Universidade Estadual De Campinas Faculdade De

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

ILÁRIA CRISTINA SGARDIOLI

Investigação da Síndrome de deleção 22q11.2 utilizando diferentes

estratégias para aplicação em saúde

CAMPINAS

2018 ii

Ilária Cristina Sgardioli

Investigação da Síndrome de deleção 22q11.2 utilizando diferentes

estratégias para aplicação em saúde

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual

de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de

Doutora em Ciências, Área de Concentração Genética Médica.

Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes

Coorientador: Prof. Dr. Társis Antonio Paiva Vieira

Este exemplar corresponde a versão final da Tese defendida pela aluna Ilária Cristina Sgardioli, orientada pela Profa. Dra. Vera Lúcia Gil-da-Silva Lopes.

CAMPINAS

2018 iii

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7253-7830

Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas Maristella Soares dos Santos – CRB 8/8402

Sgardioli, Ilária Cristina, 1981- Sg16i Investigação da síndrome de deleção 22q11.2 utilizando diferentes estratégias para aplicação em saúde / Ilária Cristina Sgardioli. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.

Orientador: Vera Lúcia Gil da Silva Lopes. Coorientador: Társis Antonio Paiva Vieira. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.

1. Síndrome da deleção 22q11.2. 2. Hibridização genômica comparativa. 3. Variações do número de cópias de DNA. 4. Perda de heterozigosidade. I. Lopes, Vera Lúcia Gil da Silva, 1967-. II. Vieira, Társis Antonio Paiva, 1981-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Investigation of 22q11.2 deletion syndrome using different strategies for an approach focused on healthcare Palavras-chave em inglês: 22q11.2 deletion syndrome Comparative genomic hybridization DNA copy number variations Loss of heterozygosity Área de concentração: Genética Médica Titulação: Doutora em Ciências Banca examinadora: Vera Lúcia Gil da Silva Lopes [Orientador] Maria Isabel de Souza Aranha Melaragno Vera de Freitas Ayres Meloni Cláudia Vianna Maurer Morelli Carmem Silvia Bertuzzo Data de defesa: 27-07-2018 Programa de Pós-Graduação: Ciências Médica iv

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

ILÁRIA CRISTINA SGARDIOLI

ORIENTADOR: Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopes

COORIENTADOR: Társis Antonio Paiva Vieira

MEMBROS:

1. PROFA. DRA. VERA LÚCIA GIL-DA-SILVA-LOPES

2. PROFA. DRA. MARIA ISABEL DE SOUZA ARANHA MELARAGNO

3. PROFA. DRA. VERA DE FREITAS AYRES MELONI

4. PROFA. DRA. CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI

5. PROFA. DRA. CARMEM SILVIA BERTUZZO

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas. A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 27/07/2018 v

Dedico este trabalho aos meus pais Manoel e Gilda, ao meu irmão Rafael e a minha avó Arlete por todo amor, dedicação e apoio em todos os momentos de minha vida. Eu os amos incondicionalmente. vi

Agradecimentos

Ao Universo, que me presenteia com coisas maravilhosas em minha vida, me ensinando que tudo é perfeitamente harmônico, o que nos propicia a colheita de tudo que plantamos;

Aos meus pais Manoel e Gilda, que me ensinaram desde cedo que todas as coisas são possíveis, desde que desejemos de coração e nos esforcemos para isso. Muito obrigada por todo amor, carinho, compreensão e apoio;

Ao meu irmão Rafael, que com sabedoria me incentiva e me apoia em momentos de maior fragilidade;

À minha avó Arlete, pelo amor incondicional e pelo apoio em todos os momentos;

À minha orientadora, Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, pela oportunidade e aprendizado durante estes anos;

Ao meu coorientador, Prof. Dr. Társis Antonio Paiva Vieira, pela oportunidade e por compartilhar seus conhecimentos comigo. Além disso, quero agradecer por toda sua amizade e contribuição neste trabalho, que foi imensa e de suma importância;

À Banca Examinadora pela contribuição na participação e elaboração desta tese;

À toda a equipe do Projeto Crânio Face Brasil, e aos pacientes e seus familiares que aceitaram participar deste estudo, tornando-o possível; vii

Ao Comitê da Associação Europeia de Citogenética, pela bolsa de estudos concedida para a participação e apresentação deste trabalho na 11ª Conferência Europeia de Citogenética em

Florença, de 1 a 4 de julho de 2017;

À Marcinha, secretária do curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas, pela paciência e disponibilidade de sempre;

Aos funcionários e ex-funcionários do Laboratório de Citogenética Humana e Laboratório de

Genética Humana Molecular, bem como aos alunos e ex-alunos pertencentes aos mesmos; pelas diversas técnicas laboratoriais realizadas e pela companhia destes anos.

viii

RESUMO

A Síndrome de Deleção 22q11.2 (SD22q11.2 – OMIM: #188400 e #192430) tem incidência estimada de 1/4.000 a 1/6.000 nascimentos. A heterogeneidade clínica desta afecção é um desafio universal para a sua suspeita. No Brasil o diagnóstico se dá por volta de 10 anos de idade, comprometendo o manejo apropriado e o aconselhamento genético. O objetivo deste trabalho foi avaliar possíveis estratégias para o diagnóstico de indivíduos com suspeita clínica de SD22q11.2, considerando duas propostas anteriores do Projeto Crânio-Face Brasil: aplicação de critérios clínicos específicos para a investigação laboratorial da SD22q11.2 e utilização de uma aplicação on-line para registro, seguimento e somatória desses critérios, a

“CranFlow: craniofacial anomalies registration, flow and management”. Foram revisados os dados clínicos e laboratoriais de 347 indivíduos registrados na Base Brasileira de Anomalias

Craniofaciais /Síndrome de Deleção 22q11.2, no período de 2008 a 2017, inicialmente investigados para a SD22q11.2 por Hibridação in situ com Fluorescência (FISH) e/ou

Amplificação de múltiplas sondas dependente de ligação (MLPA), detectando ao todo 98 casos positivos para a SD22q11.2 e cinco deleções atípicas em 22q11.2. Os 347 indivíduos foram divididos em dois grupos: (I) 168 indivíduos investigados antes da aplicação dos critérios e (II)

179 indivíduos investigados após aplicação dos critérios. A detecção da SD22q11.2 no Grupo

I e no Grupo II foi de 26,79% e 29,61%, respectivamente. No Grupo II, a presença de indivíduos com SD22q11.2 e de critérios preenchidos (42,42%) foi significante quando comparada aos 13,75% que não preencheram os critérios e apresentam deleção em 22q11.2.

Foi significantemente relacionada à presença da SD 22q11.2, a associação de cardiopatias congênitas de alto valor preditivo e voz anasalada. Portanto, a análise da aplicação dos critérios clínicos propostos se mostrou uma ferramenta útil para a suspeita diagnóstica, uma vez que permitiu um incremento diagnóstico de 3,82 vezes. Dos 249 casos negativos para SD22q11.2, a análise cromossômica em microarranjos (CMA) foi realizada para 133, cujos resultados foram ix

reanalisados neste estudo com parâmetros atualizados de interpretação. Em 34 indivíduos os resultados foram diferentes dos anteriores, possibilitando duas conclusões diagnósticas adicionais, além de sugerir a investigação complementar de três casos com suspeita de dissomia uniparental (UDP). As diferentes abordagens utilizadas neste estudo permitiram a conclusão diagnóstica de 117 casos (33,7%) da amostra, reforçando a complexidade da investigação genético-clínica. Embora, de modo geral, a CMA apresente maior rendimento diagnóstico, a aplicação dos critérios clínicos pode favorecer o diagnóstico quando utilizado em conjunto com técnicas locus-específicas, em situações em que a utilização de CMA não seja possível em larga escala. Ainda, na ausência de SD22q11.2, a investigação por CMA utilizando os parâmetros aplicados neste estudo impactariam positivamente no número de casos com diagnóstico conclusivo. Considerando uma possível estratégia para investigação da SD22q11.2 em larga escala, pode-se sugerir: a) treinamento de equipes; b) utilização dos critérios clínicos propostos e da CranFlow para registro e seguimento dos casos com suspeita desta microdeleção; c) hierarquização de exames genéticos, e d) centralização da investigação laboratorial pública. A proposta apresentada tem relevância universal e é aplicável ao Sistema Único de Saúde.

Palavras-chave: Síndrome de Deleção 22q11.2, Hibridação in situ com Fluorescência,

Amplificação de Múltiplas Sondas Dependente de Ligação, Análise Cromossômica em

Microarranjos, Variação no Número de Cópias, Perda de Heterozigose.

ABSTRACT

The 22q11.2 Deletion Syndrome (22q11.2DS - OMIM: # 188400 and # 192430) has an estimated incidence of 1/4,000 to 1/6,000 births. The clinical heterogeneity of this condition is a universal challenge for its suspicion. In Brazil, the diagnosis occurs around 10 years of age, compromising appropriate management and genetic counseling. The aim of this study was to evaluate possible strategies for the diagnosis of individuals with clinical suspicion of

22q11.2DS, considering two previous proposals from Brazil´s CranioFacial Project: application of specific clinical criteria to proceed laboratory investigation of 22q11.2DS and use of an online application for registration, follow-up and summation of these criteria, the "CranFlow: craniofacial anomalies registration, flow and management". We reviewed the clinical and laboratory data of 347 individuals registered in the Brazilian Database on Craniofacial

Anomalies/22q11.2 Deletion Syndrome, from 2008 to 2017, initially investigated for

22q11.2DS by Fluorescent in situ Hybridization (FISH) and/or Multiplex Ligation Probe- dependent Amplification (MLPA), detecting 98 cases with 22q11.2DS and five atypical deletions in 22q11.2. There were two groups of individuals: (I) 168 individuals investigated before the criteria application and (II) 179 individuals investigated after the criteria application.

The detection of 22q11.2DS in the Group I and Group II was 26.79% and 29.61%, respectively.

In Group II, the presence of individuals with 22q11.2DS who fulfilled criteria (42.42%) was significant when compared to the 13.75% who did not fill them. The association of congenital heart diseases with high predictive value and hypernasal voice was significantly related to the presence of 22q11.2DS. Therefore, the analysis of the application of the proposed clinical criteria proved to be a useful tool for the diagnostic suspicion, since it allowed a diagnostic increase of 3.82%. Of the 249 negative cases for SD22q11.2, the chromosomal microarray analysis was performed for 133 individuals and the results were reanalyzed in this study with updated interpretation parameters. The results were different from previous in 34 individuals, xi

allowing two diagnostic conclusions, which were not possible previously. Besides, the complementary investigation of three cases with suspected uniparental disomy (UPD) was suggested. The different approaches used in this study allowed the diagnostic conclusion of 117 cases (33.7%) of the sample, reinforcing the complexity of clinical genetic investigation.

Although CMA is more effective, in general, the use of clinical criteria may improve diagnosis when used with locus-specific techniques, in situations where the use of CMA is not possible on a large scale. In addition, in cases with clinical suspicion but without SD22q11.2, the investigation by CMA using the parameters applied in this study would have a positive impact in the number of cases with a conclusive diagnosis. Considering a possible strategy for

22q11.2DS investigation on a large scale, it may be suggested: a) training of teams; b) use of the proposed clinical criteria and of the CranFlow to record and follow up the cases with suspected microdeletion; c) hierarchization of genetic tests, and d) centralization of the public laboratory investigation. The presented proposal has universal relevance and is applicable to the Unified Health System.

Key words: 22q11.2 Deletion Syndrome, Fluorescence in Situ Hybridization, Multiplex

Ligation Probe-dependent Amplification, Chromosomal Microarray Analysis, Copy Number

Variations, Loss of Heterozygosity.

xii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Visualização gráfica do cromossomo 22, evidenciando a região que compreende as oito LCRs de A H (barras em azul) descritas de acordo com o genoma de referência GRCh37 - hg19, bem como os genes registrados no OMIM presentes nessas regiões. Este gráfico foi desenvolvido utilizando o conjunto de ferramentas da base de dados UCSC Genome Browser

(http://genome.ucsc.edu/) [20]...... 25

Figura 2. Adaptado de McDonald-McGinn DM et. al., 2015, esquema ilustrando o mecanismo de recombinação homóloga não alélica em 22q11.2 [22]...... 26

Figura 3. Adaptado de Zhang, 2009, esquema ilustrando os tipos de mecanismos envolvidos na formação de CNVs: recombinação homóloga não alélica (NAHR - nonallelic homologous recombination), junção de extremidades não homólogas (NHEJ: non-homologous end-joining) e forquilha de replicação seguida de troca da bolha de replicação (FoSTeS – fork stalling e template switching) [21]...... 39

Figura 4. Diferença entre heterodissomia uniparental e isodissomia uniparental. Adaptado de

Chromosome abnormalities and genetic counseling - 4th ed. [126]...... 42

Figura 5. Mecanismos pelos quais pode ocorrer a UPD de um cromossomo completo, publicada em 2018 por Niida et al. [124]...... 43

Figura 6. Mecanismo pelo qual ocorre a UPD segmentar, de acordo com Chromosome abnormalities and genetic counseling - 4th ed. [126]...... 44

Figura 7. Fluxograma da análise de CNVs e classificações...... 60

Figura 8. Fluxograma da análise de CN–LOH...... 62

Figura 9. Exemplo de interpretação dos resultados e fórmulas para executar o cálculo das proporções de inativação do cromossomo X nas amostras, descrito por Jones e colaboradores

[165]...... 67 xiii

Figura 10. Resultado da reanálise dos dados de CMA...... 74

Figura 11. Representação gráfica dos padrões de XCI para a região do gene AR (androgen receptor). A e B revela um padrão de inativação aleatório (randômico), onde A – amostra não digerida e B – amostra digerida. C e D revela um padrão de inativação preferencial para um alelo (não randômico), onde C – amostra não digerida e D – amostra digerida...... 83

Figura 12. Conclusão diagnóstica da amostra total, comparando os grupos I e II e o preenchimento ou não dos critérios propostos...... 88

Figura 13. Total de conclusão diagnóstica da amostra...... 89 xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Critérios Clínicos propostos por Monteiro et. al, 2013...... 37

Tabela 2. Propriedades Gerais das Classes de CNVs “de novo”...... 40

Tabela 3. Diferenças técnicas entre os tipos de CMA reanalisados...... 56

Tabela 4. Componentes para a realização da PCR...... 65

Tabela 5. Condições de temperatura e tempo para amplificação dos fragmentos...... 65

Tabela 6. Perfil da SD22q11.2 na amostra total e entre os grupos I e II...... 69

Tabela 7. Análise dos dados referente à aplicação dos critérios propostos por esse grupo de pesquisa na presente casuística (Grupo II)...... 71

Tabela 8. Comparação dos resultados de CMA anteriores com os resultados atuais, após a reanálise dos dados...... 75

Tabela 9. Resultados do cálculo para o padrão de inativação do cromossomo X nas mulheres investigadas...... 82

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACF: Anomalias Craniofaciais aDGV: Affymetrix® Database Genomic Variants a-GH: array Genomic Hybridization

ANS: Agência Nacional de Saúde Suplementar

AOH: Absence of heterozygosity

AR: Androgen receptor array-CGH: array Comparative Genomic Hybridization

BBAC: Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais

BBDCF: Base Brasileira de Dados Clínicos e Familiais de Fendas Orofaciais Típicas

ChAS: Chromosome Analysis Suite

ClinGen: Clinical Genome Resource

CMA: Chromosomal microarray analysis

CN-LOH: Copy Neutral – Loss of Heterozygosity

CNVs: Copy Number Variants

CranFlow: Craniofacial Anomalies: Registration, Flow, and Management

DECIPHER: DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl

Resources

DGV: Database of Genomic Variants

DNA: Deoxyribonucleic Acid

FCM: Faculdade de Ciências Médicas

FISH: Fluorescence in situ Hybridization

FoSTeS: Fork stalling e template switching

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística xvi

IDs: Imprinting disorders

Kb: Kilobase

LCR: Low Copy Repeat

LCSH: Long contiguous stretches of homozygosity

LOH: Loss of heterozygosity

MAPD: Median Absolute Pairwise Difference

Mb: Megabase

MLPA: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NAHR: Nonallelic homologous recombination

NHEJ: non-homologous end-joining

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man

OMS: Organização Mundial de Saúde pb: pares de bases

PCFB: Projeto Crânio Face Brasil

PCR: Polymerase Chain Reaction

QI: Quociente de inteligência

ROH: Regions of homozygosity

RP2: Retinitis pigmentosa 2

SD22q11.2: Síndrome de deleção 22q11.2

SNP-array: Single Nucleotide Polymorphism array

SNPQC: Single Nucleotide Polymorphism Quality Control

SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms

SUS: Sistema Único de Saúde

SVCF: Síndrome Velocardiofacial

TBX1: T-box 1 xvii

TCLE: Termo de consentimento livre e esclarecido

UCSC: University of California, Santa Cruz

UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas

UPD: Uniparental disomy

UPhD: Uniparental heterodisomy

UPiD: Uniparental isodisomy

VOUS: Variant of unknown significance

WavinessSD: Waviness Standard Deviation

WHO: World Health Organization

XCI X-chromosome inactivation

XIC: X-inactivation center

XIST: X-inactivation-specific transcript

xviii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 23

1.1. Aspectos gerais da Síndrome de Deleção 22q11.2 ...... 23

1.2. Etiologia ...... 24

1.3. Manifestações Clínicas ...... 27

1.4. Diagnóstico ...... 29

1.5. Aconselhamento Genético ...... 31

1.6. Suspeita Clínica e Diagnóstico Diferencial ...... 32

1.7. Genética Humana no âmbito do SUS ...... 33

1.8. Projeto Crânio-Face Brasil e Proposta dos Critérios Clínicos ...... 35

1.9. Dados gerados por CMA ...... 38

1.9.1. CNVs ...... 38

1.9.2. CNs–LOH ...... 41

1.10. Interpretação dos Dados de CMA Aplicados ao Diagnóstico ...... 45

1.10.1. Alterações no cromossomo X em mulheres ...... 49

2. OBJETIVOS...... 51

2.1. Objetivo Geral ...... 51

2.2. Objetivos Específicos ...... 51

3. ASPECTOS ÉTICOS ...... 52

4. CASUÍSTICA ...... 53 xix

5. MÉTODOS...... 54

5.1. Coleta de dados clínicos e aplicação dos critérios propostos ...... 54

5.2. Reanálise dos dados de CMA ...... 54

5.3. Padrão de Inativação do Cromossomo X ...... 63

6. RESULTADOS ...... 69

6.1. Dados gerais da amostra e teste dos critérios clínicos propostos para a SD22q11.2 .... 69

6.2. Diagnóstico da SD22q11.2 e Diagnóstico diferencial ...... 73

6.2.1. Alterações no cromossomo X em mulheres ...... 81

6.3. CNs–LOH ...... 85

6.4. Conclusão Diagnóstica da amostra total ...... 87

7. DISCUSSÃO ...... 90

7.1. Critérios Clínicos Propostos para suspeita da SD22q11.2 ...... 90

7.2. Conclusão diagnóstica em casos com suspeita clínica de SD22q11.2 ...... 95

7.2.1. CNVs no cromossomo X em mulheres ...... 98

7.3. CN-LOH ...... 100

7.4. Panorama da Conclusão Diagnóstica ...... 102

8. CONCLUSÕES ...... 104

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 105

10. REFERÊNCIAS ...... 107

11. APÊNDICE ...... 132

11.1. Apêndice I – Marcadores de microssatélites utilizados ...... 132

11.2. Apêndice II – Artigo 1 ...... 134 xx

11.3. Apêndice III – Artigo 2 ...... 143

11.4. Apêndice IV – Artigo 3 (Aceito para publicação) ...... 149

12. ANEXOS ...... 165

12.1. Anexo I – Atuais centros participantes do PCFB ...... 165

12.2. Anexo II – Parecer do Comitê de Ética nº 059/2008 ...... 167

12.3. Anexo III – Parecer do Comitê de Ética nº 714/2008 ...... 169

12.4. Anexo IV – Parecer do Comitê de Ética nº CAAE16525913.1.0000.5404...... 171

12.5. Anexo V – Protocolo utilizado para análise dos dados de CMA ...... 178

12.6. Anexo VI – Dados do setor de análise estatística ...... 184

12.7. Anexo VII – Autorizações para inclusão dos dois artigos publicados e do artigo aceito para publicação ...... 190

Apresentação

Em 2007, terminei minha graduação, a qual me confere os títulos de Licenciada e

Bacharel em Ciências Biológicas – Modalidade Médica. No ano seguinte, em 2008, iniciei minhas atividades acadêmicas no Departamento de Genética Médica da Faculdade de Ciências

Médicas da UNICAMP através do curso de Pós-Graduação “Lato Sensu” – Modalidade em

Genética Molecular e Citogenética. Neste mesmo ano, conheci a Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da

Silva Lopes e seu aluno de doutorado, atualmente professor do Departamento de Genética

Médica, Prof. Társis Antônio Paiva Vieira. Ainda em 2008, houve a implantação da linha de pesquisa da Síndrome de Deleção 22q11.2 no Projeto Crânio Face Brasil (PCFB), que através do projeto de doutorado do Prof. Társis e sob a supervisão da Profa. Vera, realizava a coleta de dados clínicos e disponibilizava exames laboratoriais para a investigação dos pacientes com suspeita clínica desta síndrome, e pertencentes aos centros participantes do PCFB. Nessa época, acompanhei o Prof. Társis em diferentes exames laboratoriais, os quais ele realizava para a investigação da SD22q11.2, o que me conferiu grande aprendizado. Ainda nesta época, a Profa.

Vera aceitou me orientar no curso de mestrado em Ciências Médicas da mesma instituição.

Assim, em 2009, iniciei minhas atividades no PCFB através da realização da minha dissertação de mestrado intitulada “Investigação laboratorial da Síndrome Velocardiofacial e possíveis fenocópias”, a qual foi defendida em 2011. Desde então, participei das Reuniões do

PCFB, e estas sempre são uma oportunidade de novos aprendizados e discussão dos casos em seguimento.

Em 2013, iniciei meu curso de doutorado em Ciências Médicas, através do mesmo programa de pós-graduação e no mesmo grupo de pesquisa do PCFB. Durante esses anos, realizei a análise retrospectiva dos dados clínicos e laboratoriais de toda a casuística da linha de pesquisa da SD22q11.2, os quais complementei utilizando conceitos mais recentes de 22

análises de variações de número de cópias no genoma humano e longos trechos com perda de heterozigose, e estarei abordando neste manuscrito.

Em 2017, a Associação Européia de Citogenética me concedeu a participação na

Conferência Européia de Citogenética realizada na capital da Toscana e patrimônio mundial da

UNESCO, Florença – Itália, considerada uma das cidades mais belas do mundo, capital mundial da arte e berço do Renascimento. Essa foi uma oportunidade ímpar, que acrescentou imensamente em minha vida acadêmica, científica, profissional e pessoal.

Esses dez anos de atividades acadêmicas me conferiram bastante experiência na realização de diversas técnicas laboratoriais, no desenvolvimento de diversas habilidades, desde realizar análises de testes genéticos, até o gerenciamento logístico de todo o processo laboratorial, além de conhecer trabalhos de vários outros grupos através dos diversos eventos que participei durante esses anos.

Agradeço as oportunidades que ambos, Profa Vera e Prof. Társis, me proporcionaram ao longo desses anos. 23

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos gerais da Síndrome de Deleção 22q11.2

A deleção submicroscópica no braço longo do cromossomo 22, na região 11.2, é a etiologia genética de diversas condições clínicas descritas na literatura. A heterogeneidade clínica e expressividade variável decorrente desta microdeleção levou a diferentes denominações. Assim, as Síndromes de DiGeorge, Velocardiofacial, “Conotruncal anomaly face” (conhecida também como síndrome de Takao), Shprintzen, Sedlačková, Cayler e

CATCH22 são todas causadas pela deleção em 22q11.2 [1; 2]. Portanto, a partir da descoberta da etiologia única dessas síndromes, a comunidade científica propôs o termo Síndrome de

Deleção 22q11.2 [3].

A Síndrome de Deleção 22q11.2 (SD22q11.2 – OMIM: #188400 e #192430) é a síndrome de microdeleção mais comum na espécie humana, com incidência de 1/4.000 a

1/6.000 nascimentos [4-7]. A cada ano, surgem novas informações sobre as manifestações fenotípicas associadas a esta afecção. Até o momento, mais de 180 tipos de achados clínicos diferentes têm sido associados com a SD22q11.2, entretanto não existe uma característica clínica única ou um conjunto de características clínicas comuns entre todos os indivíduos portadores da SD22q11.2 [1; 8-11]. Diversos órgãos e sistemas são acometidos, sendo as principais características: malformações cardíacas, anomalias palatais, dismorfismos faciais típicos, imunodeficiência, hipocalcemia neonatal, dificuldade de aprendizado e atraso no desenvolvimento [12-14].

O diagnóstico da SD22q11.2, que permite o manejo apropriado de aspectos de saúde e o aconselhamento genético da família, muitas vezes demora a ser aventado devido à grande variabilidade clínica inter e intrafamilial [5; 15]. 24

Delinear os aspectos clínicos e/ou fenotípicos que indiquem a realização de exames para pesquisa da deleção 22q11.2, bem como estudos de correlação genótipo-fenótipo têm sido um desafio e tema de interesse para diferentes pesquisadores [9; 16; 17].

O desafio clínico fica ainda mais evidente, quando se observam três pontos fundamentais: a) a SD22q11.2 pode estar presente no cotidiano de diversos profissionais da saúde, mesmo daqueles sem entendimento profundo de seus aspectos genéticos; b) existem diferentes técnicas para o diagnóstico laboratorial, que precisam ser bem compreendidas quanto

à resolução, aplicações e limitações; e c) outras condições com sobreposição de sinais clínicos

à SD22q11.2, que quando não suspeitadas ou diagnosticadas podem levar a conclusões diagnósticas equivocadas, quando a investigação laboratorial é negativa para a SD22q11.2.

1.2. Etiologia

O cromossomo 22 é o segundo menor dos autossomos e compreende aproximadamente

1,8% do genoma humano. Este cromossomo é rico em genes e alterações da dosagem destes são responsáveis pela etiologia de uma série de anomalias congênitas humanas incluindo a

SD22q11.2 [18]. A arquitetura genômica do cromossomo 22 é caracterizada por duplicações segmentares com sequências repetitivas, denominadas LCRs (low copy repeats), sendo susceptível a rearranjos genômicos [19]. Assim, a região 22q11.2 contém oito LCRs, denominadas de LCR22-A a LCR22-H, conforme demonstrado a seguir (Figura 1). 25

Assim, o mecanismo de origem da deleção 22q11.2 ocorre através da recombinação homóloga não alélica (NAHR - nonallelic homologous recombination) (Figura 2), mediado pelas LCRs que são sequências repetidas com baixo número de cópias maiores que 10 kb com aproximadamente 95% a 98% de homologia entre si. Durante o crossing-over na meiose I, as

LCRs podem causar instabilidade genômica e propiciar o pareamento desigual das mesmas, ocasionando rearranjos recorrentes que podem originar segmentos deletados, duplicados ou invertidos [21].

Figura 2. Adaptado de McDonald-McGinn DM et. al., 2015, esquema ilustrando o mecanismo de recombinação homóloga não alélica em 22q11.2 [22].

A deleção mais comum ocorre entre os dois maiores blocos, LCR22-A e LCR22-D, e resulta em uma deleção de aproximadamente 3 Mb [23-26]. A segunda deleção mais comum é a deleção proximal de cerca de 1.5 Mb, causada por recombinação entre as LCR22-A e LCR22-

B [25-28]. Deleções envolvendo as LCR22-B a LCR22-D, também conhecidas como deleções centrais, têm sido descritas em menor frequência [25; 26]. 27

Mais recentemente, uma síndrome de deleção distal recorrente em 22q11.2 (OMIM:

#611867) foi descrita envolvendo principalmente as LCR22-D e LCR22-E, LCR22-F ou

LCR22-G, e esta tem sido considerada uma deleção atípica na região 22q11.2, porém não relacionada com a SD22q11.2 [25; 26; 29-33]. Os tipos de deleções citadas acima, bem como as LCRs e os genes envolvidos em cada uma delas estão dispostos anteriormente na figura 1.

1.3. Manifestações Clínicas

As manifestações clínicas presentes na SD22q11.2 são amplamente heterogêneas, acometendo diversos órgãos e sistemas, entretanto a prevalência geral de problemas médicos consideráveis varia de acordo com a idade e a investigação [22].

Um dos principais sistemas afetados é o sistema cardiovascular, em que boa parte das anormalidades são evidenciadas já no período pré-natal ou neonatal, e são, muitas vezes, a manifestação inicial que leva à suspeita diagnóstica em 70% dos casos [34]. As malformações cardíacas, em especial, as anomalias congênitas conotruncais, a comunicação interventricular, o arco aórtico interrompido tipo B, a Tetralogia de Fallot e a atresia pulmonar são as principais causas de mortalidade em crianças portadoras da SD22q11.2 [5; 11; 16; 17; 22; 34-38].

Anormalidades palatais também são observadas em aproximadamente 65% dos portadores da SD22q11.2 e incluem: insuficiência velofaríngea, fenda palatal submucosa oculta, fenda palatal e úvula bífida [9; 14; 22; 34; 39; 40].

Características craniofaciais adicionais, como os dismorfismos faciais considerados típicos, são bastante frequentes na SD22q11.2 e incluem sobredobramento das hélices das orelhas, face alongada, nariz proeminente com raiz alargada e asas hipoplásicas, redundância das pálpebras superiores, hipertelorismo e retrognatia [5; 16; 17; 38]. 28

Outra característica clínica importante é a imunodeficiência, que afeta até 75% dos pacientes pediátricos com SD22q11.2. Na maioria dos casos, a imunodeficiência ocorre devido

à hipoplasia do timo e deficiência na produção de células T [22; 34; 41-43].

Cerca de 60% dos portadores da SD22q11.2 apresentam anormalidades endócrinas, sendo o hipoparatireoidismo com hipocalcemia o sinal mais frequente [22]. Outras manifestações endócrinas observadas incluem hipotireoidismo, hipertireoidismo e deficiência de hormônio do crescimento, que pode causar retardo de crescimento intrauterino e baixa estatura [22; 44-49]. Essas alterações são observadas com mais frequência na infância, do que na idade adulta dos portadores da SD22q11.2 [22].

Aproximadamente 30% dos portadores da SD22q11.2 são diagnosticados com anormalidades gastrointestinais, resultando em problemas de alimentação e deglutição, podendo necessitar de auxílio de sondas nasogástrica e (ou) nasoenterais. As características mais frequentes na infância são o refluxo gastresofágico, dismotilidade esofágica, refluxo nasofaríngeo, vômitos e constipação [50].

Anormalidades geniturinárias como agenesia renal bilateral ou unilateral, rins displásicos ou císticos, hidronefrose, criptorquidia, hipospadia, ausência de útero e hérnia inguinal, têm sido relatadas em cerca de 1/3 dos portadores da SD22q11.2 [22].

Outras importantes associações somáticas, de menor ocorrência, incluem disfagia grave, doenças autoimunes, anomalias esqueléticas, alterações oftalmológicas, anomalias anais, de sistema nervoso central, das plaquetas sanguíneas e algumas neoplasias como: hepatoblastoma, carcinoma de células renais, tumor de Wilms, carcinoma da tiróide, leucemia, neuroblastoma e melanoma [1; 2; 8; 9; 11; 17; 22; 34; 51].

Atraso do desenvolvimento neuropsicomotor é frequente nos portadores da SD22q11.2, que podem apresentar dificuldades motoras grosseiras e finas [5; 16; 17; 22; 38; 52]. 29

Similarmente, atrasos de linguagem expressiva e problemas de fala são manifestações frequentes, principalmente na infância [2; 22; 34; 53]. Os problemas na fala mais frequentes incluem defeitos na fonação, no aprendizado da fala e na compreensão [54]. Além disso, os problemas de fala podem ser intensificados devido à presença de déficits auditivos. A audição

é um fator importante para o aprendizado da fala, entretanto, cerca de 45% dos portadores da

SD22q11.2 têm perda da audição condutiva e 10% têm perda da audição neurossensorial [55].

A inteligência em crianças e adolescentes portadores da SD22q11.2 tem distribuição normal, que é comparável à população geral [22; 56; 57]. Entretanto, 2/3 desses indivíduos apresentam queda do quociente de inteligência (QI) ao longo da vida [22]. Níveis mais graves de deficiência intelectual são esporádicos e geralmente estão associados a ocorrências secundárias como parada cardíaca, hipocalcemia prolongada ou convulsões neonatais, e malformações cerebrais, que podem contribuir para um prognóstico cognitivo agravado [22;

58; 59].

Portadores da SD22q11.2 podem apresentar algumas condições de manifestação mais tardia, que incluem convulsões, doença de Parkinson de início precoce e doenças psiquiátricas

[22]. Aproximadamente 30% dos portadores da SD22q11.2 apresentam distúrbios psiquiátricos, sendo os mais frequentes transtornos de ansiedade, transtorno de hiperatividade e déficit de atenção, transtornos do espectro do autismo, impulsividade, depressão e esquizofrenia [16; 34; 38; 60-65].

1.4. Diagnóstico

Em 1981, de la Chapelle e colaboradores sugeriram a ocorrência da deleção parcial no braço longo do cromossomo 22, devido a um rearranjo cromossômico, que poderia causar a

SD22q11.2. No ano seguinte, Kelley e colaboradores fizeram essa mesma associação ao observarem três casos com rearranjos cromossômicos que ocasionaram deleção em 22q11.2 30

[66; 67]. Assim, o cariótipo com banda G permitiu a identificação de rearranjos desequilibrados, nos casos relatados por de la Chapelle (1981) e Kelley (1982), e estes propuseram que deleções em 22q11.2 em decorrência a esses rearranjos eram responsáveis pelas manifestações clínicas presentes na SD22q11.2. Entretanto, mesmo com a utilização de técnicas de alta resolução, a identificação da deleção através do cariótipo é difícil e apenas em uma minoria dos casos é possível que o diagnóstico seja confirmado por este método [68]. Assim, são necessários exames laboratoriais específicos para o diagnóstico da deleção em 22q11.2.

Em meados da década de 1990, várias alterações genômicas foram descobertas por abordagens locus específicas, dentre estes a SD22q11.2. A técnica de Hibridação in situ com

Fluorescência (Fluorescence in situ hybridization – FISH) com sonda locus específica para a região cromossômica 22q11.2, foi considerada por muitos anos como o “padrão ouro” para a detecção desta microdeleção [16; 69; 70]. Esta permite a detecção da deleção proximal e comum em 22q11.2 e é o método mais difundido. No entanto, um resultado negativo de FISH não exclui totalmente o diagnóstico da SD22q11.2, visto que raramente podem ocorrer deleções menores ou atípicas; ou ainda mutações de ponto em genes dentro da região tipicamente deletada [13; 71].

Dentro deste contexto, tecnologias na área de biologia molecular permitiram o desenvolvimento de diferentes métodos, como a técnica de Amplificação de múltiplas sondas dependente de ligação (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification – MLPA) que é um método eficaz, rápido e sensível no diagnóstico da SD22q11.2, e que detecta tanto microdeleções quanto microduplicações desta região, além de alterações em outras regiões cromossômicas que têm sido associadas ao fenótipo desta síndrome [69; 72]. Outras técnicas como análise de marcadores polimórficos de Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic

Acid – DNA), PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real e PCR quantitativa marcada com fluorescência, também têm sido utilizadas na triagem da SD22q11.2 [72-74]. Cada uma 31

delas tem vantagens e limitações, porém nenhuma delas investiga o conjunto cromossômico ou todo o conteúdo genômico.

Métodos para análise completa do genoma atingiram bastante visibilidade na área da genética por possibilitar a investigação de desequilíbrios por todo o genoma, sendo de grande valia para fins de correlação genótipo-fenótipo. Neste cenário, atualmente a técnica de análise cromossômica em microarranjos (CMA - Chromosomal microarray analysis), também chamada de cariotipagem molecular, array-CGH (array – Comparative Genomic

Hybridization) e SNP-array (Single Nucleotide Polymorphism array), tem sido a técnica de escolha para a investigação da deleção em 22q11.2 [34]. Entretanto, sua difusão em larga escala ainda esbarra nas dificuldades de alto custo de infraestrutura e insumos em alguns países.

1.5. Aconselhamento Genético

A SD22q11.2 é frequentemente esporádica, sendo mais comum a ocorrência da mutação cromossômica “de novo” [17; 44; 75-77]. Uma vez que, ambos os genitores não possuem a deleção em 22q11.2, o risco de recorrência considerado é de aproximadamente 1%

[78]. Entretanto, um estudo recente mostrou que inversões polimorfismórficas entre as LCRs C e D em 22q11.2, quando presentes em um dos genitores, predispõem a rearranjos meióticos no cromossomo 22 e aumentam o risco individual de transmissão de deleções e duplicações [75].

Até o momento, não existe uma origem parental preferencial nos casos “de novo” [62; 76; 79-

86] o que reforça a necessidade de mais estudos na investigação da ocorrência “de novo” dessa condição.

Em menor frequência, a SD22q11.2 pode ser herdada de um dos genitores. Isso ocorre principalmente devido à ampla variabilidade clínica intra e interfamilial. Quando o diagnóstico do genitor só é realizado após o diagnóstico de um filho afetado, em geral o genitor afetado apresenta fenótipo mais leve [13]. Uma vez que a SD22q11.2 possui o padrão 32

de herança autossômico dominante, quando um dos genitores é portador da deleção, o risco de recorrência é de 50% [2; 78; 87; 88]. A investigação dos genitores assintomáticos de portadores da SD22q11.2 estimou que as deleções eram herdadas em 8 a 28% dos casos [13; 40; 89; 90].

Considerando as taxas de recorrência de acordo com a origem da deleção, é de suma importância a investigação dos genitores para a realização do aconselhamento genético adequado dos indivíduos portadores da SD22q11.2 e suas famílias [15; 16].

1.6. Suspeita Clínica e Diagnóstico Diferencial

Indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 são comuns em diversas especialidades médicas como pediatria, genética clínica, otorrinolaringologia, cardiologia, imunologia, neuropediatria, entre outras [91; 92]. Entretanto, nem sempre é simples aventar esta hipótese.

Ainda, dependendo da técnica realizada para a investigação diagnóstica, um exame laboratorial negativo pode não afastar completamente a hipótese, sendo necessária complementação da investigação em casos de suspeita persistente [91].

Por outro lado, a maior parte dos indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 não tem a deleção confirmada e ficam sem diagnóstico conclusivo [11; 71; 93-95].

Devido à heterogeneidade clínica, as características comuns da SD22q11.2 podem se sobrepor a outros desequilíbrios genômicos. Correlações entre outros loci genômicos com os achados clínicos frequentes na SD22q11.2 têm sido sugeridas, uma vez que alterações cromossômicas como deleções, duplicações, cromossomos derivados, cromossomos marcadores, translocações recíprocas e não recíprocas e aneuploidias de cromossomos sexuais; assim como microdeleções em outras regiões cromossômicas foram descritas em indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 sem a deleção confirmada [7; 96-98].

Outras alterações cromossômicas não envolvendo o cromossomo 22 foram encontradas em 1,7% a 3,7% dos indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 [96; 97]. Baseada em 33

alterações raras detectadas por bandamento G, uma segunda região crítica chegou a ser sugerida em 10p (10p13-p14) [99; 100]. Deleções afetando as regiões 4q34.2-4qter, 6p25.3p24.1,

8p23.1-8pter, 17p13 e 21q22.3, como também duplicações em 9q21.12-q22.1 e 9p24.3p22.3, foram relatadas em indivíduos com fenótipo da SD22q11.2 [91; 98; 101; 102]. Com a utilização da CMA, diversas Copy number variants (CNVs) dispersas em todo o genoma têm sido relatadas em indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2.

Além de outras aberrações cromossômicas ou microdeleções, mutações no gene TBX1 foram associadas ao fenótipo de indivíduos com características clínicas da SD22q11.2 sem a deleção confirmada. A haploinsuficiência deste gene no período embrionário tem sido relacionada à ausência ou redução dos arcos faríngeos, insuficiência velofaríngea, defeitos cardíacos, dismorfismos faciais, hipoplasia tímica e disfunção na glândula paratireóide com hipocalcemia [2; 8; 103; 104]. Embora os estudos de correlação genótipo-fenótipo ainda não tenham determinado com precisão os genes específicos responsáveis pelas características clínicas da SD22q11.2, o gene TBX1 foi descrito como o principal candidato [8].

1.7. Genética Humana no âmbito do SUS

O Brasil é o quinto maior país do mundo, com mais de 8,5 milhões de km2 em extensão geográfica e com população estimada em mais de 209 milhões de habitantes [105]. Entretanto, este sempre foi caracterizado por enormes problemas econômicos, políticos e sociais, e consequentemente marcado pela desigualdade na distribuição de renda, limitando o acesso à saúde para a maior parcela da população [106].

Entretanto, a seção da Saúde da Constituição Brasileira de 1988 definiu a saúde como

"direito de todos e dever do Estado", e em 1990 através da Lei Orgânica da Saúde (Lei

8.080/90), implementou o Sistema Único de Saúde (SUS) visando fornecer para toda a população acesso à saúde. O SUS é baseado em cinco princípios básicos: universalidade, 34

integralidade, equidade, descentralização e participação social; entretanto, na prática, os problemas são evidentes [106; 107].

Em meados de 1960, os serviços de genética no Brasil começaram a se desenvolver de forma vinculada a hospitais e instituições acadêmicas de alta complexidade, permitindo testes genéticos apenas a uma pequena parcela da população através de hospitais de ensino, onde os testes têm sido oferecidos no contexto de pesquisa [74; 106; 108].

Além disso, parte da população recorre ao Sistema de Saúde Suplementar por meio de planos de saúde. Apenas em 2008, a Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS), que é a agência reguladora vinculada ao Ministério da Saúde responsável pelo setor de planos de saúde no Brasil, tornou obrigatória a cobertura de testes genéticos para microdeleção por FISH e a análise molecular (Resolução normativa nº167 de 10 de janeiro de 2008).

Em 2009, foi publicada a portaria nº 81 do Ministério da Saúde, que instituiu a Política

Nacional de Atenção Integral à Genética Clínica no âmbito do SUS, entretanto a mesma não foi implantada imediatamente devido a dificuldades na estruturação da rede necessária para seu funcionamento [107]. Apenas em 2014, a portaria nº 199 publicada em 30 de janeiro de 2014, instituiu a Política Nacional de Atenção Integral às Pessoas com Doenças Raras no âmbito do

SUS e institui incentivos financeiros de custeio. Nessa portaria, houve a implementação de novos exames laboratoriais na lista de procedimentos cobertos pelo SUS, incluindo FISH,

MLPA e CMA [109].

No Brasil, é evidente a discrepância entre os diferentes centros de diagnóstico genético localizados em diferentes regiões do país. Existem muitas dificuldades a serem enfrentadas, a principal delas é a diferença econômica que se faz bastante visível, desde dificuldades das famílias para comparecerem a consultas médicas ou a avaliações complementares; até na dificuldade de centros menores enviarem as amostras para o centro de referência [68; 74]. 35

Fica claro que o acesso à assistência genética no SUS tem, como um de seus escopos, reduzir disparidade e desigualdade nas necessidades de saúde da população no país. Entretanto, existem desafios que precisam ser contornados para a implantação adequada e eficaz da genética no SUS, desde a capacitação e reciclagem dos profissionais envolvidos nos mais diferentes níveis de atenção à saúde, até a implementação de uma rede nacional de laboratórios para testes genéticos [74; 108].

1.8. Projeto Crânio-Face Brasil e Proposta dos Critérios Clínicos

O Projeto Crânio-Face Brasil (PCFB) foi fundado em 2003 e é sediado no Departamento de Genética Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas

– UNICAMP, sob coordenação da Profa. Dra. Vera Lúcia Gil-da-Silva Lopes e tem caráter interinstitucional e multiprofissional. O PCFB tem como escopo principal propor medidas de melhoria na atenção à saúde de portadores com anomalias craniofaciais (ACF) no país. De acordo com esse propósito, a adesão dos serviços de genética e de equipes de cuidados craniofaciais é voluntária [74; 110], e atualmente dispões de 12 centros participantes que abrange quatro regiões do Brasil (Anexo I).

A partir da Base Brasileira de Dados Clínicos e Familiais de Fendas Orofaciais

(BBDCF) [111], o PCFB implantou a Base Brasileira de Anomalias Craniofaciais (BBAC), que utiliza para o gerenciamento das informações registradas uma aplicação on-line desenvolvida pelo mesmo grupo, a CranFlow (Craniofacial Anomalies: Registration, Flow, and

Management) registrada no Instituto Nacional da Propriedade Industrial sob o número

BR2015510005502. A CranFlow é atualmente utilizada para registro e seguimento evolutivo de indivíduos com Fendas Orais Típicas e SD22q11.2. Nesta, a coleta de dados utiliza formulários de avaliação de casos e de acompanhamento padronizados, com relatório de progresso, validação e codificação dos dados. Apresenta também recursos adicionais para 36

registros de exames laboratoriais do paciente, genitores e familiares; bem como “upload” e

“download” de documentos e/ou exames complementares [112].

Especificamente referente à SD22q11.2, o PCFB tem desenvolvido estratégias diagnósticas para a investigação por meio de diferentes trabalhos científicos, realizando o registro contínuo de dados clínicos, redigindo material instrucional para profissionais de saúde

(https://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/profissionais-da-saude/publicacoes-de- interesse) e pais (https://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/pacientes/material-de- apoio), e disponibilizando investigação laboratorial para os indivíduos com suspeita clínica dessa condição e provenientes dos centros participantes. Dentro desse contexto, dois estudos merecem destaque. Um deles revelou que a confirmação diagnóstica de SD22q11.2 é tardia em instituições públicas vinculadas ao PCFB, ocorrendo por volta de 10 anos de idade. Os fatores para este atraso são vários, tais como o não reconhecimento desta doença, heterogeneidade clínica, dificuldade de acesso ao especialista em genética ou a exames confirmatórios [74]. Em um segundo estudo, este mesmo grupo de pesquisa propos critérios clínicos a serem utilizados como diretrizes para a investigação laboratorial da SD22q11.2, em indivíduos com hipótese diagnóstica da SD22q11.2 (tabela 1) [17]. 37

Tabela 1. Critérios Clínicos propostos por Monteiro et. al, 2013. Coluna 1 - Indicações absolutas Coluna 2 – Manifestações Centrais Coluna 3 – Manifestações Associadas

Presença de dois ou mais itens da Coluna 2 OU um item da Presença de dois ou mais itens da Coluna 3 e ao menos um Qualquer item desta coluna Coluna 2 e ao menos dois da Coluna 3 da Coluna 2 OU quatro ou mais itens da coluna 3 *

H. Alterações neurocognitivas: Retardo do DNPM, atraso de A. Cardiopatia congênita de alto valor preditivo para a C. Outros Defeitos Conotruncais: Tetralogia de Fallot clássica, linguagem e/ou dificuldade de aprendizagem deleção: Interrupção de arco aórtico tipo B, Truncus Defeito de septo interventricular com malalinhamento arteriosus e/ou Defeito de septo interventricular com atresia posterior, Defeito de septo interventricular com estenose I. Alterações cardiovasculares: Alterações de arco aórtico e/ou pulmonar (Tetralogia de Fallot com atresia pulmonar) pulmonar, Defeito de septo interventricular alterações de vasculatura arterial pulmonar subarterial/subpulmonar e/ou Coarctação aórtica J. Dois ou mais dismorfismos sugestivos das 22q11.2DS (>= 2 D. Alterações Palatais: Insuficiência Velofaríngea, fenda anos) OU um ou mais dismorfismos sugestivos das 22q11.2DS palatal aberta ou submucosa e/ou fenda labiopalatal (<=2 anos)

E. Imunodeficiência comprovada laboratorialmente ou K. Voz anasalada B. Hipocalcemia neonatal secundária a alterações tímicas – hipoplasia/aplasia tímica hipoparatireoidismo idiopático L. Outras cardiopatias: outros defeitos de septo interventricular, F. Face característica com quatro ou mais dismorfismos dupla saída de ventrículo direito, transposição de grandes característicos, sendo ao menos três dentre os seguintes: Face artérias, comunicação interatrial e/ou forame oval pérvio alongada, pálpebras hooded, nariz tubular ou outra forma de nariz típico, hipoplasia alar. M. Outras alterações palatais: Úvula bífida isolada e/ou fenda labial G. Esquizofrenia N. Malformações de Trato genitourinário * Em pacientes abaixo de um ano de idade: Presença de um ou mais itens da Coluna 3 e ao menos um da coluna dois OU quatro ou mais itens da Coluna 3 [17]. 38

Com o intuito de testar a aplicabilidade desses critérios, a CranFlow soma automaticamente os dados registrados, a partir dos critérios propostos. Ainda, nas consultas subsequentes os critérios também são revisados automaticamente, após novas informações, sendo constantemente atualizados [112]. A avaliação dos critérios clínicos propostos para suspeição da SD22q11.2, poderia otimizar a suspeição diagnóstica desta condição clínica, embasando propostas de saúde de interesse universal e aplicáveis ao

SUS.

1.9. Dados gerados por CMA

Atualmente existem diferentes plataformas de CMA que permitem a análise de desequilíbrios por todo o genoma, entretanto cada tipo possui vantagens e desvantagens, que devem ser consideradas de acordo com a aplicabilidade necessária. Alguns tipos de

CMA também permitem a realização de genotipagem, o que permite a análise de regiões de homozigose [113; 114], que neste trabalho serão denominadas como CN-LOH (Copy

Neutral – Loss of Heterozygosity).

1.9.1. CNVs

As variações no número de cópias (Copy number variations – CNVs) são uma fonte de diversidade genética em humanos, integrando o processo de evolução e adaptação da espécie [21; 115]. Denomina-se CNVs segmentos genômicos maiores que

50 pares de bases (pb) que diferem em número de cópias, baseado na ploidia da espécie humana [115]. Portanto, as CNVs se caracterizam por duplicações, também conhecidas como ganho ou aumento de conteúdo genômico, ou deleções também denominadas de perda ou diminuição de conteúdo genômico [21]. 39

As CNVs podem se originar através de quatro principais mecanismos, dos quais três são baseados em recombinação de DNA, como a recombinação homóloga não alélica

(NAHR - nonallelic homologous recombination), a junção de extremidades não homólogas (NHEJ: non-homologous end-joining) e a retrotransposição; ou ainda em mecanismos baseados em replicação de DNA, onde ocorre parada na forquilha de replicação seguida de troca da bolha de replicação (FoSTeS – fork stalling e template switching). Esse último tem sido apontado como o principal mecanismo em casos que envolvem rearranjos genômicos complexos, que não podem ser facilmente explicados por outros mecanismos (figura 3) [21; 116].

Esses mecanismos resultam em dois tipos de CNVs “de novo” – recorrentes e não recorrentes, e estas possuem características distintas, conforme descrito na tabela 2 [117;

118]. Entretanto, ambos os tipos de CNVs estão relacionados à suscetibilidade a muitas doenças, dentre estas, aquelas causadas por microdeleções cromossômicas e microduplicações [119]. 40

Tabela 2. Propriedades Gerais das Classes de CNVs “de novo”.

CNVs Recorrentes Não recorrentes Pontos de quebra Semelhantes entre indivíduos não relacionados Únicos para cada indivíduo Junção de extremidades não homólogas (NHEJ: non- Recombinação homóloga não alélica (NAHR - nonallelic homologous end-joining) ou forquilha de replicação seguida Mecanismos de formação homologous recombination de troca da bolha de replicação (FoSTeS – fork stalling e template switching) Tipo de célula Células germinativas meióticas Células germinativas mitóticas Efeito da idade paterna Não Sim Pareamento desigual durante a recombinação devido à Predisposições genéticas Replicação e reparo de DNA arquitetura genômica Pode ou não estar associado a agentes que Pode ou não estar associado a agentes que causam Mutagêneses ambientais desestabilizam a sinapse cromossômica durante a danos no DNA ou ainda estresse durante a replicação ou meiose o reparo do DNA *Adaptada de Conover e Argueso, 2016 [117]. 41

Assim, a implicação das CNVs em manifestações clínicas relevantes depende da região envolvida, podendo representar desde variantes polimórficas benignas, até traços mendelianos ou esporádicos, ou estar associados a doenças complexas devido a mecanismos moleculares como dosagem gênica, ruptura de genes, fusão gênica ou ainda efeito posicional [21; 120].

1.9.2. CNs–LOH

As CNs-LOH, também conhecidas na literatura como regiões de homozigose

(regions of homozygosity – ROH), perda de heterozigose (loss of heterozygosity – LOH) ou ausência de heterozigose (absence of heterozygosity – AOH) têm sido atualmente implicadas em alterações constitucionais [121]. Caracterizam-se por longos trechos contínuos de homozigose (long contiguous stretches of homozygosity – LCSH), que podem ser observados em regiões idênticas por descendência ou podem ocorrer em decorrência de erros nos mecanismos de recombinação entre cromossomos homólogos, replicações de DNA ou reparo de DNA [121; 122].

CN-LOH no embrião em desenvolvimento pode ocorrer devido à dissomia uniparental (UPD – uniparental disomy), que é um fenômeno raro de segregação cromossômica durante a gametogênese ou fertilização precoce, em que ambos os homólogos ou segmentos homólogos de um par de cromossomos são derivados de um

único genitor [121; 123-125]. Existem dois tipos de UPD, a heterodissomia uniparental

(uniparental heterodisomy – UPhD), que se refere a ambos os homólogos de um único genitor devido a erros que ocorrem durante a meiose I da gametogênese; e a isodissomia uniparental (uniparental isodisomy – UPiD), em que ambas as cópias de um cromossomo não são apenas derivadas de um dos genitores, mas também representam o mesmo homólogo e ocorre devido a erros na meiose II da gametogênese (figura 4) [121; 123]. 42

Figura 4. Diferença entre heterodissomia uniparental e isodissomia uniparental. Adaptado de Chromosome abnormalities and genetic counseling - 4th ed. [126].

Existem quatro mecanismos prováveis para UPD de um cromossomo completo:

(a) não-disjunção meiótica em um dos genitores para produzir um gameta dissômico, com um concepto trissômico após a fertilização, e subsequente perda mitótica do homólogo do outro genitor dando origem a heterodissomia uniparental, mecanismo conhecido como resgate trissômico; (b) complementação gamética, com um dos progenitores produzindo um gameta dissômico e o outro um gameta nulissômico; (c) não-disjunção meiótica em um dos genitores para produzir um gameta nulissômico, com o concepto monossômico após a fertilização, e a reduplicação mitótica subseqüente do homólogo do outro genitor originando uma isodisomia uniparental; e (d) erros pós-zigóticos sequenciais; e todos estes mecanismos estão ilustrados na figura 5 [124; 125]. 43

Figura 5. Mecanismos pelos quais pode ocorrer a UPD de um cromossomo completo, publicada em 2018 por Niida et al. [124]. 44

Entretanto, a UPD segmentar pode surgir como consequência de uma recombinação somática pós-zigótica, entre o homólogo materno e paterno, sendo mais comum a ocorrência em regiões distais dos cromossomos, conforme mostrado na figura 7 [126].

Figura 6. Mecanismo pelo qual ocorre a UPD segmentar, de acordo com Chromosome abnormalities and genetic counseling - 4th ed. [126].

Assim, a UPD pode levar a três diferentes consequências, sendo estes ““imprinting”” de loci, expressão de um traço recessivo, ou ainda mosaicismo somático. Essas três alterações podem ter consequências clínicas relevantes que estão diretamente relacionadas ao conteúdo genético e tamanho da região cromossômica afetada [121; 123; 125].

O “imprinting” de loci, também conhecido como alterações de “imprinting” genômico”

(“imprinting” disorders – IDs), é um grupo de distúrbios congênitos causados por alterações moleculares de genes ou regiões cromossômicas decorrentes de eventos epigenéticos que não causam alterações na própria sequência do DNA, mas que levam a padrões de expressão desequilibrados. Portanto, o ““imprinting”” de loci pode levar a manifestação de características clínicas quando ocorre em regiões do genoma que são dependentes da origem dos genitores para serem expressas [124; 125].

Casos com UDP que levam à expressão de um traço recessivo, ocorrem quando um genitor portador heterozigoto de uma mutação para uma doença autossômica recessiva tem uma descendência com uma isodissomia, levando a uma prole que pode ser homozigota para o alelo 45

hereditário mutado e afetada pela respectiva doença. Assim, UPiD deve ser considerada em casos de homozigose de alelos recessivos, incluindo casos relacionados a condições recessivas ligadas ao cromossomo X em transmissão de mãe para filha ou ainda em mulheres afetadas

[127; 128].

O mosaicismo somático tem sido relacionado à UPD e em IDs é também uma característica de epimutações isoladas. Em alguns IDs, as epimutações estão quase sempre presentes como mosaicos; portanto, o mosaicismo de epimutação contribui para a etiologia dos

IDs e pode explicar, pelo menos em parte, o amplo espectro fenotípico [125; 129]. Em testes diagnósticos de rotina, essas epimutações representam um problema, pois o mosaicismo de baixo nível pode escapar à detecção [125; 130].

Atualmente, as CNs-LOH têm sido descritas como alterações genéticas importantes

[131]. Entretanto, quase não há relatos mostrando a análise dessa variante em indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2, sem deleção confirmada [132].

1.10. Interpretação dos Dados de CMA Aplicados ao Diagnóstico

Atualmente, em vários países a CMA tem sido o teste genético de primeira escolha para indivíduos com deficiência intelectual e/ou anomalias congênitas [133-138], incluindo a

SD22q11.2 [22].

Dentro desse contexto, a quantidade de laboratórios que tem introduzido a CMA como o teste de triagem inicial ou ainda como teste complementar tem sido crescente. Embora haja consenso sobre a necessidade de introdução deste método, os laboratórios são confrontados com muitas dúvidas sobre como implementar esta nova tecnologia, uma vez que cada laboratório é responsável por garantir a validade analítica da técnica utilizada antes de introduzi-la em seu serviço de diagnóstico de rotina [139]. 46

Embora as CNVs, quando frequentes em mais que 1% da população, sejam consideradas benignas [21; 140-142], as mesmas têm sido associadas a características humanas complexas, doenças esporádicas e mendelianas; assim como a síndromes de microdeleção e microduplicação já bem estabelecidas [21; 119; 120]. Portanto, ainda existem dificuldades e demora na interpretação das CNVs para distinguir entre aquelas que retratam a diversidade genética humana ou as que estão relacionadas a um quadro clínico específico. Além disso, as

CNVs podem ser comuns ou raras, sendo as CNVs raras as mais difíceis de interpretação e classificação, além de maior probabilidade de serem penetrantes para desencadear doenças.

Contudo, em vista dos conhecimentos atuais, geralmente estas se caracterizam como variantes benignas ou de relevância clínica de significado incerto [143]. Ainda, existem muitas sutilezas e complexidades na interpretação das CNVs em diferentes modelos de doenças genéticas, além de equívocos comuns que podem ocorrer na busca por evidências de que uma CNV é clinicamente relevante [135; 144].

Portanto, a interpretação da patogenicidade das CNVs pode ser desafiadora e depende muito da frequência de informações em amostras controle da população geral, como os bancos de dados internos ou “in house”, e bancos de dados com CNVs clinicamente relevantes relatadas previamente, sendo os mais utilizados o OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), o

DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl

Resources) e o ClinGen (Clinical Genome Resource) [133; 138; 145; 146].

Além disso, a interpretação requer considerar alguns eventos genéticos importantes como: a ocorrência de uma CNV dominante “de novo”, dominante herdada, “imprinting” genômico, ligadas ao cromossomo X, herança recessiva, herança dominante, modelo de CNV

“two-hit” e mosaicismo. Outras informações importantes como o tamanho, a localização genômica (éxons e íntrons), conteúdo gênico (especialmente em relação à sensibilidade, função, padrão de expressão e associação de doenças conhecidas), o tipo de consequência da mutação 47

(perda ou ganho de função) e o número de cópias (duplicação ou deleção), devem ser considerados [21; 133; 135; 138; 146-148].

Dentro desse contexto, todas as CNVs devem ser interpretadas para a abordagem clínica

[149], entretanto a interpretação adequada das CNVs deve ser baseada na avaliação da relevância clínica que elas possuem, além de realizar a análise de forma otimizada para que haja a conclusão diagnostica objetiva, denominando se é um achado clinicamente relevante para o indivíduo portador [134].

Devido à complexibilidade na interpretação das CNVs, em 2011, o Colégio Americano de Genética Médica (American College of Medical Genetics) desenvolveu diretrizes padrão para a interpretação e relato dos dados de CMA constitucionais para diagnóstico pós-natal, na tentativa de uma padronização dos testes aplicados em diferentes centros genéticos e para assegurar uma qualidade similar de interpretação dos dados [150]. Em 2012, Vermeesch e colaboradores apresentaram um consenso europeu sobre os critérios mínimos recomendados para a análise e o relatório dos resultados de CMA [139]. De modo geral, em ambos os protocolos citados acima, existem cinco classificações de CNVs: benigna, provavelmente benigna, variante de relevância clínica incerta (variant of unknown significance – VOUS), provavelmente patogênica e patogênica [139; 150].

Além da capacidade de detectar CNVs, a CMA, quando utilizados chips com sondas de

SNPs, pode revelar CNs-LOH no genoma e essas podem indicar três situações prováveis: 1) parentesco ancestral quando as CNs-LOH apresentam menos que 5 Mb; 2) dissomia uniparental

(UPD) quando ocorre apenas uma CN-LOH grande ou várias no mesmo cromossomo; ou ainda

3) consanguinidade quando múltiplas CNs-LOH grandes estão presentes em diferentes cromossomos [151]. Desse modo, casos de consanguinidade e, de acordo com os coeficientes teóricos da endogamia, o grau esperado de homozigose em um probando de genitores 48

consanguíneos é de 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% e 1,5625%, que representa parentesco de primeiro, segundo, terceiro, quarto e quinto grau, respectivamente [131; 151].

Entretanto, a detecção de CN-LOH não permite um diagnóstico conclusivo de imediato, mas tais achados podem ser úteis orientando testes genéticos adicionais como análise de metilação para diagnóstico de uma síndrome de UPD ou ainda sequenciamento para identificar mutações em genes nas regiões que compreendem a CN-LOH, auxiliando no diagnóstico de doenças recessivas que poderiam explicar o fenótipo do indivíduo [122; 152].

A identificação de consequências clínicas causadas por CNVs e CNs-LOH tem mudado constantemente, à medida em que o conhecimento nessa área aumenta. Um estudo realizado por Palmer e colaboradores em 2014, revelou que a reanálise dos dados de CMA em um curto período, contribuiu positivamente para o aumento na conclusão diagnóstica em uma amostra de indivíduos com deficiência intelectual [153].

Além disso, a literatura tem sido atualizada rapidamente, incluindo a descrição de novas síndromes de microdeleção e microduplicação, além de informações sobre CNVs modificadoras e de suscetibilidade [154]. As diferenças de interpretação dos dados de CMA podem ocorrer devido a diversos fatores, como a atualização da versão de mapeamento do genoma humano, descrição de diferentes protocolos para CMA, bem como a constante atualização e alimentação de bancos de dados públicos para variantes genômicas benignas ou patogênicas [153]. Dentro desse contexto, se torna uma proposta interessante revisar os dados de CMA de acordo com as atuais informações e protocolos.

A aplicação dessas diretrizes no contexto de saúde é bastante complexa e os desafios são constantes, em vista dos novos achados, tornando a discussão dessas abordagens de interpretação laboratorial bastante importantes para o diagnóstico de diferentes condições clínicas. Além disso, o impacto desses achados em saúde determina reavaliação de dados clínicos e laboratoriais, impactando a forma de atendimento em genética médica. 49

1.10.1. Alterações no cromossomo X em mulheres

Em 1961, Mary Lyon propôs o mecanismo denominado de inativação do cromossomo

X (XCI - X-chromosome inactivation), que é um processo de silenciamento aleatório de um dos cromossomos X durante o desenvolvimento embrionário em mulheres, propiciando a equivalência de dosagem com seu homólogo ancestral, o cromossomo Y [155-157].

A inativação do cromossomo X é iniciada no centro de inativação do X (X-inactivation center – XIC), localizado em Xq13, que sintetiza um grande RNA não codificante denominado

XIST – transcrito específico de inativação do cromossomo X (X-inactivation-specific transcript

– XIST). Uma vez iniciado o processo de inativação em uma célula, o mesmo é mantido por mecanismos epigenéticos, como modificações de histonas, metilação do DNA, remodeladores de cromatina e variantes de histonas, que agem sinergicamente para bloquear a expressão, repassando este padrão de inativação às células-filhas [158; 159]. No entanto, em humanos, mais de 20% dos genes ligados ao cromossomo X escapam ao silenciamento, embora geralmente estes sejam menos expressos do que os genes do alelo X ativo [159; 160].

Condições ligadas ao cromossomo X têm sido descritas com maior frequência em homens, devido à condição de hemizigose para este cromossomo. Entretanto, mulheres portadoras de alterações no cromossomo X geralmente não são afetadas, em consequência de um segundo alelo normal presente, ou ainda, devido à inativação preferencial do cromossomo

X alterado na maioria das células. Além disso, alterações no padrão de inativação do cromossomo X como a heterogeneidade entre tecidos, indivíduos e células, podem estar relacionados a manifestações de condições clínicas ligadas a este cromossomo em mulheres

[161; 162].

Um desafio frequente que surge na prática clínica é a interpretação de CNVs no cromossomo X em mulheres. Geralmente, essas alterações são descritas como não-patogênicas em mulheres, entretanto a interpretação deve ser cuidadosamente conduzida. É necessário 50

considerar as exceções que podem ocorrer no padrão de inativação do cromossomo X assim como os genes que escapam à inativação [163].

Alterações no cromossomo X em mulheres têm sido associadas a anormalidades fenotípicas mais brandas, quando comparadas com anormalidades autossômicas, devido à inativação aleatória do cromossomo X [58]. Desequilíbrios genômicos envolvendo apenas esse cromossomo em mulheres, geralmente resultam em fenótipo normal ou mais leve devido à inativação preferencial do cromossomo X alterado, entretanto há exceções [163]. Em 2014,

Evers e colaboradores mostraram que as duplicações em Xp11.23 estão associadas a deficiências intelectuais e outros transtornos do neurodesenvolvimento em mulheres, demonstrando que existem várias implicações para avaliar o significado dos desequilíbrios do cromossomo X em mulheres [58]. Em 2016, um estudo identificou genes de deficiência intelectual em mulheres que apresentavam desvio de inativação do cromossomo X [161].

Observa-se que os desafios para a suspeita da SD22q11.2 na prática clínica são diversos e incluem sua prevalência, complexidade e heterogeneidade clínicas, que a faz presente em várias especialidades da saúde, as diferentes tecnologias que possibilitam sua investigação, o reconhecimento de diagnósticos diferenciais e de mecanismos etiológicos mais recentemente passíveis de investigação por meio das técnicas de CMA e técnicas complementares. Este estudo visa trazer subsídios para colaborar na suspeição e diagnóstico de indivíduos com sinais sugestivos da SD22q11.2.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Contribuir para o diagnóstico de indivíduos com suspeita clínica de SD22q11.2.

2.2. Objetivos Específicos

1) Testar os critérios clínicos propostos anteriormente por esse grupo de pesquisa

para a investigação laboratorial da SD22q11.2;

2) Descrever um fluxograma para a investigação em larga escala da SD22q11.2

aplicável a situações de acesso restrito a técnicas de genética laboratorial;

3) Reanalisar os dados de CMA dos indivíduos com suspeita clínica de SD22q11.2

não confirmada, de forma padronizada e de acordo com as recomendações

internacionais;

4) Analisar o padrão de inativação do cromossomo X em mulheres que

apresentaram desequilíbrios genômicos neste cromossomo;

5) Descrever longos trechos de homozigose detectados através de CMA que

sugiram a ocorrência de dissomia uniparental em indivíduos com suspeita clínica

de SD22q11.2 não confirmada;

6) Descrever o percentual de conclusão diagnóstica, de acordo com o fluxograma

de testes genéticos realizados nessa amostra. 52

3. ASPECTOS ÉTICOS

Este estudo envolve indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 que têm sido registrados desde 2008 no Banco de Dados Brasileiro em Anomalias Craniofaciais /Síndrome de Deleção 22q11.2 (http://www.fcm.unicamp.br/fcm/en/cranio-face-brasil/projeto-cranio- face-brasil). Estes já haviam sido participantes de projetos anteriores deste grupo de pesquisa e consta no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido a anuência para a participação em projetos futuros.

Entretanto, para todos os projetos desenvolvidos, houve a aprovação pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas, conforme pareceres 059/2008,

714/2008 e CAAE16525913.1.0000.5404 (anexos II, III e IV); estes seguiram as diretrizes implementadas pelo Ministério da Saúde discriminadas através da resolução de número 466 datada em 12 de dezembro de 2012, que atende aos fundamentos éticos e científicos pertinentes.

Portanto, todos os participantes ou seus responsáveis legais, após orientação e esclarecimentos, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. 53

4. CASUÍSTICA

A casuística foi composta por 347 indivíduos registrados na Base Brasileira de

Anomalias Craniofaciais (BBAC), para investigação de SD22q11.2. Todos foram avaliados por geneticistas clínicos participantes do PCFB no período de 2008 a 2017.

O único critério de inclusão utilizado foi apresentar suspeita clínica da SD22q11.2.

Foram excluídos casos investigados por suspeita de SD22q11.2 exclusivamente pela presença de esquizofrenia, já que este estudo teve caráter dismorfológico.

Para a aplicação dos critérios clínicos propostos anteriormente por este grupo, o total da amostra foi dividido em dois grupos. O Grupo I foi composto 168 indivíduos que tiveram seus dados clínicos coletados por meio de protocolo desenvolvido em projetos anteriores do PCFB, com posterior registro na BBAC. Os dados clínicos deste grupo e uma extensa revisão de literatura foram utilizados para a construção da proposta dos critérios para suspeita da

SD22q11.2 por Monteiro et. al. (2013). O Grupo II foi composto por 179 indivíduos avaliados de acordo com os critérios clínicos propostos, descritos na tabela 1, e foram subdivididos em duas categorias – preencheram critérios ou não os preencheram.

5. MÉTODOS

5.1. Coleta de dados clínicos e aplicação dos critérios propostos

A coleta de dados clínicos foi realizada por meio da CranFlow, na qual a somatória dos sinais clínicos para SD22q11.2 sugeridos anteriormente por este grupo de pesquisa (tabela 1) é calculada automaticamente no primeiro registro do indivíduo, e posteriormente, nas atualizações decorrentes do acompanhamento clínico [112]. Os dados foram inseridos na

CranFlow por profissionais de saúde que receberam treinamento prévio para a utilização da

CranFlow. O protocolo para dados clínicos e exames complementares também foi padronizado na CranFlow.

Todos os dados clínicos registrados na CranFlow foram exportados, por um profissional especializado, em uma planilha do programa Microsoft Office Excel (Microsoft®) para análise, e esta foi realizada manualmente utilizando o recurso de filtros da planilha.

A análise dos dados foi realizada pelo Serviço de Estatística da Câmara de Pesquisa da

Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP. Esta constou de descrição do perfil da amostra por meio de tabelas de frequência das variáveis categóricas com valores de frequência absoluta (n) e percentual (%). Para avaliação dos fatores que discriminam a deleção foi utilizada a análise de regressão logística. Para todos os testes foi adotado o nível de significância de 5%. A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o Sistema de Análise Estatística (Statistical Analysis System© - SAS) para Windows, versão 9.4

(SAS Institute INC, 2002-2008, Cary, NC, EUA).

5.2. Reanálise dos dados de CMA

Todos os indivíduos, de ambos os grupos, foram investigados em projetos anteriores do

PCFB por meio das técnicas de FISH com a sonda TUPLE1 (Cytocell Aquarius® ou Visys 55

Abbott©) e/ou MLPA com o kit P250 – versões A1, B1 e B2 (MRC-Holland®, Amsterdam, the

Netherlands).

Além disso, 133 casos negativos para a SD22q11.2 foram investigados por CMA com as seguintes plataformas: CytoScan™ HD Array (122 indivíduos), CytoScan™ 750K Array

(sete indivíduos), Genome-Wide Human SNP Array 6.0™ (dois indivíduos) (Affymetrix®,

Santa Clara, CA, USA), ou SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray (dois indivíduos)

(Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, USA). Todos estes tiveram os dados de CMA reanalisados nesse projeto, de acordo com as recomendações propostas por Palmer et al. (2014).

Ao longo de diferentes estudos do PCFB, foram utilizados diferentes tipos de CMA, de acordo com cada projeto de pesquisa realizado anteriormente. Entretanto, cada tipo possui características específicas, bem como vantagens e desvantagens conforme descrito a seguir

(tabela 3).

Tabela 3. Diferenças técnicas entre os tipos de CMA reanalisados.

CytoScan ™ 750K CytoScan™ HD Genome-Wide Human Oligonucleotídeos SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray Array Array SNP Array 6.0™

Total 62.976 750.000 2.450.000 6.800.000

CNVs 62.976 550.000 1.700.000 946.000

SNPs - 200.000 750.000 ~ 1.000.000*

Análise de CNVs Sim Sim Sim Sim

Análise de CN-LOH Não Sim Sim Sim

Fabricante Agilent Technologies® Affymetrix® Affymetrix® Affymetrix®

* Cada chip possui aproximadamente 1 milhão de sondas oligonucleotídicas de 25 pb de sequência definida. Entretanto para cada polimorfismo de nucleotídeo único (SNP –

Single Nucleotide Polymorphism) existem de seis a oito oligonucleótidos, representado três ou quatro vezes cada alelo, o que totaliza 6,8 milhões de oligonucleotídeos. 57

Em dois casos, foi utilizada a SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray (Agilent

Technologies®, Santa Clara, CA), e esta contém apenas oligonucleotideos para a análise de

CNVs, permitindo apenas a análise de desequilíbrios genômicos. Para tanto, os dados foram analisados no programa Agilent CytoGenomics Software (version – X – Agilent®) (hg19).

Os demais 131 casos, foram avaliados através dos GeneChipsTM Probe Array da

Affymtrix®, que contêm oligonucleotideos para a análise de CNVs e SNPs, permitindo a análise de desequilíbrios genômicos, bem como de genotipagem, que fornece informações sobre longos trechos de homozigose. Os dados foram analisados no programa Chromosome Analysis Suite

(ChAS - versão 3.1.0.15 (r9069) – Affymetrix®) (hg19). Neste programa, os dados obtidos são comparados in silico com um grupo de referência que inclui os dados de 380 indivíduos controle, sendo 284 amostras pertencentes ao Projeto Internacional HapMap (haplotype map) e 96 amostras pertencentes a companhia BioServe Biotechnologies© (BioServe, Beltsville,

USA).

Para as análises de CNVs, foram utilizadas quantidades mínimas de marcadores

(oligonucleotídeos), sendo 25 oligonucleotídeos consecutivos para deleções e 50 para duplicações, de acordo com as instruções do fabricante. Não foi utilizado nenhum filtro de tamanho para a chamada de CNVs. Porém, CNVs raras menores que 20 kb não foram relatadas.

Alterações menores que 20 kb só foram consideradas quando incluíam um gene ou parte de um gene relevante para o fenótipo do indivíduo. Essas devem ser confirmadas por outro método.

Para as análises de CNs-LOH, foi utilizada a quantidade mínima de 50 oligonucleotídeos consecutivos e filtros de tamanho, sendo de 3.000 kb para os GeneChipsTM Probe Array

CytoScan™ HD Array e Genome-Wide Human SNP Array 6.0™; e 5.000 kb para o

GeneChipTM Probe Array CytoScan™ 750K Array, de acordo com as instruções do fabricante.

A análise e interpretação dos dados foram conduzidas para CNVs e CN-LOH, seguindo um fluxo de trabalho interno, que incluiu a comparação de cada alteração com um banco de 58

dados composto por 117 indivíduos da população geral brasileira, utilizado como grupo controle. Além disso, de acordo com as recomendações internacionais, todas as alterações foram comparadas em bases de dados que incluem dados de indivíduos da população geral, como: Banco de Dados de Variantes Genômicas (DGV) e do Banco de Dados de Variantes

Genômicas da Affymetrix® (aDGV). Ainda, as alterações foram comparadas com bancos de dados eletrônicos que incluem resultados de indivíduos com fenótipo anormal, como o

DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl

Resources), o ClinGen (Clinical Genome Resource) e o OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), além de revisão da literatura.

A interpretação dos dados gerados por CMA foi realizada de acordo com o “Guia

Prático para interpretação de desequilíbrios genômicos identificados pelas técnicas de

Hibridação Genômica em arrays (a-GH)” que é um protocolo adaptado a partir de revisão da literatura, e foi criado pelo Prof. Dr.Társis Antonio Paiva Vieira para uso no Laboratório de

Citogenética Humana e Citogenômica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade

Estadual de Campinas – UNICAMP (anexo V) [113; 115; 134; 135; 139; 150; 151; 164].

As classificações das CNVs encontradas foram realizadas de acordo com esse protocolo, em cinco classes diferentes:

 Classe I – Benignas: variantes comuns encontradas em mais de 1% da

população geral.

 Classe II – Provavelmente benignas: variantes não comuns, que não

possuem genes em sua extensão, ou ainda que compreendem apenas regiões íntrônicas.

 Classe III – Variante de relevância clínica incerta (VOUS): variantes

não comuns, “de novo” ou herdadas, e que incluem exóns de genes sem função definida,

não relacionados a doenças ou não sensíveis a dosagem, e que não têm significado

clínico conhecido. 59

 Classe IV – Provavelmente patogênicas: variantes não comuns: com pontos de quebra que se sobrepõe parcialmente aos de outros indivíduos portadores do mesmo desequilíbrio, porém o gene ou região crítica ainda não foram identificados; variantes descritas previamente em apenas um indivíduo com fenótipo similar; variantes que incluem exóns de genes comprovadamente relacionados a doenças e aos sinais clínicos do indivíduo em avaliação, e possuem padrão de herança compatível com o número de cópias e consequências patogênicas da mutação – ganho ou perda de função.

 Classe V – Patogênicas: variantes documentadas e bem estabelecidas na literatura, como as síndromes de deleção e duplicação; descritas em dois ou mais casos registrados nos bancos de dados de indivíduos com descrições fenotípicas similares, correlação evidente entre o desequilíbrio genômico e o fenótipo do indivíduo em investigação.

As etapas de interpretação para CNVs estão ilustradas no fluxograma a seguir. 60

Parâmetros de qualidade e configurações de filtros Marcadores genéticos: 25 deleções e 50 duplicações Sem filtro de tamanho

Confiabilidade: cobertura e distribuição das sondas, gráfico de Log2 Ratio e confirmação por sondas de SNPs

Variante rara (descrita apenas em um paciente) Ausenstes no DGV Sobreposição total com alterações CNVs nos controles com Sobreposição parcial com Presença de genes bem documentadas na literatura número de cópias idênticas e alterações em outros indivíduos Ausentes no DGV - Variantes raras Regiões exônicas Sindromes de deleções e sobreposição > 90% com fénótipo semelhante Ausência de genes Genes OMIM: duplicações >1% da população geral Variantes que incluem genes Regiões intrônicas Não sensível a dosagem Vários casos descritos nas Bases de Presentes nos controles da relacionado a doenças com Sem função conhecida Dados com a mesma extensão e população brasileira e aDGV fenótipo e padrão de herança Não relacionados a doenças fenótipo compaíveis com o quadro clínico do indivíduo

Classe I Classe II Classe III Classe IV Classe V Benigna Provavelmente Benigna Significado clínico incerto (VOUS) Provavelmente Patogênica Patogênica Não relatada* Não relatada* Relatada** Relatada** Relatada**

*Não relatada: não descrita nos relatórios de pesquisa; **reladada: descrita nos relatórios de pesquisa

Figura 7. Fluxograma da análise de CNVs e classificações. 61

As interpretações das CNs-LOH encontradas foram realizadas de acordo com o mesmo protocolo, e classificadas em duas classes diferentes:

 CN-LOH – Consanguinidade / Identidade por descendência: que são

múltiplas regiões de homozigose, em geral maiores que 10 Mb, e que são encontradas

em múltiplos cromossomos.

 CN-LOH – devido à UPD ou UPD segmentar: uma ou mais regiões de

homozigose, maiores que 10 Mb, e que são encontradas em um único cromossomo.

As etapas de interpretação para CN-LOH estão ilustradas no fluxograma a seguir.

Parâmetro de qualidade Marcadores genéticos: 50

Confiabilidade: cobertura e distribuição das sondas de SNPs

Sim Não

Filtros de tamanho indicados pelo fabricante Exlcusão CytoScan™ HD Array e SNP Array 6.0™ - 3.000 kb CytoScan™ 750K Array - 5.000 kb

Frequência nas amostras controle da população brasileira

Não Sim

Padrão de CN-LOH Sem relevância - possível artefato da técnica

Multiplas e grandes em diferentes Uma grande ou mais em um mesmo cromossomos cromossomo

CN-LOH – Consanguinidade / Identidade por descendência CN-LOH – devido à UPD ou UPD segmentar

Figura 8. Fluxograma da análise de CN–LOH. 63

5.3. Padrão de Inativação do Cromossomo X

Um dos fatores que podem influenciar na interpretação de CNVs no cromossomo X em mulheres é o padrão de inativação deste cromossomo. Por isso, em três casos pertinentes, que apresentaram VOUS maiores que 100 kb, utilizou-se o protocolo publicado por Jones (2014) com modificações, para identificar o padrão de intativação.

O método mais preciso e que foi utilizado por Jones e colaboradores, é o uso de

“primers” de PCR marcados covalentemente com moléculas fluorescentes, seguido pela detecção de sinais fluorescentes usando um sequenciador automático apropriado. Para isso, apenas um dos dois “primers” de PCR precisa ser marcado. No presente estudo, foi utilizado marcadores para os genes AR (receptor de andrógeno – androgen receptor – AR) localizado em

Xq12, e RP2 (retinite pigmentosa 2 – retinitis pigmentosa 2 – RP2) localizado em Xp11.23, ambos “primers” foram marcados em 6-carboxifluoresceína (6-Carboxyfluorescein / 6-FAM) que é um corante fluorescente com comprimento de onda de absorção de 495 nm e comprimento de onda de emissão de 517 nm. Para determinar o estado de metilação do cromossomo X, foi utilizada a enzima de restrição sensível à metilação HpaII (New England Biolabs©) que detecta

C5-metilcitosina no sítio de reconhecimento de CCGG.

As amostras de DNA genômico, obtidas de sangue periférico ou raspado de mucosa oral e na concentração de 100ng/µL, são pré-digeridas com uma endonuclease de restrição sensível

à metilação – HpaII (New England Biolabs©), que cliva apenas o sítio de reconhecimento de

DNA quando a ilha CpG adjacente não estiver metilada; portanto, apenas os genes AR e RP2 ativos no cromossomo X são digeridos.

Assim, duas reações de digestão são preparadas para cada amostra de DNA, uma com enzima e a outra sem. Os reagentes, bem como as respectivas quantidades, estão descritas a seguir.

Reação 1 – reação de predigestão com HpaII:

2,4 μl de H2O estéril destilada

0,4 μl de tTampão 10×NEBuffer

0,4 μl de enzima HpaII10 U/μl

0,8 μl de DNA na concentração de 100 ng/μl

Reação 2 – reação de digestão simulada (sem HpaII):

2,8 μl de H2O destilada e esterilizada

0,4 μl de tampão 10×NEBuffer

0,8 μl de DNA na concentração de 100 ng/μl

Os tubos foram incubados em termociclador a 37 ° C por 16 horas, e em seguida, incubados por 20 minutos a 80 °C para desativar a HpaII. Os produtos digeridos podem ser armazenados a 4 °C por até 48 horas, ou a –20 ° C por longos períodos de tempo. Após a digestão, as amostras pré-digeridas são amplificadas por PCR, e somente as regiões que são metiladas e, portanto, não digeridas, serão amplificadas com sucesso.

A amplificação dos fragmentos de DNA, digerido e não digerido, foi realizada através da técnica de PCR, que necessitou a utilização de uma enzima taq DNA polimerase otimizada

– a AmpliTaq Gold (Applied Biosystems™). Dois diferentes tipos de reações foram realizadas, uma para a amostra de DNA digerida e outra para a não digerida, conforme descrito a seguir. O volume final de cada reação foi de 10 μl.

Tabela 4. Componentes para a realização da PCR.

Componentes Amostra não digerida

Água destilada estéril 4,0 μl

Tampão 10 × AmpliTaq Gold PCR 1,0 μl

MgCl2 25 mM 0,4 μl

Mistura de dNTP (0,25 mM) 2,0 μl

Mistura de “Primers” de 10 μM (Forward + Reverse) 0,8 μl

AmpliTaq Gold Polymerase (5 U/μl) 0,2 μl

DMSO 0,6 μl

*MgCl – Cloreto de magnésio; DMSO – Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo

A mistura foi suavemente homogeneizada. Em um tubo de PCR de 0,2 ml apropriado e rotulado, foram adicionados 9 μl da mistura com 1,0 μl de amostra de DNA digerido ou não digerido. As amostras foram executadas em duplicata. Os tubos foram colocados em um termociclador e realizado a PCR sob condições descritas na tabela 5.

Tabela 5. Condições de temperatura e tempo para amplificação dos fragmentos.

Ciclos Tempo Temperaturas Etapas

1 10 minutos 94 °C Desnaturação inicial

30 30 segundos 94 °C Desnaturação

30 segundos 62 °C Anelamento

30 segundos 72 °C Extensão

1 Infinito 10 °C Espera

O armazenamento recomendado para o produto de PCR é a –20 °C, não excedendo uma semana.

As reações de PCR foram diluídas na proporção de 1:5, ou seja, foi misturado em um novo tubo 5 μl do produto da PCR com 20 μl de água destilada estéril. Em seguida, a separação dos produtos de PCR foi realizada por eletroforese capilar, utilizando uma mistura de 0,2 μl de

“size standard LIZ 500”, 12 μl de formamida Hi-Di e 1 μl do produto de PCR diluído. As misturas foram desnaturadas a 95 °C por 2 minutos e centrifugada brevemente para trazer o conteúdo para os fundos dos poços da placa. Posteriormente, a separação dos fragmentos foi realizada através de eletroforese em gel capilar automatizada, utilizando o equipamento ABI

3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems™), e a visualização dos fragmentos amplificados foi realizada através do programa Peak Scanner (Thermo FISHer Connect™) disponível eletronicamente.

Os produtos de PCR do DNA genômico digerido com HpaII são então comparados com uma alíquota separada do mesmo DNA amplificado sem digestão com HpaII. A comparação dos picos das áreas dos dois alelos fornece dados suficientes para determinar os padrões de inativação no tecido celular original da qual o DNA genômico foi derivado. As amostras que revelam um alelo preferencialmente que resistiram à digestão de HpaII são então determinadas como tendo inativação não aleatória (não randômica) ou “desviada”.

Assim, os dados obtidos foram utilizados para calcular a proporção de inativação entre os dois alelos, que reflete se uma mulher tem um padrão aleatório ou não aleatório de inativação do X. Os cálculos foram realizados de acordo com o protocolo descrito por Jones e colaboradores (2014), e está ilustrado na figura 9.

Figura 9. Exemplo de interpretação dos resultados e fórmulas para executar o cálculo das proporções de inativação do cromossomo X nas amostras, descrito por Jones e colaboradores [165].

A interpretação de resultados, de acordo com o protocolo seguido [165], é considerada da seguinte forma:

 Aleatório – abaixo de 80:20

 Moderamente desviada – 80:20 a 90:10

 Altamente desviada – acima de 90:10

Informações Complementares:

1. Sequências de “Primers”

 Gene AR (androgen receptor – AR)

Forward: 5’- GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3’

Reverse: 5’- GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3’

 Gene RP2 (retinitis pigmentosa 2 – RP2)

Foward: 5’-TGACATAGCGAGACCCTGTG -3’

Reverse: 5’-TGGTGGGTTCTCTAGCTGGT -3’

2. Endonuclease de restrição – HpaII para detecção de C5-metilcitosina no sítio de

reconhecimento de CCGG (New England Biolabs©) – Número de catálogo: NEB

#R0171

3. Kit AmpliTaq Gold™ DNA Polymerase com Tampão II e MgCl2 (Applied

Biosystems™) – Número de catálogo: N8080241 69

6. RESULTADOS

6.1. Dados gerais da amostra e teste dos critérios clínicos propostos para a

SD22q11.2

A casuística foi composta por 347 indivíduos (186 do sexo feminino, 161 do sexo masculino) com suspeita clínica da SD22q11.2. O Grupo I foi composto por 168 indivíduos (88 do sexo feminino, 80 do sexo masculino), enquanto que o Grupo II foi composto por 179 indivíduos (98 do sexo feminino, 81 do sexo masculino). O perfil dos grupos I e II, quanto à avaliação laboratorial para a deleção em 22q11.2, estão dispostos a seguir (tabela 4).

Tabela 6. Perfil da SD22q11.2 na amostra total e entre os grupos I e II.

Com SD22q11.2 Sem SD22q11.2 Total

Amostra total 98/347 (28,24%) 249/347 (71,76%) 347(100%)

Preenchem os critérios 73/347(21,04%) 122/347(35,16%) 195/347(56,20%)

Não preenchem os critérios 25/347(7,20%) 127/347(36,60%) 152/347(43,80%)

Grupo I* 45/168 (26,79%) 123/168 (73,21%) 168/347 (48,41%)

Preenchem os critérios 31/96 (32,29%) 65/96 (67,71%) 96/168 (57,14%)

Não preenchem os critérios 14/72 (19,44%) 58/72 (80,56%) 72/168 (42,86%)

Grupo II - Total 53/179 (29,61%) 126/179 (70,39%) 179/347 (51,59%)

Preenchem os critérios 42/99 (42,42%) 57/99 (57,58%) 99/179 (55,31%)

Não preenchem os critérios 11/80 (13,75%) 69/80 (86,25%) 80/179 (44,69%)

* Critérios clínicos aplicados retrospectivamente.

A análise total da amostra, revelou a presença da SD22q11.2 em 98 indivíduos, dos quais 73 preencheram os critérios propostos e 25 não os preencheram. Observa-se que os 70

critérios propostos auxiliariam na conclusão diagnóstica de 2/3 dos casos que apresentaram a

SD22q11.2.

Ao comparar os indivíduos com SD22q11.2, do Grupo I e do Grupo II, o percentual de diagnóstico da SD22q11.2 foi de 26,79% contra 29,61%, respectivamente.

No Grupo II, a presença de deleção 22q11.2 e de critérios preenchidos (42,42%) foi significante quando comparada aos 13,75% que não preencheram os critérios (p=0.0022). A distribuição geral entre os 99 que preencheram os diferentes critérios incluiu: 10 pela coluna 01

(10,10%), 24 pela coluna 02 (24,24%), 6 pela coluna 03 (6,06%) e 59 pela combinação das colunas 02 e 03 (59,60%) (p=0.0004). Ainda, a análise específica referente ao subgrupo de casos com a deleção 22q11.2 e preenchimento (42/179 – 23,5%) ou não (11/179 – 6,15%) de critérios clínicos referente ao Grupo II mostrou-se significante (p<0.001; OR 4.622; IC= 2.181-

9.792) e representa incremento diagnóstico de 3,82 vezes.

Para o Grupo II, os dados da análise univariada mostraram a distribuição dos critérios preenchidos de acordo com cada coluna, bem como a regressão logística das mesmas (tabela

5). Nesta, destacaram-se os grupos D (alterações palatais; p=0,0459) e K (voz anasalada; p<.0001). Entretanto, para o teste do conjunto de critérios deve ser considerada a análise multivariada com critério de seleção stepwise, e nesta, de acordo com a tabela 1, os resultados mostraram que a associação entre sinais clínicos do grupo A (malformações cardíacas de alto valor preditivo; p= 0.0172; OR=5.673; IC: 95%=1.360-23.664) e K (voz anasalada; p<.0001;

OR= 4.821; IC 95%= 2.377-9.778) foram os fatores significantes discriminantes para a confirmação da SD22q11.2 nesta amostra.

Tabela 7. Análise dos dados referente à aplicação dos critérios propostos por esse grupo de pesquisa na presente casuística (Grupo II).

Grupos de critérios, de Preenchem Total de Negativo para Positivo para Valor de p OR* IC95%** acordo com a Critérios Indivíduos SD22q11.2 SD22q11.2 tabela 1 A Sim 09 04 (3,47%) 05 (9,43%) 0,0949 3,177 0,818-12,336 Não 170 122 (96,83%) 48 (90,57%) - 1.000 - B# Sim ------Não ------C Sim 22 15 (11,90%) 07 (13,21%) 0,9086 1,126 0.431-2,943 Não 157 111 (88,1%) 46 (86,79%) - 1.000 - D Sim 101 65 (51,59%) 36 (67,92%) 0,0459 1,987 1,013-3,901 Não 78 61 (48,41%) 17 (32,08%) - 1.000 - E Sim 11 08 (6,35%) 03 (5,66%) 0,8610 0,885 0,225-3,474 Não 168 118 (93,65%) 50 (94,34%) - 1.000 - F Sim 22 13 (10,32%) 09 (16,98%) 0,2193 1,778 0,710-4,455 Não 157 113 (89,68%) 44 (83,02%) - 1.000 - G## Sim ------Não ------H Sim 76 48 (38,10%) 28 (52,83%) 0,0702 1,820 0,952-3,480 Não 103 78 (61,90%) 25 (47,17%) - 1.000 - 72

I Sim 03 02 (1,59%) 01 (1,89%) 0,8868 1,192 0,106-13,438 Não 176 124 (98,41%) 52 (98,11%) - 1.000 - J Sim 94 61 (48,41%) 33 (62,26%) 0,0919 1,758 0,912-3,388 Não 85 65 (51,59%) 20 (37,74%) - 1.000 - K Sim 66 34 (26,98%) 32 (60,38%) <,0001 4,123 2,096-8,111 Não 113 92 (73,02%) 21 (39,62%) - 1.000 - L Sim 66 44 (34,92%) 22 (41,51%) 0,4048 1,323 0,685-2,553 Não 113 82 (65,08%) 31 (58,49%) - 1.000 - M Sim 08 07 (5,56%) 01 (1,89%) 0,3015 0,327 0,028-2,725 Não 171 119 (94,44%) 52 (98,11%) - 1.000 - N Sim 11 10 (7,94%) 1 (1,89%) 0,1578 0,223 0,028-1,788 Não 168 116 (92,06%) 52 (98,11%) - 1.000 - Os grupos de critérios estão descrito de acordo com os critérios propostos por este grupo de pesquisa na tabela 1. *OR – razão de chances (odds ratio) para deleção; **IC95%

- intervalo de confiança da razão. B#: sem número de casos suficientes para análise; G##: indivíduos com esquizofrenia, não avaliados neste estudo.

O detalhamento das análises estatísticas realizadas, de acordo com os critérios propostos por este grupo de pesquisa, encontram-se no anexo

VI.

6.2. Diagnóstico da SD22q11.2 e Diagnóstico diferencial

Dos 347 indivíduos que compõe a casuística, 98 são portadores da SD22q11.2. Dos 249 casos negativos para a deleção típica em 22q11.2, a CMA foi realizada em 133 indivíduos (65 do sexo feminino e 68 do sexo masculino); os demais casos continuam em seguimento clínico para reavaliação do fenótipo.

De acordo com a classificação utilizada, CNVs raras menores que 20 kb não foram consideradas, e ao realizar essa filtragem, 25 indivíduos apresentaram apenas alterações menores que 20 kb. Alterações menores que 20 kb só seriam consideradas se incluíssem um gene ou parte de um gene relevante para o fenótipo do indivíduo. Essas deveriam ser confirmadas por outro método. Porém, entre os 25 indivíduos que apresentaram apenas alterações raras menores do que 20 kb, nenhuma delas incluía um gene relacionado ao fenótipo.

A análise para CNVs revelou desequilíbrios genômicos em outras regiões em 42 indivíduos, entretanto a maioria destes apresentou mais que uma CNV, com classificações diferentes.

Entre 133 indivíduos avaliados por CMA, cinco casos são deleções atípicas em 22q11.2 que haviam sido detectadas anteriormente por MLPA e que a CMA foi realizada apenas para caracterizar essas alterações; e um caso é uma deleção típica em 22q11.2 e a CMA foi utilizada para investigar um rearranjo aparentemente balanceado revelado no cariótipo por bandamento

G – 46,XX,t(3;16)(q23;p12), entretanto o resultado de CMA confirmou esta alteração como balanceada.

Dos 127 indivíduos restantes, 82 tiveram resultado de CMA normal, quatro com alterações provavelmente benignas (Classe II), 24 com VOUS (Classe III), uma com alteração provavelmente patogênica (Classe IV), 13 alterações patogênicas (Classe V). Quanto a análise de CNs-LOH, quatro casos apresentaram consanguinidade (Classe VI) e três CN-LOH (Classe

VII) (Figura 9; Tabela 6). 74

Resultado da reanálise de CMA

4 3 3% 2% 13 10% CMA normal 1 1% Classe II - Provavelmente Benigna Classe III - VOUS

Classe IV - Provavelmente 24 Patogênica 19% Classe V - Patogênica 78 62% CN-LOH – Consanguinidade / Identidade por descendência CN-LOH – devido à UPD ou 4 UPD segmentar 3%

Figura 10. Resultado da reanálise dos dados de CMA.

Após a reanálise dos dados de CMA, com os parâmetros atuais, 34 casos apresentaram alterações no resultado. Destes, sete casos tinham resultados anteriores alterados e foram classificados atualmente como resultados normais. Em 17 casos que tinham resultados anteriores normais, atualmente foram classificados: dois casos como classe II (CNVs provavelmente benignas), 15 casos como classe III (VOUS), quatro casos como CN-LOH – consanguinidade/identidade por descendência e três casos como CN-LOH – devido à UPD ou

UPD segmentar (maiores de 10 Mb). Além disso, em dois casos alterados como de significado clínico incerto foi possível a conclusão diagnóstica e atualmente foram classificados: um caso como classe II (CNV provavelmente benigna) e um caso como classe V (CNV patogênica). 75

Tabela 8. Comparação dos resultados de CMA anteriores com os resultados atuais, após a reanálise dos dados.

Tamanho Qde. ID Critérios Grupo Sexo Chip CN Chr Região Resultado Anterior Resultado Atual Classificação Alteração (Kb) Genes arr[GRCh37] CA1 Não I M HD 3 1 p31.3 261.705 1 Normal Classe III Sim 1p31.3(66194958_66456663)x3 CA2 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA3 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA4 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] CA5 Não I F HD 3.0 15 q21.1 993.408 8 Idem ao resultado atual Classe III Não 15q21.1(48023616_49017024)x3 arr[GRCh37] CA6 Não I F HD - - - - - arr(1-22,X)x2 - Sim 22q11.1(16888899_17285557)x3 CA7 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] CA8 Não I M HD 3.0 1 p31.1 126.168 1 Normal Classe III Sim 1p31.1(76948043_77074211)x3 CA9 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] CA10 Não I F HD 3.0 3 q26.2 1.983.091 21 Idem ao resultado atual - VOUS Classe IV Sim 3q26.2(168485398_170468489)x3 CA11 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA12 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA13 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA14 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA15 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA19 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA20 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA21 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA22 Não I M HD 1.0 4 p16.3 82.14 2 Normal arr[GRCh37] 4p16.3(258626_340766)x1 Classe III Sim

CA24 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA25 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA26 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA28 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não 76

arr[GRCh37] CA29 Não I F HD - - - - - arr(1-22,X)x2 - Sim 2p22.3(32628617_33334307)x3 CA31 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA34 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] CA35 Não I M HD 3.0 5 p15.2 113.945 6 Normal Classe III Sim 5p15.2(10429997_10543942)x3 arr[GRCh37] CA36 Não I M HD 3.0 17 q25.3 153.629 7 Normal Classe III Sim 17q25.3(80219636_80373265)x3 CA37 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] CA38 Não I M HD 3.0 6 q14.3 533.733 3 Idem ao resultado atual Classe III Não 6q14.3(87387316_87921049)x3 arr[GRCh37] CA39 Não I M HD - - - - - arr(1-22)x2,(XY)x1 - Sim 16q23.1(77923068_78596237)x3 CA40 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA41 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

CA43 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] CA44 Sim I M HD - - - - - arr(1-22)x2,(XY)x1 - Sim 3p26.3(1750535_2205306)x3 CA45 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA46 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA47 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] CA48 Sim I F HD - - - - - arr(1-22,X)x2 - Sim 3p26.3(1775844_2158248)x3 CA49 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA50 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA51 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] CA53 Não II M HD 1.0 8 p22 72.275 - Normal Classe II Sim 8p22(17274722_17346997)x1 arr[GRCh37] 1.0 10 q22.3 7.806.853 56 Idem ao resultado atual Classe V Não 10q22.3q23.2(81446577_89253430)x1 arr[GRCh37] 1.0 16 q12.1 189.058 Normal Classe III Sim 16q12.1(47127281_47316339)x1 arr[GRCh37] CA54* Não II F HD 1.0 22 q11.21 1.532.949 30 Idem ao resultado atual Classe V Não 22q11.21q11.22(21465661_22998610)x1 arr[GRCh37] CA55 Sim II F HD 3.0 2 p25.3 14.839.323 95 Idem ao resultado atual Classe V Não 2p25.3p24.3(12770_14852093)x3 77

arr[GRCh37] 1.0 4 q35.1 4.493.462 21 Idem ao resultado atual Classe V Não 4q35.1q35.2(186464011_190957473)x1 arr[GRCh37] CA56 Não II M HD 3.0 8 q24.3 249.053 11 Normal Classe III Sim 8q24.3(144285728_144534781)x3 arr[GRCh37] CA59 Sim II F HD 1.0 8 p23.1 3.842.400 44 Idem ao resultado atual Classe V Não 8p23.1(8093065_11935465)x1 CA60 Não II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

CA61 Não II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] 1 Sim I F HD 1.0 12 p12.2 420.726 332 Idem ao resultado atual Classe III Não 12p12.2p12.1(20994908_21415634)x1 arr[GRCh37] 2# Sim I F HD 3.0 X q25 1.076.579 5 VOUS Classe II Sim Xq25q26.1(127858672_128935251)x3 3 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

4 Sim I M 750k - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 10 Sim I F HD 3.0 20 q12 1.067.584 09 Idem ao resultado atual Classe II Não 20q12q13.12(41500568_42568152)x3 arr[GRCh37] 1.0 21 q22.3 4.786.576 116 Idem ao resultado atual Classe V Não 21q22.3(43310796_48097372)x1 CN- arr[GRCh37] 14## Sim I F HD 4 q27 41.231.706 172 Normal Classe VII Sim LOH 4q27q32.2(121450632_162682338) hmz arr[GRCh37] 18 Sim I M HD 3.0 15 q22.2 334.020 5 Normal Classe III Sim 15q22.2(62209640_62543660)x3 arr[GRCh37] 19 Sim I M HD 3.0 2 p15 316.382 6 Normal Classe III Sim 2p15(61342955_61659337)x3 arr[GRCh37] 20 Não I M HD 3.0 12 q24.33 515.849 5 Idem ao resultado atual Classe III Não 12q24.33(131963230_132479079)x3 21 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

24 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

25 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 27 Sim I F HD 3.0 16 p13.12 73.584 1 Normal Classe III Sim 16p13.12(12635612_12709196)x3 arr[GRCh37] 36 Não I M 6.0 3.0 15 15q21.1 19.307.405 157 Idem ao resultado atual Classe V Não 15q21.1q22.31(46487891_65795296)x3 41 Não I F HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 42 Sim I M HD 2.0 Y p11.2 124.660 1 Normal Classe II Sim Yp11.2(9386710_9511370)x2 arr[GRCh37] 43 Sim I M HD 2.0 X q24 10.587.388 58 Idem ao resultado atual Classe V Não Xq24q26.1(119113155_129700543)x3 arr[GRCh37] 45 Sim I M HD 3.0 6 p12.1 151.533 2 Normal Classe III Sim 6p12.1(55227312_55378845)x3 78

arr[GRCh37] 46 Sim I M HD 1.0 16 p11.2 610.621 31 Idem ao resultado atual Classe V Não 16p11.2(29567295_30177916)x1 arr[GRCh37] 47# Sim I F HD 1.0 X q21.1 6.821.384 19 VOUS Classe V Sim Xq21.1(77398962_84220346)x1 arr[GRCh37] 48 Não I F HD 1.0 15 q11.2 507.015 7 Idem ao resultado atual Classe III Não 15q11.2(22770421_23277436)x1 arr[GRCh37] 1.0 19 p13.3 1.022.426 39 Idem ao resultado atual Classe V Não 19p13.3(3793904_4816330)x1 arr[GRCh37] 49 Sim I F HD 1.0 16 p11.2 659.635 43 Idem ao resultado atual Classe V Não 16p11.2(29567295_30226930)x1 57 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 60 Sim I F HD 1.0 7 p21.3 162.043 0 Normal Classe II Sim 7p21.3(13245519_13407562)x1 62 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não CN- arr[GRCh37] 63## Não I M HD 5 p15.33 46.269.759 243 Normal Classe VII Sim LOH 5p15.33p11(113576_46383335) hmz 67 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

68 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

71 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

73 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 75 Sim I M HD 1.0 16 q23.2 72.328 1 Normal Classe III Sim 16q23.2(81170390_81264838)x1 76 Não I M HD - - - - - normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 78 Sim I M HD - - - - - arr(1-22)x2,(XY)x1 - Sim 8p11.21p11.1(42935729_43776564)x3 arr[GRCh37] 81 Sim I F HD 1.0 10 q25.1 696.402 0 Idem ao resultado atual Classe II Não 10q25.1(110420129_111116531)x1 83 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

86 Sim I F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

89 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

90 Não I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

98 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 102 Sim I F HD 1.0 3 p26.1 606.049 2 Idem ao resultado atual Classe III Não 3p26.1(7068146_7674195)x1 arr[GRCh37] 105 Sim I F HD - - - - - arr(1-22,X)x2 - Sim 7q21.13(88819024_89678695)x3 112 Não I F 8x60K - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não 79

115 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

116 Sim I M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

123 Sim II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 124* Sim II F HD 1.0 22 q11.21 1.496.535 28 Idem ao resultado atual Classe V Não 22q11.21q11.22(21465661_22962196)x1 126 Não II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 130* Não II M HD 1.0 22 q11.21 3.641.487 71 Idem ao resultado atual Classe V Não 22q11.21q11.23(20311903_23953390)x1 141 Sim II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

149 Sim II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 150 Sim II M HD 1.0 7 p21.3 161.642 2 Normal Classe III Sim 7p21.3(12227723_12389365)x1 arr[GRCh37] 1.0 16 p11.2 960.789 5 Idem ao resultado atual Classe III Não 16p11.2p11.1(34197616_35158405)x1 153 Não II M 750K - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

156 Sim II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 163* Não II M HD 1.0 22 q13.33 1.097.403 39 Idem ao resultado atual Classe V Não 22q13.33(50100435_51197838)x1 arr[GRCh37] 165 Não II M HD 1.0 17 q12 1.806.227 28 Idem ao resultado atual Classe V Não 17q12(34477385_36283612)x1 arr[GRCh37] 166 Não II F HD 1.0 3 q28 105.601 1 Normal Classe III Sim 3q28(190473333_190578934)x1 167 Não II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

176 Não II F 750K - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] 178 Sim II M HD 1.0 5 p15.33 17.398.320 119 Idem ao resultado atual Classe V Não 5p15.33p15.1(113576_17511896)x1 arr[GRCh37] 179 Sim II M HD 3.0 5 q33.2 334.198 2 Idem ao resultado atual Classe III Não 5q33.2(154330014_154664212)x3 arr[GRCh37] S01# Sim II F HD 1.0 X q27.2 476.952 4 Idem ao resultado atual Classe III Não Xq27.2(140302646_140779598)x1 S02 Sim II M 6.0 - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 187 Sim II F 750K 3.0 9 p25.3 519.846 Idem ao resultado atual Classe III Não 9q21.32q21.33(86764110_87283956)x3 arr[GRCh37] 3.0 11 q24.2 204.476 - Idem ao resultado atual Classe III Não 11q24.2(126482484_126686960)x3 192 Não II F 750K - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

193 Sim II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não 80

196 Não II M HD - - - - - Idem ao resultado atual arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não CN- arr[GRCh37] 197## Sim II F HD 6 q21 22.844.710 129 Normal Classe VII Sim LOH 6q21q23.2(109263688_132108398) hmz arr[GRCh37] 198 Sim II M HD 3.0 10 p12.1 194.249 2 Normal Classe III Sim 10p12.1(25754342_25948591)x3 201 Sim II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

202 Não II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] 206 Sim II F HD 3.0 6 p25.3 11.472.190 96 Idem ao resultado atual Classe V Não 6p25.3p24.1(156974_11629164)x3 arr[GRCh37] 1.0 9 p24.3 14.921.928 61 Idem ao resultado atual Classe V Não 9p24.3p22.3(203861_15125789)x1 207 Sim II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

209 Sim II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

211 Sim II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] 212 Não II F HD 3.0 8 q24.3 143.347 5 Normal Classe III Sim 8q24.3(146059244_146295771)x3 215 Sim II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não arr[GRCh37] 217** Sim II F HD 1.0 22 q11.21 2.882.065 79 Idem ao resultado atual Classe V Não 22q11.21(18916842_21798907)x1 225 Não II F 750K - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

228 Não II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não arr[GRCh37] 231* Não II M 750K 1.0 22 q11.21 1.083.595 29 Idem ao resultado atual Classe V Não 22q11.21(20716876_21800471)x1 arr[GRCh37] 233 Sim II F 8x60K 3.0 1 q21.2 1.835.530 07 Idem ao resultado atual Classe III Não 1q21.2(147356575_149192104)x3 arr[GRCh37] 3.0 22 q11.2 364.94 09 Idem ao resultado atual Classe III Não 22q11.21(21075575_21440514)x3 241 Não II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não 243 Não II M HD - - - - - Normal arr(1-22)x2,(XY)x1 - Não

259 Não II F HD - - - - - Normal arr(1-22,X)x2 - Não

ID: identificação da amostra; CN: número de cópias (copy number); CN-LOH: cópia neutra – perda de heterozigose (copy neutral – loss of heterozygosity); Chr: cromossomo (chromosomal); *Deleções atípicas detectadas anteriormente por MLPA; **Caso com suspeita clínica SD22q11.2 e rearranjo aparentemente balanceado detectado por cariótipo com bandamento G – 46,XX,t(3;16)(q23;p12); #Casos investigados para o padrão de XCI ; ##Alterações confirmadas por marcadores de microssatélites. Para os indivíduos que apresentaram mais que uma CNV, a conclusão diagnóstica foi realizada considerando a CNV de maior classificação. 81

6.2.1. Alterações no cromossomo X em mulheres

Foram identificadas VOUS no cromossomo X em 11 mulheres, sendo seis deleções e cinco duplicações (tabela 6). Em três casos pertinentes, que apresentaram VOUS maiores que

100 kb, o padrão de inativação do cromossomo X foi investigado. Em um caso (ID 2), foi realizada a investigação de outros membros da família.

Os resultados dos cálculos realizados para determinar o padrão de inativação do cromossomo X estão descritos a seguir na tabela 7. Além disso, na figura 10 é possível visualizar os exemplos de padrão de inativação do cromossomo X que podem ser aleatório

(randômico) ou não aleatório (não randômico).

Tabela 9. Resultados do cálculo para o padrão de inativação do cromossomo X nas mulheres investigadas.

Amostra Região Tecido Alelo 1 (Xi*) Alelo 2 (Xi*)

ID 2 - Propósito Gene AR Sangue periférico 33,11% 66,89%

Gene AR Mucosa oral 49,73% 50,27%

Gene RP2 Sangue periférico 72,23% 27,77%

Gene RP2 Mucosa oral 27,27% 72,73%

ID 2 - Genitora Gene AR Sangue periférico Não avaliado** Não avaliado**

Gene AR Mucosa oral 61,64% 38,36%

Gene RP2 Sangue periférico 48,67% 51,33%

Gene RP2 Mucosa oral 29,71% 70,29%

ID 2 – Irmã afetada 1 Gene AR Sangue periférico 52,43% 47,57%

Gene AR Mucosa oral 49,85% 50,15%

Gene RP2 Sangue periférico 66,24% 33,76%

Gene RP2 Mucosa oral 63,12% 36,88%

ID 2 – Irmã afetada 2 Gene AR Sangue periférico 29,35% 70,65%

Gene AR Mucosa oral 39,67% 60,33%

Gene RP2 Sangue periférico 33,15% 66,85%

Gene RP2 Mucosa oral 39,07% 60,93%

ID 47 - Propósito Gene AR Sangue periférico 61,03% 38,97%

Gene RP2 Sangue periférico 69,05% 30,95%

ID 183 - Propósito Gene AR Sangue periférico 60,74% 39,26%

Gene AR Mucosa oral 42,90% 57,10%

Gene RP2 Sangue periférico 39,93% 60,07%

Gene RP2 Mucosa oral 48,87% 51,13% *Xi – cromossomo X inativo; **Não avaliado – não houve amplificação dos fragmentos. 83

A seguir, a descrição dos casos investigados para o padrão de inativação do cromossomo

 ID 2: Indivíduo do sexo feminino, apresentando uma duplicação de aproximadamente

1,0 Mb compreendendo as regiões Xq25-Xq26.1 (127858672_128935251 -

GRCh37/hg19) envolvendo 5 genes, dos quais todos são registrados na base de dados

OMIM – SMARCA1, OCRL, APLN, XPNPEP2, SASH3. A princípio, essa alteração foi

classificada como VOUS (classe III). Na avaliação clínica ela apresentou

hipertelorismo, estrabismo, úvula bífida, atraso no neurodesenvolvimento, atraso de

fala, dificuldade de aprendizado, deficiência intelectual, dificuldade de alimentação e

baixa estatura. A investigação da família revelou que o propósito possuía mais duas

irmãs que apresentam dismorfismos faciais semelhantes aos dela e um irmão

fenotipicamente normal. A investigação do padrão de inativação do cromossomo X foi

realizada para todas as mulheres desta família, propósito, mãe, irmã afetada I e irmã

afetada II, revelando um padrão aleatório (randômico) para a inativação do cromossomo

X em todas, tanto para sangue periférico, quanto para mucosa oral. Todos os membros

dessa família, aqui descritos, foram investigados pela técnica de CMA que revelou

resultado normal para uma das irmãs, enquanto a outra irmã e o irmão possuem a mesma

duplicação. Considerando que o irmão fenotipicamente normal é portador da mesma

duplicação, essa alteração foi reclassificada como provavelmente benigna (classe II).

 ID 47: Indivíduo do sexo feminino, apresentando uma deleção de aproximadamente 6,8

Mb na região Xq21.1 (77398962_84220346 - GRCh37/hg19) envolvendo 19 genes, dos

quais 13 estão registrados no banco de dados OMIM – CYSLTR1, ZCCHC5, LPAR4,

MIR4328, P2RY10, GPR174, ITM2A, TBX22, CHMP1B2P, FAM46D, BRWD3,

HMGN5, SH3BGRL, POU3F4, CYLC1, RPS6KA6, MIR548I4, HDX, UBE2DNL. A 85

princípio, a alteração foi classificada como VOUS (Classe III). A paciente apresentou

orelhas dismórficas e de implantação baixa, fenda de palato, atraso no

neurodesenvolvimento, dificuldade de aprendizagem e ânus imperfurado. A

investigação dos genitores não foi possível, e nesse caso houve perda de seguimento

clínico. A investigação do padrão de inativação do cromossomo X revelou um padrão

aleatório (randômico) para a inativação desse cromossomo em sangue periférico.

Assim, essa alteração foi reclassificada como patogênica (classe V).

 ID 183: Indivíduo do sexo feminino, apresentando uma deleção de 477 kb na região

Xq27.2 (140302646_140779598 - GRCh37/hg19) envolvendo quatro genes, dos quais

todos estão registrados no banco de dados OMIM – SPANXA2-OT1, SPANXA2,

SPANXA1, LOC645188. Essa alteração foi classificada como VOUS (classe III). A

paciente apresentou fenda palatal submucosa, coartação aórtica, comunicação

interatrial, persistência do canal arterial, otite de repetição e astigmatismo. A

investigação do padrão de inativação do cromossomo X revelou um padrão aleatório

(randômico) tanto para sangue periférico, quanto para mucosa oral.

6.3. CNs–LOH

Dos 133 indivíduos com CMA realizada, foram excluídos dois casos avaliados através da SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA), que não possui oligonucleotídeos para genotipagem e consequentemente não fornece a informação das regiões de homozigose. Portanto, um total de 131 indivíduos foram analisados para CN-

LOH, e destes, quatro casos apresentaram perfil de consanguinidade. Dos 127 indivíduos restantes, 15 apresentaram CNs–LOH que não estavam presentes no grupo controle, e entre estes, três casos apresentaram CN-LOH maiores de 10 Mb em um único cromossomo. Para 86

confirmar o resultado das CN-LOH maiores que 10 Mb, foi realizada a investigação da região por marcadores de microssatélites, e os dados dos marcadores utilizados estão dispostos no apêndice I. A seguir, a descrição dos casos que apresentaram CN-LOH maiores que 10 Mb.

 ID 14: Indivíduo do sexo feminino, apresentou CN-LOH de aproximadamente 41,2 Mb

no cromossomo 4 na região q27-q32.2 (121450632_162682338 - GRCh37/hg19),

envolvendo 172 genes, dos quais 100 possuem registro na base de dados OMIM, e destes

25 genes estão relacionados a doenças com padrão de herança autossômica recessiva. O

probando é filha de casal saudável e não consanguíneo. Ela apresenta atraso motor e de

linguagem, dificuldades de aprendizagem e dismorfismos faciais. O ecocardiograma foi

normal, assim como a tomografia computadorizada do cérebro. A nasofibroscopia

revelou insuficiência velofaríngea, além de apresentar fenda palatal submucosa, úvula

bífida e voz anasalada. Na avaliação dismorfológica foram observadas orelhas

dismórficas, nariz típico com ponta bulbosa e bífida, nariz com ponte larga e comissuras

antevertidas para baixo. A avaliação oftalmológica foi normal, exceto pelo estrabismo

e a avaliação do trato geniturinário mostrou uma leve alteração da pelve renal.

 ID 63: Indivíduo do sexo masculino, apresentou CN-LOH de aproximadamente 46,2

Mb no cromossomo 5 na região p15.33-p11 (113576_46383335 - GRCh37/hg19),

envolvendo 439 genes, dos quais 119 estão registrados na base de dados OMIM, e destes

24 genes estão relacionados a doenças com padrão de herança autossômica recessiva. O

probando é filho de um casal saudável e não consanguíneo. O ecocardiograma revelou

um anel vascular. A nasofibroscopia revelou fenda palatal submuocsa,

consequentemente com dificuldade de alimentação. Na avaliação clínica, além do atraso

de desenvolvimento neuropsicomotor, observou-se face longa, nariz típico com ponta 87

bulbosa e bífida, fendas palpebrais descendentes e microcefalia. A avaliação

audiométrica mostrou perda auditiva condutiva.

 ID 197: Indivíduo do sexo feminino, apresentou CN-LOH de aproximadamente 22,8

Mb no cromossomo 6 na região q21-q23 (109263688_132108398 - GRCh37/hg19),

envolvendo 230 genes, dos quais 70 estão registrados na base de dados OMIM, e destes

14 genes estão relacionados a doenças com padrão de herança autossômica recessiva.

Trata-se de filha de um casal saudável e não consanguíneo. A intubação neonatal foi

necessária devido à anoxia. O ecocardiograma revelou comunicação interventricular e

valva tricúspide displásica. A ultrassonografia do trato urinário revelou dilatação do

sistema coletor no rim direito. Na avaliação dismorfológica, observou-se nariz típico

com ponta bulbosa e bífida e fenda palatal submucosa, assim como atraso motor e de

linguagem.

Até o momento, não foi possível investigar os genitores dessas três amostras, pois estes não compareceram para coleta de material.

6.4. Conclusão Diagnóstica da amostra total

O fluxograma a seguir (figura 11) mostra a conclusão diagnóstica em toda a casuística, de acordo com a separação em grupos e o preenchimento ou não dos critérios propostos.

347 indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2

Grupo I* Grupo II 168 indivíduos 179 indivíduos

Não Preenchem Não Preenchem Preenchem critérios Preenchem critérios Critérios Critérios 96 indivíduos 99 indivíduos 72 indivíduos 80 indivíduos

Sem deleção Com deleção Sem deleção Com deleção Sem deleção Com deleção Sem deleção Com deleção confirmada confirmada confirmada confirmada confirmada confirmada confirmada confirmada 58 indivíduos 14 indivíduos 65 indivíduos 31 indivíduos 69 indivíduos 11 indivíduos 57 indivíduos 42 indivíduos

CMA CMA CMA CMA 41 indivíduos 45 indivíduos 23 indivíduos 24 indivíduos

Alterações em Alterações em Alterado** Normal*** Alterado** Normal*** Alterado** 22q11.2 Normal*** Alterado** 22q11.2 Normal*** 02 indivíduos 39 indivíduos 05 indivíduos 40 indivíduos 02 indivíduos caracterizadas 17 indivíduos 04 indivíduos caracterizadas 18 indivíduos 04 indivíduos 02 indivíduos

*Critérios aplicados retrospectivamente; **Alterados – incluem CNVs de classe IV e V, que até o momento, permitiu a conclusão diagnóstica; ***Normal – incluem CNVs de classe II, III, VI e

VII, que até o momento, não permitiu a conclusão diagnóstica.

Figura 12. Conclusão diagnóstica da amostra total, comparando os grupos I e II e o preenchimento ou não dos critérios propostos. 89

O total de conclusão diagnóstica, de acordo com os critérios propostos, estão dispostas no gráfico a seguir.

Total de Conclusão Diagnóstica

90 83 80

50 47

40 36 34 30

20 17 17

0 Positivos para os critérios Negativos para os critérios

Total Grupo I Grupo II

Figura 13. Total de conclusão diagnóstica da amostra.

7. DISCUSSÃO

O SUS tem como escopo principal o acesso à saúde para todo cidadão, custeado pelo estado. Entretanto, é conhecido que existem diferenças regionais para assegurar o atendimento assistencial, o que, consequentemente afeta a isonomia do sistema [74]. O atendimento em genética no SUS é recente e ainda não universalizado [109]. Antes dele há um grande histórico de limitações e dificuldades, e na maioria das vezes os indivíduos com anomalias craniofaciais e seus familiares têm acesso dificultado à avaliação genética, atrasando o diagnóstico e as condutas complementares necessárias [14; 110; 166; 167].

Dentro desse contexto, o PCFB desde 2003, tem atuado no desenvolvimento de estratégias baseadas nos princípios de genética comunitária e nas diretrizes propostas pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) para atendimento de portadores de ACF [168].

Assim, os dados clínicos e laboratoriais de nove anos de experiência no diagnóstico da

SD22q11.2 foram revisados, no intuito de contribuir com estratégias diagnósticas, que possam ser implementadas em larga escala, dentro da atual realidade de saúde brasileira.

7.1. Critérios Clínicos Propostos para suspeita da SD22q11.2

A heterogeneidade da SD22q11.2 é reconhecidamente um fator que dificulta a suspeita clínica da mesma, especialmente nos casos com manifestação clínica mais leve. Os diferentes estudos sobre o assunto são focados em grupos de indivíduos com sinais clínicos semelhantes, não permitindo um consenso sobre os critérios de seleção adotados para a investigação da

SD22q11.2 e levando a dificuldades no diagnóstico clínico e na indicação para a realização de testes laboratoriais [10; 12; 14; 22; 92].

Baseados nesse contexto e na constatação de que a idade média de diagnóstico da

SD22q11.2 em serviços integrantes do PCFB é de 10 anos de idade [14], a concepção de critérios clínicos para suspeita desta afecção [17] mostra temática atual, universal e com 91

aplicação direta na prática clínica. Como aspecto bastante relevante destes critérios propostos, diferentes manifestações da SD22q11.2 estão incluídas, permitindo uma abordagem mais ampla da identificação e registro fenotípico. No entanto, sua aplicabilidade em larga escala nunca foi testada, sendo este o primeiro estudo usando esta abordagem.

Além disso, este estudo apresenta um outro diferencial que pode agregar valor na prática clínica e em saúde pública: a utilização de uma ferramenta on-line – a CranFlow, que uniformiza a coleta de dados de acordo com os critérios propostos por este grupo de pesquisa e possui recursos adicionais para registros de exames laboratoriais, dados complementares, além de facilitar a somatória dos critérios por grupos e colunas a cada consulta, já que esta é realizada automaticamente em cada avaliação registrada [112]. Portanto, a CranFlow também permite outras abordagens interessantes: acompanhar a história natural de SD22q11.2, registrar seus diagnósticos diferenciais e, focando em saúde pública, mapear as necessidades de saúde e locais de maior demanda de indivíduos com suspeita ou diagnóstico desta microdeleção e doenças correlatas.

Por outro lado, a implantação da Política Nacional de Atenção Integral a Doenças Raras

(Portaria nº 199 de 30 de janeiro de 2014) traz a necessidade de reconhecer as demandas de cada grupo de indivíduos incluídos neste grupo, onde se incluem aqueles com SD22q11.2

[109]. Certamente essas demandas passam por identificação de casos com esta suspeita diagnóstica e sua confirmação, estabelecimento de diagnósticos diferenciais, aconselhamento genético e manejo clínico. Dentro desse contexto, este estudo avaliou a aplicação dos critérios propostos para a utilização no âmbito de saúde pública e agregou, ainda, considerações acerca das mais recentes problemáticas relacionadas à interpretação laboratorial dos resultados de testes de CMA.

Com relação aos critérios clínicos para suspeita da SD22q11.2, os dados de 347 indivíduos com essa suspeita, coletados por diversos projetos que abrangeram as estratégias do 92

PCFB, foram revisados e separados em dois grupos – Grupo I e Grupo II, sendo o segundo grupo com coleta dos dados utilizando os critérios proposto por Monteiro et al. 2013. Tendo em vista a prevalência e heterogeneidade clínica desta microdeleção, a avaliação de todos os grupos com amostras de tamanho significativo para análise estatística é tarefa de muitos anos e que ultrapassam a duração de um projeto de Doutorado. Entretanto, o desenho deste estudo é consistente e permite interpretações e propostas imediatas de atenção à saúde.

Entre os indivíduos do Grupo I e do Grupo II, o diagnóstico da SD22q11.2 aparentemente parece ser similar, sendo de 26,79% contra 29,61%, respectivamente.

Entretanto, a avaliação específica do Grupo II, revela outros achados significativos. A presença de deleção 22q11.2 e de critérios preenchidos (42,42%) foi significante quando comparada aos

13,75% que não preencheram os critérios (p=0.0022). A diferença se deu, especificamente, no predomínio de casos positivos entre os casos de maior complexidade diagnóstica, ou seja, aqueles com sinais mais comuns e inespecíficos, e que tiveram a combinação de colunas 2 e 3

(p=0.0004). Ainda, a análise específica referente ao subgrupo de casos com a deleção 22q11.2 e preenchimento (42/179 – 23,5%) ou não (11/179 – 6,15%) de critérios clínicos referente ao

Grupo II mostrou-se significativa (p<0.001; OR 4.622; IC= 2.181-9.792) e representa um aumento de diagnóstico de 3,82 vezes.

Esses dados merecem comentários de alguns aspectos: a) o treinamento de todos os geneticistas clínicos participantes da coleta de dados para interpretação do exame físico de maneira similar, facilitou a suspeita neste tipo de situação clínica; b) há possibilidade de treinamento de equipes de saúde em diferentes níveis de atenção para o reconhecimento e registro de sinais frequentes e raros utilizando a CranFlow; c) em médio e longo prazos, a coleta de dados também poderá impactar os demais grupos de critérios propostos, os quais têm sinais clínicos mais raros e d) a criação de um registro de abrangência nacional que permita otimizar 93

recursos de investigação da SD22q11.2 em serviços públicos e planejar políticas públicas baseadas em dados brasileiros.

Por outro lado, o incremento diagnóstico de 3,82 vezes na presença de critérios preenchidos para a SD22q11.2, de acordo com o proposto por Monteiro et al, (2013) e a utilização da CranFlow para esta e outras anomalias craniofaciais são de aplicação universal.

Na análise univariada dos critérios propostos, destacaram-se os grupos D (anomalias palatais; p=0,0459) e K (voz anasalada; p<.0001). Esses resultados eram esperados, uma vez que esses indivíduos compõe uma amostra de serviços de genética e aqueles direcionados para anomalias palatais. Além disso, as anomalias palatais já têm sido descritas como um importante sinal clínico em indivíduos acometidos pela SD22q11.2 [14]. A análise multivariada com critério de seleção stepwise revelou que o conjunto composto por sinais do grupo A (cardiopatia de alto valor preditivo) e K (voz anasalada) são fortemente indicativos para a suspeita da SD22q11.2.

A literatura mostra diferentes proporções de positividade na detecção de SD22q11.2, de acordo com o desenho do estudo, geralmente utilizando um dos sinais clínicos, como cardiopatia [5;

11; 16; 17; 22; 34-38] ou anomalias palatais [9; 14; 22; 34; 39; 40]. Assim, os dados obtidos neste estudo sugerem a validade dos critérios propostos por Monteiro et al (2013), ao menos para os sinais mais frequentes, já no presente tamanho amostral.

Outro ponto de destaque refere-se à abordagem laboratorial que pode ser interessante para aplicação em saúde pública, especialmente em países em que o acesso à tecnologia tem custo alto, considerando infraestrutura e insumos, tornando sua incorporação limitada.

Dos casos que preencheram critérios com deleção confirmada em 22q11.2, 98 apresentaram a deleção típica e cinco atípicas na região 22q11.2. Isto, na prática, pode conferir um aspecto de hierarquização de procedimentos laboratoriais, em que, na presença de critérios clínicos presentes, técnicas de detecção locus específicas, como FISH e MLPA, poderiam ser utilizadas. Embora, em princípio isto pareça ir contra as recomendações internacionais de 94

utilização de CMA, a abordagem baseada no treinamento para reconhecimento fenotípico e utilização de infraestrutura laboratorial existente, permitiria o diagnóstico precoce de um maior número de indivíduos e com menor impacto financeiro, especialmente em regiões em que o custeio destinado à saúde é escasso.

Como exemplo, ao realizar o cálculo de custo baseado nos valores apontados pela

Comissão Nacional de Implantação de Tecnologia no SUS (CONITEC, documento 109, ano

2014) para procedimentos laboratoriais para diagnóstico de doenças raras associadas a anomalias congênitas na tabela SUS (Eixo 1) [169], podemos ter uma estimativa do impacto desse tipo de abordagem.

Atualmente, a CMA é o teste de primeira triagem indicado para a investigação de desequilíbrios genômicos, em indivíduos com anomalias congênitas múltiplas e (ou) atraso no desenvolvimento/ deficiência intelectual. Os valores escolhidos pela CONITEC por teste de

CMA é de R$ 2.000,00. Ao considerar a investigação laboratorial de 1.000 indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2, o custo estimado seria de R$ 2.000.000,00. Entretanto, os valores estimados neste mesmo documento para os métodos de FISH e MLPA, apresentam o custo por teste de R$ 204,96 e R$ 192,93, respectivamente. Para simplificar, adota-se o custo de R$ 200,00 para testes locus específicos. Ao aplicar a taxa de positividade dos indivíduos que preencheram os critérios do Grupo II, que foi de 42,42% (45/99), ao considerar o teste locus específico como primeira escolha para a investigação, haveria um custo inicial de R$

200.000,00 e a conclusão diagnóstica de 424 indivíduos portadores da SD22q11.2. Para a investigação complementar, 576 indivíduos sem diagnóstico, necessitariam da realização da

CMA, adicionando o custo de R$ 1.152.000,00 e totalizando um custo final de R$ 1.352.000,00 contra R$ 2.000.000,00 para a utilização da CMA como primeiro teste diagnóstico, representando uma economia de R$ 648.000,00. 95

Outro estudo realizado no Brasil também mostrou que a aplicação de testes locus específicos para triagem inicial se mostrou bastante eficaz, sendo alternativa importante para a triagem diagnóstica em países em desenvolvimento em que o custeio destinado à saúde é escasso [170]. Em 2014, Geddes e colaboradores realizaram um levantamento de custo- efetividade, e assim como fizeram para a instituição a qual estão locados, eles propuseram que cada instituição/sistema deve avaliar os resultados de seus testes genéticos, dentro de suas possibilidades, para desenvolver protocolos de alto rendimento dentro de um padrão custo- efetivo [171].

Dentro desse contexto, a associação da aplicação dos critérios propostos com a triagem inicial por métodos locus específicos pode delinear uma importante estratégia para a investigação diagnóstica inicial da SD22q11.2 em larga escala, uma vez que existem grandes restrições financeiras nos países em desenvolvimento, incluindo o Brasil. Ainda visando a melhoria da assistência, o PCFB desenvolveu manuais de cuidados de saúde para SD22q11.2 para profissionais de saúde, os quais poderiam ser usados para treinamento em diferentes níveis de atenção à saúde (https://www.fcm.unicamp.br/fcm/cranio-face-brasil/profissionais-da- saude/publicacoes-de-interesse). Considerando o tempo de estudo, a prevalência desta microdeleção e a abrangência dos critérios, os resultados aqui descritos parecem bastante promissores. Assim, a ampliação e a utilização em diferentes populações utilizando o mesmo desenho de estudo trariam mais informações sobre a presente estratégia de investigação.

7.2. Conclusão diagnóstica em casos com suspeita clínica de SD22q11.2

Na amostra deste trabalho houve conclusão diagnóstica para 117/347 casos (33,7%).

Considerando a utilização de MLPA e (ou) FISH para todos os casos, encontrou-se deleção típica em 22q11.2 em 98/347 indivíduos (28,24%), e deleções atípicas na região 22q11.2 em cinco indivíduos (1,44%). A técnica de CMA revelou CNVs provavelmente patogênicas e 96

patogênicas fora da região 22q11.2 em 14/133 indivíduos (10,5%). Um estudo realizado por

Koczkowska et.al. (2017) também revelou uma taxa de aumento diagnóstico em aproximadamente 12% da amostra testada, que apresentou características semelhantes à amostra descrita neste estudo [93].

Além disso, esta técnica revelou CN-LOH em três indivíduos, sugerindo a ocorrência de UPD nesses casos, entretanto os mesmos ainda estão em investigação.

Esses dados mostram a complexidade do diagnóstico perante a gama de manifestações clínicas presentes na casuística em questão. Outras alterações cromossômicas, mutações gênicas, bem como CNVs têm sido descritas em indivíduos que apresentam fenótipo sugestivo da SD22q11.2, porém sem esta deleção. Assim, esses resultados reforçam a complexidade e as dificuldades para a conclusão diagnóstica neste grupo de indivíduos onde a SD22q11.2 não foi confirmada. Dentro desse contexto, em 2017, nosso grupo de pesquisa publicou o artigo

“Diagnostic Approach to Microdeletion Syndromes Based on 22q11.2 Investigation:

Challenges in Four Cases”, na qual a abordagem é informativa para a prática clínica e pode ser aplicada em outros contextos de investigação de desequilíbrios genômicos em síndromes de microdeleção (Apêndice II) (Sgardioli et al., 2017). Além disso, mais duas alterações em outras regiões foram descritas como relato de caso, sendo que uma já foi publicada “Pure 21q22.3 deletion identified in a patient with mild phenotypic features” (apêndice III), e a outra está aceita para publicação “A rare case of concomitant deletions in 15q11.2 and 19p13.3” (apêndice IV).

As autorizações para a inclusão dos artigos acima citados neste manuscrito, estão dispostos no anexo VII.

Atualmente, a técnica de CMA tornou-se o teste genético de primeira triagem para pacientes com anomalias congênitas múltiplas, incluindo pacientes com um fenótipo sugestivo da SD22q11.2 [22; 92] ou com resultado de FISH negativo [172]. Entretanto, preocupações têm sido consideradas sobre o aumento da resolução de plataformas CMA que leva a uma maior 97

detecção de variantes menores de significado incerto, que representam desafios para a área científica, bem como para o diagnóstico clínico e aconselhamento genético apropriado [173].

Com a expansão dos testes genéticos, muitos laboratórios de financiamento público ou privado, disponibilizam a realização do CMA. Porém, até o momento, não existem normas nacionais padronizadas para relatar os resultados, principalmente as variantes de significado incerto, e na prática clínica, o modo como esta informação é transmitida para o indivíduo e seus familiares é variável. As VOUS podem conter genes de significado clínico incerto, mas podem ainda, potencialmente regular a expressão gênica [153].

Vários grupos de pesquisa utilizam bancos de dados eletrônicos [145; 174] que são constantemente atualizados. Além disso, o aumento dos casos relatados na literatura permite a descrição de novas síndromes de microdeleção e microduplicação, além de CNVs modificadoras e de suscetibilidade. Essas informações novas melhoram a interpretação das variantes de significado incerto [153]. Portanto, é esperado que algumas VOUS, após reanálise considerando tais atualizações, sejam reclassificadas progressivamente como provavelmente patogênicas ou provavelmente benignas.

Dos 133 casos com CMA, após a reanálise com parâmetros atualizados, houve alteração de resultados em 34 casos. Desses, casos com resultados alterados puderam ser reclassificados como normais quando comparados aos controles da população geral brasileira e ao aDGV, pois estes revelaram as alterações como frequentes na população geral. Em contrapartida, 15 indivíduos que possuíam resultados normais para CMA foram reclassificados com alterações de classe III – VOUS menores que 300 kb, e esses resultados devem ser acompanhados, bem como direcionados a realização de técnicas complementares, na perspectiva de esclarecimento do significado clínico destas alterações e da conclusão diagnóstica dos indivíduos. Além disso, a análise dos longos trechos de homozigose permitiu a identificação de sete casos positivos para 98

essa análise, dos quais quatro casos caracterizaram consanguinidade e três casos sugerem a ocorrência de UPD que devem ser investigadas.

Nessa perspectiva, a centralização laboratorial da investigação de SD22q11.2, otimizaria não apenas os insumos laboratoriais, como também a reanálise, quando necessária.

7.2.1. CNVs no cromossomo X em mulheres

É difícil a interpretação de CNVs no cromossomo X em mulheres, e determinar a patogenicidade das mesmas nem sempre é simples. É importante para essa interpretação a análise do padrão de inativação do cromossomo X, a fim de auxiliar na classificação.

Entretanto, deve-se considerar também os genes que escapam a esse mecanismo. Cada caso será discutido separadamente a seguir.

 ID 2: o probando, duas irmãs com dismorfismos semelhantes e a mãe foram

investigadas, e a duplicação semelhante à da paciente foi encontrada na mãe e em apenas

uma irmã. Entretanto, para descartar um padrão de inativação preferencial, foi realizado

o teste para o mesmo, e todas as mulheres apresentaram a inativação aleatória ou

randômica. Além disso, um irmão fenotipicamente normal foi investigado e possui a

mesma duplicação, o que supõe que está variação seja provavelmente benigna. Nenhum

gene contido dentro da duplicação apresentada escapa do mecanismo de inativação,

assim a duplicação não justifica o quadro clínico da paciente e pode, no momento, ser

considerada como CNV classe II – provavelmente benigna.

 ID 47: está paciente apresenta uma deleção de 6,8 Mb em Xq21.1 e o padrão de

inativação do cromossomo X foi aleatório (randômico). Meninos com deleções

intersticiais em Xq21.1 apresentam deficiência intelectual, perda de audição e 99

características faciais dismórficas [175; 176]. A paciente aqui relatada apresenta deleção de três genes importantes: TBX22, BRWD3 e POU3F4. Mutações no gene TBX22 causam fenda palatina com ou sem anquiloglossia (# 303400), inclusive em mulheres

[176-178], enquanto as alterações no gene BRWD3 têm sido relacionadas à deficiência intelectual ligada ao X (# 300659), as mulheres portadoras de mutações nesse gene com fenótipo normal relatadas na literatura apresentaram inativação preferencial do cromossomo X [176; 179]. Além disso, perda de audição (#304400) tem sido descrita em alterações que causam a perda de função do gene POU3F4 [180]. Considerando que a paciente tem padrão de inativação randômico do cromossomo X, sugere-se que o quadro clínico esteja relacionado à deleção apresentada, sendo considerada como CNV classe V – patogênica.

Anormalidades do cromossomo X em mulheres estão associadas a anormalidades fenotípicas menos graves quando comparadas com anormalidades autossômicas, devido

à inativação aleatória do cromossomo X. Nos homens, anormalidades estruturais neste cromossomo resultam em conseqüências fenotípicas mais severas, como a deficiência mental devido à dissomia funcional dos genes na região de desequilíbrio. Por outro lado, em mulheres, quando ocorrem anormalidades estruturais envolvendo apenas esse cromossomo, a inativação preferencial do X anormal muitas vezes resulta em fenótipo normal ou menos grave [163; 181]. No entanto, alguns casos excepcionais foram descritos. Em 2015, Evers e colaboradores mostraram que a duplicação no Xp11.23 está associada a deficiências intelectuais (ID) e outros transtornos do neurodesenvolvimento em mulheres [181]. Assim, quando há, anormalidades estruturais envolvendo apenas o cromossomo X em mulheres, como devemos interpretá-lo? Anormalidades estruturais no cromossomo X em mulheres geralmente são descritas como não-patogênicas, entretanto a análise deve ser cuidadosa. É necessário considerar as exceções que podem 100

ocorrer no padrão de inativação do cromossomo X, assim como os genes que escapam

da inativação.

 ID 183: está paciente apresenta uma deleção de 477 kb na região Xq27.2 envolvendo

cinco genes OMIM, e inativação randômica do X. Apesar disso, até o momento nenhum

desses genes possui relação com o quadro clínico apresentado, e, portanto, continua

sendo considerada como VOUS classe III – variante de significado clínico incerto.

7.3. CN-LOH

CNs-LOH podem estar presentes por ancestralidade/consanguinidade ou ainda por UPD em casos específicos. [122]. A detecção de CN-LOH não permite um diagnóstico conclusivo imediatamente, entretanto tais achados podem ser úteis na orientação de testes genéticos adicionais, que podem então concluir o diagnóstico [152].

Para diagnosticar uma síndrome de UPD, a análise de metilação é necessária [182]. As

CNs-LOH também podem auxiliar no direcionamento para o diagnóstico de doenças recessivas e têm sido efetivamente usadas, tanto em populações consanguíneas, quanto para diagnóstico, para priorizar genes candidatos recessivos; além de utilizadas no âmbito de pesquisa para descobrir novos genes causadores de doenças [183].

Nesse estudo, observou-se CNs-LOH raras, que foram encontradas exclusivamente no grupo de pacientes, mas não no grupo controle. Além disso, no grupo de pacientes os tamanhos das CN-LOH foram entre 3,3 Mb e 46,2 Mb (tamanho médio de 22,7 Mb) e no grupo controle foi entre 3,1 Mb e 8,5 Mb (tamanho médio 6,0 Mb). CN-LOH maiores que 10 Mb foram encontradas exclusivamente entre os pacientes e tiveram seus resultados confirmados por análise de marcadores de microssatélites. Essas serão discutidas separadamente a seguir.

101

 ID 14: A CN-LOH de 41,2 Mb no cromossomo 4 na região q27-q32.2, poderia indicar

a ocorrência de UPD, entretanto até o momento, apenas casos com UPDs materna têm

sido descritos e sem fenótipo anormal associado a atraso de desenvolvimento e

dismorfismos, que são características presentes na paciente aqui relatada. A revisão da

literatura mostrou que de cinco casos descritos com UPD deste cromossomo, um caso

apresentou fenótipo normal, em outro a paciente apresentou apenas depressão, e nos

outros três, os fenótipos foram associados a mutações recessivas [184-188]. A

ocorrência desta CN-LOH sugere uma heterodissomia uniparental, ou ainda, uma UPD

segmentar. Entretanto, para investigar essas hipóteses, é necessário investigar ambos os

genitores.

 ID 63: A CN-LOH de 46,2 Mb no cromossomo 5 na região 5p15.33-p11 poderia indicar

a ocorrência de UPD, tanto materna como paterna, e estas já têm sido descritas na

literatura [189-192]. No entanto, não há evidências de um fenótipo associado à UPD do

cromossomo 5, embora esse tipo de evento pode propiciar a ocorrência de fenótipos

geralmente associados a mutações em genes recessivos. Existem três genes na região,

que podem estar parcialmente relacionados ao quadro clínico do paciente. O gene

TRIP13 (OMIM *604507) é associado à uma Síndrome de aneuploidia diversificada em

mosaico (OMIM #617598), o gene NSUN2 (OMIM *610916) associado a deficiência

intelectual autossômica recessiva (OMIM #611091) e o gene CPLANE1 (OMIM

*614571) associado à Síndrome Orofaciodigital (OMIM #277170). Entretanto, há

necessidade de uma correlação genótipo-fenótipo mais detalhada e de investigação

laboratorial de todos esses genes, se pertinente. Além disso, a ocorrência desta CN-LOH

sugere uma heterodissomia uniparental, ou ainda, uma UPD segmentar. Entretanto, para

investigar essas hipóteses, é necessário investigar ambos os genitores. 102

 ID 197: A CN-LOH de 22,8 Mb no cromossomo 6 na região 6q21-q23 poderia indicar

a ocorrência de UPD materna que já tem sido relatada por causar restrição do

crescimento intrauterino, ou ainda UPD paterna relacionada a diabetes mellitus neonatal

transitória. Entretanto, esses achados não foram presentes na paciente aqui relatada. A

investigação dos genitores é necessária para a confirmação da UPD, além da reavaliação

clínica deste indivíduo, no entanto, o comparecimento dessa família à consulta é

aguardado.

7.4. Panorama da Conclusão Diagnóstica

Em uma visão geral, dos casos com investigação laboratorial completa (98 com

DS22q11.2 + 133 negativos para a síndrome e investigados por CMA), 117 casos investigados para SD22q11.2 (incluindo 98 positivos para SD22q11.2 + 05 deleções atípicas em 22q11.2 +

14 alterações em outras regiões do genoma) poderiam ser diagnosticados por CMA; 116 mantém seguimento clínico. Isto justificaria, como mostra a literatura, a utilização desta técnica como primeira escolha de investigação laboratorial da suspeita de SD22q11.2 [22].

Após reanálise dos dados de CMA, novos achados conclusivos foram identificados, o que reforça a importância da reanálise de acordo com os parâmetros atuais. Em um estudo realizado por Palmer et.al. (2014), a reanálise dos dados após dois anos, revelou alterações significativas em uma amostra de pacientes com deficiência intelectual [153]. Além disso, a investigação de inativação aleatória de CNVs no cromossomo X permitiu diagnóstico de 02 casos, e dos 131 indivíduos em que foi realizada a investigação de CN-LOH, três apresentaram- nas com tamanho maiores que 10 Mb em um único cromossomo, sugerindo a ocorrência de

UPD. Esses resultados foram confirmados por marcadores de microssatélites e aguardam a investigação dos genitores. 103

Todos esses resultados corroboram a necessidade de um planejamento estratégico para que a suspeita diagnóstica seja realizada precocemente e apropriadamente investigada. 104

8. CONCLUSÕES

a) A análise da aplicação dos critérios clínicos propostos por este grupo de pesquisa

mostrou-se uma ferramenta útil para suspeita diagnóstica, uma vez que permitiu um

incremento diagnóstico de 3,82 vezes. Ainda, a associação dos grupos A e K foi

significantemente relacionada à presença da SD 22q11.2.

b) A aplicação dos critérios clínicos pode favorecer a realização de técnicas menos

onerosas, em situações em que a CMA não seja possível.

c) A reanálise dos dados de CMA revelou duas conclusões diagnósticas que não havia sido

possível anteriormente, além de sugerir a investigação de três casos com suspeita de

UDP.

d) A investigação do padrão de inativação do cromossomo X permitiu a conclusão

diagnóstica de dois casos.

e) A análise de longos trechos de homozigose, permitiu a investigação complementar

direcionada para os três casos de UPD;

f) Utilizando diferentes abordagens, este estudo permitiu a conclusão diagnostica de 117

casos (33,7%) da amostra. 105

9. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este estudo apresenta dez anos de experiência desse grupo de pesquisa na investigação de indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 utilizando diferentes estratégias para apliacação em saúde. O desenvolvimento dos critérios clínicos propostos por este grupo de pesquisa, visa otimizar recursos e agilizar o diagnóstico dessa síndrome.

Importantes considerações devem serem analisadas neste estudo, visto que a estratégia utilizada nesses anos de pesquisa permite estabelecer uma estratégia de aplicação universal para investigação diagnóstica em larga escala, inclusive considerando o SUS no Brasil.

Os resultados apresentados neste estudo, não só evidenciam a complexidade fenotípica da SD22q11.2, como também a sobreposição de sinais clínicos com outras alterações genômicas. Os critérios clínicos propostos por este grupo de pesquisa para a investigação laboratorial da SD22q11.2 são promissores para a aplicação em larga escala, direcionando inicialmente a triagem dos indivíduos com suspeita clínica da SD22q11.2 por meio de testes genéticos locus específicos. Como demostrado neste estudo, essa estratégia dentro de um sistema de saúde pode economizar e otimizar recursos financeiros, sendo de suma importância a aplicação em países em desenvolvimento, onde esses recursos geralmente são escassos.

Para os casos negativos para a deleção típica em 22q11.2, a realização de CMA se faz necessária. Entretanto, as técnicas de investigação genômica geram muitos dados, o que requer recursos humanos especializados e demanda grande período de tempo. Assim, a experiência da reanálise dos dados de CMA neste estudo, mostrou a importância da padronização da análise dos dados de CMA, seguindo um guia “in house” baseado nas recomendações internacionais.

Além disso, a realização de diferentes tipos de CMA permitiu estabelecer que a plataforma

CytoScan™ 750K Array (Affymetrix®, Santa Clara, CA, USA) ou equivalente, permitiu a identificações de alterações genômicas patogênicas de forma mais rápida e eficaz, se fazendo mais viável para o contexto diagnóstico. 106

Com isso, e considerando uma possível estratégia para investigação da SD22q11.2 em larga escala, pode-se sugerir: a) treinamento de equipes utilizando o material desenvolvidos em estudos anteriores deste grupo de pesquisa; b) utilização dos critérios clínicos propostos e da

CranFlow para registro e seguimento dos casos com suspeita desta microdeleção; c) hierarquização de exames genéticos quando a opção por CMA como primeira escolha não for possível; e d) centralização da investigação laboratorial pública visando a padronização da análise de dados dos testes genéticos, principalmente dos dados de CMA.

Assim, preenchidos os critérios clínicos propostos, exames locus específico poderiam ser inicialmente utilizados com maior chance de conclusão diagnóstica. Na ausência de

SD22q11.2, a investigação por CMA utilizando os parâmetros aplicados neste estudo impactariam positivamente no número de casos com diagnóstico conclusivo. 107

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132

11.APÊNDICE

11.1. Apêndice I – Marcadores de microssatélites utilizados

1) Cromossomo 4: arr[GRCh37] 4q27q32.2(121450632_162682338) hmz

Marcador STS Coordenada Localização Resultados D4S1534 (NED) 86527334-86527492 4q21.23 1 D4S414 (VIC) 92657798-92658035 4q22.1 1-2 D4S1572 (FAM) 103989152-103989292 4q24 1 D4S406 (FAM) 144054870-144055072 4q25 1 D4S402 (FAM) 120367629-120367925 4q26 1 D4S1575(FAM) 135009884-135010102 4q28.3 1 D4S424 (VIC) 142417204-142417383 4q31.21 1 D4S413 (FAM) 158572674-158572910 4q32.1 1 D4S1597 (NED) 170079721-170080009 4q32.3 1 D4S1539 (FAM) 175924725-175924951 4q34.1 1-2 D4S415 (NED) 178948185-178948389 4q34.3 1 D4S1535 (NED) 185472902-185473092 4q35.1 1

133

2) Chromosome 5 (65/10): arr[GRCh37] 5p15.33p11(113576_46383335) hmz

Marcador STS Coordenada Localização Resultados D5S418 (VIC) 40051556-40051770 5p13.1 Não amplificou D5S426 (VIC) 34798707-34798909 5p13.2 1 D5S419 (VIC) 26694298-26694521 5p14.1 1 D5S416 (NED) 16773134-16773345 5p15.1 Não amplificou D5S630 (VIC) 9614068-9614227 5p15.31 1 D5S406 (NED) 5047184-5047361 5p15.32 1 D5S1981 (NED) 1207429-1207692 5p15.33 1 D5S407 (FAM) 56030515-56030661 5q11.2 1 D5S647 (NED) 66283133-66283277 5q12.3 1 D5S424 (VIC) 76193683-76193804 5q13.3 1 D5S641 (NED) 82038693-82038953 5q14.2 1 D5S618 (VIC) 89802224-89802392 5q14.3 1-2 D5S644 (VIC) 95838500-95838598 5q15 1-2 D5S2027 (FAM) 111173443-111173597 5q22.1 1

3) Cromossomo 6: arr[GRCh37] 6q21q23.2(109263688_132108398) hmz

Marcador STS Coordenada Localização Resultados D6S460 80350844-80351241 6q14.1 1-2 D6S300 94821062-94821262 6q16.1 1-2 D6S434 102542633-102542858 6q16.3 Não amplificou D6S287 119595472-119595638 6q22.31 1 D6S262 131772348-131772514 6q23.2 1 D6S292 136356912-136357046 6q23.3 1 D6S308 141298417-141298615 6q24.1 Não amplificou D6S446 170394226-170394428 6q27 1 134

11.2. Apêndice II – Artigo 1

Original Article

Mol Syndromol 2017;8:244–252 Accepted: April 26, 2017 DOI: 10.1159/000477598 Published online: June 24, 2017 y M. Schmid

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Syndromes Based on 22q11.2

Investigation: Challenges in Four Cases

Ilária C. Sgardioli Matheus de Mello Copelli Fabíola P. Monteiro Ana P. dos Santos Elaine Lustosa Mendes Társis Paiva Vieira Vera L. Gil-da-Silva-Lopes Department of Medical Genetics, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas, S ão Paulo, Brazil

Keywords with atypical deletions in the 22q11.2 region: 1 distal deletion and 1 central deletion). In one case with a typical Balanced translocation · Deletion 9p · 22q11.2 deletion 22q11.2 deletion, a familial balanced translocation was syndrome · Duplication 6p · Genomic imbalance · detected. In another case without a 22q11.2 deletion, a 6p Microdeletion syndromes duplication concomitant with a 9p deletion was detected by CMA. Clinical data are reported and diagnostic

Abstract investigations are discussed. Essential aspects for the In the last few decades, different methods for the detection understanding of different diagnostic techniques of of genomic imbalances, such as the microdeletion genomic imbalances are considered, and the 4 cases syndromes, were developed. The 22q11.2 deletion described underline the complexity and the difficulties syndrome (22q11.2DS) is the most common microdeletion involved in the diagnostic process. The approach is syndrome and presents wide clinical heterogeneity. The aim informative for clinical practice and may be applied in other of this study was to describe 4 unusual cases of genomic contexts of genomic imbalance investigation in imbalances found in individuals with suspected microdeletion syndromes. © 2017 S. Karger AG, Basel microdeletion syndromes. Different methods were necessary to complete the diagnosis and to obtain information for genetic counseling. The study was The great advance of knowledge and technologies in retrospective and descriptive. From August 2014 to the area of genetics and molecular biology has allowed December 2015, 39 individuals were assessed using FISH the development of different methods for the and/or MLPA; in 15 cases, chromosomal microarray (CMA) detection of genomic imbalances (GI). These are analysis was carried out. O f 39 registered individuals, we defined as losses or gains of DNA segments [Stofanko found deletions in the 22q11.2 region in 10 individuals (8 et al., 2013; Vieira et al., 2013; McDonald-McGinn et individuals with 22q11.2DS and 2 individuals presenting al., 2015]. Some GIs are

135

Table 1. M ain clinical features found in 39 cases with 22q11DS [McDonald-McGinn and Sullivan, 2011]. This suspicion technique, however, does not allow the identification of balanced chromosomal aberrations or low- Clinical features Frequency, % percentage mosaicism, both being the main complicating factors for genetic counseling [Bi et al., Congenital heart disease 69.2 2013]. Palatal abnormalities 64.1 Considering different options for 22q11.1DS diagnosis, Facial dysmorphisms 74.4 this study presents some aspects in understanding the Immunological changes 35.9 different techniques for the investigation of GIs and Development changes 71.8 reports 4 cases that showed the complexity and Hypoacusis 23.1 difficulties involved in the process of diagnosis and, Ophthalmologic changes 30.8 therefore, requiring different techniques. Neurological changes 12.8 Abnormalities in the urinary tract 20.5 Abnormalities in the gastrointestinal tract 30.8 Patients and Methods Skeletal abnormalities 56.4 From August 2014 to December 2015, 39 individuals were registered in the Brazilian Database of Craniofacial Anomalies/22q11.2 Deletion Syndrome recurrent and known as microdeletion syndromes, (http://www.fcm.unicamp.br/ fcm/en/cranio-face- some of them already well established and clinically brasil/projeto-cranio-face-brasil). For clinical evaluation, a recognizable, e.g., the 22q11.2 deletion syndrome standard protocol based on clinical criteria for suspicion of (22q11.2DS; OMIM 188400]. This stands out as the 22q11.1DS was used proposed by Monteiro et al. [2013]. The most common microdeletion syndrome, with an biological samples were tested by FISH and/or MLPA techniques for 22q11.2 deletion screening, and 15 cases were incidence of 1/4,000– 1/5,000 births [Swillen et al., also tested by CMA. 2000]. The main features of this syndrome include Cultured peripheral blood lymphocytes were used for FISH congenital cardiac malformations, palatal technique as well as for G-banding. Genomic DNA extracted abnormalities, common facial dysmorphisms, from peripheral blood with the NucleoSpin® Blood XL kit immunodeficiency, neonatal hypocalcemia, learning (MachereyNagel GmbH & Co. KG) was used for MLPA and CMA, disability, and development delay [Fernández et al., according to the manufacturer’s instructions. 2009; Monteiro et al., 2013; Vieira et al., 2015], Fluorescence in situ Hybridization indicating the need of healthcare specialists. Probes used for the 22q11.2 region were DiGeorge/VCFS Because of clinical heterogeneity, 22q11.2DS is not TUPLE1 + 22q13.3 Deletion Probe Combination (Cytocell always simple to detect [Monteiro et al., 2013]. Aquarius®). Hybridization and washing procedures were Moreover, depending on the genetic test used, a carried out according to the manufacturer’s instructions. One negative result may not completely disregard the hundred interphase nuclei per sample were analyzed, using a BX51-BF-II/BX2 fluorescence microscope (Olympus®) with diagnosis, requiring further investigation in cases of appropriate filters, and the images were recorded with the persistent clinical suspicion. For many years, FISH was FISHView software (Applied Spectral Imaging ®). considered as a “gold standard” for detecting this microdeletion [Fernández et al., 2005; Oh et al., 2007; Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Sgardioli et al., 2015]. Currently, new targeted The P250-B2 DiGeorge (MRC-Holland MLPA®) kit was used techniques such as MLPA, analysis of polymorphic DNA according to the manufacturer’s protocol. Results were ® markers, real-time PCR, and quantitative fluorescence analyzed with the GeneMapper software (Applied Biosystems TM ® PCR have been used in screening 22q11.2DS [Swillen ) and data were processed in a Microsoft Excel spreadsheet, elaborated specifically for this kit by the National Genetics et al., 2000; Jalali et al., 2008; Vieira et al., 2013]. Each Reference LaboratoryManchester one has advantages and limitations (GeneTests; (http://www.ngrl.org.uk/Manchester/projects/informatics/ml https://www. genetests.org/). pa). In addition to these, chromosomal microarray analysis Chromosomal Microarray Analysis (CMA) technique, aCGH, or SNP array detects GIs This technique was carried out with the Cytoscan 750K or throughout the whole genome using a single test. Cytoscan HD (Affymetrix®) according to the manufacturer’s Currently, this is indicated as a first-tier test for instructions. Analysis of the results was performed using the diagnostic screening of patients with multiple Chromosome Analysis Suite software, version 3.1.0.15 (r9069) congenital anomalies and/or intellectual disabilities (Affymetrix). [Miller et al., 2010]. CMA is widely available in genetic laboratories and has been the preferred choice for the diagnosis of a 22q11.2 deletion in some countries

136

Fig. 1. Patient 1 at the age of 2 years and 9 months. A, B A B Clinical pictures of the proband showing hooded eyelids, tubular nose, downturned oral commissures, question mark ear, retracted columella, and retrognathia. C Chromosomes 3 and 16 showing an apparently balanced translocation:

46,XX,t(3; 16)(q23;p12)[20]. D Interphase FISH showing the 22q11.2 deletion. ECMA hybridization profile of chromosome 22 showing a common deletion of 3 Mb in region q11.2: arr[GRCh37] 22q11.21 C D (18916842_21798907)×1.

Results Case 1 Among the 39 individuals registered in the period of this study (14 males and 25 females), ages The proband was referred for genetic testing at 2 ranged from 4 months to 23 years. The main years and 9 months, presenting with congenital clinical signs which led to suspicion are described heart disease and dysmorphisms. At birth, the in Table 1. girl’s weight was 2,210 g (<3r d percentile [

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(P75–97). Dysmorphology evaluation revealed fifth finger clinodactyly and flat feet. An echocardiogram A B revealed a ventricular septal defect, and abdominal ultrasound showed a bilateral inguinal hernia. X-ray of the spine showed an S dorsolumbar curve, scoliosis, and lordosis. The G-banded karyotype was normal. MLPA technique identified an atypical distal 22q11.2 deletion, including HIC2, PPIL2, and TOP3B probes (Fig. 2 C).

Case 3 C This patient was referred for genetic testing at 2 years and 1 month. At birth, the boy’s weight was 2,890 g (P10– 25), height 46 cm (

138

A B C

Fig.3. Patient 3 at the age of 2 years and 1 month. A Clinical somatic growth deficit. At 9 years old, her weight features of the proband showing a high forehead, was 21 kg (P3), height 108.5 cm (

Fig.4. Patient 4 at 8 years of age. A–D Clinical pictures of the proband. The facial A B appearance shows mild asymmetry, arched eyebrows with mild lateral enlargement, mild synophrys, epiblepharon, a port wine stain on the glabellar area, short palpebral C fissures, convergent strabismus to the left, low nasal bridge, square nasal tip, faint nasal D filter (A), as well as low-set and dysmorphic ears, everted lower lip, and a short neck (B). The patient’s hands show slightly clubbed thumbs (C) , and her feet show shortening of the right 4th and 5th metatarsals and the left F 3rd–5th metatarsals as well as an overlapping of the left 3rd and 4th toes (D). E Chromosomes 6 and 9 showing the

derivative chromosome 9: 46,XX,der(9) t(6; 9)(p25.3;p24.3)[20]. F FISH analysis of BAC clones of a partial metaphase with a signal for the probe of the 9p24 region (RP11- E 48M17) marked in red and 2 signals for the H probe of the 9q34 region (RP11644H13) in green (indicated by arrows), revealing a partial deletion of the short arm of chromosome 9 in region 24. G Chromosomes 6 and 9 of the mother showing a balanced translocation: G 46,XX,t(6;9) ( p25.3;p24.3)[20]. H FISH analysis of BAC clones of a partial metaphase I with 2 signals for the probe of the 9p24 region (RP11-48M17) marked in red and 2 signals for the probe in the region 9q34 (RP11-644H13) in green (indicated by arrows); however, this result shows that the region 9p24 is located in another chromosome and confirms the translocation revealed by karyotyping. I CMA hybridization profile of chromosome 6 of the patient J showing a duplication of approximately 11.5 Mb in the short arm of chromosome 6: arr[GRCh37] 6p25.3p24.1 (156974_11629164)×3. J CMA hybridization profile of chromosome 9 of the patient showing a deletion of approximately 14.9 Mb in the short arm of chromosome 9: arr[GRCh37] 9p24. 3p22.3(203861_15125789)×1. necessary [Oskarsdóttir et al., 2004; Oh et al., 2007]. a fast and accurate diagnosis of patients with clinical Patients with clinical suspicion of 22q11.2DS are phenotypes possibly caused by a GI. often seen by several medical specialties and health 22q11.2DS is suitable to illustrate this approach professionals. Lack of understanding about because of its high prevalence and clinical limitations of each diagnostic technique by these heterogeneity [Vieira et al., 2015]. Its clinical professionals may lead to difficulties in the suspicion may be difficult; therefore, accurate and interpretation of the clinical results. In this study, 4 precise clinical methods are fundamental in cases exemplify the necessity of a combined achieving diagnosis, treatment, and management. diagnostic approach, using appropriate and Follow-up care with a multidisciplinary team, complementary techniques. according to each patient’s needs, as well as In case 1, karyotyping was the first test performed adequate genetic counseling for the families are and revealed a reciprocal translocation apparently 140 balanced and inherited. Although this chromosomal negative), probably because the regions involved abnormality probably does not have impact on the have similar lengths and the banding patterns make phenotype of the patient, it could be interpreted as diagnosis more difficult. Furthermore, the causative by nonspecialists, delaying the diagnosis. cytogenetic resolution of the previous test may not On the other hand, this translocation revealed the have been adequate, which is a technical limitation possibility of new unbalanced rearrangements in the [Bi et al., 2013]. couple’s offspring recommending genetic Case 4 demonstrates the spectrum of clinical findings counseling. CMA revealed a 3-Mb microdeletion in in different genetically determined conditions. Some the 22q11.2 region, which was confirmed by FISH. studies report patients with a 9p deletion presenting This technique was used for diagnosis and also to with facial asymmetry, hypertelorism, short detect other GIs possibly associated with the palpebral fissure, strabismus, asymmetric and chromosomal translocation. It was performed since dysmorphic ears, wide nasal bridge, long nasal filter, approximately 30% of the cases harboring reciprocal high palate, malocclusion, and psychomotor translocations present GIs associated to the retardation [Freitas et al., 2011; Recalcati et al., breakpoints [Baptista et al., 2008]. Thus, different 2012; Spazzapan et al., 2016]. Whereas patients with approaches were necessary for a complete diagnosis a 6p duplication are reported having language and also for providing clarification for the family. The disorders, motor delay, and intellectual deficit identification of a chromosomal translocation would [Vermeesch et al., 2004]. There are only 2 cases not have been possible using only CMA or MLPA, reported in the literature with 6p duplication which would only have detected the 22q11.2 concomitant with 9p deletion. In both cases, the deletion. One of the limitations of these techniques patients present alterations as described above, is the inability to identify balanced rearrangements including a short neck as well as hand and foot [Bi et al., 2013]. abnormalities [Eden et al., 1985; Lytle et al., 1989]. In case 2, with a normal karyotype, investigation for All these clinical features are present in patient 4, 22q11.2DS was performed by MLPA, revealing an and many of these signs have already been described atypical 22q11.2 distal deletion. This microdeletion in 22q11.2DS patients, which restate the clinical could not be identified by FISH with the probe variability of this condition. commonly used for the proximal 22q11.2 region, The present study reinforces the difficulties to confirming that MLPA is quite effective in detecting request investigation and to diagnose the cases with atypical deletions involving smaller and variable 22q11.2DS suspicion, and describes the application regions within the 22q11.2 region [Fernández et al., of different techniques that may be used for 2005; Jalali et al., 2008; Molck et al., 2013]. investigating microdeletion syndromes. T argeted In case 3, considering the presence of multiple approaches, such as FISH, real-time PCR, analysis of congenital anomalies and a normal karyotype, CMA polymorphic DNA markers, and quantitative was the approach initially chosen, which revealed an fluorescent PCR, though well established and fast, atypical central deletion of approximately 600 kb, are only effective in detecting common deletions confirmed by MLPA. This case demonstrates the [Fernández et al., 2005; Oh et al., 2007; Molck et al., wide clinical heterogeneity of deletions in 22q11.2 2013; Vieira et al., 2013; Poirsier et al., 2016]. Thus, region. negative results may lead to false negative diagnosis, In case 4, with a previously confirmed normal since atypical 22q11.2 deletions may occur [Beaujard karyotype and no detected deletion in the above- et al., 2009; Molck et al., 2013]. In this context, MLPA mentioned region tested by FISH, CMA identified a is a more effective technique for the diagnosis of duplication of approximately 11 Mb in the short arm 22q11.2DS, and identifying typical/atypical deletions, of chromosome 6 and a deletion of approximately these in smaller size and/or variable regions within 14,9 Mb in the short arm of chromosome 9. Because the 22q11.2 region [Vorstman et al., 2006; Molck et of the large chromosome segments involved, usually al., 2013, 2015]. MLPA detected 4 deletions of 3 Mb visible by karyotyping, G-banding was repeated, and 1 atypical distal deletion that would not have which confirmed CMA results, and revealed that the been detected by FISH. In addition, it confirmed 1 mother had an apparently balanced translocation. In atypical central 22q11.2 deletion, initially detected this case, the first karyotype was normal (false by CMA. However, MLPA is also a targeted approach 141 and limited to the detection of approximately 48 Acknowledgments genomic regions. In this way, GIs outside the 22q11 The authors thank the patients and their families for their region or at loci not represented in the MLPA kit, as cooperation. We thank the biologist Nilma Lúcia Viguetti well as balanced chromosomal aberrations, cannot Campos. This study was supported by the State of São Paulo Research Foundation (FAPESP), grant 2012/51799-6 and the be detected. National Council for Scientific and Technological In the US and in European countries, CMA is an Development (CNPq), grant 460422/2014-6). V.L.G.-d.-S.-L. is effective widely used method detecting 22q11.2 and supported by CNPq, grant 304455/2012-1. other GIs [McDonald-McGinn and Sullivan, 2011]. However, an overall agreement has not yet been Statement of Ethics found for its use in detecting microdeletion This study was approved by the Ethics Committee Board of syndromes. In general, a targeted approach, such as the University of Campinas, as stated in report FISH or MLPA, is only used when there is a very strong CAAE16525913. 1.0000.5404. All participants or their legal guardians signed the informed consent form. suspicion of 22q11.2DS. In Brazil, FISH and MLPA have been used for specific screening of 22q11.2 Disclosure Statement deletion, using CMA just for cases with negative FISH The authors declare no conflicts of intere. and MLPA results, mainly because CMA is still too expensive [Jehee et al., 2011; Vieira et al., 2013]. This approach has been adopted as a low-cost strategy by our research group.

The geneticist may carry out the research and individualized genetic counseling of all cases, which frequently requires the evaluation of the parents. In cases of unconfirmed and maintained suspicion, other strategies should be considered by the genetics expert.

It is worth mentioning that in many cases in spite of technological advancement, karyotyping should not be discarded, especially for the parents. It can be the key tool for genetic counseling as seen in 2 of the 4 cases presented in this study [Sgardioli et al., 2015]. Understanding the complexity of the 22q11.2DS diagnostic approach, from clinical suspicion to diagnostic confirmation – and its specific challenges – make the present article relevant for various health professionals. They will be in the front line, indicating and interpreting findings, always aware of limitations and clinical consequences of each result.

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11.3. Apêndice III – Artigo 2

Clinical and Laboratory Research 2018 1

Pure 21q22.3 deletion identified in a patient with mild phenotypic Features Ilária Cristina Sgardioli, Matheus de Melo Copelli, Elaine Lustosa-Mendes, Társis Paiva Vieira, and Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopes Department of Medical Genetics, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, Campinas, Brazil

Partial deletions at chromosome 21 have Received September 20, 2017; revised and accepted January 6, 2018. been rarely reported and in the majority of descriptions are associated with ring chromosome 21, resulting in terminal valve regurgitation and laryngoscopy deletions of 21q22.3 and a large revealed nasal septum deviation and phenotypic variability (Roberson et al. velopharyngeal insufficiency. At 29 years, 2011). This article reports a female patient she had mild mental retardation and with a de novo 21q22.3 deletion that was physical examination was essentially the referred at 11 years because of speech same. GTG-banded karyotype was normal delay and learning disability. She also and chromosomal microarray analysis presented a history of tonic–clonic seizures (CMA) with CytoScan HD Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) revealed a terminal during her childhood and was already deletion of 4787 kb at 21q22.3 region controlled by medications. She had a long (43,310,796–48,097,372 – GRCh37/hg19; and triangular face, low-set ears, ocular Fig.1B) and an interstitial duplication of hypertelorism, upslanting palpebral 1068kb at 20q12-q13.12 region fissures, epicanthal folds, malar hypoplasia, (41,500,568–42,568,152- GRCh37/hg19). nose with broad bridge, bulbous and mild CMA with the 8x60K array Agilent (Agilent grooved tip and alar hypoplasia, long Technologies, Santa Clara, CA, USA) philtrum, furrowed tongue, high palate, confirmed the findings of the patient and cleft uvula, and microrretrognathia (Fig. revealed the same duplication at 20q12- 1A). She also exhibited joint q13.12 region in her mother. However, hyperextensibility, long hands and fingers cases with the same duplication were not with mild cutaneous syndactyly, and found in databases. As her mother is phenotypically normal, this alteration was clinodactyly of fifth and proximal considered a rare variant of unknown implantation of thumbs. Dysphagia and significance, probably benign. Fluorescence hypernasal tone in the voice were also in situ hybridization (FISH) confirmed the detected. Echocardiogram showed mitral deletion at 21q22.3 region in the patient valve prolapse with discrete and revealed normal results for both ______parents, confirming a de novo alteration. Correspondence: Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopes, MD, The patient herein reported has a rare pure Ph.D, Full Professor, Department of Medical Genetics, monosomy 21q22.3qter with mild Faculty of Medical Science, State University of Campinas phenotype. Table S1 (Supporting (UNICAMP), Tessália Vieira de Camargo, 126 CEP: information) compares the reported patient 13083-887 Campinas, SP, Brazil. Email: [email protected] with similar cases from the literature and the graphic design (Fig. 1C) allows the comparison of the deletion sizes and the 144

involved Online Mendelian Inheritance in encephalopathy probably caused by Man (OMIM) genes. The reported case variant and truncated SIK1 proteins presents a 4.7-Mb terminal deletion which (Hansen et al. 2015). Also, sequence involves 94 genes, many of them do not variations in the SIK1 gene resulted in have a known function and 53 are registered significant abnormalities of synapse in the OMIM. The dosage sensitivity of most regulation and neuronal morphology in in of these genes are not well established vitro human neuronal model, causing according to ClinGen Dosage Sensitivity epilepsy in some cases (Proschel et al. Map. However, the haploinsufficiency of 2017), a feature described in the present some genes in the 21q22.3-qter region case. could be responsible for the phenotype Despite of many genes mapped in the presentation, as well as unrecognized 21q22.3 region do not have a well-known epistatic factors should be considered. function and epistatic factors could not be Among the genes inside the deleted excluded, PRMT2 and SIK1 genes are region, the PRMT2 gene has been rated as possibly related to this mild phenotype. an important factor that acts as a negative Also, the present case contributes to a regulator of the nuclear factor-kB (NF-kB) better clinical recognition of this rare pathway and could participate in the chromosomal abnormality. regulation of chromatin (Besson et al. 2007). Another study suggests that ACKNOWLEDGMENTS arginine methyltransferases, as PRMT2, The authors are grateful to the patient when abnormally regulated could lead and her parents for their cooperation and transcripts for chromatinremodeling permission regarding the publication. This enzymes associated with reproductive study received financial support by the system diseases and cancer (Baumann et State of São Paulo Research Foundation – al. 2015). Fapesp (# 2012/51799-6) and the National Also, previous reports showed that Council for Scientific and Technological individuals with 21q deletion can be Development – CNPq (# 460422/ 2014-6). infertile, presenting azoospermia or VLG-d-S-L is supported by the National irregular menstrual cycles (Marquet et al. Council for Scientific and Technological 2015). The present patient has no history Development – CNPq (# 304455/ of other reproductive disorders or 2012-1). neoplasias until now, but she developed a severe polymenorrhea, which has lead to DISCLOSURE hysterectomy. None. Heterozygous mutations in SIK1 gene were associated to epileptic 145

Fig. 1 Patient’s dysmorphological features and 21q22.3 deletion details. (A) Image of patient’s face showing triangular and long face, hypertelorism, upslanting palpebral fissures, epicanthal folds, broad nasal base, bulbous nose, discrete spina nasal tip, alar hypoplasia, long philtrum, microrretrognathia, midface hypoplasia, low- set ears, flat occiput, low hair implantation in the neck, and the microrretrognathia was very accentuated. (B) Chromosomal microarray analysis hybridization profile of chromosome 21 of the patient showing a terminal deletion of 4787 kb in the 21q22.3 region (43,310,796–48,097,372 – GRCh37/hg19). (C) Graphic design made in UCSC Genome Browser to show OMIM genes and to compare the size of deletions between the present case and literature cases. Permission was obtained from the patient and her parents for presentation.

ETHICAL APPROVAL ClinGen Dosage Sensitivity Map – This study was approved by the Ethics https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/db Committee Board of University of var/clingen/ Campinas, as stated in report CAAE1652 5913.1.0000.5404. The patient and her REFERENCES parents signed the informed consent form. Baumann C, Olson M, Wang K, Fazleabas A, De La Fuente R. 2015. Arginine methyltransferases mediate an epigenetic ovarian response to endometriosis. Reproduction 150:297– WEB RESOURCES 310. UCSC Genome Browser – Besson V, Brault V, Duchon A et al. 2007. Modeling the moosomy for the telomeric part of human chromosome 21 http://genome.ucsc.edu/ reveals haploinsufficient genes modulating the DECIPHER – https://decipher.sanger.ac.uk/ inflammatory and airway responses. Hum Mol Genet 16:2040–2052.

146

Hansen J, Snow C, Tuttle E et al. 2015. De novo mutations in SUPPORTING INFORMATION SIK1 cause a spectrum of developmental epilepsies. Am J Hum Genet 96:682–690. Additional supporting information may be Marquet V, Bourgeois D, De Mas P et al. 2015. Double found online in the supporting information deletion of a chromosome 21 inserted in a chromosome 22 tab for this article. in an azoospermic patient. Clin Case Rep 3:757–761. Table S1 Comparison of clinical data Proschel C, Hansen JN, Ali A et al. 2017. Epilepsy-causing between the present case and literature sequence variations in SIK1 disrupt synaptic activity response gene expression and affect neuronal morphology. cases. Eur J Hum Genet 25: 216–221. Roberson ED, Wohler ES, Hoover-Fong JE et al. 2011. Genomic analysis of partial 21q monosomies with variable phenotypes. Eur J Hum Genet 19:235–238.

147

Supporting Information

Table 1 - Comparison of clinical data between the present case and literature cases.

Guion-Almeida, Ruiz-Botero and Present Case Melis, 2011 Roberson, 2011 Chen, 2012 Zhang, 2012 Zhang, 2012 Marquet, 2015 2012 Pachajoa, 2016

Sex F F M M F F M M F

Intellectual disability + ------+

Developmental delay + + ------+

Speech delay + + + - - + - - +

Learning disabilities + - - - + - - - -

Epilepsy/seizures + - - - - - + - -

Protuberante occiput + - - + - - - - -

Broad or Prominent forehead + - - + - - - - -

Micrognathia + - - + - - + - -

Retrognathism + ------

Palatal Abnormalities + - - - + + - - +

Dysphagia / Feeding difficulty + + ------

Facial dysmorphisms + + - - - + + - -

Hypertelorism + - - - + - - - -

Ophthalmologic abnormalities - - + - - + + - -

Eye external abnormalities + + - + + + - - +

Low-set/dysplastic ears + + - - + + + - +

Nasal/Nose dysmorphisms + - - + + + - - + 148

Alar hypoplasia + ------

Mouth abnormalities + - - + - - - - +

Maloccluded teeth + - - - - - + - -

Heart defects + + - - - - + - +

Hyperextensible joints + - - - - + - - +

Clinodactyly + - - + - - - - +

Cutaneous syndactyly + ------

Long hands and fingers + ------

Proximal implantation of thumbs + ------

Abnormality of the voice + ------

149

11.4. Apêndice IV – Artigo 3 (Aceito para publicação)

Cytogenetics and Genome Research

A rare case of concomitant deletions in 15q11.2 and 19p13.3

Authors: Ilária Cristina Sgardiolia, Elaine Lustosa Mendesa, Ana Paula dos Santosa, Társis Paiva

Vieiraa, Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopesa.

Author’s affiliation: aDepartment of Medical Genetics, Faculty of Medical Science, State

University of Campinas (UNICAMP), SP, Brazil

Running tittle: Concomitant deletions in 15q11.2 and 19p13.3

Conflict of interest: The authors have no conflict to declare.

*Correspondence to:

Vera Lúcia Gil-da-Silva-Lopes

Department of Medical Genetics, Faculty of Medical Science, University of Campinas

(UNICAMP), SP, Brazil

Tessália Vieira de Camargo Street, 126 - CEP 13083-887 – Campinas, SP, Brazil

Phone: 55 19 3521-8904/FAX 55 19 3521-8909

E-mail: [email protected]

150

Abstract

A female individual with concomitant deletions in 15q11.2 and 19p13.3 is reported. She presents facial dimorphisms, motor delay, learning difficulties and mild behavioral impairment.

After chromosomal microarray analysis (CMA) the final karyotype was established as 46,XX. arr[GRCh37] 15q11.2(22770421_23282798)x1, 19p13.3(3793904_4816330)x1. The deletion in 15q11.2 is 507 kb in size involving seven non-imprinted genes, of which four are registered in the OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) and are implicated as neuropsychiatric or neurodevelopmental disorders. The deletion in 19p13.3 is 1,022 kb in size and encompasses 47 genes, most of which do not have a well-known function. The genotype-phenotype correlation is discussed, and most of the features could be related to 19p13.3 deletion, except velopharyngeal insufficiency. Other genes encompassed in the deleted region, as well as unrecognized epistatic factors could also be involved. Nevertheless, the two-hit model related to the 15q11.2 deletion would be an important hypothesis to be considered.

Keywords: Concomitant deletions, 19p13.3 deletion, 15q11.2 deletion, Genomic Imbalances,

Chromosome Disorders, Chromosomal Microarray Analysis, Genotype-phenotype Correlation 151

INTRODUCTION

The high-throughput technologies has brought up great advances in the identification of structural variants in the genome, such as copy number variation (CNV), which can be part of the human genomic diversity as well as the cause of human genetic diseases (Zhang et al., 2009;

Le Scouarnec and Gribble, 2012; Valsesia et al., 2013). Besides, additional genomic imbalances have been revealed in previous well-defined pathological cases (Vallespin et al., 2013) and rare concomitant rearrangements have been described previously, for example, a sporadic case involving the chromosome 19 where the patient presented a de novo 19p13.3 microdeletion and a 16p13.11 microduplication (Shimojima et al., 2016). Similar to the case cited above, this article describes a concomitant rearrangement involving the chromosomes 15 and 19.

The deletion in 15q11.2, between breakpoints (BP) 1 and 2, is classified as a recurrent deletion, which originates due to a mechanism known as NAHR – nonallelic homologous recombination, where repeated DNA sequences share high similarity on the same chromosome causing genomic instability during the crossing-over in the first meiosis and mediate to recurrent deletions (Locke et al., 2004; Zhang et al., 2009; Burnside et al., 2011; Butler, 2017).

This deletion has been related to a wide range of clinical findings, including disorders of autism spectrum, attention deficit-hyperactivity, obsessive-compulsive and susceptibility to neuropsychiatric, as well as neurodevelopmental alterations (Dentici et al., 2009; Doornbos et al., 2009; Burnside et al., 2011; Sempere Perez et al., 2011; von der Lippe et al., 2011;

Abdelmoity et al., 2012; Butler, 2017).

Conversely, few genomic imbalances have been described in the chromosome 19. It is the densest chromosome with regard to the amount of genes in the human species and is crowded in genes already well-mapped for single-gene disorders as well as many loci with evidence for association with complex traits (Grimwood et al., 2004). 152

Deletions in 19p13.3 are classified as non-recurrent and are originated mostly by a mechanism known as NHEJ – nonhomologous end-joining, which does not require substrates with extended homology and can leave an information scar in the form of loss of several nucleotides at the join point (Nevado et al., 2015). Thus, deletions in 19p13.3 involve the deletion of dozens of genes and have been reported in individuals with multiple congenital anomalies, global developmental delay, macrocephaly, facial dysmorphisms, and behavioral and learning problems (de Smith et al., 2011; Siggberg et al., 2011; Risheg et al., 2013;

Nowaczyk et al., 2014; Nevado et al., 2015). However, due to different sizes of the deletions among in the affected individuals, there is no specific phenotype common to all patients.

This article presents the clinical characterization and genotype-phenotype correlation in a female with concomitant 15q11.2 and 19p13.3 deletions.

CLINICAL REPORT

The proband is a girl, first child of a healthy and non-consanguineous couple (mother

24-years-old and father 27-years-old) and was referred for genetic evaluation at 20 months of age, for presenting with velopharyngeal insufficiency, motor and language delay, growth deficiency, and facial dimorphisms. Pregnancy and delivery were uneventful. The newborn was small for gestational age [weight was 2,470 g (-1.80 SD), length 47 cm (-1.15 SD) and OFC 32 cm (at the 3rd percentile)]; and her Apgar scores were 6, 8 and 9, respectively. She had one episode of hypoglycemia and jaundice after 24 hours of being born, which were treated by phototherapy. The child had asthma, recurrent pneumonia, and otitis, which led to the placement of auditory tubes. During the first dysmorphological evaluation, the anthropometrical data were: weight 7,540 g (- 3.14 SD), height 74.8 cm (- 2.66 SD), and OFC

43.3 cm (below 3rd percentile). Flat occiput, high back hairline, up-slanting and narrow palpebral fissures, epicanthal folds, nose with broad bridge and anteverted nares, malar 153

hypoplasia, down-turned mouth, flat philtrum and oral hypotonia were observed (Figure 1).

Additionally, she presented wide-spaced and hypoplastic nipples, hypotonia, and mild muscle hypotrophy.

Nasofibroscopy revealed laryngeal alterations compatible with pharyngeal- laryngeal reflux, velo-palatine insufficiency, and oral dysphagia. Ophthalmologic evaluation was normal, except by narrow palpebral fissures (which were surgically corrected) and convergent strabismus. Transfontanellar ultrasonography as well as audiometry, computed tomography of brain, abdominal ultrasonography, and the echocardiogram were normal. Diagnostic investigation included GTG-banded karyotype (resolution of 400–550 bands), Fluorescent in situ Hybridization (FISH) with the TUPLE1 probe (Cytocell Aquarius®), and Multiplex

Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) with the P250-A1 kit (MRC-Holland,

Amsterdam, the Netherlands) for 22q11.2 deletion screening. The results of all these tests were normal.

Despite global stimulation, she evolved with motor and mental delay (spoke first words at 2 years old, walked without support at 3 years old, and had sphincters control at 5 years old).

Furthermore, she also presented learning difficulties (she does not recognize numbers, letters, and colors).

At eight years old, she had irritability and mild difficulty for social interactions. On physical examination, the anthropometric data were: weight of 23.4 kg (- 0.44 SD), height of

100.6 cm (2.65 SD), and OFC of 51 cm (at the 25th percentile). Dysmorphological findings were essentially the same, however, the patient also exhibited narrow forehead, slender fingers and toes, clinodactyly of 2th, 3th, and 5th fingers and of 2th to 5th toes, and halluces valgus. Bone inventory showed dysplastic right trochlea. The patient was attended at Rheumatologic Clinic due to a hypothesis of juvenile idiopathic arthritis.

154

METHODS

The genomic DNA was extracted from the peripheral blood with the Genomic DNA purification kit Unclosing® Blood XL (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) according to the manufacturer’s instructions. The chromosomal microarray analysis (CMA) of the patient was carried out with the Cytoscan 750K array (Affymetrix®, Santa Clara, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions, and the data were analyzed with the Chromosome Analysis

Suite software (ChAS version 3.1.0.15 (r9069) - Affymetrix®) (hg19).

Genomic imbalances found by the CMA were compared with a database composed of

117 Brazilian individuals who were used as a control group of the general population, as well as the Database of Genomic Variants (DGV) and the Affymetrix® Database of Genomic

Variants (aDGV). Genomic imbalances not found in the control databases were also compared with other electronic databases such as OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man),

DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl

Resources), and ClinGen (Clinical Genome Resource), besides the review of the literature. The

The BAC (bacterial artificial chromosomes) probes for FISH were selected according to the mapping data from the Ensembl genome browser (NCBI GRCh37/hg19). The BAC DNAs were labeled by Nick Translation Mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) with

Fluorescein-12-dUTP or Tetramethil-rhodamine-6-dUTP (Roche Applied Science,

Indianapolis, IN), according to the manufacturer’s instructions.

RESULTS

GTG-banded Karyotype was normal, and the CMA revealed two concomitant deletions: an interstitial deletion of 507 kb in size at 15q11.2 region (22,770,421-23,277,436 – 155

GRCh37/hg19) (Figure 2A) and another interstitial deletion of 1,022 kb in size at 19p13.3 region (3,793,904-4,816,330 – GRCh37/hg19) (Figure 2B).

Thus, the final karyotype of the patient is 46,XX. arr[GRCh37]

15q11.2(22770421_23282798)x1,19p13.3(3793904_4816330)x1.

The FISH analysis confirmed both deletions in the patient and revealed normal results for her mother; however, the patient’s father was unavailable for evaluation and sample collection.

The comparison of clinical features among the present case and the cases from literature are described in Table 1, and the comparison of deletion sizes is displayed in Figure 3.

DISCUSSION

The present case describes a girl with concomitant deletions in 15q11.2 and 19p13.3.

The main clinical features presented were motor delay, learning difficulties, mild behavioral impairment and facial dimorphisms.

The patient’s deletion in 15q11.2 is 507 kb in size between BP1 and BP2 regions and encompasses seven genes, of which four, the NIPA1 (OMIM: * 608145), NIPA2 (OMIM: *

608146), CYFIP1 (OMIM: * 606322) and TUBGCP5 (OMIM: * 608147) are catalogued in the

OMIM and are not imprinted (Burnside et al., 2011; Picinelli et al., 2016). There is an estimated phenotypic penetrance of only 10.4% for 15q11.2 deletion, which means that there is a 90% likelihood of normal phenotype (Rosenfeld et al., 2013). However, penetrance estimates among different studies vary widely for the 15q11.2 deletion, being more probable at low penetrance, since in many cases this alteration was inherited from a healthy parent or has been identified in control subjects (Cooper et al., 2011; Rosenfeld et al., 2013; Chaste et al., 2014).

Secondary CNVs have been described in individuals with 15q11.2 deletion, which tend to present a more severe clinical phenotype than the individuals without additional CNVs 156

(Burnside et al., 2011; Cafferkey et al., 2014; Hashemi et al., 2015). This mechanism is supported by the two-hit model, which has been previously described for other genomic imbalances with incomplete penetrance (Girirajan et al., 2010; Girirajan et al., 2012). Girirajan and coworkers (2010) described that in the cases where the second-hit CNV is associated with a well described syndrome, carriers manifested more severe or distinct phenotypes than the typical features of the syndrome. In the patient herein reported, the 15q11.2 deletion probably has contributed to the manifestation of the velopharyngeal insufficiency, since this feature has not been previously described in individuals with 19p13.3 deletion. In addition, behavioral problems are more commonly described in 15q11.2 deletion carriers than in individuals with

19p13.3 deletions; therefore, the behavioral phenotype of the present case could also be attributed to the 15q11.2 deletion, or to the concomitant presence of both CNVs.

The 19p13.3 monosomy is rare, and to date a deletion with the same breakpoints has not been reported in this region. However, some cases with overlapping deletions and different breakpoints have been described, as shown in Figure 3 (de Smith et al., 2011; Siggberg et al.,

2011; Risheg et al., 2013; Nowaczyk et al., 2014; Nevado et al., 2015). The 19p13.3 deletion in the patient herein reported encompasses 38 genes, many of which do not have a known function, although 26 are registered in the OMIM.

Deletion sizes between the present case and cases from the literature can be compared, showing a short region of overlapping (SRO) that comprises 55 kb including nine OMIM genes highlighted in Figure 3: ATCAY, NMRK2, DAPK3, EEF2, PIAS4, ZBTB7A, MAP2K2,

CREB3L3 and SIRT6. However, only three of them (ZBTB7A, MAP2K2, and PIAS4) were partially implicated with some clinical traits, as proposed by Nevado et al. (2015).

Dosage sensitivity was described for the PIAS4 gene suggesting that deletions are associated to macrocephalia while duplications to microcephaly (Nevado et al., 2015).

Surprisingly, the patient reported here does not present macrocephaly, which was also reported 157

in 22.9% of patients with PIAS4 copy number changes (Nevado et al., 2015). Thus, the head size could be related to other factors as additional or larger genomic imbalances, which extend toward the centromere, due to existence of putative dominant-negative regulator genes (Nevado et al., 2015). In addition, a study performed in an animal model showed that heterozygous and homozygous knockout mice for PIAS4 did not present changes related to head, which supports the results described above (Roth et al., 2004).

In conclusion, most of the patient’s phenotype could be attributed to the 19p13.3 deletion, except for the velopharyngeal insufficiency. Other genes encompassed in the deleted region, as well as unrecognized epistatic factors could also be involved. Nevertheless, the two- hit model related to the 15q11.2 deletion would be an important hypothesis to be considered.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are grateful to the patient and her mother for their cooperation and permission regarding the publication.

This study received financial support from the State of São Paulo Research Foundation

- Fapesp (# 2012/51799-6) and the National Council for Scientific and Technological

Development - CNPq (# 460422/2014-6). VLGSL is also supported by the National Council for Scientific and Technological Development—CNPq (#305985/2017-5).

STATEMENT OF ETHICS

This study was approved by the Ethics Committee Board of University of Campinas, as stated in report 059/2008. The patient signed the informed consent form.

WEB RESOURCES

ClinGen (Clinical Genome Resource) - https://www.clinicalgenome.org/ 158

DECIPHER (DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl

Resources) – https://decipher.sanger.ac.uk/

DGV (Database of Genomic Variants) - http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home?ref=GRCh37/hg19

OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) - https://www.omim.org/

DISCLOSURE STATEMENT

None.

REFERENCES

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159

Girirajan, S., Rosenfeld, J.A., Coe, B.P., Parikh, S., Friedman, N., Goldstein, A., Filipink, R.A., McConnell, J.S., Angle, B., Meschino, W.S., Nezarati, M.M., Asamoah, A., Jackson, K.E., Gowans, G.C., Martin, J.A., Carmany, E.P., Stockton, D.W., Schnur, R.E., Penney, L.S., Martin, D.M., Raskin, S., Leppig, K., Thiese, H., Smith, R., Aberg, E., Niyazov, D.M., Escobar, L.F., El-Khechen, D., Johnson, K.D., Lebel, R.R., Siefkas, K., Ball, S., Shur, N., McGuire, M., Brasington, C.K., Spence, J.E., Martin, L.S., Clericuzio, C., Ballif, B.C., Shaffer, L.G. and Eichler, E.E., 2012. Phenotypic heterogeneity of genomic disorders and rare copy-number variants. N Engl J Med 367, 1321-31.

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Table 1 – Clinical features in the present case, carrier of concomitant deletions in 15q11.2 and 19p13.3, and patients with 15q11.2 Deletion and

19p13.3 Deletion, separately.

Review of 15q11.2 Deletion Review of 19p13.3 Deletion

2014

2011

2016

2015

2013

. al.,

et. al.,

Present Present Case

15q11.2and 19p13.3

Risheg et

concomitant deletions in

Nevado

himojima et. al., 2016

Picinelli

de Smith et. 2011al.,

Burnside Siggbergal., et. 2010

Doornbos et. al., 2009

Nowaczyk

Abdelmoity et. al.,2012

Von der Lippe al.,2010 et.

Intellectual disability 6/12 5/11 11/49 13/15 1/1 + - 1/1 1/3 6/7 11/11 1/1

Developmental delay 7/8 4/7 33/56 13/15 - + - - 3/3 5/7 11/11 1/1

Speech delay 8/8 5/5 44/49 - 1/1 + - 1/1 2/3 1/7 9/11 -

Motor delay 8/9 5/7 20/56 - 0/1 + 1/1 - 2/3 1/7 - -

Learning difficulties - - - - - + - 1/1 - - - -

Memory impairment - - - - 1/1 ------

Attention deficit 2/9 0/7 16/49 7/12 1/1 ------

Behavioral problems - - 35/56 - 1/1 + - 1/1 - - 3/11 -

Anxiety 0/9 1/7 - - 1/1 - - - - 1/7 - -

Autism Spectrum 4/9 1/7 14/49 2/16 1/1 ------

Obsessive-Compulsive Disorder 2/9 0/7 16/49 - 1/1 ------

Hypotonia - - 11/56 - - + 1/1 - 3/3 4/7 10/11 1/1 162

Macrocephalic 0/9 1/5 - 2/16 - - - 1/1 1/3 2/7 10/11 1/1

Tall and/or broad forehead 5/9 0/7 - 1/16 - - - 1/1 2/3 7/7 9/11 1/1

Ears abnormalities 6/9 0/7 - 1/16 - - 1/1 1/1 3/3 - 7/11 1/1

Hair implant abnormalities - - - - - + - - 1/3 3/7 - -

Facial dysmorphisms 0/9 1/7 - 0/16 - + 1/1 1/1 3/3 7/7 11/11 1/1

Epicanthal folds - - - - - + - - - - 2/11 1/1

Nose dysmorphisms 0/9 2/7 - 1/16 - + - 1/1 - - 8/11 1/1

Mouth abnormalities - - - - - + - 1/1 - - 6/11 1/1

Palatal abnormalities / 4/9 0/7 - 2/16 - + ------Velopharyngeal insufficiency

Gastro-esophageal reflux - - - - - + - - 1/3 7/7 3/11 -

Difficulty feeding in childhood - - - - - + - - - 5/7 3/11 1/1

Joint and limb edema - - - - - + - - 1/3 - - -

Fingers and toes abnormalities 5/9 1/7 - 1/16 - + - 1/1 - - 4/11 -

Bone abnormalities - - - - - + - - 1/3 - - 1/1

Hyperbilirubinemia at birth - - - - - + 1/1 - 1/3 - - -

Unsteady gait ------1/1 - 1/3 - - - Data not available: -

163

Figures

Figure 1 – Patient’s face pictures, showing flat occiput, narrow forehead, up-slanting and narrow palpebral fissures (surgically corrected), epicanthal folds, nose with broad bridge and anteverted nares, malar hypoplasia, down-turned mouth, flat philtrum and oral hypotonia.

Figure 2 – CMA hybridization profile showing the concomitant deletions: an interstitial deletion of 507 kb in size at 15q11.2 region (22,770,421-23,277,436 – GRCh37/hg19) (Figure 164

2A) and another interstitial deletion of 1,022 kb in size at 19p13.3 region (3,793,904-4,816,330

– GRCh37/hg19) (Figure 2B).

Figure 3 – Comparison among sizes of 19p13.3 deletion: present case (red bar), the reported cases from literature (orange bars); SRO - Short Region Overlapping that comprises nine OMIM genes (highlighted region).

165

12. ANEXOS

12.1. Anexo I – Atuais centros participantes do PCFB

1. Serviço de Genética Médica – Depto de Genética Médica da FCM/UNICAMP

(Campinas-SP). Responsável: Profa. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes

2. Serviço de Genética do Hospital de Base/FUNFARME - FAMERP (São José do Rio

Preto-SP). Responsável: Profa. Dra. Agnes Cristina Fett Conte

3. Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Ferreira Bezerra – UFRN (Natal-RN).

Responsável: Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende

4. Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre - HCPA (Porto

Alegre-RS). Responsável: Dra. Têmis Maria Félix

5. Centrinho Prefeito Luiz Gomes (Joinville - SC). Responsável: Dra. Ana Carolina

Xavier

6. Centro de Atendimento Integral ao Fissurado Labiopalatal - CAIF (Curitiba-PR).

Responsável: Dra. Rita Tonocchi

7. Serviço de Genética do Hospital Geral César Cals – Hospital Infantil Albert Sabin

– HIAS (Fortaleza-CE). Responsável: Dra. Erlane Marques Ribeiro

8. CADEFI - Centro de Atenção aos Defeitos da Face (Recife-PE). Responsáveis: Dra.

Gabriela Ferraz e Dr. Rui Pereira

9. Serviço de Genética Médica do Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes -

HUPAA/UFAL (Maceió-AL). Responsável: Profa. Dra. Isabella Monlleó

10. Centro de Tratamento de Anomalias Craniofaciais - CETAC-PPC, UERJ (Rio de

Janeiro-RJ). Responsável: Dra. Raquel Tavares Boy da Silva

11. Serviço de Genética Perinatal – CAISM – UNICAMP (Campinas-SP). Responsável:

Profa. Dra. Denise Pontes Cavalcanti 166

12. Setor de Genética Médica, Centro de Ciências da Saúde, Núcleo de Saúde da

Criança e do Adolescente, Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas

(Maceió-AL). Reponsável: Prof. Marshall Italo Barros Fontes 167

12.2. Anexo II – Parecer do Comitê de Ética nº 059/2008

168

169

12.3. Anexo III – Parecer do Comitê de Ética nº 714/2008

170

171

12.4. Anexo IV – Parecer do Comitê de Ética nº

CAAE16525913.1.0000.5404.

172

173

174

175

176

177

178

12.5. Anexo V – Protocolo utilizado para análise dos dados de CMA

GUIA PRÁTICO PARA INTERPRETAÇÃO DE DESEQUÍLIBRIOS GENÔMICOS IDENTIFICADOS PELAS TÉCNICAS DE CHROMOSOMAL MICROARRAY ANALYSIS (CMA)

Társis Antonio Paiva Vieira Protocolo adaptado a partir de revisão da literatura (1 – 7)

Etapa 01: verificar os parâmetros de qualidade no software de análise da plataforma utilizada.  Cytoscan Affymetrix: verificar os seguintes parâmetros:  SNPQC: ≥ 15 (≥ 12*)  mapd: ≤ 0,25  wavines: ≤ 0,12 * Se os demais parâmetros forem adequados, arrays com SNPQC acima de 12 podem ser analisados. ** Se apenas um dos três parâmetros não for adequado, prosseguir a análise considerando apenas as alterações ≥ 300 Kb e reportar no relatório final uma observação descrevendo os valores dos parâmetros obtidos na reação. *** Se mais de dois parâmetros de qualidade falharem, considerar apenas alterações ≥ 1.0 Mb e reportar no relatório final uma observação descrevendo os valores dos parâmetros obtidos na reação.

Etapa 02: verificar a configuração de filtros das alterações que o programa irá mostrar: Cytoscan Affymetrix:  Selecionar o número mínimo de 50 marcadores para duplicações e de 25 marcadores para deleções. Não selecionar nenhum tamanho mínimo (em Kb) de alterações*.  Para alterações em mosaico, selecionar o número mínimo de 5.000 marcadores, tanto para deleções como para duplicações.  Para perda de heterozigose (LOH) selecionar o número mínimo de 500 marcadores e tamanho de 1.500 kb. * CNVs raras menores que 20 kb não devem ser relatadas, a não ser que incluam um gene ou parte de um gene relevante para o fenótipo do indivíduo. Essas devem ser confirmadas por outro método. 179

Etapa 03: verificar se há alterações grandes (maiores que ~ 500 Kb) em regiões de desequilíbrios genômicos recorrentes (Síndromes de deleções/ duplicações).  Se sim, verificar conforme etapa 04 e comparar os dados clínicos com os descritos na literatura (DECIPHER, OMIM, GeneReviews ou artigos de revisão). Além disso, verificar os outros desequilíbrios genômicos encontrados. Para a interpretação desses, seguir para as próximas etapas.

Etapa 04: para cada desequilíbrio genômico encontrado, verificar:

 “Confiabilidade” da alteração identificada pelo programa, principalmente para as alterações muito pequenas. Para isso, verificar:  Número de marcadores dentro da região do desequilíbrio (se a cobertura e distribuição são boas ou não);  Gráficos de Log2 Ratio e checar se “aparentemente” a alteração “realmente” existe;  Se a alteração é confirmada pelos oligonucleotídeos de SNPs.

Observação 01: não descrever alterações “não confiáveis” como patogênicas. Se a alteração for relevante (ex.: incluir gene de doença que possa explicar o fenótipo) indicar a confirmação desta, por outra técnica.

 Se a alteração já foi descrita em controles internos (grupo controle brasileiro) e no aDGV. Verificar se o tipo de alteração do controle é o mesmo do paciente. Se sim, é uma alteração frequente ou rara? Considerar frequentes as alterações encontradas em pelo menos > 1% dos indivíduos nessas bases. Alterações que também são comuns nesses grupos controle são classificadas como benignas (Classe I).

Observação 02: Deve-se levar em conta a sobreposição da região alterada com os controles. Se não houver 100% de sobreposição, verificar se há genes na região sem sobreposição. Se houver, a alteração não pode ser considerada como uma mesma alteração. Se a alteração tiver frequência ≤ 1% nos controles, seguir para a etapa 05.

Etapa 05: 180

Após essa análise inicial, selecionar as alterações que ainda não foram classificadas como patogênicas e nem benignas, copiar as coordenadas genômicas e pesquisar no UCSC Genome Browser: https://genome.ucsc.edu/

 Configurar o UCSC da seguinte maneira:  Selecionar a versão do genoma (Human assembly) adequada (de acordo com a versão do chip utilizado);  Selecionar os seguintes tracks: . Base position: full . Chrom. Band: pack . RefSeq genes: full . OMIM genes: pack . DECIPHER: pack . DGV Structural Variation: pack . Segmental Duplications: pack . SNP arrays (Affy CytoScan array) dense

 Verificar se a alteração já foi descrita no DGV. Verificar a % de sobreposição com as alterações descritas no DGV, conforme observação 01, abaixo. Se sim, é uma alteração frequente ou rara? Considerar raras as alterações encontradas em menos de 2 indivíduos encontradas em menos de dois estudos diferentes (critério estringente)6. Alterações que também são comuns no DGV (> 1%) são classificadas como benignas (Classe I).

Observação 01: Deve-se levar em conta a sobreposição da região alterada com os controles. Se não houver 100% de sobreposição, verificar se há genes na região sem sobreposição. Se houver, a alteração não pode ser considerada como uma mesma alteração. Além disso, verificar qual a plataforma utilizada nos casos descritos no DGV. As alterações descritas no DGV que foram encontradas apenas em arrays de BAC não podem ser consideradas.

 Verificar se a alteração já foi descrita em bases de dados clínicos (DECIPHER e ClinGen). Se sim, verificar se no paciente da base de dados foram encontradas outras alterações e como foram classificadas (se patogênicas ou não). Quando possível, comparar o fenótipo. Comparar preferencialmente com as alterações de tamanho igual ou menor.

181

 Verificar a presença de genes OMIM dentro da região. Verificar se a alteração inclui éxons. Iniciar a investigação pelos genes comprovadamente relacionados à doença (marcados em verde escuro). Quando houver, verificar o padrão de herança da doença e o mecanismo patogênico da mutação (ganho ou perda de função) para correlacionar com o tipo de alteração encontrada (duplicação ou deleção) e verificar se os sinais clínicos são compatíveis.

 Alterações que não foram encontradas em controles (interno, aDGV e DGV) e que não foram encontradas anteriormente em outros pacientes com quadro clínico semelhante devem ser classificadas como: variante de significado incerto.

Após essa análise, as alterações devem ser classificadas em cinco diferentes classes, seguindo as recomendações abaixo3,6:  Classe I – Benignas: variantes comuns encontradas em mais de 1% da população geral.  Classe II – Provavelmente benignas: variantes raras, que não possuem genes em sua extensão, ou ainda que compreendem apenas regiões íntrônicas.  Classe III – Variante de significado clínico incerto (VOUS): variantes raras, que não foram encontradas em controles (interno, aDGV e DGV) e que não foram encontradas anteriormente em outros pacientes com quadro clínico semelhante. Podem ser “de novo” ou herdadas. Incluem éxons de genes sem função definida, não relacionados a doenças ou não sensíveis a dosagem, e que não tem significado clínico conhecido.  Classe IV – Provavelmente patogênicas: variantes raras, que não foram encontradas em controles (interno, aDGV e DGV), com pontos de quebra que se sobrepõe parcialmente aos de outros indivíduos com fenótipo anormal, portadores do mesmo desequilíbrio, porém o gene ou região crítica ainda não foram identificados; variantes descritas previamente em apenas um indivíduo com o fenótipo similar; variantes que incluem éxons de genes comprovadamente relacionados a doenças e aos sinais clínicos do indivíduo em avaliação, e possuem padrão de herança compatível com o número de cópias e consequências patogênicas da mutação – ganho ou perda de função.  Classe V – Patogênicas: variantes documentadas e bem estabelecidas na literatura, como as síndromes de deleção e duplicação; descritas em dois ou mais casos registrados nos bancos de dados de indivíduos com descrições fenotípicas similares, correlação evidente entre o desequilíbrio genômico e o fenótipo do indivíduo em investigação.

182

Etapa 06: verificar se há regiões de homozigose grandes:  Para o chip Cytoscan HD  selecionar as regiões de perda de heterozigose (LOH) maiores que 03 Mb, para análise complementar.  Para o chip Cytoscan 750K  selecionar as regiões de perda de heterozigose (LOH) maiores que 05 Mb, para análise complementar.  Comparar com os controles utilizando os mesmos parâmetros utilizados para CNVs. Liberar no relatório final (laudo) apenas LOHs maiores que 10 Mb, ou quando houver mais que 1% de regiões de homozigose no genoma autossômico, conforme cálculo abaixo.  No relatório final, quando uma única LOH maior que 10 Mb for encontrada, descrevê-la conforme ISCN 2016. Quando forem encontradas múltiplas LOHs, descrever apenas a porcentagem que foi encontrada no genoma autossômico. Porém, não liberar como alterações patogênicas. Essas ainda necessitam ser mais bem investigadas.

Cálculo da porcentagem de regiões de homozigose (ROH):

% homozigose no genoma autossômico = soma dos segmentos com ROH nos autossomos ÷ genoma autossômico total (3.020 Mb) × 100%.

 As ROH ou LOH são classificadas conforme recomendações abaixo. Apenas as classes II e III são relatadas5.  Classe I – Consanguinidade: que são múltiplas regiões de homozigose, em geral maiores que 10 Mb, e que são encontradas em múltiplos cromossomos (a soma ultrapassa 1% do genoma autossômico).  Classe II – LOHs causadas provavelmente por dissomia uniparental total ou segmentar: uma ou mais regiões de homozigose, maiores que 10 Mb, encontradas em um único cromossomo.

Etapa 07: verificar se há alterações em mosaico:  Se houver alguma alteração em mosaico: verificar todos os parâmetros das etapas 04 e 05 deste protocolo.

183

Referências Bibliográficas: 1. Gijsbers AC, Schoumans J, Ruivenkamp CA. Interpretation of array comparative genome hybridization data: a major challenge. Cytogenet Genome Res. 2011;135(3-4):222-7. 2. de Leeuw N, Hehir-Kwa JY, Simons A, Geurts van Kessel A, Smeets DF, Faas BH, Pfundt R. SNP array analysis in constitutional and cancer genome diagnostics--copy number variants, genotyping and quality control. Cytogenet Genome Res. 2011;135(3-4):212-21. 3. Kearney HM, Thorland EC, Brown KK, Quintero-Rivera F, South ST; Working Group of the American College of Medical Genetics Laboratory Quality Assurance Committee. American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants. Genet Med. 2011;13(7):680-5. 4. Kearney, HM, Kearney, JB and Conlin, LK. Diagnostic implications of excessive homozygosity detected by SNP-based microarrays: consanguinity, uniparental disomy, and recessive single-gene mutations. Clin Lab Med. 2011;31:595-613. 5. de Leeuw N, Dijkhuizen T, Hehir-Kwa JY, Carter NP, Feuk L, Firth HV, et al. Diagnostic interpretation of array data using public databases and internet sources. Hum Mutat. 2012;33(6):930-40. 6. Vermeesch JR, Brady PD, Sanlaville D, Kok K, Hastings RJ. Genome-wide arrays: quality criteria and platforms to be used in routine diagnostics. Hum Mutat. 2012;33(6):906-15. 7. Hehir-Kwa JY, Pfundt R, Veltman JA, de Leeuw N. Pathogenic or not? Assessing the clinical relevance of copy number variants. Clin Genet. 2013;84(5):415-21. 8. Zarrei M, MacDonald JR, Merico D, Scherer SW. A copy number variation map of the human genome. Nat Rev Genet. 2015;16(3):172-83. 184

12.6. Anexo VI – Dados do setor de análise estatística

De: Serviço de Estatística – Câmara de Pesquisa – FCM – Unicamp. Para: Ilária Cristina Sgardioli / Profª Vera Lopes - Genética Médica Data: 24 de abril de 2018.

Investigação da síndrome de deleção 22q1.2 por diferentes técnicas para aplicação em saúde

OBJETIVOS:

1. Relacionar critérios (geral; subgrupos; critério que definiu) com a deleção;; 2. Avaliar fatores que discriminam a deleção.

METODOLOGIA ESTATÍSTICA:

Para descrever o perfil da amostra segundo as variáveis em estudo foram feitas tabelas de frequência das variáveis categóricas com valores de frequência absoluta (n) e percentual (%).

Para avaliação da relação entre as variáveis categóricas foi utilizado o teste Qui-quadrado e, quando necessário, o teste exato de Fisher.

Para avaliação dos fatores que discriminam a deleção foi utilizada a análise de regressão logística.

O nível de significância adotado para o estudo foi de 5%.

185

RESULTADOS:

 Período: 1

QUADRO 01. Frequências Deleção Freq. % Critérios Freq. % Coluna crit Freq % TemA Freq % ------Não 123 73.21 Não 72 42.86 0 72 42.86 0 153 91.07 Sim 45 26.79 Sim 96 57.14 1 15 8.93 1 15 8.93 2 34 20.24 3 5 2.98 4 42 25.00

TemB Freq % TemC Freq % TemD Freq % TemE Freq % ------0 168 100.00 0 146 86.90 0 74 44.05 0 165 98.21 1 22 13.10 1 94 55.95 1 3 1.79

TemF Freq % TemG Freq % TemH Freq % TemI Freq % ------0 140 83.33 0 163 97.02 0 90 53.57 0 163 97.02 1 28 16.67 1 5 2.98 1 78 46.43 1 5 2.98

TemJ Freq % TemK Freq % TemL Freq % TemM Freq % ------0 70 41.67 0 117 69.64 0 131 77.98 0 161 95.83 1 98 58.33 1 51 30.36 1 37 22.02 1 7 4.17

TemN Freq % ------0 162 96.43 1 6 3.57

QUADRO 02. Critérios x deleção (teste Qui-quadrado/*teste exato de Fisher) Criterios Delecao TemA Delecao TemC Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Não | 58 | 14 | 72 0 | 113 | 40 | 153 0 | 103 | 43 | 146 | 47.15 | 31.11 | | 91.87 | 88.89 | | 83.74 | 95.56 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Sim | 65 | 31 | 96 1 | 10 | 5 | 15 1 | 20 | 2 | 22 | 52.85 | 68.89 | | 8.13 | 11.11 | | 16.26 | 4.44 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 123 45 168 Total 123 45 168 Total 123 45 168

P-valor: 0.0628 P-valor: *0.5495 P-valor: 0.0444

TemD Delecao TemE Delecao TemF Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 60 | 14 | 74 0 | 121 | 44 | 165 0 | 105 | 35 | 140 | 48.78 | 31.11 | | 98.37 | 97.78 | | 85.37 | 77.78 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 63 | 31 | 94 1 | 2 | 1 | 3 1 | 18 | 10 | 28 | 51.22 | 68.89 | | 1.63 | 2.22 | | 14.63 | 22.22 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 123 45 168 Total 123 45 168 Total 123 45 168

P-valor: 0.0411 P-valor: *1.0000 P-valor: 0.2425

TemG Delecao TemH Delecao TemI Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 119 | 44 | 163 0 | 74 | 16 | 90 0 | 120 | 43 | 163 | 96.75 | 97.78 | | 60.16 | 35.56 | | 97.56 | 95.56 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 4 | 1 | 5 1 | 49 | 29 | 78 1 | 3 | 2 | 5 | 3.25 | 2.22 | | 39.84 | 64.44 | | 2.44 | 4.44 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 123 45 168 Total 123 45 168 Total 123 45 168

P-valor: *1.0000 P-valor: 0.0046 P-valor: *0.6110

TemJ Delecao TemK Delecao TemL Delecao 186

Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 50 | 20 | 70 0 | 91 | 26 | 117 0 | 101 | 30 | 131 | 40.65 | 44.44 | | 73.98 | 57.78 | | 82.11 | 66.67 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 73 | 25 | 98 1 | 32 | 19 | 51 1 | 22 | 15 | 37 | 59.35 | 55.56 | | 26.02 | 42.22 | | 17.89 | 33.33 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 123 45 168 Total 123 45 168 Total 123 45 168

P-valor: 0.6587 P-valor: 0.0431 P-valor: 0.0324 TemM Delecao TemN Delecao Colun crit Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 119 | 42 | 161 0 | 118 | 44 | 162 0 | 58 | 14 | 72 | 96.75 | 93.33 | | 95.93 | 97.78 | | 47.15 | 31.11 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 4 | 3 | 7 1 | 5 | 1 | 6 1 | 10 | 5 | 15 | 3.25 | 6.67 | | 4.07 | 2.22 | | 8.13 | 11.11 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 123 45 168 Total 123 45 168 2 | 24 | 10 | 34 | 19.51 | 22.22 | P-valor: *0.3864 P-valor: *1.0000 ------+------+------+ 3 | 3 | 2 | 5 | 2.44 | 4.44 | ------+------+------+ 4 | 28 | 14 | 42 | 22.76 | 31.11 | ------+------+------+ Total 123 45 168

P-valor: *0.3534

QUADRO 03. Fatores para discriminação da deleção (regressão logística) ANÁLISE UNIVARIADA:

VARIÁVEL n categoria p-valor OR* IC95% Criterios 168 S x N 0.0651 1.976 0.958-4.074 Colun crit 168 1 x 0 0.4463 2.071 0.610-7.030 2 x 0 1.726 0.674-4.422 3 x 0 2.752 0.421-18.136 4 x 0 2.071 0.870-4.921 TemA 168 1 x 0 0.5499 1.413 0.455-4.384 TemC 168 1 x 0 0.0613 0.240 0.054-1.070 TemD 168 1 x 0 0.0432 2.109 1.023-4.347 TemE 168 1 x 0 0.7968 1.375 0.122-15.543 TemF 168 1 x 0 0.2455 1.667 0.704-3.949 TemG 168 1 x 0 0.7297 0.676 0.074-6.216 TemH 168 1 x 0 0.0054 2.737 1.347-5.563 TemI 168 1 x 0 0.5041 1.861 0.301-11.519 TemJ 168 1 x 0 0.6588 0.856 0.430-1.706 TemK 168 1 x 0 0.0452 2.078 1.016-4.251 TemL 168 1 x 0 0.0350 2.295 1.060-4.970 TemM 168 1 x 0 0.3363 2.126 0.457-9.895 TemN 168 1 x 0 0.5795 0.526 0.061-4.720

ANÁLISE MULTIVARIADA: critério de seleção stepwise.

VARIÁVEL categoria p-valor OR* IC95% TemH 1 x 0 0.0047 2.837 1.277-5.844 TemL 1 x 0 0.0298 2.426 1.091-5.396

*OR - razão de chances (odds ratio) para deleção; IC95% - intervalo de confiança da razão. Deleção - sim: n=45; não: n=123.

187

 Período: 2

QUADRO 04. Frequencias Delecao Freq % criterios Freq % Colun crit Freq % TemA Freq % ------Não 126 70.39 Não 80 44.69 0 80 44.69 0 170 94.97 Sim 53 29.61 Sim 99 55.31 1 10 5.59 1 9 5.03 2 24 12.41 3 6 3.35 4 59 32.96

TemB Freq % TemC Freq % TemD Freq % TemE Freq % ------0 178 99.44 0 157 87.71 0 78 43.58 0 168 93.85 1 1 0.56 1 22 12.29 1 101 56.42 1 11 6.15

TemF Freq % TemG Freq % TemH Freq % TemI Freq % ------0 157 87.71 0 179 100.00 0 103 57.54 0 176 97.02 1 22 12.29 1 76 42.46 1 3 2.98

TemJ Freq % TemK Freq % TemL Freq % TemM Freq % ------0 85 47.49 0 113 63.13 0 113 63.13 0 171 95.53 1 94 52.51 1 66 36.87 1 66 36.87 1 8 4.47

TemN Freq % ------0 168 93.85 1 11 6.15

QUADRO 05. Critérios x deleção (teste Qui-quadrado/*teste exato de Fisher) Criterios Delecao TemA Delecao TemC Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Não | 69 | 11 | 80 0 | 122 | 48 | 170 0 | 111 | 46 | 157 | 54.76 | 20.75 | | 96.83 | 90.57 | | 88.10 | 86.79 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Sim | 57 | 42 | 99 1 | 4 | 5 | 9 1 | 15 | 7 | 22 | 45.24 | 79.25 | | 3.17 | 9.43 | | 11.90 | 13.21 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 126 53 179 Total 126 53 179 Total 126 53 179

P-valor: <.0001 P-valor: *0.1274 P-valor: 0.8085

TemD Delecao TemE Delecao TemF Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 61 | 17 | 78 0 | 118 | 50 | 168 0 | 113 | 44 | 157 | 48.41 | 32.08 | | 93.65 | 94.34 | | 89.68 | 83.02 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 65 | 36 | 101 1 | 8 | 3 | 11 1 | 13 | 9 | 22 | 51.59 | 67.92 | | 6.35 | 5.66 | | 10.32 | 16.98 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 126 53 179 Total 126 53 179 Total 126 53 179

P-valor: 0.0442 P-valor: *1.0000 P-valor: 0.2151

TemH Delecao TemI Delecao TemJ Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 78 | 25 | 103 0 | 124 | 52 | 176 0 | 65 | 20 | 85 | 61.90 | 47.17 | | 98.41 | 98.11 | | 51.59 | 37.74 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 48 | 28 | 76 1 | 2 | 1 | 3 1 | 61 | 33 | 94 | 38.10 | 52.83 | | 1.59 | 1.89 | | 48.41 | 62.26 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 126 53 179 Total 126 53 179 Total 126 53 179

P-valor: 0.0686 P-valor: *1.0000 P-valor: 0.0902

TemK Delecao TemL Delecao TemM Delecao Frequency| Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 92 | 21 | 113 0 | 82 | 31 | 113 0 | 119 | 52 | 171 188

| 73.02 | 39.62 | | 65.08 | 58.49 | | 94.44 | 98.11 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 34 | 32 | 66 1 | 44 | 22 | 66 1 | 7 | 1 | 8 | 26.98 | 60.38 | | 34.92 | 41.51 | | 5.56 | 1.89 | ------+------+------+ ------+------+------+ ------+------+------+ Total 126 53 179 Total 126 53 179 Total 126 53 179

P-valor: <.0001 P-valor: 0.4042 P-valor: *0.4392

TemN Delecao Colun crit Delecao Frequency| Frequency| Col Pct | Não | Sim | Total Col Pct | Não | Sim | Total ------+------+------+ ------+------+------+ 0 | 116 | 52 | 168 0 | 69 | 11 | 80 | 92.06 | 98.11 | | 54.76 | 20.75 | ------+------+------+ ------+------+------+ 1 | 10 | 1 | 11 1 | 5 | 5 | 10 | 7.94 | 1.89 | | 3.97 | 9.43 | ------+------+------+ ------+------+------+ Total 126 53 179 2 | 15 | 9 | 24 | 11.90 | 16.98 | P-valor: *0.1781 ------+------+------+ 3 | 4 | 2 | 6 | 3.17 | 3.77 | ------+------+------+ 4 | 33 | 26 | 59 | 26.19 | 49.06 | ------+------+------+ Total 126 53 179

P-valor: *0.0004

QUADRO 06. Fatores para discriminação da deleção (regressão logística) ANÁLISE UNIVARIADA:

VARIÁVEL n categoria p-valor OR* IC95% Criterios 179 S x N <.0001 4.622 2.181-9.792 Colun crit 179 1 x 0 0.0022 6.272 1.557-25.267 2 x 0 3.763 1.326-10.679 3 x 0 3.128 0.512-19.215 4 x 0 4.942 2.181-11.197 TemA 179 1 x 0 0.0949 3.177 0.818-12.336 TemC 179 1 x 0 0.9086 1.126 0.431-2.943 TemD 179 1 x 0 0.0459 1.987 1.013-3.901 TemE 179 1 x 0 0.8610 0.885 0.225-3.474 TemF 179 1 x 0 0.2193 1.778 0.710-4.455 TemH 179 1 x 0 0.0702 1.820 0.952-3.480 TemI 179 1 x 0 0.8868 1.192 0.106-13.438 TemJ 179 1 x 0 0.0919 1.758 0.912-3.388 TemK 179 1 x 0 <.0001 4.123 2.096-8.111 TemL 179 1 x 0 0.4048 1.323 0.685-2.553 TemM 179 1 x 0 0.3015 0.327 0.028-2.725 TemN 179 1 x 0 0.1578 0.223 0.028-1.788

ANÁLISE MULTIVARIADA: critério de seleção stepwise.

VARIÁVEL categoria p-valor OR* IC95% TemA 1 x 0 0.0172 5.673 1.360-23.664 TemK 1 x 0 <.0001 4.821 2.377-9.778

*OR - razão de chances (odds ratio) para deleção; IC95% - intervalo de confiança da razão. Deleção - sim: n=53; não: n=126.

189

REFERÊNCIAS:

 Fleiss, J.L. (1981). Statistical Methods for Rates and Proportions.2ª ed. John Wiley & Sons Inc. Nova Iorque.  Hosmer, D.W. e Lemeshow, S. (1989). Applied Logistic Regression. John Wiley & Sons Inc. Nova Iorque.

PROGRAMA COMPUTACIONAL:

Para análise estatística foram utilizados os seguintes programas computacionais:

The SAS System for Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4. SAS Institute Inc, 2002-2008, Cary, NC, USA. 190

12.7. Anexo VII – Autorizações para inclusão dos dois artigos

publicados e do artigo aceito para publicação 191

192