INSTITUTO BIOLÓGICO PÓS-GRADUAÇÃO Estudos morfológicos e moleculares de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides Samantha Zanotta Dissertação apresentada ao Instituto Biológico, da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, para obtenção do título de Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio. Área de Concentração: Sanidade Vegetal Orientador(a): Prof (a). Dr (a). Ricardo Harakava São Paulo 2013 II III SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO BIOLÓGICO Pós-Graduação Av. Cons. Rodrigues Alves 1252 CEP 04014-002 - São Paulo – SP [email protected] FOLHA DE APROVAÇÃO Nome do candidato: Samantha Zanotta Título: Estudos morfológicos e moleculares de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides Orientador (a): Prof. Dr. Ricardo Harakava Dissertação apresentada ao Instituto Biológico da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios para obtenção do título de Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio. Área de Concentração: Sanidade Vegetal Aprovada em: Banca Examinadora Assinatura: *Prof. (a) Dr.(a): *Instituição: Assinatura: *Prof. (a) Dr.(a): *Instituição: Assinatura: *Prof. (a) Dr.(a): *Instituição: *Deixe todos os campos em branco para serem preenchidos no dia do exame de Defesa da Dissertação IV Dedico àqueles que são pilares de minha vida e sem os quais a mesma não teria sentido: meus pais, Carlos e Glória, meu irmão, Brunno, meu avô, Antônio e minha avó Maria (in memorian), por dedicarem parte de suas vidas, na minha formação pessoal e profissional, pelo amor a mim dedicado e por me proporcionarem paz na alma e felicidade na vida. Amo vocês! V Agradecimentos Primeiramente e acima de tudo agradeço a Deus, por ter me dado à oportunidade de concretizar minhas metas. Aos meus pais, Carlos e Glória, por sempre me proverem de ensinamentos para a vida e para todas as questões em meus momentos mais difíceis, sem que, para isso, exigissem nada em troca. Pelo amor incondicional, orações, confiança, apoio e exemplo de vida a seguir. Ao meu irmão, Brunno, pela atenção e carinho incondicionais dedicados a minha pessoa, tanto nos momentos comemorativos como nos tumultuados. Sempre desenvolveu a função de irmão mais velho, aquele que protege e ampara. Tenho uma admiração imensa por você! Ao Dr. Ricardo Harakava, meu orientador, por me aceitar como orientada e pelas oportunidades de aprendizado que foram e continuarão a ser de valor inestimável para a continuidade da minha carreira como cientista, pesquisadora e professora. Agradeço também pela paciência, além da amizade formada. A Dra. Marta Helena Vechiato Maziero, por ter aberto as portas do Laboratório de Patologia de Sementes – Instituto Biológico (São Paulo), confiando na minha competência. A todas as suas contribuições, ensinamentos e assessoria na área de patologia de sementes e também nas suas valiosas correções, sugestões e auxílio na resolução de problemas para o bom andamento do trabalho. Ainda, agradeço pelos materiais que nunca me foram negados durante qualquer experimento realizado. Ao Instituto Biológico de São Paulo, pela oportunidade de ser aluno bolsista de mestrado (CAPES). Poder vivenciar o trabalho de um instituto com tanta história e de grande importância nacional certamente ajudou na minha formação como profissional. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa de estudo. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento do projeto de pesquisa. Aos membros da banca de avaliação Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano, Dr. José Ivanildo de Souza, Dr. Jesus Guerido Töfoli, Dra. Carmen Lídia Amorim Pires Zottarelli pelas correções, comentários dos manuscritos tanto da qualificação quanto da versão final da tese. Essa colaboração foi importantíssima, melhorando a qualidade e valorizando o trabalho final. Aos pesquisadores: Dra. Christiane Ceriani Aparecido, Dra. Margarida Fumiko Ito, Dra Aparecida de Souza Tanaka, Dr. Alderi Emídio de Araújo, MSc. Augusto César Pereira VI Goulart e Dr. Yeshmant Ramchandra Mehta, que gentilmente, cederam os isolados utilizados neste trabalho. A Fabiana, pela ajuda com os estudos morfológicos, disponibilidade durante a execução deste trabalho e por toda compreensão. Ao Wilson e a Alyne pela ajuda nos momentos corridos no Laboratório de Patologia de Sementes. Agradeço aos professores do curso de Pós Graduação do IB, amigos e colegas pelo agradável convívio e companheirismo. A todos os meus amigos que me apoiaram, me corrigiram, me aturaram, souberam entender a importância deste momento do trabalho que por tantas vezes justificou a minha ausência e me fizeram saber que, antes de tudo, a vida sem eles não teria graça alguma. Sem duvida, este, que até o momento é o capítulo mais louco da minha vida, não poderia de deixar de ser escrito sem a presença de vocês. Enfim, a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente na elaboração deste trabalho, quer me criticando, quer incentivando, gostaria de manifestar meus sinceros agradecimentos. VII Determinação coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o sucesso. Se estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los. Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de orgulho. Dalai Lama VIII ZANOTTA, S. Estudos morfológicos e moleculares de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides. SÃO PAULO. 2012. Dissertação (Mestrado em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio) – Instituto Biológico. RESUMO Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides (Cgc), agente causal da ramulose, é um dos principais patógenos que afetam o algodoeiro. A diferenciação desta variedade de Colletotrichum gossypii (Cg), causadora da antracnose que se desenvolve sobre as sementes de algodão é muito difícil quando se utilizam métodos rotineiros de patologia de sementes, baseando-se apenas nas características morfológicas. O desenvolvimento de uma metodologia para detecção e diferenciação de Cgc em sementes seria de grande valia para a diagnose destes patógenos em laboratórios de rotina, resultando na comercialização de sementes de boa qualidade sanitária. Diante disso, este trabalho teve como objetivos: estudar características morfológicas do Cgc; estudar características moleculares do Cgc; desenvolver um método eficiente, rápido e de fácil aplicação na detecção e na identificação de Cgc em sementes e plantas de algodão utilizando a técnica PCR; e realizar uma pesquisa com produtores de algodão sobre a ocorrência da ramulose. Para isso, vinte isolados de Cgc e três isolados de Cg de diferentes regiões foram obtidos. Foi efetuado o teste de patogenicidade para confirmação da identidade dos isolados, baseando-se nos sintomas característicos da doença. Os experimentos para a caracterização do crescimento, tipo e coloração micelial foram realizados utilizando-se dois meios de cultura batata- dextrose-ágar (BDA) e Czapek (CZP), e duas temperaturas de incubação, 25 e 27 °C. O crescimento micelial foi avaliado aos cinco e dez dias de incubação. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com três repetições de cada isolado e os dados foram analisados em esquema fatorial (3x2x2) aplicando-se o teste Tukey a 5% de probabilidade. As características miceliais foram avaliadas de acordo com a morfologia e coloração de micélio. Para os estudos moleculares, foi realizada a extração de DNA, a IX amplificação com iniciadores universais de regiões conservadas (ITS e Beta-tubulina) e sequenciamento dos produtos da amplificação. O teste de patogenicidade comprovou a identidade de todos os isolados. Os resultados do teste de caracterização do crescimento, tipo e coloração micelial mostraram que isolados de Cgc da mesma variedade apresentam variabilidade, tendo em vista as diferenças de crescimento, tipo e coloração micelial, em diferentes meios de cultura e temperaturas. No estudo molecular, foram observadas diferenças significativas nas sequências dos produtos amplificados para o gene da Beta- tubulina. A partir destas diferenças, foi desenhado um par de iniciadores específicos para Cgc. No teste de especificidade dos iniciadores, foi possível a observação do fragmento esperado de 230 pb somente para isolados de Cgc. Para detecção do patógeno em sementes e plantas de algodão os métodos desenvolvidos mostraram-se confiáveis. Palavras-chave: Algodoeiro, Colletotrichum gossypii, Gossypium spp., Iniciadores específicos, Ramulose. X ZANOTTA, S. Morphological and molecular studies of Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides. SÃO PAULO. 2012. Dissertation (Master in Health, Food Safety and Environmental Agribusiness) - Biological Institute Abstract Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides (Cgc), the causal agent of ramulose, is the most important pathogen affecting cotton. The differentiation of this variety and Colletotrichum gossypii (Cg) that causes anthracnose, both of which that can develop on cotton seeds, is very difficult when using routine methods of seed pathology based solely on morphology. The development of a methodology for detection and differentiation of Cgc from seeds, would be of great value for the diagnosis of these pathogens in routine laboratories, resulting in the commercialization of seeds with good sanitary quality. Thus, this work has as objectives: to study the morphological characteristics of Cgc; to study the genetic variability of Cgc; to develop an efficient, fast and easy method