Identifikation des Mehltauresistenzlocus Rpv10 für die Rebenzüchtung Zur Erlangung des akademischen Grades eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (Dr. rer. nat.) Fakultät für Chemie und Biowissenschaften Karlsruher Institut für Technologie (KIT) – Universitätsbereich genehmigte DISSERTATION von Dipl.-Biol. Florian Schwander aus Freiburg im Breisgau Dekan: Prof. Dr. Martin Bastmeyer Referent: apl. Prof. Dr. Eva M. Zyprian Korreferent: Prof. Dr. Holger Puchta Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2011 Die Durchführung dieser Arbeit erfolgte am Julius-Kühn-Institut (JKI), Institut für Rebenzüchtung Geilweilerhof und wurde durch die finanzielle Unterstützung vom Forschungsring des Deutschen Weinbaus (FDW) bei der Deutschen Landwirtschafts- Gesellschaft (DLG) über das Projekt: „Entwicklung von molekularen Markern für Resistenzeigenschaften aus der asiatischen Wildrebee Vitis amurensis gegenüber dem Falschen Mehltau Plasmopara viticola“ ermöglicht. Teile dieser Arbeit wurden bereits in der Fachzeitschrift Theoretical and Applied Genetics (Volume 124, Number 1, 163-176) unter dem Titel: Rpv10: a new locus from the Asian Vitis gene pool for pyramiding downy mildew resistance loci in grapevine (DOI: 10.1007/s00122- 011-1695-4) veröffentlicht. Die aus dieser Veröffentlichung verwendeten Abbildungen wurden aus Gründen des Copyrights durch Zitierung gekennzeichnet. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................. I ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................... IV TABELLENVERZEICHNIS ...................................................................................... VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................... VIII ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 1 ABSTRACT ................................................................................................................ 2 1 EINLEITUNG ............................................................................................ 3 1.1 Resistenzzüchtung bei Reben .............................................................................. 4 1.1.1 Genetische Ressourcen für Resistenz ..................................................................... 4 1.1.2 Markergestützte Selektion ...................................................................................... 5 1.2 Falscher Mehltau der Rebe ................................................................................. 7 1.2.1 Infektionszyklus und –verlauf ................................................................................ 8 1.2.2 Bekämpfungsstrategien ........................................................................................ 10 1.3 Pflanzliche Resistenzen ...................................................................................... 10 1.3.1 Präformierte Resistenz ......................................................................................... 11 1.3.2 Pathogenerkennung .............................................................................................. 12 1.3.3 Induzierte Resistenzen .......................................................................................... 13 1.4 Genetische Kartierung ....................................................................................... 16 1.4.1 Erstellen der genetischen Karte ............................................................................ 16 1.4.2 QTL-Analyse ........................................................................................................ 17 1.5 Zielsetzung .......................................................................................................... 18 I Inhaltsverzeichnis 2 MATERIAL & METHODEN .................................................................... 20 2.1 Material ............................................................................................................... 20 2.1.1 Pflanzenmaterial ................................................................................................... 21 2.1.2 Plasmopara viticola-Sporenmaterial .................................................................... 21 2.1.3 Genetische Ressourcen ......................................................................................... 22 2.2 Methoden ............................................................................................................. 22 2.2.1 Ermittlung der Plasmopara-Resistenz durch Blattscheibentests .......................... 22 2.2.2 Stilben-Analyse mittels HPLC ............................................................................. 23 2.2.3 Kallose-Nachweis ................................................................................................. 24 2.2.4 DNA-Extraktion ................................................................................................... 24 2.2.5 SSR-Marker .......................................................................................................... 24 2.2.6 Polymerasekettenreaktion und Fragmentlängenanalyse ...................................... 27 2.2.7 Erstellen der genetischen Karten .......................................................................... 27 2.2.8 QTL-Analysen ...................................................................................................... 28 2.2.9 Statistische Tests auf Normalverteilung ............................................................... 28 2.2.10 Abgleich mit den Genomsequenzen ..................................................................... 28 3 ERGEBNISSE ........................................................................................ 29 3.1 Phänotypisierung der Plasmopara-Resistenz ................................................... 29 3.2 Stilben-Analyse ................................................................................................... 33 3.3 Kallose-Nachweis ................................................................................................ 34 3.4 Genetische Kartierung ....................................................................................... 34 3.5 QTL-Analysen .................................................................................................... 39 3.6 Effekt der Pyramidisierung von Resistenzen ................................................... 43 3.7 Abgleich des Rpv10-Locus mit dem Referenzgenom ...................................... 45 3.8 Stammbaum der Kreuzungspopulation ........................................................... 47 3.9 Untersuchung ausgewählter Sorten auf den Rpv10-Locus ............................. 51 3.10 Untersuchung genetischer Ressourcen ............................................................. 52 II Inhaltsverzeichnis 4 DISKUSSION ......................................................................................... 58 4.1 Phänotypische Evaluierung der Plasmopara-Resistenz .................................. 58 4.2 Stilben-Analyse und Kallose-Nachweis ............................................................ 59 4.3 Genetische Karte und QTL-Analysen .............................................................. 60 4.4 Abgleich mit den veröffentlichten Genomsequenzen ...................................... 64 4.5 Abstammungsanalysen ...................................................................................... 66 4.6 Genetische Identifizierung von Rpv10+-Ressourcen ........................................ 67 4.7 Schlussfolgerungen ............................................................................................. 69 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... IX ANHANG .................................................................................................................. XX III Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schadbild des Falschen Mehltaus. a) Infizierte Blätter mit „Ölflecken“ und ersten Nekrosen. b) „Ölflecken“ auf der Blattoberseite und durch die Sporangienträger gebildeter mehlartiger Belag auf der Blattunterseite. c) Nach dem Befall der jungen Gescheine entstandene „Lederbeeren“. ..................................................................................................................... 7 Abbildung 2: Schematischer Infektionszyklus von Plasmopara viticola. Der äußere (rote) Zyklus stellt die sexuelle Vermehrung dar, während der innere (grüne) Zyklus die asexuelle Vermehrung während der Vegetationsperiode zeigt (Quelle: N. Schöppe, Staatliches Weinbauinstitut Freiburg). ............................................................................................................................. 9 Abbildung 3: Trauben der beiden Kreuzungseltern ........................................................................ 19 Abbildung 4: Beispiele für infizierte Blattscheiben der Boniturnoten 1, 5 und 9 (von links nach rechts; 2,5-fach vergrößerte Darstellung). ........................................................................................ 23 Abbildung 5: Häufigkeitsverteilung der Plasmopara viticola Resistenzklassen (9: keine Sporangienträger, 7: eins bis fünf, 5: sechs bis zwanzig, 3: mehr als zwanzig Sporangienträger, 1: dichter Sporangienträgerteppich) in der Kreuzungspopulation Gf.Ga-52-42 x ‘Solaris’. Die Daten basieren auf dem Mittelwert aus vier unabhängigen Bonituren mit je