韓藥作誌(Korean J. Medicinal Crop Sci.) 28(5) : 325 − 330 (2020) ISSN(Print) 1225-9306 ISSN(Online) 2288-0186 http://www.medicinalcrop.org http://dx.doi.org/10.7783/KJMCS.2020.28.5.325 rDNA FISH를 이용한 큰조롱과 넓은잎큰조롱의 세포유전학적 연구 김수현 1 · 김우철 2 · 김현희 3 · 허 권4† Cytogenetical Study of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Su Hyun Kim1, Woo Cheol Kim2, Hyun Hee Kim3 and Kweon Heo4† ABSTRACT Received: 2020 July 9 Background: Dried tuberous roots of Cynanchum wilfordii are known to relieve menopause 1st Revised: 2020 August 5 symptoms. However, the dried roots of C. wilfordii are morphologically similar to those of C. 2nd Revised: 2020 August 20 auriculatum, which makes it difficult to distinguish when used as a medicine. Various comparative 3rd Revised: 2020 August 26 studies have focused on chemical or molecular analysis of these roots. However, the differences Accepted: 2020 August 26 between the two species at the cytogenetic level based on chromosome structure and composition This is an open access article remain to be elucidated. distributed under the terms of the Methods and Results: For chromosome slides, the roots were fixed in 8-hydroxyquinoline, Creative Commons Attribution digested with enzyme mixture, and spread on slides. 5S and 45S rDNA were used as cytogenetic Non-Commercial License (http:// markers for the analysis of nuclear genomes by FISH. The chromosome number of the two species creativecommons.org/licenses/ was 2n = 22, with a relatively short length, 1.13 ㎛ - 4.24 ㎛ and 1.00 ㎛ - 3.42 ㎛ with respect to by-nc/3.0/) which permits unrestricted each other. Both species represent one pair of 5S and 45S rDNA signal on chromosome 1, at the non-commercial use, distribution, proximal region and peri-centromeric region, respectively. and reproduction in any medium, Conclusions: These preliminary cytogenetic data using FISH in C. wilfordii and C. auriculatum provided the original work is properly Cynanchum cited. could be valuable for the comprehension of genome history. Key Words: Cynanchum wilfordii, Cynanchum auriculatum, Chromosome, Fluorescence in situ hybridization 서언 al., 2003; Shan et al., 2006). 넓은잎큰조롱의 덩이뿌리는 우피소 (牛皮消) 또는 이엽우피소라 하여 항암 (抗癌), 보간 큰조롱 [Cynanchum wilfordii (Maxim.) Fook. f.]과 넓은잎 (保肝), 고지혈증 (高脂血症) 등을 치료하는 데 사용되어왔다 큰조롱 (Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)은 협죽도 (Ham et al., 2007; Peng et al., 2008). 그러나 한국소비자 과 (Apocynaceae) 박주가리아과 (Asclepiadoideae)에 속하는 원 (Korea Consumer Agency)과 미국 식약처 (Food and 다년생식물로 한국과 중국에서 약용작물로 활용되어왔다 Drug Administration)는 이엽우피소의 추출물로부터 유산의 위 (Chase et al., 2016). 험성이 높아진다는 연구보고서를 바탕으로 독성 식물 리스트 동북아시아 지역의 양지바른 산이나 들에 분포하며, 건조 에 등재하고 사용을 금지하고 있다 (Han and Luan, 1984; 된 덩이뿌리가 다양한 질병을 치료하는 데 사용되어 왔다. Lu et al., 1998). 큰조롱의 덩이뿌리를 백수오라 하며, 백모 (白毛), 강장 (强 최근, 국내에서는 약용작물로부터 추출된 건강기능식품의 수 壯), 보혈 (補血), 신경쇠약 (神經衰弱), 동맥경화 (動脈硬化) 요가 급격히 증가하고 있다. 특히, 백수오는 갱년기 증상을 완 등에 효능이 보고되어있다 (Hwang et al., 1999; Kim et 화하는 효과가 밝혀지며 주목받고 있다 (Chang et al., 2012). †Corresponding author: (Phone) +82-33-250-6412 (E-mail) [email protected] 1강원대학교 생물자원과학과 석사 / Master’s degree, Department of Applied Plant Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea. 2강원대학교 생물자원과학과 석사 / Master’s degree, Department of Applied Plant Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea. 3삼육대학교 생명과학과 교수 / Professor, Department of Life Science, Sahmyook University, Seoul 01795, Korea. 4강원대학교 생물자원과학과 교수 / Professor, Department of Applied Plant Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea. 325 김수현 · 김우철 · 김현희 · 허 권 그러나, 백수오와 형태적으로 유사한 이엽우피소는 높은 생산 다. 근단은 2 mM 8-hydroxyquinoline에 침지하여 12℃에서 성을 바탕으로 정확한 감별법이 부재한 시장에 혼용되고 있다 4 시간 처리하였고, Carnoy`s solution (absolute ethanol : (Jiang et al., 2011). 또한, 백수오는 주로 추출물이나 분말 형 glacial acetic acid, 3 : 1, v/v)에 12 시간 처리하여 70% 태로 가공되어 판매되기 때문에 정확한 분별 기준의 부재는 ethanol에 보관하며 실험 재료로 사용하였다. 소비자의 혼란을 초래하고 있다 (Song et al., 2004; Kim et 고정한 근단의 분열조직을 절단하여 효소 혼합액 (4% al., 2015). 따라서 다방면의 연구를 통한 기초 정보의 축적은 cellulase onzuka R-10, 1% pectolylase Y-23, 100 mM 필수적이라 할 수 있다. citric buffer)에 침지시켜 37℃에서 60 분 처리하였다. 이후 큰조롱과 넓은잎큰조롱을 구분하기 위한 약리적 (Lee et al., 분열조직을 Carnoy`s solution으로 수세하여 끝이 뭉뚝한 바늘 2013; Lee and Lee, 2015), 분자유전학적 (Kim et al., 로 분쇄하고 원심분리하여 세포를 가라앉혔다. 마지막으로 2013; Kim et al., 2018), 형태적 (Kim et al., 2014; Doh 90% aceto-ethanol (9 : 1, v/v)로 다시 혼합한 후, 슬라이드에 et al., 2015; Nam and Chung, 2015) 분야에서는 이미 연구 퍼트리고 상온에서 건조시켰다. 광학현미경 하에서 분열상이 가 진행되었으나, 게놈의 특성을 밝히는데 유용한 세포유전학 양호한 염색체를 선발하였고 이를 FISH에 이용하였다. 적 접근을 통한 연구는 염색체 수가 2n = 22라는 정보만이 밝혀져 있으며 (Albers and Meve, 2001; Yamashiro et al., 3. FISH 2002) 세부 연구정보는 부재한 실정이다. Probe 제작과 FISH는 Waminal과 Kim (2012)에 기술된 방 FISH (fluorescence in situ hybridization)를 적용한 세포유 법을 참고하여 수행하였다. 5S와 45S rDNA 서열은 Son 등 전학적 접근은, 형광물질의 탐침을 통한 마커의 위치를 가시 (2010, 2012)에서 기술한 서열을 활용하였다. 5S와 45S 화하여 게놈 구조, 계통학적 관계 및 배수성 연구 등에서 활 rDNA는 각각 digoxigenin-11-dUTP (Apexbio Tech, Houston, 용되고 있다 (Tessadori et al., 2004; Devi et al., 2005; TX, USA)과 biotin-16-dUTP (Roche, Basel, Switzerland)로 Ohmido et al., 2010). 특히, 종간 유연관계의 비교 분석에 활 label 되었다. 혼성화 혼합액 (50% formamide, 10% dextran 용되어 분류학적 관계를 규명하고 유전자의 이동 과정을 추적 sulfate, 2 × salin sodium citrate buffer, probes)은 90℃에서 함으로써 게놈의 이해도를 높이는 데 도움을 주고 있다 (Jiang 5 분간 변성시킨 후 급냉시켰다. 슬라이드에 혼성화 혼합액을 and Gill 2006; Chester et al., 2010). 주로 식물에 보편적으 적하하여, 37℃ humid chamber (Sanyo Electric Co., Ltd., 로 존재하며 높은 반복 빈도를 보이고, 서로 다른 유전자좌에 Tokyo, Japan)에서 18 시간 이상 처리하였다. 존재하는 5S와 45S rDNA를 마커로 활용한다 (Kato et al., 슬라이드는 42℃의 20% formamide와 detection buffer에서 2004; Pellerin et al., 2019). 따라서 본 연구는 두 종의 세포 5 분씩 수세한 후, 1% Cy3-streptavidin (BioLegen, SanDiego, 유전학적 데이터를 확인하여 기초 데이터를 확보하고, 유전체 CA, USA)와 anti-digoxigenin-FITC (Sigma-Aldrich Co., St. 연구를 위한 기반을 마련하여 백미꽃속 게놈에 대한 이해도를 Louis, MO, USA) 혼합액을 슬라이드에 첨가하여 37℃에서 1 높이고자 하였다. 시간 이상 반응시켰다. 슬라이드는 detection buffer에서 5 분씩 3 번 그리고 70%, 90%, 100% 에탄올에서 각각 3 분씩 수세 재료 및 방법 하였다. Vectashield를 포함한 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)를 1. 식물재료 슬라이드에 도포하여 커버 슬립을 덮은 후, 공초점 현미경 큰조롱 [Cynanchum wilfordii (Maxim.) Fook. f.]과 넓은잎 (LSM 880, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 으로 signal 큰조롱 (이엽우피소, Cynanchum auriculatum Royle ex 을 확인하고 사진을 촬영하였다. Adobe Photoshop CS6를 Wight)의 종자는 농촌진흥청 원예특작과학원 인삼특작부 (충 이용하여 이미지를 편집하였고, 염색체의 길이는 Image J 북 음성)에서 분양받았으며, 분양받은 종자를 24 시간 침종 (Wayne rasband, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석하 후, wagner pot에 파종하여 발근을 유도하여 실험에 사용하 였다. 였다. 증거표본 확보를 위하여 각각의 식물체를 석엽표본으로 만 결과 및 고찰 들어 식물표본관에 수납하였다 (Voucher No: KWNU No. 2019035 & KWNU No. 2019036). 핵형분석은 종간 유연관계뿐만 아니라 종의 기원 및 다양성 을 판단하기에 유용한 방법으로 활용된다 (Bhat and Wani, 2. 염색체 슬라이드 준비 2017). 관련된 정보는 염색체 수, 크기, 형태, satellite의 위치, 염색체 슬라이드 준비는 Kato 등 (2004)의 방법을 참고하였 그리고 banding 패턴 등이 있다 (Guerra, 2008). 326 FISH를 이용한 큰조롱과 넓은잎큰조롱의 세포유전학적 연구 Fig. 1. DAPI staining on somatic metaphase chromosomes. (A) C. wilfordii (2n = 22) and (B) C. auriculatum (2n = 22). Scale bars = 2 ㎛. Table 1. C. wilfordii C. auriculatum. 본 연구에서는 DAPI 염색을 통해 중기 상태의 염색체를 선 Karyotype analysis data of and 발하여 이전 연구보다 정확한 염색체의 수, 크기 등 특징들을 Chromosome 1) Number of Signal distribution Species length (㎛) 확인하였고, Fig. 1에 나타내었다. 두 종 모두 5 개 이상의 chromosome Mean 5S rDNA 45S rDNA 세포를 분석하였으며, 길이에 따라 각 염색체에 번호를 붙이 1 3.78±0.39* ++ 고 길이를 측정하여 Table 1에 나타내었다. 큰조롱 [Cynanchum wilfordii (Maxim.) Fook. f.]과 넓은 2 2.12±0.20 - - 잎큰조롱 (Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)을 포 3 1.99±0.15 - - 함한 백미꽃속 (Cynanchum)에 포함된 대부분의 식물 염색체 4 1.89±0.13 - - 수는 로 밝혀져 있다 5 1.79±0.15 - - 2n = 22 (Albers and Meve, 2001; Cynanchum Yamashiro et al., 2002). wilfordii 6 1.74±0.18 - - 본 연구에서도 두 종 모두 2n = 2x = 22로, 기본 염색체 7 1.68±0.16 - - 수는 x = 11인 이배체 식물임을 재확인하였다. 두 종의 경우, 8 1.58±0.19 - - 핵형 수준에서는 염색체의 길이로 차이를 확인할 수 있었다. 9 1.50±0.12 - - 큰조롱은 염색체 길이의 범위가 1.31 ㎛ - 4.24 ㎛로 확인되 10 1.45±0.11 - - 었다. 가장 긴 1 번 염색체는 평균 길이가 3.78 ± 0.39 ㎛, 11 1.36±0.08 - - 가장 짧은 11 번 염색체의 평균 길이는 1.36 ± 0.08 ㎛로 확 1 2.81±0.49 + + 인되었다. 넓은잎큰조롱의 염색체 길이 범위는 1.00 ㎛ - 3.42 2 1.76±0.38 - - ㎛ 로 확인되었다. 가장 긴 1 번 염색체는 평균 길이는 2.81 3 1.72±0.32 - - ± 0.49 ㎛, 가장 짧은 11 번 염색체의 평균 길이는 1.27 ± 4 1.67±0.28 - - 0.21 ㎛로 확인되었다. 11 쌍의 염색체 모두 큰조롱의 염색체 5 1.63±0.30 - - Cynanchum 가 넓은잎큰조롱보다 평균적으로 0.2 ㎛ 정도 더 길이가 긴 auriculatum 6 1.59±0.29 - - 것을 확인하였다 . 7 1.56±0.28 - - 핵형은 동원체를 기준으로 단완과 장완의 비율로 분석하지 8 1.54±0.30 - - 만 이번 연구에서는 일반적인 염색 방법이나 염색으로 , DAPI 9 1.46±0.28 - - 정확한 중기 염색체상을 얻지 못하였다.