entre la combinación alcohol–HgCl2 de esta condición respecto a la combinación testigo–HgCl2 de la condición Cont (p≤0,0001). Además, cuando la comparación se realizó entre los tratamientos de desinfección de vivero (kilol, alcohol, testigo) con la desinfección con NaClO en laboratorio de la condición Cont, la mejor combinación del experimento presentó un incremento de al menos 24% (p=0,001). Para la Asp no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, excepto para alcohol‒HgCl2, la cual presentó 16% más longitud en comparación con kilol‒

HgCl2 (p=0,035).

Figura 8. Longitud del brote de V. planifolia según el tratamiento de desinfección en vivero, en cada nivel de desinfección en laboratorio y de acuerdo a la condición del material (triple interacción entre factores) durante la multiplicación in vitro. Figure 8. Shoot length of V. planifolia during the in vitro multiplication according to the greenhouse disinfection treatment, at each laboratory disinfection level and according to the provenace of the plant material (triple disinfection beetwen factors).

DISCUSIÓN Ante el desafío de lograr plántulas in vitro libres de contaminación y con un desempeño morfogenético adecuado para la producción comercial, se generó un protocolo de desinfección efectivo de doble fase (vivero y laboratorio). Para el logro de 68

Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla ese objetivo se tomaron en consideración aspectos inherentes al explante y fisiológicos del material donante, considerados como fundamentales para la selección del diseño experimental en ensayos generales de cultivo in vitro (Trigiano y Gray, 2005), entre ellos: se verificó con exactitud la fidelidad genética de la población (Azofeifa-Bolaños et al., 2017), se revigorizó el material en vivero (ambiente protegido) para aumentar el crecimiento activo de los brotes y disminuir la carga microbiana de las plantas silvestres expuestas a la lluvia y polvo (George et al., 2008), se utilizó un tamaño de explante adecuado, tanto en vivero como en laboratorio y se realizó un preacondicionamiento (desinfección) en vivero en la época más seca del año. Éste último procedimiento es fundamental en las plantas que viven en asociación con hongos endófitos (Mng’omba et al., 2012), como es el caso de V. planifolia (Khoyratty et al., 2015). En lo que concierne a la presencia de bacterias del género Pantoea, posterior al proceso de desinfección, está ampliamente documentada la acción fitopatógena de algunos de sus miembros (Walterson y Stavrinides, 2015). No obstante, los resultados demostraron que su presencia no limitó las respuestas morfogenéticas. De forma similar, Luna-Guevara et al. (2016) determinaron la frecuencia de aislamiento de esta bacteria en frutos verdes y beneficiados, sin daño físico ni crecimiento microbiológico aparente, lo cual sugiere que en vainilla, Pantoea sp., es un microorganismo endófito. En relación con los géneros Erwinia y Acidovorax, la mayoría de sus miembros son considerados fitopatógenos (Fegan, 2006; Kado, 2006), y su permanencia luego del proceso de desinfección podría considerarse un aspecto negativo, sin embargo, no fue posible establecer una asociación patogénica con vainilla. Esta condición la presentan algunas especies que se encuentran con frecuencia en el suelo, agua y como endófitas, las cuales son incapaces de ejercer acción patogénica en plantas (Fegan, 2006). Acerca de la presencia de P. fluorescens, es importante señalar que algunas cepas han obtenido buenos resultados para el combate biológico de F. oxysporum en vainilla en campo (Radjacommare et al., 2010), mientras que otras, muestran una fuerte actividad antagónica in vitro (Gangadara et al., 2010), sin embargo, en la presente investigación, no se determinó la posible acción antagonista de esta bacteria. En lo que se refiere a la presencia de Fusarium spp., los resultados concuerdan con los publicados por Pinaria et al. (2010), quienes hallaron F. oxysporum en un 55,72% del total de los aislamientos, seguido de F. solani (25,65%) y F. semitectum (11,07%). Aunque F. oxysporum se ha identificado como un endófito en vainilla, la forma especial vanillae, es el agente causal de la pudrición del tallo y la raíz en V. planifolia en todas las áreas productoras, mientras que F. solani se considera como patógeno secundario

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

(Koyyappurath et al., 2016). Por otro lado, F. semitectum está asociado a diversas enfermedades en varios cultivos, pero en vainilla, es considerado un endófito o un colonizador saprofítico del tallo con una capacidad de establecerse en las partes aéreas de las plantas como un invasor secundario (Pinaria et al., 2010). El hongo Phoma sp., es reconocido como fitopatógeno, pero en pruebas de patogenicidad en vainilla no indujo lesiones necróticas en los tallos (Santa et al., 2012), por lo cual, se considera un hongo endófito (Ordóñez et al., 2012).

Los resultados obtenidos permiten concluir que el HgCl2 fue más efectivo que el NaClO como desinfectante, tanto de manera independiente como combinada con un previo tratamiento de desinfección en vivero. Con respecto a este desempeño, se confirmó por qué el cloruro de mercurio es el agente más utilizado en los protocolos de cultivo in vitro de vainilla en laboratorios de todo el mundo (Geetha y Shetty, 2000; Kalimuthu et al., 2006; Janarthanam y Seshadri, 2008; Divakaran y Babu, 2009; Tan et al., 2011; Renuga y Saravana Kumar, 2014). La efectividad del proceso de doble desinfección concuerda con los resultados de Mng’omba et al. (2012), quienes determinaron que la aplicación de fungicidas a las plantas madres contribuyeron de forma significativa a las condiciones asépticas de los cultivos in vitro. Además, los mismos autores afirmaron que una fase previa de desinfección en vivero puede disminuir la necesidad de usar desinfectantes más fuertes en laboratorio como el HgCl2. Los resultados de este experimento, concordaron de forma parcial con los investigadores antes mencionados, pues el proceso de desinfección en vivero con kilol logró disminuir la contaminación en laboratorio tanto con el uso de NaClO como HgCl2; aún así, la efectividad de los tratamientos restantes fue menor, lo cual indica la necesidad de mejorar el protocolo de establecimiento con agentes esterilizadores para el material vegetal e inocuos para el explante, el ser humano y el ambiente. Sin embargo, ante la falta de metodologías efectivas para el cultivo aséptico en laboratorio y para el establecimiento formal de ensayos, en vainilla o algunas especies leñosas con endófitos, el HgCl2 continúa siendo la mejor opción. Al respecto, se concluyó que el uso de alcohol como método preventivo en vivero, no es funcional para disminuir la contaminación, incluso en presencia de HgCl2, lo cual podría explicarse, al menos de forma parcial, por la cutícula, cuya estructura está compuesta por polímeros lipofílicos (cutina y ceras), que dentro de sus funciones está prevenir a la planta del déficit hídrico y proveer una barrera muy efectiva contra la entrada de patógenos (Reina-Pinto y Yephremov, 2009). Por lo tanto, si hay ruptura de la composición de la cutícula por la acción de solventes orgánicos como el alcohol, se

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla elimina una de las barreras naturales al contacto con los patógenos (Tafolla-Arellano et., 2013).

Es importante mencionar que, aunque el HgCl2 es un potente antiséptico de amplio espectro, su uso debe ser analizado con anterioridad al establecimiento in vitro de cada cultivo, pues su efectividad puede ser menor si no se aplica un procedimiento de desinfección previo en vivero. Por ejemplo, el uso de este compuesto durante el proceso de desinfección de la especie Uapaca kirkiana (Phyllanthaceae), fue menos eficiente cuando se utilizaron explantes de especímenes colectados directamente del campo (Mng’omba et al., 2007). Aún así, es importante señalar que en Costa Rica los protocolos de desinfección clásicos que utilizan diversas concentraciones de hipoclorito de calcio [Ca(ClO)2], NaClO, alcohol y otros no han logrado la asepsia adecuada para el establecimiento in vitro de vainilla (datos no mostrados), lo cual implica una pérdida constante de material genético promisorio que compromete la supervivencia de las plantas, muchas de las cuales son escasas y únicas. En cuanto a la respuesta morfogenética de la longitud del brote, en ausencia de reguladores de crecimiento, los resultados de este trabajo fueron muy superiores a los indicados en algunos procedimientos de otros autores (Giridhar y Ravishankar, 2004; Tan et al., 2011; Zuraida et al., 2013). En este sentido, el promedio logrado (10,54 ± 0,89 cm) no se ha obtenido en protocolos con periodos de evaluación de 60 días, aún con el uso de reguladores de crecimiento. Al respecto, se han obtenido valores de 4,20 ± 0,14 cm al utilizar un medio MS complementado con 1 mg/l BAP (Tan et al., 2011), 3,8 ± 0,2 cm en un medio MS complementado con 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l ANA (Tan et al., 2010) y 2,9 ± 0,19 cm en un medio MS complementado con 5 mg/l BAP + 1 mg/l AFA (ácido fenilacético) (Giridhar et., 2003). Otros protocolos similares con un periodo de evaluación de 45 días originaron valores de 4,5 ± 0,14 cm (Zuraida et al., 2013), 2,6 ± 0,1 cm (Giridhar y Ravishankar, 2004) y 3,81 ± 0,33 cm (Giridhar et al., 2001). En lo que respecta al desarrollo morfogenético de la variable longitud de la raíz, en ausencia de auxinas y en medio MS, los resultados de este trabajo (6,20 ± 0,63 cm) no coinciden con referencias previas donde se evaluó esta variable. Los valores anteriores, están por encima de muchas investigaciones donde se complementaron los medios con auxinas, las cuales son precursoras de los meristemos radiculares (George et al., 2008). Por ejemplo, al complementar el medio MS con 2 mg/l BAP + 1 mg/l AFA se obtuvo 1,04 ± 0,25 cm después de 60 días de evaluación (Giridhar et al., 2003). Otros investigadores, después de 30 días de evaluación, obtuvieron 4,52 ± 0,21 cm en medio MS (Zuraida et al., 2013), 4,01 ± 0,22 cm y 4,42 ± 0,2 al complementar el medio MS con 1 mg/l de ANA (Tan et al., 2010, 2011). Por su parte, Janarthanam y

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla

Seshadri (2008) obtuvieron 6,37 ± 1,10 cm al complementar el medio con 1 mg/l de AIA + 0,1 mg/l de ANA, mientras que Giridhar et al. (2001), obtuvieron 8,5 ± 2,07 cm con el uso de 2 mg/l de AIB, ambos trabajos obtuvieron los resultados mencionados después de un periodo de observación de 45 días. Este es el primer trabajo que indica valores de referencia para las variables peso y diámetro del brote, número y peso de raíces durante el establecimiento in vitro de V. planifolia, los cuales podrían incorporarse como parámetros agronómicos importantes para la selección temprana de rasgos deseables en futuros programas de mejoramiento. Las investigaciones basadas en las mediciones de las variables longitud del brote y longitud de la raíz no proporcionan argumentos suficientes para este trabajo como una medida confiable del rendimiento morfogenético, pues un mayor tamaño no significa una mejor vigorosidad de la planta ni una mayor adaptación a condiciones ex vitro. Los resultados de este experimento permitieron la obtención de mayores evidencias para la definición de una planta vigorosa y saludable adecuada para la producción comercial, la cual se podría usar de forma directa durante la aclimatización, pues los valores de longitud del brote y longitud de la raíz, complementados con los valores de las demás variables, fueron mayores en comparación con los protocolos indicados en la literatura. Durante el establecimiento in vitro de vainilla, este trabajo sugiere indicar valores de referencia homogéneos de la longitud, peso y diámetro de los explantes iniciales. Lo anterior, para evitar que los volúmenes heterogéneos, modifiquen las reservas de carbono, y por tanto, la respuesta organogénica. Esto, junto con las diferentes condiciones experimentales, no permite una comparación adecuada del potencial morfogénico del explante entre un trabajo y otro. Resultados similares a los de esta investigación, en cuanto al diseño, la eficiencia en la desinfección del HgCl2 y el efecto sobre la regeneración se obtuvieron en maní (Arachis hypogaea L.) (Maina et al., 2010). La interacción entre los tres factores (Figura 8), validó los resultados de los efectos independientes y demostró que la desinfección en vainilla tiene efectos directos en la longitud del brote en el proceso de multiplicación, por lo cual, no sólo hay que considerar el mecanismo de desinfección aplicado durante las fases iniciales sino la condición del material procedente de la fase de establecimiento. Si el material proviene de brotes limpios que se originaron de estacas asociadas con contaminación bacteriana, la longitud será menor que si proceden de medios asépticos (p≤0,05). Los resultados de esta investigación, refuerzan la tesis de que el éxito de un protocolo de cultivo de tejidos empieza con una esterilización efectiva de los explantes. Para el caso particular de la vainilla, este trabajo es quizá el primero en el que se muestra el

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla efecto de la contaminación asociada a los segmentos nodales de vainilla sobre el rendimiento morfogenético durante el establecimiento y multiplicación. Si bien los resultados indicaron que se puede obtener respuestas morfogenéticas en presencia de contaminación, la prevalencia de contaminantes in vitro puede liberar toxinas que al ser absorbidas por las plantas, limitan su desarrollo; además, estos contaminantes compiten por los componentes nutricionales del medio de cultivo (Pierik, 1997; George, 2008). Las evidencias encontradas concuerdan con lo propuesto por los autores antes mencionados, tanto en el ensayo de establecimiento como en el de multiplicación, puesto que, aún cuando las plantas en los medios contaminados permanecieron verdes y vigorosas de manera visible, los valores de crecimiento evaluados, fueron estadísticamente menores que los obtenidos en los medios libres de microorganismos. Los análisis serológicos del material utilizado demostraron la ausencia de los virus más comunes en vainilla y confirma de nuevo que, en Costa Rica, los principales problemas fitosanitarios de la vainilla y otras orquídeas, son causados principalmente por hongos y bacterias comunes (Rivera-Coto y Corrales-Moreira, 2007). Por esta razón, en cualquier intercambio de material vegetal entre países, es necesario reducir el riesgo de introducir patógenos exóticos (en especial virus), por lo que es perentorio cumplir con las obligaciones de la Convención Internacional de Protección Fitosanitaria (CIPF) (https://www.ippc.int/es/), en especial lo concerniente al certificado fitosanitario que se requiere para cualquier transferencia de material vegetal (Roux-Cuvelier y Grisoni, 2010).

CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en la presente investigación demostraron que el protocolo propuesto de esterilización y regeneración fue apropiado para el establecimiento y multiplicación in vitro de plantas silvestres de V. planifolia. Se logró un 100% de explantes libres de contaminantes durante el establecimiento de segmentos nodales homogéneos en cuanto a longitud, peso y diámetro con el uso de un proceso de doble desinfección (kilol en vivero y HgCl2 en laboratorio). Esta práctica fue la más eficiente para el establecimiento formal de ensayos, la reducción óptima de la carga microbiológica y para el aumento significativo de la respuesta morfogenética de las variables de crecimiento durante el establecimiento y multiplicación sin el uso de aditivos al medio de cultivo. La aplicación de este proceso constituirá un aporte para la conservación ex situ de las vainillas costarricenses. En consecuencia, si el país pretende establecer plantaciones comerciales a partir de material genético certificado en el corto y mediano plazo, hay que continuar con la

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Efecto de la desinfección sobre la morfogénesis in vitro de vainilla optimización de estos protocolos y, paralelo a ello, es necesaria la caracterización morfológica, molecular, bioquímica y agronómica de las plantas donantes antes del establecimiento de un programa de micropropagación comercial.

AGRADECIMIENTOS A Stefanny Orozco Cayasso y Juan Pablo Castillo Jiménez del Laboratorio de Fitopatología de la ECA‒UNA por su ayuda en los ensayos fitopatológicos, a Lisela Moreira Carmona y William Villalobos Müller del CIBCM‒UCR por su colaboración en las pruebas serológicas. Este trabajo es parte de los requisitos de graduación del programa de Maestría Académica en Manejo de Recursos Naturales de la Universidad Estatal a Distancia de Costa Rica.

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CAPITULO III

Respuestas morfogenéticas de plantas in vitro y esquejes de Vanilla planifolia Andrews (Orchidaceae) durante el desarrollo inicial del cultivo en vivero y en sistemas agroforestales

José Bernal Azofeifa Bolaños Maestría en Manejo de Recursos Naturales, UNED. Instituto de Investigación y Servicios Forestales, Universidad Nacional de Costa Rica, Heredia, Costa Rica; [email protected]

(Este artículo será publicado con las siguientes coautorías: José Bernal Azofeifa-Bolaños, Germán Rivera-Coto, Amelia Paniagua-Vásquez y Roberto Cordero-Solorzano. Cuadernos de Investigación UNED).

ABSTRACT Morphogenetic responses of in vitro plants and cuttings of Vanilla planifolia Andrews (Orchidaceae) during the initial development of the culture in greenhouse and agroforestry systems. Vanilla planifolia is the most economically important orchid in the world. However, a hybrid widely grown in Costa Rica since nineties with good resistance to Fusarium spp., and imported from Madagascar, has provoked a lack of technical knowledge about morphogenetic responses of V. planifolia. The aim of this research was to compare the effect of the plant type (cutting and micro cutting) on the morphogenetic response of Vanilla planifolia under two growing conditions: nursery and an agroforestry system (Four treatments). The independent effects for both factors were significantly different for the variables total weight and emergent shoot, number of internodes, length and weight of roots (p <0.05). The total length and the average root length only showed significant differences for the explant type factor, while the variable number of roots only showed significant differences for the condition factor (p <0.05). Significant interaction between factors were obtained for all variables except for the total weight and the emergent shoot (p <0.05). The vitroplants cultivated in an agroforestry system, after a period of acclimatization in nursery, presented higher agronomic characteristics in relation to the cuttings grown in both conditions, as well as the vitroplants grown in nursery. The highest values for the variables root length and weight were obtained when cuttings 78

were grown at nursery, suggesting a more intense growth and development mechanism in the search for water and nutrient supplies. The results of this research are the first data evaluated in a systematic form of some agronomic characteristics during the initial development of V. planifolia in Costa Rica, and evidence the lack of this type of research to improve the knowledge of the species as a high-quality commercial crop. Key words: vanilla, wild type relatives, domestication, Costa Rica

RESUMEN

Vanilla planifolia es la orquídea económicamente más importante del mundo, sin embargo, el cultivo comercial en Costa Rica de esta especie fue desplazado por un híbrido resistente a fusariosis e importado de Madagascar en los años noventa. Esta situación provocó un vacío de información sobre aspectos morfogenéticos de V. planifolia. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue comparar el efecto que ocasiona la procedencia del explante (esqueje y plántula in vitro) sobre la respuesta morfogenética en condiciones de vivero y en un sistema agroforestal (cuatro tratamientos). Los efectos independientes de ambos factores presentaron diferencias significativas para las variables peso total y del brote emergente, número de entrenudos, longitud y peso de las raíces. Las variables longitud total y promedio de las raíces solo presentaron diferencias significativas para el factor tipo de explante, mientras que la variable número de raíces solo presentó diferencias para el factor condición de crecimiento. En cuanto a los efectos explicados mediante la interacción significativa entre ambos factores se incluyeron todas las variables excepto el peso total y del brote emergente. Se concluyó que las vitroplantas cultivadas en un sistema agroforestal, después de un periodo de aclimatización en vivero, presentaron características agronómicas superiores en relación con los esquejes cultivados en ambas condiciones, así como, las vitroplantas cultivadas en vivero. Los mayores valores para las variables longitud y peso de las raíces se obtuvieron cuando se cultivaron esquejes en vivero, lo cual sugiere un mecanismo de alargamiento radical más intenso en la búsqueda de los suministros de agua y nutrientes. Los resultados de esta investigación son los primeros datos que evalúan de forma sistemática características agronómicas durante el desarrollo inicial de V. planifolia en Costa Rica, y evidencian, la carencia de este tipo de investigaciones para mejorar el conocimiento de la especie como cultivo comercial. Palabras claves: vainilla, parientes silvestres, domesticación, Costa Rica

Cantidad de palabras: 5539

En los últimos 30 años, el conocimiento en Costa Rica sobre aspectos morfogenéticos en vainilla, tanto en condiciones de vivero y de campo, se debe, casi exclusivamente, al cultivo de un híbrido desarrollado en Madagascar entre Vanilla planifolia (herencia materna) y V. pompona (herencia paterna), el cual es más resistente a la principal enfermedad del cultivo ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. radicis-vanillae (Belanger & Havkin-Frenkel, 2011). Sin embargo, sólo V. planifolia y V. × tahitensis son permitidas en Estados Unidos (principal consumidor mundial) como productos alimenticios (21CFR169.175). Para lograr el ingreso a ese mercado en condiciones óptimas de competencia es necesario un cambio en las poblaciones de vainilla cultivada en el país, para lo cual se requiere contar con información básica sobre una serie de aspectos agronómicos que garanticen el éxito de futuras plantaciones. Cuando se analiza la disponibilidad de tales conocimientos generados en Costa Rica, se observa un vacío de información aplicable a V. planifolia. Esta especie, de la cual hay materiales silvestres en el país, puede establecerse por dos vías: por medio de plantas producidas in vitro o mediante esquejes obtenidos en fincas o de plantas silvestres. La primera opción es la más

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viable, pues no pone en riesgo las escasas poblaciones silvestres (Azofeifa-Bolaños, Paniagua-Vásquez & García-García, 2014). Sin embargo, no se cuenta con parámetros comparativos de la respuesta morfogenética de plantas producidas in vitro respecto a esquejes de plantas, durante el desarrollo inicial en vivero y campo; información fundamental para promover el uso y comercialización de recursos fitogenéticos nativos, sin afectar su conservación, dándoles un manejo sostenible en el tiempo. Lo cual se enmarca dentro del modelo de desarrollo impulsado por el gobierno, que busca la conciliación de la conservación del patrimonio natural con el crecimiento económico (Azofeifa-Bolaños et al., 2014). Consiente de esta problemática la Universidad Nacional de Costa Rica, está realizando esfuerzos para propiciar este modelo dentro de sus investigaciones, por lo que procura dar el mejor manejo posible al material genético de vainilla que posee en el banco de germoplasma, que entre sus accesiones cuenta con 10 genotipos silvestres de V. planifolia coleccionados en los bosques de la costa Caribe (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). Este germoplasma es de importancia para preservar e incrementar la variabilidad genética del cultivo, debido a las condiciones críticas de conservación de la especie en estado silvestre (Soto- Arenas & Solano-Gómez, 2007; Soto-Arenas, 1999). Como parte de esta estrategia, es prioritario la caracterización morfoagronómica de este material silvestre para generar datos de su potencial productivo que permita la toma de decisiones por parte de los mejoradores del cultivo. Por lo tanto, el beneficio principal de este estudio será determinar si las plantas procedentes de laboratorio, muestran características agronómicas superiores durante el desarrollo inicial del cultivo, con respecto a las procedentes de esquejes de plantas maduras originarias de poblaciones silvestres.

MATERIALES Y MÉTODOS Los explantes usados para el experimento fueron obtenidos de plantas de V. planifolia caracterizadas mediante descriptores morfológicos y moleculares correspondientes a individuos de la accesión UNA-VAN-00229 de la colección de vainilla a cargo de la UNA (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). La aclimatización de las vitroplantas y los ensayos de vivero se realizaron en un invernadero del Instituto de Investigación y Servicios Forestales (INISEFOR-UNA), Santa Lucía, Barva, Heredia (coordenadas geográficas aproximadas 10° 01' 21,93'' N - 84° 06' 43,6 W), el cual fue acondicionado con sarán (malla al 50% de sombra). Las condiciones atmosféricas dentro del invernadero tuvieron un promedio de 81% de humedad relativa con valores mínimos de 38,5 y máximos de 100 y una temperatura de 23°C que osciló entre 17 y 39°C. Se aplicó riego manual dos veces por semana. La investigación en campo se realizó en la finca "Río Blanco", ubicada en La Colonia de Guápiles, Pococí, Limón (Coordenadas geográficas aproximadas 10° 15' 57,1'' N ‒ 83° 49' 06,4'' W) (Figura 1). La parcela experimental de 5239 m2 se trabajó bajo un diseño espacial en sistemas agroforestales con árboles de las especies Minquartia guianensis Aubl., Cordia alliodora (Ruiz & Pav.) Oken., Virola koschnyi Warb., Vochysia ferruginea Mart. e Hyeronima alchorneoides Allemão sembrados cada 5 x 5 m y árboles tutores de las especies Erythrina sp (Poró) y Gliricidia sepium (madero negro) sembrados cada 2 x 2 m, los cuales le proporcionaron sombra natural a los explantes de vainilla (Figura 2). La topografía de la zona es plana con una altura promedio de 157 m.s.n.m. El clima es cálido húmedo con promedios anuales de 4577,2 mm de precipitación, 87% de humedad relativa y 24,4°C de temperatura (IMN, 2011). Los suelos de la zona son franco arenosos. La zona de vida según Holdridge es bosque muy húmedo tropical (bmhT) (Quesada, 2007).

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Figura 1. Ubicación de la parcela experimental de Vanilla planifolia en Sistemas Agroforestales, Guápiles, Costa Rica.

Figura 2. Parcela experimental establecida en La Colonia de Guápiles con un arreglo espacial en sistemas agroforestales. En la foto, árboles de Vochysia sp. y Erythrina sp.

Con el objetivo de comparar el desempeño agronómico inicial de esquejes y vitroplantas durante el establecimiento en vivero y campo, se realizó un experimento bifactorial (2 x 2). El primer factor consistió en el tipo de explante a dos niveles: esqueje tradicional y vitroplanta. El segundo factor fue la condición de cultivo, vivero y campo. La combinación de los niveles de ambos factores resultó en cuatro tratamientos (Figuras 3 y 4).

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A B C D

Figura 3. Tipos de explantes en cada condición de crecimiento: vitroplanta en campo (A) y vivero (B). Esqueje en campo (C) y vivero (D).

En el vivero, cada tipo de explante se cultivó en un sustrato compuesto de musgo Sphagnum L., arena y piedra, asociado a tutores artificiales de madera, mientras en la condición de campo, los explantes se cultivaron en asocio a un árbol tutor de Poró (Erythrina sp.) con una longitud aproximada de 2,0 m. Se utilizó un diseño experimental no balanceado completamente al azar con 49 repeticiones para el tratamiento que usó esquejes y 41 para el tratamiento que usó vitroplantas. La unidad experimental consistió de un tipo de explante con ocho entrenudos cultivada en cada condición. Para evitar heterogeneidad en los resultados, las plantas usadas fueron uniformes en longitud y peso (Gómez, 2012). Para el caso de los esquejes, se utilizaron un total de 69 unidades experimentales con una longitud promedio de 61,02 cm y un peso de 20,7 g. Por su parte, se utilizaron 41 vitroplantas con una longitud aproximada de 18,26 cm y un peso promedio de 3,26 g. En total se utilizaron 110 tipos de explantes en ambas condiciones durante seis meses. Después del periodo de evaluación, se midió la longitud, el peso total y del brote nuevo, el número de entrenudos; la longitud total y promedio, el peso y el número de raíces totales. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza previa comprobación de la normalidad de los datos y homogeneidad de varianzas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SAS v9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Para los casos donde se registró diferencias significativas entre los niveles de un factor, se aplicó la prueba la separación de las medias de mínimos cuadrados mediante la prueba DMS protegida ("protected LSD" en inglés).

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RESULTADOS En relación con la respuesta morfogenética de los explantes, se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos que evaluaron el tipo de explante y entre las condiciones de cultivo para las variables peso total y del brote emergente, número de entrenudos, longitud y peso de las raíces (Cuadro 1 y 2). De forma independiente a la condición de cultivo, el esqueje incrementó los valores de las variables longitud, peso total y del brote emergente, longitud total, promedio y peso de las raíces un 17, 64, 46, 39, 50 y 54%, respectivamente. Con el uso de vitroplantas se incrementó un 21% más los entrenudos en comparación con los esquejes. Por otra parte, solo la longitud total y promedio de las raíces presentaron diferencias significativas para el factor tipo de explante (Cuadro 2).

Cuadro 1. Medias de algunas variables de crecimiento (± error estándar) de los brotes de V. planifolia según el tipo de explante. Tratamiento Brote Raíces

Longitud Peso Total Peso Número Longitud Longitud Peso Número (cm) (g) (g) entrenudos total (cm) (cm) (g) In vitro (n=41) 37,01(2,62)a 11,61(1,93)a 9,85(1,30)a 14,07(0,62)b 80,16(8,83)a 5,40(0,58)a 0,96(0,17)a 12,45(0,63)a Esqueje (n=49) 44,82(2,44)b 32,03(1,80)b 18,18(1,24)b 11,17(0,57)a 132,54(8,22)b 10,92(0,54)b 2,11(0,15)b 12,01(0,59)a

F* (p)** F (p) F (p) F (p) F (p) F (p) F (p) F (p)

4,75(0,032) 59,76(<,0001) 21,48(<,0001) 11,88(0,0009) 18,85(<,0001) 48,48(<,0001) 25,78(<,0001) 0,26(0,6117) * Estadístico F. **Probabilidad asociada al ANDEVA, en negrita los valores significativos. Tratamientos cuyas medias tienen letras diferentes en una misma columna difieren (p<0,05) según el método de medias de mínimos cuadrados.

En lo que se refiere a los efectos independientes del factor condición de crecimiento respecto al tipo de explante, se presentaron valores mayores para todas las variables medidas en el campo en comparación con el vivero, excepto para la variable longitud promedio de la raíz, que presentó un aumento no significativo de 7%. La variación del crecimiento de los explantes para la condición campo en relación con el vivero fue de 44, 43, 66, 59, 30 y 25% mayor para las variables longitud, peso total y del brote emergente, número de entrenudos, peso y número de raíces (Cuadro 3).

Cuadro 2. Medias de algunas variables de crecimiento (± error estándar) de los brotes de V. planifolia según la condición de cultivo. Tratamiento Brote Raíces Peso Total Número Longitud Longitud Longitud (cm) Peso (g) Peso (g) Número (g) entrenudos Total (cm) (cm) Vivero (n=41) 29,44(2,62)a 15,80(1,93)a 7,12(1,32)a 7,36(0,62)a 96,97(8,83)a 8,46(0,58)a 1,26(0,17)a 10,44(0,63)a Campo (n=49) 52,39(2,44)b 27,84(1,80)b 20,91(1,22)b 17,88(0,57)b 115,73(8,22)a 7,86(0,54)a 1,81(0,15)b 14,02(0,59)b

F* (p)** F (p) F (p) F (p) F (p) F (p) F (p) F (p)

41,04(<,0001) 20,75(<,0001) 58,87(<,0001) 156,68(<,0001) 2,42(0,1237) 0,57(0,4512) 6,01(0,0162) 17,29(0,0001) * Estadístico F. **Probabilidad asociada al ANDEVA, en negrita los valores significativos. Tratamientos cuyas medias tienen letras iguales en una misma columna no difieren (p>0,05) según el método de medias de mínimos cuadrados.

Para el factor de variación correspondiente a la interacción entre factores (tipo de explante por condición de cultivo), se presentaron diferencias significativas para las variables largo del brote (F=31,91; n=90), número de entrenudos (F=42,57; n=90), número de raíces (F=10,32; n=90), longitud radical total (F=28,92; n=90), longitud radical promedio (F=16,85; n=90) y peso de raíces (F=9,39; n=90) (Figura 4). Solo la variable peso del explante (F=0,12; n=90; p=0,7331), no presentó diferencias significativas en la interacción entre los factores. 83

In vitro Esqueje In vitro Esqueje p<,0001 p<,0001 80 30 c c 60 B BC 20 B 40 A a 10 a 20

0 0 Número entrenudosde Número Longitud del brote (cm) brote del Longitud Vivero Campo Vivero Campo

In vitro Esqueje In vitro Esqueje p=0,0019 p<,0001 20 200 b B A 15 A 150 b B a 10 100 a

5 50 Número raíces de Número 0 0

Vivero Campo Longitud radical (cm) total Vivero Campo

In vitro Esqueje In vitro Esqueje p=0,0001 p=0,0029 15 C 3 B B B 10 2 b ab a 5 1

a Peso radical (g) Peso

Longitud radical (cm) radical Longitud 0 0 Vivero Campo Vivero Campo

Figura 4. Respuesta morfogenética de algunas variables de crecimiento de plantas silvestres de V. planifolia según tratamiento de condición de cultivo y tipo de explante. *Letras minúsculas diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos que evaluaron el crecimiento de plántulas in vitro en condiciones de vivero y campo, y las mayúsculas, el crecimiento de los esquejes en ambas condiciones (p≤0,05), según el método de medias de mínimos cuadrados. Valor p asociado a la interacción entre factores del ANDEVA.

Los valores más altos para las variables longitud del brote, número de entrenudos y el número de raíces se obtuvieron con la combinación de plantas procedentes del cultivo in vitro cultivadas en condiciones de campo. Por su parte, los explantes procedentes de esquejes y cultivados en condiciones de vivero presentaron los valores más altos para las variables radiculares (Figura 4). Los valores más bajos obtenidos en el experimento para todas las variables evaluadas se obtuvieron con las plantas procedentes de laboratorio cultivadas en condiciones de vivero (Figura 4). Para el caso de la longitud del brote, las mayores diferencias fueron de 74 y 26% entre la combinación in vitro – campo respecto a las combinaciones que usaron explantes in vitro (p<,0001) y esquejes (p=0,038) en la condición vivero. Las mayores diferencias en cuanto al número de entrenudos fueron de 73, 61 y 38% entre la combinación in vitro – campo en comparación con los tratamientos in vitro – vivero, esqueje – vivero y esqueje – campo (P<,0001).

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Los explantes in vitro aumentaron el número de raíces un 40% cuando se cultivaron en campo respecto a los cultivados en vivero (p<,0001) y un 26 y 21% más raíces que los explantes tradicionales cultivados en vivero y campo (P<0,038). Por su parte, el alcance radical de las raíces primarias, secundarias y terciarias fue 75% mayor cuando se cultivó el esqueje tradicional en vivero respecto a la vitroplanta (p<,0001) y de 30 y 22% en comparación con los esquejes y vitroplantas cultivados en campo (P≥0,105). Mientras, el largo de la raíz se incrementó 68, 48 y 30% cuando se cultivaron los esquejes en condiciones de vivero respecto a las vitroplantas cultivadas en vivero y campo, así como a los esquejes cultivados en campo. El peso radical fue más de 6 veces mayor cuando los esquejes tradicionales se cultivaron en vivero respecto a las vitroplantas (p<,0001) pero de solo 27 y 6% comparado con los esquejes y vitroplantas cultivados en campo (P≥0,294).

DISCUSIÓN Ante la falta de información relacionada con el manejo agronómico de individuos silvestres de V. planifolia, en condiciones de invernadero y campo a partir de plántulas in vitro y esquejes, se obtuvo un protocolo de manejo que generó información científica básica para conocer la variabilidad de algunos parámetros de crecimiento de forma temporal y espacial; para de esta forma, contribuir a la comprensión de algunos aspectos organogénicos fundamentales en cuanto al desarrollo inicial de la especie como cultivo comercial. Aunque se logró un 100% de sobrevivencia durante la aclimatización y endurecimiento de las vitroplantas en vivero, este tipo de explante presentó los valores más bajos para todas las variables en esta condición, lo cual evidencia que los estudios para dar seguimiento de forma sistemática a las respuestas morfogénicas de estos procesos durante el desarrollo inicial, son nulos. Si solo se considera estos valores porcentuales como una estrategia eficaz del procedimiento para la multiplicación masiva y la generación de plantas libres de plagas y enfermedades. En relación con la longitud del brote lograda en este trabajo (58,61 ± 3,93 cm), no hay información en los protocolos de aclimatización que evalúan plantas originadas a partir del cultivo in vitro para ninguna condición de crecimiento durante un periodo como el estudiado (seis meses). Tales trabajos, solo indican valores de supervivencia durante las primeras semanas (Bello-Bello, Martínez-Estrada, Caamal-Velázquez, & Morales- Ramos, 2016; Giridhar & Ravishankar, 2004; Janarthanam & Seshadri, 2008; Lee- Espinosa et al., 2008; Tan, Chin, & Alderson, 2011). Los experimentos encontrados en la literatura con evaluaciones de algunas respuestas morfogénicas, durante el desarrollo inicial del cultivo, muestran diversidad de condiciones a la propuesta en este experimento. A pesar de ello, algunos han obtenido resultados similares para algunas de las variables analizadas. Por ejemplo, a partir de esquejes con cuatro entrenudos y cultivados en medios de enraizamiento con proporciones iguales de suelo forestal, estiércol y arena fina, se obtuvo un brote de 57,60 cm, después de 19 semanas (Adugna, Belew, & Tilahun, 2015). De forma similar, con la misma cantidad de entrenudos pero en condiciones de vivero con suelo forestal y suficiente humus, Hailemichael et al. (2012) obtuvieron un valor máximo de 35,94 cm, después de seis meses. Otros investigadores informaron un valor de 42,4 cm cuando se cultivaron esquejes de cuatro a cinco entrenudos en condiciones de invernadero (Umesha, Murthy, & Smitha, 2011), lo cual es congruente con los valores obtenidos en este trabajo para los esquejes cultivados en condiciones de vivero (43,47 ± 3,93 cm) y campo (46,18 ± 3,26 cm). Por su parte, científicos colombianos obtuvieron un brote de 39,25 cm luego de inocular un sustrato compuesto de fragmentos de madera y vermicompost con hongos endófitos aislados de las raíces de plantas silvestres de vainilla, después de seis meses de evaluación en condiciones de invernadero (Ordóñez, Otero, & Díez, 2012). Existen otras investigaciones en las cuales se indican valores muy superiores en relación con la longitud de la planta. Al respecto, hay un grupo de trabajo que indicó un

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valor de 229 cm luego de siete meses de cultivo en condiciones de vivero, no obstante, fueron experimentos con fertilización química (fórmula: 27 – 11 – 11) a una dosis de 20 g/planta/por año en sustratos compuestos por 75% de fibra de coco o fragmentos de madera (Osorio, Osorio, Díez, & Moreno, 2014). Además, en la investigación citada, se tomó como variable la altura total de la planta desde la base hasta el ápice de crecimiento y, desde esa perspectiva, no quedó claro si la planta cultivada al inicio de la investigación correspondió a un explante con un ápice de crecimiento activo. De ser así, este meristemo continuará el crecimiento y no se activarán brotes axilares, como ocurrió en este experimento para algunos esquejes (datos no mostrados). Debido a los resultados obtenidos en cuanto a la generación de entrenudos por parte de las vitroplantas, es recomendable incluir esta variable como una de las características principales en los estudios que evalúan el desempeño agronómico en las etapas iniciales del cultivo; pues después del tamaño, es el carácter más importante como indicador de producción para los productores de vainilla en México. Esto obedece a una relación empírica entre la mayor cantidad de entrenudos y la reducción del tiempo de la primera cosecha (Baltazar-Nieto, 2010). Incluso, es propuesto como un adecuado indicador de otras variables dependientes o de respuesta como la longitud total, área foliar, biomasa total y variables radicales (Arango & Moreno, 2011). En lo que respecta al número de raíces, el valor más bajo de este trabajo obtenido a partir de vitroplantas cultivadas en vivero (9,27 ± 0,88 cm), está por encima de los mejores tratamientos de otras investigaciones donde se evaluaron factores diversos. Hailemichael et al. (2012) en las condiciones de cultivo mencionadas obtuvieron 3,68 raíces, mientras que Umesha et al. (2011) solo 1,75. Contrario a los esperado, las diferencias obtenidas en las variables anteriores para las plantas procedentes del cultivo in vitro, refuerzan la hipótesis de la vigorosidad y sanidad de las plantas obtenidas en condiciones asépticas de laboratorio, pero hace falta mucha investigación sobre la plasticidad fenotípica de estos explantes en condiciones naturales para entender si los rasgos observados son medibles y, en qué medida, están determinados por la genética. En lo que se refiere a la longitud radical total, el mejor valor obtenido en esta investigación (155 ± 15,41 cm) dista de la longitud de 221,97 cm obtenida por Ordóñez et al. (2012) luego de seis meses. El trabajo mencionado, proporcionó valores de referencia de la plasticidad fenotípica de las raíces en su totalidad. Empero, no permite una inferencia adecuada para explicar los datos de esta investigación porque la variación durante el desarrollo y crecimiento radical, son la respuesta a las variadas condiciones ambientales, que se sugiere, son inducidas por la intensidad y variación espacio-temporal en el suministro de agua y nutrientes (Shen et al., 2013). Ante este escenario, se debe de realizar experimentación controlada para medir dicha plasticidad con estudios sobre: gradientes de intensidad lumínica, humedad, temperatura, riego, diferentes tipos de suelo y sustratos o ambos, y diferentes genotipos, entre otros factores. De esa forma, se podría sugerir un ideotipo de la arquitectura del sistema radical en vainilla para cada parámetro evaluado. En relación con la longitud de la raíz, el valor más alto obtenido (12,85 cm) fue muy inferior comparado con los trabajos de Hailemichael et al. (2012), Umesha et al. (2011) y Adugna et al. (2015), quienes obtuvieron valores de 30, 29 y 17,50 cm, respectivamente. La presente investigación propone un mecanismo de alargamiento radicular provocado por un estrés nutricional debido al impedimento que ofrecen los tutores artificiales de madera para la absorción de fosforo, por los altos contenidos de hierro (Osorio, 2012). Esta situación estimuló el desarrollo de raíces adventicias aéreas con longitudes significativamente mayores en los esquejes cultivados en vivero en contraposición con los de campo (datos no mostrados). En esta última condición, la formación de musgo y líquenes propició microambientes a las raíces aéreas de los esquejes, lo cual evitó la interceptación radicular en el suelo y, por tanto, menores

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valores de longitud (Figura 5). Además, sustratos porosos como el utilizado en este estudio, según el mismo autor, mejoran la absorción de fósforo por la planta, pues la longitud radical es el factor principal en la incorporación de este elemento en la planta.

A1 A2 A3

B1 B2 B3

Figura 5. Diferencias en la longitud de las raíces adventicias del brote nuevo en esquejes cultivados en sistemas agroforestales (A) y vivero (B). Barra de escala = 10 cm. Las flechas indican la localización de las raíces de cada explante en ambas condiciones de crecimiento

En algunos ejemplos, cuando las plantas son cultivadas en medios oligotróficos, la relación de partes aéreas/partes subterráneas disminuye, pues las raíces tienden a aumentar la capacidad de absorción (Chen, Mendelssohn, Lorenzen, Brix, & Miao, 2005). Los resultados de este experimento concuerdan con esta afirmación y confirman la condición oligotrófica en vivero. Además, la planta de vainilla incrementa la demanda nutricional de N, P, K, Ca y Mg, a través del tiempo (Monnin & Perret, 2013). Las menores fluctuaciones de los valores obtenidos en la condición de campo para ambos explantes, sugiere poca variación de estos elementos al estar en constante movilización, mientras en vivero, sin la renovación del sustrato, se generó ambientes de oligotrofia que provocaron mayores fluctuaciones.

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En lo que concierne al peso radical, los valores obtenidos con la mejor combinación (2,18 ± 0,24 g) fueron superiores y congruentes con el trabajo de Adugna et al. (2015), quienes indicaron un valor de 1,16 g después del periodo de evaluación. No obstante, muy por debajo del valor de 23,59 g obtenido en el trabajo de Hailemichael et al. (2012), el cual es un valor muy elevado teniendo en consideración que la longitud máxima del brote fue solo 36 cm. Otras causas que podrían explicar la mayor longitud total, promedio y peso radical en los esquejes (en la condición de vivero) son la poca densidad, buena aireación y drenaje de los sustratos compuestos por musgo, arena y piedra que, indudablemente, incrementaron la porosidad para permitir una mayor penetración y raíces más largas, lo cual está en concordancia con el trabajo de Adugna et al. (2015). La diversidad de resultados que muestra la literatura en relación con la respuesta morfogenética de estas variables, refleja la inconsistencia metodológica en este tipo de estudios, que buscan el mejoramiento del manejo agronómico en distintos países productores de vainilla. Al igual que en México, en Costa Rica, muy pocas personas saben cultivar técnicamente la vainilla no híbrida de forma rentable. Básicamente, no hay estudios sistemáticos para tecnificar el cultivo en planes y programas nacionales de producción. A lo anterior debe agregársele el desconocimiento del material genético de V. planifolia cultivado en el país, así como la calidad productiva y fitosanitaria del mismo. Además, en los últimos años, ha surgido el agravante del cultivo del híbrido de Madagascar, que posee mayores facilidades de manejo, pero no es apto para la exportación a Estados Unidos por el código de regulación federal (21 CFR169.3) que impuso un estándar de identidad para V. planifolia y V. × tahitensis (FDA, 2016), lo que impide la comercialización de otras especies con importancia agrícola. Por último, un error técnico que se ha obviado en todas las investigaciones de vainilla consultadas, es la falta de valores de referencia para la longitud y peso del explante inicial, pues la heterogeneidad de respuestas está muy relacionada con las reservas de carbono de cada explante (Osorio, Osorio, Diez, & Moreno, 2012). Lo anterior es fundamental para el diseño de trabajos afines, pues la variación es afectada por longitudes grandes de poco peso y viceversa, en los explantes originales.

AGRADECIMIENTOS Al programa de Maestría Académica en Manejo de Recursos Naturales con énfasis en Biodiversidad de la Universidad Estatal a Distancia de Costa Rica porque este trabajo, además de ser requisito de graduación, es parte de los resultados de la tesis de dicho programa.

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Selección cualitativa en invernadero de esquejes de vainilla silvestre

CAPITULO IV

Nota Técnica

Efecto de la selección cualitativa del esqueje sobre la sobrevivencia y desarrollo morfogenético en invernadero de Vanilla planifolia Andrews procedente de poblaciones silvestres2

José Bernal Azofeifa Bolaños Maestría en Manejo de Recursos Naturales, UNED. Instituto de Investigación y Servicios Forestales, Universidad Nacional de Costa Rica, Heredia, Costa Rica; [email protected]

(Esta nota técnica será publicada con las siguientes coautorías: José Bernal Azofeifa-Bolaños, Germán Rivera-Coto, Amelia Paniagua-Vásquez y Roberto Cordero-Solorzano. Agronomía Mesoamericana)

RESUMEN El objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad de adaptación y el desempeño morfogenético de esquejes procedentes de poblaciones silvestres de V. planifolia en condiciones de vivero. Se evaluaron dos tratamientos: 1) esquejes seleccionados de forma cualitativa de acuerdo a su calidad fitosanitaria, daño mecánico y vigorosidad y 2) esquejes sin selección. La sobrevivencia de los seleccionados fue mayor (60%) respecto a los que no lo fueron (45%). Las respuestas morfogenéticas de los esquejes seleccionados fueron estadísticamente mayores para todas las variables evaluadas. Para esta condición, el peso, la longitud y el número de explantes del brote nuevo; el número y peso de las raíces y el número de entrenudos fue 43,37; 36,77; 29,11; 27,54; 46,30 y 45,00% mayor, que las obtenidas en el tratamiento sin selección, respectivamente. Es la primera vez que se informa de un proceso inicial de domesticación en vivero para individuos con un genotipo conocido de V. planifolia en Costa Rica. Para esta especie, es urgente un programa de conservación ex situ por su extrema rareza y peligro de extinción en condiciones silvestres, por lo cual este estudio no sólo significa un intento para la conservación de la especie sino que además indica valores de su potencial morfogenético durante el establecimiento fuera de condiciones naturales. Palabras claves: vainilla, Costa Rica, especies silvestres, domesticación, potencial agronómico.

2 Este trabajo es parte de los resultados de la tesis del Programa de Maestría Académica en Manejo de Recursos Naturales de la Universidad Estatal a Distancia con énfasis en gestión de la Biodiversidad. El trabajo fue realizado en el Instituto de Investigación y Servicios Forestales de la Universidad Nacional de Costa Rica. 91

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ABSTRACT Effect of qualitative selection of cuttings from wild populations of V. planifolia on the survival and morphogenetic development in greenhouse. In order to evaluate the adaptation capacity and morphogenetic performance of wild V. planifolia under nursery conditions, the effect of two treatments 1) qualitatively selected cuttings according to their phytosanitary quality, mechanical damage and vigorosity and 2) cuttings without selection, were evaluated. The survival of the selected cuttings was greater (60%) than those that were not (45%). The morphogenetic responses of the selected explants were statistically higher for all variables evaluated. For this condition, the weight, length and number of explants of the new shoot; the number and weight of the roots and the number of internodes were 43.37, 36.77, 29.11, 27.54, 46.30 and 45.00% higher than those obtained in the treatment without selection, respectively. This is the first time that an initial process of domestication with a known genotype individuals of V. planifolia, is reported under nursery conditions, in Costa Rica. For this species, an ex situ conservation program is urgently needed because of its extreme rarity and danger of extinction in wild conditions. Consequently, this study not only means an efficient attempt for the conservation of the species but also indicates values of its morphogenetic potential during the establishment out of natural conditions. Key words: vanilla, Costa Rica, wild species, domestication, agronomic potential.

INTRODUCCIÓN El 10% de las especies de vainilla conocidas están registradas en Costa Rica, lo cual convierte al país en el más diverso de Mesoamérica. (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). En términos generales, el sabor y aroma natural de vainilla es producido durante el proceso de beneficiado de las cápsulas de V. planifolia, V. pompona y V. × tahitensis. Sin embargo, el 95% de la producción proviene de V. planifolia. Por este motivo, es la especie más cultivada y, por tanto, la orquídea con mayor impacto económico del mundo, sólo superada por el azafrán en el mercado de las especias (Havkin-Frenkel y Belanger, 2007). El acervo genético de las vainillas de Costa Rica está conformado por V. costaricensis Soto Arenas, V. dressleri Soto Arenas, V. hartii Rolfe, V. helleri A.D. Hawkes, V. inodora Schiede, V. odorata C.Presl, V. planifolia Andrews, V. pompona Schiede, V. sarapiquensis Soto Arenas, V. sotoarenasii M.Pignal, Azof.-Bolaños & Grisoni y V. trigonocarpa Hoehne. (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). En consecuencia, el país cuenta con poblaciones naturales de dos de las tres especies con mayor importancia en el mundo. Esto refleja la disponibilidad de recursos genéticos de vainilla y abre la posibilidad de generar materiales promisorios para diversas unidades productivas en otras regiones agroclimáticas adecuadas para el cultivo. La búsqueda de parientes silvestres de V. planifolia es de importancia relevante para incrementar la variabilidad genética natural de la especie. Por este motivo, a partir del 2012 se inició la estrategia integral de conservación del género en Costa Rica, la cual pretende conservar los recursos genéticos primarios de V. planifolia y el acervo 92

Selección cualitativa en invernadero de esquejes de vainilla silvestre genético secundario conformado por el resto de las especies, muchas de las cuales poseen rasgos deseables que podrían incorporarse en el cultivo. Este plan de manejo ex situ es necesario, debido a las condiciones críticas de conservación de esta especie en estado silvestre (Soto-Arenas y Solano-Gómez, 2007; Soto-Arenas, 1999). Como parte de esa búsqueda, se localizaron poblaciones naturales de V. planifolia en la costa caribe de Costa Rica, que se caracterizaron a nivel bioquímico, morfológico y molecular. En este proceso una nueva especie de vainilla se registró y al menos diez individuos correspondieron a V. planifolia, de los cuales seis accesiones se encuentran en la colección de la Universidad Nacional de Costa Rica (UNA) (Azofeifa- Bolaños et al., 2017). Posterior a las caracterizaciones antes mencionadas, la siguiente fase de la estrategia de conservación fue la caracterización agronómica del material silvestre en condiciones de vivero (Azofeifa-Bolaños et al., 2014). No obstante, durante el establecimiento de individuos provenientes de poblaciones naturales hay aspectos de manejo que se deben considerar, entre ellos están: la homogeneidad genética, la condición fitopatológica de los esquejes, el daño mecánico durante el transporte, la edad fisiológica y ontogenética del material y el lugar de procedencia, entre otros. La presente investigación trabajó con esquejes de una población silvestre con la finalidad de evaluar la capacidad de adaptación y la calidad fitosanitaria en condiciones de vivero. Los explantes usados para el experimento correspondieron a individuos de la población natural de Barra de Parismina, identificados en la colección de vainilla de la UNA con el código UNA-VAN-00229 (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). Los ensayos de adaptación se realizaron en un invernadero del Instituto de Investigación y Servicios Forestales (INISEFOR-UNA), Santa Lucía, Barva, Heredia (coordenadas geográficas aproximadas 10° 01' 21,93'' N - 84° 06' 43,6 O), el cual fue acondicionado con sarán (malla al 50% de sombra). Las condiciones atmosféricas dentro del invernadero fueron en promedio de 81% de humedad con valores mínimos de 38,5 y máximos de 100 y una temperatura promedio de 23°C que osciló entre 17 y 39°C. Se aplicó riego manual dos veces por semana. Con el objetivo de evaluar la capacidad de adaptación de los esquejes durante el establecimiento en vivero se realizó un experimento que comparó las respuestas morfogenéticas de explantes seleccionados por su condición fitosanitaria, vigorosidad y daño mecánico. Para ello, se conformaron dos poblaciones de trabajo: con selección (esquejes verdes, sin daños fitopatológicos, ni daños mecánicos) y sin selección (esquejes verdes, con daños fitopatológicos y/o daños mecánicos) (Figura 1).

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A B C

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D E F G

H I

J K

L M N

Ñ O P Q

R S

Figura 1. Esquejes de plantas silvestres de V. planifolia, empleados para el establecimiento en vivero. A- Explantes seleccionados por su sanidad, vigorosidad y ausencia de daños mecánicos. B, C- Explantes con y sin selección cultivados sobre un sustrato de piedra y arena, asociado a tutores de madera. D-K- Explantes con problemas fitosanitarios. L-R- Explantes con daños mecánicos (barra de escala: 1 cm). Figure 1. Wild plant stem cuttings of V. planifolia used for the establishment in greenhouse. A- Selected explants for their health, vigorosity and absence of mechanical damages. B, C- Explants with and without selection cultivated on a substrate of stones and sand associated to artificial wooden tutors. D-K- Explants with phytosanitary problems. L-R- Explants with mechanical damage (scale bar: 1 cm)

Se utilizó un diseño completamente al azar con 63 repeticiones para el tratamiento con selección y 49 para el tratamiento sin selección. La unidad experimental consistió

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de un esqueje con y sin selección procedente de condiciones silvestres. En total se cultivaron 112 esquejes en el vivero sobre un sustrato compuesto de arena y piedra, asociado a tutores artificiales de madera (Figura 1B, 1C). Después del periodo de evaluación, se midió el peso, la longitud y el número de entrenudos del brote nuevo, el peso y el número de raíces totales y el número de entrenudos del explante inicial. Para calcular la significancia estadística de las unidades experimentales se utilizó la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SAS v9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Los resultados de esta investigación indican, por vez primera, el efecto del manejo inicial durante el establecimiento en vivero de plantas procedentes de poblaciones silvestres. Aspectos sencillos como la observación del estado en que se encuentra el material antes de su cultivo, propician un mayor éxito en las respuestas morfogenéticas de algunas variables de crecimiento en comparación con plantas de la misma población pero sin selección (Cuadro 1). Los resultados indican que el coeficiente de sobrevivencia fue mejor en las plantas seleccionadas (60%) en comparación con las que no lo fueron (45%). Aunque se presentó sobrevivencia en el tratamiento sin selección, y aun cuando los brotes generados permanecieron verdes y vigorosos de forma visible, las respuestas morfogenéticas en todas las variables evaluadas fueron estadísticamente menores (P≤0,0034) que las obtenidas en el tratamiento con selección (Cuadro 1).

Cuadro 1. Medias de algunas variables de crecimiento (± error estándar) de plantas silvestres de V. planifolia según la selección inicial de esquejes durante el establecimiento en vivero. Table 1. Mean number of some growth parameters (± standard error) of wild V. planifolia plants according to the effect of an early cuttings selection during the greenhouse establishment. Tratamiento Brote Raíces Número Peso Longitud Número Peso entrenudos Número (g) (cm) entrenudos (g) iniciales Con selección (n=63) 63,29(3,90) 144,88(7,99) 19,37(0,94) 7,73(0,09) 20,08(1,03) 5,94(0,45) Sin selección (n=49) 35,84(4,86) 91,61(10,14) 13,73(1,43) 4,27(0,24) 14,55(1,52) 3,19(0,49)

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t* (p)** t (p) t (p) t (p) t (p) t (p) 13,7(< 4,46(<0,0001) 4,19(0,0001) 3,29(0,0014) 0,0001) 3,01(0,0034) 4,14(0,0001) * Estadístico t. **Probabilidad asociada a la prueba t de Student, en negrita los valores significativos (p < 0,05). *t statistic. ** Student’s t-test indicate p-values < 0.05. Significant values are shown in bold.

El peso, la longitud y el número de explantes del brote nuevo fueron 43,37; 36,77 y 29,11% mayores cuando el explante fue seleccionado, respectivamente. Mientras que el número y peso de las raíces fueron 27,54 y 46,30% mayores respecto a los explantes sin selección. Después del proceso de evaluación, el número de entrenudos iniciales se redujo casi el doble (45%) cuando los explantes usados no fueron seleccionados. Prácticamente todos los explantes seleccionados conservaron la cantidad de entrenudos durante la siembra inicial. Esta variable, junto con la longitud del esqueje, son los rasgos más importantes como indicadores de producción de V. planifolia en México, pues la reducción del tiempo para la cosecha está relacionado con la mayor cantidad de entrenudos (Baltazar-Nieto, 2010). Investigadores colombianos proponen el número de entrenudos como un indicador eficiente de otras variables dependientes o de respuesta como la longitud total, área foliar, biomasa total y variables radiculares (Arango y Moreno, 2011). Por lo tanto, la selección minuciosa del material de forma cualitativa y sin el uso de biocidas, es un parámetro a considerar por parte de los curadores de las colecciones de vainilla. Estos resultados indican la importancia de sistematizar las estrategias de manejo de poblaciones silvestres de vainilla para la creación de medidas y acciones de conservación en el ámbito nacional y/o regional. No sólo es necesario continuar con la búsqueda y recolección de individuos en estado silvestre para su conservación in situ y ex situ, sino también, implementar un protocolo de establecimiento para futuros ensayos de caracterización, control fitosanitario, fitomejoramiento y reintroducción en zonas de alta prioridad, entre otros. La obtención de especímenes silvestres sin conocimiento previo de aspectos de manejo agronómico, puede comprometer la supervivencia de plantas, que de por sí, ya se encuentran en peligro crítico de extinción (Soto-Arenas y Solano-Gómez, 2007; Soto-Arenas, 1999), además, puede provocar el traslado de problemas fitosanitarios a otras zonas. Lo anterior, se agrava cuando la extracción es realizada por personas ajenas a las necesidades de conservación del género Vanilla, que colectan materiales silvestres sin valor comercial de especies indistinguibles de V. planifolia. En México, 97

Selección cualitativa en invernadero de esquejes de vainilla silvestre durante los años ochenta, la falta de asesoría sobre el conocimiento de los recursos genéticos en algunas regiones, ocasionó el establecimiento de plantaciones de V. cribbiana, V. inodora, V. insignis, V. odorata y V. pompona, aunque según Soto- Arenas y Solano-Gómez (2007), la intención era cultivar solo V. planifolia. Este desacierto se repite en Costa Rica donde se han dado situaciones similares, debido a falta de apoyo profesional o malas asesorías. La recolección de material, conservación y evaluación del germoplasma es crítico tanto en las zonas de distribución natural como en los centros de dispersión secundaria (Duval et al., 2006). Desafortunadamente, los esfuerzos para la búsqueda sistemática de parientes silvestres en Mesoamérica, son muy pocos (Azofeifa-Bolaños et al., 2014; Hernández-Ruíz et al., 2016) y no se conoce la diversidad intraespecífica de las vainillas costarricenses en relación con individuos de América Central y México. Aun así, la importancia del acervo genético primario de V. planifolia en Costa Rica es una prioridad, debido a la diversidad de genes que se podría aportar a la reducida base genética de las plantaciones comerciales, confirmada con varios estudios moleculares (Bory et al., 2008; Lubinsky et al., 2008; Minoo et al., 2008). En consecuencia, para el manejo de plantas silvestres es necesaria la evaluación de la adaptabilidad y el potencial agronómico en condiciones ambientales particulares con el fin de determinar rasgos deseables para el fitomejoramiento. En Costa Rica, este es el primer trabajo que brinda datos sobre estos temas. Para luego establecer individuos en un banco de germoplasma y determinar si existe homogeneidad intraespecífica respecto a los especímenes silvestres y cultivados de otras regiones. En el presente caso, lo fundamental fue preservar el material silvestre, el cual generó plantas homogéneas en cuanto a peso y longitud para ensayos subsecuentes. Aunque no se logró la totalidad de sobrevivencia, la selección cualitativa de los esquejes funcionó de forma convincente para multiplicar el material. Cualquier estrategia técnica que evite la disminución de poblaciones silvestres de vainilla, es necesaria para salvaguardar los únicos y escasos recursos genéticos que existen en la zona de distribución natural de la especie. Antes de esta investigación, solo en México se había generado información sobre el número total de especímenes silvestres conocidos. Según Soto-Arenas y Solano-Gómez (2007), para 1997 el número de individuos genéticos conocidos era aproximadamente 30, sin embargo, se advierte de la posibilidad de extinción de muchos de ellos ante la falta de esfuerzos de conservación, así como por los incendios ocurridos en 1998, la colecta excesiva de plantas silvestres, el abandono de plantaciones establecidas con plantas silvestres, la fragmentación del hábitat y por el asocio a zonas de alta población (Soto-Arenas, 1999; Bory et al., 2008). Después de esas investigaciones llevadas a cabo hace más 98

Selección cualitativa en invernadero de esquejes de vainilla silvestre de dos décadas, solo en Costa Rica se ha confirmado seis poblaciones silvestres de V. planifolia, las cuales se caracterizaron mediante descriptores morfológicos y moleculares (Azofeifa-Bolaños et al., 2017). Los primeros resultados de la capacidad adaptativa a condiciones ambientales totalmente diferentes y la capacidad morfogenética de los individuos de la población de barra de Parismina, sugieren un material promisorio para el establecimiento de unidades productivas en diferentes regiones del país. Este primer intento de domesticar individuos silvestres en condiciones de vivero, ha brindado resultados prometedores, en particular si se piensa que existen bosques primarios sin explorar en la parte norte del Caribe, donde las estimaciones realizadas sobre la distribución espacial de la especie, son altas para el hallazgo de nuevos parientes silvestres de V. planifolia.

CONCLUSIONES Es la primera vez que se informa de un proceso inicial de domesticación en vivero de individuos silvestres de V. planifolia en Costa Rica, donde no solo se logró implementar una estrategia para conservar este material considerado como raro, único y valioso, sino que se cuantificó su potencial morfogenético fuera de condiciones naturales. Si bien es cierto que, aunque no se puede aducir que existe una correlación entre la sobrevivencia y las mejores respuestas organogénicas con la calidad fitosanitaria, el daño mecánico y la vigorosidad, los resultados de la estrategia de selección cualitativa llevada a cabo en este trabajo, indican la necesidad de adoptar este procedimiento, como mecanismo inicial para la domesticación de individuos silvestres. En particular, si se toma en consideración que el cultivo de vainilla mediante semilla sexual no es viable, por lo cual todo el manejo debe de realizarse de forma vegetativa.

AGRADECIMIENTOS Al programa de Maestría Académica en Manejo de Recursos Naturales con énfasis en Biodiversidad de la Universidad Estatal a Distancia de Costa Rica porque este trabajo, además de ser requisito de graduación, es parte de los resultados de la tesis de dicho programa.

LITERATURA CITADA Arango, D.A., and F. Moreno. 2011. Desarrollo inicial de la vainilla (Vanilla planifolia Andrews, Orchidaceae) bajo diferentes usos de la tierra y condiciones climáticas en Colombia. p. 1–17. In Lombardi, I., Nalvarte, W., Ojeda, W., Hilario, E., 99

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Selección cualitativa en invernadero de esquejes de vainilla silvestre

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CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

La presente investigación generó resultados que permitieron ahondar en elementos básicos de la caracterización, conservación, uso y manejo de V. planifolia en condiciones silvestres, de laboratorio, vivero y campo. Los resultados novedosos y originales permiten un aporte importante a la ciencia y la sociedad. Las principales conclusiones se indican a continuación:

a) Las misiones de recolección de parientes silvestres de vainilla para esta investigación, permitieron el descubrimiento de una nueva especie que crece en simpatría con V. planifolia, la cual presenta muchos rasgos deseables para programas de mejora genética, entre estos: contenido aromático único que combina vainillina y anís, resistencia a la principal enfermedad del cultivo en el mundo ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. radicis-vanillae, indehiscencia de la cápsula en la madurez, floración temprana y mayor éxito reproductivo (alta producción de frutos), entre otros. b) El germoplasma silvestre de V. planifolia hallado en este trabajo, es el primer material caracterizado de forma molecular en Costa Rica y constituye una contribución importante para el incremento de la base genética del cultivo en el ámbito mundial. c) Los parientes silvestres de V. planifolia encontrados en esta investigación, confirmaron la extensión del área de distribución natural de esta especie hacia el sur de Costa Rica. d) Es la primera vez que se informa de un proceso inicial de domesticación en vivero de individuos silvestres de V. planifolia en Costa Rica, donde no solo se logró implementar una estrategia para conservar este material considerado como raro, único y valioso, sino que se cuantificó su potencial morfogenético fuera de condiciones naturales. e) Se logró un 100% de explantes libres de contaminantes durante el establecimiento in vitro con el uso de un proceso de doble desinfección (kilol en

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vivero y HgCl2 en laboratorio). Esta práctica fue la más eficiente para el establecimiento formal de ensayos, la reducción óptima de la carga microbiológica y para el aumento significativo de la respuesta morfogenética de plantas silvestres durante el establecimiento y multiplicación in vitro. Además, el buen estado fitosanitario de este material propició la manifestación de la vigorosidad para algunas variables en condiciones de campo. f) La sobrevivencia durante la aclimatización como medida para mostrar la eficiencia de los protocolos de cultivo de tejidos en vainilla, no representa un parámetro adecuado del potencial morfoagronómico, pues disminuye con el paso de los días y no precisa cuan bien adaptadas se encuentran las plántulas en condiciones ambientales particulares. g) Es la primera vez que se indican valores de referencia para los explantes iniciales en laboratorio, vivero y campo h) La especie identificada que predominó en los aislamientos bacterianos fue Pantoea citrea y constituye la primera vez que se informa sobre la presencia de la especie en vainilla. i) Es la primera vez que se cuantifica y se compara de forma sistemática el potencial morfogenético de plántulas in vitro y esquejes en dos condiciones de crecimiento (vivero y sistemas agroforestales) durante el desarrollo inicial de V. planifolia en Costa Rica, por lo cual son los primeros valores de referencia de algunos índices del vigor de estos explantes en las condiciones de crecimiento citadas. j) En las condiciones particulares de esta investigación y, contrario a lo usado por los productores, las plántulas procedentes del cultivo in vitro, aclimatizadas en vivero y cultivadas en un sistema agroforestal, fueron mejores como explantes que los esquejes tradicionales para las variables longitud del brote, número de entrenudos y raíces. Mientras los esquejes manifestaron mejores respuestas en vivero para las variables longitud y peso de las raíces. k) Las condiciones de crecimiento evaluadas durante el establecimiento de individuos silvestres de V. planifolia en laboratorio, permiten la obtención de plántulas in vitro de ocho nudos en dos meses en comparación de los cuatro y seis meses para obtener la misma cantidad en condiciones de campo y vivero, respectivamente. l) Con los resultados de esta investigación se vislumbra la posibilidad de establecer a mediano o largo plazo plantaciones comerciales en la región del Caribe costarricense, que contribuirían al mejoramiento de las críticas condiciones sociales y ambientales por la falta de alternativas de trabajo rentables y viables ecológicamente.

RECOMENDACIONES

Los resultados de esta investigación dan base para establecer varias recomendaciones para el desarrollo futuro de investigaciones en vainilla. Entre estas se citan:

a) Se recomienda la caracterización molecular para tener certeza de la especie correcta en estudios con vainilla, pues la mayoría de especies sin caracteres florales y/o frutales son difíciles de identificar. En el caso particular, los registros taxonómicos existentes de la zona de estudio sólo indicaban la presencia de V. planifolia y, como se demostró en este trabajo, había una especie nueva del grupo planifolia, que no era distinguible con facilidad, con sólo caracterizaciones morfológicas. b) Es necesario un programa de conservación permanente de parientes silvestres de V. planifolia debido a su rareza extrema y peligro crítico de extinción en

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condiciones naturales. Para ello, se debe priorizar la búsqueda en la zona del Caribe donde existen muchas zonas sin explorar con condiciones ecológicas muy similares a las poblaciones silvestres encontradas en este trabajo. c) Se recomienda realizar experimentación con marcadores genéticos para determinar los niveles de variación intraespecífica del germoplasma silvestre hallado en esta investigación de las especies silvestres de V. planifolia y los parientes cercanos (V. sotoarenasii). d) No se recomienda la domesticación inicial de parientes silvestres de V. planifolia por personas ajenas a los objetivos de conservación de especies de Vanilla spp. e) Se recomienda indicar valores de referencia de la longitud, peso y diámetro de los explantes iniciales, en las investigaciones relacionadas con el desempeño morfogenético en laboratorio, invernadero y campo o donde no es posible tener un control sobre la edad fisiológica y ontogenética de los explantes, pues las reservas de carbono heterogénas generan variación en los resultados y hace muy difícil la comparación con investigaciones similares. f) Es prioritario continuar haciendo investigaciones exploratorias con otros agentes esterilizadores para los materiales vegetales, que sean inocuos para el explante, el ser humano y el ambiente. g) En las investigaciones es fundamental la certificación fitosanitaria de esquejes o el uso de vitroplantas para la propagación masiva y el establecimiento de plantaciones comerciales, con el fin de evitar el traslado de problemas fitosanitarios a otras zonas. h) Se requiere continuar haciendo investigaciones para lograr la tecnificación del cultivo, producto de una estrategia nacional de investigación con la participación de instituciones gubernamentales y de educación superior, que propicien el establecimiento de plantaciones en las distintas zonas agroecológicas del país. i) Las investigaciones futuras deben ser de carácter multidisciplinario, para evitar enfoques parciales que lleven al fracaso por omisiones en aspectos técnicos, económicos, ecológicos o sociales. j) Durante el establecimiento inicial del cultivo de vainilla en sistemas agroforestales, se recomienda el cultivo de árboles heliófilos, pues los árboles esciófilos lentifican el crecimiento en zonas con alta iluminación y aumentan el tiempo para la generación de sombra primaria requerida por los tutores y la vainilla. k) Como parte de las recomendaciones culturales para el cultivo de V. planifolia en sistemas agroforestales, se recomienda sembrarla asociada a tutores vivos, los cuales le aportan condiciones favorables para la retención de nutrientes, sombra y abono orgánico como resultado de la descomposición de la materia orgánica en la base del tutor. l) En el establecimiento de parcelas experimentales o comerciales, no es recomendable el ingreso constante de personas, animales domésticos o maquinaria, para evitar daños mecánicos y el ingreso de agentes inductores de problemas fitosanitarios.

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ANEXOS

ANEXO 1: Datos crudos del efecto de la selección cualitativa del esqueje sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante el desarrollo inicial del cultivo en vivero Procedencia Peso Longitud # raíces Peso raíces # entrenudos # entrenudos ini Con selección 10,6 42,9 8 0,7 5 9 Con selección 44,5 123,91 17 3,7 17 7 Con selección 71,3 165,3 25 7,5 19 7 Con selección 57,9 167,47 21 4,7 20 8 Con selección 75,2 168,29 27 6,7 25 7 Con selección 104,9 215,03 23 7,1 23 7 Con selección 51 100,94 17 5,2 15 9 Con selección 78,8 154,32 20 8,1 20 9 Con selección 2,8 14,91 2 0,1 3 8 Con selección 117,4 236,49 36 11,1 32 8 Con selección 58,2 128,07 21 5,2 19 7 Con selección 70,1 170,28 23 5,4 22 9 Con selección 110,7 223,46 27 10 27 7 Con selección 118,8 263,19 31 11,2 31 8 Con selección 60,6 171,53 25 4,7 24 7 Con selección 82,9 189,76 22 9,4 22 8 Con selección 60,9 154,62 23 5 22 7 Con selección 32,1 48,31 8 5,3 6 8 Con selección 109,4 233,59 32 9,7 26 7 Con selección 58,6 140,5 22 6,3 22 8 Con selección 17,4 58,79 8 0,5 8 8 Con selección 89,5 141,6 19 5,9 17 8 Con selección 84,6 178,88 23 6,2 23 8 Con selección 54 142,82 17 5,8 18 8 Con selección 90,7 176,79 26 11,1 25 8 Con selección 60,1 171,79 26 4,9 23 8 Con selección 73,7 133,95 17 14,1 18 8 Con selección 67,9 128,44 16 6 17 8 Con selección 107 225 27 8,3 24 8 Con selección 49,8 141,48 24 3 21 9 Con selección 29,8 55,02 9 4,4 10 8 Con selección 73,5 136,75 17 15,2 17 8 Con selección 68,8 174,09 23 13,4 23 8 Con selección 93 177,73 24 9,1 25 8 Con selección 88,4 161,25 21 7,7 22 7 Con selección 20,9 61 8 0,7 8 8 Con selección 9 50,03 8 0,4 8 7 Con selección 19,3 58,44 8 9 7 Con selección 88,9 228,79 31 9,8 33 9

104

Con selección 63,9 197,34 32 5,3 28 9 Con selección 13,3 62,36 10 0,7 10 7 Con selección 50,7 152,03 18 3,6 19 8 Con selección 50,8 126,38 22 3,4 19 7 Con selección 36,6 74,82 9 5,6 9 7 Con selección 61,1 158,43 24 3,9 23 7 Con selección 83,4 218,4 26 6,9 26 9 Con selección 78,7 211,07 30 7,7 27 7 Con selección 87 172 24 22 7 Con selección 55,4 159,08 23 3,8 20 8 Con selección 9,5 23,7 3 0,2 4 7 Con selección 32,1 97,04 16 2 19 7 Con selección 40,5 105,9 16 3,5 16 8 Con selección 123 282,26 33 9,7 33 7 Con selección 49,8 108,66 17 3,7 16 7 Con selección 63,7 136,09 23 6,3 22 8 Con selección 40,3 94,25 17 2,6 17 8 Con selección 7,8 21,81 2 0,1 5 8 Con selección 68,3 148,87 19 7,4 19 8 Con selección 115,7 224,76 29 9,4 28 8 Con selección 61,3 169,59 20 4,9 22 7 Con selección 114 258,64 36 7,3 33 7 Con selección 64,4 113,61 18 8,2 19 7 Con selección 52,9 95,13 16 2,8 15 8 Sin selección 7,5 34,73 7 0,9 7 3 Sin selección 50,6 112,36 14 4,9 14 6 Sin selección 77,5 164,69 28 9,2 25 6 Sin selección 18,6 88,64 10 1,3 12 4 Sin selección 0 0 0 0 0 4 Sin selección 31,9 94,33 16 2,3 12 6 Sin selección 10 67,57 17 0,6 18 3 Sin selección 27,8 106,74 17 1,3 15 4 Sin selección 6,4 24,18 7 0,1 4 5 Sin selección 73 168,83 27 5,8 26 4 Sin selección 67,6 144,52 21 10,7 21 6 Sin selección 89,7 224,33 32 9,8 28 6 Sin selección 1,4 12,26 2 0 2 6 Sin selección 76,2 159,03 25 8,5 21 5 Sin selección 12,3 47,74 6 0,4 6 3 Sin selección 0 0 0 0 0 3 Sin selección 25,5 90,38 17 2,2 15 5 Sin selección 62,4 125,51 13 5,9 13 6 Sin selección 35,6 89,28 16 3,8 13 Sin selección 90,2 220,71 30 8,1 32 3 Sin selección 0 0 0 0 0 5 105

Sin selección 9,7 25,7 5 0 5 6 Sin selección 18,3 63,91 16 1,4 12 2 Sin selección 77,3 172,62 28 8,7 25 6 Sin selección 0 0 0 0 0 6 Sin selección 48,6 133,07 24 5,1 22 5 Sin selección 45,6 132,8 24 3,9 19 4 Sin selección 15,8 75,65 11 0,7 10 0 Sin selección 3,3 19,67 2 0 4 5 Sin selección 108,1 255,9 39 8,2 32 6 Sin selección 0 0 0 0 0 6 Sin selección 0 0 0 0 0 5 Sin selección 15,2 57,54 10 0,9 9 6 Sin selección 2,2 10,63 3 0,1 3 2 Sin selección 15,5 62,77 10 0,7 4 Sin selección 5,1 17,02 3 0,2 4 0 Sin selección 67,9 134,21 25 6,2 23 3 Sin selección 0 0 0 0 0 4 Sin selección 31,8 79,33 9 2,4 8 0 Sin selección 9,2 56,76 8 0,7 9 3 Sin selección 53,2 138,32 22 3,6 25 5 Sin selección 46,5 122,61 20 4 19 4 Sin selección 141,6 261,31 36 10,8 34 4 Sin selección 82,8 181,62 26 7,3 26 5 Sin selección 52,1 134,13 22 5,4 22 6 Sin selección 9,6 34,48 8 0,1 8 5 Sin selección 38,8 120,24 19 2,6 20 4 Sin selección 51,4 105,53 17 4,6 16 3 Sin selección 42,5 117,48 21 2,8 20 3

ANEXO 2: Características morfológicas, culturales, bioquímicas y fisiológicas de los aislados fúngicos y bacterianos del ensayo de desinfección de dos fases Tratmiento Prueba Anaerobiosis YDC 37°C KD Actividad 40°C Hongo Bacteria Gram pectolítica T11 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T13 (-) (+) (-) (-) Fusarium solani Erwinia sp. T14 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T15 (-) (+) (-) (-) Fusarium solani Erwinia sp. T16 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T17 (-) (+) (+) Rosa (+) T18 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T19 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T110 (-) (-) (-) (-) (-) (+) Fusarium sp. Acidovorax sp. T111 (-) (+) (+) Amarillo Phoma sp. Pantoea sp. T112 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T113 (-) T114 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea

106

T115 (-) (+) (-) (-) Fusarium sp. Erwinia sp. T22 Fusarium oxysporum T24 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T25 (-) (-) (+) (-) Xanthomona ssp. T26 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T27 (-) (+) (-) (-) Alternaria sp. Erwinia sp. T210 (-) (+) (-) (-) Micelio estéril Erwinia sp. T212 (-) (-) (+) Pseudomonas fluorescens T213 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T32 (-) (+) (-) (-) Erwinia sp. T33 (-) (-) (-) (+) Acidovorax sp. T34 (-) (+) (-) (-) Fusarium semitectum Erwinia sp. T35 (-) (+) (+) Amarillo (-) Pantoea sp. Erwinia sp. T36 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T37 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T38 (-) (+) (+) Rosa (+) Micelio estéril Pantoea citrea T39 Micelio estéril T310 Micelio estéril T311 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T312 (-) (+) (+) Amarillo Fusarium semitectum Pantoea sp. T313 (-) (+) (-) (-) Erwinia sp. T315 (-) (+) (+) Rosa (-) Pantoea citrea Erwinia sp. T41 (-) (+) (-) (-) Fusarium oxysporum Erwinia sp. T42 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T43 (-) (+) (-) (-) Fusarium oxysporum Erwinia sp. T46 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T47 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T49 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T410 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T411 (-) (+) (+) Amarillo Pantoea sp. T412 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T413 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T415 (-) (+) (+) Rosa (+) Fusarium oxysporum Pantoea citrea T67 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T69 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea T610 (-) (-) (+) Pseudomonas fluorescens T611 Cladosporium sp. T612 (-) (+) (-) (-) Erwinia sp. T613 (-) (+) (-) (-) Fusarium oxysporum Erwinia sp. T615 (-) (+) (+) Rosa (+) Pantoea citrea

ANEXO 3: Codificación binaria para el análisis de regresión logística de la contaminación presente en los aislados totales, fúngicos y bacterianos del ensayo de desinfección de dos fases Vivero Laboratorio Tratamientos Contaminación Hongos Bacterias Otros Alcohol Cloro 1 1 2 1 2

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Alcohol Cloro 1 2 2 2 2 Alcohol Cloro 1 1 1 1 2 Alcohol Cloro 1 1 2 1 2 Alcohol Cloro 1 1 1 1 2 Alcohol Cloro 1 1 2 1 2 Alcohol Cloro 1 2 2 2 2 Alcohol Cloro 1 1 2 1 2 Alcohol Cloro 1 1 2 1 2 Alcohol Cloro 1 1 1 1 2 Alcohol Cloro 1 1 1 1 2 Alcohol Cloro 1 1 2 1 2 Alcohol Cloro 1 2 2 2 2 Alcohol Cloro 1 1 2 1 2 Alcohol Cloro 1 1 1 1 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Kilol Cloro 2 1 1 2 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Kilol Cloro 2 1 2 1 2 Kilol Cloro 2 1 2 1 2 Kilol Cloro 2 1 2 1 2 Kilol Cloro 2 1 1 1 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Kilol Cloro 2 1 1 1 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Kilol Cloro 2 1 2 1 2 Kilol Cloro 2 1 2 1 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Kilol Cloro 2 2 2 2 2 Testigo Cloro 3 2 2 2 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 1 1 1 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 1 1 1 2 Testigo Cloro 3 1 1 2 2 Testigo Cloro 3 1 1 2 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 1 1 1 2 Testigo Cloro 3 1 2 1 2 Testigo Cloro 3 2 2 2 1 Testigo Cloro 3 1 2 1 2

108

Alcohol Mercurio 4 1 1 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 1 1 2 Alcohol Mercurio 4 2 2 2 2 Alcohol Mercurio 4 2 2 2 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 2 2 2 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 1 2 1 2 Alcohol Mercurio 4 2 2 2 2 Alcohol Mercurio 4 1 1 1 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Kilol Mercurio 5 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 1 2 1 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 1 2 1 2 Testigo Mercurio 6 1 2 1 2 Testigo Mercurio 6 1 1 2 2 Testigo Mercurio 6 1 2 1 2 Testigo Mercurio 6 1 1 1 2 Testigo Mercurio 6 2 2 2 2 Testigo Mercurio 6 1 2 1 2 109

ANEXO 4. Datos crudos del efecto de la desinfección de doble fase sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante el establecimiento in vitro. Vivero Laboratorio Trat Longitud Peso Diámetro Número Raíces Longitud Raíces Peso Raíces Alcohol Cloro T1 6,43 0,86 0,27 6 1,66 0,03 Alcohol Cloro T1 7,21 1,05 0,29 3 2,04 0,01 Alcohol Cloro T1 Alcohol Cloro T1 5,25 1,24 0,35 3 2,13 0,06 Alcohol Cloro T1 Alcohol Cloro T1 12,96 2,79 0,32 5 6,56 0,18 Alcohol Cloro T1 6,35 2,43 0,36 9 3,01 0,07 Alcohol Cloro T1 6,33 0,87 0,27 3 2,03 0,02 Alcohol Cloro T1 12,91 1,44 0,28 3 5,07 0,08 Alcohol Cloro T1 Alcohol Cloro T1 Alcohol Cloro T1 9,67 2,06 5 4,01 0,08 Alcohol Cloro T1 12,47 2,15 0,32 5 3,56 0,08 Alcohol Cloro T1 10,4 2,38 0,32 6 4,67 0,1 Alcohol Cloro T1 Kilol Cloro T2 8,16 0,89 0,28 2 1,29 0 Kilol Cloro T2 Kilol Cloro T2 Kilol Cloro T2 3,3 2,23 0,36 3 3,06 0,11 Kilol Cloro T2 7,23 1,01 0,38 3 6,51 0,12 Kilol Cloro T2 8,78 2,32 0,25 3 8,56 0,15 Kilol Cloro T2 Kilol Cloro T2 12,05 1,92 0,31 5 3,9 0,06 Kilol Cloro T2 11,07 2,57 0,32 6 6,23 0,13 Kilol Cloro T2 Kilol Cloro T2 1,47 0,16 0,36 Kilol Cloro T2 2,3 0,3 0,3 2 0,35 0 Kilol Cloro T2 3,39 1,82 0,33 3 2,99 0,06 Kilol Cloro T2 8,66 1,56 0,31 2 1,24 0,01 Kilol Cloro T2 7,63 2,14 0,3 3 3,73 0,12 Testigo Cloro T3 8,59 1,7 0,3 4 4,54 0,12 Testigo Cloro T3 6,56 0,76 0,3 2 0,8 0 Testigo Cloro T3 14,67 1,88 0,32 4 4,39 0,06 Testigo Cloro T3 Testigo Cloro T3 8,92 2,01 0,31 8 2,19 0,07 Testigo Cloro T3 8,06 1,74 0,27 3 6,86 0,19 Testigo Cloro T3 7,55 1,67 0,23 4 4,96 0,11 Testigo Cloro T3 Testigo Cloro T3 Testigo Cloro T3 8,86 0,7 0,3 3 1,96 0,03 Testigo Cloro T3 9,1 0,27 5 2,12 0,05

110

Testigo Cloro T3 Testigo Cloro T3 6,48 0,66 0,32 4 1,31 0,01 Testigo Cloro T3 13,8 2,77 0,34 6 6,5 0,12 Testigo Cloro T3 10,38 3,25 0,29 3 11,8 0,34 Alcohol Mercurio T4 Alcohol Mercurio T4 7,87 1,23 0,29 4 3,43 0,05 Alcohol Mercurio T4 Alcohol Mercurio T4 6,85 0,94 0,29 3 3,4 0,04 Alcohol Mercurio T4 Alcohol Mercurio T4 8,75 1,68 0,29 6 3,67 0,04 Alcohol Mercurio T4 12,78 1,62 0,27 5 4,47 0,05 Alcohol Mercurio T4 12,67 2,19 0,31 5 3,91 0,05 Alcohol Mercurio T4 9,83 1,9 0,27 5 3,26 0,05 Alcohol Mercurio T4 8,73 1,15 0,28 3 4,1 0,07 Alcohol Mercurio T4 6,82 0,94 0,3 4 2,27 0,04 Alcohol Mercurio T4 9,04 1,08 0,32 4 2,76 0,04 Alcohol Mercurio T4 8,49 1,21 0,33 3 3,45 0,04 Alcohol Mercurio T4 Alcohol Mercurio T4 8,27 0,3 3 1,71 0,02 Kilol Mercurio T5 9,31 2,72 0,27 5 7,87 0,23 Kilol Mercurio T5 Kilol Mercurio T5 13,03 2,91 0,33 6 6,79 0,13 Kilol Mercurio T5 9,52 2,75 0,29 6 3,58 0,08 Kilol Mercurio T5 12,44 2,92 0,33 5 7,61 0,17 Kilol Mercurio T5 9,66 2,76 0,29 4 6,24 0,16 Kilol Mercurio T5 10,31 2,26 0,28 6 5,1 0,12 Kilol Mercurio T5 Kilol Mercurio T5 9,08 2,26 0,28 5 7,16 0,16 Kilol Mercurio T5 6,68 2,33 0,27 4 6,35 0,14 Kilol Mercurio T5 14,65 2,18 0,33 5 3,95 0,06 Kilol Mercurio T5 7,18 1,53 0,26 4 5,7 0,1 Kilol Mercurio T5 Kilol Mercurio T5 Kilol Mercurio T5 14,18 2,38 6 7,91 0,19 Testigo Mercurio T6 9,2 1,45 0,29 2 9,01 0,19 Testigo Mercurio T6 5,32 1,06 0,26 6 3,45 0,06 Testigo Mercurio T6 4,11 0,69 0,25 3 4,88 0,07 Testigo Mercurio T6 4,26 0,69 0,23 3 3,09 0,04 Testigo Mercurio T6 4,68 1,18 0,26 3 6,71 0,15 Testigo Mercurio T6 11,85 2,69 0,31 7 5,05 0,1 Testigo Mercurio T6 4,03 0,85 0,22 4 4,45 0,06 Testigo Mercurio T6 13,12 2,59 0,31 6 5,03 0,11 Testigo Mercurio T6 10,88 2,84 0,32 7 6,3 0,13 Testigo Mercurio T6 9,78 1,31 0,3 5 2,84 0,03 Testigo Mercurio T6 7,64 2,19 0,27 6 8,64 0,17 111

Testigo Mercurio T6 Testigo Mercurio T6 Testigo Mercurio T6 8,32 0,99 0,23 4 4,37 0,05 Testigo Mercurio T6 12,49 2,6 0,26 7 3,54 0,07

ANEXO 5: Datos crudos del efecto de la desinfección de doble fase sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante la multiplicación in vitro. Vivero Laboratorio Trat Tratamiento Número de nudo Peso Longitud Alcohol Cloro T1 T11 5 2,1 14,27 Alcohol Cloro T1 T14 2 1,31 14,36 Alcohol Cloro T1 T14 3 1,48 13,74 Alcohol Cloro T1 T16 1 2,42 12,73 Alcohol Cloro T1 T16 2 3,8 17,54 Alcohol Cloro T1 T16 3 0,57 11,69 Alcohol Cloro T1 T16 4 2,62 10,61 Alcohol Cloro T1 T16 5 3,23 18,28 Alcohol Cloro T1 T17 4 3,96 15,18 Alcohol Cloro T1 T112 5 3,82 17,18 Alcohol Cloro T1 T113 3 3,06 15,08 Alcohol Cloro T1 T113 4 3,18 16,35 Alcohol Cloro T1 T113 5 2,95 15,26 Alcohol Cloro T1 T114 3 3,21 17,56 Alcohol Cloro T1 T114 4 2,48 16,33 Kilol Cloro T2 T21 1 2,98 15,75 Kilol Cloro T2 T24 2 4,47 18,24 Kilol Cloro T2 T25 3 1,16 10,53 Kilol Cloro T2 T25 4 2,39 14,21 Kilol Cloro T2 T26 1 2,77 16,4 Kilol Cloro T2 T26 2 0,76 4,88 Kilol Cloro T2 T26 3 2,81 17,24 Kilol Cloro T2 T26 4 2,65 16,47 Kilol Cloro T2 T26 5 1,29 9,2 Kilol Cloro T2 T28 3 1,78 13,79 Kilol Cloro T2 T28 4 0,73 10,44 Kilol Cloro T2 T29 1 2,39 15,81 Kilol Cloro T2 T29 2 2,6 16,1 Kilol Cloro T2 T29 3 3,82 19,19 Kilol Cloro T2 T29 4 2,59 16,74 Kilol Cloro T2 T29 5 3,55 7,92 Kilol Cloro T2 T212 1 0,32 2,67 Kilol Cloro T2 T213 1 3,58 17,22 Kilol Cloro T2 T213 2 3,27 14,31 Kilol Cloro T2 T213 3 3,6 17,87 Kilol Cloro T2 T215 3 3,02 18,82 Kilol Cloro T2 T215 4 3,83 14,63

112

Testigo Cloro T3 T31 2 2,32 17,88 Testigo Cloro T3 T31 3 1,76 14,49 Testigo Cloro T3 T33 3 1,87 17,74 Testigo Cloro T3 T33 5 2,23 15,8 Testigo Cloro T3 T35 4 1,65 17,26 Testigo Cloro T3 T35 5 2,7 18,5 Testigo Cloro T3 T35 6 2,49 15 Testigo Cloro T3 T36 3 2,1 15,08 Testigo Cloro T3 T36 4 2,95 12,39 Testigo Cloro T3 T37 4 3,95 25,05 Testigo Cloro T3 T310 2 Testigo Cloro T3 T310 3 Testigo Cloro T3 T311 4 20,22 Testigo Cloro T3 T313 2 3,35 12,97 Testigo Cloro T3 T314 2 2,94 8,22 Testigo Cloro T3 T314 3 2,43 10,14 Testigo Cloro T3 T314 4 2,67 11,78 Testigo Cloro T3 T314 5 2,32 10,88 Testigo Cloro T3 T314 6 0,94 7,82 Testigo Cloro T3 T314 7 3,35 16,1 Alcohol Mercurio T4 T44 4 4,02 15,93 Alcohol Mercurio T4 T49 3 4,2 18,75 Alcohol Mercurio T4 T49 4 0,82 13,59 Alcohol Mercurio T4 T49 5 2,22 17,03 Alcohol Mercurio T4 T411 1 2,68 14,65 Alcohol Mercurio T4 T412 3 3,56 14,45 Alcohol Mercurio T4 T412 4 2,15 14,9 Alcohol Mercurio T4 T415 4 3,99 20,02 Kilol Mercurio T5 T57 4 2,64 16,77 Kilol Mercurio T5 T57 5 2,14 16,38 Kilol Mercurio T5 T511 1 1,37 11 Kilol Mercurio T5 T511 2 1,99 11,88 Kilol Mercurio T5 T511 3 2,73 14,1 Kilol Mercurio T5 T511 4 3,16 17,33 Testigo Mercurio T6 T66 2 2,66 8,22 Testigo Mercurio T6 T66 4 2 4,66 Testigo Mercurio T6 T67 1 0,81 6,75 Testigo Mercurio T6 T67 2 0,64 3,95 Testigo Mercurio T6 T67 3 2,67 9,87 Testigo Mercurio T6 T69 5 0,65 14,7 Testigo Mercurio T6 T611 2 2,14 8,37 Testigo Mercurio T6 T611 3 0,93 6,44 Testigo Mercurio T6 T615 1 2,89 13,07 Testigo Mercurio T6 T615 4 3,86 17,57 Testigo Mercurio T6 T615 7 0,72 3,91 113

Alcohol Cloro T7 T11 1 2,96 16,02 Alcohol Cloro T7 T11 2 3,6 19,75 Alcohol Cloro T7 T11 3 1,64 13,76 Alcohol Cloro T7 T11 4 4,36 23,16 Alcohol Cloro T7 T12 1 2,83 15,77 Alcohol Cloro T7 T16 6 3,53 19,2 Alcohol Cloro T7 T17 1 3,71 17,87 Alcohol Cloro T7 T17 2 3,61 16,61 Alcohol Cloro T7 T17 3 3,11 18,58 Alcohol Cloro T7 T18 1 5,02 25,14 Alcohol Cloro T7 T18 2 2,8 16,4 Alcohol Cloro T7 T18 3 3,74 21,93 Alcohol Cloro T7 T18 4 3,42 18,18 Alcohol Cloro T7 T19 1 3,76 20,15 Alcohol Cloro T7 T19 2 2,7 16,48 Alcohol Cloro T7 T19 3 5,05 23,41 Alcohol Cloro T7 T19 4 3,24 19,53 Alcohol Cloro T7 T19 5 3,07 17,94 Alcohol Cloro T7 T112 1 2,06 20,18 Alcohol Cloro T7 T112 2 2,87 12,5 Alcohol Cloro T7 T112 3 2,14 17,07 Alcohol Cloro T7 T112 4 1,83 14,25 Alcohol Cloro T7 T113 1 3,52 20,22 Alcohol Cloro T7 T113 2 4,3 22,67 Alcohol Cloro T7 T114 1 4,29 21,74 Alcohol Cloro T7 T114 2 3,46 17,78 Kilol Cloro T8 T24 1 2,8 18,23 Kilol Cloro T8 T24 3 2,96 17,4 Kilol Cloro T8 T214 1 3,94 20,26 Kilol Cloro T8 T214 2 5,35 23,88 Kilol Cloro T8 T214 3 2,61 14,99 Kilol Cloro T8 T215 1 1,14 14,22 Kilol Cloro T8 T215 2 2,48 16,47 Testigo Cloro T9 T31 1 5,48 25,52 Testigo Cloro T9 T33 1 3,76 19,6 Testigo Cloro T9 T33 3 2,19 10,05 Testigo Cloro T9 T33 4 3,39 16,69 Testigo Cloro T9 T35 1 2,19 18,99 Testigo Cloro T9 T35 2 1,83 14,6 Testigo Cloro T9 T35 3 2,96 17,53 Testigo Cloro T9 T36 1 3,17 20,91 Testigo Cloro T9 T36 2 3,76 22,47 Testigo Cloro T9 T37 1 2,1 15,42 Testigo Cloro T9 T37 2 3,16 18,67 Testigo Cloro T9 T37 3 1,41 13,3 114

Testigo Cloro T9 T311 1 1,76 15,8 Testigo Cloro T9 T311 2 4,3 21,43 Testigo Cloro T9 T311 3 2,51 17,29 Alcohol Mercurio T10 T42 1 2,77 15,24 Alcohol Mercurio T10 T42 2 4,39 21,97 Alcohol Mercurio T10 T42 3 3,84 24,58 Alcohol Mercurio T10 T42 4 3,39 20,08 Alcohol Mercurio T10 T44 1 0,78 3,37 Alcohol Mercurio T10 T44 2 5,47 27,79 Alcohol Mercurio T10 T44 3 2,9 20,69 Alcohol Mercurio T10 T46 1 3,33 13,72 Alcohol Mercurio T10 T46 2 2,99 12,09 Alcohol Mercurio T10 T46 3 4,07 23,45 Alcohol Mercurio T10 T46 4 1,45 6,72 Alcohol Mercurio T10 T46 5 2,26 15,32 Alcohol Mercurio T10 T46 6 4,16 15,66 Alcohol Mercurio T10 T47 1 4,45 22,05 Alcohol Mercurio T10 T47 2 3,97 21,71 Alcohol Mercurio T10 T47 3 4,61 23,47 Alcohol Mercurio T10 T47 4 2,02 12,71 Alcohol Mercurio T10 T47 5 2,05 14,92 Alcohol Mercurio T10 T48 1 5,65 23,55 Alcohol Mercurio T10 T48 2 2,65 19,23 Alcohol Mercurio T10 T48 3 2,8 20,16 Alcohol Mercurio T10 T48 4 4,78 23,64 Alcohol Mercurio T10 T48 5 2,45 15,42 Alcohol Mercurio T10 T48 6 4,67 25,09 Alcohol Mercurio T10 T49 1 4,31 22,12 Alcohol Mercurio T10 T49 2 4,95 28,42 Alcohol Mercurio T10 T410 1 4,81 25,01 Alcohol Mercurio T10 T410 2 2,64 18,62 Alcohol Mercurio T10 T410 3 3,44 21,79 Alcohol Mercurio T10 T411 2 3,34 21,05 Alcohol Mercurio T10 T411 3 3,7 22,44 Alcohol Mercurio T10 T411 4 2,53 14,54 Alcohol Mercurio T10 T411 5 3,55 19,78 Alcohol Mercurio T10 T412 1 3,91 20,62 Alcohol Mercurio T10 T412 2 4,4 23,54 Alcohol Mercurio T10 T413 1 4,01 22,85 Alcohol Mercurio T10 T413 2 3,17 20,77 Alcohol Mercurio T10 T413 3 3,54 20,16 Alcohol Mercurio T10 T413 4 4,92 24,99 Alcohol Mercurio T10 T415 1 3,8 23,69 Alcohol Mercurio T10 T415 2 2,11 17,6 Alcohol Mercurio T10 T415 3 2,97 18,76 115

Kilol Mercurio T11 T53 1 3,04 16,39 Kilol Mercurio T11 T53 2 1,98 14,13 Kilol Mercurio T11 T53 3 4,95 21,62 Kilol Mercurio T11 T53 4 2,05 12,58 Kilol Mercurio T11 T53 5 5,07 21,3 Kilol Mercurio T11 T53 6 3,22 18,07 Kilol Mercurio T11 T53 7 5,05 20,9 Kilol Mercurio T11 T54 1 3,86 13,32 Kilol Mercurio T11 T54 2 2,9 12,59 Kilol Mercurio T11 T54 3 3,82 18,61 Kilol Mercurio T11 T54 4 1,49 10,71 Kilol Mercurio T11 T54 5 4,38 18,49 Kilol Mercurio T11 T55 1 2,73 13,22 Kilol Mercurio T11 T55 2 3,18 15,79 Kilol Mercurio T11 T55 3 3,2 20,59 Kilol Mercurio T11 T55 4 2,68 14,71 Kilol Mercurio T11 T55 5 2,95 11,25 Kilol Mercurio T11 T55 6 3,39 12,66 Kilol Mercurio T11 T56 1 2,23 14,31 Kilol Mercurio T11 T56 2 3,5 17,51 Kilol Mercurio T11 T57 1 2,68 16,67 Kilol Mercurio T11 T57 2 5,4 25,85 Kilol Mercurio T11 T57 3 4,94 18,41 Kilol Mercurio T11 T59 1 1,03 13,54 Kilol Mercurio T11 T59 2 4,5 24,27 Kilol Mercurio T11 T59 3 2,88 18,3 Kilol Mercurio T11 T59 4 2,55 12,48 Kilol Mercurio T11 T510 1 2,49 18,65 Kilol Mercurio T11 T510 2 2,9 19,93 Kilol Mercurio T11 T510 3 4,48 19,99 Kilol Mercurio T11 T510 4 5,51 24,8 Kilol Mercurio T11 T511 5 2,87 17,79 Kilol Mercurio T11 T512 1 2,46 16,41 Kilol Mercurio T11 T512 2 4,83 24,42 Kilol Mercurio T11 T512 3 2,69 19,64 Kilol Mercurio T11 T512 4 2,61 18 Kilol Mercurio T11 T515 1 3,39 16,66 Kilol Mercurio T11 T515 2 2,21 9,87 Kilol Mercurio T11 T515 3 3,1 16,05 Kilol Mercurio T11 T515 4 2,32 9,35 Kilol Mercurio T11 T515 5 3,1 14,65 Kilol Mercurio T11 T515 6 0,63 1,67 Testigo Mercurio T12 T61 1 3,05 21,77 Testigo Mercurio T12 T62 1 4,61 20,55 Testigo Mercurio T12 T63 1 2,16 12,49 116

Testigo Mercurio T12 T63 2 3,67 15,52 Testigo Mercurio T12 T63 3 3,49 21,86 Testigo Mercurio T12 T65 1 3,22 18,61 Testigo Mercurio T12 T65 2 2,67 21,42 Testigo Mercurio T12 T65 3 2,46 12,84 Testigo Mercurio T12 T66 1 2,25 18,82 Testigo Mercurio T12 T66 3 3,12 14,87 Testigo Mercurio T12 T66 5 3,46 17,38 Testigo Mercurio T12 T66 6 1,89 11,04 Testigo Mercurio T12 T66 7 5,19 19,17 Testigo Mercurio T12 T68 1 3,23 20,72 Testigo Mercurio T12 T68 2 1,71 12,57 Testigo Mercurio T12 T68 3 3,45 20,13 Testigo Mercurio T12 T68 4 6,31 25,03 Testigo Mercurio T12 T68 5 4,04 20,14 Testigo Mercurio T12 T68 6 4,44 22,05 Testigo Mercurio T12 T69 1 4,1 24,07 Testigo Mercurio T12 T69 2 4,03 21,66 Testigo Mercurio T12 T69 3 3,21 20,49 Testigo Mercurio T12 T69 4 6,57 26,25 Testigo Mercurio T12 T69 6 3,31 23,08 Testigo Mercurio T12 T611 1 2,82 10,03 Testigo Mercurio T12 T614 1 4,65 21,9 Testigo Mercurio T12 T614 2 Testigo Mercurio T12 T614 3 3 16,02 Testigo Mercurio T12 T615 2 Testigo Mercurio T12 T615 3 Testigo Mercurio T12 T615 5 3,5 14,72 Testigo Mercurio T12 T615 6

ANEXO 6: Datos crudos del efecto de la condición y el tipo de explante sobre la respuesta de algunas variables de crecimiento durante el desarrollo inicial del cultivo en vivero y en sistemas agroforestales Tipo de planta Condición Fertilización PT PE NRT PR NE LB (cm) LRT (cm) LRP (cm) Esqueje Vivero Sin Fertilización 15,3 6,8 10 0,9 8 33,94 59,74 5,97 Esqueje Vivero Sin Fertilización 36,1 14,3 13 2,9 10 40,16 182,5 14,04 Esqueje Vivero Sin Fertilización 24,7 12,8 11 1,9 10 47,82 124,87 11,35 Esqueje Vivero Sin Fertilización 22,8 10,4 11 1,4 8 36,74 93,01 8,46 Esqueje Vivero Sin Fertilización 28,3 10,3 11 2,8 8 37,63 159,32 14,48 Esqueje Vivero Sin Fertilización 13,4 4,1 8 0,9 5 21,22 53,97 6,75 Esqueje Vivero Sin Fertilización 29,3 14,5 12 2,5 10 48,21 162,8 13,57 Esqueje Vivero Sin Fertilización 12,1 4,6 7 0,6 6 21,16 45,41 6,49 Esqueje Vivero Sin Fertilización 32 14,3 15 2,1 10 50,55 140,63 9,38 Esqueje Vivero Sin Fertilización 18,5 5,8 10 1,2 7 30,63 115,85 11,59 Esqueje Vivero Sin Fertilización 26,1 10,9 11 2,2 8 47,71 124,7 11,34 117

Esqueje Vivero Sin Fertilización 27,1 12,8 17 2,1 9 37,02 170,9 10,05 Esqueje Vivero Sin Fertilización 33,7 14,6 10 2,3 9 48,8 134,33 13,43 Esqueje Vivero Sin Fertilización 20,6 9,1 10 2,1 8 44,05 176,07 17,61 Esqueje Vivero Sin Fertilización 32 13,5 10 2,8 8 47,14 191,85 19,19 Esqueje Vivero Sin Fertilización 11,6 4,6 9 0,7 6 22,13 57,44 6,38 Esqueje Vivero Sin Fertilización 35,6 15 13 4,1 10 50,5 159,62 12,28 Esqueje Vivero Sin Fertilización 61,1 29,6 18 5,8 15 96,09 435,49 24,19 Esqueje Vivero Sin Fertilización 37,4 14 2,5 9 53,16 258,49 18,46 Esqueje Vivero Sin Fertilización 28,4 12,3 12 1,8 9 54,64 264,95 22,08 In vitro Vivero Sin Fertilización 2,7 1,7 5 0,1 7 10,85 14,13 2,83 In vitro Vivero Sin Fertilización 1,8 0,4 6 0,1 2 2,39 19,87 3,31 In vitro Vivero Sin Fertilización 5,1 3,1 9 0,5 7 15,46 36,29 4,03 In vitro Vivero Sin Fertilización 3,8 2,5 8 0,7 6 16,07 56,16 7,02 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,9 3 6 0,1 7 16,3 19,86 3,31 In vitro Vivero Sin Fertilización 2,8 1,6 10 0,1 6 13,58 53,63 5,36 In vitro Vivero Sin Fertilización 6,2 3,8 13 0,7 7 21,63 63,63 4,89 In vitro Vivero Sin Fertilización 3,9 2,2 14 0,3 5 14,14 33,51 2,39 In vitro Vivero Sin Fertilización 1,3 0,9 8 0 5 11,9 24,16 3,02 In vitro Vivero Sin Fertilización 8,4 6,4 15 0,8 8 28,19 67,22 4,48 In vitro Vivero Sin Fertilización 7,4 4,2 9 0,4 7 21,42 37,35 4,15 In vitro Vivero Sin Fertilización 5,22 3,44 10,5 0,44 6,8 18,688 45,885 4,296 In vitro Vivero Sin Fertilización 3,84 2,35 9,5 0,22 5,7 14,481 32,74 3,426 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,78 2,93 10 0,33 6,1 16,748 40,272 3,911 In vitro Vivero Sin Fertilización 3,35 1,9 8,1 0,28 5,5 11,26 27,789 3,497 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,1 2,57 9,3 0,34 6,2 14,789 35,07 3,55 In vitro Vivero Sin Fertilización 3,37 2,05 8,70 0,38 5,6 13,648 38,423 4,455 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,91 3,37 10,4 0,41 6,1 16,933 43,683 3,978 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,11 2,44 9,5 0,33 6,1 15,722 44,187 4,786 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,11 2,36 7,8 0,33 5,6 14,044 34,854 4,301 In vitro Vivero Sin Fertilización 4,21 2,53 7,9 0,23 6,6 15,344 36,44 4,404 Esqueje Campo Sin Fertilización 19,8 10,9 8 2,1 8 22,58 139,29 17,41 Esqueje Campo Sin Fertilización 85,5 61,4 21 5,9 22 103,53 329,48 15,69 Esqueje Campo Sin Fertilización 20 8,3 10 0,9 12 36,21 62,76 6,28 Esqueje Campo Sin Fertilización 34,8 22,5 10 1,3 12 39,88 111,85 11,19 Esqueje Campo Sin Fertilización 19 7,5 5 1,4 8 21,11 82,14 16,43 Esqueje Campo Sin Fertilización 34,1 26,8 10 3,2 13 43,31 133,46 13,35 Esqueje Campo Sin Fertilización 43,7 15 3,6 15 52,86 199,54 13,30 Esqueje Campo Sin Fertilización 29,5 24,8 8 1,7 12 34,14 65,23 8,15 Esqueje Campo Sin Fertilización 31,2 15,8 9 2 11 32,29 100,25 11,14 Esqueje Campo Sin Fertilización 49,1 34,1 22 2,3 20 73,78 147,85 6,72 Esqueje Campo Sin Fertilización 53,1 40,5 19 2,7 19 67,33 117,8 6,20 Esqueje Campo Sin Fertilización 52,7 34,5 14 1,2 14 52,96 54,67 3,91 Esqueje Campo Sin Fertilización 29 18,5 9 1,6 11 32,1 78,29 8,70 Esqueje Campo Sin Fertilización 60,2 44,9 20 2,8 19 73,65 132,51 6,63 Esqueje Campo Sin Fertilización 27,7 15,6 18 1,9 15 48,82 108,02 6,00 118

Esqueje Campo Sin Fertilización 22,4 16,3 9 0,3 14 36,76 12,93 1,44 Esqueje Campo Sin Fertilización 29,7 24,5 11 0,9 15 41,75 41,92 3,81 Esqueje Campo Sin Fertilización 52,9 34,7 14 2,3 17 61,03 125,01 8,93 Esqueje Campo Sin Fertilización 36,5 19,5 13 3,1 12 34,85 117,77 9,06 Esqueje Campo Sin Fertilización 21,5 10,7 8 2 9 25,08 86,6 10,83 Esqueje Campo Sin Fertilización 46,3 35,1 20 2,7 18 59,06 154,78 7,74 Esqueje Campo Sin Fertilización 73,7 57,2 17 4,9 17 83,74 232,36 13,67 Esqueje Campo Sin Fertilización 38,6 30,9 13 2,6 16 46,92 133,89 10,30 Esqueje Campo Sin Fertilización 30,3 22,1 12 0,6 13 55,09 40,61 3,38 Esqueje Campo Sin Fertilización 28 17,2 10 2 9 26,92 130,25 13,03 Esqueje Campo Sin Fertilización 26,5 20,8 10 0,7 16 56,15 28,36 2,84 Esqueje Campo Sin Fertilización 18,3 7,7 7 0,3 7 15,2 54,45 7,78 Esqueje Campo Sin Fertilización 20 10,3 7 0,5 12 27,94 58,72 8,39 Esqueje Campo Sin Fertilización 31,8 20,3 11 1,7 11 34,14 94,09 8,55 In vitro Campo Sin Fertilización 9,1 7,2 9 1,9 11 27,99 89,31 9,92 In vitro Campo Sin Fertilización 57,2 52,3 27 4,8 38 127,25 363,47 13,46 In vitro Campo Sin Fertilización 36,6 33,3 27 1,4 34 88,32 278,53 10,32 In vitro Campo Sin Fertilización 30,1 26,7 18 3,1 29 79,1 168,31 9,35 In vitro Campo Sin Fertilización 8,5 8,1 13 0,2 20 50,78 17,55 1,35 In vitro Campo Sin Fertilización 6,4 5,9 13 0,3 21 47,46 41,17 3,17 In vitro Campo Sin Fertilización 10,6 9,9 13 0,7 17 39,25 69,98 5,38 In vitro Campo Sin Fertilización 18,4 16,5 16 1,8 18 51,77 106,03 6,63 In vitro Campo Sin Fertilización 15,2 13,4 19 1,6 27 62,85 104,65 5,51 In vitro Campo Sin Fertilización 1,1 1 4 0,1 9 19,59 9,49 2,37 In vitro Campo Sin Fertilización 14,85 13,33 14,8 1,38 21,4 53,12 88,03 5,85 In vitro Campo Sin Fertilización 17,6 15,84 15,1 1,65 21,3 56,07 110,34 6,49 In vitro Campo Sin Fertilización 14,33 13,05 15 1,12 22,2 56,82 84,69 4,57 In vitro Campo Sin Fertilización 25,3 22,64 17,3 2,25 22,3 63,41 181,72 9,92 In vitro Campo Sin Fertilización 19,87 17,78 15,5 2 21,3 58,72 135,79 8,05 In vitro Campo Sin Fertilización 26 23,49 19,3 1,86 25,4 68,95 177,99 8,55 In vitro Campo Sin Fertilización 20,34 18,39 15 1,69 21,4 59,16 137,51 6,96 In vitro Campo Sin Fertilización 15,35 13,94 13,9 1,09 20,5 52,9 86,28 4,98 In vitro Campo Sin Fertilización 16,79 14,95 13,4 1,71 20,4 54,17 106,1 6,68 In vitro Campo Sin Fertilización 14,74 13,32 14,1 1,07 21,3 54,47 82,53 4,99

119