LÁGYROTHADÁST, ILLETVE HAJTÁSSZÁRADÁST OKOZÓ BAKTÉRIUMOS BETEGSÉGEKKEL SZEMBENI ELLENÁLLÓKÉPESSÉG VIZSGÁLATA IN VITRO BURGONYA- ÉS ALMANÖVÉNYEKEN Doktori értekezés Hudák Ildikó Témavezető: Dr. Tóth Magdolna, DSc egyetemi tanár Társkonzulens: Dr. Hevesi Mária, CSc Budapesti Corvinus Egyetem Gyümölcstermő Növények Tanszék Budapest 2014 A doktori iskola megnevezése: Kertészettudományi Doktori Iskola tudományága: Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok vezetője: Dr. Tóth Magdolna egyetemi tanár, DSc Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Gyümölcstermő Növények Tanszék Témavezető: Dr. Tóth Magdolna egyetemi tanár, DSc Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Gyümölcstermő Növények Tanszék Társkonzulens: Dr. Hevesi Mária ny. tudományos főmunkatárs, CSc. Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Gyümölcstermő Növények Tanszék A jelölt a Budapesti Corvinus Egyetem Doktori Szabályzatában előírt valamennyi feltételnek eleget tett, az értekezés műhelyvitájában elhangzott észrevételeket és javaslatokat az értekezés átdolgozásakor figyelembe vette, azért az értekezés nyilvános vitára bocsátható. Dr. Tóth Magdolna Dr. Tóth Magdolna Az iskolavezető jóváhagyása A témavezető jóváhagyása 2 A Budapesti Corvinus Egyetem Élettudományi Területi Doktori Tanács 2014. június 3-i határozatában a nyilvános vita lefolytatására az alábbi Bíráló Bizottságot jelölte ki: BÍRÁLÓ BIZOTTSÁG: Elnöke Palkovics László, DSc Tagjai Király Ildikó, PhD Kruppa József, PhD Papp István, PhD Schwarczinger Ildikó, PhD Opponensek Ficzek Gitta, PhD Janda Tibor, DSc Titkár Király Ildikó, PhD 3 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 6 2.1. A vizsgálatba vont növényfajok szerepe a termesztésben és a mikroszaporításban 6 2.1.1. A burgonya jelentősége és mikroszaporításának lehetősége 6 2.1.2. Az alma jelentősége és mikroszaporításának lehetősége 8 2.2. A vizsgált baktériumfajok 11 2.2.1. A burgonyát károsító baktériumfajok, az előidézett betegségek és a védekezési lehetőségek 11 2.2.2. Az almát károsító baktériumfaj 22 2.3. Kiemelések a növényi stresszfolyamat ismeretköréből és a növények antioxidáns védelmi rendszeréből 32 3. A KUTATÁSOK CÉLJA 36 4. ANYAG ÉS MÓDSZER 38 4.1. Felhasznált anyagok 38 4.1.1. Baktériumfajok azonosítása, biokémiai tulajdonságaik és virulenciájuk vizsgálata 38 4.1.2. Burgonya - és almafajtákból előállított in vitro növények 40 4.2. A fertőzések és tünetértékelések vizsgálati módszerei 40 4.2.1. Burgonyafajták hajtásfertőzése in vitro körülmények között 41 4.2.2. Burgonya mikrogumó fertőzése in vitro körülmények között 43 4.2.3. Primer burgonyagumó fertőzése üvegházi körülmények között 44 4.2.4. Mikroszaporított almafajták hajtásfertőzése 45 4.3. Biokémiai vizsgálatok anyaga és módszerei 48 4.3.1. A kísérletbe bevont növényfajok/fajták és mintavételek 48 4.3.2. Vizsgálati módszerek 48 4.3.2.1. Peroxidáz enzimaktivitás fotometriás meghatározása 48 4.3.2.2. Szénhidráttartalom meghatározása 49 5. EREDMÉNYEK 50 5.1. Az API 20E és API 50CH tesztetek eredményei 50 5.2. Burgonyafajták fogékonysága a baktériumfajokkal szemben 52 5.2.1. In vitro burgonyafajták fogékonysága a hajtásfertőzés alapján 52 4 5.2.1.1. A Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum fertőzés hatása 54 5.2.1.2. A Dickeya dadantii fertőzés hatása 56 5.2.1.3. Baktérium sejtszám meghatározása 58 5.2.2. Burgonya mikrogumók fogékonysága a gumófertőzés alapján 61 5.2.2.1. A Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum fertőzés hatása 61 5.2.2.2. A Dickeya dadantii fertőzés hatása 63 5.2.3. Primer burgonyagumók fogékonysága a gumófertőzés alapján 66 5.2.3.1. A Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum fertőzés hatása 66 5.2.3.2. A Dickeya dadantii fertőzés hatása 67 5.3. Almafajták fogékonysága 69 5.3.1. Baktérium sejtszám meghatározása 71 5.4. Biokémiai vizsgálatok eredményei 73 5.4.1. Peroxidáz enzimaktivitás változások Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum fertőzés következtében 73 5.4.2. Szénhidráttartalom alakulása Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum fertőzés következtében 74 5.4.3. Peroxidáz enzimaktivitás változások Dickeya dadantii fertőzés következtében 76 5.4.4. Szénhidráttartalom alakulása Dickeya dadantii fertőzés következtében 77 5.4.5. Peroxidáz enzimaktivitás változások Erwinia amylovora fertőzés következtében 79 5.4.6. Szénhidráttartalom alakulása Erwinia amylovora fertőzés következtében 80 5.5. Új tudományos eredmények 85 6. MEGVITATÁS, KÖVETKEZTETÉSEK 86 7. ÖSSZEFOGLALÁS 92 8. SUMMARY 95 M1 IRODALOMJEGYZÉK 98 M2 TÁBLÁZATOK 106 9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 117 5 Rövidítések jegyzéke APX aszkorbát peroxidáz CAT kataláz Dd Dickeya dadantii Ea Erwinia amylovora EDTA etiléndiamin-tetraecetsav FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Fi fertőzési index GR glutation reduktáz H2O2 hidrogén-peroxid HPLC High Pressure Liquid Chromatography KSH Központi Statisztikai Hivatal MS Murashige and Skoog táptalaj NAD(P)H oxidáz nikotinsavamid adenin dinukleotid foszfát-oxidáz Pca Pectobacterium carotovorum subsp. artosepticum Pcc Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PLRV potato leafroll virus POD peroxidáz PVA Potato Virus A PVM Potato Virus M PVS Potato Virus S PVX Potato Virus X PVY Potato Virus Y ROS Reactive Oxygen Species SOD szuperoxid dizmutáz SPSS Statistical Package for the Social Sciences U unit 6 1. BEVEZETÉS A környezeti és természeti tényezők változása új biotikus és abiotikus stresszfaktorok megjelenését idézte elő hazánkban is. Fontos nemesítési cél a megfelelő termésbiztonság elérése, amelyet döntően befolyásol egy adott növényfaj/fajta stressztűrése, azaz a káros biotikus és abiotikus hatásokkal szembeni ellenállóságuk mértéke. Az ilyen stresszhatások közül hazánkban az utóbbi években jelentős termésveszteségeket idéztek elő a különböző baktériumos betegségek, így az Erwinia fajok okozta elváltozások is. A különböző Erwinia fajok egymástól teljesen eltérő betegségtüneteket váltanak ki a gazdanövényeken, számos növény mellett a régiónkban nagy jelentőséggel bíró burgonyán és almán idéznek elő jelentős károsodásokat. A burgonyát károsító Erwinia fajok (Erwinia carotovora subsp. carotovora és Erwinia carotovora subsp. atroseptica), valamint az Erwinia chrysanthemi) gazdanövényeik húsos növényi szöveteiben pektinbontó képességüknél fogva ún. lágyrothadást okoznak. Ezzel szemben az Erwinia amylovora pektin bontására nem képes, hanem a Rosaceae család számos növényfaján hajtáselhalást, rákosodást idéz elő. A molekuláris biológiai kutatások eredményeként a burgonyát károsító baktériumfajok taxonómiai besorolása az ismeretek bővülése következtében többször változott az évek során (Waldee, 1945, Hauben et al., 1998). Az Erwinia nemzetség molekuláris genetikai vizsgálatai alapján az Erwinia carotovora subsp. carotovora-t és az Erwinia carotovora subsp. atroseptica-t átsorolták a Pectobacterium nemzetségbe. 2005-ben pedig az Erwinia chrysanthemi-t sorolták át a Dickeya nemzetségbe, melynek hat különböző biotípusát különböztetik meg (Samson et al., 2005). Ennek megfelelően az Erwinia carotovora subsp. carotovora ma érvényben lévő elfogadott neve a Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (továbbiakban Pcc) (Jones, 1901) Hauben et al. (1998), az Erwinia carotovora subsp. atrosepticáé a Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum (továbbiakban Pca) (van Hall, 1902) Hauben et al. (1998), és az Erwinia chrysanthemié a Dickeya dadantii (továbbiakban Dd) (Burkholder et al. 1953) Samson et al. (2005). Sem a Pectobacterium, sem a Dickeya fajok nem tartoznak a burgonya zárlati károsítói közé sem hazánkban, sem Európában. Földrajzi elterjedésük igen széles körű, gyakorlatilag mindenütt előfordulnak, ahol burgonyát termesztenek, ezáltal komoly gazdasági károkat okozhatnak szerte a világon. Hazánkban laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatokra olyan esetekben kerül sor, amikor az állományban jelentős arányban szártőrothadásos tüneteket észlelnek, vagy felmerül a zárlati Ralstonia solenacearum fertőzés gyanúja. Németh (2013) szerint hazánkban a legjelentősebb baktériumos eredetű burgonya tőpusztulással járó esetekben kiváltó kórokozóként 7 Dickeya fajt azonosítottak. 2001 és 2011 között vizsgálták a Pectobacterium és Dickeya fajok hazai előfordulását és arra az eredményre jutottak, hogy a következő gyakorisági sorrendet lehet felállítani: Dickeya fajok (77%), Pcc (16%) és Pca (6%). 2007-ben Hollandiában csak a Dickeya fajok közel 30 millió € veszteséget okoztak a burgonya vetőgumó kereskedelemben (Slawiak et al. 2008). Az ellenük való védekezés a mai napig nem megoldott. Megoldást jelenthetne az ellenálló fajták bevonása a termesztésbe. Az Erwinia amylovora (Burill) Winslow et al. (továbbiakban Ea) az egész világon problémát jelent, az általa okozott tűzelhalás a legnehezebben leküzdhető betegségek egyike. Mivel a növényvédőszeres védekezés lehetőségei korlátozottak, az egyik legköltségkímélőbb lehetőség szintén az ellenállóbb fajták köztermesztésbe vonása lenne. Mivel a tűzelhalás kórokozója karantén károsító, ezért a fajták fogékonysága szabadföldi kísérletekben nem tesztelhető, kizárólag laboratóriumi körülmények között végezhetők vizsgálatok. Mikroszaporított növényeken végzett fertőzések hatására bekövetkező biokémiai változásokról szóló szakirodalom elenyésző számban áll rendelkezésünkre. Ráadásul előfordul, hogy ezek eltérő eredményeket közölnek. Ezért tartottuk fontos feladatunknak a biotikus stressz hatására létrejövő gazdaválasz nyomonkövetését biokémiai markerekkel. Azt szeretnénk tisztázni, hogy az eltérő betegségtípusokra azonosan vagy eltérően reagálnak a növények. Mivel a biokémiai