UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA New insights into alternative splicing using microarray technology Ana Rita Fialho Grosso Doutoramento em Ciencias^ Biomedicas,´ especialidade de Ciencias^ Morfologicas´ 2009 UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA New insights into alternative splicing using microarray technology Ana Rita Fialho Grosso Doutoramento em Ciencias^ Biomedicas,´ especialidade de Ciencias^ Morfologicas´ 2009 Tese orientada por Professora Doutora Maria do Carmo Fonseca Professor Doutor Simon Tavar´e(University of Cambridge, UK) A impress~aodesta disserta¸c~aofoi aprovada pela Comiss~ao Coordenadora do Conselho Cient´ıficoda Faculdade de Medicina de Lisboa em reuni~aode 22 de Setembro de 2009. As opini~oesexpressas s~aoda exclusiva responsabilidade do seu autor. O desenvolvimento e execu¸c~aogr´afica da presente disserta¸c~aoforam financiados pela Funda¸c~aopara a Ci^enciae a Tecnologia (Bolsa SFRH/ BD/22825/2005). 4 Resumo Palavras-chave: splicing alternativo, regula¸c~aode splicing, bioinform´atica, microarrays Nos eucariotas, a transcri¸c~aodos genes pela RNA Polimerase II origina mol´eculas precursoras de RNA mensageiro (pr´e-mRNA),sendo necess´ariasv´ariasetapas de proces- samento at´e`aforma¸c~aodo RNA maduro (mRNA) que ´etransportado para o citoplasma, onde serve de molde para a s´ıntese proteica. Adicionalmente, a mesma mol´eculade pre-mRNA pode gerar diversos tipos de mRNA funcional devido ao splicing alternativo. Este processo consiste na inclus~aoou exclus~ao de regi~oesdo pr´e-mRNAe ´eum importante mecanismo respons´avel pela grande variedade de prote´ınas nos Eucariotas (Black, 2003). V´ariosestudos baseados em an´alisesde ESTs (expressed sequence tags) revelaram que mais de 60% dos genes humanos est~aosujeitos ao splicing alternativo, e esse n´umeroaumentou para 80% com o aparecimento dos microar- rays (Johnson et al., 2003; Kampa et al., 2004). Mais recentemente, as novas tecnologias de sequencia¸c~aode RNA revelaram 92 a 95% dos genes humanos sujeitos ao splicing al- ternativo (Wang et al., 2008a; Pan et al., 2008). O splicing do pr´e-mRNA est´aa cargo do spliceosoma, um complexo macromolecular formado a partir de v´ariaspequenas part´ıculasribonucleoproteicas nucleares (snRNPs) e outras prote´ınasreguladoras (Jurica and Moore, 2003; Wahl et al., 2009). Atrav´esde interac¸c~oesdo RNA e prote´ınasdo complexo com o pr´e-mRNA,os snRNPs medeiam o reconhecimento e subsequente liga¸c~ao`asjun¸c~oesex~ao-intr~ao(s´ıtiode splicing). A selec¸c~aoe identifica¸c~aoentre os diferentes s´ıtiosde splicing depende de m´ultiplas interac¸c~oesRNA-RNA e RNA-prote´ına que envolvem a liga¸c~aocooperativa de v´arias prote´ınasreguladoras (reguladores em trans) aos sinais reguladores n~aocodificantes na sequ^enciado pr´e-mRNA(regula¸c~aoem cis). Os sinais reguladores incluem sequ^encias curtas e muito degeneradas localizadas nos s´ıtiosde splicing e outras sequ^enciasregu- ladoras denominadas de activadores (enhancers) e silenciadores (silencers) localizadas em ex~oesou intr~oes.Os reguladores em trans s~aodesignados de factores de splicing e usual- mente classificadas como activadores ou repressores, dependendo se facilitam ou suprimem a liga¸c~aodos snRNPs aos s´ıtiosde splicing. i Resumo O processo de splicing alternativo ´eregulado em resposta a vias de sinaliza¸c~ao,e ´e espec´ıficoa fases de desenvolvimento e tipo de tecido. De acordo com o actual modelo, a regula¸c~aodo splicing alternativo resulta de interac¸c~oescombinat´oriasde v´ariasprote´ınas agindo positivamente e negativamente, e decis~oes de splicing espec´ıficasa um tipo de c´elula ou tecido resultam provavelmente de diferen¸casna concentra¸c~aoe/ou actividade destas prote´ınas(Matlin et al., 2005; Shin and Manley, 2004; Singh and Valc´arcel, 2005). Uma previs~aoimediata deste modelo ´eque a abund^anciarelativa das prote´ınas reguladoras de splicing deve variar de acordo com os tecidos. Ao longo das ´ultimasd´ecadascome¸caram a ficar dispon´ıveis dados em larga escala para abordar sistematicamente esta quest~ao, permitindo o desenvolvimento de meta- an´alisescomputacionais. A tecnologia dos microarrays alterou profundamente o modo de investiga¸c~ao,movendo de uma abordagem gene-a-gene para estudos globais e `aescala do genoma. Neste contexto, o presente estudo teve como objectivo gerar previs~oesbaseadas em microarrays para compreens~aodo c´odigodo splicing alternativo que controla e coordena o transcriptoma. Para explorar a hip´oteseda express~aoespec´ıficaa tecidos das prote´ınas de splicing, neste trabalho analisamos padr~oesde express~aog´enicaobtidos a partir de estudos de microarray anteriormente publicados. A an´alisecontemplou as v´ariasfam´ıliasde prote´ınas hnRNP, SR, cinases-SR, helicases de RNA, prote´ınassnRNP e muitas outras prote´ınas associadas com o splicing (Barbosa-Morais et al., 2006; Chen et al., 2007). Em primeiro lugar, o estudo incidiu na altera¸c~aoda express~aodos factores de splic- ing durante quatro tipos de diferencia¸c~aocelular do ratinho: miog´enese,adipog´enese, eritropoiese e espermatog´enese.Para identificar varia¸c~oesda express~aoespec´ıficasao tipo celular foi necess´ariocomparar dados de microarray provenientes de diferentes sistemas biol´ogicose ensaios experimentais. Para resolver este problema, foi desenvolvida uma nova abordagem que se baseia em m´etodos de regress~ao(Grosso et al., 2008). A minha an´alise revelou diferen¸casrobustas que distinguem um processo de diferencia¸c~aodos outros e es- tas assinaturas de express~aog´enicainclu´ıamprote´ınasdas v´ariasfam´ıliasdos factores de splicing. Em seguida, explorei as varia¸c~oesna express~aodos factores de splicing em v´ariosteci- dos humanos, de chimpanz´ee de ratinho. Comparando padr~oesde express~aodo c´erebro, test´ıculos,cora¸c~ao,f´ıgadoe rim, 104 genes apresentaram altera¸c~oesna express~aoespec´ıficas a tecidos, em pelo menos um organismo. A minha an´aliserevelou que o maior n´umero de factores de splicing diferencialmente expressos ocorreu no test´ıculoe no c´erebro,en- quanto que o f´ıgadoapresentou padr~oessemelhantes ao rim. Curiosamente, os resultados mostram que os dois tecidos com maior quantidade de splicing alternativo (Yeo et al., ii Resumo 2004; Pan et al., 2004; Clark et al., 2007) s~aoos que apresentam uma maior varia¸c~aona express~aode factores de splicing. Assim, os meus resultados mostram que assinaturas de factores de splicing est~aocorrelacionadas com padr~oesde splicing espec´ıficosde tecidos. Utilizando PCR quantitativo em tempo real confirmei 75% das previs~oesdos microar- rays para a miogenese e eritropoiese e 71% para v´ariostecidos. De um modo geral, eu identifiquei mais de 100 genes que apresentam uma express~aodiferencial associada a um determinado tecido ou processo de diferencia¸c~ao. Estes resultados mostraram que to- dos os genes das principais fam´ıliasde factores de splicing apresentam express~aog´enica diferencial, incluindo prote´ınascinases-SR e prote´ınasdos snRNP. O processo de splicing alternativo est´atamb´emassociado a doen¸cashumanas, incluindo cancro (Wang and Cooper, 2007; Cooper et al., 2009). S~aoconhecidas v´ariasmuta¸c~oesque afectam o splicing de oncogenes, genes supressores tumorais e outros genes relevantes para o cancro (Srebrow and Kornblihtt, 2006; Venables, 2006). Contudo, muitas das anomalias de splicing identificadas nas c´elulastumorais n~aoest~aoassociados com muta¸c~oesnos genes afectados. De facto, estudos recentes sugerem que as mudan¸casna express~aode factores de splicing podem desempenhar um papel fundamental na perturba¸c~aogeral do splicing que ocorre em muitos cancros (Kirschbaum-Slager et al., 2004; Karni et al., 2007; Kim et al., 2008; Ritchie et al., 2008). Com o objectivo de pesquisar eventuais associa¸c~oesentre a express~aode factores de splicing e padr~oesde splicing em cancro, realizei uma meta-an´aliseglobal que integra dados em larga escala de experi^enciasde microarrays em v´ariostipos de cancro. A evolu¸c~aoda tecnologia dos microarrays tem permitido explorar a express~aog´enicaao n´ıvel do ex~aoe estudar varia¸c~oesdos padr~oesde splicing em grande escala (Blencowe, 2006). Em primeiro lugar, estudei as varia¸c~oesde express~aog´enicade v´ariosfactores de splic- ing em 13 tipos de cancro: bexiga, c´erebro,mama, c´olon,es´ofago,cabe¸cae pesco¸co, rim, f´ıgado, pulm~ao,neuroblastoma, pr´ostata,tir´oidee vulva. Comparando cancro e correspondentes tecidos normais foram identificadas varia¸c~oespara 192 genes, que codi- ficam prote´ınasdas fam´ıliasdos factores de splicing snRNPs, hnRNPs, SRS, cinases-SR, RNA-helicases e outros reguladores de splicing. Os meus resultados tamb´emmostraram que a maioria dos factores de splicing com varia¸c~oesna express~aoeram essencialmente mais expressos em cancro (sobre-express~ao),e de facto foi observado um enriquecimento de factores de splicing entre todos os genes sobre-expressos. Alguns genes desregulados apareciam em v´arioscancros, sugerindo que alguns cancros podem apresentar as mesmas varia¸c~oesde factores de splicing. Em seguida, seleccionei um conjunto de eventos de splicing desregulados em cancro atrav´esda aplica¸c~aode uma metodologia de an´aliseexaustiva a dados de microarrays de splicing de estudos anteriores em cancro do c´olone pulm~ao.Foram encontrados ex~oescon- iii Resumo tendo s´ıtiosde liga¸c~aopara SF2/ASF obtidas a partir dados de CLIP-seq (Sanford et al., 2009) para SF2/ASF, que ´esobre-expresso em ambos os cancros. Foram tamb´emidentifi- cadas pequenas sequ^enciasenriquecidas associadas com eventos de splicing de cancro