Baltymų, Išskirtų Iš Vaistinių Ožiarūčių (Galega Officinalis L.) Šaknų, Kiekinis Nustatymas Ir Kapsulių Su Baltymais Gamyba

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

LINAS MALINOVAS Baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais gamyba

Magistro baigiamasis darbas Vientisųjų studijų programa „Farmacija“, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis „Farmacija“

Darbo vadovė: Prof. dr. Nijolė Savickienė

Darbo konsultantai: Prof. habil. dr. Arūnas Savickas Prof. dr. Ona Ragažinskienė

KAUNAS, 2021

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data:

Baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais gamyba

Magistro baigiamasis darbas Vientisųjų studijų programa „Farmacija“, valstybinis kodas 6011GX003 Studijų kryptis „Farmacija“

Darbo konsultantai: Darbo vadovė: Prof. habil. dr. Arūnas Savickas Prof. dr. Nijolė Savickienė Prof. dr. Ona Ragažinskienė

Recenzentas: Darbą atliko: Data: Magistrantas: Linas Malinovas

KAUNAS, 2021

TURINYS

TYRIMO SANTRAUKA ...... 5 SUMMARY ...... 8 PADĖKA ...... 11 SANTRUMPOS ...... 12 SĄVOKOS ...... 13 ĮVADAS ...... 14 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...... 15 1. Literatūros apžvalga ...... 16 1.1. Galega officinalis L. charakteristika bei paplitimas ...... 16 1.2. Galega officinalis L. augalinės žaliavos cheminė sudėtis bei farmakologinės savybės ...... 17 1.3. Augalų baltymai ir jų funkcijos ...... 18 1.4. Baltymų išskyrimo iš vaistinės augalinės žaliavos ir baltymų išskirstymo metodai ...... 19 1.4.1. Baltymų išskirstymo metodas - gelchromatografija ...... 20 1.4.2. Baltymų išskirstymas afininės chromatografijos metodu ...... 21 1.4.3. Baltymų išskirstymas jonų mainų chromatografijos metodu ...... 22 1.4.4. Baltymų atskyrimo ir gryninimo metodas – hidrofobinės sąveikos chromatografija .. 22 1.5. Baltymų kiekinė – kokybinė analizė masių spektrometrijos metodu ...... 23 1.6. Baltymų kiekinis nustatymas ...... 23 1.6.1. Bradford metodas ...... 24 1.6.2. Biureto metodas ...... 24 1.6.3. Lowry metodas ...... 25 1.6.4. Bicinchonino rūgšties (BCR) metodas...... 25 1.7. Baltymų technologinis funkcionalizavimas ...... 26 1.8. Kietosios kapsulės ...... 26 1.9. Kietųjų kapsulių gamyba ...... 28 1.10. Kietųjų kapsulių kokybės testai ...... 28 2. TYRIMO METODIKA ...... 30 2.1. Tyrimo objektas ...... 30 2.2. Tyrimo reagentai ...... 30 2.3. Įranga ...... 31 2.4. Tyrimo metodai ...... 31 2.4.1 Baltymų išskyrimas iš Galega officinalis L. augalinės žaliavos – šaknų ...... 31

2.4.2 Baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. augalinės žaliavos – šaknų, kiekinis nustatymas Bradford metodu ...... 32 2.4.3 Baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. augalinės žaliavos – šaknų, mėginių liofilizacija ...... 33 2.5. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Galega officinalis L. šaknų, gamyba ...... 35 2.6. Kietųjų kapsulių užpildo miltelių Carr indekso ir Hausner koeficiento nustatymas ...... 36 2.7. Kietųjų kapsulių užpildymas ...... 37 2.8. Kietųjų kapsulių masės vienodumo nustatymas ...... 38 2.9. Kietųjų kapsulių tirpimo testas ...... 38 2.10. Statistinė duomenų analizė ...... 39 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...... 40 3.1. Baltymų, išskyrimas iš Galega officinalis (L.) šaknų bei išskirtų baltymų ekstraktų kiekinė analizė ...... 40 3.2. Kietųju kapsulių užpildo miltelių technologinių savybių vertinimas ...... 41 3.3. Kietųjų kapsulių su baltymais gamyba ir masės vienodumo nustatymas ...... 44 3.4. Kietųjų kapsulių tirpimo testas ...... 44 IŠVADOS ...... 46 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...... 47 LITERATŪROS SĄRAŠAS ...... 48 PRIEDAI ...... 53

TYRIMO SANTRAUKA

Lino Malinovo magistro baigiamasis darbas: “Baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, kiekinis nustatymas ir kapsulių su baltymais gamyba. Mokslinio darbo vadovė: prof. dr. N. Savickienė1. Konsultantai: prof. habil. dr. Arūnas Savickas2, prof. dr. Ona Ragažinskienė3. Kaunas, 2021. 1 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. 2 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. 3 Vytauto Didžiojo universiteto, Kauno botanikos sodo, Vaistinių ir prieskoninių augalų skyrius. Tikslas: Nustatyti baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, kiekį skirtingais augalų vegetacijos (intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo, sėklų brandos) laikotarpiais bei pagaminti kietąsias kapsules su išskirtų baltymų ekstraktais. Uždaviniai: 1. Iš vaistinių ožiarūčių augalinės žaliavos – šaknų, išskirti baltymus skirtingais augalų vegetacijos periodais ((intensyvaus augimo (A3), butonizacijos (B), intensyvaus žydėjimo (Ž2) ir sėklų brandos (V2)). 2. Nustatyti baltymų kiekį išskirtuose baltymų ekstraktuose. 3. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. šaknų, liofilizuotais ekstraktais. 4. Atlikti kietųjų kapsulių kokybės nustatymo testus.

Tyrimo objektas: vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknys, surinktos Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus kolekcijoje, skirtingais augalo vegetacijos periodais ((intensyvaus augimo (A3), butonizacijos (B), intensyvaus žydėjimo (Ž2) ir sėklų brandos (V2)). Tyrimo metodai: baltymų ekstrakcija iš šviežios augalinės žaliavos (šaknų), naudojant buferinį tirpalą PBS 0,01M, kurio pH = 7,2, paruoštą iš Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl ir dejonizuoto vandens; baltymų išsodinimas amonio sulfatu (AS); baltymų resuspendavimo metodas, naudojant 10 kartų skiestą buferinį tirpalą PBS, baltymų kiekinis nustatymas Bradford metodu; baltymų ekstraktų, išskirtų iš augalinės žaliavos – šaknų, liofilizavimas; kietųjų kapsulių su liofilizuotais baltymų ekstraktais gamyba: baltymų ekstrakto liofilizuotų miltelių technologinių savybių (birumo, suberiamojo

6 tankio, išbyrėjusių miltelių kūgio kampo) vertinimas; kietųjų kapsulių kokybės kontrolės testai: masės vienodumo testas, baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių, kiekio tyrimas. Gauti tyrimų rezultatai apdoroti, naudojant duomenų analizės programą Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, JAV).

Rezultatai: 1. Nustatytas baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. šaknų, surinktų skirtingais augalų vegetacijos laikotarpiais, kiekis baltymų ekstraktų mėginiuose: intensyvaus augimo – 1,19 ± 0,03 mg/ml, butonizacijos – 1,200 ± 0,021 mg/ml, intensyvaus žydėjimo – 1,250 ± 0,017 mg/ml ir sėklų brandos - 1,310 ± 0,025 mg/ml. 2. Atlikus išskirtų baltymų ekstraktų mėginių liofilizavimą, pakartotinai nustatytas baltymų kiekis mėginiuose skirtingais augalo vegetacijos periodais – intensyvaus augimo 2,090 ± 0,021 mg/g, butonizacijos – 2,370 ± 0,019 mg/g, intensyvaus žydėjimo – 3,480 ± 0,023 mg/g ir sėklų brandos - 5,380 ± 0,019 mg/g. 3. Parinkta kapsuliavimui tinkanti mišinio sudėtis: 35% liofillizuotų baltymų miltelių ir 65% pagalbinių medžiagų (polivinilpirolidono – 20%, Prosolv® - 79%, magnio stearato – 1%). 4. Atlikus kietųjų kapsulių su baltymais tirpimo testą, nustatytas išsiskyrusių baltymų kiekis po 45 min. rūgštinėje terpėje – 0,147 ± 0.022 mg (92,05%), šarminėje terpėje – 0,120 ± 0.013 mg (75,1%). Atlikus kietųjų kapsulių masės vienodumo testą, nustatyta vidutinė kapsulės masė – 0,2900 ± 0,0018 g.

Išvados: 1. Išskirti baltymų ekstraktai iš vaistinių ožiarūčių šaknų, surinktų skirtingais augalų vegetacijos laikotarpiais: intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo ir sėklų brandos, pritaikius išskyrimui baltymų išsodinimo amonio sulfatu metodą. 2. Atlikus baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių šaknų, ekstraktų kiekinį nustatymą skirtingais augalo vegetacijos periodais, nustatyta, jog daugiausia baltymų (1,310 ± 0.025 mg/ml) šaknys sukaupia sėklų brandos fazėje. Taip pat nustatyta, jog baltymų kiekis šaknyse didėjo, keičiantis augalo vegetacijos fazei tokia tvarka: intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo ir sėklų brandos. 3. Atlikus kietųjų kapsulių miltelių užpildo technologinių savybių (birumo, kūgio kampo, Carr indekso, Hausner koeficiento) vertinimą, nustatyta, jog užpildas kurio sudėtis: 35% liofilizuotų

baltymų ekstrakto miltelių ir 65% pagalbinių medžiagų mišinio (20% polivinilpirolidono, 79% Prosolv, 1% magnio stearato) buvo tinkamas kietųjų kapsulių gamybai. 4. Atlikus kietųjų kapsulių su liofilizuotų baltymų ekstraktų masės vienodumo testą, kapsulių tirpimo testą, įvertinta, kad kietosios kapsulės pagamintos tinkamai (atitiko Europos farmakopėjos reikalavimus).

SUMMARY

Master thesis of Linas: Quantification of proteins isolated from the raw material of Goats Rue (Galega Officinalis (L.)) roots and production of protein hard capsules. Supervisor of the research paper: prof. dr. N. Savickiene1. Consultants: prof. habil. dr. Arunas Savickas2, prof. dr. Ona Ragazinskiene3. Kaunas, 2021. 1 Department of Pharmacognosy, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy. 2 Department of Pharmaceutical Technology and Social Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy. 3 Department of Vytautas Magnus University, Kaunas Botanical Garden, Medicinal and Spice Plants. The aim: To determine the quantitative composition of proteins isolated from the raw material of Goat‘s Rue (Galega officinalis L.) root’s, during different periods of plant vegetation (intensive growth, butonization, intensive flowering, seed formation and seed maturity) and to produce hard capsules with isolated protein extracts. Objectives: 1. From the raw plant material - roots of Goat‘s Rue, extract proteins in different vegetation periods ((intensive growth (A3), butonization (B), intensive flowering (Ž2) and seed maturity (V2)). 2. Determine the quantitative composition of proteins isolated from Goat‘s Rue. 3. To produce hard capsules with proteins isolated from the medicinal raw material roots of Galega officinalis L. 4. Perform protein release analysis from hard capsules.

Research Object: Roots of Goat’s Rue (Galega Officinalis L.) collected in the collection of Medicinal and Spice Plants Department of Kaunas Botanical Garden (Vytautas Magnus University KBS), Vytautas Magnus University, in different periods of plant vegetation (intensive growth (A3), butonization (B), intensive flowering (Ž2) and seed maturity (V2)). Research methods: protein extraction from fresh plant raw material (roots) using a buffer solution of 0.01 M in PBS, pH = 7.2, prepared from Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaCl and deionized water; protein precipitation with ammonium sulfate (AS); protein resuspension method using 10-fold diluted buffer in PBS, protein quantification by the Bradford method; lyophilization of proteins isolated from

9 plant raw materials - roots; production of hard capsules with proteins: evaluation of technological properties of protein lyophilized powder (bulk, bulk density, cone angle of spilled powder); quality control tests for hard capsules: mass uniformity test, examination of the amount of protein released from hard capsules. The obtained research results were processed using data analysis program Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, USA).

Results: 1. The content of proteins isolated from the roots of Galega officinalis L. collected at different periods of plant vegetation was determined in samples of protein extracts: 1.19 ± 0.03 mg / ml for intensive growth, 1.200 ± 0.021 mg / ml for butonization, and for intensive flowering. 1,250 ± 0,017 mg / ml and seed maturity 1,310 ± 0,025 mg / ml. 2. 2. After lyophilization of the extracted protein extracts samples, the protein content in the samples was repeatedly determined during different vegetation periods of the plant - 2.090 ± 0.021 mg / g of intensive growth, 2.370 ± 0.019 mg / g of butonization, 3.480 ± 0.023 mg / g of intensive flowering and seed maturity - 5.380 ± 0.019 mg / g. 3. 3. Selected composition of the mixture suitable for encapsulation: 35% lyophilized protein powder and 65% excipients (polyvinylpyrolidone - 20%, Prosolv® - 79%, magnesium stearate - 1%). 4. After the protein release from the hard capsules, the amount of released protein was determined after 45 minutes. In acidic environment - 0,147 ± 0.022 mg (92,05%), in alkaline environment - 0,12 ± 0.013 mg (75,1%). The average capsule weight of the hard capsules was determined to be 0.22900 ± 0.0018 g.

Conclusions: 1. Isolated protein extracts from Goat’s rue roots collected during different vegetation periods of plants: intensive growth, butonization, intensive flowering and seed maturity, applying the method of protein precipitation with ammonium sulphate. 2. Quantification of protein extracts from Goat’s rue roots during different vegetation periods of the plant showed that most of the protein (1.310 ± 0.025 mg / ml) accumulates in the seeds during the seed maturity phase. It was also found that the amount of protein in the roots increased with the change of the vegetation phase of the plant in the following order: intensive growth, butonization, intensive flowering and seed maturity.

3. The evaluation of the technological properties of the hard capsule powder filler (flow, cone angle, Carr index, Hausner coefficient) revealed that the filler composition: 35% lyophilized protein extract powder and 65% excipient mixture (20% polyvinylpyrrolidone, 79% Prosolv, 1% magnesium stearate) was suitable for the production of hard capsules. 4. The mass uniformity test for hard capsules with lyophilized protein extracts, the capsule dissolution test, assessed that the hard capsules were properly produced (complied with the requirements of the European Pharmacopoeia).

PADĖKA

Labai dėkoju magistrinio darbo vadovei prof. dr. Nijolei Savickienei už išskirtinę kantrybę, atskingą bei pamokantį požiūrį, konsultacijas ir visapusišką pagalba rengiant baigiamąjį magistrinį darbą. Dėkoju konsultantamas prof. habil. dr. Arūnui Savickui bei prof. dr. Onai Ragažinskienei už vertingas konsultacijas, idėjas magistrinio darbo metu. Taip pat išskirtinai norėčiau padėkoti dr. Gabrielei Balčiūnaitei už konsultacijas bei pagalbą atliekant tyrimus. Taip pat dr. Modestui Žiliui bei dr. Agnei Mazurkevičiūtei, padėjusiems atlikti reikiamus tyrimus.

SANTRUMPOS

PBS – Fosfatinis buferinis tirpalas BSA – Jaučio serumo albuminas AS – Amonio sulfatas TRIS - Tris(hidroksimetil)aminometanas MS – Masių spektrometrija MS / MS – Tandeminė masių spektrometrija Eur. Ph. - Europos farmakopėja PEI - Polymin P (Polietilenaminas) ITIS ̶ Taksonominės informacijos tinklo duomenų bazė HIC – Hidrofobinės sąveikos chromatografija A3, B, Ž2, V2 – augalo vegetacijos fazės: intensyvus augimas (A3), butonizacija (B), intensyvus žydėjimas (Ž2) ir sėklų branda (V2) DEAE – Dietilaminoetilceliuliozė

SĄVOKOS

Ligandas – molekulė ar jonas kompleksiniame junginyje susijungęs koordinaciniu ryšiu su centriniu atomu Eliucija – medžiagos išplovimas iš chromatografinės kolonos Supernatantas – po centrifugavimo virš nuosėdų susidaręs skystis

ĮVADAS

Šiuolaikinės mitybos rekomendacijos skatina augalinių produktų vartojimą. Atkreipiamas dėmesys ir į augalinės kilmės baltymus, siekiant sumažinti ar iš dalies pakeisti gyvūninės kilmės baltymų vartojimą. Augalinės kilmės baltymų vartojimas mažina kraujo lipidų koncentraciją, nutukimą, kraujospūdį. Taip pat nustatyta, jog dietos, kurios yra praturtintos augalinės kilmės baltymais, turi įtakos ilgesnei gyvenimo trukmei. Ankštinių (Fabaceae) šeimos augalai sintetina daugybę antrinių metabolitų, kurie pasitarnauja kaip apsauginiai junginiai nuo patogenų ir žolėdžių gyvūnų bei kaip signaliniai junginiai, kurie pritraukia apdulkinančius ir vaisius bei sėklas platinančius gyvūnus. Šios šeimos augalai kaupia antrinius metabolitus: alkaloidus, flavonoidus, aminus, terpenoidus ir kitus junginius. Yra nustatyta, kad dėl ankštinių augalų šaknų gumbeliuose esančių azotą fiksuojančių bakterijų, Fabaceae šeimos augalai pasižymi didele koncentracija kaupiamų pirminių metabolitų – baltymų. Ankštinių (Fabaceae) augalų sėklos, turinčios 20–45% baltymų, yra puikus geros kokybės baltymų, turinčių nepakeičiamos amino rūgšties – lizino ir pakeičiamųjų amino rūgščių – glutamino ir asparagino, šaltinis. Taip pat nustatyta, jog vartojant Fabaceae augaluose esančius baltymus, yra mažinama lipoproteinų, sukeliančių koronarinių širdies ligų vystymąsi, koncentracija. Pastebėta, jog sėklose esančių peptidų ir bioaktyvių junginių deriniai pasižymi, antimikrobiniu, antitromboziniu bei kraujospūdį ir cholesterolio kiekį mažinančiu poveikiu [46;47]. Remiantis literatūros šaltiniais, ankštinių šeimos sėklos, ne tik kaupia baltymus, todėl racionalu ištirti Fabaceae šeimos augalų skirtingos žaliavos baltymų kiekinę sudėtį. Vaistinių ožiarūčių augalinė žaliava – šaknys, perspektyvi farmakognostinė žaliava. Atliekant šio MBD eksperimentus naudota vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.), augalinė žaliava – šaknys, kurios buvo surinktos Vytauto Didžiojo universiteto, Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus kolekcijoje, skirtingais augalo vegetacijos periodais. Tyrimo unikalumas – pirmą kartą išskirti baltymų ekstraktai iš Lietuvoje introdukuoto Galega officinalis L. rūšies augalų šaknų ir nustatytas baltymų kiekis ekstraktuose skirtingais augalų vegetacijos laikotarpiais bei pagamintos kietosios kapsulės su išskirtų baltymų liofilizuotais ekstraktais.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: Nustatyti baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, kiekį skirtingais augalų vegetacijos (intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo, sėklų brandos) laikotarpiais bei pagaminti kietąsias kapsules su išskirtų baltymų ekstraktais. Uždaviniai: 1. Iš vaistinių ožiarūčių augalinės žaliavos – šaknų, išskirti baltymus skirtingais augalų vegetacijos periodais ((intensyvaus augimo (A3), butonizacijos (B), intensyvaus žydėjimo (Ž2) ir sėklų brandos (V2)). 2. Nustatyti baltymų kiekį išskirtuose baltymų ekstraktuose. 3. Pagaminti kietąsias kapsules su baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. šaknų, liofilizuotais ekstraktais. 4. Atlikti kietųjų kapsulių kokybės nustatymo testus.

1. Literatūros apžvalga

1.1. Galega officinalis L. charakteristika bei paplitimas

1 Pav. Vaistinis ožiarūtis (https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/dd/Galega_officinalis_bgiu.jpg) (https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fe/Galegaofficinalis03.jpg)

Vaistinis ožiarūtis (Galega officinalis L.) – pupinių šeimos daugiametis 40-60 cm aukščio ankštinis augalas. Šaknis liemeninė, stora, šviesiai ruda, labai šakota, su šakninėmis atžalomis viršutinėje dalyje. Stiebai statūs, per bamblius daugiau ar mažiau lenkti, negiliai vagoti, tuščiaviduriai šakoti, pliki, ar negausiai padengti trumpais plaukeliais. Lapai trumpakočiai, 5-20 cm ilgio, priešiški, neporomis plunksniški, 2-4 cm ilgio, 1,5–1,8 cm pločio. Šio augalo žiedai gali būti įvairių spalvų: nuo šviesiai mėlynos iki violetinės. Žiedai būna susitelkę stiebų viršūnėse kekėmis. Prielapiai - laisvi dideli, plačiai lancetiški, smailiaviršūniai, pusiau strėliški. Vaisiai - 20-50 mm linijiškos, tiesios, gelsvai rudos ankštys. Sėklos - pailgai inkstiškos, lygios, geltonos. Galega officinalis L. augalai žydi visą vasarą. Vaistinis ožiarūtis dauginasi sėklomis, o pumpurai yra žemės paviršiuje ir žiemos metu jie yra apsaugomi mirusio augalo liekanomis. Sunokusios ir išdžiūvusios augalų ankštys sproginėja ir išbarsto sėklas. Augalo sutrinti lapai skleidžia kvapą, panašų į ožkos kailio, todėl jie ir vadinami ožiarūčiais [1;2]. Bendrinio taksonominės informacijos tinklo (ITIS) duomenų bazėje pateikiama Galega officinalis L. botaninė klasifikacija (1 lentelė).

1 lentelė. Galega officinalis L. botaninė klasifikacijas (ITIS)

Karalystė Plantae Žalieji augalai Skyrius Tracheophyta Induočiai Klasė Magnoliopsida Magnolijūnai Poklasis Rosidae Ėrškėčiažiedžiai Eilė Fabales Pupiečiai Šeima Fabaceae Pupiniai Gentis Galega L. Ožiarūčiai

Vaistiniai ožiarūčiai savaime yra paplitę Pietų Europoje ir Pietvakarių Azijoje [1;2].

1.2. Galega officinalis L. augalinės žaliavos cheminė sudėtis bei farmakologinės savybės

Tradicinėje medicinoje Galega officinalis L. vaistinė augalinė žaliava – žolė, buvo naudojama cukrinio diabeto, ilgalaikės hiperglikemijos sukeltos poliurijos, tuberkuliozės, epilepsijos bei įvairių infekcinių ligų gydymui. Surinkta augalinė žaliava – žolė, yra džiovinama gerai vėdinamoje patalpoje arba šildomoje džiovyklėje iki 50 ℃ temperatūroje. Išdžiovintos žaliavos galiojimo laikas yra ne daugiau kaip 2 metai [2]. Vienos iš pagrindinių Galega officinalis L. vaistinėje augalinėje žaliavoje – žolėje, randamų biologiškai aktyvių medžiagų yra alkaloidai, tai yra azoto guanido junginiai – galeginas (izoamileno guanidas) ir 4 – hidroksigaleginas. Šių komponentų daugiausia nustatyta augalų žydėjimo ir vaisių formavimosi metu. Minėti alkaloidai pasižymi hipoglikeminiu ir galaktogeniniu poveikiais. Taip pat galeginas ir guanidinas mažina kraujo spaudimą, o vartojamas didelėmis dozėmis gali paralyžuoti CNS. Nustatyta, jog biguanidų grupės junginiai – galeginas, guanidinas, gali sukelti plaučių edemas, hidrotoraksą. Mokslininkai nustatė, kad galeginas slopina apetitą, todėl vaistinių ožiarūčių preparatai gali būti vartojami kūno masės indekso sumažinimui. Galeginas taip pat slopina gram teigiamų (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureaus, Streptococcus faecalis ) bei gram neigiamų (Enterobacter aerogenes , Serratia marcescens , Yersinia enterocolitica) bakterijų dauginimąsi [1;50]. Augalinėje žaliavoje – žolėje, taip pat aptikti tricikliai chinazolino alkoloidai (vazicinas, vazicinolis, vazicinonas),

18 flavonoidai, flavonoidų glikozidai. Ekperimentinio tyrimo metu tirti augalinėje žaliavoje esantys fenoliniai junginiai. Buvo nustatyti 48 junginiai, tarp kurių identifikuoti 7 junginiai: kavos, ferulo, cikoro rūgštys, rutinas, kvercetinas, hiperozidas ir apigeninas [49]. Nustatyta, kad Galega officinalis L. žolėje esantys flavonoliai, rutinas, chlorogeno rūgštis, hidroksicinamono rūgštis pasižymėjo stipriu antioksidaciniu poveikiu. Taip pat identifikuoti junginiai (galeginas, hidroksigaleginas, flavonoliai), kurie sujungia metilglioksalą, sukeliantį diabeto ar neurodegeneracinių ligų vystymąsi [49]. Apibendrinant Galega officinalis L. vaistinės augalinės žaliavos – žolės, farmakologinius poveikius, galima išskirti šiuos efektus: antioksidacinis, hipoglikeminis, hipotenzinis, kūno masę reguliuojantis, galaktogeninis, antiseptinis. Vaistinės augalinės žaliavos – šaknų, fitocheminė sudėtis nėra išsamiai tirta. Yra žinoma, jog Galega officinalis L. gyvena simbiotinėje saveikoje su rizobijomis - ankštinių (Fabaceae) augalų šaknų gumbelių bakterijomis, kurios fiksuoja atmosferoje esantį azotą ir teikia augalams reikalingus azoto junginius. Tiriant Galega officinalis L. simbiotinę sąveiką su šiomis bakterijomis, indefikuota specifinė augalui bakterijų rūšis - Neorhizobium galegae symbiovar (sv.) officinalis. Bakterijos – rizobijos, padeda Galega officinalis L. augalams prisitaikyti prie dirvožemio, paveikto druskomis - chloridais [47;48]. Remiantis šiais literatūros šaltiniais, galime daryti prielaidą, kad simbiozės metu sukauptas šaknyse azotas gali būti panaudotas baltymų sintezei. Tačiau trūksta informacijos apie Galega officinalis L. šaknyse esančių baltymų kokybinę – kiekinę sudėtį.

1.3. Augalų baltymai ir jų funkcijos

Baltymai atlieka pagrindines funkcijas: struktūrinę, metabolinę ir transportavimo. Baltymai yra svarbūs augalų apsauginiams mechanizmams ir dalyvauja fotosintezėje. Baltymų kiekio kaupimąsi augaluose lemia išoriniai aplinkos faktoriai - temperatūra, drėgmė, gaunamas šviesos kiekis ar pavojus, kurį sukelia žoliaėdžiai gyvūnai. Augalai turi specifinį baltymą, fermentą RuBisCO, skirtą katalizuoti fotosintezės reakciją. Kai trūksta šio fermemento, lėtėja fotosintezė, o per mažas fotosintezės aktyvumas apsprenžia lėtą augalo augimą. Glicinas ir gliutamo amino rūgštys, esančios augalų ląstelėse, padeda padidinti chlorofilo koncentraciją – tai turi įtakos intensyvesnei fotosintezei. Augalų baltymai dalyvauja vandens molekulių skaidyme ir ATF gamyboje [5]. Yra žinoma jog apie 20 aminorūgščių įtakoja augalų fiziologinius procesus. Augaliniuose biosintezės procesuose dalyvauja L-aminorūgštys, pasižyminčios dideliu metaboliniu aktyvumu.

Priešingai nei L-aminrūgštys, D-aminorūgštys nedalyvauja baltymų sintezėje. Pagrindinė D- aminorūgščių paskirtis – struktūrinė apsauga nuo bakterijų [51;53]. Veikiant išoriniams aplinkos dirgikliams, augalai atitinkamai reguliuoja augimo bei vystymosi procesus. Šias funkcijas atlieka indolo-3-acto rūgšties-baltymų kompleksiniai junginiai, kurie priskiriami fitohormonų auksinų pogrupiui. Šie fitohormoniniai junginiai randami nedideliais kiekiais augalinėse ląstelėse. Dėka šių fitohormonų augalai skatinimi prisitaikymui prie nuolat besikeičiančios aplinkos. Taip pat šie hormonai svarbūs metabolizmo reakcijoms, ląstelių dalijimosi procesams, ląstelių diferenciacijai. Nors augalo atsakas į abiotinius stresorius priklauso nuo įvairių veiksnių, fitohormonai laikomi kaip svarbiausios endogeninės medžiagos, skirtos moduliuoti fiziologines ir molekulines reakcijas [51]. Apibendrinant mokslinių literatūros šaltinių informaciją, baltymai dalyvauja kaip statybinė medžiaga ląstelių organelių ir audinių struktūroje, svarbūs medžiagų apykaitai, apsaugai nuo aplinkos stresorių. Nuo baltymų kokybinės – kiekinės sudėties priklauso ir fotosintezės intensyvumas.

1.4. Baltymų išskyrimo iš vaistinės augalinės žaliavos ir baltymų išskirstymo metodai

Išskiriant baltymus iš vaistinės augalinės žaliavos pradžioje atliekamas baltymų nusodinimas. Ši procedūra taip pat naudojama išsodinant baltymus iš tirpalų bei atskiriant juos nuo įvarių priemaišų. Baltymų nusodinimo metodas pagrįstas organino tirpiklio, rūgšties ar druskos pridėjimu, siekiant sumažinti dielektrinę konstantą baltymo mėginyje arba pakeičiant pH reikšmę. Sumažėjusi dielektrinė konstanta sutrikdo hidrofobinę sąveiką tarp mėginio ir jame esančių baltymų, todėl sumažėja baltymų tirpumas, ir baltymai atsiskiria nuo mėginio [6]. Šiandieninėje praktikoje dažniausiai naudojami baltymų nusodinimo metodai: nusodinimas amonio sulfatu (AS) bei nusodinimas polietileniminu (PEI) [7]. Nusodinimas amonio sulfatu (AS) pagrįstas sąveika tarp druskų anijonų ir teigiamai įkrautų aminorūgščių liekanų, todėl mažėja baltymo molekulės tirpumas. Druskos anijono ir aminorūgščių sąveika yra veiksmingesnė tada, kai pH yra mažesnis už izoelektrinį tašką. Į tirpalą įpylus amonio sulfato druskos, padidėja vandens paviršiaus įtemptis, dėl kurios padidėja hidrofobinė baltymų ir vandens sąveika. Baltymai reaguoja į šią situaciją, mažindami savo paviršiaus plotą, bei bandydami kuo labiau sumažinti sąlytį su tirpikliu. Tuomet keičiasi baltymo formos struktūra, ir baltymai atsiskiria nuo vandeninės terpės [8].

PEI, kurio prekės pavadinimas yra Polymin P, yra katijoninis polimeras, kuris yra naudojamas tekstilės ir popieriaus pramonėje. PEI yra etilenimino polimerizacijos produktas, gaunant bazinį polimerą su struktūra: CH3CH2N - (- CH2CH2 - NH -) n - CH2CH2NH2. Paprastai polimerizacijos laipsnis (n) lygus 700 – 2000. PEI jungiasi prie neigiamai įkrautų baltymų makromolekulių, tokių kaip nukleino rūgštys ar rūgštiniai baltymai, ir suformuoja kompleksinį junginį, kuris iškrenta į nuosėdas. Mėginys centrifuguojamas 5min. 5000aps/min. Rūgštinio baltymo susijungimas su PEI priklauso nuo tirpalo druskų koncentracijos, pvz.: esant mažai druskos koncentracijai (0,1 M NaCl), rūgštinis baltymas susijungia su PEI ir nusėda, bet esant (0,4 M NaCl) koncentracijai, baltymas atsiskiria nuo polimero ir tampa tirpiu. Jei turime mažesnės pH reikšmės rūgštinį baltymą, jis aktyviau jungiasi su PEI, esant mažai druskų koncentracijai, pvz.: 0,1 M NaCl, ir atsiskiria nuo polimero bei tampa tirpiu - prie aukštesnės druskų koncentracijos (0,9 M NaCl) [7]. Tyrimuose taikomas ir baltymų nusodinimo metodas, naudojant organinius tirpiklius: acetoną, etanolį arba metanolį, kuris gali būti sumaišytas su chloroformu. Įpylus organinio tirpiklio, mėginio dielektrinė konstanta sumažėja, todėl molekulių tarpusavio sąveika padidėja, baltymų molekulės sulimpa ir nusėda. Metodas dažniausiai taikomas, siekiant sukoncentruoti labai praskiestus vandeninius baltymų tirpalus. Tyrimai rodo, kad šio baltymų nusodinimo metodo efektyvumas priklauso nuo baltymų molekulinės masės. Jeigu šį metodą taikome mažesnės molekulinės masės baltymų nusodinimui, naudojamas didesnis organinio tirpiklio tūris. Minėtas metodas efektyvesnis, nusodinant rūgštinius baltymus [9]. Atlikus baltymų nusodinimą, vykdomas baltymų išskirstymas - išgryninimas, taikant įvairius chromatografijos metodus. Tai gali būti gelchromatografija, afininė, jonų mainų hidrofobinės sąveikos chromatografija. Atliekant chromatografinius metodus baltymų adsorbcija priklauso nuo baltymų kompleksinės sudėties, tiriamojo mėginio koncentracijos [54]. Baltymų išskirstymas - išgryninimas yra būtinas tolimesniems baltymų struktūros ir jų kiekio tyrimams. Atliekant baltymų gryninimą svarbu pašalinti nepageidaujamas priemaišas. Baltymų išskirstymas priklauso nuo jų biologinių, fizikinių ir cheminių savybių: molekulių dydžio, grynojo krūvio bei hidrofobiškumo [54].

1.4.1. Baltymų išskirstymo metodas - gelchromatografija

Taikant gelchromatografijos metodą, baltymai išskirstomi pagal skirtingą molekulių dydį ir agregatinę formą.

Baltymai nesijungia su stacionaria (nejudria) faze. Jų judėjimas priklauso nuo judrios fazės (eliuento) tekmės greičio [11]. Gelchromatografija yra plačiai taikoma molekulių, kurios yra jautrios temperatūros, pH pokyčiams, atskyrimui. Šis metodas gali būti pritaikomas įvairiomis sąlygomis: galima keisti sorbentus, eliuentus, tiriamųjų mėginių koncentraciją ar tūrį [12]. Gelchromatografijos metu naudojama kolonėlė, kuri yra užpildyta porėtu geliu. Gelis turi būti stabilus ir negali reaguoti su medžiagomis, kurias norima atskirti. Į gelio užpildytą kolonėlę yra įleidžiama tirpiklio (gali būti naudojamas natrio chloridas, kalio chloridas, katijoninis fosfatinis, anijoninis TRIS – HCl ir kiti tirpikliai), kuris užpildo poras ir naudojamas kaip mobilioji fazė baltymams. Medžiagos iš kolonėlės išteka molekulių dydžio mažėjimo tvarka. Pirmiausiai išteka didžiausi junginiai, nes jie neprasiskverbia į gelio poras, vėliau - smulkesni junginiai. Procesas vyksta tol, kol visas tirpiklis prateka pro kolonėlę, ir tada ištekėję junginiai yra fiksuojami [13]. Gelchromatografijos metodo privalumai: paprastumas, tuo pačiu ir tyrimo greitis. Tačiau šis metodas turi tam tikrų trūkumų – gali įvykti nespecifinė sąveika tarp baltymų ir dervų, todėl mažėja skiriamoji geba. Taikant šį metodą, naudojamas nedidelis tiriamojo baltymo tūris. Metodą sunku yra pritaikyti, jei yra maža tiriamų baltymų koncentracija mėginyje [14].

1.4.2. Baltymų išskirstymas afininės chromatografijos metodu

Afininės (giminingumo) chromatografijos būdu baltymai yra išskirstomi pagal jų giminingumą ligandui. Tai yra selektyviausias ir universaliausias skysčių chromatografijos metodas. Baltymai jungiasi nekovalentinėmis jungtimis su specifinėmis medžiagomis – ligandais. Ligandais gali būti fermentai, hormonai, antikūnai, polisacharidai. Ligandai rišasi su baltymu arba baltymų grupe. Stacionarios (nejudrios) fazės metu ligandai susijungia su chemiškai inertiška matrica. Inertinė matrica sudaryta iš agarozės, poliakrilamido, dekstrano, celiuliozės darinių. Tiriamų baltymų mišinys užpilamas ant nejudrios fazės. Pirmiausiai kolonėle išteka visi nesąveikaujantys baltymai (neprisijungę prie ligandų). Prisijungę prie ligandų baltymai yra išplaunami, keičiant eliucijos sąlygas – didinama druskos tirpalo judriosios fazės joninė jėga arba keičiamas pH [15]. Afininės chromatografijos metodu galima selektyviai išskirti atskirą baltymą iš tiriamojo baltymų mišinio. Metodas pasižymi tikslumu. Šiam metodui būdingas trūkumas – ligando sudėtyje esantys metalų jonai gali užteršti tiriamąjį baltymų mėginį, tuomet įvyksta baltymų denatūracija, ir sumažėja jų biologinis aktyvumas [44].

1.4.3. Baltymų išskirstymas jonų mainų chromatografijos metodu

Jonų mainų chromatografijos metodu baltymai yra išskirstomi pagal jų bendrą elektrinio krūvio dydį. Remiamasi sąveika tarp baltymo ir jonizuotų grupių, kurios yra nejudrioje fazėje. Sąveika taip pat priklauso nuo terpės dielektrinės konstantos ir konkurencijos su kitais esančiais jonais [16]. Terpės pH yra parenkamas toks, kad tiriamas baltymas pasirinktoje terpėje įgautų elektros krūvį. Teigiamą elektros krūvį turintiems baltymams gryninti naudojamos neigiamai įkrautos karboksimetilceliuliozės kolonėlės, o neigiamą – dietilaminoetilceliuliozės kolonelės [13]. Šis metodas nėra labai selektyvus, todėl yra naudojamas kaip tarpinis variantas baltymų išskyrimo procese. Vėliau taikomi papildomai metodai, pavyzdžiui, hidrofobinės sąveikos chromatografija [17].

1.4.4. Baltymų atskyrimo ir gryninimo metodas – hidrofobinės sąveikos chromatografija

Hidrofobinės sąveikos chromatografija (HIC) yra chromatografijos metodas baltymų atskyrimui bei gryninimui, naudojant baltymo paviršiaus hidrofobines savybes. Pagrindinis metodo privalumas yra tai, kad HIC gali būti taikomas tiek pradiniame, tiek galutiniame baltymų gryninimo etape. Atliekama sąveika su hidrofobinio pobūdžio chromatografiniais sorbentais. HIC remiasi baltymų hidrofobiškumu, skatindama hidrofobinės sąveikos atskyrimą tarp imobilizuotų hidrofobinių ligandų ir baltymų paviršiuje esančiu nepolinių sričių. Adsorbcija priklausomai didėja esant didelei druskos koncentracijai judriojoje fazėje, o eliucija pasiekiama sumažinant eliuento druskos koncentraciją. Šio metodo privalumas - galimybė naudoti sudėtingų baltymų mišinių grynininą, parenkant skirtingas eliuavimo sąlygas. Lyginant skirtingų tipų chromatografijas, HIC taikoma metodika nepažeidžia tiriamų baltymų struktūros [18;19]. Imobilizuotų hidrofobinių ligandų ir baltymų paviršiuje esančių nepolinių sričių sąveiką skatina įvairios druskos. Kai baltymai yra įšvirkščiami į HIC kolonėles, tuo pat metu yra didinama druskos koncentracija. Kuo didesnė druskos koncentracija, tuo mažesnis išplautų baltymų kiekis. Likusią neišplautą baltymų dalį galima desorbuoti mažos koncentracijos druskos buferiu arba vandeniu [19]. Įvairios stacionarios fazės gali skirtis atitinkamai nuo ligando tipo, ligando grandinės ilgio ir ligando tankio. HIC plačiausiai naudojami ligandai yra linijinės grandinės alkanai su arba be amino grupės. Fenilas (ir kitos aromatinės grupės) taip pat naudojamas kaip ligandas, nes pasižymi mišria sąveika tarp baltymo hidrofobinės ir aromatinės ligando dalies. Hidrofobiškumas ir sąveikos stiprumas

23 didėja, ilgėjant n-alkilo struktūrinei grandinei, tačiau baltymo adsorbcijos selektyvumas atitinkamai gali sumažėti [18].

1.5. Baltymų kiekinė – kokybinė analizė masių spektrometrijos metodu

Masių spektrometrija yra analitinis metodas, kuris naudojamas atomų ar molekulių masei nustatyti. Metodo pagalba galima identifikuoti junginius bei nustatyti jų kiekį. Veikimo mechanizmas - paremtas jonizuotų dalelių, kurios indentifikuojamos pagal krūvių ir masių santykių skirtumus (m / z), atskyrimu [20]. Taip pat galimos metodo modifikacijos: tandeminė masių spektrometrija MS / MS, kuri pagrįsta dviejų ir daugiau masės analizatorių sujungimu, naudojant papildomą reakcijos etapą, siekiant padindinti metodo jautrumą. Masiu spektrometrijos prietaise esantis jonų šaltinis naudojamas jonų gamybai dujų fazėje. Masės analizatorius atskiria jonus pagal jų (m / z) santykį arba masės ir įkrovos santykį, detektorius įvertina jonų koncentraciją kiekvienam (m / z) santykiui. Kompiuteris konvertuoja duomenis iš analizatoriaus pagal (m / z) santykį. Dažnai masių spektrometrijos metodas kombinuojamas su kitais metodais, pvz: dujų chromatografija, skysčių chromatografija arba kapiliarine elektroforeze. Be to, masių spektrometre gali būti keli analizatoriai: kvadrupolinis masių analizatorius, kvadrupolinė jonų gaudyklė, lėkio (skriejimo) trukmės masių analizatorius, jonų ciklotroninio rezonanso analizatorius [20;21]. Masių spektrometrija ir tandeminė masių spektrometrija (MS / MS) yra pagrindiniai metodai, naudojami baltymų identifikavimui ir kiekiniam nustatymui. Taikant MS ir MS / MS naudojami nepažeisti baltymai, baltymų kompleksai, baltymų jonų fragmentai. Norint analizuoti baltymus MS metodu, prieš tai būtina žinoti, kokie peptidiniai ryšiai yra baltymo struktūroje, kaip lengvai suardomi peptidiniai ryšiai, nuo kokių veiksnių (peptidų krūvio būsenos, peptidų dydžio, struktūro bei sekos) priklauso baltymo labili būklė [22].

1.6. Baltymų kiekinis nustatymas

Baltymų kiekio nustatymui taikomi spektrofotometriniai analizės metodai: Bradford metodas, Lowry metodas, Biureto metodas [23]. Kiekinė analizė pagrįsta tiriamųjų baltymų koncentracijos lyginimu su jau žinomos koncentracijos baltymų standartais.

1.6.1. Bradford metodas

Bradford metodas yra pagrįstas dažų “Coomassie Blue G250“ absorbcijos poslinkiu. „Coomassie Blue G-250“ dažai, priklausomai nuo terpės pH reikšmės, gali būti: anijono struktūrinėje formoje (mėlynos spalvos), neutralūs (žalios spalvos) ir katijoninėje struktūrinėje formoje (raudonos spalvos). “Coomassie Blue G250“ katijoninė struktūrinė forma vyrauja rūgštiniame reagento tirpale. Šios dažų struktūrinės formos absorbcijos maksimumas - 470 nm. Priešingai, dažų anijoninės struktūrinės formos, reaguojančios su tiriamais baltymais, absorbcijos maksimumas atitinka 595nm bangos ilgį. Bradford metodu metu nustatomos 1-2000 μg/ml koncentracijos [25]. “Coomassie Blue G250“ dažai lengviausiai jungiasi su baltymu, turinčiu arginilo liekaną, tačiau neprisijungia prie laisvų amino rūgščių. Todėl gali skirtis tyrimo atsakas (nustatomas skirtingas baltymų kiekis), priklausomai nuo tiriamų baltymų kokybės. Tai yra pagrindinis Bradford metodo trūkumas. Lyginant Bradford metodo teikiamus privalumus su kitais baltymų kiekinio nustatymo metodais, yra išskiriamas reakcijos greitis, paprastumas bei jautrumas. Bradford metodo metu naudojamas reagentas “Coomassie Blue G250“ yra stabilus ir mažai jautrus įvairiems mėginių detergentams (įvairių druskų buferiniams tirpalams). Dėl metodo išskirtinio jautrumo, jis gali būti atliekamas nustatant mažus baltymų kiekius (1 - 10 μg/ml) [25].

1.6.2. Biureto metodas

Nustatant baltymų koncentraciją Biureto metodu, naudojamas reagentas, kurio sudetyje yra natrio hidroksidas (NaOH) ir hidratuoto vario (II) sulfatas. Vario jonų stabilizavimui pridedamas kalio natrio tartratas. Biureto metodas pagrįstas reagento ir tiriamų baltymų peptidinių jungčiu reakcija, kai Cu2+ jonai redukuojami iki Cu+. Susidaręs junginys nudažo tirpalą rožine spalva, šviesos bangos ilgis matuojamas ties 540nm bangos ilgiu. Biureto metodas negali būti naudojamas baltymų, kurie yra išsodinti amonio sulfatu, mėginių tyrimui [26]. Metodas nėra labai jautrus, todėl naudojamas didesnių baltymų koncentracijų (5-160mg/ml) nustatymui [27]. Baltymų kiekio nustatymui dažniau naudojamos Biureto metodo modifikacijos: 1) bicinchonino rūgšties (BCA) metodas; 2) Lowry metodas. Pritaikant baltymų kiekinei analizei Biureto metodo modifikacijas, naudojami papildomi reagentai, todėl Biureto reakcijos metu susidaręs Cu+ toliau

25 reaguoja su atinkamais reagentais, sudarydamas chelatinius junginius, kurių spalva yra stabilesnė. Tai užtikrina mažesnius baltymų koncentracijų nuokrypius.

1.6.3. Lowry metodas

Lowry kiekinis baltymų nustatymo metodas (Biureto metodo modifikacija) vykdomas šarminėje terpėje. Metodas pagrįstas Cu2+ redukcija ir Cu+ jonų chelatinių junginių susidarymu. Šis metodas vykstas dviem etapais: 1) Tiriamuose baltymuose esančios peptidinės jungtys jungiasi su dvivalenčiais vario jonais ir redukuoja juos iki vienvalenčių vario jonų. Susidaro chelatiniai junginiai. 2) Chelatiniai junginiai reaguoja su Folin-Ciocalteau reagentu, ir susidaro tamsiai mėlynos spalvos junginys, kurio šviesos absorbcija matuojama esant 650-700 nm bangos ilgiui. Yra nustatyta jog gaunama reakcijos spalva daugiausiai priklauso nuo aromatinių aminorūgščių - tirozino bei triptofono [28]. Baltymo kiekis gali būti nustatomas 1-1000 µg/ml koncentracijos intervale. Pagrindinis metodo privalumas – baltymų kiekinės analizės tyrimą galima atlikti stipriai šarminėje aplinkoje. Taip pat išskiriamas metodo tikslumas. Šiam parametrui turi įtakos tiriamo baltymų tirpalo grynumas. Gautų rezultatų tikslumą sumažina mėginiuose esančios priemaišos (glicerolis, disulfidai, tioliai), trukdančios chelatinių junginių susidarymui, o tai sąlygoja spalvos išnykimą [28].

Lowry metodo jautrumo ir tikslumo užtikrinimui atliekamos modifikacijos: 1) Į mėginį pridedamos dvi dalys “Folin-Ciocalteau” reagento, po įpiltos kiekvienos dalies reagento naudojamas sūkurinis maišytuvas; 2) Ditiotritolio reagento įpylimas į mėginį, praėjus 3 minutėmis po “Folin-Ciocalteau” reagento pridėjimo; 3) Tiriami baltymai nusodinami nusodinimi natrio dodecil-sulfatu kur yra sumažinamas sąveikaujančių medžiagų poveikis [29;30;31].

1.6.4. Bicinchonino rūgšties (BCR) metodas

Bicinchonino rūgšties baltymų kiekinės analizės metodas yra giminingas Lowry metodui. Šis metodas taip pat pagrįstas Cu2+ virtimo į Cu+ reakcija. Reakcijos metu susidaręs bicinchonino rūgšties ir baltymų kompleksas yra ryškiai violetinės spalvos. Absorbcija matuojama esant 562nm bangos ilgiui. Šio metodo privalumai - (lyginant su Lowry metodu) bicinchonino rūgšties metodas

26 atliekamas vienu etapu, be to, metodas atsparesnis tiriamojo mėginio priemaišoms, kurios trukdo baltymų kiekio nustatymui. Metodas leidžia nustatyti baltymų mikro koncentracijas (0,5–10 μg/ml) [32].

1.7. Baltymų technologinis funkcionalizavimas

Baltymai nėra stabilios makromolekulės. Virškinamajame trakte baltymus skaido fermentai. Šios makromolekulės, turėdamos antrinę ir tretinę struktūras, yra dar “jautresnės” fermentų aktyvumui. Farmacinė forma turi užtikrinti technologinių formų su baltymais stabilumą bei bioprieinamumą. Yra išskiriami du pagrindiniai baltymų patekimo į organizmą būdai – invazinis (vartojamos parenterinės farmacinės formos) bei neinvazinis (vartojamos neparenterinės farmacinės formos). Parenteriniu būdu vartojant baltyminės kilmės preparatus, yra didelis biologinis prieinamumas kuris gali siekti apytikriai iki 100%. Parenterinis vartojimo būdas susijęs ir su trūkumais: sukelia skausmą bei diskomfortą, randus injekcijos vietoje, vietines alergines reakcijas ar odos infekcijas, o intraveninių būdu leidžiamas injekcijas privalo atlikti sveikatos priežiūros specialistas. Todėl neparenterinės farmacinės formos su baltymais išlieka populiaresnės, nes yra jų paprastas vartojimo būdas, nesudėtingos laikymo sąlygos. Tačiau gaminant neparenterines farmacines formas svarbu užtikrinti baltymų stabilumą bei biopreinamumą. Vienos pažangiausių farmacinių neparenterinių formų yra kietosios kapsulės. Tarpusavyje lyginant kietąsias kapsules su paprastomis tablėtemis pastebimi šie privalumai: vaisto forma yra geriau apsaugota nuo rūgščios skrandžio terpės, kietųjų kapsulių užpildymui naudojamas granuliuotas mišinys, netaikant suspaudimo proceso, kuris gali pažeisti veikliąsias medžiagas [55;56].

1.8. Kietosios kapsulės

Kietosios kapsulės yra dozuotos talpyklės, kurias sudaro dvi viena į kitą įlendančios cilindrinės apvalkalų dalys (kapsulės korpusas, kapsulės dangtelis) bei kapsulių užpildas. Dažniausiai kietųjų kapsulių apvalkalai gaminami iš gyvūninės kilmės želatinos, tačiau taip pat gali būti naudojama hidroksipropil-metilceliuliozė arba krakmolo hidrolizatas, kurių populiarumas didėja, dėl religinių ar kultūrinių priežasčių, vengiant gyvūninės kilmės komponentų [34]. Apvalkalas, pagamintas iš

27 gyvūninės kilmės želatinos, yra stabilus sausoje aplinkoje, tačiau suyra šiltoje drėgnoje aplinkoje, todėl kapsulės su šiuo apvalkalu greitai tirpsta ir atpalaiduoja veikląsias medžiagas [35]. Pagrindiniai kapsulių privalumai, lyginat su kitomis farmacinėmis formomis: 1) Užmaskuojamas nemalonus ar kartus veikliųjų medžiagų skonis; 2) Lengvai virškinamos virškinimo trakte; 3) Sudrėkusios yra slidžios todėl lengvai praryjamos; 4) Biologinis prieinamumas yra geresnis nei tablečių;

Tačiau taip pat kapsulės turi ir trūkumų: 1) Dėl greito atsipalaidavimo lokalizuotose vietose gali susidaryti aukšta veikliųjų medžiagų koncentracija, kuri sukelia perdozavimą; 2) Higroskopiškos veikliosios medžiagos gali absorbuoti drėgmę iš želatininio kapsulių apvalkalo, kuriame paprastai būna 13-16% drėgmės. Tokiu būdu kapsulės pažeidžiamos laikymu metu [35;36].

Priklausomai nuo kapsulių talpos yra išskiriami pagrindiniai 8 kietųjų kapsulių tipai (2 lentelė) [37].

2 Lentelė. Kietųjų kapsulių numeriai ir jų vidutinė talpa

Kapsulės 000 00 0 1 2 3 4 5 tipas

Talpa (ml) 1,31 0,95 0,67 0,48 0,37 0,27 0,2 0,13

Talpa (mg) 950 650 450 300 250 200 150 100

Skirtingų kapsulių tipų dydžių pasirinkimas priklauso, nuo kapsuliuojamųjų medžiagų užpildo masės, kapsulių vartojimo - paros dozių paskirstymo, veikliųjų bei pagalbinių medžiagų tankio [37].

1.9. Kietųjų kapsulių gamyba

Kapsulių užpildui yra naudojamos pagalbinės medžiagos. Dažniausiai vartojamos slidinančiosios medžiagos (aerosilas, talkas), rečiau – pildikliai bei stabilizatoriai: laktozė, manitolis, krakmolas. Kapsuliuojant higroskopines medžiagas, pridedama aerosilo, magnio karbonato arba magnio oksido. Gaminant kapsules su skystais ar tirštais ekstraktais, naudojamos pagalbinės medžiagos, adsorbuojančios skystį ir suteikiančios kapsuliuojamam mišiniui birumo. Kapsulių užpildo dalelės turi būti panašaus dydžio ir formos, užtikrinant kapsulių turinio homogeniškumą [38;39]. Gaminant kietųjų kapsulių apvalkalus, pirmiausia, ruošiamas želatinos tirpalas nerūdijančio plieno rezervuaruose. Želatina tirpinama 60 – 70oC demineralizuotame vandenyje. Pagaminus pirminį tirpalą, yra įmaišomos reikalingos pagalbinės medžiagos. Kietųjų kapsulių apvalkalas išgaunamas, į specialias nerūdijančio plieno formas patalpinus želatinos tirpalą. Norint tolygiai paskirstyti želatinos sluoksnį, ištraukus liejimo formas iš tirpalo, yra sukamos horizontaliu paviršiumi bei paveikiamos šalto oro srove, siekiant sustingdyti želatiną. Galutinė apvalkalo gamybos stadija yra formos džiovinimas specialiose krosnyse karšta oro srove. Išdžiovintos kapsulių apvalkalo dalys nuimamos nuo formų ir nuvalomos [40].

1.10. Kietųjų kapsulių kokybės testai

Pagaminus kietąsias kapsules atliekami kokybės užtikrinimo testai. Remiantis 10.0 Europos farmakopėją (Ph.Eur.), taikomi šie kapsulių kokybės užtikrinimo testai: 1) Tirpinimo testas (2.9.3); 2) Masės vienodumo nustatymas (2.9.5);

Tirpinimo testas padeda įvertinti vaistinės medžiagos atsipalaidavimo iš kietųjų kapsulių ir pačių kapsulių tirpimo greitį, kuris priklauso nuo kapsulės užpildo ir apvalkalo sudėties [42]. Kapsulės, patekusios į virškinimo traktą, pradeda irti. Kietųjų kapsulių tirpimo procesui ir vaistinų medžiagų atsipalaidavimui turi įtakos fiziologinės sąlygos: virškinimo trakto temperatūra, skrandžio turinio kiekis, skrandžio judrumas, virškinamųjų sulčių pH, taip pat ir užsigeriamo vandens temperatūra [43]. Atliekant kietųjų kapsulių tirpimo testą, pasirenkama tam tikros pH reikšmės terpė, atsižvelgiant į preparato farmakokinetines ir farmakodinamines savybes. Šiam tyrimui naudojamas vanduo, fosfatinis buferis, acetato buferis ar druskos rūgšties tirpalas. Testavimui naudojant vandeninę

29 terpę, papildomai naudojami fermentai (pepsinas, papainas, pankreatinas), pagerinantys kapsulių tirpimo greitį. Geriausiai kapsulės apvalkalas tirpsta, esant žmogaus kūno temperatūrai – 37oC. Mažėjant temperatūrai – mažėja kapsulių tirpumas [40]. Kietųjų kapsulių tirpimo testui naudojamas mentinis, krepšelinis ar pratakios kameros prietaisai, priklausomai nuo kapsuliuotu preparatų cheminių bei fizikinių savybių. Visų prietaisų dalys, kurios gali liestis su tiriamaisiais preparatais, yra chemiškai inertiškos, neadsorbuoja, nereaguoja ir netrukdo tiriamajam mėginiui. Jos yra pagamintos iš nerūdijančio plieno, padengtos tinkamomis medžiagomis, užtikrinančiomis minėtąją preparato apsaugą [44]. Atliekant kietųjų kapsulių masės vienodumo testą, įvertiname pagamintų kapsulių vidutinę masę. Leidžiamas tiriamųjų kapsulių vidutinės masės nuokrypis pagal Europos farmakopėjos (Eur. Ph. 01/2016:20903) reikalavimus - ne daugiau 10% (3 Lentelė).

3 Lentelė. Leistinas kietųjų kapsulių nuokrypis

Vaisto Vidutinė masė Didžiausias nuokrypis (%) forma Kietosios kapsulės Iki 300mg 10%

300mg ir daugiau 7,5%

Pagal Europos farmakopėjos (Eur. Ph. 01/2008:20905) reikalavimus kapsulių, sveriančių mažiau nei 300mg, vidutinės masės nuokrypis negali būti didesnis nei 10%, kapsulių, sveriančių daugiau nei 300mg, vidutinės masės nuokrypis negali būti didesnis nei 7,5 % (3 Lentelė).

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – baltymų ekstraktai išskirti iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, surinktų Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus kolekcijoje, skirtingais augalo vegetacijos periodais ((intensyvaus augimo (A3), butonizacijos (B), intensyvaus žydėjimo (Ž2) ir sėklų brandos (V2)).

Žaliavos (šaknų) surinkimo laikas nurodytas 4 lentelėje:

4 lentelė. Galega officinalis L. augalinės žaliavos - šaknų surinkimo periodas

Vegetacijos Augalinės žaliavos laikotarpis surinkimo data Intensyvus augimas 2018-05-02

Butonizacija 2018-05-15

Intensyvus 2018-05-28 žydėjimas Sėklų brendimas 2018-06-13

2.2. Tyrimo reagentai

Natrio fosfatas (≥ 99,0 proc.) Sigma-Aldrich® Chemie GmBh (Merck, Darmstadt, Vokietija); Natrio chloridas (99,0-100,5 proc.) Sigma-Aldrich® Chemie GmBh (Merck, Darmstadt, Vokietija); Dinatrio fosfatas (≥ 99,0 proc.) (Sigma-Aldrich®, JAV)

Fosfatinis buferinis tirpalas (PBS): 7,6 mM Na2HPO4, 2,3 mM NaH2PO4, 0,15 mM NaCl (Sigma- Aldrich®, JAV); Skystasis azotas (Gaschema, Lietuva); Ultra švarus-dejonizuotas vanduo, ruoštas „Millipore“ vandens valymo sistema (JAV); Coomasie G-250 briliantinis mėlynasis dažiklis Roti®-Quant (CarlRoth GmbH, Vokietija);

Jaučio serumo albuminas (JSA) (Sigma-Aldrich®, JAV); Skystasis azotas (Gaschema, Lietuva); Amonio sulfatas (≥ 99,0 proc.) Sigma-Aldrich® Chemie GmbH (Merck, Darmstandt, Vokietija); Polivinilpirolidonas Sigma-Aldrich® Chemie GmBh (Merck, Darmstadt, Vokietija); Prosolv® SMCC HD90 (JRS Pharma, Vokietija); Magnio stearatas AppliChem (Vokietija);

2.3. Įranga

Automatiniai dozatoriai Eppendorf (JAV); Analitinės svarstyklės CP64-0CE Sartorius (Goettingen, Vokietija); Buitinis smulkintuvas Biotecha (Lietuva); Šaldoma centrifuga Eppendorf® (JAV); Magnetinė maišyklė MS-3000 Biosan® (Latvija); Orbitalinė purtyklė Mini Shaker VWR J&M Scientific (JAV); Spektrofotometras Infinite M200 Tecan (Šveicarija); Chromatografinėje analizėje naudotos stiklinės kiuvetės Merck (Vokietija); Prietaisas miltelių birumo įvertinimui Erweka AG GmbH (Vokietija); Tankinimo prietaisas SOTAX TD1 (Šveicarija);

2.4. Tyrimo metodai

2.4.1 Baltymų išskyrimas iš Galega officinalis L. augalinės žaliavos – šaknų

Baltymų kiekio augalinėje žaliavoje nustatymui buvo pasirinktas baltymų išsodinimas amonio sulfatu metodas. Pirmiausia, buvo paruošta po tris (10g) Galega officinalis L. šaknų, surinktų skirtingos augalo vegetacijos fazės metu, mėginius. Žaliava nuplauta šaltu vandeniu, supjaustyta, atšaldyta su skystu azotu, susmulkinta, naudojant buitinį smulkintuvą, ir užpilta praskiestu fosfatinio buferio tirpalu - PBS (5ml PBS praskiestas dejonizuotu vandeniu iki 50ml) (pH 7,2). Paruošti mėginiai įpilti į kūgines kolbas, į kurias įdėti magnetukai. Kolbos pastatytos ant magnetinių maišyklių nuolatiniam maišymui. Ekstrakcija vykdyta 2 val. 4 ℃ temperatūroje. Gautas

32 baltymų ekstraktas buvo supiltas į sandariai uždaromus mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai buvo sudėti į centrifugą ir centrifuguoti 20 min., naudojant 8500 aps./min. greitį 4 ℃ temperatūroje. Gauti baltymų ekstraktai perfiltruoti, atskirtos nuosėdos ir vėl centrifuguoti 20 min., naudojant 8500 aps./min. greitį 4 ℃ temperatūroje. Atlikus pirminę centrifugavimo procedūrą, centrifugatai naudoti baltymų nusodinimui. Mėginiai prisotinti amonio sulfatu iki 80proc. (m/v)., įdedant 6,97g amonio sulfato druskos. Prisotinti mėginiai vėl buvo supilti į kūgines kolbas, įdėti magnetukai, ir kolbos paliktos ant magnetinių maišyklių 16val. 4 ℃ temperatūroje (baltymų išsodinimui). Praėjus 16val. tirpalai su išsodintais baltymais buvo supilti į mėgintuvėlius ir taip pat centrifuguoti 20 min., naudojant 8500 aps./min. greitį 4 ℃ temperatūroje. Po centrifugavimo mėginių supernatantas buvo atskirtas nuo nuosėdų ir vykdytas suspendavimas, įpilant po 10 ml. praskiesto buferinio tirpalo (PBS). Tuomet baltymų ekstrakto mėginiai buvo suplakti sūkuriniu maišytuvu (Vortex) ir laikyti 4 ℃ tolimesniam tyrimui.

2.4.2 Baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. augalinės žaliavos – šaknų, kiekinis nustatymas Bradford metodu

Siekiant nustatyti baltymų kiekinę sudėtį buvo pasirinktas kiekinės analizės Bradford metodas. Metodas pagrįstas specifiniu Coomasie G-250 briliantinio mėlynojo dažiklio G-250 susijungimu su baltymu, susidarant kompleksiniams mėlynos spalvos junginiams, kuriuos galima aptikti naudojant spektrofotometrą. Pirmiausia, paruošti jaučio serumo albumino (JSA) standarto tirpalai ir „Roti-Quant“ reagentas kalibracinės kreivės sudarymui. Buvo pasirinktos šios jaučio serumo albumino koncentracijos: 0,125, 0,25, 0,5 ir 1,0 mg/ml. Šie standarto tirpalai buvo supilstyti į 0,5ml tūrio mėgintuvėlius ir laikyti -18 ℃ temperatūroje. Ruošiant „Roti-Quant“ reagentą, buvo paimta po 250 µl briliantinio mėlynojo dažiklio (G-250) ir praskiesta 1000 µl distiliuotu vandeniu. Tokiu būdu paruoštas reagentas gali būti laikomas iki 2 savaičių. Taip pat pasirinktas neigiamos kontrolės tirpalas – praskiestas fosfatinis buferinis tirpalas (PBS), ir išpilstytas į mėgintuvėlius po 40μl. Į neigiamos kontrolės tirpalus, standarto tirpalus ir baltymų mėginius įpilta po 2 ml praskiesto Roti-Quant tirpalo ir išmaišyta sūkuriniu maišytuvu Vortex. Visi tirpalai laikyti 5 minutes 20 ℃ temperatūroje, kad dažiklio molekulės prisijungtų prie baltymų. Praėjus nustatytam laikui, mėginiuose esančių baltymų kiekis tirtas spektrofotometru. Išmatuota

33 mėginių šviesos absorbcija esant 595 nm bangos ilgiui. Sudaryta kalibracinė kreivė baltymų koncentracijų nustatymui (2 pav).

Kalibracinė Kreivė 0.4 0.35 y = 0.312x + 0.057 0.3 R² = 0.9931 0.25 0.2

0.15 Absorbcija 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Standarto koncentracija (mg/ml)

2 pav. Bradford metodo kalibracinė kreivė, skirta baltymų kiekio nustatymui.

Baltymų koncentracija apskaičiuota, naudojant 1 formulę:

풀−ퟎ,ퟎퟓퟕ 푿 = (1 formulė) ퟎ,ퟎퟑퟏퟐ X – koncentracija (mg/ml); Y – tiriamojo tirpalo absorbcija

2.4.3 Baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. augalinės žaliavos – šaknų, mėginių liofilizacija

Liofilizacija – dehidratacijos procesas, kuris atliekamas džiovinant šalčiu, siekiant išsaugoti baltymų struktūrines bei biologines savybes. Ši procedūra vyksta trimis etapais: užšaldymu, pirminiu ir antriniu džiovinimu. Visi etapai vykdomi šaldant, naudojant aukštą minusinę temperatūrą.

Atliekant pirminį etapą, baltymų ekstraktų mėginiai buvo įdėti į liofilizatoriaus vidų ir laikyti 1 valandą iki kol vidaus temperatūra pasiekė -50 ℃. Mėginiai patalpinti į liofilizatoriaus kamerą, ir slėgis sumažintas iki 1000 kPA. Antrinio džiovinimo metu temperatūra buvo sumažinta iki - 43,7 ℃, ir mėginiai buvo laikyti 24 valandas vakuume. Atlikus baltymų ekstraktų mėginių liofilizaciją, gauti liofilizuoti baltymų ekstrakto milteliai, kurie toliau buvo naudoti pakartotiniam baltymų kiekiniam nustatymui Bradford metodu. Naudojant jaučio albumino standarto tirpalus pakartotinai sudaryta kalibracinė kreivė (3 pav.).

Kalibracinė Kreivė 0.45 0.4 0.35 y = 0.3394x + 0.0627 R² = 0.9955 0.3 0.25 0.2

Absorbcija 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Standarto koncentracija (mg/ml)

3 pav. Bradford metodo kalibracinė kreivė, skirta baltymų kiekio nustatymui.

Baltymų koncentracija liofilizuotuose baltymų ekstrakto milteliuose apskaičiuota, naudojant pirmąją formulę (2 formulė). 풀−ퟎ,ퟎퟔퟐퟕ 푿 = (2 formulė) ퟎ,ퟑퟑퟗퟒ X – koncentracija (mg/ml); Y – tiriamojo tirpalo absorbcija

2.5. Kietųjų kapsulių su baltymais, išskirtais iš Galega officinalis L. šaknų, gamyba

Kietųjų kapsulių gamybai reikėjo paruošti miltelių mišinį su atitinkamomis miltelių technologinėmis savybėmis: birumu, tinkamu subėrimo kūgio kampu, suberiamuoju tankiu. Siekiant sumažinti liofilizuoto baltymų ekstrakto miltelių purumą, pagalbinių medžiagų pirmojo mišinio gamybai naudota 20% polivinilpirolidono, 79% Prosolv, 1% magnio stearato, antrojo - 20% polivinilpirolidono, 79% mikrokristalinės celiuliozės, 1% magnio stearato, trečiojo – 20% Prosolv, 79% aerosilo, 1% magnio sterato. Nustatytos vienos kapsulės sudėtinės dalys – 35% liofilizuoto baltymų ekstrakto miltelių ir 65% pagalbinių medžiagų mišinio. Ruošiant mišinį, medžiagos buvo sudėtos į grūstuvę mažėjimo tvarka ir disperguotos 3 minutes. Sumaišius liofilizuoto baltymų ekstrakto miltelius su pagalbinių mežiagų mišiniu, gauta miltelių masė buvo palikta džiūti 20 ± 3 ℃ temperatūroje 24 valandas. Masei išdžiūvus, ji pertrinta per 2 mm sietą. Tuomet buvo tirtos miltelių mišinio technologinės savybės (birumas, subėrimo kūgio kampas, Carr indekso ir Hausner koeficiento nustatymas), įvertinant miltelių mišinio tinkamumą kapsuliavimui. Birumo nustatymui buvo pasverta po 50,00 ± 0,01 g tiriamųjų miltelių mišinio ir suberta į prietaiso Erweka AG (Vokietija) piltuvėlį, miltelius veikiant prietaiso vibracija 20 sekundžių. Atidarius piltuvėlį, išmatuotas laikas (sekundėmis), per kurį išbiro visa tiriamųjų miltelių mišinio masė.

풎 푩 = (2 formulė) 풕−ퟐퟎ B – miltelių birumas(g/sek); m –miltelių masė (50 g); t - bandymo laikas (sek.)

Remiantis Europos farmakopėja (Eur. Ph. (01/2010:20936)) miltelių mišinio birumas turi būti ne mažesnis nei 4 – 5 g/s.

Miltelių mišinio subėrimo kampas išmatuotas, atlikus miltelių mišinio birumo tyrimą. Byrėdami mišinio milteliai suformuoja kūgį. Matlankiu matuojamas kūgio kampas. Remiantis Europos farmakopėja (Eur. Ph (01/2008:20916)), kapsulių gamybai tinkamiausias miltelių mišinys, kurio subėrimo kūgio kampas yra tarp 25-30 laipsnių. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą (Eur. Ph (01/2008:20916)) pateiktas 5 lentelėje.

5 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą (Eur. Ph (01/2008:20916))

Birumas Kūgio kampas laipsniais (o) Puikus 25-30

Geras 31-35

Vidutinis 36-40

Priimtinas 41-45

Blogas 46-55

Labai blogas ≥ 56

2.6. Kietųjų kapsulių užpildo miltelių Carr indekso ir Hausner koeficiento nustatymas

Carr indeksas – suspaudžiamumo indeksas, ir Hausner koeficientas yra rodikliai padedantys įvertinti miltelių mišinio birumą. Kapsulės užpildo tūris įvertintas pagal Carr indeksą. Šis indeksas ir Hausner koeficientas nustatytas, atliekant miltelių mišinio suspaudžiamumo tyrimą tankinimo aparatu - SOTAX TD 1. Miltelių mišinys supiltas į cilindrą, pritvirtintą prie prietaiso platformos, atliekančios judesius aukštyn ir žemyn. Minėtu prietaisu buvo atlikta 1250 sutankinimų. SOTAX TD 1 prietaisas apskaičiavo Carr indekso ir Hausner koeficiento reikšmes pagal 3 ir 4 formules:

(푻 −푻 )풙ퟏퟎퟎ 푪푰 = 풎풂풙 풔 % (3 formulė) 푻풎풂풙 CI – Carr indeksas 3 푇푠 – medžiagos suberiamasis tankis (g/푐푚 ) 3 푇푚푎푥 – medžiagos didžiausias suberiamasis tankis (g/푐푚 )

푻풎풂풙 푯푹 = (4 formulė) 푻풔 HR – Hausner koeficientas 3 푇푠 – medžiagos suberiamasis tankis (g/푐푚 ) 3 푇푚푎푥 – medžiagos didžiausias suberiamasis tankis (g/푐푚 )

Remiantis Europos farmakopėja (Eur. Ph. (01/2010:20936)) Carr indekso ir Hausner koeficiento koreliacija yra pateikta 6 lentelėje.

6 lentelė. Miltelių birumo vertinimas pagal Carr indeksą ir Hausner koeficientą (Eur. Ph. (01/2010:20936))

Carr indeksas (%) Birumas Hausner koeficientas < 10 Puikus 1,00-1,11

11-15 Geras 1,12 – 1,18

16-20 Vidutinis 1,19 – 1,25

21-25 Priimtinas 1,26 – 1,34

26-31 Blogas 1,35 – 1,45

32-37 Labai blogas 1,46 – 1,59

>38 Netinkamas > 1,60

2.7. Kietųjų kapsulių užpildymas

Pasirinkti „1“ dydžio kietųjų kapsulių apvalkalai buvo užpildyti pagamintu miltelių mišiniu, naudojant kapsulių užpildymo mašinelę Capsule – 15. Didesnieji kietųjų kapsulių cilindriniai apvalkalai įstatyti į apatinę mašinėlės plokštelę. Miltelių mišinys išbertas ant plokštelės su įstatytais

38 apvalkalais ir tolygiai paskirstytas, užpildant visas kietąsias kapsules vienodu tūriu. Viršutiniai kietųjų kapsulių apvalkalai sustatyti į viršutinę mašinėlės plokštelę taip, kad apatiniai ir viršutiniai kietųjų kapsulių apvalkalai susijungtų. Pagamintos kietosios kapsulės laikytos tamsioje patalpoje – 4 ± 1 ℃ temperatūroje.

2.8. Kietųjų kapsulių masės vienodumo nustatymas

Kietųjų kapsulių masės vienodumo testas buvo atliktas, remiantis Europos farmakopėja (Ph. Eur. 01/2008:20905). Buvo pasverta 20 vnt. kietųjų kapsulių ir apskaičiuota vidutinė kiekvienos kietosios kapsulės masė. Tuomet pasverta kiekviena kietoji kapsulė atskirai: atidarius kapsulę, išbertas ir pasvertas užpildas bei želatininis kietosios kapsulės apvalkalas. Paskaičiuota kietosios kapsulės masė, kaip skirtumas tarp užpildo ir nepažeistos kapsulės masių. Remiantis Europos farmakopėja (Ph. Eur. 01/2008:20905), leižiamas ne daugiau kaip 2 kietųjų kapsulių masės nuokrypis – ≤7.5%, nuo kietųjų kapsulių masės vidurkio.

2.9. Kietųjų kapsulių tirpimo testas

Baltymų išsiskyrimo iš kietųjų kapsulių testas atliktas, įvertinant, koks kiekis baltymų išsiskyrė per tam tikrą laiką. Šis testas atliktas su pratakios kameros prietaisu SOTAX CE 7smart (Sotax AG, Šveicarija) su pompa Sotax CP 7-35. Atliekant testą buvo pasirinktos kietųjų kapsulių suirimui naudotos terpės: rūgštinė (0,1N HCL tirpalas) ir šarminė (1:10 PBS tirpalas). Rūgštine terpė simuliavo skrandžio terpę (pH 1,2), šarminė terpė - plonosios žarnos terpę (pH 6,8). Kietųjų kapsulių tirpimo ir suirimo testas atliktas, pasirenkant nedidelį atitinkamos terpės 50ml tūrį. Terpės tekėjimo greitis – 8 ml/min (120 pulsų/min), temperatūra - 37 ± 0,5 ℃. Kietųjų kapsulių patalpinimui naudotos 22,6 mm skersmens celės, kurių apatinė dalis užpildyta 5 mm skersmens rubininiu ir 1 mm skersmens stikliniais rutuliukais. Kiekvienos kietosios kapsulės pritvirtinimui naudotas inertiško metalo laikiklis. Vieno bandymo metu buvo tirtos 7 kietosios kapsulės su skirtinga terpe – rūgštine ir šarmine. Testo metu kiekvienos terpės mėginiai (po 2ml) buvo paimti 3 kartus kas 15 min. t.y., po 15, 30 ir 45 min. Kiekvieną kartą paėmus terpės mėginio (po 2ml), tiriamosios terpės (rūgštinės ar šarminės) tūris

39 buvo papildytas 2 mililitrais. Bandymas kartotas 2 kartus. Terpių mėginiuose buvo nustatytos baltymų koncentracijos, naudojant Bradford metodą.

2.10. Statistinė duomenų analizė

Gauti duomenys pateikti vidurkio - standartinio nuokrypio (SD) išraiška. Visi atlikti tyrimai kartoti tris kartus. Statistinė duomenų analizė atlikta, naudojant programinį paketą MS Office Excel 2010 (Microsoft Corporation, JAV).

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Baltymų, išskyrimas iš Galega officinalis (L.) šaknų bei išskirtų baltymų ekstraktų kiekinė analizė

Išskirti baltymų ekstraktai iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, pagal 2.1 skyriuje aprašytą metodiką, naudojant fosfatinį buferinį tirpalą (PBS) bei vykdant baltymų nusodinimą amonio sulfatu (AS). Naudojant spektrofotmetrinės analizės - Bradford metodą, buvo nustatytas baltymų kiekis gautų ekstraktų mėginiuose. Baltymų kiekis ekstraktų mėginiuose apskaičiuotas, naudojant 2.4.2 ir 2.4.3 skyriuose pateiktas formules (1 formulė ir 2 formulė). Gauti rezultatai pateikti 7 lentelėjė.

7 lentelė. Baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. šaknų, surinktų skirtingais vegetacijos laikotarpiais, kiekis baltymų ekstraktų mėginiuose (mg/ml) ir baltymų kiekis liofilizuotų ekstraktų mėginiuose (mg/g).

Vegetacijos Baltymų, išskirtų iš Baltymų kiekis laikotarpis vaistinių ožiarūčių liofilizuotų baltymų šaknų, kiekis ekstraktų ekstraktų mėginiuose mėginiuose (mg/ml) (mg/g) Intensyvus 1,19 ± 0.03 2,090 ± 0.021 augimas Butonizacija 1,200 ± 0.021 2,370 ± 0.019

Intensyvus 1,250 ± 0.017 3,480 ± 0.023 žydėjimas Sėklų branda 1,310 ± 0.025 5,380 ± 0.019

Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad daugiausiai vaistinių ožiarūčių šaknys sukaupia baltymų sėklų brandos fazėje, mažiausiai – intensyvaus augimo fazėje.

3.2. Kietųju kapsulių užpildo miltelių technologinių savybių vertinimas

Siekiant įvertinti ar liofilizuotų baltymų miltelių bei pasirinktų pagalbinių medžiagų mišiniai tinkami kapsuliavimui, buvo atlikti miltelių technologinių savybių tyrimai. Pirmiausia, patikrintas pagamintų mišinių birumas ir suberiamasis kūgio kampas. Taip pat atliktas miltelių ir pasirinktų pagalbinių medžiagų mišinių suspaudžiamumo indekso tyrimas, naudojant tankinimo prietaisą - SOTAX TD 1. Atlikus birumo testą su visais pagamintais kietųjų kapsulių receptūrų mišiniais, nustatyta, kad pirmasis ir antrasis mišiniai pasižymėjo tinkamu birumu (pirmojo mišinio birumas – 4,24 g/sek, antrojo mišinio – 4,1 g/sek). Dėl per didelio purumo trečiasis mišinys pasižymėjo prastu birumu (3,1 g/sek). Gauti rezultatai pateikti 4 paveiksle.

Birumas 5 4.24* 4.1* 4 3.1 3

0 Miltelių Miltelių birumo greitis (g/sek) 1 2 3

Kietųjų kapsulių užpildo mišinys

4 pav. Kietųjų kapsulių užpildo miltelių birumo greitis (g/sek) *p < 0,05 lyginant su kontroline grupe (Galega officinalis L. šaknų liofilizuotų baltymų milteliai).

Atlikus kietųjų kapsulių užildo birumo testą, matlankiu išmatuotas kiekvieno išbyrėjusių miltelių mišinio kūgio kampas. Nustatytas pirmojo mišinio kūgio kampas – (310), antrojo – (330), trečiojo – (360). Remiantis 5 lentelės pateiktais duomenimis, pirmojo ir antrojo kietųjų kapsulių užpildo mišino nustatytas kūgio kampas buvo geras, o trečiojo mišinio – vidutinis. Rezultatai pateikti 5 paveikslėlyje.

Kūgio kampas

40 36 ) 0 33 35 31* 30 25 20 15 10 5

0 Miltelių Miltelių kampas kūgio ( 1 2 3

Kietųjų kapsulių užpildo mišinys

5 pav. Kietųjų kapsulių užpildo miltelių kūgio kampas (0) *p < 0,05 lyginant su kontroline grupe (Galega officinalis L. šaknų liofilizuotų baltymų milteliai).

Atliktas kietųjų kapsulių užpildo - liofilizuotų baltymų miltelių ir pagalbinių medžiagų mišinių suspaudžiamumo indekso tyrimas, naudojant sutankinimo prietaisą – SOTAX TD1. Gauti rezultatai (apskaičiuoti pagal 3 formulę) parodė, kad pirmasis mišinys pasižymėjo geru birumu (Carr indeksas – 14%), antrasis mišinys pasižymėjo vidutiniu birumu (Carr indeksas – 17%), trečiasis mišinys – blogu birumu (Carr indeksas – 26%). Rezultatai nurodyti 6 paveiksle.

Carr indeksas 30 26 25

20 17 14* 15

Miltelių Miltelių Carrindeksas (%) 0 1 2 3

Kietųjų kapsulių užpildo mišinys

6 pav. Kietųjų kapsulių užpildo miltelių Carr indeksas (%) *p < 0,05 lyginant su kontroline grupe (Galega officinalis L. šaknų liofilizuotų baltymų milteliai).

Naudojant SOTAX TD1 prietaisą, pagal 4 formulę apskaičiuotas Hausner koeficientas. Kuo mažesnis Hausner koeficientas, tuo tinkamesnis miltelių mišinys kapsuliavimui. Pirmasis bei antrasis mišiniai pasižymėjo geru birumu (pirmojo Hausner koeficientas – 1,23, antrojo – 1,24). Trečiasis mišinys pasižymėjo priimtinu birumu (Hausner koeficientas 1,3). Apskaičiuoti rezultatai pateikti 7 paveiksle.

Hausner koeficientas 1.32 1.3 1.3 1.28 1.26 1.24 1.24 1.23*

1.22 ų Hausnerkoeficientas 1.2

Milteli 1.18 1 2 3

Kietųjų kapsulių užpildo mišinys

7 pav. Kietųjų kapsulių užpildo miltelių Hausner koeficientas *p < 0,05 lyginant su kontroline grupe (Galega officinalis L. šaknų liofilizuotų baltymų milteliai).

Atliktus kietųjų kapsulių užpildo miltelių mišinių testus nustatyta, jog kapsuliavimui tinkamas pirmasis mišinys kurio pagalbinių medžiagų sudėtis - 20% polivinilpirolidono, 79% Prosolv, 1% magnio stearato, bei antrasis mišinys kurio pagalbinių medžiagų sudėtis - 20% polivinilpirolidono, 79% mikrokristalinės celiuliozės, 1% magnio stearato. Trečiasis mišinys kurio pagalbinių medžiagų sudėtis – 20% Prosolv, 79% aerosilo, 1% magnio sterato, nebuvo tinkamas kietųjų kapsulių gamybai. Dėl geresnių miltelių užpildo technologinių savybių (birumo, kūgio kampo, Carr indekso, Hausner koeficiento) kietųjų kapsulių gamybai buvo pasirinktas pirmasis mišinys. Nustatytas pasirinktojo kietųjų kapsulių užpildo miltelių geras birumas, Carr indeksas – 14 % (pagal 6 lentelės duomenis). Įvertinus Hausner koeficientą, kurio reikšmė – 1,23, nustatytas kietųjų kapsulių užpildo miltelių vidutinis birumas (pagal 6 lentelės duomenis). Baltymų, išskirtų iš

Galega officinalis L. šaknų, liofilizuotų miltelių ir pagalbinių medžiagų mišinio, skirto kapsuliavimui, kokybės parametrai pateikti 8 lentelėje.

8 lentelė. Baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. šaknų, liofilizuotų baltymų ekstrakto miltelių ir pagalbinių medžiagų mišinio, skirto kapsuliavimui, kokybės parametrai.

Birumas (g/s) Kūgio kampas (0) Carr Hausner indeksas (%) koeficientas Liofilizuotų 4,24 31 14 1,23 miltelių ir pagalbinių medžiagų mišinys

Remiantis Europos farmakopėjos (Eur. Ph. (01/2010:20936) nurodytais reikalavimais, užpildo miltelių mišinys yra tinkamas kapsuliavimui.

3.3. Kietųjų kapsulių su baltymais gamyba ir masės vienodumo nustatymas

Pagamintos “1“ tipo kietosios kapsulės, turinčios 65 % pagalbinių medžiagų bei 35% liofilizuotų baltymų, išskirtų iš Galega officinalis L. šaknų, miltelių. Atliekant kietųjų kapsulių masės vienodumo testą su atsitiktinai pasirinktomis kietosiomis kapsulėmis (n = 20), nustatyta vidutinė kapsulės masė – 0,2900 ± 0,0018 g. Remiantis Europos farmakopėjos (Eur. Ph. 01/2008:20905) reikalavimais, pagamintos kietosios kapsulės vidutinės masės nuokrypis buvo 3.33% (negali būti didesnis nei 7,5 %).

3.4. Kietųjų kapsulių tirpimo testas

Baltymų išsiskyrimo iš kietųjų kapsulių testas atliktas, naudojant pratakios kameros SOTAX prietaisą. Kietosios kapsulės pradėjo irti po 10 sekundžių. Kietosios kapsulės suiro 13 minučių laikotarpyje – tiriant šarminėje terpėje, o rūgštinėje terpėje - per 9 minutes. Testo pabaigoje (po 45min.)

45 atlikta išsiskyrusių baltymų kiekinė analizė Bradford metodu mėginiuose. Gauti rezultatai pavaizduoti 9 lentelėje ir 10 lentelėje.

9 Lentelė. Baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių kiekis šarminėje terpėje.

Mėginio ėmimo laikas Iš kietųjų kapsulių Iš kietųjų kapsulių Baltymų kiekis, esantis išsiskyrusių baltymų išsiskyrusių baltymų kapsulėje (mg) kiekis (mg) kiekis (%) Po 15min. 0,040 ± 0.032 24,79 Po 30min. 0,100 ± 0.023 62,87 0,16 ± 0.02 mg Po 45min. 0,120 ± 0.013 75,10

10 Lentelė. Baltymų, išsiskyrusių iš kietųjų kapsulių kiekis rūgštinėje terpėje.

Mėginio ėmimo laikas Iš kietųjų kapsulių Iš kietųjų kapsulių Baltymų kiekis, esantis išsiskyrusių baltymų išsiskyrusių baltymų kapsulėje (mg) kiekis (mg) kiekis (%) Po 15min. 0,086 ± 0.017 53,83 Po 30min. 0,137 ± 0.031 85,75 0,16 ± 0.02 mg Po 45min. 0,147 ± 0.022 92,05

Rūgštinės terpės mėginiuose (po 45min.) nustatytas iš kietųjų kapsulių išsiskyrusių baltymų kiekis - 0,147 ± 0.022 mg (92,05%), šarminės terpės mėginiuose – 0,120 ± 0.013 mg (75,1%). Pagal Europos farmakopėjos (Eur. Ph. 01/2016:20903) reikalavimus - iš kietųjų kapsulių išsiskyrusių baltymų kiekis turi būti ne mažesnis nei 75% (po 45 testo minučių).

IŠVADOS

1. Išskirti baltymų ekstraktai iš vaistinių ožiarūčių šaknų, surinktų skirtingais augalų vegetacijos laikotarpiais: intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo ir sėklų brandos, pritaikius išskyrimui baltymų išsodinimo amonio sulfatu metodą. 2. Atlikus baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių šaknų, ekstraktų kiekinį nustatymą skirtingais augalo vegetacijos periodais, nustatyta, jog daugiausia baltymų (1,310 ± 0.025 mg/ml) šaknys sukaupia sėklų brandos fazėje. Taip pat nustatyta, jog baltymų kiekis šaknyse didėjo, keičiantis augalo vegetacijos fazei tokia tvarka: intensyvaus augimo, butonizacijos, intensyvaus žydėjimo ir sėklų brandos. 3. Atlikus kietųjų kapsulių miltelių užpildo technologinių savybių (birumo, kūgio kampo, Carr indekso, Hausner koeficiento) vertinimą, nustatyta, jog užpildas kurio sudėtis: 35% liofilizuotų baltymų ekstrakto miltelių ir 65% pagalbinių medžiagų mišinio (20% polivinilpirolidono, 79% Prosolv, 1% magnio stearato) buvo tinkamas kietųjų kapsulių gamybai. 4. Atlikus kietųjų kapsulių su liofilizuotų baltymų ekstraktų masės vienodumo testą, kapsulių tirpimo testą, įvertinta, kad kietosios kapsulės pagamintos tinkamai (atitiko Europos farmakopėjos reikalavimus).

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Atlikus baltymų, išskirtų iš vaistinių ožiarūčių (Galega officinalis L.) šaknų, surinktų skirtingais augalų vegetacijos periodais, kiekinį nustatymą ir įvertinus gautus rezultatus, rekomenduojama šaknis rinkti paskutinėje sėklų brandos vegetatyvinėje fazėje, nes šiame periode žaliava sukaupia didžiausią baltymų kiekį.

2. Remiantis mokslinės literatūros šaltiniais, trūksta informacijos apie Galega officinalis L. šaknyse esančių baltymų kokybinę sudėtį. Rekomenduojame atlikti baltymų, išskirtų iš Lietuvoje auginamų vaistinių ožiarūčių šaknų, kokybines sudėties tyrimą.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Autorių kolektyvas. Vaistai iš gamtos. Žinynas apie augalinius vaistus, jų vartojimą ir poveikį organizmui. Alma littera; 2011 2. Ragažinskienė O, Rimkienė S, Sasnauskas V. Vaistiniu̜ augalu̜ enciklopedija. Lututė; 2005. 3. Song, R (2016). Mechanism of Metformin: A Tale of Two Sites. Diabetes Care, 39(2), (2016). 187–189. doi:10.2337/dci15-0013 4. Bailey, C. J. (2017). Metformin: historical overview. Diabetologia, 60(9), 1566– 1576. doi:10.1007/s00125-017-4318-z 5. Gutauskas A, Urbanavičienė R. Biologijos enciklopedija. Kaunas: Šviesa; 2006. 6. Castro-Perez, J., & Prakash, C. Recent advances in mass spectrometric and other analytical techniques for the identification of drug metabolites. Identification and Quantification of Drugs, Metabolites, Drug Metabolizing Enzymes, and Transporters; 2020. p.39–71. 7. Burgess, R. R. Chapter 20 Protein Precipitation Techniques. Guide to Protein Purification, 2nd Edition; 2009. p.331–342. 8. Wingfield, P. Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate. Current Protocols in Protein Science; (1998). p. A.3F.1–A.3F.8. 9. Santa, C., Anjo, S. I., & Manadas, B. Protein precipitation of diluted samples in SDS-containing buffer with acetone leads to higher protein recovery and reproducibility in comparison with TCA/acetone approach. PROTEOMICS, (2016). p. 1847–1851. 10. Janson J-C. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. New Jersey: Wiley; 2012. 11. Coskun, Ozlem. “Separation techniques: Chromatography.” Northern clinics of Istanbul vol. 3,2 156-160. 11 Nov. 2016. 12. Berek, D. Size exclusion chromatography - A blessing and a curse of science and technology of synthetic polymers. Journal of Separation Science; (2010). p. 33(3), 315–335. 13. Duong-Ly, K. C., & Gabelli, S. B. Gel Filtration Chromatography (Size Exclusion Chromatography) of Proteins. Laboratory Methods in Enzymology: Protein Part C; (2014). 105– 114. 14. Ó’Fágáin, C., Cummins, P. M., & O’Connor, B. F. Gel-Filtration Chromatography. Protein Chromatography; (2016). p. 15–25. 15. Hage, D. S., & Matsuda, R. Affinity Chromatography: A Historical Perspective. Affinity Chromatography; (2015). p. 1–19.

16. Karlsson E, Hirsh I. Ion exchange chromatography. In: Janson J C, editor. Protein purification. Principles, high resolution methods and applications. 3nd ed. New Jersey: John Wiley & Sons; 2011. 17. Chern, M.-K., Shiah, W.-J., Chen, J.-J., Tsai, T.-Y., Lin, H.-Y., & Liu, C.-W. Single-step protein purification by back flush in ion exchange chromatography. Analytical Biochemistry; (2009). p. 392(2) 18. Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., & Cabral, J. M. S. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. Journal of Biotechnology; (2001). 87(2), 143–159. 19. Jungbauer, A., Machold, C., & Hahn, R. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. Journal of Chromatography A; (2005). p. 1079(1-2), 221–228. 20. Murayama, C., Kimura, Y., & Setou, M. Imaging mass spectrometry: principle and application. Biophysical Reviews; (2009). 1(3), p. 131–139. doi:10.1007/s12551-009-0015-6 21. Wysocki, V. H., Resing, K. A., Zhang, Q., & Cheng, G. Mass spectrometry of peptides and proteins. Methods (2005). p. 35(3), 211–222. 22. Hutanu D, Darie CC Trends in Characterization of PEGylated Proteins by Mass Spectrometry; (2014). 23. He F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 2011. 24. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook; (2009). p. 17–24. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_4 25. Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. Wiley; (2009). p. 111. 26. Luke Evans Technical Note:Colorimetric Protein Assays Assays for Determining Protein Concentration https://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/Colorimetric_Protein_Assays.pdf 27. Waterborg J.H. The Lowry Method for Protein Quantitation. In: Walker J.M. (eds) The Protein Protocols Handbook; (2009) Springer Protocols Handbooks. Humana Press, Totowa, NJ. 28. Hess, H. H., Lees, M. B., & Derr, J. E. A linear Lowry-Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry; (1978). p. 85(1), 295–300. 29. Larson, E., Howlett, B., & Jagendorf, A. Artificial reductant enhancement of the Lowry method for protein determination. Analytical Biochemistry; (1986). p. 155(2), 243–248.

30. Vallejo, C. G., & Lagunas, R. Interferences by sulfhydryl, disulfide reagents and potassium ions on protein determination by Lowry’s method. Analytical Biochemistry; (1970). p. 36(1), 207– 212. 31. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook; (2009). p 32. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., … Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry; (1985). p. 150(1), 76–85. 33. Larry L., Augsburger Hard Shell Capsules https://www.pharma.dupont.com/content/dam/dupont/amer/us/en/nutrition- health/general/pharmaceuticals/documents/problem-solver- documents/Hard%20Shell%20Capsules.pdf 34. B.Srividya, & C, Sowmya & Chappidi, Suryaprakash. Capsules and It’s Technology: An Overview; (2014). International Journal of Pharmaceutics and Drug Analysis. 35. Advantages and Disadvantages of Hard Gelatin Capsules; (2020) https://www.pharmapproach.com/advantages-and-disadvantages-of-hard-gelatin-capsules/ 36. Capsule Size Chart https://www.capsulesupplies.com/capsule-size-chart/ 37. M. E. Aulton Pharmaceutics the science of dosage form design; Churchill Livingstone Edinburg, London, New York, Philadelphia, St Lois, Sydney, Toronto, 2002. 38. LOYD V. ALLEN, JR. The Art, Science, and Technology of Pharmaceutical Compounding, Third Edition; 2008. 39. Jones BE. Manufacture and properties of two-piece hard capsules. In: Podczeck F, Jones BE, editors. Pharmaceutical Capsules. London: Pharmaceutical Press; 2004. 40. Allen HV, Ansel HC. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2014. 41. European Pharmacopoeia 7th Edition. Dissolution test for solid dosage forms (01/2010:20903). 42. Garbacz, G., Cadé, D., Benameur, H., & Weitschies, W. Bio-relevant dissolution testing of hard capsules prepared from different shell materials using the dynamic open flow through test apparatus. European Journal of Pharmaceutical Sciences; (2014). p. 57, 264–272. 43. European Pharmacopoeia 5th Edition. Dissolution test for solid dosage forms. 44. R. Gutiérrez, E. M. Martín del Valle & M. A. Galán Immobilized Metal‐Ion Affinity Chromatography: Status and Trends, Separation & Purification Reviews; (2007). p. 36:1, 71- 111.

45. Yvonne Maphosa and Victoria A. Jideani. The Role of Legumes in Human Nutrition, Functional Food - Improve Health through Adequate Food, Maria Chavarri Hueda; (2017). IntechOpen, 46. Grela, E. R., Kiczorowska, B., Samolińska, W., Matras, J., Kiczorowski, P., Rybiński, W., & Hanczakowska, E. Chemical composition of leguminous seeds: part I—content of basic nutrients, amino acids, phytochemical compounds, and antioxidant activity. European Food Research and Technology, (2017). p. 243(8), 1385–1395. 47. Egamberdieva, D., Berg, G., Lindström, K., & Räsänen, L. A. (2013). Alleviation of salt stress of symbiotic Galega officinalis L. (goat’s rue) by co-inoculation of Rhizobium with root-colonizing Pseudomonas. Plant and Soil, 369(1-2), 453–465. 48. Bromfield, E. S. P., Cloutier, S., Robidas, C., Tran Thi, T. V., & Darbyshire, S. J. Invasive Galega officinalis (Goat’s rue) plants in Canada form a symbiotic association with strains of Neorhizobium galegae sv. officinalis originating from the Old World. Ecology and Evolution. (2019). 49. Bednarska, K., Kuś, P., & Fecka, I. Investigation of the Phytochemical Composition, Antioxidant Activity, and Methylglyoxal Trapping Effect of Galega officinalis L. Herb In Vitro. Molecules; (2020). p.25(24), 5810. 50. Pundarikakshudu, K., Patel, J. K., Bodar, M. S., & Deans, S. Anti-bacterial activity of Galega officinalis L. (Goat’s Rue). Journal of Ethnopharmacology; (2001). p. 77(1), 111–112. 51. 1 Wani, S. H., Kumar, V., Shriram, V., & Sah, S. K. Phytohormones and their metabolic engineering for abiotic stress tolerance in crop plants. The Crop Journal; (2016). p. 4(3), 162– 176. 52. Brueckner, Hans & Westhauser, T. Bruckner, H. & Westhauser, T. Chromatographic determination of L- and D-amino acids in plants. Amino acids 24; (2003). p. 43-55. 10.1007/s00726-002-0322-8. 53. Üner Kolukisaoglu and Juan Suarez. D-Amino Acids in Plants: New Insights and Aspects, but also More Open Questions, Amino Acid - New Insights and Roles in Plant and Animal, Toshiki Asao and Md. Asaduzzaman; (2017) IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.68539 54. Asenjo, J. A., & Andrews, B. A. Protein purification using chromatography: selection of type, modelling and optimization of operating conditions. Journal of Molecular Recognition, (2009). p. 22(2), 65–76. 55. Brown, T. D., Whitehead, K. A., & Mitragotri, S. Materials for oral delivery of proteins and peptides. Nature Reviews Materials; (2019). doi:10.1038/s41578-019-0156-6

56. Brown, L. R. Commercial challenges of protein drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery, 2(1); (2005). p. 29–42.

PRIEDAI